(57)【要約】      （修正有）【課題】高圧連続流運転に適合した、ポリペプチドなどのポリマー分析物を含む液体サンプルの分析に使用する高圧オンライン／連続流ＩＭＥＲシステムのための装置、方法、及びキットの提供。【解決手段】固体固定相は、超高性能液体クロマトグラフィーシステム内に無機／有機ハイブリッド粒子（例、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子）を含んでおり、固体固定相に共有結合した酵素はプロテアーゼであり、圧力モジュレーターをさらに含んでいる、固定化酵素反応器。モジレーターが、チャンバーと流体連絡していて、約２５００〜３５０００ｐｓｉの圧力下で、入口から固体固定相を通って出口の外へ流れる、ポリマー分析物を含む液体サンプルの連続流を維持される様に適合されている、固定化酵素反応器。【選択図】図１
2018023372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口および出口を有するチャンバーを規定する壁；
酵素に共有結合していて、チャンバー内に配置された固体固定相；および
チャンバーと流体連絡していて、約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で、入口から固体固定相を通って出口の外へ流れる、ポリマー分析物を含む液体サンプルの連続流を維持するように適合された圧力モジュレーター
を含む装置。
【請求項２】
固体固定相は、無機／有機ハイブリッド粒子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
固体固定相は、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
固体固定相は、モノリス、多孔質材料、表面多孔質材料、多孔質粒子、表面多孔質粒子、または無孔質材料もしくは粒子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
固体固定相は、０．１から２．５ｃｍ３／ｇの範囲内の平均細孔容積を有する孔を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
固体固定相は、１００から１，０００Åの範囲内の平均孔径を有する孔を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
固体固定相は、セラミック、シリカ、無機シリカ、表面ハイブリッド、または金属酸化物を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
固体固定相は、０．１から１０μの範囲内の平均径を有する粒子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
共有リンカーは、有機官能化シランリンカーを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
共有リンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
圧力は、８，０００から１５，０００ｐｓｉの範囲内にある、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
出口から流出する分析物を収集するために構成された捕捉カラム；
収集された分析物を分離するために構成されたクロマトグラフィーカラム；および
分離された分析物を分析するために構成された質量分析計
をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
固体固定相に結合された捕捉基をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で、酵素に共有結合した固体固定相にポリマー分析物を含む液体サンプルを連続的に流し、これによりポリマー分析物を酵素的に開裂させることを含む、方法。
【請求項１５】
固体固定相は、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
共有リンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
圧力は、８，０００から１５，０００ｐｓｉの範囲内にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
出口から流出する分析物を収集すること；
液体クロマトグラフィーによって収集された分析物を分離すること；
分離された分析物を質量分析法によって分析することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
固体固定相に、捕捉基が結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
酵素に結合させることができ、ならびに約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で操作することができる固体固定相を選択すること；
入口および出口を有するチャンバー内に酵素に共有結合した固体固定相を配置することを含み、
チャンバーは、前記圧力下で入口から固体固定相を通って出口の外へ流れる、ポリマー分析物を含む液体サンプルの連続流を維持するように適合された圧力モジュレーターと流体連絡している方法。
【請求項２１】
固体固定相は、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
共有リンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
圧力は、８，０００から１５，０００ｐｓｉの範囲内にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
液体サンプルを連続的に流動しながら、（ｉ）約２，５００から３５，０００ｐｓｉの間の圧力および（ｉｉ）約２，５００未満の第２の圧力の間を循環させることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
固体固定相に、捕捉基が結合している、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、概して固定化酵素反応器（ＩＭＥＲ）に関する。本技術は、より詳細には、ポリマー分析物を含む液体サンプルの分析において、酵素に共有結合した固体固定相を使用する、高圧連続流システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
固定化酵素は、不溶性材料に付着させられる酵素であり、酵素は反応の間、これに保持され、反応後には生成物から分離され、所望により再使用することができる。ＩＭＥＲ内で酵素を固定化するためには、３種の一般的方法がある。第１の一般的方法は、ガラス、アルギン酸ビーズまたはマトリックス上への吸着を含み、酵素は不活性材料の外側に付着させられる。吸着は化学反応ではないので、固定化酵素の活性部位はマトリックスまたはビーズによって遮断される可能性があり、該酵素の活性は減少させられる。第２の一般法は封入法を含んでおり、このとき酵素は不溶性ビーズまたはマイクロスフェア、例えばアルギン酸カルシウムビーズ内に封入される。しかし、不溶性物質は反応物質の到達および生成物の退出を妨害する可能性がある。第３の一般法は公差結合法であり、このとき酵素は化学反応を通してマトリックスに共有結合させられる。
【０００３】
共有結合したＩＭＥＲおよびＩＭＥＲ媒体は、様々な形態で入手できる。例えば、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社（米国カリフォルニア州）から入手できるＰＯＲＯＳＺＹＭＥ媒体は、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を利用する。ＯｒａＣｈｒｏｍ社（米国マサチューセッツ州）から入手できるＳＴＹＲＯＳＺＹＭＥ（商標）媒体は、完全透水性のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスを利用する。アガロースビーズ媒体もＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国マサチューセッツ州）から入手できる。現在、殆どの工業用のＩＭＥＲは、これらの媒体を低圧条件下で使用している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本技術は、様々な実施形態において、ポリマー分析物を含む液体サンプルの分析において酵素に共有結合した固体固定相を使用する高圧オンライン／連続流ＩＭＥＲシステムのための装置、方法、およびキットに関する。本固体固定相およびシステムは、本装置、方法およびキットの効率および使い易さを増加させることのできる、高圧連続流運転のために適合する。