(57)【要約】【課題】新たな抗腫瘍剤を提供する。【解決手段】クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物を熱水抽出処理し、その熱水抽出液から分子量１００００以下の低分子物質を除去した後、精製処理して得られる、糖組成がガラクトースを主構成成分とし、更にグルコース、マンノース、キシロース、ラムノース、アラニノース及びフラクトースを他の構成成分とする高分子量のヘプチドヘテロ多糖体を、抗腫瘍剤の活性成分とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物を熱水抽出処理し、その熱水抽出液から分子量１００００以下の低分子物質を除去した後、精製処理して得られる、糖組成がガラクトースを主構成成分とし、更にグルコース、マンノース、キシロース、ラムノース、アラニノース及びフラクトースを他の構成成分とする高分子量のペプチドヘテロ多糖体を含有することを特徴とするクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離されるペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
精製処理が、エタノール沈殿処理、イオン交換クロマト処理及びゲル濾過処理から選ばれる少なくとも一つである請求項１記載のクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離されるペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤。
【請求項３】
ペプチドヘテロ多糖体が、分子量１００万〜５００万のものである請求項１又は２記載のクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離されるペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤。
【請求項４】
更に５−フルオロラウシルを含有する請求項１〜３のいずれか一つの項記載のクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離されるペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液から精製分離される特定の糖組成を有する高分子量のペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離された、糖組成がマンノースを主構成成分とし、更にグルコースを他の構成成分とする多糖体や、糖成分がラムノースを主構成成分とし、更にグルコース、ガラクトース、マンノース及びキシロースを他の構成成分とする多糖体に、免疫調節作用や免疫賦活作用のあることが報告されている（例えば非特許文献１及び２参照）。またクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液から精製分離した高分子量のペプチドヘテロ多糖体に、補体第３成分の活性化作用のあることが報告されている（例えば特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−４４７５３号公報
【特許文献２】特開２０１７−５２９１２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，Ｖｏｌ．２２４，Ｎｏ２，２２５〜２２８頁
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．５８，９２７〜９３６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液から精製分離した高分子量のペプチドヘテロ多糖体の新たな用途を提供する処にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の課題を解決するべく研究した結果、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物を熱水抽出処理し、その熱水抽出液から低分子物質を除去した後、精製処理して得られる、特定の糖組成を有する高分子量のペプチドヘテロ多糖体に優れた抗腫瘍活性があることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物を熱水抽出処理し、その熱水抽出液から分子量１００００以下の低分子物質を除去した後、精製処理して得られる、糖組成がガラクトースを主構成成分とし、更にグルコース、マンノース、キシロース、ラムノース、アラニノース及びフラクトースを他の構成成分とする高分子量のヘプチドヘテロ多糖体を含有することを特徴とするクロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物から分離されるペプチドヘテロ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤に係る。
