(57)【要約】      （修正有）【課題】効果的に免疫システムを刺激して、ＤＮＡベースの組成物に起因する導入遺伝子の非制御増殖の問題を避けつつ、前立腺癌（ＰＣａ）の処置を可能にするための、ＲＮＡベースの新規抗原組成物の提供。【解決手段】少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物であって、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、以下の抗原：ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）；ＰＳＡ（前立腺特異抗原）；ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）；ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）；ＰＡＰ（前立腺酸フォスファターゼ）；及びＭＵＣ１（ムチン１）、又はこれらのフラグメントをコードしており、かつ、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、モノシストロニック、バイシストロニック又はマルチシストロニックである、組成物。前記組成物を含有するワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物であって、
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、以下の抗原：
・ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、
・ＰＡＰ（前立腺酸フォスファターゼ）、および
・ＭＵＣ１（ムチン１）、
または、これらのフラグメントをコードしており、かつ、
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、モノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックである、組成物。
【請求項２】
各々の上記抗原またはそれらのフラグメントは、個別のｍＲＮＡによってコードされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＡＰおよびＭＵＣ１またはそれらのフラグメントは、１つのｍＲＮＡによってコードされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上記抗原またはそれらのフラグメントは、少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡおよび／またはマルチシストロニックｍＲＮＡによってコードされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのｍＲＮＡ、好ましくは、少なくとも２つのｍＲＮＡ、より好ましくは、少なくとも３つのｍＲＮＡ、さらにより好ましくは、少なくとも４つのｍＲＮＡ、さらにより好ましくは、少なくとも５つのｍＲＮＡ、または、さらにより好ましくは、少なくとも６つのｍＲＮＡは、それぞれ、配列番号２、５、８、１１、１４、１７または８７のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列から選択される少なくとも１つのコード配列を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、
上記コード配列は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７または８７のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含むか、または、配列番号２、５、８、１１、１４、１７または８７のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列からなる、請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、改変されたｍＲＮＡ、特に、安定化されたｍＲＮＡである、請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項８】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、増加しており、
好ましくは、上記少なくとも１つのｍＲＮＡのコードされたアミノ酸配列は、野生型ｍＲＮＡのコードされたアミノ酸配列と比較して、改変されていない、請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、
上記コード配列は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、８２、８３、８４または８５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含むか、または、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、８２、８３、８４または８５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列からなる、請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含み、および／または、
３’ＵＴＲは、好ましくは、１０から２００までの、１０から１００までの、４０から８０までの、もしくは５０から７０までのアデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）テールを含み、および／または、
３’ＵＴＲは、好ましくは、１０から２００までの、１０から１００までの、２０から７０までの、２０から６０までの、もしくは１０から４０までのシトシンヌクレオチドのポリ（Ｃ）テールを含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、
上記３’ＵＴＲは、次のエレメント：
ａ）好ましくは配列番号６９に従ったヒトα−グロビン遺伝子などのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲのα−複合体−結合中心部位に由来する３’−ＵＴＲ：
ｂ）好ましくは１０から２００までの、１０から１００までの、４０から８０までの、または５０から７０までのアデノシンヌクレオチドからなるポリ（Ａ）テール、および
ｃ）好ましくは１０から２００までの、１０から１００までの、２０から７０までの、２０から６０までの、または１０から４０までのシトシンヌクレオチドからなるポリ（Ｃ）テール、
を（５’から３’方向に）含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
６つのｍＲＮＡを含み、
各々のｍＲＮＡは、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）およびＭＵＣ１（ムチン１）からなる群から選択される異なる抗原をコードし、かつ、
好ましくは、各々のｍＲＮＡは、配列番号１、４、７、１０、１３および１６のＲＮＡ配列から選択されるＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含み、
上記３’ＵＴＲは、次のエレメント：
ａ）好ましくは１０から２００までの、１０から１００までの、４０から８０までの、または５０から７０までのアデノシンヌクレオチドからなるポリ（Ａ）テール、
ｂ）好ましくは１０から２００までの、１０から１００までの、２０から７０までの、２０から６０までの、または１０から４０までのシトシンヌクレオチドからなるポリ（Ｃ）テール、および
ｃ）ヒストンステムループ、
を（５’から３’方向に）含む、請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
上記ヒストンステムループは、完全または部分的に逆相補的な２つの隣り合った配列の分子内塩基対によって形成される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
上記ヒストンステムループ中のループは、３塩基から１５塩基の長さ、好ましくは、３塩基から１０塩基の長さ、３塩基から８塩基の長さ、３塩基から７塩基の長さ、３塩基から６塩基の長さ、４塩基から５塩基の長さ、または４塩基の長さを有する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
上記ヒストンステムループ中のステム領域を形成している配列は、５塩基から１０塩基の長さ、好ましくは、５塩基から８塩基の長さを有する、請求項１３〜１５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、下記の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
式（Ｉ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）：
【化１】
2018184422.tif 000022
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【化２】
2018184422.tif 000023
から選択される少なくとも１つのヒストンステムループを含み、
ステム１境界エレメントまたはステム２境界エレメントのＮ１−６は、１つから６つのＮの連続配列、好ましくは、２つから６つのＮの連続配列、より好ましくは、２つから５つのＮの連続配列、さらにより好ましくは、３つから５つのＮの連続配列、もっとも好ましくは、４つから５つのＮの連続配列、または、５つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１〔Ｎ０−２ＧＮ３−５〕は、エレメントステム２と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ、５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つのＮの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３−５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ステム２中のその相補的ヌクレオチドであるシチジンがグアノシンによって置換されている条件で、シチジンまたはそのアナログによって必要に応じて置換されていてもよく、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とエレメントステム２との間に位置し、かつ、３つから５つのヌクレオチドの連続配列、より好ましくは４つのヌクレオチドの連続配列であり、
各々のＮ０−４は、別の連続配列とは独立して、０から４つのＮの連続配列、好ましくは、１つから３つのＮの連続配列、より好ましくは、１つから２つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
Ｕ／Ｔは、ウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３〜５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ０〜２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｃは、シチジンまたはそのアナログであり、ステム１中のその相補的ヌクレオチドであるグアノシンがシチジンに置換されている条件で、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換されていてもよく、
ステム１およびステム２は、互いに塩基対合することができ、塩基対がステム１とステム２との間で生じ得る逆相補的配列を形成しているか、または、不完全な塩基対がステム１とステム２との間で生じ得る部分的逆相補的配列を形成している、請求項１３〜１６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
上記少なくとも１つのヒストンステムループは、下記の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）：
【化３】
2018184422.tif 000024
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）：
【化４】
2018184422.tif 000025
のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１３〜１７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
配列番号２５〜６６に従った上記ヒストンステムループヌクレオチド配列のうちの何れか１つ、好ましくは、配列番号７０のヌクレオチド配列、もっとも好ましくは、配列番号７１に従ったＲＮＡ配列、を含む、請求項１３〜１８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号１９〜２４のＲＮＡ配列の何れか１つのＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、請求項１〜１９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
６つのｍＲＮＡを含み、
各々のｍＲＮＡは、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）およびＭＵＣ１（ムチン１）からなる群から選択される異なる抗原をコードし、かつ、各々のｍＲＮＡは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３または２４に従ったＲＮＡ配列から選択される異なるＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である、請求項１〜２０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
１つのｍＲＮＡは、ＰＳＡをコードし、かつ配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＰＳＭＡをコードし、かつ配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＰＳＣＡをコードし、かつ配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＳＴＥＡＰをコードし、かつ配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＰＡＰをコードし、かつ配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一であり、かつ、
１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一である、請求項１〜２１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
類似案件ＰＰ１５１２１３の請求項２３と同じです。
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、１つ以上のポリカチオン、好ましくはプロタミンまたはオリゴフェクトアミン、もっとも好ましくはプロタミンと、複合体化している、請求項１〜２２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
上記１つ以上のポリカチオンに対する上記少なくとも１つのｍＲＮＡのＮ／Ｐ比は、約０．１から１０の範囲にあり、当該範囲は、約０．３から４の範囲、約０．５から２の範囲、約０．７から２の範囲、および約０．７から１．５の範囲を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
１つ以上のポリカチオンと複合体化した少なくとも１つのｍＲＮＡ、および少なくとも１つの上記遊離ｍＲＮＡを含む、請求項１〜２４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
上記複合体化ｍＲＮＡは、遊離ｍＲＮＡと同一である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
上記遊離ｍＲＮＡに対する上記複合体化ｍＲＮＡのモル比は、約０．００１：１から約１：０．００１までのモル比から選択され、当該モル比は、約１：１の比を含む、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
上記組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１〜２７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
上記少なくとも１つのアジュバントは、
カチオン性またはポリカチオン性の化合物であって、上記カチオン性またはポリカチオン性の化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性のペプチドまたはカチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質を含み、これらのペプチドまたはタンパク質は、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−アルギニン、塩基性ポリペプチド、ＨＩＶ結合ペプチドを含む細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドもしくはＶＰ２２アナログペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡもしくはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐｌｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、もしくはヒストン、キトサンを含むカチオン性ポリサッカリド、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むカチオン性ポリマー、ＤＯＴＭＡ：１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドを含むカチオン性脂質、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシル（ｇｌｉｃｙｌ）スペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）−ジメチル塩化アンモニウム、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクトアミン）、または、−アミノ酸−ポリマーまたは逆ポリアミドを含む修飾ポリアミノ酸を含むカチオン性もしくはポリカチオン性のポリマー、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））を含む修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリラート））を含む修飾アクリラート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））を含む修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリラート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーを含む修飾ポリβアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースのデンドリマーを含むデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）を含むポリイミン、ポリ（プロピレンイミン）、ポリアリルアミン、シクロデキストリンベースのポリマーを含む糖骨格ベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなど、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなどのシラン骨格ベースのポリマー、上記のカチオン性ポリマーから選択される１つ以上のカチオン性ブロックと１つ以上の親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロックポリマー、を含んでいるような、カチオン性またはポリカチオン性の化合物；
または、
以下の全体的な式（ＩＩＩ）（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘを有する以下のタンパク質またはペプチドから選択されるカチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質、またはカチオン性もしくはポリカチオン性のペプチドであって、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５であり、かつ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＯｒｎの全体的な含有量が上記オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を示すという条件で、ｌ、ｍ、ｎまたはｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択される任意の数であってもよく、Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＯｒｎ以外のネイティブな（＝天然に存在する）アミノ酸またはネイティブではないアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってもよく、かつ、Ｘａａの全体的な含有量が上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないという条件で、ｘは、０、１、２、３または４から選択される任意の数であってもよい、カチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質、またはカチオン性もしくはポリカチオン性のペプチド；
または、
式（ＩＶ）：ＧｌＸｍＧｎを有する核酸であって、Ｇは、グアノシン、ウラシル、またはグアノシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログである、核酸；
または、
式（Ｖ）：ＣｌＸｍＣｎを有する核酸であって、Ｃは、シトシン、ウラシル、またはシトシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログである、核酸；
からなる群から選択される、請求項１〜２８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２９の何れか１項に記載の組成物を含む、ワクチン。
【請求項３１】
請求項１〜２９の何れか１項に記載の組成物は、適応免疫反応を誘発する、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
上記ワクチンは、薬学的に許容され得るキャリアをさらに含む、請求項３０または３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、被検体に、個別的に投与される、請求項３０〜３２の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項３４】
前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは前立腺腺癌、局所限定、局所進行、転移性、去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）、転移性の去勢抵抗性および非転移性の去勢抵抗性前立腺癌、および疾患またはそれに関連した障害の治療のためのワクチンとしての使用のための、請求項１〜２９の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
各々のｍＲＮＡは、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）およびＭＵＣ１（ムチン１）からなる群から選択される１つの抗原をコードする、前立腺癌の治療のための６つのｍＲＮＡの組み合わせの使用。
【請求項３６】
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＰＳＡをコードし、かつ、配列番号２、３または８２のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなり、
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号５、６または８３のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなり、
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号８、９または８４のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなり、
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号１１、１２または８５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなり、
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＰＡＰをコードし、かつ、配列番号１４または１５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなり、
１つのｍＲＮＡは、コード配列を含み、当該コード配列は、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１７、１８または８７のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、または、からなる、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ領域にヒストンステムループを含む、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
各々のｍＲＮＡは、配列番号１９〜２４に従ったＲＮＡ配列の異なる１つと同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列を含む、請求項３５〜３７の何れか１項に記載の使用。
【請求項３９】
６つのｍＲＮＡを含み、
１つのｍＲＮＡは、ＰＳＡをコードし、かつ、配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＰＡＰをコードし、かつ、配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一である、請求項３５〜３８の何れか１項に記載の使用。
【請求項４０】
上記６つのｍＲＮＡの各々は、別々に投与される、請求項３５〜３９の何れか１項に記載の使用。
【請求項４１】
上記ｍＲＮＡは、皮内注射により投与される、請求項３５〜４０の何れか１項に記載の使用。
【請求項４２】
上記治療は、共同療法、例えば前立腺手術、放射線療法、ホルモン治療および／または化学療法に補助される、請求項３５〜４１の何れか１項に記載の使用。
【請求項４３】
類似案件ＰＰ１５１２１３の請求項４５と同じです。
請求項１〜２９の何れか１項に記載の組成物、ならびに／または、請求項３０〜３３の何れか１項に記載のワクチン、ならびに、任意的に 可溶化するための液体賦形剤、ならびに、任意的に、上記活性組成物および／もしくは上記ワクチンの投与および投与量の情報を伴った技術的指示書、を含む、キット、好ましくはパーツのキット。
【請求項４４】
上記キットは、パーツのキットであり、かつ、上記キットの各パーツは、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、請求項１に規定された抗原から選択される異なる抗原をコードしており、パーツのキットのすべてのパーツは、請求項１〜２９の何れか１項または請求項３４に記載の組成物または請求項３０〜３３の何れか１項に記載のワクチンを形成する、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
上記キットは、６つのｍＲＮＡを含む少なくとも２つのパーツを含む、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
６つのすべてのｍＲＮＡは、別々のパーツ中の凍結乾燥形態で提供される、請求項４３〜４５の何れか１項に記載のキット。
【請求項４７】
上記キットは、一部分として、乳酸リンガー溶液を含む、請求項４３〜４６の何れか１項に記載のキット。
【請求項４８】
上記キットは、６つのパーツを含み、各々のパーツは、上記６つのｍＲＮＡの１つを含む、請求項４３〜４７の何れか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類において（適応性）免疫応答を誘発することのできる抗原の組み合わせをコードする、少なくとも一つのｍＲＮＡを含む組成物であって、前記抗原は、ＰＳＡ（前立腺特異性抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異性膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ  １）及びＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）から成る群から選択されることを特徴とする組成物に関する。本発明はさらに、そのような抗原の組み合わせをコードする少なくとも一つのｍＲＮＡを含むワクチンならびに、（ワクチン調整のための）前記組成物および／または前記ワクチンを使用することにより、（適応性ある）免疫応答を誘発し、前立腺癌、好ましくは前立腺腺癌、限局性、局所進行性、転移性、去勢抵抗性（ホルモン不応性）、転移性去勢抵抗性、及び非転移性去勢抵抗性前立腺癌およびそれに関する疾患または異常を処置することに関する。最後に、前記発明は用具、特に、前記組成物および／またはワクチンを収容するパートの用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、前立腺癌は、最も多く診断される癌であり、世界の先進国の男性において、癌による死亡原因のうち４番目に多い死亡原因である。効果的な治療処置方法は、消耗性のものであり、現在では、局所性疾患にのみ使用される。ホルモン不応性（去勢抵抗性；去勢不応性）前立腺癌において、約１年を超えて生存期間を延ばすことが示された薬剤は存在していない（例えば、Pavlenko, M., A. K. Roos, et al. (2004) A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer. Br J Cancer 91(4): 688-94.を参照のこと).米国のように特に先進的な西側諸国においては、前立腺癌は、現在、最も多く診断される悪性腫瘍でもあり、米国(例えば、Jemal, A., R. Siegel, et al. (2006). Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 56(2): 106-30を参照のこと) 及びヨーロッパ(例えば、Thomas-Kaskel, A. K., C. F. Waller, et al. (2007). Immunotherapy with dendritic cells for prostate cancer. Int J Cancer 121(3): 467-73を参照のこと)、それぞれにおける男性の癌による死亡原因のうち３番目に多い死亡原因である。最も多く診断される腫瘍は、ホルモン依存性で最初に増殖する腺癌である。
【０００３】
前立腺癌は、男性の生殖器官における分泌腺である前立腺において進行する癌疾患である。前立腺癌は、前立腺細胞が変異し、制御不能に増殖し始めた時に起こる。正常な対照細胞と比較して、前立腺がん細胞に過剰発現することが示されている典型的な抗原は、特に、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ−２、及びＥｐ−ＣＡＭのような抗原である。これらの前立腺がん細胞は、前立腺から、特に骨及びリンパ節のような体の他の部分に拡散（転移）し得る。前立腺癌は、痛み、排尿困難、勃起障害、及び他の症状の原因となり得る。典型的には、前立腺癌は、５０歳を超える男性において最も多く発症し、患者群に最も多く存在する。しかしながら、前立腺癌は、決定は可能であっても、ほとんどの場合発見されないままである。前立腺癌の決定は、典型的には、理学的検査、又は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）テストのような血液テストのスクリーニングにより行われる。前立腺癌が疑われる場合、典型的には、前立腺の一部を除去し、顕微鏡下でこれを検査する（生検）ことにより癌が確認される。Ｘ線及び骨のスキャンのようなさらなる試験は、前立腺癌が拡散していないかを決定するために行われ得る。
【０００４】
前立腺癌の処置は、未だ解決できない難問である。現在の治療方法は、手術、放射線療法、ホルモン療法、時には化学療法、プロトン療法、又はこれらの組み合わせのような、前立腺癌の処置に適用され得る。しかしながら、男性の年齢及び健康状態と同様に、拡散範囲、顕微鏡下外観、及び初期の処置に対する癌の反応は、病気の成り行きを決定する上で重要である。前立腺癌は、通常高齢の男性において診断される疾患であるため、緩やかに進行する前立腺癌が拡散する前、又は、症状が出始める前に、他の理由でその多くが死亡し得る。このことが、処置の選択を困難にしている。治療の目的と共に、局所的な前立腺癌（前立腺内に含まれる腫瘍）を処置するかしないかの決定は、患者の生存期間及びクオリティオブライフにおいて、予想される有益な効果と有害な効果とのトレードオフの関係にある。
【０００５】
しかしながら、手術、放射線療法、ホルモン療法及び化学療法等の上述した治療方法は全て、厳格な制限を受ける一例として、手術による前立腺の除去、又は前立腺摘除術は、初期段階の前立腺癌又は放射線療法に反応しない癌のどちらかにおいて、一般的な処置である。神経損傷は、クオリティオブライフを顕著に変化させる原因となり得る。最も多く見られる重大な症状は、排尿制御の欠如及び性的不能である。しかしながら、前立腺癌の切除に成功したとしても、臓器を超えた前立腺癌の拡散が、解決できない問題として残る。
【０００６】
放射線療法は、前立腺癌処置において一般的に用いられている。放射線療法は、初期の癌において手術の代わりに用いられ得、また、痛みを伴う骨への転移を処置するために、進行した前立腺癌においても用いられる。放射線療法は、また、放射線療法単独では癌が完治する可能性が低い場合に、リスクが中程度の疾患のためのホルモン療法と組み合わせることもできる。しかしながら、放射線療法もまた、ハイリスクであり、患者の免疫系を破壊するので、免疫防御の完全な損失につながる場合がある。さらに、放射線療法は、典型的には、癌が成長している部位に局所的に適用し、そのため、前立腺癌の臓器を超えた拡散に関する上述した問題を避けることができない。放射線療法を全身に適用した場合、細胞及び免疫系の深刻な損傷につながり得る。
【０００７】
化学療法は、非常にわずかな患者しかこの種の治療に反応しないため、前立腺癌にはあまり効果のない処置として考えられていた。しかしながら、転移した前立腺癌を有する患者（治療の反応者）の何人かにおいては、化学療法が有益であり得る。反応率は約２０％であり、化学療法は、それ故に、腫瘍再発の処置、及び、ホルモン療法に失敗したときの処置の間に、役割を果たす。しかしながら、化学療法は、典型的には、一時しのぎでしかなく、患者における前立腺癌の総合的な除去にはつながらない。典型的な化学療法の薬剤には、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、スラミン及び他の薬剤が含まれるが、これらの中に、患者の生存期間を顕著に延長する薬剤はない。New England Journal of Medicineにおいて２００４年に発表されたように、より最近の研究において、３週間毎にドセタキセル薬剤の投与により、中央値で２．５か月患者の生存期間が延長することが証明された(Tannock IF et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer. N Engl J Med. 2004 Oct 7;351(15):1502-12)。
【０００８】
ホルモン療法は、典型的には、投薬を用いるか、又は前立腺癌細胞がジヒドロステロン（ＤＨＴ）を得ることを阻害するための手術と組み合わせて用いられる。 ジヒドロステロンは、前立腺において生産されるホルモンであり、多くの前立腺癌細胞の成長及び拡散に要求される。ＤＨＴの阻害は、前立腺癌の成長停止や、縮小さえももたらすこともある。しかしながら、癌は、初期においてはホルモン療法に反応するが、１から２年後には耐性を獲得するので、前立腺癌を治癒させることはほとんどない。例えば、緩和アンドロゲン欠乏療法は、典型的には、８０％に至る患者に寛解をもたらすが、１５〜２０か月後には、腫瘍細胞がホルモンに反応しなくなり、アンドロゲンに依存することなく前立腺癌が進行するようになる。このような状況においては、処置の選択肢はほとんどなく、化学療法の効果は限定的である（上記を参照）。それゆえに、ホルモン療法は、たいてい、癌が前立腺から拡散したときに使用される。また、ホルモン療法は、この癌の再発を防ぐための放射線療法又は手術を行っている特定の男性にも行われ得る。
【０００９】
第３相試験（臨床試験gov ID NCT00887198）の暫定的な分析結果に基づけば、アビラテロン酢酸エステル／プレドニゾンは、ヨーロッパ及び米国において、去勢不応性前立腺癌を有し、化学療法未治療の患者の処置のために承認され、これらは、偽薬／プレドニゾンコントロールと比較して、進行させずに生存させる期間及び他の副次的評価項目を顕著に延長した。全体的な生存期間は改善する傾向にあった一方で、その差は統計的に有意ではなかった(Ryan C.J. et al. (2013). Abiraterone in metastatic prostate cancer without previous chemotherapy. N Engl J Med. Jan 10;368(2):138-48.)。
【００１０】
患者がこれらの疾患の症状を発症するとすぐに、化学療法（好ましくはドセタキセルを用いて）を開始することが推奨される。この状況における追加の治療の選択肢としては、痛みを伴う骨への転移への放射線照射、又は、ストロンチウム−８９又はサマリウム−１５３又はラジウム２２３−塩化物（アルファラディン）のような骨親和性の放射性同位体を用いた処置がある。
【００１１】
ドセタキセルを用いた処置の間の病気の進行の後、新たな抗ホルモン剤であるエンザルタミド (Scher H.I. et al. (2012). Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. N Engl J Med. Sep 27;367(13):1187-97)、アビラテロン酢酸エステル／プレドニゾン(de Bono, J.S., et al. (2011). Abiraterone and increased survival in metastatic prostate cancer. N. Engl. J. Med. 364:1995-2005)、又は、新規のタキサンカバジタキセル／プレドニゾン(Yap, et al. (2011). The changing therapeutic landscape of castration-resistant prostate cancer. Nat Rev Clin Oncol. 8:597-610) を用いて処置を継続する。第３相試験において生存期間への有益性が証明された承認された処置の選択肢であるが、これらの処置のうち、長期間の生存をもたらし得るものはなく、また、化学療法薬剤は重大な副作用を有する。大きな毒性なしに可能な処置の効果を延長できる新規の治療の選択肢が、緊急に要求されている。
【００１２】
方法の１つとして、前立腺全摘出手術、又は、外部照射（ビーム）及び近接照射療法のような放射線療法を含む、臓器限局性の前立腺癌のために用いられた上述の標準的な療法が、いくつかの状況下において、ネオアジュバント又はアジュバントホルモン療法とも組み合わされてもよい(例えば、Totterman, T. H., A. Loskog, et al. (2005). The immunotherapy of prostate and bladder cancer. BJU Int 96(5): 728-35.を参照のこと)。これらの療法が短期間では比較的効果的である一方で、当初は限局性の疾患を有していた患者のかなりの部分（３０〜４０％）が、最終的には再発し得る。転移性前立腺癌の主な療法は、アンドロゲン除去である。この療法は、たいてい、細胞減少及び緩和をもたらす一方で、ホルモン不応性疾患の進行が、典型的には、１４〜２０か月以内に起こる。進行性のアンドロゲン依存性前立腺癌の化学療法の分野においては、多くの臨床研究が報告されている。最近になってやっと、２つの試験が、ホルモン不応性（去勢抵抗性）疾患を伴う患者の全体的な生存がわずかに向上したことを明らかにしている。
【００１３】
上述した内容を総合すると、上述した手術、放射線療法、ホルモン療法、時には化学療法、プロトン療法等のような標準的な技術が、単独で適用した場合、前立腺癌（ＰＣａ）の効果的な処置に適していると思われない。処置の改善された方法の１つは、それ故に、そのような標準的な技術を他の方法と組み合わせることを含む。本発明によれば、適応免疫系が、前立腺癌（ＰＣａ）の処置又は補足の処置のための方法として取り組まれている。
【００１４】
当該技術分野において公知なように、免疫システムは多数の疾患の処置および予防において重要な役割を果たしている。現在分かっている段階の知識によれば、例えば癌細胞などを特定し殺すことにより生体を保護するために多種のメカニズムが哺乳動物によって提供されている。本発明の目的としては、これらの癌細胞は検出され、生体の正常な（健康な）細胞および組織から識別されなければならない。
【００１５】
人間など脊椎動物の免疫システムは、精巧かつダイナミックなネットワークの中で相互に作用し合う多くの種類のタンパク質、細胞、器官、および組織からなる。このより複雑な免疫応答の一部として、脊椎システムは、特定の病原体あるいは癌細胞をより効果的に認識するよう、時間をかけて適応してきた。適応プロセスは免疫記憶を作り出し、今後の（異物との）遭遇の間のより効果的な保護をも可能にする。適応されたあるいは獲得された免疫のこのプロセスは、予防接種戦略のための基盤を形成している。
【００１６】
適応性免疫システムは抗原特異的であり、抗原提示と呼ばれるプロセスのあいだ、特定の「自己」または「非自己」抗原の認識を必要とする。抗原特異性は、特定の病原体、または病原体の影響を受けた細胞、または癌細胞に対して調整された応答の生成を可能にする。これらの調整された応答の搭載を可能にする能力は、体内においていわゆる「記憶細胞」によって維持されている。人体が病原体に２回以上感染する際は、これら特定の記憶細胞が速やかにその病原体を排除するために用いられる。順応性の免疫システムは従って、免疫的記憶だけでなくより強力な免疫応答も可能にし、そこでは各病原体および癌細胞は、１つまたはそれ以上の標識抗原により「記憶」される。
【００１７】
脊椎動物における適応性免疫システムの主要な構成要素は優勢的に、細胞レベルではリンパ球を、分子レベルでは抗体を含む。適応性免疫システムの、細胞質構成要素としてのリンパ球は、骨髄中の造血幹細胞に由来するＢ細胞およびＴ細胞を含む。Ｂ細胞は体液性応答に関与し、Ｔ細胞は細胞性媒介免疫応答に関与する。Ｂ細胞とＴ細胞の両方は、特定の標的を認識する受容分子を運搬する。Ｔ細胞は抗原（例えば、病原体の小さな破片）が処理され、主要組織適合複合体（major histocompatibility complex, ＭＨＣ）分子と呼ばれる「自己」受容体とともに結合した状態となってはじめて、病原体標的構造などの「非自己」の標識を認識する。対照的に、Ｂ細胞抗原特異性受容体はＢ細胞表面抗体分子であり、Ｂ細胞表面上の抗体が特定の異物の抗原と結びついたとき、病原体を病原体として認識する。この抗原／抗体複合体はＢ細胞によって回収され、タンパク質加水分解によってペプチドに加工される。Ｂ細胞はその後これらの抗原ペプチドを自身の表面ＭＨＣクラスＩＩ分子上に配列する。このＭＨＣと抗原の結合体はマッチするヘルパーＴ細胞を引き付け、ヘルパーＴ細胞はリンホカインを放出しＢ細胞を活性化する。活性化されたＢ細胞がその後分裂を始めると、その子孫細胞は、この抗原を認識する抗体の何百万ものコピーを内包する。これらの抗体は血漿およびリンパの中を循環し、病原体あるいは癌細胞と結びついて抗原を発現し、補足的な活性化による破壊あるいは食細胞による取り込みおよび破壊のために、病原体や癌細胞をマークする。適応性の免疫システムの細胞質組成物としての細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は、ＣＴＬ応答を形成しうる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は内因性の病原菌およびＭＨＣタイプ１分子によって結合された自己抗原から、ペプチドを識別できる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞中で傷害性タンパク質を放出することで殺傷機能を発揮する。
【００１８】
免疫システムのメカニズムは、それゆえに、様々な病気の治効のある処置のための標的を形成し得る。適切な方法は一般的に、先天性免疫応答を誘発するためのアジュバントの投与、あるいは、適応性免疫システムを引き出すための抗原または免疫原の投与に基づく。抗原は一般的に、病原体の特定の組成物（例えば、表面タンパク質）またはその破片に基づくように、望ましいポリペプチド、タンパク質または抗原の発現に続く患者への核酸の投与も計画される。
【００１９】
去勢抵抗性の前立腺癌は、特定の免疫反応を引き起こすように設計された能動免疫療法が、総合的な生存の顕著な延長に基づいて承認されている、現在までに示された唯一の癌である。前立腺癌関連抗原ＰＡＰとアジュバントＧＭ−ＣＳＦとからなる融合タンパク質でパルスされた、自家抗原提示細胞からなる能動免疫療法に用いられるシプリューセル−Ｔ（Sipuleucel-T）は、５１２人の患者を登録した第３相試験において、無症候の又は症状が最小の去勢抵抗前立腺癌を有する患者において、偽薬と比較して中央値で４．１か月の生存期間の延長を示している(25.8 vs 21.7 mo; p=0.03)。これらの結果に基づいて、シプリューセル−Ｔは、２０１０年にこれらの患者群の処置用として、ＦＤＡに認可された。(Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E.R., Small, E.J., et al. (2010). Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N. Engl. J. Med. 363:411-422).
