(57)【要約】【課題】ＤＦＡIIIとベタインを含有する骨強化用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ＤＦＡIIIとベタインを骨強化用組成物に配合する。【選択図】図１
2018184365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインを含有する骨強化用組成物。
【請求項２】
ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインを含有する骨粗鬆症の予防改善用組成物。
【請求項３】
ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインをそれぞれ３質量％以上含有する請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイフラクトースアンハイライドIII（以下「ＤＦＡIII」）とベタインを含有する骨強化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年高齢化に伴う疾患として、骨粗鬆症が問題となっている。骨粗鬆症（osteoporosis）とは、骨密度の低下または骨質の劣化により骨強度が低下し、骨折しやすくなる疾患あるいはその状態を指す。一般に、閉経や老化に伴い骨密度が低下する。これによって、骨組織が脆くなって、骨強度が低下し、小さな衝撃でも骨折が発生する。
また、小児や成長期のカルシウム不足による骨強度の低下も問題となっている。
これらの疾患や栄養の不足から起こる骨強度の低下を予防するため、日常的にカルシウムを高含有する小魚や牛乳の摂取が推奨されている。
【０００３】
また、卵殻粉末や貝殻粉末、炭酸カルシウム、骨粉由来カルシウム等を高含有するカルシウムサプリメントや、カルシウムの吸収促進や、コラーゲン線維の合成促進によって骨強化を促進するサプリメント製剤など様々なタイプの骨強化剤や骨強化促進組成物が提案されている。
特許文献１には、カルシウム源、乳酸源及びクエン酸源から成り、かつ、カルシウム易吸収性があることを特徴とする易吸収性カルシウム組成物。該カルシウム組成物を含むことを特徴とするカルシウム補給剤、骨強化カルシウム剤及び骨強化食品が開示されている。
特許文献２には、ダイフラクトースアンハイドライドIII（ＤＦＡIII）と炭酸カルシウムが骨粗鬆症予防又は治療剤として有用であることが記載されている。ＤＦＡIIIはカルシウム吸収促進成分としてすでに実用化されている。
特許文献３には、乳由来の塩基性タンパク質画分である（１）分子量分布が２，０００〜２４，０００、（２）等電点が７．５〜１１及び（３）構成アミノ酸として塩基性アミノ酸を１０％以上含有する組成物が、骨強化及び骨吸収抑制作用を有することが記載されている。
特許文献４には、ヒドロキシアパタイトの微結晶の分散液と、魚類の鱗から酸性水溶液を用いて抽出したＩ型コラーゲン水溶液を混合することによって得られるヒドロキシアパタイト／Ｉ型コラーゲン複合粒子と卵黄からエタノール可溶成分を除いた後に水を用いて抽出した卵黄水溶性成分を、タンパク質分解酵素によって分解して得られる卵黄由来ペプチドを含有する組成物が記載されている。この組成物は骨量を増加させる効果を有するといわれている。
特許文献５には、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の菌体又はその処理物を含有するコラーゲン産生促進用組成物、コラーゲン吸収促進用組成物が記載されている。この組成物は骨強化に有用であることが記載されている。
このほかにも多様な先行技術が存在するが、いずれも一長一短があり、未だに好ましい骨強化剤や骨強化組成物は提供されていない。
【０００４】
一方、ベタインは別名トリメチルグリシンとも呼ばれる化合物である。ベタインは、保湿性があるため、化粧品の保湿剤としてしばしば使用される。また、血中中性脂肪低減作用（特許文献５）、急性肝臓機能障害の予防や治療効果（特許文献６）などへの利用が提案されている。しかし、ベタインが骨強化作用に関わることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０９−０９８７３８号公報
