(57)【要約】【課題】ボトリオコッセンの定量による産生物を基としてのボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法に代わる、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法を提供すること、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法を提供すること。【解決手段】分析操作に手間がかかるボトリオコッセンの直接定量を行うことなく、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出を行うために、ボトリオコッセン合成経路においてSSL1/SSL3が係わるボトリオコッセン合成工程を幾つかの工程に分けて段階的に改良した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（squalene synthase-like、SSL）酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）遺伝子及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させるSSL3遺伝子変異体を有する宿主細胞（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを親（出発原材料）として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域に変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、1-gen変異体の色素蓄積量との比較で色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する宿主細胞（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）工程（２）で得られた2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入し、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
（３）の工程が、野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、3-gen変異体を取得する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（２）の工程において、ボトリオコッセンに対するスクアレンの産生比率が高まることによって色素蓄積量が増加した宿主細胞を除去する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
エラープローンPCR（Error-prone PCR）により変異プラスミド・ライブラリーを作製する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
3-gen変異体が野生型のSSL3遺伝子においてSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に変換されたF137L変異をコードする核酸配列で置換された変異のみを持つSSL3遺伝子を持つ宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ボトリオコッセン合成能を促進させるSSL酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、黄色色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL3遺伝子であって、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異であるSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異を少なくとも導入されたSSL3遺伝子を有する大腸菌（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを出発原材料として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、1-gen変異体の黄色色素蓄積量との比較で黄色色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する大腸菌（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する大腸菌（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法と組み合わせて、次の工程として3-gen変異体を培養する工程を含む、ボトリオコッセンの製造方法。
【請求項８】
SSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異のみを持つ、SSL3変異体。
【請求項９】
請求項８に記載のSSL3変異体を発現する宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、ボトリオコッセンの製造方法。
【請求項１１】
宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母、藻類のいずれかである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクアレン合成酵素様（Squalene Synthase-Like、以下、SSLと略称する場合もある。）酵素変異体の作出方法、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及び該スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法の発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核藻類ボトリオコッカスの一種ボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が高濃度に蓄積するトリテルペノイドとして、ボトリオコッセン（Botryococcene）がある。トリテルペノイドはC30の分子骨格を持つイソプレノイドの総称であり、大きく、カロテノイドとステロイドの２つに分類される。
【０００３】
ボトリオコッセンは、良質な次世代燃料としての利用価値が注目を浴びている。また、ボトリオコッカスのレース（Race）によっては、その末端を部分環化した特殊な構造の炭化水素を蓄積するものも知られており、該特殊な構造に拠る特徴的な物性のボトリオコッセンを発現するボトリオコッカスの存在も期待し得る。
【０００４】
ボトリオコッセンの生合成機構は、カロテノイドやスクアレン（Squalene）の生合成機構と類似している。ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、２分子のファルネシル二リン酸（Farnesyl diphosphate、以下、FPPと略すこともある。）を縮合させて、中間体であるプレスクアレン二リン酸（Presqualene diphosphate、以下、PSPPと略すこともある。）を生じる第１反応工程が共通する。ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、第２反応工程の途中のプレスクアレン二リン酸からピロリン酸脱離によって生じたカルボカチオンのクエンチング過程後の反応が相違し、ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの最終産物が作り分けられる（図１）。
【０００５】
ボトリオコッセン（以下、BOと略すこともある。）の生合成では、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)からプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程をスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）が触媒し、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる第２反応工程をスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）が触媒する（図１）。
【０００６】
ボトリオコッカス ブラウニーレースBからスクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子が単離され、SSL1及びSSL3の両遺伝子の共発現が効率のよいボトリオコッセン生合成を示すことが報告されている（非特許文献１）。
【０００７】
プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレン（以下、SQと略すこともある。）が合成される反応はスクアレン合成酵素（SQS）が触媒する（図１）。デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）は、スクアレンを基質としてデヒドロスクアレン（DSQ）を産生する（非特許文献２、図１）。
