(57)【要約】【課題】身体の老化の程度を測定することを課題とする。【解決手段】サイトカインの産生量を指標とする老化の測定方法を提供する。本発明の老化の評価方法は、身体の老化、特に免疫系の老化の程度を定量的に測定することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインの産生量を指標とする老化の測定方法。
【請求項２】
サイトカインがＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＦＮ−γである請求項１に記載の老化の測定方法。
【請求項３】
炎症型サイトカインと抑制型サイトカインの産生量の比を指標とする請求項１に記載の老化の測定方法。
【請求項４】
ＩＬ−６とＩＬ−１０の産生量の比を指標とする請求項１から３のいずれか１項に記載の老化の測定方法。
【請求項５】
生体から採取された細胞を培地で培養する工程、
培養後に培地に産生されたサイトカインの量を測定する工程、
を含む老化の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
加齢に伴う身体の老化の程度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本は長寿国であるが、一方で、加齢に伴う疾患の増加が問題となっている。身体の老化の程度を知ることは、加齢性の疾患の予防につながり望ましい。
老化の過程で起きる事象として、組織、臓器の萎縮、各種機能の低下など、さらに、細胞レベルにおいては、テロメアの短縮など様々なものが知られ、老化の程度を評価するためのマーカーや、測定方法が提案されている。
テロメア長を測定するキットは市販され、また、皮膚のエストロゲン応答性に基づいて皮膚老化を測定する方法（特許文献１）、老化マーカーを抗体で測定して、老化を測定する方法（特許文献２）、骨形成たんぱく質を老化のマーカーとする方法（特許文献３）などが提案されている。
ところで、免疫は生体の防御機構である。免疫系は加齢とともに機能は低下しつつ、一方、炎症反応は強くなるといわれている。免疫系の老化は、動脈硬化、免疫系疾患、感染症、ガンなどの発症と深く関わりがあり、免疫系の老化の程度を測定することは、これらの疾患を予防するためにも有意義である。免疫系の老化については、非特許文献１から３などを参照することができる。
【０００３】
本発明は、身体の老化、特に免疫系の老化に注目した老化の測定方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１８３８７９号公報
【特許文献２】特開平８−３１９２９８号公報
【特許文献３】特表２００５−５２８５８１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  ５２９，２５８（２０１６）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５,１３３ (２００４)
【非特許文献３】日本老年医学会雑誌４８巻３号（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
身体の老化の程度を測定することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
サイトカインの産生量を指標とする老化の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の老化の評価方法は、身体の老化、特に免疫系の老化の程度を定量的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−６の産生量の結果を示す。
【図２】各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−１０の産生量の結果を示す。
【図３】各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−６とＩＬ−１０の産生量の比を示す。
【図４】各週齢における抗ＣＤ３抗体刺激時のＩＦＮ−γの産生量の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明はサイトカインの産生量を指標とする老化の測定方法を提供する。
サイトカインは、特に限定されることはなく、各種インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＩＬ−３７、ＴＳＬＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、さらにはケモカイン等を測定することができるが、特に好ましくは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、またはＩＦＮ−γを測定することができる。また、炎症型のサイトカイン（ＩＬ−１，ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）と、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）との２種を測定することができ、さらには、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの産生の量の比を求めて、これを指標として老化の測定をすることができる。
【００１１】
測定するサイトカインは、血中のサイトカインであってもよいし、あるいは、血液等から単離された細胞を培養して産生されるサイトカインであってもよいし、あるいは、遺伝子レベルにおけるサイトカインの発現量であってもよい。細胞を培養する際は、各種抗原、スーパー抗原、毒素、抗体等で刺激を加えてもよく、例えば抗ＣＤ３抗体あるいは、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：リポ多糖）などで刺激を加えてもよい。
【００１２】
測定の対象は、ヒトあるいはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどの実験動物、ペット、家畜、その他あらゆる哺乳動物である。
【００１３】
サイトカインの測定方法は特に限定されず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、酵素免疫測定）法、フローサイトメトリーを用いた測定、イムノクロマトグラフィー、その他、あらゆる測定方法で測定することができ、また、産生されたサイトカインを直接的に測定するのではなく、細胞のサイトカインの発現量をｍＲＮＡ量などに基づいてリアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシングなどにより測定してもよい。
【００１４】
また、さらなる実施形態として、本発明は、生体から採取された細胞を培地で培養する工程、培養後に培地に産生されたサイトカインの量を測定する工程を含む老化の測定方法を提供する。
