(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された安全性プロファイルを示し、且つ十分に長い期間にわたり異種核酸配列を効率的に発現することが可能である、新規ウイルスベクターの提供【解決手段】細胞において少なくとも１種の異種核酸配列を発現する方法であって、該少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターによる、該細胞の感染により、少なくとも１種の異種核酸配列を細胞へ導入することを含み、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている方法。前記ウイルスベクターがパラミクソウイルス又はラブドウイルスのベクターである、方法。【選択図】図３
2018023388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において少なくとも１種の異種核酸配列を発現する方法であって、
該細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで感染することにより、少なくとも１種の異種核酸配列を細胞へ導入することを含む方法であって、
ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに
ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている、方法。
【請求項２】
前記組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス及びヒト呼吸器合胞体ウイルスを含むパラミクソウイルス、又は水疱性口内炎ウイルス若しくは狂犬病ウイルスを含むラブドウイルスのベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｐタンパク質の変異が、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸配列２−７７の又はその配列への、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸配列２−７７と相同のアミノ酸配列の又はその配列への、１個又は複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記変異が：
（ａ）センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２から７７の欠失、又はセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸２−７７と相同のアミノ酸の欠失であるか；あるいは
（ｂ）センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸３３−４１の欠失、又はセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸３３−４１と相同のアミノ酸の欠失である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の再プログラミング因子が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに／又はここで該プログラミング因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記治療的タンパク質が、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ｐ９１−ＰＨＯＸ、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、β−グロビン（ＨＢＢ）、ジストロフィン、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、グルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、フィブリリン−１（ＦＢＮ１）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）、癌自殺遺伝子産物、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原、免疫刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカイン、免疫抑制物質、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも部分的に分化した細胞のより少なく分化した細胞への再プログラミング、又は所望の分化状態へプログラミングされるべき細胞のプログラミングのインビトロ法であって：
（ａ）ドナー由来の少なくとも部分的に分化した細胞又はプログラミングされるべき細胞を提供する工程、
（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも１種の異種核酸配列を、工程（ａ）において提供される細胞へ導入する工程、並びに
（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで該少なくとも１種の異種核酸配列が、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも部分的に分化した細胞が、高分化型体細胞、前駆体細胞、系列−制限された幹細胞、体性幹細胞及び前駆細胞からなる群から選択される哺乳動物の細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも部分的に分化した細胞が、少能性細胞、多能性細胞、又は万能性細胞へ再プログラミングされる、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記プログラミングされるべき細胞が、高分化型体細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
遺伝性障害を治療するインビボ法であって：
少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを患者へ投与し、該少なくとも１種の異種核酸配列を患者の細胞へ導入する工程を含み、
ここで該少なくとも１種の異種核酸配列が、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
遺伝性障害を治療するインビトロ法であって：
（ａ）ドナー由来の細胞を提供する工程、
（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも１種の異種核酸配列を、工程（ａ）において提供された細胞へ導入する工程、並びに
（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するか及び／又は該細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで該少なくとも１種の異種核酸配列が、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０及び１２のいずれか一項記載の方法により、インビトロにおいて調製された細胞又は細胞集団。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１３記載の細胞又は細胞集団。
【請求項１５】
請求項１３記載の細胞又は細胞集団、あるいは請求項７〜９のいずれか一項記載の再プログラミングのインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団に由来した再分化した細胞又は再分化した細胞集団を含有する、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複製−欠損しているが、転写−コンピテントである、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用する、細胞において少なくとも１種の異種核酸配列を発現する方法に関する。特に本発明は、より少なく分化した状態に細胞を再プログラミングする方法、並びに該組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用する、インビボ及びインビトロにおける遺伝子治療の方法に関する。加えて本発明は、該インビトロ法により調製された細胞又は細胞集団、及びこの調製された細胞又は細胞集団の医薬品としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えウイルスベクターは、安定したトランスジェニック発現を媒介する哺乳動物細胞への外来遺伝子の導入に利用可能ないくつかの公知の物質の中のひとつである。レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを含む様々なウイルスが、この目的のために使用されている。これらの組換えウイルスは、ウイルスワクチンの製造における使用又は遺伝子欠損症の治療のための遺伝子治療ベクターとしての使用が特に知られている。組換えウイルスの他の適用は、レトロウイルス又はレンチウイルスが媒介した形質導入、及び特定の細胞の再分化因子又は再プログラミング因子の発現による、誘導万能幹（ｉＰＳ）細胞としても公知の万能細胞の脱分化を含む。
【０００３】
前述のウイルス−媒介型アプローチにおける遺伝子送達に関連した重大な問題点は、宿主細胞に悪性の形質転換を引き起こし得るウイルスベクター由来の遺伝物質の、宿主細胞ゲノムＤＮＡへの組込みである。特に、例えば再プログラミング因子をコードしている遺伝子のレトロウイルス−媒介型送達は、結果的に導入遺伝子のゲノム組込みを生じ得る。このことは、癌遺伝子の活性化又は腫瘍抑制遺伝子の破壊の引き金となり、悪性の細胞形質転換に繋がることがある。ウイルスベクターの組込みに関連した別の問題点は、組込まれダウンレギュレーションされた導入遺伝子は、再活性化され、細胞の形質転換を引き起こすことがあるという事実である。
【０００４】
別の懸念としては、遺伝子送達に使用されたウイルスは、該患者の隣接する健常細胞に、又は該患者から他の個体へ若しくは環境へと伝達され得る可能性がある。更なる問題点は、ウイルスベクターは、残留し、且つウイルス成分に対する免疫応答又はウイルス感染の遅延型作用などの、有害作用を引き起こし得ることである。更に外来遺伝子の延長された発現はまた、自己抗原に対する自己免疫様反応を生じるか、又はシグナル伝達経路のような細胞プロセスを妨害することがある。
【０００５】
