(57)【要約】【課題】低温で高い性能、特に高い洗浄性能を有するα−アミラーゼおよび変異体をスクリーニングする向上した方法の提供。【解決手段】高い性能を低温で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、ａ）前記α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する前記α−アミラーゼの結合性を判定するステップ；ｂ）前記基質に対する結合性が低いα−アミラーゼを選択するステップ、を含む方法；並びに、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法であって、ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高い洗浄性能を５〜３５℃で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、
ａ）デンプンに対する前記α−アミラーゼの結合性を判定するステップ；
ｂ）前記デンプンに対する結合性が標準洗剤α−アミラーゼよりも低いα−アミラーゼを選択するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記α−アミラーゼのデンプンに対する結合性が、配列番号８を有するα−アミラーゼの９０％未満の結合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）デンプンに対する結合性について前記変異体をテストするステップ；
ｃ）前記基質に対する結合性が前記親α−アミラーゼよりも低く、且つ、５〜３５℃で高い洗浄性能を有する変異体を選択するステップ
を含む、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法。
【請求項４】
前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜１５の１つに対して、少なくとも９０％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜１５の１つに対して、少なくとも９５％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜１５の１つに対して、少なくとも９７％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記変異体のデンプンに対する結合性が、前記親α−アミラーゼの９０％未満の結合性である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
α−アミラーゼ活性を有し、かつ、配列番号２に対して少なくとも９０％配列同一性を有する変異体ポリペプチドであって、
配列番号２におけるアミノ酸位置を基準とした場合に、以下：
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｆ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｙ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ２８４Ｄ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｄ４６７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｍ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｋ４８５Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；および
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
から選択される修飾を含み、
配列番号２のアミノ酸配列からなる親α−アミラーゼと比して、デンプンに対する結合性が低く、かつ、５〜３５℃での洗浄性能が高い、変異体ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２に対して、少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に対して、少なくとも９７％配列同一性を有する、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物。
【請求項１２】
ランドリーまたは自動皿洗浄を含む硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける請求項８〜１０のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【０００２】
本発明は、低温で高い性能を有する、特に洗剤中において低温で高い性能を有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、このようなアミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
【０００４】
洗剤、製パン、醸造、例えば異性化糖の調製またはデンプンからのエタノール製造の一部におけるデンプン液化および糖化などの数々の公知の用途におけるα−アミラーゼの産業的な使用には長い歴史がある。α−アミラーゼのこれらの用途および他の用途は公知であり、特に細菌性α−アミラーゼといった微生物由来のα−アミラーゼが利用される。
【０００５】
用いられた最初の細菌性α−アミラーゼは、Ｔｅｒｍａｍｙｌとしても知られるＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼであり、これは広範に特徴付けが行われ、この酵素に係る結晶構造が判明している。ＳＰ７０７などのアルカリ性アミラーゼが、洗剤における用途が見出された特定の一群のα−アミラーゼを形成する。これらの公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途における機能が改善されるよう修飾されている。
【０００６】
α−アミラーゼの耐熱性を高める方法は詳細に研究されている。Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）には、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼの特定の領域がＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの対応する領域で置換されたキメラα−アミラーゼが開示されている。このキメラα−アミラーゼは、耐熱性に関わる領域を特定するために構築された。このような領域は、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼのアミノ酸残基１７７−１８６およびアミノ酸残基２５５−２７０を含むことが見出された。Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８では、ＡｍｙＳ−タイプアミラーゼの耐熱性は、２つのアミノ酸残基Ｒ１７９−Ｇ１８０（ＡｍｙＳ番号）をループ（Ｆ１７８〜Ａ１８４）から欠失させることにより高められることが示されている。しかしながら、Ｓｈｉａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）には、同一のループが欠失したＡｍｙＳ酵素は、高温でのコーンスターチ加水分解に対して親酵素よりも特異活性が低く、ＡｍｙＳアミラーゼの重要な利点の一つが犠牲になっていることが示されている。
【０００７】
環境保護のために、洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセス中の温度を下げることがますます重要となっている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常用いられる温度よりも高い。α−アミラーゼは洗剤組成物において用いられる重要な酵素であり、その使用は、ランドリーの洗濯または皿洗いの最中におけるデンプン質の汚れを除去するためにますます重要となっている。従って、温度が低い場合であっても洗浄性能、汚れ除去効果および／または活性が保持されるα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にも関わらず、多くの汚れは完全に除去することが困難である。これらの問題は、低い洗浄温度（例えば冷水）および短期間の洗浄サイクルの使用増加により悪化している。それ故、低温下で機能することが可能であり、同時に特異活性（デンプン分解活性）、安定性および／または洗浄性能などの他の望ましい特性が維持または増加可能であるデンプン分解酵素を得ることが望ましい。
【０００８】
それ故、本発明は、低温で高い性能、特に高い洗浄性能を有するα−アミラーゼおよび変異体をスクリーニングする向上した方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、特に高い洗浄性能といった高い性能を低温で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、
ａ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する酵素の結合性を判定するステップ、
ｂ）基質に対する親和性が低く、特に基質に対する結合性と活性との間の比が小さいα−アミラーゼを選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ
を含む、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、特許請求された方法に基づいて選択可能である変異体および本発明の方法を用いて選択したα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、生デンプンに対するアミラーゼの結合性と、特に低温での洗浄性能といった低温性能との間に逆相関が存在するという所見に基づいている。例えば、多数の実験用洗剤アミラーゼサンプルに対するデータを用いることにより、米デンプンに対する結合性とＡＭＳＡ試験における洗浄性能との間に明らかな相関が見られる。それ故、固体基質に対する結合性が低いα−アミラーゼが、特に低温での洗剤における高い性能といった、低温での高い性能を有することが意外にも見出された。
【００１３】
定義
α−アミラーゼ活性：「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成するα−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）の活性を意味する。
【００１４】
基質結合性：「基質結合性」もしくは「固体基質に対する結合性」という用語、または、文法的に同等の用語は、固体材料に固定化された基質を含む固体基質に対して結合するα−アミラーゼの特性として理解される。この用語は相対的な用語であり、これは、普通、基準α−アミラーゼと比した相対的な結合性として表記される。変異体に関しては、基質結合性は普通、変異体の出発点とされた親α−アミラーゼに対して計測される。基質結合性は、固体基質を伴うα−アミラーゼの溶液をインキュベートし、基質を除去し、固体基質に結合したままのα−アミラーゼの初期量の画分を測定することにより計測され得、固体基質に対する基質結合性を判定するための好ましい方法が以下の材料および方法の項において開示されている。
【００１５】
変異体：「変異体」という用語は、改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を１つまたは複数（いくつか）の位置で含むα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
【００１６】
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００１７】
野生型酵素：「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されたα−アミラーゼを意味する。
【００１８】
親または親α−アミラーゼ：「親」または「親α−アミラーゼ」という用語は、本発明の酵素変異体をもたらすために改変が行われたα−アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。変異体に関連して、親ポリペプチドは、変異体において特異的に改変された残基を除いて、変異体と全く同一の配列を有するポリペプチドである。
【００１９】
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度といった、少なくとも１％の純度である。
【００２０】
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、この変異体は、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度および１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または、古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成されることが可能である。
【００２１】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾に続くその最終形態にあるポリペプチドを意味する。
【００２２】
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２３】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
【００２４】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２５】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２６】
断片：「断片」という用語は、成熟型ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、この断片はα−アミラーゼ活性を有する。
【００２７】
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’−および／または３’−末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
【００２８】
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００２９】
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
【００３０】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を最大で１０重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で０．５重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
【００３１】
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、通常は、ＡＴＧ開始コドン、または、ＧＴＧおよびＴＴＧなどの代わりの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
【００３２】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
【００３３】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
【００３４】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
【００３５】
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
【００３６】
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含む変異体の生成に関与するいずれかのステップを含む。
【００３７】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
【００３８】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
【００３９】
デンプン除去プロセス：「デンプン除去プロセス」という表現は、ランドリーなどの例えば生地クリーニングといったデンプンが生地から除去される洗浄プロセスにおけるものなどの、デンプンが除去（または転化）されるいずれかの種類のプロセスに関する。デンプン除去プロセスはまた、皿洗浄などの硬質面クリーニングであることが可能であり、または、産業上もしくは組織的なクリーニングなどの一般的なクリーニングプロセスであることが可能である。この表現はまた、一般的に、他のデンプン除去プロセスまたはデンプン転化、エタノール製造、デンプン液化、生地糊抜き、紙およびパルプ製造、ビール製造、ならびに、洗剤を含む。
【００４０】
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比して向上した変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、熱活性、耐熱性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、基質／補助因子特異性、向上した表面特性、生成物特異性、前処理されたバイオマスの存在下での高い安定性または溶解度、保管条件下での向上した安定性および化学安定性が挙げられる。
【００４１】
洗浄性能：本文脈において、「洗浄性能」という用語は、例えばランドリー、または、皿洗浄などの硬質面クリーニングの最中にクリーニングされるべき対象物に存在するデンプンまたはデンプンを含有する汚れを除去する酵素の能力として用いられる。洗浄性能は、ＡＭＳＡの記載において、または、以下の方法の項におけるビーカ洗浄性能テストにおいて定義されるいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を算出することにより定量化され得る。
【００４２】
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、例えば汚れ除去の向上により、親アミラーゼの洗浄性能と相対的な、または、前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが１つまたは複数の特定の位置に欠失を有さないα−アミラーゼと相対的な、または、配列番号４に示されているアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの活性と相対的なアミラーゼ変異体の洗浄性能の改変を示す変異体酵素として本明細書において定義される。「洗浄性能」という用語は、一般的なクリーニング（例えば皿洗浄における硬質面クリーニング）を含むが、ランドリーなどの生地における洗浄性能、および、産業上もしくは組織的なクリーニングをも含む。
【００４３】
低温：「低温」は、５〜３５℃、好ましくは５〜３０℃、より好ましくは５〜２５℃、より好ましくは５〜２０℃、最も好ましくは５〜１５℃および特に５〜１０℃の温度である。好ましい実施形態において、「低温」は、１０〜３５℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは１０〜２５℃、最も好ましくは１０〜２０℃および特に１０〜１５℃の温度である。
【００４４】
第１の態様において、本発明は、
ａ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する酵素の結合性を判定するステップ、
ｂ）特に基質に対する結合性と活性との間の比が小さいα−アミラーゼといった、基質に対する結合性が低いα−アミラーゼを選択するステップ
を含む、特に低温で高い洗浄性能を有するといった、低温で高い性能を有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法に関する。
【００４５】
この態様によれば、本発明は、低温で高い性能を有するα−アミラーゼのスクリーニングであって、特に低温で高い洗浄性能を有する洗剤α−アミラーゼのスクリーニングに関する。この方法は、低温で良好な性能を有する酵素を見出すために新規のα−アミラーゼをスクリーニングするために好適である。この方法はまた、自動化され、また、高スループットのスクリーニング法に適合しているという利点を有し得る。
【００４６】
