(57)【要約】【課題】哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞の機能を調節するための複数の生物活性分子を細胞内に送達することが可能な機能化された生体適合性ナノ粒子を提供すること。【解決手段】前記機能化された生体適合性ナノ粒子は：５〜５０ｎｍのサイズにわたり、その上にポリマーコーティングを有する中心ナノ粒子と、前記ポリマーコーティングと共有結合する複数の官能基とを含み、ここで、前記複数の生物活性分子が、前記複数の官能基と結合され、前記複数の生物活性分子が、少なくともペプチドおよびタンパク質を含み、前記ペプチドが、哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞内に進入することが可能であり、そして前記タンパク質が、細胞内において新しい機能性を提供することが可能である。前記タンパク質は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４からなる群から選択される転写因子であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／５５０，２１３号に対して優先権の利益を請求し、その内容は、全ての目的について全体が参照によって本開示に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、有機合成およびナノバイオテクノロジー関し、より具体的には、細胞機能を調節する生物活性分子の細胞内への送達のための機能性ナノ粒子およびそれに関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
正常に増殖、遊走および様々な細胞型へ分化する細胞の能力は、胚形成および成熟細胞の機能において重要であり、成熟細胞としては、様々な遺伝性疾患または後天性疾患における造血系および／または循環器系の細胞が挙げられるが、限定されない。幹細胞および／またはさらに分化した特殊化された細胞型の機能的な能力は、様々な病的状態において変化するが、生物活性成分の細胞内への導入の際、正常化され得る。例えば、骨髄幹細胞／前駆細胞の損なわれた生存および／または好中球への分化のような異常な細胞の機能が、周期性または重篤な先天性好中球減少症の患者において観察され、これらの患者は、重篤な命を脅かす感染症に苦しみ、徐々に進行し、急性骨髄性白血病またはその他の悪性腫瘍を発症し得る（Ａｐｒｉｋｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｌｏｏｄ，  ９７，  １４７（２００１）；Ｇｏｒａｎ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｏｓｔｍａｎｎ  Ｓｙｄｎｒｏｍｅ：  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２，  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ，  ａｎｄ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０３，  ３３５５（２００４））。重篤な先天性好中球減少症またはバース症候群（Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のような遺伝性疾患または後天性疾患は、様々な遺伝子の変異によって引き起こされ、患者の血液細胞および／または心臓細胞の不十分な産生および機能（その後の好中球減少症、心筋症および／または心不全を導く）が原因である（Ｍａｋａｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ８８：１９５−２０９（２０１２））。重篤な先天性好中球減少症の表現型は、好中球エラスターゼ遺伝子、ＨＡＸ１遺伝子またはウィスコット−アルドリッチ症候群タンパク質（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子における異なる置換、欠失、挿入または切断による変異によって引き起こされる（Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｌｏｏｄ．  ９６：２３１７−２３２２  （２０００）；  Ｄｅｖｒｉｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＷＡＳＰ  ｃａｕｓｅｓ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７：３１３−７  （２００１）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＨＡＸ１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａ��ｓｅｓ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  （Ｋｏｓｔｍａｎｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３９：８６−９２  （２００７））。
【０００４】
ミトコンドリアＴＡＺ遺伝子における機能喪失型変異によっておそらく誘発される多系統の幹細胞の疾患であるバース症候群のようなその他の遺伝性疾患は、好中球減少症（血中好中球の低下したレベル）に関連しており、この好中球減少症は、重篤かつ時々命を脅かす致命的な感染症および／または心臓移植によって解決され得る心不全へ導き得る心筋症の再発を引き起こし得る。ほとんどの場合において、遺伝性または後天性のヒトの疾患の病変形成および発症に結び付けられる変異遺伝子産物は、別個の細胞内の事象に影響し、異常な細胞の機能および特異的な疾患表現型へと導く。
【０００５】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）でのこれらの患者の治療は、細胞表面に位置するＧ−ＣＳＦ受容体分子の立体構造の変化を引き起こし、その後、最終的に正常レベル付近まで好中球の産生を回復し、患者の生活の質を向上させる細胞内の事象の連鎖を引き起こす（Ｗｅｌｔｅ  ａｎｄ  Ｄａｌｅ．  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ７２，  １５８  （１９９６））。それにもかかわらず、Ｇ−ＣＳＦで治療した患者は、白血病発症に進展することがあり（Ａｐｒｉｋｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ｔｏ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３１，  ３７２  （２００３）；  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １４０，  ２１０  （２００８）；  Ｐｅｔｅｒ
Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｈａｒｅｄ  ＥＬＡＮＥ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｎａｌ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｇｎｅｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  ５５，  ３１４  （２０１０））、これが新規の代替アプローチが検討されている理由である。
【０００６】
細胞内の事象は、様々な生物活性分子の細胞内輸送の際、明確に機能化されたナノ粒子を使用して、より効果的に影響され、制御され得る。これらの生物活性分子は、細胞の機能を正常化するか、必要な場合、望ましくない細胞を除去し得る。しかしながら、細胞膜は、外因性刺激による影響から、細胞内の事象のカスケードを保護する活性バリアとして機能する。
【０００７】
したがって、当該分野において、細胞膜を透過し、目的の細胞内の事象に影響することが可能である新しいタイプの生物活性分子が必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たし、さらなる関連した利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｐｒｉｋｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｌｏｏｄ，  ９７，  １４７（２００１）
【非特許文献２】Ｇｏｒａｎ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｏｓｔｍａｎｎ  Ｓｙｄｎｒｏｍｅ：  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２，  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ，  ａｎｄ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０３，  ３３５５（２００４）
【非特許文献３】Ｍａｋａｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｂａｒｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ８８：１９５−２０９（２０１２）
【非特許文献４】Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｌｏｏｄ．  ９６：２３１７−２３２２  （２０００）
【非特許文献５】Ｄｅｖｒｉｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＷＡＳＰ  ｃａｕｓｅｓ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ２７：３１３−７  （２００１）
【非特許文献６】Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＨＡＸ１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  （Ｋｏｓｔｍａｎｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３９：８６−９２  （２００７）
【非特許文献７】Ｗｅｌｔｅ  ａｎｄ  Ｄａｌｅ．  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ａｎｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ７２，  １５８  （１９９６）
【非特許文献８】Ａｐｒｉｋｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ｔｏ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３１，  ３７２  （２００３）
【非特許文献９】Ｐｈｉｌｉｐ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １４０，  ２１０  （２００８）
【非特許文献１０】Ｐｅｔｅｒ  Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｈａｒｅｄ  ＥＬＡＮＥ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｎａｌ  Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｇｎｅｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  ５５，  ３１４  （２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の概要
いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質および／またはペプチドを、細胞機能を調節するために、生体適合性ナノ粒子と結合させる機能化方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、機能化された生体適合性ナノ粒子それ自体に関する。
【００１０】
一実施形態において、哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞機能を調節するための複数の生物活性分子を細胞内に送達することが可能な機能化された生体適合性ナノ粒子は：５〜５０ｎｍのサイズにわたり、その上にポリマーコーティングを有する中心ナノ粒子と、前記ポリマーコーティングと共有結合する複数の官能基とを包含し、ここで、前記複数の生物活性分子が、前記複数の官能基と結合され、前記複数の生物活性分子が、少なくともペプチドおよびタンパク質を含み、前記ペプチドが、哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞内に進入することが可能であり、そして前記タンパク質が、細胞内において新しい機能性を提供することが可能である。
【００１１】
前記中心ナノ粒子は、鉄を含み、磁性であってもよい。本発明の前記ペプチドは、前記タンパク質と結合してもよい（前記ナノ粒子との結合とは反対に）。前記ペプチドおよびタンパク質は、１種または複数の挿入リンカー分子（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）によって、それぞれ前記ナノ粒子に結合してもよい。前記ペプチドは、いくつかの実施形態において、５〜９個の塩基性アミノ酸を含んでもよく、他方で、その他の実施形態において、前記ペプチドは９個またはそれより多くの塩基性アミノ酸を含む。前記タンパク質は、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４からなる群から選択される転写因子のような転写因子であってもよい。
【００１２】
