(57)【要約】【課題】焦点面以外での多光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善する。【解決手段】２光子励起顕微鏡１００は、パルスレーザ光源１と、分散光学系１０と、対物レンズ６と、を備える走査型多光子励起顕微鏡である。パルスレーザ光源１は、パルス光を出射する。分散光学系１０は、分散光学系であり、パルス光を分散させる少なくとも２つの分散素子である回折格子１１と回折格子１２を含む。分散光学系１０は、分散したパルス光である分散光を出射し、対物レンズ６は、分散光を集光する。【選択図】図１
2018072735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス光を出射するパルスレーザ光源と、
前記パルス光を分散させる少なくとも２つの分散素子を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する分散光学系であって、分散した前記パルス光である分散光を出射する分散光学系と、
前記分散光を集光する対物レンズと、を備える
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記分散光学系から出射される前記分散光は、光の進行方向を揃えた複数の波長の光を含む
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記分散光に含まれる前記複数の波長の光の各々は、平行光束である
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記少なくとも２つの分散素子は、互いに対応する分散度を有する一組の分散素子を含む
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、さらに、
前記分散光学系と前記対物レンズの間の光路中に配置された、試料を走査するスキャナを備える
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項６】
請求項５に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、さらに、
前記パルスレーザ光源と前記スキャナの間の光路中に配置された光束形状を変換する光束変換光学系を備える
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項７】
請求項６に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記光束変換光学系は、
前記分散光学系と前記スキャナの間の光路中に配置されていて、
前記分散光学系から射出された輪帯状の光束からなる前記分散光を、円形の光束からなる分散光に変換する
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項８】
請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記少なくとも２つの分散素子の構造は、軸対称性を有する
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項９】
請求項８に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記少なくとも２つの分散素子の構造は、前記対物レンズの光軸に対応する軸に対して、軸対称性を有する
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記少なくとも２つの分散素子は、径方向に前記パルス光を分散させる
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、さらに、
前記分散光学系は、さらに、
前記分散光を複数の分散光に分割する光分割素子と、
前記複数の分散光のうちの少なくとも一つの分散光が他の分散光とは前記対物レンズの瞳面の異なる位置に入射するように、前記少なくとも一つの分散光に作用する光学素子と、を備える
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１１に記載の走査型多光子励起顕微鏡において、
前記光学素子は、前記少なくとも一つの分散光の光路中に配置されたイメージローテータである
