(57)【要約】【課題】匂いを増強する物質を探索する方法の提供。【解決手段】匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること、および該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択することを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【請求項２】
嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【請求項３】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１０Ａ６、およびこれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１およびこれと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＲ２Ｗ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６が配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、
請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＲ２Ｗ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり、
前記ＯＲ１Ａ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、ベンゼン類、環状アルカン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドである、
請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも８０％の同一性が９０％以上の同一性である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも８０％の同一性が９５％以上の同一性である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも８０％の同一性が９９％以上の同一性である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
試験物質非存在下での前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に増加させるかまたは１２０％以上に増加させる試験物質を、匂いの増強を引き起こす物質として選択する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に低下させるかまたは９０％以下に低下させる試験物質を、匂いの抑制を引き起こす物質として選択する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に増加させるかまたは１２０％以上に増加させる試験物質を、嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に低下させるかまたは９０％以下に低下させる試験物質を、嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記嗅覚受容体の応答が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、カルシウムイメージング、または電気生理学的手法により測定される、
請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された試験物質の匂いの増強または抑制作用を官能評価することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な匂いの認識機構に基づいて匂いを制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
香りは、日常生活を豊かに過ごすために重要な役割を担っている。例えば、香りは料理に豊かな風味をもたらし、日用製品に賦香される香りは清潔感など様々な快さを提供している。一方で、不快な香りも重要である。健康や衛生状態が損なわれていることを一早く知らせるためにも、臭気は大きな役割を担っている。これら香りの重要さは、風邪など呼吸器系の疾患が生じた際に食事の味わいが損なわれることや、嗅覚感度を低下した高齢者がガスに賦香された匂いに気づけずに危険を被ることからも想像できる。人々に豊かな生活を提供するために、香りをより明確に感じさせる技術が構築されれば、賦香する香料の量を削減しながらも十分な効果をもたらすことができる。
【０００３】
香りの原因となる匂い物質の多くは、分子量約３０〜３００の揮発性の低分子有機化合物である。それら匂い物質は、匂いの質と共に化学構造にも多様性があり、分子生物学的見地からの研究においては、しばしば化学構造に基づく分類がなされる。例えば非特許文献１においては、１２５種類の匂い物質を、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ならびにケトン類およびその他、の１３グループに分類している。また特許文献１では、匂い物質をアミン類、アルコール類、アルデヒド類、ケトン類、酸、エステル類、ベンゼン類、バニリン様化合物、およびラクトン類、の９つに分類している。
【０００４】
これら匂い物質は、鼻腔内最深部に広がる嗅神経細胞が有している嗅覚受容体によって認識される。嗅覚受容体は匂い物質を結合して活性化し、嗅神経細胞に電気的興奮を引き起こす。この電気的興奮が神経接続を介して高次脳へと伝達されることにより匂いが知覚される。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、ヒトの場合約４００種類が存在する。この大きな受容体数が、上記の様々な匂いの検知を可能にする分子基盤である。これら約４００の嗅覚受容体それぞれは、異なる嗅神経細胞で発現する。一方、同じ嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞は、嗅球における軸索の投射先において特有の同領域に収束する。このために、鼻腔内でどの嗅覚受容体が活性化されたかという情報は、発火する嗅球の領域という幾何学的な情報に反映され、失われることなく高次脳領域に伝達される。このように、個々の匂い物質に対して活性化される嗅覚受容体の組み合わせの情報が高次脳領域に伝わり、匂いの質の違いを生させるのだと考えられている。
【０００５】
匂いとその認識に関わる嗅覚受容体との関係については知見が蓄積されてきている。それらによると、概して嗅覚受容体は、構造的に類似した匂い物質を選択的に認識する。例えば、非特許文献１では、マウスの約一千の嗅覚受容体のうち約４５％が、化学構造的に１３グループに分類される匂い物質のうち、ただ１グループのみを認識することが示唆されている。特許文献１では、マウスの嗅覚受容体の１つＭＯＲ２１５−１が、上記９グループに分類されるいずれの匂い物質も認識せず、ムスクの香りを呈する大環ケトン構造を選択的に認識することが示されている。対照的に、非特許文献１では、１３．４％の嗅覚受容体は５〜９グループの匂い物質を認識し、特に１．８％は１０〜１２グループという、構造的に極めて幅広い匂い物質を認識することが示唆されている。これら嗅覚受容体はＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体と記述されている。代表的なＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体として、非特許文献１ではマウスＯｌｆｒ４２が挙げられている。またそのヒトの相同遺伝子であるＯＲ２Ｗ１も、非特許文献２によりＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体として挙げられている。
【０００６】
Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体という幅広い匂い物質を区別なく認識する受容体を備えることに、生物にとってどのような意義があるのだろうか。非特許文献２では、次のような仮説が提唱されている：すなわち、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、(1)検知できる匂い物質の種類を増やすためにある、(2)一つの匂い物質に対して活性化される嗅覚受容体の組み合わせパターンを増やすことに寄与し、匂い間の識別に役立っている、(3)匂いの質を伝えるのではなく、何らかの匂いが存在しているということに気付かせる役割をもつ、(4)匂いの質を伝えるのではなく、匂い物質の総合濃度を認識し知覚強度に変換する、という４つの仮説である。しかし、今のところ、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割は定かでない。
【０００７】
特許文献２〜１３には、ＯＲ２Ｗ１を活性化させる化合物が開示されている。また特許文献２〜１１には、ＯＲ２Ｗ１アンタゴニストとしての作用を有するいくつかの化合物を各種悪臭の抑制に使用することが開示されている。しかし、これらの化合物はＯＲ２Ｗ１と共に他の嗅覚受容体の活性も変化させるため、該化合物の匂いの受容にＯＲ２Ｗ１がどのような機序で寄与しているのかは明らかでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報第２０１５／０２０１５８号
【特許文献２】特許第５７９８３８２号公報
【特許文献３】特許第５５９３２７１号公報
【特許文献４】特許第５９８２０４４号公報
【特許文献５】特許第５６４６２５５号公報
【特許文献６】特許第５６９７３８３号公報
【特許文献７】国際公開公報第２０１２／０２９９２２号
【特許文献８】特開２０１５−９１８０２号公報
【特許文献９】特開２０１５−２０２０７５号公報
【特許文献１０】特開２０１５−２１１６６７号公報
【特許文献１１】特開２０１５−２０２０７７号公報
【特許文献１２】特許５５２０１７３号公報
【特許文献１３】特開２０１６−００８９５５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nara K et al, J Neurosci, 31:9179-91, 2011
