(57)【要約】      （修正有）【課題】塩味修飾物質等の目的物質をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】塩味受容体をコードしているTMC6タンパク質を、細胞または細胞膜に担持された形態で用いて、TMC6タンパク質の活性化または不活性化を、細胞または細胞膜の膜電位、細胞または細胞膜の膜電流、および細胞内の陽イオン濃度または細胞膜により区分される空間の内の一方の空間における陽イオン濃度から選択される１種またはそれ以上のパラメーターを指標として、目的物質をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMC6タンパク質を利用して目的物質を同定する工程を含む、物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記目的物質が、TMC6タンパク質に作用する物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記TMC6タンパク質に作用する物質が、TMC6タンパク質に結合する物質またはTMC6タンパク質を活性化もしくは不活性化する物質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的物質が、塩味修飾物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩味修飾物質が、塩味代替物質、塩味増強物質、または塩味低減物質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記目的物質が、TMC6タンパク質が関与する疾病の予防薬または治療薬の有効成分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程が、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）前記TMC6タンパク質と被検物質を接触させる工程；
（Ｂ）前記接触の際の前記被検物質の前記TMC6タンパク質への作用を測定する工程；および
（Ｃ）前記作用に基づいて目的物質を同定する工程。
【請求項８】
前記作用が、前記被検物質の前記TMC6タンパク質への結合、または前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化もしくは不活性化である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）である、請求項７または８に記載の方法：
（Ｂ１）前記接触の際の該TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて目的物質を同定する工程。
【請求項１０】
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）である、請求項９に記載の方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ２との差に基づいて目的物質を同定する工程。
【請求項１１】
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）である、請求項１０に記載の方法：
（Ｃ２−１）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させない条件；
（Ｃ２−２）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させる条件であって、該被検物質の濃度が前記工程（Ａ）における該被検物質の濃度よりも低い濃度である条件。
【請求項１２】
前記TMC6タンパク質が、細胞または細胞膜に担持された形態で用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化が、それぞれ、前記細胞の活性化または不活性化を指標として測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化が、前記細胞または細胞膜の膜電位、前記
細胞または細胞膜の膜電流、および前記細胞内の陽イオン濃度または前記細胞膜により区分される空間の内の一方の空間における陽イオン濃度から選択される１種またはそれ以上のパラメーターを指標として測定される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記陽イオンが、ナトリウムイオンまたはカルシウムイオンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（Ａ）が、塩味物質の存在下で実施される、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味増強物質であると同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の不活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味低減物質であると同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（Ａ）が、塩味物質の非存在下で実施される、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味代替物質であると同定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩味物質が、水性媒体中でナトリウムイオンを与える物質である、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩味物質が、塩化ナトリウムである、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記TMC6タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のTMC6タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のTMC6タンパク質のキメラタンパク質。
【請求項２４】
前記TMC6タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列を含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列において、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列に対して、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質。
【請求項２５】
前記細胞が、生物の細胞である、請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、動物細胞である、請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
TMC6遺伝子が導入された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩味修飾物質等の目的物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の属する技術分野において、上皮性ナトリウムチャネル（epithelial sodium channel、「ENaC」ともいう）が塩味受容体であることはコンセンサスを得ている（非特許文献１）。また、マウスには、ENaCを介する塩味受容機構とそれ以外の未知の塩味受容機構が存在することが知られている（非特許文献２）。マウスにおいて、ENaCは塩味受容（塩味に対する味神経応答）のおよそ半分を担っていると考えられる（非特許文献１）。
【０００３】
Kv3.2タンパク質はナトリウム電流を流す（すなわち、ナトリウムチャネルとして機能する）ことが報告されている（特許文献１）。また、Kv3.2タンパク質の活性化物質が官能評価でわずかに塩味増強効果を示したことが報告されている（特許文献１）。
【０００４】
TMC6遺伝子にコードされるTMC6タンパク質は、そのアミノ酸配列より10回膜貫通型のタンパク質であり、イオンチャネルの一種と予想されている。また、TMC6遺伝子の破壊により、免疫機能が低下することが知られている（非特許文献３〜４）。しかしながら、TMC6タンパク質の実際の機能は同定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2011/040475
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chandrashekar J. et al., The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 2010 Mar 11;464(7286):297-301.
【非特許文献２】Roper SD, The taste of table salt. Eur J Physiol. 2015 Mar;467(3):457-63.
【非特許文献３】Kurima K. et al., Characterization of the transmembrane channel-like (TMC) gene family: functional clues from hearing loss and epidermodysplasia verruciformis. Genomics. 2003 Sep;82(3):300-8.
