(57)【要約】【課題】従来のワクチンアジュバントとして知られているLPSは毒性が強いため、毒性を低減させるなどの改変を必要とするものであった。また、LPSの活性中心であるリピドA、例えばモノホスホリルリピドA（MPL）は、アジュバントとして有効であるが、他の基剤との組み合わせが必要であった。更に、アジュバントとして現在検討されているOMVは大腸菌などの病原菌由来のものが多く、その毒性から安全性に問題が残るものであった。これらの課題を解決する新たなアジュバントが必要とされていた。【解決手段】酢酸菌由来の外膜小胞（Outer Membrane Vesicle；OMV）を含む、免疫増強剤を提供する。本発明の免疫増強剤は、単独で、又はワクチンアジュバントとして使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸菌由来の外膜小胞（Outer Membrane Vesicle；OMV）を含む、免疫増強剤。
【請求項２】
酢酸菌がアセトバクター属（Acetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、アサイア属（Asaia）、及び／又はコマガテイバクター属（Komagateibacter）に属する、請求項１記載の免疫増強剤。
【請求項３】
酢酸菌がアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・オルレアネンシス（Acetobacter orleanensis）、アセトバクター・オリエンタリス（Acetobacter orientalis）、アセトバクター・ポモルム（Acetobacter pomorum）；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateurii）、グルコノバクター・ジャポニクス（Gluconobacter japonicus）；グルコナセトバクター・リクエファシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）；アサイア・ボゴレンシス（Asaia bogorensis）、アサイア・シアメンシス（Asaia siamensis）；コマガテイバクター・エウロパエウス（Komagataeibacter europaeus）、コマガテイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、コマガテイバクター・マルタセチ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガテイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）、コマガテイバクター・オボエディエンス（Komagataeibacter oboediens）、及びコマガテイバクター・キシリヌス（Komagataeibacter xylinus）から選択される1種以上である、請求項２記載の免疫増強剤。
【請求項４】
OMVが粒径50〜200nmである、請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫増強剤。
【請求項５】
OMVがpH1〜8の水性溶液中で安定である、請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫増強剤。
【請求項６】
ワクチンアジュバントである、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫増強剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の免疫増強剤を含む、アジュバント組成物。
【請求項８】
抗原と組み合わせて投与される、請求項７記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項記載の免疫増強剤を含み、ワクチン組成物の一部として投与される、免疫原性組成物。
【請求項１０】
経口的に投与又は摂取される、請求項１〜６のいずれか１項記載の免疫増強剤、請求項７若しくは８記載のアジュバント組成物、又は請求項９記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
液状、半固体状、若しくは固体状の医薬品、飲食品、又はサプリメントとして提供される、請求項１０記載の免疫増強剤、アジュバント組成物、又は免疫原性組成物。
【請求項１２】
以下：
pH1〜8の緩衝液中、25℃〜37℃の範囲の温度で酢酸菌を対数増殖期後期まで培養するステップ、
培養液から菌体を分離するステップ、及び
菌体から放出されたOMVを取得するステップ
を含む、酢酸菌由来OMVの製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法で得られた酢酸菌由来OMVを製剤化するステップを含む、免疫増強剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規免疫増強剤及びその製造方法に関する。より具体的には、本発明は、ワクチンアジュバント、免疫原性組成物、また免疫増強効果を期待できる飲食品及びサプリメント等に利用することができる酢酸菌由来の外膜小胞を含む免疫増強剤、及びその好適な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細菌やウイルス等による感染症の予防を目的として、また近年では寄生虫感染や癌、免疫疾患に対する治療及び予防を目的として、ヒトを含む動物宿主における免疫応答を高めるためのワクチンの製造及び開発が行われている。ワクチンは、抗原と、その抗原性を高めるためのアジュバントとを含むことが一般的である。
【０００３】
