(57)【要約】【課題】本発明の課題は、製造コストを低く抑えることができることを期待することができる細胞性免疫活性化組成物を提供することにある。【解決手段】本発明に係る細胞性免疫活性化組成物は、菌体外多糖体を有効成分とする。なお、菌体外多糖体は、乳酸菌によって生成されるものであることが好ましい。また、乳酸菌は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）であることが好ましい。【選択図】図１
2018203698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体外多糖体を有効成分とする細胞性免疫活性化組成物。
【請求項２】
前記菌体外多糖体は、菌体外多糖体生成乳酸菌によって生成される
請求項１に記載の細胞性免疫活性化組成物。
【請求項３】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）である
請求項１に記載の細胞性免疫活性化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞性免疫活性化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去に、細胞性免疫の活性化などを目的とした飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、化粧品（以下「細胞性免疫活性化組成物」という。）に利用可能な化合物として「フコイダンオリゴ糖」を利用することが提案されている（例えば、特開２００７−０３９３４１号公報等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−０３９３４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、フコイダンオリゴ糖を得るためには、藻類からフコイダンを抽出した後、そのフコイダンを酸や酵素を用いて加水分解する必要がある。
【０００５】
このように、フコイダンオリゴ糖を得るためには少なくとも抽出・加水分解の２つの工程を経る必要があり、製造時のランニングコストや人件費が高くなってしまうおそれが高い。このため、フコイダンオリゴ糖を利用する細胞性免疫活性化組成物の製造コストが高くなってしまうことが十分に想定される。
【０００６】
本発明の課題は、製造コストの抑制を期待できる細胞性免疫活性化組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１局面に係る細胞性免疫活性化組成物は、菌体外多糖体を有効成分とする。すなわち、菌体外多糖体を細胞性免疫活性化組成物としてまたはその一成分として使用する。なお、菌体外多糖体は、菌体外多糖体生成乳酸菌によって生成されるものであることが好ましい。また、乳酸菌は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）であることが好ましく、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ−１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１）であることが特に好ましい。また、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる。
【０００８】
本願発明者らの鋭意検討の結果、本発明の第１局面に係る菌体外多糖体が、生物（ヒトを含む）の細胞性免疫を活性化させて病原体の感染や腫瘍の発生を抑制することができることが明らかとされた。すなわち、細胞性免疫活性化組成物は、病原体感染抑制組成物または腫瘍発生抑制組成物であるとも言える。また、細胞性免疫の活性化は、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることによって実現されていることも明らかになっている。したがって、細胞性免疫活性化組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞活性化組成物であるとも言える。つまり、菌体外多糖体は、生物（ヒトを含む）の細胞性免疫を有効に活性化させることができる。
【０００９】
そして、この菌体外多糖体は、例えば、菌体外多糖体を生成し得る特定の乳酸菌を乳に投入しその乳を発酵させることによって生成することができる。すなわち、この菌体外多糖体は基本的に一工程で製造することができる。このため、菌体外多糖体を利用する細胞性免疫活性化組成物は、製造コストを抑制できることが期待できる。
【００１０】
本発明の第２局面に係る方法は、菌体外多糖体を細胞性免疫活性化剤として使用する方法、すなわち細胞性免疫活性化剤としての使用のための菌体外多糖体を提供することである。
【００１１】
本発明の第３局面に係る方法は、上述の細胞性免疫活性化組成物を経口投与することにより細胞性免疫を活性化させることである。なお、投与期間は、１週間以上であることが好ましく、２週間以上であることがより好ましく、３週間以上であることがさらに好ましく、４週間以上であることが特に好ましい。
【００１２】
本発明の第４局面に係る菌体外多糖体の使用は、細胞性免疫を活性化させるための組成物の製造のための行為である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】メラノーマ抗原で免疫したマウスを用いた実施例・比較例（実施例１・実施例２・比較例１・比較例２・比較例３・比較例４）の抗原・菌体外多糖体の培地添加条件およびその条件から得られる結果をまとめたグラフ図である。
【図２】インフルエンザウイルス抗原で免疫したマウスを用いた実施例・比較例（実施例３・比較例５・比較例６・比較例７）の抗原・菌体外多糖体の培地添加条件およびその条件から得られる結果をまとめたグラフ図である。
【図３】非免疫マウスを用いた実施例・比較例（比較例８・比較例９・比較例１０・比較例１１）の抗原・菌体外多糖体の培地添加条件およびその条件から得られる結果をまとめたグラフ図である。
