(57)【要約】      （修正有）【課題】時間および試薬を節約し、処理中の標的の喪失および／または標的の修飾を防ぐのを助ける、サンプルから核酸を単離するためのより簡便な方法を提供する。【解決手段】改良された簡便な核酸精製のための方法であって、核酸をサンプルから遊離させるための溶解工程、固体マトリックスへの核酸の結合、汚染物質を除去するためのマトリックスの洗浄、およびバッファー中のマトリックスからの核酸の溶出からなる。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）核酸を含む又は含む疑いのある試料を準備し、
ｂ）試料を１以上の溶解試薬と接触させ、
ｃ）試料中の核酸が固体基体に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、試料を固体基体と接触させ、
ｄ）試料中に核酸が存在する場合には、核酸に結合した固体基体を水性ベース分離ゲルに通過させることを含む、溶解バッファー成分を核酸サンプルから除去する方法。
【請求項２】
溶解バッファーが約１モル濃度を超える濃度で塩を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体基体が微粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固体基体が直径約０．１ｎｍから約５ｎｍの微粒子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
固体基体が直径約０．８ｎｍから約５ｎｍの微粒子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
微粒子が磁気を帯びている、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
固体基体に結合した核酸を、固体基体から核酸を溶出する水性ゲルに通過させた後で溶出バッファーと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒中の核酸の沈殿を含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エタノールである有機溶媒中の核酸の沈殿を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
固体基体に結合した核酸を、水性ゲルに通過させた後で酵素と接触させる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸を、希釈を行うことなく、固体基体上で配列決定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
固体基体に結合した核酸を、非メチル化シトシンが脱アミノ化されるように、水性ゲルに通過させた後で亜硫酸水素塩と接触させる、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
核酸内の少なくとも１つの核塩基がエピジェネティックな修飾を有するかどうかを決定することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸が、核酸ハイブリダイゼーション、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される実体を介して固体基体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ｉ）核酸を含む疑いのあるサンプル、
ｉｉ）核酸への結合に適した微粒子、および
ｉｉｉ）水性ベース分離ゲル
を準備し、
ｂ）サンプル中の核酸が磁気微粒子に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、サンプルを微粒子と接触させて、負荷磁気微粒子を生成させ、
ｃ）負荷微粒子を水性ベース分離ゲルを介して磁場で引き寄せることを含む、サンプルからの核酸を富化させるための方法。
【請求項１７】
分離ゲルがアガロースを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アガロースが約０．１０％から約１．０％の濃度である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分離ゲルがエタノールおよびグリセロールの１以上をも含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
粒子が、核酸に結合するのに適した官能基を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
微粒子が磁気を帯びている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
磁気微粒子がシリカおよびガラスの１以上で少なくとも部分的に被覆されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
磁気微粒子が回転楕円体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
サンプルが溶解バッファーを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の精製のための１工程法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸精製は典型的に、核酸をサンプルから遊離させるための溶解工程、固体マトリックスへの核酸の結合、汚染物質を除去するためのマトリックスの洗浄、およびバッファー中のマトリックスからの核酸の溶出からなる。このプロセスは、汚染物の除去におけるマトリックスの洗浄においては特に、複雑である。汚染物を除去するが核酸を除去しないマトリックスに溶液を加える必要があり、ついで、マトリックスからの核酸の溶出の前に、これらの溶液を除去する必要がある。固体マトリックスとして磁気粒子を使用する場合には、典型的に、それを結合工程後に捕捉し、溶液からの粒子の捕捉および除去により又は粒子の固定化および溶解−結合溶液の除去により溶解−結合溶液から分離し、ついで洗浄溶液中に遊離させる必要がある。洗浄後、粒子を再び捕捉し、洗浄溶液から分離する必要がある。例えば、Ａｌｄｅｒｔｏｎ，Ｒ．Ｐ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０１：１６６−１６９およびＷＯ９１／００２１２を参照されたい。幾つかの方法は、数個の異なる洗浄溶液を使用する数個の洗浄工程を要する。粒子が洗浄された後、それらを溶出バッファーに再懸濁させて、粒子から核酸を遊離させる必要がある。更に、これらの手法は核酸に選択的でないことが多い。それどころか、種々の固体および溶解物質も凝集する。
