(57)【要約】【課題】容易にＢＬＶの感染性を評価可能な方法等を提供すること。【解決手段】本発明は、デルタレトロウイルスのＬＴＲに由来し、Ｕ５領域の活性が低下しているか有さないがＵ３領域のプロモータ活性を有する発現制御配列と、当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されているレポーター遺伝子とを含んでなる遺伝子構築物が、発現可能に導入されている、ウシ白血病ウイルスに感染可能な細胞、および、当該細胞を用いたウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルスに感染可能な細胞と、
遺伝子構築物と、を含み、
上記遺伝子構築物は、１）デルタレトロウイルスのＬＴＲに由来し、Ｕ５領域の活性が低下しているか有さないがＵ３領域のプロモータ活性を有する発現制御配列と、２）当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されているレポーター遺伝子と、を含んでなり、
上記遺伝子構築物が、発現可能に上記細胞内に導入されている、細胞。
【請求項２】
上記発現制御配列は、Ｕ５領域の活性を有さない、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
上記発現制御配列は、上記Ｕ３領域に含まれる糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）の活性が低下しているか活性を有さない、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
上記発現制御配列は、配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有するＵ３領域を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞。
【請求項５】
上記デルタレトロウイルスは、ウシ白血病ウイルスである、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞。
【請求項６】
上記レポーター遺伝子は、発光を触媒する酵素をコードするか、発光タンパク質をコードする、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞。
【請求項７】
ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットであって、
請求項１から６の何れか一項に記載の細胞を含む、キット。
【請求項８】
ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法であって、
請求項１から６の何れか一項に記載の細胞と、評価対象となる試料とを接触させる接触工程を含む、方法。
【請求項９】
上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現に基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現と、シンシチウムの形成とに基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記試料が、血液由来である、請求項８から１０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ白血病ウイルスの感染性を評価するための方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）と最も近縁のレトロウイルスで、Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（ＥＢＬ）を誘発する。近年、ＢＬＶ感染牛の数が増加し、比例して発症牛の数も急増傾向にある。
【０００３】
現在、ＢＬＶの感染性を評価する方法としてシンシチウム法（ＳＩＡ）が用いられている。ＳＩＡはＣＣ８１ネコ腎由来細胞株と、分画した牛の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とを共培養し、形成されるシンシチウムを計数することで行われる。
【０００４】
非特許文献１には、牛血液から分離したリンパ球を牛由来初代細胞またはＣＲＦＫ細胞と共培養してシンシチウムを形成させ、抗ＢＬＶ ｐ２５抗体を用いて免疫染色した後、ペルオキシダーゼの発色を用いて顕微鏡下で観察および計数する感染性試験法が記載されている。
【０００５】
非特許文献２には、ＢＬＶ由来のＬＴＲ全長とＥＧＦＰ遺伝子とをコードするプラスミドをＣＲＦＫ細胞に導入して作製したｓｔａｂｌｅ細胞をレポーター細胞として使用し、ＢＬＶ粒子のcell free感染をさせ、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）によってＥＧＦＰ陽性細胞の数を測定する感染性試験法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】L. Jerabek et al., Ann. Rech. Vet., 9, (4), 729-734 (1978)
【非特許文献２】Nancy A. Jewell et al., Journal of Virological Methods, 123, 17-24 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の方法では、シンシチウムの鑑別に熟練を要し、培養および計数に時間と手間がかかるという問題がある。また、非特許文献２に記載の方法では、ＥＧＦＰ陽性細胞の数は、ＢＬＶ粒子が発現するＴａｘタンパク質の量は反映するものの、ＢＬＶ粒子の感染性を必ずしも反映していないという問題があり、感染性有無の検出感度限界に近い場合にはバックグラウンドの非特異的蛍光の影響が特に大きくなる。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、容易にＢＬＶの感染性を評価可能な方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下のものを提供する。
＜１＞  ウシ白血病ウイルスに感染可能な細胞と、
遺伝子構築物と、を含み、
上記遺伝子構築物は、１）デルタレトロウイルスのＬＴＲに由来し、Ｕ５領域の活性が低下しているか有さないがＵ３領域のプロモータ活性を有する発現制御配列と、２）当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されているレポーター遺伝子と、を含んでなり、
上記遺伝子構築物が、発現可能に上記細胞内に導入されている、細胞。
＜２＞  上記発現制御配列は、Ｕ５領域の活性を有さない、＜１＞に記載の細胞。
＜３＞  上記発現制御配列は、上記Ｕ３領域に含まれる糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）の活性が低下しているか活性を有さない、＜１＞または＜２＞に記載の細胞。
＜４＞  上記発現制御配列は、配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有するＵ３領域を含む、＜１＞から＜３＞の何れかに記載の細胞。
＜５＞  上記デルタレトロウイルスは、ウシ白血病ウイルスである、＜１＞から＜４＞の何れかに記載の細胞。
＜６＞  上記レポーター遺伝子は、発光を触媒する酵素をコードするか、発光タンパク質をコードする、＜１＞から＜５＞の何れかに記載の細胞。
＜７＞  ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットであって、
＜１＞から＜６＞の何れかに記載の細胞を含む、キット。
＜８＞  ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法であって、
＜１＞から＜６＞の何れかに記載の細胞と、評価対象となる試料とを接触させる接触工程を含む、方法。
＜９＞  上記接触工程の開始後に、上記レポーター遺伝子の発現に基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞  上記接触工程の開始後に、シンシチウムの形成と、上記レポーター遺伝子の発現とに基づいて、上記試料におけるウシ白血病ウイルスの感染性を評価する、＜８＞に記載の方法。
＜１１＞  上記試料が、血液由来である、＜８＞から＜１０＞の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、容易にＢＬＶの感染性を評価することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】pBLU3-EGFPレポータープラスミドの構築を示す図である。
