(57)【要約】【課題】シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクターの提供。【解決手段】シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体と、関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含むレンチウイルスベクター粒子が提供される。レンチウイルスベクター粒子は、（ａ）シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体を含むエンベロープ、および（ｂ）関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含み、本Ｅ２糖タンパク質変異体は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、本Ｅ２糖タンパク質変異体は、参照配列（ＨＲ株）と比較して、ヘパラン硫酸への結合が減少している。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離核酸分子または方法または治療ワクチンまたは予防ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、概して、標的遺伝子送達に関し、より具体的には、樹状細胞を標的とし、したがって樹状細胞ワクチン接種に使用することができるエンベロープを含む、偽型レンチウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始および制御に必須な抗原提示細胞である。ＤＣは、抗原を捕捉および処理し、末梢からリンパ器官に移動して、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に制限される様式で、抗原を静止Ｔ細胞に提示することができる。これらの細胞は、骨髄（ＢＭ）に由来し、樹状形態および高い可動性を示す。特化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのＤＣの発見は、ＤＣにインビトロで特異的抗原を負荷することを伴う、ＤＣに基づく免疫付与／ワクチン接種の戦略における試みを加速させた（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、これらの試みはすべて、自己ＤＣにエクスビボで特異的抗原を負荷し、次いで患者に投与することを含む、患者固有の治療という労働集約的な準備を伴う。
【０００３】
代替戦略は、組み換えウイルス系ベクターを、指定抗原をコードする遺伝子を宿主細胞に対して直接送達する機序として利用することである。この例において、所望の適合免疫応答の誘導を通して、発現した遺伝子産生物が治療利益を提供する。しかしながら、安全かつ有効なシステムを達成するには多数の困難がある。これらの困難のうちのいくつかとしては、所望の一連の宿主細胞を標的とするベクターを設計すること、適切な送達システムを提供すること、有効な免疫応答を引き出すように所望の抗原を発現させること、および指定されたヒト被検体集団に渡って広く利用されることができるように、組み換えウイルスベクターウイルスの十分に力価の高い薬学的組成物を常に製造することが含まれる。研究室規模のシステムを、医薬産業によって産生されることができる製品に発展させることにおいて、後者は特に困難である。
【０００４】
研究室では多くのレンチウイルスベクターが、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質で偽型化される。ＶＳＶエンベロープタンパク質は、多くの細胞型を標的とすることができるため（「汎親和性」エンベロープ）、これはモデルシステムとして広く使用され、産生システムは、概して高い力価を提供する。
【０００５】
本明細書に開示されるシンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込まれる。通常、ウイルス膜（エンベロープ）は、単一の前駆体タンパク質の開裂から産生される、２つの糖タンパク質ヘテロ二量体Ｅ１およびＥ２の三量体の複数の複製を含む。前駆体タンパク質は、そのＮからＣ末端に、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１タンパク質を含む。小Ｅ３糖タンパク質は、Ｅ２タンパク質が膜に転位するためのシグナル配列として機能し、フリンまたはいくつかの他のＣａ２＋依存セリンプロテイナーゼによって、Ｅ２から開裂する。６Ｋタンパク質は、Ｅ１タンパク質が膜に移動するためのシグナル配列として機能し、次に、前駆体タンパク質から開裂する。
【０００６】
Ｅ１およびＥ２糖タンパク質は、それぞれ膜貫通領域を有し、Ｅ２は、約３３残基の細胞質ドメインを有するが、Ｅ１の細胞質尾部は非常に短い（約２残基）。Ｅ１およびＥ２はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。
【０００７】
本技術分野において記載されるシンドビスウイルスの単離体は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）との相互作用を介して、細胞に感染すると考えられる。特許文献１において、レンチウイルスパッケージ化システムが記載され、Ｅ３／Ｅ２エンベロープ融合タンパク質（ＳＶＧｍｕと呼ばれる）は、多数の修飾を含有し、タンパク質のＨＳへの結合を減少させるが、ＤＣ−ＳＩＧＮ表面分子を介して、ＤＣへの結合および感染を維持することが意図される。特許文献１において、野生型ＳＶＧのｃＤＮＡは、カリフォルニア工科大学のＤｒ．Ｊ．Ｈ．Ｓｔｒａｕｓｓ研究室から得られ、ＰＣＲによってｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化され、プラスミドｐＳＶＧを生成した。１０残基のタグ配列を、ＰＣＲ突然変異生成によって、アミノ酸７１と７４の間のＥ２タンパク質に挿入し、ＨＳ結合部位を崩壊させた。追加の欠失をＳＶＧのＥ３糖タンパク質に導入して、アミノ酸６１〜６４を除去した。この修飾ＳＶＧは、ＳＶＧｍｕとして指定された（特許文献１の配列番号１１）。ＳＶＧｍｕのｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐＳＶＧｍｕと指定される、特許文献１の配列番号３）において、ＣＭＶプロモーターの下流にクローン化された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１１６３６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｐａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．２００５．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６
【非特許文献２】Ｆｉｇｄｏｒ，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態
ＳＶＧｍｕ偽型ウイルス粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗原を発現する細胞を選択的に形質導入することができるが、このシステムのいくつかの点は、治療用途に適切でない。例えば、Ｅ３／Ｅ２融合タンパク質は、インフルエンザヘマグルチニンの抗原エピトープを示し、ウイルスゲノムは、宿主染色体に組み込まれ、有害な宿主遺伝子を活性化することができ、本発明者らは、ウイルスの力価が、ＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽型化した粒子の力価と比較して低いことを発見した。重要なことに、Ｅ２糖タンパク質からのＥ３の適切な処理を回避する変異（いわゆる「ｐＥ２変異体」）を有する、シンドビスウイルス株、例えば、ＳＶＧｍｕは、許容細胞株において成長不良であり、マウスの病原性を深刻に減衰させる。
【００１１】
本発明の３つの例示的なＥタンパク質変異体に対して、レンチウイルスベクターを偽型化するための国際公開第ＷＯ２００８／０１１６３６号において使用されるＳＶＧｍｕ  Ｅ３−Ｅ２タンパク質のアラインメントが、図１に示される。図１に示される番号付けは、シンドビスウイルスエンベロープタンパク質のＨＲ株を参照する。他に指定のない限り、本明細書で使用される番号付けは、シンドビスウイルスの本株を参照する。本発明者らは、ＳＶＧｍｕタンパク質を修飾して、向上したレンチウイルス産生システムを提供した。本発明のウイルス粒子は、ＳＶＧｍｕを使用するものよりも著しく高い力価で産生され、より強い免疫反応も刺激する。さらに、偽型レンチウイルス粒子は、ＤＣに対する選択性を維持しながら、向上した力価および向上した感染性を有する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、（ａ）１６０Ｘが存在しないか、もしくは非酸性アミノ酸である、配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または樹状細胞に感染することができる、その配列番号１の変異体を含むエンベロープであって、このＥ２糖タンパク質もしくはその変異体がＥ３に融合されないエンベロープと、（ｂ）関心の配列を含むレンチウイルスゲノムとを含む、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスベクター粒子を提供する。
【００１３】
変異体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合することができてもよい。好ましくは、ＨＲ株からの基準タンパク質と比較して、ヘパラン硫酸への結合も減少している。ＨＲ株のＥ２タンパク質は、配列番号１８として示される。
【００１４】
好ましくは、１６０Ｘは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の１つである。一態様において、１６０Ｘは存在しないか、またはグリシン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンである。一実施形態において、Ｘはグリシンである。
【００１５】
配列番号１の変異体は、１６０Ｘが維持され、かつ上に定義したとおりである、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有する配列を含むものとして定義される。変異体は、独立して欠失しているか、または非塩基性アミノ酸で置換される、残基５０〜１８０に渡る領域内のリシンおよびアルギニンの１つ以上を有してもよい。一実施形態において、非塩基性アミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。
【００１６】
一態様において、残基Ｘは、欠失、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択され、残基５０〜１８０に渡る領域内の１つ以上のリシンおよびアルギニンは、独立して欠失しているか、または非塩基性アミノ酸で置換される。
【００１７】
別の態様において、Ｘは、欠失、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択され、残基５０〜１８０に渡る領域内の１つ以上のリシンおよびアルギニンは、好ましくは少なくとも１５９位を含み、独立して欠失しているか、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸で置換される。
【００１８】
置換または欠失されてもよい正電荷アミノ酸の候補には、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９および１５９におけるリシン、ならびに残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、および１７２におけるアルギニンが含まれる（番号付けは配列番号１を参照）。置換される場合、置換は、グルタミン酸またはアスパラギン酸から独立して選択されてもよい。
【００１９】
特定の実施形態において、リシン残基７０、７６、および１５９の１つ以上が欠失または置換される。置換される場合、置換は、グルタミン酸またはアスパラギン酸から独立して選択されてもよい。
【００２０】
シンドビスウイルスは、ＲＮＡゲノムを有するため、上述されるものに加えて、置換、挿入、または欠失を含む変異は、上に定義される配列番号１に対する相同性パーセンテージの範囲内で、配列番号１のＥ２配列の一部に対して行われてもよい。例えば、配列番号１の変異体は、３位がＴまたはＶ、２３位がＶ、２０９位がＲ、２６４位がＧ、および３９３位がＨである場合に存在する。これらの変化の１つ以上、または配列番号１に対する他の変異が行われてもよいが、但し、変異体がＤＣに感染する能力を維持することとする。
【００２１】
一実施形態において、変異体は、配列番号１の残基７０〜７６の領域内に挿入を全く含有しない。本実施形態において、配列番号１の残基７１〜７５の配列は、非荷電であり得るか、または変異体がＤＣに感染する能力に影響しない、１つもしくは２つの置換を含んでもよい。
【００２２】
ある例において、Ｅ２タンパク質は、最初に、少なくともＥ３との融合において、またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。ある実施形態において、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現する。シンドビスウイルスは、天然にはポリタンパク質の一部としてＥ２を発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、および６Ｋ／Ｅ１の結合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および開裂される配列を有する。Ｅ３／Ｅ２ポリタンパク質配列は、配列番号２０として提示される。通常、Ｅ３／Ｅ２結合は、Ｅ３／Ｅ２ポリタンパク質の残基６５〜６６の間で、フリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって開裂される。フリンは、２つのアミノ酸によって分離される対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるＥ３／Ｅ２開裂を維持するために、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ、配列番号２６）は、２つのアミノ酸分離を有する２つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持する必要がある。
【００２３】
本発明の一実施形態において、ポリタンパク質は、配列番号２０の残基１〜６５に対応するＥ３配列を含むか、またはその変異体であって配列番号２０の残基１〜６５に対して少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有し、ここで残基６２〜６５はＲＳＫＲであり（配列番号２７）、変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができる変異体を含む。好ましくは、ポリタンパク質のＥ２部分は、本明細書で上に記載される実施形態のいずれかである。
【００２４】
あるいは、Ｅ３／Ｅ２フリン開裂配列または他の開裂配列のいずれかの代わりに、異なる開裂配列を使用することができる。認識および開裂部位は、限定されないが、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ（例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、ＩＸａ因子、Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼに組み込むことができる。これらの酵素に対する認識および開裂部位配列は、よく知られている。
【００２５】
そのような開裂部位が使用される場合、それは配列番号２０の少なくとも残基１〜６０、例えば、残基１〜６１もしくは１〜６２を含む、Ｅ３ポリタンパク質、または配列番号２０の対応する数の残基に対して少なくとも８０％の配列同一性、もしくは少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、もしくは９８％の配列同一性を有する、その変異体に導入されてもよく、これらはＣ末端において本開裂配列に直接融合され、順にポリタンパク質のＥ２部分に融合される。好ましくは、ポリタンパク質のＥ２部分は、本明細書において上に記載される実施形態のいずれかである。
【００２６】
本発明のＥ２タンパク質配列は、１６０Ｘが以下の表に定義されるとおりである、配列番号１の変異体を含み、タンパク質は、以下の残基７０、７６ならびに１５９および１６０以外は、配列番号１において提示されるとおりであり、それは以下のとおりである。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
随意に、上記配列のそれぞれは、配列番号１に対して１つ以上のさらなる変更を含んでもよいが、未変更である配列番号１の残基７１〜７５を有するか、または変異体がＤＣに感染する能力に影響しないが、本領域内のアミノ酸の数を変更しない１つもしくは２つの置換を有してもよい。
【００２９】
本発明のさらなるＥ２タンパク質配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５であり、残基１６０は、Ｇｌｙの代わりにＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌである。そのような変異体は、未変更である配列番号１の残基７１〜７５も含み得るか、または変異体がＤＣに感染する能力に影響しないが、本領域内のアミノ酸の数を変更しない、１つもしくは２つの置換を有してもよい。
【００３０】
随意に、配列番号３〜１５のＥ２配列、または上記２つの段落に記載されるさらなる変異体は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＥ２配列を提供するように、他の位置において異なってもよい。「少なくとも８０％の配列同一性」は、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、または９８％の配列同一性のいずれをも含む。
【００３１】
上記実施形態において、配列番号２０の６６位に対応する、第１のＥ２残基は、Ｓｅｒであってもよい。
【００３２】
上に示されるように、配列番号３〜１５のいずれかを含む、本発明のＥ２配列、および前記３つの段落に記載されるその変異体は、少なくともＥ３／Ｅ２配列、および好ましくはシンドビスＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質配列を含むポリタンパク質から発現されてもよい。実施形態のそれぞれにおけるＥ３ポリタンパク質配列は、配列番号２０の残基１〜６５、または非天然開裂部位を有する変異体を含む、上述されるその変異体のものであってもよい。
（発明の概要）
本特許出願は、関心の配列を有するゲノムとアルボウイルスの糖タンパク質を含むエンベロープとを含む、偽型レンチウイルスベクターを対象とする。アルボウイルス糖タンパク質は、シンドビスウイルス、デングウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来し得る。特に、糖タンパク質がシンドビスウイルスからのＥ２タンパク質である場合、Ｅ２タンパク質は、配列番号１と比較して、残基１６０において少なくとも１つのアミノ酸変更を有する。アミノ酸変更は、欠失であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であることができる。Ｅ２糖タンパク質は、あるいは配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異タンパク質であり得、欠失またはグルタミン酸以外のアミノ酸のいずれかである、残基１６０の変更も有することができる。糖タンパク質は、樹状細胞の感染を促進する。すべての場合において、Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３との融合タンパク質の一部ではない。一部の実施形態において、Ｅ２糖タンパク質または変異体は、ＤＣ−ＳＩＧＮを結合する。レンチウイルスベクターは、関心の配列を含むレンチウイルスゲノムも含む。
【００３３】
ある実施形態において、残基１６０は、存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンである。一実施形態において、残基１６０はグリシンである。さらに、Ｅ２糖タンパク質の他の変更は、前述の残基１６０の変更と組み合わせて起こり得る。そのような変更の１つは、Ｅ２の正味正電荷を減少させるためのアミノ酸の変更である。正味正電荷を減少させるための１つの方法は、リシンの１つを塩基性でないアミノ酸に変更することである。特定の実施形態において、リシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つ以上が変更される。ある実施形態において、これらのリシンの１つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸に変更される。特定の実施形態において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３〜１６の１つである。変更の組み合わせの例には、限定されないが、１６０位におけるグルタミン酸の変更、および非塩基性残基へのリシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つ以上の変更が挙げられる。他の変更は、残基１６０および随意に本明細書に開示される他の変更のいずれかの変更と組み合わせて行われてもよい。例えば、前述されるＥ２糖タンパク質のいずれかは、随意に、１つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を含んでもよい。１つの特定例として、Ｅ２〜Ｅ３の間のタンパク質開裂部位は、天然配列または異なるエンドペプチダーゼによって開裂される変更配列のいずれかであり得る。上記のいずれかと組み合わされ得る他の実施形態において、配列番号１の残基７１〜７５の配列は、未変更であるか、または変異体がＤＣに感染する能力に影響しない１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する。
【００３４】
ある実施形態において、前述のウイルス粒子のいずれかのレンチウイルスベクターゲノムは、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来抗原、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶ抗原をコードする、関心の配列を含む。一部の実施形態において、記載されるベクター粒子のいずれかは、少なくとも１０５／ｍＬ  ＩＵの力価で産生される。
【００３５】
別の態様において、残基１６０が存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができ、残基１６０が存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、その変異型をコードする第１の核酸分子と、ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする第２の核酸分子と、ｒｅｖをコードする第３の核酸分子と、関心の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む、偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージ化システムが提供される。パッケージ化システムのＥ２糖タンパク質または変異体は、上記実施形態のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ｐｏｌタンパク質は、非機能的インテグラーゼを有する。特定の実施形態において、非機能的インテグラーゼは、Ｄ６４Ｖ変異を有する。一部の実施形態において、第２の核酸分子は、非組み込みレンチウイルスゲノムである。特定の実施形態において、ａｔｔ部位が変異もしくは欠失しているか、またはＰＰＴ部位が変異もしくは欠失しているか、あるいは両方である。非組み込みレンチウイルスゲノムは、非機能的インテグラーゼと組み合わせて、およびＥ２タンパク質または変異体のいずれかと組み合わせて使用することができる。レンチウイルスベクターは、少なくとも１０５ＩＵ／ｍＬの力価に産生されることが好ましい。一部の例において、細胞は、上述される第１および第４の核酸分子でトランスフェクトされる。細胞は、安定な形質転換で、既に第２および第３の核酸分子を含んでいてもよい。
【００３６】
上述されるような糖タンパク質、または随意にシンドビスＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質の形態であるＥ３／Ｅ２糖タンパク質、またはＥ３配列が配列番号２０の残基１〜６５に対応する、Ｅ３／Ｅ２糖タンパク質、または配列番号２０の残基１〜６５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、その変異体をコードする単離核酸分子であって、残基６２〜６５は、ＲＳＫＲであり（配列番号２７）、変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込むことができ、随意にさらに、Ｅ２ポリタンパク質の残基１はＳｅｒである、単離核酸分子が提供される。Ｅ２糖タンパク質は、上述される変異体のいずれかであり得、変更の組み合わせを含む。さらに、核酸分子を含む発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞であるように、提供される。
【００３７】
上記の変異体または組み合わせのいずれか１つのレンチウイルスベクター粒子を作製する方法が提供され、細胞において、残基１６０がグルタミン酸以外であるか、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができる、その変異体であり、および残基１６０が欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質をコードする第１の核酸分子と、（ｉｉ）第２の核酸分子であって、転写することができ、転写物は偽型レンチウイルスベクター粒子へと構築される、第２の核酸分子と、を発現することを含む。
【００３８】
