(57)【要約】【課題】  潰瘍性大腸炎の疾患状態の判断に有用な、潰瘍性大腸炎の検査方法および装置ならびに治療薬のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  潰瘍性大腸炎の検査方法が開示される。この方法は、被検体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う工程；該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを取得する工程；ならびに該データを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の該指標因子の基準と比較する工程；を含み、該嫌気培養が、該培養液のｐＨが該培養の開始時において６．２から６．７であり、その後放置されて行われる。また、潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法が開示される。さらに、潰瘍性大腸炎の検査装置が開示される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
潰瘍性大腸炎の検査方法であって、
被検体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う工程；
該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを取得する工程；ならびに
該データを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の該指標因子の基準と比較する工程；
を含み、
該嫌気培養が、該培養液のｐＨが該培養の開始時において６．２から６．７であり、その後放置されて行われる、方法。
【請求項２】
前記被検体が、前記潰瘍性大腸炎に罹患したかまたはその疑いのある被検体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記潰瘍性大腸炎の指標因子が、酪酸量、ラクノスピラ科細菌量、および培養液ｐＨのプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養液のｐＨが、前記培養の開始時において６．２から６．５である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法であって、
潰瘍性大腸炎に罹患しておりかつ治療薬候補が投与された個体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う工程；
該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを取得する工程；ならびに
該データを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の該指標因子の基準と比較して、該治療薬候補の有効性を評価する工程；
を含み、
該嫌気培養が、該培養液のｐＨが該培養の開始時において６．２から６．７であり、その後放置されて行われる、方法。
【請求項６】
潰瘍性大腸炎の検査装置であって、
（ａ）被検体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う、嫌気培養手段；
（ｂ）該嫌気培養手段の該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを測定する、測定手段；ならびに
（ｃ）健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準を予め格納し、かつ該測定手段から得られた該指標因子のデータを該指標因子の基準と比較する、比較手段；
を備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性大腸炎の検査方法および装置、ならびに潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎は世界的に蔓延しており、その患者数は、日本においても激増している。潰瘍性大腸炎の現状の主要な治療法は、非ステロイド製剤のメサラジン（５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ））の投与である。しかし、本治療法では、疾患は一時的に緩和するが、再発の可能性を排除するものではなく寛解するものではない。よって、潰瘍性大腸炎の治癒のために、潰瘍性大腸炎の疾患状態を判断するための検査およびその治療薬の要請がある。
【０００３】
潰瘍性大腸炎患者の腸内環境をみると、健常者と比べて大腸菌の繁殖が増大しており、異常を示している。潰瘍性大腸炎の治癒には腸内環境の是正が必要と考えられる。
【０００４】
ところで、ヒトの腸管内では多種・多様な細菌が絶えず増殖を続けており、これらは腸内細菌叢（フローラ）と呼ばれる。腸内細菌叢の研究において、ヒトの腸内環境を再現する腸管模倣培養装置による培養が利用されている。腸内細菌叢の構成バランスをほぼ維持したまま培養可能な培養方法および装置が提案されている（特許文献１および非特許文献１）。この培養方法では、個々の腸内細菌叢が、低級脂肪酸が添加された培地を用いて、嫌気的環境で、培地のｐＨを６．０〜７．０の範囲に調節しながら培養される。
【０００５】
潰瘍性大腸炎の検査および治療薬のスクリーニングには、潰瘍性大腸炎患者の腸内環境を模した培養方法および装置が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１３６９１６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takagi, Rら，PLoS One 11, e0160533 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、潰瘍性大腸炎の疾患状態の判断に有用な、潰瘍性大腸炎の検査方法および装置ならびに治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、潰瘍性大腸炎の検査方法を提供し、この方法は、
