(57)【要約】      （修正有）【課題】ＬＲＲＫ２遺伝子に変異を有する患者においてパーキンソン病（ＰＤ）を治療する方法の提供。【解決手段】薬学的組成物を投与することにより、患者においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、前記薬学的組成物は、少なくとも治療的に有効な量のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤を含み、前記ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は置換ピペラジン誘導体化合物群から選択される、方法。【選択図】図１
2018184401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物を投与することにより、患者においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、前記薬学的組成物は、
少なくとも治療的に有効な量のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤を含み、前記ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は置換ピペラジン誘導体化合物群から選択される、方法。
【請求項２】
前記置換ピペラジン誘導体化合物群は以下の一般式を有し、
2018184401.tif 000006
上式においてｎは０、１、又は２であり、
Ｇ１は、
５員環又は６員環の不飽和複素環であって、前記不飽和複素環が少なくともＳ又はＮを有している、
５員環又は６員環の飽和炭素環であって、前記飽和炭素環が少なくとも１以上のカルボン酸若しくはメタノンで置換されている又はベンゼンと縮合している、
不飽和ビシクロヘプテンである、又は
２から４のＣを有する不飽和メチル置換アルケンであり、
Ｇ２は、
４−アセトフェノン、
４−ニトロベンゼン、又は
２−ピリジンである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｎが１であり、Ｇ１が２−ピリジン又は２−チオフェンであり、Ｇ２が４−アセトフェノン又は４−ニトロベンゼンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｎが１であり、Ｇ１がメチル置換ブテンであり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｎが１であり、Ｇ１が不飽和ビシクロヘプテンであり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ｎが０であり、Ｇ１がインダンであり、Ｇ２が２−ピリジンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ｎが０であり、Ｇ１がホルミルシクロヘキサンカルボン酸であり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
緩衝剤が、前記ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤を送達するのに適切な酸レベルを調整することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
パーキンソン病の治療又は予防用のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤であって、以下の一般式を有し、
2018184401.tif 000007
上式においてｎは０、１、又は２であり、
Ｇ１は、
（１）５員環又は６員環の不飽和複素環であって、前記不飽和複素環が少なくともＳ又はＮを有している、
（２）５員環又は６員環の飽和炭素環であって、前記飽和炭素環が少なくとも１以上のカルボン酸若しくはメタノンで置換されている又はベンゼンと縮合している、
（３）不飽和ビシクロヘプテンである、又は
（４）２から４のＣを有する不飽和メチル置換アルケンであり、
Ｇ２は、
（１）４−アセトフェノン、
（２）４−ニトロベンゼン、又は
（３）２−ピリジンである、
ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【請求項１０】
パーキンソン病の治療又は予防用のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤であって、以下の一般式を有するＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
2018184401.tif 000008
【請求項１１】
ｎが１であり、Ｇ１が２−ピリジン又は２−チオフェンであり、Ｇ２が４−アセトフェノン又は４−ニトロベンゼンである、請求項９に記載のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【請求項１２】