エクスビボ手順及びインビボ手順における外来遺伝子の宿主細胞への送達の安全性を増すために、特にウイルスベクターの望ましくない伝播の観点から、様々な戦略が提唱されている。例えばＷＯ  ２００６／０８４７４６  Ａ１においては、複製−欠損しているが転写−コンピテントなマイナス鎖ＲＮＡウイルスが説明されている。その改善された安全性プロファイルのために、このウイルスは、生ワクチンとしての使用に適していると説明されている。
【０００６】
加えて、標的細胞のゲノムへの遺伝子の挿入により引き起こされる何らかの問題点を回避するために、標的細胞のゲノムには組込まれず且つ異種遺伝子産物の一過性の発現が可能であるウイルスの遺伝子構築体を導入することが試みられた。例えばＷＯ  ２０１０／００８０５４  Ａ１は、センダイウイルスベクターなどの、染色体に組込まれないウイルスベクターを使用する、ＥＳ（胚細胞）−様細胞の作製のための方法を開示している。しかしこのウイルスベクターは、感染した標的細胞において効率的に複製することができ、その結果生成されたウイルス粒子は、各細胞分裂後に、娘細胞間で均等に分配されるであろう。従って作製されたＥＳ−様細胞は、それらの細胞質内に望ましくない高度のウイルス負荷を含む。
【０００７】
同様のアプローチが、ＷＯ  ２０１０／１３４５２６  Ａ１に開示されており、そこでは、体細胞の誘導万能幹（ｉＰＳ）細胞への再プログラミングのために、センダイウイルスベクターが使用されている。センダイウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクター配列の組込みを生じず、従って、宿主ゲノムへのベクター配列のランダム組込みにより引き起こされる腫瘍原性の形質転換のリスクを低下する。しかし、ＷＯ  ２０１０／１３４５２６  Ａ１に開示されたセンダイウイルスベクターは、複製−コンピテントであるので、適切な安全性プロファイルを確実なものにするために、再プログラミング後にかなり努力してこれを取り除くことが必要である。更にウイルスの除去のためにＷＯ  ２０１０／１３４５２６  Ａ１において使用されるｓｉＲＮＡの送達率も、ｓｉＲＮＡ−媒介された発現阻害も、１００％には到達しないので、このアプローチは、生きたウイルスの使用に関連した健康上のリスクを十分に取り除くことはできない。
【発明の概要】
【０００８】
発明の目的
先行技術を考慮し、本発明の目的は、改善された安全性プロファイルを示し、且つ十分に長い期間にわたり異種核酸配列を効率的に発現することが可能である、新規ウイルスベクターを提供することである。特に本発明は、様々な疾患の遺伝子治療アプローチとして、標的細胞において治療的タンパク質をコードしている遺伝子を送達し且つ発現する新規方法を提供することを目的としている。更に本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞を再生医療における使用に適しているより少なく分化した細胞へ再プログラミングするため、又は所望の分化状態を選ぶように細胞をプログラミングするために、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている遺伝子を送達し且つ発現することを目的としている。
【０００９】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、少なくとも１種の異種核酸配列を細胞において発現する方法に関する。この方法は、インビトロ法又はインビボ法であり、且つ該細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで感染することにより、少なくとも１種の異種核酸配列を細胞へ導入する工程を含み、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質をコードしている。
【００１０】
好ましい実施態様において、インビトロ法により、少なくとも部分的に分化した細胞は、より少なく分化した細胞へと再プログラミングされ、この方法は：（ａ）ドナー由来の少なくとも部分的に分化した細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、少なくとも１種の異種核酸配列を、該細胞へ導入する工程、並びに、（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、ここで、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子をコードしている。
【００１１】
別の好ましい実施態様において、プログラミングされるべき細胞は、インビトロ法により、所望の分化状態へとプログラミングされ、この方法は：（ａ）ドナー由来のプログラミングされるべき細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、少なくとも１種の異種核酸配列を、該細胞へ導入する工程、並びに、（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、細胞のプログラミング因子をコードしている。
【００１２】
更に別の好ましい実施態様において、遺伝性障害は、少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを患者へ投与し、該少なくとも１種の異種核酸配列を患者の細胞へ導入する工程を含む、インビボ法により、治療され、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている。
【００１３】
また更に好ましい実施態様において、遺伝性障害は、インビトロ法により治療され、この方法は：（ａ）ドナー由来の細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも１種の異種核酸配列を、該細胞へ導入する工程、並びに、（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するか及び／又は細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養する工程を含み、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスのゲノム複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに、ここで該少なくとも１種の異種核酸配列は、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている。
【００１４】
第二の態様において、本発明は、本発明のインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団に関連している。この細胞又は細胞集団は、医薬品として、特に遺伝子治療又は再生医療において使用するための医薬品として、使用することができる。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、本発明のインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団、あるいは本発明の再プログラミングのインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団に由来する再分化した細胞又は再分化した細胞の集団を含有する医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様は、添付された特許請求の範囲に記載されている。
【００１７】
本発明は、以下の詳細な説明、実施例、及び添付された図面を参照し、より完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）により形質導入されたＶｅｒｏ細胞の、１日目（ｄ１）、６日目（ｄ６）、１２日目（ｄ１２）及び３０日目（ｄ３０）の、倍率１００×での、光学顕微鏡画像（上側部分）及び蛍光画像（下側部分）を示している。
【００１９】
【図２】図２は、ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／Ｏｃｔ４により、各々ＭＯＩ  ３又は２０で、２、５、８及び１２日目（ｄ２、ｄ５、ｄ８及びｄ１２）に、形質導入された、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）におけるｍＲＮＡ発現を、陰性対照としての形質導入されないＨＦＦ細胞、並びに陽性対照としてのＧＦＰ導入遺伝子及びＯｃｔ４導入遺伝子を持っている組換えレンチウイルスベクターと比較し示す、棒グラフである。
【００２０】
【図３】図３は、ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／Ｎａｎｏｇにより、各々ＭＯＩ  ３又は２０で、２、５、８及び１２日目（ｄ２、ｄ５、ｄ８及びｄ１２）に、形質導入された、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）におけるｍＲＮＡ発現を、陰性対照としての形質導入されないＨＦＦ細胞、並びに陽性対照としてのＧＦＰ導入遺伝子及びＮａｎｏｇ導入遺伝子を持っている組換えレンチウイルスベクターと比較し示す、棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は細胞における治療的タンパク質をコードしている異種核酸配列（本明細書において「導入遺伝子」と称されることもある）を発現する方法を提供する。本方法は、特異的組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの使用を基にしている。この組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、少なくとも１種の異種核酸配列を保有するように設計され、且つ関心対象の異種タンパク質の効率的生成を可能にする程度まで依然転写−コンピテントである一方で、その複製を欠損していることにより特徴付けられる。
【００２２】
本発明は、一般にワクチン接種には、特にワクチンとしての組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの使用には関係しない。すなわち、本組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターによりコードされた細胞の再プログラミング因子若しくはプログラミング因子又は治療的タンパク質は、ワクチン接種目的には使用されず、通常はこの目的には適していない。
【００２３】
本発明の方法において、組換え複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、細胞（本明細書において「宿主細胞」と称されることもある）を感染するために使用され、これにより少なくとも１種の異種核酸配列がその細胞へ導入される。導入された核酸は、ＲＮＡであり、これは細胞のゲノムには組込まれず、依然細胞質に留まり、その細胞質において、これはウイルスＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＲｄＲｐ）の鋳型として働き、ＲＮＡプラス鎖を作出し、このＲＮＡプラス鎖は標的細胞の翻訳機構により解読され、所望の異種タンパク質を生成する。