アジュバントとしては、例えばアルミニウム化合物、サポニン、エマルジョン、リピドA等が実用化されている。また、アジュバントの一形態として、リピドAを含む細菌由来のリポ多糖（lipopolysaccharides、LPS）が注目されている。しかしながら、LPSは強い毒性を有することから、循環器系に入ると免疫系を過剰に活性化し、敗血症などを発症させるなど副反応が強すぎるため、そのままではアジュバントとして用いることが難しいことが知られている。そのため、従来、化学合成や遺伝子改変によってLPSの活性中心であるリピドA部分の化学構造を改良し、弱毒化して用いられてきた（特許文献１）。また近年、アジュバントの作用メカニズム等との関連において、免疫系において重要な機能を有するToll様受容体（Toll-like receptor、TLR）の存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
近年、多くのグラム陰性細菌が放出する直径20-300 nm程度のベシクルである外膜小胞（Outer Membrane Vesicle；OMV）について、エンドサイトーシスなどによる細胞への取り込みがあること（非特許文献２）、またLPSおよびタンパク質などの親株由来の成分を１つの構造体内に持つことから、ワクチンとしての利用可能性が示唆され（非特許文献３）、例えば髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）等に対するワクチンが検討されている（特許文献２及び３、非特許文献４）。しかしながら、OMVは、含まれるLPSに起因する強毒性を同様に持つために、何らかの方法での弱毒化が必要である。例えば、界面活性剤によるLPSの除去や、遺伝子改変によるリピドA構造の改良などが実施されている。
【０００５】
一方、鹿児島県特産の醸造酢である黒酢は、コレステロールや中性脂肪の減少などの生活習慣病の改善、アレルギー疾患の改善など、健康の維持に有用な機能性食品であることが知られている。
【０００６】
黒酢は糖化発酵、アルコール発酵、乳酸発酵、酢酸発酵を担う酢酸菌などの様々な微生物が関与して発酵され、さらに長期間熟成されて製造されている。本発明者等のグループによるこれまでの研究から、黒酢には微生物由来の疎水性成分が含まれ、これらが自然免疫系を活性化することを見出している（非特許文献５）。また、醸造酢の発酵微生物の一つである酢酸菌のLPS画分がTLR4を弱く活性化すること、活性中心であるリピドAが酸に強い構造を持っていることを明らかにしている（非特許文献６）。酢酸菌LPSは黒酢由来の疎水性画分と構成糖、及び分子量が類似していることから、酢酸菌LPSが黒酢の機能性に関わっている可能性が高い。しかしながら、LPS様成分が黒酢中で、どのような形態で存在しているのかは明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平8-508722
【特許文献２】特表2005-514388
【特許文献３】特表2014-520801
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Toussi DN and Massari P, Vaccines 2014, 2, 323-353
【非特許文献２】O'Donoghue EJ et al., Cell Microbiol. 2016, 18(11), 1508-1517
【非特許文献３】Baker JL et al., Curr Opin Biotechnol. 2014, 29, 76-84
【非特許文献４】Asevedo R et al., Front Immunol. 2014, 5: 121
【非特許文献５】Hashimoto M et al., J. Biosci. Bioeng. 2013, 116(6), 688-696
【非特許文献６】Hashimoto M et al., J. Biol. Chem. 2016, 291(40), 21184-21194
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の通り、アジュバントとしての利用が知られているLPSは毒性が強いため、毒性を低減させるなどの改変を必要とするものであった。また、LPSの活性中心であるリピドA、例えばモノホスホリルリピドA（MPL）は、アジュバントとして有効であるが、他の基剤との組み合わせが必要であった。更に、アジュバントとして現在検討されているOMVは大腸菌などの病原菌由来のものが多く、その毒性から安全性に問題が残るものであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、黒酢の醸造において用いられる発酵微生物の機能を検討する中で、これらの微生物由来の成分が最終的に黒酢中に残存し得ることから、特に酢酸菌由来の免疫調節性成分が含まれる可能性に着目し、酢酸菌の培養中でOMVが産生されているか否かについて検討した。
【００１１】
その結果、酢酸菌がLPSを含むOMVを産生すること、そして得られた外膜小胞が弱毒性であることを見出した。更に、得られたOMVは耐酸性を有することもわかり、アジュバントとして、またワクチン、特に経口ワクチンとして有効であり得ることを見出すに到った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．酢酸菌由来の外膜小胞（Outer Membrane Vesicle；OMV）を含む、免疫増強剤。
２．酢酸菌がアセトバクター属（Acetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、アサイア属（Asaia）、及び／又はコマガテイバクター属（Komagateibacter）に属する、上記１記載の免疫増強剤。