【非特許文献２】Yu Y et al, Proc Natl Acad Sci USA, 112:14966-71, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割に関して、匂いの質を伝達するのではなく、匂いの総合的な濃度を認識して知覚強度を制御しているという仮説が提唱されていた（非特許文献２）。しかし、この仮説とともに異なる複数の仮説も提唱されており、それら仮説の検証はなされていなかった。さらに、嗅覚受容体は４００種類以上と数が多いこと、およびＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が幅広い匂い物質応答性を有することから、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体のみを活性化させて、そのときに起こる匂い感覚への影響を評価することは困難であった。そのため、従来、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割については、信頼できる検証結果は得られていなかった。
【００１１】
逆説的であるが、上記の非特許文献２の仮説(4)が提示されているということは、匂いの知覚強度がどのように生み出されているのかが現在のところ不明であることを意味する。もし、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が匂いの質ではなく強度を制御しているのであれば、その活性を制御することは、香りを、その種類に関わらず、より明確に感じさせる技術として有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、異なる構造的分類に属する様々な種類の匂い物質に対して応答するヒトのＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を同定した。さらに本発明者らは、１種類のＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体のみを選択的に活性化させる物質を見出し、これを用いたＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体単独応答モデルを構築することによって、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の役割を検証することに初めて成功した。その結果、本発明者らは、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性を増強させることで、各種匂い物質の匂いを鋭敏に、もしくはより強く感じられるようになることを見出した。
【００１３】
本発明は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を指標として、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質を選択する方法を提供する。また本発明は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を指標として、匂いの種類に関わらず匂い感覚の増強または抑制を引き起こす物質を選択する方法を提供する。
【００１４】
したがって、本発明は、匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法を提供する。
また本発明は、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体に対する活性化作用に基づいて、嗅覚感度を制御し、あるいは匂いを増強または抑制することができる物質を効率良く選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】左：化学構造の異なる物質群に対するヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６の応答性。右：１１群の物質群に対するＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６の応答割合（％）を示す。
【図２】ｌ−アルギニン（上）およびｌ−ヒスチジン（下）に対する嗅覚受容体の応答。左：化学構造。中央：ＯＲ２Ｗ１発現細胞の応答。独立した３回の実験からの平均値および標準誤差を示す。ＭｏｃｋはＯＲ２Ｗ１を発現させない細胞の応答を示す。右：４２７種類のヒト嗅覚受容体の応答。
【図３】ｌ−アルギニンによる、ＰＥＡの匂いの検出閾値の上昇効果。左：検出閾値。図中、実線で繋がる二つの点は、生理食塩水またはそれを溶媒とする１０ｍＭ  ｌ−アルギニンもしくは１０ｍＭ  ｌ−ヒスチジンを点鼻する前後での個々の被験者のＰＥＡ検知閾値濃度を表す。図中の“×２”は、そのデータを示す被験者が二人いたことを表す。右：閾値変化率。図中のバーは平均値を表す。＊：Ｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎ  ｔｅｓｔによる事後検定；生理食塩水とｌ−アルギニン、もしくは生理食塩水とｌ−ヒスチジン、の間の比較）。
【図４】ｌ−アルギニンによるＰＥＡおよびＨＣＡの匂いの検出強度の上昇効果。左：生理食塩水、ならびにｌ−アルギニンおよびｌ−ヒスチジンの生理食塩水溶液の単独噴霧に対する匂い強度評価。中央：ｌ−アルギニンまたはｌ−ヒスチジン存在下および非存在下でのＰＥＡの匂い強度評価。（＋）；ｌ−アルギニンまたはｌ−ヒスチジンとＰＥＡの併用、（−）；ＰＥＡ単独。右：ｌ−アルギニンまたはｌ−ヒスチジン存在下および非存在下でのＨＣＡの匂い強度評価。（＋）；ｌ−アルギニンまたはｌ−ヒスチジンとＨＣＡの併用、（−）；ＨＣＡ単独。データは平均値を表す（左図および右図はｎ＝８、中央図はｎ＝１０）。エラーバー＝標準誤差。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ−ｍｅａｓｕｒｅ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｄａｋ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）。
【図５】ＯＲ２Ｗ１のＰＥＡおよびＨＣＡに対する応答性。独立した３回の実験からのデータを示す。ＰＥＡに対するＭｏｃｋ細胞の応答のみ、独立した２回の実験からのデータを示す。データはすべて、平均値および標準誤差を示す。ＭｏｃｋはＯＲ２Ｗ１を発現させない細胞の応答を示す。
【図６】ＯＲ２Ｗ１活性化物質による匂い増強作用。左：化合物ＡおよびＢの匂い強度、中央〜右：化合物ＡおよびＢによるＰＥＡ（中央）およびＨＣ（右）の匂いの増強効果。各図のバーは左端から（−）；匂い物質単独（１回目）、（Ａ）；匂い物質＋化合物Ａ、（Ｂ）；匂い物質＋化合物Ｂ、（−）；匂い物質単独（２回目）における匂い物質の匂い強度を表す。各図のバーとエラーバーは、それぞれ平均値と標準誤差（ｎ＝５）を表す。＊：Ｐ＜０．０５、Ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｔｅｓｔ）およびＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ。
【図７】ＯＲ２Ｗ１アンタゴニスト化合物によるＯＲ２Ｗ１活性化作用およびスカトール臭抑制作用。各図の横軸は、ＯＲ２Ｗ１アンタゴニスト化合物を表す。左図の縦軸は、各アンタゴニスト化合物存在下でのＯＲ２Ｗ１のスカトール応答（匂い応答（％））を示す。右図の縦軸は、官能試験における各アンタゴニストのスカトール臭抑制効果（４〜８名による官能評価の平均値）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸配列に関して記述する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１９】
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体またはそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、「嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチド」とは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓもしくはＧαｏｌｆと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう。
【００２０】
本明細書において、「Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」とは、嗅覚受容体ポリペプチドのうち、異なる匂いを有する複数種の匂い物質に応答する嗅覚受容体をいい、より詳細には、異なる構造的分類に属する複数の匂い物質に応答する嗅覚受容体をいう。匂い物質の構造的分類の例としては、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ケトン類、酸類、ベンゼン類、ラクトン類、スルフィド類などが挙げられる。本明細書におけるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、上記構造的分類のうちの、好ましくは９群以上、より好ましくは１１群以上、さらに好ましくは１３群以上について、それらに対する応答を調べたときに、好ましくは３８％以上の群、より好ましくは７７％以上の群に対して応答する嗅覚受容体である。なお、嗅覚受容体に関する「ある構造的分類の群に対して応答する」とは、嗅覚受容体が、当該構造的分類の群に属する少なくとも１種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上の匂い物質に応答することを意味する。
【００２１】
本明細書において、ある物質による「匂いの増強」および「匂いの抑制」とはそれぞれ、個体における該物質存在下での匂いに対する感受性が、該物質の非存在下での感受性と比べて強くなる現象および弱くなる現象をいう。匂いに対する感受性の強弱は、匂いに対する検出強度または検知閾値（感度）を基準に評価することができる。例えば、標的の匂いに対する検出強度が増加、または検知閾値が低下（もしくは検出感度が増加）した場合、該標的の匂いに対する感受性は増強した、すなわち該標的の匂いは増強した、と判断される。また例えば、標的の匂いに対する検出強度が低下、または検知閾値が上昇（もしくは検出感度が低下）した場合、該標的の匂いに対する感受性は抑制された、すなわち該標的の匂いは抑制された、と判断される。あるいは、匂いに対する感受性の強弱は、嗅覚感度の強弱を反映する。嗅覚感度の強弱は、嗅覚受容体の応答性を基準に評価することができる。すなわち、ある匂いに対する嗅覚受容体の応答性の増強および低下は、それぞれ、該匂いに対する嗅覚感度の増強および抑制を表す。したがって、匂いに対する感受性の強弱は、該匂いに対する嗅覚受容体の応答性を基準に評価することができる。
【００２２】