【図２】ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞によるＰＢＭＣのＢＬＶ感染性の検出の結果を示す図である。
【図３】ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｌ細胞を用いたＢＬＶ定量的解析の結果を示す図である。
【図４】pBLU3GREM-LucとpME/BLV-Taxの一過性発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔１．細胞〕
本発明の細胞は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染可能な細胞内に、後述する遺伝子構築物が発現可能に導入されてなるものである。本発明の細胞は、一例として、後述の〔３．ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法〕において、ＢＬＶの感染を評価するために用いられるため、以下、レポーター細胞と称する場合もある。
【００１３】
（細胞の特性）
本発明において、細胞はＢＬＶに感染可能である。「ＢＬＶに感染可能である」とは、ＢＬＶに対する感染感受性を有することをいう。動物の個体がＢＬＶに感染するか否かとは関りなく、ＢＬＶに感染可能な細胞は、哺乳動物に広く見出すことができる。具体的には例えば、ウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、スイギュウ（Bubalus bubalis）、ヒツジ、ヤギ等のウシ科の哺乳動物；ブタ；マウス；ラット；ウサギ；ネコ；コウモリ；サル；ヒト等の哺乳動物に由来する細胞の中から、ＢＬＶに感染可能な細胞を見出すことができる。ＢＬＶに感染可能な細胞として、より具体的には、例えば、ネコ由来の細胞（ＣＲＦＫ、ＣＣ８１）、ヒツジ由来の細胞（ＦＬＫ）、マウス由来の細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、コウモリ由来の細胞（Tb1Lu）、ヒト由来の細胞（HeLa, 293T）、イヌ由来の細胞（D17）、ウシ由来の細胞（MDBK）等が挙げられる。
【００１４】
また、本発明において、レポーター細胞を含め、ＢＬＶに感染可能な細胞は、ＢＬＶに感染すると、融合細胞であるシンシチウムを形成するものであることが好ましい。
【００１５】
（遺伝子構築物）
上記遺伝子構築物は、以下に記載の「発現制御配列」と、当該発現制御配列の制御下に発現可能に連結されている「レポーター遺伝子」と、を含んでなる。
【００１６】
発現制御配列は、デルタレトロウイルスのＬＴＲ（long terminal repeat）に由来し、Ｕ５領域の活性が低下しているかまたは有さないが、Ｕ３領域のプロモータ活性を有する。
【００１７】
デルタレトロウイルスとしては、ウシ白血病ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス等が挙げられる。ＢＬＶへの特異性をより高める観点から、デルタレトロウイルスは、ウシ白血病ウイルスであることが好ましい。
【００１８】
ＬＴＲは、レトロウイルスが共通に有する繰り返し配列であり、５’側にある５’ＬＴＲと３’側にある３’ＬＴＲとの間に、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の宿主への感染および増殖に必要なタンパク質をコードしている遺伝子領域が挟まれている。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲはそれぞれ、機能的に５’側からＵ３領域とＲ領域とＵ５領域とに区分される。本発明において、「ＬＴＲ」には、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲのいずれも包含されるが、５’ＬＴＲであることが好ましい。
【００１９】
なお、「発現制御配列が、デルタレトロウイルスのＬＴＲに由来する」とは、１）発現制御配列がデルタレトロウイルスのＬＴＲの断片や当該断片に変異を導入したものであることの他、２）発現制御配列が、デルタレトロウイルスのＬＴＲの配列に基づいて人工的に設計され、製造されていること、も包含している。
【００２０】
遺伝子構築物において、Ｕ５領域の活性は、野生型のＵ５領域と比較して低下しているかまたは有さない。これによって、野生型のＵ５領域にあるＩＲＦ（interferon regulatory factor binding site）等による非特異反応を低下させることができ、ＢＬＶの感染性を評価する際の感度が高くなる。Ｕ５領域の活性は、Ｕ５領域の配列によってもたらされる。野生型のＵ５領域の塩基配列の一例として、ＢＬＶ由来である配列番号２に示す塩基配列が挙げられる。一実施形態において、Ｕ５領域の塩基配列にＵ５領域の活性を低下させる変異を有しており、特にＵ５領域にあるＩＲＦの活性を低下させる変異を有している。好ましい一実施形態において、発現制御配列はＵ５領域の配列全体を含まないか、少なくともＵ５領域のＩＲＦの配列を含まない。
【００２１】
遺伝子構築物は、Ｕ３領域のプロモータ活性を有する。Ｕ３領域のプロモータ活性は、ＬＴＲのＵ３領域の配列によってもたらされる。デルタレトロウイルスのＵ３領域は、感染早期にＢＬＶから発現するＴａｘタンパク質に応答し、下流の遺伝子の発現を正に制御するプロモータとしての機能を有し、Ｔａｘ  responsive element（以下、ＴｘＲＥと称する）と称される配列を含んでいる。例えば、ＢＬＶのＵ３領域には、ＴｘＲＥ１、ＴｘＲＥ２、ＮＦｋＢｓｉｔｅ１、ＮＦｋＢｓｉｔｅ２、ＴｘＲＥ３、ＴＡＴＡボックス等の配列が含まれる。野生型のＵ３領域の塩基配列の一例として、ＢＬＶ由来である配列番号１に示す塩基配列が挙げられる。Ｕ３プロモータ活性をもたらす配列としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％または９７％以上、さらに好ましくは９８％または９９％以上、さらに好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００２２】
一実施形態において、発現制御配列は、Ｕ３領域の一つまたは複数のＴｘＲＥに、その活性（Ｔａｘタンパク質への応答性）を低下させる変異を有さないことが好ましい場合があり、さらには一切の変異を有さないことが好ましい場合がある。ＢＬＶのＵ３領域のように３つＴｘＲＥを持つ場合には、ＴｘＲＥ１、ＴｘＲＥ２、ＴｘＲＥ３のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てにその活性を低下させる変異を有していないことが好ましい場合があり、さらには一切の変異を有さないことが好ましい場合がある。また、一実施形態において、少なくともＴｘＲＥ２には変異（例えば、その活性を低下させる変異）を有していないことが好ましい場合がある。
【００２３】
一実施形態において、Ｕ３領域において、ＴｘＲＥ以外の機能性配列に変異を導入して、プロモータ活性の特異性（Ｔａｘタンパク質依存性）をさらに向上させてもよい。例えば、Ｕ３領域に糖質コルチコイド応答エレメント（glucocorticoid response element；ＧＲＥ）が含まれる場合、ＧＲＥの活性は低下しているかまたは有さないことが好ましい場合がある。したがって、一実施形態において、Ｕ３領域に含まれるＧＲＥの塩基配列に変異を有していることが好ましい場合がある。野生型のＧＲＥ配列の一例として、配列番号３に示す塩基配列が挙げられる。配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の１３８〜１５５番目である。一実施形態において、配列番号３に示す塩基配列の４番目、５番目、６番目、１０番目、１１番目、１４番目および１５番目に相当する塩基配列のうちの少なくとも１つに変異を有していることが好ましく、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つ全てに変異を有していることがより好ましい場合がある。
【００２４】
