(57)【要約】      （修正有）【課題】腹部膨満、腹部痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、及び嘔吐等のラクトース不耐性の症状を低減させるための組成物及び方法の提供。【解決手段】ベータカゼインアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼイン変異体を少なくとも７５重量％含む組成物を投与することにより、消化プロセス及び腸機能に関わる酵素の活性及びレベルの制御を担う、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＯＯＫＢＲ等の遺伝子の変化を予防又は最小化し、ラクトース不耐性の症状を低減させる方法。該ベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含むことが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の使用であって、該組成物が、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の使用であって、該ベータカゼインが、１００％のベータカゼインＡ２を含む使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用であって、該組成物が、乳または乳製品である使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、該乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、または非低温殺菌乳である使用。
【請求項６】
請求項４に記載の使用であって、該乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームである使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用であって、ラクトース不耐性の症状が、腹部膨満および痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、ならびに嘔吐の１以上を含む使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用であって、ラクトース不耐性の症状の予防または低減が、該動物による該組成物の消費に対する急性反応である使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用であって、該組成物が、該動物を、将来のラクトースへの曝露の際にラクトース不耐性の症状を予防または低減するような体質にする使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用であって、該動物がヒト、イヌ、またはネコである使用。
【請求項１１】
動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物であって、その組成物が、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む組成物。
【請求項１２】
動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の製造における乳の使用であって、該乳が、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
【請求項１３】
動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の製造におけるベータカゼインＡ２の使用であって、該組成物が、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、該ベータカゼインＡ２が、乳の構成要素である使用。
【請求項１５】
動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための方法であって、該動物
によるベータカゼインを含有する組成物の消費、または該組成物の該動物への消費のための提供を含み、該ベータカゼインが少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトース不耐性の症状を低減または予防するための乳タンパク質ベータカゼインＡ２の使用に関する。特に、本発明は、乳および乳由来食物製品に関する。出願人は、高レベルのタンパク質ベータカゼインＡ２を含有する乳および乳製品の消費ならびにベータカゼインＡ１を含有する乳および乳製品の回避は、ラクトース不耐性の症状を低減または予防するために有益であることを見出している。特に、その有益な作用は、即時（急性）であり、加えて、将来のラクトースへの曝露に対するラクトース不耐性の症状を予防または低減する進行中の（ｏｎｇｏｉｎｇ）（ベータカゼインＡ１への曝露後の）体質（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を誘導する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトース不耐性は、一般に、弱められたラクトースを消化する能力を指す。ラクトースは、ガラクトースおよびグルコース単糖を含む二糖炭水化物である。ラクトースは、乳および乳由来酪農製品中にある。ヒトの乳は、約９％のラクトースを含み、一方で未処理の牛乳は、約４．７％のラクトースを含む。ヤギ、バッファローおよびヒツジからの乳も、４．５〜５．０％の範囲のラクトースを含有する。ラクトースの消化は、ラクトースのガラクトースおよびグルコースへの、ラクターゼ酵素による加水分解（または開裂）である。
【０００３】
ラクトース不耐性である人は、彼らの消化系において十分なレベルのラクターゼを欠いている。ラクトースは、小腸の壁を通って血流中に吸収されることができず、従って、ラクターゼにより分解されない場合、無傷で通過して結腸に入る。結腸におけるラクトースの細菌発酵は、大量のガスを生成する。さらに、未吸収の炭水化物および発酵産物は、結腸の浸透圧を上昇させ、それは腸中への水の流れの増大を引き起こす。従って、ラクトース不耐性は、腹部膨満および痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、またはさらには嘔吐を含むある範囲の症状を引き起こし得る。これらの症状は、通常はラクトースの消費の約３０分〜２時間後に起こる。
【０００４】
早期乳児期の哺乳類は、ラクターゼを生成するが、この生成は、通常は離乳後に止まる。しかし、一部のヒト集団は、ラクターゼ生成が成人期へと継続するラクターゼ持続症（ｌａｃｔａｓｅ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）を発現してきた。異なる集団におけるラクターゼ持続症の程度は、酪農製品が食物源として利用可能である文化に有利に働く自然選択の結果であると考えられている。
【０００５】
ラクトース不耐性は、許容され得るラクトースの量が人によって異なる点で、絶対的ではない。一般に、ラクトース不耐性の人は、試行錯誤により、どれだけ多くのラクトースを彼らが許容することができるかを割り出さなければならない。これは、通常は、食事のラクトースのレベルを制御することにより、または食事のラクトースを完全に避けることにより行われる。一部の場合において、酵素的ラクターゼ補助剤が用いられることができる。植物ベースの乳または乳派生物、例えば豆乳、ライスミルク、アーモンドミルク、ココナッツミルク、エンバクミルク、ヘンプミルク（ｈｅｍｐ  ｍｉｌｋ）、およびピーナッツミルクが、それらは本質的にラクトースを含まないため、用いられることができる。多くの利用可能なラクトースを含まない、またはラクトースを低減した食物も存在する。そのような食物の利用可能性にも関わらず、食事における乳または酪農製品の回避は、しばしば困難である。
【０００６】
乳（および他の酪農製品）の消費およびラクトース不耐性の症状の間の関連は、周知で
ある。しかし、明確にラクトース不耐性に関する医学的診断の非存在下で、多くの人は、彼らは、彼らが患っている症状を乳または他の酪農製品の消費と関連付けるため、誤って彼ら自身をラクトース不耐性であると考える。その症状は、実際には、そうでなければ無視できる、または目立たない作用を悪化させる他の乳構成要素によるものである可能性がある。タンパク質は、そのような症状を引き起こす、また悪化させ得る構成要素の例である。