ｎが１であり、Ｇ１がメチル置換ブテンであり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項９に記載のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【請求項１３】
ｎが１であり、Ｇ１が不飽和ビシクロヘプテンであり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項９に記載のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【請求項１４】
ｎが０であり、Ｇ１がインダンであり、Ｇ２が２−ピリジンである、請求項９に記載のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【請求項１５】
ｎが０であり、Ｇ１がホルミルシクロヘキサンカルボン酸であり、Ｇ２が４−ニトロベンゼンである、請求項９に記載のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、ＡＲＦＧＡＰ１阻害を介したパーキンソン病治療と題する、２０１４年４月１０日に出願された仮出願第６１／９７８０９４号の利益を主張し、この仮出願はその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
本技術は概してパーキンソン病の治療方法に関し、より具体的にはＡＲＦＧＡＰ１阻害を介したパーキンソン病の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
より多くの人がより長く生きるのに伴い、進行性の運動性及び認知機能の低下を伴う、パーキンソン病（ＰＤ）のような年齢関連神経変性疾患の有病率が増加している。パーキンソン病は、黒質におけるドパミン作動性神経の死により生じ、患者の進行性の運動機能障害を招く。この病気の初期の症状は運動に関連し、ふるえ、硬直、及び移動開始の困難という特徴的な徴候を伴う。この病気の後期の症状は痴呆を含む。ＰＤの結果として生じる生活の質の低下がしばしば長引くという性質は、ＰＤを患う個人だけでなく、ＰＤ患者の看護を提供する家族、医療専門家、及び医療システムにも影響を与える。根底にあり進行するＰＤの病態生理に向けた治療は限られている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の追加の特徴及び利点は、続く説明において述べられ、及び、部分的にはこの説明から自明であるか若しくは本明細書で開示された原理を実践することにより知ることができる。本開示の特徴及び利点は、添付の請求の範囲で特に示されている手段及び組み合わせによって実現し及び得ることができる。本開示のこれらの及び他の特徴は、続く説明及び添付の請求の範囲からより完全に明らかとなり、又は本明細書で述べられる原理を実践することにより知ることができる。
【０００５】
パーキンソン症候群の多くの症例は原因不明であるが、ＰＤの進展に影響を与えるいくつかの遺伝子座が発見されてきており、いくつかの変異は散発性の病気のリスク要因として関係するとされている。１０年前、ＬＲＲＫ２遺伝子における常染色体優性変異が晩発性ＰＤの原因となることが発見された。この遺伝子の変異は、４％の遺伝性ＰＤ症例及び１％の散発性ＰＤ症例の原因となっていることが発見された。ＬＲＲＫ２遺伝子産物は、２つのメンバからなるプロテインキナーゼファミリーの一部であり、他方のファミリーメンバー（ＬＲＲＫ１）はＰＤの発病に影響を持っていない(Civiero and Bubacco、２０１２年）。ＬＲＲＫ２は、プロテインキナーゼ活性及び内在性ＧＴＰアーゼ活性を有する多機能多ドメインたんぱく質である（図１）(Kumar and Cookson、２０１２年）。ＰＤに寄与すると考えられているＬＲＲＫ２変異の効果によって示唆されるように、向上し及び／又は不適切に制御されているのは、ＬＲＫＫ２のキナーゼ活性である。加えて、ＬＲＲＫ２は細胞内シグナル伝達の足場として働いているかもしれない（Greggio、２０１２年）。ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の標的の１つはＬＲＲＫ２自身であり、ＧＴＰアーゼドメインに向けた自己リン酸化を伴う（Webber他、２０１１年）。ＬＲＲＫ２キナーゼ機能とＬＲＲＫ２ＧＴＰアーゼ活性との間には明確な制御関係があるにもかかわらず、その詳細は不明なままであった。
【０００６】
ＬＲＲＫ２を介在した効果のレギュレーターを特定する試みにおいて、研究ではモデルシステムであるSaccharomyces cerevisiae酵母を用いた遺伝学的アプローチが用いられてきた。これらの細胞において、全長ＬＲＲＫ２は不溶性の封入体を形成することを大部分の理由として、全長ＬＲＲＫ２の発現は生存能力に影響を有さないことが見出された（Xiong他、２０１０年）。しかしながら、トランケートされた形のＬＲＲＫ２たんぱく質は酵母細胞生存能力の喪失を引き起こし、ＬＲＲＫ２のＧＴＰアーゼドメインに依存する様式での細胞内小胞輸送にも影響を与えた（Xiong他、２０１０年）。マウスの一次ニューロンにおいて、同じＬＲＲＫ２トランケーションの発現は神経毒性、及びS. cerevisiae細胞で観察されたのと同様の輸送における問題を引き起こし、全長ＬＲＲＫ２の過剰発現も同様であり（Xiong他、２０１０年）、この結果により研究者は酵母細胞におけるトランケートされたたんぱく質の使用によりＬＲＲＫ２活性の毒性効果についての有効な情報が与えられると結論づけた。
