(57)【要約】【課題】目視により確認できないニワトリの羽性遺伝子型を、多くの品種で簡便に鑑別する方法を提供する。【解決手段】ニワトリの羽性遺伝子型の鑑別方法は、ニワトリ由来の試料に含まれるゲノムDNAを鋳型とする遺伝子増幅法により、Z染色体上のポリチミン配列を有する識別領域を増幅するステップと、増幅された識別領域の塩基数に基づいてニワトリの羽性遺伝子型を鑑別するステップとを備えている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリの羽性遺伝子型の鑑別方法であって、
ニワトリ由来の試料に含まれるゲノムDNAを鋳型とする遺伝子増幅法により、Z染色体上のポリチミン配列を有する識別領域を増幅するステップと、
増幅された前記識別領域の塩基数に基づいて前記ニワトリの羽性遺伝子型を鑑別するステップとを備えている羽性遺伝子型の鑑別方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記識別領域の塩基数は、６０塩基対以上９０塩基対以下であることを特徴とする鑑別方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記識別領域を増幅するステップでは、配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いたPCR法により前記識別領域が増幅されることを特徴とする鑑別方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つにおいて、
前記羽性遺伝子型を鑑別するステップでは、ゲル電気泳動法により分離されたバンドの本数に基づいて羽性遺伝子型を鑑別することを特徴とする鑑別方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つにおいて、
前記識別領域は、ニワトリのZ染色体において、SPEF2遺伝子の１０００〜１２００塩基対上流側の領域、及びSPEF2遺伝子の上流側配列の部分的重複構造であるdSPEF2の１０００〜１２００塩基対上流側の領域とに存在することを特徴とする鑑別方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つにおいて、
前記試料は遅羽の表現型を持つ雄のニワトリ由来であり、
遅羽遺伝子を持つZ染色体をZK、速羽遺伝子を持つZ染色体をZk+と表記するとき、ZK上の２箇所に前記識別領域が含まれているとともに、Zk+上の１箇所に前記識別領域が含まれており、ZK上の前記識別領域と、Zk+上の前記識別領域とでは塩基数が重複していないことを特徴とする鑑別方法。
【請求項７】
請求項６において、
前記識別領域には、塩基数が相異なる少なくとも６種類の型があり、
ZK上には少なくとも６種類の型のうち、１種類又は２種類の型の前記識別領域が存在し、
Zk+上にはZKに含まれる前記識別領域とは異なる型の前記識別領域が１種類存在していることを特徴とする鑑別方法。
【請求項８】
請求項７において、
前記識別領域の種類には、配列番号３で表される塩基配列からなるa型と、配列番号４で表されるb型と、配列番号５で表される塩基配列からなるc型と、配列番号６で表される塩基配列からなるd型と、配列番号７で表される塩基配列からなるe型と、配列番号８で表される塩基配列からなるf型とがあることを特徴とする鑑別方法。
【請求項９】
ニワトリの羽性遺伝子型を鑑別するために用いられるプライマーセットであって、
ニワトリのZ染色体において、ポリチミン配列を有する識別領域の上流側部分にアニールするフォワードプライマーと、前記識別領域の下流側部分にアニールするリバースプライマーとからなり、PCR法によって前記識別領域を増幅可能にするプライマーセット。
【請求項１０】
請求項９において、
前記識別領域は、ニワトリのZ染色体において、SPEF2遺伝子の１０００〜１２００塩基対上流側の領域、及びSPEF2遺伝子の上流側配列の部分的重複構造であるdSPEF2の１０００〜１２００塩基対上流側の領域とに存在し、
