(57)【要約】【課題】細胞における受容体の細胞膜内への移行状況を効率よく検出できる細胞情報取得方法および細胞情報取得装置を提供する。【解決手段】細胞情報取得方法は、細胞の細胞膜表面の受容体と、受容体に結合可能な結合物質と、を結合させるステップＳ１１の結合工程と、結合工程後に、細胞の細胞膜の透過処理を行うステップＳ１２の透過処理工程と、透過処理工程後に、標識物質により標識された結合物質を用いて、細胞膜内の受容体を標識するステップＳ１３の標識工程と、標識工程後に、細胞を含む試料を流路に流すステップＳ１４の工程と、流路を流れる試料に含まれる細胞に光を照射するステップＳ１５の工程と、細胞への光の照射により細胞中の標識物質から生じた光に基づく信号を取得するステップＳ１６の工程と、を含む。【選択図】図１
2018072095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の細胞膜表面の受容体と、前記受容体に結合可能な結合物質と、を結合させる結合工程と、
前記結合工程後に、前記細胞の細胞膜の透過処理を行う透過処理工程と、
前記透過処理工程後に、標識物質により標識された結合物質を用いて、前記細胞膜内の受容体を標識する標識工程と、
前記標識工程後に、前記細胞を含む試料を流路に流す工程と、
前記流路を流れる前記試料に含まれる前記細胞に光を照射する工程と、
前記細胞への光の照射により前記細胞中の前記標識物質から生じた光に基づく信号を取得する工程と、を含む、細胞情報取得方法。
【請求項２】
取得した前記信号に基づいて、前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報として、前記信号の波形の高さに関する情報を取得する情報取得工程をさらに含む、請求項１に記載の細胞情報取得方法。
【請求項３】
前記信号は、前記標識物質から生じた光に基づいて受光部により出力される電気信号である、請求項１または２に記載の細胞情報取得方法。
【請求項４】
前記細胞膜表面の受容体に結合した結合物質は、前記標識物質が生じる第１の波長の光とは異なる第２の波長の光を生じる標識物質により標識されており、
前記細胞への光の照射により、前記第２の波長の光に基づく信号を取得する、請求項１に記載の細胞情報取得方法。
【請求項５】
取得した前記第１の波長の光に基づく信号および前記第２の波長の光に基づく信号を用いて、前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報として、前記第１の波長の光に基づく信号の波形の高さに関する情報と前記第２の波長の光に基づく信号の波形の高さに関する情報との比または差分を取得する情報取得工程をさらに含む、請求項４に記載の細胞情報取得方法。
【請求項６】
取得した前記第１の波長の光に基づく信号および前記第２の波長の光に基づく信号を用いて、前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報として、前記第１の波長の光に基づく信号の波形の面積に関する情報と前記第２の波長の光に基づく信号の波形の面積に関する情報との比または差分を取得する情報取得工程をさらに含む、請求項４に記載の細胞情報取得方法。
【請求項７】
取得した前記第１の波長の光に基づく信号および前記第２の波長の光に基づく信号を用いて、前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報として、前記第１の波長の光に基づく信号の波形の幅に関する情報と前記第２の波長の光に基づく信号の波形の幅に関する情報との比または差分を取得する情報取得工程をさらに含む、請求項４に記載の細胞情報取得方法。
【請求項８】
前記第２の波長の光に基づく信号は、前記第２の波長の光を生じる標識物質から生じた光に基づいて受光部により出力される電気信号である、請求項４ないし７の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項９】
前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報を表示する表示工程をさらに含む、請求項１ないし８の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１０】
前記細胞における受容体の前記細胞膜内への移行状況を示す情報に基づいて、前記細胞ごとに、前記受容体の細胞膜内移行の有無を判定する判定工程をさらに含む、請求項１ないし９の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１１】
前記細胞は、前記受容体がターゲットとなる分子標的薬が投与された被検者から採取した血液中の細胞である、請求項１０に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１２】
前記判定工程において、前記移行状況を示す情報を所定の閾値と比較することにより、前記受容体の細胞膜内移行の有無を判定する、請求項１０または１１に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１３】
前記判定工程において前記細胞ごとに判定された前記受容体の細胞膜内移行の有無を表示する表示工程をさらに含む、請求項１０ないし１２の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１４】
前記判定工程において、前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の数を取得する、請求項１０ないし１３の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１５】
前記判定工程において取得された前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の数を表示する表示工程をさらに含む、請求項１４に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１６】
前記判定工程において、前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の数に基づいて、細胞外刺激の有無を判定する、請求項１４または１５に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１７】
前記判定工程において、前記受容体の細胞膜内移行の有無を判定した前記細胞のうち、前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の割合を取得する、請求項１０ないし１６の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１８】
前記判定工程において取得された前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の割合を表示する表示工程をさらに含む、請求項１７に記載の細胞情報取得方法。
【請求項１９】
前記判定工程において、前記受容体が前記細胞膜内へ移行した前記細胞の割合に基づいて、細胞外刺激の有無を判定する、請求項１７または１８に記載の細胞情報取得方法。
【請求項２０】
前記判定工程において判定された前記細胞外刺激の有無を表示する表示工程をさらに含む、請求項１６または１９に記載の細胞情報取得方法。
【請求項２１】
前記流路を流れる前記試料に含まれる前記細胞の画像を取得する工程をさらに含む、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の細胞情報取得方法。
【請求項２２】
細胞の細胞膜の透過処理を行う透過処理工程と、
前記透過処理工程後に、受容体に結合可能であり前記細胞膜内の生理環境において光を生じる標識物質により標識された結合物質を用いて、前記受容体を標識する標識工程と、
前記標識工程後に、前記細胞を含む試料を流路に流す工程と、
前記流路を流れる前記試料に含まれる前記細胞に光を照射する工程と、
前記細胞への光の照射により前記細胞中の前記標識物質から生じた光に基づく信号を取得する工程と、を含む、細胞情報取得方法。
【請求項２３】
前記標識物質は、前記細胞膜内のｐＨにおいて光を生じる、請求項２２に記載の細胞情報取得方法。
【請求項２４】
細胞の細胞膜表面の受容体および前記受容体に結合可能な結合物質を結合させ、前記結合物質が結合した前記細胞の細胞膜の透過処理を行い、前記透過処理がなされた前記細胞膜内の受容体を標識物質により標識された結合物質を用いて標識して試料を調製する試料調製部と、
前記試料を流すフローセルと、
前記フローセルを流れる前記試料に光を照射する光源と、
前記標識物質から生じた光を受光し、前記標識物質から生じた光に基づく信号を出力する受光部と、を備える、細胞情報取得装置。
【請求項２５】
前記試料調製部は、前記細胞膜表面の受容体を前記標識物質が生じる第１の波長の光とは異なる第２の波長の光を生じる標識物質により標識し、
前記受光部は、前記第２の波長の光を受光し、前記第２の波長の光に基づく信号を出力する、請求項２４に記載の細胞情報取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞情報取得方法および細胞情報取得装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜表面に存在する種々の受容体（レセプター）は、神経伝達物質、ホルモン、細胞増殖因子といった対応する物質（リガンド）が特異的に結合することにより、細胞内へとシグナルを伝達する。細胞膜表面の種々の受容体において、リガンドと結合しシグナルを伝達した後、複合体を形成して細胞膜内に移行する受容体があることが知られている。細胞における受容体の細胞膜内移行の有無を解析することにより、リガンドの有無や、生体反応を把握することが期待されている。
【０００３】
非特許文献１には、図１８（ａ）に示すように、細胞膜表面の受容体４０１を第１の標識物質４０２で標識された抗体４０３と結合させ、細胞膜４０４の透過処理を行い、図１８（ｂ）に示すように、細胞膜内の受容体４０１を第２の標識物質４０５で標識された抗体４０６と結合させ、共焦点顕微鏡を使用して細胞膜内外の受容体４０１をそれぞれ区別して観察する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nissa L. Carrodus、他４名、"Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons"、Journal of Visualized Experiments 84、（米国）、2014年2月12日、e51139、p. 1―6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、共焦点顕微鏡を使用して、目視により細胞ごとに受容体の検出が行われるため、細胞膜内への受容体の移行状況を短時間で効率よく把握することが困難である。
【０００６】
たとえば、受容体をターゲットとする分子標的薬の薬効をモニタリングするにあたり、受容体が細胞膜内へ移行した細胞の数や検体中の細胞に対する受容体が細胞膜内へ移行した細胞の割合といった受容体の移行状況は有益な指標となり得る。しかし、非特許文献１に記載の目視による確認では観察できる細胞数に限界があり、受容体が細胞膜内へ移行した細胞の数や検体中の細胞に対する受容体が細胞膜内へ移行した細胞の割合を算出しようとすると膨大な手間と時間がかかってしまう。また、対象細胞がＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）等の希少な細胞である場合、大量の検体を処理する必要があり、その大量の検体に含まれる多数の細胞について、細胞ごとに受容体の移行を識別する必要がある。非特許文献１に記載の方法では、測定を行う検体量には限界があり、また、個々の細胞について受容体の細胞膜内への移行状況を目視により識別するには、膨大な手間と時間がかかってしまう。
【０００７】
かかる課題に鑑み、本発明は、細胞における受容体の細胞膜内への移行状況を効率よく検出できる細胞情報取得方法および細胞情報取得装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞（１０）の細胞膜（１１）表面の受容体（１２）と、受容体（１２）に結合可能な結合物質（３１）と、を結合させる結合工程（Ｓ１１、Ｓ２１）と、結合工程（Ｓ１１、Ｓ２１）後に、細胞（１０）の細胞膜（１１）の透過処理を行う透過処理工程（Ｓ１２）と、透過処理工程（Ｓ１２）後に、標識物質（４２）により標識された結合物質（４１）を用いて、細胞膜（１１）内の受容体（１２）を標識する標識工程（Ｓ１３）と、標識工程（Ｓ１３）後に、細胞（１０）を含む試料を流路（２０１）に流す工程（Ｓ１４）と、流路（２０１）を流れる試料に含まれる細胞（１０）に光を照射する工程（Ｓ１５）と、細胞（１０）への光の照射により細胞（１０）中の標識物質（４２）から生じた光に基づく信号を取得する工程（Ｓ１６）と、を含む。
