(57)【要約】【課題】新規なマイクロＲＮＡ形成阻害剤を提供する。【解決手段】本発明のマイクロＲＮＡ形成阻害剤は、例えば下記の化合物を含む。【化１】2018131391.tif 000030  ［式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択される。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１〜６で表される化合物のうち少なくとも１種を含有している、マイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【化１】
2018131391.tif 000027
［式中、化学式１のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択され、
化学式３のＸは、炭素数１〜４０のリンカーであり、上記リンカーはアリール部分を有していてよく、
化学式４のＲ５は、水素原子またはアミノ基であり、Ａは、メチレン基またはアシル基であり、ｍは、０〜１０の自然数であり、
化学式５のＲ６は、水素原子またはアミノ基であり、ｎは、０〜１０の自然数であり、
化学式６の「＊」と「＊」とは、炭素数１〜１０のリンカーを介して接続しており、上記リンカーは二重結合または三重結合を有していてもよい。］
【請求項２】
上記マイクロＲＮＡの前駆体は、バルジ構造、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造、ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列（配列番号２２）および／またはループ部に位置するＵＧＧ配列を有している、請求項１に記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【請求項３】
上記マイクロＲＮＡの前駆体は、シトシンバルジ構造を有している、請求項１または２に記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【請求項４】
上記化合物は、下記化学式７で表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【化２】
2018131391.tif 000028
［式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択される。］
【請求項５】
下記化学式１〜６で表される化合物のうち少なくとも１種の化合物を用いてマイクロＲＮＡ形成阻害剤を調剤する工程を含む、マイクロＲＮＡ形成阻害剤の製造方法。
【化３】
2018131391.tif 000029
［式中、化学式１のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択され、
化学式３のＸは、炭素数１〜４０のリンカーであり、上記リンカーはアリール部分を有していてよく、
化学式４のＲ５は、水素原子またはアミノ基であり、Ａは、メチレン基またはアシル基であり、ｍは、０〜１０の自然数であり、
化学式５のＲ６は、水素原子またはアミノ基であり、ｎは、０〜１０の自然数であり、
化学式６の「＊」と「＊」とは、炭素数１〜１０のリンカーを介して接続しており、上記リンカーは二重結合または三重結合を有していてもよい。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ形成阻害剤に関する。本発明はまた、マイクロＲＮＡ形成阻害剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）は、２０塩基程度のヌクレオチドからなる１本鎖ＲＮＡであり、相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合し、当該ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を阻害する機能を有している。当該機能は、癌化、分化、発生など種々の生命現象に重要な役割を果たしている。したがって、ｍｉＲＮＡの機能を調節することにより、上述したようなｍｉＲＮＡが関わっている生命現象を調節することが可能になる。
【０００３】
ｍｉＲＮＡの機能を調節する従来技術として、標的ｍｉＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドを用いる方法がある。例えば非特許文献１は、ａｎｔａｇｏｍｉｒと呼ばれるオリゴヌクレオチドを合成し、当該オリゴヌクレオチドがマウスの内因性ｍｉＲＮＡの機能を阻害したことを報告している。
【０００４】
ｍｉＲＮＡの機能を調節する他の方法として、成熟過程にあるｍｉＲＮＡ前駆体を標的とする方法がある。当該方法は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（共にマイクロＲＮＡ前駆体である）に作用する酵素を阻害することにより、ｍｉＲＮＡの形成を阻害するものである（非特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Krutzfeldt J et. al. (2005) "Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'" Nature, vol.438 (issue 7068), pp.685-689
【非特許文献２】Schoniger C et. al. (2013) "Perspectives in targeting miRNA function" Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol.21 (No.20), pp.6115-6118
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ｍｉＲＮＡの機能を調節する従来技術には開発の余地が多く残されており、ｍｉＲＮＡの機能を調節する新たな技術の開発が望まれていた。
【０００７】
本発明の一態様は、上述の先行技術に鑑み、新規なマイクロＲＮＡ形成阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、特定の基本骨格を有する化合物がマイクロＲＮＡの形成を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成からなるものである。
【０００９】
＜１＞下記化学式１〜６で表される化合物のうち少なくとも１種を含有している、マイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【００１０】
【化１】
2018131391.tif 000002
【００１１】
［式中、化学式１のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択され、化学式３のＸは、炭素数１〜４０のリンカーであり、上記リンカーはアリール部分を有していてよく、化学式４のＲ５は、水素原子またはアミノ基であり、Ａは、メチレン基またはアシル基であり、ｍは、０〜１０の自然数であり、化学式５のＲ６は、水素原子またはアミノ基であり、ｎは、０〜１０の自然数であり、化学式６の「＊」と「＊」とは、炭素数１〜１０のリンカーでと接続しており、上記リンカーは二重結合または三重結合を有していてもよい。］。
【００１２】
＜２＞上記マイクロＲＮＡの前駆体は、バルジ構造、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造、ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列（配列番号２２）および／またはループ部に位置するＵＧＧ配列を有している、＜１＞に記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【００１３】
＜３＞上記マイクロＲＮＡの前駆体は、シトシンバルジ構造を有している、＜１＞または＜２＞に記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【００１４】
＜４＞上記化合物は、下記化学式７で表される、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載のマイクロＲＮＡ形成阻害剤。
【００１５】
【化２】
2018131391.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択される。］。
【００１７】
＜５＞下記化学式１〜６で表される化合物のうち少なくとも１種の化合物を用いてマイクロＲＮＡ形成阻害剤を調剤する工程を含む、マイクロＲＮＡ形成阻害剤の製造方法。
【００１８】
【化３】
2018131391.tif 000004
【００１９】
［式中、化学式１のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基および第３級アミン残基から選択され、化学式３のＸは、炭素数１〜４０のリンカーであり、上記リンカーはアリール部分を有していてよく、化学式４のＲ５は、水素原子またはアミノ基であり、Ａは、メチレン基またはアシル基であり、ｍは、０〜１０の自然数であり、化学式５のＲ６は、水素原子またはアミノ基であり、ｎは、０〜１０の自然数であり、化学式６の「＊」と「＊」とは、炭素数１〜１０のリンカーでと接続しており、上記リンカーは二重結合または三重結合を有していてもよい。］。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の一態様によると、新規なマイクロＲＮＡ形成阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ（配列番号１）の構造を示す図である。（ｂ）は、ＢｚＤＡＮＰによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である（放射性元素による標識なし）。（ｃ）は、ＢｚＤＡＮＰによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である（放射性元素による標識あり）。（ｄ）は、ＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体による、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である（放射性元素による標識なし）。（ｅ）は、ＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体による、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である（放射性元素による標識あり）。
【図２】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６（配列番号２）の構造を示す図である。（ｂ）は、ＢｚＤＡＮＰ非存在下における、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６の切断反応の継時的変化を示す電気泳動像である。（ｃ）は、ＢｚＤＡＮＰ存在下における、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６の切断反応の継時的変化を示す電気泳動像である。（ｄ）は、基質濃度および反応速度の初速をプロットしたグラフである。
【図３】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａのアデニンバルジ変異体（配列番号３）の構造を示す図、およびＢｚＤＡＮＰによる上記変異体の切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｂ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａのグアニンバルジ変異体（配列番号４）の構造を示す図、およびＢｚＤＡＮＰによる上記変異体の切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｃ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａのウラシルバルジ変異体（配列番号５）の構造を示す図、およびＢｚＤＡＮＰによる上記変異体の切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｄ）は、各種のバルジ構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａまたはその変異体における、ＢｚＤＡＮＰによる切断反応の阻害効果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１（配列番号６）の構造を示す図、およびＢｚＤＡＮＰによる上記ｍｉＲＮＡの切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｂ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０（配列番号７）の構造を示す図、およびＢｚＤＡＮＰによる上記ｍｉＲＮＡの切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【図５】（ａ）は、３種類のヘアピン型人工ＲＮＡ（配列番号８〜１０）を示す図である。（ｂ）は、（ａ）で示されているヘアピン型人工ＲＮＡの配列を一部変更し、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を導入した３種類のヘアピン型人工ＲＮＡ（配列番号１１〜１３）を示す図である。
