(57)【要約】【課題】光量を損失することなく標本における複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりする。【解決手段】対物レンズ３と、対物レンズ３により標本Ｓに励起光を照射させるとともに、対物レンズ３により集光された観察光に基づき標本Ｓの画像情報を取得する観察光学系５と、対物レンズ３により照射される刺激光を走査する走査部３５を備え、走査部３５により刺激光の照射位置を走査させて標本Ｓに光刺激を与える第１刺激光学系７と、対物レンズ３の瞳共役位置に配置されかつ対物レンズ３により照射される刺激光の位相を変調可能なＳＬＭ４１を備え、ＳＬＭ４１により刺激光の照射位置を選択的に切り替えて標本Ｓに光刺激を与える第２刺激光学系９と、第１刺激光学系７の光路および第２刺激光学系９の光路の少なくとも一方を選択する光路選択部１１とを備える顕微鏡装置１を提供する。【選択図】図１
2018072511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に照明光および刺激光を照射する一方、前記標本からの観察光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより前記標本に前記照明光を照射させるとともに、前記対物レンズにより集光された前記観察光に基づき前記標本の画像情報を取得する観察光学系と、
前記対物レンズにより照射される前記刺激光を走査する走査部を備え、該走査部により前記標本上における前記刺激光の照射位置を走査させて前記標本に光刺激を与える第１刺激光学系と、
前記対物レンズの瞳共役位置に配置されかつ該対物レンズにより照射される前記刺激光の位相を変調可能な位相変調素子を備え、該位相変調素子により前記標本上における前記刺激光の照射位置を選択的に切り替えて前記標本に光刺激を与える第２刺激光学系と、
前記第１刺激光学系の光路および前記第２刺激光学系の光路の少なくとも一方を選択する光路選択部とを備える顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第２刺激光学系が、前記位相変調素子により位相が変調された前記刺激光に含まれる０次光を遮光する遮光部材を備え、
前記走査部が、前記遮光部材により前記０次光が遮光される前記標本上の領域において前記刺激光を走査させる請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記走査部が、前記標本上の前記第２刺激光学系による刺激領域と前記観察光学系の観察視野との差の領域において前記刺激光を走査させる請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記第２刺激光学系が、前記刺激光として極短パルスレーザにより前記標本に光刺激を与える請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１刺激光学系および前記第２刺激光学系が、共通の光源から発せられる前記刺激光により前記標本に光刺激を与える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光路選択部が、前記刺激光を反射する反射部材を備え、前記刺激光の光路上における前記反射部材の挿脱の切り替えに応じて、前記第１刺激光学系の光路と前記第２刺激光学系の光路とを択一的に選択する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記光路選択部が、光源から発せられる複数波長の前記刺激光を波長に応じて分岐するダイクロイックミラーを備え、該ダイクロイックミラーにより、前記第１刺激光学系の光路と前記第２刺激光学系の光路の両方を前記刺激光の波長に応じて選択する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記光路選択部が、前記共通の光源から発せられる前記刺激光の光路を分岐および合成する偏光ビームスプリッタと、該偏光ビームスプリッタに入射する前記刺激光の偏光成分を調整する波長板とを備える請求項５に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本における任意の全ての領域や複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりする顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載の顕微鏡装置は、ガルバノミラーにより任意の領域ごとに刺激光を照射する第１の刺激光学系と、光を反射または透過する微小素子が複数配列されたディジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）により任意の全ての領域や複数の領域に同時に刺激光を照射する第２の刺激光学系とを備えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５５９１００７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置は、ＤＭＤの微小素子を選択的にオンオフさせることにより、ＤＭＤに入射する刺激光の中から利用する刺激光のみを選択して標本に照射し、利用しない刺激光は捨てているため、利用しない刺激光が無駄になり、刺激光量が不足するという問題がある。
【０００５】
本発明は、光量を損失することなく標本における複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりすることができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本に照明光および刺激光を照射する一方、前記標本からの観察光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより前記標本に前記照明光を照射させるとともに、前記対物レンズにより集光された前記観察光に基づき前記標本の画像情報を取得する観察光学系と、前記対物レンズにより照射される前記刺激光を走査する走査部を備え、該走査部により前記標本上における前記刺激光の照射位置を走査させて前記標本に光刺激を与える第１刺激光学系と、前記対物レンズの瞳共役位置に配置されかつ該対物レンズにより照射される前記刺激光の位相を変調可能な位相変調素子を備え、該位相変調素子により前記標本上における前記刺激光の照射位置を選択的に切り替えて前記標本に光刺激を与える第２刺激光学系と、前記第１刺激光学系の光路および前記第２刺激光学系の光路の少なくとも一方を選択する光路選択部とを備える顕微鏡装置である。
