(57)【要約】      （修正有）【課題】血管の狭窄又は閉塞疾患（例えば、脳血管疾患、心血管疾患、動脈硬化性血管疾患、冠状動脈疾患、末梢血管疾患など）の治療に効果的なサクサチリン誘導体の提供。【解決手段】特定な配列のアミノ酸配列からなるサクサチリンと免疫グロブリンのＦｃ領域がコンジュゲーションされたことを特徴とするサクサチリン誘導体。【選択図】図６
2018161136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるサクサチリンと免疫グロブリンのＦｃ領域がコンジュゲーションされたことを特徴とするサクサチリン誘導体。
【請求項２】
前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、前記サクサチリンのＮ末端又はＣ末端にコンジュゲーションされている請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項３】
前記サクサチリン誘導体は、Ｎ末端にリーダー配列がさらにコンジュゲーションされている請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項４】
前記サクサチリン誘導体は、天然のサクサチリンよりも４〜６．５倍の増加した半減期を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項５】
前記サクサチリン誘導体は、天然のサクサチリンと類似した血栓溶解能を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項６】
前記サクサチリン誘導体は、血小板凝集に対するＩＣ５０値が１００〜５００ｎＭである請求項５に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項７】
前記サクサチリン誘導体は、血小板凝集に対するＩＣ５０値が１００〜２５０ｎＭである請求項６に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項８】
前記サクサチリン誘導体は、血栓内に存在するインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に結合して血栓を分解する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項９】
前記サクサチリン誘導体は、血栓を構成する血小板表面のＧＰ  ＩＩｂ−ＩＩＩａに結合して血栓を分解する請求項８に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１０】
前記サクサチリン誘導体は、好中球に存在するインテグリンαＭβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ値の結合力を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１１】
前記サクサチリン誘導体は、好中球に存在するインテグリンαＬβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ値の結合力を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載のサクサチリン誘導体をコードすることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２に記載のヌクレオチド配列；及び（ｂ）前記ヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項１から１１のいずれかに記載のサクサチリン誘導体の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする血栓溶解用組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物を含むことを特徴とする血管の狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療用の薬剤学的組成物。
【請求項１７】
前記血管は、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、小動脈、毛細血管、又は小静脈である請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１８】
前記血管の狭窄又は閉塞疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、小窩性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、片頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、器具血管形成術以後再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１９】
前記薬剤学的組成物は、血管内に直接注入される方式で投与される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２０】
前記薬剤学的組成物は、血栓によって血管が閉塞した患者に投与される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２１】
前記閉塞は、部分的閉塞又は完全閉塞である請求項２０に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２２】
前記薬剤学的組成物は、プラスミノゲン活性剤（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含まない請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２３】
請求項１から１１のいずれかに記載のサクサチリン誘導体の薬剤学的有効量を対象に投与する工程を含むことを特徴とする血管の狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療方法。
【請求項２４】
前記血管の狭窄又は閉塞疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、小窩性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、片頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、器具血管形成術以後再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国保健福祉部の支援下で課題番号Ａ０８５１３６によってなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は、韓国保健産業振興院、研究事業名は、“先導型特性化研究開発事業”、研究課題名は、“先導型脳心血管疾患融合研究事業団”、主管機関は、延世大学校産学協力団、研究期間は、２０１２．１２．０１〜２０１３．１１．３０である。
【０００２】
本願は、２０１３年７月３０日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−００９０４６８号、及び２０１４年７月３０日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００９７４６１号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。
【０００３】
本発明は、増加した半減期を有するサクサチリン誘導体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
ほとんどの脳卒中は、脳内の主幹動脈又は脳内のさらに小さな動脈の血栓塞栓性閉塞（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）によって引き起こされる（非特許文献１）。虚血性脳卒中の場合、早い血栓溶解のみが、不可避な完全な梗塞の発病を抑制するための唯一に確立された治療方法である（非特許文献２）。組換え組織プラスミノゲン活性因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｏｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｒｔ−ＰＡ）の静脈内投与による治療法は、虚血性脳卒中の発病（ｏｎｓｅｔ）後、４．５時間内に行うことができる現在唯一に承認された虚血性脳卒中に対する治療法である（非特許文献３〜４）。しかし、半分以上の患者が血栓溶解治療後、成功的な再貫通（ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を成すのに失敗する（非特許文献５〜６）。たとえ閉塞した動脈が血栓溶解治療法によって成功的に再貫通されるとしても、このような回復（ｂｅｎｅｆｉｔｓ）は、再貫流損傷（非特許文献７）、脳出血（非特許文献８）、及び再閉塞（非特許文献９）の危険によって再び弱化される。また、ｒｔ−ＰＡは、神経毒性を有すると報告された（非特許文献１０〜１４）。
【０００５】
再貫通戦略は、その効能が証明されたが、適用可能性の限界及び潜在的な副作用を誘発するために、ｒｔ−ＰＡよりもさらに効能に優れた新規な血栓溶解製剤（ａｇｅｎｔｓ）を開発するための多くの試み（ｅｆｆｏｒｔｓ）があった。このような試みは、ｔ−ＰＡの変異体、動物ソース由来のプラスミノゲン活性因子及びマイクロプラスミンを含む。前述した薬物（ｄｒｕｇｓ）は、次のような目的を有する：（ａ）フィブリン特異性の増大；（ｂ）血漿内半減期の延長；（ｃ）プラスミノゲン活性因子抑制剤−１による抑制能の減少；及び（ｄ）神経毒性の回避。複数の薬物は、臨床実験を完了し、幾つかの薬物は、現在効能を研究している状態である。このような薬物は、血栓内フィブリンをターゲットとし、例えば、ｒｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）などの血栓溶解剤がこれに該当する。しかし、血栓は、血小板−フィブリノーゲン相互作用によって形成される。また、トロンビン、白血球及び赤血球細胞も、血栓の構成成分である。フィブリンをターゲットとする血栓溶解製剤に対する血栓の抵抗性は、脳卒中患者で見られる低い再開通率（ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）の主な理由の１つであり、このような現象は、血小板−豊富血栓による閉塞でさらに一般的に起こりうる。このような側面で、血小板をターゲットとする治療法が改善された血栓溶解の効能のために、フィブリンをターゲティングする治療法に対する選択的又は追加的な方法であり得る。
【０００６】