【０００７】
世界中の人々に消費されている乳、主に牛乳は、ヒトの食事におけるタンパク質の主な源である。牛乳は、典型的には１リットルあたり約３０グラムのタンパク質を含む。カゼインは、そのタンパク質の最大の構成要素（８０％）を構成し、ベータカゼインは、カゼインの約３７％を構成する。過去２０年間に、カゼインタンパク質、特にベータカゼインがいくつかの健康障害に関与していることを示す一連の証拠が増えてきている。
【０００８】
ベータカゼインは、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２として分類され得る。これらの２種類のタンパク質は、ほとんどのヒトの集団において消費される乳中の主なベータカゼインである。ベータカゼインＡ１は、ベータカゼインＡ２と１個のアミノ酸が異なる。ヒスチジンアミノ酸がベータカゼインＡ１の２０９アミノ酸配列の６７位に位置しており、一方でプロリンがベータカゼインＡ２の同じ位置に位置している。しかし、この１個のアミノ酸の違いは、腸中でのベータカゼインの酵素消化に決定的に重要である。６７位におけるヒスチジンの存在は、ベータカゾモルフィン−７（ＢＣＭ−７）として知られる７アミノ酸を含むタンパク質断片が酵素消化で生成されることを可能にする。従って、ＢＣＭ−７は、ベータカゼインＡ１の消化産物である。ベータカゼインＡ２の場合、６７位はプロリンで占められており、それはその位置におけるアミノ酸結合の切断を妨げる。従って、ＢＣＭ−７はベータカゼインＡ２の消化産物ではない。
【０００９】
他のベータカゼインのバリアント、例えばベータカゼインＢおよびベータカゼインＣも、６７位においてヒスチジンを有し、他のバリアント、例えばＡ３、ＤおよびＥは、６７位においてプロリンを有する。しかし、これらのバリアントは、欧州起源の雌ウシからの乳中に非常に低いレベルでしか存在しないか、または全く存在しない。従って、本発明の文脈において、ベータカゼインＡ１という用語は、６７位においてヒスチジンを有するあらゆるベータカゼインを指し、ベータカゼインＡ２という用語は、６７位においてプロリンを有するあらゆるベータカゼインを指す。
【００１０】
ＢＣＭ−７は、オピオイドペプチドであり、体全体でオピオイド受容体を強力に活性化することができる。ＢＣＭ−７は、胃腸壁を越えて循環に入る能力を有し、これはそれがオピオイド受容体を介して全身および細胞性活性に影響を及ぼすことを可能にする。出願人は、以前に、乳および乳製品中のベータカゼインＡ１の消費ならびにＩ型糖尿病（国際公開第１９９６／０１４５７７号）、冠動脈性心疾患（国際公開第１９９６／０３６２３９号）および神経障害（国際公開第２００２／０１９８３２号）を含む特定の健康状態の発生率の間の関連を決定している。
【００１１】
ＢＣＭ−７は消化機能にも影響を及ぼし得るという推測が存在してきた。オピオイド受容体は、胃腸運動性、粘液産生およびホルモン産生の制御を含む胃腸機能の調節において役割を果たしていることが報告されている（例えば、Mihatsch, W.A, et al., Biol. Neonate, 2005, 87(3):160-3）。乳中にあるカゼインは、腸運動性の阻害と関係していると
考えられており、それは便秘をもたらす可能性があり(Gunn T.R. and Stunzer D., NZ Med. J., 1986, 99(813):843-6)、カゾモルフィン類および合成カゾモルフィン誘導体に関
する研究は、ＢＣＭ−７がこのオピオイド受容体に媒介される作用に寄与していることを示している(Charlin V. et al., Rev. Med. Chil., 1992, 120(6):666-9)。しかし、カゾモルフィンおよび腸における通過時間の間の関連に関するいくらかのインビトロの証拠は
存在するが、その作用は必ずしもヒトにおけるインビボの作用に外挿され得るわけではないことは明らかである。例えば、少なくとも１つの研究は、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２の消費および便秘の間の関係を実証することができなかった(Crowley, E.T., Nutrients, 2013, 5, 253-266)。加えて、ＢＣＭ−７は、ミュー−オピエート受容体に媒介される経路を介して粘液の産生を刺激し(Zoghbi, S., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 290(6):G1105-13)、免疫系と関係する細胞である粘膜固
有層リンパ球の増殖を調節する(Elitsur, Y. and Luk, G.D., Clin. Exp. Immunol., 1991, 85(3):493-7)ことが示されている。より最近になって、ベータカゼインＡ１は、胃腸
管において組織の炎症を引き起こすことが報告されている(Ul Haq, M.R., et al., Eur. J. Nutr., 2013; Barnett, M.P.G., et al., Int. J. Food Sci. Nutr., 2014)。ベータ
カゼインＡ１由来のＢＣＭ−７により誘導される炎症は、影響を受けた組織の後成的ＤＮＡ修飾およびその後の遺伝子発現に対する下流の作用を有することが実証された(Trivedi, M.S., et al., J. Nut. Bio., 2014)。
【００１２】
上記の報告は、カゼインおよびカゾモルフィン（ＢＣＭ−７を含む）ならびに胃腸機能の間の関連を示している。これらの報告は、乳タンパク質もしくは一般にカゼインを用いた研究またはＢＣＭ−７自体を用いた研究に基づいている。しかし、今までに、ベータカゼインＡ１の消費を胃腸機能および特にラクトース不耐性の症状に直接関連付ける報告は存在しなかった。加えて、ベータカゼインＡ２の含有率が高い（そして逆にベータカゼインＡ１の含有率が低い）乳を飲んだ後の胃腸機能の改善に言及する、未知または未確認の条件を有する消費者からの逸話的な報告（オンラインおよびメディア）が存在してきたが、これらは非科学的な報告であり、これらは機能におけるあらゆる改善の原因に関して非特異的である。さらに、そのような乳の消費において改善作用がないことの多くの逸話的な報告も存在する。これらの報告は、それらが便秘から下痢までの、運動性および便の硬度の消化作用の連続体（ｃｏｎｔｉｎｕａ）にわたる報告を含む点で、矛盾している。結論は、特に潜在的に結果に影響を及ぼし得る変数の数が非常に大きい食物製品および生理機能の場合には、逸話的な報告から確信をもって出すことはできない。
【００１３】
出願人は、ここで、ベータカゼインＡ１の消費およびラクトース不耐性の症状の間の直接的な関連に関する決定的な科学的証拠を見出した。腸の健康に影響を及ぼし得るヒトの食事における無数の要因、ならびに乳および乳製品が多岐にわたるタンパク質構成要素および他の構成要素を含有することを考慮すると、出願人のベータカゼインＡ１の消費およびラクトース不耐性の症状の間の明確な直接的関係の発見は、驚くべきものである。重要なことだが、出願人は、ベータカゼインＡ１の消費に対する急性かつ望ましくない応答の証拠だけでなく、ベータカゼインＡ１の消費および結果としてもたらされるＢＣＭ−７の生成は、動物において、より低いラクトースのレベルおよび結果として将来のラクトースへの曝露の際にラクトース不耐性の症状を引き起こす増大した可能性をもたらす遺伝的変化を誘導し得るという点で、進行中の（ベータカゼインＡ１またはＢＣＭ−７への曝露後の）応答の証拠も見出している。
【００１４】
従って、ラクトース不耐性の症状を低減もしくは予防するための方法を提供すること、または少なくとも既存の方法に対する有用な代替策を提供することが、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第１９９６／０１４５７７号
【特許文献２】国際公開第１９９６／０３６２３９号
【特許文献３】国際公開第２００２／０１９８３２号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Mihatsch, W.A, et al., Biol. Neonate, 2005, 87(3):160-3
【非特許文献２】Gunn T.R. and Stunzer D., NZ Med. J., 1986, 99(813):843-6
【非特許文献３】Charlin V. et al., Rev. Med. Chil., 1992, 120(6):666-9