【０００７】
本態様によれば、観察光学系により、対物レンズを介して、標本に照明光が照射されるとともに標本からの観察光が集光されて、標本の画像情報が取得されることで、画像情報に基づいて標本を観察することができる。また、光路選択部により第１刺激光学系の光路が選択されて、走査部により標本上において刺激光の照射位置が走査されることで、標本の任意の領域ごとに光刺激を与えることができる。また、光路選択部により第２刺激光学系の光路が選択されて、位相変調素子により標本上において刺激光の照射位置が選択的に切り替えられることで、標本の任意の全ての領域や複数の領域に同時に光刺激を与えることができる。
【０００８】
この場合において、第２刺激光学系は、位相変調素子により、刺激光の位相を変調することによって標本上の照射位置を選択的に切り替えるので、ＤＭＤを用いた場合のように刺激光の一部が利用されずに無駄になるということがない。したがって、光量を損失することなく標本における複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりすることができる。
【０００９】
上記態様においては、前記第２刺激光学系が、前記位相変調素子により位相が変調された前記刺激光に含まれる０次光を遮光する遮光部材を備え、前記走査部が、前記遮光部材により前記０次光が遮光される前記標本上の領域において前記刺激光を走査させることとしてもよい。
【００１０】
位相変調素子により位相が変調された刺激光の軸中心には、位相変調の影響を受けない０次光が含まれる。そのため、標本における刺激光中の０次光が照射される位置付近は、所望の強度分布で光刺激することができない。そこで、位相変調素子により位相が変調された刺激光中の０次光を遮光部材により遮光することで、所望しない強度分布による光刺激を防ぐことができる。また、遮光部材により０次光が遮光される標本上の領域については、第１刺激光学系の走査部により刺激光が走査されることで、標本上の所望の領域にもれなく光刺激を与えることができる。
【００１１】
上記態様においては、前記走査部が、前記標本上の前記第２刺激光学系による刺激領域と前記観察光学系の観察視野との差の領域において前記刺激光を走査させることとしてもよい。
【００１２】
位相変調素子は、刺激領域を広くすると分解能が低下し、刺激領域を狭くすると分解能が向上する。このように構成することで、位相変調素子の分解能を確保するために刺激領域を狭くした場合であっても、第２刺激光学系による刺激領域と観察光学系の観察視野との差の領域について第１刺激光学系の走査部により刺激光が走査されるので、標本上の所望の領域にもれなく光刺激を与えることができる。
【００１３】
上記態様においては、前記第２刺激光学系が、前記刺激光として極短パルスレーザにより前記標本に光刺激を与えることとしてもよい。
このように構成することで、第２刺激光学系により標本に光刺激を与える場合に、より効果的にマルチフォトン効果を発生させることができる。
【００１４】
上記態様においては、前記第１刺激光学系および前記第２刺激光学系が、共通の光源から発せられる前記刺激光により前記標本に光刺激を与えることとしてもよい。
このように構成することで、刺激光学系ごとに光源を用意しなくて済み、光源の数が少なくなる分だけ安価にすることができる。
【００１５】
上記態様においては、前記光路選択部が、前記刺激光を反射する反射部材を備え、前記刺激光の光路上における前記反射部材の挿脱の切り替えに応じて、前記第１刺激光学系の光路と前記第２刺激光学系の光路とを択一的に選択することとしてもよい。
【００１６】
このように構成することで、反射部材が、刺激光の光路上に挿入されることにより第１刺激光学系の光路と第２刺激光学系の光路の一方が選択され、刺激光の光路上から反射部材が脱離されることにより第１刺激光学系の光路と第２刺激光学系の光路の他方が選択される。したがって、刺激光の光量損失を低減して、第１刺激光学系および第２刺激光学系により、標本に交互に光刺激を与えることができる。
【００１７】
上記態様においては、前記光路選択部が、光源から発せられる複数波長の前記刺激光を波長に応じて分岐するダイクロイックミラーを備え、該ダイクロイックミラーにより、前記第１刺激光学系の光路と前記第２刺激光学系の光路の両方を前記刺激光の波長に応じて選択することとしてもよい。
このように構成することで、第１刺激光学系と第２刺激光学系とで別々の波長の刺激光により標本に同時に光刺激を与えることができる。
【００１８】
上記態様においては、前記光路選択部が、前記共通の光源から発せられる前記刺激光の光路を分岐および合成する偏光ビームスプリッタと、該偏光ビームスプリッタに入射する前記刺激光の偏光成分を調整する波長板とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、波長板による刺激光の偏光成分の調整割合に応じて、第１刺激光学系および第２刺激光学系の一方により標本に光刺激を与えたり、これらの両方により標本に同時に光刺激を与えたりすることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、光量を損失することなく標本における複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりすることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置における投影関係を説明する図である。
【図３】観察光学系の観察視野と第１刺激光学系の刺激領域（第１刺激領域）との関係の一例を示す図である。
【図４】観察光学系の観察視野と第２刺激光学系の刺激領域（第２刺激領域）との関係の一例を示す図である。
【図５】本発明の第１実施形態の変形例に係る顕微鏡装置の一例の一部を示す概略構成図である。
【図６】本発明の第１実施形態の変形例に係る顕微鏡装置の他の一例の一部を示す概略構成図である。
【図７】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図８】図７の顕微鏡装置の第１刺激光学系による刺激領域と第２刺激光学系による刺激領域との関係の一例を示す図である。