【０００３】
他の方法は例えばエタノールでの核酸の沈殿を要する。ついで、沈殿した核酸を洗浄し、再可溶化する必要がある。核酸の単離のためのクロマトグラフィー法も存在するが（例えば、ＥＰ  ０  ６５８  １６４を参照されたい）、これらの方法も複数の工程および洗浄を要する。
【０００４】
先行技術であるＢｏｒｅａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ）によるＳＣＯＤＡ（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｒａｇ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）系は、核酸を一点に集中させるためにパルス電場を使用するが、これは典型的に、非常に希薄でありうる予め精製された物質である。Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫｅｌｓｏにより開発されたオイルゲート系（Ｓｕｒ．ら，Ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ＰＣＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｓｓ  ｏｆ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｌｉｑｕｉｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．２０１２  １２（５）：６２０−６２８）は、洗浄を省略することを試みるために油を介して粒子を引き寄せるが、この方法は相当な塩のキャリーオーバーを引き起こした。なぜなら、油が粒子の周囲に溶解溶液の大きな液滴を残し、これが大量の塩のキャリーオーバーを引き起こしたからである。したがって、この系を使用する場合には追加的な処理が必要であった。
【０００５】
最新技術とみなされている核酸の単離／精製のための方法は或る欠点を有すると理解されうる。そのような欠点は例えば純度、選択性、回収率、実験安全性および簡便さ、ならびに単離／精製プロセスの速度に関するものである。換言すれば、公知の先行技術の方法は複数の工程を要し、しばしば、多数の工程および／または標的核酸の変化ゆえに標的核酸の喪失（例えば、過酷な処理条件の反復による修飾基の喪失）をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９１／０００２１２号
【特許文献２】欧州特許第０６５８１６４号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｌｄｅｒｔｏｎ，Ｒ．Ｐ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０１：１６６−１６９
【非特許文献２】Ｓｕｒ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．２０１２  １２（５）：６２０−６２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、解決されるべき課題は、時間および試薬を節約し、処理中の標的の喪失および／または標的の修飾を防ぐのを助ける、サンプルから核酸を単離するためのより簡便な方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、溶出バッファーから細胞溶解−結合溶液を分離するためのゲルの使用に関する。細胞溶解−結合溶液中の核酸を捕捉するために、粒子を使用する。粒子は磁気を帯びており、磁場を用いて集結される。特に、汚染物を除去するゲルを介して磁場により粒子を引き寄せ、集結した粒子を溶出バッファーに再懸濁させる。このプロセスは極めて簡便である。ゲルは細胞溶解−結合溶液を溶出バッファーから分離し、それらの２つの間の混合を制限または排除する。ゲルを通る粒子の移動は汚染物および塩を除去する。汚染物は、ゲルを通過することにより除去される（すなわち、それらは「スキージ（ｓｑｕｅｅｇｅｅ）」除去される）。塩は、ゲルを通過することにより希釈される。ついで粒子は溶出バッファー中に直接的に通過し、該バッファー中で核酸が遊離される。ついで磁気粒子はゲル内に引き戻され、または遠心分離または沈降（重力）により溶出バッファーから分離されうる。このプロセスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶウイルス）ＲＮＡを検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、ＨＣＶウイルスＲＮＡを血漿サンプルから成功裏に精製することが示されている。
【００１０】
本発明は、溶解バッファー成分を核酸サンプルから除去する方法を含み、該方法は、核酸を含む又は含む疑いのある試料を準備し、試料を１以上の溶解試薬と接触させ、試料中の核酸が固体基体に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、試料を固体基体と接触させ、試料中に核酸が存在する場合には、核酸に結合した固体基体を水性ベース分離ゲルに通過させることを含む。本方法は、溶解バッファーが約１モル濃度を超える濃度で塩を含有する場合に有用である。固体基体は微粒子であることが可能であり、微粒子は直径約０．１ｎｍから約５ｎｍまたは直径約０．８ｎｍから約５ｎｍでありうる。更に、微粒子は磁気を帯びていてもよい。
【００１１】
本発明は更に、固体基体に結合した核酸を、固体基体から核酸を溶出する水性ゲルに通過させた後で溶出バッファーと接触させることを想定している。そして更に、核酸は有機溶媒中で沈殿せず、あるいは核酸は有機溶媒中で沈殿してもよく、有機溶媒はエタノールまたはいずれかの他の適当な有機溶媒でありうる。
【００１２】
