(57)【要約】      （修正有）【課題】間葉系幹細胞移植後の全身性の強い免疫抑制作用が抑制された、間葉系幹細胞移植方法の提供。【解決手段】間葉系幹細胞移植における後天的免疫寛容誘導方法であって、受容個体に免疫原を導入する日の2〜14日前の期間内に間葉系幹細胞及び前記免疫原と同一免疫原性を有する免疫原又はその一部を少なくとも1回投与する第１工程、並びに、受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日に間葉系幹細胞を投与する第２工程、を含む前記方法。前記間葉系幹細胞は、間葉系結合組織、中枢神経系又は肝臓の再構築用の幹細胞であって、インターロイキン-10（IL-10）を過剰に発現するものであることが好ましい。前記免疫原はウイルス、細胞、組織又は臓器であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
後天的免疫寛容誘導方法であって、
受容個体に免疫原を導入する日の2日前〜14日前の期間内に間葉系幹細胞及び前記免疫原と同一免疫原性を有する免疫原又はその一部を少なくとも1回投与する第１工程、及び
受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日に間葉系幹細胞を投与する第２工程を含む前記方法。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が、インターロイキン-10（IL-10）を過剰に発現することのできる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記IL-10の過剰発現が外因性のIL-10発現システムによる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞が、間葉系結合組織、中枢神経系又は肝臓の再構築用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫原がウイルス、細胞、組織又は臓器である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞移植において生存率及び生着率の高い移植用の間葉系幹細胞、当該移植用の間葉系幹細胞を製造する方法、及び間葉系幹細胞の移植後の生着を増強する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells；以下、本明細書ではしばしば「MSCs」と略称する）は、間葉系に属する細胞への分化能を有する体性幹細胞である。MSCsは、増殖力が旺盛であり、細胞数確保が容易であること、移植時の拒絶反応が少ないこと、及び倫理的な障壁が低いこと等の理由から、現時点で最も現実的な細胞移植治療のプラットフォームと考えられており、骨、血管、心筋等の間葉系結合組織や中枢神経系の再構築等の再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
また、MSCsには、炎症性疾患における炎症制御療法への応用や、患者本人のMSCsに対して治療遺伝子を導入する自家移植治療の有効性が高いという利点がある（非特許文献１）。さらに、MSCsは炎症や組織障害のある部位に集積する性質や免疫抑制能を有することから、造血幹細胞の生着促進を目的として骨髄移植と同時に骨髄由来MSCsの移植が行われている（非特許文献２）。MSCsの免疫抑制作用はMSCsが集積した局所に限定され、全身性の強い免疫抑制は起こらないと想定されることから、免疫抑制剤と比較して安全性が高いと考えられており、その臨床的効果が期待されている。
【０００４】
それ故、これまでにも標的組織にMSCsを移植する細胞移植治療や、MSCsの免疫制御機能を利用した移植片対宿主病等の炎症性疾患に対する炎症制御療法の臨床試験が実施されている（非特許文献３〜６）。また、カナダやニュージーランドでは、有効性や安全性が確立され、既に医薬承認されている。
【０００５】
ところが、MSCsは移植後の生存率や生着率が不安定なため生着不全を生じやすく、本来の性質を長期にわたって維持することが困難という大きな問題がある。それ故、MSCsを用いた自家移植治療において、これまでは治療遺伝子を安定的に発現することができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Connick et al., 2012, Lancet Neurol. 11(2):150-156.
【非特許文献２】Carrancio S., et al., 2012,Cell Transplant.11:15-156
【非特許文献３】M von Bonin et al., 2009, Bone Marrow Transplant.,43:245-251
【非特許文献４】Tolar et al., 2011, Hum.Gene Ther., 22:257-262
【非特許文献５】Si Y.L., et al., 2011, Ageing Res. Rev.,10:93-103
【非特許文献６】Wang et al. 2012, J. Hematol.Oncol.,5:19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題点を鑑み、移植後の細胞生存率や生着率を改善した、副作用が少なく安全性の高いMSCsを開発し、提供すること、及び細胞生存率及び生着率の高い移植用幹細胞を簡便に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者はMSCsに対して様々な処理を行ったところ、抗炎症性サイトカインであるインターロイキン-10（以下、本明細書ではしばしば「IL-10」と略称する）をMSCs内で過剰に発現させたときに、そのMSCsの移植後の生存率及び生着率が劇的に向上することを見出した。
【０００９】
さらに、細胞移植や組織移植を受ける受容個体に対して、移植前に免疫原と共にMSCsで少なくとも1回処理することで後天的な免疫寛容を誘導できることを見出した。
【００１０】
本発明は、前記知見に基づくものであって、以下を提供する。
【００１１】
（１）IL-10を過剰に発現することのできるMSCsからなる移植用幹細胞。
【００１２】
（２）前記IL-10の過剰発現が外因性のIL-10発現システムによる、（１）に記載の移植用幹細胞。
【００１３】
（３）前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、（２）に記載の移植用幹細胞。
【００１４】
（４）間葉系結合組織、中枢神経系又は肝臓の再構築用である、（１）〜（３）のいずれかに記載の移植用幹細胞。
【００１５】
（５）IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムをMSCsに導入する工程を含む、移植用幹細胞の製造方法。
【００１６】
（６）前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、（５）に記載の移植用幹細胞の製造方法。
【００１７】
（７）IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを有効成分とする、間葉系幹細胞生着増強剤。
【００１８】
（８）前記IL-10発現システムがプラスミドベクター又はウイルスベクターである、（７）に記載の間葉系幹細胞生着増強剤。
【００１９】
（９）後天的免疫寛容誘導方法であって、受容個体に免疫原を導入する日の2日前〜14日前の期間内にMSCs及び前記免疫原と同一免疫原性を有する免疫原又はその一部を少なくとも1回投与する第１工程、及び受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日にMSCsを投与する第２工程を含む前記方法。
【００２０】
（１０）前記MSCsが（１）〜（４）のいずれかに記載の移植用幹細胞である、（９）に記載の方法。
【００２１】
（１１）前記免疫原がウイルス、細胞、組織、又は臓器である、（９）又は（１０）に記載の方法。
【００２２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-108408号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の移植用幹細胞によれば、移植後の細胞生存率及び生着率が高く、また安全性の高いMSCsを提供することができる。
【００２４】
本発明の移植用幹細胞の製造方法によれば、簡便に移植後の生着率が高い移植用幹細胞を製造することができる。
【００２５】
本発明のMSCs生着増強剤によれば、移植後のMSCsの細胞生存率及び生着率を増強することができる。
【００２６】
本発明のMSCs免疫寛容誘導方法によれば、移植後の細胞に対する拒絶反応を抑制できる。また、それによって移植後の細胞生存率及び生着率をさらに増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】組換えIL-10をMSCsと共にNOD/Scidマウスの下腿に局注投与したときのMSCsの生存率を示す。Aは、投与2、4日後のマウスのin vivoイメージング像を示す。マウス左下腿にはMSCsと組換えIL-10を（(+)で示す）、マウス右下腿にはMSCsのみを（(-)で示す）、それぞれ投与している。またB、Cは、Aのイメージング像に基づいて算出された定量値で、それぞれ投与2日後及び4日後を示す。
【図２】IL-10発現AAVベクター及びコントロールのLacZ発現AAVベクターをMSCsと共にNOD/Scid マウスの下腿に局注投与した時のMSCsの生存率を示す。Aは、投与9日後のin vivoイメージング像を示す。IL-10発現AAVベクター（IL-10)はマウス左下腿に、LacZ発現AAVベクター（LacZ）はマウス右下腿に、それぞれ投与している。またBは、Aのin vivoイメージング像に基づいて算出された定量値を示す。
