(57)【要約】      （修正有）【課題】組換え細菌宿主系統、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び細胞中で対象のタンパク質を生成するための方法の提供。【解決手段】特定の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、並びにＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子を含む組換えグラム陰性細菌細胞であって、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する組換えグラム陰性細菌細胞、細胞を用いる方法、抗ＦｃＲｎ抗体などの特定の抗体においてタンパク質の発現における細胞の使用、並びにタンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．Ｄ１３３、Ｈ１４５、Ｈ１５７、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異ｓｐｒ遺伝子、並びに
ｂ．ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子
を含む組換えグラム陰性細菌細胞であって、
野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する上記組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項２】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｄ１３３Ａ、Ｈ１４５Ａ、Ｈ１５７Ａ、Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｖ１３５Ｄ、Ｖ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃから選択される１つ又は複数の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ、Ｖ１３５Ｇ、及びＧ１４７Ｃから選択される１つ又は複数の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｃ９４などの、Ｃ９４及びＨ１４５Ａの変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｄ１３３Ａ、Ｈ１４５Ａ、及びＨ１５７Ａから選択される変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項２に記載の細胞。
【請求項６】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｃ９４Ａから選択される変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
変異体ｓｐｒ遺伝子が細胞のゲノムに組み入れられている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質をコードする遺伝子が、プラスミド上など、細胞中に一過性にトランスフェクトされる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質をコードする遺伝子が、細胞のゲノム中に組み入れられている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質が、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、又はＦｋｐＡとＳｋｐとの組合せ、特にＦｋｐＡである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
以下の変異遺伝子：
ａ．シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｂ．低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅ  ＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である、変異ｐｔｒ遺伝子、
ｃ．低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である、変異ＯｍｐＴ遺伝子
の１つ又は複数をさらに含んでいる、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
細胞のゲノムが、変異ｓｐｒ遺伝子及び変異Ｔｓｐ遺伝子以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が、ＤｓｂＣをコードする遺伝子を含まない、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性、及び変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、及びタンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質の発現に適するＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、又はＦｋｐＡとＳｋｐとの組合せ、特にＦｋｐＡをコードする遺伝子を有する組換えグラム陰性細菌細胞であって、細胞のゲノムが、野生型細胞及び変異ｓｐｒ遺伝子に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）である上記組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項１６】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ、Ｖ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｈ１４５Ａ、Ｇ１４７Ｃ、Ｈ１５７Ａ、及びＷ１７４Ｒから選択される１つ又は複数の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、請求項１から６までのいずれか一項において規定される、１つ又は複数の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでいるノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を有する、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、遺伝子開始コドンに対するミスセンス変異によって作り出された制限マーカー部位、及び任意選択によって１つ又は複数のさらなる点変異を含んでいる、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が配列番号３を含んでいる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、例えば、大腸菌がＫ１２又はＷ３１１０系統である、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
対象のタンパク質が、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントがＦｃＲｎに特異的である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２５】
野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、変異体ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、及びタンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質を発現するのに適する遺伝子をコードする遺伝子、及びＦｃＲｎに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項２６】
低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項１から２６までのいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を、培養培地中、対象の組換えタンパク質を発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、対象の組換えタンパク質を、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップとを含む、対象のタンパク質を生成するための方法。
【請求項２８】
対象のタンパク質を細胞から回収するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象のタンパク質が、ペリプラズム及び／又は上清から回収される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細菌宿主系統、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関する。本発明は、このような細胞中で対象のタンパク質を生成するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌などの細菌細胞は、組換えタンパク質を生成するために一般的に用いられる。特に、プラスミドによって遺伝子の挿入を可能にする宿主細胞として細菌細胞が多用途であるという性質のため、組換えタンパク質を生成するのに大腸菌などの細菌細胞を用いると有利な点が多い。大腸菌は、ヒトインスリンを含めた多くの組換えタンパク質を生成するのに用いられている。
【０００３】
組換えタンパク質を生成するのに細菌細胞を用いるのは利点が多いにもかかわらず、プロテアーゼ感受性のタンパク質を生成するのが困難であるなど、重大な制限が依然として存在する。プロテアーゼは、大腸菌のペリプラズム及び細胞質における古く、損傷を受け、又はミスフォールディングされたタンパク質を代謝回転する上で重要な役割を果たす。細菌のプロテアーゼは、対象の組換えタンパク質を分解するように作用し、それによって活性タンパク質の収率を大幅に低減することが多い。
【０００４】
数々の細菌のプロテアーゼが同定されている。大腸菌において、ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ（ｐｔｒ）、ＤｅｇＰ、ＯｍｐＴ、Ｔｓｐ、ｐｒｌＣ、ｐｔｒＡ、ｐｔｒＢ、ｐｅｐＡ−Ｔ、ｔｓｈ、ｅｓｐｃ、ｅａｔＡ、ｃｌｐＰ、及びｌｏｎを含めたプロテアーゼが同定されている。
【０００５】
Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）は、６０ｋＤａのペリプラズムプロテアーゼである。Ｔｓｐの最初に知られた基質はペニシリン結合性タンパク質−３（ＰＢＰ３）であったが（「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」Ｎａｇａｓａｗａ  Ｈ、Ｓａｋａｇａｍｉ  Ｙ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ、Ｈａｒａ  Ｈ、Ｈｉｒｏｔａ  Ｙ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８９年１１月、１７１巻（１１）、５８９０〜３頁、及び「Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｓｐ  ｇｅｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３」、Ｈａｒａ  Ｈ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ、Ｈｉｇａｓｈｉｔａｎｉ  Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１年８月、１７３巻（１５）、４７９９〜８１３頁）、Ｔｓｐはファージテイルタンパク質を切断することもできることが後に発見され、したがってテイル特異的プロテアーゼ（Ｔａｉｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）（Ｔｓｐ）と新たに命名された（Ｓｉｌｂｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、２９５〜２９９頁（１９９２年））、Ｓｉｌｂｅｒらは（「Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｃ（ｔｓｐ）  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔａｉｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２」、Ｓｉｌｂｅｒ、Ｋ．Ｒ．、Ｓａｕｅｒ、Ｒ．Ｔ．、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、１９９４年、２４２巻、２３７〜２４０頁）、ｐｒｃ遺伝子のセグメントをＫａｎｒマーカーを含むフラグメントで置換することによって変異が作り出されたｐｒｃの欠失系統（ＫＳ１０００）について記載している。
【０００６】
Ｔｓｐ（ｐｒｃ）活性を低減することは、対象のタンパク質のタンパク質分解を低減するのに望ましい。しかし、プロテアーゼｐｒｃを欠く細胞は、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示すことが見出された。Ｈａｒａらは、遺伝子外サプレッサー（ｓｐｒ）変異を含む熱耐性復帰変異体を単離した（Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻、６３〜７２頁（１９９６年））。ｓｐｒは、１８ｋＤａの膜結合ペリプラズムプロテアーゼであり、ｓｐｒの基質は細胞分裂の間細胞壁の加水分解に関与する外膜におけるＴｓｐ及びペプチドグリカンである。ｓｐｒ遺伝子は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＦＶ４（ＳＰＲ＿ＥＣＯＬＩ）と呼ばれている。
【０００７】
変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる改善されたプロテアーゼ欠損系統は記載されている。Ｃｈｅｎらは、ｐｒｃ（Ｔｓｐ）、並びに遺伝子の上流及び下流の領域を増幅し、選択マーカー及びｓｐｒＷ１７４Ｒ変異を含んでいるベクター上でこれらを一緒にライゲートすることによって作り出された別のプロテアーゼであるＤｅｇＰ（大腸菌のペリプラズムにおける組換え抗体フラグメントの高レベルの蓄積は三重変異体（ΔＤｅｇＰΔｐｒｃ  ｓｐｒＷ１７４Ｒ）宿主系統を必要とする）における変異の異なる組合せを有する大腸菌系統の構築について記載している（Ｃｈｅｎ  Ｃ、Ｓｎｅｄｅｃｏｒ  Ｂ、Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ＪＣ、Ｊｏｌｙ  ＪＣ、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＣ、Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ＪＥ、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ＫＭ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、２００４年３月５日、８５巻（５）、４６３〜７４頁）。ΔＤｅｇＰ、Δｐｒｃ、及びｓｐｒＷ１７４Ｒ変異の組合せは、最高レベルの抗体軽鎖、抗体重鎖、及びＦ（ａｂ）’２−ＬＺを提供することが見出された。ＥＰ１３４１８９９は、プロテアーゼＤｅｇＰ及びＰｒｃをそれぞれコードする染色体ＤｅｇＰ及びｐｒｃを欠いており、ｐｒｃ変異体を抱く系統が示す増殖表現型を抑制するタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を抱く大腸菌系統を開示している。
【０００８】
Ｔｓｐ及びｓｐｒの両方に変異を含んでいる、他の改善されたプロテアーゼ欠損系統は、ＷＯ２０１１／０８６１３６に記載されている。
【０００９】
ＷＯ０２／４８３７６に開示されている系統はｌａｃ−であり、チミジン、フコース、又はマルトースを炭素源として用いる培養液中では増殖することができない。これは、商業規模上での使用を意図する系統にとって重大な欠点であり得る。アルカリホスファターゼ生成の欠如など、系統に付随するさらなる短所が存在し得る。後者は、培養培地からのリン酸塩の利用に関与するペリプラズムタンパク質である。
【００１０】
ある種のタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性及び／又はイソメラーゼ活性及び／又はシャペロン活性を示し、組換えタンパク質発現に用いられる細胞系において用いた場合、有利な性質をもたらすことが見出されている。
【００１１】
本発明は、Ｔｓｐ及びｓｐｒ変異の両方を有し、組換えタンパク質を生成するための有利な手段を提供するタンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質（単数又は複数）をコードする少なくとも１つの遺伝子を有する新たな細菌系統を提供する。
【００１２】
本発明の第１の態様において、
ａ．Ｄ１３３、Ｈ１４５、Ｈ１５７、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、並びに
ｂ．ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子（単数若しくは複数）
を含む組換えグラム陰性細菌細胞であって、
野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態において、
ａ．Ｄ１３３、Ｈ１４５、Ｈ１５７、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、
ｂ．ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子（単数若しくは複数）、
ｃ．抗体又はその結合性フラグメントなど、対象のタンパク質を発現することができる遺伝子
をコードする組換えグラム陰性細菌細胞であって、
細胞が、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、細胞ゲノムのＤＮＡの残りは、それに組換え細胞が由来する野生型細胞と同質遺伝子である、
組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【００１４】
一実施形態において、細胞のゲノムは、変異ｓｐｒ遺伝子、野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾、及びタンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質を発現する遺伝子（単数又は複数）以外は野生型の細菌細胞に対して同質遺伝子である。
【００１５】
第２の態様において、本発明は、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、ｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、細胞のゲノムは、野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾、変異ｓｐｒ遺伝子、及びタンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質を発現するために導入される遺伝子（単数又は複数）以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
【００１６】
本発明の第１の態様及び第２の態様によって提供する細胞は、有利な増殖及びタンパク質生成の表現型を示す。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞において対象のタンパク質を発現することを含む、対象のタンパク質を生成するための方法を提供する。
【００１８】
第４の態様において、本発明は、本明細書に記載するプロセスから発現されるタンパク質にも拡張する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】宿主細胞と「シャペロン」との様々な組合せで行った５Ｌ規模上の発酵の結果を示す図である。Ｗ３１１０は野生型大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）系統である。様々な組合せとは：シャペロンなしの野生型；ＦｋｐＡ及びＳｋｐを有する野生型；ＭＸＥ０１６変異体ｓｐｒ及びＷＯ２０１１／０８６１３６に公開したΔＴｓｐ；ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ；ＭＸＥ０１６及びＳｋｐ；ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ及びＳｋｐ；ＷＯ２０１１／０８６１３６に開示したＭＸＥ０１７；ＭＸＥ０１７及びＦｋｐＡ及びＳｋｐであった。
【図２】導入後フィード速度５．４ｇ／ｈ、６．０ｇ／ｈ、及び７．０ｇ／ｈでのフィード速度変動実験の結果を示す図であり、ＭＸＥ０１６に対して、より速いフィード速度で作成された大多数のさらなるＦａｂ’は上清において失われた。
【図３Ａ】ＭＸＥ０１６＋／−ＦｋｐＡに対する細胞の生存能（３Ａ）及びＦａｂ’力価（３Ｂ）を示す図である。
【図３Ｂ】ＭＸＥ０１６＋／−ＦｋｐＡに対する細胞の生存能（３Ａ）及びＦａｂ’力価（３Ｂ）を示す図である。
【図４】２０Ｌパイロット規模生成に対する一次回収データを示す図である。
【図５】非還元性条件下、２０Ｌパイロット規模生成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色ゲル上の初期回収を示す図である。ＦｋｐＡ関連バンド以外、タンパク質のプロファイルは２つの系統間で非常に類似すると思われる。
【図６】非還元性の条件下、２０Ｌパイロット規模プロセスに対するＨｉｓタグウエスタンブロットを示す図である。全長のＦｋｐＡが検出され、約３０ｋＤａのバンドに相当し、シグナルはＭＸＥ０１６単独において予想通り検出されなかった。
【図７Ａ】様々な遺伝子における様々な変異を示す図である。
【図７Ｂ】様々な遺伝子における様々な変異を示す図である。
【図７Ｃ】様々な遺伝子における様々な変異を示す図である。
【図７Ｄ】抗体の軽鎖（ＬＣ）、抗体の重鎖（ＨＣ）、ＦｋｐＡポリヌクレオチド配列、及び／又はＳｋｐポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターの創製を示す図である。
【図８】様々なポリヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示す図である。
【００２０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、開始コドンの上流の６個のヌクレオチドＡＴＧＡＡＣを含んでいる野生型Ｔｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号２は、野生型Ｔｓｐタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、開始コドンの上流の６個のヌクレオチドＡＴＧＡＡＴを含んでいる変異ノックアウトＴｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号４は、野生型ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号５は、野生型ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号６は、変異ノックアウトＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２６】
