(57)【要約】【課題】本発明は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの上気道感染症予防又は緩和効果を与えるために、必要十分量の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが安定化されている組成物を提供することを課題とする。【解決手段】２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とする上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とする上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物。
【請求項２】
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール１０μｇ以上を１日一回摂取することができるように調製された２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトのための請求項１に記載の経口組成物。
【請求項３】
２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの長期間安定性を有する請求項１又は２に記載の経口組成物。
【請求項４】
酵素分解大豆レシチン又はライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチンを含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項５】
縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸及びモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項６】
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチメセルロースから選択される１以上のセルロース誘導体を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項７】
酵素分解大豆レシチン又はライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチンと、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸及びモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースから選択される１以上のセルロース誘導体を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の経口組成物。
【請求項８】
１日用量として２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを１０〜３５μｇ含有する請求項１〜７のいずれかに記載の経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上気道感染症予防又は上気道感染症状緩和用経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上気道は、鼻孔から喉頭（気管末端）までの範囲の器官をいう。かぜなどの症状を引き起こすウイルス類が鼻粘膜から咽頭粘膜に感染し、これらの部位にウイルスが増殖することによって、鼻水、くしゃみ、鼻づまり、喉の痛みなどの症状があらわれる場合を医学上、上気道感染症（かぜ症候群）としている。なお、上気道に感染したウイルスが気管から呼吸細気管支まで移行し、これらの部位で増殖することにより気管支炎の症状があらわれることを下気道感染症と呼ぶ。
通常の上気道感染症（かぜ症候群）であれば、体力があれば自然に治癒し、１週間程度で回復する。原因となる微生物としてはウイルスが大部分で、全体の８０〜９０％を占め、残りは一般細菌、マイコプラズマ、クラミジアなどである。ウイルスの中ではライノウイルス、コロナウイルスが多く、これに続くのがＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルスである。これらのウイルスには季節的流行の特徴があり、ライノウイルスは春と秋、コロナウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルスは冬に多い傾向があるといわれている。上気道感染症の防御のためには、手洗い・うがいをすること、バランスのとれた食事を摂ること、十分な睡眠時間を取るなどの日常習慣の励行が推奨されている。
【０００３】
また、いわゆるかぜ症候群に対する予防にビタミンＤの摂取が効果的であるといわれている。
ビタミンＤ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ）は、ビタミンの一種であり、脂溶性ビタミンに分類される。ビタミンＤはさらにビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール、Ｅｒｇｏｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）とビタミンＤ３（コレカルシフェロール、Ｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）に分けられる。ビタミンＤ２は植物に、ビタミンＤ３は動物に多く含まれ、ヒトではビタミンＤ３が重要な働きを果たしている。ビタミンＤ欠乏は、日光への不十分な曝露、不十分な食事摂取、栄養成分吸収減退、異常代謝に関係している。また、ビタミンＤ欠乏は、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、高血圧症、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギー、ガン、およびいくつかの自己免疫病に関わることが知られている。
【０００４】
ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）は、肝臓でＣ２５の位置でヒドロキシ化の代謝を受け、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（別名２５（ＯＨ）Ｄ３、カルシフェジオール）へと変化し肝細胞に貯えられ、必要なときにα−グロブリンと結合しリンパ液中に放出される。この代謝物を含めてビタミンＤ３として利用されている。
近年、このビタミンＤ３の代謝物である２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの作用が注目を集めている。例えば筋肉の発達促進（特許文献１）、高血糖の改善（特許文献２）、高血圧症の改善（特許文献３）、生殖能力の改善（特許文献４）、エオタキシンの増加に伴って発症するアレルギー疾患の改善（特許文献５）などが代表的な作用である。
また特許文献６には、ビタミンＤ３代謝物（２５（ＯＨ）Ｄ３）の２０位の誘導体が、強い炎症性呼吸器疾患や感染症を治療できることが記載されている。
【０００５】
上記したようにビタミンＤ３は、肝臓によって２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ３）に代謝される。次に肝臓または腎臓内で１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換される。ビタミンＤ代謝物は、血漿中で担体タンパク質に結合され、身体全体に分布する。血清２５（ＯＨ）Ｄレベルは、ビタミンＤの体内貯蔵レベルを反映し、ビタミンＤ欠乏の臨床症状と相関するといわれている。しかしその有効性レベルを維持するための投与量をどのように定めるべきかについては、全く不明である。
【０００６】
一方、上記した上気道感染症の原因の一つであるインフルエンザの流行と血液中の２５（ＯＨ）Ｄレベルに重要な関係があることが非特許文献１に紹介されている。ここではビタミンＤとして８００ＩＵ／日投与することで風邪の発症の季節性がなくなることが紹介されている。ところが、その後の臨床試験では、ビタミンＤに有意な上気道感染症予防効果が認められないという試験結果が得られたとの報告もあり、ビタミンＤの上気道感染症に対する有効性については混沌とした状態にあるといっても過言ではない。
【０００７】
また、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５（ＯＨ）Ｄ３）は、化学的に極めて不安定なことが知られている。特に酸化による影響が大きい。通常、空気中で酸化されてその活性を速やかに消失することが知られている。特許文献７には、ビタミンＤと油成分、ポリグリセリン脂肪酸エステル多価アルコールを含む安定なマイクロエマルジョンの技術が開示されている。特許文献８には、活性型ビタミンＤ類を塩基性高分子物質中に分散してなる安定化組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５５９３５５０号公報
【特許文献２】特許第５６９１０７２号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１１８２６号公報
【特許文献４】特表２００９−５０４６９９号公報
【特許文献５】特表２０１３−５４５７６６号公報
【特許文献６】特許第３９９２２９７号公報
【特許文献７】特開平１１−２３６３３０号公報
【特許文献８】特開平０５−２７９２６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ビタミン広報センター発行ニュースレター：２００９年９月公開「インフルエンザに対する免疫力の検証」  http://www.vic-japan.gr.jp/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、ビタミンＤ３代謝物である２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの上気道感染症に対する効果を検証する過程で、ヒトにおける上気道感染症を予防又は緩和する有効な２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中有効濃度を明らかにし、さらにその効果を得るための有効投与量を明らかにした。またこの有効投与量は投与する製剤中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性に依存していることに着目し、上気道感染症に対する予防又は緩和効果をより確実にするための組成を見いだし、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの上気道感染症予防又は緩和効果を与えるために、必要十分量の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが安定化された経口組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とする上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物。
（２）２５−ヒドロキシコレカルシフェロール１０μｇ以上を１日一回摂取することができるように調製された２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトのための（１）に記載の経口組成物。
（３）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの長期間安定性を有する（１）又は（２）に記載の経口組成物。
（４）酵素分解大豆レシチン又はライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチンを含有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の経口組成物。
（５）縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸及びモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤を含有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の経口組成物。
（６）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチメセルロースから選択される１以上のセルロース誘導体を含有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の経口組成物。
