(57)【要約】【課題】優れた除菌効果及び高い安全性を有する除菌剤、除菌方法及び除菌キットを提供する。【解決手段】除菌剤は、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを有効成分として含有する。除菌方法は、前記除菌剤を除菌対象物に接触させる接触工程を備える方法である。除菌キットは、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを備える。前記エタノールの含有量が７０ｖ／ｖ％以上であってもよい。前記エタノールの含有量が８０ｖ／ｖ％以上であってもよい。前記除菌剤又は前記除菌キットは、食品に用いられてもよい。前記除菌対象物が食品であってもよい。前記食品が食肉であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを有効成分として含有する除菌剤。
【請求項２】
前記エタノールの含有量が７０ｖ／ｖ％以上である請求項１に記載の除菌剤。
【請求項３】
前記エタノールの含有量が８０ｖ／ｖ％以上である請求項１又は２に記載の除菌剤。
【請求項４】
前記ナイシンの含有量が１．２５ｐｐｍ以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の除菌剤。
【請求項５】
食品に用いられる請求項１〜４のいずれか一項に記載の除菌剤。
【請求項６】
前記食品が食肉である請求項５に記載の除菌剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の除菌剤を除菌対象物に接触させる接触工程を備える除菌方法。
【請求項８】
前記接触工程において、前記除菌対象物に前記除菌剤を塗布する請求項７に記載の除菌方法。
【請求項９】
前記接触工程において、前記除菌対象物を前記除菌剤に浸漬する請求項７に記載の除菌方法。
【請求項１０】
前記除菌対象物が食品である請求項７〜９のいずれか一項に記載の除菌方法。
【請求項１１】
前記食品が食肉である請求項１０に記載の除菌方法。
【請求項１２】
６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、
ナイシンと
を備える除菌キット。
【請求項１３】
前記エタノールの含有量が７０ｖ／ｖ％以上である請求項１２に記載の除菌キット。
【請求項１４】
前記エタノールの含有量が８０ｖ／ｖ％以上である請求項１２又は１３に記載の除菌キット。
【請求項１５】
食品に用いられる請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の除菌キット。
【請求項１６】
前記食品が食肉である請求項１５に記載の除菌キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除菌剤、除菌方法及び除菌キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイシンは乳酸菌由来の抗菌ペプチドとして広く知られている。ナイシンは、グラム陽性の食品汚染菌や食中毒菌に対して、高い除菌効果を示すことから、様々な食品に対して、食品保存料として利用されている。日本でも対象食品は限定されているが、２００９年３月にナイシンＡが食品添加物として許可されている。具体的には、「食肉」、「ホイップクリーム類」、「チーズ（プロセスチーズを除く）」、「プロセスチーズ」、「穀類及び澱粉を主原料とする洋生菓子」、「洋菓子」、「ソース類、マヨネーズ、ドレッシング」、「卵加工品」及び「味噌」の合計９品目について、ナイシンＡの食品添加物としての使用が可能となった。
【０００３】
一方、従来から、エタノールは除菌剤として広く使用されている。ナイシンと３０ｖ／ｖ％以下程度の低濃度エタノールとを組み合わせることによって、グラム陽性菌であるリステリア・モノサイトゲネス又はグラム陰性菌である大腸菌等の細菌に対して、除菌の相乗効果があることについては、すでに報告されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
また、特許文献１には、ナイシンと、ナイシンの安定化剤としてチオクト酸又はその医療若しくは食品衛生上許容される塩とを含む殺菌用組成物が開示されている。さらに、実施例において、この殺菌用組成物と２５ｗ／ｗ％のアルコールとを含むアルコール製剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２７００１４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Brewer R et al., “Enhanced inactivation of Listeria monocytogenes by nisin in the presence of ethanol”, Letters in Applied Microbiology, vol.34, p18-21, 2002.
【非特許文献２】Komsan Phongphakdee and Sunee Nitisinprasert, “Combination Inhibition Activity of Nisin and Ethanol on the Growth Inhibition of Pathogenic Gram Negative Bacteria and Their Application as Disinfectant Solution”, Journal of Food Science, vol.80, nr.10, M2241- M2246, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１及び２、並びに特許文献１では、単一の菌に対し、ナイシンとエタノールとを添加してその効果を検討しており、雑多な菌が存在する条件下での除菌対象物に対する除菌効果については検討されていない。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、優れた除菌効果及び高い安全性を有する除菌剤、除菌方法及び除菌キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ナイシンと高濃度のエタノールとを用いることで、食肉等の有機物の存在下においても、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれも効果的に除菌できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る除菌剤は、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを有効成分として含有する。
前記エタノールの含有量が７０ｖ／ｖ％以上であってもよい。
前記エタノールの含有量が８０ｖ／ｖ％以上であってもよい。
前記ナイシンの含有量が１．２５ｐｐｍ以上であってもよい。
上記態様に係る除菌剤は、食品に用いてもよい。
前記食品が食肉であってもよい。
【００１１】
本発明の第２態様に係る除菌方法は、上記第１態様に係る除菌剤を除菌対象物に接触させる接触工程を備える方法である。
前記接触工程において、前記除菌対象物に前記食品の除菌剤を塗布してもよい。
前記接触工程において、前記除菌対象物を前記食品の除菌剤に浸漬してもよい。
前記除菌対象物が食品であってもよい。
前記食品が食肉であってもよい。
【００１２】
本発明の第３態様に係る除菌キットは、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを備える。
前記エタノールの含有量が７０ｖ／ｖ％以上であってもよい。
前記エタノールの含有量が８０ｖ／ｖ％以上であってもよい。
上記態様に係る除菌キットは、食品に用いてもよい。
前記食品が食肉であってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