１例として、チャンバーは超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）カラムであってよく、固体固定相は無機／有機ハイブリッド粒子（例、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子）であってよく、酵素はプロテアーゼであってよく、ポリマー分析物はタンパク質であってよく、およびシステムは約２，５００から１５，０００ｐｓｉの圧力下で該タンパク質を含む液体サンプルの連続流を維持することができる。そこで本装置は、プロテオミクスにおける用途、例えば重水素交換質量分析法（ＨＤＸ  ＭＳ）のための分析物を調製することができる。この他の例および用途は、当業者であれば本開示および特許請求の範囲から理解することができよう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様において、本技術は、入口および出口を有するチャンバーを規定する壁、ならびに酵素に共有結合していて該チャンバー内に配置されている固体固定相を含む装置を特徴とする。本装置は、該チャンバーと流体連絡していて、約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で該入口から該固体固定相を通過して該出口の外へ流れるポリマー分析物を含む液体サンプルの連続流を維持するように適合されている圧力モジュレーターをさらに含んでいる。
【０００６】
また別の態様において、本技術は、ポリマー分析物を含む液体サンプルを約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で酵素に共有結合している固体固定相に連続的に流し、これにより該ポリマー分析物を酵素的に開裂させることを含む方法を特徴とする。
【０００７】
さらに別の態様において、本技術は、酵素に結合させることができ、約２，５００から３５，０００ｐｓｉの圧力下で機能する固体固定相を選択することを含む方法を特徴とする。本方法は、入口および出口を有するチャンバー内で酵素に共有結合した固体固定相を配置することをさらに含んでいる。本チャンバーは、ポリマー分析物を含む液体サンプルが入口から固体固定相をを通って出口の外へ流れる連続流を維持するように適合されている圧力モジュレーターと流体連絡している。
【０００８】
様々な実施形態において、固体固定相は、無機／有機ハイブリッド粒子を含むことができる。固体固定相は、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子を含むことができる。
【０００９】
一部の実施形態において、固体固定相は、モノリス、多孔質材料、表面多孔質材料、多孔質粒子、または表面多孔質粒子を含むことができる。固体固定相は、０．１から２．５ｃｍ３／ｇの範囲内の平均細孔容積を有する孔を含むことができる。固体固定相は、１００から１，０００Å（オングストローム）の範囲内の平均孔径を有する孔を含むことができる。固体固定相は、無孔質であってよい。固体固定相は、セラミック、シリカ、無機シリカ、表面ハイブリッド、または金属酸化物を含むことができる。固体固定相は、０．１から１０μ（ミクロン）の範囲内の平均径を有する粒子を含むことができる。
【００１０】
幾つかの実施形態において、共有リンカーは、有機官能化シランリンカーを含むことができる。共有リンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドであってよい。
【００１１】
様々な実施形態において、本装置内または本方法の１つ以上において使用される圧力は、８，０００から１５，０００ｐｓｉの範囲内にある。
【００１２】
一部の実施形態において、本装置は、以下の：出口から流出する分析物を収集するために構成された捕捉カラム；収集された分析物を分離するために構成されたクロマトグラフィーカラム；および分離された分析物を分析するために構成された質量分析計の内の１つ以上を含むことができる。
【００１３】
幾つかの実施形態において、本方法の１つ以上は、以下の：出口から流出する分析物を収集すること；液体クロマトグラフィーによって収集された分析物を分離すること；および質量分析法によって分離された分析物を分析することの内の１つ以上を含むことができる。
【００１４】
様々な実施形態において、本方法の１つ以上は、液体サンプルを連続的に流しながら、（ｉ）約２，５００から３５，０００ｐｓｉの間の圧力および（ｉｉ）約２，５００未満の第２の圧力の間を循環させることを含んでいる。
【００１５】
一部の実施形態において、さらに固体固定相に捕捉基が結合されている。捕捉基は、高親和性／特異的捕捉剤（例、抗体もしくは抗体複合体）または低親和性／非特異的捕捉剤であってよい。捕捉基は、固体固定相に共有結合させることができる。
【００１６】
本技術によるオンライン高圧法は、従来法より単純な運転およびサンプル調製ならびに増加したスループットを含む利点を有している。このようなオンライン高圧法は、改良されたタンパク質消化効率および低圧での消化に抵抗性であるポリマーを消化する能力を含む利点をさらに有している。ポリマー分析物は、生体高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、炭水化物、デオキシリボ核酸またはリボ核酸であってよい。ポリマー分析物は、酵素によって開裂できる結合を有する非天然型ポリマー（ヘテロもしくはホモポリマー）であってよい。
【００１７】
本技術の他の態様および利点は、これらの全部が本技術の原理を例示する目的でのみ示している以下の図面および説明から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
上述した技術の利点は、また別の利点と一緒に、添付の図面と結び付けて以下の説明を参照することによってより明確に理解することができる。図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、この代わりに本技術の原理を具体的に例示することに重点が置かれている。
【図１】典型的な固体固定相の調製を示す図である。
【図２Ａ】典型的なＩＭＥＲシステムの略図を示す図である。
【図２Ｂ】典型的なＩＭＥＲシステムの略図を示す図である。
【図２Ｃ】典型的なＩＭＥＲシステムの略図を示す図である。
【図３Ａ】９００ｐｓｉでのタンパク質消化の比較を示す図である。
【図３Ｂ】９，５００ｐｓｉでのタンパク質消化の比較を示す図である。
【図４】９００ｐｓｉおよび９，５００ｐｓｉ下でホスホリラーゼｂから生成されたペプチドフラグメントの数の比較を示す図である。
【図５】ＰＯＲＯＳ（登録商標）カラムおよびＢＥＨカラム内での完全重水素化ポリペプチド内の逆交換率（％）の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本技術は、ポリマー分析物を含む液体サンプルの分析において酵素に共有結合している固体固定相を使用する高圧連続流（例、オンライン）ＩＭＥＲシステムのための装置、方法およびキットを含んでいる。このようなオンライン法は、従来法に比較してより単純な運転およびサンプル調製を含む利点を有する。このような高圧法は、改良されたタンパク質消化効率および低圧での消化に抵抗性であるポリマーを消化する能力を含む利点をさらに有している。ポリマー分析物は、生体高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、炭水化物、デオキシリボ核酸またはリボ核酸であってよい。ポリマー分析物は、酵素によって開裂できる結合を有する非天然型ポリマー（ヘテロもしくはホモポリマー）であってよい。
【００２０】
ＩＭＥＲは、例えばプロテオミクスおよびバイオテクノロジーにおいて数多くの用途を有する。ＩＭＥＲシステムのための１つの一般的用途は、（例えばＬＣ−ＭＳによる分析前の）タンパク質特性解析における重要なサンプル調製ステップであるタンパク質分解である。タンパク質消化は、一般に、サンプルタンパク質をより小さく分画化されたペプチドへ開裂するためにプロテアーゼおよびサンプルタンパク質を接触させることによってオフラインで実施される。オフラインタンパク質消化法は、標準プロトコールであるが、望ましくない厄介な問題、例えばポリペプチドの修飾および減少を有する場合がある。オフライン消化法のこの他の不利点には、本技術による方法と比較した場合に、より長いオペレータ時間およびより多量の酵素使用（例、より高額のコスト）が含まれる。タンパク質消化法は具体例として提供したが、本技術は、酵素工程を利用する本質的にあらゆる分析物調製または分析に適用することができる。
【００２１】
