(57)【要約】      （修正有）【課題】異常スプライスバリアントが関わる疾病に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、及びそれらの探索方法の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩、及び野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを利用したスクリーニング方法。2018198615.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、
を含む方法。
【請求項２】
テスト物質の発現が、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、
該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキット。
【請求項８】
さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。
【化１】
2018198615.tif 000008
［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である；
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
【請求項１０】
請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１１】
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための、又は、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記細胞が、神経細胞、がん細胞、又は感染細胞である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１０から１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、
哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
前記細胞に請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を哺乳類細胞、ヒト細胞、哺乳類個体又はヒト個体に接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、
哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、
ヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
前記個体に請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、
請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれかに記載の方法における、請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１０から１３のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための請求項９に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩の使用。
【請求項１９】
ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、
を含む方法。
【請求項２０】
３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法、医薬組成物、キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、選択的スプライシングを検出できるレポーターシステム及びそれを用いて選択的スプライシングに影響を及ぼす化合物を同定する方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2011/152043号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
家族性自律神経失調症（ＦＤ: Familial Dysautonomia）は、神経の発達異常、変性、衰退により、感覚神経と自律神経に障害を持つ先天性・致死性の常染色体劣性遺伝病である。ＦＤ患者のほとんどは、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第２０イントロン内に一塩基置換（ＩＶＳ２０+6T→C変異）を持つ（図１Ａ）。この変異のために、主に神経系の組織において第２０エクソンがｍＲＮＡに組み込まれない異常スプライシング（エクソンスキッピング）が起き、正常なＩＫＢＫＡＰタンパク質が産生されなくなることが、病気の原因であると考えられている（図１Ａ）。
【０００５】
米国特許第７７３７１１０号は、サイトカイニンの１つであるＫｉｎｅｔｉｎが、ＩＶＳ２０+6T→C変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子における異常スプライシングを抑制できることを開示する。
【０００６】
ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子は、エクソン９、１０が相互排他的スプライシングを受ける。エクソン９が残るときの産物はＰＫＭ１ｍＲＮＡであり、アイソフォームＰＫＭ１が産生される。エクソン１０が残るときの産物はＰＫＭ２ｍＲＮＡであり、アイソフォームＰＫＭ２が産生される。これらのアイソフォームの発現は組織特異性があり、ＰＫＭ１はエネルギー要求性の高い細胞、例えば、神経細胞や筋細胞で発現する。一方、ＰＫＭ２は、ほとんどの癌、細胞増殖が活発な臓器、未分化細胞で発現する（図５）。
【０００７】
低酸素状態など、vivoにおけるがん組織に近い環境下では、ＰＫＭ２アイソフォームを発現する細胞のほうがＰＫＭ１を発現する細胞よりも増殖能が高い。また、各アイソフォームを発現させた腫瘍細胞の移植実験では、ＰＫＭ２アイソフォームを発現する腫瘍の方がＰＫＭ１を発現する腫瘍よりも腫瘍の増大が顕著である（Chrisofk et al., Nature (Letters) 2008）。
【０００８】
２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）は、ウイルス感染した細胞において、選択的スプライシングの改変によってＰＭＬ（promyelocytic leukemia）アイソフォームの発現をスイッチングさせることが知られている（Nojima et al., Nucleic Acid Research, 2009）。
【０００９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝病、がん、又は感染症等に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらの探索方法を提供する。
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらの探索方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩に関する。
【化１】
2018198615.tif 000002
［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である；
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
【００１１】
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【００１２】
本開示は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物に関する。
【００１３】
本開示は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、
前記細胞に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は本開示に係る医薬組成物をヒト細胞又はヒト個体に接触させることを含む方法に関する。
【００１４】
