(57)【要約】【課題】メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ （以下、ＭＴＨＦＤ２と略称する）の作用を阻害する薬剤に対する被験者の反応性を予測する方法、および該薬剤の投与による奏功性が高いと予測される患者を選別する方法を提供すること。【解決手段】被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるグリシンデカルボキシラーゼ（以下、ＧＬＤＣと略称する）遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法、前記阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、並びに前記方法により選別された被験者に該阻害薬を投与することを疾患治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるグリシンデカルボキシラーゼ（以下、ＧＬＤＣと略称する）遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ （以下、ＭＴＨＦＤ２と略称する）阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法。
【請求項２】
前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量測定により行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣタンパク質の定量測定により行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損が検出された試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析が該遺伝子のコピー数を測定することにより行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１−６のいずれか１項に記載の方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法。
【請求項８】
被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１−６のいずれか１項に記載の方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む、疾患治療方法。
【請求項１０】
被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者由来の生物学的試料中のグリシンデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；以下、ＧＬＤＣと略称することがある）遺伝子またはその遺伝子産物を指標にして、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−２；以下、ＭＴＨＦＤ２と略称することがある）阻害薬に対する反応性を予測する方法に関する。さらに本発明は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、および該方法により選別された被験者にＭＴＨＦＤ２阻害薬を投与することを含む疾患治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に係る酵素であるＭＴＨＦＤのアイソフォームの１つであり、ミトコンドリアに存在する。ＭＴＨＦＤ２は、二機能性酵素であり、ミトコンドリア内で、ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応およびメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ反応を触媒する。ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を基質として、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸（５，１０−Ｍｅｔｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を生成する反応である。メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ反応は、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸を基質として、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸（１０−Ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）を生成する反応である。
【０００３】
葉酸は、水溶性ビタミン群の１つであるが、生体内では合成されず、食品から摂取される。腸管から吸収された葉酸は生体内で代謝を受け、その代謝産物であるテトラヒドロ葉酸が補酵素として核酸合成に寄与する。そのため、がん細胞において葉酸代謝を阻害すると、核酸合成が阻害され、その結果、細胞増殖が抑制される。この点に着目し、葉酸代謝阻害剤が抗がん剤として開発されている。
【０００４】
ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に関わる酵素であり、また、急速ながん細胞増殖との関連が報告された代謝系であるミトコンドリアにおける１炭素代謝に関連する（非特許文献１）。そのため、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害することにより、がん細胞の急速な細胞増殖を抑制することができると考えることができる。
【０００５】
最近、ＭＴＨＦＤ２ががん治療における有望な標的分子であり得ることが報告されている（非特許文献１）。具体的には、ＭＴＨＦＤ２の発現が多様ながん疾患でｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルのいずれにおいても著しく亢進していること、およびＭＴＨＦＤ２の発現増強と乳がんの予後不良との相関が認められることが観察された。一方、ＭＴＨＦＤ２の発現は、発生中の胚で認められたが、ほとんどの健常成人組織ではそれが増殖中であっても認められなかった。また、がん細胞において、ＭＴＨＦＤ２の発現をＲＮＡ干渉により阻害すると、がん細胞の増殖低下および著しい細胞死が引き起こされた。したがって、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤は、副作用の少ない有用な抗がん剤として期待される。
【０００６】
ＧＬＤＣは、ミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素である。
【０００７】
グリシン代謝酵素の欠損は高グリシン血症を引き起こす。また、グリシン消費量およびミトコンドリアのグリシン生合成経路ががん細胞の増殖速度と強く関連することが報告されている（非特許文献２）。具体的には、グリシンの摂取およびそのミトコンドリアでの生合成を拮抗することにより、急速に増殖している細胞が優先的に障害されたこと、さらには、その生合成経路の高発現が、乳がん患者のより高い死亡率に関連することが示されている。
【０００８】
また、ＧＬＤＣが、非小細胞肺がんのがん幹細胞および腫瘍発生を推進することが報告されている（非特許文献３）。具体的には、ＧＬＤＣが解糖およびグリシン／セリン代謝の劇的変化を誘導し、その結果、ピリミジン代謝の変化を引き起こして、がん細胞増殖を制御することが示されている。また、臨床では、ＧＬＤＣの異常な活性化と肺がん患者の予後不良との相関、および多様な種類のがんにおけるＧＬＤＣの異常な発現が観察されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nilsson R. et al., Nature Communications, 2014. 5, Article number: 3128 doi:10.1038/ncomms4128.
【非特許文献２】Jain M. et al., Science, 2012. 336(6084), p.1040-1044. doi: 10.1126/science.1218595.
【非特許文献３】Zhang W. C. et al., Cell, 2012. 148, p.259-272.
【非特許文献４】ヒューマンメタボロームデータベース、インターネット＜URL：http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB00123＞
【非特許文献５】Hirayama A. et al., Cancer Research, 2009. 69(11), p.4918-4925.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、がん疾患等の疾患の治療領域において分子標的治療薬の開発が盛んになり、その効果を確実に得られる患者を選別して薬剤を投与するという考えが定着しつつある。そのため、分子標的薬の開発時には、患者選別や副作用低減を目的とした薬剤効果の評価方法を開発することが求められている。
【００１１】
例えば、葉酸代謝を阻害する薬剤は、がん細胞におけるＤＮＡ合成やＤＮＡメチル化を阻害するため、がん細胞の増殖を抑制すると考えることができる。そのため、葉酸の吸収やその代謝を阻害する薬剤を抗がん剤として開発することが期待される。このような薬剤を開発する際には、該薬剤に対する患者の反応性の予測、ひいては該薬剤により効果が得られる患者の選別や副作用低減等を目的とした薬剤効果の評価方法を開発することが求められる。
【００１２】
本発明の課題は、葉酸代謝に係る酵素であるＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤による有効な疾患治療、例えばがん疾患治療を可能にするために、該薬剤に対する患者の反応性を予測する方法、および該薬剤による奏功性が高いと予測される患者を選別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、多種類のがん細胞で高頻度に欠損していることが報告されているがん抑制遺伝子ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子が存在する染色体９ｐ２１領域の近傍に位置するＧＬＤＣ遺伝子に着目した。ある特定の遺伝子が欠損する際には、その近傍に位置する別の遺伝子が共欠損することが報告されている。実際、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がホモ欠損しているがん細胞の中には、ＧＬＤＣ遺伝子もヘテロ欠損しているものがある。
【００１４】
そこで、ミトコンドリアの酵素であるＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対するがん細胞の反応性と、ミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素として知られているＧＬＤＣの発現との関連性を検討した。その結果、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株ではＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖が強く阻害されるが、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現がん細胞株、中等度発現がん細胞株、および非発現がん細胞株では細胞増殖に影響は認められなかった。また、ＧＬＤＣ遺伝子高発現がん細胞株でＧＬＤＣ遺伝子をノックダウンすると、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖が阻害された。
【００１５】
このように、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対するがん細胞の反応性とＧＬＤＣ遺伝子の発現との間に関連性があることを明らかにしたことに基づき、本発明を達成した。
【００１６】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法、
２．前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、前記１．の方法、
３．ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量測定により行われる、前記２．の方法、
４．ＧＬＤＣ遺伝子の発現の測定がＧＬＤＣタンパク質の定量測定により行われる、前記２．の方法、
５．前記生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損が検出された試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む、前記１．の方法、
６．ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析が該遺伝子のコピー数を測定することにより行われる、前記５．の方法、
７．前記１．−６．のいずれかの方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象を選別する方法、
