(57)【要約】【課題】皮膚老化に伴って減少するＫＬＫ７の産生を促進する新たな組成物を提供することを課題とする。【解決手段】酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上を含むカリクレイン７産生促進用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上を含むカリクレイン７産生促進用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物を含むカリクレイン７産生促進のための皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚細胞のカリクレイン７（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７）（以下、ＫＬＫ７という。）の産生を促進する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＫＬＫ７は、キモトリプシン様活性を示すカリクレイン遺伝子ファミリーのＳ１セリンプロテアーゼである。主として皮膚において発現し、皮膚生理に深く関与していることが報告されている。
特許文献１には、ヒトＫＬＫ７は、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群または他の掻痒性皮膚疾患、例えば結節性痒疹、老人の不特定の掻痒ならびに上記障壁機能不全を伴う他の疾患、例えば炎症性腸疾患およびクローン病のような炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患の処置のための潜在的な標的と考えられ、その特異的調節剤（アゴニストまたは阻害剤）を供給することで、これらの疾患を治療する方法が提案されている。
一方、皮膚から採取した角層におけるＫＬＫ７の発現量は、目尻の弾力性の低下に伴って有意に減少すること、及び目尻のしわ体積率の増加に伴って有意に減少することが知られている（特許文献２）。
特許文献３には、女性の皮膚の老化により発現が変化するタンパク質としてＫＬＫ７を特定して、女性の皮膚の加齢により生じた皮膚の老化現象の程度を判定するためのキットが提案されている。このようにＫＬＫ７の発現量の低下が皮膚の老化の一因であることも明らかになっている。
また、ヒト表皮角化細胞におけるＫＬＫ７の発現量は、カルシウム、ビタミンＤ３、レチノイン酸といった細胞分化に影響を与える分子によって変動することが知られている。また、ＫＬＫ７は、銅イオンや亜鉛イオン等の遷移金属イオンがＫＬＫ７アミノ酸側鎖のヒスチジン残基にμＭオーダーで共有結合することで阻害されることが知られている。
ＫＬＫ７産生促進剤としては、既に塩化カルシウム、レチノイン酸が知られている。
本出願人は、多数の天然成分のカリクレイン産生促進作用について研究を行い、チオレドキシン、シリビン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物、パントテン酸またはその塩、セダノリド、環状フォスファチジン酸にＫＬＫ７産生促進作用を見いだし特許出願を行っている（特許文献４）。また特許文献４には、皮膚の弾力性低下や、シワの増加を、皮膚内のＫＬＫ７量が低下しているか否かを指標として評価することができることが記載されている。上記のような技術背景から、老化にともなってＫＬＫ産生能の低下した皮膚細胞におけるＫＬＫ７産生を促進するための促進剤の探索が継続的に行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１０−５３６７３２号公報
【特許文献２】特許第５３６２２１９号公報
【特許文献３】特許第５６６３０５４号公報
【特許文献４】特開２０１６−３１９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、皮膚老化に伴って減少する皮膚細胞のＫＬＫ７の産生を促進する物質を探索する過程で見出されたものである。すなわち本発明は、皮膚細胞のＫＬＫ７産生を促進する新たな組成物を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明は以下の構成である。
（１）酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上を含むカリクレイン７産生促進用組成物。
（２）（１）に記載の組成物を含むカリクレイン７産生促進のための皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ＫＬＫ７の産生を促進する組成物が提供される。本発明の組成物は皮膚外用剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】酵母抽出液ＢＧがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフである。
【図２】ビタミンＢ２がヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフである。
【図３】イノシトールがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
本願は、酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上を含むカリクレイン７（ＫＬＫ７）産生促進用組成物に係る発明である。
【０００９】
