(57)【要約】      （修正有）【課題】正常なミトコンドリア機能の維持又は回復のために有用な物質の提供。【解決手段】ミトコンドリア病の治療又はミトコンドリア機能の修復、回復若しくは維持に使用するためのα-1-ミクログロブリン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア病の治療又はミトコンドリア機能の修復、回復若しくは維持に使用するためのα-1-ミクログロブリン。
【請求項２】
ミトコンドリア関連疾患又は障害が、以下のリスト：
・アルパース病(乳児進行性灰白異栄養症)
・バース症候群(乳児致死性心筋症)
・β酸化欠損症
・心筋症
・カルニチン-アシル-カルニチン欠乏症
・カルニチン欠乏症
・クレアチン欠乏症候群(脳クレアチン欠乏症候群(CCDS)にはグアニジノアセテートメチルトランスフェラーゼ欠乏症(GAMT欠乏症)、L-アルギニン:グリシンアミジノトランスフェラーゼ欠乏症(AGAT欠乏症)及びSLC6A8関連クレアチン輸送体欠乏症(SLC6A8欠乏症)が含まれる)
・補酵素Q10欠乏症
・呼吸鎖複合体Ｉ欠乏症(NADHデヒドロゲナーゼ(NADH-CoQレダクターゼ)欠乏症)
・呼吸鎖複合体II欠乏症(スクシネートデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体III欠乏症(ユビキノン-シトクロムｃオキシドレダクターゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体IV欠乏症/COX欠乏症(シトクロムｃオキシダーゼ欠乏症は呼吸鎖複合体IVの欠損により引き起こされる)
・呼吸鎖複合体Ｖ欠乏症(ATPシンターゼ欠乏症)
・COX欠乏症
・CPEO(慢性進行性外眼筋麻痺症候群)
・CPT I欠乏症
・CPT II欠乏症
・フリートライヒ運動失調(FRDA又はFA)
・脳筋症
・グルタル酸尿症II型
・KSS(カーンズ・セイアー症候群)
・乳酸アシドーシス
・LCAD(長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・LCHAD
・リー病又は症候群(亜急性壊死性脳脊髄症)
・LHON(レーバー遺伝性視神経萎縮)
・ルフト病
・MCAD(中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・MELAS(ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様エピソード)
・MERRF(ミオクローヌスてんかん・赤色ぼろ線維症候群)
・MIRAS(ミトコンドリア劣性運動失調症候群)
・ミトコンドリア細胞障害
・ミトコンドリアDNA涸渇
・ミトコンドリア脳症(脳筋症、脳脊髄障害を含む)
・ミトコンドリアミオパシー
・MNGIE(ミトコンドリア神経胃腸脳筋障害)
・NARP(ニューロパシー・運動失調・網膜色素変性症)
・ピアソン症候群
・ピルベートカルボキシラーゼ欠乏症
・ピルベートデヒドロゲナーゼ欠乏症
・POLG変異
・呼吸鎖欠損症
・SCAD(短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・SCHAD
・VLCAD(超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
からの１以上の疾患又は障害である、請求項１に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項３】
呼吸鎖障害の治療又は予防に使用するための、請求項１又は２に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項４】
呼吸鎖障害が呼吸鎖複合体Ｉ、II、III、IV又はＶ欠損が関与するものである、請求項３に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項５】
小児又は若年成人のミトコンドリア機能不全の治療又は予防に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項６】
アルパース病、バース症候群、フリートライヒ運動失調、KSS、リー病又は症候群、LHON、MELAS、MERRF、MIRAS及びNARPの治療又は予防に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項７】
女性のミトコンドリア機能不全の治療又は予防に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項８】
ミトコンドリア欠損又は機能不全に関連する網膜損傷若しくは機能不全又は眼疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のα-1-ミクログロブリン。
【請求項９】
α-1-ミクログロブリンを対象者に投与することを含んでなる、ミトコンドリア欠損症、ミトコンドリア病若しくは障害、薬物誘導ミトコンドリア副作用又は環境誘導ミトコンドリア作用の１以上を患っている対象者を治療する方法。
【請求項１０】
α-1-ミクログロブリンを対象者に投与することを含んでなる、ミトコンドリア欠損症、ミトコンドリア病若しくは障害、薬物誘導ミトコンドリア副作用又は環境誘導ミトコンドリア作用の１以上を予防する方法。
【請求項１１】
対象者がヒトを含む哺乳動物である請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリア病又は障害が請求項２〜８のいずれか１項に記載のものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、α-1-ミクログロブリン(A1M)が損傷に対するミトコンドリアの保護に重要な役割を果たすという知見に基づく。A1Mは、呼吸鎖複合体Ｉサブユニットに結合することによりミトコンドリアの構造及び機能を保護する。ミトコンドリアは幾つかのヒト疾患に関連付けられており、本明細書に開示する知見は、ミトコンドリア関連疾患の治療でのA1Mの使用を支持する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ミトコンドリアは真核細胞の細胞小器官であり、エネルギー源として使用されるアデノシン三リン酸(ATP)の細胞による供給量のほとんどを生成する。よって、ミトコンドリアは、エネルギー産生、真核細胞の生存及び正しい細胞機能に不可欠である。エネルギー供給に加え、ミトコンドリアは、細胞シグナル伝達、細胞分化、細胞死並びに細胞サイクル及び細胞増殖の制御のような多くの他のプロセスに関与する。特に、ミトコンドリアは、細胞アポトーシスの決定的に重要な調節因子であり、複数の形態の非アポトーシス性細胞死(例えば壊死)でも主要な役割を果たす。
【０００３】
近年、ミトコンドリアが種々の疾患の一因であると記述する論文が数多く発表されている。ミトコンドリアゲノムにおける変異又は欠失が引き起こすとされる疾患もあれば、ミトコンドリア機能の損傷が引き起こすとされる疾患も存在する。現在、ミトコンドリア病を治癒させ得る利用可能な治療法が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
正常なミトコンドリア機能の維持又は回復の重要性が認識されていることを鑑みれば、ミトコンドリアの構造及び機能の保護に使用できるか又はミトコンドリアの機能不全の回復若しくは治療に使用できる物質を特定する必要がある。
【０００５】
α-1-ミクログロブリン(A1M)は、ヒト及びカレイ(plaice)を含む幾つかの種の血漿、肝臓及び尿から単離され、特徴付けられた26kDaの血漿及び組織タンパク質である(31)。血漿では、A1Mは遊離形態で見出されるし、他のより大きな血漿タンパク質に共有結合している。ヒトでは、A1Mは、IgA、アルブミン及びプロトロンビンと複合体を形成する(5)。遊離A1M及び種々の高分子量複合体は、全ての組織の細胞外マトリクスにも存在し、共に血漿に起源を有するし末梢合成にも起源を有する(4)。組織では、A1Mは、血管の血液と組織との界面、肺の空気と組織との界面、臍帯の母体と胎児との界面に、特に傷害部位に優先的に局在する(44)。A1Mの生理機能は知られていないが、レダクターゼ活性を有し、遊離のヘム及びラジカルに結合することが示されており、よって酸化ストレスを伴う状況で保護機能を有する可能性を示唆されている(31)。A1Mは多くの細胞タイプに結合し、多くの場合で、続いて内在化する(36, 49)。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、A1Mの細胞取り込みの詳細な研究を行い、その過程で、このタンパク質が損傷細胞でミトコンドリアに主に局在し、ミトコンドリアの構造及び機能を保護し得ることを見出した。
【０００７】
本発明は、ミトコンドリア関連疾患を予防又は治療するためのA1Mの使用に関する。実施例に示すように、A1Mは、過剰ストレスに曝され高率のATP産生を強いられた細胞に対して有益な効果を有する。このような状況で、A1Mは、環境ストレスをものともせず、細胞のATP産生を維持することができる。A1Mは、呼吸鎖複合体のサブユニットに結合するので、概して、ミトコンドリアの減損若しくは損傷又はミトコンドリア機能(の少なくとも一部)の損傷が関与する疾患の予防又は治療に使用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】インタクトの細胞及びアポトーシス細胞へのA1Mの結合を示す。
【図２】アポトーシス細胞へのA1M結合の時間分析を示す。
【図３】共焦点顕微鏡観察及び透過型電子顕微鏡観察により分析した、ミトコンドリアへのA1M結合を示す。
【図４】125I-A1M結合により分析した、ミトコンドリアへのA1Mの結合を示す。
【図５】BN-PAGE、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを用いて調べたミトコンドリアへのA1Mの結合の特異性を示す。
【図６】A1Mによるミトコンドリア構造の保護を示す。
【図７】培養培地のみ(Ａ)、250μM H2O2(Ｂ)又は250μM H2O2＋0.25mg/ml A1M(Ｃ)とRTにて20時間インキュベートしたヒト初代ケラチノサイトを示す。
【図８】A1Mによるミトコンドリア機能の保護を示す。
【図９】A1Mの配列表を示す。
【図１０】温和条件下及びストレス条件下で培養した網膜中のミトコンドリアrRNA(Ａ)並びに細胞性A1M、HO1及びSODのmRNA(Ｂ)のリアルタイムPCR定量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ミトコンドリア病は、赤血球を除く身体の全ての細胞に存在する特殊区画であるミトコンドリアの不具合に起因する。ミトコンドリアが機能しなくなると、細胞で生成されるエネルギーが次第に少なくなり、続いて細胞傷害が起こり、細胞死さえも生じる。このプロセスが全身で繰り返されると、その人の生命はひどく危うい。
ミトコンドリアの疾患は、ほとんどの場合で、エネルギー要求性の高い器官、例えば脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓並びに内分泌系及び呼吸系に現れる。
ミトコンドリア病の症状には、運動制御の喪失、筋肉の脱力及び疼痛、痙攣、視覚/聴覚障害、心疾患、肝疾患、胃腸障害、嚥下障害などが含まれ得る。
ミトコンドリア病は先天的でもあり得るし、(ミトコンドリアに通常存在するタンパク質又はRNA分子の機能変化をもたらす)自発的変異に起因し得る。
【００１０】
ミトコンドリアの欠乏(例えば、呼吸鎖複合体Ｉ、II、III若しくはIVの欠乏)又は酵素の欠乏(例えば、ピルベートデヒドロゲナーゼの欠乏)が関与する多くの疾患が見出されている。しかし、実態は複雑であり、多くの要因がその疾患に関与している可能性がある。
今日まで、利用可能な根治治療はない。利用可能な治療は、症状を寛解し、疾患進行を遅延させ得るものだけである。
したがって、本明細書に記載された本発明者らによる知見は非常に重要である。なぜならば、この知見により、ミトコンドリアに対するA1Mの有益な効果がミトコンドリア構造の維持及び引き起こされたミトコンドリア欠損を回復させる能力の両方に関して証明されたからである。
【００１１】
本発明は、ミトコンドリア病の治療に使用するA1Mに関する。このような疾患には、神経系、脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓並びに内分泌系及び呼吸系の疾患が含まれるが、これらに限定されない。多くの疾患がミトコンドリア欠損を有し得、したがって本明細書で言及したもの以外の疾患も、A1Mを用いる治療又は予防に適切であり得る。
細胞死には、偶発的か、ストレス誘導性か又はアポトーシス性かにかかわらず、しばしば、細胞分解及びリサイクルプログラムの活性化が関与する(7)。したがって、細胞死は、温存されたインタクトのミトコンドリア機能を必要とするエネルギー依存性プロセスである。オートファジーによるミトコンドリア消去(ミトファジー(mitophagy))は、プログラムされた細胞死の間で中心的役割を果たすと示唆されている(23)。よって、プログラムされた細胞死の間に機能的ミトコンドリアが必要であるが、それがどのように達成されるかは未だ理解されていない。
