(57)【要約】【課題】安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供する。【解決手段】アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、
生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、
ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法。
【請求項２】
更に、触媒であるマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及びマンガンイオン（Ｍｎ２＋）の少なくとも一方の存在下にて前記被検液に前記グルタミン合成酵素を作用させて前記リン酸を生成する請求項１に記載のアンモニアの定量方法。 
【請求項３】
更に、補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させる請求項１又は請求項２に記載のアンモニアの定量方法。 
【請求項４】
前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生成された過酸化水素を測定する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアンモニアの定量方法。 
【請求項５】
呈色反応又は電気化学反応を行い、生成された前記過酸化水素を測定する請求項４に記載のアンモニアの定量方法。 
【請求項６】
ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、
前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬。 
【請求項７】
水素供与体を含有する第１試薬と、
カップラーを含有する第２試薬と、を含有し、
ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、前記第１試薬及び前記第２試薬の少なくとも一方に含有され、
酵素は、前記グルタミン合成酵素、前記ピルビン酸オキシダーゼ及び前記ペルオキシダーゼからなる定量試薬キット。
【請求項８】
ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、
前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片。
【請求項９】
アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、
生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、
ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置。
【請求項１０】
アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記Ｌ−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、
前記反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、
を備えるアンモニアの定量装置。
【請求項１１】
アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記Ｌ−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された前記過酸化水素、前記水素供与体、及び前記カップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、
前記反応部での反応により生成された前記色素を測定する測定部と、
を備えるアンモニアの定量装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンモニア定量方法としては、化学測定方法及び酵素測定方法が知られている。化学測定方法としては、インドフェノール法が主に用いられている。一方、酵素測定方法としては、グルタミン酸脱水素酵素を用いる方法の他、グルタミン合成酵素、カルバメートキナーゼ、カルバモイルリン酸合成酵素等を用いる方法がある。
【０００３】
グルタミン合成酵素を用いた酵素測定方法としては、例えば、アンモニア、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＬ−グルタミン酸の存在下でグルタミン酸合成酵素を作用させ、生成したＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合物にキナーゼを作用させて、生成したキナーゼ反応生成物を定量することでアンモニアを定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００４】
より具体的には、特許文献１には、以下の４段階の反応にてアンモニアを定量する方法が開示されている。
（１）アンモニア、ＡＴＰ及びＬ−グルタミン酸の存在下、グルタミン合成酵素を作用させ、Ｌ−グルタミン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びリン酸を生成する。
（２）生成されたＡＤＰ及びホスホエノールピルビン酸の存在下、ピルビン酸キナーゼを作用させ、ＡＴＰ及びピルビン酸を生成する。
（３）生成されたピルビン酸、生成されたリン酸及び酸素の存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用させ、アセチルリン酸、二酸化炭素及び過酸化水素を生成する。
（４）生成された過酸化水素、フェノール及び４−アミノアンチピリンの存在下、ペルオキシダーゼを作用させてキノン系色素を生成する。５００ｎｍの吸光度の増加量からアンモニアを定量する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６２−３８００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載されたアンモニアの定量方法では、上述のように、４段階の反応を経てアンモニアが定量される。反応経路が多い場合、必要な試薬数が増えるという問題がある。また、特許文献１に記載されたアンモニアの定量方法では、高価なホスホエノールピルビン酸を使用しているため、測定費用が増加するという問題がある。そこで、安価、且つ簡便にアンモニアを定量する方法が求められている。
【０００７】
本発明は、安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するための具体的な手段は、以下の通りである。
＜１＞  本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
＜２＞  本発明の一態様は、更に、触媒であるマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及びマンガンイオン（Ｍｎ２＋）の少なくとも一方の存在下にて前記被検液にグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成する＜１＞に記載のアンモニアの定量方法である。
