(57)【要約】【課題】本発明は、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質およびこれを用いたＬ−カルニチンの測定法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質の、アシルカルニチンエステラーゼとしての使用：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質の、アシルカルニチンエステラーゼとしての使用：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質を用いて検体中に存在するアシルカルニチンよりＬ−カルニチンを生成する方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質を用いて検体中に存在するアシルカルニチンよりＬ−カルニチンを生成し、前記検体中のＬ−カルニチンを測定することにより検体中の総カルニチンを測定する方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質の製造と利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルニチンは脂肪酸代謝において重要な役割を果たしているアミノ酸誘導体である。脂肪酸を運搬するキャリアーとして、ミトコンドリア内での脂肪酸のβ酸化に必要不可欠な因子であり、有機酸血症などの場合では蓄積した中間代謝物の有機酸と結合してミトコンドリア外に排出する解毒作用を有するなど、生体内で重要な役割を果たしている。
生体内でＬ−カルニチンとアシルＣｏＡからアシル−Ｌ−カルニチンが合成される。
【０００３】
臨床的には、血液中のカルニチンの測定は、生体の代謝異常の判定のために重要であり、近年、低フリーカルニチン血症などの対象疾患の有機酸代謝異常や脂肪酸代謝異常症などに広げた拡大新生児マススクリーニングが全国的な広がりを見せている。さらに、Ｌ−カルニチン製剤の適応拡大がなされ、メチルマロン酸血症とプロピオン酸血症の２つに加え、カルニチン欠乏症への適応が追加され、投与可能な疾患が大きく広がってきている。先天性の代謝異常や、肝硬変・慢性腎疾患に伴う症状、人工透析などの医療行為の副作用でカルニチン欠乏症が起こると、肝臓での糖新生が阻害され、低ケトン性低血糖を示す。
【０００４】
さらに、アシル−Ｌ−カルニチンに関しては、カルニチン代謝異常症の鑑別にも応用されている。また、タンデマススクリーニングの代替法として期待されており、幅広い基質特異性も要求される。
【０００５】
アシル−Ｌ−カルニチンを測定するために、アシルカルニチンエステラーゼを用いた酵素法が開発され、汎用の自動分析装置を用いて定量することが可能になった（特許文献１から３）。
【０００６】
そこで、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質素を種々の微生物培養物からスクリーニングした結果、アルカリゲネス属に属する微生物が産生するタンパク質が短鎖から長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対して活性を示すことが見いだされた(特許文献１)。
【０００７】
しかしながら、現状では天然供給源から酵素を精製するため、精製効率が低く、大量生産には不向きであった。今後、カルニチン測定試薬の市場拡大が予想されることから、安定的に高い精製効率でアシルカルニチンエステラーゼを製造する方法が求められている。
【０００８】
一方、Pseudomonas aeruginosa PA5384遺伝子が短鎖アシル−Ｌ−カルニチン加水分解酵素であることが報告されたが、中鎖乃至長鎖のアシル−Ｌ−カルニチンへの反応性が乏しく、総カルニチン測定には応用できない可能性が高いことが示唆された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平４−１４８６８１号公報
【特許文献２】特開平９−３２２８００号公報
【特許文献３】特開平１０−３２３１９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、大腸菌を宿主として発現させた短鎖アシル−Ｌ−カルニチンから長鎖アシル−Ｌ−カルニチンまで広い基質特異性を有するアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質を用いたアシル−Ｌ−カルニチンの測定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題に鑑み、広くアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を探索した結果、総カルニチン測定に応用できる性質を有するアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を見出し、該遺伝子の大腸菌での可溶化発現に成功した。すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１２】
[１]  以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質の、アシルカルニチンエステラーゼとしての使用：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
[２]  以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質を用いて検体中に存在するアシルカルニチンよりＬ−カルニチンを生成する方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
[３]  以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質を用いて検体中に存在するアシルカルニチンよりＬ−カルニチンを生成し、前記検体中のＬ−カルニチンを測定することにより検体中の総カルニチンを測定する方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により効率良くアシルカルニチンエステラーゼを生産することが可能になる。また、本発明により作製されたアシルカルニチンエステラーゼは総カルニチン測定試薬として応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アシルカルニチンエステラーゼ活性の測定法の原理を示す図である。
【図２】プラスミドｐＴＲＰ−ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗの構築図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質の製造