８．被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、前記７．の方法、
９．前記１．−６．のいずれかの方法により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有すると予測された被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む、疾患治療方法、
１０．被験者ががん疾患患者であり、かつ疾患治療ががん疾患治療である、前記９．の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を指標としてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測することを含む、ＭＴＨＦＤ２阻害薬への反応性の予測方法を提供することができる。
【００１８】
本発明に係る方法は、被験者におけるＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果の予測を、該薬剤を投与する前に実施することを可能にする。また、本発明に係る方法により、該薬剤の奏功性が高いと予測される被験者を選別することができ、該薬剤による有効な治療を実施できる。さらに本発明に係る方法は、被験者由来の生物学的試料を用いてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施できるため、被験者への負担が少ない。このように、本発明に係る方法は、がん疾患等の疾患の治療領域において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】５種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を示す図である。図の縦軸は、Ａ５４９におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現量に対する各細胞株での該ｍＲＮＡの相対的発現値（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＧＬＤＣ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。検討したすべてのがん細胞株で、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現が検出されたが、Ａ５４９以外の細胞での発現は低かった。（実施例１）
【図２】５種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣタンパク質の定量分析により検討した結果を示す図である。タンパク質の検出は、抗ＧＬＤＣ抗体を用いてウエスタンブロット法により行った。矢頭は、ＧＬＤＣタンパク質のバンドを示す。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。ＧＬＤＣタンパク質のバンドの位置は、Ａ５４９をＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＧＬＤＣと表示する）で処理して該遺伝子の発現を阻害することによる該バンドの消失の検出により確認した。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は、陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１）
【図３】１種の正常細胞株ＨＥＫ２９３、７種のがん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ−１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、およびＨＥＣ５０ＢにおけるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を示す図である。ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析は、３種類のプライマーセット（プライマーセット１、プライマーセット２、およびプライマーセット３）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により行った。プライマーセット１は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの３´末端側の部分塩基配列（ＧＬＤＣ−Ｃｔｅｒ）を、そして、プライマーセット２およびプライマーセット３はいずれもＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの５´末端側の部分塩基配列（それぞれＧＬＤＣ−Ｎｔｅｒ１およびＧＬＤＣ−Ｎｔｅｒ２）を増幅するプライマーセットである。図の縦軸は、ＨＥＫ２９３におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現量に対する各細胞株での該ｍＲＮＡの相対的発現値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。図中、結果を示すバーは、左側からＨＥＫ２９３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ−１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、およびＨＥＣ５０Ｂを示す。（実施例１）
【図４−Ａ】３種のがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＮＣＩ−Ｈ２３４７において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ  １００）およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ  ０）で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて行った。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すアデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）量を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１）
【図４−Ｂ】ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＮＣＩ−Ｈ２３４７におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用い、ＧＬＤＣタンパク質の検出は抗ＧＬＤＣ抗体を用いて行った。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「１」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかった細胞を示し、「２」、「３」、「４」、および「５」はそれぞれ陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡ、２ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２、５ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２、および１０ｎＭのｓｉＭＴＨＦＤ２で処理した細胞を示す。（実施例１）
【図５−Ａ】がん細胞株Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、再播種当日の細胞数に対する細胞増殖の割合（Ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ  ｖｓ  ｄａｙ０））を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを、「ｎｏ  ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示す。また、「×」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした（ｓｉＲＮＡ  ＴＦ）日を示す。（実施例１）
【図５−Ｂ】がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３４７およびＮＣＩ−Ｈ１９７５において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖への影響をグリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、再播種当日の細胞数に対する細胞増殖の割合（Ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ  ｖｓ  ｄａｙ０））を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを、「ｎｏ  ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示す。また、「×」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした（ｓｉＲＮＡ  ＴＦ）日を示す。（実施例１）
【図５−Ｃ】ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用いて行った。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「（−）」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかった細胞を示し、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡで処理した細胞を示す。（実施例１）
【図６−Ａ】がん細胞株ＢＴ４７４およびＡ５４９の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響をグリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭと表示する）を用いて２回行った。１回目および２回目のノックダウンにはｓｉＭをそれぞれ１０ｎＭおよび０．１ｎＭまたは１ｎＭ使用した。図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示し、図の縦軸は再播種時の細胞数に対する細胞増殖の割合（ｇｒｏｗｔｈ（ｆｏｌｄ，ｄａｙ０＝１））を示す。図中、「ｎｏ  ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示し、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１）
【図６−Ｂ】ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしたがん細胞株ＢＴ４７４におけるＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭ２と表示する）を用いて行った。ＭＴＨＦＤ２タンパク質の検出は、抗ＭＴＨＦＤ２抗体を用いて行った。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）は、ウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。図中、「ｎｏ  ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを示す。（実施例１）
【図７】がん細胞株ＨＥＣ５０Ｂ、Ａ５４９、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響をグリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（０））で検討した結果を示す図である。ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２と表示する）を用いて行った。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すＡＴＰ量を示し、図の横軸は細胞を再播種後の培養日数を示す。図中、「ｎｏ  ＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡによる処理を行わなかったことを示し、「ｓｉＣｔｒｌ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。（実施例１）