タンパク質消化は、ＩＭＥＲ内で実施することもできる。市販で入手できるＩＭＥＲ媒体には、ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社（米国カリフォルニア州）から入手可能な２０μｍのＰＯＲＯＳＺＹＭＥ媒体（ポリスチレンジビニルベンゼン粒子）、ＯｒａＣｈｒｏｍ社（米国マサチューセッツ州）から入手可能なＳＴＹＲＯＳＺＹＭＥ（商標）媒体（完全透水性のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックス、およびアガロースビーズ媒体が含まれる。しかしこれらの媒体は、高圧が該媒体を破壊してＩＭＥＲを非機能性にさせるために、相当に低圧（例、２，０００ｐｓｉ未満）でしか使用することができない。このため、このような媒体はこれらの用途および操作条件が、基本的に限定される。
【００２２】
先行技術とは対照的に、本技術は、高圧下でのオンライン運転のために適合した固体固定相を利用する。高圧は、２，５００から３５，０００ｐｓｉ、例えば８，０００から１５，０００ｐｓｉの範囲内の圧力を含むことができる。耐圧性固体支持体の１つの例は、ＢＥＨ粒子である。固体支持体の修飾は、リンカー、例えばトリエトキシシリルブチルアルデヒドなどの有機官能性シラン化学リンカーを用いて達成でき、プロテアーゼを固定化するために使用できる。この固体固定相は、ＩＭＥＲを生成するためにカラム内に充填することができ、該ＩＭＥＲはこの後オンラインＬＣシステム内でタンパク質を消化するために使用できる。オンライン消化は高圧下で、例えば重水素交換質量分析法（ＨＤＸ  ＭＳ）のためのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米国マサチューセッツ州）製ＵＰＬＣ−ＭＳシステム内で実施できる。
【００２３】
重要なことに、固体固定相もしくは支持体は、高圧運転下で破壊されない、または非機能性にされない。本技術は、オンライン運転（例えばオフライン法、例えば別個のサンプル調製もしくはサンプルサイクリングを用いる静的加圧カラムとは対照的に、サンプルを該固体支持体上を連続的に流しながらの圧力下での運転）をさらに維持する。オンライン運転は、分画化ペプチドを捕捉カラム内に収集し、この後に迅速および連続方法でクロマトグラフによって分離することを可能にすることによって、効率を上昇させることができる。同様に、高圧運転は、例えば、タンパク質消化の効率を増加させ、分析測定を改良し、および該機器の運転速度を増加させることによってさらに効率を上昇させることができる。
【００２４】
（用語の定義）
上記で使用したように、用語「脂肪族基」には、典型的には１から２２個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖を特徴とする有機化合物が含まれる。
【００２５】
脂肪族基には、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基が含まれる。複雑な構造では、鎖は分枝状または架橋状であってよい。アルキル基には、直鎖状アルキル基および分枝状アルキル基を含む、１個以上の炭素原子を有する飽和炭化水素が含まれる。このような炭化水素部分は、１個以上の炭素上で、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルキルチオ、またはニトロ基と置換されてよい。炭素の数が他に特定されない場合は、本明細書で使用する「低級脂肪族」は、上記に規定したような、しかし１から６個の炭素原子を有する脂肪族基（例、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル）を意味する。このような低級脂肪族基の代表、例えば低級アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、２−クロロプロニル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、２−アミノブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、３−チオフェニルなどである。本明細書で使用する用語「ニトロ」は−ＮＯ２を意味する；用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒもしくは−Ｉを意味する；用語「チオール」はＳＨを意味する；および「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味する。そこで本明細書で使用する用語「アルキルアミノ」は、上記で規定したように、これに付着した１つのアミノ基を有するアルキル基を意味する。適切なアルキルアミノ基には、１から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を有する基が含まれる。用語「アルキルチオ」は、上記で規定したように、これに付着した１つのスルフヒドリル基を有するアルキル基を意味する。適切なアルキルチオ基には、１から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を有する基が含まれる。本明細書で使用する用語「アルキルカルボキシル」は、上記で規定したように、これに付着した１つのカルボキシル基を有するアルキル基を意味する。本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、上記で規定したように、これに付着した１個の酸素原子を有するアルキル基を意味する。代表的なアルコキシ基には、１から約１２個の炭素原子、または１から６個の炭素原子を有する基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、アルキル類に類似するが、少なくとも１つの二重もしくは三重結合を各々含有する不飽和脂肪族基を意味する。適切なアルケニルおよびアルキニル基には、２から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を有する基が含まれる。
【００２６】
用語「脂環式基」には、３個以上の炭素原子の閉環構造が含まれる。脂環式基には、飽和環式炭化水素であるシクロパラフィン類もしくはナフタレン類、２個以上の二重結合を備えて不飽和であるシクロオレフィン類、および三重結合を有するシクロアセチレン類が含まれる。これらは芳香族基を含んでいない。シクロパラフィン類の例には、シクロプロパン、シクロヘキサンおよびシクロペンタンが含まれる。シクロオレフィン類の例には、シクロペンタジエンおよびシクロオクタテトラエンが含まれる。脂環式基には、さらにまた縮合環構造および置換脂環式基、例えばアルキル置換脂環式基が含まれる。脂環式基の例では、このような置換基は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ３、−ＣＮなどをさらに含むことができる。
【００２７】
用語「複素環基」には、環内の１個以上の原子が炭素以外の元素、例えば窒素、硫黄または酸素である閉環構造が含まれる。複素環基は、飽和もしくは不飽和であってよく、複素環基、例えばピロールおよびフランは芳香族の性質を有していてよい。これらには、縮合環構造、例えばキノリンおよびイソキノリンが含まれる。複素環基の他の例には、ピリジンおよびプリンが含まれる。複素環基は、さらにまた１つ以上の構成元素で、例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ３、−ＣＮなどで置換されてもよい。適切な複素環式芳香族および複素脂環式基は、一般には環１個当たり３から約８員および１つ以上のＮ、ＯもしくはＳ原子を備える１から３個の別個もしくは縮合環、例えばクマリニル、キノリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノおよびピロリジニルを有する。
【００２８】
用語「芳香族基」には、１つ以上の環を含有する不飽和環状炭化水素が含まれる。芳香族基には、０から４個のヘテロ原子を含むことのできる５および６員の単環式基、例えばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが含まれる。芳香族環は、１つ以上の環位置で、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ３、−ＣＮなどで置換されてよい。
【００２９】
用語「アルキル」には、飽和脂肪族基が含まれ、直鎖状アルキル基、分枝状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含んでいる。幾つかの実施形態において、直鎖状または分枝状アルキルは、この骨格内に３０個以下の炭素原子、例えば直鎖状についてはＣ１−Ｃ３０または分枝状についてはＣ３−Ｃ３０を有する。幾つかの実施形態において、直鎖状または分枝状アルキルは、この骨格内に２０個以下の炭素原子、例えば直鎖状についてはＣ１−Ｃ２０または分枝状についてはＣ３−Ｃ２０を有し、一部の実施形態において１８個以下である。同様に、特定のシクロアルキル類はこれらの環構造内に４から１０個の炭素原子を有し、一部の実施形態において該環構造内に４から７個の炭素原子を有する。用語「低級アルキル」は、鎖内に１から６個の炭素を有するアルキル基および環構造内に３から６個の炭素を有するシクロアルキル類を意味する。