インテグリンファミリーのメンバーである血小板糖タンパク質（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａは、高密度で血小板膜表面に存在する（非特許文献１５）。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体は、フィブリノーゲンに特異的に結合することによって、血小板凝集経路の最終工程を媒介する（非特許文献１６）。したがって、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体をターゲティングすることが、血小板に作用する薬物開発のための大黒柱（ｍａｉｎｓｔａｙ）であった。多くの血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤が開発されたが、これらは、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するヒト−マウスキメラ抗体のＦａｂ断片（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、ＲＧＤペプチドの非ペプチド類似体（チロフィバン及びラミフィバン）及びＫＧＤモチーフを含む環状ヘプタペプチドディスインテグリン（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）を含む（非特許文献１７〜１９）。前述したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤は、不安定性狭心症、急性心筋梗塞、そして、経皮的冠状動脈形成術（Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｍｏｒａｌ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ、ＰＴＣＡ）及びステント施術を受けた患者に効果的であった。脳卒中の場合、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）は、症状が発病してから５時間〜６時間が経て処理された患者でその効能を示していない（非特許文献２０）。しかし、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤は、再閉塞した脳卒中患者で血栓を溶解させ、選択された患者に効果的である（非特許文献９、２１、１７、２２〜２３）。
【０００７】
韓国のヘビ毒から精製され、クローニングされた新規なディスインテグリンであるサクサチリン（Ｓａｘａｔｉｌｉｎ）は、トリペプチド配列であるＡｒｇＧｌｙＡｓｐ（ＲＧＤ）を有するが、この配列は、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するディスインテグリンの認知部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）である（非特許文献２４〜２５）。サクサチリンは、血小板凝集（非特許文献２４）及び血小板活性化（非特許文献２６）上に強力な抑制効能を有して、血栓生成を妨害するものと知られている。
【０００８】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、それを全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｒｄｌａｗ，Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献２】１９９５；及びＣｈｏｉ，Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６
【非特許文献３】Ｃａｐｌａｎ，Ｍｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献４】Ｌｏｐｅｚ−Ｙｕｎｅｚ，Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献５】Ｒｈａ  ａｎｄ  Ｓａｖｅｒ，２００７
【非特許文献６】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，２００７；３８：１９２−１９３
【非特許文献７】Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ  ａｎｄ  Ｄｕｔｋａ，１９９０
【非特許文献８】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献９】Ｈｅｏ，Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｃｋｌ，１９９７
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ，Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８
【非特許文献１２】Ｎｉｃｏｌｅ，Ｄｏｃａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献１３】Ｙｅｐｅｓ，Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献１４】Ｍａｔｙｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｃｋｌ，２００３
【非特許文献１５】Ｓｈａｔｔｉｌ  ａｎｄ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，１９９７
【非特許文献１６】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｃｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８
【非特許文献１７】Ｓｅｉｔｚ，Ｍｅｉｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献１８】Ａｂｏｕ−Ｃｈｅｂｌ，Ｂａｊｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献１９】Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献２０】Ａｄａｍｓ，Ｅｆｆｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献２１】Ｓｅｉｔｚ，Ｈａｍｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献２２】Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献２３】Ｃｈｅｎ，Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献２４】Ｈｏｎｇ，Ｋｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献２５】Ｈｏｎｇ，Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献２６】Ｊａｎｇ，Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、血管内血栓の生成を抑制するか、又は既に生成された血栓を効果的に溶解して、部分的又は完全閉塞した血管を再貫通させることができる血栓溶解剤を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、ディスインテグリン、具体的には、ヘビ毒由来のサクサチリンと免疫グロブリンＦｃ断片からなる組換えタンパク質（又は、サクサチリン誘導体）が、サクサチリンタンパク質と類似した血栓溶解能を有するだけではなく、顕著に増加したタンパク質の半減期を示し、それを用いたＦｅＣｌ３−誘導された頸動脈動物モデルで血管内に既に形成された血栓を非常に効率的に溶解させ、その効能も、親タンパク質であるサクサチリンよりも長期間持続することができるということを確認することによって、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、サクサチリン誘導体を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記サクサチリン誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターによって形質転換された細胞を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、血栓溶解用組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、血管狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、血管狭窄又は閉塞疾患の予防、又は治療方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、血管狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療に用いられるサクサチリン誘導体の用途を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一態様によれば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるサクサチリンと免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のＦｃ領域がコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたサクサチリン誘導体を提供する。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述したサクサチリン誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）前述したヌクレオチド配列；及び（ｂ）前記ヌクレオチド配列に作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）プロモーターを含む組換えベクターを提供する。
【００２３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した組換えベクターで形質転換された細胞又は形質転換体を提供する。
【００２４】
本発明者らは、血管内血栓の生成を抑制するか、又は既に生成された血栓を効果的に溶解して、部分的又は完全閉塞した血管を再貫通させることができる血栓溶解剤を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、ディスインテグリン、具体的には、ヘビ毒由来のサクサチリンと免疫グロブリンＦｃ断片からなる組換えタンパク質（又は、サクサチリン誘導体）が、サクサチリンタンパク質と類似した血栓溶解能を有するだけではなく、顕著に増加したタンパク質の半減期を示し、それを用いたＦｅＣｌ３−誘導された頸動脈動物モデルで血管内に既に形成された血栓を非常に効率的に溶解させ、その効能も、親タンパク質であるサクサチリンよりも長期間持続することができるということを確認した。
【００２５】
本発明のサクサチリン誘導体、すなわち、サクサチリン（配列番号１及び配列番号２）とＦｃの融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるサクサチリンと免疫グロブリンのＦｃ領域で構成されたタンパク質であって、血栓内に存在するインテグリン、具体的には、血栓を構成する血小板表面のＧＰ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＩｂ−ＩＩＩａに競争結合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）して血小板などをフィブリノーゲンなどの血栓の構成成分から取り外す原理で血栓を効率的に分解することができる。
【００２６】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体は、親タンパク質であるサクサチリンと類似した血栓溶解能を有する。
【００２７】
本発明の一具現例において、本発明のサクサチリン誘導体は、血小板凝集に対するＩＣ５０値が１００〜５００ｎＭ、望ましくは、１００〜２５０ｎＭである。
【００２８】