一例において、配列番号３に示す塩基配列の４番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＴである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の５番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＡである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の６番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＴである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の１０番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＡである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の１１番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＣである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の１４番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＴである。一例において、配列番号３に示す塩基配列の１５番目に相当する塩基配列の変異後の塩基はＡである。７つ全てに変異を有している場合のＧＲＥ配列の一例として、配列番号４に示す塩基配列が挙げられる。
【００２５】
Ｕ３領域のＧＲＥの活性は低下しているかまたは有さないことにより、非特異的反応を抑え得る、かつ／またはＴａｘタンパク質に対する反応性が向上し得る。そのため、Ｕ３領域のＧＲＥの活性は低下しているかまたは有さない場合、ウシ白血病ウイルスに対する感度が高くなり得る。
【００２６】
一実施形態において、発現制御配列におけるＵ３領域の塩基配列として、ＧＲＥ配列に変異（例えば上述の変異）を有しており、かつＵ３領域のＧＲＥ配列以外の配列が配列番号１に示す塩基配列のＧＲＥ配列以外の配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００２７】
発現制御配列は、ＬＴＲのＲ領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。Ｒ領域の塩基配列の一例として、配列番号５に示す塩基配列が挙げられる。Ｒ領域の塩基配列としては、例えば、配列番号５に示す塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００２８】
一実施形態において、発現制御配列は、ＬＴＲのＲ領域のうちのＵ３領域に隣り合う連続している領域を含み得る。一例において、当該領域は、Ｒ領域の５’末端の塩基から１５０ｂｐ以内、好ましくは１２０ｂｐ以内、より好ましくは１００ｂｐ以内、さらに好ましくは７０ｂｐ以内、よりさらに好ましくは５０ｂｐ以内である。
【００２９】
遺伝子構築物において、Ｒ領域の活性は、野生型と比較して低下しているかまたは有さないことが好ましい。一実施形態において、Ｒ領域の塩基配列に変異を有している。好ましい一実施形態において、発現制御配列はＲ領域の配列を含まない。
【００３０】
好ましい一実施形態において、発現制御配列は、以下の（１）〜（３）のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを満たす：
（１）Ｕ５領域の配列を含まない、（２）Ｕ３領域のＧＲＥの活性が低下しているかまたは有さない、（３）Ｒ領域の活性が低下しているかまたは有さない。
【００３１】
一実施形態において、発現制御配列として、配列番号６に示す塩基配列および配列番号７に示す塩基配列が挙げられる。別の一実施形態において、発現制御配列として、配列番号６に示す塩基配列または配列番号７に示す塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００３２】
レポーター遺伝子は、上記発現制御配列の制御下に発現可能に連結されている。このような構成により、発現制御配列がＴａｘタンパク質に応答して、レポーター遺伝子の発現を正に制御し、Ｔａｘタンパク質の存在下でレポーター遺伝子の発現が誘導される。
【００３３】
レポーター遺伝子としては、その発現によってレポーター細胞を可視化する遺伝子であることが好ましい。好ましいレポーター遺伝子として、具体的には、例えば、発光を触媒する酵素をコードする遺伝子、自発光型の発光タンパク質をコードする遺伝子、呈色化合物分解酵素をコードする遺伝子等が挙げられる。発光を触媒する酵素をコードする遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。発光タンパク質をコードする遺伝子等としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子、イエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子等が挙げられる。呈色化合物分解酵素をコードする遺伝子としては、βガラクトシダーゼ遺伝子等が挙げられる。これら遺伝子の具体的な配列は、当該技術分野において広く知られており、当業者は容易に選択することができる。
【００３４】
プロモータ配列によりレポーター遺伝子の発現が誘導される限り、プロモータ配列とレポーター遺伝子との間に他の配列を含んでいてもよい。
【００３５】
また、遺伝子構築物は他の配列を含んでいてもよい。そのような配列としては、抗生物質耐性遺伝子、ターミネーター、制限酵素部位等が挙げられる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３６】
遺伝子構築物は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよいが、二本鎖であることが好ましい。また、遺伝子構築物は、環状であってもよいし、直鎖状であってもよい。また、遺伝子構築物を構成する核酸は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドであってもよい。遺伝子構築物としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。細胞内において、遺伝子構築物は、内在性のＤＮＡと独立して存在していてもよいし、内在性のＤＮＡに組み込まれていてもよい。なお、遺伝子構築物は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて作製すればよい。
【００３７】
遺伝子構築物を細胞に導入する方法は、特に限定されず、例えば、リポフェクション法、マイクロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ウイルスベクター法等の公知の方法で導入すればよい。
【００３８】
一実施形態において、細胞は、遺伝子構築物が安定的に導入されている。また、別の実施形態において、細胞は、遺伝子構築物が安定的に導入されて、株化している。
【００３９】
一実施形態において、細胞は、後述の評価方法において好適に利用することができる。また、一実施形態において、細胞は、ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用である。
【００４０】
〔２．ウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キット〕
本発明のウシ白血病ウイルスの感染性の評価用キットは、上記レポーター細胞を構成要素として含んでいる。
【００４１】
なお、本明細書において、「ウシ白血病ウイルスの感染性の評価」は、細胞に感染できるウシ白血病ウイルスが存在するか否かという定性的な評価であってもよいし、細胞に感染できるウシ白血病ウイルスがどのくらい存在するかという定量的な評価であってもよい。
【００４２】
キットにおいて、レポーター細胞は、容器（チューブまたはプレート等）に格納されていてもよく、液体とともに当該容器に格納されていてもよい。一実施形態において、レポーター細胞は、凍結保存液とともに凍結された形態であることが好ましく、使用時に解凍することが好ましい。一実施形態において、レポーター細胞は、１回分に小分けされていてもよい。
【００４３】
キットは、さらに必要に応じて、レポーター細胞を培養するための各種試薬（培養培地、バッファー等）、レポーター細胞および細胞試料（後述する）を培養するための器具（プレート、ピペット等）、測定の時の対照用の細胞、測定の時の対照用の生物学的試料（後述する比較用試料に相当）、測定結果を評価するときに用いられる対照用のデータ、測定装置、キットの使用説明書、などのうちの少なくとも１つを備えていてもよい。また、発光を触媒する酵素をコードする遺伝子が導入されている細胞の場合、発光の基質、補因子、バッファ等のうちの少なくとも１つを備えていてもよい。キットの使用説明書には、後述の〔３．ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法〕の欄で説明する本発明に係る感染性の評価方法の内容が記録されている。
【００４４】
〔３．ウシ白血病ウイルスの感染性の評価方法〕
本発明に係るウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の感染性の評価方法は、上記レポーター細胞と、評価対象となる試料とを接触させる工程（以下「接触工程」とも称する）を含む方法である。
