(57)【要約】      （修正有）【課題】ノッチシグナリング経路における異常なノッチ発現及びシグナリングを抑制する、肺疾患の新規治療方法の提供。【解決手段】Ｊａｇｇｅｄ１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質の治療有効量を、対象に投与することを含む、肺疾患に関連する状態を有する対象の治療方法。前記抗原結合タンパク質は、ヒトＪａｇｇｅｄ１に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｇｇｅｄ１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質の治療有効量を、対象に投与することを含む、肺疾患に関連する状態を有する対象の治療方法。
【請求項２】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与が、噴霧化による、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与が、皮下注射による、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドに特異的結合する、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒトＪａｇｇｅｄ１が、配列番号３５３を含む配列を有する、請求項６に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項８】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体又はその抗体断片である、請求項６又は７に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はＦ（ａｂ’）２断片である、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型又はＩｇＧ４型のものである、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ＩｇＧ１型又はＩｇＧ２型のものである、請求項１２に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
標識基に結合している、請求項８に記載のいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原結合タンパク質が、抗体又はその断片であり、ここで、前記抗体が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、ここでは、前記ＣＤＲＬ１が、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４及び１３０から成る群から選択される配列を含み、前記ＣＤＲＬ２が、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５及び１３１から成る群から選択される配列を含み、前記ＣＤＲＬ３が、配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６及び１３２から成る群から選択される配列を含み、前記ＣＤＲＨ１が、配列番号１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６及び２６２から成る群から選択される配列を含み、前記ＣＤＲＨ２が、配列番号１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３３、２３９、２４５、２５１、２５７及び２６３から成る群から選択される配列を含み、前記ＣＤＲＨ３が、配列番号１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、２２８、２３４、２４０、２４６、２５２、２５８及び２６４から成る群から選択される配列を含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記抗原結合タンパク質が、抗体又はその断片であり、ここで、前記抗体が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、ここでは、各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３６、配列番号１３７及び配列番号１３８；配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４２、配列番号１４３及び配列番号１４４；配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１４８、配列番号１４９及び配列番号１５０；配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５４、配列番号１５５及び配列番号１５６；配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号１６０、配列番号１６１及び配列番号１６２；配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８；配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１７２、配列番号１７３及び配列番号１７４；配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号１７８、配列番号１７９及び配列番号１８０；配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６；配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号１９０、配列番号１９１及び配列番号１９２；配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１９６、配列番号１９７及び配列番号１９８；配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４；配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２０８、配列番号２０９及び配列番号２１０；配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２１４、配列番号２１５及び配列番号２１６；配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号２２０、配列番号２２１及び配列番号２２２；配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号２２６、配列番号２２７及び配列番号２２８；配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４；配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号２３８、配列番号２３９及び配列番号２４０；配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号２４４、配列番号２４５及び配列番号２４６；配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号２５０、配列番号２５１及び配列番号２５２；配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号２５６、配列番号２５７及び配列番号２５８；ならびに配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２６２、配列番号２６３及び配列番号２６４から成る群から選択される配列を含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記抗原結合タンパク質が抗体又はその断片であり、ここは、前記抗体又はその断片が、配列番号２６７、２７１、２７５、２７９、２８３、２８７、２９１、２９５、２９９、３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７及び３５１から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号２６８、２７２、２７６、２８０、２８４、２８８、２９２、２９６、３００、３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８及び３５２から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗原結合タンパク質が抗体又はその断片であり、ここで、前記抗体又はその断片が、配列番号２６７を含む軽鎖可変領域と配列番号２６８を含む重鎖可変領域；配列番号２７１を含む軽鎖可変領域と配列番号２７２を含む重鎖可変領域；配列番号２７５を含む軽鎖可変領域と配列番号２７６を含む重鎖可変領域；配列番号２７９を含む軽鎖可変領域と配列番号２８０を含む重鎖可変領域；配列番号２８３を含む軽鎖可変領域と配列番号２８４を含む重鎖可変領域；配列番号２８７を含む軽鎖可変領域と配列番号２８８を含む重鎖可変領域；配列番号２９１を含む軽鎖可変領域と配列番号２９２を含む重鎖可変領域；配列番号２９５を含む軽鎖可変領域と配列番号２９６を含む重鎖可変領域；配列番号２９９を含む軽鎖可変領域と配列番号３００を含む重鎖可変領域；配列番号３０３を含む軽鎖可変領域と配列番号３０４を含む重鎖可変領域；配列番号３０７を含む軽鎖可変領域と配列番号３０８を含む重鎖可変領域；配列番号３１１を含む軽鎖可変領域と配列番号３１２を含む重鎖可変領域；配列番号３１５を含む軽鎖可変領域と配列番号３１６を含む重鎖可変領域；配列番号３１９を含む軽鎖可変領域と配列番号３２０を含む重鎖可変領域；配列番号３２３を含む軽鎖可変領域と配列番号３２４を含む重鎖可変領域；配列番号３２７を含む軽鎖可変領域と配列番号３２８を含む重鎖可変領域；配列番号３３１を含む軽鎖可変領域と配列番号３３２を含む重鎖可変領域；配列番号３３５を含む軽鎖可変領域と配列番号３３６を含む重鎖可変領域；配列番号３３９を含む軽鎖可変領域と配列番号３４０を含む重鎖可変領域；配列番号３４３を含む軽鎖可変領域と配列番号３４４を含む重鎖可変領域；配列番号３４７を含む軽鎖可変領域と配列番号３４８を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３５１を含む軽鎖可変領域と配列番号３５２を含む重鎖可変領域から成る群から選択される軽鎖可変領域と重鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項８に記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片をコードする核酸分子。
【請求項２０】
制御配列に作動可能に連結されている、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞によって生成される、抗体又はその断片。
【請求項２４】
前記抗体を分泌する宿主細胞から前記抗体又はその断片を調製するステップを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片の作製方法。
【請求項２５】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体又はその断片及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
ヒトＪａｇｇｅｄ１への結合について請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と競合する、単離された抗原結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｊａｇｇｅｄ１に特異的な抗原結合タンパク質を使用する、肺疾患の治療又は改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノッチシグナリング経路は多種多様な細胞機能を調節する（Ｋｏｐａｎ  ｅｔ  ａｈ，Ｃｅｌｌ  １３７，２１６−２３３（２００９））。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む基本的構造要素を共有する４種のノッチ受容体、すなわち、ノッチ１〜４が哺乳動物で特定されている。同様に、ノッチの標準的なリガンドは、ある種の構造的な類似性を有するが、ノッチのいくつかの非標準的リガンドも特定されている（Ｋｏｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３７，２１６−２３３（２００９））。哺乳動物の５種の標準的なリガンドは、デルタ様１、デルタ様３、デルタ様４、Ｊａｇｇｅｄｌ及びＪａｇｇｅｄ２である。ノッチ受容体の細胞外ドメインへのノッチリガンドの結合は、ＡＤＡＭ（ジスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）ファミリーのアルファセクレターゼによる細胞外のＳ２部位でのタンパク質分解性切断から始まるシグナリングカスケードを作動させる。Ｓ２での切断に続いて、細胞内のＳ３部位でのガンマセクレターゼによるタンパク質分解性切断が起こり、これによって、細胞内ドメインの放出ならびにＨｅｓｌ及びＨｅｙなどのノッチ依存的転写因子を最終的に活性化する下流のイベントがもたらされる。
【０００３】
異常なノッチ発現及びシグナリングは、がんを含めたいくつかの疾患に関係づけられている（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６４，２７４６−２７６２（２００７））。治療剤としての開発に最適な臨床特性を有する薬剤の必要性が存在し続けていることは明らかである。本明細書に記載される発明は、この必要性を満たし、かつ他の利益を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３７，２１６−２３３（２００９）
【非特許文献２】Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６４，２７４６−２７６２（２００７）
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本発明は、肺疾患に関連する状態を有する対象を治療する方法に関し、この方法は、治療有効量の、Ｊａｇｇｅｄ１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。ある種の実施形態では、対象はヒトである。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、静脈内に、噴霧によって、又は皮下注射によって投与される。
【０００６】
一態様では、本発明は、Ｊａｇｇｅｄ１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。
【０００７】
ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体又はこれらの抗体断片である。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はＦ（ａｂ’）２断片である。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質はヒト抗体である。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体である。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−又はＩｇＧ４−型のものである。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、標識基に結合している。
【０００８】
ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体又はその断片である。ある種の実施形態では、抗体は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、ここでは、ＣＤＲＬ１は、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４及び１３０から成る群から選択される配列を含み、ＣＤＲＬ２は、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５及び１３１から成る群から選択される配列を含み、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６及び１３２から成る群から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６及び２６２から成る群から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ２は、配列番号１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３３、２３９、２４５、２５１、２５７及び２６３から成る群から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ３は、配列番号１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、２２８、２３４、２４０、２４６、２５２、２５８及び２６４から成る群から選択される配列を含む。
【０００９】
ある種の実施形態では、抗体は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、ここでは、各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３６、配列番号１３７及び配列番号１３８；配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４２、配列番号１４３及び配列番号１４４；配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１４８、配列番号１４９及び配列番号１５０；配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５４、配列番号１５５及び配列番号１５６；配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号１６０、配列番号１６１及び配列番号１６２；配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８；配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１７２、配列番号１７３及び配列番号１７４；配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号１７８、配列番号１７９及び配列番号１８０；配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６；配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号１９０、配列番号１９１及び配列番号１９２；配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１９６、配列番号１９７及び配列番号１９８；配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４；配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２０８、配列番号２０９及び配列番号２１０；配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２１４、配列番号２１５及び配列番号２１６；配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号２２０、配列番号２２１及び配列番号２２２；配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号２２６、配列番号２２７及び配列番号２２８；配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４；配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号２３８、配列番号２３９及び配列番号２４０；配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号２４４、配列番号２４５及び配列番号２４６；配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号２５０、配列番号２５１及び配列番号２５２；配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号２５６、配列番号２５７及び配列番号２５８；ならびに配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２６２、配列番号２６３及び配列番号２６４から成る群から選択される配列を含む。
【００１０】
ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体又はその断片であり、ここでは、抗体又はその断片は、配列番号２６７、２７１、２７５、２７９、２８３、２８７、２９１、２９５、２９９、３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７及び３５１から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号２６８、２７２、２７６、２８０、２８４、２８８、２９２、２９６、３００、３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８及び３５２から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１１】
ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体又はその断片であり、ここでは、抗体又はその断片は、配列番号２６７を含む軽鎖可変領域と配列番号２６８を含む重鎖可変領域；配列番号２７１を含む軽鎖可変領域と配列番号２７２を含む重鎖可変領域；配列番号２７５を含む軽鎖可変領域と配列番号２７６を含む重鎖可変領域；配列番号２７９を含む軽鎖可変領域と配列番号２８０を含む重鎖可変領域；配列番号２８３を含む軽鎖可変領域と配列番号２８４を含む重鎖可変領域；配列番号２８７を含む軽鎖可変領域と配列番号２８８を含む重鎖可変領域；配列番号２９１を含む軽鎖可変領域と配列番号２９２を含む重鎖可変領域；配列番号２９５を含む軽鎖可変領域と配列番号２９６を含む重鎖可変領域；配列番号２９９を含む軽鎖可変領域と配列番号３００を含む重鎖可変領域；配列番号３０３を含む軽鎖可変領域と配列番号３０４を含む重鎖可変領域；配列番号３０７を含む軽鎖可変領域と配列番号３０８を含む重鎖可変領域；配列番号３１１を含む軽鎖可変領域と配列番号３１２を含む重鎖可変領域；配列番号３１５を含む軽鎖可変領域と配列番号３１６を含む重鎖可変領域；配列番号３１９を含む軽鎖可変領域と配列番号３２０を含む重鎖可変領域；配列番号３２３を含む軽鎖可変領域と配列番号３２４を含む重鎖可変領域；配列番号３２７を含む軽鎖可変領域と配列番号３２８を含む重鎖可変領域；配列番号３３１を含む軽鎖可変領域と配列番号３３２を含む重鎖可変領域；配列番号３３５を含む軽鎖可変領域と配列番号３３６を含む重鎖可変領域；配列番号３３９を含む軽鎖可変領域と配列番号３４０を含む重鎖可変領域；配列番号３４３を含む軽鎖可変領域と配列番号３４４を含む重鎖可変領域；配列番号３４７を含む軽鎖可変領域と配列番号３４８を含む重鎖可変領域；及び配列番号３５１を含む軽鎖可変領域と配列番号３５２を含む重鎖可変領域から成る群から選択される軽鎖可変領域と重鎖可変領域の組み合わせを含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、本発明による抗体又はその断片をコードする核酸分子に関する。一実施形態では、核酸分子は制御配列に作動可能に連結される。
【００１３】
一態様では、本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
【００１４】
一態様では、本発明は、本発明による核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００１５】
一態様では、本発明は、本発明の宿主細胞によって生成される抗体又はその断片に関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、抗体を分泌する宿主細胞から抗体又はその断片を調製するステップを含む、本発明による抗体又はその断片の作製方法に関する。
【００１７】
一態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの抗体又はその断片及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
一態様では、本発明は、ヒトＪａｇｇｅｄ１への結合について本発明による抗体又はその断片と競合する単離された抗原結合タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１  １５Ｄ１１．１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した刺激していないＡＬＩ培養物の過ヨウ素酸シッフ／アルシアンブルー染色を示す図である。図１Ｅ〜１Ｆは、様々な処理群の杯細胞数及びムチン含量パーセントの定量化を示す。ベースラインの無刺激条件下にわずかな杯細胞しか存在せず、抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌ）処理は、杯細胞の数をベースライン未満に低減した。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１  １５Ｄ１１．１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した刺激していないＡＬＩ培養物の過ヨウ素酸シッフ／アルシアンブルー染色を示す図である。図１Ｅ〜１Ｆは、様々な処理群の杯細胞数及びムチン含量パーセントの定量化を示す。ベースラインの無刺激条件下にわずかな杯細胞しか存在せず、抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌ）処理は、杯細胞の数をベースライン未満に低減した。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１  １５Ｄ１１．１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した、刺激していない又はＩＬ−１３刺激したＡＬＩ培養物の過ヨウ素酸シッフ／アルシアンブルー染色を示す図である。図２Ｆ及び２Ｇは、様々な処理群の杯細胞数及びムチン含量パーセントの定量化である。ＩＬ−１３刺激条件下に大量の杯細胞が存在し、抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）処理は、杯細胞の数及びムチン含量パーセントを有意に低減した。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｅは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１  １５Ｄ１１．１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した、刺激していない又はＩＬ−１３刺激したＡＬＩ培養物の過ヨウ素酸シッフ／アルシアンブルー染色を示す図である。図２Ｆ及び２Ｇは、様々な処理群の杯細胞数及びムチン含量パーセントの定量化である。ＩＬ−１３刺激条件下に大量の杯細胞が存在し、抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）処理は、杯細胞の数及びムチン含量パーセントを有意に低減した。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌもしくは１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した、刺激していない又はＩＬ−１３刺激した３Ｄ気管支球（ｂｒｏｎｃｈｏｓｐｈｅｒｅ）培養物由来の杯細胞マーカーのＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ及びＦＯＸＡ３に対するｑＰＣＲの結果を示す図である。ＩＬ−１３は杯細胞分化を誘導し、抗Ｊａｇ−１処理（１０ｕｇ／ｍｌ及び１ｕｇ／ｍｌ）は杯細胞分化をブロックしたが、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）処理はブロックしなかった。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）又は抗Ｊａｇ−１（１０ｕｇ／ｍｌもしくは１ｕｇ／ｍｌ）で処理していない又は処理した、刺激していない又はＩＬ−１３刺激した３Ｄ気管支球（ｂｒｏｎｃｈｏｓｐｈｅｒｅ）培養物由来の杯細胞マーカーのＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ及びＦＯＸＡ３に対するｑＰＣＲの結果を示す図である。ＩＬ−１３は杯細胞分化を誘導し、抗Ｊａｇ−１処理（１０ｕｇ／ｍｌ及び１ｕｇ／ｍｌ）は杯細胞分化をブロックしたが、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）処理はブロックしなかった。
【図４−１】図４Ａは、ＯＶＡチャレンジの研究設計の模式的な概要を示し、図４Ｂ〜４Ｅは、コントロール、抗Ｊａｇ−１（１５Ｄ１１．１）又は抗ＴＳＬＰ処理マウスの肺気道の過ヨウ素酸シッフ染色を示し、図４Ｆ及び４Ｇは、様々な処理群の気道上皮における、杯細胞及びムチン含量パーセントの定量化を示す図である。コントロール処理した気道及び抗ＴＳＬＰ処理した気道は大量の杯細胞を示し、抗Ｊａｇ−１処理群は、杯細胞数及びムチン含量パーセントの低減を示す。
【図４−２】図４Ａは、ＯＶＡチャレンジの研究設計の模式的な概要を示し、図４Ｂ〜４Ｅは、コントロール、抗Ｊａｇ−１（１５Ｄ１１．１）又は抗ＴＳＬＰ処理マウスの肺気道の過ヨウ素酸シッフ染色を示し、図４Ｆ及び４Ｇは、様々な処理群の気道上皮における、杯細胞及びムチン含量パーセントの定量化を示す図である。コントロール処理した気道及び抗ＴＳＬＰ処理した気道は大量の杯細胞を示し、抗Ｊａｇ−１処理群は、杯細胞数及びムチン含量パーセントの低減を示す。
【図５−１】図５Ａは、すべての群に対する体重の変化を示す図である。ＯＶＡ無し及び有りで感作させたマウスをグラフ図５Ｂ及び図５Ｃに別々に示す。
【図５−２】図５Ａは、すべての群に対する体重の変化を示す図である。ＯＶＡ無し及び有りで感作させたマウスをグラフ図５Ｂ及び図５Ｃに別々に示す。
【図６】ｈＪａｇｇｅｄ１に対するヒト抗ｈＪａｇｇｅｄ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の結合親和性の評価を示す図である。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＫｉｎＥｘＡを使用する平衡測定による細胞上親和性を示す図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ノッチリガンドファミリーのメンバーに対する１５Ｄ１１．１の種間反応性及び選択性のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図９】ヒトＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への１５Ｄ１１．１の結合を示す図である。
【図１０】マウスＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対する１５Ｄ１１．１の種間反応性を示す図である。
【図１１】ラット−Ｊａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への１５Ｄ１１．１の結合を示す図である。
【図１２】ヒトＪａｇｇｅｄ−１誘導性ヒトノッチ２活性化共培養アッセイにおける抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１３】マウスＪａｇｇｅｄ−１に対する１５Ｄ１１．１の種間反応性を示す図である。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｌは、刺激していない気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｌは、刺激していない気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１４−３】図１４Ａ〜１４Ｌは、刺激していない気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１４−４】図１４Ａ〜１４Ｌは、刺激していない気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｌは、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１５−２】図１５Ａ〜１５Ｌは、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１５−３】図１５Ａ〜１５Ｌは、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１５−４】図１５Ａ〜１５Ｌは、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｊａｇ１抗体の予防的投薬が、ＩＬ−１３の気管内送達によって誘導される、マウス杯細胞化生モデルにおいて、ノッチシグナリング経路遺伝子Ｎｒａｒｐ及び杯細胞マーカー遺伝子Ｍｕｃ５ａｃの発現を阻害することを示す図である。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｊａｇ１抗体の予防的投薬が、オボアルブミン誘導性喘息モデルにおいて、線毛性気道上皮細胞の表現型を推進し、杯細胞化生を阻害することを示す図である。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｊａｇ１抗体の予防的投薬が、オボアルブミン誘導性喘息モデルにおいて、線毛性気道上皮細胞の表現型を推進し、杯細胞化生を阻害することを示す図である。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｄは、オボアルブミン誘導性喘息モデルにおけるＪａｇ１中和Ａｂの治療的投薬が分泌細胞の遺伝子発現を阻害することを示す図である。
【図１８−２】図１８Ａ〜１８Ｄは、オボアルブミン誘導性喘息モデルにおけるＪａｇ１中和Ａｂの治療的投薬が分泌細胞の遺伝子発現を阻害することを示す図である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、Ｊａｇ１抗体処理が粘液閉塞性肺疾患のｂ−ＥＮａＣトランスジェニックマウスモデルにおいて気道粘液閉塞を低減させることを示す図である。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｆは、Ｊａｇ１抗体の投薬が、サルの呼吸上皮においてムチン含量の低減を阻害することを示す図である。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、１５Ｄ１１．１抗体の薬物動態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実施例中にあるものを含めて、本明細書で使用される組換えポリペプチド及び核酸の方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載されるものであり、これらの両方は、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本明細書で使用されるセクションの見出しは構成上の目的のためだけであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００２２】
本明細書で別段定義しない限り、本出願に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００２３】
一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される専門語及びこれらの技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本出願の方法及び技法は、特に指示がない限り、当技術分野で周知であり、本明細書全体を通して引用され議論される様々な一般的参考文献及びより特定の参考文献に記載されているような従来の方法に従って、一般に行われる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。酵素反応及び精製技法は、製造者の仕様書に従って、当技術分野で一般に達成されるように、又は本明細書に記載のように実施される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学及び医化学及び薬化学に関連して使用される術語ならびにこれらの実験の手順及び技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。標準的な技法を、化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤及び送達ならびに患者の治療に使用することができる。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法体系、プロトコール及び試薬などに限定されず、したがって、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、開示されるものの範囲を制限することを意図するものではなく、これは、請求項によってのみ規定される。
【００２５】
操作実施例以外、又は他で指示される場合以外、本明細書で使用される成分量又は反応条件を表すすべての数は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用される場合の用語「約」は、±１％を意味し得る。
【００２６】