さらなる例として、公知の前立腺関連抗原に基づくワクチン接種の研究が、Noguchiら(2003)及び(2004)において行われている(例えば、Noguchi, M., K. Itoh, et al. (2004). Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA-A2-positive patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer. Cancer Sci 95(1): 77-84;及び Noguchi, M., K. Kobayashi, et al. (2003). Induction of cellular and humoral immune responses to tumor cells and peptides in HLA-A24 positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptide vaccination. Prostate 57(1): 80-92.を参照のこと)。 Noguchi et al. (2003)及び(2004)においては、選択された標的に対する体液性免疫反応と同様に細胞内において増大を示す、転移性ホルモン抵抗性（去勢抵抗性）前立腺癌患者に、ワクチン接種のマルチペプチド試験を行う２つの第１相試験を行っている。ワクチン接種戦略は、大きな中毒作用が許容されないため、安全であった。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルの安定化又は減少も観察され、ただ１人の患者において、骨への転移の喪失が示された。前立腺癌細胞によるペプチド発現と同様に、患者のＨＬＡハロタイプの演繹的知識の必要性からなる臨床応用が、このアプローチを大きく制限している。
【００２０】
他の最近のアプローチのいくつかは、例えば、ワクチン接種における異なる抗原の使用、又は、異なる抗原又はその断片を搭載した樹状細胞の使用のように、細胞ベースのワクチン接種法を利用している。一例によれば、臨床試験において、組み換えヒトＰＳＡでパルスした自家樹状細胞を用いて、前立腺癌患者のワクチン接種を行っている (例えば、 Barrou, B., G. Benoit, et al. (2004). Vaccination of prostatectomized prostate cancer patients in biochemical relapse, with autologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA. Cancer Immunol Immunother 53(5): 453-60を参照のこと)。前立腺癌が進行した患者を、ＰＳＣＡ及びＰＳＡペプチドが搭載された樹状細胞でワクチン接種した結果、患者の１０人中５人が、少なくとも１つの抗原に対して免疫反応を示した (例えば、Thomas-Kaskel, A. K., R. Zeiser, et al. (2006). Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer 119(10): 2428-34を参照のこと)。
【００２１】
他の例として、Murphyら(1996)はペプチド単独でのワクチン接種と、パルスされた樹状細胞でのワクチン接種とを比較するために、対応する第１相試験中の前立腺癌患者を、２つのHLA-A*0201 PSMAエピトープでワクチン接種した。結果は、パルスされた樹状細胞をワクチン接種した患者の方が多く、ワクチン接種に反応したことを示した。この研究は、ペプチド又はタンパク質を搭載した樹状細胞に基づくワクチン接種が、少なくともいくつかの例において、一時的なＰＳＣの減少又は安定化のような検出可能な免疫反応を導くことを示した(例えば、Murphy, G., B. Tjoa, et al. (1996). Phase I clinical trial: T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from prostate-specific membrane antigen. Prostate 29(6): 371-80参照のこと)。
【００２２】
前立腺患者のワクチン接種は、また、例えば、ペプチドカクテルが搭載された樹状細胞のような、ペプチドの組み合わせが搭載された樹状細胞により行われ得る (例えば、Fuessel, S., A. Meye, et al. (2006). Vaccination of hormone-refractory prostate cancer patients with peptide cocktail-loaded dendritic cells: results of a phase I clinical trial. Prostate 66(8): 811-21を参照のこと)。カクテルは、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、サバイビン、プロステイン及びＴｒｐ−ｐ８（一過性受容器電位ｐ８）のペプチドを含んでいた。また、臨床試験が、ホルモン不応性前立腺癌の樹状細胞ベースのマルチエピトープ免疫療法を用いて行われた。 (例えば、Waeckerle-Men, Y., E. Uetz-von Allmen, et al. (2006). Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma.  Cancer Immunol Immunother 55(12): 1524-33を参照のこと)。Waeckerle-Men, Y., E. Uetz-von Allmenら (2006)はＰＳＣＡ、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）、ＰＳＭＡ及びＰＳＡを用いて、ホルモン不応性前立腺癌のワクチン接種を試験した。
【００２３】
例えば、樹状細胞に搭載する場合のように、抗原タンパク質又はペプチドを用いたワクチン接種が、免疫応答を誘発する一般的な方法である一方で、免疫作用またはワクチン接種は、また、細胞内に必要な遺伝情報を組み込むための核酸の使用に基づき得る。一般に、核酸を細胞内に導入するための様々な方法が開発されている。例えば、リン酸カルシウム法、ポリプレン遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、顕微注射、およびリポフェクション法などである。リポフェクション法は特に好適な方法であることが分かっている。
【００２４】
前立腺癌のワクチン接種処置は、例えば、自家腫瘍由来のトータルｍＲＮＡの樹状細胞へのトランスフェクションに基づき得る(Heiser et al. (2002)参照のこと(例えば、Heiser, A., D. Coleman, et al. (2002). Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors. J Clin Invest 109(3): 409-17.参照のこと)。この方法は、事前のＨＬＡ型判定なしに、複数のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ患者特異腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）を標的とした利点を有する。さらに、ｍＲＮＡが、腫瘍細胞系からでなく、外科サンプルから得られたため、間質性抗原でさえ、この方法の標的となった。例として、Heiserらは、ＰＳＡをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞を用いた、ＤＣベースの免疫療法プロトコルを開発した。ワクチン接種は、Ｔ細胞のＰＳＡ反応を好適に許容及び誘導した。しかしながら、このようなＤＣベース抗前立腺癌ワクチンは、強いＴ細胞反応の生成を現し、臨床反応を伴い得るが、後者の頻度は、未だ満足のいくものではない。
【００２５】
ワクチン接種法においては、また、要求される遺伝情報を細胞に組み込むために、ＤＮＡを核酸として用いてもよい。例えば、ＤＮＡウイルスも同様に、ＤＮＡビヒクルとし用いられ得る。その伝染性の性質により、そうしたウイルスは非常に高い遺伝子導入率を達成する。用いられるウイルスは、遺伝子導入された細胞中にいかなる機能性伝染性粒子も形成されないように遺伝的に改変されている。例えば、第１相試験を、Ederら(2000)の研究においては、ＰＳＡを発現する組み換えワクチンウイルスを用いて行った。著者らは、ＰＳＡに対するＴ細胞免疫反応、さらに、選抜された患者における血清ＰＳＡ安定化を証明した(例えば、Eder, J. P., P. W. Kantoff, et al. (2000). A phase I trial of a recombinant vaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer. Clin Cancer Res 6(5): 1632-8.参照のこと)。組み換えウイルスからの高度の免疫原性ペプチドにより誘導される免疫反応は、外来タンパク質の免疫原性により強調され得る。しかしながら、免疫系は、組み換えウイルスの複製を低減し、これにより、臨床転帰を制限することが示された。組み換えワクチンは、いくつかの試験において、免疫原性及び腫瘍反応の証拠を示しているが、これらの結果は、さらなる臨床試験のために、さらに実証される必要がある。
【００２６】
さらなるアプローチにおいては、ホルモン不応性癌患者のワクチン接種を、ＰＳＡを発現するＤＮＡプラスミドを用いて行っている(例えば、Pavlenko, M., A. K. Roos, et al. (2004). A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer. Br J Cancer 91(4): 688-94参照のこと)。Garcia-Hernandezら(2007)は、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードするプラスミド又はウイルス様レプリコンを用いた、治療的及び予防的ワクチン接種が、腫瘍を患うマウスにおいて、生存期間が延長したことを示した(例えば、Garcia-Hernandez Mde, L., A. Gray, et al. (2007). In vivo effects of vaccination with six-transmembrane epithelial antigen of the prostate: a candidate antigen for treating prostate cancer. Cancer Res 67(3): 1344-51を参照のこと)。近年、ＳＴＥＡＰは、進行したヒト前立腺癌の指標タンパク質として同定され、ヒト前立腺癌において高度に過剰発現する。その機能は、現在のところ不明である。
【００２７】
しかしながら、遺伝情報の運搬体としてＤＮＡを用いる間に、例えば起こり得る再結合などが原因で、制御されない導入された遺伝子またはウイルスの遺伝子が増殖するリスクを排することはできない。このことはまた、例えばホスト細胞のゲノムの無傷の遺伝子中に、ＤＮＡが挿入され、結果このゲノムが変異ししたがって完全にまたは部分的に不活性化する恐れがある、あるいは遺伝子が誤報を引き起こす恐れがあるというリスクを包含する。言い換えれば、細胞にとって必須である遺伝子産物の合成が、完全に抑制されてしまうか、またはその代わりに、変性したまたは不正な遺伝子産物が発現される恐れがある。ＤＮＡは、細胞の成長制御に関与する遺伝子に例えば統合され得る。この場合、ホスト細胞が変質し癌や腫瘍形成につながる恐れがある。さらに、細胞内に導入されたＤＮＡが発現することになる場合は、対応するＤＮＡビヒクルが、ウイルスＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーターを含んでいることが必要である。このようなプロモーターの、被処置細胞への遺伝子内への組み込みは、細胞内での遺伝子発現の望まない制御変容に結びつく恐れがある。免疫応答を誘発するための因子として（例えば、ワクチンとして）ＤＮＡを用いるもう一つのリスクは、処置された患者内で、病原性抗ＤＮＡ抗体が導入され、それによって（場合によっては死に至る）免疫反応を引き起こすことである。
【００２８】
したがって、効果的に免疫システムを刺激して、ＤＮＡベースの組成物に起因する導入遺伝子の非制御増殖の問題を避けつつ、前立腺癌（ＰＣａ）の処置を可能にするために、ＲＮＡベースの抗原組成物が開発されている。WO 2009/046975は、PSA(前立腺特異抗原；KLK3又はカリクレイン３としても知られている)、PSMA(前立腺特異膜抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)及びSTEAP(前立腺の６回膜貫通型上皮抗原)からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも一つのＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００２９】
上述した組成物における抗原の組み合わせが、前立腺癌患者群のうちの応答者の数を顕著に増加させるとしても、それにも関わらず、当該技術分野において公知のいずれの方法も有効ではない、非応答患者が存在する。前立腺癌の高い発生率及び死亡率の増加を考えると、さらなる選択肢又は改善された処置が強く求められている。
【００３０】
したがって本発明の目的は、免疫システムを刺激することで前立腺癌（ＰＣａ）又はワクチンの処置を可能にする組成物を提供することである。
【００３１】
本発明の根底にある目的は、請求する内容によって解決される。
【発明の概要】
【００３２】
この目的は、本発明の対象によって、特に、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物によって解決され、ここで、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは：
・STEAP (前立腺の６回膜貫通型上皮抗原);
・PSA (前立腺特異抗原)、
・PSMA (前立腺特異膜抗原)、
・PSCA (前立腺幹細胞抗原);
・PAP (前立腺酸性フォスファターゼ)、および、
・ＭＵＣ１（ムチン−１）、
または、これらのフラグメントまたはその変異体をコードしており、かつ、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、モノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックである。
【００３３】
驚くべきことに、抗原、本発明に係る組成物に含まれる少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている上述の群の抗原性タンパク質または抗原性ペプチド、の特定の組み合わせは、前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは前立腺腺癌、局所性、局所進行性、転移性、去勢抵抗性（ホルモン不応性）、転移去勢抵抗性、及び、非転移去勢抵抗性の前立腺癌の処置、およびそれに関連した疾患または障害の処置、を可能にする（適応）免疫システムを効果的に刺激することが可能である。本発明に係る抗原の組み合わせが、単一の組成物として適用されるか、または個々の抗原の別々の投与によって適用されるかにかかわらず、上述の疾患および障害の治療に対して有益な効果が達成される。従って、本明細書に記載されている抗原の任意の組み合わせ、例えば、６つに分けられたｍＲＮＡの調合形態のものは、まさに同一の目的を満たし、かつ、所望の効果を達成するであろう。そのようなワクチン接種の戦略への応答者の数は、他のアプローチと比較して顕著に増加することが期待される。本明細書において、用語、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、同義語として使用されるであろう。本発明に関し、発明の組成物は、免疫反応、好ましくは、組成物に含まれる成分の少なくとも１つに起因して、または、むしろ、組成物の少なくとも１つの成分によって、すなわち、上記で規定された抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡによって、コードされている抗原の少なくとも１つに起因して、本明細書で規定される適応免疫反応を誘発することができる組成物としてさらに理解されるであろう。本発明によると、抗原の組み合わせは、別々に投与されるか（例えば、同時に）、または単一の組成物として投与されるかにかかわらず、所望の免疫反応を誘発することができる。別々の投与とは、異なるｍＲＮＡが、実質的に同時であるように、例えば１０分以内であるか、または、延長期間を超えて、例えば、３０分より長く、時間差があることを意味してもよい。
【００３４】
以下において、本発明に係る抗原の組み合わせは、抗原の組み合わせをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物の記述によって示されるであろう。本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、それが１つの単一組成物として投与されるか、または別々の調合の形態、例えば、それぞれが１つの抗原をコードし、かつ別々に（例えば、同時に）投与される６つの別々のｍＲＮＡとして調合されている形態で投与されるかにかかわらず、本明細書に記載されている特徴によって特徴づけられることが理解される。
【００３５】
前立腺癌細胞において過剰発現する多くの抗原のうち、本発明は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＡＰ、及びＭＵＣ１を特に選択した。これらの抗原は、本発明によれば、免疫療法の可能性のある標的を代表することが同定された。本発明によると、上記の抗原の１つ以上は、少なくとも１つのｍＲＮＡによって与えられた少なくとも１つのＯＲＦ／コード領域／コード配列によってコードされている。これに関し、メッセンジャーＲＮＡは、典型的な一本鎖ＲＮＡであり、当該一本鎖ＲＮＡは、（少なくとも）いくつかの構造要素、例えば、任意の５’ＵＴＲ領域、コード領域が後に続く上流側に位置する任意のリボソーム結合サイト、任意の３’ＵＴＲ領域から構成されている。当該任意の３’ＵＴＲ領域は、ポリＡテール（および／またはポリＣテール）が後に続いてもよい。本発明によると、組成物は、上記で規定された少なくとも６つの抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。その点で、上記組成物それ自体が、上記で規定された少なくとも６つの抗原を与える限り、１つのｍＲＮＡが、１つ以上の抗原をコードしてもよい。従って、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、１つより多いＯＲＦ／コード領域／コード配列を含んでもよく、組成物は、全体として、上記で規定された少なくとも６つの各抗原のための少なくとも１つのコード領域を含む。あるいは、少なくとも６つの各抗原のためのコード領域は、組成物の別々のｍＲＮＡ上に配置されてもよい。少なくとも１つのｍＲＮＡのためのさらに好ましい実施形態は、下記で提供される。
【００３６】
上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにコードされる抗原の１つは、ＰＳＡである。本発明に関して、ＰＳＡは、“前立腺特異抗原”であり、文献においてＫＬＫ３（カリクレイン−３）と同義を意味し得る。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、３３ｋＤａのタンパク質であり、前立腺組織の良性及び悪性の全ての型の上皮細胞によって排他的に生成される、アンドロゲン調節カリクレイン様セリン前立腺である。特に、ＰＳＡは、正常な前立腺上皮細胞において高度に発現し、前立腺癌において最も特徴付けられた腫瘍関連抗原の１つに挙げられる。生理的に、精液中に高濃度で存在し、精液凝塊のために、高分子量のタンパク質を分裂してより小さいポリペプチドにする機能を有する。この作用は、凝塊の液化をもたらす。ＰＳＡは、また、血清中に存在し、モノクローナル免疫放射定量測定法又はポリクローナル放射免疫測定の何れかによって、確実に測定され得る。ＰＳＡは、今日、前立腺癌のスクリーニング、診断、及び観察のための腫瘍マーカーとして最も広く用いられている。特に、血清ＰＳＡを検出するためのいくつかの免疫分析が、臨床で広範囲に用いられている。近年、血清におけるＰＳＡ  ｍＲＮＡのための、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析が開発されている。
【００３７】
この発明に関し、ＰＳＡ(前立腺特異抗原）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、アクセッション番号NP_001639.1(図３１;配列番号７６)で寄託されたＰＳＡのアミノ酸配列をコードする配列、又はアクセッション番号NM_001648で寄託された配列を含み得る。好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図２、３又は２７のいずれかに示されるコーディング配列を含む（配列番号２、３又は８２）。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１または１９に示されている配列（配列番号１または１９）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号NP_001639.1で寄託された、若しくは、図３１（配列番号７６)に示されたＰＳＡ配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号NM_001648、若しくは、図１、２、３、１９又は２７（配列番号１、２、３、１９又は８２）のいずれかに示された配列の断片又は変異体を含み得るＰＳＡ抗原配列を代替的にコードし得る。
【００３８】
ＰＳＭＡは、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされたもう１つの抗原である。本発明に関して、“ＰＳＭＡ”は、“前立腺特異膜抗原”であり、ＦＯＬＨ１（葉酸加水分解酵素１）又は“ＰＳＭ”と同義を意味し得る。ＰＳＭＡは、１００ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ＰＳＭＡ発現は、前立腺組織に大きく制限されるが、検出可能なレベルのＰＳＭＡ  ｍＲＮＡは脳、唾液腺、小腸及び腎細胞癌において観察されている(Israeli et al., 1993, Cancer Res 53 : 227-230).ＰＳＭＡは、多くの初期及び転移性の前立腺癌において、多く発現するが、多くの正常な上皮新生物標本においても発現する(上記Gao et al. (1997))。特に、ＰＳＭＡは、前立腺癌細胞及び非前立腺固形腫瘍血管新生において高度に発現し、抗癌イメージング及び治療剤の標的である。ＰＳＭＡは、葉酸、抗癌剤メトトレキサート、及び神経ペプチドＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸塩を含む、小分子基質上で、グルタミン酸カルボキシペプチターゼ（ＧＣＰＩＩ）として作用する。前立腺癌において、ＰＳＭＡ発現は、ホルモン不応性及び転移性疾患における高レベルの発現と共に、病気の進行への関連が示されている。細胞内の位置は、細胞質及び／又は膜である。ＰＳＭＡは、前立腺癌のバイオマーカーであると考えられ、イメージング及び治療の標的としての利用が活発に研究されている。
【００３９】
本発明に関して、ＰＳＭＡ(前立腺特異膜抗原)をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、アクセッション番号NP_004467.1(図３２;配列番号７７)で寄託されたＰＳＭＡのアミノ酸配列をコードする配列又はアクセッション番号NM_004476で寄託された配列を含み得る。好ましくは、図５、６又は１８のいずれかに示されたコード配列(配列番号５、６又は８３)を含む。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図４または２０に示されている配列（配列番号４または２０）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号NP_004467.1で寄託された、若しくは、図３２（配列番号７７）に示されたＰＳＭＡ配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号NM_004476、若しくは、図４、５、６、２０又は２８（配列番号４、５、６、２０又は８３）のいずれかに示された配列の断片又は変異体を含み得るＰＳＭＡ抗原配列を代替的にコードし得る。
【００４０】
本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによりコードされたさらなる抗原は、ＰＳＣＡである。本発明に関して、“ＰＳＣＡ”は、“前立腺幹細胞抗原”である。ＰＳＣＡは、グレードの高い前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、アンドロゲン依存性及びアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍を含む、前立腺癌の全ての段階にわたって、広く過剰発現する。ＰＳＣＡ遺伝子は、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定細胞表面抗原のＴｈｙ−Ｉ／Ｌｙ−６ファミリーのメンバーである、幹細胞抗原２と３０％の相同性を示し、 アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩ固定配列、及び複数のＮ−グリコシル化部位を有する、１２３アミノ酸のタンパク質をコードする。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡ発現は、アンドロゲン依存性及びアンドロゲン非依存性の両方の前立腺癌異種移植において、高度にアップレギュレートされる。ｉｎ  ｓｉｔｕのｍＲＮＡ分析を、前立腺の幹細胞区画であると推定される基底細胞上皮におけるＰＳＣＡ発現に適用するフローサイトメトリー分析は、ＰＳＣＡが、主に細胞表面に発現し、ＧＰＩ架橋により固定されることを証明する。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を、前立腺癌の８０％より多い対立ゲインの領域である、染色体８ｑ２４．２に対するＰＳＣＡに適用する。ＰＳＣＡは、悪性前立腺癌、正常な前立腺、及び、非悪性新生物を区別するための、前立腺癌マーカーとして使用し得る。例えば、ＰＳＣＡは、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）に関して、前立腺癌において非常に高いレベルで発現する。
【００４１】
本発明に関し、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、アクセッション番号O43653.1で寄託されたＰＳＣＡのアミノ酸配列をコードする配列(図３３；配列番号７８）、又は、アクセッション番号NM_005672で寄託された配列を含み得る。好ましくは、図８、９又は２９（配列番号８、９、又は８４）の何れかに示すコーディング配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図７または２１に示されている配列（配列番号７または２１）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号O43653.1で寄託された、若しくは、図３３（配列番号７８）に示されたＰＳＣＡ配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号NM_005672、若しくは、図７、８、９、２１又は２９（配列番号７、８、９、２１又は８４）のいずれかに示された配列の断片又は変異体を含み得るＰＳＣＡ抗原配列を代替的にコードし得る。
【００４２】
加えて、ＳＴＥＡＰは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる。本発明に関して、“ＳＴＥＡＰ”は、“前立腺の６回膜貫通型上皮抗原”であり、ＳＴＥＡＰ１と同義を意味し得る。ＳＴＥＡＰ又はＳＴＥＡＰ−１は、新規の細胞表面タンパク質であり、ヒト前立腺組織、並びに、前立腺、膀胱、腸及び卵巣の悪性腫瘍を含む他の主要な悪性腫瘍や、ユーイング肉腫において主に発現し、ほぼ一般的な腫瘍抗原として機能し得ることが示唆されている。特に、ＳＴＥＡＰは、初期の前立腺癌において高度に発現し、正常組織においては発現が制限されている。カプラン・マイヤー分析において、骨髄サンプル中のＳＴＥＡＰの確実性は、新たな転移を伴う生存に高度に関連していた（ｐ＝０．００１）。
【００４３】
本発明に関し、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）（又はＳＴＥＡＰ１）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、アクセッション番号NP_036581.1(図３４；配列番号７９)で寄託されたＳＴＥＡＰのアミノ酸配列をコードする配列、又は、アクセッション番号NM_012449で寄託された配列を含み得る. 好ましくは図１１、１２又は３０（配列番号１１、１２又は８５）のいずれかに示されたコーディング配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１０または２２で示される配列（配列番号１０または２２）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号NP_036581.1で寄託された、若しくは、図３４（配列番号７９）に示されたＳＴＥＡＰ配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号NM_012449、若しくは、図１０、１１、１２、２２又は３０（配列番号１０、１１、１２、２２又は８５）のいずれかに示された配列の断片又は変異体を含み得るＳＴＥＡＰ抗原配列を代替的にコードし得る。
【００４４】
さらに、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ＰＡＰをコードする。 “ＰＡＰ”は、“前立腺酸性フォスファターゼ”であり、例えば、ＰＳＡＰ（前立腺特異酸性フォスファターゼ）又はＡＣＰＰ（酸性フォスファターゼ、前立腺）と同義を意味し得る。ＰＡＰは酵素であり、前立腺の上皮細胞から分泌され、正亜燐酸モノエステルのアルコール及び正亜燐酸塩への変換を触媒する。初期の腺癌の９５％より多くと同様に、腫瘍に隣接する正常組織を含む正常な成人前立腺組織サンプルの９５％より多くが、ＰＡＰを強く発現する。ＰＡＰ発現は、前立腺に加えて、いくつかのヒト組織（例えば、腎臓、肺、精巣、腸、膵臓）においても検出され得るが、約１〜２倍少ないレベルであり、ＰＡＰは一般に、組織特異前立腺抗原として考えられており、正常及び悪性の両方の前立腺細胞において高度に発現する。さらに、ＰＡＰが前立腺癌骨転移において強く発現し、疾患の骨芽細胞腫相の原因となり得ることが証明されている。ＰＡＰは、患者において、ＣＴＬ反応を含む長期ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘引することが示されている。ＰＡＰで刺激した自家抗原提示細胞を用いた前立腺癌患者の処置は、生存期間の向上と有利な安全性プロファイルをもたらしている。
【００４５】
この発明に関し、ＰＡＰをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、アクセッション番号NP_001090.2(図３５；配列番号８０)で寄託されたＰＡＰのアミノ酸配列をコードする配列、又は、アクセッション番号NM_001099.4で寄託された配列を含み得る。好ましくは、図１４又は１５のいずれか（配列番号１４又は１５）に示されたコーディング配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１３または２３で示される配列（配列番号１３または２３）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号NP_001090.2で寄託された、若しくは、図３５（配列番号８０）に示されたＰＡＰ配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号NM_001099.4、若しくは、図１３、１４、１５、又は２３（配列番号１３、１４、１５、又は２３）のいずれかに示された配列の断片又は変異体を含み得るＰＡＰ抗原配列を代替的にコードし得る。
【００４６】
最後に、ＭＵＣ１は、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる。“ＭＵＣ１”は、“ムチン１”であり、例えば、ＣＤ２２７又はＤＦ３と同義とみなされ得る。ＭＵＣ１は、腺上皮の管腔表面において通常発現する、大きな粘液性糖タンパク質である。正常な上皮におけるその機能は、上皮細胞の潤滑化及び保護である。ＭＵＣ１の発現は、前立腺癌を含む多くのヒト悪性腫瘍において、頻繁に増加し、管腔表面にもはや制限されず、異常なグリコシル化により特徴付けられる。ＭＵＣ１は、初期の前立腺癌の約６０％及びリンパ節転移の９０％において発現する。さらに、ＭＵＣ１ポジティブ初期前立腺腫瘍の８６％が、より悪性の疾患との関連を示すグリーソング分類７であった。ヒト前立腺癌の遺伝子発現プロファイリングは、ＭＵＣ１が悪性の臨床病理学的特徴を有するサブグループにおいて高度に発現すること、及び、再発のリスクが高いことも示している。ＭＵＣ１の過剰発現及び過少発現の両方が、前立腺癌進行のリスクを上げることが見出されている。ＭＵＣ１は、免疫原性であることが示され、患者におけるＣＤ８＋  ＣＴＬｓ及びＩｇＭ抗体を含む特異免疫反応を誘引することが説明されている。異なるワクチン接種アプローチを用いたＭＵＣ１に対するワクチン接種が、進行した非小細胞肺癌患者における第２相試験において臨床上有益な傾向に関連し、より耐性を示した。同じワクチンを用いた前立腺癌におけるＭＵＣ１に対するワクチン接種が、何人かの患者において、ＰＳＡ倍加時間の延長に関連した(Bilusic, M., et al. (2011) Immunotherapy in prostate cancer: emerging strategies against a formidable foe. Vaccine. 29:6485-6497; Dreicer, R. et al. (2009). MVA-MUC1-IL2 vaccine immunotherapy (TG4010) improves PSA doubling time in patients with prostate cancer with biochemical failure. Invest New Drugs. 27:379-386, Sangha, R. and North, S. (2007). L-BLP25: a MUC1-targeted peptide vaccine therapy in prostate cancer. Expert Opin Biol Ther. 7:1723-1730)。
【００４７】
この発明に関し、ＭＵＣ１をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、好ましくはｍＲＮＡであり、アクセッション番号AAA60019.1（図３６；配列番号８１)で寄託されたＭＵＣ１のアミノ酸配列をコードする配列、若しくは、図３７（配列番号８６；ＭＵＣ１  ５´ＶＮＴＲ）に示された不完全アミノ酸配列、又は、アクセッション番号J05582.1で寄託された配列を含み得る少なくとも１つのｍＲＮＡ、を含み得る。好ましくは、図１７、１８又は３８（配列番号１７、１８又は８７）のいずれかに示されたコーディング配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１６または２４で示される配列（配列番号１６または２４）を含むか、または、からなる。さらに好ましい実施形態によると、上記組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、アクセッション番号AAA60019.1で寄託された、若しくは、図３６又は３７（配列番号８１又は８６)に示されたＭＵＣ１配列の断片、変異体、又はエピトープから選択され、又は、アクセッション番号J05582.1、若しくは、図１６、１７、１８、２４又は３７（配列番号１６、１７、１８、２４又は８７）に示された配列の断片又は変異体を含み得る、ＭＵＣ１抗原配列を代替的にコードし得る。
