(57)【要約】      （修正有）【課題】ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を確実に判定することのできる分化判定方法及び分化マーカーを提供する。【解決手段】ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法は、（ａ）ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させて被験細胞を得る工程と、（ｂ）前記被験細胞におけるＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、他特定の２０種から少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程と、を含むｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法。前記工程（ｂ）の後に更に、前記被検細胞におけるＨＭ９、ＧＭ２又はＧＭ３から少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、前記ｉＰＳ細胞における発現量と比較して、減少している場合、軟骨細胞に誘導されりると判定する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させて被験細胞を得る工程と、
（ｂ）前記被験細胞におけるＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程と、
を含むｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の後にさらに、前記被験細胞におけるＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、前記ｉＰＳ細胞における発現量と比較して増加している場合、前記被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の分化判定方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）の後にさらに、前記被験細胞におけるＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、前記ｉＰＳ細胞における発現量と比較して減少している場合、前記被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の分化判定方法。
【請求項４】
ＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカー。
【請求項５】
ＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量増加により、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定する、
ことを特徴とする請求項４に記載の分化マーカー。
【請求項６】
ＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量減少により、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定する、
ことを特徴とする請求項４に記載の分化マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法及びｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の再生医療への応用に関しては、癌化や脱分化（標的細胞以外への分化）といった生物学的リスクの回避が不可欠である。これに対する重要な戦略の一つは、幹細胞から標的とする成熟細胞（軟骨細胞など）への分化マーカーを利用することである。理想的な分化マーカーの条件は、分化誘導シグナルに対し鋭敏に反応し、かつその分化制御機能が証明されていることである。
【０００３】
これまで、タンパク質、プロテオグリカン等をターゲットとした軟骨細胞の分化マーカーの探索研究が数多く行われてきた。
【０００４】
非特許文献１−３では、Ｓｏｘ９を軟骨分化誘導マーカーとして使用することが報告されている。また、非特許文献４には、アグリカンを分化マーカーとして使用し得ることが示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｋｉｙａｍａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｏｘ９  ｈａｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ５  ａｎｄ  Ｓｏｘ６．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００２；１６：２８１３-２８２８．
【非特許文献２】Ａｋｉｙａｍａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｏｘ９  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４；  １８：１０７２-１０８７．
【非特許文献３】Ｙｕｋｉｏ  Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｗｐ２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｌａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｏｘ９  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ２５．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：２５１．２０１１
【非特許文献４】渡辺秀人，軟骨アグリカンとコンドロイチン硫酸合成機構生化学，第８０巻第１号，２００８年１月，２８−３２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１−３に記載のＳｏｘ９及び非特許文献４に記載のアグリカンは、あらゆる細胞由来の軟骨細胞に発現するものであった。また、Ｓｏｘ９及びアグリカンは、軟骨細胞に分化した後に発現するマーカーであるため、軟骨細胞に完全に分化する前の状態の細胞（軟骨様細胞等）が将来的に軟骨細胞に分化し得るか否かまでは判別できるものではなかった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を確実に判定することのできる分化判定方法及び分化マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法は、
（ａ）ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させて被験細胞を得る工程と、
（ｂ）前記被験細胞におけるＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程と、
を含む。
【０００９】
例えば、前記工程（ｂ）の後にさらに、前記被験細胞におけるＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、前記ｉＰＳ細胞における発現量と比較して増加している場合、前記被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含む。
【００１０】
例えば、前記工程（ｂ）の後にさらに、前記被験細胞におけるＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、前記ｉＰＳ細胞における発現量と比較して減少している場合、前記被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含む。
【００１１】
本発明の第２の観点に係るｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカーは、ＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。
【００１２】
例えば、ＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量増加により、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定する。
【００１３】