ことを特徴とする走査型多光子励起顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型多光子励起顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスの脳などの生体試料の深部観察に適した顕微鏡として、従来から、２光子励起顕微鏡などの多光子励起顕微鏡が知られている。例えば、特許文献１には、パルス光で試料を走査することで、試料の画像を取得する走査型多光子励起顕微鏡が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２６３７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
赤外域のレーザ光など長波長の光を用いる多光子励起顕微鏡であっても、散乱の影響により、生体試料表面を基準とした焦点面の深さが深くなるほど、焦点面へ光が届きにくくなる。このため、生体試料の深部を観察する場合、焦点面で２光子励起を生じさせるために、焦点面の深さが深くなるほどレーザ出力を大きくすることがある。
【０００５】
しかしながら、レーザ出力が大きくなると、生体試料内部の焦点面以外の面でも２光子励起が生じ得る。焦点面以外の面から生じた蛍光は、背景光となって蛍光画像のＳ／Ｎ比（Signal to Noise ratio）を低下させる要因となる。
【０００６】
以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面に係る目的は、焦点面以外での多光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様に係る走査型多光子励起顕微鏡は、パルス光を出射するパルスレーザ光源と、前記パルス光を分散させる少なくとも２つの分散素子を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する分散光学系であって、分散した前記パルス光である分散光を出射する分散光学系と、前記分散光を集光する対物レンズと、を備える。
【発明の効果】
【０００８】
上記の態様によれば、焦点面以外での多光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１に係る２光子励起顕微鏡１００の構成を示した図である。
【図２】領域Ａにおけるパルス幅の変化を例示した図である。
【図３】２光子励起顕微鏡１００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ２の分布を示した図である。
【図４】実施例２に係る２光子励起顕微鏡２００の構成を示した図である。
【図５】２光子励起顕微鏡２００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ４の分布を示した図である。
【図６】実施例３に係る２光子励起顕微鏡３００の構成を示した図である。
【図７】回折格子３１と回折格子３２を例示した図である。
【図８】２光子励起顕微鏡３００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ５の分布を示した図である。
【図９】実施例４に係る２光子励起顕微鏡４００の構成を示した図である。
【図１０】実施例５に係る２光子励起顕微鏡５００の構成を示した図である。
【図１１】ホログラム光学素子５１とホログラム光学素子５２を例示した図である。
【図１２】２光子励起顕微鏡５００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ６の分布を示した図である。
【図１３】実施例６に係る２光子励起顕微鏡６００の構成を示した図である。
【図１４】２光子励起顕微鏡６００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ８の分布を示した図である。
【図１５】光束変換光学系８０の構成を例示した図である。
【図１６】光束変換光学系９０の構成を例示した図である。
【図１７】光束変換光学系１１０の構成を例示した図である。
【図１８】実施例７に係る２光子励起顕微鏡７００の構成を示した図である。
【図１９】２光子励起顕微鏡７００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ１４の分布を示した図である。
【図２０】実施例８に係る２光子励起顕微鏡８００の構成を示した図である。
【図２１】部分反射ミラー８１６の構成を示した図である。
【図２２】２光子励起顕微鏡８００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ１９の分布を示した図である。
【図２３】ミラー８１７の構成を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［実施例１］