ヒトＫＬＫ７は、分子質量２７，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。ＫＬＫ７は、角質層の細胞間どうしの結合部分を切断することにより皮膚表面からの細胞の落屑を促す作用が知られている。ＫＬＫ７遺伝子は、組織中では皮膚で多く発現される一方、脳、乳腺、脊髄、腎臓等でも発現が見られる。
また、ＫＬＫ７の利用として、皮膚の弾力性低下や、シワの増加を、皮膚内のＫＬＫ７量が低下しているか否かを指標として評価することができる。ＫＬＫ７の産生を促進することにより、皮膚内のＫＬＫ７量を増加させ、皮膚の老化を抑制することが期待できる。
【００１０】
本発明のＫＬＫ７産生促進用組成物は、酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上の成分をＫＬＫ７産生促進の有効成分として含有している。
【００１１】
本発明の組成物の有効成分である酵母抽出物とは、自己消化または酸加水分解することによって得られた液の濃縮又は乾燥物、或いは該濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む溶液で抽出して得られた組成物の、蒸発残留物である。つまり、本発明の酵母抽出物は、酵母の細胞を集めて破砕し、酵母自身に含まれる消化酵素の作用によって自己消化させたもの、あるいは酸やアルカリ、さらにはタンパク質分解酵素、核酸分解酵素により分解したものをろ過し、或いはろ過せずに、濃縮又は乾燥したものでもよいし、前記濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む混合溶液にて抽出した組成物の蒸発残留物でもよい。したがって、酵母抽出物には、アミノ酸類、糖類などの酵母の培養によって得られる成分が豊富に含まれる。
【００１２】
本発明に用いる酵母抽出物は、市販品を用いることができる。乾燥物の市販品としてはSpectrum Chemical Mfg.Corp.のYeast Extract Powder(YE105)を例示することができる。酵母抽出物を水及び／又はアルコール類で抽出・分散した市販品としては、丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」、一丸ファルコス株式会社製の「イーストリキッド１０００４０」、ＢＩＯＤＥＬＬ製の「チトカタライザー」を例示することができる。
酵母抽出物を得るための原料である酵母は、特に制限はなく、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に代表される醸造用酵母、パン酵母は勿論のこと、トルラ属酵母（例えばCandida utilis）等のどのような酵母も利用することができる。
さらに、本発明に使用する酵母は、培養された酵母のみならず、ビール、清酒等の醸造後の酵母であっても差し支えない。なお、ビール醸造に利用された酵母（ビール酵母）の場合、ホップ由来の苦味、渋味等を有しているので、水洗その他の脱苦味等の処理をした後、酵母抽出物の製造に用いることが望ましい。
また、生の酵母ばかりでなく、ドラム乾燥、噴霧乾燥等により製造された乾燥酵母も原料として用いることができる。酵母を原料として、酵母抽出物とするためには次のような工程を一般的には採用する。
原料酵母を常法により、自己消化させ、あるいは酸分解、アルカリ分解、プロテアーゼによって分解処理を行う。ついで、不溶物をろ過により除去した後、加熱濃縮あるいは減圧濃縮を行うが、場合によっては噴霧乾燥処理を行う。かくして得られた濃縮物又は乾燥物は本発明の酵母抽出物として用いることができるが、厚生省薬務局審査課編「医薬部外品原料規格2006」（以下「外原規」）において「酵母エキス（１）」又は「酵母エキス（２）」として規格化されているものを用いてもよい。
また、「酵母エキス（１）」又は「酵母エキス（２）」を、さらに水及び／又はアルコールの混合溶液にて抽出した組成物も本発明の酵母抽出物として用いることができるが、こちらは「外原規」において「酵母エキス（３）」、「酵母エキス（４）」として規格化されているものを用いてもよい。
前記抽出に用いるアルコールとしては、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、例えばエタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコールが例示できる。また、これらのアルコールは混合物であっても良い。
【００１３】
溶解又は分散操作にあたっては、用いる溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、溶解操作時間を、原料及び使用する溶媒によってそれぞれ任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、酵母中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。操作は、例えば溶媒と酵母抽出物の混合物を１〜１０時間連続的に振盪あるいは撹拌混合することで行われる。そして所定の操作が終了後、１０００〜１５０００Ｇで遠心分離を行い、不溶解性あるいは非分散性沈殿物を除去すれば本発明に使用する酵母抽出物を得ることができる。
【００１４】
酵母抽出物は、溶媒抽出後、さらに適宜精製操作を施すことも可能であり、活性炭処理やクロマト分離などを行っても良い。また１，３ブチレングリコールを用いた抽出の場合、抽出液から減圧濃縮などの方法で濃縮した濃縮物を本発明の酵母抽出物とすることができる。
【００１５】
