(57)【要約】      （修正有）【課題】藻類にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むために用いられる新規発現ベクターを提供することを課題とする。形質転換された藻類、形質転換された珪藻、及び、ポリヌクレオチドを提供することも課題とする。【解決手段】藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列を含む、発現ベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの配列を含む、発現ベクター。
（Ａ）配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における、塩基番号１〜２３９８の塩基配列
（Ｂ）藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列であって、配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における、塩基番号１〜２３９８の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された配列
（Ｃ）藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列であって、配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における、塩基番号１〜２３９８の塩基配列において、８０％以上の同一性を有する配列
【請求項２】
配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項３】
配列番号１、３、又は、５のいずれかの配列からなる発現ベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターにより形質転換された藻類。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクターにより形質転換された珪藻。
【請求項６】
配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現ベクター、形質転換された藻類、形質転換された珪藻、及び、ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリイソプレンゴムの原料であるイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）の工業的製造方法としては、ナフサを熱分解した際に副生するＣ５留分から抽出できることが知られている。しかし、上記副生成物から製造されるイソプレンは供給量が必ずしも十分ではなく、又、原料となる石油価格の変動の影響を受け易いことから、近年ではイソプレンの安定的な確保のために、非石油資源由来のイソプレンの製造方法の開発、具体的には動物細胞、又は植物細胞等にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンを製造する方法の開発が進められてきた。
【０００３】
上記形質転換体としては、例えば、特許文献１には、「（ａ）イソプレン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）５−ホスホメバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、（ｃ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種で形質転換され、且つ、有用部分の生産性が高められた、形質転換植物。」が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−０３５８３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、イソプレン合成酵素遺伝子を組み込むことにより得られる形質転換体を用いた、より効率の高いイソプレンの製造方法の開発を進めてきた。その中で、形質転換を行う対象となる宿主として、集光能力及びＣＯ２固定能力が高い藻類に着目し、形質転換の方法の検討してきた。本発明者らが、特許文献１に記載されたポリヌクレオチドを用いて藻類の形質転換体の生成を試みたところ、形質転換効率が低く、しかもイソプレン合成酵素遺伝子の発現は検出されなかった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、藻類にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むために用いられる新規発現ベクターを提供することを課題とする。
また、本発明は形質転換された藻類、形質転換された珪藻、及び、ポリヌクレオチドを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、所定の発現ベクターによれば上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
［１］  後述する（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの配列を含む、発現ベクター。
［２］  配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［３］  配列番号１、３、又は、５のいずれかの配列からなる発現ベクター。
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の発現ベクターにより形質転換された藻類。
［５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の発現ベクターにより形質転換された珪藻。
［６］  配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、藻類にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むために用いられる新規発現ベクターを提供することができる。
また、本発明によれば形質転換された藻類、形質転換された珪藻、及び、ポリヌクレオチドを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、実施態様に基づき、詳細に説明する。
なお、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様に基づいてなされるもので、本発明はそのような実施態様に限定されない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