レンチウイルスベクター粒子はいずれも、ヒトまたは動物被検体を治療する方法において使用することができる。治療は、免疫付与のためのワクチンであり得、ワクチンは、予防的または治療的である。ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤とともに、レンチウイルスベクター粒子を含む。あるいは、レンチウイルスベクター粒子は、インビトロで細胞に投与することができ、細胞を上記レンチウイルスベクター粒子のいずれかと混合することを含む。
【００３９】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照するときに明らかとなるであろう。さらに、２００９年７月２４日に出願された米国特許出願第６１／２２８，４９１号は、あらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または樹状細胞に感染することができ、１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するその配列番号１の変異体を含むエンベロープであって、Ｅ２は、シンドビスウイルスＥ３との融合タンパク質の一部ではない、エンベロープと、
（ｂ）関心の配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムと、
を含む、レンチウイルスベクター粒子。
（項目２）
前記Ｅ２糖タンパク質または変異体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、項目１に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目３）
前記１６０Ｘは、存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンであり、例えば、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、項目１または項目２に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目４）
１６０Ｘは、グリシンである、項目１または項目２に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目５）
前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、その正味正電荷を低減するように変更された少なくとも１つのアミノ酸を有する、項目１、２、３、または４に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目６）
前記変更されたアミノ酸は、配列番号１のリシン７０、リシン７６、またはリシン１５９から成る群から選択され、置換がグルタミン酸またはアスパラギン酸から随意に独立して選択される、項目５に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目７）
前記Ｅ２変異体配列は、配列番号２、３、または４であり（変異体１、２、および３）、１つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を随意に含む、項目１、２、３、４、５、または６に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目８）
配列番号１の残基７１〜７５の配列が未変化である変異体か、または前記変異体がＤＣに感染する能力に影響しないが、この領域内のアミノ酸の数を変更しない、１つもしくは２つの置換を有する変異体である、項目１、２、３、４、５、６、または７に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目９）
前記関心の配列は、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来抗原、例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶ抗原をコードする、前記項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目１０）
前記粒子は、少なくとも１０５／ｍＬのＩＵを有する、前記項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目１１）
シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体を含むエンベロープ内に偽型化されたレンチウイルスベクターゲノムであって、前記ゲノムは、関心の配列を含み、
前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、前記レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、上記項目１〜１０のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を有する、レンチウイルスベクターゲノム。
（項目１２）
偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージ化システムであって、
（ｉ）１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である配列番号１のシンドビスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第１の核酸分子と、
（ｉｉ）ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする、第２の核酸分子と、
（ｉｉｉ）ｒｅｖをコードする、第３の核酸分子と、
（ｉｖ）関心の配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムと、
を含む、パッケージ化システム。
（項目１３）
前記Ｅ２糖タンパク質は、上記項目１〜９のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を有する、項目１２に記載のパッケージ化システム。
（項目１４）
前記ｐｏｌタンパク質は、非機能的インテグラーゼを有する、項目１２または１３に記載のパッケージ化システム。
（項目１５）
前記非機能的インテグラーゼは、Ｄ６４Ｖ変異を有する、項目１４に記載のパッケージ化システム。
（項目１６）
前記第４の核酸分子は、非組み込みレンチウイルスゲノムである、項目１２、１３、１４、または１５に記載のパッケージ化システム。
（項目１７）
前記レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも１０５ＩＵ／ｍＬのタイターに産生される、項目１２、１３、１４、１５、または１６に記載のパッケージ化システム。
（項目１８）
項目１２、１３、１４、１５、１６、または１７のいずれか１項に記載の第１および第４の核酸分子でトランスフェクトされた細胞。
（項目１９）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のいずれか１項に記載のタンパク質、または随意にシンドビスＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質の形態であるＥ３／Ｅ２糖タンパク質、または前記Ｅ３配列が、配列番号２０の残基１〜６５に対応する、Ｅ３／Ｅ２糖タンパク質、または配列番号２０の残基１〜６５に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体をコードする単離核酸分子であって、残基６２〜６５がＲＳＫＲであり（配列番号２７）、前記変異体は、偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができ、随意にさらに、Ｅ２ポリタンパク質の残基１はＳｅｒである、単離核酸分子。
（項目２０）
項目１９に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２１）
項目２０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目２２）
細胞において、
（ｉ）１６０Ｘがグルタミン酸以外である配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第１の核酸分子と、
（ｉｉ）第２の核酸分子であって、転写されることができ、前記転写物が偽型レンチウイルスベクター粒子へと構築される、第２の核酸分子と、
を発現させることを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター粒子を作製する方法。
（項目２３）
ヒトまたは動物被検体の治療方法において使用するための、項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター粒子。
（項目２４）
レンチウイルスベクター粒子をインビトロで細胞に送達する方法であって、前記細胞を、項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター粒子と混合することを含む、方法。
（項目２５）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、治療または予防ワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】４つのシンドビスウイルスエンベロープ、ＳＶＧｍｕ、ＳＩＮ−Ｖａｒ１、ＳＩＮ−Ｖａｒ２、およびＳＩＮ−Ｖａｒ３のエンベロープタンパク質の配列アラインメントである。アラインメントは、ＳＶＧｍｕ、前述されるシンドビスエンベロープに対して示される。ＳＶＧｍｕに対する主な差異は、Ｅ３とＥ２との間のフリン様プロテアーゼ開裂部位（ＲＳＫＲ、配列番号２７）の再生、ＨＡエピトープタグの除去、およびヘパリン結合を減少させるための一連のリシン置換を含む。
【図１Ｂ】同上
【図２】パッケージ化ウイルス粒子において使用される例示的なベクターの概略図である。
【図３】レンチウイルスベクター粒子調製物の粗上澄み液の力価のグラフを示し、ベクターゲノムは、３つの異なるシンドビスウイルスエンベロープタンパク質、ＳＶＧｍｕ、およびＳＩＮ−ＨＲで偽型化された。ウイルス上澄み液は、標準方法を使用して、一時的なトランスフェクションによって生成し、トランスフェクションから４８時間後に回収した。力価は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−ＤＣ−ＳＩＧＮ）上で決定した。力価は、上澄み液１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現単位の数として表され、３つの独立したトランスフェクションの平均である。エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。
【図４Ａ】偽型レンチウイルスベクター粒子の投与後のマウスにおける、Ｔ細胞の免疫学的反応を示すグラフである。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＶＡをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターの２つの用量（ｎｇ  ｐ２４において示される）の１つで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるＯＶＡ２５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数および機能は、ＭＨＣ−ｌ／ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、９日目に決定した。
【図４Ｂ】（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、用量範囲のＯＶＡをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるＯＶＡ２５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージは、ＭＨＣ−ｌ／ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、１１日目に決定した。
【図４Ｃ】（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、用量範囲のＯＶＡをコードする組み込み不全レンチウイルスベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるＯＶＡ２５７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージは、細胞内サイトカイン染色によって、９日目に決定した。
【図５Ａ】例示的なレンチウイルスゲノムの図を提示する。図５Ｂは、３つのベクター構造のＵ３領域の配列を提示する。（Ａ）すべてのレンチウイルスベクターに含まれる要素が、上部の例示的ベクターゲノムに示される。利用されるプロモーターは、ヒトユビキチン−Ｃプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含む。標準ＳＩＮ  Ｕ３領域に加えて、一連の拡大欠失が示される。３つのベクターのすべてからのＵ３領域の配列アラインメントは、（Ｂ）に示される。示される配列は、ポリプリン路（ＰＰＴ）を含み、構造７０４において欠失し、拡大Ｕ３欠失は、７０３および７０４構造の両方に存在する。
【図５Ｂ】例示的なレンチウイルスゲノムの図を提示する。図５Ｂは、３つのベクター構造のＵ３領域の配列を提示する。（Ａ）すべてのレンチウイルスベクターに含まれる要素が、上部の例示的ベクターゲノムに示される。利用されるプロモーターは、ヒトユビキチン−Ｃプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含む。標準ＳＩＮ  Ｕ３領域に加えて、一連の拡大欠失が示される。３つのベクターのすべてからのＵ３領域の配列アラインメントは、（Ｂ）に示される。示される配列は、ポリプリン路（ＰＰＴ）を含み、構造７０４において欠失し、拡大Ｕ３欠失は、７０３および７０４構造の両方に存在する。
【図６】図６Ａ−６Ｂ。２９３Ｔ細胞の形質導入に続くレンチウイルスベクターからのＧＦＰ発現を示す。図６Ａにおいて、ＧＦＰは、ＵｂｉＣプロモーターに操作可能に結合され、図６Ｂにおいて、ＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターに操作可能に結合された。ＧＦＰ発現レベルは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する２９３Ｔ細胞の形質導入から４８時間後に、インテグラーゼ不全レンチウイルスベクターから決定した。形質導入した細胞におけるＧＦＰ発現は、標準フローサイトメトリー方法によって決定し、各形質導入細胞プールから計５０，０００事象を回収して、平均発現レベルを決定した。
【図７】５継代中のＧＦＰ陽性細胞の数を示す。異なるベクター調製により細胞をトランスフェクトし、７２時間毎に継代した。異なるＮＩＬＶ構成によりトランスフェクトした２９３Ｔ細胞培養において、相対ＧＦＰ力価を決定した。野生型インテグラーゼ（ＩＮ＋）またはＤ６４Ｖ変異体インテグラーゼ（ＩＮ−）のいずれかを使用して、ベクターをパッケージ化し、それを使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する２９３細胞を形質導入した。次に、形質導入細胞培養を、７２時間毎に１５日間継代した。各継代において、培養中のＧＦＰ＋細胞の数は、標準フローサイトメトリー法を使用して決定した。継代に伴うＧＦＰ発現の喪失は、経時的なベクターエピソームの喪失を示す。
【図８】組み込み（Ｉｎｔｗｔ）または非組み込み（ＩｎｔＤ６４Ｖ）レンチウイルスベクターの投与に続くＣＤ８Ｔ細胞反応を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からのＧａｇ抗原をコードする、組み込み（Ｉｎｔｗｔ）または非組み込み（ＩｎｔＤ６４Ｖ）レンチウイルスベクターの２．５×１０１０個のゲノムで皮下的に免疫付与した。膵臓における抗原特異的Ｔ細胞の数およびそれらのサイトカイン分泌プロファイルは、細胞内サイトカイン染色によって、１０日目に決定した。
【図９】媒体単独または腫瘍抗原をコードするウイルス粒子のいずれかを受容するマウスにおける腫瘍サイズ（左のグラフ）および生存率（右のグラフ）を示すグラフを提示する。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０４個のＣＴ２６結腸癌細胞を皮下的に注入した。１日後、媒体または３．２μｇ（ｐ２４カプシド）のＡＨ１Ａ５ペプチド（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ、配列番号２５）、修飾ＣＴ２６  ＣＤ８Ｔ細胞エピトープをコードする、ＤＣ標的非組み込みレンチウイルスベクター（ＤＣ−ＮＩＬＶ）のいずれかで皮下的に処置した。ワクチン接種したマウス対対照マウスの初期腫瘍成長および長期生存が表される。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本開示は、レンチウイルスベクター粒子（例えば、ビリオン、レンチウイルス粒子）を使用して、関心の配列をＤＣに送達するための、樹状細胞（ＤＣ）を標的とするための方法および組成物を提供する。レンチウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスＥ２に由来するエンベロープ糖タンパク質変異体と、関心の配列を含むゲノムと、随意に他の成分とを含む。糖タンパク質変異体は、ＨＲ、基準シンドビスウイルス株と比較して、ヘパラン硫酸への結合の減少を呈する。エンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。本明細書で使用する、感染を「促進する」とは、形質導入を促進することと同一であり、偽型レトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の標的細胞への受容体を介した侵入を促進または強化する際に、単独または他の分子と協調する、エンベロープ糖タンパク質の役割を指す。
【００４２】
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、１つ以上の、プラスミドベクター、および／または機能的ベクター粒子を生成するのに必要な成分を一緒にコードする、組み込み要素を含有する、細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、単一ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。ほとんどの場合、産生細胞クロモソームに安定して組み込まれる、複数のプラスミドベクターまたは個別の発現カセットを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝的成分を分離するが、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。一例示において、パッケージ化細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する１つ以上のプラスミドでトランスフェクトされ、ＬＴＲ、ｃｉｓ作用性パッケージ化配列、関心の配列、ウイルス酵素的および構造的成分（例えばｇａｇおよびｐｏｌ）をコードする少なくとも１つのプラスミド、ならびにアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドを含む。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、通常、関心の配列を含有する２つのＲＮＡゲノムと、樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む、コアを含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である場合、糖タンパク質は、基準株ＨＲと比較して、ヘパラン硫酸への結合が減少するように操作される。これは、通常、ＨＲ  Ｅ２糖タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の変更を伴う。
【００４３】
理論に制約されることなく、細胞表面へのウイルス粒子の結合は、エンドサイトーシスを誘発し、ウイルスをエンドソームにもたらし、膜融合を引き起こして、ウイルスコアが細胞質に侵入するのを可能にすると考えられる。レンチウイルスベクター粒子を組み込むことを利用する、ある実施形態の場合、逆転写および産生物の核への移動に続いて、ウイルスのゲノムは、標的細胞ゲノムに組み込み、関心の配列を標的細胞のゲノムに組み込む。しかしながら、挿入突然変異の機会を減少させ、指定抗原の一時的発現を促進するために、他の実施形態は、標的細胞ゲノムに組み込まれないが、代わりに、関心の配列をエピソームから発現する、非組み込みレンチウイルスベクター粒子を利用する。いずれにしても、次に、感染したＤＣは、関心の配列、例えば、抗原、刺激分子を発現する。次に、抗原は、樹状細胞によって処理され、Ｔ細胞およびＢ細胞に提示され得、抗原特異的免疫反応を生じる。上述される特異的経路は、樹状細胞が抗原特異的免疫反応を刺激することができる限り、必要とされない。
【００４４】
予防または治療効果を提供するために、ウイルス粒子を被検体に投与することができる。関心の配列の産生物は、通常、疾患をもたらす薬剤または罹患した細胞（例えば、腫瘍細胞）の抗原である。樹状細胞の感染および産生物の発現に続いて、免疫反応が産生物に対してもたらされる。免疫反応は、体液性もしくは細胞性、または両方であってもよい。Ａ．ウイルスベクターエンベロープ
節足動物媒介性ウイルス（アルボウイルス）は、蚊等の感染した節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、またはトリ等の宿主に伝播するウイルスである。アルボウイルスは、正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムと、糖タンパク質含有エンベロープとを有する、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含む、ウイルスの亜科にさらに分割される。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、および西ナイルウイルスは、フラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の成員である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２（１９９２））。シンドビスウイルスのエンベロープは、２つの膜貫通糖タンパク質を含み（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３，１３（２００５））、Ｅ１は、融合に関与すると考えられ、Ｅ２は、細胞結合に関与すると考えられる。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。
【００４５】
上述されるように、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を使用して、レンチウイルス系ベクターゲノムを偽型化することができる。「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる、１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾、変異、または操作されてもよい。
【００４６】
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込み、通常、２つの糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２の複数の複製を含む。各糖タンパク質は、膜貫通領域を有し、Ｅ２は、約３３残基細胞質ドメインを有するが、Ｅ１の細胞質尾部は、非常に短い（約２残基）。Ｅ１およびＥ２はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。Ｅ２は、最初に、フリンまたは他のＣａ２＋依存セリンプロテイナーゼによって、Ｅ２および小糖タンパク質であるＥ３に開裂される、前駆体タンパク質として合成される。Ｅ２およびＥ１をコードする配列の間に、タンパク質をコードする配列である６Ｋが位置する。Ｅ３および６Ｋは、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質をそれぞれ膜に移行させる働きをする、シグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域は、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１をコードする配列を含む。本明細書で使用する、アルボウイルスの「エンベロープ」は、少なくともＥ２を含み、またＥ１、６Ｋ、およびＥ３を含んでもよい。シンドビスウイルス、ＨＲ株のエンベロープ糖タンパク質の例示的配列は、配列番号１７として提示される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて認めることができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受入番号ＧＱ２５２６７７（特にＧｅｎＢａｎｋにおいて）およびＮＣＢＩにおけるウイルス変異データベース（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列を参照することにより組み込まれる）において認めることができ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は、受入番号ＮＰ０４０８２４（エンベロープ糖タンパク質の配列を参照することによって組み込まれる）において認めることができる。
【００４７】