【００４５】
＜接触工程＞
（評価対象となる試料）
評価対象となる試料は、ＢＬＶの感染性の評価対象となる試料であって、感染性のウイルス粒子またはウイルス遺伝子を含有する細胞の何れかまたは両方を含み得る試料である。ウイルス粒子は、通常、細胞外に存在する。評価対象となる試料の由来は、被験動物由来の試料であってもよいし、培養された試料（例えば、培養細胞や培養組織、培養上清等）であってもよいが、一例において、被験動物由来の試料であることが好ましい。また、被験動物由来の試料は、細胞を含む試料であってもよいし、細胞を含まない試料であってもよい。一実施形態において、被験動物由来の試料は、ＢＬＶの主要な感染対象細胞である白血球を含む試料であることが好ましい。なお、試料は、ウイルス粒子またはウイルス遺伝子を含有する細胞の何れかまたは両方を含むことが疑われる試料であることが好ましいが、（結果として）ウイルス粒子およびウイルス遺伝子を含有する細胞の何れも含まない場合もあり得る。
【００４６】
被験動物としては、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられ、特に、ＢＬＶに感染しうる動物であることが好ましい。非ヒト動物は、特に限定されないが、例えば、ウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、スイギュウ（Bubalus bubalis）、ヒツジ、ヤギ等のウシ科の哺乳動物；ブタ；マウス；ラット；ウサギ；ネコ；およびサル等の哺乳動物が挙げられる。被験動物は、好ましくはウシ科の哺乳動物であり、より好ましくは、ウシ、コブウシおよびスイギュウであり、さらに好ましくはウシおよびスイギュウであり、特に好ましくはウシである。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、および役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。被験動物は、生きている動物であってもよいし、死亡した動物であってもよい。
【００４７】
特に限定されないが、試料は、例えば、被験動物の組織に由来する試料；または、血液、尿、唾液、乳汁、および鼻汁等の、被験動物の体液に由来する試料；が挙げられる。試料は、好ましくは体液に由来するものであり、より好ましくは血液または乳液に由来するものであり、さらに好ましくは血液に由来するものである。なお、被験動物由来の試料は、被験動物から取得した試料そのものでもよいが、被験動物から取得した試料を精製して、細胞を濃縮したもの或いは細胞以外の成分を濃縮したものでもよい。
【００４８】
血液に由来する試料としては、例えば、全血液、あるいは、全血液から白血球を精製した（あるいは、赤血球や血小板等の他の細胞を除去した）試料等が挙げられる。そのような試料としては、例えば、精製したＰＢＭＣ（末梢血単核球）；ＷＢＣ（白血球）；または、全血液から赤血球を破砕または除去した試料；等があげられる。
【００４９】
（接触工程の条件や詳細の例示）
上記レポーター細胞と、評価対象となる試料とを接触させる工程では、例えば、ＢＬＶの細胞間感染が成立しうる条件にて、レポーター細胞と試料とを接触させる。
【００５０】
評価対象となる試料が細胞試料である場合の接触工程の具体的な一例では、レポーター細胞と細胞試料との双方を維持可能な細胞培養用の液体培地中において、レポーター細胞と細胞試料とを接触させる。細胞培養用の液体培地は、レポーター細胞および細胞試料の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えば、当該細胞試料に適した基礎培地を液体培地のベースとすればよい。液体培地に、レポーター細胞と細胞試料とを加える順序などは特に限定されない。なお、細胞試料が、細胞を含む液体（例えば、体液）である場合は、細胞試料とレポーター細胞とを直接接触させてもよい。
【００５１】
評価対象となる試料が細胞試料である場合の接触工程の一例では、レポーター細胞と細胞試料とを、所定の温度条件下で、所定の時間、接触させる。すなわち、レポーター細胞と細胞試料とをインキュベーションする。接触工程の温度条件は、細胞培養が可能な条件であればよいが、例えば、３５℃以上で４０℃以下の範囲内であることが好ましく、３７℃以上で３８℃以下の範囲内であることがより好ましい。接触工程の時間は、ＢＬＶの細胞間感染が成立しうる時間であればよいが、例えば、１６時間以上であることが好ましく、４８時間以上であることがより好ましい。接触工程の時間の上限は特に限定されず、ＢＬＶの感染性の評価の際に、タイムラプスイメージング等の経時的な観察を行う場合は、求められている観察時間に応じて適宜設定すればよい。なお、接触工程のその他の条件は、例えば、レポーター細胞および細胞試料をインキュベーションする条件に準じて決定をすればよい。
【００５２】
評価対象となる試料が細胞を含まない試料である場合の接触工程の一例では、レポーター細胞を維持可能な細胞培養用の液体培地中において、レポーター細胞と当該試料とを接触させる。細胞培養用の液体培地は、レポーター細胞の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えば、レポーター細胞に適した基礎培地を液体培地のベースとすればよい。液体培地に、レポーター細胞と試料とを加える順序などは特に限定されない。
【００５３】
評価対象となる試料が細胞を含まない試料である場合の接触工程の一例では、レポーター細胞と試料とを、所定の温度条件下で、所定の時間、接触させる。すなわち、レポーター細胞と試料とをインキュベーションする。接触工程の温度条件は、細胞培養が可能な条件であればよいが、例えば、３５℃以上で４０℃以下の範囲内であることが好ましく、３７℃以上で３８℃以下の範囲内であることがより好ましい。接触工程の時間は、ＢＬＶのcell-free感染が成立しうる時間であればよいが、例えば、１６時間以上であることが好ましく、４８時間以上であることがより好ましい。接触工程の時間の上限は特に限定されず、ＢＬＶの感染性の評価の際に、タイムラプスイメージング等の経時的な観察を行う場合は、求められている観察時間に応じて適宜設定すればよい。なお、接触工程のその他の条件は、例えば、レポーター細胞および試料をインキュベーションする条件に準じて決定をすればよい。
【００５４】
＜ＢＬＶの感染性の評価の工程（評価工程）＞
上記評価工程は、上記接触工程の開始後に行われる工程であり、レポーター細胞における、レポーター遺伝子の発現を指標にして、上記試料におけるＢＬＶの感染性を評価する。好ましくは、評価工程では、１）レポーター遺伝子の発現と、２）シンシチウムの形成とを指標にして、上記試料におけるＢＬＶの感染性を評価する。
【００５５】
評価工程は、接触工程の終了後に行ってもよく、接触工程と並行して行ってもよい。より具体的には例えば、接触工程の終了後にレポーター細胞を固定化してから、評価工程を行う手順が挙げられる。また、例えば、接触工程を所定の時間行った後に、上記レポーター細胞と試料との接触を維持したままで評価工程を行う手順（例えば、タイムラプスイメージング等の経時的な観察を行う場合）が挙げられる。
【００５６】
（レポーター遺伝子の発現の検出と評価）
レポーター遺伝子の発現は、当該レポーター遺伝子の種類に応じた、公知の方法で検出すればよい。例えば、レポーター遺伝子が発光関連遺伝子である場合は、レポーター遺伝子の発現により生じる発光を検出する。発光を検出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、顕微鏡（例えば、蛍光顕微鏡等の光学顕微鏡）観察、発光の画像解析（例えば、プレートリーダーを用いた解析を含む）、受光素子（例えば、ＣＣＤ等）を用いた発光量の解析、これら方法の組合せ等の方法を挙げることができる。
【００５７】
なお、発光関連遺伝子とは、１）各種のルシフェラーゼ遺伝子のように、発光を触媒する酵素（発光基質要求型の発光タンパク質）をコードして、基質の存在下において発光を生じさせる遺伝子、および、２）各種の蛍光タンパク質のような、自発光型の発光タンパク質をコードする遺伝子、の双方を指す。それぞれの発光タンパク質を用いて発光させる方法は、公知の方法を採用すればよく、例えば、蛍光タンパク質の場合は、所定の波長の光で当該タンパク質を励起すればよく、発光基質要求型の発光タンパク質の場合は、基質の共存下で基質−酵素反応を生じさせればよい。例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の場合は、ホタルルシフェリン（基質）と、ＡＴＰと、所定の金属イオン（マグネシウムイオン等）とを共存させた条件で、当該遺伝子を発現させればよい。
【００５８】