【０００９】
結合物質は、たとえば一または複数の抗体である。細胞膜表面の受容体に結合する結合物質と、細胞膜内の受容体に結合する結合物質とは、同じ物質であってもよく、異なる物質であってもよい。「細胞膜表面の受容体と結合物質とを結合させる」とは、必ずしも細胞膜表面の受容体の全てが結合物質と結合していなくてもよく、少なくとも細胞膜表面の一部の受容体が結合物質と結合していればよいことを示す。また、「細胞膜内の受容体を標識する」とは、必ずしも細胞膜内の全ての受容体が標識されていなくてもよく、少なくとも細胞膜内の一部の受容体が標識されていればよいことを示す。
【００１０】
本態様に係る細胞情報取得方法によれば、結合工程において、細胞膜表面の受容体のほとんどが結合物質と結合する。これにより、透過処理工程後に行われる標識工程において、多くの結合物質は、細胞膜表面の受容体と結合することなく、細胞膜内の受容体と結合する。したがって、細胞膜内の受容体が標識物質により標識されることになる。そして、標識物質から生じた光に基づく信号が取得される。取得された信号は、標識物質から生じた光に基づく信号であるから、細胞膜内に存在する受容体を示す。
【００１１】
よって、取得した信号によれば、細胞において受容体が細胞膜内へ移行している状況を効率よく検出できる。これにより、受容体の移行状況を把握することができ、たとえば、受容体をターゲットとする分子標的薬の薬効をモニタリングする際の指標とすることができる。また、たとえば、対象細胞がＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）等の希少な細胞であっても、フローサイトメータにより大量のサンプルを測定して、個々の細胞について受容体の移行状況を効率よく検出できる。これにより、オペレータの手間と時間を低減させることができる。
【００１２】
本態様に係る細胞情報取得方法は、取得した信号に基づいて、細胞（１０）における受容体（１２）の細胞膜（１１）内への移行状況を示す情報として、信号の波形の高さに関する情報を取得する情報取得工程（Ｓ１７）をさらに含むよう構成され得る。受容体は、細胞膜表面から細胞膜内へと移行した場合、細胞膜内において凝集する。また、信号の波形の高さは、受容体が凝集している場合に特に大きくなる。したがって、受容体が凝集して細胞膜内へと移行する場合に、移行状況を示す情報として信号波形の高さに関する情報を取得すれば、受容体の細胞膜内への移行状況をより精度よく検出できる。
【００１３】
ここで、結合工程では、細胞膜表面の全ての受容体が結合物質と結合するわけではなく、たとえば、一割程度の一部の受容体が未結合のまま残る場合がある。この場合、細胞膜内に移行した受容体を標識工程において標識しようとすると、細胞膜表面の未結合の受容体が標識物質で標識され、細胞膜表面の受容体を標識する標識物質から生じる光はノイズとなる。しかしながら、上述したように、信号の波形の高さは、受容体が内部移行して凝集している場合に特に大きくなる。したがって、信号の波形の高さに関する情報によれば、内部移行した受容体に基づく信号と、細胞膜表面から生じるノイズに基づく信号とを、精度よく区別できる。よって、受容体の細胞膜内への移行状況を精度よく検出できる。
【００１４】
なお、移行状況を示す情報として、信号の波形の面積または幅に関する情報を取得してもよい。ただし、受容体が細胞膜内へ移行し細胞膜内において凝集している場合、信号の波形の高さが特に大きくなるため、上記のように、移行状況を示す情報として、信号の波形の高さに関する情報を取得するのが望ましい。
【００１５】
本態様に係る細胞情報取得方法において、信号は、標識物質（４２）から生じた光に基づいて受光部（２２１）により出力される電気信号であるよう構成され得る。電気信号とは、たとえば、受光部により出力される電流や電圧等の信号である。
【００１６】
本態様に係る細胞情報取得方法において、細胞膜（１１）表面の受容体（１２）に結合した結合物質（３１）は、標識物質（４２）が生じる第１の波長（λ２１）の光とは異なる第２の波長（λ２２）の光を生じる標識物質（３２）により標識されてもよい。この場合、本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞（１０）への光の照射により、第２の波長（λ２２）の光に基づく信号を取得するよう構成され得る。第２の波長の光に基づく信号は、細胞膜表面の受容体を標識する標識物質から生じた光に基づく信号であるから、細胞膜表面に存在する受容体を示す。また、受容体が細胞膜表面から細胞膜内に移行すると、細胞膜表面の受容体が減り、細胞膜内の受容体が増える。したがって、第１の波長の光に基づく信号および第２の波長の光に基づく信号によれば、細胞における受容体の移行状況をより精度よく検出できる。
【００１７】
この場合に、本態様に係る細胞情報取得方法は、取得した第１の波長（λ２１）の光に基づく信号および第２の波長（λ２２）の光に基づく信号を用いて、細胞（１０）における受容体（１２）の細胞膜（１１）内への移行状況を示す情報として、第１の波長（λ２１）の光に基づく信号の波形の高さに関する情報と第２の波長（λ２２）の光に基づく信号の波形の高さに関する情報との比または差分を取得する情報取得工程（Ｓ１７）をさらに含むよう構成され得る。受容体が細胞膜内へと移行した細胞においては、受容体が凝集しているため、細胞膜内の受容体に対応する第１の波長の光に基づく信号の波形の高さは大きくなる。一方、受容体が細胞膜内へ移行していない細胞においては、受容体の凝集が起こりにくいため、細胞膜表面の受容体に対応する第２の波長の光に基づく信号の波形の高さは、受容体が凝集している場合の第１の波長の光に基づく信号の高さに比べて小さくなる。このように、第１の波長の光に基づく信号の波形の高さと第２の波長の光に基づく信号の波形の高さは、受容体の移行状況に応じて特徴的に変化する。したがって、受容体が細胞膜内へ移行したことは、２つの信号波形の高さの比または差分に現れやすい。これにより、受容体の細胞膜内への移行状況を精度よく検出できる。
【００１８】
なお、情報取得工程において、取得した第１の波長（λ２１）の光に基づく信号および第２の波長（λ２２）の光に基づく信号を用いて、細胞（１０）における受容体（１２）の細胞膜（１１）内への移行状況を示す情報として、第１の波長（λ２１）の光に基づく信号の波形の面積に関する情報と第２の波長（λ２２）の光に基づく信号の波形の面積に関する情報との比または差分を取得してもよく、第１の波長（λ２１）の光に基づく信号の波形の幅に関する情報と第２の波長（λ２２）の光に基づく信号の波形の幅に関する情報との比または差分を取得してもよい。ただし、第１の波長の光に基づく信号の波形の高さと第２の波長の光に基づく信号の波形の高さとの間の違いに比べて、第１の波長の光に基づく信号の波形の面積と第２の波長の光に基づく信号の波形の面積との間には違いが生じにくく、第１の波長の光に基づく信号の波形の幅と第２の波長の光に基づく信号の波形の幅との間には違いが生じにくい。したがって、情報取得工程では、第１の波長の光に基づく信号の波形の高さに関する情報と第２の波長の光に基づく信号の波形の高さに関する情報との比または差分を取得するのが望ましい。
【００１９】
本態様に係る細胞情報取得方法において、第２の波長（λ２２）の光に基づく信号は、第２の波長（λ２２）の光を生じる標識物質（３２）から生じた光に基づいて受光部（２２２）により出力される電気信号であるよう構成され得る。電気信号とは、たとえば、受光部により出力される電流や電圧等の信号である。
【００２０】
本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞（１０）における受容体（１２）の細胞膜（１１）内への移行状況を示す情報を表示する表示工程（Ｓ１９）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、細胞ごとの内部移行の程度を円滑かつ視覚的に把握できる。
【００２１】
本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞（１０）における受容体（１２）の細胞膜（１１）内への移行状況を示す情報に基づいて、細胞（１０）ごとに、受容体（１２）の細胞膜内移行の有無を判定する判定工程（Ｓ１８）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、細胞ごとに受容体の細胞膜内移行の有無を円滑に判定できる。また、受容体の細胞膜内移行の有無が判定されると、当該受容体が分子標的薬のターゲットである場合には、判定結果を薬効モニタリングに役立てることができる。また、対象とする受容体を、細菌性の疾患に対応する受容体やウイルス性の疾患に対応する受容体とすることで、判定結果に基づいて、被検者が細菌性とウイルス性のいずれの疾患に罹患しているかを知ることができる。
【００２２】
この場合に、細胞（１０）は、たとえば、受容体（１２）がターゲットとなる分子標的薬が投与された被検者から採取した血液中の細胞とされる。こうすると、被検者に対する分子標的薬の薬効をモニタリングできるようになる。
【００２３】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において、移行状況を示す情報を所定の閾値と比較することにより、受容体（１２）の細胞膜内移行の有無を判定するよう構成され得る。こうすると、移行状況を示す情報に応じて、細胞ごとに受容体の細胞膜内移行の有無を明確に判定できる。
【００２４】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において細胞（１０）ごとに判定された受容体（１２）の細胞膜内移行の有無を表示する表示工程（Ｓ１９）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、細胞ごとに判定された内部移行の有無を円滑かつ視覚的に把握できる。
【００２５】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において、受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の数を取得するよう構成され得る。こうすると、分子標的薬の薬効の評価や、細胞外刺激の有無の判定を円滑に行うことができる。
【００２６】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において取得された受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の数を表示する表示工程（Ｓ１９）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、受容体が細胞膜内へ移行した細胞の数を円滑かつ視覚的に把握できる。
【００２７】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において、受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の数に基づいて、細胞外刺激の有無を判定するよう構成され得る。こうすると、細胞外刺激の有無を円滑に判定できる。
【００２８】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において、受容体（１２）の細胞膜内移行の有無を判定した細胞（１０）のうち、受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の割合を取得するよう構成され得る。こうすると、分子標的薬の薬効の評価や、細胞外刺激の有無の判定を円滑に行うことができる。
【００２９】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において取得された受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の割合を表示する表示工程（Ｓ１９）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、受容体が細胞膜内へ移行した細胞の割合を円滑かつ視覚的に把握できる。
