(57)【要約】      （修正有）【課題】非精製の若しくは低純度のダイズホスファチジルセリンを脂質供給源として使用することによって作製されるコクリエートの提供。【解決手段】約40重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、多価カチオン及び生物学的活性物質を含むコクリエート。好ましい該コクリエートは、抗真菌剤アンホテリシンBを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、
多価カチオン、及び
生物学的活性物質
を含むコクリエート。
【請求項２】
ダイズベースのリン脂質が、少なくともダイズホスファチジルセリン及びホスファチジン酸で構成される、請求項１に記載のコクリエート。
【請求項３】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１又は２に記載のコクリエート。
【請求項４】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項３に記載のコクリエート。
【請求項５】
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項６】
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項５に記載のコクリエート。
【請求項７】
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項８】
多価カチオンが、Ca++である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項９】
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１０】
生物学的活性物質が、クルクミンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１１】
生物学的活性物質が、アミノグリコシドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１２】
生物学的活性物質が、アミカシンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１３】
コクリエートが、胆汁酸塩をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１４】
ダイズベースのリン脂質対胆汁酸塩の重量比が、20：1と0.5:1の間、好ましくは10:1と3:1の間である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１５】
ダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを生産するための方法であって、
a．(i)ダイズホスファチジルセリンを、脂質二重層の約40重量%〜74重量%の量で含む脂質二重層、及び(ii)生物学的活性物質の充填物を有するリポソームを、水性媒体中で調製する工程、
b．多価カチオンを、(a)のリポソームの懸濁液に添加し、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを形成する工程、並びに
c．このダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを集める工程を含む上記方法。
【請求項１６】
脂質二重層が約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
脂質二重層が約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程(a)において、リポソームの懸濁液を含む水性媒体が6.5〜7.5のpHを有する緩衝環境であり、生物学的活性物質の充填物が、リポソームに添加される前、pH10以上である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リポソームの懸濁液が、ホスフェートによって緩衝化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
多価カチオンが、Ca++である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性物質が、クルクミンである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的活性物質が、アミカシンである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
脂質二重層対生物学的活性物質の重量比が、約3:1と約20:1の間である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程(b)の前に(a)のリポソームの懸濁液に胆汁酸塩を加える工程、又は工程(b)の後にダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートに胆汁酸塩を加える工程をさらに含み、脂質二重層対胆汁酸塩の重量比が、20:1と0.5:1の間、好ましくは、10:1と3:1との間である、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
真菌感染を有する患者を処置する方法であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)抗真菌剤を含む抗真菌に有効な量のコクリエートを患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項３０】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗真菌剤が、アンホテリシンBである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
細菌感染を有する患者を処置する方法であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)抗生物質を含む抗真菌に有効な量のコクリエートを患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項３３】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗生物質が、アミノグリコシドである、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗生物質が、アミカシンである、請求項３２又は３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
本出願は、2012年7月30日出願の米国仮特許出願第61/677,414号及び2013年6月17日出願の米国仮特許出願第61/835,825号に対する優先権を主張し、これらの出願はそれぞれ、本文中で参考として組み込まれる。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、非精製の若しくは低純度(40〜74重量%)のダイズ(soy)ベースのホスファチジルセリン(PS)のコクリエート（cochleate）を調製する能力、ダイズベースのPSから薬物‐コクリエートを調製する方法、並びにこの薬物が充填されたコクリエートの薬学的処置としての使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
コクリエート送達ビヒクルは、広範な生物活性治療用製品の送達のための広い領域にわたる技術である。コクリエート送達ビヒクルは、単純な、天然に存在する材料、例えば、ホスファチジルセリン及びカルシウムの、安定なリン脂質カチオン沈殿物である。
【０００４】
二層構造のコクリエートは、関連の、すなわち「コクリエート化された」分子について、分解からの保護を提供する。コクリエート構造全体は、一連の固い層であるので、コクリエート構造の外側層が過酷な環境条件若しくは酵素に曝されている場合でも、このコクリエート構造の内側の成分は、実質的に無傷なままである。このことは、胃における消化からの保護を含む。
【０００５】
これらの独特な特性を利用し、コクリエートは、広範な、重要であるが処方が難しい生物薬剤(水溶性の低い化合物、タンパク質及びペプチド薬物、並びに非常に親水性な分子を含む)を媒介し、そして経口バイオアベイラビリティを高めるために、使用されている。例えば、アンホテリシンB、DNAワクチン及び遺伝子治療のための大型DNA構築物/プラスミド、ペプチド処方物、並びにクロファジミンなどの抗生物質の、コクリエート媒介型経口送達が、達成されている。
【０００６】
コクリエートは、カチオン含有緩衝液中で保存することができ、又は粉末状に凍結乾燥させて室温にて保存し、そして投与の前に液体で再構成することができる。凍結乾燥は、コクリエートの形態又は機能に何ら悪影響を及ぼさない。コクリエート調製物は、カチオン含有緩衝液中で4℃にて2年間を超えて安定であること、及び凍結乾燥粉末として室温にて少なくとも1年間安定であることが示されている。