例えば、ＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量減少により、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を確実に判定することのできる分化判定方法及び分化マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】軟骨分化誘導に伴う糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖発現の解析結果を示す図である。（ａ）はＢＭＳＣｓ−ＤＣｓ、ｉＰＳＭＳＣ−ＤＣｓ等におけるＮ−結合型糖鎖の発現を表す図であり、（ｂ）はｉＰＳ−ＭＳＣｓにおけるＨＭ５及びＨＭ９の発現を表す図である。
【図２】軟骨分化誘導に伴う糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）発現の解析結果を示す図である。
【図３】軟骨分化誘導に伴う糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）発現の解析結果を示す図である。
【図４】Ｎ−結合型糖鎖の生合成経路を示す図である。
【図５】軟骨分化誘導に伴う糖脂質の糖鎖発現の解析結果を示す図である。（ａ）はＢＭＳＣｓ−ＤＣｓ、ｉＰＳＭＳＣ−ＤＣｓ等におけるＧＳＬの発現を表す図であり、（ｂ）はｉＰＳ−ＭＳＣｓにおけるＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１の発現を表す図である。
【図６】多重免疫染色の結果を示す図である。（ａ）はＤＡＰＩの免疫染色標本を表す図、（ｂ）はＳｏｘ９の免疫染色標本を表す図、（ｃ）はＳｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａの免疫染色標本を表す図、（ｄ）はすべての多重免疫染色標本を表す図、（ｅ）はＳｏｘ９＋ＳＬＡ（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ）の免疫染色標本を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
まず、本実施形態におけるｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法について詳細に説明する。
【００１７】
本実施形態におけるｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法は、
（ａ）ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させて被験細胞を得る工程と、
（ｂ）前記被験細胞におけるＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する工程と、
を含む。
【００１８】
本実施形態におけるｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化判定方法は、
ＨＭ５、
ＨＭ９、
からなる群より選択されるＮ−結合型糖鎖のハイマンノース型糖鎖、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
からなる群より選択されるＮ−結合型糖鎖のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖、
ＧＭ２及び
ＧＭ３
からなる群より選択されるガングリオシド、
Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ及び
Ｌｅｗｉｓ  Ａ
からなる群より選択されるラクト系糖鎖、並びに
Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１
からなる群より選択されるラクト系又はグロボ系糖鎖
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖を分化マーカーとして用いるものである。各糖鎖を表１に列挙する。
【００１９】
【表１】
2018023297.tif 000002
【００２０】
本実施形態による分化判定方法によって、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導された細胞について、ｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞を経て軟骨細胞に至るまでの過程において、軟骨分化誘導されているか否かを判別することができる。当該分化判定方法によれば、例えば、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて完全に軟骨細胞に分化した細胞を選別することができ、また、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経て軟骨細胞に分化する途中の段階の細胞（間葉系幹細胞、軟骨用細胞等を含む）を選別することができる。このように、当該分化判定方法によって、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させた細胞について、完全に軟骨細胞に分化する前の状態の細胞についても将来的に軟骨細胞に分化するか否かを予想することができる。なお、当該分化判定方法は、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させた細胞について用いることができるものであり、ｉＰＳ細胞以外の他の細胞（例えば、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣｓ））から軟骨分化誘導させた細胞については、軟骨分化誘導されているか否かを判別することはできない。
【００２１】
本明細書において、「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞又は誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性と自己複製能を獲得した細胞である。マウスｉＰＳ細胞の樹立に用いた４遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣを、ヒト由来線維芽細胞に導入してヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功したことが報告されている（Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２，２００７）。本実施形態で使用されるｉＰＳ細胞は、上記のような公知の方法により作製されたｉＰＳ細胞であってもよく、今後見出される新たな方法により作製されたｉＰＳ細胞であってもよい。また、本実施形態ではｉＰＳ細胞として、ヒト、マウス等の任意の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。
【００２２】
工程（ａ）の「ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導」する方法としては、例えば、ｉＰＳ細胞を間葉系幹細胞培養用培地にて培養して継代した後、軟骨誘導培地にて培養して軟骨細胞に分化誘導する方法等が挙げられる。ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導できる方法であれば、適宜採用され得る。
【００２３】
工程（ａ）の「被験細胞」とは、ｉＰＳ細胞に軟骨分化誘導を行った結果得られた細胞であり、前述の完全に軟骨細胞に分化した細胞及び間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経て軟骨細胞に分化する途中の段階の細胞の他、軟骨分化誘導を行ってもなお未分化の状態で間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）まで至っていない細胞、軟骨分化誘導を行ったにもかかわらず癌細胞など他の細胞に分化された細胞などを含み得る。
【００２４】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた被験細胞におけるＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を測定する。これらの糖鎖のうち複数の組み合わせの糖鎖の発現量を測定してもよい。
【００２５】
本明細書において、「ＨＭ５」とは、“Ｎ−結合型糖鎖”のハイマンノース型糖鎖であり、（Ｍａｎ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される糖鎖である。