前記プライマーセットは、SPEF2遺伝子の上流側に位置する前記識別領域と、dSPEF2の上流側に位置する前記識別領域とを共に増幅可能であることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１１】
請求項９又は１０において、
前記フォワードプライマーは、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーは、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１２】
ニワトリの羽性遺伝子型を鑑別するために用いられるキットであって、
請求項７〜１１のいずれか１つに記載されたプライマーセットを備えているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された技術は、ニワトリの羽性遺伝子型鑑別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日の鶏産業界において、ニワトリの初生雛の雌雄判別法は、飼育効率を高め、コストを軽減するためになくてはならないものである。
【０００３】
雌雄判別法の一つに、主翼羽の表現型の違いを利用した羽性鑑別法がある。
【０００４】
図１は、羽性鑑別法の概念を模式的に示す図である。鳥類であるニワトリの性別を決定する性染色体は、Z染色体とW染色体であり、Z/Zで雄、Z/Wで雌となる。上述の主翼羽の表現型には、主翼羽の発育が遅延する遅羽と、発育が通常である速羽とがある。この羽性を決定する遺伝子（遅羽遺伝子K、速羽遺伝子k+）はZ染色体上にあり、遅羽遺伝子Kは速羽遺伝子に対して優性である。このため、図１に示すように、遅羽遺伝子Kを有するZ染色体をZK、速羽遺伝子k+を有するZ染色体をZk+と表記すると、種鶏（ペアレントストック；PS）の段階で雌をZK/W（遅羽性）とし、雄をZk+/Zk+（速羽性）とすることで、コマーシャル鶏の雌を速羽性に、雄を遅羽性に、それぞれ固定することができる。
【０００５】
羽性の違いは目視により判別可能であるので、この方法によれば、迅速にコマーシャル鶏の雛の雌雄を判別することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】中村明弘他、Res. Bull. Aichi Agric. Res. Ctr. 34：214-217(2002)
【非特許文献２】中村明弘他、日本家禽学会誌、46(J1), J9-J15, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、図１に示すように、上述の羽性鑑別法を用いるためには、種鶏の親鶏となる雌系原種鶏の集団を、ZK/Wの雌とZK/ZKの雄のみで構成することが好ましい。これは、雌系原種鶏の集団にヘテロ型（ZK/Zk+）の雄が混じっていると、速羽性の雌が生まれる可能性があり、選別の手間が増えるためである。なお、雄系原種鶏の集団は、Zk+/Wの雌とZk+/Zk+の雄のみで構成されればよい。
【０００８】
雌系原種鶏の集団の構成と、雄系原種鶏の集団の構成とを以上のように管理することで、雌系原種鶏同士を掛け合わせて生まれた雌の遺伝型をZK/W（遅羽性）に固定するとともに、雄系原種鶏同士を掛け合わせて生まれた雄の遺伝型をZk+/Zk+（速羽性）に固定することができる。そのため、不要な種鶏が生まれる無駄を省き、選別の手間も省くことができる。
【０００９】
しかしながら、遅羽遺伝子は優性遺伝子であるので、遅羽遺伝子と速羽遺伝子とを持ったヘテロ型（ZK/Zk+）の雄と、ホモ型（ZK/ZK）の雄は共に遅羽性となり、従来の羽性鑑別のみで両者を鑑別することはできない。このため、雌系原種鶏の集団からヘテロ型の雄を排除するためには、別の方法が必要となる。
【００１０】
非特許文献１には、遅羽遺伝子に連鎖する内在性ウイルス遺伝子（ev-21）をマーカーとして用いたpolymerase chain reaction（PCR）法によって遺伝子の羽性を判定する方法が記載されている。
【００１１】
