(57)【要約】      （修正有）【課題】脂質を含有する支持膜と相互作用する標的分子の分子間相互作用を、蛍光分子などのラベル化剤を用いずとも、高感度に検出することを可能にする検出方法を提供する。【解決手段】脂質を含有する支持膜１２と粒子本体１０とを有する粒子１の、支持膜に標的分子が相互作用した場合の支持膜の構造の変化、及び／又は支持膜と相互作用する標的分子、を検出する検出工程を有し、検出する手法として、ラマン分光法を用いることを特徴とする、検出方法。【選択図】図１
2018072134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子の、前記支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び／又は前記支持膜と相互作用する標的分子、を検出する検出工程を有し、
前記検出する手法として、ラマン分光法を用いることを特徴とする、検出方法。
【請求項２】
前記粒子が、基板に形成された流体を送液可能な流路内に設けられており、前記流路内に、前記標的分子を含む第１の液を送液する送液工程を有することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記送液工程が、前記流路に、前記標的分子を含まない液、又は前記第１の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む液である第２の液を送液する第二送液工程を有することを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記粒子の前記支持膜と接触する前の第１の液と、前記粒子の前記支持膜と接触した後の第１の液について、それらの液に含まれる前記標的分子の量又は濃度の差を測定することにより、前記支持膜に相互作用した前記標的分子の絶対量を見積もる算出工程を有することを特徴とする、請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法に用いられるデバイスであって、
流路と、前記流路に液を導入するための導入口と、を有する基板を備え、
前記流路内に、脂質を含有する支持膜及び粒子本体を有する粒子が設けられていることを特徴とする、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン分光法を用いた検出方法及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
微量の標的分子を効率よく検出するためには、マイクロアレイ素子が一般的に使われる。現在、ほとんどのマイクロアレイ素子の作製には、固体表面に直接、生体高分子（ＤＮＡ、酵素、可水溶性タンパク質等）を共有結合で固定化するという手法がとられている。ＤＮＡチップを代表とする、現在までに成功を収めている素子は、共有結合による固定化に際して、生体分子の機能を維持できるものに限られている。
【０００３】
近年、マイクロアレイ素子を生体膜へ拡張する試みが、精力的に行われている。生体膜は、細胞の内部と外界を隔てる膜である。標的分子と生体膜および膜を形成する脂質分子との相互作用機構を解明することは、生体膜の生理機能および生命現象との関連を知るために重要であり、注目が高まっている。
【０００４】
マイクロアレイ素子を用いて、生体膜と相互作用する吸着分子の吸着サイトや分子構造を解明するためには、生体膜が有する最も重要な性質である流動性を維持する必要があるため、ＤＮＡのように共有結合による固定化を行うことができないという問題がある。この解決法の一つとして、生体膜からなる支持膜をマイクロアレイ素子の固体表面に支持させる手法が注目されている。自然界において効率よく特異的反応場として用いられている生体膜を、支持膜としてマイクロアレイ素子の固体基板上に支持させることで、より自然に近い環境を素子上へ実現し、これまで機能を維持したままでの固定化が難しかった膜タンパク質に代表される生体高分子などについても、その機能を失わせることなく固体表面に担持することが可能になると期待されている（非特許文献１）。
【０００５】
従来、脂質を含有する支持膜の構造、挙動、性質などの分析手法として代表的なものに、蛍光顕微鏡観察、Ｘ線散乱法、ラマン分光法が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】E. Sackmann, “Supported membranes: Scientific and practical applications” Science, vol. 271, pp. 43-48, 1996.