黄色ブドウ球菌由来のデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）は、スクアレンを色素（ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）／ジアポリコペン(Diapolycopene)）に直接変換できる（非特許文献３）。
【０００８】
上述のとおり、SSL3は、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる反応工程を触媒する（図１）。ここで、SSL3の２つのアミノ酸置換（N171A及びG207Q；番号はGenBank アクセッション番号: HQ585060.1で特定されるSSL3のアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定するものであり、番号の前後のアルファベットはアミノ酸の１文字表記であり、番号の前に記載のアミノ酸から番号の後に記載のアミノ酸に置換されたものを意味する。）によって、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンにほぼ完全に変換できることが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、SSL3におけるN171AまたはG207Qのそれぞれの単一のアミノ酸置換では、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンへの完全変換は起こらない（非特許文献４）。このように、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンに変換できるアミノ酸変異を有するSSL酵素変異体を得ることは容易ではない。
【０００９】
ボトリオコッセンは安定な炭化水素化合物であり、有機溶媒抽出でほぼ定量的に細胞からボトリオコッセンを取り出すことができる。しかし、ボトリオコッセンを直接検出・定量するためには、他のトリテルペノイド類と同様に、ガスクロマトグラフィー等を利用した手間のかかる分析操作が必要となる。そのため、ボトリオコッセン合成活性の高いSSL1及びSSL3（以下、SSL1/SSL3ということもある。）を従来のボトリオコッセンの定量を行いつつスクリーニングすること又は作出することは困難である。これが、SSL1/SSL3の活性改良などの試みを阻んできた最大の理由である。
【００１０】
ボトリオコッセンの結晶構造の取得とそれに立脚した機能改良の努力が世界各国で行われているが、良好な回析像（diffractionイメージ）が取れないなどの理由から、未だにその成功例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Niehaus, T.D., Okada, S., Devarenne, T.P.,Watt, D. S., Sviripa, V., and Chappell, J. Identification of unique mechanisms for triterpene biosynthesis in Botryococcus braunii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 108, 12260-12265. (2011)
【非特許文献２】Furubayashi M, Li L, Katabami A, Saito K,Umeno D. Directed evolution of squalene synthasefor dehydrosqualene biosynthesis. FEBS Lett 588, 3375-3381 (2014)
【非特許文献３】Furubayashi M, Li L, Katabami A, SaitoK, Umeno D, Construction of carotenoid biosynthetic pathways using squalene synthase. FEBS Lett., 588, 436-442 (2014)
【非特許文献４】Bell SA, Niehaus TD, Nybo SE, Chappell J. Structure-functionmapping of key determinants for hydrocarbon biosynthesis by squalene andsqualene synthase-like enzymes from the green alga Botryococcus braunii race B. Biochemistry 53(48): 7570-7581 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、ボトリオコッセンの定量による産生物を基としてのボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法に代わる、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法を提供すること、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、分析操作に手間がかかるボトリオコッセンの直接定量を行うことなく、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出を行うために、ボトリオコッセン合成経路においてSSL1/SSL3が関わるボトリオコッセン合成工程を幾つかの工程に分けて段階的に改良することにより、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は以下からなる：
１．  ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（squalene synthase-like、SSL）酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）遺伝子及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させるSSL3遺伝子変異体を有する宿主細胞（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを親（出発原材料）として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域に変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、1-gen変異体の色素蓄積量との比較で色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する宿主細胞（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）工程（２）で得られた2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入し、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
２．  （３）の工程が、野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、3-gen変異体を取得する工程である、前項１に記載の方法。
３．  （２）の工程において、ボトリオコッセンに対するスクアレンの産生比率が高まることによって色素蓄積量が増加した宿主細胞を除去する工程をさらに含む、前項１又は２に記載の方法。
４．  エラープローンPCR（Error-prone PCR）により変異プラスミド・ライブラリーを作製する、前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．  3-gen変異体が野生型のSSL3遺伝子においてSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に変換されたF137L変異をコードする核酸配列で置換された変異のみを持つSSL3遺伝子を持つ宿主細胞である、前項１に記載の方法。
６．  ボトリオコッセン合成能を促進させるSSL酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、黄色色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL3遺伝子であって、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異であるSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異を少なくとも導入されたSSL3遺伝子を有する大腸菌（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを出発原材料として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、1-gen変異体の黄色色素蓄積量との比較で黄色色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する大腸菌（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する大腸菌（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
７．  前項１〜６のいずれか１項に記載の方法と組み合わせて、次の工程として3-gen変異体を培養する工程を含む、ボトリオコッセンの製造方法。
８．  SSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異のみを持つ、SSL3変異体。
