(57)【要約】【課題】非特異的な核酸の増幅を抑制することができる核酸増幅反応方法を提供する。【解決手段】逆転写酵素、ポリメラーゼ、プライマー、およびプローブを含む反応溶液を、逆転写反応を行うために加熱する工程と、前記加熱する工程の後に、前記反応溶液に核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程と、を含み、前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、前記加熱する工程において、前記反応溶液を加熱する時間は、５秒以上４８０秒以下である、核酸増幅反応方法。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素、ポリメラーゼ、プライマー、およびプローブを含む反応溶液を、逆転写反応を行うために加熱する工程と、
前記加熱する工程の後に、前記反応溶液に核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程と、
を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を加熱する時間は、５秒以上４８０秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を５０℃以上７０℃以下に加熱する、核酸増幅反応方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上６０秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記反応溶液に含まれる前記逆転写酵素の量は、３０ユニット以上６０ユニット以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を６０℃以上７０℃以下に加熱し、
前記反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上３０秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項６】
請求項１において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を６６℃以上７０℃以下に加熱し、
前記反応溶液を加熱する時間は、６０秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項８】
請求項７において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項１０】
請求項９において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸
増幅反応方法。
【請求項１１】
請求項９において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、
前記プローブは、加水分解プローブである、核酸増幅反応方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項において、
前記プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか１項において、
前記逆転写酵素は、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス由来である、核酸増幅反応方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項において、
前記プライマーは、人工核酸を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項において、
前記プライマーは、ターゲットＲＮＡに配列特異的なプライマーである、核酸増幅反応方法。
【請求項１７】
逆転写反応および核酸増幅反応を行うための試薬であって、
逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、試薬。
【請求項１８】
逆転写反応および核酸増幅反応を行うための試薬であって、
逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、試薬。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の試薬の使用方法であって、
前記試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液を５秒以上４８０秒以下の間加熱して逆転写反応を行った後に、前記反応溶液に熱サイクルを付与して核酸増幅反応を行う、試薬の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応方法、試薬、および試薬の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応溶液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
ＰＣＲの高速化は、遺伝子検査の検査時間短縮化のために必要な技術であり、遺伝子検査の業界において非常に期待されている。
【０００５】
例えば特許文献１には、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ、プライマーが少なくとも２μＭの濃度で提供され、１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５２０６１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方、核酸には、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）およびＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の大きく２種類が存在する。鋳型核酸がＲＮＡの場合、ＰＣＲの前に、逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する。
【０００８】
上記のような逆転写反応のための加熱工程と、核酸増幅のために熱サイクルを付与する熱サイクル付与工程と、において同一のプライマーを用いることが可能である。発明者は、鋭意研究の結果、熱サイクルを高速化させようとして所望のプライマーを選択すると、逆転写反応における非特異的な増幅を抑える条件が変わってくることを見出した。
【０００９】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる核酸増幅反応方法を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる試薬およびその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
逆転写酵素、ポリメラーゼ、プライマー、およびプローブを含む反応溶液を、逆転写反応を行うために加熱する工程と、
前記加熱する工程の後に、前記反応溶液に核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程と、
を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を加熱する時間は、５秒以上４８０秒以下である。
【００１１】
このような核酸増幅反応方法では、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法であって、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１２】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を５０℃以上７０℃以下に加熱してもよい。
【００１３】
このような核酸増幅反応方法では、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００１４】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上６０秒以下であってもよい。
【００１５】
このような核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１６】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液に含まれる前記逆転写酵素の量は、３０ユニット以上６０ユニット以下であってもよい。
【００１７】
このような核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができ（詳細は後述する「３．  実験例」参照）、かつ低コスト化を図ることができる。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を６０℃以上７０℃以下に加熱し、
