(57)【要約】      （修正有）【課題】抗生物質に対する感受性を含む、原核生物の細胞生存能力表現型を変化させる方法および組成物の提供。【解決手段】結合部位は遺伝子に機能的に結合しておらず、標的転写因子は、ＷｈｉＢ７、ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ、Ｓｉｇｍａ５４（もしくはＳｉｇＡ）、Ｆｕｒ、ＴｃｄＲ、Ｖｆｒ、ＮｔｒＣ、ＡｒｓＲ、ＴｃａＡ、ＡｇｒＡ、ＷａｌＲ、ｓｉｇＢ、Ｋｓｉｇ、もしくはｆｈｕ、またはこれらのいずれかの機能的変異体もしくはホモログから選ばれ、標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは細胞の適応機構、細胞の固有の抗生物質耐性機構、細胞のビルレンス因子、細胞のストレス機構のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含み、二次構造の少なくとも１つのエレメントを含む、標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記結合部位は遺伝子に機能的に結合しておらず、
前記標的転写因子は、ＷｈｉＢ７、ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ、Ｓｉｇｍａ５４（もしくはＳｉｇＡ）、Ｆｕｒ、ＴｃｄＲ、Ｖｆｒ、ＮｔｒＣ、ＡｒｓＲ、ＴｃａＡ、ＡｇｒＡ、ＷａｌＲ、ｓｉｇＢ、Ｋｓｉｇ、もしくはｆｈｕ、またはこれらのいずれかの機能的変異体もしくはホモログから選ばれ、
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
（ｉ）細胞の適応機構、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞のストレス機構
のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含み、
二次構造の少なくとも１つのエレメントを含む、デコイポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記標的転写因子が、
（ａ）細胞の排出ポンプタンパク質、細胞壁の組成、細胞壁密度もしくは細胞壁代謝を決定するタンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｂ）細胞のストレス応答の１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｃ）金属調節タンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｄ）窒素固定タンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｅ）病原性タンパク質もしくはビルレンス因子をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｆ）１個のまたは複数個の必須遺伝子、
のうち１つ以上を発現させるためのレギュレーターを含む、請求項１に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状二本鎖ＤＮＡもしくは直鎖オリゴヌクレオチド、および／または前記転写因子の結合部位の１より多いコピー、および／または前記結合部位に付加的な配列、および／または前記ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾塩基もしくは修飾糖、および／またはプラスミドもしくはプラスミドライブラリーを含む、請求項１または２に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記デコイポリヌクレオチドが、前記転写因子結合部位の複数のダイレクトリピートを含む、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記デコイポリヌクレオチドが、複数の転写因子結合部位を含む、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記デコイポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’コレステロール修飾を有する直鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項３、４、または５に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状ダンベルを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記デコイポリヌクレオチドが、プラスミドを含み、当該プラスミドが、スネア配列を含むモノマー配列の１つ以上のコピーを有し、当該スネア配列が前記転写因子結合部位を含み、当該結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項９】
デコイポリヌクレオチド中の前記転写因子の結合部位が、配列番号７〜８、１８〜２７、４４、４５、４８、４９、５７〜６０のいずれかまたはデコイ機能を保持するその変異体もしくはフラグメントを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号５７、配列番号５８または配列番号６０の配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項１１】
細菌感染の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
前記細菌感染の治療が、１種以上の抗生物質および／または他の抗菌剤の使用を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
細菌感染が、肺炎、菌血症、百日咳、ライム病、ブルセラ症、急性腸炎、敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、野兎病、インフルエンザ、消化器潰瘍、レジオネラ症、淋病、院内感染、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、リケッチア、腸チフス、赤痢、コレラ、疫病、炭疽菌、偽膜性大腸炎、ジフテリア、リステリア病、結核、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）から選ばれることを含む、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、洗浄組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドと、１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とを含むキットであって、前記デコイと前記１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とは、殺菌、細菌増殖阻害、細菌のビルレンス低減のために組み合わせて使用される、キット。
【請求項１７】
殺菌する、細菌増殖を阻害する、または細菌ビルレンスを低減させる生体外方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて適用することを含む、方法。
【請求項１８】
原核細胞の生存能力を低減させる方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、かつ
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
（ｉ）細胞の適応機構、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞のストレス機構
のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含む、方法。
【請求項１９】
原核生物の抗生物質感受性を増加させる方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより前記細胞の抗生物質感受性を増加させ、かつ
前記標的転写因子は、細胞の固有の抗生物質耐性機構をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターを含む、方法。
【請求項２０】
生存能力を低減させることが、
（ｉ）ストレス応答などの細胞の適応応答を阻害すること、
（ｉｉ）抗生物質に対する細胞の感受性を増加させること、
（ｉｉｉ）１個以上の必須遺伝子の発現を阻害すること、
（ｉｖ）１個以上のビルレンス遺伝子の発現を阻害すること、のうち１つ以上を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
原核生物が菌類である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記菌類が病原性である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子デコイ配列を用いて、原核生物、特に病原菌の表現型を修飾するための方法および組成物に関する。
【０００２】
本願は、２００８年１０月３日に出願の米国仮出願番号第６１／１０２，４１４号、２００８年１０月３日に出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３号、２００９年４月４日に出願の米国仮出願番号第６１／１６７，５９２、および２００９年４月４日に出願の英国特許出願番号第０９０６９１３０号に関連し、これら文献の内容は全体として参照により本書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
細菌増殖の制御およびビルレンスの制御は、特に医学的および獣医学的用途において、深刻化する課題となっており、公衆衛生にとっての大きな問題になり得る。病原菌に対する抗生物質の使用は当技術分野では周知である。しかしながら、かかる抗生物質の広範な使用は、少なくとも１種、そして場合によっては複数種の抗生物質に対する耐性を有する細菌の出現をもたらした（いわゆる多剤耐性菌）。発見されたり研究中であったりする抗生物質の数は低減しているので状況は悪化している。事実、抗生物質耐性は、抗菌研究にとって大きな問題であり、市販の抗生物質や現在開発中の抗生物質の有効性に対する脅威である。それゆえ、細菌の蔓延および感染に対処するために使用することができる新規な抗菌剤が必要とされている。
【０００４】
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、皮膚感染から中毒性ショックによる致命的な敗血症までの広範な重篤度で多くのヒトおよび動物の病気を引き起こす、世界的な大きな健康問題である（Ｌｏｗｙ、「Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」（１９９８年）３３９：５２０〜５３２）。推定では、人口の２０％が、軟部組織感染において黄色ブドウ球菌のキャリアであり（多くの場合は臨床的特徴に気付かない）、そこから黄色ブドウ球菌は身体に浸透でき血液そしてその後は骨や心臓組織に感染する（ＧｏｒｄｏｎおよびＬｏｗｙ、「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」（２００８年）４０（Ｓ５）：Ｓ３５０〜９）。元来細胞外の病原と考えられたが、細胞間に存続することにより、黄色ブドウ球菌が抗菌作用またはマクロファージ取り込みを回避することができることを示唆する実質的証拠が明らかになっており（ＧａｒｚｏｎｉおよびＫｅｌｌｅｙ、「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００９年）１７：５９〜６５）、その治療が複雑になる可能性がある。抗生物質への最初の暴露以来、多剤耐性菌株が臨床においてごく当たり前であるほどにまで、耐性機構が獲得されるかまたは発達しており（Ｈａｗｋｅｙ、「Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．」（２００８年）６２（Ｓ１）：ｉ１〜９）、これにより治療の選択肢がさらに制限されている。
【０００５】
黄色ブドウ球菌がこれほど万能な病原である理由はいくつかある。黄色ブドウ球菌は、宿主の免疫反応を逃れる機構を有する（Ｆｏｓｔｅｒ、「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００５年）３：９４８〜９５８）、黄色ブドウ球菌は、様々なビルレンス決定因子を産生することができる（Ｎｏｖｉｃｋ、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．」（２００３年）４８：１４２９〜１４４９）、黄色ブドウ球菌は、宿主組織を異化する能力を有する（Ｖｏｊｔｏｖら（２００２年）「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９９：１０１０２〜１０１０７）、黄色ブドウ球菌は、宿主中でみられる栄養素が制限され酸素の無い環境に容易に適応することができる（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋら、「Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．」（２００２年）８：１１５５〜１１７２）。これらプロセスの多くが転写レベルで制御され、それら自体は現在は従来の抗生物質の標的にはなっていない（従来の抗生物質はほとんど、細胞壁合成、タンパク質合成、またはＤＮＡ合成に作用する）。
【０００６】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌：ＧＡＳ）の感染は、通常、様々な抗生物質を用いて治療することができる。早期治療は、侵襲性のＡ群連鎖球菌感染症による死亡リスクを低減させ得る。しかしながら、最善の医療をもってしてもあらゆる場合に死亡を防げるわけではない。重症患者には、集中治療室での支持療法が必要である場合がある。壊死性筋膜炎の患者には、損傷組織を取り除くために、多くの場合に手術が必要である。マクロライド系抗生物質に耐性のある化膿連鎖球菌株が出現しているが、どの株もペニシリンに一様に感受性を維持している。
【０００７】
ペニシリンおよび他のベータラクタムに対する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の耐性が世界中で増加している。耐性の主要機構は、ペニシリン結合タンパク質をコードする遺伝子における変異の導入を伴う。選択圧が重要な役割を果たすと考えられβ−ラクタム系抗生物質の使用が、感染およびコロニー形成のリスク因子とされている。肺炎連鎖球菌は、肺炎、菌血症、中耳炎、脳膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎、および関節炎の原因である。
【０００８】
ペニシリン耐性淋病と同様に、肺炎連鎖球菌（肺炎球菌として一般に知られる）が原因のペニシリン耐性の肺炎は、１９６７年に最初に検出された。ペニシリン代替物に対する耐性は、黄色ブドウ球菌以上であることも知られている。１９９３年までには大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、５種類のフルオロキノロン変異体に耐性があった。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、通常、イソニアジドおよびリファンピンに耐性があり、場合によっては一般的な治療には全般的に耐性がある。ある程度の耐性を示す他の病原としては、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）が挙げられる。
【０００９】
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）は、医療施設で発見された別のスーパーバグ（超強力な細菌）である。ペニシリン耐性腸球菌は１９８３年に発見され、バイコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は１９８７年に発見され、リネゾリド耐性腸球菌（ＬＲＥ）は１９９０年代後半に発見された。
【００１０】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は非常に蔓延している日和見病原菌である。緑膿菌の最も厄介な特徴の１つは、その低抗生物質感受性である。この低感受性は、染色体にコードされる抗生物質耐性遺伝子を有する多剤排出ポンプ（例えば、ｍｅｘＡＢ−ｏｐｒＭ、ｍｅｘＸＹなど）と細菌の細胞性エンベロープの低透過性との共同作用に起因する。内因性の耐性に加えて、緑膿菌は、染色体にコードされる遺伝子における変異や、抗生物質耐性決定因子の遺伝子水平伝播により容易に獲得耐性を生じる。緑膿菌分離株による多剤耐性の発生は、抗生物質耐性遺伝子の種々の変異および／または水平伝播の獲得を含むいくつかの異なる遺伝的事象を必要とする。超変異は、慢性感染症をもたらす緑膿菌株における変異によって駆動される抗生物質耐性の選択に有利に働く一方で、インテグロンにおけるいくつかの異なる抗生物質耐性遺伝子のクラスター化は、抗生物質耐性決定因子の共同獲得に有利に働く。最近の研究のいくつかでは、生物膜形成または小型コロニー変種の出現に関連した表現型耐性は、抗生物質による治療に対する緑膿菌集団の応答において重要である可能性があることを示している（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ  Ｐ．（編集者）「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第一版）（２００５年）Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００１１】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、世界中の病院において下痢の原因となる院内病原菌である。クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシレは、１９８９年〜１９９２年にニューヨーク、アリゾナ、フロリダ、およびマサチューセッツの病院で下痢の大発生の原因病原体として報告された（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ．ら、「Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」（１９９９年）３４１：１６４５〜１６５１）。地理的に離れた場所でのシプロフロキサシンおよびレボフロキサシンなどのフルオロキノロン系抗生物質に耐性のあるクロストリジウム・ディフィシレ株の発生も２００５年に北米で報告された（Ｌｏｏ  Ｖ．ら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」（２００５年）３５３（２３）：２４４２〜９）。
【００１２】
大腸菌およびサルモネラ菌は、汚染された食品から直接やってくる。大腸菌で汚染された肉では、大腸菌の８０パーセントは、製造されている１種以上の薬剤に対して耐性があり、抗生物質抵抗性の膀胱感染症を引き起こす（「ＨＳＵＳファクトシート」）。サルモネラ菌は、１９７０年代に初めてヒトにおいて発見され、場合によっては９種類もの異なる抗生物質に対して耐性がある（「ＨＳＵＳファクトシート」）。両方の細菌が蔓延すると、重大な健康被害がある。毎年多くの人々が感染して入院し、結果的にいくらかの人々は死亡する。
【００１３】
２００４年１１月５日に、疾病対策予防センター（ＣＤＣ）は、イラク／クウェート地域やアフガニスタンで負傷した軍人が治療を受ける軍事医療施設の患者にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の血流感染が増加していることを報告した。これらのうちのほとんどは多剤耐性を示し、分離株のいくつかはすべての薬剤に耐性を示した。
【００１４】
ＤＮＡをベースとする治療薬は、生存能力または病原性に必須の遺伝子標的に作用するように設計された新規なクラスの抗菌剤を構成する。かかる治療薬は、可能性として多くの病原菌に対して適用可能であり、標的部位の修飾を通した当該治療薬に対する耐性の発生は、可能性が非常に低い事象であると期待されている。さらに、当該薬剤は、可能性として、迅速な開発時間という利点や多数の新規かつ耐性のない標的に同時に作用するという利点を有する。
【００１５】
ＤＮＡをベースとする治療薬は、既存の治療剤の限界を克服する可能性を有している。というのも、ＤＮＡをベースとする治療薬は、抗生物質耐性機構の発現を防ぐことによるかまたは必須遺伝子もしくは適応性のある遺伝子を下方制御することにより増殖を阻害することによって、可能性としてどのような病原菌も治療するように設計できるからである。さらに、細菌は、当該薬剤に対する耐性を生じる可能性はない。というのも、耐性を生じるには、転写因子およびその同族結合部位の両方に影響を与える変異を同時に必要とするからである。これは、とりわけ、いくつかの必須遺伝子を制御する薬剤対して当てはまることである。
【００１６】
転写因子デコイ（ＴＦＤ）は、そのようなＤＮＡをベースとした治療薬の一つである。デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子の結合部位を模倣し、転写因子がその同族ゲノム標的に結合するのを阻止するように設計され、結果として遺伝子発現が修飾される（ＭａｎｎおよびＤｚａｕ、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」（２０００年）１０６：１０７１〜１０７５）。
【００１７】
新規なクラスの治療剤として機能する可能性がデコイオリゴヌクレオチドの開発に拍車をかけ、その有用性は主に真核細胞系において実証されている（ＭａｎｎおよびＤｚａｕ（２０００年））。この目的のため、デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子ＥＦ２がラットにおける平滑筋増殖を抑制することを実証するため（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」米国（１９９５年）９５：５８５５〜５８５９）、ＳＴＡＴ３が仲介する癌の増殖をブロックするため（Ｌｅｏｎｇら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」米国（２００３年）１００：４１３８〜４１４３）、ならびにｃＡＭＰ応答エレメントの標的化がインビボでの癌の増殖を制御することができることを示すため（Ｐａｒｋら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（１９９９年）２７４：１５７３〜１５８０）に使用されている。
【００１８】
ＴＦＤは、ＤＮＡをベースとする他の治療薬と比べて明確な利点がある。ＴＦＤの作用機序は単純である。ＴＦＤは、転写因子を隔離することにより遺伝子発現を制御して、細胞を多数の特異的結合配列のコピーであふれかえらせることによって転写因子がプロモーターに結合するのを阻止する（したがって、「デコイ」という言葉になる）。これは、ｍＲＮＡの複雑な二次構造のために標的を明確にすることが難しいアンチセンス戦略とは対照的である。アンチセンス手法と比べて、ＴＦＤは、迅速に作用して、遺伝子の発現を阻止する一方で、アンチセンス手法は、発現の結果に対処するというように、ＴＦＤにはさらなる利点がある。その結果、ＴＦＤははるかに低い濃度で効果がある。というのも、ＴＦＤと転写因子との単一の相互作用が、単一の遺伝子の転写をブロックすることができるのからである（さもなければアンチセンス手法の標的となる何千ものｍＲＮＡのコピーが生じ得る）。
【００１９】
本発明者らの知る限り、原核生物におけるデコイの使用に関しては２つの報告がある。１つ目は、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）におけるリブロース１，５，−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒｂｃ）遺伝子発現のＣＯ２調節を変化させるために、ｒｂｃ遺伝子のプロモーターにおけるＡＴを多く含む成分を模倣するように設計されたＡＴを多く含むデコイオリゴヌクレオチドが使用された（Ｏｎｉｚｕｋａら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．」（２００３年）５４２：４２〜４６）。
【００２０】
２つ目の報告では、抗生物質アクチノロージンの産生の経路特異的活性剤をコードするＳ．セリカラー（Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）におけるａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４のプロモーター中の新規なシス調節配列を同定するために、デコイオリゴヌクレオチドが使用された（ＭｃＡｒｔｈｕｒおよびＢｉｂｂ、「ＰＮＡＳ」（２００８年）１０５：１０２０〜１０２５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｏｎｉｚｕｋａら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．」（２００３年）５４２：４２〜４６）
【非特許文献２】ＭｃＡｒｔｈｕｒおよびＢｉｂｂ、「ＰＮＡＳ」（２００８年）１０５：１０２０〜１０２５）
【発明の概要】
【００２２】
このような背景において本発明が考案された。
【００２３】
本発明者らは、細胞の生存能力を変化させるため、原核生物における細胞経路、応答、および耐性機構の調節を破壊するためのＴＦＤ技術を使用した。例えば、当該方法は、抗生物質耐性表現型、環境条件に対する細胞の適応応答、細胞ビルレンス、および細胞の必須代謝のうち１つ以上を変化させるために使用され得る。そうすることで、本発明者らは、細菌感染を治療しかつ細菌増殖を抑える手段を提供した。
【００２４】
したがって、１つの態様では、本発明は、原核細胞の生存能力を低減させるための、転写デコイ因子（ＴＦＤ）の使用にある。
【００２５】
特に、本発明は、原核細胞の生存能力を低減させる方法を包含し、当該方法は、
（ａ）標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド（デコイ配列）を提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における上記結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、かつ
上記標的転写因子は、
（ｉ）細胞の適応応答、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞のストレス応答、もしくは
（ｖ）細胞の必須遺伝子、のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
【００２６】
別の態様では、本発明は下記のものを提供する。
・原核生物の抗生物質感受性を増加させる方法であって、当該方法は、
（ａ）標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド（デコイ配列）を提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における上記結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより上記細胞の抗生物質感受性を増加させ、かつ
上記標的転写因子は、
（ｉ）細胞の適応応答、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞の必須遺伝子、のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
【００２７】
本発明はまた下記のものも提供する。
・標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、
上記結合部位は、遺伝子に機能的に結合しておらず、かつ
上記標的転写因子は、
（ｉ）細胞の適応応答、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞の必須遺伝子、のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む。
【００２８】
標的転写因子は、次のものから選ばれてもよい。ＷｈｉＢ７（配列番号５および９）、ＦａｂＢ（配列番号６）、ＬｙｔＭ（配列番号７）、Ｓｓａ（配列番号８）、ＦａｄＲ（配列番号１０）、ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ（配列番号１１および１２）、Ｓｉｇｍａ５４（またはＳｉｇＡ）（配列番号１３および１４）、Ｆｕｒ（配列番号１５、１６および１７）、ＴｃｄＲ（配列番号１８）、Ｖｆｒ（配列番号１９、２０および２１）、ＮｔｒＣ（配列番号２２）、ＡｒｓＲ（配列番号：２３および２４）、ＴｃａＡ（配列番号２５）、ＡｇｒＡ（配列番号２６および２７）、ＷａｌＲ（配列番号４４、４５、４８、４９および５７）、ｓｉｇＢ（配列番号５８）、またはＫｓｉｇ（配列番号５９および６０）、あるいはそのいずれかの機能的変異体またはホモログ。