被検体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う工程；
該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを取得する工程；ならびに
該データを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の該指標因子の基準と比較する工程；
を含み、
該嫌気培養は、該培養液のｐＨが該培養の開始時において６．２から６．７であり、その後放置されて行われる。
【００１０】
１つの実施形態では、上記被検体は、上記潰瘍性大腸炎に罹患したかまたはその疑いのある被検体である。
【００１１】
１つの実施形態では、上記潰瘍性大腸炎の指標因子は、酪酸量、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌量、および培養液ｐＨのプロファイルからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００１２】
１つの実施形態では、上記培養液のｐＨは、上記培養の開始時において６．２から６．５である。
【００１３】
本発明は、潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法を提供し、この方法は、
潰瘍性大腸炎に罹患しておりかつ治療薬候補が投与された個体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う工程；
該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを取得する工程；ならびに
該データを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の該指標因子の基準と比較して、該治療薬候補の有効性を評価する工程；
を含み、
該嫌気培養は、該培養液のｐＨが該培養の開始時において６．２から６．７であり、その後放置されて行われる。
【００１４】
本発明は、潰瘍性大腸炎の検査装置を提供し、この装置は、
（ａ）被検体から採取した糞便試料を含む培養液を用いて嫌気培養を行う、嫌気培養手段；
（ｂ）該嫌気培養手段の該培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを測定する、測定手段；ならびに
（ｃ）健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準を予め格納し、かつ該測定手段から得られた該指標因子のデータを該指標因子の基準と比較する、比較手段；
を備える。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、潰瘍性大腸炎患者の腸内環境を模した培養方法が提供され、これにより、潰瘍性大腸炎の検査のための方法および装置が提供される。また、当該培養方法は、潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニングにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の潰瘍性大腸炎の検査装置の一例を模式的に示す図である。
【図２】１３人の健常者（Ａ）および１１人の潰瘍性大腸炎患者（Ｂ）のそれぞれの糞便試料および培養液のｐＨプロファイルを示すグラフである。
【図３】健常者（ＨＳ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定データの主座標分析（ＰＣｏＡ）を示すグラフである。
【図４】健常者（ＨＳ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の全腸内細菌に対する各種腸内細菌科の存在比率を示すグラフである。
【図５】健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の全腸内細菌に対するラクノスピラ科細菌の存在比率を示す箱髭図である。
【図６】健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）における、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびＳＣＦＡ（コハク酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、および酪酸の合計）の量を示す箱髭図である。
【図７】潰瘍性大腸炎患者由来の培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）中のラクノスピラ科菌の存在比率を、培養により生成した酪酸量に対してプロットした結果（Ａ）、ならびに部分Ｍａｙｏスコアに対して、潰瘍性大腸炎患者由来の糞便試料（Ｂ）および培養液試料（Ｃ）中のラクノスピラ科菌の存在比率をプロットした結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（潰瘍性大腸炎の検査方法）
本発明は、潰瘍性大腸炎の検査方法を提供する。本発明の潰瘍性大腸炎の検査方法は、潰瘍性大腸炎の罹患状態の判定に利用可能である。「罹患状態」とは、罹患の有無および疾患の重篤度を包含する。本発明における検査方法は、被検体が潰瘍性大腸炎を罹患しているか、被検体の潰瘍性大腸炎の症状が進行しているか、または治療中の被検体の潰瘍性大腸炎の症状が緩和したかの判定に用いられ得る。
【００１８】
被検体は、腸管を有する任意の動物であり、例えば、哺乳動物であり、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどが挙げられる、好ましくはヒトである。被検体は、家畜動物または愛玩動物であってもよい。１つの実施形態では、被検体は、潰瘍性大腸炎に罹患したかまたはその疑いのある被検体である。
【００１９】