【図９】本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置の一部を示す概略構成図である。
【図１０】図９の顕微鏡装置のλ／２板による刺激光の偏光方向の一例を示す図である。
【図１１】本発明の第３実施形態の変形例に係る顕微鏡装置のλ／４板による刺激光の偏光方向の一例を示す図である。
【図１２】本発明の第４実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図１３】本発明の第５実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図１４】本発明の各実施形態の変形例に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示すように、標本Ｓに励起光（照明光）および刺激光を照射する一方、標本Ｓからの蛍光（観察光）を集光する対物レンズ３と、標本Ｓの画像情報を取得する観察光学系５と、標本Ｓに光刺激を与える第１刺激光学系７および第２刺激光学系９と、第１刺激光学系７の光路および第２刺激光学系９の光路の一方を選択する光路選択部１１とを備えている。
【００２２】
観察光学系５は、標本Ｓを励起して蛍光を発生させるための励起光を発生する観察光源（Ｌａｓｅｒ）１３と、観察光源１３から発せられた励起光を２次元的に走査させるスキャンユニット１５と、スキャンユニット１５により走査された励起光を集光する瞳投影レンズ１７と、瞳投影レンズ１７により集光された励起光を平行光に変換する結像レンズ１９と、結像レンズ１９により平行光に変換された励起光を対物レンズ３に向けて反射する反射ミラー２１と、対物レンズ３により集光される標本Ｓからの蛍光を励起光の光路から分岐させる励起ダイクロイックミラー２３と、励起ダイクロイックミラー２３により分岐された蛍光を検出する検出器２５とを備えている。
【００２３】
観察光源１３としては、例えば、多光子励起を生じさせる近赤外域の極短パルスレーザ光（励起光）を発振する近赤外パルスレーザを採用することができる。
【００２４】
スキャンユニット１５は、例えば、近接ガルバノミラースキャナ（互いに近接配置された一対のガルバノミラー（図示略）を備え、これら一対のガルバノミラーの中間に対物レンズ３の瞳位置の共役位置が位置しているガルバノスキャナ）を用いることができる。一対のガルバノミラーは、それぞれ励起光の光軸に交差する軸回りに揺動角度を制御可能に設けられており、これら一対のガルバノミラーの揺動角度を変更制御することにより励起光を２次元的に走査させることができるようになっている。
【００２５】
励起ダイクロイックミラー２３は、反射ミラー２１により対物レンズ３に向けて反射されてきた励起光を透過させる一方、対物レンズ３により集光されて励起光の光路を戻る標本Ｓからの蛍光を検出器２５に向けて反射するようになっている。また、励起ダイクロイックミラー２３は、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９からの刺激光を透過させるようになっている。
【００２６】
検出器２５としては、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）を用いることができる。
【００２７】
第１刺激光学系７および第２刺激光学系９は、互いに共通の構成として、標本Ｓを刺激するための刺激光を発生する刺激光源（Ｌａｓｅｒ）２７と、刺激光源２７から発せられた刺激光の波長、位置（ＳＩＦＴ）、傾き（ＴＩＬＴ）およびビーム径などを調整するアライメント機構２９と、刺激光を集光する瞳投影レンズ３１と、瞳投影レンズ３１により集光された刺激光の光路を観察光学系５の光路に合成する合成ダイクロイックミラー３３とを備えている。
【００２８】
刺激光源２７としては、例えば、多光子励起を生じさせる近赤外域の極短パルスレーザ光（刺激光）を発振する近赤外パルスレーザを採用することができる。これにより、第２刺激光学系９により標本Ｓに光刺激を与える場合に、より効果的にマルチフォトン効果を発生させることができる。
【００２９】
合成ダイクロイックミラー３３は、観察光学系５の瞳投影レンズ１７と結像レンズ１９との間の光路上に配置されている。この合成ダイクロイックミラー３３は、観察光学系５の瞳投影レンズ１７からの励起光を結像レンズ１９に向けて透過させる一方、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９の瞳投影レンズ３１からの励起光を結像レンズ１９に向けて反射するようになっている。
【００３０】
第１刺激光学系７は、アライメント機構２９を通過した刺激光を走査させる走査部３５を備えている。走査部３５は、例えば、スキャンユニット１５と同様の近接ガルバノミラースキャナである。
【００３１】
第２刺激光学系９は、アライメント機構２９を通過した刺激光のビーム径を変更可能なビームエキスパンダ３７と、ビームエキスパンダ３７を通過した刺激光を反射する反射ミラー３９と、反射ミラー３９により反射された刺激光の位相を変調可能な空間光位相変調器（位相変調素子、Ｓｐａｔｉａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、以下「ＳＬＭ」という。）４１と、ＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光を瞳投影レンズ３１にリレーする第１リレーレンズ４３および第２リレーレンズ４５とからなるリレー光学系と、これらリレーレンズ４３，４５によりリレーされる刺激光を反射する反射ミラー４７とを備えている。また、第２刺激光学系９には、ＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光に含まれる０次光を遮光するマスク（遮光部材）４９が備えられている。
【００３２】
ビームエキスパンダ３７は、例えば、ＳＬＭ４１の有効領域に合わせて刺激光のビーム径を拡大するようになっている。