【非特許文献４】Crowley, E.T., Nutrients, 2013, 5, 253-266
【非特許文献５】Zoghbi, S., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 2006, 290(6):G1105-13
【非特許文献６】Elitsur, Y. and Luk, G.D., Clin. Exp. Immunol., 1991, 85(3):493-7
【非特許文献７】Ul Haq, M.R., et al., Eur. J. Nutr., 2013
【非特許文献８】Barnett, M.P.G., et al., Int. J. Food Sci. Nutr., 2014
【非特許文献９】Trivedi, M.S., et al., J. Nut. Bio., 2014
【発明の概要】
【００１７】
本発明の第１観点において、動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の使用が提供され、ここで、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１８】
本発明の第２観点において、動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物が提供され、その組成物は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００１９】
本発明の別の観点において、動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の製造における乳の使用が提供され、ここで、その乳は、ベータカゼインを含有し、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００２０】
別の観点において、動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減するための組成物の製造におけるベータカゼインＡ２の使用が提供され、ここで、その組成物は、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。そのベータカゼインＡ２は、好ましくは乳の構成要素である。その乳は、好ましくは牛乳である。
【００２１】
本発明のさらなる観点において、動物においてラクトース不耐性の症状を予防または低減する方法であって、その動物によるベータカゼインを含有する組成物の消費、またはその組成物のその動物への消費のための提供を含む方法が提供され、ここで、そのベータカゼインは、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む。
【００２２】
ベータカゼインＡ２の量は、ベータカゼインの７５重量％〜１００重量％の範囲のあらゆる量、例えば少なくとも９０％またはさらには１００％であることができる。
【００２３】
本発明の特定の態様において、組成物は、乳または乳製品である。乳は、粉乳または液乳であることができる。乳製品は、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、アイスクリーム、またはあらゆる他の乳製品であることができる。
【００２４】
ラクトース不耐性の症状は、腹部膨満および痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、ならびに嘔吐であり得るが、それらに限定されない。
【００２５】
動物による組成物の消費に対する応答は、急性応答である可能性があり、加えて動物において将来のラクトースへの曝露に対するラクトース不耐性の症状を予防または低減する体質を誘導し得る。
【００２６】
本発明のほとんどの態様において、動物はヒトである。しかし、他の態様において、動物は、イヌ、ネコ、または飼料に乳が補われるあらゆる他の飼育動物であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける胃腸通過時間を示す。
【図２】図２は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける十二指腸ラクターゼ活性を示す。
【図３】図３は、実施例１の飼料を与えられたラットにおける結腸ミエロペルオキシダーゼ活性を示す。
【図４】図４は、神経細胞およびＧＩ上皮細胞における、モルヒネおよびＢＣＭ−７濃度依存性のシステインの取り込みを示す。
【図５】図５は、神経細胞およびＧＩ上皮細胞における、時間依存性のシステインの取り込みを示す。
【図６】図６は、ＢＣＭ−７およびモルヒネのシステイン取り込みへの作用の媒介における、μオピオイド受容体の関与を示す。
【図７】図７は、時間の経過にわたるＢＣＭ−７およびモルヒネのシステインレベル、ＧＳＨ／ＧＳＳＧおよびＳＡＭ／ＳＡＨへの作用を示す。
【図８】図８は、ラクトース代謝およびラクトース合成に関与していることが示されている遺伝子におけるＣｐＧメチルへのＢＣＭ−７の影響を示す。
【図９】９は、ラクトース代謝およびラクトース合成に関与していることが示されている遺伝子におけるＣｐＧメチルへのＢＣＭ−７の影響を示す。
【図１０】図１０は、ラクターゼをコードしているＬＣＴ遺伝子の、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２飼料を１０および２０週間与えられたＮＯＤマウスの小腸におけるレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、タンパク質ベータカゼインを含有する組成物およびラクトース不耐性の症状の低減または予防のためのその使用に関する。重要なことだが、そのベータカゼインは、ベータカゼインのＡ２バリアントであり、またはその組成物中に存在する総ベータカゼインバリアントの少なくとも７５重量％を構成する。その組成物中のＡ２バリアントの優勢（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ）の重要性は、出願人がＡ１バリアントおよびヒトにおけるラクトース不耐性の症状の間の直接的な関連が存在することを示しているという事実による。出願人は、十二指腸中の高レベルのＡ２バリアントを含有する乳タンパク質の存在は、ラクターゼ活性を有益に刺激することも示している。従って、Ａ１バリアントの消費が回避され、代わりにＡ２バリアントが消費される場合、腸の健康における向上が予想され得る。
【００２９】
用語“ラクトース不耐性の症状”は、本明細書で用いられる際、腹部膨満および痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、ならびに嘔吐を含むある範囲の症状のいずれか１つ以上を意味することが意図されており、その症状は、急性、移行期または慢性であることができる。
【００３０】
用語“急性”は、本明細書で用いられる際、別途示されない限り、ベータカゼインＡ１の消費からベータカゼインＡ１またはＢＣＭ−７が腸から出る（典型的には消費の８〜２０時間後）までの期間の間を意味することが意図されている。
【００３１】
ほとんどのヒト集団の食事におけるベータカゼインの主な（それのみではないとしても）源は、乳または乳に由来する製品であるため、そして消費されるほとんどの乳はベータカゼインのＡ１およびＡ２バリアントのみの混合物を含有するため、高含有率のＡ２バリ
アントを有する乳（またはそのような乳から作られた製品）の消費は、必然的に、Ａ１バリアントの消費が低いことを意味するであろう。これに従って、ベータカゼインの唯一の食事での源がＡ２バリアントを含有し、他のバリアントを含有しない場合、Ａ１バリアントの食事での摂取は排除され、従って、ベータカゼインＡ１の消費に起因するラクトース不耐性の有害な症状も、排除されることが予想され得る。
【００３２】
従って、本出願の発明は、食事におけるベータカゼインＡ１の低減または排除、およびベータカゼインＡ２の促進に基づいており、これは、ベータカゼインを含有する食物組成物、特に乳および乳製品中のベータカゼインが、主に、さらには排他的にベータカゼインＡ２であることを確実にすることにより達成される。
【００３３】
理想的には、組成物中のベータカゼインは、１００％ベータカゼインＡ２である。従って、ベータカゼインＡ１の完全な排除は、ラクトース不耐性の症状を完全に低減または排除することにより、関係する健康の利益を最大化する。しかし、症状は、ベータカゼインが主にベータカゼインＡ２である、例えば、７５重量％〜１００％のあらゆる量であるあらゆる組成物において低減される可能性があり、それには８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％および９９重量％が含まれるが、それらに限定されない。