一実施形態において、この方法は、新規のα−アミラーゼを見出すために好適である。簡便な一つの方法は、多数の候補α−アミラーゼをテストし、１種の既知の洗剤α−アミラーゼを標準として包含し、次いで、標準洗剤α−アミラーゼよりも基質に対する結合性が低い新規の候補α−アミラーゼを選択することである。選択されたα−アミラーゼは、高い洗浄性能を有する候補となり、安定性、特異活性等などの洗剤酵素に重要な他の特性についてさらにテストされることが可能である。
【００４７】
数々の洗剤アミラーゼが文献から公知であって、配列番号１、２、３、４、５、６、８、１０、１１および１２を有するα−アミラーゼなどの野生型アミラーゼ：国際公開第２００１０６６７１２号パンフレットおよび国際公開第２００６００２６４３号パンフレットにおいて開示されている変異体などのこれらのいずれかの変異体が挙げられ、これらの公知の洗剤アミラーゼのいずれかが標準洗剤α−アミラーゼとしてこの方法において好適に包含され得る。
【００４８】
この実施形態におけるα−アミラーゼは、９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性、より好ましくは１０％未満の結合性および最も好ましくは５％未満の結合性などの標準洗剤α−アミラーゼの９５％未満の結合性を有するなど、選択された標準洗剤アミラーゼよりも低い基質に対する結合性を有するよう選択される。
【００４９】
あるいは、配列番号１を有するα−アミラーゼであるＳＰ７２２を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＳＰ７２２よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５０】
あるいは、配列番号２を有するα−アミラーゼであるＳＰ７０７を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＳＰ７０７よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５１】
あるいは、配列番号３を有するα−アミラーゼであるＡＡ５６０を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＡＡ５６０よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５２】
あるいは、配列番号４を有するα−アミラーゼであるＳＰ６９０を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＳＰ６９０よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５３】
あるいは、配列番号５を有するα−アミラーゼであるＫＳＭ−ＡＰ１３７８を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＫＳＭ−ＡＰ１３７８よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５４】
あるいは、配列番号６を有するα−アミラーゼであるＳＰ７−７を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＳＰ７−７よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５５】
本発明の方法はまた、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＢＬＡよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために、配列番号１３を有するα−アミラーゼであるバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＢＬＡ）などの他の親α−アミラーゼと共に用いられ得る。
【００５６】
あるいは、配列番号１４を有するα−アミラーゼであるバチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ（ＢＡＮ）を親α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＢＡＮよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５７】
あるいは、配列番号１５を有するα−アミラーゼであるバチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ゲオバチルスステアロテルモイルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））α−アミラーゼ（ＢＳＧ）を親α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性といった、ＢＳＧよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ
を含む親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関する。
【００５９】
この方法は、基本的には、低温で向上した性能を有する変異体の選択に望ましいいずれかの公知のα−アミラーゼについて用いられ得るが、しかしながら、好ましい実施形態において、本発明の方法は、低温で向上した洗浄性能を有する変異体の生成に用いられる。
【００６０】
他の実施形態において、本発明の方法は、クリーニング分野での用途、発酵されて摂取用もしくは燃料用のエタノールを提供するための糖質にデンプンを分解するためのデンプンの糖化もしくは液化などの用途、または、生地の生産における用途において、低温で向上した性能を有する親α−アミラーゼの変異体を選択するためのアミラーゼを見出すために用いられる。すべてのこのような用途は技術分野において公知であり、当業者は、本発明の方法に従って選択されたα−アミラーゼがこれらの用途にどのように適用され得るかを認識するであろう。
【００６１】
この好ましい実施形態において、親α−アミラーゼは、洗剤α−アミラーゼであって、すなわち、界面活性剤、キレート剤および洗剤においてルーチン的に用いられる他の成分の存在下での活性、ならびに、８〜１１、９〜１０などの範囲内などのアルカリ性ｐＨでの活性などの、クリーニングおよびランドリーにおいて通常適用される条件下で活性を有するα−アミラーゼであり得る。
【００６２】
変異体は、親α−アミラーゼの表面に位置する１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップによって調製され得る。
【００６３】
当業者は、親分子の表面に位置する残基を同定することにより、修飾されるべき残基をどのようして同定するかを知っているであろう。これに関連して、分子の表面上に位置する残基は、自然な形態の分子における周囲の媒質と残基の少なくとも一部が直接接触している残基であると理解される。親分子の３Ｄ構造が入手可能である場合には親分子の３Ｄ構造から、または、親の３Ｄ構造が入手可能ではない場合には、親α−アミラーゼと３Ｄ構造が入手可能であるα−アミラーゼとアラインさせ、アラインメントにおいてα−アミラーゼの表面上に位置する残基に対応する分子の表面上に位置する残基を親α−アミラーゼの残基として同定することにより、当業者はこの種の情報を抽出することが可能であることが認識されるであろう。α−アミラーゼの３Ｄ構造は２つ以上が技術分野において公知であるため、所与の親α−アミラーゼの表面上に位置する残基の同定は、親α−アミラーゼと、この親α−アミラーゼに対する配列同一性が最も高いα−アミラーゼに係る３Ｄ構造とのアラインメントに基づいて行われるべきである。
【００６４】
変異体は、親α−アミラーゼの表面上の位置に残る１つまたは複数のアミノ酸について、親α−アミラーゼの表面に位置する１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップであって、親α−アミラーゼの表面に位置する、例えば少なくとも３個の残基、例えば少なくとも４個の残基、例えば少なくとも５個の残基、例えば少なくとも６個の残基、例えば少なくとも７個の残基、例えば少なくとも８個の残基、例えば少なくとも９個の残基、例えば少なくとも１０個の残基といった少なくとも２個の残基など、例えば２０個以下の残基または３０個以下の残基といった１５個以下の残基など、表面上に位置する少なくとも１個の残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップなどのステップによって生成される。
【００６５】
変異体はまた、分子の表面上に位置していない１つまたは複数のアミノ酸残基におけるさらなる置換、欠失または挿入を含有していてもよい。このような置換、欠失または挿入は従来技術において多く開示されており、本発明に従って用いられてもよい。このような好ましい追加の置換、挿入または欠失の例としては、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットに開示されている親α−アミラーゼにおける残基Ｄ１８３およびＧ１８４の欠失を挙げることが可能である。
【００６６】
変異体は、その親α−アミラーゼに対して、好ましくは少なくとも９０％配列同一性、好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％配列同一性、および、最も好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有して生成される。
【００６７】
変異体は、９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性など、親α−アミラーゼの９５％未満の結合性を有するよう、親α−アミラーゼよりも低い基質に対する結合性を有するよう選択される。
【００６８】
好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１〜１５を有するα−アミラーゼ、および、これらの１つに対して少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性、好ましくは少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性、より好ましくは少なくとも９７％同一性を有するα−アミラーゼから選択される親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関し、この方法は、以下のステップを含む。
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップであって、ここで、変異体は、その親α−アミラーゼに対して少なくとも９０％配列同一性、好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％配列同一性、および、最も好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；ならびに
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップであって、ここで、変異体は、９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性など、親α−アミラーゼの９５％未満の結合性を有するステップ。
【００６９】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜１５を有するα−アミラーゼ、および、これらの１つに対して少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも８７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性および最も好ましくは少なくとも９７％配列同一性を有するα−アミラーゼから選択される親α−アミラーゼの変異体に関し、ここで：
ｉ）変異体は、親α−アミラーゼに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８７％配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％配列同一性を有し、ならびに
ｉｉ）変異体は、親α−アミラーゼと比して、８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満、好ましくは６０％未満、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性など、低い固体基質に対する結合性を有する。
【００７０】
本発明の方法を用いることにより、このような変異体が提供され得る。
【００７１】
本発明の変異体はまた、１つまたは複数の残基が親α−アミラーゼの表面上に位置していると共に、基質結合部位の一部が置換されているか欠失している変異体を含む。親α−アミラーゼの表面上に存在するこのような基質結合部位は文献においていくつかの親α−アミラーゼについて開示されており、このような基質結合部位は、所与の親α−アミラーゼとこのような基質結合部位が同定されている他のα−アミラーゼ配列とをアラインさせることにより他の親α−アミラーゼにおいて同定され得ることを当業者は認識するであろう。
【００７２】
基質結合部位の一部である残基の例としては以下が挙げられる。
ａ）配列番号２におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｎ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｒ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７、
ｂ）配列番号５におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｋ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７、
ｃ）配列番号４におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｋ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７、
ｄ）配列番号１３におけるＷ１３８、Ｗ１５７、Ｗ１６５、Ｅ１６７、Ｗ１８４、Ｅ１８９、Ｅ２５５、Ｆ２５７、Ｆ２７９、Ｆ２８４、Ｇ２９９、Ｇ３００、Ｋ３１５、Ｗ３４２、Ｒ４３７、Ｗ４６７およびＧ４７５、
ｅ）配列番号１４におけるＷ１３６、Ｗ１５５、Ｗ１６３、Ｅ１６５、Ｗ１８４、Ｅ１８９、Ｅ２５５、Ｆ２５７、Ｆ２７９、Ｆ２８４、Ｇ２９９、Ｇ３００、Ｒ３１５、Ｗ３４２、Ｒ４３７、Ｗ４６７およびＧ４７５、
ｆ）配列番号１５におけるＷ１３９、Ｗ１５８、Ｗ１６６、Ｅ１６８、Ｗ１８７、Ｅ１９２、Ｆ２６０、Ｆ２８７、Ｇ３０２、Ｇ３０３、Ｗ３４５、Ｗ４３７、Ｗ４６７、Ｇ４７４およびＧ４７５。
【００７３】
本発明の変異体はまた、上記ａ）〜ｈ）に記載されている残基などの基質結合部位の一部である残基に近接した位置に１つまたは複数のかさ高いアミノ酸残基を導入する１つまたは複数の修飾を含む変異体を含む。これに関して、かさ高いアミノ酸残基は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＨｉｓおよびＩｌｅなどの、ＴｙｒおよびＴｒｐが好ましい大型の側鎖を有するアミノ酸から選択されることが可能である。基質結合部位の一部である残基に近接してとは、修飾される残基が基質結合部位の一部である残基から１０Å未満に位置し、好ましくはこのような残基から６Å未満、および、最も好ましくは３Å未満に位置することを意味することが意図されている。入手可能である構造情報に基づいてこのような残基を同定することは当業者により実施可能な範囲内である。
【００７４】
他の好ましい変異体は、配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも８７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％同一性、より好ましくは少なくとも９９％配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有すると共に、以下の置換を含む変異体を含む。
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｆ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ｎ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｙ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ａ５１Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ２８４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ２８４Ｄ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｄ４６７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｍ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｋ４８５Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１６０Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｆ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｆ２６２Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ３６３Ｈ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７６Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ７２Ｓ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｍ２０２Ｌ＋Ｙ２０３Ｇ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ３４５Ｄ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ３０２Ｎ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｐ３８０Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｌ２３０Ｉ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｅ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７Ｑ。
【００７５】
他の好ましい変異体は、上記の置換の１つを伴う配列番号２から構成される変異体を含む。
【００７６】
本発明の他の好ましい変異体は、配列番号１３に対して、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％同一性を有すると共に、配列番号１３におけるＫ３１５および／またはＷ４６７、好ましくはＫ３１５ＡＮＣＱＥＧＨＩＬＭＦＰＳＴＷＹＶＭ、特に好ましくはＫ３１５Ｍおよび／またはＷ４６７ＡＦに対応する位置において置換を含む変異体である。好ましい実施形態において、位置Ｋ３１５における置換は、好ましくはＧ４８Ａ、Ｔ５１ＩＬ、Ｇ１０７Ａ、Ｈ１５６Ｙ；Ａ１８１Ｔ、Ｎ１９０Ｆ、Ｉ２０１Ｆ、Ａ２０９ＶおよびＱ２６４Ｓから選択されるさらなる置換と組み合わされる。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法を用いて選択されるα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
【００７８】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を特徴とする変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
ｉ）配列番号１〜１２の１つに対して、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％同一性を有し、
ｉｉ）９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性など、親α−アミラーゼの９５％未満の結合性である固体基質もしくは固定化基質に対する結合性を有する。
【００７９】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を特徴とする変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