【００４８】
本発明に関し、抗原、または、そのフラグメント、エピトープもしくは変異体を参照する場合、当該参照は、本発明で提供されるｍＲＮＡ配列のうちの１つ以上によってコードされている抗原またはペプチドに関係している。なお、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、それらの配列のフラグメントまたは変異体を含んでもよい。そのようなフラグメントまたは変異体は、通常、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルのいずれかで、野生型の全配列に対して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、同程度により好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、もしくは、さらに９７％の上述された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドまたは抗原性配列またはこれらコード核酸配列のうちの１つに配列相同性を有する配列を含んでもよい。
【００４９】
本発明に関する抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの“フラグメント”は、そのアミノ酸配列（または、そのコードされた核酸配列）に関して、元の（天然の）タンパク質（または、そのコードされた核酸配列）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端で切断されたか、Ｃ末端で切断されたか、または、配列内で切断された、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの配列を含んでもよい。従って、そのような切断は、アミノ酸レベルまたは同様に核酸レベルのいずれかにおいて発生してもよい。従って、上記で規定されたそのようなフラグメントに関する配列相同性は、好ましくは、上記で規定された全ての抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチドを示すか、または、上記の抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのすべての（コード）核酸配列を示す。
【００５０】
本発明に関する抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのフラグメントは、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの配列をさらに含んでもよく、当該配列は、約６個から約２０個のアミノ酸の長さ、またはさらに多くのアミノ酸の長さを有し、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理され、かつ提示されるフラグメントであり、好ましくは、約８個から約１０個のアミノ酸、例えば、８個、９個または１０個（または、６個、７個、１１個もしくは１２個のアミノ酸）のアミノ酸の長さを有しているか、または、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理され、かつ提示されるフラグメントであり、好ましくは、約１３個以上、例えば１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のアミノ酸の長さを有しており、ここで、これらのフラグメントは、アミノ酸配列の任意の部分から選択されてもよい。これらのフラグメントは、一般的に、ペプチドフラグメントおよびＭＨＣ分子からなる複合体の形態で、Ｔ細胞により認識される。すなわち、フラグメントは、一般的に、これらの元々の形態では認識されない。
【００５１】
また、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのフラグメントは、それらの抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのエピトープを含む。本発明に関するエピトープ（“抗原決定基”とも呼ばれる）は、一般的に、本明細書で規定される（天然の）抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの外部表面上に配置されたフラグメントであり、好ましくは、５個から１５個のアミノ酸を有し、より好ましくは、５個から１２個のアミノ酸を有し、さらにより好ましくは、６個から９個のアミノ酸を有し、抗体、またはＢ細胞の受容体によって認識される、すなわち、これらの元々の形態で認識されてもよい。抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの上記のエピトープは、上記の抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの、本明細書で言及される何れかの変異体からさらに選択されてもよい。これに関し、抗原決定基は、立体配置的エピトープ、または非連続的エピトープであり得て、当該エピトープは、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのセグメントからなり、当該セグメントは、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのアミノ酸配列において非連続的であるが、三次元構造においてまとめられるか、または、単一のポリペプチド鎖からなる直鎖状エピトープである。それゆえに、これに関して、特に好ましくは、抗原の断片、抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。
【００５２】
上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの“変異体”は、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよく、ここで、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの核酸は交換される。それにより、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、１つ以上の置換されたアミノ酸、挿入されたアミノ酸および／または欠失したアミノ酸などの１つ以上の変異のために元の配列とは異なるアミノ酸配列を有して、生成されてもよい。好ましくは、これらのフラグメントおよび／または変異体は、全長の天然抗原または天然抗原性タンパク質、例えば、その特異的抗原性の性質と比較して、同一の生物学的機能または特異的活性を有する。
【００５３】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、上記で規定された抗原または抗原性タンパク質をコードしており、ここで、コードされたアミノ酸配列は、その生理的配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含む。それらのコードされたアミノ酸配列、およびコードしているこれらのヌクレオチド配列は、特に、上記で規定された用語である変異体のうちに入る。同一のクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正または負に荷電した側鎖、側鎖またはアミノ酸における芳香族基、水素結合の一部となり得る側鎖、例えば、ヒドロキシル官能基を有している側鎖、を有しているアミノ酸である。これは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸が、同様の極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されるか、または、例えば、疎水性側鎖により特徴づけられるアミノ酸が、同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されること（例えば、スレオニン（セリン）によってセリン（スレオニン）が置換されるか、またはイソロイシン（ロイシン）によってロイシン（イソロイシン）が置換される）を意味する。挿入および置換は、特に、三次元構造に変形をもたらさないそれらの配列位置において、または結合領域に影響を与えないそれらの配列位置において、可能である。挿入または欠失による三次元構造に対する変形は、例えばＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を用いて容易に決定され得る（Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam）。
【００５４】
なお、また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよい上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの変異体は、それらの配列を含んでもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡの核酸は、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの各アミノ酸配列の変更を導くことなく、遺伝暗号の縮重によって交換される。すなわち、アミノ酸配列、または、それらの少なくとも一部は、上記の意味の範囲内で、１つ以上の変異において元の配列とは異なってもよい。
【００５５】
なお、また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよい上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの変異体は、本明細書で規定されたＲＮＡ配列に対応するそれらのＤＮＡ配列を含んでもよく、また、本明細書で規定されたＤＮＡ配列に対応するさらなるＲＮＡ配列を含んでもよい。当業者は、ＤＮＡ配列へのＲＮＡ配列の翻訳（または、逆も同様である）、または、相補鎖配列の作製（すなわち、Ｔ残基を用いて、Ｕ残基を置換することにより、および／または、所定の配列に関する相補鎖を構成することにより）に精通している。
【００５６】
２つの配列（核酸配列、例えば、上記で規定されたＲＮＡ配列もしくはｍＲＮＡ配列、または、アミノ酸配列、好ましくはコードされたこれらのアミノ酸配列、例えば、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのアミノ酸配列）が同一であるパーセンテージを決定するために、配列は、その後、互いに比較される目的で整列され得る。第１の配列における位置が、第２の配列における位置の場合と同じ成分によって占有されている場合、２つの位置は、この位置において同一である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、位置の総数で割った同一位置の数の関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定され得る。使用され得る数学的アルゴリズムの好ましい例ではあるが、限定されない例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズム、または、Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムで統合される。本発明の配列と、ある程度同一である配列は、このプログラムによって特定され得る。
【００５７】
本明細書で使用される用語“組成物”は、少なくとも１つのｍＲＮＡを示し、必要に応じて、さらなる賦形剤を示す。従って、用語“組成物”は、ｍＲＮＡがモノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックであるかにかかわらず、上記で規定された抗原をコードしているｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ種）の任意の混合物を含む。また、本発明の意味の範囲内で、用語“組成物”は、上記で規定された６つ全ての抗原をコードしているマルチシストロニックＲＮＡからなる実施形態を示す。好ましくは、組成物は、各ｍＲＮＡ種が上記の抗原のうちの１つをコードすることにより、少なくとも６つの異なるｍＲＮＡ種を含む。用語“組成物”は、好ましくは、少なくとも１つの他の好適な物質を伴った少なくとも１つのｍＲＮＡに関する。一般的に、組成物は、医療分野における使用のために設計されている医薬組成物であってもよい。従って、一般的に、組成物は、少なくとも１つのさらなる賦形剤を含み、当該賦形剤は、薬学的に許容されるものであり、例えば、キャリア、ビヒクルなどから選択されてもよい。組成物は、液体組成物または乾燥組成物であってもよい。組成物が液体である場合、それは、少なくとも１つのＲＮＡの水溶液または分散液である。“組成物”が乾燥組成物である場合、一般的に、それは、少なくとも１つのｍＲＮＡの乾燥凍結された組成物である。本明細書で使用される用語“組成物”は、さらなる活性成分と組み合わされた本発明の少なくとも１つのｍＲＮＡをさらに示す。好ましくは、組成物は、免疫賦活性組成物、すなわち、少なくとも１つの成分を含む組成物であり、当該成分は、免疫反応を誘導し得るか、または、それから、免疫反応を誘導し得る成分が導きだせる。これに関し、免疫反応は、適応免疫システムの結果、および／または先天性免疫システムの結果であってもよい。
【００５８】
上記抗原の特定の組み合わせが、効果的に（適応）免疫システムを刺激することができ、従って、肺癌の治療、好ましくは、前立腺癌（ＰＣａ）の治療を可能にすることが見出されたため、本発明に係る組成物は、上記で規定された少なくとも６つの抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。
【００５９】
要約すると、本発明の目的は、本明細書で規定される抗原の新規な組み合わせをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物を提供することによって解決される。好ましい実施形態では、組成物は、６つの抗原（ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＡＰ、および、ＭＵＣ１（ムチン−１））を含み、当該６つの抗原は、６つのモノシストロニックｍＲＮＡによってコードされ、これら各々のｍＲＮＡは、規定された抗原の群から選択される異なる抗原をコードしている。あるいは、組成物は、モノシストロニックｍＲＮＡ、バイシストロニックｍＲＮＡおよび／またはマルチシストロニックｍＲＮＡの組み合わせ物を含んでもよく、ここで、６つの抗原のうちの１つより多くのものが、バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡによってコードされている。本発明によると、モノシストロニックｍＲＮＡ、バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡの任意の組み合わせは、本明細書で規定された６つ全ての抗原をコードしているものが想定され、例えば、各々のバイシストロニックｍＲＮＡが上記の６つの抗原のうち２つをコードしている３つのバイシストロニックｍＲＮＡ、または、２つのバイシストロニックｍＲＮＡおよび２つのモノシストロニックｍＲＮＡが想定される。
【００６０】
好ましい実施形態によると、組成物は、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号２、５、８、１１、１４または１７（または８７）のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるｍＲＮＡ配列から選択される少なくとも１つのコード配列を含む。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡにおけるコード配列は、配列番号２、５、８、１１、１４または１７（または８７）に従ったＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物の少なくとも６つの各抗原は、１つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡによってコードされていてもよい。言い換えると、本発明の組成物は、６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡを含んでもよく、これら６つの各々の（モノシストロニック）ｍＲＮＡは、上記で規定されたただ１つの抗原をコードしていればよい。
【００６２】
より好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、それぞれのｍＲＮＡにおいて、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードしており、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１、または、それらのフラグメントもしくは変異体をコードしている。
【００６３】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡ、および、必要に応じて、さらなる賦形剤を含み、ここで、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードし、かつ、配列番号２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号５と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号８と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号１１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＰＡＰをコードし、かつ、配列番号１４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１７（または８７）（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含む。
【００６４】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、それぞれのｍＲＮＡにおいて、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードし、かつ、配列番号２に従ったコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号５に従ったコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号８に従ったコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号１１に従ったコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードし、かつ、配列番号１４に従ったコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１７（または８７）に従ったコード配列、または、それのフラグメントを含む。
【００６５】
本発明によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ領域にヒストンステムループを好ましくは含み得る。好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各ｍＲＮＡは、ここで規定されたヒストンステムループを含む。
【００６６】
別の特に好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、（少なくとも）１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡ、すなわち、本発明に係る６つの抗原のうちの２つ以上のコード配列を運ぶ（少なくとも）１つのｍＲＮＡを含む。（少なくとも）１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡに属する２つ以上の抗原の上記コード配列は、下記で規定される少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム進入サイト）配列によって隔離されてもよい。従って、用語“２つ以上の抗原をコードする”は、それに限定されることなく、（少なくとも）１つの（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）ｍＲＮＡが、例えば、上記の定義の範囲内で、上記で言及された抗原の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの（好ましくは、異なる）抗原、またはこれらのフラグメントもしくは変異体をコードしてもよいことを意味し得る。より好ましくは、それに限定されることなく、（少なくとも）１つの（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）ｍＲＮＡは、例えば、上記の定義の範囲内で、上記で言及された抗原の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの（好ましくは、異なる）抗原、または、これらのフラグメントもしくは変異体をコードしてもよい。これに関し、上記で規定された、いわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム進入サイト）配列は、単独のリボソーム結合サイトとして機能することができるが、また、それは、いくつかのタンパク質をコードしている上記で規定されたバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡを供給するように機能することができ、当該バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡは、互いに独立してリボソームによって翻訳される。本発明によって使用され得るＩＲＥＳ配列の例は、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からのＩＲＥＳ配列である。
【００６７】
さらなる特に好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、上記で規定された少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡの混合物と、上記で規定された少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡとを含んでもよい。少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡ、および／または、少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡもしくはマルチシストロニックｍＲＮＡは、好ましくは、上記の定義の範囲内の種々の抗原またはこれらのフラグメントもしくは変異体をコードしている。しかし、また、少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡ、および少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡは、本発明の組成物が全体として上記で規定された６つの抗原を供給するという条件で、好ましくは、上記で言及された抗原から選択される（部分的に）同一の抗原をコードしてもよい。当該抗原のうちの１つ以上の複数のコピーを備えることにより、上記の１つ以上の抗原の相対的なタンパク質量が増加し得る。すなわち、６つの各抗原の量間の比は、調整され得る。さらに、上記の実施形態は、本発明の組成物を、それを必要としている患者に、時間をずらして、例えば、時間依存的に投与することに対して有益であり得る。ここに記載した本発明に係る上記の組成物の成分、特に、本発明に係る少なくとも６つの抗原の特定の組み合わせをコードしている種々のｍＲＮＡは、例えば、パーツ組成物のキット（の種々のパーツ）に含まれてもよく、または、例えば、本発明に係る種々の組成物の成分として、別々に投与されてもよい。
【００６８】
これに関して、特に好ましくは、少なくとも６つの抗原のそれぞれが、別個のｍＲＮＡをコードし、キットの異なる部分に含まれる。少なくとも６つの抗原の１つをコードする各ｍＲＮＡは、好ましくは、ここに記載した異なる組成物の成分とは別に投与される。本発明の組成物を記載した全ての実施形態は、異なる抗原をコードするｍＲＮＡを含む組成物のそのような組み合わせに適用可能である。
【００６９】
好ましくは、６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約５０ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、または、約１００ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約２５０ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、約５００ヌクレオチドから約１００００ヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは、約５００ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さを含む。
【００７０】
一実施形態によると、６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡの形態のものであり、本明細書で規定される任意の修飾は、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに導入されてもよい。本明細書で規定される修飾は、好ましくは、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡを安定化に導く。
【００７１】
従って、第一の実施形態によると、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、“安定化ｍＲＮＡ”として提供されてもよく、当該安定化ｍＲＮＡとは、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性を有するｍＲＮＡということである。そのような安定化は、例えば、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの修飾されたリン酸主鎖によって影響され得る。本発明に関連する主鎖の修飾は、ｍＲＮＡに含まれるヌクレオチドの主鎖のリン酸が化学的に修飾される修飾である。これに関連して好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオネート修飾リン酸主鎖、好ましくは、硫黄原子によって置換されているリン酸主鎖に含まれるリン酸酸素のうちの少なくとも１つを含む。安定化ｍＲＮＡは、例えば、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネートなどの、例えば、非イオン性ホスホネートアナログをさらに含んでもよく、ここでは、荷電したホスホネート酸素は、アルキル基またはアリール基またはホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルによって置換されており、ここでは、荷電した酸素残基が、アルキル化された形態で存在している。いかなる限定も意味することなく、そのような主鎖の修飾は、一般的に、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホロチオネート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオリン酸））からなる群からの修飾を含む。
【００７２】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、糖修飾を、さらに、または代わりに含む。本発明に関連する糖修飾は、少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの糖の化学的修飾であり、また、いかなる限定を意味することなく、一般的に、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−メチルウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体である（２’−アラシチジン−５’−三リン酸、２’−アラウリジン−５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含む。
【００７３】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの塩基修飾をも、追加として、または代替として含んでもよく、当該少なくとも１つの塩基修飾は、好ましくは、改変されていないｍＲＮＡ配列、すなわち、自然の（＝天然の）ｍＲＮＡ配列と比較して、特に少なくとも１つのｍＲＮＡ配列によりコードされている少なくとも１つのタンパク質の発現を増加させるのに適している。この場合における「かなり」とは、天然のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％、最も好ましくは、少なくとも１５０％、２００％または３００％以上、タンパク質の発現が増加していることを意味する。本発明に関して、上記の塩基修飾を有するヌクレオチドは、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸、２−チオシチジン−５’−三リン酸、２−チオウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、６−アザシチジン−５’−三リン酸、６−アザウリジン−５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、８−アザアデノシン−５’−三リン酸、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸、シュードウリジン−５’−三リン酸、またはピューロマイシン−５’−三リン酸、キサントシン−５’−三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される。特に、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、およびシュードウリジン−５’−三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが好ましい。
【００７４】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、同様に、これらのリボースまたは塩基部分の修飾を含むさらに修飾されたヌクレオチドを導入することにより修飾され得る（また、好ましくは、安定化される）。通常、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、任意の天然の（＝自然発生的な）ヌクレオチド、例えば、グアノシン、ウラシル、アデノシンおよび／またはシトシンまたはそのアナログを含んでもよい。これに関連して、ヌクレオチドアナログは、自然発生的なヌクレオチドの非自然発生的な変異体として規定される。従って、アナログは、非自然発生的な官能基で化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、当該官能基は、好ましくは、付加されるか、もしくは自然発生的なヌクレオチドから脱離されるか、または、ヌクレオチドの自然発生的な官能基と置換する。従って、自然発生的なヌクレオチドの各成分、すなわち、ｍＲＮＡ配列の主鎖（上記参照）を形成する塩基成分、糖（リボース）成分および／またはリン酸成分は、修飾されてもよい。グアノシン、ウラシル、アデノシンおよびシトシンのアナログは、いかなる限定も意味することなく、例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化などによって化学的に改変された任意の自然発生的または非自然発生的なグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジンまたはシトシンを含み、これらは、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアモノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デンザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デンザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デンザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−キュエオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、キュエオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキシン、キサントシン、およびキシロ−アデノシンを含む。上記のアナログの調製法は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および米国特許第５，７００，６４２号によって当業者に知られている。本発明によると、上記に記載されたアナログの場合、本発明に係る組成物のｍＲＮＡの免疫抗原性を上昇させ、および／または、導入されたｍＲＮＡのさらなる修飾を妨害しない、それらのアナログが特に好ましい。
【００７５】
特定の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、脂質修飾を含み得る。そのような脂質修飾ｍＲＮＡは、一般的に、本明細書で規定されたｍＲＮＡを含み、上記で規定された６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている。そのような脂質修飾ｍＲＮＡは、一般的に、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された少なくとも１つのリンカーと、各々のリンカーと共有結合により連結された少なくとも１つの脂質と、をさらに含む。第３の選択肢によると、脂質修飾ｍＲＮＡは、本明細書で規定されるｍＲＮＡ、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された少なくとも１つのリンカー、および、各リンカーと共有結合により連結された少なくとも１つの脂質を含み、また、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された（リンカー無しで）少なくとも１つの（二官能）脂質も含む。
【００７６】