培養液は、被検体から採取した糞便試料を培養培地に添加して調製され得る。培養培地は、嫌気培養に使用可能な培地であればいずれでもよい。糞便試料は、予め懸濁液（例えば、１％  Ｌ−アスコルビン酸添加０．１Ｍリン酸緩衝液に懸濁）として調製し、培地１００ｍＬに対し、例えば１００μＬで添加され得る。嫌気培養用培地としては、例えば、岐阜大学処方嫌気性培地（ＧＡＭ培地）であり、例えば、ＧＡＭ寒天培地、変法ＧＡＭ寒天培地、ＧＡＭ半流動高層培地、ＧＡＭブイヨンおよび変法ＧＡＭブイヨン（例えば、いずれも日水製薬株式会社製）が挙げられる。培養前に、培地は滅菌され得る（例えば、オートクレーブ滅菌）。液体培養が好ましく、培養の間、培養液は適宜撹拌され得る。糞便試料は、採取後、検査を開始するまで嫌気性培養スワブなどの容器内に保管され得る。
【００２０】
培養の嫌気的環境は、培地に対して嫌気的ガスを曝気させることにより作り出すことができる。嫌気的ガスは、例えば、窒素、窒素および二酸化炭素、あるいは、窒素および二酸化炭素および水素である。嫌気的ガスの曝気は、例えば流量０．１〜１．０ｄＬ／分にて常時行うか、あるいは、間欠的に行う。また、嫌気的ガスは、窒素と二酸化炭素とからなる混合ガスであることが好ましい。なお、常時、嫌気的ガスを曝気するのが好ましい。
【００２１】
本発明においては、嫌気培養は、培養液のｐＨが培養の開始時において６．２〜６．７であり、その後放置されて行われる。好ましくは開始時のｐＨは、６．２〜６．５である。培養の開始時（例えば、糞便試料を含む培養液を嫌気的環境下に置いた時点）、培養液のｐＨが上記範囲内であればよく、必要に応じてｐＨ調節剤によって上記範囲内にｐＨを調節する。培養開始後は、ｐＨに関しては放置する。培養中、上記範囲内にｐＨを維持することを意図した操作（例えば、ｐＨ調節剤またはアルカリ添加によるｐＨ調節）を行わない。
【００２２】
培養期間は、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータが取得可能となる期間であることが好ましい。培養期間は、データを取得する潰瘍性大腸炎の指標因子に依存するが、例えば、２４時間〜４８時間、好ましくは、２４時間〜３０時間である。培養温度は、被検体の体温付近の温度が用いられ、例えば、被検体がヒトである場合、例えば、３６℃〜３８℃、好ましくは、３７℃である。培養の様式は問わないが、好ましくは、１回バッチ式である。
【００２３】
培養液から、潰瘍性大腸炎の指標因子のデータが取得される。潰瘍性大腸炎の指標因子とは、潰瘍性大腸炎の罹患状態（例えば、罹患の有無または疾患の重篤度）の判断に利用することができる因子をいう。潰瘍性大腸炎の指標因子の例としては、酪酸量、ラクノスピラ科細菌量、および培養液ｐＨのプロファイルが挙げられ、これらの指標因子の少なくとも２つの組み合わせでもよい。潰瘍性大腸炎の指標因子のデータは、その指標因子に応じて、培養の開始時、培養中、培養終了後に、培養液から取得される。
【００２４】
酪酸量は、培養液より当業者が通常用いる方法（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））に従って測定され得る。培養液は、採取した糞便中に存在し得る腸内細菌により生成される酪酸を測定できれば、任意の時点で回収され得るが、好ましくは、培養の後半から終了前後に回収される。
【００２５】
ｐＨプロファイルは、培養期間にわたりｐＨの変動により表される。培養期間中、ｐＨを継続的にモニタリングしてもよく、または間欠的に複数回測定するものであってもよい。
【００２６】
ラクノスピラ科細菌量とは、ラクノスピラ科に属すると分類された細菌の量であり、属の区別は問わない。ラクノスピラ科細菌量は、試料中のラクノスピラ科細菌の多さを表すことができる値であればよく、例えば、試料中の細菌数、試料中の全腸内細菌に対する存在比率などが挙げられる。好ましくは、全腸内細菌に対する存在比率である。ラクノスピラ科細菌量は、当業者が腸内細菌の検出、同定および定量に通常用いる技術（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定、リアルタイムＰＣＲなど）を用いて決定され得る。その際に用いるプライマーセットは、公知の配列情報に基づいて作成してもよく、または市販のものを用いてもよい。ラクノスピラ科細菌量測定のための試料として、培養の任意の時点で回収した培養液を用い得る。例えば、培養開始時の培養液試料（糞便試料）、培養中または培養後の培養液試料を単独または組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
指標因子のデータは、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の同じ指標因子の基準と比較される。例えば、潰瘍性大腸炎の指標因子が酪酸量である場合、酪酸量について取得したデータが、酪酸量に関する健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の基準と比較される。基準の作成において、上記培養から取得したデータを用いることができる。「基準」は、潰瘍性大腸炎の罹患の有無および重篤度によって、作成され得る。
【００２８】
個体もまた、上述した被検体と同様の動物であり得る。「健常個体」とは、少なくとも潰瘍性大腸炎に罹患していない個体をいう。「健常個体」は、以前に潰瘍性大腸炎疾患に罹患していたが、治癒した個体であってもよい。「潰瘍性大腸炎に罹患した個体」とは、潰瘍性大腸炎に罹患中の個体をいう。「潰瘍性大腸炎に罹患した個体」は、潰瘍性大腸炎に罹患している限り、治療中の個体であってもいい。「健常個体」または「潰瘍性大腸炎に罹患した個体」は、被検体と同一個体であってもよい。
【００２９】
健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の「基準」は、予め該当する個体（例えば個体集団）から取得したデータに基づいて作成された基準を用いる場合、および被検体自身から以前に取得されたデータ自体を基準に用いる場合を包含する。後者の場合、例えば、被検体の治療効果の検証手段として、本発明の検査方法を用いることができる。
