(57)【要約】【課題】細胞内における酸化還元状態の変化を単一の励起波長での蛍光で評価でき、かつその細胞内発現量に依らずに酸化還元状態の変化を評価できる分子ツールの提供。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、かつ２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、
１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、
１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、
２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、
２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、かつ
２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換された
アミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質。
【請求項２】
１番目と２番目のアミノ酸残基との間へのバリン（Ｖ）の挿入；
２６番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３０番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）への置換；
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）への置換；
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）への置換；
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）への置換；
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）への置換；及び
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）への置換；
から成る群から選択される少なくとも１つの変異をさらに有する、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
１番目と２番目のアミノ酸残基との間にバリン（Ｖ）が挿入され、
２６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、
３０番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）で置換され、
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）で置換され、
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、かつ
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換された、請求項１又は２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質又は請求項４に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質、又は請求項４に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、
前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
検出された蛍光の変色に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすること
を含む方法。
【請求項９】
抗癌剤のスクリーニング方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光タンパク質、又は請求項４に記載の融合タンパク質を癌細胞内に存在させ、
候補薬剤の添加前における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
候補薬剤を前記癌細胞に添加し、
候補薬剤の添加後における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
候補薬剤の添加前後における蛍光の変色に基づいて、候補薬剤添加前と比較して細胞内を酸化状態とする薬剤を選択すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内における酸化還元状態をモニターするための蛍光タンパク質、ＤＮＡ、ベクター、形質転換体、及び方法に関する。また本発明は、当該蛍光タンパク質を用いて抗癌剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内では、酸化還元反応が関連する様々な事象が起こっている。例えば細胞呼吸の代謝系の最終段階に位置する電子伝達系では、ＮＡＤＨの酸化によって生じた電子が最終的に酸素に伝達され、水が生成する。当該電子伝達系と共役して起こる酸化的リン酸化によりＡＴＰが生成する。
【０００３】
植物の光合成においても酸化還元反応が起こっている。葉緑体のチラコイド膜において、クロロフィル（光合成色素）が光エネルギーを用いて水を分解し、プロトン、酸素分子及び電子を生じる。このときに生じた電子によってＮＡＤＰ+が還元され、ＮＡＤＰＨが生成する。さらに、チラコイド膜内外のプロトン濃度勾配を利用して、ＡＴＰ合成酵素によってＡＴＰが生成する。
【０００４】
また、好気生物が酸素を消費する過程で発生する活性酸素種は、非常に強力な酸化作用を有し、過剰に存在すると細胞内タンパク質、酵素、細胞膜、ＤＮＡなど、細胞を構成する多くの分子を酸化変性し、細胞機能障害を引き起こし得る。
【０００５】
細胞内におけるこのような酸化還元事象の詳細を理解するために、細胞内の酸化還元状態をモニターできる分子ツールの開発が望まれている。
【０００６】
細胞内の酸化還元状態をモニターできる分子ツールとして、蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＳ１４７及びＱ２０４がシステイン残基で置換された、ｒｏＧＦＰ（Redox-sensitive green fluorescent protein）が知られている（非特許文献１、２）。ｒｏＧＦＰは、上記２つのシステイン残基中のチオール基がジスルフィド結合により結ばれた酸化型、又は上記システイン残基中のチオール基が遊離状態である還元型のいずれかの形態で存在する。酸化型と還元型の存在比は、ｒｏＧＦＰの周囲環境の酸化還元状態に依存して変化する。当該変化は、ｒｏＧＦＰの励起スペクトルの形状変化として検出される。ｒｏＧＦＰの励起スペクトルには２つの励起極大波長（４００ｎｍ、４９０ｎｍ）が存在し、当該励起波長における蛍光強度の比を測定することで、ｒｏＧＦＰの周囲環境の酸化還元状態をモニターすることが可能となる。
【０００７】
また、酸化還元に伴って蛍光強度が変化する酸化還元応答蛍光タンパク質Ｏｂａ−Ｑ（oxidation balance sensed quenching protein）が報告されている（特許文献１、非特許文献３）。Ｏｂａ−Ｑは単一の励起波長・蛍光波長で酸化還元状態の変化を観察できるため、細胞内での多色観察に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１５−９１２２６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hanson G.T.et al., Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 13044-13053.