【図６】（ａ）は、図５に示されている６種類のヘアピン型人工ＲＮＡについて、ＮＣＤによる切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｂ）は、図５に示されている６種類のヘアピン型人工ＲＮＡについて、（Ｚ）−ＮＣＴＳによる切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【図７】（ａ）は、図５の（ｂ）に示されているＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する３種類のヘアピン型人工ＲＮＡについて、ＮＣＤの濃度による切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｂ）は、図５の（ｂ）に示されているＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する３種類のヘアピン型人工ＲＮＡについて、（Ｚ）−ＮＣＴＳの濃度による切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【図８】（ａ）は、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する内在性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−４３２ｇ（左、配列番号１４）およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１５８７ｇｕ（右、配列番号１５）の構造を示す図である。（ｂ）は、（Ｚ）−ＮＣＴＳおよび（Ｅ）−ＮＣＴＳによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−４３２ｇ切断反応およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１５８７ｇｕ切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【図９】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３（配列番号１６）の構造を示す図である。（ｂ）は、ＮＤ−ｌｉｎｋによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。（ｃ）は、ＮＤによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【図１０】（ａ）は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の一般構造を示す図である。ステム部の配列および構造がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａとほぼ同一であるのに対し、ループ部の塩基配列がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａとは異なっている。（ｂ）は、各種のループ変異体の構造を示す図（上段、配列番号１７〜２０）、およびＲＮＤ−ｌｉｎｋによる当該ループ変異体の切断反応の阻害効果を示す電気泳動像（下段）である。
【図１１】（ａ）は、実施例１０で用いたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体（配列番号２１）の構造を示す図である。（ｂ）は、各種のＣＭＢＬ３による、上記ループ変異体切断反応の阻害効果を示す電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【００２３】
本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２４】
〔１．本発明の背景および技術思想〕
本発明の構成を説明する前に、本発明の背景となる発見および技術思想について説明する。
【００２５】
上述した非特許文献１に開示されている、オリゴヌクレオチドを用いる方法では、上記オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送が難しく、オフターゲット効果が発生してしまう（例えば、Krutzfeldt J et. al. (2007) "Specificity, duplex degradation and subcellular localization of antagomirs" Nucleic Acids Research, vol.35 (No.9), pp.2885-2892を参照）。
【００２６】
上述した非特許文献２に開示されている成熟過程にあるマイクロＲＮＡを阻害する方法では、多くの場合、ＲＮＡに結合する既知の物質の中から、標的マイクロＲＮＡの前駆体に結合する化合物を、スクリーニングにより得ている。
【００２７】
一方、本発明の一態様は、上述の方法とは異なり、オリゴヌクレオチドよりも小型の低分子化合物をマイクロＲＮＡ形成阻害物質として選択する。このため、合成および修飾、ならびに細胞内への輸送も容易である。更に、当該低分子化合物は、マイクロＲＮＡの前駆体に結合親和性が高くなるように、分子構造から設計または選択されたものである。一実施形態において、上記低分子化合物は、マイクロＲＮＡ前駆体の有する、バルジ構造、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造、ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ（配列番号２２）配列、ループ部に位置するＵＧＧ配列などの構造上の特徴に注目した上で、マイクロＲＮＡ形成阻害物質となる化合物として選抜されている。
【００２８】
〔２．化合物〕
本発明の一実施形態に係るマイクロＲＮＡ形成阻害剤は、化学式１〜６で表される化合物のうち、少なくとも１種を含有している。
【００２９】
一実施形態において、上記化合物は、化学式１で表される。
【００３０】
【化４】
2018131391.tif 000005
【００３１】
化学式１中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基、および第３級アミン残基から選択される。
【００３２】
上記第１級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ２が挙げられる。上記第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ）２ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ）３ＮＨ（ＣＨ３）などが挙げられる。上記第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２などが挙げられる。
【００３３】
上記構成の中では、Ｒ１およびＲ２の内、少なくとも一方が第２級アミン残基であることが好ましく、Ｒ１およびＲ２の両方が第２級アミン残基であることがより好ましい。当該構成であれば、化学式１で表される化合物と、ＲＮＡ前駆体中のバルジ構造との結合が強まり、マイクロＲＮＡ形成阻害効果の増大が見込める。
【００３４】
上述した好ましい化合物の例としては、下記化学式７で表される化合物が挙げられる。
【００３５】
【化５】
2018131391.tif 000006
【００３６】
化学式７中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、第１級アミン残基、第２級アミン残基、および第３級アミン残基から選択される。
【００３７】
上記第１級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ２が挙げられる。上記第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（Ｃ２Ｈ５）などが挙げられる。上記第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ３）（Ｃ２Ｈ５）などが挙げられる。
【００３８】
化学式７で表される物質の中でも、マイクロＲＮＡの形成を阻害する能力が高く好ましい物質として、下記化学式で表される、ＢｚＤＡＮＰ（ＩＵＰＡＣ名：N,N'-Bis(3-aminopropyl)benzo[c][1,8]naphthyridine-3,6-diamine）およびＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体（ＩＵＰＡＣ名：N,N'-Bis(3-dimethylaminopropyl)benzo[c][1,8]naphthyridine-3,6-diamine）が挙げられる。
【００３９】
【化６】
2018131391.tif 000007
【００４０】
一実施形態において、上記化合物は、化学式２で表されるＮＣＤ（ＩＵＰＡＣ名：2,2'-[Iminobis(trimethyleneoxycarbonylimino)]bis(7-methyl-1,8-naphthyridine)）である。
【００４１】
【化７】
2018131391.tif 000008
【００４２】
一実施形態において、上記化合物は、化学式３で表される。
【００４３】
【化８】
2018131391.tif 000009
【００４４】
化学式３中、Ｘは、炭素数１〜４０のリンカーであり、上記リンカーはアリール部分を有していてもよい。
【００４５】
上述した化学式３で表される化合物の中でも、マイクロＲＮＡの形成を阻害する能力が高く好ましい物質として、上記Ｘの構造が、以下に示されるＸ１またはＸ２である物質が挙げられる。
【００４６】
【化９】
2018131391.tif 000010
【００４７】
ＸがＸ１である場合、化学式３で表される物質は（Ｚ）−ＮＣＴＳ（ＩＵＰＡＣ名：(Z)‐4,4′‐Bis[bis[3‐[(7‐methyl‐1,8‐naphthyridine‐2‐yl)carbamoyloxy]propyl]aminomethyl]stilbene）である。ＸがＸ２である場合、化学式３で表される物質は（Ｅ）−ＮＣＴＳ（ＩＵＰＡＣ名：(E)‐4,4′‐Bis[bis[3‐[(7‐methyl‐1,8‐naphthyridine‐2‐yl)carbamoyloxy]propyl]aminomethyl]stilbene）である。
【００４８】
一実施形態において、上記化合物は、化学式４で表される。
【００４９】
【化１０】
2018131391.tif 000011
【００５０】
化学式４のＲ５は、水素原子またはアミノ基である。Ａは、メチレン基（−ＣＨ２−）またはアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）である。ｍは、０〜１０の自然数である。
【００５１】
上述した化学式４で表される化合物の中でも、マイクロＲＮＡの形成を阻害する能力が高く好ましい物質として、下記化学式で表されるＮＤ（ナフチリジンダイマー；ＩＵＰＡＣ名：3,3′‐Iminobis[N‐(7‐methyl‐1,8‐naphthyridine‐2‐yl)propionamide]）およびＮＤ−ｌｉｎｋ（ＩＵＰＡＣ名：4-amino-N,N-bis(3-((7-methyl-1,8-naphthyridin-2-yl)amino)-3-oxopropyl)butanamide）が挙げられる。
【００５２】
【化１１】
2018131391.tif 000012
【００５３】
一実施形態において、上記化合物は、化学式５で表される。
【００５４】
【化１２】
2018131391.tif 000013
【００５５】
化学式５中、Ｒ６は、水素原子またはアミノ基である。また、ｎは、０〜１０の自然数である。
【００５６】
上述した化学式５で表される化合物の中でも、マイクロＲＮＡの形成を阻害する能力が高く好ましい物質として、下記化学式で表されるＲＮＤ−ｌｉｎｋ（ＩＵＰＡＣ名：2,3-bis(7-amino-1,8-naphthyridin-2-yl)-N-(3-aminopropyl)propanamide）が挙げられる。
【００５７】
【化１３】
2018131391.tif 000014
【００５８】
一実施形態において、上記化合物は、化学式６で表される。
【００５９】
【化１４】
2018131391.tif 000015
【００６０】
化学式６中、「＊」と「＊」とは、炭素数１〜１０のリンカーを介して接続している。上記リンカーは二重結合または三重結合を有していてもよい。
【００６１】
上述した化学式４で表される化合物の中でも、マイクロＲＮＡの形成を阻害する能力が高く好ましい物質として、「＊」と「＊」との連結部分が下記化学式Ｙ１、Ｙ２またはＹ３で表される化合物が挙げられる。
【００６２】
【化１５】
2018131391.tif 000016
【００６３】
「＊」と「＊」との連結部分がＹ１である化合物は、ＣＭＢＬ３ａＬである。「＊」と「＊」との連結部分がＹ２である化合物は、ＣＭＢＬ３ｂＬである。「＊」と「＊」との連結部分がＹ３である化合物は、ＣＭＢＬ３ｃＬである。上記ＣＭＢＬ３ａＬ、ＣＭＢＬ３ｂＬおよびＣＭＢＬ３ｃＬを総称して、ＣＭＢＬ３Ｌと称する。
【００６４】