【００３０】
酪酸量について、潰瘍性大腸炎患者は、健常個体と比較して少ない値となる。ラクノスピラ科細菌量について、潰瘍性大腸炎患者は、健常個体と比較して低い値となる。ｐＨプロファイルについては、健常個体および潰瘍性大腸炎患者を比較すると、培養期間中のｐＨの変動が異なる。例えば、図２に示すように、健常個体のｐＨプロファイルにおいては、培養液ｐＨの変動がヒト大腸内における通常のｐＨを再現し得るのに対し、潰瘍性大腸炎患者は異常を示し得る。
【００３１】
（潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法）
本発明はまた、潰瘍性大腸炎の治療薬のスクリーニング方法を提供する。この方法においては、糞便試料が、潰瘍性大腸炎に罹患しておりかつ治療薬候補が投与された個体から採取される。培養工程およびデータ取得工程は、上記のとおりである。治療薬候補の有効性の評価のため、取得したデータを、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準と比較する。この比較工程もまた、上記のとおりである。取得したデータが、重篤度の高い罹患個体の基準よりも、健常個体の基準またはより重篤度の低い罹患個体の基準に適合するかが判定され得る。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、「基準」として、予め該当する個体（例えば個体集団）から取得したデータに基づいて作成された基準を用いることで、「治療薬候補」が潰瘍性大腸炎の治療に有効かを判定することができる。本発明のスクリーニング方法はまた、「基準」の個体を治療薬候補投与前の罹患個体（「潰瘍性大腸炎に罹患した個体」）とし、この基準に対し、当該治療薬候補の投与後の個体（「潰瘍性大腸炎に罹患しておりかつ治療薬候補が投与された個体」）のデータを比較することで、その個体に適合した治療薬を選択するために用いることもできる。
【００３３】
（潰瘍性大腸炎の検査装置）
本発明はまた、潰瘍性大腸炎の検査方法を提供する。本発明の検査装置について図面を用いて説明する。
【００３４】
図１は、本発明の潰瘍性大腸炎の検査装置の一例を模式的に示す図である。
【００３５】
本発明の検査装置１００は、嫌気培養手段１１０、測定手段１４０、および比較手段１７０を備える。
【００３６】
本発明の検査装置１００において、嫌気培養手段１１０は、培養槽１１２と、培養槽１１２を密閉可能な蓋体１１４とを備え、そして培養槽１１２内には被検体から採取した糞便資料を含む培養液１０２が収容され、嫌気培養が行われる。図１に示す実施形態では、蓋体１１４の上方に配置されたモータ１１６から、シャフト１１８が培養槽１１２の培養液１０２内に浸漬する位置まで延びており、シャフト１１８の端部には少なくとも１つの撹拌翼１２０が設けられている。そして、モータ１１６によりシャフト１１８が回転し、培養液１０２が撹拌翼１２０によって撹拌される。
【００３７】
なお、図１においてモータ１１６は蓋体１１４の上方に設けられているが、本発明はこのような配置にのみ限定されるものではない。モータは培養槽１１２の下方に設けられていてもよい。あるいは、撹拌翼１２０を磁性材料で構成することにより、シャフト１１８はモータと分離されていてもよい。この場合、モータの軸芯周りには他の磁性材料でなる部材が設けられ、当該部材の回転に伴って撹拌翼１２０も回転し得る
【００３８】
さらに、図１に示す嫌気培養手段１１０では、培養槽１１２内に、例えば、蓋体１１４の上方を通じて給気管１２２が配置されている。給気管１２２は、バルブ１２４の開閉によって不活性ガス（例えば、窒素ガス、炭酸ガス、およびそれらの組み合わせ）を培養槽１１２内に導入して、培養槽１１２内を嫌気状態にすることができる。培養槽１１２内には、好ましくは逆止弁（図示せず）が取り付けられた排気管１２６も設けられており、培養槽１１２内の不要な気体は当該排気管１２６を通じて培養槽１１２の外に排出される。図１において、給気管１２２および排気管１２６はともに蓋体１１４を貫通し、その端部が培養槽１１２内に配置されるように記載されているが、本発明は必ずしもこのような構成にのみ限定されるものではない。例えば、排気管１２２および排気管１２６の両方またはいずれか一方が、培養槽１１２を貫通して配置されていてもよい。
【００３９】
嫌気培養手段１１０はまた、培養槽１１２内にサーモスタットのような温度調節手段１２８が設けられている。温度調節手段１２８により、培養槽１１２内の培養液１０２を所望の温度に保持することが可能である。
【００４０】
本発明において、上記嫌気培養手段１００は、例えば市販のジャーファーメンターであってもよい。
【００４１】
本発明の検査装置１００において、測定手段１４０は、嫌気培養手段１１０内の培養液１０２の温度やの培養液１０２から潰瘍性大腸炎の指標因子に対応するデータを取得する役割を果たす。
【００４２】
図１に示す実施形態では、測定手段１４０として、温度センサ１４２および化学センサ１４４が培養槽１１２の培養液１０２中に浸漬する位置に設けられている。化学センサ１４４の例としては、必ずしも限定されないが、水素イオン電極（ｐＨ電極）、イオン選択性電極などのイオンセンサが挙げられる。このような化学センサは、培養液１０２内に含まれる潰瘍性大腸炎の指標因子（例えば、酪酸などの有機酸含量、培養液のｐＨプロファイル）を選択的に検出することができる。なお、図１では、測定手段１４０として、温度センサ１４２および化学センサ１４４の２つのセンサが設けられている例を記載しているが、本発明はこれに限定されない。本発明の検出装置において、測定手段は少なくとも１つが設けられている。
【００４３】
本発明の検査装置１００において、比較手段１７０は、測定手段１４０から得られた指標因子のデータを、予め格納する健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準と比較する役割を果たす。
【００４４】
図１に示す実施形態では、比較手段１７０は、制御部１７２、記憶部１７４および表示部１７６から構成されている。