【００１２】
複合体Ｉ、II、III及びIVは、ミトコンドリア内膜に埋め込まれたタンパク質複合体である。これらは、呼吸鎖として知られ、電子供与体(例えばNADH)と電子受容体(例えばO2)との間の電子伝達と、H+イオンの伝達との共役により機能する。得られる内膜上の電気化学的プロトン勾配を利用して、(いずれも細胞質中で産生される)グルコース、ピルベート及びNADHの酸化によりアデノシン三リン酸(ATP)の形態の化学エネルギーを生成する。この細胞呼吸プロセスは、好気呼吸としても知られ、酸素の存在に依存する。酸素が制限されている場合、解糖産物は、ミトコンドリア非依存性プロセスである嫌気発酵により代謝される。グルコースからのATP産生は、好気呼吸の間、発酵と比較して約13倍高い。
【００１３】
本発明者らは、ヒト血漿及び組織の低分子量タンパク質であるA1Mがミトコンドリアに、より具体的にはミトコンドリア複合体Ｉに結合することを示した。更に、このタンパク質は、ミトコンドリアをヘム誘導膨潤及びATP産生能喪失から保護できることが示された。これら知見に基づいて、本発明者らは、A1Mが細胞ハウスキーピング機構に関与することを示唆している。A1Mは、現時点では未知の幾つかの異なる機序によりこの保護を発揮している可能性がある。作用機序にかかわらず、本明細書に記載の研究は、A1Mがミトコンドリアに有益な効果を有し、したがってミトコンドリア病を治療又は予防し得る薬物であることを明確に示す。更に、A1Mは、ミトコンドリアに副作用を引き起こす薬剤で治療される患者で、該副作用の予防及び/又は治療に使用し得る。例としては、スタチンでの治療などが挙げられる。更に、A1Mは、化粧品において、例えば年齢に関連する肌の変化を処置するために、使用し得る。或いは、A1Mは、環境中の物質又は条件が引き起こす望まないミトコンドリア作用の予防及び/又は治療に使用し得る。
【００１４】
上記のように、A1Mは複合体Ｉのサブユニットに結合する。このことは、A1Mが、呼吸鎖に欠損があるミトコンドリア病の治療に使用するに特に適切であることを示す。より具体的には、A1Mが、複合体Ｉ欠乏症又は複合体Ｉ関連疾患の治療に使用するに特に適切であることを示す。
【００１５】
本明細書の実施例で報告するように、細胞アポトーシスの誘導を利用して、細胞形質膜に対する損傷及び細胞外壁の破壊を引き起こすストレス誘導細胞傷害により特徴付けられる状況を模倣した。細胞がヨウ化プロピジウム(PI)を内在化できるや否や、外因性A1Mは高親和性で細胞内結合をした。このことは、取り込み機序が細胞外区画からのA1Mの受動的な漏れであることを示唆する。よって、ミトコンドリアへのA1Mの結合は、形質膜が破裂した壊死細胞でも起きるはずである。インビボでの壊死性細胞死の多くの形態が、実際、調節された一連のATP依存性細胞崩壊事象(すなわち、ネクロプトーシスと呼ばれる、特定経路に従うプログラムされた壊死)として説明できることがますます明らかになってきている(7, 46)。よって、A1Mの可能な役割は、エネルギー依存性細胞分解プロセスへのATP利用性を確保するために、アポトーシス性細胞及びネクロプトーシス性細胞の両方において、そしておそらくは他のタイプの壊死性細胞においてもオートファジーによらない細胞死の間に、ミトコンドリア機能の保存に関与することである。
【００１６】
ミトコンドリアの構造及び機能の保護機序は不明である。AM1は、レダクターゼ特性並びにヘム及びラジカル結合特性に基づく抗酸化機能に帰せられている(2, 53)。したがって、これら特性が保護効果に関与していると推測され得る。或いは、A1Mは大きなタンパク質複合体の少なくとも１つ(複合体Ｉ)の内因性成分であるようなので、この複合体に対して構造安定化効果を有する可能性がある。アポトーシス、ネクロプトーシス及び他の形態の細胞死の間、外因性A1Mの更なる結合が、呼吸タンパク質複合体の物理化学的な構造及び機能を維持するために必要であり得る。別の可能性は、複合体ＩへのA1Mの結合がミトコンドリア内膜の他の成分(例えば、孔タンパク質又は膜脂質)に対して有益な効果を有するという可能性である。
A1Mとミトコンドリアとの相互作用を調べ、幾つかの異なる細胞タイプ、すなわちリンパ球、骨髄球及び白血球起源のヒト血液細胞、ヒトケラチノサイト及び単離したマウス肝臓ミトコンドリアで特異的結合を観察した。まとめると、本発明者らの結果は、本明細書で調べた保護効果及び相互作用は全ての細胞タイプにまで一般化できることを示唆する。
【００１７】
本明細書で報告するように、A1Mは４つの異なるタンパク質：NADHデヒドロゲナーゼ複合体の疎水性部分中のNDUFAB1サブユニット(45)、N-アセチルグルコサミンキナーゼ(18)、snRNA結合性タンパク質LSm5(40)及びガン抗原NY-CO-3(42)と相互作用することが見出された。この４つのタンパク質のいずれも偽陽性でなかった。すなわち、DNA結合性ベイト融合タンパク質とも、それに融合した任意のタンパク質とも相互作用しなかった。よって、これら候補は、酵母ツーハイブリッド系における真正のA1M相互作用性タンパク質とみなされた。酵母ツーハイブリッド系により単離された11クローン中８つが同じ複合体Ｉサブユニットであったことを考慮すれば、このタンパク質は最も興味深いタンパク質とみられるので、更なる研究の標的として選択した。ミトコンドリアへの結合は代替の方法論的アプローチによっても支持され、この関連性の機能的役割は、A1Mの抗酸化機能と両立するものとされ得た。N-アセチルグルコサミンキナーゼ、snRNA結合性タンパク質LSm5及びNY-CO-3に対するA1Mの結合の生理学的意味は推定され得る。これらタンパク質は、細胞質、核及び形質膜にそれぞれ局在しており、これらタンパク質への結合の役割は、ミトコンドリアの他に、他の細胞区画にも内在化したA1Mを局在化させることであり得る。別の可能性は、これら３つのタンパク質への結合が抗酸化及びラジカルスカベンジングとは無関係であるA1Mの他の機能を反映するというものである。
【００１８】
A1Mはリポカリンタンパク質ファミリーのメンバーである。リポカリンは、細菌、植物及び動物に由来し、通常20〜25％程度のアミノ酸配列類似性を有し、進化上共通の起源を示唆する特定の共通する構造的特徴を共有する約50タンパク質からなる機能的に多様な群を構成する(11, 12, 51)。興味深いことに、植物及び緑藻で見出された２つのリポカリンであるビオラキサンチン-デエポキシダーゼ(VDE)及びゼアキサンチンエポキシダーゼ(ZDE)は、葉緑体のチラコイド膜(植物のATP産生性光合成小器官)に局在し、そこで集光系IIと関係し、キサントフィル光保護系に参加している((14)に概説)。ビオラキサンチン保護サイクルとこの論文中の結果(植物及び動物の両方のエネルギー変換小器官におけるリポカリンベースの保護系の存在)との間に明白な類似性が存在する。ミトコンドリア及び葉緑体が共通の原核生物又は真核生物の祖先を有すると仮定すれば((15, 30, 50)を参照)、これら２つのリポカリン系は進化上関係していると推測し得る。
【００１９】
細胞は、致命的な傷害に曝されると、最終的には分解されてその成分がリサイクルされる。これは、通常、周囲環境(すなわち、隣接する細胞及び組織)を更なる損傷から保護するために十分に制御されることが必要である高度に複雑なエネルギー消費プロセスである。このプロセスの間のミトコンドリアエネルギー機構の保存及び維持は、生命維持に重要である。本発明者らは、血漿及び組織糖タンパク質たるA1Mが、ミトコンドリアのエネルギー産生の維持に中心的役割を果たし、同時に呼吸鎖を補助することにより、健常組織で望まない破壊的反応を防止することを示す。よって、これら知見は、ミトコンドリアの恒常性を維持する新規機序を示唆する。
本発明に関して、用語「α-1-ミクログロブリン」は、配列番号１(ヒトA1M)及び配列番号２(ヒト組換えA1M)で特定されるα-1-ミクログロブリン並びに類似の治療活性を有するそれらのホモログ、フラグメント又はバリアントを含むものとする。１つの好適な局面において、α-1-ミクログロブリンは本明細書で特定されるように配列番号１又は２に従う。配列表に、ヒトA1M及びヒト組換えA1Mのアミノ酸配列(それぞれ配列番号１及び２)並びに対応するヌクレオチド配列(それぞれ配列番号３及び４)を示す。
上記のように、A1Mのホモログもまた、本明細書の記載に従って使用できる。理論的には、今までに見出された最も原始的なもの(魚類(カレイ)由来のもの)を含む全ての種に由来するA1Mを使用できる。A1Mはまた、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、雌ウシ及びカレイからの単離形態で入手可能である。
【００２０】
A1Mのホモログ、バリアント及びフラグメントを考慮すれば、このタンパク質の重要な部分としては以下のものが同定されている：
Y22 (チロシン、22位、塩基対64〜66)
C34 (システイン、34位、塩基対100〜102)
K69 (リジン、69位、塩基対205〜207)
K92 (リジン、92位、塩基対274〜276)
K118 (リジン、118位、塩基対352〜354)
K130 (リジン、130位、塩基対388〜390)
Y132 (チロシン、132位、塩基対394〜396)
L180 (ロイシン、180位、塩基対538〜540)
I181 (イソロイシン、181位、塩基対541〜543)
P182 (プロリン、182位、塩基対544〜546)
R183 (アルギニン、183位、塩基対547〜549)
(本明細書を通してアミノ酸及びヌクレオチドの番号は、配列番号１及び３を参照するものである；他の種由来の他のA1M、A1Mアナログ又はそれらの組換え配列を用いる場合、当業者は、活性部位又は酵素活性を担う部位のアミノ酸を同定する方法を理解している。)
【００２１】
具体的には、A1Mの細胞保護効果は、C34側鎖の遊離チオリル基に依存し、K92、K118及びK130残基により調節されることが観察されている。よって、このタンパク質のこれら部分を含み、そして/又は類似の様式で構成されるA1Mアナログは、A1Mと類似する効果を有すると考えられ、よって本発明に包含される。
ヒトA1Mは３つの位置にてオリゴ糖で置換されている：２つのシアリル化複合体タイプ、おそらくはAsn17及びAsn96に連結したジアンテナ炭水化物、及びThr5に連結した１つのより単純なオリゴ糖。異なる種由来のA1Mタンパク質の糖質含量は大きく変化し、アフリカツメガエル(Xenopus leavis)でのグリコシル化なしから或る範囲の異なるグリコシル化パターンにわたる。しかし、ヒトでの１つのグリコシル化部位(Asn96に対応)は、哺乳動物で保存されており、この特定の炭水化物が機能的に重要であり得ることが示唆される。
【００２２】
A1Mは、血漿又は尿から単離したときには、黄褐色である。この色は、そのポケットへの入口に主に位置する種々のアミノ酸側鎖基に共有結合した不均一な化合物による。これら改変体は、おそらく、インビボでA1Mにより共有結合的に捕捉された有機酸化体(例えばヘム、キヌレニン及びチロシルラジカル)の酸化型分解産物を表す。
A1Mはまた、電荷及びサイズが不均一であり、褐色がより強いA1M分子はより負に荷電している。この不均一性のもっともらしい説明は、異なる側鎖基が異なるラジカルで異なる程度に修飾されており、この修飾が該タンパク質の正味の電荷を変化させているというものである。共有結合した着色物質は、Cys34並びにLys92、Lys118及びLys130に見出されており、後者は100〜300Daの分子質量を有する。トリプトファンの代謝産物であるキヌレニンが、血液透析患者の尿に由来するA1Mでリジル残基に共有結合していることが見出された。この場合、キヌレニンがこのタンパク質の褐色の色源となっているようである。合成ラジカルABTS(2,2'-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン)-6-スルホン酸)の酸化型フラグメントは、Y22及びY132の側鎖に結合していた。
【００２３】
C34はA1Mの反応中心である。C34は、K69、K92、K118及びK130の正荷電側鎖に近接していることにより(この近接がC34チオール基の脱プロトン化を誘導する)、非常に負荷電性となり、このことは、C34が電子を供与する高い能力を有することを意味する。予備データは、C34が既知の最も負荷電性である基の１つであることを示している。
理論的には、A1Mの独特な酵素特性及び非酵素特性を特徴付けるアミノ酸(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、I181、P182、R183)(これらについては下記で詳述する)は、別のフレームワーク上で、例えば、同じ全体フォールディング構造を有するタンパク質(別のリポカリン)又は完全に人工的な有機若しくは無機分子(例えばプラスチックポリマー、ナノ粒子又は金属ポリマー)上で、類似の三次元形態で配置することができる。
したがって、記載されるような反応中心及びその周囲を含む構造を含んでなるホモログ、フラグメント又はバリアントは好適である。
【００２４】