３．酢酸菌がアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・オルレアネンシス（Acetobacter orleanensis）、アセトバクター・オリエンタリス（Acetobacter orientalis）、アセトバクター・ポモルム（Acetobacter pomorum）；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateurii）、グルコノバクター・ジャポニクス（Gluconobacter japonicus）；グルコナセトバクター・リクエファシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）；アサイア・ボゴレンシス（Asaia bogorensis）、アサイア・シアメンシス（Asaia siamensis）；コマガテイバクター・エウロパエウス（Komagataeibacter europaeus）、コマガテイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、コマガテイバクター・マルタセチ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガテイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）、コマガテイバクター・オボエディエンス（Komagataeibacter oboediens）、及びコマガテイバクター・キシリヌス（Komagataeibacter xylinus）から選択される1種以上である、上記２記載の免疫増強剤。
４．OMVが粒径50〜200nmである、上記１〜３のいずれか記載の免疫増強剤。
５．OMVがpH1〜8の水性溶液中で安定である、上記１〜４のいずれか記載の免疫増強剤。
６．ワクチンアジュバントである、上記１〜５のいずれか記載の免疫増強剤。
７．上記１〜６のいずれか記載の免疫増強剤を含む、アジュバント組成物。
８．抗原と組み合わせて投与される、上記７記載のアジュバント組成物。
９．上記１〜６のいずれか記載の免疫増強剤を含み、ワクチン組成物の一部として投与される、免疫原性組成物。
１０．経口的に投与又は摂取される、上記１〜６のいずれか記載の免疫増強剤、上記７若しくは８記載のアジュバント組成物、又は上記９記載の免疫原性組成物。
１１．液状、半固体状、若しくは固体状の医薬品、飲食品、又はサプリメントとして提供される、上記１０記載の免疫増強剤、アジュバント組成物、又は免疫原性組成物。
１２．以下：
pH1〜8の緩衝液中、25℃〜37℃の範囲の温度で酢酸菌を対数増殖期後期まで培養するステップ、
培養液から菌体を分離するステップ、及び
菌体から放出されたOMVを取得するステップ
を含む、酢酸菌由来OMVの製造方法。
１３．上記１２記載の方法で得られた酢酸菌由来OMVを製剤化するステップを含む、免疫増強剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、酢酸菌から効果的にOMVを回収することができる。酢酸菌由来OMVは強酸性条件下においても安定であることから、本発明の免疫増強剤は胃を通過して腸管に到達し、消化管内での感染症状に対して有効であるだけでなく、腸からの吸収も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】804培地（ハイポリペプトン(和光純薬工業社) 5 g、酵母抽出物 5 g、グルコース 5 g、MgSO4・7H2O 1 g、±寒天 15 g、蒸留水 1L、pH6.6-7.0）中で27℃で培養したアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus） NBRC 3283株の増殖曲線を示す。
【図２】アセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus） NBRC 3283株由来のOMV中のヘキソース含量を培養日数との関係で示す。
【図３】Optiprepを用いた密度勾配遠心法によるOMVの精製を示す。
【図４】Ａ：酢酸菌由来のOMV中に含まれる糖がLPS中の糖とほぼ同一であることを示す。Ｂ：OMV中に含まれるタンパク質が酢酸菌由来の外膜タンパク質であることを示す。MP：マーカータンパク質、Ap LPS：アセトバクター・パスツリアナス由来LPS、Ap OMV：アセトバクター・パスツリアナス由来OMV、OmpA：アセトバクター・パスツリアナス由来膜タンパク質。
【図５】酢酸菌由来のOMVを多く含む画分３がTLR2活性化能（Ａ）及び弱いTLR4活性化能（Ｂ）を有することを示す。横軸はOptiprepで分取したそれぞれの画分を、縦軸は画分を含まない場合と比較した相対ルシフェラーゼ活性を示す。黒いバーは画分の1/10希釈物、白いバーは画分の1/100希釈物を用いた場合の結果を示す。
【図６】酢酸菌由来のOMVが用量依存的にTLR2（Ａ）及びTLR4活性化能（Ｂ）を有することを示す。横軸は試料1ml中のOMV濃度、縦軸はOMVを含まない場合と比較した相対ルシフェラーゼ活性を示す。
【図７】酢酸菌由来のOMVが酸性条件下で安定であることを示す。Ａ：疑似胃液（pH 1.6）中の安定性、Ｂ：HEPESバッファー中の安定性。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、酢酸菌由来の外膜小胞（Outer Membrane Vesicle；OMV）を含む、免疫増強剤を提供する。OMVは、酢酸菌由来のLPSをその膜中に含むが、従来食品工業において安全に使用されてきたことから、安全性が実証されている一方で、LPS及び小胞自体による免疫増強作用を有することが見出された。