ＳＬＭ４１は、対物レンズ３の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。また、ＳＬＭ４１は、図示しない制御装置により制御されて、入射した刺激光の波面形状を位相変調により変化させて反射または透過するようになっている。また、ＳＬＭ４１は、位相変調量に応じて刺激光の照射位置を切り替えることができるようになっている。これにより、ＳＬＭ４１は、標本Ｓ上での刺激光の強度分布を３次元的に変化させて、標本Ｓに所望の３次元的なパターンの刺激光を照射することができるようになっている。例えば、ＳＬＭ４１は、標本Ｓ上の１点に刺激光を照射したり、標本Ｓ上の３次元的な多点に刺激光を同時に照射したりすることができる。
【００３３】
マスク４９は、例えば、ＳＬＭ４１と反射ミラー４７との間の光路上に配置されている。また、マスク４９は、ＳＬＭ４１からの刺激光が第１リレーレンズ４３により結像する位置に配置され、さらに、第２リレーレンズ４５および瞳投影レンズ３１、結像レンズ１９、対物レンズ３からなる後段の光学系により、マスク４９に標本Ｓが投影されるようになっている。
【００３４】
ＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光の軸中心には位相変調の影響を受けない０次光が含まれているため、標本Ｓにおける０次光の照射位置付近には、所望の強度分布で光刺激することができない。マスク４９により、ＳＬＭ４１により位相変調が施された刺激光に含まれる０次光を除去することで、所望しない照明パターンによる光刺激を防ぐことができる。
【００３５】
光路選択部１１は、アライメント機構２９と走査部３５との間の光路上に挿脱可能に配置される第１ミラー（反射部材）５１と、第２リレーレンズ４５と瞳投影レンズ３１との間の光路上に挿脱可能に配置される第２ミラー５３とを備えている。この光路選択部１１は、第１ミラー５１を光路上から脱離させた場合は第２ミラー（反射部材）５３が光路上に挿入され、第１ミラー５１を光路上に挿入した場合は第２ミラー５３が光路上から脱離されるようになっている。
【００３６】
第１ミラー５１が光路上から脱離されて第２ミラー５３が光路上に挿入されると、アライメント機構２９を通過した刺激光がそのまま第１刺激光学系７の走査部３５に入射し、走査部３５により走査された刺激光が第２ミラー５３により反射されて瞳投影レンズ３１に入射する。これにより、第１刺激光学系７によって標本Ｓに刺激光を照射することができる。
【００３７】
一方、第１ミラー５１が光路上に挿入されて第２ミラー５３が光路上から脱離されると、アライメント機構２９を通過した刺激光が第１ミラー５１により反射されて第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７に入射し、反射ミラー３９、ＳＬＭ４１を介してリレーレンズ４３，４５によりリレーされた刺激光がそのまま瞳投影レンズ３１に入射する。これにより、第２刺激光学系９によって標本Ｓに刺激光を照射することができる。
【００３８】
このように構成された顕微鏡装置１は、図２に示すように、観察光学系５のスキャンユニット１５と第１刺激光学系７の走査部３５が１次瞳共役位置に配置されており、結像レンズ１９と瞳投影レンズ１７により対物瞳がスキャンユニット１５に投影されるとともに、結像レンズ１９と瞳投影レンズ３１により対物瞳が走査部３５に投影されるようになっている。
【００３９】
また、ＳＬＭ４１が２次瞳共役位置に配置されており、結像レンズ１９、瞳投影レンズ３１、第２リレーレンズ４５および第１リレーレンズ４３により対物瞳がＳＬＭ４１に投影されるようになっている。また、対物レンズ３、結像レンズ１９、瞳投影レンズ３１および第２リレーレンズ４５により、標本位置がマスク４９の位置に投影されるようになっている。
【００４０】
観察光学系５のスキャンユニット１５と第１刺激光学系７の走査部３５は、光学的に等価な配置となっている。これにより、図３に示すように、標本Ｓにおける観察光学系５の観察視野と第１刺激光学系７の刺激領域（図３において「第１刺激領域」と表記する。）とが同一となっている。すなわち、第１刺激光学系７は、走査部３５により、観察光学系５の観察視野の全域に亘り刺激光を走査させることができ、これにより、観察視野の中心を含む全域に光刺激を与えることができる。
【００４１】
第２刺激光学系９においては、ＳＬＭ４１に対する投影倍率によって刺激領域が変化し、刺激領域が増大するほど刺激ポイントごとの分解能が低下する。本実施形態においては、刺激ポイントごとの分解能を確保するため、例えば、図４に示すように、第２刺激光学系９の刺激領域（図４において「第２刺激領域」と表記する。）は、観察光学系５の観察視野よりも狭く設定されている。
【００４２】
また、マスク４９により０次光が遮光される標本Ｓ上の領域、すなわち、観察光学系５の観察視野の中心付近には、ＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光が照射されないようになっている。したがって、第２刺激光学系９は、観察光学系５の観察視野よりも狭い領域で、かつ、観察視野の中心付近を除く領域に光刺激を与えることができる。
【００４３】
このように構成された顕微鏡装置１の作用について説明する。
まず、本実施形態に係る顕微鏡装置１により標本Ｓを多光子励起観察する場合について説明する。この場合は、観察光学系５の観察光源１３から励起光を発生させる。
【００４４】
観察光源１３から発せられた励起光は、スキャンユニット１５により走査された後、瞳投影レンズ１７、合成ダイクロイックミラー３３、結像レンズ１９および反射ミラー２１を介して励起ダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ３により標本Ｓに照射される。これにより、スキャンユニット１５の一対のガルバノミラーの動作に応じて標本Ｓ上で励起光が２次元的に走査される。
【００４５】
励起光が走査されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ３により集光されてレーザ光の光路を戻り、励起ダイクロイックミラー２３により反射されて、検出器２５により検出される。すなわち、標本Ｓからの蛍光は、スキャンユニット１５に戻らずに検出器２５により検出される（ノンデスキャン検出方式）。
【００４６】
検出器２５により蛍光が検出されたら、例えば、検出された蛍光の強度情報とその検出時のスキャンユニット１５による励起光の走査位置情報とに基づいて、図示しないＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）等により標本Ｓの２次元的な蛍光画像を生成する。これにより、蛍光画像に基づいて標本Ｓを観察することができる。