【非特許文献２】M. Tutus , S. Kaufmann , I. M. Weiss , and M. Tanaka “Functional Coating of Porous Silica Microparticles with Native Biomembranes towards Portable Flow-Through” Adv. Funct. Mater., vol. 22, pp. 4873-4878, 2012. Biochemical Microreactors
【非特許文献３】高鳥翔、藤本豊士、「生体膜脂質の局在可視化法」生化学、vol.86, pp.5-17, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のとおり、脂質を含有する支持膜の分析手法としては、蛍光顕微鏡観察、Ｘ線散乱法、ラマン分光法が挙げられる。
【０００８】
しかし、蛍光顕微鏡による生体膜の挙動の観察には、蛍光色素でラベル化した脂質分子を膜中に混在させる必要がある。高感度な観測が可能となる一方、生体膜試料の調整法が煩雑となること、蛍光色素分子が系に及ぼす影響を除去できないこと、細胞から切り出した生体膜など生体により近い試料への適用がしにくいこと、などの問題が生じる（非特許文献３）。また、生体膜および膜を形成する脂質分子、もしくは生体膜と相互作用する吸着分子を直接観測することはできないという問題もある。
【０００９】
Ｘ線散乱法は、蛍光色素などのラベル化が不要で、生体膜および膜を形成する脂質分子の構造、挙動、性質の僅かな変化を高感度にとらえることができる一方、装置が大がかりで簡易な測定に向かないこと、電子密度のコントラストが大きくない系では感度が充分に期待できないという問題がある。
【００１０】
ラマン分光法は、非接触で、顕微境を用いた微小領域の測定が可能であり、マイクロアレイ素子の測定法として、優れている。蛍光分子などのラベル化剤を用いることなく、生体膜および膜を形成する脂質分子、もしくは測定対象となる生体膜と相互作用する吸着分子を、直接観測することを可能にする。一方、蛍光検出と比較して、微弱な散乱光を検出信号に用いるため、検出の高感度化には工夫が必要という問題が生じる。
【００１１】
本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、脂質を含有する支持膜と標的分子との分子間相互作用を、蛍光分子などのラベル化剤を用いずとも、高感度に検出することを可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
支持膜を担持する固体表面として、２次元平面基板だけでなく、ビーズなど粒子状の表面に担持することが可能である（例えば、非特許文献２）。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ビーズなど粒子状の表面を用いて、測定対象を高密度に配置することが、ラマン分光法による検出の高感度化に非常に効果的であることを見出した。
【００１３】
本発明の一態様は、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子の、前記支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び／又は前記支持膜と相互作用する標的分子、を検出する検出工程を有し、前記検出する手法として、ラマン分光法を用いることを特徴とする、検出方法である。
【００１４】
本発明の一態様は、上記検出方法であって、前記粒子が、基板に形成された流体を送液可能な流路内に設けられており、前記流路内に、前記標的分子を含む第１の液を送液する送液工程を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の一態様は、上記検出方法であって、前記送液工程が、前記流路に、前記標的分子を含まない液、又は前記第１の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む液である第２の液を送液する第二送液工程を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の一態様は、上記検出方法であって、前記粒子の前記支持膜と接触する前の第１の液と、前記粒子の前記支持膜