慣例に従って、本明細書で使用する場合、「ａ」及び「ａｎ」は、他に特に指示がない限り「１つ又は複数」を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」及び「残基」は互換的であり、ペプチド又はポリペプチドに関して使用する場合、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体及び天然に存在するアミノ酸と化学的に類似している天然に存在しないアミノ酸を指す。
【００２８】
「天然に存在するアミノ酸」は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、及び合成後に修飾される、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有することができるが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
【００２９】
「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の通常の化学構造と異なるが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物である。例としては、アミドのメタクリロイル又はアクリロイル誘導体、β−、γ−、δ−アミノ酸（例えば、ピペリジン−４−カルボン酸）などが挙げられる。
【００３０】
「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって成長ポリペプチド鎖に組み込まれない化合物である。「天然に存在しないアミノ酸」としては、限定はされないが、天然にコードされるアミノ酸（限定されないが、２０種の一般アミノ酸を含める）の修飾（例えば、翻訳後修飾）により生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長ポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸も挙げられる。ポリペプチド配列中に挿入され得る又はポリペプチド配列中の野生型残基と置換され得る天然に存在しないアミノ酸の例の非限定なリストとしては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、以下が挙がられる（Ｌ型又はＤ型；括弧内のように略される）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」と略される）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅ又はアミノ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）及び他の類似したアミノ酸ならびに具体的に列挙されたもののうちのいずれかの誘導体化型。
【００３１】
用語「単離核酸分子」は、供給源の細胞から全核酸が単離される場合に核酸が天然に見出されるポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド又は他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖のポリマー（例えば、本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１核酸配列）又はそれらの類似体を指す。好ましくは、単離核酸分子は、ポリペプチド生成におけるその使用又はその治療上、診断上、予防上もしくは研究上の使用を妨げると思われる、核酸の天然環境で見出される任意の他の混入している核酸分子又は他の分子を実質的に含まない。
【００３２】
用語「単離ポリペプチド」は、供給源の細胞から単離される場合にポリペプチドが天然に見出されるポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド又は他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されたポリペプチド（例えば、本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列又は本発明の抗原結合タンパク質）を指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、その治療上、診断上、予防上又は研究上の使用を妨げると思われる、その天然環境で見出される任意の他の混入しているポリペプチド又は他の混入物を実質的に含まない。
【００３３】
用語「コードする」は、１つ又は複数のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始コドンも終止コドンも必要としない。
【００３４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する用語「同一の」及びパーセント「同一性」は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子内におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、（たとえあるとしても）アライメント中のギャップを、特定の数理モデル又はコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理することができる。整列させた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するのに使用することができる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが挙げられる。
【００３５】
パーセント同一性の計算では、配列間の最大のマッチを与えるように比較配列が整列される。パーセント同一性を決定するのに使用されるコンピュータープログラムは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含むＧＣＧプログラムパッケージである。コンピューターアルゴリズムのＧＡＰは、パーセント配列同一性が決定されることになる２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを整列させるのに使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドを最適にマッチさせるように整列される（アルゴリズムによって決定される「マッチスパン」）。ギャップ開始ペナルティー（これは、３×平均ダイアゴナルとして計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用される比較行列のダイアゴナルの平均である。「ダイアゴナル」は、特定の比較行列によって完全なアミノ酸マッチのそれぞれに割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（これは、通常、ギャップ開始ペナルティーの１／１０である）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムとともに使用される。ある種の実施形態では、標準比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列については、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２を、ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もアルゴリズムによって使用される。
【００３６】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチド又はヌクレオチド配列に対するパーセント同一性を決定するための推奨パラメーターは以下のものである。
【００３７】
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
【００３８】
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、上記のＢＬＯＳＵＭ６２
【００３９】
ギャプペナルティー：１２（末端ギャップについてはペナルティー無し）
【００４０】
ギャップ長ペナルティー：４
【００４１】
類似性の閾値：０
【００４２】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのある種のアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらし得、この小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関係性がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアライメント方法（例えば、ＧＡＰプログラム）を、所望により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続的なアミノ酸に及ぶアライメントをもたらすように調整することができる。
【００４３】
用語「Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド」及び「Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質」は互換的に使用され、ヒト又はマウスなどの哺乳動物で発現する天然に存在する野生型ポリペプチドを意味し、天然に存在するアレル（例えば、ヒトＪａｇｇｅｄ１タンパク質の天然に存在するアレル型）を含む。本開示において、用語「Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド」は、１２１８個のアミノ酸残基から成り、ヌクレオチド配列の配列番号３５４にコードされる任意の全長Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド、例えば配列番号３５３を指すように互換的に使用され得る。
【００４４】
用語「Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド」は、天然に存在するＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列（例えば、配列番号３５３）が修飾されたＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドも包含する。そのような修飾としては、限定されないが、天然に存在しないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体との置換を含めた、１つ又は複数のアミノ酸置換が挙げられる。
【００４５】
様々な実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、天然に存在するＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド（例えば、配列番号３５３）と少なくとも約８５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、天然に存在するＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、配列番号３５３）と少なくとも約９０パーセント又は約９５、９６、９７、９８もしくは９９パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。そのようなＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、好ましくは、野生型Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドの少なくとも１つの活性、例えば、ノッチ受容体に結合する能力を有するが、必ずしも有さなくてもよい。本発明は、そのようなＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列をコードする核酸分子も包含する。
【００４６】
用語「Ｊａｇｇｅｄ１活性アッセイ」（「Ｊａｇｇｅｄ１機能アッセイ」とも称される）は、細胞環境でＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ１受容体（すなわち、ノッチ１〜４）の活性を測定するのに使用することができるアッセイを意味する。
【００４７】
用語「Ｊａｇｇｅｄ１結合アッセイ」は、ノッチ１〜４へのＪａｇｇｅｄ１の結合を測定するのに使用することができるアッセイを意味する。一実施形態では、「Ｊａｇｇｅｄ１結合アッセイ」は、ノッチ１〜４発現細胞に結合している蛍光標識されたＪａｇｇｅｄ１を測定する、ＦＭＡＴ又はＦＡＣＳを使用するアッセイでもよく、Ｊａｇｇｅｄ１／ノッチ１〜４結合タンパク質の活性は、ノッチ１〜４発現細胞に結合している蛍光標識されたＪａｇｇｅｄ１を移動させることについて測定することができる。別の実施形態では、「Ｊａｇｇｅｄ１結合アッセイ」は、放射性標識されたノッチ１〜４発現細胞に結合しているＪａｇｇｅｄ１を測定するアッセイでもよく、Ｊａｇｇｅｄ１／ノッチ１〜４結合タンパク質の活性は、ノッチ１〜４発現細胞に結合している放射性標識されたＪａｇｇｅｄ１を移動させることついて測定することができる（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２００１）１５４７：１４３−１５５）。
【００４８】
本明細書で使用する場合「抗原結合タンパク質」は、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド（例えば、配列番号３５３で提供されるようなヒトＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド）などの特定の標的抗原に特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。この用語は、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むインタクト抗体、ならびにそれらの誘導体、バリアント、断片及び変異体を包含する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片が挙げられる。抗原結合タンパク質は、以下でさらに記載されるようなナノボディ及びｓｃＦｖなどのドメイン抗体も含む。
【００４９】
一般に、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、該抗原結合タンパク質が非Ｊａｇｇｅｄ１分子に本質的にバックグラウンドの結合を示す場合に、その標的抗原Ｊａｇｇｅｄ１に「特異的に結合する」ためのものである。しかし、Ｊａｇｇｅｄ１に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種由来のＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドと交差反応することができる。典型的には、表面プラズマ共鳴技法（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）又は結合平衡除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）によって測定したときに解離定数（ＫＤ）が≦１０−７Ｍである場合に、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質はヒトＪａｇｇｅｄ１に特異的に結合する。Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、記載される方法を使用して測定したときに、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に「高親和性」で、及びＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合に「非常に高親和性」で、ヒトＪａｇｇｅｄ１に特異的に結合する。
【００５０】
「抗原結合領域」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的には、免疫グロブリン、単鎖免疫グロブリン又はラクダ科動物抗体の１つ又は複数の「相補的結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある種の抗原結合領域は、１つ又は複数の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造を維持して、抗原結合領域と抗原の結合を促進するのを援助し得る。
【００５１】
組換えＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を含めて、「組換えタンパク質」は、組換え技法を使用して、すなわち、本明細書に記載の組換え核酸の発現を介して、作製されるタンパク質である。組換えタンパク質を生成する方法及び技法は当技術分野で周知である。
【００５２】
用語「抗体」は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン又は標的抗原への特異的結合に対してインタクト抗体と競合し得るそれらの断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び二特異性抗体が挙げられる。そのような「抗体」は、抗原結合タンパク質の種である。インタクト抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む。抗体は、単に単一の供給源に由来してもよく、又は「キメラ」でもよく、すなわち、さらに以下に記載するように、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合タンパク質、抗体又は結合断片は、ハイブリドーマ中で、組換えＤＮＡ法によって、又はインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、生成することができる。
【００５３】
抗体又はその断片に関して使用する場合、用語「軽鎖」は、全長軽鎖及び結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ及び定常領域ドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖及びラムダ鎖を含む。
【００５４】
抗体又はその断片に関して使用する場合、用語「重鎖」は、全長重鎖及び結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨ及び３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含める）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含める）、ＩｇＭならびにＩｇＥを含めた任意のアイソタイプのものでもよい。
【００５５】
本明細書で使用する場合、抗体又は免疫グロブリン鎖（重鎖又は軽鎖）の「免疫学的に機能的な断片」（又は、単に「断片」）という用語は、全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、抗原に特異的に結合することができる抗体部分（どのようにしてその部分が得られた又は合成されたかを問わない）を含む抗原結合タンパク質である。そのような断片は、これらが標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープへの特異的結合について、インタクト抗体を含めた他の抗原結合タンパク質と競合することができるという点において、生物学的に活性である。
【００５６】
これらの生物学的に活性断片は、組換えＤＮＡ法によって生成することができ、又はインタクト抗体を含めた抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。
【００５７】
別の実施形態では、Ｆｖ、ドメイン抗体及びｓｃＦｖは本発明の抗体に由来してもよい。
【００５８】
本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば１つ又は複数のＣＤＲは、二機能性の治療特性を有する、又は血清半減期が延長した、体内の特定の標的に対する治療剤を生成するために、第２のタンパク質に又は小分子に共有結合できることがさらに意図される。
【００５９】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００６０】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって、互いに結合している。
【００６１】
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖ならびにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインさらにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域を含む、１つの重鎖の部分を含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成され得る。
【００６２】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の定常領域の部分を含む２つの重鎖を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に結合している２つのＦａｂ’断片から構成される。
【００６３】
「Ｆｖ領域」は重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００６４】
「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が可動性リンカーによって結合して単一のポリペプチド鎖を形成しており、これが抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。ｓｃＦｖは、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号に詳細に記載されており、これらの開示は参照により組み込まれる。
【００６５】
「ドメイン抗体」又は「単鎖免疫グロブリン」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。ドメイン抗体の例としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が挙げられる。いくつかの場合には、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価のドメイン抗体を生成する。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じ抗原又は異なる抗原を標的にすることができる。
【００６６】
「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価抗体」は、２つの抗原結合領域を含む。いくつかの場合には、２つの結合領域は同じ抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質及び二価抗体は二特異性でもよい。以下を参照されたい。
【００６７】
「多特異性抗原結合タンパク質」又は「多重特異性抗体」は、１つより多い抗原又はエピトープを標的にするものである。
【００６８】
「二特異性」、「二重特異性」又は「二機能性」抗原結合タンパク質又は抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有する、ハイブリッド型の抗原結合タンパク質又は抗体である。二特異性の抗原結合タンパク質及び抗体は、多特異性抗原結合タンパク質又は多重特異性抗体の種であり、限定されないが、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二特異性の抗原結合タンパク質又は抗体の２つの結合部位は、同じ又は異なるタンパク質標的に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００６９】
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）に関連して使用する場合、用語「競合する」は、抗原結合タンパク質間の競合を意味し、試験下の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片）が、共通の抗原（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１又はその断片）への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を妨げる又は阻害するアッセイによって決定される。多数の種類の競合的結合アッセイを使用することができ、例えば以下のものである：固相直接又は間接的放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接又は間接的酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）。典型的には、このようなアッセイは、非標識の試験抗原結合タンパク質及び標識された参照抗原結合タンパク質のいずれかを有する固体表面又は細胞に結合した精製された抗原の使用を含む。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合は、これは、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害するであろう。いくつかの場合には、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％又はそれ以上阻害される。
【００７０】
用語「抗原」は、選択的結合剤、例えば抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含める）が結合することができ、さらに、その抗原に結合することができる抗体を生成するために動物で使用することができる、分子又は分子の一部を指す。抗原は、様々な抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することができる１つ又は複数のエピトープを有する。
【００７１】
用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する分子の部分である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合することができる任意の決定基を含む。エピトープは、連続的でもよいし、非連続的（不連続）（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で互いに連続的でないが、分子の文脈内では、抗原結合タンパク質が結合するアミノ酸残基）でもよい。立体構造エピトープは、活性タンパク質の立体構造中に存在するが、変性タンパク質中に存在しないエピトープである。ある種の実施形態では、エピトープは、これが、抗原結合タンパク質を生成するのに使用されるエピトープと類似している３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生成するのに使用されるエピトープで見出されるアミノ酸残基のどれも又はその一部しか含まないという点において、模倣性でもよい。大抵の場合、エピトープはタンパク質に存在するが、いくつかの場合には、核酸などの他の種類の分子に存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基などの、分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特定の３次元構造特性及び／又は特定の荷電特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質及び／又は高分子の複合混合物において、標的抗原のエピトープを優先的に認識する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」は、分子の記載される種が存在する優勢種であること、すなわち、モル基準で、これが、同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。ある種の実施形態では、実質的に純粋な分子は、目的の種が、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モル基準）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を構成する。他の実施形態では、目的の種は、従来の検出方法によって組成物中に混入種を検出することができない、本質的な均一性まで精製され、それにより、組成物は単一の高分子種から成る。
【００７３】
用語「治療する」は、任意の客観的又は主観的パラメーター、例えば、軽減；寛解；症状を縮小すること、又は傷害、病状又は状態を患者にとってより忍容可能にすること；変性又は減退の速度の緩徐化；変性の最終点をより衰弱しないようにすること；患者の身体的又は精神的健康を向上させることを含めた、傷害、病状又は状態の治療又は改善の成功の任意の兆候を指す。症状の治療又は改善は、身体検査、精神神経的検査及び／又は精神医学的評価の結果を含めた、客観的又は主観的パラメーターに基づき得る。
【００７４】
「有効量」は、一般に、症状の重症度及び／又は頻度を低減する、症状及び／又は根本原因を排除する、症状及び／又はその根本原因の出現を予防する、及び／又は病態（例えば、肺疾患）に起因するもしくは関連する損傷を改善させるもしくは修復するのに十分である量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、どのような方法であれ、病態又は症状、特に病態に関連する状況もしくは症状を治す、又は疾患に関連する病態もしくは任意の他の望ましくない症状の進行を予防する、妨げる、遅らせるもしくは逆転させるのに十分である量である。「予防有効量」は、対象に投与する場合に、意図された予防効果、例えば、病態の発症（もしくは再発）を予防することもしくは遅らせること、又は病態もしくは関連する症状の発症（もしくは再発）の可能性を低減させることを有する、医薬組成物の量である。一用量の投与によって完全な治療効果又は予防効果が生じるとは限らず、一連の用量の投与後のみに生じる場合もある。したがって、治療的又は予防的有効量は、１又は複数の投与で投与してもよい。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効用量」及び「治療有効量」は、研究者、医師又は他の臨床医が求める、組織系、動物又はヒトにおける生物学的又は医薬的応答（治療を受ける疾患又は障害の症状の緩和又は改善を含める）を誘発する、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の量、すなわち、１つ又は複数の所望の生物学的又は医薬的応答の観察可能なレベル、例えば、貯蔵ムチンのレベルの低減及び／又は上皮の体積あたりの杯細胞数の低減を支持する、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の量を意味する。
【００７６】
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、一本鎖と二本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態でもよい。修飾としては、塩基修飾、例えば、ブロモウリジン及びイノシン誘導体、リボース修飾、例えば、２’，３’−ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間結合修飾、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデートが挙げられる。
【００７７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドはセンスオリゴヌクレオチドでもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原標識を含めた標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００７８】
「単離核酸分子」は、単離ポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部と結合していないか、それが天然で連結していないポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ又はこれらの何らかの組み合わせを意味する。本開示において、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」はインタクトな染色体を包含しないことを理解されたい。指定の核酸配列を「含む」単離核酸分子は、指定の配列に加えて、１０個まで、もしくはさらに２０個までの、他のタンパク質もしくはその一部に対するコード配列を含むことができ、又は列挙される核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含むことができ、及び／又はベクター配列を含むことができる。
【００７９】
特に明記しない限り、本明細書に論じる任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は転写方向と称され、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖の、ＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’側である配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖の、ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’側である配列領域は「下流配列」と称される。
【００８０】
用語「制御配列」は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転写終結配列を含むことができる。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子に対する１つ又は複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列及び転写終結配列を含むことができる。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含むことができる。
【００８１】
用語「ベクター」は、タンパク質がコードする情報を宿主細胞へ伝達するのに使用される、任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【００８２】
用語「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」は、宿主細胞の形質転換に適しており、それらに作動可能に連結された１つ又は複数の異種のコード領域の発現を（宿主細胞とともに）指示及び／又は制御する核酸配列を含む、ベクターを指す。発現コンストラクトは、限定はされないが、作動可能に連結されたコード領域の転写、翻訳に影響を及ぼすかこれらを制御し、イントロンが存在する場合は、作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含むことができる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」は、この用語が適用される成分が、それらが、適切な条件下でそれらの固有の機能を実行することが可能になる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」、ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるように、それらに連結される。
【００８４】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されており、それによって目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は親細胞の後代を含み、これは、目的の遺伝子が存在する限り、後代が元の親細胞と形態又は遺伝子構成が同一であるかどうかを問わない。
【００８５】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は本明細書で互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーだけでなく、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、例えば、糖タンパク質を形成するために炭水化物残基を付加することによって修飾された、又はリン酸化されたアミノ酸ポリマーも包含することができる。ポリペプチド及びタンパク質は天然に存在する非組換え細胞によって生成することができ、又は遺伝子操作されたもしくは組換えの細胞によって生成することができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸への付加及び／又は天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸の置換を有する分子を含む。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、抗原結合タンパク質の１つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、抗原結合タンパク質の１つもしくは複数のアミノ酸への付加、及び／又は抗原結合タンパク質の１つもしくは複数のアミノ酸の置換を有するＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質、抗体又は配列を包含する。用語「ポリペプチド断片」は、全長タンパク質と比較した場合に、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、全長タンパク質と比較した場合に、修飾されたアミノ酸を含むこともできる。ある種の実施形態では、断片は約５〜５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸長でもよい。有用なポリペプチド断片としては、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能的な断片が挙げられる。
【００８６】