【非特許文献４】Keresztes G. et al., TMC and EVER genes belong to a larger novel family, the TMC gene family encoding transmembrane proteins. BMC Genomics. 2003 Jun 17;4(1):24.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、塩味修飾物質等の目的物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、TMC6遺伝子が塩味受容体をコードしていることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
TMC6タンパク質を利用して目的物質を同定する工程を含む、物質のスクリーニング方法
。
［２］
前記目的物質が、TMC6タンパク質に作用する物質である、前記方法。
［３］
前記TMC6タンパク質に作用する物質が、TMC6タンパク質に結合する物質またはTMC6タンパク質を活性化もしくは不活性化する物質である、前記方法。
［４］
前記目的物質が、塩味修飾物質である、前記方法。
［５］
前記塩味修飾物質が、塩味代替物質、塩味増強物質、または塩味低減物質である、前記方法。
［６］
前記目的物質が、TMC6タンパク質が関与する疾病の予防薬または治療薬の有効成分である、前記方法。
［７］
前記工程が、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、前記方法：
（Ａ）前記TMC6タンパク質と被検物質を接触させる工程；
（Ｂ）前記接触の際の前記被検物質の前記TMC6タンパク質への作用を測定する工程；および
（Ｃ）前記作用に基づいて目的物質を同定する工程。
［８］
前記作用が、前記被検物質の前記TMC6タンパク質への結合、または前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化もしくは不活性化である、前記方法。
［９］
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）である、前記方法：
（Ｂ１）前記接触の際の該TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて目的物質を同定する工程。
［１０］
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）である、前記方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ２との差に基づいて目的物質を同定する工程。
［１１］
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）である、前記方法：
（Ｃ２−１）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させない条件；
（Ｃ２−２）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させる条件であって、該被検物質の濃度が前記工程（Ａ）における該被検物質の濃度よりも低い濃度である条件。
［１２］
前記TMC6タンパク質が、細胞または細胞膜に担持された形態で用いられる、前記方法。［１３］
前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化が、それぞれ、前記細胞の活性化または不活性化を指標として測定される、前記方法。
［１４］
前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化が、前記細胞または細胞膜の膜電位、前記細胞または細胞膜の膜電流、および前記細胞内の陽イオン濃度または前記細胞膜により区分される空間の内の一方の空間における陽イオン濃度から選択される１種またはそれ以上のパラメーターを指標として測定される、前記方法。
［１５］
前記陽イオンが、ナトリウムイオンまたはカルシウムイオンである、前記方法。
［１６］
前記工程（Ａ）が、塩味物質の存在下で実施される、前記方法。
［１７］
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味増強物質であると同定される、前記方法。
［１８］
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の不活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味低減物質であると同定される、前記方法。
［１９］
前記工程（Ａ）が、塩味物質の非存在下で実施される、前記方法。
［２０］
前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味代替物質であると同定される、前記方法。
［２１］
前記塩味物質が、水性媒体中でナトリウムイオンを与える物質である、前記方法。
［２２］
前記塩味物質が、塩化ナトリウムである、前記方法。
［２３］
前記TMC6タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のTMC6タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のTMC6タンパク質のキメラタンパク質。
［２４］
前記TMC6タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列を含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列において、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列に対して、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質。
［２５］
前記細胞が、生物の細胞である、前記方法。
［２６］
前記細胞が、動物細胞である、前記方法。
［２７］
TMC6遺伝子が導入された細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、塩味修飾物質等の目的物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】哺乳類のTMC6タンパク質の系統樹を示す図。
【図２】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。図２から図７を順番に連結することにより、N末端からC末端までのTMC6タンパク質全長のアライメントを示す図になる。
【図３】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。
【図４】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。
【図５】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。
【図６】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。
【図７】哺乳類のTMC6タンパク質のアラインメントを示す図。
【図８】ノックアウトマウスにおける遺伝子の変異部位とその周辺の塩基配列を示す図。（Ａ）TMC6遺伝子。（Ｂ）TMC3遺伝子。（Ｃ）TMC8遺伝子。
【図９】野生型C57BL/6Jマウスおよび各種ノックアウトマウスのNaCl嗜好性の試験結果を示す図。