ｉ）これらの１つに対して少なくとも８０％配列同一性であって、配列番号１〜１２の１つに対して好ましくは少なくとも８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％同一性を有し
ｉｉ）９０％未満の結合性；好ましくは８０％未満の結合性、好ましくは７０％未満の結合性、好ましくは６０％未満の結合性、好ましくは５０％未満の結合性、好ましくは４０％未満の結合性、好ましくは３０％未満の結合性、より好ましくは２０％未満の結合性および最も好ましくは１０％未満の結合性など、配列番号８を有するα−アミラーゼの９５％未満の結合性である固体基質もしくは固定化基質に対する結合性を有する。
【００８０】
本発明はまた、α−アミラーゼの米デンプンに対する結合（ｄｉｎｇ）が配列番号８を有するα−アミラーゼの米デンプンに対する結合性よりも低く、好ましくは８０％未満、より好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２０％未満および最も好ましくは１０％未満であるα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
【００８１】
α−アミラーゼの固体基質に対する結合性の判定
本発明の目的に関して、α−アミラーゼの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性は、原理上は、技術分野において公知である基質に対する結合性を判定する方法のいずれかを用いて判定することが可能である。普通、このような方法は、α−アミラーゼを固体基質もしくは固定化基質と接触させ、基質に結合したα−アミラーゼの画分を判定するステップを含む。
【００８２】
固体基質もしくは固定化基質は、テスト条件下で実質的に不溶性であるα−アミラーゼに対するいずれかの基質であり得る。固体基質は、コムギデンプン、トウモロコシデンプンまたは米デンプンなどのデンプンであり得、ここで、米デンプンが好ましい。あるいは、この判定は、固体マトリックスに固定化されたα−アミラーゼに係る可溶性または不溶性基質のいずれかを含む固定化基質を用いて行われ得る。本発明によれば、その基質に対するα−アミラーゼの結合性は、２０℃で、デンプンの存在下に、ｐＨ８で計測した結合したアミラーゼの画分として判定される。その基質に対するα−アミラーゼの結合性は、α−アミラーゼの水溶液をデンプンと共にインキュベートし、結合したアミラーゼの画分を以下に開示する方法を用いて判定することにより判定可能である。
【００８３】
従来の変異体の決定
本発明の目的のために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５において開示されている成熟型ポリペプチドが、他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基を判定するために用いられる。他のα−アミラーゼのアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５において開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、判定される。
【００８４】
他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：２９４７−２９４８）を用いて複数のポリペプチド配列のアラインメントによって確認可能である。
【００８５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
【００８６】
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【００８７】
本発明のα−アミラーゼ変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
【００８８】
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
【００８９】
欠失．アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置*。従って、位置１９５でのグリシンの欠失は「Ｇｌｙ１９５*」または「Ｇ１９５*」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」または「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」とされる。
【００９０】
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
【００９１】
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
【００９２】
【表１】
2018153191.tif 000002
【００９３】
複数の改変．複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、アルギニンおよびグリシンに対する位置１７０および１９５でのチロシンおよびグルタミン酸の置換を表す。
【００９４】
異なる置換．１つの位置で異なる置換を導入可能である場合、異なる置換はコンマによって分けられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、アルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による位置１７０での置換を表す。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す。
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【００９５】
親α−アミラーゼ
親α−アミラーゼはまた、配列番号１の成熟型ポリペプチドＳＰ７２２に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【００９６】
一態様において、この親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【００９７】
親は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成されることが好ましい。
【００９８】
他の実施形態において、親は配列番号１の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【００９９】
親α−アミラーゼはまた、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．１５１，２５−３１に開示されている配列番号２の成熟型ポリペプチドＳＰ７０７に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１００】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１０１】
親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１０２】
他の実施形態において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１０３】
親α−アミラーゼはまた、配列番号３の成熟型ポリペプチドＡＡ５６０に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１０４】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号３の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１０５】
親は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１０６】
他の実施形態において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１０７】
親α−アミラーゼはまた、国際公開第９５２６３９７号パンフレットに開示されている配列番号４の成熟型ポリペプチドＳＰ６９０に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１０８】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号４の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１０９】
親は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１１０】
他の実施形態において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１１１】
親α−アミラーゼはまた、欧州特許第６７０３６７号明細書に開示されている配列番号５の成熟型ポリペプチドＫＳＭ−ＡＰ１３７８に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１１２】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号５の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１１３】
親は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１１４】
他の実施形態において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１１５】
親α−アミラーゼはまた、配列番号６の成熟型ポリペプチド、ｓｐ７−７に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１１６】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号６の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１１７】
親は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１１８】
他の実施形態において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１１９】
親α−アミラーゼはまた、配列番号７の成熟型ポリペプチド、ＳＰ７２２＋Ｔ１８３*＋Ｇ１８４*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１２０】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号７の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１２１】
親は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１２２】
他の実施形態において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１２３】
親α−アミラーゼはまた、配列番号８の成熟型ポリペプチド、ＳＰ７０７＋Ｇ１８２*＋Ｈ１８３*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１２４】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号８の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１２５】
親は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１２６】
他の実施形態において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１２７】
親α−アミラーゼはまた、配列番号９の成熟型ポリペプチド、ＡＡ５６０＋Ｔ１８３*＋Ｇ１８４*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１２８】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号９の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号９の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１２９】
親は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１３０】
他の実施形態において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１３１】
親α−アミラーゼはまた、配列番号１０の成熟型ポリペプチドＳＰ６９０＋Ｔ１８３*＋Ｇ１８４*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１３２】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１０の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１３３】
親は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１３４】
他の実施形態において、親は、配列番号１０の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１３５】
親α−アミラーゼはまた、配列番号１１の成熟型ポリペプチド、ＫＳＭ−ＡＰ１３７８＋Ｄ１８３*＋Ｇ１８４*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１３６】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１１の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１３７】
親は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１３８】
他の実施形態において、親は、配列番号１１の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１３９】
親α−アミラーゼはまた、配列番号１２の成熟型ポリペプチド、ＳＰ−７−７＋Ｇ１８２*＋Ｈ１８３*に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１４０】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１２の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１４１】
親は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１４２】
他の実施形態において、親は、配列番号１２の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１４３】
親α−アミラーゼはまた、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の配列番号１３の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１４４】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１３の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１３の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１４５】
親は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１３の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１４６】
他の実施形態において、親は、配列番号１３の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１４７】
親α−アミラーゼはまた、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の配列番号１４の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１４８】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１４の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１４の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１４９】
親は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１４の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１５０】
他の実施形態において、親は、配列番号１４の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１５１】
親α−アミラーゼはまた、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ゲオバチルスステアロテルモイルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来の配列番号１５の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１５２】
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１５の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１５の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
【０１５３】
親は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１５の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１５４】
他の実施形態において、親は、配列番号１５の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１５５】
配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列またはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から親をコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング法の後に、対象の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドといった少なくとも１４ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
【０１５６】
このような他の生体から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の生体由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得、これがサザンブロッティングにおいて用いられる。
【０１５７】
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、低度〜きわめて高度の緊縮条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５またはそのサブ配列をコードするポリヌクレオチドに対応する標識化ヌクレオチドプローブにポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは技術分野において公知であるいずれかの他の検出手段を用いて検出可能である。
【０１５８】
一態様において、核酸プローブは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５またはその断片のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１５９】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長鎖プローブに関して、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃での、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、きわめて低度および低度の緊縮性に対しては２５％ホルムアミド、中度および中度−高度の緊縮性に対しては３５％ホルムアミド、または、高度およびきわめて高度の緊縮性に対しては５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、４５℃（きわめて低度の緊縮性）、５０℃（低度の緊縮性）、５５℃（中度の緊縮性）、６０℃（中度−高度の緊縮性）、６５℃（高度の緊縮性）または７０℃（きわめて高度の緊縮性）で、１５分間、３回洗浄される。