図１は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡１００の構成を示した図である。図１に示す２光子励起顕微鏡１００は、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。
【００１１】
２光子励起顕微鏡１００は、パルスレーザ光（以降、単にパルス光Ｌ１と記す）を出射するパルスレーザ光源１と、パルス光Ｌ１を分散させる少なくとも２つの分散素子を含む分散光学系１０を備える。
【００１２】
パルスレーザ光源１は、例えば、フェムト秒オーダーのパルス幅Ｗ１を有するパルス光Ｌ１を出射する超短パルスレーザである。パルスレーザ光源１から出射されるパルス光Ｌ１は、例えば、近赤外域の波長を有する。
【００１３】
分散光学系１０は、反射型の分散素子である回折格子１１と反射型の分散素子である回折格子１２を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する光学系である。回折格子１１と回折格子１２は、例えば、ブレーズド回折格子である。分散光学系１０は、ミラー２を介して入射したパルス光Ｌ１を、回折格子１１と回折格子１２のそれぞれで分散させて、空間的に分離した複数の波長の光を含む分散光Ｌ２を出射する分散光学系である。
【００１４】
なお、分散光学系を入射した平行光束を平行光束として射出する光学系として構成するためには、分散光学系に含まれる一組の分散素子が互いに対応する分散度を有することが望ましい。即ち、分散光学系１０の回折格子１１と回折格子１２は、互いに対応する格子周期を有することが望ましい。本実施例では、回折格子１１と回折格子１２は同じ格子周期を有している。
【００１５】
スキャナ３は、試料を走査するための走査装置であり、例えば、ガルバノスキャナ、レゾナントスキャナなどを含む。スキャナ３は、分散光学系１０と対物レンズ６の間の光路中に配置される。
【００１６】
２光子励起顕微鏡１００は、リレー光学系４と、ダイクロイックミラー５と、対物レンズ６を備える。２光子励起顕微鏡１００は、さらに、ダイクロイックミラー５の反射光路上に、集光レンズ７と、光検出器８を備える。
【００１７】
リレー光学系４は、アフォーカルリレー光学系であって、スキャナ３を対物レンズ６の瞳面ＰＰ又はその近傍に投影する光学系である。ダイクロイックミラー５は、波長に応じて入射光を透過又は反射させる光学素子である。ダイクロイックミラー５は、パルスレーザ光源１から出射したパルス光Ｌ１を透過させ、蛍光を反射するように構成されている。対物レンズ６は、分散光学系１０によって分散したパルス光である分散光Ｌ２を対物レンズ６の焦点面に集光する。
【００１８】
集光レンズ７は、ダイクロイックミラー５で反射した蛍光を光検出器８に導く光学系である。集光レンズ７は、対物レンズ６の瞳面ＰＰを光検出器８の受光面又はその近傍に投影するように構成されている。光検出器８は、ノンデスキャンディテクタであり、試料で発生した蛍光を検出する。光検出器８は、例えば、アルカリ系の光電子増倍管、ガリウム砒素リン系の光電子増倍管などである。
【００１９】
２光子励起顕微鏡１００では、パルスレーザ光源１から出射したパルス光Ｌ１は、ミラー２を介して分散光学系１０に入射する。分散光学系１０に入射したパルス光Ｌ１は、回折格子１１及び回折格子１２により分散光Ｌ２に変換される。
【００２０】
より詳細には、分散光学系１０に入射したパルス光Ｌ１はまず回折格子１１で分散する。即ち、パルス光Ｌ１は波長毎に異なる角度で回折し、複数の波長の光に空間的に分離する。図１では、図面を簡略化するため、３つの波長の光（成分光Ｌ２ａ、成分光Ｌ２ｂ、成分光Ｌ２ｃ）からなる分散光Ｌ２が図示されている。なお、パルス光Ｌ１が平行光束であるため、複数の波長の光の各々も平行光束である。
【００２１】
その後、回折格子１１からの複数の波長の光は、回折格子１２に異なる入射角で入射し、波長毎に異なる角度で回折する。回折格子１１と回折格子１２は、波長毎の回折角の違いが回折格子１１と回折格子１２により相殺されるような対応する格子周期を有している。そのため、分散光学系１０から、それぞれが平行光束である光の進行方向を揃えた複数の波長の光を含む分散光Ｌ２が出射される。
【００２２】
なお、分散光Ｌ２のパルス幅Ｗ２は、パルス光Ｌ１のパルス幅Ｗ１よりも広くなる。これは、分散光Ｌ２に含まれる複数の波長の光が空間的に分離していて、分散方向の各位置における分散光Ｌ２は単一の波長の光で構成されているからである。
【００２３】