【図４】ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原で免疫したマウスを用いた実施例・比較例（実施例４・比較例１２・比較例１３・比較例１４）の抗原・菌体外多糖体の培地添加条件およびその条件から得られる結果をまとめたグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下では、本発明の実施の形態を示すことにより本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下に記載する個々の形態には限定されない。
【００１５】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、菌体外多糖体を有効成分として含む。ここで、菌体外多糖体は、菌体外多糖体を生成する能力を有する特定の乳酸菌（以下「菌体外多糖体生成乳酸菌」と称する。）が乳を発酵する際に生成され得る。すなわち、菌体外多糖類は、菌体外多糖体生成乳酸菌を乳入りの培地で培養した際の培養物、代謝物等に含まれ得る。乳は、哺乳動物から得られる。ここで、哺乳動物の種類は特に限定されないが、例えば、ヒト，サル，ゴリラ，マントヒヒ，チンパンジー等の霊長動物や、ウマ，ウシ，スイギュウ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ラクダ，シカ等の家畜動物、イヌ，ネコ等の愛玩動物等が挙げられる。また、乳は、生乳であることが好ましいが、その加工品である殺菌乳，脱脂乳，全脂粉乳，部分脱脂乳，脱脂粉乳，全脂濃縮乳，脱脂濃縮乳，クリーム，バター，バターミルク，ホエイ，ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ），ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）等であってもよい。
【００１６】
菌体外多糖体生成乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）が挙げられる。なお、この乳酸菌の中でもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１）が特に好ましい。ここで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１０７３Ｒ−１株は、２００６年１１月２９日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に、受託番号でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。なお、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの特許微生物寄託業務は２０１２年４月１日をもって独立行政法人製品評価技術基盤機構に承継されており、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターは２０１３年４月１日をもって日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構事業所内に移転している。
【００１７】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、動物、特にヒトに摂取されることによって、その機能を発揮する。なお、ここにいう「ヒト」は、老若男女を問わず、乳児から高齢者まで、幅広い年齢層のヒトであってよい。すなわち、この細胞性免疫活性化組成物は、例えば、子供の細胞性免疫活性化、成人や高齢者の細胞性免疫活性化のために用いることができる。また、ここにいう「摂取」とは、ヒトの体内に入れば摂取経路に限定はなく、例えば、経口摂取、経管摂取、経腸摂取など、公知の摂取方法の全てによって実現され得る。このとき、典型的には、消化管を経由する経口摂取、経腸摂取が挙げられるが、経口摂取が好ましく、飲食による経口摂取がより好ましい。
【００１８】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物には、菌体外多糖体が含まれていればそれでよく、その含有量は特に限定されないが、細胞性免疫活性化組成物が液状体である場合、菌体外多糖体は３０μｇ／ｍＬ以上含有されるのが好ましく、６０μｇ／ｍＬ以上含有されるのがより好ましく、９０μｇ／ｍＬ以上含有されるのがさらに好ましく、１２０μｇ／ｍＬ以上含有されるのがさらに好ましく、１５０μｇ／ｍＬ以上含有されるのが特に好ましい。なお、菌体外多糖体の含有量は多ければ多いほどその効果が高まることが期待されるが、上限は、例えば０．５ｍｇ／ｍＬである。
【００１９】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物の単位包装あたりの質量は特に限定されないが、効果を十分に得ることができ且つ一回で摂取し切りやすいとの観点から、５０ｇ以上５００ｇ以下の範囲内であることが好ましく、６０ｇ以上２００ｇ以下の範囲内であることがより好ましく、８０ｇ以上１５０ｇ以下の範囲内であることがさらに好ましく、１００ｇ以上１２０ｇ以下の範囲内であることが最も好ましい。また、上述の単位包装とは、袋、箱、容器当たりの単位包装のみならず、それらに含まれる一回あたりの単位包装であってもよいし、一日当たりの単位包装であってもよい。なお、複数の日数、例えば１週間分の摂取に適切な数量をまとめて包装したもの、または複数の個包装を含むもの等とすることもできる。
【００２０】
本発明の実施の形態において、細胞性免疫活性化組成物は、１週間以上、好ましくは２週間以上、より好ましくは４週間以上、継続して摂取することが望ましい。なお、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は安全に摂取できるため、摂取期間は特に限定されず、永久的に継続することができる。また、この細胞性免疫活性化組成物は、一部の期間にのみ継続的に摂取されてもよいし、任意の期間で断続的に摂取されてもよい。
【００２１】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、医薬品または飲食品として使用することができる。その医薬品または飲食品は、細胞性免疫活性化効果を有する点で有用である。本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を医薬品または飲食品として使用する場合には、単独の菌体外多糖体生成乳酸菌から得られた菌体外多糖体を使用してもよく、または２種類以上の菌体外多糖体生成乳酸菌から得られた菌体外多糖体を組み合わせて使用してもよい。