配列番号７は、野生型ＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２７】
配列番号８は、野生型ＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号９は、変異ＤｅｇＰ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００２９】
配列番号１０は、変異ＤｅｇＰタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１１は、ＡｓｅＩ制限部位を含む変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３１】
配列番号１２は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３２】
配列番号１３は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異Ｔｓｐ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３３】
配列番号１４は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３４】
配列番号１５は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子の領域に対する５’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３５】
配列番号１６は、ＡｓｅＩ制限部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の領域に対する３’オリゴヌクレオチドプライマーの配列である。
【００３６】
配列番号１７は、野生型ｓｐｒ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号１８は、最初のアミノ酸残基２６個であるシグナル配列を含んでいる野生型ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３８】
配列番号１９は、シグナル配列のない非変異ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３９】
配列番号２０は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる変異ＯｍｐＴ配列のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２１は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる変異ＯｍｐＴ配列のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２２は、変異ノックアウトＯｍｐＴ配列のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２３は、ＯｍｐＡオリゴヌクレオチドアダプターの配列を示す。
【００４３】
配列番号２４は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列１（ＩＧＳ１）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４４】
配列番号２５は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列２（ＩＧＳ２）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４５】
配列番号２６は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列３（ＩＧＳ３）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４６】
配列番号２７は、大腸菌Ｆａｂ発現に対する遺伝子間配列４（ＩＧＳ４）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００４７】
配列番号２８は、野生型ＦｋｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号２９は、野生型ＦｋｐＡ遺伝子のタンパク質配列である。
【００４９】
配列番号３０は、ｈｉｓタグ付したＦｋｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号３１は、ｈｉｓタグ付したＦｋｐＡ遺伝子のタンパク質配列である。
【００５１】
配列番号３２は、野生型ｓｋｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号３３は、野生型ｓｋｐ遺伝子のタンパク質配列である。
【００５３】
配列番号３４は、ｈｉｓタグ付したｓｋｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号３５は、ｈｉｓタグ付したｓｋｐ遺伝子のタンパク質配列である。
【００５５】
配列番号３６から配列番号７４までは、ＦｃＲｎ抗体又はそのフラグメントの様々なアミノ酸及びＤＮＡの配列を示し、これらは本発明の細胞系における発現に適する。特に、配列番号５０は、抗ＦｃＲｎ抗体軽鎖１５１９ｇＨ２０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号５８は、抗ＦｃＲｎ抗体重鎖１５１９ｇＨ２０の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５６】
本発明者らは、対象の組換えタンパク質を発現するのに適する、改善された組換えグラム陰性細菌細胞を提供している。
【００５７】
一実施形態において、タンパク質は抗体又はその結合性フラグメント、特に治療用抗体である。
【００５８】
特に、本発明者らは、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子を、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有するグラム陰性細菌細胞中に組み入れることにより、対象の組換えタンパク質を発現するのに適する改善された組換えグラム陰性細菌細胞を提供している。
【００５９】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）を細胞のゲノム中に組み入れて、例えば、安定な細胞系を提供する。一実施形態において、発現用の組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を安定な細胞系中にトランスフェクトして、所望の組換えタンパク質の発現を提供する。
【００６０】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする遺伝子（単数若しくは複数）を１つ又は複数のプラスミド上に提供し、例えば、プラスミドを細胞中に一過性にトランスフェクトして本開示の細胞系を提供する。
【００６１】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）を、対象の組換えタンパク質に対するコード配列も含んでいるプラスミド上に提供する。
【００６２】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）を、対象の組換えタンパク質に対するコード配列を含まないプラスミド上に提供する。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、野生型細菌細胞に比べて、並びに変異Ｔｓｐ遺伝子のみ又は変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞に比べて、改善した細胞増殖の表現型を有する新たな系統を提供する。
【００６４】
本発明の細胞は多くの利点を有する。本発明者らは、驚くべきことに、本開示による細胞は、野生型細胞に比べて、又は変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を含む細胞に比べて、増大した細胞生存能を示し得ることを見出した。
【００６５】
生存可能ではない細胞は培養物中で溶解し、ＤＮＡデブリを作り出す傾向があるので、細胞生存能は実際、特に重要である。このＤＮＡデブリは、所望のタンパク質を精製する困難、代価、及び出費を増大する。したがって、溶解した非生存性の細胞からのＤＮＡデブリを最小にすることは、組換えタンパク質を効率的に製造する上で重大な問題であり、例えば、ＵＳ６，２５８，５６０を参照されたい。
【００６６】
細胞生存能は、蛍光色素及びＦＡＣＳ分析、又は同様のものを用いるなど、数々のルーチン技術のあらゆる１つによって測定することができる。
【００６７】
具体的には、本開示による細胞は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞に比べて、低減した細胞溶解の表現型を一般的に示す。
【００６８】
さらに、新たな系統は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞に比べて、細胞からのタンパク質の漏出を低減し、長期間のペリプラズム蓄積を可能にする。これは、例えば、標的タンパク質の合計発現レベルが同様であるが、その系統があまり漏出性ではないためより多くのタンパク質がペリプラズム中に蓄積し、又はより少ないタンパク質が上清に蓄積する場合、これらのあまり漏出性ではない性質を有する細胞は、一般に、タンパク質の回収を促進することから工場規模の生成により適するという理由で、特に重要である。
【００６９】
さらに、本開示による細胞は、ＦｋｐＡなどのタンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）の非存在下で、野生型細菌細胞に比べて、又は変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を含んでいる細胞に比べて、対象のタンパク質の増大した収率を示し得る。改善されたタンパク質の収率は、ペリプラズムタンパク質の収率及び／又は上清タンパク質の収率であり得る。一実施形態において、本発明の細胞は、細胞からの漏出が低減するため、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を有する細胞に比べて、改善されたペリプラズムタンパク質収率を示す。
【００７０】
組換え細菌細胞は、より速い速度で対象のタンパク質を生成することができることがあり、したがって、野生型細菌細胞に比べて、又は変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子を含んでいる細胞に比べて、より短時間で同量の対象のタンパク質が生成され得る。対象のタンパク質を生成する速度がより速いのは、細胞の増殖の最初の期間にわたって、例えば、タンパク質発現の誘導後最初の５時間、１０時間、２０時間、又は３０時間にわたって、特に著しいことがある。
【００７１】
本発明による細胞は、ペリプラズム及び／又は培地において、およそ１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、又は４．０ｇ／Ｌの対象のタンパク質の最大収率を発現するのが好ましい。
【００７２】
さらに、フォールディングを促進するタンパク質（単数又は複数）の発現は、適切なフォールディングが提供されるタンパク質を最大にすることによって、発現をさらに最適化する。当業者であれば、適切なフォールディングは生物学的機能に不可欠であり、したがって所望のフォールディングを有するタンパク質を単離することが極めて重要であるということを十分承知している。これは、発現されるタンパク質は細胞にとって天然ではなく、したがって細胞は適切なフォールディングを有するタンパク質を自動的に発現しないことがあるので、タンパク質がグラム陰性細菌において発現される場合には特に重要である。不適切なフォールディングは、凝集又は他の不純物としてそれ自体発現することがある。所望のタンパク質の単離は広範な精製を必要とし得るが、広範な精製は代価に関係し、所望のタンパク質が低収率に終わることもある。発現された、適切にフォールディングされたタンパク質の量を最大にすることで、必要とされる精製の量を最小にし、使用できる収率を最適化することができ、ゆえに都合がよい。
【００７３】
フォールディングを促進するタンパク質の発現に付随する利点には、以下の１つ又は複数が含まれる：力価が高い（例えば、野生型の０．５ｇ／Ｌに比べて約１．０５ｇ／Ｌに増大）、収集時の生存能がより高い（例えば、＞９５％）、フィード速度が増大することで力価が増大する（プロセス開発に対する見込みがより良好である）、２０Ｌ規模などの商業生成規模で力価が高く、収集時の生存能がより高い、及び、特に２０Ｌ規模での抽出物の清澄化がより容易である。
【００７４】
本発明が提供する細胞は、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐのプロテアーゼ活性を有し、このため対象のタンパク質、特に、Ｔｓｐに対してタンパク分解感受性である対象のタンパク質のタンパク分解性を低減し得る。したがって、本発明が提供する細胞は、野生型の細菌細胞に比べて、インタクトなタンパク質、好ましくは高収率の対象のタンパク質、及び低収率のタンパク分解性フラグメント、又は好ましくはタンパク分解性フラグメントのないタンパク質（好ましくは対象のタンパク質）をより高い収率で提供し得る。
【００７５】
本発明の一実施形態において、細胞は、本開示による修飾を導入することが必要とされるゲノムに対して最小の変異だけを有する。例えば、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質をコードする遺伝子（単数又は複数）を細胞中に、例えばプラスミド上に、一過性に導入することができるので、細菌細胞は野生型細菌細胞と、ｓｐｒ遺伝子に対する１つ又は複数の変異、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾が異なるだけであり得る。一実施形態において、細胞は、細胞の増殖に、及び／又は対象のタンパク質を発現する能力に、有害な効果を有し得るいかなる他の変異を有さない。
【００７６】
したがって、本発明の１つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対してさらなる遺伝子操作された変異を含んでいる細胞に比べて、改善されたタンパク質発現及び／又は改善された増殖の特徴を示し得る。本発明が提供する細胞はまた、細胞のゲノムに対するさらなるかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成において用いるのにより適している。
【００７７】
当業者であれば、発酵法、ＥＬＩＳＡ、及びタンパク質Ｇ  ＨＰＬＣを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて、それが望ましい収率の対象のタンパク質を有するか否かを見るために、候補の細胞クローンを試験することが容易にできる。適切な発酵法は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  Ｄ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆａｂｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｉｎｇｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｅ，ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄ，Ｆａｂ’ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ，ｔａｉｌ  ｐｉｅｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨ．２０９：１９３−２０２；Ｂａｃｋｌｕｎｄ  Ｅ．Ｒｅｅｋｓ  Ｄ．Ｍａｒｋｌａｎｄ  Ｋ．Ｗｅｉｒ  Ｎ．Ｂｏｗｅｒｉｎｇ  Ｌ．Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｇ．Ｆｅｄｂａｔｃｈ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｒｔｉｃｌｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３５（４）：３５８−６５，２００８  Ｊｕｌ  ３１；Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ＫＭ．Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ＪＣ．Ｊｏｌｙ  ＪＣ．Ａｒｎｏｔｔ  Ｄ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｕｐｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．［Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｒｔｉｃｌｅ］Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１（９）：１１３３−４８，２００１  Ｓｅｐ；及びＨｏｒｎ  Ｕ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ  Ｗ．Ｋｒｅｂｂｅｒ  Ａ．Ｋｎｕｐｆｅｒ  Ｕ．Ｋｕｊａｕ  Ｍ．Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ  Ｒ．Ｍｕｌｌｅｒ  Ｋ．Ｍａｔｚｋｕ  Ｓ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．Ｈｉｇｈ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｙｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｒｔｉｃｌｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４６（５−６）：５２４−３２，１９９６  Ｄｅｃ．に記載されている。当業者であれば、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣ、円偏光二色性、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することも容易にできる。
【００７８】
本発明を、次に、より詳しく記載する。
【００７９】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、本明細書において交換可能に用いられる。「ペプチド」は１０個以下のアミノ酸を意味するものとされる。
【００８０】
「ポリヌクレオチド」の語は、文脈上別段の記載がなければ、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００８１】
本明細書で用いられる「低減した活性」は、適切なアッセイにおいて匹敵する条件下で測定した場合、野生型系統における相当する酵素活性と比較して、より低いレベルの、Ｔｓｐ酵素活性などの酵素活性を意味する。一実施形態において、低減した活性は、野生型の比較物（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）の酵素活性の、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下である。一実施形態において、酵素活性のレベルを決定するための分析は、結果を直接的な比較において用いようとする場合に伴って行われる。
【００８２】
本明細書で用いられる直接的な比較は、本明細書に規定する低減した活性が存在するか否かを評価する目的で、又はアッセイから得られた活性の結果を順位付けする目的で、２つ以上の結果の数値を比較する場合を意味する。
【００８３】
本明細書で用いられる「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語は、本明細書の文脈において「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されたい。
【００８４】
本明細書で用いられる野生型細胞は、非変異細胞又はコントロール細胞と交換可能に用いられる。
【００８５】
非変異細胞又はコントロール細胞は、本発明の文脈において、本発明の組換えグラム陰性細胞と同じ型の細胞を意味し、細胞は上記の低減されたＴｓｐタンパク質活性を有し、変異体ｓｐｒ遺伝子を有するように修飾されていない。例えば、非変異細胞は野生型細胞であってよく、あらゆる変異を導入する修飾の前の本発明の細胞と同じ宿主細胞の集団に由来してよい。
【００８６】
「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び「系統」の表現は交換可能に用いられる。
【００８７】
「変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型」の表現は、本発明の文脈において、変異体のＴｓｐ遺伝子を有する細胞によって表される表現型を意味する。典型的に、変異体のＴｓｐ遺伝子を含んでいる細胞は、特に高い細胞密度で溶解することができる。これらの細胞の溶解は、あらゆる組換えタンパク質の上清中への漏出をもたらす。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、低いモル浸透圧濃度では熱感受性の増殖も示すことがある。例えば、４０℃以上などの高温では、細胞は増殖率を示さず、若しくは低減した増殖率を示し、又は細胞は低浸透圧性の培地中で死滅する。
【００８８】
本発明の文脈において「同質遺伝子の（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）」の語は、本発明の細胞のゲノムが、それに細胞が由来する野生型の細胞に比べて、変異ｓｐｒ遺伝子、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、実質的に同じ、又は同じゲノム配列を有することを意味する。この実施形態において、細胞のゲノムはさらなる天然に存在しない変異又は遺伝子操作された変異を含んでいない。一実施形態において、本発明による細胞は、起こり得るあらゆる天然に存在する変異を考慮に入れて、変異ｓｐｒ遺伝子、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細胞に比べて実質的に同じゲノム配列を有し得る。一実施形態において、本発明による細胞は、変異ｓｐｒ遺伝子、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細胞に比べて正確に同じゲノム配列を有していてよい。
【００８９】
「野生型」の語は、本発明の文脈において、天然に存在することがあり、又は環境から単離され得るグラム陰性細菌細胞の系統を意味し、いかなる遺伝子操作されている変異も有さない。大腸菌の野生型系統の一例にはＷ３１１０Ｋ−１２系統などのＷ３１１０がある。
【００９０】
あらゆる適切なグラム陰性細菌を、本発明の組換え細胞を生成するための親細胞として用いることができる。適切なグラム陰性細菌には、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター  バウマンニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、及び大腸菌が含まれる。親細胞が大腸菌であるのが好ましい。本発明において大腸菌のあらゆる適切な系統を用いることができるが、Ｋ−１２  Ｗ３１１０などの野生型Ｗ３１１０系統を用いるのが好ましい。
【００９１】
