(57)【要約】      （修正有）【課題】混入している桿状のウイルス、例えば、バキュロウイルス等を、本質的に球状のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス遺伝子療法ベクター等の調製物から除去する為の方法の提供。【解決手段】バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を分離する方法で、パルボウイルスビリオンの集団及びバキュロウイルスビリオンの集団を含む試料を接線流濾過方式によるフィルターで濾過するステップを含み、前記フィルターが３０〜７０ｎｍの公称孔径を有する、方法。試料を濾過する前に密度勾配、予備濾過、クロマトグラフィーステップ及びこれらの組み合せから選択される方法により予備精製されることが好ましい方法。好ましくは、ハルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、方法。フィルターが、ウイルスフィルター又は限外濾過膜であり、サーフェスフィルター及び／又はデプスフィルターである方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を分離するための方法であって、パルボウイルスビリオンの集団及びバキュロウイルスビリオンの集団を含む試料をフィルターで濾過するステップを含み、前記フィルターが３０〜７０ｎｍの公称孔径を有する、方法。
【請求項２】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バキュロウイルスがアウトグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
フィルターがウイルスフィルター又は限外濾過膜である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フィルターがサーフェスフィルター及び／又はデプスフィルターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フィルターが、銅アンモニア再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド又は再生セルロースからなる群から選択される材料を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィルターが３０〜４０ｎｍの公称孔径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルターが３２〜３８ｎｍの公称孔径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
フィルターが、銅アンモニア再生セルロース、好ましくは銅アンモニア再生セルロース中空糸を含み、より好ましくはフィルターがプラノバ３５膜又はウルチポアＤＶ５０フィルターである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を、２つ以上のフィルターを使用する濾過に供する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
濾過するステップの前の前記試料が、密度勾配、予備濾過、クロマトグラフィーステップ、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、並びにこれらの方法の組み合わせからなる群から選択される方法を使用して予備精製される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
予備濾過が、孔径が７０〜２００ｎｍのフィルターによって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料のｐＨが６〜１０、好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、最も好ましくは約８である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスフィルター表面１ｃｍ２当たり試料１〜２００ｍｌ、好ましくは１ｃｍ２当たり８０〜１２０ｍｌが濾過される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
パルボウイルスの少なくとも８５％が溶出し、バキュロウイルスの力価が少なくとも５ｌｏｇ低下する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ウイルス学及び遺伝子療法の分野に関する。特に、本発明は、混入している桿状のウイルス、例えば、バキュロウイルス等を、本質的に球状のウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス遺伝子療法ベクター等の調製物から除去するための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
遺伝子療法において使用するためのウイルスベクターの生産では、安全上の理由で複製欠損性ウイルスが使用される。複製欠損性ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト細胞に感染し、その細胞に導入遺伝子を移入することができるが、細胞において自ら複製することができない。一般には、複製欠損性ウイルスは、例えば、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子等の、ウイルスの複製のために重要なウイルス遺伝子を欠失させることによって実現される。これにより、対象の遺伝子産物（複数可）をウイルス遺伝子の代わりに組み込むことも可能になる。宿主細胞においてウイルス粒子を生成するために、複製欠損性ウイルスから欠失しているウイルス遺伝子を別々に、例えば、ヘルパーウイルスを用意することによってもたらす必要がある。
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、直径およそ１８〜２６ｎｍの外側の正二十面体の構造タンパク質の被膜を有する一本鎖のＤＮＡ分子を構成する非自己複製性ウイルスである。野生型ＡＡＶウイルスは、宿主細胞のゲノム内に統合すること、又はヘルパーウイルスの存在下で宿主細胞において複製することができる。アデノウイルスは、有望なヘルパーウイルスとして最初に同定された。しかし、ヒト及び動物に対して病原性であるヘルペスウイルス等の他の本質的に球形状の哺乳動物ヘルパーウイルスも適切である。近年、昆虫細胞においてバキュロウイルスベースの発現系によってアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを生産すること（Ｕｒａｂｅら［２００２］  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（１６）：１９３５−４３）が、遺伝子療法の工業的な応用のために容易に規模を変えることができるので、ますます一般的になっている。この生産系では、一般にはＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子及びＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）が隣接する対象の遺伝子産物（導入遺伝子ＤＮＡ）をコードする３つの組換えバキュロウイルスが使用される。
【０００４】
ヘルパーウイルス又はウイルスベースの発現系を使用したウイルスベクターの調製に伴う重大な不都合は、生産物のウイルス粒子とヘルパーウイルスとが混在する集団が形成され、それをさらに精製しなければならないことである。遺伝子療法においてウイルスベクターを使用する場合、混入ウイルスには潜在的な病原性及び／又は免疫原性があるので、例えばアデノウイルス又はバキュロウイルス等の混入ウイルスは回避するか最小限にするかしなければならない。
【０００５】
ヘルパーウイルスを排除するためいくつかの方法が現在当技術分野で公知であるが、これらの方法全てに不都合がある。これらの方法の例は密度勾配遠心分離若しくは熱不活化又はそれらの組み合わせである。しかし、密度勾配遠心分離は、経済的に、比較的小さな体積でのみ実行可能であり、したがって、この方法は工業的な規模では実行不可能である。熱不活化は、ＡＡＶとヘルパーウイルスとの熱安定性が異なることに基づく。例えば、アデノウイルスとＡＡＶとが混在する集団を５６〜６５℃まで加熱することにより、ヘルパーウイルスがほぼ選択的に熱不活化され、ＡＡＶの活性の損失はほんのわずかである。残念ながら、変性したヘルパーウイルスタンパク質はなお試料中に存在し、遺伝子療法において使用する際に患者の細胞性免疫応答を惹起できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、６７３３−６７４０）。
【０００６】
さらに、イオン交換（アニオン及び／又はカチオンベース）クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーを含めたカラムクロマトグラフィー法が、ＡＡＶベクターを精製するために開発されてきた。これらの方法により、ＡＡＶベクターの高度に濃縮された調製物がもたらされるが、これらの方法単独では、販売される医薬製品の規制要件を満たすヘルパーウイルスの十分な枯渇が示されることを確証することができない。
