(57)【要約】      （修正有）【課題】テロメラーゼ活性測定化合物の提供。【解決手段】式Ｉ（Ｒ1はＣ１〜６アルキレン基；Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はＣ１〜３アルキル基；ｍ及びｎは０又は１で、少なくとも一方は１）ナフタレンジイミド誘導体。2018203652.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2018203652.tif 000018
（式中、
Ｒ1は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立的に、１〜３炭素原子を有するアルキル基を示し、
ｍおよびｎは、それぞれ独立的に、０または１であり、
ｍおよびｎの少なくとも一方は１であり、および
Ｒ2またはＲ3と結合しているＮは、カチオン化されてもよい）
を有することを特徴とするフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含むことを特徴とする、核酸塩基配列を電気化学的に検出するための電気化学活性検出用組成物。
【請求項３】
前記核酸塩基配列が四重鎖構造を構成していることを特徴とする、請求項２に記載の電気化学活性検出用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むテロメラーゼ伸長用プライマーが固定された電極とを含むことを特徴とする、テロメラーゼ活性検出キット。
【請求項５】
（１）  電極上に、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むプライマーを固定する工程と、
（２）  前記プライマーに、テロメラーゼ活性を検出しようとする試料を作用させ、前記プライマーの伸長産物を形成する工程と、
（３）  前記伸長産物を形成した電極を、請求項１に記載のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含む電解質溶液に接触させ、前記伸長産物中に四重鎖構造を形成し、得られた四重鎖構造と前記フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体との反応により電気化学活性プローブを形成する工程と、
（４）  前記電気化学活性プローブの酸化還元電流を測定する工程と
を含むことを特徴とする電気化学的テロメラーゼ活性検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体、テロメラーゼ活性検出キット、およびテロメラーゼ活性検出方法に関する。より詳細には、本発明は、癌の早期発見に有用な電気化学活性プローブとして用いることができるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体、当該フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含むテロメラーゼ活性検出キット、および当該フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を用いるテロメラーゼ活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌の早期発見法の１つとして、癌マーカーを用いた診断が行われている。癌マーカーは、癌細胞が産生する物質または癌の存在に応じて非癌細胞が産生する物質である。癌マーカーの測定は、癌の存在を示唆し、臨床診断補助および／または転移・再発の早期発見に有用である。
【０００３】
近年、テロメラーゼが癌マーカーとして注目されている。テロメラーゼは、染色体の末端に存在するテロメア配列（ヒトの場合、６塩基からなる５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列が数百回繰り返されている）を認識し伸長する酵素であり、鋳型ＲＮＡと触媒サブユニットタンパク質から構成されている。テロメア配列は、正常細胞であれば細胞分裂の度に短くなることが知られている。しかし、癌に冒された場合、テロメラーゼが活性を有し、テロメア配列は逆に伸長されることが知られている。したがって、患者のテロメラーゼ活性を調べることは、癌の早期発見に極めて有用である。
【０００４】
テロメラーゼ活性の検出方法としては、現在、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）法が広く用いられている（たとえば、非特許文献１参照）。ＴＲＡＰ法は大きく３つの工程からなる。最初の工程では、細胞から抽出したテロメラーゼによる伸長反応を行う。すなわち、テロメラーゼは、基質であるオリゴヌクレオチド（ＴＳ）の３’末端に相当数のテロメア配列（ＴＴＡＧＧＧ）を付加してＴＴＡＧＧＧ鎖の伸長反応を行う。次の工程では、２種類のプライマー（ＴＳプライマーとＲＰプライマー）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、伸長生成物を増幅する。最後の工程では、増幅産物を電気泳動し、６塩基ずつ増加する生成物のラダーを生成させ、そのラダーを32Ｐを用いた放射性検出法や蛍光色素を用いた蛍光検出法により検出する。これにより、高感度のテロメラーゼ活性の検出が可能となっている。
【０００５】
しかしながら、ＴＲＡＰ法は、伸長反応、ＰＣＲ、電気泳動という多数の工程を必要とし、一連の操作に長時間を要するという問題がある。また、伸長生成物として、ＰＣＲによって伸長されたヌクレオチド鎖、および／またはプライマーダイマーが生成することにより、偽陽性が生じる可能性があるという問題もある。
【０００６】