【００２６】
本明細書において、「ＨＭ９」とは、“Ｎ−結合型糖鎖”のハイマンノース型糖鎖であり、（Ｍａｎ）６＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される糖鎖である。
【００２７】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）であり、例えば、（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００２８】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）であり、例えば、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００２９】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）であり、例えば、（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３０】
本明細書において、「（（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）であり、例えば、（Ｇａｌ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３１】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３２】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３３】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）２（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３４】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３５】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）２（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３６】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２」は“Ｎ−結合型糖鎖”のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２で表される。
【００３７】
本明細書において、「ＧＭ２」とは、“Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖”の一つであり、「（Ｈｅｘ）２（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」で表される糖鎖であって、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００３８】
本明細書において、「ＧＭ３」とは、“Ｇｇ系列ＧＳＬ糖鎖”の一つであり、「（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」で表される糖鎖であって、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００３９】
本明細書において、「Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ」とは、ルイス糖鎖であり、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１で表される糖鎖であって、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００４０】
本明細書において、「Ｌｅｗｉｓ  Ａ」とは、ルイス糖鎖であり、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１で表される糖鎖であって、例えば、（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００４１】
本明細書において、「Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５」とは、ラクト又はグロボ系ＧＳＬ糖鎖であり、（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｇｌｃ）１で表される糖鎖である。
【００４２】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」とは、ラクト又はグロボ系ＧＳＬ糖鎖であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｇｌｃ）１で表される。
【００４３】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１」とは、ラクト又はグロボ系ＧＳＬ糖鎖であり、例えば、（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００４４】
本明細書において、「（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」とは、ラクト又はグロボ系ＧＳＬ糖鎖であり、例えば、（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｇｌｃ）１で表される。
【００４５】
工程（ｂ）において、糖鎖の発現量を測定する方法は、公知の方法が用いられるが、例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。
【００４６】
工程（ｂ）の後にさらに、前記の被験細胞におけるＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、（軟骨分化誘導前の）ｉＰＳ細胞における発現量と比較して増加している場合、被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含んでいてもよい。
【００４７】
工程（ｂ）の後にさらに、前記の被験細胞におけるＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量が、（軟骨分化誘導前の）ｉＰＳ細胞における発現量と比較して減少している場合、被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する工程を含んでいてもよい。
【００４８】
上記の「被験細胞は軟骨細胞に分化誘導されていると判断する」とは、ｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞を経て軟骨細胞に至るまでの過程において、軟骨分化誘導されているか否かを判別することであり、例えば、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて完全に軟骨細胞に分化した細胞であると判断することであり、また、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経て軟骨細胞に分化する途中の段階の細胞（間葉系幹細胞、軟骨用細胞等を含む）であると判断することも含む。
【００４９】
次に、本実施形態におけるｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカーについて説明する。
【００５０】
本実施形態におけるｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカーは、ＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。
【００５１】
上記の「ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定する」とは、ｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞を経て軟骨細胞に至るまでの過程において、軟骨分化誘導されているか否かを判別することであり、例えば、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて完全に軟骨細胞に分化した細胞であると判定することであり、また、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経て軟骨細胞に分化する途中の段階の細胞（間葉系幹細胞、軟骨用細胞等を含む）であると判定することも含む。
