(57)【要約】【課題】この発明は、安全で、かつ、肌のくすみ抑制するくすみ抑制剤、及び、前記くすみ抑制剤を含む化粧料、前記くすみ抑制剤を含む皮膚外用剤を提供することを目的とする。【解決手段】ハマメリス由来の抽出物の抽出物を有効成分とする、肌のくすみを抑制する肌のくすみ抑制剤であること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハマメリス由来の抽出物を有効成分とする、肌のくすみを抑制する肌のくすみ抑制剤。
【請求項２】
前記有効成分は、タンパク質のカルボニル化を抑制するカルボニル化抑制剤を含有する
請求項１に記載のくすみ抑制剤。
【請求項３】
前記有効成分は、フィラグリン遺伝子の発現を活性化させる
請求項１又は請求項２に記載のくすみ抑制剤。
【請求項４】
前記有効成分は、カスパーゼ１４遺伝子の発現を活性化させる
請求項１乃至請求項３のうちのいずれかに記載のくすみ抑制剤。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のうちのいずれかに記載のくすみ抑制剤を含有する
化粧料。
【請求項６】
請求項１乃至請求項４のうちのいずれかに記載のくすみ抑制剤を含有する
皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、肌のくすみを抑制するくすみ抑制剤、及び、前記くすみ抑制剤を含む化粧料、前記くすみ抑制剤を含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、紫外線の照射や、排ガス等に含まれる硫化化合物や窒素化合物などにより生体内で誘発された活性酸素は、細胞や遺伝子を損傷し、あるいは脂質を分解する。分解された脂質は、細胞内のタンパク質と結合してカルボニル化タンパク質を生成し、細胞内に堆積することとなる。このカルボニル化タンパク質は黄色をしており、肌のくすみの原因となっている。
【０００３】
このような肌のくすみに対する安全で効果的な対応として、スーパーオキシドディスムターゼやカタラーゼ等の活性酸素分解酵素を含む化粧料や、あるいはビタミンＣやビタミンＥなどの抗酸化作用を有する化合物を含む化粧料など、様々な提案がされてきた。
【０００４】
例えば、特許文献１には、天然物であるシソ科キャットニップのエッセンスからなる活性酸素消去剤が提案されており、安全に抗酸化機能を向上させることができるとされている。また、より抗酸化機能を向上させるために、前記活性酸素消去剤に活性酸素分解酵素であるスーパーオキシドディスムターゼを配合することも提案されている。しかしながらこれらの活性酸素消去剤は、肌のくすみ対策としては十分な効果が得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１１８６３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この発明は、上述した問題を鑑み、安全で、かつ、肌のくすみを抑制するくすみ抑制剤、前記くすみ抑制剤を含む化粧料及び前記くすみ抑制剤を含む皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、ハマメリス由来の抽出物を有効成分とする、肌のくすみを抑制する肌のくすみ抑制剤であることを特徴とする。  
またこの発明は、上述のくすみ抑制剤を含有する化粧料又は皮膚外用剤であることを特徴とする。
【０００８】
上述のハマメリス由来の抽出物とは、ハマメリスの全部又は一部から抽出したものを含む。ハマメリスの一部とは、例えば花や茎、種子、葉、根などから抽出したものを含む。なお、ハマメリスの一部から抽出したものとは、これらの部位の内、複数を選択して抽出したものも含む。
【０００９】
なお、抽出物の抽出方法は、例えば乾燥させたハマメリスの全部又は一部を粉砕し、有機溶媒や水などで溶解した後に、固形物を濾過して抽出物を抽出する方法などが考えられるが、この方法に限らずどのような方法で抽出してもよい。
【００１０】
前記化粧料は、性状が液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよく、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料等とすることができる。  
同様に、前記皮膚外用剤も液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよい。
【００１１】
この発明によると、天然物であるハマメリスから抽出した抽出物を用いた肌のくすみ抑制剤であるため、安全に肌のくすみ抑制することができる。
【００１２】
この発明の態様として、前記有効成分は、タンパク質のカルボニル化を抑制するカルボニル化抑制剤を含有することができる。  
この発明によると、肌のくすみの一因であるカルボニル化タンパク質が生成されることを抑制できるため、確実に肌のくすみを抑制できる。