９．  前項８に記載のSSL3変異体を発現する宿主細胞。
１０．  前項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、ボトリオコッセンの製造方法。１１．  宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母、藻類のいずれかである、前項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、分析操作に手間がかかるボトリオコッセンの直接定量を行うことなくボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体をスクリーニングすること又は作出することが可能となり、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】トリテルペノイド（ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレン）の生合成経路を示す図である。
【図２】３段階を経るボトリオコッセンを効率よく生合成するスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を作出する工程を示す。
【図３】SSL3ライブラリのスクリーニング方法を示す。（ａ）原理、（ｂ）模式図、（ｃ）取得した変異体のスペクトルの例示
【図４】野生型SSL3およびその変異体、またtSQSをCrtNと共に細胞内に発現させた場合の色素合成量
【図５】SSL1/SSL3のみの発現によるボトリオコッセンの大腸菌内蓄積
【図６】第１世代（１−ｇｅｎ）SSL3変異体の遺伝子変異解析
【図７】第２世代（２−ｇｅｎ）SSL1/SSL3変異体の活性スクリーニング （ａ）スクリーニング操作と原理、（ｂ）コロニー色
【図８】１−ｇｅｎ変異体、２−ｇｅｎ変異体のカロテノイド蓄積量
【図９】得られた変異体の遺伝子変異解析
【図１０】pET-SSL1、pET-SSL3plasmid発現後のWestern blotting（株：BL21(AI)）
【図１１】SSL3のF137の位置をhSQS結晶構造（PDB:3WEG）を鋳型として作ったSSL3のSwiss model上にマッピング（黒色：基質ポケット）したものを示す
【図１２】１−ｇｅｎ変異体、２−ｇｅｎ変異体、３−ｇｅｎ変異体の生産物解析結果
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法の発明に関する。
【００１８】
ボトリオコッセンとは、C30の分子骨格を持つイソプレノイドであるトリテルペノイドの一種である。藻類ボトリオコッカスの一種ボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）がボトリオコッセンを生合成し、高濃度にボトリオコッセンを蓄積することが知られている。
トリテルペノイドであるボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、類似しており、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程が共通する。一方、第２反応工程の途中の中間体であるプレスクアレン二リン酸からピロリン酸脱離によって生じたカルボカチオンのクエンチング過程後の反応が相違し、ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレン(SQ)の最終産物が作り分けられる。
「ボトリオコッセンを選択的に蓄積する」とは、トリテルペノイドの生合成において、スクアレン (SQ)の生産が殆どみられず、ボトリオコッセンが生産されていることを意味する。
【００１９】
ボトリオコッセンの生合成では、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程をスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）が触媒し、中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる第２反応工程をスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）が触媒する。本明細書において、スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）はボトリオコッセン合成酵素ともいう。
スクアレン合成酵素様（squalene synthase-like、SSL）酵素は、ボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が保持するスクアレン合成酵素(BSS)に類似した酵素をコードする３つの遺伝子として見出されたものであり、スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）、スクアレン合成酵素様酵素２（SSL2）、及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）からなる（非特許文献１）。
【００２０】
本明細書において、「スクアレン合成酵素様（SSL）酵素」の範囲には、ボトリオコッセン生合成の各過程に係わるボトリオコッセン合成酵素のいずれも含まれる。また、ボトリオコッセン合成酵素は、酵素活性等のその基本的な性質が阻害されない限りにおいて、そのアミノ酸配列のＮ末端側やＣ末端側に別のタンパク質等、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドが付加されたものであってもよい。ボトリオコッセン合成酵素は、各種生物内に有している天然の酵素であってもよいし、変異体であってもよい。「（組換え）スクアレン合成酵素様(SSL)酵素変異体」とは、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素がそのタンパク質の一部のアミノ酸残基の置換、欠失、付加等により変異したタンパク質の概念である。
このようなSSL変異体としては、SSL1変異体、SSL3変異体が挙げられ、SSL3変異体の具体例としては、アミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異のみを持つSSL3変異体がある。
【００２１】
本明細書において、置換変異の起こったアミノ酸残基を「F137L」のように、アミノ酸一文字表記と番号との組み合わせによって表現する。
本明細書において、該番号は配列表の配列番号又はGenBank等のアクセッション番号等で特定されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定するものである。番号の前後のアルファベットはアミノ酸の１文字表記であり、番号の前に記載のアミノ酸から番号の後に記載のアミノ酸に置換された変異であることを意味する。
【００２２】
本明細書では、慣例に従い、以下の通り、各アミノ酸を１文字又は３文字で表記することがある。すなわち、アラニン：A又はAla、アルギニン：R又はArg、アスパラギン：N又はAsn、アスパラギン酸：D又はAsp、システイン：C又はCys、グルタミン酸：E又はGlu、グルタミン：Q又はGln、グリシン：G又はGly、ヒスチジン：H又はHis、イソロイシン：I又はIle、ロイシン：L又はLeu、リジン：K又はLys、メチオニン：M又はMet、フェニルアラニン：F又はPhe、プロリン：P又はPro、セリン：S又はSer、トレオニン：T又はThr、トリプトファン：W又はTrp、チロシン：Y又はTyr、バリン：V又はVal、として表記することがある。
【００２３】
（組換え）SSL酵素変異体には、SSL酵素タンパク質の一部のアミノ酸残基の置換、欠失、付加等による変異によりその酵素活性、基質特異性、および安定性等の性質に変化が生じるものがある。これに対し、変異させていないSSL酵素を野生型のSSL酵素という。
【００２４】
本明細書において、SSL1及びSSL3をコードする遺伝子をそれぞれSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子という。「SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子の変異体」とは、SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加等により変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。また、SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子は、その機能、例えばコードするタンパク質の発現や、発現されたタンパク質の機能が阻害されない限りにおいて、そのＤＮＡの５’末端側や３’末端側に、別のタンパク質をコードする遺伝子、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドをコードする遺伝子が付加されたものであってもよい。
【００２５】
SSL酵素変異体は、変異を導入する目的のSSL酵素遺伝子が挿入された変異プラスミド・ライブラリーを構築するライブラリ化を行い、該プラスミド・ライブラリーから、宿主細胞において酵素活性、発現量または安定性が高い変異体を選択することにより取得できる。SSL酵素変異体の作製および変異プラスミド・ライブラリーの構築は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実施することができる。