【００４７】
次に、本実施形態に係る顕微鏡装置１により標本Ｓに光刺激を与える場合について説明する。
第１刺激光学系７により標本Ｓを光刺激する場合は、光路選択部１１の第１ミラー５１を光路上から脱離させる一方、第２ミラー５３を光路上に挿入し、この状態で、刺激光源２７から刺激光を発生させる。
【００４８】
刺激光源２７から発せられた刺激光は、アライメント機構２９により波長、ビーム径、傾きおよび位置等が調整された後、そのまま第１刺激光学系７の走査部３５に入射して走査される。走査部３５により走査された刺激光は、光路選択部１１の第２ミラー５３により反射されて、瞳投影レンズ３１、合成ダイクロイックミラー３３、結像レンズ１９および反射ミラー２１を介して励起ダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ３により標本Ｓに照射される。これにより、走査部３５の一対のガルバノミラーの動作に応じて標本Ｓ上で刺激光を２次元的に走査させ、標本Ｓの任意の領域ごとに光刺激を与えることができる。
【００４９】
次に、第２刺激光学系９により標本Ｓに光刺激を与える場合は、光路選択部１１の第１ミラー５１を光路上に挿入する一方、第２ミラー５３を光路上から脱離させ、この状態で、刺激光源２７から刺激光を発生させる。
【００５０】
刺激光源２７から発せられた刺激光は、アライメント機構２９により波長、ビーム径、傾きおよび位置等が調整された後、光路選択部１１の第１ミラー５１により反射されて第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７によりビーム径が拡大され、反射ミラー３９を介してＳＬＭ４１に入射する。
【００５１】
ＳＬＭ４１に入射した刺激光は、位相変調により波面が変化されて射出され、リレーレンズ４３，４５によりリレーされる。そして、刺激光は、そのまま瞳投影レンズ３１、合成ダイクロイックミラー３３、結像レンズ１９および反射ミラー２１を介して励起ダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ３により標本Ｓに照射される。これにより、ＳＬＭ４１の位相変調量に応じたパターンで標本Ｓに刺激光を照射し、標本Ｓの任意の全ての領域や複数の領域に同時に光刺激を与えることができる。
【００５２】
ここで、第１刺激光学系７は、図３に示すように、観察光学系５の観察視野の中心を含む全域に光刺激を与えることができるが、走査部３５の走査範囲に応じて標本Ｓの任意の領域ごとにしか刺激光を照射することができない。一方、第２刺激光学系９は、ＳＬＭ４１による位相変調量に応じて任意の複数の領域に同時に刺激光を照射することができるが、図４に示すように、観察光学系５の観察視野よりも狭い領域で、かつ、観察視野の中心付近を除く領域にしか刺激光を照射することができない。
【００５３】
そこで、例えば、複数の領域にタイムラグ無く同時に光刺激を与える場合は、第２刺激光学系９により刺激光を照射することが有効であり、また、任意の領域ごとに強い光刺激を与えたり、第２刺激光学系９の刺激領域よりも外側や観察視野の中心付近など、第２刺激光学系９では刺激光を照射することができない領域に光刺激を与えたりする場合は、第１刺激光学系７により刺激光を照射することが有効となる。
【００５４】
したがって、光路選択部１１により第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路とを切り替えることで、標本Ｓにおける所望の領域に所望のタイミングで光刺激を与えることができる。
【００５５】
この場合において、第２刺激光学系９が、ＳＬＭ４１により刺激光の位相を変調することによって標本Ｓ上の照射位置を選択的に切り替えるので、ＤＭＤ（ディジタルマイクロミラーデバイス）を用いた場合のように刺激光の一部が利用されずに無駄になるということがない。
【００５６】
したがって、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９により、光量を損失することなく標本Ｓにおける複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりすることができる。
【００５７】
また、本実施形態においては、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９が、共通の刺激光源２７から発せられる刺激光により標本Ｓに光刺激を与えることで、刺激光学系７，９ごとに光源を用意しなくて済み、光源の数が少なくなる分だけ安価にすることができる。
【００５８】
本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、単一波長の刺激光を発生する刺激光源２７を採用するとともに、刺激光を反射する第１ミラー５１および第２ミラー５３を備える光路選択部１１を採用することとしたが、これに代えて、複数波長の刺激光を発生する刺激光源を採用するとともに、刺激光を分岐または合成するダイクロイックミラーを備える光路選択部を採用することとしてもよい。
【００５９】
この場合、例えば、図５に示すように、波長がブロードバンドの刺激光源５５を採用することとしてもよい。また、刺激光源５５からの刺激光を波長に応じて透過または反射して、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路とに分岐する第１ダイクロイックミラー５７と、第１刺激光学系７からの刺激光を反射または第２刺激光学系９からの刺激光を透過して、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路とを合成する第２ダイクロイックミラー５８とを備える光路選択部５９を採用することとしてもよい。
【００６０】
また、例えば、図６に示すように、異なる波長の２つの刺激光を同時に射出する波長変換型レーザ光源６１を採用するとともに、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路とを合成するダイクロイックミラー６２を備える光路選択部６３を採用することとしてもよい。
【００６１】
