(57)【要約】【課題】  新規な耐熱性ルシフェラーゼを提供すること。【解決手段】  以下の(a)又は(b)の変異型ルシフェラーゼ。(a) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニン及び／又は294位のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている、前記変異体(b) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼの変異体であって、その変異体のアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の292位及び／又は294位に対応する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、前記変異体【選択図】  図１−１
2018153133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の変異型ルシフェラーゼ。
(a) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニン及び／又は294位のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
(b) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼの変異体であって、その変異体のアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の292位及び／又は294位に対応する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列における、215位のアラニン、354位のグルタミン酸及び465位のフェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものである請求項１記載の変異型ルシフェラーゼ。
【請求項３】
請求項１記載の変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養することを含む、変異型ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１記載の変異型ルシフェラーゼを含むキット。
【請求項８】
請求項１記載の変異型ルシフェラーゼを用いて、生物発光アッセイを行う方法。
【請求項９】
請求項１記載の変異型ルシフェラーゼを結合した標的タンパク質と発光基質との反応により生じた発光を測定する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントの結合により再構成されたルシフェラーゼと発光基質との反応により生じた発光を測定する請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法に用いられる、請求項１記載の変異型ルシフェラーゼのＣ末端又はＮ末端フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性ルシフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼは、発光バクテリアやホタルなどの生物発光において、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を持つ酵素であり、レポーター酵素として、真核細胞における遺伝子の発現や制御に関する研究に用いられている。
【０００３】
しかし、野生型ルシフェラーゼの熱安定性は３０℃程度であり、４０℃を超えると活性が消失し、高温での保存安定性に欠け、また、反応速度を高めるための高温反応条件下でのアッセイに使用できないという問題がある。
【０００４】
この問題を解消するために、種々の耐熱性菌の中から耐熱性ルシフェラーゼの探索が行われてきた（特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第5951325号
【特許文献２】特許第3844082号
【特許文献３】特許第3048466号
【特許文献４】特許第3681911号
【特許文献５】特許第5090304号
【特許文献６】特許第5185479号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な耐熱性ルシフェラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、これらの問題を解決すべく、鋭意努力した結果、北米産ホタルルシフェラーゼの292位及び／又は294位のアミノ酸残基を変異することにより、耐熱性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）以下の(a)又は(b)の変異型ルシフェラーゼ。
(a) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニン及び／又は294位のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
(b) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼの変異体であって、その変異体のアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の292位及び／又は294位に対応する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
（２）配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列における、215位のアラニン、354位のグルタミン酸及び465位のフェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものである（１）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（３）（１）記載の変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（４）（３）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（５）（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）（５）記載の形質転換体を培養することを含む、変異型ルシフェラーゼの製造方法。
（７）（１）記載の変異型ルシフェラーゼを含むキット。
（８）（１）記載の変異型ルシフェラーゼを用いて、生物発光アッセイを行う方法。
（９）（１）記載の変異型ルシフェラーゼを結合した標的タンパク質と発光基質との反応により生じた発光を測定する（８）記載の方法。
（１０）（１）記載の変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントの結合により再構成されたルシフェラーゼと発光基質との反応により生じた発光を測定する（８）記載の方法。
（１１）（１０）記載の方法に用いられる、（１）記載の変異型ルシフェラーゼのＣ末端又はＮ末端フラグメント。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規な耐熱性ルシフェラーゼが提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】野生型ルシフェラーゼと各変異体ルシフェラーゼにおける加熱処理後の発光残存活性の比較。
【図１−２】野生型ルシフェラーゼと292位または294位変異体ルシフェラーゼにおける加熱処理後の発光残存活性の比較。
【図２】発光試薬に導入した野生型ルシフェラーゼと各変異体ルシフェラーゼにおける加温処理後の発光残存活性の比較（23℃の場合）。
【図３】発光試薬に導入した野生型ルシフェラーゼと各変異体ルシフェラーゼにおける加熱処理後の発光残存活性の比較（40℃の場合）。