例えば、変異プラスミド・ライブラリーの構築はエラープローンPCR（Error-prone PCR）を用いてランダム変異を導入することにより行うことができる。エラープローンＰＣＲのプロトコールとしてはSaviranta et al. 1998が挙げられる。
【００２６】
野生型のSSL1遺伝子とは、配列番号1に示される核酸配列からなる遺伝子をいう。野生型のSSL1遺伝子がコードするタンパク質とは、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００２７】
野生型のSSL3遺伝子とは、配列番号3に示される核酸配列からなる遺伝子をいう。野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質とは、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
SSL3遺伝子は、SSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異が部位特異的に導入されたものであってもよい。
【００２８】
「野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入」するとは、例えば、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号4の２７番目のアミノ酸リジン（K）が、突然変異の導入によりアミノ酸アルギニン（R）に置換されている突然変異が導入されたSSL3遺伝子がコードするタンパク質の場合、当該突然変異が導入されたSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の２７番目の突然変異アルギニン（R）を野生型の対応する２７番目のアミノ酸リジン（K）で再度置換する変異を導入することを意味する。
また、野生型のアミノ酸配列と突然変異型のアミノ酸配列を決定し、同一又は類似のアミノ酸が同じ位置になるようにそれぞれのアミノ酸配列を並べるアライメントを行い、野生型のアミノ酸と対応する突然変異型のアミノ酸を決定することができる。
【００２９】
「対応するアミノ酸」とは、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列又は構造的類似性に基づきアミノ酸配列を整列させたときに、タンパク質における類似の位置を占有するアミノ酸をいう。タンパク質のアミノ酸配列又は構造的類似性に基づきアミノ酸配列を整列させるアライメントツールは当業者に既知である。例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）を利用することができる。満足なアライメントを生成するために、いずれかの配列にギャップを導入することができることは当業者によく知られている。
【００３０】
「類似のアミノ酸」は、類似の特性、例えば極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷又はサイズを有する。類似のアミノ酸は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；リジン、アルギニン及びヒスチジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グリシン、アラニン及びセリン；トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びメチオニンである。当業者は、例えば配列類似性検索ツール（www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html）を利用することができる。
【００３１】
スクアレン合成酵素（SQS）は、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程、中間体であるPSPPから最終産物であるスクアレンが生成される第２反応工程の２段階の工程で触媒として機能する。ボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）から単離されたスクアレン合成酵素（BSS）は、スクアレン合成に機能するものの、ボトリオコッセンの合成には機能しない。
本明細書において、サーモシネココッカス(Thermosynechococcus elongatus)由来のスクアレン合成酵素(SQS)をtSQSと称する。
【００３２】
本発明で用いられるベクターは、好ましくは発現ベクターである。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。具体的には、大腸菌では、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ、およびｐＡＣＹＣ１８４等を、枯草菌ではｐＹＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ  ＤＮＡ等を、酵母では、ｐＲＳ３０３、ＹＥｐ２１３、ＴＯｐ２６０９等を挙げることができる。ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を有する核酸を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を有する核酸を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を有する核酸を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列を有する核酸に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００３３】
本発明で用いられる色素は、スクアレン合成経路を経由して生合成される色素およびその誘導体であり、色素合成に関与する酵素の基質がスクアレン合成酵素の基質と共通する色素であれば制限されない。例えば、色素は、カロテノイドの１種であるジアポニューロスポレン（黄色）及びジアポリコペン（赤色）が挙げられる。色素合成量の増加による色の変化の視認性が良い色素が好ましい。色素合成に関与する酵素の変異体により生成された色素も好ましい。ジアポニューロスポレン（黄色）及び／又はジアポリコペン（赤色）の色素が宿主細胞で生成され、色素蓄積量の増加により目視又は視認される。
【００３４】
ジアポフィトエン脱水素酵素（CrtN）は、ジアポフィトエンを基質として、ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）を合成する。黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子は黄色ブドウ球菌 S.aureus (ATCC 35556) ゲノムから入手することができ、遺伝子の置換は種々の部位特異的変異法により行うことができる。野生型のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）は黄色の色素ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）を主に合成するが（Raisig, A. et al.; Biochim Biophys Acta1533, 164-170 (2001)）、CrtN変異体は、赤色のジアポリコペン(Diapolycopene)を合成する。
【００３５】
デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドとは、CrtN遺伝子を発現するプラスミドを意味する。CrtN発現プラスミドは、CrtN遺伝子に加え、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子を発現するように組み合わせてもよい。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）はイソペンテニル二リン酸（IPP）をジメチルアリル二リン酸（DMAPP）に異性化する酵素である。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）を導入した場合は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）を導入していない場合に比べて、カロテノイドの生産量が増加する。
CrtN発現プラスミドには、例えば、pAC-CrtN-idiが用いられる。pAC-CrtN-idi は、CrtN遺伝子及びidi遺伝子を含む大腸菌発現用プラスミドである。具体的には、土壌細菌（Pantoeaananatis, DSM30080）のゲノムから CrtN遺伝子をPCR増幅し、lacP/O下流において大腸菌用発現プラスミド（pAmod）に組み込み pAC-CrtNを得た。このpAC-CrtNに大腸菌ゲノムからPCR増幅したidiをlacP/O下流において組み込み 、pAC-CrtN-idiを得た。
【００３６】