【図１０】野生型C57BL/6JマウスおよびTMC6遺伝子のホモノックアウトマウスのNaCl以外の呈味物質嗜好性の試験結果を示す図。
【図１１】マウスの有郭乳頭の切片像を示す図（写真）。（Ａ）野生型C57BL/6Jマウス。（Ｂ）TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウス。（Ｃ）TMC6遺伝子のホモノックアウトマウス。
【図１２】高濃度NaCl液での刺激による細胞内カルシウム濃度の変動を示す図。縦軸は、YFP/CFP値の相対値を示す。（Ａ）TMC6発現細胞（マウスのTMC6遺伝子とYC2.60遺伝子を発現するCHO-K1細胞）。（Ｂ）対照細胞（YC2.60遺伝子を発現するCHO-K1細胞）。
【図１３】高濃度NaCl液での刺激によるTMC6発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変動を示す図（写真）。（Ａ）YFP蛍光強度の写真。（Ｂ）YFP/CFP値（FRET値）の写真。（Ｃ）YFP/CFP値（FRET値）のグラフ。
【図１４】高濃度NaCl液での刺激によるTMC6発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変動（フレーム1〜108）を示す図（写真）。
【図１５】高濃度NaCl液での刺激によるTMC6発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変動（フレーム109〜216）を示す図（写真）。
【図１６】高濃度NaCl液での刺激によるTMC6発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変動（フレーム217〜324）を示す図（写真）。
【図１７】高濃度NaCl液での刺激による細胞内カルシウム濃度の変動を示す図。縦軸は、YFP/CFP値の相対値を示す。（Ａ）TMC6発現細胞（ヒトのTMC6遺伝子とYC2.60遺伝子を発現するCHO-K1細胞）。（Ｂ）対照細胞（YC2.60遺伝子を発現するCHO-K1細胞）。
【図１８】高濃度NaCl液での刺激による細胞内カルシウム濃度の変動を示す図。縦軸は、YFP/CFP値の相対値を示す。（Ａ）マウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子の発現細胞。（Ｂ）アカゲザルのTMC6遺伝子の発現細胞。（Ｃ）オランウータンのTMC6遺伝子の発現細胞。（Ｄ）対照細胞。
【図１９】6xHisがＣ末に付加されたマウスのTMC6タンパク質を発現する細胞の蛍光免疫染色像を示す図（写真）。（Ａ）抗His-tag抗体（Alexa488）。（Ｂ）抗TMC6抗体＋抗chicken IgY抗体（Alexa568）。（Ｃ）前記（Ａ）と（Ｂ）のマージ画像。（Ｄ）微分干渉像。
【図２０】TMC6タンパク質を含有する粗精製膜画分を用いた電気生理学的解析の結果を示す図。
【図２１】TMC6タンパク質を含有しない粗精製膜画分を用いた電気生理学的解析の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の方法は、TMC6タンパク質を利用した塩味修飾物質等の目的物質のスクリーニング方法である。
【００１４】
＜１＞TMC6タンパク質
「TMC6タンパク質」とは、TMC6遺伝子にコードされるタンパク質をいう。TMC6タンパク
質は、具体的には、塩味受容体タンパク質であってよい。TMC6タンパク質は、例えば、ナトリウムチャネル等のイオンチャネルとして機能し得る。
【００１５】
なお、遺伝子およびタンパク質の表記は生物種によって異なり得る。よって、生物種によっては、TMC6遺伝子、Tmc6遺伝子、tmc6遺伝子等の種々の表記のTMC6遺伝子に相当する遺伝子が存在し得るが、いずれの表記の遺伝子も、本発明においては一律に「TMC6遺伝子」と表記してよく、また、本発明における「TMC6遺伝子」に包含されるものとする。また、生物種によっては、TMC6タンパク質、Tmc6タンパク質、tmc6タンパク質、TMC6p、Tmc6p、tmc6p等の種々の表記のTMC6タンパク質に相当するタンパク質が存在し得るが、いずれの表記のタンパク質も、本発明においては一律に「TMC6タンパク質」と表記してよく、また、本発明における「TMC6タンパク質」に包含されるものとする。
【００１６】
TMC6遺伝子およびTMC6タンパク質としては、各種生物のTMC6遺伝子およびTMC6タンパク質が挙げられる。生物としては、例えば、哺乳類、両生類、魚類、腕足動物が挙げられる。生物としては、特に、哺乳類が挙げられる。哺乳類として、具体的には、例えば、表１に示すものが挙げられる。これら各種生物由来のTMC6遺伝子の塩基配列およびTMC6タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。哺乳類のTMC6タンパク質の一例について、それらのmRNAのNCBIアクセッション番号およびアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。また、それら哺乳類のTMC6タンパク質の系統樹を図１に示す。また、それら哺乳類のTMC6タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図２〜７に示す。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
すなわち、TMC6遺伝子は、例えば、上記例示したTMC6タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、TMC6タンパク質は、例えば、上記例示したTMC6タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質
であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００１９】
また、TMC6タンパク質としては、キメラTMC6タンパク質も挙げられる。「キメラTMC6タンパク質」とは、TMC6タンパク質のキメラタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のキメラタンパク質）をいう。また、言い換えると、「キメラTMC6タンパク質」とは、TMC6タンパク質のキメラ配列を有するタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のキメラ配列を有するタンパク質）をいう。「TMC6タンパク質のキメラ配列」とは、TMC6タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列（すなわち、２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列）をいう。「TMC6タンパク質のキメラ配列」とは、具体的には、TMC6タンパク質のアミノ酸配列であって、その部分配列が、１種またはそれ以上の他のTMC6タンパク質のアミノ酸配列の部分配列で置換されたアミノ酸配列をいう。キメラTMC6タンパク質の構築におけるアミノ酸配列の置換は、TMC6タンパク質のアミノ酸配列中の対応する部位間で実施することができる。「TMC6タンパク質のアミノ酸配列中の対応する部位」とは、それらTMC6タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントにおいて対応する位置に配列される部位をいう。キメラTMC6タンパク質としては、例えば、上記例示したTMC6タンパク質のキメラタンパク質（具体的には、上記例示したTMC6タンパク質から選択される２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のキメラタンパク質）が挙げられる。