【００３０】
さらに、本明細書および特許請求の範囲を通して使用する用語「アルキル」（「低級アルキル」を含む。）には、「未置換アルキル類」および「置換アルキル類」が含まれ、後者は該炭化水素骨格の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を意味する。このような置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスフォナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素環式芳香族部分を含むことができる。当業者であれば、炭化水素鎖上で置換された部分は、適切であればこれら自体が置換されてよいことを理解するであろう。シクロアルキル類は、例えば上述した置換基とさらに置換されてよい。「アラルキル」部分は、例えば１から３個の別個もしくは縮合環および６から約１８個の炭素環原子を有するアリール、例えばフェニルメチル（ベンジル）と置換されたアルキルである。
【００３１】
用語「アリール」には、０から４個のヘテロ原子を含むことのできる５および６員の単環式芳香族基、例えば未置換もしくは置換ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが含まれる。アリール基には、多環式縮合芳香族基、例えばナフチル、キノリル、インドリルなどがさらに含まれる。芳香族環は、１個以上の環位置で、例えばアルキル基について上述したような置換基で置換されてよい。適切なアリール基には、未置換および置換フェニル基が含まれる。本明細書で使用する用語「アリールオキシ」は、上記で規定したように、これに付着した１個の酸素原子を有するアリール基を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「アラルコキシ」は、上記で規定したように、これに付着した１個の酸素原子を有するアラルキル基を意味する。適切なアラルコキシ基は、１から３個の別個もしくは縮合環および６から約１８個の炭素環原子、例えばＯ−ベンジルを有する。
【００３３】
本明細書で使用する用語「アミノ」は、式−ＮＲａＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは、独立して水素、アルキル、アリール、もしくはヘテロシクリルである、またはＲａおよびＲｂはこれらが付着している窒素原子と一緒に環内に３から８個の原子を有する環状部分を形成する。）の未置換もしくは置換部分を意味する。そこで、用語「アミノ」には、環状アミノ部分、例えば他に特に規定されない限りピペリジニルまたはピロリジニル基が含まれる。「アミノ置換アミノ基」は、ＲａおよびＲｂの内の少なくとも１つがアミノ基とさらに置換されているアミノ基を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「保護基」は、有機合成の分野において周知である官能基の化学修飾を意味する。典型的な保護基は変動してよく、概してＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，１９９９］に記載されている。
【００３５】
「有機−無機ハイブリッド材料」を含む「ハイブリッド」には、無機に基づく構造が含まれるが、このとき有機官能基は内部もしくは「骨格」無機構造ならびに該ハイブリッド材料表面の両方に不可欠である。ハイブリッド材料の無機部分は、例えば、アルミナ、シリカ、チタン、セリウム、もしくはジルコニウムまたはこれらの酸化物、またはセラミック材料であってよい。上述したように、典型的なハイブリッド材料は、米国特許第４０１７５２８号、同第６５２８１６７号、同第６６８６０３５号、同第７１７５９１３号および同第７９１９１７７号に示されており、前記特許の開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「ＢＥＨ」は、エチレン架橋ハイブリッド材料である有機−無機ハイブリッド材料を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する用語「吸着基」は、コア材料に非共有的に付着している架橋もしくは非架橋のモノマー、オリゴマーまたはポリマーを意味する。Ｚが吸着基を表す幾つかの実施形態において、該基はコア材料Ｘ、コア材料Ｘの表面、または固定相材料の表面上に吸着されてよい。例には、アルコール類、アミン類、チオール類、ポリアミン類、デンドリマー類、またはポリマー類が含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
用語「官能化基」もしくは「官能化可能基」には、固定相へ幾つかのクロマトグラフィー官能性を付与する有機官能基が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「末端基」は、これ以上の反応を受けることのできない基を表す。幾つかの実施形態において、末端基は、親水性末端基であってよい。親水性末端基には、アルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリトリトール、ペンタエリトリトールエトキシレート、１，３−ジオキサン−５，５−ジメタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、一価、二価、もしくは多価炭水化物基、多触覚炭水化物、末梢親水性基を含有するデンドリマー、末梢親水性基を含有するデンドリグラフ、または両性イオン基の保護形もしくは脱保護形が含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「表面付着基」は、反応してコア材料、該コア材料の表面、または固体固定相材料の表面に共有結合する、非共有結合する、吸着する、またはさもなければ付着することのできる基を表している。幾つかの実施形態において、表面付着基は、シロキサン結合によって該コア材料の表面に付着している。表面付着基は、固体固定相と酵素との間の共有結合を提供できる。
【００４１】
固体固定相
本技術によるＩＭＥＲ装置、方法およびキットは、ポリマー分析物を含む液体サンプルの高圧連続流運転および分析を達成するために様々な固体固定相、リンカーおよび酵素を利用することができる。１つの例は、ＢＥＨ（例、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国マサチューセッツ州、ＢＥＨ  １３０Å、ＢＥＨ  ２００Å、またはＢＥＨ  ３００Å）である。圧力は、実際チャンバー圧（例、固体固定相床１ｍｍ当たりの圧力とは対照的に）を意味することができる。
【００４２】
一般に、固体固定相は、高圧ＩＭＥＲ運転および酵素への共有結合のために選択された、および／または適合する本質的にあらゆる材料を含むことができる。高圧には、例えば、約２，０００、２，２５０、２，５００、２，７５０、３，０００、３，２５０、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、もしくは６，０００ｐｓｉより高い圧力、または約５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２２，５００、２５，０００、２７，５００、３０，０００、３２，５００もしくは３５，０００ｐｓｉまでの圧力またはこれらの間のあらゆる個別値もしくは範囲を含むことができる。より高い圧力もまた本技術によって企図されている。例えば、約４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００以上までの圧力。一般に、圧力は、固体支持体、機器システムおよび所望の流量を顧慮して選択すべきである。酵素への共有結合は、固体固定相の表面上の官能基またはリンカー分子を通して達成することができる。
【００４３】
様々な実施形態において、固体固定相は、無機／有機ハイブリッド粒子を含むことができる。１つの典型的な無機／有機ハイブリッドは、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国マサチューセッツ州）である。固体固定相は、モノリス、粒子、多孔質粒子、および／または表面多孔質粒子を含むことができる。粒子は、球形または非球形であってよい。固体固定相は、シリカ、無機シリカ、および／または金属酸化物を含むことができる。一部の実施形態において、チャンバーには固定相材料を含有するために１つ以上のフリットが装備されている。固定相材料がモノリシック構造である実施形態において、ハウジングは１つ以上のフリットを含めずに使用できる。
【００４４】