【００１３】
詳述すると、紫外線や窒素化物などの外的要因により誘発される活性酸素により、例えば脂質が分解されることにより生じるアルデヒト化合物と生体内のタンパク質が結合して、生成されるカルボニル化タンパク質が肌の内部に堆積することは、肌のくすみの一因となる。  
本発明によると、細胞内の活性酸素の量を低減できるとともに、不飽和アルデヒトに起因する、あるいは、不飽和脂肪酸に起因するタンパク質のカルボニル化を抑制できるため、肌のくすみを抑制することができる
【００１４】
またこの発明の態様として、前記有効成分は、フィラグリン遺伝子の発現を活性化させる発現活性剤としてもよい。  
この発明によると、分解されることにより天然保湿因子（ＮＭＦ）となるフィラグリンに対応するフィラグリン遺伝子の発現を活性化できる。これにより発現されたフィラグリンが、タンパク質分解酵素によって分解されてＮＭＦとなり、肌の保湿機能を向上するとともに、肌のバリア機能を向上させることができ、肌のくすみを抑制することができる。
【００１５】
またこの発明の態様として、前記有効成分は、カスパーゼ１４遺伝子の発現を活性化させる発現促進剤としてもよい。  
この発明によると、フィラグリンを分解するタンパク質分解酵素であるカスパーゼ１４に対応するカスパーゼ１４遺伝子の発現が活性化されるため、よりフィラグリンの分解が促進されることとなり、より確実に肌の保湿機能を向上するとともに、肌のバリア機能を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１６】
この発明により、安全で、かつ、肌のくすみを抑制するくすみ抑制剤、前記くすみ抑制剤を含む化粧料、及び前記くすみ抑制剤を含む皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ハマメリス抽出物の有無に対する細胞内における活性酸素濃度の増減を示した棒グラフ。
【図２】比較例であるオウレン抽出物の有無に対する細胞内における活性酸素濃度の増減を示した棒グラフ。
【図３】ハマメリス抽出物の濃度に対する正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）の蛍光画像。
【図４】アクロレインを添加した培地における、ハマメリス抽出物の濃度に対する正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）の蛍光画像。
【図５】アクロレインの有無及びハマメリス抽出物の濃度に対するカルボニル化タンパク質の量を示した棒グラフ。
【図６】比較例であるオウレン抽出物の濃度に対する正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）の蛍光画像。
【図７】アクロレインを添加した培地における、比較例であるオウレン抽出物の濃度に対する正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）の蛍光画像。
【図８】アクロレインの有無及び比較例であるオウレン抽出物の濃度に対するカルボニル化タンパク質の量を示した棒グラフ。
【図９】オレイン酸を添加した角質(Stratum Coreum)におけるハマメリス抽出物の濃度に対する角質(Stratum Coreum) の蛍光画像。
【図１０】オレイン酸を添加した角質(Stratum Coreum)にＵＶＡを照射した状態における、ハマメリス抽出物の濃度に対する角質(Stratum Coreum) の蛍光画像。
【図１１】ＵＶＡの照射の有無、及びハマメリス抽出物の濃度に対するカルボニル化タンパク質の量を示した棒グラフ。
【図１２】オレイン酸を添加した場合における比較例であるオウレン抽出物の濃度に対する角質(Stratum Coreum)の蛍光画像。
【図１３】オレイン酸を添加し、ＵＶＡを照射した状態における、比較例であるオウレン抽出物の濃度に対する角質(Stratum Coreum)の蛍光画像。
【図１４】ＵＶＡの照射の有無、及び比較例であるオウレン抽出物の濃度に対するカルボニル化タンパク質の量を示した棒グラフ。
【図１５】ハマメリス抽出物の濃度に対するフィラグリンの発現量を示した棒グラフ。
【図１６】ハマメリス抽出物の濃度に対するカスパーゼ１４の発現量を示した棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本実施形態に係るハマメリス由来の抽出物は、ハマメリス由来の成分を抽出したものであれば特に抽出させるために用いる部位は限定されず、例えば、花や葉、実、茎、種子、根等の各部分も使用できるが、花や葉を用いることが好ましい。より好ましくは花を用いることがよい。なお、例えば花と葉を用いて抽出するなど、複数の部位を用いて抽出しても構わない。
【００１９】