【特許文献２】特許第４７０３１１８号公報
【特許文献３】特開２００７−２４６４１３号公報
【特許文献４】特開２０１３−２２４２７７号公報
【特許文献５】特開２００３−２６１４４５号公報
【特許文献６】特開２０１１−９３８６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、長年にわたりＤＦＡIIIやベタインの生体に及ぼす影響について検討を行っている。老化促進が系統的に確立されている老化促進マウス（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ，以下「ＳＡＭ」）を用いた研究行ったところ、ＤＦＡIIIとベタインを併用すると、老化に伴う骨粗鬆症を改善し、骨密度の向上が確認された。さらに骨強度を上昇させる効果を見いだした。
本発明は、この研究に基づいている。
すなわち、本発明は、ＤＦＡIIIとベタインを含有する骨強化用組成物を提供することを課題とする。また本発明は、ＤＦＡIIIとベタインを含有する骨粗鬆症の予防改善用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインを含有する骨強化用組成物。
（２）ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインを含有する骨粗鬆症の予防改善用組成物。
（３）ダイフラクトースアンハイライドIII（ＤＦＡIII）とベタインをそれぞれ３質量％以上含有する（１）又は（２）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＤＦＡIIIとベタインを含有する骨強化用組成物が提供される。また本発明によりＤＦＡIIIとベタインを含有する骨粗鬆症の予防改善用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の組成物を投与した骨粗鬆症発症ＳＡＭの大腿骨破断試験における破断変形度測定結果を示す。
【図２】本発明の組成物を投与した骨粗鬆症発症ＳＡＭの大腿骨破断試験での破断エネルギー測定結果を示す。
【図３】本発明の組成物を投与した骨粗鬆症発症ＳＡＭの大腿骨（皮質骨）骨密度測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＤＦＡIIIとベタインを含有する骨強化用組成物及び骨粗鬆症予防改善用組成物に係る発明である。
本発明にかかる骨強化用組成物又は骨粗鬆症予防改善用組成物は、ダイフラクトースアンハイドライドIII（Difructose Anhydride III、ＤＦＡIII）と、ベタイン（トリメチルグリシン）および／またはその塩あるいはそのエステルとを含有する。
【００１１】
ＤＦＡIIIは、フラクトース２分子が１，２’および２，３’で結合している２糖類（di-D-fructofuranose-1,2':2,3 dianhydride）であり、難消化性である。甘味は蔗糖の約１／２を有し、水への溶解性が高く、ビフィズス菌増殖作用を有している。また、カルシウムの吸収促進作用を有する。
ＤＦＡIIIは、従来、カラメルなどに存在することが知られていたが、工業的には、イヌリンをイヌリン分解酵素、例えば、Arthrobacter sp.Ｈ６５−７株が産生するイヌリンフラクトトランスフェラーゼ（ＥＣ２.４.１.９３）により発酵させたり、レヴァンをArthrobacter nicotinovorans ＧＳ−９が産生するレヴァンフルクトトランスフェラーゼ（ＥＣ２.４.１.１０）により発酵させたりすることにより製造することができる。
【００１２】
ベタインはビート（甜菜）中に比較的多く（０．０７〜０．３０％）存在し、１９世紀中頃ビート糖の廃糖蜜からはじめて単離されている。ビート以外の植物及び動物にも広く見いだされ、動物ではエビ、カニ、イカ、貝類などの水産物に多く含まれており、植物では麦芽、キノコ類、植物の葉、タケノコ、種子などに含まれ、小麦のフスマには約０．３５％も有されている。