【０００７】
全ゲノム解析アプローチにより、研究者は、いくつかの酵母遺伝子の欠損によりトランケートされたＬＲＲＫ２たんぱく質の有害な効果が最小化されることを見出した（Xiong他、２０１０年）。欠損によりＬＲＲＫ２の毒性が最小化される酵母遺伝子の１つが、小胞輸送において機能する高度に保存されたＧＴＰアーゼ活性化たんぱく質（ＧＡＰ）をエンコードするＧＣＳ１遺伝子である（Poon他、１９９６年）。酵母Ｇｃｓ１たんぱく質の哺乳類におけるオーソログはＡｒｆＧＡＰ１である（Cukierman他、１９９５年）。効果的な方法で、ヒトＡｒｆＧＡＰ１の過剰発現は、Ｇｃｓ１を欠損した酵母に対して有毒である（図２）。より最近になって、ＡｒｆＧＡＰ１及びＬＲＲＫ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及びマウス脳内でｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用することが示された（Stafa他、２０１２年、Xiong他、２０１２年）。In vitroでは、ＡｒｆＧＡＰ１たんぱく質はＬＲＲＫ２のＧＴＰアーゼ活性のＧＡＰである（図３）。続いて、ＡｒｆＧＡＰ１はＬＲＲＫ２が介在するリン酸化の基質である（Stafa他、２０１２年）。より重要なことに、一次神経細胞においてＡｒｆＧＡＰ１発現を減少させることにより、変異（ＰＤ促進性）ＬＲＲＫ２による、又は正常ＬＲＲＫ２の過剰発現による、神経毒性効果のいくらかが軽減された。これらの知見は、阻害薬によりＡｒｔＧＡＰ１を標的とすることが、ＬＲＫＫ２に関連するＰＤの進展に対処する効果的な方法であることを示唆している。このように、ＡｒｆＧＡＰ１活性を阻害する薬の特定は、重要なＰＤへの治療介入として役に立つだろう。
【０００８】
前に述べたように、出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeは、これら他のたんぱく質の阻害を介して、変異ＬＲＲＫ２活性の有害な作用を改善することができる小分子を特定するための実験系として用いることができる。ＰＤ（Cooper他、２００６年、Gitler他、２００８年、Xiong他、２０１０年、Stafa他、２０１２年）を含む多くの細胞プロセスについての分子的基盤に対する、及び根底にある病気の基盤に対するかなりの見識が、酵母Saccharomyces cerevisiaeの研究から生まれた。この出芽酵母は、主にこの系がもたらす遺伝的及び分子的な容易性のために、広く研究されている。さらに、中核的な細胞プロセスが進化的に保存されていることは、酵母における知見が、ヒトの文脈においてもとても大きな価値を与えることを可能とする。酵母から哺乳類細胞まで、小胞輸送を含む多くの基本的プロセスの構成要素について、構造的及び機能的な保存がみられる（Balter及びVogel、２００１年；Bonifacino及びGlick、２００４年；Botstein他、１９９７年）。この程度に、この機能的な保存に基づいて、酵母における小分子の実験的スクリーニングにより、ヒトの文脈において有用な薬が明らかとなるだろう。
【０００９】
全体として、ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤のスクリーニングは、異常なＬＲＲＫ２活性が病気の進行に役割を果たすいくつかの形のＰＤの治療のための新規なアプローチの特定につながるだろう。本発明は、治療的有効量のフェニルピペラジン誘導体分子を投与することにより、ＬＲＲＫ２変異を伴うＰＤに苦しむ個人を安全に及び効果的に治療する組成物及び方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、アルツハイマー病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症を含む、一般化された神経変性状態に苦しむ個人を安全に及び効果的に治療する組成物及び方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、フェニルピペラジン誘導体小分子を含む薬学的組成物と、ＰＤに苦しんでいる患者にこの組成物を投与するための指示と、を含むキットを提供する。
【００１２】
本明細書において用いられる場合、「フェニルピペラジン誘導体小分子」という用語は、環の反対の位置に２つの窒素原子を含む６員環からなり、窒素原子の１つに結合したフェニル基（Ｃ６Ｈ５）を備える、任意の有機分子として定義される。
【００１３】
本明細書において用いられる場合、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２以上のヌクレオチドの鎖を意味する。
