(57)【要約】      （修正有）【課題】溶液中のホタルルシフェリンを安定化させる方法の提供。【解決手段】ホタルルシフェリン溶液にＤＭＳＯ類似体を共存させることを特徴とする、ホタルルシフェリンの安定化方法。ＤＭＳＯ類似体は、下記式で表されるＤＭＳＯ類似体から選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体等。2018203721.tif 000014（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基又はメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホタルルシフェリンを含む溶液にＤＭＳＯ類似体を共存させることを特徴とするホタルルシフェリン溶液の安定化方法。
【請求項２】
前記ＤＭＳＯ類似体が、下記式で表されるＤＭＳＯ類似体から選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である請求項１に記載の安定化方法。
【化３】
2018203721.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基またはメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。
【請求項３】
前記ＤＭＳＯ類似体がジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、３−(エチルスルフィニル)プロパン酸、メチル(メチルチオ)メチルスルホキシドから選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である請求項１および２に記載の安定化方法。
【請求項４】
ホタルルシフェリンを含む溶液にＤＭＳＯ類似体が共存することを特徴とするホタルルシフェリン溶液。
【請求項５】
前記ＤＭＳＯ類似体が、下記式で表されるＤＭＳＯ類似体から選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である請求項４に記載のホタルルシフェリン溶液。
【化３】
2018203721.tif 000013
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基またはメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。
【請求項６】
前記ＤＭＳＯ類似体がジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、３−(エチルスルフィニル)プロパン酸、メチル(メチルチオ)メチルスルホキシドから選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である請求項４および５に記載のホタルルシフェリン溶液。
【請求項７】
ホタルルシフェリンの安定化剤としてＤＭＳＯ類似体を含むホタルルシフェリン溶液をルシフェラーゼ反応時にＤＭＳＯ類似体の終濃度が５％以下となるように用いることを特徴とするホタルルシフェラーゼ発光反応測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホタルルシフェリンの安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタルルシフェラーゼによる発光反応は、酸素、ＡＴＰおよび補因子として２価金属イオン、例えばＭｇ２＋、Ｍｎ２＋の存在下において、ホタルルシフェラーゼの触媒作用により、その基質であるホタルルシフェリンが酸化される際に光が生じるものである。
【０００３】
ホタルルシフェラーゼによる発光反応は、ＡＴＰがごく微量であっても進行することから、高感度検出が可能であり、生物由来のＡＴＰの高感度・簡易検出法に利用されている。また、その発光量はＡＴＰ量に比例することから、ホタルルシフェラーゼによる発光反応はＡＴＰの定量に利用されている。
【０００４】
例えば、細菌検査の分野においては、細菌由来のＡＴＰを発光反応で検出することにより、培養を必要とせずに迅速かつ高感度に検出できることから、細菌の有無や菌数の検査に利用されている。食品加工の分野においては、加工用食材残渣に由来するＡＴＰを検出することにより、加工用の器具や設備の清浄度の検査に利用されている。
【０００５】
また、ＡＴＰの定量以外の発光反応の利用方法としては、臨床検査分野において、生体内物質、例えばホルモンや疾患マーカー抗原あるいは抗体等の微量物質の測定系において、ホタルルシフェラーゼを標識物質として用いる生物発光酵素免疫測定法がある。
【０００６】
しかし、ホタルルシフェリンは溶液の状態では劣化しやすいため、保存により経時的に発光強度が低下してしまうことから、発光反応を利用する測定系においてはホタルルシフェリン溶液の安定化が問題であった。
【０００７】
