(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡ合成効率が良好で温和な条件で脱保護することができ、かつ脱保護後の精製の容易な、２’位の水酸基が保護されたヌクレオシド又はそのヌクレオチド誘導体の提供。【解決手段】式（１）で表すヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。2018184351.tif 000054（Ｘ１及びＸ２は夫々独立にＨ、置換／非置換のシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基等；Ｂａは修飾／非修飾の核酸塩基；Ｒｐとしては式（Ｐ１）が例示される；Ｒはメトキシ基等の電子供与性を有する置換基；Ｒ１及びＲ２は夫々独立にＨ又はアルキル基）【選択図】図２
2018184351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表すヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。
【化１】
2018184351.tif 000042
（上記一般式（１）中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に、水素原子、置換基を有してもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は下記一般式（２）を表し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表し、Ｒｐは下記一般式（Ｐ１）、（Ｐ２）又は（Ｐ３）を表す。）
【化２】
2018184351.tif 000043
（上記一般式（２）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、炭素数１〜７のアルキル基を表し、Ｒ５はリン酸の保護基を表し、Ｒ３及びＲ４は互いに連結して環構造を形成してもよい。）
【化３】
2018184351.tif 000044
（上記一般式（Ｐ１）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ＋ｒ）は１以上であり、ｎは１以上（５−ｐ−ｑ−ｒ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化４】
2018184351.tif 000045
（上記一般式（Ｐ２）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ＸはＯ又はＳであり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１以上であり、ｎは１以上（３−ｐ−ｑ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化５】
2018184351.tif 000046
（上記一般式（Ｐ３）中、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ７は炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１であり、ｎは１であるが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよく、ｎが０の場合には（ｐ＋ｑ）は２でもよい。）
【請求項２】
下記一般式（１ａ）で表す請求項１記載のヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。
【化６】
2018184351.tif 000047
（一般式（１ａ）中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に、水素原子、置換基を有してもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は下記一般式（２）を表し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表す。）
【化７】
2018184351.tif 000048
（上記一般式（２）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、炭素数１〜７のアルキル基を表し、Ｒ５はリン酸の保護基を表し、Ｒ３及びＲ４は互いに連結して環構造を形成してもよい。）
【請求項３】
下記一般式（３）で表すヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体。
【化８】
2018184351.tif 000049
（上記一般式（３）中、波線を付した単結合はそれぞれＲＮＡのホスホジエステル結合を形成するリン原子（ＲＮＡの末端である場合には末端の水素原子）へ結合し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表し、Ｒｐは下記一般式（Ｐ１）、（Ｐ２）又は（Ｐ３）を表す。）
【化９】
2018184351.tif 000050
（上記一般式（Ｐ１）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ＋ｒ）は１以上であり、ｎは１以上（５−ｐ−ｑ−ｒ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化１０】
2018184351.tif 000051
（上記一般式（Ｐ２）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ＸはＯ又はＳであり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）が１以上であり、ｎは１以上（３−ｐ−ｑ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化１１】
2018184351.tif 000052
（上記一般式（Ｐ３）中、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ７は炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１であり、ｎは１であるが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよく、ｎが０の場合には（ｐ＋ｑ）は２でもよい。）
【請求項４】
下記一般式（３ａ）で表すリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含む請求項３記載のＲＮＡ誘導体。
【化１２】
2018184351.tif 000053
（上記一般式（３ａ）中、波線を付した単結合はそれぞれＲＮＡのホスホジエステル結合を形成するリン原子（ＲＮＡの末端である場合には末端の水素原子）へ結合し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表す。）
【請求項５】
請求項３又は４記載のＲＮＡ誘導体を含むことを特徴とする核酸医薬。
【請求項６】
請求項１又は２記載のヌクレオチドの誘導体を用いてＲＮＡ鎖を伸長させる工程を備えることを特徴とする、ＲＮＡ誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項６記載のＲＮＡ誘導体製造方法で得たＲＮＡ誘導体に対して、還元操作を行うことでＲＮＡの２’位水酸基に施した保護基Ｒｐを脱保護する工程を備えることを特徴とするＲＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体、それを構成単位として含むＲＮＡ誘導体、核酸医薬、及びＲＮＡ誘導体若しくはＲＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬は、合成されたオリゴヌクレオチドを基盤構造とする医薬品である。核酸医薬は、特定のタンパクの発現を抑制する等の作用を持ち、これまで治療の難しかった疾病に対する新たな治療方法を提供するものとして期待されている。こうした核酸医薬として応用可能性のある技術として、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉法、デコイ法等が提案されてきた。これらの中でも、ＲＮＡ干渉法は、ｓｉＲＮＡと呼ばれ２１〜２３量体という比較的短鎖のＲＮＡを用いる手法であり、化学合成したＲＮＡでもこれを実現できることから注目を集めている。
【０００３】
しかしながら、ＲＮＡの化学合成は、ＤＮＡのそれと比べて合成効率が十分とはいえず、困難なのも事実である。ＲＮＡを構成するヌクレオシドは、ＤＮＡの場合と異なり、２’位に水酸基を持つのでこれに保護基を導入しなければならないが、その保護基の導入効率が悪く、また２’位に導入した保護基の立体障害により鎖伸長の反応効率が悪いこと等がその原因として挙げられる。
【０００４】
