(57)【要約】【課題】ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル（式（Ｉ）で表される化合物）の新規な用途を提供する。【解決手段】以下の式（Ｉ）【化１】2018203687.tif 000006で表される化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗老化剤。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）
【化１】
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で表される化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項２】
請求項１記載の抗老化剤を含有するアルツハイマーの予防・治療薬。
【請求項３】
請求項１記載の抗老化剤を含有する皮膚のしみ・しわ予防・治療薬。
【請求項４】
請求項１記載の抗老化剤を含有するメタボリックシンドロームおよびそれを原因とする疾患の予防・治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル（式（Ｉ）で表される化合物）、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を有効成分とする抗老化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＫ１ (RAC/CDC42-activated kinase 1) と呼ばれるセリン／スレオニンを燐酸化する蛋白キナーゼが、発癌性を持つばかりではなく、老化現象にも深く関与するいわゆる「悪玉酵素」であり、癌や認知症などを含む一連の難病の原因になっていることが判明した。しかも、ＰＡＫ１は正常な細胞の増殖には必須ではないばかりか、薬剤耐性の主因がＰＡＫ１の異常な活性化であることも明らかになった（非特許文献１、２）。
【０００３】
本発明者らは、上記ＰＡＫ１を阻害する化合物をクリックケミストリーと呼ばれる化学反応で、ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステル等が、優れたＰＡＫ１遮断剤になりうることを見出し、特許出願した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第６０８２４８８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】丸田 浩 (2001).「癌との闘い: "シグナル" 療法と "遺伝子" 療法」(共立出版)
【非特許文献２】Maruta H (2014). Herbal therapeutics that block the oncogenic kinase PAK1: A practical approach towards PAK1-dependent diseases and longevity. Phytother Res 28: 656-72.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステルがＰＡＫ１を阻害するところまでは見出していたが、特定の用途に特に有効であることまでは見出していなかった。
【０００７】
従って、本発明者らは、ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステルの新規な用途を見出すことを本発明の課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステルについて、鋭意研究を進めたところ、この化合物が線虫の寿命延長効果、すなわち、抗老化作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の式（Ｉ）
【化１】
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で表される化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする抗老化剤である。
【００１０】
また、本発明は、上記抗老化剤を含有するアルツハイマー予防・治療薬、皮膚のしみ・しわ予防・治療薬、メタボリックシンドロームおよびそれを原因とする疾患の予防・治療薬である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗老化剤は、老化を抑制することができる。従って、本発明の抗老化剤は、高齢化、加齢等の老化に関連した疾患等の予防、治療、予防・治療（予防と治療）、改善、抑制等に役立つ。また、本発明の抗老化剤は線虫に対して長寿性の特性を示し、ブラインシュリンプに対して毒性を示さないため、副作用を引き起こすこともない。
【００１２】
そのため、本発明の抗老化剤は、これを有効成分とすることにより、アルツハイマー予防・治療薬、皮膚のしみ・しわ予防・治療薬、メタボリックシンドロームおよびそれを原因とする疾患の予防・治療薬とすることができる。
【００１３】
また、本発明の抗老化剤の有効成分である１５Ｋは、ＰＡＫ１のみを特異的に阻害し、他の生命活動に必須なＰＡＫｓ（ＰＡＫ２〜ＰＡＫ６）を阻害しないため、老化に限らず種々の疾患の作用機構の解明に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】C.エレガンスのBrood sizeに対する１５Ｋの影響を示す図である。線虫はこの薬物の異なる濃度で処理され、成虫の卵の数（受精率）がカウントされた。１５Ｋは、対照（N2野生型）と比較して、Brood sizeを有意に減少させた。結果は、各治療につき9反復を用いた3つの独立した実験の平均±SEである。アスタリスクは、処置と対照との間の統計的有意性を示す。 * 0.01≦p≦0.05、** p <0.01、*** p <0.001
