(57)【要約】      （修正有）【課題】キトサンへ抗体を標識する方法を提供する。【解決手段】酸性溶液中でキトサン中のアミノ基を異なる官能基に変換し、官能基と反応する標識物質を酸性溶液中に添加することを特徴とするキトサンを標識する方法。酸性溶液のｐＨが１．０以上６．０以下である、キトサンを標識する方法。官能基がチオール基であって、標識物質がマレイミド基を有する標識物質である、キトサンを標識する方法。標識物質が抗体である、キトサンを標識する方法。抗体がＢＮＰとの親和性を有する、キトサンを標識する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性溶液中でキトサン中のアミノ基を異なる官能基に変換し、前記官能基と反応する標識物質を前記酸性溶液中に添加することを特徴とするキトサンを標識する方法。
【請求項２】
前記酸性溶液のｐＨが１．０以上６．０以下であることを特徴とする請求項１に記載のキトサンを標識する方法。
【請求項３】
前記官能基がチオール基であって、前記標識物質がマレイミド基を有する標識物質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のキトサンを標識する方法。
【請求項４】
前記標識物質が抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のキトサンを標識する方法。
【請求項５】
前記抗体がＢＮＰとの親和性を有することを特徴とする請求項４に記載のキトサンを標識する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンを標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エビやカニなどの甲殻類に多く含まれる化合物として、キチンがある。キチンは地球上で１年間に約１０００億トンも合成されていると推測されており、非常に豊富な生物資源として知られている（非特許文献１−５）。キチンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが鎖状に長くつながった構造を持っており、その量の豊富さや環境調和性などから大きな注目を集めていた。しかし、この化合物は水に溶けないため、そのほとんどは利用されずに廃棄されていた。
【０００３】
キチンをアルカリ処理するとアセチル基が除かれ、主としてＤ−グルコサミンから構成される化合物へ変わる。この化合物はキトサンと呼ばれており、キチンと異なり酸性のｐＨでは水に溶ける。しかし、中性領域のｐＨでは水に不溶となるため、その化学修飾や加工面においては使いづらさが残っていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「キチン・キトサンの話」  矢吹稔
【非特許文献２】「最後のバイオマス  キチン、キトサン」  キチン、キトサン研究会編
【非特許文献３】「キチン、キトサン実験マニュアル」  キチン、キトサン研究会編
【非特許文献４】「キチン、キトサンの応用」  キチン、キトサン研究会編
【非特許文献５】「キチン、キトサンハンドブック」  キチン、キトサン研究会編
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、キトサンへ抗体を標識することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）酸性溶液中でキトサン中のアミノ基を異なる官能基に変換し、前記官能基と反応する標識物質を前記酸性溶液中に添加することを特徴とするキトサンを標識する方法。
（２）前記酸性溶液のｐＨが１．０以上６．０以下であることを特徴とする（１）に記載のキトサンを標識する方法。
（３）前記官能基がチオール基であって、前記標識物質がマレイミド基を有する標識物質であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のキトサンを標識する方法。
（４）前記標識物質が抗体であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のキトサンを標識する方法。
（５）前記抗体がＢＮＰとの親和性を有することを特徴とする（４）に記載のキトサンを標識する方法。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明はキトサンを標識する方法に関するものであり、酸性溶液中でキトサン中のアミノ基を異なる官能基に変換し、前記官能基と反応する標識物質を前記酸性溶液中に添加することを特徴とする。使用する酸性溶液は、ｐＨが酸性であれば特にその種類が限定されるものではなく、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸・１水和物）緩衝液などを用いることができる。溶液のｐＨは、１．０以上６．０以下であることが好ましく、４．０以上５．５以下であることがより好ましく、４．５以上５．０以下であることが更に好ましい。
【０００９】
本発明では、キトサン中のアミノ基を異なる官能基に変換することを特徴とするが、その官能基としては、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、ニトロ基、スルホ基が挙げられ、中でもチオール基が好ましい。
【００１０】
前記官能基と反応する標識物質としては抗体、ペプチド、核酸、蛋白質、糖鎖、脂質、ホルモン、薬剤、ウイルス、色素などが挙げられ、中でも抗体が好ましく、特にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）との親和性を有する抗体であることが好ましい。上述した標識物質は、前記官能基と反応するように、必要に応じて適切な官能基を導入しておく。例えば、前記官能基がチオール基である場合、標準物質がマレイミド基を有していないのであれば、前記酸性溶液に添加する前に、標準物質にマレイミド基を導入しておく必要がある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、キトサンに抗体を標識することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キトサンに標識された抗体量をＥＬＩＳＡで調べた結果を示すものである。
【実施例】
【００１３】
以下、抗ＢＮＰ抗体をキトサンへ標識する実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００１４】
なお、使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示すとおりである。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
酸性トラウト溶液（ｐＨ５．０）
１００ｍＭ    酢酸ナトリウム
２ｍｇ／ｍｌ  ２−イミノチオラン塩酸塩
中性トラウト溶液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
２ｍｇ／ｍｌ  ２−イミノチオラン塩酸塩  
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
１００ｍＭ    酢酸ナトリウム
炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）
１２ｍＭ      炭酸ナトリウム