固体固定相は、例えば、１から１０μの範囲内の平均径を有する粒子を含むことができるが、適切であれば所望される用途により小さな、またはより大きな径を選択することができる。例えば、平均粒径は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、８．６、９、９．５、または１０μである。一般に、粒径は、所望の圧力および／または流量を考慮して選択することができる。例えば、大きな粒径は高圧消化中のカラムヘッドから末端への一貫した圧力を達成するために使用することができる。固体固定相は、０．１から２．５ｃｍ３／ｇの範囲内の平均細孔容積を有する孔を含むことができる。例えば、平均細孔容積は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、または２．５ｃｍ３／ｇである。一部の実施形態において、多孔質粒子は、これらが高圧に抵抗する能力と同時にタンパク質被覆のための相当に大きな表面積（単位質量またはカラム容積当たり）を提供するので、有益な場合がある。
【００４５】
固体固定相は、１００から１，０００Åの範囲内の平均孔径を有する孔を含むことができる。例えば、平均孔径は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、またはこれらの間のあらゆる数値もしくは範囲であってよい。
【００４６】
幾つかの実施形態において、前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ      式１
（式中、Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料もしくは一群のこれらのブロックコポリマーを含む表面を有するコア組成物である；Ｗは、水素もしくはヒドロキシルである；およびＱは、非存在、または分析物との静電相互作用、ファン・デル・ワールス（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）相互作用、水素結合相互作用または他の相互作用を最小限に抑える官能基である。）によって表されるコア組成物および表面組成物を有する粒子またはモノリスを含んでいる。
【００４７】
さらに、幾つかの実施形態において、ＷおよびＱは、コア組成物Ｘまたは該コア組成物の表面の自由原子価を使用する。一部の実施形態において、ＷおよびＱは、表面組成物を形成するために選択される。他の実施形態において、Ｘは、１つのブロックコポリマーまたは１群のブロックポリマーを形成するために選択することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、Ｘは、シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、または脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。特定の実施形態において、Ｘは、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。幾つかの他の特定の実施形態において、脂肪族架橋シランの脂肪族基は、エチレンである。
【００４９】
幾つかの実施形態において、コア材料Ｘは、酸化セリウム、酸化ジルコニウム、またはセラミック材料である。幾つかの他の実施形態において、コア材料Ｘは、クロマトグラフィー向上性細孔形状（ＣＥＰＧ）を有することができる。ＣＥＰＧは、例えば当分野における他のクロマトグラフィー媒体とは区別されるように、材料のクロマトグラフィー分離能力を強化することが見出されている形状を含んでいる。例えば、形状は、形成する、選択する、もしくは構築することができ、様々な特性および／または因子を使用すると、材料のクロマトグラフィー分離能力が、当分野において公知または従来法で使用される形状と比較して「向上している」かどうかを決定することができる。これらの因子の例には、高分離効率、より長いカラム寿命および高質量移動特性（例えば、減少した帯域拡張および良好なピーク形状によって証明される。）が含まれる。これらの特性は、当分において認識された技術を使用して測定または観察することができる。例えば、多孔質無機／有機ハイブリッド粒子のクロマトグラフィー向上性細孔形状は、先行技術粒子からは、どちらも例えば質量移動速度を低下させてより低効率をもたらすために望ましくない「インク瓶」または「シェル形」の細孔形状もしくは形態の非存在によって識別される。クロマトグラフィー向上性細孔形状は、微小孔の小集団しか含有していないハイブリッド材料内で見出されている。微小孔の小集団は、ハイブリッド材料において約３４Å未満の径の全ての孔が該材料の比表面積に約１１０ｍ２／ｇ未満しか寄与しない場合に達成される。このような低微小孔表面積（ＭＳＡ）を備えるハイブリッド材料は、高分離効率および良好な質量移動特性（例えば、減少した帯域拡張および良好なピーク形状によって証明される。）を含むクロマトグラフィー向上を生じさせる。微小孔表面積（ＭＳＡ）は、バレット−ジョイナー−ヘレンダ（ＢＪＨ：Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ）法を使用して等温の吸着脚からの多点窒素収着分析によって決定された、３４Å以下の径を備える孔内の表面積であると規定されている。本明細書で使用する頭字語「ＭＳＡ」および「ＭＰＡ」は、「微小孔表面積」を意味するために互換的に使用される。
【００５０】
幾つかの実施形態において、コア材料Ｘは、式Ｚ’ａ（Ｒ’）ｂＳｉ−Ｒ’’（式中、Ｚ’＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ、ジアルキルアミノもしくはトリフルオロメタンスルホネートである；ａおよびｂは、ａ＋ｂ＝３であることを前提に、各々０から３の整数である；Ｒ’は、Ｃ１−Ｃ６直鎖状、環式もしくは分枝状アルキル基である、およびＲ’’は、官能化基である。）を有する表面修飾剤を用いて表面修飾されてよい。また別の実施形態において、コア材料Ｘは、ポリマーでコーティングすることによって表面修飾されてよい。
【００５１】
幾つかの実施形態において、表面修飾剤は、オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、オクチルジメチルクロロシランおよびオクタデシルジメチルクロロシランから成る群から選択される。一部の実施形態において、表面修飾剤は、オクチルトリクロロシランおよびオクタデシルトリクロロシランから成る群から選択される。他の実施形態において、表面修飾剤は、イソシアネートまたは１，１’−カルボニルジイミダゾール（特に、ハイブリッド基が（ＣＨ２）３ＯＨ基を含有する場合）から成る群から選択される。
【００５２】
他の実施形態において、材料は、有機基およびシラノール基修飾の組み合わせによって表面修飾されている。さらに他の実施形態において、材料は、有機基修飾およびポリマーを用いたコーティングの組み合わせによって表面修飾されている。別の実施形態において、有機基は、キラル部分を含んでいる。さらに他の実施形態において、材料は、シラノール基修飾およびポリマーを用いたコーティングの組み合わせによって表面修飾されている。
【００５３】
他の実施形態において、材料は、材料上の有機基と修飾試薬との間の有機共有結合の形成を介して表面修飾されている。さらに他の実施形態において、材料は、有機基修飾、シラノール基修飾およびポリマーを用いたコーティングの組み合わせによって表面修飾されている。他の実施形態において、材料は、シラノール基修飾によって表面修飾されている。幾つかの実施形態において、表面修飾層は、多孔質または非多孔質であってよい。
【００５４】
固定相材料の他の実施形態において、Ｑは、親水性基、疎水性基または非存在である。Ｑが親水性基である固定相材料の一部の実施形態において、Ｑは、脂肪族基である。他の実施形態において、前記脂肪族基は、脂肪族ジオールである。さらに他の実施形態において、Ｑは、式２：
【００５５】
【化１】
2018023372.tif 000003
（式中、ｎ１は、０から３０の整数である；ｎ２は、０から３０の整数である；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各発生は、独立して水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、両性イオン、または基Ｚを表す；Ｚは：
ａ）固定相材料の表面と式３：
（Ｂ１）ｘ（Ｒ５）ｙ（Ｒ６）ｚＳｉ−      式３
（式中、ｘは、１から３０の整数である、
ｙは、０から２の整数である、
ｚは、０から２の整数である、
およびｘ＋ｙ＋ｚ＝３である、
Ｒ５およびＲ６の各発生は、独立してメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｉｓｏ−プロピル、テキシル、置換もしくは未置換アリール、環状アルキル、分枝状アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、または両性イオンを表す；