【非特許文献２】Lohman J.R.et.al., Biochemistry, 2008, 47, 8678-8688
【非特許文献３】Sugiura K. et.al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 457, 242-248
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｒｏＧＦＰを使用した場合、細胞内における酸化還元状態をモニターするには、二つの励起波長での蛍光強度を測定する必要があり、手間がかかるという問題があった。また、蛍光顕微鏡観察で酸化還元状態の変化を直接評価できないという問題点があった。さらに、ｒｏＧＦＰはｐＨ感受性が高く、細胞内での使用が困難であるとの問題点があった。
【００１１】
また、Ｏｂａ−Ｑは酸化還元状態の変化を蛍光強度の変化として検出するため、細胞内でのＯｂａ−Ｑの発現量が観察結果に影響を与える。特にＯｂａ−Ｑの発現量が低い場合、細胞内における酸化還元状態の精密な定量が困難であるという問題点があった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、細胞内における酸化還元状態の変化を単一の励起波長での蛍光で評価でき、かつその細胞内発現量に依らずに酸化還元状態の変化を評価できる分子ツールを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討した結果、驚くべきことに、ＧＦＰに特定のアミノ酸変異を施した蛍光タンパク質の蛍光が、酸化還元状態の変化に応じて変色することを見出した。当該蛍光タンパク質を用いれば、細胞内における酸化還元状態の変化を、そのタンパク質の発現量に依存せずに、その蛍光の変色に基づいて測定することが可能となることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
従って、本発明は以下の態様を有する。
［１］
配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、
１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、
１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、
２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、
２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、かつ
２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換された
アミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質。
［２］
１番目と２番目のアミノ酸残基との間へのバリン（Ｖ）の挿入；
２６番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３０番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）への置換；
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）への置換；
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）への置換；
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）への置換；
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）への置換；及び
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）への置換；
から成る群から選択される少なくとも１つの変異をさらに有する、［１］に記載の蛍光タンパク質。
［３］
１番目と２番目のアミノ酸残基との間にバリン（Ｖ）が挿入され、
２６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、
３０番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）で置換され、
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）で置換され、
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、かつ
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換された、［１］又は［２］に記載の蛍光タンパク質。
［４］
［１］〜［３］のいずれか１つに記載の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質。
［５］
［１］〜［３］のいずれか１つに記載の蛍光タンパク質又は［４］に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［６］
［５］に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
［７］
［６］に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
［８］
細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、
［１］〜［３］のいずれか１つに記載の蛍光タンパク質、又は［４］に記載の融合タンパク質を細胞内に存在させ、
前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
検出された蛍光の変色に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすること
を含む方法。
［９］
抗癌剤のスクリーニング方法であって、
［１］〜［３］のいずれか１つに記載の蛍光タンパク質、又は［４］に記載の融合タンパク質を癌細胞内に存在させ、
候補薬剤の添加前における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
候補薬剤を前記癌細胞に添加し、
候補薬剤の添加後における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、
候補薬剤の添加前後における蛍光の変色に基づいて、候補薬剤添加前と比較して細胞内を酸化状態とする薬剤を選択すること
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の蛍光タンパク質によれば、細胞内における酸化還元状態の変化を、蛍光タンパク質の蛍光の変色に基づいて、蛍光顕微鏡観察などで簡便にモニターすることができる。本発明の蛍光タンパク質は、単一の励起波長を用いて細胞内における酸化還元状態の変化をモニターすることができる。また、蛍光タンパク質の細胞内発現量に依らずに酸化還元状態の変化をモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＦＲＯＧ／Ｂ（Fluorescent protein with RedOx-dependent change in color between Green and Blue）（配列番号２）の、酸化型及び還元型のそれぞれにおける蛍光スペクトルである。また、蛍光スペクトルは、励起光波長を４００ｎｍとして測定した。