【００２９】
本発明はまた、２つ以上の標的転写因子の２つ以上の結合部位を含む上記のようなデコイポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
・遺伝子に機能的に結合していない標的転写因子の結合部位を含む外因性デコイポリヌクレオチド、を含む細胞であって、当該細胞は、１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した当該転写因子の結合部位を含み、かつ当該標的転写因子は、
（ｉ）細胞の適応応答、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞の必須遺伝子、のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む。
【００３１】
・本発明のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて投与することを含む、被験体の細菌感染の治療方法。
【００３２】
・殺菌する、細菌増殖を阻害する、または細菌ビルレンスを低減させる生体外方法であって、本発明のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて適用することを含む、方法。
【００３３】
・本発明のデコイポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【００３４】
・本発明のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、殺菌剤組成物。
【００３５】
・本発明のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、洗浄組成物。
【００３６】
・本発明のデコイポリヌクレオチドと、１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とを含むキットであって、上記デコイと上記１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とは、殺菌、細菌増殖阻害、細菌ビルレンス低減のために組み合わせて使用される、キット。
【００３７】
・原核細胞の病原性の低減方法であって、
（ａ）標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した上記転写因子の結合部位を含む原核細胞に上記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
上記デコイポリヌクレオチドの導入は、上記細胞における結合部位への上記標的転写因子の結合を低減させ、上記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより細胞ビルレンスを低減させ、かつ
上記標的転写因子は、
（ｉ）細胞の適応応答、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞の必須遺伝子、のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子の発現のレギュレーターを含む、方法である。
【００３８】
・標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、当該結合部位は、配列番号５７、配列番号５８、または配列番号６０に示す配列を有する、デコイポリヌクレオチド。
【００３９】
・細菌感染の治療における、配列番号５７、配列番号５８、または配列番号６０の配列を含むデコイポリヌクレオチドの使用。
【００４０】
一般に、転写因子デコイ（ＴＦＤ）配列（またはデコイ配列）は、細胞における転写因子への結合に関連して、細胞における未変性のシス調節配列または内在性のシス調節配列を含むかまたはそれらと競合する同族転写因子の結合部位を含む。シス調節配列を含む適切な宿主細胞へ導入されると（本明細書に記載の方法や他の方法により）、デコイ配列は、同族転写因子への結合をめぐって細胞中でシス調節配列と競合する。かかる競合によって、細胞中のシス調節配列への転写因子の結合が低減され、シス調節配列への転写因子の結合によって発現が調節される遺伝子の発現が変化する。本明細書では、デコイ機能は、この様式で同族転写因子への結合をめぐってシス調節配列と競合する配列の能力を指す。
【００４１】
シス調節配列またはシス調節エレメントは、一般に、１個のまたは複数個の遺伝子の転写開始部位の上流（５’）または下流（３’）に存在し、当該１個のまたは複数個の遺伝子の発現を調節するように機能するヌクレオチド配列を指す。典型的には、シス調節配列は、タンパク質（転写因子）の結合部位を含み、当該タンパク質の結合は、所与の遺伝子の転写を調節する。当該配列へのタンパク質の結合は、遺伝子の発現の直接的または間接的な修飾をもたらす。例えば、結合したタンパク質は、転写のために必要とされる近傍の領域に結合したもう一つのタンパク質と相互作用し正しい位置にタンパク質を固定し得るか、または転写に必要な別のタンパク質の結合を阻害し得る。典型的には、シス調節配列またはシス調節エレメントは、遺伝子のプロモーター領域中に存在するが、原核生物においては、シス調節配列またはシス調節エレメントが影響を与える遺伝子の何百塩基対も上流または下流に位置するのは珍しいことではない。
【００４２】
シス調節配列は、抑制的（転写因子が結合した場合に遺伝子の転写を阻害または低減させる）、または活性的（転写因子が結合した場合に遺伝子の転写を活性化または増加させる）であり得る。したがって、シス調節配列と結合する転写因子は、負のエフェクター（リプレッサータンパク質）または正のエフェクター（アクチベーター）であり得る。
【００４３】
デコイポリヌクレオチドまたはデコイ配列の標的配列は、デコイポリヌクレオチドまたはデコイ配列が転写因子の結合をめぐって競合する細胞転写因子結合部位を指す。同様に、標的レギュレーターは、デコイ配列が結合する転写因子である。デコイ配列の標的遺伝子は、細胞転写因子結合部位に機能的に結合した遺伝子である。したがって、デコイ配列は、標的遺伝子の発現の調節を破壊する。
【００４４】
本発明者らは、原核生物の表現型、特に細菌の病原性に対しておよび細菌感染への取り組みに対して関連性のある表現型を変化させるためにデコイを使用した。特に、本発明者らは、細胞をより死滅させやすくまたは増殖阻害されやすくするため、および／または厳しい条件下で生存能力を低下させるため、および／またはビルレンスを低下させるために、細胞経路、応答、および耐性機構の発現を破壊するようにデコイを使用した。
【００４５】
１つの態様では、本方法は、例えば、一般的な条件下で、細胞の生存能力を低下させるために遺伝子の発現を破壊する。例えば、細胞は、抗生物質に対する感受性の増加、ストレス応答の低下、ビルレンス応答の低下、および／または必須遺伝子の発現の破壊により生存能力が低減し得る。本方法は、細胞の防御もしくは生存システムおよび／またはビルレンスシステムを弱体化するためにデコイを使用し得る。本方法は、細胞死に対して細胞をより脆弱にし、かつ／または増殖もしくは病原性を阻害し得る。したがって、１つの態様では、本デコイは、殺菌効果または静菌効果をもたらし得る。
【００４６】
例えば、１つの態様では、本発明者らは、原核生物、特に細菌（特に病原菌）の抗生物質感受性表現型を変化させるためにデコイを使用した。１つの態様では、感受性の増加は、１種類の抗生物質または抗生物質のクラスに特異的ではない。１つの態様では、感受性の増加は、任意の１種類の抗生物質または抗生物質のクラスの構造および／または機構に特異的ではない。１つの態様では、広範な抗生物質または抗生物質のクラスに対する感受性が増加する。
【００４７】
１つの態様では、感受性の増加は、アミノグリコシド（カナマイシンなど）、カルバペネム（メロペネムなど）、セファロスポリン（セフェピムなど）、糖ペプチド（バンコマイシンおよびダプトマイシンなど）、ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリンなど）、ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシシンＢなど）、キノリン（レバクインなど）、スルホンアミド（バクトリムなど）、テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）、ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、ザイボックスから選ばれる任意の１種類の抗生物質または抗生物質のクラスに特異的ではない。
【００４８】
本明細書に記載のデコイ法はまた、細胞の適応応答または細胞のビルレンスなどの表現型を変化させるために使用することができる。当該方法はまた、例えば、所与の培養条件または生理的条件下（例えば、栄養素が制限された）での、必須遺伝子の細胞発現および細胞生存を変化させるために使用してもよい。
【００４９】
一般に、上記方法は、細菌感染および関連疾患を標的とする新規な手段を提供する。これは、抗生物質の影響を強めることによるか、または細菌に対する直接的な阻害作用、例えば、増殖阻害または生存阻害、ビルレンス決定因子の発現の阻害、必須遺伝子の発現の阻害による場合がある。したがって、ＴＦＤは、それ自体で、抗生物質または抗菌剤として作用し得る。１つの態様では、上記方法は、細胞の生存能力を決定する遺伝子の発現を破壊するデコイを使用する。
【００５０】
上記のように、本方法は、細胞経路、応答、および耐性機構の調節を破壊するためにデコイを使用する。場合によっては、これは、グローバルな調節分子の結合を標的とすること伴う。標的遺伝子は、抗生物質に応答して調節されるものであってもよい。
【００５１】
標的としては、内因性の多剤耐性機構を含む内因性の抗生物質耐性機構のレギュレーターを挙げることができる。内因性機構は、例えば、抗生物質が細胞から除去される速度を増加させることによるか、または細胞壁の透過性または浸透性を低減させることにより、抗生物質などの薬剤に対する物理的障壁をもたらし得る。内因性機構は、細胞質に侵入した抗生物質に対する耐性をもたらし得る。内因性耐性機構は、ストレスや本明細書に記載の他の条件などの環境条件に応答して誘導され得る。場合によっては、内因性耐性機構をコードする遺伝子の発現は、抗生物質に応答して調節される。例えば、当該遺伝子は、発現が抗生物質に応答して異なって調節される、生理的役割を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。内因性耐性において役割を果たすタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、排出ポンプ、または細胞壁の組成もしくは密度または細胞壁代謝を決定するタンパク質をコードし得る。１つの態様では、標的遺伝子は、例えば、抗生物質の構造または機構の点で抗生物質に特異的でないかまたは抗生物質のクラスに特異的でない耐性機構をコードする。
【００５２】
標的としては、細胞の適応応答のレギュレーターを挙げることができる。典型的には、当該標的は、環境条件（例えば、厳しい環境条件）に対する適応応答である。当該標的の例としては、酸化ストレス応答または過酸化ストレス応答などのストレス応答、栄養素の欠如（例えば、窒素制限）に対する応答、毒素（例えば、高鉄分状態などの金属毒）に対する応答、高酸度（低ｐＨ）状況に対する応答が挙げられる。したがって、標的としては、ストレス応答遺伝子のレギュレーター、金属調節タンパク質、および窒素固定遺伝子のレギュレーターを挙げることができる。
【００５３】
細胞適応遺伝子は、その発現が環境要因により決定され、細菌がその環境で生存し病気の原因となる能力に影響を及ぼす遺伝子である。例えば、細菌は、宿主内に見られる低鉄分濃度条件に適応する必要がある場合があり、鉄を隔離し細胞内へ取り込むことができるタンパク質を発現する一連の遺伝子を誘導することによって、このような条件に適応し得る。これはまた、バイオフィルムの形成、細胞壁生理機構、および一次代謝の変化を含むことになる。
【００５４】
ストレス応答遺伝子は、細胞適応遺伝子のクラスを形成する。一連の遺伝子の数には限りがあり、そのすべてまたはいくらかが広範なストレスに応答して誘導される。ストレスとしては、物理的要因（温度変化、酸性度、低酸素）、生物的要因（宿主または他の細菌に応答して）、および化学的要因（抗生物質を用いた治療など）を挙げることができる。
【００５５】
また、生理的条件に対する応答を挙げることもできる。したがって、標的としては、病原性遺伝子または毒素などのビルレンス因子の発現のレギュレーターを挙げることができる。また標的として、バイオフィルム形成および栄養素（例えば、鉄）捕捉を決定するタンパク質のレギュレーターが挙げられる。
【００５６】
ビルレンス因子の遺伝子は、毒素などの、病気の原因となる細菌からの特異的分子の産生を制御するか、または細菌が生存し病気の原因となる能力に影響を与える宿主からの応答を誘発する遺伝子である。
【００５７】
また標的としては、必須遺伝子のレギュレーターが挙げられる。これは、その発現が、一般的な環境条件において細胞生存に不可欠な遺伝子である。例えば、標的は、ＤＮＡ複製、一次代謝経路、脂肪酸合成、または細胞分裂に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子のレギュレーターであってもよい。
【００５８】
必須遺伝子は、細菌が任意の環境中で生存するために必要とされる遺伝子である。
【００５９】
しばしば、細胞においては、上記の系は重複する。したがって、１種の調節タンパク質が、環境ストレスに応答してビルレンス因子をコードする遺伝子の発現および細胞壁代謝を調節する場合がある。別の例では、調節タンパク質は、特定の環境条件下（例えば、栄養素不足）にある細胞にとって必要な遺伝子の発現を制御し得る。
【００６０】
１つの態様では、本方法は、その発現の調節が、一般に、抗生物質（例えば、１種より多い抗生物質または１より多い抗生物質のクラス）の存在下で細胞が生存する能力を決定する遺伝子を標的にしてもよい。
【００６１】
抗生物質耐性遺伝子の例は、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に開示されている。本明細書に記載のものなどのデコイは、抗生物質耐性を変化（例えば、増加）させるために、ベータラクタマーゼ、排出ポンプ（例えば、図１のもの）、アミノグリコシド修飾酵素、またはｅｒｍＢ遺伝子をコードするＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３中の任意の１個以上の遺伝子を標的とするために使用されてもよい。実際、デコイは、１より多い遺伝子もしくは転写因子および／または１より多い菌株に作用するために標的とされる２つ以上の配列を含んでもよい。例えば、デコイは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌からのＳｉｇ結合セットを含んでもよい。
【００６２】
ＴＦＤは、様々な細菌感染が人の体内のどの部分で起こっても、その治療のために使用され得る。細菌感染の５つの一般的な領域を記載することができる。気道感染症が、最も一般的であり、耳、喉、および副鼻腔を含む上気道の感染症が、局所適用またはエアゾール製剤で治療することができる。下気道の感染症としては、肺炎（様々な病原菌により引き起こされる）、気管支炎、および嚢胞性繊維症の感染合併症が挙げられる。地域医療や病院医療の両方における共通の問題は、尿路感染症であり、尿が感染し、抗菌剤を、膀胱、前立腺、尿管、および腎臓に入れる必要がある。細菌が粘膜侵入または毒素産生のいずれかにより病気を引き起こす場合（その一例はコレラの流行である）、腸は感染症（消化管感染症の例）に弱く、抗生物質は、使用される場合、口から摂取されるか、静脈内投与される。局所適用により治療することができる皮膚軟部組織感染症は、外傷や火傷の後によくみられ、微生物のコロニー化や移入が起こり、局所化したまたは組織に迅速に広がった感染症の両方をもたらす。皮膚感染症の原因である微生物は、多くの場合、表皮感染（とびひ）、蜂巣炎（血液にまで及び得るより多くの深部への感染症）、および壊死性筋膜炎（多くの場合生命を脅かす急速進行性の感染症）を引き起こす化膿連鎖球菌などの皮膚の正常細菌叢から生じる。最後に、細菌性髄膜炎などの中枢神経系の感染症は、病原菌が血液脳関門を通過しているので、治療剤も血液脳関門を通過しなければならず、恐らく最も治療が困難である。
【００６３】
デコイは、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載のように調製および試験されてもよい。
【００６４】
本方法を検討する場合、上記の態様の任意の１つ以上が組み合わされてもよい。
【００６５】
本方法は、原核生物における遺伝子発現を破壊するためにデコイポリヌクレオチドを使用する。デコイポリヌクレオチドは、転写因子結合部位（デコイ配列）を含む。一般に、本方法では、デコイポリヌクレオチドは、転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子を含む標的細胞へ導入される。上記ポリヌクレオチドは、細胞結合部位から転写因子をタイトレーションし、細胞において機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現の調節を破壊する。遺伝子発現の変化は、細胞表現型の変化をもたらす。
【００６６】
本方法を使用して標的とされ得る転写因子および遺伝子としては、本明細書および同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載のものが挙げられる。具体例はとしては、図２にも記載されている下記のレギュレーターおよび調節配列が挙げられる。
【００６７】
特定のレギュレーターそれぞれへの言及には、記載の種のレギュレーターおよびそれと同族のすべての種のレギュレーターへの言及が含まれる。各標的に関して、未変性の結合部位および／またはコンセンサス結合配列が示されている。レギュレーターを標的とするデコイ配列は、表示の未変性の配列またはコンセンサス配列、あるいは本発明に記載のデコイ機能を有するそのバリアントまたはフラグメント、例えば他の種における未変性の結合部位、を含んでもよい。デコイ機能についてバリアント配列を試験する方法は、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されている。下記に記載のように、特定のレギュレーターを標的とするデコイは、当該レギュレーターが存在する原核生物における使用に特に適している。また、各レギュレーターに関して記載しているものは、当該レギュレーターを標的とするデコイの用途（例えば、デコイを用いた治療後に細胞が典型的に感受性を持つようになる抗生物質）の例である。
【００６８】
本明細書で提供される配列は、結合部位の一本鎖を示す。しかし当然のことながら、自然界および本発明のＴＦＤでは、配列は二本鎖となる。本明細書に記載の配列に対する相補鎖は、Ｊｏｓｅｐｈ  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤａｖｉｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第三版、２００１年から明確かつ容易に誘導することができる。
【００６９】
ＷｈｉＢ７
ＷｈｉＢ７は、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、恥垢菌（Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）および結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））を含む放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）中の抗生物質耐性遺伝子の転写レギュレーターである（Ｎｇｕｙｅｎら、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２００６年）１４：３０４〜３１２）。
【００７０】
恥垢菌株ＭＣ２  １５５における未変性のＷｈｉＢ７結合部位は下記を含む。
５’−ＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡ  ＡＡＡＧＧＣＣＡＣＧ  ＧＡＣＣＣＧＣＡＧＴ  ＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣ  ＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴ  ＴＴＴＧＴＣＧＧＡＣ  ＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡ  ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣ  ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣ  ＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡ  ＧＡＴＣＡＣ−３’（配列番号９）
【００７１】
遺伝子座ＣＰ０００４８０  ６９８８２０９ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００６年１２月１２日
定義Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｓｔｒ．ＭＣ２  １５５、全ゲノム。
アクセッションＣＰ０００４８０
バージョンＣＰ０００４８０．１  ＧＩ：１１８１６８６２７
座標２０３１３６３７−２０３１７４２
【００７２】
用途：マクロライド、リンコサミド、クロラムフェニコール、イミペネム、プリスチナマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、イソニアジド、エタンブトールを含む広範な親水性／疎水性抗生物質の効果増強
【００７３】
ＷｈｉＢ７  ＴＦＤ配列の一例は、下記を含む。
ＷｈｉＢ７  ＴＦＤ  ５’  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ３’（配列番号５、実施例２）
【００７４】
ＦａｄＲ
ＦａｄＲは、大腸菌における脂肪酸合成の必須経路中の遺伝子（ｆａｂＡおよびｆａｂＢを含む）の発現のレギュレーターである（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＣｒｏｎａｎ、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００１年）１８３：５９８２〜５９９０）。
【００７５】
大腸菌Ｋ１２における未変性のＦａｄＲ結合部位は次の配列を含む。
５’  ＡＧＴＡＡＧＴＴＴＣ  ＧＡＡＴＧＣＡＣＡＡ  ＴＡＧＣＧＴＡＣＡＣ  ＴＴＧＴＡＣＧＣＣＧ  ＡＡＣＡＡＧＴＣＣＧ  ＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ  ＴＡＡ−３’（配列番号１０）
【００７６】
ＬＯＣＵＳ  ＣＰ０００９４８  ４６８６１３７ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００８年６月０５日
定義Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＤＨ１０Ｂ、全ゲノム。
アクセッションＣＰ０００９４８
バージョンＣＰ０００９４８．１  ＧＩ：１６９８８７４９８
座標２５３１４１９−２５３１４８１
【００７７】
用途：プラテンシマイシン、プラテンシン（ｐｌａｔｎｅｃｉｎ）誘導体、ホマレン酸、コリツベリン、環状ソルホン（ｓｏｌｆｏｎｅｓ）、アントラニル酸誘導体、セルレニン酸（ｃｅｒｕｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの脂肪酸合成を標的とする任意の抗生物質の効果増強。
【００７８】
ＦａｄＲ  ＴＦＤ配列の一例は下記を含む。
ＦａｂＢ  ＴＦＤ  ５’  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ３’（配列番号６、実施例３）
【００７９】
ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ
ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦは、黄色ブドウ球菌、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む、低Ｇ＋Ｃグラム陽性菌中の二成分レギュレーターである。ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦは、ＬｙｔＭおよびＳｓａＡを含む少なくとも１２個の遺伝子ならびにビルレンス決定および細胞壁合成の遺伝子の必須レギュレーターであることが知られている（ＤｕｂｒａｃおよびＭｓａｄｅｋ、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００４年）１８６：１１７５〜１１８１）。
【００８０】
黄色ブドウ球菌における（ＬｙｔＭおよびＳｓａのプロモーターにおける）ＹｙｃＦおよびＹｙｃＧの未変性の結合部位は、以下を含む。
ＹｙｃＦ＿ＬｙｔＭ
５’−ＧＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１１）
【００８１】
遺伝子座ＣＰ０００７３０  ２８７２９１５ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００７年１１月１６日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、全ゲノム。
アクセッションＣＰ０００７３０
バージョンＣＰ０００７３０．１  ＧＩ：１６０３６７０７５
座標３２２０７３−３２２１０９
【００８２】
ＹｙｃＦ＿ＳｓａＡ
５’−ＡＴＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１２）
【００８３】
遺伝子座ＣＰ０００７３０  ２８７２９１５ｂｐ  ＤＮＡ環状ＢＣＴ  ２００７年１１月１６日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、全ゲノム。
アクセッションＣＰ０００７３０
バージョンＣＰ０００７３０．１  ＧＩ：１６０３６７０７５
座標２４１５０６７−２４１５０９３
【００８４】
用途：マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ（ＭＬＳＢ）抗生物質の効果増強
【００８５】
ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ  ＴＦＤ配列の例としては、次のものが挙げられる。
ＬｙｔＭ  ＴＦＤ  ５’  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＡ  ３’
ＳｓａＡ  ＴＦＤ  ５’  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ａ  ３’
（配列番号７および８、実施例４）
【００８６】
Ｓｉｇｍａ５４またはＳｉｇＢ
Ｓｉｇｍａ５４すなわちＳｉｇＢは、適応応答の主要なコントローラであり、恥垢菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含む細菌の約６０％に存在する（Ｗｉｇｎｅｓｈｗｅｒａｒａｊ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２００８年）６８：５３８〜５４６）。
【００８７】
黄色ブドウ球菌および肺炎桿菌中の未変性の結合部位は下記を含む。
ＳＡ＿ｓｉｇ
５’−  ＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡ  ＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡ  ＴＡＡＴＴＴＣＴＡＡ  ＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１３）
【００８８】
遺伝子座ＣＰ０００７３０  ２８７２９１５ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００７年１１月１６日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、全ゲノム
アクセッションＣＰ０００７３０
バージョンＣＰ０００７３０．１  ＧＩ：１６０３６７０７５
座標２１８７０５１−２１８７０１７
【００８９】
ＫＰ＿ｓｉｇ
５’−ＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧ  ＣＧＣＡＣＧＧＴＴＴ  ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴ−３’（配列番号１４）
【００９０】
遺伝子座Ｘ１３３０３  ２４２０６ｂｐ  ＤＮＡ  直鎖ＢＣＴ  ２００５年４月１８日