本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、本開示に係る医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
【００１６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
【００１７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキットに関する。
【００１８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、家族性自律神経失調症（ＦＤ）患者のほとんどが有する、IKBKAP遺伝子の第20イントロン内の一塩基置換変異（ＩＶＳ２０+6T→C変異）を説明する図である。ＩＶＳ２０+6T→C変異があると主に神経組織において異常スプライシング（エクソンスキッピング）が起き、正常なIKBKAPタンパク質が産生されなくなる。このことがＦＤの原因と考えられている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの一又は複数の実施形態を説明する図である。このコンストラクトは、正常ヒトIKBKAP遺伝子の一部のゲノム領域に対してＩＶＳ２０+6T→C変異を導入し、その配列を用いて作製された。このコンストラクトにおいて、野生型スプライシングの場合、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳される。一方、異常スプライシングの場合には、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳される。
【図２】図２は、野生型レポーターコンストラクト及びＦＤ型レポーターコンストラクトをそれぞれＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ＲＴ−ＰＣＲによりスプライシング産物を確認した結果の一例を示す。野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクトした細胞では正常スプライシング産物が確認され、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクトした細胞では異常スプライシング産物が確認された。
【図３】図３は、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を化合物１とともに培養した後（２４時間及び４８時間後）のＧＦＰ（正常スプライシング）／ＲＦＰ（異常スプライシング）の蛍光シグナル比を示す図である。化合物１は、濃度依存的にＧＦＰ／ＲＦＰ比を高め、その効果はＫｉｎｅｔｉｎよりも優れていた。
【図４】図４は、ＦＤ患者細胞を化合物１とともに培養した後（６０時間後）、ＦＤ患者細胞の内在性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のスプライシング産物ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより確認した図である。化合物１を添加することにより、異常スプライシング産物が抑制され、正常スプライシング産物が増加され、その効果はＫｉｎｅｔｉｎよりも優れていた。
【図５】図５は、ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子の、エクソン９、１０における相互排他的スプライシングを説明する概略図である。エクソン１０が残るアイソフォームＰＫＭ２は、ほとんどの癌で発現する。
【図６】図６は、スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの一又は複数の実施形態を説明する図である。ＰＫＭ遺伝子のエクソン８から１１のゲノム領域を、フレームの異なるよう連結させたＲＦＰ、ＧＦＰ、ｃＤＮＡに連結させた。９を選択した場合には、ＲＦＰにフレームが合い、１０を選択した場合にはＲＦＰにフレームが合うように設計し、９、１０どちらも選択されず、スキップしてしまった場合、また、どちらとも選択された場合にはＲＦＰ及びＧＦＰのどちらにもフレームが合わないように設計されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［一般式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物］
本開示は、一態様において、下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩に関する。
【化２】
2018198615.tif 000003
【００２１】
式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
【００２２】
Ｒ1及びＲ2における炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ1及びＲ2における炭素数１―６の環状アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００２３】
Ｒ1及びＲ2におけるヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を１〜２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５〜６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、３−オキサジアゾリル、２−イミダゾリル、２−チアゾリル、３−イソチアゾリル、２−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、２−フリル、３−フリル、３−ピロリル、２−キノリル、８−キノリル、２−キナゾリニル、８−プリニルが挙げられる。Ｒ1及びＲ2におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
【００２４】
Ｒ1及びＲ2におけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。ハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
【００２５】
式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である。
【００２６】
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
【００２７】
Ｒ3及びＲ4における炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ3及びＲ4における炭素数１―６の環状アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００２８】
Ｒ3及びＲ4におけるヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を１〜２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５〜６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、３−オキサジアゾリル、２−イミダゾリル、２−チアゾリル、３−イソチアゾリル、２−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、２−フリル、３−フリル、３−ピロリル、２−キノリル、８−キノリル、２−キナゾリニル、８−プリニルが挙げられる。Ｒ1及びＲ2におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ3及びＲ4におけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。ハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
【００３０】
式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、前述のＲ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。
【００３１】
Ｘにおける炭素数１―６の直鎖又は分枝のアルキル基（アルキルオキシ基及びアルキルチオ基におけるアルキル基を含む）としては、一又は複数の実施形態において、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等が挙げられる。また、Ｘにおける炭素数１―６の環状アルキル基（アルキルオキシ基及びアルキルチオ基におけるアルキル基を含む）としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００３２】