【０００７】
最後に、米国特許第６，４７９，２７３号には、組換えＡＡＶとアデノウイルス、すなわち、直径が実質的に異なる２つの本質的に球状のウイルスの分離は、両方のウイルスを含有する溶液を、孔径がおよそ５０ｎｍのフィルター膜又は孔径がおよそ３５ｎｍのフィルター膜を通して１回又は複数回濾過することによって実現されることが開示されている。ｒＡＡＶは直径がおよそ２５ｎｍであることが開示されており、また、アデノウイルスは直径がおよそ６５〜９０ｎｍといわれているが、それよりも大きな直径、例えば１００ｎｍ近くが文献において報告されている［Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＰａｒｋｓ（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（１０）：１６６４−１６６６；Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ（２００３）２００３年１月７日〜１０日、ＷＣＢＰ第７回年次総会、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ］。しかし、昆虫細胞においてバキュロウイルスベースの発現系によってＡＡＶベクターを生産したことに起因する混入ウイルスは、バキュロウイルス科（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）に由来し、したがって、桿状であり、長さおよそ２６０ｎｍ、直径およそ２０ｎｍである。（組換え）ＡＡＶは実質的に球状であり、直径がおよそ１８〜２６ｎｍであるので、バキュロウイルスは部分的に（２次元で）標的ウイルスと同様のサイズを有する。
【０００８】
規制要件、例えば、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＭＡ）によるヒト又は動物起源の細胞株に由来するバイオテクノロジー製品のウイルス安全性評価（ＩＣＨ  Ｑ５Ａ（Ｒ１））では、生物医薬品を精製するためのプロセスには、いかなる生産物以外のウイルスも除去できることが必要とされる。ウイルス混入物の除去は、「ウイルスクリアランス」又は「ウイルス除去」プロセスのステップによって実施され、通常、クロマトグラフィー及び／又はウイルス濾過によって得られる。「ウイルス不活化」プロセスのステップも、生産物以外のウイルスによって引き起こされる潜在的な病原性の影響を弱めるために使用される。このプロセスのステップは、通常、極端な物理的条件（例えば、ｐＨ、温度）及び／又は化学的条件（例えば、界面活性剤、溶媒）を含む。医薬製品は、通常およそ２００ｋＤａ未満のタンパク質であり、「ウイルス除去」プロセスはよく確立されている。しかし、数千ｋＤａのウイルスを含む遺伝子療法製品に関する比較的新しい種類の製品に対する「ウイルス除去」プロセスは、文書による十分な裏付けがない。特に、医薬製品が球状のウイルスであり、ウイルス混入物が桿状のウイルスである「ウイルス除去」のプロセスは未だ実証されていない。
【０００９】
したがって、当技術分野では、工業的な規模での使用が技術的且つ経済的に実行可能であり、ウイルスベースの発現系の生産物以外のウイルスを、ＡＡＶを含有する試料、好ましくはバキュロウイルスベースの発現系から得られた組換えＡＡＶ試料から部分的に又は完全に除去できる追加的な分離／精製方法が必要とされている。それにより、生産物以外のウイルスの潜在的な病原性及び／又は免疫原性が低下する。特に、当技術分野では、生産物以外のウイルスが、長さがＡＡＶの直径の数倍であるが直径がＡＡＶと同様の桿状である場合の追加的な分離／精製方法が必要とされている。
【００１０】
［本発明の説明］
本発明の簡単な説明
第１の態様では、本発明は、バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を分離するための方法であって、パルボウイルスビリオンの集団及びバキュロウイルスビリオンの集団を含む試料を、パルボウイルスビリオンのみが通過できるフィルターで濾過するステップを含む方法に関する。フィルターは３０〜７０ｎｍ、より好ましくは３０〜４０ｎｍ、さらにより好ましくは３２〜３８ｎｍ、最も好ましくは（約）３５ｎｍの公称孔径を有することが好ましい。好ましい実施形態では、パルボウイルスはアデノ随伴ウイルスであり、バキュロウイルスはアウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）マルチカプシド（ｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ）核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）であることがより好ましい。
【００１１】
好ましい実施形態では、試料の濾過に使用するフィルターは、ウイルスフィルター又は限外濾過膜である。フィルターはサーフェスフィルター及び／又はデプスフィルターであることが好ましい。本発明の方法において使用するためのフィルターは、銅アンモニア再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、例えば、ポリエーテルスルホン、例えば、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン等、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド又は再生セルロースからなる群から選択される材料を含むことが好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのフィルターは、銅アンモニア再生セルロース、好ましくは銅アンモニア再生セルロース中空糸を含み、フィルターはプラノバ（Ｐｌａｎｏｖａ）（商標）３５膜（Ａｓａｈｉ  ＫＡＳＥＩ；ｗｗｗ．ｐｌａｎｏｖａｆｉｌｔｅｒｓ．ｃｏｍ）であることがより好ましい。別の好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのフィルターは、ウルチポア（Ｕｌｔｉｐｏｒ）（商標）ＶＦ  Ｇｒａｄｅ  ＤＶ５０ウイルス除去フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．；ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ）である。
【００１２】
本発明による方法のある実施形態では、試料を、２つ以上のフィルターを使用する濾過に供する。
【００１３】
本発明による方法では、試料を、濾過するステップの前に、密度勾配、予備濾過、クロマトグラフィーステップ、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、並びにこれらの方法の組み合わせからなる群から選択される方法を使用して予備精製することができる。予備濾過は、孔径が７０〜２００ｎｍのフィルターによって実施することが好ましい。本発明の方法に供される試料のｐＨは６〜１０、好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、最も好ましくは約８であることが好ましい。本発明のある実施形態では、ウイルスフィルター表面１ｃｍ２当たり試料１〜２００ｍｌ、好ましくは１ｃｍ２当たり８０〜１２０ｍｌが濾過される。
【００１４】
本発明の方法により、パルボウイルスの少なくとも８５％が溶出し、バキュロウイルスが少なくとも５ｌｏｇ、すなわち、１０×１０５低下することが好ましい。
【００１５】
定義
「ウイルス（ｖｉｒｕｓ）」又は「複数のウイルス（ｖｉｒｕｓｅｓ）」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するウイルス又は遺伝子操作によって改変されたウイルス（すなわち、いわゆる組換えウイルス）だけでなく、ウイルス粒子、すなわち、感染性ウイルスと非感染性ウイルスの両方、国際公開第９６／１１２７２号によるパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）様粒子等のウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）、並びに核酸を含有するが空であってもよいカプシド、及びその一部、特に、１つ又は複数の、好ましくは数個のサブユニット又はカプソメア、特にいくつかのカプソメアが会合して又は組み合わさってカプシドの少なくともおよそ５０％、好ましくは少なくとも８０％、特におよそ９０％を構成するようなカプシドも包含する。混合物から除去されるウイルスは、特に、本質的に球状ではない桿状構造を有するが、医薬製品であるウイルスは、本質的に球状、好ましくは正二十面体の形状である。さらに、「ウイルス」という用語は、そのウイルスのビリオンの集団、好ましくはウイルスの均一な集団を指し得ることが理解される。したがって、「パルボウイルス」という用語は、パルボウイルスビリオンの集団、好ましくはパルボウイルスビリオンの均一な集団を指し得る。