【０１６０】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短い短鎖プローブに関して、緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度で、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハート溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭナトリウム一塩基性リン酸、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび０．２ｍｇのイースト菌ＲＮＡ／ｍｌでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、６Ｘ  ＳＣＣ中で１度、また、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、および、算出したＴmより５℃〜１０℃低い温度で６×ＳＳＣを用いて１５分間ずつ２回洗浄される。
【０１６１】
親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
【０１６２】
親は細菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）α−アミラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）α−アミラーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
【０１６３】
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）α−アミラーゼである。
【０１６４】
他の態様において、親は、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）α−アミラーゼである。
【０１６５】
他の態様において、親は、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）α−アミラーゼである。
【０１６６】
親は、真菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）α−アミラーゼなどのイースト菌α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）またはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）α−アミラーゼなどの糸状真菌性α−アミラーゼであり得る。
【０１６７】
他の態様において、親は、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼである。
【０１６８】
他の態様において、親は、アクレモニウムセルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクスラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビアアクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビアアルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビアアルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビアアウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビアフィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビアミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビアオビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビアペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビアセトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビアスペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビアスブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）α−アミラーゼである。
【０１６９】
他の態様において、親は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のα−アミラーゼといったバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）α−アミラーゼである。
【０１７０】
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
【０１７１】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０１７２】
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることによりもたらされ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
【０１７３】
親は、一のポリペプチドの一部分が、他のポリペプチドの一部分のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０１７４】
親はまた、１個のポリペプチドが他のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１７５】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【０１７６】
変異体の調製
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
【０１７７】
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（いくつか）の突然変異を形成する技術である。
【０１７８】
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
【０１７９】
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
【０１８０】
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
【０１８１】
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
【０１８２】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１８３】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【０１８４】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
【０１８５】
変異体
親における必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにα−アミラーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。α−アミラーゼの活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、親に関連するポリペプチドによるよるアイデンティティの分析から推測されることも可能である。
【０１８６】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドに関連する。
【０１８７】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【０１８８】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【０１８９】
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であり得る。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【０１９０】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。
【０１９１】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ���ｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
【０１９２】
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【０１９３】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる好適な転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【０１９４】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
【０１９５】
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２に記載されている。
【０１９６】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダー配列が用いられ得る。
【０１９７】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１９８】
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１９９】
制御配列はまた、変異体をコードする配列の３’−末端に作動可能にリンクする配列であるポリアデニル化配列であり得、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が用いられ得る。
【０２００】
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
【０２０１】
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０２０２】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード領域のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード領域が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード領域は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード領域を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード領域がもちいられてもよい。
【０２０３】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０２０４】
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０２０５】
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【０２０６】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード領域は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【０２０７】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が変異体のＮ−末端に存在する場合、プロペプチド領域は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ−末端に隣接して位置されている。
【０２０８】
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
【０２０９】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数（いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０２１０】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０２１１】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０２１２】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数（いくつか）の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【０２１３】
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。
【０２１４】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【０２１５】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のヌクレオチド配列を含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０２１６】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を意味する。
【０２１７】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０２１８】
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
【０２１９】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
【０２２０】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０２２１】
実質的に純粋な変異体を得るために、上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０２２２】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【０２２３】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
【０２２４】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０２２５】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０２２６】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０２２７】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０２２８】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法により（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合により（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、電気穿孔法により（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテンスにより（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７０を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いる��とが可能である。
【０２２９】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
【０２３０】
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）。
【０２３１】
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
【０２３２】
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
【０２３３】
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
【０２３４】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【０２３５】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシスアネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシスカレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシスギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシスパンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシスリブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシススブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシススブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルスヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕ��）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビアラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツスエリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテスビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテスベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
【０２３６】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
【０２３７】
生成方法
本発明はまた：（ａ）本発明の宿主細胞を変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。
【０２３８】
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【０２３９】
変異体は、変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
【０２４０】
変異体は技術分野において公知である方法により回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
【０２４１】
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０２４２】
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
【０２４３】
組成物
本発明はまた、本発明の変異体を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、このような変異体が富化されている。「富化」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が、例えば１．１の富化因子で高められることを意味する。
【０２４４】