と接触した後の第１の液について、それらの液に含まれる前記標的分子の量又は濃度の差を測定することにより、前記支持膜に相互作用した前記標的分子の絶対量を見積もる算出工程を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の一態様は、上記検出方法に用いられるデバイスであって、流路と、前記流路に液を導入するための導入口と、を有する基板を備え、前記流路内に、脂質を含有する支持膜及び粒子本体を有する粒子が設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、脂質を含有する支持膜に対する検出を、蛍光分子などのラベル化剤を用いずとも、ラマン分光法により、高感度に実施できる検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る粒子の構成を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るデバイスの構成を示す模式図（（a）は斜視図、（ｂ）は断面図）である。
【図３】実施例で得られたラマンスペクトルを示す図である。
【図４】実施例で得られたラマンスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の検出方法及びデバイスの一実施形態を、適宜、図面を参照しながら説明する。
【００２１】
（粒子）
まず、実施形態に係る粒子について説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る粒子の構成を示す模式図である。実施形態に係る粒子１は、脂質を含有する支持膜１２と、粒子本体１０と、を有するものである。
【００２２】
粒子本体の材料としては、無機物であってもよく、有機物であってもよく、支持膜を担持可能な種々の材料を採用できる。無機物としては、例えば、アルミニウム、亜鉛、鉄、銅、ニッケル等の金属又はそれらの酸化物や、シリカ等のケイ素酸化物、チタン、雲母、ガラス等が挙げられる。有機物としては、アクリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、フェノール樹脂等の高分子が挙げられる。これらの中で、粒子本体の材料としてはシリカが好適である。粒子本体がシリカビーズである場合、その表面は、高分子薄膜でコーティングされていてもよく、粒子本体の表面は、金属または金属酸化物などでコーティングされてもよい。粒子本体は、末端にチオール基やジスルフィド基を有するアルカンチオールの単分子膜で被覆されてもよい。ビーズの表面を高分子薄膜でコーティングしたものを用いて、支持膜として、人工生体膜だけでなく天然の生体膜をも表面に保持することができる（例えば、文献：S. Kaufman and M. Tanaka, “Cell Adhesion onto Highly Curved Surfaces: One-Step Immobilization of Human Erythrocyte Membranes on Silica Beads” CHEMPHYSCHEM, vol. 4, pp. 699 -704, 2003など参照）。
【００２３】
粒子１の表面には、支持膜１２が形成されている。支持膜１２は、脂質を含有する。支持膜は、脂質分子のみから構成されていてもよく、細胞本来の形質膜の構成を反映したものとする観点から、脂質分子の他に、タンパク質、コレステロール等のステロイド、糖鎖などの成分をさらに含有してもよい。
支持膜が含有する脂質としては、リン脂質や糖脂質等が挙げられる。リン脂質としては、天然物であっても人工物であってもよい、リン脂質としては、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスフィチジル酸、ホスフィチジルイノシトール等のグリセロリン脂質が挙げられる。ホスファチジルコリンとしては、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等が挙げられる。
支持膜が含有してもよいタンパク質としては、レセプター、イオンチャネル等の膜貫通型タンパク質や、グリセロフォスファチジルイノシトール等に結合する脂質結合型タンパク質、タンパク質付着型タンパク質等が挙げられる。また、ビオチンやヒスチジンオリゴマーでタグ付けされた人工タンパク質などが挙げられる。