上記態様によれば、優れた除菌効果及び高い安全性を有する除菌剤、除菌方法及び除菌キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】試験例１における除菌試験の結果である。具体的には、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射した牛もも肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図１Ｂ】試験例１における除菌試験の結果である。具体的には、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射した豚もも肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図１Ｃ】試験例１における除菌試験の結果である。具体的には、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射した鶏ささみ肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図２Ａ】試験例１における食味試験の結果である。具体的には、除菌剤未噴射の、加熱調理した牛もも肉の肉片（対照）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、若しくは、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射し、加熱調理した牛もも肉の肉片の食味試験の結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】試験例１における食味試験の結果である。具体的には、除菌剤未噴射の、加熱調理した豚もも肉の肉片（対照）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、若しくは、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射し、加熱調理した豚もも肉の肉片の食味試験の結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】試験例１における食味試験の結果である。具体的には、除菌剤未噴射の、加熱調理した鶏ささみ肉の肉片（対照）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤６）、若しくは、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）を噴射し、加熱調理した鶏ささみ肉の肉片の食味試験の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】試験例２における除菌試験の結果である。具体的には、１．２５ｐｐｍナイシン含有２０〜８０ｖ／ｖ％エタノール溶液に、５、１５、又は、３０秒間、常温で浸漬した鶏ささみ肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図３Ｂ】試験例２における除菌試験の結果である。具体的には、２０〜８０ｖ／ｖ％エタノール溶液に、５、１５、又は、３０秒間、常温で浸漬した鶏ささみ肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図４】試験例３における除菌試験の結果である。具体的には、１．２５ｐｐｍナイシン含有６０〜８０エタノール溶液に、５、１５、又は、３０秒間、４℃で浸漬した鶏ささみ肉の肉片での菌体の減少率を示すグラフである。
【図５】試験例４における除菌試験の結果である。具体的には、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液を１００回連続的に用いて、鶏ささみ肉の肉片を浸漬した際の各回数での菌体の減少率を示すグラフである。
【図６】試験例５における食味試験の結果である。具体的には、除菌剤に未浸漬の、加熱調理した鶏ささみ肉の肉片（対照）、又は、１．２５ｐｐｍナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（除菌剤７）に浸漬し、加熱調理した鶏ささみ肉の肉片の食味試験の結果を示すグラフである。
【図７Ａ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図７Ｂ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図７Ｃ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／２０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図７Ｄ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／２０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図７Ｅ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／１０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図７Ｆ】試験例６における各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／１０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【図８】試験例７における各溶液の噴射によるL. lactis NBRC12007の減少率を示すグラフである。
【図９】試験例８における各溶液の噴射後のシンク表面分離菌の生菌数を示すグラフである。
【図１０Ａ】試験例８における各溶液の噴射後のシンク表面分離菌Ａ株の生菌数を示すグラフである。
【図１０Ｂ】試験例８における各溶液の噴射後のシンク表面分離菌Ｂ株の生菌数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪除菌剤≫
本発明の一実施形態に係る除菌剤は、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを有効成分として含有する。
【００１６】
本実施形態の除菌剤は、ナイシンと、６０ｖ／ｖ％以上の高濃度エタノールとを含むことで、食品や残留皮脂及びタンパク質が付着した衣類等の有機物等が存在する条件において、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれに対しても、優れた除菌効果を有する。
また、本実施形態の除菌剤に含まれるエタノール及びナイシンは、すでに食品添加剤として食品への使用が認可されている。そのため、本実施形態の除菌剤は高い安全性を有する。
【００１７】
一般に、「除菌」とは、物体や液体等の対象物や、限られた空間に含まれる微生物の数を減らし、清浄度を高めることを意味する。本実施形態の除菌剤は、６０ｖ／ｖ％以上の高濃度エタノールを含むことで、微生物の機能性タンパク質を変性させ、細胞膜や細胞壁に損傷を与えることができると考えられる。さらに、ナイシンを含むことで、高濃度エタノールが蒸発後に、高濃度エタノールにより損傷を受けた細胞壁を通過して微生物の細胞膜にナイシンが到達し、細胞膜上に形成された細孔から低分子成分の流出とＡＴＰの枯渇とにより、微生物を殺傷することで除菌効果を発揮できると推察される。
【００１８】
また、本実施形態の除菌剤は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれに対しても、優れた除菌効果を有する。