ハマメリス由来の抽出物を得る方法は、どのような方法であってもよい。例えば、乾燥させたハマメリスの花や葉などを粉砕した粉砕物を適当な抽出溶媒に浸漬する方法、ハマメリスの花や葉を常温から抽出溶媒の沸点の範囲内において攪拌して抽出する方法等によって抽出物を得ることができる。
【００２０】
具体的には、ハマメリス由来の抽出物の抽出方法として、乾燥したハマメリスの花や葉などをミキサーやすりこぎなどで粉砕し、２５℃以上８０℃以下の温度の水又は２０〜７０％エタノール水溶液で数時間から１０日間程抽出して濾過する方法が好ましい。より好ましくは、２５℃以上８０℃以下の温度の水又は２０〜７０％エタノールで1週間程静置又は撹拌して抽出することが好ましい。
【００２１】
ハマメリスから抽出物を抽出する前記抽出溶媒はどのような溶媒であってもよいが、本発明が化粧料や皮膚用外溶剤として使用される場合には、水及びエタノールを適当な割合で混合して抽出溶媒とすることが好ましい。
【００２２】
このようにして得られたハマメリス由来の抽出物は、肌のくすみを抑制させる効果を有する。  
具体的に、肌のくすみは、紫外線や窒素化合物により分解された脂質などが細胞内のタンパク質と結合することにより、タンパク質が変性して黄色に変色したカルボニル化タンパク質となり細胞内で堆積することが一因と考えられている。
【００２３】
ここで、ハマメリス由来の抽出物は抗酸化機能を向上させる効果を奏する有効成分を有するため、過酸化水素やフリーラジカルなどといった活性酸素を還元させて、生体内における活性酸素濃度を低減できる。これにより活性酸素による脂質の酸化を抑制でき、タンパク質のカルボニル化を抑制できる。
【００２４】
また、ハマメリス由来の抽出物は、生体内における活性酸素濃度を低減するだけでなく、不飽和アルデヒト、あるいは、不飽和脂肪酸に起因するタンパク質のカルボニル化を阻害する効果を奏するため、カルボニル化タンパク質の生成をより確実に抑制できる。したがって、肌のくすみを抑制して美白効果を奏する。
【００２５】
さらにまた、前記抽出物は、分解されてＮＭＦとなるフィラグリンの遺伝子及びフィラグリンを分解するカスパーゼ１４の遺伝子の発現を活性化できる。  
詳述すると、フィラグリンは角層においてカスパーゼ１４によって分解されて、ＮＭＦの前駆体となる。このように、フィラグリン及びカスパーゼ１４の発現量が増加させることにより、ＮＭＦを増加させることができる。これにより、肌の保湿機能を向上できるため、肌の老化を抑制しながら肌のバリア機能が向上し、肌のくすみを抑制できる。
【００２６】
このように抽出されたハマメリス由来の抽出物は、活性酸素の濃度を低減するとともに、細胞内のタンパク質のカルボニル化を阻害できるため、よりタンパク質のカルボニル化を抑制できる。加えて、保湿成分であるＮＭＦを増加させることで肌の保湿機能及び肌のバリア機能を向上できる。これにより、肌のくすみを抑制できるとともに、美白効果や肌の老化を防止でき、化粧料や皮膚外用剤として有用である。
【００２７】
上述の皮膚外用剤または化粧料の性状は、液状、ゲル状、クリーム状、半固形状、固形状、スティック状、パウダー状等のいずれであってもよく、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗顔料、メーキャップ化粧料等の皮膚用化粧料等とすることができる。
【００２８】
本実施形態に係る皮膚外用剤又は化粧料には、上記抽出物が有する抗酸化機能の活性化の促進や、細胞内のタンパク質のカルボニル化の抑制を妨げない限り、通常の皮膚外用剤や化粧料の製造に用いられる主剤、助剤またはその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、清涼剤、乳化剤、増泡剤、増粘剤、消臭・脱臭剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、美白剤、酵素、ホルモン類、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、精製水などを配合することができる。
【００２９】
前記皮膚外用剤は、上記抽出物が有する抗酸化機能の活性化の促進や、細胞内のタンパク質のカルボニル化の抑制を妨げない限り、皮膚外用剤に通常用いられる種々の成分、例えば、保湿剤、油性物質、界面活性剤、増粘剤、中和剤、防腐剤、抗酸化剤、色素、香料、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、他の薬効成分などが挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下実施例をもって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１：ハマメリスの抽出物の抽出方法
乾燥させたハマメリスの花及び葉（１００ｇ）をミキサーで粉砕した後に、５０ｗ／ｗ％のエタノールを加えて室温で１週間撹拌しながら抽出し，濾過を行った。得られた濾液は、濃縮・乾燥してハマメリス抽出物（５．２ｇ）を得た。
