(57)【要約】【課題】糖尿病や生活習慣病等の予防や処置に有用な、血糖上昇抑制用組成物を提供する。【解決手段】シリンガ酸又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有する血糖上昇抑制用組成物である。上記組成物は、細胞への糖取り込み促進のためのものであることが好ましい。また、上記組成物は、ＧＬＵＴ４活性化のためのものであることが好ましい。また、上記組成物は、糖尿病の予防・改善のためのものであることが好ましい。また、上記組成物は、インスリン抵抗性の予防・改善のためのものであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリンガ酸又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする血糖上昇抑制用組成物。
【請求項２】
前記シリンガ酸又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を乾燥分当たり０．１〜１００質量％含有することを特徴とする血糖上昇抑制用組成物。
【請求項３】
細胞への糖取り込み促進のためのものである、請求項１記載の血糖上昇抑制用組成物。
【請求項４】
ＧＬＵＴ４活性化のためのものである、請求項１記載の血糖上昇抑制用組成物。
【請求項５】
糖尿病の予防・改善のためのものである、請求項１記載の血糖上昇抑制用組成物。
【請求項６】
インスリン抵抗性の予防・改善のためのものである、請求項１記載の血糖上昇抑制用組成物。
【請求項７】
飲食品用の組成物である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の血糖上昇抑制用組成物。
【請求項８】
医薬品用の組成物である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の血糖上昇抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊芝菌糸体培養培地抽出物から同定された成分を有効成分とする血糖上昇抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリン分泌障害もしくは作用不全により高血糖状態を呈する代謝性疾患であり、神経障害、網膜症及び腎症などの合併症を誘発させ、患者の生活の質（ＱＯＬ）を低下させるため、発症前または発症初期からの血糖コントロールが重要とされる。現在、糖尿病を含む生活習慣病の予防を企図した健康食品や食品成分の開発が盛んに行われている。
【０００３】
本出願人らにおいても、特許文献１に開示したように、霊芝菌糸体をバガス（砂糖きびの線維性成分）と脱脂した米糠を原料とした固形培地に増殖させて子実体発生直前に培地ごと粉砕し、これを熱水抽出・噴霧乾燥させてなる霊芝菌糸体培養培地抽出物にマルターゼ阻害活性があることを見出し、糖質の消化吸収を抑えることによって、糖尿病の予防、治療を図るための医薬品、健康食品等として利用し得ることを明らかにしている。
【０００４】
一方、別の研究によれば、例えば、本出願人らにより特許文献２に開示したように、上記霊芝菌糸体培養培地抽出物に含まれるシリンガ酸が、低酸素脳虚血に伴う障害の予防・改善野ための有効成分として利用し得ることが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４６０２６７４号公報
【特許文献２】特許第５９１９２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血糖上昇抑制用組成物の新たな有効成分を提供できれば治療や処置の選択の幅が広がる。また、有効成分が単離・同定された化合物であれば、その有効性を製造バッチ等によらずに安定的に担保することが容易であるので、望ましい。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、単離・同定された化合物を有効成分とし、糖尿病や生活習慣病等の予防や処置に有用な、血糖上昇抑制用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、植物繊維質原料を含む培地で霊芝菌の菌糸体を培養して得られる培養培地抽出物から、血糖上昇抑制の作用効果を有する成分を単離・同定し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の血糖上昇抑制用組成物は、シリンガ酸又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
上記組成物は、シリンガ酸又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を乾燥分当たり０．１〜１００質量％含有することが好ましい。
【００１１】
また、細胞への糖取り込み促進のためのものであることが好ましい。
【００１２】
また、上記組成物は、ＧＬＵＴ４活性化のためのものであることが好ましい。
【００１３】
また、上記組成物は、糖尿病の予防・改善のためのものであることが好ましい。
【００１４】
また、上記組成物は、インスリン抵抗性の予防・改善のためのものであることが好ましい。
【００１５】
また、上記組成物は、飲食品用の組成物であることが好ましい。
【００１６】