【００２４】
驚くべきことに、本発明の方法は、結果的に高い導入遺伝子発現レベルを生じる一方で、同時に優れた安全性プロファイルを有すことがわかった。本発明において使用される複製−欠損ＲＮＡウイルスによる感染時には、野生型ＲＮＡウイルスと比べ、はるかに少ない鋳型が存在する。減少した鋳型の数を考慮すると、本明細書に記載された複製−欠損ＲＮＡウイルスを使用し観察された異種タンパク質の発現は、予想外に高かった。
【００２５】
更にマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、宿主の染色体には組込まれないと考えられるので、本発明の方法は、染色体の組込みに関連した悪性の形質転換のリスクを排除している。加えて分化した細胞における再プログラミング因子をコードしている染色体に組込まれた遺伝子のその後の再発現のリスクは、排除される。同じく複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、患者の隣接する健常細胞には伝達されないか、又は患者から他の個体へ若しくは環境へは伝達されない。
【００２６】
加えて複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルス粒子は、各細胞分裂周期において生成された娘細胞間で均等に分布され、結果的に検出不可能なレベルまで次第に希釈される。別の言い方をすると、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、先行技術において説明されたような追加の精緻な精製を必要とせずに、感染された標的細胞から完全に排除され得る。
【００２７】
更に本発明の複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルス成分に対する免疫応答、ウイルス感染の遅延型作用、自己抗原に対する自己免疫様反応、内因性宿主遺伝子の変更された発現及び予想不可能な有害事象などの、ウイルスベクターの残留に関連したリスクを回避する。
【００２８】
複製−欠損しつつ、そのＲＮＡゲノムを転写するＲＮＡウイルスベクターの能力は、ウイルスＰタンパク質における変異の結果である。Ｐタンパク質は、Ｐタンパク質及びＬタンパク質からなるウイルスＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＲｄＲｐ）の一部である。ｖＲｄＲｐは、ウイルス転写とウイルス複製の両方を実行する。従ってこれら二つの機能は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて結びつけられている。Ｐタンパク質の変異は、ウイルスのゲノム複製能の喪失に繋がる一方で、導入された異種核酸配列の発現には必須であるウイルスの転写能は喪失されないことがわかっている。別の言い方をすると、Ｐタンパク質におけるある種の変異は、ｖＲｄＲｐの複製活性及び転写活性とは結びつけられない。
【００２９】
標的細胞の感染後、本明細書に記載された複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、そのウイルスのタンパク質及びウイルスゲノムに含まれる少なくとも１種の異種核酸配列によりコードされた異種タンパク質を発現させる。異種遺伝子産物を発現するために、本発明において使用される組換えウイルスは、初期一次転写を実行することが可能でなければならない。本明細書において使用される用語「初期（ｅａｒｌｙ）一次転写」とは、ウイルスのＲＮＡゲノムが、そのウイルス粒子に元来含まれたｖＲｄＲｐ分子により転写されている、感染された宿主細胞における最初の転写事象を称することが意図されている。
【００３０】
更に、本発明において使用される組換えウイルスは、後期一次転写を実行することが可能でなければならない。本明細書において使用される用語「後期（ｌａｔｅ）一次転写」とは、新生タンパク質合成が始まり、且つ新たに合成されたｖＲｄＲｐによる転写の実行が増大される相を意味することが意図されている。初期一次転写とは対照的に、後期一次転写時のウイルス複製は、新生タンパク質合成により左右される。先行技術において、用語「二次転写」は、後期一次転写と同義語として使用されることが多いが、本明細書においてはそのようには使用されないことは注意すべきである。
【００３１】
十分量のＮタンパク質が生成されると直ちに、ｖＲｄＲｐは複製モードのスイッチを入れ、アンチゲノムを生成する。このアンチゲノム鋳型から、Ｎタンパク質によりキャプシド形成された新たなゲノムが複製される。細胞におけるウイルス転写の鋳型の数が増加するので、いわゆる「二次転写」相が始まり、これは一次転写よりもはるかに高い転写効率を示す。本明細書において使用される用語「一次転写」は、特に指定しない限りは、初期及び後期一次転写の両方を指すことが意図される。
【００３２】
好ましくは、組換えウイルスベクターが後期一次転写を実行する能力は、そのタンパク質合成が、対応する野生型ウイルス、すなわち本明細書に記載ような遺伝子Ｐにおける変異を伴わないウイルスの、ウイルスタンパク質合成の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、又は少なくとも５％であるようなものである。後期一次転写活性は、対応する野生型ウイルスの活性よりも、好ましくは２０分の１以下、より好ましくは１０分の１以下である。後期一次転写の能力は、異種遺伝子産物、例えば説明されたようにレポータータンパク質の発現の定量的測定により決定することができる（例えばその開示が引用により本明細書中に組込まれているＷＯ  ２００６／０８４７４６  Ａ１の実施例７．１及び７．３参照）。
【００３３】
これに関連して、（複製−コンピテントな）野生型ＲＮＡウイルスによる感染時には、転写及び複製の鋳型として働くリボ核タンパク質複合体（ＲＮＦ）を生成することができない本明細書において使用される複製−欠損ＲＮＡウイルスと比べ、約５００〜約１０００倍多い鋳型が存在するという事実を考慮し、前述の異種発現レベルは予想外に高いことは留意されなければならない。
【００３４】
本発明の意味内において、「複製能の喪失」とは、標的細胞、すなわちＰ遺伝子における変異により影響を受ける任意のトランス機能（ｉｎ  ｔｒａｎｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を提供せず且つ補償しない細胞において、残存する複製能、すなわちウイルスゲノムの増幅は、検出不可能であることを意味する。実際ウイルス複製は、全面的に無効とされていると考えられる。減少した又は条件的な複製−欠損とは対照的に、ウイルスのゲノム複製を可能にする許容的条件（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は存在しない。複製に関する能力の喪失は、当該技術分野において説明されたように決定することができる（例えばその開示が引用により本明細書中に組込まれているＷＯ  ２００６／０８４７４６  Ａ１の実施例８参照）。
【００３５】
本発明において使用される組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、野生株、変異株、実験室での継代株、ワクチン株、遺伝子構築された株などを含む、モノネガウイルス目の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来することが好ましい。本明細書において使用される用語「ウイルスベクター」は、細胞へ形質移入され且つ細胞ゲノム内で若しくはゲノムから独立して複製され得るウイルス−由来の核酸に関連しており、並びにウイルス全体若しくはウイルス粒子、又はウイルスゲノムと会合タンパク質からなるウイルスコアを含む。本発明において使用される複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、最初のマイナス鎖ＲＮＡウイルスを遺伝的に修飾することにより得ることができる。
【００３６】
それから組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが誘導されるウイルスは、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、アレナウイルス科若しくはブニヤウイルス科に属するマイナス鎖ＲＮＡウイルス、又はそれらの組換え変種から選択することができる。本発明における使用に特に好ましいのは、パラミクソウイルス、例えばセンダイウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、例えばヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）１、２、３、４ａ若しくは４ｂ型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）など、又はラブドウイルス、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）若しくは狂犬病ウイルスなどである。本発明の特に好ましい実施態様において、ウイルスは、センダイウイルス、例えばセンダイ伏見株（ＡＴＣＣ  ＶＲ１０５）、センダイハリス株、センダイＣａｎｔｅｌｌ株又はセンダイＺ株である。
【００３７】
好適な組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、感染されるべき細胞型及び用途に応じて選択することができる。例えばセンダイウイルス及びムンプスウイルスは、非常に広い宿主細胞特異性を示す。センダイウイルスは、ウマ由来の細胞及び多様な動物のＢリンパ球などの多くの組織型の様々な動物細胞に感染することができる。あるいは、例えば麻疹ウイルス又は牛疫ウイルスなど、高い宿主細胞特異性を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスを使用することが望ましいことがある。人工的に修飾された宿主細胞特異性を伴うウイルスも使用することができる。
【００３８】
本発明に従い、本発明において使用される組換えＲＮＡウイルスのウイルスゲノムによりコードされた変異されたＰタンパク質は、ウイルス転写能の喪失を伴わずにウイルスゲノム複製能の喪失につながる少なくとも１つの変異を含む。この少なくとも１つの変異は、特定の型の変異に限定されず、但しウイルス転写能の喪失を伴わずに、好ましくは初期及び／又は後期一次転写能の喪失を伴わずに、複製能の喪失を生じることを条件とする、欠失、置換及び／又は挿入を含む。
【００３９】