【図４】野生型ルシフェラーゼと変異体ルシフェラーゼのタンパク質量当たりの活性比較。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、以下の(a)又は(b)の変異型ルシフェラーゼを提供する。
(a) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニン及び／又は294位のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
(b) 配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼの変異体であって、その変異体のアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の292位及び／又は294位に対応する部位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、前記変異体
(a)のルシフェラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体である。この変異体は、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニン及び／又は294位のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されている。配列番号１は、野生型ルシフェラーゼ（北米産ホタルルシフェラーゼ）のアミノ酸配列を示す。配列番号１のアミノ酸配列における、292位及び／又は294位のフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外のアミノ酸に置換されているとよく、フェニルアラニン以外のアミノ酸としては、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、芳香族アミノ酸（トリプトファン）、プロリンなどの疎水性アミノ酸を例示することができる。
【００１３】
(b)のルシフェラーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼの変異体である。配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼは、天然由来であっても、変異型であってもよい。
【００１４】
ルシフェラーゼの例としては、ホタル天然ルシフェラーゼ（具体的には、北米産ホタル天然ルシフェラーゼ、ヘイケボタル由来ルシフェラーゼ、ゲンジボタル由来ルシフェラーゼ、ヒメボタル由来ルシフェラーゼ、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼ、鉄道虫由来ルシフェラーゼ、ツチボタル由来ルシフェラーゼ、ウミボタル由来ルシフェラーゼ、ウミサボテン由来ルシフェラーゼ）、ホタルルシフェラーゼ以外の天然ルシフェラーゼ（具体的には、渦鞭毛藻（虫）由来ルシフェラーゼ、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、キヨタケ由来ルシフェラーゼ、発光バクテリア由来ルシフェラーゼ、ラチア由来ルシフェラーゼ、発光ゴカイ由来ルシフェラーゼ）などの天然ルシフェラーゼ、それらの変異体などを挙げることができる。
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼとしては、配列番号１のアミノ酸配列における、215位のアラニン、354位のグルタミン酸及び465位のフェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものを例示することができる。配列番号１のアミノ酸配列における、215位のアラニンがアラニン以外のアミノ酸に置換される場合には、脂肪族アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン）、プロリンなどの疎水性アミノ酸で置換されるとよい。配列番号１のアミノ酸配列における、354位のグルタミン酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換される場合には、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどの正電荷をもつアミノ酸、アスパラギン酸などの負電荷をもつアミノ酸などで置換されるとよい。配列番号１のアミノ酸における465位のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸に置換される場合には、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、芳香族アミノ酸（トリプトファン）、プロリンなどの疎水性アミノ酸で置換されるとよい。
【００１６】
本発明の範囲内にあるルシフェラーゼの変異には、以下のものが含まれる。
F292L
A215L, F292L
E354K(E354R), F292L
F465R, F292L
A215L, E354K(E354R), F292L
A215L, F465R, F292L
E354K(E354R), F465R, F292L
A215L, E354K(E354R), F465R, F292L
F294L
A215L, F294L
E354K(E354R), F294L
F465R, F294L
A215L, E354K(E354R), F294L
A215L, F465R, F294L
E354K(E354R), F465R, F294L
A215L, E354K(E354R), F465R, F294L
F292L, F294L
A215L, F292L, F294L
E354K(E354R), F292L, F294L
F465R, F292L, F294L
A215L, E354K(E354R), F292L, F294L
A215L, F465R, F292L, F294L
E354K(E354R), F465R, F292L, F294L
A215L, E354K(E354R), F465R, F292L, F294L
【００１７】
本発明の変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼのＤＮＡ配列をベクターに組み込んだプラスミド（テンプレートDNA）を鋳型として、変異を導入したプライマーを用いてinversePCRを行い、鋳型プラスミドを制限酵素で切断し、その後、直鎖状プラスミドであるPCR産物をセルフライゲーションにより環状化し、変異体のプラスミドＤＮＡを生成させ、このプラスミドを宿主に形質転換し、培地で培養することにより得られる。以上の操作は、KOD-plus mutagenesis kit（東洋紡）を用いて行うことができる。
【００１８】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼのＤＮＡ配列を配列番号２に示す。配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼ遺伝子およびその組換え体ＤＮＡは、北米産ホタルから公知の方法に従って調製することができる。また、プロメガ社より購入することが可能である。
【００１９】
本発明は、上記の変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡも提供する。
【００２０】
また、本発明は、上記の変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターも提供する。変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを組み込む発現ベクターとしては、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば真核性のものではp3XFLAG-CMV-9、p3XFLAG-CMV-10、pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40、細菌性のものではpQE70、pQE60、pQE-9、 pBluescriptII KS、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T、pET-11a等がある。