前記反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上３０秒以下であってもよい。
【００１９】
このような核酸増幅反応方法では、蛍光強度を確保しつつ、逆転写反応の時間を短縮化できる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記加熱する工程において、
前記反応溶液を６６℃以上７０℃以下に加熱し、
前記反応溶液を加熱する時間は、６０秒以下であってもよい。
【００２１】
このような核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度をより高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であってもよい。
【００２３】
このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下であってもよい。
【００２５】
このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００２６】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００２７】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００２８】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００２９】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、熱サイクルの高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００３０】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であってもよい。
【００３１】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、熱サイクルの高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００３２】
このような核酸増幅方法では、２価の陽イオンの種類によって伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制するのに最適な濃度範囲が異なってくる。
【００３３】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、加水分解プローブであってもよい。
【００３４】
このような試薬では、ポリメラーゼによってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消してレポーター色素が発光することにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００３５】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含んでもよい。
【００３６】
このような試薬では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、プローブのＴｍ値を高くすることができる。
【００３７】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記逆転写酵素は、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス由来であってもよい。
【００３８】
このような核酸増幅反応方法では、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００３９】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーは、人工核酸を含でもよい。
【００４０】
このような核酸増幅反応方法では、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００４１】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーは、ターゲットＲＮＡに配列特異的なプライマーであってもよい。
【００４２】
このような核酸増幅反応方法では、プライマーは、特定の塩基配列にのみアニーリングするので、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる。
【００４３】
本発明に係る試薬は、
逆転写反応および核酸増幅反応を行うための試薬であって、
逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００４４】
このような試薬は、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法に用いられることができ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００４５】
本発明に係る試薬は、
逆転写反応および核酸増幅反応を行うための試薬であって、
逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である。
【００４６】
このような試薬は、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法に用いられることができ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００４７】
本発明に係る試薬の使用方法は、
本発明に係る試薬の使用方法であって、
前記試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液を５秒以上４８０秒以下の間加熱して逆転写反応を行った後に、前記反応溶液に熱サイクルを付与して核酸増幅反応を行う。
【００４８】
このような試薬は、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法に用いられることができ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフ。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図３】本実施形態に係る反応溶液に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置を模式的に示す断面図。
【図４】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図５】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図６】逆転写反応のための加熱時間と、相対蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図７】逆転写反応のための加熱時間と、相対蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図８】電気泳動の結果。
【図９】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１０】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１１】逆転写酵素の量と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１２】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１３】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１４】逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１５】ＰＣＲの反応時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１６】ＰＣＲの反応時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１７】逆転写反応時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図１８】電気泳動の結果。
【図１９】電気泳動の結果。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００５１】
１．  試薬
まず、本実施形態に係る試薬について説明する。本実施形態に係る試薬は、逆転写反応および核酸増幅反応を行うための試薬である。試薬は、例えば、液状であってもよいし、凍結乾燥された状態であってもよい。例えば、凍結乾燥された試薬は、容器（図示せず）内に固定されており、該容器に、ＲＮＡを含む鋳型核酸溶液を導入して、鋳型核酸溶液と試薬とを接触させる。試薬は、鋳型核酸溶液の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液に取り込まれ、反応溶液となる。したがって、反応溶液は、鋳型核酸および試薬を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００５２】