本明細書において、「1-gen変異体」とは、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子は、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたものであればよく、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異がさらに導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含んでもよい。1-gen変異体は、SSL3の生産物特異性がスクアレンにシフトした変異体であり、CrtNの活性によって、色素を蓄積する。1-gen変異体は、SSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を有している。1-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の1gen-m2(1gM2)、1gen-m8(1gM8)、1gen-m12(1gM12)が挙げられる。
【００３７】
本明細書において、「2-gen変異体」とは、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子（1-gen変異体が有するSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子）を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。2-gen変異体は、全体活性（BO+SQ＋それ以外）の促進したSSL1/SSL3、安定性や異種発現性の促進したSSL1/SSL3を有するものであることが期待される。2-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の2gen-m1(2gM1)、2gen-m2(2gM2)、2gen-m3(2gM3)、2gen-m4(2gM4)、2gen-m5(2gM5)、2gen-m6(2gM6)が挙げられる。
【００３８】
1-gen変異体が持つSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異は、例えば、図６に示すものが挙げられる。
【００３９】
2-gen変異体が持つ変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異は、例えば、図９に示すものが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、「3-gen変異体」とは、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。3-gen変異体は、2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入されたものである。
酵素の安定性や全体活性が促進せずとも、生産物のボトリオコッセンに対するスクアレンの産生比率が高まることによっても、黄色コロニーが得られることから、このような黄色コロニーを除去することによって、3-gen変異体を得ることが好ましい。
また、3-gen変異体は、野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、2-gen変異体が持つ変異のうち、1-gen変異体が持たない変異である、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入されたものであってもよい。
3-gen変異体は、2-gen変異体が持つ変異のうち、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入されたものであることから、ボトリオコッセンの生産量が純粋に高まることが期待される。
3-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の野生型のSSL3遺伝子にF137Lアミノ酸変異を導入することにより作製した変異体が挙げられる。
【００４１】
本発明で用いられる、宿主細胞は、色素合成可能なものであり、上記色素合成に関与する酵素により色素を生合成することができる宿主細胞であれば制限されない。天然の細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、藻類など）でも、遺伝子組換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blue（大腸菌株（XL1BLUE）ともいう）のようなクローニングに用いられる株、HB101やBL21などの遺伝子発現に用いられる株が挙げられる。
藻類には、真核藻類、ボトリオコッカスが含まれ、特にボトリオコッセンを天然に合成することで知られるボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が好ましい。
【００４２】
本発明で用いられる好ましい宿主細胞は、色素合成に関与する酵素遺伝子若しくはその変異体により形質転換されているか、又は該遺伝子若しくはその変異体を天然に発現する細胞である。黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された大腸菌が好ましい。また、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子が発現するように形質転換され、イソプレノイド経路が強化された大腸菌が好ましい。CrtN遺伝子とidi遺伝子またはそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
【００４３】
ベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
【００４４】
細菌を宿主細胞として用いる場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが例示できる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を例示できる。
【００４５】
酵母を宿主細胞として用いる場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。
【００４６】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を用いることができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示できる。
【００４７】
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４８】
宿主細胞の培養については、宿主細胞に適した公知の培地や条件下で培養する。例えば、大腸菌等の細菌であれば、固体培地においてコロニーを形成する条件下で培養を行う。
培地は、宿主細胞の培養に一般的に用いられるような成分が含まれるものでよい。
培養時の温度は特に限定されないが、大腸菌であれば、30〜37℃とするのが好ましい。培養時間も特に限定されないが、大腸菌であれば、形質転換により導入した遺伝子の発現から12〜72時間培養することが好ましく、24〜48時間培養することがさらに好ましい。
【００４９】
藻類の培養に必要な環境要因として、光、温度、栄養分、二酸化炭素が挙げられる。光の強度は目的生産物が効率よく産生される条件であればよい。藻類の培養液としては、藻類の培養に用いることができるものであればよく、Ｃ培地、ＡＦ-６培地などの藻類用の液体培地の他、液肥などを用いることもできる。
【００５０】
本発明の一態様は、３段階に分けたボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）変異体の作出方法である（図２）。
【００５１】
１．ボトリオコッセン合成酵素であるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の活性改良
スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子を大腸菌で共発現するプラスミドを構築した。当該構築されたプラスミドを大腸菌に導入したところ、ボトリオコッセンだけを選択的に蓄積していた（図２の(A)）。当該プラスミドコンストラクトを持つ大腸菌を親（出発原材料）として、以下に示すとおり、大きく３つの段階に分けてスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の活性改良を行った。
【００５２】
２．スクアレン合成を行うSSL3の変異体を含む１−ｇｅｎ変異体の取得（工程１）
SSL3遺伝子全域にエラープローンPCRを用いてランダム変異を導入（ランダム化）した。ライブラリ化されたプラスミド（pUC-SSL1-[SSL3]mut：ブラケットで囲んだ[SSL3]部分がランダム化されていることを示す）を、CrtN発現プラスミドを先に導入した大腸菌株（XL1BLUE）に追加導入した。得られた形質転換体それぞれにコロニーを形成させた。SSL3の生産物特異性がスクアレン（SQ）にシフトした変異体は、CrtNの活性によって、黄色色素（ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）（DNEU））を蓄積した（図２の(B)）。黄色コロニーは、スクアレン（SQ）合成能が促進したSSL3変異体をコードするプラスミドを持つ１−ｇｅｎ変異体であることが期待される。
【００５３】
３．スクアレン合成活性が促進したSSL1/SSL3の変異体を有する２−ｇｅｎ変異体の取得（工程２）