しかし、この方法は、雄個体が少なくともヘテロ型で遅羽遺伝子を持っているかどうかの判別には利用できるものの、遅羽性雄個体がホモ型であるかヘテロ型であるかの判別には利用できない。
【００１２】
また、非特許文献２には、ZK及びZk+上に配列が共通するunoccupied region（UR）が存在するとともに、ZK上のUR内にev-21が挿入されたoccupied region（OR）が存在することが記載されている。同文献では、多型によりZk+上のURには制限酵素MboIの制限サイトがあるのに対し、ZK上のURにはMboIの制限サイトがないことを利用して、PCR-RFLP法による雄の遅羽個体のホモ型とヘテロ型の鑑別が可能であることが記載されている。
【００１３】
しかしながら、この方法は、PCR法によって増幅されたDNA断片を特定の制限酵素を用いて処理する必要があり、手間とコストがかかるという不具合がある上、制限酵素サイトの多型が存在せず、適用できない品種も多い。
【００１４】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的は、目視により確認できない羽性遺伝子型を多くの品種で簡便に鑑別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書に開示されたニワトリの羽性遺伝子型の鑑別方法は、ニワトリ由来の試料に含まれるゲノムDNAを鋳型とする遺伝子増幅法により、Z染色体上のポリチミン配列を有する識別領域を増幅するステップと、
増幅された前記識別領域の塩基数に基づいて前記ニワトリの羽性遺伝子型を鑑別するステップとを備えている。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書に開示された鑑別方法によれば、目視により確認できない雄鶏の羽性遺伝子の型を多くの品種で簡便に鑑別しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、羽性鑑別法の概念を模式的に示す図である。
【図２】図２は、本明細書に開示された実施形態に係る羽性遺伝子の鑑別方法を説明する図である。
【図３】図３は、UPS領域の増幅ステップにより増幅されるUPS領域の遺伝子型を示す図である。
【図４】図４は、a型からf型までのUPS領域を有する速羽性の雌を試料とした場合の電気泳動結果（左図）と、複数のUPS領域の組み合わせを有する遅羽性の雌を試料とした場合の電気泳動結果（右図）とを示す写真図である。
【図５】図５は、遅羽性を示すヘテロ型の雄を試料とした場合の電気泳動結果（左図）と、遅羽性を示すホモ型の雄を試料とした場合の電気泳動結果（右図）とを示す写真図である。
【図６】図６は、実施例に係る方法による検査結果を示す図である。
【図７】図７は、比較例に係る方法により検査した場合に見られるUR配列のハプロタイプを示す図である。
【図８】図８は、比較例に係る方法による検査結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００１９】
図２は、本明細書に開示された実施形態に係る羽性遺伝子の鑑別方法を説明する図である。
【００２０】
本願発明者らは、雄の羽性遺伝子型について、ホモ型個体とヘテロ型個体とを鑑別するために、遅羽遺伝子を持つZ染色体（ZK）と速羽遺伝子を持つZ染色体のZk+とを区別するためのよりよい指標となる配列の探索を行った。その結果、ZKとZk+には、精子の鞭毛タンパク質をコードするSPEF2遺伝子と、その上流側に位置し、ポリチミン配列を有する６０〜９０塩基対程度の識別領域とが共通して含まれていることが分かった。また、ZKにはSPEF2遺伝子の部分的重複構造であるdSPEF2と、その上流側に位置し、ポリチミン配列を有する識別領域とが含まれていることも分かった。本明細書では、この識別領域のことを「up-stream region of the SPEF2/dSPEF2 gene (UPS)領域」と呼ぶこととする。
【００２１】