【００１６】
パルボウイルス科のウイルスは小さなＤＮＡの動物ウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書ではパルボウイルスと称され、ディペンドウイルス属を含む。それらの属の名称から推定することができる通り、ディペンドウイルスのメンバーは、通常、細胞培養物において増殖性感染するためにはアデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスとの同時感染を必要とするという点で独特である。
【００１７】
ディペンドウイルス属としては、通常ヒトに感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、血清型１及び４）、及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシアデノ随伴ウイルス、イヌアデノ随伴ウイルス、ウマアデノ随伴ウイルス、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。現在では、少なくともＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８及びＡＡＶ−９の血清学的に区別可能な種類を弁別することが可能である。ＡＡＶベクターは、直径が１８〜２６ｎｍ、一般には約２５ｎｍである外側の正二十面体の構造タンパク質の被膜を有する一本鎖のＤＮＡを構成する。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、第６９章、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３版、１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、本明細書においてＡＡＶについて言及することによってさらに例示及び説明されている。しかし、本発明は、ＡＡＶに限定されず、他のパルボウイルスに同等に適用できることが理解される。本発明は、野生型パルボウイルスに見いだされるサイズ（直径１８〜２６ｎｍ）と同様のサイズも有するキメラカプシドタンパク質及び／又はＡＡＶハイブリッドウイルス（又はシュードタイピングされたウイルス）を含むＡＡＶキメラウイルスにまで及ぶことも理解される。説明及びいくつかの例がＷＯ００２８００４において示されている。ＡＡＶキメラウイルス及び／又はハイブリッドウイルスの例は、例えば、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／３、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／５．２、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／９である。
【００１８】
ＡＡＶゲノムは、ウイルスの複製のために必要なタンパク質をコードするｒｅｐ遺伝子及びウイルスの構造タンパク質をコードするｃａｐ遺伝子からなる。複製のために必要であるｒｅｐ遺伝子（例えば、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ６８及び／又はｒｅｐ７８）又はカプシド構造に必要であるｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ−１、ＶＰ−２及び／又はＶＰ−３）のうちの１つ又は複数を、例えば、アデノ随伴ベクターを調製する際にウイルス内で導入遺伝子と置き換えることができる。５’末端及び３’末端になお存在するＩＴＲ領域が、導入遺伝子を感染性組換えＡＡＶ粒子にパッケージングするため及び組換えＡＡＶゲノムのＤＮＡを複製するために、シス活性エレメントとして必要である（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（７）：７９３−８０１）。「組換えパルボウイルスベクター又は組換えＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）とは、本明細書では、パルボウイルス又はＡＡＶの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接する対象のポリヌクレオチド配列、対象の遺伝子又は「導入遺伝子」を１つ又は複数含むベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターをより大きな核酸構築物（例えば、染色体、又は、クローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルス等の別のベクター）に組み込む場合には、ｒＡＡＶベクターは、一般には、「プロベクター（ｐｒｏ−ｖｅｃｔｏｒ）」と称され、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下での複製及びカプシド形成によって「レスキュー」することができる。
【００１９】
「昆虫細胞」とは、本明細書で使用される場合、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの複製を可能にし、また、培養物中で維持できる昆虫細胞を指す。例えば、使用する細胞株は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ細胞株、又は蚊細胞株、例えば、セスジヤブカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株に由来し得る。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、ハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びエクスプレスＳＦ＋（ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋）（登録商標）（米国特許第６，１０３，５２６号；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）を含めた、バキュロウイルスに感染しやすい昆虫種由来の細胞である。培養物中での昆虫細胞の成長条件、及び培養物中の昆虫細胞における異種性産物の産生は、当技術分野で周知であり、例えば、昆虫細胞の分子工学に関する以下の参考文献に記載されている。分子工学及び昆虫細胞におけるポリペプチドの発現の方法体系は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ’  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９７−１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３９巻；米国特許第４，７４５，０５１号；米国特許出願公開第２００３１４８５０６号；及び国際公開第０３／０７４７１４号に記載されている。
【００２０】
［発明の詳細な説明］
組換えｒＡＡＶは、昆虫細胞において、昆虫細胞にＡＡＶベクター及びｒｅｐ機能及びｃａｐ機能を有する３つの組換えバキュロウイルスを感染させる、バキュロウイルスベースの発現系を用いて生産することができる。感染させた昆虫細胞を培養すると、ＡＡＶ非構造タンパク質遺伝子及びＡＡＶ構造タンパク質遺伝子が発現され、導入遺伝子ＤＮＡが複製され、組換えＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶ粒子）がパッケージングされ、アセンブリングされる。ｒＡＡＶ粒子は、両末端がＩＴＲ領域と隣接する対象の遺伝子産物（複数可）（導入遺伝子（複数可））を、一本鎖ＤＮＡの形態で含有する。同時に、組換えバキュロウイルスはこれらの細胞において複製され、このうちのいくらかは、一般に、数日後に感染細胞の溶解及び死をもたらす。生じたウイルス（バキュロウイルス及びｒＡＡＶ粒子）は細胞培養上清に部分的に放出される、又は、溶解した細胞内に残る。この理由で、一般に、細胞を、当業者に公知の細胞破壊方法、例えば、交互に凍結融解することを用いて、又は、ウイルスの本質的に完全な放出を実現するために例えばトリプシンを用いた酵素による加水分解によって、又は界面活性剤溶解によって破壊する。
【００２１】
バキュロウイルスベースの発現系等のウイルスベースの発現系を用いた、又はヘルパーウイルス系を用いたウイルスベクターの調製に伴う重大な不都合は、生産物のウイルス粒子と生産物以外のウイルスとが混在する集団が形成され、その集団をさらに精製しなければならないことである。便宜上、「ヘルパーウイルス」という単語は、本明細書では、例えば、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス等の、ＡＡＶの生産に使用される「真の」ヘルパーウイルス、又はバキュロウイルスのいずれかを示すために使用されるが、バキュロウイルスが実際にヘルパー機能をもたらすのか、単にＡＡＶ遺伝子を昆虫細胞に送達するだけなのかは未だ不明である。遺伝子療法においてウイルスベクターを使用する場合、バキュロウイルスには潜在的な病原性又は免疫原性があるので、混入バキュロウイルスは回避されるべきである。