【図８】ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたがん細胞株Ａ５４９におけるＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンによる該がん細胞株の細胞増殖への影響を検討した結果を示す図である。細胞増殖の測定は、１０％  ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で細胞を培養することにより行った。本培地はグリシンを１３３  μＭ以上含有する。ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンは、ＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＧＬＤＣまたはｓｉＧと表示する）およびＭＴＨＦＤ２遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（図中、ｓｉＭＴＨＦＤ２またはｓｉＭと表示する）を用いて行った。図中、「ｓｉＣ」は陰性コントロールの短鎖干渉ＲＮＡを意味する。また、下向き矢印は、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖が低下したことを示す。（実施例２）
【図９】様々な細胞株についてＧＬＤＣ遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）を解析した結果を示す図である。（実施例３）
【図１０−Ａ】ＭＴＨＦＤ２遺伝子のショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する）を安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現を、ＭＴＨＦＤ２タンパク質の定量分析により検討した結果を示す図である。図中、「ｓｈＭＴＨＦＤ２」はＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを示し、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを示す。β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）をウエスタンブロット法におけるローディングコントロールとして測定した。（実施例４）
【図１０−Ｂ】ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）の、グリシン  １００  μＭ存在下（Ｇｌｙ（１００））およびグリシン非存在下（Ｇｌｙ（−））での細胞増殖を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃクロンは、再播種後３日目に細胞増殖を測定した。図の縦軸は、細胞増殖の程度を示すＡＴＰ量を示す。図中、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを意味する。（実施例４）
【図１１】ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを安定的に発現させたがん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃの３つのクロン（Ｍ１２、Ｍ１３、およびＭ１８）を移植したゼノグラフトモデルマウスにおいて、腫瘍増殖を検討した結果を示す図である。図中、「ｓｈＭＴＨＦＤ２」はＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡを意味し、「ｓｈＣｔｒｌ」はコントロールｓｈＲＮＡを意味する。図の縦軸は腫瘍体積を示し、横軸はがん細胞クロン移植後の日数を示す。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法に関し、本方法は被験者由来の生物学的試料中のＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物をＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の指標として解析することを特徴とする。
【００２１】
本発明において「被験者」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法による検査を受けるヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。例えば、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果が期待される疾患に罹患したヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療効果が期待される疾患として、がん疾患を好ましく例示できる。ヒト以外の哺乳動物は、哺乳動物として類別される生物であればいかなる生物であってもよく、例えばサル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、等を含む。
【００２２】
本発明における「被験者」として、がん疾患を疑われたヒトおよびヒト以外の哺乳動物、およびがん疾患と診断されたヒトおよびヒト以外の哺乳動物を好ましく例示できる。
【００２３】
がん疾患とは、生体内において「腫瘍」または「がん」の発生が認められる疾患を意味する。「腫瘍」または「がん」は、増殖および／または転移が認められるものを含む。また、「腫瘍」または「がん」は、がん疾患の治療後に再発したものを含む。
【００２４】
本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。
「がん」は、通常、狭義の悪性腫瘍を意味し、悪性腫瘍の中で上皮細胞から発生するものを指す。一方、非上皮性の悪性腫瘍を肉腫と呼ぶ。「悪性腫瘍」とは、組織や細胞が生体内の制御に反して自律的に過剰に増殖することによって形成される組織塊腫瘍の中で、特に浸潤性を有し、増殖・転移する等悪性を示すものをいう。がんは病理組織学的な分類では、腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんの３種類に分類できる。腺がんは、腺組織に由来するがんであり、大腸がん、乳がん、胃がん、肺がん、胆嚢がん、腎臓がん、前立腺がん、十二指腸がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚部がん、子宮体部がん等を例示できる。扁平上皮がんは、上皮の基底細胞が悪性化し、異型性、多形成を増し、上皮下結合組織中で増殖して形成された腫瘍であり、口腔がん、舌がん、咽頭、食道がん、気管支がん、喉頭がん等を例示できる。移行上皮がんは、移行上皮組織に由来するがんであり、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、口腔がんを例示できる。一方、肉腫には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、悪性リンパ腫等がある。
【００２５】
本明細書において「生物学的試料」は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物をいい、例えば腫瘍生検、髄液、胸腔内液、腹腔内液、リンパ液、皮膚切片、血液、尿、糞便、痰、呼吸器、腸管、尿生殖器管、唾液、乳、消化器官、およびこれらから採取された細胞を挙げることができるが、遺伝子発現解析が可能である限りにおいて特に限定されない。「生物学的試料」は、例えば、がん疾患の治療目的で行われた手術の際に得られた切除組織の一部、がん疾患を疑われた対象者から生検等によって採取された組織の一部、あるいは胸腔内液や腹腔内液に由来する細胞を好ましく例示できる。
【００２６】
生物学的試料は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物等から調製したタンパク質抽出液や核酸抽出液であっても良い。タンパク質抽出液や核酸抽出液の調製は、自体公知のタンパク質調製法や核酸調製法を利用して実施できる。
【００２７】
生物学的試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療を行う前に採取された生物学的試料が好ましい。このような生物学的試料を使用することにより、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療を実施する前にＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する感受性予測が可能になり、その結果、被験者に対してＭＴＨＦＤ２阻害薬を含む治療を適用するか否かの判定、すなわち、ＭＴＨＦＤ２阻害薬を含む治療を適用する被験者の選別を実施することができる。
【００２８】
ＭＴＨＦＤ２は、葉酸代謝に係る酵素であるＭＴＨＦＤのアイソフォームの１つである。ＭＴＨＦＤ２は、ミトコンドリアに存在する二機能性酵素であり、ミトコンドリア内で、ＮＡＤ＋依存性メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ反応およびメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ反応の触媒作用を有し、急速ながん細胞増殖との関連が報告された代謝系であるミトコンドリアにおける１炭素代謝に関連する（非特許文献１）。そのため、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害することにより、がん細胞の急速な細胞増殖を抑制することができると考えることができる。
【００２９】
本明細書において「ＭＴＨＦＤ２阻害薬」とは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物を標的とする薬剤であって、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現、すなわちＭＴＨＦＤ２遺伝子の転写やＭＴＨＦＤ２  ｍＲＮＡの翻訳、並びにＭＴＨＦＤ２タンパク質の作用等を阻害することにより、細胞や生体におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物の機能やその生理学的作用を抑制する薬剤をいう。かかる薬剤として、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡ等の低ＲＮＡ分子、アプタマー、リポザイム、抗体、または低分子化合物を挙げることができるが、これらに限定されず、ＭＴＨＦＤ２遺伝子またはその遺伝子産物の機能やその生理学的作用を抑制する物質であればいずれの物質であってもよい。
【００３０】
本明細書において「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する感受性と言い換えることができる。例えば、「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬によるがん細胞の増殖抑制や細胞死、並びに該阻害薬によるがん疾患治療におけるがんの縮小や消滅あるいはがん疾患の寛解や部分寛解が認められることを意味する。「ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性の指標とする」とは、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を評価するマーカーとして使用することをいう。
【００３１】
ＧＬＤＣはミトコンドリアに局在するグリシン開裂系を構成する分子の１つであり、グリシン代謝酵素である。
【００３２】
ＧＬＤＣ遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は既に報告されている。ヒトＧＬＤＣ遺伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列として、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿０００１７０（ＶＥＲＳＩＯＮ：ＮＭ＿０００１７０．２  ＧＩ：１０８７７３８００）で登録されているｍＲＮＡの塩基配列および該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を例示でき、これら配列を配列表の配列番号１および２に記載する。ＧＬＤＣ遺伝子は、例示した塩基配列からなるものだけでなく、ＧＬＤＣと生物学的機能が同等であるタンパク質、例えばホモログやスプライスバリアント等の同族体、変異体、および誘導体をコードするものであってもよい。また、ＧＬＤＣタンパク質は、例示したアミノ酸配列からなるものだけでなく、同等の生物学的機能を有するタンパク質、例えばホモログやスプライスバリアント等の同族体、変異体、および誘導体であってもよい。
【００３３】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡやＤＮＡ等の塩基配列によって示される遺伝情報をいう。遺伝子というときは、タンパク質をコードするものだけでなく、ＲＮＡやＤＮＡとして機能するものも含む。「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡだけでなく、これに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡやこれらから構成される２本鎖ＲＮＡであってもよい。
【００３４】
本明細書において「遺伝子発現」（単に発現と表記する場合もある）とは、遺伝子情報がｍＲＮＡに転写され、次いで、タンパク質に翻訳されて細胞の構造および機能として生体内で作用を示すことをいう。また、「発現量」とは、遺伝子発現の過程において生じる産物、例えば転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の量をいう。
【００３５】