【００４５】
図１において、制御部１７２は、嫌気培養手段１１０内の給気管１２２のバルブ１２４、モータ１１６および温度調節手段１２８とケーブル１８１，１８２，１８３を介して電気的に接続されている。これにより、制御部１７２は、給気管１２２のバルブ１２４の開閉、モータ１１６の回転数、および温度調節手段１２８の設定温度を制御することができる。制御部１７２はまた、測定手段１４０（すなわち、温度センサ１４２および化学センサ１４４）とケーブル１８４，１８５を介して電気的に接続されている。これにより、温度センサ１４２および化学センサ１４４で検出された温度データおよび指標因子のデータは、電気信号としてケーブル１８４，１８４を介して制御部１７２に送信され得る。
【００４６】
なお、図１では、制御部１７２と、バルブ１２４、モータ１１６、温度調節手段１２８、温度センサ１４２、および化学センサ１４４とはケーブル１８１，１８２，１８３，１８４および１８５による有線接続の例が記載されているが、本発明はこれに限定されない。当該有線接続に代えて、これらの間に図示しない通信手段を介することにより無線による接続が行われてもよい。
【００４７】
記憶部１７４は、健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準が予め情報として格納されており、制御部１７２からの指令によって当該基準を読み出し、適宜制御部１７２に送信する。記憶部１７４はまた、制御部１７２から送信された指標因子のデータを保存することもできる。
【００４８】
記憶部１７４の例としては、外付けまたは内臓ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フロッピーディスクのような磁気ディスク；ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ±Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ-ＲＡＭ、ブルーレイディスク（例えば、ＢＤ−ＲＯＭ、ＢＤ−Ｒ、ＢＤ−Ｒ  ＢＤＸＬおよびＢＤ−ＲＥ）、レーザーディスク（登録商標）などの光ディスク；光磁気ディスク；ならびにＵＳＢメモリ、ソリッドステートドライ（ＳＳＤ）、ＳＤメモリーカード、ミニＳＤカード、マイクロＳＤカード、ＳＤＨＣメモリーカード、ミニＳＤＨＣカード、マイクロＳＤＨＣカード、ＳＤＸＣメモリーカード、マイクロＳＤＸＣカードなどのフラッシュメモリ；が挙げられる。
【００４９】
図１において、表示部１７６は、ケーブル１８８を介して制御部１７２と電気的に接続されている。表示部１７６は、制御部１７２が制御する嫌気培養手段１１０内のバルブ１２４の開閉状態、モータ１１６の回転数、温度調節手段１２８の設定温度等の各情報や、測定手段１４０から得られた培養液１０２の温度および取得した指標因子の取得データを作業者が比較的に認識することができるように表示する。このような表示部１７６の例としては、ディスプレイ、プリンター等が挙げられる。なお、図１では、表示部１７６と制御部１７２とはケーブル１８８による有線接続の例が記載されているが、本発明はこれに限定されない。当該有線接続に代えて、これらの間に図示しない通信手段を介することにより無線による接続が行われてもよい。
【００５０】
本発明の検査装置１００において、制御部１７２は、化学センサ１４４から得られた培養液１０２中の糞便試料に関する潰瘍性大腸炎の指標因子のデータを、記憶部１７４にて予め格納された健常個体および／または潰瘍性大腸炎に罹患した個体の指標因子の基準と比較する。そして、制御部１７２から送信されたその比較結果が表示部１７６にて表示される。また、化学センサ１４４から得られた潰瘍性大腸炎の指標因子のデータおよび／または制御部１７２から得られた比較結果は、必要に応じて記憶部１７４に別途保存されてもよい。本発明の検査装置１００において、制御部１７２は、パーソナルコンピュータのような電子計算機であってもよい。
【００５１】
このようにして、本発明の検査装置１００は、被検体から採取した糞便試料から潰瘍性大腸炎の検査を行うことができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を詳述する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１：糞便試料の採取および培養）
１３人の健常者および１１人の潰瘍性大腸炎患者から糞便試料を採取した。なお実験参加者は、２か月以上にわたりいかなる抗生物質も受けていない者であった。実験参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。Ｍａｙｏ臨床スコアおよび部分Ｍａｙｏスコアにより疾患活動性を決定した。糞便採取の１か月前の間に内視鏡検査を受けた患者について、内視鏡Ｍａｙｏ臨床スコアを決定した（ｎ＝９）。糞便採取の時点で、部分Ｍａｙｏ臨床スコアを決定した（ｎ＝１１）。本実験は、神戸大学医学部附属病院のガイドラインに従って行い、神戸大学の治験倫理審査委員会によって認可された。本実験で使用した全ての方法は、神戸大学の医療倫理による認可ガイドラインに従った。糞便試料は採取後、嫌気性培養スワブ（２１２５５０  ＢＤ  ＢＢＬ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｗａｂ；ベクトン・ティッキンソンアンドカンパニー製）内に保管し、実験室に送付した。
【００５４】