用語「単離タンパク質」は、対象タンパク質が、（１）通常は一緒に見出されるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含んでいないこと、（２）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含んでいないこと、（３）異なる種由来の細胞によって発現されること、（４）天然でそれが関連しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物もしくは他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）天然でそれが関連していないポリペプチドと（共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって）作動可能に結合していること、又は（６）天然に存在しないことを意味する。典型的には、「単離タンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ又はそれらの任意の組み合わせが、そのような単離タンパク質をコードしてもよい。好ましくは、単離タンパク質は、その治療上の、診断上の、予防上の、研究上の又は他の使用を妨げると思われる、その天然環境で見出されるタンパク質又はポリペプチド又は他の混入物を実質的に含まない。
【００８７】
ポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）の「バリアント」は、別のポリペプチド配列に対して、１つ又は複数のアミノ酸残基が、アミノ酸配列中に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している、及び／又はアミノ酸配列中に置換されている、アミノ酸配列を含む。バリアントは融合タンパク質を含む。
【００８８】
ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失又は置換バリアントと異なるある種の様式で、例えば、別の化学的部分へのコンジュゲーションを介して、化学的に修飾された、ポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）である。
【００８９】
生物的物質、例えば、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などに関連して本明細書全体を通して使用される用語「天然に存在する」は、天然に見出される物質を指す。
【００９０】
本明細書で使用する場合「対象」又は「患者」は、いかなる哺乳動物でもよい。典型的な実施形態では、対象又は患者はヒトである。
【００９１】
本明細書で開示されるように、本開示によって記載されるＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、標準的な分子生物学的方法を使用して操作及び／又は生成することができる。様々な実施例において、配列番号３５３のすべて又は一部を含むことができる、Ｊａｇｇｅｄ１をコードする核酸配列を、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから単離及び／又は増幅することができる。プライマーは、標準的な（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅技法に従って、本明細書に提供される核酸配列及びアミノ酸配列に基づいて設計することができる。次いで、増幅したＪａｇｇｅｄ１核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴づけすることができる。
【００９２】
本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１配列のすべて又は一部の単離又は増幅においてプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技法、例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用して設計及び生成することができ、又はより長いＤＮＡ配列から単離することができる。
【００９３】
ヒトＪａｇｇｅｄ１の１２１８アミノ酸配列は
【００９４】
【化１】
2018203735.tif 000002
である。
【００９５】
（配列番号３５３）
【００９６】
これは、以下のＤＮＡ配列にコードされる。
【００９７】
【化２】
2018203735.tif 000003
2018203735.tif 000004
2018203735.tif 000005
（配列番号３５４）。
【００９８】
本明細書で述べるように、用語「Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド」は、天然に存在するＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列、例えば、ヒトアミノ酸配列の配列番号３５３を包含する。しかし、用語「Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド」は、１つ又は複数のアミノ酸によって、天然に存在するＪａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列のアミノ酸配列と異なり、その結果、配列が配列番号３５３と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含する。Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、保存的又は非保存的のいずれかで、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸を使用して、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドの特定の位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換を導入することによって生成することができる。
【００９９】
「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸残基（すなわち、野生型Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列の所与の位置に見出される残基）と非天然残基（すなわち、野生型Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド配列の所与の位置に見られない残基）との置換であって、その結果、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響がない置換を含むことができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物システムでの合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基も包含する。これらは、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆転又は逆位の形態を含む。
【０１００】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のクラスに分類することができる。
【０１０１】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
【０１０２】
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
【０１０３】
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
【０１０４】
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
【０１０５】
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
【０１０６】
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０７】
アミノ酸のさらなる群を、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理を使用して、構築することもできる。いくつかの場合には、そのような特色の２つ以上に基づいて、置換をさらに特徴づけることが有用であり得る（例えば、「極性が小さい」残基、例えばＴｈｒ残基との置換は、適切な状況において、非常に保存的な置換を表し得る）。
【０１０８】
保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。非保存的酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。
【０１０９】
上記の分類のものと類似した既知の生理化学的特性を有する合成アミノ酸残基、希少アミノ酸残基又は修飾アミノ酸残基を、配列中の特定のアミノ酸残基に対する「保存的」置換基として使用することができる。例えば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、典型的なＬ−Ａｒｇ残基に対する置換基として働くことができる。特定の置換が上記のクラスの２つ以上の点から記載され得る場合もあり得る（例えば、小型且つ疎水性の残基との置換は、１つのアミノ酸を、上記のクラスの両方で見出される残基（複数可）、又は両方の定義を満たすそうした残基と類似した生理化学的特性を有することが当技術分野で既知である他の合成残基、希少残基もしくは修飾残基と置換することを意味する）。
【０１１０】
配列番号３５４に対して縮重したもの及び配列番号３５３のポリペプチドバリアントをコードするものを含めた、本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、本開示の他の態様を形成する。
【０１１１】
本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１核酸配列を発現させるために、適切なコード配列、例えば配列番号３５４を適切なベクターにクローニングすることができ、適切な宿主に導入した後、その配列を発現させて、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されているような）当技術分野で既知の標準的なクローニング及び発現技法に従って、コードされるポリペプチドを生成することができる。本発明は、本発明による核酸配列を含むそのようなベクターにも関する。
【０１１２】
「ベクター」は、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する、（ｂ）そこからのポリペプチドの生成を促進する、（ｃ）それによる標的細胞のトランスフェクション／形質転換を促進する、（ｄ）核酸配列の複製を促進する、（ｅ）核酸の安定性を促進する、（ｆ）核酸及び／又は形質転換された／トランスフェクトされた細胞の検出を促進する、及び／又は（ｇ）そうでなければ、有利な生物学的及び／又は生理化学的な機能をポリペプチドをコードする核酸に与える、送達媒体を指す。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（発現制御エレメントの適切なセットを含む核酸配列）を含めた、任意の適切なベクターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。
【０１１３】
原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞）におけるＪａｇｇｅｄ１タンパク質の発現のために、組換え発現ベクターを設計することができる。一実施形態では、宿主細胞は哺乳類の非ヒト宿主細胞である。代表的な宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ系統のＴＯＰ１０Ｆ’、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳動物細胞株のＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３−ＥＢＮＡ  ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を含めた、クローニング及び発現に一般的に使用される宿主が挙げられる。あるいは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼならびにインビトロ翻訳系を使用して、組換え発現ベクターをインビトロで転写及び翻訳することができる。好ましくは、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むクローニングサイトの上流にプロモーターを含む。オン及びオフを切り替えることができるプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターが挙げられる。
【０１１４】
したがって、組換えＪａｇｇｅｄ１の発現を促進する、Ｊａｇｇｅｄ１をコードする核酸配列を含むベクターが本明細書に提供される。様々な実施形態では、ベクターは、Ｊａｇｇｅｄ１の発現を調節する、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の適切なプロモーター、エンハンサー及び他の発現促進エレメントを含むことができるか、これらと結合することができる。そのようなエレメントの例としては、強発現プロモーター（例えばヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターもしくはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド生成のための複製開始点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、及び／又は好都合なクローニングサイト（例えばポリリンカー）が挙げられる。ベクターは、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成的プロモーターに対立するものとして誘導性プロモーターも含むことができる。一態様では、代謝関連組織、例えば肝臓組織又は膵臓組織において配列の発現を促進する組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。
【０１１５】
本開示の別の態様では、本明細書に開示されるＪａｇｇｅｄ１核酸及びベクターを含む宿主細胞が提供される。様々な実施形態では、ベクター又は核酸は宿主細胞ゲノムに組み込まれ、他の実施形態では、ベクター又は核酸は染色体外にある。
【０１１６】
そのような核酸、ベクター又はこれらのいずれかもしくは両方の組み合わせを含む、酵母細胞、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）及び哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）などの組換え細胞が提供される。様々な実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドの発現のためにコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド又は直鎖状の発現エレメントなどの組み込まれていない核酸を含む細胞が提供される。
【０１１７】
形質転換によって、又はトランスフェクションによって、本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを宿主細胞に導入することができる。発現ベクターで細胞を形質転換する方法は周知である。
【０１１８】
Ｊａｇｇｅｄ１をコードする核酸は、ウイルスベクターを介して、宿主細胞もしくは宿主動物中に位置することができ、及び／又は宿主細胞もしくは宿主動物に送達することができる。この役割において、任意の適切なウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターは、任意の数のウイルスのポリヌクレオチドを、単独で、又は所望の宿主細胞において本発明の核酸の送達、複製及び／又は発現を促進する１つもしくは複数のウイルスタンパク質と組み合わせて、含むことができる。ウイルスベクターは、ウイルスの核酸及びＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、ウイルスゲノムのすべて又は一部を含むポリヌクレオチド、ウイルスタンパク質／核酸コンジュゲート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はインタクトなウイルス粒子でもよい。ウイルス粒子のウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子又は改変ウイルス粒子を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターアンプリコンのような、複製及び／又は発現のために別のベクター又は野生型ウイルスの存在を必要とするベクターでもよい（例えば、ウイルスベクターはヘルパー依存性ウイルスでもよい）。典型的には、そのようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子、又は導入遺伝子の能力を増大させる、もしくは核酸のトランスフェクション及び／又は発現を援助するようにそのタンパク質及び／又は核酸内容物が改変されたウイルス粒子から成る（そのようなベクターの例としては、ヘルペスウイルス／ＡＡＶアンプリコンが挙げられる）。典型的には、ウイルスベクターは、通常はヒトに感染するウイルスに類似する及び／又は由来する。この点で適切なウイルスベクター粒子としては、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科のウイルスの任意のウイルス、もしくはアデノウイルス科のウイルスに由来する任意のウイルスを含める）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）又は他のパルボウイルス及びパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含める）が挙げられる。
【０１１９】
本明細書に記載のように発現したＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドは、それが天然に発現している細胞から単離することができ、又はＪａｇｇｅｄ１を発現するように操作された細胞、例えばＪａｇｇｅｄ１を天然には発現しない細胞から単離することができる。
【０１２０】
Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドを単離するのに用いることができるタンパク質精製方法、ならびに関連する材料及び試薬は、当技術分野で既知である。Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドを単離するのに有用であり得るさらなる精製方法は、Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５１４−９，Ｆａｉｒｌｉｅ  ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ  ２５４：６７−７６などの参考文献に見出すことができる。
【０１２１】
ヒトＪａｇｇｅｄ１（ｈＪａｇｇｅｄ１）を含めたＪａｇｇｅｄ１に結合するアンタゴニスト抗原結合タンパク質が本明細書に提供される。一実施形態では、ヒトＪａｇｇｅｄ１は、配列番号３５３に記載されるような配列を有する。
【０１２２】
提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のような１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）が埋め込まれている及び／又は結合しているポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質では、ＣＤＲは、ＣＤＲ（複数可）の適切な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲ（複数可）を方向づける「フレームワーク」領域に埋め込まれている。本明細書に記載のある種の抗原結合タンパク質は抗体であるか、抗体に由来する。他の抗原結合タンパク質では、ＣＤＲ配列は様々な種類のタンパク質スキャフォールドに埋め込まれている。様々な構造を以下にさらに記載する。
【０１２３】
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、様々な有用性を有する。例えば、抗原結合タンパク質は、Ｊａｇｇｅｄ１の特異的結合アッセイ、親和性精製において及びＪａｇｇｅｄ１活性の他のアンタゴニストを特定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質の他の用途としては、例えば、Ｊａｇｇｅｄ１に関連する疾患又は状態の診断及びＪａｇｇｅｄ１の有無を決定するためのスクリーニングアッセイが挙げられる。提供される抗原結合タンパク質がアンタゴニストであるとすれば、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、これが、肺疾患を治療する、ムチンレベルを低減する及び杯細胞レベルを低減するのに有用な治療方法において価値を有する。したがって、一態様では、本発明は対象において分泌細胞の分化を阻害する方法に関し、この方法は、配列番号３５３からなるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する治療有効量の抗原結合タンパク質を対象に投与すること含む。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、本出願に開示されるＣＤＲＳ及び／又はＶＨ及びＶＬを含む。
【０１２４】
Ｊａｇｇｅｄ１の活性をモジュレートするのに有用な様々な選択的結合剤が提供される。これらの薬剤としては、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体及び抗原結合領域を有するポリペプチド）を含み、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド、特にヒトＪａｇｇｅｄ１に特異的に結合する抗原結合タンパク質が挙げられる。
【０１２５】
一般に、提供される抗原結合タンパク質は、典型的には、本明細書に記載されるような、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５又は６個）のＣＤＲを含む。いくつかの場合には、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造、ならびに（ｂ）ポリペプチド構造に挿入されている及び／また結合している１つ又は複数のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとることができる。例えば、これは、天然に存在する抗体もしくはその断片もしくはバリアントのフレームワークでもよく、もしくはそのフレームワークを含んでもよく、又は事実上完全に合成されていてもよい。様々なポリペプチド構造の例を、以下にさらに記載する。
【０１２６】
ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は抗体であるか、抗体に由来する。したがって、提供されるある種の抗原結合タンパク質の例としては、限定されないが、それぞれ、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、合成抗体（「抗体模倣体」と本明細書で言及することもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体及びそれぞれの部分又は断片が挙げられる。いくつかの場合には、抗原結合タンパク質は、完全な抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）である。他の場合では、抗原結合タンパク質は、本発明の抗体由来のＣＤＲを使用するｓｃＦｖである。
【０１２７】
一実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は以下の活性の１つ又は複数を有する。
【０１２８】
（ａ）例えば、表面プラズマ共鳴又は結合平衡除外アッセイ技法によって測定した場合に、ＫＤが≦２００ｎＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ又は≦１ｎＭであるように、ヒトＪａｇｇｅｄ１に結合する。
【０１２９】
（ｂ）少なくとも３日のヒト血清中半減期を有する。
【０１３０】
提供されるいくつかの抗原結合タンパク質は、例えば以下に記載のように測定した場合に、少なくとも１０４／Ｍ×秒、少なくとも１０５／Ｍ×秒又は少なくとも１０６／Ｍ×秒のＪａｇｇｅｄ１に対するオン速度（ｋａ）を有する。提供されるある種の抗原結合タンパク質は、遅い解離速度又はオフ速度を有する。例えば、いくつかの抗原結合タンパク質は、１×１０−２ｓ−１又は１×１０−３ｓ−１又は１×１０−４ｓ−１又は１×１０−５ｓ−１のｋｄ（オフ速度）を有する。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、２５ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は５０ｎＭ未満のＫＤ（平衡結合親和性）を有する。
【０１３１】
アッセイに応じて、抗原結合タンパク質のその標的への結合は、ＥＣ５０（標的に結合した場合に最大半量応答を与える抗原結合タンパク質の濃度）として測定することもできる。本発明の抗Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質に対するＥＣ５０は、様々な濃度の抗原結合タンパク質を、Ｊａｇｇｅｄ１を発現する細胞とともにインキュベートすることによって決定することができる。本発明の抗Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ又は３０ｎＭ未満のＥＣ５０を有し得る。
【０１３２】
ＩＣ５０（最大半量阻害濃度：特定の生物学的又は生化学的な機能の阻害における抗原結合タンパク質の有効性の尺度）も抗Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の活性の尺度に使用することもできる。ＩＣ５０は、機能アッセイを使用して測定することができる。例えば、細胞結合性又は可溶性のＪａｇｇｅｄ１リガンドを細胞が発現するノッチ受容体を活性化するのに使用することができ、ここでは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を使用してノッチ受容体経路の活性化を測定することができる。一実施形態では、レポーター細胞が発現するノッチ受容体はノッチ２である。本発明の抗Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ又は２ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。
【０１３３】
別の態様では、（例えば、ヒト対象に投与する場合に）インビトロで又はインビボで少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は少なくとも３日の半減期を有する。様々な他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は６０日又はそれ以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、非誘導体化又は非修飾抗体と比較して長い半減期を有するように、誘導体化又は修飾される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は血清半減期を増大させるために点変異を含む。そのような変異体及び誘導体化形態に関するさらなる詳細を以下に提供する。
【０１３４】
提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、天然に存在する抗体と関連する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一のカプレットからそれぞれ構成される１つ又は複数の四量体を含むが、哺乳動物のいくつかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も生成する。典型的な抗体では、各対又はカプレットは、１つの全長「軽」鎖（ある種の実施形態では、約２５ｋＤａ）及び１つの全長「重」鎖（ある種の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を含む。個々の免疫グロブリン鎖のそれぞれは、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成され、それぞれおおよそ９０〜１１０アミノ酸から成り、特徴的なフォールディングパターンを発現している。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。各鎖のアミノ末端部は、典型的には、抗原認識に関与する可変ドメインを含む。カルボキシ末端部は、鎖の他の末端よりも進化的に保存されており、「定常領域」又は「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、カッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類され、これらのそれぞれは、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む。重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロン鎖に分類され、これらは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧは限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含めた、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプはＩｇＭ及びＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプはＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプは４つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプは２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは５つの重鎖及び５つの軽鎖を含む。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能に関与し得る１つ又は複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインをそれぞれ含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプ及びサブタイプのうちのいずれかを有することができる。ある種の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプのものである。用語「Ｊａｇｇｅｄ１抗体」及び「抗Ｊａｇｇｅｄ１抗体」は、本出願及び図の全体を通して互換的に使用される。両方の用語は、Ｊａｇｇｅｄ１に結合する抗体を指す。
【０１３５】
全長の軽鎖及び重鎖では、可変領域及び定常領域は、約１２個又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合しており、重鎖は、約１０個又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。
【０１３６】
本明細書に提供される抗体については、免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又はＣＤＲと呼ばれることの方が多い、３つの超可変領域によって結合している比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、同じ全体構造を示す。上述の各重鎖／軽鎖対の２つの鎖由来のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列して、Ｊａｇｇｅｄ１の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は両方とも、典型的にはこれらの要素の以下の順序と一致する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらのドメインのそれぞれの位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、又はＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３で規定されている。
【０１３７】
以下の実施例に記載されているように調製及び特定した特定の抗体に対する配列情報を表１に概説する。したがって、一実施形態では、抗原結合タンパク質は、表１の行の１つに指定されるＣＤＲ、可変ドメインならびに軽鎖及び重鎖配列を有する抗体である。
【０１３８】
配列番号を本発明の抗体及びその断片の可変軽鎖、可変重鎖、軽鎖、重鎖、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３配列に割り当て、表１に示す。配列番号を本発明の抗体及びその断片の可変軽鎖、可変重鎖、軽鎖、重鎖、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３配列をコードするポリヌクレオチドに対しても割り当て、表２に示す。本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号によってだけでなく、コンストラクト名（例えば、１５Ｄ１１．１）又は識別番号（例えば、ｉＰＳ：４８０４９９）によっても特定することができる。
【０１３９】
本明細書に提供される様々な軽鎖及び重鎖可変領域を表３に示す。これらの可変領域のそれぞれを重鎖定常領域又は軽鎖定常領域に結合させて、それぞれ、完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成することができる。さらに、そのようにして生成した重鎖及び軽鎖配列のそれぞれを結合させて、完全な抗体構造体を形成することができる。
【０１４０】
【表１】
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【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６７、２７１、２７５、２７９、２８３、２８７、２９１、２９５、２９９、３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７及び３５１から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６８、２７２、２７６、２８０、２８４、２８８、２９２、２９６、３００、３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８及び３５２から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６７、２７１、２７５、２７９、２８３、２８７、２９１、２９５、２９９、３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７、３３１、３３５、３３９、３４３、３４７及び３５１から成る群から選択される配列を含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号２６８、２７２、２７６、２８０、２８４、２８８、２９２、２９６、３００、３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、３４８及び３５２から成る群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６７を含む軽鎖可変領域と配列番号２６８を含む重鎖可変領域；配列番号２７１を含む軽鎖可変領域と配列番号２７２を含む重鎖可変領域；配列番号２７５を含む軽鎖可変領域と配列番号２７６を含む重鎖可変領域；配列番号２７９を含む軽鎖可変領域と配列番号２８０を含む重鎖可変領域；配列番号２８３を含む軽鎖可変領域と配列番号２８４を含む重鎖可変領域；配列番号２８７を含む軽鎖可変領域と配列番号２８８を含む重鎖可変領域；配列番号２９１を含む軽鎖可変領域と配列番号２９２を含む重鎖可変領域；配列番号２９５を含む軽鎖可変領域と配列番号２９６を含む重鎖可変領域；配列番号２９９を含む軽鎖可変領域と配列番号３００を含む重鎖可変領域；配列番号３０３を含む軽鎖可変領域と配列番号３０４を含む重鎖可変領域；配列番号３０７を含む軽鎖可変領域と配列番号３０８を含む重鎖可変領域；配列番号３１１を含む軽鎖可変領域と配列番号３１２を含む重鎖可変領域；配列番号３１５を含む軽鎖可変領域と配列番号３１６を含む重鎖可変領域；配列番号３１９を含む軽鎖可変領域と配列番号３２０を含む重鎖可変領域；配列番号３２３を含む軽鎖可変領域と配列番号３２４を含む重鎖可変領域；配列番号３２７を含む軽鎖可変領域と配列番号３２８を含む重鎖可変領域；配列番号３３１を含む軽鎖可変領域と配列番号３３２を含む重鎖可変領域；配列番号３３５を含む軽鎖可変領域と配列番号３３６を含む重鎖可変領域；配列番号３３９を含む軽鎖可変領域と配列番号３４０を含む重鎖可変領域；配列番号３４３を含む軽鎖可変領域と配列番号３４４を含む重鎖可変領域；配列番号３４７を含む軽鎖可変領域と配列番号３４８を含む重鎖可変領域；及び配列番号３５１を含む軽鎖可変領域と配列番号３５２を含む重鎖可変領域から成る群から選択される軽鎖可変領域と重鎖可変領域の組み合わせを含む。
【０１４６】