組成物は、主な酵素成分として変異体を含み得る例えば単成分組成物である。または、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）といったアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；例えば、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｅｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）といったフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）もしくはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）；または、例えば、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉ���ｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）といったトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する微生物によって例えば生成され得る。
【０２４５】
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。変異体は、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
【０２４６】
洗剤組成物
一実施形態において、本発明は、本発明の酵素を１種または複数種の追加のクリーニング組成成分と共に含む洗剤組成物に関する。
【０２４７】
追加の成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に記載される例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分が含まれる。成分の選択には、布地の取り扱いに関して、クリーニングされる布地の種類、汚染物の種類および／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合物の検討が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、これは限定として解釈されるべきではなく、当業者に認識されるであろうとおり追加の官能基が成分中に含まれていてもよい。
【０２４８】
本発明の酵素
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、洗浄液１リットル当たり、０．０１〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．００５〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０１〜２５ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．０５〜１０ｍｇのタンパク質、最も好ましくは０．０５〜５ｍｇのタンパク質、および、さらに最も好ましくは０．０１〜１ｍｇのタンパク質などの０．００１〜１００ｍｇのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加され得る。
【０２４９】
本発明の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖質もしくは糖質アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくは、例えば芳香族ホウ酸エステルといったホウ酸誘導体、または、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体といった従来の安定化剤を用いて安定化され得、および、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。
【０２５０】
本発明のポリペプチドはまた、参照により本明細書に援用される国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに開示の洗剤配合物に組み込まれてもよい。
【０２５１】
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／またはノニオン性および／または半極性および／または両イオン性またはこれらの混合物であり得る１種または複数種の界面活性剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種または複数種のノニオン性界面活性剤および１種または複数種のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約１０％などの約０．１％〜６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含む。ランドリー洗剤に用いられ得る技術分野において公知であるいずれかの界面活性剤が利用され得る。
【０２５２】
含まれる場合、洗剤は、通常は、約５％〜約１５％または約２０％〜約２５％を含む約５％〜約３０％などの約１％〜約４０重量％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩およびスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキルスルフェート（ＡＳ）、脂肪族アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第１級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても公知であるＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ）、第２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはセッケンのジエステルおよびモノエステル、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２５３】
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約４０重量％のカチオン性界面活性剤を含むであろう。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ＡＤＭＥＡＱ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリル塩化アンモニウム（ＤＳＤＭＡＣ）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびに、これらの組み合わせ、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルコキシル化第４級アンモニウム（ＡＱＡ）が挙げられる。
【０２５４】
含まれる場合、洗剤は、通常、約３％〜約５％または約８％〜約１２％などの、例えば約０．５％〜約３０％、特に約１％〜約２０％、約３％〜約１０％といった約０．２％〜約４０重量％のノニオン性界面活性剤を含有するであろう。ノニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（ＰＦＡ）、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステルなどのアルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルコサミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、ならびに、商品名ＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮで入手可能な生成物、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２５５】
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約４０重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（ＡＯ）、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２５６】
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約４０重量％の両性イオン性界面活性剤を含有するであろう。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタインおよびスルホベタイン、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２５７】
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１２１−１２８による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
【０２５８】
洗剤は、約０．５〜約５％または約３％〜約５％などの０〜５重量％のヒドロトロープを含有し得る。ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム（ＳＣＳ）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフタレンナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２５９】
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約１０％〜約４０％などの約０〜６５重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含有し得る。皿洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、ＣａおよびＭｇと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリーまたは皿洗浄洗剤または産業上もしくは組織的な（？）クリーニングに用いられ得る洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのビルダーおよび／またはコビルダーが利用され得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、イミノジエタノール（ＤＥＡ）および２，２’、２”−ニトリロトリエタノール（ＴＥＡ）などのエタノールアミン、および、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２６０】
洗剤組成物はまた、約１０％〜約４０％などの０〜５０重量％の洗剤コビルダーまたはこれらの混合物を含有し得る。洗剤組成物は、コビルダーを単独で含んでいても、または、例えばゼオライトビルダーといったビルダーと組み合わせて含んでいてもよい。コビルダーの非限定的な例としては、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）などのポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマーが挙げられる。さらに非限定的な例としては、クエン酸塩、アミノカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩およびホスホン酸塩などのキレート剤、ならびに、アルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の特定の例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンエペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（ＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびに、これらの組み合わせおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／またはコビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に開示されている。
ホスホン酸塩などの湯垢抑制剤。
【０２６１】
漂白系
洗剤は、約０％〜約１０％などの０〜２０重量の漂白系を含有し得る。ランドリー＋皿洗浄＋Ｉ＆Ｉ洗剤において用いられるいずれかの技術分野において公知である漂白系が利用され得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。本明細書において漂白活性化剤とは、ペルオキシド漂白剤様過酸化水素と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含み、好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム３，５，５トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）安息香酸塩（ＤＯＢＳ）、４−（３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）、および／または、国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）が特に好ましいファミリーである。ＡＴＣまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、最終的にはクエン酸およびアルコールに分解されるために、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管に際して生成物中における良好な加水分解安定性を有しており、これは効果的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、ランドリー添加剤に対して良好な補助能を提供する。または、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）過カプロン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
【化１】
2018153191.tif 000003
（ｉｉｉ）およびこれらの混合物（式中、各Ｒ1は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソ−ノニル、イソ−デシル、イソ−トリデシルおよびイソ−ペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白は、例えばスルホン化アエンフタロシアニンであり得る。
【０２６２】
ポリマー
洗剤は、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％または０．２〜１％などの０〜１０重量％のポリマーを含有し得る。ランドリー、皿洗浄およびＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのポリマーが利用され得る。ポリマーは、上記のコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止および／もしくは油脂クリーニング特性を提供し得る。例示的な再汚染防止剤ポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、ならびに、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなどのポリカルボキシレートが挙げられる。例示的な繊維保護ポリマーとしては、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーンが挙げられる。例示的な汚染物遊離ポリマーとしては、テレフタル酸およびオリゴマー系グリコールのコポリマーが挙げられる。例示的な移染防止ポリマーとしては、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）およびポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）が挙げられる。他の例示的なポリマーは、例えば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。
【０２６３】
布地色調剤
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ、Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ、Ａｃｉｄ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｂａｓｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｂａｓｉｃ  ＶｉｏｌｅｔおよびＢａｓｉｃ  Ｒｅｄ、または、これらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
【０２６４】
（追加の）酵素
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼといった、タンパク分解酵素、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼなどの１種または複数種［追加］の酵素を含み得る。
【０２６５】
普通、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素的および非酵素的処方成分等との親和性）、酵素は有効量で存在しているべきである。
【０２６６】
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼといった、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。
【０２６７】
特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０  ４９５  ２５７、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
【０２６８】
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）およびＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０２６９】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物性由来のものを含む。微生物性由来のものが好ましい。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。タンパク分解酵素は、セリンタンパク分解酵素またはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物性タンパク分解酵素またはトリプシン−様タンパク分解酵素であり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシンであって、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から誘導されたもの、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のトリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）タンパク分解酵素である。
【０２７０】
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４。
【０２７１】
好ましい市販されているタンパク分解酵素酵素としては、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（商標）およびＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）およびＦＮ３（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０２７２】