レポーター細胞におけるレポーター遺伝子の発現の程度は、主に、上記接触工程から評価工程を行う系中でのＴａｘタンパク質の量に依存する。系中のＴａｘタンパク質は、上記試料に含まれ得るＢＬＶが発現することによって供給される。すなわち、一実施形態では、レポーター遺伝子の発現が検出される場合は、試料がＢＬＶを含んでいると判断し、レポーター遺伝子の発現が検出されない場合は、試料がＢＬＶを含んでいないか、ＢＬＶをごく微量にしか含んでいないか、ＢＬＶの活動性が低いと判断する。或いは、他の実施形態では、レポーター遺伝子の発現量が所定の量（閾値）以上であるときに、試料がＢＬＶを含んでいると判断し、レポーター遺伝子の発現が閾値未満の場合は、試料がＢＬＶを含んでいないか、ＢＬＶをごく微量にしか含んでいないか、ＢＬＶの活動性が低いと判断する。
【００５９】
（シンシチウムの形成の検出と評価）
シンシチウムの形成の検出は、例えば、レポーター遺伝子の発現が見られるレポーター細胞に関して、融合細胞の形成が生じているか否かを検出すればよい。レポーター遺伝子が発光関連遺伝子である場合は、レポーター遺伝子の発現により発光しているレポーター細胞に関して、例えば、顕微鏡（例えば、光学顕微鏡）観察、発光の画像解析、または、これら方法の組合せ等の方法によって、シンシチウムの形成を検出する。シンシチウムが形成されると、形成前と比較して発光のスポットが明らかに大きくなるため、シンシチウムの形成を容易に検出可能である。当該検出は、一定範囲（例えば、顕微鏡の一視野内）におけるシンシチウムの形成の検出であってもよい。
【００６０】
ＢＬＶによる細胞間感染またはcell-free感染が成立した場合に、シンシチウムが形成される。レポーター細胞におけるシンシチウムの形成の程度は、主に、上記試料に含まれ得るＢＬＶの感染性に依存する。すなわち、一実施形態では、シンシチウムの形成が検出される場合は、試料が感染性の高いＢＬＶを含んでいると判断し、シンシチウムの形成が検出されない場合は、試料が感染性の高いＢＬＶを含んでいないと判断する。或いは、他の実施形態では、シンシチウムの形成が所定の個数または密度（閾値）以上であるときに、試料が感染性の高いＢＬＶを含んでいると判断し、シンシチウムの形成が閾値未満の場合は、試料が感染性の高いＢＬＶを含んでいないと判断する。
【００６１】
試料におけるＢＬＶの感染性の評価の一例として、レポーター細胞において、シンシチウムの形成と、レポーター遺伝子の発現とが見られる場合、特に、レポーター遺伝子の発現が見られるレポーター細胞がシンシチウムを形成している場合に、試料におけるＢＬＶの感染性が高いと評価する。一方で、レポーター細胞において、レポーター遺伝子の発現が見られるが、シンシチウムの形成が見られない場合に、試料におけるＢＬＶの感染性が低いか感染性がないと評価する。レポーター細胞において、レポーター遺伝子の発現自体が見られない場合に、試料におけるＢＬＶの感染性が低いか感染性がないと評価する。
【００６２】
（検出結果同士を比較しての評価）
レポーター遺伝子の発現とシンシチウムの形成とを指標にして、上記試料におけるＢＬＶの感染性を評価する他の形態として、評価対象となる試料における検出結果と、比較用試料（コントロール）における検出結果とを比較して評価をしてもよい。この形態において、上記試料および比較用試料における、レポーター遺伝子の発現およびシンシチウムの形成の検出方法は、上記したものと同様の方法を採用すればよい。
【００６３】
比較用試料は、評価の目的等に応じて、適宜選択することができる。ＢＬＶを含んでいる「ある試料」と比較して、評価対象となる試料でのＢＬＶの感染性を評価する場合は、当該「ある試料」での、レポーター遺伝子の発現およびシンシチウムの形成の検出結果を閾値（基準値）として、評価対象となる試料での検出結果を評価すればよい。
【００６４】
評価の目的等にもよるが、評価対象となる試料と、比較用試料とは同種の試料であることが好ましい。比較の観点にも依存するが、「同種の試料」とは、例えば、１）試料が由来する被験動物の動物種が同じであること、２）試料が由来する組織が同じであること、３）被験動物から採取された試料が何らかの処理を受けている場合は同一の処理を受けていること、の少なくとも一つ、好ましくは全ての条件を満たすことを指す。
【００６５】
評価の目的等にもよるが、評価対象となる試料と比較用試料とは、同一の条件下で、レポーター遺伝子の発現およびシンシチウムの形成の検出を行うことが好ましい。あるいは、異なる条件下でこれらの検出を行う場合、検出結果をノーマライズして比較可能とすることが好ましい。
【００６６】
試料におけるＢＬＶの感染性の評価の一例として、比較用試料よりも評価対象となる試料において、レポーター遺伝子の発現が見られるレポーター細胞がシンシチウムを形成している個数が多い（少なく）または密度が高い（低い）場合に、試料におけるＢＬＶの感染性が、比較試料における感染性より高い（低い）と評価する。
【００６７】
＜その他の工程＞
本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から試料を採取する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料を前処理して細胞試料を調製する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料を前処理して細胞を含まない試料を調製する工程を含み得る。生物学的な試料の前処理としては、例えば、公知の方法に従って、採取された全血液から白血球を精製する（あるいは、赤血球や血小板等の他の細胞を除去する）こと、採取された全血液から細胞以外の成分を精製すること等が挙げられる。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養して得られた培養液から培養細胞を回収する工程を含み得る。また、本発明に係る感染性の評価方法の一実施形態は、被験動物から採取された試料に含まれる細胞を培養して得られた培養液から上清を回収する工程を含み得る。
【００６８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００６９】
〔pBLU3-EGFPレポータープラスミドの構築〕
感染性牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）クローンpBLV-IFをテンプレートとして用い、BLV long terminal repeat（ＬＴＲ）のＵ３領域２１６ｂｐおよびＲ領域上流側４９ｂｐをＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲは、ForwardプライマーとしてAAAATTAATTGTATGAAAGATCATGCCGACCTAGG（配列番号８）を用い、ReverseプライマーとしてAAGAGAGCTCAGGACCGAGAG（配列番号９）を用い、酵素としてKOD plusを用い、以下の条件で実施した。
【００７０】
【表１】
2018023329.tif 000002
【００７１】
得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動後、２７０ｂｐ付近のバンドを切り出し、FastGene Gel/PCR Extraction kit（日本ジェネティクス）を用いて精製した。Nano dropを用いてＤＮＡ濃度を測定し、ＰＣＲ産物２μｇを制限酵素処理に供した。ＰＣＲ産物２μｇを１０Ｕ／５０μＬ Sac I（TOYOBO）により３７℃で２時間処理を行い、前述のkitを用いて精製した。さらに１０Ｕ／５０μＬ NdeI（TaKaRa）により３７℃で２時間処理を行い、同様に再精製し、insert断片とした。
【００７２】
pEGFP-N1（Clontech）２μｇを１０Ｕ／５０μＬ Sac I（TOYOBO）により３７℃で２時間処理を行い、前述のkitを用いて精製した。さらに１０Ｕ／５０μＬ PshBI（TaKaRa）により３７℃で２時間処理を行い、電気泳動後に切り出して、同様に再精製し、vector断片とした。
【００７３】
Nano dropを用いてＤＮＡ濃度を測定し、vector断片５０ｎｇとinsert断片１０ｎｇをligation high ver2.0（TaKaRa）と混合し、１６℃で３０分間反応させた。
【００７４】
５μＬのligation反応液を１００μＬのXL-10Gold competent cells（Agilent）に添加し、氷上で６０分間静置し、４２℃で６０秒間ヒートショックした後、氷上に戻した。５００μＬのＳＯＢ培地を加え３７℃で６０分間前培養した後、カナマイシン含有ＬＢプレートに植菌して培養し、colony directional PCRを用いて標的遺伝子導入大腸菌クローンを選択した。ＰＣＲは、酵素としてGoTaq green Master Mix（Promega）を用い、ForwardプライマーとしてGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC（配列番号１０）を用い、ReverseプライマーとしてGGCCGTTTACGTCGCCGTCC（配列番号１１）を用い、以下の条件で実施した。