【０００７】
コクリエートは、幾つかの方法、例えば、トラッピング方法若しくはヒドロゲル方法(国際特許出願第WO 03/082209号、その内容全体は、本文中に参考として組み込まれる)によって調製され得る。
【０００８】
ダイズPSは、健康食品店にて栄養補助食品として販売されている。非精製(40%) PSは、栄養補助食品として及び老人において脳機能を向上させる有益な効果を有する成分として、使用され、そして研究されてきた(Villardita Cら, Clin. Trials J. 24, 1987, 84-93)。
【０００９】
非精製ダイズPS(NSPS)は、患者に対して販売され、そして研究されてきているが、NSPS(若しくは低純度PS)は、コクリエートを作製するために使用されたこと、及びこれらのコクリエートを用いて薬物を送達するために使用されたことはない。WO 03/082209において以前開示された通り、NSPSは、コクリエートを形成せず、PSの含量において、少なくともPSの約75重量%に達するまでNSPSを高めるために精製プロセスが必要であり、このような割合によって、コクリエートの形成が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 03/082209
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Villardita Cら, Clin. Trials J. 24, 1987, 84-93
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
NSPS又は低純度のダイズベースのPS(40〜74重量%)であっても、コクリエートを形成することができることが、予期せず見出された。
【００１３】
簡潔にいうと、本発明に従い、改善された脂質を基にしたコクリエートが、非精製の若しくは低純度のダイズホスファチジルセリンを脂質供給源として使用することによって作製される。改善されたコクリエートは、約40〜74重量%(好ましくは45〜70重量%、より好ましくは45〜55重量%)の量のダイズホスファチジルセリンを含む。この改善されたコクリエートは、空のコクリエートであっても、又は充填されたコクリエートであってもよい。充填されたコクリエートは、任意の生物学的活性物質、又は生物学的活性物質の組み合わせ、例えば、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン若しくは血管拡張剤等を含み得る。本発明の実施の際に、特に重要なことは、抗真菌剤若しくは抗生物質が、本発明のダイズベースのホスファチジルセリンコクリエート内に充填され、費用効果的であり且つ改善された、毒性が低減した抗真菌薬/抗生物薬が提供されることである。好ましい抗真菌剤としては、アンホテリシン-B及びナイスタチンが挙げられる。好ましい抗生物質としては、アミノグリコシド及びアミカシンが挙げられる。
【００１４】
本発明の改善された脂質を基にしたコクリエートは、以下の工程を含む方法によって作製され得る:(a) (i)ダイズベースのホスファチジルセリンを脂質二重層の約40〜74重量%(好ましくは45〜70重量%、より好ましくは45〜55重量%)の量で含む脂質二重層、及び(ii)生物学的活性物質の充填物を有するリポソームを、水性媒体中で調製すること、(b)多価カチオンを(a)のリポソームの懸濁液に添加し、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを形成すること、並びに(c)このダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを集めること。
【００１５】
本発明はまた、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートは、真菌感染若しくは細菌感染を有する患者に投与され得ることをも教示する。本発明のダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートは、免疫無防備状態の患者の全身性真菌感染の処置においてすら、簡便に経口で投与される。本発明のホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートはまた、非経口で、若しくは他の手段によっても投与される。好ましい生物学的活性物質は、アンホテリシン-B、クルクミン及びアミカシンである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、マウス腹腔マクロファージにおける、MAC 101及びMAC 109に対するアミカシンコクリエートインビトロ研究を示す。
【図２】図2は、MAC 101感染IP-送達のマウスモデルにおけるアミカシンコクリエートインビボ有効性を示す。
【図３】図3は、MAC 101感染経口送達のマウスモデルにおけるアミカシンコクリエートインビボ有効性を示す。
【図４】図4は、PS特性に関連するゲンタマイシンコクリエート化を示す。
【図５】図5は、PS特性に関連するアミカシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図６】図6は、PS特性に関連するアミカシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図７】図7は、PS特性に関連するゲンタマイシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図８】図8は、PS特性に関連するゲンタマイシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図９】図9は、PS特性に関連するパロモマイシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図１０】図10は、PS特性に関連するパロモマイシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【図１１】図11は、PS特性に関連するパロモマイシン胆汁酸塩のコクリエート化効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の用語は、本文中で使用される場合、以下で示される定義を有する。
【００１８】
「コクリエート（cochleate）」は、安定な、リン脂質-カチオン沈殿物であり、空であっても、充填されていてもよい。
【００１９】
「空のコクリエート」は、リン脂質及びカチオンしか含まないコクリエートである。
【００２０】
「充填されたコクリエート」は、リン脂質-カチオン構造内に1種以上の生物学的活性化合物を有するコクリエートである。
【００２１】
「ダイズホスファチジルセリン」若しくは「ダイズベースのホスファチジルセリン」は、ダイズを基にした組成物に由来しているホスファチジルセリンである。
【００２２】
本発明の実施において、改善されたリン脂質を基にしたコクリエートは、このコクリエートの脂質成分の40〜74重量%の量のダイズホスファチジルセリンを用いて作製される。或いは、ダイズホスファチジルセリンは、コクリエートの脂質成分の約40重量%、45重量%、50重量%、55重量%、60重量%、65重量%、若しくは70重量%、又はその任意の増大した値であってもよい。これらの値及び範囲の間の全ての値及び範囲が、本発明によって含まれることを意味することが、理解されるべきである。好ましい実施形態において、リン脂質は、45〜70%のダイズホスファチジルセリンを含む。より好ましい実施形態において、リン脂質は、45〜55%のダイズホスファチジルセリンを含む。
【００２３】
ホスファチジン酸は、本発明の改善されたコクリエートにおいてホスファチジルセリンの他のさらなるリン脂質が存在する場合、好ましいリン脂質である。ホスファチジン酸に加えて本発明の改善されたコクリエートにおいて使用され得る他のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。さらなるリン脂質の混合物はまた、ダイズホスファチジルセリンと組み合せても使用され得る。
【００２４】
ダイズホスファチジルセリン出発材料は、市販されているか、又はいくつかのダイズリン脂質の混合物であるダイズリン脂質組成物から周知且つ標準的な精製技術に従って精製され得る。
【００２５】
コクリエートをリポソーム出発材料から沈殿させるために、任意の多価化合物が使用され得る。好ましくは、多価化合物は、Ca++、Zn++、Ba++、及びMg++などの二価カチオンである。これらのカチオンの好ましい供給源としては、カルシウム、亜鉛、バリウム及びマグネシウムの塩化物塩が挙げられる。CaCl2は、特に好ましい二価カチオン源である。
【００２６】
1つの実施形態において、本発明のダイズホスファチジルセリンコクリエートは、さらに胆汁酸塩を含んでもよい。ダイズベースのリン脂質対胆汁酸塩の重量比は、20:1と0.5:1との間であり、好ましくは、10:1と3:1との間である。