【００５２】
上記のＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１の糖鎖については、前述同様である。これらの糖鎖のうちの複数を組み合わせて分化マーカーとして用いてもよい。
【００５３】
ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させる過程において、例えば、ＨＭ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量増加が確認された場合、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定することができる。
【００５４】
ｉＰＳ細胞を軟骨分化誘導させる過程において、例えば、ＨＭ９、ＧＭ２及びＧＭ３からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量減少が確認された場合、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定することができる。
【００５５】
以上説明したように、本実施形態の分化判定方法及び分化マーカーによれば、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて完全に軟骨細胞に分化した細胞であることを確実に判定することができる。また、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させて間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経て軟骨細胞に分化する途中の段階の細胞（間葉系幹細胞、軟骨用細胞等を含む）であることを確実に判定することができ、将来的に軟骨細胞に分化するか否かを予想することが可能である。したがって、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させた細胞を患者に移植する際に、良好に分化可能な細胞とそうでない細胞とを判別し、良好に分化可能な細胞のみを選別して移植することができる。
【００５６】
また、本実施形態の分化判定方法及び分化マーカーによれば、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させた細胞を患者に移植した後に、例えば癌化した場合、癌化した部位の細胞における本実施形態の分化マーカーの挙動を調べることで、癌化の原因が移植した細胞によるものか否かを判別することができる。
【００５７】
また、本実施形態の分化判定方法及び分化マーカーによれば、ｉＰＳ細胞治療の治療効果の情報を得ることができる。より具体的には、ｉＰＳ細胞から軟骨分化誘導させた細胞を患者に移植した後に、移植部位の軟骨組織における本実施形態の分化マーカーの挙動を調べることで、ｉＰＳ細胞からどの程度軟骨細胞への分化誘導に成功し、どの程度軟骨細胞として移植部位に定着しているのかを把握することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
マウス人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣｓ）から段階的に軟骨細胞へと分化誘導し、エンドグリコセラミダーゼ及びグライコブロッティング法により糖鎖の網羅的解析を行った。
【００６０】
（軟骨様細胞の調製）
（１）ｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を経由する多段階ステップによる軟骨細胞分化誘導
ｏｎ  ｆｅｅｄｅｒのプロトコルによりｉＰＳ細胞を培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１−９．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．）。ｉＰＳ細胞のコロニーを確認した後、該コロニーをトリプシンで剥がし収集した。収集した細胞を分散し、セルストレーナー（φ４０μｍ）で濾過した。濾過したｉＰＳ細胞を遠心後、上清を除き、間葉系幹細胞培養用培地（ＤＭＥＭＨＧ（Ｇｉｂｃｏ）：１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１％  非必須アミノ酸、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、５ｎｇ／ｍＬ  ヒト組み換えｂＦＧＦを含む（インビトロジェン社））に再度分散した。分散したｉＰＳ細胞を至適濃度でゼラチンコートしたｄｉｓｈに播種した。約一週間程度の培養の後、接着し８０％程度コンフルエントになった細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）を継代した。継代を５−７回繰り返したものを軟骨分化誘導のステップに使用した。
【００６１】
（２）ｉＰＳ−ＭＳＣｓ及び骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣｓ）からの軟骨様細胞の分化誘導
ｉＰＳ−ＭＳＣｓ及びＢＭＳＣｓに対して、ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｓｏｕｎｇ  ｄｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｕｎｘ３／ＡＭＬ２／Ｃｂｆａ３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００７；２２：１２６０−７０．）を行い、軟骨様細胞に分化誘導した。軟骨誘導培地として、１％  ＫＳＲ（インビトロジェン社）、１％  ＩＴＳ＋  ｐｒｅｍｉｘ（ヒト組み換えインスリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸、ＢＳＡ及びリノール酸を含有する；ＢＤバイオサイエンス社）、４０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−プロリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％  非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸及び１０−７Ｍ  デキサメタゾン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＨＧ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた。アルギン酸ビーズ形成の２日目、高効率に軟骨細胞を分化させるために、培養系をヒト組み換えＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄシステムズ社）で処理した。培地及び成長因子を１週間に３回、置換した。軟骨分化誘導後、各タイムポイント（培養１日後＝Ｄａｙ１、培養７日後＝Ｄａｙ７、培養１４日後＝Ｄａｙ１４、培養２１日後＝Ｄａｙ２１、培養２８日後＝Ｄａｙ２８）の細胞を４℃のＰＢＳで６回洗浄し、スクレイパーを用いてサンプルを確保した。
【００６２】
調製した細胞について、クロロフォルム−メタノール抽出によって、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）画分と、ペレットに含まれるタンパク質画分と、に分画した。
【００６３】
スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）画分については酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５、４８μＬ）に溶解し、エンドグリコセラミダーゼＩ（ＥＧＣａｓｅ  Ｉ、２５ｍＵ、２μＬ）を加え、３７℃で１６時間インキュベートし、ＧＳＬより糖鎖を切断した。
【００６４】
１０μｇ相当のタンパク質画分を重炭酸アンモニウム緩衝液（３３０ｍＭ、３０μＬ）に溶解し、ＤＴＴ（１２０ｍＭ、１０μＬ）を加え、室温で３０分インキュベートした。次にＩＡＡ（１２３ｍＭ、２０μＬ）を加え、６０分間暗所で放置した。４倍量のエタノールを加え、−３０℃で３時間静置し、遠心をした後ペレットを回収した。回収したタンパク質を含むペレットを、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む重炭酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ、９３μＬ）に溶解し、トリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ、５μＬ）を加え消化した。１０分間９０℃で加熱し酵素を失活した後、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（１ｕｎｉｔ／μＬ、２μＬ）を加え、Ｎ結合型糖鎖を切断した。