Ｂ１は、−ＯＲ７、−ＮＲ７’Ｒ７’’、−ＯＳＯ２ＣＦ３、もしくは−Ｃｌである；このときＲ７、Ｒ７’およびＲ７’’は、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｉｓｏ−プロピル、テキシル、フェニル、分枝状アルキルもしくは低級アルキルである。）の１部分との間の共有結合もしくは非共有結合の形成によって生成された表面付着基；
ｂ）直接炭素−炭素結合形成を通して、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ウレア、カーボネート、カルバメート、複素環、トリアゾール、もしくはウレタン結合を通してのＸの表面ハイブリッド基への直接結合；または
ｃ）固定相材料の表面に共有結合していない吸着基；
ｄ）Ｗが水素である場合に、固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基との反応による共有結合の形成によって生成された表面結合基）を表す；
Ｙは、直接結合；ヘテロ原子結合；エステル結合；エーテル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；イミド結合；ウレア結合；チオウレア結合；カーボネート結合；カルバメート結合；複素環結合；トリアゾール結合；ウレタン結合；ジオール結合；ポリオール結合；スチレン、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコールのオリゴマー；スチレン、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコールのポリマー；炭水化物基、多触角炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフ、または両性イオン基を表す；および
Ａは、
ｉ．）親水性末端基；
ｉｉ．）水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキル、もしくは基Ｚ；または
ｉｉｉ．）官能化可能基を表す。
【００５６】
Ｑが式２の脂肪族ジオールである幾つかの実施形態において、ｎ１は、２から１８、または２から６の整数である。Ｑが式２の脂肪族ジオールである他の実施形態において、ｎ２は、０から１８、または０から６の整数である。Ｑが式２の脂肪族ジオールであるさらに他の実施形態において、ｎ１は、２から１８の整数であり、ｎ２は０から１８の整数であり、ｎ１は２から６の整数である、およびｎ２は、０から１８の整数であり、ｎ１は、２から１８の整数であり、およびｎ２は、０から６の整数である、またはｎ１は、２から６の整数であり、ｎ２は０から６の整数である。
【００５７】
Ｑが式２の脂肪族ジオールである固定相材料のさらに他の実施形態において、Ａはｉ）親水性末端基を表し、前記親水性末端基は、アルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリトリトール、ペンタエリトリトールエトキシレート、１，３−ジオキサン−５，５−ジメタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、一価、二価、もしくは多価炭水化物基、多触覚炭水化物、末梢親水性基を含有するデンドリマー、末梢親水性基を含有するデンドリグラフ、または両性イオン基の保護形もしくは脱保護形である。
【００５８】
Ｑが式２の脂肪族ジオールである固定相材料のさらに他の実施形態において、Ａはｉｉ．）水素、フルオロ、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピル、低級アルキル、または基Ｚを表す。
【００５９】
Ｑが式２の脂肪族ジオールである固定相材料のさらになお他の実施形態において、Ａはｉｉｉ．）官能化可能基を表し、前記官能化可能基は、アミン、アルコール、シラン、アルケン、チオール、アジド、もしくはアルキンの保護形もしくは脱保護形である。一部の実施形態において、前記官能化可能基は、この後の反応ステップにおいて新規な表面基を生じさせることができるが、前記反応ステップはカップリング、メタセシス、ラジカル付加、ヒドロシリル化、縮合、クリック、または重合である。
【００６０】
さらに他の実施形態において、基Ｑは、表面修飾剤であってよい。これらの材料のために使用できる表面修飾剤の非限定的例には：
Ａ．）親水性表面装飾を生じさせるシラン類
【００６１】
【化２】
2018023372.tif 000004
【００６２】
【表１】
2018023372.tif 000005
Ａは、以下から選択される：
【００６３】
【化３】
2018023372.tif 000006
または
Ｂ）疎水性もしくは混合親水性／疎水性表面装飾
【００６４】
【化４】
2018023372.tif 000007
【００６５】
【表２】
2018023372.tif 000008
（式中、Ａは、以下の：Ｈ、フェニル、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ８、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、もしくは−Ｒ８（式中、Ｒ８は、オクタデシル、ドデシル、デシル、オクチル、ヘキシル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、フェニル、ベンジル、フェネチル、フェニルエチル、フェニルプロピル、ジフェニルエチル、ビフェニルから選択される。）を生じさせるシラン類が含まれる。
【００６６】
幾つかの実施形態において、Ｚは、直接炭素−炭素結合形成を通して、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ウレア、カーボネート、カルバメート、複素環、トリアゾール、もしくはウレタン結合を通しての表面有機官能性ハイブリッド基への付着を表す。
【００６７】
他の実施形態において、Ｚは、材料の表面に共有結合していない吸着表面基を表す。この表面基は、架橋結合ポリマー、または他の吸着表面基であってよい。例には、アルコール類、アミン類、チオール類、ポリアミン類、デンドリマー類、またはポリマー類が含まれるがこれらに限定されない。
【００６８】
酵素
本技術によるＩＭＥＲ装置、方法およびキットは、ポリマー分析物を含む液体サンプルの高圧連続流運転および分析を達成するために様々な酵素を利用することができる。１つの例は、サンプル調製のためにＨＤＸ  ＭＳにおいて使用されるペプシンである。
【００６９】
一般に、酵素は、サンプル調製または分析のために機能できる本質的にあらゆるタンパク質触媒を含むことができる。１つの典型的な酵素は、プロテアーゼである。プロテアーゼは、特異的開裂プロテアーゼ（例、トリプシン）または非特異的開裂プロテアーゼ（例、ペプシン）であってよい。本技術は、数多くの様々なタイプの酵素、例えばトリプシン、キモトリプシン、ｌｙｓＣ、アミダーゼ類、ＰＮＧａｓｅ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｖ８ならびにこれらおよび／または他の酵素の混合物とともに様々なプロテオミクス用途において使用することができる。プロテアーゼは、以下の広範囲の群：セリンプロテアーゼ類、トレオニンプロテアーゼ類、システインプロテアーゼ類、アスパラギン酸プロテアーゼ類、メタロプロテアーゼ類、およびグルタミン酸プロテアーゼ類のいずれか１つから選択することができる。または、プロテアーゼは、以下の広範囲の群：酸性プロテアーゼ類、中性プロテアーゼ類、または塩基性プロテアーゼ類（もしくはアルカリプロテアーゼ類）のいずれか１つから選択することができる。酵素は、１つより多いプロテアーゼの組み合わせを含む（例、蓄積的および／または相補的機能を有する）ことができる。酵素（もしくは酵素類）は、所望の機能（例、１つ以上の特異的結合を開裂する。）を達成するため、および／または所望の条件下（例、酵素の運転ｐＨをサンプルのｐＨに適合させる。）で運転するために選択することができる。
【００７０】
酵素に加えて、固体固定相は、さらに捕捉基を結合させることができる。捕捉基は、高親和性／特異的捕捉剤（例、抗体もしくは抗体複合体）または低親和性／非特異的捕捉剤であってよい。捕捉基は、固体固定相に共有結合させることができる。捕捉基は、第２作用様式（例、ポリマー分析物の共鳴時間を増加させ、これによりＩＭＥＲの効率を増加させる。）を提供することができる。
【００７１】
共有リンカー
本技術によるＩＭＥＲ装置、方法およびキットは、当該の酵素を固体固定相上に固定化するために様々なリンカーを使用することができる。１つの例は、トリエトキシシリルブチルアルデヒド（ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳ、Ｇｅｌｅｓｔ社から入手できる。）である。