【図２】ＦＲＯＧ／Ｂの還元型及び酸化型の蛍光色の観察結果を示す図である。還元型では青色の蛍光を発し、酸化型では緑色の蛍光を発する。
【図３】ＦＲＯＧ／Ｂの酸化還元電位変化を示す図である。
【図４】ＦＲＯＧ／ＢのｐＨ感受性を示す図である。
【図５】ＦＲＯＧ／Ｂを発現させたＨｅＬａ細胞へ、酸化剤（ジアミド）及び還元剤（ＤＴＴ）を添加した場合における蛍光強度の経時変化を示す図である。
【図６】ＦＲＯＧ／Ｂを発現させたＨｅＬａ細胞へ、酸化剤（ジアミド）及び還元剤（ＤＴＴ）を添加した場合における、共焦点顕微鏡による経時観察の結果を示す図である。
【図７】Ａｌｌ１５４１−ＦＲＯＧ／Ｂ融合タンパク質（配列番号３）を発現させた細胞へ、酸化剤（Ｈ2Ｏ2）を添加した場合における蛍光強度の経時変化を示す図である。
【図８】ＦＲＯＧ／Ｂが酸化還元状態の変化に応じて蛍光が変色するメカニズムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、アミノ酸は、特に断らない限り１文字表記で表す。アミノ酸配列の表記は、例えば配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１４９番目のアミノ酸残基であるアスパラギンを、特に断らない限りＮ１４９と表す。他のアミノ酸残基の場合も同様に表記する。また、アミノ酸配列における置換の表記は、例えば配列番号１のＮ１４９がＣに置換される場合、特に断らない限りＮ１４９Ｃと表す。他のアミノ酸置換の場合も同様に表記する。また、アミノ酸配列における挿入の表記は、例えば配列番号１のＭ１とＳ２との間にバリン（Ｖ）が挿入される場合、特に断らない限りＭ１＿Ｓ２ｉｎｓＶと表す。他のアミノ酸挿入の場合も同様に表記する。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＧＦＰ）に複数のアミノ酸残基が同時に置換及び／又は挿入された変異体は、先頭に「ＧＦＰ」と記載し、それぞれの置換及び／又は挿入をハイフン（−）で結ぶこととする。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＧＦＰ）にＭ１＿Ｓ２ｉｎｓＶの挿入がなされ、Ｋ２６Ｒ、Ｓ３０Ｒ、Ｙ３９Ｎ、Ｎ１０５Ｔ、Ｎ１４９Ｃ、Ｖ１５０Ｄ、Ｉ１７１Ｖ、Ｓ２０２Ｃ、Ｔ２０３Ｖ、Ｓ２０５Ｖ、Ａ２０６Ｋ、Ｖ２２４Ｒ及びＨ２３０Ｌのアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列は、「ＧＦＰ−Ｍ１＿Ｓ２ｉｎｓＶ＿Ｋ２６Ｒ＿Ｓ３０Ｒ＿Ｙ３９Ｎ＿Ｎ１０５Ｔ＿Ｎ１４９Ｃ＿Ｖ１５０Ｄ＿Ｉ１７１Ｖ＿Ｓ２０２Ｃ＿Ｔ２０３Ｖ＿Ｓ２０５Ｖ＿Ａ２０６Ｋ＿Ｖ２２４Ｒ及びＨ２３０Ｌ」と表す。配列番号１に対する他の変異体も同様に表記する。
【００１８】
本明細書において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのタンパク質間の配列の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYXや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。なお、本明細書において、ＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１）の変異体におけるアミノ酸配列の番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列を基準として行い、ＧＦＰの塩基配列（配列番号２２）の変異体における塩基配列の番号付けは、配列番号２２の塩基配列を基準として行う。
【００１９】
本明細書において「励起スペクトル」とは、検出する蛍光波長を固定し、励起光の波長を連続的に変化させ、得られる蛍光強度を波長ごとにプロットしたもののことである。本明細書において「励起極大波長」とは、上記励起スペクトルにおいて、最も強い蛍光強度を与える波長のことである。励起スペクトルは分光蛍光光度計により測定される。
【００２０】
本明細書において「蛍光スペクトル」とは、励起光の波長を固定して、得られる蛍光強度を波長ごとにプロットしたもののことである。励起波長の違いによって、蛍光スペクトルの形状は変化することはない。通常、固定する励起波長は励起極大波長を使用する。
【００２１】
励起光によって励起された、酸化型及び還元型の蛍光タンパク質が放出する蛍光の蛍光強度は、分光蛍光光度計や蛍光顕微鏡などで測定することが可能である。
【００２２】
本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、かつ２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質を、以下で「本発明の蛍光タンパク質」とも呼ぶ。
【００２３】
本発明の蛍光タンパク質は、導入された上記２つのシステイン残基中のチオール基がジスルフィド結合により結ばれた酸化型、又は上記システイン残基中のチオール基が遊離状態である還元型のいずれかの形態で存在する。その半反応式は以下の通りである。
【００２４】
【数１】
2018023308.tif 000002
【００２５】
細胞内には、過酸化水素を含む活性酸素などの電子受容体（酸化剤）、及びグルタチオンやチオレドキシンなどの電子供与体（還元剤）が存在する。これらの量は、当該細胞の存在する環境に応じて変動する。ここで本発明において、「細胞内における酸化還元状態をモニターする」とは、当該細胞内における酸化剤及び還元剤の量の変動をモニターすることである。細胞内に本発明の蛍光タンパク質が存在する場合、当該細胞内の酸化剤存在量が増大すると、上記半反応式の平衡は酸化型へと偏る。逆に、当該細胞内の還元剤存在量が増大すると、上記半反応式の平衡は還元型へと偏る。そして、細胞内における酸化還元状態の変化は、本発明の蛍光タンパク質の蛍光の変色として観察される。
【００２６】
励起光波長を固定して蛍光を測定すると、本発明の蛍光タンパク質の酸化型の蛍光色は、還元型の蛍光色と異なる。したがって、当該蛍光色に基づいて、当該蛍光タンパク質が酸化型で存在しているのか、それとも還元型で存在しているのかが識別可能となり、当該蛍光タンパク質が存在する周囲環境における酸化還元状態をモニターすることができる。
【００２７】
「蛍光の変色」は、本発明の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルに存在する２つの蛍光スペクトルピークのうち、長波長側のピーク（以下で「第一の蛍光スペクトルピーク」とも呼ぶ）に由来する蛍光（Ｆ１）と短波長側のピーク（以下で「第二の蛍光スペクトルピーク」とも呼ぶ）に由来する蛍光（Ｆ２）との比率（Ｆ１／Ｆ２）の変化として定量化することができる。ここで、（Ｆ１／Ｆ２）の値が大きいほど、より酸化的な状態であることを示し、（Ｆ１／Ｆ２）の値が小さいほど、より還元的な状態であることを示す。
【００２８】
Ｆ１とＦ２との比率は、特に限定されないが例えば、第一の蛍光スペクトルピークのピーク面積と第二の蛍光スペクトルピークのピーク面積との比率であってもよい。例えば、第一の蛍光スペクトルピークのピーク面積は、４９０nm〜６００nmの領域の蛍光スペクトルの面積として計算され、第二の蛍光スペクトルピークのピーク面積のピーク面積は、４１０nm〜４９０nmの領域の蛍光スペクトルの面積として計算されてもよい。ここで４９０nmは、第一の蛍光スペクトルピークと第二の蛍光スペクトルピークとの境界である。
【００２９】
