(57)【要約】【課題】血管内皮系細胞に特異的に結合するペプチドを用いることによって、高い血管内皮化の効率を達成できる医療機器又は医療用材料を得ることができる、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理におけるペプチドの使用と、前述の表面処理において好適に使用されるペプチドと、前述のペプチドで表面処理された、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の製造方法と、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の、前述のペプチドを含む表面処理剤とを提供すること。【解決手段】血管内皮前駆細胞の表面に特異的に結合する特定の１０種類のアミノ酸配列のいずれか１つを含むペプチドを用いて、医療機器又は医療用材料の表面処理を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理におけるペプチドの使用であって、前記ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ペプチドの使用。
【請求項２】
前記医療機器又は前記医療用材料の表面に、前記ペプチドを結合又は付着させることを含む、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項３】
以下のＩ）、及びＩＩ）：
Ｉ）前記医療機器又は前記医療用材料の表面にリンカー部位を結合させることと、
ＩＩ）前記リンカー部位に、前記ペプチドを結合させることと、
を、Ｉ）に次いでＩＩ）を行うか、ＩＩ）に次いでＩ）を行うことを含む、請求項２に記載のペプチドの使用。
【請求項４】
前記ペプチドがメルカプト基を含み、
前記リンカー部位が、末端にＮ−置換マレイミド基を有し、
前記Ｎ−置換マレイミド基と、前記メルカプト基とを反応させることを含む、請求項３に記載のペプチドの使用。
【請求項５】
前記医療機器が、人工血管、ステント、人工弁、カテーテル、バルーン、人工心臓ポンプ、及び人工肺からなる群より選択される１種以上を備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項６】
前記医療用材料が、繊維、フィルム、シート、バッグ、チューブ、織布、不織布、成形体、及び生体由来組織、並びにこれらの材料のうちの２種以上を含む複合材料からなる群より選択される１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
前記医療機器又は前記医療用材料の表面がフッ素樹脂からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項９】
血液と接触して使用される、表面処理された医療機器又は医療用材料の製造方法であって、
前記医療機器又は前記医療用材料の表面にペプチドを結合又は付着させることを含み、
前記ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、製造方法。
【請求項１０】
以下のＩ）、及びＩＩ）：
Ｉ）前記医療機器又は前記医療用材料の表面にリンカー部位を結合させることと、
ＩＩ）前記リンカー部位に、前記ペプチドを結合させることと、
を、Ｉ）に次いでＩＩ）を行うか、ＩＩ）に次いでＩ）を行うことを含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ペプチドがメルカプト基を含み、
前記リンカー部位が、末端にＮ−置換マレイミド基を有し、
前記Ｎ−置換マレイミド基と、前記メルカプト基とを反応させることにより、前記ペプチドを前記リンカー部位に結合させる、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記医療機器が、人工血管、ステント、人工弁、カテーテル、バルーン、人工心臓ポンプ、及び人工肺からなる群より選択される１種以上を備える、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記医療用材料が、繊維、フィルム、シート、バッグ、チューブ、織布、不織布、成形体、及び生体由来組織、並びにこれらの材料のうちの２種以上を含む複合材料からなる群より選択される１種である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤であって、
前記表面処理剤がペプチドを含み、
前記ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤。
【請求項１５】
血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤のセットであって、
前記セットが、ペプチドを含む第１剤と、前記医療機器又は前記医療用材料の表面に結合可能な官能基と、前記ペプチドと結合可能な官能基とを有するリンカー化合物を含む第２剤とを含み、
前記ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤のセット。
【請求項１６】
前記ペプチドがメルカプト基を有し、前記リンカー化合物が、前記ペプチドと結合可能な官能基として、Ｎ−置換マレイミド基を有する、請求項１５に記載の表面処理剤のセット。
【請求項１７】
血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤のセットであって、
前記セットが、ペプチドを含む第１剤と、医療機器又は医療用材料の表面に存在する官能基と、ペプチドが有する官能基とを縮合させる縮合剤を含む第２剤とを含み、
前記ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理における、血管内皮系細胞に特異的に結合するペプチドの使用と、前述の表面処理において好適に使用されるペプチドと、前述のペプチドで表面処理された、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の製造方法と、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の、前述のペプチドを含む表面処理剤とに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、血液と接触して用いられる、人工血管、人工弁、ステント等の埋植医療機器について、抗血栓性や生体適合性の向上が望まれている。
例えば、埋植医療機器の表面に、血管内皮系細胞結合性のタンパクやペプチドを固定化して、種々の材料の表面の抗血栓性を向上させることが試みられている。
【０００３】
具体的には、生体由来の細胞外マトリックスを人工血管の材料として用い、当該人工血管の内腔に、ＲＥＤＶ配列を含む、特定の配列を有する血管内皮系細胞接着性ペプチドを固定化することによって、血栓の形成を抑制する方法が提案されている（特許文献１）。
また、フィブロネクチン、ビロトネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質の結合ドメインに由来する、ＲＧＤ配列や、ＹＩＧＳＲ配列を含むペプチドによる被覆によって、血管ステント等の医療機器の表面の血管内皮化を、当該医療機器が血管内に留置された後に促進させる方法が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１４／０６５０１７号
【特許文献２】特表２０１０−５０２３６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１及び２に記載の発明において利用される、ＲＥＤＶ配列やＲＧＤ配列は、代表的な細胞接着分子であるフィブロネクチンから見出された細胞接着性ペプチド配列であって、ＹＩＧＳＲ配列は細胞接着性分子ラミニンから見出された細胞接着性ペプチド配列である。