上記工程１で得られた１−ｇｅｎ変異体（第１世代）は、ボトリオコッセンに加えて、スクアレンを合成する。そして、合成されたスクアレンの蓄積量は色素量として視認することができる。そこで、この１−ｇｅｎ変異体を親（出発原材料）として使用し、SSL1-SSL3(mut)の２遺伝子全域にエラープローンPCRを実施して、ランダム変異を導入した。こうしてライブラリ化されたプラスミド（pUC-[SSL1-SSL3(1-gen)]mut：ブラケットで囲んだ[SSL1-SSL3(1-gen)]部分がランダム化されていることを示す）を、CrtN発現プラスミドを先に導入した大腸菌株（XL1BLUE）に再び導入し、親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体よりも黄色のより強いコロニーを探索した（図２の(C)）。色素蓄積量の促進した変異体クローンは、全体生産物（BO+SQ＋それ以外の生産物）の生産活性が促進したSSL1/SSL3変異体、安定性や異種発現性の促進したSSL1/SSL3変異体を含むプラスミドを持つ２−ｇｅｎ変異体であることが期待される。ここで、酵素の安定性や全体生産物の生産活性が促進してないにもかかわらず、生産物のSQ/BO比率が高まることによって、黄色のより強いコロニーが出現し得る。そこで、得られた２−ｇｅｎ変異体クローンの生産物のそれぞれに対してHPLC解析を行い、生産物のSQ/BO比率が高まることによって黄色がより強くなったコロニーを色素蓄積量の促進した変異体クローンから除外した。
【００５４】
４．ボトリオコッセン生産量が促進したSSL1/SSL3の変異体を有する３−ｇｅｎ変異体株の取得（工程３）
上記工程２で得られた２−ｇｅｎ変異体（第２世代）から、１−ｇｅｎ変異体で導入された生産物特異性がスクアレン（SQ）にシフトした特異性変換に関わる変異を除去し、すなわち、スクアレン（SQ）を合成しない野生型のアミノ酸に再置換し、３−ｇｅｎ変異体（第３世代）とした（図２の(D)）。工程１で得られた１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の変異が、全体活性に影響を与えず特異性のみを変更するものであれば、当該変異を除去して得られた３−ｇｅｎ変異体は、２−ｇｅｎ変異体で得られた活性変異のみを持つものであり、ボトリオコッセンの生産量が純粋に高まっているものであること期待される。
あるいは、この３−ｇｅｎ変異体（第３世代）は、野生型のSSL1/SSL3に、２−ｇｅｎ変異体株で見いだされた活性変異を導入したものとして作出してもよい。複数の活性促進変異が見いだされる場合、それらを組み合わせた変異を導入することにより、更なる活性の促進が期待し得る。
【００５５】
本発明の一態様は、ボトリオコッセン合成酵素を持つ宿主細胞を培養することにより、宿主細胞にボトリオコッセン生合成を行なわせ、ボトリオコッセンを製造する方法に関する。ボトリオコッセン合成酵素を持つ宿主細胞には、例えば、SSL3変異体を発現する宿主細胞が用いられる。宿主細胞は、好ましくは大腸菌を使用することができる。SSL3変異体を発現するボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）を使用してもよい。
【００５６】
本発明の一態様であるスクリーニング方法では、ジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された宿主細胞（例えば大腸菌）において、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体の機能により、野生型のスクアレン合成酵素様（SSL）酵素を持つ宿主細胞の色素蓄積量と比較したスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体による色素蓄積量の増加を指標として、目視又は視認によりボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を持つ宿主細胞をスクリーニングし取得することができる。
【００５７】
本発明の一態様は、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング用キットに関する。
本発明の一態様であるキットは、黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された細胞を含むものであり得る。当該細胞は、冷凍保存してバイアル内に封入したものが好適である。あるいは、本発明に係るキットは、所望の細胞を色素合成可能な細胞に形質転換するための黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子発現ベクターを構成要素として含むものであり得る。
さらに、上記本発明に係るキットは、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子を発現するベクター、ジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子発現ベクター、クローニング酵素セット、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子を増幅するためのプライマーセット、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリー、マイクロプレート、スクアレン合成経路及び／又はイソプレノイド経路の強化された菌株、培地や添加剤などのスクリーニングに有用な物質や器具（画像スキャナや測色光度計、色見本、コロニピッカー）などをキットの構成要素として加えることができる。
【００５８】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）およびスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子は株式会社デンソーにより取得された。スクアレン合成酵素様酵素変異体の作出は千葉大学により行われた。
【００６０】
１．スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）およびスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子の抽出
池から採集しAF-6培地で1か月培養したボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）株の中で、容器内で水面上に浮いた細胞をピペットで単離した。
単離したボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）株を1%CO2、蛍光灯の環境下においてAF-6培地中で培養し、増殖させた。増殖した藻体に抽出溶媒としてヘキサンを添加し、オイル成分を抽出した。GC-MSにて抽出したオイルを定性分析し、ボトリオコッセンを生産する株を選抜し、MH1株と名付けた。
MH1株は、1%CO2、25℃室温、光量150μmol photons/m2/secの環境下において1Lガラス培養瓶を用いてAF-6培地中で3週間培養した。培養開始から14日目の培養液を80mL回収しRNA抽出に用いた。
【００６１】
回収した培養液から細胞を集め、RNA抽出キット（QIAGEN社製のRNeasy Plant Mini Kit）を使用して、キットに付属のプロトコールに従ってRNA抽出を実施した。得られたRNAを用いて、シーケンスライブラリーキット（イルミナ社製TruSeq Small RNA Sample Prep Kit及びTruSeq RNA Sample Preparation Kit v2）を使用して、キットに付属のプロトコールに従ってシーケンスライブラリーを作製した。作製したシーケンスライブラリーを用いて、鋳型ＤＮＡの塩基配列を取得した。
【００６２】
シーケンスデータの解析により、リード数102,018,468個、解析鎖長10,201,846,800bpの塩基配列情報を得た。
シーケンスデータの解析には、イルミナ社のマニュアル（クラスター形成：cBot User GuideRev.J、TruSeq PE Cluster Kit v3 Reagent Preparation GuideRev.B；シークエンス解析：HiSeq 2000 User Guide Rev.M、TruSeq SBS Kit v3(200 Cycles) Reagent Preparation Guide Rev.B；データ処理：CASAVA v1.8 User Guide Rev.D）を参考に、イルミナ社の機器、試薬、ソフトウェア(クラスター形成：cBot、TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS；シークエンス解析：HiSeq 2000、TruSeq SBS Kit v3-HS(200 Cycles)；データ処理：HiSeq Control Software (HCS) v2.0.12、Real Time Analysis (RTA)v1.17.21、Consensus Assessment of Sequence And Veriation(CASAVA) v1.8.2)を使用した。
【００６３】
De novoアセンブリをソフトウェア（株式会社CLCバイオジャパン社製  CLC Genomics Workbench 6.5.1）を用いて行った。De novoアセンブリの条件は以下のとおりである：Ambiguous trim =Yes、Ambiguous limit = 0、Quality trim = Yes、Quality limit = 0.00035、Create report = Yes、Save discarded sequences= No、Remove 5' terminal nucleotides = No、Maximum number of nucleotides in reads = 1,000、Minimum number of nucleotides in reads = 97、Discard short reads = Yes、Remove 3' terminal nucleotides = No、Discard long reads = Yes、Save broken pairs=No