【図３】IL-10発現プラスミドDNA又はコントロールのGFP発現プラスミドDNAを導入したMSCsを、NOD/Scidマウスの下腿に局注投与した時のMSCsの生存率を示す。この図では、IL-10発現プラスミドDNA（IL-10(+))をマウス左下腿に、GFP発現プラスミドDNA（IL-10(-)）をマウス右下腿に、それぞれ投与している。Aは、投与日（0 day)から3日、7日、及び10日後のマウスのin vivoイメージング像を示す。また、Bは、IL-10発現プラスミドDNA又はGFP発現プラスミドDNAの導入から12日間培養後のMSCsにおけるIL-10発現量を示す。そして、Cは、Aのイメージング像に基づいて算出された投与3日、7日、10及び12日後の定量値を示す。
【図４】MSCs移植マウスにおける血清中のIL-10濃度を示す。ContはMSCsのみ移植したコントロールマウスを、pIL-10(+)MSCsは図３Aに記載のマウスIL-10発現プラスミドDNAを導入したMSCsであるIL-10(+)MSCsを移植した2匹のマウス（No.1、No.2）を、そしてAAV1-IL-10はMSCs移植部位にマウスIL-10発現AAVベクターAAV1-IL-10をMSCsと共投与したマウスを示す。
【図５】AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入とIL-10の発現を示す。AはGFP発現AAVベクター（AAV1-GFP)を遺伝子導入した7日後のMSCsの結果である。矢印はGFP発現AAVベクターが導入され、GFPを発現しているMSCsを示す。BはAAV1-GFP又はマウスIL-10発現AAVベクター（AAV1-IL-10)を導入した7日後のMSCsにおけるIL-10の発現結果を示す。
【図６】本発明の移植用幹細胞をNOD/Scidマウスへ局注投与した後のMSCsの生存率を示す。Aは、MSCs投与から各日後におけるマウスのin vivoイメージング像を示す。この図では、AAV1-IL-10を導入したMSCsであるvIL-10(+)MSCsをマウス左下腿に（IL-10(+))、コントロールのAAV1-GFPを導入したMSCsであるvIL-10(-)MSCsをマウス右下腿に（IL-10(-))、それぞれ投与している。またBはAの結果に基づいて算出した定量値（n=5）である。
【図７】マウス筋組織における移植したMSCsの生着を示す図である。AはvIL-10(-)MSCsの、BはvIL-10(+)MSCsの筋組織における生着像を、そしてCは組織染色像より算出したvIL-10(-)MSCs及びvIL-10(+)MSCsの生着率を示す。
【図８】イヌへのvIL-10(+)MSCs移植フローの概念図を示す。
【図９】移植30日後のイヌ筋組織におけるvIL-10(+)MSCsの生着を示す図である。破線円内や矢印で示す濃い斑点は、筋線維内膜及び外膜に生着したvIL-10(+)MSCsを示す。
【図１０】Aは、MSCsを移植した左右前脛骨筋組織における4部位の位置を示す。TA-2がMSCsの移植部位である。Bは、移植30日後の左右前脛骨筋組織における各部位のMSCsの生存率及び組織内IL-10濃度を示す。（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ左前脛骨筋（vIL-10(-)MSCsを移植）及び右前脛骨筋（vIL-10(+)MSCsを移植）におけるMSCsの生存率である。また（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ左前脛骨筋及び右前脛骨筋における各部位の筋組織中のIL-10濃度である。
【図１１】非分化誘導MSCsの生着及び筋線維形成を示す。Aは、筋組織中におけるMSCsの病理像である。破線円内の矢印で示す部位は移植したvIL-10(+)MSCsの炎症部位での生着を、また矢頭で示す部位は生着したMSCsから新たに形成された筋線維を示す。また、Bにおいて破線内の明るい細胞は、in vitroにおいてMSCsと筋芽細胞が融合していることを示す。
【図１２】本発明の後天的免疫寛容誘導方法による免疫寛容誘導効果を示す図である。A：免疫原のAAV9-Lucのみを正常犬の前脛骨筋組織に局所投与し、本発明の免疫寛容誘導処理を行っていない対照用犬（Cont-AAV）を示す。B：本発明の後天的免疫寛容誘導方法に基づいて免疫原のAAV9-Lucと共にMSCsを正常犬の上記同部位に局所投与した免疫寛容誘導犬（MSCs+AAV）を示す。C：MSCsのみを正常犬の上記同部位に局所投与し、免疫原のAAV9-Lucを投与していない対照用犬（Cont-MSCs）を示す。A〜Cの左図は、それぞれの犬における実験用タイムテーブルを示す。i.v.は静脈内投与を、i.ｍ.は筋肉内投与（局所投与）を示す。また右図は、前脛骨筋組織を生検し、免疫原のAAV9におけるマーカー遺伝子であるルシフェラーゼの発現を、抗ルシフェラーゼ抗体を用いて検出した図である。ルシフェラーゼ発現細胞は、図中、明るい細胞として示される。図中のスケールバーは、100μmである。
【図１３】静脈内投与を用いた本発明の後天的免疫寛容誘導方法による免疫寛容誘導効果を示す図である。A：免疫原のAAV9-Lucのみを正常犬に静注し、本発明の免疫寛容誘導処理を行っていない対照用犬（Cont-AAV）を示す。B：本発明の後天的免疫寛容誘導方法に基づいて免疫原のAAV9-Lucと共にMSCsを正常犬に静注した免疫寛容誘導犬（MSCs+AAV）を示す。C：本発明の後天的免疫寛容誘導方法に基づいて免疫原のAAV9-μDysと共にMSCsを筋ジストロフィー誘導患犬（DMD)に静注した免疫寛容誘導犬（DMD/MSCs+AAV）を示す。A〜Cの左図は、それぞれの犬における実験用タイムテーブルを示す。i.v.は静脈内投与を示す。また右図は、側頭筋を生検し、ルシフェラーゼの発現を、抗ルシフェラーゼ抗体を用いて（A及びB）、又はマイクロジストロフィンの発現を、抗ジストロフィン抗体を用いて（C）、検出した図である。各図中に見られる白い斑点は、核であり、ルシフェラーゼ又はマイクロジストロフィン発現細胞は、図中、明るい細胞として示される。図中のスケールバーは、A及びBが100μm、Cが50μmである。
【図１４】各種イヌの15m走における走行タイムの結果を示す図である。図中、横軸下段の「pre」は、筋ジストロフィー患犬（DMD)に対して、本発明の後天的免疫寛容誘導方法によって前処理を行った時点を示す。他の数値は、AAV9-μDysを導入した基準日からの経過時間（週）を示す。また、横軸上段のカッコ内の数値は、筋ジストロフィー患犬（DMD)の週齢を示す。
【図１５】筋ジストロフィー患犬の病態評価を示す図である。縦軸は、Grading Scoreのスコア値を、横軸は患犬の月齢を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．移植用幹細胞
１−１．概要及び定義
本発明の第１の態様は、移植用幹細胞である。
【００２９】
「移植用幹細胞」とは、細胞移植のための幹細胞であって、受容個体（レシピエント）の特定組織へ移植し、移植部位及び／又はその周辺部位に生着させて、周辺環境に応じて適切に分化させることを目的とする。本態様の移植用幹細胞は、特に、骨、血管、心筋等の間葉系結合組織、中枢神経系、又は肝組織の補充や再構築等の組織再生に好適に利用し得る。本明細書で「受容個体」とは、脊椎動物、好ましくは鳥類又は哺乳動物（ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、及びげっ歯類を含む）、より好ましくはヒトである。
【００３０】
「生着」とは、一般的には移植された細胞、組織又は臓器が移植部位において本来の機能を発揮し得る状態となることをいう。本明細書では移植対象物が幹細胞であることから、特に、移植した幹細胞が移植部位又はその周辺部位等において、所定の遺伝子を適時発現し、また周辺環境に応じて適切な細胞分化を行う機能を有することをいう。本明細書に記載の「生着率」とは、移植した幹細胞に対する生着した幹細胞の割合をいう。一方、本明細書に記載の「生存率」とは、移植した幹細胞に対する移植後に生存している幹細胞の割合をいう。生着率や生存率は、細胞数のような絶対値から算出してもよいし、細胞由来の標識強度のような相対値から算出してもよい。
【００３１】
１−２．構成
本発明の移植用幹細胞は、インターロイキン-10を細胞内で過剰に発現することのできる間葉系幹細胞からなる。
【００３２】
「間葉系幹細胞（MSCs）は、前述のように、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有する細胞である。またMSCsは、胚葉差を超えて、神経細胞（外胚葉系由来）や肝細胞（内胚葉系由来）への可塑的分化能も知られている。本態様の移植用幹細胞は、MSCsをベースとする。
【００３３】
「インターロイキン-10（Interleukin-10；IL-10）」は、抗炎症性サイトカインである。2型ヘルパーT細胞（Th2細胞）をはじめ、単球、マクロファージ、肥満細胞、活性化B細胞、角化細胞等の多くの細胞で生産され、単球系細胞に作用して炎症性サイトカインの産生等を抑制制御し、炎症症状を抑制する他、マクロファージの機能抑制制御を行うことが知られている。
【００３４】
本明細書においてIL-10は、野生型IL-10の他、野生型IL-10と同等以上の生理活性を保持する、変異型IL-10及びIL-10断片を包含する。
【００３５】
本明細書で「野生型IL-10」とは、IL-10本来の機能を有し、自然界に存在する対立遺伝子群において、最も多く存在する対立遺伝子にコードされた各生物種のIL-10タンパク質をいう。例えば、配列番号１に示すヒトIL-10、配列番号３に示すマウスIL-10、配列番号５に示すラットIL-10、配列番号７に示すイヌIL-10、配列番号９に示すチンパンジーIL-10、配列番号１１に示すウシIL-10等が該当する。
【００３６】
本明細書で「変異型IL-10」とは、前記野生型IL-10に変異が生じたIL-10タンパク質をいう。具体的には、野生型IL-10のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、又は付加を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列と85％以上、90％以上、好ましくは95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上のアミノ酸同一性を示す変異体を意味する。ここで「複数個」とは、2〜10個、2〜7個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個をいう。また、「同一性」の％は、BLASTやFASTAによるタンパク質の検索システムを用いて、必要に応じてギャップを導入して、野生型IL-10のアミノ酸配列との一致度が最大となるようにアラインメントしたときの野生型IL-10の全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合をいう。
