(57)【要約】【課題】種子の発芽率を維持しながら、種子の生存率を維持させることができる種子の生存率維持剤及び生存率維持方法の提供。【解決手段】  ブラシノステロイド合成阻害剤を含む、種子の生存率維持剤。  ブラシノステロイド合成阻害剤を含むプライミング液を種子に吸収させる工程と、  吸水後の種子を乾燥する工程を含む、種子の生存率維持方法。  ブラシノステロイド合成阻害剤を吸収した種子。【選択図】図２
2018184358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシノステロイド合成阻害剤を含む、種子の生存率維持剤。
【請求項２】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項１に記載の種子の生存率維持剤。
【請求項３】
ブラシノステロイド合成阻害剤を含むプライミング液を種子に吸収させる工程と、
吸水後の種子を乾燥する工程とを含む、種子の生存率維持方法。
【請求項４】
プライミング液のブラシノステロイド合成阻害剤の濃度が２〜１００μＭである、請求項３に記載の種子の生存率維持方法。
【請求項５】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項３又は４に記載の種子の生存率維持方法。
【請求項６】
ブラシノステロイド合成阻害剤を吸収した種子。
【請求項７】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項６に記載の種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライミング後の種子の生存率を維持することができる化合物及び該化合物を用いた種子の生存率維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、種子の保存は乾燥条件下で行われるが、採種後の時間が経過するに伴い種子の発芽率は低下する。また、採種後の種子は、それぞれ休眠性が異なるため、同時に播種しても発芽時期が揃わない。
そこで、播種前の種子にプライミング処理（一定条件下での吸水及び乾燥処理）を施し、種子の発芽率を向上させ、発芽時期を揃える方法がとられている（非特許文献１、２）。
【０００３】
しかしながら、プライミング処理を施すことにより、一時的な吸水を経た種子の発芽率は向上するものの、種子を保存した際の種子寿命（種子が発芽できる期間）が短くなる欠点があった（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Varierl, A., Vari, A. K., & Dadlani, M.，“The subcellular basis of seed priming”，Current Science，2010年， Vol. 99，No. 4，p. 450-456
【非特許文献２】Paparella S, Araujo SS, Rossi G, Wijayasinghe M, Carbonera D, Balestrazzi A，“Seed priming: state of the art and new perspectives”， Plant Cell Reports， 2015年，Vol. 34， p. 1281-93
【非特許文献３】Liu, Y., Bino, R. J., van der Burgz, W. J., Groot, S. P. C., & Hilhorst, H. W. M.， “Effects of osmotic priming on dormancy and storability of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seeds”， Seed Science Research, 1996年，Vol. 6， p. 49-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、プライミングを経ても、種子の生存率を維持させることができる種子の生存率維持剤及び生存率維持方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、プライミング処理において、特定の化合物を含む液に種子を浸漬させることにより、上述した課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、次の発明を提供するものである。
【０００８】
〈１〉
ブラシノステロイド合成阻害剤を含む、種子の生存率維持剤。
【０００９】
〈２〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈１〉記載の種子の生存率維持剤。
【００１０】
〈３〉
ブラシノステロイド合成阻害剤を含むプライミング液を種子に吸収させる工程と、
吸水後の種子を乾燥する工程とを含む、種子の生存率維持方法。
【００１１】
〈４〉
プライミング液のブラシノステロイド合成阻害剤の濃度が２〜１００μＭである、〈３〉に記載の種子の生存率維持方法。
【００１２】
〈５〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈３〉又は〈４〉に記載の種子の生存率維持方法。
【００１３】
〈６〉
ブラシノステロイド合成阻害剤を吸収した種子。
【００１４】
〈７〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈６〉に記載の種子。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、プライミングを経ても、種子の生存率を維持させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】水でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の発芽率（ａ）と生存率（ｂ）を表すグラフである。