一般的に、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに含まれる脂質（複合体化しているか、または、それに共有結合により結合している）は、好ましくは、それ自身、生物学的に活性を有する脂質または親油性残基である。そのような脂質は、好ましくは、例えば、ビタミン、例えば、ＲＲＲ−α−トコフェロール（以前は、Ｄ−α−トコフェロール）を含むα−トコフェロール（ビタミンＥ）、Ｌ−α−トコフェロール、ラセミ体Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、ビタミンＥコハク酸（ＶＥＳ）、またはビタミンＡおよびその誘導体、例えば、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＤおよびその誘導体、例えば、ビタミンＤ、および、また、そのエルゴステロール前駆体、ビタミンＥおよびその誘導体、ビタミンＫおよびその誘導体、例えば、ビタミンＫおよび関連するキノンまたはフィトール化合物、または、胆汁酸などのステロイド、例えば、コール酸、デオキシコール酸、デヒドロコール酸、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロールまたはチオコレステロール、などの天然物質または天然化合物を含む。本発明の範囲内のさらなる脂質または親油性残基は、いかなる限定を意味することなく、ポリアルキレングリコール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、例えば、Ｃ１−Ｃ２０−アルカン化合物、Ｃ１−Ｃ２０−アルケン化合物またはＣ１−Ｃ２０−アルカノール化合物などの脂肪族基、例えば、ドデカンジオール残基、ヘキサデカノール残基またはウンデシル残基などの脂肪族基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、例えば、ホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシドまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、などのリン脂質（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、などのポリアミンまたはポリアルキレングリコール（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、パルミチンまたはパルミチル残基（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール残基（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）、および、また、ワックス、テルペン、脂環式炭化水素、飽和モノ不飽和脂肪酸残基または飽和ポリ不飽和脂肪酸残基（saturated and mono- or poly-unsaturated fatty acid residues）、などを含む。
【００７７】
本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、同様に、インビボでｍＲＮＡの分解を防止するために、種々のアプローチにより安定化されてもよい。一般的に、インビボでのｍＲＮＡまたはＲＮＡの不安定性および（高速）分解は、ＲＮＡに基づいた組成物の応用における深刻な問題を代表し得ることが、当該技術分野で知られている。ＲＮＡのこの不安定性は、一般的に、ＲＮＡ分解酵素“ＲＮアーゼ”（リボヌクレアーゼ）に起因し、ここで、そのようなリボヌクレアーゼを伴ったコンタミネーションは、たまに、溶液中のＲＮＡを完全に分解し得る。従って、細胞の細胞質中のｍＲＮＡの自然分解は、とても細かく調節され、また、ＲＮアーゼコンタミネーションは、通常、上記の組成物を使用する前に、特に、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を用いて、特別な処理によって除去されてもよい。自然分解の多くのメカニズムが、これに関連して、従来技術において知られており、当該メカニズムも同様に利用されてもよい。例えば、末端構造は、一般的に、インビボにおけるｍＲＮＡに対して非常に重要である。例として、自然発生ｍＲＮＡの５’末端には、通常、いわゆる“キャップ構造”（修飾されたグアノシンヌクレオチド）があり、また、３’末端には、一般的に、２００個に達するアデノシンヌクレオチド（いわゆるポリＡテール）の配列がある。
【００７８】
従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、いわゆる“５’キャップ”構造の付加によって、ＲＮアーゼによる分解に対して安定化され得る。これに関連して、５’キャップ構造として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが特に好ましい。しかし、修飾、例えば、脂質修飾が、本発明に係る組成物のｍＲＮＡの５’末端にまだ導入されていない場合、または、修飾が、（修飾されていない、または、化学的に修飾された）ｍＲＮＡの免疫抗原性に干渉しない場合にのみ、上記の修飾が導入される。
【００７９】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約１０個から２００個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、好ましくは、約１０個から１００個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、より好ましくは、約４０個から８０個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、または、さらにより好ましくは、約５０個から７０個のアデノシンヌクレオチドの３’末端に、ポリＡテールを含んでもよい。
【００８０】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約１０個から２００個のシトシンヌクレオチドの３’末端、好ましくは、約１０個から１００個のシトシンヌクレオチドの３’末端、より好ましくは、約２０個から７０個のシトシンヌクレオチドの３’末端、または、さらにより好ましくは、約２０個から６０個、もしくは約１０個から４０個のシトシンヌクレオチドの３’末端に、ポリＣテールを含んでもよい。
【００８１】
本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループを含むか又はコードする。本発明に関し、そのような通常のヒストンステムループ（それがヒストンステムループであるかないかにかかわらず）は、一般的に、ヒストン遺伝子に由来し、かつ、２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列の分子内塩基対を含み、それにより、ステムループを形成する。ステムループは、一本鎖ＤＮＡにおいて、または、より一般的には、ＲＮＡにおいて生じ得る。
【００８２】
本願に関し、ヒストンステムループは、そのＤＮＡによって、または、その対応するＲＮＡ配列によって記述され得る。従って、本願全体にわたって、本明細書でＤＮＡ配列（例えば、配列番号３７乃至６６および７０）によって示される、ヒストンステムループ配列に対するいかなる参照でも、対応するＲＮＡ配列を含む。これは、特に、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡに含まれるヒストンステムループ配列に適用される。従って、ヒストンステムループを規定する具体的なＤＮＡ配列を参照することにより、対応するＲＮＡ配列も規定される。
【００８３】
また、構造は、ヘアピンまたはヘアピンループとして知られ、通常、連続した配列内のステムおよび（末端）ループからなり、ここで、ステムは、ある種のスペーサーとしての短い配列によって分け隔たれた２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列によって形成され、これは、ステムループ構造のループを作り出す。２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列は、例えば、ステムループエレメントのステム１およびステム２として規定されてもよい。これら２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列、例えば、ステムループエレメントのステム１およびステム２が、互いに塩基対を形成し、連続配列におけるステムループエレメントのステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成されたその末端の終わりに不対ループを含む二本鎖核酸配列の伸長を導いた場合に、ステムループが形成される。それに関して、不対ループは、一般的に、これらのいずれのステムループエレメントとも塩基対を形成することができない核酸の領域を示す。結果として生じたロリポップ状の構造は、多くのＲＮＡ二次構造の主要な構築ブロックである。従って、ステムループ構造の形成は、結果として生じたステム領域およびループ領域の安定性による。ここで、第１の必要条件は、一般的に、それ自身で折り曲がり、対になった二本鎖を形成することができる配列が存在することである。対になったステムループエレメントの安定性は、長さ、それが含むミスマッチまたはバルジの数（一般的に、少ない数のミスマッチは、特に、長い二本鎖伸長部分において許容できる。）、および、対になった領域の塩基組成物によって決定される。本発明に関し、３塩基から１５塩基のループの長さが想定される一方で、より好ましいループの長さは、３塩基〜１０塩基、より好ましくは、３から８、３から７、３から６、または、さらにより好ましくは、４塩基から５塩基、また、最も好ましくは、４塩基である。ヒストンステムループにおけるステム領域を形成する配列は、一般的に、５塩基から１０塩基の長さ、より好ましくは、５塩基から８塩基の長さを有し、ここで、好ましくは、塩基のうちの少なくとも１つは、ミスマッチを示す、すなわち、塩基対を形成しない。
【００８４】
本発明に関し、ヒストンステムループは、一般的に、ヒストン遺伝子（例えば、ヒストンファミリーＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４からの遺伝子）に由来し、かつ、２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列の分子内塩基対を含み、それによって、ステムループを形成する。一般的に、ヒストン３’ＵＴＲステムループは、ヒストンｍＲＮＡの核細胞質間の輸送と、細胞質における安定性および翻訳効率の調節と、に関連しているＲＮＡエレメントである。後生動物のヒストン遺伝子のｍＲＮＡは、ポリアデニル化およびポリＡテールを欠いており、その代わりに、３’末端プロセシングが、この高度に保存されたステムループと、２０ヌクレオチド下流付近のプリンリッチ領域（ヒストン下流エレメント、またはＨＤＥ）との間のサイトで発生する。ヒストンステムループは、３１ｋＤａのステムループ結合タンパク質と結合する（ＳＬＢＰ、ヒストンヘアピン結合タンパク質またはＨＢＰとも呼ばれる）。そのようなヒストンステムループ構造は、好ましくは、他の配列エレメントおよび配列構造と組み合わせた本発明によって使用され、それは、ヒストン遺伝子において、自然（これは、非形質転換生物／細胞を意味する）には発生しないが、本発明によれば、組み合わされ、人工的な非相同的核酸を提供する。従って、本発明は、ヒストンステムループ構造と、他の非相同的配列エレメントとの人工的な（非天然の）組み合わせを提供し、当該組み合わせは、ヒストン遺伝子または後生動物ヒストン遺伝子では発生せず、また、ヒストン以外のタンパク質をコードしている遺伝子の機能配列領域および／または調節配列領域（転写および／または翻訳に影響を与える）から隔離されており、有益な効果を与えることを見出した。従って、本発明の一実施形態は、ヒストンステムループと、ポリ（Ａ）配列、またはポリアデニル化シグナルを示す配列（コード領域の３’末端）との組み合わせを含み、当該組み合わせは、後生動物ヒストン遺伝子では発生しない。本発明の別の好ましい態様によると、好ましくは、後生動物ヒストン遺伝子では発生しない、ヒストンステムループ構造と、上記で規定された本発明に係る抗原の少なくとも１つをコードしているコード領域との組み合わせが、本明細書と共に提供される（コード領域およびヒストンステムループ配列は、非相同的である）。
【００８５】
従って、ヒストンステムループは、本明細書に記載されているステムループ構造であり、当該ステムループ構造は、好ましくは、機能的に規定される場合は、その天然結合パートナー、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ、ヒストンヘアピン結合タンパク質またはＨＢＰとも呼ばれる）に結合する性質を示す／保持する。
【００８６】
好ましい実施形態において、ヒストンステムループ配列は、マウスヒストンタンパク質に由来しない。より具体的には、ヒストンステムループ配列は、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４に由来しなくてもよい。また、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、マウスヒストンステムループ配列を含まなくてもよく、また、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４も含まなくてもよい。さらに、本発明によれば、少なくとも１つのｍＲＮＡが少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子を含んでいる場合であっても、少なくとも１つのｍＲＮＡは、ステムループプロセシングシグナル、より具体的には、マウスヒストンプロセシングシグナルを含まなくてもよく、最も具体的には、マウスステムループプロセシングシグナルＨ２ｋＡ６１４を含まなくてもよい。しかし、少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子は、ＷＯ０１／１２８２４の配列番号７ではなくてもよい。
【００８７】
上記で規定された少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、５’ＵＴＲ、上記で規定された抗原をコードしているコード領域、またはそれらのフラグメント、変異体もしくは誘導体、および／または、好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループを含む３’ＵＴＲ領域を含む。上記で規定された抗原に加えて、さらなるペプチドまたはタンパク質が、少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる場合、コードされるペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、上記で規定されたヒストンタンパク質、レポータータンパク質および／またはマーカータンパク質もしくは選択タンパク質ではない。少なくとも１つのｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、好ましくは、本明細書と共に規定されるポリ（Ａ）配列および／またはポリ（Ｃ）配列も含む。３’ＵＴＲの個々のエレメントは、少なくとも１つのｍＲＮＡの配列に沿った５’から３’の任意の順序で、そこに存在してもよい。さらに、また、本明細書に記載されるさらなるエレメントが含まれてもよく、当該さらなるエレメントは、本明細書と共に規定される安定化配列（例えば、グロビン遺伝子のＵＴＲに由来する）、ＩＲＥＳ配列などである。また、各々のエレメントは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、少なくとも１回（特に、ジシストロニックな構成物またはマルチシストロニックな構成物において）、好ましくは、２回以上、繰り返されてもよい。例として、個々のエレメントは、下記の順序で、少なくとも１つのｍＲＮＡに存在してもよい：
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’、または、
５’−コード領域−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’、または、
５’−コード領域−ポリアデニル化シグナル−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’、または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’など。
【００８８】
これに関し、上記で規定された抗原に加えて、さらなるペプチドまたはタンパク質が、少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている場合、コードされているペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、βガラクトシダーゼ、特に、ＥＧＦＰ）、および／または、マーカータンパク質もしくは選択タンパク質（例えば、α−グロブリン、ガラクトキナーゼおよびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子を含まない。好ましくは、本発明のｍＲＮＡは、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（ｅＧＦＰ、ＲＦＰまたはＢＦＰなど）、α−グロビン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、または、耐性遺伝子（ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンに対して耐性を有する遺伝子など）をコードしていない。好ましい実施形態では、本発明に係るｍＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードしていない。別の実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、ＧＦＰまたはその変異体をコードしていない。
【００９０】
さらに好ましい実施形態では、本発明に係るｍＲＮＡは、ウイルス由来のタンパク質（または、タンパク質のフラグメント）、好ましくは、オルソミクソウイルス科のファミリーに属するウイルスに由来するタンパク質をコードしていない。好ましくは、ｍＲＮＡは、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質、より好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスに由来するタンパク質をコードしていない。好ましくは、本発明に係るｍＲＮＡは、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ：核外輸送タンパク質）、ＰＡ、ＰＢ１（ポリメラーゼベイシック１（polymerase basic 1））、ＰＢ１−Ｆ２およびＰＢ２からなる群から選択されるインフルエンザＡ型タンパク質をコードしていない。別の好ましい実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、そのオボアルブミン（ＯＶＡ）またはそのフラグメントをコードしていない。好ましくは、本発明に係るｍＲＮＡは、インフルエンザＡ型タンパク質またはオボアルブミンをコードしていない。
【００９１】
好ましい一実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステムループ配列、好ましくは、下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列を含む。
【００９２】
式（Ｉ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【００９３】
【化１】
2018184422.tif 000002
【００９４】
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【００９５】
【化２】
2018184422.tif 000003
【００９６】
ここで、
ステム１境界エレメントＮ１〜６、またはステム２境界エレメントＮ１〜６は、１つから６つのＮの連続配列、好ましくは、２つから６つのＮの連続配列、より好ましくは、２つから５つのＮの連続配列、さらにより好ましくは、３つから５つのＮの連続配列、もっとも好ましくは、４つから５つのＮの連続配列、または、５つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１〔Ｎ０−２ＧＮ３−５〕は、エレメントステム２と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ、５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つのＮの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３−５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ステム２中のその相補的ヌクレオチドシチジンがグアノシンによって置換される条件で、シチジンまたはそのアナログによって必要に応じて置換されてもよく、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とエレメントステム２との間に位置し、かつ、３つから５つのヌクレオチドの連続配列、より好ましくは４つのヌクレオチドの連続配列であり、
ここで、各々のＮ０−４は、別の連続配列とは独立して、０から４つのＮの連続配列、好ましくは、１つから３つのＮの連続配列、より好ましくは、１つから２つのＮの連続配列であり、ここで、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
ここで、Ｕ／Ｔは、ウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
ここで、Ｎ３〜５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ここで、Ｎ０〜２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、また、
ここで、Ｃは、シチジンまたはそのアナログであり、ステム１中のその相補的ヌクレオチドグアノシンがシチジンに置換される条件で、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換されてもよく、
ここで、ステム１およびステム２は、互いに塩基対合し、逆相補的配列を形成することができ、例えば、ヌクレオチドＡおよびＵ／ＴもしくはＧおよびＣのワトソン−クリック型塩基対によって、または、非ワトソン−クリック型塩基対、例えば、揺らぎ塩基対、逆ワトソン−クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、逆フーグスティーン型塩基対によって、塩基対がステム１とステム２との間で生じ得るか、または、互いに塩基対合し、部分的に逆相補的配列を形成することができ、一方のステム中の１つ以上の塩基が、もう一方のステムの逆相補的配列における相補的塩基を有してないことに起因して、不完全な塩基対がステム１とステム２との間で生じ得る。
【００９７】
上記に関し、揺らぎ塩基対は、一般的に、２つのヌクレオチド間の非ワトソン−クリック塩基対である。これに関し、用いられてもよい４つの主要な揺らぎ塩基対は、グアノシン−ウリジン、イノシン−ウリジン、イノシン−アデノシン、イノシン−シチジン（Ｇ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ａ、およびＩ−Ｃ）およびアデノシン−シチジン（Ａ−Ｃ）である。
【００９８】
従って、本発明に関し、揺らぎ塩基は、上記で説明したように、さらなる塩基と揺らぎ塩基対を形成する塩基である。従って、非ワトソン−クリック塩基対、例えば、揺らぎ塩基対は、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるヒストンステムループ構造のステムで生じ得る。
【００９９】
上記に関し、部分的な逆相補的配列は、ステム１とステム２との塩基対によって形成されたステムループ配列のステム構造において、最大で２つのミスマッチ、好ましくは、１つだけのミスマッチを含む。言い換えると、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１とステム２との全体の配列にわたって、互いに（完全な）塩基対合が可能であり（１００％の可能で正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対）、それにより、逆相補的配列を形成し、ここで、各々の塩基は、相補的結合パートナーとして、その正確なワトソン−クリック塩基対の相手、または、その正確な非ワトソン−クリック塩基対の相手を有する。あるいは、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１とステム２との全体の配列にわたって、互いに、部分的な塩基対合が可能であり、ここで、１００％の可能で正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対のうちの少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％は、正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対で占有され、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％または約５％の残りの塩基は、対になっていない。
【０１００】
好ましい実施形態によると、本明細書で定義された少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）は、約１５ヌクレオチドから約４５ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、また、さらにより好ましくは、約２０から約３０の長さ、また、最も好ましくは、約２４ヌクレオチドから約２８ヌクレオチドの長さを含む。
【０１０１】
さらに好ましい実施形態によると、本明細書で規定される少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメント）は、約１０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１０ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、また、さらにより好ましくは、約１６ヌクレオチドから約１７ヌクレオチドの長さ、また、最も好ましくは、約１６ヌクレオチドの長さを含む。
【０１０２】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、下記の具体的な式（Ｉａ）または式（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでもよい。
【０１０３】
式（Ｉａ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【０１０４】
【化３】
2018184422.tif 000004
【０１０５】
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【０１０６】
【化４】
2018184422.tif 000005
【０１０７】
ここで、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定された通りである。
【０１０８】
第１の態様に係る特にさらにより好ましい実施形態によると、少なくとも１つのｍＲＮＡは、下記の具体的な式（Ｉｂ）または式（ＩＩｂ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むか、またはコードしてもよい。
【０１０９】
式（Ｉｂ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【０１１０】
【化５】
2018184422.tif 000006
【０１１１】
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【０１１２】
【化６】
2018184422.tif 000007
【０１１３】
ここで、
Ｎ、Ｃ，Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定された通りである。
【０１１４】
さらにより好ましい実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、そのステムループ構造で、ヒストンステムループ配列を表す直鎖配列として示された下記の具体的な式（Ｉｃ）から式（Ｉｈ）または（ＩＩｃ）から（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでもよい。
【０１１５】
式（Ｉｃ）（ステム境界エレメント無しの後生動物ヒストンステムループ共通配列および原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１１６】
【化７】
2018184422.tif 000008
【０１１７】
式（ＩＩｃ）（ステム境界エレメントを有する後生動物ヒストンステムループ共通配列および原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１１８】
【化８】
2018184422.tif 000009
【０１１９】
式（Ｉｄ）（ステム境界エレメント無し）
【０１２０】
【化９】
2018184422.tif 000010
【０１２１】
式（ＩＩｄ）（ステム境界エレメント有り）
【０１２２】
【化１０】
2018184422.tif 000011
【０１２３】
式（Ｉｅ）（ステム境界エレメント無しの原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２４】
【化１１】
2018184422.tif 000012
【０１２５】
式（ＩＩｅ）（ステム境界エレメントを有する原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２６】
【化１２】
2018184422.tif 000013
【０１２７】
式（Ｉｆ）（ステム境界エレメント無しの後生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２８】
【化１３】
2018184422.tif 000014
【０１２９】
式（ＩＩｆ）（ステム境界エレメントを有する後生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１３０】
【化１４】
2018184422.tif 000015
【０１３１】
式（Ｉｇ）（ステム境界エレメント無しの脊椎動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１３２】
【化１５】
2018184422.tif 000016
【０１３３】
式（ＩＩｇ）（ステム境界エレメントを有する脊椎動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１３４】
【化１６】
2018184422.tif 000017
【０１３５】
式（Ｉｈ）（ステム境界エレメント無しのヒトヒストンステムループ共通配列（ホモサピエンス））
【０１３６】
【化１７】
2018184422.tif 000018
【０１３７】
式（ＩＩｈ）（ステム境界エレメントを有するヒトヒストンステムループ共通配列（ホモサピエンス））
【０１３８】
【化１８】
2018184422.tif 000019
【０１３９】
ここで、上記の各々の式（Ｉｃ）から式（Ｉｈ）または式（ＩＩｃ）から式（ＩＩｈ）において、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定した通りであり、
各々のＵは、Ｔによって置換されてもよく、
ステムエレメント１およびステムエレメント２において（高度に）保存された各々のＧまたはＣは、対応するステムにおけるその相補的なヌクレオチドがその相補的ヌクレオチドにより並行して置換されるという条件で、その相補的ヌクレオチド塩基ＣまたはＧによって置換されてもよく、および／または、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｂ、Ｖ、ＤおよびＮは、下記の表で規定されるヌクレオチド塩基である。
【０１４０】
【表１】
2018184422.tif 000020
【０１４１】
これに関し、上記の式（Ｉ）もしくは式（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩａ）から式（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列が、自然発生ヒストンステムループ配列から選択され、特により好ましくは、原生動物ヒストンステムループ配列または後生動物ヒストンステムループ配列から選択され、また、特にさらにより好ましくは、脊椎動物から選択され、また、最も好ましくは、哺乳類ヒストンステムループ配列から選択され、特に、ヒトヒストンステムループ配列から選択されることが、特に好ましい。
【０１４２】
特に好ましい実施形態によると、本発明の具体的な式（Ｉ）もしくは式（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩａ）から式（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列は、後生動物および原生動物、原生動物、後生動物、脊椎動物およびヒトにおける自然発生ヒストンステムループ配列のうちで、最も頻繁に発生するヌクレオチド、または、最も頻繁に発生するヌクレオチドもしくは２番目に頻繁に発生するヌクレオチドを、各々のヌクレオチドの位置に含むヒストンステムループ配列である。これに関し、すべてのヌクレオチドのうちの、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、最も好ましくは、少なくとも９０％は、自然発生ヒストンステムループ配列のうちで最も頻繁に発生するヌクレオチドに一致することが特に好ましい。
【０１４３】
さらに特定の実施形態において、上記の具体的な式（Ｉ）または式（Ｉａ）から式（Ｉｈ）のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列は、下記のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメント無し）から選択される：
ＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢ（式（Ｉｃ）に従った配列番号３７）
ＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に従った配列番号３８）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に従った配列番号３９）
ＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４０）
ＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４１）
ＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４２）
ＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４３）
ＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４４）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４５）
ＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４６）
ＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４７）
ＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４８）
ＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号４９）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号５０）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号５１）。
【０１４４】
さらに、これに関し、具体的な式（ＩＩ）または（ＩＩａ）から（ＩＩｈ）のうちの１つに従った下記のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）が特に好ましい：
Ｈ＊Ｈ＊ＨＨＶＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢＶＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５２）