定義Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｎｉｆ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ
アクセッションＸ１３３０３
バージョンＸ１３３０３．１  ＧＩ：４３８２０
座標１８３０１−１８３３０
【００９１】
用途：殺菌性抗生物質および静菌性抗生物質、例えば本明細書に記載のものの効果増強。
【００９２】
Ｆｕｒ
Ｆｕｒ調節は当初、鉄の調節に関して重要であると記載されが、中でも金属調節（Ｚｎ−Ｚｕｒ）や過酸化物（Ｐｅｒ）に対する耐性の決定という他の適応経路に関与するとの認識が高まっている。Ｆｕｒ調節は、少なくとも黄色ブドウ球菌、大腸菌、ピロリ菌、枯草菌で起こる（Ｆｕｒ、ＰｅｒＲ、Ｚｕｒ、ＭｎｔＲ）（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ２００１年、Ｌａｖａｒｒ２００３年、およびＤｅｌａｎｙ２００１年）。
【００９３】
黄色ブドウ球菌および大腸菌において結合するＦｕｒのコンセンサス配列は下記を含む。
ＳＡ＿ｆｕｒ
５’−ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＴ−３’（配列番号１５）
Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００１年）１８３：４６８に記載のコンセンサス配列（「Ｆｕｒ  ＢＯＸ」）
【００９４】
ＥＣ＿ｆｕｒ
５’−ＧＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１６）
ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」（１９９８年）２８３：５３７に記載のコンセンサス配列。
【００９５】
ピロリ菌中の未変性の結合配列は下記を含む。
ＨＰ＿ｆｕｒ
５’−ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＡＡＡ−３’（配列番号１７）
【００９６】
遺伝子座ＣＰ００１０７２  １６０８５４８ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００８年６月１２日
定義Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  Ｓｈｉ４７０、全ゲノム
アクセッションＣＰ００１０７２
バージョンＣＰ００１０７２．２  ＧＩ：１８９４９１８９５
座標６９１４１５−６９１３７４
【００９７】
用途：ストレス（殺菌性）を誘導し得る抗生物質全般の効果増強。ストレス応答機構および環境適応を混乱させるための抗生物質を用いずに、Ｆｕｒデコイを使用してもよい。
【００９８】
ＴｃｄＲ
ＴｃｄＲは、自己調節され、ビルレンスを決定する２種類のメジャーな菌体外毒素の発現を調節する代替シグマ因子である。ＴｃｄＲ調節は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ）（ホモログはＢｏｔＲ）、Ｃ．テタニ（Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ）（ＴｅｔＲ）、およびウェルシュ菌（Ｃ．  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ＵｖｉＡ）において起こることが知られている（Ｍａｔａｍｏｕｒｏｕｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２００７年）６４：１２７４〜１２８８）。
【００９９】
Ｃ．ディフィシレ中のコンセンサス結合部位は下記を含む。
ＴｃｄＲ
５’−ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ａ  ＴＴ−３’（配列番号１８）
【０１００】
コンセンサス配列（ＴｃｄＲ：−３５および−１０ボックスには下線が引かれている）は、Ｄｕｐｕｙ、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．」（２００６年）５５：１１９６に記載されている。
【０１０１】
用途：多くの抗生物質、とりわけ静菌特性を有するものの効果増強。
【０１０２】
Ｖｆｒ
Ｖｆｒは、緑膿菌および大腸菌中の毒性因子のグローバルレギュレーターである（Ｋａｎａｃｋ、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２００６年）１５２：３４８５〜３４９６）。大腸菌のホモログはＣＲＰであり、結合部位は、ｔｏｘＡ遺伝子のプロモーターおよびｒｅｇＡ遺伝子のプロモーターＰ１に生じる。
【０１０３】
緑膿菌中のコンセンサス配列および２つの未変性の結合部位は下記のとおりである。
ＰＡ＿Ｖｆｒ
５’−ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  Ｔ−３’（配列番号１９）
Ｋａｎａｃｋ、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００６年）５５：１１９６に記載のコンセンサス配列。
【０１０４】
ＰＡ＿ＴｏｘＡ
５’−ＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡ  ＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ  ＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号２０）
【０１０５】
遺伝子座ＥＵ５９５７３６  ２６ｂｐ  ＤＮＡ  直鎖ＢＣＴ  ２００８年６月１５日
定義Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＡＣＳ４５８  ｃｌｏｎｅ  ｆａ１３６６、全配列
アクセッションＥＵ５９５７３６  領域：１０１４５．．１０１７０
バージョンＥＵ５９５７３６．１  ＧＩ：１８７９３９５５１
座標１０１４５−１０１７０
【０１０６】
ＰＡ＿ＲｅｇＡ
５’−ＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号２１）
【０１０７】
遺伝子座ＥＵ５９５７３６  ２６ｂｐ  ＤＮＡ直鎖ＢＣＴ  ２００８年６月１５日
定義Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＡＣＳ４５８  ｃｌｏｎｅ  ｆａ１３６６、全配列
アクセッションＥＵ５９５７３６  領域：１０１４５．．１０１７０
バージョンＥＵ５９５７３６．１  ＧＩ：１８７９３９５５１
座標３１２−３３４
【０１０８】
抗生物質：緑膿菌および大腸菌におけるビルレンスを決定する一連の遺伝子の発現を制御する抗生物質を用いずにデコイを使用してもよい。デコイは、抗生物質、とりわけ静菌特性を有するものの効果を増強させるために使用してもよい。
【０１０９】
ＮｔｒＣ
ＮｔｒＣは、少なくとも肺炎桿菌における環境適応に必要な必須遺伝子ｇｌｎＡのレギュレーターである（Ｍｉｎｃｈｉｎら、「Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ」（１９８９年）８：３４９１〜３４９９）。
【０１１０】
肺炎桿菌中の未変性の結合部位は下記を含む。
ＫＰ＿ＮｔｒＣ
５’−ＧＣＴＴＴＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣＧＡＴＣＧＣＴ−３’（配列番号２２）
【０１１１】
遺伝子座Ｘ１３３０３  ２４２０６ｂｐ  ＤＮＡ直鎖ＢＣＴ  ２００５年４月１８日
定義Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｎｉｆ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ
アクセッションＸ１３３０３
バージョンＸ１３３０３．１  ＧＩ：４３８２０
座標１８１５９−１８２０１
【０１１２】
用途：デコイは、環境適応に必要な必須遺伝子ｇｌｎＡの発現を混乱させる抗生物質を用いずに、ストレス（殺菌性）を誘導し得る抗生物質全般と組み合わせて使用されてもよい。
【０１１３】
ＡｒｓＲ
ＡｒｓＲは、少なくともピロリ菌、Ｈ．アシノニチス（Ｈ．  ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ）、およびＨ．フェリス（Ｈ．  ｆｅｌｉｓ）における酸適応をコードする遺伝子のレギュレーターである（Ｐｆｌｏｃｋら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００６年）１８８：３４４９〜３４６２）。結合部位は、Ｐｆｌｏｃｋらに記載のように、ａｍｉＥプロモーターおよびｒｏｃＦプロモーター中に存在する。
【０１１４】
未変性の結合配列の例としては、下記を含む。
ＨＰ＿ＡｍｉＥ
５’−ＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡ  ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＴ  ＴＴＴＣＡＴＡＴＴＣ  ＡＴＴＡＴＡＡＡＴＣ  ＣＧＴＴＴＡＣＡＣＡ  ＡＴＴＡＴＴ  −３’（配列番号２３）
【０１１５】
遺伝子座ＡＥ０００５１１  ５６ｂｐ  ＤＮＡ  直鎖ＢＣＴ  ２００５年１２月２７日
定義Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ２６６９５、全ゲノム
アクセッションＡＥ０００５１１  領域：３１０９１０．．３１０９６５
バージョンＡＥ０００５１１．１  ＧＩ：６６２６２５３
座標３１０９１０−３１０９６５
【０１１６】
ＨＰ＿ＲｏｃＦ
５’−ＧＡＡＡＴＴＧＴＴＣ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴ  ＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴ  ＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴ  ＧＧＴＴＧＴＴＡＡＴ  ＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧ  Ａ−３’（配列番号２４）
【０１１７】
遺伝子座ＡＥ０００５１１  ６１ｂｐ  ＤＮＡ  直鎖ＢＣＴ  ２００５年１２月２７日
定義Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ２６６９５、全ゲノム
アクセッションＡＥ０００５１１  領域：１４５９８３０．．１４５９８９０
バージョンＡＥ０００５１１．１  ＧＩ：６６２６２５３
座標１４５９８３０−１４５９８９０
【０１１８】
用途：デコイは、環境適応に必要となる鉄の取り込みを仲介する必須遺伝子の発現を混乱させるために単独で、あるいはストレス（殺菌性）を誘導し得る抗生物質全般と組み合わせて使用されてもよい。
【０１１９】
糖ペプチド耐性コンセンサス配列（ＧＩＳＡ）
コンセンサス配列は、公開されているマイクロアレイデータの生物情報分析により決定された。モチーフは、糖ペプチド耐性菌とその親株との、および当該耐性菌と復帰変異株との比較を行った際に、アップレギュレートされることが示された遺伝子において発見された（Ｓｃｈｅｒｌ、「ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」（２００６年）７：２９６）。１７／２２のプロモーターが、共通するコンセンサス配列を有すると分かった。
【０１２０】
公知のビルレンスの正のレギュレーターであるｔｃａＡ（Ｍａｋｉ、「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．」（２００４年）４８：１９５３）のプロモーターに見られるコンセンサス配列の例がデコイにおいて使用されてもよい（下記を参照のこと）。
【０１２１】
ＳＡ＿ＴｃａＡ
５’−ＴＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号２５）
【０１２２】
遺伝子座ＣＰ０００７３０  ２８７２９１５ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００７年１１月１６日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、全ゲノム
アクセッションＣＰ０００７３０
バージョンＣＰ０００７３０．１  ＧＩ：１６０３６７０７５
座標２４７６４５２−２４７６４３６
【０１２３】
コンセンサス配列は、少なくとも黄色ブドウ球菌中に生じる。当該配列を標的とするデコイは、未変性のプロモーターにおける配列に結合する調節タンパク質のどれを標的とするために使用されてもよい。典型的には、未変性の配列にて結合することにより調節された遺伝子は、糖ペプチド耐性および／またはビルレンスに寄与する。
【０１２４】
用途：デコイは、糖ペプチド抗生物質の効果を増強させるために使用されてもよい。
【０１２５】
ＡｇｒＡ
コンセンサス配列は、公開されているマイクロアレイデータの生物情報分析により決定された。モチーフは、ビルレンスに関連するレギュレーターであるＡｇｒにより正に調節されることが示された遺伝子において見出された（Ｄｕｎｍａｎ、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」（２００１年）１８３：７３４１）。
【０１２６】
推定上のモチーフは、病原性の決定に関与する可能性が高いと考えられる２種類のプロモーターにおいて生じることが分かった（ＡｒａＣ様転写レギュレーター上流のＳＡ２０９３およびＢｌｔ様遺伝子であるＳＡ１２６９）。
【０１２７】
ＳＡ＿Ａｇｒ＿２０９３
５’−ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡ−３’（配列番号２６）
【０１２８】
遺伝子座ＣＰ０００７３０  ２８７２９１５ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００７年１１月１６日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００＿ＴＣＨ１５１６、全ゲノム
アクセッションＣＰ０００７３０
バージョンＣＰ０００７３０．１  ＧＩ：１６０３６７０７５
座標２４１４７９０−２４１４７７１
【０１２９】
ＳＡ＿Ａｇｒ＿１２６９
５’−ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴ−３’（配列番号２７）
【０１３０】
遺伝子座ＡＰ００９３２４  ２８８０１６８ｂｐ  ＤＮＡ  環状ＢＣＴ  ２００８年１月０９日
定義Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３  ＤＮＡ、全ゲノム
アクセッションＡＰ００９３２４
バージョンＡＰ００９３２４．１  ＧＩ：１５６７２０４６６
座標１５４９５８０−１５４９５６１
【０１３１】
結合モチーフは、少なくとも黄色ブドウ球菌で生じ、緑膿菌および大腸菌などの多くのグラム陰性種においてホモログを含む。当該モチーフを標的とするデコイは、未変性のプロモーターにおいて当該モチーフと結合する任意の調節タンパク質を標的とするために使用されてもよい。典型的には、未変性の配列にて結合することにより調節される遺伝子は、細胞のビルレンスを決定する。
【０１３２】
用途：デコイは、緑膿菌および大腸菌におけるビルレンスを決定する一連の遺伝子の発現を制御するために使用されてもよい。
【０１３３】
一般に、ポリヌクレオチドにおけるデコイ配列（転写因子結合部位）は、遺伝子に機能的に結合していない。転写因子結合部位は、同族のプロモーターの他の要素から単離されてもよい。
【０１３４】
デコイポリヌクレオチドは、プラスミドベクターを含んでもよい。例えば、デコイポリヌクレオチドは、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されかつ／または同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載の方法に従って調製されたｎ［スネア］プラスミドを含んでもよい。
【０１３５】
デコイポリヌクレオチドは、デコイ配列の１より多いコピーを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、デコイ配列の複数コピーを含む多量体分子を含んでもよい。例えば１〜１０００コピーである。典型的には、２コピー以上、例えば、２〜１０００コピー、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００または９００コピーある。例えば、１０〜２００、１０〜１５０、２０〜１２０、２０〜１００、３０〜１００、３０〜８０、３０〜５０、３０〜４０コピーがあってもよい。例えば、デコイ配列の３０コピーがあってもよい。典型的には、デコイの複数コピー、例えば、デコイ配列の複数のダイレクトリピートがある。
【０１３６】
あるいは、デコイポリヌクレオチドは、１より多いデコイ配列またはデコイ配列の複数コピーも含んでもよい。
【０１３７】
デコイポリヌクレオチドは、デコイ配列に付加的な配列を含んでもよい。典型的には、付加的な配列は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの作用によるデコイ配列の分解に対する耐性増進をもたらす。デコイポリヌクレオチドは、二次構造の少なくとも１種のエレメントを含んでもよい。典型的には、この二次構造は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの作用によるデコイ配列の分解に対する耐性増進をもたらす。デコイポリヌクレオチドは、より高いヌクレアーゼ耐性を付与するために修飾塩基または糖を含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性を低減させるまたは阻害させるため、ポリヌクレオチドの末端に２’ＯＨヌクレオチドまたはアミンを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、直鎖オリゴヌクレオチドを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、環状二本鎖ＤＮＡ（例えば、いわゆるダンベル構造）を含んでもよい（Ａｈｎら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．」（２００３年）３１０：１０４８〜１０５３）。典型的には、ダンベルは、小さなステムループ構造により挟まれた（ｂｒａｃｋｅｔｅｄ）標的配列、または他の配列を組み込んだ二本鎖領域を有する。デコイポリヌクレオチドは、分子の一方のまたは各５’末端にコレステロール修飾を含んでもよい。
【０１３８】
デコイポリヌクレオチドは、１つ以上の上記の特徴を任意の適切な組み合わせで含んでもよい。
【０１３９】
デコイポリヌクレオチドは、本明細書に記載され、かつ／または同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載の方法によって同定された任意のデコイ配列を含んでもよく、記載のような付加的な配列を含んでもよい。
【０１４０】
上記と同様に、デコイポリヌクレオチドは、ｎ［スネア］プラスミドを含んでもよい。例えば、直鎖オリゴヌクレオチドと比較して、当該プラスミドは、細菌へ容易に導入されたり、正の選択により維持することができたり、エキソヌクレアーゼ分解の問題を回避するという利点を有する。
【０１４１】
デコイオリゴヌクレオチドのプラスミド性バージョンを作製する利点としては、製造コストの削減や、ヌクレアーゼによるインビボ分解に対する耐性の増加や、プラスミド濃度の維持（必要であれば自己複製および正の選択による）や、広い宿主域や、別個であるが適合性のあるｎ［スネア］プラスミドを用いて組み合わせまたはシス調節配列を試験する能力（相乗効果の試験をするため）が挙げられる。
【０１４２】
ｎ［スネア］プラスミドは、本方法においてデコイポリヌクレオチドとしての使用に適している。ｎ［スネア］プラスミドおよびライブラリーはまた、公知であるかまたは推定上のシス調節配列の、可能性のあるデコイ機能を試験するために、または新規なシス調節配列（デコイ配列として働く可能性のある）についてスクリーニングするために適している。
【０１４３】
ｎ［スネア］プラスミドの使用の原理を図３に示す。当該プラスミドは「スネア」配列（図中では複数のコピーで示される）を含む。「スネア」が細胞のシス調節配列と転写因子への結合をめぐって競合する（すなわちデコイ機能を有する）転写因子結合部位を含む場合は、細胞へのｎ［スネア］プラスミドの導入は、転写因子を細胞のシス調節配列からスネア上へとタイトレーションすることになる。これは、そのシス調節配列によってまたは細胞の表現型の変更によって細胞中で発現が調節される１個のまたは複数個の遺伝子の発現の変化として検出することができる。
【０１４４】
一般に、ｎ［スネア］プラスミドは、プラスミドベクターおよびインサート配列（スネアを含むインサート）を含む。プラスミド中にスネア配列を組み込むことは、当技術分野におけるデコイ分解の問題に対処し、細胞中でのデコイ（および遺伝子発現に対する影響）の安定した維持を可能にする。
【０１４５】
インサート配列は、モノマー配列（スネアを含む）の１コピー以上を含む。したがって、インサートは（例えば）１〜２００のモノマー配列を含んでもよい。典型的には、２コピー以上、例えば、２〜２００コピー、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または１９０コピーが存在する。例えば、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、１０〜１５０、１０〜５０、５〜５０、５〜４０、１０〜４０、５〜３０コピーが存在し得る。例えば、モノマー配列が３０コピー存在してもよい。プラスミドは、典型的にはモノマーのホモポリマーを含む。典型的には、上記コピーはモノマーの複数コピーであり、例えばモノマー配列の複数のダイレクトリピートである。モノマーの（したがって、スネアの）複数コピーの提供は、デコイのタイトレーション力を増加させる。
【０１４６】
モノマー配列はスネア配列を含む。
【０１４７】
典型的には、スネア中の転写因子結合部位は、遺伝子（例えば、スネアまたはスネアプラスミド中の）へ機能的に結合されていない。その意味で、結合部位はその同族の１個のまたは複数個の遺伝子から隔離されている。スネア中の結合部位は、その同族プロモーター中の他のエレメントからも隔離されていてもよい。１つの例では、モノマー配列は遺伝子を含まない。
【０１４８】
モノマーは、スネアに加えてさらなる配列を含んでもよい。しばしば、かかるさらなる配列は、スネアおよび／またはプラスミドインサートを産生するために使用される方法に由来する。例えば、モノマーは、「カスタム」スネアが本明細書における方法に従ってカスタムｎ［スネア］ライブラリーのために産生される場合に典型的に生じるアダプター配列などのアダプター配列を含んでもよい。アダプター配列は、例えば、１種以上の制限酵素のための認識部位および／または切断部位を含んでもよい。
【０１４９】
モノマーは、プライマー（例えば、モノマーの産生または複数のモノマーを含むインサートの産生において使用されるプライマー）の結合部位を提供するヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１５０】
例えば、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載のローリングサークル増幅方法を使用してプラスミドインサートが調製されると、モノマーは典型的にはローリングサークル複製において使用されるプライマー（例えば、Ｔ７プライマー）の結合部位に対応するセグメントを含む。
【０１５１】
ランダム化スネア配列を含むモノマーは、典型的には、定常配列領域もまた含む。例えば、ヌクレオチドｎ個のランダム化スネア配列に、定常配列領域が隣接してもよい。あるいは、定常配列の中央コアに、ランダム化ヌクレオチド配列領域が隣接してもよい。
【０１５２】
モノマーの長さは、例えば、ヌクレオチド１０００個まで、例えば、ヌクレオチドが９００個、８００個、７００個、６００個、５００個、４００個、３００個、２００個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、または１０個までであり得る。典型的には、モノマーの長さは、例えば、ヌクレオチド１０個〜１００個、１０個〜５０個、２０個〜７５個、３０個〜６０個、３０個〜５０個、３５個〜５５個、例えば、３５〜５４個の範囲である。例えば、モノマーの長さは、ヌクレオチド３０個、４０個または５０個であってもよい。
【０１５３】
モノマーのスネア部分は典型的にはヌクレオチド１０個〜３０個、例えば、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個（例えば、１９個）など、ヌクレオチド１０個〜２５個、１０個〜２０個、１５個〜２０個のサイズにわたってもよい。
【０１５４】
アダプター配列は、例えば、ヌクレオチドを５個〜３０個、例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個など、ヌクレオチドを５個〜２５個、５個〜２０個、５個〜１５個または５個〜１０個含んでもよい。
【０１５５】
典型的には、ｎ［スネア］プラスミド中のインサートは、本明細書において記載のようなモノマーの１以上のコピーを含む。インサートがモノマーの多重リピートを含む場合、これらはタンデムリピートであってもよい。
【０１５６】
プラスミドベクター中のインサートは、例えば、約１．５ｋｂ、例えば、１〜２ｋｂ、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または１．８ｋｂを含んでもよい。しかしながら、適切な宿主細胞中におけるプラスミドの安定した維持および本方法における効率的な使用を可能にする任意の適切なインサートサイズを使用してもよい。
【０１５７】
典型的には、単一のプラスミド中のすべてのモノマーの配列は同一である。
【０１５８】
ｎ［スネア］プラスミドにおいて使用されるプラスミドベクターは、原核生物宿主または真核生物宿主における使用に適する場合がある。例えば、ベクターは、細菌宿主、例えば、放線菌宿主などの原核生物宿主において使用され得る。例えば、プラスミドベクターは、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）株または大腸菌株、例えばストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、例えば、Ａ３（２）（またはＭ１４５株またはＭ６００株）、大腸菌、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・シンナモネオウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｏｕｓ）の１種以上における使用に適する場合がある。適切な宿主は本明細書においてさらに記載されている。
【０１５９】
典型的には、ベクターは広い宿主域および／またはシャトルベクターであり、したがって、１種より多い宿主において維持および増殖させることができる。プラスミドは接合性プラスミドであってもよい。これは接合によって１つの細胞からもう一つの細胞への容易な伝播を可能にする。
【０１６０】
好ましくは、プラスミドは自己複製型である。典型的には、プラスミドは高コピー数プラスミドである。例えば、プラスミドは、例えば細胞１個当たり２０〜１００コピー、例えば細胞１個当たり２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５または１００コピーで維持されていてもよい。高コピー数は、スネア中のデコイ配列のタイトレーション力を増加させる。
【０１６１】
典型的には、ｎ［スネア］プラスミドは複製起点を含む。適切な起点は当技術分野において公知である。典型的には、プラスミドはさらに１種以上の検出可能なマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性をコードする１種以上の遺伝子（例えば、アプラマイシン耐性をコードするａａｃ遺伝子）を含む。マーカー遺伝子の発現によって、宿主細胞中のプラスミドの維持に対するスクリーニングが可能になる。
【０１６２】
適切なプラスミドベクターの例としては、ｐＩＪ８６が挙げられる。適切なベクターは当技術分野において公知である。
【０１６３】
スネアは、ゲノムまたはゲノムフラグメントに由来するかまたはそれらから単離された配列を含んでもよい。ゲノムフラグメントは、対象となる特定の機能または表現型をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を含んでもよい。スネアは、例えば、このような遺伝子のプロモーター領域または周囲の配列、例えば、プロモーターよりも遺伝子からの距離が遠い配列、に由来するかまたはそれらから単離された配列を含んでもよい。本明細書に記載のように、スネアは、このような配列と転写因子結合をめぐって競合する配列を含んでもよい。このようなスネアの調製方法は、本明細書や同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されている。