【００２２】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を医薬品または飲食品として利用するに際し、細胞性免疫活性化組成物の状態は限定されず、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕した破砕物などの状態のものを使用することができる。
【００２３】
さらに、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、保健機能食品や病者用食品（細胞性免疫活性化食品等）とすることもできる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたものである。そして、同制度では、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型が規定されている。本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を、特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として、ヒト等の動物に投与することにより、例えば、細胞性免疫の活性化が可能となる。
【００２４】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物に、その用途、効能、機能、有効成分の種類、機能性成分の種類、摂取方法などの説明を表示することが好ましい。ここにいう「表示」は、医薬品、医薬部外品、保健機能食品、特定保健用食品、一般食品、健康補助食品、健康食品およびサプリメントそれぞれにおいて適した表示とすべきである。また、ここにいう「表示」には、需要者に対して上記説明を知らしめるための全ての表示が含まれる。この表示は、上述の表示内容を想起・類推させ得るような表示であればよく、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体などの如何に拘わらない全てのあらゆる表示を含み得る。例えば、製品の包装・容器に上記説明を表示すること、製品に関する広告・価格表もしくは取引書類に上記説明を表示して展示もしくは頒布すること、またはこれらを内容とする情報を電磁気的（インターネットなど）方法により提供することが挙げられる。
【００２５】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を包装してなる製品が例えば飲食品である場合、その飲食品には、例えば「細胞性免疫活性化」との表示や、「細胞性免疫を活性化させる」との表示が付されることが好ましい。
【００２６】
なお、以上のような表示を行うために使用する文言は、上述の例に限定されず、そのような意味と同義である文言であってもかまわない。そのような文言としては、例えば、需要者に対して、「細胞性免疫が活性化する」、「病原体の感染抑制に役立つ」あるいは「腫瘍の発生抑制に役立つ」等の種々の文言が許容され得る。
【００２７】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を飲食品とする場合、飲食品の種類は特に限定されない。飲食品は、例えば、牛乳、加工乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、その他の乳製品、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、乳幼児用粉乳等食品、妊産婦・授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等であってよい。このような飲食品の製造にあたっては、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物の有効成分である菌体外多糖体をそのまま使用したり、他の飲食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の食品組成物における製法を利用することができる。また、飲食品の形状についても特に限定されず、通常用いられる飲食品の形状であればかまわない。例えば、固体状（粉末、顆粒状を含む）、ペースト状、液状、懸濁状などのいずれの形状でもよく、またこれらに限定されない。このとき、乳飲料、発酵乳、清涼飲料、ゼリー飲料、タブレット、粉末食品がより好ましく、ヨーグルトはさらに好ましい。
【００２８】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物の有効成分である菌体外多糖体には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー、機能性成分、食品添加物等、通常の食品に含まれる成分であれば問題なく添加することができる。上記飲食物の製造において、タンパク質源として、例えば大豆タンパク質、乳タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物等の、食品製造に通常使用されるタンパク質またはタンパク質含有原材料を使用することができる。糖類の供給源の例としては、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質源としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロテン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。機能性成分として、例えばオリゴ糖、グルコサミン、コラーゲン、セラミド、ローヤルゼリー、ポリフェノールなどが挙げられる。食品添加物として、例えば乳化剤、安定剤、増粘剤、ゲル化剤、甘味剤、酸味料、保存料、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、着色剤、香料などが挙げられる。バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などは本発明の実施の形態に係る飲食品の製造に好適に用いることのできる成分の例である。また、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物には、細胞性免疫活性化効果を有する任意の成分、例えば、フコイダンオリゴ糖等が添加されてもよい。