【００６４】
得られたコンティグをもとにBLAST Databaseを構築し、既知のshowa株由来のSSL1遺伝子（Genbankアクセッション番号:HQ585058.1）及びSSL3遺伝子（Genbankアクセッション番号:HQ585060.1）をクエリー配列とし、TBLASTXを用いた相同遺伝子検索を行った。その結果、それぞれの全長ORFとそれぞれ89％、87％の相同性を持つ、MHSSL-1（配列番号1）、MHSSL-3（配列番号3）の配列を得た。本明細書において、野生型のスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子は、それぞれ配列番号1及び配列番号3に示される配列を有するものである。
【００６５】
２．１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の作出（図２(B)）
野生型のスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子を大腸菌（XL1BLUE）で共発現するプラスミドコンストラクトを作製した。当該プラスミドコンストラクトを発現する大腸菌（XL1BLUE）を図１２において野生型（WT）として示す。
当該プラスミドコンストラクトの作製において、SSL1及びSSL3の２つの酵素遺伝子のC末端にHis-tag配列を挿入したものをpUC18Nmベクターにあるlacプロモーターの後ろにオペロンの状態で挿入した。SSL1はXbaI/XhoIサイトの間にSD配列（AGGAGG）の後ろにSSL1の配列をつけた状態で配置した。SSL3は、SD配列（AGGAGG）の後ろにあるSpeI/ApaIサイトの間に配置し挿入した。
【００６６】
使用したプラスミド
【表１】
2018198576.tif 000003
【００６７】
SSL3遺伝子(His-tag含まない塩基長1158 bp)にMn2+を用いたエラープローンPCR法によって遺伝子変異を導入した。
エラープローンPCRは以下の条件で行った。
His-tagを付加したSSL3遺伝子をpUC18発現ベクターで発現するように組み込んだpUC18m- MHSSL3hisを鋳型として用いた。
PCR反応には、NEB社のTaq polymerase 5 units、鋳型（pUC18m- MHSSL3his）15 ngを使用した。反応条件はdNTP濃度 0.2 mM、バッファ組成（1×Thermol pol. buffer：20 mM Tris-HCl（25℃でpH8.8）、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1% Triton（登録商標）X-100）、MnCl2の濃度は10μMおよび50μMであった。
増幅サイクルは、95℃で5分→（95℃で15秒、52℃で15秒、72℃で1分30秒）を25サイクル→72℃で10分とした。増幅率は1000倍であった。
使用したプライマーセットは、
Slic-MHSSL3-F：5'-CATCATCATCATtaaCTCGAGAGGAGGATTACAACTAGTATGAAACTGCGTGAAGTGCTGC-3'（配列番号5）
Slic-MHSSL3-R：5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3'（配列番号6）
である。
エラープローンPCR法において、Mn2+の最終濃度を10μM にしたものをSSL3-10、 Mn2+の最終濃度を50 μMにしたものをSSL3-50とした。CrtN遺伝子及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子を発現するプラスミド(pAC-CrtN-idi)を予め導入した大腸菌（XL1BLUE ）に、エラープローンPCR法によって得られたPCR産物をpUC18NmベクターのSpeI/ApaIサイトに挿入したライゲーション産物を形質転換し、１プレートあたり300〜500コロニー程度となるように、ニトロセルロース膜をのせたLB（carb. cm.）固体培地に散布した。
【００６８】
SSL3ライブラリおよびスクリーニングサイズ
【表２】
2018198576.tif 000004
【００６９】
上記コロニーを37℃で20 時間静置培養後、室温（約25 ℃）でさらに24 時間静置した。SSL3-10ライブラリおよびSSL3-50ライブラリから、それぞれ約5000個および約6000個のコロニーをスクリーニングした（表２）。色素の蓄積がみられるようになったコロニーが12個（SSL3-10ライブラリから10個、SSL3-50ライブラリから2個）得られた（図３(b)）。色素の蓄積がみられるようになったコロニーをピックアップし、48 deep well plateを用いて、2 mL LB(carb. cm.) 液体培地中で37℃にて一晩培養後、プラスミドを抽出した。
【００７０】
野生型のSSL3とCrtNを発現する大腸菌株（SSL3wt-CrtN）は色素の吸収スペクトルを有しないのに対して、得られた12個の１−ｇｅｎ変異体全てが、スクアレン合成酵素とCrtNを発現する大腸菌株（tSQS-CrtN）を用いた場合と同じような色素のスペクトルを示した（図３(c)）。これらの色素の蓄積量は、tSQS-CrtNと比較して約1/5程度であった（図４）。この比率は、野生型のSSL1及びSSL3を大腸菌内で単独発現させた場合のボトリオコッセンの合成量（〜0.7 mg/L）がtSQSを単独発現させた場合のスクアレン合成量（約3.4 mg/L）の約1/5であること（図５）と合致しており、野生型のSSL1及びSSL3の細胞活性は、十分改善の余地があることが示唆された。
【００７１】
得られた12個の１−ｇｅｎ変異体（M1〜M12）の、SSL3部分の遺伝型を決定した。Chappellらは、構造モデルをもとに、反応特異性に影響を与えそうな２つのアミノ酸残基の置換によって（N171A、G207Q）、SSL3の反応特異性をスクアレン(SQ)合成活性に変換することを示した（非特許文献４）。一方、本発明者らは、スクリーニングベースで、先入観なくスクアレン(SQ)合成能の促進した変異体をランダムサーチし、ボトリオコッセン合成酵素にスクアレン(SQ)合成能を賦与するアミノ酸置換があることを見出した。このアミノ酸変異はChappellらが標的にしていない新たな13個のスクアレン合成活性にシフトした変異を含むものである（図６、V50A、Y49C、Y49H、V151A、K154I、N171Y、F168L、A175V、F182C、N210D、I226L、F283L、P289L）。
【００７２】
３．２−ｇｅｎ変異体（第２世代）の作出（図２(C)）
上記得られた12個の１−ｇｅｎ変異体（M1〜M12）のプラスミド（pUC-lacP-SSL1wt-[SSL3]1g）を等モルずつプールしたものを親（出発原材料）とし、SSL1遺伝子及びSSL3変異体遺伝子の全領域にエラープローンPCRをかけた。
１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の変異体から得られたプラスミドを等モルで混ぜたものを鋳型として、エラープローンPCRは以下の条件で行った。
PCR反応には、NEB社のTaq polymerase 5 units、鋳型10 ngを使用した。反応条件はdNTP濃度 0.2 mM、バッファ組成（1×Thermol pol. buffer：20 mM Tris-HCl（25℃でpH 8.8）、10 mM(NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1% Triton（登録商標）X-100）、MnCl2の濃度は10 μMおよび50 μMであった。
増幅サイクルは、95℃で5分→（95℃で15秒、52℃で15秒、72℃で1分30秒）を25サイクル→72℃で10分とした。PCR増幅率は1000倍であった。
使用したプライマーセットは、
inF：5'-CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3'（配列番号7）
Slic-MHSSL3-R：5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3'（配列番号6）
である。
作製されたプラスミド・ライブラリーpUC-[SSL1his-SSL3his_1g]libをCrtN発現プラスミド(pAC-CrtN-idi)が予め導入された大腸菌（XL1BLUE）に形質転換し、LB培地上でコロニーを形成させた。形成させたコロニーから、プラスミド（pUC-lacP-SSL1wt-[SSL3]1g）を発現する親（出発原材料）（１ｇＭ１２）よりも色素の蓄積量が多くなるコロニーをスクリーニングした（図７（ａ））。約3000個のコロニーをスクリーニングした（表３）。
【００７３】
第２世代ライブラリ
【表３】
2018198576.tif 000005
【００７４】
結果、より色素の蓄積量が多いコロニーを６つ取得した（２ｇＭ１、２ｇＭ２、２ｇＭ３、２ｇＭ４、２ｇＭ５、２ｇＭ６、図７（ｂ））。これらを液体培地内で震蘯培養し、アセトン抽出画分をHPLC-PDA解析してジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）の極大吸収波長（470 nm）での吸光度を用いてカロテノイド生産量を決定した（図８）。
【００７５】