【０００８】
一般にクロレラとしては、クロレラ・ピレノイドサ、クロレラ・エリプソイデア、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・レギラリス等が挙げられるが、本発明では、なかでもクロレラ・ピレノイドサを用いる。
【０００９】
本発明において、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物は、例えば、クロレラ・ピレノイドサの粉体の１０〜２５質量％水懸濁液を、１０℃以下に冷却して湿式粉砕機に供し、細胞壁破砕物のスラリーの温度が４０℃以下となるよう微粉砕した後、直ちに１０℃以下に冷却することにより得られる。必要に応じて、更に真空乾燥し、粉砕することもできる。用いる湿式粉砕機としては、外周に冷媒の流通可能なジャケットを備えるボールミルや振動ミル等が挙げられる。
【００１０】
本発明において、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出処理には、７０℃以上の熱水を用いるのが好ましく、９５〜１００℃の熱水を用いるのが好ましい。通常、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の５〜２０質量％熱水懸濁液を撹拌下に１〜５時間抽出処理する。
【００１１】
前記のように熱水抽出処理したものを、例えば遠心分離し、その上澄液を透析濾過や限外濾過等に供して、分子量１００００以下の低分子物質を除去する。尚、本発明において分子量は、ゲル濾過法により測定されるプルラン換算の数平均分子量である。
【００１２】
前記のように分子量１００００以下の低分子物質を除去したものを精製処理に供する。精製処理は、エタノール沈殿処理、イオン交換クロマト処理及びゲル濾過処理から選ばれる少なくとも一つで行なうのが好ましく、二つ以上を組合わせて行なうのがより好ましい。例えば、前記のように分子量１００００以下の低分子物質を除去したものに、３容量倍程度の無水エタノールを加え、沈殿物を遠心分離し、遠心分離した沈殿物を無水エタノールで洗浄し、乾燥した後、かくしてエタノール沈殿処理したものを、イオン交換クロマト処理及びゲル濾過処理に供する。イオン交換クロマト処理は、例えば和光純薬工業社製の商品名ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｃｌ−）等を用いて行なうことができ、またゲル濾過処理は、例えば和光純薬工業社製の商品名Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０等を用いて行なうことができる。
【００１３】
以上説明したように、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物を熱水抽出処理し、その熱水抽出液から分子量１００００以下の低分子物質を除去した後、精製処理すると、特定の糖組成を有する高分子量のペプチドヘテロ多糖体が得られる。本発明では、かかるペプチドヘテロ多糖体を抗腫瘍活性成分として用いる。
【００１４】
前記のペプチドヘテロ多糖体は、糖組成がガラクトースを主構成成分とし、更にグルコース、マンノース、キシロース、ラムノース、アラビノース及びフラクトース等を構成成分とする、分子量が１００万〜５００万程度の高分子量のものであり、糖組成がガラクトースを主構成成分とするという特徴を有し、また分子量が極めて高いという特徴を有する。
【００１５】
詳しくは実施例の欄で後述するように、前記のペプチドヘテロ多糖体は、優れた抗腫瘍活性を示し、５−フルオロラウシルと併用すると、更により優れた抗腫瘍活性を示す。
【発明の効果】
【００１６】
本発明で用いる、クロレラ・ピレノイドサの細胞壁破砕物の熱水抽出液から精製分離される特定の糖組成を有する高分子量のペプチドヘテロ多糖体は、優れた抗腫瘍活性を示す。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるというものではない。
【００１８】
試験区分１（ペプチドヘテロ多糖体の分離）
クロレラ・ピレノイドサの２０質量％水懸濁液を、外周に冷媒の流通可能なジャケットを有し且つ粉砕筒内に粉砕媒体としてグラスビーズを装填したボールミルに供して、品温を４０℃以下に保持しつつ２時間、湿式粉砕した後、湿式粉砕したスラリーを取り出し、真空乾燥して粉砕し、細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサの乾燥粉砕物４００ｇを得た。