（７）酵素分解大豆レシチン又はライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチンと、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸及びモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤と、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースから選択される１以上のセルロース誘導体を含有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の経口組成物。
（８）１日用量として２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを１０〜３５μｇ含有する（１）〜（７）のいずれかに記載の経口組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを１日当たり１０μｇ投与することができる、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物が提供される。この組成物は、日常的に摂取することで血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持することができる。
また、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物であって、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持するために組成物中に含有される２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ３代謝物）が安定化された経口用組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】臨床試験１において、プラセボ、ビタミンＤ３、２５（ＯＨ）Ｄ３を投与した被験者の投与前後の血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度を示すグラフである。
【図２】本発明の組成物（酵素分解大豆レシチン、ライスレシチンオイル含有）の２５（ＯＨ）Ｄ３の安定性試験の結果を示すグラフである。
【図３】本発明の組成物（縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸、およびモノラウリン酸ソルビタン含有）の２５（ＯＨ）Ｄ３の安定性試験の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の組成物（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース含有）の２５（ＯＨ）Ｄ３の安定性試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とする上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物に係る発明である。
２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、２５（ＯＨ）Ｄ３とも表記される化合物であって、海外及びわが国においては飼料用添加物として市販されており、これを本発明に用いることができる。なお、本発明に用いられる２５−ヒドロキシコレカルシフェロールについて、本願明細書においてはビタミンＤ３代謝物、２５ＯＨＤ３、２５ＯＨＤと記載する場合がある。尚、２５ＯＨＤと記載しているものは、２５ＯＨＤ３に加えて２５ＯＨＤ２も含まれる場合がある（後述する臨床試験において血清25-hydroxyvitamin D濃度はRIA2抗体法にて測定した為、食事の内容により２５ＯＨＤ２が含まれるケースが想定できるが、本試験ではほとんど無視できるレベルと考えられる）。
【００１６】
ヒトにおいて、本発明でいうところの、上気道感染症予防又は上気道感染症状緩和効果を得るためには、日常的に血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの濃度を３０ｎｇ／ｍＬを超えるようにする必要がある。このためには日常、毎日２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを１０μｇ以上摂取できるような組成物を投与する必要がある。なお２５−ヒドロキシコレカルシフェロールやビタミンＤ類は、高用量を摂取すると有害作用をもたらす場合があるため、１日の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの摂取量又は投与量は、この量を大幅に超過しないようにし、３５μｇ以下とすることが好ましい。
【００１７】
また、本願発明者らの研究によると、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの通常の錠剤は、調製直後から速やかにその含有量が減じていくことが確認された。これを防ぐためには、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含む組成物もしくは製剤には、酵素分解大豆レシチン及びライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチンを配合するか、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸およびモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤を配合するか、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースのいずれか１以上を配合するかしなければならない。あるはこれらの全てを配合しなければならない。かくすることで、調製した組成物中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが長期間安定化し、日常的に１日用量として、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール１０〜３５μｇを含む本発明組成物を経口で投与することによって、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの濃度を、常時３０ｎｇ／ｍＬを超えて維持することができる。
【００１８】
本発明で用いる大豆レシチンとは、大豆油を得る工程で、脱ガム工程によって得られる水和物であり、レシチンとその他リン脂質を含む。本発明においては食品や医薬品の乳化剤として利用可能な程度に脱色、精製されたものであれば使用可能である。
酵素分解大豆レシチンとは、リゾレシチンとも呼ばれ、大豆レシチンを酵素処理したものである。大豆レシチンと同様に食品や医薬品の乳化剤として利用可能な程度に脱色、精製されたものであれば使用可能である。
ライスレシチンオイルとは、米油精製工程において、大豆レシチンと同様に脱ガム工程によって得られる水和物であり、レシチンとその他リン脂質を含む。本発明においては食品や医薬品の乳化剤として利用可能な程度に脱色、精製されたものであれば使用可能である。
【００１９】
本発明の組成物を得るためには、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをエタノールなどの溶媒に溶解させる。溶媒としては水又はエタノールが好ましい。この溶解液を酵素分解大豆レシチン、ライスレシチンオイルから選択される１以上のレシチン（以下「レシチン類」）と均質に混合し、混合終了後２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含むレシチン類を乾燥させて溶媒を除去することで得ることができる。混合に当たっては、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが可能な限り小粒子として分散されるように混合する。必要に応じて高圧ホモジナイザーを用いることもできる。乾燥にあたっては、できるだけ低温で行うことが好ましく、真空凍結乾燥や減圧乾燥などの方法を採用することが好ましい。
【００２０】
レシチン類と２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、レシチン類１０００質量部当たり２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５（ＯＨ）Ｄ３）を０．１〜１０質量部の比率となるようにすることが好ましい。
かくして得られる組成物は、レシチン中に２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが分散した状態で安定化される。
この組成物は、そのまま経口投与することができる。また常法によって賦形剤を加えて錠剤やカプセル剤とすることができる。経口投与剤とする場合、１日の投与量が２５−ヒドロキシコレカルシフェロールとして１０〜３５μｇとなるように製剤化する。
なお、この組成物は、澱粉や糖を加えて粉末とし、散剤や顆粒剤とすることも可能である。
【００２１】
本発明には界面活性剤としてグリセリン脂肪酸エステルを配合することができる。
本発明で用いるグリセリン脂肪酸エステルは、グリセリンの持つ３つのヒドロキシ基のうち１つないし２つに脂肪酸がエステル結合したもので、代表的な食品用乳化剤である。
本発明に使用するグリセリン脂肪酸エステルは、グリセリン重合度１〜５が好ましく、ＨＬＢが５以下を示すものを使用する。
【００２２】
本発明には界面活性剤としてソルビタン脂肪酸エステルを配合することができる。
ソルビタン脂肪酸エステルは、ソルビタンと脂肪酸のエステルで、食品用乳化剤や化粧品・工業用界面活性剤として、単独または他の界面活性剤と配合して用いられる。
ソルビタンには水酸基が４つあり、それぞれに各種の脂肪酸がエステル結合するため、種類は多様である。本発明の目的にはモノラウリン酸ソルビタン（ソルビトール型）を示すものが適する。
【００２３】
本発明の組成物を得るためには、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをエタノールなどの溶媒に溶解させる。溶媒としては水又はエタノールが好ましい。この溶解液をグリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステルと均質に混合し、混合終了後２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含むグリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステルの溶液を乾燥させて溶媒を除去することで得ることができる。混合に当たっては、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが可能な限り小粒子として分散されるように混合する。必要に応じて高圧ホモジナイザーを用いることもできる。乾燥にあたっては、できるだけ低温で行うことが好ましく、真空凍結乾燥や減圧乾燥などの方法を採用することが好ましい。
【００２４】
グリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステルと２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステル１０００質量部当たり、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを０．１〜１０質量部の比率となるようにすることが好ましい。
かくして得られる組成物は、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステル中に２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが分散した状態で安定化される。この組成物は、そのまま経口投与することができる。また常法によって賦形剤を加えて錠剤やカプセル剤とすることができる。経口投与剤とする場合、１日の投与量が２５−ヒドロキシコレカルシフェロールとして１０〜３５μｇとなるように製剤化する。
なお、この組成物は、澱粉や糖を加えて粉末とし、散剤や顆粒剤とすることも可能である。
【００２５】
