(57)【要約】【課題】インボルクリン遺伝子の発現促進効果に優れ、皮膚に適用することによりインボルクリン濃度を速やかに上昇させて、バリア機能を顕著に向上させる効果を発揮するインボルクリン遺伝子発現促進剤を提供する。【解決手段】本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、下記式（１）［式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なって、水素原子、又は、置換基を示す。ｎは１以上の整数を示す］で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種を有効成分として含む。【化１】2018203682.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2018203682.tif 000018
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なって、水素原子、又は、置換基として、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ3、−ＣＯＮＲ32、−ＣＯＲ3、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＮＨＣＯＲ3、−ＯＲ3、−ＳＲ3、−ＯＣＯＲ3、−ＳＯ3Ｒ3、及び−ＳＯ2ＮＲ32からなる群より選択される基を１又は２以上有していてもよい炭化水素基（前記Ｒ3は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す）を示す。ｎは１以上の整数を示す］
で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種を有効成分として含む、インボルクリン遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インボルクリン遺伝子発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの表皮及び真皮細胞層は化学物質を選択的に透過させる機能を有する。そして、表皮を構成する角質層によってアレルゲンの進入が阻止される。
【０００３】
一方、アレルギー性皮膚疾患、尋常性魚鱗癬、老人性乾皮症等の患者の多くは、皮膚のバリア機能が低下してアレルゲンが侵入し易い状態となり、アレルゲンの侵入によりアレルギー反応が引き起こされて強い掻痒感が生じ、掻破により皮膚表面が傷ついてバリア機能が更に低下するという負のサイクルが引き起こされている。
【０００４】
ここで、インボルクリンは、角化の際にトランスグルタミナーゼ等の酵素の働きによって互いに架橋して、角質細胞の外壁を形成し、角質層の強度を高める働きを有することが知られている。従って、皮膚バリア機能の低下を抑制し、皮膚バリア機能を高く保持するためには、細胞内においてインボルクリンの合成を促進して、インボルクリン濃度を上昇させることが考えられる。
【０００５】
特許文献１には、アトピー性皮膚炎等の炎症性疾患において過剰発現が観察されているソラヤシンという分泌タンパク質を内服又は外用すると、インボルクリン遺伝子の発現を促進する効果が得られることが記載されている。また、特許文献２には、バラ科のイチゴ属植物に含有されるチリロサイドを内服又は外用すると、インボルクリンの合成を促進する効果が得られることが記載されている。しかし、何れの場合も、インボルクリン遺伝子の発現促進効果としては未だ不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−６０７３５号公報
【特許文献２】特開２０１６−７４６１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、インボルクリン遺伝子の発現促進効果に優れ、皮膚に適用することによりインボルクリン濃度を速やかに上昇させて、バリア機能を顕著に向上させる効果を発揮するインボルクリン遺伝子発現促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題を解決するため鋭意検討した結果、下記式（１）で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物は、インボルクリン遺伝子の発現促進効果に優れ、皮膚に適用することによりインボルクリン濃度を速やかに上昇させて、バリア機能を顕著に向上させる効果を発揮することを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）
【化１】
2018203682.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なって、水素原子、又は、置換基として、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ3、−ＣＯＮＲ32、−ＣＯＲ3、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＮＨＣＯＲ3、−ＯＲ3、−ＳＲ3、−ＯＣＯＲ3、−ＳＯ3Ｒ3、及び−ＳＯ2ＮＲ32からなる群より選択される基を１又は２以上有していてもよい炭化水素基（前記Ｒ3は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す）を示す。ｎは１以上の整数を示す］
で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種を有効成分として含む、インボルクリン遺伝子発現促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、有効成分として上記式（１）で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種を含むため、インボルクリン遺伝子の発現促進効果に優れ、皮膚に適用することにより、インボルクリン濃度を速やかに上昇させて、バリア機能を顕著に向上させる効果を発揮する。更に、上記式（１）で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物は安全性に優れる。そのため、本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、インボルクリン濃度が低下することにより引き起こされる様々な症状（例えば、アレルギー性皮膚疾患等）を改善する目的で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤による、インボルクリン遺伝子の発現促進効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［インボルクリン遺伝子発現促進剤］
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、有効成分として、下記式（１）で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種を含む。
【００１３】
下記式（１）で表される化合物は少なくとも１個の不斉原子を有する。そのため、下記式（１）で表される化合物には少なくとも２種の光学異性体が存在する。本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、下記式（１）で表される化合物として、光学異性体（若しくは、鏡像異性体）の等量混合物（＝ラセミ体）を使用してもよく、又前記光学異性体の等量混合物を光学分割して得られる光学活性体（若しくは、片方の鏡像異性体）を使用しても良い。尚、ラセミ体の光学分割にはジアステレオマー塩法やキラルカラムを用いた分割法等、周知慣用の方法を採用することができる。
【００１４】
【化２】
2018203682.tif 000003
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一又は異なって、水素原子、又は、置換基として、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ3、−ＣＯＮＲ32、−ＣＯＲ3、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＮＨＣＯＲ3、−ＯＲ3、−ＳＲ3、−ＯＣＯＲ3、−ＳＯ3Ｒ3、及び−ＳＯ2ＮＲ32からなる群より選択される基を１又は２以上有していてもよい炭化水素基（前記Ｒ3は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基を示す）を示す。ｎは１以上の整数を示す］