具体的には、親タンパク質であるサクサチリン、そして、本発明のＦｃ−サクサチリン及びサクサチリン−ＦｃのＩＣ５０値は、それぞれ１５０ｎＭ、１９６ｎＭ、及び３６２ｎＭであった（参考：図４）。本明細書で使われる用語“ＩＣ５０値（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）”は、生物学的又は生化学的活性を抑制する化合物の効能を評価する指標であって、特定薬物又は他の物質（例えば、本発明のサクサチリン誘導体）が、特定生物学的過程（例えば、血栓溶解）又は前記過程に含まれた構成成分（例えば、酵素、細胞受容体など）を半分まで抑制するのに必要な定量的な濃度測定値を提供する。通常、薬理学的研究で拮抗剤として薬物の強さ（ｐｏｔｅｎｃｙ）の評価に用いられる。一方、血栓溶解能は、当業者に公知の多様な方法、例えば、フィブリンプレートアッセイ方法（Ａｓｔｒｕｐ  Ａ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒｔｚ  Ｓ．Ｔｈｅ  ｆｉｂｒｉｎ  ｐｌａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４０：３４６−３５１（１９５２））、血栓分解を示すＤダイマー（Ｄ−ｄｉｍｅｒ）を検出する方法（米国公開特許番号第ＵＳ２００９／０３０５３０１  Ａ１号）、放射線同位元素を用いる方法（国際公開特許番号第ＷＯ９４／２２４９４号）、血管内血栓重量測定法、血栓溶解後、遊離された粉砕物の濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）測定法などを用いて測定されるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の一具現例において、本発明のサクサチリン誘導体は、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）に存在するインテグリンαＭβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）値の結合力を有する。
【００３０】
本発明の一具現例において、本発明のサクサチリン誘導体は、好中球に存在するインテグリンαＬβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ値の結合力を有する。
【００３１】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体の処理量は、１〜２０ｍｇ／ｋｇであり、より具体的には、３〜１５ｍｇ／ｋｇであり、最も具体的には、５〜１０ｍｇ／ｋｇである。本発明によれば、本発明のサクサチリン誘導体は、少ない投与量で完全閉塞した血管の再貫通に効果を示した（参考：図６Ａないし図６Ｃ）。図６から確認できるように、１３０ｎｍｏｌ／ｋｇのサクサチリン、Ｆｃ−サクサチリン又はサクサチリン−Ｆｃ処理は、完全閉塞した血管の再貫通に約３０％程度の血流量の回復効果を示した。さらに、サクサチリン処理グループは、９０分間ほど再閉塞が進行したが、Ｆｃ−サクサチリン又はサクサチリン−Ｆｃ処理グループは、持続的に再貫通の効果を示した。
【００３２】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体は、経口又は非経口、具体的には、非経口で投与し、非経口投与である場合には、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注入、静脈内注入、動脈内注入、筋肉注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与し、最も具体的には、ボーラス注入である。
【００３３】
また、血管の再貫通の効果を有する薬物（例えば、本発明のサクサチリン誘導体）は、適した持続時間を有することが望ましく、具体的には、１０分間内外の持続時間を有することが臨床的に最も適し、有効である。
【００３４】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体に含まれた免疫グロブリンのＦｃ領域は、サクサチリンのＮ末端又はＣ末端にコンジュゲーションされ、より具体的には、Ｎ末端にコンジュゲーションされる。
【００３５】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体は、Ｎ末端にリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む。
【００３６】
通常、目的タンパク質に免疫グロブリンのＦｃ領域が結合された融合タンパク質は、親タンパク質よりも効能が低く表われるか、又は半減期増加効果があまり大きくない。一方、本発明のサクサチリン誘導体は、サクサチリン親タンパク質と類似した血栓溶解活性を有するだけではなく、サクサチリン親タンパク質よりも遥かに増加した半減期を示した（参考：図５Ａないし図５Ｃ）。具体的には、本発明のＦｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃの半減期は、それぞれ８．６分間及び１２．５分間であって、親タンパク質であるサクサチリンの半減期（２．０分間）よりも遥かに長かった。
【００３７】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体は、親タンパク質であるサクサチリンよりも４倍以上増加した半減期を有し、より具体的には、約４〜６．５倍の増加した半減期を有する。
【００３８】
本明細書で使われる用語“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリン連鎖不変領域のカルボキシル末端部分を意味し、具体的には、免疫グロブリン重鎖不変領域又はその一部を意味する。例えば、本発明のサクサチリン誘導体の製造に用いられる免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；又は（ｅ）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組合わせを含みうる。
【００３９】
本発明の一具現例によれば、本発明のサクサチリン誘導体の製造に用いられた免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．，ＣＡＡ４９８６６．１）及びその断片（例えば、配列番号７）を含む。
【００４０】
また、本発明は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域以外にも、ＧｅｎＢａｎｋ及び／又はＥＭＢＬデータベースに開示されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、例えば、ＡＦ０４５５３６．１（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＡＦ０４５５３７．１（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、ＡＢ０１６７１０（Ｆｅｌｉｘ  ｃａｔｕｓ）、Ｋ００７５２（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、Ｕ０３７８０（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、Ｚ４８９４７（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、Ｘ６２９１６（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、Ｌ０７７８９（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｖｉｓｉｏｎ）、Ｘ６９７９７（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、Ｕ１７１６６（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ）、Ｘ０７１８９（Ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ＡＦ５７６１９．１（Ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｕｓ  ｖｕｌｐｅｃｕｌａ）、又はＡＦ０３５１９５（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）などを含む他の免疫グロブリンＦｃ領域又はその断片配列も用いられうる。
【００４１】
さらに、免疫グロブリン重鎖不変領域内のアミノ酸配列の置換又は欠失が、本発明のサクサチリン誘導体の製造に有用である。前記置換又は欠失を通じて製造されたＦｃ変異体は、融合タンパク質の安定性、溶解性及び構造的無欠性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）などを改善させて、より最適化された融合タンパク質の製造に有用である。
【００４２】
本発明は、配列番号２のサクサチリンと配列番号７の免疫グロブリンのＦｃ領域で構成された融合タンパク質（配列番号４又は配列番号６）をコードするヌクレオチド配列を提供し、具体的には、配列番号３及び配列番号５で例示されているが、これに限定されるものではなく、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、如何なるものも用いられるということは当業者に自明である。
【００４３】
また、本発明の融合タンパク質は、多様な検出可能な標識因子（ｔａｇ）でタギングされ、前記タグは、Ｈｉｓ（ｎ）、フラッグ（ｆｌａｇ）、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＨＳＶを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書で使われる用語“タグ（ｔａｇ）”は、３〜４０つのアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を意味し、本発明の融合タンパク質、ペプチド、タンパク質リガンド（例えば、本発明の融合タンパク質）又は非ペプチドリガンドに特異的な結合親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を付与する。また、本発明で用いられるタグは、蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）タグ、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）タグ、及び発色（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）タグを含みうる。
【００４４】
本発明のサクサチリン誘導体は、（ａ）前記サクサチリン誘導体をコードするヌクレオチド配列；及び（ｂ）前記ヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターを含む組換えベクターを用いて低コストで量産されうる。
【００４５】
本明細書で使われる用語“プロモーター”は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。本発明の組換え発現ベクターで発現対象物質（すなわち、サクサチリン−Ｆｃ融合タンパク質）−コードヌクレオチド配列は、前記プロモーターに作動的に連結される。本明細書で言及される用語“作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター配列、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又はトランスレーションを調節する。