本発明で用いるヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下「ＨＰＭＣ」）は、メチルセルロースにヒドロキシプロポキシル基を導入したセルロースエーテルであり、水溶性のセルロース誘導体である。本発明の目的に適したＨＰＭＣは、食品添加物用としても市販されている。このようなＨＰＭＣとしては、信越化学工業株式会社製のＨＰＭＣメトローズ  ＳＥ０６、メトローズＳＥ５０、メトローズＮＥ１００、メトローズＳＦＥ４００、メトローズＮＥ４０００、メトローズＳＦＥ４０００を例示することができる。
【００２６】
本発明で用いるヒドロキシプロピルセルロース（以下「ＨＰＣ」）は、セルロースの水酸基を酸化プロピレンでエーテル化することで得られ、多数のヒドロキシプロピル基（−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）を持つ。１グルコースあたりの置換された水酸基の平均数は置換度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＤＳ）として表され、これは最大３である。しかしヒドロキシプロピル基にも水酸基が含まれるため、反応途中にここもエーテル化される。そのため、１グルコースあたりのヒドロキシプロピル基の数であるモル置換度（ｍｏｌｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＭＳ）は３より大きくなる。
セルロースは結晶性が高いため、ＨＰＣを水溶性とするにはＭＳを４以上にする必要がある。また疎水基と親水基を持つため、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は約４５℃で、これ以上の温度では不溶性となる。本発明においては水溶性であることが好ましい。
ＨＰＣは、食品添加物として広く利用されており、その安全性も熟知されている。ＨＰＣの分子量は、食品添加物として市販されているものとしては、質量平均分子量４００００〜９１００００の範囲であるが、必要に応じて分子量の範囲を選択できる。本発明にあっては分子量の小さいものが好ましく、特に好ましくは、質量平均分子量が４００００〜１４００００ものである。なおＨＰＣの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）で容易に測定可能である。
食品添加物として市販されているＨＰＣとしては、例えば日本曹達株式会社のセルニーＳＳＬ（分子量４００００）、セルニーＳＬ（分子量１０００００）、セルニーＬ（分子量１４００００）、セルニーＭ（分子量６２００００）、セルニーＨ（分子量９１００００）を例示することができる。
メチルセルロース（以下「ＭＣ」）は、例えば信越化学工業株式会社製のメトローズＭＣＥ−４００を例示することができる。
【００２７】
本発明の組成物を得るためには、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをエタノールなどの溶媒に溶解させる。溶媒としては水又はエタノールが好ましい。この溶解液をＨＰＭＣ、ＨＰＣ又はＭＣと均質に混合し、混合終了後２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含むＨＰＭＣ、ＨＰＣ又はＭＣの溶液を乾燥させて溶媒を除去することで得ることができる。混合に当たっては、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが可能な限り小粒子として分散されるように混合する。必要に応じて高圧ホモジナイザーを用いることもできる。乾燥にあたっては、できるだけ低温で行うことが好ましく、真空凍結乾燥や減圧乾燥などの方法を採用することが好ましい。
【００２８】
ＨＰＭＣ、ＨＰＣ又はＭＣと２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、ＨＰＭＣ、ＨＰＣ又はＭＣ１０００質量部当たり２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを０．１〜１０質量部の比率となるようにすることが好ましい。
かくして得られる組成物は、ＨＰＭＣ、ＨＰＣ又はＭＣの形成するマトリックス構造中に２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが分散した状態で安定化される。
この組成物は、そのまま経口投与することができる。また常法によって賦形剤を加えて錠剤やカプセル剤とすることができる。経口投与剤とする場合、１日の投与量が２５−ヒドロキシコレカルシフェロールとして１０〜３５μｇとなるように製剤化する。
なお、この組成物は、澱粉や糖を加えて粉末とし、散剤や顆粒剤とすることも可能である。
【実施例】
【００２９】
以下に、試験例並びに実施例を示し本発明の作用効果について具体的に説明する。
＜臨床試験（１）＞
本発明の組成物の投与がヒト血液中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度に及ぼす影響について試験例を示し説明する。
１．女性の血中２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度に与える影響試験
１）試験対象
被験者選択基準及び除外基準は下記の通りである。
選択基準
１．  健常な閉経後の日本人女性
２．  年齢５０歳以上７０歳未満
３．  血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度３０ｎｇ／ｍＬ以下
４．  臨床化学検査、血液学的検査をもとに健康であると判断された者
５．  ＢＭＩ１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ２
６．  本人の自由意思に基づく文書による同意が得られる者
【００３０】
除外基準
１．  喫煙者  
２．  日光に過度に曝露する行動の予定
３．  血清カルシウムが１０．２ｍｇ／ｄＬ以上
４．  空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬ以上
５．  過去６ヵ月以内のホルモン補充療法
６．  試験期間中のマルチビタミン以外のサプリメントの使用（試験開始前に摂取を中止し試験が終わるまで摂取しない者は除く）  
７．  過去３ヵ月以内のビタミンＤサプリメントの使用
８．  過去３ヵ月以内に６００ｍｇ／日以上のカルシウムサプリメントの使用
９．  安静時血圧が１４５／９５ｍｍＨｇ以上
１０．高血圧の治療
１１．精神疾患の罹患歴、試験内容の理解が難しい状態
１２．高強度の運動を継続的に行う者  
１３．試験食品の吸収に影響する状態：腸管吸収障害、スプルー（小腸の吸収障害を伴う症候群）、大腸炎、消化器手術、Ｍ．Ｗｈｉｐｐｌｅ病（全身性細菌感染症による吸収不良症候群）
１４．高カルシウム血症の保因リスクとなる疾患：多臓器肉芽腫性疾患、結核、リンパ腫、原発性副甲状腺機能亢進症
１５．腎臓結石
１６．クレアチニンクリアランスが３０ｍＬ／ｍｉｎ以下（重篤な腎不全）
１７．乳製品に対する過敏症またはアレルギー
１８．薬物の使用：抗凝固薬、ステロイド薬、副甲状腺ホルモン、チアジド系利尿薬、抗痙攣薬、抗精神病薬、統合失調症治療薬、脂肪の吸収に影響を及ぼす薬
１９．骨代謝に影響を及ぼす可能性のある薬物の過去１年間における使用
２０．脂肪を含まない食事を摂っている、その他の極端な食習慣
２１．減量プログラムの実践、食事が医師の管理下にある
２２．急性または重篤な疾病の兆候：意図していない減量、寝汗、癌の治療など
２３．過去１年以内の骨折または過去３ヵ月以内の転倒
２４．アルコール消費量：≦１４０ｇ／週
２５．試験責任医師または試験分担医師が試験対象として不適合と判断した者
【００３１】
２）試験対象品
次の錠剤を試験品とした。
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール  １０μｇ含有製剤  
ビタミンＤ３  １０μｇ含有製剤
プラセボ製剤  ２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをセルロースで置換
【００３２】
３）試験プロトコール
無作為化二重盲検並行群間比較試験とした。摂取方法および摂取期間は、１日１回朝食後に１１２日間（１６週間）摂取する。
スクリーニング検査および摂取１６週後検査日には、体重測定、血圧、脈拍測定、臨床検査、食物摂取頻度調査（ＢＤＨＱ（株式会社ジェンダーメディカルリサーチ））を実施した。
臨床検査は、血液検査として２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５（ＯＨ）２  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ、ｓｅｒｕｍ  Ｃａ、ｉｎｔａｃｔ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）、血清２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度はＲＩＡ２抗体法にて測定した。
【００３３】
４）被験食品の摂取状況と安全性
１日１回の摂取の順守状況は最終検査時に残存被験食品数を算定して判定した。有害事象の出現状況は日誌および最終検査時に実施した問診により監視した。
【００３４】
５）指導事項
被験者には、試験期間中、下記の指導事項の尊守を求めた。
・長期旅行や激しい運動（登山、マラソン等）、太陽光に強度に曝露する行動を控える
・過剰な飲酒は避ける
・生活習慣を変更しない
・新しいサプリメント・医薬品の摂取開始は原則禁止（体調不良時の頓服薬の服用は可）
・他のヒト試験への参加や献血は禁止
【００３５】
６）統計解析
試験実施計画書に適合した解析対象集団（被験食品の摂取期間中の摂取率が８０％未満であった者、指導事項を守れなかった者、摂取後検査を受けなかった者を除外）を解析した。各群内の摂取前後の比較について対応のあるｔ検定を行い、有意水準は両側５％とした。統計解析ソフトはＥｘｃｅｌ統計ｖｅｒ．７（エスミ社）を使用した。
【００３６】
２．結果
１）被験者
スクリーニング試験には１１２名が参加し、そのうち被験者の選択基準に適合し除外基準に該当しない８２名の被験者をランダム化した。ランダム化後、摂取開始前に３例が同意を撤回した。試験食品の摂取を開始した被験者はプラセボ群２７例、ビタミンＤ３群２６例、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群２６例であった。うち、７例が個人的な理由により同意を撤回（プラセボ群：摂取後検査日の都合が悪いため１例、ビタミンＤ３群：膝・肩の痛みがあるため１例、歯科治療を開始するため１例、摂取後検査日の都合が悪いため１例、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群：胃炎のため１例、家族の看病のため１例、アトピー性皮膚炎の治療を開始するため１例）し、１例が試験責任医師の判断により中止（ビタミンＤ３群：風邪等の症状が続き内服治療をおこなったため）となり、計７０例が試験を完遂した。完遂した被験者のうち試験計画書に適合しないと判断された被験者４例（プラセボ群：指導事項からの逸脱（高強度の運動を継続的におこなったため）１例、ビタミンＤ３群：試験食品の摂取率が８０％未満１例、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群：試験食品の摂取率が８０％未満２例）を除いた６６名を試験実施計画書に適合した解析対象集団とした。試験実施計画書に適合した解析対象集団の背景を表１に示した。
【００３７】
【表１】
2018131423.tif 000003
【００３８】
２）血液検査
血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度はビタミンＤ３群、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群でベースライン検査に比べて最終検査時で有意に上昇した。一方プラセボ群では有意に低下した（図１参照）。その他の血液項目の結果について、表２に示した。血中１，２５（ＯＨ）２ＤはビタミンＤ３群、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で、ベースライン検査に比べて最終検査時で有意に上昇した。ｃａｌｃｉｕｍ濃度は３群ともベースライン検査に比べて最終検査時で有意に上昇したが、ビタミンＤ３群、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群においては、血中ｃａｌｃｉｕｍ濃度が基準値（１０．２ｍｇ／ｄＬ）を超えた被験者は認められなかった。プラセボ群では１例で１０．０ｍｇ／ｄＬから１０．５ｍｇ／ｄＬへ変動した。副甲状腺ホルモンは３群とも有意な変動は認められなかった。ＨｂＡ１ｃはビタミンＤ３群のみ有意に上昇したが、基準値内（４．６−６．２％）での変動であった。