本開示のポリペプチドの構造に改変及び変更をなし、なおも該ポリペプチドと類似する特性を有する分子をもたらすことは可能である(例えば、保存的アミノ酸置換)。例えば、活性の相当な喪失を伴うことなく、配列中の或るアミノ酸を別の特定のアミノ酸に置換することができる。当該ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのはそのポリペプチドの相互作用能及び性質であるので、或る特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列になすことができ、にもかかわらず類似の性質を有するポリペプチドを得ることができる。
そのような変更をなすに際して、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。ポリペプチドへの相互作用性生物学的機能の付与に際してのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野で広く理解されている。或る特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸に代えて置換することができ、この置換は、依然として類似する生物学的活性を有するポリペプチドを生じることが知られている。各アミノ酸には疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。その指数は次のとおりである：イソロイシン(＋4.5)；バリン(＋4.2)；ロイシン(＋3.8)；フェニルアラニン(＋2.8)；システイン/システイン(＋2.5)；メチオニン(＋1.9)；アラニン(＋1.8)；グリシン(−0.4)；スレオニン(−0.7)；セリン(−0.8)；トリプトファン(−0.9)；チロシン(−1.3)；プロリン(−1.6)；ヒスチジン(−3.2)；グルタミン酸(−3.5)；グルタミン(−3.5)；アスパラギン酸(−3.5)；アスパラギン(−3.5)；リジン(−3.9)；及びアルギニン(−4.5)。
【００２５】
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は得られるポリペプチドの二次構造を決定し、二次構造はそのポリペプチドと他の分子(例えば、酵素、基質、レセプター、抗体、抗原など)との相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸を、類似のハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸で置換して、依然として機能的に等価なポリペプチドを取得できることは、当該分野において公知である。このような変更において、ハイドロパシー指数が±２以内のアミノ酸同士の置換が好適であり、±１以内のアミノ酸同士の置換が特に好適であり、±0.5以内のアミノ酸同士の置換がより更に好適である。類似のアミノ酸同士の置換は、特に置換により作製する生物学的に等価な機能的ポリペプチド又はペプチドを、免疫学的な実施形態で使用することが意図されている場合、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(＋3.0)；リジン(＋3.0)；アスパラギン酸(＋3.0±１)；グルタミン酸(＋3.0±１)；セリン(＋0.3)；アスパラギン(＋0.2)；グルタミン(＋0.2)；グリシン(0)；プロリン(−0.5±１)；スレオニン(−0.4)；アラニン(−0.5)；ヒスチジン(−0.5)；システイン(−1.0)；メチオニン(−1.3)；バリン(−1.5)；ロイシン(−1.8)；イソロイシン(−1.8)；チロシン(−2.3)；フェニルアラニン(−2.5)；トリプトファン(−3.4)。或るアミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸に代えて置換して、依然として生物学的に等価な(特に、免疫学的に等価な)ポリペプチドを取得できると理解されている。このような変更において、親水性値が±２以内のアミノ酸同士の置換が好適であり、±１以内のアミノ酸同士の置換が特に好適であり、±0.5以内のアミノ酸同士の置換が尚更に好適である。
【００２６】
上記で概説したとおり、アミノ酸置換は、一般には、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前記特性の１以上を考慮する代表的な置換は当業者に周知であり、次のものが含まれる(元の残基：代表的置換)：(Ala：Gly，Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln1 His)、(Asp：Glu，Cys，Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn，Gln)、(Ile：Leu，Val)、(Leu：Ile，Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)及び(Val：Lle，Leu)(ただし、これらに限定されない)。よって、本開示の実施形態は、上記のようなポリペプチドの機能的又は生物学的等価物を意図する。具体的には、ポリペプチドの実施形態には、興味対象のポリペプチドに対して約50％、60％、70％、80％、90％及び95％の配列同一性を有するバリアントが含まれることがある。
本発明に関して、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の相同性は、パラメータ「同一性」で記述される。配列アラインメント及び相同性スコア算出は、タンパク質アラインメント及びDNAアラインメントの両方に有用である完全Smith-Watermanアラインメントを用いて行なってもよい。デフォルトのスコア付けマトリクスBLOSUM50及び同一性マトリクスをそれぞれタンパク質アラインメント及びDNAアラインメントに使用する。ギャップにある最初の１つの残基のペナルティーは、タンパク質では−12、DNAでは−16であり、ギャップにある追加の残基のペナルティーは、タンパク質では−２、DNAでは−４である。アラインメントは、FASTAパッケージ バージョンv20u6を用いて行なってもよい。
【００２７】
タンパク質配列の複数のアラインメントは、「ClustalW」を用いて作製してもよい。DNA配列の複数のアラインメントは、タンパク質のアラインメントをテンプレートとして用いて行ない、アミノ酸をDNA配列の対応するコドンで置換してもよい。
或いは、アミノ酸配列及びDNA配列を整列させる異なるソフトウェアを使用することもできる。２つのアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、EMBOSSパッケージ(http://emboss.org)バージョン2.8.0のNeedleプログラムを用いて決定する。Needleプログラムは、記載された全体アラインメントアルゴリズムを実行する。使用する置換マトリクスはBLOSUM62であり、ギャップオープニングペナルティーは10であり、ギャップエクステンションペナルティーは0.5である。
アミノ酸配列(例えば配列番号１)と異なるアミノ酸配列(例えば配列番号２)との間の同一性の程度は、２つの配列のアラインメント中での正確な一致の数を、「配列番号１」又は「配列番号２」のどちらか短い方の長さで除して算出する。結果はパーセント同一性で表す。
正確な一致は、２つの配列が重複部分の同じ位置に同一アミノ酸残基を有するときに生じる。
【００２８】
該当する場合、２つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、同一性テーブル及び次の複数のアラインメントパラメータ：ギャップペナルティー10及びギャップ長ペナルティー10と共にLASER-GENETM MEGALIGNTMソフトウェア(DNASTAR, Inc., Madison, Wl)を用いるWilbur-Lipman法により決定することができる。ペアワイズアラインメントパラメータはKtuple＝３、ギャップペナルティー＝３及びウィンドウ＝20である。１つの特定の実施形態では、或るポリペプチドのアミノ酸配列と、配列番号１のアミノ酸配列との(に対する)同一性のパーセンテージは、ｉ)２つのアミノ酸配列を、BLOSUM62置換マトリクス、ギャップオープニングペナルティー10及びギャップエクステンションペナルティー0.5と共にNeedleプログラムを用いて整列させ；ii)アラインメント中の正確な一致の数を計数し；iii)正確な一致の数を２つのアミノ酸配列の短い方の長さで除し、iv)iii)の除算の結果をパーセンテージに変換することにより決定する。本発明の他の配列列との(に対する)同一性のパーセンテージも同様に算出する。
例として、ポリペプチド配列は参照配列と同一(すなわち100％同一)であってもよいし、参照配列と比較して或る整数の数までのアミノ酸の変更を含んでいてもよい(％同一性は100％未満となる)。このような変更は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換(保存的及び非保存的置換を含む)又は挿入から選択され、この変更は参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置若しくはカルボキシ末端位置で生じていてもよいし、これら末端位置間のどこかに、参照配列中のアミノ酸の間に個々に散在しているか若しくは参照配列内に１以上の連続群で散在していてもよい。
【００２９】
保存的アミノ酸バリアントは、天然に存在しないアミノ酸残基を含んでなることもできる。天然に存在しないアミノ酸としては、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチル-グリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニル-アラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込む幾つかの方法が当該分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸を合成する方法及びtRNAをアミノアシル化する方法は当該分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E. coli S30抽出物及び市販の酵素並びに他の試薬を含んでなる細胞フリー系で行う。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製する。第２の方法では、翻訳を、アフリカツメガエル卵母細胞で、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより行う。第３の方法では、E. coli細胞を、置換すべき天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下に、所望の天然に存在しないアミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸を、天然の対応物の代わりにタンパク質に組み込む。天然に存在するアミノ酸残基を、インビトロ化学修飾により、天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾を部位特異的変異誘発と組み合わせて、置換の範囲を更に拡げることができる。A1Mの抗酸化特性を支持するに十分な３次元構造を提供する代替の化学構造は、他の技術(例えば、人工的足場、アミノ酸置換など)によって提供してもよい。更に、上記に列挙され、図３及び６に示されるようなA1Mの活性部位を模倣する構造は、A1Mと同じ機能を有するものとして企図される。
【００３０】
具体的なミトコンドリア関連疾患に使用するためのA1M
より具体的には、本発明は、以下：
・アルパース病(乳児進行性灰白異栄養症)
・バース症候群(乳児致死性心筋症)
・β酸化欠損症
・心筋症
・カルニチン-アシル-カルニチン欠乏症
・カルニチン欠乏症
・クレアチン欠乏症候群(脳クレアチン欠乏症候群(CCDS)にはグアニジノアセテートメチルトランスフェラーゼ欠乏症(GAMT欠乏症)、L-アルギニン:グリシンアミジノトランスフェラーゼ欠乏症(AGAT欠乏症)及びSLC6A8-関連クレアチン輸送体欠乏症(SLC6A8欠乏症)が含まれる)
・補酵素Q10欠乏症
・呼吸鎖複合体Ｉ欠乏症(NADHデヒドロゲナーゼ(NADH-CoQレダクターゼ)欠乏症)
・呼吸鎖複合体II欠乏症(スクシネートデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体III欠乏症(ユビキノン-シトクロムｃオキシドレダクターゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体IV欠乏症/COX欠乏症(シトクロムｃオキシダーゼ欠乏症は呼吸鎖複合体IVの欠損によって引き起こされる)
・呼吸鎖複合体Ｖ欠乏症(ATPシンターゼ欠乏症)
・COX欠乏症
・CPEO(慢性進行性外眼筋麻痺症候群)
・CPT I欠乏症
・CPT II欠乏症
・フリートライヒ運動失調(FRDA又はFA)
・脳筋症
・グルタル酸尿症II型
・KSS(カーンズ・セイアー症候群)
・乳酸アシドーシス
・LCAD(長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・LCHAD