前記グラム陽性菌として具体的には、例えば、エグジゴバクテリウム属（Exiguobacterium）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）（スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus  aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミス（Staphylococcus  epidermis）等）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）（ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus  mutans）等）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）（ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus  plantarum）等）に属する微生物；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（VRSA）、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）、ペニシリン耐性肺炎球菌（PRSP）等の抗生物質耐性菌等が挙げられ、これらに限定されない。
前記グラム陰性菌として具体的には、例えば、エッシェリヒア属（Escherichia）（例えば、大腸菌（エッシェリヒア・コリ（Escherichia  coli））等）、エンテロバクター属（Enterobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）、バチルス属（Bacillus）（バチルス・ズブチリス（Bacillus  subtilis）等）に属する微生物；多剤耐性緑膿菌（MDRP）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、多剤耐性アシネトバクター等の抗生物質耐性菌等が挙げられ、これらに限定されない。
【００１９】
なお、本実施形態の除菌剤を用いることができる除菌対象物としては、特別な限定はない。除菌対象物として具体的には、例えば、口腔、歯及び歯周、鼻腔、手指、顔、足等のヒトを含む動物の身体の一部；食肉、食肉加工品、野菜、果実等の食品；衣類；医療器具、調理器具、衛生器具、介護用品、ベビー用品、おもちゃ、食品製造機、医療機器、食卓、机、椅子、家具備品等の器具及び機械；家庭用及び業務用の厨房、食品加工工場、食品素材製造工場、家屋、ホテル、レストラン等の室内、医療施設、病室、床、作業台等の場所等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２０】
前記食肉としては、魚介類及び畜肉に分けられる。
魚介類として具体的には、例えば、アユ、コイ、マス、サケ、スケトウダラ、ホキ、タイ、マグロ、カジキ、イワシ、サバ、アジ、サンマ、ハモ、タチウオ、フナ等の魚類；ヤツメウナギ等の無顎類；アワビ、サザエ、フジツボ、カキ、ホタテガイ等の貝類；タコ、イカ等の頭足類；エビ、カニ等の甲殻類；ウニ、ナマコ等の棘皮動物等が挙げられ、これらに限定されない。また、魚介類は生食用として提供されるものであってもよく、加熱用として提供されるものであってもよい。
畜肉として具体的には、例えば、牛、豚、馬、羊、山羊等の家畜の肉；猪、鹿、熊等の獣の肉；鶏、七面鳥、ウズラ、アヒル、合鴨等の家禽の肉；鴨、キジ、スズメ、ツグミ、鳩等の野鳥の肉；兎、カエル、カンガルー、スッポン、海豚、クジラ、鰐等のその他の動物の肉等が挙げられ、これらに限定されない。また、畜肉は生食用として提供されるものであってもよく、加熱用として提供されるものであってもよい。
【００２１】
前記食肉加工品としては、例えば、ハンバーグ、ミートボール、ミートローフ、ハム、ソーセージ等の畜肉の加工食品；かまぼこ、つみれ、ちくわ、はんぺん、魚肉ソーセージ等の魚介類の加工食品が挙げられ、これらに限定されない。
【００２２】
前記野菜として具体的には、例えば、アブラナ科（ダイコン、キャベツ、ハクサイ、ワサビ）、キク科（レタス、菊花）、セリ科（ニンジン、金時ニンジン、セロリ、パセリ）、ナス科（トマト、トウガラシ、パプリカ、ジャガイモ、ナス）、アオザ科（ホウレンソウ）、ユリ科（タマネギ、らっきょう、ニンニク、ネギ、ニラ）、ウリ科（キユウリ）等が挙げられ、これらに限定されない。また、野菜は生食用として提供されるものであってもよく、加工用として提供されるものであってもよい。
前記果実として具体的には、例えば、イチゴ、サクランボ、ブドウ、スダチ、カポス等が挙げられ、これらに限定されない。また、果実は生食用として提供されるものであってもよく、加工用として提供されるものであってもよい。
【００２３】
中でも、除菌対象物としては、ヒトを含む動物の身体の一部、食品、残留皮脂及びタンパク質が付着した衣類、調理器具、食品製造機、家庭用及び業務用の厨房、食品加工工場、及び食品素材製造工場等の有機物等が存在する条件であることが好ましい。後述の実施例に示すとおり、エタノールのみでは、除菌効率が低いのに対し、本実施形態の除菌剤によれば、高い除菌効率が達成される。また、除菌対象物としては、食品であることがより好ましく、食肉であることがさらに好ましく、生食用の食肉であることが特に好ましい。本実施形態の除菌剤を使用することで、食肉を生食用として提供できる。
食肉としては、牛、豚、又は鶏由来の肉が好ましく、牛又は鶏由来の肉がより好ましく、鶏由来の肉がさらに好ましい。
本実施形態の除菌方法によれば、除菌対象物が食品（特に、食肉）である場合、後述の実施例に示すように、優れた除菌効果を発揮しながら、食品（特に、食肉）の味及び香りを良好に保つことができる。
【００２４】
＜エタノール及びナイシンの含有量＞
なお、本実施形態の除菌剤において、「有効成分として含有する」とは、エタノール及びナイシンをそれぞれ除菌効果が奏する成分として含有することを意味する。
【００２５】
本実施形態の除菌剤中のエタノールの含有量の下限値として具体的には、６０ｖ／ｖ％以上であることが好ましく、７０ｖ／ｖ％以上であることがより好ましく、８０ｖ／ｖ％以上であることがさらに好ましい。
一方、本実施形態の除菌剤中のエタノールの含有量の上限値として具体的には、特別な限定はなく、例えば９９ｖ／ｖ％以下、例えば９５ｖ／ｖ％以下であってもよい。
本実施形態の除菌剤中のエタノールの含有量が上記範囲であることにより、後述の実施例に示すように、有機物等が存在する条件において、ナイシンとの相乗効果により、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれの細菌に対しても、優れた除菌効果を発揮することができる。
【００２６】
本実施形態の除菌剤中のナイシンの含有量の下限値としては、除菌効果を奏する量であれば、特別な限定はない。本実施形態の除菌剤中のナイシンの含有量の下限値として、具体的には、０．５ｐｐｍ以上であることが好ましく、１．０ｐｐｍ以上であることがより好ましい。
一方、本実施形態の除菌剤中のナイシンの含有量の上限値として具体的には、特別な限定はなく、製造コストの観点から、例えば２．０ｐｐｍ以下、例えば１．８ｐｐｍ以下であってもよい。また、製造コストに特に限定がない場合には、本実施形態の除菌剤は２．０ｐｐｍよりも多く、ナイシンを含有していてもよい。
本実施形態の除菌剤中のナイシンの含有量が上記範囲であることにより、後述の実施例に示すように、有機物等が存在する条件において、エタノールとの相乗効果により、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれの細菌に対しても、優れた除菌効果を発揮することができる。
本実施形態の除菌剤の構成成分について、以下に詳細を説明する。
【００２７】
＜エタノール＞
本実施形態の除菌剤に含まれるエタノールとしては、例えば、工業用アルコール、日本薬局方において指定されている純度９９．５％以上の無水エタノール、水を４〜５％含有する含水エタノール、純度７０〜９０％の消毒用エタノール等が挙げられ、これらに限定されない。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
除菌剤に含まれるエタノールの含有量が上記範囲となるように、上述の例示したエタノールを用いればよい。また、エタノールの純度は、除菌剤を使用する対象物の種類に応じて、適宜選択すればよい。中でも、除菌対象物が食品である場合、純度９９．５％以上の無水エタノールを用いることが好ましい。
【００２８】
＜ナイシン＞