【００２７】
胆汁酸塩は、カチオン、通常はナトリウムと化合した胆汁酸である。胆汁酸は、主として哺乳類の胆汁中に見られるステロイド酸である。胆汁酸は、市販されている(例えば、Sigma -Aldrich  カタログ番号48305 Flukaコール酸ナトリウム塩〜50%、デオキシコール酸ナトリウム塩〜50%)。
【００２８】
胆汁酸塩の添加は、ダイズホスファチジルセリンコクリエートのコクリエート化効率を高めることが、予期せず見出された。例えば、胆汁酸塩を含めることにより、本発明のダイズホスファチジルセリンコクリエート(例えば、50%のダイズPSを使用したもの)は、少なくとも約75%のダイズホスファチジルセリンを含むコクリエートよりも、コクリエート化の効率がよい。
【００２９】
1つの実施形態において、本発明のダイズホスファチジルセリンコクリエートは、以下の工程を含むプロセスによって作製される:
a.(i)ダイズベースのホスファチジルセリンを脂質二重層の約40〜74重量%(好ましくは45〜70重量%、より好ましくは45〜55重量%)の量で含む脂質二重層、及び(ii)生物学的活性物質の充填物を有するリポソームを、水性媒体中で調製すること、
b.多価カチオンを(a)のリポソームの懸濁液に添加し、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを形成すること、並びに
c.このダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを集めること。
【００３０】
1つの実施形態において、リポソームの懸濁液を含む水性媒体は、6.5〜7.5のpHを有する緩衝環境であり、そして生物学的活性物質の充填物は、リポソームに添加される前、pH10以上である。好ましい実施形態において、リポソームの懸濁液は、ホスフェートによって緩衝化されている。
【００３１】
別の実施形態において、本方法は、工程(b)の前に(a)のリポソームの懸濁液に胆汁酸塩を加える工程、又は工程(b)の後にダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートに胆汁酸塩を加える工程をさらに含み、ここで、脂質二重層対胆汁酸塩の重量比は、20:1及び0.5:1の間、好ましくは、10:1と3:1との間である。
【００３２】
本発明は、(1)ダイズホスファチジルセリンの約40〜74重量%(好ましくは45〜70重量%、より好ましくは45〜55重量%)を構成するダイズのリン脂質を疎水性ドメインの周りに配置されて含む脂質単層、並びに(2)この脂質単層の周りに配置された脂質層を含むジオデート(geodate)組成物を提供し、ここで、この脂質層は、二価カチオンを含むカチオン層と負に帯電したシート様層とが交互に重なった構造及び疎水性ドメインを伴うカーゴ部分を含む。
【００３３】
国際特許出願第WO 2004/041247号は、ジオデート組成物を作製する方法を開示しており、その内容全体は、本文中で参考として組み込まれる。
【００３４】
生物活性のある活性物質/薬物(「充填物」若しくは薬物と呼ぶ)は、水性媒体中で疎水性であっても、親水性であっても、又は両親媒性であってもよい。この薬物は、タンパク質、小ペプチド、生物活性ポリヌクレオチド、抗真菌剤、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗感染剤、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド性抗炎症剤、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン、非ステロイド性抗炎症剤、トランキライザー若しくは血管拡張剤であってもよいが、これらに限定されない。例としては、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、ビタミンA、カバマゼピン(cabamazepine)、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン類、パクリタキセル及びタキソテレが挙げられる。
【００３５】
この薬物は、ポリペプチド、例えばシクロスポリン、アンギオテンシンI、II及びIII、エンケファリン類及びその類似物、ACTH、抗炎症性ペプチドI、II、III、ブラジキニン、カルシトニン、b-エンドルフィン、ダイノルフィン(dinorphin)、ロイコキニン、黄体ホルモン放出ホルモン(LHRH)、インスリン、ニューロキニン、ソマトスタチン、サブスタンスP、甲状腺放出ホルモン(TRH)及びバソプレシンであってもよい。
【００３６】
この薬物は、抗原であってもよいが、タンパク質抗原に制限されない。この抗原はまた、炭水化物若しくはDNAであってもよい。抗原性タンパク質の例としては、インフルエンザウイルス若しくはセンダイウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質、動物細胞膜タンパク質、植物細胞膜タンパク質、細菌膜タンパク質及び寄生虫膜タンパク質が挙げられる。
【００３７】
この抗原は、供給源粒子、細胞、組織若しくは生物から、公知の方法によって抽出される。この抗原の生物学的活性は、維持されている必要はない。しかし、いくつかの場合(例えば、タンパク質が膜融合若しくはリガンド結合活性、又は免疫系によって認識される複合体立体構造を有する場合)、生物学的活性を維持することが望ましい。これらの場合、膜タンパク質の生物学的活性を破壊しない界面活性剤を含有する抽出緩衝液が、使用される。好適な界面活性剤としては、コール酸塩、デオキシコール酸塩などのイオン性界面活性剤又はTween、BRIG若しくはTritonなどの不均質ポリオキシエチレン界面活性剤が挙げられる。
【００３８】
本方法の使用は、抗原、より具体的にはタンパク質の、生物学的活性を維持したリポソームへの再構築を可能にし、ついにはコクリエートとの効率的な結合を可能にする。これは、抗原の生物学的に活性な形態への効率的な再構築に対して、その全てが悪影響を有し得る有機溶媒、超音波処理又は極端なpH、温度若しくは圧力を排除する。
【００３９】
改善された本コクリエートは、適切であれば、複数の抗原性分子、生物学的関連分子若しくは薬物処方物を、充填物と共に含み得る。
【００４０】
コクリエート構造を単離し、ポリマー溶液を除去するために、コクリエート沈殿物を、陽に帯電した分子、より好ましくは二価カチオンを含む緩衝液で繰り返し洗浄する。陽に帯電した分子の洗浄緩衝液への添加は、コクリエート構造が洗浄工程を通して維持され、これらが沈殿物であり続けることを確実にする。
【００４１】
コクリエートが沈殿する培地は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウムなどの塩を含み得る。この培地は、Tween 80、BRIG若しくはTritonなどのポリマーを含み得る。薬物-コクリエートは、適切な製薬的に許容できるキャリア(例えば、二価カチオン含有緩衝液)中に希釈することによって、作製され得る。
【００４２】
このコクリエート粒子は、腸溶性であってもよい。このコクリエート粒子は、ゼラチンカプセル内に入れられてもよく、このカプセルが腸溶性コーティングされていてもよい。
【００４３】
当業者は、本発明を実施する効果的な処置のために、最も有効である治療的手段を決定し得る。例えば、「Goodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics」、(第6版、Goodmanら編, MacMillan Publ. Co., New York, 1980)を含む、多くの出典及び参考文献のいずれかに対する言及もまた、なされ得る。
【００４４】
生物学的活性物質を含む本発明の改善されたダイズホスファチジルセリンコクリエートは、簡便に経口で患者に投与され、それによりこのコクリエートが血流に吸収されて、生物活性充填物が、全身に送達される。これは、アンホテリシン-B及びパクリタキセルなどの水不溶性薬物には特に有用である。さらに、多くの疎水性薬物の毒性は、充填物としてアンホテリシン-Bを含むダイズホスファチジルセリンコクリエートについて見ると、実質的に低減される。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の実施を説明するが、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
[実施例1]
(アンホテリシンB結晶コクリエート処方)
ベンチサイズのアンホテリシンB結晶処方の手順:
#1.1処方実験:
1.33mL 0.1N NaOH中43mg(0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には40mgのアンホテリシンB)のアンホテリシンBを、6.6mL 50mMリン酸緩衝液pH7.4中200mgジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS、Avanti若しくはNOF Corporation製)と混合し(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。生じた混合物に29.3mgの塩化カルシウムを加え、結晶コクリエートを形成した。良い結晶化コクリエートを作製するため、脂質:アンホテリシンBの重量比を、約5:1とした。