一般的に酵素とその基質が共存する状態ではそれぞれが単独で存在するよりも安定性が向上することはよく知られた事実である。ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンが共存する場合の安定化技術としては、安定化剤としてポリオールを添加し、ｐＨ５．５〜７．４としたホタルルシフェラーゼ・ホタルルシフェリンの水溶液が知られている（特許文献１）。しかし、この方法においては、ホタルルシフェラーゼによる発光反応の至適ｐＨ（８．５付近）を外れている点、ｐＨ６．０以下ではルシフェリンの溶解度が小さくなる点などの問題点に加え、例えば、生物発光酵素免疫測定法では、標識物質であるホタルルシフェラーゼによる発光反応を検出するという反応系の性質上、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンとを予め同一試薬中に共存させることができないといった実用面での問題が多々存在する。
【０００８】
ホタルルシフェリンの安定化技術としては、アデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、およびフェニルフォスフェート等のリン酸供与体をホタルルシフェリン溶液に共存させることにより、溶液中のホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献２）。
【０００９】
また、ホタルルシフェリン溶液のｐＨをやや酸性に保持することにより、溶液中のホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献３）。
【００１０】
さらに、ホタルルシフェリン溶液中のホタルルシフェリンを、シクロデキストリンに包接させることで、溶液中のホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献４）。
【００１１】
一方、ウミホタルルシフェリンについては、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸性溶質を用いてｐＨを酸性に保持することで、溶液中のウミホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献５）。しかし、ホタルルシフェリン（化学式１）とウミホタルルシフェリン（化学式２）とは、それぞれ構造が全く異なるため、ウミホタルルシフェリンの安定化方法がそのままホタルルシフェリンに適用できるとは言い難い。
【００１２】
【化１】
2018203721.tif 000002
【００１３】
【化２】
2018203721.tif 000003
【００１４】
これまで、何れの方法によってもルシフェリン溶液の十分な安定化効果は得られておらず、溶液の状態で長期間保存してもルシフェリンの劣化を抑制し得るルシフェリン溶液の組成の確立が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開９４／１１５２８号公報
【特許文献２】特開２０００−１６６５５０号公報
【特許文献３】特開２０００−２５３８９９号公報
【特許文献４】特開２０００−３１９２８０号公報
【特許文献５】特開平０８−１５４６９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、溶液中のホタルルシフェリンを安定化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上述の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ホタルルシフェリンの溶液にＤＭＳＯ類似体を共存させることにより、ホタルルシフェリンの保存安定性が向上することを見出した。
【００１８】
すなわち、本発明の構成は、以下の［１］から［７］の通りである。
［１］ホタルルシフェリンを含む溶液にＤＭＳＯ類似体を共存させることを特徴とするホタルルシフェリン溶液の安定化方法。
［２］前記ＤＭＳＯ類似体が、下記式で表されるＤＭＳＯ類似体から選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である［１］に記載の安定化方法。
【化３】
2018203721.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基またはメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。
［３］前記ＤＭＳＯ類似体がジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、３−（エチルスルフィニル）プロパン酸、メチル（メチルチオ）メチルスルホキシドから選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である［１］および［２］に記載の安定化方法。
［４］ホタルルシフェリンを含む溶液にＤＭＳＯ類似体が共存することを特徴とするホタルルシフェリン溶液。
［５］前記ＤＭＳＯ類似体が、下記式で表されるＤＭＳＯ類似体から選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である［４］に記載のホタルルシフェリン溶液。
【化３】
2018203721.tif 000005
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基またはメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。