【００２２】
したがって、本発明は、例えば、規制当局による認可を受けたパルボウイルス製品を得るために適した、工業的な規模での使用が技術的且つ経済的に実行可能であり、桿状のウイルス粒子及び本質的に球状のウイルス粒子を含むウイルス試料において、特に、桿状のウイルス粒子の直径がパルボウイルス粒子と同様である（すなわち、桿状のウイルス粒子が２次元では同様であるが、３次元では同様でなく、それよりも大きくなければならない）場合に、桿状のウイルスの減少、好ましくは枯渇を実証することができ、したがって、ヘルパーウイルスの潜在的な病原性及び／又は免疫原性が低下する分離／精製方法を提供する。２次元のサイズが同様である生産物以外のウイルスと生産物のウイルスとの混合物を濾過技法によって、好ましくは高レベルで分離することができることは困難であり可能性が低いことが当業者には理解される。
【００２３】
したがって、第１の態様では、本発明は、一方のビリオンの集団が本質的に球状のビリオンを含み、他方のビリオンの集団が桿状のビリオンを含むことが好ましい試料中の２つのビリオンの集団を分離するための方法であって、両方のビリオンの集団を含む試料を、本質的に球状のビリオンのみが通過できるフィルターで濾過するステップを含む方法に関する。桿状のウイルスの縦横比は少なくとも４：１であることが好ましい。桿状のウイルスの直径と本質的に球状の直径の違いが１２ｎｍを超えないことも好ましい。本質的に球状のウイルスがパルボウイルスであること、及び桿状のウイルスがバキュロウイルスであることが好ましい。特に、本発明は、バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を分離するための方法であって、パルボウイルスビリオンの集団及びバキュロウイルスビリオンの集団を含む試料を、パルボウイルスビリオンのみが通過できるフィルターで濾過するステップを含む方法に関する。
【００２４】
「分離」という用語は、本明細書で使用される場合、分離される粒子の両方を試料から回収することを意味するものではない。「分離」という用語は、本明細書で使用される場合、桿状のウイルス粒子を試料から部分的又は完全に除去すること、したがって、本質的に球状のウイルス粒子の試料への桿状のウイルスの混入を減少させることを示す。したがって、分離とは、試料中の本質的に球状のウイルス粒子の精製を意味するものと理解される。バキュロウイルスとパルボウイルスの場合では、「分離」という用語は、本明細書で使用される場合、バキュロウイルスを試料から部分的又は完全に除去すること、したがって、パルボウイルスを含む試料中へのバキュロウイルスの混入を減少させることを示すと言うことができる。この場合、分離とは、試料中のパルボウイルスの精製を意味する。
【００２５】
濾過とは、例えば、固体を、サイズが異なる固体から、又は流体から、媒体を間にはさんで、所与のサイズ限界を下回るサイズの固体のみ、又は流体のみが通過できるようにすることによって分離するために使用される物理的操作である。試料中のサイズが大きすぎる固体は供給液に保持される。フィルターを通過した固体を含む流体は、濾液又は透過液と称することができる。
【００２６】
本発明に適用される「ウイルス除去」のプロセスは、「ウイルス濾過」としても公知の「濾過」によって行う。「ウイルス濾過」は、ウイルス混入物から医薬製品を、ウイルスフィルター又は限外濾過膜等のフィルターによって分離することであると理解される。医薬製品自体もウイルス（遺伝子療法）ベクター等のウイルスであってもよいことが理解される。
【００２７】
ウイルス濾過とは、公称孔径がナノメートル規模の膜を使用する濾過技術である。ウイルスフィルター及び限外濾過膜は、一般には、公称孔径が３０ナノメートル〜１マイクロメートルの範囲内である、又は分画分子量（ＭＷＣＯ）が１００００〜７５００００ダルトンの範囲内、好ましくは１００００〜５０００００ダルトンの範囲内、より好ましくは１００００〜１０００００ダルトンの範囲内である膜を含む。フィルターの種類の分類は、膜の構造、材料、及びベンダーに左右される。使用の種類によっても分類が決定される。限外濾過膜を接線流濾過（ＴＦＦ）方式（クロスフロー濾過としても公知であり、再循環中、試料を含む供給流体がフィルターに対して平行であり、試料を含む供給流体の一部のみが透過産生物（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に使用され、供給流体の最大部分はフィルターを横切ることなくモジュールから出る）で使用することもでき、デッドエンドフィルターとして使用することもできる（試料の全てがフィルターを通過する）。用語は当業者には非常によく理解される。
【００２８】
ウイルス濾過では、一般には、膜にかかる圧力差：０．０２ＭＰａ〜０．８ＭＰａ、好ましくは０．０２ＭＰａ〜０．１ＭＰａの膜間圧（膜間の圧力損失）を用いる。圧力差は、試料に適用する（すなわち、ポンプによって）流速の影響を受ける可能性がある。フィルターをＴＦＦ方式で操作する場合、膜の前に保持液のラインを圧縮することにより、又は膜の後に（すなわち、透過液において）ポンプを使用することにより、試料に圧力をかけることによって膜間圧を調節することもできる。これらの操作は、当業者が容易に決定することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、本質的に球状のビリオンの集団は、二十面体対称性を有し、直径がおよそ１８〜２５ｎｍのビリオンである。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本質的に球状のビリオンの集団は、パルボウイルスビリオン、好ましくはアデノ随伴ウイルスの集団である。
【００３０】
形状の「縦横比」とは、その形状の長い方の寸法と短い方との寸法の比率である。したがって、対称の物体については、ちょうど２つの測定値、例えば棒の長さ及び直径等によって説明される。本発明の他の実施形態のいずれかの代わりに、又はそれと組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、桿状のウイルスの縦横比は、少なくとも４：１、好ましくは少なくとも５：１、より好ましくは少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、又はおよそ１３：１である。本発明の方法を用いて分離されるバキュロウイルス等の桿状のビリオンの集団では、ビリオンの直径が１８〜３０ｎｍ、より好ましくは２０〜２７ｎｍ、より好ましくは２０〜２５ｎｍ、より好ましくは２０〜２３ｎｍであり、長さが７０ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは８０ｎｍ〜２８０ｎｍ、９０ｎｍ〜２６０ｎｍ、１００ｎｍ〜２６０ｎｍ、１２０ｎｍ〜２６０ｎｍ、１４０ｎｍ〜２６０ｎｍ、１６０ｎｍ〜２６０ｎｍ、１８０ｎｍ〜２６０ｎｍ、２００ｎｍ〜２６０ｎｍ、２２０ｎｍ〜２６０ｎｍ、２４０ｎｍ〜２６０ｎｍであることが好ましい。ビリオンの直径が２０〜２３ｎｍであり、長さが１８０〜２８０ｎｍであること、特に、直径が約２０ｎｍであり、長さが約１２０〜２６０ｎｍであることがより好ましい。
【００３１】
本発明の桿状のビリオンの集団は、バキュロウイルス科に属するビリオンの集団であることが好ましい。バキュロウイルス科という名称は、それらのビリオンが桿状であることが理由で提唱され、ラテン語の杖（ｂａｃｕｌｕｍ）＝杖（ｃａｎｅ、ｗａｌｋｉｎｇ  ｓｔｉｃｋ、ｓｔａｆｆ）に由来する。最もよく研究されたバキュロウイルスは、非対称形状であり、直径がおよそ２０−１２０〜２６０ｎｍ（すなわち、２次元ではおよそ２０ｎｍであり、３次元ではおよそ１２０〜２６０ｎｍである、或いは、より好ましくは、直径がおよそ２０ｎｍであり、長さがおよそ１２０〜２６０ｎｍであると表される）であるアウトグラファ・カリフォルニカ単核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）である。バキュロウイルス科の属に分類されるウイルスは、アルファバキュロウイルス（Ａｌｐｈａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ベータバキュロウイルス（Ｂｅｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、デルタバキュロウイルス（Ｄｅｌｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）及びガンマバキュロウイルス（Ｇａｍｍａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、それらのそれぞれのメンバーは、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）ＮＰＶ、鱗翅目（Ｌｅｄｉｄｏｐｔｅｒａｎ）ＧＶ、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）ＮＰＶ及び双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）ＮＰＶである。いくつかのバキュロウイルスはゲノム長が異なることが決定されているので、カプシド長は、８０ｋｂ〜１６０ｋｂで変動するゲノム長に応答して柔軟性がある可能性があることが示唆される。本明細書の他の箇所で定義されているパルボウイルスビリオンの集団から本発明の方法を用いて分離できるバキュロウイルスの例が表１に提供される（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｇ．Ｆ．Ｒｏｈｒｍａｎｎ；第２版；２０１１年１月２６日；第１章：「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｔａｘｏｎｏｍｙ」に基づく）。