試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、プローブと、ｄＮＴＰと、バッファーと、逆転写酵素と、を含む。本実施形態に係る試薬は、例えば、逆転写反応および核酸増幅反応（ＰＣＲ）を連続的に行うワンステップ型の逆転写ＰＣＲのための試薬である。
【００５３】
１．１．  プライマー
プライマーは、鋳型核酸（テンプレート）にアニールするよう設計されている。アニール（アニーリング）とは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。試薬は、プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  
Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応溶液に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上６．４μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応溶液に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００５４】
プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、好ましくは７０℃以上７５℃以下である。これにより、本実施形態に係る試薬は、熱サイクルの高速化（時間の短縮化）を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。Ｔｍ値は、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする温度の指標であり、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値以上の温度であれば、半数以上のプライマーが鋳型核酸にアニーリングする。フォワードプライマーのＴｍ値と、リバースプライマーのＴｍ値とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００５５】
Ｔｍ値の算出方法としては、例えば、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法が挙げられ、下記式（１）によって算出することができる。
【００５６】
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
【００５７】
なお、式（１）において、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００５８】
プライマーの塩基数を多くすることによりプライマーのＴｍ値を高くする場合は、プライマーを増幅領域の内側（プライマーを鋳型核酸の５´末端側）に伸ばすように設計することで、伸長反応による核酸の増幅領域を増やすことなく、Ｔｍ値を高くすることができる。これにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５９】
プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる。なお、人工核酸については、後述する「１．４．  プローブ」で説明する。
【００６０】
プライマーは、ターゲットＲＮＡ（プライマーがアニーリングするＲＮＡ）に配列特異的なプライマーであってもよい。すなわち、プライマーは、ターゲットＲＮＡの特定の塩基配列にのみアニーリングするプライマーであってもよい。これにより、プライマーは、特定の塩基配列にのみアニーリングするので、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる。ターゲットＲＮＡに配列特異的なプライマーは、ターゲットＲＮＡの配列が既知である場合に有効である。
【００６１】
１．２．  ポリメラーゼ
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など
、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させる加水分解型と、ＫＯＤポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させない非加水分解型とが、存在する。ＫＯＤは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１であり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のＤＮＡポリメラーゼである。反応溶液に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５ユニット（Ｕ）以上である。
【００６２】
ここで、図１は、Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフである。縦軸は、温度を変化させたときにポリメラーゼの活性効率が最大となる値を１００％とした相対活性効率である。各温度におけるポリメラーゼの活性効率は、ｄＮＴＰに、ｄＮＴＰが伸長反応に取り込まれる際に発光するような工夫を行い、一定の時間経過後、ｄＮＴＰによる蛍光強度（蛍光輝度）を測定することにより、求めることができる。蛍光強度が高いほど、ポリメラーゼの活性効率は、高くなる。図１に示す例では、Ｔａｑポリメラーゼは、７０℃付近のときに、相対活性効率が最大となっている。
【００６３】
１．３．  ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。反応溶液に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００６４】
１．４．  プローブ
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。反応溶液に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上２．４μＭ以下であり、好ましくは０．５μＭ以上１．８μＭ以下である。
【００６５】
プローブは、例えば、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブである。より具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＴａｑポリメラーゼを用いる。
【００６６】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＫＯＤポリメラーゼを用いる。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００６７】
プローブが非加水分解プローブの場合は、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールす
る増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００６８】
プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー（ＭＧＢ）分子の少なくとも一方を含んでもよい。これにより、プローブの塩基数が多くなることを抑制しつつ（塩基長が長くなることを抑制しつつ）、プローブのＴｍ値を高くすることができる。プローブの塩基数が多くなると、例えばプローブを分解するための時間が長くなり、ＰＣＲの高速化が困難になる場合がある。
【００６９】
人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が挙げられる。ＬＮＡの化学式を下記式（２）に示す。
【００７０】
【化１】
2018023360.tif 000003
【００７１】
なお、式（２）において、Ｂａｓｅ（塩基）は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）等が挙げられるが、特に限定されない。また、塩基は、メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。
【００７２】
人工核酸は、ＬＮＡを修飾したＬＮＡアナログであってもよく、具合的には、３’アミノ− ２’，４’− ＢＮＡ、２’，４’− ＢＮＡＣＯＣ、または２’，４’− ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）であってもよい。また、修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸は、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、またはこれらを修飾したアナログであってもよい。プローブに含まれる人工核酸の数は、特に限定されず、１つのプローブは、複数の人工核酸を含んでいてもよい。