アルファウイルス、および特にシンドビスウイルスの樹状細胞上の細胞受容体は、これまで明らかに識別されていないが、１つの受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮであると考えられる（Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１２０２２，２００３）。「付着」、「結合」、「標的」等の用語の使用は、同義的に用いられ、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分との間の相互作用の機序を示すことを意味しない（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３）−Ｇｒａｂｂｉｎｇ  Ｎｏｎｉｎｔｅｇriｎ、ＣＤ２０９としても知られる）は、物質の急速結合およびエンドサイトーシスが可能なＣ型レクチン様受容体である（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３３−５４，２００４）。Ｅ２は、ＤＣ−ＳＩＧＮを通して、樹状細胞に対してウイルスを標的とすると考えられる。本明細書に示されるように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子細胞よりも優れた（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍優れた）シンドビスウイルスＥ２で偽型化されるウイルスベクター粒子によって形質導入される。Ｅ２糖タンパク質がウイルス感染を促進する機序は、場合によって、ＤＣ−ＳＩＧＮに直接結合するか、または構造もしくは一部の他の機序を変更することによって、ＤＣ−ＳＩＧＮに関与すると考えられる。実際の機序に関わらず、Ｅ２による標的は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞、つまり樹状細胞に選択的である。
【００４８】
シンドビスウイルスは、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合すると考えられる（Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：７３５７，１９９８、Ｂｕｒｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：７３４９，１９９８）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンは、大部分の細胞型の表面に見られるため、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を減少させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させるか、またはシンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への結合を増加させる、例えば、活性を増加させるか、またはそれら両方によって達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現され得、かつエンベロープがＤＣ−ＳＩＧＮに特異的である場合でさえも起こり得る、他の分子への非特異的結合が減少し、向上した特異性が、望ましくない副作用、例えば、望ましい免疫反応を低減し得る副作用または他の細胞型の的外れな形質導入と関連付けられる副作用を回避する役割を果たし得る。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代替として、またはそれらに加えて、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質で偽型化したウイルス粒子は、ＶＳＶＧ等の糖タンパク質で偽型化したウイルス粒子を超える他の利点を提供し得る。そのような利点の例には、補体媒介性溶解の減少および／または神経細胞標的の減少が挙げられ、いずれもＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルス粒子の投与と関連すると考えられる。
【００４９】
種々の例示において、レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少または抑止した。つまり、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質は、他の細胞型に対してＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に選択的にウイルスを配向するように修飾されてもよい。特に構造研究および分子モデリングから得られる情報に基づいて、エンベロープタンパク質の変異体配列、特にＥ２およびＥ１糖タンパク質は、糖タンパク質がそれらのエンベロープタンパク質としての機能を維持しながら、望ましい結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように設計および生成される。各糖タンパク質に対する変異体配列の候補を作製し、下記の方法または本技術分野において知られている他の方法を使用して分析して、最も望ましい特性を有するエンベロープ糖タンパク質を識別してもよい。
【００５０】
シンドビスＥ２のある変異体配列は、配列番号１と比較して、残基１６０において少なくとも１つのアミノ酸の変更を有する。残基１６０は欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸に変更される。変更は、最も一般的に、少なくとも１つのアミノ酸の置換であるが、あるいは１つ以上のアミノ酸の追加または欠失であり得る。好ましくは、あらゆる追加アミノ酸は少数であり、安全性を低下させ得る抗原エピトープ（例えば、ヘマグルチニンタグ配列）を含まない。２つ以上の変更がある場合、それらはいずれも同一型（例えば、置換）または異なる型（例えば、置換および欠失）であり得る。複数の変更は、タンパク質配列において分散するか、または隣接して位置付けることができる。
【００５１】
第１の例において、変異体配列は、約残基５０〜約残基１８０の領域に少なくとも１つのアミノ酸変更を含む。この領域内に、ヘパラン硫酸への結合に関与するアミノ酸が存在する。Ｅ２の正味正電荷を減少させることによって、ヘパラン硫酸との静電相互作用を減少させることができ、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。この領域内の正電荷アミノ酸の候補には、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９におけるリシン、および残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２におけるアルギニンが挙げられる（Ｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４７：１８３−１９０，２００６）。これらのアミノ酸の少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸へのＥ２結合において直接実装される。正味正電荷は、リシンもしくはアルギニンの欠失、またはリシンもしくはアルギニンを中性もしくは負電荷アミノ酸の置換によって減少させることができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンの１つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸と置換されてもよい。ある実施形態は、リシン７０、７６、または１５９の少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２が、Ｅ３を有するポリタンパク質として発現される場合、天然Ｅ３／Ｅ２開裂部位に隣接して位置するリシンは維持される。つまり、認識配列および開裂部位は未変更である。あるいは、天然エンドペプチダーゼ開裂部位配列は、異なるエンドペプチダーゼの認識配列と置換される。
【００５２】
Ｅ２のある変異体はまた、樹状細胞への結合に良い影響を与える方法で修飾される。基準ＨＲ配列の残基１６０において認められるグルタミン酸の変更は、樹状細胞への結合を向上させることができる（その全体が組み込まれる、Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４，１１８４９，２０００を参照）。残基１６０の欠失または残基１６０の置換等の変更は、ある変異体において認められる。特定の変異体では、非荷電アミノ酸がＧｌｕに置換され、他の変異体では、非酸性アミノ酸がＧｌｕに置換される。通常、Ｇｌｕ１６０は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の１つと置換される。
【００５３】
他の変異体は、２つ以上のアミノ酸変更を含む。通常、これらの変異体において、変更の１つはＧｌｕ１６０であり、残りの変更は、残基約５０〜約１８０に渡る領域内のリシンおよびアルギニンの１つ以上の変更である。ある変異体は、非酸性残基へのＧｌｕ１６０の変更または欠失、および非塩基性アミノ酸へのリシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つ以上の変更を含む。いくつかの特定の変異体は、Ｇｌｙに対してＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対してＬｙｓ７０、およびＧｌｕに対してＬｙｓ１５９；Ｇｌｙに対してＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対してＬｙｓ７０、７６、および１５９；Ｇｌｕ１６０およびＬｙｓ７０の欠失およびＧｌｕに対する１５９；ならびにＧｌｕ１６０およびＬｙｓ７０、７６の欠失、およびＧｌｕに対して１５９の変更を含む。
【００５４】
ある例において、Ｅ２タンパク質は、最初に、少なくともＥ３との融合またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。リーダー配列がＥ３であるか、または別の配列であるかに関わらず、ウイルスエンベロープのＥ２は、Ｅ３または他のリーダー配列を含んではならない。言い換えれば、Ｅ２は、好ましくは、Ｅ３／Ｅ２融合タンパク質ではない（例えば、ＳＶＧｍｕと呼ばれるＥ３／Ｅ２融合タンパク質）。ある実施形態において、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現される。シンドビスウイルスは、自然に、Ｅ２をポリタンパク質の一部として発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、および６Ｋ／Ｅ１の接合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および開裂される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合は、残基６５〜６６の間でフリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって開裂される。フリンは、２つのアミノ酸によって分離される、対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるＥ３／Ｅ２開裂を維持するために、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ、配列番号２６）は、２つのアミノ酸分離を有する２つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持しなければならない。あるいは、Ｅ３／Ｅ２フリン開裂配列または他の開裂配列のいずれかの代わりに、異なる開裂配列を使用することができる。認識部位および開裂部位は、限定されないが、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、ＩＸａ因子、Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼのために組み込むことができる。これらの酵素の認識および開裂部位配列は、よく知られている。
【００５５】
既述されるもの以外に、Ｅ２内のアミノ酸が変更されてもよい。一般に、変異体Ｅ２配列は、基準Ｅ２配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。変異体糖タンパク質は、Ｅ２を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力等の生物学的機能を呈しなければならない。実験によって、ウイルス会合、細胞表面への付着、および感染の種々の態様において、重要な役割を有すると考えられる、エンベロープ糖タンパク質の領域が識別された。変異体を作製する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。Ｅ２の細胞質尾部−約残基４０８〜４１５は、ウイルス会合に重要である（その全体が組み込まれる、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：４４５８−４４６８，２００６）。他の領域は、二次構造の形成に関与し（約残基３３〜５３）、ならびに輸送およびタンパク質安定性に関与する（約残基８６〜１１９）（その全体が組み込まれる、Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ３６３：１２４−１４７，２００７）。変異体は、膜に広がる領域、約残基３７０〜３８０の疎水特性を維持してもよい。変異体は、Ｎ結合した糖鎖付加部位残基ＮＩＴ（残基１９６〜１９８）およびＮＦＴ（残基３１８〜３２０）の１つまたは両方を維持してもよく、パルミトイル化される部位の１つ以上を維持してもよい（Ｃ−３９６、Ｃ４１６、およびＣ４１７）（組み込まれる、Ｓｔｒａｕｓｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５８，４９１〜５６２、１９９４；ｐｐ．４９９〜５０９）。一方、Ｅ２の多くの領域は、欠失事象なしに変更されてもよい。例えば、Ｅ２の多くの異なる位置におけるトランスポゾンの挿入は、依然として生存ウイルスをもたらす（Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈ、前記の個所）。
【００５６】
ある実施形態において、タグペプチドが、Ｅ３、６Ｋ、またはＥ１タンパク質に組み込まれてもよい。いくつかの目的で、タグは、Ｅ２に組み込まれてもよいが、タグは、ヒト患者に投与するための産生物での使用には望ましくない。短い配列である（例えば、５〜３０アミノ酸）タグペプチドを使用して、ウイルス粒子内のエンベロープ発現およびその存在の検出を促進することができる。検出目的で、タグ配列は、通常、抗体または化学物質によって検出可能となる。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を促進することである。タグの結合パートナーを含有する物質を使用して、ウイルスを吸収することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを移動させる部分による処理によって達成することができ、またはタグ配列が開裂可能な配列と結合している場合には適切なエンドペプチダーゼによる処理は、便宜的にウイルスの放出を可能にする（例えば、Ｑｉａｇｅｎカタログ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）。タグペプチドの除去は、一般に、動物被検体におけるウイルス粒子使用の安全目的で望ましい。タグが除去されない場合、タグに対する免疫反応が起こり得る。
【００５７】
適切なタグには、限定されないが、特に、その抗体が商業的に入手可能であるＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（その全体が組み込まれる、米国特許第４，７０３，００４号）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）（その全体が組み込まれる、米国特許第４，５６９，７９４号）、チオレドキシン、ＨＡ（ヘマグルチニン）−タグが挙げられる。ポリ（Ｈｉｓ）は、ニッケルまたはコバルト等の結合性金属イオンを含有する親和性媒体上に吸着し、低ｐＨ媒体で溶出することができる。
【００５８】
ウイルス粒子は、樹状細胞を標的とするウイルスに組み込まれる、エンベロープ糖タンパク質の特異性を決定するように評価されてもよい。例えば、骨髄細胞の混合群を被検体から取得し、インビトロで培養することができる。あるいは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するか、または発現しない同質遺伝子細胞株を取得して使用することができる。組み換えウイルスを、骨髄細胞の混合群または同質遺伝子細胞株に投与することができ、ウイルスに組み込まれるレポーター遺伝子の発現は、培養細胞において分析することができる。ある実施形態は、限界希釈分析を用いてもよく、細胞の混合群は、別々の部分に分けられ、次に、漸減量のウイルスで別々に培養される（例えば、各部分のウイルスは２倍、５倍、１０倍少ない）。一部の実施形態において、混合細胞群中の感染細胞の少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。ある実施形態において、感染した樹状細胞対感染した非樹状細胞（または非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれ以上である。限界希釈の場合、通常、優れた選択性は、より高い希釈（すなわち、より少量の）ウイルス投入で見られる。
【００５９】
偽型ウイルス粒子の活性は、多様な手技のいずれかによって決定することができる。例えば、感染効率（ＩＵ、感染単位）を測定するための好適な方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノム内でコードされる産生物の発現を測定することによってである。分析することができるあらゆる産生物を使用してもよい。便宜的な種類の産生物の１つは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質である。ＧＦＰおよび分析は、実施例３等の実施例において例示される。使用することができる他の産生物には、細胞表面上で発現されるタンパク質（例えば、抗体結合による検出）、酵素等が挙げられる。産生物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性／活性は、免疫反応を決定することによって評価することができる。さらに、哺乳類における副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的とする能力は、例えば、以下に記載されるような細胞培養において直接試験することもできる。
【００６０】
ウイルス粒子を調製して、それらの選択性および／またはそれらが標的細胞膜の貫通を促進する能力に関して試験することもできる。未修飾糖タンパク質を有するエンベロープを有するウイルス粒子は、比較のための対照として使用することができる。つまり、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を、標準感染分析を使用して、ウイルスに感染させる。既定の時間が経過した後、例えば、感染から４８時間後に細胞を採取することができ、例えば、フローサイトメトリーによって、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを決定することができる。選択性は、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージを計算することによって、スコア化することができる。同様に、変異体エンベロープ糖タンパク質がウイルス力価に及ぼす影響は、変異体エンベロープを含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージを、対応する野生型（未修飾）エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した細胞のパーセンテージで割ることによって定量化することができる。特に適切な変異体は、選択性と感染力価との最良の組み合わせを有する。変異体が選択されると、ウイルス濃度分析を行って、これらのウイルスが、活性を低下させることなく濃縮され得ることを確認してもよい。ウイルスの上澄みを採取し、超遠心分離法によって濃縮する。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限界希釈およびエンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって決定することができ、上述されるように、ウイルスによって発現される産生物の発現を測定する。
【００６１】
レンチウイルスベクター粒子の標的細胞への侵入は、別の種類の活性評価である。ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（βラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質を利用して、ＨＩＶ−１ウイルスの貫通、ＢｌａＭおよびシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、Ｅ１の融合が評価されており、Ｅ２／Ｅ１融合タンパク質を使用して、標的細胞への融合および貫通を促進することにおけるエンベロープタンパク質の有効性を評価することができる。ウイルス粒子は、例えば、パッケージ化細胞を、ウイルス要素ＢｌａＭ−Ｖｐｒ、および関心の変異体エンベロープ（ならびに必要に応じて親和性分子）で一時的にトランスフェクトすることによって調製されてもよい。得られるウイルスを使用して、結合の遊離阻害剤（例えば、抗体）の不在または存在下で、標的分子（または親和性分子）が特異的に結合する、分子を発現する細胞に感染することができる。次に、細胞をＣＯ２非依存培地で洗浄し、ＣＣＦ２染料（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を負荷する。室温で培養して、開裂反応を完了させた後、パラホルムアルデヒドによって細胞を固定し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡で分析することができる。青色細胞の存在は、ウイルスが細胞質中に貫通したことを示し、遮断抗体が添加される場合は、青色細胞が少なくなることが予想される（その全体が組み込まれる、Ｃａｖｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１１５１−１１５４，２００２）。
【００６２】
貫通が低ｐＨに依存するか否かを調査するため、および所望のｐＨ依存を有するエンベロープ糖タンパク質を識別するために、ＮＨ４ＣｌまたはｐＨを変更する他の化合物を、感染ステップにおいて添加することができる（ＮＨ４Ｃｌは、エンドソームの酸性コンパートメントを中和する）。ＮＨ４Ｃｌの例において、青色細胞の消失は、ウイルスの貫通が低ｐＨ依存であることを示す。さらに、活性がｐＨ依存であることを確認するために、リソソーム作用剤、例えば、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシン  Ａｌ、モネンシン、ニゲリシン等を、培養緩衝液に添加してもよい。これらの薬剤は、エンドソームコンパートメント内のｐＨを上昇させる（例えば、Ｄｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２００，１−８，１９９７）。これらの薬剤の阻害作用は、ウイルス融合および侵入に対するｐＨの役割を明らかにする。異なる融合分子を示すウイルス間の異なる侵入動態を比較し、特定の施用に対して最も適切なものが選択されてもよい。
【００６３】
ＰＣＲ系侵入分析を利用して、逆転写を監視し、ウイルス侵入の動態を示すようなウイルスＤＮＡ合成の動態を測定することができる。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子は、２９３Ｔ細胞等の標的細胞、ＤＣ、またはエンベロープタンパク質分子の適切な結合パートナー（受容体）を発現するように操作されたか、または自然に発現する、あらゆる他の細胞と共に培養される。即時または（感染を起こすための）時間増分後のいずれかで、未結合ウイルスを除去し、細胞のアリコートをウイルス核酸に関して分析する。これらのアリコートからＤＮＡを抽出して、一般に、半定量分析において、ＬＴＲ特異的プライマーでプライムする増幅分析にかける。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ産生物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
Ｂ．レンチウイルスベクターゲノム
ウイルスベクター粒子は、関心の配列を含むゲノムを含む。他の配列は、ゲノムがウイルス粒子にパッケージ化されるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入に続いて関心の配列の発現を促進する配列等を含んでもよい。ゲノムは、多量の適切な入手できるレンチウイルスゲノム系ベクターのいずれかに由来し得、ヒト遺伝子治療施用に対して識別されるもの、例えば、ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａによって説明されるものを含む（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１，２００１）。簡潔性の目的で、ゲノムは、「ウイルスベクターゲノム」または「ベクターゲノム」とも呼ばれる。
１．骨格
適切なレンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、フェリン免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものを含む。レンチウイルスの望ましい特性は、それらが分裂および非分裂細胞の両方に感染することができることであり、標的細胞が分裂している（または標的細胞を刺激して分裂させる）必要はない。一般に、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、得られるウイルスベクター粒子が偽型化されるように、異なるウイルスに基づく。望ましくは、ベクターゲノムの安全機能が組み込まれる。安全性機能は、自己不活性化ＬＴＲおよび非組み込みゲノムを含む。例示的ベクターは、実施例５および図５においてさらに論じられ、そのようなベクターは、関心の抗原の発現のために、本発明の実施形態において使用されてもよい。
【００６４】
一部の例示的な実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、ＨＩＶ−１ゲノムまたはＳＩＶゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構成は、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲからの配列を含み、特に、レンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列を含んでもよい。ＬＴＲ配列は、あらゆる種からのあらゆるレンチウイルスからのＬＴＲ配列であってもよい。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶからのＬＴＲ配列であってもよい。通常、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【００６５】