【００１６】
酢酸菌は、エタノールを酸化発酵して酢酸を生産するグラム陰性の好気性細菌である。本発明において好適に使用できる酢酸菌としては、例えばアセトバクター属（Acetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、アサイア属（Asaia）、コマガテイバクター属（Komagateibacter）に属するものが挙げられる。
【００１７】
特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるアセトバクター属の細菌としては、具体的にはアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・オルレアネンシス（Acetobacter orleanensis）、アセトバクター・オリエンタリス（Acetobacter orientalis）、アセトバクター・ポモルム（Acetobacter pomorum）等が挙げられる。
【００１８】
特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるグルコノバクター属の細菌としては、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateurii）、グルコノバクター・ジャポニクス（Gluconobacter japonicus）等が挙げられる。
【００１９】
また、特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるグルコナセトバクター属の細菌としては、具体的にはグルコナセトバクター・リクエファシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）等が挙げられる。
【００２０】
また、特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるアサイア属の細菌としては、具体的にはアサイア・ボゴレンシス（Asaia bogorensis）、アサイア・シアメンシス（Asaia siamensis）等が挙げられる。
【００２１】
また、特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるコマガテイバクター属の細菌としては、コマガテイバクター・エウロパエウス（Komagataeibacter europaeus）、コマガテイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、コマガテイバクター・マルタセチ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガテイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）、コマガテイバクター・オボエディエンス（Komagataeibacter oboediens）、コマガテイバクター・キシリヌス（Komagataeibacter xylinus）等が挙げられる。
【００２２】
酢酸菌は、例えば独立行政法人  製品評価技術基盤機構のNITE Biological Resource Center（NBRC）から入手することができ、例えばアセトバクター・パスツリアナスはNBRC3283株等、アセトバクター・アセチはNBRC14818株等、アセトバクター・オリエンタリスはNBRC16606株等を好適に利用することができる。
【００２３】
同様に、グルコノバクター・オキシダンスはNBRC14819株等、グルコノバクター・フラテウリはNBRC3285株等、グルコノバクター・ジャポニクスはNBRC3272株等を好適に利用することができる。
【００２４】
また、グルコナセトバクター・リクエファシエンスはNBRC12388株等、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカスはNBRC110704株等を好適に利用することができる。
【００２５】
アサイア・ボゴレンシスはNBRC16594株等、アサイア・シアメンシスはNBRC16457株等を好適に利用することができる。
【００２６】
コマガテイバクター・エウロパエウスはNBRC3261株等、コマガテイバクター・ハンセニイはNBRC14820等を好適に利用することができる。
【００２７】
酢酸菌由来のOMVは、上記の酢酸菌を培養することによって取得することができる。酢酸菌の培養のための培地としては、酢酸菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩および場合によりビタミン、アミノ酸、核酸等を含む、従来使用されてきた培地を適宜使用することができ、特に限定するものではない。
【００２８】
培地に含むことができる炭素源としては、グルコース、シュークロース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール等のアルコール類等が挙げられる。
【００２９】
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等が挙げられる。
【００３０】
無機塩としては、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３１】
炭素源、窒素源、無機塩を含み、かつアミノ酸、核酸等も含み得るものとして、例えば酵母等の微生物、カゼイン・ダイズ・玄米・コムギ等の動植物由来の原料から抽出・酵素分解・精製・乾燥等の処理を行ったものを利用することもできる。例えば酵母抽出物、カゼイン分解産物、ダイズ分解産物、穀物分解産物等が挙げられる。
【００３２】