・リー病又は症候群(亜急性壊死性脳脊髄症)
・LHON(レーバー遺伝性視神経萎縮)
・ルフト病
・MCAD(中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・MELAS(ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様エピソード)
・MERRF(ミオクローヌスてんかん・赤色ぼろ線維症候群)
・MIRAS(ミトコンドリア劣性運動失調症候群)
・ミトコンドリア細胞障害
・ミトコンドリアDNA涸渇
・ミトコンドリア脳症(脳筋症、脳脊髄障害を含む)
・ミトコンドリアミオパシー
・MNGIE(ミトコンドリア神経胃腸脳筋障害)
・NARP(ニューロパシー・運動失調・網膜色素変性症)
・ピアソン症候群
・ピルベートカルボキシラーゼ欠乏症
・ピルベートデヒドロゲナーゼ欠乏症
・POLG変異
・呼吸鎖欠損症
・SCAD(短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・SCHAD
・VLCAD(超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
から選択されるミトコンドリア関連疾患の治療に使用するためのA1Mに関する。
【００３１】
米国ミトコンドリア病財団(United Mitochondrial Disease Foundation)のウェブページの情報を参照して、以下に、上記疾患の幾つかをより詳細に説明する：
呼吸鎖複合体１欠乏症：ミトコンドリア内部には、エネルギーを産生する４つの連鎖反応に従って電子を運搬するタンパク質群(呼吸鎖複合体Ｉ〜IV)が存在する。この連鎖は電子伝達鎖として知られる。５番目の群(複合体Ｖ)がATPを量産する。まとめると、電子伝達鎖及びATPシンターゼが呼吸鎖を形成し、この全体プロセスが酸化的リン酸化又はOXPHOSとして知られる。
呼吸鎖複合体Ｉ(この連鎖の第１ステップ)は、最も一般的な(呼吸鎖欠乏症の３分の１程度を占める)ミトコンドリア異常部位部位である。複合体Ｉ欠乏症は、しばしば、出生時又は幼児期にみられ、通常、進行性神経変性障害であり、特には高いエネルギーレベルを必要とする器官及び組織(例えば、脳、心臓、肝臓及び骨格筋)において、種々の臨床症状の原因である。レーバー遺伝性視神経萎縮(LHON)、MELAS、MERRF及びリー症候群(LS)を含む多くの特定のミトコンドリア障害が複合体Ｉ欠乏症と関連付けられている。
【００３２】
３つの主要な型の複合体Ｉ欠乏症が存在する：
ｉ)致死性幼児多系統障害 − 筋緊張低下、発育遅延、心疾患、乳酸アシドーシス、呼吸器不全により特徴付けられる。
ii)ミオパシー(筋疾患) − 小児期又は成人期に発症し、脱力又は運動不耐性により特徴付けられる。
iii)ミトコンドリア脳筋症(脳及び筋疾患) − 小児期又は成人期に発症し、不定の症状組合せ(眼筋麻痺、色素性網膜症(失明を伴う網膜の色変化)、難聴、感覚性ニューロパシー(感覚器官を含む神経損傷)、発作、痴呆、運動失調(異常な筋協調)及び不随意運動が含まれ得る)を含む。この型の複合体Ｉ欠乏症は、リー症候群及びMELASを引き起こし得る。
複合体Ｉ欠乏症のほとんどの症例は、常染色体劣性遺伝(母方及び父方の両方の欠損核遺伝子の組合せ)に起因する。頻繁ではないが、この障害は母性遺伝するか又は散発性であり、遺伝子欠損はミトコンドリアDNAに存在する。
治療：全てのミトコンドリア病と同様に、複合体Ｉ欠乏症については、治療法は現時点で存在しない。(有効であるかもしれないし有効でないかもしれない)種々の処置法には、リボオフラビン、チアミン、ビオチン、コエンザイムQ10、カルニチン及びケト原性食餌のような代謝療法が含まれることがある。幼児型多系統型の治療は成功していない。
複合体Ｉ患者についての臨床経過及び予後は、高度に変動し、具体的遺伝子欠損、発症年齢、関係する器官及び他の因子に依存し得る。
【００３３】
複合体III欠乏症：症状として４つの主要な形態が挙げられる：
ｉ)致死性幼児脳筋症、先天的乳酸アシドーシス、緊張低下、異栄養性姿勢、発作及び昏睡。赤色ぼろ線維症が一般的。
ii)遅発性脳筋症(小児期〜成人期)：脱力、低身長、運動失調、痴呆、難聴、感覚性ニューロパシー、色素性網膜症及び錐体路徴候の種々の組合せ。赤色ぼろ線維が一般的。乳酸アシドーシスは可能性あり。
iii)運動不耐性を伴い、固定脱力に進展するミオパシー。赤色ぼろ線維が一般的。乳酸アシドーシスは可能性あり。
iv)幼児型組織球様心筋症
【００３４】
複合体IV欠乏症/COX欠乏症：症状として２つの主要な形態が挙げられる：
１．脳筋症：典型的には、最初の６〜12ヶ月齢は正常であり、その後発達退行、運動失調、乳酸アシドーシス、視神経萎縮、眼筋麻痺、眼振、ジストニー、錐体路徴候及び呼吸困難を示す。頻繁な発作。リー症候群を引き起こし得る。
２．ミオパシー：２つの主要な変型ト：
１．致死性乳児ミオパシー：生後間もなく発症し得、緊張低下、脱力、乳酸アシドーシス、赤色ぼろ線維症、呼吸不全及び腎障害を伴い得る。
２．良性乳児ミオパシー：生後間もなく発症し得、緊張低下、脱力、乳酸アシドーシス、赤色ぼろ線維症、呼吸困難を伴い得るが、(その子が生存すれば)後に自然に改善する。
【００３５】
KSS(カーンズ・セイアー症候群)：KSSは、しばしば眼瞼の下垂(眼瞼下垂)から始まる、緩徐進行性の多系統ミトコンドリア病である。他の眼筋も最終的に関与して眼球運動の麻痺を生じる。網膜の変性により、通常、薄暗い環境で見え難くなる。
KSSは３つの主要な特徴で特徴付けられる：
・典型的には、20歳前に発症するが、乳児期又は成人期にも起こり得る。
・特定の眼筋の麻痺(慢性進行性外眼筋麻痺症 − CPEOと呼ばれる)
・有色素(着色)物質の異常蓄積を引き起こす網膜変性(色素性網膜症)。
加えて、以下の状態の１以上が存在する：
・心臓における電気信号ブロック(心伝導障害)
・脳脊髄液タンパク質上昇
・協調運動不能(運動失調)。
【００３６】
KSS患者は、聴覚消失、痴呆、腎機能不全及び筋脱力のような障害も有し得る。成長遅延、低身長又は糖尿病を含む内分泌異常もまた顕性となり得る。
KSSは稀な障害である。KSSは、通常、細胞核DNA中ではなく、むしろミトコンドリアDNA(mtDNA)内の遺伝物質の１つの大きな欠失(喪失)により引き起こされる。これら欠失(150種を超えるものが存在する)は典型的には自発的に生じる。頻繁ではないが、変異は母親からの遺伝である。
全てのミトコンドリア病と同様、KSSの治療法は存在しない。
処置法は、症状及び関与する器官のタイプに基づき、以下のものを含み得る：コエンザイムQ10、糖尿病用インスリン、心臓薬及び心臓ペースメーカー(これらにより命が救われるかもしれない)。眼瞼下垂については外科的介入も考慮され得るが、眼科外科病院で専門家により行われるべきである。
KSSは、緩徐進行性であり、予後は重篤度に依存して変わる。死亡は30年め又は40年めに一般的であり、臓器系の不全に起因し得る。
【００３７】
リー病又は症候群(亜急性壊死性脳脊髄症)：症状：発作、緊張低下、疲労、眼振、鈍い反射、摂食及び嚥下障害、呼吸障害、貧弱な運動機能及び運動失調。
原因：ピルベートデヒドロゲナーゼ欠乏症、複合体Ｉ欠乏症、複合体II欠乏症、複合体IV/COX欠乏症、NARP。
リー病は、進行性神経代謝障害であり、一般には乳児期及び小児期に、しばしばウイルス感染後に発症するが、十代及び成人でも発症することがある。リー病は、MRIで、 脳(特に中脳及び脳幹)の視認できる壊死病変(死亡組織又は死亡しつつある組織)により特徴付けられる。
子供は、多くの場合、出生時には正常に見えるが、代表的には、数ヶ月〜２年以内に症状を示し始める。そのタイミングはかなり早くなったり遅くなったりする。初期症状には、吸引、頭部制御、歩行及び会話のような基本的スキルの喪失が含まれる。これらは、他の障害、例えば被刺激性、食欲喪失、嘔吐及び発作を伴い得る。幾つかの機能が急激に低下し又は一時的に回復する期間が存在し得る。最終的には、その子は、心臓、腎臓、視覚及び呼吸の合併症も発症し得る。
【００３８】
リー病を引き起こす２以上の欠損症が存在する。それらには、ピルベートデヒドロゲナーゼ(PDHC)欠乏症及び呼吸鎖酵素(複合体Ｉ、II、IV及びＶ)欠損症が含まれる。遺伝形態は、欠損に依存して、Ｘ連鎖優性(Ｘ染色体上の欠損であり、この疾患は通常男性でのみ生じる)、常染色体劣性(母方及び父方の両方の遺伝子により遺伝)及び母性(母方の遺伝子のみによる遺伝)であり得る。全く遺伝しない自然発生症例も存在し得る。
リー病の治療法は存在しない。処置は、一般には、ビタミン及びサプリメント療法(多くの場合、「カクテル」組合せで)のバリエーションを含み、一部にのみ有効である。種々の対処としては、チアミン、コエンザイムQ10、リボフラビン、ビオチン、クレアチン、スクシネート及びイデベノンの使用の可能性が挙げられる。試験薬剤、例えばジクロロ酢酸(DCA)もまた、幾つかのクリニックで臨床試験中である。幾つかの症例では、特別な食餌が命じられ得るが、代謝障害の知識を有する食餌療法士がモニターすべきである。
リー病の予後は不良である。欠損に依存して、患者は、典型的には、数年〜十代半ばまで生存する。リー様症候群と診断されたか又は成人期までに症状を示さなかった患者は、より長く生存する傾向にある。
【００３９】
MELAS(ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様エピソード)：症状：限局的神経学的欠損、再発性頭痛、認知退行、疾患進行、赤色ぼろ線維症を伴う、低身長、発作、卒中様エピソード
原因：ミトコンドリアDNA点変異：A3243G(最も一般的)
MELAS − ミトコンドリアミオパシー(筋脱力)、脳症(脳及び中枢神経系疾患)、乳酸アシドーシス(細胞老廃物の蓄積)及び卒中様エピソード(部分麻痺、部分的視力喪失又は他の神経学的異常)
MELASは、進行性神経変性障害であり、典型的には、２歳〜15歳の間に発症するが、幼児期にも発症し得、成人期になっても発症し得る。初期症状としては、卒中様エピソード、発作、片頭痛及び再発性嘔吐を挙げ得る。
通常、患者は幼児期には正常のように見えるが、低身長が一般的である。然程一般的ではない幼児初期の症状として、発達遅延、学習能力不全又は注意欠陥障害を挙げ得る。運動不耐性、四肢脱力、難聴及び糖尿病が卒中様エピソードの発症に先行することがある。
【００４０】
卒中様エピソード(多くの場合、発作を伴う)は、MELASの顕著な症状であり、部分麻痺、失明及び限局的神経学的欠損を引き起こす。これらエピソードの緩やかな累積的効果は、多くの場合、運動技能(発話、動き及び摂食)の喪失、感覚障害(失明及び身体感覚の喪失)及び知的障害(痴呆)の不定の組合せを生じる。MELAS患者はまた、筋脱力、末梢神経機能不全、糖尿病、聴力低下、心及び腎障害並びに消化器異常を含む更なる症状を患い得る。乳酸は、通常、血液若しくは脳脊髄液又はその両方に高レベルで蓄積する。
MELASは、ミトコンドリア内でのDNA欠損に起因して母性遺伝する。MELASを引き起こし得る少なくとも17の異なる変異が存在する。A3243G変異が非常に最も優勢であり、原因の約80％を占める。
MELASの治療法は存在せず、具体的な処置もない。臨床試験で有効性は証明されていないが、一般的処置として、CoQ10、クレアチン、フィロキノン並びに他のビタミン及びサプルメントのような代謝療法を挙げられる。更なる症状を管理するために発作用医薬及びインスリンのような薬剤が必要となり得る。筋機能不全患者には、監視下での中程度の運動が有益であり得る。選別された症例では、処方され得る他の療法として、ジクロロ酢酸(DCA)及びメナジオンが挙げられるが、これらは有害な副作用をもたらす可能性があるためにルーチンで使用されない。
MELASの予後は不良である。代表的には、死亡年齢は10〜35歳であるが、より長く生存する患者もいる。死亡は、進行性痴呆及び筋脱力又は他の罹患器官(例えば、心臓又は腎臓)の合併症に起因する全身衰弱の結果であり得る。
【００４１】
MERRFは、通常は小児期に発症するが成人期でも発症し得る、進行性多系統症候群である。進行速度は広範に変化する。症状の発現及び程度は罹患した同腹個体間で異なることがある。
MERRFの古典的特徴としては、次のものが挙げられる：
・ミオクロヌス(短時間で突然の単収縮筋痙攣) − 最も特徴的な症状
・てんかん性発作
・運動失調(協調障害) 
・赤色ぼろ線維症(MERRFその他のミトコンドリア障害の患者の筋生検で観察される特徴的な微視的異常)。追加の症状として、聴力低下、乳酸アシドーシス(血中乳酸レベルの上昇)、低身長、運動不耐性、痴呆、心臓障害、眼の異常及び発話障害を挙げてもよい。
MERRFは少数例が突発性であり、ほとんどの症例は、ミトコンドリア内の変異に起因する母性遺伝である。最も一般的なMERRF変異は、80％を超える症例の原因であるA8344Gである(GeneReview論文)。他に４つのミトコンドリアDNA変異がMERRFを引き起こすと報告されている。母親はその全ての子にMERRF変異を伝達するが、症状を発現しない子もいる。
全てのミトコンドリア障害と同様に、MERRFの治療法は存在しない。処置として、コエンザイムQ10、L-カルニチン及び種々のビタミン(多くの場合、「カクテル」組合せで)を挙げてもよい。発作の管理には、通常、抗痙攣薬が必要である。他の症状を抑制する医薬も必要であるかもしれない。