［発現ベクター］
本発明の実施形態に係る発現ベクターは、（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの配列を含む、発現ベクターである。
【００１２】
（Ａ）配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における、塩基番号１〜２３９８の塩基配列
【００１３】
（Ｂ）藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列であって、配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における、塩基番号１〜２３９８の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された配列
【００１４】
（Ｃ）藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列であって、配列番号１における、塩基番号１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号１〜２２８９の塩基配列、又は、配列番号５における塩基番号１〜２３９８の塩基配列において、８０％以上の同一性を有する配列
【００１５】
本明細書において、「１又は複数個」は、所定の塩基配列に対して、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換及び／又は付加されてもよいことを意図する。
【００１６】
本明細書において、「同一性」とは、所定の塩基配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であることを意図する。上記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴなどの解析ソフトウェアを用いて算出することができる。
【００１７】
〔藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列〕
本明細書において、藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列とは、藻類細胞中で機能し、その下流に配置されたイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列の発現を制御し得る配列を意図する。
【００１８】
配列番号１の発現ベクターにおける、塩基番号１〜５６４の塩基配列、配列番号３の発現ベクターにおける、塩基番号１〜５６４の塩基配列、及び、配列番号５の発現ベクターにおける、塩基番号１〜６３１の塩基配列は、それぞれ、珪藻細胞中でプロモーターとして機能する配列である。配列番号１、３及び５に示した発現ベクターにおいて、上記の配列には、それぞれ、配列番号１における、塩基番号５７１〜２３５８の塩基配列、配列番号３における、塩基番号５７１〜２２８９の塩基配列、及び、配列番号５における、塩基番号６３８〜２３９８の塩基配列で表されるイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列が作動可能に連結している。
【００１９】
〔イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列〕
本明細書において、イソプレン合成活性を有するタンパク質（以下、本明細書において「イソプレン合成酵素」ともいう。）とは、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）が酸化的に脱リン酸される反応を触媒する酵素を意図する。
【００２０】
配列番号１の発現ベクターにおいて、塩基番号５７１〜２３５８番目の塩基配列は、イソプレン合成活性を有するタンパク質（配列番号２）をコードし得る。
配列番号３の発現ベクターにおいて、塩基番号５７１〜２２８９番目の塩基配列は、イソプレン合成活性を有するタンパク質（配列番号４）をコードし得る。
配列番号５の発現ベクターにおいて、塩基番号６３８〜２３９８番目の塩基配列は、イソプレン合成活性を有するタンパク質（配列番号６）をコードし得る。
【００２１】
＜イソプレン合成活性を有するタンパク質（イソプレン合成酵素）＞
本明細書において、イソプレン合成活性を有するタンパク質としは、イソプレン合成活性を有していれば特に制限されない。イソプレン合成活性を有するタンパク質としては、例えば、配列番号２、配列番号４、及び、配列番号６に示したアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。
上記イソプレン合成活性を有するタンパク質は、配列番号２、配列番号４、及び、配列番号６に示したアミノ酸配列を有するタンパク質に制限されず、例えば、上記アミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、イソプレン合成活性を有するタンパク質であってもよい。
また、上記アミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質であってもよい。
なお、１又は複数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１又は複数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１又は複数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個又は１〜５個である。上記タンパク質は、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。
また、上記アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、イソプレン合成活性を有するタンパク質であってもよい。上記アミノ酸配列との同一性％は、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上であってもよい。
【００２２】
上記タンパク質は、安定性の観点から、所定の緩衝液〔例、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液〕中で４℃にて４８時間保存した場合に、残存活性が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上又は６５％以上であることが好ましい。
【００２３】