【００３２】
【表１】
2018023365.tif 000002
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、バキュロウイルスビリオンの集団は、アウトグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）の集団である。アウトグラファ・カリフォルニカの多数の核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）はＡＡＶ生産系において選択されるバキュロウイルス種である。ＡｃｍＮＰＶは最も研究されたバキュロウイルスである。このウイルスは、最初にアルファルファシャクトリムシ（鱗翅目）から単離されたものであり、１５４個のオープンリーディングフレームを伴う１３４ｋｂｐのゲノムを含有する。主要なカプシドタンパク質ＶＰ３９はいくつかの副次的なタンパク質と一緒に、ｐ６．９タンパク質を伴うＤＮＡを封入する桿状ヌクレオカプシド（２１ｎｍ×２６０ｎｍ）を形成する。バキュロウイルス媒介性ＡＡＶ生産プロセスでは、ＡＡＶ複製について現在スクリーニングされている遺伝子のうち７種がバキュロウイルス複製に関連すると思われ（ｌｅｆ−１、ｌｅｆ−２、ｌｅｆ−１１、ｄｎａ−ｐｏｌ、ｌｅｆ−３、ｌｅｆ−７、及びｄｂｐ）、３種がトランス活性化因子（ｐ３５、ｉｅ−１、ｉｅ−２）をコードすると説明されている。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、桿状のビリオンの直径と本質的に球状のビリオンの直径の違いは、サイズで１２ｎｍ未満、好ましくは１１ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、９ｎｍ未満、８ｎｍ未満、７ｎｍ未満、６ｎｍ未満、５ｎｍ未満であり、それによって球状ビリオンの直径が２つのうちの大きい方であることが好ましい。したがって、例えば、パルボウイルスビリオンの集団を、バキュロウイルスビリオンの集団、好ましくはアデノ随伴ウイルスから分離する本発明の好ましい実施形態では、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）の直径とバキュロウイルスの直径（２次元で）の違いは５ｎｍ未満であるので、２種類のビリオンは部分的に同様のサイズである。
【００３５】
本発明において使用するためのフィルターは、公称孔径が、桿状のウイルスの直径（すなわち、桿状のウイルスの長さではなく短い方の寸法の直径）の１．２〜３．３倍であることが好ましい膜である。異なるフィルター製造者に使用される「孔径」、「除去率」、「有効サイズ」、「公称孔径」又は「特定の最小サイズを有する粒子の除去を可能にする孔径」という用語は、本発明の目的では等価の用語であり、本明細書では互換的に使用することができる。
【００３６】
膜は、桿状のウイルスの直径の少なくとも１．３倍、１．４倍、１．５倍であるが、桿状のウイルスの直径の３．２倍未満、３．１倍未満、３．０倍未満、２．９倍未満、２．７倍未満、２．５倍未満、２．３倍未満、２．１倍未満、１．９倍未満、１．８倍未満である孔径を有することが好ましい。膜は桿状のウイルスの直径の１．６〜１．７倍である孔径を有することがより好ましい。好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのフィルターは３０〜７０ｎｍの孔径、より好ましくは３０〜６０ｎｍの孔径、より好ましくは３０〜５０ｎｍの孔径、より好ましくは３０〜４０ｎｍの孔径、より好ましくは３２〜３８ｎｍの孔径、より好ましくは３４〜３６ｎｍの孔径、最も好ましくは３５ｎｍの孔径を有する。３５ｎｍの孔径を有するウイルスフィルターの例は、例えば、Ａｓａｈｉ−Ｋａｓａｉプラノバ３５Ｎ膜（ｗｗｗ．ｐｌａｎｏｖａｆｉｌｔｅｒｓ．ｃｏｍ）である。別の好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのフィルターは、ウルチポア（商標）ＶＦ  Ｇｒａｄｅ  ＤＶ５０ウイルス除去フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．；ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ）である。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明において使用するためのフィルターは、ウイルスフィルター又は限外濾過膜である。ウイルスフィルターは、一般には、細孔のサイズがナノメートル規模のフィルターである。ウイルスフィルターは、細孔のサイズがナノメートル規模であり、繊維内の細孔が非対称であり、それにより特定のサイズの粒子が捕捉され、それよりも小さな粒子はフィルターを通過するようなフィルターであることが好ましい。本発明において使用することができるウイルスフィルターの例は、３５Ｎプラノバ膜である。限外濾過膜の例は、ペリコン２（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２）又はペリコン３（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ザルトコン（Ｓａｒｔｏｃｏｎ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）及びセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｃｅｔｔｅ）（Ｐａｌｌ）である。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、フィルター、例えば、３５Ｎプラノバフィルターでは、形態が異なるウイルスを識別するために表面機構若しくは深層機構又はその２つの組み合わせを使用する。表面濾過は孔径に基づき、濾過の間、直径が細孔の直径よりも大きい粒子がフィルターの「流入」側面の表面に保持され、「ケーク」が形成されることを伴う。対照的に、深層濾過では、個々の繊維層の組成に起因して粒子はフィルター媒体の内側にトラップされる。一般には、流入側面の層は粗い繊維からなり、流出側面の層は細かい繊維からなる。デプスフィルターは、粒子を、単に媒体の表面だけでなく媒体全体を通して保持するために多孔質濾過媒体を使用するフィルターの種類である。これらのフィルターは、一般に、他の種類のフィルターと比較して、目詰まりする前に大きな質量の粒子を保持することができるので、濾過される流体が高負荷量の粒子を含有する場合に使用される。
【００３９】
「フィルター膜」とは、全てのフィルターにおいて、ふるいを行う実際のフィルター材料を意味すると理解されることに留意する。使用するフィルター膜は、優先的に、再生セルロース、例えば、銅アンモニア再生セルロース、例えば、好ましくは銅アンモニア再生セルロース中空糸等で構成されることが有利であるが、他の適切な材料は、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース又はポリアミドである。サイズがおよそ４０〜４００ｎｍの粒子の除去を可能にする孔径を有するそのような膜の例は、公称孔径がおよそ５０ｎｍ又は２０ｎｍであるＰａｌｌ  ＧｍｂＨ、６３３０３  ＤｒｅｉｅｉｃｈからのウルチポアＶＦ膜、公称孔径がおよそ１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍ又は７２ｎｍであるＡｓａｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｌｔｄ.、Ｔｏｋｙｏ、ＪａｐａｎからのＡｓａｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌベンベルグ（Ｂｅｍｂｅｒｇ）微細孔性膜、又は他の製造者、すなわち、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、３７０７５  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ又はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ  ＧｍｂＨ、３７５８２  Ｄａｓｓｅｌからの対応する膜である。本発明の好ましい実施形態では、フィルターは、銅アンモニア再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド又は再生セルロースを含み、フィルターは、銅アンモニア再生セルロース中空糸又はポリフッ化ビニリデンを含有することが好ましい。
【００４０】