【０１６４】
デコイポリヌクレオチドは、任意の適切な方法により調製され得る。
【０１６５】
例えば、ダンベルは、直鎖オリゴヌクレオチドとして調製され、Ｔ４リガーゼでライゲーションされてもよい。あるいは、実施例１に記載のように、ダンベルデコイは、適切なプライマーを使用してＰＣＲにより調製されてもよい。各プライマーは、一般に、ダンベル構造のステムループを形成する部分を含む。そのようなプライマーの例は、実施例１に示されている。典型的には、プライマーを使用するＰＣＲ増幅の後、増幅産物の制限消化およびライゲーションを行い、閉環ダンベルを形成させる。
【０１６６】
あるいは、ダンベルは、実施例１に記載のように、プラスミドの制限消化により調製することができる。消化の後、ライゲーションを行い、閉環ダンベル構造が形成される。
【０１６７】
ｎ［スネア］プラスミドおよびｎ［スネア］プラスミドライブラリーの調製方法は、本明細書や同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されている。
【０１６８】
本方法は、細胞中へデコイ配列を２つ以上導入することを含んでもよい。例えば、異なった株（例えば、異なった臨床株）におけるレギュレーターの結合のための変異配列を含むデコイ配列のカクテルを使用してもよい。デコイ配列は、臨床において上記異なった株が発生するのと同じ比率でカクテル中に存在していてもよい。別の例では、１つより多いレギュレーターが標的となってもよい。
【０１６９】
１つの態様では、本明細書に記載の方法は、インビトロ法を含む。
【０１７０】
本明細書で言及される宿主細胞は、デコイ分子を使用して遺伝子発現（および表現型）を変化させることが所望される宿主細胞、たとえば、病原菌であってもよい。
【０１７１】
典型的には、上記方法が細胞表現型を変化させるために使用される場合、宿主細胞はデコイの非存在下では当該表現型を示す。医学的または治療的に関連のある表現型を変化させる（例えば、抗生物質感受性を増加させる）ためのデコイは、一連の細胞においてスクリーニングされてもよい。例えば、デコイは、表現型のバクテリアモデル（例えば、抗生物質耐性モデル）においてまず試験され、次いで、例えば、病原体または臨床分離株においてさらに検証されてもよい。デコイは、動物モデル、例えば、マウスモデルにおいてさらに検証されてもよい。
【０１７２】
デコイがプラスミドである場合、典型的には、宿主細胞はプラスミドベクターと適合性があり、かつ／または当該プラスミドが安定して維持および複製できる宿主細胞である。宿主細胞はまた、典型的には、プラスミド中の任意の検出可能な標識遺伝子と適合性がある。
【０１７３】
一般に、宿主細胞は、１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した、対象となるシス調節配列、すなわちスクリーニングされるシス調節配列または宿主細胞に導入されたデコイ配列が競合することが意図されるシス調節配列、を含む。１個のまたは複数個の遺伝子の発現の修飾は、直接的または間接的に（例えば、表現型の変化により）検出することができる。
【０１７４】
典型的には、細胞は、遺伝子に機能的に結合したシス調節配列を含むプロモーターを含む。「機能的に結合した」とは、遺伝子の発現を調節するようにシス調節配列および／またはプロモーターが機能することができる（適切な条件、例えば、必要な転写因子の存在下で）ような様式で、当該シス調節配列および／またはプロモーターが遺伝子に結合されていることを意味する。したがって、同族転写因子が結合すると、シス調節配列は上記１個のまたは複数個の遺伝子の発現を調節する（抑制または活性化する）ように機能する。
【０１７５】
細胞におけるシス調節配列の機能は、結合した遺伝子の発現についてモニタリングすることによって決定することができる。これは、遺伝子の発現について直接モニタリングすることによって、または当該遺伝子の発現に関連する特定の表現型の発現についてモニタリングすることによって行うことができる。例えば、機能のスクリーニングは、１種以上の抗生物質に対する耐性についてスクリーニングすること、ストレス応答についてスクリーニングすること、ビルレンス因子の発現についてスクリーニングすること、または必須遺伝子の発現についてスクリーニングすることを含んでもよい。スクリーニング方法は、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されている。
【０１７６】
宿主細胞は、その未変性の（同族）遺伝子に機能的に結合した（すなわち、配列（またはプロモーター）が天然で発生する際に発現を調節する１個のまたは複数個の遺伝子に結合された）シス調節配列（例えば、当該配列を含むプロモーター）を含んでもよい。シス調節配列および調節された遺伝子は、細胞に内因性（例えば、抗生物質耐性病原菌に本来備わっている耐性機構をコードする遺伝子）であってもよい。
【０１７７】
適切な宿主細胞は当技術分野において公知であり、本明細書の実施例において記載されている。
【０１７８】
本方法は、原核生物全般における使用に適している。特に、本方法は、病原、とりわけ病原菌（例えば、ヒトに影響を与える病原菌）で使用され得る。このような菌としては、以下の属のものが挙げられる（グラム染色試験の結果にしたがって記載する）。
【０１７９】
グラム陰性：アシネトバクター、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、レジオネラ、レプトスピラ、ナイセリア、プロテオバクテリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、シゲラ、トレポネーマ、ビブリオ、エルシニア。
【０１８０】
グラム陽性：バチルス、クロストリジウム、コリネバクテリア、エンテロコッカス、リステリア、ミコバクテリア、スタヒロコッカス、ストレプトコッカス。
【０１８１】
染色されなかったもの：クラミジア、マイコプラズマ。
【０１８２】
グラム陰性病原性種およびそれらが原因となる疾患の例としては次のものが挙げられる。Ａ．バウマンニ（Ａ．  ｂａｒｕｍａｎｎｉｉ）（肺炎、菌血）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）（ブルセラ病）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（急性腸炎）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（敗血症および肺炎）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（インフルエンザ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）（消化性潰瘍）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ）（レジオネラ症）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（淋病）、アシネトバクターｓｐｐ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）（院内感染）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（敗血症）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）（リケッツ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（腸チフス）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓ．  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（赤痢）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（コレラ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（疫病）。
【０１８３】
グラム陽性病原性種およびそれらが原因となる疾患の例としては次のものが挙げられる。バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽菌）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（偽膜性大腸炎）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（院内感染）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（リステリア病）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（敗血症）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎）。
【０１８４】
下記の属（上記の種を含む）の細菌には、本方法が特に適している。エシェリキア、ヘリコバクター、クレブシエラ、ナイセリア、プロテオバクター、シュードモナス、サルモネラ、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、スタヒロコッカス、シゲラ。
【０１８５】
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のデコイポリヌクレオチド（デコイ分子）を含む１個のまたは複数個の宿主細胞に関する（例えば、本明細書中の任意の方法により当該細胞に導入されたもの）。特に、本発明は、プラスミド／デコイ分子がない細胞と比較して、デコイポリヌクレオチドの存在によって、例えば、抗生物質に対する感受性の増加、ビルレンスの低減、適応反応の低下という変化した遺伝子発現および／または表現型を示すそのような宿主細胞に関する。例えば、本発明は、本明細書に記載のデコイポリヌクレオチドを使用して、生存能力を低下させた病原菌または臨床分離株に関する。
【０１８６】
デコイポリヌクレオチドは、任意の適切な手段により宿主細胞に導入され得る。例えば、形質転換、形質移入、接合が挙げられる。例えば、ポリヌクレオチドが接合性プラスミドを含む場合は、このポリヌクレオチドは接合により導入されてもよい。デコイポリヌクレオチド（例えば、環状ダンベル構造）は、形質移入により細胞に導入されてもよい。細胞は培養液中にあってもよく、デコイはこの液に加えられてもよい。あるいは、細胞は固体培地上で培養されてもよく、デコイは、デコイで飽和させた吸収紙ディスクから形質移入され、培地に上塗りされてもよい。典型的には、デコイポリヌクレオチドは培地に加えられ、細胞に取り込まれる。細胞が固体培地上で培養される場合は、デコイポリヌクレオチドはろ紙ディスクに加えられ、ディスクから細胞に取り込まれてもよい。形質移入を補助するため透過性緩衝液を使用してもよい。
【０１８７】
１つの態様では、デコイポリヌクレオチドの形質移入は、コレステロールの使用を含んでもよい。特に、当該方法では、一方または両方の５’末端にコレステロール修飾を有する直鎖デコイポリヌクレオチドを使用してもよい。この修飾は、細胞による取り込みを促進すると考えられている。
【０１８８】
デコイはさらに、例えば、５’末端において、蛍光染料（例えば、Ｃｙ５）などの検出可能な標識で標識化されていてもよい。これは、細胞における取り込みおよび保持のモニタリングを促進することになる。
【０１８９】
実施例１に記載のように、コレステロールデコイおよび／または検出可能な標識デコイは、コレステロールプライマーおよび／または検出可能な標識プライマーを使用して調製されてもよい。
【０１９０】
細胞へのデコイポリヌクレオチドの形質移入は、９個のＤ−アルギニンの直鎖に結合したコレステロール分子から成るＲ９−コレステロールの使用を含んでもよい（Ｋｉｍ  Ｗ．Ｊ．ら、「Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ」（２００６年）１４：３４３〜３５０）。
【０１９１】
一般に、細胞におけるデコイポリヌクレオチドまたはプラスミドライブラリーの取り込みおよび／または保持がモニタリングされる。例えば、プラスミドデコイは、プラスミドの存在について正の選択を可能にしプラスミド増殖のモニタリングを可能にする検出可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする）を含んでもよい。デコイポリヌクレオチドの存在もｑｒｔ−ＰＣＲによりモニタリングすることができる。
【０１９２】
一般に、デコイ配列は、転写因子の結合をめぐって細胞の転写因子結合部位と競合する転写因子の結合部位を含む。細胞の部位から転写因子をタイトレーションすることにより、デコイは、細胞中の結合部位に機能的に結合した上記１個のまたは複数個の遺伝子の発現を破壊する。
【０１９３】
デコイ配列は、転写因子の、未変性の細胞結合部位の配列を含んでもよい。未変性の配列は当技術分野において入手可能であり、内因性の結合配列の例は、特定のレギュレーターに関しては本明細書に記載している。
【０１９４】
デコイ配列は、所与のレギュレーターのコンセンサス結合部位を含んでもよい。このようなコンセンサス部位もまた、当技術分野において入手可能であり得、いくつかの特定のレギュレーターに関しては本明細書に例示している。
【０１９５】
あるいは、デコイ配列は、デコイ機能を保持する、未変性またはコンセンサス結合配列の変異体を含んでもよい。
【０１９６】
変異体は、例えば、親配列におけるヌクレオチドを１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上変化させることにより調製し得る。例えば、フットプリント実験は、特定のヌクレオチドが転写因子結合にそれほど重大ではなく変化させてもよいということを示す場合がある。
【０１９７】
適切な宿主細胞へデコイ配列を含むデコイポリヌクレオチドを導入することによって、推定上のデコイ配列を、所与の転写因子結合部位と競合する能力に関して試験することができる。宿主細胞は、例えば、表現型の変化についてスクリーニングすることによって、直接的または間接的に発現を測定することができる１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した標的転写因子結合部位を含む。試験配列のデコイ機能は、遺伝子の発現の変化または表現型の変化についてスクリーニングすることにより測定することができる。
【０１９８】
本明細書に記載のいずれのデコイポリヌクレオチドを使用してもよい。本明細書に記載のいずれの宿主細胞を使用してもよい。
【０１９９】
例えば、試験配列を、まず、適切なレポーター細胞へ導入し、レポーター遺伝子の発現をモニタリングして、デコイ機能を評価してもよい。ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載の「生死」リポーター細胞を用いた、一般的なレポーターをベースとしたアッセイ系を使用してもよい。正常な状況下で各レポーターは細胞死を引き起こし、細胞が増殖できるのはデコイが転写因子をタイトレーションすることによって救助（ｒｅｌｉｅｖｅ）する場合のみであるので、この手法により、スコアリング可能な表現型を必要とするという問題が解決される。従って、両方のレポーターについての選択は細胞生存に依存し、これはスクリーニングプロセスを大幅に促進させる。当該系の他の特色は、迅速、包括的、またはハイスループットのスクリーニングを基盤として、このような生死スクリーニングを容易に自動化できるということである。天然のコンテキストにおいて容易にスコアリングできる表現型を有していないプロモーターを制御する調節配列を同定することもまた可能である。
【０２００】
それに代わり、またはそれに加えて、デコイ配列は、その同族の遺伝子に機能的に結合した標的結合部位を含む宿主細胞において試験されてもよく、これにより、当該遺伝子の発現を破壊する能力を測定することができる。デコイによって表現型を変化させることが意図される場合には、スクリーニングに用いられる宿主細胞は、特定の表現型を示す。
【０２０１】
例えば、本明細書に記載のレギュレーターを標的とするデコイ配列は、抗生物質に対する宿主細胞の感受性の増加についてスクリーニングすることにより試験されてもよい。本明細書に記載のように抗生物質が選択されてもよい。
【０２０２】
場合によっては、デコイ配列は、標的レギュレーターに対して適切な別の表現型についてスクリーニングすることにより試験されてもよい。例えば、ストレス応答のレギュレーターを標的とするデコイは、低下したストレス応答（生理的ショックに対する耐性により測定される）を検知することにより評価することができる。ビルレンス因子のレギュレーターを標的とするデコイは、低下したビルレンスプログラムを測定することにより評価することができる。後者の例は、凍結バイアルからの再懸濁後の生存能力の低下、あるいは特定の遺伝子の下方制御（ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定される）であり得る。
【０２０３】
例えば、脂肪酸合成にとって不可欠な遺伝子の調節を標的とするＦａｂＢデコイは、適切な株、例えば、ルリア・ベルターニＬＢ培地（１％［ｗ／ｖ］バクト・トリプトン、０．５％［ｗ／ｖ］酵母エキス、１％［ｗ／ｖ］ＮａＣｌ）中で増殖させた、例えば、大腸菌に対して、脂肪酸合成の過程に対して作用する抗生物質（例えば、セルレニン）の存在下で、試験されてもよい。例えば、セルレニンの濃度が１０μｇ／ｍｌの場合、未処理の細菌は正常に成長し、著しくより緩慢にそしてより低最終密度にまで増殖するデコイ処理された細菌に対するコンパレーターとして働く。
【０２０４】
例えば、ストレス応答は、ストレス条件（例えば、アルカリ条件）下のＬＢ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌などの適切な菌株で誘導され得る。例えば、ＫＯＨを３０ｍＭ含むＬＢ培地を使用してもよい。未処理の細菌は、アルカリ条件によるストレス応答の誘発によって、この培地中でよく増殖するが、ストレスに対する制御応答の大部分であるｓｉｇＢの調節を標的とするＳＡ＿ｓｉｇＢデコイで処理した細菌の増殖は少ない。
【０２０５】
場合によっては、関連性のある１個のまたは複数個の遺伝子の発現についてのスクリーニングは、適切な培養条件下での宿主細胞の生存能力を測定することを含む。例えば、評価されている発現型が抗生物質耐性である場合、スクリーニングは、抗生物質の存在下において細胞を培養し、細胞生存能力があるかどうかを測定することを含んでもよい。「生死」レポーター宿主細胞を含むスクリーニングでは、レポーター遺伝子（対象となるシス調節配列に機能的に結合された遺伝子）の発現が宿主細胞生存能力について測定される条件下で細胞を培養すること、および生存細胞を単離することを含む。
【０２０６】
例えば、測定されている細胞表現型が細胞の生存能力であるならば、本方法は、本明細書で記載のように液体培地中での宿主細胞の培養を含んでもよい。これは、残存する少数の細胞のみを分析するだけでよいという利点がある。
【０２０７】
本明細書に記載のｎ［スネア］プラスミドは、下記工程を含む方法により調製されてもよい。
・モノマー配列の１より多いコピーを含むポリヌクレオチドを提供すること、および
・適切なプラスミドベクターへポリヌクレオチドをクローニングすること。
【０２０８】
モノマーの組成は、ｎ［スネア］プラスミドに関して本明細書において記載したとおりである。適切なプラスミドベクターについても記載している。
【０２０９】
モノマー配列の１より多いコピーを含むポリヌクレオチドは、下記工程を含む方法により提供されてもよい。
（１）（ｉ）対象となる配列と（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位とを含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること（ここで上記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）、ならびに
（２）鋳型として上記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと。これによってモノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドが提供される。
【０２１０】
上記方法の工程（１）は、ＰＣＲによってローリングサークル増幅産物を増幅し、必要とされるサイズのポリヌクレオチド断片（例えば、モノマー配列のリピートを３０〜５０個含む断片）を単離することをさらに含んでもよい。これは、例えばＰＡＧＥ解析によって行うことができる。
【０２１１】
環状オリゴヌクレオチドは、下記工程を含む方法により調製してもよい：
・対象となる試験配列（ｉ）と、ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（ｉｉ）とを含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、
・典型的にはユニバーサル連結オリゴヌクレオチドの存在下において、例えばＴａｑリガーゼを使用して、上記オリゴヌクレオチドを環状にすること、
・任意に、エキソヌクレアーゼにより残存する直鎖ＤＮＡを消化すること、および
・例えばＰＡＧＥを用いて、単量体環状オリゴヌクレオチドを回収すること。
【０２１２】
ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーは当技術分野において公知である。例えば、Ｔ７プライマーを使用してもよい。
【０２１３】
ローリングサークル増幅を行う方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＢｓｔＩポリメラーゼを使用してもよい。
【０２１４】
１つの例では、ローリングサークル増幅産物のＰＣＲ増幅は、ローリングサークル増幅に使用した同じプライマー（例えば、Ｔ７プライマー）を使用して行われる。
【０２１５】
一般に、モノマーにおける配列（ｉ）は、本明細書において記載のようなスネア配列を含む。
【０２１６】
本明細書に記載のように、スネア配列は、ゲノムＤＮＡから（例えば、全ゲノムから）またはゲノム断片から単離してもよい。いったん単離されたら、スネア配列は、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載の方法によってｎ［スネア］プラスミドを形成するために使用されてもよい。
【０２１７】
ゲノムまたはゲノム断片からのスネア配列の調製のためのプロトコルは、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載されている。
【０２１８】
本明細書に記載のように、スネア配列はランダム化ヌクレオチド配列を含んでもよい。典型的には、スネアは、長さが「ｎ」のヌクレオチドのランダム化（または可変）ヌクレオチド配列を含む。一般に、ｎは、ヌクレオチド５個〜５０個、例えば１０個〜５０個、例えば２０個〜４０個、例えば２５個〜３５個、例えば６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個にわたってもよい。
【０２１９】
ランダム化配列（および、任意に、記載のような定常配列）を含むオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の方法を用いて合成してもよい。
【０２２０】
ヌクレオチドバイアスを、オリゴヌクレオチドのランダム化（または可変）領域中に導入してもよい。例えば、適切であればＧＣバイアスを導入してもよい。
【０２２１】
上記方法のモノマーは、このように調製されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。次いで、ｎ［スネア］プラスミドが調製されてもよい。
【０２２２】
記載のように、本発明の１つの態様は、抗生物質に対する原核生物の感受性を増加させることである。例えば、これは、細胞の内因性耐性機構または細胞の適応応答を標的とすることによるものであってもよく、抗生物質により誘導されるストレス状態における細胞の生存能力の低下を意味する。
【０２２３】
１つの態様では、本方法は、抗生物質全般の効果を高めるのに適している（ＡｌｅｋｓｈｕｎおよびＬｅｖｙ、「Ｃｅｌｌ」（２００７年）１２８：１０３７〜１０５０）。これは、静菌性抗生物質および殺菌性抗生物質の両方を包含する。例としては、アミノグリコシド（カナマイシンなど）、カルバペネム（メロペネムなど）、セファロスポリン（セフェピムなど）、糖ペプチド（バンコマイシンおよびダプトマイシンなど）、ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリンなど）、ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシシンＢなど）、キノリン（レバクインなど）、スルホンアミド（バクトリムなど）、テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）、ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、およびザイボックスなどとして公知の抗生物質のクラスが挙げられる。
【０２２４】
１つの態様では、細胞におけるストレス応答の抑制をもたらすかまたは細胞がストレスを受ける方法は、殺菌性抗生物質の効果を強化するのに特に適している（Ｋｏｈａｎｓｋｉら、「Ｃｅｌｌ」（２００７年）１３０：７９７〜８１０）。
【０２２５】
殺菌性抗生物質としては、下記のものが挙げることができる。
【０２２６】
β−ラクタム系
（ａ）ペニシリン
（ｂ）カルバペネム
（ｃ）モノバクタム（Ｍｏｎｂａｃｔａｍｓ）
（ｄ）セファロスポリン
第一世代：セファセトリル（Ｃｅｆａｃｅｔｒｉｌｅ）（セファセトリル（ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ））、セファドロキシル（Ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）（セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｙｌ）、デュリセフ（Ｄｕｒｉｃｅｆ））。セファレキシン（Ｃｅｆａｌｅｘｉｎ）（セフレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）、ケフレックス（Ｋｅｆｌｅｘ））、セファログリシン（Ｃｅｆａｌｏｇｌｙｃｉｎ）（セファログリシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｌｙｃｉｎ））、セファロニウム（Ｃｅｆａｌｏｎｉｕｍ）（セファロニウム（ｃｅｐｈａｌｏｎｉｕｍ））、セファロリジン（Ｃｅｆａｌｏｒｉｄｉｎｅ）（セファロラジン（ｃｅｐｈａｌｏｒａｄｉｎｅ））、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）（セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）、ケフリン（Ｋｅｆｌｉｎ））、セファピリン（Ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）（セファピリン（ｃｅｐｈａｐｉｒｉｎ）、セファドリル（Ｃｅｆａｄｒｙｌ））、セファトリジン（Ｃｅｆａｔｒｉｚｉｎｅ）、セファザフル（Ｃｅｆａｚａｆｌｕｒ）、セファゼドン（Ｃｅｆａｚｅｄｏｎｅ）、セファゾリン（Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）（セファゾリン（ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、アンセフ（Ａｎｃｅｆ）、ケフゾール（Ｋｅｆｚｏｌ））、セフラジン（Ｃｅｆｒａｄｉｎｅ）（セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）、ベロセフ（Ｖｅｌｏｓｅｆ））、セフロキサジン（Ｃｅｆｒｏｘａｄｉｎｅ）、セフテゾール（Ｃｅｆｔｅｚｏｌｅ）；
第二世代：セファクロル（Ｃｅｆａｃｌｏｒ）（セクラー（Ｃｅｃｌｏｒ）、ジスタクロル（Ｄｉｓｔａｃｌｏｒ）、ケフラール（Ｋｅｆｌｏｒ）、ラニクロル（Ｒａｎｉｃｌｏｒ））、セフォニシド（Ｃｅｆｏｎｉｃｉｄ）（モノシド（Ｍｏｎｏｃｉｄ））、セフプロジル（Ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）（セフプロキシル（ｃｅｆｐｒｏｘｉｌ）、セフジル（Ｃｅｆｚｉｌ））、セフロキシム（Ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ）（ジンナット（Ｚｉｎｎａｔ）、ジナセフ（Ｚｉｎａｃｅｆ）、セフチン（Ｃｅｆｔｉｎ）、ビオフロクシム（Ｂｉｏｆｕｒｏｋｓｙｍ））、セフゾナム（Ｃｅｆｕｚｏｎａｍ）、セフメタゾール（Ｃｅｆｍｅｔａｚｏｌｅ）、セフォテタン（Ｃｅｆｏｔｅｔａｎ）、セフォキシチン（Ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ）、カルバセフェム（Ｃａｒｂａｃｅｐｈｅｍｓ）：ロラカルベフ（Ｌｏｒａｂｉｄ）、セファマイシン（Ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎｓ）：セフブペラゾン（ｃｅｆｂｕｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフメタゾール（ｃｅｆｍｅｔａｚｏｌｅ）（ゼファゾン（Ｚｅｆａｚｏｎｅ））、セフミノックス（ｃｅｆｍｉｎｏｘ）、セフォテタン（ｃｅｆｏｔｅｔａｎ）（セフォタン（Ｃｅｆｏｔａｎ））、セフォキシチン（ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ）（メフォクシン（Ｍｅｆｏｘｉｎ））