【００７３】
１．５．  バッファー
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。
【００７４】
バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。２価の陽イオンの濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる（具体的には熱サイクルの１サイクル当たりの時
間を９秒以下にすることができる）。２価の陽イオンの濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００７５】
具体的には、バッファーは、２価の陽イオン化合物と、ＫＣＬと、Ｔｒｉｓと、を含む。より具体的には、バッファーは、ＭｇＣｌ２を含み、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来する。すなわち、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２が電離して生成される。２価の陽イオンがＭｇＣｌ２に由来する場合は、Ｍｇ２＋の濃度は、ポリメラーゼの活性に起因する。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、好ましくは５ｍＭ以上７ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭである。ＭｇＣｌ２の濃度を４ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＣｌ２の濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。なお、核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている状態では、核酸増幅反応試薬は、固形の状態で、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ、賦形剤、例えばトレハロースを含む。
【００７６】
２価の陽イオン化合物は、ＭｇＳＯ４に由来していてもよい。この場合は、バッファーは、ＭｇＣｌ２の代わりにＭｇＳＯ４を含み、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭである。ＭｇＳＯ４の濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＳＯ４の濃度を３ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００７７】
１．６．  逆転写酵素
逆転写酵素は、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてＤＮＡを合成する酵素である。逆転写反応は、逆転写酵素により、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてＤＮＡを合成する反応のことである。逆転写反応では、ＰＣＲで用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの一方をＲＮＡにアニーリングさせて、相補的ＤＮＡを合成することができる。
【００７８】
逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００７９】
反応溶液に含まれる逆転写酵素の量は、例えば、５ユニット以上６０ユニット以下であり、好ましくは３０ユニット以上６０ユニット以下である。反応溶液に含まれる逆転写酵素の量を５ユニット以上とすることにより、逆転写酵素の量が少なすぎて十分に逆転写反応が行われないことを抑制することができる。反応溶液に含まれる逆転写酵素の量を６０ユニット以下とすることにより、高価な逆転写酵素の量を少なくてきるので低コスト化を図ることができる。
【００８０】
１．７．  その他の成分
試薬が凍結乾燥されている場合、試薬（凍結乾燥試薬）は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力
な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、試薬の各成分と、糖と、を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００８１】
１．８．  使用方法
本実施形態に係る試薬の使用方法では、試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて反応溶液を調整し、反応溶液を５秒以上４８０秒以下の間加熱して逆転写反応を行った後に、反応溶液に熱サイクルを付与して核酸増幅反応を行う。
【００８２】
本実施形態に係る試薬は、例えば、以下の特徴を有する。
【００８３】
試薬では、逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＣｌ２と、を含み、プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。また、試薬では、逆転写酵素と、ポリメラーゼと、プライマーと、プローブと、ＭｇＳＯ４と、を含み、プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、試薬が逆転写反応および核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である。そのため、試薬は、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法に用いられることができ、非特異的な核酸の増幅（目的の領域以外の領域にプライマーがアニーリングして核酸が増幅すること）を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００８４】
試薬では、プローブは、加水分解プローブであってもよい。そのため、試薬は、ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼによってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消してレポーター色素が発光することにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００８５】
試薬では、プローブは、人工核酸およびＭＧＢ分子の少なくとも一方を含んでいてもよい。そのため、試薬では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、プローブのＴｍ値を高くすることができる。
【００８６】
２．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。
【００８７】
まず、本実施形態に係る試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する（ステップＳ１）。具体的には、試薬が収容されている容器に、ピペット等を用いて鋳型核酸溶液を導入し、試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する。反応溶液は、例えば、鋳型核酸と、プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、逆転写酵素と、を含む。
【００８８】
鋳型核酸溶液は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００８９】
次に、反応溶液を、逆転写反応を行うために加熱する（ステップＳ２）。本工程におい
て、反応溶液を、例えば、５０℃以上７０℃以下に加熱し、好ましくは６０℃以上７０℃以下に加熱し、より好ましくは６６℃以上７０℃以下に加熱する。反応溶液を５０℃以上７０℃以下に加熱することにより、核酸を増幅させた後（核酸増幅反応後）の蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができる。反応溶液を加熱する方法は、特に限定されず、例えば、ヒートブロックやホットプレート上にビーカー（水槽）を配置し、該ビーカー内の液体（食塩水やオイル）を温め、該液体内に反応溶液が収容された容器を配置することによりにより、反応溶液を加熱する方法などが挙げられる。
【００９０】