MERRFの予後は、発症年齢、症状のタイプ及び重篤度、関係する器官及び他の因子に依存して広範に変化する。
【００４２】
ミトコンドリアDNA涸渇：症状としては次の３つの主要な形態が挙げられる：
１．先天性ミオパシー：新生児脱力、人工呼吸を必要とする緊張低下。腎機能不全の可能性。重篤な乳酸アシドーシス。優勢には赤色ぼろ線維症。呼吸不全に起因する死亡は、通常、１歳前に起こる。
２．乳児型ミオパシー：１歳までは正常な初期発育の後、脱力が現れ、急速に悪化して、呼吸不全を引き起こし、代表的には数年以内に死亡する。
３．ヘパトパシー：肝肥大及び難治性肝不全、ミオパシー。重症乳酸アシドーシス。死亡は、代表的には、１年目に起きる。
【００４３】
本発明は、ミトコンドリア関連疾患の治療におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。この疾患は、本明細書で特定された疾患のいずれか(単独疾患又は任意の組合せ)であり得る。例えば、本発明は、本明細書で言及した疾患の１つの治療又は本明細書で言及した一群の疾患(具体的な群が明示的に言及されているかどうかにかかわらず)の治療におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。よって、一群の疾患又は障害は無作為に選択されてもよい。疾患は、ミトコンドリア欠損若しくはミトコンドリア機能の不規則であってもよいし、これらにより引き起こされるものであってもよい。
具体的には、本発明は、呼吸鎖障害の治療又は予防におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。より具体的には、呼吸鎖障害には複合体Ｉ、II、III、IV又はＶ欠損が含まれる。
より具体的には、本発明は、小児又は若年成人のミトコンドリア機能不全の治療又は予防におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。例として、アルパース病、バース症候群、フリートライヒ運動失調、KSS、リー病又は症候群、LHON、MELAS、MERRF、MIRAS及びNARPが挙げられる。
より具体的には、本発明は、女性のミトコンドリア機能不全の治療又は予防におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。
【００４４】
本発明はまた、ミトコンドリアの欠損又は機能不全に関連する網膜の損傷若しくは機能不全又は眼疾患の治療又は予防におけるα-1-ミクログロブリンの使用に関する。
療法施術：A1Mの投与経路及び/又は態様は、所望する結果に依存して変えることができる。当業者は、投与経路又は態様及びレジメンを所望の治療応答が得られるよう調整できることを知っている。投与経路として、非経口、経腸、粘膜/局所投与が挙げられるが、これらに限定されず、静脈内、皮下、筋内、皮内、脳内、口、経口、皮膚、吸入によるものなどが含まれる。
A1Mは、特定の用途に設計された医薬組成物に製剤化されてもよい。当業者は、種々の医薬組成物を設計するための指針を見出す方法を知っている(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. 1990, Mack Publishingを参照)。
【００４５】
眼投与には、A1Mは、液体組成物又は医用デバイス(コンタクトレンズ又は他の眼内挿入物)に製剤化されてもよい。液体組成物としては、溶液、分散液、乳液及び懸濁液が挙げられ、単回用量形態又は複数用量形態の点眼剤の形態で提供されてもよいし、適用前に液体で再構成する乾燥粉剤として提供されてもよい。組成物はまた、眼ローション、クリーム、軟膏又はゲルとして提供されてもよい。医薬的に許容され得る賦形剤、例えば溶媒(例えば、水、天然油又は(例えばヒマシ油のような)植物油を含む油)、ゲランガム、キサンタンガム、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース)などのような増粘剤、パラベン又は塩化ベンザルコニウムのような保存剤、pH調節剤(例えば、塩酸、水酸化ナトリウム)、リン酸塩又はクエン酸塩のような緩衝剤、安定増強剤、等張化剤(例えば、塩化ナトリウム)などが含まれていてもよい。
【００４６】
口投与のためには、A1Mは、固体、半固体又は液体組成物で製剤化され得る。組成物は単位投薬形態であっても、複数単位投薬形態であってもよい。組成物として、粉剤、錠剤、カプセル、薬袋(sachet)、フィルム、オブラート、ゲル、クリーム、軟膏、溶液、分散液、乳液、懸濁液、スプレーなどが挙げられる。組成物は、１又は２以上の医薬的に許容し得る賦形剤を含む。そのような賦形剤(及び他の種類の組成物用の賦形剤)は当業者に周知である(例えば、特定の製剤タイプに該当する賦形剤及び具体的製剤を調製する方法に関しては、「Remington's Pharmaceutical Science」Gennaroら編(Mack Publishing Company)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」Roweら編(PhP Press)及び公式モノグラフ(例えば、欧州薬局方又は米国薬局方)を参照)。
【００４７】
A1Mは、好ましくは、医薬組成物の形態で投与される。A1Mのポリペプチド性質に起因して、組成物は、好ましくは、非経口用途に設計され得るが、A1Mは、例えば創傷の治癒に関連して皮膚に、関節に又は脳内腔に、局所的に適用されてもよい。A1Mは、液体に、例えば溶液、分散液、乳液、懸濁液などに製剤化することができ、又は皮膚への投与に適切な製剤(例えば、ローション、クリーム、軟膏、懸濁物、乳剤、ペースト、粉剤、パッチ、プラスター、包帯剤、石鹸、シャンプー、日焼け防止ローションなど)であってもよい。更に、A1Mは、医用デバイス又は装置に(例えば、カテーテル上の放出可能なコーティングなどとして)含まれていてもよい。
或いは及び加えて、活性物質を身体の特定部分に標的付ける特定のキャリアを含むことができる。例えば、抗体-A1M複合体(ここで、抗体は、或る特定のエピトープに対する特異性により、選択された局所に標的付けられている(「ホーミング」)；このようなホーミング特性(例えば、或る組織に特異的なインテグリン-レセプター)を有し、大量のA1Mを分泌する人工的又は天然の能力を有する幹細胞又は組換え細胞。この処置は、薬剤が特定の部位、出血部位などで濃縮し、必要なA1Mが少なくて済むので、より効率的である。
【００４８】
非経口用途には、適切な溶媒として、水、植物油、プロピレングリコール及びこの目的に通常認可されている有機溶媒が挙げられる。一般には、当業者は、特定の製剤タイプに該当する賦形剤及び具体的製剤を調製する方法に関して、指針を「Remington's Pharmaceutical Science」Gennaroら編(Mack Publishing Company)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」Roweら編(PhP Press)及び公式モノグラフ(例えば、欧州薬局方又は米国薬局方)に見出すことができる。
【００４９】
本発明を以下の図面及び実施例において説明する。
図面の説明
図１．インタクトの細胞及びアポトーシス細胞に対するA1Mの結合。Ａ．HCQ.4細胞を、ハムスター抗マウスCD3抗体(４μg/ml)をコーティングしたプラスチック上で18時間培養した。A1M結合の分析には、１×106細胞を１mg/mlのA1Mとインキュベートし、洗浄し、マウス抗A1M抗体とインキュベートし、洗浄し、最後にFITC接合ヤギ抗マウスIgG(GAM-FITC)とインキュベートした。10 000細胞をA1M結合について分析した(白抜きピーク)。バックグランドは、最初の工程でBSAとインキュベートした細胞によるものと設定した(影付きピーク)。アポトーシス細胞に対する結合(右ヒストグラム)を未処理細胞(左ヒストグラム)と比較した。Ｂ．５％エタノール又は10％ DMSOの存在下でHCQ.4細胞を15時間培養することにより、A1Mの結合をPIの取込みと相関付けた。フローサイトメトリ分析については、A1Mを細胞とインキュベートし、続いてマウス抗A1M抗体及びFITC接合ヤギ抗マウスIgGとインキュベートした。分析の前に、細胞をPIでも染色し、死細胞を検出した。Ｃ．プレＢ細胞株70Z/3のアポトーシス細胞に対するA1Mの結合をフローサイトメトリで分析した。細胞をベンズアミド薬剤デクロプラミド(declopramide；3-CPA)により15時間アポトーシスに誘導し、ビオチン化A1Mと、続いてSAPEとのインキュベーションによりA1M結合について分析した。バックグランドは、SAPEのみとインキュベートした細胞によるものと設定した(影付きピーク)。Ｄ．K562細胞を20μM及び0.25mg/mlのA1Mと２時間インキュベートし、マウス抗A1M抗体及び続くヤギ抗マウスIgG F(ab')2フラグメント(Alexa Fluor(登録商標) 594、赤色)での染色に付した。細胞を、DAPIと共にProLong Gold AntiFade Reagentを用いてマウントし、視認検査し記録した。写真は３つの別個の実験についてのものである。サイズバーは10μmである。Ｅ．A1M結合の特異性を競合細胞結合アッセイにより決定した。抗CD3との18時間の架橋によりアポトーシスに誘導したHCQ.4細胞(右ヒストグラム)を、み処理HCQ.4細胞(左ヒストグラム)と比較した。１×106細胞/サンプルを１μg/mlの125I-A1M(１)、125I-A1M＋2.5mg/mlの未標識A1Mの添加(２)、オボアルブミン(３)、BSA(４)又はAGP(５)と混合した。細胞を４℃にて30分間インキュベートし、スクロース勾配で遠心分離して未結合タンパク質から分離した後、試験管を凍結し、細胞ペレットを切り取りガンマカウンターでカウントした。結果は、１回の実験の３組の平均値±SEMとして表す。群間の統計学的比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行った(*** Ｐ＜0.001)。
【００５０】
図２．アポトーシス細胞に対するA1Mの結合の時間分析。Ａ．抗CD3をコーティングしたプラスチック上での培養によりHCQ.4細胞にアポトーシスを誘導した。誘導後の異なる時点(０、１、２、４、８及び16時間)でサンプルを採取した。細胞をFITC接合A1M(0.1mg/ml)及びPIで染色した。10 000細胞を分析した。Ｂ．ベンズアミド3-CPAとのインキュベーションによりアポトーシスに誘導したプレＢ細胞に対するA1Mの結合をフローサイトメトリにより分析し、アネキシンＶの結合及び7AAD取込みと相関付けた。アポトーシス70Z/3細胞をビオチン化A1M(0.025mg/ml)と、続いてSAPE、アネキシンＶ及び7AADとインキュベートした。10 000細胞を分析し、7AAD陰性細胞(左図)及び7AAD陽性細胞(右図)のそれぞれについてゲートを開閉した。
【００５１】
図３．共焦点顕微鏡観察及び透過型電子顕微鏡観察により分析した、ミトコンドリアに対するA1Mの結合。Ａ．培地のみ(左)又は0.25mg/ml A1M(右)と２時間インキュベートしたK562細胞を洗浄し、Mito-Tracker(赤色)と15分間インキュベートし、新鮮な培地で洗浄した。洗浄後、細胞を、５μg/mlのモノクローナルマウス抗A1M(BN 11.3)で、続いてヤギ抗マウスIgG F(ab')2フラグメント(Alexa Fluor(登録商標) 488；緑色)で染色した。細胞を、DAPI(青色)と共にProLong Gold AntiFade Reagentを用いてマウントし、共焦点顕微鏡観察による視認検査を行い記録した。写真は、３つの別個の実験のものである。サイズバーは５μmを示す。Ｂ．RTにて10μM A1Mと20時間インキュベートしたヒト初代ケラチノサイトの概観。ミトコンドリア構造を矢印で強調し、(Ｃ)に高倍率で示す。ヒト初代ケラチノサイトの薄切片を金標識抗A1Mで免疫標識し、ミトコンドリアとの相関を示した。この相関を矢頭で強調した(Ｃ)。サンプルを「材料及び方法」に記載したように調製して観察した。バースケールは、(Ｂ)では２μmを示し、(Ｃ)では0.1μmを示す。
【００５２】
図４．125I-A1M結合により分析した、ミトコンドリアに対するA1Mの結合。Ａ．約2.5μg/mlの125I-A1Mを0.5mgの精製ミトコンドリアとPBS＋４％ BSA中1.0mg/mlの未標識タンパク質(A1M又はAGP)の存在下又は不在下で混合して、ミトコンドリアに対するA1M結合の特異性を調べた。この混合物を４℃にて30分間インキュベートし、スクロース勾配で遠心分離して未結合タンパク質を分離した後、試験管を凍結し、細胞ペレットを切り出してガンマカウンターでカウントした。各点は３回の測定の平均値±SEMを表す。群間の統計学的比較はスチューデントのｔ検定を用いて行った(*** Ｐ＜0.001)。Ｂ．BN-PAGE及びウェスタンブロッティングを用いてミトコンドリアに対するA1M結合の特異性を更に調べた。２つの別個体に由来するミトコンドリア膜タンパク質５μgを、BN-PAGE ４〜16％ Bis-Trisゲル上で分離し、PVDFメンブレンにブロットした。ブロッキング後、メンブレンを複合体ＩのサブユニットNDUFV1、複合体IIIのコアＩ、マウスA1Mのそれぞれに対する抗体とインキュベートしたか又はクーマシーで染色した。Ｃ．新たに調製したミトコンドリアを複合体Ｉに対する抗体で免疫沈降させて複合体Ｉ結合も調べた。免疫沈降後、結合後に溶出させたタンパク質を12％ SDS-PAGE上で分離し、PVDFメンブレンにブロットした。ブロッキング後、メンブレンをマウスA1Mに対する抗体とインキュベートした。左レーン、ミトコンドリア出発材料(SM)、右レーン、結合後に溶出させた材料(IP)。