＜３＞  本発明の一態様は、更に、補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させる＜１＞又は＜２＞に記載のアンモニアの定量方法である。
＜４＞  本発明の一態様は、前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて生成された過酸化水素を測定する＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のアンモニアの定量方法である。
＜５＞  本発明の一態様は、呈色反応又は電気化学反応を行い、生成された前記過酸化水素を測定する＜４＞に記載のアンモニアの定量方法である。
＜６＞  本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。
＜７＞  本発明の一態様は、水素供与体を含有する第１試薬と、カップラーを含有する第２試薬と、を含有し、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、前記第１試薬及び前記第２試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、前記グルタミン合成酵素、前記ピルビン酸オキシダーゼ及び前記ペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。
＜８＞  本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。
＜９＞  本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
＜１０＞  本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記Ｌ−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、前記反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
＜１１＞  本発明の一態様は、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、前記被検対象中にて、前記アンモニア、前記アデノシン三リン酸及び前記Ｌ−グルタミン酸の存在下にて前記グルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成された前記リン酸及び前記ピルビン酸の存在下にて前記ピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された前記過酸化水素、前記水素供与体、及び前記カップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、前記反応部での反応により生成された前記色素を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一態様によれば、安価、且つ簡便にアンモニアを定量することが可能なアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、アンモニア量と５６０ｎｍの吸光度の増加量との関係を示すグラフである。
【図２】実施例２において、アンモニア濃度とＫ／Ｓ値との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態に係る定量装置１００を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一態様のアンモニアの定量方法、定量試薬、定量試薬キット、試験片及び定量装置について説明する。
本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本明細書において、アンモニアを含有する被検液は、アンモニア及びアンモニウムイオンの少なくとも一方を含む被検液を意味し、アンモニア濃度及びアンモニア量はそれぞれ、アンモニアとアンモニウムイオンとの合計濃度及び合計量を意味している。
本明細書において、Ｌ−グルタミン酸、リン酸、ピルビン酸及びアセチルリン酸は、それぞれ塩であってもよい。
【００１２】
〔アンモニアの定量方法〕
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）からＡＴＰを生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。
【００１３】
本態様の定量方法では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の２段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア（アンモニア及びアンモニウムイオンの合計）を定量することができる。
【００１４】
従来公知のアンモニアの定量方法では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の他、ピルビン酸キナーゼを介した反応を行っており、少なくとも３段階反応を経て、被検液に含有されるアンモニアを定量している。ピルビン酸キナーゼを介した反応として、より詳細には、ホスホエノールピルビン酸及びグルタミン合成酵素を介した反応により生じたＡＤＰの存在下にて、ピルビン酸キナーゼを作用させ、ＡＴＰ及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応に用いられるピルビン酸を生成している。従来公知のアンモニアの定量方法では、ＡＴＰ及びＡＤＰのサイクリング反応の一部としてピルビン酸キナーゼを介した反応を行っている。
【００１５】
しかしながら、従来公知のアンモニアの定量方法では、ＡＴＰ及びＡＤＰのサイクリング反応の一部としてホスホエノールピルビン酸を用いた反応が必要であり、ホスホエノールピルビン酸はＡＴＰ、ピルビン酸等と比較して高価であるため、測定費用が増加するという問題がある。さらに、アンモニアの定量を好適に行う観点から、サイクリング対象ではないホスホエノールピルビン酸を多めに使用してピルビン酸オキシダーゼを作用させる反応を安定的に行うことが想定されるため、測定費用がより増加することが懸念される。
【００１６】
一方、本態様は、ピルビン酸キナーゼを介してＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を行わないアンモニアの定量方法である。そのため、本態様の定量方法は、従来公知のアンモニアの定量方法に比べて反応経路が少なく必要な試薬数を削減することができる。したがって、本態様の定量方法では、より簡便にアンモニアを定量することができる。さらに、本態様の定量方法では、高価なホスホエノールピルビン酸を使用しないため、より安価でアンモニアを定量することができる。
【００１７】