Ｍ＊Ｈ＊ＭＨＭＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５３）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５４）
Ｎ＊Ｎ＊ＮＮＮＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨＮＨＮ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５５）
Ｎ＊Ｎ＊ＨＨＮＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹＤＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５６）
Ｎ＊Ｈ＊ＨＨＶＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹＲＨＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５７）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＨＭＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢＶＭＨ＊Ｈ＊Ｎ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号５８）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号５９）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号６０）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＡＭＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣＶＨＮ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６１）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣＶＣＨ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６２）
Ｍ＊Ｍ＊ＡＡＭＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＭＣＹ＊Ｍ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６３）
Ｎ＊Ｈ＊ＡＡＨＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣＶＨＢ＊Ｎ＊Ｈ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６４）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣＶＭＹ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６５）
Ｈ＊Ｍ＊ＡＡＡＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＲＭＹ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６６）。
【０１４５】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、具体的な式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または、（ＩＩ）もしくは（ＩＩａ）から（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列の１００％保存されていないヌクレオチド、または、自然発生ヒストンステムループ配列、との少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、または、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、を示す少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含む。
【０１４６】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号７０のＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡに従った配列、または、より好ましくは、配列番号７０に従った核酸配列の対応するＲＮＡ配列のＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７１）である。
【０１４７】
好ましい実施形態において、ヒストンステムループ配列は、ループ配列５’−ＵＵＵＣ−３’を含まない。より具体的には、ヒストンステムループは、それぞれ、ステム１配列５’−ＧＧＣＵＣＵ−３’、および／または、ステム２配列５’−ＡＧＡＧＣＣ−３’を含まない。別の好ましい実施形態では、ステムループ配列は、ループ配列５’−ＣＣＵＧＣＣＣ−３’、または、ループ配列５’−ＵＧＡＡＵ−３’を含まない。より具体的には、ステムループは、ステム１配列５’−ＣＣＵＧＡＧＣ−３’を含まないか、または、それぞれ、ステム１配列５’−ＡＣＣＵＵＵＣＵＣＣＡ−３’、および／もしくは、ステム２配列５’−ＧＣＵＣＡＧＧ−３’もしくは５’−ＵＧＧＡＧＡＡＡＧＧＵ−３’を含まない。また、ステムループ配列は、好ましくは、哺乳動物のインシュリンレセプター３’−非翻訳領域に由来しない。また、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスのヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４遺伝子（Ｈ２ｋＡ６１４）に由来するヒストンステムループプロセシングシグナルを含まなくてもよい。
【０１４８】
好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム（好ましくは自己スプライシングリボザイム）、ウイルス核酸配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列、ｎｅｏ遺伝子、不活性化プロモーター配列および不活性化エンハンサー配列からなる群の成分のうちの、１つ、または２つ、または少なくとも１つもしくは全て、または１つもしくは全てを除いて、含まない。さらにより好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムを含まない、かつ、ｎｅｏ遺伝子、不活性化プロモーター配列、不活性化エンハンサー、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列、からなる群のうちの１つを含まない。従って、ｍＲＮＡは、好ましい態様では、リボザイム、好ましくは自己スプライシングリボザイムまたはｎｅｏ遺伝子の何れも含まないか、または、あるいは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムまたは任意の耐性遺伝子（例えば、通常、選抜するために適用される）の何れも含まない。別の好ましい態様では、本発明の少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムまたはヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列の何れも含まなくてもよい。
【０１４９】
あるいは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、特定のタンパク質因子（例えば、切断ポリアデニル化特異因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子ＩおよびＩＩ（ＣＦＩおよびＣＦＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によって（転写）ｍＲＮＡにポリアデニル化を伝達するシグナルとして本明細書で規定されるポリアデニル化シグナルを必要に応じて含む。これに関し、共通ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ共通配列を含んでいる。特に好ましい態様では、ポリアデニル化シグナルは、以下の配列のうちの１つを含む：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ、または、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ（ここで、ウリジンは、通常、ＲＮＡ中に存在し、また、チミジンは、通常、ＤＮＡ中に存在する）。いくつかの実施形態において、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡで使用されるポリアデニル化シグナルは、Ｕ３のｓｎＲＮＡ、Ｕ５、ヒト遺伝子Ｇ−ＣＳＦからのポリアデニル化プロセシングシグナル、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナル配列に一致しない。特に、上記のポリアデニル化シグナルは、何れの抗生物質耐性遺伝子（または何れの他のレセプター、マーカーまたは選抜遺伝子）と組み合わされず、特に、耐性ｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）と組み合わされない。また、好ましくは、上記のポリアデニル化シグナルの何れもが、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡ中のマウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４からのヒストンステムループまたはヒストンステムループプロセシングシグナルと組み合わされない。
【０１５０】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのＧ／Ｃ含有量、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量を変更することにより、改変されてもよく、それに伴い、安定化されてもよい。
【０１５１】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量は、その特定の野生型ｍＲＮＡ、すなわち改変されていないｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、変更され、特に増加される。少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型ｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列と比較して改変されていない。本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるこの改変は、翻訳される任意のｍＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳に関して重要であるという事実に基づいている。従って、種々のヌクレオチドの組成物および配列が重要である。特に、増加したＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量を有する配列は、増加したＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量を有する配列よりも安定である。従って、本発明によると、ｍＲＮＡのコドンは、これらが増加したＧ／Ｃヌクレオチド量を含むように、各々の野生型ｍＲＮＡと比較して変更される一方で、翻訳されるアミノ酸配列を維持する。完全に同一のアミノ酸（いわゆる遺伝コードの縮退）をコードしているいくつかのコドンに関して、安定性に関して最も好ましいコドンが決定され得る（いわゆる代替コドン利用）。少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸に従って、その野生型配列と比較したｍＲＮＡ配列の改変に関して種々の可能性がある。独占的にＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドを含むコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンの改変は必要ない。従って、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）およびＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンは、ＡまたはＵが存在しないため、改変を必要としない。反対に、Ａヌクレオチドおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同一のアミノ酸をコードしているが、Ａおよび／またはＵを含まない他のコドンの置換によって改変され得る。これらの例としては、Ｐｒｏのコドンが、ＣＣＵまたはＣＣＡから、ＣＣＣまたはＣＣＧに改変され得ること、Ａｒｇのコドンが、ＣＧＵまたはＣＧＡまたはＡＧＡまたはＡＧＧから、ＣＧＣまたはＣＧＧに改変され得ること、Ａｌａのコドンが、ＧＣＵまたはＧＣＡから、ＧＣＣまたはＧＣＧに改変され得ること、Ｇｌｙのコドンが、ＧＧＵまたはＧＧＡから、ＧＧＣまたはＧＧＧに改変され得ることが挙げられる。他のケースでは、ＡヌクレオチドまたはＵヌクレオチドを、コドンから除去することができないが、しかし、より少ないＡヌクレオチド含有量および／またはＵヌクレオチド含有量を含むコドンを使用することにより、Ａ含有量およびＵ含有量を減少させることが可能である。これらの例としては、Ｐｈｅのコドンが、ＵＵＵからＵＵＣに改変され得ること、Ｌｅｕのコドンが、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡから、ＣＵＣまたはＣＵＧに改変され得ること、Ｓｅｒのコドンが、ＵＣＵまたはＵＣＡまたはＡＧＵから、ＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣに改変され得ること、Ｔｙｒのコドンが、ＵＡＵからＵＡＣに改変され得ること、Ｃｙｓのコドンが、ＵＧＵからＵＧＣに改変され得ること、Ｈｉｓのコドンが、ＣＡＵからＣＡＣに改変され得ること、Ｇｌｎのコドンが、ＧＡＡからＣＡＧに改変され得ること、Ｉｌｅのコドンが、ＡＵＵまたはＡＵＡから、ＡＵＣに改変され得ること、Ｔｈｒのコドンが、ＡＣＵまたはＡＣＡから、ＡＣＣまたはＡＣＧに改変され得ること、Ａｓｎのコドンが、ＡＡＵからＡＡＣに改変され得ること、Ｌｙｓのコドンが、ＡＡＡからＡＡＧに改変され得ること、Ｖａｌのコドンが、ＧＵＵまたはＧＵＡから、ＧＵＣまたはＧＵＧに改変され得ること、Ａｓｐのコドンが、ＧＡＵからＧＡＣに改変され得ること、Ｇｌｕのコドンが、ＧＡＡからＧＡＧに改変され得ること、ストップコドンであるＵＡＡが、ＵＡＧまたはＵＧＡに改変され得ることが挙げられる。これに反して、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）のコドン、およびＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、配列改変の可能性はない。本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡのＧ／Ｃ含有量を、その特定の野生型ｍＲＮＡ（すなわち、元の配列）と比較して増加させるために、上記に列記された置換が、個々、または全ての可能な組み合わせの何れかで、使用され得る。従って、例えば、野生型の配列で生じるＴｈｒのすべてのコドンは、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）に改変され得る。しかし、好ましくは、例えば、上記の置換可能性の組み合わせが使用される：
元の配列（野生型ｍＲＮＡ）においてＴｈｒをコードしている全てのコドンの、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）への置換、および、
Ｓｅｒをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＣＣ（またはＵＣＧまたはＡＧＣ）への置換、元の配列においてＩｌｅをコードしているすべてのコドンの、ＡＵＣへの置換、および、
Ｌｙｓをもともとコードしている全てのコドンの、ＡＡＧへの置換、および、
Ｔｙｒをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＡＣへの置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｇｌｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＡＧへの置換、および、
Ａｌａをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および、
Ａｒｇをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＧＣ（またはＣＧＧ）への置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｇｌｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＡＧへの置換、および、
Ａｌａをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および、
Ｇｌｙをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＧＣ（またはＧＧＧ）への置換、および、
Ａｓｎをもともとコードしている全てのコドンの、ＡＡＣへの置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｐｈｅをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＵＣへの置換、および、
Ｃｙｓをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＧＣへの置換、および、
Ｌｅｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＵＧ（またはＣＵＣ）への置換、および、
Ｇｌｎをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＡＧへの置換、および、
Ｐｒｏをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＣＣ（またはＣＣＧ）への置換など。好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量は、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチド、またはそのフラグメント、もしくはその変異体、をコードしている野生型ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも７％、より好ましくは、少なくとも１５％、特に好ましくは、少なくとも２０％、増加される。具体的な実施形態によると、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチド、またはそのフラグメント、その変異体、または野生型ｍＲＮＡ配列の全配列、をコードしている領域における置換可能なコドンのうちの、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％、また、最も好ましくは、少なくとも９０％、９５％、または１００％は、置換され、それにより、上記の配列のＧＣ／含有量を上昇させる。これに関し、本発明に係る組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおけるＧ／Ｃ含有量を、特に、タンパク質をコードする領域において、野生型配列と比較して極限まで（すなわち置換可能なコドンの１００％）増加させる。本発明によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるさらに好ましい改変は、翻訳効率も、細胞におけるｔＲＮＡの発生の異なる頻度によって決定されるという発見に基づいている。従って、いわゆる“稀なコドン”が、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、増加した程度に存在する場合、対応する改変された少なくとも１つのｍＲＮＡ配列は、比較的に“頻度が高い”ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合より、有意に劣る程度で翻訳される。本発明によると、本発明に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、細胞中では比較的に稀であるｔＲＮＡをコードしている、野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞中で比較的に頻度が高く、かつ比較的に稀なｔＲＮＡと同一のアミノ酸を送達する、ｔＲＮＡをコードしているコドンと交換されるように、上記抗原をコードしている領域は、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較して改変される。この改変によって、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの配列は、頻繁に発生するｔＲＮＡが利用することができるコドンが挿入されるように改変される。言い換えると、本発明によると、この改変によって、細胞中で比較的に稀であるｔＲＮＡをコードしている野生型配列のすべてのコドンは、細胞中で比較的に頻度が高く、かつ、各ケースにおいて、比較的に稀なｔＲＮＡと同一のアミノ酸を送達する、ｔＲＮＡをコードしているコドンと、各ケースにおいて交換され得る。どのｔＲＮＡが細胞中で比較的に頻繁に発生するか、また、反対に、どのｔＲＮＡが比較的に稀に発生するかは、当業者に知られている。例えば、Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666を参照すること。最も頻繁に発生するｔＲＮＡを特定のアミノ酸のために使用するコドン、例えば、（ヒト）細胞中で最も頻繁に発生するｔＲＮＡを使用するＧｌｙコ��ンが特に好ましい。本発明によると、ｍＲＮＡのコード領域によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、本発明に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、増加された連続的Ｇ／Ｃ含有量、特に、最大化された連続的Ｇ／Ｃ含有量と、“頻度の高い”コドンとを関連付けることが特に好ましい。この好ましい実施形態は、本発明に係る組成物の、特に効率的に翻訳および安定化された（改変された）少なくとも１つのｍＲＮＡの提供を可能にする。上記で説明された本発明（増加されたＧ／Ｃ含有量、ｔＲＮＡの交換）に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡの測定は、ＷＯ０２／０９８４４３で説明されているコンピュータプログラムを使用して実施され得る。当該開示内容は、その全範囲が本発明に含まれる。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのリボソーム結合サイトの環境におけるＡ／Ｕ含有量は、その特定の野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合サイトの環境におけるＡ／Ｕと比較して増加される。この改変（リボソーム結合サイト周辺で増加したＡ／Ｕ含有量）は、少なくとも１つのｍＲＮＡへのリボソーム結合の効率を上昇させる。リボソーム結合サイト（コザック配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号６７）、ＡＵＧは、開始コドンを形成する）へのリボソームの効果的な結合もまた、少なくとも１つのｍＲＮＡの効率的な翻訳の効果を有する。本発明のさらなる実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、潜在的に不安定化させる配列エレメントに関して改変されてもよい。特に、この少なくとも１つのｍＲＮＡのコード領域ならびに／または５’および／もしくは３’非翻訳領域は、それが、不安定化配列エレメント、その特定の野生型ｍＲＮＡと比較して好ましくは改変されていない、少なくとも１つの改変ｍＲＮＡによってコードされたアミノ酸配列、を含まないように、特定の野生型ｍＲＮＡと比較して改変されていてもよい。例えば、真核生物のＲＮＡの配列において、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が発生し、これに対して、シグナルタンパク質は、インビボで結合し、ＲＮＡの酵素分解を調節することが知られている。改変された少なくとも１つのｍＲＮＡのさらなる安定化のために、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドをコードしている領域において、不安定化配列エレメントがここに含まれないか、または実質的に含まれないように、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較した１つ以上の上記の改変が、必要に応じて実施され得る。また、本発明によると、非翻訳領域（３’−ＵＴＲおよび／または５’−ＵＴＲ）に存在するＤＳＥも、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡから、上記の改変によって除去され得る。上記の不安定化配列は、例えば、ＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）であり、当該ＡＵリッチ配列は、多くの不安定なＲＮＡの３’−ＵＴＲセクションで生じる（Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674）。従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡが上記の不安定化配列を含まないように、野生型ｍＲＮＡと��較して改変されている。また、これは、可能性のあるエンドヌクレアーゼによって認識されるそれらの配列モチーフ、例えば、配列ＧＡＡＣＡＡＧに適用される。当該配列モチーフは、トランスフェリン受容体をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントに含まれる（Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980）。また、これらの配列モチーフは、好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡで取り除かれる。また、好ましくは、本発明によると、改変された形態で、例えば、リボソーム結合を向上するために、または、本発明に係る組成物の少なくとも１つ（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）のｍＲＮＡに位置するコードされた種々の抗原の発現を可能にするために、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、改変された形態で、上記で規定された少なくとも１つのＩＲＥＳ、ならびに／または、少なくとも１つの５’安定化配列および／もしくは３’安定化配列を有する。また、好ましくは、本発明によると、例えば、リボソーム結合を向上するために、または、本発明に係る組成物の少なくとも１つ（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）のｍＲＮＡに位置するコードされた種々の抗原の発現を可能にするために、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、改変された形態で、上記で規定された少なくとも１つのＩＲＥＳ、ならびに／または、少なくとも１つの５’安定化配列および／または３’安定化配列を有する。
【０１５２】
本発明によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、さらに好ましくは、少なくとも１つの５’安定化配列および／または３’安定化配列を有する。５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域におけるこれらの安定化配列は、サイトゾル中の少なくとも１つのｍＲＮＡの半減期を増大させる効果を有する。これらの安定化配列は、自然発生配列に対して１００％の配列相同性を有し得る。当該安定化配列は、ウイルス、バクテリアおよび真核生物で発生し得るが、これも、部分的または完全に合成であり得る。例えば、ホモサピエンスまたはアメリカツメガエルからのβ−グロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）は、安定化配列の例として言及され得る。当該安定化配列は、安定化されたｍＲＮＡのための本発明で使用され得る。安定化配列の別の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号６８）を有し、当該安定化配列は、α−グロブリン、α（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼをコードしている非常に安定的なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに、または、チロシンヒドロキシラーゼをコードしている非常に安定的なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに、含まれる（Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414を参照すること）。上記の安定化配列は、当然、個々に使用されるか、または、互いに組み合わされて使用されるか、また、当業者に知られている他の安定化配列と組み合わせて使用され得る。従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、グロビンＵＴＲ（非翻訳領域）安定化ｍＲＮＡとして、特に、α−グロビンＵＴＲ安定化ｍＲＮＡとして存在する。好ましくは、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、配列番号６９に従ったヒトα−グロビン遺伝子などのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲのα−複合体−結合中心部位に由来する３’−ＵＴＲ中の安定化配列を含む：
α−グロビン遺伝子のα−複合体−結合中心部位（本明細書では“muag”とも呼ばれる）
ＧＣＣＣＧＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＣＣＵＵＧＣＡＣＣＧ（配列番号６９）。
【０１５３】
それにもかかわらず、好ましくは、よく知られた部位特異的突然変異誘発の技術による、または、オリゴヌクレオチドライゲーション法を用いた、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの調製のためのＤＮＡマトリックスを使用して、塩基の置換、付加または脱離は、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡと共に実施される（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001を参照）。そのようなプロセスにおいて、少なくとも１つのｍＲＮＡの調製のために、対応するＤＮＡ分子は、インビトロで転写されてもよい。このＤＮＡマトリックスは、好ましくは、インビトロでの転写のために、好適なプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを含み、当該プロモーターの後には、調整される少なくとも１つのｍＲＮＡのための所望のヌクレオチド配列と、インビトロでの転写のための終止シグナルとが続く。目的の、少なくとも１つのｍＲＮＡのマトリックスを形成するＤＮＡ分子は、バクテリア中で複製され得るプラスミドの一部として、発酵による増殖とその後の単離とによって調整されてもよい。本発明に好適なものとして言及され得るプラスミドは、例えば、プラスミドｐＴ７Ｔｓ（GenBank accession number U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360）、ｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ、例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−１（Promega のGenBank accession number X65300）、およびｐＳＰ６４（GenBank accession number X65327）である。また、Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001を参照すること。
【０１５４】
カチオン性化合物、特に、ポリカチオン性化合物、例えば、（ポリ）カチオン性ペプチドまたは（ポリ）カチオン性タンパク質、と少なくとも１つのｍＲＮＡとを会合させるか、もしくは複合体化することにより、または、これらに少なくとも１つのｍＲＮＡを結合することにより、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの安定化は、同様に実施され得る。特に、ｍＲＮＡに対するポリカチオン性核酸結合タンパクとして、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジンを使用することは、特に効果的である。さらに、ポリ−Ｌ−リジンまたはヒストンなどの、他のカチオン性ペプチドまたはカチオン性タンパク質を使用することが、同様に可能である。ＲＮＡを安定化するためのこの手段は、ＥＰ−Ａ−１０８３２３２で説明されており、この開示は、その全文が参照により本発明に組み込まれる。本発明に係る組成物のｍＲＮＡを安定化するために使用され得るさらに好ましいカチオン性物質は、カチオン性多糖類、例えば、キトサン、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）などを含む。本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡと、カチオン性化合物、例えばカチオン性タンパク質またはカチオン性脂質、例えば、脂質に基づく複合体形成試薬としてのオリゴフェクタミン、との会合または複合体化は、好ましくは、処理される細胞または処理される有機体への薬学的活性成分として存在する少なくとも１つのｍＲＮＡの転移を増加させる。また、ＲＮＡの安定化のために保持する、複合体化による本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに対する安定化効果に関する、本明細書における開示で、それは参照される。
【０１５５】
特に好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、分泌シグナルペプチドを、さらに、または代わりにコードしてもよい。そのようなシグナルペプチドは、一般的に、約１５個から３０個のアミノ酸の長さを示し、かつ、好ましくは、コードされたペプチドのＮ末端に位置する、配列であるが、これらに限定されない。本明細書で規定されるシグナルペプチドは、好ましくは、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの、画定された細胞のコンパートメントへの輸送、好ましくは、細胞表面への輸送、小胞体（ＥＲ）への輸送、または、エンドソーム−リソソームコンパートメントへの輸送を可能にする。本明細書で規定される分泌シグナルペプチドの例は、古典的ＭＨＣ分子または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣＩ分子およびＭＨＣＩＩ分子のシグナル配列、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列）、本明細書で規定されるサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書で規定される免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン、カルネキシンおよびさらなる膜関連タンパク質のシグナル配列、または、小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム−リソソームコンパートメントに関連したタンパク質のシグナル配列を含むが、これらに限定されない。特に好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列は、本発明に従って使用されてもよい。