【００３４】
本発明の組成物は、典型的には乳であるが、あらゆる乳由来の製品、例えばクリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームであることもできる。組成物は、乳から得られたベータカゼインを含有する非乳製品であることもできる。組成物は、ベータカゼイン自体であることができ、またはベータカゼインから調製されることができ、そのベータカゼインは、粉末もしくは顆粒のような固体形態、または固体のケーキの形態であることができる。
【００３５】
乳は、ヒト、ヤギ、ブタおよびバッファローを含むあらゆる哺乳類から得ることができ、本発明の好ましい態様において、乳は牛乳である。
【００３６】
乳は、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳もしくは非低温殺菌乳、または乳のあらゆる他の形態であることができる。
【００３７】
本発明の組成物は、主にヒトによる消費に適用可能であるが、健康の利益は一部の他の動物、例えばネコ、イヌおよび他の飼育動物にも関連していることは、理解されるべきである。
【００３８】
本発明に関する支持は、実施例において記載される実験において見出される。
【００３９】
実施例１は、実施例２〜４のラットの試験に関する給餌方法論を述べている。飼料を表１において示す。Ａ１乳飼料は、飼料中の全てのベータカゼインがベータカゼインＡ１である配合物に基づいている。Ａ２乳飼料は、飼料中の全てのベータカゼインがベータカゼインＡ２である配合物に基づいている。対照飼料は、タンパク質含有物が卵白である配合物に基づいている。
【００４０】
実施例２は、実施例１の異なる飼料を与えられたラットにおける胃腸通過時間（ＧＩＴＴ）の研究を記載している。トレーサーとして用いられた二酸化チタン（ＴｉＯ２）を、動物に、給餌の１２時間後に経口投与した。ＴｉＯ２の回収を、図１において、時間（ｈｏｕｒｓ）に対する％回収として示す。Ａ１飼料を与えられたラットは、Ａ２飼料を与えられたラットと比較して遅延した通過を示し、両方の群が、対照飼料を与えられたラットと比較して遅延を示した。これは、ベータカゼインＡ１が、ＢＣＭ−７の遊離のため、ベ
ータカゼインＡ２よりも高い一般オピオイド活性を有することと一致している。ラクトース不耐性の症状は、腸中のラクトースの細菌発酵に関連している。発酵の間の細菌数は、ＧＩＴＴと共に指数関数的に増大する。従って、運動性が２倍低下する場合、発酵の速度、従ってラクトース不耐性の症状の発現において４倍の増大があるであろう。従って、実施例２は、ベータカゼインＡ１を含有する飼料が、ベータカゼインＡ２を含有する飼料と比較して、ＧＩＴＴにおける遅延に寄与してラクトース不耐性の症状を引き起こす可能性がより高いことの証拠である。
【００４１】
実施例３は、急性給餌（１２時間後）後の十二指腸におけるラクターゼ活性が、慢性給餌後（６０時間後）と比較して、１００％Ａ２飼料を与えられたラットに関して強く上昇しているが、１００％Ａ１飼料を与えられたラットに関しては上昇していないことを示している。これは、ベータカゼインＡ２、およびベータカゼインＡ２を含有する乳または乳製品は、健康な胃腸機能および食事中のラクトースの消化を促進するために、または乳および酪農製品が消費された際に経験されるラクトース不耐性の症状を軽減もしくは排除するために用いられることができることを意味する。ベータカゼインＡ２を含有する食事は、ラクターゼの分泌または活性を刺激するが、ベータカゼインＡ１を含有する食事はそれを刺激しないと考えられる。これは、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の消化産物が、小腸に入る乳タンパク質の塊（ｂｏｌｕｓ）による酵素分泌の刺激後の組織炎症および機能に対して有する差異のある作用によるものである可能性が最も高い。
【００４２】
実施例４は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２飼料の、ラットの結腸におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性への作用に関する。ＭＰＯ活性は、炎症に関するマーカーである(Krawisz, et al., Gastroenterology, 1984, 87(6):1344-1350およ
びDommels, Y.E.M., et al., Genes Nutr., 2007, 2(2):209-223)。結腸のＭＰＯ活性は
、ベータカゼインＡ１を与えられたラットにおいて、ベータカゼインＡ２を与えられたラットと比較して増大することが分かり、これは、ベータカゼインＡ１を与えられたラットにおける好中球の増大したレベルを示しており、それは今度は炎症反応の指標である。その作用は、ナロキソン（既知のオピオイド受容体拮抗薬）で処理されたラットにおいては観察されず、これは、その作用が、ＢＣＭ−７のミュー−オピエート受容体との相互作用を通して媒介されていることを示している。結腸の炎症は、ラクトース不耐性の症状に対する増大した易罹患性または感受性を引き起こす。
【００４３】
実施例５は、ＢＣＭ−７は、システインの取り込みを濃度依存性の様式で阻害することができることを示している。モルヒネは、ＢＣＭ−７よりも大きい有効性を示し、ＩＣ５０値は、神経細胞において（それぞれ）０．１６および１．３１ｎＭ、ＧＩ上皮細胞において（それぞれ）６．３８および１５．９５ｎＭであった（図４）。システイン取り込みの阻害は、３０分後に完全に発現され、４８時間のモルヒネまたはＢＣＭ−７曝露を通して持続した（図５）。これは、ＢＣＭ−７への１回の曝露後のシステイン取り込みへの長期の慢性作用を示している。選択的μ−拮抗薬の存在下で遮断され、デルタオピオイド受容体では遮断されないことは、これらの作用がμ−オピオイド受容体により媒介されていることを示した。
【００４４】
食物由来ペプチドは、細胞中のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のレベルを制御することができるグルタチオンのレベルを含む酸化還元代謝を変化させることが報告されている。ＳＡＭは、ＤＮＡメチル化変化の媒介に関する普遍的なメチル供与体である。これらの変化は、後成的制御記憶の一部であり、恒常性を維持するために遺伝子発現のレベルを制御することができる。重要なことだが、これらの変化は、高度に安定であり、遺伝子発現／抑制に干渉し、従って遺伝子レベルを永久に変化させる可能性を有し得る。従って、グルタチオンのレベルは、遺伝子が重要な役割を果たしている経路、例えばラクトース合成および代謝経路に影響を及ぼし得る。従って、ＢＣＭ−７により酸化還元に基づくシ
グナル伝達経路を介して誘導される後成的変化は、ラクトース合成および代謝の原因となる制御遺伝子に影響を及ぼす可能性があり、従って体におけるラクトースレベルに影響を及ぼす可能性がある。体は、特定の合計レベルのラクトースを吸収する、代謝する、取り除く（ｃｌｅａｒ）、または貯蔵するように順応する（ａｔｔｕｎｅｄ）。そのレベルが、ＢＣＭ−７の影響下で変化した場合、ラクトースレベルを制御する体の能力が飽和し、従って下流の病態生理学的無症候性または臨床的作用を誘導し得る。
【００４５】
実施例６は、ＢＣＭ−７およびモルヒネが、システインおよびグルタチオン（ＧＳＨ）レベル両方における時間依存性の低下を引き起こすことを示している。神経細胞におけるシステインの細胞内レベルおよび細胞の酸化還元状態（ＧＳＨの、その酸化型であるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）に対する比率により反映される）も低下し（図６）、これは、酸化的ストレス状態の可能性を示している。さらに、メチル化能力（ＳＡＭ／ＳＡＨの比率により示される）も、ＢＣＭ−７処理により、異なる時点において影響を受けた（図７）。従って、ＢＣＭ−７は、主な細胞内抗酸化物質レベル、特にＧＳＨレベルにおける低減を誘導する。低減したＧＳＨレベルは、ＳＡＭレベルを制御することにより、酸化的ストレスシグナル伝達経路を介してクロマチン修飾を誘導することが知られている。
【００４６】