分散光学系１０から出射した分散光Ｌ２は、その後、スキャナ３で偏向され、リレー光学系４及びダイクロイックミラー５を介して対物レンズ６に入射し、試料中に設けられた対物レンズ６の焦点に集光する。即ち、複数の波長の光が対物レンズ６の瞳面ＰＰにおいてそれぞれ異なる位置に入射し、複数の波長の光が対物レンズ６の焦点に集光する。
【００２４】
分散光Ｌ２が集光した焦点では２光子励起が起こり、試料から蛍光が放射される。対物レンズ６に取り込まれた蛍光は、ダイクロイックミラー５を反射し、集光レンズ７を介して光検出器８で検出される。
【００２５】
図２は、対物レンズ６と焦点面の間の領域Ａにおけるパルス幅の変化を例示した図である。横軸は、対物レンズ６の光軸方向の位置Ｚを示し、縦軸は、励起光であるパルス光の強度Ｉを示している。図２に示すように、対物レンズ６から出射した分散光Ｌ２のパルス幅は、焦点面（位置Ｚ０）に近づくにつれて徐々に短くなり、焦点面で最も短くなる。焦点面におけるパルス幅はパルス幅Ｗ１程度である。また、パルス幅が短くなるにつれて光パルスのピーク強度も大きくなる。なお、２光子励起効率は、励起光の強度の２乗に比例し、且つ、パルス幅に反比例する。
【００２６】
２光子励起顕微鏡１００によれば、焦点面では短いパルス幅を有しながら焦点面以外では焦点面でのパルス幅よりも長いパルス幅を有することになるため、焦点面での高い２光子励起効率を維持しながら、焦点面以外では低い２光子励起効率を実現することができる。これにより、焦点面以外での２光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【００２７】
図３は、２光子励起顕微鏡１００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ２の分布を示した図である。２光子励起顕微鏡１００は、図２に示すように、分散光Ｌ２が分散方向に関して対物レンズ６の瞳径程度に広がって分布し、且つ、瞳Ｐ内におさまるように構成される。
【００２８】
このため、２光子励起顕微鏡１００によれば、ケラレ等による分散光Ｌ２の光量損失を抑制しながら、２光子励起を発生させるのに十分な開口数を実現することができる。
【００２９】
［実施例２］
図４は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡２００の構成を示した図である。図４に示す２光子励起顕微鏡２００は、図１に示す２光子励起顕微鏡１００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡２００は、パルスレーザ光源１と分散光学系１０の間の光路中にシリンドリカルレンズ２１とシリンドリカルレンズ２２からなる光束変換光学系２０を備える点が、２光子励起顕微鏡１００とは異なる。
【００３０】
シリンドリカルレンズ２１とシリンドリカルレンズ２２は、屈折力を有する面を揃えて配置されている。このため、２光子励起顕微鏡２００では、シリンドリカルレンズ２１とシリンドリカルレンズ２２により、光束断面Ｓ１が円形状を有するパルス光Ｌ１が、光束断面Ｓ２が楕円形状を有するパルス光Ｌ３に変換される。そして、変換後のパルス光Ｌ３が分散光学系１０により分散光Ｌ４に変換される。分散光Ｌ４には、それぞれパルス幅Ｗ２を有する、成分光Ｌ４ａ、成分光Ｌ４ｂ、成分光Ｌ４ｃが含まれている。
【００３１】
図５は、２光子励起顕微鏡２００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ４の分布を示した図である。２光子励起顕微鏡２００では、シリンドリカルレンズ２１とシリンドリカルレンズ２２は、それらの屈折力を有する面が回折格子１１及び回折格子１２による光の分散方向と直交するように配置されている。これにより、図５に示すように、分散光Ｌ４が対物レンズ６の瞳Ｐ全体に広がり、瞳Ｐが分散光Ｌ４によって満たされる。
【００３２】
２光子励起顕微鏡２００によっても、２光子励起顕微鏡１００と同様の理由により、焦点面での高い２光子励起効率を維持しながら、焦点面以外では低い２光子励起効率を実現することができる。従って、焦点面以外での２光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【００３３】
さらに、２光子励起顕微鏡２００によれば、図５に示すように、分散光Ｌ４により対物レンズの瞳Ｐが満されるため、方向によらず高い開口数が実現される。このため、２光子励起顕微鏡１００よりも高い解像力を発揮することができる。
【００３４】
［実施例３］