第三世代：セフカペン（Ｃｅｆｃａｐｅｎｅ）、セフダロキシム（Ｃｅｆｄａｌｏｘｉｍｅ）、セフジニル（Ｃｅｆｄｉｎｉｒ）（オムニセフ（Ｏｍｎｉｃｅｆ））、セフジトレン（Ｃｅｆｄｉｔｏｒｅｎ）、セフェタメト（Ｃｅｆｅｔａｍｅｔ）、セフィキシム（Ｃｅｆｉｘｉｍｅ）（スプラックス（Ｓｕｐｒａｘ））、セフメノキシム（Ｃｅｆｍｅｎｏｘｉｍｅ）、セフォジジム（Ｃｅｆｏｄｉｚｉｍｅ）、セフォタキシム（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）（クラフォラン（Ｃｌａｆｏｒａｎ））、セフピミゾール（Ｃｅｆｐｉｍｉｚｏｌｅ）、セフポドキシム（Ｃｅｆｐｏｄｏｘｉｍｅ）（バンティン（Ｖａｎｔｉｎ）、ＰＥＣＥＦ）、セフテラム（Ｃｅｆｔｅｒａｍ）、セフチブテン（Ｃｅｆｔｉｂｕｔｅｎ）（セダックス（Ｃｅｄａｘ））、セフチオフル（Ｃｅｆｔｉｏｆｕｒ）、セフチオレン（Ｃｅｆｔｉｏｌｅｎｅ）、セフチゾキシム（Ｃｅｆｔｉｚｏｘｉｍｅ）（セフィゾクス（Ｃｅｆｉｚｏｘ））、セフトリアキソン（Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）（ロセフィン（Ｒｏｃｅｐｈｉｎ））、セフォペラゾン（Ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ）（セフォビッド（Ｃｅｆｏｂｉｄ））、セフタジディム（Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）（フォータム（Ｆｏｒｔｕｍ）、フォルタズ（Ｆｏｒｔａｚ））、オキサセフェム（Ｏｘａｃｅｐｈｅｍｓ）：ラタモキセフ（ｌａｔａｍｏｘｅｆ）（モキサラクタム（ｍｏｘａｌａｃｔａｍ））
第４世代：セフクリジン（Ｃｅｆｃｌｉｄｉｎｅ）、セフェピム（Ｃｅｆｅｐｉｍｅ）（マキシピーム（Ｍａｘｉｐｉｍｅ））、セフルプレナム（Ｃｅｆｌｕｐｒｅｎａｍ）、セフォセリス（Ｃｅｆｏｓｅｌｉｓ）、セフォゾプラン（Ｃｅｆｏｚｏｐｒａｎ）、セフピロム（Ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ）、セフキノム（Ｃｅｆｑｕｉｎｏｍｅ）、オキサセフェム（Ｏｘａｃｅｐｈｅｍｓ）：フロモキセフ（ｆｌｏｍｏｘｅｆ）
まだ分類されていないもの：セフトビプロル（Ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ）、セファクロメジン（Ｃｅｆａｃｌｏｍｅｚｉｎｅ）、セファロラム（Ｃｅｆａｌｏｒａｍ）、セファパロル（Ｃｅｆａｐａｒｏｌｅ）、セフカネル（Ｃｅｆｃａｎｅｌ）、セフェドロロール（Ｃｅｆｅｄｒｏｌｏｒ）、セフェムピドン（Ｃｅｆｅｍｐｉｄｏｎｅ）、セフェトリゾール（Ｃｅｆｅｔｒｉｚｏｌｅ）、セフィビトリル（Ｃｅｆｉｖｉｔｒｉｌ）、セフマチレン（Ｃｅｆｍａｔｉｌｅｎ）、セフメピジウム（Ｃｅｆｍｅｐｉｄｉｕｍ）、セフォベシン（Ｃｅｆｏｖｅｃｉｎ）、セフォキサゾール（Ｃｅｆｏｘａｚｏｌｅ）、セフロチル（Ｃｅｆｒｏｔｉｌ）、セフスマイド（Ｃｅｆｓｕｍｉｄｅ）、セフタロリン（Ｃｅｆｔａｒｏｌｉｎｅ）、セフチオキシド（Ｃｅｆｔｉｏｘｉｄｅ）、セフラセチム（Ｃｅｆｕｒａｃｅｔｉｍｅ）
【０２２７】
アミノグリコシド系：
（ａ）アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）、パロモマイシン（ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ロドストレプトマイシン（ｒｈｏｄｏｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）；
（ｂ）アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、例えばドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）
【０２２８】
キノロン系：
（ａ）フルオロキノロン系；
第一世代；
第二世代；
第三世代；
第４世代。
【０２２９】
糖ペプチド系抗生物質：
（ａ）バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、テイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）、テラバンシン（ｔｅｌａｖａｎｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、デカプラニン（ｄｅｃａｐｌａｎｉｎ）、およびダルババシン（ｄａｌｂａｖａｎｃｉｎ）。
【０２３０】
ペプチド系抗生物質：
（ａ）ランチビオティック系；
デュラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）、ナイシン（ｎｉｓｉｎ）、エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）、アクタガルジン（ａｃｔａｇａｒｄｉｎｅ）、ミクロビスポリシン（ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒｉｃｉｎ）、およびメルサシジン（ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）；
（ｂ）リポペプチド系；
キュービシン（ｃｕｂｉｃｉｎ）。
【０２３１】
ストレプトグラミン系：
キヌプリスチン（Ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ）＋ダルホプリスチン（ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ）（シナシッド（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ）（登録商標））。
【０２３２】
しかしながら、本デコイおよび本方法はまた、マクロライド、ケトライド、テトラサイクリン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン）、オキサゾリジノン（リネゾリド）などの静菌性抗生物質の効果を増加させるために使用されてもよい。
【０２３３】
本方法が、治療で使用される場合、デコイポリヌクレオチドは、１種以上の抗生物質（一般的には、細胞がデコイによりさらに感受性を持つようになる抗生物質）と組み合わせて適用されてもよい。抗生物質は、上に記載のものから選択されてもよい。
【０２３４】
場合によっては、細菌種および標的とされる細菌感染に応じて、使用する抗生物質を選択することが適切である。
【０２３５】
例えば、結核菌は、イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、ピラジンイミド（ｐｙｒａｚｉｎｉｍｉｄｅ）を使用して現在治療される結核の病原体である。したがって、結核菌を標的とする方法では、これらの薬剤１種以上を、デコイポリヌクレオチドと共に使用し得る。同様に、黄色ブドウ球菌感染は、典型的には、ペニシリンで治療される。例えば、大腸菌または肺炎桿菌などの広域スペクトルβラクタマーゼ産生菌によるグラム陰性菌感染は、しばしばβ−ラクタムで治療される。
【０２３６】
場合によっては、デコイポリヌクレオチドの種類、およびそのデコイポリヌクレオチドが細胞において発現を破壊する遺伝子が、デコイと組み合わせて使用することができ細胞がより感受性を有するようになる抗生物質の種類を決定することになる（そして抗生物質自体も決定することになる）。例えば、本明細書に記載のＦａｂＢ  ＴＦＤは、脂肪酸合成に必要な必須酵素のレギュレーター（ＦａｄＲ）の結合部位を標的とする。したがって、当該デコイで処理された細胞は、脂肪酸合成を阻害する抗生物質にとりわけ感受性を持つようになる。特定の標的に関するさらなる情報は、本明細書に提供されている。
【０２３７】
本デコイは、例えば、本明細書に記載の任意の応答などの、細胞適応反応または生理反応を変化させるために使用されてもよい。デコイはまた、必須遺伝子の発現を変化させるために、したがって、当該遺伝子が必須である条件下での細胞の生存能力を変化させるために使用されてもよい。デコイはまた、細胞のビルレンスを変化させるために使用されてもよい。
【０２３８】
デコイはまた、例えば、細胞壁または細胞膜の組成を変化させることによって、抗生物質の取り込みを増加させるために使用されてもよい。
【０２３９】
デコイ、特に、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載のｎ［スネア］法により見出されたデコイはまた、未知の遺伝系の調節を標的としてもよい。これらの例では、デコイを用いた細菌の処理の結果、例えば、抗生物質感受性が測定され得るが、感受性の変化の基礎となる遺伝的メカニズムは、依然として不明である。
【０２４０】
場合によっては、ミコバクテリア中のＷｈｉＢ７およびそのホモログなどの公知の遺伝子の調節を標的とするデコイを用いた処理が、抗生物質に対する細胞の感受性を増加させるが、変化の基礎となる表現型のメカニズムは、依然として不明である。
【０２４１】
場合によっては、転写プロファイリングにより黄色ブドウ球菌における糖ペプチド耐性に関与すると同定されたものや、プロモーター内の共通のシス制御モチーフを有することが見出されたものの割合など、生物情報学的方法によって抗生物質感受性を測定する際に関連が示される遺伝子の調節を標的とするデコイは、抗生物質に対する細胞の感受性を増加させるが、変化の基礎となる表現型のメカニズムは、依然として不明である。
【０２４２】
本デコイポリヌクレオチドには、例えば、医学的または獣医学的な治療用途、ならびに、例えば、殺菌剤および洗浄剤における、例えば、非治療用途などの他の生体外用途を含む多くの用途がある。本デコイは、原核細胞の生存能力を低減させるか、細胞を殺すか、増殖を阻害するか、またはビルレンスを低減させる必要がある場合の方法に使用される。
【０２４３】
記載のように、本デコイポリヌクレオチドおよび本方法は、抗生物質に対する原核生物の感受性を増加させるために使用されてもよい。したがって、デコイは、１種以上の抗生物質（例えば、本明細書に記載の抗生物質）の効果を強化させるために使用されてもよい。これは、例えば、ヒトまたは動物における細菌感染を治療するかまたは予防するための医学的または獣医学的な使用、あるいは、例えば、洗浄組成物におけるインビトロ使用のためであってもよい。したがって、デコイは、殺菌性組成物または静菌性組成物において使用されてもよい。
【０２４４】
あるいは、上記デコイポリヌクレオチドおよび方法は、致死的な環境要因または抗菌剤に対する感受性を原核生物に与えるまたは増加させるために使用されてもよい。
【０２４５】
したがって、１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のデコイポリヌクレオチドを投与することを含む、被験体の細菌感染を治療する方法を提供する。被験体は、ヒトまたは動物であってもよい。本発明はまた、医療で使用するための、例えば、被験体の細菌感染の治療または予防で使用するための本明細書に記載のデコイポリヌクレオチドを提供し、細菌感染の治療用薬剤の製造のためのデコイの使用を提供する。
【０２４６】
デコイは、当該デコイが細胞に対してより感受性を持たせる抗生物質および／または他の抗菌剤と組み合わせて使用されてもよい。適切な抗生物質は本明細書に記載されている。抗生物質は、デコイと同時に、または前に、または後に投与されてもよい。抗生物質およびデコイは、同一のまたは別々の組成物中で投与されてもよい。従って、本発明は、本明細書で同定されるおよび／または記載されるデコイポリヌクレオチドを１種以上の抗生物質または他の抗菌治療剤（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）と組み合わせて被験者に投与する併用療法を包含する。
【０２４７】
１つの態様では、本発明は、デコイポリヌクレオチドと、生理学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物あるいは薬剤に関する。当該組成物はさらに、記載の１種以上の抗生物質または他の抗菌剤を含んでもよい。
【０２４８】
治療的な使用のための許容される担体または希釈剤は薬学の分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編．１９８５年）に記載されている。医薬担体、賦形剤、または希釈剤は、意図する投与経路および標準的な薬務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはこれらに加えて、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでもよい。
【０２４９】
様々な方法が、細菌感染部位へ本発明のデコイを送達するために使用されてもよい。インビボおよび／またはインビトロ送達方法としては、口腔（ｂｕｃｃｈａｌ）または経口（ｏｒａｌ）送達、静脈内送達、感染への直接注射または間接注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、または他の注射法）、局所適用、水溶液または培地溶液中での直接暴露、形質移入（例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ・デキストランに基づいたもの、および脂質仲介性のもの）、トランスジェニック発現（例えば、マイクロインジェクション、胚性幹細胞生成、またはレトロウイルス導入により送達されたデコイ発現系）、あるいは当技術分野において公知の任意の他の一般的に使用される核酸送達系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。投与は、適切な投与量の抗生物質と組み合わせもよく、当該抗生物質は、デコイと同時にまたは別々に投与される。
【０２５０】
下記実施例に記載のように、標的遺伝子の発現に対する予測可能な効果を示しかつ静菌効果を有するために必要とされるＴＦＤの数は、細胞１個当たりわずか分子約５０００個であり得る。実施例に記載の標準的なインビトロアッセイにおいて、１００００００個もの細菌細胞が、たった１ｎＭのＴＦＤで効率的に死滅されることが示され、これは、死滅させるためには０．００１％未満の形質移入効率で十分であることを示唆している。蛍光標識されたＴＦＤの取り込みを測定するために蛍光顕微鏡検査法を使用して形質移入を定量すると、視界内の黄色ブドウ球菌細胞はすべて形質移入されていることを示す。アンチセンス法などの、細菌感染に対処するための他の核酸ベース戦略と比較して、細胞を殺すために必要なこの分子数は、１００〜１０００分の１である。これは、アンチセンス法およびＴＦＤはいずれも遺伝子を阻害するように作用するが、ＴＦＤは転写を防止するように初期段階で作用する一方で、アンチセンス法は、最も一般的に繰り返し行われるものでは、立体的に転写産物（何千ものｍＲＮＡ分子）をブロックするということを部分的に反映している。第２に、ＴＦＤは、正に誘導される必須遺伝子を標的とするように設計されており、したがって生存のためにスイッチが入り、正に調節される必要がある（転写因子は自身の産生を駆動する）。インビトロでは、この後者の特徴は、遺伝子が誘導されない場合、転写因子のコピーは比較的少ない可能性があり、少数のＴＦＤが誘導をブロックすることができることを意味している。治療状況においては、微生物集団中の天然の変種や、既に誘導された遺伝子によって、細胞１個当たりにより多くの転写因子が存在する場合がある。この状況では、治療効果が見られるためにはより多くのＴＦＤが必要になることが予想され、１００倍（１００ｎＭまで）に用量を増加させるかまたは形質移入効率を向上（二桁に）させることが有益な効果が見られるためには十分であると推測される。
【０２５１】
いくつかのデコイは、細菌感染を治療または予防するための抗生物質を伴わないで使用されてもよい。例えば、本明細書に記載のデコイのいくつかは、細胞がストレス状況下で生存する能力、または必須遺伝子を発現する能力、または必須栄養素を得る能力を低下させることになる。いくつかのデコイは、例えば、ビルレンス因子の発現を予防することにより、細胞ビルレンスを無力化することになる。したがって、必須遺伝子を標的とするために使用されるデコイは、細菌が感染症となる前に細菌に対処するため、そのままで治療剤としてまたは予防薬の形態として、特定の病原菌の増殖を防止するために単独で使用されてもよい。同様に、ビルレンス決定遺伝子を標的とするデコイは、感染の蔓延を予防するために単独で使用されてもよい。別の例では、ピロリ菌に対して作用する本明細書に記載のデコイは、胃潰瘍／消化器系の癌の発生に対する独自の治療剤（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）を提供し得る。
【０２５２】
同様に、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の増殖を防止する作用を有するデコイは、歯の変色を治療するかまたは防止するために使用されてもよい。
【０２５３】
デコイが治療のために用いられる特定の感染症または関連症状は、一般に、当該デコイが標的とする病原性細胞に依存する。本方法を使用して標的とされ得る細菌感染および関連疾患は、特定の細菌に関連して、および図２に記載されている。
【０２５４】
本明細書に記載のデコイポリヌクレオチドはまた、細菌の増殖または感染力を止めるか防止するために、インビトロで、例えば、洗浄用のものなどの抗菌性製品中（例えば、殺菌剤）で使用することができる。デコイが抗生物質に対する感受性を増加させる場合、典型的には、抗菌性組成物はまた、１種以上の抗生物質および／または１種以上の抗菌剤を含む。１つの態様では、本発明は、そのような洗浄組成物に関する。
【０２５５】
本発明のデコイポリヌクレオチドはさらに、微生物の増殖を低減もしくは防止させるおよび／または微生物を死滅させるのに十分な時間および状況下で表面（仕事台や手など）に適用される製品中で使用されてもよく、これにより増殖が低減もしくは防止されるかまたは微生物が死滅される。例えば、１種以上のデコイが表面に噴霧されてもよい。このような噴霧用途は、例えば、食料の調理のための表面を準備するか、または患者に挿入する物を殺菌するために有用である。これは、デコイ製剤の噴霧が、表面または物の取り扱い作業を減らし、これにより汚染のリスクをさらに低減させるからである。手洗い剤および洗口剤用途もまた、本発明の範囲に包含される。
【０２５６】
上の状況では、デコイは、適切な水性剤形に処方されてもよい。この場合、当該処方物は、水性組成物を形成するために水を含んでもよい。水性組成物は、水性溶媒および有機溶媒ならびにそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【０２５７】
本発明はまた、細菌の増殖もしくはビルレンスを停止させるまたは阻害する際に組み合わせて使用される、本明細書に記載のデコイポリヌクレオチドと１種以上の抗生物質または他の抗菌剤とを含む抗菌用途向けキットに関する。典型的には、キットは使用説明書を含む。また、キットは、治療用途向け、例えば、細菌感染に対するもの、または非治療用途向け、例えば、洗浄または殺菌用であってもよい。
【０２５８】
本明細書に言及する文書はすべて、参照により本書に援用される。
【０２５９】
本発明を、次の図を参照して、非限定的な実施例で用いて詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】Ｐｏｏｌｅ  Ｊ．「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．」（２００５年）５６、２２〜２４）の表１を複写したものであり、それぞれ、非フルオロキノリン抗生物質およびフルオロキノリン抗生物質に対する、排出が仲介する耐性を記載している。右側欄の参考番号は当該文献中の番号を指す。
【図２】Ｐｏｏｌｅ  Ｊ．（同上）からの表２を複写したものであり、本方法によって標的とすることができるレギュレーターおよび調節配列の例を記載している。表はまた、当該レギュレーターまたは配列が存在する菌株の例および当該細菌に関連する適応症の例を示す。
【図３】遺伝子発現に影響を及ぼすためにどのようにｎ［スネア］プラスミドを使用することができるかを図で表したものである。遺伝子（Ａ）は、遺伝子のプロモーター内でシス調節配列（Ｃ）への転写抑制因子（Ｂ）の結合により転写的に不活性である。細胞へ導入されると、ｎ［スネア］プラスミドは、ゲノムプロモーターから転写因子Ｂをタイトレーションすることにより、標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことができ、下流遺伝子の転写的な抑制を解放する（Ｄ）。
【図４】配列番号３および４のプライマーならびに適切なベクター基質（実施例１．２）を使用して得られた増幅産物を示す。
【図５】抑制濃度未満のイソニアジド（ＩＺ）またはリファンピシン（ＲＦ）の存在下で培養された恥垢菌の増殖曲線を示し、実施例２のように、当該細菌は、ＷｈｉＢ７デコイ配列（＋）で処理されるか、または陰性対照配列（−）で処理された。
【図６】セルレニンの存在下における大腸菌の増殖曲線を示し、実施例３のように、当該細菌は、ＦａｂＢデコイ（ＦａｄＲ結合部位を標的とする）で処理されるか、または陰性対照配列で処理された。
【図７】エレクトロポレーションから生じるストレス条件下の黄色ブドウ球菌の増殖曲線を示し、当該細菌は、実施例４のように、未処理（第一曲線）またはＳｓａＡデコイ（第二曲線）もしくはＬｙｔＭデコイ（第三曲線）で処理された。
【図８】未播種の培地（ＢＨＩ陰性対照）の存在下で増殖させた黄色ブドウ球菌、スクランブルＴＦＤ配列を有する対照ＴＦＤで形質移入されＢＨＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌、ＳｓａＡ  ＴＦＤ（ＷａｌＲを含む）で形質移入されＢＨＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌、ｆｈｕＴＦＤ（鉄の取り込みをブロックするように設計）で形質移入されＢＨＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌、ｓｉｇＴＦＤで形質移入されＢＨＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌、無関係なＴＦＤで形質移入されＮＲＰＭＩ培地（ＢＨＩと比較して鉄分が制限された）中で増殖させた黄色ブドウ球菌、ならびにｆｈｕＴＦＤで形質移入されＮＲＰＭＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌の増殖曲線を示す。
【図９】Ｆｕｒ＿ＴＦＤｓが、鉄分が制限されていない培地中の黄色ブドウ球菌の増殖を撹乱させないことを示す。黄色ブドウ球菌は、Ｆｕｒ＿ＴＦＤを有するが形質移入試薬としてグラミシジンを有さない（ＴＦＤのみ；白丸）、あるいは６０ｎＭのグラミシジンを１ｎＭの対照ＴＦＤと組み合わせた（対照ＴＦＤ；白の三角形）、およびｆｈｕオペロンの発現を操作するように設計されたＦｕｒ＿ＴＦＤと組み合わせた（Ｆｕｒ＿ＴＦＤ；黒の正方形）ＢＨＩ培地中で増殖させた。結果は、３回繰り返した平均であり、エラーバーは標準誤差を示す。
【図１０】Ｆｕｒ＿ＴＦＤがｆｈｕ遺伝子の抑制を除去することを示す。（Ａ）グラミシジンが仲介する黄色ブドウ球菌の形質移入。細胞は、ＴＦＤ単独で、あるいはグラミシジンと対照ＴＦＤまたはＦｕｒ＿ＴＦＤとで処理され、採取され、洗浄され、溶解された。ゲノムの数に対するＴＦＤの平均数を測定するためｑＰＣＲが使用された。（Ｂ）Ｆｕｒ＿ＴＦＤの形質移入は、黄色ブドウ球菌中のｆｕｒ遺伝子を抑制する。並行試料が、ｑＰＣＲによりｆｈｕ発現の相対レベルを測定するために使用された。
【図１１】Ｆｕｒ＿ＴＦＤが鉄制限培地中の黄色ブドウ球菌の増殖を防ぐことを示す。黄色ブドウ球菌は、Ｆｕｒ＿ＴＦＤを有するが形質移入試薬としてグラミシジンを有さない（ＴＦＤのみ；白丸）、あるいは６０ｎＭのグラミシジンを１ｎＭの対照ＴＦＤと組み合わせた（対照ＴＦＤ；白の三角形）、およびＦｕｒ＿ＴＦＤと組み合わせた（Ｆｕｒ＿ＴＦＤ；黒の正方形）鉄制限培地（ＮＲＰＭＩ）中で増殖させた。結果は、３回繰り返した平均であり、エラーバーは標準誤差を示す。
【図１２】黄色ブドウ球菌Ｆｕｒ標的ＴＦＤ（ＳＡｆｈｕ）の潜在的な効果的宿主域を測定するための遺伝子分析の結果を示す。図の上側に示すＭＥＭＥ由来コンセンサス配列は、下側に記載の配列から作成された黄色ブドウ球菌Ｆｕｒ結合部位モチーフである。
【図１３】対照ＴＦＤ、または黄色ブドウ球菌代替シグマ因子ＳｉｇＢの−１０／−３５認識配列を含むＴＦＤ（ＳＡ３  ＴＦＤ）の存在下における３つのＭＲＳＡ株の増殖曲線を示す。
【図１４】「ダンベル」配置のＳｉｇＴＦＤが、臨床的に単離されたＭＲＳＡ菌株ＭＲＳＡ−５の増殖を抑制することを示す。
【図１５】ダンベル配置のＷａｌＲ  ＴＦＤが、ＥＭＲＳＡ１５の増殖を防止することを示す。ｆｈｕ  ＴＦＤは、コントロールとして使用される。
【図１６】黄色ブドウ球菌は、１ｎＭのＷａｌＲ＿ＴＦＤ／ＤＯＴＡＰ混合物を有するが形質移入試薬としてリソスタフィンを有さない（ＴＦＤのみ；白丸）、あるいは６２μｇ／ｍｌのグラミシジンを１ｎＭの対照ＴＦＤ（Ｓｃｒ＿ＴＦＤ；白の三角形）、およびＷａｌＫＲレギュロンの発現を操作するように設計されたＷａｌＲ＿ＴＦＤ（黒の正方形）と組み合わせたＢＨＩ培地中で増殖させた黄色ブドウ球菌を示す。
【図１７】耐性機構は検出されていない。（Ａ）図１に記載のインビトロ増殖実験の完了後のＥＭＲＳＡ−１６の全生菌数。（Ｂ）ＷａｌＲ＿ＴＦＤ処理により死滅しなかった細胞は、継代培養され、インビトロ増殖実験で試験された。ＷａｌＲ＿ＴＦＤは、継代培養された細胞を効果的に死滅させた。その後５回繰り返し、全生菌数を測定することにより決定されたようにＷａｌＲ＿ＴＦＤで処理された細胞には再増殖は見られなかった。（Ｃ）同様に、前もって４回のＴＦＤ選択に暴露された細菌の増殖曲線は、当該細菌が効率的に死滅するので耐性の兆候を示さない。細胞増殖は、３０時間にわたり培養物のＡ４２０を記録することにより測定され、細胞は、未処理（媒体のみ；白丸）であるかあるいは対照ＴＦＤと形質移入混合物とで（白の三角形）またはＷａｌＲ＿ＴＦＤと形質移入混合物とで（黒の四角形）処理された。
【図１８】微量希釈実験によると、ＥＭＲＳＡ−１６を死滅させるためにはＷａｌＲ＿ＴＦＤにわずかに接触させる必要があるのみであることを示す。細胞は、未処理（媒体のみ；白丸）であるかあるいは対照ＴＦＤと形質移入混合物とで（白の三角形）またはＷａｌＲ＿ＴＦＤと形質移入混合物とで（黒の四角形）３０分間培養した後、形質移入剤またはＴＦＤ複合体のどちらも使用しないで培地中へ１００倍に希釈した。ＷａｌＲ＿ＴＦＤで元々処理された細胞のみ増殖することができなかった。
【図１９】ＷａｌＲ＿ＴＦＤは、マウス敗血症モデルにおいてＥＭＲＳＡ−１６を死滅させる際にバンコマイシンと同程度効果的である。ＥＭＲＳＡ−１６の腎臓負担は、マウスを全身感染させ、対照ＴＦＤ（Ｓｃｒ＿ＴＦＤ、１ｎＭ  ＷａｌＲ＿ＴＦＤ、バンコマイシンおよびベヒクルのみ）で処理した後に測定した。
【図２０】ＦａｂＢ  ＴＦＤで大腸菌を形質移入すると、大腸菌が、脂肪酸合成を阻害する抗生物質（セルレニン）に対して感受性を持つことを示す。大腸菌ゲノム中に存在しない配列を有するＦＤであるので、ＷｈｉＢ７  ＴＦＤが陰性対照として使用される。
【図２１】肺炎桿菌のσ５４因子の認識配列を含むＴＦＤで形質移入すると、細菌増殖が遅延されることを示す。ＷｈｉＢ７  ＴＦＤが陰性対照として使用される。
【図２２】黄色ブドウ球菌および他の生物における厳密な一致を見出すためのＷａｌＲ結合部位として同定される配列を示す。コンセンサス配列が由来するヒットのサブセットが示されている。
【図２３】パネルＡは、黄色ブドウ球菌ＳｉｇＢ結合部位のＭＥＭＥ由来コンセンサス配列を示す。パネルＢは、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（代表的な属としてバチルス属、リステリア属、およびスタヒロコッカス属が挙げられるグラム陽性菌感染物）中のコンセンサス配列に対する一致が起こる例を記載している（Ｅ値＜１００）。
【図２４】パネルＡは、ＫＰ＿ＳｉｇＴＦＤがインビトロにて肺炎桿菌を死滅させることを示す。ＫＰ＿Ｓｉｇ配列を含むＴＦＤは、インビトロにて細胞増殖を防止した（ＫＰ＿Ｓｉｇ、黒い四角形）。未処理細胞（肺炎桿菌、白丸）およびスクランブル配列からなる対照ＴＦＤ（ＫＰ対照ＴＦＤ（白い三角形）という２種類の対照を使用した。パネルＢは、肺炎桿菌Ｓｉｇ結合部位のＭＥＭＥ由来コンセンサス配列を示す。
【０２６１】
（配列の簡単な説明）