本発明は更に、固体基体に結合した核酸を、固体基体からの溶出の前または後、水性ゲルに通過させた後で酵素と接触させることを想定している。酵素はＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素でありうる。そして更に、核酸は、希釈を行うことなく、固体基体上で配列決定されうる。
【００１３】
本発明は更に、固体基体に結合した核酸を、非メチル化シトシンが脱アミノ化されるように、水性ゲルに通過させた後で亜硫酸水素塩と接触させる場合を想定している。本発明は更に、核酸内の少なくとも１つの核塩基がエピジェネティックな修飾を有する場合を想定している。
【００１４】
本発明は更に、核酸が、核酸ハイブリダイゼーション、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される実体を介して固体基体に結合する場合を想定している。
【００１５】
本発明は、サンプルからの核酸を富化させるための方法を含み、該方法は、核酸を含む疑いのあるサンプル、核酸への結合に適した微粒子および水性ベース分離ゲルを準備し、サンプル中の核酸が磁気微粒子に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、サンプルを微粒子と接触させて、負荷（ｌｏａｄｅｄ）磁気微粒子を生成させ、該負荷微粒子を水性ベース分離ゲルを介して磁場で引き寄せることを含む。ゲルはアガロースゲルでありうる。アガロースゲルは約０．１０％から約１．０％の濃度でありうる。また、分離ゲルはエタノールおよびグリセロールの１以上を含みうる。粒子は、核酸に結合するのに適した官能基をも含みうる。
【００１６】
微粒子は磁気を帯びていてもよく、磁気微粒子は、場合により、シリカおよびガラスの１以上で少なくとも部分的に被覆されていてもよい、と更に想定される。磁気微粒子は回転楕円体でありうるが、任意の形状が本発明において適していると想定される。
【００１７】
サンプルは溶解バッファーを含みうると更に想定される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は核酸の１工程の単離および精製方法に関する。該方法は簡便であり、当業者により容易に実施される。該方法は、溶解溶液（細胞溶解溶液は当業者に公知である）、および核酸に結合する固体基体（例えば、酸化鉄粒子、磁気粒子、ガラス、シリカなどで少なくとも部分的に被覆された磁気粒子）を加えることを含む。存在する核酸は粒子に結合する。ついで水性ゲル（例えば、アガロースゲルが挙げられるが、核酸に適合性の任意のゲル、例えばＳＤＳアクリルアミドゲルが好適である）を介して、磁気粒子の場合にはアッセイ容器の外部に配置された磁気源（すなわち、磁石）で、粒子を引き寄せる。ゲルを介して粒子を引き寄せる行為は不溶性汚染物を除去（すなわち、「スキージ（ｓｑｕｅｅｇｅｅ）」）し、可溶性汚染物（例えば、塩）を希釈する。粒子は、ゲルを出た後、溶出バッファーに進入する。核酸は溶出バッファー中で遊離される。ついで磁気粒子はゲル内に引き戻され、あるいは沈降される（またはゲル表面からの溶出バッファーの除去の後で遠心分離される）ことが可能である。該方法は典型的にはチューブ内で実施され、チューブ内では溶解バッファーの上にゲルが層をなしており、ゲルの上に溶出バッファーが層をなしている。場合により、ゲルの上に非溶出バッファーが層をなしており、所望により、後の時点で粒子から核酸が溶出されうる。溶出バッファーは有機溶媒（例えば、エタノール）を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００１９】
典型的に、溶解バッファーは塩を含む。溶解バッファー中に典型的に存在する塩には、グアニジニウムチオシアナート（ＧＩＴＣ）（典型的な範囲は０．５Ｍから４．０Ｍ）、ＮａＣｌ（典型的な範囲は０．１Ｍまでおよび１０．５Ｍ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。溶解バッファーは典型的に、バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；典型的な濃度は約２５ｍＭ、ｐＨ約７からｐＨ約８、または当業者に公知の他の適当なバッファー）および界面活性剤（例えば、ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ（ＴＭ）−Ｘ、ポリソルベート、デオキシコラート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；典型的に用いられる濃度は約０．１％から約２．０％の範囲である）をも含有する。
【００２０】
本発明はいずれの特定のサンプルまたはサンプル型にも限定されない。例えば、サンプル物質は体液、例えば血漿、血清、血液、脊髄液、精液、膣液、喀痰および唾液、脳脊髄液、リンパ液ならびに消化液を含みうる。他のサンプル物質には、単離または富化された細胞集団および組織が含まれうる。サンプルは新鮮な又は固定（保存）されたものでありうる。固定サンプルは包埋（例えば、パラフィン包埋）されうる。更に、サンプルは考古学的発掘物から得られうる。すなわち、先史時代の組織、例えば骨は、本発明の方法により富化または単離されうる核酸を与えうる。あるサンプル型は、例えば、サンプルを（例えば、懸濁細胞の遠心分離により）濃縮するため又は大きなサンプル源を破壊（例えば、骨の粉砕または組織の消化分解）するための前処理を要しうる。そのような前処理は、主として、本発明の方法によりより容易に取扱い可能な出発物質を得るためのものである。
【００２１】
本発明において使用されるゲルは約０．１％から約１．０％、約０．１５％から約０．７５％、約０．２％から約０．５０％の濃度でありうる。
【００２２】