【００４６】
本発明のベクターシステムは、当業者に公知の多様な方法を通じて構築され、これについての具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００４７】
本発明の発現ベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬプロモーター、ｐＲプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、害毒の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／害毒終結配列を含むことが一般的である。この際、バクテリア複製開始点は、長いＤＮＡ挿入物（ｉｎｓｅｒｔｓ）の安定したバクテリア複製に有用な当業者によく知られた複製開始点から選択され、ＣｏｌＥ１、Ｆ因子（Ｆ−ｆａｃｔｏｒ）及びＰ１レプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のバクテリア選択マーカーは、当業者に知られたバクテリア選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、バクテリア選択マーカー遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ゼオシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びクロラムフェニコールのような抗生剤に対する抵抗性を付与する遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉが用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４（１９８４））、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５（１９８０））が調節部位として用いられうる。
【００４８】
また、本発明の組換えベクターが眞核細胞に適用される場合に用いられるプロモーターは、本発明の発現対象物質の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
望ましくは、本発明に用いられる組換えベクターは、ポリアデニル化配列を含む（例：ウシ成長ホルモンターミネーター又はＳＶ４０由来ポリアデニル化配列）。
【００５０】
本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法は、当業者に公知の多様な方法を利用でき、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：６１２７−６１４５（１９８８））などによって実施され、眞核細胞である場合、トランスダクション（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、遺伝子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ＹＡＣで用いられる酵母旧形質体／細胞融合、植物細胞で用いられるアグロバクテリウム媒介形質転換などを用いて実施することができる。
【００５１】
また、本発明の組換え発現ベクターを用いて形質転換された動物細胞の製造は、当業者に通常の公知の遺伝子転移方法によって実施される。例えば、電気穿孔法、リポソーム媒介転移方法（Ｗｏｎｇ、ら、１９８０）及びレトロウイルス媒介転移方法（Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．４１：１７３−１８２；Ｋｏｐｃｈｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，ｅｄ．Ｎ．Ｌ．Ｆｉｒｓｔ  ＆  Ｆ．Ｐ．Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，ｐｐ．２７５−２９３，Ｂｏｓｔｏｎ；Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ；Ｌｅｅ，Ｍ．−Ｒ．ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，Ｒ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄ．１６，１０７−１１０）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、前述した形質転換された動物細胞は、哺乳動物由来の細胞である。
【００５３】
本発明の一具現例によれば、本発明の外来遺伝子が導入された動物細胞を選択するに当って、前記外来遺伝子は、選択マーカーであって、望ましくは、抗生剤耐性遺伝子を含む。本発明で用いられる選択マーカーは、眞核細胞に抗生剤を付与する如何なる遺伝子も可能であり、例えば、ネオマイシン及びカナマイシン耐性遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）前述したサクサチリン誘導体の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む血栓溶解用組成物を提供する。
【００５５】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した血栓溶解用組成物を含む血管の狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００５６】
本発明の組成物は、有効成分として前述した本発明のサクサチリン誘導体を含むために、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００５７】
本発明の組成物は、既に生成されて塊状の血栓を効果的に溶解して、多様な血管狭窄又は閉塞疾患の治療に簡便かつ効率的に適用可能である。すなわち、本発明の組成物は、既に生じた血栓を溶かして血管を効果的に開通する原理で血管狭窄又は閉塞疾患の治療に適用可能である。
【００５８】
本明細書の用語“閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）”は、血管が完全に詰まるか、又は部分的に詰まって、血管が狭まっている状態を包括する用語である。本発明で言及された閉塞の程度は、測定された血流量に基づいて判断されうる。すなわち、閉塞の程度は、部分的閉塞（ｐａｒｔｉａｌ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）又は完全閉塞（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）に分類され、部分的閉塞は、正常血流量（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ）の４０〜８０％レベルに減少した場合を意味し、完全閉塞は、９０〜１００％レベルに減少した場合を意味する。
【００５９】
血管内血流量を測定する方法は、当業者に公知の方法によって実施され、例えば、超音波希釈法（Ｌｅｅ  ＫＨ，Ｐａｒｋ  ＪＹ，Ｃｈｏｉ  ＳＪ，Ｋｉｍ  ＪＫ，Ｈｗａｎｇ  ＳＤ，Ｊｏｈ  ＪＨ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｃｅｓｓ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２４：２６５−２７３（２００５））、ドップラー超音波法（Ｓｔｒａｕｃｈ  Ｂ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｌｌ  Ｒ，Ｇｅｏｌｙ  Ｋ，Ｆｏｒｃａｓｔｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｅｓｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，１９：５５４−５５７，（１９９２））、グルコースポンプテスト（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｕｍｐ  ｔｅｓｔ、ＧＰＴ；Ｍａｇｎａｓｃｏ  Ａ，Ａｌｌｏａｔｔｉ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎｏｌｉ  Ｃ，Ｓｏｌａｒｉ  Ｐ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｕｍｐ  ｔｅｓｔ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７：２２４４−２２４８（２００２））、近赤外線（７００〜１０００ｎｍ）を用いる方法（Ｂｕｕｎｋ  Ｇ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｅｖｅｎ  ＪＧ，Ｍｅｉｎｄｅｒｓ  ＡＥ，Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｊｕｇｕｌａｒ  ｂｕｌｂ  ｏｘｉｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍａｔｏｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｅｓｔ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ，５３：１３−１９（１９９８））、熱伝導血流測定法（Ｏｇａｔａ  Ｎ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ＪＹ，Ｉｍｈｏｆ  ＨＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｅｕｒｙｓｍ  ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ），１３８：７２６−７３１（１９９６））などを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の一具現例によれば、本発明で血流量の測定方法は、超音波を用いたドップラー超音波法を用いる。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物が適用可能な動物は、特に制限されず、具体的には、哺乳動物であり、より具体的には、ヒト、マウス、ラット、兎、猿、豚、馬、牛、羊、カモシカ、犬、及び猫であり、さらに具体的には、ヒト及びマウスである。
【００６１】
本発明の一具現例によれば、前記動物血管は、動脈、静脈、毛細血管を含み、より具体的には、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ａｒｔｅｒｉｅｓ）、腎動脈、腸骨動脈、小動脈、毛細血管、小静脈を含み、最も望ましくは、大動脈及び頸動脈を含む。
【００６２】
