(57)【要約】【課題】脱脂による低カロリーなアスタキサンチン濃縮物の新たな製造方法を提供すること。【解決手段】アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料を、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出により脱脂及び濃縮する、アスタキサンチン濃縮物の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料を、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出により脱脂及び濃縮する、アスタキサンチン濃縮物の製造方法。
【請求項２】
二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出における抽出温度が５０℃以上１２０℃以下である、請求項１に記載のアスタキサンチン濃縮物の製造方法。
【請求項３】
二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出における抽出圧力が１０ＭＰａ以上１５ＭＰａ以下である、請求項１または請求項２に記載のアスタキサンチン濃縮物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘマトコッカスなどのアスタキサンチンを含有する天然物由来の原料から、低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を得る製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは赤色を呈するカロテノイドの一種で、化学名が「３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン−４，４’−ジオン」の色素化合物である。アスタキサンチンは、自然界に広く分布しており、例えば、エビ、カニ等の甲殻類や、これらを餌とするマダイの体表、サケ・マス等のサケ科魚類の筋肉の赤色部分などに見られる。さらに、緑藻ヘマトコッカス等の藻類、赤色酵母ファフィア等の酵母類等に存在することも知られている。
またアスタキサンチンは、ビタミンＥの約１０００倍、β−カロテンの約４０倍とカロテノイドの中で最も高い抗酸化作用を有するほか、様々な生理活性を有することが知られている。このようなアスタキサンチンの抗酸化作用や生理活性の応用として、抗炎症作用、抗動脈硬化作用、糖尿病に対する作用、光傷害からの網膜保護作用、日周リズム調節作用、免疫賦活作用、抗ストレス作用、筋肉持続力向上作用、運動中での血中乳酸値上昇抑制作用及び運動後の疲労回復作用、酸化防止作用、抗炎症作用、皮膚老化防止作用、美白及び日焼け防止作用などが報告されており、近年、健康食品や化粧品の分野における注目素材の１つとなっている。
【０００３】
アスタキサンチンは、上述の天然物などからの抽出や有機合成により生産することができるが、近年の消費者の天然嗜好等により、市販されているアスタキサンチンのほとんどは、緑藻ヘマトコッカス、オキアミ、ファフィア酵母、アスタキサンチン産生細菌から抽出して生産されている。天然物からの抽出方法としては、粉砕した後、アセトンやエタノールなどの有機溶媒による抽出や二酸化炭素による超臨界抽出後、抽出溶媒を除去することによって、アスタキサンチンが製造されている。例えば、特許文献１には、培養した緑藻ヘマトコッカスのシスト細胞をアセトン処理し、夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、エタノールでアスタキサンチンを抽出する方法が報告されている。また、特許文献２には、細胞壁を破壊した緑藻ヘマットコッカスを、水、グリセリン等の補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを得る方法が報告されている。しかしながら、これら抽出方法により製造された市販のアスタキサンチン製品は、トリグリセリド等の油脂類を多く含有しているため、高カロリーな製品であり、摂取した場合に肥満となりやすいという問題があった。さらに、超臨界二酸化炭素流体を用いる抽出技術では、仮にエントレーナーとして水やエタノール等のアルコールを使用したとしても、超臨界二酸化炭素へのトリグリセリドの比較的高い溶解性のために、非極性であるトリグリセリド等の油脂類がアスタキサンチンと共に同時抽出される傾向にあるため、アスタキサンチンの抽出手法として課題が多かった。しかも、脱脂された低カロリーなアスタキサンチン抽出物を効率的かつ連続的に得るためには、１回の抽出操作毎に試料の仕込み直しを要する（半）回分式抽出法では限界があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−０５６３４６号公報
