(57)【要約】【課題】ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する微生物を用いた５‐ヒドロキシエクオールの製造方法の提供。【解決手段】下記工程（ａ）を含む５‐ヒドロキシエクオールの製造方法。工程（ａ）：ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物に、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）を含む５‐ヒドロキシエクオールの製造方法。
工程（ａ）：ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物に、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程。
【請求項２】
前記アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
水素を含む１種類以上の気体を含む気相下で前記工程（ａ）が行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記気相における前記水素の割合が０．１％以上１００％以下である、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた５‐ヒドロキシエクオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類はポリフェノールの１種であり、イソフラボンを基本骨格とするフラボノイドである。近年の調査により、イソフラボン類は女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。
【０００３】
また、大豆に含まれるイソフラボン類には、主に糖と共有結合した配糖体も含まれ、そのため、大豆はイソフラボンアグリコンを極少量含む。配糖体形のイソフラボン類として、例えば、ダイジン（daidzin）、グリシチン（glycitin）、ゲニスチン（genistin）が挙げられる。
これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素（β‐グルコシダーゼ等）の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（ｇlycitein）、ゲニステイン（genistein）となる。
これらのうちダイゼインは腸内細菌の働きにより、ジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経てエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている。同様に、ゲニステインも一部の腸内細菌の働きによりジヒドロゲニステイン（dihydrogenistein）、５‐ヒドロキシエクオール（5-hydroxyequol）へと変換されることが知られている（非特許文献７）。
【０００４】
エクオールは、これらの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献８及び９）が、５‐ヒドロキシエクオールも同様にエストロゲン様活性を有し、また、３‐β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害活性を有することが報告されており（特許文献１）、アルドステロン及び糖質コルチコイドの生合成を阻害することにより、これらのホルモンの過剰症に対する予防もしくは治療への利用が期待されている。
【０００５】
しかしながら、イソフラボンの代謝には個人差があり、上記のようにダイゼインを発酵させてエクオールを産生する能力を有する腸内細菌を保有する人は少なく、その保有率は日本人で約５割、欧米人で約３割程度であることが明らかとなっている（非特許文献１０及び１１）。また、５‐ヒドロキシエクオールはエクオール産生菌が有する酵素により産生されると考えられているが、全てのエクオール産生菌がゲニステインを代謝し、５‐ヒドロキシエクオールを産生できるわけではないことが知られている（非特許文献１２）。従って、５‐ヒドロキシエクオールを産生する腸内細菌を保有しない人は、大豆等のゲニステインを含有する食品を摂取しても５‐ヒドロキシエクオールを体内で産生することができない。
【０００６】
これらの課題を解決するために、近年、エクオールを乳酸菌や腸内細菌等の嫌気性微生物を用いて産生する試みがなされているが（特許文献２〜５）、５‐ヒドロキシエクオールについてはそのような取り組みは報告されていない。
【０００７】
これまでにエクオール産生菌であるスラッキア（Slackia）属、コリオバクテリウム（Coriobacterium）属の２属の嫌気性微生物がゲニステインから５‐ヒドロキシエクオール
を産生できることが明らかとなっている（非特許文献７、１３〜１４）。しかしながら、たとえば、エクオール産生菌であるエガセラ（Eggerthella）属によるゲニステインの代謝および５‐ヒドロキシエクオール産生は報告されておらず（非特許文献１２）、５‐ヒドロキシエクオールの産生においては、産生菌選択の幅が非常に狭い状態であった。
【０００８】
また、これまでの報告はエクオールの産生経路に焦点を当てたものであり、どのような発酵条件・発酵方法により、より効果的・実用的に５‐ヒドロキシエクオールが製造できるかについては明らかとなっていなかった。たとえば、非特許文献７では初発ゲニステイン濃度が100μM程度であり、また基質として高価な純品のゲニステインを使用している為、実用的生産（工業化）を目指したものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−８１８７５号公報
【特許文献２】特開２００６−２０４２９６号公報
【特許文献３】特表２００６−５０４４０９号公報
【特許文献４】特開２００８−６１５８４号公報
【特許文献５】特開２０１０−１０４２４１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Adlercreutz, H., The Lancet Oncol., 3, 364-373 (2002)
【非特許文献２】Duncan, A. M. et al., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 17, 253-271 (2003)
【非特許文献３】Wu, A. H. et al., Carcinogenesis, 23, 1491-1496 (2002)
【非特許文献４】Yamamoto, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 95,906-913 (2003)
【非特許文献５】Onozawa, M. et al., Jpn. J. Cancer Res., 90, 393-398 (1999)
【非特許文献６】Ridges, L. et al., Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10, 204-211 (2001)
【非特許文献７】Matthies, A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74(15), 4847-52(2008)
【非特許文献８】Schmitt, E. et al., Toxicol. In Vitro, 15, 433-439 (2001)
【非特許文献９】Sathyamoorthy, N. and Wang, T. T., Eur. J. Cancer, 33, 2384-2389 (1997)
【非特許文献１０】Arai, Y. et al., J. Epidemiol., 10, 127-135 (2000)
【非特許文献１１】Setchell, K. D. et al., J. Nutr., 133, 1027-1035 (2003)
【非特許文献１２】Kawada,Y.  et al. Biosci. Microbiota Food Health, 35, 113-121 (2016)
【非特許文献１３】Matthies, A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 75(6), 1740-4(2009)