本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法は、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者由来の試料であると予測することを含む。
【００３６】
生物学的試料中のＧＬＤＣ遺伝子の発現の解析は、具体的には、例えば、測定対象の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ量を測定するか、または測定対象の遺伝子産物であるタンパク質量を測定することにより実施することができる。
【００３７】
ｍＲＮＡ量を測定する方法としては、公知の遺伝子発現検出方法を用いることができる。例えば、ノザンブロッティング法、ドットブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量ＲＴ−ＰＣＴ、ハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡアレイ法等の数々の分子生物学的手法を使用してｍＲＮＡ量の測定を実施できる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いて公知の方法でｍＲＮＡ量の測定を実施できる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を結合させておき、これを生物学的試料から単離・精製したｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡとハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のｍＲＮＡ量を検出することができる。なお、プローブは、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、プローブは、測定対象の遺伝子について作製したプローブを支持体上に固定化したＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップの形で用いることもできる。支持体としては、ポリヌクレオチドを固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。支持体として、一般的には、例えば、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機素材、また天然高分子材料としてニトロセルロースや合成高分子材料としてナイロン等を挙げることができる。ＤＮＡチップやＤＮＡアレイは市販のものを使用することができる。支持体上に固定するポリヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドであっても良い。合成オリゴヌクレオチドの配列上に蛍光標識が可能な核酸誘導体を導入することも可能である。また、支持体上で目的のオリゴヌクレオチドを合成できるアフィメトリックス型のＤＮＡチップ技術、および、合成したＤＮＡ断片をＤＮＡプローブとしてスポッティングすることにより固定するスタンフォード型のＤＮＡチップ技術のいずれも用いることができる。さらに、支持体が３次元構造をした３Ｄ−Ｇｅｎｅ型（東レ株式会社製）の柱状の面に所望のポリヌクレオチドをスポットして固定化することもできる。なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、４２℃で１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３８】
ＧＬＤＣ遺伝子に由来するｍＲＮＡやｃＤＮＡを定量的に検出するためのプローブおよびプライマーセットは、該ｍＲＮＡやｃＤＮＡを特異的に検出することができる限りにおいて特に限定されないが、１２〜２６塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなプローブおよびプライマーセットは、測定対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、そして、決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて常法に従って合成することができる。また、市販されている遺伝子検出用のプライマーやプローブから所望のものを選択して利用することもできる。
【００３９】
ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡを定量的に検出するためのプライマーセットとして、下記３種類のプライマーセットを例示できる。プライマーセット１は、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット２は、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット３は、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。プライマーセット１は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの第２４２８番目から第２５９５番目までの３´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット２は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの第３６４番目から第４７９番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット３は、配列番号１に記載のＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの第６３５番目から第７４３番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。
【００４０】
ＧＬＤＣタンパク質を定量的に測定する方法としては、公知のタンパク質測定法を用いることができる。例えば、ＧＬＤＣタンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用できる。具体的には、ウエスタンブロット法、酵素免疫固相法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、および放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ；ＲＩＡ）等を挙げることができる。
【００４１】
なお、ＧＬＤＣタンパク質に対する抗体は、ＧＬＤＣタンパク質を抗原とするものであって、当該抗原に特異的に結合する限り、ヒト型抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、均質な抗体を安定的に生産できる点で、モノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により作製できる。また、市販されている抗体から所望の抗体を選択して利用することもできる。
【００４２】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、目的の抗原や目的の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用し、これを通常の免疫方法に従って所望の動物に免疫して得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって既知の親細胞と融合させた後、通常のスクリーニング方法で所望のモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ細胞）を選別することにより作製できる。ハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（「メソッズ  オブ  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８１年、第７３巻、ｐ．３−４６）等に準じて実施できる。
【００４３】
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、ＧＬＤＣタンパク質やその断片を抗原として使用することができる。なお、ＧＬＤＣタンパク質やその断片は、例えばサムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」、第２版、第１−３巻、コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス出版、ニューヨーク１９８９年等の成書に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得できる。
【００４４】
ＧＬＤＣタンパク質の定量のために、該タンパク質、その断片および抗体を支持体に固定して使用することもできる。支持体は、タンパク質を固定化できるものであれば限定されず、一般的には、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機材料または天然高分子材料のニトロセルロースや合成高分子材料のナイロンやポリスチレン等を例示できる。
【００４５】
本発明では、以上のようにして生物学的試料におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を測定した後、当該発現量に基づいてＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する。具体的には、上述したいずれかの方法によりＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を測定した後、当該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を評価する。生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が検出され、かつその発現量が非常に低いとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると予測する。これに対し、生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が高いか低いとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。また、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出されない場合、このような生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。
【００４６】
ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づく反応性の予測は、予め基準値を設定し、この基準値と比較することによって行うことが好ましい。生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が検出され、かつその発現量が基準値と比較して低ければ、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると予測する。これに対し、生物学的試料においてＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が基準値と比較して高ければ、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。また、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出されない場合、このような生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性がないと予測する。
【００４７】
ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を評価する基準値は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞における該遺伝子またはその遺伝子産物の発現を予め測定し、その定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。好ましくは、グリシンの存在下、例えば生理学的濃度のグリシンの存在下、より具体的には５０  μＭ〜２００  μＭ、好ましくは１００  μＭのグリシンの存在下でＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づいて基準値を設定することが適当である。さらに好ましくは、グリシンの存在下でＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さない細胞であって、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物を低発現している細胞におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量に基づいて基準値を設定することが適当である。ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さず、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が高発現である細胞としてがん細胞株Ａ５４９を例示できる。ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を示さず、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物が低発現である細胞としてがん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を例示できる。がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５におけるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現量を基準値とすることがより好ましい。