一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０５、３０９、３１３、３１７、３２１、３２５、３２９、３３３、３３７、３４１、３４５及び３４９から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６６、２７０、２７４、２７８、２８２、２８６、２９０、２９４、２９８、３０２、３０６、３１０、３１４、３１８、３２２、３２６、３３０、３３４、３３８、３４２、３４６及び３５０から成る群から選択されるポリヌクレオチドにコードされる重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６５、２６９、２７３、２７７、２８１、２８５、２８９、２９３、２９７、３０１、３０５、３０９、３１３、３１７、３２１、３２５、３２９、３３３、３３７、３４１、３４５及び３４９から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域、ならびに配列番号２６６、２７０、２７４、２７８、２８２、２８６、２９０、２９４、２９８、３０２、３０６、３１０、３１４、３１８、３２２、３２６、３３０、３３４、３３８、３４２、３４６及び３５０から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２６５を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２６６を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２６９を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２７０を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２７３を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２７４を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２７７を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２７８を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２８１を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２８２を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２８５を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２８６を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２８９を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２９０を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２９３を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２９４を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号２９７を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号２９８を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３０１を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３０２を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３０５を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３０６を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３０９を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３１０を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３１３を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３１４を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３１７を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３１８を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３２１を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３２２を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３２５を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３２６を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３２９を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３３０を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３３３を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３３４を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３３７を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３３８を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３４１を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３４２を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；配列番号３４５を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３４６を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域；及び配列番号３４９を含むポリヌクレオチド配列にコードされる軽鎖可変領域と配列番号３５０を含むポリヌクレオチド配列にコードされる重鎖可変領域から成る群から選択される軽鎖可変領域と重鎖可変領域の組み合わせを含む。
【０１４７】
いくつかの抗原結合タンパク質は、表３に列挙される抗体の１つ関する行の１つに列挙される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを含む。いくつかの場合には、抗原結合タンパク質は、表３に列挙される抗体の１つからの２つの同一の可変軽鎖ドメイン及び２つの同一の可変重鎖ドメインを含む。提供されるいくつかの抗原結合タンパク質は、表３に列挙される抗体の１つに関する行の１つに列挙される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを含むが、ただし、ドメインの一方又は両方が、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸残基で、表に指定された配列と異なり、そのような配列の違いのそれぞれが、独立に、単一アミノ酸の欠失、挿入又は置換のいずれかであり、欠失、挿入及び／又は置換が、表３に指定される可変ドメイン配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個以下のアミノ酸の変化をもたらす。一実施形態では、抗原結合タンパク質は表３の可変領域配列を含むが、Ｎ末端メチオニンが欠失している。他の抗原結合タンパク質も表３に列挙される抗体の１つに関する行の１つに列挙される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを含むが、ただし、ドメインの一方又は両方が、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインが表３に指定される重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインの配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そうしたアミノ酸配列から成るという点において、表に指定された配列と異なる。
【０１４８】
別の態様では、抗原結合タンパク質は、単に、表３に列挙される抗体からの可変軽鎖ドメイン又は可変重鎖ドメインから成る。さらに別の態様では、抗原結合タンパク質は、表３に列挙されるものからの同じ可変重鎖ドメインの２つ以上又は同じ可変軽鎖ドメインの２つ以上を含む。より詳細に以下に記載されるように、リンカーを介して、そのようなドメイン抗体を一緒に融合又は結合させることができる。半減期を延ばすための１つ又は複数の分子（例えば、ＰＥＧ又はアルブミン）にドメイン抗体を融合又は結合させることもできる。
【０１４９】
他の提供される抗原結合タンパク質は、表３に示す重鎖と軽鎖の組み合わせによって形成される抗体のバリアントであり、それぞれこれらの鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、軽鎖及び／又は重鎖を含む。いくつかの場合には、そのような抗体は少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含むが、他の場合では、バリアント型は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む。
【０１５０】
重鎖可変領域の様々な組み合わせを軽鎖可変領域の様々な組み合わせのうちのいずれかと組み合わせることができる。
【０１５１】
さらなる実施形態では、本明細書に提供される単離された抗原結合タンパク質は、表３に記載の配列を含むヒト抗体であり、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−又はＩｇＧ４−型のものである。
【０１５２】
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、１つ又は複数のＣＤＲが移植されている、挿入されている及び／又は結合しているポリペプチドである。抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲを有することができる。したがって、抗原結合タンパク質は、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。いくつかの抗原結合タンパク質はＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ３の両方を含む。特定の軽鎖及び重鎖ＣＤＲをそれぞれ表４Ａ及び４Ｂに指定する。
【０１５３】
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１によって記載されている系を使用して特定することができる。本明細書に開示されるある種の抗体は、表４Ａ及び４Ｂに提示されるＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸配列と同一である又はかなりの配列同一性を有する、１つ又は複数のアミノ酸配列を含む。これらのＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって記載される系を使用する。
【０１５４】
天然に存在する抗体内のＣＤＲの構造及び特性は前に記載した。手短に言えば、従来の抗体では、ＣＤＲは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク内に埋め込まれており、ここで、これらは抗原結合及び認識に関与する領域を構成する。可変領域は、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、上記によってフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と命名される。Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７、上記）も参照されたい）内に少なくとも３つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含む。上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３も参照されたい。しかし、本明細書に提供されるＣＤＲは、従来の抗体構造の抗原結合ドメインを規定するのに使用することができるだけでなく、本明細書に記載のように、様々な他のポリペプチド構造中に埋め込むこともできる。
【０１５５】
一実施形態では、抗体又はその断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４及び１３０から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＬ１を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５及び１３１から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＬ２を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６及び１３２から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＬ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６及び２６２から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＨ１を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３３、２３９、２４５、２５１、２５７及び２６３から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＨ２を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、２２８、２３４、２４０、２４６、２５２、２５８及び２６４から成る群から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３６、配列番号１３７及び配列番号１３８；配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４２、配列番号１４３及び配列番号１４４；配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１４８、配列番号１４９及び配列番号１５０；配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号１５４、配列番号１５５及び配列番号１５６；配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号１６０、配列番号１６１及び配列番号１６２；配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８；配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１７２、配列番号１７３及び配列番号１７４；配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号１７８、配列番号１７９及び配列番号１８０；配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６；配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号１９０、配列番号１９１及び配列番号１９２；配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号１９６、配列番号１９７及び配列番号１９８；配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号２０２、配列番号２０３及び配列番号２０４；配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２０８、配列番号２０９及び配列番号２１０；配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２１４、配列番号２１５及び配列番号２１６；配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号２２０、配列番号２２１及び配列番号２２２；配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号２２６、配列番号２２７及び配列番号２２８；配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号２３２、配列番号２３３及び配列番号２３４；配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号２３８、配列番号２３９及び配列番号２４０；配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号２４４、配列番号２４５及び配列番号２４６；配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号２５０、配列番号２５１及び配列番号２５２；配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号２５６、配列番号２５７及び配列番号２５８；ならびに配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号２６２、配列番号２６３及び配列番号２６４から成る群から選択される配列を含む。
【０１５６】
一実施形態では、抗体又はその断片は、ポリヌクレオチドにコードされるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１及び１２７から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＬ１を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２及び１２８から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＬ２を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３及び１２９から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＬ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、２２３、２２９、２３５、２４１、２４７、２５３及び２５９から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＨ１を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、２３０、２３６、２４２、２４８、２５４及び２６０から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＨ２を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、配列番号１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、２２５、２３１、２３７、２４３、２４９、２５５及び２６１から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列にコードされるＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、抗体又はその断片は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み、各ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５；配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１；配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７；配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３；配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９；配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５；配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７；配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３；配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９；配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５；配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１；配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７；配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３；配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９；配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号２２３、配列番号２２４及び配列番号２２５；配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号２２９、配列番号２３０及び配列番号２３１；配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号２３５、配列番号２３６及び配列番号２３７；配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号２４１、配列番号２４２及び配列番号２４３；配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号２４７、配列番号２４８及び配列番号２４９；配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号２５３、配列番号２５４及び配列番号２５５；ならびに配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号２５９、配列番号２６０及び配列番号２６１から成る群から選択される配列を含む配列にコードされる。
【０１５７】
別の態様では、抗原結合タンパク質は、表４Ａ及び４Ｂに列挙されるＣＤＲの１、２、３、４、５又は６個のバリアント型を含み、それぞれ、表４Ａ及び４Ｂに列挙されるＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの抗原結合タンパク質は、表４Ａ及び４Ｂに列挙されるＣＤＲのうちの１、２、３、４、５又は６個を含み、それぞれ、又はまとめて、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸がこの表に列挙されるＣＤＲと異なる。
【０１５８】
様々な他の実施形態では、抗原結合タンパク質はそのような抗体に由来する。例えば、一態様では、抗原結合タンパク質は、表４Ａ及び４Ｂに列挙される任意の特定の抗体に関する行の１つに列挙されるＣＤＲの１、２、３、４、５又は６個すべてを含む。別の態様では、抗原結合タンパク質は、表４Ａ及び４Ｂの抗体に関する行の１つに列挙されるＣＤＲの１、２、３、４、５又は６個のバリアント型を含み、各ＣＤＲは、表４Ａ及び４Ｂに列挙されるＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの抗原結合タンパク質は、表４Ａ及び４Ｂの行の１つに列挙されるＣＤＲのうちの１、２、３、４、５又は６個を含み、それぞれ、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸がこれらの表に列挙されるＣＤＲと異なる。別の態様では、抗原結合タンパク質は表４Ａ及び４Ｂの行に列挙されるＣＤＲの６個すべてを含み、ＣＤＲに対するアミノ酸変化の総数は、まとめて、１、２、３、４又は５アミノ酸以下である。
【０１５９】
さらに別の態様では、表３、４Ａ及び４Ｂに列挙されるＣＤＲ及び／又は可変ドメインを含む抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性抗体又はこれらの抗体断片である。別の実施形態では、本明細書に提供される単離された抗原結合タンパク質の抗体断片は、表３、４Ａ及び４Ｂに列挙される配列を有する抗体に基づくＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又はｓｃＦｖである。
【０１６０】
さらに別の態様では、表３、４Ａ及び４Ｂに提供される単離された抗原結合タンパク質は、標識基と結合することができ、Ｊａｇｇｅｄ１との結合について、本明細書に提供される単離された抗原結合タンパク質のうちの１つの抗原結合タンパク質と競合することができる。
【０１６１】
別の実施形態では、ヒトＪａｇｇｅｄ１（例えば、配列番号３５３）への特異的結合について、上記の例示の抗体又は機能断片のうちの１つと競合する抗原結合タンパク質が提供される。そのような抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のうちの１つと同じエピトープ又は重複エピトープに結合することができる。例示の抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質及び断片は、類似した機能特性を示すことが期待される。例示の抗原結合タンパク質及び断片として、表３、４Ａ及び４Ｂに含まれる可変領域ドメイン及びＣＤＲを有するものを含めて、上記のものが挙げられる。したがって、具体例として、提供される抗原結合タンパク質としては、以下を有する抗体と競合するものが挙げられる。
【０１６２】
表４Ａ及び４Ｂに列挙される任意の抗体に関して列挙されるＣＤＲの６個すべて、又は
【０１６３】
表３に列挙される任意の抗体に関して列挙されるＶＨ及びＶＬ。
【０１６４】
提供される抗原結合タンパク質には、Ｊａｇｇｅｄ１に結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当技術分野で既知の任意の技法を使用して、例えば、免疫化スケジュールの終了後にトランスジェニック動物から採取された不死化脾臓細胞によって、生成することができる。脾臓細胞は、当技術分野で既知の任意の技法を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって、不死化することができる。ハイブリドーマ生成融合手順で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体生成性であり、高い融合効率及び所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持するある種の選択培地で脾臓細胞を生育できないようにする酵素欠損を有する。マウス融合で使用するための適切な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが挙げられ、ラットの融合で使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【０１６５】
いくつかの場合には、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＪａｇｇｅｄ１免疫原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合し、それによって、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチドに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を特定することによって、生成される。そのようなハイブリドーマ細胞株及びそれによって生成される抗Ｊａｇｇｅｄ１モノクローナル抗体は、本出願の態様である。
【０１６６】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、当技術分野で既知の任意の技法を使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂをさらにスクリーニングして、特定の特性、例えばＪａｇｇｅｄ１活性を増大させる能力を有するｍＡｂを特定することができる。
【０１６７】
前述の配列に基づくキメラ抗体及びヒト化抗体も提供される。治療剤として使用するためのモノクローナル抗体は、様々な方法によって使用前に改変することができる。一例はキメラ抗体であり、これは、機能的な免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖又はその免疫学的に機能的な部分を生成するように共有結合している異なる抗体由来のタンパク質セグメントから成る抗体である。一般に、重鎖及び／又は軽鎖の部分は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（複数可）の残部は、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である。キメラ抗体に関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号及び第５，５３０，１０１号に記載されている。
【０１６８】
一般に、キメラ抗体作製の目的は、意図された患者の種に由来するアミノ酸の数を最大にするキメラを生成することである。一例は「ＣＤＲ移植」抗体であり、これは、抗体が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、抗体鎖（複数可）の残部は、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である。ヒトで使用するために、げっ歯類抗体由来の可変領域又は選択されたＣＤＲが、多くの場合ヒト抗体に移植され、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲに置き換わる。
【０１６９】
キメラ抗体の１つの有用な種類は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物で最初に産生されたモノクローナル抗体から生成される。典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体中のある種のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体の対応する残基に相同であるように改変される。ヒト化は、例えば、げっ歯類の可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域と置換することによる様々な方法を使用して実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照されたい）。
【０１７０】
一態様では、本明細書に提供される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲが、同じ又は異なる系統種由来の抗体からのフレームワーク領域（ＦＲ）に移植される。例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２及び／又はＶＬ１及びＶＬ２のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを生成するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を特定することができる。他の実施形態では、本明細書に開示される重鎖又は軽鎖のＦＲが異なる重鎖又は軽鎖由来のＦＲと置き換えられる。一態様では、Ｊａｇｇｅｄ１抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲの希少アミノ酸は置き換えられないが、残りのＦＲアミノ酸は置き換えられる。「希少アミノ酸」は、この特定のアミノ酸がＦＲ中で通常見出されない位置に存在する特定のアミノ酸である。あるいは、１つの重鎖又は軽鎖から移植される可変領域を、本明細書で開示されるその特定の重鎖又は軽鎖の定常領域と異なる定常領域とともに使用することができる。他の実施形態では、移植される可変領域は単鎖Ｆｖ抗体の一部である。
【０１７１】
ある種の実施形態では、ヒト以外の種由来の定常領域をヒト可変領域（複数可）とともに使用して、ハイブリッド抗体を生成することができる。
【０１７２】
完全ヒトＪａｇｇｅｄ１抗体も提供される。ヒトを抗原に曝露することなく所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体を作製する方法が、利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の生成を実行するために提供される１つの特定の手段は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性のＩｇ遺伝子が不活化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の望ましい抗原で免疫化することができる動物であるマウスで完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する、１つの手段である。完全ヒト抗体を使用して、時には、マウス又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって引き起こされ得る、免疫原性及びアレルギー性応答を最小化することができる。
【０１７３】
完全ヒト抗体は、内在性の免疫グロブリン生成がない状態でヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（通常マウス）を免疫化することによって、生成することができる。この目的のための抗原は、典型的には６個以上の連続的なアミノ酸を有し、随意に、ハプテンなどの担体にコンジュゲートしている。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そうした方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードする内在性のマウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含む、ヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノム中に挿入することによって、生成される。次いで、完全ではないがヒト免疫グロブリン遺伝子座の相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系改変のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異性であるが、マウスではなくヒトのアミノ酸配列（可変領域を含む）を有する抗体を生成する。そのような方法のさらなる詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，５４５，８０７、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号及び第５，５４５，８０６号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１及びＥＰ５４６０７３Ａ１に記載されている。
【０１７４】
「ＨｕＭａｂ」マウスと本明細書で言及する上記のトランスジェニックマウスは、内在性の［ミュー］及び［カッパ］鎖の遺伝子座を不活性化する標的変異とともに、再編成されていないヒト重鎖（［ミュー］及び［ガンマ］）ならびに［カッパ］軽鎖免疫グロブリン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭ又は［カッパ］の発現の低減を示し、免疫化に応じて、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子はクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧ［カッパ］モノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に記載されている。前述の参考文献は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９及び第５，７７０，４２９号ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第ＷＯ９３／１２２７号、ＷＯ９２／２２６４６及びＷＯ９２／０３９１８を参照されたい。これらすべての開示は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するのに利用される技術は、ＷＯ９８／２４８９３及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６にも開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を使用して、Ｊａｇｇｅｄ１に対するヒトモノクローナル抗体を生成する��とができる。トランスジェニックマウスを使用するヒト抗体の生成に関するさらなる詳細を以下に提供する。
【０１７５】
ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを、上記のものなどのトランスジェニックマウスから生成し、選択することができる。適切なベクター及び宿主細胞を使用して、そのような抗体をクローニングし、発現させることができ、又は培養したハイブリドーマ細胞から抗体を採取することができる。
【０１７６】
完全ヒト抗体はまた、（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）ファージディスプレイライブラリーに由来し得る。ファージディスプレイ技法は、糸状バクテリオファージの表面への抗体レパートリーの提示、及び引き続く、選定した抗原へのその結合によるファージの選択を通じて、免疫選択を模倣する。１つのそのような技法が、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１０４９４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７７】
Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質はまた、上記のＣＤＲ、可変領域及び／又は全長鎖を有するＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の構造に基づく、バリアント、模倣体、誘導体又はオリゴマーであり得る。
【０１７８】
一実施形態では、例えば、抗原結合タンパク質は、上で開示した抗原結合タンパク質のバリアント型である。例えば、抗原結合タンパク質のいくつかは、重鎖又は軽鎖、可変領域又はＣＤＲの１つ又は複数において、１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１７９】
天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて、以下のクラスに分類することができる。
【０１８０】
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
【０１８１】
２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
【０１８２】
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
【０１８３】
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
【０１８４】
５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び
【０１８５】
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１８６】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物システムでの合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができる。これらは、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆転又は逆位形態を含む。
【０１８７】
非保存的酸置換は、上記のクラスのうちの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。そのような置換残基は、ヒト抗体と相同な抗体領域に、又は分子の非相同領域に導入することができる。
【０１８８】
そのような変化を起こす場合、ある種の実施形態によれば、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質のハイドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値（「ハイドロパシー指数」）を割り当て、次いで、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均することによって、計算される。各アミノ酸は、その疎水性及び荷電特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【０１８９】
タンパク質に相互作用的生物学的機能を与えることにおけるハイドロパシープロファイルの重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照されたい）。ある種のアミノ酸は、類似したハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、類似した生物活性を依然として保持することが知られている。ハイドロパシー指数に基づいて変化を起こす場合、ある種の実施形態では、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの態様では、±１以内であるものが含まれ、他の態様では、±０．５のものが含まれる。
【０１９０】
特に、本件のように、それによって生成される生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドが免疫学的実施形態における使用が意図される場合、親水性に基づいて類似のアミノ酸の置換を効果的に行うことができることも当技術分野で理解されている。ある種の実施形態では、その隣接するアミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原結合又は免疫原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１９１】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変化を起こす場合、ある種の実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のものが含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。いくつかの場合には、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１９２】
例示的保存的アミノ酸置換を表５に記載する。
【０１９３】
【表６】
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【０１９４】
当業者は、周知の技法を使用して、本明細書に記載されるような、ポリペプチドの適切なバリアントを決定することができる。当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的にすることによって、活性を損なうことなく変化させることができる適切な分子領域を特定することができる。当業者はまた、類似したポリペプチドの間で保存されている、分子の残基及び部分を特定することができる。さらなる実施形態では、生物活性又は構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物活性を損なうことなく、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を受けることができる。
【０１９５】
さらに、当業者は、活性又は構造に重要な残基を類似したポリペプチドにおいて特定する構造−機能研究を精査することができる。そのような比較を考慮して、類似したタンパク質における活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。
【０１９６】
当業者はまた、３次元構造及びアミノ酸配列を、類似したポリペプチドのその構造に関して解析することができる。そのような情報を考慮して、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアライメントを、その３次元構造について予測することができる。当業者は、タンパク質の表面にあると予想されるアミノ酸残基に根本的な変化を起こさないように選択することができ、これは、そのような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基に単一アミノ酸置換を含む試験バリアントを生成することができる。次いで、Ｊａｇｇｅｄ１活性に対するアッセイを使用してこれらのバリアントをスクリーニングすることができ、このようにして、どのアミノ酸を変えることができるか、及びどれを変えるべきではないかに関して情報を得る。言い換えれば、そのような慣例的実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の変異と組み合わせて、さらなる置換が回避されるべきであるアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【０１９７】
いくつかの科学刊行物が２次構造の予測を扱ってきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：２２２−２４５、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、２次構造の予測を補助するために、コンピュータープログラムが現在利用可能である。２次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を越える配列同一性又は４０％を越える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似した構造トポロジーを有し得る。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の進展によって、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳み構造の潜在的な数を含めて、２次構造の予測能力が高められた。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中の折り畳み構造の数は限られていること、及びいったん構造の不可欠な数が解明されると、構造予測が劇的に正確になるであろうことが示唆された（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１９８】
２次構造予測のさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−３８７、Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）及び「進化的連関」（Ｈｏｌｍ，１９９９，上記、及びＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７，上記を参照されたい）が挙げられる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する。（３）タンパク質複合体形成するために結合親和性を変える、（４）リガンドもしくは抗原結合親和性を変える、及び／又は（４）そのようなポリペプチドに対して他の物理化学的もしくは機能的特性を与えるか、そのような特性を改変する、アミノ酸置換が行われる。例えば、天然に存在する配列において、単一又は複数のアミノ酸置換（ある種の実施形態では、保存的アミノ酸置換）を行うことができる。分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側にある抗体部分において、置換を行うことができる）。そのような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を使用することができる（例えば、親又は天然抗原結合タンパク質を特徴づける２次構造を乱さない１つ又は複数の置換アミノ酸）。当技術分野で認識されているポリペプチドの２次及び３次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
さらなる好ましい抗体バリアントとしてはシステインバリアントが挙げられ、これは、親又は天然のアミノ酸配列における１つ又は複数のシステイン残基が欠失しているか、別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている。システインバリアントは、特に抗体が生物学的に活性な立体構造に再度折り畳まれなければならない場合に、有用である。システインバリアントは、天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、典型的には、不対システインによって生じる相互作用を最小限にするために偶数個を有する。
【０２０１】
開示される重鎖及び軽鎖、可変領域ドメインならびにＣＤＲを使用して、Ｊａｇｇｅｄ１に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むポリペプチドを調製することができる。例えば、ＣＤＲの１つ又は複数を分子（例えば、ポリペプチド）に共有結合的又は非共有結合的に組み込んで、免疫接着体を作製することができる。免疫接着体は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込むことができ、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（複数可）を共有結合的に連結することができ、又は非共有結合的にＣＤＲ（複数可）を組み込むことができる。ＣＤＲ（複数可）は、免疫接着体が目的の特定の抗原（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１ポリペプチド又はそのエピトープ）に特異的に結合することを可能にする。
【０２０２】
本明細書に記載される可変領域ドメイン及びＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」又は「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド又はペプチド領域と非ペプチド領域の組み合わせでもよい。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２、及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（これらは、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣体を使用して、類似した治療効果又は予防効果をもたらすことができる。そのような化合物は、コンピューター処理した分子モデリングを活用して開発されることが多い。一般に、ペプチド模倣体は、所望の生物活性、例えば、ここではＪａｇｇｅｄ１に特異的に結合する能力を示す抗体と構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−ならびに−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合で随意に置き換えられている１つ又は複数のペプチド結合を有する、タンパク質である。ある種の実施形態では、コンセンサス配列の１つ又は複数のアミノ酸の同じ種類のＤ−アミノ酸との体系的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を使用して、より安定なタンパク質を生成することができる。さらに、当技術分野で既知の方法（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参照により本明細書に組み込まれる）によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることによって、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列バリエーションを含む拘束性ペプチドを生成することができる。
【０２０３】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質の誘導体も提供される。誘導体化抗原結合タンパク質は、抗体又は断片に所望の特性、例えば、特定の用途における半減期の増大を与える任意の分子又は物質を含むことができる。誘導体化抗原結合タンパク質は、例えば、検出可能（もしくは標識）部分（例えば、放射性分子、比色分子、抗原性分子もしくは酵素分子、検出可能なビーズ（例えば、磁気もしくは高電子密度（例えば金）ビーズ）、もしくは別の分子に結合する分子（例えば、ビオチンもしくはストレプトアビジン））、治療的もしくは診断的部分（例えば、放射性、細胞毒性もしくは医薬的に活性な部分）、又は特定の用途（例えば、ヒト対象などの対象への投与もしくはインビボもしくはインビトロでの他の使用）に対して抗原結合タンパク質の適合性を増大させる分子を含むことができる。抗原結合タンパク質を誘導体化するのに使用することができる分子の例としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗原結合タンパク質のアルブミン連結型誘導体及びペグ化誘導体は、当技術分野で周知の技法を使用して調製することができる。ある種の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるペグ化単鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、トランスチレチン（ＴＴＲ）又はＴＴＲバリアントにコンジュゲート又は連結される。ＴＴＲ又はＴＴＲバリアントは、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールから成る群から選択される化学物質で化学的に修飾され得る。
【０２０４】
他の誘導体としては、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した異種性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、他のタンパク質又はポリペプチドとのＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の共有結合性又は凝集性コンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲートされたペプチドは、異種性シグナル（もしくはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母のアルファ因子リーダーでもよく、又はエピトープタグなどのペプチドでもよい。Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の精製又は特定を容易にするために加えられるペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４及び米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質をＦＬＡＧペプチドに連結することもできる。ＦＬＡＧペプチドは非常に抗原性であり、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現組換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。所与のポリペプチドにＦＬＡＧペプチドが融合している融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ又は複数の標識を含む。用語「標識基」又は「標識」は、任意の検出可能な標識を意味する。適切な標識基の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基又は第２のレポーターが認識する所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するように、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で既知であり、適すると思われるように使用することができる。
【０２０６】
用語「エフェクター基」は、細胞毒性剤として働く、抗原結合タンパク質に結合している任意の基を意味する。適切なエフェクター基の例は、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の適切な基としては、毒素、治療的基又は化学療法的基が挙げられる。適切な基の例としては、カリケアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシン及びマイタンシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、エフェクター基は、潜在的な立体障害を低減するように、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。
【０２０７】
一般に、標識は、それが検出されることになるアッセイに応じて、以下の様々なクラスに分類される：ａ）放射性でも重同位元素でもよい同位体標識、ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）、ｃ）レドックス活性部分、ｄ）光学色素、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ｅ）ビオチン標識基、及びｆ）第２のレポーターが認識する所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するように、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で既知である。
【０２０８】
特異的な標識としては、光学色素が挙げられ、これには、限定されないが、発色団、蛍光体及びフルオロフォアが含まれ、多くの場合、後者が特異的である。フルオロフォアは、「小分子」蛍光物質又はタンパク質性蛍光物質のいずれかであり得る。
【０２０９】
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を介して検出することができる任意の分子を意味する。適切な蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）が挙げられる。フルオロフォアを含めた適切な光学色素が、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
【０２１０】
適切なタンパク質性蛍光標識としてはまた、限定されないが、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ又はＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）を含めた緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ、Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、第５４１８１５５号、第５６８３８８８号、第５７４１６６８号、第５７７７０７９号、第５８０４３８７号、第５８７４３０４号、第５８７６９９５号、第５９２５５５８号）が挙げられる。
【０２１１】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその一部をコードする核酸も提供され、これらには、抗体の一方もしくは両方の鎖、又はその断片、誘導体、変異タンパク質、もしくはバリアントをコードする核酸、重鎖可変領域又はＣＤＲのみをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特定する、解析する、変異させる又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又はシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸及びこれらの配列の相補的配列が含まれる。核酸はいかなる長さでもよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００もしくはそれ以上のヌクレオチド長でもよく、及び／又は１つもしくは複数のさらなる配列、例えば調節配列を含むことができ、及び／又はより大きな核酸、例えばベクターの一部でもよい。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチドならびにこれらの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含むことができる。本明細書に提供される任意の可変領域をこれらの定常領域に結合させて、完全な重鎖及び軽鎖配列を形成することができる。しかし、これらの定常領域配列は具体例としてのみ提供されることを理解されたい。いくつかの実施形態では、可変領域配列は当技術分野で既知の他の定常領域配列に結合される。
【０２１２】
ある種の抗原結合タンパク質又はその一部（例えば、全長抗体、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメイン又はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３）をコードする核酸を、Ｊａｇｇｅｄ１又はその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって、核酸を単離することができる。ファージディスプレイは既知の技法の別の例であり、これによって、抗体の誘導体及び他の抗原結合タンパク質を調製することができる。１つのアプローチでは、目的の抗原結合タンパク質の成分であるポリペプチドを任意の適切な組換え発現系で発現させ、発現させたポリペプチドをアセンブルさせて、抗原結合タンパク質を形成する。
【０２１３】
一態様は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせる方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書で定義されるように、中程度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む予備洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣ及び５５℃のハイブリダイゼーション温度のハイブリダイゼーション緩衝液（又は、４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％のホルムアミドを含むものなどの他の類似したハイブリダイゼーション溶液）ならびに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせ、続いて、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄する。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままになるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大又は低下させることができる。
【０２１４】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメーター及び適切な条件を考案するための手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，上記、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）に記載されており、例えば、核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当業者が容易に決定することができる。
【０２１５】
変異によって核酸へ変化を導入し、それによって、その核酸がコードするポリペプチド（例えば、抗体又は抗体誘導体）のアミノ酸配列を変化させることができる。当技術分野で既知の任意の技法を使用して、変異を導入することができる。一実施形態では、例えば、部位特異的変異誘発プロトコールを使用して、１つ又は複数の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の実施形態では、例えば、ランダム変異誘発プロトコールを使用して、１つ又は複数のランダムに選択された残基を変化させる。どのようにそれが行われようと、変異体ポリペプチドを発現させ、所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０２１６】
コードするポリペプチドの生物活性を有意に変えることなく、変異を核酸に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基において、アミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を行うことができる。あるいは、コードするポリペプチドの生物活性を選択的に変化させる１つ又は複数の変異を核酸に導入することができる。例えば、変異は、量的又は質的に生物活性を変化させることができる。量的変化の例としては、活性を増大、低減又は排除することが挙げられる。質的変化の例としては、抗体の抗原特異性を変化させることが挙げられる。一実施形態では、当技術分野で確立されている分子生物学的技法を使用して、本明細書に記載の任意の抗原結合タンパク質をコードする核酸を変異させて、アミノ酸配列を変えることができる。
【０２１７】
別の態様は、核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適した核酸分子を提供する。核酸分子は、全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片又はポリペプチドの活性部分をコードする断片を含むことができる。
【０２１８】
核酸配列に基づくプローブを、核酸又は類似した核酸、例えばポリペプチドをコードする転写産物を検出するのに使用することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子を含むことができる。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を特定するのに使用することができる。
【０２１９】
別の態様は、ポリペプチド又はその一部（例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ又は１つもしくは複数の可変領域ドメインを含む断片）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ又は複数の調節配列を含む。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーター及びサイトメガロウイルスプロモーター）、ある種の宿主細胞のみでヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７を参照されたい）ならびに特定の処理又は条件に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーター及び原核生物系と真核生物系の両方におけるｔｅｔ応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい）が挙げられる。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解されるであろう。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸にコードされる融合タンパク質又はペプチドを含めた、タンパク質又はペプチドを生成することができる。
【０２２０】
別の態様は、組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、いかなる原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又は真核細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））でもよい。従来の形質転換又はトランスフェクション技法によって、ベクターＤＮＡを原核細胞又は真核細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用する発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、細胞のごく一部のみがそのゲノムに外来ＤＮＡを組み込むことができることが知られている。こうした組み込み体を特定及び選択するために、一般に、（例えば、抗生物質抵抗性に関する）選択マーカーをコードする遺伝子を目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬物に抵抗性を与えるものが挙げられる。数ある方法の中でも、薬物選択によって、導入核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞を特定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２２１】
上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写又は発現カセットの形態の発現系及びコンストラクトならびにそのような発現系又はコンストラクトを含む宿主細胞も本明細書に提供される。
【０２２２】
いくつかの従来の技法のいずれかによって、本明細書に提供される抗原結合タンパク質を調製することができる。例えば、当技術分野で既知の任意の技法を使用して、組換え発現系によって、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を生成することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照されたい。
【０２２３】
抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株で（例えば、特に、抗体はハイブリドーマで発現させることができる）又はハイブリドーマ以外の細胞株で発現させることができる。抗体をコードする発現コンストラクトを使用して、哺乳類、昆虫又は微生物の宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、第４，９５９，４５５で例示されるように、ウイルス又はバクテリオファージ中へポリヌクレオチドをパッケージングし、当技術分野で既知のトランスフェクション手順によってコンストラクトで宿主細胞を形質導入することを含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法を使用して、実施することができる。使用される最適な形質転換手順は、どの種類の宿主細胞が形質転換されているかに依存する。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、核酸と正電気を帯びた脂質との混合及び核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０２２４】
組換発現コンストラクトは、典型的には、以下の１つ又は複数を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む：本明細書に提供される１つ又は複数のＣＤＲ、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）、及び／又はＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の別のスキャフォールド部分。これらの核酸配列は、標準的なライゲーション技法を使用して、適切な発現ベクター中に挿入される。一実施形態では、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域は、抗Ｊａｇｇｅｄ１特異的重鎖定常領域又は軽鎖可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクター中に連結される。ベクターは、典型的には、用いられる特定の宿主細胞で機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞の機構に適合し、遺伝子の増幅及び／又は発現が生じ得ることを可能にする）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを使用するタンパク質−断片相補性アッセイを用いるベクターが使用される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２７０，９６４号を参照されたい）。適切な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。抗体及び断片をクローニングする及び発現させるための他の有用なベクターとしては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉａｎｃｈｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９−４４に記載されているものが挙げられる。さらなる適切な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに論じられている。
【０２２５】
典型的には、宿主細胞のうちのいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミド維持のため、ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含む。ある種の実施形態では、まとめて「隣接配列」と称されるそのような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列１つ又は複数を含む：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択マーカー要素。これらの配列のそれぞれを以下に記載する。
【０２２６】
随意に、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質をコードする配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含むことができる。このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）又はＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードし、これらに対する市販の抗体が存在する。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を親和性精製又は検出するための手段として働くことができる。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとして、タグに対する抗体を使用する、カラムクロマトグラフィーによって達成することができる。随意に、続いて、切断のためのある種のペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製されたＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質からタグを除去することができる。
【０２２７】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／又は系統由来）、異種（すなわち、宿主細胞種もしくは系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つを超える供給源由来の隣接配列の組み合わせ）、合成又は天然でもよい。したがって、隣接配列の供給源は、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物、又は任意の植物でもよく、但し、隣接配列が宿主細胞の機構において機能的であり、その機構によって活性化され得るということを条件とする。
【０２２８】