Ｘにおけるヘテロアリール（ヘテロアリールオキシ基、ヘテロアリールチオ基及びヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を１〜２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５〜６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、その他の一又は複数の実施形態において、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、３−オキサジアゾリル、２−イミダゾリル、２−チアゾリル、３−イソチアゾリル、２−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、２−フリル、３−フリル、３−ピロリル、２−キノリル、８−キノリル、２−キナゾリニル、８−プリニルが挙げられる。Ｘにおけるアリール基（アリールオキシ基及びアリールチオ基におけるヘテロアリールを含む）としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
【００３３】
Ｘにおけるアリール基及びヘテロアリール基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。
【００３４】
Ｘにおけるハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
【００３５】
また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、Ｋｉｎｅｔｉｎを含まず、また、一又は複数の実施形態において、式（Ｉ）及び（Ｉ'）におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＸはＫｉｎｅｔｉｎとなる組み合わせ（Ｒ1及びＲ2が２−フリルメチル及び水素原子、Ｒ3が水素原子、かつ、Ｘが水素原子の組み合わせ）ではない。
【００３６】
また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物は、不斉炭素原子が存在する場合、及び／又は、立体異性体が存在する場合、一又は複数の実施形態において、各異性体の混合物、又は、単離されたものである。
【００３７】
本開示において「プロドラッグ」は、一又は複数の実施形態において、生体内で容易に加水分解され、式（Ｉ）又は（Ｉ'）で表される化合物を再生するものが挙げられ、例えばカルボキシル基を有する化合物であればそのカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物、アルキルチオカルボニル基となった化合物、又はアルキルアミノカルボニル基となった化合物が挙げられる。また、例えばアミノ基を有する化合物であれば、そのアミノ基がアルカノイル基で置換されアルカノイルアミノ基となった化合物、アルコキシカルボニル基により置換されアルコキシカルボニルアミノ基となった化合物、アシロキシメチルアミノ基となった化合物、又はヒドロキシルアミンとなった化合物が挙げられる。また例えば水酸基を有する化合物であれば、その水酸基が前記アシル基により置換されてアシロキシ基となった化合物、リン酸エステルとなった化合物、又はアシロキシメチルオキシ基となった化合物が挙げられる。これらのプロドラッグ化に用いる基のアルキル部分としては前記アルキル基が挙げられ、そのアルキル基は置換（例えば炭素原子数１〜６のアルコキシ基等により）されていてもよい。一又は複数の実施形態において、例えばカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物を例にとれば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどの低級（例えば炭素数１〜６）アルコキシカルボニル、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２−メトキシエトキシカルボニル、２−メトキシエトキシメトキシカルボニル、ピバロイロキシメトキシカルボニルなどのアルコキシ基により置換された低級（例えば炭素数１〜６）アルコキシカルボニルが挙げられる。
【００３８】
本開示において「製薬上許容される塩」とは、薬学的、薬理的、及び／又は医薬的に許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
【００３９】
前記無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００４０】
前記無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。前記有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
【００４１】
前記酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。前記塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
【００４２】
本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
【００４３】
式（Ｉ）又は（Ｉ'）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、下記式（ＩＩ）の化合物である。
【化３】
2018198615.tif 000004
式（ＩＩ）において、Ｙはハロゲン原子である。Ｙにおけるハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。
【００４４】
［医薬組成物］
本開示は、一態様において、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【００４５】
式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、遺伝病の一因となる異常スプライシングを抑制するための用途に使用されうる。本開示において「遺伝病の一因となる異常スプライシング」は、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する、遺伝病の一因となる異常スプライシングである。
【００４６】
遺伝病の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の原因であるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングが挙げられる（上述及び図１Ａ）。ＦＤ以外にも、異常スプライシングが原因である遺伝病は多く知られている。
【００４７】
よって、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体において遺伝病の一因となる異常スプラシングを変化させるための用途に使用されうる。該遺伝病の一因となる異常スプラシングは、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであり、さらなる一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングである。
【００４８】
式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体において遺伝病の一因となる異常スプラシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための用途に使用されうる。該遺伝病の一因となる異常スプラシングは、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであり、さらなる一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングである。
【００４９】
よって、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための用途に使用されうる。
【００５０】
また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための用途に使用されうる。
【００５１】