【００３７】
本明細書において「IL-10断片」とは、野生型IL-10又は変異型IL-10のポリペプチド断片をいう。IL-10断片のアミノ酸の長さ及び領域は、野生型IL-10の生理活性を保持する長さ及び領域であれば、特に限定はしない。通常はIL-10の機能ドメインを破壊しない状態で包含するポリペプチド断片が好適に用いられる。ここでいう機能ドメインとは、IL-10に特有の抑制性活性機能を担い、又はその機能を発揮する上で不可欠な領域をいう。
【００３８】
MSCsはIL-10をコードする内因性のIL-10遺伝子を有しており、その遺伝子に起因するIL-10を発現し得る。それ故、本態様の移植用幹細胞は、通常のMSCsよりもIL-10を過剰に発現することを特徴とする。本明細書において「IL-10を過剰（に）発現」とは、通常のMSCsにおけるIL-10の発現量の2倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上の発現量をいう。
【００３９】
本態様の移植用幹細胞がIL-10を過剰発現する機序は特に限定しない。例えば、内因性のIL-10の発現増強によるものであってもよいし、外因性のIL-10発現システムによるものであってもよい。
【００４０】
「内因性のIL-10の発現増強」とは、MSCsのゲノム上におけるIL-10遺伝子の発現量が結果的に増強されれば、その機序は特に限定はしない。例えば、IL-10遺伝子の発現を制御するエンハンサー又はプロモーターに変異が生じ、IL-10を過剰に発現するようになった変異型MSCs、ゲノム上におけるIL-10遺伝子が重複により多コピー化された変異型MSCs等が挙げられる。
【００４１】
「外因性のIL-10発現システム」とは、MSCs内に導入された外来のIL-10発現システムをいう。
【００４２】
「IL-10発現システム」とは、MSCs内でIL-10遺伝子を発現可能な状態で包含する一つの発現系単位をいう。IL-10遺伝子を持続的に発現できる発現単位が好ましい。
【００４３】
「IL-10遺伝子」は、前記IL-10をコードする遺伝子又はその断片をいう。例えば、前述の配列番号１に示すヒトIL-10をコードする配列番号２に示すヒトIL-10遺伝子、配列番号３に示すマウスIL-10をコードする配列番号４に示すマウスIL-10遺伝子、配列番号５に示すラットIL-10をコードする配列番号６に示すラットIL-10遺伝子、配列番号７に示すイヌIL-10をコードする配列番号８に示すイヌIL-10遺伝子、配列番号９に示すチンパンジーIL-10をコードする配列番号１０に示すチンパンジーIL-10遺伝子、配列番号１１に示すウシIL-10をコードする配列番号１２に示すウシIL-10遺伝子等が該当する。
【００４４】
IL-10発現システムは、IL-10遺伝子の他に、MSCs内で当該IL-10遺伝子を発現する上で必要な構成要素を有する。そのような構成要素には、例えば、プロモーター及びターミネーターが含まれる。IL-10発現システムにおいて、IL-10遺伝子は、核酸発現システム内のプロモーターとターミネーターの制御下で発現可能な状態で配置されている。その他、エンハンサー、ポリA付加シグナル、5'-UTR（非翻訳領域）配列、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含んでいてもよい。
【００４５】
プロモーターは、MSCs内で作動可能なプロモーターであれば、特に制限はしない。例えば、IL-10発現システムを含むMSCsが哺乳動物由来の場合は、哺乳動物で作動可能なプロモーターであるヒトサイトメガロウイルス、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等のウイルスプロモーター、又はエロンゲーションファクター1α（EF1α）等の哺乳類細胞由来のプロモーターを使用することができる。プロモーターには、その発現制御の性質により過剰発現型プロモーター、構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、又は誘導性プロモーター等が知られているが、IL-10発現システムに使用するプロモーターは、過剰発現型プロモーター又は構成的プロモーターが好ましい。IL-10発現システムは、移植幹細胞における内因性IL-10遺伝子の発現が移植部位において位置的制御又は量的制御を受けている場合であっても、その制御から独立してIL-10遺伝子を常時発現することができることが望ましい。IL-10発現システムにおいて、プロモーターは、IL-10遺伝子の開始コドンよりも上流に配置される。
【００４６】
ターミネーターは、MSCs内で、プロモーターにより転写されたIL-10遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。IL-10発現システムにおいて、ターミネーターは、IL-10遺伝子の終止コドンよりも下流側に配置される。
【００４７】
IL-10発現システムには、IL-10遺伝子を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそっくり取り出して組み込んだものの他、組換えIL-10遺伝子と各構成要素を組合せて人工的に構築したものが存在するが、本発明ではいずれの核酸発現システムも利用できる。また、IL-10発現システムは、1システム内にIL-10遺伝子を1つ含むモノシストロニックであってもよいし、2以上のIL-10遺伝子を含むポリシストロニックであってもよい。
【００４８】
IL-10発現システムとして、例えば、IL-10発現型のプラスミドベクター、IL-10発現型のウイルスベクター、又はIL-10発現型の人工染色体ベクターが挙げられる。好ましくはウイルスベクターである。
【００４９】
「プラスミドベクター」とは、プラスミドを改変した遺伝子ベクターである。IL-10発現型のプラスミドベクターに用いるプラスミド部分は、MSCs内でIL-10遺伝子を発現可能であれば、特に限定はしない。プラスミドベクターはMSCs内では自己複製能を有さないことから、プラスミドベクターを用いる場合、それがMSCsのゲノム内に挿入されていない限りIL-10遺伝子の発現は、通常、一過的である。IL-10発現システムの骨格となるプラスミド部分は、市販の発現プラスミド、例えば、哺乳動物細胞用発現プラスミドを用いることもできる。
【００５０】
「ウイルスベクター」とは、ウイルスの感染能や複製能を利用した遺伝子ベクターである。ウイルスゲノムから病原性に関する遺伝子を除去し、外来遺伝子（ここではIL-10遺伝子）を組み込んだウイルス核酸（DNA又はRNAを含む）を包含するウイルス粒子から構成される。IL-10発現システムには、当該分野で公知のあらゆるウイルスに由来するベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルス（レンチウイルス、マウスモロニー白血病ウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus；以下、「AAV」と表記する）、センダイウイルスが挙げられる。パルボウイルスに属する非病原性のウイルスであるAAVは、自己複製能の欠損により自律的増殖ができず、増殖にはアデノウイルスやヘルペスウイルスの共感染を必要とするため感染性が低い。また宿主における免疫原性も低い。それ故、遺伝子ベクターとして、安全性が高いという利点を有する。さらに、AAVは、宿主域が広く、筋細胞、神経細胞、肝細胞等の種々の細胞に感染可能である。したがって、AAVは、本態様におけるIL-10発現システムのウイルスベクターとしても好ましい。また、ウイルスベクターは、カプシド又は被膜粒子からなる外殻タンパク質に包含された細胞感染能を有するウイルス粒子とすることができる。
【００５１】
「人工染色体」は、ヒト人工染色体（HAC; Human Artificial Chromosome）を含む。
【００５２】
本態様の移植用幹細胞は、MSCs一つあたりに同一の又は異なる複数のIL-10発現システムを含むことができる。これにより、個々のシステムからのIL-10の発現量が少ない場合でも、一細胞あたりのIL-10発現システム数を増やすことで、一MSCsあたりのIL-10発現量を増加させて、過剰発現状態にすることができる。
【００５３】
１−３．効果
本態様の移植用幹細胞によれば、移植後の細胞生存率及び生着率が高く、副作用の低い幹細胞を提供することができる。したがって、本態様の移植用幹細胞を移植細胞として、骨、血管、心筋等の間葉系結合組織、中枢神経系、又は肝臓に移植することによって、移植細胞は、移植組織に生着し、周辺環境に応答して適当な分化誘導を受けることから、組織再構築等の再生医療に適用することができる。
【００５４】
２．移植用幹細胞の製造方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、移植用幹細胞の製造方法である。本態様の製造方法は、IL-10発現システムをMSCsに導入して、IL-10を過剰に発現することのできるMSCsを製造することを特徴とする。
【００５５】
２−２．方法
本態様の製造方法は、IL-10発現システム導入工程を含む。IL-10発現システム導入工程は、IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを少なくとも一つMSCsに導入する工程をいう。
【００５６】
IL-10発現システム導入工程で使用するIL-10発現システムの構成は、前記第１態様に記載のIL-10発現システムと同じでよい。
【００５７】
IL-10発現システムの調製は、当該分野で公知の方法、例えば、Green ＆ Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従って行えばよい。
【００５８】
以下でIL-10発現システムとしてのプラスミドベクター又はウイルスベクターの調製について具体例を挙げて説明をするが、IL-10発現システムの調製は、以下に制限されるものではない。