本発明の方法は、バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を精製するために特に適している。実際、ｒＡＡＶ粒子とバキュロウイルスを分離するための本発明の方法では、孔径が３５ｎｍであるウイルスフィルター、例えば、Ａｓａｈｉ−Ｋａｓａｉプラノバ３５Ｎ膜が特に有利である。これらのフィルターにより、特に、少なくとも５ｌｏｇ１０の感染性バキュロウイルスを混合集団から本質的に定量的除去することの実現だけでなく、およそ９０％超のｒＡＡＶ粒子の高収量の実現も可能になる。
【００４１】
桿状のウイルスの力価の低下、すなわち、除去されるウイルスの力価が低下する因子は、少なくとも５ｌｏｇ、例えば、ｒＡＡＶビリオンと１０ｘ１０５個のバキュロウイルスビリオンが混在する集団を本発明の方法に従って分離した後に、バキュロウイルスビリオンが濾液中に検出されないことが好ましい。本発明の方法によって実現される桿状のウイルスの力価の低下は、少なくとも５．５ｌｏｇ、少なくとも６ｌｏｇ、少なくとも６．５ｌｏｇ、少なくとも７ｌｏｇ、少なくとも８ｌｏｇ、少なくとも９ｌｏｇ、最も好ましくは少なくとも１０ｌｏｇであることが好ましい。力価は、例えば、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイ等の、当技術分野で公知の一般的な方法によって決定することができる。例えば、試料中のバキュロウイルスビリオンの集団の感染性バキュロウイルスの力価は、ＴＣＩＤ５０アッセイを使用して決定することができる。この方法は、陽性対照試料において、単層のＳｆ９昆虫細胞を感染性バキュロウイルスに感染させることに基づく。陽性対照試料の培養培地中の段階希釈を用いて細胞を感染させる。細胞を＋２８℃で７日間インキュベートする。その後、上清を、単層のＳｆ９昆虫細胞を伴う新しく調製したプレートに移し、＋２８℃で７日間インキュベートする。感染が進行するにしたがい、感染細胞は互いに、及びプレート表面に付着したままでいることができなくなり、付着していない細胞が形成される、すなわち、細胞変性効果（ＣＰＥ）が示され、これは、顕微鏡レベルで観察することができる。ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬにおける力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ方法を用いて算出する。
【００４２】
本発明の方法を用いて本質的に球状のビリオンの集団の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％が回収されることが好ましい。したがって、本質的に球状のビリオンの集団の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％が溶出液（又は透過液）中に回収されることが好ましい。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、２つ以上のフィルターを通して試料を濾過する。
【００４４】
分離しようとするビリオンの集団を含む試料は、一般には、ウイルスベースの発現系由来、例えば、ＡＡＶビリオンを生産するための昆虫細胞培養物由来の培養上清（例えば、培養培地）、ＡＡＶビリオンを生産するためのウイルスベースの発現系由来の昆虫細胞、又は培養上清と昆虫細胞との組み合わせである。試料を本発明の方法において使用する前に凍結融解サイクルに供することが好ましい。試料を本発明の方法において使用する前に予備精製することがより好ましい。これにより、本質的に球状のビリオン（例えば、パルボウイルスビリオン、好ましくはＡＡＶ）の集団の濾過にわたる収量が増加し、これは、フィルターの寿命に関しても有利であると考えられる。したがって、好ましい実施形態では、試料は細胞性混入物を含まない。
【００４５】
したがって、好ましい実施形態では、上記方法は、ビリオンの集団を含む試料を、例えば、遠心分離、１つ又は複数の密度勾配、予備濾過及び／又はクロマトグラフィーによって予備精製することを含む。試料が、例えばｒＡＡＶ培養物の上清である場合には、試料を、例えば、より大きな粒子が除去され、濾液中にバキュロウイルス及びｒＡＡＶ粒子が保持されるように予備濾過することによって予備精製することが好ましい。予備濾過は、以下により詳細に記載されている通り、上記のビリオンの集団の実際の分離の前に行うことが有利である。好ましい実施形態では、試料を、密度勾配、予備濾過、クロマトグラフィーステップ、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィー、並びにこれらの方法の組み合わせからなる群から選択される方法を用いて予備精製する。そのような精製方法の例としては、Ｂｒｕｍｅｎｔら、２００２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｋａｌｕｄｕｖら、２００２  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｏｔｔｅｒら、２００２  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ及びＣｅｃｃｈｉｎｉら、２０１０  Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙが挙げられる。予備精製は、密度勾配並びに１つ又は複数の予備濾過及び／又は遠心分離ステップを含むことが好ましい。予備精製は、１回又は複数回の予備濾過を１つ又は複数のクロマトグラフィーステップと組み合わせて含むことが好ましい。
【００４６】
分離しようとするビリオンの集団を通過させるが、それよりも大きな不純物は保持することが可能になる１つ又は複数の膜フィルターを使用して試料を予備精製することは特に好適である。一般に、予備精製により、その後の桿状のビリオンの集団と本質的に球状のビリオンの集団との分離をもたらす、本発明の方法において使用されるフィルターが目詰まりすることが防止される、又はより難しくなる。ビリオンの集団を分離している間のフィルターの目詰まりは、試料を本発明の方法に供する前に除去されていない、又は適切に除去されていない試料中のウイルス培養物の構成物によって起こり得る。そのような構成物を適切に除去するためには低スピードでの遠心分離では不十分であり、したがって、フィルターの目詰まりを最小限にするためには試料をさらに予備精製することが好ましい。
【００４７】
予備精製は予備濾過によって行うことが好ましい。ＡＡＶ及びバキュロウイルスを含み、本発明の方法に供される試料を予備精製するための膜フィルターは７０〜２００ｎｍ、より好ましくは８０〜１８０ｎｍ、９０〜１５０ｎｍ、１００〜１３０ｎｍの孔径を有することが好ましい。例えば、孔径がおよそ１００ｎｍの膜フィルター、例えば、ウルチポアＮ６６（Ｕｌｔｉｐｏｒ  Ｎ６６）フィルター（Ｐａｌｌ  ＧｍｂＨ、６３３０３  Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）等が、ｒＡＡＶ粒子とバキュロウイルスとが混在する集団を予備精製するために特によく適している。したがって、好ましい実施形態では、予備濾過は、孔径が７０〜２００ｎｍのフィルターによって実施する。
【００４８】
予備精製のための適切な方法及び手段は、本発明の方法において、上記の通り、また当業者が試験することができる通りパルボウイルスビリオンの集団とバキュロウイルスビリオンの集団とを分離するために使用されるフィルターに左右される。予備精製後の状態は以下のようにならなければならない。１）フィルターは完全なままであり、２）パルボウイルスは安定であり、３）塩濃度は生理的なものに近く、且つ４）フィルターにかかる圧力損失は、それによってパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）が「溶解」し、したがって、機能的でなくなるほどは大きくない。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、試料のｐＨは６〜１０、好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、特におよそ８．０である。必要であれば、試料のｐＨを、適切な緩衝液、例えば、トリス／ＨＣｌ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン）を用いて調整して、上に明記されているｐＨにする。試料のｐＨは、濾過後のＡＡＶの好収量がもたらされるので、約８．０であることが好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、試料のｐＨは、ＡＡＶが安定であることを確実にするために、６〜８．５（本質的に生理的）である。ｐＨがこの範囲内である緩衝液は、好ましくは、特定のパルボウイルスに適した伝導率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）も有するべきである。一般には、必要な伝導率は、ＡＡＶの血清型及び導入遺伝子に左右される。当業者は、場合ごとに適切な緩衝液を決定することができる。一般には、バックグラウンド伝導率は、生理的伝導率、すなわち１３７ｍＭのＮａＣｌと同等であるべきである。適切な緩衝溶液の例はＭＥＳ、Ｔｒｉｚｍａ、ビス−トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ及びビス−トリスプロパンである。