【００３０】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において、受容体（１２）が細胞膜（１１）内へ移行した細胞（１０）の割合に基づいて、細胞外刺激の有無を判定するよう構成され得る。こうすると、細胞外刺激の有無を円滑に判定できる。
【００３１】
本態様に係る細胞情報取得方法は、判定工程（Ｓ１８）において判定された細胞外刺激の有無を表示する表示工程（Ｓ１９）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、細胞外刺激の有無を円滑かつ視覚的に把握できる。
【００３２】
本態様に係る細胞情報取得方法は、流路（２０１）を流れる試料に含まれる細胞（１０）の画像（３２１、３２２、３２３）を取得する工程（Ｓ４１）をさらに含むよう構成され得る。こうすると、たとえば、細胞における受容体の移行状況を、画像を参照して確認できる。また、各細胞における受容体の細胞膜内移行の有無を、画像を解析することにより判定することもできる。ただし、画像解析により受容体の細胞膜内移行の有無を判定しようとすると、大量のサンプルを処理する場合、膨大な数の細胞について画像解析を行う必要が生じる。この場合、画像解析を行う処理部に過大な負荷がかかってしまう。したがって、細胞における受容体の移行状況の検出は、標識物質から生じた光に基づく信号を用いて行われるのが望ましい。
【００３３】
本発明の第２の態様は、細胞情報取得方法に関する。本態様に係る細胞情報取得方法は、細胞（１０）の細胞膜（１１）の透過処理を行う透過処理工程（Ｓ１２）と、透過処理工程（Ｓ１２）後に、受容体（Ｓ１２）に結合可能であり細胞膜（１１）内の生理環境において光を生じる標識物質（５２）により標識された結合物質（５１）を用いて、受容体（１２）を標識する標識工程（Ｓ３１）と、標識工程（Ｓ３１）後に、細胞（１０）を含む試料を流路（２０１）に流す工程（Ｓ１４）と、流路（２０１）を流れる試料に含まれる細胞（１０）に光を照射する工程（Ｓ１５）と、細胞（１０）への光の照射により細胞（１０）中の標識物質（５２）から生じた光に基づく信号を取得する工程（Ｓ１６）と、を含む。
【００３４】
細胞膜内の生理環境において光を生じる標識物質は、たとえば、後述するように細胞膜内のｐＨにおいて光を生じるよう構成されるほか、細胞膜内の温度や細胞膜内の酸素分圧において光を生じるよう構成されてもよく、細胞膜内の物質と反応することにより光を生じるよう構成されてもよい。取得される信号は、たとえば、標識物質から生じた光に基づいて受光部により出力される電気信号である。
【００３５】
本態様に係る細胞情報取得方法によれば、細胞膜内の受容体と細胞膜表面の受容体の両方が、標識物質により標識される。このとき、細胞膜内と細胞膜表面の標識物質のうち、細胞膜内の受容体を標識する標識物質のみが光を生じる状態となる。また、標識物質から生じた光に基づく信号が取得される。取得された信号は、細胞膜内の受容体を標識する標識物質から生じた光に基づく信号であるから、細胞膜内に存在する受容体を示す。したがって、取得された信号によれば、第１の態様と同様、細胞において受容体が細胞膜表面から細胞膜内へ移行している状況を効率よく検出でき、オペレータの手間と時間を低減させることができる。
【００３６】
この場合に、標識物質（５２）は、細胞膜（１１）内のｐＨにおいて光を生じるよう構成され得る。通常、細胞膜内のｐＨは、細胞外のｐＨとは異なっている。したがって、標識物質が細胞膜内のｐＨにおいて光を生じるように構成されると、細胞膜内に存在する受容体を標識する標識物質からのみ光が生じるため、受容体の細胞膜内への移行状況を確実に検出できる。
【００３７】
本発明の第３の態様は、細胞情報取得装置（１００）に関する。本態様に係る細胞情報取得装置（１００）は、細胞（１０）の細胞膜（１１）表面の受容体（１２）および受容体（１２）に結合可能な結合物質（３１）を結合させ、結合物質（３１）が結合した細胞（１０）の細胞膜（１１）の透過処理を行い、透過処理がなされた細胞膜（１１）内の受容体（１２）を標識物質（４２）により標識された結合物質（４１）を用いて標識して試料を調製する試料調製部（１３０）と、試料を流すフローセル（２００）と、フローセル（２００）を流れる試料に光を照射する光源（２１１、２１２）と、標識物質（４２）から生じた光を受光し、標識物質（４２）から生じた光に基づく信号を出力する受光部（２２１、２２２）と、を備える。
【００３８】
受光部は、たとえば光検出器である。第３の態様に係る細胞情報取得装置によれば、第１の態様と同様の効果が奏される。
【００３９】
本態様に係る細胞情報取得装置（１００）において、試料調製部（１３０）は、細胞膜（１１）表面の受容体（１２）を標識物質（４２）が生じる第１の波長（λ２１）の光とは異なる第２の波長（λ２２）の光を生じる標識物質（３２）により標識してもよい。この場合、受光部（２２１、２２２）は、第２の波長（λ２２）の光を受光し、第２の波長（λ２２）の光に基づく信号を出力するよう構成され得る。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、細胞における受容体の細胞膜内への移行状況を効率よく検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、実施形態１に係る細胞情報取得方法を示すフローチャートである。
【図２】図２（ａ）〜（ｄ）は、実施形態１に係る細胞における受容体の内部移行について説明するための模式図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１に係る細胞に刺激が加えられたことにより受容体が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す模式図である。図３（ｄ）〜（ｆ）は、実施形態１に係る細胞に刺激が加えられておらず受容体が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す模式図である。
【図４】図４（ａ）は、実施形態１に係る受容体が内部移行している細胞にレーザ光が照射される状態を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態１に係る受容体が内部移行していない細胞にレーザ光が照射される状態を示す模式図である。図４（ｃ）は、図４（ａ）に示す細胞にレーザ光を照射した場合に取得される第２信号の波形を示す模式図である。図４（ｄ）は、図４（ｂ）に示す細胞にレーザ光を照射した場合に取得される第１信号の波形を示す模式図である。図４（ｅ）、（ｆ）は、それぞれ、信号波形から取得される面積および幅を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態１の検証の事前準備で取得された移行状況の判定結果を示す図である。
【図６】図６（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施形態１の検証で取得された移行比率、移行差、および移行値を示す図である。図６（ｄ）〜（ｆ）は、それぞれ、図６（ａ）〜（ｃ）に基づいて取得されたグラフの分析結果を示す図である。
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態１の変更例の検証で取得された移行比率および移行差を示す図である。
【図８】図８は、実施形態１の装置構成に係る細胞情報取得装置の構成を示すブロック図である。
【図９】図９は、実施形態１の装置構成に係るフローサイトメータの構成を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施形態１の装置構成に係る表示部に表示される画面の構成を示す模式図である。
【図１１】図１１は、実施形態２に係る細胞情報取得方法を示すフローチャートである。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｃ）は、実施形態２に係る細胞に刺激が加えられたことにより受容体が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す模式図である。図１２（ｄ）〜（ｆ）は、実施形態２に係る細胞に刺激が加えられておらず受容体が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施形態３に係る細胞情報取得方法を示すフローチャートである。
【図１４】図１４（ａ）〜（ｃ）は、実施形態３に係る細胞に刺激が加えられたことにより受容体が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す模式図である。図１４（ｄ）、（ｅ）は、実施形態３に係る細胞に刺激が加えられておらず受容体が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す模式図である。
【図１５】図１５は、実施形態４に係る細胞情報取得方法を示すフローチャートである。
【図１６】図１６は、実施形態４の装置構成に係るフローサイトメータの構成を示す模式図である。
【図１７】図１７は、実施形態４の装置構成に係る表示部に表示される画面の構成を示す模式図である。
【図１８】図１８は、関連技術の構成を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
＜実施形態１＞
実施形態１は、細胞膜表面に存在する受容体と細胞膜内に存在する受容体とをそれぞれ標識物質により標識し、標識物質から生じた蛍光に基づいて受容体の細胞膜内移行の有無を判定する細胞情報取得方法に、本発明を適用したものである。受容体（レセプター）は、たとえば、対応するリガンドと結合することにより活性化され、細胞膜表面から細胞膜内へ移行する。実施形態１では、細胞膜表面の受容体と細胞膜内の受容体とを互いに異なる波長の蛍光を生じる標識物質で標識し、フローサイトメトリーに基づいて各標識物質から生じた蛍光を受光し、受光した各蛍光に基づいて細胞における受容体の移行状況を示す情報を取得する。
【００４３】
受容体とリガンドが結合することにより内部移行する場合、受容体とリガンドの組合せとしては、たとえば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とＥＧＦが挙げられる。
【００４４】
受容体とリガンドが結合することにより内部移行する場合の受容体とリガンドの組合せは、ＥＧＦＲとＥＧＦに限らない。たとえば、ＥＧＦＲが属するチロシンキナーゼ型受容体とそのリガンドの組合せの場合、受容体とリガンドの組合せとしては、ＰＤＧＦＲと血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦＲと血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＦＧＦ２Ｒと線維芽細胞増殖因子（ＦＤＦ）、などが挙げられる。たとえば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とそのリガンドの組合せの場合、受容体とリガンドの組合せとしては、ＭＣＨＲ１とメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）が挙げられる。この他、受容体とリガンドの組合せとして、Ｐ２Ｙ１２受容体とＡＤＰ、エリスロポエチン受容体とエリスロポエチン、などが挙げられる。
【００４５】
図１に示すように、実施形態１の細胞情報取得方法は、ステップＳ１１〜Ｓ１９のステップを含む。ステップＳ１１は、結合工程であり、ステップＳ１３は、標識工程である。以下には、オペレータが、試料の調製を行い、調製した試料から生じた蛍光を受光して信号を出力するフローサイトメータと、フローサイトメータから出力された信号を解析するための解析装置とを用いて、図１の細胞情報取得方法を実行する場合について説明する。図１の各ステップが、細胞情報取得装置における処理により実行されてもよい。細胞情報取得装置が図１の各ステップを行う場合の装置構成については、追って、図８〜１０を参照して説明する。
【００４６】
図２（ａ）〜（ｄ）を参照して、細胞における受容体の内部移行について説明する。
【００４７】
図２（ａ）に示すように、細胞１０に対して刺激が加えられていない場合、細胞膜１１すなわち細胞膜表面に、受容体１２が分布している。図２（ｂ）に示すように、細胞１０の周囲に受容体１２に対応するリガンド２０が現れる。そして、図２（ｃ）に示すように、受容体１２とリガンド２０が結合することにより、細胞１０が刺激を受容した状態となる。その後、図２（ｄ）に示すように、リガンド２０と結合した受容体１２は、細胞１０の内部すなわち細胞膜内に移行する。こうして、細胞１０の外部のシグナルが、細胞１０の内部へと伝達される。
【００４８】