図６は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡３００の構成を示した図である。図６に示す２光子励起顕微鏡３００は、図１に示す２光子励起顕微鏡１００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡３００は、分散光学系１０の代わりに分散光学系３０を備える点が２光子励起顕微鏡１００とは異なる。分散光学系３０は、反射型の分散素子である回折格子３１と反射型の分散素子である回折格子３２を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する光学系である。分散光学系３０は、分散光Ｌ５を出射する分散光学系である。
【００３５】
図７は、回折格子３１と回折格子３２を例示した図である。回折格子３１と回折格子３２は、図７に示すように、同心円状に切られた溝を有するブレーズド回折格子である。回折格子３２は開口を有していて、同心円状に切られた溝は開口を取り囲むように形成されている。回折格子３２は、開口の代わりに光を透過する透過領域を有してもよい。ミラー２を介して分散光学系３０に入射したパルス光Ｌ１は、回折格子３２の開口を通過して回折格子３１に入射する。その後、回折格子３１と回折格子３２のそれぞれで分散し、空間的に分離した複数の波長の光を含む分散光Ｌ５が出射される。
【００３６】
図８は、２光子励起顕微鏡３００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ５の分布を示した図である。回折格子３１と回折格子３２の構造は、それぞれ軸対称性を有している。より詳細には、溝によって描かれる同心円の中心を通る軸であって対物レンズ６の光軸と対応する軸に対して、軸対称性を有している。これにより、パルス光は回折格子３１及び回折格子３２で径方向に分散する。その結果、分散光Ｌ５に含まれる複数の波長の光（成分光Ｌ５ａ、成分光Ｌ５ｂ、成分光Ｌ５ｃ）が、図８に示すように、瞳面ＰＰで同心円状に分布する。
【００３７】
２光子励起顕微鏡３００によっても、２光子励起顕微鏡１００と同様の理由により、焦点面での高い２光子励起効率を維持しながら、焦点面以外では低い２光子励起効率を実現することができる。従って、焦点面以外での２光子励起の発生を抑制して蛍光画像のＳ／Ｎ比を改善することができる。
【００３８】
また、２光子励起顕微鏡３００では、分散光Ｌ５に含まれる複数の波長の光の各々が瞳面ＰＰにおいて瞳Ｐの形状に対応する輪帯形状に分布し、瞳Ｐの中心部分を除き分散光Ｌ５により瞳Ｐを満たすことができる。従って、２光子励起顕微鏡３００によれば、２光子励起顕微鏡１００と同様にケラレ等による光量損失を抑えながら、方向によらず高い開口数を実現して高い解像力を発揮することができる。
【００３９】
また、２光子励起顕微鏡３００では、瞳Ｐの端を通過する波長成分が他の波長成分よりも多くケラレてしまうことがない。このため、特定の波長成分が不足してパルス幅が短くなりきらないといった事態を回避することができる。従って、２光子励起顕微鏡３００によれば、瞳Ｐの端を通過する波長成分でケラレが生じやすい２光子励起顕微鏡２００よりも、さらにパルス幅を短くすることができる。
【００４０】
さらに、２光子励起顕微鏡３００では、瞳面ＰＰにおける分散光Ｌ５の光量分布が対物レンズ６の光軸に対して対称な形状を有している。このため、２光子励起顕微鏡３００が焦点面に形成する点像の強度を表す点像分布関数（PSF：Point Spread Function）の形状も光軸に対して対称な形状となる。従って、方向に依存しない良好な蛍光画像を得ることができる。
【００４１】
［実施例４］
図９は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡４００の構成を示した図である。図９に示す２光子励起顕微鏡４００は、図６に示す２光子励起顕微鏡３００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡４００は、分散光学系３０の代わりに分散光学系４０を備える点が２光子励起顕微鏡３００とは異なり、その他の構成は２光子励起顕微鏡３００と同様である。このため、図９では、スキャナ３以降の構成については、記載が割愛されている。
【００４２】
分散光学系４０は、分散素子である回折格子４１と分散素子である回折格子４１を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する光学系である。分散光学系４０は、分散光Ｌ５を出射する分散光学系である。回折格子４１は、透過型の回折格子である点が反射型の回折格子である回折格子３１とは異なる。また、回折格子４２は、透過型の回折格子である点が反射型の回折格子である回折格子３２とは異なる。
【００４３】
２光子励起顕微鏡４００によっても、２光子励起顕微鏡３００と同様の効果を得ることができる。