【００１４】
本明細書において用いられる場合、「阻害」という用語は、たんぱく質の生物学的活性の低下、好ましくはヒトたんぱく質であるＡｒｆＧＡＰ１の活性の低下を指す。
【００１５】
本明細書において用いられる場合、「遺伝子」という用語は、特定のたんぱく質、又は特定の場合には機能的又は構造的ＲＮＡ分子、をコードする核酸分子を意味する。
【００１６】
本明細書において用いられる場合、「たんぱく質」又は「ポリペプチド」は、長さ又は例えばグリコシル化若しくはリン酸化のような翻訳後修飾とは無関係に、アミノ酸のペプチド結合鎖を意味するように類義的に用いられる。
【００１７】
核酸分子又はポリペプチドに言及する場合、「野生型」という用語は、自然に発生する（例えば、ネイティブ、ＷＴ）核酸又はポリペプチドを意味する。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、「治療」及び「療法」(treatment and therapy)という用語は、治療薬を患者若しくは被験者に適用若しくは投与すること、又は、不調若しくは病気、不調若しくは病気の症状、若しくは不調若しくは病気の素因を有する患者若しくは被験者から単離された組織若しくは細胞系に、不調若しくは病気、不調若しくは病気の症状、若しくは不調若しくは病気の素因を、治療し、癒し、軽減し、緩和し、治し、解決し、改良し、改善し、若しくは影響を与える目的で、治療薬を適用若しくは投与することとして定義される。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」という用語は、所望の治療効果又は応答をもたらすであろうピペラジン誘導体小分子の量を意味する。
【００２０】
「患者」、「被験者」、及び「個人」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、治療され、診断され、及び／又は生物学的資料が採取される、哺乳類（例えば、ヒト、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ等）を意味する。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、「キット」という用語は、コンポーネントを含むパッケージされた製品のことを指し、このコンポーネントを用いて、ＰＤの治療のために治療的有効量のピペラジン誘導体小分子が投与される。このキットは、好ましくは、このキットのコンポーネントを保持する箱又はコンテナを含む。この箱又はコンテナには、ラベル又は米国食品医薬品局が承認したプロトコルが貼られている。この箱又はコンテナは、好ましくはプラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン、又はプロピレン容器内に格納されている、本発明のコンポーネントを保持している。この容器は、キャップされた管又はびんである。このキットはまた、ピペラジン誘導体小分子を投与する際の指示を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本開示の上記の及び他の利点及び特徴が得られる態様を説明するために、前に簡単に記述された原理のより詳細な記述が、添付の図面に示されている特定の実施形態を参照して与えられるだろう。これらの図面は本開示の典型的な実施形態のみを表しているためその範囲を限定するものとしては考えられないことを理解して、本明細書の原理が添付の図面を用いながらさらなる具体性及び詳細をもって記述及び説明される。
【００２３】
【図１】ＬＲＲＫ２たんぱく質の概略ドメイン構造を示す。残基１〜６６０はＬＲＲＫ２に特有の繰り返し配列をエンコードし、残基９８４〜１２７８はＬＲＲドメインをエンコードし、残基１３３５〜１５１０はＲＯＣ  ＧＴＰアーゼドメインをエンコードし、残基１５１９〜１７９５はＣＯＲドメインをエンコードし、残基１８７９〜２１３８はキナーゼドメインをエンコードし、残基２１３８〜２５２７はＷＤ４０ドメインをエンコードする。病気とともに明確に分離される変異箇所は赤で示されており、ＰＤと関連するＲ１４４１Ｈ及びＮ１４３７Ｈの位置は青で強調されている。ドメイン境界は、黒で残基番号により示されている。
【００２４】
【図２】酵母細胞における実験結果を示し、空ベクターを有する酵母株と比較して、ヒトＡｒｆＧＡＰ１の発現が酵母における低成長の表現型を引き起こす（下の線）ことを示す。
【００２５】
【図３】ＡｒｆＧＡＰ１とＬＲＲＫ２との間の相互調節モデルを表す。ＬＲＲＫ２発現の増加、又はＬＲＲＫ２キナーゼ活性を増加させる変異は、細胞死を誘導する。ＡｒｆＧＡＰ１はＬＲＲＫ２に結合し、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を促進し、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性及び自己リン酸化を減らす。ＬＲＲＫ２はまたＡｒｆＧＡＰ１をリン酸化し、そのＧＡＰ活性を阻害する。この相互調節は、細胞の生存能力に対する複雑な影響につながる。
【００２６】