波長変換型レーザ光源６１は、例えば、単一波長の刺激光を発生する発振部６５と、アライメント機構２９と、発振部６５からアライメント機構２９を介して入射される刺激光の一部を透過率に応じて透過させ、残りを反射するハーフミラー６７と、ビームエキスパンダ３７と、反射ミラー３９と、ハーフミラー６７からビームエキスパンダ３７および反射ミラー３９を介して入射される刺激光の波長を変調する波長変調素子（ＯＰＯ：Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ）６９とを備えることとしてもよい。そして、ハーフミラー６７を透過した波長の刺激光が第１刺激光学系７の走査部３５に入射し、ハーフミラー６７により反射されて波長変調素子６９により波長を変調された刺激光が第２刺激光学系９のＳＬＭ４１に入射することとしてもよい。
【００６２】
本変形例によれば、図５および図６のいずれの構成においても、第１刺激光学系７と第２刺激光学系９とで別々の波長の刺激光により標本Ｓに同時に光刺激を与えることができる。
【００６３】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置７１は、図７に示すように、光路選択部１１に代えて、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路の両方を選択する光路選択部７３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００６４】
光路選択部７３は、刺激光の光路を分岐させる第１ハーフミラー７５と、刺激光の光路を合成する第２ハーフミラー７７とを備えている。
第１ハーフミラー７５は、アライメント機構２９を通過した刺激光の一部を透過率に応じて透過させて第１刺激光学系７の走査部３５に入射させる一方、残りを反射して第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７に入射させるようになっている。
【００６５】
第２ハーフミラー７７は、第１刺激光学系７の走査部３５からの刺激光を反射して瞳投影レンズ３１に入射させる一方、第２刺激光学系９のリレーレンズ４３，４５からの刺激光を透過させて瞳投影レンズ３１に入射させるようになっている。
【００６６】
また、第１刺激光学系７は、刺激光の光路を遮断可能なシャッタ７９を備えている。シャッタ７９は、例えば、光路選択部７３の第１ハーフミラー７５と第１刺激光学系７の走査部３５との間の光路上に配置されており、開閉することにより、第１ハーフミラー７５と走査部３５との間の光路を開放または遮断するようになっている。
【００６７】
このように構成された顕微鏡装置７１の作用について説明する。
観察光学系５による標本Ｓの観察については第１実施形態と同様であるので説明を省略し、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９による標本Ｓの光刺激について説明する。
【００６８】
第１刺激光学系７および第２刺激光学系９により標本Ｓに光刺激を与える場合は、シャッタ７９を開いて光路を開放した状態で、刺激光源２７から刺激光を発生させる。刺激光源２７から発せられた刺激光は、アライメント機構２９により波長、ビーム径、傾きおよび位置等が調整された後、光路選択部７３の第１ハーフミラー７５により、その透過率に応じて一部が透過して残りが反射される。
【００６９】
第１ハーフミラー７５を透過した刺激光は、シャッタ７９を通過して第１刺激光学系７の走査部３５により走査され、光路選択部７３の第２ハーフミラー７７により反射されて瞳投影レンズ３１に入射する。
【００７０】
一方、第１ハーフミラー７５により反射された刺激光は、第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７によりビーム径が拡大されて反射ミラー３９により反射された後、ＳＬＭ４１により位相が変調されてリレーレンズ４３，４５によりリレーされ、光路選択部７３の第２ハーフミラー７７を透過して瞳投影レンズ３１に入射する。
【００７１】
光路選択部７３の第２ハーフミラー７７により瞳投影レンズ３１に入射されて光路が合成された第１刺激光学系７からの刺激光と第２刺激光学系９からの刺激光は、それぞれ合成ダイクロイックミラー３３、結像レンズ１９および反射ミラー２１を介して励起ダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ３により標本Ｓに照射される。
【００７２】
これにより、第１刺激光学系７と第２刺激光学系９とにより標本Ｓに同時に光刺激を与えることができる。例えば、図８に示すように、第２刺激光学系９により観察光学系５の観察視野の中心付近を除く領域に刺激光を照射するとともに、第１刺激光学系７により観察光学系５の観察視野の中心付近に刺激光を照射すれば、観察光学系５の観察視野の中心を含むすべての領域に同時に光刺激を与えることができる。
【００７３】
観察光学系５の観察視野の中心付近に光刺激を与えない場合は、例えば、シャッタ７９を閉じて第１刺激光学系７の光路を遮断することとしてもよいし、シャッタ７９を開いて第１刺激光学系７の光路を開放したまま、走査部３５により観察光学系５の観察視野外に向けて刺激光を走査させることとしてもよい。
【００７４】
また、照射時間を考慮して、第２刺激光学系９のＳＬＭ４１による光刺激の強度を強くすることとしてもよい。また、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路のどちらかにＮＤフィルタ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｆｉｌｔｅｒ）を設けることとしてもよい。
【００７５】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置８１は、図９に示すように、光路選択部１１に代えて、第１刺激光学系７の光路と第２刺激光学系９の光路の両方を選択する光路選択部８３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００７６】
光路選択部８３は、刺激光源２７からの刺激光を分岐および合成する第１偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ：Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  Ｂｅａｍ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ）８５および第２偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）８７と、刺激光の偏光方向を変更するλ／２板８９とを備えている。