キメラTMC6タンパク質として、具体的には、例えば、哺乳類のキメラTMC6タンパク質（具体的には、哺乳類のTMC6タンパク質から選択される２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のキメラタンパク質）が挙げられる。すなわち、TMC6タンパク質は、例えば、上記例示したTMC6タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列（具体的には、上記例示したTMC6タンパク質のアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列）を有するタンパク質であってもよい。キメラ配列として、具体的には、例えば、配列番号１と２６に示すアミノ酸配列のキメラ配列や配列番号２６と３５に示すアミノ酸配列のキメラ配列が挙げられる。配列番号１と２６に示すアミノ酸配列のキメラ配列として、具体的には、例えば、配列番号２６の１〜１５位のアミノ酸配列と配列番号１の１８〜８０７位のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列が挙げられる。キメラTMC6タンパク質としては、塩味受容体としての機能を有するものを選択することができる。
【００２０】
キメラTMC6タンパク質を構成するTMC6タンパク質の数は、特に制限されない。キメラTMC6タンパク質を構成するTMC6タンパク質の数は、２種であってもよく、３種またはそれ以上であってもよい。
【００２１】
キメラTMC6タンパク質における各TMC6タンパク質の構成比率は特に制限されない。各TMC6タンパク質の構成比率は、キメラTMC6タンパク質を構成するTMC6タンパク質の構成比率の合計が１００％を超えない範囲で適宜設定することができる。各TMC6タンパク質の構成比率は、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上であってもよく、９９％以下、９７％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または１％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。「各TMC6タンパク質の構成比率」とは、キメラTMC6タンパク質を構成するアミノ酸残基の総数に対する各TMC6タンパク質に由来するアミノ酸残基の個数の比率をいう。なお、キメラTMC6タンパク質を構成するアミノ酸残基の内、キメラTMC6タンパク質を構成するTMC6タンパク質の保存配列に該当するアミノ酸残基は、それらTMC6タンパク質のいずれに由来するとみなしてもよい。
【００２２】
キメラTMC6タンパク質における各TMC6タンパク質に由来する部位の分布態様は特に制限
されない。キメラTMC6タンパク質において、各TMC6タンパク質に由来する部位は、１ヶ所に固まって存在していてもよく、２ヶ所またはそれ以上に分散して存在していてもよい。例えば、或るTMC6タンパク質（TMC6タンパク質Ａ）の内部のアミノ酸配列を別のTMC6タンパク質（TMC6タンパク質Ｂ）のアミノ酸配列で置換してキメラTMC6タンパク質をデザインした場合、TMC6タンパク質Ａのアミノ酸配列はキメラTMC6タンパク質のＮ末側とＣ末側に分散して残存する。
【００２３】
同様に、TMC6遺伝子としては、キメラTMC6遺伝子が挙げられる。キメラTMC6タンパク質についての記載は、キメラTMC6遺伝子にも準用できる。
【００２４】
TMC6遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTMC6遺伝子、例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列を有する遺伝子、のバリアントであってもよい。同様に、TMC6タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTMC6タンパク質、例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列を有するタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「TMC6遺伝子」という用語は、上記例示したTMC6遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「TMC6タンパク質」という用語は、上記例示したTMC6タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したTMC6遺伝子やTMC6タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００２５】
また、由来する生物種で特定されるTMC6遺伝子は、当該生物種において見出されるTMC6遺伝子そのものに限られず、当該生物種において見出されるTMC6遺伝子の塩基配列を有する遺伝子およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、由来する生物種で特定されるTMC6タンパク質は、当該生物種において見出されるTMC6タンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出されるTMC6タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。それら保存的バリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。例えば、「哺乳類のTMC6タンパク質」という用語は、哺乳類において見出されるTMC6タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。また、例えば、「哺乳類のキメラTMC6タンパク質」という用語は、哺乳類において見出されるTMC6タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。言い換えると、「哺乳類のキメラTMC6タンパク質」を構成するTMC6タンパク質は、哺乳類において見出されるTMC6タンパク質そのものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。
【００２６】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、TMC6遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが塩味受容体としての機能を有するタンパク質をコードすることをいう。また、TMC6タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが塩味受容体としての機能を有することをいう。
【００２７】
タンパク質が塩味受容体としての機能を有することは、例えば、当該タンパク質を有する（発現する）細胞を塩化ナトリウム等の塩味物質と接触させた際の当該細胞の活性化を確認することにより、確認できる。活性化の確認は、例えば、当該タンパク質以外の塩味
受容体（ここでは「他の塩味受容体」ともいう）が機能しない条件で実施してよい。そのような条件としては、他の塩味受容体を有さない細胞を用いた条件や、他の塩味受容体の機能を阻害剤で阻害した条件が挙げられる。その他の条件については、後述する本発明の方法の記載を準用できる。
【００２８】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００２９】