また、上記組成物は、医薬品用の組成物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、その有効成分であるシリンガ酸が、優れた血糖上昇抑制の作用効果を有する。よって、これを利用して、糖尿病や生活習慣病等の予防や処置に有用な、血糖上昇抑制用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試験例１において得られたシリンガ酸及びバニリン酸が霊芝菌糸体培養培地抽出物より同定された結果を示す図表である。
【図２】試験例２においてシリンガ酸及びバニリン酸が細胞のグルコースの取り込みに与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図３】試験例３においてシリンガ酸が細胞のグルコースの取り込みに与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図４】試験例４においてシリンガ酸が体重に与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図５】試験例４においてシリンガ酸が摂食量に与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図６】試験例４においてシリンガ酸が血糖値に与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図７】試験例５においてシリンガ酸が血中インスリン値に与える影響について試験した結果を示す図表である。
【図８】試験例６においてシリンガ酸が骨格筋におけるＧＬＵＴ４タンパク質の発現に与える影響について試験した結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の血糖上昇抑制用組成物は、下記化学式（１）で示されるシリンガ酸（4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid）、又はその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有するものである。
【００２０】
【化１】
2018203678.tif 000002
【００２１】
シリンガ酸は公知方法によって合成でき、また、市販もされているので、そのような化学合成品を用いることができる。あるいは、アサイー、椎茸、マンネン茸等からも分離可能であり、そのような天然物由来のものを用いてもよい。その塩や溶媒和物の形態に特に制限はなく、典型的には、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、エタノール溶媒和物などが挙げられる。
【００２２】
本発明の血糖上昇抑制用組成物においては、上記有効成分以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤、注射剤、吸引剤、塗布剤等の形態にして利用することができる。その場合、剤形形態によっても異なり一概ではないが、上記有効成分を組成物の全体中に乾燥分当たり０．１〜１００質量％含有していることが好ましく、乾燥分当たり０．５〜５０質量％含有していることがより好ましく、乾燥分当たり１〜２０質量％含有していることが最も好ましい。また、その投与量としては、対象の年齢、性別、健康状態等や投与形態等によっても異なり一概ではないが、典型的には、例えば、経口投与する場合において成人1日当たり０．２〜２ｇ程度である。投与量がその範囲よりも少ないと十分な効果が得られにくく、投与量がその範囲よりも多いと、何らかの副作用を生じるリスクが高まる。なお、本発明による血糖上昇抑制用組成物は、ヒトを適用対象にできることは勿論であるが、ペットや家畜等の動物を適用対象にすることに、特に制限はない。あるいは、アカルボース、SU剤（スルホニル尿素剤）、ピオグリタゾン等の他の糖上昇抑制作用のある成分と併用してもよく、特に制限はない。
【００２３】
本発明の血糖上昇抑制用組成物の投与形態については、例えば経口投与、静脈内投与、脳内局所投与、腹腔内投与、吸引、経鼻投与、経皮投与、随腔内投与等の投与形態が挙げられる。なかでも、後述する実施例で示されるように、経口摂取により十分な血糖上昇抑制の作用効果が得られるので、摂取者の負担の軽減や服用のし易さの観点からは、経口投与の形態が好ましい。
【００２４】
上記組成物の使用形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、健康保健用食品、機能性表示食品、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用健康食品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメントなど各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。また、各種の飲食品と組み合わせて使用されることも可能である。特に、健康保健用食品、機能性表示食品の製品形態であれば、自己の血糖値が気になる人に対して、糖尿病の予防・改善のためのものや、インスリン抵抗性の予防・改善のためのもの等として、健康管理の一環として摂取してもらいやすくなるので、好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２６】
＜試験例１＞
出発材料として霊芝菌糸体培養培地抽出物（商品名「ＭＡＫ」、野田食菌工業株式会社）（以下、「ＭＡＫ」という。）を使用し、DPPHフリーラジカル抑制能を指標にして、その活性画分を単離し、更にその活性成分を同定した。具体的には、抗酸化活性試験は、以下のとおり行った。
【００２７】
（DPPHフリーラジカル抑制能試験）
（１）被検試料