本明細書において、「嗅覚感度の増強を引き起こす物質」（いわゆる嗅覚感度増強剤）とは、その物質を標的匂い物質と併用（例えば標的匂い物質と同時にまたは先だって使用）したときに、該標的匂い物質を単独で使用した場合と比べて、該標的匂い物質に対する嗅覚受容体の応答を増強する物質である。あるいは、「嗅覚感度の増強を引き起こす物質」とは、匂いの増強を引き起こす物質である。また本明細書において、「嗅覚感度の抑制を引き起こす物質」（いわゆる嗅覚感度抑制剤）とは、その物質を標的匂い物質と併用したときに、該標的匂い物質を単独で使用した場合と比べて、該標的匂い物質に対する嗅覚受容体の応答を低下させる物質である。あるいは、「嗅覚感度の抑制を引き起こす物質」とは、匂いの抑制を引き起こす物質である。嗅覚感度増強剤および抑制剤は、それ自身に匂いを有していてもよい。
【００２３】
本明細書において、「匂いの増強を引き起こす物質」（いわゆる匂い増強剤）とは、その物質を匂いの原因物質と併用（例えば匂いの原因物質と同時にまたは先だって使用）したときに、該原因物質を単独で使用した場合と比べて、該原因物質の匂いを増強させる物質である。本明細書において、「匂いの抑制を引き起こす物質」（いわゆる匂い抑制剤）とは、その物質を匂いの原因物質と併用したときに、該原因物質を単独で使用した場合と比べて、該原因物質の匂いを抑制する物質である。匂い増強剤および匂い抑制剤は、それ自身に匂いを有していてもよい。
【００２４】
本発明者らは、「匂いの増強」および「匂いの抑制」が、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性の増強および低下によって生じることを明らかにした。Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が活性化または抑制されることにより、個体の嗅覚感度が増強または抑制される。すなわち、嗅細胞が匂いの原因物質に応答するときに、該応答に先だってまたは同時にＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が活性化または抑制されることにより、個体の嗅覚感度が増強または抑制され、あるいは個体に認識される該匂いに対する検出強度または感度の増加または低下が生じる。したがって、本発明による嗅覚感度または匂いの増強には、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性を増強させる物質（例えば受容体アゴニスト等）が使用され得、本発明による嗅覚感度または匂いの抑制には、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性を低下させる物質（例えば受容体アンタゴニスト等）が使用され得る。
【００２５】
したがって本発明は、匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または抑制させる試験物質を、匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法を提供する。
また本発明は、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または抑制させる試験物質を、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。
【００２７】
本発明の方法においては、まず、少なくとも１種のＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を準備する。本発明の方法で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、好ましくは哺乳動物由来の嗅覚受容体である。哺乳動物由来の嗅覚受容体の例としては、ヒト、チンパンジー、サルなどの霊長類、およびマウス、ラットなどのげっ歯類の嗅覚受容体が挙げられ、好ましい例としては、ヒト、マウスおよびラットの嗅覚受容体が挙げられ、より好ましい例としてはヒト嗅覚受容体が挙げられる。ヒト、マウスおよびラットの嗅覚受容体の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ[www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank]より取得することができる。本発明の方法で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、単一種の動物に由来する嗅覚受容体であってもよいが、２種以上の動物種に由来する嗅覚受容体の組み合わせであってもよい。
【００２８】
本発明の方法で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、嗅覚受容体ポリペプチドの集団を探索し、その中から、上述した「Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」の定義を満たすものを同定することによって得ることができる。例えば、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、後述の実施例１に記載されるように、様々な匂い物質に対する嗅覚受容体の応答性を調べ、その中から、上述した「Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」の定義を満たす嗅覚受容体を選択することで同定される。以下に、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の探索の手順を詳述する。
【００２９】
Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の探索に供される嗅覚受容体ポリペプチドは、匂い物質に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、該嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器もしくは嗅細胞等の、該嗅覚受容体を天然に発現する組織もしくは細胞、またはそれらの培養物；該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞またはその培養物；該嗅覚受容体を有する当該組換え細胞の膜；該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。
【００３０】
好ましい態様において、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の探索に供される嗅覚受容体ポリペプチドは、哺乳動物の嗅細胞等の該嗅覚受容体を天然に発現する細胞、または該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物であり得る。好ましい例としては、ヒト嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換えヒト細胞が挙げられる。
【００３１】
該組換え細胞は、該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。あるいは細胞内に該遺伝子の転写産物を直接導入することによっても該嗅覚受容体ポリペプチドを発現させることが可能である。好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されているタンパク質である。
【００３２】
該嗅覚受容体ポリペプチドに様々な匂い物質を添加し、それぞれに対する応答を測定する。この測定は、嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、該原因物質添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、該該原因物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、レポータージーンアッセイ等が挙げられる。嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する他の方法としては、カルシウムイメージング法が挙げられる。さらに別の方法としては、電気生理学的手法による測定が挙げられる。電気生理学的測定では、例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを他のイオンチャネルとともに共発現させた細胞（アフリカツメガエル卵母細胞等）を作製し、該細胞上のイオンチャネルの活動をパッチクランプ法、二電極膜電位固定法などで測定することにより、該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する。
【００３３】
Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の探索に用いる匂い物質には、異なる匂いを有する複数種の匂い物質が用いられる。好ましくは、構造的分類が異なる複数種の匂い物質が用いられる。より好ましくは、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ケトン類、酸類、ベンゼン類、ラクトン類およびスルフィド類からなる１７群の構造的分類のうちの９群以上、さらに好ましくは１１群以上、なお好ましくは１３群以上のそれぞれに属する匂い物質を含む匂い物質のセットが用いられる。該匂い物質のセットは、上述した構造的分類の各群について、少なくとも１種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上の匂い物質を含む。ただし、探索に供する嗅覚受容体に添加する匂い物質は、一回の応答測定につき１種類が好ましい。
【００３４】
次いで、測定された応答に基づいてＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を同定する。応答性の評価は、該匂い物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド（試験群）の応答を、対照群と比較することによって行うことができる。対照群としては、異なる濃度の該匂い物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、該匂い物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチド、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、該匂い物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチド、該嗅覚受容体ポリペプチドが発現していない細胞、などを挙げることができる。
【００３５】