また例えば、Ｆ１とＦ２との比率は、第一の蛍光スペクトルピークの極大蛍光波長における蛍光強度と第二の蛍光スペクトルピークの極大蛍光波長における蛍光強度との比率であってもよい。
【００３０】
本発明の蛍光タンパク質の蛍光強度をより増大させるために、本発明の蛍光タンパク質は、
１番目と２番目のアミノ酸残基との間へのバリン（Ｖ）の挿入；
２６番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３０番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）への置換；
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）への置換；
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）への置換；
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）への置換；
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）への置換；及び
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）への置換
から成る群から選択される少なくとも１つの変異を有しても良い。
【００３１】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、かつ２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、さらに、
１番目と２番目のアミノ酸残基との間へのバリン（Ｖ）の挿入；
２６番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３０番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）への置換；
３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）への置換；
１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）への置換；
１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）への置換；
２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）への置換；
２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）への置換；及び
２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）への置換
から成る群から選択される少なくとも１つの変異を有する、蛍光タンパク質である。
【００３２】
本発明の蛍光タンパク質のより好ましい一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１番目と２番目のアミノ酸残基との間にバリン（Ｖ）が挿入され、２６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、３０番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、３９番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）で置換され、１０５番目のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）で置換され、１４９番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、１５０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸（Ｄ）で置換され、１７１番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、２０２番目のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）で置換され、２０３番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、２０５番目のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）で置換され、２０６番目のアミノ酸残基がリシン（Ｋ）で置換され、２２４番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）で置換され、かつ２３０番目のアミノ酸残基がロイシン（Ｌ）で置換されたアミノ酸配列からなる、蛍光タンパク質である。
【００３３】
異なる蛍光色を有する（すなわち、極大蛍光波長が大きく異なる）、複数の酸化還元応答性蛍光タンパク質は、その色の違いにより、同一細胞内で同時に使用しても区別可能である。また、極大励起波長が大きく異なる酸化還元応答性蛍光タンパク質の組み合わせは、一方の蛍光タンパク質がほとんど反応できない波長の励起光を照射することで、他方の蛍光タンパク質のみの蛍光を観察することを可能とする。
【００３４】
本発明の蛍光タンパク質においては、例えば励起光波長を３８０〜４１０ｎｍ付近に、好ましくは４００ｎｍ付近に固定して蛍光が測定される。
【００３５】
野生型のＧＦＰの蛍光強度は、周囲環境のｐＨ変化に依存して変動する。一方、本発明の蛍光タンパク質は、ｐＨ７．０〜８．０の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い。ここで、「ｐＨ感受性が低い」とは、ｐＨを変化させて、本発明の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルに存在する２つの蛍光スペクトルピークのうち、長波長側のピークに由来する蛍光（Ｆ１）と短波長側のピークに由来する蛍光（Ｆ２）との比率（Ｆ１／Ｆ２）の変動率が通常４０％以内、好ましくは３０％以内のことである。
【００３６】
本発明の蛍光タンパク質は、親タンパク質（ＧＦＰ）に対して、アミノ酸変異を導入することで作製され得る。変異の導入方法については以下で詳述する。また、本発明の蛍光タンパク質は、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできる。
【００３７】
本発明の蛍光タンパク質は、それ単独の形態のみに制限されるものではなく、任意の改変、修飾等を加えた態様で使用することができる。例えば、第二のタンパク質との融合、タンパク質精製を容易とするためのペプチドタグ（例えばＨｉｓタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ）の付加、タンパク質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。
【００３８】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とが融合されてなる、融合タンパク質である。本発明の蛍光タンパク質と、第二のタンパク質とは、所定数のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して連結される。リンカーを構成するアミノ酸配列及びそのアミノ酸残基数は、本発明の蛍光タンパク質の機能を阻害しない限り、任意に選択され得る。例えば、1又は複数のグリシン及びセリンを含むＧＳリンカーが挙げられる。例えば、（ＧＧＳＧＧ)nであっても良い。ここで、ｎ＝１〜１０である。上記第二のタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ペルオキシレドキシン、ペルオキシダーゼ、グルタレドキシンがある。特に、本発明の蛍光タンパク質とペルオキシレドキシン、ペルオキシダーゼ又はグルタレドキシンとを融合させたタンパク質は、融合前の本発明の蛍光タンパク質と比較して、酸化還元感受性を向上させることができる。