逆転写反応を行うために加熱する工程（ステップＳ２）において、反応溶液を加熱する時間は、５秒以上４８０秒以下であり、好ましくは１０秒以上６０秒以下であり、より好ましくは１０秒以上３０秒以下である。反応溶液を加熱する時間を５秒以上４８０秒以下とすることにより、核酸を増幅させた後の蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができ（詳細は後述する「３．  実験例」参照）、高感度で核酸の増幅を検出することができる。なお、本工程において、「反応溶液を加熱する時間」とは、逆転写反応を行うための所望の温度にするための昇温時間を含まない時間である。
【００９１】
次に、反応溶液に、核酸を増幅させるための（ＰＣＲのための）熱サイクルを付与する（ステップＳ３）。ここで、図３は、本実施形態に係る反応溶液６に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置１００を模式的に示す断面図である。
【００９２】
熱サイクル装置１００は、図３に示すように、第１ホットプレート１０と、第２ホットプレート１２と、第１ビーカー２０と、第２ビーカー２２と、アーム３０と、固定部３２と、を含む。
【００９３】
第１ホットプレート１０は、第１ビーカー２０に収容されている液体２を第１温度に加熱する。第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。液体２は、第１ホットプレート１０により第１温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００９４】
第２ホットプレート１２は、第２ビーカー２２に収容されている液体４を第２温度に加熱する。第２温度は、第１温度よりも低い温度である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。すなわち、本工程では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。つまり、アニーリング反応と伸長反応とを同じ温度で行う。上述した図１より、ポリメラーゼの活性効率の観点からは、第２温度は、７０℃程度が最適であるといえる。液体４の種類は、第２ホットプレート１２により第２温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００９５】
アーム３０は、一端３０ａが固定部３２によって固定されており、他端３０ｂが自由端となっている。アーム３０の他端３０ｂは、反応溶液６が収容されている容器８を支持している。アーム３０は、図示せぬモーターにより、一端３０ａが固定された状態で、他端３０ｂが円弧状に往復運動する。
【００９６】
アーム３０の往復運動により、反応溶液６は、第１温度に加熱された液体２中と、第２温度に加熱された液体４中とに、交互に配置される。これにより、反応溶液６に、ＰＣＲのための熱サイクルを付与することができる。本工程における熱サイクル数は、モーターの駆動および停止により適宜設定することができ、例えば、２０サイクル以上６０サイクル以下である。反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および反応溶液６の液体４から液体２への移動時間は、例えば、０．５秒程度である。
【００９７】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ３）において、１サイクル当たりの変性反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体２中に配置されている時間）は、例えば、０．３秒以上５秒以下であり、好ましくは０．５秒以上２秒以下である。変性反応のための加熱時間を０．３秒以上とすることにより、変性反応の時間が短すぎて変性が十分に行われないことを抑制することができる。変性反応のための加熱時間を５秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００９８】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ３）において、１サイクル当たりのアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体４中に配置されている時間）は、例えば、６秒以下であり、好ましくは４秒以下であり、より好ましくは３秒以下であり、さらにより好ましくは１秒以上１．５秒以下である。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を６秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００９９】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ３）において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、好ましくは７秒以下であり、より好ましくは６秒以下である。１サイクル当たりの時間を９秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。なお、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、変性反応、アニーリング反応、および伸長反応にかかる時間と、これらの反応を行うための反応溶液の移動時間（例えば、反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間）と、を含む。
【０１００】
次に、反応溶液の蛍光強度を測定する（ステップＳ４）。例えば、熱サイクルを付与した反応溶液を、透光性の容器に移し、該透光性の容器に光を照射して蛍光強度を測定する。これにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【０１０１】
本実施形態に係る核酸増幅反応方法は、例えば、以下の特徴を有する。
【０１０２】
核酸増幅反応方法では、プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、逆転写反応を行う工程（ステップＳ２）において、反応溶液を加熱する時間は、５秒以上４８０秒以下である。そのため、核酸増幅反応方法では、逆転写反応を行い、かつ熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法であって、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【０１０３】
核酸増幅反応方法では、逆転写反応を行うために加熱する工程（ステップＳ２）において、反応溶液を５０℃以上７０℃以下に加熱し、反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上６０秒以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【０１０４】
核酸増幅反応方法では、逆転写酵素の量は、３０ユニット以上６０ユニット以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度を高くすることができ（詳細は後述する「３．  実験例」参照）、かつ低コスト化を図ることができる。
【０１０５】
核酸増幅反応方法では、逆転写反応を行うために加熱する工程（ステップＳ２）において、反応溶液を６０℃以上７０℃以下に加熱し、反応溶液を加熱する時間は、１０秒以上３０秒以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応方法では、蛍光強度を確保しつつ、逆転写反応の時間を短縮化できる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【０１０６】
核酸増幅反応方法では、逆転写反応を行うために加熱する工程（ステップＳ２）におい
て、反応溶液を６６℃以上７０℃以下に加熱し、反応溶液を加熱する時間は、６０秒以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応方法では、蛍光強度測定において蛍光強度をより高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【０１０７】
核酸増幅反応方法では、熱サイクルを付与する工程（ステップＳ３）において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応では、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【０１０８】
核酸増幅反応方法では、熱サイクルを付与する工程（ステップＳ３）において、プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、熱サイクルの１サイクル当たり６秒以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応では、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【０１０９】
核酸増幅反応方法では、プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【０１１０】