【００２１】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００２２】
本発明の変異型ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
【００２３】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００２４】
組換えベクターを宿主に導入するには、リン酸カルシウム法によるもののほか、Lipofectamine、Lipofectamine2000（いずれもインビトロジェン）、GeneJuice（メルク）、Xfect（クロンテック）、FuGENE 6 （ロシュ・アプライド）、HilyMax（同仁化学研究所）などの市販の遺伝子導入試薬を用いればよい。
【００２５】
形質転換体を培地で培養し、培養物から本発明の変異型ルシフェラーゼを採取することができる。よって、本発明は、変異型フシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを含む形質転換体を培養することを含む、変異型ルシフェラーゼの製造方法を提供する。変異型ルシフェラーゼが培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から変異型ルシフェラーゼを分離し、精製すればよい。変異型ルシフェラーゼが形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から変異型ルシフェラーゼを分離し、精製すればよい。
【００２６】
本発明の変異型ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を利用する生物発光アッセイに用いることができる。よって、本発明は、変異型ルシフェラーゼを用いて、生物発光アッセイを行う方法を提供する。生物発光アッセイにおいては、変異型ルシフェラーゼを結合した標的タンパク質と発光基質との反応により生じた発光を測定するとよい。発光基質は、ルシフェリン（例えば、多複素式有機酸Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△2−チアゾリン−４−カルボン酸）であるとよい。発光波長は562ｎｍが適当である。
【００２７】
上記アッセイを行うために、本発明の変異型ルシフェラーゼは、取扱い説明書、発光基質、その他の試薬とともにキットを構成するとよい。よって、本発明は、変異型ルシフェラーゼを含むキットも提供する。
【００２８】
本発明の生物発光アッセイ法は、分割酵素アッセイであってもよい。すなわち、変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントの結合により再構成されたルシフェラーゼと発光基質との反応により生じた発光を測定するものであってもよい。ルシフェラーゼの分割酵素アッセイについては、特許第5816412号に記載されており、それを参照するとよい。本発明は、上記の分割酵素アッセイに用いられる、変異型ルシフェラーゼのＣ末端又はＮ末端フラグメントも提供する。変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の３９９〜５５０番目に対応する部位の連続するアミノ酸からなる配列を含むとよく、変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列中の１〜４１６番目に対応する部位の連続するアミノ酸からなる配列を含むとよい。上記の３９９〜５５０番目に対応する部位、１〜４１６番目に対応する部位は、それぞれ、最初のアミノ酸と最後のアミノ酸の部位が１７個以下程度前後してもよい。また、C末端フラグメントとＮ末端フラグメントは、重複するアミノ酸配列を含んでもよい。重複するアミノ酸の数は、１〜200個が好ましく、5〜30個がより好ましい。
【００２９】
分割酵素アッセイにおいて、ターゲットタンパク質と変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させるとよい。例えば、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な細胞に導入し、適当な時間培養することにより、融合タンパク質を細胞に発現させることができる。ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡ及び変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡは、PCR等を用いる公知の方法で調製することができる。発現ベクターとしては、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば真核性のものではp3XFLAG-CMV-9、p3XFLAG-CMV-10、pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40、細菌性のものではpQE70、pQE60、pQE-9、 pBluescriptII KS、pTrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T、pET-11a等がある。ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡは、変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡの上流又は下流のいずれに組み込んでもよい。また、ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡとの間には、１〜50個のヌクレオチドからなるリンカー配列を挿入してもよい。
【００３０】
融合タンパク質を発現させる細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などの細胞を例示することができる。
【００３１】
ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと変異型ルシフェラーゼのＣ末端フラグメントをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを宿主に導入するには、リン酸カルシウム法によるもののほか、Lipofectamine、Lipofectamine2000（いずれもインビトロジェン）、GeneJuice（メルク）、Xfect（クロンテック）、FuGENE 6 （ロシュ・アプライド）、HilyMax（同仁化学研究所）などの市販の遺伝子導入試薬を用いればよい。
【００３２】
変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメントは、例えば、変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメントをコードするＤＮＡを組み込んだベクターをタンパク質発現用宿主（例えば、大腸菌）に導入し、適当な時間培養した後、培養物から目的のタンパク質（変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメント）を採取することができる。目的のタンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から目的のタンパク質を分離し、精製すればよい。目的のタンパク質が宿主の細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から目的のタンパク質を分離し、精製すればよい。
【００３３】