TMC6遺伝子のホモログまたはTMC6タンパク質のホモログは、例えば、上記例示したTMC6遺伝子の塩基配列または上記例示したTMC6タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、TMC6遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知のTMC6遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００３０】
TMC6遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば配列番号１〜４７に示すアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３２】
また、TMC6遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００３３】
また、TMC6遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば配列番号
１〜４７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００３４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００３５】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、TMC6遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、TMC6遺伝子は、例えば、遺伝コードの縮重による上記例示したTMC6遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、TMC6遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００３６】
なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、DNAに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「TMC6遺伝子」とは、TMC6タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。TMC6遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。TMC6遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。TMC6遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。TMC6遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。TMC6遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。TMC6遺伝子がRNAを含む場合、上記例示した塩基配列等のDNAに関する記載は、RNAに合わせて適宜読み替えてよい。TMC6遺伝子は、イントロンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。TMC6遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００３７】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３８】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）
、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００３９】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００４０】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００４１】
また、TMC6タンパク質は、TMC6タンパク質の保存配列（すなわち、２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。TMC6タンパク質は、例えば、上記例示したTMC6タンパク質の保存配列（具体的には、上記例示したTMC6タンパク質から選択される２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。TMC6タンパク質は、具体的には、例えば、哺乳類のキメラTMC6タンパク質の保存配列（具体的には、哺乳類のTMC6タンパク質から選択される２種またはそれ以上のTMC6タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。また、TMC6タンパク質は、例えば、配列番号１〜４７に示す全てのアミノ酸配列（計４７個）のアラインメントにおいて、１０個以上、２０個以上、または３０個以上のアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。保存配列は対象のアミノ酸配列のアラインメントにより決定できる。
【００４２】
また、TMC6タンパク質は、上述したようなTMC6タンパク質のアミノ酸配列に加えて、その他のアミノ酸配列を有していてもよい。すなわち、TMC6タンパク質は、上述したようなTMC6タンパク質のアミノ酸配列とその他のアミノ酸配列との融合タンパク質であってもよい。その他のアミノ酸配列は、TMC6タンパク質が塩味受容体としての機能を損なわない限り、特に制限されない。その他のアミノ酸配列としては、例えば、HisタグやV5エピトープタグ等のタグ配列が挙げられる。その他のアミノ酸配列は、例えば、TMC6タンパク質のＮ末端、若しくはＣ末端、又はその両方に連結されていてよい。
【００４３】
＜２＞TMC6タンパク質の製造
TMC6タンパク質は、目的物質のスクリーニングに利用可能な任意の形態で製造し使用することができる。製造および使用されるTMC6タンパク質の形態は、本発明の方法の実施態
様等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００４４】
TMC6タンパク質は、例えば、TMC6遺伝子を発現させることにより製造できる。TMC6遺伝子の発現は、例えば、細胞を用いて実施してもよいし、無細胞タンパク質合成系を用いて実施してもよい。細胞を用いたTMC6遺伝子の発現については、後述するTMC6タンパク質を有する細胞の説明を参照できる。発現したTMC6タンパク質は、適宜、後述するような、目的物質のスクリーニングに利用可能な形態で取得し、本発明の方法に使用できる。
【００４５】
TMC6タンパク質は、例えば、精製物や粗精製物等の所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。TMC6タンパク質は、具体的には、例えば、構造物に担持された形態で使用されてもよい。構造物としては、例えば、細胞や細胞膜が挙げられる。言い換えると、TMC6タンパク質は、例えば、TMC6タンパク質を有する細胞やTMC6タンパク質を有する細胞膜等の、TMC6タンパク質を有する（担持する）構造物の形態で使用することができる。これらTMC6タンパク質を有する構造物も、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。
【００４６】
TMC6タンパク質を有する細胞を「本発明の細胞」ともいう。TMC6タンパク質は、例えば、細胞膜に局在して機能し得る。よって、本発明の細胞は、TMC6タンパク質を、例えば、細胞膜に有していてよい。