【００３２】
比較例１：オウレンの抽出物の抽出方法
乾燥させたオウレンの花及び葉（１００ｇ）をミキサーで粉砕した後に、５０ｗ／ｗ％のエタノールを加えて室温で１週間撹拌しながら抽出し，濾過を行った。得られた濾液は、濃縮・乾燥してオウレン抽出物（３．８ｇ）を得た。
【００３３】
正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）の培養方法
正常ヒト新生児ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）をヒトケラチノサイト増殖用培地サプリメント（ＨＫＧＳ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地とｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ用培地を用いて３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下に１日間プレ培養した後、Ｅｐｉｌｉｆｅ培地を抜き取り、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡソリューションとＴｒｙｐｓｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇソリューションを用いて、ＨＥＫｎを剥離して継代培養を行った。
【００３４】
試験例１：細胞内活性酸素の抑制作用の測定
ハマメリス抽出物を添加したＨＥＫｎにおける活性酸素の抑制作用の測定方法について記載する。
【００３５】
上述の方法によりＨＥＫｎを培養するＥｐｉＬｉｆｅ培地に最終濃度が０μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、及び２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリスの抽出物を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
【００３６】
次に、ハマメリス抽出物を添加したＨＥＫｎにＲＯＳ検出蛍光プローブＨ２ＤＣＦＤＡ（CALBIOCHEM 287810）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養した。その後、終濃度０μＭ、及び、５００μＭとなるように過酸化水素水を添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養し、各条件における蛍光強度をマイクロプレートリーダ（Life Technologies 社 FLoid（登録商標））で計測し評価した。その結果を図１に示す。
【００３７】
比較試験例１：細胞内活性酸素の抑制作用の測定
比較例であるオウレン抽出物を添加したＨＥＫｎにおける活性酸素の抑制作用の測定方法について記載する。
【００３８】
同様に、上述のＨＥＫｎを培養するＥｐｉＬｉｆｅ培地に最終濃度が０μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、及び２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したオウレンの抽出物を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
【００３９】
次に、比較例であるオウレン抽出物を添加したＨａＣａＴケラノサイトにＲＯＳ検出蛍光プローブＨ２ＤＣＦＤＡを添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養した。その後、終濃度０μＭ、及び、５００μＭとなるように過酸化水素水を添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分培養し、各条件における蛍光強度をマイクロプレートリーダで計測し評価した。その結果を図２に示す。
【００４０】
図１及び図２は、ハマメリス抽出物及び比較例であるオウレン抽出物を添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地で培養したＨＥＫｎにおいて、過酸化水素水を添加した場合のハマメリス及びオウレン抽出物の濃度に対する過酸化水素の抑制効果を示した棒グラフであり、縦軸は細胞のタンパク量に対する蛍光強度を示す。  
なお、細胞のタンパク量は、ＢＣＡ（Bicin Choninic Acid）法を用いて測定した。
【００４１】
図１に示すように、ＨＥＫｎを培養するＥｐｉＬｉｆｅ培地に対して過酸化水素水を添加することにより、活性酸素濃度が大幅に増加するが、過酸化水素処理する前にハマメリス抽出物を添加した場合、活性酸素濃度を低減できることが分かった。また、ハマメリス抽出物の濃度が濃いほど、過酸化水素水（活性酸素）が減少することが分かった。