そのような背景から、例えば特許文献１には、ＲＮＡ合成のために、２’位の水酸基をシアノエチル基で保護したヌクレオシド又はそのヌクレオチドが提案されている。特許文献１によれば、保護基であるシアノエチル基は、温和な条件で効率良くヌクレオシド又はそのヌクレオチドにおける２’位の水酸基に導入できるとされている。また、特許文献２によれば、２’位に保護基として導入されたシアノエチル基は、テトラブチルアンモニウムフロリド（ＴＢＡＦ）を用いることにより、容易に脱保護できるとされる。
【０００５】
また、非特許文献１には、４−ニトロベンジルオキシメチレン基で２’位の水酸基を保護することが提案されている。このような保護基の導入されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトを用いることで、ＤＮＡ合成の際に用いられるデオキシリボヌクレオシドのホスホロアミダイトと同等の鎖伸長速度と鎖伸長効率が実現できるとされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８５２７１号
【特許文献２】特開２００６−２４８９２９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｃｅｋ  Ｃｉｅｓｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００７，９，６７１−６７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１及び２や非特許文献１に記載された手法によれば、２’位の水酸基が保護されたＲＮＡを効率的に合成することが可能である。しかしながら、これを脱保護する場合、２’位の水酸基の保護基としてシアノエチル基を用いた場合には、水溶液中でＴＢＡＦを用いるので脱保護されたＲＮＡの精製が難しく、同じく保護基として４−ニトロベンジルオキシメチレン基を用いた場合には、ニトロ基の還元操作に続いて、０．１Ｍ酢酸水溶液中９０℃の加熱を行うという過酷な条件を用いなければならなかった。また、核酸医薬では、体内での分解を避けつつ作用部位まで薬剤を送達するために、薬剤となるＲＮＡを適切な保護基で修飾する必要があるが、上記のように、脱保護するために必要な９０℃の加熱を人体内で行うことはできない。
【０００９】
本発明は、以上の状況に鑑みてなされたものであり、ＲＮＡ合成効率が良好で温和な条件で脱保護することができ、かつ脱保護後の精製の容易な、２’位の水酸基が保護されたヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以上の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、非特許文献１に記載された４−ニトロベンジルオキシメチレン基を初めとするニトロアリールメトキシメチレンを２’位の水酸基のための保護基とする場合において、芳香環にメトキシ基のような電子供与性基を導入することにより、ニトロ基の還元操作を行った後、３７℃程度の温度条件で脱保護が完了するばかりでなく、脱保護した後に得られたＲＮＡについても極めて容易に精製できることを見出した。このような温度条件で脱保護が可能であれば、ＲＮＡ合成の際に有用であることは勿論、体温での脱保護も可能なので、核酸医薬としても有用である。本発明は、以上の知見によりなされたものであり、以下のようなものを提供する。
【００１１】
（１）本発明は、下記一般式（１）で表すヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体である。
【化１】
2018184351.tif 000003
（上記一般式（１）中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に、水素原子、置換基を有してもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は下記一般式（２）を表し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表し、Ｒｐは下記一般式（Ｐ１）、（Ｐ２）又は（Ｐ３）を表す。）
【化２】
2018184351.tif 000004
（上記一般式（２）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、炭素数１〜７のアルキル基を表し、Ｒ５はリン酸の保護基を表し、Ｒ３及びＲ４は互いに連結して環構造を形成してもよい。）
【化３】
2018184351.tif 000005
（上記一般式（Ｐ１）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ＋ｒ）は１以上であり、ｎは１以上（５−ｐ−ｑ−ｒ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化４】
2018184351.tif 000006
（上記一般式（Ｐ２）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ＸはＯ又はＳであり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１以上であり、ｎは１以上（３−ｐ−ｑ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化５】
2018184351.tif 000007
（上記一般式（Ｐ３）中、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ７は炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１であり、ｎは１であるが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよく、ｎが０の場合には（ｐ＋ｑ）は２でもよい。）
【００１２】
（２）また本発明は、下記一般式（１ａ）で表す（１）項記載のヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体である。
【化６】
2018184351.tif 000008
（一般式（１ａ）中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に、水素原子、置換基を有してもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は下記一般式（２）を表し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表す。）
【化７】
2018184351.tif 000009
（上記一般式（２）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、炭素数１〜７のアルキル基を表し、Ｒ５はリン酸の保護基を表し、Ｒ３及びＲ４は互いに連結して環構造を形成してもよい。）
【００１３】
（３）本発明は、下記一般式（３）で表すヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体でもある。
【化８】
2018184351.tif 000010
（上記一般式（３）中、波線を付した単結合はそれぞれＲＮＡ誘導体のホスホジエステル結合を形成するリン原子（ＲＮＡ誘導体の末端である場合には末端の水素原子）へ結合し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表し、Ｒｐは下記一般式（Ｐ１）、（Ｐ２）又は（Ｐ３）を表す。）
【化９】
2018184351.tif 000011
（上記一般式（Ｐ１）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ＋ｒ）は１以上であり、ｎは１以上（５−ｐ−ｑ−ｒ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化１０】
2018184351.tif 000012
（上記一般式（Ｐ２）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、ＸはＯ又はＳであり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１以上であり、ｎは１以上（３−ｐ−ｑ）以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【化１１】
2018184351.tif 000013
（上記一般式（Ｐ３）中、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、各Ｒ６はそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ７は炭素数１〜５のアルキル基であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立に０又は１で（ｐ＋ｑ）は１であり、ｎは１であるが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよく、ｎが０の場合には（ｐ＋ｑ）は２でもよい。）
【００１４】