【００５１】
好ましい実施形態では、フィルター表面１ｃｍ２当たり試料少なくとも０．５ｍｌ、好ましくは１ｃｍ２当たり１〜１００ｍｌが濾過される。しかし、これは、分離しようとする試料中のウイルスの純度及び濃度に大きく左右され、また、大部分の事象において濾過は下流のプロセスの最後に適用されるので、１ｃｍ２当たり１Ｌ超を濾過することができる。任意の他の好ましい実施形態の代わりに、又は任意の他の好ましい実施形態と組み合わせて、本発明の好ましい実施形態では、フィルター表面１ｃｍ２当たり少なくとも１〜１０ｍｌ、好ましくは１〜５ｍｌ、特に約１．５ｍｌの試料が濾過される。一般に、これにより、例えば、バキュロウイルスの除去を同時に実現しながら、ｒＡＡＶ粒子の高収量が実現される。
【００５２】
したがって、本発明は、本質的に球状のビリオンの集団と桿状のビリオンの集団との分離／精製を単純かつ安価な様式でもたらす方法を提供し、該方法は工業的な規模で適用できる。本発明の方法は、特に穏やかな条件下で用いることができ、本質的に球状のビリオンを高収量でもたらし、同時に桿状のビリオンを減少させる、さらには濾液から排除する。本発明のさらなる利点は、本発明に従って精製されたビリオンは、他のウイルス、例えば、バキュロウイルスを適切に含まないので、例えば、遺伝子療法用のウイルスベクターとして直接使用できることである。バキュロウイルスＤＮＡのわずかな残留画分が濾液中に残っている可能性があるが、このＤＮＡは、複製コンピテントバキュロウイルスには関連せず、一緒にパッケージングされたｒＡＡＶ内のＤＮＡに関連し、したがって、これは感染性バキュロウイルスを表さない。
【００５３】
好ましい実施形態では、例えば遊離のバキュロウイルスタンパク質及びウイルス成分粒子等のバキュロウイルス構成物は、本発明の方法によって減少する。これは、これらの構成物は、ウイルスベクターが遺伝子療法において使用された際に患者において非特異的な免疫応答を誘導しうるので、特に有利である。
【００５４】
上記の実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、本発明の方法を、例えば、２種以上の異なるバキュロウイルスのベクターを使用してバキュロウイルス発現系を使用し、したがって、多数の種類のバキュロウイルスビリオンをもたらす場合等の、３種以上の異なるビリオンの集団を分離するために適用できることは本発明の実施形態である。上記の本発明の方法を用いて、パルボウイルスビリオン集団からバキュロウイルス集団を分離することができる。したがって、本発明は、ビリオンの集団を含む試料を、本質的に球状のビリオンのみが通過できるフィルターで濾過するステップを含む、試料中の少なくとも２つのビリオンの集団を分離するための方法であって、１つ又は複数のビリオンの集団が本質的に球状のビリオンを含み、１つ又は複数の他のビリオンの集団が桿状のビリオンを含むことが好ましい方法にも関する。
【００５５】
本文書及びその特許請求の範囲では、「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は、その単語の次に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されるものではないということを意味する、非限定的な意味で使用されている。さらに、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」によって要素に言及することにより、文脈がたった１つのその要素があるということを明らかに必要としている場合を除き、その要素が２つ以上存在する可能性は排除されない。したがって、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」とは、通常、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味する。
【００５６】
本明細書において引用されている全ての特許及び文献参照は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
以下の実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ウイルス濾過中のＧＣ及びＴＰの回収率を示すグラフである。この図には、試料の体積、膜の使用後洗浄液及び上述の一定分量のプールに対して行った補正を含めた回収率がゲノムコピーの％インプット及び濾液の全粒子として示されている。
【図２】ウイルス濾過中のバキュロウイルスの減少を示すグラフである。  この図には、バキュロウイルススパイク材料、ウイルスフィルター供給液（スパイクＡＩＥＸ溶出液）、濾過体積（ｘｍＬ）に応じたナノ濾液、並びにウイルスフィルター濾液及びウイルスフィルター洗浄液の最終的なプールのＴＣＩＤ５０によって測定されたバキュロウイルスの力価が示されている。濾液及び最終的なプールは、アッセイではバキュロウイルスに関して十分な陽性が生じなかったので最大の可能性のある力価である。
【実施例】
【００５９】
実施例１
Ｕｒａｂｅら、２００２（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １３（１６）：１９３５−１９４３）によって以前に記載されている通り、昆虫細胞に３つの組換えバキュロウイルスを感染させた後に、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を生産した。
感染させた３日後に細胞培養物を界面活性剤により溶解させ、その後、９Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（Ｍｅｒｃｋ）を添加することによってヌクレアーゼ処理し、製造者の推奨でインキュベートした。
【００６０】
その後、粗製の溶解したバルクをポールプロファイル（Ｐａｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）（登録商標）スター（Ｓｔａｒ）及びポールスポール（Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ）（登録商標）フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を順番に用いて濾過することによって清澄化した。界面活性剤の存在下、少なくとも２８℃でウイルス減少インキュベーションを実施した。この材料をＡＶＢセファロースＨＰ（ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に述べると、濾過した細胞溶解物を直径２０ｃｍのカラム（ＢＰＧ２００／５００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ベッドの高さおよそ６ｃｍ）に、１時間当たり１５０ｃｍの線速度で適用した。ＵＶ吸収曲線がベースラインに戻り、安定化するまで、カラムをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。吸着したｒＡＡＶ粒子を酸性培地（ＨＣｌを用いてｐＨ３．０に調整した５０ｍＭのクエン酸ナトリウム）に溶出させ、カラム溶出液をすぐに１／１０体積の１Ｍトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を用いて調整した。
【００６１】
この中和された溶出液に、Ｕｒａｂｅら（２００２；上記）によって以前に記載されている通り製造された１０％ｖ／ｖのバキュロウイルススパイクを清澄化した後に加えて、１９００ｇで１５分遠心分離し、０．２μｍのボトルトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で濾過することによって、ウイルスフィルターに供給するための、バキュロウイルスとＡＡＶとが混在する集団を用意した。
【００６２】
使用する前に、プラノバ３５Ｎフィルターを製造推奨に従って調製した。簡単に述べると、保存液を除去し、６０ｍＭのトリス／ＨＣＬ、ｐＨ８．０を４０ｍｌ添加することによって全てを空気パージし、フラッシング手順を製造推奨に従って実施した。
【００６３】
ウイルスフィルターへの供給流速を、蠕動ポンプを使用して製造推奨の通り１分当たり５ｍｌに設定した（表２参照）。ウイルス濾過中、供給圧力及び透過流をモニターした（表２参照）。
【００６４】
【表２】
2018023365.tif 000003
【００６５】
濾液５０ｍｌ、２５０ｍｌ及び４００ｍｌを取得した後に、Ｓｆ９細胞株を使用した感染性バキュロウイルスに対するＴＣＩＤ５０アッセイによってバキュロウイルスを滴定するために試料を収集した。結果は、接種された組織培養Ｓｆ９細胞の５０％において細胞変性効果を生じさせるために必要なウイルスの量を示すＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染量で示されている。
【００６６】