たとえば、上記の受容体１２とリガンド２０が、それぞれＥＧＦＲとＥＧＦである場合、刺激物質としてＥＧＦが分泌されると、ＥＧＦが細胞膜表面のＥＧＦＲと結合する。そして、ＥＧＦＲとＥＧＦの複合体が細胞膜内に移行する。受容体１２とリガンド２０が他の組合せの場合も、同様に複合体が細胞膜内に移行する。なお、リガンド２０が結合し細胞膜内に移行した受容体１２は、エンドソームへと運ばれ、その後リソソームで分解される。
【００４９】
図１に戻り、ステップＳ１１〜Ｓ１９の各工程について、図３（ａ）〜（ｆ）を適宜参照しながら説明する。図３（ａ）〜（ｃ）は、細胞１０に刺激が加えられたことにより受容体１２が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す図である。図３（ｄ）〜（ｆ）は、細胞１０に刺激が加えられておらず受容体１２が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す図である。
【００５０】
ステップＳ１１において、オペレータは、細胞膜表面の受容体１２を標識する結合工程を行う。具体的には、オペレータは、図３（ａ）、（ｄ）に示すように、細胞１０と結合物質３１とを接触させて、細胞膜表面の受容体１２と結合物質３１とを結合させる。結合物質３１は、受容体１２に結合可能な物質であり、たとえば、受容体１２と特異的に結合する抗体である。また、結合物質３１は、標識物質３２により標識されている。標識物質３２は、所定波長の光が照射されると蛍光を生じる蛍光物質である。ステップＳ１１の結合工程により、細胞膜表面の受容体１２が結合物質３１と結合すると、細胞膜表面の受容体１２は、結合物質３１を介して標識物質３２により標識される。
【００５１】
なお、結合物質３１は、複数の抗体により構成されてもよい。「細胞膜表面の受容体１２と結合物質３１とを結合させる」とは、必ずしも細胞膜表面の受容体１２の全てが結合物質３１と結合していなくてもよく、少なくとも細胞膜表面の一部の受容体１２が結合物質３１と結合していればよいことを示す。
【００５２】
ステップＳ１２において、オペレータは、細胞１０の細胞膜１１の透過処理を行う。これにより、図３（ａ）、（ｄ）に示す細胞１０の細胞膜１１は、それぞれ、図３（ｂ）、（ｅ）において破線で示すように透過状態とされる。透過処理により、続くステップＳ１３において、標識物質４２により標識された結合物質４１が、細胞膜１１を通って、細胞膜外から細胞膜内へと入ることができるようになる。
【００５３】
ステップＳ１３において、オペレータは、結合物質４１を用いて細胞膜内の受容体１２を標識する標識工程を行う。具体的には、オペレータは、図３（ｃ）に示すように、標識物質４２により標識された結合物質４１を、透過処理が施された細胞膜１１を通して細胞膜内へ送る。そして、オペレータは、細胞１０と結合物質４１とを接触させて、細胞膜内の受容体１２と結合物質４１とを結合させる。結合物質４１は、受容体１２に結合可能な物質であり、たとえば、受容体１２と特異的に結合する抗体である。標識物質４２は、所定波長の光が照射されると、標識物質３２から生じる蛍光とは異なる波長の蛍光を生じる蛍光物質である。
【００５４】
ここで、結合物質４１が認識する受容体１２の部位は、結合物質３１が認識する受容体１２の部位と同じである。結合物質４１の認識部位と結合物質３１の認識部位とが同じであれば、結合物質４１と結合物質３１は、同じ物質であってもよく、異なる物質であってもよい。
【００５５】
受容体１２が細胞膜内に移行している細胞１０の場合、ステップＳ１３の標識工程により、図３（ｃ）に示すように、細胞膜内の受容体１２は、結合物質４１を介して標識物質４２により標識される。一方、受容体１２が細胞膜内に移行していない細胞１０の場合、図３（ｆ）に示すように、細胞膜内は標識物質４２により標識されない。
【００５６】
なお、結合物質４１は、複数の抗体により構成されてもよい。また、「細胞膜内の受容体１２が標識される」とは、必ずしも細胞膜内の受容体１２の全てが標識されていなくてもよく、少なくとも細胞膜内の一部の受容体１２が標識されていればよいことを示す。
【００５７】
ステップＳ１４〜Ｓ１６において、オペレータは、フローサイトメトリー法により、標識物質４２から生じた蛍光に基づく第１信号を取得し、標識物質３２から生じた蛍光に基づく第２信号を取得する工程を行う。
【００５８】
ステップＳ１４において、オペレータは、ステップＳ１１〜Ｓ１３の各工程を経た細胞１０を含む試料を、フローサイトメータに供給する。フローサイトメータは、供給された試料をフローセルの流路に流す。ステップＳ１５において、フローサイトメータは、フローセルの流路を流れる試料に、標識物質３２、４２から蛍光を生じさせるための光を照射する。これにより、試料に含まれる細胞１０に光が照射され、標識物質３２、４２から互いに異なる波長の蛍光が生じる。ステップＳ１６において、フローサイトメータは、細胞１０への光の照射により標識物質３２、４２から生じた蛍光をそれぞれ受光部により受光する。受光部は、標識物質４２から生じた蛍光に基づく第１信号と、標識物質３２から生じた蛍光に基づく第２信号とを出力する。第１信号および第２信号は、波形状の信号である。こうして、オペレータは、フローサイトメータを用いることにより、第１信号および第２信号を取得する。
【００５９】
ステップＳ１１〜Ｓ１６の処理工程によれば、結合工程において、細胞膜表面の受容体１２のほとんどが、結合物質３１と結合する。これにより、透過処理工程後に行われる標識工程において、多くの結合物質４１は、細胞膜表面の受容体１２と結合することなく、細胞膜内の受容体１２と結合する。したがって、細胞膜内の受容体１２が標識物質４２により標識されることになる。そして、ステップＳ１６において、標識物質４２から生じた光に基づく第１信号が取得される。第１信号は、標識物質４２から生じた光に基づく信号であるから、細胞膜内に存在する受容体１２を示す。
【００６０】
よって、第１信号によれば、細胞において受容体１２が細胞膜内へ移行している状況を効率よく検出できる。また、たとえば、対象細胞がＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）等の希少な細胞であっても、フローサイトメータにより大量のサンプルを測定して、個々の細胞について受容体１２の移行状況を効率よく検出できる。これにより、オペレータの手間と時間を低減させることができる。
【００６１】
また、結合工程において、細胞膜表面の受容体１２が、結合物質３１と結合することにより標識物質３２により標識される。そして、ステップＳ１６において、第１信号とともに、標識物質３２から生じた光に基づく第２信号が取得される。第２信号は、標識物質３２から生じた光に基づく信号であるから、細胞膜表面に存在する受容体１２を示す。受容体１２が細胞膜表面から細胞膜内に移行すると、細胞膜表面の受容体１２が減り、細胞膜内の受容体１２が増える。したがって、第１信号と第２信号によれば、細胞において受容体１２が細胞膜表面から細胞膜内へ移行している状況をより精度よく検出できる。
【００６２】
次に、ステップＳ１７において、解析装置は、ステップＳ１６において取得された第１信号および第２信号に基づいて、細胞ごとに、受容体１２の細胞膜内への移行状況を示す情報を取得する情報取得工程を行う。具体的には、解析装置は、細胞ごとに、第１信号の波形から第１情報を取得し、第２信号の波形から第２情報を取得する。そして、解析装置は、取得した第１情報と第２情報に基づいて、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として、「移行比率」、「移行差」、または「移行値」を取得する。移行比率は、第１情報を第２情報で除算した値、すなわち比に対応する値である。移行差は、第１情報を第２情報で減算した値、すなわち差分に対応する値である。移行値は、第１情報である。移行状況を示す情報を取得することにより、細胞ごとの受容体１２の移行状況を円滑に検出できる。
【００６３】
ここで、第１情報は、第１信号の波形の高さであり、第２情報は、第２信号の波形の高さである。なお、第１情報は、第１信号の波形の面積や幅でもよく、第２情報は、第１信号の波形の面積や幅でもよい。ただし、第１情報および第２情報は信号波形の高さである方が、以下、図４（ａ）〜（ｄ）を参照して説明する理由から好ましい。
【００６４】
図４（ａ）は、図３（ｆ）に示した細胞１０にレーザ光が照射される状態を示す模式図である。図４（ｂ）は、図３（ｃ）に示した細胞１０にレーザ光が照射される状態を示す模式図である。図４（ａ）、（ｂ）に示すように、フローサイトメータでは、フローセルを流れる細胞１０に対して、扁平形状のレーザ光が照射される。
【００６５】
図４（ａ）に示す細胞１０の場合、受容体１２が細胞膜内に移行していないため、細胞膜表面が標識物質３２により標識され、細胞膜内は標識物質４２によりほぼ標識されていない。したがって、図４（ａ）に示す細胞１０がレーザ光の照射領域を通過すると、細胞膜表面に広く分布する標識物質３２から蛍光が生じ、細胞からは標識物質４２に基づく蛍光はほぼ生じない。この場合、細胞膜表面の受容体１２に対応する第２信号の波形は、図４（ｃ）に示すような形状となる。
【００６６】
一方、図４（ｂ）に示す細胞１０の場合、受容体１２が細胞膜表面から細胞膜内に移行しているため、細胞膜内が標識物質４２により標識され、細胞膜表面は図４（ａ）の場合に比べて標識物質３２により標識されていない。また、受容体１２は凝集した状態で細胞膜内に移行するため、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質４２も凝集した状態となる。したがって、図４（ｂ）に示す細胞１０がレーザ光の照射領域を通過すると、細胞膜内において凝集して分布する標識物質４２から蛍光が生じ、細胞からは図４（ａ）の場合に比べて標識物質３２に基づく蛍光は生じない。この場合、細胞膜内の受容体１２に対応する第１信号の波形は、図４（ｄ）に示すように、図４（ｃ）に示す第２信号の波形に比べて高さが大きい形状となる。
【００６７】
このように、受容体１２の移行がない細胞１０においては、受容体１２の凝集は起こらないため、第２信号は、細胞膜表面の受容体１２に応じてある程度の値を持つものの、図４（ｃ）に示すように、第２信号の波形の高さは大きくない。一方、受容体１２が細胞膜内に移行している細胞１０においては、受容体１２の凝集が起こっているため、第１信号は、細胞膜内の受容体１２に応じてある程度の値を持ち、かつ、図４（ｄ）に示すように、第１信号の波形の高さは、図４（ｃ）に比べて大きくなる。したがって、第１情報および第２情報として蛍光に基づく信号波形の高さを取得すれば、受容体１２の移行状況に応じて第１情報の値と第２情報の値が特徴的に変化するため、受容体１２の細胞膜内への移行状況を精度よく検出できる。
【００６８】
また、図１のステップＳ１１の結合工程では、細胞膜表面の全ての受容体１２が結合物質３１と結合するわけではなく、たとえば、一割程度の一部の受容体１２が未結合のまま残る。この場合、図１のステップＳ１３の標識工程において、結合物質３１が結合しなかった細胞膜表面の受容体１２に結合物質４１が結合して、細胞膜表面の受容体１２が標識物質４２により標識される場合が起こり得る。また、結合物質４１が受容体１２以外の物質に結合して、受容体１２以外の物質が標識物質４２により標識される場合も起こり得る。細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質４２から生じる光や、受容体１２以外の物質を標識する標識物質４２から生じる光は、いずれもノイズとなる。
【００６９】
しかしながら、上述したように受容体１２は凝集した状態で細胞膜内に移行するため、細胞膜内の受容体１２以外の物質を標識する標識物質４２の凝集度は、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質４２の凝集度に比べて低い。したがって、第１情報として信号波形の高さを取得すれば、第１情報は、凝集する標識物質４２を反映する値となる。これにより、内部移行した受容体１２に基づく信号と、細胞膜表面から生じるノイズに基づく信号および受容体１２以外の物質から生じるノイズとを、精度よく区別できる。よって、細胞膜内の受容体１２以外の物質が標識物質４２により標識されている場合でも、受容体１２の細胞膜内への移行状況を精度よく検出できる。
【００７０】
ここで、上述したように、第１情報の値と第２情報の値は、いずれも受容体１２の移行状況に応じて特徴的に変化する。したがって、受容体１２が細胞膜内へ移行したことは、移行比率、移行差、および移行値に現れやすい。よって、ステップＳ１７において、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として、移行比率、移行差、または移行値が取得されると、移行状況を示す情報に基づいて、受容体１２の移行状況を精度よく検出できるようになる。