融合タンパク質を細胞に発現させた後、変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメントを添加し、発光の有無若しくは発光波長の変化を検出する。例えば、融合タンパク質を発現する細胞の培養液に変異型ルシフェラーゼのＮ末端フラグメントを添加し、適当な時間静置した後、発光の有無若しくは発光波長の変化を検出するとよい。ターゲットタンパク質と変異型ルシフェラーゼのC末端フラグメントとの融合タンパク質を細胞に発現させた後、変異型ルシフェラーゼのN末端フラグメントを添加する場合には、発光基質（ルシフェリン）を加えてから、発光の有無又は発光波長の変化を検出するとよい。発光波長は562ｎｍが適当である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
変異体ルシフェラーゼの作製
変異体ルシフェラーゼを作製するためのプラスミドは、inversePCR法（Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction.  Genetics  120(3):621-623.）に基づき、野生型（Wild）ルシフェラーゼをpET28aまたはpET28bベクター（メルク社製）に組み込んだプラスミド（テンプレートDNA）に対して部位特異的変異導入を行うことにより、作製した。
PCR反応は、下記の組成で反応液を調製し、95℃で2分処理後、98℃で10秒、68℃で7分のサイクルを10サイクル行った。
テンプレートDNA  pET28a (pET28b)-WildLuc（50ng/μl）   0.5μl
プライマー１（10pmol/μl）                             0.5μl
プライマー２（10pmol/μl）                             0.5μl
2mM dNTP混合物（TOYOBO社製）                           2.5μl
ポリメラーゼ（TOYOBO社製）                             0.5μl
10×緩衝液                                             2.5μl
滅菌水                                                 18μl
※プライマー１及び２の塩基配列は表１に示す。
増幅したPCR産物は、まず、Dpn I処理により鋳型プラスミド（野生型ルシフェラーゼの配列が存在するテンプレートDNA）を消化した。その後、Dpn I処理により消化されなかったDNAをセルフライゲーションにより環状化し、変異体のプラスミドDNAを生成させた。このプラスミドDNAを大腸菌BL21（DE3）にトランスフォーメーション（形質転換）し、50μg/mlカナマイシンを含むLB寒天培地に撒き、37℃で一晩培養した。塩基配列の確認は、生じたコロニーから液体培養し、プラスミドDNAを抽出した上で行った。なお、複数の改変部位を有する変異体ルシフェラーゼについては、プライマーの配列を各々の改変アミノ酸に変わるよう設計し、前記手法を繰り返すことにより作製した。
上記の方法により、変異体ルシフェラーゼM2(A215L, E354K)、M1-354R(E354R)、M1-465R(F465R)、M3-354K(A215L, E354K, F465R)、M3-354R(A215L, E354R, F465R)、M5(A215L, E354K, F465R, F292L, F294L)、M3K+292(A215L, E354K, F465R, F292L)、M3K+294(A215L, E354K, F465R, F294L)、M1-292L(F292L)、M1-294L(F294L)を作製した。
【００３５】
表１  変異体作製に使用したオリゴヌクレオチドの配列
2018153133.tif 000003
【００３６】
〔実施例２〕
変異体ルシフェラーゼの耐熱性評価
各組み換えルシフェラーゼの耐熱性は、下記の手法により評価した。改変プラスミドを導入したBL21（DE3）細胞を50μg/mlカナマイシンおよび0.5mM IPTGを含むLB寒天培地に撒き、37℃で一晩培養後、1コロニー分の菌体を200μlの溶菌バッファーに入れ、変異体ルシフェラーゼを抽出した。なお、溶菌に使用したバッファーの組成は下記の通りである。
トリス緩衝液（pH6.8〜pH8.0、終濃度0.1〜100mM）
Triton X-100（終濃度0.001〜10%）
リゾチーム（終濃度0.1mg/ml〜20mg/ml）
この溶菌液を35℃〜45℃で30分間加熱処理し、「ピッカジーン発光キット（東洋ビーネット社製）PGL100」を用いて、発光活性を測定した。図1-1は、各変異体ルシフェラーゼにおける加熱処理後の発光活性を示す。本図より、本発明のルシフェラーゼ変異体は野生型ルシフェラーゼに対して、約1.5〜16倍の熱安定性を有していることが分かる。また、F292L、F294Lの改変部位は、既知の改変部位およびその組み合わせにより改善された熱安定性に対して、さらなる耐熱性の向上を付与していることが分かる。特に、F292LおよびF294Lの両部位を改変した変異体「M5」ルシフェラーゼは、既存の改変部位と組み合わせることにより、野生型ルシフェラーゼとの比較において、約9倍の耐熱性から約16倍の耐熱性へと向上させた。本結果は、野生型ルシフェラーゼの耐熱性改善において、F292LとF294Lの相乗効果を示している。
図1-2は、292位または294位を単独で変異させた場合の耐熱性効果を示す。図1-1と同様の方法にて試験し、加熱処理後の発光活性を野生型と比較した。本図より、292位および294位における改変は、野生型に対して、それぞれ約3.6倍、約3.2倍の残存活性を示し、単独の変異でも耐熱性を付与することが分かる。
【００３７】
〔実施例３〕
変異体ルシフェラーゼを発光試薬に導入した際の耐熱性評価
各変異体ルシフェラーゼを導入した大腸菌BL21（DE3）を50μg/mlカナマイシン含有LB液体培地に植菌し、37℃で数時間振盪培養した。OD600＝0.3〜0.7の段階でIPTG（終濃度0.5mM）を添加し、変異体ルシフェラーゼの発現を誘導後、約5時間培養した後に遠心分離によって集菌し、実施例2と同様の溶菌バッファーを用いて大腸菌から総タンパク質を抽出した。抽出した総タンパク質からの変異体ルシフェラーゼの精製には、ニッケルを結合させたHisカラムを用いた。
この精製した変異体ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼの代わりに発光試薬“『細胞の』ATP測定試薬（東洋ビーネット社製）CA”に導入し、発光試薬へ導入した後の耐熱性を評価した。耐熱性の評価には、「室温15〜30℃における安定性」および「30〜50℃における加温耐性」として、23℃で24時間の加温処理、および40℃で30分間の加熱処理を行い、処理後の発光残存活性を測定した。図2は、発光試薬に導入した野生型ルシフェラーゼと各変異体ルシフェラーゼにおける加温処理（23℃）後の発光残存活性の比較データを示す。また、図3は、発光試薬に導入した野生型ルシフェラーゼと各変異体ルシフェラーゼにおける加熱処理（40℃）後の発光残存活性の比較データを示す。本図より、本発明のルシフェラーゼ変異体は、発光試薬中に存在している場合においても、野生型ルシフェラーゼと比較して約1.6〜107倍の耐熱性を有していることが分かる。特に、高温になるほど、その耐熱性効果を発揮していた。また、F292L、F294Lの改変部位は、実施例2と同様に、既知の改変部位およびその組み合わせにより改善された熱安定性に対して、さらなる耐熱性の向上を付与していることが分かる。
【００３８】
〔実施例４〕
変異体ルシフェラーゼの比活性の測定