別の態様において、本発明は、哺乳類の細胞内の細胞機能性を変化させる方法に関する。この新規の方法は、有効量の機能化された生体適合性ナノ粒子を細胞に投与し、細胞内の細胞機能性を変化させることを含む。細胞機能性の変化は、細胞の物理化学的な性質における変化、細胞の増殖性の性質における変化、細胞の生存能力における変化、または細胞の形態学的表現型の性質における変化を含み得る。細胞機能性の変化は、幹細胞またはさらに特殊化された細胞型を含む新規の細胞型を産生する細胞の後天性の能力を含み得る。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞機能を調節するための複数の生物活性分子を細胞内に送達することが可能な機能化された生体適合性ナノ粒子であって、該ナノ粒子は：
５〜５０ｎｍのサイズにわたり、その上にポリマーコーティングを有する中心ナノ粒子と、
該ポリマーコーティングと共有結合する複数の官能基と
を含み、ここで、該複数の生物活性分子が、該複数の官能基と結合され、該複数の生物活性分子が、少なくともペプチドおよびタンパク質を含み、該ペプチドが、該哺乳類の細胞膜を貫通し、該細胞内に進入することが可能であり、そして該タンパク質が、該細胞内において新しい機能性を提供することが可能である、ナノ粒子。
（項目２）
前記ナノ粒子が鉄を含む、項目１に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目３）
前記ペプチドが、前記タンパク質と結合される、項目２に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目４）
前記ペプチドおよび前記タンパク質が、１種またはそれより多くの挿入リンカー分子によって、それぞれ前記ナノ粒子に結合する、項目３に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目５）
前記ペプチドが、５〜９個の塩基性アミノ酸を含む、項目１に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目６）
前記ペプチドが、９個またはそれより多くの塩基性アミノ酸を含む項目１に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目７）
前記タンパク質が転写因子である、項目５に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。（項目８）
前記転写因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４からなる群から選択される、項目７に記載の機能化された生体適合性ナノ粒子。
（項目９）
哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法であって、項目１に記載の有効量の機能化された生体適合性ナノ粒子を該細胞に投与し、該細胞内の細胞機能性を変化させることを含む、方法。
（項目１０）
前記細胞機能性の変化が、前記細胞の物理化学的な性質における変化を含む、項目９に記載の哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法。
（項目１１）
前記細胞機能性の変化が、前記細胞の増殖性の性質における変化を含む、項目９に記載の哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法。
（項目１２）
前記細胞機能性の変化が、前記細胞の生存能力における変化を含む、項目９に記載の哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法。
（項目１３）
前記細胞機能性の変化が、前記細胞の形態学的表現型の性質における変化を含む、項目９に記載の哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法。
（項目１４）
前記細胞機能性の変化が、幹細胞またはさらに特殊化された細胞型を含む新規の細胞型を産生する前記細胞の後天性の能力を含む、項目９に記載の哺乳類細胞内の細胞機能性を変化させる方法。
【００１３】
本発明のこれらの態様または他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると、より明白になる。しかしながら、様々な変化、変更および置換は、本明細書中に開示される具体的な実施形態に対して行われ得、それらの本質的な精神および範囲から逸脱することがないことが理解される。最後に、本明細書中で引用される様々な文献のすべては、参照によって本開示に明確に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従って、ペプチドおよびタンパク質分子のナノ粒子への同時結合に基づく、ナノ粒子の多段階の機能化のスキームを表している。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施形態に従って、等モル比の長鎖ＬＣ１−ＳＰＤＰおよびヨード酢酸と、アミン基を含有するナノ粒子との反応を表している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施形態に従って、遊離ＳＨ基を提供するためのＰＤＰのジスルフィド結合の還元を表している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の実施形態に従って、タンパク質のリジン基と、長鎖ＬＣ１−ＳＭＣＣとの反応を表している。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施形態に従って、ＳＭＣＣと反応し、末端の反応性マレイミド基を含有するタンパク質と、多機能性ナノ粒子との反応を表している。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＬＣ２−ＳＭＣＣとペプチドのアミノ基との反応を表している。この反応は、本発明の実施形態に従って、その後メルカプトエタノールとの反応が続き、末端マレイミドをアルコールに変える。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明の実施形態に従って、ナノ粒子上の遊離カルボキシル基に対する、修飾されたペプチドと機能性ビーズ（および結合したタンパク質）との反応を表している。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の実施形態に従って、ＬＣ１−ＳＰＤＰとアミン基を含有するナノ粒子との反応を表している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の実施形態に従って、遊離ＳＨ基を提供するためのＰＤＰのジスルフィド結合の還元を表している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の実施形態に従って、タンパク質のリジン基と長鎖ＬＣ２−ＳＭＣＣとの反応を表している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明の実施形態に従って、ＳＭＣＣと反応し、末端の反応性マレイミド基を含有するタンパク質と、多機能性ナノ粒子との反応を表している。
【００１５】