（４）また本発明は、下記一般式（３ａ）で表すリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含む（３）項記載のＲＮＡ誘導体である。
【化１２】
2018184351.tif 000014
（上記一般式（３ａ）中、波線を付した単結合はそれぞれＲＮＡのホスホジエステル結合を形成するリン原子（ＲＮＡの末端である場合には末端の水素原子）へ結合し、Ｂａは修飾されていてもよい核酸塩基を表す。）
【００１５】
（５）本発明は、（３）項又は（４）項記載のＲＮＡ誘導体を含むことを特徴とする核酸医薬でもある。
【００１６】
（６）本発明は、（１）項又は（２）項記載のヌクレオチドの誘導体を用いてＲＮＡ鎖を伸長させる工程を備えることを特徴とする、ＲＮＡ誘導体の製造方法でもある。
【００１７】
（７）本発明は、（６）項記載のＲＮＡ誘導体製造方法で得たＲＮＡ誘導体に対して、還元操作を行うことでＲＮＡの２’位水酸基に施した保護基Ｒｐを脱保護する工程を備えることを特徴とするＲＮＡの製造方法でもある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＲＮＡ合成効率が良好で温和な条件で脱保護することができ、かつ脱保護後の精製の容易な、２’位の水酸基が保護されたヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、三塩化チタンによるＯＮ２の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】図２は、三塩化チタンによるＯＮ３の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【図３】図３は、ニトロレダクターゼによるＯＮ１の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、ニトロレダクターゼによるＯＮ２の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【図５】図５は、ニトロレダクターゼによるＯＮ３の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【図６】図６は、ニトロレダクターゼによるＯＮ４の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体の一実施形態、ＲＮＡ誘導体の一実施形態、核酸医薬の一実施形態、ＲＮＡ誘導体の製造方法の一実施態様、及びＲＮＡの製造方法の一実施態様について説明を行うが、本発明は以下の実施形態及び実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の範囲において適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００２１】
［ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体］
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体（以下、単にヌクレオシドの誘導体とも呼ぶ。）は、下記一般式（１）で表す化合物である。この化合物は、ＲＮＡ合成のために好ましく用いられ、特にホスホロアミダイトである場合には、固相合成法による鎖伸長反応において高い反応速度と反応効率を実現できる。
【００２２】
【化１３】
2018184351.tif 000015
【００２３】
本発明は、上記一般式（１）に示すリボヌクレオシドの２’位に特有の保護基（Ｒｐ）を備える点に特徴がある。そこでまずは、保護基となるＲｐについて説明する。上記一般式Ｒｐは、下記一般式（Ｐ１）、（Ｐ２）又は（Ｐ３）で表す１価の基である。
【００２４】
【化１４】
2018184351.tif 000016
【００２５】
上記一般式（Ｐ１）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表す。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペントキシ基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基等が挙げられる。各Ｒ６はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基である。この炭素数１〜５のアルキル基としては、上記で例示したものと同じものを挙げることができる。これらの中でも、Ｒとしては、メトキシ基が好ましい。ｐ、ｑ及びｒは、それぞれ独立に０又は１で、（ｐ＋ｑ＋ｒ）は、１以上である。つまり、上記の芳香環（すなわち、ベンゼン環）において、ニトロ基は、少なくとも１個存在し、メチレン炭素に結合した、芳香環上の炭素原子から１原子離れた（すなわち隣接する）又は３原子離れた炭素原子に結合することになる。ｎは、１以上（５−ｐ−ｑ−ｒ）以下の整数であるが、後述するＲ１及びＲ２の少なくとも一つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。
【００２６】
上記に示すように、各Ｒは、いずれも電子供与性基である。本発明は、ニトロ基及びこうした電子供与性基が芳香環に結合していることがポイントである。次にそのことを説明する。下記スキーム１及び２は、上記一般式（Ｐ１）を説明のための一例として具体化したものである。下記スキーム１及び２に示すように、本発明のヌクレオシドの誘導体は、還元操作によりニトロ基がアミノ基に変換されると、アミノ基に含まれる窒素原子上の孤立電子対が芳香環へ移動し、酸素原子とメチレン炭素間の結合を切断する。このとき、アミノ基に含まれる窒素原子は正電荷を帯びることになるが、芳香環に電子供与性基が結合していることにより、この正電荷を帯びている構造が安定化される。その結果、この反応が進行しやすくなると考えられる。下記スキーム１を参照するとわかるように、この反応は、脱離基に含まれるメチレン炭素に結合した、芳香環上の炭素原子から３原子離れた炭素原子にニトロ基（還元されてアミノ基になる。）が結合していれば進行することになる。また、下記スキーム２を参照するとわかるように、脱離基に含まれるメチレン炭素に結合した、芳香環上の炭素原子から１原子離れた（すなわち隣接する）炭素原子にニトロ基が結合していても同様に反応が進行することになる。下記スキーム１及び２では芳香環がベンゼン環だが、芳香環がどのような構造であっても、このような条件が満たされることにより同じような共鳴構造を書くことができるので、例えば、芳香環がフラン環やチオフェン環やイミダゾール環であっても、芳香環に電子供与性基が結合していることにより、脱保護反応が同じように促進されることになる。後述の一般式（Ｐ２）及び一般式（Ｐ３）はそのような例となる。
【００２７】
なお、下記スキーム１及び２に示すように、芳香環が脱離した後、Ｒｐの一部である−ＣＨ２Ｏ−が２’位の水酸基に結合したままとなるが、この−ＣＨ２Ｏ−は速やかにホルムアルデヒドとなって脱離する。
【００２８】
【化１５】
2018184351.tif 000017
【化１６】
2018184351.tif 000018
【００２９】
上記一般式（Ｐ１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基である。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。Ｒ１及びＲ２は、芳香環に結合する炭素原子（芳香環がベンゼン環ならばベンジル位になる。）に結合しており、これらがアルキル基であれば芳香環との間で超共役を生じて、上記の電子供与性基と同様に、窒素原子上の正電荷を安定化することができる。このため、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であれば、電子供与性基であるＲが芳香環に結合していなくても脱保護反応が促進される。上記「Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。」とは、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であれば、超共役により脱保護反応が促進されるので、必ずしも芳香環にＲが結合していなくてもよい、という意味である。このことは、以下に説明する一般式（Ｐ２）及び（Ｐ３）でも同様である。
【００３０】
上記一般式（Ｐ１）のより具体的な例として、下記一般式（Ｐ１ａ）及び（Ｐ１ｂ）を挙げることができる。勿論、上記一般式（Ｐ１）はこれら一般式（Ｐ１ａ）及び（Ｐ１ｂ）に限定されるものではない。
【００３１】
【化１７】
2018184351.tif 000019
（上記一般式（Ｐ１ａ）中、各Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記一般式（Ｐ１）におけるものと同様であり、ｎは、１以上４以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。上記一般式（Ｐ１ｂ）中、各Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記一般式（Ｐ１）におけるものと同様であり、ｎは、１以上３以下の整数だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。）
