(57)【要約】【課題】ATLLを始めとする非ホジキンリンパ腫発症のリスクを有効且つ適切に判定できる方法を提供する。【解決手段】被験者のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、及び、G7467A変異の有無の少なくとも一つを検出する。非ホジキンリンパ腫は、成人T細胞性白血病リンパ腫(ATLL)である。被験者のHLA-A*02陽性の有無を検出することが好ましい。ATLLキャリアではウイルス遺伝子（Tax及びHBZ）による増殖促進作用と宿主免疫（主にTax特異的CTL）による抑制作用の均衡状態にあるが、発症の段階ではTaxの発現低下、それに伴うHBZの発現向上が見られる。例えばG7340A変異が存在する場合、Taxの発現が低くHBZの発現が高い。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の試料中のHTLV-1のTax遺伝子領域におけるTax発現低下とHBZ発現向上にかかる遺伝子変異の有無を検出する工程を有する非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項２】
被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のTax領域におけるＧ→Ａの変異の有無を検出する工程を有する請求項１記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項３】
被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、及び、G7467A変異の有無の少なくとも一つを検出する工程を有する請求項２記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項４】
前記非ホジキンリンパ腫は、成人T細胞性白血病リンパ腫(ATLL)である請求項１乃至３の何れか１項に記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項５】
前記非ホジキンリンパ腫は、B細胞リンパ腫である請求項１乃至３の何れか１項に記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項６】
前記被験者のHLA-A*02陽性の有無を検出する請求項４記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項７】
（１）PCR法により、被験者の試料中のHTLV-1遺伝子の5’LTR又はgagにおける欠失を検出する第１工程と、
（２）被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、及び、G7467A変異の有無の少なくとも一つを検出する第２工程と、
を有する非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項８】
前記PCR法は、二つのPCRを一つのPCR反応チューブで反応させるデュアルPCRであり、５’側の欠失を検出するプライマーは配列番号２１で示されるプライマーと、配列番号２２で示されるプライマーとであり、３’側の欠失を検出するプライマーは配列番号２３で示されるプライマーと、配列番号２４で示されるプライマーとである請求項７記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項９】
前記PCR法はデジタルPCR法である請求項７記載の非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法。
【請求項１０】
非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定のための診断マーカーであって、
被験者のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、又は、G7467Aである診断マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性リンパ腫はリンパ組織内の細胞が悪性化したものであるが、ホジキン細胞等の特徴的な巨細胞が認められるものをホジキンリンパ腫といい、そのほかのものを非ホジキンリンパ腫という。
【０００３】
非ホジキンリンパ腫の一つである成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫(adult T-cell leukemia/lymphoma,以下「ATLL」と略することがある。)は、ヒトT細胞性白血病ウイルスI型（human Tcell leukemia virus type I,以下「HTLV-I」と略することがある。）により惹起されるCD4陽性T細胞の悪性腫瘍である。HTLV-Iは生体内において、ウイルスの複製よりも感染細胞のクローナルな増殖によりそのコピー数を増やし、その副産物としてATLLを発症すると考えられる。ATLLは、日本でも九州や四国地方に多いというように病気の発症に地域的特徴のある病気である。
【０００４】
ATLLは、発症後の予後が非常に悪く２年以内に多くが死亡する症例であり、母乳や精液、血液等によって感染し、キャリアは日本全国に約100万人といわれ、100人に１人近い割合となる。キャリアのうち発症するのは５〜10％とされ、年間約1000の発症例が報告されている。潜伏期間は30〜70年といわれ、中高年層の発症が多くみられる。
【０００５】
ATLLに対する治療法は少なく、その中でも治療成績が優れるものとしてはmLSG15 (VCAP/AMP/VECP)という治療法があり、この治療法は抗がん剤を数種類組み合わせて、期間を開けながら各抗がん剤を順に投与していく治療法である。しかしながらmLSG15 (VCAP/AMP/VECP)でも根治できる患者さんの数は少ない。そのためATLL発症のリスクを有効且つ適切に判定する手法が切望される。
【０００６】
例えば非特許文献１には、ATLL発症のリスク診断マーカーとして可溶型IL-2レセプターが記載されている。しかしながら、この診断マーカーは、他の癌や自己免疫疾患でも発現が増加する。
【０００７】
例えば特許文献１には、被験者由来の細胞中のCYP1B1の発現レベルとコントロール細胞中のCYP1B1の発現レベルとを比較し、被験者由来の細胞中のCYP1B1の発現レベルが、有意に増加していることを指標とするATLL発症の危険性判定方法が記載されている。しかしながら、ATLL発症とCYP1B1発現との相関が十分ではない場合もあるため、この手法ではATLL発症の危険性を適切に判断することは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−０５７３７１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】S.Kamihira et al., Cancer, 73, 2753-2758, 1994,"Significance of soluble interleukin-2 receptor levels for evaluationof the progression of adult T-cellleukemia."