本発明のこれらの態様および他の態様は、参照が以下の添付の図面と併せて詳細な説明に対して行われる場合、当業者にとってさらに容易に明白となる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の詳細な説明
細胞内に生物活性分子を送達するために、本発明の発明者らは、共有結合した生物活性分子を有する細胞膜透過性ナノ粒子に基づく普遍的なデバイスを提供する。この目的を達成するために、本発明者らは、本明細書中に、ナノ粒子とタンパク質およびペプチドとの共有結合を確保する新規の機能化方法を提供する。本発明の修飾された細胞透過性ナノ粒子は、細胞の機能を制御および／または正常化するための生物活性分子の細胞内輸送についての普遍的なメカニズムを提供する。
【００１７】
正常に増殖、遊走および様々な細胞型へ分化する細胞の能力は、胚形成および成熟細胞の機能において重要であり、成熟細胞としては、様々な遺伝性疾患または後天性疾患における造血系および循環器系の幹細胞／前駆細胞およびさらに分化した細胞が挙げられるが、限定されない。幹細胞および／またはさらに分化した特殊化された細胞型の機能的な能力は、細胞内の事象における異常な変化に起因する様々な病的状態において変わるが、生物活性成分の細胞内への導入の際、正常化され得る。例えば、重篤な命を脅かす感染症に苦しみ、白血病発症に進展し得る周期性または重篤な先天性好中球減少症の患者において観察される、ヒト骨髄前駆細胞の損なわれた生存および好中球への分化は、好中球エラスターゼの細胞膜透過性の小分子阻害剤によって正常化され得、この小分子阻害剤は、異常な細胞内の事象を妨げ、通常の表現型を見かけ上回復する。それにもかかわらず、疾患を引き起こす標的変異産物に特異的なそのような小分子は、めったに利用できず、これが、効率的な細胞膜透過性デバイスが、細胞の機能を調節することが可能な生物活性分子の細胞内輸送に必要とされる理由である。
【００１８】
本明細書中に開示されている方法は、例えば、科学文献に以前に記述されている粒子と類似する超常磁性酸化鉄の粒子を含む生体適合性ナノ粒子を利用する。この型のナノ粒子は、骨髄細胞、リンパ節細胞、脾臓細胞および肝臓細胞の磁気共鳴イメージングのために、臨床状態において使用され得る（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  （ＭＩＯＮ）；  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｍａｇｎ．  Ｒｅｓｏｎ．  Ｍｅｄ．，  ２９，  ５９９  （１９９３）；Ｈａｒｉｓｉｎｇｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＲ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｎｄ  ｐｅｌｖｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．  １７２，  １３４７  （１９９９）を参照のこと）。これらの常磁性酸化鉄のナノ粒子は、架橋されたデキストランで覆われた約５ｎｍの核を含有し、約４５ｎｍの全体の粒子サイズを有している。重要なことに、架橋された細胞膜透過性のＴａｔ由来ペプチドを含有するこれらのナノ粒子が、細胞１つあたり３０ｐｇまでの超常磁性鉄のナノ粒子の量において、造血系細胞および神経系前駆細胞内へ効率的に内部移行することが例示されている（Ｌｅｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ４１０  （２０００））。さらに、ナノ粒子の取り込みは、骨髄由来ＣＤ３４＋原始前駆細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の増殖および分化の性質またはその細胞の生存率に影響しない（Ｍａｉｔｅ  Ｌｅｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ４１０  （２０００））。これらのナノ粒子は、標識した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの追跡に使用され得る。
【００１９】
標識した細胞は、それらの分化する能力を維持し、磁気共鳴イメージングを使用して組織試料において検出もされ得る。本明細書で、本発明者らは、新規ナノ粒子に基づくデバイスを提供し、ここで、当該デバイスは、細胞内の事象を標的とし、細胞の機能および性質を調節する細胞初期化溶液についての生物活性分子の細胞内輸送のための優秀なビヒクルとして機能し得るペプチドおよびタンパク質を運ぶように機能化される。
【００２０】
ナノ粒子−ペプチド／タンパク質複合物に関する一般的な記述：
様々な長さのリンカーが順番に結合するＸ／Ｙ官能基を有する生体適合性のコーティング（例えば、デキストラン多糖）がされている鉄または他の物質に基づくナノ粒子は、それらのＸ／Ｙ官能基を介してタンパク質および／またはペプチド（もしくは他の小分子）と共有結合する。
【００２１】
架橋に使用され得る官能基としては：
−ＮＨ２（例えば、リジン、ａ−ＮＨ２）、
−ＳＨ、
−ＣＯＯＨ
−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）、
糖質、
−ヒドロキシル（ＯＨ）、
−リンカーのアジド基の光化学による結合、
が挙げられる。
【００２２】
架橋試薬としては：
ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）  同様に、アミノ基およびチオール基を架橋するためのスルホ−ＳＭＣＣ、スルホスクシンイミジル誘導体も利用可能である。
【００２３】
ＬＣ−ＳＭＣＣ（長鎖ＳＭＣＣ）、同様にスルホ−ＬＣ−ＳＭＣＣ。
【００２４】
ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（ピリジル（ｐｙｐｒｉｄｙｌ）ジチオ）−プロピオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ））  同様にスルホ−ＳＰＤＰ。アミンと反応し、チオール基を提供する。
【００２５】
ＬＣ−ＳＰＤＰ（長鎖ＳＰＤＰ）、同様にスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ。
【００２６】
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）  −ＮＨ２基と−ＣＯＯＨとを結合させるために使用される試薬。
【００２７】
ｎ＝１，２，３，４〜２４のグリコール単位のＳＭ（ＰＥＧ）ｎ、同様にスルホ−ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ誘導体。
【００２８】
ｎ＝１，２，３，４〜１２のグリコール単位のＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎ、同様にスルホ−ＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎ誘導体。
【００２９】
カルボキシル基およびアミン基の両方を含有するＰＥＧ分子、