【００４４】
［実施例５］
図１０は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡５００の構成を示した図である。図１０に示す２光子励起顕微鏡５００は、図９に示す２光子励起顕微鏡４００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡５００は、分散光学系４０の代わりに分散光学系５０を備える点が２光子励起顕微鏡３００とは異なり、その他の構成は２光子励起顕微鏡４００と同様である。分散光学系５０は、分散素子であるホログラム光学素子５１と分散素子であるホログラム光学素子５２を含み、入射した平行光束を平行光束として射出する光学系である。分散光学系５０は、分散光Ｌ６を出射する分散光学系である。
【００４５】
図１１は、ホログラム光学素子５１とホログラム光学素子５２を例示した図である。ホログラム光学素子５１とホログラム光学素子５２は、周期的な屈折率分布を有する光学素子であり、例えば、透過型の回折格子の一種であるＶＰＨ（Volume Phase Holographic）グレーティングである。図１１に示すホログラム光学素子５１とホログラム光学素子５２は、６０度ずつ異なる６方向に光を分散させるように構成されている。ミラー２を介して分散光学系５０に入射したパルス光Ｌ１は、ホログラム光学素子５１とホログラム光学素子５２のそれぞれで分散し、空間的に分離した複数の波長の光を含む分散光Ｌ６が出射される。なお、ホログラム光学素子の分散方向は６方向に限らない。
【００４６】
図１２は、２光子励起顕微鏡５００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ６の分布を示した図である。パルス光はホログラム光学素子５１及びホログラム光学素子５２で径方向に沿った６方向に分散する。その結果、図１２に示すように、分散光Ｌ６に含まれる複数の波長の光（成分光Ｌ６ａ、成分光Ｌ６ｂ、成分光Ｌ６ｃ）の各々が瞳面ＰＰにおいて円周方向に並んだ６箇所に入射し、分散光Ｌ６が全体として瞳面ＰＰで同心円状に分布する。
【００４７】
２光子励起顕微鏡５００によっても、２光子励起顕微鏡３００及び２光子励起顕微鏡４００と同様の効果を得ることができる。
【００４８】
［実施例６］
図１３は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡６００の構成を示した図である。図１３に示す２光子励起顕微鏡６００は、図９に示す２光子励起顕微鏡４００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡６００は、分散光学系４０とスキャナ３の間の光路中に、光束形状を変換する光束変換光学系７０を備える点が２光子励起顕微鏡４００とは異なる。光束変換光学系７０は、アキシコンレンズ７１とアキシコンレンズ７２を含んでいる。
【００４９】
図１４は、２光子励起顕微鏡６００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ７の分布を示した図である。２光子励起顕微鏡６００では、光束変換光学系７０により、分散光学系４０から射出された輪帯状の光束からなる分散光Ｌ５が、円形の光束からなる分散光Ｌ７に変換される。これにより、図１４に示すように、瞳Ｐの中心部分を含む瞳Ｐ全体が分散光Ｌ７によって満たされる。
【００５０】
２光子励起顕微鏡６００によっても、２光子励起顕微鏡４００と同様の効果を得ることができる。さらに、２光子励起顕微鏡６００によれば、瞳Ｐの中心部分にも光が入射するため、２光子励起顕微鏡６００が焦点面に形成する点像の強度を表す点像分布関数（PSF）のサイドローブを抑制することができる。
【００５１】
図１５は、光束変換光学系８０の構成を例示した図である。図１６は、光束変換光学系９０の構成を例示した図である。図１７は、光束変換光学系１１０の構成を例示した図である。光束変換光学系８０は、一組の凸レンズ（凸レンズ８１と凸レンズ８２）を含んでいる。光束変換光学系９０は、凸レンズ９１と凹レンズ９２を含んでいる。光束変換光学系１１０は、輪帯ミラー１１１と円錐ミラー１１２を含んでいる。光束変換光学系８０、光束変換光学系９０、光束変換光学系１１０は、いずれも輪帯状の光束からなる分散光を、円形の光束からなる分散光に変換するように構成されている。図１３では、アキシコンレンズ７１とアキシコンレンズ７２を含む光束変換光学系７０を例示したが、２光子励起顕微鏡６００は、光束変換光学系７０の代わりに他の光束変換光学系を備えてもよく、例えば、図１５から図１７に示す光束変換光学系を備えてもよい。
【００５２】
［実施例７］