配列番号１および２−実施例１．１のｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターからの標的配列の増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３および４−実施例１．２の、ダンベルデコイの産生におけるｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターからの標的配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号５−実施例２で用いたＷｈｉＢ７デコイ
配列番号６−実施例３で用いたＦａｂＢデコイ
配列番号７−実施例４で用いたＬｙｔＭデコイ
配列番号８−実施例４で用いたＳｓａＡデコイ
配列番号９−恥垢菌株ｍｃ２  １５５における未変性のＷｈｉＢ７結合部位
配列番号１０−大腸菌Ｋ１２における未変性のＦａｄＲ結合部位
配列番号１１−黄色ブドウ球菌におけるＹｙｃＦ／ＹｙｃＧの未変性の結合部位
配列番号１２−黄色ブドウ球菌におけるＹｙｃＦ／ＹｙｃＧの未変性の結合部位
配列番号１３−黄色ブドウ球菌におけるＳｉｇＢの未変性の結合部位
配列番号１４−肺炎桿菌  におけるＳｉｇＢの未変性の結合部位
配列番号１５−黄色ブドウ球菌におけるＦｕｒ結合のコンセンサス配列
配列番号１６−大腸菌におけるＦｕｒ結合のコンセンサス配列
配列番号１７−ピロリ菌におけるＦｕｒの未変性の結合配列
配列番号１８−クロストリジウム・ディフィシレ  におけるＴｃｄＲのコンセンサス結合部位
配列番号１９−緑膿菌におけるＶｆｒのコンセンサス結合部位
配列番号２０−緑膿菌におけるＶｆｒの未変性の結合部位
配列番号２１−緑膿菌におけるＶｆｒの未変性の結合部位
配列番号２２−肺炎桿菌におけるＮｔｒＣの未変性の結合部位
配列番号２３−ピロリ菌におけるＡｒｓＲの未変性の結合配列
配列番号２４−ピロリ菌におけるＡｒｓＲの未変性の結合配列
配列番号２５−黄色ブドウ球菌における糖ペプチド耐性コンセンサス配列
配列番号２６−黄色ブドウ球菌におけるＡｇｒ結合モチーフ
配列番号２７−黄色ブドウ球菌におけるＡｇｒ結合モチーフ
配列番号２８−ＳａｓｉｇＢ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号２９−ＳａｓｉｇＢ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のためのリバースプライマー配列
配列番号３０−ＳＡｆｈｕＴＦＤのＰＣＲ調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号３１−ＳＡｆｈｕ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のためのリバースプライマー配列
配列番号３２−ＳｓａＡ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のためのフォワードプライマー配列
配列番号３３−ＳｓａＡ  ＴＦＤのＰＣＲ調製のためのリバースプライマー配列
配列番号３４−制御配列
配列番号３５−制御配列
配列番号３６−１６ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマー配列
配列番号３７−１６ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー配列
配列番号３８−ｆｈｕ遺伝子のＰＣＲ定量のためのフォワードプライマー配列
配列番号３９−ｆｈｕ遺伝子のＰＣＲ定量のためのリバースプライマー配列
配列番号４０−リン酸化ＳｉｇダンベルＴＦＤオリゴヌクレオチド配列
配列番号４１−リン酸化ＳｉｇダンベルＴＦＤオリゴヌクレオチド配列
配列番号４２−Ｓｉｇ結合部位のスクランブル型を含むダンベルＴＦＤのためのリン酸化プライマー
配列番号４３−Ｓｉｇ結合部位のスクランブル型を含むダンベルＴＦＤのためのリン酸化プライマー
配列番号４４−ＷａｌＲの結合配列を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号４５−ＷａｌＲの結合配列を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号４６−ＷａｌＲ結合部位のスクランブル型を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号４７−ＷａｌＲ結合部位のスクランブル型を組み込んだリン酸化ダンベルオリゴヌクレオチド
配列番号４８−ＷａｌＲの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号４９−ＷａｌＲの結合部位を組み込んだリン酸化オリゴヌクレオチド
配列番号５０−ＦａｂＢプロモーターのフォワードプライマー
配列番号５１−ＦａｂＢプロモーターのリバースプライマー
配列番号５２−ＷｈｉＢ７  ＴＦＤのフォワードプライマー
配列番号５３−ＷｈｉＢ７  ＴＦＤのリバースプライマー
配列番号５４−肺炎桿菌のσ５４因子の認識配列を含むＴＦＤのフォワードプライマー
配列番号５５−肺炎桿菌のσ５４因子の認識配列を含むＴＦＤのリバースプライマー
配列番号５６−細胞透過性ペプチドの配列
配列番号５７−ＷａｌＲ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号５８−ＳｉｇＢ  ＴＦＤコンセンサス配列
配列番号５９−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤ配列
配列番号６０−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＦＤコンセンサス配列
【０２６２】
［実施例］
一般に、本明細書において言及される技術の多くは当技術分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、第三版、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌを参照してもよい。
【０２６３】
（実施例１）
１．１ストレプトリジンＯの存在下でのコレステロール標識ＴＦＤ
オリゴヌクレオチドプライマー（１つは５’コレステロール修飾を有しており、もう１つはその５’末端または他に類似の修飾（例えば、Ｃｙ５などの蛍光染料など、容易に転写因子デコイ（ＴＦＤ）の取り込みを測定することができるように）を有する）を使用して、ＴＦＤをＰＣＲにより調製する。ＴＦＤが前もってベクター（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ）へクローニングされている場合、プライマーは、挿入物に最も近接するベクター配列にアニーリングするように設計される、例えば：
配列番号１  Ｃｈｏｌ＿ＴＥｆ：５’コレステロール−ＴＥＧ−ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣ
配列番号２  Ｃｙ５＿ＴＥｒ−５’Ｃｙ５−ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧ
【０２６４】
ＴＦＤとして使用される配列がクローニングされていない場合、直接的に合成（十分に短い場合）およびアニーリングされてＴＦＤを形成させるか、あるいはＴＦＤ内でアニーリングするように設計されたプライマーを使用してゲノムＤＮＡから直接的に増幅される。
【０２６５】
ＰＣＲ産物はエタノール中で沈殿され、５００〜１０００ｎｇ／μｌの濃度でＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）において再懸濁される。典型的には、抗生物質感受性アッセイは、各ウェルが培養液を２００ｍｌ含む９６ウェルプレートを使用して行われる。例えば、エンテロコッカス・フェシウムの場合は、この培養液は、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）であり、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種される。
【０２６６】
１．２ＰＣＲによるダンベルの調製
ダンベルデコイは、標的因子の結合部位を含み、ステムループ構造が隣接する、二本鎖中心を特徴とする共有結合的に閉環した一本鎖ＤＮＡである。ステムループは、通常はデコイポリヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼの作用を阻止することによりデコイを安定化させる。それゆえ、ダンベルＴＦＤ（ＤＢ）は、その特徴的形状のためにそう呼ばれる。
【０２６７】
ＤＢは、１．１に記載のように、標的結合部位を含むｐＧＥＭＴＥａｓｙ由来プラスミドをテンプレートとして使用するＰＣＲにより調製される。増幅において使用されるプライマーは次のとおりである：
配列番号３  ＤＢＴＥｆ：５’Ｐ−ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＡＧＡＡＧＡＧＣ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ
配列番号４  ＤＢＴＥｒ−Ｐ−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＡ
【０２６８】
プライマーのステムループを形成することになる部分に下線を引いている。適切なベクターを用いた増幅は、図４に示すＤＮＡ産物を生じ、ここで転写因子に結合するＤＢの部分は「ＮＮＮ  ＮＮＮ」として示す。太字で示す配列は、ニッキング制限酵素（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）Ｎｔ．ＢｓｐＱ１の結合部位を表す。図４の後半部分では、Ｎｔ．ＢｓｐＱ１でＰＣＲ産物を消化した結果が示され、これは一本鎖領域としてステムループ構造を示し、これはステムループを形成することになり続いてＴ４  ＤＮＡリガーゼで処理されてライゲーションされることができ、共有結合的に閉じた環およびＤＢが形成される。
【０２６９】
１．３プラスミドの制限消化によるダンベルオリゴヌクレオチドの調製
あるいは、ダンベルは、適切なＰＣＲクローニングベクターへ図４に示す平滑末端化ＰＣＲ産物をクローニングすることにより作成することができ、同一性やプラスミドの調製が確認される。次いで、プラスミドは消化させることができ、挿入物が放出され、これはＮｔ．ＢｓｐＱ１でさらに消化されて図４の後半部分に示す断片を放出する。これは、ＤＮＡ分子を共有結合的に閉環させそしてＤＢを形成させるため、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで同様に処理することができる。
【０２７０】
この手法の利点としては、ダンベルが多量に必要な場合に、実用的にも経済的にもスケールアップしやすいことである。
【０２７１】
１．４  Ｒ９コレステロール剤を用いた形質移入
Ｒ９コレステロールは、真核細胞においてｓｉＲＮＡ（または他の核酸ベースの治療剤）分子などの形質移入を支援する特性に関して記載されている（米国特許出願番号第２００７−０２０７９６６号）。ここで、我々はＴＦＤを用いて様々な細菌を形質移入してＲ９コレステロー有用性を記載する。
【０２７２】
９個のＤ−アルギニン直鎖に結合したコレステロール分子から成るＲ９−コレステロールは過去に記載されたように合成した（Ｋｉｍ  Ｗ．Ｊ．ら、「Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．」（２００６年）１４−３４３〜３５０）。ＴＦＤは、５％グルコースを捕足したＴＥベース緩衝液においてＲ９−コレステロールの量を増やして混合した。この混合物を室温で１時間培養し、次いで、形質移入において直接使用あるいはアガロースゲル電気泳動により分析した。典型的には、ゲル中でＤＮＡとの複合体が動かない最少の量のＲ９−コレステロールを使用した（つまり、核酸バックボーンの電荷はポリアルギニンの結合により中和された）。コレステロール分子は、ＴＦＤが細菌細胞膜と会合し、そうして細胞に入ることを支援する。
【０２７３】
ＴＦＤ／Ｒ９−コレステロール接合体は、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの培養液に様々な濃度で混合された。例えば、エンテロコッカス・フェシウムの場合は、この培養液は、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）であり、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種される。
【０２７４】
（実施例２）
恥垢菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に抗生物質に対する感受性を与えるためのＷｈｉＢ７デコイ
ＷｈｉＢ７は、抗生物質に対する恥垢菌の感受性を決定することに関与することが示されている、恥垢菌中の遺伝子である。この遺伝子を機能的に欠如させることによって、この細菌が抗生物質に過敏になる（ＰＮＡＳ（２００５年）１０２：１２２００）。ＷｈｉＢ７は転写レギュレーターであると考えられており、このような遺伝子はいくつか文献に記載されている。ＷｈｉＢ７の近縁相同体は、結核の原因物質である病原体結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に存在する。
【０２７５】
実施例１．１に記載のようにＷｈｉＢ７デコイ配列を含有するデコイポリヌクレオチドを調製し、様々な濃度を使用して、培養液２０ｍＬ（ワイヤーバッフル（ｗｉｒｅ  ｂａｆｆｌｅ）付きの２００ｍＬ振盪フラスコ中）中で増殖させた恥垢菌に形質移入した。使用した培地は、９Ｈ１１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、１０％ＯＤＡＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抑制濃度未満の抗生物質イソニアジド（ＩＺ）もしくはリファンピシン（ＲＦ）を添加したものであった。このフラスコを振盪しながら３７℃で温置し、様々な間隔で試料を採取し、それらの吸収を測定した（細胞増殖をモニタリングするため）。フラスコをＷｈｉＢ７  ＴＦＤ（＋）１００ｎＭで処理するかまたは陰性対照ＴＦＤ（−）で処理した。ＷｈｉＢ７  ＴＦＤで処理したフラスコでは、細胞が両方の被験抗生物質に対して感受性を持つようになったが、対照ＴＦＤの場合は感受性を有するようにならなかったことが明らかであった（図５参照）。
【０２７６】
配列番号５−ＷｈｉＢ７  ＴＦＤ  ５’ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ３’
【０２７７】
（実施例３）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の必須遺伝子を下方制御するためのＦａｂＢデコイ
ＦａｂＢデコイは、脂肪酸合成の必須経路に関与する遺伝子（ｆａｂＡおよびｆａｂＢを含む）の発現を調節するＦａｄＲレギュレーターの結合部位を含有する。ｆａｄＲ遺伝子を機能的にノックアウトすると、その結果、脂肪酸合成に関する欠失があり、抗生物質セルレニン（脂肪酸合成を標的とする（「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ」（２００５年）１８３：５２９２））の存在下で増殖できない大腸菌株が得られることが明らかになっている。
【０２７８】
ＦａｂＢデコイは、配列：
配列番号６  ＦａｂＢ  ＴＦＤ  ５’ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ３’を含有した。
【０２７９】
実施例１．１に記載のように、このデコイを調製し、様々な濃度で使用し、１μｇ／ｍＬセルレニン（Ｓｉｇｍａ）を添加した富栄養培地（１Ｌ当たりトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、酵母抽出物１ｇ含み、０．２％グルコースおよび０．４％アセテート（最終濃度）を添加）２００μＬを含有する９６ウェルプレートのウェルに対して形質移入を行った。このプレートを振盪しながら３７℃で温置し、プレートリーダーを使用して（５９５ｎＭで）吸収読み取りを行った。データ点は全て３回測定してとった。細菌に対しては、ＴＦＤで処理せずに（未処理）、ＦａｂＢ  ＴＦＤ（ＦａｂＢ）により形質移入を行うか、または配列が大腸菌のゲノム中に存在しないＴＦＤからなる陰性対照（Ｖａｎ）により形質移入を行った。
【０２８０】
図６で明らかなように、未処理試料および陰性対照は両者とも、上記の培養液中で同様の速度で増殖したが、ＦａｂＢ  ＴＦＤで処理すると、細胞は殆ど増殖しなくなった。
【０２８１】
（実施例４）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）にストレス応答に対する感受性を与えるデコイ
エレクトロポレーションによってデコイポリヌクレオチドを黄色ブドウ球菌に形質移入した。標準的方法によって細菌細胞を調製した。簡潔に述べると、４２０ｍＭで吸収が０．３に到達することにより規定される初期対数期まで、ＬＢ培地中にて３７℃で細胞を増殖させた。この細胞を４℃に冷却し、低速遠心によって回収し、同程度の体積の滅菌氷冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで３回洗浄した。最後に、この細胞を１０％グリセロール中で元の体積の１０分の１で再懸濁した。エレクトロポレーションキュベット中で細胞５０μＬをＴＦＤ１μＬ（典型的には、ＤＮＡ１００ｎｇから１μｇ）と混合し、２．５ｋＥＶ、１００Ωおよび２５μＦの設定（３．８〜４．８ｍｓの範囲の時定数となる。）で、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒにおいて電気穿孔処理を行うことによって、エレクトロポレーションを行った。典型的には、エレクトロポレーション済み細胞５０μＬを使用して、３０ｍＭ  ＫＯＨ（ストレス応答を誘導するため）入りのＢＨＩ培地またはＬＢ培地１０ｍＬに接種した。９６ウェルプレートのウェルに細胞２００μＬを分注し、このプレートを穏やかに振盪させながら３７℃で温置し、吸収を測定することにより増殖をモニタリングした。増殖曲線のプロットから、擬似エレクトロポレーション（この場合は、ＤＮＡが形質移入されていない）を通じて得られたかまたは無関係の配列により形質移入を行った対照と比較して増殖速度が低下したことにおいて、特異的ＴＦＤの影響が明らかになった（図７）。次のデコイ配列は、ストレス条件下で黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することが可能であった。
【０２８２】
配列番号７：ＬｙｔＭ  ＴＦＤ  ５’ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＡ  ３’
配列番号８：ＳｓａＡ  ＴＦＤ  ５’ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ａ３’
【０２８３】
（実施例５）
Ｓｉｇ  ＴＦＤは黄色ブドウ球菌の増殖を阻害した
Ｓｉｇ＿ＴＦＤは、黄色ブドウ球菌ＳｉｇＢタンパク質の結合部位を含有していた。このタンパク質は、ストレス関連遺伝子の多くを調節する代替シグマ因子である（Ｗｉｇｎｅｓｈａｗｅｒａｊａｊ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２００８年）６８：５３８）。黄色ブドウ球菌細胞に対してこのＴＦＤにより形質移入を行い、９６ウェルプレートにおいて、限定培地中で細胞を増殖させることによって、ＴＦＤがこの細胞の増殖を阻害することは明白である。Ｆｈｕ  ＤＮＡは、鉄制限条件下で鉄の取り込みを制御するＦｕｒ転写因子の結合部位を含有する（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」（２００１年）１８３：４６８）。ＳｓａＡは、増殖速度に影響を与える１２種類の遺伝子を制御することが既に示されている、二成分レギュレーターＷａｌＲの結合部位を含有する（ＤｕｂｒａｃおよびＭｓａｄｅｋ、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００４年）１８６：１１７５）。
【０２８４】
５．１  ＰＣＲによるＴＦＤの調製
同時係属中の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３５３に記載のように、ＰＣＲによってＴＦＤを調製する。このＰＣＲ反応で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、５’末端が修飾されており、例えば、このうち１つは、５’コレステロール修飾を有する。使用されるその他の修飾には、ＴＦＤの取り込みを容易に測定することができるように、ビオチン、アミン、細胞浸透性ペプチド、蛍光色素（例えば、Ｃｙ５またはフルオレセインなど）が挙げられる。試験が検討されるその他の修飾としては、病原性細菌の膜に特有である脂質が挙げられる。したがって、ＰＣＲにより作製されるＴＦＤは、その５’末端が、ＴＦＤのインビボでの安定性を向上させるため、取り込み効率を向上させるため、蛍光による検出を可能にするため、に役立つ様々な分子によって修飾され得る。ＴＦＤが既にベクター（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ）にクローニングされている場合、挿入物に直接隣接するベクター配列とアニーリングするようにプライマーを設計し、例えば：
配列番号１−Ｃｈｏｌ＿ＴＥｆ：５’コレステロール−ＴＥＧ−ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣ  ３’
配列番号２−Ｃｙ５＿ＴＥｒ：５’Ｃｙ５−ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧ  ３’である。
【０２８５】
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿処理し、５００〜１０００ｎｇ／μＬの濃度になるようにＴＥ緩衝液中で再懸濁する。
【０２８６】
試験しようとする結合部位を含有する合成リン酸化オリゴヌクレオチド対を一緒にアニーリングさせることによって、ＴＦＤをクローニングする。オリゴヌクレオチドの各対は、３’末端にアデニンを含有するが、これは、５’チミン突出を有するｐＧＥＭ＿Ｔｅａｓｙベクターにクローニングし易くするため（ＰＣＲ産物のクローニングを促進するため）である。
【０２８７】
Ｓｉｇ  ＴＦＤに対して使用したプライマー配列は、
配列番号２８−ＳａｓｉｇＢ  ＦＯＲ：ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  Ｔ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  Ａ
配列番号２９−ＳＡＳｉｇＢ  ＲＥＶ：ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ  Ａである。
【０２８８】
Ｆｈｕ  ＴＦＤに対して使用したプライマー配列は、
配列番号３０−ＳＡｆｈｕ  ＦＯＲ：ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＡ
配列番号３１−ＳＡｆｈｕ  ＲＥＶ：ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＴＡである。
【０２８９】
ＳｓａＡ  ＴＦＤに対して使用したプライマー配列は、
配列番号３２−ＳｓａＡ  ＦＯＲ：ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ａ
配列番号３３−ＳｓａＡ  ＲＥＶ：ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  Ａである。
【０２９０】
５．２  ９６ウェルプレートでの増殖試験の実施
セクション５．１におけるように、コレステロール／Ｃｙ５で標識したデコイポリヌクレオチドを調製した。次いで、典型的には、ＴＦＤ１μｇをリポソーム形質移入試薬ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）０．３μＬと複合体形成させ、室温で１０分間温置した。６０ｎＭグラミシジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより。カタログ番号Ｇ５００２）を添加した、鉄制限培地ではないＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより）または同様にグラミシジンを添加した鉄欠乏培地（ＮＲＰＭＩ）からなる培養液２００μＬが各ウェルに入った９６ウェルプレートを用いて、細菌細胞の増殖におけるそれらの影響を明らかにするためのアッセイを行った。鉄欠乏に対する方法は他所で詳細に記載されている（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（２００４年）３０５：１６２６〜１６２８）。様々な濃度の、ＴＦＤと複合体化させたコレステロール／Ｃｙ５標識デコイ１μＬを各ウェルに添加し、温置中、間隔を置いて培養液の吸収を測定することによって、黄色ブドウ球菌の細菌増殖におけるそれらの影響をモニタリングした。プレートを振盪しながら３７℃で温置し、プレートリーダーを用いて吸収の読み取り（４５０ｎＭ）を行った。いくつかのデコイ：Ｓｉｇ、ｆｈｕおよびＳｓａＡを試験した。
【０２９１】
図８で見られるように、わずか１０ｎＭのＳｉｇ  ＴＦＤで処理することにより、ＢＨＩ培地中で増殖が阻止され、一方で同様の量のｆｈｕ  ＴＦＤは、この培地（非鉄制限である。）中での細菌増殖に影響がなかったことが明らかである。ＳｓａＡ  ＴＦＤ１０ｎＭにより、細菌増殖が測定可能な程度に遅延した。
【０２９２】
鉄制限培地を使用した場合、ｆｈｕ  ＴＦＤ１０ｎＭで増殖を抑制できることが判明したが、一方で、同様の量の対照ＴＦＤ（ＳｓａＡ）は、これらの条件下で細菌増殖に影響を及ぼさなかった。
【０２９３】
（実施例６）
ｆｈｕのＦｕｒ  ＴＦＤ調節発現および鉄制限培地中での黄色ブドウ球菌の増殖抑制
細菌の鉄取り込みの調節において中心的役割を果たすＦｕｒ転写因子（ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅおよびＰｒｏｃｔｏｒ（２００９年）「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．」７３：２３３〜２４８）に結合するようにＴＦＤを設計し、これは捕捉された鉄の移入を調節するｆｈｕオペロンを負の方向に制御する。鉄は、増殖に必須であり、電子伝達に必要とされ、多くの酵素的プロセスにおいて補因子として作用する。しかし、宿主において、鉄の存在量は限定されており、通常、トランスフェリンおよびラクトフェリンなどの宿主担体タンパク質へ組み込まれることにより、細菌が鉄を利用できなくなっている。これに応じて、黄色ブドウ球菌は、高親和性の鉄キレート剤であるシデロホアを合成し、これは、鉄に結合し、ＡＢＣ輸送体（ｆｈｕＣＢＧによりコードされるものなど）を使用して、鉄・シデロホア複合体を細菌細胞質に移入させる。過剰な鉄を移入すると、フェントン反応により遊離基が形成され、続いて細胞損傷が起こるので（ＷａｎｄｅｒｓｍａｎおよびＤｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ、「Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」（２００４年）５８：６１１〜６４７）、鉄取り込みは厳重に制御されねばならない。Ｆｕｒノックアウト株は、インビトロで、鉄制限培地中ではあまり増殖せず、動物モデルにおいてその病原性を喪失し（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ」（２００１年）１８３：４６８〜４７５）、これにより、治療標的としてのＦｕｒの可能性が明らかとなる。
【０２９４】
６．１  方法
６．１．１  細菌株および培養条件
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８ＮＡ培養物をＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）中で増殖させ、維持した。５０％グリセロールと初期対数期（Ａ６００で０．３のＯＤ）の培養物を同じ体積で混合することによって、凍結保存物を調製し、−８０℃で凍結した。ＢＨＩは、非鉄制限条件に対して使用される培地であり、鉄制限増殖条件の場合は、既に記載のように調製したＮＲＰＭＩ（Ｓｋａａｒら、２００４年）であった。
【０２９５】
６．１．２  ＴＦＤの調製
Ｆｕｒの結合部位（ＳＡＦｕｒ１、５’Ｐ−ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＡ−３’（配列番号３０）およびＳＡＦｕｒ２、５’Ｐ−ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＴＡ−３’（配列番号３１））および調節配列（Ｃｏｎ１、５’Ｐ−ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＡ−３’（配列番号３４）およびＣｏｎ２、５’Ｐ−ＡＣＧ  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＡＡ−３’（配列番号３５）を含有するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、ＴＦＤ配列を含有するプラスミドを作製し、これらをｐＧＥＭＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと形質転換した。次に、ｐＧＥＭＴｅａｓｙを標的とした標識化プライマーｃｈｏｌ−Ｔｅｆ（５’−コレステロール−ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣ−３’（配列番号１））およびｃｙ５−Ｔｅｒ（５’−Ｃｙ５−ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号２））を用いてＰＣＲによってＴＦＤを増幅し、エタノール沈殿により精製した。