dSPEF2の上流側に位置するUPS領域と、SPEF2の上流側に位置するUPS領域とは、塩基数の違いを利用して容易に区別可能であることから、本願発明者らは、UPS領域を目印として、ZKとZk+とを鑑別する方法に想到した。なお、dSPEF2は６０００塩基対程度であり、図２に示すdPRLRは７００００塩基対程度であると考えられる。
【００２２】
UPS領域は、多数のニワトリの品種において、dSPEF2の１０００〜１２００塩基対上流側の領域（例えば１１００塩基対上流側）の領域と、SPEF2遺伝子の１０００〜１２００塩基対上流側（例えば１１００塩基対上流側）の領域とにそれぞれ位置していることが確かめられ、多くの品種について当該鑑別方法が適用できると考えられた。
【００２３】
−鑑別方法の説明−
本実施形態の鑑別方法では、まずニワトリの雛から試料を採取する。試料は十分な量のゲノムDNAを得られるものであれば特に限定されないが、被検体への影響を最小限にする観点から、試料として血液を用いるのが好ましい。
【００２４】
次に、この試料から公知の方法によってゲノムDNAを抽出する。そして、抽出されたゲノムDNAを鋳型として、例えば下記のプライマーセットを用いたpolymerase chain reaction（PCR）法を行い、UPS領域を増幅する。
【００２５】
フォワードプライマー：5'-AGCTTGATCACACCACCTGCA-3'  （配列番号１）
リバースプライマー：5'-AGTTTTAAATTCTGTTCTTCCGTA-3'  （配列番号２）
このステップにより、図２に示す速羽遺伝子k+が含まれた試料では、塩基配列Xを有するUPS領域が増幅され、遅羽遺伝子Kが含まれた試料では、塩基配列YとZを有するUPS領域が増幅される。なお、各UPS領域において、ポリチミン配列の上流近傍の配列及び下流近傍の配列は、それぞれ相同性が非常に高い。また、UPS領域の配列は複数の品種間でよく保存されている。このため、上記のプライマーセットによれば、UPS領域毎に異なるプライマーセットを用いなくてもZK及びZk+上のUPS領域を増幅することができる。増幅されるUPS領域の塩基数は特に限定されないが、６０塩基対以上９０塩基対以下であってもよい。
【００２６】
図３は、UPS領域の増幅ステップにより増幅されるUPS領域のタイプを示す図である。本願発明者らが調べた範囲では、各品種のニワトリのZK及びZk+上において、a型からf型までの塩基数が異なる６種類のUPSが確認されている。a型（配列番号３）の長さは６４塩基対、b型（配列番号４）の長さは７０塩基対、c型（配列番号５）の長さは７４塩基対、d型（配列番号６）の長さは７８塩基対、e型（配列番号７）の長さは８２塩基対、f型（配列番号８）の長さは８４塩基対である。PCR法を用いているため、本ステップで増幅されるUPSの両端は、プライマーの配列に一致しているが、a型からf型のそれぞれでは、ポリチミン配列の塩基数が１８塩基対から３８塩基対までの範囲で異なっている。
【００２７】
次いで、例えばゲル電気泳動法等によって、先のステップで増幅されたDNA断片（UPS領域）を分離し、得られたバンドの本数を確認する。本ステップで、ポリアクリルアミドゲルを用いる場合、a型からf型までの６種類のUPSをそれらの塩基数によって短時間で簡便に区別することができる。
【００２８】
図４は、a型からf型までのUPS領域を有する速羽性の雌を試料とした場合の電気泳動結果（左図）と、複数のUPS領域の組み合わせを有する遅羽性の雌を試料とした場合の電気泳動結果（右図）とを示す写真図である。なお、図４の右図において、「a-b」とあるのは、遅羽遺伝子を持つZKにおいて、dSPEF2の上流に位置するUPS領域（図２に示す配列「Y」）がa型で、SPEF2の上流に位置するUPS領域（図２に示す配列「Z」）がb型であることを表している。a-c、a-e、c-eもこれと同様に、配列Yと配列Zの組み合わせがそれぞれa型とc型、a型とe型、c型とe型であることを表す。
【００２９】