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含んでもよい（いずれもそれら全体が組み込まれる、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：９８７３，１９９８、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８１５０，１９９８）。自己不活性化ベクターは、一般に、３’末端反復配列（ＬＴＲ）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、ベクター組み込み中に５’ＬＴＲに複製される。一例において、３’ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１、およびＮＦ−κＢ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、侵入および逆転写に続いて生成されるプロウイルスは、不活性化５’ＬＴＲを含む。その論理的根拠は、ベクターゲノムの移動のリスク、およびＬＴＲが付近の細胞プロモーターに及ぼす影響を減少させることによって、安全性を向上させることである。自己不活性化３’ＬＴＲは、本技術分野においてしられているあらゆる方法によって構成されてもよい。
【００６６】
随意に、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列は、ウイルス構成のプロモーター配列、例えば、異種プロモーター配列と置換されてもよい。これは、パッケージ化細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。エンハンサー配列が含まれてもよい。パッケージ化細胞株においてウイルスゲノムの発現を増加させる、あらゆるエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用されてもよい。一実施例において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（それぞれその全体が組み込まれる、米国特許第５３８５８３９号および米国特許第５１６８０６２号）。
【００６７】
ある実施形態において、挿入突然変異のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムを組み込み不全となるように構成することによって最小化される。多様なアプローチを遂行して、非組み込みベクターゲノムを再生することができる。これらのアプローチは、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素成分への突然変異を操作することを含む。ベクターゲノム自体を修飾して、例えば、付着部位の一方または両方を変異もしくは欠失すること、または欠失もしくは修飾を通して３’ＬＴＲ−近位ポリプリン区画（ＰＰＴ）を非機能的にすることによって、組み込みを回避することができる。さらに、非遺伝的アプローチが使用可能であり、これらは、インテグラーゼの１つ以上の機能を阻害する薬剤を含む。アプローチは、相互排他的ではなく、つまり、それらの１つより多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的であり得るか、またはインテグラーゼおよびＰＰＴ部位が非機能的であり得るか、または付着部位およびＰＰＴ部位が非機能的であり得るか、またはそれらのすべてが非機能的であり得る。
【００６８】
上記のように、１つのアプローチは、非機能的インテグラーゼを作製および使用することである。インテグラーゼは、ウイルス二重鎖平滑末端ＤＮＡの開裂と、染色体標的部位の２つの鎖において、末端を５’リン酸塩に結合することに関与する。インテグラーゼは、亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含有するＮ末端ドメイン、触媒コアおよび保存ＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ−１におけるＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含有する中央ドメインコア、およびＤＮＡ結合特性を有するＣ末端ドメインの３つの機能ドメインを有する。インテグラーゼに導入される点突然変異は、正常機能を崩壊させるのに十分である。多くのインテグラーゼ突然変異が構成および特性化された（すべてそれら全体が組み込まれる、Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ａｎｄ  Ｔｈｒａｓｈｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：４８３，２００７、Ａｐｏｌｏｎｉａ，Ｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｐｒｉｌ  ２００９，ｐｐ，８２−９７、Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：２７２９，１９９５、Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：１１２１，２００６を参照）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を欠失または突然変異させて、好ましくは、逆転写酵素活性または核標的を著しく損なうことなく、タンパク質を不活性化することができ、それによって、プロウイルスの標的細胞ゲノムへの組み込みのみを回避する。許容される突然変異は、インテグラーゼ触媒、鎖移転、ａｔｔ部位への結合、宿主染色体ＤＮＡへの結合、および他の機能を低下させることができる。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶインテグラーゼの残基３５における、単一アスパラギン酸からアスパラギンへの置換は、ウイルスＤＮＡの組み込みを完全に抑止する。インテグラーゼの欠失は、一般に、Ｃ末端ドメインに限定される。残基２３５〜２８８のコード配列の欠失は、有用な非機能的インテグラーゼをもたらす（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：２７２９，１９９５）。さらなる実施例として、突然変異、例えば、Ａｓｐ６４（残基数は、ＨＩＶ−１に対して指定され、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼの対応する残基数は、当業者によって容易に決定され得る）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えば、Ｗ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）を生成することができる。他の突然変異を構成し、組み込み、導入遺伝子の発現、および他の望ましいパラメータに関して試験することができる。これらの機能に関する分析は、よく知られている。突然変異は、部位特異的突然変異誘発および核酸配列の化学合成を含む、多種の手技のいずれかによって生成することができる。１つの突然変異を作製してもよいか、またはこれらの突然変異の複数がインテグラーゼ内に存在することができる。例えば、インテグラーゼは���２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸等において、突然変異を有してもよい。
【００６９】
あるいは、またはインテグラーゼ変異体の使用と組み合わせて、Ｕ３およびＵ５内の付着部位（ａｔｔ）を突然変異させることもできる。インテグラーゼは、これらの部位に結合し、３’末端ジヌクレオチドは、ベクターゲノムの両端で開裂する。ＣＡジヌクレオチドは、陥没した３’末端に位置付けられ、ＣＡは、宿主染色体へのヌクレオチドブロック組み込みの突然変異を処理するために必要とされる。ＣＡジヌクレオチドのＡは、組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両端における突然変異は、最良の結果をもたらす（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：９０１１（１９９９）。一例示において、各末端のＣＡは、ＴＧに変更される。他の例示において、各末端のＣＡは、一端においてＴＧに変更され、他端においてＧＴに変更される。他の例示において、各端のＣＡは欠失し、他の例示において、ＣＡのＡは各末端で欠失する。
【００７０】
組み込みは、ポリプリン区画（ＰＰＴ）の変異または欠失によって阻害することもできる（その全体が組み込まれる、第ＷＯ２００９／０７６５２４号）、３’ＬＴＲに近位に位置付けられる。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成のプライマー結合部位として機能することができる、約１５ヌクレオチドのポリプリン配列である。この例において、ＰＰＴの突然変異または欠失は、逆転写プロセスを標的とする。機序にとらわれることなく、ＰＰＴを変異または欠失させることによって、線状ＤＮＡの産生は、根本的に減少し、本質的に１−ＬＴＲ  ＤＮＡ環のみが産生される。組み込みは、線状二本鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、組み込みは、本質的にそれなしで排除される。上記のように、ＰＰＴは、変異または欠失によって非機能的にすることができる。通常、約１５ｎｔ  ＰＰＴ全体が欠失されるが、一部の実施形態において、より短い１４ｎｔ、１３ｎｔ、１２ｎｔ、１１ｎｔ、１０ｎｔ、９ｎｔ、８ｎｔ、７ｎｔ、６ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、および２ｎｔの欠失が作製されてもよい。変異が作製される場合、通常、複数の変異が、特にＰＰＴの５’半分で作製されるが（ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１１１５０，２００３）、最初の４つの塩基における単一および二重変異は、依然として転写を減少させる。ＰＰＴの３’末端で作製される変異は、一般に、より劇的な効果を有する（Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：５２８８，１９９６）。
【００７１】
ベクターゲノム非組み込みを作製するためのこれらの異なるアプローチは、個別または組み合わせて使用することができる。複数のアプローチを使用して、重複機構によって二重安全ベクターを構築してもよい。したがって、ＰＰＴ変異または欠失は、ａｔｔ部位もしくは欠失、またはインテグラーゼ変異と組み合わせることができるか、またはＰＰＴ変異もしくは欠失は、ａｔｔ部位変異もしくは欠失およびインテグラーゼ変異の両方と組み合わせることができる。同様に、ａｔｔ部位変異または欠失およびインテグラーゼ変異は、相互に組み合わされるか、またはＰＰＴ変異もしくは欠失と組み合わされてもよい。
２．調節要素
本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムは、標的細胞において発現することが望ましい、関心の配列を含む。通常、関心の配列は、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ配列との間に位置付けられる。さらに、関心の配列は、好ましくは、他の遺伝要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む、転写調節配列と機能的な関係にあり、特定の方法で関心の配列の発現を調節する。ある例において、有用な転写調節配列は、活性に関して、一時的かつ空間的に高度に調節されるものである。成分の発現を調節するために使用され得る発現制御要素は、本技術分野において知られており、これらに限定されないが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節要素を含む。
【００７２】
関心の配列およびあらゆる他の発現可能な配列は、通常、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター構成において、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置付けられるものであり、関心の配列に操作可能に結合される。内部プロモーター／エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている、あらゆるプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであってもよい。「機能的関係」および「操作可能に結合される」は、制限なく、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触すると関心の配列が発現される、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して、配列が正しい位置および配向にあることを意味する。
【００７３】
内部プロモーター／エンハンサーの選択は、関心の配列の望ましい発現パターンおよび知られているプロモーター／エンハンサーの特定の特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性であってもよい。使用されてもよい構成的プロモーターの非限定例は、ユビキチンのプロモーター（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５５１０４７４号、第ＷＯ９８／３２８６９号）、ＣＭＶ（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８１：６５９，１９８４、米国特許第５１６８０６２号）、β−アクチン（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４８３１−４８３５）、およびｐｇｋ（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｇｅｎｅ  ６０：６５−７４、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：４０９−４１７、およびＤｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：２６３５−２６３７を参照）を含む。
【００７４】
あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。一部の好適な実施形態において、プロモーターは、標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ−３、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む、樹状細胞によって発現される、あらゆる産生物に由来し得る。さらに、プロモーターは、関心の配列の誘導性発現を可能にするように選択されてもよい。誘導性発現のための多数のシステムが本技術分野において知られており、テトラサイクリン応答システム、ｌａｃオペレーター−リプレッサーシステム、ならびに熱ショック、金属イオンを含む多様な環境変化または生理学的変化に応答するプロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素症、ステロイド、例えば、プロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えば、ＶＥＧＦプロモーターが含まれる。プロモーターの組み合わせを使用して、関心の遺伝子の望ましい発現を得てもよい。当業者は、関心の有機体または標的細胞における遺伝子の望ましい発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。
【００７５】
ウイルスゲノムは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ応答性プロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、関心の配列に操作可能に結合することができ、終結配列に結合することもできる。さらに、複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターを組み込んでもよい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、当業者によく知られている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適切な範囲は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐａｕｌｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ  １２８３−１２９８（２０００）において見つけることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、下流ＲＮＡコード配列を転写するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩを指示することができる、あらゆる合成または操作ＤＮＡフラグメントも含む。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター、またはウイルスベクターゲノムの一部として使用されるプロモーターは、誘導可能であり得る。あらゆる適切な誘導性Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、本発明の方法とともに使用することができる。特に適したＰｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｈｋａｗａ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ  ５７７−５８５（２０００）およびＭｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ  １６７２−１６８２（２００１）において提供される、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。
【００７６】
内部エンハンサーは、関心の遺伝子の発現を増加させるように、ウイルス構成に存在してもよい。例えば、ＣＭＶエンハンサー（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，４１：５２１，１９８５）を使用してもよい。ＨＩＶ、ＣＭＶ等のウイルスゲノム、および哺乳類ゲノム中の多くのエンハンサーが識別および特性化された（ＧｅｎＢａｎｋを参照）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者であれば、望ましい発現パターンに基づいて、適切なエンハンサーを選択することができる。
【００７７】
ウイルスベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、関心の配列に操作可能に結合されるプロモーター、ウイルス成分、および本明細書に論じられる他の配列を含有する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるのを許可する、核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性、構成的、一時的に活性、または組織特異的であってもよい。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的要素の存在または不在によって誘導される。それらが操作可能に結合される遺伝子の発現を、生物体の発生、その製造のある段階において、または特定の組織において、オンオフすることができるため、誘導性プロモーターは、遺伝子操作において有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとしてグループ分けすることができる。通常、化学的に調節されるプロモーターは、これらに限定されないが、アルコール調節されるプロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節されるプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）、ステロイド調節されるプロモーター（例えば、ｒａｔグルココルチコイド受容体（ＧＲ）系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）系プロモーター、モスエクジソン受容体系プロモーター、およびステロイド／レチノイド／チロイド受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属調節されるプロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター）、および原因関連プロモーター（例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病因関連（ＰＲ）タンパク質系プロモーター）を含む。通常、物理的に調節されるプロモーターには、これらに限定されないが、温度調節されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節されるプロモーター（例えば、大豆ＳＳＵプロモーター）が含まれる。他の例示的プロモーターは、他の部分、例えば、２００９年５月１８日にアクセスされたＰａｔｅｎｔ  Ｌｅｎｓウェブサイト上の″Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ″（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００７８】
当業者は、特定の状況に基づいて、適切なプロモーターを選択することができる。多くの異なるプロモーターは、プロモーターを発現される遺伝子に操作可能に結合するための方法であるとして、本技術分野においてよく知られている。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、パッケージ化細胞および標的細胞において発現させてもよい。しかしながら、異種プロモーターは、一般に、天然プロモーターと比較して、優れた転写および望ましいタンパク質の高い収率を許可するため、好適である。
【００７９】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得てもよい。プロモーターは、例えば、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または通常、天然配列と関連付けられるプロモーターであってもよいが、但し、そのようなプロモーターは、標的細胞と適合する。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において自然発生するウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターであり得る。
【００８０】
転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーは、通常、その転写を増加させるように、プロモーターに作用する、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用エレメントである。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）および真核細胞ウイルスに由来する多くのエンハンサー配列が知られている。例には、複製起点の外側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の外側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対して５’または３’位でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから５’位に位置付けられる。
【００８１】
発現ベクターは、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有してもよい。これらの配列は、真核細胞またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合によっては３’の未翻訳領域において見つけられる場合が多く、本技術分野においてよく知られている。
【００８２】
ウイルスベクターゲノムは、追加の遺伝因子を含有してもよい。構成物に含まれてもよい因子の種類は、いかなる方法においても限定されず、特定の結果を達成するために選択されてもよい。例えば、標的細胞へのウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれてもよい。そのようなシグナルの例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。さらに、標的細胞内のプロウイルス組み込み部位の特性化を促進する因子が含まれてもよい。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサーは、構成物に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロブリンからのインスレーター配列は、ウイルスゲノム構成物に含まれてもよい。この因子は、メチル化および異質染色質化の効果に起因して、標的細胞内で組み込みプロウイルスをサイレンシングする機会を減少させる。さらに、インスレーターは、染色体上の組み込み部位において、周囲のＤＮＡからの正または負の位置効果から、内部エンハンサー、プロモーター、および外来遺伝子を遮断し得る。さらに、ベクターゲノムは、関心の遺伝子の発現を強化するように設計された１つ以上の遺伝因子を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答配列（ＷＲＥ）が構成物に配置されてもよい（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３６６８−３６８１、Ｄｅｇｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７９−１９０）。
【００８３】
ウイルスベクターゲノムは、通常、パッケージ化または産生細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構成される。プラスミドは、一般に、細菌中のプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、本技術分野においてよく知られている。さらに、複製の原核生物起源を含むベクターは、その発現が薬物耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬物耐性産生物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【００８４】
