(57)【要約】【課題】ケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現促進剤を提供する。【解決手段】  フィチン酸を有効成分とするケラチン５遺伝子発現促進剤。フィチン酸を有効成分とするケラチン１０遺伝子発現促進剤。フィチン酸を有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤。フィチン酸を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィチン酸を有効成分とするケラチン５遺伝子発現促進剤。
【請求項２】
フィチン酸を有効成分とするケラチン１０遺伝子発現促進剤。
【請求項３】
フィチン酸を有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤。
【請求項４】
フィチン酸を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィチン酸を有効成分とするケラチン５遺伝子発現促進剤に関する。また、フィチン酸を有効成分とするケラチン１０遺伝子発現促進剤に関する。また、フィチン酸を有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤に関する。また、フィチン酸を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、温度、紫外線、物理的な衝撃といった外部刺激から生体を保護する機能や、生体内の水分蒸発を防ぐ保湿機能を有しており、生命活動に重要な役割を果たしている。皮膚は皮下組織、真皮、及び表皮の３層から構成され、表皮は内側から基底層、有棘層、顆粒層、角層の４層から構成される。中でも最外層を構成する角層は生体を強力に被覆し、侵入物に対する防御や水分の保持という役割を担っている。
【０００３】
表皮では、表皮角化細胞が基底層から、有棘層、顆粒層、及び角層へと分化・成熟しながら移行し、最終的には垢として剥がれ落ちる。表皮角化細胞が基底膜から角層まで移行することを角化という。また、表皮角化細胞の基底層での分裂から剥離するまでの表皮の生まれ変わりは、一般的にターンオーバーと呼ばれる。皮膚のターンオーバーを促進することで表皮角化細胞を新しく且つ正常な状態に保つことができ、その結果、皮膚バリア機能が向上する。
【０００４】
表皮角化細胞は角化の各過程において、種々のたんぱく質や酵素を産生しながら分化・成熟することが知られている。例えば、基底層ではケラチン５等、有棘層ではケラチン１０及びトランスグルタミナーゼ等、顆粒層ではロリクリン等が産生されており、これらをコードする遺伝子は、表皮角化細胞の分化に関連するマーカーとして知られている。
【０００５】
フィチン酸は玄米等の穀類に多く含まれる有機リン酸化合物である。フィチン酸はシグナル伝達物質としても知られ、その他にも血小板凝集を減少させることによる、血栓症やアテローム性動脈硬化症の予紡効果等様々な報告がなされている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｏｒｋ  Ｊ．  Ｄ．，  Ｏｄｏｍ  Ａ．  Ｒ．，  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｒ．，  Ｉｖｅｓ  Ｅ．  Ｂ．，  Ｗｅｎｔｅ  Ｓ．  Ｒ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  ９６−１００  （１９９９）．
【非特許文献２】Ｖｕｃｅｎｉｋ  Ｉ．，  Ｐｏｄｃｚａｓｙ  Ｊ．  Ｊ．，  Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎ  Ａ．  Ｍ．，  Ａｎｔｉｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９，  ３６８９−３６９３  （１９９９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、フィチン酸の生理機能に関する研究は盛んに行われている。しかしながら、フィチン酸が表皮角化細胞の分化等に関連する遺伝子であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を促進することについては知られていなかった。
【０００８】
よって、本発明の目的は、ケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現促進剤を提供することである。また、これらの遺伝子の発現を促進することにより、表皮角化細胞の角化促進、ターンオーバーの促進、皮膚バリア機能を強化させることが可能な促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の様な事情に鑑み、本発明者らは皮膚のターンオーバーのメカニズムに着目して鋭意研究を重ねた結果、フィチン酸が表皮角化細胞の分化に関連する特定の遺伝子の発現を促進することを見出して本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、フィチン酸を有効成分とするケラチン５遺伝子発現促進剤を提供する。また、フィチン酸を有効成分とするケラチン１０遺伝子発現促進剤を提供する。また、フィチン酸を有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤を提供する。また、フィチン酸を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、表皮角化細胞の分化に関連する遺伝子（以下、単に「分化関連遺伝子」と称することがある）であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を促進する剤（発現促進剤）を提供することができる。また、前記の促進剤は表皮角化細胞の分化を促進することが可能であるため、ターンオーバーの促進、皮膚バリア機能の強化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】フィチン酸によるケラチン５遺伝子の発現量を示すグラフである
【図２】フィチン酸によるケラチン１０遺伝子の発現量を示すグラフである
【図３】フィチン酸によるロリクリン遺伝子の発現量を示すグラフである
【図４】フィチン酸によるトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現量を示すグラフである