図４の左図に示すように、雌にはZ染色体が１つしか存在しないので、UPS領域を持つ品種の速羽性の雌を試料とする場合、a型からf型のいずれかのバンドが１本のみ観察される。一方、図４の右図に示すように、遅羽性の雌を試料とする場合、a-a型では１本のバンドが、a-b型、a-c型、a-e型、c-e型ではそれぞれ２本のバンドが観察される。
【００３０】
図５は、遅羽性を示すヘテロ型の雄を試料とした場合の電気泳動結果（左図）と、遅羽性を示すホモ型の雄を試料とした場合の電気泳動結果（右図）とを示す写真図である。
【００３１】
図５の左図に示すように、例えばa型、b型、e型のUPS領域を持つヘテロ型の個体、a型、c型、e型のUPS領域を持つヘテロ型の遅羽性雄では、それぞれ３本のバンドが観察される。これに対し、図５の右図に示すように、例えばa-b型、a-e型、c-e型のZKを持つホモ型の遅羽性雄では、それぞれ２本のバンドが観察される。
【００３２】
以上のことから、遅羽性と速羽性とが区別できるニワトリに対して本実施形態の鑑別方法を用いれば、バンドの本数を確認するだけで、遅羽性の雄がヘテロ型であるのかホモ型であるのかを簡便に鑑別することができる。本実施形態の方法は、非特許文献１、２に記載された方法に比べて適用できる品種の数が多く、異なる品種同士を掛け合わせる際にも使用できる範囲が広い。また、本実施形態の方法は、非特許文献１に記載の方法に比べて制限酵素による処理が不要であり、PCR法に用いる一般的な試薬を用いて実施できるので、手間とコストを低減することが可能となる。
【００３３】
本実施形態の鑑別方法は、検査対象となるニワトリの集団において、速羽遺伝子を有するZk+のUPS領域（図２に示す配列X）と、遅羽遺伝子を有するZK上の２つのUPS領域（図２に示す配列Y、Z）との間で塩基配列の塩基数が重複していない場合に使用することができる。この理由を以下に説明する。
【００３４】
例えば、図２に示す配列Xがa型のUPSであり、配列Y、Zがそれぞれa型とe型のUPS領域である場合（すなわち、配列Xと配列Y、Zとの間でa型が重複している場合）、ヘテロ型の遅羽性雄では２本のバンドが観察される。一方、ホモ型の遅羽性雄でも２本のバンドが観察されるので、ホモ型とヘテロ型とを鑑別することができない。
【００３５】
これに対し、図２に示す配列Xが例えばb型のUPS領域であり、配列Y、Zがそれぞれa型とe型のUPS領域である場合、ヘテロ型の遅羽性雄では３本のバンドが観察され、ホモ型の遅羽性雄では２本のバンドが観察されるので、バンドの本数の違いによってホモ型とヘテロ型とを鑑別することができる。この場合、速羽性雄ではb型UPS領域の１本のみのバンドが観察されるので、速羽性の雄であることも鑑別することができる。
【００３６】
このため、本実施形態の方法は、目視による羽性鑑別法と組み合わせて遅羽性雄の遺伝子型を鑑別するために用いてもよいし、遅羽性雄の遺伝子型の鑑別と雄の羽性鑑別の両方を行うために用いてもよい。
【００３７】
また、図２に示す配列Xがb型のUPS領域であり、配列Y、Zが共にa型のUPS領域である場合、ヘテロ型の遅羽性雄では２本のバンドが観察され、ホモ型の遅羽性雄ではa型UPS領域の１本のバンドが観察される。このため、バンドの本数の違いによってホモ型とヘテロ型とを鑑別することができる。
【００３８】
この場合、速羽性雄ではb型UPS領域の１本のバンドが観察されるので、バンドの本数に基づいて羽性の鑑別をすることはできないが、a型UPS領域とb型UPS領域との塩基配列の塩基数の違いに基づいて鑑別することが可能である。
【００３９】
以上のように、本実施形態の方法は、羽性の違いがあり、且つZK上とZk+上とで塩基数が重複するUPS領域が無い場合に適用できる。このことは、非特許文献１、２に記載された従来の方法でも同様である。しかし、本実施形態の方法では、従来の方法に比べてZK上のUPS領域の型とZk+上のUPS領域の型とが重複する確率が低いので、本実施形態の方法の方が従来の方法よりも多くの品種のニワトリに適用することが可能である。
【００４０】
本実施形態の方法を用いれば、簡便且つ低コストで雌系原種鶏の羽性遺伝子の型を均一にすることができる。また、本実施形態の方法は、雌系原種鶏のさらに親世代にあたる雌系原々種鶏に用いることもできる。