さらにまた、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための用途に使用されうる。
【００５２】
上記実施形態において、哺乳類細胞若しくはヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞又はヒト以外の哺乳類の細胞である。ヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの神経細胞である。上記実施形態において、ヒト細胞及びヒト個体は、一又は複数の実施形態において、内在性のＩＫＢＫＡＰ遺伝子にＩＶＳ２０+6T→C変異を有する。本開示において、ＩＶＳ２０+6T→C変異とは、図１Ａで示すとおり、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第２０イントロン内における一塩基置換（Ｔ→Ｃ）である。ヒト細胞及びヒト個体がＩＶＳ２０+6T→C変異を有するか否かは、限定されない一又は複数の実施形態において、一塩基置換を検出できる方法が挙げられ、或いは、塩基配列シーケンス、アレイ、各種遺伝子増幅方法が挙げられる。
【００５３】
式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。また、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
【００５４】
式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングが関与する疾病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
【００５５】
式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の用途に使用されうる。
【００５６】
本開示において「医薬組成物」は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。
【００５７】
本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、治療効果を有する他の有効成分を含まず、或いは、さらに一又は複数の有効成分を含有する。
【００５８】
前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記コーティング剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
【００５９】
また、液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００６０】
本開示に係る医薬組成物の使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分である式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物の体内濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
【００６１】
［方法及び使用］
本開示は、その他の一態様において、以下の方法に関しうる。
（ａ）哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の発症若しくは進行の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法。
（ｂ）哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の発症若しくは進行の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法。
（ｃ）ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法。
これら（ａ）〜（ｃ）の方法は、式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を前記ヒト細胞又は前記ヒト個体に接触させることにより達成されうる。
【００６２】
上記（ａ）〜（ｃ）の方法における哺乳類細胞又はヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は一又は複数の実施形態においてヒト細胞であり、ヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒトの神経細胞である。上記（ａ）〜（ｃ）の方法におけるヒト細胞及びヒト個体は、一又は複数の実施形態において、内在性のＩＫＢＫＡＰ遺伝子にＩＶＳ２０+6T→C変異を有する。
【００６３】
in vitro又はex vivoの哺乳類細胞若しくはヒト細胞に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を接触させる方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞培養液に式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはその塩又は本開示に係る医薬組成物を添加することが挙げられる。添加濃度としては、限定されない一又は複数の実施形態において式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物の濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭの間のいずれかになるように添加することが挙げられる。in vivoのヒト細胞及びヒト個体に（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又は本開示に係る医薬組成物を接触させる方法は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。
【００６４】
本開示は、さらにその他の一態様において、本開示に係る医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む、異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる疾病又は家族性自律神経失調症（ＦＤ）の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法に関する。前記対象は、一又は複数の実施形態において、該疾病の罹患者、異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる遺伝病の変異遺伝子保有者、ＦＤ患者、又は、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子保有者が挙げられる。本開示に係る医薬組成物の投与方法については、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。
【００６５】
したがって、本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ａ１］  下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。
【化４】
2018198615.tif 000005
［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である；
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
［Ａ２］  ［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
［Ａ３］  哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための、
哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための、又は、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための、［Ａ２］記載の医薬組成物。
［Ａ４］  前記細胞が、神経細胞である、［Ａ３］記載の医薬組成物。
［Ａ５］  異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、［Ａ２］から［Ａ４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［Ａ６］  前記異常スプライシングが、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングである、［Ａ５］に記載の医薬組成物。