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液を用いる。被検液としては、アンモニアを含有するものであればよく、例えば、酵素反応により生成されたアンモニアを含有するもの、及び、化学反応（例えば、加水分解）により生成又は遊離されたアンモニアを含有するものが挙げられる。被検液として、より具体的には、血液、血清、尿等が挙げられる。なお、本態様の定量方法では、分析対象となる被検液に、後述の各成分をそれぞれ添加してアンモニアの定量を行ってもよく、後述の各成分を含浸させたろ紙等にアンモニアを含有する被検液を付着させてアンモニアの定量を行ってもよい。
【００１８】
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液に、ＡＴＰ及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させることでリン酸を生成する。例えば、アンモニア（ＮＨ３）を含有する被検液に、ＡＴＰ及びＬ−グルタミン酸塩（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）の存在下にてグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を作用させることにより、以下の反応式（１）に示すように、ＡＤＰ、リン酸塩（Ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）が生成される。
【００１９】
【化１】
2018023364.tif 000002
【００２０】
また、本態様の定量方法では、リン酸の合成反応を効率よく行う観点から、触媒であるマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及びマンガンイオン（Ｍｎ２＋）の少なくとも一方の存在下にて、アンモニアを含有する被検液にグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成することが好ましい。
【００２１】
本態様の定量方法では、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる。例えば、生成されたリン酸塩、ピルビン酸塩（Ｐｙｒｕｖａｔｅ）及び酸素の存在下（これらを含有する水溶液中）にてピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ）を作用させることにより、以下の反応式（２）に示すように、アセチルリン酸塩（Ａｃｅｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、二酸化炭素及び過酸化水素が生成される。
【００２２】
【化２】
2018023364.tif 000003
【００２３】
また、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行う。例えば、リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる際に消費された酸素を測定してアンモニアの定量を行ってもよく、リン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させる際に生成された過酸化水素を測定してアンモニアの定量を行ってもよい。
【００２４】
消費された酸素を測定してアンモニアの定量を行う場合、例えば、酸素電極を用いて溶液中における溶存酸素量を測定することが好ましい。
【００２５】
生成された過酸化水素を測定してアンモニアの定量を行う場合、例えば、呈色反応又は電気化学反応を行うことが好ましい。
【００２６】
呈色反応を行う場合、例えば、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させればよい。これにより、水素供与体及びカップラーが酸化縮合反応して色素が生成される。生成された色素が吸収する特定波長における吸光度と、被検液に含有されるアンモニア濃度とは比例関係にあるため、特定波長における吸光度を測定することでアンモニアの定量を行うことが可能である。
【００２７】
また、ろ紙等に生成された色素を付着させて得られた試験紙の反射率を測定することでアンモニアの定量を行ってもよい。例えば、生成された過酸化水素、水素供与体及びペルオキシダーゼを含有する液体並びにカップラーを含有する液体にろ紙等を含浸して得られた試験紙の反射率を測定することでアンモニアの定量を行ってもよい。
【００２８】
一例として、生成された過酸化水素、水素供与体である１−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（ＮＤＳＡ）及びカップラーである４−アミノアンチピリンの存在下にてペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を作用させることにより、以下の反応式（３）に示すように、キノンイミン系色素（Ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ  ｄｙｅ）が生成され、５６０ｎｍの吸光度が増加する。
【００２９】
【化３】
2018023364.tif 000004
【００３０】
水素供与体としては、カップラーとの酸化縮合反応により色素が生成されるものであれば特に限定されず、フェノール、フェノール誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、アニリン、アニリン誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。中でも、得られる色素における感度及び波長の観点から、アニリン及びアニリン誘導体が好ましい。
【００３１】
アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。
【００３２】
カップラーとしては、水素供与体との酸化縮合反応により色素が生成されるものであれば特に限定されず、４−アミノアンチピリン、４−アミノアンチピリン誘導体、フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等が挙げられる。
【００３３】
次に、電気化学反応を行う場合、例えば、生成された過酸化水素の電気化学反応で生じる電流の値を測定すればよい。測定された電流値と、被検液に含有されるアンモニア濃度とは比例関係にあるため、電流値を測定することでアンモニアの定量を行うことが可能である。
【００３４】
本態様の定量方法では、ピルビン酸オキシダーゼの補酵素であるチアミンピロリン酸及びフラビンアデニンヌクレオチドの存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させることが好ましい。
【００３５】
本態様の定量方法では、反応温度は、１０℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜４０であることがより好ましく、３０℃〜３７℃であることが更に好ましい。また、反応時間は、１分間〜６０分間であることが好ましく、２分間〜３０分間であることがより好ましく、５分間〜１５分間であることが更に好ましい。
【００３６】