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、ATLLを始めとする非ホジキンリンパ腫発症のリスクを有効且つ適切に判定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にかかる非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法は、被験者の試料中のHTLV-1のTax遺伝子領域におけるTax発現低下とHBZ発現向上にかかる遺伝子変異の有無を検出する工程を有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば非ホジキンリンパ腫発症のリスクを有効且つ適切に判定することができ、これにより例えばATLL発症リスクが高いキャリアを早期に同定することができ、発症予防や病態悪化遷延を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ATLL発症におけるHTLV-1コンポーネント遺伝子の発現変化を示す図である。
【図２】３種類のHTLV-1/EBV感染B細胞（LMY3B,OATL9とLMH115）におけるHTLV-1とEBVの遺伝子発現を示す写真図である。
【図３】HTLV-1/EBV感染B細胞のHTLV-1ゲノムシーケンス解析結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は作製したTax変異G7340AにおけるPCR産物のシーケンス解析結果を示す図であり、（Ｂ）は作製したTax変異G7340Aを有するPCR産物の電気泳動結果を示す図であり、（Ｃ）は作製したTax変異G7340Aを有するmRNAのシーケンス解析結果を示す図であり、（Ｄ）はTax変異G7340Aを有する場合のTax遺伝子発現及びHBZ発現を示す図である。
【図５】Tax変異G7322Aを有する場合の発現を示す図であり、そのうち（Ａ）はTax遺伝子発現であり、（Ｂ）はHBZ発現を示す図である。
【図６】Tax変異G7467Aを有する場合の発現を示す図であり、そのうち（Ａ）はTax遺伝子発現であり、（Ｂ）はHBZ発現を示す図である。
【図７】HTLV-1ゲノム5’側欠失の検出方法を説明する図であり、そのうち（Ａ）はpX1MT-M/Wt（野生型）及びpX1MT-M/5’dMT（5’側欠失を有するHTLV-1産生ベクター）の説明であり、（Ｂ）はデュアルリアルタイムPCRの増幅結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本実施形態にかかる非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法は、被験者の試料中のHTLV-1のTax遺伝子領域におけるTax発現低下とHBZ発現向上にかかる遺伝子変異の有無を検出する工程を有する。
【００１６】
具体的には、被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のTax領域におけるＧ→Ａの変異の有無を検出する。
【００１７】
より具体的には、被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、及び、G7467A変異の有無の少なくとも一つを検出する。
【００１８】
HTLV-1遺伝子はレトロウイルス科のデルタレトロウイルス属に分類され、long terminalrepeat（LTR）やgag，pol，envといった構造遺伝子を有している。HTLV-1に特徴的な配列としてenvと3'LTRとの間にpX領域が存在する。pX領域のプラス鎖には4種のopen readingframe（ORF）とalternative splicingにより複数の調節遺伝子が存在する。ORF Iにはp12I，ORF IIにはp13IIとp30II，ORF IIIにはrex，ORF IVにはtaxがコードされる。一方pX領域のマイナス鎖にはHTLV-I bZIP factor（HBZ）がコードされる。
【００１９】
図１に示されるように、ATLL患者ではウイルス遺伝子（Tax及びHBZ）による増殖促進作用と宿主免疫（主にTax特異的CTL）による抑制作用の均衡状態にあるが、taxのプロモーターである5'LTRの欠失や、Tax領域においてTax発現低下にかかる遺伝子変異が存在している場合、感染細胞はウイルス抗原（tax）の発現が低下することにより宿主の細胞免疫システムから逃避し、結果として生きのびた細胞が特異的に増殖し、ATLLの病態が惹起される（発症リスク小）。後述の実施例で示されているが、例えばG7467A変異が存在する場合、細胞刺激性物質の存在の下、野生型と比較してTaxの発現が低下する一方でHBZの発現が上昇し、G7467A変異は発症リスク小の遺伝子変異と考えられる。