本明細書においては、「核酸」なる語は少なくとも１つの核酸を示すと理解される。更に、「核酸」なる語は核酸の混合物をも示しうる。「核酸」なる語はＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの両方を含む。更に、本明細書中で用いる「核酸」または「ＮＡ」はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を意味する。本明細書中で用いる「核酸配列」は鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列を意味する。それらは天然または人工配列、および特にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列またはオリゴヌクレオチドであって、修飾されている又は修飾塩基を含有するものでありうる。これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌またはウイルス由来などでありうる。それらは当業者に公知のいずれかの技術により、特に細胞溶解、ライブラリーのスクリーニング、化学合成により入手可能であり、あるいはライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的または酵素的修飾を含む混合方法により入手可能である。それらは化学修飾されていることが可能であり、例えば、それらは偽核酸（ＰＮＡ）、種々の化学結合（例えば、ホスホロチオアートまたはメチルホスホナート）により修飾されたオリゴヌクレオチド、または官能化された（例えば、異なる特徴的特性を有する１以上の分子でカップリングされた）オリゴヌクレオチドでありうる。
【００２３】
本発明の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に単離し又は富化させるために改変されうる。例えば、捕捉粒子としての非被覆酸化鉄の使用はＲＮＡに選択的である。例えば、シリカ粒子またはシリカ被覆粒子はＤＮＡに特異的である。しかし、バッファーを３３％  エタノールとする場合には、例えば、シリカ粒子は全核酸の単離または富化のためにＤＮＡおよびＲＮＡに結合する。
【００２４】
「基体」なる語は、水溶液中で実質的に不溶性である物質を示し、基体が加えられると（高いイオン強度の）水溶液中の核酸が基体に吸着されうる。「基体」なる語は、磁気誘引性粒子、および非被覆酸化鉄のような又は例えばシリカ、ガラス、水晶もしくはゼオライトで被覆された磁気誘引性粒子を含む。しかし、基体は磁気を帯びている必要はない。更に、粒子は、核酸への結合に適した官能基を含みうる。そのような官能基（機能的グループ）の例には、タンパク質（またはその機能的部分）、抗体（またはその機能的部分）、化学的リンカー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、核酸ハイブリダイゼーションによるもの、アプタマー、ビオチンなど）が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、核酸は基体に直接的に結合する必要はなく、本明細書に記載されているとおり又は当業者に公知のとおり、１以上の実体を介して結合してもよい。更に、非磁気粒子は、例えば遠心分離（例えば、低速遠心分離）により、水性ベースゲルを通過させられうる。この実施形態においては、溶出バッファー（または塩類液など）がチューブの底に存在し、溶出バッファーの上にゲルが層をなしており、ゲルの上に溶解バッファーが存在すると想定される。遠心分離の力は、粒子をゲルを介して溶出バッファー中に引っ張り下ろす。もう１つの実施形態においては、チューブを、磁力を用いる場合と同様に準備し（溶解バッファーは底、溶出バッファーは最上部）、チューブに栓をし、反転させた後で遠心分離に付す。更に、微粒子を、ゲルを介して移動させるための他の手段が想定される。例えば、荷電粒子は電気泳動型法によりゲルを介して引き寄せられうる。そして更に、粒子が沈降に付され（またはゲルのレベルまで遠心分離され）、溶解バッファーが除去された場合には、フレンチプレスに類似した装置で微粒子はゲルを介して押出されうる。
【００２５】
基体は、球状、楕円形、長方形、桿状、らせん状および無定形（これらに限定されるものではない）を含む任意の形状のものでありうる。本発明の基体はサイズによっては限定されないが、好ましくは、最大径において約０．２ｍｍ以下、０．０２ｍｍ以下、２．０μｍ以下、２００ｎｍ以下、２０ｎｍ以下および２ｎｍ以下である。本発明の基体は直径約０．１ｎｍから約５ｎｍであることも可能であり、直径約０．８ｎｍから約５ｎｍでありうる。更に、基体は、水溶液のような液相に分散された場合には、懸濁液を生成しうる、または溶液から沈降しうる、と理解される。
【００２６】
「高いイオン強度」および「高濃度」なる語は、約１Ｍ以上の濃度の溶解塩によって生じる、水溶液中のイオン強度または濃度を意味する。典型的には、塩は１から１０Ｍの濃度で水溶液中に存在する。より典型的なのは１から８Ｍの濃度のカオトロピック塩である。好ましい実施形態においては、本発明の溶解バッファーは約１Ｍを超える塩濃度を有する。
【００２７】
「低いイオン強度」および「低濃度」なる語は、約１Ｍ未満の濃度の溶解塩によって生じる、水溶液中のイオン強度または濃度を意味する。
【００２８】
「磁気」および「磁気粒子」なる語は、磁気を帯びた、および／またはそれ自身の持続的磁場を生成する物質から構成される物体を意味するものとする。当業者に公知のいずれかの適当な物質が本発明における使用のために想定され、イオン系物質（例えば、酸化鉄）または酸化鉄含有物質が最も頻繁に想定される。本発明においては、磁気粒子（多官能性磁気粒子；ＭＭＰ）が基体を構成し、サイズによっては限定されないが、好ましくは、最大径において約０．２ｍｍ以下、０．０２ｍｍ以下、２．０μｍ以下、２００ｎｍ以下、２０ｎｍ以下および２ｎｍ以下である。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の磁気粒子は、核酸に結合するように、ガラス、シリカまたは当業者に公知の１以上の物質で少なくとも部分的に被覆されている。マイクロおよびナノサイズの磁気粒子は当業者にとって商業的に入手可能である（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ，ＮＹ；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）。更に、粒子は実験室内で当業者により合成されうる。例えば、Ｓｔａｒｍａｎｓ  ＬＷら，Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｍｉｃｅｌｌｅｓ（ＩＯＮ−Ｍｉｃｅｌｌｅｓ）  ｆｏｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｆｅｂ  ２０；８（２）ｅ５７３３５；Ｈｅｉｔｓｃｈ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｔ．ら，Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｒｏｄｓ  Ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅ−Ｄｏｐｅｄ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｓｈｅｌｌｓ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｊｕｌｙ；１８１（７）：１５９０−１５９９を参照されたい。