この変異は、各マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質のＮ−末端領域へ影響を及ぼす。好ましくは、Ｐ遺伝子における少なくとも１つの変異は、センダイウイルスのＰタンパク質の、アミノ酸配列２から７７の若しくはその配列への（番号付けは、例えばＷＯ  ２００６／０８４７４６  Ａ１に従う）、特にアミノ酸配列３３から４１の若しくはその配列への、１個若しくは複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換であるか、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合は、センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸配列２から７７、特にアミノ酸配列３３から４１に対応するか若しくは相同なアミノ酸配列の又はその配列への、１個若しくは複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換である。
【００４０】
本発明の意味内で、用語「相同」とは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の相同性の程度を指す。より好ましい実施態様において、用語「相同」は、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９５％を超えるアミノ酸同一性の値を意味する。
【００４１】
センダイウイルスのＰタンパク質のアミノ酸配列２から７７の、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルス以外のウイルス由来のＰタンパク質同等物における対応するか若しくは相同なアミノ酸配列の、１個又は複数のアミノ酸の欠失が、特に好ましい。最も好ましいのは、センダイウイルスのアミノ酸２から７７又は３３から４１の欠失、あるいはセンダイ以外のウイルスの場合、センダイウイルス以外のウイルスのＰタンパク質同等物における対応するか若しくは相同なアミノ酸配列の欠失である。更にアミノ酸３２０の下流のセンダイウイルスＰタンパク質のＣ−末端領域、あるいはセンダイ以外のウイルス由来のＰタンパク質同等物の対応する又は相同なＣ−末端領域は、ウイルス転写に必須であると考えられるので、このＣ−末端領域は、変異を含まないことが好ましい。
【００４２】
本組換えＲＮＡウイルスベクターは、前述のＰ遺伝子における変異に加え、１つ又は複数の他のウイルス遺伝子における追加の変異を持つことができ、これは、ウイルスの伝播若しくはウイルスの細胞傷害性を減少するか、ウイルスの細胞特異性を変更するか、又はウイルスの減弱を媒介することが好ましい。例えば本組換えＲＮＡウイルスベクターは追加的に、ウイルスのエンベロープタンパク質をコードしている遺伝子の一つにおいて変異又は欠失を有することができる。
【００４３】
また本組換えＲＮＡウイルスベクターは、Ｃ、Ｗ、及びＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、Ｐ遺伝子のＮ−末端ＯＲＦと重複しているので、ウイルスのＰタンパク質におけるＮ−末端欠失の結果として、Ｃ、Ｗ、及び／又はＶ  ＯＲＦにおいて１又は複数の変異も有し得る。更に本明細書において使用される組換えＲＮＡウイルスベクターは、加えてＣ’遺伝子の代替開始コドンＡＣＧの欠失を有することができる。Ｃ’遺伝子は、感染された細胞において抗−ＩＦＮ反応活性を示すことがわかっている非構造タンパク質をコードしている。Ｃ’遺伝子の開始コドンの欠失は、感染された標的細胞における異種遺伝子産物の発現レベルの増加を生じることがわかった。通常は、こうして達成可能な導入遺伝子発現の増加は、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％である。
【００４４】
本発明に従い、本組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは更に、異種遺伝子産物をコードしている異種核酸配列を少なくとも１種含む。本明細書において使用される用語「異種」とは、本発明において使用される複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター以外の給源に由来するタンパク質又は核酸を指すことが意図されている。この異種遺伝子産物は、好ましくはタンパク質、特に細胞のより少ない分化状態への細胞再プログラミングを媒介又は促進する再プログラミング因子、所与の細胞を所望の分化状態へと分化するプログラミング因子、及び治療的タンパク質である。しかしこれは、リボザイム、アンチセンス−分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ、又はｐｉＲＮＡ分子であってもよい。この異種核酸配列は、通常は、ウイルスゲノムに含まれ、且つ適切な発現制御配列と機能的に連結されている。
【００４５】
本明細書において使用される用語「再プログラミング因子」又は「細胞再プログラミング因子」とは、それ自身によるか、又は他の遺伝子若しくは異種遺伝子産物との組合せのいずれかで、少なくとも部分的に分化した細胞をより少なく分化した細胞へ変換することが可能である、異種遺伝子産物、好ましくはタンパク質又はｍｉＲＮＡを指すことが意図されている。また、本明細書において使用される用語「再プログラミング因子」に含まれるのは、細胞再プログラミングを促進する補助因子である（すなわち、これらの補助因子は、細胞再プログラミングの効率を増大する）。細胞再プログラミング因子は通常は、胚性幹細胞において又は初期胚において発現されるが、分化された体細胞の大半においては発現されないか若しくは低下した発現を示す遺伝子によりコードされたタンパク質である。そのような胚性幹細胞に特異的な遺伝子は、通常は、転写因子及び核タンパク質である。
【００４６】
本明細書において使用するための好ましい細胞再プログラミング因子は、Ｏｃｔ−３、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＴＢＸ３ｂ、ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴ、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４７】
少なくとも１種の異種核酸配列によりコードされた「プログラミング因子」とは、所与の細胞を所望の分化状態へ分化することができる因子を指すことが意図されている。例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、Ｍａｆａ、及びそれらの組合せであるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明において使用するための治療的タンパク質は、重症複合型免疫不全症におけるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、慢性肉芽腫症におけるｐ９１−ＰＨＯＸ、血友病ＢにおけるＩＸ因子、血友病ＡにおけるＶＩＩＩ因子、嚢胞性線維症における嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、鎌状赤血球貧血におけるβ−グロビン（ＨＢＢ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるジストロフィン、レッシュ・ナイハン症候群におけるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、フェニルケトン尿症におけるフェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）、ゴーシェ病におけるグルコシルセラミダーゼ（ＧＢＡ及びＧＢＡ２）、マルファン症候群におけるフィブリリン−１（ＦＢＮ１）、及びハンチントン病におけるハンチンチン（ＨＴＴ）、並びにそれらの組合せなどの遺伝性障害における、通常は変異の結果としての機能障害があるタンパク質の生物学的活性型を含む。
【００４９】
本発明の方法はまた、１種又は複数の治療的遺伝子の送達による、多因子性の遺伝性障害の治療のために使用することができる。例えば、高コレステロール血症の治療のための治療的遺伝子は、アポリポタンパクＢ（ａｐｏＢ）、低密度リポタンパク受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、並びにそれらの組合せを含む。更にパーキンソン病の治療のための治療的遺伝子は、シヌクレインα（ＳＮＣＡ）、パーキン（ＰＲＫＮ）、ロイシン−リッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、パーキンソンタンパク質７（ＤＪ−１）、ＡＴＰａｓｅ型１３Ａ２（ＡＴＰ１３Ａ２）を含む。加えて癌の治療のための治療的遺伝子は、癌自殺遺伝子、抗血管新生因子、チロシナーゼ−関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含む癌自己抗原がある。
【００５０】
特に癌免疫療法における使用に関する、好適な治療的タンパク質は、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含む増殖因子、並びにインターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７を含むサイトカインなどの免疫刺激因子に加え、インターフェロンなどの免疫抑制タンパク質を更に含むことができる。
【００５１】
本複製−欠損ＲＮＡウイルスベクターに組込まれる異種核酸配列は、用途及びそれに該核酸配列が送達されるべき標的細胞に応じて、ヒト又は他の哺乳動物から誘導することができる。この核酸配列及びコードされたアミノ酸配列は、異種遺伝子産物が野生型遺伝子産物と同等の機能活性を示す限りは、必ずしも野生型配列を有してはいない。この核酸配列は、ヌクレオチドの変換、挿入又は欠失を持つことができる。異種遺伝子産物は、例えばタグ、好ましくはＶＰ６タグを追加的に含む、融合タンパク質として発現され得る。
【００５２】
異種核酸配列の高発現が望ましい場合、その配列は、ウイルスのマイナス鎖ＲＮＡゲノムの３’領域へ、好ましくはウイルスのＮ遺伝子の直前に挿入されることが好ましい。その理由は、パラミクソウイルスのようなマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、それらのマイナス鎖ゲノムの３’末端で転写ユニットを最も効率的に転写するからである。更に下流の遺伝子の転写レベルは、次第に減少し、この現象は、極性作用（ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔ）と称される。これは、異種導入遺伝子をウイルスゲノム内の異なる位置に挿入することにより、その発現レベルの調節を可能にする。こうして、細胞傷害能又は発癌能を伴う異種遺伝子産物（例えば、ｃ−Ｍｙｃ）をコードしている核酸配列は、ウイルスのマイナス鎖ゲノムの５’領域へ挿入することができる。好都合なことに、異種核酸配列は、転写カセットとして挿入することができる。いくつかの異種核酸配列は、独立した転写カセットとしてウイルスゲノムへ挿入することができる。転写カセットは、転写開始配列、転写ターミネーター、及び好ましくは翻訳シグナルに機能的に連結された、異種遺伝子産物をコードしている核酸配列を通常含む。