この方法において、生体は、上記同様、あらゆる哺乳動物を含み、サイトカインは、上記と同様、限定されないが、特に好ましくは、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＦＮ−γである。また、採取される細胞は、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球等の免疫応答に関わる細胞を含んでいることが好ましく、血液、脾臓、リンパ節などから採取することができ、侵襲性を鑑みると、血液から採取されることがもっとも好ましい。
また、この方法は、培養する工程において、培地に抗ＣＤ３抗体またはＬＰＳが含まれることをさらに特徴とすることができる。また、さらに、炎症型サイトカインと抑制型サイトカインの産生量の比を求める工程を有することができる。
【００１５】
また、本発明はさらなる実施形態として、各種サイトカインを測定するための抗体あるいはプライマー、試薬などを含む老化測定のためのキット、ＩＬ−６またはＩＬ−１０を測定するための抗体あるいはプライマー、試薬などを含む老化測定のためのキット、あるいは、炎症型のサイトカインと、抑制型サイトカインとの２種以上のサイトカインを測定するための抗体、あるいはプライマー、試薬などを含む老化測定のためのキット、さらには、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの産生の量の比を簡易的に測定することができる老化測定のためのキットを提供する。これらのキットはＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリーを用いた方法、イムノクロマトグラフィー、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシング、その他、あらゆる測定方法で測定するためのものが考えられ、また、特に、炎症系サイトカインと抑制型サイトカインの産生の量の比を簡易的に測定する場合は、イムノクロマトグラフィーを用いたキットは簡便性に優れており好ましい。
【実施例】
【００１６】
９〜１００週齢のオスのＮＯＤ（Ｎｏｎ−Ｏｂｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ）マウスを用い、それらの細胞の応答を調べた。ＮＯＤマウスは日本クレア株式会社から購入後、群馬大学内の動物飼育施設で市販の飼料および水道水を自由摂取させることにより適当な週齢となるまで飼育した。ＮＯＤマウスは１型糖尿病モデルマウスであるが、実験に用いられたのはいずれも１型糖尿病未発症であった。
【００１７】
細胞の応答を観察するため、適当な週齢となったＮＯＤマウスから脾臓を回収し、すりつぶして脾臓細胞を得た。脾臓細胞はＨＬ−１培地に懸濁し、１×１０６個／ウェルとなるように、９６ウェルプレートに播種した。一部のウェルは、ＬＰＳまたは抗ＣＤ３抗体をいずれも最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２存在下で、培養を行い、培養開始から、３日後に、細胞増殖応答を観察した。また、同様に、脾臓細胞を１×１０７個／ウェルとなるように、２４ウェルプレートに播種し、一部のウェルは、ＬＰＳまたは抗ＣＤ３抗体をいずれも最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で、培養を行い、培養開始３日後に培養上清を回収し、含まれるサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）を測定した。サイトカインの測定はＥＬＩＳＡで、従来方法に従って測定した。
【００１８】
なお、細胞の応答の観察の実験は４回に分けて行った。すなわち、第１回は、１０週齢のＮＯＤマウス１匹、３２週齢のＮＯＤマウス１匹、１００週齢のＮＯＤマウス１匹を、第２回では１２週齢のＮＯＤマウス３匹、６１週齢のＮＯＤマウス３匹を、第３回では、９週齢のＮＯＤマウス２匹、２３週齢のＮＯＤマウス２匹、４２週齢のＮＯＤマウス２匹、６２週齢のＮＯＤマウス２匹を、第４回では、９週齢のＮＯＤマウス２匹、８８週齢のＮＯＤマウス１匹を実験に供した。いずれの実験においても、同じ週齢のマウスの脾臓細胞はプールして実験に用いた。
【００１９】
結果
脾臓嫡出前のマウスの外見の様子を比較したところ、加齢に伴い毛並みが悪くなるものの、顕著な老化の様子は認められなかった。また、体重は１０〜３０週齢の期間単調増加し、その後約３５ｇで一定になった。
脾臓細胞数は１０週齢から加齢に伴い徐々に減少し、１００週齢では１０週齢のおよそ２／３となった。脾臓細胞を抗ＣＤ３抗体あるいはＬＰＳ刺激を加えて培養した際の、細胞増殖応答については、いずれの刺激を用いた場合も、週齢による顕著な差はみられなかった。
サイトカインの産生応答は次のとおりであった。すなわち、ＬＰＳ刺激時は、ＩＬ−６および１０は明確に産生が認められ、そのほかのサイトカインについては、産生は認められなかった。抗ＣＤ３刺激時は、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γの産生が認められた。
【００２０】
各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−６の産生量の結果を図１に示す。ＩＬ−６の産生量は、１０週齢から６０週齢までは増加し、６０週齢以上では、減少傾向にあった。
【００２１】
各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−１０の産生量の結果を図２に示す。ＩＬ−１０は１０週齢から加齢に伴い、その産生量が大きく単調減少した。
【００２２】
各週齢におけるＬＰＳ刺激時のＩＬ−６とＩＬ−１０の産生量の比を図３に示す。興味深いことに、ＩＬ−６／ＩＬ−１０値は加齢に伴い単調増加し、６０週齢あたりで両者の産生モル数が同程度になり（ＩＬ−６／ＩＬ−１０  ≒  １）、その後、さらに増加し、８０週齢以後では、一定となった。ＩＬ−６は炎症型のサイトカインであり、ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインである。この結果より、炎症型サイトカインと抗炎症型サイトカインの産生量の比は、老化の測定の指標となることが分かった。
【００２３】
各週齢における抗ＣＤ３抗体刺激時のＩＦＮ−γの産生量を図４に示す。ＩＦＮ−γの産生量は週齢に伴い単調減少した。なお、ＩＬ−６，ＩＬ−１０はいずれも加齢に伴い、減少傾向にあった。
【００２４】
以上の結果より、サイトカインの産生量は、生体、特に免疫系の老化の測定の指標となり、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−１０あるいはＩＦＮ−γの産生量は、老化の測定の指標として有用であるといえる。また、炎症型サイトカインと抗炎症型サイトカインの産生量の比は、老化の測定の指標として有用であるといえる。
なお、抗ＣＤ３の刺激は、主に免疫系におけるＴ細胞応答を刺激し、一方ＬＰＳは抗原提示細胞に影響を及ぼしたものと推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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