【図２】ブラシノステロイド合成阻害剤存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【図３】ブラシノステロイド存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
《種子の生存率維持剤》
〈ブラシノステロイド合成阻害剤〉
本発明の種子の生存率維持剤は、ブラシノステロイド合成阻害剤を含む。
本発明で用いられるブラシノステロイド合成阻害剤としては、ブラシノステロイドの合成を阻害するものであれば特に限定されないが、具体的には特開２００３−１１３００８号公報に記載された下記式（１）〜（４）で表される化合物又はその塩が例示できる。
【００１８】
式（１）で表される化合物は次の通りである。
【化１】
2018184358.tif 000003
【００１９】
式（１）中、Ｒ１は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基又は置換基を有してもよいフェニル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいフェニル基を示す。
【００２０】
式（１）中のＲ１で表される炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を挙げることができる。これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。
式（１）中のＲ２で表される炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数３〜６の分岐鎖状のアルキル基、例えば、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のかさ高いアルキル基が好ましい。
式（１）中のＲ２又はＲ３で表されるフェニル基が置換基を有する場合、その置換基の種類、個数、又は結合位置は特に限定されない。例えば、１個ないし３個、好ましくは１個又は２個程度の置換基を有し、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。フェニル基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子）、アルキル基（メチル基、エチル基等）、シクロアルキル基（シクロプロピル基等）、ハロゲン化アルキル基（トリフルオロメチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（エトキシカルボニル基等）、アルカノイル基（アセチル基等）、アロイル基（ベンゾイル基等）、アラルキル基（ベンジル基等）、アリール基（フェニル基等）、ヘテロアリール基（ピリジル基等）、ヘテロ環基（ピロリジニル基等）、水酸基、ニトロ基、シアノ基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのうち、ハロゲン原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ基等が好ましい。
【００２１】
式（１）で表される化合物としては、４−（４−クロロフェニル）−２−フェニル−３−（１，２，４−トリアゾイル）ブタン−２−オール又はその塩が特に好ましい。
【００２２】
次に、式（２）で表される化合物は次の通りである。
【化２】
2018184358.tif 000004
【００２３】
式（２）中、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ１３は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数２〜６のアルコキシアルキル基を示し、Ｒ１４は置換基を有してもよいフェニル基を示し、Ｘは単結合又は−ＣＨ２−を示す。
【００２４】
式（２）中のＲ１１、Ｒ１２又はＲ１３で表される炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等を挙げることができる。
式（２）中のＲ１３で表される炭素数２〜６のアルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基等を挙げることができる。
これらのうち、Ｒ１１及びＲ１２が水素原子であり、Ｒ１３がエチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基等の直鎖状アルキル基である場合が好ましい。
式（２）中のＲ１４で表されるフェニル基が置換基を有する場合、その置換基の種類、個数、又は結合位置は特に限定されない。例えば、１個ないし３個、好ましくは１個又は２個程度の置換基を有し、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
フェニル基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子）、アルキル基（メチル基、エチル基等）、シクロアルキル基（シクロプロピル基等）、ハロゲン化アルキル基（トリフルオロメチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（エトキシカルボニル基等）、アルカノイル基（アセチル基等）、アロイル基（ベンゾイル基等）、アラルキル基（ベンジル基等）、アリール基（フェニル基等）、ヘテロアリール基（ピリジル基等）、ヘテロ環基（ピロリジニル基等）、水酸基、ニトロ基、シアノ基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのうち、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン化アルコキシ基及び水酸基が好ましく、ハロゲン原子及びハロゲン化アルキル基がより好ましい。