【００５３】
異種核酸配列をｍＲＮＡ安定化エレメントに機能的に連結することも可能である。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）は、そのｍＲＮＡを安定化し且つその発現を延長するために、その導入遺伝子の３’ＵＴＲ領域へと挿入することができる。
【００５４】
本発明に関連して、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、異種遺伝子産物をコードしている異種核酸配列を２つ以上持つことができる。あるいは、各々が異種遺伝子産物をコードしている異種核酸配列を少なくとも１つ持っている２種以上の複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを、同時に使用することができる。例えば複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、異なる再プログラミング因子をコードしている核酸配列をいくつか含むことができる。あるいは、異なる再プログラミング因子をコードしている異なる核酸配列を持っている複数の複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを、同時に使用することができる。
【００５５】
この複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、溶液、懸濁液、凍結乾燥品の形で、あるいは任意の別の形で提供することができる。これは、ｐＨ調節剤、緩衝液、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの毒性調節物質、湿潤剤、アジュバントなどとの組合せでも提供することができる。
【００５６】
好適なウイルスベクターは、意図された用途、患者の生理的状態、体重、年齢及び性別、投与の形態、並びに組成によって決まる。ベクター粒子の数は通常、その用途に応じ、１回投与量につき少なくとも１×１０４から１×１０８個まで、好ましくは５×１０５から１×１０７個まで変動する。別の言い方をすると、本発明の組換えウイルスベクターによる感染は、その用途に応じて、好ましくは感染多重度（ＭＯＩ）が０．０１〜５０で、より好ましくは０．５〜３０で実行されるであろう。
【００５７】
本発明の複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、その開示が引用により本明細書中に組込まれている、ＷＯ  ２００６／０８４７４６  Ａ１に説明されたように、ウイルス−産生細胞及びウイルス−増幅細胞により、調製することができる。
【００５８】
ウイルス−産生細胞は、ウイルス粒子の最初の産生のために使用される。ウイルス−産生細胞は、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。ウイルス−産生細胞は、好ましくは、本発明において使用される複製−欠損ＲＮＡウイルスベクターをコードしているＤＮＡ分子に加え、その遺伝子産物が本発明の組換えウイルス粒子の集成を可能にするヘルパー配列をトランスで含む。ヘルパー配列は、ウイルスのＮタンパク質、ウイルスのＰタンパク質、及び／又はウイルスのＬタンパク質を含み、好ましくはウイルスのＮタンパク質及びウイルスのＰタンパク質を含む。ヘルパー細胞は、１又は複数の追加のプラスミドベクターを含むことができ、これはウイルスのＮタンパク質、ウイルスのＰタンパク質、及び／又はウイルスのＬタンパク質をトランスで提供する。驚くべきことに、ウイルス粒子の産生は、ウイルスのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を同時発現することにより著しく増大され得ることわかったので、好ましくは、このヘルパー配列は、ウイルスのＰ遺伝子及び追加的にウイルスのＮ遺伝子を含む。あるいは、そのゲノムに組込まれたヘルパー配列を安定して発現しているヘルパー細胞を、使用することができる。
【００５９】
このヘルパー配列は、ウイルス−産生細胞において、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写を可能にする転写シグナルと機能的に連結されていることが好ましい。好ましくは、この転写シグナルは、所与のウイルス−産生細胞のための異種転写シグナル、例えばＴ７又はＳＰ６プロモーターなどのバクテリオファージプロモーターである。この場合、ウイルス−産生細胞は、ヘルパー配列の転写を媒介する、一致する（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）異種ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを含まなければならない。
【００６０】
本発明において使用される複製−欠損ＲＮＡウイルスをコードしているＤＮＡ分子は、好ましくは、ベクター増幅細胞（すなわち、大腸菌などの、原核生物ベクター増幅細胞）においてのみではなく、真核生物ヘルパー細胞、特に哺乳動物のウイルス−産生細胞においても増殖するのに適しているベクター（例えば、プラスミドベクター）である。ベクターは、複製起点、及び／又は選択マーカー配列などの、該細胞における増殖に必要な遺伝的エレメントを含む。
【００６１】
ウイルスゲノムをコードしているＤＮＡ分子は、通常、ヘルパー配列と結合して先に説明されたような転写シグナルと機能的に連結されている。一般に、このＤＮＡ分子は、転写ターミネーター及びリボザイム配列を、ウイルスゲノムをコードしているＤＮＡ配列の３’末端に、更に含む。このリボザイム配列は、ウイルス配列の３’末端での転写物の切断を可能にする。
【００６２】
ウイルス−増幅細胞は、ウイルス−産生細胞において最初に集成されたウイルス粒子を増幅するために使用される。ウイルス−産生細胞から得られた組換え複製−欠損ＲＮＡウイルスは、ウイルス−増幅細胞の感染に使用される。ウイルス−増幅細胞は、先に説明されたヘルパー配列を含み、この配列はウイルスのＮタンパク質、ウイルスのＰタンパク質、及び／又はウイルスのＬタンパク質を提供する。好ましくは、そのゲノム内に組込まれたヘルパー配列を安定して発現しているウイルス−増幅細胞が使用される。好ましくは、ウイルス−増幅細胞は、ウイルスのＮタンパク質及びＰタンパク質のみを発現するが、ウイルスのＬタンパク質は発現しないように、遺伝的に修飾されており、その理由は、驚くべきことにこの同時発現が、最高のウイルス産生速度に繋がることがわかったからである。
【００６３】
好ましくは、ウイルス−増幅細胞は、哺乳動物の細胞である。特に、ウイルス−増幅細胞は、ドイツ微生物・細胞バンク（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託番号ＤＳＭＡＣＣ２７０２で寄託されたＨ２９細胞であることができる。他の好適なウイルス−増幅細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞株）由来の細胞又はＬＬＣＭＫ２細胞（アカゲザル腎細胞株）由来の細胞であり、これらは、言及されたヘルパー配列（すなわち、ウイルスのＮ、Ｐ、及び／又はＬ遺伝子）により安定して又は一過性に形質移入される。
【００６４】
本発明の方法に従い、少なくとも１種の異種核酸配列を導入するために、様々な異なる細胞が、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにより感染され得る。複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにより感染され得る細胞の例は、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、粘膜組織細胞、肝細胞、肺線維芽細胞、及び上皮細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
感染される細胞は、任意の宿主生物から入手されるか又は誘導され得る。この細胞は、生検試料又は血液試料などの試料の形で各宿主生物から直接採取することができる。これはまた、宿主生物から入手され、引き続き培養されるか、増殖されるか、形質転換されるか、又は選択された処置に曝露されるかした細胞であることができる。一部の実施態様において、この細胞は、宿主生物に含まれてよい。例えば、これは、宿主生物の血液又は器官内に存在してよい。
【００６６】
それから細胞が誘導又は入手される宿主生物は、好ましくは哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。例示的哺乳動物は、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イヌ、ヤギ、ウマ、、ブタ、ゾウ、ニワトリ、マカク、及びチンパンジーからなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、少なくとも部分的に分化した細胞のより少なく分化した細胞への再プログラミング、又は所望の分化状態へプログラミングされるべき細胞のプログラミングのインビトロ法であって：
（ａ）ドナー由来の少なくとも部分的に分化した細胞又はプログラミングされるべき細胞を提供する工程、
（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも１種の異種核酸配列を、工程（ａ）において提供される細胞へ導入する工程、並びに
（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現するのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスの転写能を喪失することのないウイルスゲノムの複製能の喪失につながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、並びに該異種核酸配列は、細胞の再プログラミング因子又はプログラミング因子をコードしている。
【００６８】