【００３２】
【化１８】
2018184351.tif 000020
【００３３】
上記一般式（Ｐ２）中、各Ｒはそれぞれ独立に、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表す。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペントキシ基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基等が挙げられる。各Ｒ６はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基である。この炭素数１〜５のアルキル基としては、上記で例示したものと同じものを挙げることができる。これらの中でも、Ｒとしては、メトキシ基が好ましい。ｐ及びｑは、それぞれ独立に０又は１で、（ｐ＋ｑ）は、１以上である。つまり、上記の五員環において、ニトロ基は、少なくとも１個存在し、メチレン炭素に結合した、五員環上の炭素原子から１原子離れた（すなわち隣接する）又は３原子離れた炭素原子に結合することになる。ｎは、１以上（３−ｐ−ｑ）以下の整数だが、後述するＲ１及びＲ２の少なくとも一つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。
【００３４】
上記一般式（Ｐ２）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基である。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。Ｘは、Ｏ又はＳである。Ｘがこれらのヘテロ原子であることにより、一般式（Ｐ２）における五員環が芳香族性を備えるようになる。このような芳香族性を備えることにより、一般式（Ｐ２）におけるニトロ基が還元された際に脱保護されることは、上記一般式（Ｐ１）の場合と同様である。
【００３５】
上記一般式（Ｐ２）のより具体的な例として、下記一般式（Ｐ２ａ）及び（Ｐ２ｂ）を挙げることができる。勿論、上記一般式（Ｐ２）はこれら一般式（Ｐ２ａ）及び（Ｐ２ｂ）に限定されるものではない。
【００３６】
【化１９】
2018184351.tif 000021
（上記一般式（Ｐ２ａ）中、各Ｒ、Ｘ、Ｒ１及びＲ２は、上記（Ｐ２）におけるものと同様であり、ｎは、１又は２だが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。
【００３７】
【化２０】
2018184351.tif 000022
【００３８】
上記一般式（Ｐ３）中、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、−Ｓｉ（ＯＲ６）３、−ＳｉＲ６（ＯＲ６）２、−ＳｉＲ６２（ＯＲ６）、−ＳｉＲ６３、又は−ＮＲ６２を表す。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペントキシ基等が挙げられる。炭素数１〜５のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基等が挙げられる。各Ｒ６はそれぞれ独立に炭素数１〜５のアルキル基である。この炭素数１〜５のアルキル基としては、上記で例示したものと同じものを挙げることができる。これらの中でも、Ｒとしては、メトキシ基が好ましい。ｐ及びｑは、それぞれ独立に０又は１で、（ｐ＋ｑ）は１である。つまり、上記のイミダゾール環において、ニトロ基は１個存在し、メチレン炭素に結合した、イミダゾール環上の炭素原子から１原子離れた（すなわち隣接する）又は３原子離れた炭素原子に結合することになる。ｎは１であるが、後述するＲ１及びＲ２の少なくとも一つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、ｎは０でもよい。また、ｎが０の場合には、（ｐ＋ｑ）、すなわちイミダゾール環におけるニトロ基の数は２でもよい。
【００３９】
上記一般式（Ｐ３）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基である。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。Ｒ７は、炭素数１〜５のアルキル基である。炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。一般式（Ｐ３）におけるイミダゾール環もまた芳香族性を備えるので、一般式（Ｐ３）におけるニトロ基が還元された際に脱保護されることは、上記一般式（Ｐ１）の場合と同様である。
【００４０】
上記一般式（Ｐ３）のより具体的な例として、下記一般式（Ｐ３ａ）を挙げることができる。勿論、上記一般式（Ｐ３）はこの一般式（Ｐ３ａ）に限定されるものではない。
【００４１】
【化２１】
2018184351.tif 000023
（上記一般式（Ｐ３ａ）中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記一般式（Ｐ３）におけるものと同様であるが、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一つが炭素数１〜５のアルキル基であることを条件に、Ｒは水素原子でもよい。）
【００４２】
上記一般式（１）中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に、水素原子、置換基を有してもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は下記一般式（２）を表す。Ｘ１及びＸ２は、本発明のヌクレオシドの誘導体における５’位の酸素原子と３’位の酸素原子にそれぞれ結合する。水素原子及び下記一般式（２）で表す置換基を除くこれらの置換基は、５’位の水酸基の保護基としてよく用いられるものであるし、下記一般式（２）で表す置換基はホスホロアミダイトである。この一般式（２）で表す置換基が３’位に結合されるとＲＮＡの固相合成にて鎖伸長反応に用いられる材料となる。
【００４３】
【化２２】
2018184351.tif 000024
【００４４】
上記一般式（２）中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、炭素数１〜７のアルキル基を表す。このような置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプシル基等が挙げられる。これらの中でもイソプロピル基が好ましく挙げられ、Ｒ３及びＲ４の両方がイソプロピル基であることが特に好ましく挙げられる。なお、Ｒ３及びＲ４は、互いに連結して環構造を形成してもよい。
【００４５】
Ｒ５はリン酸の保護基である。このような保護基としては、ＲＮＡ合成の鎖伸長反応における各化学処理により脱離することがなく、鎖伸長反応終了後のＲＮＡ切り出しの際の脱保護プロセスで容易に脱離するものが選択される。このような保護基としては、シアノエチル基が好ましく用いられるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
上記一般式（１）中、Ｂａは、修飾されていてもよい核酸塩基を表す。ここで、「核酸塩基」とは、生物の染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、核内小分子ＲＮＡ等、天然に存在する核酸に見出される全ての核酸塩基、及び核酸の合成に使用可能な、置換基を有してもよいヘテロ芳香環全般を含む。これには天然に見出されないものも含まれる。代表的な核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、核酸塩基には保護基を有するものも含まれる。
【００４７】
上記一般式（１）で表す本発明のヌクレオシドの誘導体のうち、特にＲｐをより具体化した例として下記の一般式（１ａ）を挙げることができる。もちろん、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
【化２３】
2018184351.tif 000025
【００４９】
上記一般式（１ａ）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｂａは、上記一般式（１）におけるものと同じである。
【００５０】