実施例７は、ＢＣＭ−７により誘導されたＤＮＡメチル化レベルを調べている。図８は、ＢＣＭ−７により影響を受ける炎症反応の媒介の原因である遺伝子の１つであるＭＰＯにおけるＤＮＡメチル化の変化を示している。酸化還元状態における変化は、炎症遺伝子の後成的状態における長期の変化を引き起こすことが示されている。これは、分子的損傷（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｕｌｔｓ）の記憶に相当し、ラクトース不耐性に対する長期の慢性的変化および炎症反応に寄与している可能性がある。従って、ＢＣＭ−７は、ベータカゼインＡ１を与えた研究から明らかであるように、ＭＰＯ活性を変化させるだけでなく、ＭＰＯ遺伝子の後成的状態も変化させ、従って、ラクトースの合成および代謝への進行中の、および長期の作用（ａｆｆｅｃｔ）を有する。変化したラクトースレベルの下流の作用は、胃腸機能不全および消化の問題を含み得る。図９において示されているように、ＢＣＭ−７は、酵素、例えばラクトースの代謝および分解に関わっているラクターゼの後成的状態を変化させる。これは、人によって許容可能である可能性も許容可能でない可能性もある蓄積したラクトースのレベル、およびラクトースの制御された濃度をもたらし得る。許容可能でない場合、消化機能における変化および腸の炎症が予想され得る。
【００４７】
ＢＣＭ−７は、表４において示されるように、消化機能に関わる酵素にも影響を及ぼす。Ｂ４ＧＡＬＴ２、ＬＧＡＬＳ１２およびＢ４ＧＡＬＴ１は、ガラクトース代謝に関わる酵素をコードする遺伝子である。ガラクトースは、ラクトースの合成における重要な中間体である。同様に、ＧＫＮ１、ＧＡＬＫ２、ＧＡＬＲ２、ＧＡＬＴ、およびＧＡＬＲ１は、ガラクトースのレベルの制御に関わり、従って、ラクトースのレベルを間接的に制御する酵素をコードしている。これらの酵素の活性における変化は、ラクトースのレベルにおける変化を間接的にもたらし得る。ＢＣＭ−７は、これらの酵素の酵素活性を、これらの遺伝子の後成的状態を制御することにより変化させる。これは、酸化還元状態の機構的制御により媒介される。これらの変化は、最終的にラクトースレベルを急性期において歪めるだけでなく、次の世代に渡される可能性さえある後成的変化のために長期の作用も有し得る。
【００４８】
ＢＣＭ−７は、ラクトースの合成および代謝における変化を媒介するだけでなく、消化プロセスおよび腸機能に関わる酵素の活性およびレベルも制御し得る。コレシストキニン、モチリン、セクレターゼ、およびオキシトシンのような酵素に関する遺伝子は、ＢＣＭ−７により影響される変化した後成的状態を有することが示されている。これは、個人の胃腸機能および消化能力に直接影響を及ぼすであろう。従って、ＢＣＭ−７は、変化した
腸の運動性、消化異常、鼓腸および下痢の症状に寄与していると考えられ、その全てがラクトース不耐性の症状である。
【００４９】
ラクターゼ酵素レベルに対する後成的変化の下流の作用は、ｑＰＣＲでのｍＲＮＡレベルの研究においてさらに確証された（実施例８）。ＮＯＤマウスに、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２富化試料を、離乳後に与えた。安楽死後、腸試料を解剖し、収集した。ＲＮＡを、これらの試料から単離し、小腸におけるラクターゼ酵素レベルに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施した。図１０において示されているように、ラクターゼ酵素のｍＲＮＡレベルは、ベータカゼインＡ２飼料を１０および２０週間与えられたマウスの小腸において、ベータカゼインＡ１飼料を同じ期間にわたって与えられたマウスの小腸におけるラクターゼｍＲＮＡのレベルと比較してより高かった。ラクターゼ酵素のより高いレベルを有することで、ベータカゼインＡ２を与えられたマウスは、ラクトースを消化系から取り除くと考えられ、特定のレベルのラクトースのみを利用可能にするであろう。従って、ラクトース不耐性と関係する症状が回避される。対照的に、小腸においてラクターゼｍＲＮＡのより低いレベルを有することで、ベータカゼインＡ１飼料を与えられたマウスは、より高いレベルのラクトースが蓄積することを可能にし、従ってラクトース不耐性の症状を引き起こし得る。
【００５０】
これらの研究は、ベータカゼインＡ１の消費およびラクトース不耐性の症状の間の関連、そしてさらに、（ベータカゼインＡ１の消費と比較した）ベータカゼインＡ２の消費が、将来のラクトースへの曝露に対するラクトース不耐性の症状を予防または低減する有益な体質を誘導することの最初の明確な科学的証拠である。以前に、（ベータカゼインＡ１自体ではなく）ＢＣＭ−７に関連する非決定的かつ矛盾する逸話的報告が、当業者の間で混乱をもたらしており、多くがそのような関連はなかったと信じている。出願人の発見により、自身をラクトース不耐性であると考えた多くの人々が苦しんできた問題に対する代替の可能性のある解決策、すなわち、食事におけるベータカゼインＡ１の回避が提供される。これは、ラクトース不耐性の症状を低減または予防するために利用可能な、主にベータカゼインＡ２であるベータカゼイン含有物を有する乳を得て、その乳に由来する製品を生産することにより達成され得る。
【００５１】
雌ウシの乳は、ベータカゼインＡ１およびベータカゼインＡ２の相対的割合に関して試験されることができる。あるいは、雌ウシは、ベータカゼインＡ１またはベータカゼインＡ２または両方の組み合わせを含有する乳を生産するそれらの能力に関して遺伝学的に試験されることができる。これらの技法は、周知である。
【００５２】
本発明は、ラクトース不耐性の症状を回避するための、既存の方法を超える明確な利点を有する。ほとんどの既存の方法は、食事の修正に頼っており、その多くは、しばしば限られた実際の成功しか有さず、または実際の成功を有しない。本発明は、比較的管理するのが容易である解決策、すなわち、ベータカゼインＡ１を含有する乳または乳製品の回避、ならびに、食事における乳および乳製品が、主にベータカゼインＡ２である、好ましくは１００％ベータカゼインＡ２であるベータカゼインを含有することを確実にすることを提供する。本発明は、大規模な食事の修正、例えば乳製品または他の一般的な食物製品の回避に関するあらゆる必要性を回避する。
【００５３】
本明細書における先行技術文書へのあらゆる参照は、そのような先行技術が広く知られている、またはその分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという自認と考えられるべきではない。
【００５４】
本明細書で用いられる際、単語“含む”、“含むこと”、および類似の単語は、排他的または包括的な意味で解釈されるべきではない。換言すると、それらは、“含んでいるが
、それに限定されない”を意味することが意図されている。
【００５５】
本発明は、以下の実施例への参照によりさらに記載される。特許請求されるような本発明が、これらの実施例により限定されることは決して意図されていないことは、理解されるであろう。
【実施例】
【００５６】
実施例１：給餌方法論
７２匹の離乳させた（４週齢）オスのウィスターラットを用いた。対照試料での７日間の順化期間の後、ラットに、１２または６０時間のどちらかの間、３種類の飼料：１００％Ａ１飼料、１００％Ａ２飼料、対照試料の１種類を与えた（処置あたりｎ＝６）。飼料のタンパク質構成要素は、（Ａ１およびＡ２飼料に関して）脱脂乳および（非乳タンパク質対照試料に関して）卵白に由来し、エネルギーおよび多量栄養素の組成に関して釣り合いが取られた（表１参照）。期間の終了の１５分前に、ラットにナロキソンまたは生理食塩水（対照）のどちらかを腹腔内注射により与え、次いで非消化性トレーサーである二酸化チタンを経口強制摂取させた。便および尿試料を、その後の２４時間にわたって７つの時点で採取し、それらが分析されるまで−２０℃（便）または−８０℃（尿）で保管した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例２：胃腸通過時間
胃腸通過時間（ＧＩＴＴ）を、実施例１に従って給餌したラットにおいて測定した。二酸化チタン（ＴｉＯ２）を、１００％Ａ１飼料、１００％Ａ２飼料、または対照飼料を１２時間与えた後に動物に経口投与するトレーサーとして用いた。結果を、表２において、そして図１において示す。回収データは、時間（ｈｏｕｒｓ）に対する％ＴｉＯ２回収と
して表わされている。Ａ１飼料を与えられたラットは、Ａ２飼料を与えられたラットと比較して遅延した通過を示し、両方の群が、対照飼料を与えられたラットと比較して遅延を示した。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