式（２）中のＲ１４で表される置換フェニル基としては、例えば、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、４−ブロモフェニル基、４−トリフルオロメトキシフェニル基、４−トリイル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル基、３−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル基、４−ブロモ−２−クロロフェニル基等を挙げることができる。これらのうち、４−トリフルオロメチルフェニル基、４−ブロモフェニル基、２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル基が好ましい。
【００２５】
式（２）で表される化合物としては、Ｒ１１及びＲ１２が水素原子であり、Ｒ１３がｎ−プロピル基であり、Ｒ１４が４−トリフルオロメチルフェニル基であり、かつＸが単結合である化合物並びにＲ１１及びＲ１２が水素原子であり、Ｒ１３がｎ−プロピル基であり、Ｒ１４が４−ブロモフェニル基であり、かつＸが単結合である化合物が特に好ましい。
【００２６】
次に、式（３）で表される化合物は次の通りである。
【化３】
2018184358.tif 000005
【００２７】
式（３）中、Ｒ２１は炭素数２〜６のアルケニル基又は置換基を有してもよいフェニル基を示し、Ｒ２２及びＲ２３はそれぞれ独立に置換基を有してもよいフェニル基を示す。
【００２８】
式（３）中のＲ２１で表される炭素数２〜６のアルケニル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、ビニル基、アリル基、２−ブテニル基等を挙げることができる。
式（３）中のＲ２１、Ｒ２２又はＲ２３で表されるフェニル基が置換基を有する場合、その置換基の種類、個数、又は結合位置は特に限定されない。例えば、１個ないし３個、好ましくは１個又は２個程度の置換基を有し、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
フェニル基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子）、アルキル基（メチル基、エチル基等）、シクロアルキル基（シクロプロピル基等）、ハロゲン化アルキル基（トリフルオロメチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（エトキシカルボニル基等）、アルカノイル基（アセチル基等）、アロイル基（ベンゾイル基等）、アラルキル基（ベンジル基等）、アリール基（フェニル基等）、ヘテロアリール基（ピリジル基等）、ヘテロ環基（ピロリジニル基等）、水酸基、ニトロ基、シアノ基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのうち、ハロゲン原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ基等が好ましい。
式（３）中のＲ２２で表される置換フェニル基としては、２，４−ジフルオロフェニル基等を挙げることができ、Ｒ２３で表される置換フェニル基としては、４−クロロフェニル基等を挙げることができる。
【００２９】
式（３）で表される化合物としては、６−（４−クロロフェニル）−４−フェニル−５−（１，２，４−トリアゾイル）ヘキセ−１エン−４−オール又はその塩が特に好ましい。
【００３０】
最後に、式（４）で表される化合物は次の通りである。
【化４】
2018184358.tif 000006
【００３１】
式（４）中、Ｒ３１及びＲ３２はそれぞれ独立に置換基を有してもよいフェニル基を示し、Ｘは単結合又は−ＣＨ２−を示す。
【００３２】
式（４）のＲ３１及びＲ３２で表されるフェニル基が置換基を有する場合、その置換基の種類、個数、又は結合位置は特に限定されない。例えば、１個ないし３個、好ましくは１個又は２個程度の置換基を有し、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
フェニル基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子）、アルキル基（メチル基、エチル基等）、シクロアルキル基（シクロプロピル基等）、ハロゲン化アルキル基（トリフルオロメチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（エトキシカルボニル基等）、アルカノイル基（アセチル基等）、アロイル基（ベンゾイル基等）、アラルキル基（ベンジル基等）、アリール基（フェニル基等）、ヘテロアリール基（ピリジル基等）、ヘテロ環基（ピロリジニル基等）、水酸基、ニトロ基、シアノ基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのうち、ハロゲン原子及びアルコキシ基が好ましく、塩素原子、フッ素原子及びメトキシ基がより好ましい。
式（４）のＲ３１及びＲ３２で表される置換フェニル基としては、例えば、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、３，４−ジクロロフェニル基、２−フルオロフェニル基、３−フルオロフェニル基、４−フルオロフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、２，５−ジフルオロフェニル基、３，４−ジフルオロフェニル基、２，６−ジフルオロフェニル基、２−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２−フルオロ−４−トリフルオロメチル基、２−フルオロ−５−メトキシフェニル基等を挙げることができる。