【００２９】
これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。また上記原材料は、天然物、天然物加工品、合成品および／またはこれらを多く含む食品のいずれを用いてもよい。
【００３０】
ところで、本願発明者らは、上述の細胞性免疫活性化組成物が細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を有意に高めることを確認している。このため、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞活性化組成物とも言える。また、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化により病原体の感染や腫瘍の発生を抑制することが知られていることから、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、病原体感染抑制組成物、腫瘍発生抑制組成物とも言える。すなわち、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物を包装してなる製品が例えば飲食品である場合、その飲食品には、例えば、「細胞傷害性Ｔ細胞活性化」との表示や、「病原体感染抑制」、「腫瘍発生抑制」との表示、その他これらの表示に類する等が付されてもよい。
【００３１】
また、本願発明者らは、上述の細胞性免疫活性化組成物の具体的な作用効果として、抗原特異的なインターフェロンγの産生を強力に促進することを確認している。このとき、抗原は、特に限定されないが、例えばメラノーマ抗原、インフルエンザウイルス抗原、ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原等が挙げられる。このため、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物は、抗原特異的インターフェロンγ産生促進用組成物とも言える。
【００３２】
本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化組成物の有効成分である菌体外多糖体を病原体感染防御医薬品や腫瘍縮小医薬品とすることもできる。そのような医薬品を製造する場合、菌体外多糖体は、破砕あるいは未粉砕した処理物として使用することができる。また、この際に使用する菌体外多糖体は、単独の菌体外多糖体生成乳酸菌から得られた菌体外多糖体であってもよいし、２種類以上の菌体外多糖体生成乳酸菌から得られた菌体外多糖体を組み合わせたものであってもよい。
【００３３】
上記医薬品中における菌体外多糖体の含有量は、その目的、用途に応じて任意に定めることができる。含有量の一例として、１５０μｇ／ｍＬを占めることが挙げられるが、本発明の実施の形態ではこれに限定されない。
【００３４】
上述の菌体外多糖体を有効成分とする医薬品の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。適当な投与量の一例として、有効成分として０．１ｇ〜１０００ｇ／ｋｇ／ｄａｙを挙げることができるが、本発明の実施の形態ではこれに限定されない。例えば、感染防御や腫瘍縮小の目的で長期間に亘って摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよい。また、本有効成分は安全性の問題が見当たらないため、上記範囲よりも多量に使用しても差し支えない。
【００３５】
上記医薬品の剤型は、菌体外多糖体を腸内に到達させるため、経口投与が可能な剤型が好ましい。本発明の実施の形態による医薬品の好ましい剤型の例としては、例えば錠剤、丸剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、トローチ剤等を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬である菌体外多糖体に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、界面活性剤、コーティング剤などの、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る補助剤を混ぜ合わせることによって製剤化することができる。
【００３６】
また、菌体外多糖体を医薬品として使用する場合には、例えば、経口投与の場合、菌体外多糖体をそのまま摂取させることができるが、例えば医薬品の一般的な製法に従い、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができる。
【００３７】
上記医薬品における菌体外多糖体の含有量は、剤形、用法、患者の年齢、性別、脳機能の程度、及びその他の条件等により適宜設定することができる。
【００３８】
上記医薬品は経口投与するのが好ましい。この医薬品を投与することにより、病原体の感染を防御したり、腫瘍を縮小させたりする。よって、この医薬品は、細胞変異に起因する種々の症状の改善又は予防に有用である。また、本発明の実施の形態に係る細胞性免疫活性化効果を損なわない限り、菌体外多糖体を有効成分とする本医薬品と、他の医薬を併用してもかまわない。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（調製例）
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）の１０質量％脱脂粉乳培地培養物中の菌体外多糖体を精製した。具体的には、以下に示すようにして菌体外多糖体を精製した。
【００４１】