【００２４】
粒子本体の表面上に支持膜を形成させる方法は公知であり、脂質、及び必要により脂質以外の支持膜を構成し得る上記成分を含む組成物を用意し、例えば、実施例に記載の方法により行うことができる。
さらに、粒子表面に形成された支持膜に対し、任意成分を含むベシクルを支持膜にベシクル融合をさせてもよい。例えば、プロテオソーム等の任意のタンパク質を含むベシクルを、支持膜にベシクル融合させることで、任意のタンパク質を膜タンパク質として支持膜に担持させることができる。また、ベシクルは、人工膜だけでなく小胞体や筋小胞体、単離した細胞膜などの生体由来の膜を直接利用することもできる。
【００２５】
支持膜は、脂質二分子膜と呼ばれる構造を有していてもよい。脂質二分子膜は、一般的に、極性頭部と疎水性炭化水素鎖を併せ持つ両親媒性の脂質分子を構成成分とする単一膜が、疎水性炭化水素鎖が内側となるよう形成される構造体である。後述の本発明の一実施形態に係る検出方法において、脂質二分子膜を粒子本体の表面に支持した状態において、脂質二分子膜が液と接する面を支持膜の膜表面と呼び、炭化水素鎖が存在する領域を支持膜の膜内と呼ぶ。
【００２６】
＜デバイス＞
図２は、本発明の一実施形態に係るデバイスの構成を示す模式図である。
実施形態のデバイスは、同一基板上に，複数の流路を有してもよい。実施形態に係るデバイス３は、流路３１ａ，３１ｂと、前記流路に液Ｌを導入するための導入口３３ａ，３３ｂと、排出口３３ｃ，３３ｄと、を有する基板３０を備え、前記流路３１ａ，３１ｂ内に、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子１が充填されている。導入口は、基板の表面に開口し、導入口を通じて流路内へと液を導入可能である。なお、各導入口／排出口は、前記流路から液を排出するための排出口／導入口を兼ねることができる。すなわち、流体の流れの上流の開口であれば導入口として用いることができ、流体の流れの下流の開口であれば排出口として用いることができる。液Ｌとしては、後述の第１の液又は第２の液が挙げられる。
【００２７】
前記基板は、材料としては、例えばシリコン、石英、ガラス、サファイア等の無機材料や、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂等の樹脂を用いることができる。前記基板は、前記流路の壁面を構成する。
基板は、同一の材料で構成された２つの基板が積層された積層体であってよい。基板への流路の形成には、エッチング法などでウエハを削って溝を形成したり、蒸着法で壁を堆積して溝を形成したりした後に、別の基板で溝のフタをすればよい。流路の形成法としては、ダイシングソーを用いた簡便な方式や、ドライエッチング、ウェットエッチング、サンドブラスト法、ミリング法等が適用できる。ポリスチレンなどの樹脂については、射出成型法などで作製してもよい。
流路の材質および作製方法には、種々の方法が挙げられるが、ポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂を、鋳型を用いて作製する方法が好ましい。
【００２８】
基板は、互いに異なる材料で構成された２つの基板が積層された積層体であってよい。図２に示すように、基板３０は、ガラス基板３０ａと樹脂シート３０ｂとが積層された積層体である。このように、ガラス基板３０ａ上に、溝を形成した樹脂シート３０ｂを貼りつけることで、基板３０に流路を形成してもよい。
【００２９】
流路内の粒子をラマン分光法により観測するため、流路が形成された部分の少なくとも一部において、流路を基準とした基板の上面又は下面のいずれかは、ラマン散乱光を透過可能なものであってよい。基板が、２つの基板が積層された積層体である場合、少なくとも一方の基板は、ラマン散乱光を透過可能な透明基板であることが好ましい。
【００３０】
流路の幅は、１００μｍ〜１０００μｍ程度が好ましく、流路の高さは１０μｍ〜５００μｍ程度が好ましく、流路の長さは１ｍｍ〜１０ｍｍ程度が好ましい。上記に挙げたサイズの流路では、ポンプなどの外部の駆動力を使わなくても、毛管現象を利用して、液を簡単に送液することが可能である。また、複数本の流路を並列させる場合は、異なる流路からの液漏れを回避するため、流路の間隔は１０μｍ以上が好ましい。
【００３１】
＜検出方法＞