本明細書に記載される成分の１つ以上を含有するプラスミドは、本技術分野においてよく知られる標準手技を使用して容易に構成される。構成されるプラスミドにおいて適切な配列を確認するための分析の場合、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって精製および分析される大腸菌、または従来方法によって決定されるそのＤＮＡ配列において複製されてもよい。
【００８５】
哺乳類細胞において一時的発現のために構成されるベクターを使用してもよい。一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製を蓄積するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴い、順に、発現ベクターにおいて、抗原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる、高レベルのポリペプチドを合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２を参照されたい。ポリペプチドの発現に対する適合に適した他のベクターおよび方法は、本技術分野においてよく知られており、特定の状況に対して容易に適合される。
【００８６】
本明細書に提供される手技を使用して、当業者は、パッケージ化細胞を、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトし、適切な手技を使用して発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体を使用して発現を測定することによって、特定の発現系の有効性を試験することができることを認識するであろう。適切なレポーター遺伝子は、本技術分野においてよく知られている。
３．関心の配列の種類
関心の配列は、いかなる方法においても限定されず、当業者が標的細胞に組み込み、転写、および発現させることを望む、あらゆる核酸を含む。産生物は、タンパク質または核酸であり得る。関心の配列は、タンパク質またはｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖ＲＮＡ、またはメッセージＲＮＡに相補的なＲＮＡを含む、核酸分子をコードすることができ、メッセージＲＮＡに対するこの相補（アンチセンス）ＲＮＡの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。一部の例において、関心の配列は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードすることができる。特に、腫瘍抗原およびＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、マラリア、または結核等の病原体からの感染疾患抗原が望ましい。
【００８７】
ある例において、関心の配列は、分子の発現を下方調節する関心の低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子であり得る。例えば、ｓｉＲＮＡまたはミクロＲＮＡをコードする遺伝子を使用して、樹状細胞の活性または変異を阻害するものを含む、細胞内の負の調節因子の発現を下方調節することができる。ｓｉＲＮＡおよびミクロＲＮＡは、本技術分野においてよく知られている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６，１９９８、″Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ″ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ５２，２００８、Ｔａｇａｎｏｖ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６：１３３−１３７、Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｅ．Ｌｕｎｄ．２００７．Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ  ３８７：ｐｅ２５、Ｔｉｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １：１４２，２００９も参照されたい）。あるいは、関心の配列は、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖ＲＮＡ、または約２０リボヌクレオチド長よりも大きいアンチセンスＲＮＡをコードすることができる。当業者であれば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ分子が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現し得ること、あるいは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから転写される、非コードＲＮＡの成分であり得ることを理解するであろう。
【００８８】
さらに、関心の配列は、複数の産生物をコードしてもよい。一部の構成において、送達される配列は、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、少なくとも１つのミクロＲＮＡ、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ、もしくは少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ分子をコードする複数の遺伝子、あるいはそれらのあらゆる組み合わせを含むことができる。例えば、送達される配列は、それに対する免疫反応が所望される１つ以上の抗原をコードする、１つ以上の遺伝子を含むことができる。１つ以上の抗原は、単一の疾患または障害と関連付けることができるか、またはそれらは、複数の疾患および／または障害と関連付けることができる。一部の例において、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする遺伝子とともに含まれることができ、その組み合わせは、免疫反応を誘発し、所望の配向および規模に調節することができる。他の例において、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ，またはアンチセンスＲＮＡ分子をコードする配列は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする遺伝子とともに構成されることができ、その組み合わせは、免疫反応の範囲を調節することができる。産生物は、コード配列が１つのプロモーターと機能的関係にある、初期融合産生物として産生されてもよい。あるいは、産生物は、別々にコードされてもよく、各コード配列は、プロモーターと機能的関係にある。プロモーターは、同一であるか、または異なってもよい。
【００８９】
ある構成において、ベクターは、樹状細胞成熟／刺激因子をコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。例示的刺激分子には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）等が挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、通常、樹状細胞内でコード配列を発現させる、１つ以上の調節因子の制御下にある。樹状細胞の成熟は、良好なワクチン接種に寄与する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ  ａｎｄ  Ｐａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６（２００５）、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７（２００３）、Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０（２００４））。成熟は、抗原捕捉に活発に関与する細胞からのＤＣを、Ｔ細胞プライミングに特化される細胞に変換することができる。例えば、ＣＤ４０ＬによってＣＤ４０をＣＤ４−ヘルパーＴ細胞に係合することは、ＤＣ成熟に重要なシグナルであり、ＣＤ８Ｔ細胞の強力な活性をもたらす。そのような刺激分子は、成熟因子または成熟刺激因子とも称される。免疫チェックポイントは、癌における機能的細胞性免疫の活性に対する重要な障壁を表し、ＣＴＬＡ４およびプログラム死−１（ＰＤ−１）を含む、Ｔ細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、クリニックにおいて評価されている標的薬剤の例である。慢性感染症および癌において重要な耐性機序は、高レベルのＰＤ−１を発現するＡｇ特異的Ｔ細胞の機能的消耗である。治療的免疫付与の有効性は、免疫チェックポイントの制御と組み合わせることによって著しく強化されることが示されたため、非限定例として、当業者であれば、免疫チェックポイントを阻害する代替アプローチが、プログラム死（ＰＤ）リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２）の発現を阻害することであると理解することができる。阻害を達成するための一方法は、本明細書に記載されるもの等のＲＮＡ分子の発現によってであり、ＲＮＡ分子の１つ以上をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＣにおいて、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の発現を抑制する。ＤＣの成熟または免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ−１リガンド等の特定因子の発現は、ＭＨＣ  ＩＩ等の表面マーカーの上方調節のフローサイトメトリー分析、および発現したケモカインおよびサイトカインのプロファイルによって特性化することができる。
【００９０】
検出可能な産生物、通常、タンパク質をコードする配列を含まれることにより、所望の産生物を発現している細胞の識別を可能にすることができる。例えば、蛍光マーカータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、（例えば、抗原をコードする）関心の配列とともに構成物に組み込まれる。他の例において、タンパク質は、抗体によって検出可能であってもよいか、またはタンパク質は、検出可能な産生物を産出するように基質に作用する酵素であってもよく、トランスフェクトまたは形質導入した標的細胞の選択を可能にする、例えば、ヒグロマイシン耐性等の薬物耐性を付与する産生物であってもよい。典型的な選択遺伝子は、真核細胞での使用に適切な抗生物質または他の毒素、例えば、本技術分野において知られている中で、ネオマイシン、メトトレキセート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠陥を相補するか、または培地から抑制される重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択的マーカーは、別個のプラスミド上に随意に存在し、共トランスフェクションによって導入することができる。
【００９１】
パッケージ化細胞において所望のウイルスを産生するために必要な要素（例えば、関心の配列、エンベロープ分子、ＤＣ成熟因子）の２つ以上を含む、１つ以上の多シストロン発現単位を利用してもよい。多シストロンベクターは、必要とされる核酸分子の総数を減少させ、したがって、複数のベクターゲノムからの調和した発現と関連付けられる可能な困難を回避する。多シストロンベクターにおいて、発現される種々の要素は、１つ以上のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御要素）に操作可能に結合される。一部の構成において、多シストロンベクターは、関心の配列、レポーター産生物をコードする配列、およびウイルス要素を含む。関心の配列は、通常、抗原および随意にＤＣ成熟因子をコードする。時には、多シストロンベクターは、抗原をコードする遺伝子、ＤＣ成熟因子をコードする遺伝子、およびウイルス要素を含む。
【００９２】
多シストロン発現ベクターにおいて発現される各成分は、同一プロモーターから種々のタンパク質の別個の発現を可能にするように、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素またはウイルス２Ａ要素によって分離されてもよい。ＩＲＥＳ要素および２Ａ要素は、本技術分野において知られている（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９３７，１９０号、ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：６１６−６２６）。一実施形態において、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４）からの２Ａ様配列と結合される、フリン開裂部位配列（ＲＡＫＲ）をコードするオリゴヌクレオチド（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３：５８４−５９０）を使用して、多シストロンベクター内の遺伝要素を分離する。特定の多シストロンベクターの有効性は、標準プロトコルを使用して、各遺伝子の発現を検出することによって容易に試験することができる。
【００９３】
特定の例示において、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列、ＨＩＶ  ５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列、パッケージ化配列（Ψ）、ＨＩＶ−１フラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、関心の遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス応答配列、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列、そのエンハンサー配列の欠失を有するＵ３要素、ニワトリβ−グロブリンインスレーター、ならびに３’ＨＩＶ  ＬＴＲのＲおよびＵ５配列を含む。一部の例示において、ベクターゲノムは、正常なレンチウイルス５’ＬＴＲおよび自己不活性化３’ＬＴＲを含む（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｉｗａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５：１２０，１９９９）。
【００９４】
ベクターゲノムの構成は、本技術分野において知られる、あらゆる適切な遺伝子操作技術を使用して達成することができ、制限なしに、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９７））、および″ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ″（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００）に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準技術を含む。
４．ウイルス粒子の産生
本技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡ複製を含む、感染性レンチウイルス粒子を産生してもよい。１つの方法において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージ化するために必要な成分のすべてを含有するパッケージ化細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、１つ以上の関心の配列に加えて、ウイルス成分をコードする１つ以上の遺伝子含んでもよい。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージ化細胞株において別々に提供される。
【００９５】
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含有する、１つ以上のプラスミドベクターでトランスフェクトされる細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、それらは、単に一ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。多くの場合、複数のプラスミドベクターを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子成分を分離し、主に、そうでなければ複製可能なウイルスを生成し得る組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、必要に応じて、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。複数のプラスミドベクターを用いるシステムの一例として、細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する少なくとも１つのプラスミド（すなわち、ベクターゲノムプラスミド）でトランスフェクトされ、ＬＴＲ、シス作用パッケージ化配列、および多くの場合、異種プロモーターに操作可能に結合される、関心の配列、ウイルス酵素的および構造的成分をコードする少なくとも１つのプラスミド（すなわち、ＧａｇおよびＰｏｌ等の成分をコードする、パッケージ化プラスミド）、およびアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのエンベローププラスミドを含む。追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載され、本技術分野において知られるようなＲｅｖ発現プラスミドを使用して、レトロウイルス粒子産生を強化することができる。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、関心の配列を含むゲノムを含むコア、および樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である場合、糖タンパク質を操作して、基準ＨＲ株と比較して、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。
【００９６】
本発明のプラスミドベクターによるパッケージ化細胞のトランスフェクションは、よく知られている方法によって達成することができ、使用される方法は、いかなる方法においても限定されない。多数の非ウイルス送達システムは、本技術分野において知られており、例えば、エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質系送達システム、「裸の」ＤＮＡの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を使用する送達、例えば、Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ  ＡＧに記載されるものが含まれる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００１．Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ）。通常、陽イオン性脂質または塩処理方法が用いられる。例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒａｈａｍら（１９７３．Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６）を参照されたい。リン酸カルシウム沈殿方法が最も頻繁に使用される。しかしながら、ベクターを細胞に導入するための他の方法を使用してもよく、核微量注入および細菌原形質融合を含む。
【００９７】
パッケージ化細胞株は、ウイルスゲノムＲＮＡをレンチウイルスベクター粒子にパッケージ化するためのトランスにおいて必要な、ウイルス調節および構造的タンパク質を含む成分を提供する。パッケージ化細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することができる、あらゆる細胞株であってもよい。一部の適切なパッケージ化細胞株には、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、２９３Ｔ、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）細胞が挙げられる。パッケージ化細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。そのようなパッケージ化細胞株は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１８１号に記載される。あるいは、パッケージ化細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、１つ以上の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸によって、一時的にトランスフェクトされてもよい。得られるウイルス粒子を回収し、標的細胞の感染に使用する。エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、通常、ｐｃＤＮＡ３等の発現ベクター（Ｉｎvｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）にクローン化される。真核細胞発現ベクターは、本技術分野においてよく知られており、多数の商業的供給源から入手できる。次に２９３Ｔ細胞等のパッケージ化細胞を、関心の配列をコードする（通常、抗原をコードする）ウイルスベクターゲノム、ウイルスパッキング成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、および標的分子の発現のためのベクターで共トランスフェクトする。エンベロープは、パッケージ化細胞の膜上に発現され、ウイルスベクターに組み込まれる。
【００９８】
１つのシナリオにおいて、本明細書に記載されるように、Ｅ２等のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を調製するために、１つ以上のベクターを使用して、ポリヌクレオチド配列をパッケージ化細胞株に導入する。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含む、ウイルスの種々の成分をコードするポリヌクレオチド配列、関心の配列（通常、抗原をコードする）、およびパッケージ化細胞によって提供されないウイルスを産生するために必要なあらゆる成分を含有することができる。
【００９９】
さらに他のシナリオにおいて、パッケージ化細胞は、抗原をコードするウイルスベクターゲノム、および１つ以上の追加のベクターで共トランスフェクトされる。例えば、抗原をコードするウイルスベクターに加えて、第２のベクターは、好ましくは、修飾した（変異体とも呼ばれる）シンドビスウイルスエンベロープをコードする遺伝子を担持する。一部の状況において、抗原をコードするウイルスベクターゲノムは、選択した免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列も含み、非限定例として、ケモカイン、サイトカイン、ＤＣ成熟因子、または免疫チェックポイント機序を調節する因子を含む。他の状況において、選択した免疫調節因子をコードするポリヌクレオチド配列は、抗原をコードするウイルスベクターおよび１つ以上の追加ベクターによって、パッケージ化細胞に共トランスフェクトされる、第３のベクターに含有される。
【０１００】
ウイルスの産生は、本明細書に記載のとおり測定され、容量当たりのＩＵとして表現される。ＩＵは、感染単位、あるいは形質導入単位（ＴＵ）であり、ＩＵおよびＴＵは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的測定値として同義的に使用することができる。本明細書に記載されるように、ゲノムが容易に測定可能な産生物を発現することができる、ウイルスが産生される。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好適である。レンチウイルスベクターは、通常、非組み込みである。次に、ウイルスを標的細胞に投与し、例えば、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰを発現する標的細胞の数を決定する（実施例３を参照）。次に、力価を計算する。力価は、可能な限り高いことが好ましいが、細胞上澄みの少なくとも１×１０５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０６ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも１×１０７ＩＵ／ｍＬである（あらゆる濃縮前）。あるいは、力価は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを有する同一細胞において偽型化された同一のレンチウイルスベクターの力価の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％である。
Ｃ．ウイルスの送達
ウイルスは、ウイルスが、関心のポリヌクレオチドの送達が所望される、標的樹状細胞（ＤＣ）と接触するのを可能にする、あらゆる方法で、標的細胞に送達されてもよい。時によって、適切な量のウイルスが、例えば、身体への注入を通して、ヒトまたは他の動物に直接（インビボ）導入される。適切な動物には、限定されないが、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、または他のトリが挙げられる。ウイルス粒子は、静脈内、皮内、皮下、結節内、腹腔内、または粘膜等の多数の経路によって注入されてもよい。ウイルスは、すべて参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２４１，２７５号、第７，１１５，１０８号、第７，１０８，６７９号、第７，０８３，５９９号、第７，０８３，５９２号、第７，０４７，０７０号、第６，９７１，９９９号、第６，８０８，５０６号、第６，７８０，１７１号、第６，７７６，７７６号、第６，６８９，１１８号、第６，６７０，３４９号、第６，５６９，１４３号、第６，４９４，８６５号、第５，９９７，５０１号、第５，８４８，９９１号、第５，３２８，４８３号、第５，２７９，５５２号、第４，８８６，４９９号に開示されるデバイス等の皮下注入デバイスを使用して送達されてもよい。他の注入位置も適切であり、例えば、標的細胞を含む器官に直接注入される。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入、または骨髄内注入を使用して、ウイルスをリンパ節、脾臓、および骨髄にそれぞれ送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば、眼、口、または皮膚の上皮組織との直接接触を含む、他の手段を通して導入を行うことができる。