【００７１】
なお、上述したように、第１情報および第２情報は、信号波形の高さに限らず、図４（ｅ）に示すような信号波形の面積でもよく、図４（ｆ）に示すような信号波形の幅でもよい。ただし、第１情報および第２情報が信号波形の面積や幅の場合、第１情報および第２情報が信号波形の高さの場合に比べて、第１情報と第２情報のいずれにおいても、受容体１２の移行に応じて値の変化が生じにくい。したがって、第１情報および第２情報は、信号波形の高さであることが望ましい。
【００７２】
図１に戻り、ステップＳ１８において、解析装置は、ステップＳ１７において取得した移行状況を示す情報に基づいて、細胞ごとに、受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定する判定工程を行う。具体的には、解析装置は、細胞ごとに取得した移行状況を示す情報を所定の閾値と比較することにより、細胞ごとに受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定する。
【００７３】
たとえば、解析装置は、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として移行比率を取得した場合、移行比率が閾値ｔｈ１以上であれば受容体１２の移行ありと判定し、移行比率が閾値ｔｈ１未満であれば受容体１２の移行なしと判定する。また、解析装置は、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として移行差を取得した場合、移行差が閾値ｔｈ２以上であれば受容体１２の移行ありと判定し、移行差が所定の閾値ｔｈ２未満であれば受容体１２の移行なしと判定する。また、解析装置は、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として移行値を取得した場合、移行値が閾値ｔｈ３以上であれば受容体１２の移行ありと判定し、移行値が閾値ｔｈ３未満であれば受容体１２の移行なしと判定する。
【００７４】
このように、ステップＳ１８の判定工程では、移行状況を示す情報に基づいて受容体１２の細胞膜内移行の有無が判定されるため、受容体１２の細胞膜内移行の有無を円滑に判定できる。また、ステップＳ１８の判定工程では、移行状況を示す情報が所定の閾値と比較されることにより、受容体１２の細胞膜内移行の有無が判定されるため、受容体１２の細胞膜内移行の有無を明確に判定できる。
【００７５】
また、受容体１２の細胞膜内移行の有無が判定されると、当該受容体１２が分子標的薬のターゲットである場合には、判定結果を薬効モニタリングに役立てることができる。たとえば、ある受容体１２がターゲットとなる分子標的薬が被検者に投与され、この被検者から採取された血液中の細胞１０がステップＳ１１の結合処理に供される場合、当該受容体１２の細胞膜内移行の有無が判定されると、被検者に対する分子標的薬の薬効をモニタリングできるようになる。
【００７６】
たとえば、ターゲットとなる受容体１２が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の場合、分子標的薬としてチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）が知られている。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は細胞膜上に存在するが、上皮成長因子受容体が活性化されることにより細胞の分化や増殖が起こる。しかし、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は変異が起こることにより、がん化、浸潤・転移に関わるようになる。ここで、チロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）により、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化を阻害することで、がん細胞の増殖に必要なシグナル伝達を遮断できる。これにより、がん細胞の増殖を抑制できる。チロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）が投与された被検者から採取した血液中の細胞における受容体１２の細胞膜内移行状況を判定することにより、細胞における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化の指標とすることができ、被検者における対するチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）の薬効をモニタリングできるようになる。
【００７７】
また、ターゲットとする受容体１２を、細菌性の疾患に対応する受容体１２やウイルス性の疾患に対応する受容体１２とすることで、判定結果に基づいて、被検者が細菌性とウイルス性のいずれの疾患に罹患しているかを知ることができる。
【００７８】
なお、ステップＳ１８の判定工程で用いる所定の閾値は、受容体１２が細胞膜内に移行した標準細胞群に基づいて取得した移行状況を示す情報と、受容体１２が細胞膜内に移行していない標準細胞群に基づいて取得した移行状況を示す情報とに基づいて設定される。これにより、細胞における受容体１２の移行状況を検出する環境に応じて、適切な閾値を設定できる。
【００７９】
さらに、ステップＳ１８の判定工程において、解析装置は、各細胞における受容体１２の細胞内移行の有無に基づいて、受容体１２が細胞膜内へ移行した細胞１０の数、すなわち受容体１２の移行ありと判定した細胞１０の数を取得する。また、ステップＳ１８の判定工程において、解析装置は、受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定した細胞１０のうち、受容体１２の移行ありと判定した細胞１０の割合を取得する。これにより、上述したような分子標的薬の薬効の評価や、後述する細胞外刺激の有無の判定を円滑に行うことができる。
【００８０】
さらに、ステップＳ１８の判定工程において、解析装置は、細胞ごとに判定された受容体１２の細胞膜内移行の有無の判定結果に基づいて、細胞外刺激の有無を判定する。たとえば、解析装置は、受容体１２が細胞膜内へ移行した細胞１０の数に基づいて、当該数が所定値以上であれば、細胞外刺激ありと判定し、当該数が所定値未満であれば、細胞外刺激なしと判定する。あるいは、解析装置は、受容体１２の移行ありと判定した細胞１０の割合に基づいて、当該割合が所定値以上であれば、細胞外刺激ありと判定し、当該割合が所定値未満であれば、細胞外刺激なしと判定する。受容体１２とリガンド２０の組合せがＥＧＦＲとＥＧＦの場合、上記のように細胞に対する細胞外刺激の有無が判定されると、細胞の増殖や分化により分泌されるＥＧＦの有無を円滑に判定できる。
【００８１】
ステップＳ１９において、解析装置は、ステップＳ１８における判定結果に関する情報を表示する表示工程を行う。具体的には、解析装置は、判定結果に関する情報として、各細胞における受容体１２の移行状況を示す情報、各細胞における受容体１２の細胞膜内移行の有無、受容体１２が細胞膜内へ移行した細胞１０の数、細胞膜内移行の有無を判定した細胞のうち受容体１２の移行ありと判定した細胞の割合、細胞外刺激の有無、などを表示部に表示する。これにより、オペレータは、判定結果に関する情報を円滑かつ視覚的に把握できる。また、オペレータは、表示部に表示された移行状況を示す情報を参照することにより、細胞ごとの内部移行の程度を円滑かつ視覚的に把握できる。判定結果を表示する画面構成については、追って図１０を参照して説明する。
【００８２】
＜実施形態１の検証の事前確認＞
次に、発明者らが実施形態１の検証に先がけて行った、実施形態１の検証の事前確認ついて説明する。実施形態１の検証の事前確認および後述する実施形態１の検証では、９９．９％と高いＥＧＦＲの発現率を有するA549細胞を用いて、ＥＧＦＲの細胞膜内移行を検証した。
【００８３】
１．準備
細胞として、ヒト肺がん細胞株（A549）（JCRBより寄託）を用意した。刺激物質として、Alexa488標識EGF（Thermo Fisher Scientific:E13345）を用意した。Alexa488標識EGFは、ＥＧＦＲにリガンドとして特異的に結合するＥＧＦを、蛍光物質であるAlexa488で標識したものである。この他、PRMI-1640培地（SIGMA:R8758-500ML）、ウシ胎仔血清（Hyclone:515-83582）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO:15240-062）、D-PBS(-)（Wako:045-29795）、ガラスボトム6well plate（Iwaki:5816-006）、パラホルムアルデヒド（Wako:160-16061）、0.05w/v%トリプシン-0.53mmol/L EDTA（Wako:204-16935）、Hoechst33342（Dojindo:346-07951）、CellHunt Orange（セタレ バイオテック:7138）を用意した。
【００８４】
２．試薬調製
５００ｍＬのRPMI-1640培地に、５０ｍＬのウシ胎仔血清および５ｍＬのAntibiotic-Antimycoticを添加し、細胞培養培地（以下、「完全培地」という）を作製した。５００ｍＬのRPMI-1640培地に、５００μＬのウシ胎仔血清および５ｍＬのAntibiotic-Antimycoticを添加し、細胞培養培地（以下、「飢餓培地」という）を作製した。飢餓培地に終濃度２００ｎｇ／ｍＬとなるようにAlexa488標識EGFを添加し、細胞培養培地（以下、「２００ｎｇ／ｍＬ刺激培地」という）を作製した。飢餓培地に終濃度２０００ｎｇ／ｍＬとなるようにAlexa488標識EGFを添加し、細胞培養培地（以下、「２０００ｎｇ／ｍＬ刺激培地」という）を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度４ｗ／ｖ％となるようにPBSで溶解した後に、ｐＨ７．４に調整した。CellHunt Orangeを終濃度１ｍＭとなるようにDMSOで溶解した。CellHunt Orange溶液、Hoechst33342、およびPBSを１：１：９９８の割合で混合し、細胞染色液を作製した。
【００８５】
３．手順
A549細胞株は、メーカー推奨プロトコルに準じて、完全培地にて培養した。購入後から継代回数３０回以内の細胞を用いた。A549細胞を培養している７５ｃｍ２フラスコからアスピレーターを用いて培地を除去し、４ｍＬのPBSにて一度フラスコ内を洗浄した。０．０５％のトリプシン２ｍＬをフラスコに添加し、３７℃で５分間静置し細胞を剥離した。完全培地５ｍＬをさらに添加し、全量を１５ｍＬ遠沈管に回収し、３００×ｇ（１５００ｒｐｍ）で３分間遠心した。上清を除去し、細胞濃度が５×１０４／ｍＬとなるように完全培地で懸濁し、６ウェルガラスプレートに２ｍＬ／ウェルで播種し、３７℃５％ＣＯ２環境下で終夜培養した。
【００８６】
翌日、完全培地を除去し、１ｍＬのPBSにて洗浄した。飢餓培地２ｍＬを添加し、３時間飢餓処理を行った。飢餓培地を除去し、それぞれのウェルに、飢餓培地、２００ｎｇ／ｍＬ刺激培地、または２０００ｎｇ／ｍＬ刺激培地を５００μＬ添加し、室温で１０分間培養した。添加した培地を除去し、１ｍＬのPBSで３回洗浄した後に、５００μＬ４％PFA-PBSを添加し、室温で１５分間固定した。５００μＬのPBSで３回洗浄した後、５００μＬの細胞染色液を添加し、室温で１５分間染色した。５００μＬのPBSで３回洗浄した後、５００μＬのPBSを添加し、共焦点定量イメージングサイトメーターを用いてAlexa488標識EGFおよびHoechst33342から生じた蛍光を撮像した。そして、撮像画像を解析して、Alexa488標識EGFの移行状況を判定した。
【００８７】
４．判定結果
図５は、上記手順３で行われたAlexa488標識EGFの移行状況の判定の結果を示す図である。左端は、飢餓培地を添加した場合、すなわちAlexa488標識EGF濃度を０ｎｇ／ｍＬとして、刺激を加えていない場合を示している。中央は、Alexa488標識EGF濃度を２００ｎｇ／ｍＬとして、低刺激を加えた場合を示している。右端は、Alexa488標識EGF濃度を２０００ｎｇ／ｍＬとして、高刺激を加えた場合を示している。
【００８８】