次に、実施形態のデバイス３を用いた検出方法について説明する。なお、本発明の検出方法は、下記実施形態のデバイスで実施されるものに限定されない。
【００３２】
実施形態の検出方法は、送液工程と、第二送液工程と、検出工程と、第二検出工程と、算出工程とを有する。以下各工程について説明する。
【００３３】
（送液工程）
送液工程は、粒子が設けられた前記流路内に、前記標的分子を含む第１の液を送液する工程である。
【００３４】
流路３１ａ内には、粒子１が充填されている。粒子１は、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する。流路３１aへと通じる導入口３３aから第１の液を導入し、流路３１a内に第１の液を送液する。第１の液は、支持膜と相互作用する標的分子を含む。送液は、第１の液が粒子と接触するまで行う。粒子との接触を経て流路３１aを通過した第１の液は、排出口３３ｃへと排出される。
粒子が設けられた前記流路内に、前記標的分子を含む第１の液を送液することにより、高効率に、支持膜と標的分子とを相互作用させることができる。また、用意する第１の液の量を少なくすることができ、少量のサンプルに対しても検出を行うことができる。
【００３５】
第１の液に含まれる標的分子としては、支持膜と相互作用し得るものであり、特に制限されない。標的分子としては、生理活性物質、低分子化合物、細胞、ベシクル、生体分子、生体高分子等が挙げられる。生体分子としては、脂質、アミノ酸、糖等が挙げられる。生体高分子としては、核酸、タンパク質、糖鎖等が挙げられる。細胞としては、動物細胞、植物細胞、微生物等が挙げられる。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。タンパク質としては、酵素、受容体、抗体等が挙げられる。
【００３６】
第１の液は、標的分子の他に、標的分子を溶解又は分散可能な媒体を含み得る。媒体としては、水、各種緩衝液等の液体が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００３７】
第１の液が送液されて流路内に導入されると、第１の液と粒子が接触し、第１の液に含まれる標的分子と支持膜との相互作用が生じる。ここで、標的分子と支持膜との相互作用としては、標的分子と支持膜との結合、標的分子と支持膜との吸着、標的分子の支持膜への貫入、支持膜の貫通等の状態を包含する。前記結合としては化学結合が挙げられ、共有結合、配位結合、イオン結合、水素結合、分子間力等の結合であってよい。
【００３８】
（第二送液工程）
本実施形態の送液工程は、第二送液工程を含む。
第二送液工程は、前記流路に、前記標的分子を含まない液、又は前記第１の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む液である第２の液を送液する工程である。
【００３９】
本実施形態では、デバイス３の流路３１ｂ内に第２の液を送液する。流路３１ｂ内には、流路３１a内と同じく、粒子１が充填されている。粒子１は、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する。流路３１ｂへと通じる導入口３３ｂから第２の液を導入し、流路３１ｂに第２の液を送液する。第２の液は、前記標的分子を含まない液、又は前記第１の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む。送液は、第２の液が粒子と接触するまで行う。粒子との接触を経て流路３１aを通過した第２の液は、排出口３３ｄへと排出される。
【００４０】
第２の液に含まれ得る標的分子は、第１の液で例示したものが挙げられる。第２の液が標的分子を含む場合、標的分子の量又は濃度に関して第１の液の対照として扱えるよう、第１の液と第２の液の標的分子は、同じ種類のものを用いることが好ましい。
【００４１】
第２の液に含まれてもよい媒体は、第１の液で例示したものが挙げられる。第１の液及び第２の液が媒体を含む場合、標的分子の量又は濃度に関して第１の液の対照として扱えるよう、第１の液と第２の液の媒体は、同じの種類のものを用いることが好ましい。
【００４２】
標的分子を含まない第２の液が流路内に導入されても、通常、第１の液に含まれる標的分子と支持膜との相互作用と、同一の相互作用は生じない。