本発明の組成物によって治療される疾患は、多様な血管狭窄又は閉塞疾患を含み、例えば、脳血管疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＶＤ）、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、動脈硬化性血管疾患（ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＡＤ）、末梢血管疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＡＤ）などがあり、より具体的には、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、小窩性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、片頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患（ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔ）、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症（ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、肺塞栓症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ）、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、器具血管形成術以後再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症を含み、最も具体的には、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、及び心筋梗塞症を含む。
【００６３】
本明細書で使われる用語“脳血管疾患（ＣＶＤ）”は、酸素−豊富血液を顔面及び脳に供給する血管で起こる動脈硬化性血管疾患であって、一般的に、ＣＡＤ及び／又はＰＡＤと共に発生する同伴疾患（ｃｏｍｏｒｂｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）だけではなく、虚血性疾患又は血流量の不足を引き起こす疾患も含む。例えば、ＣＶＤは、虚血性脳血管疾患、急性脳梗塞、脳卒中、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、静脈瘤、軽度認知障害（Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ、ＭＣＩ）、又は一過性虚血発作（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ａｔｔａｃｋｓ、ＴＩＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
本明細書で使われる用語“心血管疾患”又は“動脈硬化性血管疾患”は、心臓、心臓弁膜、血液、及び身体の血管構造（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に影響を及ぼす多様な状態の分類に用いられる一般的な用語であって、心臓又は血管に影響を及ぼす疾病を含む。具体的には、代謝症侯群、症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、アテローム血栓症、冠状動脈疾患、安定及び不安定狭心症、脳卒中、大動脈狭窄症、又は大動脈瘤のような大動脈疾患、脳血管疾患、末梢血管疾患、又は急性虚血性動脈硬化性イベントを含むが、これらに限定されるものではない。特に、動脈硬化性血管疾患は、非虚血性疾患よりは虚血性疾患又は虚血誘発性（ｐｒｏｉｓｃｈｅｍｉｃ）疾患を意味する。
【００６５】
本明細書で言及する用語“冠状動脈疾患（ＣＡＤ）”は、心筋に血液を供給する動脈（冠状動脈）がアテローム硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）、カルシウム沈殿による硬化及び／又は狭まって発生する動脈硬化性血管疾患を意味する。ＣＡＤは、心筋への血流量の減少をもたらし、これにより、心筋が十分な量の酸素を供給されず、究極的に壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を引き起こす。ＣＡＤは、急性冠状動脈症侯群、心筋梗塞（心臓麻痺）、狭心症（安定及び不安定）、又は心臓に血液を供給する血管で発生するアテローム性動脈硬化症及びアテローム血栓症を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
本明細書で使われる用語“末梢血管疾患（ＰＡＤ）”は、心臓及び脳以外のところで発生するアテローム性動脈硬化症及びアテローム血栓症のような疾患であって、一般的に、ＣＡＤと共に発生する同伴疾患を含む。
【００６７】
本明細書で使われる用語“薬剤学的有効量”は、前述したサクサチリン誘導体の効能又は活性（すなわち、血栓溶解能）を果たすのに十分な量を意味する。
【００６８】
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００６９】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与し、非経口で投与される場合、ボーラス注入、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与し、最も具体的には、血管内に直接注入される方式（例えば、ボーラス注入又は静脈内注入）で投与される。血管内に直接投入される方式とは、動脈、静脈、毛細血管を含む血管、例えば、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、小動脈、毛細血管、小静脈を含む血管内に投与されることを意味し、血栓が生じた血管部位によって適切にその投与方法を選択することができる。
【００７０】
また、本発明の薬剤学的組成物は、適用される疾患の種類及び処方医の決定によって、投与経路が決定されることが望ましい。例えば、本発明の組成物に含まれる有効成分であるサクサチリン誘導体の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間などを考慮して決定し、特定範囲の濃度に限定されるものではない。本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。
【００７１】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、又は多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもあり得るが、分散剤又は安定化剤をさらに含みうる。
【００７２】
本発明の薬剤学的組成物は、単純に血栓生成を予防する原理であって、前記疾病を予防又は治療するものではなく、既に生じた血栓を溶かして血管を効果的に開通する原理であって、前記血管狭窄又は閉塞性疾患の治療にその特徴がある。例えば、脳梗塞の場合、血栓生成を予防する方式の薬剤学的組成物（例えば、アスピリン）は、既によく知られている。しかし、一旦、血栓が生成され、脳血管を閉塞させて、脳梗塞が発病した以上、それを効果的に治療することができる薬剤学的組成物はほとんどない実情であり、プラスミノゲン活性因子（ｒｔ−ＰＡ）の静脈内投与による治療法は、脳梗塞発病後、３時間内に行うことができる現在唯一に承認された脳梗塞の治療法である。しかし、プラスミノゲン活性因子を用いた治療法の場合、前記のような時間的制限を受けるだけではなく、半分以上の患者が血栓溶解治療後、成功的な再貫通を成すのに失敗する現実において、既に生成された血栓を効果的に溶解することができる本発明の薬剤学的組成物は、一旦、発病した血管の狭窄又は閉塞疾患の治療において非常に現実的であり、画期的な方案であると言える。それだけではなく、本発明の血管狭窄又は閉塞疾患の治療用薬剤学的組成物は、微小血管の閉塞も効果的に治療し、また再狭窄も起こさないという点で、その価値が大きいと言える。
【００７３】
本発明の他の態様によれば、本発明は、サクサチリン誘導体の薬剤学的有効量を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する工程を含む血管の狭窄又は閉塞疾患の予防、又は治療方法を提供する。
【００７４】
本発明の一具現例において、前記血管の狭窄又は閉塞疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、小窩性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、片頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、器具血管形成術以後再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択される。
【００７５】
本発明の予防又は治療方法は、前記本発明の他の一態様である’サクサチリン誘導体’を対象に投与することでなされるので、重複される内容については、本明細書の記載の過度な複雑性を避けるために省略する。
【００７６】
本発明の他の態様によれば、本発明は、血管の狭窄又は閉塞疾患の予防、又は治療のためのサクサチリン誘導体の用途を提供する。
【００７７】
本発明の用途は、前記本発明の他の一態様である’サクサチリン誘導体’を用いる用途に関するものなので、重複される内容については、本明細書の記載の過度な複雑性を避けるために省略する。
【発明の効果】
【００７８】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、増加した半減期を有するサクサチリン誘導体及びその用途に関するものである。
（ｂ）本発明のサクサチリン誘導体は、親タンパク質であるサクサチリンと類似した血栓溶解能を有するだけではなく、顕著に増加したタンパク質の半減期を有し、それを用いてＦｅＣｌ３−誘導された頸動脈動物モデルで血管内に既に形成された血栓を長期間の間に非常に効率的に溶解させる。
（ｃ）したがって、本発明のサクサチリン誘導体を有効成分として含む組成物は、貫通後、再狭窄も起こさず、微小血管まで効果的に開放させて、血管の狭窄又は閉塞疾患（例えば、脳血管疾患、心血管疾患、動脈硬化性血管疾患、冠状動脈疾患、末梢血管疾患など）の治療に非常に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、それぞれｐＹＫ６０３ベクター及びｐＹＫ６０２ベクターのマルチクローニング位置にクローニングされたサクサチリン誘導体の構造を図式的に示す図面である。構成成分間の距離又は制限酵素位置間の距離は、比率によって表示されていない。ｌｅａｄｅｒ（リーダー配列）、免疫グロブリンＧ２ａガンマチェーン。
【図２】図２は、本発明のサクサチリン誘導体の発現を確認したウェスタンブロッティングの結果である。精製されたタンパク質の安定性を確認するために、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物の生成の有無を調査した（レーン２及びレーン４）。その結果、本発明のサクサチリン誘導体は、非常に安定した（沈殿物が生じていない）。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃの精製結果を示す図面であって、ゲル電気泳動イメージ（左側パネル）及び電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ；右側パネル）が提示される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃの精製結果を示す図面であって、ゲル電気泳動イメージ（左側パネル）及び電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ；右側パネル）が提示される。
【図４】図４は、親タンパク質であるサクサチリン及び本発明のサクサチリン誘導体（Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃ）の血小板凝集抑制活性を測定した結果である。血小板凝集アッセイのために、親タンパク質であるサクサチリンとＦｃ−サクサチリンは、５０、１００、１５０、２００、２５０、及び３００ｎＭを使い、サクサチリン−Ｆｃは、２００、３００、３５０、４００、５００、及び６００ｎＭを使った。