各場合において、上記手順３で取得した撮像画像に基づいて、複数の細胞に対して細胞膜表面のＥＧＦＲが細胞膜内に移行したか否かを判定した。ＥＧＦＲが細胞膜内に移行していると判定した場合、当該細胞を陽性とした。そして、判定対象となった細胞のうち陽性の細胞数が占める割合、すなわち陽性率を求めた。図５に示すように、Alexa488標識EGF濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合、陽性率はほぼ０となった。Alexa488標識EGF濃度が２００ｎｇ／ｍＬの場合、陽性率は８８．４％となった。Alexa488標識EGF濃度が２０００ｎｇ／ｍＬの場合、陽性率は９６．８％となった。
【００８９】
このように、Alexa488標識EGF濃度が０ｎｇ／ｍＬの場合、すなわち刺激が加えられていない場合、ほぼ全ての細胞において、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行しないことが確認された。また、Alexa488標識EGF濃度が２０００ｎｇ／ｍＬの場合、すなわち高刺激が加えられた場合、９５％以上の細胞において、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行することが確認された。したがって、Alexa488標識EGF濃度を０ｎｇ／ｍＬとすることにより、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行していない細胞を作製できることが分かった。また、Alexa488標識EGF濃度を２０００ｎｇ／ｍＬとすることにより、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行している細胞を作製できることが分かった。
【００９０】
以下に示す実施形態１の検証では、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行していない細胞と、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行している細胞とを、上記事前確認の結果に基づいて作製し、ＥＧＦＲの細胞膜内移行の検証を行った。
【００９１】
＜実施形態１の検証＞
発明者らは、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行していない細胞と、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行している細胞とに対して、図１を参照して説明した実施形態１の手法によってＥＧＦＲの細胞膜内への移行の有無を判定した。
【００９２】
１．準備
細胞として、ヒト肺がん細胞株（A549）（JCRBより寄託）を用意した。刺激物質として、Alexa488標識EGF（Thermo Fisher Scientific:E13345）を用意した。この他、PRMI-1640培地（SIGMA:R8758-500ML）、ウシ胎仔血清（Hyclone:515-83582）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO:15240-062）、D-PBS(-)（Wako:045-29795）、パラホルムアルデヒド（Wako:160-16061）、Alexa647標識抗EGFR抗体（SantaCruz:SC-120 AF647）、PE標識抗EGFR抗体（SantaCruz:SC-120 PE）、ウシ血清アルブミン（Sigma:A7906-50G）、Triton-X（ナカライテスク:35501-15）を用意した。
【００９３】
Alexa647標識抗EGFR抗体は、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体を、蛍光物質であるAlexa647で標識したものである。この検証において、Alexa647標識抗EGFR抗体は、図３（ａ）〜（ｆ）に示す結合物質３１と標識物質３２とが結合したものに相当する。PE標識抗EGFR抗体は、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体を、蛍光物質であるPEで標識したものである。この検証において、PE標識抗EGFR抗体は、図３（ｃ）に示す結合物質４１と標識物質４２とが結合したものに相当する。
【００９４】
２．試薬調製
５００ｍＬのRPMI-1640培地に、５０ｍＬのウシ胎仔血清および５ｍＬのAntibiotic-Antimycoticを添加し、上記事前準備と同様、完全培地を作製した。５００ｍＬのRPMI-1640培地に、５００μＬのウシ胎仔血清および５ｍＬのAntibiotic-Antimycoticを添加し、上記事前準備と同様、飢餓培地を作製した。飢餓培地に終濃度４０００ｎｇ／ｍＬとなるようにAlexa488標識EGFを添加し、細胞培養培地（以下、「４０００ｎｇ／ｍＬ刺激培地」という）を作製した。パラホルムアルデヒドを終濃度４ｗ／ｖ％となるようにPBSで溶解した後に、ｐＨ７．４に調整した。ウシ血清アルブミンを終濃度１ｗ／ｖ％となるようにPBSで溶解したものを、以下、洗浄液とした。
【００９５】
３．手順
A549細胞株は、メーカー推奨プロトコルに準じて、完全培地にて培養した。購入後から継代回数３０回以内の細胞を用いた。A549細胞を培養している１５０ｃｍ２フラスコからアスピレーターを用いて完全培地を除去し、８ｍＬのPBSにて洗浄した。飢餓培地２０ｍＬを添加し、３時間飢餓処理を行った。セルスクレイパーにより細胞を剥離し、５０μｍメッシュに通し単細胞分散した。全量を５０ｍＬ遠沈管に移し、３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去し、細胞濃度が４×１０６／ｍＬとなるように飢餓培地で懸濁した。２５０μＬずつ１．７ｍＬチューブに添加し、それぞれのチューブに、２５０μＬの飢餓培地または２５０μＬの４０００ｎｇ／ｍＬ刺激培地を添加し、室温で１０分間培養した。これにより、４０００ｎｇ／ｍＬ刺激培地が添加されたチューブでは、Alexa488標識EGF濃度が２０００ｎｇ／ｍＬとなった。
【００９６】
３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去して１ｍＬの洗浄液を加える洗浄操作を２回繰り返した後、４％のPFA-PBSを５００μＬ添加し、室温で１５分間固定した。３００×ｇ５で分間遠心し、上清を除去して１ｍＬの洗浄液を加える洗浄操作を２回繰り返した後、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにPBSで調製したAlexa647標識抗EGFR抗体液を５００μＬ添加し、１５分間染色した。この手順は、図１に示す結合工程に対応する。３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去して１ｍＬの洗浄液を加える洗浄操作を２回繰り返した後、終濃度０．０５ｗ／ｖ％となるようにPBSで希釈したTriton-X溶液を５００μＬ添加し、１５分間膜透過処理を行った。この手順は、図１に示す透過処理工程に対応する。３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去して１ｍＬの洗浄液を加える洗浄操作を２回繰り返した後、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにPBSで調製したPE標識抗EGFR抗体液を５００μＬ添加し、１５分間染色した。この手順は、図１に示す標識工程に対応する。
【００９７】
３００×ｇで５分間遠心し、上清を除去して１ｍＬの洗浄液を加える洗浄操作を２回繰り返した後、３００μＬのPBSを添加し、汎用フローサイトメータの「BD Accuri」により、細胞から生じる蛍光を測定した。
【００９８】
細胞膜内のＥＧＦＲを標識するためのPE標識抗EGFR抗体から生じた蛍光に基づく信号は、実施形態１で説明した第１信号に対応する。細胞膜表面のＥＧＦＲを標識するためのAlexa647標識抗EGFR抗体から生じた蛍光に基づく信号は、実施形態１で説明した第２信号に対応する。第１情報を第１信号の波形の高さとし、第２情報を第２信号の波形の高さとした。そして、細胞におけるＥＧＦＲの移行状況を示す情報として、移行比率、移行差、および移行値を取得した。
【００９９】
４．検証結果
図６（ａ）〜（ｆ）は、実施形態１の検証結果を示す図である。図６（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、実施形態１の検証の手順３で得られた移行比率、移行差、および移行値を示す図である。図６（ａ）〜（ｃ）において、グラフの左側は、Alexa488標識EGF濃度を０ｎｇ／ｍＬとし刺激を加えていない細胞群を示しており、グラフの右側は、Alexa488標識EGF濃度を２０００ｎｇ／ｍＬとし十分な刺激を加えた細胞群を示している。図６（ａ）〜（ｃ）のグラフにおいて、各細胞におけるＥＧＦＲの移行状況を示す情報は、縦方向に延びた箱ひげ図によって示されている。箱ひげ図において、上端と下端は、それぞれ最大値と最小値を示しており、箱部分の横線は中央値を示している。箱部分の上端から最大値までの間には、全細胞の１／４が含まれ、箱部分の下端から最小値までの間には、全細胞の１／４が含まれる。
【０１００】
図６（ａ）に示すように、ＥＧＦＲの移行状況を示す情報を移行比率とした場合、刺激なしの細胞の分布と刺激ありの細胞の分布に、違いが見られた。図６（ｂ）に示すように、ＥＧＦＲの移行状況を示す情報を移行差とした場合も、刺激なしの細胞の分布と刺激ありの細胞の分布に、違いが見られた。図６（ｃ）に示すように、ＥＧＦＲの移行状況を示す情報を移行値とした場合も、刺激なしの細胞の分布と刺激ありの細胞の分布に、違いが見られた。
【０１０１】
したがって、図６（ａ）〜（ｃ）の場合、カットオフを設定することにより、各細胞を、刺激なしの細胞と刺激ありの細胞のいずれかに適正に分類できることが分かった。言い換えれば、図６（ａ）〜（ｃ）の場合、各細胞を、ＥＧＦＲが細胞膜内に移行していない細胞とＥＧＦＲが細胞膜内に移行している細胞のいずれかに適正に分類できることが分かった。
【０１０２】
また、図６（ａ）〜（ｃ）のグラフにおいて、所定の閾値は、所定の閾値により各細胞を分類した場合に、感度と特異度が最大となるように設定された。たとえば、図６（ａ）の場合、感度と特異度が最大となるよう所定の閾値ｔｈ１を設定すると、図６（ｄ）に示すように、所定の閾値ｔｈ１すなわちカットオフは１．０となった。このとき、ＡＵＣ（Area Under the Curve）は０．９８６、感度は９７．８％、特異度は８４．３％となった。
【０１０３】
また、図６（ｂ）の場合、感度と特異度が最大となるよう所定の閾値ｔｈ２を設定すると、図６（ｅ）に示すように、所定の閾値ｔｈ２すなわちカットオフは３１７．８３２となった。このとき、ＡＵＣは０．９８６、感度は９８．６％、特異度は９１．３％となった。また、図６（ｃ）の場合、感度と特異度が最大となるよう所定の閾値ｔｈ３を設定すると、図６（ｆ）に示すように、所定の閾値ｔｈ３すなわちカットオフは５９６．４となった。このとき、ＡＵＣは０．９２５、感度は８４．１％、特異度は８７．２％となった。
【０１０４】
図６（ｄ）〜（ｆ）に示すように、移行比率、移行差、および移行値の何れが用いられたとしても、感度と特異度を十分高い値に設定できることが分かった。したがって、細胞における受容体の移行状況を示す情報として、移行比率、移行差、および移行値のいずれを用いても、細胞における受容体の内部移行の状況を精度よく検出できることが分かった。また、図６（ｄ）〜（ｆ）に示すように、移行比率と移行差が用いられた場合、いずれもＡＵＣが０．９８６となり、移行値が用いられた場合に比べてＡＵＣが高くなった。このことから、細胞における受容体の移行状況を示す情報として、移行比率と移行差を用いれば、高い精度で細胞における受容体の内部移行の状況を検出できることが分かった。
【０１０５】
なお、第１情報および第２情報を信号波形の面積とした場合も、以下に示すように、対象細胞を刺激なしの細胞と刺激ありの細胞のいずれかに分類できる。
【０１０６】
図７（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、第１情報および第２情報を信号波形の面積とした場合の移行比率と移行差を示す図である。図７（ａ）に示す場合も、刺激なしの細胞の分布と刺激ありの細胞の分布に、違いが見られた。同様に、図７（ｂ）に示す場合も、刺激なしの細胞の分布と刺激ありの細胞の分布に、違いが見られた。したがって、第１情報および第２情報を信号波形の面積とし、移行比率と移行差を用いる場合も、カットオフを設定することにより、各細胞を刺激なしの細胞と刺激ありの細胞のいずれかに適正に分類できることが分かった。よって、信号波形の面積を用いる場合も、受容体の内部移行の状況を検出できることが分かった。
【０１０７】