【００４７】
TMC6タンパク質は、該タンパク質をコードする遺伝子（TMC6遺伝子）から発現する。よって、本発明の細胞は、TMC6遺伝子を有していてよい。本発明の細胞は、具体的には、TMC6遺伝子を発現可能に有していてよい。なお、本発明の細胞は、TMC6タンパク質を発現するまでTMC6遺伝子を有していれば足りる。すなわち、本発明の細胞は、TMC6タンパク質の発現後には、TMC6遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。また、本発明の細胞は、言い換えると、TMC6遺伝子を発現した細胞であってよく、また、TMC6タンパク質を発現した細胞であってよい。なお、「TMC6遺伝子の発現」と「TMC6タンパク質の発現」とは同義に用いられ得る。
【００４８】
本発明の細胞は、１コピーのTMC6遺伝子を有していてもよく、２コピーまたはそれ以上のTMC6遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、１種のTMC6遺伝子を有していてもよく、２種またはそれ以上のTMC6遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、１種のTMC6タンパク質を有していてもよく、２種またはそれ以上のTMC6タンパク質を有していてもよい。
【００４９】
本発明の細胞は、本来的にTMC6遺伝子を有するものであってもよく、TMC6遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。
【００５０】
本来的にTMC6遺伝子を有する細胞としては、上記のようなTMC6遺伝子が由来する生物の細胞、例えば、ヒトやマウス等の哺乳類の味細胞、が挙げられる。本来的にTMC6遺伝子を有する細胞は、例えば、同細胞を有する生物や組織から取得できる。
【００５１】
TMC6遺伝子を有するように改変された細胞としては、TMC6遺伝子が導入された細胞が挙げられる。すなわち、本発明は、TMC6遺伝子が導入された細胞も提供する。
【００５２】
なお、本発明の細胞およびそれを取得するために用いられる細胞（例えば、TMC6遺伝子が導入される又は導入された細胞）を総称して「宿主細胞」ともいう。
【００５３】
宿主細胞は、機能するTMC6タンパク質を発現でき、以て目的物質のスクリーニングに利
用可能なものであれば特に制限されない。宿主細胞は、具体的には、TMC6タンパク質発現時に塩化ナトリウム等の塩味物質との接触により活性化されるものであればよい。宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞等の真核細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、動物細胞が挙げられる。動物としては、例えば、哺乳類、鳥類、両生類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類としては、例えば、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。霊長類としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリが挙げられる。両生類としては、例えば、アフリカツメガエルが挙げられる。また、宿主細胞が由来する組織または細胞は特に制限されない。宿主細胞が由来する組織または細胞としては、例えば、卵巣、腎臓、副腎、舌上皮、松果体、甲状腺、メラノサイトが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO）が挙げられる。CHOとして、具体的には、例えば、CHO-DG44やCHO-K1が挙げられる。ヒトの細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（HEK）が挙げられる。HEKとして、具体的には、例えば、HEK293やHEK293Tが挙げられる。サルの細胞としては、例えば、アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株（COS）が挙げられる。COSとして、具体的には、例えば、COS-1が挙げられる。アフリカツメガエルの細胞としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21、SF+等のSpodoptera frugiperda由来細胞や、High-Five等のTrichoplusia ni由来細胞が挙げられる。宿主細胞は、個々の独立した細胞（例えば遊離の細胞）であってもよいし、組織等の集合体を形成していてもよい。
【００５４】
TMC6遺伝子は、TMC6遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、TMC6遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【００５５】
取得したTMC6遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、TMC6遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol.,
154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、TMC6遺伝子のバリアントを化学合成によって直接取得してもよい。
【００５６】
TMC6遺伝子を宿主細胞に導入する形態は特に制限されない。TMC6遺伝子は、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。具体的には、例えば、TMC6遺伝子をDNA等の転写を要する形態で導入する場合、宿主細胞において、TMC6遺伝子は、当該宿主細胞で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主細胞において、TMC6遺伝子は、染色体外に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。
【００５７】
TMC6遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主細胞において機能するものであれば特に制限されない。「宿主細胞において機能するプロモーター」とは、宿主細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主細胞由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、TM
C6遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、TMC6遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。例えば、動物細胞において機能するプロモーターとしては、SV40プロモーター、EF1aプロモーター、RSVプロモーター、CMVプロモーター、SRalphaプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００５８】