カルボキシル基およびスルフヒドリル基の両方を含有するＰＥＧ分子、
が挙げられ得る。
【００３０】
キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）試薬およびブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）試薬としては：
シトラコン酸無水物−ＮＨに特異的、
エチルマレイミド−ＳＨに特異的、
メルカプトエタノール−マレイミドに特異的、
が挙げられる。
【００３１】
上記を考慮すると、本発明者らは、生体適合性ナノ粒子を処理して、表面に機能的なアミンを産生し、次にそのアミンが使用されて、タンパク質および短鎖ペプチドを化学的に結合させた。
【００３２】
タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または転写因子）を、超常磁性または別のナノ粒子と結合させる場合において、以下のプロトコルが使用され得る：外側にアミノ官能基を含有する超常磁性ビーズは、様々な製造者から購入し得る。それらは、２０〜５０ｎｍのサイズで、ナノ粒子１つあたり１０またはそれより多くのアミン基を有する１ｍｌあたり１０１５〜１０２０のナノ粒子に及び得る。ナノ粒子は、１０，０００ダルトンの分画分子量のＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニット（微小カラム）の使用によって、的確な反応バッファー（０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．２）内に置かれる。約４回の洗浄が、適切な緩衝系を保証するのに一般的に必要とされる。ナノ粒子は、製造者が推奨するようにフィルターユニットから取り除かれる（低速で回転することによってカラム／フィルター装置を反転する）。
【００３３】
ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから入手）は、ＡＣＲＯＳから入手したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（密封されたバイアルかつ無水）中に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かされた。試料は、密閉され、ほとんどすぐに使用される。
【００３４】
１０ｍｌの溶液が、２００μｌの体積のナノ粒子に加えられる。これは、存在する使用可能なアミン基に対して大過剰量のＳＭＣＣを提供し、反応を１時間進めておく。過剰なＳＭおよびＤＭＦは、３，０００ダルトンの分画のＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターカラムを使用して取り除かれ得る。５回の体積の交換が適切なバッファーの交換を保証するのに一般的に必要とされる。過剰なＳＭＣＣがこの段階で取り除かれることが重要である。
【００３５】
例として、市販の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または精製された組換えＧＦＰあるいは他のタンパク質のような、任意のペプチドベースの分子は、−３０℃で凍結するための特定量のエチレングルコールを含有する溶液に加えられる。１４μｌ中の３μｇのタンパク質に、ＰＢＳ中で新たに調製された１０μｌのＤＴＴ（ジチオスレイトール、クリーランド試薬）溶液が、激しくボルテックスしながら加えられる。タンパク質は通常１つよりも多くのシステインを含有するため、異なるＧＦＰ分子と架橋する傾向がある。それゆえ、過剰なＤＴＴは、ジチオール結合および遊離ＧＦＰを還元する。４℃で２時間反応を進めておき、その後、過剰な試薬が、３，０００分画分子量のＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニットによって取り除かれる。
【００３６】
活性化されたナノ粒子およびタンパク質溶液は、組み合わせられ、２時間反応させておき、その後、未反応のタンパク質は、適切な分画分子量（ＧＦＰの例においては、５０，０００ダルトンの分画）を有するＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニットによって取り除かれる。試料は、−８０℃で保存される。Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターカラムを使用する代わりに、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐカラムのような固体のサイズフィルタリング成分を含有する小さなスピンカラムも使用され得る。サイズ排除カラムが存在する。ＳＭＣＣもまた、より水溶性にさせるスルホ誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）として購入し得ることにも注意する必要がある。また、ＤＭＳＯは、標識試薬についての溶媒担体として、ＤＭＦの代わりに使用され得る；さらに、無水である必要がある。
【００３７】
他のすべての架橋試薬は、同様の態様において適用され得る。ＳＰＤＰもまた、ＳＭＣＣとして同様の態様においてタンパク質／適用可能なペプチドに適用される。それは、ＤＭＦに容易に溶ける。ジチオールは、１時間またはそれより長い時間のＤＴＴとの反応によって切断される。副産物および未反応物質の除去後、それは、３，０００分画分子量のＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターカラムの使用によって精製される。
【００３８】
ペプチドおよびタンパク質でナノ粒子を標識する、より直接的かつ制御された別の方法は、２つの異なる二官能性カップリング試薬を使用することである。この反応順序は、図１のものと多少類似している。ヨード酢酸は、ナノ粒子の表面上に選択された数の「カルボキシル」基を導入するために使用される。
【００３９】
ＬＣ−ＳＭＣＣを含有するペプチドは、アミノメルカプトエタノールで処理される。これは、スルフヒドリル基を介する結合を作り出し、遊離アミノ基を提供する。その後、このアミノ基は、ＥＤＣを使用してナノ粒子上のカルボキシル基と結合する。ＥＤＣは、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩として公知である。このカップリング段階は、反応スキームの最後に行われる。
【００４０】
図１は、常磁性ナノ粒子−タンパク質／ペプチド付加物の一般的な表現を示している。この常磁性ナノ粒子は、多糖で覆われており、その後機能化される。表面にアミンを有するものを購入し得る。それらはまた、任意の他の機能化された形式に変更／変形され得る。延長剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）／結合剤（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）は、物理的に２つのユニットに一緒に結合する。
【００４１】
様々な官能基は、架橋試薬を介してナノ粒子をタンパク質と化学的に結合させるために使用され得る。使用可能な様々な官能基は、多くのタンパク質／ペプチドが、一段階ずつナノ粒子に結合することを可能とする。