上記タンパク質は、イソプレン合成活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、及び触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。
具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、及び相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域及び相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域及び機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレン合成酵素のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２４】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、及び硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、及びグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２５】
〔任意配列〕
本発明の発現ベクターは、藻類細胞中でプロモーターとして機能する配列と、それに作動可能に連結したイソプレン合成酵素をコードする配列を含んでいれば、その他の任意配列を含んでいてもよい。
【００２６】
配列番号１で表される発現ベクターには、任意配列として以下の配列が含まれる。
ターミネーター（Lhcr14_ter）配列である、塩基番号２３７６〜２４８１の塩基配列；プロモーター（ACAT_pro）配列である、２５０３〜３１２８の塩基配列；Streptomyces nourseiに由来するnourseothricin acetyltransferaseをコードし得る、塩基番号３１３７〜３７０６の塩基配列；ターミネーター（Lhcr14 ter）配列である、塩基番号３７２９〜３８３４の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号３８４８〜３８６４の塩基配列；複製開始点である、塩基番号４０７７〜４５３２の塩基配列；beta-lactamaseをコードし得る、塩基番号４９１９〜５７７９の塩基配列；複製開始点である、塩基番号５９５０〜６５３８の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号６９２４〜６９４０の塩基配列；である。
【００２７】
配列番号３で表される発現ベクターには、任意配列として、以下の配列が含まれる。ターミネーター（Lhcr14 ter）配列である、塩基番号２３０７〜２４１６の塩基配列；プロモーター（ACAT pro）配列である、塩基番号２４３４〜３０５９の塩基配列；Streptomyces nourseiに由来するnourseothricin acetyltransferaseをコードし得る、塩基番号３０６８〜３６３７の塩基配列；ターミネーター（Lhcr14 ter）配列である、塩基番号３６６０〜３７６９の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号３７７９〜３７９５の塩基配列；複製開始点である、塩基番号４００８〜４４６３の塩基配列；プロモーター（AmpR promoter）配列である、塩基番号４７４５〜４８４９の塩基配列；beta-lactamaseをコードし得る、塩基番号４８５０〜５７１０の塩基配列；複製開始点である、塩基番号５８８１〜６４６９の塩基配列；タンパク質結合サイトである、塩基番号６７５７〜６７７８の塩基配列；プロモーター（lac promoter）配列である、塩基番号６７９３〜６８２３の塩基配列；タンパク質結合サイトである、塩基番号６８３１〜６８４７の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号６８５５〜６８７１の塩基配列；である。
【００２８】
配列番号５で表される発現ベクターには、任意配列として、以下の配列が含まれる。ターミネーター（Lhcr14 ter）配列である、塩基番号２４１２〜２５２０の塩基配列；プロモーター（ACAT pro）配列である、塩基番号２５８４〜３１６３の塩基配列；Streptomyces nourseiに由来するnourseothricin acetyltransferaseをコードし得る、塩基番号３１７２〜３７４１；ターミネーター（Lhcr14 ter）配列である、塩基番号３７６４〜３８７３の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号３８８３〜３８９９の塩基配列；複製開始点である、塩基番号４１１２〜４５６７の塩基配列；プロモーター（AmpR promoter）配列である、４８４９〜４９５３の塩基配列；beta-lactamaseをコードし得る、塩基番号４９５４〜５８１４の塩基配列；複製開始点である、塩基番号５９８５〜６５７３の塩基配列；タンパク質結合サイトである、塩基番号６８６１〜６８８２の塩基配列；プロモーター（lac promoter）配列である、塩基配列６８９７〜６９２７の塩基配列；タンパク質結合サイトである、塩基番号６９３５〜６９５１の塩基配列；プライマー結合サイトである、塩基番号６９５９〜６９７５の塩基配列；である。
【００２９】
本発明の実施形態に係る発現ベクターに含まれる任意配列としては上記に制限されず、一般的なベクターに含まれるその他の配列であってもよい。例えば、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の発現を調整するオペレーター、ターミネーター、及びエンハンサー等のいわゆる調整配列を含んでもよい。更に、上記とは異なるプロモーターやそれに制御される遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子）等を含んでもよい。
【００３０】
上記発現ベクターは、ターミネーター配列を含むことが好ましい。ターミネーター配列としては、藻類細胞で機能するものであれば特に限定されないが、例えば上記Lhcr14 ter等が挙げられる。
【００３１】
本発明の第二の実施形態に係る発現ベクターは、配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターである。
【００３２】
配列番号３における、塩基番号５７１〜６６３の塩基配列は、珪藻のＣｇＰｓｂ３１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ３７３９９２）の葉緑体移行配列に対応し、葉緑体移行シグナルペプチドをコードし得る。