リパーゼ：好適なリパーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば、欧州特許第２５８  ０６８号明細書および欧州特許第３０５  ２１６号明細書に記載のＨ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））または国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語、テルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））由来のリパーゼ；例えば、Ｐ．アルカリ（Ｐ．ａｌｃａｌｉ）遺伝子またはＰ．シュードアルカリ（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ）遺伝子（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スツツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属の一種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＳＤ７０５株（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）といったシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ；例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６４／７４４９９２号公報）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
【０２７３】
他の例は、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７  ２２５、欧州特許第２６０  １０５、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレットおよび国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに記載のものなどのリパーゼ変異体である。
【０２７４】
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）およびＬｉｐｅｘ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２７５】
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またがβ）は、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書により詳細に記載されているバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な系統といった、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
【０２７６】
有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットおよび国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８および４４４。
【０２７７】
市販されているアミラーゼは、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）Ｐｌｕｓ，Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ（商標）およびＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）である。
【０２７８】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）といったコプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。
【０２７９】
市販されているペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２８０】
洗剤酵素は、１種または複数種の酵素を含有する個別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤（すなわち、個別の添加剤または複合添加剤）は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。
【０２８１】
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および米国特許第４，６６１，４５２号明細書に開示のとおり生成され得、任意により、技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、および、１５〜８０個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖質または糖質アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
【０２８２】
補助材
ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。他の任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤／分解剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、ＣＭＣ、および／または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレイを含む布地コンディショナ、充填材／加工助剤、蛍光性白色化剤／光学増白剤、起泡増進剤、起泡（セッケンの泡）調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、セッケン泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの処方成分が利用され得る。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
【０２８３】
分散剤−本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することが可能である。特に粉末洗剤が分散剤を含んでいてもよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモ−またはコポリマー酸またはその塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０２８４】
移染防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、１種または複数種の移染防止剤を含み得る。好適な高分子移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または、さらには約０．１％〜約３重量％のレベルで存在し得る。
【０２８５】
蛍光性白色化剤−本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、蛍光性白色化剤または光学増白剤などのクリーニングされる物品の色合いを変え得る追加の成分を含有するであろう。存在する場合、増白剤は、約０，０１％〜約０，５％のレベルであることが好ましい。ランドリー洗剤組成物における使用に好適ないずれかの蛍光性白色化剤が、本発明の組成物中に用いられ得る。最も一般的に用いられる蛍光性白色化剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体の分類に属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体タイプの蛍光性白色化剤の例としては：４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；４，４’−ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネートおよび２−（スチビル−４”−ナフト−１．，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光性白色化剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能であるＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光性白色化剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ製の市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸである。本発明における使用に好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。
【０２８６】
好適な蛍光性増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、または、さらには約０．２重量％の下限レベルから、０．５またはさらには０．７５重量％の上限レベルを含む。
【０２８７】
汚染物遊離ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル系布地などの布地からの汚染物の除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚染物の除去を補助する１種または複数種の汚染物遊離ポリマーを含み得る。汚染物遊離ポリマーは、例えば、ノニオン性またはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであり得る（例えばＣｈａｐｔｅｒ  ７，Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他のタイプの汚染物遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）により詳細に記載されている。他の汚染物遊離ポリマーは、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（共に本明細書において参照により援用されている）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造といった置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、ノニオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、および、これらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物が挙げられる。
【０２８８】
再汚染防止剤−本発明の洗剤組成物としてはまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、ならびに、エトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種または複数種の再汚染防止剤が挙げられ得る。上記の汚染物遊離ポリマーに記載のセルロース系ポリマーは、再汚染防止剤としても機能し得る。
【０２８９】
他の好適な補助材としては、これらに限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地軟化剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、セッケン泡抑制剤、溶剤、液体洗剤用構造化剤、および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
【０２９０】
洗剤生成物の配合物
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質な錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の圧縮もしくは濃縮液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。
【０２９１】
洗剤配合物形態：層（同一のまたは異なる相）、ポーチ、機械用量単位に対応した形態。
【０２９２】
ポーチは、単一または複数のコンパートメントとして構成されることが可能である。例えば水との接触に先だってポーチから組成物が漏れ出るような組成物の漏れが防止される、組成物の保持に好適であれば如何なる形態、形状および材料のものであることも可能である。ポーチは、内部容積を有する水溶性フィルム製のものである。前記内部容積は、ポーチのコンパートメントに分離されていることが可能である。好ましいフィルムは、フィルムまたはシートに形成される好ましくはポリマーである高分子材料である。好ましいポリマー、コポリマーまたはその誘導体は、ポリアクリレート、および、水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から選択される。好ましくは、フィルム中のポリマーのレベルは、例えばＰＶＡで少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には約２０，０００〜約１５０，０００であろう。フィルムはまた、ポリアクチドおよびポリビニルアルコール（Ｃｈｒｉｓ  Ｃｒａｆｔ  Ｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｏｆ  Ｇａｒｙ，Ｉｎｄ．，ＵＳから市販されている商品名Ｍ８６３０で知られている）などの加水分解的に分解性および水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびこれらの混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物であることが可能である。ポーチは、水溶性フィルムにより分離された固体ランドリークリーニング組成物または部分成分および／または液体クリーニング組成物または部分成分を含んでいることが可能である。液体成分用のコンパートメントは、固形分を含有するコンパートメントとは組成が異なっていることが可能である。参照：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０  Ａ１号明細書）
【０２９３】
洗剤処方成分は、水溶性ポーチ中のコンパートメントにより、または、錠剤の異なる層中において相互に物理的に分離されていることが可能である。これにより、成分間の負の保管相互作用を防止することが可能である。コンパートメントの各々の異なる溶解プロファイルはまた、洗浄溶液中における選択された成分の溶解を遅延させることが可能である。
【０２９４】
粒状洗剤配合物
粒状洗剤は、国際公開第０９／０９２６９９号パンフレット、欧州特許第１７０５２４１号明細書、欧州特許第１３８２６６８号明細書、国際公開第０７／００１２６２号パンフレット、米国特許第６４７２３６４号明細書、国際公開第０４／０７４４１９号パンフレットまたは国際公開第０９／１０２８５４号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。他の有用な洗剤配合物が、国際公開第０９／１２４１６２号パンフレット、国際公開第０９／１２４１６３号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４０号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４１号パンフレット、国際公開第０９／１１７３４２号パンフレット、国際公開第０９／０７２０６９号パンフレット、国際公開第０９／０６３３５５号パンフレット、国際公開第０９／１３２８７０号パンフレット、国際公開第０９／１２１７５７号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９６号パンフレット、国際公開第０９／１１２２９８号パンフレット、国際公開第０９／１０３８２２号パンフレット、国際公開第０９／０８７０３３号パンフレット、国際公開第０９／０５００２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２５号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２６号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２７号パンフレット、国際公開第０９／０４７１２８号パンフレット、国際公開第０９／０２１７８４号パンフレット、国際公開第０９／０１０３７５号パンフレット、国際公開第０９／０００６０５号パンフレット、国際公開第０９／１２２１２５号パンフレット、国際公開第０９／０９５６４５号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４４号パンフレット、国際公開第０９／０４０５４５号パンフレット、国際公開第０９／０２４７８０号パンフレット、国際公開第０９／００４２９５号パンフレット、国際公開第０９／００４２９４号パンフレット、国際公開第０９／１２１７２５号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９１号パンフレット、国際公開第０９／１１５３９２号パンフレット、国際公開第０９／０７４３９８号パンフレット、国際公開第０９／０７４４０３号パンフレット、国際公開第０９／０６８５０１号パンフレット、国際公開第０９／０６５７７０号パンフレット、国際公開第０９／０２１８１３号パンフレット、国際公開第０９／０３０６３２号パンフレット、および、国際公開第０９／０１５９５１号パンフレット、国際公開第２０１１０２５６１５号パンフレット、国際公開第２０１１０１６９５８号パンフレット、国際公開第２０１１００５８０３号パンフレット、国際公開第２０１１００５６２３号パンフレット、国際公開第２０１１００５７３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８４４号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０４号パンフレット、国際公開第２０１１００５６３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８３０号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１２号パンフレット、国際公開第２０１１００５９０５号パンフレット、国際公開第２０１１００５９１０号パンフレット、国際公開第２０１１００５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１３５２３８号パンフレット、国際公開第２０１０１２０８６３号パンフレット、国際公開第２０１０１０８００２号パンフレット、国際公開第２０１０１１１３６５号パンフレット、国際公開第２０１０１０８０００号パンフレット、国際公開第２０１０１０７６３５号パンフレット、国際公開第２０１００９０９１５号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４６号パンフレット、国際公開第２０１００３３７４７号パンフレット、国際公開第２０１００３３８９７号パンフレット、国際公開第２０１００３３９７９号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４０号パンフレット、国際公開第２０１００３０５４１号パンフレット、国際公開第２０１００３０５３９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６７号パンフレット、国際公開第２０１００２４４６９号パンフレット、国際公開第２０１００２４４７０号パンフレット、国際公開第２０１００２５１６１号パンフレット、国際公開第２０１００１４３９５号パンフレット、国際公開第２０１００４４９０５号パンフレット、国際公開第２０１０１４５８８７号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５０３号パンフレット、国際公開第２０１０１２２０５１号パンフレット、国際公開第２０１０１０２８６１号パンフレット、国際公開第２０１００９９９９７号パンフレット、国際公開第２０１００８４０３９号パンフレット、国際公開第２０１００７６２９２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７４２号パンフレット、国際公開第２０１００６９７１８号パンフレット、国際公開第２０１００６９９５７号パンフレット、国際公開第２０１００５７７８４号パンフレット、国際公開第２０１００５４９８６号パンフレット、国際公開第２０１００１８０４３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７８３号パンフレット、国際公開第２０１０００３７９２号パンフレット、国際公開第２０１１０２３７１６号パンフレット、国際公開第２０１０１４２５３９号パンフレット、国際公開第２０１０１１８９５９号パンフレット、国際公開第２０１０１１５８１３号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９４２号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６１号パンフレット、国際公開第２０１０１０５９６２号パンフレット、国際公開第２０１００９４３５６号パンフレット、国際公開第２０１００８４２０３号パンフレット、国際公開第２０１００７８９７９号パンフレット、国際公開第２０１００７２４５６号パンフレット、国際公開第２０１００６９９０５号パンフレット、国際公開第２０１００７６１６５号パンフレット、国際公開第２０１００７２６０３号パンフレット、国際公開第２０１００６６４８６号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３１号パンフレット、国際公開第２０１００６６６３２号パンフレット、国際公開第２０１００６３６８９号パンフレット、国際公開第２０１００６０８２１号パンフレット、国際公開第２０１００４９１８７号パンフレット、国際公開第２０１００３１６０７号パンフレット、国際公開第２０１００００６３６号パンフレットに記載されている。