【００７２】
一般に、共有リンカーは、固体固定相および酵素を共有結合（例、カルボン酸およびアミンによって形成されるアミド結合）させることのできる本質的にあらゆる化学的成分を含むことができる。他の例は、アミンおよびＮＨＳ−アルデヒド類、例えばスクシンイミジルｐ−ホルミルベンゾアート（ＳＦＢ）もしくはスクシンイミジルｐ−ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）ならびにアミン類およびグルタルアルデヒド類を含んでいた。幾つかの実施形態において、共有リンカーは、有機官能化シランリンカーを含むことができる。有機官能化シランリンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドであってよい。一般に、酵素はシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基形成および還元アミノ化を通してリンカーに共有結合することができる。一般に、シランリンカーは、ヒドロキシル基を有する固体支持体に、該リンカーおよび固体支持体を接触させることならびに反応混合物をエタノールアミンを用いてクエンチさせることを通して共有結合することができる。この他の酵素は、固体支持体上、例えばＢＥＨ上に適切な固定化プロトコール（例えば、固体支持体の化学的機能性およびタンパク質上の結合部位に合わせて選択される。）を使用して固定化することができる。標的ｐＨでの酵素活性に依存して、固定化プロトコール中には様々なｐＨが必要になる場合がある。例えば、ＢＥＨトリプシンカラムは、酸性ｐＨではなくむしろ中性ｐＨで調製することが必要になる。
【００７３】
図１は、典型的な固体固定相の調製反応を示している。第１に、酵素（ペプシン）は、ＮａＣＮＢＨ３によるシッフ塩基形成および還元アミノ化を通してリンカー（トリエトキシシリルブチルアルデヒド、ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳ）と反応させられる。第２に、酵素−リンカーは、固体支持体（酸処理ＢＥＨ）の表面上でアルコール基と反応させられ、エタノールアミンを用いてクエンチさせられる。
【００７４】
ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳは、第１級もしくは第２級アミン（ＮＨ−）とともにシッフ塩基を形成するアルデヒド化合物である。あらゆるタンパク質は遊離アミンを備えるＮ末端を含有するので、そこでペプシンのＮ末端およびあらゆる利用可能な側鎖アミン基は、ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳとのシッフ塩基複合体を形成させられる。
【００７５】
ＡＬＤカップリング溶液（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ社）を温和な還元剤（ＮａＣＮＢＨ３）としての複合混合物に加え、還元アミノ化を開始させた。シッフ塩基が２時間にわたる攪拌インキュベーションを通して還元されると、このタイプの結合は安定性になる。
【００７６】
酸処理ＢＥＨ（５μ径、３００Åの孔径）を、ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳおよびペプシンの還元複合体を含有する溶液中に加えた。ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳの他方の端は、ＢＥＨ粒子の表面上のシラノールのヒドロキシル基と反応させるために利用できるトリエトキシシリル基を含有している。この反応は、一晩にわたる回転後に完了したので、この後に未反応アルデヒド基を遮断するために１Ｍエタノールアミンを加えることによってクエンチした。
【００７７】
ペプシンＢＥＨのバッチをＮａ３クエン酸塩、ＮａＣｌを用いて洗浄し、最後に０．０８％  ＴＦＡ水溶液中で洗浄して保存した。ペプシンは、塩基性条件下で不可逆的に非活性化した。そこでペプシン溶液のｐＨはバッチ合成を通してｐＨ５下の酸性で保持した。
【００７８】
酵素に結合した固体固定相を次にＩＭＥＲシステムにおいて使用するためにチャンバー（例、カラム、例えば０．１％ギ酸水溶液を含む２．１×３０ｍｍのＵＰＬＣハウジング）内に配置した。様々な実施形態において、チャンバーはＵＰＬＣハウジングであってよい。しかし一般には、チャンバーはオンライン高圧運転のために適合しさえすればよく、様々な幾何学的形態（例、短い共鳴時間のためにはずんぐりして短い、または長い共鳴時間のためには細長い形態）を想定することができる。
【００７９】
高圧システム
ＩＭＥＲは、高圧下で、例えば高圧ＬＣシステム内で使用できる。１つの例は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製ＳＹＮＡＰＴ（商標）Ｑ−ＴＯＦ（商標）質量分析法と結合され、上昇エネルギー質量分析法（ＭＳＥ）モードで獲得され、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  ＳＥＲＶＥＲ（商標）（ＰＬＧＳ、定量的および定性的プロテオミクス研究のための完全統合化Ｍａｓｓ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（商標）プラットホームである。）を使用して処理される、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米国マサチューセッツ州）から入手できるｎａｎｏＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ（登録商標）（ＵＰＬＣ（登録商標））システムである。
【００８０】
図２ＡからＣは、典型的なＩＭＥＲシステムの概略図である。ペプシンカラムは、図１に示した方法によって、ペプシン、ｂＡＬＤ−ＴＥＯＳ、およびＢＥＨ  ５μ、３００Å粒子を用いて調製した。ペプシン−ＢＥＨ粒子をＵＰＬＣカラムハードウエア（２．１×３０ｍｍ）内に装填し、このハードウエアを次にｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ（登録商標）上に据え付けた。ＩＭＥＲシステムをＨＤＸ−ＭＳのためにセットアップしてオンラインで運転させると、分析の速度および便宜性が増加した。
【００８１】
ＩＭＥＲシステム成分は、実験段階に対応する位置に示されている、２個の６ポート弁（つまり、図２ＡからＣに示した略図における１から６と表示された各ポート）を含んでいた。１００μＬ／分の０．０５％ギ酸（ｐＨ２．５）をペプシンカラムに通して補助溶媒マネージャー内に流した。二成分溶媒マネージャーにおいて、勾配を４０μＬ／分で流した。各場合において、タンパク質サンプルをペプシンカラム内に装填し、およそ３０秒間にわたり消化させた。図２Ａおよび２Ｂは、捕捉モードで弁を機能させているシステムを示している。図２Ａは、低圧（９００ｐｓｉ）での実験セットアップを示し、図２Ｂは、高圧（９，５００ｐｓｉ）での実験セットアップを示している。図２Ｂに示した実験では、２．１×１５０ｍｍカラムは、流動制限装置（例、圧力モジュレーター）として機能させるために、捕捉カラムの後に配置した。
【００８２】
２．１×１５０ｍｍカラムは捕捉カラムの後に配置された典型的な流動制限装置（例、圧力モジュレーターを図示したが、流動制限装置は、システム内で圧力を作り出す、および／または維持する本質的にあらゆる構造または機器であってよい。例えば、流動制限装置は、キャピラリーチュービング、充填カラム、またはマイクロ流体素子であってよい。
【００８３】
Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米国マサチューセッツ州）製捕捉カラム２０１（２．１×５ｍｍ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μ径）は、脱塩ステップにおいて消化されたペプチドから塩を除去するために使用した。消化および結果として起こる捕捉（３分間）後に、弁を捕捉モードから溶出モードに切換え、ＭＳ分析のためにペプチドを分析カラム内で分離した。
【００８４】
図２Ｃは、弁が溶出モードにあるＩＭＥＲシステムを示している。捕捉されたペプチドは、捕捉カラムから放出され、分析カラム内で溶媒勾配を使用して分離された。溶出モード中、ペプシンカラムに高圧を適用しなかった。溶媒はペプシンカラムを通って廃棄物内に方向付けた。二成分溶媒マネージャー（ＢＳＭ）は、捕捉ペプチドを溶出するために流れを捕捉カラムへ駆動した。最後に、ペプチドが分析カラム内で分離された。
【００８５】
また別の実験セットでは、トリプシンカラムを、図２ＡからＣに図示したインラインＩＭＥＲシステム内のペプシンカラムの代わりに使用した。トリプシンカラムを用いると、補助溶媒マネージャー（ＡＳＭ）は、１０μＬ／分の流量で２０ｍＭ重炭酸アンモニウムをｐＨ７．９で送達した。