本発明では、酵母エキス（３）として規格化されているものを用いることが好ましい。  酵母エキス（３）は、酵母の自己消化又は酸加水分解によって得られた液を乾燥したものを、さらに水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液にて抽出して得られる組成物である。酵母エキス（３）を含む市販品としては、前述した丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」が挙げられるが、これは酵母の自己消化によって得られた消化液を噴霧乾燥し、得られたものを水で抽出し、１，３−ブチレングリコールを加えたものである。丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」を例にとると、本発明の酵母抽出物に該当する蒸発残留物は、１０ｍＬを１０５℃で６時間乾燥させたときに０．８〜２．４ｗ／ｖ％を示す。後述する試験例で用いた、丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」は、酵母抽出物１．６質量％、水４９．２質量％、１，３−ブチレングリコール４９．２質量％から成る。
本発明では、酵母抽出物として、組成物当たり０．００１〜１質量％含有することが好ましい。
【００１６】
本発明の組成物の構成成分であるビタミンＢ２は、リボフラビン (Riboflavin)、ラクトフラビン（Lactoflavine）とも呼ばれ、ビタミンの中で水溶性ビタミンに分類される生理活性物質で、ヘテロ環状イソアロキサジン環に糖アルコールのリビトールが結合したものである。生体内においては脂肪、炭水化物および蛋白質の代謝や、呼吸、赤血球の形成、抗体の生産、正常な発育に必要とされる。甲状腺の正常な活性の維持や、皮膚、爪あるいは頭髪をはじめ、体全体の正常な健康状態の維持に不可欠であり、不足すると口内炎や舌炎、皮膚炎、てんかん発作などの症状を生じるといわれている。
本発明に用いるビタミンＢ２は、食品や医薬品に使用される規格を満たすものであればどのようなものでも使用可能である。日本薬局方では、定量するとき、リボフラビンを９８．０%以上含むものと定めており、このような高純度のものを用いることが好ましい。
本発明では、ビタミンＢ２として、組成物当たり０．００００００１〜１質量％含有することが好ましい。
【００１７】
イノシトールは、シクロヘキサンの各炭素原子上の水素原子が1つずつヒドロキシ基に置き換わった構造（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）を持つ、シクリトールの１種である。ビタミンＢ群の１種とも言われており、ヒトの場合、糖尿病などが原因で体内のイノシトールが不足すると、神経症状が起こるなどの悪影響が知られている。また食品に広く含有されており、その安全性も熟知されている。
本発明に用いるイノシトールは、食品や医薬品に使用されるように調製されたものであればどのようなものでも使用可能である。
本発明では、イノシトールとして、組成物当たり、０．０１〜３質量％含有することが好ましい。
【００１８】
本発明のＫＬＫ７産生促進組成物としては、医薬品、化粧品、食品、飲料などを例示できる。その投与経路も、経口投与、経皮投与のいずれも可能である。なかでも経皮投与が好ましく、化粧品や皮膚外用医薬などの経皮組成物の形態を採用することが特に好ましい。経口投与などにより、有効成分を皮膚に到達させることもできる。
【００１９】
本発明の酵母抽出物、イノシトール、ビタミンＢ２から選ばれる１種以上を含むカリクレイン７産生促進用組成物を人に投与する製剤とするために、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料などが好適に例示できる。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤類、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に試験例を示し、本発明の組成物の示す効果について具体的に説明する。
＜ＫＬＫ７産生促進効果の測定方法＞
ヒト表皮細胞を用い、ＫＬＫ７産生促進効果を確認した。
１．試験試料
試験試料には、酵母抽出物として「酵母抽出液ＢＧ（丸善製薬株式会社製  酵母抽出物１．６質量％含有）、ビタミンＢ２として「リボフラビン（和光純薬工業株式会社製）」、イノシトールとして「イノシトール（築野ライスファインケミカルズ株式会社製）を用いた。それぞれの試料は、培養液で希釈して、最終培地中の試料濃度とした。
【００２１】
２．試験に用いた細胞
細胞は、NHEK-Neo（ヒト表皮角化細胞、新生児皮膚由来、Life Technologies Japan社製）を用いた。培養液は、EpiLife（登録商標）Medium with 60μM Calcium（Life Technologies Japan社製）にHumedia-KG2増殖添加剤セット（倉敷紡績株式会社製）を加えた培地を用いた。
【００２２】
３．産生促進効果確認試験
Humedia-KG2添加EpiLifeで培養したヒト新生児ケラチノサイトNHEK-Neoを、1 × 105 cells/ wellの細胞密度で6 well plateに播種して、３７℃５％ＣＯ２インキュベーターにて３日間培養培養した。培養終了後に試験試料を添加した培地に交換後、さらに２日間３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。その後培養上清を回収した。ＫＬＫ７産生量は、培地濃縮倍率を一定とし、ウェスタンブロット法で定量した。定量に当たって、抗ＫＬＫ７抗体（abnova社）を用いて測定した。
【００２３】
４．結果
酵母抽出液ＢＧの試験結果を図１、ビタミンＢ２の試験結果を図２、イノシトールの試験結果を図３に示した。なお図１の酵母抽出液ＢＧの試験結果、及び図２、図３のビタミンＢ２及びイノシトールの試験結果は、コントロールのＫＬＫ７産生量を１とした時の相対値である。