【図２】１５Ｋは、HSP16.2 :: GFP融合遺伝子を含むCL2070 C.エレガンスにおけるHSP16.2遺伝子発現をアップレギュレーションすることを示す図である。左側（A）：１５Ｋの異なる濃度で処理されたコントロール線虫および線虫におけるHSP16.2 :: GFP発現の画像。右側（B）：各CL2070群でGFP強度を定量化した。各値は、各治療につき6反復（18回の測定）の平均±SEを表す。アスタリスクは、処置と対照との間の統計的有意性を示す。 * 0.01≦p≦0.05、** p <0.01、*** p <0.001
【図３】１５ＫはC.エレガンスの寿命を促進することを示す図である。左側（A）：2つの独立した試験（各処置につき8つの複製）からの１５Ｋ処置後の線虫の生存分析。右側（B）：１５Ｋ処置後の中央生存時間（MST）。アスタリスクは、処置と対照との間の統計的有意性を示す図である。 * 0.01≦p≦0.05、** p <0.01、*** p <0.001
【図４】ブラインシュリンプに対し、１５Ｋは毒性がないことを示す図である。ブラインシュリンプ（Artemia salina）幼生を１５℃で２４時間および４８時間、２０℃でインキュベートした。死んだ幼生の数および幼生の総数を虫眼鏡（５倍または１０倍）を用いて数えた。結果は平均±ＳＥとして表された。ダンカンの５％確率検定では、異なる集団平均間に有意差は認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の抗老化剤の有効成分は、下記一般式（１）で示される化合物、あるいはこの化合物の薬学的に許容される塩である。
【化２】
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【００１６】
この一般式（１）で示される化合物は、ケトロラックの1,2,3-methylene-Triazolyl エステルである（以下、この化合物を「１５Ｋ」という）。この１５Ｋは特許第６０８２４８８号の製造例３に基づいて合成することができる。なお、１５Ｋは原料であるケトロラックがラセミ体（５０／５０）であるため、１５Ｋもラセミ混合物である。なお、１５Ｋの（Ｒ）体のみがＰＡＫ１を阻害するものであるが、（Ｓ）体はＣＯＸ−２を直接阻害することが知られている（Guo Y, Kenney SR Jr2, Muller CY, et al (2015). R-ketorolac Targets Cdc42 and Rac1 and Alters Ovarian Cancer Cell Behaviors Critical for Invasion and Metastasis. Mol Cancer Ther. 14;  2215-27.）。そして、（Ｓ）体は（Ｒ）体のＰＡＫ１の阻害作用を阻害することはないため、１５Ｋは光学分割されていなくてもよいが、好ましくはＲ体である。１５Ｋを光学分割する場合、公知の光学分割の方法を用いることができる。
【００１７】
上記１５Ｋは、公知の方法により、例えば、塩酸塩等の薬学的に許容される塩とすることができる。
【００１８】
この１５Ｋあるいはこの化合物の薬学的に許容される塩は、そのまま抗老化剤として用いることもできるが、例えば、公知の賦形剤、基剤等と組み合わせて、錠剤、カプセル、粉薬等の経口投与用の剤形や、軟膏、クリーム、化粧水等の皮膚投与用の剤形、注射、パッチ等の非経口投与用の剤型等としてもよい。なお、この抗老化剤は、その他の抗老化作用を有する薬剤や、その他各種薬剤と組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
本発明の抗老化剤の投与量は、特に限定されないが、経口投与用や非経口投与用の剤形の場合、上記１５Ｋあるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を、各剤中、例えば、１日分として、１〜１０ｍｇ含有させればよい。また、皮膚投与用の剤形の場合、上記１５Ｋあるいはこの化合物の薬学的に許容される塩を、各剤中、例えば、１日分として、０.１〜１ｍｇ／ｍｌで含有させればよい。
【００２０】
以上説明した本発明の抗老化剤は、高齢化または加齢に関連した疾患の患者の身体の老化を防止することができる。なお、本発明の抗老化剤はＰＡＫ１のみを特異的に阻害するため副作用がないと考えられる。
【００２１】
具体的に、本発明の抗老化剤は、細胞透過性が高く、脳関門を通過することが出来るＰＡＫ１阻害剤であるため、これを有効成分とすることにより、アルツハイマーの予防・治療薬となる。また、本発明の抗老化剤はアルツハイマーの予防・治療だけでなく、脳と関連ある疾患、例えば、脳腫瘍、認知症、鬱病、パーキンソン病等も予防・治療できる可能性がある。
【００２２】
また、本発明の抗老化剤は、細胞透過性が高く、チロシナーゼを阻害し、メラニンの生合成を抑えるＰＡＫ１阻害剤であるため、これを有効成分とすることにより、皮膚のしみ・しわ予防・治療薬となる。
【００２３】