【００４８】
本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法はまた、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の発現を、該遺伝子の遺伝子型の解析により評価することで実施できる。ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析によりヘテロ欠損が検出された生物学的試料ではＧＬＤＣ  ＤＮＡのコピー数が低下するため、該遺伝子の発現が低下していると考えることができる。すなわち、被験者由来の生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型を解析し、該遺伝子のヘテロ欠損が検出された生物学的試料は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有する被験者由来の生物学的試料であると予測することができる。
【００４９】
ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の解析には、公知の方法をいずれも使用できる。例えば、遺伝子型の解析は、ＧＬＤＣ  ＤＮＡのコピー数変化（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）を検出することによって実施できる。ＣＮＶとは、染色体上の１ｋｂ以上にわたるゲノムＤＮＡが、正常ヒト体細胞、すなわちディプロイドゲノムでは２コピーであるものが、１コピー以下、あるいは３コピー以上となっている現象をいう。遺伝子コピー数が１コピー以下であるときには、ゲノムＤＮＡが欠失しており、３コピー以上であるときにはゲノムＤＮＡが重複していると考えることができる。一般的に、遺伝子発現量とＣＮＶの相関が認められる遺伝子は少数であることが知られているが、後述する実施例に示すように、ＧＬＤＣ遺伝子の発現とＣＮＶとの間で相関が認められた。具体的には、ＧＬＤＣ遺伝子の発現がｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも非常に低いがん細胞株であり、かつ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下を示したＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、ＧＬＤＣ  ＤＮＡのコピー数が１コピー以下であった。したがって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のゲノムＧＬＤＣ遺伝子はヘテロ欠損であり、また、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株では該遺伝子の発現が低下していると考えることができる。
【００５０】
本発明において生物学的試料を用いてＧＬＤＣ  ＤＮＡのＣＮＶの検出を行い、ＧＬＤＣ  ＤＮＡのコピー数が１以下であるとき、該生物学的試料を提供した被験者はＭＴＨＦＤ２阻害薬に対して反応性を有すると評価できる。
【００５１】
ＣＮＶの検出は公知の方法を利用して実施でき、このような方法として具体的には、アレイ  ＣＧＨ法、一塩基多型（ＳＮＰ）  アレイ法、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｑＰＣＲ）法、マルチプレックス  ライゲーション−ディペンデント  プローブ  アンプリフィケーション法等を挙げることができる。
【００５２】
本発明は、また、前記予測方法を使用することを特徴とする、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者の選別方法に関する。さらに本発明は、前記予測方法により選別された被験者にＭＴＨＦＤ２阻害薬の有効量を投与することを含む疾患治療方法に関する。
【００５３】
本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を有する被験者の選別方法は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い生物学的試料を提供した被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別することを含む。
【００５４】
本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に疾患治療方法は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を測定し、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現が検出され、かつ、該遺伝子またはその遺伝子産物の発現量が予め設定した基準値よりも低い生物学的試料を提供した被験者を、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量を投与することを含む。
【００５５】
本発明に係る方法を適用できる疾患は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬により治療効果が得られる疾患である限りにおいていずれでもよく、がん疾患を好ましい疾患として例示できる。がん疾患は、いずれのがん疾患であってもよい。本発明に係る方法を適用できるがん疾患として、具体的には、大腸がん、肝臓がん、皮膚がん、肺がん、腎臓がん、前立腺がん、十二指腸がん、卵巣がん、子宮体がん、子宮頚がん、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、胃がん、口腔がん、舌がん、咽頭、食道がん、気管支がん、喉頭がん、膀胱がん、腎盂がん、尿管がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、悪性リンパ腫等が発生する疾患を例示できる。
【００５６】
本発明に係る方法で、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患治療に反応性を有するとして選別された被験者は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量の投与による治療効果が得られると考えることができる。例えば、がん疾患では、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に反応性を有するとして選別された被験者は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬の治療有効量の投与により、腫瘍細胞の増殖の抑制や細胞死が誘導され、腫瘍の縮小や消滅あるいはがん疾患の寛解や部分寛解が生じると考えることができる。
【００５７】
ＭＴＨＦＤ２阻害薬は、それ自体またはそれを含む組成物として被験者に投与される。当該組成物は、有効成分のほか、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、希釈剤、賦形剤等の医薬用担体を１種または２種以上含有する医薬組成物として製造される。医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００５８】
用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を使用してこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００５９】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。また、腫瘍内への直接投与も可能である。
【００６０】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００６１】
本発明に係るＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法によれば、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による治療前に、被験者から採取した生物学的試料を用いた遺伝子発現解析、例えばｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルの発現解析により、ＭＴＨＦＤ２阻害薬投与による患者の反応性、すなわち該阻害薬による治療効果をより客観的、特異的に予測することができる。したがって、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性がなく、その投与効果を期待できない患者への過度の負担となるような薬剤投与を防止することができ、当該患者にとって有効な治療方針の知見を提供することができる。
【００６２】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６３】
まず、実施例で用いた細胞株を表１に示す。
【００６４】
【表１】
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【実施例１】
【００６５】
ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性とがん細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルとの関連性を検討するために、ＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルが異なるがん細胞株を使用し、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンによる細胞増殖への影響を測定した。
【００６６】
その結果、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株で、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖が強く阻害された。一方、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現細胞株、中等度発現細胞株、および非発現細胞株では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子をノックダウンしても細胞増殖は阻害されなかった。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有すると考えることができる。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
【００６７】
１−１．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現解析  １
【００６８】
まず、検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析を行った。具体的には、ＲＮイージー  ミニ  キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５）からｍＲＮＡを抽出し、ハイキャパシティー  ｃＤＮＡ  リバース  トランスクリプション  キット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。調製した各細胞のｃＤＮＡおよびＧＬＤＣ、リボゾーマル  プロテイン  ラージ  Ｐ０（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｌａｒｇｅ，Ｐ０；以下、ＲＰＬＰ０と略称する）に対するタックマンプローブ（Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をタックマン  ファスト  アドバンスト  マスター  ミックス（Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、ヴィイア７（Ｖｉｉａ７；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行い、デルタデルタＣｔ法によりｍＲＮＡを定量した。タックマンプローブは、タックマン（登録商標）  ジーン  エクスプレッション  アッセイズ（Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＲＰＬＰ０およびＧＬＤＣの解析には、それぞれアッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１およびアッセイＩＤ：ｓ０１５８０５９１＿ｍ１のタックマンプローブを用いた。
【００６９】
ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５）における発現を、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析により検討した結果を図１に示す。各細胞株におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ発現は、Ａ５４９で検出されたＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現量として表した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５の各細胞株の全てにおいて、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現が認められたが、その発現量はＡ５４９と比較して低いことが判明した。
【００７０】
１−２．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のタンパク質レベルでの発現解析
検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣタンパク質の定量分析を行った。具体的には、ＲＩＰＡ  バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて各細胞（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５）の細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＧＬＤＣおよびβ−アクチンタンパク質を検出した。ウエスタンブロット法は、抗ＧＬＤＣ抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ９７６２５）、抗β−アクチン抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製、ｓｃ−６９８７９）を用いて、従来報告されている方法に準じて実施した。ＧＬＤＣタンパク質のバンド位置の確認は、Ａ５４９細胞をＧＬＤＣ遺伝子の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で処理して該遺伝子の発現を阻害することによる該バンドの消失の検出により行った。
【００７１】
ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ−１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、ＨＥＣ５０Ｂ）における発現を、ＧＬＤＣタンパク質の定量分析により検討した結果を図２に示す。検討したすべての細胞株で、ＧＬＤＣタンパク質が検出されたが、Ａ５４９における発現量と比較して、他の４種類の細胞株での発現は低かった。具体的には、ＮＣＩ−Ｈ１９７５での発現は中等度であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＣＩ−Ｈ２３４７での発現は非常に低かった。
【００７２】
１−３．各細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現解析  ２
検討に使用した細胞株におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの定量分析を行った。具体的には、ＲＮイージー  ミニ  キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ−１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、ＨＥＣ５０Ｂ）からｍＲＮＡを抽出し、ハイキャパシティー  ｃＤＮＡ  リバース  トランスクリプション  キット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。その後、各細胞のｃＤＮＡ、後述の３種のプライマー  セット（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ）をファスト  ＳＹＢＲＲ  グリーン  マスター  ミックス（Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、Ｖｉｉａ７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行い、デルタデルタＣｔ法によりｍＲＮＡを定量した。
【００７３】
使用した３種類のプライマーセットはＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の塩基配列に基づいて作成したプライマーセットである。プライマーセット１は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの３´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット２は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。プライマーセット３は、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの５´末端側の部分塩基配列を増幅するものである。
【００７４】
各プライマーセットの塩基配列を以下に示す：
プライマー−１−フォワード：ｔｇａｔｇｔｃｔｃｇｃａｃｃｔａａａｔｃｔｔｃａｃ（配列番号３）
プライマー−１−リバース：ｃｔｇａｃｇｇｔｔｃｃｃａｃａｇｇａｃａ（配列番号４）
プライマー−２−フォワード：ｇｃｃｃａｇａｃａｃｇａｃｇａｃｔｔ（配列番号５）
プライマー−２−リバース：ｇｇａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇａｔｃａａｔ（配列番号６）
プライマー−３−フォワード：ｔｔｇｃｇｇａａｃｔｔａｃｔｇｇａｇａａｃ（配列番号７）
プライマー−３−リバース：ａｃａｃｃａｔｇｇｔｃｔｇｇｔａｇｔｔｇａｇｔ（配列番号８）
【００７５】
ＧＬＤＣ遺伝子の各細胞株（ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＬＵＤＬＵ−１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、ＨＥＣ５０Ｂ）における発現を、上記プライマーセットを用いてＧＬＤＣ  ｍＲＮＡを定量することにより測定した結果を図３に示す。各細胞株におけるＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ発現は、ＨＥＫ２９３で検出されたＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ発現量に対する相対的発現量として表した。ＨＥＫ２９３、ＬＵＤＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＡｓＰＣ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＢｘＰＣ３の各細胞株において、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現が認められたが、ＨＥＣ５０Ｂでは、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡは検出されなかった（図中、ｎ．ｄ．と表示する）。また、ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現が認められた細胞株であっても、ＬＵＤＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、およびＢｘＰＣ３で検出されたＧＬＤＣ  ｍＲＮＡの発現量は中等度であり、さらにＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＡｓＰＣ−１における発現は非常に低いことが判明した。
【００７６】
１−４．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験  １
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験は、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＮＣＩ−Ｈ２３４７を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数２ｘ１０５／ウェルで６ウェル  プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン（登録商標）  ＲＮＡｉマックス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）  ＲＮＡｉＭａｘ））を用いてトランスフェクションした。その翌日に細胞数８００／ウェルで９６ウェル  プレートに再播種し、再播種の１日後および４日後にそれぞれ２回目および３回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１、４、および６日後に培地交換を行った。再播種の０、１、４、６、および８日後にセルタイターＧｌｏ  ルミネッセント  セル  バイアビリティ  アッセイ（Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ−セリンを最終濃度４００  μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００  μＭとなるように添加したものを用いた。
【００７７】
ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞を６ウェル  プレートに播種し、翌日にＲＩＰＡ  バッファーを用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、およびβ−アクチンの各タンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５６７７２）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，＃１２７９４）、抗β−アクチン抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製、ｓｃ−６９８７９）を用いた。
【００７８】
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＮＣＩ−Ｈ２３４７を用いて行った結果を図４−Ａおよび図４−Ｂに示す。これら３種類の細胞において、グリシン非存在下ではＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められた（図４−Ａ）。しかし、グリシン存在下では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＣＩ−Ｈ２３４７では細胞増殖の低下が認められたが、Ａ５４９の細胞増殖は影響を受けなかった（図４−Ａ）。これら細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子およびＧＬＤＣ遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定したところ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現が各細胞においてｓｉＲＮＡによるノックダウンで低下していることが確認され、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の抗ＧＬＤＣ抗体（＃１２７９４）を用いて、今回の条件でウエスタンブロットを行なった場合は、ＧＬＤＣの発現はＡ５４９で認められるが、他の２種類の細胞ではＧＬＤＣの発現が検出されないことが明らかとなった（図４−Ｂ）。
【００７９】
１−５．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験  ２
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、およびＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数２ｘ１０５／ウェルで６ウェル  プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン（登録商標）  ＲＮＡｉマックス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）  ＲＮＡｉＭａｘ））を用いてトランスフェクションした。その３日後に細胞数８００／ウェルで９６ウェル  プレートに再播種し、再播種の当日、３日後、および７日後にそれぞれ２回目、３回目、および３回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１、５、および８日後に培地交換を行った。再播種の０、１、３、５、７、および１０日後にセルタイターＧｌｏ  ルミネッセント  セル  バイアビリティ  アッセイ（Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ−セリンを最終濃度４００  μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００  μＭとなるように添加したものを用いた。