【図４】空ベクタを持つ酵母のｇｃｓ１ノックアウト株（３Ｂ−ＶＥＣ）、又はＡｒｆＧＡＰ１発現ベクタを持つ酵母株（３Ｂ−１４１）に対する、３３０００個の小分子化合物のスクリーニング結果を示す。
【００２７】
【図５】スクリーニングにより特定された６つの小分子である、ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  ＩＤ  ５４２０３７６番、５４３１９４２番、５４６８１２３番、５２６１３４４番、５４２９８１４番、５４５９８０４番による、酵母のＡｒｆＧＡＰ１  ｇｃｓ１ノックアウト株の用量依存性成長を示す。３Ｂ−ＶＥＣ点は、ＡｒｆＧＡＰ１を発現しない、空ベクタを有するｇｃｓ１ノックアウト酵母株の成長レベルを表す。
【００２８】
【図６】酵母における一次スクリーニングにおける８つの上位ヒットを表し、５４６８１２３を除いて全てがフェニルピペラジン誘導体分子である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示の様々な実施形態が以下に詳細に議論される。特定の実装例が議論されるが、これは説明の目的でのみなされていることを理解すべきである。本開示において引用された全ての文献は本明細書に組み込まれる。当業者は、本開示の精神及び範囲から離れることなく、他の構成要素及び構成が用いられてもよいことを理解するだろう。
【００３０】
治療的有効量の置換ピペラジン誘導体分子の投与によりパーキンソン病を治療するための組成物及び方法が記載される。好ましい実施形態において、治療レジメンは、ＡｒｆＧＡＰ１たんぱく質の阻害により、ＬＲＲＫ２変異により引き起こされたＰＤの治療に向けて適合される。
【００３１】
一実施形態において、治療的有効量のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は、以下の一般式を有している。
【化１】
2018184401.tif 000003
【００３２】
ここで、ｎ＝０、１、又は２であり、Ｇ１は（１）５員環又は６員環の不飽和複素環であって、不飽和複素環が少なくともＳ又はＮを有しているか、（２）５員環又は６員環の飽和炭素環であって、飽和炭素環が少なくとも１以上のカルボン酸若しくはメタノンで置換されている又はベンゼンと縮合しているか、（３）不飽和ビシクロヘプテンか、（４）２から４のＣを有する不飽和メチル置換アルケンであり、Ｇ２は（１）４−アセトフェノンか、（２）４−ニトロベンゼンか、（３）２−ピリジンである。さらなる実施形態においては、ｎ＝１であり、Ｇ１は２−ピリジン又は２−チオフェンであり、Ｇ２は４−アセトフェノン又は４−ニトロベンゼンである。
【００３３】
別の実施形態において、ｎ＝１であり、Ｇ１はメチル置換ブテンであり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００３４】
別の実施形態において、ｎ＝１であり、Ｇ１は不飽和ビシクロヘプテンであり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００３５】
別の実施形態において、ｎ＝０であり、Ｇ１はインダンであり、Ｇ２は２−ピリジンである。
【００３６】
別の実施形態において、ｎ＝０であり、Ｇ１はホルミルシクロヘキサンカルボン酸であり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００３７】
別の実施形態において、パーキンソン病を治療又は予防するＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は、以下の一般式を有する。
【化２】
2018184401.tif 000004
【００３８】
ここで、ｎ＝０、１、又は２であり、Ｇ１は（１）５員環又は６員環の不飽和複素環であって、不飽和複素環が少なくともＳ又はＮを有しているか、（２）５員環又は６員環の飽和炭素環であって、飽和炭素環が少なくとも１以上のカルボン酸若しくはメタノンで置換されている又はベンゼンと縮合しているか、（３）不飽和ビシクロヘプテンか、（４）２から４のＣを有する不飽和メチル置換アルケンであり、Ｇ２は（１）４−アセトフェノンか、（２）４−ニトロベンゼンか、（３）２−ピリジンである。
【００３９】
別の実施形態においては、ｎ＝１であり、Ｇ１は２−ピリジン又は２−チオフェンであり、Ｇ２は４−アセトフェノン又は４−ニトロベンゼンである。
【００４０】
別の実施形態において、ｎ＝１であり、Ｇ１はメチル置換ブテンであり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００４１】
別の実施形態において、ｎ＝１であり、Ｇ１は不飽和ビシクロヘプテンであり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００４２】
別の実施形態において、ｎ＝０であり、Ｇ１はインダンであり、Ｇ２は２−ピリジンである。
【００４３】
別の実施形態において、ｎ＝０であり、Ｇ１はホルミルシクロヘキサンカルボン酸であり、Ｇ２は４−ニトロベンゼンである。
【００４４】