図１８は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡７００の構成を示した図である。図１８に示す２光子励起顕微鏡７００は、図１に示す２光子励起顕微鏡１００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡７００は、分散光学系１０の代わりに分散光学系７１０を備える点が、２光子励起顕微鏡１００とは異なる。
【００５３】
分散光学系７１０は、回折格子１１と回折格子１２を備え、入射した平行光束を平行光束として射出する点は、分散光学系１０と同様である。分散光学系７１０は、さらに、分散光Ｌ２を複数の分散光に分割する光分割素子であるハーフミラーと、それら複数の分散光のうちの少なくとも一つの分散光が他の分散光とは瞳Ｐの異なる位置に入射するように少なくとも一つの分散光に作用する光学素子であるイメージローテータと、を備えている。
【００５４】
分散光学系７１０では、回折格子１２から出射された分散光Ｌ２は、まず、ハーフミラー７１１に入射し、分散光Ｌ９と分散光Ｌ１０に分割される。ハーフミラー７１１を透過した分散光Ｌ９は、イメージローテータ７２１で所定の角度だけ回転し、ミラー７１２で反射してハーフミラー７１４に入射する。ハーフミラー７１１で反射した分散光Ｌ１０は、ハーフミラー７１３に入射し、分散光Ｌ１１と分散光Ｌ１２に分割される。ハーフミラー７１３で反射した分散光Ｌ１１は、イメージローテータ７２２で所定の角度だけ回転し、ハーフミラー７１４に入射する。ハーフミラー７１４に入射した分散光Ｌ９と分散光Ｌ１１は、ハーフミラー７１４により合成され、分散光Ｌ１３がハーフミラー７１６に入射する。ハーフミラー７１３を透過した分散光Ｌ１２は、ミラー７１５を介してイメージローテータ７２３に入射し、イメージローテータ７２３で所定の角度だけ回転し、ハーフミラー７１６に入射する。ハーフミラー７１６に入射した分散光Ｌ１３と分散光Ｌ１２は、ハーフミラー７１６により合成され、分散光Ｌ１４が分散光学系７１０から出射される。
【００５５】
図１９は、２光子励起顕微鏡７００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ１４の分布を示した図である。イメージローテータ７２１、イメージローテータ７２２、イメージローテータ７２３での光束の回転量を調整することで、図１９に示すように、瞳Ｐの中心部分を含む瞳Ｐ全体が分散光Ｌ１４によって満たされる。
【００５６】
２光子励起顕微鏡７００によっても、２光子励起顕微鏡１００と同様の効果を得ることができる。また、２光子励起顕微鏡７００では、瞳Ｐの中心部分にも光が入射するため、２光子励起顕微鏡６００と同様に、２光子励起顕微鏡７００が焦点面に形成する点像の強度を表す点像分布関数のサイドローブを抑制することができる。また、２光子励起顕微鏡７００では、瞳面ＰＰにおける分散光Ｌ１４の光量分布が光軸に対して対称な形状を有する。このため、焦点面に形成する点像の強度を表す点像分布関数（PSF）の形状が光軸に対して対称な形状となり、方向に依存しない良好な蛍光画像を得ることができる。さらに、２光子励起顕微鏡７００によれば、例えば、同心円状に溝が切られた回折格子など、特殊な形状又は特性を有する分散素子を用いることなく、瞳Ｐ全体を分散光で満たすことができる。
【００５７】
［実施例８］
図２０は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡８００の構成を示した図である。図２０に示す２光子励起顕微鏡８００は、図１８に示す２光子励起顕微鏡７００と同様に、スキャナ３を備える走査型２光子励起顕微鏡である。２光子励起顕微鏡８００は、分散光学系７１０の代わりに分散光学系８１０を備える点が、２光子励起顕微鏡７００とは異なる。
【００５８】
分散光学系８１０は、回折格子１１と回折格子１２を備え、入射した平行光束を平行光束として射出する点は分散光学系７１０と同様である。分散光学系８１０は、さらに、光分割素子であるハーフミラーと、少なくとも一つの分散光が他の分散光とは瞳Ｐの異なる位置に入射するように少なくとも一つの分散光に作用する光学素子であるイメージローテータを備える点も分散光学系７１０と同様であるが、その具体的な構成が分散光学系７１０とは異なる。
【００５９】