マルチチャンネル培養器（Ｂｉｏ  Ｊｒ．８；エイブル株式会社製）を用いるヒト大腸を模した１回バッチ式培養装置を作製した。本インビトロモデル装置は、８つの並列した独立の容器からなり、各容器に、１００ｍＬのオートクレーブ（１１５℃にて１５分間）した岐阜大学処方嫌気性培地（ＧＡＭ培地［Ｃｏｄｅ  ０５４２２］；日水製薬株式会社製）を入れ、培養開始時ｐＨを６．５に調整したものであった。培養前に３７℃にて１時間、０．２μｍ  ＰＴＦＥ膜（ポール・コーポレーション製）を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ２：ＣＯ２＝８０：２０）に曝気（１５ｍＬ／分）することにより、培養容器の嫌気性条件を構築した。接種物の調製のため、各糞便試料を、１％のＬ−アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社製）を添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，ＮａＨ２ＰＯ４および０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４の２：１混合物からなる）２ｍＬ中に懸濁した。１００μＬの上記糞便懸濁液を各培地含有容器内に接種して、嫌気培養を開始した。培養の間、培地を濾過滅菌した混合ガスに曝気することにより、嫌気性条件を維持した。
【００５５】
培養開始時、６時間後、９時間後、１２時間後、２４時間後および３０時間後に、容器の側面の突出部分より培養液の一部を回収した。培養期間中５分毎にｐＨデータを採取した。培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液）については、菌叢評価にも使用した。培養３０時間後に回収した試料（培養液）については、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）定量にも使用した。なお糞便試料および培養液は、測定に供するまで−２０℃下に保管した。
【００５６】
（実施例２：健常者および潰瘍性大腸炎患者の糞便培養液のｐＨプロファイル評価）
実施例１により、健常者（ｎ＝１３）および潰瘍性大腸炎患者（ｎ＝１１）のそれぞれに由来の試料につき採取したｐＨデータに基づき、ｐＨプロファイルを作成した。
【００５７】
図２は、１３人の健常者（Ａ）および１１人の潰瘍性大腸炎患者（Ｂ）のそれぞれの糞便試料および培養液のｐＨプロファイルを示すグラフである。縦軸は測定したｐＨ値を示し、横軸は培養時間（時間）を示す。その結果、健常者の大半は、培養６時間後ｐＨが約５．５〜６．０の間に低下後、徐々に上昇して培養後期にはｐＨ６．５（大腸のｐＨ）に近付くという変動が見られた（図１（Ａ））。これに対し、潰瘍性大腸炎患者では、培養６時間後ｐＨが約６．０に低下後、ｐＨは６．５付近に急上昇してさらに下降し、その後は下降後のｐＨを維持するかまたは徐々に上昇したが、健常者と比べて明らかに異常なｐＨの動きを示した（図１（Ｂ））。このように、ｐＨプロファイルを見るだけで、患者の状態をおおまかに予測できる。
【００５８】
（実施例３：健常者および潰瘍性大腸炎患者の糞便培養液の菌叢評価）
（３−１：微生物ＤＮＡの抽出）
培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液）について、大腸内細菌叢の菌のＤＮＡ抽出を下記のようにして行った。ＤＮＡ抽出における抽出液には、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）飽和フェノール５００μＬ、溶菌緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，０．５Ｍ  ＥＤＴＡ）２５０μＬ、１０％ＳＤＳ  ５０μＬ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇを用いた。試料に抽出液を２００μＬ添加したものをＦａｓｔＰｒｅｐ２４  （ＭＰ）を用い、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。そして、遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質変性後イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させた。ＤＮＡを析出させて、１００μＬのＴＥに溶解したものを鋳型ＤＮＡとして使用した。精製したＤＮＡを、使用するまで−２０℃下に保管した。
【００５９】
（３−２：１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定）
ゲノムＤＮＡを、Ｓ−Ｄ−Ｂａｃｔ−０３４１−ｂ−Ｓ−１７（配列番号１）およびＳ−Ｄ−Ｂａｃｔ−０７８５−ａ−Ａ−２１（配列番号２）のプライマー対を用いた細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域の増幅に供した。イルミナアダプターオーバーハングヌクレオチド配列（イルミナ株式会社製）を遺伝子特異的配列に付加した。製造者の指示に従ってＰＣＲサイクリング反応を行った。確認したアンプリコンＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＤＮＡ精製ビーズ（ベックマン・コールター株式会社製）を用いて精製し、２５μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に溶出した。アンプリコンをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００  ＤＮＡ  １０００チップ（アジレント・テクノロジー株式会社製）において定量し、等モル濃度でプールした。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子産物（内部コントロール（ＰｈｉＸコントロールＶ３；イルミナ株式会社製）と共に）を、６００サイクルＭｉＳｅｑ試薬キット（イルミナ株式会社製）と共にＭｉＳｅｑシーケンサー（イルミナ株式会社製）を用いて、ペアエンドシーケンスに供した。ＰｈｉＸ配列を切り出し、２０以上のＱスコアのペアエンドリードを、ソフトウェアパッケージＱＩＩＭＥバージョン１．９．１を用いてつなげた。キメラ配列を同定し、ライブラリーから排除した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いてＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓ系統学的データベースによって、ペアエンドリードを系統学的に分類した。９７％類似性に達したＯＴＵ（Operational Taxonomic Unit）を、シャノン・ウィーナー指数およびシンプソン指数の多様性比較と、Ｃｈａｏの生物種数推定のために用いた。各試料からのＯＴＵ情報を用いて主座標分析（ＰＣｏＡ）を行い、ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づいて算出した。本実験で生成した生配列データの全てをＭＧ−ＲＡＳＴに預け、アクセッション番号が付与された。