【００４１】
なお、本実施形態の方法において、識別領域であるUPS領域を増幅するためにPCR法を用いる例を説明したが、loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法などのPCR法以外の方法を用いてもよい。
【００４２】
また、羽性遺伝子を鑑別する際に増幅されたUPS領域同士を分離する方法としてゲル電気泳動以外の方法を用いてもよい。
【００４３】
なお、本実施形態の方法では、PCR用のプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いたが、プライマーの塩基配列は、これらに限られず、多型が見られるUPS領域を共通して増幅できる配列であればよい。つまり、ポリチミン配列の上流側部分にアニールするフォワードプライマーと、当該ポリチミン配列の下流側部分にアニールするリバースプライマーとの組み合わせであって、ZK及びZk+上の複数のUPS領域を共通に増幅できるプライマーセットであれば好ましく用いられる。
【００４４】
また、UPS領域を増幅できるプライマーセットを含む鑑別用キットを予め作製しておき、これを用いて羽性遺伝子型の鑑別を行ってもよい。
【実施例】
【００４５】
上述の実施形態に係る遺伝子型の鑑別方法（実施例）と、非特許文献２に記載された従来の鑑別方法（比較例）の適用範囲を確認するための検査を行った。実施例の方法では、日本鶏と外国鶏を含む３４品種、３９系統の識別領域の型を調べ、比較例の方法でも同様に、日本鶏と外国鶏を含む３４品種、３９系統について識別領域の型を調べた。
【００４６】
−実施例に係る方法−
まず、各ニワトリ個体の翼下静脈から血液を採取した。採取した血液の量は、雛で２００μL、成鶏で１mLであった。次に、１０μLの血液から、「DNeasy Blood & Tissue Kit 」（QIAGEN製）を用いてゲノムDNAを抽出した。
【００４７】
次に、抽出したゲノムDNA３０〜５０ngを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いてPCRを行った。
【００４８】
フォワードプライマーとリバースプライマーを５pmolずつ、DNAポリメラーゼ（「TaKaRa Ex Taq」（タカラバイオ製））を０．６２５unit含む反応液（２５μL）を９４℃２分で処理した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。その後、反応液を１２℃で保持した。
【００４９】
次に、２５μLのPCR産物に５μLの６×Blue/Orange Loading Dye（プロメガ製）を加え、このうち１５μLをゲル電気泳動に用いた。ここでは、低分子量DNA用ポリアクリルアミドゲル（「SuperSep（登録商標） DNA 15%、17ウェル」（和光純薬製）を用い、２０mAで９０分間電気泳動を行った。DNAマーカーとして６μLの「10bp DNA Step Ladder」（和光純薬製）を用いた。
【００５０】
電気泳動後、ゲルを取り出し、「GelRed」（登録商標；和光純薬製）を用いてDNA染色を行った。３０分間染色を行った後、撮影装置（「WSE-5200 Printgraph 2M」（ATTO製））を用いてゲルを撮影した。この電気泳動の結果から、各試料のZ染色体が持つUPS領域の型を判定した。
【００５１】
−比較例に係る方法−
実施例に係る方法と同様の手順で雛又は成鶏から血液を採取し、この血液からゲノムDNAを抽出した。次いで、このゲノムDNAを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRを行うことにより、ZK及びZk+においてOR配列を増幅せず、UR配列のみを増幅する（図２参照）。
【００５２】
