(57)【要約】【課題】反応特異性の高い抗コルチゾール抗体を取得すること。特にコルチゾールとよく似た構造をもつコルチコステロンとコルチゾールとを識別することができる抗体を取得すること。【解決手段】ステロイド骨格の３位にリンカーが導入されたコルチゾールを有する免疫抗原を用いて免疫した後、生成した抗コルチゾール抗体を回収することにより、コルチコステロンとの交叉反応性が５％未満である抗コルチゾール抗体を製造する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド骨格の３位にリンカーが導入されたコルチゾール。
【請求項２】
請求項１に記載のコルチゾールを有することを特徴とする免疫抗原。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫抗原を用いて免疫することを特徴とする免疫方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法で免疫した後、生成した抗コルチゾール抗体を回収することを特徴とする、抗コルチゾール抗体の製造方法。
【請求項５】
コルチコステロンとの交叉反応性が５％未満であることを特徴とする、抗コルチゾール抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗コルチゾール抗体単離用の抗原及び抗体の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾールは副腎皮質から分泌されるステロイドホルモンの一種であり、血糖値や血圧をコントロールする作用がある。通常その血中濃度は適正にコントロールされているが、副腎や下垂体に腫瘍ができると異常値を示すことが知られている。そのためその正確な血中濃度を知ることが、病気の診断を行う上では必須となっている。
【０００３】
コルチゾールの血中濃度測定では通常、抗コルチゾール抗体を用いた競合法が利用されている。この方法ではまず、固相化された抗コルチゾール抗体をアルカリホスファターゼなどの酵素で標識されたコルチゾール（以下、標識コルチゾール）と検体との混合物に加え反応させる。そしてその後これを洗浄し、固相に結合している標識コルチゾールから出るシグナルを測定する。検体中のコルチゾール濃度が低い時には多くの標識コルチゾールが固相に結合して強いシグナルがでる。しかし血中コルチゾール濃度が高くなると固相に結合する標識コルチゾールが減り、弱いシグナルとなる。このシグナル変化の割合を調べることにより、血中のコルチゾール濃度を求めることができる（図１）。
【０００４】
コルチゾールは臨床上その値が非常に重要なものではあるが、その測定系構築は容易ではない。血中には、コルチゾールと類似の構造をもつ化合物が多数存在している。そのためこれらの化合物が抗コルチゾール抗体へ誤って結合（交叉反応）することもある。そしてその結果、正確な血中濃度を測定できなくなってしまうことがある。コルチゾール測定系の構築では、この交叉反応をいかに抑制するかが重要な課題となっている。
【０００５】
抗コルチゾール抗体を取得するためには、コルチゾールを実験動物に免疫することが必要である。しかしコルチゾールは分子量が小さいため、これ単独で免疫してもその抗体が作られない。このような場合は一般的に、分子量の大きなタンパク質（キャリアタンパク質）へこれを結合させてから免疫を行うことが必要となる。しかしコルチゾールには、キャリアタンパク質との反応性を有する官能基がない。そのためこの抗体を取得するためには、キャリアタンパク質との反応性のある官能基をリンカーとしてコルチゾールへ導入することが必要となる。しかしこの時、ステロイド骨格のどの部位へリンカーを導入するかが重要な問題となる。免疫して得られる抗体は一般的に、リンカー導入部位の反対側から抗原を認識して結合する。しかし現実には、抗体によって識別させたい箇所へ特異的に結合する抗体を得ることは困難である。そして、どのような性質の抗体が得られるかは、実際に免疫を行い確認するしかなかった。。
【０００６】
コルチゾールとよく似た構造をもつ化合物に、コルチコステロンがある。コルチコステロンは、コルチゾールの１６位にある水酸基が水素原子に置換されただけの類似化合物である。そしてこの化合物はその類似性のため、コルチゾールの測定系において交叉反応を引き起こす化合物であることが分かっていた。そのため正確なコルチゾール濃度を測定するためには、この両者を識別する抗体を取得することが必要とされていた。
【０００７】
【化１】
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【０００８】
【化２】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、反応特異性の高い抗コルチゾール抗体を取得することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）ステロイド骨格の３位にリンカーが導入されたコルチゾール。
（２）（１）に記載のコルチゾールを有することを特徴とする免疫抗原。
（３）（２）に記載の免疫抗原を用いて免疫することを特徴とする免疫方法。
（４）（３）に記載の方法で免疫した後、生成した抗コルチゾール抗体を回収することを特徴とする、抗コルチゾール抗体の製造方法。
（５）コルチコステロンとの交叉反応性が５％未満であることを特徴とする、抗コルチゾール抗体。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は反応特異性の高い抗コルチゾール抗体を取得する方法に関するものであり、３位にリンカーを導入したコルチゾールを用いて抗原を作製し、免疫することを特徴とする。コルチゾールに導入されるリンカーに関しては特に限定されるものではないが、Ｎ−ヒドロキシエステルやイミドエステル、マレイミド、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、アルコキシアミンなどを用いることができる。またこれら以外のものでもキャリアタンパク質との反応性があれば特にその種類が限定されるわけではなく、ビオチンなどを用いることもできる。
【００１３】
本発明では、コルチゾールのステロイド骨格の３位にリンカーが導入され、そのリンカーにキャリアタンパク質を結合させて、免疫抗原として用いることができる。
【００１４】
キャリアタンパク質として使用されるタンパク質は抗原性さえあれば特にその種類が限定されるものではないが、アルブミンやブルーキャリアプロテイン（ＢＣＰ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、アビジンなどを用いることができる。
【００１５】
更に免疫に使用される動物は、抗体を作ることさえできれば特にその種類が限定されるわけではなく、マウスやウサギ、ラット、ラクダ、魚類などを用いることができる。そして更には、抗体さえ作られれば特に動物を用いる必要もなく、動物から単離されたＢ細胞などに対して抗原を加えて免疫し、抗体を作らせることもできる。また免疫によって得られる抗体もコルチゾールとの反応性を有していれば特にその種類やサブクラスが限定されるわけではなく、ＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、一本鎖抗体などを取得することができる。またこの抗体はモノクローナル抗体である必要もなく、これらの混合物やポリクローナル抗体であっても構わない。
【００１６】
このような免疫抗原を用いて免疫した後、生成した抗コルチゾール抗体を回収することにより、酷似した構造を有するコルチコステロンとの交叉反応性が５％未満のものを得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、反応特異性の高い抗コルチゾール抗体を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】競合法によるコルチゾール測定の原理図である。