実施例３：ラクターゼ活性
凍結させ、粉末状にした十二指腸組織試料を、氷冷脱イオン水中でホモジナイズし（１：５  重量／体積）、次いで２，２００ｇで４において３０分間遠心分離した。上清を回収し、脱イオン水でさらに希釈した（１：２５）。試料をラクトースと共にインキュベートし、遊離したグルコースを、グルコースオキシダーゼキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて決定し、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。表３および図２は、ラットの急性（１２時間）および慢性（６０時間）給餌群の両方に関する十二指腸ラクターゼに関する結果を示す。十二指腸のラクターゼ活性は、急性給餌Ａ２群において、慢性給餌Ａ２群ならびに急性および慢性給餌Ａ１群の両方と比較して高められていた。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
実施例４：ＭＰＯ活性
実施例１に従って給餌したラットからの結腸組織を、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性に関して、確立された方法(Grisham, M.B., et al., Methods Enzymol., 1990, 186:729-742)に基づいて定量化した。結腸組織（５０ｍｇ）をホモジナイズし、遠心分離により分配し、超音波プローブにより破壊し、凍結融解サイクルを施した。内在性ＭＰＯは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質のＨ２Ｏ２依存性の酸化を触媒し、それは５６２ｎｍにおいて比色測定で測定される。活性は、同じホモジネートに関するビ
シンコニン酸（ＢＣＡ）(Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150(1):76-85)
タンパク質決定により標準化された。結果を図３において示す。Ａ１を与えられた動物と比較して、Ａ２動物は、有意に低いレベルの急性給餌後のＭＰＯ活性を示した。これは、持続性であり、慢性給餌によりさらに増大し、ナロキソンの経口投与により完全に可逆的であった。
【００６３】
実施例５：ＢＣＭ−７のシステインの取り込みへの作用
放射能標識された［３５Ｓ］−システインの取り込みアッセイを、Ｃａｃｏ−２−ＧＩ上皮細胞および神経細胞において、ベータカゼインＡ１から遊離したＢＣＭ−７の存在下で実施し、未処理の対照ならびにモルヒネ（原型的オピオイド受容体作動薬）に対して比較した。細胞における前処理を、以前に記載されたように(Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014)、３０分、４、２４および４８時間の異なる時点に関して実施した。ＳＨ−
ＳＹ５Ｙヒト神経細胞およびＣａｃｏ−２腸上皮細胞を、６ウェルプレートに蒔き、薬物で前処理し、取り込みを測定する前に様々な時間の間インキュベートした。培地を吸引し、細胞を６００μＬのＨＢＳＳで３７℃において洗浄した。非放射活性ＨＢＳＳを吸引し、６００μＬの、［３５Ｓ］−システイン（１μＣｉ／１ｍＬ）、１０μＭの未標識のシステインおよび１００μＭのＤＴＴを含有する３７℃のＨＢＳＳで置き換え、細胞を５分間インキュベートした。その［３５Ｓ］−システイン／ＨＢＳＳ混合物を吸引し、氷冷ＨＢＳＳによる２回の洗浄により処理を終了した。次いで、細胞を６００μＬのｄＨ２Ｏで溶解させ、剥がし、１．５ｍＬの微量遠心チューブ中に集め、１０秒間超音波処理した。それぞれの試料の１００μＬを、タンパク質アッセイのために取り分けた。それぞれの試料の２００μＬ（３通り（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ））を、４ｍＬのシンチレーション流体を含むシンチレーションバイアル中に取り分け、ボルテックスし、放射活性に関して計数した（タンパク質含有量に対して標準化した）。加えて、モルヒネおよびＢＣＭ−７のシステイン取り込み作用を、選択的μ−拮抗薬であるＤ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ（ＣＴＡＰ）、およびデルタ拮抗薬ナルトリンドール（ＮＴＩ）の存在下でも特性付けた。結果を図４、５および６において示す。これらの図中で用いられている記号＊は、未処理の対照に対して比較した統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示し、記号＃は、未処理の対照に対して比較した統計的有意差（ｐ＜０．００５）を示す。
【００６４】
実施例６：ＢＣＭ−７のＧＳＨおよびＳＡＭレベルへの作用
この実施例は、実施例５において観察されたようなシステイン取り込みにおける低下が、ＧＳＨの変化に変換され、抗酸化レベルに影響を及ぼし得るかどうかを調べた。ＧＳＨの細胞内レベルを、ＢＣＭ−７ならびにモルヒネを用いて、異なる時間（３０分間、４時間、２４時間）の間、ＨＰＬＣおよび電気化学勾配検出法(Hodgson et al., J. Alzh. Dis. 2013, Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014)を用いて測定した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞を、α−ＭＥＭ中でコンフルエントまで増殖させた。培地を吸引し、細胞を１ｍＬの氷冷ＨＢＳＳで２回洗浄した。ＨＢＳＳを吸引し、０．６ｍＬの氷冷ｄＨ２Ｏを細胞に添加した。細胞を、フラスコ／ディッシュから剥がし、ｄＨ２Ｏ中で懸濁した。細胞懸濁液を、氷上で１５秒間超音波処理し、懸濁液の１００μＬを、タンパク質含有量を決定するために用いた。残りの溶解物を、微量遠心チューブに入れ、等量の０．４Ｎ過塩素酸を添加し、続いて氷上で５分間インキュベートした。試料を５，０００×ｇで遠心分離し、上清を新しい微量遠心チューブに移した。１００μＬのそれぞれの試料を、円錐形のマイクロオートサンプラーバイアルに入れ、オートサンプラーの冷却トレー中で４℃で維持した。これらの試料のそれぞれの１０μＬを、ＨＰＬＣシステム中に注入した。
【００６５】
酸化還元およびメチル化経路の代謝産物の分離を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８分析カラム（３×１５０ｍｍ；３．５μｍ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（４．６×１２．５ｍｍ；５μｍ）ガードカラムを用いて成し遂
げた。２つの移動層を用いた。移動層Ａ：０％アセトニトリル、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．４ｍＭ  １−オクタンスルホン酸、リン酸によりｐＨ２．６５に調節。移動層Ｂ：５０％アセトニトリル。流速は、最初０．６ｍＬ／分に設定し、段階勾配を用いた：０〜９分０％Ｂ、９〜１９分５０％Ｂ、１９〜３０分５０％Ｂ。次いで、カラムを、次の運転の前に５％Ｂで１２分間平衡化した。温度を２７℃で維持した。用いた電気化学検出器は、ＢＤＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｅｌ  ５０４０を有するＥＳＡ  ＣｏｕｌＡｒｒａｙであり、作動電位は１５００ｍＶに設定した。試料濃度を、代謝産物のピーク面積から、標準的な較正曲線およびＥＳＡに供給されたＨＰＬＣソフトウェアを用いて決定した。試料濃度を、タンパク質含有量に対して標準化した。一部の場合において、試料を必要に応じて移動相中で希釈し、または５０μｌまでの試料を注入して、チオールレベルが標準曲線の範囲内であることを確実にした。結果を図７において示す。
【００６６】
実施例７：ＢＣＭ−７のＤＮＡメチル化レベルへの作用
ＢＣＭ−７により誘導される全体的なＤＮＡメチル化のレベルを、以前に記載された(Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014)ようなメチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質富化ゲノム配列決定（ＭＢＤ−ｓｅｑ）を用いて調べ、一方で、ｍＲＮＡ翻訳マイクロアレイデータを、未処理の対照ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞および１μＭのＢＣＭ−７で４時間処理した細胞から、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｖ３マイクロアレイチップを用いて得た。