本実施形態の除菌剤に含まれるナイシンとしては、例えば、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱ等が挙げられ、これらに限定されない。本実施形態の除菌剤は、これらナイシンを１種類含有していてもよく、２種類以上含有していてもよい。
中でも、本実施形態の除菌剤に含まれるナイシンとしては、ナイシンＡであることが好ましい。
【００２９】
ナイシンＡは、乳酸菌Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓにより産生され、欧米等５０カ国以上ですでに食品添加物として認可使用されている。ナイシンＺは、ナイシンＡに類似のタンパク質である。ナイシンＡを構成する３４個のアミノ酸残基のうち、Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基が、ナイシンＡではヒスチジン残基であるのに対し、ナイシンＺではアスパラギン残基である点のみが異なる。
【００３０】
本実施形態の除菌剤に含まれるナイシンは、公知の方法を用いて、乳酸菌を培養し、精製することによって得ることができる。具体的には、例えば、まず、ＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）を用いて、乳酸菌を培養する。次いで、培養上清をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６、シグマ社製）処理してナイシンを吸着させる。次いで、アンバーライトを蒸留水及び４０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄する。次いで、０．１ｗ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含む７０ｖ／ｖ％イソプロパノールでナイシンを溶出させる。次いで、溶出画分を、陽イオン交換カラム（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて精製することで、ナイシンの精製品を得ることができる。また、陽イオン交換カラム後のナイシンを、必要に応じて、逆相クロマトグラフィーを用いて精製することで、さらにナイシンの精製度を高めることができる（参考文献１：Zendo T et al., “Identification of the Lantibiotic Nisin Q, a New Natural Nisin Variant Produced by Lactococcus lactis 61-14 Isolated from a River in Japan”, Biosci.  Biotechnol.  Biochem., vol.67, No.7, p1616-1619，2003）。
また、ナイシンの市販品を用いてもよく、具体的には、例えば、ナイシンＡ試薬（ナイシン２．５％含有、Ｓｉｇｍａ社製）等が挙げられ、これに限定されない。
本実施形態の除菌剤は、公知の方法を用いて製造されたナイシンとナイシンの市販品とをそれぞれ単独で含有していてもよく、２種類以上含有していてもよい。
【００３１】
＜その他構成成分＞
本実施形態の除菌剤は、チオクト酸及びその類縁体等のナイシン安定剤を実質的に含まないことが好ましい。
なお、本実施形態の除菌剤において、「実質的に含まない」とは、ナイシン安定剤を全く含まない、又は、ナイシンの安定効果を奏しない程度の微量しか含まないことを意味する。ナイシン安定化剤を微量含む場合、その含有量は、ナイシン１質量部に対して、例えば１質量部未満程度であってもよい。
【００３２】
本実施形態の除菌剤は、除菌効果を妨げない範囲において、エタノール及びナイシン以外のその他の構成成分を含有していてもよい。
その他の構成成分として具体的には、例えば、界面活性剤（乳化剤、分散剤（再付着防止剤））、キレート剤、湿潤剤、研磨剤、殺菌剤（抗菌剤）、粘度調整剤、溶剤（例えば、水等）、潤滑剤、保湿剤、安定化剤、洗浄用酵素、防腐剤、防黴剤、着色料、香料（着香剤及び芳香剤を含む）等が挙げられ、これらに限定されない。
また、本実施形態の除菌剤に含まれるその他の構成成分については、当該除菌剤の形態及び除菌対象物の種類に応じて、適宜選択すればよい。
本実施形態の除菌剤は、エタノール、ナイシン、及び水のみからなることが好ましい。
【００３３】
＜形状及び形態＞
本実施形態の除菌剤は、液状、半固形状、又は固形状とすることができる。本実施形態の形状として具体的には、例えば、液剤、乳剤（エマルジョン）、ゲル剤、それらを含浸させた種々の剤形等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の除菌剤が液状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、液で出るタイプ等）、詰替用ボトル入り等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の除菌剤が半固形状又は固形状である場合、その形態として具体的には、例えば、噴霧用容器入り、プッシュ式容器入り（例えば、ジェルで出るタイプ等）、口腔内洗浄及びリンス剤、歯磨き剤、ディッピング剤、清拭綿、ペーパータオル、ウエットティッシュ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３４】
本実施形態の除菌剤の保存条件としては、特別な限定はなく、例えば−２０℃以上４０℃以下の温度で保存してもよい。除菌剤に含まれるナイシンの活性を、より長期間、高く保てることから、好ましくは１０℃以下、より好ましくは５℃以下で保存してもよい。
【００３５】
＜除菌効果の評価法＞
本実施形態の除菌剤は、例えば、食品に対して用いる場合、後述の実施例に示す評価方法を用いることで、その除菌効果を評価することができる。
具体的には、例えば、まず、食肉等の食品を準備し、一定の大きさに調製する。次いで、除菌剤との接触前に、食品をＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定する。これを除菌前の菌体数とする。次いで、本実施形態の除菌剤と食品とを接触させる（食品に除菌剤を噴射する、又は、食品を除菌剤に浸漬する等）。次いで、除菌後の食品をＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定する。
菌数の減少率、すなわち除菌率を以下の式（１）を用いて、算出する。
除菌率（％）＝［１−（除菌後の菌数／除菌前の菌数）］×１００  ・・・（１）
【００３６】
上記評価法において、エタノール及びナイシンの濃度、接触時間、接触温度等の条件は、目的に応じて、適宜変更することができる。また、培地の種類及び培養条件についても、微生物の種類に応じて、適宜変更することができる。
【００３７】
上記評価法において、微生物の除菌率が７０％以上であることが好ましく、除菌剤は除菌効果を有すると判断することができる。求められる除菌率は、使用分野、用途、又は子葉方法等により異なる。
【００３８】
≪除菌方法≫
本発明の一実施形態に係る除菌方法は、上述の除菌剤を除菌対象物に接触させる接触工程を備える方法である。
【００３９】
本実施形態の除菌方法によれば、除菌対象物を効果的且つ安全に除菌することができる。
次いで、本実施形態の除菌方法の接触工程について、以下に詳細を説明する。
【００４０】
［接触工程］
接触工程では、上述の除菌剤を除菌対象物に接触させる。
本実施形態の除菌方法において、用いられる除菌剤の構成成分及び組成は、上述の除菌剤において記載されたものと同様である。
接触方法としては、除菌剤の形状及び除菌対象物の種類に応じて、適宜選択することができる。接触方法として具体的には、例えば、除菌対象物に除菌剤を塗布する方法、除菌対象物を除菌剤に浸漬する方法、除菌対象物に除菌剤を添加して混合する方法等が挙げられる。
また、除菌対象物に除菌剤を塗布する方法には、除菌対象物に液体状又は半固体状等の除菌剤を噴射する方法、除菌対象物に液体状又は半固体状等の除菌剤を、刷毛等を用いて塗りつける方法、及び除菌対象物に固体状（例えば、シート状等）等の除菌剤を貼り付ける方法等が包含される。
【００４１】