得られた６つの２−ｇｅｎ変異体を遺伝子解析した結果、親（出発原材料）とした１−ｇｅｎ変異体と得られた２−ｇｅｎ変異体の関係は、1gM2を親（出発原材料）とした変異体が３つ（2gM1、2gM2、2gM5）、1gM8を親（出発原材料）とした変異体が３つ（2gM3、2gM4、2gM6）であった。
【００７６】
得られた６つの２−ｇｅｎ変異体を遺伝子解析した結果、２−ｇｅｎ変異体で新たに追加された変異は６つすべてにおいてSSL1内部又はSSL1の翻訳開始配列に見つかった（図９）。この結果は、（１）SSL1がボトリオコッセン合成活性の律速になっていること、（２）SSL1にはSSL1遺伝子発現タンパクの翻訳量や発現タンパクの安定性（可溶性あるいはフォールディング効率）に改良の余地があること、（３）SSL1のC末端部位への変異導入によって比較的簡単にその安定性は向上し得ることを意味している。
【００７７】
このことを確認するために、実際に、SSL1wtとSSL3wtを、さまざまな効率の翻訳開始配列の下に配置し、それらを形質転換した大腸菌株のウェスタンブロッティングを行ったところ、SSL1の全画分と可溶性画分がSSL3より明らかに少なかった（図１０）。
【００７８】
総合すると、６つの２−ｇｅｎ変異体の殆どが、ボトリオコッセン合成活性の律速となっているSSL1のC末端の可溶性や発現量の向上させる変異によって、又は、SSL1の翻訳開始効率の向上によって、全体のボトリオコッセン生産量が向上したと推察される。なお、2gM3、2gM4、2gM5、2gM6に見られたRBS（ribosomalbinding site）の変異によって、RBS カリキュレータにより計算された翻訳開始効率（RBS score）に変化が見られなかったが、実際の発現量は上方制御されているものと思われる。
【００７９】
４．３−ｇｅｎ変異体（第３世代）の作出（図２(D)）
2gM3ではSSL3においてF137Lのアミノ酸変異が見いだされた。2gM3の持つSSL3におけるアミノ酸変異は、F137Lを除いて2gM4、2gM6の持つアミノ酸変異と同一であった。遺伝子解析の結果、2gM3、2gM4、2gM6はいずれも1gM8を親（出発原材料）とした変異体であった。
CrtN-idi共存条件下におけるカロテノイドの蓄積量が、2gM3＞2gM4 ＝ 2gM6となっていることから、SSL3のF137Lアミノ酸変異がカロテノイド蓄積量の差の原因と考えた。
SSL3のF137Lアミノ酸変異を、結晶構造が明らかになっているヒトスクアレン合成酵素(hSQS)の結晶構造上にマッピングした（図１１、使用したソフトはPymolである）。SSL3のF137Lアミノ酸変異は、hSQS結晶構造上の基質ポケット（黒色部分）と直接相互作用するヘリックス上には位置しないが、１世代目で導入されたと考えられるSSL3のスクアレン合成活性変異（A175V）アミノ酸が位置するヘリックスと隣り合うヘリックス上に位置し、Chappellら（非特許文献４）が示唆しているボトリオコッカス  ブラウニースクアレン合成酵素のSSL3反応に関わるアミノ酸A177と隣り合うことが分かった。
【００８０】
１−ｇｅｎ変異体、２−ｇｅｎ変異体の生産物解析結果を図１２に示す。
2gM2、2gM5は親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM2)と比較してスクアレン合成量は多くなってないものの、2gM2、2gM5では、デヒドロスクアレン（DSQ）の生産が確認された（図１２）。デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）にとってデヒドロスクアレン（DSQ）は天然基質である（図１）。このデヒドロスクアレン（DSQ）の生産量の違いが、親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM2)よりも2gM2、2gM5が色の濃いコロニーとなった理由と推察された。
2gM3、2gM4、2gM6はいずれも、それらの親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM8)よりボトリオコッセン、スクアレン(SQ)ともに生産量が増加していた。全体としての活性があがったものと思われる。その主な要因は、SSL1の翻訳開始効率の向上によるものであると推察されるが、特にF137L変異を持つ2gM3はデヒドロスクアレン（DSQ）／スクアレン(SQ)の増加が最も顕著であり、この変異は更なる活性促進をもたらしている要素である可能性が示唆される。
【００８１】
そこで、2gM3のSSL3に存在する３つのアミノ酸変異（K27R、F137L、A175V）について、それぞれの効果を調べるために、図１２に示すように点変異を有する#1〜#5 の変異体を作製し、それぞれのSSL3に存在するアミノ酸変異の効果を評価した。
各変異体は以下のとおりPCRにより点変異を導入することにより作製した。
#1は鋳型である2gM3のA175Vを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
#2は鋳型である1gM8にF137Lのアミノ酸置換変異を導入したものである。
#3は野生型のSSL3遺伝子の鋳型（pUC18m-MHSSL3his）にF137Lのアミノ酸置換変異を導入したものである。
#4は鋳型である2gM3のK27R 及びA175Vを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
#5は鋳型である2gM3のK27Rを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
PCR反応の組成は以下のとおりである：
KOD Plus neo TYB、KOD-401、使用量 1 U
反応条件はdNTP濃度0.2 mM、10 × KOD Plus neo bufferの組成は、60mM (NH4)2SO4、100mM KCl、1.2M Tris-HCl (25℃でpH 8.8)、1% Triton（登録商標）X-100、0.01% BSA、1.5mMMgSO4
増幅サイクルは、94℃で2min →（98℃で10秒 、68℃で2 min 30秒）を25サイクル → 68℃で10分とした。PCR増幅率は45倍であった（鋳型：100 ng、 最終収率： 4500 ng）。
上記各変異導入のためExSite-PCR法で以下の適切なプライマーセットを使用して増幅させ、Slic方法（Jeong 2013 AEM）を用いてクローニングを行った。
ssl3-R27-F：5'-ATGGCATTTCGTCGCAAACGTCGC-3' （配列番号8）
ssl3-R27-R：5'-GCGACGAAATGCCATCAGCATCATTTG-3'（配列番号9）
ssl3-V175-F：5'-TCACCAACAATGGTCCGGTGGCCAT-3'（配列番号10）
ssl3-V175-R：5'-GACCATTGTTGGTGAACGCGTACAG-3'（配列番号11）
ssl3-F137L-F：5'-CTGTCCAAACAGGACCAAGAACTTATC-3'（配列番号12）
ssl3-F137L-R：5'-GTCCTGTTTGGACAGTTTCAGAAATTCTTC-3'（配列番号13）
ssl3-A151-F：5'-GTATGAAACTGGGCAAAGAAATGACCGTGT-3'（配列番号14）
ssl3-A151-R：5'-TGCCCAGTTTCATACACATATCCGTGATAA-3'（配列番号15）
ssl3-L289-F：5'-TGTCTTTAAATTCTGCGCGGTGCCG-3'（配列番号16）
ssl3-L289-R：5'-CAGAATTTAAAGACACCTTCATCCCAAACCAG-3'（配列番号17）
【００８２】
３−ｇｅｎ変異体の生産物解析結果を図１２に示す
図１２の#3は、野生型のSSL3遺伝子に２−ｇｅｎ変異体において導入されたアミノ酸変異F137Lを導入することにより作製した３−ｇｅｎ変異体である。野生型と比較して、#3の３−ｇｅｎ変異体ではボトリオコッセン合成活性が増加した。そしてスクアレン(SQ)の蓄積は確認されなかった。
【００８３】
図１２の#2は、１−ｇｅｎ変異体(1gM8)にアミノ酸変異F137Lを導入した変異体である。当該変異体#2において、１−ｇｅｎ変異体(1gM8)に比べてスクアレン(SQ)、ボトリオコッセンの合成活性がともに増加した。この異なるアミノ酸変異を持つ両者においてアミノ酸変異F137Lは、単独で細胞活性を促進する変異であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の方法によれば、ボトリオコッセンの定量を行うことなくボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を作出することができる。本発明の方法により作出されるボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を発現する宿主細胞は、ボトリオコッセンを効率よく合成するのに有用である。すなわち、本発明により、良質な次世代燃料としてその利用価値が注目されるボトリオコッセンを効率よく合成することが可能となる。
【図１】
2018198576.tif 000006
【図２】
2018198576.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018198576.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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