【０１５６】
上記の改変のうちの何れかは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに適用されてもよく、また、さらに、本発明に関して使用されている何れかの（ｍ）ＲＮＡに適用されてもよく、また、適している場合または必要な場合、改変のこれらの組み合わせが、各々の少なくとも１つのＲＮＡにおいて、互いに干渉しないという条件で、上記の改変のうちの何れかは、任意の組み合わせで互いに組み合わされてもよい。当業者は、適宜、自由に選択することができる。
【０１５７】
好ましい実施形態によると、組成物は、本明細書に記載されたように改変された少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、８２、８３、８４または８５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列から選択される少なくとも１つのコード配列を含む。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各ｍＲＮＡにおけるコード配列は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、８２、８３、８４または８５に従ったＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【０１５８】
好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の６つの各抗原は、１つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡによってコードされてもよい。言い換えると、本発明の組成物は、６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡを含んでもよく、ここで、各々のこれら６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡは、上記で規定されたちょうど１つの抗原をコードしてもよい。
【０１５９】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、各々の当該６つのｍＲＮＡは、本明細書に記載されているように改変されており、ここで、各ｍＲＮＡでは、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードしており、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードしており、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードしており、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１、または、そのフラグメントもしくはその変異体をコードしている。
【０１６０】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードし、かつ、配列番号３又は８２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号６又は８３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号９又は８４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号１２又は８５と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードし、かつ、配列番号１５と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１８と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１６１】
一実施形態において、組成物は、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号１、４、７、１０、１３または１６のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡは、配列番号１、４、７、１０、１３または１６に従ったＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【０１６２】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードし、かつ、配列番号１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号７と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号１０と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードし、かつ、配列番号１３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１６と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１６３】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、上記で説明した組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ領域にヒストンステムループを含む。好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡは、本明細書で規定されるヒストンステムループを含む。
【０１６４】
好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡはＰＳＡをコードし、かつ、配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＭＡをコードし、かつ、配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＳＣＡをコードし、かつ、配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＳＴＥＡＰをコードし、かつ、配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡはＰＡＰをコードし、かつ、配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１６５】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物は、組成物の免疫賦活性を高めるために、アジュバントを含んでもよい。これに関し、アジュバントは、本発明に係る組成物の投与および送達を補助するのに適している任意の化合物として理解されてもよい。さらに、そのようなアジュバントは、組成物に結合することなく、先天性免疫システムの免疫反応、すなわち非特異的免疫反応を開始または増進させる。言い換えると、投与されたとき、本発明に係る組成物は、一般的に、本発明の組成物に含まれる少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている少なくとも６つの抗原に起因した適応免疫反応を開始させる。さらに、本発明に係る組成物は、本発明に係る組成物への、本明細書で規定されるアジュバントの添加に起因した（支持的な）先天性免疫反応を発生させてもよい。
【０１６６】
かかるアジュバントは技術者にとって既知の、および本事例に対して好適な、すなわち、哺乳類における免疫応答の誘導を支持する、いかなるアジュバントから選択されてもよい。望ましくは、アジュバントは以下から成る群から選択されてよいが、これに限定されない：ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニクス、ミョウバン溶液、アルミニウム水酸化物、ＡＤＪＵＭＥＲＴＭ（ポリホスファゼン）、リン酸アルミニウムジェル、藻類由来のグルカン、アルガムリン、アルミニウム水酸化物ジェル（ミョウバン）、高タンパク質吸収アルミニウム水酸化物ジェル、低粘着アルミニウム水酸化物ジェル、ＡＦまたはＳＰＴ（スクアレンエマルジョン）（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、プルロニックＬ１２１（１．２５％）リン酸緩衝サリンｐＨ７．４），ＡＶＲＩＤＩＮＥＴＭ（パラペンジアミン）、ＢＡＹ  Ｒ１００５ＴＭ（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ルクシラミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−アミド  ヒドロアセテート）、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬＴＭ（１−アルファ，２５−ジヒドロロキシ−ビタミンＤ３）、リン酸カルシウムジェル、ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）、コレラヘロトキシン、コレラ−トキシンＡ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融合タンパク質、コレラトキシンのサブユニットＢ、ＣＲＬ１００５（ブロックコポリマーＰ１２００５），サイトカイン含有リポソーム、ＤＤＡ（ジメチルヂオクタデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＯＣ／ミョウバン複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化物（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）の複合物、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）、イミクイモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、ＩｍｍＴｈｅｒＴＭ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロール  ジパルミテート）、ＤＲＶ（脱水−再水和ベシクルから調整される免疫リポソーム）、インターフェロンガンマ、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン７、インターロイキン１２、ＩＳＣＯＭＳＴＭ、ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３ＴＭ、リポソーム、ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥＴＭ（７−アリル−８−オキソグアノシン）、ＬＴ経口アジュバント（大腸菌レイビルエンテロトキシン−プロトキシン）、任意の組成物のミクロ球体およびミクロ粒子、ＭＦ５９ＴＭ（スクアレン−水エマルジョン）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１ＴＭ、（精製フロインド不完全アジュバント）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０ＴＭ（代���転換可能油アジュバント）、ＭＰＬＴＭ（３−Ｑ−デサシル−４’−モノホスホリル液Ａ）、ＭＴＰ−ＴＭおよびＭＴＰ−ＴＭリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ））−エチラミド、モノナトリウム塩）、ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）、ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥＴＭおよびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）、ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）、任意の組成物のナノ球体およびナノ粒子、ＮＩＳＶ（non-ionic surfactant vesicles、非イオン性界面活性剤ベシクル）、ＰＬＥＵＲＡＮＴＭ（β−グルカン）、ＰＬＧＡ、ＰＧＡおよびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー、ミクロ球体／ナノ球体）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１ＴＭ、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＯＤＤＳＴＭ（プロテノイドミクロ球体）、ポリエチレンカルバミン酸塩誘導体、ポリ−ｒＡ・ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、タンパク質コクリエート（アラバマ州アラバスター、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社）、ＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭ（ＱＳ−２１）、Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−一水素イミダゾ［４，５  ｃ］キノリン−１−エタノール）、ＳＡＦ−１ＴＭ（”Ｓｙｎｔｅｘ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”）、センダイタンパク質リポソーム、センダイ含有脂質マトリクス、スパン−８５（ソルビタントリオレート）、スペコール（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５、Ｔｗｅｅｎ８５）、スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサンおよび２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）、ステアリルチロシン（オクタデシルチロシンヒドロクロライド）、Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピラミド）、スレオニル−ＭＤＰ（ＴｅｒｍｕｒｔｉｄｅＴＭまたは［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）、Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）、ウォルターリードリポソーマ（アルミニウム水酸化物に吸着した脂質Ａを含有するリポソーム）およびリポペプチド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ、特に、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒｏｇｅｌのようなアルミニウム塩、を含む）、エマルジョン（ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｏｎを含む）、コポリマー（Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１（Ｐｏｌｏａｘｉｍｅｒ４０１０）などを含む）、リポソーム（Ｓｔｅａｌｔｈおよび、ＢＩＯＲＡＬなどのコクリエートを含む）���植物由来のアジュバント（ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭ）、同時刺激のために好適なアジュバント（Ｔｏｍａｔｉｎｅおよび、ＰＬＧ、ＰＭＭ、イヌリンなどの生体高分子を含む）、微生物由来のアジュバント（Ｒｏｍｕｒｔｉｔｉｄｅ、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、ネズミＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン類、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ類、ＶＬＰ類、コレラ毒素、熱不安定性毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／ＬｅｗｉｓＸ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ、を含む）、および、拮抗剤として好適なアジュバント（ＣＧＲＰ神経ペプチドを含む）。
【０１６７】
好適なアジュバントは、カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物から選択されてもよく、その場合は本発明の組成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと前記カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物とを複合することによりアジュバントを調整することが好ましい。発明組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡとここに定めるカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物との結合あるいは複合が、アジュバントの特性を提供し、発明組成物の少なくとも一つのｍＲＮＡに対して安定した効果を授与することが望ましい。特に、かかる望ましいカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物は、カチオン性あるいはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質（プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジン、あるいはその他のペプチドあるいはタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ：例えばＨＩＶ誘導ペプチド、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドまたは類似ペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ類、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド類、アルギニンリッチペプチド類、リジンリッチペプチド類、ＭＰＧ−ペプチド（類）、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴノマー、カルシトニンペプチド（類）、アンテナペディア由来ペプチド類（特にショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐｌｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド類、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、あるいはヒストン））を含む）。望ましいカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物はさらに、以下を含んでもよい：カチオン性多糖類（例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー類（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡすなわち１−（２，３−シオレイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥすなわちジオニルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳすなわちジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩすなわち、ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、ＤＯＴＡＰすなわちジオレオイロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４すなわちＯ，Ｏ−ジテトラデカノイル）−Ｎ−（−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン塩化物、ＣＬＩＰ１すなわちｒａｃ−（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）−ジメチルアンモニウム塩化物、ＣＬＩＰ６すなわちｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム）、ＣＬＩＰ９すなわちｒａｃ−２（２，３）ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシサクシニルオキシ）エチル−トリメチルアンモニウム、オ��ゴフェクタミン）、あるいは、カチオン性またはポリカチオン性のポリマー類（例えば、−アミノ酸−ポリマー類または逆性ポリアミド類などの変性ポリアミノ酸）、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウム臭化物））などのような変性ポリエチレン類）、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチル）メチルラクリレート））などのような変性アクリレート類、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））などの変性アミノアミン類、ジアミン端末変性１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー類などのような変性ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマー類やｐＡＭＡＭベースデンドリマー類などのようなデンドリマー類、ポリアミン（類）、ＰＥＩすなわちポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）などのようなポリイミン（類）、ポリアリラミン、糖骨格ベースポリマー類（シクロデキストリンベースポリマー類、デキストランベースポリマー類、キトサン、など）、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー類などのシラン骨格ベースポリマー類、１つまたはそれ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性のポリマーから選択される）および、１つまたはそれ以上の親水性または疎水性ブロック（例えばポリエチレングリコール）の組み合わせから成るブロックポリマー類、など。
【０１６８】
加えて、本発明の組成物のｍＲＮＡの少なくとも一つと複合することによってアジュバントとして使用できる、望ましいカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質またはペプチドは、以下のタンパク質またはペプチドから選択されてよく、以下の全体式（ＩＩＩ）を有する：（Ａｒｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘ、ただしｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５、かつｌ、ｍ、ｎ、ｏはそれぞれ独立して、０、１、２、３，４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５のうちから選択され、（ただしＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｘａａの全体的な含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の最低でも５０％を占めることが条件）、また、Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ以外の天然型（天然に存在する）アミノ酸または非天然型任意のアミノ酸から選択される任意のアミノ酸でよく、また、ｘは０、１、２、３、４から選択される任意の数字でよい（ただし、Ｘａａの全体的な含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を越えないことが条件）。この状況において特に特に好ましいオリゴアルギニンは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ａｒｇ７、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒ、などである。
【０１６９】
ＲＮＡの、アジュバント構成物中のカチオン性またはポリカチオン性の化合物に対する比率は、ＲＮＡ複合体全体の窒素／リン酸比率（Ｎ／Ｐ比率）すなわち、カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物の正に帯電した（窒素）原子の、核酸の負に帯電したリン酸原子に基づいて算出されてもよい。例えば、ＲＮＡが塩基(bases)の統計的な分散を示す場合、１μｇのＲＮＡは典型的にはおよそ３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有する。加えて、分子量および塩基性アミノ酸の数に依って、１μｇのペプチドは典型的におよそｘｍｏｌの窒素残基を含有する。（Ａｒｇ）９（分子量１４２４ｇ／ｍｏｌ、９窒素原子）について模範的に算出する場合、１μｇの（Ａｒｇ）９はおよそ７００ｐｍｏｌの（Ａｒｇ）９、したがって７００×９＝６３００ｐｍｏｌの塩基性アミノ酸＝６．３ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。ＲＮＡ／（Ａｒｇ）９質量比およそ１：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ２と算出することができる。プロタミン（鮭由来プロタミン使用の場合、分子量およそ４２５０ｇ／ｍｏｌ、２１窒素原子）について模範的に算出する場合、２μｇのＲＮＡでおよそ２：１の質量比であり、ＲＮＡ中に６ｎｍｏｌのリン酸が算出されることとなり、１μｇのプロタミンはおよそ２３５ｐｍｏｌのプロタミン分子、したがって２３５×２１＝４９３５ｐｍｏｌの塩基性窒素原子＝４．９ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。ＲＮＡ／プロタミン９質量比およそ２：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．８１と算出することができる。ＲＮＡ／プロタミン９質量比およそ８：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．２と算出することができる。本発明の状況において、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．１〜１０の範囲にあることが望ましい。複合体中のＲＮＡ対ペプチドの比率を考えるとＮ／Ｐ比率はおよそ０．３〜４の範囲にあることがより望ましく、およそ０．５〜２または０．７〜２の範囲にあることが最も望ましい。Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．７〜１．５の範囲にあることが最も望ましい。
【０１７０】
望ましい実施形態において、効果的な免疫活性化効果および、発明による少なくとも一つのｍＲＮＡの効果的な翻訳の両方を得るために、当該組成物は、２つの別々の工程において得られる。ここで、いわゆる「アジュバント構成物」は、―第一工程において―前記アジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと、カチオン性またはポリカチオン性の化合物を、安定な複合体を形成するための特定の比率で複合することによって調整される。この状況において、ｍＲＮＡの複合の後、アジュバント構成物中には、遊離カチオン性またはポリカチオン性の化合物は全く残っていないか、無視すべきほど少量が残っているだけであることが重要である。よって、アジュバント構成物中の、ｍＲＮＡおよび、カチオン性またはポリカチオン性の化合物の比率は、ｍＲＮＡが全体的に複合され、化合物中に遊離カチオン性またはポリカチオン性の化合物が全く残っていないか、無視できるほど少量が残るだけとなるような範囲の中から選択されることが典型的である。アジュバント構成物すなわちカチオン性またはポリカチオン性の化合物に対するｍＲＮＡの比率は、およそ６：１（ｗ／ｗ）からおよそ０．２５：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが望ましく、およそ５：１（ｗ／ｗ）から０．５：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることがより望ましく、およそ４：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１（ｗ／ｗ）、あるいはおよそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが更により望ましく、およそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ２：１（ｗ／ｗ）の範囲の中から選択されることが最も望ましい。
【０１７１】
好ましい実施形態によれば、本発明の（免疫活性）組成物を形成するために、本発明による抗原をコードする少なくとも一つのｍＲＮＡが第二工程において、アジュバント構成物の複合ｍＲＮＡに添加される。ここにおいて、本発明の少なくとも一つのｍＲＮＡは遊離ｍＲＮＡ、すなわち、他の化合物と複合していないｍＲＮＡとして添加される。添加に先立って、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡは複合されず、望ましくは、アジュバント構成物添加における如何なる検出可能または重大な複合反応も経験しない。このことは、カチオン性またはポリカチオン性の化合物の、アジュバント構成物中の上述の少なくとも一つのｍＲＮＡとの強い結合が原因である。言い換えれば、本発明による少なくとも一つの抗原をコードする、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡが「アジュバント構成物」に添加される際に、少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡとの複合物を形成し得る遊離カチオン性またはポリカチオン性の化合物が存在しないまたは実質的に存在しないことが望ましい。よって、本発明の組成物の少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡの効果的な翻訳がインビボで可能である。ここにおいて、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡはモノ、ジ、または多シストロンｍＲＮＡ、すなわち一つまたはそれ以上のコード配列を伝えるｍＲＮＡとして発現し得る。ジ、さらにあるいは多シストロンｍＲＮＡにおける、かかるコード配列は、ここに定義するような少なくとも一つのＩＲＥＳ配列によって分けられてもよい。
【０１７２】
特に望ましい実施形態において、本発明の組成物に含まれる前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡは、治療の特定の要求に依って、本発明の組成物のアジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと、同一でもよいし、異なっていいてもよい。さらにより望ましくは、本発明の組成物に含まれる前記少なくとも一つのｍＲＮＡは、本発明の免疫活性化組成物のアジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと同一であるとよい。
【０１７３】
特に望ましい実施形態において、前記組成物は少なくとも一つのｍＲＮＡを含み、少なくとも一つのｍＲＮＡは上記に定義したように抗体をコードすることと、前記ｍＲＮＡは前記組成物中に、一部は遊離ｍＲＮＡとして、一部は複合したｍＲＮＡとして存在する。望ましくは、上記に定義したように一つまたはそれ以上の抗原をコードする前記少なくとも一つのｍＲＮＡは上述のように複合され、その後同少なくとも一つのｍＲＮＡは、遊離ｍＲＮＡとして添加され、ここで望ましくは、ｍＲＮＡを複合するために用いられる前記化合物は、前記遊離ｍＲＮＡ組成物の添加の瞬間は前記組成物中に自由な形態では存在しないことを特徴とする。
【０１７４】
第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（すなわち、前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率は、本発明の化合物において、ある治療の特定の要求にしたがって、選択されればよい。典型的には、本発明の組成物の前記アジュバント構成物中の前記ｍＲＮＡおよび、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡ（前記アジュバント構成物中のｍＲＮＡ：遊離ｍＲＮＡ）の比率は、前記アジュバント構成物によって先天性免疫システムの有意な刺激が誘発されるように選択される。並行して、前記比率は、有意な量の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡがインビボで提供されることができ、インビボでの発現タンパク質（例えば、上記で定義したように、ａｔｓｉｘ抗原など）の効果的な翻訳および凝集につながるように選択される。前記アジュバント構成物中の前記ｍＲＮＡ：本発明の組成物中のｍＲＮＡは、およそ５：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１０（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが望ましく、およそ４：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：８（ｗ／ｗ）の範囲から選択することがより望ましく、およそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：５（ｗ／ｗ）またはおよそ１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択することが更により望ましく、アジュバント構成物中のＲＮＡ：本発明の組成物中の遊離ｍＲＮＡの比率はおよそ１：１の比率から選択されることが最も望ましい。
【０１７５】
加えて、または代わりに、第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率は、ｍＲＮＡ複合物全体の窒素／リン酸比率（Ｎ／Ｐ比率）に基づいて算出されてもよい。本発明の状況において、複合物中のＲＮＡ：ペプチドの比率を考慮して、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．１〜１０の範囲にあることが望ましく、およそ０．３〜４の範囲にあることが望ましく、およそ０．５〜２または０．７〜２の範囲にあることが最も望ましく、およそ０．７〜１．５の範囲にあることが最も望ましい。
【０１７６】