上述した化合物は、公知技術によって合成されうる。例えば、化学式１で表される化合物は[Murata A et. al. (2016) "BzDANP, a Small-Molecule Modulator of Pre-miR-29a Maturation by Dicer" ACS Chemical Biology, vol.11 (issue 10), pp.2790-2796]、化学式２で表される化合物は[Peng T et. al. (2005) "A new ligand binding to G-G mismatch having improved thermal and alkaline stability" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol.15 (issue 2), pp.259-262]、化学式３で表される化合物は[Dohno C et. al. (2012) "Naphthyridine tetramer with a pre-organized structure for 1:1 binding to a CGG/CGG sequence" Nucleic Acids Research, vol.40 (issue 6), pp.2771-2781]、化学式４で表される化合物は[Nakatani K et. al. (2001) "Recognition of Guanine-Guanine Mismatches by the Dimeric Form of 2-Amino-1,8-naphthyridine" Journal of the American Chemical Society, vol.123 (issue 50), pp.12650-12657]に記載の方法によって合成することができる。
【００６５】
また、上述した化合物として、市販の化合物を用いてもよいし、市販の化合物に対して適宜修飾を加えて合成してもよい。
【００６６】
一方、化学式５、６で表される化合物は、発明者らが新規に開発した化合物である。化学式５、６で表される化合物の合成方法の一例として、本明細書において後述する、〔合成例１〕および〔合成例２〕において用いられている方法が挙げられる。
【００６７】
〔３．マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆体〕
本発明の一実施形態に係るマイクロＲＮＡ形成阻害剤は、マイクロＲＮＡの形成を阻害する。
【００６８】
本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲとも略記する）」とは、ｍＲＮＡに結合し、当該ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を阻害する機能を有する、短いＲＮＡ（例えば、２５個以下、好ましくは２３個以下、より好ましくは２２個以下のヌクレオチドからなるＲＮＡ）を意味する。本発明の一実施形態に係るマイクロＲＮＡ形成阻害剤は、上記に定義されたマイクロＲＮＡの形成を阻害する機能を有すればよく、マイクロＲＮＡの前駆体からマイクロＲＮＡが形成される多段階の工程の中の、何れの工程を阻害するものであってもよい。
【００６９】
マイクロＲＮＡの前駆体は、相補的塩基対の間での水素結合が多くみられるステム部と、そのような水素結合が見られないループ部とから構成される、ステム・ループ構造（ステム・ヘアピン構造）を取っている（例えば図１の（ａ）参照。２５番目のＵ〜３５番目のＵまでがループ部）。なお、ステム部に含まれる全ての塩基が相補的塩基対との間に水素結合を形成している訳ではなく、対向する塩基が存在しない「バルジ」、相補的塩基対と対向していない「ミスマッチ」などの構造も存在しうる。
【００７０】
一実施形態において、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、バルジ構造、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造、ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列（配列番号２２）および／またはループ部に位置するＵＧＧ配列を有している。上記構造を含んでいるマイクロＲＮＡの前駆体は、本発明の一実施形態に係るマイクロＲＮＡ形成阻害剤の効果が表れやすい。
【００７１】
マイクロＲＮＡは、ＤＮＡの一次転写物であるｐｒｉ−ＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ  ＲＮＡ）が、ＲＮＡ切断酵素Ｄｒｏｓｈａにより切断されてｐｒｅ−ＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＲＮＡ）となり、更にｐｒｅ−ＲＮＡがＲＮＡ切断酵素Ｄｉｃｅｒによって切断されることによって、生体内で合成される。本明細書において「マイクロＲＮＡの前駆体」とは、上記ｐｒｉ−ＲＮＡおよび上記ｐｒｅ−ＲＮＡを意味する。
【００７２】
一実施形態において、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、バルジ構造を有している。ここで、「バルジ構造」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ）が二本鎖状の構造を取っている領域において、一方の鎖のポリヌクレオチドに余剰のヌクレオチドが存在するために生じるふくらみ（バルジ）を意図する。
【００７３】
例えば、「ＵＣＵ」と「ＡＡ」とが向かい合って二本鎖を形成する場合、「ＵＣＵ」の中の２つの「Ｕ」と「ＡＡ」の中の２つの「Ａ」とがそれぞれ対合して二本鎖を形成する。このとき、２つの「Ｕ」の間に存在する「Ｃ」には対合するヌクレオチドが無いため、当該「Ｃ」が膨らむこととなる。この膨らんだ構造が、バルジ構造である。
【００７４】
上述の例のように、余剰の塩基がＣ（シトシン）であることにより形成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造（Ｃバルジ構造）」と表記する。余剰の塩基がＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）またはＵ（ウラシル）についても同様に、「アデニンバルジ構造（Ａバルジ構造）」、「グアニンバルジ構造（Ｇバルジ構造）」、「ウラシルバルジ構造（Ｕバルジ構造）」と表記する。
【００７５】
一実施形態において、上記バルジ構造はシトシンバルジ構造であることが好ましい。特に、本発明の一実施形態に係るマイクロＲＮＡ形成阻害剤が、化学式１で表される化合物を含有している場合、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、バルジ構造を有していることが好ましく、シトシンバルジ構造を有していることがより好ましい。化学式１で表される化合物は、バルジ構造、特にシトシンバルジ構造に結合し、マイクロＲＮＡの形成を阻害していると考えられる。
【００７６】
【化１６】
2018131391.tif 000017
【００７７】
なお、上記マイクロＲＮＡの前駆体の構造中、バルジ構造の位置は特に限定されない。
【００７８】
一実施形態において、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有している。ここで、「ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造」とは、二本鎖状になっているポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）内で、配列「５’−ＵＧＧ−３’」と「３’−ＧＧＵ−５’」とが対向している構造であって、中央のＧ同士の間における水素結合が弱まっている構造を意味する。より具体的には、図５の（ｂ）を参照せよ。
【００７９】
マイクロＲＮＡの前駆体が、上記ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する場合、特に化学式２および化学式３で表される化合物の、マイクロＲＮＡ形成阻害効果が上昇する。
【００８０】
【化１７】
2018131391.tif 000018
【００８１】
なお、マイクロＲＮＡの前駆体の構造中、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造の位置は特に限定されない。
【００８２】
一実施形態において、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ（配列番号２２）配列を有している。ここで、上記ＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列は、ループ部に含まれていればよく、ループ部内における位置は、特に限定されない。
【００８３】
マイクロＲＮＡの前駆体が、上記ループ部に位置するＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列を有する場合、特に化学式５で表される化合物の、マイクロＲＮＡ形成阻害効果が上昇する。
【００８４】
【化１８】
2018131391.tif 000019
【００８５】
一実施形態において、上記マイクロＲＮＡの前駆体は、ループ部に位置するＵＧＧ配列を有している。ここで、ループ部に位置するＵＧＧ配列は、ループ部に含まれていればよく、ループ部内における位置は、特に限定されない。
【００８６】
マイクロＲＮＡの前駆体が、上記ループ部に位置するＵＧＧ配列を有する場合、特に化学式６で表される化合物の、マイクロＲＮＡ形成阻害効果が上昇する。
【００８７】
【化１９】
2018131391.tif 000020
【００８８】
〔４．マイクロＲＮＡ形成阻害剤およびその製造方法〕
〔２〕にて説明した化合物を有効成分として、マイクロＲＮＡ形成阻害剤を調剤（製造）することができる。すなわち本発明は、〔２〕にて説明した化合物を有効成分として含むマイクロＲＮＡ形成阻害剤およびその製造方法を包含する。
【００８９】
上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤に含まれる上記化合物の量は、上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤の使用目的、使用対象などによって、適宜定められる。上記化合物の配合量を決定するにあたっては、通常の実験に加え、以下の実施例の記載も有用であろう。
【００９０】
上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤は、上述した化合物の他にも、他の公知の有効成分および公知の添加剤を含んでいてよい。どのような有効成分および添加剤が選択されるかは、上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤の使用目的、使用対象などによって適宜選択される。例えば、上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤がヒトに対して使用される薬剤である場合は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）または日本国厚生省などの機関が定める基準に則り、他の有効成分および添加剤が選択されることが好ましい。上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤が、ヒト以外の動物に対して使用される薬剤である場合、農業目的で使用される薬剤である場合、実験目的で使用される薬剤である場合などについても、それぞれに対応する基準に則り、他の有効成分および添加剤が選択されることが好ましい。
【００９１】
上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤は、上述した化合物のうち少なくとも１種、並びに任意で、他の公知の有効成分および公知の添加物を用いて、常法によって調剤されうる。また、上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤の剤型、投与経路、処方量は、上記マイクロＲＮＡ形成阻害剤の使用目的、使用対象などによって適宜選択される。選択に際しては、下記実施例が参考になるであろう。
【実施例】
【００９２】
〔一般的な実験方法〕
別途言及しない限り、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの切断反応を、化合物によって阻害する実験は、以下の手順で行った。
【００９３】
１．下記表１または表２に示されている物質を混合し、３７℃にて３時間〜６時間、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの切断反応を進行させた。
【００９４】
【表１】
2018131391.tif 000021
【００９５】
【表２】
2018131391.tif 000022
【００９６】
表中、緩衝液はTurbo Dicer Reaction Buffer（Genlantis製）を用いた。組換えヒトＤｉｃｅｒはRecombinant Turbo Dicer（Genlantis製）を用いた。化合物は、水またはＤＭＳＯを含む水に溶解させた。水は、Milli-Q水を用いた。
【００９７】
２．６Ｍ尿素入り１５％変性アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ｂｉｓ＝１９：１）（ナカライテスク製）を用いて、１．で得られた反応溶液を電気泳動させ、切断産物を分離した。上記電気泳動は、室温、２００〜３００Ｖにて、１時間行った。
【００９８】
３−１．（放射性元素による標識がない場合）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ThermoFisher SCIENTIFIC製）３μＬにより、上記ゲルを染色した。上記染色は、室温にて、５分間〜１０分間行った。
【００９９】
４−１．（放射性元素による標識がない場合）カメラ（PENTAX MX-1、RICOH製）により、染色されたゲルを撮影した。
【０１００】
３−２．（放射性元素による標識がある場合）イメージングプレート（BAS IP MS 2025 E、ＧＥヘルスケア製）上に上記ゲルを載置し、露光させた。上記露光は、−２０℃にて一晩行った。
【０１０１】
４−２．（放射性元素による標識がある場合）イメージャー（Typhoon FLA 7000、ＧＥヘルスケア製）によってバンドを検出した。
【０１０２】
〔実施例１〕
ＢｚＤＡＮＰまたはＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体による、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ（配列番号１：acugauuucuuuugguguucagagucaauauaauuuucuagcaccaucugaaaucgguua）切断反応の阻害実験を行った。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの構造は、図１の（ａ）に示されている。
【０１０３】
〔実施例１−１〕
放射性元素により標識されていないＲＮＡを使用した切断反応阻害実験では、表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの最終濃度が４μＭ、ＢｚＤＡＮＰの最終濃度が、それぞれ、０μＭ、３．１μＭ、６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１０μＭ、２００μＭ、４００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。結果を図１の（ｂ）に示す。
【０１０４】
放射性元素により標識されているＲＮＡを使用した切断反応阻害実験では、表２の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの最終濃度を１１ｎＭ、ＢｚＤＡＮＰの最終濃度を、それぞれ０μＭ、２０μＭ、６０μＭ、１２０μＭ、１８０μＭ、２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行わせた。本実験においては、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの５’末端は、３２Ｐによって標識されていた。結果を図１の（ｃ）に示す。
【０１０５】
〔実施例１−２〕
放射性元素により標識されていないＲＮＡを使用した切断反応阻害実験では、表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの最終濃度を４μＭ、ＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体の最終濃度を、それぞれ０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。なお、対照として、ＤＡＮＰの最終濃度が２００μＭとなるように調製した反応溶液、およびＢｚＤＡＮＰの最終濃度が２００μＭとなるように調製した反応溶液についても、実験を行った。結果を図１の（ｄ）に示す。
【０１０６】
放射性元素により標識されているＲＮＡを使用した切断反応阻害実験では、表２の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの最終濃度を７１．４ｎＭ、ＢｚＤＡＮＰの最終濃度を、それぞれ０μＭ、２０μＭ、６０μＭ、１２０μＭ、１８０μＭ、２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行わせた。本実験においては、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの５’末端は、３２Ｐによって標識されていた。結果を図１の（ｅ）に示す。
【０１０７】
なお、対照に用いたＤＡＮＰの構造は下記の通りである。
【０１０８】
【化２０】
2018131391.tif 000023
【０１０９】
（結果）
図１の（ｂ）〜（ｅ）において、Ｓは基質、Ｉは中間産物（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが１箇所だけ切断されたもの）、Ｐは切断産物を表している（以下の実施例においても同様）。図１の（ｂ）および（ｃ）より、ＢｚＤＡＮＰの濃度が２００μＭ以上の場合、切断産物の生成が阻害され、４００μＭ以上の場合、特に切断産物の生成が阻害された。図１の（ｄ）および（ｅ）より、ＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体の濃度が２００μＭ以上の場合、切断産物の生成が阻害された。一方、図１の（ｄ）より、２００μＭのＤＡＮＰは、切断産物の生成を阻害しなかった。
【０１１０】
〔実施例２〕
〔実施例２−１〕
ＢｚＤＡＮＰの存在による、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６（配列番号２：acuccauuuguuuugaugauggauucuuaugcuccaucaucgucucaaaugagucu）切断反応の阻害効果を、継時的に観測した。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６の構造は、図２の（ａ）に示した。
【０１１１】
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が５０ｎＭとなるように物質を混合した（合計５０μＬ）。ＢｚＤＡＮＰを加えた混合液におけるＢｚＤＡＮＰの最終濃度は、１００μＭとした。Ｄｉｃｅｒは最後に混合液に加え、Ｄｉｃｅｒを加えたものを反応溶液とした。
【０１１２】
上記混合液にＤｉｃｅｒを添加する前（０分後）、およびＤｉｃｅｒ添加後０．５分後、１．０分後、２．５分後、５分後、１０分後、２０分後、４０分後、８０分後、１８０分後に、混合液または反応溶液を５μＬずつ分取し、１μＬのTurbo Dicer Stop Solution（Genlantis製）および１４μＬのホルムアミドを添加して切断反応を停止させた。その後、上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図２の（ｂ）および（ｃ）に示した。
【０１１３】
（結果）
図２の（ｂ）に示されているように、ＢｚＤＡＮＰ非存在下では、反応時間と共に基質が減少し、切断産物が増加していった。一方、ＢｚＤＡＮＰ存在下では、時間が経過しても基質の減少量および切断産物の増加量は抑制されていた。特に、反応開始から２０分後以降の結果は、ＢｚＤＡＮＰ存在下とＢｚＤＡＮＰ非存在下で大きく異なった。
【０１１４】
〔実施例２−２〕
ＢｚＤＡＮＰが存在することによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６（配列番号２）切断反応における最大反応速度、およびＤｉｃｅｒの解離定数の変化を調べた。
【０１１５】
表１の組成のうち、添加するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ溶液の濃度を変化させることによって、ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡ−１３６の最終濃度を、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２２５ｎＭ、３７５ｎＭとなるように調製した。ＢｚＤＡＮＰを加えた反応溶液におけるＢｚＤＡＮＰの最終濃度は、１００μＭであった。
【０１１６】
Ｄｉｃｅｒを加えてから０．５分後、１．０分後、２．５分後、５分後、１０分後、２０分後、４０分後、８０分後、１８０分後の反応溶液をそれぞれ分取し、上述の２〜４−２の方法により、電気泳動後のバンドを検出した。イメージ解析ソフトウェア（ImageQuant TL、ＧＥヘルスケア製）によって各バンドのボリュームを定量し、定量した切断生成物の量を基に、反応初速度を算出した。
【０１１７】
上述したそれぞれの基質濃度ごとに反応初速度を算出し、縦軸を反応初速度、横軸を基質濃度とする平面上にプロットした（図２の（ｄ））。また、ミカエリス＝メンテンの式に基づき、最大反応速度Ｖｍａｘおよび解離定数Ｋｍを算出した。
【０１１８】
（結果）
ＢｚＤＡＮＰの存在下においては、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３６の切断反応の最大反応速度Ｖｍａｘは、２５．４±１．２６ｐＭ／秒から６．２１±０．５６ｐＭ／秒へと、低下した。また、解離定数Ｋｍも、５２．９±８．５４ｎＭから３０．１±１１．４ｎＭへと、低下の傾向を見せた。
【０１１９】
〔実施例３〕
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａのＣバルジ構造を、Ａバルジ構造、Ｇバルジ構造またはＵバルジ構造に変更したｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ変異体（配列番号３：acugauuucuuuugguguuaagagucaauauaauuuucuagcaccaucugaaaucgguua、配列番号４：acugauuucuuuugguguugagagucaauauaauuuucuagcaccaucugaaaucgguua、配列番号５：acugauuucuuuugguguuuagagucaauauaauuuucuagcaccaucugaaaucgguua）を用い、ＢｚＤＡＮＰによる上記変異体切断反応の阻害実験を行った。
【０１２０】
実験に用いたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ変異体の構造は、それぞれ図３の（ａ）〜（ｃ）上段に示されている。上記変異体の構造は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａではＣになっている２０番目の塩基を、それぞれＡ、Ｇ、Ｕに変更したものである。
【０１２１】
表２の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度を５０ｎＭ、ＢｚＤＡＮＰの最終濃度を２００μＭとした反応溶液を調製した。対照として、最終濃度を２００μＭとしたＤＡＮＰを含む反応溶液も調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。なお、本実験においては、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａの５’末端は、３２Ｐによって標識されていた。
【０１２２】
上記反応溶液に対し、上述の２〜４−２の方法により、電気泳動、露光およびバンドの検出を行った。結果を図３の（ａ）〜（ｃ）の下段に示す。
【０１２３】
さらに、イメージ解析ソフトウェア（ImageQuant TL、GEヘルスケア製）によってバンドのボリュームを定量することにより、上記反応溶液に当初含まれていたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｏｌ）に対する、発生した切断産物の割合（％）を計算し、図３の（ｄ）に示した。なお、棒グラフ上の数値は、化合物を添加しなかった場合の切断産物の割合を１としたときの、相対値である。
【０１２４】
（結果）
図４の（ｄ）に示されているように、ＢｚＤＡＮＰは、Ｄｉｃｅｒによる全てのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａ変異体の切断反応に対して、阻害効果を示した。特に阻害効果が大きかったのは、Ｃバルジ構造、Ａバルジ構造およびＧバルジ構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにおいてであった。切断産物の生成率を少なくするとの観点からは、Ｃバルジ構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに対する阻害効果が最も大きかった。
【０１２５】
〔実施例４〕
ＢｚＤＡＮＰによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１（配列番号６：uagcuuaucagacugauguugacuguugaaucucauggcaacaccagucgaugggcugu）切断反応およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０（配列番号７：cccucaguccaccagagcccggauaccucagaaauucggcucugggucugugggga）切断反応の阻害実験を行った。
【０１２６】
図４の（ａ）上段に示されている通り、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１は、構造中にＡバルジ構造を有する。また、図４の（ｂ）上段に示されている通り、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０は、構造中にＣバルジ構造およびＣＡバルジ構造を有する。
【０１２７】
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が４μＭ、ＢｚＤＡＮＰの最終濃度が２００μＭになるように反応溶液を調製した。また、対照として、ＤＡＮＰの最終濃度が２００μＭになるように反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。
【０１２８】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図４の（ａ）および（ｂ）の下段に示す。
【０１２９】
（結果）
ＢｚＤＡＮＰは、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０の切断反応に対して、阻害効果を示した。一方、ＤＡＮＰは、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０の切断反応に対して、阻害効果を示さなかった。ＢｚＤＡＮＰによる阻害効果は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２１切断反応おけるものの方が、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−７６０におけるものより大きかった。