試験群における応答が対照群よりも増強されていた場合、該嗅覚受容体ポリペプチドは、該匂い物質に応答したと判定される。例えば、試験群における応答が、対照群と比較して好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上に増強されていれば、該嗅覚受容体ポリペプチドは、該匂い物質に応答したと判定される。あるいは、試験群における応答が、対照群と比較して統計学上に有意に増強されていれば、該嗅覚受容体ポリペプチドは、該匂い物質に応答したと判定される。
【００３６】
必要に応じて、嗅覚受容体ポリペプチドに該匂い物質を異なる濃度で添加して、同様の手順で応答を測定してもよい。応答が該匂い物質の濃度依存的に増加していれば、該嗅覚受容体ポリペプチドが該匂い物質に応答性を有するものであると確認することができる。
【００３７】
上記の応答測定に基づいて、上述した「Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」の定義を満たす嗅覚受容体ポリペプチドを選択する。好ましくは、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ケトン類、酸類、ベンゼン類、ラクトン類およびスルフィド類からなる１７群の構造的分類のうちの９群以上、より好ましくは１１群以上、なお好ましくは１３群以上（各群は、少なくとも１種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上の匂い物質で構成される）について、それらに対する応答を調べたときに、好ましくは調べた群の３８％以上、より好ましくは７７％以上に対して応答する嗅覚受容体ポリペプチドを、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体として同定する。
【００３８】
以上の手順で、同定されたＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を、本発明の方法で使用することができる。本発明の方法で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の例としては、ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１（olfactory receptor family 2 subfamily W member 1）、ＯＲ１Ａ１（olfactory receptor family 1 subfamily A member 1）およびＯＲ１０Ａ６（olfactory receptor family 10 subfamily A member 6）、ならびにこれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１０Ａ６は、いずれもＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information；[www.ncbi.nlm.nih.gov]）にそのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列情報が登録されている。本明細書において、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６とは、それぞれ、配列番号１、２および３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。
【００３９】
ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１またはＯＲ１０Ａ６と同等の機能を有するポリペプチドとしては、配列番号１、２および３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６と同様に、上述した「Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体」の定義を満たす幅広い種類の匂い物質に対して応答する嗅覚受容体ポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
好ましくは、ＯＲ２Ｗ１と同等の機能を有するポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり；
好ましくは、ＯＲ１Ａ１と同等の機能を有するポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり；
好ましくは、ＯＲ１０Ａ６と同等の機能を有するポリペプチドは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、ベンゼン類、環状アルカン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドである。
【００４１】
ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１またはＯＲ１０Ａ６と同等の機能を有するポリペプチドの別の例としては、これらヒト嗅覚受容体のマウスまたはラットのオルソログが挙げられ、その例としては、ＯＲ２Ｗ１についてはＯｌｆｒ２６３（別名Ｏｌｆｒ４２、ＭＯＲ２５６−３１、マウス）、Ｏｌｒ１６６２（ラット）などが挙げられ、ＯＲ１Ａ１についてはＯｌｆｒ４３（マウス）、Ｏｌｒ１５１３およびＯｌｒ１５１４（ラット）などが挙げられ、ＯＲ１０Ａ６についてはＯｌｆｒ５１９（マウス）、Ｏｌｆａｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ２８１およびＯｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １０Ａ３−Ｌｉｋｅ（ラット）などが挙げられる。
【００４２】
本発明の方法において、該ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６、ならびにこれらと同等の機能を有するポリペプチドは、いずれか１種が使用されればよいが、いずれか２種以上が組み合わせて使用されてもよい。好ましくは該ＯＲ２Ｗ１およびこれと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種が使用される。
【００４３】
本発明の方法において、当該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、そのＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄな応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器もしくは嗅細胞等の、該嗅覚受容体を天然に発現する組織もしくは細胞、またはそれらの培養物；該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞またはその培養物；該嗅覚受容体を有する当該組換え細胞の膜；該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の範囲に含まれる。
【００４４】
好ましい態様において、本発明の方法で使用されるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体は、哺乳動物の嗅細胞等の該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を天然に発現する細胞、または該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物であり得る。好ましい例としては、ヒトＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換えヒト細胞が挙げられる。
【００４５】
該組換え細胞は、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換するか、あるいは細胞内に該遺伝子の転写産物を直接導入することによって作製することができる。好適には、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進するために、該嗅覚受容体をコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（好ましくは、ヒトＲＴＰ１Ｓ等のＲＴＰ１Ｓ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。
【００４６】
本発明の方法においては、まず、試験物質存在下で該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定する。好ましくは、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体に試験物質を添加し、次いで該嗅覚受容体の応答を測定する。
【００４７】
本発明の方法に使用される試験物質は、嗅覚感度または匂いの増強または抑制を引き起こす物質として使用することを所望する物質であれば、特に限定されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的もしくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、または化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。また、該試験物質は、嗅覚受容体に適用することができるものである限り、匂い物質である必要はない。好ましくは、該試験物質は以下の物質を含まない；糞便臭（例えばスカトール、インドール）；体臭原因物質（例えば、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸）；アクリル酸ブチル；腐敗尿臭原因物質（例えば２−メトキシ−４−ビニルフェノール、ｐ−クレゾール等）；腋臭原因物質（例えば３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、３−メチル−２−ヘキセン酸等）；ミューゲ香料；トランス−２−ヘキセナール、シス−３−ヘキセノール；ならびに、特許文献２〜１３（その全体を参考として援用する）に記載のＯＲ２Ｗ１アゴニストおよびアンタゴニスト。
【００４８】
嗅覚受容体に試験物質を添加する手段としては、該嗅覚受容体を発現する細胞を培養する培地に試験物質を添加する方法、該嗅覚受容体に試験物質を直接滴下、散布もしくは噴霧する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００４９】
Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定する方法としては、当該分野で知られている任意の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、レポータージーンアッセイ等による細胞内ｃＡＭＰ量測定；カルシウムイメージング；ならびに、パッチクランプ法、二電極膜電位固定法等の電気生理学的手法、が挙げられる。
【００５０】
次いで、測定された応答に基づいて、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答に対して該試験物質が及ぼす作用を評価する。該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を増強させる試験物質は、嗅覚感度の増強または匂いの増強を引き起こす物質（いわゆる嗅覚感度増強剤または匂い増強剤）として選択される。一方、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を低下させる試験物質は、嗅覚感度の抑制または匂いの抑制を引き起こす物質（いわゆる嗅覚感度抑制剤または匂い抑制剤）として選択される。
【００５１】
Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答に対する試験物質の作用の評価は、該試験物質存在下での該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体（試験群）の応答を、該試験物質非存在下での該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体（対照群）の応答と比較することによって行うことができる。対照群としては、異なる濃度の試験物質を添加した該嗅覚受容体、試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体、対照物質を添加した該嗅覚受容体、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体、該嗅覚受容体が発現していない細胞、などを挙げることができる。あるいは、対照群としては、該試験物質に対して応答性を有さな
いもしくは低い応答性を有する他の嗅覚受容体が挙げられる。
【００５２】
なお、該試験物質が嗅覚感度または匂いの抑制を引き起こす物質として使用することを所望するものである場合は、試験群と対照群の両方に、試験物質とともに、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体を活性化させる物質を添加することが望ましい。そのような受容体を活性化させる物質の例としては、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体がＯＲ２Ｗ１である場合については、糞便臭（例えばスカトール、インドール）；体臭原因物質（例えば、ノナン酸、ヘキサン酸、イソ吉草酸）；アクリル酸ブチル；腐敗尿臭原因物質（例えば２−メトキシ−４−ビニルフェノール、ｐ−クレゾール等）；腋臭原因物質（例えば３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、３−メチル−２−ヘキセン酸等）；ミューゲ香料；トランス−２−ヘキセナール、シス−３−ヘキセノール；ならびに、特許文献２〜１３（その全体を参考として援用する）に記載のＯＲ２Ｗ１アゴニストが挙げられる。
【００５３】
試験群における応答が、対照群よりも増強されていた場合、当該試験物質を、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を増強する物質として選択することができる。一方、試験群における応答が、対照群よりも低下していた場合、当該試験物質を、該Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を低下させる物質として選択することができる。例えば、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答に対して試験物質が及ぼす作用は、試験物質添加群と非添加群との間、試験物質添加群と対照物質添加群との間、試験物質添加前後、またはＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体発現細胞群と非発現細胞群との間で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を比較することによって評価することができる。Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が、試験物質添加により誘導または抑制された場合、該試験物質は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を増強または低下させる物質として選択される。
【００５４】
例えば、試験物質添加群におけるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が、対照群と比較して好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上に増強されていれば、該試験物質を、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を増強する物質として選択することができる。あるいは、試験物質添加群におけるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が、対照群と比較して統計学的に有意に増強されていれば、該試験物質を、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を増強する物質として選択することができる。選択された試験物質は、嗅覚感度増強剤または匂い増強剤として取得することができる。
【００５５】
また例えば、試験物質添加群におけるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が、対照群と比較して好ましくは９０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下に低下していれば、該試験物質を、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を低下させる物質として選択することができる。あるいは、試験物質添加群におけるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が、対照群と比較して統計学的に有意に低下していれば、該試験物質を、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を低下させる物質として選択することができる。選択された試験物質は、嗅覚感度抑制剤または匂い抑制剤として取得することができる。
【００５６】
必要に応じて、上記本発明の方法で選択された試験物質の嗅覚感度または匂いの増強または抑制作用をさらに官能評価してもよい。すなわち、本発明の方法の一実施形態においては、上記手順で選択された試験物質を、嗅覚感度または匂いの増強または抑制を引き起こす物質の候補物質として取得する。次いで、該候補物質の嗅覚感度または匂いの増強または抑制作用を官能評価する。例えば、候補物質の存在下および非存在下で、匂いの検出強度もしくは検出感度を官能評価する。該候補物質の存在下で、匂いの検出強度もしくは検出感度が増強した場合、該候補物質を、嗅覚感度の増強剤または匂いの増強剤（まとめて「本発明の増強剤」ということがある）として選択する。一方、該候補物質の存在下で、匂いの強度もしくは感度が低下した場合、該候補物質を、嗅覚感度の抑制剤または匂いの抑制剤（まとめて「本発明の抑制剤」ということがある）として選択する。当該官能評価に用いる匂いは、１種類の匂いであってもよく、タイプの異なる２種類以上の匂いであってもよい。
【００５７】
当該官能評価に用いる匂いの種類は特に限定されないが、例えば、その匂い強度の増強または抑制のために該候補物質を使用することが意図される匂いを用いることが好ましい。例えば、増強または抑制したい標的匂いの検出強度もしくは検出感度が増強または低下した場合、該候補物質を、該標的匂いに対する嗅覚感度または匂いの増強剤または抑制剤として選択することができる。あるいは、候補物質の存在下で、匂いのタイプが異なる２種以上の匂いの検出強度もしくは検出感度が増強または低下した場合、該候補物質を、多様な匂いに対する嗅覚感度または匂いの増強または抑制を引き起こす物質（いわゆる「汎用性の（versatile）」嗅覚感度または匂いの増強剤または抑制剤）として選択することができる。
【００５８】
本発明の方法によって選択された本発明の増強剤または抑制剤は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性制御により標的の匂いを増強または抑制することができる物質である。より詳細には、該本発明の増強剤または抑制剤の存在下では、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答が増強または抑制されることで、標的の匂いに対する検出強度または検出感度が高まりまたは低下し、結果として該標的の匂いが増強または抑制される。したがって、該本発明の増強剤または抑制剤は、その適用と一緒にもしくは後から嗅いだ匂いを増強または抑制する作用を有する。該本発明の増強剤または抑制剤が、いわゆる「汎用性の（versatile）」嗅覚感度または匂いの増強剤または抑制剤である場合、それは、多様な匂いの増強または抑制を引き起こす物質として働く。
【００５９】
本発明の方法によって得られた本発明の増強剤または抑制剤を使用する場合の一実施形態は、以下のとおりである：まず、標的の匂いの増強または抑制を所望する対象者に対し、該標的の匂いへの曝露の前もしくはそれと一緒に、該標的の匂いに対する本発明の増強剤または抑制剤をその嗅覚受容体に適用する。該増強剤を適用した場合は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性化を介して、該対象者の該標的の匂いに対する感受性の上昇をもたらし、その結果、該対象者が標的の匂いに曝露されると、該標的の匂いをより強く感じるか、より低濃度（より高感度）で感知するようになる。一方、該抑制剤を適用した場合は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の活性抑制を介して、該対象者の該標的の匂いに対する感受性の低下をもたらし、その結果、該対象者が標的の匂いに曝露されると、該標的の匂いをより弱く感じるか、より高濃度（より低感度）で感知するようになる。
【００６０】