TMC6遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。TMC6遺伝子を含むベクターを、「TMC6遺伝子の発現ベクター」または「TMC6遺伝子の組み換えベクター」ともいう。TMC6遺伝子の発現ベクターは、例えば、TMC6遺伝子を含むDNA断片をベクターと連結することにより、構築することができる。TMC6遺伝子の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、同遺伝子を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、薬剤耐性遺伝子などのマーカーを備えていてもよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーター等の発現調節配列を備えていてもよい。ベクターは、宿主細胞の種類やTMC6遺伝子の導入形態等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞への遺伝子導入に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNAシリーズベクター（pcDNA3.1等；Thermo Fisher Scientific）、pBApo-CMVシリーズベクター（タカラバイオ）、pCI-neo（Promega）が挙げられる。なお、ベクターの種類や構成によっては、ベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るし、宿主細胞の染色体外で自律複製し得るし、あるいは宿主細胞の染色体外に一時的に保持され得る。例えば、SV40複製起点等のウイルスの複製起点を有するベクターは、動物細胞の染色体外で自律複製し得る。具体的には、例えば、pcDNAシリーズベクターはSV40複製起点を有しており、SV40のラージＴ抗原を発現する宿主細胞（COS-1やHEK293T等）において染色体外で自律複製し得る。
【００５９】
また、TMC6遺伝子は、例えば、同遺伝子を含む核酸断片を宿主細胞に導入することによっても、宿主細胞に導入することができる。TMC6遺伝子を含む核酸断片を、「TMC6遺伝子断片」ともいう。そのような断片としては、直鎖状DNAや直鎖状RNAが挙げられる。直鎖状RNAとしては、例えば、mRNAやcRNAが挙げられる。
【００６０】
ベクターや核酸断片等の核酸を宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞等の宿主細胞にベクターや核酸断片等の核酸を導入する方法としては、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合は、同ベクター（ウイルス）を宿主細胞に感染させることにより、宿主細胞に同ベクターを導入することができる。
【００６１】
また、本来的にTMC6遺伝子を有する宿主細胞を、TMC6遺伝子の発現が増大するよう改変して用いてもよい。「遺伝子の発現が増大する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変細胞と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変細胞」とは、標的の遺伝子の発現が増大するように改変されていない対照細胞を意味する。非改変細胞としては、野生型の細胞や改変元の細胞が挙げられる。TMC6遺伝子の発現を増大させる手法としては、TMC6遺伝子のコピー数を増加させることやTMC6遺伝子の転写効率や翻訳効率を向上させることが挙げられる。TMC6遺伝子のコピー数の増加は、TMC6遺伝子を宿主細胞に導入することにより達成できる。TMC6遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入されるTMC6遺伝子は、宿主細胞由来であってもよく、異種由来であってもよい。TMC6遺
伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、プロモーター等の遺伝子の発現調節配列の改変により達成できる。例えば、TMC6遺伝子の転写効率の向上は、TMC6遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。
【００６２】
本発明の細胞は、目的物質のスクリーニングに利用できる限り、その他の任意の性質を有していてよい。本発明の細胞は、例えば、塩味受容体以外の呈味受容体（「他の呈味受容体」ともいう）を有していてもよく、有していなくてもよい。また、本発明の細胞は、TMC6タンパク質以外の塩味受容体（ここでは「他の塩味受容体」ともいう）を有さないのが好ましい場合があり得る。他の塩味受容体を有さない細胞としては、他の塩味受容体をコードする遺伝子を有さない細胞や、他の塩味受容体をコードする遺伝子を有するが同遺伝子を発現していない細胞が挙げられる。本発明の細胞は、例えば、本来的に他の塩味受容体を有さないものであってもよく、他の塩味受容体を有さないように改変されたものであってもよい。他の塩味受容体を有さないように細胞を改変することは、例えば、他の塩味受容体をコードする遺伝子をノックアウトすることにより達成できる。また、本発明の細胞は、例えば、目的物質のスクリーニングのためのプローブ（例えば遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（Chem Rev. 2008 May;108(5):1550-64.））を有していてもよい。そのようなプローブを有する細胞としては、そのようなプローブをコードする遺伝子を発現する細胞が挙げられる。また、本発明の細胞は、例えば、カルシウムチャネルを有していてもよい。言い換えると、本発明の細胞は、カルシウムチャネルをコードする遺伝子を有していてもよい。
【００６３】
本発明の細胞は、本来的に上記例示したような性質を有するものであってもよく、上記例示したような性質を有するように改変されたものであってもよい。TMC6遺伝子およびTMC6タンパク質に関連する細胞の改変についての記載は、他の性質に関連する細胞の改変にも準用できる。
【００６４】
TMC6遺伝子を有する細胞は、そのまま、あるいは適宜TMC6遺伝子を発現させて、TMC6タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）として使用することができる。すなわち、TMC6遺伝子を有する細胞が既にTMC6遺伝子を発現している場合、当該細胞は、そのまま、TMC6タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）として使用してもよい。また、TMC6遺伝子を有する細胞にTMC6遺伝子を発現させることにより、TMC6タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）が得られる。例えば、TMC6遺伝子を有する細胞を培養することにより、TMC6遺伝子を発現させることができ、以てTMC6タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）が得られる。具体的には、例えば、TMC6遺伝子の導入（例えばトランスフェクション）後、宿主細胞の培養を継続し、TMC6遺伝子を発現させることができる。培地組成や培養条件は、TMC6遺伝子を有する細胞を維持する（例えば増殖させる）ことができ、TMC6遺伝子が発現する限り、特に制限されない。培養の際に、TMC6遺伝子を有する細胞は、増殖してもよく、しなくてもよい。培地組成や培養条件は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培養は、例えば、動物細胞等の細胞の培養に利用される通常の培地および通常の条件をそのまま、あるいは適宜改変して用いて実施することができる。例えば、動物細胞の培養に利用できる培地として、具体的には、Opti-MEM培地（Thermo Fisher Scientific）、DMEM培地、RPMI 1640培地、CD293培地が挙げられる。培養は、例えば、３６℃〜３８℃で、５％ＣＯ２等のＣＯ２含有雰囲気下で静置培養により行うことができる。また、必要に応じて、選択薬剤や発現誘導剤を用いることができる。