【特許文献２】特開２００４−０４１１４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記のような状況を鑑みてなされたものであり、脱脂による低カロリーなアスタキサンチン濃縮物の新たな製造方法の提供を課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料を、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出により脱脂及び濃縮すると、効率的に低カロリーなアスタキサンチン濃縮物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
特に、二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡を考慮して、超臨界向流接触抽出を行うことにより、従来の二酸化炭素による超臨界（半）回分式抽出に比べ、脱脂効率及び抽出効率が大きく改善され向上するという、今までにない新たな効果が得られることを見出し、上記課題を解決するに至ったものである。
【０００７】
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料を、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出により脱脂及び濃縮する、アスタキサンチン濃縮物の製造方法。
２．二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出における抽出温度が５０℃以上１２０℃以下である、１．に記載のアスタキサンチン濃縮物の製造方法。
３．二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出における抽出圧力が１０ＭＰａ以上１５ＭＰａ以下である、１．または２．に記載のアスタキサンチン濃縮物の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法は、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出、すなわち連続抽出によるものであるから、従来の超臨界（半）回分式抽出に比べ、生産量が格段に増加する。これは、原料の仕込み直しなどの手間が必要なくなるためである。さらに、抽出装置も小さくすることができるばかりか抽出時間も短くできるなど、処理効率を大きく向上することができる。
しかも、本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法は、二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡を考慮して、向流接触抽出を行うため、従来の超臨界（半）回分式抽出に比べ、処理圧力を大きく軽減できるなど穏和な条件下において、低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を効率的に得ることが可能である。
すなわち、本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法は、連続抽出のため処理装置をコンパクトに設計できるほか、従来の概略３０〜５０ＭＰａの抽出圧力を１０〜１５ＭＰａの範囲に軽減できるなど、ラボスケールからの実施装置へのスケールアップの実現性が大きく向上する。
これまで、二酸化炭素−エタノール混合系による超臨界向流接触抽出処理は、これまでに報告例がなく、特に、ヒトが摂取する成分の分離精製に適用されることは、本発明が初めてである。これは、本発明者の数々の試行錯誤により初めて完成されたことであり、特に、低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を効率的に得るための抽出条件を明らかにしたことは、格別顕著な効果である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置の１例を示す説明図である。
【図２】二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において「超臨界二酸化炭素−エタノール向流接触抽出」とは、二酸化炭素−エタノール混合系において、連続的な向流接触による抽出を意味する。
【００１１】
アスタキサンチンは、上述のとおり、化学名が「３，３’−ジヒドロキシ−β，β’−カロテン−４，４’−ジオン」である化合物であり、立体異性体を有する。具体的には、（３Ｒ，３’Ｒ）−アスタキサンチン、（３Ｒ，３’Ｓ）−アスタキサンチン及び（３Ｓ，３’Ｓ）−アスタキサンチンの３種の立体異性体が知られているが、本発明はこれらいずれも対象としている。さらに、本発明におけるアスタキサンチンには、これらアスタキサンチン異性体のモノエステル及びジエステルのいずれも含まれる。
【００１２】
本発明の製造方法における原料としては、植物類、藻類、甲殻類及びバクテリア等のアスタキサンチンを含有する天然物由来のものであれば、特に制限無く使用することができる。具体例として、例えば緑藻ヘマトコッカス等の藻類、赤色酵母ファフィア等の酵母類、エビ、カニ等の甲殻類、タイ、サケ等の魚類等が挙げられる。これら天然物やその抽出物は市販されており、容易に入手することができる。中でも、本発明の原料としては、品質、生産性、さらにアスタキサンチンの含有量の点から、緑藻ヘマトコッカスが好ましい。本発明の原料としては、これら天然物由来のものを単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１３】