接触時間としては、目的及び除菌対象物の種類に応じて、適宜選択することができる。
除菌対象物が食品（特に、食肉）である場合、食品の味及び香りを良好に保つために、接触時間が短いことが好ましい。このときの接触時間としては、例えば５秒以上９０秒以下であってもよく、例えば１５秒以上６０秒以下であってもよい。
【００４２】
接触温度としては、目的及び除菌対象物の種類に応じて、適宜選択することができる。
除菌対象物が食品（特に、食肉）である場合、食品の味及び香りを良好に保つために、接触温度は室温と同じ又は室温よりも低いことが好ましい。このときの接触温度としては、例えば４℃以上３０℃以下であってもよく、例えば４℃以上２５℃以下であってもよい。
【００４３】
本実施形態の除菌方法において、除菌対象物に対する除菌剤に含まれるナイシンの接触量は除菌対象物の汚染度に応じて適宜調整することができる。
例えば、除菌対象物が食品（特に、食肉）である場合、食品の表面積に対してナイシンの接触量が１μｇ／ｃｍ２以上程度となるようにすればよい。食品の表面積に対してナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、除菌効果を充分に発揮することができる。
一方、食品の表面積に対してナイシンの接触量の上限値としては、日本において食品添加物として食品に含まれるナイシンの使用基準を上回らない程度の量であってもよい。
また、除菌対象物が食品以外である場合においても、除菌対象物の表面積に対してナイシンの接触量が上記下限値以上であることにより、除菌効果を充分に発揮することができる。一方、除菌対象物の表面積に対してナイシンの接触量の上限値としては、特別な限定はなく、適切な製造コストとなる量であってもよい。
【００４４】
本実施形態の除菌方法において、必要に応じて、接触工程の後に、余分な除菌剤を拭き取る拭き取り工程、除菌対象物を乾燥させる乾燥工程等を備えていてもよい。
拭き取り方法としては、例えば、ペーパータオル、滅菌済み不織布等を用いて、手動又は自動で除菌剤を拭き取る方法等が挙げられ、これらに限定されない。
乾燥方法としては、例えば、自然乾燥、風乾燥、流動層乾燥法、低温乾燥、凍結乾燥、加圧乾燥等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４５】
本実施形態の除菌方法において、除菌対象物が食品（特に、食肉）である場合、接触工程の前に、食品を洗浄する洗浄工程を備えていてもよい。
洗浄方法としては、例えば、水、界面活性剤等を含む洗浄剤等を用いて、食品を洗浄する方法等が挙げられ、これらに限定されない。洗浄後、食品をそのまま接触工程に用いてもよい。又は、ペーパータオル等を用いて、余分な水分を手動又は自動で拭き取ってから、接触工程に用いてもよい。
【００４６】
≪除菌キット≫
本発明の一実施形態に係る除菌キットは、６０ｖ／ｖ％以上のエタノールと、ナイシンとを備える。
【００４７】
本実施形態の除菌キットは、ナイシンと、６０ｖ／ｖ％以上の高濃度エタノールとを備えており、必要に応じてナイシンが任意の濃度になるように混合することで、簡便に除菌剤を調製することができる。また、得られた除菌剤は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれに対しても、優れた除菌効果を有する。
また、本実施形態の除菌キットに含まれるエタノール及びナイシンは、すでに食品添加剤として食品への使用が認可されている。そのため、本実施形態の除菌キットは高い安全性を有する。
【００４８】
本実施形態の除菌キットに含まれるエタノール及びナイシンは、上述の除菌剤に記載されたものと同様である。
また、本実施形態の除菌キットに含まれるエタノール及びナイシンを上述の除菌剤に記載の含有量となるように混合することで、優れた除菌性を有する除菌剤を調製することができる。
【００４９】
また、本実施形態の除菌キットは、さらに、エタノール及びナイシン以外にその他の成分を備えていてもよい。その他の成分としては、上述の除菌剤においてその他構成成分として例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、その他の成分としては、水であることが好ましい。また、その他の成分は、エタノールと混合された状態で備えられていてもよい。
【００５０】
また、本実施形態の除菌キットは、さらに、蓋つき容器、噴霧用容器、プッシュ式容器、又は刷毛等を備えていてもよい。
上記容器内において、除菌剤を調製し、適宜使用すればよい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
［製造例１］除菌剤の製造
ナイシンＡ試薬（ナイシン２．５％含有、Ｓｉｇｍａ社製）２ｍｇを、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０ｖ／ｖ％の各エタノール４０ｍＬに溶解し、４種類の１．２５ｐｐｍのナイシン含有エタノール溶液を製造した。
なお、以下において、１．２５ｐｐｍのナイシン含有２０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤１、１．２５ｐｐｍのナイシン含有３０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤２、１．２５ｐｐｍのナイシン含有４０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤３、１．２５ｐｐｍのナイシン含有５０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤４、１．２５ｐｐｍのナイシン含有６０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤５、１．２５ｐｐｍのナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤６、１．２５ｐｐｍのナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤７、及び、１．２５ｐｐｍのナイシン含有９０ｖ／ｖ％エタノール溶液を除菌剤８と称する場合がある。
【００５３】
［試験例１］食肉に対する除菌剤の噴射殺菌試験及び除菌剤を噴射された食肉の食味試験
（１）食肉の準備
まず、牛もも肉、豚もも肉、及び、鶏ささみ肉をそれぞれ３ｃｍ×３ｃｍ四方にカットした。次いで、カットした各食肉の肉片を水道水に一度浸漬させ、ペーパータオルで水気を拭き取った。次いで、各肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、除菌前の細菌数とした。
【００５４】
（２）除菌剤の噴射工程
次いで、製造例１で得られた除菌剤６及び７と、対照として、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液とをそれぞれスプレー瓶に充填し、各肉片の表面に１回噴射した（噴射条件：３０ｃｍ上ななめ４５度の角度から噴射）。次いで、噴射後の肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写した。次いで、各ＬＢ寒天平板培地を倒置して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定した。測定は少なくとも３回行った。各食肉における菌数の測定結果を図１Ａ（牛肉）、図１Ｂ（豚肉）、及び、図１Ｃ（鶏ささみ肉）に示す。
【００５５】
図１Ａ、図１Ｂ、及び、図１Ｃから、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液を噴射した肉片では、菌数の減少率が低かった。また、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液を噴射した牛肉、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液を噴射した豚肉、及び、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液を噴射した鶏ささみ肉では、むしろ菌数が増えていた。よって、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液は、除菌効果が低い、又は、除菌効果が認められなかった。