【００２９】
核酸の抽出のために細胞および組織を溶解するための方法および試薬は当業者によく知られており、サンプルの核酸を破壊しないいずれかの方法が本発明による使用に適している。更に、本方法による単離および精製に適した核酸は固定サンプル（例えば、ホルマリンまたはグルタルアルデヒド固定サンプル）、包埋サンプル（例えば、パラフィン包埋サンプル）および合成核酸の溶液または懸濁液を含有する反応容器から得られうる。
【００３０】
本発明の方法により富化、単離または精製された核酸は、当業者に公知のいずれかの通常の方法で使用されうる。なぜなら、本発明の方法は、核酸を、その後続使用に有害でありうるいかなる様態においても変化させないからである。例えば、核酸は配列決定され、ＰＣＲにより増幅され、発現ベクターなどにおいて使用されうる。この点に関して、核酸を、水性ゲルに通過させた後、例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような酵素と接触させることが  可能である。更に、本発明は、核酸を希釈せずに固体基体上で配列決定することを含む。更に、本発明は、固体基体に結合した核酸を、非メチル化シトシンが脱アミノ化されるように、水性ゲルに通過させた後、亜硫酸水素塩と接触させることを含む。更に、本発明は、核酸内の少なくとも１つの核塩基がエピジェネティック修飾を有することを想定している。
【００３１】
キット
本発明は、ゲル溶液および／またはゲル成分（後記で例示されているもの、または過度な実験を伴わずに当業者により決定されうる均等物）、核酸への結合に適した磁気粒子および説明を含有するキットをも含む。場合により、特定の用途（例えば、ＲＮＡの単離）のため、および／または手順の実施で使用者を補助するために、バイアル、反応溶液および他の物品が本発明のキットにおいて提供されうる。
【００３２】
本明細書に挙げられている全ての特許、特許出願公開、文献論文、教科書および他の刊行物は、本開示に関する当業者の技術水準を示す。全てのそのような刊行物を、各個の刊行物が参照により本明細書に組み入れられると具体的および個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００３３】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または限定の非存在下で適切に実施されうる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」なる語のいずれかの本明細書中の各場合はその他の２つの用語のいずれかで置換されうる。同様に、単数形表現は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形対象物を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載されている、および／または本開示を読めば当業者に明らかになる１以上の方法および／または工程型を含む。
【００３４】
用いられている用語および表現は説明のための用語として用いられており、限定のためのものではない。この点に関して、ある用語がここで定義されており、「詳細な説明」の他の箇所または本明細書中の他の箇所では異なって定義、説明または考察されている場合には、全てのそのような定義、説明および考察がそのような用語を表すと意図される。また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外することは意図されない。
【００３５】
特許請求している本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴の文脈で具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示されている概念の修飾および変更を施しうると理解されるべきである。そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】ゲルでの溶解および最上部の溶出を示す。
【図１Ｂ】捕捉された粒子を示す。
【図１Ｃ】粒子がチューブの側面を上方に移動することを示す。
【図１Ｄ】粒子が溶出バッファー中を上方へ移動することを示す。
【図１Ｅ】磁石を使用して粒子を溶出バッファー中に移動させることによる溶出を示す。
【図１Ｆ】溶出物の除去の前に粒子を下方のゲル内へ戻して移動させることを示す。
【図２Ａ】実施例２に詳細に記載されている本発明の方法により精製された標的ヌクレオチド配列のＤＮＡ増幅曲線のグラフを示す。
【図２Ｂ】内部対照のグラフを示す。
【図３Ａ】実施例２に詳細に記載されている本発明の方法により精製された標的ヌクレオチド配列のＤＮＡ増幅曲線を示す。
【図３Ｂ】内部対照の増幅曲線を示す。
【実施例】
【００３７】
[実施例１]
本発明の概念は、核酸を磁気粒子に結合させ、ついで粘性水性ゲルまたはゲル溶液を介して粒子を引き寄せることにより、例えば細胞ライセートまたは他の細胞サンプルから核酸が容易に精製されうるというものである。第１の試験は、該ゲルが核酸非含有サンプル中の塩レベルを低減しうるかどうかを調べることであった。
【００３８】
１％  ゲルを以下のとおりに調製した。５０ｍｌの水（ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ非含有水）を０．５ｇのアガロース−ＬＥ（Ａｍｂｉｏｎ  ＃９０４０が挙げられるが、任意の商業的に入手可能なアガロースが使用可能である）と混合した。該アガロースを電子レンジ内（任意の適当な熱源が有効である）で該水中で融解させて、１％  アガロース溶液を得、５５℃に設定された加温ブロック（ｔｅｍｐ  ｂｌｏｃｋ）（すなわち、熱ブロック）上に配置して、該ゲルの融解状態を維持した。