前記第１の液とは異なる量又は濃度で前記標的分子を含む第２の液が流路内に導入されても、通常、第１の液に含まれる標的分子と支持膜との相互作用と、同一の程度の相互作用は生じない。
【００４３】
（検出工程）
検出工程は、前記粒子の支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び／又は前記支持膜と相互作用する標的分子、をラマン分光法により検出する工程である。
【００４４】
本実施形態では、流路３１a内の粒子の支持膜と、第１の液に含まれる標的分子との相互作用をラマン分光法により検出する。
【００４５】
ラマン分光法は、市販のラマン分光装置を用いて行うことができる。ラマン分光装置は、例えば、励起光を発生する光源、検出の対象に光を収束させる光学素子、ラマン散乱光を分光する分光器、ラマン散乱光を検出する検出器を備えることができる。
実施形態のデバイス３では、例えば、ラマン分光装置の光学素子を流路３１aへと向け、樹脂シート３０ｂを介して、ラマン散乱光を検出すればよい。
【００４６】
標的分子と支持膜とが相互作用すると、検出の対象とする支持膜の領域によって、少なくとも以下の２通りの検出を行うことを例示できる。
１）支持膜の構造変化を検出
標的分子によって支持膜の構造の変化が生じる場合、ラマン分光法によって、その変化を検出する。例えば、支持膜に標的分子が貫入し、その周囲の支持膜の構造に変化が生じた場合、その変化の存在を検出する。
２）標的分子を検出
標的分子自体を、ラマン分光法によって検出する。例えば、支持膜に標的分子が貫入した場合、標的分子の存在を検出する。
【００４７】
相互作用を検出するにあたり、標的分子と相互作用していない状態の支持膜の状態に関するデータを利用すれば、そのデータを参照データとして使用し、相互作用に起因するデータを判別することができる。参照データは、後述の第二検出工程で得てもよい。
【００４８】
（第二検出工程）
本実施形態の検出工程は、第二検出工程を含む。
本実施形態では、流路３１ｂ内の粒子の支持膜に対し、ラマン分光法による検出を行う。
実施形態のデバイス３では、例えば、ラマン分光装置の光学素子を流路３１ｂへと向け、樹脂シート３０ｂを介して、ラマン散乱光を検出すればよい。
第２の液が標的分子を含む場合、流路３１ｂ内の粒子の支持膜と、第２の液に含まれる標的分子との相互作用をラマン分光法により検出できる。
第２の液が標的分子を含まない場合、流路３１ｂ内の粒子の支持膜と、第１の液に含まれる標的分子との相互作用が生じていない状態についての、参照データを取得できる。
【００４９】
（算出工程）
算出工程は、粒子の支持膜と接触する前の第１の液と、粒子の支持膜と接触した後の第１の液について、それらの液に含まれる標的分子の量又は濃度の差を測定することにより、支持膜に相互作用した標的分子の絶対量を見積もる工程である。
【００５０】
粒子の支持膜と接触する前の第１の液は、例えば、流路３１aへと通じる導入口３３aから採取して得ることができる。前記送液工程を行った後、粒子の支持膜と接触した後の第１の液は、流路３１aへと通じる排出口３３ｃから採取して得ることができる。
導入口３３aから採取された第１の液に含まれる標的分子の濃度を測定し、排出口３３ｃから採取された第１の液に含まれる標的分子の濃度を測定する。標的分子は、流路３１aを通過する過程で、粒子の支持膜に捕捉される。その結果、導入口３３aから採取された第１の液に含まれる標的分子の量又は濃度よりも、排出口３３ｃから採取された第１の液に含まれる標的分子の量又は濃度のほうが低くなる。この量又は濃度の差を測定することにより、支持膜に相互作用した、第１の液の標的分子の絶対量を見積もることができる。
【００５１】
標的分子の量又は濃度の測定には、たとえば高速液体クロマトグラフィー法などを用いることができる。
【００５２】
流路３１ｂへと導入された第２の液が標的分子を含む場合には、第二算出工程として、上記の第１の液に係る算出工程と同様にして、支持膜に相互作用した、第２の液の標的分子の絶対量を見積もることができる。
【００５３】
なお、上記の実施形態では、送液工程、第二送液工程、検出工程、第二検出工程、算出工程について説明したが、本発明の検出方法において、送液工程、第二送液工程、第二検出工程、及び算出工程は、必須の工程ではない。
【００５４】