作製した変異体ルシフェラーゼと野生型ルシフェラーゼについて、タンパク質量当たりの比活性を測定した。比活性の算出には、前記発光試薬への各ルシフェラーゼの添加量と各ルシフェラーゼをSDS-PAGEによって分離した際に得られるバンド濃淡を数値化した値を用いた。図４は、その結果を示す。本図より、本発明のルシフェラーゼ変異体は、野生型ルシフェラーゼに比べて比活性が約1.8倍に上昇しており、タンパク質量当たりの活性が高いことが分かる。この結果は、同タンパク質量のルシフェラーゼを用いた際に、より高い発光量として検出されることを意味する。すなわち、ルシフェラーゼ発光検出における発光感度の上昇を意味する。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の変異型ルシフェラーゼは、リポーターアッセイなどに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
＜配列番号１＞野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号２＞野生型ルシフェラーゼのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号３＞M1-292Lのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLLSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号４＞M1-292LのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattgtcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号５＞M1-294Lのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSLFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号６＞M1-294LのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tgttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号７＞M1-354Rのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPRGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号８＞M1-354RのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccc gtggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号９＞M1-465Rのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号１０＞M1-465RのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号１１＞M2のアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号１２＞M2のＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca aaggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号１３＞M3-354Kのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号１４＞M3-354KのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca aaggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号１５＞M3-354Rのアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPRGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号１６＞M3-354RのＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccc gtggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号１７＞M3K+292のアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLLSFFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号１８＞M3K+292のＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattgtcat tcttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca aaggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号１９＞M3K+294のアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSLFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号２０＞M3K+294のＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tgttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca aaggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号２１＞M5のアミノ酸配列を示す。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVN
ITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGV
AVAPANDIYNERELLNSMNISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKII
IMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSG
STGLPKGVALPHRTLCVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMF
TTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLLSLFAKSTL
IDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAIL
ITPKGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSG
YVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVA
PAELESILLQHPNIRDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVD
YVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL
＜配列番号２２＞M5のＤＮＡ配列を示す。
1 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga
61 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt
121 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc
181 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta
241 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt
301 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt
361 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa
421 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga
481 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat
541 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga
601 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctttgtgcgt cagattctcg
661 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt
721 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt
781 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac
841 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattgtcat tgttcgccaa aagcactctg
901 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg
961 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat
1021 gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca aaggggatga taaaccgggc
1081 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa
1141 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt
1201 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct
1261 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct
1321 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa
1381 caccccaaca tccgtgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt
1441 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat
1501 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac
1561 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata
1621 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa
＜配列番号２３＞改変部位A215L用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
TTGTGCGTCAGATTCTCGCATGCCA
＜配列番号２４＞改変部位A215L用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
AGTTCTATGCGGAAGGGCCACACCC
＜配列番号２５＞改変部位E354K用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
AAAGGGGATGATAAACCGGGCGCGG
＜配列番号２６＞改変部位E354K用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
GGGTGTAATCAGAATAGCTGATGTAGTCTCAGTGAGCCC
＜配列番号２７＞改変部位E354R用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
CGTGGGGATGATAAACCGGGCGC
＜配列番号２８＞改変部位E354R用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
GGGTGTAATCAGAATAGCTGATGTAGTCTCAGTGAGCCC
＜配列番号２９＞改変部位F292L用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
TTGTCATTCTTCGCCAAAAGCAC
＜配列番号３０＞改変部位F292L用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
TAGGGTTGGTACTAGCAACGCACT
＜配列番号３１＞改変部位F294L用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
TTGTTCGCCAAAAGCACTCTGAT
＜配列番号３２＞改変部位F294L用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
TGAAAATAGGGTTGGTACTAGCAACG
＜配列番号３３＞改変部位F465R用のプライマー配列（プライマー１）のＤＮＡ配列を示す。
CGTGACGCGGGCGTGGCAGGTCTT
＜配列番号３４＞改変部位F465R用のプライマー配列（プライマー２）のＤＮＡ配列を示す。
GATGTTGGGGTGTTGTAACAATATCGATTCC
【図１−１】
2018153133.tif 000004
【図１−２】
2018153133.tif 000005
【図２】
2018153133.tif 000006
【図３】
2018153133.tif 000007
【図４】
2018153133.tif 000008
【配列表】
2018153133000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月9日(2018.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列における、292位のフェニルアラニンがロイシンに置換されており、さらに、294位のフェニルアラニン、215位のアラニン、354位のグルタミン酸及び465位のフェニルアラニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよい前記変異体。
【請求項２】
請求項１記載のルシフェラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を培養することを含む、ルシフェラーゼ変異体の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のルシフェラーゼ変異体を含むキット。
【請求項７】
請求項１記載のルシフェラーゼ変異体を用いて、生物発光アッセイを行う方法。
【請求項８】
請求項１記載のルシフェラーゼ変異体を結合した標的タンパク質と発光基質との反応により生じた発光を測定する請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載のルシフェラーゼ変異体のＣ末端フラグメントとＮ末端フラグメントの結合により再構成されたルシフェラーゼと発光基質との反応により生じた発光を測定する請求項７記載の方法であって、前記Ｎ末端フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列中の292位を含む前記方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法に用いられる、請求項１記載のルシフェラーゼ変異体のＮ末端フラグメントであって、配列番号１のアミノ酸配列中の292位を含む前記Ｎ末端フラグメント。