【００３９】
７０ｍｌのグアニジンチオシアナート（ＧＩＴＣ）含有溶解バッファー（３Ｍを超えるＧＩＴＣ、１％を超える非イオン界面活性剤および７．０を超えるｐＨを含有する溶解バッファー；あるいは、核酸を保護する、加工される組織またはサンプルに適したいずれかの溶解バッファー）および３５ｍｌの９５％  エタノールを使用して、細胞溶解−エタノール溶液を調製した。
【００４０】
１ｍｌの溶解バッファー−エタノール溶液を、サンプル添加を表す０．５ｍｌの水と共に１２ｍｍ×７５ｍｍポリプロピレンチューブに加えた。５０マイクロリットルのシリカ被覆磁気微粒子（Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ，ｍＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓＤＮＡ）も細胞溶解混合物に加えた。
【００４１】
２ｍｌの融解アガロースを溶解バッファーの最上部に穏やかに浮遊させ、冷却して沈降させた。硬化後、ゲルの表面を洗浄して、ゲルの上に載っていた可能性のある残存グアニジンを除去した。これは、５００マイクロリットルの水（前記）をゲルの表面に加え、ついで洗浄液を除去することにより行った。ついで、溶出バッファーを表すために、２００マイクロリットルの水（前記）をゲルの上に加えた。
【００４２】
溶解バッファーの領域内のチューブの側面に磁石を配置することにより、磁気粒子（ＭＭＰ）を磁石により捕捉した。代替アプローチは、より大きな磁気源をチューブの直上に配置することである。ついで磁石をゆっくりとチューブの側面で引っ張り上げて、磁場で磁気粒子を引き寄せた。磁気粒子は、ゲルを通過中に外側が幾らか擦れて汚れた。集められた粒子はチューブの側面に存在し、粒子の塊がチューブの上方へ移動するにつれて、ゲルは粒子により押しのけられた。粒子がゲルを通って移動した溝が形成された。粒子がゲルの中心を通って直接的に引き上げられるように磁石を配置することが可能でありうるが、得られた結果に基づくと、磁石の位置は重要でないようである。
【００４３】
磁石を一方の側から他方の側へ移動させることにより、磁気粒子を、ゲル層を介して水層へと移動させ、前後方向で混合した。これを数回行って、水中で粒子を混合した。ついで粒子を、磁石をチューブの側面に配置することにより捕捉し、ゲル内に引き戻して、それらを最上部の水層から除去した。図１Ａから図１Ｆを参照されたい。水層を取り出し、微量遠心チューブ内に配置した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４０分光光度計においてＡ２３０、２６０、２８０および４００で吸光度の読取りを行ったが、任意の市販の分光光度計が有効である。該装置を水でブランク化し、サンプルを測定した。
【００４４】
Ａ２３０で読取りを行った。非希釈サンプルは２．８１９４の読取値を示し、これはこの特定の分光光度計での正確な読取りのためには高すぎる。該サンプルを水で１／４０希釈し、再測定した。その読取値は４０倍希釈で１．７２６８であった。「×０．６」の係数を用いてＡ２３０をｍＭ  ＧＩＴＣに変換した。１．７２６８×４０×０．６＝４１．４ｍＭ  ＧＩＴＣ。該サンプルにおけるこのＧＩＴＣ濃度は許容されうる。幾つかのアッセイが試験されており、該反応における５０ｍＭまでのＧＩＴＣに対する許容性を示している。関心のあるアッセイは１：１のサンプル体積：アッセイ混合物の比を用い、サンプルにおける４１．４ｍＭ  ＧＩＴＣはアッセイにおける約２０ｍＭ  ＧＩＴＣと同等である。
【００４５】
該試験を反復し、今回は、ゲルを回転させて、粒子が移動する距離を増加させながら、ＭＭＰを、ゲルを介して引っ張り上げた。水中のサンプルの１／５０希釈液を使用して、分光光度計測定を行った。Ａ２３０における吸光度は０．８７９２であった。０．８７９２×５０×０．６＝サンプルにおける２６．４ｍＭ  ＧＩＴＣとなり、これは許容されうる範囲である。次に核酸含有サンプルでこの方法を試験した。
【００４６】
[実施例２]
この実験においては、既知量の核酸をサンプルにおいて使用した。被検核酸はＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ（ＴＭ）  ＨＣＶアッセイからのキャリブレーター（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）Ｂであり、ＨＣＶ内部対照をアッセイ抽出において使用した。キャリブレーターＢは、ヒト血漿における約１０，０００，０００  Ｉｕ／ｍｌ（ミリリットル当たりの国際単位）濃度のＨＣＶ配列を含有するＲＮＡサンプルである。また、該内部対照は、ＨＣＶを抽出するために使用されるサンプル調製系の抽出性能を試験するために使用されるＲＮＡ分子である。ゲル内のグリセロールおよびエタノールの存在も、それらが該抽出に何らかの影響を及ぼしうるかどうかを判定するために試験した。エタノールの存在は粒子上の核酸の保持を補助することがあり、グリセロールはゲルの密度を変化させることがある。
【００４７】
Ａｍｂｉｏｎ  Ａｇａｒｏｓｅ−ＬＥ  ＃９０４０  ロット０６４Ｐ８０Ｂを使用して、ゲルを以下のとおりに調製した。２５ｍｌの水をそれぞれが含有する３つの試薬ボトルを使用して、種々のゲルを調製した。水はＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ非含有水であった。アガロース（Ａｍｂｉｏｎ  Ａｇａｒｏｓｅ−ＬＥ  ＃９０４０  ロット０６４Ｐ８０Ｂ）を以下のとおりに各ボトルに加えた。
０．０５ｇのアガロースをボトル１に加えて０．２％ゲルを調製する。
０．１０ｇのアガロースをボトル２に加えて０．４％ゲルを調製する。
０．１５ｇのアガロースをボトル３に加えて０．６％ゲルを調製する。
【００４８】
アガロースを電子レンジ内で融解させ、ついでボトルを、５５℃に加熱された加温ブロック（ｔｅｍｐ  ｂｌｏｃｋ）上に配置して、融解状態を維持した。
【００４９】