【００１５】
前記Ｒ1、Ｒ2における炭化水素基には、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、及びこれらが単結合を介して結合した基が含まれる。
【００１６】
脂肪族炭化水素基としては、Ｃ1-20（＝炭素数１〜２０）の脂肪族炭化水素基が好ましく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、デシル基、ドデシル基等の炭素数Ｃ1-20（好ましくはＣ1-10、特に好ましくはＣ1-3）程度のアルキル基；ビニル基、アリル基、１−ブテニル基等のＣ2-20（好ましくはＣ2-10、特に好ましくはＣ2-3）程度のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基等のＣ2-20（好ましくはＣ2-10、特に好ましくはＣ2-3）程度のアルキニル基等が挙げられる。
【００１７】
脂環式炭化水素基としては、Ｃ3-20脂環式炭化水素基が好ましく、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基等のＣ3-20（好ましくはＣ3-15、特に好ましくはＣ5-8）程度のシクロアルキル基；シクロペンテニル基、シクロへキセニル基等のＣ3-20（好ましくはＣ3-15、特に好ましくはＣ5-8）程度のシクロアルケニル基；パーヒドロナフタレン−１−イル基、ノルボルニル基、アダマンチル基、トリシクロ［５．２．１．０2,6］デカン−８−イル基、テトラシクロ［４．４．０．１2,5．１7,10］ドデカン−３−イル基等の橋かけ環式炭化水素基等が挙げられる。
【００１８】
芳香族炭化水素基としては、Ｃ6-14（特に、Ｃ6-10）芳香族炭化水素基が好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００１９】
脂肪族炭化水素基と脂環式炭化水素基とが結合した基には、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２−シクロヘキシルエチル基等のシクロアルキル置換アルキル基（例えば、Ｃ3-20シクロアルキル置換Ｃ1-4アルキル基等）等が含まれる。また、脂肪族炭化水素基と芳香族炭化水素基とが結合した基には、アラルキル基（例えば、Ｃ7-18アラルキル基等）、アルキル置換アリール基（例えば、１〜４個程度のＣ1-4アルキル基が置換したフェニル基又はナフチル基等）等が含まれる。
【００２０】
前記Ｒ3における脂肪族炭化水素基としては、上記Ｒ1、Ｒ2における脂肪族炭化水素基と同様の例を挙げることができる。
【００２１】
前記Ｒ3における脂肪族炭化水素基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、オキソ基、ヒドロキシル基、置換オキシ基（例えば、Ｃ1-4アルコキシ基、Ｃ6-10アリールオキシ基、Ｃ7-16アラルキルオキシ基、Ｃ1-4アシルオキシ基等）、カルボキシル基、置換オキシカルボニル基（例えば、Ｃ1-4アルコキシカルボニル基、Ｃ6-10アリールオキシカルボニル基、Ｃ7-16アラルキルオキシカルボニル基等）、置換又は無置換カルバモイル基（例えば、カルバモイル、メチルカルバモイル等のＣ1-4アルキル置換カルバモイル、フェニルカルバモイル基等のＣ6-10アリール置換カルバモイル基）、シアノ基、ニトロ基、置換又は無置換アミノ基（例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ基等のモノ又はジＣ1-4アルキルアミノ基；１−ピロリジニル、ピペリジノ、モルホリノ基等の５〜８員の環状アミノ基；アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、ベンゾイルアミノ基等のＣ1-10アシルアミノ基；ベンゼンスルホニルアミノ、ｐ−トルエンスルホニルアミノ基等のスルホニルアミノ基）、スルホ基、複素環式基等が挙げられる。また、前記ヒドロキシル基やカルボキシル基は有機合成の分野で慣用の保護基で保護されていてもよい。
【００２２】
ｎは１以上の整数を示し、例えば１〜１０の整数である。
【００２３】
式（１）で表される化合物としては、下記［Ｉ］［II］が含まれる。
［Ｉ］式（１）中のＯＲ1基とＯＲ2基が何れもＯＨ基である化合物（化合物（Ｉ））
［II］式（１）中のＯＲ1基とＯＲ2基の少なくとも一方が、ＯＨ基以外の基である化合物（化合物（II））
【００２４】
化合物（Ｉ）の場合、ｎとしては、好ましくは２〜１０の整数、特に好ましくは２〜８の整数である。
【００２５】
化合物（II）の場合、ｎとしては、好ましくは１〜８の整数、特に好ましくは２〜６の整数である。
【００２６】
化合物（II）におけるＯＲ1基とＯＲ2基の組みあわせとしては、下記［II-i］〜［II-v］の組み合わせが好ましい。特に、式（１）中のｎが１又は２の場合は下記［II-i］〜［II-iv］の組み合わせが好ましく、式（１）中のｎが３以上の整数の場合は下記［II-v］の組み合わせが好ましい。
【００２７】
［II-i］下記式（i-1）で表される基と下記式（i-2）で表される基の組み合わせ
【化３】
2018203682.tif 000004
［式（i-1）中、Ｒ4は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式基を示す］
［式（i-2）中、Ｒ5〜Ｒ7は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ8、−ＣＯＮＲ82、−ＣＯＲ8、−ＯＣＯＲ8、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＳＲ8、−ＳＯＲ8、−ＳＯ2Ｒ8、−ＳＯ2ＮＲ82、−ＰＯ（ＯＲ8）2、及び−ＮＯ2からなる群より選択される基を示す。前記Ｒ8は、水素原子、アルキル基、又はアルケニル基を示す。Ｒ5〜Ｒ7から選択される２つの基は互いに結合して、式（i-2）で示される基において、これらの基が結合する炭素原子と共に、環を形成していてもよい］
【００２８】
前記脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基としては、上述のＲ1、Ｒ2における脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基と同様の例を挙げることができる。
【００２９】
前記複素環式基を構成する複素環には、芳香族性複素環及び非芳香族性複素環が含まれる。このような複素環としては、環を構成する原子に炭素原子と少なくとも１種のヘテロ原子（例えば、酸素原子、イオウ原子、窒素原子等）を有する３〜１０員環（好ましくは４〜６員環）、及びこれらの縮合環を挙げることができる。具体的には、ヘテロ原子として酸素原子を含む複素環（例えば、オキシラン環等の３員環；オキセタン環等の４員環；フラン環、テトラヒドロフラン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、γ−ブチロラクトン環等の５員環；４−オキソ−４Ｈ−ピラン環、テトラヒドロピラン環、モルホリン環等の６員環；ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、４−オキソ−４Ｈ−クロメン環、クロマン環、イソクロマン環等の縮合環；３−オキサトリシクロ［４．３．１．１4,8］ウンデカン−２−オン環、３−オキサトリシクロ［４．２．１．０4,8］ノナン−２−オン環等の橋かけ環）、ヘテロ原子としてイオウ原子を含む複素環（例えば、チオフェン環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環等の５員環；４−オキソ−４Ｈ−チオピラン環等の６員環；ベンゾチオフェン環等の縮合環等）、ヘテロ原子として窒素原子を含む複素環（例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピラゾール環、イミダゾール環、トリアゾール環等の５員環；イソシアヌル環、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピペリジン環、ピペラジン環等の６員環；インドール環、インドリン環、キノリン環、アクリジン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、プリン環等の縮合環等）等が挙げられる。複素環式基は前記複素環の構造式から１個の水素原子を除いた基である。