一方、伸長されたテロメア配列は、特定の条件下では四重鎖構造（四本鎖Ｇカルテット構造）を示すことが知られている。四重鎖構造が形成されると、テロメラーゼがテロメア配列を認識できないため、伸長反応は起こらない。すなわち、四重鎖構造の形成を促進する化合物、および四重鎖構造を安定化する化合物は、テロメラーゼ阻害剤としての効果を有することになる。したがって、テロメラーゼ阻害剤の存在下では、腫瘍細胞由来の試料のテロメラーゼ活性を測定できない。そのため、四重鎖構造の有無に影響を受けないテロメラーゼ活性の検出方法が必要とされている。
【０００７】
また、テロメラーゼ阻害剤がＰＣＲを阻害するような場合、ＴＲＡＰ法によるテロメラーゼ阻害剤のスクリーニングが困難となる。具体的に問題となる例は、ＰＣＲの有無を確認するインターナルコントロール配列が検出されるものの、テロメア配列に由来するラダーが検出されない場合である。この結果が、（ａ）テロメラーゼによるテロメアの伸長がされていないことに起因するのか、あるいは（ｂ）テロメラーゼによるテロメアの伸長は行われたが、テロメラーゼ阻害剤によるＰＣＲの阻害に起因するのかの判断が困難である。そのため、ＰＣＲを用いないテロメラーゼ活性の検出方法も必要とされている。
【０００８】
より簡便かつ迅速にテロメラーゼ活性を検出する方法として、電気化学的テロメラーゼ分析（ＥＣＴＡ）法が報告されている（たとえば、特許文献１および非特許文献２参照）。ＥＣＴＡ法は、電極上にテロメアＤＮＡを固定化する工程（図１（ａ））と、電極上で伸長反応させることで伸長産物を調製する工程（図１（ｂ））と、電解質処理によって伸長産物中に四重鎖構造を形成する工程（図１（ｃ））と、電解質溶液中で電気化学活性プローブを四重鎖構造と反応させる工程（図１（ｄ））と、電気化学活性プローブからの酸化還元電流を測定する工程（図１（ｅ））とを含む。ここで、電気化学活性プローブとして、フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を用いることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２２３２１８号公報
【特許文献２】特開２００１−２４２１１６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kim N. W. et al., Science, 266(5193), 2011-2015 (1994)
【非特許文献２】Mori K. et al., Clin. Chem., 59(1), 289-295 (2013)
【非特許文献３】Takenaka S, at al., Anal. Chem., 72(6), 1334-1341 (2000）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＥＣＴＡ法においては、テロメア配列の伸長産物に特徴的に含まれる四重鎖構造との相互作用の選択性が高い化合物を電気化学活性プローブとして用いることによって、検出感度を高めることができる。よって、四重鎖構造との相互作用の選択性がより高い化合物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、一般式（Ｉ）
【００１３】
【化１】
2018203652.tif 000002
【００１４】
（式中、
Ｒ1は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立的に、１〜３炭素原子を有するアルキル基を示し、
ｍおよびｎは、それぞれ独立的に、０または１であり、
ｍおよびｎの少なくとも一方は１であり、および
Ｒ2またはＲ3と結合しているＮは、カチオン化されてもよい）
を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の第２の実施形態である、核酸塩基配列の電気化学的検出を目的とする電気化学活性検出のための組成物は、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含むことを特徴とする。ここで、核酸塩基配列は、四重鎖構造を構成していてもよい。
【００１６】
本発明の第３の実施形態のテロメラーゼ活性検出キットは、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むテロメラーゼ伸長用プライマーが固定された電極とを含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の第４の実施形態の電気化学的テロメラーゼ活性検出方法は、
（１）  電極上に、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むプライマーを固定する工程と、
（２）  前記プライマーに、テロメラーゼ活性を検出しようとする試料を作用させ、前記プライマーの伸長産物を形成する工程と、
（３）  前記伸長産物を形成した電極を、第１の実施形態に記載のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含む電解質溶液に接触させ、前記伸長産物中に四重鎖構造を形成し、得られた四重鎖構造と前記フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体との反応により電気化学活性プローブを形成する工程と、
（４）  前記電気化学活性プローブの酸化還元電流を測定する工程と
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