なお、上記の実施形態では、送液工程、第二送液工程、検出工程、第二検出工程、算出工程の順に説明しており、この通りの順番で各工程を実施してもよいが、各工程を行う順序は、必ずしも上記順番のとおりでなくともよい。例えば、送液工程と検出工程は、同時に行ってもよく、第二送液工程と第二検出工程は同時に行ってもよい。また、送液工程と、第二送液工程を同時に行うこともできる。また、第二送液工程及び第二検出工程を行った後に、送液工程及び検出工程を行ってもよい。
【００５５】
実施形態のデバイスによれば、実施形態の検出方法を実施できる。
【００５６】
実施形態の検出方法は、脂質を含有する支持膜と粒子本体とを有する粒子の、前記支持膜に標的分子が相互作用した場合の前記支持膜の構造の変化、及び／又は前記支持膜と相互作用する標的分子、を検出する。これにより、粒子を支持膜の基体に用いる場合、２次元平面を基体に用いる場合と比較して、支持膜を高密度に配置することが可能となり、高感度に対象を検出することが可能となる。また、生体膜と相互作用する標的分子についても、高密度化することが可能となるという利点がある。
【００５７】
実施形態の検出方法は、前記検出する手法として、ラマン分光法を用いる。これにより、支持膜と相互作用する標的分子を、蛍光分子などのラベル化剤を用いることなく、直接観測することを可能にする。また、大がかりな装置が不要で、簡易な測定が可能になるという利点も得られる。
【００５８】
実施形態の検出方法は、前記粒子が、基板に形成された流路内に設けられている。この流路に種々の標的分子を含む溶液もしくは参照となる溶液を送液し、支持膜の置かれた環境を変えることで、精度よく対象を検出することが可能となる。
【００５９】
実施形態の検出方法は、送液工程及び検出工程と、第二送液工程及び第二検出工程と、を有する。これにより、標的分子と相互作用する支持膜について、異なる条件下での比較実験が容易となる。また液以外の測定に関する条件を同一とすることで、精度のよい比較測定を可能とする。
【００６０】
実施形態の検出方法は、算出工程を有する。ラマン分光法の顕微測定は局所的な測定であるが、標的分子の量又は濃度測定と組み合わせることにより、標的分子の支持膜への相互作用の絶対量の見積もりを容易にするという利点がある。
【００６１】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００６２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
［実施例１］
（脂質膜を表面に有する粒子の製造）
脂質分子１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（以下、ＤＯＰＣ）のクロロホルム溶液（２．５ｇ／Ｌ）を調製した。得られたクロロホルム溶液は、はじめに窒素気流下においてクロロホルムを蒸発させ、次に真空下に１晩おいてクロロホルムをさらに除去した。ここにＤＯＰＣ濃度が１ｇ／ＬになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）を加えた。これに超音波照射を４５分間行い、ＤＯＰＣのベシクルを含む透明溶液を得た。この溶液に、市販のシリカビーズ（直径約５μｍ）を混合して、ベシクルフュージョン法によりビーズ表面に脂質二分子膜を形成した。ローテータを用いて１晩撹拌した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて３回洗浄（遠心分離機を用いてビーズを沈殿させ、ＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて撹拌する、を繰り返す）し、余分なベシクルを除去した。このようにして、シリカビーズ表面に支持された脂質膜（支持膜）の、ＨＥＰＥＳ緩衝液の分散溶液（１０ｇ／Ｌ）を得た。
【００６４】
［比較例１］
（脂質膜を表面に有する平面基板の製造）
上記の実施例において、シリカビーズに代えて２次元平面基板を用い、２次元平面基板上に、脂質膜（支持膜）を形成させた。
【００６５】
（ラマン分光法による検出）
まず、実施例１で得た粒子と、比較例１で得た平面基板とで、支持膜構造の観測結果を比較した。観測された支持膜に由来するピークは、以下の通りである。
１）１０５０−１１００ｃｍ−１
２）１２００−１３００ｃｍ−１
３）１４５０ｃｍ−１
４）１６６０ｃｍ−１