ここで、緑藻ヘマトコッカスは、ヘマトコッカス属に属する藻類であり、栄養細胞から休眠状態であるシスト細胞に形態変化した後に、多量のアスタキサンチンをシスト細胞中に蓄積するものである。しかしながら、このシスト細胞は強固な細胞壁を持つため、アスタキサンチンを抽出するためには、物理的、化学的な細胞壁の破壊が必要である。細胞壁を破砕すると、緑藻ヘマトコッカスは更に微粉化するため、抽出装置の抽出槽への充填等は、非常に取り扱いが厄介であり作業性が悪い。そこで、本発明の製造方法において緑藻ヘマトコッカスを原料とする場合には、細胞壁を破砕して得られた微粉末をエタノール抽出溶液として使用することが好ましい。
【００１４】
次に、図面を参照しつつ、本発明で使用する二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置の１例について説明する。図１は、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置の１例を示す説明図である。
図１に示すように、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置Ａは、液化二酸化炭素貯蔵槽１、弁２、フィルター３、液化二酸化炭素ポンプ４、冷却機５、安全バルブ６、バルブ７、原料エタノール溶液貯蔵槽８、送液ポンプ９、プレリボンヒーター１０、向流接触抽出槽１１、オーブン１２、背圧弁１３、分離槽１４ａ、１４ｂ、乾燥ガス流量計１５、湿式ガス流量計１６、圧力センサーＰ、温度センサーＴ等により構成されている。
二酸化炭素は、液化二酸化炭素貯蔵槽１から、冷却機５を併設した液化二酸化炭素ポンプ４により、向流接触抽出槽１１底部から供給される。液化二酸化炭素はプレリボンヒーター１０により所定の温度にまで加温されて、超臨界二酸化炭素として、オーブン１２に加温され温度センサーＴにより厳密に温度管理された向流接触抽出槽１１に供給される。
一方、アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料は、エタノール溶液として、原料エタノール溶液貯蔵槽８から送液ポンプ９により、向流接触抽出槽１１上部から供給される。このエタノール溶液は、プレリボンヒーター１０により所定の温度にまで加温されて、同じく厳密に温度管理された向流接触抽出槽１１に供給される。
向流接触抽出槽１１は、超臨界抽出に汎用される、例えばディクソンパッキン等の充填物を含んでおり、超臨界二酸化炭素と原料成分を含有するエタノール溶液が向流接触することにより、原料に含まれる各成分が気相・液相間において分配され、結果として各成分が抽出される。抽出された各成分を含んでいる流体は、向流接触抽出槽１１の上部出口からは気相抽出物が、下部出口からは液相抽出物が排出され、それぞれ独立した背圧弁１３により減圧された後に分離槽１４ａ、１４ｂに集約される。分離槽１４ａで気相抽出物は、気相抽出物のエタノール溶液と二酸化炭素ガスに分離され、この二酸化炭素ガスは回収可能である。また、分離槽１４ｂで液相抽出物は、液相抽出物のエタノール溶液と二酸化炭素ガスに分離され、この二酸化炭素ガスも回収可能である。それぞれ抽出物のエタノール溶液は、エバポレーター等によりエタノールと分離することができる。図示されていないが、回収された二酸化炭素ガスは、冷却液化された後に、液化二酸化炭素貯蔵槽１に戻され、再循環使用される装置とすることも可能である。
【００１５】
本発明の製造方法により、アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料を、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出を行うと、図１中の分離槽１４ａからは無色透明な液体が得られ、分離槽１４ｂからは赤色の凝縮液を得ることができる。詳細は後述する実施例により説明するが、分離槽１４ａから得られた無色透明な液体は、アスタキサンチンを無視できる程度しか含有せず、概ねトリグリセリドのみを含有する。すなわち、本発明の製造方法は、二酸化炭素−エタノール混合系の超臨界向流接触抽出により、原料に含まれるトリグリセリドのみを気相中に抽出し、液相中には、気相中に抽出された分だけ脱脂された低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を、連続的に得ることができる手法である。
本発明で使用する二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置は、連続抽出を目的とするものであるから、目的に応じた量の原料を用いて、低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を効率的に得ることが可能である。すなわち、抽出槽の大きさを変更することなく、抽出する量を目的に応じて変更できることは、本発明の製造方法による大きな効果である。さらに、図１中の分離槽１４ｂに集約されたアスタキサンチンを含有する抽出物のエタノール溶液を、原料として再循環させることにより、脱脂効率をさらに向上させることも、本発明の製造方法では可能である。目的に応じた純度でのアスタキサンチン濃縮物が得られることも、本発明の製造方法による優れた効果の１つである。