【００５９】
（１）プラスミドベクターの調製
IL-10遺伝子のクローニングを行う。使用するIL-10遺伝子の由来種は、IL-10発現システムを導入するMSCs内でIL-10としての活性を有する限り、特に制限はしない。好ましくは導入するMSCsと同じ生物種由来のIL-10遺伝子である。例えば、ヒト由来のMSCsにIL-10発現システムを導入する場合、IL-10遺伝子は、配列番号２で示されるヒトIL-10遺伝子が好ましい。IL-10遺伝子のクローニングは、当該分野で公知の方法、例えば、上記Green ＆ Sambrook（2012）に記載の方法に従って行えばよい。例えば、ヒトIL-10遺伝子をクローニングする場合、配列番号２で示される塩基配列から適当な領域を選択し、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成する。化学合成は、ライフサイエンスメーカーの受託合成サービスを利用すればよい。次に、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトのcDNAライブラリーからヒトIL-10遺伝子を当該分野で公知の方法、例えばプラークハイブリダイゼーション法等に基づいて単離する。詳細な遺伝子の単離方法については、上記Green ＆ Sambrook2012）等を参照すればよい。ヒトcDNAライブラリーは、ライフサイエンスメーカー各社から市販されているので、それを利用することもできる。あるいは、配列番号２で示される塩基配列に基づいてプライマーペアとなるオリゴヌクレオチドを化学合成し、そのプライマーペアを用いて、ヒトのゲノムDNA又はcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法等の核酸増幅法により目的とするヒトIL-10遺伝子を増幅してもよい。核酸増幅を行なう場合には、pfuポリメラーゼのような3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有するフィデリティー（正確性）の高いDNAポリメラーゼを使用することが好ましい。核酸増幅の詳細な条件等ついては、例えば、Innis M. et al （Ed.），1990，Academic Press, PCR Protocols： A Guide to Methods and Applicationsに記載の方法を参照すればよい。単離したヒトIL-10遺伝子を必要に応じて適当なプラスミドに挿入し、大腸菌等の微生物内でクローニングした後、全長塩基配列を公知技術に基づいて確認する。この他、ヒトIL-10のcDNAクローンが市販されていることから、それを購入して用いることもできる。
【００６０】
続いて、クローニングしたヒトIL-10遺伝子を発現用プラスミドベクターの所定の部位に組み込む。これら一連の遺伝子操作技術は、当該分野で周知の技術である。詳細な方法については、上記Green ＆ Sambrook（2012）等を参照すればよい。
【００６１】
（２）ウイルスベクターの調製
基本操作は、前記プラスミドベクターの方法に準ずればよい。まず、ウイルスゲノムを当該分野で公知の方法により調製した後、それを適当なクローニングベクター（例えば、大腸菌由来のpBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系）に挿入して組換え体を得る。次に、組換え体に含まれるウイルスゲノム内の所定の部位に上記（１）で説明したIL-10遺伝子を挿入し、クローニングする。続いて、制限酵素によって前記組換え体からIL-10発現システムであるウイルスゲノム領域を切り出せばよい。これによって、目的のウイルスベクターを得ることができる。
【００６２】
IL-10発現システムをMSCs内に導入する方法、すなわちMSCsの形質転換方法は、当該分野で公知の任意の適当な方法を用いればよい。
【００６３】
例えば、IL-10発現システムがプラスミドベクターの場合、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合等の周知の方法を用いることができる。これらの具体的な方法については、当該分野で周知の方法、例えば、前記Green ＆ Sambrook（2012）等に記載の方法を参照すればよい。また、Lipofectamin 2000（life technologies）等の市販の核酸導入剤を使用してプラスミドベクターをMSCsに導入してもよい。
【００６４】
IL-10発現システムがウイルスベクターの場合、そのウイルスベクターをMSCsにウイルス感染させてMSCs内に導入すればよい。感染方法は、ベクターに用いたウイルスの種類に基づいて、当該分野で周知の方法、例えば、前記Green ＆ Sambrook（2012）等に記載の方法を参照すればよい。
【００６５】
IL-10をMSCs内で安定的かつ持続的に発現させるために、相同性組換えを介してIL-10発現システムをMSCsのゲノム内に挿入してもよい。
【００６６】
２−３．効果
本態様の製造方法によれば、MSCsをベースとして、簡便かつ比較的安価に、移植用幹細胞を製造することができる。この方法によって、移植後の生着率が高いMSCsを容易に入手することが可能となる。
【００６７】
３．間葉系幹細胞生着増強剤
３−１．概要
本発明の第３の態様は、間葉系幹細胞生着増強剤（MSCs生着増強剤）である。本態様のMSCs生着増強剤は、MSCsを細胞生存率及び生着率の高い移植用幹細胞に変換するための薬剤で、移植後のMSCsの生存率及び生着率を劇的に増強させることを特徴とする。
【００６８】
３−２．構成
本態様のMSCs生着増強剤は、IL-10を過剰発現可能なIL-10発現システムを有効成分とする。このIL-10発現システムは、前記第１態様に記載のIL-10発現システムと同一の構成を有することから、ここではその説明を省略する。本態様のMSCs生着増強剤は、乾燥した固体状態、又はそれを適当なバッファに溶解した液体状態のいずれであってもよい。有効成分であるIL-10発現システムは、核酸で構成されることから、ヌクレアーゼフリーの条件下で、MSCs生着増強剤において分解されずに安定的に保持されるような条件下、例えば、氷点下で保存されることが好ましい。
【００６９】
３−３．使用方法
本態様のMSCs生着増強剤は、有効成分であるIL-10発現システムを移植対象細胞であるMSCs内に導入することで、その目的を達成し得る。IL-10発現システムをMSCs内に導入する方法は、IL-10発現システムの種類によって異なるが、基本的には上記実施例２に記載のIL-10発現システムをMSCs内に導入する方法（MSCsの形質転換方法）に準じて行えばよい。移植対象細胞となるMSCsは、生体から単離し、培養した野生型MSCsのみならず、ルシフェラーゼ発現ベクター等のマーカー遺伝子を予め導入した変異型MSCsであってもよい。
【００７０】
３−４．効果
本態様のMSCs生着増強剤によれば、通常のMSCsから容易に細胞生存率及び生着率の高い移植用MSCsを調製することができる。
【００７１】
４．後天的免疫寛容誘導方法
４−１．概要
本発明の第４の態様は、後天的免疫寛容誘導方法である。本態様の方法は、受容個体の免疫寛容を後天的に誘導し、生体内に導入する細胞や組織等の免疫原に対する免疫応答を抑制することを特徴とする。
【００７２】
４−２．方法
本態様の方法は、第１工程及び第２工程を必須の工程として含む。
【００７３】
（１）第１工程
「第１工程」は、受容個体に免疫原を導入する日前の所定の期間内にMSCs及び該免疫原又はその一部を投与する工程である。
【００７４】
本態様でいう「免疫原」とは、生体内への導入を目的とする免疫原性を有する物質であり、主としてタンパク質をいう。例えば、ウイルス、細胞、組織、又は臓器等が挙げられる。なお、本工程及び次述する第２工程で使用する免疫原は、受容個体と異なる免疫原性を有していればよく、必ずしも同じ種類の免疫原である必要はない。「異なる免疫原性を有する」とは、免疫原性又は抗原性が異なることをいう。例えば、ヒト白血球抗原（HLA）型やウイルスの血清型が異なることをいう。受容個体であるヒト（受容者）に、異なるヒト由来の組織を移植する場合、移植組織と受容者の免疫原性であるHLA型は互いに異なる。
【００７５】
本態様でいう「その一部」とは、移植する免疫原が注射等を介して局所投与又は血管内投与できないほど大きなサイズの場合、免疫原の一部で、受容個体に局所投与又は血管内投与可能な程度のサイズのものを意味する。例えば、免疫原が特定の組織であれば、その組織を構成する1細胞〜複数個の細胞塊をいう。
【００７６】
本態様で用いるMSCsは、通常のMSCsであってもよいし、第１態様に記載したIL-10を過剰に発現することのできる移植用幹細胞としてのMSCsであってもよい。MSCsとして移植用幹細胞を用いる場合、本工程ではMSCsのみを投与することができる。
【００７７】
本工程では、免疫原の受容個体への移植日を基準日（0日目）として、その2日前から14日前の期間（13日間）、好ましくは2日前から10日前の期間（9日間）、さらに好ましくは2日前から8日前の期間（7日間）内にMSCsと免疫原又はその一部を受容個体内に投与する。MSCsと免疫原又はその一部は、それらを混合して、免疫原がウイルスの場合にはMSCsに感染させた後に、又は個別に、受容個体に同時に投与してもよいし、それぞれを順番に投与してもよい。この場合、投与順序は、制限しない。MSCs投与後に免疫原又はその一部を受容個体に投与してもよいし、その逆であってもよい。ただし、両者の投与間隔は、30分以内、好ましくは10分以内である。
【００７８】
上記期間内の投与回数は、少なくとも1回あればよい。通常は1〜数回で足りる。ただし、原則として1日あたり1回とする。期間内の投与時期は、問わないが、例えば、期間内の投与回数が1回であれば、基準日の6〜8日前の期間内が好ましい。
【００７９】
受容個体への投与方法は、限定はされないが、免疫原の移植予定箇所又はその周辺に直接投与する局所投与法か循環系を介した全身投与法が好ましく使用され得る。局所投与法には、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、骨髄内投与、組織内投与（臓器内投与、器官内投与を含む）、及び腹腔内投与等が挙げられる。循環系を介した全身投与法には、静脈内投与、動脈内投与、及びリンパ管内投与等が挙げられる。上記投与方法は、いずれも注射による液剤投与が好ましい。静脈内注射による投与方法は、本態様において好適な投与方法である。