１０質量％の脱脂粉乳培地を９０℃で殺菌してから４５℃に冷却した後、その培地に乳酸菌スターターとしてのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＯＬＬ１０７３Ｒ−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１）を１質量％接種した。３７℃で１８時間培養した後、培地を約４℃に冷却して乳酸菌スターターの培養を停止させた。そして、得られた培養物に対し、終濃度が１０質量％になるように１００質量％のトリクロロ酢酸を添加して混合し、その混合物を４℃、１２，０００×ｇで２０分間、遠心分離した。遠心分離処理により得られた上清を採り、その上清に２倍量の冷エタノールを加え、そのエタノール添加上清を４℃で一晩静置した。その後、エタノール添加上清を４℃、１２，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、得られた沈殿物を超純水に溶解させた。この水溶液を、超純水に対して透析した後、その透析処理液にＤＮａｓｅ（ＥＣ  ３．１．２１．１、シグマ・アルドリッチ社製）、ＲＮａｓｅ（ｔｙｐｅ  Ｉ−ＡＳ、ＥＣ  ３．１．２７．５、シグマ・アルドリッチ社製）、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＥＣ  ３．４．２１．６４、シグマ・アルドリッチ社製）を加えて、透析処理液を３７℃で酵素処理した。酵素処理液を９０℃で１０分間加熱することによって、酵素処理を停止させた後、その酵素処理液に２倍量のエタノールを加え、そのエタノール添加酵素処理液を４℃で一晩静置した。その後、エタノール添加酵素処理液を４℃、１２，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、得られた沈殿物を超純水に溶解させた。この水溶液を超純水に対して透析し、透析後の水溶液を凍結乾燥して菌体外多糖体の精製物とした。なお、透析には、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の透析膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ  ６，０００−８，０００）を用いた。
【００４２】
（実施例１）
１００μＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬工業株式会社）、１０μＬのメラノーマ抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  ｈｕｍａｎ  ｇｐ１００  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ，ＭＢＬ社製，抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）、８０μＬのリン酸緩衝液、および、１０μＬのヒトＢ型肝炎ウイルス抗原（Ｉ−Ａｄ  ＨＢｃ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ，ＭＢＬ社製、抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）を量り取って混ぜ合わせた後、この混合液を十分に乳化させて２００μＬの抗原乳化液を調製した。なお、この抗原乳化液には、１００μｇのメラノーマ抗原が含まれている。そして、この抗原乳化液２００μＬを４つ調製した後、各抗原乳化液を８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールスリバー社製）４匹それぞれの腹腔に注射した。すなわち、各マウスには１００μｇのメラノーマ抗原が注入されたことになる。なお、各マウスへのメラノーマ抗原注入後、各マウスの体内でメラノーマ抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖し、やがて機能的に成熟した細胞傷害性Ｔ細胞となって、マウスの体内を循環する。
【００４３】
メラノーマ抗原の注入から１週間経過後に上述のマウスらを安楽殺した。そして、各マウスから脾臓を取り出して各マウスの脾細胞をプールした。その後、同脾細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで５ｗｅｌｌ培養した。なお、この脾細胞培養時、メラノーマ抗原が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、菌体外多糖体が１５０μｇ／ｍＬとなるように、培地に上述のメラノーマ抗原溶液および菌体外多糖体（上記調製例で調製したもの）を添加した。培養開始から７２時間経過後に、抗原特異的に産生されたインターフェロンγの上清濃度を、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いて測定してその測定値の平均と標準誤差を求めたところ、その平均は８９１ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は２０４ｐｇ／ｍＬであった。
【００４４】
（実施例２）
脾細胞培養時、メラノーマ抗原が０．１μｇ／ｍＬとなるように培地にメラノーマ抗原溶液を添加した以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの腹腔に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は２５６ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は８５ｐｇ／ｍＬであった。
【００４５】
（実施例３）
抗原乳化液調製時および培地への抗原添加時においてメラノーマ抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  ｈｕｍａｎ  ｇｐ１００  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ，ＭＢＬ社製，抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）をインフルエンザウイルス抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＳＮＥＮＭＤＴＭ，ＭＢＬ社製）に代えた以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの腹腔に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１３２４０ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は３８１８ｐｇ／ｍＬであった。