【００３０】
前記Ｒ4〜Ｒ7における脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、及び複素環式基が有していてもよい置換基としては、前記Ｒ3における脂肪族炭化水素基が有していてもよい置換基と同様の例を挙げることができる。
【００３１】
［II-ii］下記式（ii-1）で表される基と下記式（ii-2）で表される基の組み合わせ
【化４】
2018203682.tif 000005
［式（ii-1）中、Ｒ9は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を示し、Ｒ10は水素原子又は下記式（r10）
【化５】
2018203682.tif 000006
（式中、Ｒ11は水素原子、メチル基、又はエチル基を示す。ｎ１は０〜４の整数、ｎ２は０又は１、ｎ３は０〜４の整数を示す。ｎ１〜ｎ３から選択される２以上が同一であってもよい。Ｘ1はアミド結合又はアルケニレン基を示し、Ｘ2は−ＣＯＯＲ3、−ＣＯＮＲ32、−ＣＯＲ3、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＮＨＣＯＲ3、−ＯＲ3、−ＳＲ3、−ＯＣＯＲ3、−ＳＯ3Ｒ3、及び−ＳＯ2ＮＲ32からなる群より選択される基（前記Ｒ3は、前記に同じ）を示す）
で表される基を示す］
［式（ii-2）中、Ｙ1は水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、ハロゲン原子、−ＣＯＯＲ8、−ＣＯＮＲ82、−ＣＯＲ8、−ＯＣＯＲ8、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＳＲ8、−ＳＯＲ8、−ＳＯ2Ｒ8、−ＳＯ2ＮＲ82、−ＰＯ（ＯＲ8）2、及び−ＮＯ2からなる群より選択される基を示す。Ｒ8は前記に同じ。Ｙ2は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、−ＣＯＯＲ3、−ＣＯＮＲ32、−ＣＯＲ3、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＮＨＣＯＲ3、−ＯＲ3、−ＳＲ3、−ＯＣＯＲ3、−ＳＯ3Ｒ3、及び−ＳＯ2ＮＲ32からなる群より選択される基（前記Ｒ3は、前記に同じ）を示す。Ｙ1とＹ2は互いに結合して、式（ii-2）中のベンゼン環を構成する炭素原子と共に、環を形成していてもよい］
【００３２】
［II-iii］置換基を有していてもよいアルコキシ基と、下記式（iii-1）〜（iii-4）で表される基から選択される基の組み合わせ
【化６】
2018203682.tif 000007
（式中、Ｒ12は水素原子、メチル基、又はエチル基を示す。Ｙ1、Ｙ2は前記に同じ。Ｙ1とＹ2は互いに結合して、式中の芳香環を構成する炭素原子と共に、環を形成していてもよい）
【００３３】
［II-iv］ＯＲ1基とＯＲ2基が、同一又は異なって、下記式（iv-1）で表される基である組み合わせ
【化７】
2018203682.tif 000008
（式中、Ｙ1、Ｙ2は前記に同じ。Ｙ1とＹ2は互いに結合して、式中のベンゼン環を構成する炭素原子と共に、環を形成していてもよい）
【００３４】
［II-v］ヒドロキシル基と置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素オキシ基（好ましくはＣ1-6アルコキシ基）との組み合わせ
【００３５】
上記アルキル基、アルケニル基、アリール基、アルコキシ基、及び脂肪族炭化水素オキシ基が有していてもよい置換基としては、前記Ｒ3における脂肪族炭化水素基が有していてもよい置換基と同様の例を挙げることができる。
【００３６】
前記脂肪族炭化水素オキシ基を構成する脂肪族炭化水素基としては、上記Ｒ1、Ｒ2における脂肪族炭化水素基と同様の例を挙げることができる。
【００３７】
前記化合物（Ｉ）としては、下記式（I-1）〜（I-5）で表される化合物（光学異性体を含む）が好ましい。
【化８】
2018203682.tif 000009
【００３８】
前記化合物（II）としては、下記式（II-1）〜（II-2）で表される化合物（光学異性体を含む）が好ましい。
【化９】
2018203682.tif 000010
【００３９】
式（１）で表される化合物は水和物であってもよく、又、式（１）で表される化合物やその水和物は塩を形成していてもよい。式（１）で表される化合物やその水和物の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニアとの塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、キノリン、ピペリジン、イミダゾール、ピコリン、ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等の含窒素有機塩基との塩；リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩；遷移金属塩；塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸との塩；シュウ酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。
【００４０】
上記式（１）で表される化合物のうち化合物（Ｉ）は、例えば下記工程［１］〜［４］を経て製造することができる。また、化合物（II）は、例えば下記工程［１］〜［１０］を経て製造することができる。
【００４１】
下記式中、ｎは前記に同じ。Ｘはハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子）を示し、Ｒ、Ｒ’は、同一又は異なって、炭素数１〜１０のアルキル基を示す。Ｒ”はアミノ基の保護基を示す。ＤＰＲは脱保護剤を示す。尚、アミノ基の保護基としては、例えば、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数７〜１８のアラルキル基、アシル基（ＲaＣ（＝Ｏ）基；Ｒaは炭素数１〜１０のアルキル基）、アルコキシカルボニル基（ＲbＯＣ（＝Ｏ）基；Ｒbは炭素数１〜１０のアルキル基）、置換基を有していても良いベンジルオキシカルボニル基、置換基を有していても良いフェニルメチリデン基、置換基を有していても良いジフェニルメチリデン基等が挙げられる。また、前記置換基としては、例えば、ハロゲン原子、炭素数１〜３のアルコキシ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００４２】
【化１０】
2018203682.tif 000011
【００４３】
【化１１】
2018203682.tif 000012
【００４４】
【化１２】
2018203682.tif 000013
【００４５】
工程［１］の反応は、式（２）で表されるジハロゲン化アルキレンに、式（３）で表される亜リン酸エステルを反応させて、式（４）で表されるホスホノアルカン酸を得る反応（ミカエリス・アルブゾフ反応；Michaelis-Arbuzov Reaction）である。前記式（３）で表される亜リン酸エステルの使用量は、式（２）で表されるジハロゲン化アルキレン１モルに対して、例えば０．１〜１．０モル程度である。
【００４６】
工程［１］の反応の反応温度は、例えば１３０〜１４０℃程度が好ましい。反応時間は、例えば０．５〜２時間程度である。
【００４７】
工程［２］の反応は、工程［１］の反応を経て得られた式（４）で表されるホスホノアルカン酸に、式（５）で表される化合物を反応させて、式（６）で表される化合物を得る反応である。前記式（５）で表される化合物の使用量は、式（４）で表されるホスホノアルカン酸１モルに対して、例えば０．７〜１．３モル程度である。
【００４８】
工程［２］の反応は、塩基の存在下で行うことが、反応の進行を促進する効果が得られる点で好ましい。前記塩基としては、例えば、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩類（特にアルカリ金属の炭酸塩類）；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；リン酸二水素ナトリウムやリン酸二水素カリウム等のリン酸塩類（特にアルカリ金属のリン酸塩類）；酢酸ナトリウムや酢酸カリウム等のカルボン酸塩類（特にアルカリ金属のカルボン酸塩類）；トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等の金属アルコキシド類（特にアルカリ金属のアルコキシ類）；水素化ナトリウム等の金属水素化物類等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。塩基の使用量は、式（４）で表されるホスホノアルカン酸１モルに対して、例えば０．９〜１．１モル程度である。