【００６６】
支持膜を担持する固体表面として、シリカビーズではなく２次元平面基板を用いた場合（比較例１）では、脂質膜に由来するラマンバンドのピーク強度が小さく（図３、破線）、強度変化を感度よく観測することができなかった。一方、支持膜を担持する固体表面として、シリカビーズを用いた場合（実施例１）では、脂質膜に由来するラマンバンドが、比較例１の数値に対し、３〜５倍程度に強く観測された（図３、実線）。よって、本発明の一実施形態の特徴であるシリカビーズに担持した支持膜を用いることで、高感度な測定が可能になったことが示された。
【００６７】
［実施例２］
（マイクロデバイス素子の製造）
脂質膜を表面に有するシリカビーズを流路内に充填したマイクロデバイス素子は、以下のように作製した。
ポリジメチルシロキサン樹脂を、鋳型を用いて流路作製した。流路は２本並んだ配置をとり、それぞれ幅３００μｍ、高さ１００μｍ、直線部の長さ５ｍｍ、直前部の２流路の間隔５０μｍの形状に成形した。流路の両端には、試料溶液を導入／排出するため、直径５００μｍの導入口／排出口が設けられている。この流路を、表面を親水処理したガラス基板に密着させて搭載した。
２本の流路に、実施例１で得た脂質膜を表面に支持したシリカビーズの分散溶液を導入し、流路内にシリカビーズを充填した（図２参照）。
【００６８】
（ラマン分光法による検出）
別途、（−）‐エピガロカテキン３‐ガラート（以下ＥＧＣＧ）をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ＝７．４）に溶解し、濃度の異なる３種類のＥＣＧＣ溶液（１μＭ，１０μＭ，１０ｍＭ）を作製した。２本の流路の一方に、ＥＧＣＧ溶液を、毛管現象による自己相液力により導入した。流路内が乾燥しないように飽和水蒸気雰囲気化にて３時間静置し、溶液中のＥＧＣＧを十分に支持膜と作用させた後、流路内の雰囲気をＨＥＰＥＳ緩衝液に置換し、支持膜に吸着したＥＧＣＧと支持膜の相互作用による支持膜構造の変化を、顕微ラマン分光法により検出した。
ＥＧＣＧを導入した流路と、ＥＧＣＧを導入していない参照用の流路において、得られたラマンスペクトルを比較した。４つのラマンピーク全てについて、強度が減少することを観測した（図４）。強度の減少の度合いは、１μＭ，１０μＭ，１０ｍＭと濃度が高くなるほど大きいことが分かった。よって、このピーク強度の変化は、ＥＣＧＣと支持膜の相互作用に由来し、その相互作用の大きさは、ＥＧＣＧの濃度が高いほど大きくなることが分かった。
【００６９】
以上から、本実施例により、本発明の一実施形態の検出方法を用いて、生体膜および膜を形成する脂質分子における、吸着分子との分子間相互作用に伴う構造変化を、蛍光分子などのラベル化剤を用いることなく直接観測できたことが示された。
【００７０】
［実施例３］
（ラマン分光法と高速液体クロマトグラフィー法との組み合わせ）
上記の実施例２でＥＧＣＧを導入した流路において、支持膜と接触する前の液体（液体１）を流路の上流の導入口から、支持膜と接触した後に流路の下流に送液された液体（液体２）を流路の下流の排出口から、それぞれマイクロシリンジで抽出し、高速液体クロマトグラフィー法を用いてＥＧＣＧ濃度の変化を測定した。その結果、濃度の異なる３種類のＥＣＧＣ溶液（１μＭ，１０μＭ，１０ｍＭ）においても、液体２のＥＧＣＧ濃度は、液体１よりも低い値となることが分かった。これは、シリカビーズ表面に支持された脂質膜上へのＥＧＣＧ吸着により、液体２中に存在するＥＧＣＧの分子数が減少したためと説明できる。
この液体１，２の濃度変化量から、シリカビーズ表面に支持された脂質膜上へのＥＧＣＧ吸着絶対量を見積もると、２０−５０ｎｇ／ｃｍ２程度であった。
【００７１】
以上から、本実施例により、溶液の濃度測定との組み合わせを可能とし、吸着の絶対量の見積もりを容易にするという本発明に係る検出方法の利点が示された。
【符号の説明】
【００７２】
１…粒子、１０…粒子本体、１２…支持膜、３…デバイス、３０…基板、３０ａ…ガラス基板、３０ｂ…樹脂シート、３１ａ，３１ｂ…流路、３３ａ，３３ｂ…導入口、３３ｃ，３３ｄ…排出口、Ｌ…液
【図１】
2018072134.tif 000003
【図２】
2018072134.tif 000004
【図３】
2018072134.tif 000005
【図４】
2018072134.tif 000006