【００５３】
図５．BN-PAGE、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを用い、ミトコンドリアに対するA1M結合の特異性を調べた。新たに単離したミトコンドリアをPBSに懸濁し、遠心分離によりペレット化し、MB2緩衝液に５mg/mlの濃度に溶解した。ミトコンドリア膜タンパク質を、0.5〜4.0ｇのジギトニン/ｇタンパク質との氷上で５分間のインキュベーションにより可溶化した。サンプルを遠心分離し、上清を集め、SBGを最終濃度4.5％まで加えた。Ａ．２つの別個体(S1及びS2)に由来するミトコンドリア膜タンパク質５μgを、BN-PAGE ４〜16％ Bis-Trisゲル上で分離し、PVDFメンブレンにブロットした。ブロッキング後、メンブレンを、複合体ＩのサブユニットNDUFV1(左)、A1M(中)及び複合体IIIのサブユニットコアＩのそれぞれに対する抗体とインキュベートした。Ｂ．トリプシン(０〜100Ｕトリプシン)処理した単離ミトコンドリアタンパク質(15μg/レーン)を12％ SDS-PAGE上で分離し、PVDFメンブレンに転写した。ブロッキング後、メンブレンをA1Mに対する抗体とインキュベートした。
【００５４】
図６．A1Mはミトコンドリア構造を保護する。ヒト初代ケラチノサイトを、培養培地のみ(Ａ)、20μMヘム(Ｂ)又は20μMヘム＋0.25mg/ml A1M(Ｃ)とRTにて20時間インキュベートした。ミトコンドリア構造を矢印で強調し、詳細に示す(拡大写真)。「材料及び方法」に記載したとおりにサンプルを調製して観察した。スケールバーは２μm(概観)及び0.5μm(拡大写真)を示す。
図７．ヒト初代ケラチノサイトを、培養培地のみ(Ａ)、250μM H2O2(Ｂ)又は250μM H2O2＋0.25mg/ml A1M(Ｃ)とRTにて20時間インキュベートした。ミトコンドリア構造を矢印で強調し、詳細に示す(拡大写真)。「材料及び方法」に記載したとおりにサンプルを調製して観察した。スケールバーは２μm(概観)及び0.5μm(拡大写真)を示す。
【００５５】
図８．A1Mはミトコンドリア機能を保護する。ヘム又はH2O2に曝露した精製ミトコンドリアのATP産生を測定して、ミトコンドリア機能に対するA1Mの効果を調べた。ミトコンドリアを、１〜20μMヘムと0.25mg/ml A1M有り若しくは無し(Ａ)で又は20〜250μMのH2O2と0.25mg/ml A1M有り若しくは無し(Ｂ)で30分間インキュベートした。ミトコンドリアを遠心分離で集め、発光アッセイキットを用いてATP産生を測定した。ATPレベルを対応するサンプルタンパク質に対して規格化した。各点は３回の測定値の平均±SEMを表す。群間の統計学的比較はスチューデントのｔ検定を用いて行った(* Ｐ＜0.05)。
図９．A1Mの配列表
図10．温和な条件下及びストレス条件下での網膜培養の間のミトコンドリアrRNA(Ａ)及び細胞性A1M、HO1及びSODのmRNA(Ｂ)のリアルタイムPCR定量。各ΔΔｔ値は、リアルタイムPCRで測定し、グリセルアルデヒド-３-ホスフェート デヒドロゲナーゼに対して規格化した、温和条件下のRNA量に対するストレス条件下のRNA量に相当する。各バーは、３連培養物の２回測定の平均である。
【実施例】
【００５６】
実験
実施例１
材料及び方法
タンパク質及び抗体
ヒト単量体血漿A1Mを、以前(48)に記載されたとおりに抗A1Mアフィニティークロマトグラフィー及びSephacryl S-300ゲルクロマトグラフィーにより単離した。Ｎ末端Hisタグを含む組換えヒトA1Mを、バキュロウイルス感染昆虫細胞(48)の培養培地から精製したか、又はイオン交換クロマトグラフィー精製工程(32)を付加した以外は記載(20)されるとおりにE. coliで発現させて精製しリフォールディングさせた。ヒト血清α1-酸性糖タンパク質(AGP)及びオボアルブミンはSigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)から購入し、ウシ血清アルブミン(BSA)はRoche Diagnostics Scandinavia AB(Bromma, Sweden)から購入した。ヘミン(フェリプロトポルフィリンIXクロライド)はPorphyrin Products, Inc.(Logan, UT)から購入し、ジメチルスルホキシド(DMSO；Sigma-Aldrich)に溶解して10mMストック溶液を調製した。H2O2はAcros Organics(Geel, Belgium)のものであった。ヒトA1Mに対するマウスモノクローナル抗体(BN11.3)は記載(29)されたように生じさせた。ウサギポリクローナル抗マウスA1M抗体(Sven；IgG画分)は、バキュロウイルス感染昆虫細胞(41)で発現させたHisタグ付加マウスA1Mでウサギを免疫することにより調製した。ハムスター抗マウスCD3抗体145.2C11は、Rikard Holmdahl博士(Lund University)から厚意により提供された。フルオレセインイソチオシアネート接合ヤギ抗マウスイムノグロブリン(GAM-FITC)及びフィコエリトリン接合ストレプトアビジン(SAPE)は、DAKO A/S(Glostrup, Denmark)から、７-アミノアクチノマイシンＤ(7AAD)はSigma-Aldrich Co.から、アネキシンV-FITCはTrevigen Inc.(Gaithersburg, MD, USA)から購入した。
【００５７】
細胞培養
マウスCD4+ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞株(HCQ.4)、マウスプレＢ細胞株(70Z/3)、ヒト赤血球様細胞株(K562)及びヒト初代ケラチノサイト(Cambrex Biologics, Karlskoga, Sweden)を、細胞及びミトコンドリアに対するA1M結合についての研究に用いた。細胞は、以前(25, 28, 37)に記載されたように培養し、下記に説明するように処理して分析した。
アポトーシスの誘導
アポトーシスは、Ｔ細胞ハイブリドーマで３つの異なる処理により誘導した：細胞を、抗CD3抗体(４μg/ml)をコーティングしたプラスチック上でインキュベートした(43)か、又は５％エタノール若しくは10％のDMSOを補充した培地中でインキュベートした(24)。細胞をCO2インキュベータで37℃にて種々の時間インキュベートした。アポトーシスは、アガロースゲル電気泳動によりDNAフラグメント化として検出し(下記)、細胞生存能は、トリパンブルー排除で測定した。プレＢ細胞株70Z/3では、(25)に記載されるように、ベンズアミド薬剤デクロプラミド(3-CPA, Oxigene Inc.)によりアポトーシスを誘導した。
アガロース電気泳動
DNAフラグメント化を検出するために、約１×106細胞を溶解し、プロテイナーゼＫ及びRNAse Aで処理し、アガロース電気泳動により分析した。
【００５８】
A1Mの標識
細胞に対するA1M結合の分析のため、A1Mをビオチン化し、FITCを接合したか又は125I放射標識した。A1Mを、長腕ビオチンＮヒドロキシスクシンイミド(Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)でビオチン化し(９)、濃度0.2mg/mlに希釈した。A1Mを、セライトに吸着させたFITC(Calbiochem Corp, San Diego, CA, USA)により、以前(13)に記載されたとおりにFITC接合した。A1Mを、クロラミンＴ法(16)を用いて125Iで標識した。得られた比放射活性はほぼ0.1〜0.2MBq/μgであった。
フローサイトメトリ
細胞に対するA1M結合をフローサイトメトリで分析した。約１×106細胞をA1M結合について３つの異なる方法の１つで分析した：１．細胞を１mg/mlの血漿又は組換え昆虫細胞A1Mと、続いて10μg/mlのモノクローナルマウス抗A1M(BN 11.3)及びGAM-FITC(20倍希釈)とインキュベートした。２．細胞を10μg/mlのビオチン化A1Mと、続いてSAPE(製造業者の推奨に従って希釈)とインキュベートした。３．細胞を0.1mg/mlのFITC接合A1Mとインキュベートした。全てのインキュベーションは、PBS＋１mg/mlのBSA中でRTにて10分間行った。インキュベーション間に、細胞をPBSで２〜３回洗浄した。漏出する細胞の検出のため、細胞をヨウ化プロピジウム(PI；Invitrogen Inc.)又は7AAD(製造業者の指示に従う)とインキュベートした。アポトーシス70Z/3細胞の検出のため、細胞を、Ca2+含有緩衝液(製造業者の指示に従う)中でFITC接合アネキシンＶともインキュベートした。全ての分析は、Becton Dickinson FACSorter及びCell Questソフトウェアパッケージを用いて行った。
【００５９】
蛍光及び共焦点顕微鏡観察
K562細胞を洗浄し、培養培地中0.5〜4.0×106細胞/mlに再懸濁し、図の説明に示したようにA1Mと又は無しでインキュベートした。次いで、細胞を、Mito-Tracker(Invitrogen Inc.)と37℃にて15分間インキュベートし、新鮮培地で洗浄するか(図3A)、又は新鮮培地で直接洗浄した(図1C)。細胞の染色は、洗浄後、氷冷Na培地(5.4mM KCl；1.2mM KH2PO4；0.8mM MgSO4；5.6mM D-グルコース；127mM NaCl；10mM Hepes；1.8mM CaCl2；pH7.3)中に再懸濁し、１％ BD CellFIXで氷上で15分間、RTにて45分間固定することにより行った。細胞をブロッキング溶液(Na培地；１％ BSA；５％ヤギ血清)で洗浄し、続いて0.02％ Triton-X中で透過化し、１％ BSA、５％ヤギ血清、0.2％ Tween-20中で１時間RTにてブロッキングした。次いで、細胞を５μg/mlのモノクローナルマウス抗A1M(BN 11.3)で４℃にて一晩染色した。その後、ヤギ抗マウスIgG F(ab')2フラグメント(Alexa Fluor(登録商標) 594；Invitrogen Inc.)を１時間RTで適用した。ProLong Gold AntiFade ReagentをDAPIと共に用いて細胞をマウントした。蛍光顕微鏡観察については、Hamamatsu C4742-95冷却CCDカメラを備えたNikon Eclipse TE300倒立蛍光顕微鏡をPlan Apochromat 100×対物レンズで使用して視認検査及び画像の記録を行った。共焦点顕微鏡観察については、エピ蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse TE300)及び共焦点レーザ走査顕微鏡(Zeiss LSM 510 Meta)を用いて細胞及び蛍光マーカーの分析を行った。エピ蛍光顕微鏡は、使用した蛍光体を選択的に可視化する適切な組合せのフィルターを備えていた。分析はPlan Apochromat 100×レンズを用いて行い、画像データはHamamatsu C4742-95 CCDカメラを用いて収集した。細胞内標識及び細胞下構造中での同時標識を分析するため、光学切片の共焦点走査を細胞全体にわたり記録した。蛍光体の励起のために、DAPIについては405nmレーザ線(ダイオードレーザ405-30)を、Alexa Fluor 488については488nmレーザ線(アルゴンレーザ)を、Mito-Trackerについては561nmレーザ線(DPSS 561-10)を使用した。個々の蛍光体の発光波長は、次のフィルターを用いて検出した：DAPIについてはバンドパス420〜480nm、Alexa Fluor 488についてはバンドパス505〜550nm、Mitotrackerについては長波長パス575nm。Alexa Fluor 488(488nm励起)検出用ピンホールを１エアリー単位に相当するように設定した後、同じ厚さの光学切片が得られるよう、すなわち対応する共焦点容積の比較が確実となるように、他の検出チャネル用ピンホールを調節した。レーザ出力及び検出セッティング(ゲイン及びオフセット)を個々のチャネルについて最適化し、より大きな構造物の高度飽和画素から小さな構造物の非飽和画素までの検出範囲を得た。異なる蛍光体を逐次的に、すなわち各チャネルで１つの蛍光体に最適なセッティングを用いて、512×512又は1024×1024のフレームサイズで走査した。細胞形態を測定するため、405nmレーザを透過光として用いて微分干渉コントラスト(DIC)画像を得た。Alexa Fluor 488蛍光(緑色)とMito-Tracker蛍光(赤色)との空間的関係を、個別に走査したチャネルからの光学切片を合成することにより決定し(共存するとき、黄色)、LSM Zenソフトウェア(「Profile」)を用いる合成画像の分析により確証した(データは示さず)。