【非特許文献１４】Schroder ,C. et al., Appl. Environ. Microbiol., 79(11), 3494-502(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する微生物を用いた５‐ヒドロキシエクオールの製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った結果、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する微生物を見出して、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。
【００１３】
〔１〕
下記工程（ａ）を含む５‐ヒドロキシエクオールの製造方法。
工程（ａ）：ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物に、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程。
〔２〕
前記アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕
前記アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物が、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785である、〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕
前記アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕
前記アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物が、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450である、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕
水素を含む１種類以上の気体を含む気相下で前記工程（ａ）が行われる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕
前記気相における前記水素の割合が０．１％以上１００％以下である、〔６〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する微生物を用いた、５‐ヒドロキシエクオールの効率的な製造方法が提供できる。該微生物は、具体的には、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物である。
本発明により得られる５‐ヒドロキシエクオールを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、５‐ヒドロキシエクオールによる公知の効果を簡便に得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明である５‐ヒドロキシエクオールの製造方法は、下記工程（ａ）を含むが、その他の工程を含んでもよい。
【００１６】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、ゲニステインを含有する溶液において、該ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属
する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物に、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生させる工程である。
【００１７】
（アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物）
本発明におけるアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物は、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する。中でも、その能力が高いことから、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）に属する微生物が好ましく、中でも、DSM 18785株がより好ましい。当該微生物は、１種でも２種以上を用いてもよい。
【００１８】
（アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物）
本発明におけるアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物は、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有する。中でも、その能力が高いことから、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）に属する微生物が好ましく、中でも、DSM 19450株が好ましい。当該微生物は、１種でも２種以上を用いてもよい。
【００１９】
本明細書において、DSMとの文言から始まる菌株の受託番号は、DSMZ (DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) に保存されている微生物に付与された番号である。
【００２０】
DSM 18785株、DSM 19450株は、いずれも各菌株と同一の菌株に制限されず、ぞれぞれと実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、上記菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９７．５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％の相同性を有する微生物である。さらに、いずれも各菌株又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
【００２１】
（ゲニステインを含有する溶液）
本発明におけるゲニステインを含有する溶液とは、該溶液において、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物に、該ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による５‐ヒドロキシエクオールの産生」欄に記載した培地である。
【００２２】
該溶液へゲニステインを添加する場合には、５‐ヒドロキシエクオールの産生前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。
溶液中のゲニステインの含有量は、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
【００２３】
（培地、及び培養による５‐ヒドロキシエクオールの産生）
工程（ａ）では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、たとえば、Thermo scientific社製 Anaerobe Basal Broth (ABB)培地、日水製薬社製のGAM培地、変法GAM培地などを使用することができる。
【００２４】
また、本発明で用いられる培地には、たとえば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、以下の化合物を挙げることができる。
ソルボース
フラクトース
メタノール
吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸など有機酸類
【００２５】
培地に加える炭素源としての有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、0.1〜10 wt/vol%の範囲から添加量を選択することによって、過不足を避けることができる。
【００２６】
上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源が加えることができる。本発明において、窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、たとえば、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源は、たとえば、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源は酵母エキス、ペプトン類である。
【００２７】
さらに、炭素源や窒素源に加えて、嫌気性微生物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。たとえば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