このため、ＲＥＤＶ配列、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列等は、様々な接着性細胞と親和性を有し、血管内皮系細胞に対する選択性が必ずしも高くない。
このため、血液と接触して用いられる医療機器や、医療用材料の表面において、高い血管内皮化の効率を達成できる表面処理方法の提供が望まれている。
【０００６】
本発明は、血管内皮系細胞に特異的に結合するペプチドを用いることによって、高い血管内皮化の効率を達成できる医療機器又は医療用材料を得ることができる、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理におけるペプチドの使用と、前述の表面処理において好適に使用されるペプチドと、前述のペプチドで表面処理された、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の製造方法と、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の、前述のペプチドを含む表面処理剤とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血管内皮前駆細胞の表面に特異的に結合する特定の１０種類のアミノ酸配列のいずれか１つを含むペプチドを用いて、医療機器又は医療用材料の表面処理を行うことによって上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、血管内皮系細胞に特異的に結合するペプチドを用いることによって、高い血管内皮化の効率を達成できる医療機器又は医療用材料を得ることができる、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理におけるペプチドの使用と、前述の表面処理において好適に使用されるペプチドと、前述のペプチドで表面処理された、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の製造方法と、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の、前述のペプチドを含む表面処理剤とを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［第１の態様］
本発明の第１の態様は、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理におけるペプチドの使用であって、当該ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ペプチドの使用に関する。
なお、本出願の明細書及び特許請求の範囲において、特段の説明なく「ペプチド」と記載される場合、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。
【００１０】
配列番号１〜１０のアミノ酸配列は、以下に記す通りである。
ＧＱＳＥＫＨＬ（配列番号１）
ＨＧＧＶＲＬＹ（配列番号２）
ＳＦＫＩＰＹＨＹＤＳＧＱ（配列番号３）
ＳＬＳＫＷＳＦ（配列番号４）
ＫＩＡＶＩＳＴ（配列番号５）
ＴＤＮＴＫＰＫ（配列番号６）
ＴＮＷＲＴＩＮ（配列番号７）
ＶＳＲＤＴＰＱ（配列番号８）
ＴＩＰＲＡＰＳＰＡＮＴＹ（配列番号９）
ＮＲＰＤＳＡＱＦＷＬＨＨ（配列番号１０）
【００１１】
配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドは、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び、類似の性質を持つ血中循環細胞に特異的に結合する一方で、血栓形成の原因となる血小板とは結合しにくい。
このため、配列番号１〜１０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有するペプチドも、血管内皮前駆細胞及び、類似の性質を持つ血中循環細胞に特異的に結合する一方で、血栓形成の原因となる血小板とは結合しにくい。
以下、ペプチド中の配列番号１〜１０のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有する部位を、ＥＰＣ結合部位とも記す。
【００１２】
以下、第１の態様について詳細に説明する。
【００１３】
＜医療機器又は医療用材料＞
前述の特定のペプチドを用いて、医療機器又は医療用材料の表面処理が行われる。当該医療機器又は当該医療用材料は血液と接触して使用される機器又は材料が使用される。
血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料を、後述するペプチドを用いて表面処理することにより、高い血管内皮化の効率を達成できる医療機器又は医療用材料を得ることができる。
医療機器又は医療用材料としては、使用時に血液と接触する部位を含む機器又は材料であれば特に限定されない。
【００１４】
医療機器の好適な具体例としては、人工血管、ステント、人工弁、カテーテル、バルーン、人工心臓ポンプ、及び人工肺からなる群より選択される１種以上が挙げられる。
２種以上の医療機器を組み合わせて備える医療機器としては、人工弁を備える人工血管や、ステントを備える人工血管（グラフト）であるステントグラフト等が挙げられる。
【００１５】
これらの医療機器における表面処理される部分の材質は特に限定されず、従来から、上記の医療機器において汎用されている材料であればよい。
【００１６】
医療用材料の好適な具体例としては、繊維、フィルム、シート、バッグ、チューブ、織布、不織布、成形体、及び生体由来組織、並びにこれらの材料のうちの２種以上を含む複合材料からなる群より選択される１種が挙げられる。
【００１７】
これらの医療機器又は医療用材料の表面処理される表面を構成する材質は、有機材料であっても無機材料であってもよく、樹脂等に代表される合成物であってもよく、動物又は植物に由来する天然物であってもよい。また、これらの材質は、天然物が化学的に変性又は改質された材質であってもよい。
【００１８】
医療機器又は医療用材料の表面処理される表面を構成する材質の具体例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸、セルロース及びキチン等の天然高分子；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメチレンカーボネート、ポリジオキサノン、及びこれらの共重合体；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリカーボネート、フッ素樹脂、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリビニルクロライド、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン等の合成樹脂；アルミナ、ジルコニア、アパタイト等のセラミック；ステンレス、コバルト合金、チタン、チタン合金等の金属材料；炭酸カルシウムやリン酸カルシウム等の無機材料が挙げられる。
【００１９】
医療用材料について、繊維や、織布又は不織布を構成する繊維は、撚糸であっても不撚糸であってもよく、また、モノフィラメントであってもマルチフィラメントであってもよい。
また、フィルム、シート、バッグ、チューブや、その他の種々の成形体は、多孔質材料や、積層材料を用いて形成されていてもよい。
【００２０】