【０１３０】
実施例１〜４の結果を総合すると、ＢｚＤＡＮＰは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのバルジ構造に結合し、Ｄｉｃｅｒによる切断反応速度を低下させ、最終的に切断反応を阻害していると推定される。上記バルジ構造は、Ｃバルジ構造であることが好ましい傾向にある。また、ＢｚＤＡＮＰアミノアルキルリンカー誘導体についても同様の阻害効果が期待できる一方で、ＤＡＮＰには阻害効果がないと見られる。
【０１３１】
〔実施例５〕
ＮＣＤまたは（Ｚ）−ＮＣＴＳによる、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有するヘアピン型人工ＲＮＡ切断反応の阻害実験を行った。
【０１３２】
実験に使用したヘアピン型人工ＲＮＡは、図５の（ａ）に示されている、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有さない配列（ｓｈＲＮＡ１＿ｆｕｌｌ（配列番号８：gacucaugucacacuaccaauucaagagauugguagugugacaugagucug）、ｓｈＲＮＡ２＿ｆｕｌｌ（配列番号９：gaccaacaugucacucacaauucaagagauugugagugacauguuggucag）およびｓｈＲＮＡ３＿ｆｕｌｌ（配列番号１０：gacuguaccaacacucacaauucaagagauugugaguguugguacagucag））、並びに図５の（ｂ）に示されている、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する配列（ｓｈＲＮＡ１＿ｍｉｓｓ（配列番号１１：gacucaugucacacuauggauucaagagauugguagugugacaugagucug）、ｓｈＲＮＡ２＿ｍｉｓｓ（配列番号１２：gauggacaugucacucacaauucaagagauugugagugacauguuggucag）およびｓｈＲＮＡ３＿ｍｉｓｓ（配列番号１３：gacuguauggacacucacaauucaagagauugugaguguugguacagucag））であった。ｓｈＲＮＡ１＿ｍｉｓｓは、ｓｈＲＮＡ＿ｆｕｌｌの配列を一部変更し、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を導入したものである。他のヘアピン型人工ＲＮＡについても同様である。
【０１３３】
〔実施例５−１〕
表１の組成に基づき、ヘアピン型人工ＲＮＡの最終濃度が２μＭ、ＮＣＤの最終濃度が２００μＭになるように反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１３４】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図６の（ａ）に示す。
【０１３５】
〔実施例５−２〕
表１の組成に基づき、ヘアピン型人工ＲＮＡの最終濃度が２μＭ、（Ｚ）−ＮＣＴＳの最終濃度が２００μＭになるように反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１３６】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図６の（ｂ）に示す。
【０１３７】
（結果）
ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造が存在しない配列においては、ＮＣＤおよび（Ｚ）−ＮＣＴＳのいずれもが、Ｄｉｃｅｒによるヘアピン型人工ＲＮＡ切断反応に対して、阻害効果を示さなかった。一方、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造が存在する配列においては、ＮＣＤおよび（Ｚ）−ＮＣＴＳのいずれもが、Ｄｉｃｅｒによるヘアピン型人工ＲＮＡ切断反応に対して、阻害効果を示した。したがって、ＮＣＤおよび（Ｚ）−ＮＣＴＳは、ヘアピン型ＲＮＡ構造中のＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造に結合し、Ｄｉｃｅｒによる切断反応を阻害していると考えられる。また、ヘアピン型ＲＮＡ中のＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造の位置は、ＮＣＤおよび（Ｚ）−ＮＣＴＳによる阻害効果のいずれにも影響しなかった。
【０１３８】
〔実施例６〕
ＮＣＤの濃度または（Ｚ）−ＮＣＴＳの濃度を変化させながら、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有するヘアピン型人工ＲＮＡ（配列番号１１〜１３）切断反応の阻害実験を行った。
【０１３９】
上記ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有するヘアピン型人工ＲＮＡとしては、図５の（ｂ）に示されているｓｈＲＮＡ１＿ｍｉｓｓ、ｓｈＲＮＡ２＿ｍｉｓｓまたはｓｈＲＮＡ３＿ｍｉｓｓを用いた。
【０１４０】
〔実施例６−１〕
表１の組成に基づき、ヘアピン型人工ＲＮＡの最終濃度が２μＭ、ＮＣＤの最終濃度がそれぞれ０μＭ、３．１μＭ、１２．５μＭ、５０μＭ、２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１４１】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図７の（ａ）に示す。
【０１４２】
〔実施例６−２〕
表１の組成に基づき、ヘアピン型人工ＲＮＡの最終濃度が２μＭ、（Ｚ）−ＮＣＴＳの最終濃度がそれぞれ０μＭ、３．１μＭ、１２．５μＭ、５０μＭ、２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１４３】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図７の（ｂ）に示す。
【０１４４】
（結果）
ＮＣＤの場合、Ｄｉｃｅｒによるヘアピン型人工ＲＮＡの切断反応に対する阻害効果は、ＮＣＤの濃度が１２．５μＭ以上の場合に観察され、特に２００μＭの場合は顕著であった。（Ｚ）−ＮＣＴＳの場合、Ｄｉｃｅｒによるヘアピン型人工ＲＮＡの切断反応に対する阻害効果は、（Ｚ）−ＮＣＴＳの濃度が１２．５μＭ以上の場合に観察された。
【０１４５】
〔実施例７〕
（Ｚ）−ＮＣＴＳまたは（Ｅ）−ＮＣＴＳによる、ＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造を有する内在性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（配列番号１４：gcuuggaguaggucauuggguggauccucuauuuccuuacgugggccacuggauggcuccuccaugucu、配列番号１５：guugggcugggcuggguugggcaguucuucugcuggacucaccugugaccagu）切断反応の阻害実験を行った。
【０１４６】
上記内在性ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしては、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−４３２ｇまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１５８７ｇｕを用いた（それぞれ構造は、図５の（ａ）参照）。
【０１４７】
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が２μＭ、（Ｚ）−ＮＣＴＳまたは（Ｅ）−ＮＣＴＳの最終濃度が２００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。
【０１４８】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図８の（ｂ）に示す。
【０１４９】
（結果）
（Ｚ）−ＮＣＴＳおよび（Ｅ）−ＮＣＴＳのいずれもが、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ−４３２ｇおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１５８７ｇｕの切断反応に対して、阻害効果を示した。また、（Ｚ）−ＮＣＴＳによる切断反応の阻害効果は、（Ｅ）−ＮＣＴＳによる切断反応の阻害効果よりも大きかった。
【０１５０】
実施例５〜８の結果を総合すると、ＮＣＤ、（Ｚ）−ＮＣＴＳおよび（Ｅ）−ＮＣＴＳは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ中にＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造が存在する場合に、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ切断反応を阻害する。これらの化合物による阻害効果は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ中のＵＧＧ／ＵＧＧミスマッチ構造の位置には影響されないと考えられる。また、ヘアピン型人工ＲＮＡの構造は、生物由来のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと類似していることから、上記阻害効果は、生物由来のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにも有効であると考えられる。
【０１５１】
〔実施例８〕
ＮＤ−ｌｉｎｋまたはＮＤによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３（配列番号１６：ggugcagugcugcaucucuggucaguugggagucugagaugaagcacuguagcuc）切断反応の阻害実験を行った。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３の構造は、図９の（ａ）に示した。
【０１５２】
〔実施例８−１〕
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が２μＭ、ＮＤ−ｌｉｎｋの最終濃度がそれぞれ０μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１５３】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図９の（ｂ）に示す。
【０１５４】
〔実施例８−２〕
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が２μＭ、ＮＤの最終濃度がそれぞれ０μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて６時間行った。
【０１５５】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図９の（ｃ）に示す。
【０１５６】
（結果）
ＮＤ−ｌｉｎｋおよびＮＤのいずれもが、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１４３の切断反応に対して、阻害効果を示した。ＮＤ−ｌｉｎｋの切断反応阻害効果は、濃度１００μＭ以上において表れ、特に濃度３００μＭ以上において顕著であった。ＮＤの切断反応阻害効果は、濃度３００μＭ以上において表れた。
【０１５７】
〔実施例９〕
ＲＮＤ−ｌｉｎｋによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の切断反応阻害実験を行った。
【０１５８】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の一般構造は、図１０の（ａ）に示した通りであり、ループ部分の構造は、図１０の（ｂ）上段に示した通りである。それぞれのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の具体的な塩基配列は、左から順に、配列番号１７（gcugauuucuuuugguguucagagagggugggagguauguuucuagcaccaucugaaaucgguua）、配列番号１８（gcugauuucuuuugguguucaggagggugggagguguucuagcaccaucugaaaucgguua）、配列番号１９（gcugauuucuuuugguguucaggagggugggagguuguucuagcaccaucugaaaucgguua）、配列番号２０（gcugauuucuuuugguguucagagagggugggagguuguuucuagcaccaucugaaaucgguua）として示されている。これらの配列は全て、ループ部にＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列（配列番号２２）を有している。
【０１５９】
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が４μＭ、ＲＮＤ−ｌｉｎｋの最終濃度が５００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて３時間行った。
【０１６０】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図１０の（ｂ）下段に示す。
【０１６１】
（結果）