【００４７】
#1.2処方実験:
次いで、0.6mL 0.lN NaOH中18mgのアンホテリシンBを、3.0mL 50mMリン酸緩衝液pH7.4中90mg DOPS(Avanti若しくはNOF Corporation製)と混合し(リポソームを、5μm、8μm、及び4.5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.33mLの0.5M塩化カルシウム溶液を加えて、結晶アンホテリシンBコクリエートを形成した。良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:アンホテリシンBの重量比を、約5:1とした。
【００４８】
小スケール規模でのアンホテリシンB (アンホテリシンB)結晶コクリエートの手順:
#1.3処方実験:
12.4mL 0.1N NaOH溶液中399mg(0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には372mg)のアンホテリシンBを、62mL 50mMリン酸緩衝液pH7.4中1.86gの50%ダイズPS(American Lecithin Company若しくはLipoid LLC)と合わせ(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。次いで、この懸濁液に抗酸化剤を加えるために、このリポソームの混合物中に、3.72mLエチルアルコール中372mgのビタミンEを加えた。次いで、520mgの塩化カルシウムの粉末を、得られた混合物に加え、アンホテリシンB結晶コクリエートを形成した。アンホテリシンBの良い結晶化コクリエートを作製するため、脂質:アンホテリシンBの重量比を、約5:1とした。
【００４９】
4.5LにスケールアップしたアンホテリシンB結晶処方の手順:
#1.4処方実験:
次いで、707mL 0.lN NaOH溶液中22.75g(0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には21.2g)のアンホテリシンBを、3.533L 50mMリン酸緩衝液pH7.4中106gの50%ダイズPSと混合し(リポソームを、10μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。次いで、コクリエートの安定的な懸濁液を作製するため、この混合物中に、3.72mLエチルアルコール中372mgのビタミンEを加えた。次いで、得られた混合物に194.8mL 1M塩化カルシウムを加え、結晶コクリエートを形成した。コクリエートの最終生成物を、冷凍乾燥機で数日間にわたって凍結乾燥した。良いアンホテリシンBの結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物の重量比を、約5:1とした。
【００５０】
[実施例2]
(クルクミン(顆粒)晶洞様コクリエート処方)
小スケール規模でのクルクミン(顆粒)晶洞様コクリエートの手順:
#2.1処方実験:
まず、1gヒマシ油及び4.0mLエチルアルコール中に50mgクルクミンを溶解し、次いで、100mL滅菌水中19の75%ダイズPS(American Lecithin Company若しくはLipoid LLC)と合わせて(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、クルクミン含有リポソームを形成した。溶液の粘性及び生地の拡散を低減するため、次いで、500mgのウシ血清アルブミン(「BSA」若しくはカゼイン)を、リポソームの混合物に加えた。次いで、得られた混合物に、16.9mLの0.lM塩化カルシウムを加え、クルクミン晶洞様コクリエートを形成した。晶洞様コクリエートの最終生成物を、冷凍乾燥機で数日間凍結乾燥した。クルクミンの良い晶洞様コクリエートを作製するため、脂質:薬物の重量比を、約20:1とした。
【００５１】
#2.2処方実験:
100mg滅菌水中100mgの75%ダイズPSを、500mgカゼイン(若しくはBSA)と混合し、次いで、2.0gヒマシ油及び4.0mLのエチルアルコール中50mgのクルクミンと混合して(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、クルクミン含有リポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、16.9mL 0.1Mの塩化カルシウムを加え、晶洞様コクリエートを形成した。晶洞様コクリエートの最終生成物を、凍結乾燥機で数日間凍結乾燥した。クルクミンの良い晶洞様コクリエートを作製するため、脂質:薬物の重量比を、約20:1とした。
【００５２】
小スケール規模でのクルクミン(晶洞様)結晶処方の手順:
#2.3処方実験:
100mL滅菌水中1000mgの75%ダイズPSを、4.0mLのエチルアルコール中20mgのクルクミンと合わせて(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、クルクミン含有リポソームを形成した。脂質二重層における薬物安定性を助けるため、リポソームの懸濁液に500mgカゼイン(若しくはBSA)を加えた。次いで、得られた混合物に、16.9mL 0.1Mの塩化カルシウムを加え、結晶コクリエートを形成した。結晶コクリエートの最終生成物を、凍結乾燥機で数日間凍結乾燥した。クルクミンの良い結晶化コクリエートを作製するため、脂質:クルクミンの重量比を、約50:1とした。
【００５３】
#2.4処方実験:
100mL滅菌水中1000mgの75%ダイズPSを、4.0mLのエチルアルコール中20mgのクルクミンと合わせて(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、クルクミン含有リポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、16.9mL 0.1Mの塩化カルシウムを加え、結晶コクリエートを形成した。次いで、脂質二重層における薬物安定性を助けるため、コクリエートの懸濁液に500mgカゼイン(若しくはBSA)を加えた。結晶コクリエートの最終生成物を、凍結乾燥機で数日間凍結乾燥した。クルクミンの良い結晶化コクリエートを作製するため、脂質:クルクミンの重量比を、約50:1とした。
【００５４】
[実施例3]
(アンホテリシンB (アンホテリシンB)晶洞様処方物)
ベンチサイズのアンホテリシンB晶洞様処方の手順:
#3.1処方実験:
0.2mL 0.1N NaOH溶液中7.5mg (0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には7mg)のアンホテリシンBを、50mgのヒマシ油と混合し、次いで、1.75mL滅菌水中35mgの50%ダイズPSと混合し(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。アンホテリシンB晶洞様処方の粘着を防ぐため、21mgのBSA若しくはカゼインを、アンホテリシンB晶洞様リポソームの混合物に加えた。アンホテリシンB晶洞様処方物の安定性を増大するため、70μLエチルアルコール中7mgのビタミンEを晶洞様リポソームの混合物に加えた。次いで、得られた混合物に、127μLの0.5M塩化カルシウムを加え、アンホテリシンB晶洞様コクリエートを形成した。アンホテリシンBの良い晶洞様コクリエートを作製するため、脂質:アンホテリシンBの重量比を、約5:1とした。
【００５５】
150mLにスケールアップしたアンホテリシンB晶洞様処方の手順:
#3.2処方実験:
14.3mL 0.1N NaOH溶液中536mg(0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には500mg)のアンホテリシンBを、3.57gのヒマシ油と混合し、次いで、125mL滅菌水中2.5gの50%ダイズPSと混合し(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含む晶洞様リポソームを形成した。次いで、晶洞様処方物の粘着を防ぐため、1.5gのBSA若しくはカゼインを、晶洞様リポソームの混合物に加えた。次いで、アンホテリシンB晶洞様処方物の安定性を増大するため、2.5mLエチルアルコール中250mgのビタミンEを晶洞様リポソームの混合物に加えた。次いで、得られた混合物に、8.88mLの0.5M塩化カルシウムを加え、晶洞様コクリエートを形成した。最終混合物のpHを、0.3mL 1N HClで中性に調整した。アンホテリシンBの良い晶洞様コクリエートを作製するため、脂質:アンホテリシンBの重量比を、約5:1とした。
【００５６】
#3.3処方実験:
125mL滅菌水中2.5gの50%ダイズPSを、1.5gのBSA若しくはカゼインと混合し、次いで、3.57gのヒマシ油を含む14.3mL 0.1N NaOH  溶液中536mg(0.932mg/mgの濃度での力価アッセイに基づくと実際には500mg)のアンホテリシンBと混合し(リポソームを、5μmフィルターで濾過した)、アンホテリシンBを含むリポソームを形成した。次いで、安定な晶洞様処方物を作製するため、2.5mLエチルアルコール中250mgのビタミンEを晶洞様リポソームの混合物に加えた。最終混合物のpHを、0.3mL 1N HClで中性に調整した。次いで、得られた混合物に、8.88mLの0.5M塩化カルシウムを加え、晶洞様コクリエートを形成した。次いで、この晶洞様コクリエートを凍結乾燥を用いて濃縮し、約5:1の脂質:アンホテリシンBの重量比で、任意の濃度(実験の要求に基づく)で滅菌水を伴う晶洞様コクリエートを、得た。
【００５７】
[実施例4]
(インビトロ研究のためのアミカシン結晶コクリエート処方物)
インビトロ研究のためのアミカシン処方の手順:
#4.1処方実験:
1.0mL蒸留脱イオン(D.D)水中2mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、そして2.0mL滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、この混合物を、滅菌水で0.5mg/mLのアミカシンの薬物濃度に調整した。アミカシンの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比を、10:1とした。
【００５８】
#4.2処方実験:
1.0mL D.D水中2mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0mL滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するため、コクリエートの混合物に52μl滅菌水中15mgの塩化ナトリウムを添加した。次いで、この混合物を、滅菌水で0.5mg/mLのアミカシンの薬物濃度に調整した。また、最終生成物は、0.066Mの塩化ナトリウムを含んだ。アミカシンの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比を、10:1とした。
【００５９】
#4.3  処方実験:
1.0mL D.D水中2mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0mL滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するため、コクリエートの混合物に264μl滅菌水中76mgの塩化ナトリウムを添加した。次いで、この混合物を、滅菌水で0.5mg/mLのアミカシンの薬物濃度に調整した。また、最終生成物は、0.33Mの塩化ナトリウムを含んだ。アミカシンの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比を、10:1とした。
【００６０】
#4.4  処方実験:
1.0mL D.D水中2mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0mL滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するため、コクリエートの混合物に524μl滅菌水中152mgの塩化ナトリウムを添加した。次いで、この混合物を、滅菌水で0.5mg/mLのアミカシンの薬物濃度に調整した。また、最終生成物は、0.66Mの塩化ナトリウムを含んだ。アミカシンの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比を、10:1とした。
【００６１】
[実施例5]
(インビボ研究のためのアミカシン結晶コクリエート処方物)
インビボ研究のためのアミカシン処方の手順:
#5.1処方実験:
20mL D.D水中200mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、200mL滅菌水中2000mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、17mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、コクリエートを、凍結乾燥下で濃縮し、10:1の脂質:アミカシン比を有する結晶コクリエート(約6.7mg/mL)を得た。
【００６２】
#5.2処方実験:
20mL D.D水中200mgアミカシンを、0.22μmフィルターを通して濾過し、200mL滅菌水中2000mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターで濾過した)、アミカシンを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、17mLの0.1M塩化カルシウムを添加し、コクリエートを形成した。次いで、結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するため、コクリエートの混合物に3.88mL滅菌水中1125.2mgの塩化ナトリウムを添加した。次いで、コクリエートを、凍結乾燥下で濃縮し、10:1の脂質:アミカシン比を有する結晶コクリエート(約6.7mg/mL及び0.66M塩化ナトリウム)を得た。
【００６３】
[実施例6]
(アミノグルコシド結晶コクリエート処方物のインビトロ研究)
マクロファージ及び感染
細胞株:マウス腹腔マクロファージ細胞株(Raw 246.7)、及び/又はTHP-1、ヒトマクロファージ細胞株。細胞を、それぞれ、5%熱不活化ウシ胎仔血清を補ったDMEM及びRPMI-1640の中で培養した。マクロファージ単層を、24ウェル組織培養プレートに105のマクロファージを加えることによって、確立した。24時間後、単層を感染させ、そしてこの感染を、1時間にわたって生じさせ、次いで、細胞外細菌を、洗浄によって除去した。ウェル内容物のいくつかを溶解させ、そしてMiddlebrook 7H10アガープレート上にプレート培養し、細菌の細胞内接種を決定した。残りのウェルを、特許請求の範囲に記載の方法に従って調製した、種々のアミノグルコシド(すなわち、アミカシン、ゲンタマイシン及びパロモマイシン)コクリエートによって、毎日処理した。処理後、細胞単層を溶解し、そして溶解物を7H10アガー上にプレート培養して、細胞内充填物を定量した。
【００６４】
【表１】
2018203750.tif 000003
表1に示される通り、アミノグルコシドコクリエートは、対応する非コクリエート化遊離薬物と比較して、種々の細菌に対して増強された有効性を有する。
【００６５】
[実施例7]
(アミカシン結晶コクリエート処方物のインビトロ研究)
方法:実施例4に示される通り、アミカシンコクリエート(Amkcch)処方物を、アミカシンコクリエート化効率及び粒子サイズについて、使用するPSの種類、PS:生物学的活性物質の比、PS:Ca++の比、及びNaCl濃度を変えることにより、最適化した。細胞内Ma感染に対するAmkcchの有効性を、M.アビウム株MAC 101若しくはMAC 109に感染したマウス腹腔マクロファージを用いて評価した。マウス腹腔マクロファージ(Mo) Raw 264.7細胞を、105細胞/ウェルにて播種した。Mo単層を、1:10の比で1時間にわたって感染させ、細胞外細菌を除去した。単層を、遊離のアミカシン及び/又はコクリエート調製物で4日間にわたって処理し、細胞内細菌の数を決定した。アッセイを、3回繰り返した。
結果:未処理の対照Ma株は、3.8×105〜4.9×106の範囲内に増殖した。遊離のアミカシン(10及び20mg/mL)で処理したMo内のMaは、それぞれ細菌6.1×104個及び3.4×104個にまで殺傷された。最適化Amkcch(10及び20mg/mL)は、10倍を超えて増強された有効性を示し、Moの中の細菌数を3.9×103個及び1.7×103個にまで減らした(遊離のアミカシンと比較してp<0.05)。
【００６６】
結論:図1に示される通り、アミカシンコクリエート処方物は、マクロファージ内のM.アビウム感染に対し、遊離のアミカシンよりも10〜50倍活性である。アミカシンのコクリエート調整物は、マクロファージ内のMa株に対し、有意且つ増強された活性を示し、このことは、コクリエートは、遊離のアミカシンよりも長い間、より高い細胞内濃度を達成したことを示唆する。
【００６７】
[実施例8]
(アミカシン結晶コクリエート処方物のインビボ研究)
アミカシンコクリエートの処方を、開発した。アミカシンコクリエートのマイコバクテリウム・アビウム複合体(MAC)に対するインビボ有効性を、C57BL/6 blackマウスを用いて評価した。
- 各群12匹のマウスに、尾静脈注射により、M.アビウム101(8.1×107細菌/マウス)を感染させた。
- 7日間後、6匹のマウスを回収し、脾臓におけるMACの数を定量して、細菌負荷の基線を確立した(0時点)。
- 図2及び図3に示す通り、マウスを、種々のアミカシンコクリエートで処理した。
- 2週間にわたり、1.0mgのアミカシン/日にて。