更に、本発明の抗老化剤は、細胞透過性が高く、脳関門を通過することが出来るＰＡＫ１阻害剤であるため、これを有効成分とすることにより、メタボリックシンドロームおよびそれを原因とする疾患の予防・治療剤となる。メタボリックシンドロームを原因とする疾患としては、例えば、糖尿病（２型）、高血圧、肥満症等が挙げられる。
【００２４】
上記した、アルツハイマーの予防・治療薬、皮膚のしみ・しわ予防・治療薬、タボリックシンドロームおよびそれを原因とする疾患の予防・治療薬は、これの有効成分である抗老化剤と同じ剤型、投与量で、投与部位に適宜あわせて選択して用いることができる。
【００２５】
なお、本発明の抗老化剤の有効成分である１５Ｋは、ＰＡＫ１のみを特異的に阻害し、他の生命活動に必須なＰＡＫｓ（ＰＡＫ２〜ＰＡＫ６）を阻害しないため、老化に限らず種々の疾患の作用機構の解明に役立つ。例えば、抗老化作用のある１５ＫがＰＡＫ１のみを特異的に阻害し、他の生命活動に必須なＰＡＫｓ（ＰＡＫ２〜ＰＡＫ６）を阻害しない原因を究明すれば、長寿の作用機構を解明できる可能性がある。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を製造例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら製造例および実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
参  考  例  １
１５Ｋの調製：
（Ｒ,Ｓ）−ケトロラック（ラセミ体：５０／５０）（２０２ｍｇ（７９４μｍｏｌ））のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に対して、０℃でＥＤＣ塩酸塩（１５６ｍｇ（８１３μｍｏｌ））とＤＭＡＰ（６０ｍｇ（４９１μｍｏｌ））を加えた。この反応液にプロパルギルアルコール（２００μｌ（３.４３ｍｍｏｌ））を滴下し、室温で５時間撹拌した。０.５Ｍの塩酸２０ｍｌでクエンチした後、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で抽出を行い、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し芒硝で脱水後にエバポレーターで減圧留去して残渣を得た。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）して化合物Ａ（１４７ｍｇ（５０１μｍｏｌ））を収率６３％、淡黄色オイル状で得た。
【００２８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.81 (d, J = 7.79 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 7.26 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 7.26 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 3.63 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 4.67 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 2.60 Hz, 2H), 4.61-4.55 (m, 1H), 4.48-4.41 (m, 1H), 4.14-4.09 (q, 1H), 2.99-2.90 (m, 1H), 2.86-2.77 (m, 1H) 2.50 (t, J = 2.20 Hz, 1H).
【００２９】
化合物Ａ（１９０ｍｇ（６４８μｍｏｌ））のＴＨＦ：水（１：１）の混合溶液４ｍｌに対して、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（６５ｍｇ（３２８μｍｏｌ））と硫酸銅無水物（２１ｍｇ（１３１μｍｏｌ））を室温で加えた。この反応液に０.５Ｍの２−アジドアニソール（１.２０ｍｌ（６００μｍｏｌ））を加え、原料が消えるまで５時間撹拌した。これを酢酸エチル２０ｍｌで３回抽出し、抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し硫酸マグネシウムで脱水後にエバポレーターで減圧留去して、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）して１５Ｋ（１９１ｍｇ（４３２μｍｏｌ））を収率８５％、うすい褐色のオイル状で得た。
【００３０】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.15 (s, 1H), 7.80-7.76 (m, 3H), 7.51 (t, J = 7.42 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 3H), 7.12-7.06 (m, 2H), 6.78 (d, J = 3.60 Hz, 1H), 6.07 (d, J = 4.11 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 4.60-4.53 (m, 1H), 4.46-4.40 (m, 1H), 4.14-4.08 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.98-2.09 (m, 1H), 2.85-2.75 (m, 1H). HRMS calcd for C25H23N4O4 (M+H)+ m/z 443.1719, found m/z 443.1737.