【００３３】
式（４）で表される化合物としては、Ｒ３１がフェニル基であり、Ｒ３２がｐ−クロロフェニル基であり、かつＸが単結合である化合物が特に好ましい。
【００３４】
上記式（１）〜（４）で表される化合物は基本骨格中に不斉炭素原子を有する場合があり、置換基の種類に応じて、さらに１個又は２個以上の不斉炭素原子を有する場合がある。これらの不斉炭素原子に基づく純粋な形態の光学活性体又はジアステレオ異性体のほか、任意の異性体混合物（例えば、２以上のジアステレオ異性体の混合物）又はラセミ体などをブラシノステロイド合成阻害剤として用いてもよい。
【００３５】
また、上記式（１）〜（４）で表される化合物の塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は置換基の種類に応じて塩基付加塩を形成することもある。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩；塩酸、硫酸等の無機酸類との塩；ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酒石酸等の有機酸類との塩；トリエチルアミンなどの有機アミンとの塩；グリシン等のアミノ酸との塩を挙げることができる。
【００３６】
上記式（１）〜（４）で表される化合物又はその塩の製造方法及びそれらのブラシノステロイド合成阻害剤としての作用は、それぞれ特開２０００−５３６５７号公報、特開２００１−２４７４１３号公報、特開２００１−２４７５５３号公報及び特開２００１−２４７４１２号公報に具体的かつ詳細に記載されている。これらの４つの明細書の開示の全てを参照として本明細書の開示に含める。
【００３７】
本発明の種子の生存率維持剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、公知のプライミング液に含まれる成分、例えば、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウム等の無機塩；ポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の種子の生存率維持剤は使用時に水と混合し、水溶液として種子に用いることが好ましい。水と混合する前に、種子の生存率維持剤を予め少量のジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶解し、水で希釈して水溶液としてもよい。該水溶液の種子の生存率維持剤の濃度は、植物の種類によって適宜調整することは可能であるが、２〜１００μＭであることが好ましく、４〜７０μＭであることがより好ましく、５〜５０μＭであることがさらに好ましい。
【００３９】
〈種子〉
本発明に用いられる種子は特に限定されないが、アブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子が好ましい。
アブラナ科の植物としては、シロイヌナズナ、ナズナ、カラシナ、タカナ、ターサイ、ケール、カリフラワー、キャベツ、メキャベツ、コールラビ、ブロッコリー、アブラナ、ミズナ、カブ、ノザワナ、コマツナ、ハクサイ、チンゲンサイ、ハボタン、ルッコラ、ダイコン、ワサビ等が挙げられる。ナス科の植物としては、ジャガイモ、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、シシトウ等が挙げられる。ウリ科の植物としては、スイカ、メロン、カボチャ、キュウリ、ニガウリ等が挙げられる。マメ科の植物としては、ダイズ、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウ、ラッカセイ等が挙げられる。
【００４０】
《種子の生存率維持方法》
本発明の種子の生存率維持方法では、採種後の種子に対して、本発明の種子の生存率維持剤を含む水溶液を用いて、プライミング処理を行う。プライミング液を本発明の種子の生存率維持剤を含む水溶液とすることで、プライミング後の生存率を維持することができる。
【００４１】
〈プライミング液の調製〉
プライミング液として、ブラシノステロイド合成阻害剤を含む水溶液を調製する。ブラシノステロイド合成阻害剤としては、上述したものが使用できる。ブラシノステロイド合成阻害剤を、予め少量のジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶解し、水で希釈して水溶液とする。
プライミング液のブラシノステロイド合成阻害剤の濃度は、植物の種類によって適宜調整することは可能であるが、２〜１００μＭであることが好ましく、４〜７０μＭであることがより好ましく、５〜５０μＭであることがさらに好ましい。
【００４２】
〈プライミング処理〉
このようにして調製したプライミング液を用いて採種後の種子にプライミング処理を行う。プライミング処理の条件は、種子の種類に応じた常法で行なえばよい。また、本発明の種子の生存率維持方法において、プライミング処理を行う前に、採種後の種子に常法の消毒処理をおこなってもよい。
【００４３】
例えば、シロイヌナズナの種子を用いた場合、プライミング処理の条件は次の通りである。
（１）暗条件での吸水
シロイヌナズナの種子およそ２００粒（約１０μＬ）に、プライミング液１００〜２００μＬ、好ましくは１５０μＬを加える。シロイヌナズナの種子およそ２００粒に対して、プライミング液の容積が５０μＬより少ないと十分に吸水できないおそれがある。
種子とプライミング液との接触方法としては、容器に種子とプライミング液を入れて容器内で種子をプライミング液に浸漬させる方法が挙げられる。また、プライミング液を吸収させた紙、布、樹脂等の吸水体を介して種子を吸水させる方法でもよい。
そして、０〜４℃、好ましくは４℃の暗所で３日間静置する。
【００４４】
（２）明条件での吸水
次に、（１）の処理後の種子を２０〜２８℃、好ましくは２２℃の明所に移し、１２時間静置する。