【００４２】
同様に、様々な架橋試薬または反応性触媒は、ヘテロ−二官能性試薬を介してタンパク質／ペプチドとナノ粒子を架橋するために使用され得る。これらの架橋試薬は、様々な長さからなることにも注意するべきである。例えば、多くは、延長剤または「長鎖」のことをいうＬＣの記号を含む。ペグ化された化合物も、様々な長さで使用可能である。このような方法で、様々な長さのリンカーが、ナノ粒子に加えられ、タンパク質のようなより大きな分子およびペプチドのような小分子について異なる結合長を提供する。
【００４３】
時々、異なるタンパク質が、同じ官能基を含有し得、このことが、様々なタンパク質でナノ粒子を標識することを難しくする。官能基の変化を可能とする試薬が存在し；それゆえ、本発明者らは、タンパク質の官能基を変化し得、したがって、他のタンパク質から妨害されずに、段階的な態様で本発明者らに選択性を与える。これは、タンパク質の官能基を変化させることを要求する。
【００４４】
様々な試薬が、タンパク質を改変するために使用され得、その結果、様々な化学が、同じような官能基とタンパク質を結合させるために使用され得る。例えば、ＳＰＤＰのような化合物が、アミンをスルフヒドリルに変えるために使用され得、その後、マレイミド部分との反応を受け入れることができる。
【００４５】
段階的な態様でタンパク質をビーズ（ナノ粒子）に結合させる場合、時々、その前に結合させたタンパク質の残基および活性基が、カップリング化学を妨げ得る。それゆえ、持続性または可逆性のキャッピング試薬が使用され、ナノ粒子と第二または第三のタンパク質とを結合させるために使用されつつある試薬の妨害から、タンパク質の活性部分をブロックし得る。
【００４６】
多くの異なるキャッピング化合物が、未反応部分を阻害するために使用され得る。キャッピング化合物はタンパク質の活性も阻害し得るので、それらは、慎重に使用される必要がある。第二の化学結合段階が必要とされ、タンパク質の官能基が妨げ得る場合、最もよく使用される。
【００４７】
タンパク質が、上述の化学を使用してビーズ（ナノ粒子）と結合し得ることを示すために、本発明者らは、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質を含有する磁性ナノ粒子の合成を提供した。ＬＣＣ−ＳＭＣＣはこの合成スキームにおいて使用された。
【００４８】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｈｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）は、化学結合を形成するために、ナノ粒子上の遊離アミン基と化学反応する。これは、ＧＦＰと反応し得るマレイミド末端基を提供する。ＧＦＰが２つのシステインを有し、様々なＧＦＰ分子からのシステインが反応し、ジスルフィド結合を形成し得ることが公知である。そのような妨害を取り除くために、その分子は、最初にクリーランド試薬で還元される。
【００４９】
このタンパク質は精製され、その後、ＬＣ−マレイミド基を含有するビーズと反応することを可能とする。この反応を１時間進めておき、反応物はＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（５０Ｋ分画）で精製される。蛍光電子顕微鏡で写真が撮影された。
【００５０】
複数の型の官能基が、ナノ粒子上に作り出され得る。これによって、３種またはそれより多くの結合した異なるタンパク質の追加を可能とする。
【００５１】
初めにの１つは表面上のアミンから始まる。
【００５２】
トラウト試薬が、いくつかのこれらのアミンをスルフヒドリルに変えるために使用され得る。さらに、ヨード酢酸が、いくつかのアミンをカルボン酸に変えるために使用され得る。
【００５３】
タンパク質およびペプチドの両方について、アミンは、以下により詳細に記載されるような異なるリンカー長の官能基に変えられる。これは、タンパク質およびペプチドを結合させる汎用基（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｇｒｏｕｐ）として機能する。
【００５４】
図１は、ナノ粒子の機能化ならびにナノ粒子とペプチドおよびタンパク質との結合の模式図を表している。
【００５５】
合成およびコーティングは、以下のように行われる：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒを通して市販されているＮＨＳ−ＬＣ−ＳＰＤＰは、両側に二官能性カップリング試薬を有する長鎖延長剤であり、アミンおよびスルフィドに変えられ得るジスルフィドに特異的である。
【００５６】
一方の末端は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有しており、他方で、延長剤のもう一方の末端は、ピリジルジチオール基を含有する。このジチオール基が、スルフヒドリルを産生するため還元され得る。ＮＨＳ−ＬＣ−ＳＰＤＰを、ナノ粒子と反応することを可能とし、その反応は、取り込まれないＮＨＳ−ＬＣ−ＳＰＤから除去され得る。結合したナノ粒子が、その後、図１に示されるように還元される。
【００５７】
結合したタンパク質の産生：アフィニティーカラムを使用して精製された生物活性タンパク質は、ナノ粒子との結合を促進するために加えられたカルボキシ末端のリジン残基からの遊離ε−アミン基を含有する。ＮＨＳ−ＬＣ−ＳＭＣＣは、二官能性カップリング試薬として使用される。この分子は、ＬＣ１鎖延長剤を有する。一方の末端は、アミンに特異的なＮ−ヒドロキシスクシンイミド試薬を有する。もう一方の末端は、スルフヒドリル基に非常に特異的であるマレイミド基を含有する。一度この物質が、タンパク質に結合し、反応混合物から分離されると、タンパク質と結合したマレイミドは、ナノ粒子を含有するスルフヒドリルに加えられる。この結果物は、ゲル濾過により分離される。
【００５８】
ナノ粒子に結合するペプチド：この場合、ペプチドもまた、ＮＨＳエステル−ＬＣ−マレイミド結合の基礎として機能するカルボキシ末端のリジンを含有する。この分子は、ＬＣ２鎖延長剤を有している。すべての手順は、タンパク質についての上記手順と同様である。
【００５９】
最適化の間、膜透過性ペプチドおよびタンパク質は、異なる比で混合され、ナノ粒子と結合した分子の最大数を達成する。すでに発表された研究に基づくと、ナノ粒子１つあたり３〜４分子の表面結合の細胞透過性ペプチドが、超常磁性ナノ粒子の効率的な細胞内輸送には十分である。
【００６０】
ＬＣ２−延長剤アームの使用は、結合したペプチドベースの分子の数を増加させる重要な手段を提供する。異なる濃度のＮＨＳ−ＬＣ−ＳＰＤＰの使用は、ナノ粒子の表面に固定されたペプチドおよびタンパク質分子の数の増加を可能とし、それゆえより効率的な透過、およびこれらの結果としてより強い細胞初期化活性を可能とする。
【００６１】
１つのナノ粒子上のペプチドおよびタンパク質の結合：これは、図１に示される手順を使用して達成され得る。この場合、ＳＭＣＣで標識されたタンパク質およびペプチドの比で、ビーズに加えられ、反応を可能とする。
【００６２】