別の実施形態において、パーキンソン病を治療又は予防するＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は、以下の一般式を有する。
【化３】
2018184401.tif 000005
［２−（３，５−ジブロモ−１λ４−ピリジン−１−イル）−１−（４−フェニルフェニル）エタン−１−オン］
【００４５】
投与
本明細書に記載された組成物を患者に投与するどのような適切な方法も用いることができる。これらの方法において、組成物は患者に対して、静脈注射による全身的、標的サイトへと直接、非経口的、経口的、髄腔内投与、又は頭蓋内投与等の任意の適切な経路で投与されることができる。この組成物は、例えば、内部若しくは外部標的サイトへと外科的に送達することにより、又は血管によりアクセス可能なサイトへのカテーテルにより、標的サイトへと直接投与されることができる。例えば、ＰＤを治療する方法において、本明細書に記載された組成物は経口又は静脈内で送達されてもよい。この組成物は、単一ボーラスとして、複数回注射として、又は持続注入（例えば、静脈内、腹膜透析による髄腔内、ポンプ注入）により、投与されてもよい。非経口投与のために、組成物は好ましくは滅菌された発熱物質不含有の形態で処方される。上に示した通り、本明細書に記載された組成物は、無菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するためには、適した治療有効成分が非経口的に許容される液体担体に溶解又は懸濁される。採用されてもよい許容される担体及び溶媒には水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及びデキストロース溶液が含まれ、水は適切な量の塩酸、水酸化ナトリウム、又は適した緩衝剤の添加により適したｐＨに調製される。この水性組成物は、１以上の保存剤（例えば、メチル、エチル、若しくはｎ−プロピルヒドロキシ安息香酸塩）も含んでいてもよい。このような組成物のうち１つが少しだけ又はわずかに水に溶ける場合、溶解促進剤又は可溶化剤が添加されてもよく、又は、溶媒が１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコール等を含んでいてもよい。本明細書に記載された組成物は、従来の薬学的慣習（例えば、本分野における標準的教科書である、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（第２０版）、A. R. Gennaro編、Lippincott Williams & Wilkins（２０００年）、及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology、J Swarbrick及びJ. C. Boylan編、Marcel Dekker, New York（１９８８〜１９９９年）、並びにアメリカ薬局方／国民医薬品集を参照）に従う任意の適した剤形で、哺乳類（例えば、げっ歯類、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ）に投与されることができる。例示的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤、並びに薬学的組成物の記載を、Remington（上述）に見つけることができる。組成物を安定化させ及び／又は保存するために、他の物質が組成物に添加されてもよい。
【００４６】
本明細書に記載される治療方法は、概して、治療的有効量の本明細書に記載される組成物を、哺乳類を含み、特にヒトである、必要とする患者（例えば動物、ヒト）に投与することを含む。このような治療は、病気、不調、又はその症状に苦しんでいる、これらを有している、これらになりやすい、又は少なくともリスクがある、患者、特にヒト、に好適に施されるだろう。「リスクがある」患者の判断は、診断テスト又は患者若しくはヘルスケア提供者の意見による任意の客観的若しくは主観的判断によりなされることができる。本明細書に記載される方法及び組成物は、貧血に関する任意の不調又は病気の治療に用いられてもよい。
【００４７】
有効投与量
本明細書に記載される組成物は、有効量、すなわち治療される哺乳類（例えば、ピペラジン誘導体化合物の投与によりＰＤを治療している）において望ましい結果を生み出すことができる量で、哺乳類（例えばヒト）に投与されることが好ましい。このような治療的有効量は標準的な方法に従って決定できる。単離された化合物の化学的分析、特にピペラジン誘導体分子は、化合物に関する以下のデータに基づく、治療の目的で血液脳関門を通過する予測された能力を示した。ＭＷ：＜４００；（Ｏ＋Ｎ）の合計：＜５；ＰＳＡ：＜６０−７０Ａ；ｃＬｏｇＰ：＜５．０；回転可能な結合の数＜８；ｐＫａ：中性又はｐＫａ７．５−１０．５の塩基性（酸を避ける）；非Ｐｇｐ基質；水溶解性：＞６０μｇ／ｍｌ；有効透過性：＞１×１０−６ｃｍ／ｓｅｃ
【００４８】