【００７５】
【表２】
2018023329.tif 000003
【００７６】
ＰＣＲにより３５３ｂｐのバンドが得られた１クローンについて、２ｍＬのカナマイシン含有液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で２４時間培養し、FastGene plasmid miniprep kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミド精製を行った。
【００７７】
BigDye terminator v1.1（Thermo fisher）およびcolony directional PCRで用いた前述の２種のプライマーを用いて導入部分のシークエンスを確認した。その結果、Vector断片の想定された位置にinsert断片が変異なく導入されたことが確認されたが、insert断片のNdeI制限酵素配列が切断されず、vector断片のPshBI切断部位に平滑末端結合した配列であることが確認された。しかしながらプラスミドの構造上問題がないと考えられることから、このプラスミドをpBLU3-EGFPレポータープラスミドとした（図１）。
【００７８】
〔pBLU3-EGFPプラスミドとＴａｘまたはＢＬＶ発現プラスミドとの共トランスフェクション〕
２９３Ｔ細胞を１×１０５cells/mLの濃度で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、０．５ｍＬずつ２４ウェルプレート（nunc）に播種し、３７℃で１６時間静置した。２６μＬ Opti-MEM（Gibco）を１．５ｍＬチューブに入れ、０．２μｇのpBLU3-EGFPレポータープラスミドと、０．５μｇのＴａｘ強制発現プラスミドpME18/BTax-FLAG（発明者らの自作）または感染性ＢＬＶ発現プラスミドpBLV-IF（発明者らの自作）と、２μＬ FuGENE HD regentとを添加し、よく混合した後、室温で１０分間静置し、transfection mixtureとした。それぞれのプラスミドの陰性コントロールとして、親株であるpME18neoプラスミドおよびpKSIIプラスミドを用いて同様にtransfection mixtureを調製した。
【００７９】
２９３Ｔ細胞を播種し１６時間静置したウェルの上清を新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ ０．５ｍＬに交換し、２５μＬのtransfection mixtureを添加した。３７℃で４８時間培養した後、上清を除いた。２５ｎｇ／ｍＬ ヘキスト３３３４２含有３．６％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを添加し、室温で６０分間静置して、細胞を固定した。蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000（Olympus）を用いて観察、撮影した。
【００８０】
その結果、pBLU3-EGFPがＢＬＶ ＴａｘまたはＢＬＶ共発現下において特異的に蛍光を示すことが確認された。また、ＢＬＶ共発現下ではシンシチウム様の大きな蛍光体として観察できることを確認した。
【００８１】
〔ｐＢＬＵ３−ＥＧＦＰレポーター細胞の構築〕
ネコ腎由来細胞株ＣＣ８１を１０％ＦＢＳ（hyclone）／ＤＭＥＭ（Gibco）に懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。３ｍＬを６ウェルプレート（nunc）に播種し、３７℃で１６時間静置した。
【００８２】
１２５μＬのOpti-MEMを１．５ｍＬチューブに入れ、２．５μＬのlipofectamine 3000 regentを加えた。１２５μＬのOpti-MEMを入れたチューブをもう一本用意し、２．５μｇのpBLU3-EGFPレポータープラスミドと５μＬのP3000 regentを加えた。これらのチューブをよく混合、室温で５分間静置し、transfection mixtureとした。
【００８３】
ＣＣ８１細胞を播種し１６時間静置したウェルの上清を新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ ３ｍＬに交換し、２５０μＬのtransfection mixtureを添加した。３７℃で４８時間培養後、上清を除き、５００μｇ／ｍＬ G418（Roche）含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに培地交換した。３７℃で引き続き培養を行い、抗生物質（５００μｇ／ｍＬ G418（Roche））により死細胞が出なくなるまで培地交換をしながら培養した。抗生物質で選択された安定導入細胞を９６ウェルプレート（nunc）に０．８ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、３７℃で単一細胞クローンによるコロニーができるまで培養した。増殖した７クローンについてＴａｘ強制発現に対する反応性を検討した。その結果、バックグラウンドが低く、Ｔａｘにより蛍光を強く発する１クローンをｐＢＬＵ３−ＥＧＦＰ安定導入ＣＣ８１細胞株、ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞として樹立した。
【００８４】
また、ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞に感染性ＢＬＶ発現プラスミドpBLV-IFをトランスフェクションして、２日間培養し、細胞を固定し、蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000（Olympus）を用いて観察、撮影した。その結果、ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞は、ＢＬＶに感染可能な細胞であり、融合細胞であるシンシチウムを形成することが確認された。
【００８５】
なお、細胞をＣＣ８１細胞からＣＨＯ細胞に変更して同様の実験を行ったところ、細胞内でのＥＧＦＰの発現は確認されるものの、融合細胞であるシンシチウムの形成は確認されなかった。これは、ＣＨＯ細胞が、ＢＬＶに感染できない細胞であることに起因する。
【００８６】
〔ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞とＦＬＫ−ＢＬＶ細胞との共培養〕
ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、60mm grid dish２枚に２ｍＬずつ播種し、３７℃で１６時間培養した。上清を除き、５μｇ／ｍＬ polybrane（SIGMA）含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたは恒常的ＢＬＶ発現細胞株ＦＬＫ−ＢＬＶを３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁した５μｇ／ｍＬ polybrane含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを２ｍＬ加えた。３７℃で３日間培養後、上清を除き、２５ｎｇ／ｍＬ ヘキスト３３３４２含有３．６％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、室温で６０分間静置した。細胞を固定し、蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000（Olympus）を用いて観察、撮影した。
【００８７】
その結果、樹立したＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞は、ＢＬＶ発現細胞との共培養条件下において、特異的にシンシチウム様の大きな蛍光を示すことが確認された。
【００８８】
なお、細胞をＣＣ８１細胞からＣＨＯ細胞に変更して同様の実験を行ったところ、上記と同様に、融合細胞であるシンシチウムの形成は確認されなかった。
【００８９】
〔牛末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）の分離〕
ＢＬＶ感染牛および非感染牛から1０ｍＬ採血を行い、１ｍＬをＤＮＡ抽出用に用い、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ法により１０５細胞中のプロウイルス量を測定した。
【００９０】