上記の構成を採用することにより、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、一本鎖、二本鎖、四重鎖などの種々の構造を有するＤＮＡに対して相互作用を有する。本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖構造または四重鎖構造を有するＤＮＡ、特に四重鎖構造を有するＤＮＡに対して、著しく大きな相互作用を示す。前述の大きな相互作用により、四重鎖構造を有するテロメア配列を、より高感度で電気化学的に検出することが可能となる。したがって、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、四重鎖構造を構成する核酸塩基配列の電気化学的検出を目的とする、電気化学活性検出用組成物、テロメラーゼ活性検出キット、および電気化学的テロメラーゼ活性検出方法において、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＣＴＡ法を説明するための模式図であり、（ａ）〜（ｅ）は、それぞれの工程を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、一般式（Ｉ）
【００２１】
【化２】
2018203652.tif 000003
【００２２】
ここで、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立的に、１〜３炭素原子を有するアルキル基を示し、ｍおよびｎは、それぞれ独立的に、０または１であり、ｍおよびｎの少なくとも一方は１であり、およびＲ2またはＲ3と結合しているＮは、カチオン化されてもよい。
【００２３】
一般式（Ｉ）に示されるように、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体は、ナフタレンジイミド環構造と、置換フェロセン構造と、それら構造を結合するリンカー部（−Ｒ1−Ｎ（Ｒ2）−）とで構成される。ナフタレンジイミド環構造は、芳香族性の板状構造であり、核酸塩基配列（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の二本鎖（二重らせん）構造などの塩基対間に平行に挿入される縫い込み型インターカレータ部分として機能する。置換フェロセン構造は、電気化学的な検出の際に、酸化還元活性部分として機能する。また、リンカー部は、一般式（Ｉ）の化合物の合成における分離および精製操作を容易とし、同合成の収率を向上させ、かつ、ナフタレンジイミド環構造のインターカレータとしての機能を補助する機能を有する。
【００２４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1は、直鎖アルキレン基であっても、分枝アルキレン基であってもよい。合成の容易性の観点から、好ましくは、Ｒ1は直鎖アルキレン基である。好ましいＲ1は、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、およびヘキサメチレン基を含む。
【００２５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ2は、出現毎に、１〜３炭素原子を有するアルキル基である。Ｒ2は、直鎖アルキル基であっても、分枝アルキル基であってもよい。合成の容易性の観点から、好ましくは、Ｒ2は直鎖アルキル基である。好ましいＲ2は、メチル基、エチル基、および１−プロピル基を含む。
【００２６】
一般式（Ｉ）において、Ｒ3およびＲ4は、出現毎に、１〜３炭素原子を有するアルキル基である。Ｒ3およびＲ4は、直鎖アルキル基であっても、分枝アルキル基であってもよい。好ましいＲ3およびＲ4は、メチル基、エチル基、１−プロピル基、および２−プロピル基（イソプロピル基）を含む。
【００２７】
一般式（Ｉ）において、ｍおよびｎは、いずれか一方が１であることを条件として、０または１である。言い換えると、一般式（Ｉ）の化合物のフェロセン構造は、少なくとも１個の「−ＣＨ2ＮＲ3Ｒ4」置換基を有する。
【００２８】
具体的な使用形態（溶液のｐＨなど）に依存して、一般式（Ｉ）の化合物は「−Ｎ（Ｒ2）−」部分構造および「−ＣＨ2ＮＲ3Ｒ4」置換基中のＮは、カチオン化されていてもよい。たとえば、酸性または中性領域の緩衝液中で一般式（Ｉ）の化合物を使用する場合、「−Ｎ（Ｒ2）−」部分構造および「−ＣＨ2ＮＲ3Ｒ4」置換基は、それぞれ「−ＮＨ（Ｒ2）+−」部分構造および「−ＣＨ2ＮＨＲ3Ｒ4+」置換基に変化し得る。
【００２９】
一般式（Ｉ）の化合物の好ましい例は、以下の化合物（Ｉａ）および（Ｉｂ）を含む。
【００３０】
【化３】
2018203652.tif 000004
【００３１】
一般式（Ｉ）の化合物は、たとえば、以下に示すスキームにしたがって合成することができる。
【００３２】
【化４】
2018203652.tif 000005
【００３３】
フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と核酸塩基配列との相互作用効果は、たとえば、紫外可視吸収スペクトロ解析およびスキャッチャードプロット解析の併用により評価することができる。あるいはまた、相互作用効果を、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル解析、または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により評価することもできる。
【００３４】
本発明の第２の実施形態である、核酸塩基配列の電気化学的検出を目的とする電気化学活性検出のための組成物は、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含むことを特徴とする。ここで、核酸塩基配列は四重鎖構造を構成していてもよい。
【００３５】
本実施形態の組成物は、固体状態であっても、液体状態であってもよい。本実施形態の組成物は、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と、追加の成分とを含む混合物である。用いることができる追加の成分は、水、有機溶媒、電解質などの当該技術で知られている任意の成分であってもよい。