【００７７】
λ／２板８９は、アライメント機構２９と光路選択部８３の第１偏光ビームスプリッタ８５との間の光路上に配置されている。このλ／２板８９は、刺激光源２７から発せられた直線偏光の刺激光を図１０に示すように斜めの直線偏光に変更するようになっている。また、λ／２板８９は、その角度を調整することにより、刺激光のＳ偏光とＰ偏光の偏光成分の分割割合を変更することができるようになっている。
【００７８】
第１偏光ビームスプリッタ８５は、λ／２板８９からの刺激光の内、例えば、Ｐ偏光成分（図９において紙面に平行な偏光成分）を第１刺激光学系７の走査部３５に向けて透過させ、Ｓ偏光成分（図９において紙面に垂直な偏光成分）を第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７に向けて反射することにより、これらの光路を分岐させるようになっている。例えば、第２刺激光学系９のＳＬＭ４１により標本Ｓに照射する刺激光の量を多くする場合は、Ｓ偏光成分の割合が多くなるようにλ／２板８９の角度を調整することとすればよい。
【００７９】
第２偏光ビームスプリッタ８７は、第１刺激光学系７の走査部３５により走査された刺激光（Ｐ偏光成分、図９において紙面に平行な偏光成分）を透過する一方、第２刺激光学系９のＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光（Ｓ偏光成分、図９において紙面に垂直な偏光成分）を反射することにより、これらの光路を合成するようになっている。
【００８０】
このように構成された顕微鏡装置８１の作用について説明する。
観察光学系５による標本Ｓの観察については第１実施形態と同様であるので説明を省略し、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９による標本Ｓの光刺激について説明する。
【００８１】
刺激光源２７から発せられた刺激光は、アライメント機構２９により波長、ビーム径、傾きおよび位置等が調整された後、λ／２板８９により斜めの直線偏光に変更されて、光路選択部８３の第１偏光ビームスプリッタ８５に入射する。第１偏光ビームスプリッタ８５に入射した刺激光の内のＰ偏光成分は、第１偏光ビームスプリッタ８５を透過して第１刺激光学系７の走査部３５により走査され、第２偏光ビームスプリッタ８７を透過して第２刺激光学系９の光路と合成される。
【００８２】
一方、第１偏光ビームスプリッタ８５に入射した刺激光の内のＳ偏光成分は、第１偏光ビームスプリッタ８５により反射されて第２刺激光学系９のビームエキスパンダ３７によりビーム径が拡大された後、反射ミラー３９を介してＳＬＭ４１により位相が変調される。ＳＬＭ４１により位相が変調された刺激光は、リレーレンズ４３，４５によりリレーされた後、光路選択部８３の第２偏光ビームスプリッタ８７により反射されて第１刺激光学系７の光路と合成される。
【００８３】
光路選択部８３の第２偏光ビームスプリッタ８７により光路が合成された第１刺激光学系７からの刺激光と第２刺激光学系９からの刺激光は、それぞれ反射ミラー２１を介して励起ダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ３により標本Ｓに照射される。
【００８４】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置８１によれば、λ／２板８９による刺激光の偏光成分の分割割合に応じて、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９の一方により標本Ｓに光刺激を与えたり、これらの両方により標本Ｓに同時に光刺激を与えたりすることができる。
【００８５】
本実施形態においては、λ／２板８９を採用することとしたが、これに代えて、例えば、刺激光源２７から発せられた直線偏光の刺激光を図１１に示すように円偏光に変更するλ／４板（図示略）を採用することとしてもよい。
【００８６】
〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置９１は、図１２に示すように、光路選択部１１に代えて、刺激光の光路を選択する複数の素子を切り替え可能な光路選択部９３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８７】
光路選択部９３は、刺激光を反射する第１ミラー５１および第２ミラー５３と、刺激光を透過率に応じて透過または反射する第１ハーフミラー７５および第２ハーフミラー７７と、刺激光をその波長に応じて透過または反射する第１ダイクロイックミラーおよび第２ダイクロイックミラー（いずれも図示略）と、これら第１ミラー５１、第１ハーフミラー７５および第１ダイクロイックミラーをアライメント機構２９と第１刺激光学系７の走査部３５との間の刺激光の光路上に選択的に配置する第１ターレット（図示略）と、第２ミラー５３、第２ハーフミラー７７および第２ダイクロイックミラーを第２リレーレンズ４５と瞳投影レンズ１７との間の光路上に選択的に配置する第２ターレット（図示略）とを備えている。
【００８８】
第１ターレットおよび第２ターレットは、刺激光の光路を開放する孔部（図示略）を有している。この光路選択部９３は、第１ミラー５１を刺激光の光路上に配置する場合は、第２ターレットの孔部が光路上に配置され、第２ミラー５３を刺激光の光路上に配置する場合は、第１ターレットの孔部が光路上に配置されるようになっている。また、光路選択部９３は、第１ハーフミラー７５を光路上に配置する場合は第２ハーフミラー７７が光路上に配置され、第１ダイクロイックミラーを光路上に配置する場合は第２ダイクロイックミラーが光路上に配置されるようになっている。
【００８９】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置９１によれば、光路選択部９３により刺激光の光路上に配置する素子を切り替えることで、第１実施形態または第２実施形態の構成と同様の方法により標本Ｓに光刺激を与えることができる。
【００９０】
〔第５実施形態〕