核酸増幅反応方法では、プライマーは、ターゲットＲＮＡに配列特異的なプライマーであってもよい。これにより、プライマーは、特定の塩基配列にのみアニーリングするので、非特異的な核酸の増幅を抑えることができる。
【０１１１】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【０１１２】
３．１．  第１実験例
３．１．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＲＮＡ）として、Ｂ型のインフルエンザ（ＩｎｆＢ）ウイルスのＲＮＡを用いた。この鋳型核酸を、試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１１３】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）          ０．４μＬ
ＳｕｐｅｒＳＣｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（２００ｕｎｉｔｓ／μＬ）  ０．０４μＬ
バッファー                                                        ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                              ０．２５μＬ
インフルエンザ検出用フォワードプライマー（１００μＭ）            ０．３２μＬ
インフルエンザ検出用リバースプライマー（１００μＭ）              ０．３２μＬ
インフルエンザ検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）                  ０．９μＬ
インフルエンザＲＮＡ（１００コピー／μＬ）                        １．０μＬ
蒸留水                                                            ４．７７μＬ
【０１１４】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１１５】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１１６】
プライマーおよびプローブのＴｍ値および配列は、下記表１のとおりである。
【０１１７】
【表１】
2018023360.tif 000004
【０１１８】
なお、表１に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。このことは、以下に示す実験例において同様である。
【０１１９】
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に充填し、ヒートブロックにて５２℃に加熱した水槽に任意の時間浸して逆転写反応を行った。逆転写反応を行った後、図３に示すような装置において、高温領域（９０℃、２秒間）と低温領域（６６℃、２秒間）とを往復運動させて、ＰＣＲを行った。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。ポリメラーゼを活性化させるため、初めに２０秒間高温領域で加熱した（ホットスタート）。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度（エンドポイントの蛍光強度）を測定した。反応溶液を加熱する時間を変えて、上記の実験を２回行った。
【０１２０】
３．１．２．  蛍光強度測定の結果
図４および図５は、逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフである。図４は１回目の実験結果であり、図５は２回目の実験結果である。図６は、図４において加熱時間が６０秒の場合の蛍光強度を１００％としたときの相対的蛍光強度を示すグラフである。図７は、図５において逆転写反応の時間が６０秒の場合の蛍光強度を１００％としたときの相対的蛍光強度を示すグラフである。
【０１２１】
図６および図７により、逆転写反応のための加熱時間を、５秒４８０秒以下とすると相対的蛍光強度は６０％以上となり、蛍光強度を高くできることがわかった。さらに、逆転写反応のための加熱時間を、１０秒以上４８０秒以下とすることにより相対的蛍光強度を７０％以上とすることができ、２０秒以上４８０秒以下とすることにより相対的蛍光強度を８０％以上とすることができ、４０秒以上１２０秒以下とすることにより相対的蛍光強度を９０％以上とすることができた。
【０１２２】
３．１．３．  電気泳動の結果
上記の反応溶液を、アガロースゲル電気泳動法によって解析を行った。図８は、電気泳動の結果である。なお、図８において、「Ｍ」は分子量マーカーを示す。
【０１２３】
図８に示すように、逆転写反応のための加熱時間が長いと、非特異的な核酸の増幅に起因するバンド（４０ｂｐ以上８０ｂｐ以下）が確認され、加熱時間が８分（４８０秒）より長くなると、顕著に確認された。また、逆転写反応のための加熱時間が長いと、目的の核酸に起因するバンド（１０３ｂｐ）が薄くなり、加熱時間が短くなるにつれて濃くなった。なお、加熱時間０秒ではバンド（１０３ｂｐ）は、確認されなかった。
【０１２４】
以上により、逆転写反応のための加熱時間が長すぎると、目的の領域以外の領域にプライマーがアニーリングして核酸が増幅し、目的の核酸の増幅を阻害していることがわかっ
た。この阻害は、加熱時間を短くすることで改善することができる。
【０１２５】
この理由は、次のように推察される。通常のＰＣＲ条件（例えば、アニーリング反応および伸長反応のための時間が２秒より長い条件）の場合、逆転写反応のための加熱時間は、一般的に３０分〜１時間である。しかしながら、第１実験のような高速の熱サイクル条件（例えば、アニーリング反応および伸長反応のための時間が２秒以下の条件）では、熱サイクルの高速化のために、Ｔｍ値が６５℃以上８０℃以下とＴｍ値が高いプライマーを用いる。このようなプライマーは、例えば、プライマーの塩基数が大きく、逆転写反応のための加熱時間を長いと、プライマーが目的の箇所以外にアニーリングしてしまい、非特的な核酸の増幅が起こり易いと考えられる。したがって、高速の熱サイクル条件では、加熱時間を４８０秒以下とすることにより、非特的な核酸の増幅を抑制できたこと考えられる。なお、本推察は仮説の一つである。
【０１２６】
３．２．  第２実験例
逆転写反応のための加熱温度および加熱時間を変化させたこと以外は、第１実験例と同様に、蛍光強度を測定した。逆転写反応のための加熱温度を、５２℃、６０℃、７０℃と変化させた。図９は、逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフである。
【０１２７】
図９に示すように、加熱温度を５０℃以上７０℃以下、かつ加熱時間を１０秒６０秒以下とすることにより、例えば加熱時間が５秒以下の場合に比べて、蛍光強度を高くできることがわかった。
【０１２８】
加熱温度を６０℃の場合は、５２℃の場合に比べて、蛍光強度が高く、蛍光強度を低下させずに、加熱時間の短縮化を図れることがわかった。また、加熱温度を７０℃の場合では、加熱時間が３０秒以上だと、５２℃および６０℃の場合に比べて蛍光強度は低下したが、加熱時間が１０秒の場合は、５２℃の場合とほぼ同等の蛍光強度であった。第２実験では、加熱温度が６０℃で加熱時間３０秒が最適な条件であった。したがって、加熱温度を６０℃以上７０℃以下、かつ加熱時間を１０秒以上６０秒以下とすることにより、蛍光強度を確保しつつ、逆転写反応の時間を短縮化できることがわかった。
【０１２９】
３．３．  第３実験例
逆転写反応のための加熱時間および逆転写酵素の量を変化させたこと以外は、第１実験例と同様に、蛍光強度を測定した。逆転写酵素の量を、８ユニット、３０ユニット、６０ユニットと変化させた。図１０は、逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフである。
【０１３０】
図１０に示すように、逆転写酵素の量を３０ユニット以上６０ユニット以下とすることにより、例えば逆転写酵素の量が８ユニットの場合に比べて、蛍光強度を高くできることがわかった。
【０１３１】
３．４．  第４実験例
逆転写反応のための加熱温度および加熱時間、ならびに逆転写酵素の量を変化させたこと以外は、第１実験例と同様に、蛍光強度を測定した。具体的には、第２実験例により、逆転写反応のための加熱温度が６０℃の場合では、加熱時間３０秒が最も蛍光強度が高かく、逆転写反応のための加熱温度が７０℃の場合では、加熱時間１０秒が最も蛍光強度が高かった。そこで、第４実験例では、加熱温度６０℃および加熱時間３０秒の場合（６０℃／３０秒）、加熱温度７０℃および加熱時間１０秒の場合（７０℃／１０秒）において、逆転写酵素の量を８ユニット、３０ユニット、６０ユニットと変化させて実験を行った。図１１は、逆転写酵素の量と、蛍光強度と、の関係を示すグラフである。