【００３６】
電解質は、電極上に固定されたテロメラーゼ伸長用プライマーから伸長したテロメア配列に四重鎖構造を形成させる機能を有する。用いることができる電解質は、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩を含む。
【００３７】
電解質は、溶液のｐＨを一定範囲内に維持する緩衝機能を有してもよい。緩衝機能を有する電解質は、酢酸／酢酸塩の混合物、リン酸／リン酸塩の混合物、クエン酸／クエン酸塩の混合物のような、ＪＩＳ規格に記載の混合物、および生化学分野においてよく知られている任意の混合物を含む。
【００３８】
用いることができる有機溶媒は、好ましくは水溶性有機溶媒である。核酸塩基配列の高次構造（四重鎖構造など）を攪乱しない範囲の比較的少量の有機溶媒を用いることが望ましい。好ましい水溶性有機溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などを含むが、それらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の第３の実施形態のテロメラーゼ活性検出キットは、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むテロメラーゼ伸長用プライマーが固定された電極とを含むことを特徴とする。
【００４０】
用いることができる電極は、金、白金、銀、銅、およびチタンのような金属電極；グラファイト、グラッシーカーボン、パイロティックグラファイト、およびカーボンファイバーのような炭素電極；酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、および酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）のような酸化物電極、シリコン（Ｓｉ）のような半導体電極を含む。好ましい電極は、金電極である。なぜなら、後述するようにテロメラーゼ伸長用プライマーの５’末端をチオール化することにより、テロメラーゼ伸長用プライマーを容易に金電極に固定することができるからである。電極は、ワイヤ、ディスク、およびプレートのような種々の形態を有してもよい。また、電極は、円形、多角形、および楕円形のような種々の形状の作用面を有してもよい。電極の作用面の面積（電極面積）は特に限定されない。円形の作用面を有する電極の場合、作用面が、２０μｍ〜１０ｍｍ、より好ましくは１ｍｍ〜３ｍｍの直径を有することが望ましい。
【００４１】
また、電極は、多数の独立した電極が配列されたアレイ電極であってもよい。たとえば、電気絶縁性基板表面に、複数の金薄膜を規則的な間隔で蒸着して、アレイ電極を形成してもよい（特許文献２参照）。
【００４２】
テロメラーゼ伸長用プライマーは、３’末端にＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を有する。テロメラーゼ伸長用プライマーは、３’末端において、複数回にわたってＴＴＡＧＧＧ配列が反復した塩基配列を有してもよい。また、テロメラーゼ伸長用プライマーは、５’末端に、ＴＴＡＧＧＧ以外の塩基配列を有してもよい。ＴＴＡＧＧＧ以外の塩基配列を配列することによって、テロメラーゼ伸長用プライマーの電極への固定、および／またはテロメラーゼによるテロメラーゼ伸長用プライマーの伸長を、より容易にすることができる。
【００４３】
テロメラーゼ伸長用プライマーの電極上への固定は、電極の種類に応じて、化学結合法および点着法のような、オリゴヌクレオチドの固定に用いる公知の方法を用いることができる。たとえば金電極を用いる場合、テロメラーゼ伸長用プライマーの５’末端をチオール化し、当該チオールと金との反応により金−硫黄結合を形成することによって、テロメラーゼ伸長用プライマーを金電極に固定することができる。たとえば、５’末端にチオール基を含むテロメラーゼ伸長用プライマーは、公知の方法（たとえば、Takenaka S, at al., Anal. Chem., 72(6),1334-1341 (2000））により得ることができる。一方、グラッシーカーボン電極を用いる場合、テロメラーゼ伸長用プライマーの５’末端にアミノ基を導入する工程と、過マンガン酸カリウムを用いる酸化により、グラッシーカーボン表面にカルボキシル基を導入する工程と、テロメラーゼ伸長用プライマーのアミノ基とグラッシーカーボン表面にカルボキシル基とを反応させてアミド結合を形成する工程とを含む方法により、テロメラーゼ伸長用プライマーをグラッシーカーボン電極に固定することができる。
【００４４】
本発明の第３の実施形態のテロメラーゼ活性検出キットは、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体、およびテロメラーゼ伸長用プライマーが固定された電極に加えて、電解質またはその溶液をさらに含んでもよい。用いることができる電解質は、第２の実施形態において説明したものと同様である。
【００４５】
本発明の第４の実施形態の電気化学的テロメラーゼ活性検出方法は、
（１）  電極上に、ＴＴＡＧＧＧからなる塩基配列を３’末端に含むプライマーを固定する工程と、
（２）  前記プライマーに、テロメラーゼ活性を検出しようとする試料を作用させ、前記プライマーの伸長産物を形成する工程と、
（３）  前記伸長産物中に四重鎖構造を形成する工程と、
（４）  第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体と、前記四重鎖構造を含む伸長産物とを電解質溶液中で反応させ、電気化学活性プローブを形成する工程と、
（５）  前記電気化学活性プローブの酸化還元電流を測定する工程と
を含むことを特徴とする。