【００３９】
【表２】
2018131423.tif 000004
【００４０】
３）ＢＭＩ、血圧
３群ともＢＭＩに有意な変動はなかった。拡張期血圧は３群ともベースライン検査に比べて最終検査時で有意に上昇した。拡張期血圧は３群とも有意な変動は認められなかった。
【００４１】
４）食事調査、活動量
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群でのみ、タンパク質、ビタミンＤの摂取量がベースライン検査に比べて最終検査時で有意に低下した。その他の項目に有意な変動は認められなかった。
【００４２】
５）安全性
被験食品摂取に関連する有害事象の報告はなかった。
【００４３】
３．評価・考察
閉経後の女性おいて、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの１０μｇ／日摂取により有意に血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度が上昇し、血中２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度が３０ｎｇ／ｍＬに達することが確認できた。
以上の試験から、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをヒトに連日１０μｇ／日投与することで、血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度を３０ｎｇ／ｍＬを超えて維持できることが明らかとなった。
【００４４】
＜臨床試験（２）＞
以下に２５−ヒドロキシコレカルシフェロールをヒトに投与し、上気道感染症の予防又は緩和を達成できることを確認した試験例を示して説明する。
１．２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取による上気道感染症への影響確認試験
１）試験対象者
予め同意を取得した被験者候補４２８例に、スクリーニング検査として、疾病歴や飲酒習慣、食習慣などの背景調査、体調確認、計測、臨床検査を実施し、選択条件に合致し、除外基準に合致しない２５２例を選択した。
被験者の選択は、同意能力を有しており、Ｉ：同意取得時の年齢が４５歳以上７４歳以下の健常日本人、ＩＩ：血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が３０ｎｇ／ｍＬ以下、ＩＩＩ：ＢＭＩが１８．５ｋｇ／ｍ２以上２４．９ｋｇ／ｍ２以下に該当する者であり、以下の除外条件に該当しない者を選択した。
Ｉ        ：喫煙者
ＩＩ      ：重篤な疾患（例：肝疾患、腎疾患、感染症、癌）に罹患している者
ＩＩＩ    ：試験結果に影響を与える疾患（例：高カルシウム血症）に罹患している者
ＩＶ      ：試験期間中に日光に過度に曝露する行動（例：農作業、リゾート旅行）予定がある者
Ｖ        ：空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄＬ以上の者
ＶＩ      ：過去６ヵ月以内にホルモン補充療法を受けた者
ＶＩＩ    ：試験期間中のマルチビタミン以外のサプリメントの使用者、ただし試験開始前に摂取を中止し試験が終わるまで摂取しない者は除く
ＶＩＩＩ  ：過去３ヵ月以内のビタミンＤサプリメントの使用
ＩＸ      ：過去３ヵ月以内に６００ｍｇ／日以上のカルシウムサプリメントの使用
Ｘ        ：高血圧：安静時血圧が１４５／９５ｍｍＨｇ以上
ＸＩ      ：高血圧の治療
ＸＩＩ    ：精神疾患の罹患歴、試験内容の理解が難しい状態
ＸＩＩＩ  ：高強度の運動を継続的に行う者（高強度の運動を週３回以上行う者）
ＸＩＶ    ：試験食品の吸収に影響する状態：腸管吸収障害、スプルー（小腸の吸収障害を伴う症候群）、大腸炎、消化器手術、Ｍ．Ｗｈｉｐｐｌｅ病（全身性細菌感染症による吸収不良症候群）
ＸＶ      ：高カルシウム血症の保因リスクとなる疾患：多臓器肉芽腫性疾患（サルコイドーシス）、結核、リンパ腫、原発性副甲状腺機能亢進症）
ＸＶＩ    ：腎臓結石
ＸＶＩＩ  ：クレアチニンクリアランスが３０ｍＬ／ｍｉｎ以下（重篤な腎不全）
ＸＶＩＩＩ：乳製品に対する過敏症またはアレルギー
ＸＩＸ    ：薬物の使用：抗凝固薬、ステロイド薬、副甲状腺ホルモン、チアジド系利尿薬、抗痙攣薬、抗精神病薬、統合失調症治療薬、脂肪の吸収に影響を及ぼす薬（ゼニカル、アライなどの末梢性肥満改善薬、脂肪吸収阻害薬）
ＸＸ      ：骨代謝に影響を及ぼす可能性のある薬物（ビスホスホネート、ホルモン補充療法薬、エストロゲン受容体調節因子、カルシトニン）の過去１年間における使用
ＸＸＩ    ：脂肪を含まない食事をとっている、その他の極端な食習慣
ＸＸＩＩ  ：減量プログラムの実践、食事が医師の管理下にある
ＸＸＩＩＩ：急性または重篤な疾病の兆候：意図していない減量、寝汗、癌の治療など
ＸＸＩＶ  ：アルコール消費量：≦１４０ｇ／週
ＸＸＶ    ：試験責任医師または試験分担医師が試験対象として不適合と判断した者
【００４５】
２）試験対象品
被験食品には２５−ヒドロキシコレカルシフェロール１０μｇを含有するハードカプセル製剤とした。プラセボは２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを結晶セルロースに置きかえ、色調などが被験食品と区別がつかないように作製した。２５−ヒドロキシコレカルシフェロールはＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．より入手した。
【００４６】
３）上気道感染症の診断と評価の基準
上気道感染症の発症、身体重症度およびｑｕａｌｉｔｙ−ｏｆ−ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）の評価には日本語版Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｕｐｐｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｓｕｒｖｅｙ−２１（ＷＵＲＳＳ−２１）を使用した。ＷＵＲＳＳ−２１は２１個の質問からなり、最初の質問（０−７のリッカート尺度：０＝症状なし、１＝ほんの少し具合が悪い、３＝少し具合が悪い、５＝中程度に具合が悪い、７＝ひどく具合が悪い）は試験期間中毎日回答させ、発症の有無および罹患期間の判定に使用した。
２番目から１１番目の１０個の質問は、上気道感染症の１０の身体症状（鼻水、鼻づまり、くしゃみ、咽頭痛、のどのいがらっぽさ、咳、のどかれ、鼻づまりによる頭部および顔面の圧迫感・重さ、痰がたまる、またそれによる胸部の圧迫感・疲労）に関する質問で、０−７のリッカート尺度（０＝なし、１＝とても軽い、３＝軽い、５＝中程度、７＝重度）を回答させ、合計値を身体重症度スコアとした。
１２番目から２０番目の９個の質問は、ＱＯＬに関する事象（物事を明確に考えられる、熟睡する、楽に呼吸できる、歩く、階段を上る、運動する、日常生活を行える、家の外で仕事ができる、家の中で仕事ができる、他人と交流ができる、自分の生活を楽しめる）についての質問で、０−７のリッカート尺度（０＝なし、１＝とても軽い、３＝軽い、５＝中程度、７＝重度）を回答させ、合計スコアをＱＯＬスコアとした。
上気道感染症の発症日は、最初の質問に２日連続で０を選択した後に、１−７を選択した日とし、消失日は、発症後２日連続で０を選択した時の２日前（最後に１−７を選択した日）とした。本試験における上気道感染症のイベントは、罹患期間（発症日から消失日の期間）が２日以上で、かつ罹患期間中の身体重症度スコアの最高値が１０を超えるものとした。罹患期間、身体重症度スコアおよびＱＯＬスコアは試験期間中の最高値を評価対象とした。
【００４７】
４）試験プロトコール
試験は無作為化二重盲検プラセボ対照並行群間比較試験とした。すなわち、試験に関与しない担当者が乱数を用いて割付表を作成し、無作為に被験者を２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群の２群に分け、それぞれを摂取させた。盲検化の対象は、試験に関与する者すべてであり、割付の開鍵は解析対象者の固定後に行った。
試験期間中は、ＷＵＲＳＳ−２１への記入と日誌に自覚症状および医薬品や健康食品の摂取など指導内容の逸脱の有無について記録させた。なお、本試験の試験食品摂取期間は冬季（１月）から春季（５月）までであった。
スクリーニング検査および摂取１６週後検査日には、体重測定、血圧、脈拍測定、臨床検査、食物摂取頻度調査（ＦＦＱｇ  ｖｅｒ．４．０（建帛社））を実施した。
臨床検査は、血液検査として２５（ＯＨ）Ｄ、１α，２５（ＯＨ）２  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ、ｓｅｒｕｍ  Ｃａ、ｉｎｔａｃｔ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、  ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ、ｐｌａｔｅｌｅ、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ、ＨｂＡ１Ｃ、ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｔｒａｎｓ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ、ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ａｌｂｕｍｉｎ、ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒａｔｉｏ、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ、ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ、ｓｏｄｉｕｍ、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ、ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、ｓｅｒｕｍ  ｉｒｏｎ、ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、尿検査はｕｒｉｎｅ  ｓｕｇａｒ、ｕｒｉｎｅ  ｏｃｃｕｌｔ  ｂｌｏｏｄ、ｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｕｒｉｎａｒｙ  ｃａｌｃｉｕｍ、ｕｒｉｎｅ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅを測定した。血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度はＲＩＡ２抗体法にて測定した。
【００４８】
５）症状観察
（ア）主要評価項目
摂取期間１６週間中の上気道感染症の発症率とした。上気道感染症の発症率は各群の上気道発症を発症した被験者数を各群の被験者数で除して算出した。
【００４９】
（イ）副次評価項目
身体重症度スコア、ＱＯＬスコア、罹患期間、４週間ごとの新規上気道感染症発症率とした。身体重症度スコア、ＱＯＬスコアおよび罹患期間は、上気道感染症を発症した被験者を評価対象とした。
【００５０】
６）サブグループ解析
骨軟化症やくる病などのリスクが高まるのは欠乏状態とされる血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ以下であり、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ超３０ｎｇ／ｍＬ以下では転倒などのリスクが高まる不足状態であるとしている。血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度低下が上気道感染症の発症率を増加させるという報告から、摂取前検査時の血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が不足状態の被験者および欠乏状態の被験者でそれぞれ、上気道感染症の発症率、身体重症度スコア、ＱＯＬスコア、罹患期間、４週間ごとの新規上気道感染症発症率を評価した。