【図５Ａ】図５Ａは、親タンパク質であるサクサチリン及び本発明のサクサチリン誘導体（Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃ）の半減期を測定した結果である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、親タンパク質であるサクサチリン及び本発明のサクサチリン誘導体（Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃ）の半減期を測定した結果である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、親タンパク質であるサクサチリン及び本発明のサクサチリン誘導体（Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃ）の半減期を測定した結果である。
【図６】図６は、サクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇの効果とサクサチリン誘導体の血栓溶解効果とを比較した結果を示す。また、血流量を測定することによって、再貫通の有無及びその程度を測定した結果を示す。
【図７】図７は、容量−反応研究から得られた各グループの平均値に対する容量反応曲線を示す。先行研究から得られたサクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇの血栓溶解効果（平均；赤色線、標準偏差；赤色領域）と比較した結果を示した。
【図８】図８は、血栓溶解効果を測定した２時間のうち、最後の１０分間の正常血流量に比べて、血流量平均百分率を分析した結果を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡを用い、サクサチリン−Ｆｃ又はＦｃ−サクサチリンと、インテグリンαＭβ２又はαＬβ２との結合分析を分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００８１】
実験方法及び実験結果
組換えサクサチリンタンパク質発現ベクターの製作、発現及び精製
Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質発現ベクターの製作
組換えサクサチリンタンパク質を発現させるために、本発明者らは、下記の表１に記載のプライマー対（サクサチリン−Ｆ及びサクサチリン−Ｒ）を用いてＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ｓｆｉＩ（ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で切断して、ｐＹＫ６０３ベクター及びｐＹＫ６０２ベクター（Ａ＆Ｒセラピューティクス）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてクローニングして、それぞれＦｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質発現用組換えベクターを製造した（図１）。
【００８２】
Ｆｃ−サクサチリンの発現ベクター用プライマー配列（制限酵素切断配列、下線で表示される）。
【００８３】
【表１】
2018161136.tif 000003
【００８４】
Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質発現の確認
前述したＦｃ−サクサチリン又はサクサチリン−Ｆｃを含む組換えベクターをそれぞれ２９２Ｅ細胞にＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。トランスフェクション後、細胞培養２日又は５日目に上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収去して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ＮＣ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、２次抗体である抗−ＨｕＦｃ−ＨＲＰ（１：２０００希釈；ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と常温で１時間反応させた。前記ＮＣ膜をＰＢＳ／Ｔで３回にわたって洗浄した後、ＥＣＬ溶液でフィルムを現像してウェスタンブロッティングを実施した（図２）。
【００８５】
Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質の精製
前述したように、トランスフェクションされた２９３Ｅ細胞の培養で３、５又は７日目の培養上澄み液を０．２２μｍトップフィルター（ｔｏｐ−ｆｉｌｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って濾過した。該濾過された上澄み液を５００μｌタンパク質Ａビーズ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がパッキングされている５ｍｌカラムにローディングしてビーズと結合させた。ポンプ（ｐｅｒｉ−ｓｔａｒｔ  ｐｕｍｐ；Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使って０．９ｍｌ／ｍｉｎの流速で４℃で一晩結合させた後、１００ｍｌ以上のＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）−ＨＣｌを用いて６つの画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に溶出させた。前記溶出液は、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）溶液で中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）させた。以後、タンパク質の量を定量し、２〜３つの画分に含まれたタンパク質をアミコンウルトラ遠心分離フィルター（ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って濃縮させた。ＰＢＳで１０回以上緩衝液を交換させた。
【００８６】
得られたタンパク質濃縮液の純度（ｐｕｒｉｔｙ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００生体分析器（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて分析した（図３Ａ及び図３Ｂ）。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００生体分析器は、ラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）技術を基盤とした分析装備でタンパク質のサイズと濃度とを同時に自動で分析することができるシステムであって、マイクロチップ内でサンプル処理、分離及び検出の全過程を同時に行って、信頼性の高いデータを２つの形態（ゲル電気泳動イメージ及びクロマトグラフィーのような電気泳動図）で分析結果を確認することができる。
【００８７】
Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質の血小板凝集抑制能
ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ  ５０；ＶｉｒＢａｃ）とロムプン（ｒｏｍｐｕｎ；Ｂａｙｅｒ）とを３：１の比率で混合した後、生理食塩水で１０倍希釈させた麻酔溶液を製造した。雄ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウス（（株）オリンエントバイオ、大韓民国）の体重を測定して、ｇ当たり１０μｌの前記麻酔溶液を腹腔内に注入した。麻酔されたマウスを固定させて開腹した後、腹大靜脈で血液を採取してクエン酸ナトリウムチューブ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｔｕｂｅ、＃３６３０４８；ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に入れ、よく混ぜた。前記採取された血液を１５ｍｌチューブに移して、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させて血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）を含む血漿層（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ、ＰＲＰ）を収得した。また、下側の血球層を再び３，０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離させて上澄み液（血漿）を得た。前記上澄み液（６００μｌ）を１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離させて血球細胞などが除去されたＰＰＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｐｏｏｒ  Ｐｌａｓｍａ）を収得し、残った血漿は、以前工程で分離したＰＲＰと混合して、引き続き実験に用いた。血小板凝集アッセイは、凝集測定器（Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ７００；Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）を用いて実施した。ＰＰＰ（５００μｌ）を添加した最初のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅｓ、＃３１２；Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）とＰＲＰ（４８０μｌ）とサクサチリン（１０μｌ）又は組換えサクサチリン（Ｆｃ−サクサチリン又はサクサチリン−Ｆｃ；１０μｌ）を添加した二番目のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）とを凝集測定器にさし、基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）をセッティングした後、前記二番目のキュベットに１０μｌのＡＤＰ（最終濃度、２０μＭ；＃３８４；Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）を入れてピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）で混合させ、凝集程度を測定した。この際、ＡＤＰのみを入れた時の凝集程度を１００％に算定し、これについての相対的な数値で各試料の凝集程度を計算した。すなわち、１００％で各試料の凝集率（％）を差し引いた値が抑制率（％）で計算される。血小板凝集に対する天然サクサチリンのＩＣ５０濃度は、１５０ｎＭであり、本発明のＦｃ−サクサチリン及びサクサチリン−ＦｃのＩＣ５０濃度は、それぞれ１９６ｎＭ及び３６２ｎＭであったが（図４）、これは、本発明の組換えサクサチリンがサクサチリンと比較されるほどの優れた血小板凝集活性を表わすということを示す。
【００８８】
Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃタンパク質の半減期