【００６０】
（３−３：リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲをＴＰ７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｉｔｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。非特許文献１に記載のように、全腸内細菌をターゲットにするプライマーセットを用いた増幅を行った。
【００６１】
（３−４：バイオインフォマティクスおよび統計学的解析）
シャノン・ウィーナー多様性指数、シンプソン指数およびＣｈａｏ１を、ＱＩＩＭＥソフトウェアパッケージを用いて算出した。ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を用いて、ＯＴＵ数、シャノン・ウィーナー多様性指数、シンプソン指数、Ｃｈａｏ１、および細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびＳＣＦＡ濃度に関する有意差を決定した。ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃに記載される微生物群衆構成の差を、ＭＡＮＯＶＡ検定を用いて試験した。０．０５未満のＰ値を有意と判断した。
【００６２】
（３−５：結果）
健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定データを以下の表１に示す。
【００６３】
【表１】
2018198560.tif 000003
【００６４】
リード（解読配列数）は菌数、そしてＯＴＵの数は菌種数（species number）の指標である。シャノン・ウィーナー多様性指数（「Shannon」）およびシンプソン指数（「Simpson」）は菌種多様性（species diversity）の指標であり、そしてＣｈａｏ１は菌種数（species richness）の指標である。
【００６５】
健常者の糞便試料（培養開始時回収）におけるＯＴＵ数は、培養液試料（培養３０時間後回収試料）においても維持された。潰瘍性大腸炎患者においても、同様に、糞便試料におけるＯＴＵ数は、培養液試料において維持された。健常者について、糞便試料と培養液試料との間で、シャノン・ウィーナー多様性指数、シンプソン指数およびＣｈａｏ１の全てにおいて有意差がなかった。潰瘍性大腸炎患者についても、糞便試料と培養液試料との間で、シャノン・ウィーナー多様性指数、シンプソン指数およびＣｈａｏ１の全ての多様性指数において有意差がなかった。したがって、糞便試料中の菌叢の菌種多様性および菌種数は、培養液試料中でも維持されていることがわかる。
【００６６】
健常者と潰瘍性大腸炎患者との間では、糞便試料においてＯＴＵ数は有意差がなく、この傾向は、培養液試料においても再現された。さらに、シャノン・ウィーナー多様性指数、シンプソン指数およびＣｈａｏ１の多様性指数においても、健常者と潰瘍性大腸炎患者との間では、糞便試料において有意差が見られず、そしてこれら全ての指数において有意差がない傾向は、培養液試料でも再現された。したがって、健常者と潰瘍性大腸患者との間の菌種多様性および菌種数の関係は、糞便試料および培養液試料ともに同様のものであった。
【００６７】
図３は、健常者（ＨＳ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定データの主座標分析（ＰＣｏＡ）を示すグラフである。図３中、「ＨＳ糞便」は健常者糞便試料、「ＵＣ糞便」は潰瘍性大腸炎患者糞便試料、「ＨＳ培養液」は健常者培養液試料、「ＵＣ培養液」は潰瘍性大腸炎患者培養液試料を表す。
【００６８】
図３に示されるように、ＵＣ糞便プロットは、ＨＳ糞便プロットとは異なるクラスターを形成した。これは、糞便試料において、潰瘍性大腸炎患者の菌叢が健常者の菌叢とは区別されることを示す。図３によれば、培養液試料プロットのクラスター形成の比較においても、このような潰瘍性大腸炎患者と健常者との間の菌叢の差異が維持されたことがわかる。
【００６９】
図４は、健常者（ＨＳ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の全腸内細菌に対する各種腸内細菌科の存在比率を示すグラフである。図４中、「ＨＳ糞便」は健常者糞便試料、「ＵＣ糞便」は潰瘍性大腸炎患者糞便試料、「ＨＳ培養液」は健常者培養液試料、「ＵＣ培養液」は潰瘍性大腸炎患者培養液試料を表す。
【００７０】
図４に示されるように、興味深いことに、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）の菌の存在比率が、糞便試料および培養液試料の両方において、潰瘍性大腸炎患者が健常者よりも有意に低い結果を示した。この点は、図５においてより明確に示される。図５は、健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の全腸内細菌に対するラクノスピラ科細菌の存在比率を示す箱髭図である。図５の縦軸は、全腸内鎖菌に対するラクノスピラ科細菌の存在比率（％）を示し、横軸は、測定した試料を示す。本培養により、糞便試料において観察された健常者に対する潰瘍性大腸炎患者のラクノスピラ科菌存在比率の低下が、同様に培養液試料においても観察された。
【００７１】