ペプチドおよびタンパク質でナノ粒子を標識する、より直接的かつ制御された別の手段は、２つの異なる二官能性カップリング試薬を使用することである（図２Ａ〜Ｆ）。この反応順序は、図１の手順と多少類似しており、以下に記載されているいくつかの変更がある。
【００６３】
ヨード酢酸が、ナノ粒子の表面上に選択された数の「カルボキシル」基を導入するために使用される。これは、段階Ｉで行われる；図２Ａ〜Ｆの段階（Ｉ〜ＶＩＩ）を参照のこと。
【００６４】
ＮＨ−ＬＣ−ＳＭＣＣを含有するペプチドは、アミノエタノールで処理される。これによって、スルフヒドリル基を介する結合を作り出し、遊離アミノ基を提供する。このアミノ基が、その後、ＥＤＡＣ（ＥＤＣ）を使用してナノ粒子上のカルボキシ基と結合する。ＥＤＡＣは、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩として公知である。このカップリング段階は、反応スキームの最後に行われる。
【００６５】
他の態様において、本発明はまた、細胞内の活性の調節のために、機能性ナノ粒子と結合した生物活性分子を送達する方法に関する。例えば、市販されているか、あるいは標準または修正された実験手順を使用して得られるいずれかの、ヒト細胞、線維芽細胞または他の細胞型は、まず、細胞が接着する基質（フィーダー細胞、ゼラチン、マトリゲル、フィブロネクチンなど）を含むか、または含まない固体表面上に、無菌条件下で蒔かれる。蒔かれた細胞は、細胞分裂／増殖または許容できる細胞生存率の維持を可能とする特異的な因子の組み合わせと共にしばらく培養される。例としては、血清成長因子（ｓｅｒｕｍ
ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）および／または様々な成長因子があり、これらは、後で取り除かれ得るか、または再び新しくされ得、そして培養が継続される。本明細書に記載された様々な方法を使用して結合した生物活性分子が結合した機能化された生体適合性の細胞透過性ナノ粒子の存在下、磁界存在下または非存在下で、蒔かれた細胞が培養される。超常磁性ナノ粒子の場合における磁石の使用は、細胞とナノ粒子との間の接触表面積における重要な上昇を提供し、それゆえ、細胞膜を通る機能性ナノ粒子のさらに向上した透過を強化する。必要な場合、細胞集団は、機能性ナノ粒子で繰り返し処理され、生物活性分子を細胞内に送達する。
【００６６】
細胞は、培養液中で懸濁されて、取り込まれなかったナノ粒子は、遠心分離または細胞の分離によって取り除かれ、細胞をクラスターとして存在させておく。その後、クラスター化した細胞は再懸濁され、新たな培地で適切な期間再培養される。この細胞は、細胞内に送達された特異的な生物活性分子によって引き起こされる、結果として生じる生物学的効果が観察されるまで、分離、再懸濁および再培養の複数のサイクルに供され得る。
【００６７】
本発明の１つの使用は、細胞の初期化に対する影響についての化合物（複数の化合物であってもよい）のスクリーニングである。これは、目的の細胞集団と、本明細書中に開示されている１つまたはそれより多くの方法を使用して、ナノ粒子と結合した化合物とを組み合わせること、適切な期間培養すること、その後、化合物に起因する任意の調節作用を決定することを含む。これは、細胞の初期化の開始および多能性幹細胞の産生、さらに特殊化された細胞型または特殊化された異なる細胞型に対する細胞の分化または分化転換、毒性に対する細胞の試験、代謝性の変化、あるいは収縮活性に対する影響、ならびに他の機能を含み得る。
【００６８】
本発明の別の使用は、ヒトまたは動物の身体の治療を意図する薬物として、または送達デバイスにおいての、特殊化された細胞の製剤である。これは、血管系あるいは直接筋肉または臓器の壁のいずれかから、臨床医が損傷した組織（心臓、筋肉、肝臓など）中または周辺にその細胞を投与することを可能とし、それゆえ、特殊化された細胞が、移植され、損傷を制限し、そして筋肉組織の再成長および特殊化された機能の回復に関与することを可能とする。
【００６９】
本発明の使用は、インタクトのゲノムを保存しつつ、細胞の初期化および幹細胞またはさらに分化した細胞型の産生を保証するための、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２転写因子のような他のタンパク質で機能化されたナノ粒子に関する。
【００７０】
本発明の別の使用は、細胞の初期化に対する影響についての化合物（複数の化合物であってもよい）のスクリーニングである。これは、目的の細胞集団と、本明細書中に開示されている方法を使用して、ナノ粒子と結合した化合物とを組み合わせること、適切な期間培養すること、その後、化合物（複数であってもよい）に起因する任意の調節作用を決定することに関する。これは、細胞の初期化の開始および多能性幹細胞の再生、さらに特殊化された細胞型または特殊化された異なる細胞型に対する細胞の分化または分化転換、毒性に対する細胞の試験、代謝性の変化、あるいは収縮活性に対する影響、ならびに他の機能を含み得る。
【００７１】
さらに本発明の別の使用は、ヒトまたは動物の身体の治療を対象とする薬物として、または送達デバイスにおいて特殊化された細胞の製剤である。これは、血管系あるいは直接筋肉または臓器の壁のいずれかから、臨床医が損傷した組織（心臓、筋肉、肝臓など）中または周辺の細胞に投与することを可能とし、それゆえ、特殊化された細胞が、移植され、損傷を制限し、そして筋肉組織の再成長および特殊化された機能の回復に関与することを可能とする。
【００７２】
さらなる例示の方法として、限定ではないが、以下の実施例は、本発明の他の態様を開示する。
【実施例】
【００７３】
実施例１
ＧＦＰを、架橋剤としてＬＣ−ＳＭＭを使用して、超常磁性粒子と結合し（ビーズのアミン基と結合）、その後、ＧＦＰのスルフヒドリルと直接結合した。ＬＣ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから入手）を、ＡＣＲＯＳから入手したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（密封されたバイアルかつ無水）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした。試料を密封し、ほとんどすぐに使用した。
【００７４】
１０ｍｌの溶液を、２００μｌの体積のナノ粒子に加えた。これは、存在する使用可能なアミン基に対して大過剰量のＳＭＣＣを提供し、反応を１時間進めておいた。過剰なＳＭＣＣおよびＤＭＦを、３，０００ダルトンの分画のＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して取り除いた。適切なバッファーの交換を保証するために５回の体積の交換を必要とした。過剰なＳＭＣＣをこの段階で取り除くことが重要だった。
【００７５】