一方、除菌剤６及び７を噴射した肉片では、菌数の減少率が高かった。特に、牛肉及び鶏ささみ肉では、除菌剤６及び７のいずれにおいても、菌数の減少率が７０％以上であった。よって、除菌剤６及び７は高い除菌効果を有することが確かめられた。
【００５６】
（３）食味試験
次いで、（２）において除菌剤を噴射した各肉片について、４℃で５時間静置した後、加熱調理した。次いで、調理後の肉片について、食味試験を行った。
対照として、除菌剤を未噴射の肉片を用いた。旨味、食感、香り（エタノール臭）及び苦味について、５段階評価で評価した。なお、数値が大きいほど、各評価項目を強く呈し、一方、数値が低いほど各評価項目を弱く呈することを意味する。
２２〜２５歳の８名の男女をパネラーとして、各肉片を評価した結果の平均値を図２Ａ（牛肉）、図２Ｂ（豚肉）、及び、図２Ｃ（鶏ささみ肉）に示す。
【００５７】
図２Ａから、対照の除菌剤未噴射の牛もも肉の肉片と比較して、除菌剤６及び７を噴射した牛もも肉の肉片では、香り（エタノール臭）が僅かに強く感じられた。一方、旨味への影響は認められなかった。
また、図２Ｂ及び図２Ｃから、対照の除菌剤未噴射の豚もも肉及び鶏ささみ肉の肉片と比較して、除菌剤６及び７を噴射した豚もも肉及び鶏ささみ肉の肉片では、香り（エタノール臭）及び苦味が僅かに強く感じられた。一方、牛もも肉の肉片と同様に、旨味への影響は認められなかった。
【００５８】
［試験例２］鶏ささみ肉の除菌剤浸漬試験１
（１）鶏ささみ肉の準備
まず、鶏ささみ肉を約２ｃｍ×３ｃｍ四方にカットした。次いで、カットした鶏ささみ肉の肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、除菌前の細菌数とした。
【００５９】
（２）除菌剤の浸漬工程
次いで、除菌剤１〜７、又は、対照として、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０ｖ／ｖ％エタノール溶液を各８０ｍＬ含む容器に、肉片を入れて、よく撹拌した後、５、１５、又は、３０秒間、常温で浸漬させた。次いで、肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、各肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写した。次いで、各ＬＢ寒天平板培地を倒置して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定した。測定は少なくとも３回行った。各条件における菌数の測定結果を図３Ａ（エタノール＋ナイシン）及び図３Ｂ（エタノールのみ）に示す。
【００６０】
図３Ａ及び図３Ｂから、除菌剤１〜７、及び、２０〜８０ｖ／ｖ％エタノール溶液のいずれにおいても、浸漬時間が３０秒間の肉片において、エタノール濃度が高くなるにつれて、菌体の減少率も上昇した。
また、エタノール濃度が２０〜５０ｖ／ｖ％においては、ナイシンの含有有無による菌体の減少率に差は見られなかった。また、菌体の減少率１００％を達成することができなった。
一方、エタノール濃度が６０〜８０ｖ／ｖ％においては、２０〜５０ｖ／ｖ％の低濃度エタノール溶液と比較して、ナイシン不含の６０〜８０ｖ／ｖ％の高濃度エタノール溶液では、菌体の減少率の上昇傾向は見られた。しかしながら、ナイシン不含のエタノール溶液では、いずれのエタノール濃度においても、菌体の減少率１００％を達成することができなった。
これに対し、ナイシン含有の６０〜８０ｖ／ｖ％エタノール溶液では、ナイシン不含の６０〜８０ｖ／ｖ％エタノール溶液よりも、菌体の減少率が高かった。さらに、ナイシン含有の７０ｖ／ｖ％及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液で３０秒間、常温で浸漬する条件で、菌体の減少率１００％を達成することができた。
【００６１】
［試験例３］鶏ささみ肉の除菌剤浸漬試験２
（１）鶏ささみ肉の準備
まず、鶏ささみ肉を約２ｃｍ×３ｃｍ四方にカットした。次いで、カットした鶏ささみ肉の肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、除菌前の細菌数とした。
【００６２】
（２）除菌剤の浸漬工程
次いで、除菌剤５〜７を各８０ｍＬ含む容器に、肉片を入れて、よく撹拌した後、５、１５、又は、３０秒間、４℃で浸漬させた。次いで、肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、各肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写した。次いで、各ＬＢ寒天平板培地を倒置して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定した。測定は少なくとも３回行った。各条件における菌数の測定結果を図４に示す。
【００６３】
図４から、４℃の条件においては、ナイシン含有の８０ｖ／ｖ％エタノール溶液で３０秒間浸漬することで、菌体の減少率１００％弱（９９．２％）を達成することができた。
また、図３Ａ及び図４から、ナイシン含有の各濃度のエタノール溶液において、常温条件下と比較して、４℃の条件下では、菌体の減少率がやや低下する傾向が確かめられた。
【００６４】
［試験例４］鶏ささみ肉の除菌剤連続浸漬試験
（１）鶏ささみ肉の準備
まず、鶏ささみ肉を約２ｃｍ×３ｃｍ四方にカットした。次いで、カットした鶏ささみ肉の肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写して、３７℃、１８時間培養し、除菌前の細菌数とした。
【００６５】
（２）除菌剤の連続浸漬工程
次いで、除菌剤７を各８０ｍＬ含む容器に、肉片を入れて、よく撹拌した後、３０秒間、常温で浸漬させた。次いで、肉片の水分をペーパータオルで拭き取った。次いで、各肉片を１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地に転写した。次いで、再度同じ除菌剤７を含む容器に、新たな肉片を入れて、３０秒間、常温での浸漬及び１．５ｗ／ｖ％ＬＢ寒天平板培地への転写を１００回連続して行った。次いで、各ＬＢ寒天平板培地を倒置して、３７℃、１８時間培養し、菌数を測定した。測定は少なくとも３回行った。結果を図５に示す。
【００６６】
図５から、４５、５５、及び６０回目で低下がみられるが、７０回目の浸漬まで、菌体の減少率１００％が観察された。一方、７５回目以降の浸漬では、菌体の減少率１００％は見られなかった。
このことから、肉片を除菌剤に浸漬させることで除菌する場合において、除菌剤は使い捨てではなく、４０回目までは連続使用しても、常に菌体の減少率１００％が達成できることが確かめられた。
【００６７】
［試験例５］除菌剤に浸漬された鶏ささみ肉の食味試験
（１）除菌剤の浸漬工程
プラスチック容器に、除菌剤７を３２０ｍＬ分注した。次いで、３ｃｍ×１４ｃｍの鶏ささみ肉（６０ｇ）を３０秒間、常温で浸漬させた。次いで、浸漬させた鶏ささみ肉の水分をペーパータオルで拭き取った。
【００６８】
（２）食味試験
次いで、鶏ささみ肉を約２ｃｍ×３ｃｍ四方にカットした。次いで、カットした鶏ささみ肉の肉片をオーブンで加熱調理した。次いで、調理後の肉片について、食味試験を行った。
対照として、除菌剤に未浸漬の肉片を用いた。旨味、苦味、香り（エタノール臭）及び食感について、５段階評価で評価した。なお、数値が大きいほど、各評価項目を強く呈し、一方、数値が低いほど各評価項目を弱く呈することを意味する。
２２〜２５歳の２０名の男女をパネラーとして、各肉片を評価した結果の平均値を図６に示す。
【００６９】
図６から、除菌剤に浸漬した肉片と、除菌剤に未浸漬の肉片とで、旨味及び食感について差異は見られなかった。また、除菌剤に浸漬した肉片は、除菌剤に未浸漬の肉片と比較して、やや苦味が低減される傾向が見られた。
【００７０】
［試験例６］除菌剤の保存性確認試験