生体由来組織としては、角膜、心臓弁、血管、皮膚、軟骨、骨、腱、筋肉、膀胱、小腸、心臓、肝臓、肺、気管、食道、水晶体、硝子体、網膜、神経、脂肪組織、脳、硬膜、胸膜、横隔膜、尿管、腎臓、膵臓、胆のう、歯肉、歯根膜、歯、胎盤、及び生殖器等の組織が挙げられる。
【００２１】
生体由来組織の中では、血液との接触量が多いこと等から、心臓弁、血管、心臓等が好ましく、血管がより好ましい。これらの生体由来組織は、通常、脱細胞化され、細胞を含まない細胞外マトリックからなる状態で使用される。
生体由来組織から脱細胞する方法は特に限定されず、周知の方法に従って行われる。
例えば、このような細胞外マトリックスを用いて作製される人工血管は、基本的に、生体適合性が高く拒絶反応が低い人工血管となり得る。
【００２２】
生体由来組織の供給源である生体は特に限定されないが、例えば、非ヒト動物（例えば、走鳥類、鳥類、又は哺乳類等）を挙げることができる。
哺乳類としては特に限定されないが、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、サル等を挙げることができる。
走鳥類としは特に限定されないが、例えば、エミュー、キーウィ、ダチョウ、ヒクイドリ、又はレア等を挙げることができる。走鳥類の首は一般的に長く、当該首に存在する頚動脈等の血管は、細く、長く、且つ、分岐が少ない。このため、走鳥類の血管を用いて人工血管を作製すれば、内腔の断面がより小さく、より長く、且つ、より分岐の少ない人工血管を実現することができる。このような人工血管は、臨床の現場において、極めて有用であるといえる。また、走鳥類等は飼育が容易であるために、多量の血管組織を安定的に供給することもできる。
【００２３】
種々の形状への加工が容易であり、生体や血液への望ましくない影響が無いか少なく、生体内で安定であること等から、医療機器又は医療用材料の表面の材質は、例えば、フッ素樹脂であるのも好ましい。
【００２４】
フッ素樹脂としては、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン樹脂）、ＰＦＡ（テトラフルオロエチレンと１−パーフルオロアルコキシ−１，２，２−トリフルオロエチレンとの共重合体）、ＦＥＰ（テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンとの共重合体）、ＥＴＦＥ（テトラフルオロエチレンとエチレンとの共重合体）、ＰＣＴＦＥ（ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂）、及びＰＶｄＦ（ポリフッ化ビニリデン樹脂）等が挙げられる。
これらのフッ素樹脂の中では、加工性、及び化学的安定性等から、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン樹脂）が好ましい。
【００２５】
＜ペプチド＞
上記の医療機器又は医療用材料の表面処理に用いられるペプチドは、前述の通り、その配列中に、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
かかる配列を有するペプチドは、血管内皮前駆細胞に特異的に結合する一方で、血栓形成の原因となる血小板とは結合しにくい。
このため、上記のペプチドにより表面処理された医療機器又は医療用材料の表面では、血栓の発生を抑制しつつ、高い血管内皮下の効率を達成しやすい。
【００２６】
ペプチドの配列における、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列の位置は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。
立体障害が小さく、ヒト血管内皮前駆細胞とペプチドとが良好に結合しやすいことから、ペプチドの配列において、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列は、医療機器又は医療用材料の表面とペプチドとの結合部位からより遠いほうの末端である非結合末端付近に存在するのが好ましい。
非結合末端は、ペプチドのＣ末端であっても、Ｎ末端であってもよい。
【００２７】
具体的には、ペプチドの非結合末端と、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する部位の非結合末端側の末端との間に存在するアミノ酸残基数が０以上５以下の整数であるのが好ましく、０であるのがより好ましい。
【００２８】
ペプチドの全長は、表面処理による所望する効果を得られる限り特に限定されない。ペプチドの全長は、８０アミノ酸残基以下が好ましく、５０アミノ酸残基以下がより好ましく、３０アミノ酸残基以下がさらに好ましく、２０アミノ段残基以下がさらにより好ましく、１５アミノ酸残基以下が特に好ましい。
また、ペプチドの調整が容易であり、且つ、所望する表面処理効果を得やすいことから、ペプチドの配列が、配列番号１〜１０の配列以外の配列を含まないのも好ましい。
つまり、ペプチドは、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２９】
ペプチドは、医療機器又は医療用材料の表面に対する接着性を有する接着部位を含んでいてもよい。
ペプチドがかかる接着性部位を含む場合、ペプチドと、医療機器又は医療用材料の表面とを接触させることで、医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを容易に担持させることができる。
【００３０】
接着性部位としては、２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる接着部位が挙げられる。
２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる接着性部位は、２つの水酸基が隣接するジヒドロキシフェニル基を有するため、医療機器又は医療用材料の表面と結合できる。
医療機器又は医療用材料が金属材料からなる場合、表面に存在する金属原子とジヒドロキシフェニル基とのキレーションによって、ペプチドが接着性部位を介して表面に結合する。
医療機器又は医療用材料が、水酸基やアミノ基のような活性水素を含む官能基を有する有機高分子やセラミック等の材料からなる場合、ジヒドロキシフェニル基が酸化されて生成するキノンと、水酸基やアミノ基のような活性水素を含む官能基とが反応することで、接着性ペプチドが接着性部位を介して医療機器又は医療用材料の表面に結合する。
【００３１】
２，３−ジヒドロキシフェニル基及び３，４−ジヒドロキシフェニル基とでは、医療機器又は医療用材料の表面との反応しやすさから３，４−ジヒドロキシフェニル基が好ましい。３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の具体例としては、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチル−Ｌ−アラニン（メチルドーパ）、及び（３Ｒ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）等が挙げられる。これらの中では、実際に、ペプチドを調製する際に入手が容易であること等から、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）が好ましい。
【００３２】
２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる接着部位は、ペプチド中の非結合末端とは反対の末端から１０アミノ酸残基以内に存在するのが好ましく、５アミノ酸残基以内に存在するのがより好ましい。
【００３３】
また、医療機器、又は医療用材料の表面が前述の生体由来組織からなる場合、接着性部位は（ＰＯＧ）ｎで表されるアミノ酸の繰り返し配列を有する部位であるのも好ましい。