予め作り出され、組換えタンパク質を発現するのに用いられるプロテアーゼ欠損細菌系統に付随する欠点は、これらが、大腸菌系統において、例えば、ｐｈｏＡ、ｆｈｕＡ、ｌａｃ、ｒｅｃ、ｇａｌ、ａｒａ、ａｒｇ、ｔｈｉ、及びｐｒｏなど、細胞の代謝及びＤＮＡ複製に関与する遺伝子に対するさらなる変異を含むことである。これらの変異は、細胞の増殖、安定性、組換えタンパク質発現収率、及び毒性に対する効果を含めた、宿主細胞に対する多くの有害効果を有し得る。これらのゲノムの変異を１つ又は複数有する系統、特にこれらの変異を多数有する系統は、細菌の増殖速度を、産業的なタンパク質生成に適さないレベルまで低減する適応度の喪失を表し得る。さらに、あらゆる上記のゲノムの変異は、予測不可能な有害な方法で、シス及び／又はトランスにおいて他の遺伝子に影響を及ぼし、それによって系統の表現型、適応度、及びタンパク質のプロファイルを変更し得る。さらに、大幅に変異した細胞を使用することは、商用、特に治療剤に使用するための組換えタンパク質を生成するのに一般に適さない、というのは、このような系統は一般的に欠陥のある代謝経路を有しており、したがって最小の培地又は化学的に規定された培地において不十分にしか増殖せず、又は全く増殖しないことがあるからである。
【００９２】
一実施形態において、本発明による細胞は、変異ｓｐｒ遺伝子、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に同質遺伝子である。変異を導入するのに、最小の変異だけを細胞のゲノムに対して行う。細胞は、細胞の増殖及び／又は対象のタンパク質を発現する能力に対して有害効果を有し得るあらゆる他の変異を有さない。したがって、本発明の１つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対してさらなる遺伝子操作された変異を含んでいる細胞に比べて、改善したタンパク質発現及び／又は改善した増殖の特徴を示し得る。本発明が提供する細胞はまた、細胞のゲノムに対するさらなるかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成における使用により適している。
【００９３】
好ましい一実施形態において、細胞は、変異ｓｐｒ遺伝子、及び野生型細胞に比べてＴｓｐタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、Ｗ３１１０系統などの野生型大腸菌細胞に同質遺伝子である。
【００９４】
本発明の細胞は、野生型細胞と、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことにより、さらに異なっていてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、外来性でも、又は内在性でもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質転換され、及び／又は宿主細胞のゲノム中に組み入れられる適切な発現ベクター内に含まれていてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム中に挿入されている実施形態において、挿入されたポリヌクレオチド配列が対象のタンパク質をコードするため、本発明の細胞は野生型細胞とやはり異なる。ポリヌクレオチドが細胞中の発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムの最小のかく乱をもたらすのが好ましい。
【００９５】
ｓｐｒタンパク質は、大腸菌膜結合ペリプラズムプロテアーゼである。
【００９６】
ｓｐｒタンパク質の野生型アミノ酸配列を、Ｎ末端にシグナル配列を有する配列番号２１、及びアミノ酸２６個のシグナル配列のない配列番号２２において示す（ＵｎｉＰｒｏｔ受諾番号Ｐ０ＡＦＶ４による）。本発明におけるｓｐｒタンパク質配列のアミノ酸番号付けはシグナル配列を含んでいる。したがって、ｓｐｒタンパク質のアミノ酸１は、配列番号２１に示す最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）である。
【００９７】
変異ｓｐｒ遺伝子が細胞の染色体ｓｐｒ遺伝子であるのが好ましい。
【００９８】
変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｔｓｐ遺伝子をさらに含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をコードしている。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞は、良好な細胞増殖速度を有し得るが、これらの細胞の一つの制限は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向があることである。したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向がある。変異Ｔｓｐ遺伝子を有する細胞も、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示す。しかし、本発明の細胞が有するｓｐｒ変異は、低減したＴｓｐ活性を有する細胞中に導入した場合、低減したＴｓｐ表現型を抑制し、したがって、細胞は、特に高い細胞密度で溶解の低減を表す。細胞の増殖の表現型は、当業者であれば、フラスコ振盪又は高い細胞密度の発酵技術の間に容易に測定することができる。細胞溶解の表現型の抑制は、特にペリプラズムにおいて増殖速度の改善及び／又は組換えタンパク質の生成から見ることができ、Ｔｓｐ変異体及び野生型ｓｐｒを有する細胞に比べて、ｓｐｒ変異体を有し、低減したＴｓｐ活性を有する細胞によって示される。
【００９９】
本発明による細胞は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有する、好ましくは、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異体ｓｐｒ遺伝子を含んでいる。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【０１００】
上記のアミノ酸の１つ又は複数の変異は、アミノ酸をコードするヌクレオチドの１個、２個、又は３個に対するあらゆる適切なミスセンス変異であってよい。変異は、アミノ酸残基を、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができる変異ｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸へ変化させる。ミスセンス変異は、アミノ酸を、野生型アミノ酸に比べて異なるサイズであり、且つ／又は異なる化学性質を有するアミノ酸へ変化させることができる。
【０１０１】
一実施形態において、変異体ｓｐｒ遺伝子は、Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＧ、Ｈ１４５Ａ、Ｇ１４７Ｃ、及びＨ１５７Ａから選択される１つ又は複数の変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１０２】
一実施形態において、変異は、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７のアミノ酸残基の触媒三残基の１つ、２つ、又は３つに対するものである（「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＭＲ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮｌｐＣ／Ｐ６０  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｐｒ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｔｒｉａｄ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、４７巻、９７１５〜９７１７頁）。
【０１０３】
したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、Ｃ９４に対する変異、又はＨ１４５に対する変異、又はＨ１５７に対する変異、又はＣ９４及びＨ１４５に対する変異、又はＣ９４及びＨ１５７に対する変異、又はＨ１４５及びＨ１５７に対する変異、又はＣ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７に対する変異を含んでいてよい。
【０１０４】
この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなる変異も有さないのが好ましい。
【０１０５】
Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つが、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。したがって、ｓｐｒタンパク質は、Ｃ９４、Ｈ１４５、及びＨ１５７の１つ、２つ、又は３つの変異を有することができる。一実施形態において、ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質を生成することが見出されている、ミスセンス変異Ｃ９４Ａを含んでいる。別の一実施形態において、ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質を生成することが見出されている、ミスセンス変異Ｈ１４５Ａを含んでいる。
【０１０６】
本明細書の置換変異体に対する呼称は、１つの文字とそれに続く１つの数字とそれに続く１つの文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を表し、２番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。一実施形態において、変異体のｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異、好ましくはＳ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を含んでいる。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質がいかなるさらなる変異を有さないのが好ましい。したがって、変異ｓｐｒ遺伝子は、Ｎ３１に対する変異、又はＲ６２に対する変異、又はＩ７０に対する変異、又はＱ７３に対する変異、又はＳ９５に対する変異、又はＶ９８に対する変異、又はＱ９９に対する変異、又はＲ１００に対する変異、又はＬ１０８に対する変異、又はＹ１１５に対する変異、又はＤ１３３に対する変異、又はＶ１３５に対する変異、又はＬ１３６に対する変異、又はＧ１４０に対する変異、又はＲ１４４に対する変異、又はＧ１４７に対する変異を含んでいてよい。
【０１０７】
一実施形態において、変異体ｓｐｒタンパク質は、アミノ酸：Ｓ９５及びＹ１１５、又はＮ３１、Ｑ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又はＱ７３、Ｒ１００及びＧ１４０、又はＲ１００及びＧ１４０、又はＱ７３及びＧ１４０、又はＱ７３及びＲ１００、又はＲ６２、Ｑ９９及びＲ１４４、又はＱ９９及びＲ１４４に対する複数の変異を含んでいる。
【０１０８】
Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７の１つ又は複数のアミノ酸は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、及びＲ１４４の１つ又は複数は、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。
【０１０９】
一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、１つ又は複数の以下の変異を含んでいる：Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃ。一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は１つ又は複数の以下の変異を含んでいる：Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、及びＧ１４７Ｃ。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【０１１０】
一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＶ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、及びＧ１４７Ｃから選択される変異を１つ有する。この実施形態において、ｓｐｒタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。
【０１１１】
さらなる一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、以下から選択される複数の変異を有する：Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ、Ｎ３１Ｙ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、Ｑ７３Ｒ、Ｒ１００Ｇ、及びＧ１４０Ｃ、Ｒ１００Ｇ及びＧ１４０Ｃ、Ｑ７３Ｒ及びＧ１４０Ｃ、Ｑ７３Ｒ及びＲ１００Ｇ、Ｒ６２Ｃ、Ｑ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ、又はＱ９９Ｐ及びＲ１４４Ｃ。
【０１１２】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｃ９４Ａを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１３】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｖ１０３Ｅを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１４】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｄ１３３Ａを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１５】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｖ１３５Ｄを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１６】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｖ１３５Ａを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１７】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｈ１４５Ａを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１８】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｇ１４７Ｃを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１１９】
一実施形態において、変異ｓｐｒ遺伝子は、変異Ｈ１５７Ａを有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１２０】
一実施形態において、変異体ｓｐｒ遺伝子は、Ｈ１４５Ａ、Ｈ１５７Ａ、及びＤ１３３Ａから選択される変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする。
【０１２１】
本発明の一実施形態において、あらゆる適切な変異（単数又は複数）を、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるｓｐｒタンパク質をもたらす、ｓｐｒ遺伝子に対して行ってもよい。好ましくは、ｓｐｒタンパク質は１つ又は複数の以下の変異を有し得る：Ｎ３１Ｙ、Ｒ６２Ｃ、Ｉ７０Ｔ、Ｑ７３Ｒ、Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｑ９９Ｐ、Ｒ１００Ｇ、Ｌ１０８Ｓ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ、Ｖ１３５Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１４０Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｈ１４５Ａ、Ｇ１４７Ｃ、Ｈ１５７Ａ、及びＷ１７４Ｒ。一実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、変異Ｗ１７４Ｒを含んでいない。ｓｐｒ遺伝子が、上記に論じた１つ又は複数の変異を含むのが好ましい。
【０１２２】
本発明による細胞は、野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有する。「野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性」の表現は、細胞のＴｓｐ活性が野生型細胞のＴｓｐ活性に比べて低減していることを意味する。細胞を、Ｔｓｐの活性を低減するのに適するあらゆる手段によって修飾することができる。
【０１２３】
一実施形態において、低減したＴｓｐ活性は、Ｔｓｐ及び／又は関連の調節性の発現配列をコードする内因性ポリヌクレオチドの修飾による。修飾は、Ｔｓｐ遺伝子の転写及び翻訳を低減又は停止することができ、或いは野生型Ｔｓｐタンパク質に比べて低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質の発現を提供することができる。
【０１２４】
一実施形態において、関連の調節性の発現配列を、Ｔｓｐ発現を低減するように修飾する。例えば、Ｔｓｐ遺伝子に対するプロモーターを遺伝子の発現を防止するように変異させてもよい。
【０１２５】
好ましい一実施形態において、本発明による細胞は、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を有している。
【０１２６】
染色体のＴｓｐ遺伝子が変異しているのが好ましい。
【０１２７】
本明細書で用いられる「Ｔｓｐ遺伝子」は、ペニシリン結合性タンパク質−３（ＰＢＰ３）及びファージテイルタンパク質に対して作用することができるペリプラズムプロテアーゼであるプロテアーゼＴｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）をコードする遺伝子を意味する。野生型Ｔｓｐ遺伝子の配列を配列番号１に示し、野生型Ｔｓｐタンパク質の配列を配列番号２に示す。
【０１２８】
変異Ｔｓｐ遺伝子、又はＴｓｐをコードする変異Ｔｓｐ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子のいずれかを意味する。
【０１２９】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異Ｔｓｐ遺伝子が野生型の非変異Ｔｓｐ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。
【０１３０】
変異Ｔｓｐ遺伝子が、野生型の非変異Ｔｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＴｓｐタンパク質をコードするのが好ましい。変異Ｔｓｐ遺伝子が、プロテアーゼ活性を有さないＴｓｐタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体Ｔｓｐを欠くのではなく、即ち、Ｔｓｐ遺伝子配列はあらゆる形態のＴｓｐタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【０１３１】
低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＴｓｐ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＴｓｐタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、Ｔｓｐのプロテアーゼ活性が試験されるＫｅｉｌｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｓｐ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ＊」、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２７０巻４８号、１２月１日発行、２８８６４〜２８８６８頁、１９９５年、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｃ．Ｋｅｉｌｅｒ及びＲｏｂｅｒｔ  Ｔ．Ｓａｕｅｒ）において記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１３２】
ＴｓｐはＫｅｉｌｅｒら（上述）において、残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５を含む活性部位を有すると報告されており、残基Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２はＴｓｐの構造を維持するのに重要である。Ｋｅｉｌｅｒら（上述）は、変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ａ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａには検出可能なプロテアーゼ活性がなかったという所見を報告している。変異Ｔｓｐ遺伝子Ｓ４３０Ｃは野生型活性の約５〜１０％を示したことがさらに報告されている。したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異は、Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数の残基に対するミスセンス変異などの変異を含むことがある。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＴｓｐ変異が、活性部位の残基Ｓ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５の１つ、２つ、又は３つ全てに対するミスセンス変異などの変異を含むことができるのが好ましい。
【０１３３】
したがって、変異Ｔｓｐ遺伝子は以下を含むことができる：Ｓ４３０に対する変異、又はＤ４４１に対する変異、又はＫ４５５に対する変異、又はＳ４３０及びＤ４４１に対する変異、又はＳ４３０及びＫ４５５に対する変異、又はＤ４４１及びＫ４５５に対する変異、又はＳ４３０、Ｄ４４１、及びＫ４５５に対する変異。
【０１３４】
Ｓ４３０、Ｄ４４１、Ｋ４５５、Ｇ３７５、Ｇ３７６、Ｅ４３３、及びＴ４５２の１つ又は複数が、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。適切な変異の例には、Ｓ４３０Ａ、Ｓ４３０Ｃ、Ｄ４４１Ａ、Ｋ４５５Ａ、Ｋ４５５Ｈ、Ｋ４５５Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｇ３７６Ａ、Ｅ４３３Ａ、及びＴ４５２Ａがある。変異Ｔｓｐ遺伝子は、活性部位残基に対する１つ、２つ、又は３つの変異を含むことができ、例えば、遺伝子は以下を含むことができる：Ｓ４３０Ａ、若しくはＳ４３０Ｃ、及び／又はＤ４４１Ａ及び／又はＫ４５５Ａ若しくはＫ４５５Ｈ、若しくはＫ４５５Ｒ。
【０１３５】
Ｔｓｐ遺伝子が点変異Ｓ４３０Ａ又はＳ４３０Ｃを有するのが好ましい。
【０１３６】
「ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が、Ｔｓｐタンパク質を欠く細胞を提供するために、野生型遺伝子によってコードされるＴｓｐタンパク質の発現を防ぐ１つ又は複数の変異を含んでいることを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳されない。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は、タンパク質の発現をもたらさないように、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異され得る。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【０１３７】
好ましい一実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによって変異されない。この実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流、及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含み、それによってＴｓｐタンパク質の発現を防いでよい。開始コドンに対する変異は、開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは、挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、コード配列の５’末端に２つのＡＴＧコドンを含んでおり、ＡＴＧコドンの１つ又は両方はミスセンス変異によって変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、第２のＡＴＧコドン（コドン３）からＴＣＧコドンに変異されてよい。Ｔｓｐ遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び１つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。好ましい一実施形態において、Ｔｓｐ遺伝子は第５のコドンから「Ｔ」を欠失するように変異されており、それによって、コドン１１及び１６に終止コドンをもたらすフレームシフトを生じている。好ましい一実施形態において、コドン２１に第３のインフレーム終止コドンを作り出すように、Ｔｓｐ遺伝子はＡｓｅＩ制限部位を挿入するように変異される。
【０１３８】
好ましい一実施形態において、ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子は配列番号３のＤＮＡ配列を有し、これは開始コドンの上流にＡＴＧＡＡＴの６個のヌクレオチドを含んでいる。一実施形態において、変異Ｔｓｐ遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド７から２０４８のＤＮＡ配列を有する。
【０１３９】
本発明において、細胞は、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる１つ又は複数の遺伝子も有する。例として、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなどのタンパク質が含まれる。
【０１４０】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質は、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、又はこれらの組合せである。
【０１４１】
一実施形態において、タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質は、ＦｋｐＡ、又はＦｋｐＡとＳｋｐとの組合せから選択される。
【０１４２】
ＦｋｐＡは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ４５５２３を有する、ペプチジル−プロリル  シス−トランスイソメラーゼである。
【０１４３】
Ｓｋｐは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＵ７を有するシャペロンタンパク質である。
【０１４４】
タンパク質のフォールディングを促進するためのタンパク質は、細胞のゲノムにおける遺伝子によってコードされ、又はその中に、例えば、適宜、プラスミド若しくはプラスミドの組合せ上に、一過性にトランスフェクトされ得る。
【０１４５】
一実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、ＤｓｂＣをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいない。
【０１４６】
本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、並びに／或いは変異ｐｔｒ遺伝子をさらに含んでおり、変異ｐｔｒ遺伝子は低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子及び／又は変異ＯｍｐＴ遺伝子であり、変異ＯｍｐＴ遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である。
【０１４７】
この実施形態において、細胞のゲノムが、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。
【０１４８】
本明細書で用いられる「ＤｅｇＰ」は、ＤｅｇＰタンパク質（ＨｔｒＡとしても知られている）をコードする遺伝子を意味し、ＤｅｇＰタンパク質はシャペロン及びプロテアーゼとしての二重機能を有する（「Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ」、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＮＤ、Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９４年、２４４巻、１９〜６１頁）。非変異のＤｅｇＰ遺伝子の配列を配列番号７に示し、非変異のＤｅｇＰタンパク質の配列を配列番号８に示す。
【０１４９】
低温でＤｅｇＰはシャペロンとして機能し、高温でＤｅｇＰはプロテアーゼとしての機能を優先する（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）、及び「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｔｒＡ  （ＤｅｇＰ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ  Ｊら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１５４巻、３６４９〜３６５８頁）。
【０１５０】
細胞がＤｅｇＰ変異を含んでいる実施形態において、細胞におけるＤｅｇＰ変異は、シャペロン活性を有するが完全なプロテアーゼを有さないＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を提供する。
【０１５１】
「シャペロン活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて同じ、又は実質的に同じシャペロン活性を有することを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のシャペロン活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型ＤｅｇＰに比べて同じシャペロン活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。
【０１５２】
「低減したプロテアーゼ活性を有する」の表現は、本発明の文脈において、変異ＤｅｇＰタンパク質が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、野生型の非変異のＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＤｅｇＰタンパク質をコードするのが好ましい。変異ＤｅｇＰ遺伝子が、プロテアーゼ活性のないＤｅｇＰタンパク質をコードするのがより好ましい。細胞は、染色体のＤｅｇＰを欠くのではなく、即ち、ＤｅｇＰ遺伝子配列は、あらゆる形態のＤｅｇＰタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【０１５３】
シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＤｅｇＰ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ及びシャペロンの活性は、当業者であれば、ＤｅｇＰのプロテアーゼ及びシャペロン活性がＤｅｇＰの天然の基質であるＭａｌＳ上で試験されるＳｐｉｅｓｓらにおいて記載されている方法（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）、及びまた「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｔｒＡ  （ＤｅｇＰ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ」、Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ  Ｊら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１５４巻、３６４９〜３６５８頁において記載されている方法などのあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１５４】
ＤｅｇＰはセリンプロテアーゼであり、アミノ酸残基Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の触媒三塩基からなる活性中心を有する（「Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９４年、２４４巻、１９〜６１頁、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ及びＢａｒｒｅｔｔ  Ａ）。シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＤｅｇＰ変異は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つに対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。
【０１５５】
したがって、変異ＤｅｇＰ遺伝子は以下を含んでいてよい：Ｈｉｓ１０５に対する変異、又は、Ａｓｐ１３５に対する変異、又は、Ｓｅｒ２１０に対する変異、又は、Ｈｉｓ１０５及びＡｓｐ１３５に対する変異、又は、Ｈｉｓ１０５及びＳｅｒ２１０に対する変異、又は、Ａｓｐ１３５及びＳｅｒ２１０に対する変異、又は、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０に対する変異。
【０１５６】
Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、シャペロン活性、及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されていてよい。例えば、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つは、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。さらなる適する変異は、例えば、Ａｓｐ１３５がＬｙｓ又はＡｒｇに変異され、極性のＨｉｓ１０５がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕなどの非極性のアミノ酸に変異され、小型の親水性のＳｅｒ２１０がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、又はＴｙｒなどの大型又は疎水性の残基に変異されるなど、Ｈｉｓ１０５、Ａｓｐ１３５、及びＳｅｒ２１０の１つ、２つ、又は３つの、反対の性質を有するアミノ酸への変化である。ＤｅｇＰ遺伝子が、図１１ｃに示す通り、シャペロン活性を有するがプロテアーゼを有さないタンパク質を生成することが見出されている点変異Ｓ２１０Ａを含んでいるのが好ましい（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。
【０１５７】
ＤｅｇＰは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する、ＰＤＺ１（残基２６０〜３５８）及びＰＤＺ２（残基３５９〜４４８）の２つのＰＤＺドメインを有する（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。本発明の一実施形態において、ｄｅｇＰ遺伝子は、ＰＤＺ１ドメイン及び／又はＰＤＺ２ドメインを欠失するように変異される。ＰＤＺ１及びＰＤＺ２の欠失は、ＤｅｇＰタンパク質のプロテアーゼ活性の完全な喪失及び野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて低下したシャペロン活性をもたらし、ＰＤＺ１又はＰＤＺ２いずれかの欠失は、野生型ＤｅｇＰタンパク質に比べて５％のプロテアーゼ活性及び同様のシャペロン活性をもたらす（「Ａ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｃｅｌｌ、９７巻３号、３３９〜３４７頁、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ、Ｂｅｉｌ  Ａ、Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ）。
【０１５８】
変異ＤｅｇＰ遺伝子は、例えば、図７Ｃに示す通り、同定及びスクリーニング方法において助けとなるためにＡｓｅＩなど、サイレントの天然に存在しない制限部位も含んでいてよい。
【０１５９】
点変異Ｓ２１０Ａ及びＡｓｅＩ制限マーカー部位を含んでいる変異ＤｅｇＰ遺伝子の好ましい配列を配列番号９に提供し、コードされるタンパク質配列を配列番号１０に示す。
【０１６０】
細胞が、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる本発明の実施形態において、本発明が提供する１つ又は複数の細胞は、変異細胞に比べて細胞からの正確にフォールディングされたタンパク質の収率の改善を提供することができ、ＤｅｇＰ遺伝子は、染色体欠損ＤｅｇＰなど、ＤｅｇＰ発現を防ぐノックアウトＤｅｇＰに対して変異されている。ＤｅｇＰの発現を防ぐノックアウト変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は完全に失われるが、本発明による細胞においてＤｅｇＰのシャペロン活性は保持され、完全なプロテアーゼ活性は失われる。これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、タンパク質のタンパク質分解性を防ぐようにプロテアーゼ活性は低減されており、宿主細胞におけるタンパク質において正確なフォールディング及び輸送を可能にするようにシャペロン活性は維持されている。
【０１６１】
これらの実施形態において、本発明による１つ又は複数の細胞は、ＤｅｇＰ発現を防ぐ変異ノックアウトＤｅｇＰ遺伝子を有する細胞に比べて細胞の増殖が改善されていてよい。理論によって拘泥しようとするものではないが、シャペロン活性を必要とする全てのタンパク質をプロセシングする細胞の能力を増大し得るシャペロン活性をＤｅｇＰプロテアーゼが保持するため、細胞増殖の改善が示され得る。したがって、細胞の増殖及び再生に必要な正確にフォールディングされたタンパク質の生成は、ＤｅｇＰノックアウト変異を有する細胞に比べて本発明の１つ又は複数の細胞において増大し、それによって増殖を制御する細胞の経路を改善し得る。さらに、知られているＤｅｇＰプロテアーゼ欠損系統は一般に温度感受性であり、約２８℃を超える温度では通常増殖しない。しかし、本発明による細胞は温度感受性ではなく、細菌からタンパク質を生成する工業規模に通常用いられる、およそ３０℃からおよそ３７℃の温度を含めた２８℃以上の温度で増殖することができる。
【０１６２】
本発明の一実施形態において、細胞は変異ｐｔｒ遺伝子を有する。本明細書で用いられる「ｐｔｒ遺伝子」は、高分子量のタンパク質を分解するプロテアーゼであるＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードする遺伝子を意味する。非変異のｐｔｒ遺伝子の配列を配列番号４に示し、非変異のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の配列を配列番号５に示す。
【０１６３】
変異ｐｔｒ遺伝子、又はＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードする変異ｐｔｒ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子のいずれかを意味する。
【０１６４】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードする変異ｐｔｒ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異ｐｔｒ遺伝子が、野生型の非変異のｐｔｒ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。
【０１６５】
変異ｐｔｒ遺伝子が、野生型の非変異のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩをコードするのが好ましい。変異ｐｔｒ遺伝子がプロテアーゼ活性を有さないＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体ｐｔｒを欠いておらず、即ち、ｐｔｒ遺伝子配列は、あらゆる形態のＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の発現を防止するように欠失又は変異されていない。
【０１６６】
低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異がｐｔｒ遺伝子中に導入されてよい。グラム陰性細菌から発現されたＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１６７】
「ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が１つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【０１６８】
好ましい一実施形態において、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによって変異されない。ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩタンパク質の発現を防いでいる。
【０１６９】
標的のノックアウト遺伝子開始コドンに対する変異は開始コドンの機能の喪失を引き起こし、それによって標的の遺伝子は確実に、コード配列の開始に適切な開始コドンを含んでいない。開始コドンに対する変異は開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。
【０１７０】
好ましい一実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は、ＡＴＧ開始コドンがＡＴＴに変化するように変異されている。
【０１７１】
ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び１つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。
【０１７２】
１つ又は複数の挿入された終止コドンがインフレーム終止コドンであるのが好ましい。しかし、１つ又は複数の挿入された終止コドンは、或いは、又はさらに、フレーム外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）終止コドンであってよい。１つ又は複数のフレーム外終止コドンは、フレーム外開始コドンが挿入又は欠失のフレームシフト変異によってインフレーム開始コドンに変化される場合に翻訳を停止するのに必要とされ得る。１つ又は複数の終止コドンが、ナンセンス点変異及びフレームシフト変異を含めたあらゆる適切な変異によって導入されてよい。１つ又は複数の終止コドンがフレームシフト変異及び／又は挿入変異によって、好ましくは遺伝子配列のセグメントを、終止コドンを含んでいる配列で置換することによって導入されるのが好ましい。例えば、終止コドンＴＡＡを含んでいるＡｓｅＩ制限部位を挿入してもよい。
【０１７３】
好ましい一実施形態において、ｐｔｒ遺伝子は、図７Ａに示す通り、ＡｓｅＩ制限部位の挿入によって、インフレーム終止コドンを挿入するように変異される。好ましい一実施形態において、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子は配列番号６のＤＮＡ配列を有する。
【０１７４】
上記に記載したノックアウト変異は、標的のノックアウト遺伝子部位の上流又は下流の染色体ＤＮＡに対して最小のかく乱を引き起こし、又はかく乱を引き起こさず、外来のＤＮＡ（例えば、対象のタンパク質、特に治療用タンパク質の発現に対する細胞の適合性に影響を及ぼし得る、抗生物質耐性マーカー）の挿入及び保持を必要としないので有利である。したがって、本発明による１つ又は複数の細胞は、増殖の特徴の改善及び／又は外来ＤＮＡの遺伝子コード配列中への挿入によってプロテアーゼ遺伝子がノックアウトされた細胞に比べてタンパク質発現の改善を示すことがある。
【０１７５】
一実施形態において、本発明による細胞は、変異ＯｍｐＴ遺伝子を有する。本明細書で用いられる「ＯｍｐＴ遺伝子」は、外膜プロテアーゼであるプロテアーゼＯｍｐＴ（外膜プロテアーゼＴ）をコードする遺伝子を意味する。野生型の非変異ＯｍｐＴ遺伝子の配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｐ０９１６９である。
【０１７６】
変異ＯｍｐＴ遺伝子、又はＯｍｐＴをコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子のいずれかを意味する。
【０１７７】
「低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする変異ＯｍｐＴ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、変異ＯｍｐＴ遺伝子が野生型の非変異ＯｍｐＴ遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ＯｍｐＴ遺伝子は、野生型の非変異ＯｍｐＴタンパク質のプロテアーゼ活性の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又は５％以下を有するＯｍｐＴタンパク質をコードしていてよい。変異ＯｍｐＴ遺伝子は、プロテアーゼ活性を有さないＯｍｐＴタンパク質をコードしていてよい。この実施形態において、細胞は染色体ＯｍｐＴを欠くのではなく、即ち、ＯｍｐＴ遺伝子配列はあらゆる形態のＯｍｐＴタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。
【０１７８】
低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をＯｍｐＴ遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるＯｍｐＴタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｃｉｄｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５０５巻（２００１年）  ４２６〜４３０頁）及びＤｅｋｋｅｒら（「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｔｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ａｄｄｒｅｓｓｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４０巻、１６９４〜１７０１頁）において記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。