【００８０】
本工程で1回の投与あたりにおけるMSCsの細胞数及び免疫原の量は、限定はしないが、MSCsであれば、例えば、5×105 cells/kg B.W.（Body Weight)〜2×106cells/kg B.W.の範囲であればよい。また、免疫原の量は、その種類によって異なるが、ウイルスであれば1×105v.g./cell〜1×106v.g./cellの範囲、細胞であれば1×102〜1×1010個/kg B.W.の範囲であればよい。
【００８１】
（２）第２工程
「第２工程」とは、受容個体に免疫原を導入する日の前日又は当日にMSCsを投与する工程をいう。
【００８２】
本工程で投与するMSCsは、第１工程で投与したMSCsと異なるMSCsであってもよい。例えば、第１工程で通常のMSCsを投与し、本工程では第１態様に記載したIL-10を過剰に発現することのできる移植用幹細胞を投与することができる。
【００８３】
免疫原導入日、すなわち基準日の前述又は当日のいずれにMSCsを投与してもよいが、好ましくは前日投与である。基準日当日にMSCsを投与する場合、導入する免疫原とは別個に投与してもよいし、免疫原の導入と同時に投与してもよい。免疫原の導入と別個に投与する場合、MSCs投与後に免疫原を導入することが好ましい。また、免疫原の導入と同時に投与する場合、導入する免疫原がウイルスのように局所投与又は循環系を介した全身投与が可能であれば、MSCsと混合して導入することもできる。
【００８４】
４−３．効果
本態様の後天的免疫寛容誘導方法で処理した受容個体は、前処理で使用した免疫原に対して免疫寛容性が誘導される。したがって、その後、当該分野で公知の方法で免疫原を受容個体に導入することで、受容個体における導入した免疫原への免疫応答を抑制することができる。それ故、免疫原が細胞、組織、又は臓器の場合、それらの移植による受容個体内での免疫応答による拒絶反応を抑制又は回避できることから、移植後の細胞等の生存率を高め、また受容個体への生着率を増強することができる。
【００８５】
［比較例１］
＜組換えIL-10によるMSCsの生存率の改善効果の検証＞
（目的）
組換えマウスIL-10をMSCsと共に筋肉組織内に導入したときの移植細胞の生存率の改善効果を検証する。
【００８６】
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
ラット骨髄由来MSCs（SD-rat MSCs）にルシフェラーゼ発現ベクターpLucを導入して、ルシフェラーゼを安定に発現する細胞株SD-rat MSCs-Lucを樹立した。SD-rat MSCs-Lucを10% FBS（ニチレイ）含有DMED/F-12(1:1)（GIBCO）培地を入れたディッシュに播種して、5% CO2存在下37℃で培養した。以下、本明細書における比較例１〜２及び実施例１〜２に記載の「MSCs」は、実験に使用した「SD-rat MSCs-Luc」を意味する。
【００８７】
２．マウスへの局所移植
培養後のMSCsをトリプシン処理により回収後、細胞数5×106個/100μLとなるようにPBSで調整し、MSCs溶液を調製した。組換えマウスIL-10（PEPROTEC）を0.3μg/10μL生理食塩水（以下、「0.3μgのIL-10」と略称する）及び1.0μg/10μL生理食塩水（以下、「1.0μgのIL-10」と略称する）に調整し、それぞれ前記MSCs溶液と混和して、NOD/Scidマウス（3ヶ月齢、♂）の左下腿に局注投与することによりMSCsを移植した。コントロールには組換えIL-10を含まないMSCs溶液（IL-10(-)MSCs）を右下腿に局注投与した。投与から1及び4日後に同量の組換えマウスIL-10を左下腿に追加投与した。
【００８８】
３．移植したMSCsにおける生存率の検証
投与から2、4、9日後に、移植したMSCsのルシフェラーゼ発光活性をマウスの生体外から測定するin vivo生体イメージング解析を行った。2％イソフルラン麻酔下にて15mg/mLのルシフェリン溶液を150mg/kgとなるように、200〜300μLをマウス腹腔内に投与した。20分後のルシフェラーゼ発光量をIVIS（登録商標）Imaging System（PerkinElmer）を用いて測定し、ソフトウェア；Living Image（登録商標）3.2を用いてROI(Region of Interest)として数値化した後、投与後の移植したMSCsの生存率を定量的に解析した。コントロールであるIL-10(-)MSCsにおけるROIを1としたときの、IL-10(+)MSCsにおける発光値の比率を算出した。
【００８９】
（結果）
図１に結果を示す。Aは、投与2、4日後のマウスのイメージング像(n=2)を、またBは、Aのイメージング像に基づいて算出された定量値を示す。0.3μgのIL-10をMSCsと共に投与した場合、2日後、4日後共にIL-10(-)MSCsと比較して生存率に大きな差は認められなかった。しかし、1.0μgのIL-10をMSCsと共に投与した場合には、投与から2日後には3.2倍、4日後には1.7倍となった。この結果から、IL-10による量依存的な移植MSCsの生存率の改善が確認された。
【００９０】
しかし、0.3μg及び1.0μgのIL-10共に、投与から9日後には、MSCsの生存は確認できなかった。したがって、IL-10をMSCsと共に組織内に投与した場合、移植されたMSCsの生存率は、IL-10の量依存的に改善し得るものの、その効果は一過的であり、生着は困難であることが明らかとなった。
【００９１】
［比較例２］
＜IL-10発現AAVベクターの同時投与によるMSCs生存率の改善効果の検証＞
（目的）
IL-10発現AAVベクターをMSCsと共に筋肉組織内に同時投与したときのMSCsの生存率の改善効果を検証する。
【００９２】
（方法）
１．組換えAAVの調製
本比較例では、組換えAAV1(rAAV1)を使用した。rAAV1は、Okadaらの方法(Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20:1013-1021; Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218)に従って調製した。
【００９３】
IL-10発現AAVベクター（AAV1-CAG-mIL-10-WPRE(EW)；以下、「AAV1-IL-10」と表記する）の調製は、まず、マウス末梢血リンパ球よりRNAを採取後、RT-PCRによりcDNAに逆転写し、そのcDNAを鋳型として、5’側にBamHIタグを有する配列番号１３（Fw:5’-CGCGGATCCATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCT-3’）及び１４(Rv:5’-GAGGATCCTCTTAGCTTTTCATTTTGATCAT-3’)からなるプライマーセットを用いて、PCRによりマウスIL-10のコード領域を組換えマウスIL-10遺伝子として増幅した。続いて、増幅産物をBamHIで切断後、pW-CAG-WPREベクター(Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218)のBamHI部位に組み込んでAAV1-IL-10を調製した。AAV1-IL-10は、投与した組織内において持続的にIL-10を発現することができる。
【００９４】
一方、IL-10に代えてLacZを含むLacZ発現AAVベクター（pAAV-LacZ；以下、AAV1-LacZと表記する）(Agilent Technologies)をコントロールとした。
【００９５】
２．マウスへの局所移植とMSCs生存率の検証
基本的な方法は、比較例１に記載の方法に準じた。投与4日前にNOD/Scid マウス（5ヶ月齢、♂）の左右下腿に10μMカルジオトキシン（Sigma-Aldrich）100μLを局注投与し、筋傷害を誘発した。AAV1-IL-10及びAAV1-LacZを、5×108 g.c.及び1×109 g.c.に調整し、5×106個/100μL MSCs 溶液と混和して、AAV1-IL-10をマウスの左下腿に及びAAV1-LacZを右下腿に、それぞれ局注投与した。投与から9日後、in vivo生体イメージング解析によりMSCsの生存率を定量的に解析した。
【００９６】
（結果）
図２に結果を示す。Aは投与9日後のマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値（n=４）示す。AAV1-IL-10を局注投与した場合であっても、投与した量に関わらず移植MSCsの生存率の改善効果は認められなかった。したがって、投与組織内でIL-10を持続的に発現させた場合でも、MSCsの生着はできないことが明らかとなった。
【００９７】
［実施例１］
＜IL-10を細胞内で過剰発現するMSCsによるMSCs生存率の向上効果の検証＞
（目的）
IL-10発現プラスミドによりMSCsにおけるIL-10の細胞内発現量を増加させたときのMSCsの生存率の向上効果、及び血清中のIL-10濃度を検証する。
【００９８】
（方法）
１．MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入
マウスIL-10発現プラスミドDNA（pW-CAG-mIL-10-WPRE）及びコントロールGFP発現プラスミドDNA(pW-CAG-EGFP-WPRE)を2μg、それぞれ100μLのNucleofection溶液（Human MSC Nucleofector kit、LONZA）／MSCs 5×105個と混ぜ合わせ、Amaxa Nucleofectorシステム（C-17モード）を用いて遺伝子導入を行った。なお、pW-CAG-mIL-10-WPREは、pW-CAG-WPREのBamHI部位に、比較例２で調製した組換えマウスIL-10遺伝子を導入して調製した。また、pW-CAG-EGFP-WPREは、pW-CAG-WPREのBamHI部位に、EGFP遺伝子を導入して調製した(Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218)。詳細は本品添付プロトコルに従った。以下、マウスIL-10発現プラスミドDNAを導入したMSCsをpIL-10(+)MSCs、コントロールのGFP発現プラスミドDNAを導入したMSCsをpIL-10(-)MSCsとする。