【０２９６】
６．１．３  形質移入手順
１ｍＬメタノール中で２１ｍｇを溶解させることによってグラミシジン（Ｓｉｇｍａ）の保存溶液を新たに調製し、使用前に水中で希釈し、増殖培地中でさらに１００分の１に希釈して、６０ｎＭの最終濃度とした。凍結黄色ブドウ球菌保存物を１００分の１、グラミシジン添加済み培地に接種し、室温で１０分間温置した。ＴＦＤ１μｇをＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）２μｇと混合し、ベンチ上で室温にて１０分間温置することによって、ＴＦＤ−ＤＯＴＡＰ複合体を形成させた。次に、このＴＦＤ複合体を接種済み培地と混合し、９６ウェル平底プレートに分注し、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダー中で振盪しながら３７℃で培養することによって増殖を分析した。
【０２９７】
６．１．４  リアルタイムｑＰＣＲによるＴＦＤ数の定量
個々のウェルからの細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で２回洗浄し、１００μＬの水中で再懸濁した。各ｑＰＣＲ反応において各試料１μＬを使用し、ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬを添加したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ混合液１２．５μＬ中で、ＴＦＤ（ＴｅｆおよびＴｅｒ；配列番号１および２）または１６Ｓ  ｒＲＮＡ（ｓｔｙｐＦ、５’−ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＡＴＡ−３’（配列番号３６）；ｓｔｙｐＲ、５’−ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＴＡＡ−３’（配列番号３７））の何れかを増幅させるためのプライマーとＤＮＡ標準物質または試料を混合した。得られたデータを使用して、ゲノム１個当たりに存在するＴＦＤ数を計算した。
【０２９８】
６．１．５  ＲＮＡ分析
ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）で培養物を処理し、記載のように細菌を回収し、−８０℃で保存した。１００μｇ／ｍＬリソスタフィンを含有するＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μＬ中で細胞ペレットを再懸濁し、３７℃で３０分間温置して細胞を溶解した。ＲＬＴ緩衝液７００μＬを添加し（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ抽出キット）、製造者のプロトコールに従いＲＮＡを回収した。室温にて１５分間、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＮａｓｅＩを用い、２５μＬ中でＲＮＡ試料２．５μｇを１．２５Ｕ  ＤＮＡｓｅＩと混合して、残存ＤＮＡを全て消化した。２５ｍＭ  ＥＤＴＡ２．５μＬを添加し、６５℃で１０分間加熱することによって、ＤＮＡｓｅＩ酵素を不活性化し、ランダムプライマー合成（ＮＥＢ  Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ）を用いたｃＤＮＡ合成に対してこの処理済ＲＮＡを使用した。標準的リアルタイムＰＣＲ法を用い、ｃＤＮＡを使用して、ｆｈｕ遺伝子に対するプライマー（ｑＳＡｆｈｕＦ、５’−ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＴ  ＧＣ−３’（配列番号３８）；ｑＳＡｆｈｕＲ、５’−ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＡＧＧ−３’（配列番号３９））を用い、１６ｓ  ｒＲＮＡのレベル（プライマーｓｔｙｐＦおよびｓｔｙｐＲ；配列番号３６および３７を使用）を用いて正規化して、相対的転写を定量した。
【０２９９】
６．２  結果
６．２．１  非鉄制限培地中でのＦｕｒ  ＴＦＤの形質移入
鉄利用率は、５９種類の黄色ブドウ球菌遺伝子（そのうち１７種類は、Ｆｕｒ制御されることが分かっている（Ａｌｌａｒｄら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．」（２００６年）８：１６７９〜１６９０；Ｘｉｏｎｇら、「Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」（２０００年）１８１：１０２０〜１０２６；Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」（２００１ａ）１８３：４６８〜４７５））の制御に影響を与える。Ｆｕｒはまた、酸化ストレス耐性に必要とされる触媒をコードするｋａｔＡを含む一部のＰｅｒ−制御を受ける遺伝子の正のレギュレーターとしても作用し（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」（２００１ｂ）６９：３７４４〜３７５４；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」（２００４年）７２：９７２〜９７９）、したがって、結果的に、ｆｕｒ変異体は、その、毒性のあるヒドロキシラジカル形成阻止能に支障をきたしている。これらの幅広く複雑な制御特性は、黄色ブドウ球菌ｆｕｒ変異体のビルレンス低下の主な原因であり得る。Ｆｕｒ活性を調節するためにＴＦＤ法を適用可能であるかを評価するために、Ｆｕｒ結合部位（これは、黄色ブドウ球菌のｆｈｕプロモーターにおいて行われるフットプリンティング実験により既に同定されていた（Ｘｉｏｎｇら、２０００年））を組み込むＴＦＤを設計した。対照ＴＦＤは、黄色ブドウ球菌ゲノムには存在しない類似ヌクレオチド組成物の無関係な配列から構成され；これは、Ｆｕｒ  ＴＦＤの作用が配列特異的であるか否かおよび形質移入手順のみにより生じる死滅効果があるか否かを立証するためであった。各ヌクレオチド配列を大腸菌ベクターｐＧＥＭＴＥａｓｙに連結し、得られたプラスミドを挿入部位に隣接するプライマーとともに使用して、ＰＣＲによりＴＦＤを作製した。このプライマーは、通常どおり、一部はエキソヌクレアーゼからＴＦＤを保護することによりＴＦＤの安定性を向上させるために、５’末端を修飾したが、また、コレステロール（フォワードプライマー）およびｃｙ５色素（リバースプライマー）でもその分子を官能化した。故に、ＴＦＤの全長は、Ｆｕｒ  ＴＦＤの場合は６０ｂｐであり、対照ＴＦＤの場合は６２ｂｐであった。
【０３００】
形質移入を達成するために、市販の脂質製剤ＤＯＴＡＰとＴＦＤを混合し、安定な複合体を形成させ、リン酸骨格の負電荷を遮蔽した。次に、６０ｎＭグラミシジンを添加した非鉄制限培地であるＢＨＩ中で黄色ブドウ球菌とＴＦＤ−ＤＯＴＡＰ複合体を混合した。グラミシジンは、グラム陽性細菌の膜に対して活性を有する抗菌性ペプチドである（ＨｅｒｒｅｌｌおよびＨｅｉｌｍａｎ、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」（１９４１年）２０：５８３〜５９１）。発明者らによる先行実験から、グラミシジンの亜致死濃度は、細菌膜へのＴＦＤ−ＤＯＴＡＰ複合体の融合およびＴＦＤの取り込みを可能とするために十分であることが確認された。対照ＴＦＤとともに形質移入試薬を添加すると、その結果、黄色ブドウ球菌の増殖速度が低下した。これは、おそらく、細胞壁の弱体化を通じてある程度の殺菌活性が生じたためである。Ｆｕｒまたは対照ＴＦＤの何れか１μＭを用いて形質移入を行った結果、高濃度鉄添加培地中で非常に類似した増殖曲線が得られた（図９）。興味深いことに、ｆｕｒノックアウトから、富栄養培地中での増殖欠陥が示されたが（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、２００１年）、一方で、対照とＦｕｒ＿ＴＦＤ処理試料との間で差は見られなかった。この差に対する説明としては、増殖条件（例えば９６ウェルプレート上で通気性が悪いこと）および培地が異なることが挙げられ得るが、より適切には、遺伝子ノックアウトとＴＦＤ処理の影響との間の根本的な相違であり得る。Ｆｕｒ＿ＴＦＤは、その部位に結合可能なあらゆる転写因子（Ｆｕｒタンパク質だけでなく、同じ部位に結合するさらなるタンパク質）の結合を阻止する。細菌中の転写制御が以前に考えられていたものよりも複雑であり、真核生物におけるように、多くのレギュレーターネットワークからのインプットがあり、故にモジュラーであり、複数の転写因子が発現に影響を及ぼすということが次第に分かってきた（Ｂａｒｎａｒｄら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００４年）７：１０２〜１０８）。
【０３０１】
細胞の形質移入が起こったか否かおよび起こった場合に１ゲノム当たりいくつのＴＦＤが入ったかを明らかにするために、定量的ＰＣＲを行った。グラミシジンおよびＤＯＴＡＰ非存在下で、細菌細胞内部のＴＦＤまたは細菌細胞に接着したＴＦＤは検出されず、このことから、ＴＦＤが自然には細胞に入らず、洗浄手順により、細胞表面に非特異的に会合したＴＦＤが首尾よく全て除去されたことが分かる。形質移入試薬の存在下では、Ｆｕｒおよび対照ＴＦＤが、１ゲノム当たりそれぞれ４５００および５３４０ＴＦＤ検出された（図１０Ａ）。故に、この形質移入手順により、高濃度鉄添加培地中での増殖に目立った差別的効果を有することなく、相当数の両ＴＦＤが細菌細胞に送達された。
【０３０２】
６．２．２  ｆｈｕのＴＦＤ調節発現
Ｆｕｒ＿ＴＦＤが、Ｆｕｒに結合し、ｆｈｕプロモーターにＦｕｒが結合することを妨害するように作用している場合、ｆｈｕ遺伝子の抑制が解除されるはずであることが予想される。これを調べるために、Ｆｕｒ＿ＴＦＤで処理した試料中に存在するｆｈｕ転写産物のコピー数（リボソームＤＮＡに対して標準化）を対照試料と比較した（図１０Ｂ）。図９で示される試料から単離したＲＮＡにおいて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｆｕｒ＿ＴＦＤがｆｈｕ転写に対して予想される変化をもたらしたことが分かった：対照試料の場合よりも５倍高かったことが立証された。故に、病原性に対して必須であることが知られている黄色ブドウ球菌中の遺伝子発現のパターンを変化させるために、特異的ＴＦＤの形質移入を使用することができる。
【０３０３】
６．２．３  鉄制限培地中でのＦｕｒ  ＴＦＤの増殖に対する影響
同じ形質移入プロトコールを用いて、鉄制限培地中で培養した黄色ブドウ球菌にＦｕｒおよび対照ＴＦＤを導入した（Ｓｋａａｒら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（２００４年）３０５：１６２６〜８）。ＢＨＩ中での増殖と比較した場合、予想されるように、この培地中での増殖が遅延した。しかし、Ｆｕｒ  ＴＦＤにより形質移入を行った培養物は、実験中を通じて、増殖の徴候を何ら示さず（図１１）、このことから、鉄制限条件下での鉄制御のかく乱は、増殖に悪影響を及ぼすことが分かり、Ｆｕｒノックアウト変異体で見られた結果が再現された（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、２００１ａ）。
【０３０４】
Ｆｕｒ転写因子は、一般に、フェントン反応により引き起こされる鉄毒性を防ぐ、鉄過剰条件下で鉄取り込み遺伝子の転写を下方制御する全体的に作用するリプレッサーと考えられている（ＷａｎｄｅｒｓｍａｎおよびＤｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」（２００４年）５８：６１１〜６４７）。黄色ブドウ球菌ｆｕｒの変異はまた、ビルレンスに対しても悪影響を与え、鉄制限条件下で増殖不能になり、その結果、インビボで弱毒化する（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、２００１ａ）。その理由は依然として明らかではないが、おそらく、環境変化への細菌の適応におけるＦｕｒの中心的役割および酸化ストレスへの応答能低下を反映している。ビルレンスにおける影響は、黄色ブドウ球菌に特有なものではないようである。ｆｕｒの変異により、インビボで、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の弱毒化が引き起こされる（Ｍｅｙら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」（２００５年）７３：８１６７〜８１７８；Ｐａｌｙａｄａら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」（２００４年）１８６：４７１４〜４７２９；Ｂｕｒｙ−Ｍｏｎｅら、「Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００４年）５３：６２３〜６３８；Ｊａｃｏｂｓｅｎら、「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」（２００５年）７３：３７４０〜３７４４；Ｈａｒｖｉｅら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（２００５年）１５１：５６９〜５７７）。黄色ブドウ球菌Ｆｕｒコンセンサス配列のバイオインフォマティクス分析（ＭＥＭＥソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ４＿１／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）を使用）および以前同定された配列（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら、２００１ａ）から、これは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｙｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）において、ならびに黄色ブドウ球菌においてよく保存されており（図１２）、その他のバチルス目に対する活性が予想される。
【０３０５】
病原性細菌を処理するために、アンチセンス分子が使用されてきた。中でも注目すべきは、ペプチド核酸（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」（１９９８年）１６：３５５〜３５８）およびモルホリノオリゴヌクレオチド（Ｓｈｅｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」（２００９年）１０６：８１６３〜８１６８）など、修飾骨格を使用することおよびカチオン性ペプチドにより送達を達成することである。これらは、マイクロモルレベルの濃度で標的ｍＲＮＡの翻訳を下方制御し、インビトロおよびインビボで微生物の増殖を阻害する。修飾骨格への転換には、それにより体液中でのオリゴヌクレオチドの安定性が向上し、リン酸骨格の負電荷が低減するかまたは除去されるという長所がある。この後者の効果には、負に荷電した細菌外膜を通じて、修飾オリゴヌクレオチドがより形質移入され易くなるという長所がある。しかし、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を阻害することによりＴＦＤが作用し、リン酸骨格がタンパク質認識に重要である可能性があるので、これは容易に置き換えることはできない。
【０３０６】
この実施例において、ナノモルレベルの濃度で細菌を死滅させるためにペプチドおよびリポソームの組み合わせを用いて、天然の骨格を有する巨大なオリゴヌクレオチドとして、ＴＦＤを細胞に効率的に送達し得ることが明らかになった。ＴＦＤは、酵素プロセス（転写）を阻害するので、はるかに低い濃度で有効であり、その一方、アンチセンスは、転写産物（ｍＲＮＡ）において立体障害物として作用する。ＴＦＤを使用するさらなる長所は、ＴＦＤが、単一の標的を有するのではなく、多くの必須遺伝子の発現を阻害し、これらが耐性機構に反応しないようにすることである。
【０３０７】
（実施例７）
Ｓｉｇ  ＴＦＤはＭＲＳＡ株の増殖を阻害する
実施例５．１におけるように、コレステロール／Ｃｙ５で標識したデコイポリヌクレオチドを調製した。典型的には、次に、Ｓｉｇ  ＴＦＤ１μｇをリポソーム形質移入試薬ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン；Ｒｏｃｈｅ）０．３μＬと複合体形成させ、室温で１０分間温置した。９６ウェルプレート（各ウェルが、６０ｎＭグラミシジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号Ｇ５００２）を添加したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からなる培養液２００μＬを含有する）を用いて、細菌細胞の増殖におけるそれらの影響を調べるためのアッセイを行った。様々な濃度の、ＴＦＤと複合体化した、コレステロール／Ｃｙ５標識デコイ１μＬを各ウェルに添加し、メチシリン耐性株（ＭＲＳＡ）であると判定された黄色ブドウ球菌の臨床分離株の細菌増殖に対する影響をモニタリングした。温置中、間隔を置いて、培養液の吸収を測定することにより、増殖をモニタリングした。このプレートを振盪しながら３７℃で温置し、プレートリーダーを用いて吸収読み取り（４５０ｎＭ）を行った。
【０３０８】
図１３で示されるように、わずか１０ｎＭのＳｉｇで処理することにより、ＢＨＩ培地中のＭＲＳＡ株の増殖が阻止されたことが明らかであった。黄色ブドウ球菌ゲノムでは見られない、同様の長さの無関係の配列を含有する同等量の対照ＴＦＤは、この培地中での細菌増殖に影響を及ぼさなかった。
【０３０９】
（実施例８）
Ｓｉｇ  ＴＦＤは、ＥＭＲＳＡ１５（臨床分離流行株）に対する抗生物質の作用を増強する
実施例９．１（下記参照）に記載のように、Ｓｉｇダンベル型ＴＦＤを調製した。実施例５．２に記載のように、よく特徴が分かっているＭＲＳＡ株であるＥＭＲＳＡ１５を用いて増殖アッセイを行った。この株は、メチシリン（この抗生物質２ｍｇ／ｍＬ中で増殖可能）、０．５ｍｇ／ｍＬエリスロマイシンおよび０．５ｍｇ／ｍＬシプロフロキサシンに対して耐性を示す（ＰｏｒｔｅｒおよびＤａｍａｎｉ、「Ｊ．Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」（２００７年）６５：８８）。
【０３１０】
下記の表１で示されるように、細菌培養物の増殖におけるラグタイムを調べることにより測定したところ、Ｓｉｇ  ＴＦＤ１０ｎＭの存在下で、ＥＭＲＳＡ１５株は、メチシリン、エリスロマイシン、およびシプロフロキサシンに対して再び感受性を持つようになった。このような実験において、対照ＴＦＤ（実施例５．１に記載）および抗生物質で処理した培地に対する０ｈのラグタイムから、この培養物が、抗生物質を添加した培地中で増殖させた未処理細菌と同じ時点で増殖を開始したことが示唆される。Ｓｉｇ  ＴＦＤで処理した培養物に対して、ラグタイムとは、抗生物質存在下で対照ＴＦＤにより見られるものと比較した、増殖の遅れである。故に、６．４時間（２ｍｇ／ｍＬメチシリン存在下）、８．２時間（０．５ｍｇ／ｍＬエリスロマイシン存在下）および８．３時間（０．５ｍｇ／ｍＬシプロフロキサシン存在下）のラグタイムから、Ｓｉｇ  ＴＦＤが、これらの抗生物質と相乗的に作用して、増殖を遅らせたことが示唆される。
【０３１１】
この効果のメカニズムは、Ｓｉｇ  ＴＦＤがストレス応答レギュロンの抗生物質介在性誘導を阻害するかまたは下方制御し、細菌細胞の感受性をより高めるということであると考えられる。殆どの抗生物質がストレス応答を引き起こすので、発明者らは、ＴＦＤを併用した場合、このような抗生物質の全てまたは殆どの有効性が向上すると予想する。
【０３１２】
【表１】
2018023367.tif 000002
【０３１３】
ラグタイムは、ＴＦＤの処理によって（擬似形質移入培養と比較して）増殖が遅れる時間として規定する。
【０３１４】
（実施例９）
ダンベル形状のＳｉｇ  ＴＦＤは臨床分離ＭＲＳＡ株の増殖を抑制する
９．１  ライゲーションによるＴＦＤダンベルの調製（ＤＢ−ＴＦＤ）
それぞれ黄色ブドウ球菌代替シグマタンパク質の認識部位の一方の鎖を含有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。この分子の何れかの末端で、低分子ヘアピンループは、この分子を分解から保護するように作用した。各オリゴヌクレオチドを２５０ｐｍｏｌ／μＬの濃度でｄＨ２Ｏ中で再懸濁した。
【０３１５】
ＳｉｇダンベルＴＦＤ（ＳＡ３  ＴＦＤと呼ばれる）を形成させるために、次のリン酸化オリゴヌクレオチドを合成した：
【０３１６】
配列番号４０−ＳｉｇＤＢ＿ＳＡ３：ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  Ｔ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ
配列番号４１−ＳｉｇＤＢ＿ＳＡ３：Ｐ−ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ
【０３１７】
アニーリングした場合、これらは次の分子を形成した。
【０３１８】
【化１】
2018023367.tif 000003
【０３１９】
典型的には、各オリゴヌクレオチド３０μＬをｄＨ２Ｏ２７μＬと混合し、次のＰＣＲプログラムを用いてアニーリングを行った：ＡＮＮＥＡＬ：９５℃で３分間、−０．１℃／秒で８℃まで冷却、終了。その後、１０ｘＮＥＢリガーゼ緩衝液１０μＬおよびＨＣ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）３μＬを添加した。この混合物を１６℃で一晩温置した。次に、この物質をＴ７エクソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で徹底的に消化して未連結オリゴヌクレオチドを全て除去し、次いでエタノール沈殿を２回行うことにより回収した。
【０３２０】
Ｓｉｇ結合部位のスクランブル型を含有するＤＢ＿ＴＦＤも調製した。この場合、使用したリン酸化プライマーは：
配列番号４２−ＳｉｇＳｃｒ＿ＳＡ１：ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  Ｔ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＡＴ
配列番号４３−ＳｉｇＳｃｒ＿ＳＡ２：ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  Ａ
であった。
【０３２１】
９．２  ９６ウェルプレート中での増殖試験の実施
ダンベル形状のＳｉｇ  ＴＦＤおよび臨床分離ＭＲＳＡ株を用いて、実施例５．１に記載のように、増殖アッセイを行った。
【０３２２】
図１４で示されるように、わずか１０ｎＭのＳｉｇ  ＴＦＤ濃度で細胞増殖を抑制することができ、一方で、同様の濃度の対象ＴＦＤでは抑制できなかった。
【０３２３】
（実施例１０）
ＷａｌＲ  ＤＢ−ＴＦＤはＥＭＲＳＡ１５の増殖を阻止する
１０．１  ＷａｌＲ結合部位を含有するＤＢ  ＴＦＤの調製
ＷａｌＲの結合配列をダンベル型オリゴヌクレオチドに組み込み、実施例９．１に記載のように調製した。これらのリン酸化オリゴヌクレオチドの配列は：
配列番号４４−ＷａｌＲＤＢ２．１：ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  Ａ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ
配列番号４５−ＷａｌＲＤＢ２．２：ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＴＴＡであった。
【０３２４】
ＷａｌＲ結合部位のスクランブル型を含有するオリゴヌクレオチドの第二の対を使用して、対照ダンベル（Ｓｃｒ．ＷａｌＲ）を作製した。これらのリン酸化オリゴヌクレオチドの配列は：
配列番号４６−ＷａｌＲＤＢ３．１：Ｐ−ＣＴＴＧＧ  ＴＴＴＴＴ  ＣＣＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  Ｃ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧ  ＡＴＧＣＣＡ
配列番号４７−ＷａｌＲＤＢ３．１：Ｐ−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣであった。
【０３２５】
１０．２  リソスタフィンとの同時処理によるＥＭＲＳＡ１５の形質移入
グラミシジンの代わりに０．５〜２．５ｐｇ／ｍＬのリソスタフィンを培地に添加したことを除き、実施例７．１に記載のように、増殖アッセイを行った。リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌の細胞壁に特異的であるリゾチーム様酵素である。
【０３２６】
図１５に見られるように、わずか１０ｎＭのＳｉｇ  ＤＢ−ＴＦＤで、細菌増殖を阻害することが可能であったが、一方で、同等量の対照ＤＢ−ＴＦＤでは影響がなかった。
【０３２７】
（実施例１１）
ＷａｌＲ  ＴＦＤはマウス敗血症モデルにおけるＭＲＳＡの増殖を阻害する
この実施例で使用したＴＦＤは、二成分系ＷａｌＫＲの作用を阻害する。当該タンパク質は、細胞壁代謝、特にペプチドグリカン合成に関与する遺伝子の低分子レギュロンの発現を調節する必須シグナル伝達経路を形成する。
【０３２８】
１１．１  方法
１１．１．１  細菌株および増殖
ＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）中で、黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６培養物を増殖させ、維持した。５０％グリセロールと初期対数増殖期（Ａ６００で０．３のＯＤ）の培養物を同じ容量で混合し、−８０℃で凍結することによって、凍結保存物を調製した。
【０３２９】
１１．１．２  ＴＦＤの調製
既に記載のように、ダンベル形状になるようにＴＦＤを調製した（Ａｈｎら、２００３年）。リン酸化オリゴヌクレオチドの対を連結して、ｌｙｔＭのプロモーターに存在するようなＷａｌＲタンパク質の結合部位を含有するＴＦＤ（ＷａｌＲ＿ＴＦＤ）または結合部位のスクランブル型を含有するＴＦＤ（Ｓｃｒ＿ＴＦＤ）を形成させることによって、ＴＦＤを調製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ４００Ｕ中で１００ｐｍｏｌ／μＬの最終濃度となるようにこれらのオリゴヌクレオチドを再懸濁し、１６℃で一晩温置した。翌朝、反応緩衝液に１０ＵエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）を添加し、３７℃で３０分間消化し、その後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。水中で１ｍＭの濃度になるようにＴＦＤを再懸濁した。
【０３３０】
ＷａｌＲ＿ＴＦＤを形成するために使用したオリゴヌクレオチド対の配列は、
配列番号４８−ＷａｌＲ１：５’−Ｐ−ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ−３’および
配列番号４９−ＷａｌＲ２：５’−Ｐ−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＴＴＡ−３’であった。
【０３３１】
Ｓｃｒ＿ＴＦＤには、使用した配列は：
配列番号４６−ＷａｌＲＤＢ３．１：５’−Ｐ−ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＣＣＡ−３’および
配列番号４７−ＷａｌＲＤＢ３．１：５’−Ｐ−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣ−３’であった。
【０３３２】
１１．１．３  インビトロでのＭＲＳＡの形質移入
ＴＦＤ１μｇをＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）２μｇと混合し、ベンチ上で室温にて１０分間温置することによって、ＴＦＤ−ＤＯＴＡＰ複合体を形成させた。次に、１０ｎｇ／ｍＬリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ；Ｌ９０４３）を添加した接種済み培地とこのＴＦＤ複合体を混合し、９６ウェル平底プレートに分注し、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダー中で振盪しながら３７℃で培養することによって、増殖を分析した。