【００５１】
７）探索的な有効性解析
探索的な有効性解析として、身体重症度スコアの合計値、ＱＯＬスコアの合計値を評価した。合計値は、摂取期間中の上気道感染症発症時のスコアをすべて合計して算出した。
【００５２】
８）安全性評価
安全性の評価は、臨床検査値の変動、被検者からの自覚症状の訴え、医師による有害事象についての慣例的な診察を基に評価した。
【００５３】
９）解析対象者
有効性解析対象は、試験実施計画書に適合した解析対象集団（ＰＰＳ）とした。ＰＰＳは、所定の試験スケジュールを完遂した被験者である最大の解析対象集団（Ｆｕｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｅｔ；ＦＡＳ）の内、Ｉ：試験食品の摂取率が８０％を下回った者、ＩＩ：試験結果の信頼性を損なう行為（日誌記録の欠損や指導事項の不遵守など）が顕著に見られる者、ＩＩＩ：割付後に除外基準に該当していたことが明らかになった者、ＩＶ：試験食品摂取開始日から上気道感染症を発症していた者、Ｖ：除外することが適当であると試験責任医師が判断した者、を除外した集団とした。
安全性の評価の内、有害事象についてはＦＡＳを評価対象とした。臨床検査値などの評価はＰＰＳを評価対象とした。
【００５４】
１０）統計解析  
被験者の年齢、ＢＭＩ、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度、血清１α，２５（ＯＨ）２  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ濃度、インタクトＰＴＨ、血清カルシウム、尿中カルシウム、クレアチニンクリアランスはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ、性別はＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔでプラセボ群と２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の比較を行った。
主要評価項目の摂取期間１６週間中の上気道感染症の発症率および副次評価項目の４週ごとの新規上気道感染症の発症率は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔで評価した。その他の副次評価項目の評価は、上気道感染症の罹患期間にはＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔ、身体重症度スコアおよびＱＯＬスコアはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔを適用した。なお、上気道感染症の罹患期間の中央値はカプラン−マイヤー法を用いて求めた。
検定の有意水準は両側５％とし、両側１０％を有意傾向とした。全ての解析はＪＭＰ（登録商標）１２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。
【００５５】
２．試験結果
１）被験者の背景  
同意を取得した被験者候補４２８例に対し、スクリーニング検査を実施し、２５２例の被験者を選択した。この２５２例を２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群にそれぞれ１２６例ずつ無作為に割付けた。このうち、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１例とプラセボ群の１例の計２例が、試験食品摂取前に同意の撤回をして、脱落した。この結果、２５０例が試験食品摂取を開始した。試験食品摂取中に２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１例、プラセボ群の２例が個人の理由で最終検査に来院できないことを理由に同意の撤回をして脱落し、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１２４例、プラセボ群の１２３例が所定の試験スケジュールを完遂した。試験スケジュールを完遂した２４７例の内、制限事項の不遵守により２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１例とプラセボ群の１例、食事調査などの回答状況から有効性の評価項目の信頼性の疑いがあったプラセボ群の１例、試験食品摂取開始日に上気道感染症を発症していた２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１３例、プラセボ群の１５例、試験食品摂取前より高血圧症の治療を開始し、除外基準に該当したことが明らかとなったプラセボ群の１例がＰＰＳより除外された。よって、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の１１０例、プラセボ群の１０５例がＰＰＳとなった。試験食品の摂取率は２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で９９．８％、プラセボ群で９９．４％であった。安全性の評価対象は試験食品を摂取した２５０例の内、安全性の評価ができると判断された２４８例（２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群１２５例、プラセボ群１２３例）となった。
本試験のＰＰＳの被験者背景情報を表３に示す。
【００５６】
【表３】
2018131423.tif 000005
【００５７】
性別を除き、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群との間に有意差が認められる項目はなかった。なお、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度に関して、欠乏状態（２０  ｎｇ／ｍＬ以下）と判断される者は２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で６１例、プラセボ群で６０例、不足状態（２０ｎｇ／ｍＬ超３０ｎｇ／ｍＬ以下）と判断される者は２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で４９例、プラセボ群で４５例であった。
ＦＦＱｇによる食事調査の結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
2018131423.tif 000006
【００５９】
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群およびプラセボ群で試験食品摂取前から摂取１６週後時点で有意に変動した項目はなく、群間で有意な差を示す項目もなく、本試験期間中での食習慣の大きな変動はなかったものと推測された。
【００６０】
３．有効性評価
１）主要評価項目
本試験で摂取期間中に上気道感染症を発症した被験者は２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で４１例、プラセボ群では４３例であった。なお、摂取期間中の上気道感染症の総イベント数は２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で５２件、プラセボ群では６６件であった。
主要評価項目である摂取期間１６週間中の上気道感染症の発症率は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群で３７．３％、プラセボ群で４１．０％であった（表５参照）。
【００６１】
【表５】
2018131423.tif 000007
【００６２】
２）副次評価項目
身体重症度スコアは、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群が２６．７±１１．６であったのに対し、プラセボ群で３１．２±１６．３であり、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群が低値ではあった。ＱＯＬスコアについては、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群が２７．６±１７．２であったのに対し、プラセボ群で３１．３±１９．３であり、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群が低値であった。
上気道感染症の罹患期間については、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群（中央値：１０日間）はプラセボ群（中央値：１３日間）と比較して、低値であった（表５参照）。
２５（ＯＨ）Ｄの活性化（ヒドロキシル化）は主として腎臓が担っていることから、腎機能マーカーであるクレアチニンクリアランスと性別を調整因子として、罹患期間についてさらに解析を行ったところ、食品効果が有意（ｐ＝０．０４６）であり、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取による上気道感染症の罹患期間短縮効果が示された。
４週ごとの新規上気道感染症発症率については、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群およびプラセボ群ともに季節が進むにつれて、発症率が低下していた。また発症率の低下は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群がプラセボ群と比較して早く低下しており、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取による影響と判断した（表６参照）。
【００６３】
【表６】
2018131423.tif 000008
【００６４】
３）サブグループ解析
スクリーニング時の血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ以下の２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層および２０ｎｇ／ｍＬ超３０ｎｇ／ｍＬ以下の２５（ＯＨ）Ｄ不足層の上気道感染症の発症率、身体重症度スコア、ＱＯＬスコア、罹患期間、４週ごとの新規上気道感染症発症率を表７および表８に示す。
【００６５】
【表７】
2018131423.tif 000009
【００６６】
【表８】
2018131423.tif 000010
【００６７】
上気道感染症の発症率については、血清２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層および不足層のいずれにおいても、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取による発症率への影響について、プラセボ群との有意差はなかった。しかしながら、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群において、２５（ＯＨ）Ｄ不足層は欠乏層と比較して、上気道感染症の発症率が低く、高い血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が上気道感染症の発症予防に有効であった。
４週ごとの新規上気道感染症イベントの発症率については、血清２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層および不足層のいずれにおいても、試験期間が経過するにつれて、発症率の低下が認められた。しかしながら、いずれの層でも２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群に有意な差は認められなかった。上気道感染症の発症率の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群の差に着目すると、２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層では、摂取開始９−１２週後が最大（２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群：８．２％、プラセボ群：１８．３％）であった。一方で、２５（ＯＨ）Ｄ不足層では、摂取開始後５−８週後に２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群とプラセボ群の差が最大（２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群：１０．２％、プラセボ群：２２．２％、ｐ＝０．１５９）であり、２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層と比較して、２５（ＯＨ）Ｄ不足層の方が２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取群の上気道感染症の発症率の低下は早かった。
身体重症度スコアおよびＱＯＬスコアについては、２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層では、ＱＯＬスコアがプラセボ群と比較して低値であった。一方で、２５（ＯＨ）Ｄ不足層は、身体重症度スコアがプラセボ群と比較して低値であった。
【００６８】
４）有効性
被験食品摂取期間中の上気道感染症の身体重症度と上気道感染症によるＱＯＬの低下を、罹患期間などとあわせて総合的に判断するために、試験食品摂取期間中の身体重症度スコアとＱＯＬスコアの合計値をそれぞれ算出した。その結果を表９に示す。
【００６９】
【表９】
2018131423.tif 000011
【００７０】
身体重症度スコアの合計値は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群はプラセボ群と比較して有意に低値（ｐ＝０．０４９６）であった。ＱＯＬスコアの合計値では、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群はプラセボ群と比較して有意に低値（ｐ＝０．０１９）であった。これらの結果から、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取が上気道感染症罹患時の身体重症度の緩和やＱＯＬを改善したことが明らかとなった。
【００７１】
５）２５（ＯＨ）Ｄ血中濃度
試験開始前、試験食品摂取期間中の血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、株式会社エスアールエルに依頼しＲＩＡ２抗体法にて測定した。
結果を表１０に示す。
【００７２】
【表１０】
2018131423.tif 000012
【００７３】
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取群の１６週経過後の血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、２５（ＯＨ）Ｄ欠乏層で初期値１５．４±２．７ｎｇ／ｍＬから４１．９±１１．６ｎｇ／ｍＬと約２．７倍上昇した。また、２５（ＯＨ）Ｄ不足層で初期値２４．９±３．１ｎｇ／ｍＬから４９．６±１３．６ｎｇ／ｍＬと約１．９９倍上昇した。このことから２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトが１日１０μｇ摂取し続けると、３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持できることが分かった。
【００７４】
６）安全性
いくつかの項目で、有意な変動が見られた項目があったが、いずれも臨床的意義のない変動であると試験責任医師は判断した。また、期間中に高カルシウム血症を発症した被験者はいなかった。
有害事象は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール群の７３例に２５６件、プラセボ群の７４例に３３９件発生した。発生した有害事象については感冒、腹痛などの症状で、いずれも軽度であり、試験期間中に症状が消失した。すべての有害事象に関して、試験責任医師は試験食品との関連性を否定した。有害事象の発現率は群間で差は認められなかった。
以上の結果より、本試験条件下における２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの安全性に問題は無かった。
【００７５】
４．総合評価
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取によって血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が上昇していると考えられる摂取開始から９−１２週間後に、上気道感染症の発症率でプラセボ群との差が大きかった。これは、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度を高くすることで上気道感染症を予防できたものと評価した。血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度が欠乏（２０ｎｇ／ｍＬ以下）している被験者層と比較して血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度が不足（２０ｎｇ／ｍＬ超３０ｎｇ／ｍＬ以下）している被験者層でより早く発症率の低下がみられた。
すなわち血清中の２５（ＯＨ）Ｄが３０ｎｇ／ｍＬ以下のヒトに本発明の組成物を投与することで上気道感染症を低下させる。
また、上気道感染症の罹患期間を、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取によって短縮することが確認された（軽減できた）。さらに、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール摂取によって上気道感染症罹患時の身体重症度およびＱＯＬを改善したことから、上気道感染症の緩和効果を本発明の組成物が有することが確認できた。
【００７６】
次に、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含有する組成物の安定性について試験例を示し説明する。これは、上気道感染症の予防又は上気道感染症状緩和効果をより確実にすることを目的とした取り組みである。すなわち血中２５（ＯＨ）Ｄ濃度を長期にわたり高く維持させる為には、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの有効投与量を確実に投与できる組成物（製剤）である必要があり、そのためには組成物（製剤）中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの安定性の確保が非常に重要なことに基づく。組成物（製剤）中に含有される２５−ヒドロキシコレカルシフェロールが安定化されることで、長期保存に耐えうる市場に流通させてもよい製品となる。
尚、参考情報として、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）も試験した。以下の説明中で２５−ヒドロキシコレカルシフェロールとコレカルシフェロールを区別しないときはビタミンＤ３類と表記している。
【００７７】
＜２５−ヒドロキシコレカルシフェロール組成物の安定性試験＞
以下に試験例を示し、本発明を説明する。
１．レシチン類によるビタミンＤ３類の安定性試験
（１）ビタミンＤ３類
下記の表１１に示すビタミンＤ３類を用いて試験をおこなった。
【００７８】
【表１１】
2018131423.tif 000013
【００７９】
（２）レシチン類
市販の下記の表１２に示すレシチン類を試験に用いた。
【００８０】
【表１２】
2018131423.tif 000014
【００８１】
（３）試験方法
・試料の調製
１）コレカルシフェロールの調製
ビタミンＤ３１７５μｇを無水エタノール１７５０ｍｇに溶解させ溶液とした。この溶液１．７５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各レシチン類１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥して除去し試験用の組成物を得た。
【００８２】
２）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの調製
（２５（ＯＨ）Ｄ３）１０．２０５ｍｇを無水エタノール５００ｇに溶解させ溶液とした。この溶液２．５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各レシチン類１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥し試験組成物を得た。
【００８３】
３）安定性試験
上記試験組成物を６０℃の恒温槽で２週間保存し、ビタミンＤ３類の残存率を測定した。
・コレカルシフェロールの分析方法
１．コレカルシフェロール含有試験組成物約０．０１ｇを精密に量り、２０ｍＬ程度の容器に入れ、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、５分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに採取し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．コレカルシフェロール標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整後、０．１、０．５、１．０、５．０、１０．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜、希釈し、標準溶液とする。
試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、コレカルシフェロールのピーク面積を求める。標準溶液のコレカルシフェロールのピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料のコレカルシフェロールの含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデシル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：アセトニトリル
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
含有量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液のコレカルシフェロール面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【００８４】
・２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの分析方法
１．２５−ヒドロキシコレカルシフェロール(２５（ＯＨ）Ｄ３)含有試験組成物約０．１ｇを２０ｍＬ程度の容器に精密に量り、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、１０分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに移し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．２５（ＯＨ）Ｄ３標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整後、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜希釈し、標準溶液とする。試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、２５（ＯＨ）Ｄ３のピーク面積を求め標準溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３のピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料の２５（ＯＨ）Ｄ３含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデシル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：８０％アセトニトリル水溶液
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
２５（ＯＨ）Ｄ３含量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【００８５】
（４）結果
各試料の安定性試験結果を表１３及び図２に示す。なお結果は、保存期間経過後の残存率で表している。
【００８６】
【表１３】
2018131423.tif 000015
【００８７】