本明細書において使用される用語「分化した」とは、万能性の幹細胞と比べ制限された潜在能を発揮する細胞を指すことが意図されている。用語「潜在能」とは、細胞の分化の可能性、すなわち異なる細胞形に分化する細胞の可能性を意味する。従って本発明の文脈において、分化した細胞は、万能幹細胞よりもより分化した全ての細胞を表し、且つ全てではないが複数の細胞系列に分化する能力を依然有する細胞を含む。分化した細胞は、特に、体細胞を含む。同様に本明細書において使用される用語「分化」とは、特定の形態又は機能への細胞の順応を指すことが意図される。分化は、より拘束された細胞、すなわち高分化型細胞のような、特定の機能に永久に拘束されていると考えられる細胞に繋がる。
【００６９】
更に本明細書において使用される用語「再プログラミング」又は「脱分化」とは、特定の細胞の分化状態のより少ない分化状態への変換を指す。用語「再プログラミング」及び「脱分化」は、本明細書において互換的に使用され、且つ形態又は機能の特化の喪失を指す。脱分化は、より少なく拘束された細胞に繋がる。従ってこれは特定の細胞の潜在能の程度の増加をいい、且つ高分化型細胞の、少能性細胞、好ましくは多能性細胞、又はより好ましくは万能性細胞への変換を含む。これはまた、少能性細胞又は多能性細胞などの、万能性細胞と比べ、制限された潜在能を発揮する細胞の分化状態の、より少ない分化状態への変換を含む。本発明の文脈において、再プログラミング又は脱分化は、万能幹細胞以外の細胞を、その最初の状態又はその分化経路における任意の中間の状態へと復帰することを意味する。
【００７０】
本発明の文脈内で、本明細書において使用される「少なくとも部分的に分化した細胞」とは、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞又は万能幹細胞を除く、多細胞生物の体を構築する細胞を指す。部分的に分化した細胞の例は、例えば、体性幹細胞、系列制限された（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）幹細胞、前駆体細胞、及び前駆細胞を含む。（より）分化した細胞の例は、高分化型体細胞などの体細胞を含む。好ましくは、少なくとも部分的に分化した細胞は、体性幹細胞、系列制限された幹細胞、前駆体細胞、前駆細胞、及び高分化型体細胞から選択された哺乳動物の細胞である。
【００７１】
本明細書において使用される用語「幹細胞」とは、無限に増殖することができ且つ自己再生し及び多様な特定された細胞型へと分化する能力を有する多細胞生物の細胞を指す。幹細胞は、胚性幹細胞（すなわち、胚盤胞の内部細胞塊に由来する万能幹細胞）及び「体性幹細胞」としても公知の成体幹細胞（すなわち、成体組織を補充する、体の修復系として作用する様々な組織において認められた多分化能性幹細胞）である。例は、間葉系幹細胞、造血幹細胞、及び神経幹細胞を含むが、これらに限定されるものではない。いわゆる癌幹細胞も含む。多くの癌型が、そのような癌幹細胞を含むことがわかっており、これは、それらの自己再生能に及び分化能より特徴付けられる。癌幹細胞は、それから生じるが、幹細胞において通常発現される自己再生に関連したプログラミングを発現する前駆体に類似している。
【００７２】
本発明の意味における「前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞」は、１又は複数の最終の形態へ分化するよう拘束される段階まで発達した幹細胞である。前駆体細胞は、例えば、新たな血液細胞、系列制限された幹細胞、又は体性幹細胞の特定の種類を形成するように拘束される。
【００７３】
本発明の意味における「前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞」は、単能性又は多能性細胞であり、これは特定の細胞型、例えば成熟した体細胞へ分化する能力を有し、且つ限定された自己再生能を有する。好適な前駆細胞の例は、神経系前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、又は造血前駆細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の意味における「体細胞」は、任意の少なくとも部分的に分化した細胞であり、且つ生殖細胞又は配偶子を含まない。本発明における使用のための体細胞は、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、心臓、眼又は神経の組織を含む任意の組織の細胞であることができる。好適な体細胞の例は、線維芽細胞、骨髄性細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、角化細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、膠細胞、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵ベータ細胞、メラニン形成細胞、造血細胞、筋細胞、マクロファージ、単球、及び単核細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
本発明の意味における「高分化型体細胞」は、分化経路の最終段階の細胞である。高分化型細胞は、より特定された形態又は機能へと進行性の発達的変化を受けている成熟細胞である。分化した細胞は、個別の特徴を有し、特異的機能を発揮し、且つそれらのより少なく分化された対応物よりも恐らくより少なく分化する。
【００７６】
本発明の方法に従い再プログラミングされている、少なくとも部分的に分化した細胞は、特定の生物に特に限定されず、且つ先に本明細書において言及した生物を含むが、これらに限定されるものではない。また細胞型は、特に制限されず、先に言及した細胞を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、再プログラミングされる細胞は、高分化型体細胞である。
【００７７】
本発明のインビトロ再プログラミング法により作出される本発明の意味における「より少なく分化した細胞」とは、少なくとも部分的に分化した当初の細胞と比べ、増加した程度の潜在能を有する細胞である。好ましくは、少なくとも部分的に分化した細胞のより少なく分化した細胞への再プログラミングのインビトロ法は、少なくとも部分的に分化した細胞が、少能性細胞、多能性細胞又は万能性細胞へと再プログラミングされることを特徴としている。
【００７８】
「万能性細胞」は、３つの胚葉である外胚葉、中胚葉及び内胚葉へと分化する可能性を有する細胞を意味する。「万能性」とは、オムニポテンシー（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）（生物の全ての細胞を生じる細胞の可能性）よりも低い潜在能の程度をいう。
【００７９】
「多能性細胞」は、複数のしかし限定された数の系列の細胞へと分化する可能性を有する細胞を意味する。これは、万能性よりも低い潜在能の程度をいう。多能性幹細胞は、それらの起源の組織及び器官に特異的な唯一の細胞型へと通常分化していく幹細胞である。多能性幹細胞は、胎児、新生児及び成人の期間の様々な組織及び器官の成長及び発達のみではなく、成体組織ホメオスタシスの維持及び組織損傷時の再生を誘導する機能にも関与している。組織−特異的多能性細胞は集合的に「成体幹細胞」と称される。
【００８０】
「少能性細胞」は、わずかな細胞型へと分化する可能性を有する細胞を意味する。「少能性」とは、多能性よりも低い潜在能の程度をいう。
【００８１】
好ましくは、本発明の再プログラミング法により作出されるより少なく分化した細胞は、「誘導万能幹（ｉＰＳ）細胞」である。本発明の文脈において、用語「誘導万能幹細胞」又は用語「ｉＰＳ細胞」とは、特異的幹細胞に関連した再プログラミング因子の異種発現により、少なくとも部分的に分化した細胞から、すなわち非万能細胞から、通常は体細胞から、人工的に誘導された万能幹細胞型を指すことが意図されている。ｉＰＳ細胞は、幹細胞関連した遺伝子発現パターン、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、潜在能及び分化可能性などの多くの観点で、胚性幹細胞などの天然の万能幹細胞に類似している。
【００８２】
本明細書において使用される用語「万能幹細胞」とは、３つの胚葉である外胚葉、中胚葉及び内胚葉へと分化する可能性を有する幹細胞をいう。「万能幹細胞」は、胚性幹（ＥＳ）細胞のような天然の万能幹細胞及び誘導万能幹（ｉＰＳ）細胞を含む。胚性幹細胞は、胚盤胞の内側に位置した内部細胞塊に由来し、且つ胎盤の細胞又は他の子宮の支持細胞以外の、任意の細胞型へ分化する能力を有し、従って新たな生存している生物は形成することができない。
【００８３】
多分化能は、各々の幹細胞又は幹細胞−様細胞を、引き続き細胞混合物から完全に統合された生物を形成する、胚の胚盤胞と一緒にした後、２種以上の生物に由来する細胞の配合物であるキメラを形成する細胞の能力により評価することができる。多分化能を評価する更なる方式は、マウスの皮膚の下側への各幹細胞の注入であり、そこでこれらは奇形腫を形成することができる。更なる評価方法は、更に分化することが不可能である４Ｎ胚へのそれらの注入による、対応する細胞の多分化能を測定する、四倍体補完のインビボ試験である。得られる正常な２Ｎ胚は、移入された万能細胞の発達を継続する。
【００８４】
細胞の分化状態はまた、細胞により示された表現型を基に、顕微鏡的に評価することもできる。顕微ラマン分光法又はＦＴ−ＩＲ分光法は、これに関して分化状態を評価するのに適した技術である。あるいは、細胞の分化状態は、細胞の分化状態のマーカー量を、通常は細胞タンパク質を測定することにより評価することができる。分化マーカーは、マイクロアレイハイブリダイゼーション又は抗体染色などの様々な技術を使用し、ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルにおいて検出することができる。一般に、細胞の分化状態を評価するために、いくつかのマーカーの組合せを選択することは利点がある。
【００８５】
細胞の分化状態のマーカータンパク質の例は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍ１７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄｌ、Ｎｍｙｃｌ、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ、Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆｌ、Ｔｃｆａｐ２ｃ及びＺｆｐ５５３、又はＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｅｒａｓ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｂａｆ２５０ａ、ＢＣ０３１４４１、Ｅｎｏ３、Ｅｔｖ５、Ｇｍ１７３９、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｈｅｓ６、Ｊｕｂ、Ｍｔｆ２、Ｍｙｏｄｌ、Ｎｍｙｃｌ、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒｇ２、Ｏｔｘ２、Ｒａｂ２ｂ、Ｒｂｐｓｕｈ、Ｒｅｓｔ、Ｓｔａｔ３、Ｕｔｆ１、Ｔｃｆａｐ２ｃ及びＺｆｐ５５３の一つのプロモーターのメチル化状態を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明により調製されたｉＰＳ細胞は、通常は、ＥＳ−様細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼを発現する。更に本発明のｉＰＳ細胞は、通常は内因性Ｏｃｔ−３／４又はＮａｎｏｇを、特にＯｃｔ−３／４とＮａｎｏｇの両方を発現する。更にこれらは好ましくは、ＴＥＲＴを発現し、且つテロメラーゼ活性を示す。