酢酸菌の培養のための培地は液体培地、寒天培地等の固体培地のいずれも使用可能であるが、本発明においては、酢酸菌から放出されるOMVを回収して精製することから、液体培地の使用が好適である。本発明の実施において、例えばNBRCから入手できる804培地、350培地等を好適に使用することができる。
【００３３】
培養温度は、特に限定するものではないが、例えば25℃〜37℃の範囲の温度であれば酢酸菌が好適に増殖することができる。培養中のpHは約1〜約8の範囲であれば良く、培養中のpH変化等も考慮すれば、培地のpHとして約5.5〜約7.0のものを使用することが好ましい。当分野で通常行われるように、pHの調整のためには緩衝剤が好適に使用される。
【００３４】
酢酸菌由来のOMVは、上記のような培地組成及び培養条件において、酢酸菌を対数増殖期後期まで培養した場合に培地中に放出されることが確認された。一方、定常期を過ぎて培養を継続すると、次第にOMV量が減少することも確認された（図２）。従って、酢酸菌由来のOMVの回収量を増大するためには、酢酸菌の増殖が対数増殖期後期から定常期にあることが好ましい。
【００３５】
従って、酢酸菌由来のOMVを好適に回収するためには、pH約1〜約8の緩衝液中、25℃〜37℃の範囲の温度で酢酸菌を少なくとも対数増殖期の後期まで培養することが好ましい。
【００３６】
当分野において、細菌の培養における「対数増殖期」及び「定常期」との用語は一般的に理解され、使用されるものである。本明細書におけるこれらの用語も当分野における通常の意味を有するものであって、具体的には、「対数増殖期」とは細胞が一定時間毎に分裂して増殖し、時間に対して細胞数の対数が右上がりの直線となる段階をいい、「定常期」とは対数増殖期を過ぎて増殖が見かけ上静止する段階をいうと理解されている。対数増殖期の前の段階は増殖速度が低い「誘導期」と呼ばれ、定常期を過ぎると、死滅する細菌数が増殖を上回る「死滅期」と呼ばれる段階に移行する。細菌の増殖が誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期のいずれであるかは、培養中の細胞数を計数し、あるいは600nmにおける光学密度（OD600）を測定することによって増殖曲線を作成し、決定することができる。
【００３７】
また、上記の対数増殖期は、上記の誘導期から細胞の増殖速度が上昇し始める前期、指数関数的に細胞が増殖して上記の直線的な増殖を示す中期、及び増殖速度が低下し始めて上記の定常期に到る前の後期とに分けることができる。本明細書において、「対数増殖期後期」とは、従って、細胞の増殖速度が低下し始め、厳密には実際の増殖が増殖曲線における上記の直線的増殖よりは低下して定常期に移行する前の段階をいうものとする。また、対数増殖期後期とは、OD600を測定した場合に、その細菌で達成される最大OD値の約3/4以上のOD値が得られる段階に相当し得る。
【００３８】
培養における対数増殖期及び定常期は、培養する細菌によって異なり、また培養条件によっても異なり得る。
【００３９】
例えば酢酸菌としてアセトバクター・パスツリアナスを培養する場合には、pH約1〜約8の緩衝液中で植菌から3日間以上培養することによって、培養液中にOMVが放出される。これは、培養中の酢酸菌の増殖が対数増殖期の後期頃に相当する。植菌から培養2日以下の場合には、培養中にOMVはほとんど放出されない。一方、培養7日を超えると、OMV量が増大しないため、限定するものではないが、アセトバクター・パスツリアナスを培養する場合、培養は7日以下とすることが工程短縮のためには有益である。
【００４０】
また、この場合、OD600が約0.6〜約0.8の培養液からOMVを取得することが好ましい。これは、培養液中での酢酸菌の細胞濃度が約3〜4×108個/mlに相当し得る。
【００４１】
本発明の免疫増強剤において使用可能なOMVは、培養中で放出されるOMVをそのまま使用することができ、特に限定するものではないが、粒径50〜200nmの範囲内のものを好適に使用することができる。
【００４２】
本発明の免疫増強剤は、単独で使用することができる。あるいは、本発明の免疫増強剤は、ワクチンアジュバントとして使用することができる。従って、本発明はまた、本発明の免疫増強剤を含む、アジュバント組成物を提供する。
【００４３】
酢酸菌由来のOMVはpH約1〜約8の水性溶液中で安定である。従って、本発明の免疫増強剤は、従来用いられてきたアジュバントの投与経路の中でも、特に経口投与する場合に有利であり得る。
【００４４】
アジュバントの機能は、一般的に大きく2つに分けることができる。一つは、抗原と共に投与された場合に、抗原を投与部位に貯留して徐放性をもたらすような好適な送達システムを提供するもの、もう一つは免疫細胞の活性化及び機能に直接的に作用して免疫応答を増強するものである（Toussi DN and Massari P, Vaccines 2014, 2, 323-353）。
【００４５】
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の免疫増強剤は、OMV中に酢酸菌由来のLPSを含み、これがTLRアゴニストとして作用してNF-κBの活性化につながるシグナル伝達を誘導し得る。更に、OMVは、従来のアジュバントとして使用されてきたリポソームやエマルジョンと同様の親油性膜部分を有しており、これが抗原の徐放性に寄与し得る。
【００４６】