【００４９】
工程［２］の反応は溶媒の存在下で行うことが好ましい。前記溶媒としては、例えば、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；スルホラン等のスルホン類；酢酸エチル等のエステル類；ジメチルホルムアミド等のアミド類；メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール等のアルコール類；ペンタン、ヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム、ブロモホルム、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等の含ハロゲン化合物；ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、エチルメチルカーボネート等の鎖状カーボネート；エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート等の環状カーボネート等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み併せて使用することができる。
【００５０】
工程［２］の反応の反応温度は、例えば１００〜１１０℃程度が好ましい。反応時間は、例えば６〜２４時間程度である。
【００５１】
工程［３］の反応は、工程［２］の反応を経て得られた式（６）で表される化合物の保護基で保護されたカルボキシ基（−ＣＯＯＲ’）、及び保護基で保護されたアミノ基（−ＮＨＲ"）、及び保護基で保護されたホスホン酸基（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）2）を脱保護して、式（７）で表される化合物を得る反応である。保護基で保護された基の脱保護は、脱保護剤を反応させることにより行うことができる。前記脱保護剤（上記式中では、「ＤＰＲ」で表される）としては、強塩基（例えば、水酸化ナトリウム）又は強酸（例えば、塩酸）を好適に使用することができる。
【００５２】
工程［３］の反応の反応温度は、例えば９０〜１００℃程度が好ましい。反応時間は、例えば２０〜２４時間程度である。
【００５３】
工程［４］の反応は、工程［３］の反応を経て得られた式（７）で表される化合物に、脱保護剤をトラップする作用を有する化合物を反応させて、化合物（Ｉ）を得る反応である。脱保護剤をトラップする作用を有する化合物としては、例えば脱保護剤が塩酸である場合は、プロピレンオキシドを使用することができる。脱保護剤をトラップする作用を有する化合物の使用量は、式（７）で表される化合物１モルに対して、例えば３．０〜６．０モル程度である。
【００５４】
工程［５］は、化合物（Ｉ）のカルボキシル基に保護基を導入する工程であり、例えば、化合物（Ｉ）とＲCＯＨ（ＲCは置換基を有していてもよいアリール基又はアラルキル基を示し、好ましくはベンジル、４−ニトロベンジル基である）を反応させることにより保護基を導入することができる。この反応は、酸触媒（例えば、塩酸等）の存在下、室温付近の温度環境下で行うことが好ましい。反応時間は、例えば１２〜２４時間程度である。
【００５５】
工程［６］は、化合物（Ｉ）のアミノ基に保護基を導入する工程であり、例えば、溶媒に溶解した化合物（Ｉ）中にＲ”Ｘを滴下して反応させることにより、保護基を導入することができる。この反応は、塩基（例えば、炭酸水素ナトリウム等）の存在下で行うことが好ましい。
【００５６】
前記溶媒としては、例えば、水、ハロゲン化炭化水素系溶媒、飽和又は不飽和炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒等を１種又は２種以上使用することができる。
【００５７】
滴下時温度は、室温以下が好ましく、特に０℃付近が好ましい。反応時間は、例えば０．５〜２時間程度である。また、滴下終了後は例えば２５〜３０℃に保温した状態で、例えば１０〜２４時間程度、撹拌しつつ熟成させることが好ましい。
【００５８】
工程［７］は、リン酸基の２つのヒドロキシル基をハロゲン原子で置換する工程であり、例えば、工程［５］［６］を経て得られた化合物に、触媒及び溶媒の存在下でハロゲン化剤を反応させることにより行うことができる。前記触媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を使用することができる。また、前記溶媒としては、ハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒等を１種又は２種以上使用することができる。前記ハロゲン化剤としては、例えば、塩酸オキサリル、塩化チオニル、五塩化リン、オキシ塩化リン等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。この反応は、室温付近の温度で１時間程度行うことが好ましい。
【００５９】
工程［８］は、Ｒ1ＯＨを反応させて、工程［７］を経て得られたリン原子に結合するハロゲン原子の一方をＯＲ1に置換する工程である。この反応は塩基の存在下で行うことが好ましく、塩基としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルイソプロピルアミン、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン等が挙げられる。また、この反応は溶媒の存在下で行うことが好ましく、溶媒としては乾燥ジクロロメタンを使用することが好ましい。反応は、−６５℃付近で３０分間程度撹拌した後、室温までゆっくり昇温し、その後室温を保持した状態で１〜３時間程撹拌して行うことが好ましい。
【００６０】
工程［９］は、Ｒ2ＯＨを反応させて、リン原子に結合するハロゲン原子の他方をＯＲ2に置換する工程である。工程［９］は、Ｒ1ＯＨに代えてＲ2ＯＨを使用する以外は工程［８］と同様の方法で行うことができる。
【００６１】
工程［１０］は、保護基で保護されたカルボキシル基とアミノ基を脱保護する工程であり、例えば、接触水素還元法、塩化アルミニウムを用いた脱保護法等により行うことができる。前記接触水素還元法は、パラジウムを活性炭や硫酸バリウム等の担体に担持させたパラジウム系触媒や白金系触媒の存在下で、水素ガスをバブリングする方法である。また、前記塩化アルミニウムを用いた脱保護法は、三塩化アルミニウムを加えた溶媒（例えば、乾燥ニトロメタン等の高極性溶媒）で、工程［９］を経て得られた化合物とアニソールとを反応させる方法である。
【００６２】
各工程の反応雰囲気としては反応を阻害しない限り特に限定されず、例えば、空気雰囲気、窒素雰囲気、アルゴン雰囲気等の何れであってもよい。また、反応は常圧、減圧又は加圧下で行なうことができる。更に、反応はバッチ式、セミバッチ式、連続式等の何れの方法でも行うことができる。
【００６３】
各工程終了後は、得られた反応生成物に、例えば、ろ過、濃縮、蒸留、抽出、晶析、吸着、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の分離手段や、これらを組み合わせた分離手段を施して精製してもよい。
【００６４】
式（１）で表される化合物の水和物は、上記方法で得られた化合物（Ｉ）又は化合物（II）を、水と水溶性溶媒とを用いた晶析処理に付すことにより製造することができる。
【００６５】
前記水溶性溶媒としては、室温（２５℃）において水に溶解する有機溶媒が好ましく、水に対する溶解度が５０％以上（好ましくは８０％以上、特に好ましくは９５以上）のものが好ましい。
【００６６】
前記水溶性溶媒としては、アルコール（例えば、メタノール、エタノール等の炭素数１〜５の低級アルコール）を使用することが好ましい。
【００６７】