【０１０１】
あるいは、標的細胞は、例えば、培養プレートにおいて、インビトロで提供され、ウイルスと接触される。標的細胞は、通常、健康な被検体または治療を必要とするか、もしくは抗原に対する免疫反応を刺激することが望ましい被検体から得られた樹状細胞を含む細胞群である。被検体から細胞を得る方法は、本技術分野においてよく知られており、静脈切開術、外科的切開、および生検が挙げられる。ヒトＤＣは、ＣＤ３４α＋ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の個所に記載されるようなインビトロ培養方法を使用することによって生成されてもよい（例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １０６，２７１−２７４（２００１））。
【０１０２】
ウイルスを培地中に懸濁し、培養プレート、管、または他の容器のウェルに添加してもよい。ウイルスを含有する培地は、細胞のプレーティング前、または細胞がプレーティングされた後に添加されてもよい。細胞は、通常、適量の培地中で培養して、生存能力を提供し、宿主細胞の形質導入が起こるように、培地中のウイルスの適切な濃度を可能する。細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染するのに十分な時間に、ウイルスで培養される。好ましくは、細胞は、少なくとも１時間、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間、ウイルスで培養される。
【０１０３】
インビボおよびインビトロ送達の両方において、所望の標的細胞に感染するのに十分な数を含有するウイルス粒子のアリコートを使用してもよい。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、一般に、少なくとも１ＩＵ／μＬ、より好ましくは、少なくとも１０ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも３００ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０４ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０５ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０６ＩＵ／μＬ、またはさらにより好ましくは、少なくとも１×１０７ＩＵ／μＬである。
【０１０４】
インビトロでのウイルス感染に続いて、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入（または再導入）することができる。細胞は、皮内、皮下、または末梢血流に導入することができる。動物に導入された細胞は、好ましくは、有害な免疫反応を回避するために、その動物に由来する細胞である。類似する免疫背景を有するドナーに由来する細胞を使用してもよい。使用することもできる他の細胞は、有害な免疫反応を回避するように設計されるものを含む。
【０１０５】
標的細胞は、例えば、関心の配列または遺伝子の組み込み、転写、および／または発現、組み込まれる遺伝子の複製数、および組み込みの位置に関して分析されてもよい。そのような分析は、あらゆる時間に行われてもよく、かつ本技術分野において知られているあらゆる方法によって行われてもよい。
【０１０６】
ウイルスまたはウイルス感染した樹状細胞が投与される被検体は、感染細胞の位置、ウイルス送達されたポリヌクレオチドまたは関心の遺伝子の発現、免疫反応の刺激に関して分析し、本技術分野において知られているあらゆる方法によって、疾患または障害と関連付けられる症状を監視することができる。
【０１０７】
上に開示される細胞に感染する方法は、細胞の個別の特異的特性に依存しない。結果として、それらは、多様な動物種に容易に拡大される。一部の例において、ウイルス粒子は、ヒトまたはヒト樹状細胞に送達され、他の例において、それらは、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはマウス、またはトリ等の動物に送達される。本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムを偽型化して、広範な宿主範囲ならびに標的細胞の特異性を付与する。当業者であれば、特定の動物種において関心の配列の望ましい発現を達成するために適切な内部プロモーターおよび他の要素にも気付くであろう。したがって、当業者であれば、あらゆる種からの樹状細胞に感染する方法を修飾することができる。
Ｄ．治療的および予防的免疫付与
樹状細胞は、疾患または障害の予防または治療のための、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクター粒子、特に、患者における免疫反応の活性化が有益となるものに感染させてもよい。多くのそのような疾患は、よく知られている。例えば、本発明の方法による治療または予防の影響を受けやすい疾患または障害には、限定されないが、癌、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、および寄生感染を含む感染が挙げられる。他の方法において、疾患は、関心の配列を樹状細胞に送達するために、本明細書に記載されるウイルス粒子によって治療され、関心の配列の発現は、疾患特異的抗原を産生し、抗原特異的細胞免疫反応および体液性免疫反応の刺激をもたらす。一般に、関心の配列は、それに対して免疫反応が所望される抗原をコードするが、通常は、樹状細胞において発現されない。抗原は、樹状細胞によって発現および提示される。ウイルスベクターゲノムは、ＤＣ成熟因子をさらにコードしてもよい。
【０１０８】
典型的な用途において、ウイルス粒子は、それに対する免疫反応が所望される抗原をコードする配列を樹状細胞に送達する。樹状細胞をウイルスとインビトロで接触させることによって、送達が達成され得、感染した樹状細胞が患者に提供される。またある時には、樹状細胞にインビボで感染させるために、ウイルスを被検体に送達することによって、送達が達成され得る。次に、樹状細胞は、患者において抗原特異的Ｔ細胞またはＢ細胞を刺激し、発現した抗原に対する細胞性および体液性免疫反応を誘導する。そのような方法において、疾患または障害を患う患者は、所望の特異性を有する免疫細胞を生成することによって治療される。
【０１０９】
疾患または障害と関連付けられるあらゆる抗原は、本明細書に記載されるように、ウイルス粒子を使用して樹状細胞に送達することができる。疾患または障害と関連付けられる抗原は、樹状細胞を標的とするウイルス粒子の調製のために識別される。多くの疾患および障害と関連付けられる抗原は、本技術分野においてよく知られている。抗原は、疾患または障害と関連付けられることが前もって知られ得るか、または本技術分野において知られているあらゆる方法によって識別されてもよい。例えば、患者が罹患している癌種に対する抗原、例えば、腫瘍関連抗原が知られ得るか、または本技術分野において知られている多様な方法のいずれかによって、腫瘍自体から識別されてもよい。
【０１１０】
腫瘍関連抗原は、例えば、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、および乳癌を含む、多様な癌に関して知られている。一部の乳癌において、例えば、Ｈｅｒ−２受容体は、癌細胞の表面上で過剰発現される。例示的な腫瘍抗原には、これらに限定されないが、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１が挙げられ、睾丸の免疫特権領域において、および未変異抗原である、系統特異的腫瘍抗原、例えば、メラニン細胞−黒色腫系統抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌−５Ｔ４、ＳＭ２２−α、炭酸脱水酵素ＩおよびＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α）、ＶＥＧＦまたは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、および前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１（これらは同一組織に由来する正常および新生細胞において発現される抗原である）；正常細胞と比較して、腫瘍細胞において変異される遺伝子、または腫瘍において異なるレベルで転写される遺伝子に由来するエピトープ／ペプチド、例えばテロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型または野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０  １Ｂ１、および異常発現したイントロン配列、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ；骨髄腫およびＢ−細胞リンパ腫において固有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再構成；腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープタンパク質／ペプチド、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、腫瘍選択的発現を有する非変異腫瘍胎児タンパク質、例えば、癌胎児性抗原およびα−フェトタンパク質等の多様な腫瘍細胞において発現される。多数の腫瘍関連抗原が検討された（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、″Ｔｕｍｏｒ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ｂｙ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，″Ｂｏｏｎ  Ｔ，Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ  Ｊ  Ｃ，Ｖａｎｄｅｎｅｙｎｄｅ  Ｂ，Ｖａｎｄｅｒｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ，Ｖａｎｐｅｌ  Ａ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：３３７−３６５，１９９４、″Ａ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，″Ｒｅｎｋｖｉｓｔ  Ｎ，Ｃａｓｔｅｌｌｉ  Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐ  Ｆ，Ｐａｒｍｉａｎｉ  Ｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５０：（１）３−１５  ＭＡＲ  ２００１を参照）。
【０１１１】
抗原は、感染疾患、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ等と関連付けられる抗原でもあり得る。抗原は、例えば、ｇｐ１２０であり得る（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１２０２２−１２０３２、Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：９３−１０３、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：７３４９−７３５６）。他の例示的抗原には、これらに限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ、およびｒｅｖが挙げられる（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３（５）：３８３−３９２、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（４）：１６７−１８１）。
【０１１２】
ウイルス抗原の例には、これらに限定されないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（例えば、Ｂ型肝炎コアまたは表面抗原、またはＣ型肝炎ウイルスＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コア、または非構造的タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質）、免疫不全ウイルスポリペプチド（例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、Ａ型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはヌクレオタンパク質）、白血病ウイルスポリペプチド、マルバーグウイルスポリペプチド、またはオルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。
【０１１３】
細菌抗原の例には、これらに限定されないが、アクチノミセスポリペプチド、バシルスポリペプチド、バクテロイドポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド（例えば、Ｂ．ライム病ＯｓｐＡ）、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コキシエラポリペプチド、ダーマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド（例えば、Ｈ．インフルエンザ型ｂ外膜タンパク質）、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、スタフィロコッカスポリペプチド、ストレプトコッカスポリペプチド（例えば、Ｓ．ピロゲンＭタンパク質）トレポネマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド（例えば、Ｙ．ペスティスＦ１）およびＶ抗原が挙げられる。
【０１１４】
真菌抗原の例には、これらに限定されないが、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、パシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コッキジオイドポリペプチド、コニジオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィラロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドが挙げられる。
【０１１５】
プロトゾア寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エンタモエバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチド（例えば、Ｐ．熱帯性サーカムスポロゾイト（ＰｆＣＳＰ）、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）、および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられる。
【０１１６】
蠕虫寄生抗原の例には、これらに限定されないが、アカントケイロネマポリペプチド、ネコ円虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、大口腸線虫ポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィムポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボツリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイドポリペプチド、ヘモンカスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、血色食道虫ポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイドポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリクリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびバンクロフト糸状虫ポリペプチドが挙げられる。
【０１１７】
外部寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、ノミからのポリペプチド（保護抗原ならびにアレルゲンを含む）；カタダニおよび軟ダニを含むダニ；ハエ（例えば、小昆虫、蚊、サシチョウバエ、クロバエ、ウシアブ、ノサシバエ、シカバエ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ症をもたらすハエ、およびヌカカ）；アリ；クモ；シラミ；ダニ；および半翅類の昆虫（例えば、トコジラミおよびサシガメ）が挙げられる。
【０１１８】
抗原が識別および選択されると、所望の抗原をコードする配列が識別される。好ましくは、配列は、ｃＤＮＡを含む。ウイルス感染に続いて、関心の配列（例えば、抗原をコードするもの）は、標的樹状細胞によって発現される。エクスビボで接触されると、次に、標的樹状細胞は、例えば、注入によって患者に戻され、それらは、所望の抗原に対して免疫反応を生成することができる、免疫細胞と相互作用する。好適な実施形態において、組み換えウイルスは、患者に注入されて、標的樹状細胞を原位置で形質導入する。次に、樹状細胞は、治療される疾患または障害と関連付けられる特定の抗原を発現し、患者は、疾患または障害に対して有効な免疫反応を開始することができる。
【０１１９】
ウイルスベクターゲノムは、複数の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有してもよく、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対して免疫反応を生成する。一部の実施形態において、抗原は、単一疾患または障害に関連する。他の実施形態において、抗原は、複数の疾患または障害に関連する。
【０１２０】
ウイルスの一部において、ＤＣの成熟を活性化および／または刺激するＤＣ成熟因子は、関心の配列と併せて送達される。代替例において、ＤＣは、ウイルスの送達前、ウイルスの送達と同時、またはウイルスの送達後に、ＤＣ成熟因子の送達によって活性化される。ＤＣ成熟因子は、ウイルスの投与とは別に提供されてもよい。
【０１２１】
本明細書に記載されるように、１つ以上の免疫調節またはＤＣ成熟因子は、ウイルスゲノムに含有され、ウイルスが樹状細胞に感染した後に発現される、１つ以上の配列によってコードすることができる。免疫調節因子をコードする配列は、パッケージ化細胞株において１つ以上の抗原をコードするウイルスベクターで共トランスフェクトされる、個別のベクターにおいて提供することもできる。
【０１２２】
本明細書に記載される方法は、患者における養子免疫療法に使用することができる。上述されるように、免疫反応が所望される抗原が識別される。所望の抗原をコードするポリヌクレオチドが得られ、組み換えウイルスにパッケージ化される。標的樹状細胞は、患者から採取し、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えウイルスで形質導入される。次に、樹状細胞を患者に戻す。
【０１２３】
ウイルス粒子は、インビボで注入されてもよく、それらは、ＤＣに感染し、通常、抗原をコードする、関心の配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０６ＩＵであり、少なくとも１×１０７ＩＵ、少なくとも３×１０７ＩＵ、少なくとも１×１０８ＩＵ、少なくとも３×１０８ＩＵ、少なくとも１×１０９ＩＵ、または少なくとも３×１０９ＩＵであり得る。選択した間隔で、受容体のリンパ器官からＤＣを使用して、マーカー発現、例えば、ＧＦＰまたはルシフェラーゼを観察することによって、発現を測定してもよい。核酸モニタリング技術および逆転写（ＲＴ）活性の測定値を使用して、ウイルス粒子の生体内分布を分析することもできる。末梢血単核細胞からのＴ細胞、リンパ節、またはレンチウイルスベクター粒子で治療した受容体の悪性もしくは標的病因に感染した組織は、抗原刺激に対する反応の規模および期間から測定されてもよい。上皮細胞およびリンパ細胞等のＤＣ以外の組織細胞は、インビボ遺伝子送達の特異性に関して分析されてもよい。
【０１２４】
ＡＩＤＳの流行（および他のウイルス疾患）を終結させるための最も有効な潜在的方法は、有効な予防ワクチンであることが広く同意される。これまで、ＨＩＶに対するワクチン接種方法は、第３相試験を良好に通過していない。したがって、新規の有効なワクチン接種戦略が緊急に必要とされる。１つの戦略は、ＤＣのワクチン接種である。この実装において、上述されるもの等のウイルスタンパク質をコードする配列は、ウイルスベクターにクローン化される。患者を、本明細書に記載されるように構成されたウイルスに感染させる。動物モデルにおいて、分子クローン化したＨＩＶレポーターウイルス（ＮＦＮＳＺ−ｒ−ＨＳＡＳ、ＮＬ−ｒ−ＨＳＡＳ）および臨床単離体を使用し、尾静脈注射によって動物に曝露してもよい。感染の証拠は、脾細胞、リンパ節、および末梢血において経時的に監視されてもよい。レポーターウイルスにおけるＨＩＶ−ｇａｇタンパク質のＰＣＲ増幅およびＨＡＳのフローサイトメトリーを使用して、ウイルスの組み込みおよび複製を試験してもよい。生産的原位置ＤＣワクチン接種は、ＨＩＶ曝露に対する耐性を増加させ得る。
【０１２５】
ワクチンは、アジュバントを含む場合が多い。本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントは、組み換えウイルス粒子とともに、組み換えウイルス粒子の前、または組み換えウイルス粒子の後に投与されてもよい。ウイルス粒子とともに投与される場合、望ましいアジュバントは、ウイルス粒子の完全性を著しく崩壊させない（例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を崩壊させない）。
【０１２６】
多様なアジュバントをウイルスと組み合わせて使用して、ウイルスベクターゲノムにおいてコードされる抗原に対する免疫反応を引き起こすことができる。好適なアジュバントは、反応の定量形態に影響する抗原において構造変化をもたらすことなく、抗原に対する固有反応を増補する。好適なアジュバントは、ａｌｕｍ、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノリン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む（英国特許第ＧＢ２２２０２１１号を参照）。ＱＳ２１は、南アフリカで見られるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａriａ  Ｍｏｌｉｎａという木の枝から単離されたトリテルペン配糖体またはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５、米国特許第５，０５７，５４０号を参照）。他のアジュバントは、モノリン酸化脂質Ａ等の免疫刺激剤と随意に組み合わせて、水中油エマルション（例えば、スクアランまたはピーナッツ油）である（Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７））。別のアジュバントはＣｐＧである（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ，Ｎｏｖ．１５，１９９８を参照）。あるいは、Ａβをアジュバントに結合することができる。例えば、Ａβのリポペプチド版は、Ｂ型肝炎抗原ワクチン接種に関して記載されるように、パルミチン酸または他の脂質をＡβのＮ末端に直接結合することによって調製することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，１３８３−１３９２（１９９７））。しかしながら、そのような結合は、それに対する免疫反応の性質に影響するように、Ａβの構造を実質的に変更してはならない。アジュバントは、活性成分を有する治療組成物の成分として投与することができるか、または治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に個別に投与することができる。
【０１２７】
一群のアジュバントは、アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリマーまたは単量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシン等の他の特定の免疫刺激剤の有無に関わらず使用することができる。別の群のアジュバントは、水中油エマルション製剤である。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ＡＩ−Ｄ−イソグル−Ｌ−アラ――ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（商標）、または他の細菌細胞壁成分の有無に関わらず使用することができる。水中油エマルションは、（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ  ミクロ流動化剤（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（マサチューセッツ州ニュートン））等のミクロ流動化剤を使用してサブミクロン粒子に製剤された、５％  スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５を含有する（随意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）、ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）いずれもサブミクロンエマルションにミクロ流動化されるか、または粒径の大きいエマルションを生成するようにボルテックスされる、１０％  スクアラン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％  プルロン遮断したポリマー  Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する、ＳＡＦ、および（ｃ）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる基からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ（モンタナ州ハミルトン）。別の群の好適なアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ（マサチューセッツ州ウースター）、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ等からそこで生成される粒子である。他のアジュバントは、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【０１２８】