［６］前記ＤＭＳＯ類似体がジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、３−(エチルスルフィニル)プロパン酸、メチル(メチルチオ)メチルスルホキシドから選択される一種類以上のＤＭＳＯ類似体である［４］および［５］に記載のホタルルシフェリン溶液。
［７］ホタルルシフェリンの安定化剤としてＤＭＳＯ類似体を含むホタルルシフェリン溶液をルシフェラーゼ反応時にＤＭＳＯ類似体の終濃度が５％以下となるように用いることを特徴とするホタルルシフェラーゼ発光反応測定方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、溶液中のホタルルシフェリンの保存安定性を向上させることができ、このことはホタルルシフェラーゼによる発光反応を利用する測定系において、長期にわたり安定かつ高感度な測定に寄与する。また、本発明の好ましい実施形態においては、公知のホタルルシフェリン安定化方法、或いは安定化剤と組み合わせることで、その効果を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００２１】
「ホタルルシフェラーゼ」とはアメリカホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、コメツキムシなどの甲虫類由来のルシフェラーゼであり、これらのルシフェラーゼはその一次構造すなわちアミノ酸配列において異なるが、ＡＴＰとルシフェリンを基質とした生物発光反応を触媒する点すなわち機能において同等である。また、ルシフェラーゼの安定性の向上や発光波長を改変するために一部のアミノ酸配列を置換することで作り出された変異ルシフェラーゼすなわち組換えルシフェラーゼも天然のルシフェラーゼと同様に利用することが可能である。
【００２２】
「ホタルルシフェリン」とは、ホタルルシフェラーゼによる発光反応における基質である。ホタルルシフェリンもホタルルシフェラーゼと同様に発光反応における発光の制御のために、ホタルルシフェリン誘導体、ホタルルシフェリン類似体等が多数開発され、実際に利用されている。また、発光の制御以外に、検出の可視化や多項目検出を目的に発光波長を改変したものも開発されている。ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼによる生物発光反応における基質となるものであれば特に構造や由来は限定されない。例えば、Ｄ−ルシフェリン誘導体、アミノルシフェリン誘導体等の公知のものを用いることが可能である。
【００２３】
「２価金属イオン」は、ホタルルシフェラーゼによる発光反応系における補因子として必須である。２価金属イオンとして、好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００２４】
「ＤＭＳＯ類似体」は、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、フェニルビニルスルホキシド、エチルビニルスルホキシド、（ジ）ブチルスルホキシド、および以下の式（化学式３）で表されるＤＭＳＯ類似体を選択することができる。
【００２５】
【化３】
2018203721.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ビニル基、フェニル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基またはメチルチオメチル基を示し、Ｒ１とＲ２は同じ或いは異なってもよい。
【００２６】
「ジメチルスルホキシド」は、ＤＭＳＯ（ＣＡＳ  Ｎｏ．６７−６８−５、以下、ＤＭＳＯと記載する場合もある）とも呼ばれる。ジメチルスルホキシドは水や種々の有機溶媒によく溶解し、また、有機物や無機塩をもよく溶解することから、優れた溶媒として一般に広く利用されている。
【００２７】
「ジエチルスルホキシド」は、ＤＥＳＯ（ＣＡＳ  Ｎｏ．７０−２９−１）とも呼ばれる。
【００２８】
これらの他にＤＭＳＯ類似体として、「３−（エチルスルフィニル）プロパン酸」（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３７３７５−８２−７）や「メチル（メチルチオ）メチルスルフィド」（ＣＡＳ  Ｎｏ．３３５７７−１６−１、ＭＭＴＳとも呼ばれる）が挙げられる。
【００２９】
本発明の要件は、ホタルルシフェリンの溶液にＤＭＳＯ類似体を共存させることにある。
【００３０】
ＤＭＳＯ類似体によるホタルルシフェリンの安定化効果は、ホタルルシフェリン溶液中にＤＭＳＯ類似体が共存することで認められ、ＤＭＳＯ類似体の濃度に比例してルシフェリンの安定化効果は大きくなる。
【００３１】
ただし、ＤＭＳＯ類似体は、ルシフェラーゼ反応すなわちルシフェラーゼに対し阻害作用（酵素阻害作用）を示すため、反応時の濃度、つまり終濃度は１０．０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましく、５．０％（ｗ／ｖ）以下であることがより好ましい。
【００３２】
さらに、本発明は、公知のホタルルシフェリン安定化方法、或いは安定化剤を任意に選択して組み合わせることもできる。例えば、安定化剤としては、シクロデキストリン、ボロン酸誘導体またはその塩等を用いることができる。
【００３３】