濾液のうち約１ｍｌの試料を取得し、これらをＡＡＶにおける対象の遺伝子のゲノムコピー（以後ＧＣと称される）、及びＡＡＶの全粒子（以後ＴＰと称される）について分析して、それらの関連する回収率をモニターした。ＧＣ及びＴＰの分析は下記の通り実施した。
【００６７】
試料のゲノムコピー濃度を決定するために、試験試料の１０倍段階希釈物及び必要条件を満たした標準試薬を調製し、外来性ＤＮＡをＤＮａｓｅ消化によって除去し、カプシド形成したＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化によって遊離させる。次いで、放出されたウイルスＤＮＡを、マグネシルブルー（ＭａｇｎｅＳｉｌ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）を使用して精製した。その後、ベクターのゲノム配列に特異的なプライマーを使用した定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを増幅する。色素であるサイバーグリーン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ）に結合する蛍光ＤＮＡを含めることによってＤＮＡ増幅をリアルタイムでモニターする。試料中に存在するＤＮＡの量は、試験試料について見いだされるＣｔ値と標準試薬について見いだされるＣｔ値を比較することによって算出することができる。平行線検定（ｐａｒａｌｌｅｌ−ｌｉｎｅ−ａｓｓａｙ）設計を使用して、試験試料の段階希釈物を、必要条件を満たした標準試薬と対照して試験し、それにより比率をもたらす。この比率を、標準試薬のゲノム含有量を使用してゲノムコピー濃度（ｇｃ／ｍＬ）に変換する。
【００６８】
ＡＡＶ粒子の総数（正確なゲノムを含有する完全な粒子（ベクター粒子）並びに空の粒子の両方）を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて決定する。ゲル濾過ＨＰＬＣを、バイオベーシックＳＥＣ−１０００（ＢｉｏＢａｓｉｃ  ＳＥＣ−１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１分当たり１ｍＬの流速で使用し、Ｄ−ＰＢＳの水相を用い、２５℃で実施する。２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収を用いて溶出をモニターする。試験試料のピーク面積を、１ｍＬ当たりのＡＡＶ粒子の量が既知である必要条件を満たした標準試薬の較正曲線を使用して数量化する。
【００６９】
プラノバ３５Ｎフィルターを、製造品説明書の通り６０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を１０ｍｌ使用して洗浄した。洗浄液を濾液と一緒にプールし、ＴＣＩＤ５０アッセイによるバキュロウイルスの感染力価のために試料を採取した。洗浄液を、濾液材料と一緒にプールする前に、後でＧＣ及びＴＰの力価を決定するために試料採取した。濾液及び洗浄のプールを、手動で混合して、均一性を確実にし、後でＧＣ及びＴＰの力価を決定するために試料採取した。ＴＰ及びＧＣの力価から回収率を算出し、それが図１に示されている。
【００７０】
試料の感染性バキュロウイルスの力価を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを用いて決定する。この方法は、単層のＳｆ９昆虫細胞を試験試料中の感染性バキュロウイルスに感染させることに基づく。試験試料の培養培地中の３倍段階希釈物を使用して、細胞を８重に感染させる。プレートを＋２８℃で７日間インキュベートする。その後、上清を新しく調製したプレートに移し、＋２８℃で７日間インキュベートする。感染が進行するにしたがい、感染細胞は互いに、及びプレート表面に付着したままでいることができなくなり、付着していない細胞が形成される、すなわち、細胞変性効果（ＣＰＥ）が示され、これは、顕微鏡レベルで観察することができる。ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬにおける力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ方法を用いて算出する。
【００７１】
結果
バキュロウイルスの滴定についての結果が図２に示されている。
【００７２】
スパイク溶液の感染性バキュロウイルスの力価は、８．１ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。１０％のスパイク溶液を加えたスパイクＡＩＥＸ溶出液は７．６２ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。ナノ濾液のＴＣＩＤ５０値は少なくとも６ｌｏｇ減退し、この特定のアッセイの数量化のレベルである１．５１１ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬを下回る。したがって、ナノ濾過によりバキュロウイルスが少なくとも６ｌｏｇの減少し、したがって、ナノ濾過は、２次元のサイズが同等である２種のウイルスを識別するために実行可能な単位操作である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月21日(2017.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスビリオンの集団からパルボウイルスビリオンの集団を分離するための方法であって、パルボウイルスビリオンの集団及びバキュロウイルスビリオンの集団を含む試料を接線流濾過方式においてフィルターで濾過するステップを含み、前記フィルターが３０〜７０ｎｍの公称孔径を有する、方法。
【請求項２】
濾過するステップの前の試料が、密度勾配、予備濾過、クロマトグラフィーステップ、及び、これらの方法の組み合わせからなる群から選択される方法を使用して予備精製され、予備精製試料となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パルボウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
バキュロウイルスがアウトグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃｍＮＰＶ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フィルターがウイルスフィルター又は限外濾過膜である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フィルターがサーフェスフィルター及び／又はデプスフィルターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フィルターが、銅アンモニア再生セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、修飾若しくは非修飾ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド又は再生セルロースからなる群から選択される材料を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルターが３０〜４０ｎｍの公称孔径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルターが３２〜３８ｎｍの公称孔径を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フィルターが、銅アンモニア再生セルロース、好ましくは銅アンモニア再生セルロース中空糸を含み、より好ましくはフィルターがプラノバ３５膜である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２において得られた予備精製試料を、２つ以上のフィルターを使用する濾過に供する、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２の前記クロマトグラフィーステップが、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーである、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２の予備濾過が、孔径が７０〜２００ｎｍのフィルターによって実施される、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料のｐＨが６〜１０、好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、最も好ましくは８である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスフィルター表面１ｃｍ２当たり試料１〜２００ｍｌ、好ましくは１ｃｍ２当たり８０〜１２０ｍｌが濾過される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
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