式（１）で表される化合物の塩は、上記方法で得られた化合物（Ｉ）又は化合物（II）に、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム等の塩基性化合物；アンモニア；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、キノリン、ピペリジン、イミダゾール、ピコリン、ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等の含窒素有機塩基；リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸；シュウ酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸等を反応させることにより製造することができる。
【００６８】
式（１）で表される化合物は少なくとも１個の不斉原子を有する。例えば、式（１）で表される化合物が１個の不斉原子を有する場合、式（１）で表される化合物は２種の光学異性体の等量混合物（＝ラセミ体）である。ラセミ体の光学分割にはジアステレオマー塩法やキラルカラムを用いた分割法等、周知慣用の方法を採用することができる。
【００６９】
ジアステレオマー塩法では、ラセミ体に塩基性光学活性物質を反応させて２種のジアステレオマー塩を形成させ、これらの溶解度の差を利用して分別晶析することにより一方のジアステレオマー塩を容易に単離することができる。
【００７０】
前記塩基性光学活性化合物としては、例えば、Ｄ−又はＬ−リジン、Ｄ−又はＬ−アルギニン、Ｄ−又はＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンヒドラジド、Ｄ−又はＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル等が挙げられる。
【００７１】
また、単離された一方のジアステレオマー塩を、例えばイオン交換樹脂を用いて分解することにより、式（１）で表される化合物に含まれる２種の光学異性体の一方を単離することができる。前記イオン交換樹脂としては、酸性陽イオン交換樹脂が好ましく、例えば、商品名「アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ」（オルガノ（株）製）、商品名「ダイヤイオン」（三菱化学（株）製）等を使用することができる。
【００７２】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、有効成分として、上記式（１）で表される化合物［例えば化合物（Ｉ）及び／又は化合物（II）、好ましくは上記式（I-1）〜（I-5）（II-1）〜（II-2）で表される化合物］、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種（光学異性体を含む）を含む。
【００７３】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、皮膚表面に適用することにより、表皮細胞層においてインボルクリン遺伝子（＝インボルクリンをコードする遺伝子）の発現を促進し、表皮角化細胞中のインボルクリン濃度を顕著に上昇させることができる。インボルクリン濃度の上昇度は、適用前の濃度の、例えば１．１倍以上（例えば１．１〜３倍）、好ましくは１．３倍以上、特に好ましくは１．５倍以上である。また、インボルクリンは、角化の際にトランスグルタミナーゼ等の酵素の働きによって互いに架橋して、角質細胞の外壁を形成し、角質層の強度を高める。
【００７４】
上記のように角質層の強度が高められることで、皮膚のバリア機能が向上する。そのため、本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、インボルクリン産生量の低下によって引き起こされる皮膚バリア機能の低下に起因する様々な症状（例えば、アレルギー性皮膚疾患、尋常性魚鱗癬、老人性乾皮症等）を改善する目的で、好適に使用することができる。その他、インボルクリン産生の低下を予防する用途にも好適に使用することができる。
【００７５】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、皮膚のバリア機能を向上、若しくはバリア機能の低下を防止する効果を有し、且つ細胞毒性を有さず、安全性に優れる。そのため、例えば、外皮用薬、点眼薬、点鼻薬、点耳薬、口腔薬、スキンケア用化粧料、入浴剤等の添加剤として好適に使用することができる。
【００７６】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤の添加量は用途に応じて適宜調整することができる。例えば、化粧品に添加する場合、化粧品中の式（１）で表される化合物、その塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも１種の濃度（２種以上含有する場合はその合計の濃度）は、例えば０．５〜７０μＭ、好ましくは１０〜６０μＭ、特に好ましくは３０〜６０μＭ、最も好ましくは４０〜６０μＭである。
【００７７】
前記外皮用薬やスキンケア用化粧料の使用形態は、特に制限されず、例えば、ペースト状、ゲル状、液状、乳液状、クリーム状の製剤として使用することができる。また、シート状基材に含浸させてシート状製剤として使用したり、容器に封入してエアゾール状の製剤やスプレー状の製剤として使用することもできる。
【００７８】
前記外皮用薬には、塗布剤（クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、液剤、チンキ剤）、貼付剤（パップ剤、プラスター剤、テープ剤、パッチ剤）が含まれる。また前記口腔薬には含嗽薬、噴霧薬が含まれる。
【００７９】
前記スキンケア用化粧料には、例えば、ファンデーション、アイシャドウ、マスカラ、アイブロウ、チーク、口紅、マニキュア等のメイクアップ化粧料や、化粧水、乳液、美容液等の基礎化粧料等が含まれる。
【００８０】
本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤をスキンケア用化粧料に使用した場合は、アンチエイジング効果や美白効果を発揮する。また、点眼薬に使用した場合は、白内障予防又は進行抑制、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎等の治療又は予防に効果を発揮する。更に、外皮用薬に使用した場合は、皮膚炎等の治療又は予防に効果を発揮する。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８２】
実施例１
式（II-2）で表される４種類の光学異性体（ジアステレオマー）の等量混合物（ＤＬ−２−アミノ−４−［（ＲＳｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸、商品名「ＧＧｓＴｏｐ」、和光純薬工業（株）製）をインボルクリン遺伝子発現促進剤（１）（ＤＬ−ＧＧｓＴｏｐ（ＲＳ））とした。
【００８３】
実施例２
式（２）で表される化合物（ＤＬ−２−アミノ−４−［（ＲＳｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸、商品名「ＧＧｓＴｏｐ」、和光純薬工業（株）製）（１０.０ｇ）を水（１０ｍＬ）に７０℃で加熱溶解し、エタノール（４５ｍＬ）を加えて、４０℃で少量のＤ−２−アミノ−４−［（Ｒｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸・１水和物／Ｌ−２−アミノ−４−［（Ｓｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸・１水和物の結晶を接種し、室温下で２日間ゆっくりと撹拌した。さらに１５℃で３時間撹拌した後、析出した結晶をろ過・洗浄・乾燥して、無色結晶（３．８６ｇ）を得た。得られた無色結晶（３．８０ｇ）と水（３．８ｍＬ）を７０℃に加熱し、メタノール（３．８ｍＬ）とエタノール（４５ｍＬ）を加えて溶解後、室温下で２日間ゆっくりと撹拌した。さらに１５℃で３時間撹拌した後、析出した結晶をろ過・洗浄・乾燥して、無色結晶（３．１０ｇ）を得た。さらにこの無色結晶（３．００ｇ）を、水（３．０ｍＬ）とメタノール（６．０ｍＬ）とエタノール（３０ｍＬ）の混合溶媒を用いて３回再結晶して、Ｄ−２−アミノ−４−［（Ｒｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸・１水和物／Ｌ−２−アミノ−４−［（Ｓｐ）−（３−カルボキシメチルフェノキシ）（メトキシ）ホスホリル］ブタン酸・１水和物の等量混合物（２．２１ｇ）を無色結晶として得た。これを、インボルクリン遺伝子発現促進剤（２）（ＤＬ−ＧＧｓＴｏｐ（ＲＳ）・Ｈ2Ｏ）とした。
Mp(DSC)：106.3℃.