【００３９】
本発明の融合タンパク質は、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ、及び第二のタンパク質をコードするＤＮＡを、リンカーをコードするＤＮＡと連結した形で組み換えベクターに挿入し、当該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することで作製することができる。また、本発明の蛍光タンパク質と第二のタンパク質とを別々に作製し、それらを連結することで作製することもできる。本発明の蛍光タンパク質と第二のタンパク質とを連結する時期に特に限定はなく、それらを個別に作製後速やかに連結させてもよく、又はいずれか一方のタンパク質が作製されて特定の用途に使用された後に、他方のタンパク質と連結させてもよい。
【００４０】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質、又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡである。一の実施形態において、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡは、親タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列番号２２の塩基配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列において、本発明の蛍光タンパク質を特徴付けるアミノ酸変異に対応するコドンの置換又は挿入がなされた塩基配列からなる。
【００４１】
本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの作製方法は、特に限定されないが、例えば、親タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、配列番号２２の塩基配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを基に、ＰＣＲ、部位特異的変異法その他の一般的な遺伝子工学的手法によって作製することができる。また部位特異的変異等の遺伝子工学的手法は、例えばManiatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）及びその他の、当業者に広く利用されている実験操作マニュアル書に記載されている。
【００４２】
本発明の一態様は、本発明の蛍光タンパク質、又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターである。本発明の組み換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよく、また本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等が挙げられる。
【００４３】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたり、あるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００４４】
また、本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択すればよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち宿主細胞の染色体複製とは無関係に自律的に複製可能なベクターであってもよい。また、宿主細胞のゲノムに統合され、統合された染色体と共に複製されるものであってもよい。例えば、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることが可能である。
【００４５】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＧＢＴ−９（Clontech社製）、ｐｅｔ２３ａ（Novagen社製）等を例示することができる。本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質の発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作も、前記Maniatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）及びその他の実験操作マニュアル書の記載に基づいて行うことができる。
【００４６】
本発明の一態様は、本発明の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞である。宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、バチラス（Bacillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌、エルウニア（Erwinia）属細菌、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属細菌、ロドバクター（Rhodobacter）属細菌、ストレプトミセス（Streptomyces）属微生物、ザイモモナス（Zymomonas）属微生物、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞を挙げることができる。
【００４７】
宿主細胞に組み換えベクターを導入する方法としては、前記のManiatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982）を初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、及び、BIO/TECHNOLOGY vol. 6, 1988, page 47等に記載されている。
【００４８】
本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質は、本発明の組み換えベクターを前記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、タンパク質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００４９】