無機化合物                      ビタミン類
リン酸二水素カリウム            ビオチン
硫酸マグネシウム                葉酸
硫酸マンガン                    ピリドキシン
塩化ナトリウム                  チアミン
塩化コバルト                    リボフラビン
塩化カルシウム                  ニコチン酸
硫酸亜鉛                        パントテン酸
硫酸銅                          ビタミンB12
明ばん                          チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ              ｐ‐アミノ安息香酸
塩化カリウム
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
【００２８】
培養中の気相、水相としては、空気又は酸素を含まないことが好ましく、例えば、窒素及び／又は水素を任意の比率で含むことや、窒素及び／又は二酸化炭素を任意の比率で含むことが挙げられ、水素を含む気相や水相であることが好ましい。気相における水素の割合は、５‐ヒドロキシエクオールの産生が促進されることから、通常０．１％以上、好ましくは１．０％以上、より好ましくは２．０％以上であり、一方、通常１００％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
培養中の気相や水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、例えば、培養前に上記ガスで気相を置換する、培養中も培養器の底部から供給する、培養器の気相部に供給する、培養前に上記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。前記水素は、水素ガスをそのまま用いてもよいが、培地にギ酸など水素の前駆体を添加し、微生物の作用により培養中に水素を生成してもよい。
【００２９】
通気量としては、０．００５〜２ｖｖｍが挙げられ、０．０５〜０．５ｖｖｍが好ましい。また、混合ガスはナノバブルとして供給することもできる。
培養温度は、２０℃〜４５℃、より好ましくは２５℃〜４０℃、さらに好ましくは３０℃〜３７℃が好ましい。
培養器の加圧条件は、生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、０．００１〜１ＭＰａの範囲、好ましくは０．０１〜０．５ＭＰａを挙げることができる。
培養時間としては、通常８〜３４０時間、好ましくは１２〜１７０時間、より好ましくは１６〜１２０時間を挙げることが出来る。
【００３０】
本発明におけるアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム（continuous fermentation system）が好適である。
【００３１】
上記微生物の培養においては、培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。そのための培養器は、通常の嫌気的培養に用いられる培養槽がそのまま利用できる。上記微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは基質ガスなどで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。
たとえば、嫌気培養ジャー（anaerobic jar）を、上記微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。
【００３２】
（その他の工程）
本発明は、以下の工程を含んでもよい。
本発明は、例えば、得られた５‐ヒドロキシエクオールを定量する工程を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。例えば、培養液の一部を採取して適宜希釈し、よく撹拌した後、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー定量することなどが挙げられる。
【００３３】
また、本発明は、上記工程で得られた５‐ヒドロキシエクオールを精製する工程や、濃縮する工程を含んでもよい。精製工程における精製処理としては、熱等による微生物の殺菌；精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
さらに、５‐ヒドロキシエクオールを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
【００３４】
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３６】
各実施例においては、以下の方法により、ゲニステイン、ジヒドロゲニステイン、５‐
ヒドロキシエクオールの定量を行った。
【００３７】
（ゲニステイン、ジヒドロゲニステイン、５‐ヒドロキシエクオールの定量）
培養液20μLを50倍希釈し、よく攪拌した後、孔径0.45 μmの精密濾過膜（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜）でろ過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。
【００３８】
（高速液体クロマトグラフィー条件）
カラム：Synergi 4μm polar-RP (Phenomenex、φ4.6×150 mm)
移動相：水/メタノール［55：45, v/v］
流速：1.0 mL/min
カラム温度：40 ℃
検出：UV280 nm
保持時間：ゲニステイン: 17.2分、ジヒドロゲニステイン: 13.0分、５‐ヒドロキシエクオール: 7.2分
【００３９】
（前培養および本培養培地の調製）
前培養培地としてABB培地を使用した。また、ABB培地に6.0 g/Lとなるようにイソフラボンアグリコン（ダイゼインおよびゲニステインの混合物）を添加した本培養培地を調製した。18 mm試験管に前培養培地を10 mL、本培養培地を5 mL分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして窒素ガスでガス置換した後に、121 ℃、15分間滅菌した。
【００４０】
（実施例１）
前培養培地にアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を置換した後、37℃、200 spmで24時間振とう培養を行った。
【００４１】
その後、前培養液から本培養培地に植菌し、37℃、250 rpmで振とう培養を行い、46時間後にサンプリング、HPLCによる分析を行った。その結果、表１に示される通り、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株が0.09 g/Lの５‐ヒドロキシエクオール（5HEQ）を産生することを確認した。また、原料であるゲニステイン（GEN）が0.63 g/L残存し、５‐ヒドロキシエクオールの前駆体であるジヒドロゲニステイン（DHG）は1.94 g/L蓄積していた。
【００４２】
（実施例２）
アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株を用いたこと以外は実施例１と同様にした。その結果、表１に示される通り、最大0.13 g/Lの５‐ヒドロキシエクオール（5HEQ）が産生されることを確認した。また、原料であるゲニステイン（GEN）が0.62 g/L残存し、ジヒドロゲニステイン（DHG）が1.93 g/L蓄積していた。
【００４３】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、ゲニステインから５‐ヒドロキシエクオールを産生する能力を有するアサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物及び／又はアドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物を用いることによって、効率的に５‐ヒドロキシエクオールを製造することができる。
本発明により得られる５‐ヒドロキシエクオールを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、５‐ヒドロキシエクオールによる公知の効果を簡便に得ることができる。