【００８７】
本発明において、異なる再プログラミング因子の組合せはまた、再プログラミングされるべき細胞の、細胞再プログラミングを誘導するように使用することができる。再プログラミング因子をコードしているいくつかの遺伝子は、同じ複製−欠損ＲＮＡウイルスベクターへ挿入されてよい。あるいは、異なる再プログラミング因子をコードしている異なる核酸配列は各々、個別の複製−欠損ウイルスベクターへ挿入されてよい。本発明において使用される複製−欠損ＲＮＡウイルスベクターはまた、関心対象の異種タンパク質をコードしている異種核酸配列の１又は複数を持っている異なる型の１種又は複数のベクターと組合せて使用することもできる。
【００８８】
本明細書において利用される複製−欠損ＲＮＡウイルスベクターから発現された再プログラミング因子は、細胞再プログラミングを促進する化合物と組合せて使用することができ、この化合物は、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＭＡＰキナーゼインヒビター、ＤＮＡメチラーゼインヒビター（例えば、５−アザシチジン）、並びにヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、及びバルプロ酸（ＶＰＡ））を含む。これらの化合物の添加はまた、細胞再プログラミングの誘導に必要な再プログラミング因子の数を限定することができる。更に、複製−欠損ＲＮＡウイルスを使用する再プログラミング因子の体細胞への送達は、追加の内因性再プログラミング因子の内因性の発現を誘導する体細胞の化学的処置と組合せることができる。
【００８９】
本発明のインビトロプログラミング法において、所望の分化状態へとプログラミングされるべき細胞は、本明細書において先に言及した細胞、すなわち、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、粘膜組織の細胞、肝細胞、肺線維芽細胞、及び上皮細胞を含むが、これらに限定されるものではない高分化型体細胞である。
【００９０】
本発明の文脈において、再プログラミングのインビトロ法によりにおいて得られた細胞、通常は幹細胞−様細胞は、関心対象の特定の分化した細胞を得るために使用することができる。本発明のインビトロプログラミング法により得られる細胞のように、そのような細胞は、同一個体由来の細胞を使用し、選択された細胞型の細胞を提供することができるという利点があり、例えば再生医療において使用することができる。例証的実施例のように、ヒト造血幹細胞は、骨髄移植手術を必要とする医療において使用することができる。そのような細胞はまた、１種又は複数の細胞株の形成において使用することもできる。
【００９１】
本発明により得られた細胞は、多くの生理学的状態及び疾患、例えば、多発性硬化症のような神経変性疾患、卵巣癌及び白血病のような後期癌、並びにＨＩＶ感染症（“ＡＩＤＳ”）などの免疫系を損傷する疾患の治療における使用に適していると予想される。治療することができる生理的状態の更なる例は、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾患、すなわち高コレステロール血症、心臓疾患、軟骨置換、熱傷、足部潰瘍、胃腸疾患、血管疾患、腎疾患、尿道疾患、並びに老化に伴う病気及び状態を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
別の好ましい実施態様において、細胞において異種核酸配列を発現する方法は、遺伝性障害を治療するインビボ法であり、この方法は、少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを患者へ投与し、該少なくとも１種の異種核酸配列を患者の細胞へ導入することを含み、ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス転写能を喪失することなくウイルスゲノム複製能を喪失することにつながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、且つここで該異種核酸配列は、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている。
【００９３】
更なる好ましい実施態様において、細胞において異種核酸配列を発現する方法は、遺伝性障害を治療するインビトロ法であり、この方法は：
（ａ）ドナーから細胞を提供する工程、
（ｂ）少なくとも１種の異種核酸配列を含む組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターで、細胞を感染することにより、該少なくとも１種の異種核酸配列を、工程（ａ）において提供された細胞へ導入する工程、並びに
（ｃ）感染された細胞を、該少なくとも１種の異種核酸配列を発現する及び／又は該細胞を増殖させるのに有効な条件下で培養する工程を含み、
ここで組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルス転写能を喪失することなくウイルスゲノム複製能を喪失することにつながる、変異されたＰタンパク質をコードしているウイルスゲノムを含み、且つここで該異種核酸配列は、該遺伝性障害を治療することが可能である治療的タンパク質をコードしている。
【００９４】
本発明のインビボ法及びインビトロ法により治療されるべき遺伝性障害は、重症複合型免疫不全症、慢性肉芽腫症、血友病Ａ／Ｂ、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、レッシュ・ナイハン症候群、フェニルケトン尿症、ゴーシェ病、マルファン症候群、ハンチントン病、高コレステロール血症、パーキンソン病、ディジョージ症候群、アルツハイマー病、及び癌からなる群から選択されることが好ましい。
【００９５】
遺伝子治療アプローチは、治療されるべき遺伝性障害及び感染されるべき細胞型に応じて、インビトロ又はインビボにおいて実行することができる。インビボにおける遺伝子治療アプローチに関して、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、例えば、エアロゾル、液剤、散剤などの形状で、経口的、局所的、経鼻的、経肺的など、通常の様式で投与することができる。インビボにおける遺伝子治療アプローチは、遺伝性障害が影響を及ぼす血液細胞を標的とすることができる。この場合、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、非経口的に投与され得る。肺細胞が標的とされる場合、複製−欠損マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを含有する医薬組成物は、経肺的に投与される。
【００９６】
別の態様において、本発明は、本発明のインビトロ法、特に細胞の再プログラミング又はプログラミングのインビトロ法、及び遺伝性障害を治療するインビトロ法により調製された細胞又は細胞集団に関する。
【００９７】
この細胞又は細胞集団は、様々な疾患を治療するための医薬品として使用することができる。前述のように、本発明の再プログラミングのインビトロ法により得られた再プログラミングされた細胞は、所望の細胞型へと分化させることができ、その後所与の疾患の治療において使用される。特に再プログラミングのインビトロ法により作出されたｉＰＳ細胞は、基礎研究に加え、再生医療において使用することができる。本発明により作出された患者−特異的ｉＰＳ細胞は、例えば、幹細胞療法における使用に適している。患者から収集された体細胞は、最初に本発明のインビトロ再プログラミング法を使用しより少ない分化状態へと再プログラミングされ、当業者に公知の手順（例えば、レチノイン酸、増殖因子、サイトカイン、及びホルモンによる処理）に従い所望の体細胞型へと分化され、その後該患者へと投与される。
【００９８】
別の態様において、本発明は、本発明のインビトロ再プログラミング法により調製された、本発明の細胞又は細胞集団、若しくは該細胞又は細胞集団から誘導された再分化した細胞又は再分化した細胞集団を含有する医薬組成物に関する。脱分化した細胞を分化する手段は、当該技術分野において公知であり、且つ本明細書においても先に記されている。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、液剤、懸濁剤の形状、又は意図された用途に適した任意の他の形状であることができる。通常は、本組成物は更に、医薬として許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含有する。ｐＨ値調節剤、緩衝液、張度調節剤なども、含有することができる。本組成物は、通常の経路により投与することができる。該ウイルスの治療的有効量が、患者へ投与され、これは特定の用途（例えば、再生医療又は遺伝子治療）、疾患の種類、患者の体重、年齢、性別及び健康状態、投与及び製剤の様式などによって決まる。投与は、必要に応じ、単回又は反復投与であることができる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、臨床医薬品及び／又は獣医学用医薬品における用途に適している。これは、再生医療に加え遺伝子治療において使用することができる。特に、本発明の医薬組成物は、抗腫瘍療法において使用することができる。
【０１０１】
ここで、本発明は、下記実施例により更に例示されるであろう。
【実施例】
【０１０２】
実施例
以下は、本発明の方法の使用は、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用し、安全且つ信頼できる様式で、効率的且つ長期の導入遺伝子発現を可能にすることを示している。本発明に関連したこれらの予想外の利点の多い特徴は、医学的状態の治療において有用であるとはこれまで考えられなかったこれらのウイルスベクター型の新たな適用分野を開拓した。
【０１０３】
実施例１  長期の導入遺伝子発現