【００８０】
各細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンレベルの確認は、１−４．に記載した方法と同様の方法により行った。
【００８１】
検討した細胞の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響を図５−Ａおよび図５−Ｂに示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＣＩ−Ｈ２３４７では、グリシン非存在下およびグリシン存在下の両条件下で、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められた（図５−Ａの右パネルおよび図５−Ｂの左パネル）。一方、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ１９７５では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、グリシン非存在下で細胞増殖の低下が認められたが、グリシン存在下では細胞増殖の低下は認められなかった（図５−Ａの左パネルおよび図５−Ｂの右パネル）。
【００８２】
検討した細胞におけるＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現をタンパク質レベルで測定したところ、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現は、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５で高く、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＣＩ−Ｈ２３４７では比較的低いことが確認された（図５−Ｃ）。また、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現が各細胞においてｓｉＲＮＡによるノックダウンで低下していることが明らかになった（図５−Ｃ）。
【００８３】
１−６．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験  ３
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９およびＢＴ４７４を用いて行った。具体的には、Ａ５４９は５％  コンフルエント、ＢＴ４７４は２５％  コンフルエントとなるよう各細胞を１００  ｍｍ  ディッシュに播種し、翌日にＭＴＨＦＤ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その２日後にＡ５４９は細胞数８００／ウェル、ＢＴ４７４は細胞数４０００／ウェルで９６ウェル  プレートに再播種し、同時に２回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の１日後に培地交換を行った。再播種の０、１、３、５、および７日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ−セリンを最終濃度４００  μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００  μＭとなるように添加したものを用いた。
【００８４】
ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞を１００  ｍｍ  ディッシュに播種し、２日後にＲＩＰＡ  バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、β−アクチンタンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，＃１２７９４）、抗β−アクチン抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いた。
【００８５】
ＢＴ４７４およびＡ５４９の細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの影響を図６−Ａに示す。ＢＴ４７４では、グリシン非存在下および存在下のいずれにおいてもｓｉＲＮＡによるＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンで細胞増殖の低下が認められたが、その効果はグリシン存在下と比較してグリシン非存在下の方が高かった（図６−Ａ）。また、ＢＴ４７４でＭＴＨＦＤ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＭＴＨＦＤ２タンパク質の発現が阻害されたことが確認された（図６−Ｂ）。
【００８６】
１−７．ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験  ４
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験を、Ａ５４９、ＨＥＣ５０Ｂ、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いて行った。具体的には、各細胞を細胞数１．５ｘ１０５／ウェルで６ウェル  プレートに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その翌日に細胞数８００／ウェルで９６ウェル  プレートに再播種し、再播種の１日後と４日後に２，３回目のトランスフェクションを行なった。培地中のグリシン濃度の影響を調べるため、再播種の２，５日後に培地交換を行った。再播種の１、４、６、８日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。初回播種および再播種時にはＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。また、培地交換時にはＭＥＭ培地に透析済みウシ胎児血清（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を最終濃度１０％となるように添加し、さらにＬ−セリンを最終濃度４００  μＭとなるように添加し、そしてグリシンを最終濃度０もしくは１００  μＭとなるように添加したものを用いた。
【００８７】
ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウン実験の結果、ＨＥＣ５０ＢおよびＡ５４９では、グリシン非存在下でＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖の低下が認められたが、グリシン存在下では、細胞増殖の低下は認められなかった（図７）。一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、グリシン存在下および非存在下のいずれにおいても細胞増殖の低下が認められた（図７）。
【００８８】
以上、説明したように、ＧＬＤＣ遺伝子の発現とＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下との間に関連性があることが明らかになった。すなわち、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞株、例えばＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖低下が認められたが、ＧＬＤＣ遺伝子高発現細胞株であるＡ５４９、ＧＬＤＣ遺伝子非発現細胞株であるＨＥＣ５０Ｂ、およびＧＬＤＣ遺伝子中等度発現細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５ではＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより細胞増殖低下は認められなかった。この結果は、いずれもグリシン存在下の条件で認められた結果であり、グリシン非存在下では、ＧＬＤＣ遺伝子の発現の有無や工程に関わらず、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによる細胞増殖低下が認められた。
【００８９】
ヒト健常人のグリシン血中濃度は数百μＭレベルであることが報告されている（非特許文献４）。また、ヒト大腸がんおよび胃がんのメタボロ解析データによれば、密度１として換算すると、組織中のグリシン濃度はｍＭオーダーであることが報告されている（非特許文献５）。マウスについても、グリシン血中濃度がヒト血中濃度と同レベルであることを本発明者らは確認している。さらに、Ａ５４９細胞をマウスに移植して形成させた腫瘍中のグリシン濃度はヒトと同じくｍＭオーダーであると推定された（密度１として換算）。また、インビトロで培養したＡ５４９細胞についても細胞内グリシン濃度はｍＭオーダーであると推定された（細胞１個の体積を長径から見積もり換算）。
【００９０】
このように、生体内や腫瘍組織内でグリシン濃度が高いことから、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのがん細胞の挙動は、本実施例のグリシン存在下の条件における各細胞の挙動と相関すると考えることができる。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有し、ＧＬＤＣ遺伝子高発現細胞株、中等度発現細胞株、および非発現細胞株では該反応性を有さないと考えることができる。
【実施例２】
【００９１】
ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性とがん細胞株におけるＧＬＤＣ遺伝子の発現レベルとの関連性をさらに検討するために、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞を用いてＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子のダブルノックダウンによる細胞増殖への影響を測定した。
【００９２】
その結果、ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞でＧＬＤＣ遺伝子をノックダウンして該遺伝子の発現を低下させると、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンによりグリシン存在下の細胞増殖が低下した。この結果は、実施例１で観察された結果、すなわちＧＬＤＣ遺伝子の発現が非常に低いがん細胞は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性を有することを強く支持するものである。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
【００９３】
各細胞を細胞数３ｘ１０５／ウェルで２５  ｃｍ２  フラスコに播種し、翌日にｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ）を用いてトランスフェクションした。その３日後に細胞数１０００／ウェルで９６ウェル  プレートに再播種し、再播種の０日後と３日後にそれぞれ２回目および３回目のトランスフェクションを行なった。再播種の１および３日後に培地交換を行った。再播種の０、１、３、５、および７日後にセルタイターＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞内ＡＴＰ量の測定を行い、細胞増殖を定量した。培地は、ＲＰＭＩ培地にウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を最終濃度１０％となるように添加したものを使用した。この培地には、グリシンが１３３  μＭ以上含有されている。
【００９４】
ノックダウンレベルを確認するため、再播種時に余った細胞をＲＩＰＡ  バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロット法により、ＭＴＨＦＤ２、ＧＬＤＣ、β−アクチンタンパク質を検出した。抗体は、それぞれ抗ＭＴＨＦＤ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗ＧＬＤＣ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃１２７９４）、抗β−アクチン抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）を用いた。
【００９５】
ＧＬＤＣ遺伝子の高発現が認められたＡ５４９細胞を用いて、ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子をダブルノックダウンした結果を図８に示す。ＭＴＨＦＤ２遺伝子のみをノックダウンしても、細胞増殖には全く影響は認められなかった（図８の左パネル）。また、ＧＬＤＣ遺伝子のノックダウンにより細胞増殖が低下した。一方、ＧＬＤＣ遺伝子およびＭＴＨＦＤ２遺伝子をダブルノックダウンすると、グリシン存在下の条件にも拘らず細胞増殖が著しく低下した（図８の右パネル）。
【００９６】
本結果は、ＧＬＤＣ遺伝子の非常に低い発現とＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性とが関連することを、さらに支持するものである。