ＭＡＫを、順次、限外濾過、DIAION HP-20 カラム（吸着）、ＯＤＳカラム（逆相）及びシリカゲルカラム（順相）のＭＰＬＣの各分画手段に処して、分離分画した。分画した各フラクションの溶媒を乾燥させ、重量から各フラクションの成分の含有率（％）を算出し、図１に示した。
【００２８】
（２）抗酸化活性の評価
DPPHフリーラジカル抑制能から測定した。ラジカルの抑制効果は、DPPHの減少量による吸光度の変化により評価した。遮光した試験管に検体溶液1 mLに同量のDPPH溶液を加え、今後した後、25℃の水浴で30間分反応させ、525 nmで測定した。試料およびDPPHは50％エタノールに溶解した。抑制率は、試料を含む溶液とコントロール溶液の吸光度の比によって求めた。
【００２９】
（活性成分の同定）
最終のシリカゲルカラム／ＭＰＬＣによる分画後に高い抗酸化活性を示す画分が採取され、その画分に含まれる化合物を 1H-NMR、13C-NMR分析（アジレント・テクノロジー株式会社）、及びLC/MS分析（日本電子株式会社）により同定したところ、下記化学式（２）に示すシリンガ酸（Syringic acid）（分子量１９８．１７）及び下記化学式（３）に示すバニリン酸（Vanillic acid）（分子量１６８．１）であった。
【００３０】
【化２】
2018203678.tif 000003
【００３１】
【化３】
2018203678.tif 000004
【００３２】
なお、別途、ＭＡＫ中のシリンガ酸とバニリン酸の含有量を、化成品のシリンガ酸（和光純薬工業株式会社）とバニリン酸（Sigma-Aldrich株式会社）を標品としたＨＰＬＣにより定量した結果、ＭＡＫ１ｇ中にシリンガ酸は０．５１１ｍｇ、バニリン酸は０．８６８ｍｇが含まれていた。
【００３３】
＜試験例２＞
シリンガ酸（化成品、和光純薬工業株式会社製）とバニリン酸（化成品、Sigma-Aldrich株式会社製）を使用して、細胞のグルコースの取り込みを促進する活性を試験した。
【００３４】
（グルコース取り込み量の測定試験）
（１）使用細胞
ラット骨格筋由来培養細胞であるＬ６細胞を使用し、培養は、液体培地として１０％ウシ血清アルブミンを添加したDulbecco's Modified Eagle's Mediumを使用して、３７℃、５％ＣＯ2の環境下に培養した。
【００３５】
（２）グルコース取り込み量の測定
Ｌ６細胞を播種し、２４時間培養した。その後、上記化成品を使用して、最終濃度１００μＭのシリンガ酸又はバニリン酸を添加し、更に２４時間培養した。その際、最終濃度１０ｎＭのInsulinの存在下で３０分間培養したもの、あるいは最終濃度１０ｍＭのTroglitazoneの存在下で２４時間培養したものを、陽性対照とした。また、各試料を添加しないで２４時間培養したものを、陰性対照（Control）とした。続いて、Krebs-Ringer's phosphate buffer[123 mM NaCl, 4.94 mM KCl, 1.23 mM MgSO4, 0.84 mM CaCl2, 4.99 mM glutamine, 20 mM NaH2PO4, 15 mM Hepes（pH 7.4）]に置換し２時間培養した後、2-[3H(G)]-Deoxy-D-glucose（以下、「[3H]2-DG」という場合がある。）（9.25 MBq, NET328A, パーキンエルマー, Waltham, USA）を添加し１０分間培養した。その後、培養液を取り除き氷冷ＤＭＥＭ培地、氷冷ＰＢＳにて各１回洗浄した。さらに、１Ｎ ＮａＯＨを含む０．１％ＳＤＳを加え細胞を回収後、液体シンチレーションカウンター（LSC5100, アロカ, Tokyo, Japan）を用いて放射活性を測定した。
【００３６】
結果は、各試験群の結果をControl群のグルコース取り込み量を１とした相対値で表した（ｎ＝３）。
【００３７】
その結果、図２に示されるように、シリンガ酸の添加により、Control群と比較して、細胞のグルコースの取り込み量の増加がみられた。一方、バニリン酸ではグルコース取り込み量の増加は認められなかった。
【００３８】
＜試験例３＞
シリンガ酸（化成品、和光純薬工業株式会社製）を使用して、試験例２と同様に、細胞のグルコースの取り込みを促進する活性を試験した。
【００３９】
具体的には、被験試料を、上記化成品を使用して、シリンガ酸の最終濃度を０．０１μＭ、１μＭ、１００μＭの各濃度とした以外は、試験例２と同様にして、グルコース取り込み促進活性を試験した。その際、最終濃度１０ｎＭのInsulinの存在下で３０分間培養したものを陽性対照とした。
【００４０】
結果は、各試験群の結果をControl群のグルコース取り込み量を１とした相対値で表し、各値は平均値±標準偏差で示した。統計的有意差は、等分散検定の後、t検定により解析した。（ｎ＝３）。
【００４１】
その結果、図３に示されるように、シリンガ酸の添加により、Control群と比較して、細胞のグルコースの取り込み量の増加が、最終濃度０．０１μＭで約１．１倍となり、最終濃度１μＭ、１００μＭでそれぞれ約１．２ 倍、１．３倍と、有意に増加し、シリンガ酸の濃度に依存的なグルコース取り込み量の増加がみられた。
【００４２】
＜試験例４＞
シリンガ酸（化成品、和光純薬工業株式会社製）を使用して、動物実験により、シリンガ酸が血糖値に与える影響について試験した。具体的には、動物試験は、以下のとおり行った。
【００４３】
（動物試験）