免疫には、抗原との接触直後に生じる自然免疫と、T細胞及びB細胞の活性化によってその後に生じる特異的な獲得免疫とがあることが知られている。自然免疫は、生体に侵入する微生物を認識して排除するシステムの一つであり、生体防御系の最前線を担う重要な役割を果たしている。自然免疫を担う宿主細胞は、宿主には存在しない微生物に特有の分子構造を認識し、このシステムを活性化することで生体防御を開始する。近年、動物の細胞表面にある受容体タンパク質であるTLRが、この分子認識に関与するレセプターであることが明らかになっている。更に脊椎動物では、獲得免疫が働くためにもTLR等を介した自然免疫の作動が必要であるとされている。現在、TLRはヒトにおいて10種類特定されているが、多くのTLRはホモ二量体又はヘテロ二量体として作用することが知られている。微生物由来成分がリガンドとしてTLRに結合し、活性化されたTLRが細胞シグナル伝達経路を介して転写因子NF-κBを活性化し、サイトカインなどの誘導を行うことによって、免疫あるいは炎症を誘導する。
【００４７】
上記TLRの中で、TLR2はリポタンパク質等をリガンドとし、TLR4はグラム陰性菌のLPSをリガンドとして認識することが報告されている。
【００４８】
本発明の免疫増強剤は、LPSを含むOMVを含むものであり、理論に拘束されるものではないが、TLR2及びTLR4の双方に対してリガンドとして作用し得ると考えられる。本発明者等の知見では、酢酸菌由来OMVとの接触によって、双方の活性化を確認することができた。
【００４９】
TLR2／TLR4依存細胞活性化能は、例えばTLR2又はTLR4とルシフェラーゼとを共発現する細胞を使用したルシフェラーゼアッセイにより確認することができる。このような細胞にサンプルを加え、培養すると、サンプルによってTLR2又はTLR4が刺激される場合に、シグナル伝達によって転写因子NF-κBが活性化し、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するため、ここにルシフェラーゼ基質を加えると翻訳されたルシフェラーゼにより化学発光が生じる。この化学発光量をルミノメーターを用いて定量することによりTLR2／TLR4依存細胞活性を測定することができる。
【００５０】
本発明者等は先に、酢酸菌由来のLPS又はリピドAがTLR4活性化能を有することを見出しているが（J. Biol. Chem. 2016, 291(40), 21184-21194）、本発明の免疫増強剤は、同様のアッセイ系で検討した場合に、TLR4の活性化能だけでなく、LPS又はリピドAではほとんど検出されなかったTLR2活性化能を有しており、むしろTLR2活性化能の方が顕著に高いという特徴を有することを確認した。すなわち本発明の免疫増強剤は、TLR2及びTLR4の双方を活性化することができるだけでなく、耐酸性を有するという有利な効果を奏するものである。
【００５１】
本発明のアジュバント組成物は、上記の本発明の免疫増強剤に加えて、1種以上の他のアジュバントを含むことができる。他のアジュバントとしては、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン等のアルミニウム化合物、酢酸菌以外の細菌由来のLPS又はリピドA等を含み得るが、OMVの構造が変化し得るサポニン、リポソーム等との併用はしないことが好ましい。この場合、他の細菌由来のLPSは場合によって毒性を低減させるように改変したものを選択することが好ましい。
【００５２】
本発明のアジュバント組成物は、単独で、又は抗原と組み合わせて投与することができる。抗原と組み合わせて投与する場合、アジュバント組成物の投与は抗原の投与と同時であっても、抗原の投与の前又は後であっても良い。また、アジュバント組成物は、一次免疫の際に投与されても、追加免疫の際に投与されても良い。
【００５３】
本発明の免疫増強剤はまた、抗原と共に、免疫原性組成物として調製することもできる。従って、本発明はまた、上記の本発明の免疫増強剤を含み、ワクチン組成物の一部として投与される、免疫原性組成物を提供する。この場合、親油性を有する抗原をOMVに組み込むことができる。あるいはまた、遺伝子工学的に特定の抗原を発現するように改変した酢酸菌を培養することで、意図する抗原をLPSと共に含むOMVを作製することも可能である。そのようなOMVの作製は、本明細書の記載及び当分野における技術常識に基づいて行うことができる。
【００５４】
本発明のアジュバント組成物及び免疫原性組成物は、酢酸菌由来のOMV及び任意に抗原を含む他、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤等を任意に含み得る。
【００５５】
本発明の免疫増強剤、アジュバント組成物及び免疫原性組成物は、様々な投与経路で投与することができる。経口又は非経口のいずれの投与経路を利用することができ、また全身投与又は局所投与のいずれでも良い。例えば経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、経鼻、吸入、病変内等の経路を用いて投与することができる。しかしながら、本発明の組成物は、経口摂取による安全性及び消化管内における安定性が実証されていることから、経口投与して特に有利な効果を発揮することができる。
【００５６】
酢酸菌由来のOMVは、酸性条件から中性条件下、具体的にはpH約1〜約8の水溶液中において経時的に安定であることが見出された。従って、本発明の免疫増強剤、アジュバント組成物、及び免疫原性組成物は、経口的に投与又は摂取して、消化管内での感染に対して有効に作用することができ、また腸からの吸収も期待することができる。
【００５７】
従って、本発明の免疫増強剤、アジュバント組成物、又は免疫原性組成物は、例えば液状、半固体状、若しくは固体状の医薬品として、またその免疫増強効果を期待して飲食品又はサプリメントとして提供することができる。この場合、経口で使用可能な任意の形態のものとすることができる。本発明の免疫増強剤は、従来より安全性が実証されている酢酸菌由来のOMVを利用するものであり、任意の飲食品に対して好適に添加することができる。
【００５８】