ここで、Ｐはプロリンであり、Ｏはヒドロキシプロリンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは括弧内のアミノ酸配列の繰り返し数である。
ｎの数は特に限定されないが、１以上２０以下の整数であってよく、２以上２０以下の整数であってよく、３以上２０以下の整数であってよく、４以上２０以下の整数であってよく、５以上２０以下の整数であってよく、６以上２０以下の整数であってよく、７以上２０以下の整数であってよく、８以上２０以下の整数であってよく、９以上２０以下の整数であってよく、１０以上２０以下の整数であってよい。
【００３４】
（ＰＯＧ）ｎで表されるアミノ酸の繰り返し配列を有する接着性部位は、ペプチド中の非結合末端とは反対の末端付近に存在するのが好ましい。
具体的には、ペプチド中の非結合末端とは反対の末端と、（ＰＯＧ）ｎで表されるアミノ酸の繰り返し配列を有する部位における、ペプチド中の非結合末端とは反対の末端に近い末端との間に存在するアミノ酸残基の数が、０以上５以下の整数であるのが好ましく、０であるのがより好ましい。
【００３５】
ペプチドが上記の接着性部位を有する場合、ペプチドは、接着性部位と、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する部位との間に、任意のアミノ酸配列を有するスペーサー部位を有していてもよい。
当該スペーサー部位のアミノ酸配列は、配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有する部位の立体構造に与える影響が小さいことから、サイズが大きかったり、極性が高かったりする側鎖を有さないグリシンやアラニンのようなアミノ酸の残基を多く含むのが好ましい。
【００３６】
以上説明したペプチドは、設計されたアミノ酸配列に従って、公知の手法により取得することができる。好適な方法としてはＦｍｏｃ法やＢｏｃ法のような固相合成方法が挙げられる。このような固相合成方法で得られる粗製のペプチドは、必要に応じて逆相ＨＰＬＣ等の方法を用いて精製することができる。取得されるペプチドが所望の配列であるか否かは、公知の手段で確認することができる。このような手段としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで測定されるペプチドの分子量と、アミノ酸配列から算出されるペプチドの理論上の分子量とを比較する方法が挙げられる。
【００３７】
＜表面処理方法＞
医療機器、又は医療用材料の表面処理は、ペプチドを、医療機器、又は医療用材料の表面に担持できる方法であれば特に限定されない。
典型的には、医療機器、又は医療用材料の表面にペプチドを結合又は付着させることにより、ペプチドによる表面処理が行われる。
【００３８】
医療機器又は医療用材料の表面へのペプチドの担持は、例えば、分子間の相互作用による弱い結合による担持であってもよく、表面とペプチドとの間に共有結合を形成させる担持であってもよい。
表面とペプチドとの間に共有結合を形成させる方法は特に限定されない。典型的な方法としては、表面に存在する、水酸基、カルボキシ基、アミノ基等の反応性の官能基を、ペプチドが有する、カルボキシ基、アミノ基、水酸基等の官能基と縮合させる方法が挙げられる。縮合によりペプチドを表面に結合させる場合、公知の縮合剤を用いて、表面と、ペプチドとの縮合を行うのが好ましい。縮合剤の種類は、縮合剤がペプチドや医療機器又は医療材料に悪影響を与えない限りにおいて特に限定されず、縮合反応に関与する官能基の種類によって適宜選択される。
また、医療機器、又は医療用材料における表面処理される表面は、特段前処理されていなくてもよく前処理されていてもよい。
【００３９】
ペプチドは、医療機器又は医療用材料の表面に直接担持されてもよい。
また、医療機器又は医療用材料の表面にリンカー化合物を担持させてリンカー部位を形成した後、当該リンカー部位を介在させて、医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを担持させてもよい。
【００４０】
医療機器又は医療用材料の表面へのペプチドの担持は、医療機器又は医療用材料の表面とペプチドとを接触させることにより行われる。
医療機器又は医療用材料の表面とペプチドとを接触させる方法は特に限定されない。医療機器又は医療用材料の表面とペプチドとを接触させる際、医療機器又は医療用材料の表面とペプチドとの均一な接触が容易であることから、通常、ペプチドは溶液の形態で使用される。
ペプチドの溶液を医療機器又は医療用材料の表面に接触させる方法としては、塗布、噴霧、及び浸漬のようは方法が挙げられる。これらの方法の中では浸漬が好ましい。医療機器又は医療用材料の表面が多孔質材料からなる場合もあるが、浸漬によれば、多孔質材料が有する細孔の内部表面にもペプチドを接触させることができる。
【００４１】
浸漬により、医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを接触させる際の温度や時間は、ペプチドの医療機器又は医療用材料の表面への結合又は付着が良好に進行する限り特に限定されない。典型的には、浸漬は、５〜９０℃、好ましくは２０〜７０℃で行われる。また、浸漬時間は、０．１〜４８時間が好ましく、１〜２４時間がより好ましい。
【００４２】
医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを接触させる際のペプチドの使用量は、医療機器又は医療用材料の被処理面の面積に対して、０．１〜５０ｍｇ／ｍ２が好ましく、５．０〜２０ｍｇ／ｍ２がより好ましい。
【００４３】
表面処理時に用いるペプチドの溶液の濃度は特に限定されない。典型的には、ペプチドの溶液の濃度は、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０２〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。
【００４４】
ペプチドにリンカー化合物を結合させて、当該リンカー化合物に由来するリンカー部位を形成した後、当該リンカー部位を介して、ペプチドを医療機器、又は医療用材料の表面に担持させてもよい。
具体的には、リンカー化合物を用いて医療機器又は医療用材料の表面処理を行う場合、以下のＩ）、及びＩＩ）：
Ｉ）医療機器又は医療用材料の表面にリンカー部位を結合させることと、
ＩＩ）リンカー部位に、ペプチドを結合させることと、
を任意の順序で行うことを含む、方法により表面処理を行うのが好ましい。
つまり、上記のＩ）に次いでＩＩ）を行ってもよく、ＩＩ）に次いでＩ）を行ってもよい。
【００４５】
前述の表面の前処理の典型例としては、以下の１）、２）又は３）の処理が挙げられる。
１）プラズマ処理、グロー放電処理、又はコロナ放電処理のような処理
２）化学的処理
３）リンカー化合物による処理。
【００４６】
１）の処理によれば、前処理が施された表面に、水酸基、パーオキサイド基、あるいは、フリーラジカル等が生成する。このため、静電気的な親和力や、水素結合等により、ペプチドが前処理された表面に吸着されやすい。
また、前処理により表面に水酸基が生成している場合は、ペプチドのＣ末端（カルボキシ基）と水酸基との反応によりエステル化を行い、ペプチドを化学的に表面に固定してもよい。
エステル化の方法は特に限定されないが、縮合剤を用いる方法が挙げられる。縮合剤としては、２，４，６−トリクロロベンゾイルクロリド、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物等が挙げられる。
また、４−ジメチルアミノピリジン等の塩基性触媒の存在下に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのようなカルボジイミド化合物を縮合剤として用いてエステル化を行うこともできる。