本発明の一態様は、細胞内の酸化還元状態をモニターする方法であって、本発明の蛍光タンパク質、又は融合タンパク質を前記細胞内に存在させ、前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、検出された蛍光の変色に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることを含む方法である。以下で「本発明の酸化還元状態をモニターする方法」とも呼ぶ。当該方法において、細胞内に本発明の蛍光タンパク質、又は融合タンパク質を存在させるためには、本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換えベクターを細胞へと形質転換し、当該細胞内で本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を発現させるか、或いは、本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を細胞内へ直接導入する。本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質を細胞内へ直接導入する方法は特に限定されないが、例えば、カチオン性脂質をベースとしたタンパク質導入試薬などを使用して行われる。また、エレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法によっても行われる。
【００５０】
上記における、蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光の検出は、特に限定されないが、例えば蛍光顕微鏡を使用して、又は分光蛍光光度計を使用して行われる。例えば、蛍光顕微鏡で観察しながら、本発明の蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光の変色に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることができる。また、「検出された蛍光の変色に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすること」は、本発明の蛍光タンパク質の蛍光スペクトルに存在する２つの蛍光スペクトルピークのうち、長波長側のピーク（以下で「第一の蛍光スペクトルピーク」とも呼ぶ）に由来する蛍光（Ｆ１）と短波長側のピーク（以下で「第二の蛍光スペクトルピーク」とも呼ぶ）に由来する蛍光（Ｆ２）との比率（Ｆ１／Ｆ２）の変化に基づいて細胞内の酸化還元状態をモニターすることであってもよい。
【００５１】
本発明の一態様は、抗癌剤のスクリーニング方法であって、本発明の蛍光タンパク質、又は本発明の融合タンパク質を癌細胞内に存在させ、候補薬剤の添加前における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、候補薬剤を前記癌細胞に添加し、候補薬剤の添加後における前記蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出し、候補薬剤の添加前後における蛍光の変色に基づいて、候補薬剤添加前と比較して細胞内を酸化状態とする薬剤を選択することを含む、前記方法に関する。以下で「本発明のスクリーニング方法」とも呼ぶ。
【００５２】
一般的に癌細胞内は、正常細胞内と比較して還元的な状態に保たれている。癌細胞内をより酸化的な状態に誘導し得る薬剤は、抗癌剤の候補となり得る。従来の癌細胞のスクリーニング法では、癌細胞に対して薬剤候補を添加し、癌細胞が死滅するか否か、或いは癌細胞の形状変化を確認することで行われている。しかし、癌細胞が死滅するまでに一定の時間を要するため、薬剤の効果を確認するまでに時間がかかる。また、癌細胞の形状変化を確認するには細胞の画像処理が必要となる。本発明のスクリーニング方法を用いれば、癌細胞内の酸化還元状態を蛍光の変化により候補薬剤をスクリーニングすることができるため、癌細胞の死滅を待たずに迅速に行うことが可能である。また、画像処理手段を用いる必要もない。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法において、本発明の蛍光タンパク質又は本発明の融合タンパク質の癌細胞内に存在させる工程、及び蛍光タンパク質又は融合タンパク質の蛍光を検出する工程は、上記の本発明の酸化還元状態をモニターする方法と同様にして行うことができる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は決して以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００５５】
以下の実施例において、親タンパク質（ＧＦＰ）からの変異体の作製は、部位特異的突然変異誘発法により行われた。使用されるプライマーの配列を以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
2018023308.tif 000003
【００５７】
ここで、表１におけるプライマー名は「Ｐｒｉｍｅｒ＿プライマー番号（Ｆ／Ｒ）−導入される変異」として表記される。「Ｆ」はフォワードプライマー、「Ｒ」はリバースプライマーを示す。例えば、Primer_1(F)-M1_S2insV（配列番号４）は、フォワードプライマーであり、Ｃ１４７＿Ｓ１４８ｉｎｓＤを導入するためのプライマーであることを示す。その他のプライマーも同様に表記される。
【００５８】
実施例１：
ＦＲＯＧ／Ｂ（ＧＦＰ−Ｍ１＿Ｓ２ｉｎｓＶ＿Ｋ２６Ｒ＿Ｓ３０Ｒ＿Ｙ３９Ｎ＿Ｎ１０５Ｔ＿Ｎ１４９Ｃ＿Ｖ１５０Ｄ＿Ｉ１７１Ｖ＿Ｓ２０２Ｃ＿Ｔ２０３Ｖ＿Ｓ２０５Ｖ＿Ａ２０６Ｋ＿Ｖ２２４Ｒ及びＨ２３０Ｌ）（配列番号２）の作製
ＧＦＰをコードするＤＮＡ（配列番号２２）を、ｐｅｔ２３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込んだベクター（ｐｅｔ２３ａ／ＧＦＰ）を鋳型として、ＰｒｉｍＳｔａｒ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を使用した部位特異的突然変異誘発法により、Ｍ１＿Ｓ２ｉｎｓＶ、Ｋ２６Ｒ、Ｓ３０Ｒ、Ｙ３９Ｎ、Ｎ１０５Ｔ、Ｎ１４９Ｃ、Ｖ１５０Ｄ、Ｉ１７１Ｖ、Ｓ２０２Ｃ、Ｔ２０３Ｖ、Ｓ２０５Ｖ、Ａ２０６Ｋ、Ｖ２２４Ｒ及びＨ２３０Ｌに対応する塩基配列の変異を配列番号１に導入した。変異を導入するためのプライマーとして、配列番号４及び５の組み合わせ、配列番号６及び７の組み合わせ、配列番号８及び９の組み合わせ、配列番号１０及び１１の組み合わせ、配列番号１２及び１３の組み合わせ、配列番号１４及び１５の組み合わせ、配列番号１６及び１７の組み合わせ、配列番号１８及び１９の組み合わせ、並びに配列番号２０及び２１の組み合わせを使用した。
【００５９】
ｐｅｔ２３ａ／ＧＦＰ  １０ｐｇを鋳型として、上記プライマー、並びにＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘを用いてＰＣＲ（５０μｌ反応系）を行った。ＰＣＲは、９８℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、１５秒のアニーリング反応及び７２℃、２０秒の伸長・連結反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００６０】
作製した変異体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してＬＢ  ＋５０μＭアンピシリンプレート培地で一晩培養後、２０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で約３時間前培養した。これを、１Ｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で本培養し、吸光度０．４〜０．６のときに、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養温度を２５℃に下げて一晩培養した。培養後の菌体を遠心により回収して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて破砕後、２００００×Ｇで３０分遠心して、ＦＲＯＧ／Ｂ（Fluorescent protein with RedOx-dependent change in color between Green and Blue）を含む上清を得た。