- マウスを、3週と2日間後(処理の2週間後)に回収し、脾臓をホモジナイズして7H10アガー上に配置した。
- プレート上のコロニーを係数し、データを分析した。
図2及び図3に示す通り、I.P.若しくは経口で投与されたアミカシンコクリエートは、活性であり、脾臓における細菌負荷の量を減らした。高塩濃度のアミカシンコクリエート調製物は、経口であり
結論:アミカシンコクリエート処方物の経口送達は、IP遊離アミカシンに類似のインビボ有効性を示した。
【００６８】
[実施例9]
(インビトロ研究のためのアミノグルコシド処方のための高塩手順)
#9.1処方実験:
1.0ml D.D水中の2mgのアミノグルコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターを通して濾過した)、アミノグルコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mlの0.1M塩化カルシウムを加え、コクリエートを形成した。次いで、この混合物を、アミノグルコシドの薬物濃度0.5mg/mlに滅菌水で調整した。アミノグリコシドの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比は、約10:1であった。
【００６９】
#9.2  処方実験:
1.0ml D.D水中の2mgのアミノグルコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターを通して濾過した)、アミノグルコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mlの0.1M塩化カルシウムを加え、コクリエートを形成した。結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するために、次いで、52μl滅菌水中15mgの塩化ナトリウムをコクリエートの混合物に加えた。次いで、この混合物を、アミノグルコシドの薬物濃度0.5mg/mlに滅菌水で調整した。また、最終生成物は、0.066Mの塩化ナトリウムを含む。アミノグリコシドの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比は、約10:1であった。
【００７０】
#9.3  処方実験:
1.0ml D.D水中の2mgのアミノグルコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターを通して濾過した)、アミノグルコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mlの0.1M塩化カルシウムを加え、コクリエートを形成した。結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するために、次いで、264μl滅菌水中76mgの塩化ナトリウムをコクリエートの混合物に加えた。次いで、この混合物を、アミノグルコシドの薬物濃度0.5mg/mlに滅菌水で調整した。また、最終生成物は、0.33Mの塩化ナトリウムを含む。アミノグリコシドの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比は、約10:1であった。
【００７１】
#9.4  処方実験:
1.0ml D.D水中の2mgのアミノグルコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSと合わせ(リポソームを、5、0.8及び0.45μmフィルターを通して濾過した)、アミノグルコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.206mlの0.1M塩化カルシウムを加え、コクリエートを形成した。結晶コクリエートの凝集サイズを縮小するために、次いで、524μl滅菌水中152mgの塩化ナトリウムをコクリエートの混合物に加えた。次いで、この混合物を、アミノグルコシドの薬物濃度0.5mg/mlに滅菌水で調整した。また、最終生成物は、0.66Mの塩化ナトリウムを含む。アミノグリコシドの良い結晶化コクリエートを作製するために、脂質:薬物比は、約10:1であった。
【００７２】
【表２】
2018203750.tif 000004
コクリエート化百分率を、コクリエートを形成し、次いで遠心分離した後の、上清中のアミカシンの量を測定すること(ニンヒドリンアッセイ)により、決定する。次いで、上清中の量を、コクリエート化プロセスの間の総量から減算する。これは、上清の百分率として報告される。上清の百分率が低いほど、コクリエート化の効率がより高い。表2において列挙される結果は、コクリエート化において、50%ダイズPSが85% PSよりも効率的であることを明らかに示している。
【００７３】
【表３】
2018203750.tif 000005
コクリエート化百分率を、コクリエートを形成し、次いで遠心分離した後の、上清中のアミカシンの量を測定すること(ニンヒドリンアッセイ)により、決定する。次いで、上清中の量を、コクリエート化プロセスの間の総量から減算する。これは、上清の百分率として報告される。上清の百分率が低いほど、コクリエート化の効率がより高い。表3において列挙される結果は、コクリエート化において、50%ダイズPSが85% PSよりも効率的であることを明らかに示している。
【００７４】
【表４】
2018203750.tif 000006
コクリエート化百分率を、コクリエートを形成し、次いで遠心分離した後の、上清中のアミカシンの量を測定すること(ニンヒドリンアッセイ)により、決定する。次いで、上清中の量を、コクリエート化プロセスの間の総量から減算する。これは、上清の百分率として報告される。上清の百分率が低いほど、コクリエート化の効率がより高い。表4において列挙される結果は、コクリエート化において、50%ダイズPSが99.99% PSよりも効率的であることを明らかに示している。
【００７５】
図4は、PS特性に関連するゲンタマイシンコクリエート化を示す。表1〜3と同じく、図4に列挙される結果は、より低い胆汁酸塩濃度におけるゲンタマイシンのコクリエート化において、50%ダイズPSが85% PS若しくは99.99% PSよりも効率的であることを明らかに示している。
【００７６】
[実施例10]
(アミカシン、ゲンタマイシン及びパロモマイシンの胆汁酸塩コクリエートのコクリエート化効率)
#10.1  インビトロ研究のための、胆汁酸塩による(カルシウムの後の)アミノグリコシド処方についての手順。
種々の量の胆汁酸塩(Sigma -Aldrichカタログ番号48305 Flukaコール酸ナトリウム塩約50%、デオキシコール酸ナトリウム塩約50%)によるアミノグリコシド処方物の結晶コクリエート：
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、20.4mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、11.3mM含んだ。
【００７７】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20 mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、13.6mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、7.8mM含んだ。
【００７８】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、6.8mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、3.9mM含んだ。
【００７９】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、3.4mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、1.95mM含んだ。
【００８０】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、1.7mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、0.97mM含んだ。
【００８１】
#10.2  インビトロ研究のための、胆汁酸塩による(カルシウムの前の)アミノグリコシド処方についての手順。
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、20.4mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、11.3mM含んだ。
【００８２】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、13.6mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、7.8mM含んだ。