ＲＮＤ−ｌｉｎｋは、Ｄｉｃｅｒによる４種類のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体（Ｎ１１  Ｒａｎｋ２、Ｎ１１  Ｒａｎｋ３、Ｎｍｉｘ  Ｒａｎｋ１およびＮｍｉｘ  Ｒａｎｋ２）の切断反応のいずれに対しても、阻害効果を示した。すなわち、ＲＮＤ−ｌｉｎｋによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ切断反応の阻害効果は、ループ内にＧＧＧＵＧＧＧＡＧＧＵ配列があればよく、当該配列のループ内における位置には影響されないことが示唆される。
【０１６２】
〔実施例１０〕
ＣＭＢＬ３ａＬ、ＣＭＢＬ３ｂＬまたはＣＭＢＬ３ｃＬによる、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体（配列番号２１：gcugauuucuuuugguguucagaguggggugagcuuucuagcaccaucugaaaucgguua）の切断反応阻害実験を行った。上記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の構造は、図１１の（ａ）に示した。上記配列は、ループ部にＵＧＧ配列を有している。
【０１６３】
表１の組成に基づき、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最終濃度が２μＭ、ＣＭＢＬ３ａＬ、ＣＭＢＬ３ｂＬまたはＣＭＢＬ３ｃＬの最終濃度が３００μＭとなるように、反応溶液を調製した。反応は、３７℃にて２時間行った。
【０１６４】
上述の２〜４−１の方法により、電気泳動、染色および撮影を行った。結果を図１１の（ｂ）に示す。
【０１６５】
（結果）
ＣＭＢＬ３ａＬ、ＣＭＢＬ３ｂＬおよびＣＭＢＬ３ｃＬのいずれもが、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−２９ａループ変異体の切断反応に対して、若干の阻害効果を示した。
【０１６６】
〔合成例１〕
化学式５で表される化合物の一例である、ＲＮＤ−ｌｉｎｋの合成方法について、以下の化学反応式を基に説明する。
【０１６７】
【化２１】
2018131391.tif 000024
【０１６８】
［化合物１−２および化合物１−３の合成］
化合物１−１から化合物１−２を得る反応、および化合物１−２から化合物１−３を得る反応は、[He H et. al. (2009) "A Small Molecule Affecting the Replication of Trinucleotide Repeat d(GAA)n" Chemistry -A European Journal, vol.15 (issue 40), pp.10641-10648]に記載されている方法を採用した。概要は以下の通りである。化合物１−１をアセトンに溶解させ、クロロギ酸メチルおよび炭酸カリウムを反応させて、化合物１−２を得た。次いで、化合物１−２をクロロホルム−アセトニトリル混合溶媒に溶解させ、Ｎ−ブロモスクシンイミドおよびベンゾイルペルオキシドを反応させて、化合物１−３を得た。
【０１６９】
［化合物１−４の合成］
化合物１−２（３０２ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を、無水テトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解させ、０℃に冷却した。次いで、リチウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ、４．１４ｍＬ、４．１４ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下で、０℃にて３０分間撹拌した。さらに、炭酸ジエチル（０．３３ｍＬ、２．７６ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて１時間撹拌した後、室温に昇温させて２．５時間撹拌した。得られた反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチル／飽和塩化アンモニウム溶液で抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）により合成物を分離精製して、化合物４（３３１ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を薄橙色固体として得た（収率８３％）。
【０１７０】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物１−４のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): d = 8.46 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.27 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.19 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 4.20 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 4.12 (s, 2H), 3.88 ppm (s, 3H), 1.27 ppm (t, 3H, J = 7.1 Hz); ESI-MS: m/z: 290 [M+H] +, 312 [M+Na] +。 
【０１７１】
［化合物１−５の合成］
化合物１−４（１９１ｍｇ、０．６６０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン６ｍＬに溶解させ、０℃に冷却した。次いで，リチウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ、１．３１ｍＬ、１．３１ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下で、０℃にて１時間撹拌した。さらに、テトラヒドロフラン６ｍＬに溶解させた化合物１−３（２０２ｍｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて４０分間撹拌した後、室温に昇温させて一晩撹拌した。得られた反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチル／飽和塩化アンモニウム溶液で抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中、酢酸エチル６０％）により合成物を分離精製して、化合物１−５（１３４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を薄黄色固体として得た（収率５３％）。
【０１７２】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物１−５のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): d = 8.31 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.27 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.11 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.96 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 5.09 (dd, 1H, J1 = 6.4, J2 = 8.5 Hz), 4.13-4.01 (m, 3H), 3.83 (s, 6H), 3.76 (dd, 1H, J1 = 6.4, J2 = 14.9 Hz), 1.08 ppm (t, 3H, J = 7.3 Hz); ESI-MS: m/z: 505 [M+H] +, 527 [M+Na] +。
【０１７３】
［化合物１−６（ＲＮＤ−ｌｉｎｋ）の合成］
化合物１−５（２６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）と１，３−ジアミノプロパン（２６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）とを混合し、６０℃で７．５時間撹拌した。得られた反応溶液に水を加え、凍結乾燥により、１，３−ジアミノプロパンおよび水を留去した。逆相高速液体クロマトグラフィー（水中、アセトニトリル９％、酢酸０．１％）により合成物を分離精製して、目的の化合物１−６（ＲＮＤ−ｌｉｎｋ、１２ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を白色固体として得た（収率５６％）。
【０１７４】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物１−６（ＲＮＤ−ｌｉｎｋ）のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (CD3OD, 400 MHz): d = 8.02 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.93 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.29 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 6.87 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 4.41 (dd, 1H, J1 = 5.5, J2 = 10.1 Hz), 3.73 (dd, 1H, J1 = 10.1, J2 = 13.7 Hz), 3.51 (dd, 1H, J1 = 5.5, J2 = 14.2 Hz), 3.43-3.37  (m, 1H), 3.27-3.21 ppm (m, 1H), 3.17-3.10 ppm (m, 1H), 3.08-3.01 ppm (m, 1H), 1.89-1.80 ppm (m, 2H); ESI-MS: m/z: 417 [M+H] +。
【０１７５】
〔合成例２〕
化学式６で表される化合物の一例である、ＣＭＢＬ３ａＬ、ＣＭＢＬ３ｂＬおよびＣＭＢＬ３ｃＬの合成方法について、以下の化学反応式を基に説明する。
【０１７６】
【化２２】
2018131391.tif 000025
【０１７７】
［化合物２−２の合成］
化合物２−１（３−ブテン−１−オール、０．７２ｇ、１０ｍｍｏｌ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．６２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン３０ｍＬに溶解させ、アルゴン雰囲気下で、室温にて一晩撹拌した。反応溶液に水３０ｍＬを加え、２５ｍＬのクロロホルムで２回抽出した。有機層を水（３０ｍＬ）で４回、飽和塩化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去し、化合物２−２（０．８８ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を無色液体として得た（収率５３％）。
【０１７８】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−２のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (m, 1H), 7.41-7.40 (m, 1H), 7.06 (m, 1H), 5.81 (ddt, J = 17.2, 10.1, 6.8 Hz, 1H), 5.18 (dtd, J = 17.4, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.15 (dtd, J = 10.4, 1.4, 1.5 Hz, 1H), 4.46 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (tdt, J = 6.7, 6.7, 1.4 Hz, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 148.2, 136.7, 132.5, 130.2, 117.8, 116.7, 66.1, 32.5. HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C8H11N2O2 [M+H]+ 167.082, found: 167.0813; Calcd. for C8H10N2NaO2[M+Na]+ 189.0640, found: 189.0632。
【０１７９】
［化合物２−３の合成］
化合物２−３は、[Nakatani K et. al. (2013) "A dimeric form of N-methoxycarbonyl-2-amino-1,8-naphthyridine bound to the A-A mismatch in the CAG/CAG base triad in dsRNA" Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, vol.23 (issue 2): pp. 558-561]の、Supplementary Materialに記載されている方法に従って合成した。
【０１８０】
［化合物２−４の合成］