【００８６】
図２ＡからＣと結び付けて記載した装置および方法を使用して、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミン、シトクロームＣおよびモノクローナル抗体を含む複数のモデルタンパク質を消化した。各場合に、オンライン高圧ＩＭＥＲは、固体固定相の劣化を伴わずに高い消化効率および実験再現性ならびに９５％までの配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を示した。
【００８７】
ＨＤＸ  ＭＳは、このためにＩＭＥＲシステムを使用できる１つの典型的分析技術である。また別の実施例では、トリプシンＩＭＥＲは、様々なプロテオミクス用途を有する、オンライントリプシン消化機器（例、広範に使用されるオフライントリプシン消化法の代替法として）として使用できる。さらに別の実施例では、本技術は、タンパク質同定および／または特性解析のための２Ｄ  ＬＣオンライン消化のために使用できる。サンプル調製法に加えて、本技術は、屈折率検出器、ＵＶ検出器、光散乱検出器および質量分析計を含む様々な分析法とともに使用できる。
【００８８】
実験結果
図３Ａは、図２Ａと結び付けて記載した９００ｐｓｉペプシン消化後のホスホリラーゼｂのクロマトグラムを示している。９００ｐｓｉでホスホリラーゼｂを消化すると１１８種の共通ペプチドで、７６％の配列包括度が生じたのみである。これとは対照的に、図３Ｂは、図２Ｂと結び付けて記載した９，５００ｐｓｉペプシン消化後のホスホリラーゼｂのクロマトグラムを示している。９，５００ｐｓｉでホスホリラーゼｂを消化すると、無傷タンパク質が全く残留することなく、１３９種の共通ペプチドで、８２％の配列包括度が生じた。このため、高圧消化は、より多数のペプチドおよびより高い配列包括度を生じさせた。
【００８９】
図４は、９００ｐｓｉ消化（図２Ａおよび３Ａに対応する、右側の明色バー）および９，５００ｐｓｉ消化（図２Ｂおよび３Ｂに対応する左側の暗色バー）についての４から２３の各ペプチド長に対するペプチド数のプロット図を示している。さらに、この図は、高圧法がホスホリラーゼｂの消化においてより多数の短ペプチド（例、より高い配列包括度）をもたらすことを証明している。
【００９０】
一般に、加圧消化は、低圧で消化するのが困難なタンパク質を含むタンパク質についての消化効率を増加させることができるために、さらに有益である。さらに、本技術の高圧オンライン装置および方法の結果として生じる向上した配列包括度および消化効率は、より高次のタンパク質構造における局在性立体構造変化の向上した分解能を提供できるため、プロテオミクス用途、例えばＨＤＸ  ＭＳにおいて有益である。
【００９１】
ＨＤＸ  ＭＳ中、「逆交換」と呼ばれる現象が発生する可能性がある；タンパク質骨格からの水素が重水素と交換されると、標識重水素は、温度、ｐＨおよびペプシンカラム媒体が適正に制御されない場合は急速に水素へ戻される可能性がある。逆交換は、より高次のタンパク質構造における局所性立体構造変化に関する情報の消失を引き起こす。そこで、ＨＤＸ  ＭＳ内における迅速な消化および／または急速な脱塩（例、１０分間未満の分離）を通してより低レベルの逆交換を達成することが重要である。
【００９２】
図５は、十分に重水素化されたブラディキニンのＨＤＸ  ＭＳ分析における様々な温度での逆交換率（％）を示している。この図は、本技術（図２Ｂに記載したオンライン高圧ペプシンＩＭＥＲ）の実施形態における逆交換率（％）と低圧ＰＯＲＯＳ（登録商標）ペプシンカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州）から市販で入手できる、図２Ａに類似するセットアップ）からの逆交換率（％）とを比較している。比較における両方の実験は、同一流量、温度および試薬を用いて実施した。唯一の変量は、固体固定相および圧力であった−Ｐｏｒｏｓ装置は低圧で運転したが、本技術の実施形態による装置はオンライン、高圧で運転した。３７℃未満の全温度で、本技術の実施形態はＰＯＲＯＳ（登録商標）カラムより低い逆変換率を示した。何らかの特定の理論によって拘束されることを意図しなくても、本技術の優れた運転は、少なくとも一部には、高圧での増加したタンパク質消化効率に起因する。
【００９３】
上記の例示および実施例は、ＨＤＸ  ＭＳの状況における本技術の利点−減少した実験アーチファクトおよび信号消失（例、逆交換）と結び付けた、増加したタンパク質消化速度および効率を証明している。様々なプロテオミクスおよびバイオテクノロジー用途におけるこれらやこの他の利点は、当業者には明白になるであろう。
【００９４】
本技術は、特定の実施形態を参照しながら詳細に図示および記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定された本技術の精神および範囲から逸脱せずに、形態および詳細において様々に変更され得ることを理解できるはずである。
【図１】
2018023372.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月30日(2017.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１７２バール（約２，５００ｐｓｉ）から約２４１３バール（約３５，０００ｐｓｉ）の圧力下で、オンラインシステムにおいて共有結合リンカーにより酵素に結合した固体固定相にポリマー分析物を含む液体サンプルを流し、これによりポリマー分析物を酵素的に開裂させることを含む、方法。
【請求項２】
酵素に結合でき、約１７２バール（約２，５００ｐｓｉ）から約２４１３バール（約３５，０００ｐｓｉ）の圧力下で操業できる固体固定相を選択し、
酵素に共有結合した固体固定相を、入口および出口を有するチャンバー内に配置することを含む、方法であって、
当該チャンバーは、圧力モジュレーターと流体連絡しており、当該圧力モジュレーターは、オンラインシステムにおいて、圧力下でポリマー分析物を含む液体サンプルが入口から固体固定相を通って出口の外へ流れる流れを維持するように適合されている、
方法。
【請求項３】
固体固定相は、０．１から１０μｍの範囲内の平均径を有する粒子を含み、
当該粒子が、０．１から２．５ｃｍ３／ｇの範囲内の平均細孔容積または１００から１，０００Åの範囲内の平均孔径の少なくとも１つをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固体固定相は、捕捉基に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
固体固定相は、エチレン架橋（ＢＥＨ）粒子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
共有リンカーは、トリエトキシシリルブチルアルデヒドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
酵素は、プロテアーゼを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
酵素は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、ｌｙｓＣ、アミダーゼ、ＰＮＧａｓｅ、ＰＮＧａｓｅ  ＦまたはＶ８の１種以上を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
酵素は、トリプシンまたはペプシンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリマー分析物は、生体高分子の分析物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
生体高分子の分析物は、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、デオキシリボ核酸またはリボ核酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体高分子の分析物は、タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
圧力は、約５５１バール（約８，０００ｐｓｉ）から約１０３４バール（約１５，０００）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
出口から流出する分析物を収集すること；
液体クロマトグラフィーによって収集された分析物を分離すること；
分離された分析物を質量分析法によって分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）約１７２バール（約２，５００ｐｓｉ）から約２４１３バール（約３５，０００ｐｓｉ）の間の第１の圧力および（ｉｉ）約１７２バール（約２，５００ｐｓｉ）未満の第２の圧力の間を循環させることをさらに含む、請求項２に記載の方法。