【００６１】
上記の上清を７０℃で３０分間加熱し、大腸菌由来のタンパク質を変性させた。その後、２００００×Ｇで１５分間遠心し、変性タンパク質を除去した。遠心後の上清をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０カラム（東ソー社製）にアプライし、２０％〜０％の間で溶出液中の硫酸アンモニウム濃度を連続的に低下させてフラクションを分取した。分画したフラクション中で夾雑物の少ない部分を一晩２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液中で透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、ＦＲＯＧ／Ｂを得た。得られたタンパク質を、終濃度２０％になるようにグリセロールを加えて液体窒素で凍結し、保存した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号２３とする。
【００６２】
実施例２：
ＦＲＯＧ／Ｂの蛍光スペクトルの測定
５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて、実施例１で作製したＦＲＯＧ／Ｂの１μＭ溶液を調製し、分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を使用してＦＲＯＧ／Ｂの蛍光を測定した。ＦＲＯＧ／Ｂの還元型の蛍光を測定する場合は、蛍光強度測定前に１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下にて１５分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ還元型とした。ＦＲＯＧ／Ｂの酸化型の蛍光を測定する場合は、蛍光強度測定前に、空気酸化によりあらかじめ酸化型とした。極大励起波長（４００ｎｍ付近）における蛍光タンパク質の蛍光を記録した。
【００６３】
酸化型及び還元型のＦＲＯＧ／Ｂの蛍光スペクトルを図１に示す。酸化型及び還元型の蛍光スペクトルのいずれにも、２つの蛍光スペクトルピークが存在した。このうち、５１０ｎｍ付近に極大蛍光波長を有するピークを「第一の蛍光スペクトルピーク」と呼び、４５０ｎｍ付近に極大蛍光波長を有するピークを「第二の蛍光スペクトルピーク」と呼ぶ。還元型から酸化型となると、第一の蛍光スペクトルピークの蛍光強度は増大する一方、第二の蛍光スペクトルピークの蛍光強度は減少する。４９０nm〜６００nmの領域の第一の蛍光スペクトルのピーク面積（ＦG）と４１０nm〜４９０nmの領域の第二の蛍光スペクトルピークのピーク面積（ＦB）との比（ＦG／ＦB）を計算することで、細胞内におけるＦＲＯＧ／Ｂの発現量に依存せずに、細胞内の酸化還元状態を定量的にモニターすることが可能である。
【００６４】
実施例３：ＦＲＯＧ／Ｂの蛍光色の観察
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いて、実施例１で作製したＦＲＯＧ／Ｂの１０μＭ溶液を調製し、サンプルとした。ＦＲＯＧ／Ｂの還元型の蛍光を観察する場合は、蛍光強度測定前に１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で、１５分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ還元型とした。ＦＲＯＧ／Ｂの酸化型の蛍光を観察する場合は、蛍光強度測定前に、空気酸化によりあらかじめ酸化型とした。高圧キセノンランプＬａｍｂｄａＬＳ光源からの光をダイクロイックミラーＤＭ４１０（ＯＬＹＭＰＵＳ）及びバンドパスフィルターＢＰ３４０−３９０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて分光し励起光とした。サンプルから出た蛍光を、ロングパスフィルターＢＡ４２０ＩＦ（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて分光した後、カラーＣＣＤカメラＡＲＴＣＡＭ−５００ＭＩＷＯＭ（ＡＲＴＲＡＹ）を用いて検出した。結果を図２に示す。ＦＲＯＧ／Ｂは、酸化型が緑色の蛍光を発し、還元型が青色の蛍光を発する。
【００６５】
ＦＲＯＧ／Ｂの蛍光の変色が生じるメカニズムには、ＥＳＰＴ現象が寄与していると考えられる。図８にその推定メカニズムを示す。ＦＲＯＧ／Ｂは、本来青色の蛍光を発する非電離状態のＧＦＰ発色団が、励起時にプロトンを放出することで緑色の蛍光を発するようになるＥＳＰＴ（Excited-state proton transfer）という現象を利用している。ＧＦＰが本来持つＥＳＰＴ経路では、非電離状態の発色団から放出されるプロトンが水分子を介してＳ２０５（またはＴ２０３）、Ｅ２２２の順に輸送される。ＦＲＯＧ／Ｂでは、Ｓ２０５とＴ２０３をバリン（Ｖ）に置換することによってＥＳＰＴ経路を遮断し、代わりにＨ１４８、Ｄ１５０（ＧＦＰの１５０番目アミノ酸のバリン（Ｖ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した）からなる新たなＥＳＰＴ経路を形成させた。この新たな経路を形成するＨ１４８及び１５０の位置が、１４９番目及び２０２番目に導入したシステイン（Ｃ）のジスルフィド結合の形成によって変化する。これにより、ＥＳＰＴ発生確率が変わり、結果的に蛍光波長が青色〜緑色の間で変化することになると推定される。
【００６６】
実施例４：
酸化還元電位の測定
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に終濃度２０ｍＭの酸化型ＤＴＴ及び、それぞれ還元型ＤＴＴを終濃度８．０ｍＭ、４．０ｍＭ、２．０ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．４０ｍＭ、０．２０ｍＭ、８０μＭ、４０μＭ、２０μＭ、８．０μＭ、４．０μＭ及び２．０μＭ加えた１２種類の反応液に、実施例１で作製したＦＲＯＧ／Ｂを終濃度１μＭとなるように加え、室温で２時間保温することでサンプルとした。このとき各サンプルの酸化還元電位はネルンストの式より、それぞれ−３１８ｍＭ、−３０９ｍＶ、−３００ｍＶ、−２８９ｍＶ、−２８０ｍＶ、−２７１ｍＶ、−２５９ｍＶ、−２５０ｍＶ、−２４１ｍＶ、−２２９ｍＶ、−２２１ｍＶ及び−２１２ｍＶと算出される。各サンプルについて蛍光スペクトルを分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を用いて測定し、還元型ＦＲＯＧ／Ｂの割合を還元率（Ｒ）として以下の式を用いて求めた。ここでＦGO、ＦBO、ＦGR及びＦBRはそれぞれ完全酸化時の４９０ｎｍ〜６００ｎｍの領域の第一の蛍光スペクトルのピーク面積、４１０ｎｍ〜４９０ｎｍの領域の第二の蛍光スペクトルピークのピーク面積、完全還元時の４９０ｎｍ〜６００ｎｍの領域の第一の蛍光スペクトルのピーク面積及び４１０ｎｍ〜４９０ｎｍの領域の第二の蛍光スペクトルピークのピーク面積をあらわす。
【数２】
2018023308.tif 000004
横軸を酸化還元電位、縦軸を還元率としてプロットし、ネルンストの式でフィッティングし、ＦＲＯＧ／Ｂの中間酸化還元電位−２９５ｍＶを得た。結果を図３に示す。
【００６７】
実施例５：