【００６０】
酵母２ハイブリッドシステム
GAL4ベースの酵母２ハイブリッドシステムを使用して、A1M相互作用性細胞タンパク質を検索した。A1M-ビクニン遺伝子(AMBP)のA1M部分(アミノ酸１〜183)をコードするDNAを、pCR-Script構築物をテンプレートとして用いるPCRにより増幅した。このフラグメントを完全に配列決定し、酵母２ハイブリッドベクターpBD-GAL4 Camファージミドベクター(Stratagene, La Jolla, CA, USA)にライゲートした。次いで、この組換えベクターをS. cerevisiae酵母宿主YRG-2株(Stratagene)中に形質転換した。酵母株の増殖及び維持並びに２ハイブリッドアッセイは、Stratagene及びhttp://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/ units/biochem/gietz/が推奨するような標準プロトコルを用いて行った。ベイトプラスミドpBD-GAL4-A1Mを有する約7.5×108のYRG-2を、15〜20μgのヒト白血球MATCHMAKER cDNAライブラリ(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA)で形質転換した。得られる約２×106の形質転換体を、ヒスチジンプロトトロフィーアッセイ及びβ-galコロニーリフトアッセイにより分析した。His+LacZ+形質転換体の組換えライブラリプラスミドを単離し、直接２ハイブリッドアッセイで、A1Mベイトプラスミド及び無関係のタンパク質をコードするベイトプラスミドを用いて再試験した。A1Mをコードするベイトプラスミドでレポーター遺伝子の活性化を生じるが、無関係のタンパク質をコードするベイトプラスミドでは生じないプラスミドを、真正の陽性体とみなした。ベクタープライマーpAD5'：5'-tccagattacgctagcttgggtggtcatatg-3'及びpAD3'：5'-gtgaacttgcggggtttttcagtatctacga-3'を用いて、挿入物のDNA配列を決定した。Innovagen AB(Lund, Sweden)により挿入物の１つを完全に配列決定した。
【００６１】
マウス肝組織からのミトコンドリア調製
マウス肝組織を氷冷単離緩衝液(320mMスクロース、10mM Trizma Base、２mM EGTA)中に収集し、続いて２mlのホモジナイゼーション緩衝液(１％ BSAを補充した単離緩衝液)中でホモジナイズした。このホモジネートから、19％パーコールでの密度精製を含む逐次の遠心分離によりミトコンドリアを調製した。ミトコンドリア調製物のタンパク質濃度はNanodropを用いて測定し、単離ミトコンドリアを凍結させることなく使用した。
競合細胞結合アッセイ及びミトコンドリア結合アッセイ
細胞及びミトコンドリアに対するA1M結合の特異性は、(3, 49)に記載されるような競合細胞結合アッセイにより調べた。15〜18時間の抗CD3架橋によりHCQ.4細胞でアポトーシスを誘導した。細胞を採集し、結合アッセイで正常細胞と比較した。このデータのスキャッチャードプロットを用いて、結合親和性定数を算出した。
複合体Ｉの免疫捕捉
新たに調製したミトコンドリアについて複合体Ｉ免疫捕捉キット(MitoSciences)を用いて複合体Ｉの免疫沈降を行った。免疫沈降後、結合タンパク質をSDS緩衝液を用いて溶出し、続いてSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを用いて分析した。
【００６２】
呼吸鎖複合体及びスーパー複合体の単離
新たに単離した非凍結ミトコンドリアペレットを、コンプリートミニプロテアーゼインヒビターを補充したPBSに再懸濁した。ミトコンドリアを５分間5000×ｇにてペレット化し、続いてMB2緩衝液(1.75Ｍアミノカプロン酸、7.5mM Bis-Tris pH7.0、＋２mM EGTA pH 8.0)中濃度５mg/mlに溶解した。0.5％ジギトニンとの氷上で５分間のインキュベーションにより、ミトコンドリア膜タンパク質を可溶化させた。サンプルを30分間13000×ｇで遠心分離し、上清を収集し、タンパク質濃度を前述のように測定した。最後に、SBG(750mMアミノカプロン酸、５％ Serva Blue G)を最終濃度4.5％まで加えた。
ブルーネイティブPAGE、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティング
５μgのミトコンドリア膜タンパク質を、BN-PAGE ４〜16％ Bis-Trisゲル(Invitrogen Inc.)上で分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色したか、又はIblot装置(Invitrogen Inc.)を用いてPVDFメンブレン(Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA)にブロットした。複合体Ｉ免疫沈降タンパク質を12％ SDS-PAGE上で分離し、PVDFメンブレンに転写した。４℃で一晩のブロッキング後、メンブレンを複合体ＩのサブユニットNDUFV1に対する抗体(Sigma)又はマウスA1Mとインキュベートした。一次抗体を、HRP連結ヤギ抗マウス(DAKO)又はヤギ抗ウサギ(DAKO)とのインキュベーションにより検出した。
【００６３】
透過型電子顕微鏡観察(TEM)
20μMのヘムと10μMのA1M有り又は無しでRTにて20時間インキュベートしたヒトケラチノサイト(約１百万細胞)を遠心分離によりペレット化し、0.15Ｍカコジル酸ナトリウム(pH7.4)(カコジル酸緩衝液)中2.5％グルタルアルデヒドで、RTにて１時間、続いて４℃にて一晩固定した。次いで、サンプルをカコジル酸緩衝液で洗浄し、カコジル酸緩衝液中１％の四酸化オスミウムで１時間RTにて後固定し、段階系列のエタノール中で脱水した後、アセトンを中間溶媒として用いてEpon 812中に包埋した。標本をLKBウルトラミクロトームでダイアモンドナイフを用いて50〜70nm厚の超薄切片にした。この超薄切片を酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。80kV加速電圧で稼動させたJEOL JEM 1230電子顕微鏡で標本を観察した。画像をGatan Multiscan 791 CCDカメラで記録した。Aurion-BSAをブロッキング剤として使用する改変を加えた以外は以前(39)に記載されたように、金標識抗A1M(BN11.3)で薄切片を免疫標識した。最終的に、サンプルを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、80kV加速電圧で稼動させたJEOL JEM 1230電子顕微鏡で標本を観察した。画像をGatan Multiscan 791電荷結合素子カメラで記録した。
【００６４】
ATPアッセイ
発光アッセイキット(Promega, Madison, WI)を用い、ルシフェラーゼのATP依存活性に基づいて、細胞ATP産生を測定した。ATPレベルは、対応するサンプルのタンパク質含量に対して規格化した。
統計分析
統計分析はOrigin 8ソフトウェアを用いて行った。統計学的評価にはスチューデントのｔ-検定を使用し、Ｐ＜0.05のときを有意とみなした。
【００６５】
結果
損傷細胞に対するA1Mの特異結合
アポトーシス細胞及び健常細胞に対するA1Mの結合をフローサイトメトリで分析し、未処理細胞と比較した。最初に、CD3分子と固定化抗マウスCD3抗体との架橋(図1A、E)によるか又は５％エタノール若しくは10％ DMSOとのインキュベーション(図1B)により、マウスＴ細胞ハイブリドーマ(HCQ.4)でアポトーシスを誘導した。これら処理は、15〜18時間後にDNAフラグメント化及びトリパンブルーの取込みを生じた(示さず)。未処理細胞に対しては、弱いA1M結合を検出することができた(図1A、左パネル)。抗CD3と架橋した細胞(図1A、右パネル)又はエタノール若しくはDMSOで処理した細胞(図1B)に対しては、更により強い結合を検出することができた。結合をPI取り込みと相関付けることができた。すなわち、PIを組み込むことができた細胞のみがより強いA1M結合を示した(図1B)。薬剤3-CPAを用いてアポトーシスに誘導し、A1Mと、続いて抗A1MとインキュベートしマウスプレＢ細胞株のフローサイトメトリは、同様な結果を示した(図1C)。これにより、アポトーシス細胞に対する結合はＴ細胞に限定されないことが示された。
【００６６】
損傷細胞に対するA1M結合を更に特徴付けるため、ヘムの添加によりアポトーシスに誘導し、A1Mと、続いて抗A1Mとインキュベートした、ヒト赤血球様細胞株K562(図1D)及び前骨髄球細胞株HL 60(示さず)を蛍光顕微鏡観察して結合を調べた。図に示されるように、２つの異なるタイプの染色が観察できた：ほとんどの細胞の細胞表面に対する弱い顆粒状染色、及び細胞の一部(約６％)に対するより顕著で均質な細胞内染色。同様の結果がHL 60細胞でも得られた(示さず)。これら結果は、アポトーシス細胞に対するA1Mの強い結合が主に細胞内であることを示しており、このことは共焦点顕微鏡観察により確証された(下記参照；図3A)。
【００６７】
結合の特異性を調べるため、CD3架橋によりアポトーシスに誘導したHCQ.4細胞について競合細胞結合アッセイを行い、正常な未処理細胞と比較した。125I標識A1M及び過剰の未標識A1M、オボアルブミン、BSA又はAGPを細胞に添加した(図1E)。アポトーシス細胞(図1E、左)に対しては、未処理細胞(右)と比較して、より多くのA1Mが結合した。過剰の未標識A1Mは、未処理細胞への結合と同じベースラインレベルにまでアポトーシス細胞への125I-A1M結合をブロックした。この減少は有意であることが判明した(ｐ＜0.001)。未標識の対照タンパク質のいずれも、未処理細胞に対する125I-A1Mの結合を有意に減少させなかった。よって、A1Mの特異結合が示された。アポトーシス細胞に対しては、対照タンパク質による有意な僅かな減少が見られた(ｐ＜0.05)。この僅かな減少は、露出した細胞内構造への非特異バックグランド結合の増加に起因する可能性がある。したがって、これら結果は、アポトーシス細胞に対するA1Mのより強い特異結合を示す。スキャッチャードプロットから、アポトーシスHCQ.4細胞に対するA1M結合の親和定数は、１×106Ｍ-1と決定することができた。これら細胞の生存能は、トリパンブルー排除によれば25％であった(示さず)。
【００６８】
上記のように、A1M結合性細胞はPIを内在化した(図1B)。このことは、A1M結合がアポトーシスプロセスの後期に、細胞膜の漏れが始った後に起きることを示す。この結果を確証するため、抗CD3架橋によりアポトーシスに誘導したHCQ.4細胞に対するA1Mの結合についての時間分析を行った。誘導後の種々の時点で採取したサンプルのフローサイトメトリは、PI取込みがA1Mの結合に先行することを示す(図2A)。PI取込みについて陰性の細胞には明白な結合相関は観察されなかった。同じ結果が、マウスプレＢ細胞をA1M、アネキシンＶ(アポトーシスのマーカー)及び7AAD(細胞膜透過性のマーカー染料)で三重染色したときに得られた(図2B)。7AAD陽性細胞のみが強いA1M結合を示した一方、7AADについては陽性はなくアネキシンＶについて陽性である細胞は、A1Mに結合しなかった。
【００６９】
細胞内A1M結合性タンパク質の同定
A1Mと相互作用する細胞タンパク質を検索するため、酵母２ハイブリッドシステムを用いた。A1MをコードするcDNAをベイトとして用い、ヒト白血球ライブラリーでA1M相互作用性タンパク質を検索した。約２×106の形質転換体をレポーター遺伝子活性化について分析した。ヒスチジンを欠くプレートで合計168のコロニーが生存し、そのうち13コロニーは、β-ガラクトシダーゼについて陽性であった。His+LacZ+組換えライブラリプラスミドを単離し、直接２ハイブリッドアッセイでベイトタンパク質のみをコードするベイトプラスミド及び無関係のタンパク質に融合した該タンパク質をコードするベイトプラスミドを用いて試験した。11の組換えプラスミドは、A1Mと相互作用するがベイトタンパク質とも該タンパク質に融合した他の無関係のタンパク質とも相互作用しないタンパク質をコードすることが示された。挿入物のDNA配列決定により、そのうち７つはミトコンドリア複合体ＩのSDAPサブユニット(NDUFAB1)の短縮型であり、１つは該サブユニットの完全配列であり、１つはsnRNA結合性タンパク質であり、１つはＮ-アセチルグルコサミンキナーゼであり、１つは結腸ガン抗原であることが明らかになった。全ての挿入物は、プレイベクターにおいてインフレームであった(表Ｉ)。
【００７０】
【表１】
2018203756.tif 000002
【００７１】
ミトコンドリア複合体Ｉに対するA1Mの結合