例として、市販の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または精製された組換えＧＦＰあるいは他のタンパク質のような、任意のペプチドベースの分子を、−３０℃で凍結するための特定量のエチレングルコールを含有する溶液に加えた。１４μｌ中の３μｇのタンパク質に、ＰＢＳ中で新たに調製された１０μｌのＤＴＴ（ジチオスレイトール、クリーランド試薬）溶液を、激しくボルテックスしながら加えた。タンパク質は通常１つよりも多くのシステインを含有するため、異なるＧＦＰ分子と架橋する傾向があった。それゆえ、過剰なＤＴＴが、ジチオール結合および遊離ＧＦＰを還元した。４℃で２時間反応を進めさせておき、その後、過剰な試薬を、３，０００分画分子量のＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニットによって取り除いた。
【００７６】
活性化されたナノ粒子およびタンパク質溶液を組み合わせて、２時間反応させておき、その後、未反応のタンパク質を、適切な分画分子量（ＧＦＰの例においては、５０，０００ダルトンの分画）を有するＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニットによって取り除いた。試料を−８０℃で保存した。より水溶性であるＳＭＣＣのスルホ誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）を使用し得ることにも注意する必要がある。ＤＭＳＯもまた、標識試薬についての溶媒担体として、ＤＭＦの代わりに使用し得；さらに、無水である必要がある。
【００７７】
実施例２
この方法において、リジンのアミノ基を、ビーズ上のスルフヒドリルとのカップリング反応に使用した。ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸バッファーで新たに平衡化されたビーズを、これらの実験において使用した。１ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＦ中）のＬＣ−ＳＰＤＰを新たに調製した。１０μｌのＳＰＤＰ溶液を、激しくボルテックスしながらビーズ懸濁液に加え、１時間反応させた。その後、未反応の物質を、遠心分離によって取り除き、１０Ｋの分画のＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して、ナノ粒子をリン酸バッファーで洗浄した。ＳＰＤＰのジスルフィド結合を、クリーランド試薬を使用して切断した；１ｍｇを溶液に加え、反応を１時間進めさせた。副産物および未反応のクリーランド試薬を、１０Ｋの分画のＡｍｉｃｏｎスピンフィルターによって取り除いた。
【００７８】
上記の反応が進む間、ＧＦＰをＮ−エチルマレイミドを使用してブロックした。過剰なエチルマレイミドをＧＦＰ溶液に加えた。室温で１時間反応が進み、未反応の物質を、３Ｋの分画のＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して取り除いた。ＧＦＰを、その後、過剰なＳＭＣＣと１時間反応させておいた。その後、ＧＦＰをスピンカラムで精製し、その後ＰＤＰ−ナノ粒子と反応した。反応は１時間進み、最終物を、５０Ｋの分画のＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して精製した。
【００７９】
実施例３
市販、または以下の文献に記載されているような標準の実験手順を使用して得られるヒト線維芽細胞を（Ｍｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｉｓｌ１  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２４：７００  （２０１０））、６穴プレートの、１５０，０００〜２００，０００の密度であらかじめ蒔かれたフィーダー細胞を含むか、または含まない固体表面上に、無菌条件下において１５０，０００細胞密度で蒔く。フィーダー細胞は、市販、または標準の実験法を使用したいずれかで入手した。蒔かれた細胞を、細胞分裂／増殖または許容できる細胞生存率の維持を可能とする特異的な因子の組み合わせと共に、血清含有培地中でしばらく培養し、これらは後で取り除き得るか、または再び新しくし得、５％のＣＯ２および雰囲気酸素の加湿されたインキュベーターで、無菌条件下で培養を継続した。
【００８０】
コニカルチューブの底で回収された細胞または蒔かれた細胞を、磁界存在下または非存在下で、本明細書中で開示された様々な方法を使用して結合した生物活性分子を有する機能化された生体適合性の細胞透過性ナノ粒子を含有する５０μｌの懸濁液で処理する。
【００８１】
超常磁性ナノ粒子の場合における磁界の使用は、細胞とナノ粒子との間の接触表面積における重要な増加を提供し、それゆえ、細胞膜を通る機能性ナノ粒子の向上した透過を確保する。重要なことに、ＰＥＧが結合するいくつかのタンパク質ベースの薬物（ＰＥＧ−ＧＣＳＦ、Ａｍｇｅｎ、ＣＡ；ＰＥＧ−インターフェロン、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ／Ｍｅｒｃｋ、ＮＪ）のポリ（エチレングリコール）ＰＥＧが媒介する保護と同様に、結合したペプチドと併せて使用されるナノ粒子が、ポリペプチドのサイズを増加させて、タンパク質の表面を覆い、それゆえ、タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解を減少させ、結果として使用されるタンパク質分子のより長い安定性を生じさせる。必要な場合、細胞集団を機能性ナノ粒子で繰り返し処理し、生物活性分子を細胞内に送達する。
【００８２】
この細胞を培養液中に懸濁して、取り込まれなかったナノ粒子を約１２００ｘｇで１０分間の遠心分離によって取り除き、細胞をペレット中にクラスターとして存在させておく。その後、クラスター化した細胞を再懸濁し、同様の手順を使用して再び洗浄し、新たな培地で適切な期間、再培養する。細胞内に送達された特異的な生物活性分子によって、引き起こされる結果としての生物学的効果が観察されるまで、細胞を、培養液中の分離、再懸濁および再培養の複数のサイクルに供し得る。
【００８３】
緑色蛍光タンパク質のこの具体的な実施例において、細胞透過性ナノ粒子は、タンパク質を細胞内に送達し、このことは、標的細胞による新規緑色蛍光の取得を与える。この新しく獲得される性質は、様々な応用にさらに使用され得る高度の均一性で、細胞内に送達されたタンパク質を有する細胞のその後の選別および分離を可能とする。重要なことに、結合したタンパク質を有する細胞透過性の機能性ナノ粒子の使用は、細胞のゲノムへのいずれの組み込みも欠いており、それゆえ新規（この場合蛍光）の特徴を有するすべての細胞は、インタクトのゲノムを維持し、細胞ＤＮＡの完全性を保護することを保証する。
【００８４】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化され得る。前述の実施形態は、それゆえ、本明細書中に記載される発明の限定よりもむしろ例証となると考えられる。本発明の範囲は、それゆえ、前述の説明よりもむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等の意味および範囲内に属するすべての変化は、本明細書中に包含されることを意図する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【外国語明細書】
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