【００３３】
上記塩基配列を含み、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いることによって、上記発現ベクターによって形質転換された藻類細胞中で、イソプレン合成酵素遺伝子がより高発現しやすい。
【００３４】
本発明の第三の実施形態に係る発現ベクターとしては、配列番号１、３、又は、５のいずれかの発現ベクターが挙げられる。上記発現ベクターによれば、藻類細胞中により効率的にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むことができる。
【００３５】
本発明の実施形態に係る発現ベクターは、所定の配列を含んでいれば、その種類は、特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、及びコスミドベクター等が挙げられる。なかでもプラスミドベクターが好ましい。
【００３６】
上記発現ベクターは公知の遺伝子工学的手法、又は合成方法によって製造することができる。例えば、上記プロモーター配列として機能する配列を含むベクターのクローニング部位を決定し、制限酵素処理又はインバースＰＣＲによってベクターを線状化する。次に、イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードする配列の両末端に上記ベクターと相補的な配列を導入して、これをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応で融合させる方法等が挙げられる。
【００３７】
上記発現ベクターは、藻類にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込むために用いることができる。上記発現ベクターを用いて、藻類にイソプレン合成酵素遺伝子を組み込む方法については後述する。
【００３８】
［形質転換された藻類、及び、形質転換された珪藻］
上記形質転換された藻類は、上記発現ベクターが藻類に導入されたものである。
藻類としては珪藻綱、ハプト藻綱、ピンギオ藻綱、及び黄金色藻綱等に属する藻類等が挙げられる。なかでも、珪藻網に属する藻類（以下、単に「珪藻」という。）が好ましい。
珪藻としては、キートセラス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、ファエオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄｕｃｔｙｌｕｍ）、シクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、スケルトネマ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、オドンテラ属（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）、及びニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）等に分類される珪藻が挙げられ、なかでもキートセラス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）が好ましく、ツノケイソウがより好ましく、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓが更に好ましい。
なお、上記藻類及び珪藻は、変異体であってもよい。
なお、本明細書において、形質転換された藻類、及び、形質転換された珪藻をあわせて「形質転換体」ということがある。
【００３９】
上記形質転換体は、上記発現ベクターを宿主である藻類の細胞（以下、「宿主藻類細胞」という。）に導入することにより作製することができる。
宿主藻類細胞に上記発現ベクターを導入する方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
宿主藻類細胞に上記発現ベクターを導入する方法としては、例えば、例えば、パーティクルガン法、ガラスビーズ揖持法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、多重パルスエレクトロポレーション法等が挙げられる。上記方法によれば、イソプレン合成酵素遺伝子が、宿主細胞中の、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡに組み込まれた状態で宿主細胞に保持されるので、宿主細胞を形質転換することができる。
【００４０】
なお、上記形質転換体は、イソプレン合成酵素の基質であるＤＭＡＰＰを合成する経路が強化されていてもよい。
上記強化の方法としては、ＷＯ２０１３／１７９７２２号パンフレット［００３４］〜［００３９］段落の記載を参照することができ、上記内容は本明細書に組み込まれる。
【００４１】
上記形質転換体によれば、イソプレン合成活性を有するタンパク質を生成することができ、上記タンパク質によれば、ＤＭＡＰＰからイソプレンを合成することができる。
なお、上記形質転換体かを用いて所定のタンパク質を生成する方法としては、培養が挙げられ、培養の方法については後述する。
【００４２】
上記形質転換体によれば、イソプレンを製造することができる。イソプレンの製造方法としては、例えば、以下の工程を含有するイソプレンの製造方法が挙げられる。
・上記形質転換体を用いて、上記タンパク質を生成する工程
・上記タンパク質の存在下で、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンを生成する工程
【００４３】
上記イソプレンの製造方法では、ＤＭＡＰＰは、形質転換体により、培地中の炭素源から効率的に供給される。形質転換体は、培地中の炭素源から、イソプレンを主にアウトガスとして生産するため、形質転換体から発生するイソプレンを採取することができる。なお、イソプレン合成酵素の基質であるＤＭＡＰＰは、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。
【００４４】
形質転換体を用いて、タンパク質を生成する工程としては、形質転換体を培養する方法が挙げられる。
上記形質転換体を培養する培地としては、液体培地が好ましく、藻類の生育に適する点で、海水を含む液体培地がより好ましい。
また、培地の添加成分としては、例えば窒素源、リン源、マグネシウム、ケイ素、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びビタミン類等を挙げることができ、これらの添加量は藻類に応じて調節すればよい。