【００２０】
HTLV-1のマイナス鎖にコードされるHTLV-1 bZIP factor（HBZ）遺伝子は全てのATLL症例で保存され発現しており、ATLLの発症にはHBZが必須であると考えられており、Taxの発現低下それに伴うHBZの発現向上が認められることによりATLLの病態が誘導される（発症リスク中）。後述の実施例で示されているが、例えばHTLV-1遺伝子にG7340A変異又はG7322A変異が存在する場合、この変異によって、Tax遺伝子のスプライシングエラーが生じ、そしてTax遺伝子の発現が著しく低下し、HBZの発現が大きく向上しており、G7340A変異又はG7322A変異はG7467A変異よりもATLL発症のリスクが高い。
【００２１】
加えて、HBZ RNAはp53やCDKN1A等の細胞増殖、細胞死に関わる遺伝子の機能に、HBZタンパク質はFoxp3やIL-4等の宿主免疫に関わる転写因子、サイトカインの機能に影響を与えるところ、HBZの発現向上により、例えばp53等のがん抑制遺伝子に変異が引き起こされ、細胞死の阻害が誘導される（発症リスク大）。
【００２２】
なお、後述の実施例にて示されるように、HTLV-1/EBV感染Ｂ細胞はHTLV-1のみならずEBVも感染しており、両ウイルスのコンポーネント遺伝子が発現していることが判明しており、HTLV-1遺伝子にG7340A変異が存在する場合はB細胞リンパ腫の発症リスクが高い。
【００２３】
また、後述の実施例において示されるように、HTLV-1 G7340A変異は特にHLA-A*02陽性HTLV-1感染者に多く認められる。そのため被験者のHLAを検査し、HLA-A*02陽性の場合には、HTLV-1遺伝子のG7340A変異の検出が推奨されることになる。
【００２４】
また、本実施形態にかかる非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法は、（１）リアルタイムPCR法により、被験者の試料中のHTLV-1遺伝子の5’LTR又はgagにおける欠失を検出する第１工程と、（２）被験者の試料中のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、及び、G7467A変異の有無の少なくとも一つを検出する第２工程と、を有する。
【００２５】
ATLL細胞ではHTLV-Iプロウイルスにしばしば欠失が認められ、プロウイルス内部を欠失し5'LTRは残存する1型欠失型プロウイルスと、5'LTRも欠失する2型欠失型プロウイルスに分類される。換言すれば、1型欠失型プロウイルスは内部配列のみの欠失で5'LTRは残存しており、2型欠失型プロウイルスはgag，pol，env等の内部配列に加えて5'LTRも欠失している。5'LTRはHTLV-Iプラス鎖転写のプロモーター及びエンハンサーであるため、この部位が欠失すると、Taxをはじめプラス鎖にコードされる遺伝子群の転写は失われる。なお3'LTRの欠失例は存在しない。3'LTRはHBZ遺伝子のプロモーターであり、HBZのcoding領域も全例で保存され発現している。上記第１工程及び第２工程を行うことにより、網羅的な非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定が可能となる。
【００２６】
なお、リアルタイムPCR法としては、例えば１本のPCRチューブで２種類のPCR反応を行うデュアルリアルタイムPCR法を採用することができる。かかる場合は同じDNA量を用いても5'PCRと3'PCRとの増幅効率（蛍光強度）が相違するため補正値を算出して補正を行うことが好ましい。即ち蛍光色素が相違するため効率に差がでるためその効率の差を補正値として用いることが好ましい。デュアルリアルタイムPCR法は１本のPCRチューブで２種類のPCR反応を行うため経済的であり、補正値は1.0〜1.3の範囲となるため測定精度も担保される。
【００２７】
リアルタイムPCR法の代替法として、デジタルPCR法を採用することも可能である。デジタルPCR法とはサンプルに含まれる個々の分子の数をカウントして絶対定量を行うPCR法である。デジタルPCRでは、多数のウェルにDNAやcDNAサンプルを分配して、個々のウェルで同時並行にエンドポイントPCRを行う。1つあるいは複数のターゲット分子を含むウェルもあればターゲット分子を全く含まないウェルが存在する。PCR終了後にウェル毎にPCR増幅の有無を解析し、増幅があったウェルはターゲット分子が入っていたポジティブ反応として、増幅がなかったウェルはターゲットを含まないネガティブ反応として数をカウントする。
【００２８】