【００８３】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、6.8mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、3.9mM含んだ。
【００８４】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、3.4mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、1.95mM含んだ。
【００８５】
0.2ml滅菌水中2mgのアミノグリコシドを、0.22μmフィルターを通して濾過し、2.0ml滅菌水中20mgの50%ダイズPSリポソームと合わせ(ダイズPSリポソームを、まず、5、0.8及び0.45μmのフィルターを通して濾過した)、アミノグリコシドを含むリポソームを形成した。アミノグリコシドコクリエート結晶の粒子サイズをより小さくするため、次いで、1.7mgの胆汁酸塩をこのアミノグリコシドコクリエートの混合物に添加した。次いで、得られた混合物に、0.159mlの0.1M塩化カルシウムを添加して勢いよく混合し、アミノグリコシドコクリエートを形成した。次いで、この混合物を、緩衝液により、懸濁液として、0.5mg/mlのアミノグリコシドの薬物濃度に調整した。最終アミノグリコシドコクリエート処方物は、0.97mM含んだ。
【００８６】
図5〜11は、アミカシン胆汁酸塩、ゲンタマイシン胆汁酸塩及びパロモマイシン胆汁酸塩を含むアミノグリコシド胆汁酸塩の、コクリエート化効率を示す。
コクリエート化百分率を、コクリエートを形成し、次いで遠心分離した後の、上清中のアミノグリコシド胆汁酸塩の量を測定すること(ニンヒドリンアッセイ)により、決定する。次いで、上清中の量を、コクリエート化プロセスの間の総量から減算する。これらの結果は、より低い胆汁酸塩濃度におけるコクリエート化において、50%ダイズPSが75% PS若しくは99.99% PSよりも効率的であることを明らかに示している。Aは、コクリエート化の後に添加された胆汁酸塩である。Bは、コクリエート化の前に添加された胆汁酸塩である。
【図１】
2018203750.tif 000007
【図２】
2018203750.tif 000008
【図３】
2018203750.tif 000009
【図４】
2018203750.tif 000010
【図５】
2018203750.tif 000011
【図６】
2018203750.tif 000012
【図７】
2018203750.tif 000013
【図８】
2018203750.tif 000014
【図９】
2018203750.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
2018203750.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月7日(2018.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約40重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、
多価カチオン、及び
生物学的活性物質
を含むコクリエート。
【請求項２】
ダイズベースのリン脂質が、少なくともダイズホスファチジルセリン及びホスファチジン酸で構成される混合物である、請求項１に記載のコクリエート。
【請求項３】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１又は２に記載のコクリエート。
【請求項４】
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項３に記載のコクリエート。
【請求項５】
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項６】
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項５に記載のコクリエート。
【請求項７】
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項８】
多価カチオンが、Ca++である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項９】
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１０】
生物学的活性物質が、水性媒体中で親水性であるか、又は生物学的活性物質が、水性媒体中で疎水性であるが、コクリエートを形成する前にpH10以上の水性媒体に可溶化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１１】
生物学的活性物質が、アミノグリコシドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１２】
生物学的活性物質が、アミカシンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１３】
コクリエートが、胆汁酸塩をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項１４】
ダイズベースのリン脂質対胆汁酸塩の重量比が、20：1と0.5:1の間、好ましくは10:1と3:1の間である、請求項１３に記載のコクリエート。
【請求項１５】
ダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを生産するための方法であって、
a．(i)ダイズホスファチジルセリンを、脂質二重層の約40重量%〜70重量%の量で含む脂質二重層、及び(ii)生物学的活性物質の充填物を有するリポソームを、水性媒体中で調製する工程、
b．多価カチオンを、(a)のリポソームの懸濁液に添加し、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを形成する工程、並びに
c．このダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを集める工程を含む上記方法。
【請求項１６】
脂質二重層が約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
脂質二重層が約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的活性物質が、水性媒体中で親水性であり、リポソームの懸濁液を含む水性媒体が6.5〜7.5のpHを有する緩衝環境であり、生物学的活性物質の充填物が、リポソームに添加される前、pH10以上である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リポソームの懸濁液が、ホスフェートによって緩衝化されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
多価カチオンが、Ca++である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性物質が、アミカシンである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
脂質二重層対生物学的活性物質の重量比が、約3:1と約20:1の間である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程(b)の前に(a)のリポソームの懸濁液に胆汁酸塩を加える工程、又は工程(b)の後にダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートに胆汁酸塩を加える工程をさらに含み、脂質二重層対胆汁酸塩の重量比が、20:1と0.5:1の間、好ましくは、10:1と3:1との間である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
真菌感染の処置のための組成物であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)抗真菌剤を含む有効な量のコクリエートを含む、上記組成物。
【請求項２９】
抗真菌剤が、アンホテリシンBであり、アンホテリシンBが、コクリエートを形成する前にpH10以上の水性媒体に可溶化されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
細菌感染の処置のための組成物であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)アミノグリコシドを含む有効な量のコクリエートを含む、上記組成物。
【請求項３１】
アミノグリコシドが、アミカシンである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ダイズベースのリン脂質が、約50重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコクリエート。
【請求項３３】