【００１６】
続いて、図面を参照しつつ、二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡について説明する。図２は、The Journal of Supercritical Fluids, Volume 47, Issue 2, December 2008, Pages 109-116 より引用した、二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡を示す図である。図中の曲線は混合流体の臨界軌跡であり、この曲線の上側（高圧側）の領域では、二酸化炭素とエタノールの２成分が任意の組成で均一に混合し均一相を形成することを示す。したがって、相分離を形成する温度圧力条件を設定することにより、良好な抽出条件を設定することができる。
さらに、この二酸化炭素とエタノールの混合流体の臨界軌跡と超臨界向流接触抽出の溶媒は二酸化炭素リッチであるべきことや、後述する実験データを考慮すると、本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法における抽出温度の下限は、５０℃（３２３．２Ｋ）以上が好ましく、７０℃（３４３．２Ｋ）以上がより好ましく、８０℃（３５３．２Ｋ）以上が特に好ましい。また抽出温度の上限は１２０℃（３９３．２Ｋ）以下が好ましい。本発明のアスタキサンチン濃縮物の製造方法における抽出圧力の下限は、１０ＭＰａ（１００ｂａｒ）以上が好ましく、１１ＭＰａ（１１０ｂａｒ）以上がより好ましく、１２ＭＰａ（１２０ｂａｒ）以上が特に好ましい。また抽出圧力の上限は１５ＭＰａ（１５０ｂａｒ）以下が好ましい。これら本発明の製造方法における抽出条件は、従来の超臨界（半）回分式抽出条件に比べ、極めて穏和な条件である。
【００１７】
本発明の製造方法により得られるアスタキサンチン濃縮物は、リン脂質類、タンパク質類、クロロフィル類、ステロール類、緑藻ヘマトコッカス等の藻類の培養に使用される栄養源等も含まれていないので、食品色素、食品添加物、健康食品、化粧品、香料、医薬品、飼料などとして安全性が高い素材として、利用価値が高いものである。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の製造方法について詳細に説明するが、本発明は、これらの例に限定されるものではない。
【００１９】
＜アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料の調整＞
アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料として、緑藻ヘマトコッカスの乾燥物を使用した。この乾燥物は、アスタキサンチンを１．４２重量％、トリグリセリドを５２．４重量％含有するものである。なお、この乾燥物は、Ａｌｇａｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊａｐａｎ（株）より提供されたものである。
この乾燥物５７７．１８ｍｇにエタノール２５０ｍｌ（１９７．３ｇ）を添加し、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、その後不溶物を濾過することにより、向流接触抽出に使用する原料エタノール溶液を調整した。この原料エタノール溶液のアスタキサンチン含有量は０．０４２ｍｇ／ｇ（エタノール）であり、トリグリセリドの含有量は１．５３ｍｇ／ｇ（エタノール）であった。
【００２０】
＜超臨界向流接触抽出装置の各ユニット詳細＞
本発明の製造方法に使用する、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置の主要ユニットは、以下の機器を使用した。
図１中の液化二酸化炭素ポンプ：日本分光（株）製、ＰＵ−２０８５
図１中の冷却機５：日本分光（株）製、ＰＵ−２０８０−ＣＯ２
図１中の向流接触抽出槽１１：３／８インチチューブ（外径９．５３ｍｍ）、ＳＵＳ３０４製、肉厚１．６５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
抽出槽中の充填物：ディクソンパッキン、ＳＵＳ３０４製、外径１．５ｍｍ
図１中のオーブン１２：（株）島津製作所製、ＣＴＯ−２０ＡＣ
図１中の背圧弁１３：日本分光（株）製、ＢＰ−２０８０−Ｄ
図１中の乾燥ガス流量計：（株）シナガワ製、ＤＣ−２
図１中の湿式ガス流量計：（株）シナガワ製、Ｗ−ＮＫ−０．５
図１中の圧力センサー：ＧＥ  Ｓｅｎｓｉｎｇ製、ＰＴＸ６２１
【００２１】
＜分析方法＞
１．アスタキサンチンの分析方法
本発明の製造方法におけるアスタキサンチンの分析には、ＵＶ可視分光光度計（日本分光（株）製、Ｖ−５７０）を使用した。
具体的には、標準試薬アスタキサンチン（純度９４％）の波長４７８ｎｍにおける吸光度と濃度との関係から検量線を作成し、本発明の抽出物に含まれるアスタキサンチンの含有量を算出した。
２．トリグリセリドの分析方法