サクサチリン、Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃ（ｉｎ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を含む反応チューブにＮＨＳ−ローダミン（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ；＃４６４０６、１０ｍｇ／ｍｌ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，米国）を添加し、常温で１時間反応させた。ＰＤ１０脱塩カラム（ｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ）（＃１７−０８５１−０１；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を用いて反応していない（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｅｄ）ＮＨＳ−ローダミンを除去した。ローダミン−コンジュゲーションされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（＃２３２２５；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，米国）で測定した後、実験に利用するまで４℃で暗条件で保管した。
【００８９】
ローダミン−標識されたサクサチリンを０．５ｍｇ／ｍｌになるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈させた後、８週齢のＩＣＲマウス（３匹；（株）オリンエントバイオ、大韓民国）にインスリン注射器（＃３２８８２；ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，米国）を用いてしっぽ静脈に注入した。この際、投与容量は、５ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ（マウス重量）で実施した。前記タンパク質投与後、０分目、５分目、１０分目、２０分目、４０分目、及び８０分目に前記マウスの頚静脈で血液を採取して、常温で３０分間暗条件で保持させて血液を凝固させた。前記血液を４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて上澄み液（血清）を分離した。前記収得された血清８０μｌを黒色９６ウェルプレート（＃４３７１１；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，米国）に入れ、マイクロプレート蛍光測定器（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ；５５２ｎＭの励起波長及び５７５ｎＭの発光波長；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，米国）を用いて蛍光測定して半減期を計算した。
【００９０】
ローダミン−コンジュゲーションされたＦｃ−サクサチリン又はサクサチリン−Ｆｃを０．５ｍｇ／ｍｌになるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈させた後、９週齢のＩＣＲマウス（５匹）にインスリン注射器を用いてしっぽ静脈に注入した。この際、投与容量は、５ｍｇ／１０ｍｌ／ｋｇ（マウス重量）で実施した。前記タンパク質投与後、０分目、５分目、１０分目、３０分目、及び６０分目、そして、２時間目、４時間目、及び８時間目に前記マウスの頚静脈で血液を採取して、常温で３０分間暗条件で保持させて血液を凝固させた。前記血液を４℃で１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させて上澄み液（血清）を分離した。前記収得された血清８０μｌを黒色９６ウェルプレート（＃４３７１１；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，米国）に入れ、マイクロプレート蛍光測定器（５５２ｎＭの励起波長及び５７５ｎＭの発光波長）を用いて蛍光測定して半減期を計算した。
【００９１】
その結果、ローダミン−コンジュゲーションされたサクサチリン、Ｆｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃの半減期は、それぞれ２．０分間、８．６分間、及び１２．５分間であった（図５Ａないし図５Ｃ）。したがって、本発明のＦｃ−サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃは、サクサチリンと比較して顕著に増加した半減期を有するということを確認することができた。
【００９２】
インテグリンとサクサチリンとの結合
９６ウェルプレートに各インテグリン（αIIｂβ３、αｖβ３、αＭβ２、及びαＬβ２）を１００ｎｇ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩中コーティングした。コーティング後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。１％  ＢＳＡ（ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔ）溶液で常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキング後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。サクサチリン−Ｆｃ又はＦｃ−サクサチリンを１００ｎＭから１／４ずつ連続希釈して８つのサンプル溶液を製造した。
【００９３】
前記サンプル溶液を１００μｌずつ３重で各ウェルにローディングし、常温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）共役ＨＲＰ抗体を１：２，０００に希釈して、各ウェルに１００μｌずつ添加し、常温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ＴＭＢ溶液を添加し、室温で３０分間反応させた後、終結溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を添加して反応を終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定して、好中球及び内皮細胞の相互作用に関与するインテグリンとサクサチリンとの結合を確認した。
【００９４】
インテグリンαＭβ２及びαＬβ２は、好中球に存在するインテグリンであって、内皮細胞に存在するＩＣＡＭ−１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）と相互作用して、好中球が内皮細胞に集まるようにする。ＥＬＩＳＡを用いた結合分析の結果、Ｆｃ−サクサチリンは、インテグリンαＭβ２及びαＬβ２と強く結合した（Ｋｄ、６．９×１０−９Ｍ及び９．２×１０−９Ｍ）。また、Ｆｃ−サクサチリンよりは弱いが、サクサチリン−Ｆｃも、インテグリンαＭβ２及びαＬβ２と結合した（Ｋｄ、３．０×１０−７Ｍ及び４．４×１０−７Ｍ）（図９）。
【００９５】
ＦｅＣｌ３による血栓生成モデルを用いた組換えサクサチリン誘導体の血栓溶解効果
３２〜３４ｇの８週齢の雄ＩＣＲマウスを用いた。実験室動物の管理及び利用は、国際実験動物管理認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の指針に適当な基準に延世大学校医科大学動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）の検討と承認とを受けたプロトコルによって実施した。手術過程を説明すれば、動物は、７０％  Ｎ２Ｏ及び３０％  Ｏ２で構成された混合物（大韓特殊ガス、大韓民国）内に５％イソフルラン（日盛新薬、大韓民国）の吸入を通じて麻酔させた。麻酔は、２％イソフルランで保持させた。手術過程の間に、動物の体温は、直腸用プローブで持続的にモニタリングし、恒温被覆調節ユニット（Ｈｏｍｅｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｂｌａｎｋｅｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｕｎｉｔ）及びヒーティングパッド（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて３７．０±０．２℃に保持した。サクサチリン及びサクサチリン−Ｆｃのインビボ血栓溶解活性をテストするために、ＦｅＣｌ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）−誘導された頸動脈血栓モデルを用いた。頸部正中切開（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を実施して、左側総頸動脈を手術顕微鏡（ＳＥＩＬＥＲ，米国）下で気をつけて解剖した。超音波ドップラー流速プローブ（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ  ｐｒｏｂｅ；Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  ＭＡ０．７ＰＳＢ）を総頸動脈（ＣＣＡ）の中央部位に位置させた。頸動脈血流量は、超音波ＴＳ４２０血流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）及びｉＷｏｒｘ  ＩＸ−３０４Ｔデータ獲得システム（ｉＷｏｒｘ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｖｅｒ，ＮＨ）を用いて測定した。対照群としてＣＣＡの基本血流量を５分間測定した。対照群の基本血流量の決定後、プローブを除去した。露出されたＣＣＡ中央地点の外側表面（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）に５０％  ＦｅＣｌ３で飽和された濾過紙（７００×５００μＭ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ，日本）を５分間接触させることによって、化学的ストレスによる酸化的血管損傷が誘導された。濾過紙を除去した後、ＣＣＡを生理食塩水で洗浄し、その血流量を測定した。血流量の減少を通じて血栓形成及び動脈閉塞を決定し、完全閉塞は、血流が１０分間不在した場合と定義された。
【００９６】
ＣＣＡ閉塞１０分間後、ＰＥ−１０チュービング（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）と連結された注入ポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｎｅｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，米国）を用いて左側大腿静脈を通じて０、１．５、７．５、１５、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦｃ−サクサチリンをボーラス注入した。頸動脈血流量を注入開始時間から２時間連続してモニタリングした。各グループ当たり５匹のマウスを用いて血栓溶解効果を評価し、先行研究で評価したサクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇの効果と比較した。
【００９７】