【００４６】
工程（１）は、第３の実施形態において説明したように、５’末端にチオール基を含むテロメラーゼ伸長用プライマーを金電極に固定する方法、５’末端にアミノ基を含むテロメラーゼ伸長用プライマーを、表面にカルボキシル基を形成したグラッシーカーボン電極に固定する方法、点着法などのオリゴヌクレオチドの固定に用いられる任意の既知の方法で実施することができる。
【００４７】
工程（２）は、テロメラーゼ伸長用プライマーを固定した電極を、試料を含む溶液に浸漬することによって実施することができる。試料は、癌マーカーの存在を試験しようとする細胞である。被検細胞は、ヒト由来の細胞であれば、特に限定されない。試料溶液は、好ましくは、被検細胞の抽出液である。抽出液は、被検細胞を抽出用緩衝液中に懸濁させる工程と、必要に応じて、得られた懸濁液に非イオン性界面活性剤を添加する工程と、凍結融解、ホモジナイズなどのような生化学分野で用いられる通常の技術により細胞膜を破壊する工程とを含む方法により得ることができる。
【００４８】
工程（２）は、被検細胞抽出液中のテロメラーゼにより、電極に固定されたテロメラーゼ伸長用プライマーから伸長産物が得られるのに十分な条件（ｐＨ、温度、継続時間）で実施される。
【００４９】
工程（３）は、工程（２）を実施した電極を、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含む電解質溶液に接触させることによって実施される。用いることができる電解質は、第２の実施形態で説明した化合物を含む。
【００５０】
工程（３）は、伸長産物が四重鎖構造を形成するのに十分であり、かつ形成された四重鎖構造とフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体とが結合するのに十分な条件（ｐＨ、温度、継続時間）で実施される。
【００５１】
代替法として、工程（３）を２段階で実施してもよい。この代替法の工程（３）は、（３ａ）伸長産物が形成された電極を第１の電解質溶液と接触させる工程と、（３ｂ）工程（３ａ）を実施した電極を、第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体を含む第２の電解質溶液に接触させる工程とを含む。この代替法では、工程（３ａ）において、伸長産物中に四重鎖構造を形成させ、工程（３ｂ）において、工程（３ａ）で得られた四重鎖構造とフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体との反応により電気化学活性プローブを形成する。この代替法は、工程（３ａ）で使用する第１の電解質溶液が緩衝機能を持たない場合、および／または、工程（３ｂ）で使用する第２の電解質溶液による四重鎖構造の形成が不充分な場合において、特に有効である。
【００５２】
工程（３）を２段階で実施する場合、工程（３ａ）は、伸長産物が四重鎖構造を形成するのに十分な条件（ｐＨ、温度、継続時間）で実施される。工程（３ｂ）は、工程（３ａ）で形成された四重鎖構造とフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体とが結合するのに十分な条件（ｐＨ、温度、継続時間）で実施される。
【００５３】
工程（４）は、公知の電気化学測定法により実施することができる。たとえば、作用極、対極および基準極の３電極系において、作用極に対して所定の電位を印加することにより、作用極に固定された電気化学活性中心（第１の実施形態のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体中のフェロセン構造）の酸化電流または還元電流を測定する方法を利用することができる。ここで、工程（３）で得られた電気化学活性プローブを作用極とする。用いることができる方法は、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、矩形波ボルタンメトリー（ＳＷＶ）、微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）を含む。あるいはまた、ポテンシオスタットを用いて、作用極と基準極との間に所定の電位を印加して、作用極と対極との間に流れる電流を測定してもよい。また、基準極を省略した２電極系において、工程（３）で得られた電気化学活性プローブを含む作用極と対極との間の所定の電位を印加して、作用極と対極との間に流れる電流を測定してもよい。
【００５４】
本実施形態では、電気化学活性中心に起因する酸化電流または還元電流の量によって、四重鎖構造形成の程度が検出される。四重鎖構造形成の程度は、テロメラーゼ伸長用プライマーからの伸長産物の形成の程度、すなわち、試料中のテロメラーゼ活性に相当する。したがって、本実施形態では、電気化学活性中心に起因する酸化電流または還元電流の量により、試料中の癌マーカーとしてのテロメラーゼの存在の有無、および含有量を測定することができる。
【実施例】
【００５５】
（合成例１）  化合物（ＩＩＩａ）の合成
【００５６】
【化５】
2018203652.tif 000006
【００５７】
窒素雰囲気下、１，１’−ジブロモフェロセン２．０３７０ｇ（５．９２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、−７８℃冷却下、ｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍ、ｎ−ヘキサン溶液）４．０ｍｌ（６．５１６ｍｍｏｌ）を加え２０分攪拌した。次いでＮ，Ｎ−ジメチルメチレンアンモニウムヨージド２．２ｇ（１１．８４８ｍｍｏｌ）を加え、その後室温に放置して１６時間攪拌した。この反応液に塩化アンモニウム水溶液（１００ｍｌ）およびクロロホルム（１５０ｍｌ）を加えて分液し、水相を５０ｍｌのクロロホルムでさらに２回抽出した。得られた有機相（２５０ｍｌ）を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して粗製生物を得た。これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体として１−ブロモ−１’−（（ジメチルアミノ）メチル）フェロセン１．６６９２ｇ（５．１８３５ｍｍｏｌ，収率８７．５％）を得た。