例えば、キートセロス属に使用できる培地としては、海塩及び所定量のＮａ２ＳｉＯ３を補充したダイゴＩＭＫ培養培地等が挙げられる。
【００４５】
形質転換体の培養条件としては、タンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、及び連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
バッチ培養法は、培地に形質転換体を加え、培養条件の制御を行いながら培養を行う方法である。
バッチ培養法では、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少又は停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
【００４６】
流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。
【００４７】
連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら
、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に
保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
適宜、培地の一部又は全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ
、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐ
ことができる。
【００４８】
上記の方法により生成したイソプレンを採取する方法としては、ガスストリッピング、分留、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱、又は真空による固相からの脱着、及び、溶媒による抽出等が挙げられる。
例えば、ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
【００４９】
本発明の実施形態に係る形質転換体を用いたイソプレンの製造方法は、液体培地と、上記形質転換体と、を容器内に収容する工程と、形質転換体を液体培地中で培養して、培養液を得る工程と、容器内の気相からイソプレンを採取する工程と、を有するイソプレンの製造方法である。
【００５０】
上記容器としては、特に制限されず、公知の容器を用いることができる。
上記容器としては、例えば、平板培養容器、管型培養容器、エアドーム型培養容器、及び中空のシリンダー型容器等が挙げられる。上記容器は、密閉容器であってもよい。
【００５１】
上記容器内で、形質転換体を培養して、培養液を得る工程に係る培養条件等ついては、既に説明したとおりである。また、容器内の気相からイソプレンを採集する方法についても既に説明したとおりである。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００５３】
［ギンドロ由来イソプレン合成酵素遺伝子のクローニング］
〔植物材料及び生育条件〕
イソプレン合成酵素遺伝子は、ポプラ属樹木のギンドロ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）から、イソプレン合成酵素遺伝子配列を利用したＰＣＲにてクローニングした。
（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）は、９００ｍＬセルカルチャーフラスコに、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ寒天培地（１％、質量／容量）に３％のショ糖を添加したもの（ｐＨ５．７）を加えて、培養を行った。培養条件は２５℃、長日条件（１６時間明期（１２０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）、８時間暗期）であった。
【００５４】
〔Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出〕
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコールに従って行った。試料はＰ．ａｌｂａ（約５ｃｍ草丈）緑葉１３０ｍｇをサンプリングし、液体窒素で凍結したものを用いた。
【００５５】
〔Ｐ．ａｌｂａ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた逆転写反応〕
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２．５μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて逆転写反応に供した。
【００５６】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（２．５μｇ）１２μｌ（ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ水でメスアップ）
５０μＭ  ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０  １μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ      １μｌ                                
合計                            １４μｌ
【００５７】
上記の反応液を６５℃で５分間加熱後、氷上に移し、５  ｘ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ，０．１Ｍ  ＤＴＴ１μｌ，ＲＮａｓｅＯＵＴ ＴＭ   ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μｌ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＴＭ   ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μｌを加え５０℃で６０分間インキュベートして逆転写反応を行った。その際、反応液をまず湯浴にて一気に温め、反応液の蒸発を防ぐためにエアインキュベーターに移し、反応を行った。その後ヒートブロック（７０℃）で１５分間加熱し酵素を失活させた。室温に戻した後、反応液にＲＮａｓｅ  Ｈ  １μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートしてテンプレートのＲＮＡを分解した。この逆転写反応産物をテンプレートとしてポジティブコントロールであるβ−ａｃｔｉｎ（ベータ−アクチン）が増幅することを確認した。