【００４２】
同様に、図２に示すように、過酸化水素処理する前にオウレン抽出物が添加されているＨＥＫｎにおいても、活性酸素濃度を低減できることが分かった。また、オウレン抽出物の濃度が濃いほど、過酸化水素水（活性酸素）が減少することが分かった。
【００４３】
このことから、ハマメリス抽出物及びオウレン抽出物は活性酸素濃度を低減する効果を奏するため、活性酸素による損傷や脂質の分解などを低減するとともに、活性酸素による肌の老化等を抑制できる。
【００４４】
試験例２：タンパク質のカルボニル化の抑制作用実験  
以下、ＨＥＫｎを用いて、ハマメリス抽出物及び比較例であるオウレン抽出物によるタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法及びその結果について記載する。
【００４５】
＜試験例２−１＞
先ず、ハマメリス抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法によりＥｐｉＬｉｆｅ培地で培養したＨＥＫｎを培養した後、最終濃度が０μｇ／ｍｌ、及び、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリスの抽出物を添加し、２４時間、３７℃にてインキュベートした。
【００４６】
その後、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体（Ｆｌｕｏｒｅｓ−５−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄した後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図３）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図５）。  
なお、ハマメリス抽出物を添加せずに培養したものをコントロールとして用いた。
【００４７】
＜試験例２−２＞
アクロレインを添加した場合のハマメリス抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法によりＥｐｉＬｉｆｅ培地で培養したＨＥＫｎを培養した後、最終濃度が０μｇ／ｍｌ、及び、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリスの抽出物と、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインを添加し、２８時間、３７℃にてインキュベートした。
【００４８】
その後、スライドガラスに残っている試薬をエタノールで洗浄し、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図４）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図５）。  
なお、ハマメリス抽出物を添加せずに培養し、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインを添加したものをコントロールとして用いた。
【００４９】
この結果、不飽和アルデヒトであるアクロレインを添加しないＨＥＫｎでは、ハマメリス抽出物の添加の有無によるカルボニル化タンパク質の量の差がほとんど見られなかった（図３及び図５）。一方、アクロレインを添加したＨＥＫｎでは、ハマメリス抽出物を添加していない場合に、著しくカルボニル化タンパク質が増加しているのに対し（図４（ａ）参照）、ハマメリス抽出物を添加した場合には、不飽和アルデヒトに起因するカルボニル化タンパク質の量が増加しておらず、タンパク質のカルボニル化が抑制されていることが分かった（図４（ｂ）乃至（ｆ）参照）。
【００５０】
また、ハマメリス抽出物の終濃度が３．１３μｇ／ｍｌ以下では、ハマメリス抽出物の濃度が濃いほどタンパク質のカルボニル化を抑制しているが（図４（ｂ）乃至（ｆ）参照）、添加したハマメリス抽出物の終濃度が３．１３μｇ／ｍｌ以上では、カルボニル化タンパク質の量に大きな差異は見られなかった（図５参照）。
【００５１】
＜比較例２−１＞
比較例であるオウレン抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法によりＥｐｉｌｉｆｅ培地で培養したＨＥＫｎを培養した２４時間後、最終濃度が０μｇ／ｍｌ、及び、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したオウレンの抽出物と、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインを添加し、２４時間、３７℃にてインキュベートした。
【００５２】
その後、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図６）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図８）。  