被験者の試料としては、例えば末梢血白血球を使用することができる。定法により、血液白血球を分離し、ゲノムDNAを抽出して使用することが可能である。これにより被験者の苦痛を減らし、少量の試料から多くの情報を得ることができる。
【００２９】
リスク判定補助の対象となる非ホジキンリンパ腫発症は、Ｂ細胞リンパ腫に分類される疾患又はＴ細胞リンパ腫に分類される疾患の何れも挙げられることが可能である。Ｂ細胞リンパ腫に分類される疾患は、例えば、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫/白血病 Precursor B-lymphoblastic leukemia/lymphoma(B-LBL)、慢性Ｂリンパ球性白血病Chronic lymphocytic leukemia(B-CLL)、小リンパ球性リンパ腫Small lymphocytic lymphoma(B-SLL)、前駆細胞性白血病Prolymphocytic leukemia (B-PLL)、Lymphoplasmacytoid lymphoma、辺縁帯B細胞性リンパ腫 Marginal zone B cell lymphoma、ヘアリーセル白血病Hairly cell leukemia、濾胞性リンパ腫 Follicular center lymphoma、マントル細胞リンパ腫 Mantle cell lymphoma、形質細胞腫/形質細胞性骨髄腫 Plasmacytoma/ Plasma Cell myeloma、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫 Diffuse large B cell lymphoma、原発性縦隔大細胞型B細胞性リンパ腫 Primary mediastinal large B cell lymphoma、バーキットリンパ腫 Burkitt's lymphoma等である。Ｔ細胞リンパ腫に分類される疾患は、例えば、成人T細胞性リンパ腫/白血病 Adult T-Cell Lymphoma/Leukemia (ATLL)、前駆T細胞リンパ芽球性リンパ腫/白血病Precursor T cell lymphoblastic lymphoma/leukemia (T-LBL)、慢性Tリンパ球性白血病/前駆リンパ球性白血病T cell chronic lymphocytic leukemia/ T-Prolymphocytic lymphoma (T-PLL)、大顆粒T細胞性白血病 T-Cell Large Granular Lymphocyte Leukemia (T-LGL)、大顆粒NK細胞性白血病NK-Cell Large Granular Lymphocyte Leukemia (NK-LGL)、分類不能末梢性T細胞リンパ腫 Unspecified periferal T-Cell lymphoma、血管免疫芽球性T細胞性リンパ腫Angioimmunoblastic T-Cell Lymphoma、血管中心性リンパ腫Angiocentric Lymphoma、腸管T細胞性リンパ腫 Intestinal T-Cell Lymphoma、未分化大細胞（CD30陽性）リンパ腫 Anaplastic large Cell (CD30+) Lymphoma、ホジキン様/ホジキン関連未分化大細胞リンパ腫 ALCL Hodgkin's-Like /Hodgkin's-related、菌状息肉症 Mycosis fungoides等である。特に、本発明によればATLLのリスクを有効且つ適切に判定することができる。
【００３０】
また、本発明にかかる非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定のための診断マーカーは、被験者のHTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、又は、G7467A変異である。
【００３１】
また、本発明は、HTLV-1遺伝子のG7340A変異、G7322A変異、又は、G7467Aを検出するためのプライマー又はプローブを含む、リンパ腫発症のリスク判定キットである。G7340A変異、G7322A変異、又は、G7467Aの有無は、例えばプライマー又はプローブを用いて調べることができる。例えば、PCR用プライマーを用いて被験者から採取された試料から得られたDNAと、正常型HTLV-1遺伝子のDNAとを増幅し、増幅されたDNAを比較することにより行うことが可能である。
【００３２】
また、本発明にかかる非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定補助方法は、被験者のＢ細胞から採取したHTLV-1ウイルスの変異を調べて非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定をするものであり、そのHTLV-1ウイルスの変異は例えばG7340Aである。