この比較例に係る方法は、Z染色体上の遅羽遺伝子と連鎖する上述のev-21をマーカーとして利用する方法である。ORはZ染色体において、ev-21が挿入された領域であり、URはORと共通する配列を有するが、ev-21が挿入されていない領域である。URがZKとZk+の両方に存在し、且つZK上のURとZk+上のURとで塩基配列の多型が見られる場合、増幅されたUR配列のDNA断片を制限酵素HaeIII又はMbo Iで処理することで、ZKとZk+とを識別することが期待される。
【００５３】
フォワードプライマー：5'-AATGGTACTACAGAGAAGGTAGGAATATC-3' （配列番号９）
第１のリバースプライマー：5'-GTAAGACTAACACAGTATTCTCGAGT-3' （配列番号１０）
第２のリバースプライマー：5'-CCTAGAACACTGGACATGGTATGATATCTCAGCC-3' （配列番号１１）
ここでは、フォワードプライマーと第１のリバースプライマーとのセットを用いる場合と、フォワードプライマーと第２のリバースプライマーとのセットを用いる場合との両方を行った。第２のリバースプライマーは第１のリバースプライマーよりもZ染色体の下流側にアニールする。
【００５４】
次に、フォワードプライマーと第１のリバースプライマーとのセットを用いた場合にはPCR産物を制限酵素HaeIIIで処理し、フォワードプライマーと第２のリバースプライマーとのセットを用いた場合にはPCR産物をMboIで処理してもよい。URを含む領域の型によって、PCR産物におけるHaeIIIの切断部位の有無、及びMbo Iの切断部位の有無が異なることから、これらのサンプルを２%アガロースゲルを用いて電気泳動し、制限酵素による切断パターンを比較することで、鑑別が可能となる。
【００５５】
ここでは、フォワードプライマーと第１のリバースプライマーとのセットを用い、UR領域を増幅し、その塩基配列を決定することで、制限酵素（Hae III、及びMbo I）による処理を行うことなくこれらの制限酵素の切断サイトの有無を検査、比較した。
【００５６】
−検査結果−
図６は、実施例に係る方法による検査結果を示す図である。日本鶏の結果は図６の左側に記載し、外国鶏の結果は同図の右側に記載した。同図において、横斑プリマスロックAと横斑プリマスロックBは、同じ品種であるが異なる系統であることを示し、白色プリマスロックA、白色プリマスロックB及び白色プリマスロックCは、白色プリマスロックの相異なる系統を示し、白色レグホーンA、白色レグホーンBは、白色レグホーンの相異なる系統を示し、ロードアイランドレッドA、ロードアイランドレッドBは、ロードアイランドレッドの相異なる系統を示す。
【００５７】
また、各品種の速羽遺伝子k+で見られたUPS領域の型を表１に示した。各品種の遅羽遺伝子Kで見られたUPS領域の型を表２に示した。なお、表１に示す日本鶏の２０品種は、図６の左側に示す日本鶏から速羽遺伝子k+を持たないインギーを除いた品種を意味している。また、表１に示す外国鶏の１２品種とは、１つの品種の異なる系統は１品種として数えるとともに、速羽遺伝子k+を持たない品種ライトサセックスを除いた品種の数を意味している。
【００５８】
【表１】
2018023307.tif 000003
【００５９】
【表２】
2018023307.tif 000004
【００６０】
図６及び表１、２に示すように、速羽遺伝子k+では塩基数の相異なる６種類のUPS領域（a型、b型、c型、d型、e型及びf型）が見られ、遅羽遺伝子Kでは５種類の組み合わせの型（a-a型、a-b型、a-c型、a-e型及びc-e型）が見られた。どの型のUPS領域を持っているかは、品種ごとに異なっていた。
【００６１】
表１に示すように、日本鶏の速羽遺伝子においてはc型のUPS領域が最も多く見られ、次いでb型のUPS領域が多く見られた。外国鶏においてもc型のUPS領域が最も多く見られ、次いでb型のUPS領域が多く見られた。しかし、外国鶏では、日本鶏に比べてe型のUPS領域が多く見られ、a型、d型のUPS領域は見られなかった。
【００６２】
表２に示すように、遅羽遺伝子K上にUPS領域が見つかった１３品種のうちでは、a-e型を示す品種が７６％と最も多く、次いでa-b型を示す品種が１５％と多かった。
【００６３】