また、血流量を測定することによって、再貫通の有無及びその程度を測定した（図６のＢ）。基本血流量に対するデータ及びＣＣＡ閉塞後、２時間持続的にモニタリングされた血流量に対するデータが、ｉＷｏｒｘ  Ｌａｂｓｃｒｉｂｅ２データ獲得ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０４５０００）を用いて得られた。その結果、得られた血流時間（ｆｌｏｗ−ｔｉｍｅ）曲線下の面積を計算して、頸動脈血流量を分析した。動物間の生理学的条件の変異によって引き起こされる誤差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を避けるために、あらゆる測定された数値は、各動物の最小血流量によって標準化された。血栓溶解効果を下記のように計算し、正常血流量の平均値に対する百分率で表示した：（サクサチリン誘導体投与後、２時間の平均血流量／正常血流量の平均値）×１００（％）。容量−反応研究で各グループの平均値が計算され、それを容量反応曲線で示した（平均値±標準偏差、図７）。また、先行研究から得られたサクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇの血栓溶解効果（平均；赤色線、標準偏差；赤色領域）と比較した。一方、各動物で毎１分間血流量の平均を計算し、投与量及び投与方法に対してそれぞれ代表的なパターンを時間−依存的に確認した（図６のＡ）。各グループであらゆる動物の平均値を計算し、経時的な変化を連続した棒グラフで示した（平均値±標準偏差）。
【００９８】
正常血流量と比較して、投与グループでの血流量の平均百分率は、次の通りであった（図７）：（ａ）生理食塩水投与グループ、３．０３±０．７５％；（ｂ）Ｆｃ−サクサチリン１．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、１７．８１±１２．２２％；（ｃ）Ｆｃ−サクサチリン７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、８９．４０±４１．１８％；（ｄ）Ｆｃ−サクサチリン１５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、５９．９４±１６．９７％；（ｅ）Ｆｃ−サクサチリン１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、７４．６８±２０．５３％；及び（ｆ）サクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、７８．２４±４８．６１％（平均値±標準偏差）。
【００９９】
血栓溶解効果を測定した２時間のうち、最後の１０分間の正常血流量に比べて、血流量平均百分率を分析した（図８）。（ａ）生理食塩水投与グループ、３．２９±１．２５％；（ｂ）Ｆｃ−サクサチリン１．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、２３．０６±１１．７５％；（ｃ）Ｆｃ−サクサチリン７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、１１９．５２±４６．３２％；（ｄ）Ｆｃ−サクサチリン１５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、６９．０５±２６．０７％；（ｅ）Ｆｃ−サクサチリン１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、７２．４９±２２．４９％；及び（ｆ）サクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与グループ、８１．５４±５７．５０％（平均値±標準偏差）。
【０１００】
総合して見れば、Ｆｃ−サクサチリンは、投与容量−依存的な血栓溶解効果を示し、Ｆｃ−サクサチリン７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与による平均血栓溶解効果及び最後の１０分間の血栓溶解効果は、既存のサクサチリン６５０ｎｍｏｌ／ｋｇを投与した時と比較した時、統計的に類似しているレベルの効果を示した。
【０１０１】
６５０ｎｍｏｌ／ｋｇサクサチリンを投与した場合、経時的にサクサチリン投与群で血栓溶解効果及び血栓再形成抑制効果の明らかな減少が観察された。前述した突然の再閉塞は、サクサチリンをボーラス注入した総５匹マウスのうち、３匹で平均約９０分目に観察された（図６のＡ矢印）。一方、Ｆｃ−サクサチリン７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ以上の容量を投与した場合、血管の再開通以後に再閉塞なしに２時間の間に血栓溶解及び血栓形成抑制効果が一定に保持されることを確認した。
【０１０２】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に一具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【０１０３】
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【図１】
2018161136.tif 000004
【図２】
2018161136.tif 000005
【図３Ａ】
2018161136.tif 000006
【図３Ｂ】
2018161136.tif 000007
【図４】
2018161136.tif 000008
【図５Ａ】
2018161136.tif 000009
【図５Ｂ】
2018161136.tif 000010
【図５Ｃ】
2018161136.tif 000011
【図６】
2018161136.tif 000012
【図７】
2018161136.tif 000013
【図８】
2018161136.tif 000014
【図９】
2018161136.tif 000015
【配列表】
2018161136000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月6日(2018.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるサクサチリンと免疫グロブリンのＦｃ領域がコンジュゲーションされたことを特徴とするサクサチリン誘導体。
【請求項２】
前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、前記サクサチリンのＮ末端又はＣ末端にコンジュゲーションされている請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項３】
前記サクサチリン誘導体は、Ｎ末端にリーダー配列がさらにコンジュゲーションされている請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項４】
前記サクサチリン誘導体は、天然のサクサチリンよりも４〜６．５倍の増加した半減期を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項５】
前記サクサチリン誘導体は、天然のサクサチリンと類似した血栓溶解能を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項６】
前記サクサチリン誘導体は、血小板凝集に対するＩＣ５０値が１００〜５００ｎＭである請求項５に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項７】
前記サクサチリン誘導体は、血小板凝集に対するＩＣ５０値が１００〜２５０ｎＭである請求項６に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項８】
前記サクサチリン誘導体は、血栓内に存在するインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）に結合して血栓を分解する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項９】
前記サクサチリン誘導体は、血栓を構成する血小板表面のＧＰ  ＩＩｂ−ＩＩＩａに結合して血栓を分解する請求項８に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１０】
前記サクサチリン誘導体は、好中球に存在するインテグリンαＭβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ値の結合力を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１１】
前記サクサチリン誘導体は、好中球に存在するインテグリンαＬβ２に対して１×１０−８〜１×１０−１０ＭのＫｄ値の結合力を有する請求項１に記載のサクサチリン誘導体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載のサクサチリン誘導体をコードすることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２に記載のヌクレオチド配列；及び（ｂ）前記ヌクレオチド配列に作動的に連結されたプロモーターを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項１から１１のいずれかに記載のサクサチリン誘導体の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする血栓溶解用組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物を含むことを特徴とする血管の狭窄又は閉塞疾患の予防又は治療用の薬剤学的組成物。
【請求項１７】
前記血管は、大動脈、頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜動脈、腎動脈、腸骨動脈、小動脈、毛細血管、又は小静脈である請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１８】
前記血管の狭窄又は閉塞疾患は、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、小窩性脳梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、片頭痛、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢血管疾患、血管性頭痛、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣、再狭窄症、器具血管形成術以後再狭窄症、及び血管炎による血管閉塞症からなる群から選択される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１９】
前記薬剤学的組成物は、血管内に直接注入される方式で投与される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２０】
前記薬剤学的組成物は、血栓によって血管が閉塞した患者に投与される請求項１６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２１】
前記閉塞は、部分的閉塞又は完全閉塞である請求項２０に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２２】
前記薬剤学的組成物は、プラスミノゲン活性剤（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含まない請求項１６に記載の薬剤学的組成物。