［Ａ７］  遺伝病が、家族性自律神経失調症（ＦＤ）である、［Ａ６］に記載の医薬組成物。
［Ａ８］  哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類細胞若しくは哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト細胞若しくはヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を哺乳類細胞、ヒト細胞、哺乳類個体又はヒト個体に接触させることを含む、方法。
［Ａ９］  哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させる方法、哺乳類個体における遺伝病の一因となる異常スプラシング又はヒト個体におけるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させる方法、又は、ヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させる方法であって、前記個体に［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［Ａ１０］  前記異常スプライシングが、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングである、［Ａ７］又は［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１１］  異常スプライシングが発症若しくは進行の一因となる遺伝病又は家族性自律神経失調症の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療方法であって、［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を必要とされる対象に投与することを含む方法。
［Ａ１２］  ［Ａ８］から［Ａ１１］のいずれかに記載の方法における、［Ａ１］記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩又は［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
［Ａ１３］  ［Ａ２］から［Ａ７］のいずれかに記載の医薬組成物を製造するための［Ａ１］の化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩の使用。
【００６６】
［スプライシングレポーターＤＮＡコンストラクト］
本開示は、その他の態様において、野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトに関する。
【００６７】
本開示において「疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシング」は、一又は複数の実施形態において、疾病における選択的スプライシング、疾病に特異的な選択的スプライシング、疾病において正常時よりも多く起る選択的スプライシング、又は、疾病の発症若しくは進行の一因となる選択的スプライシングをいう。疾病としては、遺伝病、がん、又は感染症が挙げられる。
【００６８】
遺伝病の発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングであって、さらなる一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）の原因であるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングが挙げられる（上述及び図１Ａ）。ＦＤ以外にも、異常スプライシングが原因である遺伝病は多く知られている。
【００６９】
がんの発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼＭ）遺伝子のエクソン９、１０の相互排他的スプライシングで、ＰＫＭ２アイソフォーム（エクソン１０）選択されるスプライシングが挙げられる（上述及び図５）。ＰＫＭ２は、ほとんどのがんで発現し、腫瘍の増大に寄与するものと考えられている。ＰＫＭ遺伝子以外にも、がんの発症又は進行の一因となる選択的スプライシングは存在すると考えられる。
【００７０】
感染症の発症又は進行の一因となる異常スプラシングとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）が感染した細胞における、ＰＭＬ（promyelocytic leukemia）アイソフォームの発現スイッチングをもたらす選択的スプライシングが知られている（Nojima et al., Nucleic Acid Research, 2009）。感染症としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫による感染症が挙げられる。
【００７１】
上記実施形態において、哺乳類細胞若しくはヒト細胞は、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を含む。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞又はヒト以外の哺乳類の細胞である。細胞は、一又は複数の実施形態において、神経細胞、がん細胞、又は感染細胞である。
【００７２】
本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を含む遺伝子領域の異常スプライシングを検出できるスプライシングレポーターとして機能しうるＤＮＡコンストラクトである。本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子を含み、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成される。
【００７３】
本実施形態に係るレポーターコンストラクトは、その他の一又は複数の実施形態において、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有するヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の第１９エクソンから第２１エクソンの領域と２つの異なるレポーター遺伝子を含み、第２０エクソンを含む野生型スプライスバリアントと第２０エクソンがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成される。一又は複数の実施形態において、第１９エクソンから第２１エクソンの領域部分は、第２０エクソンがエクソンスキップされる異常スプライシングが起る範囲であれば、第１９エクソン及び／又は第２１エクソンが部分的に欠失してもよい。
【００７４】
本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトにおけるレポーター遺伝子は、限定されない一又は複数の実施形態において、各種蛍光蛋白質の遺伝子である。
【００７５】
本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、限定されない一又は複数の実施形態において、図１Ｂに示すレポーターコンストラクトで説明されうる。図１ＢのＤＮＡコンストラクトは、ＣＡＧプロモーターの下流にＧＳＴタンパク質の遺伝子、変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）、及びＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）をこの順に連結されている。このコンストラクトにおいて、野生型スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分が、３ｎ＋１塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子のストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームとなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳され緑色蛍光タンパク質が発現する。一方、異常スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分が、３ｎ塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳され赤色蛍光タンパク質が発現する。