なお、オウレン抽出物を添加せずに培養したものをコントロールとして用いた。
【００５３】
＜比較例２−２＞
アクロレインを添加した場合のオウレン抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法によりＥｐｉＬｉｆｅ培地で培養したＨＥＫｎを２４時間培養した後、最終濃度が０μｇ／ｍｌ、及び、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したオウレンの抽出物と、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインを添加し、２４時間、３７℃にてインキュベートした。
【００５４】
その後、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図７）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図８）。  
なお、オウレン抽出物を添加せずに培養し、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインを添加したものをコントロールとして用いた。
【００５５】
この結果、不飽和アルデヒトであるアクロレインを添加しないＨＥＫｎでは、オウレン抽出物の添加の有無によるカルボニル化タンパク質の量の差がほとんど見られなかった（図６及び図８）。一方、アクロレインを添加したＨＥＫｎでは、オウレン抽出物を添加していない場合には、著しくタンパク質がカルボニル化しているのに対し（図６（ａ）参照）、オウレン抽出物を添加した場合には、カルボニル化タンパク質の量が増加しておらず、タンパク質のカルボニル化が抑制されていることが分かった。
【００５６】
また、ハマメリスと同様に、添加したオウレン抽出物の終濃度が３．１３μｇ／ｍｌ以下では添加したオウレン抽出物の濃度が濃いほど、タンパク質のカルボニル化を抑制していることが分かった（図６（ｂ）乃至（ｆ）参照）。なお、添加したオウレン抽出物の終濃度が３．１３μｇ／ｍｌ以上では、不飽和アルデヒトに起因するカルボニル化タンパク質の量に大きな差異は見られなかった（図８参照）。
【００５７】
また、ハマメリス抽出物及びオウレン抽出物を添加することにより、アクロレインを含まないＨＥＫｎと同レベルまで、カルボニル化タンパク質の生成を低減できる。このことから、ハマメリス抽出物及びオウレン抽出物は、不飽和アルデヒトであるアクロレインに対してタンパク質のカルボニル化を効果的に阻害する機能を有することが分かった。
【００５８】
＜試験例２−３＞
オレイン酸を添加した場合のハマメリス抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法により、テープストリッピング法で角層を剥がし、スライドガラスに転写し、Ｘｙｌｅｎｅに一晩付けた。乾燥させた後、最終濃度が０ｍｇ／ｍｌ、及び、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、１．００ｍｇ／ｍｌ、２．００ｍｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリスの抽出物と終濃度が５％となるようにオレイン酸を添加し、４８時間、３７℃にてインキュベートした。
【００５９】
その後、スライドガラスに残っている試薬をエタノールで洗浄し、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図９）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図１１）。  
なお、ハマメリス抽出物を添加せずに培養し、オレイン酸を添加したものをコントロールとして用いた。
【００６０】
＜試験例２−４＞
オレイン酸を添加してＵＶＡ照射した場合のハマメリス抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
テープストリッピング法で角層を剥がし、スライドガラスに転写し、Ｘｙｌｅｎｅに一晩付けた。乾燥させた後、最終濃度が０ｍｇ／ｍｌ、及び、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５０ｍｇ／ｍｌ、１．００ｍｇ／ｍｌ、２．００ｍｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリスの抽出物と終濃度が５％となるようにオレイン酸を添加し、ＢＬＢＬａｍｐｓでＵＶＡを１０Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後、４８時間、３７℃にてインキュベートした。
【００６１】