1H-NMR (600 MHz, D2O) δH: 2.12-2.34 (4H, m), 3.74 (2H, s), 3.87 (3H, d, JH-P = 11.3 Hz)3.87-3.89 (1H, m), 7.16-7.17 (2H, m), 7.21 (1H, br d, JH-H = 7.9 Hz), 7.42(1H,dd JH-H = 7.9 and 7.9 Hz).
31P-NMR (121 MHz, D2O) δP: 32.5.
HRMS-FAB (m/z): [M -H2O + H]+ calcd for C13H19NO7P, 332.0899; found, 332.0887.
【００８４】
実施例３
【化１３】
2018203682.tif 000014
【００８５】
１，２−ジブロモエタン（８０ｍｌ、９２８ｍｍｏｌ）に亜リン酸トリエチル（４０．０ｍｌ、２３３ｍｍｏｌ）を加え、撹拌下に油浴で１４０℃まで昇温し、同温度で３０分間加熱した後、放冷した。４０℃付近まで冷却した後、減圧を開始した。徐々に減圧と加熱を強め、臭化エチル等の副生成物、および過剰のジブロモエタンを留去した。その後、さらに真空度を上げ（約１ｍｍＨｇ）、約１３０℃で加熱、蒸留することによって、無色無臭の油状の２−ブロモエチルホスホン酸ジエチル（３６．３ｇ）を得た。
【００８６】
【化１４】
2018203682.tif 000015
【００８７】
２−ブロモエチルホスホン酸ジエチル（２５．０ｇ，１０２ｍｍｏｌ）に、トルエン（７０ｍＬ）、ジエチルカーボネート（４０ｍＬ）、アセトアミドマロン酸ジエチル（１６．９ｇ、７７．６ｍｍｏｌ）、および６０％水素化ナトリウム（４．４０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）をヘキサンで洗浄したものを仕込み、１１０℃で還流した。２４時間還流した後、室温まで冷却し、セライトを用いてろ過し、得られたろ液を減圧濃縮することによって、褐色油状の２−アセタミド−２−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］マロン酸ジエチル（３３．３ｇ）を得た。
【００８８】
【化１５】
2018203682.tif 000016
【００８９】
２−アセタミド−２−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］マロン酸ジエチル（３３．３ｇ、８７．３ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸（１５４ｍＬ）に溶解し、２４時間還流した。その後、減圧濃縮し、褐色油状のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・塩酸塩（２１．１ｇ）を得た。
【００９０】
【化１６】
2018203682.tif 000017
【００９１】
ＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・塩酸塩（２１．１ｇ、９６．１ｍｍｏｌ）を水（３０ｍＬ）に溶解し、５〜１０℃に冷却下に激しく撹拌しながらプロピレンオキシド（３０ｍＬ、４２８ｍｍｏｌ）を滴下すると同時に、エタノール（１５０ｍＬ）を少しずつ滴下した後、室温下で４日間撹拌した。析出した結晶をろ取し、エタノールで洗浄した後、４０℃で真空乾燥して、無色粉末状のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物（１１．８ｇ）を得た。
Mp(DSC)：115.3℃, 203.1℃(dec).
IR(cm-1) : 3147, 2981, 2287, 1704, 1637, 1524, 1834, 1103, 1024, 895.
【００９２】
得られたＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物（５．００ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）とＬ−Ａｒｇ（４．９９ｇ、２８．６ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に加熱溶解し、７０℃でメタノール（６５ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し、２５℃で３時間撹拌した。析出晶をろ過し、洗浄、乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（４．４１ｇ）を得た。
[α]D20 + 6.3 (c1, H2O), 89.3%de.
【００９３】
この粗結晶Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（４．３０ｇ）に水（４３ｍＬ）を加え、７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（４３ｍＬ）を滴下した。徐冷し、２０℃で３時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（３．６２ｇ）を得た。
[α]D20 + 6.3 (c1, H2O), 98.3%de.
【００９４】
さらにこの再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（３．５０ｇ）に水（３５ｍＬ）を加え７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（３５ｍＬ）を滴下した。徐冷後、１０℃で２時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（３．３５ｇ）を得た。
Mp(DSC)：263℃(dec), [α]D20 + 6.5 (c1, H2O), 100%de.
IR(cm-1) : 3355, 2945, 2084, 1663, 1581, 1412, 1338,1162, 984, 780, 687.
1H-NMR (600 MHz, D2O) δH: 1.57-1.74 (4H, m), 1.84-1.93 (2H, m), 2.02-2.14 (2H, m), 3.22 (2H, dd, JH-H = 6.9 and 6.9 Hz), 3.75 (1H, dd, JH-H = 6.2 and 6.2 Hz), 3.78 (1H, dd, JH-H = 6.5 and 5.5 Hz). 
31P-NMR (121 MHz, D2O) δP: 23.7.
【００９５】
再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｌ−Ａｒｇ塩（２．３５ｇ）を純水に溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（１０．４ｍＬ）にゆっくりと通液し、純水（３００ｍＬ）で洗浄後、通液と洗水を合して濃縮した。残渣の固体にメタノール（１０ｍＬ）を加えて分散ろ過し、メタノールで洗浄後、乾燥して、無色結晶のＤ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物（１．１９ｇ）を得た。
Mp(DSC)：98.0℃, 211.0℃(dec), [α]D20 -17.3 (c1, H2O), 100%ee.