ＰＢＭＣの分離は、血液８ｍＬを２，５００ｒｐｍ、室温で２０分間遠心後、白い中間層を２ｍＬ ＰＢＳに移した。ＰＢＳを添加して１０ｍＬにし、４ｍＬ Ficoll paque（GE）が入った１５ｍＬチューブに積層し、１，８００ｒｐｍ、室温で３０分間遠心した。白い中間層を２ｍＬ ＰＢＳに移し、ＰＢＳで１５ｍＬにした後、１，５００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心した。ＰＢＳでさらに１回洗浄した後、１ｍＬ １０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（Gibco）に懸濁し、細胞数を計数板により計測した。
【００９１】
〔ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞によるＰＢＭＣのＢＬＶ感染性の検出〕
ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞を5x Penicillin-Streptomycin-Glutamine（Gibco）、1x MEM Non-Essential Amino Acids Solution（Gibco）、5ug/mL polybrane（SIGMA）含有１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で懸濁し、１２ウェルプレートに播種した。そこにＰＢＭＣまたはＦＬＫ−ＢＬＶ細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で３日間培養した。上清を交換し、蛍光を共焦点蛍光顕微鏡FV-1000（Olympus）を用いて観察、撮影した。さらに３７℃で培養を続け、２４時間おきに同条件で観察、撮影を行った。
【００９２】
その結果、樹立されたＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｇ細胞がＢＬＶ感染牛由来ＰＢＭＣとの共培養下で、特異的にシンシチウム様の大きな蛍光を示し、非感染牛由来ＰＢＭＣとの共培養ではシンシチウム様の大きな蛍光は見られなかった（図２）。またＰＢＭＣが血中プロウイルス量の高いＢＬＶ感染個体から得られたものほど早期に、強い蛍光を発する傾向が見られた（図２のＢ）。なお、図２において、ｂｏｖｉｎｅ １〜４は感染牛、ｂｏｖｉｎｅ ５は非感染牛である。
【００９３】
〔pBLU3-Lucレポータープラスミドの構築〕
テンプレートとしてpGL3（Promega）を用い、ルシフェラーゼ遺伝子１６５３ｂｐをＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲは、ForwardプライマーとしてAAAGGATCCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC（配列番号１２）を用い、ReverseプライマーとしてAAAGCGGCCGCTACACGGCGATCTTTCCGCC（配列番号１３）を用い、酵素としてKOD plusを用い、以下の条件で実施した。
【００９４】
【表３】
2018023329.tif 000004
【００９５】
得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動後、１７００ｂｐ付近のバンドを切り出し、FastGene Gel/PCR Extraction kit（日本ジェネティクス）を用いて精製した。Nano dropを用いてＤＮＡ濃度を測定し、ＰＣＲ産物２μｇを制限酵素処理に供した。ＰＣＲ産物２μｇを１０Ｕ／５０μＬ BamHI（TOYOBO）および１０Ｕ／５０μＬNotI（TOYOBO）により３７℃で２時間処理を行い、前述のkitを用いて精製し、insert断片とした。
【００９６】
pBLU3-EGFP（前述）２μｇを１０Ｕ／５０μＬ BamHI（TOYOBO）および１０Ｕ／５０μＬNotI（TOYOBO）により３７℃で２時間処理を行い、電気泳動後に３６００ｂｐ付近のバンドを切り出して、同様に再精製し、vector断片とした。
【００９７】
Nano dropを用いてＤＮＡ濃度を測定し、vector断片２５ｎｇとinsert断片３７ｎｇをligation high ver2.0（TaKaRa）と混合し、１６℃で３０分間反応させた。
【００９８】
５μＬのligation反応液を１００μＬのXL-10Gold competent cells（Agilent）に添加し、氷上で６０分間静置し、４２℃で６０秒間ヒートショックした後、氷上に戻した。５００μＬのＳＯＢ培地を加え３７℃で６０分間前培養した後、カナマイシン含有ＬＢプレートに植菌して培養し、colony directional PCRを用いて標的遺伝子導入大腸菌クローンを選択した。ＰＣＲは、酵素としてGoTaq green Master Mix（Promega）を用い、ForwardプライマーとしてGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC（配列番号１０）、ReverseプライマーとしてGCCCATATCCTTGCCTGATAC（配列番号１４）を用い、以下の条件で実施した。
【００９９】
【表４】
2018023329.tif 000005
【０１００】
ＰＣＲにより１２９４ｂｐのバンドが得られた８クローンのうち３クローンについて、２ｍＬのカナマイシン含有液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で２４時間培養し、FastGene plasmid miniprep kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミド精製を行った。
【０１０１】
BigDye terminator v1.1（Thermo fisher）および以下の２種のプライマーを用いて導入部分のシークエンスを確認した。Primer 1：CGCATGCCAGAGATCCTATTT（配列番号１５）、Primer 2：GCCCATATCCTTGCCTGATAC（配列番号１４）。その結果、すべてのクローンでVector断片の想定された位置にinsert断片が変異なく導入されたことが確認された。このうち１つのクローンを選択し、pBLU3-Lucレポータープラスミドとした。pBLU3-Lucレポータープラスミドでは、図１のpBLU3-EGFPプラスミドと比べて、EGFPの代わりにLucが挿入された構成となっている。
【０１０２】
〔ｐＢＬＵ３−Ｌｕｃレポーター細胞の構築〕
ｐＢＬＵ３−ＥＧＦＰレポーター細胞と同様の方法で、ｐＢＬＵ３−Ｌｕｃレポーター細胞の構築し、ｐＢＬＵ３−Ｌｕｃ安定導入ＣＣ８１細胞株、ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｌ細胞として樹立した。
【０１０３】
〔ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｌ細胞を用いたＢＬＶ定量的解析〕
ＣＣ８１−ＢＬＵ３Ｌ細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、５０μＬずつ９６ウェルプレートに１０ウェル播種した。そこにＢＬＶ産生株ＦＬＫ−ＢＬＶ細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに６×１０５、２×１０５、２×１０４、２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で懸濁したものを５０μＬずつ２ウェルに加えた。３７℃で２４時間、５％炭酸存在下で共培養した後、上清を除き、ウェルをＰＢＳで洗浄した。そこにＰＢＳで５倍希釈したピッカジーン培養細胞溶解剤Ｌｕｃ（東洋ビーネット）１００μＬを加え、室温で１５分間静置した。溶解液を１．５ｍＬチューブに回収し３，０００ｒｐｍ、室温で３分間遠心し、上清１０μＬを96well white plateに移した。５０μＬのピッカジーン発光キット（東洋ビーネット）を添加し、EnSightマルチモードプレートリーダー（PerkinElmer）により発光を測定時間０．１秒で測定した。その結果、ＦＬＫ−ＢＬＶ細胞の添加量依存的な発光量増加が見られ、細胞数１００〜３００００の間でＲ２＝０．９９９７で比例を示した（図３）。
【０１０４】
〔pBLU3-LucへのＧＲＥ変異の導入〕
pBLU3-Lucレポータープラスミドをテンプレートとし、以下のプライマーおよびPrimeSTAR MaxDNA Polymerase（TaKaRa）を用いて、ＬＴＲのＵ３領域に存在するglucocorticoid response element（ＧＲＥ）配列に変異を導入した。
Forward primer：CGAAAAATCCTATCCCACAGTAGCTGACCTCACC（配列番号１６）
Reverse primer：GGTGAGGTCAGCTACTGTGGGATAGGATTTTTCG（配列番号１７）