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、フィチン酸を有効成分とするケラチン５遺伝子発現促進剤、フィチン酸を有効成分とするケラチン１０遺伝子発現促進剤、フィチン酸を有効成分とするロリクリン遺伝子発現促進剤、及びフィチン酸を有効成分とするトランスグルタミナーゼ遺伝子発現促進剤に関する。なお、これらの遺伝子発現促進剤を「本発明の促進剤」と称する場合がある。また、ケラチン５遺伝子を単に「Ｋ５」と、ケラチン１０遺伝子を単に「Ｋ１０」と、ロリクリン遺伝子を単に「ＬＯＲ」と、トランスグルタミナーゼ遺伝子を単に「ＴＧａｓｅ」と称することがある。
【００１４】
本発明の促進剤は、フィチン酸を有効成分とすることを特徴とする。フィチン酸は、ＩＮＣＩ名（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１６版，第２巻，２０１６年，ｐ．２７２４）で「Ｐｈｙｔｉｃ  Ａｃｉｄ」と表記される化合物である。フィチン酸は塩を形成していても良く、フィチン酸塩としては、例えば、フィチン酸ナトリウム、フィチン酸カリウム等のフィチン酸アルカリ金属塩等が挙げられる。フィチン酸は市販品を用いることもでき、例えば、商品名「フィチン酸」（築野ライスファインケミカルズ（株）製）、商品名「５０％フィチン酸溶液」（和光純薬工業（株）製）が挙げられる。
【００１５】
本発明の促進剤は表皮角化細胞の分化関連遺伝子であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現を促進する。本発明の促進剤は、経口、注射、外用のいずれでも効能を発揮するが、外用剤に配合して用いられることが好ましく、特に皮膚外用剤に配合して用いられることがより好ましい。皮膚外用剤には、皮膚用化粧料、皮膚洗浄剤、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１６】
本発明の促進剤を含有する外用剤の剤形は特に限定されないが、例えば、液状、ミスト状、霧状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ワックス状、フォーム状等の各種剤形に調製して使用できる。また、前記外用剤は、所望の効果の発現が阻害されない範囲であれば、例えば、水、低級アルコール、多価アルコール、糖アルコール、紫外線吸収剤、香料、防腐剤、キレート剤、抗菌剤、酸化防止剤、保湿剤、清涼剤、ビタミン類、界面活性剤、油性原料、カチオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、両性ポリマー、アニオン性ポリマー、植物抽出液、噴射剤、ｐＨ調整剤、アミノ酸、抗炎症剤、収斂剤、色素、増粘剤等のその他の成分と混合し、攪拌すること等により調製することができる。具体的には、化粧水、柔軟化粧品、収れん化粧水、ふき取り用化粧水、アフターシェーブローション、スキンローション、スキンクリーム、マッサージクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、ミルキーローション、リップクリーム、洗顔料、シェービングフォーム、シェービングクリーム、ボディソープ、乳液類、制汗剤、デオドラント剤などの種々の形態の外用剤とすることができ、製剤化については、一般に知られている方法により製造すればよい。
【００１７】
本発明の促進剤を外用剤（特に皮膚外用剤）に使用する場合、外用剤におけるフィチン酸の濃度はその使用態様に応じて適宜調整されるが、遺伝子の発現促進の観点からは０．０１ｍＭ以上であることが好ましく、０．０５〜３．０ｍＭであることが好ましく、０．１〜２．０ｍＭであることが更に好ましい。
【００１８】
本発明の促進剤を外用剤（特に皮膚外用剤）に使用する場合、フィチン酸の配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、遺伝子の発現促進の観点からは、外用剤全体に対して０．０００６質量％以上配合することが好ましく、０．００３〜０．２質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００６〜０．１５質量％の範囲で配合することが更に好ましい。
【００１９】
本発明の促進剤は、分化関連遺伝子であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、特に好ましくは全ての遺伝子の発現を促進する剤である。
【実施例】
【００２０】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２１】
［使用試薬］
本実施例にて用いた、エタノール、クロロホルム、２−プロパノール、Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（ＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒ）、及び５０％フィチン酸溶液は和光純薬工業（株）より購入した。また、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃａ  ａｎｄ  Ｍｇ（ＰＢＳ（−））、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｐｌｕｓ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔはタカラバイオ（株）より購入した。また、Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＮＨＥＫ；正常ヒト表皮角化細胞）、ＮＨＥＫ培養培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２特注ＧＣ別添）は倉敷紡績（株）より購入した。
【００２２】
［遺伝子発現量測定］
ＮＨＥＫを、３７℃、５％ＣＯ2の条件下でＮＨＥＫ培養培地を用いて培養した。得られたＮＨＥＫを、ＮＨＥＫ培養培地が２ｍＬ注入された６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＧｍｂＨ）に４．０×１０5細胞／ウェルとなるように播種し、８０％コンフルエントになるまで培養した。これに培地中のフィチン酸濃度が０．０５、０．１、１．０、及び５．０ｍＭとなるようにフィチン酸（５０％フィチン酸溶液をＮＨＥＫ培養培地で１０ｍＭに希釈したもの）をそれぞれ添加し、４８時間追培養後に総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの逆転写後、リアルタイムＰＣＲによりＫ５、Ｋ１０、ＬＯＲ、及びＴＧａｓｅの遺伝子発現量を測定・算出し、その結果を図１〜４に記載した。なお、フィチン酸を添加することなく同様の操作を行ったものをコントロールとした。ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、リアルタイムＰＣＲ等の操作については、以下の通りに行った。