次に、本発明のヌクレオシドの誘導体の合成方法を説明するために、一例としてウリジンの２’位水酸基に本発明の特徴となる保護基を導入する方法を説明する。その合成経路の一例を下記のスキーム３に示す。スキーム３に示すように、まず、市販のウリジン１を出発原料とし、３’及び５’位の水酸基をシリル基で保護して化合物２を得る。次いで、化合物２を無水酢酸及び酢酸の共存下にて反応させ化合物３とする。その後、化合物３にベンジルアルコール類化合物（２−メトキシ−４−ニトロベンジルアルコール、又は化合物８）をトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）及びＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）と共に加え、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（Ｅｔ３Ｎ−３ＨＦ）を用いて３’及び５’位のシリル保護基を除去し、２’位水酸基が保護されたウリジン４、９を得る。化合物４のウリジンは、上記一般式（Ｐ１）において、ベンゼン環にメトキシ基が１個導入されたものであり、化合物９のウリジンは、上記一般式（Ｐ１）において、ベンゼン環にメトキシ基が２個導入されたものである。
【００５１】
【化２４】
2018184351.tif 000026
【００５２】
また、上記化合物４及び９のヌクレオシド誘導体から、ＲＮＡ合成のためのモノマー化合物を得るための合成経路の一例を下記スキーム４に示す。スキーム４は、上記化合物４及び９のヌクレオシド誘導体の５’位水酸基をトリチル化し、３’位水酸基を亜リン酸化してホスホロアミダイト（化合物１３及び１５）を得る経路の一例である。
【００５３】
【化２５】
2018184351.tif 000027
【００５４】
本発明のヌクレオシドの誘導体は、２’位の水酸基が保護されているものの、ＲＮＡ合成の際の鎖伸長反応において、従来見られたような立体障害による効率低下がなく、高い効率で反応を進行させることが可能である。また、２’位に導入された保護基は、保護基中のニトロ基をアミノ基に還元する還元操作を行うことで、弱酸性〜中性の水溶液中で容易に脱離させることが可能であり、かつ、脱離した保護基が、逆相カラムクロマトグラフィー等による処理で容易に取り除かれるという特徴を備える。この脱保護は、ヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体の状態で行うことが可能なのは勿論、ＲＮＡ合成して得たＲＮＡ誘導体の状態で行うことも可能なので、必要に応じて所望のタイミングで行うことが可能である。
【００５５】
脱保護を行うための還元操作で用いる還元剤としては、ニトロ基の還元において通常用いられる還元剤を用いることができる。このような還元剤としては、三塩化チタン、アジチオン酸、ヨウ化サマリウム、Ｚｎダスト等を挙げることができるが、中でも三塩化チタンを好ましく挙げることができる。また、この還元処理は、上記に挙げた還元剤のみならず、ＮＡＤＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下、ニトロレダクターゼのような細胞内酵素によっても進行させることが可能である。そのため、２’位の水酸基が保護されたＲＮＡ誘導体を本発明のヌクレオシド誘導体から合成し、これを核酸医薬として人体に投与して所望の細胞まで送達させた後に、細胞内酵素により脱保護させて機能を発現させるような使い方も可能である。特に、癌細胞のように、還元環境に置かれた細胞内では上記の脱保護が速やかに進行する。
【００５６】
［ＲＮＡ誘導体］
下記一般式（３）で表すリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体も本発明の一つである。このＲＮＡ誘導体は、上記で説明した本発明のヌクレオシド誘導体をもとにＲＮＡ合成して得られるものであり、構成単位となるヌクレオチドの少なくとも一部において、２’位の水酸基が上述の保護基で保護されている。本発明のＲＮＡ誘導体は、全ての構成単位において２’位に上述の保護基を備えていてもよいし、一部の構成単位においてのみ２’位に上述の保護基を備えていてもよい。なお、ＲＮＡ誘導体の構成単位とは、ＲＮＡ誘導体を構成する重合鎖に含まれる一つ一つのヌクレオチドからリン酸部分を取り除いた断片部分（すなわち、下記一般式（３）で表す部分）をいう。
【００５７】
【化２６】
2018184351.tif 000028
【００５８】
上記一般式（３）中、波線を付した単結合はそれぞれＲＮＡ誘導体のホスホジエステル結合を形成するリン原子へ結合する。なお、ＲＮＡ誘導体の末端に上記一般式（３）で表す構成単位が存在する場合、一般式（３）において波線を付した単結合は、末端に存在する水素原子に結合する。
【００５９】
上記一般式（３）において、Ｂａ及びＲｐは、上記一般式（１）におけるＢａ及びＲｐと同じものである。そのため、上記一般式（３）におけるＢａ及びＲｐについてのここでの説明を省略する。
【００６０】
本発明のＲＮＡ誘導体は、２’位の水酸基が、上記一般式（Ｐ１）〜（Ｐ３）で表す保護基で保護されており、この保護基は、一般式（Ｐ１）〜（Ｐ３）に示すニトロ基が還元されることで、弱酸性〜中性の水溶液中、３７℃付近の温度で容易に脱保護される。そして、脱保護反応を行った水溶液をそのまま逆相カラムクロマトグラフィーで処理することにより、脱離した保護基由来の化合物と目的のＲＮＡとを容易に分離することができる。この脱保護は、ＲＮＡ誘導体に対する還元操作を行うことで進行する。還元操作に用いる還元剤は、既に説明したように、ニトロ基の還元において通常用いられる還元剤に加えて、ＮＡＤＨの存在下、ニトロレダクターゼのような細胞内酵素によっても進行させることができる。
【００６１】
このため、本発明のＲＮＡ誘導体は、ＲＮＡ合成における中間体として有用であるばかりでなく、核酸医薬としても有用である。すなわち、２’位の水酸基が保護された、本発明のＲＮＡ誘導体を核酸医薬として人体に投与して所望の細胞まで送達させた後に、細胞内酵素により脱保護させて機能を発現させるような使い方も可能である。特に、癌細胞のように、還元環境に置かれた細胞内では上記の脱保護が速やかに進行する。
【００６２】
［核酸医薬］
上記本発明のＲＮＡ誘導体を含むことを特徴とする核酸医薬もまた、本発明の一つである。これについては上記ＲＮＡ誘導体で説明した通りであるので、ここでの説明を省略する。
【００６３】
［ＲＮＡ誘導体の製造方法］
上記本発明のヌクレオチドの誘導体を用いてＲＮＡ鎖を伸長させる工程を備えることを特徴とするＲＮＡ誘導体の合成方法もまた、本発明の一つである。既に説明したように、本発明のヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体は、２’位の水酸基に特定の保護基Ｒｐ（すなわち、上記一般式（Ｐ１）〜（Ｐ３）で表す基）を備えたＲＮＡ誘導体の合成に用いることができる。このとき、ＲＮＡ鎖を伸長させる工程を行うことになるが、そのような工程としてはホスホロアミダイトを用いた固相合成法を初めとして各種のものが公知なので、目的に合った方法を適宜選択して行えばよい。
【００６４】
［ＲＮＡの製造方法］
上記本発明のＲＮＡ誘導体の製造方法で得たＲＮＡ誘導体に対して、還元操作を行うことでＲＮＡの２’位水酸基に施した保護基Ｒｐを脱保護する工程を備えることを特徴とするＲＮＡの製造方法もまた、本発明の一つである。既に説明したように、本発明のＲＮＡ誘導体は、２’位の水酸基に導入された保護基Ｒｐ（すなわち、上記一般式（Ｐ１）〜（Ｐ３）で表す基）を備え、この保護基Ｒｐは、弱酸性〜中性の水溶液中で還元操作を行うことで容易に脱離させることが可能である。そして、この還元操作を行った水溶液を逆相カラムクロマトグラフィー等で処理することにより、保護基が脱離して生じた化合物と目的物であるＲＮＡとを容易に分離することができる。これらのことについては既に説明した通りであるので、ここでの説明を省略する。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を示すことにより本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。なお、下記の合成例における化合物番号は、上記スキーム３及び４にて化合物に付した番号に対応する。
【００６６】
・化合物２の合成
【化２７】
2018184351.tif 000029
【００６７】
ウリジン（１０．４９ｇ、４２．５９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで三回共沸脱水した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ピリジン（２００ｍＬ）に溶解した。これに、１，３−ジクロロ−１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン（ＴＩＰＤＳＣｌ２、１６．３５μＬ、５１．１１ｍｍｏｌ）を加え、氷浴上で７時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により原料消失を確認し、水（２０ｍＬ）を加え、減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、水で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜０：１００で展開、８７．５：１２．５〜７５：２５で溶出）で精製し、化合物２を白色泡状固体（１８．３９ｇ、３７．７８ｍｍｏｌ、収率８９％）として得た。
【００６８】
・化合物３の合成
【化２８】
2018184351.tif 000030