シクロデキストリンとしては、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体が挙げられる。より具体的には、例えば、メチル−α−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、メチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキプロピル−γ−シクロデキストリン等が含まれる。これらのシクロデキストリンは単独すなわち一種類、または二種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
ボロン酸誘導体としては、ほう酸、エチルボロン酸、プロピルボロン酸、ブチルボロン酸、ヘキシルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウム、３−チオフェンボロン酸、３−フリルボロン酸、２，５−チオフェンジイルビスボロン酸、フェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノフェニルボロン酸等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ボロン酸誘導体の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。これらのボロン酸誘導体またはその塩は単独すなわち一種類、または二種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００３５】
本発明において、ルシフェリン溶液は、前出の成分を水または緩衝液に溶解することにより調製することができる。緩衝液としては、生化学で一般的に用いられるものであれば特に限定はなく、例えば、りん酸緩衝液、りん酸くえん酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリシン緩衝液、トリス緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液等が挙げられる。
【００３６】
ルシフェリン溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ５．０〜７．２、好ましくは、ｐＨ５．５〜６．８等の範囲で適宜設定することができる。
【００３７】
本発明によれば、かかる構成をとることにより、ホタルルシフェリン溶液の保存安定性を向上させることが可能となり、ひいてはホタルルシフェラーゼによる発光反応を利用する測定系において、長期にわたり安定かつ高感度な測定が可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１．ホタルルシフェリンの保存安定性へのＤＭＳＯ類似体の影響
（１）実験材料
ルシフェリン溶液として、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）と、同組成に加えて、ジメチルスルホキシド、およびＤＭＳＯ類似体であるジエチルスルホキシド、３-(エチルスルフィニル)プロパン酸、メチル(メチルチオ)メチルスルホキシドの４種類の化合物それぞれについて、０．４、２．０％（ｗ／ｖ）の２種類の濃度で含む、計９種類の試薬を調製し、それぞれの溶液を３群に分け、１群は−３０℃、別の１群は２５℃、残りの１群は３７℃で１週間保存した。
ホタルルシフェラーゼ反応試薬として、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、３０ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＭ  ＡＴＰ−２Ｎａ、０．１ｍＭ  ピロリン酸カルシウムからなる試薬を調製した。
ホタルルシフェラーゼ溶液として、１ｘ１０−１１Ｍを調製した。
【００４０】
（２）実験方法
マイクロプレートにホタルルシフェラーゼ溶液１０μＬを分注し、ルミノメーターＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０（ベルトルード社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ反応試薬５０μＬ、次いでルシフェリン溶液５０μＬを添加して、発光強度を測定した。
【００４１】
（３）結果
表１に示すように、−３０℃保存品の発光強度を１００％として比較すると、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯ類似体を含有しない場合（すなわち対照）の発光強度は、２５℃保存品では７５％、３７℃保存品では４０％に低下した。
一方、ルシフェリン溶液にジメチルスルホキシドおよびＤＭＳＯ類似体であるジエチルスルホキシド、３-(エチルスルフィニル)プロパン酸、メチル(メチルチオ)メチルスルホキシドを含有する場合、２５℃保存品については、ジメチルスルホキシドおよびその他３種類のＤＭＳＯ類事体それぞれの含有濃度０．４、２．０％（ｗ／ｖ）いずれも７７％以上の発光強度を示し、３７℃保存品についても、ＤＭＳＯおよびその他３種類のＤＭＳＯ類事体それぞれの含有濃度０．４、２．０％（ｗ／ｖ）いずれも４８％以上の発光強度を示した。これらの結果から、ＤＭＳＯおよびＤＭＳＯ類似体によるルシフェリンの保存安定化効果が認められた。
【００４２】
【表１】
2018203721.tif 000007
【００４３】