化合物２−３（０．４３２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン２ｍＬに溶解させ、０℃に冷却した。次いで、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド−テトラヒドロフラン溶液（１Ｍ、３．０ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）および１８−クラウンエーテル（触媒量）を加え、アルゴン雰囲気下で、０℃にて３０分間撹拌した。さらに、テトラヒドロフラン３ｍＬに溶解させた化合物２−２（２．５ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。砕氷を加えて反応をクエンチし、テトラヒドロフランをロータリーエバポレーターで減圧留去した。残渣を水１０ｍＬで希釈し、クロロホルム２０ｍＬで３回抽出した。有機層を回収し、飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール０〜０．１％）により分離精製して、化合物２−４（０．４２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を灰白色固体として得た（収率６６％）。
【０１８１】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−４のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.30 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.14 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.09 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 7.77 (br, 1H), 7.76 (br, 1H), 7.49 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.82 (ddt, J = 17.0, 10.2, 6.8 Hz, 2H), 5.19-5.09 (m, 4H), 4.94 (s, 2H), 4.82 (s, 2H), 4.27 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.47 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 162.6, 162.2, 155.9, 154.4, 153.6, 153.5, 153.0, 139.0, 137.3, 137.1, 133.5, 119.4, 119.0, 118.7, 118.0, 117.6, 113.2, 80.7, 64.7, 53.5, 53.4, 33.2, 28.2; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C33H38N7O6[M+H]+ 628.2884, found: 628.2870, Calcd. for C33H37N7NaO6[M+Na]+ 650.2703, found: 650.2699。
【０１８２】
［化合物２−５および化合物２−６の合成］
化合物２−４（３１．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、Grubbs触媒（第２世代、１２．８ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を含む容器を封管して９５℃に昇温させ、１時間反応させた。反応溶液をセライト濾過して得られた濾液、および残渣をジクロロメタン（１０ｍＬ）で３回洗浄した洗浄液を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（化合物２−５: クロロホルム中、メタノール０．５〜１％；化合物２−６:クロロホルム中、メタノール２〜３％）および分取用薄層クロマトグラフィーにより合成物を分離精製し、化合物２−５（白色固体、２３．１ｍｇ、０．０３８５ｍｍｏｌ）を収率７７％、化合物２−６（白色固体、３．５ｍｇ、０．００５８ｍｍｏｌ）を収率１２％で得た。
【０１８３】
JNM-ECA600（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−５のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.61 (br, 1H), 7.54 (br, 1H), 7.52 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.67 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 4.90 (s, 4H), 4.88 (s, 2H), 4.33-4.30 (m, 4H), 2.92 (br, 4H), 1.62 (s, 9H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 161.7, 155.3, 153.4, 153.3, 153.1, 137.7, 135.9, 135.7, 129.1, 128.9, 119.6, 118.4, 118.1, 117.9, 113.0, 80.9, 64.9, 64.7, 55.2, 54.5, 31.5, 31.4, 28.5; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C31H34N7O6[M+H]+600.2571, found: 600.2554; Calcd. for C31H33N7NaO6 [M+Na]+ 622.2390, found: 622.2372。
【０１８４】
JNM-ECA600（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−５のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 10.22 (brs, 2H), 8.275 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.86 (d, J= 9.6 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.55 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 4.87 (brs, 2H), 4.76 (brs, 2H), 4.38 (brm, 2H), 4.35 (brm, 2H), 2.58 (brm, 4H), 1.31 (s, 9H); 13C NMR (175 MHz, CDCl3) δ 161.6, 161.4, 155.7, 154.6, 154.3, 154.0, 153.9, 138.2, 136.6, 136.4, 129.2, 129.1, 120.5, 119.6, 118.2, 118.0, 114.0, 113.9, 81.1, 64.9, 64.7, 28.4, 27.5, 27.4; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C31H34N7O6[M+H]+600.2571, found: 600.2551; Calcd. for C31H33N7NaO6 [M+Na]+ 622.2390, found: 622.2369。
【０１８５】
［化合物２−７の合成］
化合物２−５および化合物２−６の混合物（０．０１２ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と、シクロヘキセン（１．０ｍＬ）とを無水エタノール（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素バブリングにより、室温にて３０分間脱気した。次いで、パラジウム炭素（１０％）を添加し（５ｍｏｌ％）、窒素雰囲気下にて６〜７時間加熱還流した。反応終了後、グラスフィルターにより触媒を濾過して得られた濾液、および残渣を酢酸エチルで洗浄した洗浄液を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール）で分離精製し、化合物２−７（７．５ｍｇ、０．０１２４ｍｍｏｌ）を灰白色固体として得た（収率６２％）。
【０１８６】
AVANCEIII700（Bruker BioSpin製）によって測定された、化合物１−４のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ 10.29  (brs, 1H), 10.28 (brs, 1H), 8.04 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.925 (d, J  = 8.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.64 (s, 4H), 4.18 (t, J = 5.25 Hz, 4H), 1.64 (quint, J = 5.4, 4H), 1.57 (s, 9H), 1.49 (quint, J = 3.3 Hz, 4H); 13C NMR (175 MHz, DMSO-d6) δ160.8, 160.6, 154.9, 154.0, 153.9, 153.5, 138.3, 136.9, 136.8, 118.6, 118.3, 117.8, 113.5, 80.3, 64.7, 53.9, 53.1, 28.7, 28.1, 25.9; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C31H35N7NaO6 [M+Na]+ 624.2547, found: 624.2538。
【０１８７】
【化２３】
2018131391.tif 000026
【０１８８】
［化合物２−８の合成］
化合物２−５（２１ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した後、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール１〜４％）により合成物を分離精製し、化合物２−８（１４．１ｍｇ）を白色固体として得た（収率８１％）。
【０１８９】
JNM-ECA600（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−８のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.89 (br, 2H), 8.19 (d, J= 9.0 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 5.65 (t, J = 3.3 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 4.21 (s, 4H), 2.48-2.47 (m, 4H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 163.5, 154.0, 153.6, 153.4, 153.2, 138.5, 136.0, 129.2, 119.7, 118.3, 113.0, 64.7, 55.5, 31,7, 31.6; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C26H26N7O4 [M+H]+ 500.2046, found: 500.2040, Calcd. for C26H25N7NaO4 [M+Na]+ 522.1866, found: 522.1857。
【０１９０】
［化合物２−９の合成］
化合物２−６（１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した後、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール５〜８％）により合成物を分離精製し、化合物２−８（６ｍｇ）を白色固体として得た（収率７２％）。
【０１９１】
JNM-ECA600（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−９のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.19 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.60-5.55 (br, 2H), 4.33 (brs, 4H), 4.26-4.21 (m, 4H), 2.55 (m, 4H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 163.7, 154.0, 153.6, 153.4, 138.6, 136.0, 129.2, 119.7, 118.4, 112.9, 64.7, 55.6, 31.7; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C26H26N7O4 [M+H]+ 500.2046, found: 500.2039; calculated for C26H25N7NaO4 [M+Na]+ 522.1866, found: 522.1855。
【０１９２】
［化合物２−１０の合成］
化合物２−７（７５ｍｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した後、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール５〜８％）により合成物を分離精製し、化合物８（４．２６ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率６８％）。
【０１９３】