【０３３３】
１１．１．４  マウス敗血症モデル
Ｅｕｐｒｏｔｅｃ（ＵＫ）によりマウス敗血症実験が行われた。この実験で使用したマウス（雄ＣＤ１マウス）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ  ＵＫ）により提供され、特定病原体不在であった（配達時１６〜１８ｇ）。マウスは全て、実験開始時に体重が２２〜２５ｇであった。
【０３３４】
１１．１．５  忍容性試験
忍容性試験のために、１処置群当たり２匹のマウスの群（したがってこの試験に対して合計１０匹）で、マウスを処置した。この試験の第１日目に全マウスの体重測定を行い、無作為に飼育箱に入れた。これらのマウスに対して、１０ｍＬ／ｋｇを用いて静脈内投与により次の処置を行い、５種類の処置群は：１００μＭ  ＷａｌＲ＿ＴＦＤ；２．５ｍＭ  ＤＯＴＡＰ；６．３μｇ／ｍＬリソスタフィン；ＴＦＤ／ＤＯＴＡＰ／リソスタフィンの混合物；食塩水であった。処置後、１００時間にわたりこれらのマウスの体重測定を毎日行い、その後、これらを安楽死させ、肺、肝臓、脾臓および腎臓を摘出し、目視検査および重量測定を行った。
【０３３５】
１１．１．６  ＰＫ試験
ＰＫ試験のために、１つの時点当たり３匹のマウスとなる群（したがってこの試験に対して合計２４匹）で、マウスを処置した。５ｎＭ／ｋｇ  ＷａｌＲ＿ＴＦＤ、２５ｎＭ／ｋｇ  ＤＯＴＡＰ、３１．５ｍ／ｋｇリソスタフィンの混合物の静脈内送達によりマウスを処置した。投与後５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間の時点で、イソフルオラン麻酔後、心臓穿刺によって、マウスの各セットから採血した。全試料を血漿として回収した（ヘパリンで抗凝固剤処理し、分離前に氷上で保存）。血液回収後、腎臓を摘出し、１ｍＬ氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズ処理した。ｑＰＣＲを用いて生体試料中のＴＦＤを検出した。
【０３３６】
１１．１．７組織負荷試験（ｔｉｓｓｕｅ  ｂｕｒｄｅｎ  ｓｔｕｄｙ）
組織負荷試験のために、１処置群当たり８匹のマウスとなる群（したがってこの試験に対して合計４８匹）で、マウスを処置した。黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６の２ｘ１０ｍＬ培養物を調製し、３７℃で一晩、オービタルシェーカー（２２０ｒｐｍ）上に置いた。翌日、この黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６培養物をシェーカーから取り出し、ペレット化し、２回洗浄し、その後、０．１３２のＯＤ（１．５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）になるように食塩水中で再懸濁した。次に、この黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６の保存溶液をさらに食塩水中で１：１．５希釈し（１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）、即ち細菌２．０ｘ１０７個／マウスとした。次に、１．０ｘ１０８／ｍＬ縣濁液０．２ｍＬを用いて４８匹のマウスに感染させた。感染量を確認するために、接種後の残存懸濁液中の１ｍＬ当たりの黄色ブドウ球菌ＥＭＲＳＡ１６細菌数も数えた。感染から１、９時間および１７時間後に化合物またはビヒクルの何れかでマウスを処置したが、バンコマイシンの投与は１時間後のみであった。処置物質は、以前のように、ＤＯＴＡＰと５：１のモル比の１ｎＭ／ｋｇＴＦＤ濃度及び６３μｇ／ｋｇリソスタフィンを用いた、ＴＦＤ／ＤＯＴＡＰ／リソスタフィンの混合物であった。感染から２５時間後、全動物の体重測定を行い、次いで安楽死させた。すぐに腎臓を摘出し、氷冷滅菌リン酸緩衝食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０中でホモジナイズした。ＣＬＥＤ寒天上で臓器ホモジネートを定量的に培養し、３７℃で最長３日間温置し、コロニー数を数えた。Ｓｔａｔｓ  Ｄｉｒｅｃｔを用いて、この培養負荷（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｕｒｄｅｎ）からのデータをＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験により分析した。
【０３３７】
１１．２  結果
１１．２．１  ＷａｌＲ  ＴＦＤは、インビトロでＭＲＳＡを迅速に抑制する
保存性が高い２成分系ＷａｌＫ／ＷａｌＲ（ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦとも呼ばれる）は、遺伝子ノックアウト実験において、黄色ブドウ球菌およびその他のグラム陽性病原体の生存に必須であることが示されている。転写因子ＷａｌＲの結合部位が、ｌｙｔＭ／ＳＡ０２６５を含むレギュロンにおける遺伝子のいくつかのプロモーターで同定されている（Ｄｕｂｒａｃ、Ｂｏｎｅｃａら、２００７年）。ＷａｌＲ＿ＴＦＤおよび配列が無作為に再編成されたスクランブル型（Ｓｃｒ＿ＴＦＤ）で使用したものは、この型であった。
【０３３８】
この試験では、イギリスの病院に固有のＭＲＳＡ株であるＥＭＲＳＡ−１６を使用した（Ｃｏｘ、Ｍａｌｌａｇｈａｎら、１９９５年）。市販の脂質製剤であるＤＯＴＡＰとＴＦＤを混合し、ＥＭＲＳＡ−１６を接種した培地およびリソスタフィンと混合した。リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌の細胞壁で作用するリゾチーム剤であり、この実験では、細菌のペプチドグリカン外層を菲薄化するため、および細菌の露出した内膜とＤＯＴＡＰ担体の融合後ＴＦＤを細胞に形質移入できるようにするために使用した。この形質移入プロトコールを用いて、対照ＴＦＤであるＳｃｒ＿ＴＦＤでの処置は、未処理試料と比較した場合、細菌増殖において検出可能な影響がなかったことが観察された。しかし、ＷａｌＲ＿ＴＦＤは、インビトロにおいて、１ｎＭの濃度でＥＭＲＳＡ−１６の増殖を阻害した（図１６）。総生存数から、ＷａｌＲ＿ＴＦＤでの処理により、生存数が５桁減少したという結果が確認された（図１７Ａ）。何らかの耐性の発生があるか否かを判定するために、ＷａｌＲ＿ＴＦＤ処理により死滅しなかった細菌を継代培養した。このプロセスを全４回繰り返し、生存細胞数の減少（図１７Ｂ）およびインビトロ増殖曲線の両方を記録した（図１７Ｃ、黒の四角形：４回目の継代の細菌）。故に、ＴＦＤ介在性の殺菌に対する耐性メカニズムの発現に対する証拠はない。
【０３３９】
ＴＦＤが接触したその時に細菌を死滅させたかまたは作用するには長時間の曝露が必要とされるか否かを調べるために、ＥＭＲＳＡ−１６に対して１ｎＭ  ＷａｌＲ＿ＴＦＤ／ＤＯＴＡＰ複合体を用いて形質移入を行い、３０分間温置した後、ＴＦＤ複合体またはリソスタフィン不含の新鮮な培地へと微量希釈した。さらに４８時間インビトロでの増殖を追跡したところ（図１８）、増殖が観察されないことが明白であり、このことから、最初の接触時にＴＦＤが細菌細胞を効果的に死滅させることが確認された。
【０３４０】
１１．２．２  忍容性試験
ＩＶ投与後、全薬物が忍容性良好であり、報告すべき急性事象はなかった。処置後、マウスは、苦痛の徴候なく、通常どおり摂餌および摂水した。処置したマウスの体重増加はビヒクル対照マウスと同様であった。剖検からは、腎臓、肺、肝臓またはＧＩ管の全体的な異常は示されなかった。腎臓、肺および肝臓重量は正常範囲内であった。試験化合物は全て、忍容性があり、この忍容性試験で使用した最大用量までのさらなる投与に適している。
【０３４１】
１１．２．３  組織負荷試験
比較的穏やかな感染を確実に成立させるために（これは処置に対してより感受性がある）、投与感染用量は、細菌２．０ｘ１０７個／マウスを目標とした。ビヒクル、Ｓｃｒ＿ＴＦＤ複合体１ｎＭ、ＷａｌＲ＿ＴＦＤ複合体１ｎＭまたはバンコマイシン（コロニー形成単位（ｃｆｕ）を２分の１にするために十分な濃度で使用）の何れかを全身的に投与することによってこれらのマウスを処置した。処置後、これらのマウスを屠殺し、その腎臓内で見られる負荷を測定した（図１９）。結果の統計学的分析から、ＷａｌＲ＿ＴＦＤ処置マウスにおいて、Ｓｃｒ＿ＴＦＤ対照と比較した場合に、バンコマイシンにより達成されたものと同程度、負荷量が低下したことが分かった（下記表２）。
【０３４２】
【表２】
2018023367.tif 000004
【０３４３】
この実験におけるＷａｌＲ＿ＴＦＤは、インビトロおよびインビボの両方でＭＲＳＡに対してナノモル濃度で迅速な殺菌活性を有することが分かった。
【０３４４】
（実施例１２）
ＦａｂＢ  ＴＦＤによる大腸菌の形質移入によって、脂肪酸合成を阻害する抗生物質に対して細菌が感受性になる
１２．１ＦａｂＢ  ＴＦＤの調製
大腸菌のＦａｂＢ遺伝子の上流にある、脂肪酸合成酵素の転写レギュレーターであるＦａｄＲの結合部位を組み込むように、ＦａｂＢ  ＴＦＤを設計した。ＦａｂＢ遺伝子は、脂肪酸合成に関与する酵素をコードする（「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（２００５年）１８３：５２９２）。
【０３４５】
ＦａｂＢプロモーターの６０塩基対の部分をｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターにクローニングしたことを除き、実施例４．１に記載のように、ＰＣＲ  ＴＦＤを作製した。プロモーター配列を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドは：
配列番号５０−ｆａｂＢｆ：ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ
配列番号５１−ｆａｂＢｒ：ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＧＴＡであった。
【０３４６】
恥垢菌から単離したゲノムＤＮＡを用いた増幅反応において使用した場合に、同様の大きさのＰＣＲ断片を生じさせた配列を有する対照ＴＦＤも作製した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は：
配列番号５２−ＷｈｉＢ７．ｆ：ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ
配列番号５３−ＷｈｉＢ７．ｒ：ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＴＧであった。
【０３４７】
１２．２  増殖アッセイ
数ヶ所変更したことを除いて実施例４．１に記載のように、大腸菌細菌培養物の増殖に対するＴＦＤの影響を測定した：使用培地はＬＢであり；使用した同時形質移入物は、グラミシジンではなく４０ｎＭポリミキシンであり；この培地には１０μｇ／ｍＬセルレニン（ＣＥＲ）も添加した。ＣＥＲは、脂肪酸合成に対して作用する抗生物質である。これは、使用した濃度で、大腸菌の増殖に対して顕著な影響はなかった。
【０３４８】
図２０は、ＦａｂＢ  ＴＦＤ  １０ｎＭでの大腸菌の処理により、この細菌をセルレニンの作用に対して感受性を持たせるが、対照ＴＦＤ（ＷｈｉＢ７；大腸菌）ゲノム内にないことが知られる配列を含有）では感受性を有さないことを示す。使用した抗生物質であるセルレニン（ＣＥＲ）は、２０μｇ／ｍＬで、対照ＴＦＤ存在下で細胞増殖を阻害し始め、この時点までに、ＦａｂＢ  ＴＦＤの相乗作用によって細胞が死滅する。
【０３４９】
ＦａｂＢ  ＴＦＤは脂肪酸合成オペロンの遺伝子を下方制御するように設計されているので、発明者らの仮説は、このＴＦＤは、直接または間接的に脂肪酸合成をかく乱する任意の抗生物質と組み合わせて使用し得、この抗生物質の有効性を向上させるかまたは耐性メカニズムを阻止するということである。
【０３５０】
（実施例１３）
肺炎桿菌のσ５４因子に対する認識配列を含有するＴＦＤの形質移入により細菌増殖が遅延する
病原性生物である肺炎桿菌由来の代替シグマ因子σ５４の結合部位を含有するＰＣＲ  ＴＦＤを作製し、試験した。無関係の対照ＴＦＤの活性と比較して、Ｓｉｇ  ＴＦＤは細胞増殖を阻害した。σ５４は、細菌でのストレス反応の制御を調節するシグマ因子のさらなる例である。
【０３５１】
１３．１  ＴＦＤの調製
実施例５．１に記載のようにＴＦＤを調製した。使用した、アニーリングされるオリゴヌクレオチドの配列は：
配列番号５４−Ｋｓ５４ｆ：Ｐ−ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  Ａ
配列番号５５−Ｋｓ５４ｒ：Ｐ−ＡＴＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＣＧＧ  Ａであった。
【０３５２】
１３．２  肺炎桿菌の形質移入
使用培地をＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、第３巻、ページＡ３）に変更して、セクション４．１に記載のように増殖アッセイを行った。この培地には同時形質移入物を何ら添加しなかった。
【０３５３】
ＴＦＤを細胞浸透性ペプチドと複合体形成させることによって形質移入を達成した。このペプチドは、２つの部分：９個のＤ−アルギニンの線状鎖および肺炎桿菌の膜を浸透可能であることが分かっている既に述べられたペプチド配列から構成された（Ｖａａｒａ、「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」（１９９６年）４０：１８０１）。正に荷電したアルギニン（Ｒ９）は、電荷相互作用を通じてＴＦＤのリン酸骨格に結合する役割を果たす。形質移入部分と複合体化して細菌に形質移入するためのこのようなＲ９テールの使用は、既に記載されている（Ｋｉｍ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（２００６年）１４：３４３）。使用ペプチドの全配列は：
配列番号５６−ＩＫＦＬＫＦＬＫＦＬ−（Ｄ−アルギニン）９であった。
【０３５４】
５％グルコースを添加したＴＥを基とした緩衝液中のＩＫＦＬＫＦＬＫＫＬ−Ｒ９ペプチドの漸増量とＴＦＤを混合した。この混合液を室温で１時間温置し、次いで、形質移入で直接使用するかまたはアガロースゲル電気泳動により分析した。典型的には、ＤＮＡとの複合体がゲルにおいて移動しなくなる（即ち、ポリアルギニンの結合によって、核酸骨格の電荷が中和される）最小量のＩＫＦＬＫＦＬＫＫＬ−Ｒ９を使用いた。９６ウェルプレート中で、培養物２００μＬにＩＫＦＬＫＦＬＫＫＬ−Ｒ９−ＴＦＤ複合体を様々な濃度で混合した。
【０３５５】
図２１は、Ｓｉｇ  ＴＦＤ１０ｎＭで肺炎桿菌培養物の増殖を阻害するのに十分であり、一方で、対照ＴＦＤでは阻害が見られなかったことを示す。
【０３５６】
（実施例１４）
黄色ブドウ球菌内のＷａｌＲ結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
黄色ブドウ球菌（ＳＡ）ならびに、エンテロコッカス・フェシウム（ＥＦ）、肺炎連鎖球菌（ＳＰ）、リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）およびミュータンス菌（ＳＭ）など、ＷａｌＲ結合部位が存在することが分かったその他の病原性生物における公開されているＷａｌＲ結合部位の例の有無を調べるために、ＭＥＭＥ検索（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ４／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｍｅ．ｃｇｉ）を使用した。
【０３５７】
この検索由来のヒットの一部を図２２で示す。完全なセットから、配列：
ＴＧＴ  ＷＡＷ  ＮＮＮ  ＮＮＴ  ＧＴＡ  ＡＷ（配列番号５７）を有するコンセンサス部位が抽出された。
【０３５８】
ＩＵＰＡＣ一文字コードを使用する（ＷはＡまたはＴである。）。
【０３５９】
したがって、ＷａｌＲ  ＴＦＤコンセンサス配列は、上記で列挙される生物の増殖に影響を及ぼすことが予想される。
【０３６０】
（実施例１５）
黄色ブドウ球菌内のＳｉｇＢ結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
バチルス目（グラム陽性感染物）（この代表的な属としては、バチルス、リステリアおよびスタフィロコッカスが含まれる。）の黄色ブドウ球菌のＳｉｇＢ結合部位のコンセンサス配列に対する一致の存在例を見出すために、（Ｅ−値＜１００で）ＭＥＭＥ検索（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ｍｅｍｅ４／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｍｅ．ｃｇｉ）を使用した。
【０３６１】
この検索由来のヒットの例を図２３で示す。完全なセットから、配列：
ＧＫＴ  ＴＷＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＫ  ＧＧＴ  ＡＷ（配列番号５８）を有するコンセンサス部位が抽出された。
【０３６２】
ＩＵＰＡＣ一文字コードを使用する（ＫはＧまたはＴであり、ＷはＡまたはＴである。）。
【０３６３】
（実施例１６）
肺炎桿菌内のＳｉｇ結合部位の存在を検出し、そのコンセンサス配列を推測するためのバイオインフォマティクス分析
Ｂａｒｒｉｏｓら１９９９（「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２２：４３０５〜４３１３）に記載のように、肺炎桿菌ｇｌｎＡ遺伝子のプロモーター領域から、代替シグマ因子（シグマ５４）の結合部位を含有するＴＦＤを取り出し、ＰＣＲ＿ＴＦＤに組み込んだ場合に、インビトロで、肺炎桿菌細胞を死滅させることが示された（図２４Ａ参照）。
【０３６４】
使用したＴＦＤ配列は：
配列番号５９−ＫＰ＿Ｓｉｇ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ａｇａ  ｔｔＴ  ＣＧＣ  Ｔであった。
【０３６５】
細胞浸透性ペプチドを用いて、実施例１３に記載のように細胞に形質移入した。ＫＰ＿Ｓｉｇ配列を含有するＴＦＤは、インビトロで細胞増殖を阻害したが、一方で、２種類の対照は、細胞増殖に影響がなかった。使用した２種類の対照は、未処理細胞（肺炎桿菌）とスクランブル配列からなる対照ＴＦＤとであった。
【０３６６】
コンセンサス配列を定義するために、その他の肺炎桿菌遺伝子（ｎｉｆＢ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＭおよびｎｉｆＵ）で見出される同様の結合部位を使用した：
配列番号６０−ＴＧＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＷＴＴ  ＴＧＣ  Ｗ
【０３６７】
ＩＵＰＡＣ一文字コードを使用する（ＷはＡまたはＴである）。
【図１−１】
2018023367.tif 000005
【図１−２】
2018023367.tif 000006
【図１−３】
2018023367.tif 000007
【図１−４】
2018023367.tif 000008
【図１−５】
2018023367.tif 000009
【図２】
2018023367.tif 000010
【図３】
2018023367.tif 000011
【図４】
2018023367.tif 000012
【図５】
2018023367.tif 000013
【図６】
2018023367.tif 000014
【図７】
2018023367.tif 000015
【図８】
2018023367.tif 000016
【図９】
2018023367.tif 000017
【図１０Ａ】
2018023367.tif 000018
【図１０Ｂ】
2018023367.tif 000019
【図１１】
2018023367.tif 000020
【図１２】
2018023367.tif 000021
【図１３】
2018023367.tif 000022
【図１４】
2018023367.tif 000023
【図１５】
2018023367.tif 000024
【図１６】
2018023367.tif 000025
【図１７Ａ】
2018023367.tif 000026
【図１７Ｂ】
2018023367.tif 000027
【図１７Ｃ】
2018023367.tif 000028
【図１８】
2018023367.tif 000029
【図１９】
2018023367.tif 000030
【図２０】
2018023367.tif 000031
【図２１】
2018023367.tif 000032
【図２２】
2018023367.tif 000033
【図２３】
2018023367.tif 000034
【図２４Ａ】
2018023367.tif 000035
【図２４Ｂ】
2018023367.tif 000036
【配列表】
2018023367000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月14日(2017.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物の標的転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記結合部位は遺伝子に機能的に結合しておらず、
前記標的転写因子は、ＷｈｉＢ７、ＹｙｃＧ／ＹｙｃＦ、Ｓｉｇｍａ５４（もしくはＳｉｇＡ）、Ｆｕｒ、ＴｃｄＲ、Ｖｆｒ、ＮｔｒＣ、ＡｒｓＲ、ＴｃａＡ、ＡｇｒＡ、ＷａｌＲ、ｓｉｇＢ、Ｋｓｉｇ、もしくはｆｈｕ、またはこれらのいずれかの機能的変異体もしくはホモログから選ばれ、
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
（ｉ）細胞の適応機構、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞のストレス機構
のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターであって、
二次構造の少なくとも１つのエレメントを含み、
前記デコイポリヌクレオチド中の前記標的転写因子の結合部位は、配列番号５〜２７、４０、４１、４４、４５、４８、４９、５７〜６０のいずれかまたはデコイ機能を保持するその変異体もしくはフラグメントによりコードされた配列を含むデコイポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記標的転写因子が、
（ａ）細胞の排出ポンプタンパク質、細胞壁の組成、細胞壁密度もしくは細胞壁代謝を決定するタンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｂ）細胞のストレス応答の１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｃ）金属調節タンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｄ）窒素固定タンパク質をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｅ）病原性タンパク質もしくはビルレンス因子をコードする１個のまたは複数個の遺伝子、
（ｆ）１個のまたは複数個の必須遺伝子、
のうち１つ以上を発現させるためのレギュレーターである、請求項１に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状二本鎖ＤＮＡもしくは直鎖オリゴヌクレオチド、および／または前記転写因子の結合部位の１より多いコピー、および／または前記結合部位に付加的な配列、および／または前記ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾塩基もしくは修飾糖、および／またはプラスミドを含む、請求項１または２に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記デコイポリヌクレオチドが、前記転写因子の結合部位の複数のダイレクトリピートを含む、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記デコイポリヌクレオチドが、複数の転写因子結合部位を含む、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記デコイポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’コレステロール修飾を有する直鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項３、４、または５に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状ダンベルを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記デコイポリヌクレオチドが、プラスミドを含み、当該プラスミドが、スネア配列を含むモノマー配列の１つ以上のコピーを有し、当該スネア配列が前記転写因子の結合部位を含み、当該結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、請求項３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項９】
細菌感染の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
前記細菌感染の治療が、１種以上の抗生物質および／または他の抗菌剤の使用を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
細菌感染が、肺炎、菌血症、百日咳、ライム病、ブルセラ症、急性腸炎、敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、野兎病、インフルエンザ、消化器潰瘍、レジオネラ症、淋病、院内感染、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、リケッチア、腸チフス、赤痢、コレラ、疫病、炭疽菌、偽膜性大腸炎、ジフテリア、リステリア病、結核、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）から選ばれることを含む、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて含む、洗浄組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドと、１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とを含むキットであって、前記デコイと前記１種以上の抗生物質および／または抗菌剤とは、殺菌、細菌増殖阻害、細菌のビルレンス低減のために組み合わせて使用される、キット。
【請求項１５】
殺菌する、細菌増殖を阻害する、または細菌ビルレンスを低減させる生体外方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを、任意に１種以上の抗生物質および／または抗菌剤と組み合わせて適用することを含む、方法。
【請求項１６】
原核細胞の生存能力を低減させる方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、かつ
前記標的転写因子は、細胞の必須遺伝子のレギュレーター、あるいは
（ｉ）細胞の適応機構、
（ｉｉ）細胞の固有の抗生物質耐性機構、
（ｉｉｉ）細胞のビルレンス因子、
（ｉｖ）細胞のストレス機構
のうち１つ以上をコードする１個のまたは複数個の遺伝子を発現させるためのレギュレーターである、方法。
【請求項１７】
原核生物の抗生物質感受性を増加させる方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のデコイポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）１個のまたは複数個の遺伝子に機能的に結合した前記転写因子の結合部位を含む原核細胞に前記デコイポリヌクレオチドを導入すること、を含み、
前記デコイポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における結合部位への前記標的転写因子の結合を低減させ、前記機能的に結合した１個のまたは複数個の遺伝子の発現を変化させ、これにより前記細胞の抗生物質感受性を増加させる、方法。
【請求項１８】
生存能力を低減させることが、
（ｉ）ストレス応答などの細胞の適応応答を阻害すること、
（ｉｉ）抗生物質に対する細胞の感受性を増加させること、
（ｉｉｉ）１個以上の必須遺伝子の発現を阻害すること、
（ｉｖ）１個以上のビルレンス遺伝子の発現を阻害すること、のうち１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
原核生物が菌類である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記菌類が病原性である、請求項１９に記載の方法。