実施例２．ホタルルシフェリンの保存安定性へのＤＭＳＯの濃度の影響
（１）実験材料
ルシフェリン溶液として、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）に加えて、ＤＭＳＯを０−２０％（ｗ／ｖ）の範囲で、０．０、１．０、２．５、５．０、７．５、１０．０、１５．０、２０．０％（ｗ／ｖ）含むように８種類の試薬を調製し、ＤＭＳＯ含有濃度毎に溶液を３群に分け、１群は−３０℃、別の１群は２５℃、残りの１群は３７℃で１週間保存した。
ホタルルシフェラーゼ反応試薬として、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、３０ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＭ  ＡＴＰ−２Ｎａ、０．１ｍＭ  ピロリン酸カルシウムからなる試薬を調製した。
ホタルルシフェラーゼ溶液として、１ｘ１０−１１Ｍを調製した。
【００４４】
（２）実験方法
実施例１と同様に行った。
【００４５】
（３）結果
表２に示すように、−３０℃保存品の発光強度を１００％として比較すると、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯを含有しない場合（すなわち対照）の発光強度は、２５℃保存品では７９％、３７℃保存品では４７％に低下した。
一方、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯを含有する場合、２５℃保存品については、ＤＭＳＯ含有濃度２．５から２０．０％（ｗ／ｖ）で８０％以上の発光強度を示し、且つ、ＤＭＳＯの含有濃度依存的に高い発光強度比率を示した。３７℃保存品についても、ＤＭＳＯ含有濃度１．０から２０．０％（ｗ／ｖ）で何れも５４％以上の発光強度を示し、且つ、ＤＭＳＯの含有濃度依存的に高い発光強度比率を示した。これらの結果から、ルシフェリン溶液中に含有されるＤＭＳＯの濃度依存的にルシフェリンの保存安定化効果が認められた。
【００４６】
【表２】
2018203721.tif 000008
【００４７】
実施例３．ＤＭＳＯによるホタルルシフェラーゼの酵素活性への影響
（１）実験材料
ルシフェリン溶液として、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）に加えて、ＤＭＳＯを０−２０％（ｗ／ｖ）の範囲で、０．０、１．０、２．５、５．０、７．５、１０．０、１５．０、２０．０％（ｗ／ｖ）含むように８種類の試薬を調製し（保存０時間）、以下の実験に用いた。
ホタルルシフェラーゼ反応試薬として、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、３０ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＭ  ＡＴＰ−２Ｎａ、０．１ｍＭ  ピロリン酸カルシウムからなる試薬を調製した。
ホタルルシフェラーゼ溶液として、０Ｍと１ｘ１０−１１Ｍを調製した。
【００４８】
（２）実験方法
実施例１と同様に行った。
【００４９】
（３）結果
表３に示すように、ルシフェリン溶液（保存０時間）では、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯを含有しない場合（すなわち対照）の発光強度を１００％として比較すると、溶液に含まれるＤＭＳＯの濃度が高くなるにつれて、発光強度が低下しており、ルシフェラーゼ活性阻害の影響が大きくなる傾向が観察された。ルシフェリン溶液のＤＭＳＯ含有濃度が１．０〜１０．０％（ｗ／ｖ）（すなわちルシフェラーゼ反応時の終濃度０．５〜４．５％）では、対照のおよそ８０％以上のルシフェラーゼ活性が確認されたが、１５．０％（ｗ／ｖ）（すなわちルシフェラーゼ反応時の終濃度６．８％（ｗ／ｖ））以上では、対照の７０％未満であった。
実施例１、２および３より、ＤＭＳＯ類似体によるホタルルシフェリンの安定化効果は、ホタルルシフェリン溶液中にＤＭＳＯ類似体が共存すること、さらにはＤＭＳＯ類似体の濃度依存的に認められ、また、ＤＭＳＯ類似体のルシフェラーゼに対する酵素阻害作用を軽減するため、ルシフェラーゼ反応時の終濃度で５％（ｗ／ｖ）以下となるように用いることが好ましく、これらの条件でＤＭＳＯ類似体を用いるために、ルシフェリン溶液とホタルルシフェラーゼ反応試薬の組成および混合容量は自由に設計することができる。つまり、今回の実験では、調製した各溶液について、ホタルルシフェラーゼ溶液は１０μＬ、ホタルルシフェラーゼ反応試薬は５０μＬ、ホタルルシフェリン溶液は５０μＬの容量で用いたが、各溶液中の各種成分の終濃度が同じになるように各溶液を作製し、例えば、ホタルルシフェラーゼ反応試薬６６μＬ、ルシフェリン溶液３３μＬの容量で用いることで、ルシフェラーゼ反応時のＤＭＳＯ類似体の持ち込みを少なくし、ルシフェラーゼに対する影響、すなわち阻害作用を小さくすることが可能である。
【００５０】
【表３】
2018203721.tif 000009
【００５１】
実施例４．他のルシフェリン安定化剤との組合せ効果（１）
（１）実験材料
ＤＭＳＯと、ルシフェリンの安定化剤の一つであるボロン酸誘導体との組合せによる安定化効果の検証を行った。ボロン酸誘導体には３−フリルボロン酸を用いた。