【００６９】
化合物２（４．０２ｇ、８．２６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、７ｍＬ）に溶解した。酢酸（ＡｃＯＨ、１１ｍＬ、１８９．９８ｍｍｏｌ）、及び無水酢酸（Ａｃ２Ｏ、７ｍＬ、７４．３４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で３日間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、氷浴上で飽和炭酸ナトリウム水溶液を加えた。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、及び飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜０：１００で展開、７５：２５で溶出）で精製し、化合物３を白色粉末固体（３．４２ｇ、６．２５ｍｍｏｌ、収率７５．７％）として得た。
【００７０】
・化合物４の合成
【化２９】
2018184351.tif 000031
【００７１】
化合物３（２７６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）及び２−メトキシ−４−ニトロベンジルアルコール（１０３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１．７ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ、１２６ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（４９７ｍｇ）、及びトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ、５０μＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を順次加え、ドライアイス＋アセトニトリル上で４０分撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、２８５μＬ）を加え、セライト濾過し、減圧下濃縮した。酢酸エチルに溶解させ、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えた。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。これを無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（Ｅｔ３Ｎ−３ＨＦ、２８５μＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９７：３で展開、９８：２で溶出）で精製し、化合物４を黄色粉末固体（０．１２９ｇ、０．２９４ｍｍｏｌ、収率５８．６％）として得た。化合物４は本発明のヌクレオシド誘導体に相当し、２’位水酸基の保護基に含まれる芳香環にメトキシ基が１個導入されたものになる。
【００７２】
・化合物６の合成
【化３０】
2018184351.tif 000032
【００７３】
３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（化合物５、５ｇ、２７．３ｍｍｏｌ）を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）に溶解させた。Ｋ２Ｓ２Ｏ８（７．４ｇ）を水（１５０ｍＬ）に溶解させたものを加え、室温で１週間撹拌した。その後、濃硫酸をｐＨ１〜２になるまで加え、吸引濾過した。濾液を１時間熱還流させ、放冷した。その後、吸引濾過し、化合物６を茶色固体（１．５２ｇ、７．６４ｍｍｏｌ、収率２８％）として得た。
【００７４】
・化合物７の合成
【化３１】
2018184351.tif 000033
【００７５】
化合物６（１．０７９ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）を反応容器に入れてアルゴン置換し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍＬ）に溶解させた。ＣＨ３Ｉ（９３４μＬ、８１．３ｍｍｏｌ）、及びＫ２ＣＯ３（２．０７ｇ、１０８．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で３日間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、水で２回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜７０：３０で展開、９０：１０で溶出）で精製し、化合物７を黄色粉末固体（０．７７８ｇ、３．２３ｍｍｏｌ、収率６０％）として得た。
【００７６】
・化合物８の合成
【化３２】
2018184351.tif 000034
【００７７】
化合物７（５０２ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を反応容器に入れてアルゴン置換し、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させた。氷浴上で１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ、６．２４ｍＬ、６．２４ｍｍｏｌ）を加え、氷浴上で２時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、アセトン（４ｍＬ）、飽和塩化アンモニウム水溶液（１２ｍＬ）を順次加え、セライト濾過をした。その後、減圧下濃縮をし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜４０：６０で展開、６０：４０で溶出）で精製し、化合物８を黄色粉末固体（０．３０７ｇ、１．４４ｍｍｏｌ、収率６９．２％）として得た。
【００７８】
・化合物９の合成
【化３３】
2018184351.tif 000035
【００７９】
・化合物９の合成
化合物３（０．６７２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及び化合物８（２８３ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで２回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ、３２６ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（４９６ｍｇ）、及びトリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ、１２０μＬ、１．３６ｍｍｏｌ）を順次加え、ドライアイス＋アセトニトリル上で３．５時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、１ｍＬ）を加え、セライト濾過し、減圧下濃縮した。その後、飽和炭酸ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。これを無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで２回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（Ｅｔ３Ｎ−３ＨＦ、８５５μＬ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９４：６で展開、９８：２で溶出）で精製し、化合物９を黄色粉末固体（０．３３２ｇ、０．７１ｍｍｏｌ、収率５９％）として得た。化合物９は本発明のヌクレオシド誘導体に相当し、２’位水酸基の保護基に含まれる芳香環にメトキシ基が２個導入されたものになる。
【００８０】
・化合物１１の合成
【化３４】
2018184351.tif 000036
【００８１】
上記非特許文献１に記載された手順にて化合物１０を合成した。化合物１０は、２’位の水酸基に導入された保護基における芳香環に電子供与性基が導入されておらず、本発明のヌクレオシド誘導体に該当しない。なお、化合物１０の５’位の水酸基はジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）で保護されている。化合物１０（３００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで５回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ジクロロメタン（４．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２１９μＬ、１．２６ｍｍｏｌ）、及び２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２０６μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の進行を確認し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜２０：８０で展開、５０：５０で溶出）で精製し、化合物１１を白色泡状固体（１８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、４８．３％）として得た。化合物１１は、本発明に該当せず、比較用のホスホロアミダイトである。