JNM-ECS400（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−１０のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.85 (br, 2H), 8.22 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.22 (d, J =8.0 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 4.18 (s, 4H), 1.75 (quint, J = 5.5 Hz, 4H), 1.63 (quint, J = 3.1 Hz, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 163.3, 154.1, 153.8, 153.5, 138.6, 136.2, 119.7, 118.5, 113.1, 66.4, 55.2, 28.7, 27.7; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C26H28N7O4 [M+H]+502.2203; Found: 502.2197; calcd. for C26H27N7NaO4 [M+Na]+ 524.2022; Found: 524.2013。
【０１９４】
［化合物２−１１の合成］
化合物２−１１は、[Hagihara S et. al. (2004) "Detection of guanine-adenine mismatches by surface plasmon resonance sensor carrying naphthyridine-azaquinolone hybrid on the surface" Nucleic Acids Research, vol.32 (issue 1): pp.278-286]の、Supplementary Materialに記載されている方法に従って合成した。
【０１９５】
［化合物２−１２（ＣＭＢＬ３ａＬ）の合成］
化合物２−８（１２ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）および化合物２−１１（９．３ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（２．５ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（７．６ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液のｐＨを酢酸で６に調整し、室温にて１時間撹拌した。反応溶液にさらにクロロホルム２０ｍＬを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ、水１０ｍＬおよび飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬでそれぞれ１回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２．５〜３％）により合成物を分離精製し、リンカーが付加された化合物（８．２ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率４３％）。
【０１９６】
得られた化合物（７．７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去した後、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２〜５％）により合成物を分離精製し、化合物２−１２（ＣＭＢＬ３ａＬ、２．７ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率４０％）。
【０１９７】
JNM-ECA600（JEOL RESONANCE製）によって測定された、化合物２−１２（ＣＭＢＬ３ａＬ）のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 8.50 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.69-5.67 (m, 2H), 5.03 (s, 4H), 4.35 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 3.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.37 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.13 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.47 (td, J = 5.4, 5.25 Hz, 4H), 2.11 (quint, J = 6.75 Hz, 2H), 2.02 (quint, J = 6.45 Hz, 2H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 176.7, 158.3, 154.8, 141.3, 130.4, 123.6, 120.2, 116.1, 71.4, 67.6, 60.3, 56.3, 40.8, 37.1, 34.4, 33.0, 26.3, 24.0; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C33H40N9O5 [M+H]+642.3152; Found: 642.3132; calcd. for C33H39N9NaO5 [M+Na]+ 664.2972; Found: 664.2949。
【０１９８】
［化合物２−１３（ＣＭＢＬ３ｂＬ）の合成］
化合物２−９（１５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）および化合物２−１１（１２ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（２．５ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（９．５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液のｐＨを酢酸で６に調整し、室温にて１時間撹拌した。反応溶液にさらにクロロホルム２０ｍＬを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ、水１０ｍＬおよび飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬでそれぞれ１回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２．５〜３％）により合成物を分離精製し、リンカーが付加された化合物（１１．８ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率５３％）。
【０１９９】
得られた化合物（１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去し、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加して塩基性にした。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２〜５％）により合成物を分離精製し、化合物２−１３（ＣＭＢＬ３ｂＬ、５．８ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率６１％）。
【０２００】
AVANCEIII700（Bruker BioSpin製）によって測定された、化合物２−１３（ＣＭＢＬ３ｂＬ）のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ 8.50 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 5.500-5.59 (m, 2H), 4.25 (t, J = 5.95 Hz, 4H), 3.85 (s, 4H), 3.10-3.07 (m, 2H), 2.84-2.81 (m, 4H), 2.5-2.49 (m, 2H), 2.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.96 (quint, J =7.0 Hz, 2H), 1.85 (s, 3H, CH3 from acetate salt), 1.79 (quint, J = 7.5 Hz, 2H), 1.74 (quint, J = 6.8 Hz, 2H); 13C NMR (175 MHz, DMSO-d6) δ 171.7, 171.3, 162.9, 153.3, 153.1, 153.0, 138.5, 136.1, 128.4, 121.3, 117.4, 69.8, 64.2, 62.5, 38.9, 32.6, 32.3, 32.3, 27.5, 27.2, 24.3, 24.3, 22.5 (CH3 from acetate salt); HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C33H40N9O5 [M+H]+ 642.3152; Found: 642.3131; calcd. for C33H39N9NaO5 [M+Na]+ 664.2972; Found: 664.2948。
【０２０１】
［化合物２−１４（ＣＭＢＬ３ｂＬ）の合成］
化合物２−１０（２５ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）および化合物２−１１（１９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（２．５ｍＬ）に溶解させ，ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液のｐＨを酢酸で６に調整し、室温にて１時間撹拌した。反応溶液にクロロホルム３０ｍＬを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ、水１０ｍＬおよび飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍＬでそれぞれ１回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２．５〜３％）により合成物を分離精製し、リンカーが付加された化合物（１９．７ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率５３％）。
【０２０２】
得られた化合物（１６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、４Ｎ塩酸−酢酸エチル混合溶液１ｍＬを添加し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、０℃から室温まで昇温させた（昇温時間：１時間）。溶媒をロータリーエバポレーターで減圧留去し、７Ｎアンモニア−メタノール混合溶液を添加して塩基性にした。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中、メタノール２〜５％）により合成物を分離精製し、化合物２−１４（ＣＭＢＬ３ｃＬ、８．５ｍｇ）を灰白色固体として得た（収率６１％）。
【０２０３】
AVANCEIII700（Bruker BioSpin製）によって測定された、化合物２−１４（ＣＭＢＬ３ｃＬ）のＮＭＲに関する各物性値は、以下の通りであった。
1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.67-7.60 (br, 2H), 7.23 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 4.19 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 4.15-4.13 (br, 2H), 3.86 (s, 4H), 3.32 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.66 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.17 (t, J = 7.35 Hz, 2H), 1.70-1.65 (m, 4H), 1.52-1.50 (brm, 4H), 1.28-1.22 (m, 4H); 13C NMR (175 MHz, DMSO-d6) δ 172.0, 162.9, 153.8, 153.5, 153.4, 138.1, 135.5, 120.6, 117.5, 113.0, 69.8, 64.7, 62.6, 55.9, 40.0, 36.7, 33.0, 31.0, 28.5, 27.8, 22.4, 22.1; HRMS (ESI) m/z: Calcd. for C33H42N9O5 [M+H]+ 644.3309; Found: 644.3311; calcd. for C33H41N9NaO5 [M+Na]+ 666.3128; Found: 666.3128。
【産業上の利用可能性】
【０２０４】
本発明は、マイクロＲＮＡ形成阻害剤に利用できる。当該マイクロＲＮＡ形成阻害剤は、例えば、医学分野、生命科学分野、農学分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018131391.tif 000038
【図９】
2018131391.tif 000039
【図１０】
2018131391.tif 000040
【図１１】
2018131391.tif 000041
【配列表】
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