本発明の免疫増強剤、アジュバント組成物、又は免疫原性組成物は、特に限定するものではないが、例えば1回の用量又は摂取あたりOMVを約20μg〜約100mgの範囲、又はLPSに換算して1回の用量又は摂取あたり約1μg〜約1mgの範囲で含有するものとすることができる。しかしながら、本発明の免疫増強剤は安全性が非常に高いことから、上記の範囲を超えてより多量に投与又は摂取することも可能である。
【００５９】
本発明はまた、上記の新規免疫増強剤を製造するための方法も提供する。
具体的には、本発明は、以下：
pH1〜8の緩衝液中、25℃〜37℃の範囲の温度で酢酸菌を対数増殖期後期まで培養するステップ、
培養液から菌体を分離するステップ、及び
菌体から放出されたOMVを取得するステップ
を含む、酢酸菌由来OMVの製造方法を提供する。
【００６０】
上記の緩衝液とは、酢酸菌の培養に必要な炭素源、窒素源、無機塩等を含む液体培地であり得る。当業者であれば、好適に使用可能な緩衝液を選択可能であるが、例えば上記した804培地、350培地（NBRCより入手可能）等を利用することができる。
【００６１】
上記の培養するステップは、酢酸菌の対数増殖期の後期まで、好ましくはOD600が最大OD値の3/4程度まで培養することを含む。例えば、アセトバクター・パスツリアナスを培養する場合、植菌から3日間以上、換言すればOD600が0.6程度まで培養することが好ましく、この場合、培養液中の酢酸菌の細胞濃度は、約3×108個/mlに相当し得る。従って、この実施形態では、本発明の方法は、緩衝液中の細胞濃度が約3×108個/mlを超えるまで培養することを含み得る。
【００６２】
また、培養は、定常期の間に終了することが好ましく、例えば植菌から14日以内、例えば10日以内、例えば7日以内とすることが好適であり得る。この時点での細胞濃度は、OD600が0.8程度の場合には、約4×108個/mlであり得る。
【００６３】
培養液からの菌体の分離は、遠心分離等の通常の方法によって行うことができる。
また、菌体から放出されたOMVは、超遠心分離等の方法によって取得することができる。
【００６４】
上記の本発明の方法で得られた酢酸菌由来OMVは、例えば精製、濃縮、殺菌、凍結等のステップによって、免疫増強剤として製剤化することができる。精製及び／又は濃縮ステップには、例えば遠心分離、透析等の操作が含まれる。殺菌ステップとしては、例えば滅菌ろ過等の操作が含まれる。当業者であれば、本明細書の記載及び当分野における技術常識に基づいて、製剤化のための適切な手段を選択することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１  酢酸菌のOMV産生条件の検討］
まず、酢酸菌のOMV産生の有無について検討した。
酢酸菌の一種であるアセトバクター・パスツリアナス（Acetobacter pasteurianus） NBRC 3283を、804培地（ハイポリペプトン(和光純薬工業社) 5 g、酵母抽出物 5 g、グルコース 5 g、MgSO4・7H2O 1 g、±寒天 15 g、蒸留水 1L、pH6.6-7.0）中で培養した。まず、寒天培地に冷凍ストック菌を播種し、27℃で4日間培養し、単コロニーを得た。次いで5 mlの液体培地に1μlのディスポループ（アズワン株式会社）でコロニーを播種し、27℃で振とうしながら4日間予備培養した。得られた予備培養液を25 mlの液体培地に植菌して27℃で1日間培養し、OD600が約0.8になったところでさらに800 mlの液体培地に植菌し、27℃で0-14日間振とう培養した。
【００６７】
分光光度計を用い、OD600を測定して増殖曲線を作成したところ、1-3日目に対数増殖し、５日目以降に定常期になった（図１）。そこで、各培養液をC0650ローター（ベックマン・コールター社製）を用いて、4℃、9000 rpmで20分間遠心分離して上清と菌体に分離し、0.22μmのボトルトップフィルターでろ過して菌体を除去した。培養上清をType 50Tiローター（ベックマン・コールター社製）を用いて4℃、40000 rpmで２時間超遠心分離し、上清とペレットに分離した。ペレットは50 mM HEPESバッファー（pH 7.1-7.5）で洗浄し、粗（crude）OMVとして得た。
【００６８】
培養液中のOMVの有無を透過型電子顕微鏡（TEM）及び動的光散乱法（DLS）を用いて観察した。TEMはHT7700（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて加速電圧80kVで測定した。また、測定サンプルは、カーボンコートコロジオン膜グリッド上で1％リンモリブデン酸ナトリウムを用いてネガティブ染色した。DLSはZeta sizer Nano-ZS90（マルバーン・インスツルメント社製）を用いて測定し、3回の測定平均から溶液中粒子の粒子径、粒子分布を算出した。
【００６９】
その結果、800mlの液体培地に植菌して培養開始後3日目以降にOMV粒子の存在を確認することができ、3日目以降からOMVを回収できることが明らかになった（表１）。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
さらに、培養液中の酢酸菌由来OMV量を定量した。OMVはLPSを含むと予想されるため、ヘキソース量からOMV量を推定した。ヘキソースはアントロン硫酸法を用いて比色法で定量し、グルコース量に換算した。その結果、図２に示すように、培養７日目の培養液中に最も多量のOMVが存在していることがわかった。これらの結果から、酢酸菌は７日間培養してOMVを回収することが最適であることがわかった。
【００７２】
［実施例２  酢酸菌由来OMVの精製］
粗OMVには夾雑物が含まれているため、実施例１で得られた粗OMVを、Optiprep（商標、コスモ・バイオ株式会社）を用いた密度勾配遠心法を用いて精製した。
【００７３】