【０１７９】
ＯｍｐＴは、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０００年、４６８巻、２２０〜２２４頁）において報告されており、これは、セリン、ヒスチジン、及び酸性残基をアラニンによって置換すると、Ｇｌｕ２７、Ａｓｐ９７、Ａｓｐ２０８、又はＨｉｓ１０１ではおよそ１０倍活性が低減し、Ｓｅｒ９９ではおよそ５００倍活性が低減し、Ａｓｐ８３、Ａｓｐ８５、Ａｓｐ２１０、又はＨｉｓ２１２ではおよそ１００００倍活性が低減すると開示している。Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎら（「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅ」、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、２０巻１８号、５０３３〜５０３９頁）は、Ａｓｐ８３−Ａｓｐ８５対及びＨｉｓ２１２−Ａｓｐ２１０対を含む活性部位を有すると開示している。さらに、Ｋｒａｍｅｒら（「Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＯｍｐＴ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ＦＥＢＳ、２００２年、２６９巻、１７４６〜１７５２頁）は、ループＬ４における変異Ｄ２０８Ａ、Ｄ２１０Ａ、Ｈ２１２Ａ、Ｈ２１２Ｎ、Ｈ２１２Ｑ、Ｇ２１６Ｋ／Ｋ２１７Ｇ、Ｋ２１７Ｔ、及びＲ２１８Ｌは全て、酵素活性の部分的又はほぼ完全な喪失をもたらすことを開示している。
【０１８０】
したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのＯｍｐＴ変異は、Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の残基の１つ又は複数に対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。
【０１８１】
Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の１つ又は複数は、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。例えば、Ｅ２７、Ｄ４３、Ｄ８３、Ｄ８５、Ｄ９７、Ｓ９９、Ｈ１０１、Ｅ１１１、Ｅ１３６、Ｅ１９３、Ｄ２０６、Ｄ２０８、Ｄ２１０、Ｈ２１２、Ｇ２１６、Ｋ２１７、Ｒ２１８、及びＥ２５０の１つ又は複数は、アラニンに変異していてよい。適切な変異の例には、Ｅ２７Ａ、Ｄ４３Ａ、Ｄ８３Ａ、Ｄ８５Ａ、Ｄ９７Ａ、Ｓ９９Ａ、Ｈ１０１Ａ、Ｅ１１１Ａ、Ｅ１３６Ａ、Ｅ１９３Ａ、Ｄ２０６Ａ、Ｄ２０８Ａ、Ｄ２１０Ａ、Ｈ２１２Ａ、Ｈ２１２Ｎ、Ｈ２１２Ｑ、Ｇ２１６Ｋ、Ｋ２１７Ｇ、Ｋ２１７Ｔ、Ｒ２１８Ｌ、及びＥ２５０Ａがある。一実施形態において、変異ＯｍｐＴ遺伝子は、Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる。Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａ変異を含んでいる適切な変異ＯｍｐＴ配列を配列番号２３に示す。
【０１８２】
「ノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子」の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が１つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のＤＮＡ配列を挿入することによってノックアウトされてよい。
【０１８３】
一実施形態において、ＯｍｐＴ遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってＯｍｐＴタンパク質の発現を防いでいる。開始コドンに対する変異は開始コドンの１つ、２つ、又は３つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。適切な変異ノックアウトＯｍｐＴ配列を、配列番号２４に示す。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。
【０１８４】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｏｍｐＴを欠くなど、ノックアウト変異ｏｍｐＴ遺伝子を有さない。
【０１８５】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｄｅｇＰを欠くなど、ノックアウト変異ｄｅｇＰ遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、変異ｄｅｇＰ遺伝子を有さない。
【０１８６】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｐｔｒを欠くなど、ノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を有さない。
【０１８７】
ノックアウト変異を含めた多くの遺伝子操作された変異は、上首尾に変異させた細胞の選択及び同定を可能にする抗生物質耐性マーカーの使用を伴う。しかし、上記で論じたように、抗生物質耐性マーカーの使用には数々の不都合がある。
【０１８８】
本発明のさらなる一実施形態において、細胞は抗生物質耐性マーカーを含んでおらず、抗生物質耐性マーカーを使用する上記の不都合を克服し、変異Ｔｓｐ遺伝子、変異ｓｐｒ遺伝子、及び任意選択によって変異ＤｅｇＰ遺伝子、及び／又は変異ｐｔｒ遺伝子、及び／又は変異ＯｍｐＴ遺伝子は、１つ又は複数の制限マーカー部位を含むように変異されている。制限部位は遺伝子中に遺伝子操作され、天然に存在しない。制限マーカー部位が有利であるのは、制限マーカー部位により、必要とされる染色体の変異を含んでいる正確に修飾されている細胞のスクリーニング及び同定が可能になるからである。１つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子を有するように修飾された細胞は、天然に存在しない制限マーカー部位を含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド対を用いて、細胞溶解物からゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分析することができる。増幅されたＤＮＡを、次いで、天然に存在しない制限マーカー部位でＤＮＡを消化することができる適切な制限酵素とインキュベートする前及び後にアガロースゲル電気泳動によって分析してもよい。制限酵素とインキュベートした後にＤＮＡフラグメントが存在すれば、細胞が、１つ又は複数の変異遺伝子を有するように上首尾に修飾されたことを確認している。
【０１８９】
細胞が配列番号６のＤＮＡ配列を有するノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子を有する実施形態において、配列番号１７及び配列番号１８に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムＤＮＡから天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含むＤＮＡの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムＤＮＡを、ＡｓｅＩ制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムＤＮＡ中の変異ｐｔｒ遺伝子の存在を確認してもよい。
【０１９０】
細胞が、配列番号３のＤＮＡ配列又は配列番号３のヌクレオチド７から２０４８を有するノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる実施形態において、配列番号１５及び配列番号１６に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムＤＮＡから天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含んでいるＤＮＡの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムＤＮＡを、ＡｓｅＩ制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムＤＮＡ中の変異Ｔｓｐ遺伝子の存在を確認してもよい。
【０１９１】
細胞が、配列番号９のＤＮＡ配列を有する変異ＤｅｇＰ遺伝子を含んでいる実施形態において、配列番号１９及び配列番号２０に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムＤＮＡから天然に存在しないＡｓｅＩ制限部位を含んでいるＤＮＡの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムＤＮＡを、ＡｓｅＩ制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムＤＮＡ中の変異ＤｅｇＰ遺伝子の存在を確認してもよい。
【０１９２】
１つ又は複数の制限部位を、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入することができる。制限部位を、上記に記載した通り、開始コドンの変異、及び／又は１つ若しくは複数の終止コドンを導入するような変異によって導入することができる。この実施形態が有利であるのは、制限マーカー部位が、導入されるノックアウト変異の直接的且つ独特なマーカーであるからである。
【０１９３】
ＡｓｅＩ制限部位など、インフレームの終止コドンを含む制限マーカー部位を挿入してもよい。挿入される制限部位が制限マーカー部位及び終止コドンの両方として作用して遺伝子コード配列の完全な転写を防ぐので、これは特に有利である。例えば、終止コドンがＡｓｅＩ部位の導入によってｐｔｒ遺伝子に導入される実施形態において、これは、図７Ａに示すように制限部位をまた作り出す。例えば、ＡｓｅＩ部位の導入によって終止コドンがコドン２１でＴｓｐ遺伝子に導入される実施形態において、これは、図７Ｂに示すように制限部位をまた作り出す。
【０１９４】
制限マーカー部位を、開始コドンに対する変異、及び任意選択によって１つ又は複数のさらなる点変異によって挿入してもよい。この実施形態において、制限マーカー部位がＥｃｏＲＩ制限部位であるのが好ましい。開始コドンに対する変異は制限マーカー部位も作り出すので、これは特に有利である。例えば、ｐｔｒ遺伝子の開始コドンがＡＴＴに変更される実施形態において、これは、図１１ａに示すようにＥｃｏＲＩマーカー部位をまた作り出す。例えば、Ｔｓｐ遺伝子の開始コドン（コドン３）がＡＴＧからＴＣＧに変更される実施形態において、図１ｂに示すように、コドン２のＡＡＣからＡＡＴへのさらなる点変異、及びコドン３のＡＴＧからＴＣＧへの変異は、図７Ｂに示すように、ＥｃｏＲＩ制限マーカー部位を作り出す。
【０１９５】
細胞が変異ＯｍｐＴ遺伝子を有する本発明の実施形態において、１つ又は複数の制限部位を、１つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入してもよい。例えば、ＯｍｐＴ遺伝子が変異Ｄ２１０Ａ及びＨ２１２Ａを含んでいる実施形態において、これらの変異は、選択マーカーとして用いることができるサイレントのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。
【０１９６】
ＤｅｇＰ遺伝子又はｓｐｒ遺伝子において、マーカー制限部位を、サイレントコドン変化を用いて導入してもよい。例えば、ＡｓｅＩ部位をサイレントの制限マーカー部位として用いてもよく、変異ＤｅｇＰ遺伝子に対して図７Ｃに示すように、ＴＡＡ終止コドンはフレーム外である。
【０１９７】
ｐｔｒ遺伝子及び／又はＴｓｐ遺伝子が低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ又はＴｓｐをコードするように変異されている本発明の実施形態において、１つ又は複数のマーカー制限部位を、サイレントのコドン変化を用いて導入してもよい。
【０１９８】
本発明による組換えグラム陰性細菌細胞は、あらゆる適切な手段により生成することができる。当業者であれば、染色体の遺伝子配列を、変異遺伝子配列で置換するのに用いることができる適切な技術を知っている。相同的組換えによって宿主の染色体中に組み込むのを可能にする適切なベクターを用いてもよい。
【０１９９】
適切な遺伝子置換方法は、例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９８９年９月、１７１巻、９号、４６１７〜４６２２頁）、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉら（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ、Ｓｋｏｒｕｐｓｋｉ  Ｋ及びＴａｙｌｏｒ  Ｒ．Ｋ．、Ｇｅｎｅ、１９９６年、１６９巻、４７〜５２頁）、Ｋｉｅｌら（Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ、Ｋｉｅｌ  Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、１９８７年、２０７巻、２９４〜３０１頁）、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら（Ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐＳＣ１０１  ｒｅｐｌｉｃｏｎ、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄ  Ｉ．Ｃ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１年、５巻（６）、１４４７〜１４５７頁）、並びにＲｉｅｄら（Ａｎ  ｎｐｔＩ−ｓａｃＢ−ｓａｃＲ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ，  ｕｎｍａｒｋｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｅｖｉｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｒｉｅｄ  Ｊ．Ｌ．及びＣｏｌｌｍｅｒ  Ａ．、Ｇｅｎｅ、５７巻（１９８７年）２３９〜２４６頁）に記載されている。相同的組換え／置換を可能にする適切なプラスミドは、ｐＫＯ３プラスミドである（Ｌｉｎｋら、１９９７年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７９巻、６２２８〜６２３７頁）。
【０２００】
上首尾に変異させた系統を、コロニーＰＣＲ  ＤＮＡ配列決定及びコロニーＰＣＲ制限酵素マッピングを含めた、当技術分野においてよく知られている方法を用いて同定してもよい。
【０２０１】
細胞が２つ以上の変異染色体遺伝子を含んでいる実施形態において、変異遺伝子を、グラム陰性細菌中の、同じ又は異なるベクター上に導入してもよい。
【０２０２】
一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ｏｍｐＴを欠くなど、ノックアウト変異ｏｍｐＴ遺伝子を有さない。
【０２０３】
一実施形態において、本開示による細胞は、変異ｓｐｒの特徴的な変異を３個、低減したＴｓｐを含むにすぎず、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、又はＦｋｐＡとＳｋｐとの組合せを発現する。
【０２０４】
一実施形態において、本開示による細胞系は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子、並びにＦｋｐＡ遺伝子からなる。
【０２０５】
一実施形態において、本開示による細胞系は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子、並びにＳｋｐ遺伝子からなる。
【０２０６】
一実施形態において、本開示による細胞系は、変異Ｔｓｐ遺伝子及び変異ｓｐｒ遺伝子、ＦｋｐＡ遺伝子及びＳｋｐ遺伝子からなる。
【０２０７】
一実施形態において、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子（単数若しくは複数）を、例えば、抗体又はその結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を任意選択により含んでいる発現ベクターにおいて、細胞中に一過性に形質転換する。
【０２０８】
一実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチド配列、並びにＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードするポリヌクレオチドは、別々の発現ベクター中に挿入される。
【０２０９】
重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を生成するには、細胞系を、第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターで形質転換してもよい。或いは、ベクターが軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいる、単一のベクターを用いてもよい。
【０２１０】
或いは、抗体をコードするポリヌクレオチド配列、並びにＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードするポリヌクレオチドを、１つのベクター中に挿入する。ベクターが、抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいるのが好ましい。
【０２１１】
本発明はまた、ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードする組換えポリヌクレオチド、並びにヒトＦｃＲｎに特異的な抗体又は抗原結合性フラグメントを含む発現ベクターも提供する。発現ベクターは、ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードするポリヌクレオチド配列、並びに抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる多シストロン性のベクターである。
【０２１２】
多シストロン性のベクターは、ポリヌクレオチド配列のベクター中への繰返し連続クローニングを可能にする有利なクローニング方法によって生成することができる。方法は、ＡｓｅＩ及びＮｄｅＩ制限部位の「ＡＴ」末端などの１対の制限部位の適合性の付着末端を用いるものである。コード配列を含んでおり、ＡｓｅＩ−ＮｄｅＩフラグメントなどの適合性の付着末端を有するポリヌクレオチド配列を、ＮｄｅＩなどのベクターにおける制限部位中にクローニングしてもよい。ポリヌクレオチド配列の挿入は５’制限部位を破壊するが、ＮｄｅＩなどの新たな３’制限部位を作り出し、次いでこの新たな制限部位を用いて、適合性の付着末端を含んでいるさらなるポリヌクレオチド配列を挿入してもよい。次いでこのプロセスを繰り返してさらなる配列を挿入してもよい。ベクター中に挿入された各ポリヌクレオチド配列は、終止コドンに対して３’の非コード配列を含んでおり、終止コドンはスクリーニング用のＳｓｐＩ部位、シャインダルガノリボソーム結合性配列、Ａリッチスペーサー、及び開始コドンをコードするＮｄｅＩ部位を含んでいてよい。
【０２１３】
ある抗体の軽鎖（ＬＣ）、ある抗体の重鎖（ＨＣ）をコードするポリヌクレオチド配列、ＦｋｐＡポリヌクレオチド配列、及びさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいるベクターの創製を示す図を図７ｄに示す。
【０２１４】
本発明による細胞が、上記に規定した発現ベクターを含んでいるのが好ましい。
【０２１５】
細胞が、以下の通りの１つ又は複数のさらなるタンパク質：ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなど、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質、並びに任意選択によりＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐなど、タンパク質の分泌又は転位置を促進することができる１つ又は複数のタンパク質も発現する実施形態において、１つ又は複数のさらなるタンパク質は、ＦｋｐＡをコードするポリヌクレオチド及び／又は抗体をコードするポリヌクレオチド配列として同じベクター中に挿入された１つ又は複数のポリヌクレオチドから発現されてもよい。或いは、１つ又は複数のポリヌクレオチドを、別々のベクター中に挿入してもよい。
【０２１６】
発現ベクターは、上記で規定した１つ又は複数の発現カセットを適切なベクター中に挿入することにより生成することができる。或いは、ポリヌクレオチド配列の発現を指示するための調節性の発現配列が発現ベクターに含まれていてもよく、それゆえポリヌクレオチドのコード領域だけが発現ベクターを完全にするのに必要とされ得る。
【０２１７】
ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードするポリヌクレオチド、並びに／或いは抗体をコードするポリヌクレオチドを、細胞中で細胞に適するプロモーターの制御下で発現させるために、複製可能なベクター、典型的には自律的複製性発現ベクター中に挿入するのが適切である。多くのベクターがこの目的で当技術分野において知られており、適切なベクターの選択は、核酸のサイズ及び特定の細胞型に依存し得る。
【０２１８】
宿主細胞を本発明によるポリヌクレオチドで形質転換するのに用いることができる発現ベクターの例には、以下：
プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２若しくはｐＡＣＹＣ１８４、及び／又は
ウイルスベクター、例えば、細菌のファージ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈａｇｅ）、
転移性遺伝要素、例えば、トランスポゾン
が含まれる。
【０２１９】
このような発現ベクターは、通常、プラスミドのＤＮＡ複製開始点、抗生物質の選択マーカー、プロモーター、及びマルチクローニング部位によって分離されている転写ターミネーター（発現カセット）、及びリボソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
【０２２０】
本発明において用いられるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接連結していてよく、又は代替として適切な位置に、例えば、関連のポリペプチドが関連のプロモーターに挿入された場合に関連のプロモーターに対して作用することができるようなベクター中に位置していてよい。一実施形態において、プロモーターは、それに対してプロモーターが作用するポリヌクレオチドのコード部分の前に、例えば、ポリヌクレオチドの各コード部分の前の関連のプロモーターに位置している。本明細書で用いられる「前」はプロモーターが、コードするポリヌクレオチド部分に関して５プライムエンドに位置することを意味するものとされる。
【０２２１】
プロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも、又は外来性でもよい。適切なプロモーターには、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、Ｉｐｐ、Ａｒａｂ、ｔｅｔ、及びＴ７が含まれる。
【０２２２】
用いられる１つ又は複数のプロモーターは誘導プロモーターであってよい。ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐをコードするポリヌクレオチド、並びに抗体をコードするポリヌクレオチドが１つのベクター中に挿入されている実施形態において、ＦｋｐＡをコードするヌクレオチド配列、及び抗体は、単一のプロモーター又は別々のプロモーターの制御下にあってよい。ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐ、並びに抗体をコードするヌクレオチド配列が別々のプロモーターの制御下にある実施形態において、プロモーターは独立に誘導プロモーターであってよい。
【０２２３】
細菌系において用いるためのプロモーターは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能にリンクしているシャインダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も一般に含んでいる。プロモーターは、制限酵素の消化によって細菌の供給源のＤＮＡから除去し、所望のＤＮＡを含んでいるベクター中に挿入することができる。
【０２２４】
発現ベクターが、ＷＯ０３／０４８２０８又はＷＯ２００７／０３９７１４（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている抗体又はその抗原結合性フラグメントを生成するためのジシストロン性のメッセージも含んでいるのが好ましい。好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでいる上流のシストロン、及び対応する重鎖をコードするＤＮＡを含んでいる下流のシストロン、並びにジシストロン性の遺伝子間配列（ＩＧＳ）が、ＩＧＳ１（配列番号２３）、ＩＧＳ２（配列番号２４）、ＩＧＳ３（配列番号２５）、及びＩＧＳ４（配列番号２６）から選択される配列を含んでいるのが好ましい。
【０２２５】
ターミネーターは宿主細胞に対して内在性でも、又は外来性でもよい。適切なターミネーターはｒｒｎＢである。
【０２２６】
プロモーター及びターミネーターを含んでいるさらなる適切な転写レギュレーター、並びにタンパク質ターゲティング方法は、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｓａｖｖａｓ  Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９６年９月、５１２〜５３８頁に見ることができる。
【０２２７】
発現ベクター中に挿入されたＦｋｐＡポリヌクレオチドが、ＦｋｐＡシグナル配列及びＦｋｐＡコード配列をコードする核酸を含んでいるのが好ましい。ベクターは、好ましくは宿主の染色体を独立に複製するために、ベクターの１つ又は複数の選択された宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含んでいるのが好ましい。このような配列は様々な細菌ではよく知られている。
【０２２８】
一実施形態において、ＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐ及び／又は対象のタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にヒスチジンタグを含んでいる。
【０２２９】
抗体分子は、細胞から分泌されることもあり、又は適切なシグナル配列によってペリプラズムに対して標的化することもある。或いは、抗体分子は細胞の原形質内に蓄積することがある。抗体分子がペリプラズムに対して標的化するのが好ましい。
【０２３０】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換される。適切なシグナル配列には、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが含まれる。細胞が、抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列及び抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる一実施形態において、各ポリヌクレオチドは、ＯｍｐＡなどのシグナル配列を含み得る。
【０２３１】
上記に列挙した成分の１つ又は複数を含んでいる適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いるものである。単離したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを、必要とするプラスミドを産生するのに望ましい形態において、切断し、誂え、再ライゲーションする。それによりベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクト方法、及び培養方法は、当業者にはよく知られている。この点に関して、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって生成された  ｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０２３２】
分子生物学の標準的技術を、抗体をコードするＤＮＡ配列を調製するのに用いることができる。所望のＤＮＡ配列を完全に合成してもよく、又はオリゴヌクレオチド合成技術を用いて部分的に合成してもよい。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜用いてもよい。
【０２３３】
ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載する本発明の実施形態は、関連の態様を同じものに適用することができる限り、その中に使用される成分を含んでいる宿主細胞、発現カセット、及び／又はベクターなど、本発明の代替的実施形態に等しく適用される。
【０２３４】
本発明による細胞は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むことができる。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、外来性でも、又は内在性でもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、宿主の染色体中に組み込まれてもよく、又は通常はプラスミドであるベクター中に非組入れ（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）であってもよい。
【０２３５】
一実施形態において、本発明による細胞は、対象のタンパク質を発現する。「対象のタンパク質」は、本明細書の文脈において、通常は組換えポリペプチドである、発現用のポリペプチドを意味するものとされる。しかし、対象のタンパク質は、宿主細胞において内在性の遺伝子から発現される内在性タンパク質であってもよい。
【０２３６】
本明細書で用いられる、「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。対象のタンパク質は、外来性のベクターから発現された、内在性のタンパク質若しくはその変異バージョン（例えば、減弱された生物学的活性を有するもの）に同一の外来性の配列であってよく、又はそのフラグメントであってよい。或いは、対象のタンパク質は、宿主細胞によって通常発現されない、異種性のタンパク質であってよい。
【０２３７】
対象のタンパク質は、治療用、予防用、又は診断用のタンパク質を含めたあらゆる適切なタンパク質であってよい。
【０２３８】
当業者であれば、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣ、円偏光二色性、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することも容易にできる。
【０２３９】
一実施形態において、対象のタンパク質は、免疫学的障害及び／又は自己免疫疾患を含めた疾患又は障害の処置において有用である。
【０２４０】
一実施形態において、自己免疫疾患は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、ＡＮＣＡ関連血管炎、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａｌ）、軸索性及びニューロン性ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心伝導障害、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群（ＣＲＥＳＴ  ｄｉｓｅａｓｅ）、本態性混合性クリオグロブリン血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｉｘｅｄ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病（視神経脊髄炎症候群）、拡張型心筋症、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性血管中心性線維症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性胞隔炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を有する肉芽腫症（ＧＰＡ）ウェゲナーを参照されたい、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン症、特発性低補体血性尿細管間質性腎炎（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｓｔｉｔｉａｌ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連疾患、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、キュットナー腫瘍（Ｋｕｔｔｎｅｒ’ｓ  ｔｕｍｏｕｒ）、ランバートイートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、慢性、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、ミクリッツ症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハハーベルマン病、多巣性線維硬化症、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（Ｄｅｖｉｃ’ｓ）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オーモンド病（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌感染関連性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、パラプロテイン血症性ポリニューロパチー（ｐａｒａｐｒｏｔｅｉｎｅ��ｉｃ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルク症候群、パーソネージターナー症候群（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、毛様体扁平部炎（周辺ぶどう膜炎（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｕｖｅｉｔｉｓ））、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症（オーモンド病）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫（Ｓｐｅｒｍ＆ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、スティッフパーソン症候群（ｓｔｉｆｆ  ｐｅｒｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、突発性溶血性貧血（ｗａｒｍ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ）、及びウェゲナー肉芽腫症（現在、多発血管性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）から選択される。
【０２４１】
一実施形態において、神経障害は、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、ギランバレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー（ｐａｒａｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、視神経脊髄炎症候群（ＮＭＯ、ＮＭＯスペクトラム障害、又はＮＭＯスペクトラム疾患）、及び重症筋無力症から選択される。
【０２４２】
一実施形態において、免疫学的血液学的障害は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、突発性溶血性貧血（ｗａｒｍ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ）、グッドパスチャー症候群、及び抗ＨＬＡ抗体による移植ドナー不適合から選択される。
【０２４３】
一実施形態において、疾患は、重症筋無力症、視神経脊髄炎症候群、ＣＩＤＰ、ギランバレー症候群、異常タンパク性多発ニューロパチー、難治てんかん、ＩＴＰ／ＴＴＰ、溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、ＡＢＯ不適合、ループス腎炎、腎血管炎、強皮症、線維化肺胞炎、拡張型心筋症、グレーブス病、１型糖尿病、自己免疫性糖尿病、天疱瘡、強皮症、狼瘡、ＡＮＣＡ血管炎、皮膚筋炎、シェーグレン病（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び関節リウマチから選択される。
【０２４４】
一実施形態において、皮膚科学的障害は、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎、及び拡張型心筋症から選択される。
【０２４５】
一実施形態において、本開示による抗体又はフラグメントを、同種間の臓器及び組織の移植、又はある種の新生児の状態に付随する同種免疫疾患（ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の予防又は処置において用いてもよい。
【０２４６】
タンパク質は、タンパク質分解感受性のポリペプチド、即ち、自然状態又は分泌の間のいずれかにおいて、大腸菌などの１つ又は複数のグラム陰性細菌、プロテアーゼによって切断を受けやすく、切断に感受性であり、又は切断されるタンパク質であってよい。一実施形態において、対象のタンパク質は、ＤｅｇＰ、ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ、及びＴｓｐから選択されるプロテアーゼに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＤｅｇＰ及びＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＤｅｇＰ及びＴｓｐに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるＴｓＰ及びＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、ＤｅｇＰ、ＰｒｏｔｅａｓｅＩＩＩ、及びＴｓＰに対してタンパク質分解感受性である。
【０２４７】
タンパク質が真核生物のポリペプチドであるのが好ましい。
【０２４８】
本発明による細胞によって発現される対象のタンパク質は、例えば免疫原、２つの異種性のタンパク質を含む融合タンパク質、又は抗体であってよい。対象のタンパク質として用いるための抗体には、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体が含まれる。抗体はあらゆる種からのものであってよいが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、又はヒト化フラグメントに由来しているのが好ましい。抗体は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来していてよく、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、若しくはヒトを含めたあらゆる種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は、１つを超える種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラであってよい。一例において、定常領域はある種からであり、可変領域は別の種からである。
【０２４９】
抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子であってよく、又はそのフラグメント、例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２に記載されている通り、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖフラグメント、又は二重特異性抗体、例えば、Ｆａｂ−ｄＡｂ又はＦａｂ−Ｆｖであってよい。
【０２５０】
一実施形態において、タンパク質はＦａｂ’である。
【０２５１】
抗体はあらゆる標的の抗原に特異的であってよい。抗原は、細胞に付随するタンパク質、例えば、細菌細胞、酵母菌細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞状の細胞表面タンパク質であってよく、又は可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原はまた、疾患若しくは感染の間に上方制御されるタンパク質などのあらゆる医学的に関連のあるタンパク質、例えば、受容体であってよく、且つ／又はこれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン、若しくはＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１、若しくはＣＳＦ１受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ヅヅリン（ｄｕｄｕｌｉｎ）２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、及び好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。
【０２５２】
可溶性抗原には、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７、例えば、ＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆ、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＥ、インターフェロン、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られていた）、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、及び血小板由来増殖因子、例えば、ＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−β、並びに好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌の細胞表面抗原、細菌の毒素、ウイルス、例えば、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ、及びＣ、生物テロ薬剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ毒及びクモ毒、及び毒素が含まれる。
【０２５３】
一実施形態において、抗原はＦｃＲｎである。
【０２５４】
本開示において用いるための抗体は、当技術分野において知られているあらゆる適切な方法を用いて得ることができる。ポリペプチドを（組換え的又は天然に）発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）を含めて、融合タンパク質及びその変異体を含むＦｃＲｎポリペプチド／タンパク質を用いて、ＦｃＲｎを特異的に認識する抗体を生成することができる。ポリペプチドは「成熟」ポリペプチドでも、又は生物学的に活性なフラグメント若しくはその誘導体でもよい。ヒトタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ５５８９９の番号のもとに登録されている。一実施形態において、免疫源は、ＦｃＲｎアルファ鎖又はそのフラグメントである。
【０２５５】
宿主を免疫化するのに用いるためのポリペプチドは、当技術分野においてよく知られているプロセスによって、発現系を含んでいる遺伝子操作された宿主細胞から調製してもよく、又は天然の生物学的供給源から回収してもよい。本出願において、「ポリペプチド」の語には、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質が含まれる。これらは別段の特定がなければ交換可能に用いられる。ＦｃＲｎポリペプチドは、ある場合には、例えば、アフィニティタグに融合している、融合タンパク質などの大型のタンパク質の一部であってよい。
【０２５６】
ＦｃＲｎポリペプチドに対して産生した抗体を、動物の免疫化が必要である場合、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより、よく知られているルーチンのプロトコールを用いて得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編集）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなどの多くの温血動物を免疫化してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが、一般に最も適している。
【０２５７】
一実施形態において、対象の抗原の活性を機能的に変更するのに抗体を用いることができる。例えば、抗体を中和し、前記抗原の活性を、直接的若しくは間接的に拮抗若しくはアゴナイズし（ａｇｏｎｉｓｅ）、又はそれに対する正常のリガンドの結合を単に遮断してもよい。
【０２５８】
本発明は、変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞も提供し、変異Ｔｓｐ遺伝子は低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードし、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子、変異体ｓｐｒをコードする変異体ｓｐｒ遺伝子、タンパク質のフォールディングを促進することができるもの又はタンパク質を発現又は過剰発現することができる遺伝子、及びＦｃＲｎに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列をコードする。
【０２５９】
様々な抗ＦｃＲｎ抗体及びフラグメントを、配列３６から７４までに示す。
【０２６０】
一実施形態において、重鎖は、配列番号３６、３７、及び３８から独立に選択されるＣＤＲを１個、２個、又は３個含んでいる。
【０２６１】
一実施形態において、軽鎖は、配列番号３９、４０、及び４１から独立に選択されるＣＤＲを１個、２個、又は３個含んでいる。
【０２６２】