【００５８】
窒素雰囲気下、得られた１−ブロモ−１’−（（ジメチルアミノ）メチル）フェロセン８００ｍｇ（２．４８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、７８℃冷却下、ｎ−ブチルリチウム（１．６Ｍ、ｎ−ヘキサン溶液）２．４ｍｌ（２．４８ｍｍｏｌ）を加え２０分攪拌した。次いでＤＭＦ（０．２２ｍｌ、２．７２８ｍｍｏｌ）を加え、その後室温にもどして３０分攪拌した。この反応液に塩化アンモニウム水溶液（１００ｍｌ）を加え、クロロホルム（１００ｍｌ）で５回抽出した。得られた有機相（５００ｍｌ）を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して粗製生物を得た。これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（ＩＩＩａ）５８８．８ｍｇ（２．１７１５ｍｍｏｌ，収率８７．６％）を得た。
【００５９】
（合成例２）  化合物（ＩＩＩｂ）の合成
【００６０】
【化６】
2018203652.tif 000007
【００６１】
窒素雰囲気下、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルフェロセン５．００ｇ（２０．６ｍｍｏｌ）を脱水ジエチルエーテル（１００ｍｌ）に溶解させた。室温下、ｔ−ブチルリチウム（１．６３Ｍ、ペンタン溶液）１９ｍｌ（３０．９ｍｍｏｌ）を滴下し、１５分間攪拌した。次いで脱水ＤＭＦ２．２６ｇ（３０．９ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに１５分間攪拌した。反応液に水を添加し、水相と有機相とを分離した。得られた有機相を、水および飽和食塩水で順次洗浄した。洗浄後の有機相を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、減圧濃縮して、化合物（ＩＩＩｂ）３．３４ｇ（１２．３ｍｍоｌ、収率６０％）を得た。
【００６２】
（合成例３）  化合物（ＩＶ）の合成
【００６３】
【化７】
2018203652.tif 000008
【００６４】
窒素雰囲気下、ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸二無水物４．０５ｇ（１５．１ｍｍｏｌ）およびＮ−メチル−１，３−ジアミノプロパン４．００ｇ（４５．４ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（１２０ｍｌ）に懸濁させ、１００℃で３時間加熱攪拌した。冷却後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに分散させ、固体を濾取した。得られた固体を減圧乾燥し、化合物（ＩＶ）４．６０ｇ（１１．３ｍｍоｌ、７５％）を得た。
【００６５】
（実施例１）  化合物（Ｉａ）の合成
【００６６】
【化８】
2018203652.tif 000009
【００６７】
窒素雰囲気下、化合物（ＩＩＩａ）３２５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのクロロホルムに溶解した後、化合物（ＩＶ）１２３ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。この溶液にナトリウムトリアセトキシボロビリド６３６ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を加え、次いで、酢酸０.１７２ｍｌ（３．０ｍｍｏｌ）を加えて、４８℃で４時間攪拌した。
【００６８】
反応液を室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を滴下して加え、クロロホルム（５０ｍｌ）で２回抽出した。得られた有機相（１００ｍｌ）を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮して粗製生物を得た。これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製、ジクロロメタンおよびヘキサンを用いて再結晶し、析出した結晶の吸引濾過および減圧乾燥により、黄土色の粉末として化合物（Ｉａ）１０２．０５ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ，収率３７．０%）を得た。
【００６９】
得られた粉末の1Ｈ−ＮＭＲ解析結果およびＬＣ／ＭＳ分析結果は、以下の通りである。
1Ｈ−ＮＭＲ（δH／ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：  １．９２（ｑｕｉｎ，４Ｈ），２．１６（ｓ，６Ｈ），２．１７（ｓ，１２Ｈ），２．４６（ｔ，４Ｈ），３．２６（ｓ，４Ｈ），３．３９（ｓ，４Ｈ），４．００（ｔ，４Ｈ），４．０７（ｑｕａｒ，８Ｈ），４．１０（ｔ，４Ｈ），４．２４（ｔ，４Ｈ），８．７６（ｓ，４Ｈ）。
ＬＣ／ＭＳ：  ｍ／ｚ  ９１９  ［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７０】
（実施例２）  化合物（Ｉｂ）の合成
【００７１】
【化９】
2018203652.tif 000010
【００７２】