次に、本発明の第５実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、図１３に示すように、観察光学系５に代えて、観察光源１３の代わりに水銀ランプのような照明光源１０５を採用するとともに、検出器２５の代わりにＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）１１１を採用する観察光学系１０３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００９１】
観察光学系１０３は、照明光源１０５から発せられた照明光を集光して平行光にする照明レンズ１０７と、照明レンズ１０７により平行光にされた照明光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓから戻る観察光を集光する対物レンズ３と、対物レンズ３により集光されて照明光の光路を戻る観察光を照明光の光路から分岐させる励起ダイクロイックミラー２３と、励起ダイクロイックミラー２３により照明光の光路から分岐された観察光をＣＣＤ１１１の撮像面に結像させる結像レンズ１０９とを備えている。
【００９２】
第１刺激光学系７および第２刺激光学系９は、瞳投影レンズ３１により集光された刺激光を反射する反射ミラー１１３と、反射ミラー１１３により反射された刺激光を平行光に変換する結像レンズ１９と、結像レンズ１９により平行光に変換された刺激光の光路を観察光学系１０３の光路に合成する合成ダイクロイックミラー３３とを備えている。
【００９３】
合成ダイクロイックミラー３３は、観察光学系１０３の励起ダイクロイックミラー２３と対物レンズ３との間の光路上に配置されており、刺激光を反射する一方、照明光および観察光を透過させる特性を有している。図１３に示す例では、第１ミラー５１および第２ミラー５３を備える光路選択部１１を採用している。
【００９４】
このように構成された顕微鏡装置１０１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０１により標本Ｓを観察する場合は、観察光学系１０３の照明光源１０５から照明光を発生させる。照明光源１０５から発せられた照明光は、照明レンズ１０７により集光されて励起ダイクロイックミラー２３により反射され、合成ダイクロイックミラー３３を透過して対物レンズ３により標本Ｓに照射される。
【００９５】
照明光が照射されることにより標本Ｓから戻る観察光は、対物レンズ３により集光されて照明光の光路を戻り、合成ダイクロイックミラー３３および励起ダイクロイックミラー２３を透過して、結像レンズ１０９によりＣＣＤ１１１の撮像面に結像される。これにより、ＣＣＤ１１１により像が撮影されて標本Ｓの画像が取得される。
【００９６】
次に、顕微鏡装置１０１により標本Ｓに光刺激を与える場合は、刺激光源２７から刺激光を発生させる。刺激光源２７から発せられた刺激光は、光路選択部１１により択一的に選択される第１刺激光学系７の光路または第２刺激光学系９の光路を通過し、瞳投影レンズ３１、反射ミラー１１３および結像レンズ１９を介して合成ダイクロイックミラー３３により観察光学系１０３の光路に合成され、対物レンズ３により集光されて標本Ｓに照射される。これにより、第１刺激光学系７または第２刺激光学系９によって、標本Ｓ上の領域に光刺激が与えられる。
【００９７】
本実施形態に係る顕微鏡装置１０１によれば、ＣＣＤ１１１によって取得される標本Ｓの画像により、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９によって光刺激が与えられた標本Ｓの反応を観察することができる。この場合において、第１実施形態と同様に、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９により、光量を損失することなく標本Ｓにおける複数の領域をタイムラグ無く同時に刺激したり、任意の領域ごとに強く刺激したりすることができる。
【００９８】
本実施形態においては、励起ダイクロイックミラー２３と対物レンズ３との間の光路上に合成ダイクロイックミラー３３を配置することとしたが、これに代えて、励起ダイクロイックミラー２３と結像レンズ１０９との間の光路上や、結像レンズ１０９とＣＣＤ１１１との間の光路上に合成ダイクロイックミラー３３を配置することとしてもよい。ただし、刺激光が励起ダイクロイックミラー２３を透過しなくて済む位置、すなわち、励起ダイクロイックミラー２３と対物レンズ３との間の光路上に合成ダイクロイックミラー３３を配置する構成は、刺激光の光量損失が少なく、最も現実的である。
【００９９】
上記各実施形態は以下のように変形することができる。
すなわち、図１４に示すように、観察光学系５、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９を階層状態に積み重ねて配置することとしてもよい。このようにすることで、設置面積が観察光学系５、第１刺激光学系７および第２刺激光学系９の１つ分の大きさで足り、顕微鏡装置１の周りの省スペース化を図ることができる。図１４は、第１実施形態の顕微鏡装置１を適用した例を示している。
【０１００】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【０１０１】
１，７１，８１，９１，１０１  顕微鏡装置
３          対物レンズ
５，１０３  観察光学系
７          第１刺激光学系
９          第２刺激光学系
１１，５９，６３，７３，８３，９３  光路選択部
２７，５５  刺激光源（光源）
３５        走査部
４１        ＳＬＭ（位相変調素子）
４９        マスク（遮光部材）
５１        第１ミラー（反射部材）
５３        第２ミラー（反射部材）
５７        第１ダイクロイックミラー（ダイクロイックミラー）
５８        第２ダイクロイックミラー（ダイクロイックミラー）
８５        第１偏光ビームスプリッタ（偏光ビームスプリッタ）
８７        第２偏光ビームスプリッタ（偏光ビームスプリッタ）
８９        λ／２板（波長板）
Ｓ          標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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