【０１３２】
図１１に示すように、逆転写酵素の量を３０ユニット以上にすることで、蛍光強度を高くすることができ、「７０℃／１０秒」の場合は、１０秒という短時間でありながら、「６０℃／３０秒」の場合とほぼ同等の蛍光強度を得ることができた。
【０１３３】
３．５．  第５実験例
第４実験例により、温度を上げても逆転写酵素の量を多くすれば、蛍光強度は低下せず、短時間で逆転写反応を行えることがわかった。そこで、第５実験例では、６０℃よりも高い温度（６６℃、７０℃、７４℃）において、逆転写反応のための加熱時間を変化させ、さらに逆転写酵素の量を８ユニット、３０ユニット、６０ユニットと変化させて実験を行った。逆転写反応のための加熱温度および加熱時間、ならびに逆転写酵素の量を変化させたこと以外は、第１実験例と同様に、蛍光強度を測定した。図１２〜図１４は、逆転写反応のための加熱時間と、蛍光強度と、の関係を示すグラフである。図１２は、逆転写反応のための加熱温度が６６℃の場合であり、図１３は、７０℃の場合であり、図１４は、７４℃の場合である。
【０１３４】
図１２〜図１４に示すように、加熱温度が７４℃の場合は、６６℃および７０℃の場合に比べて、蛍光強度が低下した。したがって、加熱時間を６０秒以下とし、加熱温度を６６℃以上７０℃以下とすることにより、蛍光強度を高くできることがわかった。さらに、第５実験例においても、第３実験例と同様に、逆転写酵素の量が３０ユニットおよび６０ユニットの場合は、逆転写酵素の量が８ユニットの場合に比べて、蛍光強度が高かった。
【０１３５】
３．６．  第６実験
３．６．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１３６】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）          ０．４μＬ
バッファー                                                        ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                              ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）            １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）                １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）                ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                      １．０μＬ
蒸留水                                                            ３．０５μＬ
【０１３７】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１３８】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１３９】
本実験では、Ｔｍ値が異なるプライマーを用いた。具体的には、Ｔｍ値が約６０℃（Ｔｍ６０）、約７０℃（Ｔｍ７０）、約７５℃（Ｔｍ７５）、約８０℃（Ｔｍ８０）、および約８５℃（Ｔｍ８５）のプライマーを用いた。Ｔｍ値が約６０℃、約７０℃、および約７５℃プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表２のとおりである。なお、プローブのＴｍ値および配列は、表２の「Ｎｏ．１」と同様である。
【０１４０】
【表２】
2018023360.tif 000005
【０１４１】
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、図３に示すような装置において、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度を測定した。
【０１４２】
各プライマー（Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５）を用いたＰＣＲにおいて、変性反応のための加熱温度（高温温度）は、８７℃とした。Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５を用いたＰＣＲにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱温度（低温温度）は、それぞれ、６０℃、６３℃、６６℃、６９℃、７２℃とした。ＰＣＲにおける、１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表３に示す。なお、ポリメラーゼを活性化させるため、初めに１０秒間高温温度で加熱した（ホットスタート）。反応時間は、ポリメラーゼ活性時間に加え、高温時間および低温時間にサイクル数４０を掛け、さらに、反応溶液の移動時間を足したものである。また、表３において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間と低温時間との和に、高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）および低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）を足したものである。例えば、反応時間３７０秒の場合、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間（２秒）＋高温時間（６秒）＋高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）＋低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）＝９秒となる。
【０１４３】
【表３】
2018023360.tif 000006
【０１４４】
３．６．２．  蛍光強度測定の結果
図１５は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図１５に示すように、低温時間が６秒の場合（１サイクル当たりの時間が９秒の場合）は、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認されたが、低温時間が４秒以下の場合（１サイクル当たりの時間が７秒の場合）は、Ｔｍ６０では核酸の増幅が確認されず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認
された。したがって、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上であって、８０℃未満とすることにより、４秒以下という高速ＰＣＲでも、核酸を増幅できることがわかった。これは、Ｔｍ値が高いプライマーの方が鋳型核酸に速くアニーリングするので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。また、上述した図１から、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方が、Ｔｍ６０よりも、ポリメラーゼの活性効率が高く、伸長反応を速めることができるので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。なお、本実験例で用いた装置のばらつきを考慮すると、蛍光強度が３万５千 以上であると、確実に核酸が増幅されているといえる。そのため、１サイクル当たりの時間が９秒の場合に、Ｔｍ６０は確実に核酸が増幅されているとはいえず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５は確実に核酸が増幅されているといえる。
【０１４５】
さらに、図１５より、低温時間が２秒以下であっても、プライマーのＴｍ値が７０℃以上７５℃以下であれば、核酸を増幅できることがわかった。また、図１５より、Ｔｍ８０およびＴｍ８５では、核酸の増幅が確認されなかった。これは、Ｔｍ値が高すぎて、プライマーダイマーなどが生じたためであると考えられる。
【０１４６】
なお、図１５では、熱サイクルを付与していない未反応溶液の蛍光強度（バックグラウンド）を、エンドポイントの蛍光強度から引いた値をプロットしている。蛍光強度がマイナスを示しているプロットは、測定誤差であると考えられる。
【０１４７】
３．７．  第７実験例
３．７．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、百日咳菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１４８】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）          ０．４μＬ