【００９７】
実施例１および実施例２に示した代表的ながん細胞株の結果をまとめ、表２に示す。
【００９８】
【表２】
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【実施例３】
【００９９】
ＧＬＤＣ遺伝子の非常に低い発現とＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤に対する反応性とが関連することが判明したため、次に、ＧＬＤＣ遺伝子の発現を定量的に測定することを目的として、ＧＬＤＣゲノム遺伝子のコピー数解析を行った。
【０１００】
その結果、検討した細胞株のうち、がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＧＬＤＣゲノム遺伝子のコピー数が１コピー以下であり、該がん細胞株のＧＬＤＣゲノム遺伝子はヘテロ欠損であることが明らかになった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖低下を示し、かつ、ＧＬＤＣ遺伝子またはその遺伝子産物の発現が非常に低いがん細胞株である。したがって、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株は、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤に反応性があると考えることができる。以下に、本実施例をより具体的に説明する。
【０１０１】
ＧＬＤＣ遺伝子の遺伝子型の検討は、ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を解析することにより行った。具体的には、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ミニ  キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて各細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。その後、該ゲノムＤＮＡとタックマンプローブをタックマン  ジェノタイピング  マスター  ミックス（Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混合し、Ｖｉｉａ７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＰＣＲを行った。得られたデータをコピーコーラー（登録商標）  ソフトウエア  ｖ２．０（ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒ（Ｒ）  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて解析し、各細胞のＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を算出した。タックマンプローブは、次のものを用いた：タックマン  コピー  ナンバーアッセイズ（Ｔａｑｍａｎ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｈｓ０６８８１７４２＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ１６），Ｈｓ０６８２５５９２＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ８），Ｈｓ０６８３０７４８＿ｃｎ（Ｉｎｔｒｏｎ２））およびタックマン  コピー  ナンバー  レファレンス  アッセイ  ＲＮアーゼ  Ｐ（Ｔａｑｍａｎ  Ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  ＲＮａｓｅ  Ｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
【０１０２】
様々ながん細胞株についてＧＬＤＣ遺伝子のコピー数を解析した結果を図９に示す。ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数はＡ３９５では３コピー以上であったが、ＮＣＩ−Ｈ１９７５はほぼ１コピー、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＲＢＥ、ＴＥ−１、ＳＮＵ−１０７９、ＳＷ１２７１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＢＴ−４７４、およびＨＥＣ５０Ｂは１コピー以下であった。
【０１０３】
通常、遺伝子のコピー数は２コピーである。上記結果から、ＧＬＤＣ遺伝子のコピー数が１コピーあるいはそれ以下の細胞、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１等では、ＧＬＤＣゲノム遺伝子はヘテロ欠損であると考えることができる。
【０１０４】
本結果、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１がＭＴＨＦＤ２遺伝子のノックダウンにより細胞増殖低下を示すことから、ＧＬＤＣ遺伝子のヘテロ欠損細胞株は、ＭＴＨＦＤ２の作用を阻害する薬剤に反応性があると考えることができる。
【実施例４】
【０１０５】
ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低い細胞株において、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンによるインビトロでの細胞増殖の低下が、グリシンの存在下および非存在下のいずれの条件においても認められた。そこで、インビボのグリシン豊富な環境における細胞増殖へのＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンの効果を検討した。
【０１０６】
まず、ＧＬＤＣゲノム遺伝子ヘテロ欠損細胞株であり、ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低いＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃを用いて、ＭＴＨＦＤ２遺伝子を安定的にノックダウンした細胞を作製した。ＭＴＨＦＤ２遺伝子の安定的なノックダウンは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子のショートヘアピンＲＮＡ（以下、ｓｈＲＮＡと略称する）を細胞にトランスフェクションすることにより行った。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ社より購入）にｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ  ノン−マンマリアン  ｓｈＲＮＡ  コントロール  プラスミド  ＤＮＡ（ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ  Ｎｏｎ−Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ社製）もしくはＭＴＨＦＤ２  ｓｈＲＮＡ−ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ  プラスミド  ＤＮＡ（ＭＴＨＦＤ２  ｓｈＲＮＡ−ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ社製、クロン  ＩＤ：ＴＲＣＺＮ０００００３６５５３）をレンチウイルスを用いて導入し、ピューロマイシン処理を２週間以上行なうことによりプラスミドが導入された細胞を選抜した。ＭＴＨＦＤ２  ｓｈＲＮＡ−ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞については、限界希釈法によりセルクローニングを行った。得られたクロンのうち、グリシン非存在下での３日間の細胞増殖がＮｏｎ−Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌと比べ顕著に低下しており、かつグリシン  １００  μＭ存在下での３日間の細胞増殖がＮｏｎ−Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌと同程度であるものを３クロン選抜した。選抜したクロン細胞はＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｍ１２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｍ１３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｍ１８と命名した。
【０１０７】
ＭＴＨＦＤ２遺伝子のｓｈＲＮＡまたはコンロトールｓｈＲＮＡをトランスフェクションすることによって得られたクロンにおけるＭＴＨＦＤ２のタンパク質レベルの発現を、実施例１に示した方法と同様の方法により測定した。また、これらクロンをグリシン存在下または非存在下で培養し、それらの細胞増殖を実施例１に記載した方法と同様の方法により測定した。
【０１０８】
次いで、作製したｓｈＲＮＡ導入細胞を細胞数２ｘ１０６／マウスでＳＣＩＤ雌マウス（日本クレア社）の腹側部皮下に移植し、ゼノグラフトモデルマウス（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ  ｍｏｕｓｅ）を作製した。移植後１０、１４、１８、２１、２５、および２９日に腫瘍の長径（ｔｕｍｏｒ  ｌｅｎｇｔｈ）および短径（ｔｕｍｏｒ  ｗｉｄｔｈ）をディジタル  キャリーパー（ｄｉｇｉｔａｌ  ｃａｌｉｐｅｒ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、ＣＤ−１５ＣＸ）を用いて測定し、以下の数式に従い推定腫瘍体積を算出した：推定腫瘍体積（Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、ｍｍ３）＝１／２  ｘ  （腫瘍長径）  ｘ  （腫瘍短径）２。
【０１０９】
ＭＴＨＦＤ２  ｓｈＲＮＡを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞クロンでは、ＭＴＨＦＤ２遺伝子の発現低下がタンパク質レベルで確認できた（図１０−Ａ）。これらクロンは、グリシン非存在下および存在下の両条件下での細胞増殖の低下が認められたが、グリシン非存在下での細胞増殖の程度が著しかった（図１０−Ｂ）。
【０１１０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞クロンを移植したゼノグラフトモデルマウスでは、コントロールｓｈＲＮＡを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞を移植したマウスと比較して、腫瘍体積の著しい減少が認められた（図１１）。
【０１１１】
このように、インビボのグリシン豊富な環境でも、ＭＴＨＦＤ２遺伝子ノックダウンにより、ＧＬＤＣ遺伝子発現が非常に低い細胞株の腫瘍増殖が顕著に阻害された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、ＭＴＨＦＤ２阻害薬に対する反応性を予測する方法、および、該阻害薬による治療の奏功性が高いと予測される患者を選別する方法を提供するものであり、ＭＴＨＦＤ２阻害薬による疾患の有効な治療を可能にする。このように、本発明は、疾患、例えばがん疾患の治療分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
配列番号１：ＧＬＤＣタンパク質（配列番号２）をコードするＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ。
配列番号３：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号４：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第２４２８番目から第２５９５番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。
配列番号５：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号６：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第３６４番目から第４７９番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。
配列番号７：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの断片を増幅するためのフォワードプライマー。
配列番号８：ＧＬＤＣ  ｍＲＮＡ（配列番号１）の第６３５番目から第７４３番目までの断片を増幅するためのリバースプライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図５−Ｃ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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