コレカルシフェロールは大豆レシチン、卵黄レシチン、酵素分解卵黄レシチン、ヒマワリレシチン、ライスオイルレシチンにより安定化し、酵素分解大豆レシチンでは安定化しなかった。一方２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、コレカルシフェロールとは異なり、酵素分解大豆レシチンで最も安定化され、次いでライスオイルレシチンで安定化した。また２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、大豆レシチンや卵黄レシチン、酵素分解卵黄レシチン及びヒマワリレシチンでは安定化しなかった。
【００８８】
＜グリセリン脂肪酸エステル及び／又はソルビタン脂肪酸エステルによるビタミンＤ３類の安定性試験＞
（１）ビタミンＤ３類
下記の表１４に示すビタミンＤ３類を用いて試験をおこなった。
【００８９】
【表１４】
2018131423.tif 000016
【００９０】
（２）グリセリン脂肪酸エステル及びソルビタン脂肪酸エステル
グリセリン脂肪酸エステル及びソルビタン脂肪酸エステルとして下記の表１５に示す化合物を試験に用いた。
【００９１】
【表１５】
2018131423.tif 000017
【００９２】
（３）試験方法
・試料の調製
１）コレカルシフェロールの調製
ビタミンＤ３１７５μｇを無水エタノール１７５０ｍｇに溶解させ溶液とした。この溶液１．７５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各グリセリン脂肪酸エステル又はソルビタン脂肪酸エステル１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥して除去し試験用の組成物を得た。
【００９３】
２）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの調製
２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５（ＯＨ）Ｄ３）１０．２０５ｍｇを無水エタノール５００ｇに溶解させ溶液とした。この溶液２．５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各グリセリン脂肪酸エステル又はソルビタン脂肪酸エステル１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥し試験組成物を得た。
【００９４】
３）安定性試験
上記試験組成物を６０℃の恒温槽で２週間保存し、ビタミンＤ３類の残存率を測定した。
・コレカルシフェロールの分析方法
１．コレカルシフェロール含有組成物約０．０１ｇを精密に量り、２０ｍＬ程度の容器に入れ、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、５分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに採取し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．コレカルシフェロール標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整する。ついで、０．１、０．５、１．０、５．０、１０．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜、希釈し、標準溶液とする。
試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、コレカルシフェロールのピーク面積を求め、標準溶液のコレカルシフェロールのピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料のコレカルシフェロールの含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデシル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：アセトニトリル
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
含有量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液のコレカルシフェロール面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【００９５】
・２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの分析方法
１．２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５（ＯＨ）Ｄ３）含有組成物約０．１ｇを２０ｍＬ程度の容器に精密に量り、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、１０分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに移し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．２５（ＯＨ）Ｄ３標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整後、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜希釈し、標準溶液とする。試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、２５（ＯＨ）Ｄ３のピーク面積を求め標準溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３ピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料の２５（ＯＨ）Ｄ３含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長  ２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデシル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：８０％アセトニトリル水溶液
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
２５（ＯＨ）Ｄ３含量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【００９６】
（４）結果
各試料の安定性試験結果を表１６及び図３に示す。なお結果は、保存期間経過後の残存率で表している。
【００９７】
【表１６】
2018131423.tif 000018
【００９８】
２５（ＯＨ）Ｄ３は、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン（サンソフトＮｏ.８１８Ｒ）で最も安定化し、次いでモノオレイン酸ペンタグリセリン（サンソフトＡ−１７１Ｅ）、モノグリセライド（エマルジーＭＨ）、モノラウリン酸ソルビタン（Ｌ−３００）により安定化した。しかし、デカオレイン酸デカグリセリン（サンソフトＱ−１７１０Ｓ）、ペンタオレイン酸デカグリセリン（リョートーポリグリエステルＯ−５０Ｄ）には安定化効果が確認できなかった。一方、コレカルシフェロールは、モノラウリン酸ソルビタンで最も安定化し、他はほぼ同様な結果であった。
【００９９】
＜水溶性セルロース誘導体によるビタミンＤ３類の安定性試験＞
（１）ビタミンＤ３類
下記の表１７に示すビタミンＤ３類を用いて試験をおこなった。
【０１００】
【表１７】
2018131423.tif 000019
【０１０１】
（２）セルロース及びセルロース誘導体
水溶性セルロース誘導体として下記の表１８に示す化合物を試験に用いた。
【０１０２】
【表１８】
2018131423.tif 000020
【０１０３】
（３）試験方法
・試料の調製
１）コレカルシフェロールの調製
コレカルシフェロール結晶１７５μｇを無水エタノール１７５０ｍｇに溶解させ溶液とした。この溶液１．７５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各結晶セルロース及びセルロース誘導体１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥して除去し、試験用の組成物を得た。
【０１０４】
２）２５（ＯＨ）Ｄ３の調製
（２５（ＯＨ）Ｄ３）１０．２０５ｍｇを無水エタノール５００ｇに溶解させ溶液とした。この溶液２．５ｇをバイアル瓶に予め秤量してあった各結晶セルロース及びセルロース誘導体１ｇに加え、ボルテックスミキサーを用いて３分間撹拌混合した。その後、エタノールを減圧乾燥し試験組成物を得た。
【０１０５】
３）安定性試験
上記試験組成物を６０℃の恒温槽で２週間保存し、ビタミンＤ３類の残存率を測定した。
・コレカルシフェロールの分析方法
１．コレカルシフェロール含有試験組成物約０．０１ｇを精密に量り、２０ｍＬ程度の容器に入れ、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、５分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに採取し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．コレカルシフェロール標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整後、０．１、０．５、１．０、５．０、１０．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜、希釈し、標準溶液とする。
試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、コレカルシフェロールのピーク面積を求め、標準溶液のコレカルシフェロールのピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料のコレカルシフェロールの含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：アセトニトリル
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
含有量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液のコレカルシフェロール面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【０１０６】
・２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの分析方法
１．２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５（ＯＨ）Ｄ３）含有試験組成物約０．１ｇを２０ｍＬ程度の容器に精密に量り、１０ｍＬのホールピペットにてエタノールを加え撹拌し、１０分間超音波にかけ撹拌後約１ｍＬをエッペンチューブに移し、１５０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を試料溶液とする。
２．２５（ＯＨ）Ｄ３標準品を１ｍｇ／ｍＬとなるようエタノールにて調整後、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍＬとなるようエタノール溶液にて適宜希釈し、標準溶液とする。試料溶液及び標準溶液それぞれ１０μＬを以下の条件の高速液体クロマトグラフィーに注入し、２５（ＯＨ）Ｄ３のピーク面積を求め標準溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３のピーク面積から検量線（ｙ＝ｂｘ＋ａ：ａ＝切片、ｂ＝傾き）を求め、下記に示した計算法に従って試料の２５（ＯＨ）Ｄ３含量を求める。
３．測定条件
検出器    ：紫外吸光光度計（測定波長２６５ｎｍ）
カラム    ：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に粒径５μｍのオクタデシル化シリカゲルを充填したもの（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ  Ｃ−１８  ＵＧ−１２０  資生堂社製）
カラム温度：４０℃
移動相    ：８０％アセトニトリル水溶液
流速      ：１ｍＬ／分
４．計算法
２５（ＯＨ）Ｄ３含量（μｇ／ｇ）＝（試料溶液の２５（ＯＨ）Ｄ３面積−切片）／傾き×定容量／試料採取量×純度