ベクターで有用な隣接配列は、当技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書で有用な隣接配列は、マッピングによって、及び／又は制限酵素消化によって以前に特定されており、したがって、適切な制限酵素を使用して、適切な組織供給源から単離することができる。いくつかの場合には、隣接配列の完全なヌクレオチド配列が知られている。この場合、核酸合成又はクローニングに関して本明細書に記載される方法を使用して、隣接配列を合成することができる。
【０２２９】
隣接配列のすべて又は一部のみが知られている場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、及び／又は同じもしくは別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／又は隣接配列断片などの適切なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得ることができる。隣接配列が知られていない場合は、例えば、コード配列又はさらに別の遺伝子（複数可）を含み得るより大きなＤＮＡ片から、隣接配列を含むＤＮＡ断片を単離することができる。単離は、適切なＤＮＡ断片をもたらすための制限酵素消化、それに続く、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）又は当業者に既知の他の方法を使用する単離によって達成することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０２３０】
複製開始点は、典型的には、商業的に購入した原核発現ベクターの一部であり、この開始点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を援助する。選択したベクターが複製開始点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製開始点は大抵のグラム陰性細菌に適しており、様々なウイルス性開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶもしくはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点成分は哺乳類発現ベクターに必要でない（例えば、ＳＶ４０開始点は、これがウイルスの初期プロモーターも含むという理由のみで使用されることが多い）。
【０２３１】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞の転写終結配列は、後にポリ−Ｔ配列が続くＧ−Ｃリッチ断片である。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるか、さらにベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書に記載のものなどの核酸合成方法を使用して、容易に合成することもできる。
【０２３２】
選択マーカー遺伝子は、選択的培養培地で増殖する宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、原核宿主細胞に対しては、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに抵抗性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地もしくは限定培地から利用できない不可欠な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。特定の選択マーカーは、カナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子及びテトラサイクリン抵抗性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン抵抗性遺伝子を原核と真核の両方の宿主細胞における選択に使用することもできる。
【０２３３】
他の選択遺伝子を使用して、発現させることになる遺伝子を増幅することができる。増幅は、増殖又は細胞生存に不可欠なタンパク質の生成に必要とされる遺伝子が組換え細胞の継続的世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターを含まないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体は、ベクター中に存在する選択遺伝子によって形質転換体のみが唯一適合して生存する選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度が連続的に増やされる条件下で形質転換細胞を培養することによって課せられ、それによって、選択遺伝子とＪａｇｇｅｄ１ポリペプチドに結合する抗原結合タンパク質などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅がもたらされる。結果として、抗原結合タンパク質などの増大した量のポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０２３４】
リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要であり、シャイン−ダルガルノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）を特徴とする。このエレメントは典型的にはプロモーターに対して３’及び発現されるポリペプチドのコード配列に対して５’に位置する。
【０２３５】
真核宿主細胞の発現系でグリコシル化が所望される場合などのいくつかの場合には、様々なプレ又はプロ配列を操作して、グリコシル化又は収率を向上させることができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変えること、又はプロ配列を加えることができ、これも、グリコシル化に影響を及ぼし得る。最終タンパク質生成物は、（成熟タンパク質の第１アミノ酸に対して）−１位置に、完全に除去されなかった可能性がある、発現から生じる１つ又は複数のさらなるアミノ酸を有し得る。例えば、最終的なタンパク質生成物は、アミノ末端に付加された、ペプチダーゼ切断部位に見出される、１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、成熟ポリペプチド内のそのような領域で酵素が切断する場合、所望のポリペプチドのわずかにトランケートされた形態をもたらす可能性がある。
【０２３６】
発現及びクローニングは、典型的には、宿主生物によって認識され、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質をコードする分子に作動可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’）（通常、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、２つのクラス、すなわち誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの１つに分けられる。誘導性プロモーターは栄養素の有無又は温度変化などの培養条件のある種の変化に応答して、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの増大を起こす。これに対して、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結された遺伝子を均一に転写し、すなわち、遺伝子発現に対する制御がほとんど又は全くない。様々な潜在的な宿主細胞に認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化により元のＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を含む重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０２３７】
酵母宿主で使用するのに適したプロモーターも当技術分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に使用される。哺乳類宿主細胞で使用するのに適したプロモーターは周知であり、限定されないが、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるものが挙げられる。他の適切な哺乳類プロモーターとしては、異種哺乳類プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【０２３８】
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物によって、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を含む軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡの転写を増大させることができる。エンハンサーは、転写を増大させるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、比較的配向及び位置に依存せず、転写単位に対して５’と３’の両方の位置に見いだされている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−プロテイン及びインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当技術分野で既知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが、真核生物のプロモーターの活性化に対する例示的なエンハンシングエレメントである。エンハンサーは、コード配列に対して５’又は３’のいずれかでベクター中に位置し得るが、典型的には、プロモーターから５’の部位に位置する。抗体の細胞外分泌を促進するために、適切な天然又は異種のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が生成されることになる宿主細胞の種類に依存し、異種のシグナル配列は天然のシグナル配列と置き換わることができる。哺乳類宿主細胞で機能的であるシグナルペプチドの例としては、次のものが挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されているインターロイキン−２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド、欧州特許第０４６０８４６に記載されているＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
【０２３９】
一実施形態では、リーダー配列は、配列番号３５６（ａｔｇｇａｃａｔｇａ  ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ  ａｃａｇｃｔｇｃｔｇ  ｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔ  ｇａｇａｇｇｃｇｃｃ  ａｇａｔｇｃ）にコードされる配列番号３５５（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬ  ＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ  ＲＣ）を含む。別の実施形態では、リーダー配列は、配列番号３５８（ａｔｇｇｃｃｔｇｇｇ  ｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔ  ｃｃｔｃａｃｃｃｔｃ  ｃｔｃａｃｔｃａｇｇ  ｇｃａｃａｇｇｇｔｃ  ｃｔｇｇｇｃｃ）にコードされる配列番号３５７（ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬ  ＬＴＱＧＴＧＳＷＡ）を含む。
【０２４０】
提供される発現ベクターは、市販ベクターなどの出発ベクターから構築することができる。そのようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本明細書に記載の隣接配列の１つ又は複数がもとからベクターに存在しない場合は、これらを個々に得、ベクターに連結することができる。隣接配列のそれぞれを得るのに使用する方法は、当業者に周知である。
【０２４１】
ベクターを構築し、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合配列を含む軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅及び／又はポリペプチドの発現に適した宿主細胞に挿入することできる。抗原結合タンパク質の発現ベクターでの、選択された宿主細胞の形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション又は他の既知の技法を含めた、周知の方法によって達成することができる。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞の種類に応じるものである。これらの方法及び他の適切な方法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記に記載されている。
【０２４２】
適切な条件下で培養する場合、宿主細胞は、続いて培養培地（宿主細胞が培地中に抗原結合タンパク質を分泌する場合）から、又は直接的に抗原結合タンパク質を生成する宿主細胞（抗原結合タンパク質が分泌されない場合）から収集することができる、抗原結合タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、様々な因子、例えば、所望の発現レベル、活性にとって望ましい又は必要であるポリペプチドの修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）及び生物学的に活性な分子への折り畳みやすさに依存する。
【０２４３】
発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）及びいくつかの他の細胞株を含めた、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、且つＪａｇｇｅｄ１結合特性を有する抗原結合タンパク質を構成的に生成するかを決定することによって、選択することができる。別の実施形態では、それ自体の抗体を作製しないが、異種の抗体を作製し、分泌する能力があるＢ細胞系譜からの細胞株を選択することができる。
【０２４４】
一実施形態では、本発明は、表２、３及び４で特定されるポリヌクレオチドの１つ又は複数を発現する細胞が生成する抗原結合タンパク質に関する。
【０２４５】
一態様では、Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質は、慢性の治療のために投与される。別の態様では、結合タンパク質は急性の療法のために投与される。
【０２４６】
Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を含む医薬組成物も提供され、これは、本明細書に開示される予防的及び治療的方法のうちのいずれかで利用可能である。一実施形態では、治療有効量の、抗原結合タンパク質の１つ又は複数、ならびに医薬的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントも提供される。許容可能な製剤材料は、用いられる投薬量及び濃度で、受容者に対して無毒である。
【０２４７】
ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着又は浸透を改変する、維持する又は保持するための製剤材料を含むことができる。そのような実施形態では、適切な製剤材料としては、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩もしくは他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；フィラー；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色剤、着香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増強剤（例えば、ショ糖もしくはソルビトール）；張性増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達媒体；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬的アジュバントが挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙは、医薬組成物に組み込むことができる適切な薬剤について、さらなる詳細及び選択肢を提供する。
【０２４８】
ある種の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図された投与経路、送達型式及び所望の投薬量に応じて、当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，上記を参照されたい。ある種の実施形態では、そのような組成物は、開示される抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響し得る。ある種の実施形態では、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、性質上、水性又は非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクル又は担体は、注射用水又は生理的食塩水であり得る。ある種の実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を随意の製剤化剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，上記）と混合することによって、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、保管用に調製することができる。さらに、ある種の実施形態では、適切な賦形剤、例えばショ糖を使用して、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２４９】
医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用又は経口などの消化管を介する送達用に選択することができる。そのような医薬的に許容可能な組成物の調製は当技術分野の範囲内である。
【０２５０】
製剤成分は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で存在する。ある種の実施形態では、緩衝液を使用して、生理的ｐＨで、又はわずかに低いｐＨで、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に組成物を維持する。
【０２５１】
非経口投与が意図される場合、医薬的に許容可能なビヒクル中に所望のヒトＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を含む、発熱物質を含有しない、非経口的に許容される水溶液の形態で、治療用組成物を提供することができる。非経口注射に特に適するビヒクルは、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質が滅菌した等張液として製剤化され、適切に保持される、滅菌蒸留水である。ある種の実施形態では、調製は、デポー注射を介して送達され得る生成物の制御放出又は持続性放出をもたらすことができる薬剤、例えば、注射可能なマイクロスフェア、生体浸食可能な粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソームとの所望の分子の製剤化を含むことができる。ある種の実施形態では、循環中の持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸を使用することもできる。ある種の実施形態では、埋め込み式の薬物送達デバイスを使用して、所望の抗原結合タンパク質を導入することができる。
【０２５２】
ある種の医薬組成物は、吸入用に製剤化される。いくつかの実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、吸入可能な乾燥粉末剤として製剤化される。特定の実施形態では、エアロゾル送達のために、噴射剤とともにＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質吸入溶液剤も製剤化することができる。ある種の実施形態では、溶液剤を噴霧することができる。したがって、肺内投与及び製剤方法が国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、これは、参照により組み込まれ、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載している。いくつかの製剤は経口投与することができる。この様式で投与されるＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、錠剤及びカプセル剤などの固形剤型の調合で慣習的に使用される担体とともに又はそのまま製剤化することができる。ある種の実施形態では、カプセル剤は、生物学的利用能が最大化され、前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される消化管の段階で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の吸収を容易にするために、さらなる薬剤を含むことができる。希釈剤、着香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤及び結合剤を用いることもできる。
【０２５３】
いくつかの医薬組成物は、有効量の１種又は複数のＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質を、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に含む。滅菌水又は別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することによって、単位用量形態で溶液剤を調製することができる。適切な賦形剤としては、限定されないが、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウム、又は結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンもしくはアラビアゴム、又は潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクが挙げられる。
【０２５４】
持続送達製剤又は制御送達製剤中にＪａｇｇｅｄ１結合タンパク質を含む製剤を含めて、さらなる医薬組成物が当業者に明らかになるであろう。リポソーム担体、生体浸食可能なマイクロ粒子又は多孔質ビーズ及びデポー注射などの様々な他の持続送達又は制御送達手段を製剤化する技法も当業者に既知である。例えば、参照により組み込まれ、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマーマイクロ粒子の制御放出を記載している、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。持続性放出調製物は、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続性放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（参照により組み込まれる、米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されている）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−インエタクリレート（ｉｎｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，上記）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を含むことができる。持続性放出組成物は、当技術分野で既知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができるリポソームを含むこともできる。例えば、参照により組み込まれるＥｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号、第ＥＰ０８８，０４６号及び第ＥＰ１４３，９４９号を参照されたい。
【０２５５】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合は、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後のいずれかに行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液で保管することができる。非経口組成物は、一般に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用の針で穴をあけることができる栓を有する静脈輸液バッグ又はバイアルに入れられる。
【０２５６】
ある種の製剤では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ又は１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。一実施形態では、医薬組成物は、抗原結合タンパク質、緩衝液及びポリソルベートを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、抗原結合タンパク質、緩衝液、ショ糖及びポリソルベートを含む。医薬組成物の例は、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの抗原結合タンパク質、５〜２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５〜１０％ｗ／ｖのショ糖及び０．００２〜０．００８％ｗ／ｖのポリソルベートを含むものである。例えば、ある種の組成物は、９〜１１ｍＭのナトリウム酢酸緩衝液、８〜１０％ｗ／ｖのショ糖及び０．００５〜０．００６％ｗ／ｖのポリソルベート中に６５〜７５ｍｇ／ｍＬの抗原結合タンパク質を含む。ある種のそのような製剤のｐＨは、４．５〜６の範囲である。他の製剤は、５．０〜５．５のｐＨ（例えば、５．０、５．２又は５．４のｐＨ）を有する。
【０２５７】
いったん医薬組成物が製剤化されると、これを、溶液剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固体、結晶として、又は脱水もしくは凍結乾燥した粉末剤として滅菌バイアル中に保管することができる。そのような製剤は、すぐに使える形態又は投与より前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保管することができる。単回用量の投与単位を生成するためのキットも提供される。ある種のキットは、乾燥したタンパク質を有する第１の容器及び水性製剤を有する第２の容器を含む。ある種の実施形態では、単一及び複数のチャンバーを有する予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及びリオシリンジを含むキットが提供される。用いられるＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質含有医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療上の状況及び目的に依存する。治療に適した投薬量レベルは、送達される分子、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質が使用されている適応症、投与経路ならびに患者のサイズ（体重、体表もしくは器官のサイズ）及び／又は状態（年齢及び全体的な健康状態）にある程度応じて変動することを当業者は認識するであろう。ある種の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るように、投薬量を用量調整することができ、投与経路を変更することができる。
【０２５８】
投薬頻度は、使用される製剤中の特定のＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の薬物動態パラメーターに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、単回用量として、又は経時的な２用量以上（これは、同量の所望の分子を含んでもよいし、含まなくてもよい）として、又は埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介する持続注入として、組成物を投与することができる。適切な投薬量は、適切な用量応答データを使用することによって、確認することができる。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質を長期間にわたって患者に投与することができる。ある種の実施形態では、抗原結合タンパク質は、２週間毎、毎月、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎又は６か月毎に投与される。
【０２５９】
医薬組成物の投与経路は、既知の方法に従い、例えば、経口によるもの、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内又は病巣内経路による注射を介するもの；持続性放出系による、又は埋め込みデバイスによるものである。ある種の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、又は注入によって継続的に、又は埋め込みデバイスによって、投与することができる。
【０２６０】
組成物は、所望の分子を吸収又は封入した膜、スポンジ又は別の適切な材料の埋め込みを介して、局所的に投与することもできる。ある種の実施形態では、埋め込みデバイスが使用される場合、任意の適切な組織又は器官にデバイスを埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス又は継続的投与を介し得る。
【０２６１】
本開示によるＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の医薬組成物をエクスビボで使用することが望ましい場合もある。そのような場合、患者から取り出した細胞、組織又は器官をＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質の医薬組成物に曝露し、続いて、その細胞、組織及び／又は器官を患者に移植して戻す。
【０２６２】
特定の患者の個々のプロファイルに応じて適切な治療指標及び標的脂質レベルを医師は選択することができるであろう。高脂血症の治療指針を与えるための広く認められている１つの基準は、Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０２−５２１５（２００２）であり、その印刷刊行物はその内容全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
特定の用量の有効性は、バイオマーカー又はある種の生理的パラメーターの向上を参照することにより評価することができる。適切なバイオマーカーの例としては、遊離コレステロール対血漿脂質、遊離コレステロール対膜タンパク質、ホスファチジルコリン対スフィンゴミエリンの比又はＨＤＬ−Ｃレベルが挙げられる。
【０２６４】
本明細書に開示される予防的及び治療的方法で使用するために、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質及び１種又は複数のさらなる治療剤を含む組成物、ならびにそのような薬剤が、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質と同時に又は該タンパク質に連続して投与される方法も本明細書に提供される。１種又は複数のさらなる薬剤は、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質と共製剤化することができ、又はＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質と同時投与することができる。一般に、治療方法、組成物及び化合物は、様々な病態の治療において、他の治療剤と組み合わせて用いることもでき、さらなる薬剤は同時に投与される。
【０２６５】
本明細書に提供されるＪａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、生物試料においてＪａｇｇｅｄ１を検出するのに有用である。例えば、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、診断アッセイ、例えば、血清で発現しているＪａｇｇｅｄ１を検出及び／又は定量化するための結合アッセイで使用することができる。
【０２６６】
記載される抗原結合タンパク質は、Ｊａｇｇｅｄ１と関係がある疾患及び／又は状態を検出、診断又はモニターするために、診断目的で使用することができる。開示される抗原結合タンパク質は、当業者に既知の古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ  １５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６）を使用して、試料中のＪａｇｇｅｄ１の存在を検出するための手段を提供する。Ｊａｇｇｅｄ１の検出は、インビボ又はインビトロで実施することができる。
【０２６７】
本明細書に提供される診断適用は、Ｊａｇｇｅｄ１の発現を検出するための抗原結合タンパク質の使用を含む。Ｊａｇｇｅｄ１の存在の検出に有用な方法の例としては、免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定法（ＲＩＡ）が挙げられる。
【０２６８】
診断適用のために、抗原結合タンパク質は、典型的には、検出可能な標識基で標識される。適切な標識基としては、限定されないが、次のものが挙げられる：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基又は第２のレポーターが認識する所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するように、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で既知であり、使用することができる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、Ｊａｇｇｅｄ１抗原結合タンパク質は、当技術分野で既知の技法を使用して単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照されたい。
【０２７０】
開示される別の態様は、Ｊａｇｇｅｄ１への結合について、提供される抗原結合タンパク質と競合する試験分子の存在を検出することを提供する。１つのそうしたアッセイの例は、試験分子の存在又は非存在下で、ある量のＪａｇｇｅｄ１を含む溶液における遊離抗原結合タンパク質の量を検出することを含むと思われる。遊離抗原結合タンパク質（すなわち、Ｊａｇｇｅｄ１に結合していない抗原結合タンパク質）の量の増大は、試験分子が、Ｊａｇｇｅｄ１の結合について、抗原結合タンパク質と競合できることを示すと思われる。一実施形態では、抗原結合タンパク質が標識基で標識される。あるいは試験分子が標識され、抗原結合タンパク質の存在及び非存在下で、遊離試験分子の量がモニターされる。
【０２７１】
Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質は、肺疾患に関連する状態を治療、診断又は改善するのに使用することができる。様々な実施形態では、肺疾患は、肺がん、呼吸器管又は肺の感染症、間質の疾患、ガス交換もしくは血液循環の障害、気道の疾患又は胸膜の障害でもよい。本明細書で使用する場合、「肺がん」は、原発性肺腫瘍（例えば、気管支原性癌もしくは気管支カルチノイド）又は別の器官もしくは組織（例えば、乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、頸、直腸、精巣、骨もしくは黒色腫）の原発腫瘍からの転移のいずれかを指す。本明細書で使用する場合、「呼吸器管又は肺の感染症」は、呼吸器系の任意の部分の、任意の細菌、ウイルス、真菌又は寄生体の感染症を指す。本明細書で使用する場合、「間質の疾患」としては、線維症を含めた、間質の任意の障害（例えば、間質性肺線維症、間質性肺炎、間質性肺疾患、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、サルコイドーシス又は特発性肺血鉄症）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「ガス交換又は血液循環の障害」は、血液及び肺への／からのガスの分配及び／又は交換に影響を及ぼす任意の異常（例えば、肺水腫、肺塞栓症、呼吸不全（例えば、弱った筋肉が原因）、急性呼吸不全症候群又は肺高血圧症）を指す。本明細書で使用する場合、「気道の疾患」としては、遺伝的及び環境的病因の障害（例えば、喘息、慢性気管支炎、細気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、気腫、慢性閉塞性肺疾患、びまん性汎細気管支炎又はリンパ管筋腫症を含めた、通常の規則的な呼吸パターンの任意の障害が挙げられる。本明細書で使用する場合、「胸膜の障害」としては、例えば、胸水（例えば、血胸（胸膜腔中の血液）もしくは気腫（胸膜腔の膿）、気胸（気体、例えば、外傷性、自発性もしくは緊張）、胸膜炎又は胸膜線維症もしくは胸膜石灰化が挙げられる。
【０２７２】
適用において、肺疾患に関連する状態は、治療有効用量のＪａｇｇｅｄ１結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することによって治療することができる。投与は、本明細書に記載のように、例えば、ＩＶ注射、腹腔内（ＩＰ）注射、筋肉内注射、噴霧化又は錠剤もしくは液体製剤の形態での経口によって実施することができる。ある状況では、治療的に有効な又は好ましい用量のＪａｇｇｅｄ１結合タンパク質は、臨床医が決定することができる。治療有効用量のＪａｇｇｅｄ１結合タンパク質は、特に、投与スケジュール、投与される薬剤の単位用量、Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、受容者の免疫状態及び健康に依存する。本明細書で使用する場合、用語「治療有効用量」は、研究者、医師又は他の臨床医によって探求される、組織系、動物又はヒトにおいて生物学的又は医薬的応答（治療を受ける疾患又は障害の症状の緩和又は改善を含める）を誘発する、Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質の量を意味する。