ルシフェリン溶液として、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）に加えて、２．０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯと１０ｍＭ  ３−フリルボロン酸それぞれについて含む或いは含まない組合せを変えて、具体的には、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）のみからなるもの、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）に加えて、２．０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯのみ或いは１０ｍＭ  ３−フリルボロン酸のみを含むもの、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）、２．０％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯおよび１０ｍＭ  ３−フリルボロン酸を含む４種類のルシフェリン溶液を調製した。調製した4種類のルシフェリン溶液はそれぞれ３群に分け、１群は−３０℃、別の１群は２５℃、残りの１群は３７℃で１週間保存した。
ホタルルシフェラーゼ反応試薬およびホタルルシフェラーゼ溶液は実施例１と同様に調製した。
【００５２】
（２）実験方法
実施例１と同様に行った。
【００５３】
（３）結果
表４に示すように、−３０℃保存品の発光強度を１００％として比較すると、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯと３−フリルボロン酸を何れも含まない場合の発光強度は、２５℃保存品では７４％、３７℃保存品では４０％に低下した。
一方、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯのみを含有する場合、２５℃保存品では７５％、３７℃保存品では４９％の発光強度、３−フリルボロン酸のみを含有する場合、２５℃保存品では９１％、３７℃保存品では６３％の発光強度であったが、ＤＭＳＯと３−フリルボロン酸の両方を含む場合、２５℃保存品では９２％、３７℃保存品では７０％の発光強度を示した。つまり、ＤＭＳＯまたは３−フリルボロン酸はそれぞれ単独で用いるより、これらを組み合わせて用いることによってより高いルシフェリン溶液の保存安定化効果が得られることが示された。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
実施例５．他のルシフェリン安定化剤との組み合わせ効果（２）
（１）実験材料
ボロン酸誘導体には難水溶性の誘導体が多いことから、本実施例では、難水溶性ボロン酸の一例として、２−クロロボロン酸をＤＭＳＯに溶解してルシフェリン溶液を調製した。具体的には、０．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、１０ｍＭ  ＡＤＡ（ｐＨ６．５）のみからなるもの、或いは、これらに加えて、２％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯのみ、或いは２％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯおよび５ｍＭ  ２−クロロボロン酸を含む３種類のルシフェリン溶液を調製した。調製した３種類のルシフェリン溶液はそれぞれ３群に分け、１群は−３０℃、別の１群は２５℃、残りの１群は３７℃で１週間保存した。
ホタルルシフェラーゼ反応試薬およびホタルルシフェラーゼ溶液は実施例１と同様に調製した。
【００５６】
（２）実験方法
実施例１と同様に行った。
【００５７】
（３）結果
表５に示すように、−３０℃保存品の発光強度を１００％として比較すると、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯ、２−クロロボロン酸の何れも含まない場合の発光強度は、２５℃保存品では７６％、３７℃保存品では４５％に低下した。
一方、ルシフェリン溶液にＤＭＳＯのみを含有する場合、２５℃保存品では８０％、３７℃保存品では５４％の発光強度であったが、ＤＭＳＯと２−クロロボロン酸の両方を含む場合、２５℃保存品では９２％、３７℃保存品では７５％の発光強度を示した。つまり、ＤＭＳＯと難水溶性ボロン酸誘導体との組合せにより高いルシフェリン溶液の保存安定化効果が得られることが示された。
この結果から、ＤＭＳＯを難水溶性のボロン酸誘導体の溶媒として使用することにより、ホタルルシフェリンの安定化剤として、様々なボロン酸誘導体を利用する方法が示唆された。
【００５８】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、ホタルルシフェリン溶液の保存安定性を向上させる方法を提供することができる。すなわち、ホタルルシフェラーゼによる発光反応を利用する測定系において、長期にわたり安定かつ高感度な測定が可能となる。
本発明は、細菌検査分野における細菌の有無や菌数の検査、あるいは、食品加工分野における加工用の器具や設備の洗浄度検査に利用されているＡＴＰの定量に利用できる。
また、ホタルルシフェラーゼを標識物質として用いる微量の生体内物質の検出、例えば、生物発光酵素免疫測定法に利用できる。