【００３１】
実  施  例  １
線虫投与試験：
＜材料および方法＞
（１）C.エレガンス株および試薬
C.エレガンスの野生型Ｎ２株（var.Bristol）、HSP16.2 :: GFP融合遺伝子（GFP cDNAに結合したHSP16.2遺伝子のプロモーター）を有するトランスジェニック株CL2070（dvls）および大腸菌のOP50株は、ミネソタ大学のCaenorhabditis Genetics Center（CGC）から入手した。１５Ｋは参考例１で調製したものを用いた。5-Fluoro-2'-deoxyuridine（FUdR）とアジ化ナトリウムは、それぞれKanto Chemicals（Tokyo、Japan）および和光純薬工業（株）から購入した。
【００３２】
（２）Brood sizeアッセイ
野生型Ｎ２（約20匹）を、１５Ｋ（25,50および100nM）の非存在下または存在下で、飼料源として大腸菌OP50を補充した線虫成長培地（NGM）寒天プレート上に播種した。プレートを20℃で2〜3日間インキュベートした。成虫の線虫が卵を産卵し始めてから10時間後に、各処置および対照によって飼育された卵の数を数えた。母親当たりの卵数を用いてBrood sizeを計算した（Yanase S, Luo Y, Maruta H. PAK1-deficiency/down-regulation reduces brood size, activates HSP16.2 gene and extends lifespan in C. elegans. Drug Dev Ther. 2013; 7:29-35.; Taira N, Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S. Effect of Okinawa propolis on PAK1 activity, Caenorhabditis elegans longevity, melanogenesis, and growth of cancer cells. J Agric Food Chem. 2016; 64:5484-5489.）。
【００３３】
（３）HSP16.2依存性GFP発現の評価
HSP16.2依存性GFP発現は、トランスジェニックC.エレガンスCL2070で測定した。成体CL2070線虫（20〜30匹）を、１５Ｋ（50および100nM）の非存在下（対照）または存在下でNGM寒天プレートに移し、大腸菌OP50を与え、20℃で48時間インキュベートした。子孫産生を防止するために、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUdR）（0.5mg / mL）を添加した。その後、35℃で2時間熱ショックを受け、回復のために20℃で3時間保持した。顕微鏡で蛍光を測定する前に、線虫を0.5Mアジ化ナトリウム（1μL）で固定した。GFPトランスジェニック線虫の写真は、KEYENCE BZ-X700蛍光顕微鏡（Taira et al.,2016）を用いて得た。
【００３４】
（４）ライフスパンアッセイ
L1期の野生型Ｎ２線虫（60-100虫）をNGM寒天プレートに移し、大腸菌OP50を与えた。 L4段階の線虫を異なる濃度（50および100nM）で１５Ｋで処理し、溶媒を試料を溶解するために使用した（対照として）。子孫産生を防止するために、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUdR）（0.5mg/mL）を添加した。OP50は、適切なときに（約2日おきに）供給された。生存している線虫の数を2日ごとに数え、生存率（％）は0日目の線虫の数ごとにカウントした日数で割って計算した（Taira et al.,2016）。
【００３５】
（５）安全性試験
１５Ｋをブラインシュリンプ（Artemia salina）幼虫に施用して、改変された方法（Solis, P.N.; Wright, C.W.; Anderson, M.M.; Gupta, M.P.; Phillipson, J.D. A microwell cytotoxicity assay using Artemiasalina(brine shrimp). Planta Med. 1993, 59, 250-252.）に従ってその毒性を決定した。まず、乾燥酵母を補充した人工海水中のブラインシュリンプの卵（Tetra Brine Shrimp Eggs、Tetra Japan Co.、Ltd.）を、28℃で48時間、適切な通気で孵化させた。