【００８２】
・化合物１２の合成
【化３５】
2018184351.tif 000037
【００８３】
化合物４（３１６ｍｇ、０．７１９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、反応容器に入れてアルゴン置換した後、ピリジン（７．０ｍＬ）に溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ、２６８ｍｇ、０．７９１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、水を少量加え、溶液を減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９７：３で展開、９８：２で溶出）で精製し、化合物１２を白色粉末固体（０．４０４ｇ、０．６３９ｍｍｏｌ、収率８９．０％）として得た。
【００８４】
・化合物１３の合成
【化３６】
2018184351.tif 000038
【００８５】
化合物１２（３５２ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで５回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ジクロロメタン（４．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２４６μＬ、１．４１ｍｍｏｌ）、及び２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２３０μＬ、１．０３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の進行を確認し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜４０：６０で展開、５０：５０〜４０：６０で溶出）で精製し、化合物１３を白色泡状固体（２８７ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ、収率６４．８％）として得た。
【００８６】
・化合物１４の合成
【化３７】
2018184351.tif 000039
【００８７】
化合物９（２７２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、反応容器に入れてアルゴン置換した後、ピリジン（６．０ｍＬ）に溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ、２６６ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間静置した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、水を少量加え、溶液を減圧下濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９６：４で展開、９９：１で溶出）で精製し、化合物１４を黄色泡状固体（０．３９４ｇ、０．５１ｍｍｏｌ、収率８８％）として得た。
【００８８】
・化合物１５の合成
【化３８】
2018184351.tif 000040
【００８９】
化合物１４（３４４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで７回共沸脱水し、無水トルエンで５回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、ジクロロメタン（４．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２３５μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）、及び２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２２１μＬ、０．９９ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の進行を確認し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄した。水層に目的物が含まれていた為、ジクロロメタンを用いて抽出した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０〜４０：６０で展開、４０：６０で溶出）で精製し、化合物１５を黄色泡状固体（２６７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率６１％）として得た。
【００９０】
［化合物４の化学的還元］
２’位水酸基の保護基にメトキシ基が１個導入された化合物４（１０ｍｇ、０．０２２８ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ＮＨ４Ｃｌ（３ｍｇ、０．０９１２ｍｍｏｌ）及びＺｎ（５ｍｇ、０．１５９６ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の進行を確認したところ、原料のスポットの消失と新たなスポットの出現を確認した。新たなスポットはニトロ基が還元されて生成した中間体と考えられ、遊離の（すなわち、脱保護された）ウリジンのスポットは現れなかった。セライト濾過を行い、濾液を減圧下濃縮した。残渣をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、そこから５０μＬとり、ｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸緩衝液を５０μＬ加え、３７℃で静置した。ＴＬＣにより、遊離のウリジンと同じＲｆ値のスポットが新たに出現したことが確認された。このことから、２’位水酸基の保護基にメトキシ基が１個導入された化合物４では、還元操作を行った後、緩衝液を加えて弱酸性を維持することで脱保護されることがわかった。なお、２’位水酸基の保護基にメトキシ基が導入されていない化合物（非特許文献１に記載された化合物）では、同様の操作を行っても遊離のウリジンは生成せず、脱保護されなかった。
【００９１】
［化合物９の化学的還元］
化合物９（１０ｍｇ、０．０２１３ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ＮＨ４Ｃｌ（８．４ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）及びＺｎ（１４ｍｇ、０．４４７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で撹拌した。ＴＬＣにより、ウリジンと同じＲｆ値のスポットが新たに出現したことが確認された。このことから、２’位水酸基の保護基にメトキシ基が２個導入された化合物９では、還元操作を行うだけで脱保護されることがわかった。
【００９２】
以上の結果から、メトキシ基が１個である化合物４、及びメトキシ基が２個である化合物９は、いずれも還元操作を行うことにより常温にて脱保護が可能だったが、メトキシ基が２個の化合物９は、メトキシ基が１個の化合物４よりも脱保護されやすかった。なお、メトキシ基が０個だと還元操作を行っても常温では脱保護されなかった。
【００９３】
［オリゴヌクレオチドの合成］
２’位水酸基の保護基に導入されたメトキシ基が０個のホスホロアミダイトである化合物１１、同じくメトキシ基が１個のホスホロアミダイトである化合物１３、及び同じくメトキシ基が２個のホスホロアミダイトである化合物１５をそれぞれ用いて、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いた固相ホスホロアミダイト法により、表１に示す配列を有するオリゴヌクレオチド（ＯＮ１〜ＯＮ４）を合成した。なお、表１に示した配列において、Ｔはチミン、Ｕ（ＭｅＯ）０は２’位水酸基に保護基を持ち、この保護基に導入されたメトキシ基が０個のウラシル、Ｕ（ＭｅＯ）１は同じくメトキシ基が１個のウラシル、Ｕ（ＭｅＯ）２は同じくメトキシ基が２個のウラシルを意味する。
【００９４】
【表１】
2018184351.tif 000041
【００９５】
［三塩化チタンによるＯＮ２の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ２溶液（５．０μＬ）を測り取り、内部標準として１ｍＭチミジン溶液（４．８μＬ）を加え、乾固させた。２Ｍクエン酸緩衝液（２０μＬ）、純水（１７９．６μＬ）、及び１Ｍ三塩化チタン（０．２μＬ）を順次加え、脱保護反応を行った。経時毎に１０μＬずつサンプリングし、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図１に示す。図１は、三塩化チタンによるＯＮ２の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【００９６】