IR(cm-1) : 3247, 2642, 1723, 1520, 1265, 984, 923, 731.
1H-NMR (300 MHz, D2O) δH: 1.58-1.86 (2H, m), 2.02-2.25 (2H, m), 4.00-4.06 (1H, dd, JH-H = 6.2 and 6.2 Hz). 31P-NMR (121 MHz, D2O) δP: 24.6.
【００９６】
得られたＤ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物（０．１５０ｇ、８２．０ｍｍｏｌ）とＤ−Ａｒｇ（０．１４７ｇ、８４．５ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に加熱溶解後、減圧濃縮し、メタノール（２．５ｍＬ）を徐々に加えた後、氷冷下３０分放置した。析出晶をろ過し、洗浄、乾燥して、無色の結晶Ｄ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・Ｄ−Ａｒｇ塩・１水和物（０．２９５ｇ）を得た。これをインボルクリン遺伝子発現促進剤（３）（Ｄ−ＡＰ４・Ｄ−Ａｒｇ・Ｈ2Ｏ）とした。
[α]D20 -8.2 (c1, H2O).
IR(cm-1) : 3337, 2949, 2871, 2618, 1578, 1514, 1406, 1134, 1017, 897, 663.
【００９７】
実施例４
原料として、１，２−ジブロモエタンに代えて１，３−ジブロモプロパンを使用した以外は実施例３のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物の製造方法と同様にして、ＤＬ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸を得た。
【００９８】
得られたＤＬ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（５．００ｇ）とＬ−Ｌｙｓ（３．６５ｇ）を水（５０ｍＬ）に加熱溶解し、７０℃でメタノール（７０ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し、２５℃で３時間撹拌した。析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、無色の粗結晶Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（４．１８ｇ）を得た。
[α]D25 +7.8 (c1, H2O), 84.8%de.
【００９９】
この粗結晶Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（４．１５ｇ）に水（８３ｍＬ）を加え、７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（１６６ｍＬ）を滴下した。徐冷し、１５℃で３時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．３７ｇ）を得た。
[α]D25 +7.7 (c1, H2O), 99.2%de.
【０１００】
この再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．３０ｇ）に水（５０ｍＬ）を加え、７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（１３２ｍＬ）を滴下した。徐冷し、１５℃で３時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．１３ｇ）を得た。
[α]D25 +7.6 (c1, H2O), 100%de.
IR(cm-1) : 2920, 2871, 1652, 1579, 1413, 1340, 1201, 1123, 1016, 919, 714.
【０１０１】
再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．００ｇ）を純水に溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（１４ｍＬ）にゆっくりと通液し、純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮した。残渣の固体にメタノール（２０ｍＬ）を加えて分散ろ過し、メタノールで洗浄後、乾燥して、無色結晶のＤ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（１．６４ｇ）を得た。これをインボルクリン遺伝子発現促進剤（４）（Ｄ−ＡＰ５）とした。
Mp(DSC)：236.0℃(dec), [α]D25 -24.1 (c1, 6N-HCl), 100%ee.
IR(cm-1) : 2942, 2879, 2750, 2627, 1626, 1543, 1410, 1358, 1074, 960, 753.
【０１０２】
実施例５
原料として、１，２−ジブロモエタンに代えて１，４−ジブロモブタンを使用した以外は実施例３のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物の製造方法と同様にして、ＤＬ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・１水和物を得た。
【０１０３】
得られたＤＬ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・１水和物（５．００ｇ）とＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＭ）（４．３８ｇ）を水（５５ｍＬ）に加熱溶解し、７０℃でメタノール（１００ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し、２５℃で３時間撹拌した。析出晶をろ過し、そのろ過母液を濃縮した。その残渣に純水を加えて溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（２５ｍＬ）にゆっくりと通液した。純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮し、残渣を乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・１水和物（３．１７ｇ）を得た。
[α]D26 -6.5 (c1 ,H2O), 60.8%ee.
【０１０４】
この粗結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・１水和物（３．１０ｇ）とＬ−ＨＰＧＭ（２．７１ｇ）を水（３４．５ｍＬ）に加熱溶解し、７０℃でメタノール（１４４ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し１５℃で２時間撹拌した。析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・Ｌ−ＨＰＧＭ塩・１水和物（３．３０ｇ）を得た。
[α]D25 +64.9 (c1, H2O), 96.5％de.
【０１０５】
粗結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・Ｌ−ＨＰＧＭ塩・１水和物（３．２６ｇ）に水（１９．６ｍＬ）を加え、約７０℃に加熱溶解し、これにメタノール（８２ｍＬ）を滴下した。徐冷後、１５℃で２時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・Ｌ−ＨＰＧＭ塩・１水和物（２．７６ｇ）を得た。
Mp(DSC)：126.8, 205.5℃(dec), [α]D26 +66.4 (c1, H2O), 100%de.
IR(cm-1) : 3458, 2860, 2643, 1732, 1604, 1578, 1523, 1417, 1252, 997, 893.
【０１０６】
再結晶Ｄ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・Ｌ−ＨＰＧＭ塩・１水和物（２．６６ｇ）を純水に溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（１０．７ｍＬ）にゆっくりと通液した。純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮した。残渣の固体にメタノール（１５ｍＬ）を加えて分散ろ過し、メタノールで洗浄後、乾燥して、無色結晶のＤ−２−アミノ−６−ホスホノヘキサン酸・１水和物（１．４０ｇ）を得た。これをインボルクリン遺伝子発現促進剤（５）（Ｄ−ＡＰ６・Ｈ2Ｏ）とした。
Mp(DSC)：112.9℃, 231.8℃(dec), [α]D25 -19.6 (c1, 2N-HCl), 100%ee.
IR(cm-1) : 3235, 2934, 1705, 1600, 1537, 1148, 1000, 879, 770. 
1H-NMR (600 MHz, D2O + DCl) δH: 1.43-1.67 (4H, m), 1.74-1.82 (2H, m), 1.85-1.93 (1H, m), 1.93-2.01 (1H, m), 4.06 (1H, dd, JH-H = 6.4 and 6.4 Hz). 31P-NMR (121 MHz, D2O) δP: 32.6.
【０１０７】
実施例６
原料として、１，２−ジブロモエタンに代えて１，５−ジブロモペンタンを使用した以外は実施例３のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物の製造方法と同様にして、ＤＬ−２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸を得た。
【０１０８】
得られたＤＬ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸（５．００ｇ）とＬ−Ｌｙｓ（３．３１ｇ）を水（６０ｍＬ）に加熱溶解し、６５℃でメタノール（７５ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し、２５℃で３時間撹拌した。析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．２５ｇ）を得た。
[α]D25 +6.0 (c1, H2O), 92.2%de.