【００１９】
前記のクロレラ・ピレノイドサの乾燥粉砕物に９５〜１００℃の熱水を加えて、１５質量％熱水懸濁液とし、煮沸還流下に２時間、撹拌して熱水抽出処理した。室温に冷却後、沈殿物上の上澄液を分画分子量１００００のフィルターを用いて限外濾過し、濾液を廃棄して、１回目の抽出残渣を得た。別に、前記の沈殿物についても同様の熱水抽出処理を行ない、同様に限外濾過して、２回目の抽出残渣を得た。
【００２０】
前記の１回目の抽出残渣と２回目の抽出残渣の混合物を３℃で１２時間静置した後、室温下に１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理し、上澄液と沈殿物に分けた。上澄液を回収し、３℃で分画分子量１００００のフィルターを用いて限外濾過して、非濾過画分を得た。
【００２１】
前記の非濾過画分に、３容量倍の無水エタノールを加えて撹拌し、室温下に１００００ｒｐｍで遠心分離処理して、上澄液と沈殿物に分けた。この沈殿物を回収し、無水エタノールで３回洗浄した後、更に無水エーテルで１回洗浄した。その後、４０℃で真空乾燥してＦＡ（粗多糖）を得た。
【００２２】
前記のＦＡを水に溶解させ、イオン交換クロマトグラフィー｛和光純薬工業社製の商品名ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｃｌ−）の使用による勾配溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ０→１．０ＭＮａＣｌ）｝に供して、画分ＦＡ−１、ＦＡ−２、ＦＡ−３に分画した。画分ＦＡ−１を、ゲル濾過法｛和光純薬工業社製の商品名Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０の使用による勾配溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ０→２．０ＭＮａＣｌ）｝により精製して、ＦＡ−１ａ（ペプチドヘテロ多糖体）を得た。クロレラ・ピレノイドサの乾燥粉末物４００ｇからのＦＡ（粗多糖）及びＦＡ−１ａ（ペプチドヘテロ多糖体）の収量は、真空凍結乾燥粉末でそれぞれ１５．６３ｇ及び２５３．２７ｍｇであった。
【００２３】
前記のＦＡ−１ａを分析した結果、次のような理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有するペプチドヘテロ多糖体であった。
（ａ）平均分子量：１００万
（ｂ）比旋光度：［ａ］Ｄ−１１．６（測定温度２５℃）
（ｃ）窒素含量５．３９％、蛋白質含量２９．５％、多糖含量７０．３％（各質量％）
（ｄ）糖組成（モル％）：ガラクトース（３２）／グルコース（２５）／マンノース（１３）／キシロース（８）／ラムノース（７）／アラビノース（５）／フラクトース（３）
（ｅ）アミノ酸組成（モル％）：グルタミン酸（１５．１）／アスパラギン酸（１３．８）／アラニン（９．９）／ロイシン（８．９）／トレオニン（６．５）／リシン（６．２）／バリン（５．９）／グリシン（５．８）／プロリン（５．５）／セリン（５．４）／アルギニン（４．８）／フェニルアラニン（３．６）／イソロイシン（３．１）／チロシン（２．１）／ヒスチジン（１．７）／メチオニン（１．６）
【００２４】
試験区分２（抗腫瘍活性の試験その１）
５週齢のマウス｛日本エスエルシー社製のＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳＬＣ（ＳＰＦ）｝を購入し、これらのうちで、７日間予備飼育した後、一般的症状観察及び尿検査で異常が認められなかったマウスを試験に供した。またルイス肺癌細胞は、愛知ガンセンターより供与され、三重大学医学部にて本発明者の一人である伊藤均が継代しているものを用いた。以上のマウス及び血行性に容易に肺転移を起こすルイス肺癌細胞等を用いて、次のように、試験区分１で分離したＦＡ−１ａ（ペプチドヘテロ多糖体）の抗腫瘍活性の試験を行なった。
【００２５】
１群１０匹のマウスとし、試験１では、対照群と、合計３群（第１群、第２群及び第３群）の投与群で試験した。マウスは、温度２３±２℃、相対湿度５５±５％のバリアシステムのプラスチックケージで、固形飼料（日本クレア社製の商品名クレアＣＥ−７）と水道水とを自由に摂取させて、１４日間飼育した（飼育は試験２でも、また試験３でも同じ）。
【００２６】