【００４５】
（３）乾燥
次に、（２）の処理後の種子を乾燥する。乾燥方法としては、ろ紙等の上に（２）の種子を移し、風通しのよいところ、例えばクリーンベンチ内で、室温で１２時間程通風させればよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示し、本願発明を更に詳細に説明するが、本願発明は下記の例に制限されるものではない。
【００４７】
〈種子〉
本発明で使用したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の野生型（Ｃｏｌ−０）の種子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した。
【００４８】
《水でプライミング処理を行った場合、種子の発芽率と生存率に及ぼす影響》
〈参考例１〉
・種子の消毒
シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−０）の種子およそ２００粒を、種子消毒液［５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む脱イオン水］に５分間、２２℃で浸したのち、脱イオン水で種子表面の洗浄を行った。
【００４９】
・種子のプライミング
消毒後の種子およそ２００粒を１．５ｍＬ容チューブに入れた。脱イオン水１５０μＬを該チューブに加え、４℃の暗所で３日間種子に吸水させた。その後、該チューブを２２℃の明所に移し、１２時間吸水させた。吸水後の種子をろ紙を敷いた３５ｍｍシャーレに移し、蓋を開けた状態でクリーンベンチ内で１２時間通風させ、種子の乾燥を行った。
【００５０】
・発芽試験
乾燥した種子を、０．８％の寒天を含む１／２濃度のムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）に、５０粒ずつ３反復で播種した。
播種後の種子は、２２℃の明所に静置した。
種子のプライミング後０〜７日後において、種皮からの幼根の突出及び緑化した子葉が展開した個体数の割合から発芽率を算出した。結果を図１（ａ）に示す。
【００５１】
・種子の劣化処理
次に、プライミング処理後の種子に劣化処理（ＣＤＴ；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を施し、種子の生存率を算出した。
シロイヌナズナの種子を自然劣化させた場合の種子寿命（発芽できる期間）は２年程であるため、劣化処理は、種子の寿命を迅速に評価し、予測するために通常用いられる手法である。
【００５２】
具体的には、プライミング後の乾燥した種子２００粒程度を１．５ ｍＬチューブに入れ、蓋を開けた状態で、タイトボックスに入れた。さらに、飽和塩化カリウム水溶液が入ったシャーレを、蓋を開けた状態で、種子と同じタイトボックス内に置き、タイトボックスを密閉した。密閉したタイトボックスを３７℃に移すと、タイトボックス内の相対湿度がおよそ８０%となるため、この状態で種子を０〜２０日間保存し、劣化させた。
【００５３】
・種子の生存率の算出
劣化処理後の種子を、０．８％の寒天を含む１／２濃度のムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）に、５０粒ずつ３反復で播種した。
播種後の種子は、２２℃の明所に静置した。
播種後７日目の時点で、健全な子葉の緑化及び展開を確認できた個体数の割合から、種子の生存率を算出した。結果を図１（ｂ）に示す。
【００５４】
〈参考例２〉
参考例１において、種子のプライミング処理を行わなかった以外は参考例１と同様にして、種子の発芽率及び劣化処理後の生存率を算出した。結果をそれぞれ図１（ａ）・（ｂ）に示す。
【００５５】
プライミング処理を行った参考例１の種子は、プライミング処理から１．５日経過時には８２％もの発芽率を示したのに対して、プライミング処理を行わなかった参考例２の種子は、プライミング処理から１．５日経過時の発芽率は７％に留まった。
以上の条件でプライミング処理を行うことにより、シロイヌナズナの種子の発芽が促進されることがわかった。
【００５６】
一方、劣化処理後の種子の生存率をみると、プライミング処理を行わなかった参考例２の種子は、劣化処理期間が３日間では生存率がほとんど低下せず、劣化処理期間が７日間でも８０％以上の生存率を示したのに対して、プライミング処理を行った参考例１の種子は、劣化処理期間が３日間で生存率が４０％に低下し、さらに劣化処理期間を７日間とすると生存率は０％であった。
【００５７】
以上より、シロイヌナズナの種子は単に水のみでプライミング処理を行った場合、種子の発芽率は向上するものの、種子の生存率が低下することを確認した。
【００５８】
《ブラシノステロイド合成阻害剤存在下でプライミング処理を行った場合、種子の発芽率と生存率に及ぼす影響》
・プライミング液の調製
ブラシノステロイド合成阻害剤として、以下の構造で表されるブラシナゾール（Ｂｒｚ）を用いて、プライミング液を調製した。また、参照実験用に、以下の構造で示される２４−エピブラシノリド（ＥＢＲ）を用いてプライミング液を調製した。
【００５９】
・ブラシナゾール（Ｂｒｚ）：ＴＣＩ社製、商品名ブラシナゾール
【化５】
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【００６０】
・２４−エピブラシノリド（ＥＢＲ）：シグマアルドリッチ社製、商品名Ｅｐｉｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ
【化６】
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【００６１】
表１に示す濃度の２００倍濃度のＢｒｚのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を調製し、脱イオン水で１／２００に希釈し、プライミング液Ａ〜Ｄを調製した。