【００６５】
切断した糖鎖を含むサンプルに、内部標準として非天然型糖鎖Ａ２ＧＮ１を１０ｐｍｏｌ加え、グライコブロッティング法により糖鎖を精製し、ＨＩＬＩＣ樹脂（Ｗａｔｅｒｓ）  を用いた順相カラムにより過剰試薬を除去した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより糖鎖解析を行った。
【００６６】
糖タンパク質の解析結果を図１−３に示す。図１（ａ）において、「ＢＭＳＣｓ」は骨髄間葉系幹細胞を表し、「ｉＰＳ−ＭＳＣｓ」はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞様細胞を表し、「ＢＭＳＣ−ＤＣｓ」は骨髄間葉系幹細胞由来軟骨細胞（ＢＭＳ−Ｄｅｒｉｖｅｄ−Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を表し、「ｉＰＳＭＳＣ−ＤＣｓ」はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞様細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣｓ）由来軟骨細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣ−Ｄｅｒｉｖｅｄ−Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を表し、「Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ」は軟骨細胞を表す（後述する図５（ａ）においても同様）。ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、Ｎ−結合型糖鎖のハイマンノース型糖鎖であるＨＭ５の発現が増加することが示された（図１（ｂ））。また、ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、Ｎ−結合型糖鎖のハイマンノース型糖鎖であるＨＭ９の発現が減少することが示された（図１（ｂ））。一方で、ｉＰＳ細胞由来ではないＢＭＳＣｓでは、糖鎖の著明な変化は認められなかった。また、ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、ＢＭＳＣｓに比して、Ｎ−結合型糖鎖のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ｎｅｕｔｒａｌ型）である
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の発現が増加することが示された（図２）。また、ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、ＢＭＳＣｓに比して、Ｎ−結合型糖鎖のＣｏｍｐｌｅｘ型糖鎖（ａｃｉｄｉｃ型）である
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の発現が増加することが示された（図３）。参考として、図４にＮ−結合型糖鎖の生合成経路を示す。
【００６７】
糖脂質の解析結果を図５に示す。培養１日後においてｉＰＳ−ＭＳＣｓ及びＢＭＳＣｓの糖鎖のプロファイルはＧＭ２を除き大部分が近似していた。ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、ガングリオシドであるＧＭ２及びＧＭ３の発現が減少することが示された（図５（ｂ））。また、ｉＰＳ−ＭＳＣｓにおいて、軟骨分化誘導に伴い、
Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、
Ｌｅｗｉｓ  Ａ、
Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１
の発現が増加することが示された（図５（ｂ））。一方で、ｉＰＳ細胞由来ではないＢＭＳＣｓでは、糖鎖の著明な変化は認められなかった。
【００６８】
（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ抗体の実験）
軟骨分化誘導後、培養２８日後のｉＰＳ−ＭＳＣｓを用いて、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ及び軟骨転写因子であるＳｏｘ９に対して、多重免疫染色を行った。サンプルは染色後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、それぞれ抗体の共発現を確認した。
【００６９】
抗体として、抗ＳＯＸ９抗体  １００μｇ（アブカム社、ａｂ２６４１４）、抗Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａモノクローナル抗体（１Ｈ４）（東京化成社、Ａ２５８４）、抗Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ抗体（７ＬＥ）（アブカム社、ａｂ３９６７）及び抗Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ抗体（Ｐ１２）（アブカム社、ａｂ３３５８）を用いた。
【００７０】
蛍光免疫染色を以下の通り行った。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定し、ＴＢＳ（３００μＬ）で３回洗浄した後、１００％メタノールで１５分間固定し、ＴＢＳで３回洗浄した。１時間ブロッキング（ＴＢＳ＋０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋５％  ウマ血清）を行った後、ＴＢＳ＋０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋５％  ウマ血清に希釈した一次抗体を加えて、２４ウェルプレートで、１ウェル当たり１５０μＬとし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳ＋０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋３−５％  ウマ血清中の二次抗体（１：１０００）を加えて、室温で１時間インキュベートした。この工程の後、蛍光の退色を回避するために遮光した。ＴＢＳで３回洗浄した後、スライドガラス上に１０μＬの封入剤（ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ又はＭｏｗｉｏｌ）を置き、カバーガラスをかぶせて、共焦点レーザー顕微鏡での観察に供した。
【００７１】
結果を図６に示す。図６（ａ）はＤＡＰＩの免疫染色標本、図６（ｂ）はＳｏｘ９の免疫染色標本、図６（ｃ）はＳｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａの免疫染色標本、図６（ｄ）はすべての多重免疫染色標本、図６（ｅ）はＳｏｘ９＋ＳＬＡ（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ）の免疫染色標本である。Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａは、細胞膜付近で高発現しており（図６（ｃ））、さらに、軟骨特異的転写因子であるＳｏｘ９を発現している細胞のみにおいて発現していることが明らかとなった（図５（ｅ））。
【００７２】
以上より、ＨＭ５、ＨＭ９、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｆｕｃ−（ｎ）Ｌｃ５、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１及び（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１は、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導を判定するための分化マーカーとして有用であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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