【００４６】
（実施例４）
５０μＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬工業株式会社）、５μＬのヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液（Ｉ−Ａｄ  ＨＢｃ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ，ＭＢＬ社製，抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）、４５μＬのリン酸緩衝液を量り取って混ぜ合わせた後、この混合液を十分に乳化させて１００μＬの抗原乳化液を調製した。なお、この抗原乳化液には、５０μｇのヒトＢ型肝炎ウイルス抗原が含まれている。そして、この抗原乳化液１００μＬを３つ調製した後、各抗原乳化液を８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールスリバー社製）３匹それぞれの尾根部皮下に注射した。すなわち、各マウスには５０μｇのヒトＢ型肝炎ウイルス抗原が注入されたことになる。なお、各マウスへのヒトＢ型肝炎ウイルス抗原注入後、各マウスの体内でヒトＢ型肝炎ウイルス抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖し、やがて機能的に成熟し、細胞性免疫を強力に誘導するＴｈ１細胞となって、マウスの体内を循環する。
【００４７】
ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原の注入から１週間経過後に上述のマウスらを安楽殺した。そして、各マウスから脾臓を取り出して各マウスの脾細胞をプールした。その後、同脾細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで８ｗｅｌｌ培養した。なお、この脾細胞培養時、ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、菌体外多糖体が１５０μｇ／ｍＬとなるように培地に上述のヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液および菌体外多糖体を添加した。培養開始から４８時間経過後に、抗原特異的に産生されたインターフェロンγの上清濃度を、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いて測定してその測定値の平均と標準誤差を求めたところ、その平均は１９７０９ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は７１２ｐｇ／ｍＬであった。
【００４８】
（比較例１）
脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１６８ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は４８ｐｇ／ｍＬであった。
【００４９】
（比較例２）
脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例２と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は７４ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は１３ｐｇ／ｍＬであった。
【００５０】
（比較例３）
培地への抗原添加時においてメラノーマ抗原溶液をインフルエンザウイルス抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＳＮＥＮＭＤＴＭ，ＭＢＬ社製）に代え、脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は３７ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は１２ｐｇ／ｍＬであった。
【００５１】
（比較例４）
培地への抗原添加時においてメラノーマ抗原溶液をインフルエンザウイルス抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＳＮＥＮＭＤＴＭ，ＭＢＬ社製）に代えた以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１３７ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は５８ｐｇ／ｍＬであった。
【００５２】
（比較例５）
抗原乳化液調製時においてメラノーマ抗原溶液をインフルエンザウイルス抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＳＮＥＮＭＤＴＭ，ＭＢＬ社製）に代え、脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１６９ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は２３ｐｇ／ｍＬであった。
【００５３】
（比較例６）
抗原乳化液調製時においてメラノーマ抗原溶液をインフルエンザウイルス抗原溶液（Ｈ−２Ｄｂ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＳＮＥＮＭＤＴＭ，ＭＢＬ社製）に代えた以外は、実施例１と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例１と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は５６９ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は１４６ｐｇ／ｍＬであった。