バッファー                                                        ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                              ０．２５μＬ
百日咳菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）                  ０．３２μＬ
百日咳菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）                    ０．３２μＬ
百日咳菌蛍光標識プローブ（１０μＭ）                              ０．９μＬ
百日咳菌ＤＮＡ（２０コピーまたは１００コピー／μＬ）              １．０μＬ
蒸留水                                                            ４．８１μＬ
【０１４９】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１５０】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１５１】
プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表４のとおりである。
【０１５２】
【表４】
2018023360.tif 000007
【０１５３】
上記のような反応溶液１０μＬに対して、第６実験例と同様に、ホットスタートを１０秒間行ってＰＣＲを行った。高温温度を９０℃とし、低温温度を６０℃とした。１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表５に示す。
【０１５４】
【表５】
2018023360.tif 000008
【０１５５】
３．７．２．  蛍光強度測定の結果
図１６は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図１６に示すように、プライマーのＴｍ値が約８０℃であっても、核酸の増幅を確認することができた。
【０１５６】
３．８．  第８実験例
３．８．１．  反応溶液の調整および実験方法
表１に示したリバースプライマーの代わりに、ＩｎｆＢのリバースプライマーとして、下記表６で示すＬＮＡ結合プライマー（ＬＮＡが結合（挿入）されたプライマー）を用い、反応溶液を逆転写反応する時間を２０秒、１２０秒、４８０秒と変えたこと以外は、第１実験例と同様に、蛍光強度を測定した。
【０１５７】
【表６】
2018023360.tif 000009
【０１５８】
なお、表６では、ＬＮＡが結合された塩基に下線を付している。すなわち、５´末端側から７番目の塩基である「Ｔ」と、５´末端側から１３番目の「Ｃ」と、にＬＮＡが結合されている。
【０１５９】
３．８．２．  蛍光強度測定の結果
図１７は、逆転写反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図１７では、第１実験例で用いたプライマー（ＬＮＡ無しプライマー、すなわちＬＮＡが結合されていないプライマー）を用いた場合と、表６に示すプライマー（ＬＮＡ結合プライマー）を用いた場合と、の蛍光強度を示している。
【０１６０】
図１７に示すように、ＬＮＡ結合プライマーを用いることで、４８０秒間逆転写を行っても、蛍光強度が低下せず、蛍光強度を高く保てることがわかった。
【０１６１】
３．８．３．  電気泳動の結果
上記の反応溶液を、アガロースゲル電気泳動法によって解析を行った。図１８は、ＬＮＡ結合プライマーを用い場場合の電気泳動の結果である。図１９は、ＬＮＡ無しプライマーを用い場場合の電気泳動の結果である。
【０１６２】
図１９に示すように、ＬＮＡ無しプライマーでは、逆転写反応のための加熱時間が長いと、非特異的な核酸の増幅に起因するバンド（４０ｂｐ以上９０ｂｐ以下）が確認される。一方、図１８に示すように、ＬＮＡ結合プライマーでは、加熱時間が１２０秒より長くても非特異的な増幅は確認できなかった。また、ＬＮＡ無しプライマーでは、逆転写反応のための加熱時間が長いと、目的の核酸に起因するバンド（１０３ｂｐ）が薄くなり、加熱時間が短くなるにつれて濃くなった。一方、ＬＮＡ結合プライマーでは、目的に起因するバンド（１０３ｂｐ）は、４８０秒の逆転写時間においても薄くならなった。なお、２０ｂｐ以上４０ｂｐ以下のバンドは、プライマーに起因するものである。
【０１６３】
以上により、ＬＮＡ結合プライマーを用いると、逆転写反応のための加熱時間が長すぎることによる非特的増幅を抑制することができ、目的の核酸の増幅が阻害されないことがわかった。したがって、ＬＮＡ結合プライマーを用いると、核酸増幅方法のロバスト性を向上させ、安定したＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲを行うことができることがわかった。
【０１６４】
この結果の解釈として以下のように推測される。プライマーが長いと目的の領域以外の領域にプライマーがアニーリングして核酸が増幅し、目的の核酸の増幅を阻害すると考えられる。すなわち、短い鎖長のプライマーを用いれば、このような不具合は解消できると思われる。ただし、その場合、単純にプライマーを短くしたのではＴｍ値が下がり、高速ＰＣＲを実現できない。今回、プライマーにＬＮＡを結合し、プライマーの鎖長を短くしつつ、Ｔｍ値が高いプライマーを用いることで、逆転写にロバスト性を持たせつつも高速なＰＣＲを実現することができた。
【０１６５】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１６６】
２，４…液体、６…反応溶液、８…容器、１０…第１ホットプレート、１２…第２ホットプレート、２０…第１ビーカー、２２…第２ビーカー、３０…アーム、３０ａ…一端、３０ｂ…他端、３２…固定部、１００…熱サイクル装置
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号１は、ＩｎｆＢのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、ＩｎｆＢのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、ＩｎｆＢの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号６は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号７は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号８は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号９は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１０は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号１５は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１６は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号１７は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号１８は、ＩｎｆＢのリバースプライマーの配列である。
【図１】
2018023360.tif 000010
【図２】
2018023360.tif 000011
【図３】
2018023360.tif 000012
【図４】
2018023360.tif 000013
【図５】
2018023360.tif 000014
【図６】
2018023360.tif 000015
【図７】
2018023360.tif 000016
【図８】
2018023360.tif 000017
【図９】
2018023360.tif 000018
【図１０】
2018023360.tif 000019
【図１１】
2018023360.tif 000020
【図１２】
2018023360.tif 000021
【図１３】
2018023360.tif 000022
【図１４】
2018023360.tif 000023
【図１５】
2018023360.tif 000024
【図１６】
2018023360.tif 000025
【図１７】
2018023360.tif 000026
【図１８】
2018023360.tif 000027
【図１９】
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【配列表】
2018023360000001.app