ダイズベースのリン脂質が、約50重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ダイズベースのリン脂質が、約50重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
胆汁酸塩をさらに含む、請求項２８〜３１及び３４のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
図5〜11は、アミカシン胆汁酸塩、ゲンタマイシン胆汁酸塩及びパロモマイシン胆汁酸塩を含むアミノグリコシド胆汁酸塩の、コクリエート化効率を示す。
コクリエート化百分率を、コクリエートを形成し、次いで遠心分離した後の、上清中のアミノグリコシド胆汁酸塩の量を測定すること(ニンヒドリンアッセイ)により、決定する。次いで、上清中の量を、コクリエート化プロセスの間の総量から減算する。これらの結果は、より低い胆汁酸塩濃度におけるコクリエート化において、50%ダイズPSが75% PS若しくは99.99% PSよりも効率的であることを明らかに示している。Aは、コクリエート化の後に添加された胆汁酸塩である。Bは、コクリエート化の前に添加された胆汁酸塩である。
（付記）
（付記１）
約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、
多価カチオン、及び
生物学的活性物質
を含むコクリエート。
（付記２）
ダイズベースのリン脂質が、少なくともダイズホスファチジルセリン及びホスファチジン酸で構成される、付記１に記載のコクリエート。
（付記３）
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記１又は２に記載のコクリエート。
（付記４）
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記３に記載のコクリエート。
（付記５）
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、アミノグリコシド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、付記１〜４のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記６）
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、付記５に記載のコクリエート。
（付記７）
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、付記１〜６のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記８）
多価カチオンが、Ca++である、付記１〜７のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記９）
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、付記１〜８のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１０）
生物学的活性物質が、クルクミンである、付記１〜８のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１１）
生物学的活性物質が、アミノグリコシドである、付記１〜８のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１２）
生物学的活性物質が、アミカシンである、付記１〜８のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１３）
コクリエートが、胆汁酸塩をさらに含む、付記１〜１２のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１４）
ダイズベースのリン脂質対胆汁酸塩の重量比が、20：1と0.5:1の間、好ましくは10:1と3:1の間である、付記１〜１３のいずれか一つに記載のコクリエート。
（付記１５）
ダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを生産するための方法であって、
a．(i)ダイズホスファチジルセリンを、脂質二重層の約40重量%〜74重量%の量で含む脂質二重層、及び(ii)生物学的活性物質の充填物を有するリポソームを、水性媒体中で調製する工程、
b．多価カチオンを、(a)のリポソームの懸濁液に添加し、ダイズホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを形成する工程、並びに
c．このダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートを集める工程を含む上記方法。
（付記１６）
脂質二重層が約45重量%〜70重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記１５に記載の方法。
（付記１７）
脂質二重層が約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記１６に記載の方法。
（付記１８）
工程(a)において、リポソームの懸濁液を含む水性媒体が6.5〜7.5のpHを有する緩衝環境であり、生物学的活性物質の充填物が、リポソームに添加される前、pH10以上である、付記１５〜１７のいずれか一つに記載の方法。
（付記１９）
リポソームの懸濁液が、ホスフェートによって緩衝化されている、付記１８に記載の方法。
（付記２０）
生物学的活性物質が、タンパク質、小ペプチド、ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド系抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助食品、薬草製品、ビタミン及び血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、付記１５〜１９のいずれか一つに記載の方法。
（付記２１）
生物学的活性物質が、アミノグリコシド、アンホテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、カバマゼピン(cabamazepine)、クルクミン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン類、テストステロン類、ステロイド類、フェニトイン、エルゴタミン類、カンナビノイド類、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル及びタキソテレからなる群より選択される少なくとも1つのメンバーである、付記２０に記載の方法。
（付記２２）
多価カチオンが、Ca++、Zn++、Ba++、又はMg++である、付記１５〜２１のいずれか一つに記載の方法。
（付記２３）
多価カチオンが、Ca++である、付記２２に記載の方法。
（付記２４）
生物学的活性物質が、アンホテリシンBである、付記１５〜２３のいずれか一つに記載の方法。
（付記２５）
生物学的活性物質が、クルクミンである、付記１５〜２３のいずれか一つに記載の方法。
（付記２６）
生物学的活性物質が、アミカシンである、付記１５〜２３のいずれか一つに記載の方法。
（付記２７）
脂質二重層対生物学的活性物質の重量比が、約3:1と約20:1の間である、付記１５〜２６のいずれか一つに記載の方法。
（付記２８）
工程(b)の前に(a)のリポソームの懸濁液に胆汁酸塩を加える工程、又は工程(b)の後にダイズベースのホスファチジルセリン/生物学的活性物質コクリエートに胆汁酸塩を加える工程をさらに含み、脂質二重層対胆汁酸塩の重量比が、20:1と0.5:1の間、好ましくは、10:1と3:1との間である、付記１５〜２７のいずれか一つに記載の方法。
（付記２９）
真菌感染を有する患者を処置する方法であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)抗真菌剤を含む抗真菌に有効な量のコクリエートを患者に投与することを含む、上記方法。
（付記３０）
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記２９に記載の方法。
（付記３１）
抗真菌剤が、アンホテリシンBである、付記２９又は３０に記載の方法。
（付記３２）
細菌感染を有する患者を処置する方法であって、(i)約40重量%〜74重量%のダイズホスファチジルセリンを含むダイズベースのリン脂質、(ii)多価カチオン、及び(iii)抗生物質を含む抗真菌に有効な量のコクリエートを患者に投与することを含む、上記方法。
（付記３３）
ダイズベースのリン脂質が、約45重量%〜55重量%のダイズホスファチジルセリンを含む、付記３２に記載の方法。
（付記３４）
抗生物質が、アミノグリコシドである、付記３２又は３３に記載の方法。
（付記３５）
抗生物質が、アミカシンである、付記３２又は３３に記載の方法。
【外国語明細書】
2018203750000001.pdf