ラクノスピラ科に属する菌種（属レベル）の菌数について、健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれの培養開始時の試料（糞便試料）および培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）の全腸内細菌に対する存在比率もまた、決定した。この結果を以下の表２に示す
【００７２】
【表２】
2018198560.tif 000004
【００７３】
表２は、ラクノスピラ科に属する菌種のうち、存在比率が上位５種のブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｐｐ．）、コプロコッカス属種（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ドレア属種（Ｄｏｒｅａ  ｓｐｐ．）、ラクノスピラ属種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、およびロゼブリア属種（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｓｐｐ．）の結果を示す。表２中、アスタリスク（＊）は、糞便試料および対応する培養液試料において、ＨＳおよびＵＣ患者間で有意差があることを示す（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）。
コプロコッカス属種菌について、糞便試料および培養液試料の両方において、健常者よりも潰瘍性大腸菌患者の存在比率の有意な低下が観察された。
【００７４】
（実施例４：健常者および潰瘍性大腸炎患者の糞便培養液のＳＣＦＡ定量）
培養３０時間後に回収した試料（培養液）について、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）に含まれる各種酸（コハク酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、および酪酸）の試料中の量を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所）（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）およびＲＩＤ−１０Ａ示差屈折率検出器（株式会社島津製作所）を備える）を用いて測定した。ＨＰＬＣを、０．６ｍＬ／分の流速にて移動相として５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を用いて６５℃にて操作した。
【００７５】
図６は、健常者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者のそれぞれについて、培養３０時間後に回収した試料（培養液試料）における、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびＳＣＦＡ（コハク酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、および酪酸の合計）の量を示す箱髭図である。図６中の各グラフの縦軸は、試料中の各酸の濃度（ｍＭ）を示し、横軸は、測定した試料を示す。健常者および潰瘍性大腸炎患者の両方において、酢酸、プロピオン酸、および酪酸が主として生成された。乳酸およびコハク酸はほとんど生成が見られなかった。酪酸の生成量について、潰瘍性大腸炎患者の培養液試料において、健常者の培養液試料と比較して有意な減少が見られた。
【００７６】
図７Ａに、潰瘍性大腸炎患者由来の培養液試料中のラクノスピラ科菌の存在比率（％）（横軸）を、培養により生成した酪酸量（ｍＭ）（縦軸）に対してプロットした結果を、示す。培養液試料中のラクノスピラ科菌の存在比率は、培養により生成した酪酸量と高い相関関係が見られた（図７Ａ）。すなわち、培養液試料中のラクノスピラ科菌の存在比率が低いほど、酪酸生成量は低下した。
【００７７】
図７は、部分Ｍａｙｏスコア（縦軸）に対して、潰瘍性大腸炎患者由来の糞便試料（Ｂ）および培養液試料（Ｃ）中のラクノスピラ科菌の存在比率（％）（横軸）をプロットした結果を併せて示す。部分Ｍａｙｏスコアについては、糞便試料および培養液試料とも、そのラクノスピラ科菌の存在比率との相関が見られなかった（図７ＢおよびＣ）。
【００７８】
潰瘍性大腸炎は、悪化期と寛解期とを反復により特徴づけられるため、ラクノスピラ科菌の存在比率が低く、それにより生成酪酸量が低くなることは、大腸炎の再発を引き起こし得る。よって、酪酸が末梢組織において制御性Ｔ細胞の分化を誘導し抗炎症効果を有すること（Furusawa, Y.ら, Nature 10.1038/nature12721. 2013）もまた考慮すると、潰瘍性大腸炎患者の腸内に酪酸生成菌を増大させることが、寛解期を維持するのに重要となる。さらに、上記結果によれば、この培養モデルは、潰瘍性大腸炎患者における共生細菌および代謝産物生成に対するプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの役割をハイスループットで評価するのに用いられ得ることがわかる。
【符号の説明】
【００７９】
１００    検査装置
１０２    培養液
１１０    嫌気培養手段
１１２    培養槽
１１４    蓋体
１１６    モータ
１１８    シャフト
１２０    撹拌翼
１２２    給気管
１２４    バルブ
１２６    排気管
１２８    温度調節手段
１４０    測定手段
１４２    温度センサ
１４４    化学センサ
１７０    比較手段
１７２    制御部
１７４    記憶部
１７６    表示部
【図１】
2018198560.tif 000005
【図２】
2018198560.tif 000006
【図３】
2018198560.tif 000007
【図４】
2018198560.tif 000008
【図５】
2018198560.tif 000009
【図６】
2018198560.tif 000010
【図７】
2018198560.tif 000011
【配列表】
2018198560000001.app