ベタインは、多くの植物や動物から抽出されたもの、又は生合成物から抽出した天然由来のものを使用することができる。特に、ビート（甜菜）から常法により抽出、精製したものを用いるのが好ましいが、ビート由来のベタインに限定されるものではない。形態も液状、粉末状、顆粒状、ペースト状等どのようなものでも使用することができ、特に限定されるものではない。
【００１３】
本発明の組成物においては、上記ＤＦＡIIIおよびベタインまたはその塩あるいはそのエステル以外の成分を含有していてもよい。具体的には、例えば、各種オリゴ糖を挙げることができる。より具体的には、フラクトオリゴ糖、ラフィノースのほか、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース等マルトオリゴ糖；イソマルトオリゴ糖；大豆オリゴ糖；フラクトオリゴ糖；ガラクトオリゴ糖；ペクチンオリゴ糖；マルチュロース；イソラフィノース；パラチノース；ラクチュロース；トレハロース；キシロオリゴ糖；等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００１４】
さらに、骨強化を補助するために、ＤＦＡIII以外にカルシウム吸収促進作用を示す公知の他の物質や素材を組み合わせて用いることも可能である。例えば、（１）カルシウムにアミノ酸やタンパク質、あるいはタンパク質の加水分解物を組み合わせた組成物、（２）キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸等の多糖類、（３）豆乳、納豆、酵母等のように既に食品として利用されているもの、（４）植物や貝等から抽出したエッセンス成分等を組み合わせることで、カルシウムの吸収を促進させることで、より高い骨強化並びに骨粗鬆症予防改善効果が得られることが期待できる。
【００１５】
なお、本発明の組成物は、カルシウム以外のミネラルも含んでいても構わない。
本発明の組成物の具体的な組成は特に限定されるものではないが、ＤＦＡIIIの含有量は、ベタインに対して重量比で同量〜３倍以上とすることが好ましい。本発明の組成物にあっては、ＤＦＡIIIを３質量％以上、ベタイン３質量％以上含有することにより骨強化作用又は骨粗鬆症の予防改善作用を示す。
【００１６】
本発明にかかる組成物は、骨強化又は骨粗鬆症の予防改善をするための飲食品として用いることができる。その種類は特に限定されるものではない。
飲食品は、例えば、医師の食事箋に基づく栄養士の管理の下に、病院給食の調理の際に、任意の食品に対して、本発明の組成物を加え、その場で調製した飲食品の形態で患者に与えることもできる。また本発明にかかる飲食品の形態は、液状であっても、粉末や顆粒などの固形状であってもよい。あるいは、アルコール飲料やミネラルウォーターに用時添加する易溶性製剤となっていてもよい。さらには、上記飲食品は、自然流動食、半消化態栄養食もしくは成分栄養食、またはドリンク剤等の加工形態とすることもできる。
【００１７】
また、本発明にかかる飲食品には、健康食品や栄養食品等のように、一般食品でない特定用途に用いられる機能性食品を挙げることができる。具体的には、各種サプリメント等の栄養補助食品、特定保健用食品等を挙げることができる。サプリメント等の場合には、上記促進組成物を適当な形状に加工するだけでそのまま用いることができるし、必要に応じて第３の成分を添加して用いることもできる。
【００１８】
本発明の組成物は、骨強化又は骨粗鬆症の予防改善をするための医薬品として用いることができる。医薬品の投与経路はどのようなものであってもよいが、経口投与が最も好ましい。
【００１９】
本発明にかかる医薬品の剤形としては、経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよい。具体的には、例えば、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液体製剤；散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ等の固形製剤；等が挙げられる。これら剤形はそれぞれ単独で、または組み合わせて用いることができる。
【００２０】