トリグリセリドの分析には、薄層クロマトグラフィー／水素炎イオン化検出（Thin Layer Chromatography-Frame Ionization Detector：TLC-FID）器（（株）ＬＳＩメディエンス製、イアトロスキャンＭＫ６ｓ）を使用した。
具体的には、抽出により得られたトリグリセリドを、０．１ｇのクロロホルム−メタノール混合溶液（重量比２：１）として、薄層クロマトグラフィー分離を行った。詳しくは、１μｌのサンプルをクロマロッド（登録商標）にスポットし、クロロホルム、メタノール及び水の展開溶媒（重量比５０：２０：２．５）によりサンプルを展開したところ、サンプルはクロマロッドの５ｃｍの高さまで展開された。６０℃で１分間乾燥させた後、ヘキサン、ジエチルエーテル及びギ酸の展開溶媒（重量比６５：５：０．１５）により再度展開したところ、サンプルはクロマロッドの１０ｃｍの高さまで展開された。再度乾燥後、クロマロッドをイアトロスキャンＭＫ６ｓに固定し、トリグリセリドの分析を行った。内部標準として、東京化成工業（株）製のオレイン酸コレステロール（９５．０％）を使用した。
【００２２】
＜アスタキサンチン濃縮物の製造方法＞
図１中における向流接触抽出槽１１を、温度８０℃（±０．５℃）、圧力１２．４ＭＰａ（±２８ｋＰａ）に調整した。向流接触抽出槽１１底部から超臨界二酸化炭素流体を２．８ｇ／分の流速で供給し、向流接触抽出槽１１上部から原料を含む超臨界エタノール流体を０．４３ｇ／分の流速で２０分間供給した。
定常時の二酸化炭素とエタノールそれぞれの流量は、次のとおりである。向流接触抽出槽１１への供給流量は、二酸化炭素が２．８ｇ／分、エタノールが０．４３ｇ／分、向流接触抽出槽１１上部出口からの気相流量は、二酸化炭素が２．２ｇ／分、エタノールが０．２１ｇ／分、向流接触抽出槽１１下部出口からの液相流量は、二酸化炭素が０．６０ｇ／分、エタノールが０．２２ｇ／分であった。
上記「アスタキサンチンを含有する天然物由来の原料の調整」で調整した原料エタノール溶液を２０分間で８．６ｇ向流接触抽出槽に供給し、抽出物を分離槽１４ａ、１４ｂに集約した。
【００２３】
分離槽１４ａに集約された気相抽出物中のトリグリセリドの含有量は、上述の分析方法により０．２４ｍｇ／ｇ（エタノール）であることが確認された。一方、この気相抽出物中のアスタキサンチンの含有量は、０．３２μｇ／ｇ（エタノール）であり、その含有量から、本発明の二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出法によれば、アスタキサンチンは気相中にほぼ抽出されないことが明らかとなった。また、原料エタノール溶液中のトリグリセリドの含有量は１．５３ｍｇ／ｇ（エタノール）であるから、本発明の超臨界二酸化炭素−エタノール向流接触抽出法における、上記条件下での脱脂効率は約１６％であることが明らかとなった。
上述の分析方法により、分離槽１４ｂに集約された液相抽出物中のアスタキサンチンの含有量は、０．０６３ｍｇ／ｇ（エタノール）であり、トリグリセリドの含有量は２．５ｍｇ／ｇ（エタノール）であることが確認された。原料エタノール溶液中のアスタキサンチンの含有量は０．０４２ｍｇ／ｇ（エタノール）であるから、本発明の二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出法によるアスタキサンチンの濃縮率は約１．５倍であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明の製造方法は、二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出によりアスタキサンチンを含有する天然物由来の原料に含まれるトリグリセリドを、アスタキサンチンを概略含有することなく気相中に分配させることにより、脱脂効率約１６％でトリグリセリドをアスタキサンチンから、連続的に分離することができる。しかも、液相から得られたアスタキサンチン含有成分は、原料中のアスタキサンチン濃度の約１．５倍に濃縮することができることから、本発明の製造方法は、低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を得る優れた方法である。
さらに、本発明の製造方法は連続抽出が可能であるため、液相中に抽出されたアスタキサンチン含有抽出物を、原料として再循環させることにより、脱脂効率をさらに向上させた、非常に低カロリーなアスタキサンチン濃縮物を得ることができるため、特に、医薬品や食品に応用されるアスタキサンチンの製造方法として有用な方法である。
【符号の説明】
【００２５】
Ａ：二酸化炭素−エタノール混合系超臨界向流接触抽出装置
１：液化二酸化炭素貯蔵槽
２：弁
３：フィルター
４：液化二酸化炭素ポンプ
５：冷却機
６：安全バルブ
７：バルブ
８：原料エタノール溶液貯蔵槽
９：送液ポンプ
１０：プレリボンヒーター
１１：向流接触抽出槽
１２：オーブン
１３：背圧弁
１４ａ、１４ｂ：分離槽
１５：乾燥ガス流量計
１６：湿式ガス流量計
Ｐ：圧力センサー
Ｔ：温度センサー
【図１】
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【図２】
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