本発明の方法によって得られた本発明の増強剤の適用例としては、都市ガスやプロパンガスの漏れを警告するための、それらのガスへの添加；少ない賦香量でも製品からの香りを明確に感じさせることを目的とした、香料を含む物質（例えば、香粧品、洗浄剤、デオドラント等の外用剤、洗濯用洗剤、柔軟剤等の日用品、医薬品、食品、リネン類、生理用品、衣類等）への添加；匂いを明確に感じさせることを目的とした、標的の匂いを有する製品もしくは標的の匂いを発生させる環境への適用、などが挙げられる。また、本発明の方法によって得られた本発明の抑制剤の適用例としては、トイレ、浴室、病棟もしくは介護施設、またはキッチン、寝室、クローゼット等を含む住居など、悪臭の抑制が所望される空間への適用；匂いの抑制を目的とした製品（例えば、消臭剤、デオドラント用の外用剤、または消臭用の洗浄剤、洗濯用洗剤もしくは柔軟剤）への添加；匂いの抑制が望まれる製品（例えば、紙おむつ、生理用品、肌着、下着、リネン類、またはその他の服飾類、布製品もしくは織物、医薬品、食品、等）への添加；匂いの抑制を目的とした、標的の匂いを有する製品の製造ラインもしくは標的の匂いを発生する環境への適用、などが挙げられる。しかしながら、本発明の増強剤または抑制剤の適用例は、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００６２】
〔１〕匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【００６３】
〔２〕好ましくは、前記匂いの増強が、匂いに対する検出強度または検出感度の増加であり、前記匂いの抑制が、匂いに対する検出強度または検出感度の低下である、〔１〕記載の方法。
【００６４】
〔３〕好ましくは、前記嗅覚受容体の応答を増強させる試験物質を、匂いの増強を引き起こす物質として選択する、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００６５】
〔４〕好ましくは、前記嗅覚受容体の応答を低下させる試験物質を、匂いの抑制を引き起こす物質として選択する、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００６６】
〔５〕嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【００６７】
〔６〕好ましくは、前記嗅覚感度の増強が、匂いに対する検出強度または検出感度の増加であり、前記嗅覚感度の抑制が、匂いに対する検出強度または検出感度の低下である、〔５〕記載の方法。
【００６８】
〔７〕好ましくは、前記嗅覚受容体の応答を増強させる試験物質を、嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、〔５〕又は〔６〕記載の方法。
【００６９】
〔８〕好ましくは、前記嗅覚受容体の応答を低下させる試験物質を、嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、〔５〕又は〔６〕記載の方法。
【００７０】
〔９〕好ましくは、前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、匂い物質の構造的分類の群の３８％以上に対して応答する嗅覚受容体であり、かつ、該匂い物質の構造的分類の群が、アミン類、チオール類、アルコール類、エステル類、エーテル類、アルデヒド類、環状アルカン類、テルペン類、バニリン類、カンファー類、アジン類、ムスク類、ケトン類、酸類、ベンゼン類、ラクトン類、スルフィド類からなる群より選択される９群以上である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
【００７１】
〔１０〕前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、
好ましくは、ヒト、マウスまたはラット由来のＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体であり、
より好ましくは、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１およびＯＲ１０Ａ６、ならびにこれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、ＯＲ２Ｗ１およびこれと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。
【００７２】
〔１１〕好ましくは、
前記ＯＲ２Ｗ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６が配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ２Ｗ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり、
前記ＯＲ１Ａ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、ベンゼン類、環状アルカン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドである、
〔１０〕記載の方法。
【００７３】
〔１２〕前記少なくとも８０％の同一性が、好ましくは９０％以上の同一性であり、より好ましくは９５％以上の同一性であり、さらに好ましくは９９％以上の同一性である、〔１１〕記載の方法。
【００７４】
〔１３〕好ましくは、試験物質非存在下での前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定することをさらに含む、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
【００７５】
〔１４〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答の１２０％以上に増加させる試験物質を、匂いの増強を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００７６】
〔１５〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答の１２０％以上に増加させる試験物質を、嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００７７】
〔１６〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を、匂いの増強を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００７８】
〔１７〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を、嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００７９】
〔１８〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答の９０％以下に低下させる試験物質を、匂いの抑制を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００８０】
〔１９〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答の９０％以下に低下させる試験物質を、嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００８１】
〔２０〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に低下させる試験物質を、匂いの抑制を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００８２】
〔２１〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に低下させる試験物質を、嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、〔１３〕記載の方法。
【００８３】
〔２２〕好ましくは、前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、〔１〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法。
【００８４】
〔２３〕好ましくは、前記嗅覚受容体の応答が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、カルシウムイメージング、または電気生理学的手法により測定される、〔１〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
【００８５】
〔２４〕好ましくは、前記選択された試験物質の匂い増強または抑制作用を官能評価することをさらに含む、〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
【００８６】
〔２５〕好ましくは、前記選択された試験物質の嗅覚感度の増強または抑制作用を官能評価することをさらに含む、〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００８８】
参考例
１）試験物質
フェニルエチルアルコール（ＰＥＡ）（２−Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
ヘキシルシンナムアルデヒド（ＨＣＡ）（２−（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ｏｃｔａｎａｌ）（花王株式会社）
ヒドロキシシトロネラール（ＨＣ）（７−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｎａｌ：ＨＣ）（ＢＡＳＦ社）
ｌ−アルギニン（Ｗａｋｏ社）
ｌ−ヒスチジン（Ｗａｋｏ社）
【００８９】
２）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、バリアントを含む４２７種のヒト嗅覚受容体それぞれをコードする遺伝子をクローニングした。各遺伝子は、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に組換えた。
【００９０】
３）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
【００９１】