【０１０５】
【表５】
2018023329.tif 000006
【０１０６】
得られたＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動後、バンドを切り出し、FastGene Gel/PCR Extraction kit（日本ジェネティクス）を用いて精製した。Nano dropを用いてＤＮＡ濃度を測定し、ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのXL-10Gold competent cells （Agilent）に添加し、氷上で６０分間静置し、４２℃で６０秒間ヒートショックした後、氷上に戻した。５００μＬのＳＯＢ培地を加え３７℃で６０分間前培養した後、カナマイシン含有ＬＢプレートに植菌して培養し、KOD plus（TOYOBO）を用いたＰＣＲにより大腸菌クローンを確認した。
Forward primer：GTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC（配列番号１０）
Reverse primer：GCCCATATCCTTGCCTGATAC（配列番号１４）
【０１０７】
【表６】
2018023329.tif 000007
【０１０８】
ＰＣＲにより３５３ｂｐのバンドが得られた１クローンについて、２ｍＬのカナマイシン含有液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で２４時間培養し、FastGene plasmid miniprep kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミド精製を行った。
【０１０９】
BigDye terminator v1.1（Thermo fisher）およびＰＣＲで用いたForward primerを用いて変異導入部分のシークエンスを確認した。その結果、LTR U3領域のGRE部位に想定された変異が導入されたことが確認された。このプラスミドをpBLU3GREM-Lucレポータープラスミドとした。
【０１１０】
〔pBLU3GREM-EGFPの作成〕
pEGFP-N1およびpBLU3GREM-Lucを１０Ｕ／５０μＬ BamHI（TOYOBO）および１０Ｕ／５０μＬNotI（TaKaRa）により３７℃で２時間処理を行い、０．８％アガロースゲルで電気泳動後、それぞれ７４１ｂｐ、３６４９ｂｐのバンドを切り出し、FastGene Gel/PCR Extraction kit（日本ジェネティクス）を用いて精製した。それぞれ３．５μＬと０．５μＬをligation high ver2.0（TaKaRa）と混合し、１６℃で３０分間反応させた。５μＬのLigation反応液を１００μＬのXL-10Gold competent cells（Agilent）に添加し、氷上で６０分間静置し、４２℃で６０秒間ヒートショックした後、氷上に戻した。５００μＬのＳＯＢ培地を加え３７℃で６０分間前培養した後、カナマイシン含有ＬＢプレートに植菌して培養し、ＰＣＲを用いて標的遺伝子導入大腸菌クローンを選択した。ＰＣＲは、酵素としてGoTaq green Master Mix（Promega）を用い、ForwardプライマーとしてGTAAACCAGACAGAGACGTCAGCTGCC（配列番号１０）を用い、ReverseプライマーとしてGGCCGTTTACGTCGCCGTCC（配列番号１１）を用い、以下の条件で実施した。
【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
ＰＣＲにより３５３ｂｐのバンドが得られた７クローンのうち２クローンについて、２ｍＬのカナマイシン含有液体ＬＢ培地に植菌し、３７℃で２４時間培養し、FastGene plasmid miniprep kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミド精製を行った。
【０１１３】
BigDye terminator v1.1（Thermo fisher）およびcolony directional PCRで用いた前述の２種のプライマーを用いて導入部分のシークエンスを確認した。その結果、２クローンともＬＴＲのＵ３領域のＧＲＥ配列に変異が導入され、ルシフェラーゼ遺伝子がＥＧＦＰ遺伝子に置換されていることが確認された。このうち１つのプラスミドを選択し、pBLU3GREM-EGFPレポータープラスミドとした。
【０１１４】
〔pBLU3GREM-Lucを用いたTaxの検出〕
ＣＣ８１細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、１００μＬずつ96well white plate（nunc）に２４ウェル播種し、３７℃で１６時間、５％炭酸存在下で培養した。２００μＬ Opti-MEMに0.4ug pNL1.1PGK（Promega）および８μＬ P3000 regent（invitrogen）を添加し、２０μＬずつ８本の１．５ｍＬチューブに分注した。そのうち４本に０．２μｇ pME/BLV-Taxおよび０．２μｇ pBLU3GREM-LucまたはpBLU3-Lucを加えた。残りの４本には０．２μｇ pME18neoおよび０．２μｇ pBLU3GREM-LucまたはpBLU3-Lucを加えた。
【０１１５】
そこに２００μＬ Opti-MEM（Gibco）に６μＬlipofectamine 3000 regentを加えたものを２０μＬずつ加えよく混和し、１０分間静置したものをtransfection mixtureとした。ＣＣ８１細胞培養の上清を除き、新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ １００μＬに交換した後、transfection mixtureを１０μＬずつ３ウェルに添加し、３７℃で２４時間、５％炭酸存在下で培養した。
【０１１６】
Nano-Glo Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用い、EnSightマルチモードプレートリーダー(PerkinElmer)により発光を測定時間０．１秒で測定した。その結果、変異導入前のpBLU3-Lucと比較してpBLU3GREM-LucではTax非存在下での非特異的な発光が０．４２倍に減少し、Tax存在下での発光は１．１５倍となりSignal/Background比で２．７３倍の感度向上を示した（図４）。
【０１１７】
〔pBLU3GREM-EGFPを用いたTaxの検出〕
ＣＣ８１細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、１ｍＬずつ１２ウェルプレート（nunc）に６ウェル播種し、３７℃で１６時間、５％炭酸存在下で培養した。５００μＬOpti-MEMに２０μＬ P3000 regent（invitrogen）を添加し、５０μＬずつ６本の１．５ｍＬチューブに分注した。そのうち３本に０．５μｇ pME/BLV-Taxおよび０．５μｇ pBLU3GREM-EGFPまたはpBLU3-EGFPを加えた。残りの３本には０．５μｇ pME18neoおよび０．５μｇ pBLU3GREM-EGFPまたはpBLU3-EGFPを加えた。
【０１１８】
そこに５００μＬ Opti -MEM（Gibco）に１５μＬ lipofectamine 3000 regentを加えたものを５０μＬずつ加えよく混和し、１０分間静置したものをtransfection mixtureとした。ＣＣ８１細胞培養の上清を除き、新しい１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ １ｍＬに交換した後、transfection mixtureを１００μＬずつ添加し、３７℃で４８時間、５％炭酸存在下で培養した。
【０１１９】
蛍光顕微鏡ZX-700（キーエンス）PlanFluor_DL x10レンズを用い、９視野における蛍光細胞数をマクロセルカウントにより計数した。
【０１２０】
【表８】
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【０１２１】
その結果、pBLU3GREM-EGFP導入細胞では、pBLU3-EGFP導入細胞と比較してpME18neo共発現時の非特異的蛍光発現が低下、pME/BLV-Tax共発現時における特異的蛍光発現が増加することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、ＢＬＶの感染性の評価に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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