【００７６】
本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトは、一又は複数の実施形態において、ＰＫＭ遺伝子のエクソン９、１０の相互排他的スプライシングで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトに関する。本実施形態に係るＤＮＡコンストラクトは、限定されない一又は複数の実施形態において、図６に示すレポーターコンストラクトで説明されうる。ＰＫＭ遺伝子のエクソン８から１１のゲノム領域を、フレームの異なるよう連結させたＲＦＰ、ＧＦＰ、ｃＤＮＡに連結させた。９を選択した場合には、ＲＦＰにフレームが合い、１０を選択した場合にはＲＦＰにフレームが合うように設計し、９、１０どちらも選択されず、スキップしてしまった場合、また、どちらとも選択された場合にはＲＦＰ及びＧＦＰのどちらにもフレームが合わないように設計されている。
【００７７】
本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトの製造方法は、国際公開第2011/152043号を参照でき、本文献を参照により本開示に組み込む。
【００７８】
［異常スプライシングを抑制するか否かをテストする方法］
本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した細胞を用いれば、該細胞に接触させた物質が異常スプライシングを抑制できるか否かをテストできる。したがって、本開示はその他の態様において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
【００７９】
真核細胞又は真核生物としては、一又は複数の実施形態において、哺乳類又はヒトの細胞又は個体が挙げられる。本開示に係るスクリーニング方法としては、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞を使用しうる。また、哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト細胞であり、細胞は、一又は複数の実施形態において、神経細胞、がん細胞、感染細胞である。
【００８０】
「導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、腫瘍細胞の条件と同じになるように、酸素濃度を０．５％とし、ＡＴＰ合成阻害剤であるオリゴマイシンを存在させることが挙げられる。
【００８１】
テスト物質が、一又は複数の実施形態において、タンパク質であれば、該タンパク質をコードしたｃＤＮＡの発現ベクターを、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した真核細胞又は真核生物にさらに導入することで発現させてもよい。テスト物質の発現は、一又は複数の実施形態において、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる。前記ベクターとしては、一又は複数の実施形態において、適宜、遺伝子発現ライブラリー、又は、ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを使用できる。一方、テスト物質が、一又は複数の実施形態において、低分子化合物であれば、該低分子化合物の存在下で、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを導入した真核細胞又は真核生物を培養することで接触させてもよい。
【００８２】
本開示に係るスクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である。異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病は、上述のとおり、一又は複数の実施形態において、遺伝病、がん、又は感染症である。前記遺伝病としては、限定されない一又は複数の実施形態において、家族性自律神経失調症（ＦＤ）が挙げられる。
【００８３】
したがって、本開示に係るスクリーニング方法は、その他の一又は複数の実施形態において、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入すること、
（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
【００８４】
本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｃ）における、野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現による検出は、一又は複数の実施形態において、蛍光シグナルの検出、ＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられ、特に制限されず、レポーター遺伝子に応じて適宜選択できる。
【００８５】
本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｄ）の一又は複数の実施形態において、テスト物質を接触させた細胞における野生型スプライシングの割合が高くなった場合、異常スプライシングを抑制できる候補物質として選択できる。
【００８６】
テスト物質としては、その他の一又は複数の実施形態において、低分子化合物が挙げられる。したがって、本開示は、その他の態様において、疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる低分子化合物のスクリーニング方法であって、（Ａ）本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、（Ｂ）テストする低分子化合物を前記真核細胞又は真核生物に接触させること、（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該低分子化合物を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。また、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する低分子化合物のスクリーニング方法であって、（Ａ）本開示に係るレポーターＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入すること、（Ｂ）テストする低分子化合物を前記真核細胞又は真核生物に接触させること、（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、低分子化合物を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法に関する。
【００８７】
本開示に係るスクリーニング方法の前記工程（Ｄ）の一又は複数の実施形態において、テスト低分子化合物を接触させた細胞における野生型スプライシングの割合が高くなった場合、異常スプライシングを抑制できる候補低分子化合物として選択できる。よって、本開示は、その他の態様において、異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物であって、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物に関する。
【００８８】
［キット］
本開示は、その他の態様において、本開示に係るスプライシングレポーターＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキットに関する。該キットは、本開示に係るスクリーニング方法に使用できる。また、該キットは、さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含んでもよい。
【００８９】
したがって、本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ｂ１］  疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライシングを抑制できる物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを真核細胞又は真核生物に導入し、必要に応じて導入された該細胞又は生物を該異常スプライシングが起る条件とすること、