【実施例】
【００３３】
成人T細胞白血病/リンパ腫（ATLL）患者由来の末梢血単核球(PBMC)をin vitroで培養した結果、３種類のHTLV-1/EBV感染B細胞（LMY3B, OATL9とLMH115）が得られた。ATLL由来HTLV-1/EBV感染B細胞の性状をより詳細に明らかにするために遺伝子発現解析を行った。
【００３４】
Jurkat(T-ALL)、Raji(Burkitt)、LMY3B(HTLV-1/EBV感染B細胞)、OATL9 (HTLV-1/EBV感染B細胞)、LMH115(HTLV-1/EBV感染B細胞)、MT-2(HTLV-1感染T細胞)より、Quick-RNA(登録商標)TMiniPrep（ZYMORESARCH社）を用いてRNAを精製した後、SuperScript(登録商標)III First-Strand Synthesis System (ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成はThermoFisher SCIENTIFIC社の方法に従い、65℃で5分、50℃で50分、85℃で5分でサーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて行った。それぞれの遺伝子はKOD FX Neo（東洋紡社）を用いて、94℃で2分、98℃10秒、68℃でサーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて増幅された。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件（アニーリング温度、PCRサイクル数）は表１に示した。PCR産物は2%アガロースゲルを用いて電気泳動し、Gel Doc(登録商標) EZ Gel Documentation System（BIO RAD社）で撮影した。
【００３５】
【表１】
2018023355.tif 000003
【００３６】
図２に示されるように、3種類の細胞(LMY3B、OATL9とLMH115)は、HTLV-1のみならずEBVも感染しており、両ウイルスのコンポーネント遺伝子が発現していることがわかった。そのうち２種類の細胞(LMY3BとOATL9)のTaxとHBZの発現パターンはATLL細胞で認められるのと同様に、Taxの発現が低く、HBZの発現が高いことがわかった。
【００３７】
ATLLに認められるTaxとHBZの発現パターンがHTLV-1/EBV感染B細胞(LMY3BとOATL9)で同様に認められるのかということを明らかにするために、HTLV-1プロウイルスのシーケンス解析を行った。
【００３８】
ゲノムDNAはQIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN社)を用いて、精製した。それぞれの遺伝子はKOD FX Neo（東洋紡社）を用いて、94℃で2分、98℃10秒、68℃でサーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて増幅された。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件（アニーリング温度、PCRサイクル数）は表１に示した。PCR産物はアガロース電気泳動後にQIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN社)を用いて精製し、PCR産物のシーケンスの決定はファスマック社に委託した。
【００３９】
その結果、図３に示されるように、OATL9ではTax遺伝子の領域に変異（HTLV-1の7340番目のGがAに変異、矢印ア）があることを見出した。さらにこの変異によってTax遺伝子内でスプライシングエラーが引き起こされることを明らかにした。OATL9には2つのHTLV-1プロウイルスが存在しており、その一つのHTLV-1プロウイルスにだけTax遺伝子の変異があることがわかった。しかしながら、OATL9由来ATLL患者ではTax遺伝子に変異があるウイルスのみ存在することがわかった。なお、LMY3BはTax変異が認められないが（矢印イ参照）、腫瘍性を獲得する理由としてはEBVにコードされるLMP-1遺伝子の発現により、Tax発現低下とHBZ発現向上とが誘導されることが原因であると考えられる。
【００４０】