上記医薬品においては、目的に応じて、製剤技術分野において通常使用し得る公知の添加剤を添加することができる。このような添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、安定化剤等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。より具体的には、固形製剤の場合には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。
【００２１】
また、液体製剤の場合には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤等の添加剤を製剤中に含有させることができる。
【００２２】
本発明組成物はサプリメント等の形態で用いることができるが、このようなサプリメントについても、上記医薬製剤の形態と同様で用いることができる。
【００２３】
本発明の組成物を栄養補助食品や医薬品等として用いる場合には、上記ＤＦＡIIIおよびベタイン（その塩やエステルも含む）に加えて、さらにカルシウムも含有させておくことが好ましい。これによって、本発明の組成物をカルシウム補給用組成物として用いることができる。カルシウム補給用組成物の具体的な組成は特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
以下に本発明の組成物を用いた試験例を示し、本発明を説明する。
なお、本試験は前記した老化促進マウス（ＳＡＭ）において、老化に伴って特異的に骨粗鬆症が発生し、骨強度が低下する系統のＳＡＭＰ６系と、早期老化を示すが骨粗鬆症が発症しないＳＡＭＲ１系のマウスを用いて試験を行った。
【００２５】
１．被験物質
被験物質はＤＦＡIII（純度９９％、日本甜菜製糖株式会社製）、とベタイン（純度９９％、日本甜菜製糖株式会社）を用いた。被験物質はラット、マウス用維持用精製飼料ＡＩＮ９３Ｍ（オリエンタル酵母工業株式会社製）に含まれるコーンスターチをＤＦＡIIIとベタインでそれぞれ、またはその両方を３％（ｗ／ｗ）置換し、これを試験組成物とした。なお、試験組成物の組成を下記表１に示した。
【００２６】
【表１】
2018184365.tif 000003
【００２７】
２．実験動物
動物は日本エスエルシー株式会社から１８週齢で購入し、入荷後７日間の馴化をした１９週齢のＳＡＭＰ６雄性マウス４０匹とＳＡＭＲ１雄性マウス８匹を用いた。群分けは投与開始前日に体重を測定し、その後、一般状態が良好であることを確認した後、ＳＡＭＰ６は体重層別法により１群８匹の５群に割り付け、配置した。また、ＳＡＭＲ１はそのまま８匹を１群とし、無処置群（ＰＮ群）、対照群（ＰＣ群）、ベタイン摂取群（Ｂｅ群）、ＤＦＡIII摂取群（ＤＦＡ群）、ベタイン＋ＤＦＡIII併用摂取群（ＢｅＤ群）及びＳＡＭＲ１群（ＲＣ群）を設定した。なお、ＰＮ群には血中ホモシステインを上昇させるホモシステインチオラクトンを自由飲水させ、その対照としてＰＣ群にはホモシステインチオラクトンを飲水させていない群設定である。
【００２８】
３．飼育条件
ＳＡＭＰ６、ＳＡＭＲ１ともに温度２１〜２５℃、湿度４５〜６５％、照明８〜２０時に設定した飼育条件下で、幅１７．５ｃｍ・高さ１２．５ｃｍ・奥行き２５．５ｃｍのポリカーボネート樹脂製ケージに１匹／ケージ単位で収容し、順化期間は製造後６ヶ月以内のＡＩＮ９３Ｍと水道水をそれぞれ自由摂取させて飼育した。各個体はケージラベル、架台に貼付した動物番号を記載したカラーテープにより識別した。
【００２９】
４．投与経路，投与量及び投与方法
投与は被験飼料を１２週間の自由摂取させて行った。また、ＰＮ群とＲＣ群には水道水、それ以外の群にはホモシステインチオラクトン（２３．７ｍＭ；３２ｍｇ／１０ｇＢ．Ｗ．／ｄａｙ相当）を蒸留水に溶解した水溶液を自由摂取させた。被験飼料の混餌量はＤＦＡIII、ベタインともにラットの安全性試験において摂餌量の低下などの毒性所見が観察されない３％（ｗ／ｗ）とした。
【００３０】
５．観察・測定・検査項目および方法
１）一般観察  
i) 一般状態観察
投与開始前日（群分け）から最終投与後１日までの毎日、１日１回、午前中に観察した。
ii) 体重測定
投与開始前日（群分け）、投与開始日から最終投与終了日まで１週間毎に測定した。
iii) 摂餌量測定