その後、スライドガラスに残っている試薬をエタノールで洗浄し、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体（Ｆｌｕｏｒｅｓ−５−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図１０）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図１１）。  
なお、ハマメリス抽出物を添加せずに培養し、オレイン酸を添加してＵＶＡを照射したものを、コントロールとして用いた。
【００６２】
この結果、不飽和脂肪酸であるオレイン酸を添加した角層では、ハマメリス抽出物を添加していない場合に、タンパク質のカルボニル化が見られたが（図９（ａ）及び図１１）、ハマメリス抽出物を添加することによりタンパク質のカルボニル化を抑制できることが分かった（図９（ｂ）、図９（ｃ）及び図１１）。なお、添加したハマメリス抽出物の終濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌ以上では、カルボニル化タンパク質の量に大きな差異は見られなかった（図１１参照）。
【００６３】
一方、オレイン酸を添加するとともにＵＶＡを照射した角層では、ハマメリス抽出物を添加していない場合には、著しくカルボニル化タンパク質が増加しているのに対し（図１０（ａ）参照）、ハマメリス抽出物を添加した場合には、カルボニル化タンパク質の増加量を抑制している。このことから、ハマメリス抽出物は、不飽和脂肪酸にＵＶＡを照射することにより生じるタンパク質のカルボニル化を阻害していることが分かった（図１０（ｂ）乃至（ｆ）参照）。なお、添加したハマメリス抽出物の終濃度が濃いほどタンパク質のカルボニル化を阻害することが分かった（図１１参照）。
【００６４】
これは、紫外線を角層に照射することにより、不飽和酸であるオレイン酸が酸化して角層内のタンパク質と結合し、カルボニル化タンパク質を生成することに起因すると考えられる。このように不飽和脂肪酸であるオレイン酸がＵＶＡによって酸化される環境下においてもハマメリス抽出物はタンパク質のカルボニル化を阻害できる。
【００６５】
＜比較例２−３＞
オレイン酸を添加した場合のオウレン抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
上述の方法により、テープストリッピング法で角層を剥がし、スライドガラスに転写し、Ｘｙｌｅｎｅに一晩付けた。乾燥させた後、最終濃度が０ｍｇ／ｍｌ、及び０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１０ｍｇ／ｍｌとなるように調整したオウレンの抽出物と、終濃度が５％となるようにオレイン酸を添加し、４８時間、３７℃にてインキュベートした。
【００６６】
その後、スライドガラスに残っている試薬をエタノールで洗浄し、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図１２）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図１４）。
【００６７】
＜比較例２−４＞
オレイン酸を添加してＵＶＡ照射した場合のオウレン抽出物を用いたタンパク質のカルボニル化の抑制作用の測定方法について記載する。  
テープストリッピング法で角層を剥がし、スライドガラスに転写し、Ｘｙｌｅｎｅに一晩付けた。乾燥させた後、最終濃度が０ｍｇ／ｍｌ、及び０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１０ｍｇ／ｍｌとなるように調整したオウレンの抽出物と、終濃度が５％となるようにオレイン酸を添加し、ＢＬＢ  ＬａｍｐｓでＵＶＡを１０  Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後、４８時間、３７℃にてインキュベートした。
【００６８】
その後、スライドガラスに残っている試薬をエタノールで洗浄し、カルボニル化タンパク質中のアルデヒド基と反応性の高いヒドラジド誘導体（Ｆｌｕｏｒｅｓ−５−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を用いてカルボニル染色を行った。染色液を蒸留水で洗浄後、Ｆｌｏｉｄを用いて緑色の蛍光画像を撮り（図１３）、画像解析ソフトにて細胞面積当たりの蛍光輝度を算出し、カルボニル化タンパク質レベルとして評価した（図１４）。  
なお、オウレン抽出物を添加せずに培養し、オレイン酸を添加してＵＶＡを照射したものを、コントロールとして用いた。
【００６９】
この結果、不飽和脂肪酸であるオレイン酸を添加した角層では、オウレン抽出物を添加していない場合に、タンパク質のカルボニル化はほとんど見られなかった（図１２（ａ）及び図１４）。また、オウレン抽出物を添加した場合であっても、オウレン抽出物を添加していない場合と比べてカルボニル化タンパク質の量に差異がないことが分かった（図１２（ｂ）、図１２（ｃ）及び図１１）。