HTLV-1モレキュラークローン（HTLV-1産生ベクター）にて、Tax変異G7340Aを作製した。Tax変異G7340Aの作製には、Mitchellらによって作製されたHTLV-1産生ベクター（pX1MT-M：J Virol 81:4422, 2007、共著者であった京都大学、松岡教授より供与）を用いた。変異導入のためのPCRは、PrimeSTARを用いて、98℃で2分、98℃で10秒、53℃で30秒、72℃で15分で、サーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて行った。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件は表１に示した。PCR産物はアガロース電気泳動後にQIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN社)を用いて精製し、PCR産物のシーケンスを解析した(図４(Ａ))。
【００４１】
Lipofectamine(登録商標) 3000 Reagent (ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いて、pX1MT-MとpX1MT-M G7340Aを293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後、図４(Ａ)と同様にRNA精製、cDNA合成を行った。それぞれの遺伝子はKOD FX Neo（東洋紡社）を用いて、94℃で2分、98℃10秒、68℃でサーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて増幅された。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件（アニーリング温度、PCRサイクル数）は表１に示した。PCR産物は2%アガロースゲルを用いて電気泳動し、Gel Doc(登録商標) EZ Gel Documentation System（BIO RAD社）で撮影した(図４(Ｂ))。
【００４２】
図４(Ｂ)で得られたPCR産物をQIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN社)を用いて精製し、PCR産物のシーケンスを解析した(図４(Ｃ))。
【００４３】
図４(Ｂ)で得られたcDNAを用いて、qRT-PCRを行った。qRT-PCRにはSYBR(登録商標) Premix Ex Taq(登録商標) II (Takara社)を使用し、7500 Fast＆7500リアルタイムPCRシステム(ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いてPCRと解析を行った。
【００４４】
図４(Ａ)に示されるように、OATL9で認められたスプライシングエラーが同様に引き起こされることを見出した。またこの変異によってTax遺伝子の発現がおよそ100倍低下し、HBZの発現が18倍向上していることがわかった（図４(Ｄ)）。
【００４５】
次に、G7322A変異とG7467A変異について検討を行った。この検討にはG7322A変異とG7467A変異を導入したHTLV-1モレキュラークローン（HTLV-1産生ベクター：pX1MT-M：J Virol 81:4422, 2007、共著者であった京都大学、松岡教授より供与）を用いた。変異導入のためのPCRは、PrimeSTARを用いて、98℃で2分、98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で15分、サーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて行った。
【００４６】
Lipofectamine(登録商標) 3000 Reagent (ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いて、pX1MT-M（野生型）とpX1MT-M G7322Aを293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後、Quick-RNA(登録商標)TMiniPrep（ZYMORESARCH社）を用いてRNAを精製した後、cDNA合成を行った。cDNA合成はThermoFisher SCIENTIFIC社の方法に従い、65℃で5分、50℃で50分、85℃で5分、サーマルサイクラー（BIO RAD社）を用いて行った。得られたcDNAを用いて、qRT-PCRを行った。qRT-PCRにはSYBR(登録商標) Premix Ex Taq(登録商標) II (Takara社)を使用し、7500 Fast＆7500リアルタイムPCRシステム(ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いてPCRと解析を行った。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件は表２に示した。その結果、野生型と比較し、pX1MT-M G7322A をトランスフェクションした細胞ではTax遺伝子の発現が100倍以上低下し、HBZ遺伝子の発現が約5倍向上することがわかった（図５（Ａ）（Ｂ））。