＜実施形態１の装置構成＞
実施形態１の細胞情報取得方法に基づく細胞情報取得装置の構成について説明する。
【０１０８】
図８に示すように、細胞情報取得装置１００は、制御部１１０と、記憶部１２０と、試料調製部１３０と、フローサイトメータ１４０と、信号処理部１５０と、表示部１６０と、入力部１７０と、を備える。
【０１０９】
制御部１１０は、マイクロコンピュータ、ＣＰＵなどにより構成される。記憶部１２０は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスクなどにより構成される。記憶部１２０は、制御部１１０によって実行される処理プログラムや、信号値や数値などの各種データを記憶する。制御部１１０は、細胞情報取得装置１００の各部との間で信号の送受信を行い、各部を制御する。
【０１１０】
試料調製部１３０は、検体１０１に含まれる細胞と、試料調製部１３０に接続された試薬とに基づいて、図１のステップＳ１１〜Ｓ１３に従って、ステップＳ１１〜Ｓ１３の各工程を経た細胞を含む試料を調製する。フローサイトメータ１４０は、図１のステップＳ１４〜Ｓ１６に従って、フローセル２００に試料を流し、フローセル２００を流れる試料に光源２１１、２１２からの光を照射し、標識物質３２、４２から生じた蛍光を受光部２２１、２２２により受光し、標識物質４２から生じた蛍光に基づく第１信号および標識物質３２から生じた蛍光に基づく第２信号を出力する。フローサイトメータ１４０の詳細な構成については、追って図９を参照して説明する。
【０１１１】
信号処理部１５０は、信号の処理を行うための回路により構成される。信号処理部１５０は、フローサイトメータ１４０から出力された第１信号および第２信号の波形から、細胞ごとに第１情報および第２情報を取得する。制御部１１０は、信号処理部１５０により取得された第１情報および第２情報に基づいて、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報を算出する。このように、図１のステップＳ１７は、信号処理部１５０と制御部１１０とによって実行される。
【０１１２】
制御部１１０は、図１のステップＳ１８に従って、細胞ごとに取得した受容体１２の移行状況を示す情報に基づいて、受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定し、細胞膜内移行の有無に基づいて、細胞に対する細胞外刺激の有無を判定する。制御部１１０は、図１のステップＳ１９に従って、判定結果に関する情報を、表示部１６０に表示する。表示部１６０は、ディスプレイにより構成される。また、制御部１１０は、入力部１７０を介してオペレータからの入力を受け付ける。入力部１７０は、マウス、キーボード、タッチパネルなどにより構成される。
【０１１３】
図９に示すように、フローサイトメータ１４０は、光源２１１、２１２と、受光部２２１、２２２と、集光レンズ２３１〜２３５と、ダイクロイックミラー２４１、２４２と、ミラー２５１と、フィルタ２５２と、を備える。フローセル２００には流路２０１が形成されており、流路２０１には、試料調製部１３０により調製された試料が流される。
【０１１４】
光源２１１、２１２は、半導体レーザ光源により構成される。光源２１１、２１２から出射される光は、それぞれ、波長λ１１、λ１２のレーザ光である。波長λ１１は、細胞膜内の受容体１２を標識するための標識物質４２から蛍光を励起させるための光の波長である。波長λ１２は、細胞膜表面の受容体１２を標識するための標識物質３２から蛍光を励起させるための光の波長である。波長λ１１と波長λ１２は、互いに異なる波長である。
【０１１５】
集光レンズ２３１、２３２は、それぞれ、光源２１１、２１２から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー２４１は、波長λ１１の光を反射し、波長λ１２の光を透過する。ダイクロイックミラー２４１により反射された波長λ１１の光と、ダイクロイックミラー２４１を透過した波長λ１２の光は、互いに重なった状態で、流路２０１を流れる試料に照射される。これにより、１つの細胞から、標識物質３２、４２に基づく蛍光を同時に生じさせることができる。
【０１１６】
流路２０１を流れる試料に波長λ１１の光が照射されると、標識物質４２から波長λ２１の蛍光が生じる。流路２０１を流れる試料に波長λ１２の光が照射されると、標識物質３２から波長λ２２の蛍光が生じる。集光レンズ２３３は、流路２０１を流れる試料から生じた波長λ２１、λ２２の蛍光を集光する。ミラー２５１は、集光レンズ２３３により集光された蛍光を反射する。フィルタ２５２は、波長λ２１、λ２２の蛍光を透過し、不要な光を遮断する。ダイクロイックミラー２４２は、波長λ２１の蛍光を反射し、波長λ２２の蛍光を透過する。集光レンズ２３４、２３５は、それぞれ、波長λ２１、λ２２の蛍光を集光する。
【０１１７】
受光部２２１は、波長λ２１の蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じた信号を第１信号として出力する。受光部２２２は、波長λ２２の蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じた信号を第２信号として出力する。受光部２２１、２２２は、たとえば光検出器であり、具体的には光電子増倍管（Photomultiplier Tube）により構成される。第１信号は、受光部２２１により出力される電流や電圧等の波形状の電気信号であり、第２信号は、受光部２２２により出力される電流や電圧等の波形状の電気信号である。こうして、フローサイトメータ１４０は、標識物質４２に基づく第１信号と、標識物質３２に基づく第２信号とを出力する。
【０１１８】
図１０に示すように、図１のステップＳ１９に示す表示工程において、制御部１１０は、表示部１６０に画面３１０を表示する。画面３１０は、リスト３１１〜３１３を備える。
【０１１９】
リスト３１１は、細胞を個別に識別するための通し番号と、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報と、細胞における受容体１２の細胞膜内移行の有無と、を表示する。リスト３１１の右側には、リスト３１１の表示内容をスクロールさせるためのスクロールバー３１１ａが設けられている。オペレータは、スクロールバー３１１ａを操作することにより、リスト３１１の表示領域に、全ての細胞に関する移行状況を示す情報および細胞内移行の有無を表示させることができる。リスト３１２は、細胞膜内移行の有無を判定した細胞数と、細胞膜内移行ありと判定した細胞数と、細胞膜内移行ありと判定した細胞の割合と、を表示する。リスト３１３は、細胞外刺激の有無を表示する。オペレータは、画面３１０を参照することにより、リスト３１１〜３１３に表示された各情報を、円滑かつ視覚的に把握できる。
【０１２０】
ここで、上述したように、結合物質４１が認識する受容体１２の部位は、結合物質３１が認識する受容体１２の部位と同じとされた。しかしながら、これに限らず、結合物質４１が認識する受容体１２の部位は、結合物質３１が認識する受容体１２の部位と異なっていてもよい。このような変更例では、図１のステップＳ１３の標識工程が行われると、結合物質３１は、図３（ｃ）、（ｆ）に示す場合と同様、細胞膜表面の受容体１２にだけ結合するが、結合物質４１は、細胞膜内の受容体１２だけでなく、細胞膜表面の受容体１２にも結合する。すなわち、細胞膜内の受容体１２と細胞膜表面の受容体１２の両方が、標識物質４２により標識されることになる。
【０１２１】
この変更例では、細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質４２から生じた蛍光と、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質４２から生じた蛍光とが、受光部２２１に入射する。また、細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質３２から生じた蛍光は、上記実施形態１と同様、受光部２２２に入射する。したがって、この変更例では、細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質４２から生じた蛍光に基づく信号と、細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質３２から生じた蛍光に基づく信号とが同レベルとなるように、受光部２２１、２２２の出力信号をあらかじめ調整しておく。そして、受光部２２１の出力信号から受光部２２２の出力信号を減算した減算信号を取得すれば、減算信号は、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質４２から生じた蛍光に基づく信号、すなわち第１信号となる。よって、この変更例においても、上記実施形態１と同様に、ステップＳ１７以降の処理工程を行って同様の効果を得ることができる。
【０１２２】
＜実施形態２＞
実施形態２では、結合工程において、細胞膜表面の受容体１２をブロックすることにより、細胞膜内の受容体１２のみを標識する。図１１に示すように、実施形態２の処理工程では、図１に示す実施形態１の処理工程と比較して、ステップＳ１１に代えてステップＳ２１が追加される。
【０１２３】
以下、実施形態２の処理工程について、図１２（ａ）〜（ｆ）を適宜参照しながら説明する。図１２（ａ）〜（ｃ）は、細胞１０に刺激が加えられたことにより受容体１２が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す図である。図１２（ｄ）〜（ｆ）は、細胞１０に刺激が加えられておらず受容体１２が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す図である。
【０１２４】
ステップＳ２１において、オペレータは、細胞膜表面の受容体１２をブロックする結合工程を行う。具体的には、オペレータは、図１２（ａ）、（ｄ）に示すように、細胞１０と結合物質３１とを接触させて、細胞膜表面の受容体１２と結合物質３１とを結合させる。結合物質３１は、実施形態１と同様に構成される。ただし、実施形態２の結合物質３１は、実施形態１とは異なり、標識物質３２により標識されていない。ステップＳ２１の結合工程により、結合物質３１が結合した細胞膜表面の受容体１２は、後続するステップＳ１３の標識工程において、結合物質４１が結合しない状態となる。
【０１２５】
ステップＳ１２において、オペレータは、実施形態１と同様、細胞膜１１の透過処理を行う。これにより、図１２（ａ）、（ｄ）に示す細胞１０の細胞膜１１は、それぞれ、図１２（ｂ）、（ｅ）において破線で示すように透過状態とされる。
【０１２６】
ステップＳ１３において、オペレータは、実施形態１と同様、細胞膜内の受容体１２を標識する標識工程を行う。受容体１２が細胞膜内に移行している細胞１０の場合、ステップＳ１３の標識工程により、図１２（ｃ）に示すように、細胞膜内の受容体１２は、結合物質４１を介して標識物質４２により標識される。一方、受容体１２が細胞膜内に移行していない細胞１０の場合、図１２（ｆ）に示すように、細胞膜内は標識物質４２により標識されない。ここで、実施形態２では、ステップＳ２１においてあらかじめ細胞膜表面の受容体１２がブロックされているため、ステップＳ１３において、細胞膜表面の受容体１２が標識されることがない。これにより、細胞膜内の受容体１２のみが標識される。
【０１２７】
ステップＳ１４〜Ｓ１６において、オペレータは、実施形態１と同様、フローサイトメトリー法により、標識物質４２から生じた蛍光に基づく第１信号を取得する工程を行う。第１信号の取得は、実施形態１と同様に行われる。
【０１２８】
実施形態２のステップＳ２１、Ｓ１２〜Ｓ１６によれば、実施形態１と同様、細胞膜内の受容体１２に基づく第１信号を取得できる。したがって、実施形態２においても、第１信号に基づいて、細胞において受容体１２が細胞膜内へ移行している状況を効率よく検出できる。ただし、実施形態２では、細胞膜表面の受容体１２に基づく第２信号が取得されないため、実施形態１のように、第１信号と第２信号の両方に基づいて移行状況を検出することができない。移行状況を精度よく検出するためには、実施形態１のように、第１信号と第２信号の両方を取得するのが望ましい。
【０１２９】
ステップＳ１７において、解析装置は、ステップＳ１６において取得された第１信号に基づいて、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報を取得する情報取得工程を行う。具体的には、解析装置は、細胞ごとに、第１信号の波形から第１情報を取得する。第１情報は、実施形態１と同様、第１信号の波形の高さである。そして、解析装置は、細胞における受容体１２の移行状況を示す情報として、移行値を取得する。移行値は、実施形態１と同様、第１情報である。実施形態２においても、実施形態１と同様、移行値に基づいて受容体１２の移行状況を検出できる。