本発明はアシルカルニチンエステラーゼ活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の、アシルカルニチンエステラーゼとしての使用であり、より具体的には配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いたアシル−Ｌ−カルニチンの測定法である。
【００１６】
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質も、本発明のタンパク質に包含される。さらに、配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質も、本発明のタンパク質に包含される。数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個、さらに好ましくは１個をさす。「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列」は、部分特異的突然変異誘発法等、当業者に周知の方法により、アミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより取得可能である。
【００１７】
アシルカルニチンエステラーゼ活性の測定は、酵素サイクリング法に基づく方法により行う。検体中のアシルカルニチンはアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質の作用によりＬ−カルニチンを生成する。Ｌ−カルニチンは、カルニチン脱水素酵素及びβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（チオＮＡＤ＋）により特異的に酸化され、デヒドロカルニチン及びβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（チオＮＡＤＨ）を生成する。デヒドロカルニチンはカルニチン脱水素酵素及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の存在下で、Ｌ−カルニチン及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ＋）を生成する。消費されるＮＡＤＨ量若しくは生成するチオＮＡＤＨ量はアシルカルニチンエステラーゼ活性を反映している。アシルカルニチンエステラーゼ活性の測定法の原理を図１に示す。
【００１８】
アシルカルニチンエステラーゼ活性測定法は特開平４−１４８６８１公報を参考に一部改変して実施した。具体的には、１００ ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ９．０）、１ ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）の反応液１．０ ｍＬを３７℃で５分間インキュベートする。次いで、６４０Ｕ ジアホラーゼ（オリエンタル酵母工業社製）、１５Ｕ Ｌ−カルニチン脱水素酵素、１００ ｍＭ   ＫＣｌ、０．０２５％ ＮＢＴ（和光純薬工業社製）、０．５ ｍＭオクタノイル−Ｌ−カルニチン（ＴＯＣＲＩＳ社製）を加え、被検体０．０２ ｍＬを添加して３７℃でインキュベートした後に１分間あたりの５５０ｎｍの吸光度変化を測定する（Ａ１）。被検体を添加しないブランクの吸光度変化も測定する（Ａ０）。計算式は以下の通りである。
【００１９】
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【００２０】
アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質とは、上記のような活性測定条件で測定した活性値があり、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０%以上の相同性を示すタンパク質のことをいう。
【００２１】
また、本発明のアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質は、短鎖から長鎖アシル−Ｌ−カルニチンのいずれのアシル−Ｌ−カルニチンにも反応する。短鎖から長鎖アシル−Ｌ−カルニチンとして、アセチル−Ｌ−カルニチン、プロピオニル−Ｌ−カルニチン、ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン、オクタノイル−Ｌ−カルニチン、デカノイル−Ｌ−カルニチン、ラウロイル−Ｌ−カルニチン、ミリストイル−Ｌ−カルニチン、パルミトイル−Ｌ−カルニチン、ステアロイル−Ｌ−カルニチン等が挙げられる。
【００２２】
配列番号２のアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（アシルカルニチンエステラーゼ遺伝子）として、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。遺伝子には、核酸、および１本鎖、２本鎖または３本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子、例えば、配列番号１の塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に包含される。さらに、配列番号１の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、アシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に包含される。数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個、さらに好ましくは１個をさす。
【００２３】
配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子には、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、高ストリンジェントな条件が好ましい。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで洗浄する条件である。
【００２４】
本発明のアシルカルニチンエステラーゼは、宿主に上記アシルカルニチンエステラーゼ遺伝子を導入してなる形質転換体を培養し、培養物からアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質を採取することにより製造することができる。宿主にアシルカルニチンエステラーゼ遺伝子を導入してなる形質転換体は、当技術分野で公知の方法で製造できる。本発明において、遺伝子の導入は、遺伝子の機能を有するポリヌクレオチドを組換え核酸として宿主に導入する全ての場合を含む。ポリヌクレオチドは、核酸、および１本鎖、２本鎖または３本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。遺伝子の導入には、組換えベクターによって導入する場合や、ＰＣＲ等で合成した核酸を用いて相同組換えによって導入する場合が含まれる。