【０１０９】
この粗結晶Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（３．２０ｇ）に水（６４ｍＬ）を加え、７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（１２８ｍＬ）を滴下した。徐冷し、１５℃で３時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（２．８３ｇ）を得た。
[α]D25 +6.1 (c1, H2O), 96.8%de.
【０１１０】
この再結晶（１）Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（２．８０ｇ）に水（５６ｍＬ）を加え、７０℃で加熱撹拌し、これにメタノール（１１２ｍＬ）を滴下した。徐冷し、２０℃で３時間撹拌後、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（２．３２ｇ）を得た。
[α]D25 +6.2 (c1, H2O), 100%de.
IR(cm-1) : 2916, 2856, 2186, 1652, 1577, 1416, 1354, 1324, 1130, 1037, 919, 816.
【０１１１】
再結晶（２）Ｄ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸・Ｌ−Ｌｙｓ塩（２．００ｇ）を純水に溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（８．５ｍＬ）にゆっくりと通液し、純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮した。残渣の固体にメタノール（１０ｍＬ）を加えて分散ろ過し、メタノールで洗浄後、乾燥して、無色結晶のＤ−２−アミノ−７−ホスホノへプタン酸（１．１９ｇ）を得た。これをインボルクリン遺伝子発現促進剤（６）（Ｄ−ＡＰ７）とした。
Mp(DSC)：230.4℃(dec), [α]D25 -16.8 (c1, 2N-HCl), 100%ee.
IR(cm-1) : 2918, 2856, 1715, 1530, 1537, 1092, 1008, 914, 774.
【０１１２】
実施例７
原料として、１，２−ジブロモエタンに代えて１，６−ジブロモヘキサンを使用した以外は実施例４のＤＬ−２−アミノ−４−ホスホノブタン酸・１水和物の製造方法と同様にして、ＤＬ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・１水和物を得た。
【０１１３】
得られたＤＬ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・１水和物（５．００ｇ）にＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンヒドラジド（ＨＰＧＨ）（３．８６ｇ）と水（６０ｍＬ）を加え、８０℃で加熱撹拌し、メタノール（３０ｍＬ）を徐々に加えた後、徐冷し２５℃で２時間撹拌した。析出晶をろ過し、そのろ過母液を濃縮した。その残渣に純水を加えて溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（２５ｍＬ）にゆっくりと通液した。純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮し、残渣を乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・１水和物（２．６５ｇ）を得た。
[α]D25 −9.0 (c1, 1N-HCl), 67.7%ee.
【０１１４】
この粗結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・１水和物（２．５６ｇ）にＬ−ＨＰＧＨ（１．９８ｇ）と水（９０ｍＬ）を加え、８５℃に加熱撹拌し、これにメタノール（９０ｍＬ）を滴下した。徐冷し、１５℃で２時間撹拌後、析出した結晶をろ過、洗浄、乾燥して、粗結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・Ｌ−ＨＰＧＨ塩・１水和物（３．５０ｇ）を得た。
[α]D25 +53.5 (c1, 1N-HCl), 96.2%de.
【０１１５】
さらにこの粗結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・Ｌ−ＨＰＧＨ塩・１水和物（３．４５ｇ）に水（６９ｍＬ）とメタノール（１０ｍＬ）を加え、約７５℃に加熱撹拌し、１Ｎ−ＨＣｌ（８．２０ｍＬ）を加えて溶解した。この溶液に重曹（０．６９ｇ）を発泡に注意しながら添加し、さらにメタノール（７６ｍＬ）を滴下した。徐冷後、１５℃で２時間撹拌し、析出晶をろ過、洗浄、乾燥して、再結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・Ｌ−ＨＰＧＨ塩・１水和物（３．１９ｇ）を得た。
Mp(DSC)：81.8℃, 215.1℃, [α]D25 ＋52.7 (c1, 1N-HCl), 100％de. 
IR(cm-1) : 3458, 3332, 3288, 2858, 1681, 1579, 1519, 1262, 998, 911.
【０１１６】
再結晶Ｄ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・Ｌ−ＨＰＧＨ塩・１水和物（２．５０ｇ）を純水に溶解し、イオン交換樹脂（商品名「アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ+）」、オルガノ（株）製）（２８ｍＬ）にゆっくりと通液した。純水で十分に洗浄後、通液と洗液を合して濃縮し、析出してきた結晶をろ過、洗浄、乾燥して無色結晶のＤ−２−アミノ−８−ホスホノオクタン酸・１水和物（１．３７ｇ）を得た。これをインボルクリン遺伝子発現促進剤（７）（Ｄ−ＡＰ８・Ｈ2Ｏ）とした。
Mp(DSC)：75.2℃, 240.8℃(dec), [α]D25 -14.8 (c1, 2N-HCl), 100%ee.
IR(cm-1) : 3141, 2932, 1714, 1633, 1524, 1155, 1029, 886.
1H-NMR (300 MHz, D2O) δH: 1.58-1.86(2H, m), 2.02-2.25 (2H, m), 4.00-4.06 (1H, t ). 31P-NMR (121 MHz, D2O) δP: 33.6.
【０１１７】
＜インボルクリン遺伝子発現促進効果の評価＞
実施例１〜７で得られたインボルクリン遺伝子発現促進剤（１）〜（７）について、ヒト表皮角化細胞を用いて、下記方法により、インボルクリン遺伝子発現促進作用を評価した。
１２ウェルプレートに、ヒト表皮角化細胞（NHEK；normal human epidermal keratinocyte）を、２４時間経過ごとに培地を交換しながら１０８時間培養し（４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／３．８ｃｍ2）、そこへインボルクリン遺伝子発現促進剤を添加した（添加量：５０μＭ）。
インボルクリン遺伝子発現促進剤を添加してから1２時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写し、精製したｃＤＮＡを鋳型とする、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することで、鋳型となるＤＮＡの定量を行った。結果を図１に示す。インボルクリン遺伝子発現促進剤を添加した場合のインボルクリン遺伝子の発現量を、コントロール（インボルクリン遺伝子発現促進剤の添加量ゼロの場合）のインボルクリン遺伝子発現量を１として、相対値（ＲＱ）で示した。
【０１１８】
図１より、本発明のインボルクリン遺伝子発現促進剤は、インボルクリン遺伝子の発現を促進することがわかった。
【図１】
2018203682.tif 000020