窒素雰囲気下、化合物（ＩＩＩｂ）４００ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのクロロホルムに溶解した後、化合物（ＩＶ）２１６ｍｇ（０．５３ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。この溶液にナトリウムトリアセトキシボロビリド１，１２３ｍｇ（５．３０ｍｍｏｌ）を加え、次いで、酢酸０．３ｍｌ（５．３０ｍｍｏｌ）を加えて、４８℃で４時間攪拌した。
【００７３】
反応液を室温に冷却後、炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）を滴下して加え、クロロホルム（８０ｍｌ）で２回抽出した。得られた有機相（１６０ｍｌ）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮して粗製生物を得た。これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した後、得られた粘性個体をジクロロメタンに溶解して、１Ｎ−ＨＣｌ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して、黒色粘性固体として化合物（Ｉｂ）１３９．０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ，収率２８．５％）を得た。
【００７４】
得られた粉末の1Ｈ−ＮＭＲ解析結果およびＬＣ／ＭＳ分析結果は、以下の通りである。
1Ｈ−ＮＭＲ（δH／ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：  １．９３（ｑｕａｒ，４Ｈ），２．２０（ｓ，１８Ｈ），２．５３（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｍ，４Ｈ），３．４２（ｑｕａｒ，４Ｈ），４．０４（ｍ，１２Ｈ），４．２０（ｍ，８Ｈ），８．７６（ｓ，４Ｈ）。
ＬＣ／ＭＳ：  ｍ／ｚ  ９１９  ［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７５】
（実施例３）  化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（ＩＩ）と核酸塩基との相互作用強度の測定
第１表に示す組成を有するサンプル溶液を攪拌しつつ、第１表に示す組成を有するＤＮＡ滴下剤を数μＬずつ滴下していった時の紫外可視吸収スペクトルを測定した。測定は２５℃において行った。また、ＤＮＡ滴下剤中のＤＮＡは、第２表に示すＳ１、Ｓ２またはＳ３のいずれかであった。ここで、Ｓ１は、カリウムイオンの存在する電解質溶液中で四本鎖構造を形成するため、テロメラーゼによる伸長産物中の四重鎖構造のモデルとして使用した。この手順を、化合物の吸収極大波長において、ＤＮＡ濃度に対する吸光度変化が見られなくなるまで繰り返した。
【００７６】
【表１】
2018203652.tif 000011
【００７７】
【表２】
2018203652.tif 000012
【００７８】
上記の手順で得られた３８４ｎｍの波長における吸光度の変化から、結合率を算出した。この結合率に基づいて、下記式（１）により、実験データと理論データとを最適化（ｆｉｔｔｉｎｇ）して、結合定数Ｋおよび座位数ｎを算出した。なお、式（１）中、Ｌは非結合色素濃度を表し、ｒは結合色素濃度／ＤＮＡ濃度を表す。
【００７９】
【数１】
2018203652.tif 000013
【００８０】
ＤＮＡとしてＳ１を用いた場合、５５×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、２．３の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ２を用いた場合、５．２×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、１．２の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ３を用いた場合、１５×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、７．７の結合数ｎが得られた。
【００８１】
（実施例４）  化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（ＩＩ）と核酸塩基との相互作用強度の測定
【００８２】
化合物（Ｉａ）に代えて化合物（Ｉｂ）を用いたことを除いて、実施例３の手順を繰り返して、核酸塩基との相互作用強度の測定を行った。
【００８３】
ＤＮＡとしてＳ１を用いた場合、１４×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、２．９の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ２を用いた場合、４．７×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、１．８の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ３を用いた場合、９．９×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、７．８の結合数ｎが得られた。
【００８４】
（比較例１）  化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（ＩＩ）と核酸塩基との相互作用強度の測定
化合物（Ｉａ）に代えて化合物（ＩＩ）を用いたことを除いて、実施例４の手順を繰り返して、核酸塩基との相互作用強度の測定を行った。
【００８５】
【化１０】
2018203652.tif 000014