【０２７３】
Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質を含む医薬組成物を別の化合物とともに同時投与することができることに留意されたい。Ｊａｇｇｅｄ１結合タンパク質と同時投与される化合物の同一性及び特性は、治療又は改善すべき状態の性質に依存する。
【０２７４】
開示される方法を実施するためのキットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載のものなどの医薬組成物を含むことができ、これは、本明細書に提供されるペプチド又はタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含むベクター及び細胞ならびにそのような核酸含有化合物を含む医薬組成物を含み、これらは、滅菌した容器中に提供することができる。随意に、代謝障害の治療における提供される医薬組成物の使用法に関する指示を含むこともでき、又はその指示を患者もしくは医療サービス提供者が利用できるようにすることもできる。
【０２７５】
一態様では、キットは、（ａ）治療有効量のＪａｇｇｅｄ１結合タンパク質を含む医薬組成物、及び（ｂ）医薬組成物のための１つ又は複数の容器を含む。そのようなキットは、それらの使用についての指示を含むこともでき、指示は、治療を受ける当の代謝障害に合わせることができる。指示は、キットに提供される材料の使用及び性質を説明することができる。
【０２７６】
指示は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷されていてもよく、添付文書としてキット中、キット又はその成分の容器のラベル（例えば、パッケージングに関連する）中などに存在してもよい。他の実施形態では、指示は、適切なコンピューター可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子保管データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示は、キット中に存在しないが、インターネット上のなどの遠隔の供給源から指示を得る手段が提供される。この実施形態の例は、指示を閲覧することができる及び／又は指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。
【０２７７】
キットのいくつか又はすべての成分を、無菌性を維持するのに適したパッケージング中に包装することが望ましいことが多い。キットの成分をキット収納要素中に包装して、単一の取り扱いやすいユニットを作製することができ、ここでは、キット収納要素、例えば、箱又は類似構造物は、例えば、キットの成分のいくつか又はすべての無菌性をさらに保持するために、気密容器であってもよく、そうでなくてもよい。
【実施例】
【０２７８】
実施例１：免疫化
【０２７９】
Ｊａｇｇｅｄ−１に対する完全ヒト抗体は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ技術、すなわち、対応するアイソタイプの完全ヒトＩｇＧΚ及びＩｇＧλ抗体の多様なレパートリーを発現するように操作されたトランスジェニックマウス（Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｃｏｒｖａｌａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｊｉａ，Ｘ．Ｃ．，Ｍａｙｎａｒｄ−Ｃｕｒｒｉｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．，Ｇａｌｌｏ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｏｕｉｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｖ．，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｌｕｎａ，Ｊ．，Ｒｏｙ，Ｃ．Ｍ．，Ａｂｄｅｒｒａｈｉｍ，Ｈ．，Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ，Ｆ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ａ．，Ｈａｌｅｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｋｌａｐｈｏｌｚ，Ｓ．，Ｆｉｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ｇ．，Ｚｓｅｂｏ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，１４６−１５６、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５９３−５９７）を使用して生成した。２つの型のＪａｇｇｅｄ−１免疫原、すなわち、全長ヒトＪａｇｇｅｄ−１を発現する２９３Ｔトランスフェクタント及び全長ヒトＪａｇｇｅｄ−１を発現するＣＨＯトランスフェクタントで、マウスのＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ系統を免疫化した。４．０×１０６Ｊａｇｇｅｄ−１トランスフェクト細胞／マウスで細胞免疫原を投与し、引き続いて、２．０×１０６Ｊａｇｇｅｄ−１トランスフェクト細胞／マウスの追加免疫を行った。使用した注射部位は尾基部皮下と腹腔内の組み合わせであった。使用したアジュバントは、製造者の指示に従って調製し、抗原溶液と混合した、ミョウバン（Ｅ．Ｍ．Ｓｅｒｇｅｎｔ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，カタログ番号１４５２−２５０）であった。８週〜１２週間にわたってマウスを免疫化した。
【０２８０】
最初の注射からおよそ５週間後に血清を収集し、ＣＨＯ−Ｓ細胞で一過的に発現させた組換えＢＣＭＡ受容体のＦＡＣ染色によって、特異的な力価を決定した。ＣＨＯ細胞免疫原群を使用して達成される特異的な免疫応答を優れていると判定した。免疫動物の２つの群を特定し、２つのスクリーニングキャンペーンに使用した。５匹のＸＭＧ２−ＫＬ及びＪａｇｇｅｄ−１を一過的に発現しているＣＨＯ細胞で免疫化した３匹のＸＭＧ２−ＫＬを含む、動物の第１の群をプールし、抗体生成に進めた。第２の群は、Ｊａｇｇｅｄ−１を一過的に発現しているＣＨＯ細胞で免疫化した７匹のＸＭＧ４−ＫＬ動物であり、プールし、抗体生成に進めた。
【０２８１】
実施例２：モノクローナル抗体の調製
【０２８２】
流入領域リンパ節及び脾臓を免疫動物から採取し、各コホートについてプールした。適切な培地のＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でリンパ球及び脾細胞を組織から分離して、組織から細胞を遊離させ、ＲＰＭＩに懸濁した。適切な方法を使用してＢ細胞を選択及び／又は増やし、適切な融合パートナー、例えば、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関ＣＲＬ１５８０、Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８−１５５０）と融合した。
【０２８３】
Ｂ細胞を融合パートナー細胞と１：４の比で混合した。この細胞混合物を、４００×ｇで４分間遠心分離することによって、軽くペレット化し、上清をデカントし、１ｍｌのピペットを使用して細胞混合物を軽く混合した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから得た；リンパ球１０００万個当たり１ｍｌ）で融合を誘導した。１分間にわたって軽く撹拌しながらＰＥＧ／ＤＭＳＯを緩徐に加え、続いて、１分間混合した。次いで、ＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ；Ｂ細胞１０００万個あたり２ｍｌ）を２分間にわたって軽く撹拌しながら加え、続いて、ＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１０００万個あたり８ｍｌ）を３分間にわたって加えた。
【０２８４】
融合した細胞を軽くペレット化し（４００×ｇ  ５  ６分）、Ｂ細胞２０００万個あたり２０ｍｌの選択培地（例えば、アザセリン及びヒポキサンチン［ＨＡ］ならびに必要に応じて他の補充物質を含むＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次いで、Ｂ細胞２０００万個あたり２００ｍｌの選択培地に再懸濁し、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養してから、９６ウェルにプレーティングした。
【０２８５】
得られるコロニーのクローン性を最大化するために、標準的な技法を使用して９６ウェルプレート中に細胞を分配した。培養の数日後に、ハイブリドーマ上清を収集し、ヒトＪａｇｇｅｄ−１受容体の結合の確認、リガンド結合競合アッセイによるノッチリガンドブロッキング抗体の特定及びＪａｇｇｅｄ−１受容体に関連する他の受容体（例えば、ヒトＪａｇｇｅｄ−２及びヒトＤＬＬ−４受容体）との交差反応性の評価を含む、以下の実施例で詳述するスクリーニングアッセイにかけた。次いで、目的のものに対して結合特性を有すると特定されたハイブリドーマ株を機能的スクリーニングでさらに選択し、標準的なクローニング及びサブクローニング技法にかけた。クローン株をインビトロで増やし、分泌されたヒト抗体を解析のために得、Ｖ遺伝子シークエンシングを実施した。
【０２８６】
実施例３：ＦＭＡＴによるＪａｇｇｅｄ−１受容体特異的結合抗体の選択
【０２８７】
培養の１４日後に、蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって、ヒトＪａｇｇｅｄ−１特異的モノクローナル抗体についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ヒトＪａｇｇｅｄ−１で一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対して上清をスクリーニングし、Ｊａｇｇｅｄ−１遺伝子を含まない同じ発現プラスミドで一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に対してカウンタースクリーニングした。
【０２８８】
手短に言えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の細胞を、５０μＬ／ウェルの容積で、安定なトランスフェクタントに対しておよそ４０００細胞／ウェルの密度で、及び親細胞に対しておよそ１６，０００細胞／ウェルの密度で、３８４ウェルＦＭＡＴプレート中に播種し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次いで、１０μＬ／ウェルの上清を加え、４℃でおよそ１時間プレートをインキュベートし、その後、１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５  ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を２．８μｇ／ｍｌの濃度（４００ｎｇ／ｍｌの終濃度）で加えた。次いで、プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＭＡＴプレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、蛍光を読み取った。
【０２８９】
２つのスクリーニングキャンペーン後に、４９５個（キャンペーン番号１が３３５個、キャンペーン番号２が１６０個）の抗Ｊａｇｇｅｄ−１結合ハイブリドーマ株のパネルを特定し、さらなる特性評価アッセイに進めた。
【０２９０】
実施例４：ＦＭＡＴによるリガンド結合競合アッセイによるブロッキング抗体の特定
【０２９１】
Ｊａｇｇｅｄ−１受容体に結合しノッチ−３リガンド結合をブロックする（ハイブリドーマ上清中の）抗体を特定するために、リガンド結合競合法を開発した。手短に言えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の細胞を５０μＬ／ウェルの容積で、安定なトランスフェクタントに対しておよそ３０００細胞／ウェルの密度で、及び親細胞に対しておよそ１５，０００細胞／ウェルの密度で、３８４ウェルＦＭＡＴプレート中に播種し、パルス遠心分離した。次いで、２０μＬ／ウェルの上清を加え、プレートを４℃でおよそ１時間インキュベートし、その後、１０μＬ／ウェルのヒトノッチ−３／ＡＬＥＸＡ６４７（６００ｎｇ／ｍｌの終濃度）を加えた。次いで、プレートを４℃で３時間インキュベートし、ＦＭＡＴプレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、蛍光を読み取った。
【０２９２】
実験は、陰性コントロールのハイブリドーマ上清を含んでいた。これらの陰性コントロール実験で観察された平均シグナルを、アッセイについての最大可能シグナルとして採用した。実験の上清をこの最大シグナルと比較し、各ウェルについてパーセント阻害を計算した（％阻害＝（１−（抗ＢＣＭＡハイブリドーマ上清のＦＬ１／最大ＦＬ１シグナル）。
【０２９３】
スクリーニングキャンペーン番号１については、アッセイの２反復実験が完了し、２反復実験の少なくとも１つにおいて６０％阻害を越える活性に基づいて、４９個の目的の抗体をもたらした。これら４９個のハイブリドーマ上清＋１０個の非ブロッキング上清をさらなる試験に進めた。スクリーニングキャンペーン番号２については、アッセイの２反復実験は、６０％を越える阻害で特定された４つのハイブリドーマ上清をもたらし、これらを、さらなる特性評価に進めた。
【０２９４】
実施例５：ＦＡＣｓによるリガンド結合競合アッセイによるブロッキング抗体の特定
【０２９５】
Ｊａｇｇｅｄ−１受容体に結合し、３種のリガンド、すなわち、ノッチ−３、ノッチ２及びノッチ−１の結合をブロックする（ハイブリドーマ上清中の）抗体を特定するために、リガンド結合競合を開発した。ＦＡＣｓアッセイは、２０ｕｌのハイブリドーマ上清を、一過的に発現している５０，０００細胞とともに４℃で１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄することによって実施した。次いで、５ｕｇ／ｍｌの蛍光色素標識されたノッチ−３（＃１５５９−ＮＴ，ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）リガンドで細胞を４℃で処理し、続いて、２回洗浄した。細胞を１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）機器を使用して、抗体結合を解析した。ノッチ−２（＃３７３５−ＮＴ，ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びノッチ−１（＃３６４７−ＴＫ，ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、類似したアッセイを実施した。
【０２９６】
実験は、陰性コントロールのハイブリドーマ上清を含んでいた。これらの陰性コントロール実験で観察された平均シグナルを、アッセイについての最大可能シグナルとして採用した。実験の上清をこの最大シグナルと比較し、各ウェルについてパーセント阻害を計算した（％阻害＝（１−（抗ＢＣＭＡハイブリドーマ上清のＦＬ１／最大ＦＬ１シグナル））。
【０２９７】
実施例６：フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）によるさらなる結合特性評価
【０２９８】
マウスＪａｇｇｅｄ−１オルソログならびに関連する受容体のヒトＪａｇｇｅｄ−２及びヒトＤＬＬ−４への抗Ｊａｇｇｅｄ−１受容体特異的抗体の結合を評価するために、ＦＡＣＳ結合アッセイを実施した。ＦＡＣｓアッセイは、ハイブリドーマ上清を５０，０００細胞とともに４℃で１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄することによって実施した。次いで、蛍光色素標識された２次抗体で細胞を４℃で処理し、続いて、２回洗浄した。細胞を１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）機器を使用して、抗体結合を解析した。
【０２９９】
実施例７：細胞バイオアッセイによる機能アンタゴニストの特定
【０３００】
正常ヒト気管支上皮細胞及び培養培地は、Ｌｏｎｚａから購入した。第２継代細胞を使用する気相液相界面培養は、Ｌｏｎｚａ  Ｂ−ＡＬＩプロトコールを使用して、製造者の指示の通りに実施した。エアリフトから３週間後に、培養物を、ＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）の有り無しで、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、抗Ｊａｇ−１（１５Ｄ１１．１）（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）と組み合わせて、７日間処理した（基底外側で培地に加えた）。隔日で新鮮な培地（処理有り、又は無し）に交換した。７日目に、培養物を４％ＰＦＡに室温で４８時間固定し、次いで、７０％ＥｔＯＨに移し、ＰＡＳ／ＡＢ染色について処理するまで４℃で保管した。図１及び図２を参照されたい。
【０３０１】
実施例８：ＰＡＳ／ＡＢ染色方法及び定量化方法
【０３０２】
気相液相界面培養における過ヨウ素酸シッフ／アルシアンブルー染色
【０３０３】
ＮＨＢＥドナーに由来する気相液相界面（ＡＬＩ）気管支上皮細胞培養物を４％パラホルムアルデヒド中に室温（ＲＴ）で４８時間固定し、パラフィンに包埋した。アルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ（ＡＢ／ＰＡＳ）特別染色で、４ミクロン厚の切片をムチン／杯細胞について染色した。
【０３０４】
手短に言えば、脱パラフィン後、切片を酢酸溶液で室温で３分間処理し、続いて、アルシアンブルー（ｐＨ２．５、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ；カタログ番号ａｂ１５０６６２）染色を室温で３０分間行った。水道水で２分間すすぎ、続いて、蒸留水を２回取り換えてすすいだ後、切片を１％過ヨウ素酸溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号３９５１）で、室温で１０分間処理した。蒸留水を２回取り換えて切片を再度すすぎ、続いて、シッフ溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｄｉ，Ｃａ；カタログ番号ＳＴＳＳＣＨＬＴ）で、室温で１０分間染色した。次いで、切片を高温の水道水、続いて蒸留水ですすぎ、次いで、改変型メイヤーヘマトキシリン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｄｉ  ＣＡ；カタログ番号ＨＳＭＭＨＬＴ）中で１５秒間対比染色した。続いて、切片をＴＢＳ緩衝液で青色にし、蒸留水中ですすぎ、アルコール中で脱水し、キシレン中で透明化し、次いで、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｇｌａｓ（商標）マウンティングメディア（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ；カタログ番号６４１９）を使用して、カバーガラスでマウントした。
【０３０５】
マウスの肺における過ヨウ素酸シッフ染色
【０３０６】
マウスの肺を１０％中性緩衝ホルマリン中で室温（ＲＴ）で２４時間固定し、パラフィンに包埋した。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）特別染色でムチン／杯細胞について５ミクロン厚の切片を染色した（ｘＥ５Ｅｌ−Ｚｉｍａｉｔｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｏｔａ，Ｈ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｓ．，Ｋｉｌｌｅｎ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｙ．）。
【０３０７】
手短に言えば、脱パラフィン後に、切片を新しく作製した０．５％過ヨウ素酸で室温で７分間処理した。蒸留水中ですすいだ後、切片をシッフ溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｄｉ，Ｃａ；カタログ番号ＳＴＳＳＣＨＬＴ）に室温で１５分間浸した。次いで、切片を温かい水道水中で５分間すすぎ、続いて、ＳｅｌｅｃＴｅｃｈヘマトキシリン５６０（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ；カタログ番号３８０１５７５）で室温で３分間対比染色した。次いで、切片をＳｅｌｅｃＴｅｃｈ  Ｄｅｆｉｎｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３８０３５９０）で処理し、ブルーバッファー（Ｌｉｅｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号３８０２９１５）で青色にした。次いで、切片を蒸留水中ですすぎ、アルコール中で脱水し、キシレン中で透明化し、次いで、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｇｌａｓ（商標）マウンティングメディア（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ；カタログ番号６４１９）を使用して、カバーガラスでマウントした。
【０３０８】
ＡＬＩ培養物におけるムチン体積及び杯細胞数の定量化
【０３０９】
アルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ特別染色を使用してムチン／杯細胞について染色された、気相液相界面（ＡＬＩ）気管支上皮細胞培養物の４ミクロン厚のパラフィン切片を、上皮中に存在するムチンのパーセント及び存在する杯細胞の数について定量化した。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ統合ソフトウェアパッケージ（Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用して、ＡＬＩ培養の全切片を描写し、１００×拡大率で各視野にポイントグリッドを配置し、上皮全体に載るポイントの数対ＡＢ／ＰＡＳ特別染色により染色されたムチンに載るポイントの数をカウントすることによる上皮中のムチン含量及び杯細胞数用に、ランダムにサンプリングした（以下の図を参照されたい）。
【０３１０】
【化３】
2018203735.tif 000031
【０３１１】
この方法で、切片の全面積のおよそ７５％を一様にランダムにサンプリングし、標識Ａは上皮にヒットするすべてのポイントを示し、Ｂはムチン／杯細胞にヒットするすべてのポイントを示し、Ｃは各杯細胞に対するポイントカウントを示す（すべてのあり得るカウントが示されるとは限らない）。すべてのカウントを表にし、合計した後、ソフトウェアの計算機ツールを使用して、以下の２つの計算を行った。
【０３１２】
ムチンの体積／ｅｐｉの体積（上皮中に存在するムチン貯蔵のパーセンテージ）
【０３１３】
Ｖｖ＝Ｐｓｕｂ／Ｐｒｅｆ
【０３１４】
式中
【０３１５】
Ｐｓｕｂ＝ムチンのカウントの総数
【０３１６】
Ｐｒｅｆ＝上皮全体のカウントの総数
【０３１７】
ムチン全体の体積は、上皮全体に存在するムチンのパーセンテージとして表す。
【０３１８】
杯細胞の数／上皮の体積
【０３１９】
Ｎ杯細胞／Ｖｅｐｉ＝ΣＱ−／ＢＡ×（ａ／ｐ）×ΣＰ
【０３２０】
式中
【０３２１】
ΣＱ−＝カウントされた杯細胞の数
【０３２２】
ＢＡ＝切片の厚さ
【０３２３】
ａ／ｐ＝ポイントあたりの面積
【０３２４】
ΣＰ＝カウントされた面積ポイントの数
【０３２５】
上皮の杯細胞の数は、上皮の体積（ｍｍ３）あたりの杯細胞の数又はＮ杯細胞／ｅｐｉのｍｍ３で表す。
【０３２６】
マウスの気道におけるムチン体積及び杯細胞数の定量化
【０３２７】
過ヨウ素酸シッフ特別染色を使用してムチン／杯細胞について染色された、マウスの肺の５ミクロン厚のパラフィン切片を、上皮中に存在するムチンのパーセント及び存在する杯細胞の数について定量化した。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ  統合ソフトウェアパッケージ（Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用して、目的のマウス気道を描写し、１００×拡大率で各視野にポイントグリッドを配置し、上皮全体に載るポイントの対ＡＢ／ＰＡＳ特別染色によって染色されたムチンに載るポイントの数をカウントすることによる上皮中のムチン含量及び杯細胞数の用に、ランダムにサンプリングした（以下の図を参照されたい）。
【０３２８】
【化４】
2018203735.tif 000032
【０３２９】
この方法で、目的の領域、すなわちマウスの上皮の全面積のおよそ７５％を一様にランダムにサンプリングし、標識Ａは上皮にヒットするすべてのポイントを示し、Ｂはムチン／杯細胞にヒットするすべてのポイントを示し、Ｃは各杯細胞に対するポイントカウントを示す（すべてのあり得るカウントが示されるとは限らない）。すべてのカウントを表にし、合計した後、ソフトウェアの計算機ツールを使用して、以下の２つの計算を行った。
【０３３０】
ムチンのパーセンテージ／ｅｐｉの面積（上皮中に存在するムチン貯蔵のパーセンテージ）
【０３３１】
Ｖｖ＝Ｐｓｕｂ／Ｐｒｅｆ
【０３３２】
式中
【０３３３】
Ｐｓｕｂ＝ムチンのカウントの総数
【０３３４】
Ｐｒｅｆ＝上皮全体のカウントの総数
【０３３５】
ムチン全体の体積は、マウスの気道上皮全体に存在するムチンのパーセンテージとして表す。
【０３３６】
杯細胞の数／上皮の面積
【０３３７】
Ｎ杯細胞／面積ｅｐｉ＝ΣＱ−／（ａ／ｐ）×ΣＰ
【０３３８】
式中
【０３３９】
ΣＱ−＝カウントされた杯細胞の数
【０３４０】
ａ／ｐ＝ポイントあたりの面積
【０３４１】
ΣＰ＝カウントされた面積ポイントの数
【０３４２】
上皮の杯細胞の数は、上皮の面積（ｍｍ２）あたりの杯細胞の数又はＮ杯細胞／ｅｐｉのｍｍ２として表す。
【０３４３】
正常ヒト気管支上皮細胞及び培養培地は、Ｌｏｎｚａから購入した。第２継代細胞を使用する３Ｄ気管支球培養を以前に記載されているように実施した（Ｄａｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌを参照）。プレーティングしてから１週間後に、培養物を、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ又は３．３ｎｇ／ｍｌ）の有り無しで、ＩｇＧ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、抗Ｊａｇ−１（１５Ｄ１１．１）（１０ｕｇ／ｍｌ又は１ｕｇ／ｍｌ）と組み合わせて、さらに７日間処理した。新鮮な培地（処理有り、又は無し）を隔日で変え、新鮮なサイトカイン及び処理を補充した。７日目に、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ（カタログ番号３４４８−０２０−Ｋ）のＣｕｌｔｒｅｘ３Ｄ培養細胞採取キットを若干改変した製造者のプロトコールとともに使用して、マトリゲルから気管支球を採取した。製造者のプロトコールの通りにＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙキット（カタログ番号７４１８１）を使用して、ＲＮＡを単離し、ＭＵＣ５ＡＣ（＊以下を参照されたい）、ＭＵＣ５Ｂ（＊以下を参照されたい）及びＦＯＸＡ３（Ｈｓ００２７０１３０−ｍ１）について、ｑＰＣＲを実施した。図３を参照されたい。ＨＰＲＴ（＊以下を参照されたい）をハウスキーピング遺伝子として使用し、ＨＰＲと比較して遺伝子発現を表す。
【０３４４】
オボアルブミン誘導性喘息モデルにおけるＪａｇ１中和Ａｂによる杯細胞化生の予防的阻害及び組織毒性評価。
【０３４５】
マウスアレルゲン誘導性肺炎症及び気道リモデリング（杯細胞化生）を、喘息のオボアルブミン誘導性マウスモデルで測定した。８匹のマウスから成る７つの群（全体で５６匹のマウス）を本研究で使用した。成体の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢を越える）を、１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）抗原（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＬＳ００３０５４，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）とともに又はそのまま、０．２ｍｌの２％水酸化アルミニウム（ミョウバン）ゲル（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓ，１２２６１，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、０日目及び１４日目に感作し、追加免疫した。群Ａ、Ｂ及びＣを、１ｍｌの０．９％生理食塩水を５０ｍｌのミョウバンゲルに入れた溶液の０．２ｍｌのｉ．ｐ．注射で感作し、追加免疫した。群Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを、１ｍｌの０．９％生理食塩水に溶解した２．５５ｍｇのＯＶＡを５０ｍｌのミョウバンゲルに入れた溶液の０．２ｍｌのｉ．ｐ．注射で感作し、追加免疫した。群Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧに噴霧化ＯＶＡを吸入させて、肺において抗原誘導性肺炎症及び杯細胞化生を惹起した。噴霧化ＯＶＡのチャレンジについては、プレキシガラスボックスにマウスを入れ、２１日目、２２日目及び２３日目に、１％オボアルブミンを入れた生理食塩水（０．０１ｇ／ｍｌ）を充填したネブライザー（ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ＬＣ  ＳＴＡＲネブライザー及びＰｒｏｎｅｂ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ圧縮機，Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＶＡ）によって、そのボックスにエアロゾル化ＯＶＡを２０分間噴霧した。２６日目に、５％オボアルブミンを入れた生理食塩水での２０分間の噴霧化ＯＶＡのチャレンジを行った。群Ａ、Ｂ及びＣにＯＶＡを含まない噴霧化生理食塩水を吸入させた。群Ａ及びＤにビヒクル（Ａ５２ＳｕＴ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ショ糖、０．０４％Ｔｗｅｅｎ２０、酢酸でｐＨ５．２に調整）を投与し、群Ｂ及びＥにｈｕ抗＜ｈｕ  Ｊａｇ−１＞１５Ｄ１１．１Ｍａｂ（８０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、群Ｇにラット抗＜ｍｕＴＳＬＰ＞ＩｇＧ２ａ（ｍＴＳＬＰ−Ｍ７０２、２０ｍｇ／ｋｇ））を投与し、群Ｃ及びＦに６５５−３４１−Ｇ１ヒトＩｇＧ１コントロール抗体（８０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。すべての群は、０、７、１４及び２０日目に１０ｍｌ／ｋｇの量で、尾静脈によりｉ．ｖ投与した。図４を参照されたい。２７日目に、マウスを安楽死させ、気管カニューレを介して１０％中性緩衝ホルマリンで肺を膨張させた。膨張させた肺をホルマリンに少なくとも２４時間浸した。パラフィンブロックに処理した後、肺を切片化（５μｍ）し、ガラススライド上に浮かべた。この肺切片を炎症細胞浸潤の評価のためにヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で、又はムチン含量の評価のために過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色した。毒物学者による評価のために、群Ａ、Ｂ及びＣ由来の、腎臓、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、卵巣、膵臓、結腸、十二指腸、胃、回腸、空腸及び大腿骨のＨ＆Ｅ染色スライスも調製した。
【０３４６】
１５Ｄ１１．１Ｍａｂによる４週間のＪａｇ１遮断は、体重減少を引き起こさなかった。マウスを、０日目及び１４日目に、１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）抗原を有さない又は有する０．２ｍｌの２％水酸化アルミニウムの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって感作及び追加免疫し、次いで、吸入（ＩＨ）ＯＶＡでチャレンジして、炎症＆杯細胞化生を誘導した。ビヒクル、抗Ｊａｇ１抗体１５Ｄ１１．１Ｍａｂ（８０ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプコントロール抗体６５５−３４１−Ｇ１ヒトＩｇＧ１（８０ｍｇ／ｋｇ）又はラット抗＜ｍｕＴＳＬＰ＞ＩｇＧ２ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）を０、７、１４＆２０日目に週１回投与した。ベースラインからの平均体重の変化（ｙ軸）を経時的（ｘ軸）にグラフ化した。平均±標準偏差（ｎ＝７〜８）としてデータを表す。ビヒクル又はアイソタイプコントール抗で処理したマウスと比較して、抗Ｊａｇ１抗体処理マウスにおいて体重減少が観察されなかった。しかし、ｉ．ｐ．感作＆ＯＶＡ  ＩＨは、すべての群において、一過的な体重減少を引き起こす。図５Ａ：すべての群に対する体重変化。ＯＶＡ無し＆有りで感作したマウスをグラフ図５Ｂ＆図５Ｃに別々に示す。
【０３４７】
実施例９：ｈＪａｇｇｅｄ１に対するヒト抗ｈＪａｇｇｅｄ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の結合親和性の評価
【０３４８】
抗ｈＪａｇｇｅｄ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（ＰＬ−５０４３２）を、Ｃ末端でポリヒスチジンタグと融合しており、ヒト細胞で生成され、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ（カタログ番号ＪＡＧ１−３２２６Ｈ）から得た組換えヒトＪａｇｇｅｄ１細胞外ドメイン（Ｍｅｔ１−Ｓｅｒ１０４６）に対するその親和性について評価した。５０、１５．３、５．１、１．７及び０．５６ｎＭの抗原濃度に対する結合キネティクスならびに適合を図６に示す。
【０３４９】
可溶性組換えｈＪａｇｇｅｄ１の親和性を、Ｏｃｔｅｔプラットフォーム（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６）において、製造者が推奨するキネティック測定設定下で決定した。手短に言えば、ｈＪａｇｇｅｄ１を、Ｏｃｔｅｔ緩衝液（１０ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ１００）中に１５０ｎＭから０．５ｎＭまで１対３希釈し、６０ｕｌのこの段階希釈した試料を３８４ウェル傾斜底（ＴＷ３８４）黒色ポリプロピレンマイクロプレート（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ、カタログ番号１８−００１９）に入れた（試料プレート）。試料プレートの６０ｕｌの中に存在する３ｕｇ／ｍｌの抗ｈＪａｇｇｅｄ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１を使用し、ＡＨＣ−抗ＨｕＦｃ（キネティック）バイオセンサー（カタログ番号１８−５０６０）で捕獲した。緩衝液だけを有する試料をコントロールとして使用する。
【０３５０】
抗体を３００秒間捕獲し、結合及び解離をそれぞれ３００秒及び１２００秒間測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアバージョン９．０．０．１２を使用して、結合（３００秒）及び解離（９００秒）を調べ、キネティクスを測定した。
【０３５１】
実施例１０：ＫｉｎＥｘＡを使用する平衡測定による細胞上親和性
【０３５２】
抗ｈＪａｇｇｅｄ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（ＰＬ−５０４３２）を、安定な２９３細胞株で発現している天然のヒトＪａｇｇｅｄ１に対するその親和性について評価した。
【０３５３】
培地中の細胞を段階希釈し、０．０５％ＮａＮ３の存在下で、培地中の３０ｐＭ又は１ｎＭの抗体の活性結合部位濃度とともにインキュベートし、平衡化させた。上清に残された遊離ｍＡｂを本文で説明するように測定した（図７Ａ）。遊離ｍＡｂ％（３０ｐＭについては赤色の曲線及び１ｎＭについては青色の曲線）を細胞濃度に対してプロットした。平衡を使用するＮ−曲線解析、ホールセル方法を実施して、Ｋｄ及び抗原発現レベルに対して最適値を決定した（図７Ｂ及び７Ｃ）。それらの最適値における他のパラメーターを維持しながらＫｄ又は抗原発現レベルについて最適化した値を反復的に変えることによって、９５％信頼区間を決定した。
【０３５４】
ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の親和性を平衡解離定数（Ｋｄ）を測定することによって決定した。結合平衡除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）を使用し、そこで、抗体と細胞表面発現抗原の間に平衡が確立した後に溶液に残存する遊離抗体の濃度からＫｄを決定した。よりリソース集中的なＫｉｎＥｘＡアッセイは、可溶性Ｊａｇｇｅｄ１ベースのＯｃｔｅｔアッセイ系よりも、天然型のＪａｇｇｅｄ１に対する結合親和性のより高感度な測定を提供する。Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）の結合平衡除外アッセイ方法に従った（Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７３：５２−６０（２００８））。手短に言えば、ドキシサイクリン誘導性Ｊａｇｇｅｄ１−発現細胞を使用して、２つの異なる平衡セットを準備した。細胞を、細胞解離溶液を用いて細胞解離し、氷冷の１×ＰＢＳで２回洗浄し、血球計数器を使用してカウントした。細胞をタイトレーションし、２つの異なる一定の抗体濃度（一方が３０ｐＭ及び他方が１ｎＭ）でインキュベートした。細胞のタイトレーション及び抗体溶液は０．０５％アジ化ナトリウムを含む培地中に準備した。細胞は、５０ｍＬのファルコンチューブにおいて、ミリリットルあたり８３３万の濃度から、１対３で１０ポイントについてタイトレーションした。低［Ａｂ］平衡セットについては、４．５ｍＬの６０ｐＭ  Ａｂを４．５ｍＬの各細胞タイトレーション溶液と混合して、最終的な細胞及びＡｂ濃度を２分の１に希釈した。高［Ａｂ］平衡セットについては、２００μＬの１ｎＭ  Ａｂを２００μＬの各細胞のタイトレーション溶液と混合して、最終的な細胞及びＡｂ濃度を２分の１に希釈した。各平衡セットについて、ブランクの細胞培地のみの試料及び細胞無添加試料を基準点として含めた。平衡セットを振盪しながら室温で４４時間インキュベートした。
【０３５５】
４４時間のインキュベーション後、５００×ｇで５分間の遠心分離によって上清を細胞ペレットから分離した。次いで、高［Ａｂ］及び低［Ａｂ］平衡セットの両方の上清をＫｉｎＥｘＡ２００機器に通した。
【０３５６】
各平衡試料セットをＫｉｎＥｘＡ機械で２連で読み取った。低［Ａｂ］平衡試料については、各試料について４．１ｍＬを２連でランした。高［Ａｂ］平衡試料については、各試料について１００ｕＬを２連でランした。ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート粒子）ビーズをヤギ抗ヒトＦｃ  Ａｂでコーティングし、続いて、ブロッキング溶液（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４＋１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）でブロッキングした。各平衡試料について、遊離［Ａｂ］が、コーティングしたビーズを介して平衡試料をランし、続いて、ランニング緩衝液（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４＋１％ＢＳＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）で迅速に洗浄することによって検出されると思われる。次いで、第２の検出Ａｂ、すなわちヤギ抗ｈｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９を、ランあたり６８０ｎｇ／ｍＬ及び５００μＬでフローセルに通した。次いで、ＫｉｎＥｘＡ電圧アウトプットシグナルをＫｉｎＥｘＡソフトウェアで使用して、Ｋｄを計算した。２つの異なる初期全［Ａｂ］濃度におけるプロットから、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）のｎ−曲線解析を使用して、曲線の当てはめからＫｄを得た。９５％信頼区間は、Ｋｄ低及びＫｄ高として与えられる。
【０３５７】
【表７】
2018203735.tif 000033
【０３５８】
＊Ｏｃｔｅｔの概要は３実験の平均である。
【０３５９】
実施例１１：ノッチリガンドファミリーのメンバーに対する１５Ｄ１１．１の種間反応性及び選択性のＥＬＩＳＡアッセイの結果
【０３６０】
１５Ｄ１１．１は、組換えヒトＪａｇｇｅｄ−１及びラットＪａｇｇｅｄ−１に結合するが、Ｊａｇｇｅｄ−２にも、Ｄｌｌ１にもＤｌｌ４にも結合しない。以下は、ＩＣ５０の概要である。
【０３６１】
【表８】
2018203735.tif 000034
【０３６２】
標準的なＥＬＩＳＡアッセイ形式を使用して、組換えの精製されたノッチリガンドへの結合について１５Ｄ１１．１を試験した。１５Ｄ１１．１は、（０．３ｎＭ〜０．９ｎＭの範囲にわたるＩＣ５０で）ヒト及びラットＪａｇｇｅｄ−１に結合したが、Ｊａｇｇｅｄ−２にも、Ｄｌｌ１にもＤｌｌ４にも結合しなかった。
【０３６３】
標準的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、組換えの精製されたノッチリガンド、すなわち、ヒトＪａｇｇｅｄ１Ｆｃ（組換えヒトＪａｇｇｅｄ１Ｆｃキメラ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：１２７７−ＪＧ−０５０）、ヒトＪａｇｇｅｄ１  Ｈｉｓ（ヒトＪＡＧ１／Ｊａｇｇｅｄ１  Ｈｉｓタグ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１１６４８−Ｈ０８Ｈ）、ラットＪａｇｇｅｄ１Ｆｃ（組換えラットＪａｇｇｅｄ１Ｆｃキメラ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−カタログ番号：５９９−ＪＧ−０５０）、ヒトＪａｇｇｅｄ２（組換えヒトＪａｇｇｅｄ２Ｆｃキメラ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：１７２６−ＪＧ−０５０）、マウスＪａｇｇｅｄ２（組換えマウスＪａｇｇｅｄ２Ｆｃキメラ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：４７４８−ＪＧ−０５０）、マウスデルタ様１（組換えマウスＤＬＬ１  Ｈｉｓタグ−Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：５０５２２−Ｍ０８Ｈ−５０）、ヒトデルタ様４（組換えヒトＤＬＬ４  Ｈｉｓタグ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−カタログ番号：１５０６−Ｄ４−０５０）及びマウスデルタ様４（組換えマウス  ＤＬＬ４  Ｈｉｓタグ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−カタログ番号：１３８９−Ｄ４−０５０）への結合について、１５Ｄ１１．１を試験した。ＰＢＳ、ρΗ７．４中の１ｕｇ／ｍｌの（指示される）ノッチリガンドタンパク質をＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上に４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ中のカゼインブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ）で室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴ緩衝液（０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むΡΒΤ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％（ν／ν）Ｔｗｅｅｎ２０）中の１５Ｄ１１．１の段階２倍希釈物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートをＰＢＳＴで洗浄し、結合した抗体をペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ΤΜΒ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用し、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。図８Ａ及び８Ｂにおいて、吸光度を１５Ｄ１１．１の濃度に対してプロットした。
【０３６４】
実施例１２：ヒトＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への１５Ｄ１１．１の結合
【０３６５】
１５Ｄ１１．１は、０．２９ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＪａｇｇｅｄ−１を安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合した。２９３Ｔ親細胞への１５Ｄ１１．１の結合を陰性コントロールとして使用した。
【０３６６】
ヒトＪａｇｇｅｄ−１への１５Ｄ１１．１の結合を、Ｔｅｔ誘導性様式でヒトＪａｇｇｅｄ−１を安定して発現するように操作された２９３Ｔ細胞を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。１５Ｄ１１．１は、０．２９ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合した。図９を参照されたい。
【０３６７】
手短に言えば、約６０％培養密度の２９３Ｔ細胞を、１ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下で、３７℃／５％ＣＯ２で一晩増殖させて、ヒトＪａｇｇｅｄ−１の発現を誘導した。翌朝、非酵素的細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を取り出し、２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が補充されたＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に１ｘ１０ｅ５細胞／１００ｕｌに希釈し、免疫染色用に１．５ｍｌの９６ウェルディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に一定分量に分けた。１３．２ｎＭ〜０．０２６ｎＭの濃度の範囲にわたる、１５Ｄ１１．１の１：２段階希釈を行った。１００ｕｌの抗体希釈物を１ｘ１０ｅ５個の細胞に加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄し、１５Ｄ１１．１の検出のために、（０．１ｕｇ／ｍｌ）の濃度の、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＦｃ（クローン１．３５．１）とともにさらに１時間インキュベートした。さらに２回洗浄した後、ＡＰＣチャネルを使用して、細胞をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでランした。
【０３６８】
実施例１３：マウスＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対する１５Ｄ１１．１の種間反応性
【０３６９】
１５Ｄ１１．１は、０．３６ｎＭのＥＣ５０で、マウスＪａｇｇｅｄ−１を安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合した。
【０３７０】
マウスＪａｇｇｅｄ−１に対する１５Ｄ１１．１の種間反応性を、マウスＪａｇｇｅｄ−１を安定して発現するように操作された２９３Ｔ細胞を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。１５Ｄ１１．１は、０．３６ｎＭのＥＣ５０で、マウスＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合した。図１０を参照されたい。
【０３７１】
手短に言えば、マウスＪａｇｇｅｄ−１を安定して発現する２９３Ｔ細胞を非酵素的細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて取り出し、２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が補充されたＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に１ｘ１０ｅ５細胞／１００ｕｌに希釈し、免疫染色用に１．５ｍｌの９６ウェルディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に一定分量に分けた。１３．２ｎＭ〜０．０２６ｎＭの濃度の範囲にわたる、１５Ｄ１１．１の１：２段階希釈を行った。１００ｕｌの抗体希釈物を１ｘ１０ｅ５個の細胞に加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄し、１５Ｄ１１．１の検出のために、（０．１ｕｇ／ｍｌ）の濃度の、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＦｃ（クローン１．３５．１）とともにさらに１時間インキュベートした。さらに２回洗浄した後、ＡＰＣチャネルを使用して、細胞をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでランした。
【０３７２】
実施例１４：ラット−Ｊａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への１５Ｄ１１．１の結合
【０３７３】
２９３Ｔ細胞にラットＪａｇｇｅｄ−１を一過的にトランスフェクトし、１５Ｄ１１．１の結合をフローサイトメトリーによって評価した。１５Ｄ１１．１は、０．２５ｎＭのＥＣ５０で、ラットＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした細胞に結合した。２９３Ｔ親細胞への１５Ｄ１１．１の結合を陰性コントロールとして使用した。
【０３７４】
ラットＪａｇｇｅｄ−１との１５Ｄ１１．１の種間反応性を、ラットＪａｇｇｅｄ−１を一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した。１５Ｄ１１．１は、０．２５ｎＭのＥＣ５０で、ラットＪａｇｇｅｄ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合した。図１１を参照されたい。
【０３７５】
手短に言えば、約６０％培養密度の２９３Ｔ細胞を、３７℃／５％ＣＯ２で一晩、８％（Ｖ／Ｖ）ＢａｃＭａｍ／ラットＪａｇｇｅｄ１で一過的に形質導入した。翌朝、非酵素的細胞解離溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を取り出し、２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が補充されたＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に１ｘ１０ｅ５細胞／１００ｕｌに希釈し、免疫染色用に１．５ｍｌの９６ウェルディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に一定分量に分けた。１３．２ｎＭ〜０．０２６ｎＭの濃度の範囲にわたる、１５Ｄ１１．１の１：２段階希釈を行った。１００ｕｌの抗体希釈物を１ｘ１０ｅ５個の細胞に加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄し、１５Ｄ１１．１の検出のために、（０．１ｕｇ／ｍｌ）の濃度の、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＦｃ（クローン１．３５．１）とともにさらに１時間インキュベートした。さらに２回洗浄した後、ＡＰＣチャネルを使用して、細胞をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでランした。
【０３７６】
実施例１５：ヒトＪａｇｇｅｄ−１誘導性ヒトノッチ２活性化共培養アッセイにおける抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増
【０３７７】
抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１は、ヒトＪａｇｇｅｄ−１誘導性のヒトノッチの活性化を、共培養実験において、１．６９ｎＭのＩＣ５０（ｎ＝４の実験からの２．３１ｎＭ＋／−０．５６標準偏差の平均ＩＣ５０）で、用量依存的様式でアンタゴナイズする。図１２を参照されたい。
【０３７８】
漸増量の抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（６６．７ｎＭ〜０．１３１ｎＭ）とともに、ドキシサイクリン誘導性様式でヒトＪａｇｇｅｄ−１を安定して発現するように操作された２９３Ｔ細胞を、ノッチ応答性（１２ｘＣＳＬ）ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ４、Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定的にトランスフェクトしたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞と共培養した。フローサイトメトリー及びｑＰＣＲによってＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を特性評価し、この細胞は、内在的に高レベルのノッチ２受容体を発現することが示された（データ非表示）。他のノッチファミリーメンバーの内在的発現は検出されなかった（ノッチ１＆ノッチ３）。１５Ｄ１１．１は、ｎ＝４の実験からの２．３１ｎＭ（＋／−０．５６標準偏差）の平均ＩＣ５０で、Ｊａｇｇｅｄ−１誘導性ノッチシグナリングを用量依存的様式で阻害することができた。
【０３７９】
手短に言えば、２９３Ｔ／ヒトＪａｇｇｅｄ−１  Ｔｅｔ誘導性細胞をドキシサイクリン（１ｕｇ／ｍｌ）とともに３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートして、ヒトＪａｇｇｅｄ−１の発現を誘導した。翌日、９６ウェル組織培養ディッシュ中で、漸増量の抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（６６．７ｎＭ〜０．１３１ｎＭの範囲にわたる１：２希釈）の存在下で、ドキシサイクリンで誘導した２９３Ｔ／ヒトＪａｇｇｅｄ−１細胞（２ｘ１０ｅ４個）を１２ｘＣＳＬ−ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ４、Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定して発現するＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞（２ｘ１０ｅ４個）と共培養した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で約１８時間にわたって一晩共培養した。翌日、等量のＯｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、軽く振盪しながら室温で１０分間プレートをインキュベートし、ルミノメーターで読み取った。
【０３８０】
実施例１６：マウスＪａｇｇｅｄ−１誘導性マウスノッチ１活性化の共培養アッセイにおける抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増
【０３８１】
抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１は、マウスＪａｇｇｅｄ−１誘導性マウスノッチ１活性化を、共培養実験において、７．７２ｎＭのＩＣ５０（ｎ＝３の実験からの９．０ｎＭ＋／−１．４７標準偏差の平均ＩＣ５０）で、用量依存的様式でアンタゴナイズする。
【０３８２】
マウスＪａｇｇｅｄ−１を安定して発現するように操作された２９３Ｔ細胞を、漸増量の抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（６６７ｎＭ〜１．３ｎＭ）とともに、マウスノッチ１及びノッチ応答性（７ｘＣＳＬ）ホタルルシフェラーゼレポーターを安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞と共培養した。１５Ｄ１１．１は、ｎ＝３の実験からの７．７２ｎＭ（＋／−１．４７標準偏差）の平均ＩＣ５０で、マウスＪａｇｇｅｄ−１誘導性マウスノッチ１シグナリングを用量依存的様式で阻害することができた。図１３を参照されたい。
【０３８３】
手短に言えば、２９３Ｔ／マウスＪａｇｇｅｄ−１細胞（２ｘ１０ｅ４個）を、９６ウェル組織培養ディッシュ中で、漸増量の抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１（６６７ｎＭ〜１．３ｎＭの範囲にわたる１：２希釈）の存在下で、ノッチ応答性７ｘＣＳＬ−ホタルルシフェラーゼレポーターを安定して発現する２９３Ｔ／マウスノッチ１細胞（２ｘ１０ｅ４個）と共培養した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で約１８時間にわたって一晩共培養した。翌日、等量のＯｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、軽く振盪しながら室温で１０分間プレートをインキュベートし、ルミノメーターで読み取った。
【０３８４】
実施例１７：刺激していない及び刺激した気管支球培養物における抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１の用量漸増
【０３８５】
気道上皮細胞の分化に対する抗Ｊａｇｇｅｄ−１  ｍＡｂ（１５Ｄ１１．１）処理の影響を、漸増濃度の１５Ｄ１１．１（６６．７ｎＭ〜０．１３１ｎＭ）の存在下で、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で７日間刺激していない又は刺激した、正常の健常な又は病的な（ＣＦ＆ＣＯＰＤ）気管支上皮細胞に由来する３Ｄ気管支球培養物を使用して、評価した。１５Ｄ１１．１は、処理してから７日後に、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した及び刺激していない培養物において、分泌細胞（ＳＣＧＢ１Ａ１）、杯細胞（ＭＵＣ５ＡＣ）及びノッチ活性化（ＮＲＡＲＰ）マーカーの発現を用量依存的様式で低減させ、刺激していない培養物において線毛細胞マーカーの発現（ＤＮＡＩ２）を増大させた。正常の健常なドナー細胞及び病的なドナー細胞（ＣＦ及びＣＯＰＤ）において、結果は同様であった。ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１と比較して、発現レベルを表す。
【０３８６】
正常ヒト気管支上皮細胞及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）気管支上皮細胞は、Ｌｏｎｚａから購入した。嚢胞性線維症（ＣＦ）気管支上皮細胞及び分化培地（ＵＮＣ  ＡＬＩ培地）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ（ＵＮＣ）から得た。第２継代細胞を使用する３Ｄ気管支球培養は、以前に記載されているように実施した（Ｄａｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌを参照）。手短に言えば、Ｐ１ヒト気管支上皮細胞をＴ７５組織培養フラスコ中のＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に広げた。コンフルエントになると、細胞をトリプシン処理し、ＵＮＣ分化培地＋３％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に再懸濁し、９６ウェル平底プレート中の６０ｕｌの固化した２５％マトリゲル含有ＵＮＣ  ＡＬＩ培地上に、６０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。週３回再供給して、気管支球を７日間増殖させた。７日目に、培養を＋／−ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）＋１５Ｄ１１．１でさらに７日間刺激した。新鮮な培地（処理有り、又は無し）に隔日で変え、新鮮なサイトカイン及び処理を補充した。１４日目に、オルガノイドを溶解し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅプラットフォームの製造者の仕様書に従って処理して、分泌細胞（ＳＧＢ１Ａ１；図１４Ａ、１４Ｅ、１４Ｉ、１５Ａ、１５Ｅ及び１５Ｉ）、杯細胞（ＭＵＣ５ＡＣ；図１４Ｂ、１４Ｆ、１４Ｊ、１５Ｂ、１５Ｆ及び１５Ｊ）、線毛細胞（ＤＮＡＩ２（図１４Ｃ、１４Ｇ、１４Ｋ、１５Ｃ、１５Ｇ及び１５Ｋ）ならびにＦＯＸＪ１）ならびにノッチ活性化マーカー（ＮＲＡＲＰ；図１４Ｄ、１４Ｈ、１４Ｌ、１５Ｄ、１５Ｈ及び１５Ｌ）について調べた。
【０３８７】
抗Ｊａｇ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１は、分泌細胞（ＳＣＧＢ１Ａ１；図１４Ａ、Ｅ及びＩ）、杯細胞（ＭＵＣ５ＡＣ；図１４Ｂ、Ｆ及びＪ）ならびにノッチ活性化（ＮＲＡＲＰ；図１４Ｄ、Ｈ及びＬ）マーカーの発現を低減させたが、正常（図１４Ａ〜Ｄ）又は病的（ＣＦ（図１４Ｅ〜Ｈ）及びＣＯＰＤ（図１４Ｉ〜Ｌ））気管支上皮細胞に由来する、刺激していない気管支球培養物において、処理してから７日後に、用量依存的様式で、線毛細胞（ＤＮＡＩ２；図１４Ｃ、Ｇ及びＫ）マーカーの発現の増大を示した。ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１と比較して、発現レベルを表す。
【０３８８】
抗Ｊａｇ１  ｍＡｂ  １５Ｄ１１．１は、正常又は病的（ＣＦ及びＣＯＰＤ）気管支上皮細胞に由来する、ＩＬ−１３（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激した気管支球培養物において、処理してから７日後に、用量依存的様式で、分泌細胞（ＳＣＧＢ１Ａ１；図１５Ａ、Ｅ及びＩ）、杯細胞（ＭＵＣ５ＡＣ；図１５Ｂ、Ｆ及びＪ）ならびにノッチ活性化（ＮＲＡＲＰ；図１４Ｄ、Ｈ及びＬ）マーカーの発現を低減させた。ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１と比較して、発現レベルを表す。
【０３８９】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅマルチプレックスアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、３Ｄ気管支球培養物の遺伝子発現を定量化した。Ｄａｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５のように、プロテイナーゼＫを含む３０ｕｌのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ溶解溶液を６０ｕｌの気管支球の各ウェルに２：１の比で加え、５５℃で３０分間インキュベートした。８０ｕｌの可溶化液試料を、溶解混合液、プロテイナーゼＫ、ブロッキング試薬及び特定のプローブセット及びビーズセットを有する２０ｕｌのハイブリダイゼーション溶液を含む、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提供する９６ウェルプレートに、５５℃で一晩移した。プローブセットは、標的遺伝子：ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘパネルＭ１７０１２５０１由来のＤＮＡＩ２（ＮＭ＿０２３０３６）；ＦＯＸＡ３（ＮＭ＿００４４９７１）；ＦＯＸＪ１（ＮＭ＿００１４５４）；ＨＰＲＴ１（ＮＭ＿０００１９４）；ＭＵＣ５ＡＣ（ＮＭ＿０１７５１１）；ＭＵＣ５Ｂ（ＮＭ＿００２４５８）；ノッチ３（ＮＭ＿０００４３５）；ＮＲＡＲＰ（ＮＭ＿００１００４３５４）；ＳＣＧＢ１Ａ１（ＮＭ＿００３３５７）又はＡｆｆｆｙｍｅｔｒｉｘパネルＭ１８０１３１０１由来のＤＮＡＩ２（ＮＭ＿０２３０３６）；ＦＯＸＪ１（ＮＭ＿００１４５４）；ＨＰＲＴ１（ＮＭ＿０００１９４）；ＭＵＣ５ＡＣ（ＮＭ＿０１７５１１）；ＭＵＣ５Ｂ（ＮＭ＿００２４５８）；ＮＲＡＲＰ（ＮＭ＿００１００４３５４）；ＳＣＧＢ１Ａ１（ＮＭ＿００３３５７）；ＡＮＯ１（ＮＭ＿０１８０４３）；ＳＬＣ２６Ａ４（ＮＭ＿０００４４１）を含んでいた。翌日、製造者の仕様書を使用して、洗浄液、前増幅溶液、増幅溶液及び標識プローブのストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡＰＥ）溶液を調製した。各ステップの間に、磁気プレート洗浄器でプレートを３回洗浄した。ＦｌｅｘＭａｐ  ３Ｄ機器（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で各ウェルを読み取った。ウェル全体にわたってレベルが同様であることを確実にするために、ハウスキーピング遺伝子ＨＲＰＲＴ１に対してデータを正規化した。
【０３９０】
実施例１８：Ｊａｇ１抗体の予防的投薬は、ＩＬ−１３の気管内送達によって誘導される、マウス杯細胞化生モデルにおいて、ノッチシグナリング経路遺伝子Ｎｒａｒｐ及び杯細胞マーカー遺伝子Ｍｕｃ５ａｃの発現を阻害する
【０３９１】
気管内（ＩＴ）ＩＬ−１３投与については、３〜５％イソフルランでＣ５７Ｂｌ／６マウスに麻酔をかけて効かせ、このマウスに、口を通して慎重に挿入したブラントゲル装填ピペットチップを使用して投与した。必要に応じて切歯の周りの縫合糸を使用してマウスを台の上で吊り下げて、気管を可視化した。５０マイクロリットルの生理食塩水に入れて、１０マイクログラムのマウスＩＬ−１３を３日間にわたって毎日投与した。４日目に、ＲＮＡ用に肺を回収した。５つのマウス群を使用した。３つの群に生理食塩水を気管内投与し、これらの群を、何も無し（ナイーブ）、１００ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏ）又は１００ｍｇ／ｋｇの１５Ｄ１１．１で、１日目に１度前処理した。２つの群にＩＬ−１３気管内投与し、１００ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏ）又は１００ｍｇ／ｋｇの１５Ｄ１１．１で、１日目に１度前処理した。
【０３９２】
Ａ）ノッチシグナリング経路遺伝子Ｎｒａｒｐは、１５Ｄ１１．１で処理した場合に、生理食塩水又はＩＬ−１３で気管内チャレンジしたマウスの肺でダウンレギュレートされる。Ｂ）杯細胞マーカー遺伝子Ｍｕｃ５ａｃは、ＩＬ−１３で気管内チャレンジしたマウスの肺において、アップレギュレートされ、１５Ｄ１１．１で処理した場合にダウンレギュレートされる。図１６Ａ及びＢを参照されたい。
【０３９３】
実施例１９：Ｊａｇ１抗体の予防的投薬は、オボアルブミン誘導性喘息モデルにおいて線毛性気道上皮細胞の表現型を推進し、杯細胞化生を阻害する
【０３９４】
マウスのアレルゲン誘導性肺気道リモデリング（杯細胞化生）を、喘息のオボアルブミン誘導性マウスモデルにおいて測定した。８匹のマウスから成る５つの群（全体で４０匹のマウス）を本研究で使用した。成体の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢を越える）を、１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）抗原（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＬＳ００３０５４，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）とともに又はそのまま、０．２ｍＬの２％水酸化アルミニウム（ミョウバン）ゲル（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓ，１２２６１，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、０日目及び１４日目に感作し、追加免疫した。群Ａを、１ｍＬの０．９％生理食塩水を５０ｍＬのミョウバンゲルに入れた溶液の０．２ｍＬのｉ．ｐ．注射で感作し、追加免疫した。群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを１ｍＬの０．９％生理食塩水に溶解した２．５５ｍｇのＯＶを５０ｍＬのミョウバンゲルに入れた溶液の０．２ｍＬのｉ．ｐ．注射で、感作し、追加免疫した。群Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥに噴霧化ＯＶＡを吸入させて、肺において抗原誘導性肺炎症及び杯細胞化生を惹起した。噴霧化ＯＶＡのチャレンジについては、プレキシガラスボックスにマウスを入れ、２１日目、２２日目及び２３日目に、１％オボアルブミンを生理食塩水（０．０１ｇ／ｍｌ）を充填したネブライザー（ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ＬＣ  ＳＴＡＲネブライザー及びＰｒｏｎｅｂ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ圧縮機，Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＶＡ）によって、そのボックスにエアロゾル化ＯＶＡを２０分間噴霧した。２６日目に、５％オボアルブミンを入れた生理食塩水での２０分間の噴霧化ＯＶＡのチャレンジを行った。群ＡにＯＶＡを含まない噴霧化生理食塩水を吸入させた。群Ａ及びＢに、アイソタイプコントロール抗体（１００ｍｇ／ｋｇ、ＰＬ−３５３０４）を投与し、群Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＥ（１００ｍｇ／ｋｇ）に、ｈｕ抗＜ｈｕ  Ｊａｇ−１＞１５Ｄ１１．１Ｍａｂ（ＰＬ−４２５４１）．ｍｇ／ｋｇ）を投与した。すべての群は、０、７、１４及び２０日目に５ｍＬ／ｋｇの量で、尾静脈によりｉ．ｖ．投与した。２７日目に、マウスを安楽死させ、気管カニューレを介して１０％中性緩衝ホルマリンで肺を膨張させた。膨張させた肺をホルマリンに少なくとも２４時間浸した。パラフィンブロックに処理した後、肺を切片化（５μｍ）し、ガラススライド上に浮かべた。この肺切片をムチン含量の評価のために過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色した。
【０３９５】
図１７Ａ）二重免疫蛍光染色を使用して、気道上皮の分泌細胞及び線毛細胞の量を可視化した。非感作、及びＯＶＡ感作／チャレンジの気道は、分泌細胞表現型を優位に有し、１５Ｄ１１．１で処理したＯＶＡ感作／チャレンジのマウスでより多くの線毛細胞表現型が観察される。図１７Ｂ）ＰＡＳによってムチン染色された気道上皮の代表的な画像。図１７Ｃ）立体的技法によって測定した、気道上皮中のムチン含量は、１５Ｄ１１．１処理で用量依存的様式で低下する。
【０３９６】
実施例２０：オボアルブミン誘導性喘息モデルにおけるＪａｇ１中和Ａｂの治療的投薬は、分泌細胞の遺伝子発現を阻害する
【０３９７】
喘息のマウスＯＶＡモデルでは、２２日目に５つのマウス群に投与した（治療的投薬）。１つの群は、ＯＶＡに対して感作せず、１００ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体を投与した（生理食塩水−Ｉｓｏ）。１つの群は、ＯＶＡで感作／チャレンジし、１００ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏ）を投与した。３つのマウス群は、ＯＶＡで感作／チャレンジし、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇの１５Ｄ１１．１を投与した。
【０３９８】
図１８Ａ）１５Ｄ１１．１は、分泌細胞マーカー遺伝子のＳｃｇｂ１ａ１の発現を、マウス肺組織において、１０から３０ｍｇ／ｋｇの用量のＥＤ５０で、用量依存的様式で阻害した。１５Ｄ１１．１はまた、杯細胞マーカー遺伝子（図１８Ｂ）Ｍｕｃ５ａｃ、図１８Ｃ）Ｍｕｃ５ｂ及び図１８Ｄ）ノッチシグナリング経路遺伝子のＮｒａｒｐを有意に阻害した。
【０３９９】
実施例２１：Ｊａｇ１抗体処理は、粘液閉塞性肺疾患のｂ−ＥＮａＣトランスジェニックマウスモデルにおいて気道粘液閉塞を低減させる
【０４００】
ｂ−ＥＮａＣ  トランスジェニック（Ｔｇ）マウスは、気道粘液閉塞を発病する（Ｌｉｖｒａｇｈｉ−Ｂｕｔｒｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｍｕｃｕｓ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４４：４７０−４８４）。１００ｍｇ／ｋｇの１５Ｄ１１．１又は１００ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体を、ｂ−ＥＮａＣトランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び野生型の同腹子コントロールに３週間にわたって１週１回送達した。最初の抗体投与から４週後に肺を回収し、パラフィンに包埋し、切片化し、粘液についてＰＡＳで染色した。肺の病態の重症度を気道粘液栓スコアについて０〜３の範囲に及ぶ段階で半定量的に段階分けした：０正常な肺、１中程度の／大きな気道におけるわずかなＰＡＳ陽性物質のライニング上皮、２軽度の量のＰＡＳ陽性物質且つ１以下の閉塞した中程度の大きさの気道、３中程度の量のＰＡＳ陽性物質且つ１を超える閉塞した中程度の大きさの気道。
【０４０１】
図１９Ａ）ＰＡＳによってムチン染色された気道上皮の代表的な画像。図１９Ｂ）１５Ｄ１１．１処理によって、肺において粘液栓スコアは低下した。
【０４０２】
実施例２２：Ｊａｇ１抗体の投薬がサルの呼吸上皮におけるムチン含量の低減を阻害する
【０４０３】
１５Ｄ１１．１（５０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ）の週４回投与をカニクイザルに与えた。最初の投与から２８日後に、サルを安楽死させ、肺を処理し、ムチン含量の評価のためにＰＡＳで染色した。
【０４０４】
ＰＡＳによってムチン染色されたカニクイザルの気道上皮の代表的な画像。ビヒクルだけを投与したサル（図２０Ａ〜Ｃ）と比較して、１５Ｄ１１．１は、呼吸上皮のムチン含量（すなわち、杯細胞数）を低減させた（図２０Ｄ〜Ｆ）。
【０４０５】
実施例２３：１５Ｄ１１．１抗体の薬物動態
【０４０６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びカニクイザルにおいて、単回の静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）注射後の、様々な用量レベルの１５Ｄ１１．１抗体の薬物動態プロファイルを評価した。血清試料を収集し、酵素結合免疫吸着測定法によって抗体濃度を分析した。
【０４０７】
図２１Ａ）マウス及び図２１Ｂ）カニクイザルへの様々な用量の抗体の単回の静脈内又は皮下投与の、１５Ｄ１１．１抗体のクリアランス。カニクイザルにおけるクリアランスプロファイルは、１０ｍｇ／ｋｇ未満の用量における標的媒介処分を示した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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