【０１０７】
（４）結果
各試料の安定性試験結果を表１９及び図４に示す。なお結果は、保存期間経過後の残存率で表している。
【０１０８】
【表１９】
2018131423.tif 000021
【０１０９】
２５（ＯＨ）Ｄ３は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースによって安定化することが確認できた。一方、コレカルシフェロールはヒドロキシプロピルセルロースで最も安定化し、メチルセルロースでは安定化しなかった。また結晶セルロースは、ビタミンＤ３類の安定化には寄与しなかった。
【０１１０】
前述の結果を踏まえ、以下に、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを有効成分とした安定な上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物の実処方例を示す。
１．２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物の調製（前述した安定性試験で調製したものと同一組成。これを基本処方（ａ、ｂ）に配合して製剤化する）
[２５（ＯＨ）Ｄ３]  
１．０２０５ｇを無水エタノール５０ｋｇに溶解させ溶液とした。この溶液２５０ｇを量りとり、下記に示す成分Ａ〜Ｉのいずれか１００ｇを加え、撹拌混合した後、乾燥して２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物約１００ｇを得た。
尚、以下の説明中、２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物とするために添加した成分がＡの場合、得られた２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物のことを「２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物Ａ」とあらわす。
成分Ａ；酵素分解大豆レシチン（理研ビタミン(株)製、レシマールＥＬ）
成分Ｂ；ライスレシチンオイル（築野食品工業(株)製、ライスレシチン）
成分Ｃ；モノラウリン酸ソルビタン（理研ビタミン(株)製、Ｌ−３００）
成分Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン（太陽化学(株)製、サンソフトＮｏ．８１８Ｒ）
成分Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン（太陽化学(株)製、サンソフトＡ−１７１Ｅ）
成分Ｆ；モノグリセライド（理研ビタミン(株)製、エマルジーＭＨ）
成分Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（信越化学工業(株)製、メトローズＮＥ−４０００）
成分Ｈ；ヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達(株)製、セルニーＳＳＬ）
成分Ｉ；メチルセルロース（信越化学工業(株)製、ＭＣＥ−４００）
【０１１１】
２．錠剤の実処方例
錠剤の基本処方ａに、２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｉ；メチルセルロースのいずれか）を５７．１５質量％加えて粉体を調製した。得られた粉体を、直径７ｍｍ平型隅角杵を使用し、１錠当たりの重量を１００ｍｇに設定して打錠を行った。
[基本処方ａ]                                                          質量％
１．２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉのいずれか）    ５７．１５
２．結晶セルロース                                                ４２．３５
３．ステアリン酸マグネシウム                                        ０．５
【０１１２】
２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｉ；メチルセルロース）のいずれかを含む本錠剤１錠は、２５（ＯＨ）Ｄ３を約１０μｇ含有する。そして本錠剤中の２５（ＯＨ）Ｄ３は１年経過後も８０％以上を維持した。２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトが本発明の錠剤を１日に１〜２錠摂取することで、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持することができ、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和作用を発揮し非常に有用であった。
【０１１３】
３．ハードカプセルの実処方例
ハードカプセル充填用粉体の基本処方ｂに、２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ａ；酵素分解大豆レシチン、Ｂ；ライスレシチンオイル、Ｃ；モノラウリン酸ソルビタン、Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｈ；ヒドロキシプロピルセルロース、Ｉ；メチルセルロースのいずれか）を５７．１５質量％加えて粉体を調製した。得られた粉体を、３号カプセルを使用して、１カプセル当たり１００ｍｇの粉体を充填した。
[基本処方ｂ]                                                          質量％
１．２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉのいずれか）                                                                    ５７．１５
２．乳糖                                                          ２０
３．結晶セルロース                                                ２２．３５
４．ステアリン酸マグネシウム                                        ０．５
【０１１４】
２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ａ；酵素分解大豆レシチン、Ｂ；ライスレシチンオイル、Ｃ；モノラウリン酸ソルビタン、Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｈ；ヒドロキシプロピルセルロース、Ｉ；メチルセルロース）のいずれかを含む本ハードカプセル１錠は、２５（ＯＨ）Ｄ３を約１０μｇ含有する。そして本ハードカプセル中の２５（ＯＨ）Ｄ３は１年経過後も８０％以上を維持した。２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトが本発明のハードカプセルを１日に１〜２錠摂取することで、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持することができ、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和作用を発揮し非常に有用であった。
【０１１５】
４．軟カプセルの実処方例
まず軟カプセルを調製し、次に前記した基本処方ｂに２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ａ；酵素分解大豆レシチン、Ｂ；ライスレシチンオイル、Ｃ；モノラウリン酸ソルビタン、Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｈ；ヒドロキシプロピルセルロース、Ｉ；メチルセルロースのいずれか）を５７．１５質量％加えた粉体を調製し、１軟カプセル当たり１００ｍｇとなるように充填した。
（軟カプセル処方）                                                    質量％
１．ゼラチン                                                      ７３．５
２．グリセリン                                                    １４．５
３．Ｄ−ソルビトール（７０％）                                    １２
【０１１６】
２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（Ａ；酵素分解大豆レシチン、Ｂ；ライスレシチンオイル、Ｃ；モノラウリン酸ソルビタン、Ｄ；縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、Ｅ；モノオレイン酸ペンタグリセリン、Ｆ；モノグリセライド、Ｇ；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、Ｈ；ヒドロキシプロピルセルロース、Ｉ；メチルセルロース）のいずれかを含む本ソフトカプセル１錠は、２５（ＯＨ）Ｄ３を約１０μｇ含有する。そして本ソフトカプセル中の２５（ＯＨ）Ｄ３は１年経過後も８０％以上を維持した。２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの血中濃度が３０ｎｇ／ｍＬに満たないヒトが本発明のソフトカプセルを１日に１〜２錠摂取することで、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持することができ、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和作用を発揮し非常に有用であった。
【０１１７】
一方、２５（ＯＨ）Ｄ３の安定化処理を施していないハードカプセル製剤[２５（ＯＨ）Ｄ３含有組成物（添加成分；結晶セルロース）をハードカプセル充填用粉体の基本処方ｂに５７．１５質量％加えて粉体を調製し、得られた粉体を、３号カプセルを使用して１カプセル当たり１００ｍｇの粉体を充填したもの]は、アルミ袋に３０粒入れてシリカゲルを１グラム同梱し２５℃６０％ＲＴで保管したときの１年後の２５（ＯＨ）Ｄ３含有量は初期値（１００）から７３％にまで低下しており、安定な製剤として市場供給できないものであった。
【０１１８】
以上示したとおり、本発明により、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを１日当たり１０μｇ投与することができる、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口組成物が提供できた。この組成物は、日常的に摂取することで血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持することができた。
また、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを、酵素分解大豆レシチン又はライスレシチンオイルから選ばれる１以上のレシチン、縮合リシノレイン酸ペンタグリセリン、モノオレイン酸ペンタグリセリン、モノグリセリン脂肪酸及びモノラウリン酸ソルビタンから選ばれる１以上の界面活性剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びメチルセルロースから選択される１以上のセルロース誘導体、のいずれか或いは複数を組み合わせて調製することで２５−ヒドロキシコレカルシフェロール安定化組成物とすることができ、そのまま散剤や顆粒剤にしたり、これを含有する錠剤、ソフトカプセル製剤、ハードカプセル製剤にしたりすることができた。これらの製剤は、血中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール濃度を３０〜５０ｎｇ／ｍＬに維持するために組成物中に含有される２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ３代謝物）が室温保管１年後でも８０％を下回らないように安定化された、上気道感染症の予防または上気道感染症状緩和用の経口用組成物として提供できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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