本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液を酵素反応に適したｐＨ（例えば、ｐＨが６．０〜９．０）に調整するため、緩衝液を用いてもよい。緩衝液としては、ｐＨが好ましくは６．０〜９．０、より好ましくは６．０〜８．０のものを用いてもよい。緩衝液としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。
【００３７】
また、本態様の定量方法では、アンモニアを含有する被検液に、必要に応じて上述した成分以外のその他の成分を添加してもよい。その他の成分としては、例えば、界面活性剤、防腐剤、安定化剤等が挙げられる。
【００３８】
〔定量試薬、定量試薬キット及び試験片〕
本発明の一態様は、ピルビン酸、ＡＴＰ、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる定量試薬である。本態様の定量試薬は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は水素供与体を含有する第１試薬と、カップラーを含有する第２試薬と、を含有し、ピルビン酸、ＡＴＰ、Ｌ−グルタミン酸、並びに、酵素である、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼはそれぞれ独立に、第１試薬及び第２試薬の少なくとも一方に含有され、酵素は、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる定量試薬キットである。本態様の定量試薬キットは、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
また、本発明の一態様は、ピルビン酸、アデノシン三リン酸、Ｌ−グルタミン酸及び酵素を含有し、前記酵素が、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる試験片である。本態様の試験片は、例えば、アンモニアの定量に用いられる。
【００３９】
本態様の定量試薬、定量試薬キット及び試験片では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の２段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア（アンモニア及びアンモニウムイオンの合計）を定量することができる。
【００４０】
本態様の定量試薬、定量試薬キット及び試験片を用いることで、ピルビン酸キナーゼを介してＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を行わずにアンモニアを定量することができる。そのため、本態様の定量試薬及び定量試薬キットでは、より簡便にアンモニアを定量することができる。
【００４１】
さらに、本態様の定量試薬キットを用いることで、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させることにより、水素供与体及びカップラーが酸化縮合反応して色素が生成され、本態様の定量方法と同様、アンモニアの定量を行うことが可能である。
【００４２】
なお、本態様の定量試薬及び試験片並びに定量試薬キットにおける第１試薬及び第２試薬は、前述のアンモニアの定量方法に記載されている触媒、補酵素、緩衝液及び他の成分を含んでいてもよい。本態様の定量試薬キットにおける水素供与体及びカップラーは、前述のアンモニアの定量方法に記載されているものと同様であるため、その説明を省略する。また、本態様の試験片は、例えば、水素供与体及びカップラーをさらに含有していてもよく、ろ紙等であってもよく、ろ紙等に各成分が含浸されたものであってもよい。
【００４３】
〔アンモニアの定量装置〕
本発明の一態様は、アンモニアを含有する被検液に、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させ、反応により消費又は生成された成分を測定してアンモニアの定量を行い、ピルビン酸キナーゼを介してアデノシン二リン酸からアデノシン三リン酸を生成する反応を行わないアンモニアの定量装置である。
【００４４】
本態様の定量装置では、グルタミン合成酵素を介した反応及びピルビン酸オキシダーゼを介した反応の２段階反応を経て、消費された成分又は生成された成分を測定することで被検液に含有されるアンモニア（アンモニア及びアンモニウムイオンの合計）を定量することができる。
【００４５】
本態様の定量装置を用いることで、ピルビン酸キナーゼを介してＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を行わずにアンモニアを定量することができる。そのため、本態様の定量装置では、より簡便にアンモニアを定量することができる。
【００４６】
本態様の定量装置の具体例について以下に説明する。まず、本態様の定量装置の具体例１としては、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素及びピルビン酸オキシダーゼからなる酵素と、を含有する被検対象が配置され、被検対象中にて、アンモニア、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、かつ、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させて反応を行う反応部と、反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部と、を備える定量装置が挙げられる。例えば、本発明の一実施形態に係る定量装置１００は、図３に示すように、前述の反応を行う反応部１と、反応部１での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部２と、を少なくとも備えていればよい。
【００４７】
具体例１の定量装置は、前述の反応部を備える。反応部は、前述の被検対象を配置可能な構成を有し、例えば、被検対象である被検液が貯留された採血管、採尿管等が配置される箇所、被検液が貯留される容器、アンモニアの定量に用いる各成分が含浸され、アンモニアを含有する被検液が付着したろ紙などを備える構成であればよい。
【００４８】
また、反応部は、前述の反応式（１）に示すリン酸の生成反応及び前述の反応式（２）に示す過酸化水素の生成反応が効率よく生じるように反応条件（反応温度、被検液のｐＨ等）を調整できる構成であることが好ましい。
【００４９】
具体例１の定量装置は、反応部での反応により消費又は生成された成分を測定する測定部を備える。測定部は、例えば、反応部での反応により消費された酸素又は反応部での反応により生成された過酸化水素を測定することでアンモニアを定量する。
【００５０】
測定部が反応部での反応により消費された酸素を測定する場合、測定部は、酸素電極を備え、酸素電極を用いて溶液中における溶存酸素量を測定する構成であることが好ましい。
【００５１】
測定部が反応部での反応により生成された過酸化水素を測定する場合、測定部は、生成された過酸化水素の電気化学反応で生じる電流の値を測定する構成であることが好ましい。
【００５２】