【００７０】
一方、オレイン酸を添加するとともにＵＶＡを照射した角層では、オウレン抽出物を添加していない場合には、著しくカルボニル化タンパク質が増加している（図１３（ａ）参照）。同様に、オウレン抽出物を添加した場合であっても、カルボニル化タンパク質の量にさほど差はなく、タンパク質のカルボニル化を過度に抑制していないことが分かった（図１３（ｂ）乃至（ｆ）参照）。このように不飽和脂肪酸であるオレイン酸がＵＶＡによって酸化される環境下において、オウレン抽出物はタンパク質のカルボニル化を抑制できない。
【００７１】
試験例３：遺伝子発現量の測定方法  
上述の方法によりＥｐｉｌｉｆｅで培養したＨＥＫｎを培養した後、最終濃度が０μｇ／ｍｌ、及び、５．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、２５．０μｇ／ｍｌとなるように調整したハマメリス抽出物と、終濃度が２５μＭとなるようにアクロレインとを添加し、２４時間、３７℃にてインキュベートした。  
その後、培養したＨＥＫｎから全ＲＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ法を行った。
【００７２】
上述のようにハマメリス抽出物の濃度が０μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、及び２５．０μｇ／ｍｌとして２４時間培養させたＨＥＫｎ細胞内のＲＮＡを回収し、測定対象に対応するプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法を行い、ハマメリス抽出物の添加の有無において発現されたｍＲＮＡの発現量を測定して、評価する。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００７３】
ここで、プライマーに関しては、フィラグリン及びカスパーゼ１４に対応するプライマーを作成し、これらを用いてそれぞれの発現量を調べた。なお、リアルタイムＰＣＲは遺伝子解析の分野においては、当業者であるならば周知の技術であるため詳細は省く。
【００７４】
図１５はハマメリス抽出物の添加の有無に対するフィラグリン遺伝子の発現量の表すグラフであり、図１６はハマメリス抽出物の添加の有無に対するカスパーゼ１４遺伝子の発現量の表すグラフである。  
なお、コントロールとしてアクチンを用いている。
【００７５】
図１５に示すように、ＨＥＫｎを培養するＥｐｉｌｉｆｅに添加したハマメリス抽出物の添加量が増加するごとに、フィラグリン遺伝子の発現が活性化され、フィラグリンの発現量が増加していることが分かる。
【００７６】
また、図１６に示すように、ＨＥＫｎを培養するＥｐｉｌｉｆｅに添加したハマメリス抽出物の添加量が増加するごとに、カスパーゼ１４遺伝子の発現が活性化され、カスパーゼ１４の発現量が増加されていることが分かる。
【００７７】
このように、ハマメリス抽出物を添加して培養したＨＥＫｎでは、フィラグリン遺伝子及びカスパーゼ１４遺伝子の発現量が増加している。ここで、フィラグリンはカスパーゼ１４によって分解されてＮＭＦの前駆体となることから、フィラグリン遺伝子及びカスパーゼ１４遺伝子の発現量が増加することによりＮＭＦが増加すると考えられる。したがって、ハマメリス抽出物は、肌の保湿機能を向上させるとともに、保湿機能の向上により肌のバリア機能も向上させることができる。
【００７８】
上述のように、ハマメリス由来の抽出物を添加したＥｐｉｌｉｆｅで培養されたＨＥＫｎでは、過酸化水素量を低減できるとともに、カルボニル化タンパク質の量を減少できる。このことから、ハマメリス抽出物は肌のくすみを抑制する効果を有する。
【００７９】
また、ハマメリス由来の抽出物であるハマメリス抽出物を添加したＥｐｉｌｉｆｅで培養されたＨＥＫｎでは、フィラグリン遺伝子及びカスパーゼ１４遺伝子の発現量が増加しているため、フィラグリン及びカスパーゼ１４の発現量が増加している。このため、細胞内のＮＭＦが増加され、肌の保湿機能を向上させることができ、肌のバリア機能を向上できる。
【００８０】
以上に示すように、本発明は、生体内において、活性酸素の低減を行うとともに、タンパク質のカルボニル化を抑制してカルボニル化タンパク質の量を低減できる。また、肌の保湿機能及び肌のバリア機能を向上させることができるため、肌のくすみを抑制できる。
【００８１】
また、本発明は、生体内に存在する抗酸化機能を活性化させる構成であるため、例えば所定のタンパク質の活性を抑制する阻害剤などを加える場合に比べて、安全性が高いと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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