次いで、除菌剤として、ナイシン含有の７０ｖ／ｖ％又は８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ、２ｍｇ／２０ｍＬ及び２ｍｇ／１０ｍＬ）を常温又は４℃、遮光有り又は遮光無し条件下で、最大１８週間保存した。保存開始１日目、その後は１週間ごとに、各溶液におけるナイシンの残存活性を寒天拡散法（ａｇａｒ−ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により求めた。各経過日数において、活性測定は少なくとも３回以上行った。
【００７１】
なお、寒天拡散法によるナイシンの活性測定は、下記示す手順により行った。
まず、指標菌L. delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002TをＭＲＳ培地で３７℃、１８〜２４時間培養し、同培地で１０分の１に希釈した。次いで、この希釈菌液２５０μＬを、恒温（５０℃）水浴保持しておいたＭＲＳ軟寒天培地（０．７５％（ｗ／ｖ））１０ｍＬに混合した。その後、この混合液をＭＲＳ寒天培地（１．５％（ｗ／ｖ））に重層にて固化させ、Ｎｏ．２コルクボーラーを用いて孔（ウェル、直径６ｍｍ）を作製した。また、除菌剤であるナイシン含有エタノール溶液の希釈には、各濃度のエタノールを用いて、２ｎ倍（ｎ：整数）に段階希釈した。その後、試験（希釈）溶液６５μＬを各ウェルに注入し、３７℃、１８時間にて培養した。抗菌活性値は、生育阻止円の認められた最も高い希釈濃度の逆数値と定義し、その単位をＡｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔ（ＡＵ）／ｍＬで表した。
【００７２】
また、ナイシン含有の７０ｖ／ｖ％又は８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ）を−１５℃、遮光あり条件下で、９週間保存した。保存開始１日目、その後は１週間ごとに、各溶液におけるナイシンの残存活性を寒天拡散法により求めた。各経過日数において、活性測定は少なくとも３回以上行った。
それぞれの結果を図７Ａ〜図７Ｆに示す。
図７Ａは、各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
図７Ｂは、各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／４０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
図７Ｃは、各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／２０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
図７Ｄは、各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／２０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
図７Ｅは、各種条件で保存したナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／１０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
図７Ｆは、各種条件で保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（ナイシンの含有量：２ｍｇ／１０ｍＬ）中のナイシンの残存活性の経時的な変化を示すグラフである。
【００７３】
図７Ａ及び図７Ｂから、ナイシンの含有量が２ｍｇ／４０ｍＬであるナイシン含有エタノール溶液において、常温保存のナイシン含有エタノール溶液（遮光無し）は、７０ｖ／ｖ％エタノールでは調製から２週間で、８０ｖ／ｖ％エタノールでは調製から４週間で失活した。４℃保存のナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光有り）では調製から８週間目、４℃保存のナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光有り）では調製から４週間目（調製から１８週間目も調製直後の８分の１の活性が確認）、−１５℃保存のナイシン含有７０ｖ／ｖ％及び８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光有り）では調製から６週間目まで６０００ＡＵ／ｍＬ程度の活性が維持された。また、常温保存及び４℃保存、それぞれにおいて、遮光有り条件と遮光無し条件とを比較したところ、遮光有り条件で高い活性が維持された。
【００７４】
図７Ｃ及び図７Ｄから、ナイシンの含有量が２ｍｇ／２０ｍＬであるナイシン含有エタノール溶液において、常温保存のナイシン含有エタノール溶液（遮光無し）は、７０ｖ／ｖ％エタノールでは調製から２週間で活性が大幅に低下し、４週間で失活し、８０ｖ／ｖ％エタノールでは２週間で失活した。一方、４℃保存のナイシン含有エタノール溶液では７０ｖ／ｖ％エタノール及び８０ｖ／ｖ％エタノール共に調製から４週間目までに失活することはなかった。なお、ナイシンの含有量が２ｍｇ／２０ｍＬであるナイシン含有エタノール溶液では７０ｖ／ｖ％エタノール及び８０ｖ／ｖ％エタノール共に、ナイシンの活性安定性を欠く傾向が認められた。
【００７５】
図７Ｅ及び図７Ｆから、ナイシンの含有量が２ｍｇ／１０ｍＬであるナイシン含有エタノール溶液において、常温保存のナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光無し）では、調製から２週間目で活性が大幅に低下し、６週間目で失活したが、４℃保存のナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光無し）では、調製から４週間目まで調製直後の活性を維持した。また、常温保存のナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光無し）では、調製から２週間目で活性が大幅に低下し、６週間で失活したが、４℃保存のナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光無し）では、調製から４週間目まで調製直後の活性を維持し、８週間目まで５０％の活性が維持された。なお、常温保存のナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（遮光有り）では調製から２週間目で活性が大幅に低下し、その後は徐々に活性が低下することが明らかになった。
【００７６】
以上のことから、ナイシン含有エタノール溶液の保存条件としては、４℃で遮光有りが最適であることが明らかとなった。
【００７７】
［試験例７］除菌剤のL. lactis NBRC12007（ナイシン生産菌）に対する噴射試験
指標菌液をＰＢＳで１０ｎ倍（ｎ：整数）に段階希釈した後（生菌数は塗抹平板培養法により求めた）、１０−５希釈液（１００μＬ）を１．５％（ｗ／ｖ）ＧＭ１７寒天平板培地に滴下し、コンラージ棒で菌液が乾くまで塗抹した。その後、菌液を塗沫した寒天平板培地に、ナイシン含有ＰＢＳ溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）、２０ｖ／ｖ％エタノール単独、ナイシン含有２０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）、７０ｖ／ｖ％エタノール単独、８０ｖ／ｖ％エタノール単独、ナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）、又は、ナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）をスプレーで噴射し、常温で１分間静置した。その後、各溶液を噴射した寒天平板培地を３０℃、約１８時間培養し、各溶液を噴射し培養後の菌数（Ｘ２）を測定した。また、予め各溶液の噴射前の菌数（Ｘ１）を測定しておいた。これにより、各溶液の噴射前の菌数（Ｘ１）に対する各溶液を噴射し培養後に減少した菌数（Ｘ１−Ｘ２）の割合｛（Ｘ１−Ｘ２）／Ｘ１×１００｝を菌数の減少率（％）として算出し、その結果を図８に示す。