【００９９】
２．マウスへの局注投与及び生存率の検証
基本的には比較例１に記載の方法に準じた。上記「１．MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入」によりMSCsに各遺伝子を導入した直後に、NOD/Scidマウス（6ヶ月齢、♀）の左下腿及び右下腿に、それぞれ7.5×106個/100μLのpIL-10(+)MSCs溶液及びpIL-10(-)MSCs溶液を等量ずつ局注投与した。投与から3、7、10、及び13日後にin vivo生体イメージング解析を行い、MSCsの生存率を定量的に解析した。
【０１００】
３．IL-10発現解析
MSCs由来のIL-10発現の確認は、上記「１．MSCsへのIL-10発現プラスミドDNAの遺伝子導入」において遺伝子導入したMSCsの一部を前述の10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地に播種して、5% CO2存在下37℃で12日間培養後の培養上清を用いて、ELISA法（Mouse IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC）により添付のプロトコルに従って行った。
【０１０１】
４．血清中のIL-10濃度の測定
MSCs投与から13日後にマウス心臓より採血し、血清中のIL-10濃度を、Mouse IL-10 ELISA Kit（Thermo SCIENTIFIC）を用いて定量した。対照として、比較例２においてMSCs移植部位にAAV1-IL-10を局注投与したマウスからも同様に採血し、血清中のIL-10濃度を、同キットを用いて定量した。
【０１０２】
（結果）
図３に結果を示す。Aは、MSCs投与から各日後におけるマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値（n=2）を、そしてCはMSCs由来のIL-10発現量を示す。pIL-10(+)MSCsは、pIL-10(-)MSCsと比較して、投与から7日及び10日後に、それぞれ69倍及び3.4倍もの高い値を示した。一方、投与から12日後には、ルシフェラーゼのシグナル強度が確認できなかった。この結果から、MSCs内でIL-10を過剰発現させることによって、移植後のMSCsの生存率が向上し、従来方法では困難であった投与後10日間でもMSCsの生着が可能であることが示唆された。
【０１０３】
図４は、MSCs移植マウスにおける血清中のIL-10濃度を示す。比較例２においてMSCs移植部位にAAV1-IL-10を局注投与したマウスでは、血清中のIL-10濃度が軽度（〜150pg/mL）に上昇した。一方、IL-10を細胞内で発現するpIL-10(+)MSCsを移植した本実施例の2匹のマウス（No.1、No.2）では、血清中のIL-10濃度の上昇は僅かであった。一般に、血清中のIL-10濃度が上昇すると造血傷害や免疫力の低下等の弊害を生じる。したがって、細胞内でIL-10を過剰発現するMSCsを移植すれば、血清中のIL-10濃度による副作用が低く、安全性が高いことが立証された。
【０１０４】
［実施例２］
＜IL-10を過剰発現するMSCsによる生存率及び生着率の向上効果の検証＞
（目的）
IL-10発現AAVベクターを用いてMSCsにおけるIL-10の細胞内発現量を増加させたときのMSCsの生存率及び生着率の向上効果を検証する。
【０１０５】
（方法）
１．AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認
組換えAAVの調製は、比較例２に記載の方法に準じた。10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地を入れた24 well-plate（IWAKI）にSD-rat MSCs-Lucを1×105個/wellとなるように播種し、細胞接着後にマウスIL-10発現AAVベクターであるAAV1-IL-10又はGFP発現AAVベクターであるAAV1-CAG-EGFP-WPRE(EW)(以下、「AAV1-GFP」とする)をそれぞれ5.0×1010 g.c.含む未精製培養上清を加えて、SD-rat MSCsへの遺伝子導入を行った。5% CO2存在下37℃で一晩培養後、2日おきに培地交換を行い、遺伝子導入から5〜7日目の2日分の培養液を回収した。遺伝子導入から7日後に、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡（Olympus, IX71）により観察し、遺伝子導入効率を求めた。回収した培養上清中のIL-10発現量をELISA法（Mouse IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC）を用いて定量した。なお、AAV1-GFPは、AAV1-CAG-WPRE(EW)のBamHI部位に、実施例１で調製したEGFP遺伝子を挿入して調製した。
【０１０６】
２．マウスへの局注投与及び生存率及び生着率の検証
基本的な方法は比較例１に記載の方法に準じた。上記「１．AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認」と同様に、AAV1-IL-10又はコントロールとしてのAAV1-GFPを含む未精製培養上清を用いて、MSCsへの遺伝子導入を行った。6.0×1012 g.c.で各AAVベクターを添加した10% FBS含有DMED/F-12(1:1)培地を1.6×107細胞のMSCsが接着したT225フラスコ（Thermo SCIENTIFIC）に入れて5% CO2存在下37℃で5日間培養後、再度各AAVベクターを1.1×1013 g.c./フラスコで加えて2日間培養を続けて遺伝子導入を行った。以下、本発明の移植用幹細胞に相当するAAV1-IL-10を導入したMSCsを「vIL-10(+)MSCs」とし、またコントロールのAAV1-GFPを導入したMSCsを「vIL-10(-)MSCs」とする。遺伝子導入後のMSCs（1.0×107個）をNOD/Scid マウス（3ヶ月齢、♀5匹、♂1匹）の左下腿（vIL-10(+)MSCs）及び右下腿（vIL-10(-)MSCs）にそれぞれ局注投与し、投与から3、7、18、27、31、34、42、49、54、及び67日後にin vivo生体イメージング解析を行い、MSCsの生存率を定量的に解析した。
【０１０７】
また、移植したMSCsの生着を確認するために、投与74日後に解剖を行い、MSCsを移植した筋組織の凍結ブロックを作製して免疫組織染色を行った。MSCsに導入したルシフェラーゼに対する抗体（rabbit anti-firefly Luciferase抗体、1/100希釈、Abcam Plc.）を用いてDAB染色(VECTASTAIN Elite ABC,VECTOR)を行い、続いてH＆E染色を行って筋組織内に生着したMSCsを検出した。単位面積当たりのMSCs細胞数をカウントして生着率を算出した。
【０１０８】
（結果）
１．AAVベクターによるMSCsへの遺伝子導入と発現確認
図５に結果を示す。AはvIL-10(-)MSCsへの遺伝子導入結果を、またBはvIL-10(+)MSCsでのIL-10の発現結果を示す。
【０１０９】
遺伝子導入は、GFP陽性細胞数に基づいて確認した。図５Aに示すように、遺伝子導入後のMSCsの多くがGFP陽性細胞であったことから、AAVベクターを用いたMSCsへの遺伝子導入は効率的に行われることが証明された。また、図５Bに示すように、vIL-10(+)MSCsの培養上清中からIL-10を検出できたことから、vIL-10(+)MSCsにおいてIL-10の高発現が可能であることが示された。
【０１１０】
２．マウスへの局注投与及び生存率及び生着率の検証
図６にマウスのイメージング像と移植したMSCsの生存率を示す。Aは、MSCs投与から各日後におけるマウスのイメージング像を、BはAの結果に基づいて算出した定量値（n=5）である。投与31日後のvIL-10(+)MSCsにおけるルシフェラーゼのシグナル強度は、vIL-10(-)MSCsと比較して9.7倍も高い値を示した。さらに驚くべきことに、投与後67日目でもvIL-10(+)MSCsは、ルシフェラーゼの高いシグナルが維持されており、MSCsの生存率が著しく向上することが確認できた。以上の結果から、AAVベクターを用いてIL-10をMSCs内で持続的に発現させることにより、MSCsが移植した組織内で長期にわたって生存可能となることが立証された。
【０１１１】
図７は、MSCsの移植部位である筋組織への生着を示す図である。Aは、vIL-10(-)MSCsの、BはvIL-10(+)MSCsの筋組織における生着像を、そしてCは組織染色像より単位面積当たりのMSC細胞数を測定し、算出したvIL-10(-)MSCs及びvIL-10(+)MSCsの生着率を示す。
【０１１２】
DAB染色により、vIL-10(+)MSCsは、Bの破線円内における濃い斑点で示されるように、筋線維内膜及び外膜に生着していることが立証された。またCの結果から本発明の移植用幹細胞であるvIL-10(+)MSCsは、コントロールのvIL-10(-)MSCsと比べて、生着効率が2倍以上向上し、有意な差（p<0.005）があることが立証された。
【０１１３】
［実施例３］
＜IL-10発現AAVベクターを導入したMSCsのイヌへの移植実験における生存率及び生着率改善の検証＞
（目的）
マウスにおいて立証されたAAV1-IL-10導入MSCsの生存生着率の向上効果をイヌにおいて検証する。
【０１１４】
（方法）
１．イヌ骨髄由来MSCsの調製