分散光学系８１０では、回折格子１２から出射された分散光Ｌ２は、まず、ハーフミラー８１１に入射し、分散光Ｌ１５と分散光Ｌ１６に分割される。ハーフミラー８１１を透過した分散光Ｌ１５は、イメージローテータ８２１で所定の角度だけ回転し、ミラー８１２で反射して部分反射ミラー８１６に入射する。ハーフミラー８１１で反射した分散光Ｌ１６は、ハーフミラー８１３に入射し、分散光Ｌ１７と分散光Ｌ１８に分割される。ハーフミラー８１３で反射した分散光Ｌ１７は、イメージローテータ８２２で所定の角度だけ回転し、ミラー８１４を介して部分反射ミラー８１６に入射する。ハーフミラー８１３を透過した分散光Ｌ１８は、ミラー８１５を介してイメージローテータ８２３に入射し、イメージローテータ８２３で所定の角度だけ回転し、部分反射ミラー８１６に入射する。
【００６０】
図２１は、部分反射ミラー８１６の構成を示した図である。部分反射ミラー８１６は、透過領域８１６ａと反射領域８１６ｂを備え、分散光Ｌ１８が透過領域８１６ａに入射し、分散光Ｌ１５及び分散光Ｌ１７が反射領域８１６ｂに入射するように配置されている。このため、部分反射ミラー８１６に入射した分散光Ｌ１５、分散光Ｌ１７、及び分散光Ｌ１８は、部分反射ミラー８１６により合成されて、分散光Ｌ１９が分散光学系８１０から出射される。
【００６１】
図２２は、２光子励起顕微鏡８００の対物レンズ６の瞳面ＰＰに入射する分散光Ｌ１９の分布を示した図である。イメージローテータ８２１、イメージローテータ８２２、イメージローテータ８２３での光束の回転量を調整することで、図２２に示すように、瞳面ＰＰにおいて対物レンズ６の光軸に対して軸対称に分散光Ｌ１８が分布する。
【００６２】
２光子励起顕微鏡８００によっても、２光子励起顕微鏡１００と同様の効果を得ることができる。また、２光子励起顕微鏡８００では、瞳面ＰＰにおける分散光Ｌ１９の光量分布が光軸に対して対称な形状を有する。このため、焦点面に形成する点像の強度を表す点像分布関数（PSF）の形状が光軸に対して対称な形状となり、方向に依存しない良好な蛍光画像を得ることができる。さらに、２光子励起顕微鏡８００によれば、例えば、同心円状に溝が切られた回折格子など、特殊な形状又は特性を有する分散素子を用いることなく、瞳面ＰＰにおける分散光の分布の軸対称性を２光子励起顕微鏡１００よりも改善することができる。
【００６３】
図２３は、ミラー８１７の構成を示した図である。ミラー８１７は、扇形のミラー要素８１７ａと扇形のミラー要素８１７ｂを含んでいる。図２０では、部分反射ミラー８１６を例示したが、２光子励起顕微鏡８００は、部分反射ミラー８１６の代わりにミラー８１７を備えてもよい。その場合、ミラー８１７は、図２３に示すように、分散光Ｌ１５がミラー要素８１７ａ又はミラー要素８１７ｂの一方に入射し、分散光Ｌ１７がミラー要素８１７ａ又はミラー要素８１７ｂの他方に入射するように配置される。
【００６４】
上述した実施例は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施例はこれらに限定されるものではない。走査型多光子励起顕微鏡は、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【符号の説明】
【００６５】
１・・・パルスレーザ光源、２、７１２、７１５、８１２、８１４、８１５、８１７・・・ミラー、３・・・スキャナ、４・・・リレー光学系、５・・・ダイクロイックミラー、６・・・対物レンズ、７・・・集光レンズ、８・・・光検出器、１０・・・分散光学系、１１、１２、３１、３２、４１、４２・・・回折格子、２０、７０、８０、９０、１１０・・・光束変換光学系、２１、２２・・・シリンドリカルレンズ、３０、４０、５０、７１０、８１０・・・分散光学系、５１、５２・・・ホログラム光学素子、７１、７２・・・アキシコンレンズ、８１、８２、９１・・・凸レンズ、９２・・・凹レンズ、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００・・・２光子励起顕微鏡、１１１・・・輪帯ミラー、１１２・・・円錐ミラー、７１１、７１３、７１４、７１６、８１１、８１３・・・ハーフミラー、７２１、７２２、７２３、８２１、８２２、８２３・・・イメージローテータ、８１６・・・部分反射ミラー、８１６ａ・・・透過領域、８１６ｂ・・・反射領域、８１７ａ、８１７ｂ・・・ミラー要素、Ａ・・・領域、Ｌ１、Ｌ３・・・パルス光、Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９・・・分散光、Ｌ２ａ、Ｌ２ｂ、Ｌ２ｃ、Ｌ４ａ、Ｌ４ｂ、Ｌ４ｃ、Ｌ５ａ、Ｌ５ｂ、Ｌ５ｃ、Ｌ６ａ、Ｌ６ｂ、Ｌ６ｃ、Ｌ７ａ、Ｌ７ｂ、Ｌ７ｃ・・・成分光、Ｐ・・・瞳、ＰＰ・・・瞳面、Ｗ１、Ｗ２・・・パルス幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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