【００５４】
（比較例７）
脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例３と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例３と同様にして脾細胞を５ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は２５３８ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は３２７ｐｇ／ｍＬであった。
【００５５】
（比較例８）
５０μＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬工業株式会社）、５０μＬのリン酸緩衝液を量り取って混ぜ合わせた後、この混合液を十分に乳化させて１００μＬの抗原未添加液を調製した。そして、この抗原未添加液１００μＬを３つ調製した後、各抗原未添加液を８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールスリバー社製）３匹それぞれの尾根部皮下に注射した。
【００５６】
抗原未添加液の注入から１週間経過後に上述のマウスらを安楽殺した。そして、各マウスから脾臓を取り出して各マウスの脾細胞をプールした。その後、同脾細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで８ｗｅｌｌ培養した。なお、この脾細胞培養時、培地に抗原および菌体外多糖体は一切添加されなかった。培養開始から４８時間経過後にインターフェロンγの上清濃度を、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いて測定してその測定値の平均と標準誤差を求めたところ、その平均は７７ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は３ｐｇ／ｍＬであった。
【００５７】
（比較例９）
脾細胞培養時、菌体外多糖体（実施例１で調製したものと同一のもの）が１５０μｇ／ｍＬとなるように培地に菌体外多糖体を添加した以外は、比較例８と同様にして抗原未添加液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、比較例８と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、比較例８と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は８４ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は６ｐｇ／ｍＬであった。
【００５８】
（比較例１０）
脾細胞培養時、ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原が１０μｇ／ｍＬとなるように培地にヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液（Ｉ−Ａｄ  ＨＢｃ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ，ＭＢＬ社製，抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した以外は、比較例８と同様にして抗原未添加液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、比較例８と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、比較例８と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は７９ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は４ｐｇ／ｍＬであった。
【００５９】
（比較例１１）
脾細胞培養時、ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、菌体外多糖体（実施例１で調製したものと同一のもの）が１５０μｇ／ｍＬとなるように培地にヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液（Ｉ−Ａｄ  ＨＢｃ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ，ＭＢＬ社製，抗原濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）および菌体外多糖体を添加した以外は、比較例８と同様にして抗原未添加液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、比較例８と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、比較例８と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は７６ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は３ｐｇ／ｍＬであった。
【００６０】
（比較例１２）
脾細胞培養時の培地にヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液および菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例４と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例４と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は７４ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は２ｐｇ／ｍＬであった。
【００６１】
（比較例１３）