本発明の方法で用いられる組成物の毒性および治療的有効性は、標準的な薬学的手順により判定することができる。医学及び獣医学の分野でよく知られているように、任意の１つの対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与される他の薬を含む、多くの要素に依存する。本明細書に記載された組成物の投与量は、前臨床における有効性及び安全性に基づいて決定してもよい。
【００４９】
実施例
本発明が、続く特定の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は説明のみのために与えられ、どのような方法にしろ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５０】
酵母における小分子のスクリーニング
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおける異種たんぱく質の過剰発現はしばしばその成長を阻害するが、一方で過剰発現されたたんぱく質の阻害剤は成長を回復させる。これらの単純な観察が、このようなたんぱく質の阻害剤を特定する強力なアッセイの基礎を形成する。興味のある遺伝子の誘導性発現のための発現プラスミドが、排出ポンプの欠失により化学物質に対してより感受性とされた酵母株へと導入される。たんぱく質発現は誘導され、細胞は試験化学物質に暴露され、成長が６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ６００又はＡ６００）の読み取りにより測定される。
【００５１】
今回の場合、S. Cerevisiae ｇｃｓ１ノックアウト株であって、異種たんぱく質であるｈＡｒｆＧＡＰ１（酵母ＧＣＳ１のオーソログであるヒトＡｒｆＧＡＰ１）を発現するベクタを有しているものが採用される。一般的に、ＡｒｆＧＡＰ１の発現はｇｃｓ１ノックアウト酵母の成長を抑制し、したがってＡｒｆＧＡＰ１を阻害する小分子は観察可能な成長の増加につながるだろう。このことは引き続いて、ＬＲＲＫ２変異により引き起こされたＰＤの治療に使用されうる小分子の直接の特定を可能とする。
【００５２】
阻害剤スクリーニングにおいて採用された酵母株
PPY17:114-3B-vec (gcs1::NatR, pdr5::HIS3, snq2::TRP1, ura3, ade2, プラスミドpRS315を有する)［空ベクタコントロール株］; PPY17:114-3B-141-A (gcs1::NatR, pdr5::HIS3, snq2::TRP1, ura3, ade2, プラスミドpPP16:141 pGAL1-hArfGAP1を有する)［ヒトＡｒｆＧＡＰ１発現株］
【００５３】
合成複合（ＳＣ）ミックス、ＳＣドロップアウトミックス、及びＳＣ選択培地溶液
合成複合（ＳＣ）ミックス：０．６ｇアデニン、０．６ｇウラシル、０．６ｇトリプトファン、０．６ｇヒスチジン、０．６ｇアルギニン、０．６ｇメチオニン、０．９ｇチロシン、０．９ｇリシン、１．５ｇフェニルアラニン、６．０ｇトレオニン、３．０ｇアスパラギン酸、１．８ｇイソロイシン、４．５ｇバリン、１．８ｇロイシン(Sigma)。全ての成分が秤量され、一緒に混合され、乳鉢及び乳棒が成分を均一な粉末へと粉砕するために用いられる。粉末は室温において５０ｍＬファルコンチューブに保存される。
【００５４】
ＳＣドロップアウトミックス：ロイシンを除いた全ての成分が秤量され、そして混合され、粉砕され、及びＳＣミックスと同様に保存される。
【００５５】
ＳＣ選択培地：アミノ酸を含まない酵母ニトロゲンベース(BD/Difco, Sparks, MD)０．６７％のＳＣ及びドロップアウトミックス０．０６７％が水に溶解される。０．２５ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウムが、溶液のｐＨを６．５に上げるために、全ての１００ｍＬ培地に添加される。溶液はオートクレーブされ、室温で保存される。
【００５６】
阻害剤スクリーニング
１．スクリーニングの前日、空プラスミドを含むコントロール株、及び興味のある遺伝子を含むプラスミドを有する選択された試験株が、２％グルコースを含む２ｍＬのＳＣ選択培地に接種された。細胞は、２２０ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で一晩生育された。補足：ヒト発現ベクタを発現する酵母株及び空ベクタを含む酵母株は、ＡｒｆＧＡＰ１発現を抑制するグルコース中で同じ速度で生育した。しかしながら、ＡｒｆＧＡＰ１発現が刺激されるガラクトース中では、ヒトＡｒｆＧＡＰ１を発現する酵母株は、実際、空ベクタとともに成長する酵母と比較して、低い成長を示した（図２）。
【００５７】
２．翌日、１ｍＬの一晩経った培養物はマイクロチューブに移され、５分間４７００×ｇで遠心分離された。上澄みは捨てられ、痕跡量のグルコースを除去するために、ペレットは滅菌水で洗浄され、５分間４７００×ｇで遠心分離された。
【００５８】
３．スクリーニングされる小分子を含むプレートが冷凍庫から出され、約３０〜６０分間室温で溶かされた。
【００５９】