３８ｍＭ      炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ  ７．４）
１ｍＭ        トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
７．５ｍＭ    塩化ナトリウム
０．０５％    ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
１％          スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ    りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ    りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ    塩化ナトリウム
２．７ｍＭ    塩化カリウム
０．１％      スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ          ジエタノールアミン
０．５ｍＭ    塩化マグネシウム
１０ｍＭ      ４−メチルウンベリフェリルリン酸
【００１５】
（ＥＬＩＳＡ法によるキトサンへ標識された抗体量の評価）
キトサンへ標識された抗体の量は以下の方法で調べた。
（１）ビオチンを介してＢＮＰを標識してあるアビジンを０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をウェルごとに１００μｌずつＥＬＩＳＡ用プレート（９６ウェル）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（２）次に、ブロッキング緩衝液をウェルごとに２００μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを１回洗浄した。
（３）次に、インキュベーション緩衝液をウェルごとに７０μｌずつ加えた。
（４）次に、抗体量を調べたいサンプル溶液をウェルごとに３０μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（５）次に、Ｇｏａｔ−α  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＡＬＰを含むインキュベーション緩衝液をウェルごとに１００μｌずつ加えて、室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（６）最後に、ウェルごとに１００μｌずつＡＬＰ緩衝液を加えて、３０分静置した。
（７）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４６５ｎｍ）、キトサンに標識された抗体量を調べた。
【００１６】
（実施例１）
（１）キトサンが有するアミノ基のチオール基への変換
キトサンを０．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）となるよう２ｍｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。次に、この溶液を１５ｋｒｐｍで５分間遠心し、キトサンをペレットとして回収した。その後、このペレットに酸性トラウト溶液を２ｍｌ加え、室温で１時間反応させた。反応後はこの溶液をＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）へ通し、酢酸緩衝液へバッファ交換した。以上により、キトサンのアミノ基をチオール基へ変換した。
（２）抗体へのマレイミド基の導入
ＢＮＰとの親和性を有するマウス由来抗体（ＢＣ２３−１１、特許第５８１０５１４号公報に記載の抗体）を２ｍｇ用意し、この抗体がＰＢＳ溶液中で１ｍｇ／ｍｌとなるよう濃度を調整した。次に、サクシニミジル―［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エーテルを２５０ｍＭとなるようジメチルスルホキシドに溶かし、濃度を調整した抗体溶液へ１μｌ加えた。その後、この溶液を室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）で酢酸緩衝液へバッファ交換した。以上により、抗体へマレイミド基を導入した。
（３）キトサンへの抗体標識
酸性トラウト溶液中でアミノ基をチオール基へ変換したキトサンと、マレイミド基を導入した抗体とを混ぜ、４℃で一昼夜反応させた。その後、この反応液へ１Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ｐＨ８）を加えて中和した。次に、この溶液を１５ｋｒｐｍで５分間遠心し、抗体で標識されたキトサンをペレットとして回収した。このペレットに１ｍｌのＰＢＳ溶液を加えて懸濁した後、１５ｋｒｐｍで５分間遠心して抗体標識されたキトサンを洗浄した。この洗浄を合計３回行った後、抗体標識されたキトサンを５００μｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。
【００１７】
（比較例１）
（１）キトサンが有するアミノ基のチオール基への変換
キトサンを０．２％（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）となるよう２ｍｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。次に、この溶液を１５ｋｒｐｍで５分間遠心し、キトサンをペレットとして回収した。その後、このペレットに中性トラウト溶液を２ｍｌ加え、室温で１時間反応させた。反応後はこの溶液をＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）へ通し、ＰＢＳ溶液へバッファ交換した。以上により、キトサンのアミノ基をチオール基へ変換した。
（２）抗体へのマレイミド基の導入
２ｍｇの抗体（ＢＣ２３−１１）を用意し、この抗体がＰＢＳ溶液中で１ｍｇ／ｍｌとなるよう濃度を調整した。次に、サクシニミジル―［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エーテルを２５０ｍＭとなるようジメチルスルホキシドに溶かし、濃度を調整した抗体溶液へ１μｌ加えた。その後この溶液を室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）でＰＢＳ溶液へバッファ交換した。以上により、抗体へマレイミド基を導入した。
（３）キトサンへの抗体標識
ＰＢＳ溶液中でアミノ基をチオール基へ変換したキトサンと、マレイミド基を導入した抗体とを混ぜ、４℃で一昼夜反応させた。その後、この溶液を１５ｋｒｐｍで５分間遠心し、抗体で標識されたキトサンをペレットとして回収した。このペレットに１ｍｌのＰＢＳ溶液を加えて懸濁した後、１５ｋｒｐｍで５分間遠心して抗体標識されたキトサンを洗浄した。この洗浄を２回行った後、抗体標識されたキトサンを５００μｌのＰＢＳ溶液に懸濁した。
【００１８】
実施例１と比較例１でキトサンへ標識された抗体の量を、上述のＥＬＩＳＡ法で調べた。その結果、酢酸緩衝液を用いた方が、キトサンへ抗体がよく標識されることが分かった（図１参照）。
【図１】
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