６週齢の雌性ＫＫ−Ａyマウス（日本クレア株式会社）を１週間予備飼育した後、高脂肪飼料（商品名「Quick Fat」、日本クレア株式会社製、以下同じ。）を与える群（Control群）、高脂肪飼料にシリンガ酸を０．０２５質量％混合した飼料を与える群（0.025% シリンガ酸群）、高脂肪飼料にシリンガ酸を０．２５質量％混合した飼料を与える群（0.25% シリンガ酸群）、高脂肪飼料にＭＡＫを０．５質量％混合した飼料を与える群（0.5% MAK群）、高脂肪飼料にＭＡＫを１．０質量％混合した飼料を与える群（1.0% MAK群）の５群に分け、自由摂取により８週間飼育した。飼育期間中は、体重、摂食量を１週間ごと毎週測定した。また、４、８週目に約１．５時間絶食させたマウスの尾静脈より血液を採取し、グルコース定量キット（商品名「グルコースCIIテストワコー」、和光純薬工業株式会社製）により血糖値を測定し、各値は平均値±標準偏差で示した。統計的有意差は、分散検定の後、t検定により解析した（ｎ＝４〜７）。
【００４４】
図４には体重推移の結果を、図５には摂食量推移の結果を、それぞれ示す。
【００４５】
図４、図５に示されるように、体重及び摂食量については、Control群と比較して、ＭＡＫ群及びシリンガ酸群すべてにおいて、飼育最終週まで有意な差はみられなかった。
【００４６】
また、図６には血糖値推移の結果を示す。
【００４７】
図６に示されるように、血糖値については、Control群では、０週時に223.4 ± 16.4 mg/dL、４週時に493.3 ± 64.0 mg/dL、８週時に496.4 ± 98.0 mg/dLと飼育期間の経過に伴い、血糖値の上昇が認められた。MAK群では、４週時に0.5％MAK群で371.5 ± 74.2 mg/dL 、1.0％MAK群で339.8 ± 100.3 mg/dL とControl群と比較して有意に抑制し、８週時まで血糖値に大きな変化は認められなかった。一方、シリンガ酸群では、４週時にはControl群と比較して差は認められなかったが、８週時に0.025％シリンガ酸群で291.5 ± 65.7 mg/dL、0.25％シリンガ酸群で281.0 ± 164.0 mg/dLと有意に低値を示した。
【００４８】
＜試験例５＞
飼育最終週の血中インスリン値を測定した。
【００４９】
具体的には、試験例４の動物試験の後、各群のマウス解剖時の血漿（５μＬ）を採取して、そのインスリン濃度を、超高感度ラットインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製）により測定した。各値は平均値±標準偏差で示した。統計的有意差は、分散検定の後、t検定により解析した（ｎ＝３〜６）。
【００５０】
結果を図７に示す。
【００５１】
その結果、図７に示されるように、Control群457.3 ± 101.7 ng/dLと比較して、1.0％MAK群で254.9 ± 93.2 ng/dL、更に、0.025％、0.25％シリンガ酸群で、それぞれ165.4 ± 45.0 ng/dL、177.5 ± 110.1 ng/dLと有意に低値を示した。
【００５２】
＜試験例６＞
骨格筋におけるＧＬＵＴ４（glucose transporter type 4）の発現をウエスタンブロット法により解析した。具体的には、試験例４の動物試験の後、各群のマウス解剖時に骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）を採取して、以下のとおり細胞膜画分を調製した。
【００５３】
（細胞膜画分の調製）
骨格筋０．１ｇ対して１．２ｍＬの緩衝液[10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF)、 protease inhibitor mixture（和光純薬工業株式会社製）]を加え、ポリトロンホモジナイザーで粉砕した。組織懸濁液を４５０×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を細胞抽出画分とした。さらに、上清に上述と同様の緩衝液を加え、ポリトロンホモジナイザーで粉砕した後、組織懸濁液を４５０×ｇ、４℃で１０分間遠心して、その上清を１６，８００×ｇで２０分間遠心し、得られた沈殿に緩衝液（１％ＳＤＳ、５０ ｍＭ ＤＴＴ）１５０μＬを加え、細胞膜画分とした。
【００５４】
調製した細胞膜画分を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに展開し、泳動後タンパク質をＰＶＤＦメンブランに転写し、抗ＧＬＵＴ４抗体（C-20; Santa Cruz Biotechnology製）、または対照（Control）として、膜蛋白質であるcaveolin-1対する特異抗体である抗caveolin-1抗体（N-20; Santa Cruz Biotechnology製）を用いて、常法に従い、ウエスタンブロット解析を行なった。
【００５５】
結果を図８に示す。
【００５６】
その結果、図８に示されるように、細胞膜のＧＬＵＴ４量は、Control群と比較して0.5％MAK群で１．９９倍増加した。さらに、0.025％、0.25％シリンガ酸群でそれぞれ、２．４４倍、３．０４倍増加した。
【図１】
2018203678.tif 000005
【図２】
2018203678.tif 000006
【図３】
2018203678.tif 000007
【図４】
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【図５】
2018203678.tif 000009
【図６】
2018203678.tif 000010
【図７】
2018203678.tif 000011
【図８】
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