（Ｂ）テスト物質を前記真核細胞又は真核生物に接触若しくは発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング及び異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、該テスト物質を接触若しくは発現させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法。
［Ｂ２］  テスト物質の発現が、テスト物質を発現可能なベクターを前記真核細胞又は真核生物に導入することにより行われる、［Ｂ１］記載の方法。
［Ｂ３］  異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の医薬組成物の有効成分となる候補化合物のスクリーニング方法である、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｂ４］  前記疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、［Ｂ１］から［Ｂ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ５］  ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制する物質か否かをテストする方法であって、
（Ａ）３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトを、真核細胞又は真核生物に導入すること、
（Ｂ）テストする物質を前記真核細胞又は真核生物に接触又は発現させること、
（Ｃ）野生型スプライシング又は異常スプライシングの少なくとも一方を前記レポーター遺伝子の発現により検出すること、及び、
（Ｄ）異常スプライシングのレポーター遺伝子発現に対する野生型スプライシングのレポーター遺伝子発現の割合が、テストする物質を接触させないコントロールと比べて変化したか否かを決定すること、を含む方法。
［Ｂ６］  異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、該異常スプライシングを抑制できる有効成分を含む、医薬組成物。
［Ｂ７］  異常スプライシングが発症又は進行の一因となる疾病が、遺伝病、がん、又は感染症である、［Ｂ６］に記載の医薬組成物。
［Ｂ８］  ３ｎ＋１又は３ｎ＋２塩基長のエクソンａとＩＫＢＫＡＰ遺伝子のＩＶＳ２０+6T→C変異を有するイントロンとを含む遺伝子と２つの異なるレポーター遺伝子とが、エクソンａを含む野生型スプライスバリアントとエクソンａがスキップされた異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクト。
［Ｂ９］  野生型スプライスバリアントと疾病の発症又は進行の一因となる異常スプライスバリアントとで異なるレポーター遺伝子が発現するように融合され配置又は構成されたＤＮＡコンストラクトと、該異常スプライシングを起こし得る細胞とを含むキット。
［Ｂ１０］  さらに、テスト物質を発現可能なベクターを含む、［Ｂ９］記載のキット。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。
【００９１】
製造例１：化合物１の製造
【化５】
2018198615.tif 000006
化合物１は、ＷＯ２０１０／１１８３６７に開示される方法を参考に、以下のように合成した。
２，６−ジクロロ−１Ｈ−プリン（2,6-dichloro-1H-purine）（１８９ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ、商用品）とフルフリルアミン（furfurylamine）（９７．０ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ、商用品）のアセトニトリル（acetonitrile）（２０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（triethylamine）（０．１５ｍＬ，１．０８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。混合物を室温にて６時間撹拌した後、６０℃にて３時間撹拌した。この混合溶液を減圧下で濃縮した後、水を加え、生じた白色沈殿をろ取した。得られた固体は、水、ジエチルエーテルで順次洗浄し、２−クロロ−Ｎ−（２−フラニルメチル）−７Ｈ−プリン−６−アミン（2-chloro-N-(2-furanylmethyl)-7H-purin-6-amine）（化合物１）（１９．８ｍｇ，０．０７９５ｍｍｏｌ，８．０％）を白色固体として得た。
TLC Rf ０．２２ (酢酸エチル); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 4.56-4.67 (br, 2H), 6.24-6.28 (br, 1H), 6.35-6.40 (br, 1H), 7.54-7.57 (br, 1H), 8.11-8.15 (br, 1H), 8.54-8.64 (br, 1H), 13.05-13.17 (br, 1H).
【００９２】
参考化合物１
【化６】
2018198615.tif 000007
上記参考化合物１は、Ｋｉｎｅｔｉｎであり、ナカライラスク社製のものを用いた。
【００９３】
［２色蛍光タイプのスプライシングレポーターコンストラクトの作製］
図１Ａに示されるＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分を利用して、図１Ｂに示すようなレポーターコンストラクト（ＦＤ型）を作製した。すなわち、ＣＡＧプロモーターの下流にＧＳＴタンパク質の遺伝子、変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）、及びＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）をこの順に連結したコンストラクトを作製した。なお、前記コンストラクトにおいて、野生型スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分が、３ｎ＋１塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子のストップコドン（ＵＡＡ）はアウトフレームなり、ＧＦＰ遺伝子がインフレームで翻訳され緑色蛍光タンパク質が発現する。一方、異常スプライシングを受けた場合には、ＧＳＴタンパク質の遺伝子及び変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子の１９〜２１エクソン部分が、３ｎ塩基長のｍＲＮＡとなり、ＲＦＰ遺伝子及びそのストップコドン（ＵＡＡ）がインフレームで翻訳され赤色蛍光タンパク質が発現する。
【００９４】
図１Ｂに開示されるレポーターコンストラクトを用いることで、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングが野生型スプライスか、異常スプライスかの判断が容易となる。
【００９５】
前記レポーターコンストラクト（ＦＤ型）において変異型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子が野生型ヒトＩＫＢＫＡＰ遺伝子である他は同様であるレポーターコンストラクト（野生型）もさらに作製した。
【００９６】
作製したＦＤ型レポーターコンストラクト及び野生型レポーターコンストラクトをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、ＦＤ患者における異常スプライシングが再現できるか確認した。
【００９７】
まず、蛍光顕微鏡観察を行ったところ、野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞ではＧＦＰが発現することが確認され、正常スプライシングが起きていることが確認された（データ示さず）。また、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞ではＲＦＰが発現することが確認され、異常スプライシングが起きていることが確認された（データ示さず）。