よって、酵母２ハイブリッド実験の結果は、ミトコンドリア複合体Ｉのサブユニットが主要なA1M結合性細胞内タンパク質であることを示唆する。したがって、幾つかの独立の方法を用い、ミトコンドリア、特に複合体Ｉに対する結合を詳細に調べた：共焦点顕微鏡観察、EM、細胞成分分画及びPAGE。ミトコンドリア蛍光プローブ(Mito-Tracker)及び共焦点顕微鏡観察を用いて、本発明者らは、K562細胞において細胞内A1Mの細胞内所在を、外因性A1Mを添加して又は添加することなく評価した(図3A)。外因性A1Mを添加することなく細胞を分析したときには、非常に弱い非特異的細胞内染色が観察された(示さず)。しかし、外因性A1Mの添加により、強烈なミトコンドリア特異的染色が観察された。また、初代ヒトケラチノサイト培養物を用いて透過型EM(TEM)で、結合したA1Mの細胞内所在を調べた(図3B〜C)。外因性A1Mを添加し、金標識抗A1MとインキュベートしたケラチノサイトのTEMにより、ミトコンドリアに対するA1Mの高度に特異的な局在が示された(図3C)。
ミトコンドリア結合の確証及び特異性の検証を、マウス肝臓から精製したミトコンドリアを用いて行った(図4A)。125I標識A1Mをミトコンドリアと、過剰の非標識A1M若しくは対照タンパク質AGP有り又は共に無しでインキュベートした。過剰の非標識A1Mは125I-A1M結合を高い２濃度で有意にブロックした一方、最高濃度のAGPは結合に対して効果を有さなかった。結合データのスキャッチャード分析により、1.2×106Ｍ-1の結合親和定数が得られた。
【００７２】
内因性A1Mが複合体Ｉと関連するミトコンドリアに見出されるかどうかを調べるため、マウスミトコンドリアを、凍結することなく精製し、可溶化し、非変性条件下で分離し、複合体Ｉ及びIIIのサブユニット(それぞれNDUFV1及びコアＩと呼ぶ)に対する抗体及びマウスA1Mに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析した(図4B)。結果は、A1Mが主要な複合体Ｉ含有バンド並びに複合体Ｉ及びIIIの両方を含有するスーパー複合体バンドと共に移動する一方、A1Mと主要な複合体III含有バンドとの間で同時移動は観察されないことを示す。まとめると、このことは、A1Mと複合体Ｉサブユニットとの特異結合を支持する。しかし、A1Mの大部分が約350〜400kDaに対応する位置に移動した。このことは、A1Mが、ミトコンドリア内の他の(未同定の)大きな構造物とも結合することを示唆する。全てのバンドのブロッティング強度は、ジギトニン濃度の増大につれて減少した。このことは、ゲル中で観察された全てのバンドが非共有結合性タンパク質-タンパク質相互作用に起因することを示唆する(図5A)。A1Mと複合体Ｉとの結合は、抗複合体Ｉ免疫沈降に続く抗A1Mでのブロッティングにより確証された(図4C)。結果は、出発材料中のミトコンドリア結合A1M陽性バンドの大部分が沈降することを示した(図4C、左)。また、出発材料中では検出できない新たなバンドが免疫沈降物中で観察された。SDS-PAGE及び抗A1Mでのブロッティングの前に行ったインタクトなミトコンドリアのトリプシン消化は、ミトコンドリアで見出されるA1Mの量を減少させなかった。このことは、A1Mがミトコンドリア内膜に局在していることを示唆する(図5B)。
【００７３】
A1Mはミトコンドリアの構造及び機能を保護する。
ミトコンドリア結合A1Mの生理学的役割がこの小器官の保護を付与することであると仮定して、本発明者らは、先ずTEMを用いて、ヘム及びH2O2に曝露した細胞中のミトコンドリア構造に対するA1Mの影響を調べた(図６及び７)。TEMを初代培養ヒトケラチノサイトに対して行った。ヘム(図6B)及びH2O2(図7B)による広範な破壊効果、すなわち、多数の液胞の形成、ケラチン線維の構造的な解体及びミトコンドリア膨張が観察された(図6B及び7B、拡大図)。これら効果はA1Mの添加により打ち消された。影響は特にミトコンドリア膨張に対して観察された(図6C及び7C、拡大図)。結果は、A1Mが、そうでなければ損傷し崩壊する細胞構造を保護・保存することを示唆する。
本発明者らは、次に、ミトコンドリア機能に対するA1Mの効果を、ヘム又はH2O2に曝露した精製ミトコンドリアのATP産生を測定することにより調べた(図８)。５及び20μMのヘムによるATP産生速度の有意な減少が観察された(図8A)。この減少はA1Mにより打ち消し、10μMのA1Mが存在するとき、試験したいずれの濃度のヘムでもATP産生速度の減少は観察されなかった。同様な結果がH2O2を用いても観察された(図8B)。すなわち、H2O2は、ATP産生速度を有意に減少させたが、この効果は10μM A1Mの存在下で有意に打ち消された。
【００７４】
実施例２．網膜培養物において、ストレス条件は、ミトコンドリアの構造的及び機能的損傷、細胞抗酸化応答並びに細胞A1Mアップレギュレーションを誘導する
方法
ブタ網膜を切り出し、ラット網膜(Cederlund M, Ghosh F, Arner K, Andreasson S, Akerstrom B. Vitrous levels of oxidative stress biomarkers and the radical scavenger alpha-1-microglobulin/A1M in human rhegmatogenous retinal detachment. Graefe's Arch Clin Exp Ophtalmol (2013) 251：725-732)について記載されたように、ペトリ皿で温和条件下及びストレス条件下にインビトロ培養した。２時間又は48時間後、mRNAを単離・定量し、逆転写によりcDNAを合成し、特異配列の量をリアルタイムPCRにより定量した。ストレス培養物中で得られた各mRNA種の量を、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-３-ホスフェート-デヒドロゲナーゼのmRNAに対して規格化し、非ストレス条件での規格化した遺伝子に対して相対的に表した(ΔΔCt)。
【００７５】
結果
ミトコンドリア特異的リボソームRNA(12S rRNA)の発現は、ストレス条件下で48時間培養した網膜において温和条件と比較して劇的にダウンレギュレートされた(図10a)。よって、ミトコンドリアの構造及び機能に対する損傷が示唆された。同時に、A1M遺伝子並びに２つの抗酸化遺伝子ヘムオキシゲナーゼ１(HO1)及びスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、２時間後及び48時間後の両方で、ストレス培養物において温和培養物と比較してアップレギュレートされた(図10b)。このことにより、A1Mが関与する網膜の細胞防御機構が活性化されることが示唆される。
結論
インビトロ培養の間の網膜ストレスは、網膜ミトコンドリアの構造及び機能にマイナスに影響し、抗酸化防御及びA1M発現をアップレギュレートする。これら結果は、網膜培養の間のミトコンドリア保護におけるA1Mの役割を支持する。
【００７６】
略号一覧
反応性酸素種                                ROS
ヘモグロビン                                Hb
スーパーオキシドジスムターゼ                SOD
グルタチオンペルオキシダーゼ                GPx
α1-ミクログロブリン                        A1M
ビオラキサンチン-デエポキシダーゼ           VDE
ゼアキサンチン エポキシダーゼ               ZDE
α1酸糖タンパク質                           AGP
ウシ血清アルブミン                          BSA
ジメチルスルホキシド                        DMSO
フルオレセインイソチオシアネート接合        GAM-FITC
ヤギ抗マウスイムノグロブリン
フィコエリトリン接合ストレプトアビジン      SAPE
７-アミノアクチノマイシンＤ                 7AAD
【００７７】
参考文献
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【図１−１】
2018203756.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2018203756.tif 000010
【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
2018203756.tif 000013
【図９−３】
2018203756.tif 000014
【図１０】
2018203756.tif 000015
【配列表】
2018203756000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月21日(2018.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア病若しくは障害、ミトコンドリア欠損症、薬物誘導ミトコンドリア副作用又は環境誘導ミトコンドリア作用の治療又は予防に使用するか、又はミトコンドリア機能の修復、回復若しくは維持に使用するための、α-1-ミクログロブリンを含む医薬組成物。
【請求項２】
ミトコンドリア関連疾患又は障害が、以下のリスト：
・アルパース病(乳児進行性灰白異栄養症)
・バース症候群(乳児致死性心筋症)
・β酸化欠損症
・心筋症
・カルニチン-アシル-カルニチン欠乏症
・カルニチン欠乏症
・クレアチン欠乏症候群(脳クレアチン欠乏症候群(CCDS)にはグアニジノアセテートメチルトランスフェラーゼ欠乏症(GAMT欠乏症)、L-アルギニン:グリシンアミジノトランスフェラーゼ欠乏症(AGAT欠乏症)及びSLC6A8関連クレアチン輸送体欠乏症(SLC6A8欠乏症)が含まれる)
・補酵素Q10欠乏症
・呼吸鎖複合体Ｉ欠乏症(NADHデヒドロゲナーゼ(NADH-CoQレダクターゼ)欠乏症)
・呼吸鎖複合体II欠乏症(スクシネートデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体III欠乏症(ユビキノン-シトクロムｃオキシドレダクターゼ欠乏症)
・呼吸鎖複合体IV欠乏症/COX欠乏症(シトクロムｃオキシダーゼ欠乏症は呼吸鎖複合体IVの欠損により引き起こされる)
・呼吸鎖複合体Ｖ欠乏症(ATPシンターゼ欠乏症)
・COX欠乏症
・CPEO(慢性進行性外眼筋麻痺症候群)
・CPT I欠乏症
・CPT II欠乏症
・フリートライヒ運動失調(FRDA又はFA)
・脳筋症
・グルタル酸尿症II型
・KSS(カーンズ・セイアー症候群)
・乳酸アシドーシス
・LCAD(長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・LCHAD
・リー病又は症候群(亜急性壊死性脳脊髄症)
・LHON(レーバー遺伝性視神経萎縮)
・ルフト病
・MCAD(中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・MELAS(ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様エピソード)
・MERRF(ミオクローヌスてんかん・赤色ぼろ線維症候群)
・MIRAS(ミトコンドリア劣性運動失調症候群)
・ミトコンドリア細胞障害
・ミトコンドリアDNA涸渇
・ミトコンドリア脳症(脳筋症、脳脊髄障害を含む)
・ミトコンドリアミオパシー
・MNGIE(ミトコンドリア神経胃腸脳筋障害)
・NARP(ニューロパシー・運動失調・網膜色素変性症)
・ピアソン症候群
・ピルベートカルボキシラーゼ欠乏症
・ピルベートデヒドロゲナーゼ欠乏症
・POLG変異
・呼吸鎖欠損症
・SCAD(短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
・SCHAD
・VLCAD(超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠乏症)
からの１以上の疾患又は障害である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
呼吸鎖障害の治療又は予防に使用するための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
呼吸鎖障害が呼吸鎖複合体Ｉ、II、III、IV又はＶ欠損が関与するものである請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
小児又は若年成人のミトコンドリア機能不全の治療又は予防に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アルパース病、バース症候群、フリートライヒ運動失調、KSS、リー病若しくは症候群、LHON、MELAS、MERRF、MIRAS又はNARPの治療又は予防に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
女性のミトコンドリア機能不全の治療又は予防に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ミトコンドリア欠損又は機能不全に関連する網膜損傷若しくは機能不全又は眼疾患の治療又は予防に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。