【０１３０】
なお、実施形態２においても、第１情報は、第１信号の波形の面積や幅でもよい。ただし、実施形態１で説明したように、第１信号の波形の高さは、細胞膜内において凝集した受容体１２を反映しているため、第１情報は、第１信号の波形の高さであるのが望ましい。
【０１３１】
ステップＳ１８において、解析装置は、ステップＳ１７において取得した移行値に基づいて、細胞ごとに、受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定する判定工程を行う。移行値に基づく判定は、実施形態１と同様に行われる。さらに、ステップＳ１８の判定工程において、解析装置は、実施形態１と同様に細胞外刺激の有無を判定する。また、ステップＳ１９において、解析装置は、実施形態１と同様に表示工程を行う。
【０１３２】
なお、実施形態２の装置構成は、実施形態１と同様である。ただし、実施形態２の試料調製部１３０は、図１１に示すステップＳ２１、Ｓ１２、Ｓ１３の処理工程を行う。また、実施形態２では、第２信号の取得が行われないため、図９において、光源２１２と受光部２２２は省略可能である。
【０１３３】
＜実施形態３＞
実施形態３では、細胞膜内の生理環境において蛍光を生じる標識物質を用いることにより、細胞膜内の受容体１２のみを標識する。図１３に示すように、実施形態３の処理工程では、図１１に示す実施形態２の処理工程と比較して、ステップＳ２１が省略され、ステップＳ１３に代えて、ステップＳ３１が追加される。
【０１３４】
以下、実施形態３の処理工程について、図１４（ａ）〜（ｅ）を適宜参照しながら説明する。図１４（ａ）〜（ｃ）は、細胞１０に刺激が加えられたことにより受容体１２が内部移行している細胞について処理を行った状態を示す図である。図１４（ｄ）、（ｅ）は、細胞１０に刺激が加えられておらず受容体１２が内部移行していない細胞について処理を行った状態を示す図である。
【０１３５】
ステップＳ１２において、オペレータは、実施形態２と同様、細胞膜１１の透過処理を行う。これにより、刺激が加えられている細胞１０の細胞膜１１と、刺激が加えられていない細胞１０の細胞膜１１は、それぞれ、図１４（ａ）、（ｄ）において破線で示すように透過状態とされる。
【０１３６】
ステップＳ３１において、オペレータは、結合物質５１を用いて受容体１２を標識する標識工程を行う。具体的には、オペレータは、図１４（ｂ）、（ｅ）に示すように、標識物質５２で標識された結合物質５１を、細胞１０に接触させて、細胞膜表面の受容体１２と結合物質５１とを結合させる。結合物質５１は、実施形態１の結合物質３１、４１と同様、受容体１２に結合可能な物質である。また、このとき、細胞膜１１は透過状態となっているため、標識物質５２で標識された結合物質５１は、細胞膜１１を透過して細胞膜内に入る。これにより、図１４（ｃ）に示すように、細胞膜内の受容体１２と結合物質５１とが結合する。こうして、細胞膜表面の受容体１２と細胞膜内の受容体１２とが、結合物質５１を介して標識物質５２により標識される。
【０１３７】
ここで、標識物質５２は、細胞膜内の生理環境において蛍光を生じるよう構成されている。具体的には、標識物質５２は、細胞膜内のｐＨにおいて蛍光を生じるように構成されている。細胞膜内のｐＨは、一般的には約６．８〜７．４の範囲にある。また、細胞外のｐＨは、試料の調製に用いる試薬の組成などにより、たとえば６以下または８以上とされる。これにより、標識物質５２は、細胞膜内に取り込まれると、蛍光を生じる状態となり、細胞膜内に取り込まれていないと、蛍光を生じない状態となる。よって、ステップＳ３１の標識工程により、細胞膜表面の受容体１２を標識する標識物質５２は蛍光を生じない状態となり、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質５２のみが蛍光を生じる状態となる。
【０１３８】
なお、細胞膜内の生理環境において蛍光を生じる標識物質５２は、細胞膜内のｐＨにおいて光を生じるよう構成されることに限らない。細胞膜内の生理環境において蛍光を生じる標識物質５２は、細胞膜内の温度や細胞膜内の酸素分圧において蛍光を生じるよう構成されてもよく、細胞膜内の物質、たとえばエステラーゼと反応することにより蛍光を生じるよう構成されてもよい。
【０１３９】
ステップＳ１４〜Ｓ１６において、オペレータは、実施形態２と同様、フローサイトメトリー法により、標識物質５２から生じた蛍光に基づく信号を取得する工程を行う。図１４（ｃ）に示すように、刺激が加えられている細胞１０の場合、細胞膜内の受容体１２を標識する標識物質５２からのみ蛍光が生じる。図１４（ｅ）に示すように、刺激が加えられていない細胞１０の場合、蛍光が生じない。したがって、標識物質５２から生じた蛍光に基づく信号によれば、受容体１２の細胞膜内への移行状況を確実に検出できる。ステップＳ１７〜Ｓ１９の処理工程は、実施形態２のステップＳ１７〜Ｓ１９と同様に行われる。
【０１４０】
なお、ステップＳ１２において細胞膜１１の透過処理が行われると、細胞は死んだ状態に移行する。しかしながら、細胞膜内のｐＨと細胞外のｐＨの違いにより、細胞膜内の受容体１２のみが蛍光を生じる状態となるためには、細胞が生きている状態を維持する必要がある。したがって、ステップＳ１２の透過処理の工程と、ステップＳ３１の標識工程と、ステップＳ１４〜Ｓ１６の工程とにおいて、できるだけ細胞が生きている状態が維持されるよう、たとえば各工程を迅速に行う必要がある。
【０１４１】
なお、実施形態３の装置構成は、実施形態２と同様である。すなわち、光源２１２と受光部２２２は省略される。実施形態３では、光源２１１から出射される光により、標識物質５２から蛍光が励起される。受光部２２１は、標識物質５２から生じた蛍光を受光し、標識物質５２から生じた蛍光の強度に基づく信号を出力する。試料調製部１３０は、図１３に示すステップＳ１２、Ｓ３１の処理工程を行う。
【０１４２】
＜実施形態４＞
実施形態４では、フローサイトメトリー法に基づいて、信号の取得とともに、細胞の画像を取得する。図１５に示すように、実施形態４の処理工程は、図１に示す実施形態１と比較して、ステップＳ１６の後段にステップＳ４１が追加される。
【０１４３】
図１５に示すように、実施形態４のステップＳ１４〜Ｓ１６において、オペレータは、フローサイトメトリー法により、第１信号および第２信号を取得する工程を行う。そして、ステップＳ４１において、オペレータは、フローサイトメータを用いて、細胞の画像を取得する工程を行う。
【０１４４】
具体的には、フローサイトメータは、標識物質３２、４２から生じた蛍光を受光部により受光しつつ、同時にフローセルの流路を流れる試料に含まれる細胞を撮像部により撮像する。フローサイトメータの受光部は、第１信号と第２信号を出力し、フローサイトメータの撮像部は、細胞ごとに、標識物質３２から生じた蛍光に基づく蛍光画像と、標識物質４２から生じた蛍光に基づく蛍光画像と、明視野画像とを出力する。こうして、オペレータは、フローサイトメータを用いることにより、第１信号と、第２信号と、細胞画像とを取得する。
【０１４５】
ステップＳ１７、Ｓ１８の処理工程は、実施形態１のステップＳ１７、Ｓ１８と同様に行われる。ステップＳ１９では、解析装置は、実施形態１と同様の情報に加えて、細胞ごとに取得した細胞画像を表示部に表示する。
【０１４６】
このように細胞画像が取得されると、たとえば、細胞における受容体１２の移行状況を、細胞画像を参照して確認できる。また、各細胞における受容体１２の細胞膜内移行の有無を、画像を解析することにより判定することもできる。ただし、画像解析により受容体１２の細胞膜内移行の有無を判定しようとすると、大量のサンプルを処理する場合、膨大な数の細胞について画像解析を行う必要が生じる。この場合、画像解析を行う解析装置に過大な負荷がかかってしまう。したがって、細胞における受容体１２の移行状況の検出は、第１信号および第２信号を用いて行われるのが望ましい。
【０１４７】
実施形態４の装置構成は、実施形態１と比較して、フローサイトメータ１４０内に撮像部が追加されている。具体的には、図１６に示すように、フローサイトメータ１４０は、図９に示す構成と比較して、ミラー２５１に代えてハーフミラー２５３を備え、さらに光源２１３と、集光レンズ２３６、２３７と、光学ユニット２５４と、撮像部２２３と、を備える。以下、実施形態１の装置構成と異なる部分について説明する。
【０１４８】
光源２１３は、半導体レーザ光源により構成される。光源２１３から出射される光は、波長λ１３のレーザ光である。波長λ１３は、波長λ１１および波長λ１２とは異なる波長である。集光レンズ２３６は、光源２１３から出射された光を集光する。波長λ１１〜λ１３の光は、互いに重なった状態で、流路２０１を流れる試料に照射される。試料に波長λ１３の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１３の光は、明視野画像の生成に用いられる。
【０１４９】
細胞を透過した波長λ１３の光は、集光レンズ２３３により集光される。ハーフミラー２５３は、集光レンズ２３３を透過した光の半分を透過し、半分をフィルタ２５２へと反射させる。光学ユニット２５４は、３枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット２５４の３枚のダイクロイックミラーは、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部２２３の受光面上において分離させる。集光レンズ２３７は、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを集光する。撮像部２２３は、たとえば、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部２２３は、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを受光して、波長λ２１、λ２２の蛍光にそれぞれ対応する蛍光画像と、波長λ１３の光に対応する明視野画像とを、細胞画像として出力する。
【０１５０】
図１７に示すように、実施形態４では、図１５のステップＳ１９に示す表示工程において、制御部１１０は、表示部１６０に画面３２０を表示する。画面３２０は、図１０に示す実施形態１の画面３１０と比較して、リスト３１１に、波長λ２１の蛍光に基づく蛍光画像３２１と、波長λ２２の蛍光に基づく蛍光画像３２２と、波長λ１３の光に基づく明視野画像３２３とを、細胞画像として表示する。蛍光画像３２１、３２２と明視野画像３２３は、リスト３１１において、各細胞に対応して表示される。この場合も、オペレータは、スクロールバー３１１ａを操作することにより、リスト３１１の表示領域に、全ての細胞に関する移行状況を示す情報、細胞内移行の有無、および細胞画像を表示させることができる。実施形態４においても、オペレータは、画面３１０を参照することにより、リスト３１１〜３１３に表示された細胞画像を含む各情報を、円滑かつ視覚的に把握できる。
【符号の説明】
【０１５１】
１０  細胞
１１  細胞膜
１２  受容体
２０  リガンド
３１、４１、５１  結合物質
３２、４２、５２  標識物質
１００  細胞情報取得装置
１３０  試料調製部
１４０  フローサイトメータ
２００  フローセル
２０１  流路
２１１、２１２  光源
２２１、２２２  受光部
３２１、３２２  蛍光画像
３２３  明視野画像
【図１】
2018072095.tif 000003
【図２】
2018072095.tif 000004
【図３】
2018072095.tif 000005
【図４】
2018072095.tif 000006
【図５】
2018072095.tif 000007
【図６】
2018072095.tif 000008
【図７】
2018072095.tif 000009
【図８】
2018072095.tif 000010
【図９】
2018072095.tif 000011
【図１０】
2018072095.tif 000012
【図１１】
2018072095.tif 000013
【図１２】
2018072095.tif 000014
【図１３】
2018072095.tif 000015
【図１４】
2018072095.tif 000016
【図１５】
2018072095.tif 000017
【図１６】
2018072095.tif 000018
【図１７】
2018072095.tif 000019
【図１８】
2018072095.tif 000020