４）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体４２７種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で１５分静置した。マルチウェルプレート（３８４または９６ウェルプレート、ＢｉｏＣｏａｔ）の各ウェルに、反応液を添加し、次いでＨＥＫ２９３細胞を播種した。３８４ウェルプレートには、反応液４．４μＬ、ＨＥＫ２９３細胞（２０×１０4細胞／ｃｍ2）４０μＬを添加した。９６ウェルプレートには、反応液１０μＬ、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）９０μＬを添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、嗅覚受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
【００９２】
【表１】
2018121623.tif 000002
【００９３】
５）嗅覚受容体のルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本発明での匂い物質、試験物質、またはアンタゴニストに対する細胞の応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率または細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、匂い物質または試験物質の刺激後２．５〜４時間後に製品の操作マニュアルに従って測定を行った。ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを算出した。下記式に従って、試験物質刺激に対する嗅覚受容体の応答性の指標としてＦｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅを、また嗅覚受容体に対するアンタゴニスト活性レベルの指標として匂い応答（％）を算出した。
Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ＝Ｘ／Ｙ
Ｘ：試験物質単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｙ：試験物質刺激なしの場合のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
匂い応答（％）＝（Ｚ’−Ｙ’）／（Ｘ’−Ｙ’）×１００
Ｘ’：匂い物質単独刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｙ’：匂い物質刺激なしの場合のｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
Ｚ’：匂い物質とアンタゴニストとの共刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ
【００９４】
実施例１  ヒト嗅覚受容体のリガンド選択性の評価
構造的分類の異なる様々な匂い物質に対する嗅覚受容体の応答選択性を調べた。本実施例では、化学構造の共通性に基づく１１群（アルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類、環状アルカン類、ラクトン類、各群はそれぞれ３種類の匂い物質を含む）からの３３種類の化合物を匂い物質として用いた。
【００９５】
各匂い物質のＤＭＥＭ溶液（Ｎａｃａｌａｉ）を、匂い物質の溶解度と細胞毒性を考慮して、可能な限り高い濃度で調製した（３０μＭから３０００μＭ）。参考例２）〜４）に従って作製した嗅覚受容体発現細胞の培養物から培地を取り除き、各ウェルに該匂い物質溶液を３０μＬずつ添加して、参考例５）と同様の手順でルシフェラーゼアッセイを行った。細胞をＣＯ２インキュベータ内で２．５〜４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた後、その発現量を発光量を指標に測定した。
【００９６】
結果を図１に示す。図１Ａは、ヒト嗅覚受容体ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１およびＯＲ１０Ａ６のそれぞれを発現させた細胞が応答を示した匂い物質の群を示す。嗅覚受容体が群内の３種類の物質の全てに応答を示した群を「活性あり」（黒丸）、群内のいずれか１つ以上の物質に応答を示さなかった群を「活性なし」（−）で示す。図１Ｂに示すように、調べた匂い物質群のうち、ＯＲ１Ａ１は約９０％（１１群の匂い物質グループのうち１０群）、またＯＲ２Ｗ１およびＯＲ１０Ａ６は約８０％（１１群の匂い物質グループのうち９群）に応答した。この結果から、これらの嗅覚受容体が、様々な匂い物質の群を認識できるＢｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体であることが確認された。
【００９７】
実施例２  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体選択的リガンド
試験物質として、ｌ−アルギニンおよびｌ−ヒスチジンを使用した。これらの試験物質をリンガー液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４（ＮａＯＨ））に溶解させて試験物質溶液を調製した。この試験物質溶液を用いて、参考例２）〜５）の手順に従って、ＯＲ２Ｗ１発現細胞でルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図２に示す。ＯＲ２Ｗ１は、ｌ−アルギニンに対して濃度依存的な応答を示した（図２中央上）。一方、ｌ−ヒスチジンに対しては、ＯＲ２Ｗ１発現細胞は応答を示さなかった（図２中央下）。
【００９８】
さらに、４２７種類の嗅覚受容体について、参考例２）〜５）の手順に従って、ｌ−アルギニンおよびｌ−ヒスチジン（１０ｍＭ）に対する応答を調べた。その結果、ＯＲ２Ｗ１以外にｌ−アルギニンに応答する嗅覚受容体は認められなかった（図２右上）。なお、調べたいずれの嗅覚受容体もｌ−ヒスチジンには応答しなかった（図２右下）。したがって、ｌ−アルギニンがＯＲ２Ｗ１を選択的に活性化する物質であることが示された。
【００９９】
実施例３  ｌ−アルギニンの点鼻による嗅覚への影響
１）匂いの検出閾値（検出感度）への効果
ＯＲ２Ｗ１選択的リガンドであるｌ−アルギニンの嗅覚に対する作用を、官能試験によって評価した。生理食塩水（大塚製薬）、ｌ−アルギニン１０ｍＭ生理食塩水溶液、およびｌ−ヒスチジン１０ｍＭ生理食塩水溶液の３サンプルを、点鼻スプレー（ＫＴ１１０−１０２、アズワン株式会社）に調製した。匂い物質としては、三叉神経系を活性化しないものとして官能試験に広く用いられバラの匂いを呈するフェニルエチルアルコール（ＰＥＡ）を選択した。０．００１から１００μＭまでの１１段階の濃度のＰＥＡ水溶液を試験液として用意し、３ｍＬずつ２０ｍＬ容のガラスバイアル（マルエム）に入れた。
【０１００】
実験は、投与者と被験者の双方にブラインドをかけて行われた。投与者は、被験者の鼻腔内のできる限り深部にスプレーの噴出口をセットし、一度スプレーをした。これにより噴出される液量はおよそ１００〜２００μＬである。スプレー前およびスプレー後１分後に、被験者に水溶液のみが入ったバイアル２本と、試験液のバイアル１本の計３本を提示し、どのバイアルに匂いが入っているかを質問した。試験液のバイアルを正答できた場合は一段階低い濃度、誤答した場合は一段階高い濃度の試験液を用いて再試験した。誤答を挟んで３度連続で正答した濃度を検知閾値とした。スプレー後に再度行う閾値試験は、スプレー前の閾値濃度の１０倍濃度より始めた。生理食塩水、アルギニン、ヒスチジンいずれかを点鼻し閾値試験を行った後、２時間半以上の間隔を空けてから他のサンプルを点鼻し、閾値試験を行った。サンプル点鼻前後で、被験者のＰＥＡに対する検知閾値を測定した。サンプル点鼻前の閾値濃度／サンプル点鼻後の閾値濃度を計算することにより、閾値変化率を求めた。
【０１０１】
その結果、ｌ−アルギニンの点鼻後の被験者で、ＰＥＡ検知閾値が統計学的に有意に低下した（図３）。このような効果は、ＯＲ２Ｗ１を活性化しない生理食塩水およびｌ−ヒスチジンを点鼻した場合には認められなかった。これらの結果から、ｌ−アルギニンがＰＥＡの匂いに対する人の検知閾値（検出感度）を上昇させることが明らかになり、またｌ−アルギニンにより唯一活性化されるＯＲ２Ｗ１がその効果をもたらしていることが示唆された。
【０１０２】
２）匂いの検出強度への効果
匂い物質およびｌ−アルギニンに同時曝露した場合と、匂い物質単独曝露の場合とを比べて、匂い物質の匂いが増強されるかを調べた。匂い物質は、ＰＥＡまたはヘキシルシンナミックアルデヒド（ＨＣＡ）を用いた。匂い物質を終濃度０．１ｍＭ濃度となるように、ｌ−アルギニン生理食塩水溶液および対照であるｌ−ヒスチジン生理食塩水溶液（いずれも１０ｍＭ）にそれぞれ添加した。得られた溶液を、超音波式ネブライザ（ＮＥ―Ｕ０７；オムロン  霧化粒子径１〜８μｍ（全体積粒子径分布の８０％））を用いて噴霧量最大で約１７０μＬ（約２０秒間）で噴霧し、被験者に吸引させ、匂い強度を評価した。
匂いの強度は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｅｓ，１９９６，２１：３２３−３４）の方法に従って、下記に示すＬａｂｅｌｅｄ  Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  Ｓｃａｌｅ（ＬＭＳ）により評価した。すなわち、スケール全長を１００％として、各ラベルを次の位置に設定した：Ｂａｒｅｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ，１．４％；Ｗｅａｋ，６．１％；Ｍｏｄｅｒａｔｅ，１７．２％；Ｓｔｒｏｎｇ，３５．４％；Ｖｅｒｙ  ｓｔｒｏｎｇ，５３．３％；Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ  ｉｍａｇｉｎａｂｌｅ，１００％。
【０１０３】
【化１】
2018121623.tif 000003
【０１０４】
結果、ｌ−アルギニンとの併用により、ＰＥＡおよびＨＣＡの両匂い物質の匂い強度が統計学的に有意に増強された（図４）。一方、ｌ−ヒスチジンとの併用では、いずれの匂い物質でも匂い強度の増強効果は認められなかった。これらの結果から、ｌ−アルギニンが匂いに対する人の検出強度を上昇させることが明らかになり、またｌ−アルギニンにより唯一活性化されるＯＲ２Ｗ１がその効果をもたらしていることが示唆された。
【０１０５】
３）匂いの質への効果