【００４７】
さらに、表面に水酸基を生成させることができる前処理は、リンカー化合物を用いる前処理を行うためのさらなる前処理としても有用である。表面に反応性に富む水酸基が存在することにより、リンカー化合物を表面に結合させやすい。
【００４８】
２）の処理は、医療機器又は医療用材料の表面に、水酸基、カルボキシ基、アミノ基等の反応性の官能基を化学的処理により導入する方法である。
かかる処理によれば、ペプチドとの反応性を有する官能基や、後述するリンカー化合物が有する反応性基と反応し得る官能基を、医療機器又は医療用材料の表面に導入することができる。
【００４９】
例えば、医療機器又は医療用材料の表面に、アルキル基やアルデヒド基が存在する場合、これらの基を常法に従って酸化することにより、カルボキシ基を生成させることができる。
また、医療機器又は医療用材料の表面に芳香環が存在する場合、常法によるニトロ化と、ニトロ基の還元とを行うことにより、医療機器又は医療用材料の表面にアミノ基を導入することができる。
さらに、フッ素樹脂等の材料については、ボラン（ＢＨ３）での処理の後、ＮａＯＨ等の塩基の存在下に、Ｈ２Ｏ２等の酸化剤を用いて処理することで、当該材料の表面に水酸基を導入することができる。
なお、医療機器又は医療用材料の表面への化学的な処理方法は、表面に所望する官能基を導入可能な方法であればよく、上記の具体的な処理方法には限定されない。
【００５０】
３）の処理によれば、ペプチドと化学的に結合可能な官能基を有し、且つ、医療機器又は医療用材料の表面に対して接着性を有するか、又は化学的に結合可能なリンカー化合物を用いて、医療機器又は医療用材料の表面が前処理される。
【００５１】
リンカー化合物が、医療機器又は医療用材料の表面に対して化学的に結合可能な化合物である場合、リンカー化合物は、医療機器又は医療用材料の表面に存在する官能基と反応して共有結合を形成する反応性基を有する。
リンカー化合物が有する反応性基の種類は、医療機器又は医療用材料の表面に存在する官能基の種類に応じて適宜選択される。
【００５２】
例えば、医療機器又は医療用材料の表面に水酸基が存在する場合、リンカー化合物が有する反応性基の好適な例としては、カルボキシ基、アルコキシシリル基（例えば、トリメトキシシリル基、トリトキシシリル基）、ハロシリル基（例えば、トリクロロシリル基）、ハロカルボニル基（例えば、クロロカルボニル基）、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基等が挙げられる。
医療機器又は医療用材料の表面にアミノ基（−ＮＨ２）が存在する場合、リンカー化合物が有する反応性基の好適な例としては、カルボキシ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基（ＮＨＳエステル基）、ニトロフェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル基（ＨＯＢｔエステル基）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールエステル基（ＨＯＡｔエステル基）、及びエポキシ基等が挙げられる。
表面にメルカプト基（−ＳＨ）が存在する場合、リンカー化合物が有する反応性基としては、メルカプト基、及びＮ−置換マレイミド基等が挙げられる。
【００５３】
リンカー化合物の一例としては、ペプチドとの反応性を有する官能基を有するシランカップリング剤が挙げられる。
このようなシランカップリング剤の好適な例としては、３−アミノプロピリルトリエトキシシラン、及び３−アミノプロピルトリメトキシシランのようなアミノシランカップリング剤；３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、及び３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのようなエポキシシランカップリング剤；３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシランのようなメルカプトシランカップリング剤が挙げられる。
【００５４】
アミノシランカップリング剤を用いる場合、例えば、ペプチドのＣ末端とアミノ基とを反応させることにより、リンカーであるシランカップリング剤にペプチドを結合させることができる。
エポキシ基は、アミノ基、カルボキシ基、フェノール性水酸基等の種々の官能基と反応し得る。このため、エポキシシランカップリング剤を用いる場合、ペプチド中のエポキシ基と反応し得る官能基と、エポキシ基との反応により、リンカーであるシランカップリング剤にペプチドを結合させることができる。
メルカプト基は、メルカプト基同士の反応によりジスルフィド結合を形成させる。このため、メルカプトシランカップリング剤を用いる場合、ペプチド中のメルカプト基と、シランカップリング剤由来のメルカプト基との反応により、リンカーであるシランカップリング剤にペプチドを結合させることができる。
【００５５】
また、リンカー化合物の他の好適な例としては、３−マレイミドプロピオン酸、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、４−マレイミドブタン酸、４−マレイミドブタン酸Ｎ−スクシンイミジル、６−マレイミドヘキサン酸、及び６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル等のＮ−置換マレイミド基を有する化合物が挙げられる。
これらの化合物は、カルボキシ基又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基（ＮＨＳエステル基）により医療機器又は医療用材料の表面の水酸基やアミノ基と結合し、Ｎ−置換マレイミド基によりペプチド中のメルカプト基と結合する。
【００５６】
反応性が高く、医療機器又は医療用材料の表面に良好にペプチドを結合させやすい点からは、ペプチドとしてメルカプト基を含むペプチドを用い、末端にＮ−置換マレイミド基を有するリンカー化合物を用いてリンカー部位を形成するのが好ましい。
この場合、ペプチドが有するメルカプト基と、リンカー部位の末端のＮ−置換マレイミド基とが反応し、ペプチドがスルフィド結合（−Ｓ−）を介してリンカー部位に結合する。
ペプチドにメルカプト基を導入する方法は特に限定されないが、ペプチドにシステイン残基を導入する方法が好ましい。
【００５７】
また、医療機器又は医療用材料の表面に対する接着性を有する接着性ペプチド断片と、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチド断片とを含む、少なくとも２以上のペプチド断片を結合させて、ペプチドを生成させることができる。
この場合、接着性ペプチド断片を、上記のリンカー化合物と同様に用いることができる。接着性ペプチド断片の全長は特に限定されない。接着性ペプチド断片は、前述の好適なアミノ酸残基数の範囲内である全長を有するペプチドを生成させることが可能な全長を有するのが好ましい。
【００５８】
接着性ペプチド断片としては、２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる接着部位を有するペプチドが挙げられる。接着部位については、ペプチドにおいて接着部位を設ける場合について前述した通りである。
【００５９】
また、医療機器、又は医療用材料の表面が前述の生体由来組織からなる場合、接着性ペプチド断片中の接着性部位は（ＰＯＧ）ｎで表されるアミノ酸の繰り返し配列を有する部位であるのも好ましい。
（ＰＯＧ）ｎで表されるアミノ酸の繰り返し配列を有する接着部位については、ペプチドにおいて接着部位を設ける場合について前述した通りである。
【００６０】