【図２】実施例において、コルチコステロンとの交叉反応性を比較した図である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
（１）免疫抗原の調製（３位リンカー）
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）を２５ｍｇ量り取り、５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にコルチゾールの３位からリンカーが導入されている化合物（を３．５ｍｇ量り取り、５０μｌのジメチルスルホキシドヘ溶かした。その後このコルチゾール溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そしてこの反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のコルチゾールを除去した。透析後は透析チューブの中からコルチゾールで標識されたＢＳＡ（以下、ＢＳＡ３）を回収し、免疫用の抗原として利用した。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
（２）免疫抗原の調製（２１位リンカー）
ＢＳＡを２５ｍｇ量り取り、５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にコルチゾールの２１位からリンカーが導入されている化合物を３．５ｍｇ量り取り、５０μｌのジメチルスルホキシドヘ溶かした。その後このコルチゾール溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そしてこの反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のコルチゾールを除去した。透析後は透析チューブの中からコルチゾールで標識されたＢＳＡ（以下、ＢＳＡ２１）を回収し、免疫用の抗原として利用した。
【００２２】
（３）実験動物への免疫（３位リンカー）
まず免疫動物としてウサギ（日本白色種、雌、１２週齢）を用意した。次に、１０ｍｇ／ｍｌの抗原溶液（ＢＳＡ３）とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの皮下へ２００μｌ注入し、免疫した。
【００２３】
初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、１０ｍｇ／ｍｌの抗原溶液（ＢＳＡ３）とフロイントインコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの皮下へ１００μｌ注入し、免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を１週間おきに３か月間繰り返した。
【００２４】
（４）実験動物への免疫（２１位リンカー）
まず免疫動物としてマウス（日本白色種、雌、１２週齢）を用意した。次に、１０ｍｇ/ｍｌの抗原溶液（ＢＳＡ２１）とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの皮下へ２００μｌ注入し、免疫した。
【００２５】
初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、１０ｍｇ/ｍｌの抗原溶液（ＢＳＡ２１）とフロイントインコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの皮下へ１００μｌ注入し、免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を１週間おきに３か月間繰り返した。
【００２６】
（５）抗血清の評価
３か月間の免疫後、ＢＳＡ３又はＢＳＡ２１で免疫したウサギからそれぞれ少量採血した。そしてこの血液から抗血清を調製し、コルチコステロンとの交叉反応性をそれぞれ以下の通り評価した。
【００２７】
コルチコステロンとの交叉反応性を評価するためにまず、検量線を作成した。検量線の作成法は次の通りである。まず初めに、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）を標識したコルチゾール（以下、ＣＪ）を抗ウサギＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加えて混ぜた。次に、コルチゾール濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１〜６）を用意し、ここにそれぞれ一定量加えた。そして更に前述の調製した抗血清の希釈液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてコルチゾールが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２〜６）を加えた時のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。コルチゾール濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。尚この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行った。
【００２８】
検量線作成後は、以下の方法でコルチコステロンとの交叉反応性を評価した。まずはＣａｌ１に１μｇ／ｍｌとなるようコルチコステロンを加えた溶液を作製した。そしてこの溶液をＣＪと一緒に抗ウサギＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加え、混ぜた。そして更に前述の抗血清の希釈液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてＣａｌ１を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、コルチコステロンを含むＣａｌ１を加えた時のシグナル（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ）を相対的な値［（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。この値を先程作成した検量線上にプロットし、コルチゾールとして誤って検出されている濃度を求めた。そして、コルチゾールとして誤って検出されているコルチコステロン量の割合（交叉反応率）を計算した。尚この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なった。
【００２９】
ＢＳＡ３又はＢＳＡ２１で免疫したウサギから得られた抗血清をそれぞれ用い、上記の方法でコルチコステロンとの交叉反応率を求めて比較した。実験の結果、ＢＳＡ３で免疫して得られた抗血清は、ＢＳＡ２１で免疫して得られた抗血清と比べ、コルチコステロンと交叉反応性が極めて低い（交叉反応率５％未満）ものであることが分かった（図２）。以上の結果により、ステロイド骨格の３位にリンカーを導入したコルチゾールを用いて抗原を作製して免疫することにより、コルチコステロンとの交叉反応性の極めて低い抗コルチゾール抗体を取得できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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