【００８６】
ＤＮＡとしてＳ１を用いた場合、６．１×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、２．５の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ２を用いた場合、４．６×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、０．６７の結合数ｎが得られた。ＤＮＡとしてＳ３を用いた場合、３．６×１０5Ｍ-1の結合定数Ｋ、７．６の結合数ｎが得られた。
【００８７】
（評価１）
実施例３、実施例４および比較例１で得られた結果を、第３表に示す。
【００８８】
【表３】
2018203652.tif 000015
【００８９】
第３表から分かるように、フェロセン構造中にジメチルアミノメチル置換基を有する本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｉａ）および（Ｉｂ）は、無置換のフェロセン構造を有する従来技術のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（ＩＩ）と同等またはそれ以上の、四本鎖構造を有する塩基配列Ｓ１、一本鎖構造を有する塩基配列Ｓ２、および二本鎖構造を有する塩基配列Ｓ３のそれぞれに対する結合数を示した。
【００９０】
そして、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｉａ）および（Ｉｂ）と、塩基配列Ｓ１、一本鎖構造を有する塩基配列Ｓ２、および二本鎖構造を有する塩基配列Ｓ３のそれぞれとの結合定数Ｋは、対応する従来技術のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（ＩＩ）の結合定数Ｋより大きい値を有した。特に、四本鎖構造を有する塩基配列Ｓ１および二本鎖構造を有する塩基配列Ｓ３に対して、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｉａ）および（Ｉｂ）は、従来技術のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（ＩＩ）よりも著しく大きい結合定数Ｋを有した。
【００９１】
（実施例５）  化合物（Ｉｂ）を用いるテロメラーゼ活性の電気化学的測定
下記の構造を有する、３’末端にＴＴＡＧＧＧの塩基配列を有し、５’末端にチオール基を有するテロメラーゼ伸長用プライマーＰ１を準備した。
Ｐ１：  HS-5'-TTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGG
【００９２】
表面に１５μＬの６−メルカプトヘキサノール溶液（濃度１ｍＭ）を滴下し、１時間にわたって４５℃でインキュベートして、直径３ｍｍの金電極の表面をマスキングした。マスキングした金電極の表面に対して、１０μＬのプライマーＰ１溶液（濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を滴下し、３０分間にわたって３７℃でインキュベートして、テロメラーゼ伸長用プライマーＰ１が固定された測定用電極を得た。
【００９３】
得られた測定用電極、参照極としてのＡｇ／ＡｇＣｌ電極、および対極としてのＰｔ電極からなる三極系を用いて、２５℃の測定溶液中でＳＷＶ測定を行った。ＳＷＶは、ＡＬＳ６００電気化学アナライザー（ビー・エー・エス株式会社）を用いて実施した。測定溶液として、０．１ＭのＫＣｌ（支持電解質）、および２０μＭの化合物（Ｉｂ）を含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝８．０）を用いた。ここで得られた電流値を伸長前電流値ｉ0（μＡ）とする。
【００９４】
次に、５倍濃縮ＴＲＡＰ反応緩衝液、テロメラーゼ希釈液（５００cells／μＬ、Merk Millipore社製TRAPeze（登録商標） Telomerase Detection Kitに付属する、Telomerase Positive Controlから調製した）および水を混合して、２種の伸長反応溶液を調製した。５倍濃縮ＴＲＡＰ反応緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのスペルミジン、および０．１ｍＭのｄＮＴＰを含んだ。伸長反応溶液の組成およびテロメラーゼ濃度を第４表に示す。超純水および０．２Ｕ／μＬのＲＮアーゼ阻害剤水溶液（タカラバイオ製Recombinant RNase Inhibitorを希釈して調製した）を用いて洗浄した測定用電極の表面に、１０μＬの伸長反応溶液を滴下し、３０分間にわたった３７℃でインキュベートして、伸長反応を行った。伸長反応溶液Ｂはテロメラーゼ活性を有する溶液であり、伸長反応溶液Ａはテロメラーゼ活性を持たない比較対照である。
【００９５】
【表４】
2018203652.tif 000016
【００９６】
伸長反応終了後、超純水を用いて測定用電極を洗浄した。伸長反応前の測定と同一の条件下、洗浄した測定用電極を用いて、ＳＷＶ測定を行った。ここで得られた電流値を伸長後電流値i（μＡ）とする。（ｉ−ｉ0）／ｉ0の式を用いて、電流増加率Δｉ（％）を求めた。得られた結果を第５表に示す。
【００９７】
【表５】
2018203652.tif 000017
【００９８】
第５表から分かるように、伸長反応時のテロメラーゼの有無により電流増加率Δｉに顕著な差が見られた。このことから、本発明のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｉｂ）を用いるテロメラーゼ活性検出が可能であることが示された。
【図１】
2018203652.tif 000020
【配列表】
2018203652000001.app