7日間培養した酢酸菌由来の粗OMVをHEPESバッファー中に含むサンプル250μlを60% イオジキサノールを含むOptiprep（商標、コスモ・バイオ株式会社）750μlと混合し（1:3 (v/v)）、遠心管の下層に静置した。次いで、図３に示す15-45％ OptiPrep密度勾配溶液（35％ (750μl)、30％ (1000μl)、25％ (500μl)、20％ (500μl)、15％ (500μl)、10％ (250μl)のイオジキサノール）を順に重層して密度勾配を形成した。これをMLS50ローター（ベックマン・コールター社製）を用いて4℃、50000 rpmで3時間（10,000×g）超遠心分離した後、上層から500μlずつ分取し、画分１−９に分離した。各画分を3倍量のHEPESバッファーで希釈した後、TLA100.3ローター（ベックマン・コールター社製）を用いて50000 rpmで3時間更に超遠心分離した。粗OMV及び各画分のペレットをそれぞれHEPESバッファーに懸濁させ、その後の分析に使用した。
【００７４】
粗OMV及び各画分について、15％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEで泳動後、過ヨウ素酸-銀染色により糖を分離・可視化し、画分１−９を比較した（図３）。その結果、画分３及び４のバンドが濃く見られた。また、TEMで測定したところ、画分３及び４に球状の小胞が観測され、OMVの存在が明らかとなった。すなわち、Optiprep濃度25％付近に精製OMVが回収できることがわかった。
【００７５】
画分３及び４を合わせて超遠心分離し、回収したペレットを精製OMVとして、以後の実験に用いた。
【００７６】
［実施例３  精製OMVの分析］
実施例２で得られた精製OMVを、別に取得した同じ酢酸菌由来のLPSと共に再度SDS-PAGEで分離した。泳動後、過ヨウ素酸-銀染色により糖を、CBB染色法によりタンパク質をそれぞれ可視化した。
【００７７】
その結果、糖に関して、精製OMVにおいて、酢酸菌由来LPSとほぼ同じバンドが得られた（図４Ａ）。GC-MSを用いた単糖分析の結果、構成糖は酢酸菌由来LPSと同じくグルコース、ガラクトース、ラムノースであった（データは示さない）。更に、タンパク質を染色した結果得られたバンドについて、トリプシン消化後にMALDI-TOF-MS分析（autoflex speed; Bruker Daltonics）したところ、酢酸菌由来の外膜タンパク質OmpAが検出された（図４Ｂ）。
【００７８】
これらの結果から、得られたOMVに酢酸菌由来のLPS及び膜タンパク質が含まれていることが示される。
【００７９】
[実施例４  ルシフェラーゼアッセイによるTLR活性化の評価］
酢酸菌由来OMVの自然免疫活性化能をNF-κB依存的ルシフェラーゼアッセイにより評価した。アッセイに用いる細胞として、NF-κB/DNA結合活性依存性ルシフェラーゼレポーター構築物p55IgκLucと、マウスTLR2又はマウスTLR4/MD-2と安定的に発現するマウスBa/F3細胞（Ba/mTLR2及びBa/mTLR4、東京大学医科学研究所  三宅教授よりご供与頂いた)を用い、10％ FBS、1％ ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むRPMI-1640培地を用いて培養した。
【００８０】
まず、384ウェルプレートの各ウェルに、各画分を1/10又は1/100に希釈したものを試料として10μl加え、ついで培地に懸濁させた2.5×105個/10μlの細胞を播種した。5％CO2、飽和水蒸気雰囲気下、37℃で4時間培養した後、Bright-Gloルシフェラーゼ試薬（プロメガ社製）を20μl加えて細胞を溶解した。化学発光量はルミノメーター Mithras LB940（ベルトールドジャパン社製）により定量した。結果は各細胞の無刺激の時の発光量との比を計算して、相対的ルシフェラーゼ活性として示した。
【００８１】
その結果、実施例２で得られた画分１−９の希釈物を試料として用いた場合、画分３及び４、特に画分３でToll様受容体2（TLR2）活性化能が確認された（図５Ａ）。画分３は、Toll様受容体4（TLR4）もわずかに活性化していた（図５Ｂ）。
【００８２】
また、画分３及び４を合わせて検討した結果、酢酸菌由来OMVは用量依存的にTLR2を活性化することがわかった（図６Ａ）。TLR4の活性化は相対的に弱かった（図６Ｂ）。
【００８３】
［実施例５  擬似胃液中の酢酸菌由来OMVの安定性評価］
OMVの生体内中での動態を推定するために、疑似胃液（34.2 mM NaCl-HCl pH1.6、1 mg/ml ペプシン）にOMV懸濁液を加え、酸性条件下でのOMVの安定性を検討した。DLSを用いてOMVの粒子径の変化を観測したところ、擬似胃液中のOMVの粒子径は8時間ほとんど変化せず、HEPESバッファー中のOMVと同様であった（図７）。このことは、経口摂取した酢酸菌由来OMVが酸性条件下でも安定であり、粒子形態を保持したまま胃を通過できる可能性が示される。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
現在、様々なワクチンが製造され、接種されているが、感染症に対する予防はまだまだ十分ではなく、また既存のワクチンの副作用低減の需要も存在する。酢酸菌は食品としての長い実績があり、安全性が担保されていること、醸造酢産業などで広く利用されており、取り扱いや培養が容易であることなど利点が多い。酢酸菌由来のOMVを用いることで、安全、安心なアジュバント並びにワクチンが提供でき、全く新規な製品の産業化が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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