【００２５】
遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、または動物もしくは植物の生細胞を任意に選択できるが、本発明においては、微生物が好ましく、特に大腸菌が好ましい。宿主大腸菌は通常遺伝子工学に用いられる大腸菌Ｋ−１２株の中から適切なものを選択する。代表的なものとしてＪＭ１０５やＪＭ１０９が挙げられるが、ＤＨ５あるいは誘導型の発現系に用いられるＢＬ２１、Ｎ９９ｃＩ+などを使用してもよい。
【００２６】
遺伝子は、より好ましくは、遺伝子の発現を強化する発現ベクターによって導入される。発現ベクターは、導入しようとする遺伝子を、その発現を強化する種々のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片と融合させたものである。好ましくは、発現ベクターは、遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるための転写プロモーター、転写ターミネーター、選択マーカーを含み得る。所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、オペレーター、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２７】
ベクターとしては、限定はされないが、大腸菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミド、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９８、ｐＶＣ１８、ｐＶＣ１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＭａｌ−ｃ２、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＴＲＰ等を好ましく使用でき、その他にもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とする場合によく利用されるＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４０４、ｐＡＵＲ１０１、ｐＫＧ１等も利用でき、枯草菌を宿主とする場合によく利用されるプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４等も利用できる。更に、ｐＢＩ１２２、ｐＢＩ１１０１その他の各種のものも限定なく使用できる。
【００２８】
大腸菌での発現用の転写プロモーターとして、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、あるいはこれらを融合したｔａｃおよびｔｒｃプロモーター、λファージＰＬおよびＰＲプロモーター、Ｔ７ファージのプロモーター等が例として挙げられる。しかし、プロモーターが強力すぎると目的タンパク質の大腸菌内における発現が過多となり、その結果、目的タンパク質が封入体を形成しやすくなり、その後の分離および精製工程が困難となる。ゆえに可溶性画分への発現あるいは培養上清中へのタンパク質の分泌を可能にすべく最適なプロモーターを選択する必要があり、このような点を考慮するとトリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）が望ましい。トリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）を有する発現ベクターとしては、ｐＴＲＰ（Clinica Chimica Acta 237, 43-58(1995)）等が挙げられる。
【００２９】
選択マーカーの例としては、ホルムアルデヒド耐性マーカー、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００３０】
一般的な組換えベクターの構築方法としては、例えば、ＰＣＲ法等で調製した遺伝子断片を、適当な制限酵素とリガーゼを用いて組換えベクターに組み込む方法が挙げられる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００３１】
遺伝子の導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法、コンピテントセル法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。具体的には、大腸菌への遺伝子の導入には、ハナハンの方法等を利用でき、酵母への遺伝子の導入には、リチウムイオン法等を利用できる。
【００３２】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えを利用して導入することもできる。
【００３３】
一般的に形質転換体を利用する目的物の生産方法において認められることであるが、本発明のアシルカルニチンエステラーゼの製造方法においても、導入遺伝子の選択、導入すべき宿主の選択、発現ベクターの導入手段とそれに適したＤＮＡまたはＲＮＡの構築方法の選択、培地もしくはこれに対する添加物の種類や濃度の選択、形質転換体の培養条件または生育条件の選択等の要因が、アシルカルニチンエステラーゼの生産量に影響する場合がある。
【００３４】
上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３５】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グリセリンなどのポリオール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００３６】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で培養を行う。培養期間中、培地のｐＨは宿主の発育が可能で、生産されたアシルカルニチンエステラーゼの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ４〜８程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３７】