加えて、または代わりに、第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率はまた、本発明の組成物において、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合したｍＲＮＡそれぞれ（すなわち、アジュバント構成物のｍＲＮＡ）および、第二構成物の少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡの両方のｍｏｌ比に基づいて選択されてもよい。典型的には、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、前記ｍｏｌ比が上記の（ｗ／ｗ）および／またはＮ／Ｐ定義を満足するように選択されればよい。より望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えば、およそ０．００１：１、０．０１：１、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、１：０．１、１：０．０１、１：０．００１、などのｍｏｌ比から選択されればよい。または、上記の値の任意の２つからなる任意の範囲を形成してもよく、例えばおよそ０．００１：１から１：０．００１（およそ０．０１：１から１：０．００１、０．１：１から１：０．００１、０．２：１から１：０．００１、０．３：１から１：０．００１、０．４：１から１：０．００１、０．５：１から１：０．００１、０．６：１から１：０．００１、０．７：１から１：０．００１、０．８：１から１：０．００１、０．９：１から１：０．００１、１：１から１：０．００１、１：０．９から１：０．００１、１：０．８から１：０．００１、１：０．７から１：０．００１、１：０．６から１：０．００１、１：０．５から１：０．００１、１：０．４から１：０．００１、１：０．３から１：０．００１、１：０．２から１：０．００１、１：０．１から１：０．００１、１：０．０１から１：０．００１の範囲、または、およそ０．０１：１から１：０．０１、０．１：１から１：０．０１、０．２：１から１：０．０１、０．３：１から１：０．０１、０．４：１から１：０．０１、０．５：１から１：０．０１、０．６：１から１：０．０１、０．７：１から１：０．０１、０．８：１から１：０．０１、０．９：１から１：０．０１、１：１から１：０．０１、１：０．９から１：０．０１、１：０．８から１：０．０１、１：０．７から１：０．０１、１：０．６から１：０．０１、１：０．５から１：０．０１、１：０．４から１：０．０１、１：０．３から１：０．０１、１：０．２から１：０．０１、１：０．１から１：０．０１、１：０．０１から１：０．０１、の範囲を含む。あるいは、およそ０．００１：１から１：０．０１、０．００１：１から１：０．１、０．００１：１から１：０．２、０．００１：１から１：０．３、０．００１：１から１：０．４、０．００１：１から１：０．５、０．００１：１から１：０．６、０．００１：１から１：０．７、０．００１：１から１：０．８、０．００１：１から１：０．９、０．００１：１から１：１、０．００１：０．９：１、０．００１から０．８：１、０．００１から０．７：１、０．００１から０．６：１、０．００１から０．５：１、０．００１から０．４：１、０．００１から０．３：１、０．００１から０．２：１、０．００１から０．１：１、または、およそ０．０１：１から１：０．０１、０．０１：１から１：０．１、０．０１：１から１：０．２、０．０１：１から１：０．３、０．０１：１から１：０．４、０．０１：１から１：０．５、０．０１：１から１：０．６、０．０１：１から１：０．７、０．０１：１から、１：０．８、０．０１：１から１：０．９、０．０１：１から１：１、０．００１から０．９：１、０．００１から０．８：１、０．００１から０．７：１、０．００１から０．６：１、０．００１から０．５：１、０．００１から０．４：１、０．００１から０．３：１、０．００１から０．２：１、０．００１から０．１：１などの範囲を含む）などである。
【０１７７】
更により望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物の少なくとも１つのｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えばおよそ０．０１：１から１：０．０１の範囲から選択されればよい。最も望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えばおよそ１：１のｍｏｌ比から選択されればよい。（ｗ／ｗ）およびＮ／Ｐ比率に関して、いかなる上記の定義も適応される。
【０１７８】
適したアジュバントはさらに、式（ＩＶ）：ＧｌＸｍＧｎを有する核酸であって、Ｇは、グアノシン、ウラシル、またはグアノシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログである、核酸、から選択されてもよい。
【０１７９】
他の適したアジュバントはさらに、式（Ｖ）：ＣｌＸｍＣｎを有する核酸であって、Ｃは、シトシン、ウラシル、またはシトシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログである、核酸、から選択されてもよい。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのｍＲＮＡに基づくワクチンを提供することができ、好ましくは、少なくとも６つの異なるｍＲＮＡ種に基づいており、各々のｍＲＮＡは、少なくとも上で規定された抗原、すなわち、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＡＰおよびＭＵＣ１（ムチン−１）をコードする。したがって、本発明のワクチンは、上で規定されたような組成物と同じ成分に基づいている。その限りにおいて、本発明の組成物を規定する上の記載を参照してもよい。しかしながら、本発明のワクチンは、物理的に別々の形態で提供することができ、また、別々の投与段階で投与することができる。ｍＲＮＡ成分が１つの単一の組成物によって提供されるのであれば、本発明のワクチンは、本発明の組成物に対応する。しかしながら、本発明のワクチンは、例えば、物理的に別々に提供される。例えば、ｍＲＮＡ種は、２つの別々の組成物であって、３つの異なる抗原を各々コードする少なくとも１つのｍＲＮＡ種（例えば３つの異なるｍＲＮＡ種）を含んでよい組成物が提供されるように、提供することができ、これは、組み合わされていてもされていなくてもよい。また、本発明のワクチンは、３つの異なる組成物の組み合わせであってよく、各組成物は、上記６つの抗原のうちの２つをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含んでいる。または、ワクチンは、少なくとも１つのｍＲＮＡ、好ましくは６つのｍＲＮＡ、の組み合わせとして提供され、各々が、上記６つの抗原のうちの一つをコードする。ワクチンは、使用前に単一の組成物を提供するために組み合わせてもよく、また、上記６つの異なる抗原をコードするために異なるｍＲＮＡ種を投与するのに１つ以上の投与が必要であるように使用してもよい。もしワクチンが、上記６つの異なる抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子、典型的には少なくとも少なくとも２、３、４、５または６個のｍＲＮＡ分子を含有していれば、例えば、単一の投与（すべてのｍＲＮＡ種を組み合わせる）によって、２つの別々の投与（例えば、上記６つの異なる抗原のうちの３つをコードするｍＲＮＡ分子を投与する各投与）によって、３、４、５または６個の投与（ｍＲＮＡ種のすべてが上記６つの抗原のうちの一つをコードし、物理的に別々に提供されるような場合）によって、投与が可能である。したがって、別個の実体（１つのｍＲＮＡ種を含有する）または組み合わせられた実体（１つ以上のｍＲＮＡ種を含有する）として提供されて、上記６つの抗原をコードする、モノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックのｍＲＮＡは、本発明に係るワクチンとして理解される。本発明のワクチンの特に好ましい実施形態によれば、本発明に係る抗原の各々は、個々の（モノシストロニックな）ｍＲＮＡとして提供され、別々に投与される。
【０１８１】
本発明の組成物と同様に、ワクチンの実体も、液体または乾燥（例えば凍結乾燥）形式で提供することができる。これらは、さらなる成分、特に、薬学的使用を許可する成分を含んでもよい。本発明のワクチンまたは本発明の組成物は、例えば、さらに、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはさらなる補助物質および添加物および／またはアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１８２】
本発明の組成物またはワクチンは、典型的には、上記抗原をコードする上記のような組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡを安全で効果的な量だけ含有する。ここで用いられる「安全で効果的な量」は、上記組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの量であって、前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは、前立腺の腺癌、限局性、局所進行性、転移性、去勢抵抗性（ホルモン不応性）、転移去勢抵抗性、及び、非転移去勢抵抗性前立腺癌、並びに、これに関連する疾患又は障害の３つのメインサブタイプに関する状況、の陽性の改変を顕著に誘導するのに十分な量を意味する。しかしながら、同時に、「安全で効果的な量」は、深刻な副作用を避けるのには充分小さい。すなわち、利点と危険性との顕著な関係を許可している。これらの制限の決定は、典型的には、顕著な医学的判断の範囲内である。本発明の組成物またはワクチンに関し、「安全で効果的な量」との表現は、好ましくは、過剰またはダメージを与える免疫反応は起きずに、好ましくは、測定可能レベル以下のような免疫反応も起きないように、適応性免疫システムを刺激するのに適したｍＲＮＡ（およびそれによりコードされる抗原）の量を意味する。このような、上記のような組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの「安全で効果的な量」は、さらに、ｍＲＮＡの、例えばモノシストロニック、バイシストロニックまたはさらにはマルチシストロニックなｍＲＮＡの、タイプに応じて選択してよく、これは、バイシストロニックまたはさらにはマルチシストロニックなｍＲＮＡが、モノシストロニックなＲＮＡの等量の使用よりも顕著に高い、コードされる抗原の発現を生むからである。上記の組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの「安全で効果的な量」は、さらに、特定の治療状況、年齢、治療を受ける患者の身体状況、状況の深刻度、治療期間、併用治療の性質、用いられる特定の薬学的に許容できるキャリアの性質、同様の因子、と関連して、同伴医師の知識と経験の範囲内で変化する。本発明の組成物またはワクチンは、本発明に応じて、ヒトに対し、または獣医の医学目的で、薬学的な組成物またはワクチンとして、用いることができる。
【０１８３】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物、ワクチンまたはパーツのキットの少なくとも１つのｍＲＮＡは、凍結乾燥の形式で提供される。好ましくは、少なくとも１つの凍結乾燥されたｍＲＮＡは、適したバッファ中で、有利には水性キャリアに基づいて、投与前に再構成され、例えばリンガー乳酸溶液は好ましく、リンガー溶液、リン酸バッファ液である。好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物、ワクチンまたはパーツのキットの少なくとも１つのｍＲＮＡは、６つのｍＲＮＡを含み、これは、凍結乾燥の形式で別々に提供され（任意で、少なくとも１つの別の添加剤と共に提供される）、これは、好ましくは、使用前に（リンガー乳酸溶液などの）適したバッファにて別々に再構成されて、６つの（モノシストロニックな）ｍＲＮＡのそれぞれの個々の投与を可能にする。
【０１８４】
本発明の組成物またはワクチンは、典型的には、薬学的に許容され得るキャリアを含んでもよい。「薬学的に許容され得るキャリア」との表現は、ここでは、好ましくは、本発明の組成物またはワクチンの液体または非液体ベースを含む。本発明の組成物またはワクチンが液体形状で提供されるのであれば、キャリアは、水、典型的には発熱物質の無い水、生理食塩水またはバッファ（水性）液、例えばリン酸塩、クエン酸塩などのバッファ液である。特に、本発明の組成物またはワクチンの注射には、水または好ましくはバッファ、より好ましくは水性バッファを用いてよく、これは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩を含み、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩を含み、および任意的に、カリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含む。好ましい実施形態によれば、ナトリウム、カルシウムおよび任意的にカリウム塩は、そのハロゲン化物の形であってもよく、例えば、塩化物、ヨード化物またはホウ素化物であり、また、その水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩などである。限定されないが、ナトリウム塩の例は、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４であり、任意的なカリウム塩の例は、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４であり、カルシウム塩の例は、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２である。さらに、上記カチオンの有機アニオンは、バッファ内に含まれていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上記のような注射目的に適したバッファは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および任意的に塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含んでいてよく、上記塩化物に加えてさらなるアニオンが存在していてもよい。ＣａＣｌ２は、ＫＣｌのような他の塩で置き換えてもよい。典型的には、注射バッファ内の塩は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、および、少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、の濃度で存在している。注射バッファは、特定の基準溶媒に対して高張、等張または低張であってよく、すなわち、バッファは、特定の基準溶媒に対して高い塩濃度、等しい塩濃度または低い塩濃度であってよく、ここで、好ましくは、上述のような濃度を用いてもよく、これにより、浸透作用や他の濃度効果による細胞のダメージにつながらない。基準溶媒は、例えば、血液、リンパ液、細胞液または他の体液などの、「in vivo」法で発生する液体であり、または、例えば、一般のバッファや液体のような、「in vitro」法での基準溶媒として使われうる液体である。このような一般のバッファや液体は当業者に公知である。液体ベースとしてはリンガー乳酸溶液が特に好ましい。
【０１８５】
しかしながら、互換性のある１つ以上の固体または液体充填物または希釈剤またはカプセル化化合物も同様に使用可能であり、これらは、ヒトへの投与に適する。「互換性」との用語は、ここでは、典型的な使用条件で本発明の組成物またはワクチンの薬学的効果を実質的に減じるような相互作用を起こさずに、本発明の組成物またはワクチンの構成成分が、少なくとも１つのｍＲＮＡと混合されることができることを意味する。薬学的に許容できるキャリア、充填物および希釈剤は、もちろん、治療される人への投与に適するよう、充分高純度で充分低毒性である必要がある。薬学的に許容できるキャリア、充填物またはその構成成分として用いうる化合物のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコース、トレハロースおよびスクロース；でんぷん、例えばコーンスターチまたはポテトスターチ；デキストロース；セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース；粉状トラガカント；モルト；ゼラチン；獣脂；固体潤滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；野菜油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ脂からの油；ポリオール、例えばポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；アルギン酸である。
【０１８６】
薬学的に許容できるキャリアの選択は、原則的に、本発明の組成物またはワクチンが投与される方法によって決定される。本発明の組成物またはワクチンは、例えば、全身性または局所性に投与できる。一般に、全身性投与は、例えば、経皮、経口、腸管外経路を含み、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、皮内および腹膜内の注射および／または鼻腔内の投与経路を含む。一般に、局所性投与の経路は、例えば、局所的投与経路ではあるが皮内、経皮、皮下または筋肉内の注射または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内、および舌下注射を含む。より好ましくは、ワクチンは、皮内、皮下または筋肉内の経路で、好ましくは注射によって、投与してもよく、これは、針無しおよび／または針のある注射であってよい。
【０１８７】
望ましい実施形態において本実施例の組成物またはワクチンは、無針注射の特定の一形式であるジェット注射により投与される。ここで用いる「ジェット注射」とは、無針注射の方法であって、前記少なくとも一つのｍＲＮＡ、本発明による組成物あるいはワクチンおよび、オプションとして、更に好適な結合剤を含む流動体が流出口から強出され、それにより哺乳動物の皮膚あるいは、注射の設定によっては、皮下組織あるいは筋肉組織を貫通することができる高圧の超極微液流が生まれることを特徴とする方法を指す。原則的に、前記液流は皮膚に穴を形成し、その穴を通じて前記液流が標的組織内に押し出される。望ましくは、ジェット注射は本発明による組成物またはワクチンの皮内、皮下、または筋肉内注射のために用いられる。望ましい実施形態において、ジェット注射は前記組成物またはワクチンの筋肉内注射のために用いられる。更に好適な実施形態において、ジェット注射は前記組成物またはワクチンの皮内注射のために用いられる。
【０１８８】
それゆえ、組成物／ワクチンは、液体または固体形式で処方される。本発明の組成物またはワクチンの適量は、動物モデルでのルーチン実験により決定しうる。このようなモデルは、限定されないが、うさぎ、ひつじ、マウス、ラット、犬およびヒトでない霊長類のモデルである。注射用の好ましい単位投与形式は、滅菌水溶液、生理食塩水またはそれらの混合物を含む。このような溶液のｐＨは７．４に調整すべきである。注射に適したキャリアは、ヒドロゲル、放出を制御されたまたは遅延させたデバイス、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリクスを含む。局所適用のために適した薬学的に許容できるキャリアは、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものを含む。もし本発明の組成物またはワクチンが、経口投与すべきものであれば、錠剤、カプセル剤などが好ましい単位投与形式である。経口投与に用いる単位投与形式の準備のための薬学的に許容できるキャリアは、従来公知である。その選択は、味、コスト、および安定性などの二次的な考慮事項に左右され、これらは本発明の目的には重要ではなく、当業者によって容易に行える。
【０１８９】
本発明の組成物またはワクチンは、さらに、免疫原性をさらに増大させるための１つ以上の補助物質を含むことができる。上記組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡと、補助物質との相乗作用は、上記本発明の組成物またはワクチンを用いて任意的に共同処方(co-formulated)（または別々に処方）されるが、好ましくはそれによって達成される。補助物質の種々のタイプに応じて、この点について種々の機構を考慮することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣｓ）、例えばリポ多糖類、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０リガンド、の、成熟を許可する化合物は、適した補助物質の第１クラスを形成する。一般に、補助物質としては、「危険信号」（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＦＳなど、のような様態で免疫システムに影響を与えるような任意の薬剤を使用でき、これらは、本発明に係る免疫刺激アジュバントによって生成される免疫応答が、促進され、および／または、目的に沿った影響を受けることを可能にする。特に好ましい補助物質は、サイトカインであり、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインであり、これらは、コード化される少なくとも６つの抗原による適応性免疫応答の誘発に加えて、生来の免疫応答を促進し、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−βまたはＴＮＦ−α、成長因子、例えばｈＧＨである。好ましくは、免疫原性を増加させるこのような薬剤または化合物は、別々に提供され（本発明の組成物またはワクチンと共同処方されない）、別々に投与される。
【０１９０】
本発明の組成物またはワクチンに含んでもよいさらなる添加剤は、乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ；界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；味付与剤、薬学的キャリア；錠剤形成剤；安定化剤；酸化防止剤；保存剤である。
【０１９１】
本発明の組成物またはワクチンはまた、これらは、ヒトの鐘(Toll)形レセプターＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０への（リガンドとして）その結合親和性により、または、これらは、マウスの鐘(Toll)形レセプターＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２またはＴＬＲ１３への（リガンドとして）その結合親和性により、または、免疫刺激性であることが知られているさらなる化合物を含むことができる。
【０１９２】
これに関し、本発明の組成物またはワクチンに加えてよい他のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡである。ＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡは、１本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＤＮＡ）、２本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）または２本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）とすることができる。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、ＣｐＧ−ＲＮＡの形であり、より好ましくは、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）の形である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１つまたはそれ以上の（マイトジェニックな）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含む。第１の好ましい代替物によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、すなわちＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に任意的に含まれるさらなるすべてのシトシンまたはグアニンは、メチル化されていてもされていなくてもよい。しかしながら、さらなる好ましい代替物によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化された形で存在してもよい。
【０１９３】
好ましくは、上記の化合物は、上記少なくとも６つの抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含有する（本発明の）ワクチンまたは組成物とは別個に処方されて投与される。
【０１９４】
本発明のさらなる好ましい態様によれば、本発明の組成物またはワクチンは、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害、の治療のための（薬剤の調製のための）本発明に応じて用いることができる。
【０１９５】
本発明のさらなる好ましい態様によれば、上記抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む本発明の組成物またはワクチンは、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害、の治療に用いることができる。
【０１９６】
これに関し、薬学的に効果的な量の本発明のワクチンまたは薬学的に効果的な量の本発明の組成物を、それを必要とする対象者に投与することによって、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害、を、治療する方法が、本発明に含まれる。このような方法は、典型的には、本発明の組成物またはワクチンを調製する任意的な第１のステップと、（薬学的に効果のある量の）本発明の組成物またはワクチンを、それを必要とする対象者に投与する第２のステップとを含んでいる。必要とする対象者は、典型的には、哺乳類である。本発明に関し、哺乳類は、好ましくは、限定されないが、例えば、ヤギ、牛、豚、犬、猫、ロバ、猿、類人猿、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、および、特に、ヒト、を含むグループから選択され、ここで、哺乳類は、典型的には、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害、を罹患する。
【０１９７】
特に、本発明による組成物またはワクチンは、進行性疾患状態の前立腺の去勢抵抗性転移腺癌に罹患した被験者の処置のための有益な効果を有する。典型的には、当該被験者は手術的去勢またはアンドロゲン抑制療法（ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧＮＲＨ）アゴニストまたはアンタゴニストを含む）を経験している。被験者は、少なくとも一つの第二選択抗ホルモン操作（例えば、抗アントロゲン）の後であっても進行性疾患状態で処置されることが望ましい。被験者は５０ｎｇ／ｄＬより小さな、または１．７ｎｍｏｌ／ｄＬより小さな血清テストステロンレベルを有するように選択されることがより望ましい。疾患の進行は、例えば、少なくとも一週間おいて測定される、２つの連続的なＰＳＡの上昇であって、最低値よりも少なくとも５０％上昇しておりＰＳＡが２ｎｇ／ｍｌより大きくなっていることにより特徴づけられてもよい。疾患の進行はまた、公知の技術により放射線学的に査定されてもよい。
【０１９８】
さらに本発明による組成物またはワクチンは、前立腺癌に罹患している被験者の、前立腺切除の術前、および術後の（ネオアジュバント）処置のための有益な効果を有する。
【０１９９】
本発明はまた、好ましくは、哺乳類の免疫応答を誘発し、好ましくは、肺癌、より好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害、の治療のために、本発明の組成物すなわちここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの使用にも関する。
【０２００】
同様に、本発明は、本発明のワクチン自体の使用にも関し、または、哺乳類の適応性免疫応答を誘発する、ここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡに関し、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の治療のためのものに関する。
【０２０１】
前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性前立腺癌ならびに／またはホルモン抵抗性前立腺癌、およびそれらに関連する疾病または異常の予防または処置は、本発明による抗原の組み合わせの投与によって実行されればよく、その投与は、免疫応答を誘発するための、本発明の組成物の形式でも本発明のワクチンの形式でもよい。ここに記載の少なくとも６個の抗原の組み合わせに対して対象者に免疫を付与する免疫付与プロトコルは、典型的には、本発明の組成物またはワクチンの一連の単回投与または用量を含む。ここに記載の単回用量は、それぞれ、初期／第１用量、第２用量またはさらなる任意の用量を参照し、これは好ましくは、免疫反応を「促進する」ために投与される。これに関し、各単回用量は、本発明に係る少なくとも６個の抗原すべての投与を含み、ここで、２つの単回用量同士の間隔は、少なくとも１日、好ましくは２、３、４、６または７日、から、少なくとも１週間、好ましくは２、３、４、６、７または８週間、まで変更できる。単回用量同士の間隔は、一定でもよいし、免疫付与プロトコルに沿って変化してもよく、例えば、間隔は、プロトコルの初期には短く、終わりに向かって長くしてもよい。単回用量の総数と単回用量同士の間隔とに応じて、免疫付与プロトコルは、期間を延長してもよく、好ましくは、少なくとも１週間、より好ましくは、数週間（例えば２、３、４、６、７、８、９、１０、１１または１２週間）、さらにより好ましくは、数ヶ月（例えば３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４ヶ月）、続ける。各単回用量は、ここに記載の少なくとも６個の抗原のすべての投与を含み、それゆえ、少なくとも１、好ましくは１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１または１２回の注射を必要としてもよい。この場合に、本発明の組成物を投与する場合、単回用量は典型的には１回の注射を含む。この場合に、本発明に係る各抗原をコードする個々のｍＲＮＡ処方をワクチンが含む場合、単回用量の投与中に行われる注射の最小回数は、ワクチンの個々の成分の数に対応する。ある実施形態では、単回用量の投与は、ワクチンの各成分の１回より多い注射を含む（例えば、本発明に係る６個の抗原のうちの例えば１つをコードするｍＲＮＡを含む特定のｍＲＮＡ処方）。例えば、ワクチンの個々の成分の総容量の一部は、異なる身体部位に注射してもよく、それゆえ、１回より多い注射を必要とする。より詳細な実施例では、６個の個々のｍＲＮＡ処方を含むワクチンの単回用量で、それの各々が２つの異なる身体部位に投与されるものは、１２回の注射を含む。典型的には、単回用量は、ワクチンのすべての成分を投与するのに必要なすべての注射を含み、ここで、単回分の成分は、上で概略を述べたような１回より多い注射を必要とする。この場合に、本発明のワクチンの単回用量の投与が１回より多い注射を含んでいる場合、注射は、基本的に、同時に行われ、すなわち、典型的には、単回の注射ステップを行うのに実務者に必要なタイムフレーム以内で時間差を設けて次から次へと行われる。それゆえ、好ましくは、単回用量の投与は、数分、例えば２、３、４、５、１０、１５、３０または６０分延長する。
【０２０２】
前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性前立腺癌ならびに／またはホルモン抵抗性前立腺癌、およびそれらに関連する疾病または異常の予防または治療は、本発明による抗原の組み合わせを、本発明の組成物の形式でも本発明のワクチンの形式でもよいし、同時に、言い換えれば、一度に、または時間をずらして投与することによって行ってもよい。例えば、パーツのキットとして投与し、各パーツは、少なくとも１つの好ましくは異なる抗原をコードするｍＲＮＡを含有している。好ましくは、抗原のそれぞれは、別々に投与され、すなわち、各抗原は、治療される対象者の身体の異なる部位または領域に投与され、好ましくは、同時に、または、それぞれ同じ短いタイムフレーム以内で投与される。好ましい実施形態によれば、個々のｍＲＮＡは、対象者の四肢（すなわち左／右の腕と脚）じゅうに分布するように投与される。好ましくは、（すべての少なくとも１つのｍＲＮＡの）投与は、１時間以内に行われ、より好ましくは、３０分以内に行われ、さらに好ましくは、１５、１０、５、４、３、２分以内に行われ、あるいは１分以内に行ってもよい。
【０２０３】
投与時に、好ましくは任意の投与経路が上記のようにして用いられてもよい。例えば、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによりコードされる少なくとも６個の（特に選択された）抗原に基づいた適応性免疫応答を誘発または促進することによって、好ましくは前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ：ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、およびそれに関連する疾病および障害を治療してもよい。本発明のワクチンおよび／または組成物の投与は、異なる抗原をコードする別のｍＲＮＡ組成物をさらに含んでもよいようなここに記載の本発明の他のワクチンおよび／または組成物の投与の、前、同時、および／またはその後であってもよく、ここで、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる各抗原は、好ましくは、前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の治療に適していてもよい。これに関し、ここに記載の療法はまた、前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害に関連する疾病の変調を含んでもよい。
【０２０４】
さらなる実施形態によれば、本発明はさらに、本発明の組成物、すなわち、変調のための（（本発明の）ワクチンの調製のための）ここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの使用を含んでおり、好ましくは、ここに記載の哺乳類の免疫応答を誘発または促進するための使用であり、より好ましくは、好ましくは前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害を治療するおよび／または治療をサポートするための使用である。これに関し、本発明の前立腺癌（ＰＣａ）の治療は、外科手術、放射線治療、ホルモン療法、場合によっては化学療法、陽子療法またはこれらのいくつかの組み合わせ、などの従来の前立腺癌（ＰＣａ）治療の任意のアプローチまたはアプローチの組み合わせによって補助されてもよい。前立腺癌（ＰＣａ）の治療のサポートは、ここに記載の他の実施形態のうちの任意のものにて考えてよい。したがって、本発明の組成物またはワクチンの任意の使用と、上記療法的アプローチのうちの任意のものとの併用療法は、特に、前立腺手術、ホルモン（例えば抗アンドロゲン）、および／または化学療法との組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０２０５】