上記の方法に従って、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理を行い、当該表面処理において、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを使用することによって、高い血管内皮化の効率を達成できる医療機器又は医療用材料を得ることができる、
【００６１】
［第２の態様］
本発明の第２の態様は、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。
当該ペプチドは、第１の態様において説明したペプチドと同様である。
【００６２】
［第３の態様］
本発明の第３の態様は、血液と接触して使用される、表面処理された医療機器又は医療用材料の製造方法であって、
医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを結合又は付着させることを含み、
ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、製造方法に関する。
【００６３】
第３の態様にかかる製造方法によって製造される医療機器又は医療用材料は、第１の態様において説明した医療機器又は医療用材料と同様である。
また、第３の態様にかかる製造方法において使用されるペプチドは、第１の態様において説明したペプチドと同様である。
さらに、医療機器又は医療用材料の表面にペプチドを結合又は付着させることは、第１の態様について説明した表面処理方法と同様にして行われる。
【００６４】
上記の製造方法によれば、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを用いて表面処理を行うことによって、高い血管内皮化の効率を達成できる、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料を得ることができる。
【００６５】
［第４の態様］
本発明の第４の態様は、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤であって、
表面処理剤がペプチドを含み、
ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤に関する。
【００６６】
第４の態様にかかる表面処理剤による表面処理対象である医療機器又は医療用材料は、第１の態様において説明した医療機器又は医療用材料と同様である。
また、第４の態様にかかる表面処理剤に含まれるペプチドは、第１の態様において説明したペプチドと同様である。
【００６７】
第４の態様の表面処理剤は、固体状であっても液体状であってもよく、医療機器又は医療用材料の表面に、所望する量のペプチドを均一に接触させやすいことから液体状であるのが好ましい。つまり、表面処理剤は表面処理液であるのが好ましい。
表面処理液に含まれる溶媒の種類は、ペプチドを溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。ペプチドの溶解性や、医療機器又は医療用材料の表面に対する悪影響がないこと等から、通常、表面処理液に含まれる溶媒としては水が使用される。
【００６８】
表面処理液の調製方法は特に限定されない。ペプチドが溶液の状態である場合、ペプチドを含む溶液を、ペプチドの濃度が所望する濃度となるように、希釈又は濃縮することで表面処理液が得られる。ペプチドがフリーズドライ等の方法で粉末化されている場合、ペプチドの粉末と水等の溶媒とを所定の比率で混合して、ペプチドを溶媒に溶解させることで表面処理液が得られる。
【００６９】
表面処理液中のペプチドの濃度は、特に限定されない。表面処理液中のペプチドの好ましい濃度は、第１の態様において説明したペプチドの溶液と同様である。
【００７０】
表面処理剤が表面処理液である場合、当該表面処理液は、本発明の目的を阻害しない範囲で、ペプチド中の、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる部位や、接着性部位に結合しない種々の添加剤を含んでいてもよい。表面処理液に配合され得る添加剤としては、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、粘度調整剤、安定剤、着色剤、香料、酸化防止剤、防腐剤、防黴剤、及び紫外線吸収剤等が挙げられる。これらの添加剤は、通常、これらの添加剤が種々の薬液に対して配合される量に従って、表面処理液に添加される。
【００７１】
［第５の態様］
本発明の第５の態様は、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤のセットであって、
セットが、ペプチドを含む第１剤と、医療機器又は医療用材料の表面に結合可能な官能基と、ペプチドと結合可能な官能基とを有するリンカー化合物を含む第２剤とを含み、
ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤のセットに関する。
【００７２】
第５の態様にかかる表面処理剤のセットによる表面処理対象である医療機器又は医療用材料は、第１の態様において説明した医療機器又は医療用材料と同様である。
また、第５の態様にかかる表面処理剤のセットにおいて用いるペプチドは、第１の態様において説明したペプチドと同様である。
さらに、第５の態様にかかる表面処理剤のセットにおいて用いるリンカー化合物は、第１の態様において説明したリンカー化合物と同様である。
【００７３】
第５の態様の表面処理剤のセットについて、第１剤と、第２剤とは、それぞれ固体状であっても液体状であってもよく、医療機器又は医療用材料の表面に、所望する量のペプチド又はリンカー化合物を均一に接触させやすいことから液体状であるのが好ましい。つまり、第１剤、及び第２剤は、それぞれ液状の製剤であるのが好ましい。
【００７４】
ペプチドを含む第１剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤としては、第４の態様に置いて説明したペプチドを含む表面処理液と同様の液を用いることができる。
【００７５】
リンカー化合物を含む第２剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤に含まれる溶媒の種類は、リンカー化合物を溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。溶媒は、水であっても、有機溶剤であっても、有機溶剤の水溶液であってもよい。
また、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファのような、グッド緩衝液（Ｇｏｏｄ’ｓ緩衝液）を溶媒として用いることもできる。
第２剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤におけるリンカー化合物の濃度は特に限定されない。
【００７６】
医療機器又は医療用材料の表面とリンカー化合物との間、又はリンカー化合物とペプチドとの間で縮合反応が生じる場合、表面処理剤のセットにかかる縮合反応を促進させる縮合剤を含ませてもよい。
【００７７】
縮合剤の種類は、縮合剤がペプチドや医療機器又は医療材料に悪影響を与えない限りにおいて特に限定されず、縮合反応に関与する官能基の種類によって適宜選択される。縮合剤としては、例えば、第１の態様について前述した縮合剤を用いることができる。
【００７８】
縮合剤は、第１剤、第２剤、又は第１剤と第２剤との双方に加えてもよく、縮合剤を含む第３剤として表面処理剤のセットにおいて用いられてもよい。
第３剤として縮合剤を用いる場合、縮合剤を溶解させる溶媒の種類は、溶媒がペプチドや医療機器又は医療材料に悪影響を与えない限りにおいて特に限定されず、縮合剤の種類に応じて適宜選択される。