【００５８】
〔ＲＴ−ＰＣＲによるＰ．ａｌｂａイソプレン合成酵素（ＰａｉｓｐＳ）遺伝子の単離〕
Ｈｙｂｒｉｄ  ｐｏｐｌａｒ（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ  ｘ  Ｐ．ａｌｂａ）イソプレン合成酵素遺伝子の配列を基に設計したプライマーペア（Ｆｗ．１，Ｒｖ．１）を用いて、上記逆転写産物をテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）によりＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５９】
Fw.1: 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcaactgaattattgtgcttgc -3’
Rv.1: 5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttatctctcaaagggtagaataggctctg -3’
（アンダーラインの配列はサブクローニングのためのＧＡＴＥＷＡＹ  ｓｙｓｔｅｍのａ
ｔｔＢサイトの配列）
【００６０】
１０  ｘ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ                      ５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                              ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                                            ２μｌ
５０μＭ  プライマー（Ｆｗ．１、Ｒｖ．１）                  各１μｌずつ
ＲＴｐｒｏｄｕｃｔ                                            １μｌ
１Ｕ／μｌＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ      １μｌ
上記をＨ２Ｏで５０μｌまでメスアップ
ＰＣＲ  ｐｒｏｇｒａｍ
＃１：９５℃      ４ｍｉｎ
＃２：９５℃      １ｍｉｎ
５３℃      ３０ｓｅｃ
６８℃      ２ｍｉｎ
（３０ｃｙｃｌｅｓ）
＃３：６８℃      ５ｍｉｎ
＃４：４℃        ∞
アガロース電気泳動により目的の大きさのバンドが増幅したことを確認した後、ＧＡＴ
ＥＷＡＹ ＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎにより、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした後、シーケンスにより配列を確認した。得られたコンストラクトをｐＤＯＮＲ２２１−ＰａＩｓｐＳ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ１９８１８０）とした（以下、「ＰａＩｓｐＳ遺伝子」という。）。
【００６１】
［発現ベクターの作製］
以下の方法により、各発現ベクターを作製した。
【００６２】
〔Ｌ４ｆＰａｌＳベクター（配列番号１）の作製〕
葉緑体移行配列を含めた全長タンパク質をコードするＰａ  iｓｐＳ遺伝子（配列番号１の５７１〜２３５８番目の配列）を、ｐＣｇＬｈｃｆ４ｐ  ｐｌａｓｍｉｄのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入して、Ｌ４ｆＰａｌＳベクターを得た。なお、ｐＣｇＬｈｃｆ４ｐ  ｐｌａｓｍｉｄは、ｐＣｇＮＲｐ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＢ９８１６２２）のＮＲプロモーター部分を、Ｆｃｐ遺伝子（Ｃｇ＿ｌｈｃｆ４）のプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＢ９８１６３０）に置き換えて得た。
【００６３】
〔Ｌ４ｆＰ３１ＰａｌＳベクター（配列番号３）の作製〕
ＰａＩｓｐＳ遺伝子の有する本来の葉緑体移行配列を、珪藻のＣｇＰｓｂ３１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ３７３９９２）の葉緑体移行配列に置き換えた融合タンパク質をコードする改変Ｐａ  ｉｓｐＳ遺伝子をＩｎ＿Ｆｕｓｉｏｎ反応で作成し、ｐＣｇＬｈｃｆ４ｐ  ｐｌａｓｍｉｄのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入して、Ｌ４ｆＰ３１ＰａｌＳベクターを得た。
【００６４】
〔ＮＲＰＯＰａｌＳベクター（配列番号５）の作製〕
ｐＣｇＮＲｐ  ｐｌａｓｍｉｄ（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＢ９８１６２２）を葉緑体移行シグナル付加型に改変した。Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓゲノムＤＮＡから、ＣｇＰｓｂＯ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ３７３９９３）遺伝子の葉緑体移行配列をコードする領域をＰＣＲで増幅し、ｐＣｇＮＲｐ  ベクターのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩサイトに挿入した。その結果として、得られたプラスミドをｐＣｇＮＲｐ／ＰｓｂＯｔｐベクターとした。
次に両末端にクローニングに必要な配列を付加したＰａ  ｉｓｐＳ遺伝子（葉緑体移行配列をコードする領域を除いた配列）をＰＣＲで増幅し、ｐＣｇＮＲｐ／ＰｓｂＯｔｐ  ベクター内にあらかじめ設計しておいたＡｆｌＩＩ−ＸｂａＩ  サイトにＩｎ＿Ｆｕｓｉｏｎ反応で挿入した。これをＮＲＰＯＰａlＳベクターとした。
【００６５】
［発現ベクターの珪藻細胞への導入］