もし、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が匂いの質ではなく強度のみを制御するのであれば、ＯＲ２Ｗ１単独での活性化は匂いの質（特定の匂い）を呈さないはずである。そこでｌ−アルギニンを用いて約４００の嗅覚受容体のうちＯＲ２Ｗ１だけを活性化したときに、人に匂いの感覚が生じるのかを調べた。ｌ−アルギニンは揮発性をもたないため、生理食塩水に溶かしたｌ−アルギニンを、点鼻スプレーを使用して、５名の被験者の鼻腔内に投与した。その結果、ｌ−アルギニンの点鼻は匂いの感覚を生じさせなかった。なお、別の物質を同様の手法で点鼻した場合には５名中３名で匂いの感覚が生じたことから、本手法で点鼻した物質が嗅上皮に到達することは確認された。これらの結果は、ＯＲ２Ｗ１の活性化が、匂いの質（特定の匂い）の発生に関与しないことを示唆している。さらにこの実験結果は、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、匂いの質（特定の匂い）を生み出すのではないという仮説（非特許文献２参照）を支持している。
【０１０６】
実施例４  ＰＥＡ、ＨＣＡのＯＲ２Ｗ１への作用
ＰＥＡおよびＨＣＡに対するＯＲ２Ｗ１発現細胞の応答を調べた。結果、ＯＲ２Ｗ１はＰＥＡに応答し、ＨＣＡには応答しなかった（図５）。このことから、図４で示されたｌ−アルギニンによる匂い増強作用は、ＰＥＡなどＯＲ２Ｗ１が応答する匂い物質に限られるのではなく、ＨＣＡなどＯＲ２Ｗ１が応答しない匂いにも適用できることが示された。
【０１０７】
実施例５  ＯＲ２Ｗ１活性化が匂い強度に与える影響
１）図１に示すように、ＯＲ２Ｗ１は１１群の匂い物質グループのうちの８０％に応答した。一方、香りが弱い微香性香料に絞ってＯＲ２Ｗ１の応答性を調べた結果、明確な応答を示したものは６８種類のうち１０％に満たなかった。これらの結果から、香料のＯＲ２Ｗ１活性化能の強さと匂い強度との関係性が示唆された。
【０１０８】
２）ＯＲ２Ｗ１に対する活性化作用の異なる香料による、他の香料の匂いの増強作用を調べた。試験物質として、１）においてＯＲ２Ｗ１に対する活性化作用が確認されなかった微香性香料（化合物Ａ）および最も高い活性化作用が確認された微香性香料（化合物Ｂ）を用いて、ＰＥＡまたはヒドロキシシトロネラール（ＨＣ）の匂い増強効果を調べた。二つの綿球を用意し、一方には試験物質（化合物ＡまたはＢ）、もう一方には匂い物質（ＰＥＡまたはＨＣ）を染み込ませ、それぞれをガラスバイアルに入れ、サンプルとした。５人の被験者が、匂い物質単独、匂い物質＋化合物Ａ、匂い物質＋化合物Ｂ、匂い物質単独、の順にサンプルを提示されて、それぞれについて匂い物質の匂い強度を評価した。また、化合物ＡおよびＢ単独での匂い強度を評価した。匂いの強度の評価は、実施例３と同様の手順で行った。結果を図６に示す。
【０１０９】
３）さらに、１０種類のＯＲ２Ｗ１アンタゴニスト化合物について、スカトール臭の抑制作用およびスカトール受容体活性抑制作用を調べた。スカトール受容体としては、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ８Ｈ１（特許第５５９３２７１号公報）が知られているが、これらのうちＯＲ２Ｗ１によってスカトール臭強度が制御されている可能性を検証した。参考例２）〜５）と同様の手順で、該アンタゴニスト化合物存在下での匂い応答（％）を測定した。
アンタゴニスト化合物のスカトール臭の抑制作用は以下の手順で調べた。ガラス瓶（柏洋硝子Ｎｏ．１１、容量１１０ｍＬ）に綿球を入れ、この綿球に、悪臭としてプロピレングリコールで１０5倍に希釈したスカトール、およびアンタゴニスト化合物を各々２０μＬ滴下した。ガラス瓶を一晩室温で静置し、匂い分子をガラス瓶中に十分揮発させた後、官能試験によりスカトール臭の匂いを評価した。官能試験ではスカトール臭単独での匂いの強さを５とし、アンタゴニスト化合物を混合した場合の悪臭の強さを０から１０（０．５刻み）の２０段階で評価した。小さい値ほどスカトール臭が弱いことを表す。官能試験は４〜８名で行い、結果の平均値を求めた。
結果を図７に示す。図７の各図の横軸は、アンタゴニスト化合物を表し、左図の縦軸は、各アンタゴニスト化合物存在下でのスカトールに対するＯＲ２Ｗ１活性（匂い応答（％））を表す。匂い応答（％）が高いほどアンタゴニスト化合物のアンタゴニスト活性が低いことを意味する。右図の縦軸は、アンタゴニスト化合物のスカトール臭抑制作用の強さを示す（４〜８名による官能評価の平均値）。受容体アッセイにおいてＯＲ２Ｗ１のスカトール認識を抑制した化合物はすべて、官能試験においてスカトール臭を抑制した。これは、ＯＲ２Ｗ１の活性が匂いの強さの認識に強く貢献していることを示唆する。
【０１１０】
上記１）〜３）の結果からは、実施例３〜４の結果を踏まえると、嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１が、様々な匂い物質についての、匂いの質ではなく、匂いの強さの情報を伝達している嗅覚受容体であることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月19日(2018.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いの増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、匂いの増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【請求項２】
異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いに対する嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質の選択方法であって、
試験物質存在下で、Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定すること；
該嗅覚受容体の応答を増強または低下させる試験物質を、嗅覚感度の増強または抑制を引き起こす物質として選択すること、
を含む方法。
【請求項３】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、以下：
ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１０Ａ６、
配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチド、
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類、ムスク類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチド、ならびに、
配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、ベンゼン類、環状アルカン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチド、
からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が、ヒト嗅覚受容体ＯＲ２Ｗ１および配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコール類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、酸類、テルペン類、バニリン類、ベンゼン類およびラクトン類に属する匂い分子の結合によって活性化する嗅覚受容体ポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＲ２Ｗ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６が配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、
請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
試験物質非存在下での前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体の応答を測定することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に増加させるかまたは１２０％以上に増加させる試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いの増強を引き起こす物質として選択する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に低下させるかまたは９０％以下に低下させる試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いの抑制を引き起こす物質として選択する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に増加させるかまたは１２０％以上に増加させる試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質に対する嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体の応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて、統計学的に有意に低下させるかまたは９０％以下に低下させる試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質に対する嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記嗅覚受容体の応答が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、カルシウムイメージング、または電気生理学的手法により測定される、
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記選択された試験物質の匂いの増強または抑制作用を官能評価することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記試験物質の存在下および非存在下で、匂いのタイプが異なる２種以上の匂いの検出強度もしくは検出感度を官能評価する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記匂いのタイプが異なる２種以上の匂いの検出強度もしくは検出感度が増強した場合に、前記試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いの増強を引き起こす物質、又は異なる匂いを有する複数種の匂い物質に対する嗅覚感度の増強を引き起こす物質として選択する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記匂いのタイプが異なる２種以上の匂いの検出強度もしくは検出感度が低下した場合に、前記試験物質を、異なる匂いを有する複数種の匂い物質による匂いの抑制を引き起こす物質、又は異なる匂いを有する複数種の匂い物質に対するに対する嗅覚感度の抑制を引き起こす物質として選択する、請求項１４記載の方法。