【００６７】
ゲノムＤＮＡを、試料から、Ｅａｓｙ  ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ１８００−０１）により、細胞株に関する適切なプロトコルを用いて抽出した。断片化を、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２上で、以下の設定を用いて実施した：衝撃周期１０％、強度５、２００秒の間にバーストあたり２００サイクル。２００ｂｐの平均の長さを有する断片を得た。パワーモードは周波数掃引、温度は６〜８℃、水位は１２である。最大で５μｇを、マイクロチューブ中の１３０μｌのトリス−ＥＤＴＡ中に、ＡＦＡ増感剤（ＡＦＡ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ）と共に装填した。より少ないＤＮＡ入力（５００ｎｇまで）を有する試料に関して、ＤＮＡをトリスＥＤＴＡ中で１：５希釈した。５〜３μｇの入力を有するＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００上で、ＤＮＡ１０００チップを用いて分析した。３μｇより少ない入力を有するＤＮＡを、ロータリーエバポレーター中で２５μｌまで濃縮し、断片の分布を高感度ＤＮＡチップ上でチェックした。メチル化されたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣａｐキット（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，ベルギー）を用いて捕捉した。収量は、典型的には捕捉されたＤＮＡ全体で０．５〜８ｎｇであった。続いて、断片を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩを用いて配列決定した。断片化され、捕捉されたＤＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ７５８９）を用いて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー上で４８０／５２０ｎｍにおいて決定した。
【００６８】
ＤＮＡライブラリーを調製するため、ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ  Ｓｅｔ  １（ＮＥＢ  Ｅ６０４０）を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏ  Ｋｉｔ（９６試料、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥ−４００−１００１）との組み合わせで用いた。全部の断片化されたＤＮＡを利用し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏ  Ｋｉｔにおいて提供されたｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ配列決定アダプターを用いて、ＮＥＢのプロトコルに従った。ライブラリーのサイズ選択を、２％アガロースゲル（Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ  Ｕｌｔｒａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｉｏｒａｄ  １６１−３１０７）上で実施した。１Ｋｂ  Ｐｌｕｓラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０７８７−０１８）を用いて、ゲルを１２０Ｖで２時間運転した。３００ｂｐ＋／−５０ｂｐの断片を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔカラム（Ｑｉａｇｅｎ  ２８７０４）上で溶離し、２３μｌのＥＢ中に溶離した。
【００６９】
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー増幅指標プロトコルを、以下の変更を加えて用いた：２２μｌのＤＮＡを用いて、２１サイクルの運転を実施した。試料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ  ２８１０１）上で精製し、５０μｌのＥＢ中で溶離し、１：５希釈し、ロータリーエバポレーター中で１０μｌに濃縮した。１μｌをＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＨＳ  ＤＮＡチップに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００上でのスメア分析により濃度を決定した。試料を１０ｎＭに希釈した。ＮａＯＨによる変性後、試料を１６ｐＭまで希釈した。Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄフローセルを、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎユーザーガイドに従って調製した。配列決定を、ＨｉＳｅｑユーザーガイド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＰＥ  Ｒｕｎの実施）に従って、ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ運転に関して２×５１サイクルで実施した。
【００７０】
全ゲノムＤＮＡのＭＢＤ−ｓｅｑは、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．１およびＡＮＯＶＡ後のポストホックスチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）により定められるような、差次的にメチル化された転写産物（ＤＭＴ）を明らかにした。転写産物は、差次的にメチル化／転写された遺伝子および非コードＲＮＡの両方を含んでいた。ＢＣＭ−７により特定の生物学的または機能的に関連する経路において誘導された後成的変化ならびに転写変化を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ツールを用いて評価し、最高の影響を示す経路を同定した。結果を表４において示す。ラクトース代謝およびラクトース合成の原因である遺伝子の後成的状態における変化も、図８および９において示されるように、ＢＣＭ７の下で変化したことが報告されている。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
実施例８：ＢＣＭ−７の小腸におけるラクトースレベルへの作用
ＮＯＤマウス（オスおよびメス）に、離乳から、ベータカゼインＡ１またはＡ２乳タンパク質に富化された飼料を与え始めた。これらの飼料は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆｅｅｄｓ  Ｐｔｙ．  Ｌｔｄ．（オーストラリア）により、適切な組成および栄養を確実にするように作製された。それぞれの性別および飼料からのマウスのコホート（ｎ＝１０）を、１０週目または２０週目において安楽死させた。解剖の時点で、組織試料を採取し、ＲＮ
Ａｌａｔｅｒ（商標）中で−８０℃において保管した。４０匹のＮＯＤマウスを、この試験において追跡した：群あたり１０匹（オス／メス：Ａ１／Ａ２）。
【００７３】