【００７８】
図８から、ナイシン含有ＰＢＳ溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）、２０ｖ／ｖ％エタノール単独、及び、ナイシン含有２０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）では、菌数の減少率はそれぞれ３６．４％、４３．２％及び４１％であった。一方、７０ｖ／ｖ％エタノール単独、８０ｖ／ｖ％エタノール単独、ナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）及びナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）では、菌数の減少率は１００％であった。
【００７９】
以上のことから、ナイシン含有７０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）及びナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）は、除菌剤として有用であることが確かめられた。
【００８０】
［試験例８］
１．シンク表面分離菌に対する除菌剤の噴射殺菌試験
発明者らの研究室のシンク表面より綿棒で菌（以下、「シンク表面分離菌」と称する場合がある）を回収し、ＰＢＳ１００μＬを分注した１．５ｍＬ容エッペンチューブ内で撹拌し指標菌液とした。次いで、指標菌液をＰＢＳで１０ｎ倍（ｎ：整数）に段階希釈（生菌数は塗抹平板培養法により求めた）した。その後、１０分の１の希釈液（１００μＬ）を１．５％（ｗ／ｖ）ＬＢ寒天平板培地に滴下し、コンラージ棒で菌液が乾くまで塗抹した。なお、ＬＢ寒天平板培地の含有成分としては、０．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔ（登録商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔ（登録商標）  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ社製）及び１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌであった。続いて、スプレー瓶を用いて８０ｖ／ｖ％エタノール単独、及び、４℃、遮光有りの条件で８週間保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）を、各塗抹ＬＢ寒天平板培地に１回（約０．８ｍＬ）噴射した。なお、本実験では、実用化に適した簡易的な噴射を想定し、ＬＢ寒天平板培地の３ｃｍ上斜め４５°の角度から噴射した。また、１０−１希釈菌液（１００μＬ）を滴下し、菌液が乾くまで塗抹したＬＢ寒天平板培地を本実験におけるブランクとし、各寒天平板プレートを倒置して３７℃で１８時間培養後、菌数を測定した。各プレートあたりの生菌数（ＣＦＵ）を図９に示す。
【００８１】
図９から、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液噴射時の生菌数と比較して、ナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）において生菌数が大幅に減少した。これにより、シンク表面に付着している菌に対するエタノール及びナイシンの相乗抗菌効果とその有効性が認められた。
【００８２】
２．シンク表面分離菌の菌種同定
上記「１．」においてブランクとして使用した菌を純化して、２種のシンク表面分離菌株のシングルコロニーを得た。得られた２種のシンク表面分離菌のシングルコロニーを用いて、常法に従い、染色体ＤＮＡを抽出した。次いで、抽出したＤＮＡについて、ＰＣＲ法により１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ（１６Ｓｒ）ＤＮＡを増幅し、シークエンス解析を行った。シンク表面分離菌の１６Ｓｒ  ＤＮＡ（Ｖ３−Ｖ４領域）のシーケンス解析は、ＤＮＡシーケンサーを用い、得られたデータの相同性解析は、Ｈ−Ｉｎｖ  ＤＢ  ＢＬＡＳＴ（http://www.h-invitational.jp/hinv/blast/blasttop.cgi）により行い、９６％以上の相同性が得られた配列のデータから、２種のシンク表面分離菌の菌種同定を行った。相同性の高い菌種（相同性９６％以上）を以下の表１に示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
表１から、シンク表面分離菌Ａ株はEnterobacter属又はKlebsiella属に属し、シンク表面分離菌Ｂ株はExiguobacterium属に属する可能性が示唆された。なお、Enterobacter属菌は、グラム陰性の非芽胞形成通性嫌気性の桿菌であり、日和見感染及び尿路感染症の原因菌の一つである。Klebsiella属菌は、グラム陰性桿菌の弱毒菌であり、菌交代現象を起こし、感染症を引き起こすことから昨今より問題となっている。また、Exiguobacterium属菌は、グラム陽性桿菌であり、発育温度が−２．５℃から５０℃までと幅広く、食品保存において注意すべき菌属である。
【００８５】
３．シンク表面分離菌Ａ株及びＢ株に対する除菌剤の噴射試験
シンク表面分離菌Ａ株及びＢ株を用いた以外は、「１．」と同様の方法を用いて、除菌剤の噴射試験を行った。なお、シンク表面分離菌Ａ及びＢをそれぞれ塗沫したＬＢ寒天平板培地２枚ずつに、ナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）を噴射した。シンク表面分離菌Ａ株での結果を図１０Ａに、シンク表面分離菌Ｂ株での結果を図１０Ｂに示す。
【００８６】
図１０Ａから、シンク表面分離菌Ａ株では、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液単独の噴射での生菌数に比べて、ナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）で生菌数が大幅に減少した。また、図１０Ｂから、シンク表面分離菌Ｂ株では、８０ｖ／ｖ％エタノール溶液単独及びナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ）に生菌は検出されなかった。
また、４℃、遮光有りの条件で１８週間保存したナイシン含有８０ｖ／ｖ％エタノール溶液（２ｍｇ／４０ｍＬ、活性値：１５７５４ＡＵ／ｍＬ）においても、エタノールとの共存によりナイシンがシンク表面分離菌Ａ株及びＢ株に対して十分な相乗抗菌効果を示すことが確かめられた（図示せず）。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本実施形態の除菌剤は、ナイシンと、６０ｖ／ｖ％以上の高濃度エタノールとを含むことで、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれに対しても、優れた除菌効果を有する。
また、本実施形態の除菌剤に含まれるエタノール及びナイシンは、すでに食品添加剤として食品への使用が認可されている。そのため、本実施形態の除菌剤は高い安全性を有する。
また、本実施形態の除菌方法によれば、除菌対象物を効果的且つ安全に除菌することができる。
また、本実施形態の除菌キットは、ナイシンと、６０ｖ／ｖ％以上の高濃度エタノールとを備えており、必要に応じてナイシンが任意の濃度になるように混合することで、簡便に除菌剤を調製することができる。また、本実施形態の除菌キットを用いて調製された除菌剤は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれに対しても、優れた除菌効果を有する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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