ＦＲＯＧ／ＢのｐＨ感受性
ｐＨを７．０、７．２、７．４、７．６、７．８及び８．０に調整したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、実施例１で作製したＦＲＯＧ／Ｂを終濃度１μＭとなるように調整しサンプルとした。ＦＲＯＧ／Ｂの還元型の蛍光を観察する場合は、蛍光強度測定前に１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で、１５分間室温で蛍光タンパク質を保温し、あらかじめ還元型とした。ＦＲＯＧ／Ｂの酸化型の蛍光を観察する場合は、蛍光強度測定前に、空気酸化によりあらかじめ酸化型とした。格ｐＨにおける、酸化・還元時の蛍光スペクトルを分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を用いて測定し、ＦG／ＦBの値を算出した。
【００６８】
ｐＨ７．０〜８．０におけるＦＲＯＧ／ＢのｐＨ感受性を図４に示す。ＦG／ＦBの値の変動率は３０％以下であった。これは、ＦＲＯＧ／ＢのｐＨ感受性が低いことを示している。
【００６９】
実施例６：酸化剤（ジアミド）及び還元剤（ＤＴＴ）の添加による、ＦＲＯＧ／Ｂの蛍光強度の経時変化の測定
ＨｅＬａ細胞内にＦＲＯＧ／Ｂを発現させ、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０  Ｚｅｓｓ）で観察した。４００ｎｍのｄｉｏｄｅ  ｌａｓｅｒで励起し、蛍光を４９０ｎｍ以下の青色光と４９１ｎｍ以上の緑色光に分光してそれぞれ別の検出器で検出した。測定開始５分経過後に５００μｍの１，１−アゾビス−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）（ジアミド）、１５分経過後に１０ｍＭのＤＴＴを加えた。得られた蛍光画像（図６）からＲＯＩで囲まれた領域の４９０ｎｍ以下及び４９１ｎｍ以上の蛍光輝度情報を取得し、図５の結果を得た。
【００７０】
酸化剤であるジアミド添加後に、ＦG／ＦBは増大した。一方、還元剤であるＤＴＴの添加後に、ＦG／ＦBは減少した（図５）。蛍光色の変化を図６に示す。酸化剤であるジアミド添加後に、緑色の蛍光が強くなり、還元剤であるＤＴＴの添加後に緑色の蛍光は弱くなった。また、酸化剤であるジアミド添加後に、青色の蛍光が弱くなり、還元剤であるＤＴＴの添加後に青色の蛍光は強くなった。
【００７１】
実施例７：
ＦＲＯＧ／ＢとＡｌｌ１５４１との融合タンパク質（ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１）（配列番号３）の作製
ｐｅｔ２３ａにＦＲＯＧ／Ｂに対応する塩基配列が挿入されたベクター（ＦＲＯＧ／Ｂ／ｐｅｔ２３ａと称する）に対して、ペルオキシデレドキシンであるＡｌｌ１５４１に対応する塩基配列を挿入した。さらに、ＦＲＯＧ／Ｂに対応する塩基配列とＡｌｌ１５４１に対応する塩基配列との間に、可動性リンカーである（ＧＧＳＧＧ）6に対応する塩基配列を挿入した。得られたベクターを、ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１／ｐｅｔ２３ａと称する。
【００７２】
ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１／ｐｅｔ２３ａを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換してＬＢ  ＋５０μＭアンピシリンプレート培地で一晩培養後、２０ｍｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で約３時間前培養した。これを、１Ｌの２×ＹＴ培地に植菌して３７℃で本培養し、吸光度０．４〜０．６のときに、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養温度を２５℃に下げて一晩培養した。培養後の菌体を遠心により回収して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて破砕後２００００×Ｇで３０分遠心して、ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１を含む上清を得た。
【００７３】
得られた上清を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）にアプライし２０ｍＭイミダゾール−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む洗浄バッファーで洗浄後、１００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて溶出した。分画したフラクション中で夾雑物の少ない部分を一晩２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液中で透析した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（メルクミリポア社製）を用いて濃縮し、ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１を得た。得られた融合タンパク質を、終濃度２０％になるようにグリセロールを加えて液体窒素で凍結し、保存した。なお、得られたタンパク質をコードするＤＮＡを配列番号２４とする。
【００７４】
実施例８：
Ｈ2Ｏ2の添加による、ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１の蛍光強度の経時変化の測定
あらかじめ１０ｍＭのＤＴＴで還元したＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１溶液を、嫌気チャンバーを用いて酸素非存在下で微量透析膜Ｍｉｎｉ  Ｄｙｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ  ８ｋＤａ  ｃｕｔ−ｏｆｆ、２５０μｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、用いて透析しＤＴＴを取り除いた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を用いてタンパク質の終濃度が１μＭになるよう調整し、サンプルとして使用した。分光蛍光光度計ＦＰ−８５００（日本分光株式会社）を使用してサンプルの蛍光強度を測定した。分光蛍光光度計の感度をｍｅｄｉｕｍに設定し、励起波長４００ｎｍとし、励起・蛍光バンド幅を共に５ｎｍに設定して、蛍光スペクトルを観察した。所定の濃度のＨ2Ｏ2を加え、3分後の蛍光スペクトルを観察した（図７）。
【００７５】
ＦＲＯＧ／Ｂ−Ａｌｌ１５４１は、Ｈ2Ｏ2の添加３分後に酸化型へ変化が観察された。ＦＲＯＧ／ＢをＡｌｌ１５４１と融合することで、酸化還元感受性をさらに向上させることができた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の蛍光タンパク質を用いることによって、細胞内における酸化還元状態の変化を、蛍光タンパク質の蛍光の変色に基づいて、蛍光顕微鏡観察などで簡便にモニターすることができる。また、本発明の蛍光タンパク質を用いることで、抗癌剤の迅速かつ簡便なスクリーニングが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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