Ｃ型肝炎ウイルスキャリブレーター（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）Ｂ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ；これは陰性ヒト血清における既知量のＨＣＶ核酸である）および内部標準（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を、まず、以下のとおりに、溶解−バッファー  エタノール混合物で抽出し、磁気粒子上で捕捉した。実施例１に記載されている細胞溶解エタノール混合物を溶解バッファーとして使用した。
【００５０】
該細胞溶解混合物は以下のものを含有していた：
１０ｍｌの該細胞溶解エタノール混合物、
５ｍｌのＨＣＶキャリブレーターＢ、
３５０μｌのＨＣＶ内部対照、
５００μｌのＭＭＰ（多官能性磁気粒子）。
【００５１】
該混合物をロッカープレート上に室温で１２分間配置した。
【００５２】
ライセートのインキュベーション中、９個の１５ｍｌチューブを以下のとおりに準備した。
【００５３】
【表１】
2018198599.tif 000003
【００５４】
グリセロール含量を１０％に設定した。２０％グリセロールにおいては、アガロースは溶解バッファーより高密度であり、チューブの底に沈降した。
【００５５】
細胞溶解インキュベーションが完了した後、以下のとおりにゲル技術を用いてサンプルを抽出した。１．５ｍｌのライセートを９個のチューブ（１２ｍｍ×７５ｍｍポリプロピレン）のそれぞれに入れた。２ｍｌの各アガロース混合物を穏やかに最上部に載せ、硬化させた（約４℃で〜１０分間）。１ｍｌの水を全チューブの最上部に載せて、微量の細胞溶解を除去した。最低量のアガロースおよびエタノールを使用する条件では水洗浄液の上の浮遊が生じ始め、該サンプル（＃２）はそれ以上試験しなかった。水をゲルの最上部から除去し、２００μｌの水を溶出のために全ゲルの最上部に加えた。実施例１に記載されているとおりに、磁気粒子を磁石でチューブの側面で捕捉し、ゲルを介して溶出バッファーへと引っ張り上げた。ついで、磁石を使用して、磁気粒子を溶出バッファー中で前後方向へ約２０回移動させて、それらをチューブの一方の側から他方の側へ引き寄せた。前記のとおり、粒子をゲル内に引き戻した。ついで溶出バッファーを取り出し、微量遠心チューブ内に入れた。
【００５６】
各条件から、１０μｌのサンプルを採取し、４９０μｌの水で希釈した。実施例１に記載されているとおりに、分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４０）によって２３０ｎｍで吸光度を読取って、ＧＩＴＣのキャリーオーバーを決定した。
【００５７】
該装置を水でブランク化し、ついでサンプルを測定した。
【００５８】
【表２】
2018198599.tif 000004
【００５９】
サンプルの全ては２５ｍＭ未満のＧＩＴＣ濃度を有する。
【００６０】
ついで、Ａｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ（ＴＭ）  ＨＣＶアッセイを用いて、サンプルをＨＣＶおよび内部対照配列の存在に関して試験した。Ａｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ（ＴＭ）  ＨＣＶアッセイコード４Ｊ８６−９０の３つの成分を使用して、マスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）を調製した。３２０マイクロリットルのアクチベーター（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）および９４８マイクロリットルのオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）混合物を、予め充填された酵素ボトルに加え、ピペッティングにより穏やかに混合した。ついでＰＣＲプレートのウェル内で２５マイクロリットルのマスターミックスを２５マイクロリットルの各溶出サンプルと混合した。ついでこの混合物の２５マイクロリットルをセフェイドチューブ（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｔｕｂｅ）に移し、以下のプログラムと共にセフェイド（Ｃｅｐｈｅｉｄ）（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）を使用してサイクリングした。
【００６１】
温度（℃）      時間（秒）
１サイクルの工程１
５５            １２００
４サイクルの工程２
温度            時間（秒）
９５            ２０
４６            ３０
６８            ２０
６サイクルの工程３
温度            時間（秒）
９２            ２０
６０            ３０
６８            ２０
３７サイクルの工程４
温度            時間（秒）
９０            ２０
５６            ４０
６８            ２０
３５            ４０
ついで各サンプルを測定した。
【００６２】
増幅曲線は後記のとおりであり、ＨＣＶおよび内部対照の両方が溶出物から増幅されたことを示している。図２は増幅曲線（Ａ）および内部対照（Ｂ）のグラフを示す。
【００６３】
第２の２５マイクロリットルの各アッセイ混合物も、同様にセフェイド（Ｃｅｐｈｅｉｄ）ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒにおける異なるプログラムを使用して増幅した。
【００６４】
温度（℃）      時間（秒）
１サイクルの工程１
５５            １８００
４サイクルの工程２
温度            時間（秒）
９５            ４０
４６            ３０
６８            ２０
６サイクルの工程３
温度            時間（秒）
９２            ４０
６０            ３０
６８            ２０
３７サイクルの工程４
温度            時間（秒）
９０            ３０
５６            ４０
６８            ２０
３５            ４０
各サンプルを測定した。
【００６５】
図３は増幅曲線（Ａ）および内部対照（Ｂ）のグラフを示す。
【００６６】