次に、本態様の定量装置の具体例２としては、アンモニアと、ピルビン酸と、アデノシン三リン酸と、Ｌ−グルタミン酸と、グルタミン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼからなる酵素と、水素供与体と、カップラーと、を含有する被検対象が配置され、被検対象中にて、アンモニア、アデノシン三リン酸及びＬ−グルタミン酸の存在下にてグルタミン合成酵素を作用させてリン酸を生成し、生成されたリン酸及びピルビン酸の存在下にてピルビン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、かつ、生成された過酸化水素、水素供与体、及びカップラーの存在下にてペルオキシダーゼを作用させて色素を生成する反応を行う反応部と、反応部での反応により生成された色素を測定する測定部と、を備えるアンモニアの定量装置が挙げられる。
【００５３】
色素を測定する測定部としては、色素が吸収する特定波長における吸光度を測定する構成、色素を付着させた試験紙の反射率を測定する構成等を備えていればよい。
【００５４】
本態様の定量装置における分析対象となるアンモニアを含有する被検対象は、前述のアンモニアの定量方法に記載されている触媒、補酵素、緩衝液及び他の成分を含んでいてもよい。
【００５５】
アンモニアと、前述の各成分と、を含有する被検対象は予め準備され、本態様の定量装置は、準備された被検対象が反応部に配置される構成であってもよい。
【００５６】
また、本態様の定量装置は、前述の定量試薬、前述の第１試薬及び前述の第２試薬、又は前述の各成分を貯留する貯留部を更に備え、反応部に配置されたアンモニアを含有する被検液に各試薬又は各成分が供給される構成であってもよい。あるいは、本態様の定量装置は、反応部に配置されたアンモニアの定量に用いる各成分が含浸されたろ紙等にアンモニアを含有する被検液を付着させる構成であってもよい。
【実施例】
【００５７】
次に、本発明の一態様を以下の実施例に基づき説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５８】
〔実施例１〕
以下に示す試薬１及び試薬２を調製した。なお、試薬２としては、硫酸アンモニウムの濃度が異なる４種類のものを調製した。
＜試薬１＞
ＢＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（同仁化学社製、ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
チアミンピロリン酸（東京化成工業社製）  １ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド（東京化成工業社製）  １ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム六水和物  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸二水和物（Ｒｏｃｈｅ社製）  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸カリウム（ナカライテスク社製）  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン合成酵素（キッコーマン社製）  １０Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）  １０Ｕ／ｍＬ
＜試薬２＞
４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸オキシダーゼ（旭化成社製）  １０Ｕ／ｍＬ
硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製）  ０ｍｍｏｌ／Ｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ、３．６ｍｍｏｌ／Ｌ、７．２ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５９】
次に、２００μＬの試薬２をそれぞれ、８００μＬの試薬１と混和し、３７℃で１０分間反応させた。次に、混和した試薬の吸光度を測定したところ、図１に示すように、試薬２のアンモニア量と５６０ｎｍの吸光度の増加量との間で良好な直線関係が得られた。
【００６０】
〔実施例２〕
以下に示す含浸液１及び含浸液２を調製し、ろ紙を準備した。
＜含浸液１＞
ＢＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（同仁化学社製、ｐＨ７．５）  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ナフトール−３，６−ジスルホン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
チアミンピロリン酸（東京化成工業社製）  １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド（東京化成工業社製）  １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム六水和物  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸二水和物（Ｒｏｃｈｅ社製）  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸カリウム（ナカライテスク社製）  ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン合成酵素（キッコーマン社製）  ４５Ｕ／ｍＬ
ピルビン酸オキシダーゼ（旭化成社製）  ７０Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）  ７０Ｕ／ｍＬ
＜含浸液２＞
４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
＜ろ紙＞
３ＭＭ  ＨＰ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）
【００６１】
次に、含浸液１及び含浸液２をろ紙に含浸し、乾燥させて試験片を得た。得られた試験片に図２に示すアンモニア濃度の硫酸アンモニウム水溶液を点着し、常温にて１０分間放置した後に、硫酸アンモニウム水溶液を点着させた箇所の反射率（５６０ｎｍ）を読み取り、以下に示すＫ／Ｓ値に変換した。
Ｋ／Ｓ値＝（１−Ｒ）２／２Ｒ（Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ式、Ｒは反射率）
【００６２】
図２に示すように、アンモニア濃度と５６０ｎｍにおけるＫ／Ｓ値との間で良好な直線関係が得られた。
【００６３】
以上により、本実施例では、簡便な方法で高感度なアンモニアの定量が可能であることが示された。
【符号の説明】
【００６４】
１  反応部、２  測定部、１００  定量装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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