本発明の組成物の投与または本発明のワクチンのここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与は、時間差を設けた治療で行ってもよい。時間差治療は、例えば、本発明の組成物の投与または本発明のワクチンのここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与を、好ましくは前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の、従来の療法の前に、同時に、および／または、その後に、行ってもよく、例えば、本発明の医薬品または本発明の組成物またはワクチンの投与を、好ましくは前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の、従来の療法の前に、同時に、および／または、その後に、行ってもよい。このような時間差治療は、キットを用いて、好ましくは下記のようなパーツのキットを用いて、行ってもよい。
【０２０６】
この状況において、本発明の組成物または本発明のワクチンの投与は、前立腺切除（ネオアジュバント処置）の前に、および、オプションとして追加で前立腺切除（ネオアジュバント処置）の後に実行されることが特に望ましい。
【０２０７】
時間差治療は、上記の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡが、好ましくは本発明の組成物またはワクチンの一部を形成し、上記の抗原をコードする別の少なくとも１つのｍＲＮＡの前に、同時に、および／または、その後に、投与されるような形で、本発明の組成物またはワクチンの投与を、好ましくは、上記の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与を、追加として、または代替として、含んでもよい。好ましくは、（少なくとも１つのｍＲＮＡの）投与は、１時間以内に、より好ましくは３０分以内に、さらにより好ましくは１５、１０、５、４、３または２分以内に、さらには１分以内に、行われる。このような時間差治療は、キットを用いて、好ましくは下記のようなパーツのキットを用いて、行ってもよい。
【０２０８】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、繰り返し投与され、ここで、各投与は、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡの個々の投与を含む。各投与時点において、少なくとも１つのｍＲＮＡは、１回より多い回数（例えば２または３回）投与してもよい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、６個のｍＲＮＡ（それぞれ、上記抗原の一つをコードする）を各時点で投与し、ここで、各ｍＲＮＡは、注射によって２回投与され、それゆえ、結果として、１２回の注射が四肢に分配される。
【０２０９】
最後の実施形態によれば、本発明は、キット、特にパーツのキットをも提供し、このキットは、活性の（免疫刺激性の）本発明の組成物、および／または、本発明のワクチンを含み、任意的に、可溶化するための液体賦形剤、ならびに、任意的に、本発明の組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量の情報を有する技術的指示書、を含む。技術的指示書は、本発明の組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量の情報を含んでいてよい。このようなキット、好ましくはパーツのキットは、例えば上述の適用または使用のうちの任意のものに適用でき、好ましくは、好ましくは前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の治療のための、（本発明の医薬品、好ましくはワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用できる。このキットは、好ましくは、前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の治療のための、（本発明のワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用でき、ここで、コードされる少なくとも６個の抗原に起因する本発明の組成物および／またはワクチンは、上述のような哺乳類の免疫応答を誘発または促進することができてもよい。このようなキットは、さらに、上述のような哺乳類の免疫応答を変調、好ましくは誘発するための、例えば誘導および促進するための、また、好ましくは、前立腺腺癌、局所限定・局所進行・転移・去勢抵抗性（ホルモン抵抗性）・転移去勢抵抗性および非転移去勢抵抗性の前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病および障害の治療をサポートするための、（本発明の医薬品、好ましくはワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用されてもよい。キットの特別な形式としての、パーツのキットは、キットにおける異なるパーツにおいて、１つまたはそれより多い同一または異なる、活性の本発明の（免疫刺激性）組成物、および／または、１つまたはそれより多い同一または異なる、活性の本発明の（免疫刺激性）ワクチンを、含んでいてよい。パーツのキットは、また、キットにおける異なるパーツにおいて、（例えば１つの）活性の本発明の組成物を、（例えば１つの）活性の本発明のワクチンを、および／または、上述の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを、含んでいてよく、例えば、キットの各パーツが、好ましくは異なる抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。さらに、パーツのキットの両タイプの組み合わせも可能である。パーツのキットは、in vivoで同じ治療をしている中で、例えば時間差治療を考えるとき、例えば本発明の組成物またはワクチンおよび／または上述の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの異なる処方を用いるときや濃度を増加させるとき、に用いてもよい。パーツのキットはまた、本発明の組成物の（すなわち、パーツ内で）抗原のうちの少なくとも１つの個別の処方または投与を考慮または要するとき（例えば技術上��理由）であるが例えば、in vivoで異なる抗原の組み合わせられた存在がまだ達成すべきときにも使用してよい。特に、キットの特別な形式としてのパーツのキットは考慮され、このとき、キットの各パーツは、上述の少なくとも１つの好ましくは異なる抗原を含み、パーツのキットのすべての部分は、ここに記載の本発明の組成物またはワクチンを形成する。このような特定のパーツのキットは、例えば、異なるパーツのキットとして異なる抗原が個別に処方されたがそのとき、必要上、哺乳類に同時にまたは時間差的に投与されるのであれば、特に適する。後者の場合、このようなキットの異なるパーツのすべての投与は、典型的には短い時間制限で行われ、それによって、キットの残りの部分の投与に続いてほぼ同時に、すべての抗原が哺乳類中に存在する。好ましい実施形態によれば、キットは、本発明に係る６個のｍＲＮＡを含む少なくとも２つの部分を含んでいる。好ましくは、６個のｍＲＮＡのすべてが、キットの別々の部分にて提供され、ここで、ｍＲＮＡは、好ましくは凍結乾燥される。さらに好ましくは、パーツのキットはさらに、少なくとも１つのｍＲＮＡを可溶化する賦形剤を含有し、この賦形剤は、好ましくは、リンガー乳酸溶液である。上記キットのいずれも、上述の治療に用いることができる。
【０２１０】
〔本発明の利点〕
本発明は、前立腺癌（ＰＣａ）の治療のための組成物を提供し、ここで、この組成物は、哺乳類の（適応性）免疫応答を誘発できる少なくとも６個の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、ここで、抗原は、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ：前立腺幹細胞抗原）、ＳＴＥＡＰ（Ｓｉｘ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ：前立腺６膜貫通上皮抗原）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：前立腺アルカリ性ホスファターゼ）およびＭＵＣ１（ムチン−１）から成る群から選択される。このような組成物は、前立腺癌（ＰＣａ）の効果的な治療または従来の療法を用いるときの補足的治療を可能にする。これはさらに、治療方法のためのアプローチとしてｍＲＮＡの使用により、誘導されたＤＮＡ配列の非制御の成長の問題を回避する。本発明の組成物で用いられるｍＲＮＡは、ＤＮＡ発現システムに関するさらなる顕著な利点を有し、例えば、免疫応答、免疫付与またはワクチン接種である。これらの利点は、特に、細胞中に導入されるｍＲＮＡがゲノム中に統合されないことを含んでいる。これは、さもなければ完全にまたは部分的に不活化されまたは誤情報を導くような、この遺伝子の変異の危険を回避する。これはさらに、患者に他者のＤＮＡが導入されて（致命的となる可能性のある）免疫応答をもたらすような該患者への病原性の抗ＤＮＡ抗体の誘導などの免疫応答を誘導するための薬剤として（例えばワクチンとして）ＤＮＡを用いることの他の危険を回避する。一方、抗ＲＮＡ抗体は検出されていない。
【０２１１】
次の図は、本発明をさらに例証することを意図したものである。それに加えて、該図は、本発明の主題を制限するように意図されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：１）を示し、ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図２】配列番号２に従い、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図３】配列番号３に従いＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図４】ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号４）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図５】配列番号５に従いＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図６】配列番号６に従いＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示す。
【図７】ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号７）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図８】配列番号８に従いＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図９】配列番号９に従いＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１０】ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１０）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図１１】配列番号１１に従いＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図１２】配列番号１２に従いＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１３】ＰＡＰ（前立腺アルカリホスファターゼ）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＰＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１３）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図１４】配列番号１４に従いＰＡＰ（前立腺アルカリホスファターゼ）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＰＡＰ（前立腺アルカリホスファターゼ）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図１５】（配列番号１５に従いＰＡＰ（前立腺アルカリホスファターゼ）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１６】ＭＵＣ１（ムチン１）をコードしているｍＲＮＡ配列ＲＮＡｃｔｉｖｅＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１６；Ｒ１７１５）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：安定化および良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜６４アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、〜３０シトシンの３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）。
【図１７】配列番号１７に従いＭＵＣ１（ムチン１）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化配列なしでＭＵＣ１（ムチン１）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図１８】配列番号１８に従いＭＵＣ１（ムチン１）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１９】ｍＲＮＡ配列ＰＳＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号１９）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号３に従いＰＳＡをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２０】ｍＲＮＡ配列ＰＳＭＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２０）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：配列番号６に従いＰＳＭＡをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２１】ｍＲＮＡ配列ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２１）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：配列番号９に従いＰＳＣＡをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２２】ｍＲＮＡ配列ＳＴＥＡＰ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２２）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：配列番号１２に従いＳＴＥＡＰをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２３】ｍＲＮＡ配列ＰＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（Ｒ２２５１）（配列番号２３）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号１５に従いＰＡＰをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２４】ｍＲＮＡ配列ＣＡＰ−ＭＵＣ１５・ＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（Ｒ２３１２）（配列番号２４）を示しており、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：配列番号１８に従いＭＵＣ１をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号６９に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端における〜６４アデノシン（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における〜３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列である。
【図２５】ＥＬＩＳＰＯＴによるＰＡＰ特異細胞免疫反応の検出を示しており、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１、５、８、１２および１５日目において３２μｇのＰＡＰ−ＲＮＡｃｔｉｖｅ（登録商標）（ＰＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０；配列番号１３）をワクチン接種し、最後のワクチン接種の後、５日目に、ワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスの脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの分泌のＥｘｖｉｖｏＥＬＩＳｐｏｔ分析を行い、細胞を、ＰＡＰ由来ペプチド（予測されるＭＨＣクラスＩエピトープ）またはコントロールペプチドを用いてプレート上で刺激し、グラフは、各マウスについての単一のデータポイントを示している。
【図２６】ＥＬＩＳＰＯＴによるＭＵＣ１特異細胞免疫反応の検出を示しており、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１、５、８、１２および１５日目において３２μｇのＭｕｃ１−ＲＮＡｃｔｉｖｅ（登録商標）（ＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０；配列番号１６；Ｒ１７１５）をワクチン接種し、最後のワクチン接種の後、６日目に、ワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスの脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの分泌のＥｘｖｉｖｏＥＬＩＳｐｏｔ分析を行い、細胞を、ＭＵＣ１由来のペプチド（予測されるＭＨＣクラスＩエピトープ）またはコントロールペプチドを用いてプレート上で刺激し、グラフは、各マウスについての単一のデータポイントを示している。
【図２７】配列番号８２に従いＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図２８】配列番号８３に従いＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図２９】配列番号８４に従いＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図３０】配列番号８５に従いＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図３１】配列番号７６に従うＰＳＡＮＰ＿００１６３９．１のタンパク質配列を示している。
【図３２】配列番号７７に従うＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）ＮＰ＿００４４６７．１のタンパク質配列を示している。
【図３３】配列番号７８に従うＰＳＣＡＯ４３６５３．１のタンパク質配列を示している。
【図３４】配列番号７９に従うＳＴＥＡＰＮＰ＿０３６５８１．１のタンパク質配列を示している。
【図３５】配列番号８０に従うＰＡＰＮＰ＿００１０９０．２のタンパク質配列を示している。
【図３６】配列番号８１に従い受入番号ＡＡＡ６００１９．１（Ｊ０５５８２．１）下に委託されるＭＵＣ１のタンパク質配列を示している。
【図３７】配列番号８６に従うＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲのタンパク質配列を示している。
【図３８】配列番号８７に従いＭＵＣ１をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＭＵＣ１をコードしている全長コード配列（ＣＤＳ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【０２１３】
（実施例）
次の実施例は、本発明をさらに例証することを意図している。これらは、本発明の主題を制限することを意図してはいない。
【０２１４】
〔１．コードするプラスミドの調製〕
次の実験ＤＮＡ配列においては、抗原をコードしているそれぞれのｍＲＮＡ配列末端と対応している
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、
・ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）、
・ＰＡＰ（前立腺アルカリホスファターゼ）および
・ＭＵＣ１（ムチン１）、
それぞれを調製し、in vitro転写法およびトランスフェクション実験ために用いた。
【０２１５】
そのため、図２７、２８、２９、３０、１５および１８、すなわち配列番号８２、８３、８４、８５、１５および１８に従うＲＮＡ配列と対応しているコード配列を含んでいる配列を得るより良いコドン使用のために、ｍＲＮＡをコードしている天然抗原に対応しているＤＮＡ配列（図２、５、８、１１、１４および１７、すなわち配列番号２、５、８、１１、１４および１７に従いＲＮＡ配列に対応しているコード配列を含んでいる配列）に、ＧＣ−最適化を行った。そして、該コード配列を、ポリ−Ａ−末端およびポリ−Ｃ−末端（それぞれＡ６４−Ｃ３０）によって修飾されるＧＣ−最適化されたコンストラクト（ＣｕｒｅＶａｃＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内にトランスファーした。最終構成物および対応ｍＲＮＡｓは以下のように称される：
それぞれ、ＫＬＫ３／ＰＳＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１）、
ＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号４）、
ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号７）、
ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１０）、
ＰＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１３）、および
ＭＵＣ１−５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号１６）。
【０２１６】
最終構成物は、それぞれ図１、４、７、１０、１３および１６（配列番号１、４、７、１０、１３および１６）において示されている配列に従うＲＮＡ配列に対応する配列を含み、該配列は次の配列エレメントを含む：
安定化およびより良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜７０アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）。
【０２１７】
代替として、ＧＣ−最適化ＣＤＳ配列を、配列番号７０に従いポリ−Ａ−末端、ポリ−Ｃ−末端およびヒストンステムループ配列により修飾されている、ＧＣ−最適化されたコンストラクトにトランスファーした。
【０２１８】
最終構成物および対応ＲＮＡは以下のように称される：
それぞれ、ＫＬＫ３／ＰＳＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号１９）、
ＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２０）、
ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２１）、
ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２２）、
ＰＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２３）、および
ＭＵＣ１−５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号２４）。
【０２１９】
最終構成物は、それぞれ図１９、２０、２１、２２、２３および２４（配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４）において示されている配列に従うＲＮＡ配列に対応する配列を含み、該配列は次の配列エレメントを含む：
安定化およびより良いコドン使用の為のＧＣ−最適化配列〜７０アデノシンの３’−末端（ポリ−Ａ−末端）、３’−末端における３０シトシン（ポリ−Ｃ−末端）；および配列番号７１に従うヒストンステムループ配列。
【０２２０】
〔２．In vitro転写法〕
実施例１において得られた組換えプラスミドＤＮＡに基づき、ｍＲＮＡ配列を、in vitro転写法によって作製した。そのため、組換えプラスミドＤＮＡを直線化し、引き続いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitro転写した。そしてＤＮＡテンプレートを、ＤＮアーゼＩ消化によって分解し、ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿反応によって回収し、さらにＨＰＬＣ抽出（ＰＵＲＥＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＣｕｒｅＶａｃＧｍｂＨ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって浄化した。
【０２２１】
〔３．プロタミンによる複合体化〕
本発明に係る抗原をコードしている各ｍＲＮＡを、比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）において、ｍＲＮＡへのプロタミンの添加によってプロタミンと複合体化した。１０分間のインキュベーションの後、抗原提供のｍＲＮＡとして用いた同じ量の遊離ｍＲＮＡを添加した。
【０２２２】
〔４．ｍＲＮＡワクチンの調製および抗原特有の細胞傷害性抗体の導入および抗原特有細胞傷害性のＴ細胞〕
〔４．１  ｍＲＮＡワクチンの調製〕
ｍＲＮＡワクチンは、それぞれＰＡＰ（配列番号１３）またはＭＵＣ１（配列番号１６）をコードするＧＣ−最適化ｍＲＮＡから構成される。ｍＲＮＡを、比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）において、ｍＲＮＡへのプロタミンの添加によってプロタミンと複合体化した。１０分間のインキュベーションの後、抗原提供のｍＲＮＡとして用いた同じ量の遊離ｍＲＮＡを添加した。
【０２２３】
結果として生じた組成物を、８０％（ｖ／ｖ）リンガー乳酸液中に溶解した。
【０２２４】
〔４．２  ワクチン接種〕
上記４．１下に記載されているように、３２μｇのｍＲＮＡワクチンの１つを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスの皮内にワクチン接種した。コントロールマウスの皮内に、バッファ（リンガー乳酸）を注射した。ワクチン接種は、１週間当たり２つの免疫を伴い５つの免疫を含んだ。免疫反応を、ワクチン接種サイクルの完了から５日後または６日後に分析した。
【０２２５】
〔４．３  ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応のＥＬＩＳＰＯＴ検出〕
ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応の検出のために、特異的な刺激に対する反応におけるＩＦＮ−γ分泌の分析を、ＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて単細胞レベルにおいて視覚化し得る。
【０２２６】
上記４．１下において記載されたｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスの脾臓細胞を、最後のワクチン接種から５日後または６日後に単離し、ＩＦＮ−γ捕捉抗体をコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中に移した。そして該細胞を、次のペプチドを用いて３７℃において２４時間刺激した。
【０２２７】
【表２】
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【０２２８】
インキュベーション期間の後、細胞をプレートから洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＫＰが続く、ｍｕｒｉｎｅＩＦＮ−γに対してビオチン化された第二抗体を用いて、細胞によって分泌されたＩＦＮ−γを検出した。スポットを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて視覚化し、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（免疫スポットアナライザー、ＣＴＬアナライザーＬＬＣ）を用いて計測した。
【０２２９】
〔結果〕
ＥＬＩＳｐｏｔにおいてＩＦＮ−γの分泌によって示されているように、ＭＵＣ１およびＰＡＰをコードしているｍＲＮＡ構成物両方を用いた皮内ワクチン接種は、抗原特有ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらした。
【０２３０】
〔５．臨床試験〕
〔５．１  本発明のワクチンの調製〕
本発明のｍＲＮＡワクチンは、それぞれＫＬＫ３／ＰＳＡ（配列番号１９）、ＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ（配列番号２０）、ＰＳＣＡ（配列番号２１）、ＳＴＥＡＰ（配列番号２２）、ＰＡＰ（配列番号２３）またはＭＵＣ１（配列番号２４）をコードしている、６つの個々の、別個に調剤されたＧＣ−最適化ｍＲＮＡから成る。各ｍＲＮＡを、比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）において、ｍＲＮＡへのプロタミンの添加によってプロタミンと複合体化した。１０分間のインキュベーションの後、抗原提供のｍＲＮＡとして用いた同じ量の遊離ｍＲＮＡを添加した。複合体化の後、各調剤されたｍＲＮＡを別個に凍結乾燥した。再構成のために、ｍＲＮＡをリンガー乳酸中に溶解した。本発明のワクチンの各６つの成分は、本発明の６つの抗原のうち１つをコードしている調製および凍結乾燥されたｍＲＮＡを含んでいる。
【０２３１】
〔本発明のワクチンの成分〕
成分１：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＫＬＫ３／ＰＳＡ（配列番号１９）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＫＬＫ３／ＰＳＡ（配列番号１９）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ
成分２：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ（配列番号２０）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ（配列番号２０）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ
成分３：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＰＳＣＡ（配列番号２１）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＰＳＣＡ（配列番号２１）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ
成分４：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＳＴＥＡＰ（配列番号２２）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＳＴＥＡＰ（配列番号２２）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ、
成分５：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＰＡＰ（配列番号２３）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＰＡＰ（配列番号２３）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ
成分６：比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）においてプロタミンと複合体化したＭＵＣ１（配列番号２４）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡおよびＭＵＣ１（配列番号２４）をコードしている１６０μｇのｍＲＮＡ
各成分は、凍結乾燥され、注射用にリンガー乳酸を用いて再構成される。
【０２３２】
〔５．２  第ＩＩ期臨床試験（支持研究）〕
根治的前立腺摘出術（ネオアジュバント治療）の前の６週間の期間、注射装置（ジェット注射）の任意の使用を含む非盲検、ランダム化された第ＩＩ期試験を、実施例５．１に従い調製された本発明のｍＲＮＡワクチンによって４回のワクチン接種を受ける中程度または高リスクの前立腺癌を有する患者において行う。または、該患者を手術の前のワクチン接種なしで観察する。従来の皮内注射を介して処置される患者は、実施例５．１に従う３２０μｇの各ｍＲＮＡを受ける。本発明のワクチンの各成分を、２つの別個の注射部位（１６０μｇｍＲＮＡ／注射部位）において注射した。ジェット注射によって注射された患者は、用量の半分のみ（該用量は、本発明のワクチン１６０μｇ／成分と対応している）を受け、また患者の２つの別個の注射部位（８０μｇｍＲＮＡ／注射部位）において注射した。患者は、第１週、第２週、第３週および第５週において注射を受けた。これらの患者は、４回目のワクチン接種（第６週または第７週）の後、少なくとも１週間後、ただし２週間後よりは前に根治的前立腺摘出術を経る。前立腺摘出術の後、患者は、本発明のワクチンを用いたさらなる２回のワクチン接種を任意で受ける。
【０２３３】
〔５．３  第ＩＩｂ期臨床試験〕
非盲検安全施行を伴う第ＩＩｂ期ランダム化二重盲検プラセボ対照多施設治験を、転移性の外科的去勢抵抗性前立腺癌を有する患者において行う。
【０２３４】
外科手術的な去勢またはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧＮＲＨ）アゴニストまたはアンタゴニスト治療の後、および少なくとも１回のセカンドライン抗ホルモン操作の後、進行している無兆候性のまたは最小限兆候性疾患を有する患者は、本発明のワクチンアームのために比２：１において実施例５．１またはプラセボに従い調製される本発明のワクチンを受ける。
【０２３５】
本発明のワクチンによる治療を、第１、第２、第３、第５、第７、第９、第１２、第１５、第１８および第２４週の１日目において施行し、その後最初のワクチンから１２ヶ月目までは６週毎に施し、その後は３ヶ月毎に施す。
【０２３６】
安全施行を、６人の患者において行った。
【０２３７】
〔治療管理〕
各ワクチン接種の時点において、６つの各ワクチン成分を、各成分あたり２００μｌの２回の皮内（ｉ．ｄ．）注射、合計１２回の注射として、同日に個別に投与する。
【０２３８】
〔結果〕
研究の安全施行部分の結果として、本発明のワクチンは免疫原性であり、患者の８３％において細胞および／またはホルモン免疫反応を誘発することが示され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【配列表】
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