DLA（dog leukocyte antigen）の一致するビーグル犬の雌雄ペアからドナー犬、レシピエント犬を選出した。図８に図示するように、ドナー正常犬の前肢左右上腕より骨髄液2mLを採取した。20U/mL ヘパリン含有2mL RPMI-1640（life technologies）にて培養した。Histopaque-1077 （Sigma-Aldrich）による密度勾配にて単球を単離した後（1.3×108 個）、増殖能の高いCD271陽性分画（CD271 (LNGFR)-PE ＆ Anti-PE Micro Beads 含有MSC Research Tool Box-CD271 (LNGFR) （Miltenyi Biotec）をイムノ磁気ビーズ（MACS（登録商標）Columns and MACS Separators, Miltenyi Biotec）を用いて濃縮した（CD271陽性細胞＝1.4−5×106 個）。詳細な方法は、添付のプロトコルに従った。回収した細胞は6 well plate（IWAKI）に播種し、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich）を添加したnonhaematopoietic (NH) Expansion Medium（MiltenyiBiotec）を用いて培養した。3日毎に培地を交換し、4回の継代を経てT225フラスコに10枚分、増殖させた。詳細は、Kasahara, Y., et al., 2012, Mol Ther., 20(1):168-77に従って調製した。CD271+ MSCsにpolybrane（8μg/mL）存在下でルシフェラーゼ発現レンチウイルスベクター（200μL）を感染させて、NH Expansion Medium中にて(T225フラスコ)、32℃で2日間培養し、遺伝子を導入した。続いて、AAV1-GFP又はAAV1-IL-10（それぞれ8.0×1012 g.c.）をNH Expansion Medium中にて（T225フラスコ）37℃で3日間の培養を二度行った。MSCsにおけるルシフェラーゼ発現はルシフェラーゼ活性測定（Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega）により、またIL-10発現はELISA解析（canine IL-10 ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC）により、確認した。両者とも、測定にはAppliskan （Thermo Scientific）（luminescence, 450nm, shake)を用いた。
【０１１５】
２．イヌへの同種移植及び移植細胞の生存率及び生着率の検証
移植細胞のレシピエントとしての患犬を作製した、正常ビーグル犬（4歳3ヶ月齢、♂）に筋障害を誘導するため、MSCs移植の5日前に50μMカルジオトキシン1.0 mLを左右前脛骨筋に局注投与して、患犬とした。続いて、上記「１．イヌ骨髄由来MSCsの調製」において遺伝子導入したMSCsをトリプシン処理にて回収後、2.4×107〜2.7×107 cells/2mL PBSに調整して、2％イソフルラン（日本薬局方）麻酔下で患犬の左前脛骨筋にvIL-10(-)MSCsを、及び右前脛骨筋にvIL-10(+)MSCsを局所移植した。この間、免疫抑制剤は使用していない。1ヶ月後、図１０のAに示すように移植した左右前脛骨筋組織を生検して4部位に分断後、POLYTRONホモジナイザー(150〜180min-1)を用いて筋抽出液を得た。MSCsの生着を筋抽出液のルシフェラーゼ活性（Bright-Glo Luciferase Assay System）より解析した。測定値は、組織タンパク質量（Pierce（登録商標）BCA Protein Assay Kit, Thermo scientific)で補正した。組織中のIL-10量は、筋抽出液を用いてELISA解析（canine IL-10 ELISA Kit）により算出した。
【０１１６】
移植を行った筋組織は、生検後に一部を凍結ブロックとして切片作成し、病理解析を行った。MSCsに導入したマーカーであるルシフェラーゼに対する抗体（rabbit anti-firefly Luciferase 抗体、1/100希釈、Abcam Plc.)を用いて実施例２と同様の方法でDAB染色（VECTASTAIN Elite ABC,VECTOR）を行い、続いてH＆E染色を行って筋組織内に生着したMSCsを検出した。さらに、移植細胞の局在を顕微鏡（Leica, DMR）にて観察した。また、rabbitanti-firefly Luciferase 抗体(1/50希釈、Abcam Plc.)、及びmouse anti-dystrophin抗体 (1/100希釈、NCL-DYS3, Leica)、二次抗体としてAlexa 594-conjugated anti-rabbit IgG antibodies, (1/250 希釈、life technologies)を用いて免疫組織染色を行い、核染色も兼ねたマウント剤、Vectashield Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories)を用いて封入した。移植細胞の局在を蛍光顕微鏡（Olympus, IX71）にて観察した。
【０１１７】
（結果）
図９〜１１に結果を示す。
【０１１８】
図９は、移植30日後のvIL-10(+)MSCsの移植部位である右前脛骨筋組織への生着像である。DAB染色された破線円内及び矢印で示す濃い斑点は、筋線維内膜及び外膜に生着したvIL-10(+)MSCsを示す。
【０１１９】
図１０Aは、MSCsを移植した左右前脛骨筋組織における4部位の位置を示す図である。図１０Bは、移植30日後の左右前脛骨筋組織における各部位のMSCsの生存率及び組織内IL-10濃度を示す。図中、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれルシフェラーゼ活性に基づくvIL-10(-)MSCs（左前脛骨筋組織）及びvIL-10(+)MSCs（右前脛骨筋組織）におけるMSCsの生存率を示す。また、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれvIL-10(-)MSCs（左前脛骨筋組織）及びvIL-10(+)MSCs（右前脛骨筋組織）における各部位の筋組織中のIL-10濃度を示す。MSCsの移植部位であるTA-2では、vIL-10(+)MSCsがvIL-10(-)MSCsと比較して2倍以上の生存率を有することが示された。また、vIL-10(-)MSCsを移植した場合でも筋組織内のIL-10濃度は増加したが、vIL-10(+)MSCsを移植した場合には、高濃度のIL-10が移植部位のみならずその周辺部位でも確認できた。なお、血清中のIL-10濃度の上昇は、認められなかった（図示せず）。これらの結果は、実施例２で立証したマウスにおける結果と矛盾がなく、本発明の移植用幹細胞であるvIL-10(+)MSCsは、イヌにおいても移植後の高い生存率と生着率を有することが立証された。すなわち、生物種を問わず、有効であることが示唆された。
【０１２０】
図１１は、非分化誘導MSCsの生着及び筋線維形成を示す。Aは筋組織中におけるMSCsの病理像を、またBはMSCsの筋管細胞とのin vitro融合能を示す。vIL-10(+)MSCsをレシピエント犬の右前脛骨筋に二回投与し、長期観察を行った結果、Aで示すように、移植したvIL-10(+)MSCsが炎症部位に生着していることが示された（破線円内矢印）。また、Aにおいて、矢頭は新たに形成された筋繊維を示す。さらに、Bで示すように、in vitroにおいてMSCsと筋芽細胞との融合(破線内の明るい細胞)を確認することができた。これらの結果は、本発明の移植用幹細胞を用いて、IL-10を持続的に発現させて長期間の筋組織に生着することで、周辺の筋芽細胞と融合した新たな筋線維の再形成が可能であることを示している。なお、造血障害や腫瘍形成等の有害事象は認められなかった。
【０１２１】
［実施例４］
＜MSCsを利用した後天的免疫寛容誘導の検証（１）＞
（目的）
MSCsを用いた前処理により受容個体に導入する免疫原に対して免疫寛容が誘導されることをイヌで検証する。
【０１２２】
（方法）
基本的な方法は、実施例３に記載の方法に準じて行った。
【０１２３】
１．免疫寛容誘導手順
本発明の免疫寛容誘導方法に基づいて、以下の手順で免疫寛容誘導を行った。まず、レシピエントに免疫原としてAAV9を導入することとし、この投与日を基準日として0日目とした。次に、基準日の8日前に免疫寛容誘導方法の第１工程として、MSCsと免疫原であるAAV9を静脈内投与した。対照用として、AAV9のみ又はMSCsのみを静脈内投与した。続いて、基準日の前日に免疫寛容誘導方法の第２工程として、MSCsを静脈内投与した。対照用は、投与なしとした。基準日に、免疫原であるAAV9を局所投与により導入した。導入したAAV9は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する。対照用として、AAV9を含まないPBSバッファのみを導入した。導入4週間後に生検を行った。
【０１２４】
２．イヌ骨髄由来MSCsの調製
基本的な方法は、実施例３に準じた。
【０１２５】
３．AAV9-Lucの調製
本実施例で導入及び投与する免疫原のルシフェラーゼ発現AAVベクター（AAV9-CAG-Luc：本明細書では、しばしば「AAV9-Luc」と表記する）は、比較例２の「１．組換えAAVの調製」に記載の方法に基づいて調製した。
【０１２６】
AAV9-Lucの調製は、Ohshima S., et al., 2009, Mol Ther, 17(1): 73-80、又はShin J.H., et al., 2011, Gene Ther, 18: 910-919に記載の方法に従った。AAV9-Lucは、投与した組織内において持続的にルシフェラーゼを発現することができる。
【０１２７】
４．局所投与による免疫寛容誘導の検証
レシピエントには、正常ビーグル犬（同腹の2ヶ月齢、♂又は♀）を用いた。上記「１．免疫寛容誘導手順」に従い、免疫寛容誘導のため、基準日の8日前に4×106cells (1×106 cells/kg B.W.)のMSCsとAAV9-Luc溶液2mLを前脛骨筋に注射器を用いて局所投与した（MSCs+AAV）。また、対照として、AAV9-Lucのみ（Cont-AAV）及びMSCsのみ（Cont-MSCs）を投与した。基準日前日に、MSCs+AAV及びCont-MSCsの個体に1.8×106 cells/kg B.W.でMSCsを投与した。基準日には、MSCs+AAV及びCont-AAVの個体に、AAV9-Lucを1カ所あたり1×1012v.g.(液量2mL)で局所投与にて2か所、またCont-MSCsの個体にはPBSバッファのみを2mLで局所投与にて2か所、注射器を用いて前脛骨筋に導入した。基準日から4週間後に、導入箇所である前脛骨筋を生検した。ルシフェラーゼに対する抗体（rabbit anti-firefly Luciferase 抗体、1:2000希釈、Abcam Plc.)、及び二次抗体としてのAlexa 594-conjugated anti-rabbit IgG antibodies, (1:1000 希釈、life technologies)を用いて免疫組織染色を行い、ルシフェラーゼの発現を蛍光顕微鏡（Olympus, IX71）にて観察した。