一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号３６に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号３７に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号３８に示す配列を含んでいる。
【０２６３】
一実施形態において、抗体軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号３９に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号４０に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号４１に示す配列を含んでいる。
【０２６４】
一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号３６に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号３７に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号３８に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号３９に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号４０に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号４１に示す配列を含んでいる。
【０２６５】
一実施形態において、細胞は、本明細書に開示する配列を有する抗体分子を発現する。
【０２６６】
抗体分子には、抗体及びその結合性フラグメントが含まれる。
【０２６７】
本発明によるヒト化抗体が、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメイン、及び本明細書に具体的に提供するＣＤＲを１つ又は複数有するのが適切である。このように、一実施形態において、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含んでいる、ヒトＦｃＲｎに結合するヒト化抗体を提供する。一例において、軽鎖可変ドメインは、配列番号５０に示す配列を含んでおり、重鎖可変ドメインは配列番号５８に示す配列を含んでいる。一例において、軽鎖は配列番号５４に示す配列を含んでおり、重鎖は配列番号６２に示す配列を含んでいる。
【０２６８】
発現後、抗体フラグメントを、例えば、エフェクター分子などの別の実体に対してコンジュゲートすることによってさらにプロセシングしてもよい。
【０２６９】
本明細書で用いられるエフェクター分子の語には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素（例えば、細菌若しくは植物起源の酵素的に活性な毒素及びこれらのフラグメント、例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）及びそのフラグメント）生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成の、又は天然に存在するポリマー、核酸及びこれらのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーターグループ、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。エフェクター分子は、あらゆる適切な方法によって抗体又はそのフラグメントに付着していてよく、例えば、抗体フラグメントは、ＷＯ０５／００３１７３１又はＷＯ０５／００３１７０（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている通り、少なくとも１つのエフェクター分子で付着するように修飾されていてよい。ＷＯ０５／００３１７１又はＷＯ０５／００３１７０も適切なエフェクター分子も記載している。
【０２７０】
一実施形態において、所望により、抗体又はそのフラグメント、例えばＦａｂをＰＥＧ化して必要とされる性質、例えば、抗体全体に類似の性質を有する生成物を生成する。例えば、抗体は、ＷＯ０１／０９４５８５に記載されている通り、ＰＥＧ化した抗ＴＮＦα−Ｆａｂ’であってよく、好ましくは、重鎖のＣ末端終端でリシル−マレイミド由来の基（ｌｙｓｙｌ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｕｐ）でシステイン残基の１つに付着しており、リシル残基の２つのアミノ基の各々はこれを、分子量約２００００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基に共有結合させており、その結果メトキシポリ（エチレングリコール）残基の合計平均分子量は約４００００Ｄａであり、より好ましくはリシル−マレイミド由来の基は、［１−［［［２−［［３−（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−１−オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］−カルボニル］−１，５−ペンタンジイル］ビス（イミノカルボニル）である。
【０２７１】
一実施形態において、本開示によるＦａｂ又はＦａｂ’は、ヒト血清アルブミン分子又はデンプン分子にコンジュゲートしている。
【０２７２】
細胞はまた、１つ又は複数のさらなる対象のタンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０２７３】
一実施形態において、野生型が精製の間に対象の組換えタンパク質と同時精製することが知られている１つ又は複数の大腸菌宿主タンパク質は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  Ｆａｂ’  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐＩ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、３７巻（２００４年）、１０９〜１１８頁及びＷＯ０４／０３５７９２（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）において記載されている通り、遺伝子修飾用に選択される。このような修飾された宿主タンパク質の使用により、これらが組換え抗体と最早同時精製されないように、選択された大腸菌タンパク質の物理的性質を変更することによって、大腸菌において生成された対象のタンパク質、特に抗体に対する精製プロセスが改善される。変更される大腸菌タンパク質が、リン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）、ジペプチド結合性タンパク質（ＤｐｐＡ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、及びチオレドキシンの１つ又は複数から選択されるのが好ましい。
【０２７４】
一実施形態において、汚染性の宿主タンパク質の物理的性質は、アミノ酸タグをＣ末端又はＮ末端に添加することによって変更される。好ましい一実施形態において、変更される物理的性質は等電点であり、アミノ酸タグはＣ末端に付着するポリアスパラギン酸タグである。一実施形態において、前記タグの添加によって変更される大腸菌タンパク質は、ジペプチド結合性タンパク質（ＤｐｐＡ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、及びリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）である。詳しい一実施形態において、大腸菌のリン酸結合性タンパク質（ＰｈｏＳ／ＰｓｔＳ）のｐＩは、アスパラギン酸残基を６個含んでいるポリアスパラギン酸タグ（ＰｏｌｙＤ）をＣ末端に加えることよって７．２から５．１に低減される。
【０２７５】
単独で、又はＮ末端若しくはＣ末端にタグを加えることとの組合せのいずれかで、その物理的性質を変更するための、汚染性の大腸菌タンパク質の特定の残基の修飾も好ましい。このような変更は、ｐＩ又は疎水性を変更するためのタンパク質又はアミノ酸置換基のサイズを変更するための挿入又は欠失を含むことができる。一実施形態において、これらの残基はタンパク質の表面上に位置する。好ましい一実施形態において、タンパク質のｐＩを低減するために、ＰｈｏＳタンパク質の表面残基が変更される。機能的なＰｈｏＳタンパク質を維持するために、リン酸塩の結合において重要であると関係付けられている残基（Ｂａｓｓ、ＵＳ５，３０４，４７２）を回避するのが好ましい。タンパク質の表面から遠くはなれて突出している、又は塩基性残基の大型の基である、若しくは塩基性残基の大型の基の近くにあるリシン残基を標的にするのが好ましい。一実施形態において、ＰｈｏＳタンパク質はＣ末端に付着しているヘキサポリアスパラギン酸タグを有し、分子の反対の終端にある表面残基が置換用に標的にされる。選択されたリシン残基が、中性残基から酸性残基に変わる場合よりも大きな潜在的なｐＩ変化を付与するようにグルタミン酸又はアスパラギン酸を置換するのが好ましい。本明細書における置換変異体に対する呼称は、文字とその後に続く数字、その後に続く文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を意味し、２番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。本発明におけるＰｈｏＳの好ましい変異において、リシン残基（Ｋ）２７５、１０７、１０９、１１０、２６２、２６５、２６６、３０９、３１３は、単一変異又は複合変異としてグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）に対して置換され、さらにリシン（Ｋ）３１８は、単一変異又は複合変異としてアスパラギン酸（Ｄ）に対して置換されてよい。単独の変異がＫ２６２Ｅ、Ｋ２６５Ｅ、及びＫ２６６Ｅであるのが好ましい。複合変異がＫ２６５／２６６Ｅ及びＫ１１０／２６５／２６６Ｅであるのが好ましい。全ての変異が、Ｃ末端で付着しているポリアスパラギン酸（ＰｏｌｙＤ）タグと、任意選択によってＫ３１８Ｄ置換とも組み合わされるのがより好ましい。好ましい一実施形態において、変異は少なくとも２単位のｐＩにおける低減をもたらす。本発明の変異がＰｈｏＳのｐＩを７．２から約４と約５．５との間に低減するのが好ましい。本発明の一実施形態において、大腸菌のＰｈｏＳタンパク質のｐＩは、ｐｏｌｙＤ  Ｋ３１８Ｄ、ｐｏｌｙＤ  Ｋ２６５／２６６Ｅ、及びｐｏｌｙＤ  Ｋ１１０／２６５／２６６の変異を用いて、７．２からそれぞれ約４．９、約４．８、及び約４．５に低減される。
【０２７６】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換される。適切なシグナル配列には、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＬａｍＢ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが含まれる。
【０２７７】
上記に列挙した成分の１つ又は複数を含んでいる適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いるものである。単離したプラスミド又はＤＮＡフラグメントを、必要とするプラスミドを生成するのに望ましい形態において、切断し、誂え、再ライゲーションする。
【０２７８】
一実施形態において、１つ又は複数の対象のタンパク質及び１つ又は複数の調節性の発現配列をコードする１つ又は複数のタンパク質コード配列を典型的に含んでいる対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを運搬するために、本発明において発現カセットが用いられる。１つ又は複数の制御発現配列は、終止配列などの３’非翻訳領域も含んでいてよい。適切なプロモーターを以下により詳しく論じる。
【０２７９】
一実施形態において、本発明による細胞は、プラスミドなどのベクターを含んでいる。ベクターが上記に規定した１つ又は複数の発現カセットを含んでいるのが好ましい。
【０２８０】
対象のタンパク質が重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体である実施形態において、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターを細胞系にトランスフェクトしてもよい。
【０２８１】
本発明において用いるためのベクターは、適切なベクター中に上記で定義した発現カセットを挿入することによって生成することができる。或いは、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を指示するための調節性の発現配列がベクターに含まれていてもよく、したがってポリヌクレオチドのコード領域だけがベクターを完成するのに必要とされ得る。
【０２８２】
本発明によるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するのに用いることができるベクターの例には：プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２若しくはｐＡＣＹＣ１８４、及び／又はウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾンが含まれる。
【０２８３】
多くの形態の発現ベクターが利用可能である。このようなベクターは、通常、プラスミドのＤＮＡ複製開始点、抗生物質の選択マーカー、プロモーター、及びマルチクローニング部位によって分離されている転写ターミネーター（発現カセット）、及びリボソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
【０２８４】
本発明において用いられるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接連結していてよく、又は代替として好適な位置に、例えば、関連のポリペプチドが関連のプロモーターに挿入された場合に関連のプロモーターに対して作用することができるようなベクター中に位置していてよい。一実施形態において、プロモーターは、それに対してプロモーターが作用するポリヌクレオチドのコード部分の前に、例えば、ポリヌクレオチドの各コード部分の前の関連のプロモーターに位置している。本明細書で用いられる「前」はプロモーターが、コードするポリヌクレオチド部分に関して５プライムエンドに位置することを意味するものとされる。
【０２８５】
プロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なプロモーターには、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、Ｉｐｐ、Ａｒａｂ、ｔｅｔ、及びＴ７が含まれる。
【０２８６】
用いられる１つ又は複数のプロモーターは誘導プロモーターであってよい。
【０２８７】
細菌系において用いるための発現単位は、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能にリンクしているシャインダルガノ（Ｓ．Ｄ．）リボソーム配列も一般に含んでいる。
【０２８８】
発現ベクターが、ＷＯ０３／０４８２０８又はＷＯ２００７／０３９７１４（これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる）に記載されている抗体又はその抗原結合性フラグメントを生成するためのジシストロン性のメッセージも含んでいるのが好ましい。好ましくは、抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでいる上流のシストロン、及び対応する重鎖をコードするＤＮＡを含んでいる下流のシストロン、並びにジシストロン性の遺伝子間配列（ＩＧＳ）が、ＩＧＳ１（配列番号３８）、ＩＧＳ２（配列番号３９）、ＩＧＳ３（配列番号４０）、及びＩＧＳ４（配列番号４１）から選択される配列を含んでいるのが好ましい。
【０２８９】
ターミネーターは宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なターミネーターはｒｒｎＢである。
【０２９０】
プロモーター及びターミネーターを含んでいるさらなる適切な転写レギュレーター、並びにタンパク質ターゲティング方法は、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｓａｖｖａｓ  Ｃ．  Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９６年９月、５１２〜５３８頁に見ることができる。
【０２９１】
抗体分子は、細胞から分泌されることもあり、又は適切なシグナル配列によってペリプラズムに対して標的化することもある。或いは、抗体分子は細胞の原形質内に蓄積することもある。抗体分子がペリプラズムに対して標的化するのが好ましい。
【０２９２】
ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載する本発明の実施形態は、ベクター、発現カセット、及び／又はこの中に用いられる成分を含んでいる宿主細胞など、関連する態様をこれらに適用することができる限り、本発明の代替の実施形態に等しく適用されるものである。
【０２９３】
本発明は、本発明の第１の態様又は第２の態様において上記に記載した組換えグラム陰性細菌細胞において、対象の組換えタンパク質を発現することを含む、対象の組換えタンパク質を生成するための方法も提供する。
【０２９４】
本発明の方法において用いるのが好ましいグラム陰性細菌細胞及び対象のタンパク質は、上記に詳しく記載したものである。
【０２９５】
対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが外来性である場合、ポリヌクレオチドを当技術分野において知られているあらゆる適切な手段を用いて宿主細胞中に組み入れることができる。ポリヌクレオチドが、細胞中に形質転換される発現ベクターの部分として組み入れられるのが典型的である。したがって、本発明による細胞の一態様は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。
【０２９６】
ポリヌクレオチド配列を、塩化ルビジウム、ＰＥＧ、又は電気穿孔を用いるなど、標準の技術を用いて細胞中に形質転換してもよい。
【０２９７】
本発明による方法は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで上首尾に形質転換されている安定な細胞の選択を促進する選択系も用いることができる。選択系は通常、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列の同時形質転換を使用する。一実施形態において、細胞中に形質転換された各ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいる。したがって、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの形質転換、並びにマーカーをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドの形質転換は一緒に生じ、選択系を用いて所望のタンパク質を生成するこれらの細胞を選択することができる。
【０２９８】
１つ又は複数のマーカーを発現することができる細胞は、細胞中に組み入れられる選択系のポリペプチド／遺伝子又はポリペプチド成分によって付与される性質（例えば、抗生物質耐性）のために、例えば、毒素又は抗生物質の添加など、ある種の人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができる。１つ又は複数のマーカーを発現することができない細胞は、人工的に課せられた条件下で生存／増殖／繁殖することができない。人工的に課せられる条件は、所望により幾分強力であるように選択され得る。
【０２９９】
本発明においてあらゆる適切な選択系を用いることができる。典型的に、選択系は、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はアンピリシン耐性の遺伝子など、既知の抗生物質に対して耐性をもたらすベクターの１つ又は複数の遺伝子中に含まれていることに基づいていてよい。関連の抗生物質の存在下で増殖する細胞は、これらが抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子及び所望のタンパク質の両方を発現するように選択されてよい。
【０３００】
一実施形態において、本発明による方法は、形質転換した細胞を培地中で培養し、それによって対象のタンパク質を発現させるステップをさらに含んでいる。
【０３０１】
対象のタンパク質を発現させるために、誘導可能な発現系、又は構成的なプロモーターを本発明において用いることができる。適切な誘導可能な発現系及び構成的なプロモーターは、当技術分野においてよく知られている。
【０３０２】
形質転換細胞を培養するのにあらゆる適切な培地を用いることができる。例えば、培地中で増殖するように上首尾に形質転換されている細胞だけを可能にするように、培地は抗生物質を含み得るなど、培地を特定の選択系に適応させてもよい。
【０３０３】
培地から得た細胞を、所望により、さらにスクリーニング及び／又は精製にかけてもよい。方法は、所望により対象のタンパク質を抽出及び精製する１つ又は複数のステップをさらに含むことができる。
【０３０４】
ポリペプチドを、原形質、ペリプラズム、又は上清からを含む、系統から回収することができる。
【０３０５】
一実施形態において、抗体をペリプラズムから単離する。
【０３０６】
一実施形態において、誘導後フィード速度は、５ｇ／ｈから７．５ｇ／ｈまでの範囲、例えば、約７ｇ／ｈである。
【０３０７】
タンパク質を精製するために用いる特定の方法（単数又は複数）はタンパク質のタイプに依存する。適切な方法には、イムノ−アフィニティカラム、又はイオン交換カラム上での分画化、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、疎水性−相互作用クロマトグラフィー、シリカ上クロマトグラフィー、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ及びＤＥＡＥなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈澱、及びゲルろ過が含まれる。
【０３０８】
抗体を、培養培地及び／又は原形質抽出物及び／又はペリプラズム抽出物から、従来の抗体精製手順、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、タンパク質Ｇクロマトグラフィー、タンパク質Ｌクロマトグラフィー、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）、混合モード樹脂（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅ  ｒｅｓｉｎｓ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム、エタノール、又はＰＥＧ分画／沈澱、イオン交換膜、膨張床吸着クロマトグラフィー（ＥＢＡ）、又は擬似移動床クロマトグラフィーなどによって適切に分離することができる。
【０３０９】
方法は、対象のタンパク質の発現量を測定し、高発現レベルの対象のタンパク質を有する細胞を選択するさらなるステップも含むことができる。
【０３１０】
方法は、抗体又は抗体フラグメントなどの対象のタンパク質のペグ化などの１つ又は複数のさらなる下流のプロセシングのステップも含むことができる。
【０３１１】
本明細書に記載する１つ又は複数の方法のステップを、バイオリアクターなどの適切な容器において組み合わせて行ってもよい。
【０３１２】
本開示による抗体及びフラグメントを、処置又は予防において用いてもよい。
【０３１３】