酵母エキス、ビタミンＢ２、イノシトールとも、極めて低濃度で皮膚細胞培養液中に分泌されるＫＬＫ７産生を促進することが確認された。すなわち、これらの成分を含む組成物が皮膚のＫＬＫ７産生を促進することが明らかとなった。
【００２４】
組成物の一例として下記に示す処方で化粧料を、常法により調製した。
処方例１（クリーム）
（質量％）
１．水                                                            残余
２．グリセリン                                                      ７
３．ジプロピレングリコール                                          ７
４．１，２−ペンタンジオール                                        １
５．スクワラン                                                    １０
６．メドゥフォーム油                                                ５
７．ステアリン酸ポリグリセリル−１０                                ２
８．水添レシチン                                                    ０．５
９．シマルゲルＮＳ（セピック社製）                                  ０．５
１０．ベヘニルアルコール                                            １
１１．カルボキシビニルポリマー                                      ０．１
１２．キサンタンガム                                                ０．０５
１３．水酸化カリウム                                                ０．０３
１４．酵母抽出液ＢＧ（丸善製薬株式会社製）＊１                      ０．１
＊１酵母抽出液ＢＧ０．１質量％中に、酵母抽出物は０．００１６質量％含まれる。
処方例２（クリーム）
（質量％）
１．水                                                            残余
２．ジグリセリン                                                    ４
３．１，３−ブチレングリコール                                      ５
４．１，２−ペンタンジオール                                        ０．５
５．キサンタンガム                                                  ０．２
６．トリ−２エチルヘキサン酸グリセリル                              ８
７．ホホバ油                                                        ４
８．スクワラン                                                      ４
９．自己乳化型モノステアリン酸グリセリン                            ２．５
１０．ステアリン酸ポリグリセリル−１０                              ２
１１．パルミチン酸セチル                                            ２
１２．ベヘニルアルコール                                            ２
１３．イノシトール                                                  ０．５
処方例３（美容ジェル）
（質量％）
１．水                                                            残余
２．ジグリセリン                                                  １０
３．１，３−ブチレングリコール                                      ５
４．１，２−ペンタンジオール                                        ０．５
５．アルキル変性カルボキシビニルポリマー                            ０．３
６．シリコーン油                                                    １
７．ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液）                            ０．１
８．ビタミンＢ２                                                    ０．０１ 
９．水酸化カリウム                                                  ０．０９
【図１】
2018131405.tif 000003
【図２】
2018131405.tif 000004
【図３】
2018131405.tif 000005