これらの実験は、磁気微粒子上でＨＣＶを捕捉すること、高レベルのＧＩＴＣおよび他の汚染物を除去するゲルを介して該粒子を溶出バッファー中に引き寄せること、サンプルを溶出すること、および核酸の更なる精製を行うことなくＰＣＲアッセイにおいて溶出サンプルを使用することが可能であることを示している。該抽出法は別個のいずれの洗浄工程をも用いなかった。
【図１Ａ】
2018198599.tif 000005
【図１Ｂ】
2018198599.tif 000006
【図１Ｃ】
2018198599.tif 000007
【図１Ｄ】
2018198599.tif 000008
【図１Ｅ】
2018198599.tif 000009
【図１Ｆ】
2018198599.tif 000010
【図２Ａ】
2018198599.tif 000011
【図２Ｂ】
2018198599.tif 000012
【図３Ａ】
2018198599.tif 000013
【図３Ｂ】
2018198599.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月17日(2018.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）核酸を含む又は含む疑いのある試料を準備し、
ｂ）試料を１以上の溶解バッファーと接触させ、溶解した試料を生成させ、
ｃ）試料中の核酸が固体基体に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、溶解した試料を固体基体と接触させ、固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料を生成させ、該固体基体は磁気を帯びた微粒子であり、
ｄ）固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料を、容器に置き、固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料の上に、水性ベース分離ゲルを層として重ね、さらに、水性ベース分離ゲルの上にバッファーを層として重ね、及び
ｅ）試料中に核酸が存在する場合には、核酸に結合した固体基体を、水性ベース分離ゲルを通ってバッファーを通過させることを含む、溶解バッファー成分を核酸サンプルから除去する方法。
【請求項２】
溶解バッファーが約１モル濃度を超える濃度で塩を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体基体が直径約０．１ｎｍ〜約５ｎｍの微粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固体基体が直径約０．８ｎｍ〜約５ｎｍの微粒子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
水性ゲルに通過させた後で、固体基体に結合した核酸を、固体基体から核酸を溶出する溶出バッファーと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒中の核酸の沈殿を含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エタノールである有機溶媒中の核酸の沈殿を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
固体基体に結合した核酸を、水性ゲルに通過させた後で酵素と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸を、希釈を行うことなく、固体基体上で配列決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
固体基体に結合した核酸を、非メチル化シトシンが脱アミノ化されるように、水性ゲルに通過させた後で亜硫酸水素塩と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸内の少なくとも１つの核塩基がエピジェネティックな修飾を有するかどうかを決定することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が、核酸ハイブリダイゼーション、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される実体を介して固体基体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ｉ）核酸を含む疑いのあるサンプル、
ｉｉ）核酸への結合に適した磁気を帯びている微粒子、および
ｉｉｉ）水性ベース分離ゲル
を準備し、
ｂ）サンプル中の核酸が磁気微粒子に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、サンプルを微粒子と接触させて、負荷磁気微粒子を生成させ、
ｃ）容器に、負荷磁気微粒子を置き、溶解した負荷磁気微粒子の上に、水性ベース分離ゲルを層として重ね、さらに、水性ベース分離ゲルの上にバッファーを層として重ねること、及び
ｄ）負荷磁気微粒子を水性ベース分離ゲルを介して磁場でバッファーに引き寄せることを含む、サンプルからの核酸を富化させるための方法。
【請求項１５】
分離ゲルがアガロースを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アガロースが約０．１０％〜約１．０％の濃度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分離ゲルがエタノールおよびグリセロールの１以上をも含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
粒子が、核酸に結合するのに適した官能基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
磁気微粒子がシリカおよびガラスの１以上で少なくとも部分的に被覆されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
磁気微粒子が回転楕円体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが溶解バッファーを含む、請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】
2018198599000001.pdf