投与開始日から最終投与終了日まで２日または３日毎に測定した。摂餌量は給餌開始日から２日後の残餌量を引いて算出した。残餌量の測定後、残餌に追加の給餌は行わず、新しい容器に新しい飼料を給餌し給餌開始日の重量とした。
【００３１】
２）解剖及び試験試料採取
全例とも最終投与後１日に実施した。採血はイソフルラン麻酔下で腹部大静脈からＥＤＴＡ２Ｎａ加注射筒により実施した。採取した全血は４℃、１５００×ｇ、１５分の遠心条件で血漿を分離し−８０℃で冷凍保存した。
剖検は採血終了時に腹部大静脈切断によって放血致死させてから、左右の大腿骨と脛骨を摘出した。大腿骨は股関節および膝関節から切り離して分離し、骨周囲の軟部組織を除去して、左右の重量を測定した。重量測定後，左大腿骨は速やかに７０％アルコール溶液に浸漬して固定した。右大腿骨は−２０℃以下で凍結保存した。脛骨は膝関節および足根関節から切り離して分離した後、骨周囲の軟部組織を除去して、左右の重量を測定した。重量測定後、左脛骨は速やかに冷やした４％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬して固定した。右脛骨は−８０℃以下で凍結保存した。
【００３２】
３）骨強度測定
骨強度測定装置  ＭＺ−５００Ｓ（Ｓ／Ｎ  ０９０１１１、株式会社マルトー）および骨強度検査システムＣＴＲｗｉｎ  Ｖｅｒ．１．０５（株式会社システムサプライ）を用いて、右大腿骨骨幹部の３点曲げ試験を行った。測定は、大腿骨前面を上方にして支点間距離は５ｍｍ以上で試料台に載せ、支点間の中央部で上方部からロードセルを５ｍｍ／ｍｉｎのスピードで、また、５０ｋｇｆの荷重をかけながら破断試験を行い、破断変形（ｍｍ）等を測定し、破断エネルギー（Ｎ・ｍ）を算出した。
４）骨密度の測定
末梢骨密度測定装置  ｐＱＣＴ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＸＣＴ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋，Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて左大腿骨の骨密度の測定を行った。測定は大腿骨を測定容器に入れ、骨幹部（中央）及び遠位骨幹端部（遠位成長板から近位方向に約２ｍｍの位置）を２スライスして皮質骨等の骨密度を測定した。
【００３３】
６．統計学的処理
各種検査の定量値について平均値と標準誤差を算出し、ＰＮ群またはＰＣ群を対照として各群の比較を行った。なお、検定は危険率５％以下を統計学的に有意とした。
【００３４】
７．試験結果
大腿骨の破断変形を図１、破断エネルギーを図２、骨密度を図３に示す。
１）骨強度（破断変形）
ＰＣ群（老化促進マウスＳＡＭＰ６）には、圧力負荷に対して顕著な破断変形度の低下が確認された。すなわち骨強度（弾性）の低下が確認された。一方ＢｅＤ群はＰＮ群とほぼ同程度であり、試験当初の骨強度（弾性）を維持していた。またＲＣ群（ＳＡＭＲ１）も老化に伴う骨強度の低下が観察された。すなわち本発明の組成物により、骨の弾性（柔軟性）が保たれることが明らかとなった。
【００３５】
２）骨強度（破断エネルギー）
大腿骨に負荷をかけたときの破断エネルギーは、ＰＣ群（老化促進マウスＳＡＭＰ６）で顕著な破断エネルギーの低下が確認された。すなわち老化に伴う骨粗鬆症によって骨が脆くなっていることが明らかである。一方ＢｅＤ群はＰＮ群とほぼ同程度であり、試験当初の骨強度（破断エネルギー量）を維持していた。
【００３６】
３）骨密度
図３に示すとおり、ＤＦＡ、ＢｅＤ群は、有意に骨密度が増加していた。一方ＲＣ群とＰＣ群には差が認められなかった。ＤＦＡIIIは、カルシウム吸収促進効果を有しており、その効果であるものと考えられた。
以上の結果から、本発明の組成物は骨強度を増強し、骨粗鬆症の予防改善効果があることが確認された。この効果はカルシウムの吸収促進だけでは説明できない骨強度の増強を伴っており、ＤＦＡIIIとベタインの相乗効果であるものと考えられる。
【図１】
2018184365.tif 000004
【図２】
2018184365.tif 000005
【図３】
2018184365.tif 000006