４．ペレットは１ｍＬの滅菌水に懸濁され、Ａ６００が測定された。細胞は、２％ガラクトースを含む適切なＳＣ液体選択培地でＡ６００＝０．０１まで希釈された。試験される９６ウェルプレートのそれぞれについて、１０ｍＬ以上の希釈された試験細胞が用意された。コントロール細胞についてはより少ない量が必要であった。
【００６０】
５．９６ウェルプレートの４つを除く全てのウェルに、使い捨ての８チャネルピペッターを用いて１００μＬの試験細胞が移された。酵母を含まない１００μＬの培地が２つのコントロールウェルに添加され、コントロール細胞を含む１００μＬの培地が２つのウェルに添加された。
【００６１】
６．コントロールの９６ウェルプレートが用意された。カラム１〜４（３２ウェル）には、Ａ６００＝０．００８に希釈された１００μＬのコントロール細胞が添加された。カラム５〜８には、Ａ６００＝０．０１に希釈された１００μＬの試験細胞が添加され、カラム９〜１２には細胞を含まない１００μＬの培地が添加された。
【００６２】
７．化学物質（小分子ライブラリ）が、手持ちピンニングツール又はロボットピンニングツールを用いて、保存プレートから酵母を含むプレートへと移された。ピンニングツールは、ピンを１０％ブリーチに１０秒間つけ及び振とうし、続けて７０％エタノールに１０秒間つけ及び浸透することにより洗浄及び消毒され、続けて空気乾燥又は炎の上で乾燥された。ピンが冷却されると、ピンニングツールは化学物質格納プレートにつけられ、そしてピンニングツールはウェルの端部に触ることなく慎重に取り除かれ、ウェルの端部に触ることなく試験プレートにつけられた。ピンは同様に取り除かれた。ピンは洗浄及び殺菌され、全ての化学物質が試験プレートに移されるまでこのプロセスが繰り返された。
【００６３】
８．プレートは加湿箱内に置かれ、３０℃で４０〜４２時間培養された。
【００６４】
９．５つのプレートのスタックが、酵母細胞を再度懸濁させるためにボルテクサーで低速度で（例えば、Genie 2 Voltex mixerの設定４）９０秒間振とうされ、９６ウェルプレート読み取り機を用いてＡ６００が測定された。
【００６５】
成長回復の計算
１．コントロールプレート：試験ウェル（カラム１〜４）、コントロールウェル（カラム５〜８）、及び培地のみのウェル（カラム９〜１２）の平均Ａ６００が計算された。
【００６６】
２．処理されたコントロール、及びヒトＡｒｆＧＡＰ１発現酵母株のＡ６００がプロットされた。図４を参照。それぞれの試験された化合物について、成長回復％が次の式を用いて計算された。成長回復％＝(Test & chem - Test)/(Control - Test)×100、ここでTest & chemは化学物質で処理された試験株を含むウェルのＡ６００読み取り値であり、Testはコントロールプレートから決定された化学物質で処理されていない試験細胞の平均Ａ６００であり、Controlはコントロールプレートから決定されたコントロール細胞の平均Ａ６００である。
【００６７】
３．最も高いレベルの成長回復を示したウェルが「活性」として選択された。活性な化学物質は、明らかに外れ値を示す及び／又は５０％を超える成長回復を示した場合に、二次アッセイのために選択された。
【００６８】
活性な化学物質の確認
１．増加したＡ６００読み取り値が、化合物の沈殿又は他の微生物による汚染によるものではなく、実際に酵母細胞の数の増加によるものであることを確実にするために、倒立顕微鏡により「活性な」ウェルが視覚的に検査された。
【００６９】
２．一次スクリーニング結果を確認するために、それぞれの活性な化学物質の活性が、試験株及びコントロール株の双方に対して、様々な濃度で再試験された（図５）。それぞれの活性な化合物についてのＥＣ５０が確立され、高い有効性及び低い毒性を兼ね備える化合物が選択された。全体として、３３０００個の小分子からのスクリーニングにより、８つの化合物が単離された（図６）。これらの分子のうち７つが特徴的なフェニルピペラジン構造を有していた。
【００７０】
３．補足：活性な化合物は、酵母で過剰発現された際に成長阻害も引き起こす無関係な遺伝子についての試験株に対しても試験されることができるだろう。一般的なメカニズムにより、例えばＧＡＬ１プロモータの活性への干渉により、成長を回復する化学物質は、任意の遺伝子によって阻害される成長もまた回復するはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月5日(2018.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物を投与することにより、患者においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、前記薬学的組成物は、
少なくとも治療的に有効な量のＡｒｆＧＡＰ１阻害剤を含み、前記ＡｒｆＧＡＰ１阻害剤は置換ピペラジン誘導体化合物群から選択される、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月12日(2018.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018184401000001.pdf