技術的に適切であれば、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。本明細書において、ある特徴／要素を含むものとして実施形態を記載する。本開示は、前記の特徴／エレメントからなり、又は本質的にこれらからなる別々の実施形態にも拡張される。特許及び出願など、本明細書における技術的な参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１４】
本発明を、以下の実施例において、添付の図面を参考にして、説明のみの目的でさらに記載する。
【実施例】
【０３１５】
（例１）細胞系の産生
ＭＸＥ０１６及びＭＸＥ０１７の産生は、ＷＯ２０１１／０８６１３６に示すものである。
【０３１６】
抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ’発現、及びＦｋｐＡを有する抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ’、ｓｋｐを有する抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ’、並びにＦｋｐＡ及びｓｋｐ両方の発現を有する抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ’の産生
抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖両方の配列を含むプラスミドを構築した（それぞれ配列番号６３及び５５）。プラスミドｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７Ｆａｂ’を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．、ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．において見出すことができる従来の制限クローニング方法を用いて構築した。プラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’は以下の特徴：強力なｔａｃプロモーター及びｌａｃオペレーター配列を含んでいた。プラスミドは、Ｆａｂ’重鎖のコード領域の後の独特のＥｃｏＲＩ制限部位とその後の、強力なリボソーム結合性部位を含んでいる非コード配列、次いで独特のＮｄｅＩ制限部位を含んでいた。
【０３１７】
Ｆａｂ軽鎖、重鎖遺伝子を、単一のポリシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌のペリプラズムに対するポリペプチドの転移を指示する大腸菌ＯｍｐＡタンパク質からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを軽鎖及び重鎖の遺伝子配列両方の５’末端に融合した。転写を二重転写ターミネーターｒｒｎＢ  ｔｌｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は構成的に発現されるＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって抑制解除が誘導されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はｐ１５Ａであり、これは低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。
【０３１８】
抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ及びＦｋｐＡ（ペリプラズムポリペプチド）に対する発現ベクターである、プラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’ＦｋｐＡを、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩ部位を用いて、ＦｋｐＡをｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’のＦａｂ’配列の３’末端にライゲートすることにより構築した（図７ｄを参照されたい）。５’ＥｃｏＲＩ部位をコードする新たな構築物の後に強力なリボソーム結合性部位が続き、その後に天然の開始コドン、シグナル配列、及びＦｋｐＡの成熟配列が続き、Ｃ末端のＨｉｓタグ及び最終的に強力なリボソーム結合性部位において終結し、その後に非コードＮｄｅＩ部位が続くように、ＦｋｐＡ（配列番号３０）を合成的に構築して２ＰｕｖＩＩ部位、ＳｆｕＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、及びＥｃｏＲＩを除去した。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ制限フラグメントを制限し、Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びＦｋｐＡの３つポリペプチドが全て、単一のポリシストロニックｍＲＮＡ上にコードされるように、発現ベクター中にライゲートした。
【０３１９】
抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ及びＳｋｐ（ペリプラズムポリペプチド）に対する発現ベクターである、プラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’Ｓｋｐを、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩ部位を用いて、ｓｋｐをプラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’のＦａｂ’配列の３’末端にライゲートすることにより構築した。５’ＥｃｏＲＩ部位をコードする新たな構築物の後に強力なリボソーム結合性部位が続き、その後に天然の開始コドン、シグナル配列、及びＳｋｐの成熟配列が続き、Ｃ末端のＨｉｓタグ及び最終的に強力なリボソーム結合性部位において終結し、その後に非コードＮｄｅＩ部位が続くように、ｓｋｐ（配列番号３４）を合成的に構築して４ＰｓｔＩ部位及びＥｃｏＲＶ部位を除去した。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ制限フラグメントを制限し、Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びｓｋｐの３つポリペプチドが全て、単一のポリシストロニックｍＲＮＡ上にコードされるように、発現ベクター中にライゲートした。
【０３２０】
抗ＦｃＲｎ  Ｆａｂ、ＦｋｐＡ、及びＳｋｐ（両者ともペリプラズムポリペプチド）に対する発現ベクターである、プラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’ＦｋｐＡ  Ｓｋｐを、ＮｄｅＩ部位を用いて、ＦｋｐＡ配列の３’末端に、ＳｋｐをプラスミドｐＴＴＯＤ１５１９．ｇ５７Ｆａｂ’ＦｋｐＡ配列にライゲートすることにより構築した。天然の開始コドン、シグナル配列、及びＳｋｐの成熟配列を含む５’ＡｓｅＩ部位をコードする構築物がＣ末端のＨｉｓタグにおいて終結し、最終的に非コードＮｄｅＩ部位が続くように、Ｓｋｐ（配列番号３４）を合成的に構築して４ＰｓｔＩ部位及びＥｃｏＲＶ部位を除去した。ＡｓｅＩ−ＮｄｅＩ制限フラグメントを制限し、Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、ＦｋｐＡ、及びｓｋｐの４つのポリペプチドが全て、単一のポリシストロニックｍＲＮＡ上にコードされるように、発現ベクター中にライゲートした。
【０３２１】
大腸菌Ｗ３１１０におけるｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’、ｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  ＦｋｐＡ、ｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  Ｓｋｐ、及びｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  ＦｋｐＡ  ｓｋｐ；ＭＸＥ０１２（大腸菌Ｗ３１１０  ｓｐｒ  Ｈ１４５Ａ）、ＭＸＥ０１６（大腸菌Ｗ３１１０  ΔＴｓｐ、ｓｐｒ  Ｃ９４Ａ）、並びにＭＸＥ０１７（大腸菌Ｗ３１１０  ΔＴｓｐ、ｓｐｒ  Ｈ１４５Ａ）の発酵
大腸菌Ｗ３１１０、ＭＸＥ０１２、ＭＸＥ０１６、及びＭＸＥ０１７系統を、例１において産生したプラスミドｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’、ｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  ＦｋｐＡ、ｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  Ｓｋｐ、及びｐＴＴＯＤ  １５１９．ｇ５７  Ｆａｂ’  ＦｋｐＡ  Ｓｋｐで形質転換した。系統の形質転換を、Ｃｈｕｎｇ  Ｃ．Ｔら、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．」、ＰＮＡＳ、８６巻、２１７２〜２１７５頁（１９８９年）に見られる方法を用いて行った。これら形質転換した系統を、発酵により発現に対して試験した。
【０３２２】
（例２）Ｆａｂ’発現に対するシャペロンの効果
図１に示す系統を、１Ｌ及び２．５Ｌの発酵実験において試験し、Ｆａｂ’の発現を比較した。
【０３２３】
増殖培地、接種、及び発酵のステップ
発酵プロセスを、細胞バンクのバイアルから接種材料を調製し、いくつかの前培養段階（フラスコ及びリアクター）によって増幅し、その後生成発酵槽の播種により開始した。生成発酵槽において、細胞を、バッチ及び流加培養法において規定した培地中で高密度に増殖させた。所望の細胞密度に到達したら、ＩＰＴＧを加えることにより、Ｆａｂ’の発現を誘導した。Ｆａｂ’の発現は大腸菌のペリプラズム間隙を標的化し、Ｆａｂ’は誘導期の経過にわたって蓄積する。炭素源のフィードを、誘導期の間適用して、発現及び細胞の増殖を制御した。温度、溶存酸素（ｐＯ２）、及びｐＨを制御して、培養物を最適培養条件内に維持した。
【０３２４】
バイオマス濃度及び増殖速度の測定
６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。
【０３２５】
ペリプラズム抽出
細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を（−２０℃で）保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、元の培養体積に再懸濁した。６０℃でおよそ１０時間から１２時間までインキュベートした後、抽出物を遠心分離により澄明にし、上清分画を新鮮な状態で使用し、又は分析用に（−２０℃で）保持した。
【０３２６】
Ｆａｂ’定量
ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のＦａｂ’濃度を、タンパク質Ｇ  ＨＰＬＣを用いて決定した。ＨｉＴｒａｐ  タンパク質Ｇ  ＨＰ１ｍｌカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ又は同等物）に分析物（およそ中性のｐＨ、３０℃、０．２μｍろ過）を２ｍｌ／分でローディングし、カラムを２０ｍＭリン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７の注入を用いてＦａｂ’を溶出した。溶出されたＦａｂ’をＡｇｉｌｉｅｎｔ１１００又は１２００ＨＰＬＣシステム上Ａ２８０によって測定し、既知濃度の精製Ｆａｂ’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。
【０３２７】
図１は、宿主細胞と「シャペロン」との様々な組合せで行った５Ｌ規模に対する４６の発酵の結果を示す。Ｗ３１１０は大腸菌野生型系統である。様々な組合せとは、シャペロンなしの野生型、ＦｋｐＡ及びＳｋｐを有する野生型、ＭＸＥ０１６変異体ｓｐｒ及びＷＯ２０１１／０８６１３６において公開したΔＴｓｐ、ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ、ＭＸＥ０１６及びＳｋｐ、ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ及びＳｋｐ、ＷＯ２０１１／０８６１３６において開示したＭＸＥ０１７、ＭＸＥ０１７及びＦｋｐＡ及びＳｋｐであった。
【０３２８】
ＭＸＥ０１６、ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ、ＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ及びＳｋｐ、並びにＭＸＥ０１７及びＦｋｐＡ及びＳｋｐが最善レベルの発現を示したことを、結果は示している。
【０３２９】
（例３）誘導後フィード速度の効果
３つの異なる誘導後フィード速度５．４ｇ／ｈ、６．０ｇ／ｈ、及び７．０ｇ／ｈの効果を、ＭＸＥ０１６、及びＭＸＥ０１６＋ＥｋｐＡに対して試験した。
【０３３０】
増殖培地、接種、及び発酵のステップ
発酵プロセスを、細胞バンクのバイアルから接種材料を調製し、いくつかの前培養段階（フラスコ及びリアクター）によって増幅し、その後生成発酵槽の播種により開始した。生成発酵槽において、細胞を、バッチ及び流加培養法において規定した培地中で高密度に増殖させた。所望の細胞密度に到達したら、ＩＰＴＧを加えることにより、Ｆａｂ’の発現を誘導した。Ｆａｂ’の発現は大腸菌のペリプラズム間隙を標的化し、Ｆａｂ’は誘導期の経過にわたって蓄積する。炭素源のフィードを、誘導期の間適用して、発現及び細胞の増殖を制御し、本実験においてフィード速度を３つの別々の設定値に設定した（図に示す）。温度、溶存酸素（ｐＯ２）、及びｐＨを制御して、培養物を最適培養条件内に維持した。
【０３３１】
図２は、シャペロンを発現しない、又はＦｋｐＡを発現するいずれかのプラスミドで形質転換したＭＸＥ０１６系統を示す。図は、誘導後フィード速度の増大の、Ｆａｂ’生成、及びＦｋｐＡあり及びなし両方でのペリプラズムにおける保持に対する効果を示す。データは、ＦｋｐＡ発現なしでフィード速度を増大した場合、生成されるさらなるＦａｂ’が上清に失われることを示している。これは、より速いフィード速度で生成されるさらなるＦａｂ’がペリプラズム内に保持され、より高力価をもたらす場合、ＦｋｐＡの発現には当てはまらない。
【０３３２】
（例４）収率及び細胞生存能の分析
図３Ａ及び図Ｂは、２０Ｌ規模で、シャペロンを発現しない、又はＦｋｐＡを発現するいずれかのプラスミドで形質転換したＭＸＥ０１６における細胞生存能及びＦａｂ’力価に対する効果を示す。図３Ａは、ＦｋｐＡが存在しない場合は細胞生存能がより低いことを示す。３ｂは、ＭＸＥ０１６＋ＦｋｐＡではＦａｂ’力価がより高く、生存能がより低いことを示す。
【０３３３】
図４は、ＭＸＥ０１６＋ＦｋｐＡの力価が高いほど、Ｆａｂ生成物の初期回収後、３０％多いＦａｂがもたらされることを示す。
【０３３４】
図５及び図６は、シャペロンのなしでのＭＸＥ０１６及びＦｋｐＡ発現ありでのＭＸＥ０１６の初期回収からの試料の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ｈｉｓタグウエスタンブロットを示す。試料を、Ｆａｂ’濃度にしたがってローディングし、１レーンあたり１□ｇのＦａｂ’をローディングした。ゲルは４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘであり、２時間１２５Ｖの非還元性の条件下で泳動した。ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ色素で染色し、画像処理した。ウエスタンブロットを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔシステムを用いてＰＶＤＦ膜に移し、次いで１％カゼイン溶液でブロッキングした。次いで、膜を、抗ｈｉｓ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）でプローブした。次いで、ブロットをＥＣＬ溶液で展開し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＨｙｐｅｒＰｒｏｃｅｓｓｅｒを用いて画像処理した。
【０３３５】
本発明を、好ましい実施形態を参照にして特に示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定される通り、本発明の範囲から逸脱することなしに形態及び詳細において様々な変更を行うことができることが理解されよう。
【図１】
2018198597.tif 000002
【図２】
2018198597.tif 000003
【図３Ａ】
2018198597.tif 000004
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018198597.tif 000008
【図７Ａ】
2018198597.tif 000009
【図７Ｂ】
2018198597.tif 000010
【図７Ｃ】
2018198597.tif 000011
【図７Ｄ】
2018198597.tif 000012
【図８−１】
2018198597.tif 000013
【図８−２】
2018198597.tif 000014
【図８−３】
2018198597.tif 000015
【図８−４】
2018198597.tif 000016
【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
2018198597.tif 000020
【図８−９】
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【図８−１０】
2018198597.tif 000022
【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【配列表】
2018198597000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月23日(2018.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．Ｄ１３３、Ｈ１４５、Ｈ１５７、Ｎ３１、Ｒ６２、Ｉ７０、Ｑ７３、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｑ９９、Ｒ１００、Ｌ１０８、Ｙ１１５、Ｖ１３５、Ｌ１３６、Ｇ１４０、Ｒ１４４、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする変異ｓｐｒ遺伝子、並びに
ｂ．ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、又はＦｋｐＡとＳｋｐの組合せから選択される、タンパク質のフォールディングを促進することができる１つ又は複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター
を含む組換えグラム陰性細菌細胞であって、
野生型細胞に比べて低減したＴｓｐタンパク質活性を有し、そしてＤｓｂＣをコードする遺伝子を含んでいない、上記組換えグラム陰性細菌細胞。
【請求項２】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｃ９４及びＨ１４５Ａの変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｄ１３３Ａ、Ｈ１４５Ａ、及びＨ１５７Ａから選択される変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
変異体ｓｐｒ遺伝子が、Ｃ９４Ａから選択される変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
変異体ｓｐｒ遺伝子が細胞のゲノムに組み入れられている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質をコードする遺伝子が、プラスミド上など、細胞中に一過性にトランスフェクトされる、請求項１から５までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質をコードする遺伝子が、細胞のゲノム中に組み入れられている、請求項１から５のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
タンパク質のフォールディングを促進することができるタンパク質が、ＦｋｐＡである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
以下の変異遺伝子：
ａ．シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するＤｅｇＰタンパク質をコードする変異ＤｅｇＰ遺伝子、
ｂ．低減したプロテアーゼ活性を有するＰｒｏｔｅａｓｅ  ＩＩＩタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ｐｔｒ遺伝子である、変異ｐｔｒ遺伝子、
ｃ．低減したプロテアーゼ活性を有するＯｍｐＴタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ＯｍｐＴ遺伝子である、変異ＯｍｐＴ遺伝子
の１つ又は複数をさらに含んでいる、請求項１から８までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
低減したプロテアーゼ活性を有するＴｓｐタンパク質をコードする変異Ｔｓｐ遺伝子を含んでいる、又はノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞のゲノムが、変異ｓｐｒ遺伝子及び変異Ｔｓｐ遺伝子以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
遺伝子開始コドン、並びに／或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する１つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでいるノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子を有する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が、遺伝子開始コドンに対するミスセンス変異によって作り出された制限マーカー部位、及び任意選択によって１つ又は複数のさらなる点変異を含んでいる、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
ノックアウト変異Ｔｓｐ遺伝子が配列番号３を含んでいる、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、例えば、大腸菌がＫ１２又はＷ３１１０系統である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントから選択される対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントがＦｃＲｎに特異的である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の組換えグラム陰性細菌細胞を、培養培地中、対象の組換えタンパク質を発現するのに効果的な条件下で培養するステップと、対象の組換えタンパク質を、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び／又は培養培地から回収するステップとを含む、対象のタンパク質を生成するための方法。
【請求項１９】
対象のタンパク質を細胞から回収するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象のタンパク質が、ペリプラズム及び／又は上清から回収される、請求項１９に記載の方法。