【００７９】
［第６の態様］
本発明の第６の態様は、血液と接触して使用される医療機器又は医療用材料の表面処理用の表面処理剤のセットであって、
セットが、ペプチドを含む第１剤と、医療機器又は医療用材料の表面に存在する官能基と、ペプチドが有する官能基とを縮合させる縮合剤を含む第２剤とを含み、
ペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、表面処理剤のセットに関する。
【００８０】
第６の態様にかかる表面処理剤のセットによる表面処理対象である医療機器又は医療用材料は、第１の態様において説明した医療機器又は医療用材料と同様である。
また、第６の態様にかかる表面処理剤のセットにおいて用いるペプチドは、第１の態様において説明したペプチドと同様である。
さらに、第６の態様にかかる表面処理剤のセットにおいて用いる縮合剤は、第１の態様において説明した縮合剤と同様である。
【００８１】
第６の態様の表面処理剤のセットについて、第１剤と、第２剤とは、それぞれ固体状であっても液体状であってもよく、医療機器又は医療用材料の表面に、所望する量のペプチド又はリンカー化合物を均一に接触させやすいことから液体状であるのが好ましい。つまり、第１剤、及び第２剤は、それぞれ液状の製剤であるのが好ましい。
【００８２】
ペプチドを含む第１剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤としては、第４の態様に置いて説明したペプチドを含む表面処理液と同様の液を用いることができる。
【００８３】
縮合剤を含む第２剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤に含まれる溶媒の種類は、縮合剤を溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。溶媒は、水であっても、有機溶剤であっても、有機溶剤の水溶液であってもよい。
また、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファのような、グッド緩衝液（Ｇｏｏｄ’ｓ緩衝液）を溶媒として用いることもできる。
第２剤が液状の製剤である場合、当該液状の製剤における縮合剤の濃度は特に限定されない。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
［実施例１〜１０］
Ｆｍｏｃ固相合成方法により、以下に示す配列番号１１〜２０のアミノ酸配列からなるペプチド１〜１０をそれぞれ合成した。ペプチド１〜１０は、それぞれ配列番号１〜１０のアミノ酸配列を含む。得られたペプチド１〜１０を、それぞれｅＰＴＦＥ（延伸多孔質ＰＴＦＥ）表面への固定化反応に供した。
ＧＱＳＥＫＨＬＧＧＧＣ（配列番号１１）
ＨＧＧＶＲＬＹＧＧＧＣ（配列番号１２）
ＳＦＫＩＰＹＨＹＤＳＧＱＧＧＧＣ（配列番号１３）
ＳＬＳＫＷＳＦＧＧＧＣ（配列番号１４）
ＫＩＡＶＩＳＴＧＧＧＣ（配列番号１５）
ＴＤＮＴＫＰＫＧＧＧＣ（配列番号１６）
ＴＮＷＲＴＩＮＧＧＧＣ（配列番号１７）
ＶＳＲＤＴＰＱＧＧＧＣ（配列番号１８）
ＴＩＰＲＡＰＳＰＡＮＴＹＧＧＧＣ（配列番号１９）
ＮＲＰＤＳＡＱＦＷＬＨＨＧＧＧＣ（配列番号２０）
【００８６】
まず、ｅＰＴＦＥディスク（直径１２ｍｍ）をメタノールにより洗浄した後、乾燥した。乾燥されたディスクをＢＨ３のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（１Ｍ）中に１時間浸漬した。次いで、ディスクの表面をＨ２Ｏ２／ＮａＯＨ（２ｇのＮａＯＨを１４ｍＬの純水に溶解し、使用直前に３０％Ｈ２Ｏ２溶液と混合して使用）と１時間反応させて、ディスクの表面に水酸基を導入した。
【００８７】
水酸基を表面に導入されたディスクに対して、６−マレイミドヘキサン酸のＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファ溶液（ｐＨ６、濃度１ｍｇ／ｍＬ）と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのＭＥＳバッファ溶液（ｐＨ６、濃度２ｍｇ／ｍＬ）とを１時間反応させて、ディスク表面の水酸基と、６−マレイミドヘキサン酸とのエステル化反応を行った。
前述のペプチド１〜１０をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に濃度１．５ｍｇ／ｍＬで溶解させたペプチド溶液と、Ｎ置換マレイミド基を表面に有するディスクとを１時間反応させて、ディスク表面にペプチド１〜１０を結合させた。
【００８８】
メルカプト基を有するペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＳＨ）を上記方法に従ってＰＴＦＥ表面に結合させる際の反応スキームを、以下に示す。
【化１】
2018121760.tif 000002
【００８９】
［比較例１及び２］
表面未修飾のｅＰＴＦＥディスクを、比較例１のディスクとして用いた。また、実施例１〜１０の方法に従って、表面に水酸基が導入されたｅＰＴＦＥディスクを、比較例２のディスクとして用いた。
【００９０】
＜細胞接着性評価＞
ペプチド１〜１０により表面修飾された実施例１〜１０のディスクと、表面未修飾の比較例１のディスクと、表面に水酸基が導入された比較例２のディスクとに、それぞれ、２×１０４のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種し、４時間、又は４８時間培養した後の細胞数を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて計数した。
具体的には、ペプチドで表面修飾されたディスクを、２４穴プレートのウェル内に入れ、ステンレス製リングにより底面に固定して試験を行った。
ＨＵＶＥＣ細胞はＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，より購入した。
培養は、血管内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ−２）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にＥＧＭ−２添加物質（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃ＣＣ４１７６，Ｌｏｎｚａ）を添加した培地中で、３７℃、５％ＣＯ２環境下、４、及び４８時間行った。
細胞数の計数は、非接着細胞を除去した後に、行った。
細胞数の計数結果を表１に記す。
【００９１】
また、実施例２、実施例４、実施例５、実施例１０、比較例１、及び比較例２については、４時間後の、ディスク表面の細胞の形態を、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）と共焦点顕微鏡とで観察した。
その結果、実施例２、実施例４、実施例５、及び実施例１０では、細胞の良好な伸展が確認され、糸状仮足（ｐｈｉｌｉｐｏｄｉａ）の伸長が認められた。
他方、比較例１及び比較例２では、細胞の顕著な増殖亢進が認められなかった。
【００９２】
さらに、実施例２、実施例５、比較例１、及び比較例２については、４８時間後の、ディスク表面の細胞の形態を、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）と共焦点顕微鏡とで観察した。
その結果、実施例２、及び実施例５では、顕著な細胞増殖と糸状仮足（ｐｈｉｌｉｐｏｄｉａ）の伸長とが認められた。
他方、比較例１及び比較例２では、細胞の顕著な増殖亢進が認められなかった。
【００９３】
【表１】