本明細書の組成物と併用することができる別のアジュバントは、化学式（Ｉ）によって識別され、
【０１２９】
【化１】
2018198616.tif 000004
【０１３０】
式中、Ａ１およびＡ２部分は、水素、リン酸、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、３〜２３個の炭素を有する、Ｃ３−Ｃ２３と表されるヒドロカルビルの群から独立して選択される。さらなる明確さのために、ある部分が複数の成員を有する特定の群「から独立して選択される」場合、第１の部分に選択された成員は、第２の部分に選択された成員の選択を、いかなる方法においても影響または制限しないことを理解すべきであると説明される。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が結合する炭素原子は、非対称であり、したがって、ＲまたはＳ立体化学のいずれかで存在してもよい。一実施形態において、それらの炭素原子のすべては、Ｒ立体化学であるが、別の実施形態において、それらの炭素原子のすべては、Ｓ立体化学である。
【０１３１】
「ヒドロカルビル」は、水素および炭素から全体的に形成される化学部分を指し、炭素原子の配置は、直鎖または分岐、非環状または環状であってもよく、隣接する炭素原子間の結合は、全体的に単一結合であってもよく、すなわち、飽和ヒドロカルビルを提供するか、またはあらゆる２つの隣接する炭素原子間に、二重結合または三重結合が存在してもよく、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し、ヒドロカルビル基内の炭素原子の数は、３〜２４個の炭素原子の間である。ヒドロカルビルは、アルキルであってもよく、代表的な直鎖アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を含み、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、分岐アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含むが、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重または三重結合を含有する（ヒドロカルビルが非環状である場合は、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と称され、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合は、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと称される）。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられるが、代表的な直鎖および分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル等が挙げられる。
【０１３２】
式（Ｉ）のアジュバントは、本技術分野において知られている合成方法によって得られてもよく、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／０３５５２８号、ならびにそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／０３５５２８号において識別される出版物を参照されたい。あるアジュバントは、商業的に得られてもよい。好適なアジュバントは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）のカタログで識別されるような製品番号６９９８００であり、以下のＥ１をＥ１０と組み合わせて参照されたい。
【０１３３】
本発明の種々の実施形態において、アジュバントは、式（Ｉ）の化学構造を有するが、部分Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、これらの部分に対して以前に提供された選択肢のサブセットから選択され、これらのサブセットは、以下でＥ１、Ｅ２等と識別される。
Ｅ１：Ａ１はリン酸またはリン酸塩であり、Ａ２は水素である。
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ３−Ｃ２１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ５−Ｃ２３ヒドロカルビルである。
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ５−Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ７−Ｃ１９ヒドロカルビルである。
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ７−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ９−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１１−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ９−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１１−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ７−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１−Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２−Ｃ２０ヒドロカルビルである。
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１３ヒドロカルビルである。
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４は、トリデシルである。
【０１３４】
ある選択肢において、Ｅ２〜Ｅ１０のそれぞれは、実施形態Ｅ１と組み合わされ、および／またはＥ２〜Ｅ９のヒドロカルビル基は、アルキル基であり、好ましくは、直鎖アルキル基である。
【０１３５】
式（Ｉ）のアジュバントは、随意に共アジュバントとともに、薬学的組成物に製剤されてもよく、それぞれ以下に論じられるとおりである。この点において、例えば、ＧＬＡアジュバントの水性製剤（ＡＦ）および安定したエマルション製剤（ＳＥ）製剤を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号が参照され、これらの製剤は、式（Ｉ）のアジュバントのいずれかに利用されてもよい。
【０１３６】
アジュバントは、単一組成物として本発明のウイルスとともに投与することができるか、または本発明の組み換えウイルスの投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、同一バイアルにパッケージ化して供給することができるか、または個別のバイアルにパッケージ化して使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、通常、意図される治療施用を示すラベルとともにパッケージ化される。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージ化される場合、パッケージ化は、通常、使用前に混合するための説明書を含む。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種のアジュバントの有用性に依存し、ヒトにおいて、薬学的に許容されるアジュバントは、認可されたものであるか、または関連規制機関によってヒトへの投与が承認される。例えば、完全フロインドアジュバントは、ヒト投与に適切ではない。Ａｌｕｍ、ＭＰＬ、およびＱＳ２１は好適である。随意に、２つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができ、例えば、ａｌｕｍとＭＰＬ、ａｌｕｍとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、およびａｌｕｍ、ＱＳ２１とＭＰＬを一緒に使用することができる。不完全フロインドのアジュバントは、随意にａｌｕｍ、ＱＳ２１、およびＭＰＬ、ならびにそれらのすべての組み合わせと併せて、使用することができる（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２，１７３−１８６（１９９８））。
Ｅ．薬学的組成物およびキット
本明細書に提供されるウイルス、および１つ以上の成分を含有する、薬学的組成物およびキットもまた本明細書において考慮される。薬学的組成物は、本明細書に提供されるようなウイルスベクター粒子、および薬学的担体を含むことができる。キットには、本明細書に提供される薬学的組成物および／または組み合わせ、ならびに１つ以上の成分、例えば、使用に関する説明書、化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むことができる。
【０１３７】
本明細書に提供されるようなウイルス粒子を含有する薬学的組成物、および適切な薬学的担体が本明細書において提供される。本明細書に提供される薬学的組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、含水、または凍結乾燥形態であり得る。適切な薬学的担体の例は、本技術分野において知られている。そのような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被検体に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート化剤等の安定化剤は、体内の分解から組成物を保存することができる。
【０１３８】
本明細書に提供されるウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、使用に関する説明書、デバイス、および追加の試薬等の１つ以上の成分、ならびに方法を実践するための管、容器、およびシリンジ等の成分随意に含むことができる。例示的なキットには、本明細書に提供されるウイルスを含むことができ、使用に関する説明書、被検体内のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを随意に含むことができる。
【０１３９】
関心の遺伝子（通常、抗原）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本明細書において考慮される。キットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、およびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含んでもよい。一部のキットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターを含有する。
【０１４０】
関心の配列（通常、抗原）をコードするウイルスベクター、および随意にＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において考慮される。一部のキットにおいて、キットは、ウイルスパッケージ化成分をコードする少なくとも１つのプラスミドおよびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。
【０１４１】
キットは、説明書を含んでもよい。説明書は、通常、ウイルスを説明する具体的な表現、および随意に、キットに含まれる他の成分、およびウイルスを投与するための被検体の適切な状態、適切な投与量、および適切な投与方法を含む、投与の方法を含む。説明書は、治療期間に渡って被検体をモニタリングするためのガイダンスを含むこともできる。
【０１４２】
本明細書に提供されるキットは、ウイルスを被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤またはワクチンを投与するための本技術分野において知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的デバイスには、これらに限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられる。通常、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに適合し、例えば、高圧注入デバイス等の無針注入デバイスを、高圧注入によって損傷されないウイルスとともに、キットに含めることができるが、通常、高圧注入によって損傷されるウイルスとともに、キットに含まれない。
【０１４３】
本明細書に提供されるキットは、ＤＣ活性剤または刺激剤等の化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤を被検体に投与するための本技術分野において知られる多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的なデバイスには、これらに限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイスが挙げられ、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられる。通常、化合物をキットに投与するためのデバイスは、化合物の投与に関する望ましい方法に適合する。
【０１４４】
以下の実施例は、例証の目的で提供され、限定を目的としない。
【実施例】
【０１４５】
実施例１
シンドビスウイルスエンベロープ変異体の操作
シンドビスウイルス（ＳＶ）−アルファウイルス属およびトガウイルス科の成員−は、恐らくＤＣ−ＳＩＧＮを通して、ＤＣに感染することができる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１２０２２−１２０３２）。しかしながら、ＳＶの研究室株の正準ウイルス受容体は、細胞表面ヘパラン硫酸（ＨＳ）であり、多くの細胞型で認められる（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９：４７３−４８４、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３４９−７３５６）。ヘパラン硫酸結合を減少させるために、変異体Ｅ２エンベロープ（ＳＶＧｍｕと呼ばれる）がＷａｎｇらによって構築された（その全体が組み込まれる、米国特許第２００８／００１９９９８号）。それらの戦略の一部は、Ｅ３／Ｅ２前駆タンパク質結合において４つのアミノ酸を欠失すること、および２つのアミノ酸の欠失、ならびにヘマグルチニンからの１０アミノ酸配列の後次の添加を伴う（図１Ａおよび１Ｂを参照）。天然開裂配列が崩壊したため、得られるＥ２タンパク質は、Ｅ３およびＥ２（ｐＥ２としても知られる）の融合として発現され、外来エピトープ（ヘマグルチニン）も示す。以下に示されるように、ＳＶＧｍｕは、特に発現レベルが低いことが問題である。
【０１４６】
異なる戦略を使用して、発明者らは、ヘパラン硫酸への結合を減少させ、樹状細胞との特異性を増加し、発現を向上させるように、シンドビスウイルスのＥ２糖タンパク質を操作した。これらの特性を得るための一般的なアプローチは、Ｅ２の残基１６０（図１の残基２３３）を非酸性アミノ酸、特にアラニン以外のアミノ酸に変更するか、またはそれを欠失することによって、樹状細胞の感染性を高めること、タンパク質の正味正負荷を減少させることによってヘパリン結合を減少させること、ＨＡ（ヘマグルチン）エピトープを除去すること、およびＥ２のＮ末端における開裂部位、この例ではフリン開裂部位を復元することである。ウイルスエンベロープの一部として、これらのＥ２糖タンパク質は、ＤＣの感染を媒介することができるとともに、他の細胞型の感染を減少または抑止した。
【０１４７】
これらの原理に従って、Ｅ２のいくつかの変異体配列を設計し、以下の表に示す。太字体は、ＨＲ株シンドビスウイルスエンベロープ配列からの変更を示す（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ００１５４７．１）。
【０１４８】
【表２】
2018198616.tif 000005
【０１４９】
ヒトに対してコドン最適化される核酸配列を含む、変異体の一部をコードする核酸配列を合成した（図１も参照）。変異体のＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３等の発現ベクターにクローン化した。
【０１５０】
実施例２
シンドビスウイルスＥ２エンベロープ糖タンパク質変異体を含むウイルスベクター粒子の調製
シンドビスエンベロープ偽型ウイルスは、ＦＵＧＷまたはその誘導体等のレンチウイルスベクター、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖをコードするパッケージ化プラスミド、および変異体シンドビスウイルスエンベロープ配列を用いる、２９３Ｔ細胞の標準リン酸カルシウム媒介の一時的トランスフェクションによって調製される。ＦＵＧＷは、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現を駆動するように、ヒトユビキチン−Ｃプロモーターを担持する自己不活性化レンチウイルスベクターである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｉｓ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：８６８−８７２）。レンチウイルス移動ベクター（ＦＵＧＷおよびその誘導体）は、第３代ＨＩＶ系レンチウイルスベクターであり（一般に、Ｃｏｃｋｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋａｆｒｉ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：１８４，２００７を参照）、３’ＬＴＲのＵ３領域の大部分が欠失し、自己不活性化３’−ＬＴＲをもたらす。
【０１５１】
組み換えレンチウイルスベクターの産生は、２９３Ｔ細胞（２９３ＬＴＶ細胞株、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ  ＩＮＣ，ＬＴＶ−１００）のリン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）媒介一時的トランスフェクションによって達成された。２９３Ｔ細胞は、ＣａＰＯ４と一緒に沈殿した４つのプラスミドでトランスフェクトされた。レンチウイルスベクター調製物を産生するために使用される以下の４つのプラスミドは、図３に概略的に示され、以下ｉ）レンチウイルスベクター、ｉｉ）プラスミドをコードするＨＩＶ  Ｒｅｖ、ｉｉｉ）プラスミドをコードするＨＩＶ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ、およびｉｖ）プラスミドをコードするエンベロープに対応する。レンチウイルスベクターは、望ましい抗原または免疫調節因子をコードしてもよく、特定の標的欠失を含有して、感染した細胞の宿主染色体への組み込みを回避してもよい。一時的トランスフェクションに利用することができる代替プラスミドのさらなる実施例には、本明細書に記載されるＤ６４Ｖ変異等のそれを不全にするそのインテグラーゼにおける変異を含む、ポリメラーゼホロ酵素をコードするものが挙げられる。ある目的で、プラスミドをコードするエンベロープは、ＶＳＶ−Ｇ等の非ＤＣ標的汎親和性エンベロープをコードしてもよい。
【０１５２】
本明細書に記載される実験の場合、それぞれ１２０μｇベクターおよび６０μｇのＧａｇ／ＰｏｌおよびＲｅｖプラスミド、ならびに２４０μｇのエンベローププラスミドを含有する、ＣａＰＯ４沈殿物を、０．４５μｍ孔径のフィルターを通してろ過し、ローラーボトル中で成長させ、１０％ウシ胎仔血清を補充した７５ｍＬのＤＭＥＭ培地を含有する、約６×１０７個の２９３Ｔ細胞に添加した。トランスフェクションから６時間後、培地を１００ｍＬの新鮮な培地と交換し、トランスフェクションから３６時間後に回収した。培養上澄みを低速（１２００ｒｐｍ）で遠心分離して細胞残屑をペレット化した後、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。レンチウイルスベクター調製物を含有するろ液は、１７，７００×ｇで５時間、２０℃で遠心分離することによって随意に濃縮した。次に、ペレット化したレンチウイルスベクターをＰＢＳに望ましい容量で懸濁させた。このプロセスは、通常、本明細書に記載されるシンドビスウイルス糖タンパク質エンベロープを使用して、５×１０５ＩＵ／ｍＬ以上、または各ローラーボトル培養の場合、計５×１０７ＩＵを産出した。より典型的に、このプロセスは、各ローラーボトル培養の場合、少なくとも計１×１０８ＩＵを産出した。
【０１５３】
さらなる詳細において、−４日目に、１５０ｍＬの細胞培養培地をローラーボトル（ＲＢ）に添加し、３７℃のローラーラック培養器（０．２ｒｐｍ）に最長１時間配置した。各ＲＢに、合流型１５ｃｍの皿を通過させる。−２日目に、培地をＲＢから吸引し、１００ｍＬの予熱した培地と置き換えた。−１日目に、トランスフェクションのために、細胞を調製物に播種する。ＲＢを１００ｍＬの細胞培養培地で最長１時間予熱する。培地を吸引し、１０〜１２ｍＬのＰＢＳを添加する。ＲＢを側面におき、２度回転させて細胞をコーティングする。ＰＢＳを吸引して、１０〜１２ｍＬのトリプシン溶液を添加する。ＲＢを再度側面に置き、２度回転させて細胞をコーティングする。トリプシン溶液を吸引し、ＲＢを培養器に５分間置いた。ＲＢに、１０ｍＬの温かい培地を添加し、ＲＢを一度激しく回転させて、細胞を分離する。１０ｍＬピペットを使用して、細胞をピペットで、例えば、１０回上下させて、単一の細胞懸濁液を保証する。細胞を新しい容器に除去し、培地で希釈する（ＲＢ当たり４０ｍＬの培地）。細胞をカウントし、新鮮なＲＢに７×１０７／ｍＬで播種して、培養器中で一晩保持する。
【０１５４】
０日目に、播種から約２２時間後、プラスミド溶液を以下のように調製した。各ＲＢに対して、プラスミド溶液（１２０μｇベクター、６０μｇ  Ｇａｇ／Ｐｏｌ、６０μｇ  Ｒｅｖ、６０μｇエンベロープ）、２．５ｍＬ  １．２５Ｍ  ＣａＣｌ２、およびろ過した滅菌水を一緒に混合して、最終容量を１２．５ｍＬにした。２．７ｍＬ  ２×ＨＢＳ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  デキストロース、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０、滅菌ろ過）緩衝液を５０ｍＬ管（１管／ＲＢ）に添加する。中程度の設定で渦流しながら、１２．７ｍＬ  水−ＣａＣｌ２−ＤＮＡ混合液を、１２．７ｍＬ  ２ｘＨＢＳに滴下添加する。管に蓋をし、渦流を（最大速度）５〜１０秒継続する。２５ｍＬ  培地をＲＢから除去し、沈殿物（２５ｍＬ）をＲＢに添加する。６時間培養した後、培地を吸引して、１００ｍＬの新鮮な予熱細胞培養培地を添加する。３７℃の培養器に戻す。
【０１５５】
トランスフェクションから３６〜４８時間後、ＲＢからの上澄み液を２５０ｍＬ  円錐管に回収し、以下のように処理した。上澄み液を１０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離する。０．４５μｍフィルターを通して上澄み液をろ過する。上澄み液を５００ｍＬ管内で５時間、１０，０００ｒｐｍ、２０℃で遠心分離する。ベクターをＰＢＳまたはＨＢＳＳ中で望ましい濃度に懸濁し、−８０℃で保管する。
【０１５６】
得られる偽型ウイルスベクターは、以降、ＦＵＧＷ／Ｖ１、ＦＵＧＷ／Ｖ２等と称される。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でエンベロープされたウイルスベクターゲノムは、以降、ＦＵＧＷ／ＶＳＶ−Ｇと称される。
【０１５７】
実施例３
シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子の産生
この例において、異なるシンドビスウイルスエンベロープにより偽型化したレンチウイルスベクターの力価が決定される。使用したＥ２糖タンパク質は、ＳＩＮ−Ｖａｒ１（配列番号３）、ＳＩＮ−Ｖａｒ２（配列番号４）、ＳＩＮ−Ｖａｒ３（配列番号５）、ＳＶＧｍｕ（配列番号２）、ＨＲ（配列番号１８）であった。
【０１５８】
シンドビスウイルス糖タンパク質偽型化レンチウイルスベクター粒子は、実施例２に記載されるように、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションから４８時間後に粗上澄み液を採取し、それを使用して、前日に６ウェル皿に２Ｅ５細胞／ウェルで置かれていた、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（２９３−ＤＣＳＩＧＮ）を発現する２９３Ｔ細胞に形質導入した。７２時間、３７℃で培養した後、形質導入した細胞をＧｕａｖａ  Ｅａｓｙ−Ｃｙｔｅ血球計算器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で分析することによって力価を決定した。計２５，０００事象をカウントして、ＧＦＰ＋形質導入した細胞のパーセンテージを決定し、順にこれを使用して、各ウイルスのＧＦＰ力価（ＩＵ、感染単位）を計算した。
【０１５９】