発現ベクターの珪藻細胞への導入は、「Ｉｆｕｋｕ  Ｋ，  Ｙａｎ  Ｄ，  Ｍｉｙａｈａｒａ  Ｍ，  Ｉｎｏｕｅ−Ｋａｓｈｉｎｏ  Ｎ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＹＹ，  Ｋａｓｈｉｎｏ  Ｙ．  （２０１５）  Ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｔｏｍ  Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ．    Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈ  Ｒｅｓ．  １２３：  ２０３−２１１．  ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ１１１２０−０１４−００４８−ｙ．」に記載された方法を参照して行った。具体的には、以下の方法により行った。
まず、珪藻を対数増殖期（珪藻細胞を１０％ＩＭＫ培地中で２３℃で培養し、約１．８×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなった状態を意図する。）まで育て、増殖した珪藻細胞を遠心分離（条件：７０００ｇ、４分）を用いて回収した。回収した珪藻細胞を０．７７Ｍのマンニトール（１０％ＩＭＫ培地にて希釈）で洗浄した。洗浄後、上記回収した珪藻細胞をを０．１５ｍＬのＩＭＫ培地に再懸濁したのち、５μｇの直鎖状プラスミドＤＮＡ（上記の「Ｌ４ｆＰａＩＳベクター」「Ｌ４ｆＰ３１ＰａＩＳベクター」、及び、「ＮＲＰＯＰａＩＳベクター」をＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断して直鎖状にしたもの）したものと混合して混合液を得た。上記混合液をエレクトロポレーション用のキュベット（間隙  ０．２ｃｍ）に入れた。次に、キュベットにいれた混合液に対し、ネッパジーンを用いて、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
【００６６】
３００Ｖ（パルス幅  ５ｍｓｅｃ；  ９パルス；  インターバル  ５０ｍｓｅｃ；１０％減少速度）、次いで、トランスファーパルス  ８Ｖ（パルス長  ５０ｍｓｅｃ；  ４０パルス；インターバル  ５０ｍｓｅｃ；４０％減少速度）。
上記の操作は室温で行った。エレクトロポレーションの後、珪藻細胞は４ｍｌのＩＭＫ培地に移し、セレクション圧のかからない培地でリカバリーを行った（２０℃、１６−２０時間、通常光照射化）。
次に、珪藻細胞を遠心分離（条件：７００ｇ、４分間）を用いて回収し、０．２ｍｌのＩＭＫ培地に再懸濁した。形質転換した細胞はＩＭＫプレート（１％  ａｇａｒ，４００μｇ／ｍｌ  ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）存在下で選抜をした。
【００６７】
＜導入遺伝子の発現状況の分析＞
コロニーＰＣＲにより、薬剤耐性コロニーにおける導入遺伝子の存在を確認した。一部のクローンについて液体培養後、遠心分離により集藻してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡの発現を確認した。
【００６８】
［実施例１］
Ｌ４ｆＰａｌＳベクターを用いて形質転換した珪藻を用いて、下記の方法によりイソプレンを製造した。
【００６９】
使用した培地の組成は以下のとおりである。
・ｓｅａ  ｓａｌｔｓ  ４０  ｇ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ダイゴＩＭＫ培地  ０．２５２  ｇ  （Ｗａｋｏ社製）
・珪酸ナトリウム  ５６．２  μｇ（終濃度０．２  ｍＭ）
上記を蒸留水に溶解し、１Ｌとした。
【００７０】
形質転換された珪藻の培養と、イソプレンの回収は、以下の装置（リアクター）を用いて行った。装置としては、ポンプ、活性炭、容量３００ｍＬのフラスコ、フィルター、採集管をこの順にチューブで接続した装置を用いた。
形質転換された珪藻の培養は、上記培地５ｍＬで前培養した形質転換された珪藻に、培地をを加え、１００ｍＬとしたものを、容量３００ｍＬのフラスコに収容し、温度２５℃、大気環境下で行った。
【００７１】
リアクターにおける各部は以下のものを使用した。
・ポンプ：ｎｏｎ−ｎｏｉｓｅ  Ｓ１００（（有）アーテム社製）
・活性炭：有機物除去管（活性炭入）（ジーエルサイエンス社製）
・フィルター：ＬＡＢＯＤＩＳＣＲディスポーザブルメンブレンフィルターユニット
【００７２】
・採集管  パーキンエルマー社製、ＴｕｒｂｏＭａｔｒｉｘ用ステンレスチューブ（外径６．３５ｍｍ、長さ８９ｍｍ）
上記採集管に、２．６−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅをベースにした弱極性のポーラスポリマービーズ（Ｔｅｎａｘ  ＴＡ）及び非多孔質の活性炭（Ｃａｒｂｏｐａｃｋ  Ｂ）を充填したもの。
【００７３】
上記採集管に採集したイソプレンガスの分析はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＡＴＤ−４００及び島津製作所製ＧＣＦＩＤ−ＧＣ１７Ａを用いて行った。分析条件は以下のとおりである。
・加熱脱離（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＡＴＤ−４００）分析条件
Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ：  ２８０℃，１２ｍＬＨｅ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ
Ｃｏｌｄ  Ｔｒａｐ  Ｔｅｍｐ      ：  −１０℃
・ＧＣＦＩＤ（島津製作所製ＧＣＦＩＤ−ＧＣ１７Ａ）分析条件
Ｃｏｌｕｍｎ：  スペルコＳＰＢ−１（０．２５ｍｍ×６０ｍ，  １ｕｍ）
Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｇａｓ：  Ｈｅ，  ２．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｓｐｌｉｔ  Ｒａｔｉｏ：  ５：１
Ｃｏｌｕｍ  Ｔｅｍｐ．：  ３５℃（５ｍｉｎ維持），５℃／ｍｉｎで２００℃まで，２００℃から１０℃／ｍｉｎで２５０℃（１０ｍｉｎ維持）
【００７４】
以上の結果から、実施例１のイソプレンの製造方法では、１００ｍｌの珪藻培養液から１時間当たり最大約１．２ｎｇのイソプレン生産が認められた。
【００７５】
［実施例２及び３］
発現ベクターとして、Ｌ４ｆＰ３１ＰａＩＳベクター（実施例２）、又は、ＮＲＰＯＰａＩＳベクター（実施例３）を用いたこと以外は実施例１と同様にしてイソプレンを製造したところ、それぞれ１．５ｎｇ、１０ｎｇのイソプレン生産が認められた以外は実施例１と同様に結果が得られた。
【配列表】
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