続いて、形質転換体の培養により可溶化発現したアシルカルニチンエステラーゼを、培養物から採取する。培養物には、培養液、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞または菌体の破砕物が包含される。採取方法は、通常行われる細胞または菌体の破砕物からの抽出だけでなく、場合によっては、適当な抽出溶媒を用いて培養液からも直接抽出できる。利用する宿主の種類によっては、アシルカルニチンエステラーゼの少なくとも一部が宿主細胞内または細胞表面に止まる場合があるが、細胞膜または細胞壁の破壊や、適宜な抽出溶媒による抽出等の公知の各種操作を経て、採取することができる。
【００３８】
宿主の対数増殖期を過ぎたときに上記温度範囲に設定することでアシルカルニチンエステラーゼ遺伝子が発現し、宿主内に非常に高い比活性を示すアシルカルニチンエステラーゼを製造することができる。培養後、目的のアシルカルニチンエステラーゼが宿主内に生産されるため菌体または細胞を破砕し、粗酵素懸濁液を調製する。この粗酵素懸濁液には、非常に高い比活性を示すアシルカルニチンエステラーゼが含まれる。したがって、得られた粗酵素懸濁液をそのまま利用してもよい。なお、得られた粗酵素懸濁液からアシルカルニチンエステラーゼを単離精製することもできる。このとき、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。単離精製されたアシルカルニチンエステラーゼは、所定のｐＨの緩衝液等に懸濁された状態で利用することができる。
【００３９】
本発明のアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質を利用したアシル−Ｌ−カルニチンの測定
本発明のアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質を用いることにより、検体中の総カルニチン濃度及び／又は遊離カルニチン濃度を測定する。検体としては、血清又は血漿が挙げられる。
【００４０】
上記のように、検体中のアシルカルニチンはアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質の作用によりＬ−カルニチンを生成する。Ｌ−カルニチンは、カルニチン脱水素酵素及びβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（チオＮＡＤ＋）により特異的に酸化され、デヒドロカルニチン及びβ-チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（チオＮＡＤＨ）を生成する。デヒドロカルニチンはカルニチン脱水素酵素及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の存在下で、Ｌ−カルニチン及びβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ＋）を生成する。検体中の総Ｌ−カルニチン（アシルカルニチン及び遊離カルニチン）濃度はチオＮＡＤＨの生成速度に比例するので、チオＮＡＤＨの吸光度変化量を測定することにより総カルニチン濃度を求めることができる。
【００４１】
あらかじめ、既知の濃度のＬ−カルニチンを含む標準液を作成しており、検体と標準液における吸光度変化量（例えば、１分間における吸光度変化量）を測定することにより、Ｌ−カルニチン濃度（μmol/L)＝（検体の１分間当たりの吸光度変化）/（標準液の１分間あたりの吸光度変化）×標準液中のＬ−カルニチン濃度により、Ｌ−カルニチン濃度を算出することができる。
【００４２】
また、上記の測定の際に、検体中のアシルカルニチンからＬ−カルニチンを生成させずに測定を行えば、遊離のＬ−カルニチン濃度を測定することができる。総Ｌ−カルニチン濃度から遊離のＬ−カルニチン濃度を引くとアシルカルニチン濃度を算出することができる。
【００４３】
血清中又は血漿中のＬ−カルニチンを測定することにより、カルニチン欠乏症を検出するための補助的データを得ることができる。ここで、カルニチン欠乏症としては、先天性カルニチントランスポーター異常による全身性カルニチン欠乏症である一次性カルニチン欠乏症；有機酸代謝異常症、脂肪酸代謝異常症、尿素サイクル異常症、ミトコンドリア異常症等のその他の先天性代謝異常症；及び透析や薬剤投与に起因するカルニチン欠乏症が挙げられる。
【００４４】
次に本発明を、実施例を参照することにより説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されない。実施例では、本発明に係るタンパク質を「組換えＡＣＥ」と呼ぶ。
【実施例】
【００４５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４６】
〔実施例１：組換えＡＣＥ発現系の構築〕
データベースより鋭意検索したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｌｚ４Ｗ由来のａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４７】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｌｚ４Ｗ由来のａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗ遺伝子を大腸菌で発現させるために、ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗ遺伝子を挿入したプラスミドｐＴＲＰ−ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗを図２に示す構築図にしたがって作製した。
【００４８】
データベースより探索したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｌｚ４Ｗ由来のＡｌｐｈａ／ｂｅｔａ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子を大腸菌コドンに最適化したのち化学合成した。得られたアシルカルニチンエステラーゼ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロース電気泳動後、ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収した断片は、ＬｉｇａＦａｓｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ（２．９ｋｂ）に導入した。次いで、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換し、組換え体ｐＴＲＰ−ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗ／ＪＭ１０１を得た。
【００４９】
〔実施例２：組換えＡＣＥのフラスコ培養〕
形質転換体のバッチ培養によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｌｚ４Ｗ由来の組換えＡＣＥの生産を以下の方法で実施した。