2018121760.tif 000003
【００９４】
表１の結果によれば、配列番号１〜１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、配列番号１１〜２０のアミノ酸配列を有するペプチド１〜１０を用いる表面処理には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の接着を促進させる作用があると認められる。
【００９５】
［実施例１１〜２０］
表２に記載のペプチド（ペプチド１〜ペプチド１０）を用いて、実施例１〜１０と同様にして、ｅＰＴＦＥ縫合糸（ゴアテックス（登録商標）繊維）の表面に、ペプチドを結合させる処理を行った。
【００９６】
［比較例３］
表面未修飾のｅＰＴＦＥ縫合糸を、比較例３の縫合糸として用いた。
【００９７】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏでの全血接触試験＞
内径１０ｍｍ、全長６５ｍｍのチューブ型のコネクターのチューブ内壁付近に、血流方向と平行に配向されるように、実施例１１〜２０、及び比較例３のｅＰＴＦＥ縫合糸を配置した。
次いで、内径６ｍｍ、外径１０ｍｍのポリプロピレン製のチューブ２本を、それぞれ、上記のコネクターの両端に深さ５ｍｍずつはめ込んで、ｅＰＴＦＥ縫合糸をコネクター内に固定した。
このようにして準備した、ｅＰＴＦＥ縫合糸を内部に備えるチューブ型のカートリッジを、エチレンオキシドガスで滅菌した後、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験に用いた。
【００９８】
試験用の動物としては、ミニブタ（ゲッチンゲン、雄、２５〜３０ｋｇ）を用いた。当該ミニブタを用いて、上行大動脈へ送血カニューレ、右心耳から脱血カニューレを挿入して人工心肺回路を構築した。
人工心肺回路には、脱血カニューレ／試験用カートリッジ／静脈血リザーバー／血液輸送ポンプ／人口肺／送血カニューレの順で、これらの装置を連結した。
上記の構成の人工心肺回路を用いて、活性化全血凝固時間（ＡＣＴ）が４００以上となるようにヘパリンを投与された血液を、１時間通液した。
【００９９】
＜細胞接着の確認＞
実施例１１、実施例１２、及び実施例２０のｅＰＴＦＥ縫合糸について、以下の方法に従って、細胞接着の確認を行った。
１時間の血液通液後、カートリッジを回収し、カートリッジ内のｅＰＴＦＥ縫合糸を生理食塩水により洗浄した。次いで、４％グルタルアルデヒドを用いて、ｅＰＴＦＥ縫合糸に対して固定化処理を行った。
【０１００】
次いで、実施例１１、実施例１２、及び実施例２０のｅＰＴＦＥ縫合糸に接着している細胞の表面マーカーを、蛍光免疫染色により評価した。
核は、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）のＰＢＳ溶液（１０μｇ／ｍＬ）を用いて染色した。
蛍光免疫染色に用いた抗体は、ＰＥ（フィコエリスリン）で標識されたＣＤ３４、ＣＤ１０５、及びＦｌｋ−１抗体である。血管内皮前駆細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、及びＦｌｋ−１抗体を発現している。
実施例１１、実施例１２、及び実施例２０のｅＰＴＦＥ縫合糸に対して固定化処理を行った後、１００倍に希釈された抗体溶液を添加して、室温で１時間インキュベートした後に、共焦点レーザー顕微鏡によりｅＰＴＦＥ縫合糸表面の細胞を観察した。
その結果、実施例１１、実施例１２、及び実施例２０のいずれのｅＰＴＦＥ縫合糸でも、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、及びＦｌｋ−１抗体で染色された細胞が観察された。
つまり、実施例１１、実施例１２、及び実施例２０のｅＰＴＦＥ縫合糸の表面に接着する細胞は、血管内皮前駆細胞であると考えられる。
【０１０１】
＜血小板粘着性評価＞
実施例１１〜２０、及び比較例３のｅＰＴＦＥ縫合糸について、以下の方法に従って、血小板粘着面積と、水接触角とを評価した。これらの評価結果を表２に記す。
（血小板粘着面積測定）
ミニブタから採血したクエン酸血を用いて、富血小板血漿を以下の要領で作成した。
まず、採取した血液を６００Ｇで４分間遠心した後、上清を採取して、上清中の血小板数をＺ２コールターカウンターで計測した。
また、採取した血液を１３００Ｇで１２０分間遠心して、貧血小板血漿を作成した。
両者を用いて、２×１０７血小板／ｍＬの富血小板血漿を調製した。
各サンプルを、この血小板懸濁液と３７℃で１時間接触させた後、ＰＢＳでの洗浄３回と、フォルムアルデヒドのＰＢＳ溶液（３．７ｖ／ｖ％）での１０分間の処理により固定化とを行った。次いで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１ｖ／ｖ％）で３分間処理した後、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ染色液で３０分間染色処理を行った。
洗浄後、ＰＢＳにより３回洗浄を行った後、サンプルの表面を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８０（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて撮像し、サンプルの表面の血小板で覆われている面積の割合をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアにて計測した。
（水接触角測定）
静的接触角測定は接触角測定装置ＣＡ−Ｘ（共和界面科学社）により液滴法で測定した。純水液滴を摘果して１分後に液滴像を撮像して接触角を計測した。
【０１０２】
【表２】
2018121760.tif 000004
【０１０３】
表２の結果によれば、配列番号１〜１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、配列番号１１〜２０のアミノ酸配列を有するペプチド１〜１０を用いる表面処理には、血小板の粘着を抑制する作用があると認められる。
【０１０４】
［実施例２１〜３０］
表３に記載のペプチド（ペプチド１〜ペプチド１０）を用いて、実施例１〜１０と同様にして、ｅＰＴＦＥディスク（直径１２ｍｍ）の表面に、ペプチドを結合させる処理を行った。
【０１０５】
［比較例４及び５］
表面未修飾のｅＰＴＦＥのディスクを、比較例４の試験片として用いた。また、実施例１〜１０と同様の方法で表面に水酸基が導入されたｅＰＴＦＥのディスクを、比較例５の試験片として用いた。
【０１０６】
＜ＥＰＣ（ヒト血管内皮前駆細胞）接着性評価＞
実施例２１〜３０のペプチドで表面処理されたｅＰＴＦＥの試験片と、ペプチドにより表面処理が施されていない比較例４及び５の試験片とを用いて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を２×１０４（細胞数／ウェル）の密度で播種することに変えて、ＥＰＣを１．５×１０４（細胞数／ウェル）の密度で播種することと、培養時間を、４時間、及び４８時間から、４時間のみに変更することとの他は、実施例１〜１０、比較例１、及び比較例２での細胞接着性評価と同様の方法で、ＥＰＣ（ヒト血管内皮前駆細胞）の接着性評価を行った。
【表３】
2018121760.tif 000005
【０１０７】
表３の結果によれば、配列番号１〜１０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、配列番号１１〜２０のアミノ酸配列を有するペプチド１〜１０を用いる表面処理には、４時間程度の短時間の培養でもＥＰＣ（ヒト血管内皮前駆細胞）の接着を促進させる作用があると認められる。
【配列表】
2018121760000001.app