【０２９５】
使用
本発明はまた、その組成物の使用方法に関する。
【０２９６】
ランドリー／生地／布地（家庭用ランドリーでの洗濯、産業用ランドリーでの洗濯）
硬質面クリーニング（ＡＤＷ、洗車、産業用表面）
【０２９７】
洗剤における使用．本発明のポリペプチドが添加され得、それ故、洗剤組成物の成分となる。
【０２９８】
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適なランドリー添加剤組成物およびリンスが追加された布地軟化剤組成物を含む手動式もしくは機械式ランドリー洗剤組成物として配合され得、または、通所の家庭での硬質面クリーニング作業で使用される洗剤組成物として配合され得、または、手洗いもしくは機械洗いでの皿洗い作業用に配合され得る。
【０２９９】
洗剤組成物はさらに、単位投与量形態またはセッケンバーもしくはランドリーバーの形態で配合され得る。
【０３００】
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。他の態様において、本発明は、３５℃以下の温度でのクリーニングに好適な洗剤を提供する。
【０３０１】
方法
ＡＭＳＡを用いたα−アミラーゼの洗浄性能
洗剤系組成物中のα−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を実施し得る。自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて酵素をテストする。ＡＭＳＡテストでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄される生地布きれをすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット、特に第２３〜２４頁の段落「Ｓｐｅｃｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照のこと。
【０３０２】
一般的な洗浄性能の説明
水（１５°ｄＨ）、０．８ｇ／Ｌ洗剤（例えば以下に記載のモデル洗剤Ａ）または５０ｍＭのＨＣＯ3-および本発明の酵素（例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．８および／または１．２ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度）を含むテスト溶液を調製する。デンプン（例えば、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，３１３３  ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のＣＳ−２８）で汚れた布地を加え、実施例において特定されているとおり、２０℃で３０分間、または、１５℃で２０分間、または、１５℃で４５分間、または、１５℃もしくは４０℃で２０分間洗浄する。水道からの流水で完全にすすぎ、暗中で乾燥させた後、洗浄性能の尺度として、汚れた布地の光強度または反射率値をその後に計測する。０ｍｇ酵素タンパク質／Ｌでのテストをブランクとして用いてΔレミッション値（ΔＲＥＭ）を得た。または、洗浄性能は親α−アミラーゼのものと比較をし、ここでは、親α−アミラーゼの性能結果が１００の値とされ、変異体の結果がこの値と比較される。洗浄ステップの最中においては、例えば布地と共に洗浄溶液を振盪、回転または攪拌するといった形態で機械的作用が適用されることが好ましい。
【０３０３】
ＡＭＳＡ洗浄性能実験を以下に特定した実験条件下で実施した。
【０３０４】
【表２】
2018153191.tif 000004
【０３０５】
【表３】
2018153191.tif 000005
【０３０６】
ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ2+：Ｍｇ2+：ＨＣＯ3-＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３０７】
【表４】
2018153191.tif 000006
【０３０８】
【表５】
2018153191.tif 000007
【０３０９】
１２°ｄＨ水中でのおおよその洗浄ｐＨ（Ｃａ：Ｍｇ：ＨＣＯ3＝２：１：４．５）
【０３１０】
ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2およびＮａＨＣＯ3（Ｃａ：Ｍｇ：ＨＣＯ3＝２：１：４．５）をテスト系に添加することにより水硬度を１２°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
【０３１１】
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
【０３１２】
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ  ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ）で行われる。
【０３１３】
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
【数１】
2018153191.tif 000008
【０３１４】
生地：
生地サンプルＣＳ−２８（綿上の米デンプン）は、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，３１３３  ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手される。
【０３１５】
ビーカを用いる洗浄性能テスト
このアッセイは縦型洗濯機の小規模モデルであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために用いられる。
【０３１６】
２５０ｍＬビーカ、および、各方向に１８０°で、８０／分の周期で反復的な回転動作をもたらすパドル式攪拌機を用いるビーカ洗浄性能テストは、以下のステップを含む：５０ｍＭのＮａＨＣＯ3および０．４ｍｇ／Ｌの酵素を含有する１００ｍＬの洗浄溶液（６℃、１５°ｄＨ、ｐＨ８．０）を用意するステップ；ＣＳ−２８（５ｘ５ｃｍ）の２枚の布きれとＥＭＰＡ１６２（５ｘ５ｃｍ）の２枚の布きれとを洗浄溶液に加えて洗浄を開始するステップ；撹拌速度を８０ｒｐｍに設定するステップ；６０分後に撹拌を停止し、布きれを冷たい水道からの流水ですすぐステップ；すすいだ布きれを暗中に一晩乾燥させるステップ；ならびに、以下に記載のとおり、Ｃｏｌｏｒ  Ｅｙｅを用いて４６０ｎｍでの入射光のレミッションを計測することにより洗浄性能を評価するステップ。
【０３１７】
器具および材料
循環式水浴（５℃）；ガラスビーカ（２５０ｍＬ）；１００ｍＬの洗浄溶液容量を有するビーカ毎に１本の回転アーム；テスト布きれ：Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のＣＳ−２８（綿上の米デンプン）およびＥＭＰＡ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製のＥＭＰＡ１６２（綿／ポリエステル上の米デンプン）であって、布きれは５×５ｃｍに切断されている。
【０３１８】
洗浄溶液：５０ｍＭのＮａＨＣＯ3緩衝剤、ｐＨ８．０、水硬度：１５°ｄＨ、カルシウム：マグネシウム比４：１。
【０３１９】
アミラーゼストック溶液：１ｍｇの酵素タンパク質／ｍＬ。−０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2の超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）中の溶液を用いて、アミラーゼを希釈する（アミラーゼ希釈緩衝剤）。
【０３２０】
Ｃｏｌｏｒ  Ｅｙｅ計測
洗浄性能は、Δレミッション値（ΔＲｅｍ）として表される。布きれの光反射率の評価を、極小の楕円形のアパーチャ、すなわち０．７ｃｍ2（約０．７×１．０ｃｍ）を有するＭａｃｂｅｔｈ  Ｃｏｌｏｒ  Ｅｙｅ  ７０００反射率分光測光計を用いて行った。ＵＶを含まない入射光で計測を行い、４６０ｎｍでのレミッションを抽出した。布きれを計測開口対して持ち上げるピストンからの反射を低減するために、計測の前に、計測する布きれを他の同種の布きれの上に置いた。個別の布きれに係るΔレミッション値は、アミラーゼを添加することなく洗浄した布きれのレミッション値（対照）をアミラーゼで洗浄した布きれレミッション値から減じることにより算出した。
【０３２１】
小型洗浄ロボットを用いるα−アミラーゼ洗浄性能：
小型洗浄ロボットは洗濯機の小規模モデルであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために用いられる。
【０３２２】
１００ｍＬビーカに、６０ｍＬ洗浄溶液を加え、これを１５℃または４０℃に加熱する。次いで、酵素（濃度：０．００；０．０１５；０．０５；０．２５；０．５０；１．００ｍｇ酵素タンパク質／Ｌ）を添加する。ラック上の生地（ＣＳ−２８；綿上の米デンプン）を一定の酵素濃度の洗浄溶液に沈め、２０分間洗浄する。洗浄後、ラック上の生地を、乾燥棚の中で熱を加えることなく乾燥させる。生地のレミッションを、ＺＥＩＳＳ  ＭＣＳ  ５２１  ＶＩＳ分光測光計を用いて４６０ｎｍで計測する。個々の生地に係るΔレミッション値を、アミラーゼを添加することなく洗浄した生地のレミッション値（対照）をアミラーゼで洗浄した生地のレミッション値から減じることにより算出した。
【０３２３】
α−アミラーゼ活性判定用のｐＮＰ−Ｇ７アッセイ
α−アミラーゼ活性は、Ｇ７−ｐＮＰ基質を利用する方法により判定し得る。Ｇ７−ｐＮＰは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼにより切断されることが可能であるブロックオリゴ糖（ｂｌｏｃｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）である４，６−エチリデン（Ｇ7）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ1）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドに対する略記である。切断の後、キット中のα−グルコシダーゼが加水分解された基質をさらに消化して、黄色の遊離ｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）分子を遊離させ、これにより、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）での可視分光法による計測が可能である。Ｇ７−ｐＮＰ基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３）により製造されている。
【０３２４】
試薬：
このキットのＧ７−ｐＮＰ基質は、２２ｍＭの４，６−エチリデン−Ｇ７−ｐＮＰおよび５２．４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０）を含有する。
【０３２５】
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８７ｍＭのＮａＣｌ、１２．６ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０７５ｍＭのＣａＣｌ2、≧４ｋＵ／Ｌのα−グルコシダーゼ）を含有する。
【０３２６】
基質処理溶液は、１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬を０．２ｍＬのＧ７−ｐＮＰ基質と混合することにより形成される。この基質処理溶液は、使用直前に形成される。
【０３２７】
希釈緩衝剤：５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ14Ｈ22Ｏ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８．０。
【０３２８】
手法：
分析されるアミラーゼサンプルを希釈緩衝剤中に希釈して、確実に希釈サンプル中のｐＨを７とした。アッセイを、２０μｌの希釈酵素サンプルを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μｌの基質処理溶液を添加することにより行った。溶液を混合し、室温で１分プレインキュベートし、ＯＤ４０５ｎｍで５分間にわたって２０秒毎に吸収を計測する。
【０３２９】
時間依存吸収曲線の傾斜（吸光度／分）は、所与の一連の条件下で、対象のα−アミラーゼの特異活性（活性／ｍｇ酵素）と直接的に比例する。アミラーゼサンプルは、傾斜が０．４吸光度単位／分未満であるレベルまで希釈するべきである。
【０３３０】
デンプンへの結合性の判定
アッセイ原理：
アミラーゼ変異体は、選択されるべきα−アミラーゼの用途について意図されるｐＨ値（例えば、洗剤用途に関して、ｐＨは、ｐＨ８．０またはｐＨ１０．０などのアルカリ性領域内で選択されることが好適である）に応じて、ｐＨ４．０〜１１．０の範囲内で選択されたｐＨ値で；普通５分間〜１時間の間、１０分または３０分間などの好ましくは１０〜３０分の範囲内の選択された時間で；および、普通、０℃〜３０℃の範囲内、好ましくは４℃での選択された温度で、不溶性の生の米デンプンの存在下もしくは不在下でインキュベートされる。遠心分離の後、アミラーゼ活性が、上澄中で判定される。米デンプンの存在下および不在下でインキュベートしたサンプルにおける活性における差異が、アミラーゼの不溶性デンプンに対する結合性の尺度である。
【０３３１】
材料および方法：
米デンプン（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ，Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｓ７２６０）、ＨＥＰＥＳ、塩化カルシウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、グリシン、ＥｎｚＣｈｅｋ  Ｕｌｔｒａ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ｅ３３６５１）、インキュベーションおよび希釈用９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２６９６２０）、ならびに、蛍光計測用の半分の領域が黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３６９４）。
【０３３２】
アッセイ緩衝剤は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＣａＣｌ2および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有していた。酵素タンパク質溶液を、アッセイ緩衝剤で０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈した。高ｐＨ結合緩衝剤は、５０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有していた。米デンプン溶液（２．５％）は、配列番号１４の変異体用のアッセイ緩衝剤中で、および、配列番号２の変異体用の高ｐＨ結合緩衝剤中で調製した。ＥｎｚＣｈｅｃｋ  Ｕｌｔｒａ  Ａｍｙｌａｓｅ基質溶液を、製造業者の説明書に従って調製し、アッセイ緩衝剤中に５０μｇ／ｍｌに希釈した。
【０３３３】
ａ）米デンプン（２．５％）を含む、または、含まない緩衝剤を９６マイクロウェルプレートに１００μｌ加え、４℃で３０分間プレインキュベートした。
【０３３４】
ｂ）酵素溶液２０μｌを上記のウェルに加え、プレートをミキサに置いて、４℃で９００ｒｐｍで３０分混合した。
【０３３５】
ｃ）プレートを４℃で２０００ｒｐｍで５分間遠心分離してデンプンを沈降させ、上澄みを注意深く取り除き、酵素タンパク質濃度が約２０ｎｇ／ｍｌであるようアッセイ緩衝剤中で約１２５０倍に希釈した。
【０３３６】
ｄ）希釈酵素サンプル２５μｌを、２５μｌのＥｎｚＣｈｅｃｋ  Ｕｌｔｒａ  Ａｍｙｌａｓｅ基質溶液を含有する半分の領域が黒色の９６ウェルプレートに添加し、このプレートを直ぐに蛍光計測用のプレートリーダに置いた。
【０３３７】
ｅ）蛍光強度の変化（ΔＦ．Ｉ．）を、４８５ｎｍの励起波長および５１２ｎｍの照射波長で、２５℃で３０分間計測した。０．５〜５分の時間間隔の間の蛍光の読み取り値を活性の計算に用いた（すなわち）蛍光強度／分の変化（ΔＦ．Ｉ．／分）。
【数２】
2018153191.tif 000009
【実施例】
【０３３８】
実施例１：アミロースに対する結合性および洗浄性能の判定
方法の項に記載のデンプンに対する結合性の計測方法およびＡＭＳＡ洗浄性能テストを用いて、多数のアミラーゼおよびその変異体をアミロースに対する結合性および洗浄性能について分析した。
【０３３９】
結合性分析を、８．０のｐＨ、１０分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。結合性を、５％（ｗ／ｖ）アミロース（Ｓｉｇｍａ  Ａ０５１２）を用いてテストし、洗浄性能テストを、モデル洗剤Ａ、および、０．４ｍｇ酵素タンパク質／Ｌ洗浄溶液の酵素投与量、および、１５℃の洗浄温度を用いて、ＡＭＳＡ洗浄性能テストについて記載したとおり行った。洗浄時間は４５分間であった。
【０３４０】
結果が以下の表１に示されている。
【０３４１】
【表６】
2018153191.tif 000010
【０３４２】
【表７】
2018153191.tif 000011
【０３４３】
これらの結果から、デンプンに結合した画分と洗浄性能との間に逆相関が存在することが明らかに分かる。
【０３４４】
実施例２：生の米デンプンに対する結合性および洗浄性能の判定
原理：
原理は実施例１に記載のものと同一であるが、アミロースの代わりに、５％（ｗ／ｖ）米デンプン（Ｓｉｇｍａ  Ｓ７２６０）の懸濁液のみを用いた。結合性分析を、８．０のｐＨ、１０分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
【０３４５】
【表８】
2018153191.tif 000012
【０３４６】
実施例３：アミロペクチンに対する結合性の判定
原理は実施例１に記載のものと同一であるが、アミロースの代わりに、コーン由来の５％（ｗ／ｖ）アミロペクチン（Ｆｌｕｋａ製）の懸濁液のみを用いた。
【０３４７】
【表９】
2018153191.tif 000013
【０３４８】
実施例４：バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（配列番号１３）の変異体
配列番号１３を有するＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの変異体を形成した。テストした変異体は、配列番号１３を有する親α−アミラーゼと比して、デンプンに対する結合性が低く、より良好な洗浄性能を有するものであった。
【０３４９】
結合性分析を、８のｐＨ、５％（ｗ／ｖ）不溶性米デンプン、１０分間の結合時間、および、５℃の温度で行った。
【０３５０】
変異体の洗浄性能を、「小型洗浄ロボットを用いるα−アミラーゼ洗浄性能」に記載の条件を用いる小型洗浄を用いてテストしたところ、変異体は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の親α−アミラーゼと比して、０．５ｍｇ／Ｌ、４０℃で向上した洗浄性能を有することが示された。洗浄時間は２０分間であった。
洗浄性能＝値（変異体−ブランク）／値（Ｔｅｒｍａｍｙｌ−ブランク）×１００
【０３５１】
【表１０】
2018153191.tif 000014
【０３５２】
実施例５：バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）７０７α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼの追加の変異体を生成し、変異体を基質結合性についてテストし、ＡＭＳＡ洗浄性能を、０．３ｍｇ酵素タンパク質／Ｌを用い、１５℃で、モデル洗剤Ｘ中に２０分間でテストした。
【０３５３】