［三塩化チタンによるＯＮ３の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ３溶液（４．３μＬ）を測り取り、内部標準として１ｍＭチミジン溶液（２．４μＬ）を加え、乾固させた。２Ｍクエン酸緩衝液（２０μＬ）、純水（１７２．９μＬ）、及び１Ｍ三塩化チタン（０．４μＬ）を順次加え、脱保護反応を行った。経時毎に１０μＬずつサンプリングし、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図２に示す。図２は、三塩化チタンによるＯＮ３の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【００９７】
図１に示すように、ＯＮ２では、１時間後には出発物質のピークが消失し、ニトロ基がアミノ基に還元された中間体と、脱保護体である５’−ＴＴＴＴＵ−３’のピークが確認された。図２に示すように、ＯＮ３では、１時間後に出発物質のピークが消失し、ＯＮ２の結果と同様に中間体と思われる保持時間２４分付近のピークと、５’−ＴＴＴＴＵ−３’のピークが確認された。図１と図２のそれぞれについて１２時間後の結果を比較すると、１２時間後では、メトキシ基が２個導入されたＯＮ３のほうが、メトキシ基が１個導入されたＯＮ２よりも脱保護反応が進んでいることがわかる。
【００９８】
［ニトロレダクターゼによるＯＮ１の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ１溶液（１０．８μＬ）を測り取り、内部標準として５００μＭ  Ｎ６−Ｂｅｎｚｏｙｌ−２’−ｄＡ−Ｈｙｄｒａｔｅ溶液（７．２μＬ）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、９０μＬ）、１００ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液（３０μＬ）、及び純水（４２μＬ）を順次加え、３７℃の恒温槽に２０分間静置した。そこから６０μＬを別のマイクロチューブに取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、２０μＬ）、及び純水２０μＬを加え、これを反応前とした。原液に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、４０μＬ）、純水３０μＬ、及びニトロレダクターゼ水溶液（１０μＬ）を加え、酵素反応を行った。経時毎に１０μＬずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図３に示す。図３は、ニトロレダクターゼによるＯＮ１の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【００９９】
［ニトロレダクターゼによるＯＮ２の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ２溶液（３．７５μＬ）を測り取り、内部標準として５００μＭ  Ｎ６−Ｂｅｎｚｏｙｌ−２’−ｄＡ−Ｈｙｄｒａｔｅ溶液（７．２μＬ）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、９０μＬ）、１００ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液（３０μＬ）、及び純水（４９．０５μＬ）を順次加え、３７℃の恒温槽に２０分間静置した。そこから６０μＬを別のマイクロチューブに取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、２０μＬ）、及び純水２０μＬを加え、これを反応前とした。原液に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、４０μＬ）、純水３０μＬ、及びニトロレダクターゼ水溶液（１０μＬ）を加え、酵素反応を行った。経時毎に１０μＬずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図４に示す。図４は、ニトロレダクターゼによるＯＮ２の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【０１００】
［ニトロレダクターゼによるＯＮ３の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ３溶液（６．５μＬ）を測り取り、内部標準として５００μＭ  Ｎ６−Ｂｅｎｚｏｙｌ−２’−ｄＡ−Ｈｙｄｒａｔｅ溶液（７．２μＬ）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、９０μＬ）、１００ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液（３０μＬ）、及び純水（４６．３μＬ）を順次加え、３７℃の恒温槽に２０分間静置した。そこから６０μＬを別のマイクロチューブに取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、２０μＬ）、及び純水２０μＬを加え、これを反応前とした。原液に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、４０μＬ）、純水３０μＬ、及びニトロレダクターゼ水溶液（１０μＬ）を加え、酵素反応を行った。経時毎に１０μＬずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図５に示す。図５は、ニトロレダクターゼによるＯＮ３の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【０１０１】
［ニトロレダクターゼによるＯＮ４の脱保護反応］
マイクロチューブにＯＮ４溶液（４．０μＬ）を測り取り、内部標準として５００μＭ  Ｎ６−Ｂｅｎｚｏｙｌ−２’−ｄＡ−Ｈｙｄｒａｔｅ溶液（７．２μＬ）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、９０μＬ）、１００ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液（３０μＬ）、及び純水（４８．８μＬ）を順次加え、３７℃の恒温槽に２０分間静置した。そこから６０μＬを別のマイクロチューブに取り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、２０μＬ）、及び純水２０μＬを加え、これを反応前とした。原液に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、４０μＬ）、純水３０μＬ、及びニトロレダクターゼ水溶液（１０μＬ）を加え、酵素反応を行った。経時毎に１０μＬずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるＨＰＬＣで分析した。その結果を図６に示す。図６は、ニトロレダクターゼによるＯＮ４の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すＨＰＬＣチャートである。
【０１０２】
図３に示すように、２’位水酸基の保護基がメトキシ基を持たないＯＮ１は、出発物質のピークは消失したものの、脱保護された５’−ＴＴＴＴＵ−３’のピークが観察されることはなかった。また、図４及び図５に示すように、ＯＮ２（メトキシ基１個）及びＯＮ３（メトキシ基２個）のいずれも出発物質が消失し、徐々に５’−ＴＴＴＴＵ−３’のピークが増加するのが確認されたが、ＯＮ３（メトキシ基２個）のほうが脱保護速度が速いことが確認された。これら三種類（ＯＮ１〜ＯＮ３）の脱保護実験の結果より、保護基上のニトロ基のアミノ基への還元反応は、どの保護基でも生じていることが確認された。しかし、保護基上にメトキシ基が無い場合には、ニトロ基が還元されてアミノ基に変換されても、その後の脱保護反応が進まないことが確認された。また、保護基上のメトキシ基が増えるのに伴って、還元された後の脱保護反応の速度が大きくなることも確認された。
【０１０３】
さらに、図６に示すように、２’位水酸基保護ウリジンを中央部に導入したＯＮ４（５’−ＴＴＵ（ＭｅＯ）２ＴＴ−３’）を用いて脱保護反応を行った場合にも、ＯＮ３のときと同様に、時間経過とともに脱保護反応が進行して５’−ＴＴＵＴＴ−３’のピークが増加し、４８時間後には反応が完結した。この結果から、本発明のヌクレオシド誘導体は、ＲＮＡ合成後の脱保護を温和な条件で、かつ速やかに行えることが示された。
【図１】
2018184351.tif 000055
【図２】
2018184351.tif 000056
【図３】
2018184351.tif 000057
【図４】
2018184351.tif 000058
【図５】
2018184351.tif 000059
【図６】
2018184351.tif 000060