標的形質導入の研究を促進するために、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞株を構築する。細胞株は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列を含有する、ＶＳＶＧ偽型化レンチベクターによる親２９３Ｔ細胞の安定形質導入によって生成される。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡは、プラスミドｐＵＮＯ−ｈＤＣＳＩＧＮ１Ａａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）から増幅され、レンチウイルスプラスミドＦＵＷ内のヒトユビキチン−Ｃプロモーターの下流でクローン化され、ＦＵＷ−ｈＤＣＳＩＧＮを生成する。あるいは、細胞株は、ＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列を含有する、ＶＳＶＧ偽型化広宿主性（非レンチウイルス）ベクターによる親２９３Ｔ細胞の安定した形質導入によって生成され、レンチウイルスベクター粒子による形質導入の下流核酸系分析をさらに促進する。レンチベクターまたは広宿主性ベクターを、次に、ＶＳＶＧで偽型化し、それを使用して２９３Ｔ細胞に形質導入する。あるいは、細胞株は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮをコードするプラスミドによる親２９３Ｔ細胞の安定した形質導入によって生成される。得られる細胞を、抗体染色（抗ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および細胞分類に供し、ＤＣ−ＳＩＧＮ＋細胞株の均一群を産出する。
【０１６０】
３つの独立実験において、ＳＩＮ−Ｖａｒ１エンベロープで偽型化されるレンチウイルスベクターは、ＳＶＧｍｕまたはシンドビスウイルスのＨＲ株で偽型化されるものよりも約１０倍高い力価を有した（図３、上のグラフ）。続く研究において、３つのシンドビスエンベロープ変異体の生産性を比較した。代表的な結果が示される。Ｓｉｎ−Ｖａｒ１、Ｓｉｎ−Ｖａｒ２、およびＳＩＮ−Ｖａｒ３エンベロープは、同様の全体力価を有するレンチウイルスベクター粒子を生成する。
【０１６１】
シンドビスウイルス変異体Ｅ２糖タンパク質を含むウイルスベクター粒子の特異性は、２９３Ｔ．ｈＤＣ−ＳＩＧＮまたは親２９３Ｔ細胞の形質導入、および細胞株内の可視マーカー（例えば、ＧＦＰ）の発現の測定値によって評価される。
【０１６２】
標的細胞（２９３Ｔ．ｈＤＣ−ＳＩＧＮまたは２９３Ｔ細胞）を、２４ウェル培養皿に播種し（０．２×１０６細胞／ウェル）、皿を２，５００ｒｐｍ、３０℃で９０分間、遠心分離することによって、ウイルス上澄み液（１ｍＬ／ウェル）により形質導入する。その後、上澄み液を新鮮な培養培地と置き換え、３日間３７℃で培養する。マーカーを発現する細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって測定される。
以下の表に示されるように、Ｅ２変異体１およびＥ２変異体３はいずれも、ｈＤＣ−ＳＩＧＮを発現する、優先的に標的される細胞である（細胞に特異的である）。
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
実施例４
シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むレンチウイルスベクター粒子の免疫原性
この実施例において、免疫原性は、異なるシンドビスウイルスエンベロープで偽型化したレンチウイルスベクターに関して評価される。より特異的に、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の量およびそれらのサイトカイン分泌プロファイルを決定した。使用したＥ２糖タンパク質は、ＳＩＮ−Ｖａｒ１（配列番号３）、ＳＩＮ−Ｖａｒ２（配列番号４）、ＳＩＮ−Ｖａｒ３（配列番号５）、ＳＶＧｍｕ（配列番号２）であった。
【０１６５】
ウイルスゲノムは、オボアルブミン（ＯＶＡ）をコードする配列を含む。レンチウイルスベクター粒子は、実施例２に記載されるように、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって生成した。上澄み液を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｓ、メリーランド州ケンジントン）を使用してｐ２４の量を決定した。タンパク質ｐ２４は、偽型ビリオンおよびｇａｇ遺伝子の産生物において見られる、ＨＩＶコアタンパク質である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５マウス／群）を、オボアルブミンＯＶＡをコードする組み込み不全レンチベクターで皮下的に免疫付与した。脾臓におけるＯＶＡ２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号２４）ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数および機能、ならびにサイトカイン分泌プロファイルは、ＭＨＣ−ｌ／ペプチド多量体および細胞内サイトカイン染色によって、９日目に決定した。
【０１６６】
つまり、脾臓を抽出し、７０μＭナイロンフィルターを通して押し付けることによって均質化した。赤血球を低張性ショックによって、蒸留水に短時間曝露することにより溶解して、１０ｘＰＢＳの添加によって、速やかに等張性環境に戻した。試料当たり約５×１０６個の脾細胞を、ＰＥ標識化Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７五量体（Ｐｒｏｌｍｍｕｎｅ）を用いて、２５℃で、２％  ＦＣＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）を有するＰＢＳ中で染色した。次に、細胞を２回洗浄し、生存性染料ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外線（Ｌ／Ｄ  ＮＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および以下の蛍光染色標識化抗体：ＣＤ４４  ＦＩＴＣ、ＣＤ１９  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、およびＣＤ８  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、４℃で染色した。ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター上でデータを収集し（５０，０００  ＣＤ８＋事象）、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。ＣＤ８Ｔ細胞を識別するためのゲート戦略は、以下のとおり、リンパ球（前方散乱ｌｏ−ｍｅｄ、側方散乱ｌｏ）、単一細胞（側方散乱領域＝側方散乱高）、肝臓細胞（Ｌ／Ｄ  ＮＩＲ−）、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８＋  ＣＤ１９−）であった。ＣＤ８＋ゲート内でＩＦＮ−γを発現する細胞のパーセンテージを決定し、図４Ａおよび４Ｂに表した。水平線は、平均値を示す。非特異的ＩＦＮ−γ染色は、媒体（ＨＢＳＳ）を注入したマウスの脾臓細胞において決定し、ここで細胞は、ペプチドによりインビトロで刺激した。ＩＦＮ−γ染色は、ペプチドなしで培養されたすべての試料について、０．２％未満であった（図示せず）。ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８Ｔ細胞の比率に加えて、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−２も産生するＩＦＮ−γ＋細胞の比率も、キーで示されるように表される。
【０１６７】
一式の実験において、使用されるウイルスの量は、２５００ｎｇまたは１２５ｎｇのいずれかのｐ２４を含有した。図４Ａは、シンドビス変異体エンベロープで偽型化したレンチベクターが、インビボで同様の活性を有することを示す。左端のパネルに示されるように、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の平均は、本質的に、２つの異なる投与量において同一である。さらに、ＩＦＮ−γ細胞の平均パーセンテージも類似している。サイトカイン分泌のパターン、具体的に、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αも発現するＩＦＮ−γ陽性細胞の比率も類似し、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αについて陰性であるＩ  ＩＦＮ−γは最高パーセンテージを有する。
【０１６８】
別の実験において、５匹のマウス群に、連続希釈用量のウイルスまたは媒体を投与した。ＳｉｎＶａｒ１またはＳＶＧｍｕのいずれかで、ウイルスを偽型化した。ＣＤ４４ｈｉ  Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７五量体＋発現型を有する細胞のパーセンテージは、図４Ｂに表される。接続する線は平均値を表す。図４Ｂに示されるように、ＳｉｎＶａｒ１偽型ＬＶは、実質的に、ＳＶＧｍｕよりも優れた抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の拡大を誘発した。さらに、ＳｉｎＶａｒ１偽型レンチベクターは、ＳＶＧｍｕよりも優れた機能的ＣＤ８Ｔ細胞反応を誘発した（図４Ｃ）。非特異的ＩＦＮ−γ染色は、ペプチドで再刺激されたＨＢＳＳ注入（媒体）マウスにおいて決定した。ＩＦＮ−γ染色は、ペプチドなしに培養されたすべての試料に対して、０．２％未満であった（図示せず）。
【０１６９】
実施例５
非組み込みレンチウイルスベクター（ＮＩＬＶ）の構築
多様な非組み込みレンチウイルスベクターを構築した。例示的レンチウイルスベクターの概略は、図５Ａに示される。上の図は、プロウイルス形態のベクターを示す。すべてのベクターは、スプライスドナー、パッケージ化シグナル（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）、スプライスドナー、スプライスアクセプター、中央ポリプリン路（ｃＰＰＴ）およびＷＰＲＥ要素を含有する。さらに、すべてのベクター構造は、哺乳類細胞における発現のためのプロモーター、および例示的構造において「抗原」と標識される関心の配列を含有する。実施例において利用されるプロモーターは、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）を含む。
【０１７０】
Ｕ３領域の拡大図は、すぐ上流のＰＰＴ（ポリプリン路）配列とともに、オープンボックスとして以下に示される。下には、３つの異なるＵ３領域が概略形態で示され、それらの配列は、図５Ｂおよび配列番号２１〜２３に示される。これらの構造は、Ｕ３領域に欠失を含有する。ＳＩＮ構造は、Ｕ３に約１３０個のヌクレオチドの欠失を有し（Ｍｉｙｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８１５０，１９９８、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８３：３１９４，１９８６）、ＴＡＴＡボックスが除去され、ＬＴＲプロモーター活性が抑止される。構造７０３および７０４における欠失は、レンチウイルスベクターからの発現を増加させる（その全体が組み込まれる、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６：１９６８，２００８）。さらに、構造７０４は、３’ＰＰＴの欠失を含有し、ベクターの組み込みが減少する（その全体が組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００９／０７６５２４号）。すべての構造のＵ３領域の配列は、図５Ｂに示される。３’ＰＰＴは、３位において開始し、ＳＩＮ欠失したベクターに対する拡大欠失が示される。
【０１７１】
実施例６
レンチウイルスベクター粒子による形質導入に続く樹状細胞における発現
この実施例は、拡大Ｕ３欠失を有するベクターから生成された樹状細胞におけるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）発現レベルを示す。
【０１７２】
一連のウイルスは、上述されるように、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生された。すべてのウイルスは、ＳＩＮ−Ｖａｒ１エンベロープ、ＧＦＰトランス遺伝子との操作的結合において、ＵｂｉＣまたはＣＭＶプロモーターを含有するベクターゲノム、およびＤ６４Ｖ変異を含有することによる不全インテグラーゼを含む。形質導入から４８時間後に、粗上澄み液を採取し、相当量の各上澄み液を使用して、２９３Ｔ−ＤＣＳＩＧＮ細胞を形質導入した。ＧＦＰ発現は、形質導入から７２時間後、ＧＵＡＶＡ  Ｅａｓｙ−Ｃｙｔｅフローサイトメーターを使用して決定した。形質導入した細胞群のそれぞれに対して、合計５０，０００事象をカウントした。ＦｌｏｗＪｏサイトメトリック分析ソフトウェアを使用して、データを分析した。
【０１７３】
ＵｂｉＣ（図６、パネルＡ）およびＣＭＶ（図６、パネルＢ）プロモーターの両方に対して、同様の結果が得られた。拡大Ｕ３欠失（７０３および７０４）を含有するレンチウイルスベクターは、ＳＩＮ欠失したベクターに対して、高い全体導入遺伝子発現を示した。構造７０４におけるＰＰＴの欠失は、構造７０３に対してわずかに発現を減少させた。
【０１７４】
実施例７
Ｕ３において大規模な欠失を有するベクターは非組み込みである
この実施例は、２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞の形質導入に続いて、異なるベクター欠失と不全型または野生型インテグラーゼとの組み合わせを含有する、ＳＩＮ−Ｖａｒ１偽型ベクターの相対組み込み効率を証明する。
【０１７５】
インテグラーゼ遺伝子およびＵ３欠失の多数の異なる組み合わせにより、ベクターストックを生成した。Ｕ３欠失（図５Ａおよび５Ｂを参照）、ＳＩＮ、７０３、および７０４を有するベクターは、野生型インテグラーゼ遺伝子または変異型インテグラーゼ遺伝子のいずれかで、上記のようにトランスフェクトした。これらの実験におけるベクターは、ＧＦＰおよびＧ４１８抵抗の両方をコードする、ＧＦＰ−２Ａ−新生導入遺伝子を含有する。リーディングフレームを、２Ａ自己開裂ペプチドを介して結合し、個別のタンパク質を生成する。すべてのベクターのＧＦＰ力価は、標準フローサイトメトリー法を使用して決定した。次に、ベクターストックを使用して、前日に６ウェル皿に５×１０５細胞／ウェルで置いた、２９３−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を感染させた。形質導入に続いて、細胞をトリプシンで７２時間毎に処理した。各継代において、２×１０５細胞を、２ｍＬ  ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中の６ウェル皿に再度配置した。残りの細胞を使用して、フローサイトメトリーによりＧＦＰ＋細胞の数を決定した。
【０１７６】
図７において、相対ＧＦＰ力価は、継代１において認められる力価の比率として提示される。ＧＦＰ発現の喪失は、ＧＦＰ導入遺伝子の喪失を反映し、これは、初期形質導入ステップにおける組み込みの喪失の結果である。予想されるように、Ｄ６４Ｖ変異インテグラーゼ（ＩＮ−）を含有するすべてのウイルスは、非組み込みであることが分かった。さらに、ＰＰＴ欠失（７０４）を含有するウイルスは、野生型ＩＮ遺伝子の存在下においても組み込み不全であることが分かった。これは、３’ＰＰＴの欠失が、インテグラーゼ変異と組み合わせて、重複性の安全機序を提供することを示す。
【０１７７】
実施例８
組み込みおよび非組み込みレンチウイルスベクターは、同等に免疫原性である
この実施例において、ＣＤ８Ｔ細胞反応は、組み込みまたは非組み込みウイルスによる免疫付与に続いて評価する。
【０１７８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からのＧａｇ抗原をコードする、組み込み（Ｉｎｔｗｔ）または非組み込み（ＩｎｔＤ６４Ｖ）レンチベクターの２．５×１０１０個のゲノムで皮下的に免疫付与した。膵臓中のＳＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の数および機能は、ＳＩＶ  Ｇａｇ由来のペプチドＡＡＶＫＮＷＭＴＱＴＬを再刺激に使用したことを除いて、１０日目に、上述されるように、細胞内サイトカイン染色によって決定した。図８は、非組み込みレンチベクターが、組み込みレンチベクターに相当するＣＤ８Ｔ細胞反応を引き出すことができることを示す。さらに、サイトカイン発現のパターンが類似する。
【０１７９】
実施例９
ＤＣ−ＮＩＬＶによる免疫付与は、治療効果を提供する
この実施例において、腫瘍細胞を受容したマウスは、腫瘍抗原を発現するＤＣ−ＮＩＬＶで免疫付与することによって治療される。
【０１８０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０４  ＣＴ２６結腸癌細胞を皮下注射した。１日後、マウスを、媒体、または３．２μｇのｐ２４カプシドタンパク質を含有するＳＩＮｖａｒ１偽型レンチウイルスベクター粒子調製物のいずれかで皮下的に治療した。ウイルスベクターエンベロープは、上述されるようなシンドビスウイルスＥ２の変異体を含み、ベクターは、非組み込みであり、ＡＨ１Ａ５ペプチド（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ、配列番号２５）、ＣＴ２６腫瘍細胞に対する拒絶抗原である、修飾ＭＭＴＶ  ｇｐ７０  ＣＤ８Ｔ細胞エピトープをコードする。免疫付与マウス対対照マウスの初期腫瘍成長ならびに長期生存が表される。図９は、腫瘍がＤＣ−ＮＩＬＶを受容するマウスにおいて、よりゆっくり成長し、さらに生存率（７５日目に測定）は、実質的により優れていた（２０％に比較して６０％の生存率）ことを示す。したがって、ＤＣ−標的非組み込みレンチベクター（ＤＣ−ＮＩＬＶ）は、腫瘍の治療的処置において有効である。
【０１８１】
本発明の実施形態には、これらに限定されないが、以下が含まれる。
１．  レトロウイルス、例えば、レンチウイルスベクター粒子であって、
（ａ）  １６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその配列番号１の変異体を含む、エンベロープであって、前記Ｅ２糖タンパク質またはその変異体は、Ｅ３に融合されない、エンベロープと、
（ｂ）  関心の配列を含む、レンチウイルスゲノムと、
を含む、レトロウイルスベクター粒子。
２．  前記Ｅ２糖タンパク質または変異体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、実施形態１に記載のレトロウイルスベクター粒子。
３．  前記１６０Ｘが存在しないか、またはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンであり、例えば、グリシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンから選択される、実施形態１または実施形態２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
４．  １６０Ｘがグリシンである、実施形態１または実施形態２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
５．  前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、その正味正電荷を低減するように変更された少なくとも１つのアミノ酸を有する、実施形態１、２、３または４に記載のレトロウイルスベクター粒子。
６．  前記変更アミノ酸は、配列番号１のリシン７０、７６、または１５９から成る群から選択され、置換がグルタミン酸またはアスパラギン酸から随意に独立して選択される、実施形態５に記載のレトロウイルスベクター粒子。
７．  Ｅ２変異体配列は、配列番号２、３、または４であり（変異体１、２、および３）、１つ以上のさらなる置換、挿入、または欠失を随意に含む、実施形態１、２、３、４、５、または６に記載のレトロウイルスベクター粒子。
８．  配列番号１の残基７１〜７５の配列が未変化である変異体か、または前記変異体がＤＣに感染する能力に影響しないが、この領域内のアミノ酸の数を変更しない、１つもしくは２つの置換を有する変異体である、実施形態１、２、３、４、５、６、または７に記載のレトロウイルスベクター粒子。
【０１８２】
上記実施形態のあらゆる組み合わせが、本発明により、以下の非限定的な組み合わせで示されるように考慮され、「＞」は、より早い番号の実施形態に対する言及を示す：４＞２＞１、５＞４＞１、５＞４＞２＞１、５＞３＞１、５＞３＞２＞１、６＞５＞４＞１、６＞５＞４＞２＞１、６＞５＞３＞２＞１、６＞４＞２＞１、６＞３＞２＞１、６＞５＞３＞１、７＞６＞５＞４＞１、７＞６＞５＞４＞２＞１、７＞６＞５＞３＞１、７＞６＞５＞３＞２＞１、７＞６＞４＞２＞１、７＞５＞４＞１、７＞５＞４＞２＞１、７＞５＞３＞１、７＞５＞３＞２＞１、７＞４＞２＞１、７＞３＞２＞１、７＞６＞４＞１、７＞６＞４＞２＞１、７＞６＞３＞１、７＞６＞３＞２＞１、７＞６＞２＞１、８＞４＞２＞１、８＞５＞４＞１、８＞５＞４＞２＞１、８＞５＞３＞１、８＞５＞３＞２＞１、８＞６＞５＞４＞１、８＞６＞５＞４＞２＞１、８＞６＞５＞３＞２＞１、８＞６＞４＞２＞１、８＞６＞３＞２＞１、８＞６＞５＞３＞１、８＞７＞６＞５＞４＞１、８＞７＞６＞５＞４＞２＞１、８＞７＞６＞５＞３＞１、８＞７＞６＞５＞３＞２＞１、８＞７＞６＞４＞２＞１、８＞７＞５＞４＞１、８＞７＞５＞４＞２＞１、８＞７＞５＞３＞１、８＞７＞５＞３＞２＞１、８＞７＞４＞２＞１、８＞７＞３＞２＞１、８＞７＞６＞４＞１、８＞７＞６＞３＞１、８＞７＞６＞３＞２＞１、８＞７＞６＞２＞１。
本発明のさらなる実施形態には、以下が含まれる。
９．  前記関心の配列は、腫瘍特異的抗原またはウイルス由来の抗原、例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶ抗原をコードする、上記実施形態のいずれかに記載のレトロウイルスベクター粒子。
１０．  シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体を含むエンベロープ内に偽型化されたレトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ベクターゲノムであって、前記ゲノムは関心の配列を含み、
前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、前記レトロウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進し、前記Ｅ２糖タンパク質変異体は、上記実施形態１〜９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、レトロウイルスベクターゲノム。
１１．  偽型レトロウイルスベクター粒子を産生するためのレトロウイルスベクターパッケージ化システムであって、
（ｉ）１６０Ｘが存在しないか、もしくはグルタミン酸以外のアミノ酸である、配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第１の核酸分子と、
（ｉｉ）転写されることができ、前記転写物は、偽型レトロウイルスベクター粒子へと構築される、第２の核酸分子と、
を含む、パッケージ化システム。
１２．  前記Ｅ２糖タンパク質は、上記実施形態１〜９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、実施形態１１に記載のパッケージ化システム。
１３．  前記第１の核酸分子は、随意にシンドビスウイルスＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質の形態である、Ｅ３／Ｅ２糖タンパク質をコードする、実施形態１１または１２に記載のパッケージ化システム。
１４．  前記Ｅ３配列は、配列番号２０の残基１〜６５、または配列番号２０の残基１〜６５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体に対応し、残基６２〜６５はＲＳＫＲであり（配列番号２７）、前記変異体は偽型ウイルスエンベロープに組み込まれることができ、随意にさらに前記Ｅ２ポリタンパク質の残基１が随意にＳｅｒである、実施形態１３に記載のパッケージ化システム。
１５．  ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする第３の核酸分子をさらに含む、実施形態１１、１２、１３、または１４に記載のパッケージ化システム。
１６．  第２の核酸分子は、関心の配列を含む、実施形態１１〜１５のいずれか１つに記載のパッケージ化システム。
１７．  実施形態１１〜１６のいずれか１つに記載の前記第１および第２の核酸分子でトランスフェクトされた細胞。
１８．  実施形態１〜９のいずれか１つに記載のタンパク質、または実施形態１３もしくは１４に定義されるＥ３／Ｅ２糖タンパク質をコードする、単離核酸分子。
１９．  実施形態１８の核酸分子を含む、発現ベクター。
２０．  実施形態１９の発現ベクターを含む、宿主細胞。
２１．  実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のレトロウイルスベクター粒子を作製する方法であって、細胞において、
（ｉ）１６０Ｘがグルタミン酸以外である配列番号１のシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、樹状細胞に感染することができるその変異体をコードする、第１の核酸分子と、
（ｉｉ）転写されることができ、前記転写物は偽型レトロウイルスベクター粒子へと構築される、第２の核酸分子と、
を発現させることを含む、方法。
２２．  ヒトまたは動物被検体の治療方法において使用するための、実施形態１〜１０のいずれか１つに従うレトロウイルスベクター粒子。
２３．  レトロウイルスベクター粒子をインビトロで細胞に送達する方法であって、前記細胞を、実施形態１〜１０のいずれか１つに従うレトロウイルスベクター粒子と混合することを含む、方法。
２４．  実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のレトロウイルスベクター粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、治療ワクチン。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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