次いで、幼生を人工海水を入れたガラスペトリ皿に移し、96穴プレートの各ウェルに、幼生を含む人工海水100μLを移した。その後、１５Ｋを人工海水で希釈し、各ウェルに添加した。DMSOの最終濃度を1％v / vに維持した。DMSO（1％）を対照ウェルに用いた。幼生を20℃で24時間、48時間、１５Ｋでインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの死んだ幼生の数を拡大レンズ（5倍または10倍）を用いて計数した。次いでメタノール（50μL）を各ウェルに添加し、1時間後に各ウェル中の幼生の総数を最終的にカウントした。最初に各ウェルの死亡率を決定し、その後、SreeshmaおよびNairに従って補正した（Sreeshma, L.S.; Nair, B.R. Brine shrimp lethality assay in two species of biophytumdc.(oxalidaceae). Int. J. Pharm. Sci. 2014, 6, 582-586.）。補正された死亡率を100から引いて、生存率を得た。その結果を図４に示した。
【００３６】
（６）統計分析
統計的分析システム（SAS）ソフトウェア、バージョン9.1.3（SAS Institute Inc.,Cary、NC、USA）を使用して一元配置ANOVAによってデータの有意性を評価した。すべての計算はMicrosoft Excel 2003で行った。中央生存期間（MST）はKaplan-Meier生存曲線と対数ランク検定で解析した。 P≦0.05を有意とみなした。
【００３７】
＜結果＞
Brood sizeは、長寿命の2つの良い指標の1つであるため、野生型Ｎ２線虫のBrood sizeにおける１５Ｋの効果を最初に試験した。図１に示されるように、１５Ｋは対照（１５Ｋ処置なし）と比較して50および100nMでそれぞれ62％および72％の減少で用量依存的にBrood sizeを有意に減少させた。
【００３８】
本発明者らは、HSP16.2遺伝子プロモーターと併せてGFPを保持するCL2070 C.エレガンス株の熱ショック処理後の初期段階におけるHSP16.2遺伝子発現に対する１５Ｋの効果を試験した。緑色蛍光タンパク質（GFP）は熱ショック処理条件下でのみ発現し、GFP発現レベルは35℃の熱ショック処理（Link, C.D.; Cypser, J.R.; Johnson, C.J.; Johnson, T.E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress Chaperones. 1999, 4, 235-242.）のために4時間後に徐々に減少するので、１５Ｋ処理したCL2070線虫は、35℃で2時間ショックを受け、回復のために3時間保持した。結果は、対照と比較して１５Ｋが50nMで約30％および100nMで約35％（図２Ａ）のHSP16.2遺伝子発現をアップレギュレートしたことを示した（図２Ｂ）。
【００３９】
１５ＫはBrood sizeを減らし、HSP16.2遺伝子を活性化したので（長寿命のための2つの良い予測因子）、我々は野生型Ｎ２の寿命を１５Ｋ給餌した線虫と対照との間で比較した。予想通り、この１５Ｋにより線虫の寿命が延長された。１５Ｋ処理線虫の50％は最初の20日間生存したが、１５Ｋ処理されていない線虫は最初の16日間のみ生存した（図３Ａ）。50nMおよび100nMの１５Ｋを与えた線虫の中央生存時間（MST）の有意な増加があった。１５Ｋを50回給餌した線虫は30％MST増加し、１５Ｋを100回給餌した線虫は25％MST増加した（図３Ｂ）。また、安全性試験の結果、１５Ｋはブラインシュリンプに対し、毒性を示さないことが分かった（図４）。
【００４０】
以上のことから、１５Ｋは、Brood sizeを減少し、HSP16.2遺伝子発現を活性化し、線虫の寿命を延ばすことによって長寿性の特性を示す合成PAK1遮断剤の最初の例である。そのため、１５Ｋは副作用を引き起こすことなく抗老化剤として利用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の抗老化剤は、高齢化、加齢等の老化に関連した疾患等の予防、治療、予防・治療、改善、抑制等に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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