表３には、実施形態に係る鑑別方法を適用できる速羽遺伝子k+と遅羽遺伝子Kとの組み合わせの割合を示す。
【００６４】
【表３】
2018023307.tif 000005
【００６５】
上述のように、実施形態に係る鑑別方法は、速羽遺伝子上のUPS領域と遅羽遺伝子上のUPS領域とで塩基数が重複しない場合に適用できる。このため、表３に示すように、例えばa-a型の遅羽遺伝子を持つ品種を、a型以外の速羽遺伝子を持つ品種と掛け合わせる場合に、本実施形態の鑑別方法を適用することができる。a-a型の遅羽遺伝子を持つ品種であれば、速羽遺伝子にUPS領域を持つ日本鶏のうち９０％（１８品種）、外国鶏のうち１００％（１２品種）と掛け合わせる場合に本実施形態の鑑別方法が適用できることになる。
【００６６】
表３に示すように、a-e型の遅羽遺伝子を持つ品種が最も多かったが、この場合には、速羽遺伝子にUPS領域を持つ日本鶏のうち８５％（１７品種）、外国鶏のうち５８％（７品種）と掛け合わせる場合に本実施形態の鑑別方法が適用できることになる。
【００６７】
図７は、比較例に係る方法により検査した場合に見られるUR配列のハプロタイプを示す図である。図８は、比較例に係る方法による検査結果を示す図である。
【００６８】
図７に示すように、比較例に係る検査方法によれば、増幅されたDNA断片にMboIとHae IIIの切断部位が含まれるか否かによって、UR配列のハプロタイプはA型、B型、C型の３種類に分けられることが確認できた。具体的には、Mbo Iの切断部位とHae IIIの切断部位の両方を持たないUR配列の型をA型、Mbo Iの切断部位とHae IIIの切断部位の両方を持つUR配列の型をB型、Hae IIIの切断部位のみを持つUR配列の型をC型と分類した。
【００６９】
各品種の速羽遺伝子k+で見られたUR配列の型を表４に示した。各品種の遅羽遺伝子Kで見られたUR配列の型を表５に示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
【表５】
2018023307.tif 000007
【００７２】
表４に示すように、速羽遺伝子にUR配列を含む日本鶏のうち８５％がB型であり、４５％がC型であった。一方、速羽遺伝子にUR配列を含む外国鶏のうち７５％がC型であり、６７％がB型であった。
【００７３】
これに対し、表５に示すように、遅羽遺伝子にUR配列を含む品種のうち６２％がC型のUR配列を有しており、３８％がA型のUR配列を有していた。
【００７４】
表６には、比較例に係る鑑別方法を適用できる速羽遺伝子k+と遅羽遺伝子Kとの組み合わせの割合を示す。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
比較例に係る鑑別方法を適用できるのは、速羽遺伝子上のUR配列の型と遅羽遺伝子上のUR配列の型とが重複しない場合である。表６に示すように、最も多くの品種で遅羽遺伝子Kに見られるUR配列の型はC型であるが、この場合、速羽遺伝子を持つ日本鶏の５５％（１１品種）、外国鶏の２５％（３品種）と掛け合わせる場合にしか比較例に係る鑑別方法を適用できない。
【００７７】
遅羽遺伝子Kに見られるUR配列の型がA型であれば、速羽遺伝子を持つ日本鶏の９０％（１８品種）、外国鶏の９２％（１１品種）と掛け合わせる場合に比較例に係る鑑別方法を適用できるが、A型のUR配列を遅羽遺伝子上に持つ品種の割合は３８％とかなり少ない。
【００７８】
以上の結果から、実施形態に係る鑑別方法と、従来の鑑別方法とを比べた場合、実施形態に係る方法の方が適用できる可能性が高いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
以上説明したように、本明細書に開示された羽性遺伝子型の鑑別方法は、目視では鑑別できない遅羽性雄のホモ型とヘテロ型とを鑑別するのに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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