同様に、表１に示す濃度の２００倍濃度のＥＢＲのＤＭＳＯ溶液を調製し、脱イオン水で１／２００に希釈し、プライミング液Ｅ〜Ｇを調製した。
また、０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ水溶液をプライミング液Ｈとした。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
〈実施例１〉プライミング液Ａを用いたプライミング処理
・種子の消毒
シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−０）の種子およそ２００粒を、種子消毒液［５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む脱イオン水］に５分間、２２℃で浸したのち、脱イオン水で種子表面の洗浄を行った。
【００６４】
・種子のプライミング
消毒後の種子およそ２００粒を１．５ｍＬ容チューブに入れた。プライミング液Ａ１５０μＬを該チューブに加え、４℃の暗所で３日間種子に吸水させた。その後、該チューブを２２℃の明所に移し、１２時間吸水させた。吸水後の種子をろ紙を敷いた３５ｍｍシャーレに移し、蓋を開けた状態でクリーンベンチ内で１２時間通風させ、種子の乾燥を行った。
【００６５】
・種子の劣化処理
プライミング後の乾燥した種子２００粒程度の種子が入った１．５ｍＬチューブを、蓋を開けた状態で、タイトボックスに入れた。さらに、飽和塩化カリウム水溶液が入ったシャーレを、蓋を開けた状態で、種子と同じタイトボックス内に置き、タイトボックスを密閉した。密閉したタイトボックスを３７℃に移すと、タイトボックス内の相対湿度がおよそ８０%となるため、この状態で種子を３日間保存し、劣化させた。
【００６６】
・種子の生存率の算出
劣化処理後の種子を、０．８％の寒天を含む１／２濃度のムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）に、５０粒ずつ３反復で播種した。
播種後の種子は、２２℃の明所に静置した。
播種後７日目の時点で、健全な子葉の緑化及び展開を確認できた個体数の割合から、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００６７】
〈実施例２〉プライミング液Ｂを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｂとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００６８】
〈実施例３〉プライミング液Ｃを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｃとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００６９】
〈実施例４〉プライミング液Ｄを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｄとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００７０】
〈比較例１〉プライミング液Ｈを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｈとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００７１】
〈参考例３〉プライミング処理なし
実施例１において、種子のプライミング処理を行わなかった以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００７２】
《ブラシノステロイド存在下でプライミング処理を行った場合、種子の発芽率と生存率に及ぼす影響》
〈参考例４〉プライミング液Ｅを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｅとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００７３】
〈参考例５〉プライミング液Ｆを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｆとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００７４】
〈参考例６〉プライミング液Ｇを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｇとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００７５】
〈比較参考例１〉プライミング液Ｈを用いたプライミング処理
プライミング処理におけるプライミング液Ａをプライミング液Ｈとした以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００７６】
〈参考例７〉プライミング処理なし
実施例１において、種子のプライミング処理を行わなかった以外は実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００７７】
ブラシノステロイド合成阻害剤であるＢｒｚを含むプライミング液、特にＢｒｚ濃度が５μＭ以上のプライミング液を用いてプライミング処理を行った場合、種子の生存率が増加した。
一方、ブラシノステロイドであるＥＢＲを含むプライミング液を用いてプライミング処理を行った場合、ＥＢＲ濃度の増加に伴い、種子の生存率が低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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