【００５０】
組換え体ｐＴＲＰ−ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗ/ＪＭ１０１を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１Ｌを用いて３０℃、１６０ｒｐｍで２４時間バッチ培養を行った。菌体の増殖は、培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して調べた。その結果、プラスミドｐＴＲＰ−ａｃｅ＿Ｌｚ４Ｗで形質転換した大腸菌ＪＭ１０１株のバッチ培養菌体を得ることができた。
【００５１】
発現量を確認するため、この培養液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１５分、４℃、ＢＥＣＫＭＡＮ社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、湿菌体を回収した。そして、得られた湿菌体５ｇを２５ ｍＬの抽出バッファー（１０ｍＭ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ８．０）で懸濁し、超音波破砕後（ＭＩＳＯＮＩＸ社製  ａｓｔｒａｓｏｎ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＴＲ  ＸＬ）、遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃、ＢＥＣＫＭＡＮ社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、粗抽出液を調製した。
【００５２】
組換えＡＣＥの活性測定は次のような方法で行った。アシルカルニチンエステラーゼ活性の測定は、１００ ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ ８．０）、０．５ ｍＭ オクタノイル−Ｌ−カルニチン（ＴＯＣＲＩＳ社製）の反応液１ ｍＬを試験管に入れ、３７℃で５分間インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．０５ ｍＬを添加して３７℃で  １５分間インキュベートし、沸騰水浴中で反応を停止させ、被検体とする。
【００５３】
１００ ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ ９．０）、１ ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業社製）、６４０Ｕ ジアホラーゼ（オリエンタル酵母工業社製）、１５Ｕ Ｌ−カルニチン脱水素酵素、１００ ｍＭ ＫＣｌ、０．０２５％ ＮＢＴ（和光純薬工業社製）、０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）の反応液１ ｍＬを試験管に入れ、３７℃で５分間インキュベートした。被検体０．０５ ｍＬを添加して３７℃で２分間インキュベートした後に、０．１Ｍ 塩酸を添加し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に被検体を添加しないブランクの吸光度も測定した。得られた酵素液のアシルカルニチンエステラーゼ活性を測定したところ、培地１ｍＬあたり６．６Ｕの活性が確認できた。
【００５４】
〔実施例３：組換えＡＣＥの精製〕
大量精製を行うため、培養液から得られた湿菌体１９ｇを１０ ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ ８．０）に懸濁したのち、超音波破砕にて菌体破砕を行い、得られた破砕画分を遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃  ＢＥＣＫＭＡＮ社製  Ｍｏｄｅｌ  ＨＰ−２６ＸＰ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液を用いて以下の方法で精製を行った。
【００５５】
バッファーＡ（５０ ｍＭ トリス塩酸バッファー、ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（ＪＮＣ社製）に通し、バッファーＡで洗浄後、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニア・グラジエントで目的タンパク質を溶出させた。得られた目的タンパク質の画分を５０ ｍＭ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０、３０％飽和 硫酸アンモニウム）で透析したのち、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）を実施した。透析した目的タンパク質をバッファーＣ（５０ ｍＭ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ８．０、３０％飽和 硫酸アンモニウム）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）に通し、バッファーＣで洗浄後、３０−０％飽和 硫酸アンモニウムのリニア・グラジエントで目的タンパク質を溶出させた。最終的に比活性３７．１Ｕ／ｍｇの組換えＡＣＥが調製できた。
【００５６】
〔実施例４：組換えＡＣＥの基質特異性評価〕
１００ ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）中で各々のアシルカルニチンが０．５ ｍＭになるように調製し、基質特異性を比較した。その結果、アルカリゲネス属由来の天然給源から精製したアシルカルニチンエステラーゼとほぼ同等の短鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに反応する幅広い基質特異性を持つことが示唆された。
オクタノイル−Ｌ−カルニチン：１００％、アセチル−Ｌ−カルニチン：２１％、デカノイル−Ｌ−カルニチン：９１％、パルミトイル−Ｌ−カルニチン：４８％
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により効率良くアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質を生産することが可能になる。また、本発明により作製されたアシルカルニチンエステラーゼ活性を有するタンパク質は総カルニチン測定試薬の原料として極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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