【００４７】
上記の方法と同様の方法を用いて、pX1MT-MとpX1MT-M G7467Aを293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後、最終濃度5ng/mLと100ng/mLのPMA (Phorbol 12-Myristate 13 Acetate)になるように培養液に添加した。トランスフェクション48時間後、上記の方法と同様の方法を用いて、RNA精製、cDNA合成及びqRT-PCRを行った。PCRに用いられたプライマー配列、PCR条件は表２に示した。その結果、PMAを添加していない細胞では野生型と比較し、pX1MT-M G7467A ではTax遺伝子の発現が100倍以上低下し、HBZ遺伝子は約5倍低下することがわかった。一方、5ng/mLのPMAの存在下では野生型はTax遺伝子とHBZ遺伝子の両方が約3〜5倍の発現向上が認められたが、pX1MT-M G7467A ではHBZ遺伝子の発現低下が約2倍まで改善された。さらに10ng/mLのPMAの存在下では、野生型はHBZ遺伝子の発現を約5倍低下させるのに対し、pX1MT-M G7467A はHBZ遺伝子の発現を約2倍向上させることがわかった（図６（Ａ）（Ｂ））。
【００４８】
成人T細胞白血病/リンパ腫において、HTLV-1ゲノムの5’側の欠失が高頻度に認められる（急性型：約58％、リンパ腫型：約62％、慢性型：約33％、Tomiyama, S, et al, Blood, 1996）。そこで、このHTLV-1ゲノム5’側欠失の検出方法の
樹立について検討を行った。５’側欠失領域内に一つ目のTaqmanPCR (５’PCR)を設定し、３’側保存領域内に二つ目のTaqmanPCR (３’PCR)を設定した。この二つのPCRが一つのPCR反応チューブで正確にHTLV-1ゲノムを増幅可能か検討するために（デュアルリアルタイムPCR）、pX1MT-M（Wt：野生型）と成人T細胞白血病/リンパ腫で認められるHTLV-1ゲノム5’側欠失を模倣するpX1MT-M (5’dMT:欠失型)を用いた（図７（Ａ））。
【００４９】
制限酵素AgeI（New England Biolabs）を用いて、pX1MT-M/5’dMTの作製を行った。デュアルリアルタイムPCRにはTaqMan Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher SCIENTIFIC社) と500 Fast＆7500リアルタイムPCRシステム(ThermoFisher SCIENTIFIC社)を用いた。プライマー配列、プローブ配列及びPCR条件は表２に示した。デュアルリアルタイムPCRでは同じDNA量を用いても5'PCRと3'PCRとの蛍光色素が相違するため効率に差がでるところその効率の差を補正値として用いた。補正値は1.15であった。デュアルリアルタイムPCRの結果、野生型では５’PCRと３’PCRの増幅結果が1：1であるのに対し、欠失型では増幅結果が1：0であった（図７（Ｂ））。これらの結果によりデュアルリアルタイムPCRでHTLV-1ゲノム5’側欠失が検出可能であることが示された。なお、デュアルリアルタイムPCRで使用したプライマー配列及びプローブ配列はデジタルPCR法を行う場合にも使用できる。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
Tax遺伝子の変異はHLA-A*02拘束性Tax11-19特異的細胞障害性T細胞（CTL）のエピトープ内で引き起こされており、このエピトープの14番目のグリシンからリジンに変わることで、CTLから逃避できる。OATL9のHLAのタイピングを行った結果、OATL9はHLA-A*02を持っていたことがわかった（表３）。HLA-A*02拘束性Tax11-19特異的CTLはHLA-A*02陽性キャリアの100％にその存在が認められるが、ATLLではわずか33％でしか認められないことからTax遺伝子における変異によってCTLから逃避したと強く示唆される。
【００５２】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
非ホジキンリンパ腫発症のリスク判定に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号１〜２４：プライマー
配列番号２５，２６：プローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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