【００２３】
（ＲＮＡ抽出）
ＮＨＥＫをＰＢＳ（−）により洗浄した後、２５０μＬのＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓを添加し、その細胞表面全体に均等になじませ細胞を剥離させた。これをサンプリングチューブ（５０９−ＧＲＤ−Ｑ、ビーエム（株）製）に回収し、室温で５分間静置することにより、核酸から核タンパク質を遊離させた。その後、５０μＬのクロロホルムを加え、乳白状になるまでよく振り交ぜ、再び室温で５分間静置し、１２０００×ｇ、４℃、１５分間の条件でテーブルトップマイクロ冷却遠心機３５００（久保田商事（株）製）にて遠心した。得られた上清６０〜８０μＬを新しいサンプリングチューブに回収し、２５０μＬの２−プロパノールを加えて混合した後、室温で１０分間静置し、１２０００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心した。遠心により生じたペレットに、オートクレーブ処理水で調整した７５％冷エタノールを加えて洗浄し、７５００×ｇ、４℃、５分間の条件で遠心した。その後、上清を捨てて乾燥し、２０μＬのＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒで溶解することにより、総ＲＮＡを抽出した。
【００２４】
（ＲＮＡ逆転写）
逆転写反応はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いて行った。まず抽出したＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）により測定し、ＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒにて５００ｎｇ／６．５μＬに調整した。得られた調整液６．５μＬに、２μＬの５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ  Ｉ、０．５μＬのＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）、０．５μＬのＲａｎｄｏｍ  ６ｍｅｒ（１００μＭ）を加え、１０μＬの逆転写反応溶液を調製した。なお、これらの調製は氷上で行った。調製した反応液はＶｅｒｉｔｉ  ９６−ｗｅｌｌ  サーマルサイクラー（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）により３７℃・１５分、８５℃・５秒の条件で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
【００２５】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑを用いて行い、インターカレーター法により増幅するｃＤＮＡをリアルタイムに検出した。各分化関連遺伝子に対して使用したＦｏｒｗａｒｄプライマー、及びＲｅｖｅｒｓｅプライマーを表１に示す。
【００２６】
【表１】
2018203676.tif 000002
【００２７】
１０μＬのＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（×２）、０．４μＬのＦｏｒｗａｒｄプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（１０μＭ）、０．４μＬのＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５０×）、１μＬのｃＤＮＡ溶液、及び６．８μＬのｄＨ2０を混合することにより反応液を調製した。この反応液をＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＣｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンス（株）製）によりリアルタイムＰＣＲを行った。この時の反応条件はＨｏｌｄｉｎｇ  ｓｔａｇｅ：９５℃・３０秒、Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔａｇｅ：９５℃・５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル、Ｍｅｌｔ  Ｃｕｒｖｅ  ｓｔａｇｅ：９５℃・１５秒、６０℃・６０秒、９５℃・１５秒で行い、その解析はΔΔＣｔ法を用いた相対定量で行った。
【００２８】
すべての結果は平均と標準偏差値で示し、統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））を用いたＤｕｎｎｅｔｔの検定で統計処理を行った。
【００２９】
［結果］
図１〜４に示される通り、フィチン酸が分化関連遺伝子であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を促進することが明らかになった。つまり、本発明の促進剤は上記の遺伝子群の少なくとも１つの発現を促進することが可能であることが明らかとなった。このため、フィチン酸は、１種だけではなく２種以上の分化関連遺伝子の発現を促進することが可能であることから、表皮角化細胞の分化を強力に促進することが示唆される。
【００３０】
さらに、全ての分化関連遺伝子（ケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、トランスグルタミナーゼ遺伝子）においてフィチン酸の濃度が０．１〜１．０ｍＭの間である場合に発現量の更なる増加が認められた（ｐ＜０．００１）。一方、前記の範囲に対してフィチン酸の濃度が５．０ｍＭである場合は発現量の増加は見られなかった。これはフィチン酸のキレート剤としての効力により細胞中のカルシウムイオン濃度が低下し、その結果、遺伝子発現量が減少したと考えられる。したがって、上記のフィチン酸の濃度範囲が分化関連遺伝子の発現促進に特に好ましいことが理解できる。
【００３１】
以上より、本発明の促進剤が、分化関連遺伝子であるケラチン５遺伝子、ケラチン１０遺伝子、ロリクリン遺伝子、及びトランスグルタミナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を促進することが明らかとなった。また、本発明の促進剤が表皮角化細胞の分化を促進すること、これによりターンオーバーが促進されること、皮膚バリア機能が強化されることが示唆された。
【図１】
2018203676.tif 000003
【図２】
2018203676.tif 000004
【図３】
2018203676.tif 000005
【図４】
2018203676.tif 000006