【００９８】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認したところ、図２に示すとおり、野生型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞では正常スプライシング産物が確認され、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションした細胞では異常スプライシング産物が確認された。なお、内部コントロールとして、内因性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを使用した。
【００９９】
［異常スプライシングを抑制する化合物のスクリーニング］
ＦＤ型レポーターコンストラクトを用いて、該コンストラクトから転写されるｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングを抑制できる化合物をスクリーニングした。具体的には、ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞に、テスト化合物を接触させて培養し、所定の時間後に蛍光観察を行い、ＧＦＰ（正常スプライシング産物）とＲＦＰ（異常スプライシング産物）の蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）がコントロール（例えば、溶媒のみ、又はＫｉｎｅｔｉｎ（参考化合物１））と比べて強いものを選択した。その結果、異常スプライシングを抑制する化合物の候補化合物として、前記化合物１が選択された。
【０１００】
［化合物１の異常スプライシング抑制効果の確認］
ＦＤ型レポーターコンストラクトをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞に、化合物１を接触させて培養した（化合物濃度０．４、２．０、１０．０、及び５０．０μＭ）。２４時間及び４８時間後に蛍光観察を行い、蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）を求めた。その結果を図３に示す。
【０１０１】
図３のグラフは、コントロール（溶媒のみ）、Ｋｉｎｅｔｉｎ、及び化合物１について、投与濃度と蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）との関係を示す。同図に示す通り、化合物１は、濃度依存的に蛍光強度比（ＧＦＰ／ＲＦＰ）が増加しており、その増加度は、Ｋｉｎｅｔｉｎより著しく優れていた。よって、化合物１は、Ｋｉｎｅｔｉｎよりも効果的にＩＶＳ２０+6T→C変異に起因する異常スプライシングを抑制できることが示された。
【０１０２】
［ＦＤ患者の細胞における化合物１の異常スプライシング抑制効果の確認］
ＦＤ患者細胞は、Coriell Instituteより得たものを使用した。なお、該ＦＤ患者細胞の内在性ＩＫＢＫＡＰ遺伝子は、ＩＶＳ２０+6T→C変異を有していた。
【０１０３】
該患者細胞の培養液に化合物１及びＫｉｎｅｔｉｎを２μＭ又は５０μＭの濃度で添加し、６０時間培養後、細胞を回収してＲＴ−ＰＣＲを行った。コントロールとしては、未処理細胞、及び、ＤＭＳＯ（溶媒）処理細胞を使用した。その結果を図４に示す。
【０１０４】
図４に示すとおり、化合物１は、２μＭという低い濃度で異常スプライシングを抑制できることが示された。また、その異常スプライシング抑制活性は、５０μＭの濃度のＫｉｎｅｔｉｎと同程度であることが示された。
【図１Ａ】
2018198615.tif 000010
【図１Ｂ】
2018198615.tif 000011
【図２】
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【図３】
2018198615.tif 000013
【図４】
2018198615.tif 000014
【図５】
2018198615.tif 000015
【図６】
2018198615.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月13日(2018.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物又はそれらの製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物であって、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きるスプライシングを変化させるための、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングに対する野生型スプライシングの比率を増加させるための、又は、
ヒト細胞若しくはヒト個体においてＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡにおけるエクソン２０の存在割合を増加させるための、医薬組成物。
【化１】
2018198615.tif 000017
［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である；
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］
【請求項２】
前記細胞が、神経細胞、がん細胞、又は感染細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＩＶＳ２０+6T→C変異を有する変異ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｐｒｅ−ｍＲＮＡで起きる異常スプライシングが関与する疾病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
スプライスされる遺伝子における遺伝子変異に起因する異常スプライシングが発症又は進行の一因となる遺伝病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ2及びＲ3は、水素原子であり、
Ｘは、ハロゲン原子である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒ1は、ベンジル、又はヘテロアリールメチル基である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｒ1は、ヘテロアリールメチル基であり、
Ｒ2及びＲ3は、水素原子であり、
Ｘは、ハロゲン原子である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｒ1は、２−フリルメチル、又は２−チエニルメチルであり、
Ｒ2及びＲ3は、水素原子であり、
Ｘは、ハロゲン原子である、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物が、下記式（ＩＩ）の化合物である、請求項１から８のいずれかに記載の医薬組成物。
【化２】
2018198615.tif 000018
［式（ＩＩ）において、Ｙは、ハロゲン原子である。］
【請求項１０】
下記式（Ｉ）若しくは（Ｉ'）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はそれらの製薬上許容される塩。
【化３】
2018198615.tif 000019
［式（Ｉ）及び（Ｉ'）において、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｒ3は、水素原子、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、置換若しくは無置換のヘテロアリール基、又はＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｒ4−である；
Ｒ4は、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である；
Ｘは、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、Ｒ1及びＲ2が置換したアミノ基、アジド基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルオキシ基、置換若しくは無置換のアリールオキシ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールオキシ基、メルカプト基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキルチオ基、置換若しくは無置換のアリールチオ基、置換若しくは無置換のヘテロアリールチオ基、炭素数１―６の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基である。］