Ｖｅｒｏ細胞を、Ｎ−末端アミノ酸２から７７を欠いている切断型Ｐタンパク質に加え遺伝子発現の全体のマーカーとしてのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている変異されたＰ遺伝子を含むウイルスゲノムを有する組換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）（ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／ＧＦＰ）により、感染多重度（ＭＯＩ）１で、感染した。蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡の写真を、１、６、１２及び３０日目に、倍率１００×で撮影した（露光（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）時間２秒）。
【０１０４】
図１に示されたように、検出可能なＧＦＰレベルは、３０日以下の期間にわたり、徐々に低下するのみであり、３０日目以降も依然かなり高かった。従って本発明において使用される組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、予想外に長期間にわたる導入遺伝子の発現を可能にしている。このことは、エクスビボ及びインビボ遺伝子治療的アプローチ、再生治療における使用に適したより少ない分化細胞状態への細胞の再プログラミング、並びに様々な疾患の治療における使用のための細胞の特異的に分化した細胞状態への細胞のプログラミングなどの用途の様々な新規分野を提供する。
【０１０５】
実施例２  異種ｍＲＮＡ発現のリアルタイムモニタリング
導入遺伝子としてそのウイルスゲノムに含まれた転写因子「Ｏｃｔ４」を有する組換え複製−欠損センダイウイルス（ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／Ｏｃｔ４）又は導入遺伝子としてそのウイルスゲノムに含まれた転写因子「Ｎａｎｏｇ」を有する組換え複製−欠損センダイウイルス（ＳｅＶ−ＰΔ２−７７／Ｎａｎｏｇ）を使用し、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＭＯＩ  ３又は２０で感染した。２、５、８、及び１２日目に、総細胞ＲＮＡを、トリアゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い抽出し、且つリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。このｃＤＮＡ合成工程は、ｍＲＮＡのみの増幅を可能にするオリゴ−（ｄＴ）１２−１８プライマー（酵素「ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ」；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。
【０１０６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、当業者に公知の手順に従い行った。簡単に述べると、ｑＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ社、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）を使用した。ｃＤＮＡの出発量は、各試料の閾値サイクル（ＣＴ）値を、各標準曲線のＣＴ値と比較することにより、算出した。この計算に関して、ソフトウェア「Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ」（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を使用した。規準化のために、標的遺伝子の発現レベルを、βアクチン転写物レベルと比較した。形質導入されなかったＨＦＦ細胞を、陰性対照として利用した。
【０１０７】
リアルタイムＰＣＲ条件は、以下であった：初期変性９５℃で１０分間、変性（９５℃、１５秒間）の４０サイクル、アニーリング（各アニーリング温度については下記表参照、６０秒間）、プライマー伸長相（７２℃、６０秒）。正確な産物の長さの存在は、ゲル電気泳動により管理した。下記プライマー対を使用した：
【表１】
2018023388.tif 000003
【０１０８】
形質導入されないＨＦＦ細胞を陰性対照として利用し、ｍＲＮＡ発現の最低レベルを規定した（ここでは「０．０００」として規定）。陽性対照として、ＧＦＰ導入遺伝子を持ち且つＯｃｔ４導入遺伝子及びＮａｎｏｇ導入遺伝子を、各々、発現しているレンチウイルスベクターを使用した。その発現レベルは、並行して決定したβアクチンの発現レベルに対して表わす。結果は、図２及び図３に示している。
【０１０９】
図２において認めることができるように、ＭＯＩ  ３による形質導入（図２における最初の４つの時点）に加え、ＭＯＩ  ２０による形質導入（図２において「ＭＯＩ２０」と示されている）は、５日後に依然非常に高いＯｃｔ４のｍＲＮＡ発現レベルを生じた（ＭＯＩ  ３についておよそ約３０％及びＭＯＩ  ２０について９９％を超える）。同様に、図３に示されるように、Ｎａｎｏｇの発現レベルは、５日後依然非常に高い（ＭＯＩ  ３についておよそ約７５％及びＭＯＩ  ２０について本質的に１００％）。８日後であっても、有意なＯｃｔ４及びＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現が認められた。
【０１１０】
アミノ酸２から７７のＰタンパク質に欠失を持つ複製−欠損センダイベクターから、観察されたＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの長期発現が、驚くべきことに認められた。これまで、センダイウイルスのヌクレオカプシドの半減期は、およそ約２４時間と報告されている（Ｍｏｔｔｅｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７６：１−７（１９９０）参照）。この値を基に、センダイウイルスなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、多くの用途に適していないことが、当該技術分野における一般的な確信であった。
【０１１１】
しかし当該技術分野における一般的な確信とは対照的に、組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、導入遺伝子の長期発現を可能にすることが予想外に認められた。更にこの組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスはまた、感染時に、野生型ウイルスと比べ約５００〜約１０００分の１の鋳型が存在するという事実を考慮すると、驚くほど高い発現レベルを達成することが認められた。
【０１１２】
実施例３  センダイＰ遺伝子からのＣタンパク質の排除
ウイルスベクターＳｅＶ−ＰΔ２−７７を使用し、長期遺伝子発現を更に増強する試みにおいて、Ｐ遺伝子内の遺伝子修飾を研究した。より詳細には、センダイＰ遺伝子は、Ｐタンパク質のみではなく、「Ｃタンパク質」として公知のいくつかの他の非構造タンパク質をコードしている。これらのタンパク質は、代替リーディングフレーム（Ｐタンパク質に対し−１位置）から翻訳されるか、又は翻訳の代替開始コドン（ＡＣＧの代わりにＡＵＧ（ＡＴＧ））の使用から生じる。この代替開始コドンの使用は、Ｐタンパク質の低下した遺伝子発現率（野生型と比べ約１０〜２０％の減少）をもたらすと考えられる。文献において、Ｃタンパク質は、宿主ウイルス相互作用における調節因子として、主にインターフェロン反応アンタゴニストとして作用すると説明される。
【０１１３】
本明細書に記載した実験において、ＳｅＶ−ＰΔ２−７７のウイルスベクターゲノム中のＣ’タンパク質の開始コドンは、位置指定変異誘発により排除される。より詳細には、開始コドン「ＡＣＧ」は、ナンセンスコドン「ＵＣＵ」又は類似のナンセンスコドンに変更される。インターフェロン反応のより早期の発生のために、ウイルスベクターはここで細胞からより速く排除されると当業者が予想したにも拘わらず、驚くべきことに、細胞内部でのベクターの生存時間は短縮されるが、導入遺伝子発現は増大される（２０〜４０％）ことがわかった。
【０１１４】
実施例４  複製−欠損センダイウイルスベクターの最適作製システムの評価
Ｐ遺伝子内のアミノ酸２−７７に欠失を持っている複製−欠損センダイベクターに関する最適作製システムを評価するために、比較試験を実行した。より詳細には、３種の異なる設定を比較した：
（１）追加の導入遺伝子としてＰ遺伝子のみを伴う産生細胞株。他のウイルス成分（タンパク質）は全て該ベクターのゲノム内のそれらの野生型起源において依然コードされているので、これは、高レベル量のベクターを作製するのに十分なはずである。
（２）センダイウイルスＰ遺伝子及びＮ遺伝子の安定した組込みを伴う産生細胞株。この組合せは、該ベクターの作製時に、これらのウイルスタンパク質の不均衡を生じると予想された。通常Ｎタンパク質及びＰタンパク質は、宿主細胞において、おおまかに同等なレベルで生成される（Ｈｏｍａｎｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７７：１３１−１４０（１９９０）、及びＴｏｋｕｓｕｍｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８６：３３−３８（２００２）参照）。この比は、最適なウイルス成長に関して重要であると見なされる。しかしこの設定において、非常に過剰なウイルスのＮタンパク質を生成することが予想され、Ｎタンパク質は、ＲＮＡ分子に結合するその固有の活性のために、細胞傷害性であることがわかっているので、これはより低い作製効率を生じるはずである。
（３）センダイウイルスＰ遺伝子及びＮ遺伝子及びＬ遺伝子の安定した組込みを伴う産生細胞株。この組合せは、ヌクレオカプシドの全てのウイルスのタンパク質成分を反映している。従ってこれは、ウイルス作製に対し支援的影響を有するであろう。しかし設定（２）について既に言及したように、同じく、ウイルス成分Ｎ及びＬの不均衡を生じることがあり、これらは既に、ウイルスのゲノム中にコードされており、従って作製時にこのウイルスゲノムから発現される。
【０１１５】
驚くべきことに、設定（２）が、本ウイルスベクター作製の最良の組合せとして確定された。設定（３）が、作製され得るベクターの量に関して、同等に良好であったとしても、設定（２）では、設定（３）における３種の遺伝子ではなくむしろ２種の遺伝子のみが細胞へ導入されるという利点を提供する。
【図１】
2018023388.tif 000004
【図２】
2018023388.tif 000005
【図３】
2018023388.tif 000006
【配列表】
2018023388000001.app
【外国語明細書】
2018023388000001.pdf