脾細胞培養時の培地にヒトＢ型肝炎ウイルス抗原溶液を添加しなかった以外は、実施例４と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例４と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１６１ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は５５ｐｇ／ｍＬであった。
【００６２】
（比較例１４）
脾細胞培養時の培地に菌体外多糖体を添加しなかった以外は、実施例４と同様にして抗原乳化液を調製してマウスの尾根部皮下に注射し、実施例４と同様にして脾細胞を８ｗｅｌｌ培養し、実施例１と同様にしてインターフェロンγの上清濃度を測定してその測定値の平均と標準誤差を求めた。その結果、その平均は１００５６ｐｇ／ｍＬであり、標準誤差は９９８ｐｇ／ｍＬであった。
【００６３】
（まとめ）
以上の実施例および比較例に記載の条件および結果を以下の表１にまとめた。なお、表１中、「ｇｐ１００」は「メラノーマ抗原」を示し、「ＮＰ」は「インフルエンザウイルス抗原」を示し、「ＨＢｃ」は「ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原」を示し、「ＥＰＳ」は「菌体外多糖体」を示し、「ＩＦＬ−γ」は「インターフェロンγ」を示し、「−」は「未添加であること」を示す。
【００６４】
また、この表１をグラフ化したものを図１〜４に示した。なお、図１中、左側の白棒は比較例１の結果を示し、その右隣りの黒棒は実施例１の結果を示し、中央の白棒は比較例２の結果を示し、その右隣りの黒棒は実施例２の結果を示し、右側の白棒は比較例３の結果を示し、その右隣りの黒棒は比較例４の結果を示している。また、図２中、左側の白棒は比較例５の結果を示し、その右隣りの黒棒は比較例６の結果を示し、右側の白棒は比較例７の結果を示し、その右隣りの黒棒は実施例３の結果を示している。また、図３中、左側の白棒は比較例８の結果を示し、その右隣りの黒棒は比較例９の結果を示し、右側の白棒は比較例１０の結果を示し、その右隣りの黒棒は比較例１１の結果を示している。さらに、図４中、左側の白棒は比較例１２の結果を示し、その右隣りの黒棒は比較例１３の結果を示し、右側の白棒は比較例１４の結果を示し、その右隣りの黒棒は実施例４の結果を示している。
【００６５】
【表１】
2018203698.tif 000003
【００６６】
（考察）
図１のグラフ図に示される結果より、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）から得られた菌体外多糖体は、メラノーマ抗原免疫マウスの脾細胞培養時において培地に添加する抗原の種類に関わらず、インターフェロンγの産生を促進する効果があることが明らかとなった。また、メラノーマ抗原免疫マウスの脾細胞培養時において培地に添加する抗原を、マウス免疫時と同じ抗原であるメラノーマ抗原とした場合、菌体外多糖体はＣＤ８＋Ｔ細胞が産生する抗原特異的なインターフェロンγの産生を促進する効果をさらに高められること、さらに、その添加抗原濃度が高い程その効果が高くなることが明らかとなった。
【００６７】
図２のグラフ図に示される結果より、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）から得られた菌体外多糖体は、インフルエンザウイルス抗原免疫マウスの脾細胞培養時において培地に添加する抗原の種類に関わらず、インターフェロンγの産生を促進する効果があることが明らかとなった。また、インフルエンザウイルス抗原免疫マウスの脾細胞培養時において培地に添加する抗原を、マウス免疫時と同じ抗原であるインフルエンザウイルス抗原とした場合、菌体外多糖体はＣＤ８＋Ｔ細胞が産生する抗原特異的なインターフェロンγの産生を促進する効果をさらに高められることが明らかとなった。
【００６８】
図３のグラフ図に示される結果より、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）から得られた菌体外多糖体は、非免疫マウスの脾細胞に対してインターフェロンγの産生促進効果を奏しないことが明らかとなった。
【００６９】
図４のグラフ図に示される結果より、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）から得られた菌体外多糖体は、ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原免疫マウスの脾細胞培養時において培地に添加する抗原を、マウス免疫時と同じ抗原であるヒトＢ型肝炎ウイルス抗原とした場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞が産生する抗原特異的なインターフェロンγの産生を促進する効果があることが明らかとなった。
【００７０】
以上の結果より、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus  OLL1073R-1）から得られた菌体外多糖体は、インターフェロンγの産生を促進する効果があり、特に免疫時と同じ抗原に対してはその効果がさらに顕著であったことから、菌体外多糖体はＴ細胞が産生する抗原特異的なインターフェロンγの産生を強力に促進する効果があると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明に係る細胞性免疫活性化組成物は、製造コストを低く抑えることができることを期待することができ、ヒトの健康を増進することに貢献し得る。具体的には、菌体外多糖体や、菌体外多糖体を多量に含有するヨーグルトなどの食品は細胞性免疫を活性化し、感染防御や腫瘍抑制に寄与する可能性が期待される。また、菌体外多糖体を含有する食品等を摂取することで、Ｔ細胞を介した細胞性免疫を活性化し、インフルエンザ等のウイルス感染防御やメラノーマ等の腫瘍抑制の効果が期待できる。
【受託番号】
【００７２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１
【図１】
2018203698.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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