試験１では、試験開始日に、対照群及び合計３群の投与群（第１群、第２群及び第３群）の各マウスの足蹠部皮下に、ルイス肺癌細胞を１０５個となるよう移植した。第１群のマウスは、試験開始後１０日目に、ＦＡ−１ａを５ｍｇ／ｋｇとなるよう腹腔内に投与し、前記のように１４日間飼育した。また第２群のマウスは同様にＦＡ−１ａを１０ｍｇ／ｋｇとなるよう投与し、更に第３群のマウスは同様にＦＡ−１ａを２０ｍｇ／ｋｇとなるよう投与して、１４日間飼育した。そして対照群のマウスはＦＡ−１ａに代えて生理食塩水を同様に投与し、１４日間飼育した。
【００２７】
１４日間飼育した対照群及び合計３群の投与群の各マウスについて、肺転移結節数をＷｅｘｌｅｒの方法（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９６６年、３６巻、６４１〜６４５頁）により測定し、結果を平均値±標準誤差で、表１にまとめて示した。対照群と投与群との間でスチューデントのｔ検定を行ない、危険率５％で有意と判断して、表１中に＊印で示した。
【００２８】
１群１０匹のマウスとし、試験２では、対照群と、合計２群の投与群で試験した。試験２では、試験開始日（０日目）に、対照群及び合計２群の投与群（第４群及び第５群）の各マウスの足蹠部皮下に、ルイス肺癌細胞を１０５個となるよう移植した。第４群のマウスは、試験開始後１０日目、１２日目及び１４日目に、ＦＡ−１ａを１０ｍｇ／ｋｇとなるよう腹腔内に投与し、前記のように１４日間飼育した。また第５群のマウスは同様にＦＡ−１ａを２０ｍｇ／ｋｇとなるよう投与して、１４日間飼育した。そして対照群のマウスはＦＡ−１ａに代えて生理食塩水を同様に投与し、１４日間飼育した。
【００２９】
１４日間飼育した対照群及び合計２群の投与群の各マウスについて、試験１と同様に、肺転移結節数を測定し、結果を平均値±標準誤差で、表１にまとめて示した。また対照群と投与群との間でスチューデントのｔ検定を行ない、危険率５％で有意と判断して、表１中に＊印で示した。
【００３０】
１群１０匹のマウスとし、試験３では、対照群と、第６群の投与群で試験した。試験３では、試験開始日（０日目）に、対照群及び第６群の投与群の各マウスの足蹠部皮下に、ルイス肺癌細胞を１０５個となるよう移植した。第６群のマウスは、試験開始後３日目、５日目、７日目、９日目、１０日目、１２日目及び１４日目に、ＦＡ−１ａを１０ｍｇ／ｋｇとなるよう腹腔内に投与し、前記のように１４日間飼育した。そして対照群のマウスはＦＡ−１ａに代えて生理食塩水を同様に投与し、１４日間飼育した。
【００３１】
１４日間飼育した対照群及び第６群の投与群の各マウスについて、試験１と同様に、肺転移結節数を測定し、結果を平均値±標準誤差で、表１にまとめて示した。対照群と投与群との間でスチューデントのｔ検定を行ない、危険率５％で有意と判断して、表１中に＊印で示した。
【００３２】
【表１】
2018203667.tif 000002
【００３３】
試験区分３（抗腫瘍活性の試験その２）
試験区分２と同様のマウス及びルイス肺癌細胞等を用いて、次のように、試験区分１で分離したＦＡ−１ａ（ペプチドヘテロ多糖体）及び５−フルオロラウシルについての抗腫瘍活性の試験を行なった。
【００３４】
１群１０匹のマウスとし、試験４では、対照群と、合計３群の投与群（第７群、第８群及び第９群）で試験した。試験４では、試験開始日に、対照群及び合計３群の投与群（第７群、第８群及び第９群）の各マウスの足蹠部皮下に、ルイス肺癌細胞を１０５個となるよう移植した。第７群のマウスは、試験開始後１０日目、１２日目及び１４日目に、ＦＡ−１ａを１０ｍｇ／ｋｇとなるよう腹腔内に投与し、前記のように１４日間飼育した。また第８群のマウスは同様に５−フルオロラウシルを３０ｍｇ／ｋｇとなるよう投与し、更に第９群のマウスは同様にＦＡ−１ａを１０ｍｇ／ｋｇ及び５−フルオロラウシルを３０ｍｇ／ｋｇとなるよう投与して、１４日間飼育した。そして対照群のマウスはＦＡ−１ａや５−フルオロラウシルに代えて生理食塩水を同様に投与し、１４日間飼育した。
【００３５】
１４日間飼育した対照群及び合計３群の投与群の各マウスについて、試験１と同様に、肺転移結節数を測定すると共に、肺転移率を求め、結果を平均値±標準誤差で、表２にまとめて示した。対照群と投与群との間でスチューデントのｔ検定を行ない、危険率５％で有意と判断した場合を表２中に＊印で示すと共に、危険率１％で有意と判断した場合を表２中に＊＊印で示した。
【００３６】
【表２】
2018203667.tif 000003
【００３７】
表１の結果からも明らかなように、本発明によると、優れた抗腫瘍活性を示し、またかかる抗腫瘍活性は、表２の結果からも明らかなように、５−フルオロラウシルと併用すると、一段と顕著になる。ＦＡ−１ａは、直接的肺癌細胞増殖阻害作用を示さない。しかし、ＦＡ−１ａの投与により得られた粘着性腹腔浸出細胞は、それ自体がルイス肺癌細胞の増殖阻害作用を有する。その結果としてルイス肺癌細胞の肺転移抑制効果を示し、かかる結果は養子免疫療法に応用できることを示唆している。