ＲＮＡ転写の分析のための細胞培養からのＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）からのＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲキットを用いて単離した。手順は、製造業者のプロトコルにより記載されている手順と同じであった。単離したＲＮＡを、ＤＮアーゼで処理してＲＮＡを精製し、続いてＮＤ−１０００  ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いてＲＮＡ定量化を行った。ｃＤＮＡを、以前に記載されたように、Ｒｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）からのファーストストランドｃＤＮＡ合成を用いて合成した。ＲＮＡ（１ｍｇ）、ｄＮＴＰ混合物（１ｍＭ）、ランダムヘキサマープライマー（６０ｍＭ）を、十分な分子生物学グレードのＨ２Ｏと共に添加し、１３ｍｌの最終試料体積を達成した。それぞれの試料を、６５℃で５分間変性させ、次いで氷上に置いた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  ＲＴ（２０単位／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、５  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素反応緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、および分子生物学グレードのＨ２Ｏを添加し、最終体積を２０ｍｌに調節した。この後、ＰＴＣサーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カナダケベック州サン・ブルノ）中で２５℃で１０分間および５５℃で３０分間インキュベーションした。最後に、逆転写酵素を、８５℃で５分間のインキュベーションにより阻害した。
【００７４】
ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＲｏｃｈｅからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｑＲＴ−ＰＣＲ機械を用いて３通りの試料で実施した(Trivedi et al., Mol. Pharmcol., 2014)。ｑＲＴ−ＰＣＲを、５ｍｌのｃＤＮＡ鋳型、１０ｍＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、１０ｍｌのＲｏｃｈｅからのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉマスター、ならびにｄＨ２Ｏを用いて、２０ｍｌの終体積で実施した。この目的のために用いたプライマーは、順方向５’−ＧＧＡＧＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧ−３’および逆方向５’−ＧＡＡＣＡＣＡＡＧＣＴＡＣＡＣＧＧＧＧＡ−３’であった。試料に以下のプロトコルを施した：９５℃で５分間のインキュベーション、次いで９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間を４５サイクル、続いて９５℃で５秒間、６５℃で１分間を１サイクル、そして融解曲線に関して９７℃、続いて４０℃で９０秒間の冷却。あらゆる非特異的な増幅を回避するため、鋳型なしの対照（ＮＴＣ）をそのプレート上で運転し、解離曲線を生成して非特異的な産物を決定し、これを標準化した。データを、Ｒｏｃｈｅ定量化法Ｄ（ＤＣｔ）を用いて分析し、ベータアクチンレベルに対して標準化した。結果を図１０において示す。
【００７５】
本発明は、例として記載されてきたが、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく変更および修正を行うことができることは、理解されるべきである。さらに、特定の特徴に対して既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、あたかも本明細書において具体的に言及されたかのように組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月17日(2018.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において消化プロセスおよび腸機能に関わる酵素の活性およびレベルの制御を担う１つ以上の遺伝子への後成的変化を予防または最小化するための組成物であって、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインは、少なくとも７５重量％の、ベータカゼインアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼイン変異体を含む、前記組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも７５重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、７５重量％未満の、動物の腸における酵素消化によりベータカゾモルフィン−７を生成することができるベータカゼイン変異体を含む、前記組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物であって、該１つ以上の遺伝子への後成的変化の予防または最小化が、ラクトース不耐性の症状が引き起こされる可能性を低減させる、前記組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、症状が、腹部膨満、腹部痙攣、鼓腸、下痢、悪心、腹鳴、および嘔吐の１以上を含む、前記組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物であって、該１つ以上の遺伝子が、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＯＯＫＢＲ、ＨＴＲ３Ａ、ＭＬＮＲ、ＳＬＣ１５Ａ１、ＣＴＲＢ２、ＣＴＲＢ１、ＭＥＰ１Ｂ、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＯＥＬＡ３Ａ、ＡＭＹ１Ｃ、ＣＴＳＥ、ＯＯＫＡＲ、ＣＡＰＮ９、ＬＣＴ、Ｂ４ＧＡＬＴ２、ＬＧＡＬＳ１２、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＰＧＣ、ＳＣＴＲ、ＯＸＴＲ、Ｖ１ＰＲ１、ＳＳＴ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＧＫＮ１、ＧＡＬＫ２、ＧＡＬＲ２、ＧＡＬＴ、ＧＡＬＲ１、ＣＨＳＴ１、ＮＰＹ、およびＰＹＹからなる群より選択される、前記組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも９０重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、少なくとも９９重量％のベータカゼインＡ２を含む、前記組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、７５重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、１０重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、該ベータカゼインが、１重量％未満のベータカゼインＡ１を含む、前記組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、乳または乳製品である、前記組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、該乳または乳製品が、ベータカゼインＡ２Ａ２遺伝子型を有することが知られている乳牛から得られる、前記組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、該乳が、新鮮な乳、粉乳、粉末から再構成された液乳、脱脂乳、ホモジナイズされた乳、練乳、無糖練乳、低温殺菌乳、または非低温殺菌乳である、前記組成物。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、該乳製品が、クリーム、ヨーグルト、乳餅、チーズ、バター、またはアイスクリームである、前記組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、該動物がヒト、イヌ、またはネコである、前記組成物。
【請求項１７】
動物において消化プロセスおよび腸機能に関わる酵素の活性およびレベルの制御を担う１つ以上の遺伝子への後成的変化を予防または最小化するための組成物の製造における乳の使用であって、該乳は、ベータカゼインを含有し、該ベータカゼインは、少なくとも７５重量％の、ベータカゼインアミノ酸配列の６７位にプロリンを有するベータカゼイン変異体を含む、前記使用。
【外国語明細書】
2018203753000001.pdf