結合性分析を、１０．０のｐＨ、２．５％（ｗ／ｖ）不溶性米デンプン、１０分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
【０３５４】
洗浄性能は、修飾Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
【０３５５】
【表１１】
2018153191.tif 000015
【０３５６】
実施例６：バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）７０７α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼのさらなる変異体を生成し、変異体を基質結合性および低温での洗浄性能についてテストしたところ、選択した変異体は、修飾Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*を伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼよりも基質結合性が低いものであった。ＡＭＳＡ洗浄テストを、０．３ｍｇ酵素タンパク質／Ｌを用い、１５℃、モデル洗剤Ｘ中に２０分間で行った。
【０３５７】
洗浄性能は、修飾Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
【０３５８】
【表１２】
2018153191.tif 000016
【０３５９】
実施例７：バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）７０７α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼのさらなる変異体を生成し、変異体を基質結合性および低温での洗浄性能についてテストしたところ、選択した変異体は、修飾Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*を伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼよりも基質結合性が低いものであった。ＡＭＳＡ洗浄テストを、０．３ｍｇ酵素タンパク質／Ｌを用い、１５℃、モデル洗剤Ｘ中に２０分間で行った。
【０３６０】
結合性分析を、８．０のｐＨ、１０分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
【０３６１】
洗浄性能は、修飾Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
【０３６２】
【表１３】
2018153191.tif 000017
【０３６３】
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。
【配列表】
2018153191000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月8日(2018.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）前記α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について前記変異体をテストするステップ；
ｃ）前記基質に対する結合性が前記親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ
を含む、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法。
【請求項２】
前記親α−アミラーゼが、配列番号１及び３〜１５の１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有するよう、アミラーゼから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体のデンプンに対する結合性が、前記親α−アミラーゼの９０％未満の結合性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
α−アミラーゼ活性を有し、かつ、配列番号１及び３〜１５の１つに対して少なくとも９０％配列同一性を有する変異体ポリペプチドであって、前記変異体が置換、挿入および欠失から選択される１つまたは複数の修飾により親α−アミラーゼから誘導され、前記変異体α−アミラーゼは、前記親α−アミラーゼと比して、固体デンプンに対する結合性が低く、かつ、低温での洗浄性能が高い変異体ポリペプチド。
【請求項５】
分子の表面上の１つまたは複数の基質結合部位におけるアミノ酸残基が修飾される、請求項４に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項６】
ａ）配列番号２に対して、少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、位置１８１＋１８２または１８２＋１８３または１８３＋１８４の欠失を含み、また、配列番号２におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｎ２６０、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｒ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応するいずれかの位置に１つもしくは２つ以上の修飾をさらに含む変異体α−アミラーゼ；
ｂ）配列番号５に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、位置１８１＋１８２または１８２＋１８３または１８３＋１８４の欠失を含み、また、配列番号５におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｋ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応するいずれかの位置に１つもしくは２つ以上の修飾をさらに含む変異体α−アミラーゼ；
ｃ）配列番号４に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、位置１８１＋１８２または１８２＋１８３または１８３＋１８４の欠失を含み、また、配列番号４におけるＷ１４０、Ｗ１５９、Ｗ１６７、Ｑ１６９、Ｗ１８９、Ｅ１９４、Ｆ２６２、Ｗ２８４、Ｆ２８９、Ｇ３０４、Ｇ３０５、Ｋ３２０、Ｗ３４７、Ｗ４３９、Ｗ４６９、Ｇ４７６およびＧ４７７に対応するいずれかの位置に１つもしくは２つ以上の修飾をさらに含む変異体α−アミラーゼ；
ｄ）配列番号１３に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、配列番号１３におけるＷ１３８、Ｗ１５７、Ｗ１６５、Ｅ１６７、Ｗ１８４、Ｅ１８９、Ｅ２５５、Ｆ２５７、Ｆ２７９、Ｆ２８４、Ｇ２９９、Ｇ３００、Ｋ３１５、Ｗ３４２、Ｒ４３７、Ｗ４６７およびＧ４７５に対応するいずれかの位置に修飾を含む変異体α−アミラーゼ；
ｅ）配列番号１４に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、位置１７６＋１７７または１７７＋１７８または１７８＋１７９の欠失を含み、また、配列番号１４におけるＷ１３６、Ｗ１５５、Ｗ１６３、Ｅ１６５、Ｗ１８４、Ｅ１８９、Ｅ２５５、Ｆ２５７、Ｆ２７９、Ｆ２８４、Ｇ２９９、Ｇ３００、Ｒ３１５、Ｗ３４２、Ｒ４３７、Ｗ４６７およびＧ４７５に対応するいずれかの位置に１つまたは２つ以上の修飾をさらに含む変異体α−アミラーゼ；ならびに
ｆ）配列番号１５に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、ならびに、位置１７９＋１８０または１８０＋１８１または１８１＋１８２の欠失を含み、また、配列番号１５におけるＷ１３９、Ｗ１５８、Ｗ１６６、Ｅ１６８、Ｗ１８７、Ｅ１９２、Ｆ２６０、Ｆ２８７、Ｇ３０２、Ｇ３０３、Ｗ３４５、Ｗ４３７、Ｗ４６７、Ｇ４７４およびＧ４７５に対応するいずれかの位置に１つまたは２つ以上の修飾をさらに含む変異体α−アミラーゼ
から選択される請求項５に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項７】
配列番号２に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、および、配列番号２における以下：
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｆ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ｎ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｙ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ａ５１Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ２８４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ２８４Ｄ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｄ４６７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｍ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｋ４８５Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１６０Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｆ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｆ２６２Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ３６３Ｈ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７６Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ７２Ｓ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｍ２０２Ｌ＋Ｙ２０３Ｇ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ３４５Ｄ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ３０２Ｎ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｐ３８０Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｌ２３０Ｉ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｅ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；および
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７
の位置に対応する位置に修飾を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項８】
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｆ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ｎ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｑ１６９Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｙ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ａ５１Ｉ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ１８９Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｗ２８４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｅ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ２８４Ｄ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｄ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｄ４６７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｍ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｋ４８５Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ１６０Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１８９Ｆ＋Ｅ１９０Ｐ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｆ２６２Ａ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｙ３６３Ｈ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ４７６Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ７２Ｓ＋Ｗ１４０Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｇ１０９Ａ＋Ｍ２０２Ｌ＋Ｙ２０３Ｇ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ１９４Ｓ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｅ３４５Ｄ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｋ３０２Ｎ＋Ｗ４３９Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｒ３２０Ｋ＋Ｗ４３９Ｒ
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｅ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｇ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｐ３８０Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｖ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｖ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｗ４３９Ｒ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｋ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｇ４７６Ｅ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｆ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｎ２６０Ｄ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７Ｑ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｌ２３０Ｉ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ；
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１５９Ｙ＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｎ２６０Ｐ＋Ｅ４３９Ｙ＋Ｇ４７６Ｑ＋Ｇ４７７Ｑ；および
Ｈ１８３*＋Ｇ１８４*＋Ｗ１６７Ｙ＋Ｆ２６２Ｐ＋Ｗ４６９Ｙ＋Ｇ４７６Ｒ＋Ｇ４７７Ｑ
から選択される修飾を伴う配列番号２から構成される、請求項７に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項９】
配列番号１４に対して少なくとも９０％配列同一性を有し、および、配列番号１４における以下：
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｔ３６Ｎ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１３６Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１５５Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１５５Ｆ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１６３Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｅ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｋ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｒ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ｍ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ａ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ｑ；および
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ３４２Ｙ
の位置に対応する位置に修飾を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項１０】
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｔ３６Ｎ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１３６Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１５５Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１５５Ｆ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ１６３Ｙ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｅ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｋ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｇ２９９Ｒ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ｍ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ａ；
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｒ３１５Ｑ；および
Ｅ１７８*＋Ｇ１７９*＋Ｗ３４２Ｙ
から選択される修飾を伴う配列番号１４から構成される、請求項９に記載の変異体。
【請求項１１】
配列番号１３における対して少なくとも９０％配列同一性を有し、および、配列番号１３における位置Ｋ３１５および／またはＷ４６７に対応する位置に修飾を含む、請求項４に記載の変異体α−アミラーゼ。
【請求項１２】
置換Ｋ３１５Ｍを伴う配列番号１３から構成される、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
請求項４〜１２のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物。
【請求項１４】
ランドリーまたは自動皿洗浄を含む硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける請求項４〜１２のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼの使用。