【０１２８】
（結果）
図１２に結果を示す。AはCont-AAVを、BはMSCs+AAVを、そしてCはCont-MSCsを示す。本発明の免疫寛容誘導方法で処理を行ったMSCs+AAVでは、免疫原のAAV9におけるマーカー遺伝子であるルシフェラーゼの発現が認められた（B)。一方、AAV9のみで前処理し、MSCsによる免疫寛容誘導処理を行っていないCont-AAVでは、ルシフェラーゼの発現は見られなかった（A）。AAV9-Lucを投与又は導入していないCont-MSCsでもルシフェラーゼの発現は見られなかった（C）。
【０１２９】
これらの結果は、本発明の方法で免疫誘導処理を行った個体では、免疫原であるAAV9-Lucに対する免疫寛容性が誘導され、AAV9-Lucの導入4週間後も免疫応答によって導入したAAV9-Lucが排除されていないことを示している。
【０１３０】
［実施例５］
＜MSCsを利用した後天的免疫寛容誘導の検証（２）＞
（目的）
本発明の後天的免疫寛容誘導方法における免疫原の導入は、静脈内導入であっても局所導入と同様に効果が得られることを検証する。
【０１３１】
（方法）
１．免疫寛容誘導手順
基本的な手順は、実施例４の手順に準じた。なお、本実施例では、免疫原としてAAV9-Luc又はAAV-μDysを導入した。
【０１３２】
２．ヒト由来MSCs
ヒト由来骨髄由来細胞（JCR Pharmaceuticals）を購入後、拡大培養して用いた。
【０１３３】
３．AAV9-μDysの調製
導入及び投与するAAV9-μDysは、比較例２の「１．組換えAAVの調製」に記載の方法に基づいて調製した。
【０１３４】
マイクロジストロフィン発現AAVベクター（AAV9-CMV-μDys；本明細書では、しばしば「AAV9-μDys」と表記する）の調製は、実施例４の３に記述のAAV9-Lucの調製に記載の方法に準じた。マイクロジストロフィンは、AAVベクターに組み込み可能なように開発されたジストロフィン遺伝子の短縮型で、ジストロフィンと同機能を有する。AAV9-μDysは、投与した組織内において持続的にマイクロジストロフィンを発現することができる。
【０１３５】
４．静脈内導入による免疫寛容誘導の検証
レシピエントには、11週齢の同腹の、正常ビーグル犬（♂）２頭、又はデュシェンヌ型筋ジストロフィー患犬（♂）(CXMDJ）1頭を用いた。CXMDJは、ゴールデンレトリバーの自然発症デュシェンヌ型筋ジストロフィー患犬（GRMD）の精子を海外から輸入し、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター（日本）でビーグル犬に掛け合わせて繁殖及び維持している雑種である（Shimatsu Y. et al., 2005, Acta Myol vol24(2): 145-54; Yugeta N. et al., 2006, BMC Cardiovasc Disord, 6: 47; Kobayashi M et al., 2009, Muscle Nerve, 40(5): 815-26）。
【０１３６】
上記「１．免疫寛容誘導手順」に従い、免疫寛容誘導のため、基準日の8日前に1×106 cells/kg B.W.のMSCsとAAV9-Lucを正常ビーグル犬に（MSCs+AAV-Luc）、また1×106 cells/kg B.W.のMSCsとAAV9-μDysを患犬に（DMD/MSCs+AAV-μDys）、それぞれ3mLを静注した。対照として、AAV9-Lucのみ（Cont-AAV）を投与した。AAVはそれぞれ5×105 v.g./cellとした。基準日前日に、MSCs+AAV-Luc及びDMD/MSCs+AAV-μDysの個体に2×106 cells/kg B.W.のMSCsを投与した。基準日には、MSCs+AAV-Luc及びCont-AAVの個体にAAV9-Lucを2×1012v.g./kg B.W.で、またDMD/MSCs+AAV-μDysにはAAV9-μDysを2×1012 v.g./kg B.W.で、それぞれ3mLを静脈内に導入した。基準日から4週間後に、側頭筋を摘出して生検した。ルシフェラーゼに対する抗体（rabbit anti-firefly Luciferase 抗体、1:2000希釈、Abcam Plc.)及びジストロフィンに対する抗体（mouse anti-dystrophin抗体、1:50希釈、NCL-DYS3, Leica)、及び二次抗体としてのAlexa 594-conjugated anti-rabbit IgG antibodies, (1:1000 希釈、life technologies)を用いて免疫組織染色を行い、核染色も兼ねたマウント剤、Vectashield Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories)を用いて封入した。ルシフェラーゼ又はマイクロジストロフィンの発現を蛍光顕微鏡（Olympus, IX71）にて観察した。
【０１３７】
（結果）
図１３に結果を示す。AはCont-AAVを、BはMSCs+AAV-Lucを、そしてCはDMD/MSCs+AAV-μDysを示す。本発明の免疫寛容誘導方法で処理を行ったMSCs+AAV-Lucでは、実施例４と同様にルシフェラーゼの発現が見られた（B)。一方、AAV9のみで前処理し、MSCsによる免疫寛容誘導処理を行っていないCont-AAVでは、ルシフェラーゼの発現は見られなかった（A）。これらの結果から、免疫寛容誘導処理による免疫原の導入は、局所導入に限らず、静脈内導入のような循環系を介した全身投与であっても同様の効果が得られることが立証された。
【０１３８】
また、DMD/MSCs+AAV-μDysにおいても、ルシフェラーゼを投与したMSCs+AAV-Lucと同様に、マイクロジストロフィンの発現が確認された（C）。この結果は、免疫原であるAAV9-μDysに対する免疫寛容性が誘導され、AAV9-μDysの導入4週間後であっても免疫応答によって導入したAAV9-μDysが排除されていないことを示している。
【０１３９】
［実施例６］
＜後天的免疫寛容誘導方法による遺伝子治療の検証＞
（目的）
本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いて、AAV9-μDysを導入した個体における遺伝子治療効果について検証する。
【０１４０】
（方法）
１、各種イヌの準備
11週齢の同腹の、正常ビーグル犬（Nomal)、筋ジストロフィー患犬（DMD)、及びその患犬に本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いてAAV9-μDysを導入した治療患犬（DMD/MSCs+AAV-μDys）を準備した。DMDは、前述のCXMDJ患犬、またDMD/MSCs+AAV-μDysは、実施例５で作製したAAV9-μDysを導入患犬である。
【０１４１】
２．遺伝子治療効果の検証（１）
各イヌを用いて15m走を行わせ、走行タイムを測定した。DMDについては、各週齢の個体5頭について1回のみ測定した。Nomal及びDMD/MSCs+AAV-μDysについては、1個体あたり4回測定し、その平均タイムを算出した。
【０１４２】
３．遺伝子治療効果の検証（２）
筋ジストロフィーの病態評価は、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター（日本）で使用されているGrading Score (ver.10)に従った。このGrading Scoreでは、筋ジストロフィーに関する、食事・嚥下、飲水、流涎、嚥下障害、異常発声、横臥位起き直りテスト、playfulness、歩様、後肢歩行テスト、座位姿勢、側頭筋委縮、舌下の腫大、巨舌、及び大腿筋の14項目の病態に関して、各項目中で規定した状態のいずれに該当するかを選択し、その状態に予め割り振られたスコアを合計して、スコアリングした。スコアが大きいほど、症状が重いことを示す。病態評価は、一か月に一度行った。
【０１４３】
（結果）
15m走の結果を図１４に、また筋ジストロフィーの病態評価として行ったGrading Scoreの推移を図１５に示す。
【０１４４】
図１４から、遺伝子治療未処理の筋ジストロフィー患犬（DMD）では、いずれの週齢でも正常個体（Nomal)よりも走行タイムが遅く、運動機能に障害を生じていることが示された。一方、本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いて免疫寛容誘導処理を行い、AAV9-μDysを導入した筋ジストロフィー治療患犬（DMD/MSCs+AAV-μDys）では、DMDの走行タイムと比較して、正常個体の走行タイムに近似した。また、この効果は、AAV9-μDysの導入後17週目にも維持された。
【０１４５】
筋ジストロフィーの病態評価の結果を図１５に示す。図１５から、遺伝子治療未処理の筋ジストロフィー患犬（DMD1及びDMD2）では、いずれも月齢を重ねるごとに症状が進行し、重症化していった。一方、本発明の後天的免疫寛容誘導方法を用いてAAV9-μDysを導入した筋ジストロフィー治療患犬（DMD/MSCs+AAV-μDys）では、月齢を重ねてもDMDと比較して症状の進行が非常に緩やかであった。
【０１４６】
以上の結果は、本発明の後天的免疫寛容誘導方法でレシピエントを処理することにより、導入したAAV9-μDysが免疫応答により排除されることなく長期にわたり遺伝子治療効果が維持されることを示している。
【０１４７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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