【００６５】
TMC6タンパク質が発現したことは、TMC6タンパク質の機能を測定することにより確認できる。また、TMC6タンパク質が発現したことは、TMC6遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することや、抗体を用いてウェスタンブロットによりTMC6タンパク質を検出することでも確認できる。
【００６６】
本発明の細胞は、例えば、そのまま（培養液に含まれたまま）、あるいは培地から回収して、本発明の方法に使用することができる。また、培養物やそれから回収した細胞は、例えば、適宜、洗浄、濃縮、希釈等の処理をしてから、本発明の方法に使用してもよい。このように、本発明の細胞は、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。TMC6タンパク質を有する他の構造物についても同様である。
【００６７】
また、本発明の細胞は、人工的に調製することもできる。すなわち、「細胞」という用語には、培養により得られた細胞等の生物的に得られたもの（すなわち生物の細胞）に限られず、人工脂質二重膜小胞等の非生物的に得られたものも包含される。よって、「細胞」という用語は、具体的には、脂質二重膜小胞を意味してもよい。人工脂質二重膜小胞は、TMC6遺伝子を有していなくてもよい。人工脂質二重膜小胞の製造法は特に制限されない。TMC6タンパク質を有する人工脂質二重膜小胞は、例えば、TMC6タンパク質を用いて製造することができる。人工脂質二重膜小胞は、TMC6タンパク質を、例えば、その膜に有していてよい。人工脂質二重膜小胞としては、リポソームが挙げられる。
【００６８】
TMC6タンパク質を有する細胞膜は、例えば、本発明の細胞から調製することができる。TMC6タンパク質を有する細胞膜は、具体的には、例えば、本発明の細胞を破砕した際の膜画分として得られる。
【００６９】
また、TMC6タンパク質を有する細胞膜は、人工的に調製することもできる。すなわち、「細胞膜」という用語には、培養により得られた細胞から調製された細胞膜等の生物的に得られたもの（すなわち生物の細胞の細胞膜）に限られず、人工脂質二重膜等の非生物的に得られたものも包含される。よって、「細胞膜」という用語は、具体的には、脂質二重膜を意味してもよい。人工脂質二重膜の製造法は特に制限されない。人工脂質二重膜の製造法としては、例えば、Montal-Mueller法や、液滴接触法（Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995 (2013)）が挙げられる。TMC6タンパク質を有する人工脂質二重膜は、例えば、TMC6タンパク質を用いて製造することができる。例えば、TMC6タンパク質を含有する膜画分等の適切な形態のTMC6タンパク質を、予め調製された人工脂質二重膜に組み込むことで、TMC6タンパク質を有する人工脂質二重膜を調製することができる。
【００７０】
細胞膜は、例えば、２つのウェル等の２つの空間を区分するように使用することができる。すなわち、細胞膜は、例えば、２つのウェル等の２つの空間を備える反応系であって、当該２つの空間が当該細胞膜によって互いに区分されている反応系を提供するように使用することができる。そのような反応系は、例えば、後述するような装置として提供されてよい。
【００７１】
TMC6タンパク質を含有する素材として、具体的には、TMC6遺伝子を有する細胞の培養物、同培養物から回収した細胞、同細胞の破砕物、同細胞の溶解物、同細胞の抽出物（無細胞抽出液）、同細胞をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、TMC6タンパク質を有する細胞膜、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。
【００７２】
TMC6タンパク質は、器具の一部を構成していてもよい。すなわち、TMC6タンパク質を含有する素材として、具体的には、例えば、TMC6タンパク質を備える器具も挙げられる。言い換えると、TMC6タンパク質は、具体的には、例えば、TMC6タンパク質を備える器具の形態で製造し使用することもできる。器具としては、本発明の方法を実施するための器具（すなわち目的物質をスクリーニングするための器具）が挙げられる。器具の構成は、本発明の方法の実施態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。すなわち、器具は、例えば、被
検物質のTMC6タンパク質への作用を測定できるように構成されていてよい。TMC6タンパク質を備える器具としては、例えば、TMC6タンパク質が固定化された器具や、TMC6タンパク質を有する構造物（脂質二重膜等）を備える器具が挙げられる。脂質二重膜等を備える器具として、具体的には、例えば、脂質二重膜を配列したチップ（WO2005/000558；Watanabe R. et al., Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4519.；Kamiya K. et al., Preparation of artificial cell membrane and single ion channel measurement, Electrochemistry, 83, 1096-1100 (2015)）や、液滴接触法により調製された脂質二重膜を備えるイオンチャネル測定デバイス（Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995
(2013)）が挙げられる。
【００７３】
＜３＞本発明の方法
本発明の方法は、TMC6タンパク質を利用した目的物質のスクリーニング方法である。すなわち、本発明の方法は、言い換えると、TMC6タンパク質を利用して目的物質を同定する工程を含む、目的物質のスクリーニング方法である。当該工程を「スクリーニング工程」ともいう。すなわち、本発明の方法においては、TMC6タンパク質を利用して被検物質が目的物質であるかを同定することができる。
【００７４】
TMC6タンパク質は、目的物質のスクリーニングに利用可能な任意の形態で本発明の方法に使用することができる。TMC6タンパク質は、例えば、上記例示したような形態で本発明の方法に使用することができる。TMC6タンパク質は、具体的には、例えば、TMC6タンパク質を有する細胞の形態で本発明の方法に使用することができる。すなわち、本発明の方法に使用されるTMC6タンパク質とは、例えば、精製タンパク質であってもよく、TMC6タンパク質を有する細胞等のTMC6タンパク質を含有する素材であってもよい。言い換えると、本発明の方法に使用されるTMC6タンパク質とは、例えば、細胞等の素材に含有されるものであってよい。
【００７５】
目的物質は、TMC6タンパク質を利用して同定できるものであれば特に制限されない。目的物質としては、TMC6タンパク質に作用する物質が挙げられる。TMC6タンパク質に作用する物質としては、TMC6タンパク質に結合する物質や、TMC6タンパク質を活性化または不活性化する物質が挙げられる。
【００７６】
また、TMC6タンパク質に作用する物質は、例えば、塩味修飾物質の候補となり得る。すなわち、目的物質としては、塩味修飾物質も挙げられる。「塩味修飾物質」とは、塩味に影響する物質の総称である。塩味修飾物質としては、塩味代替物質、塩味増強物質、塩味低減物質が挙げられる。「塩味代替物質」とは、それ自体が塩味を呈する物質をいう。塩味代替物質を「塩味物質」ともいう。「塩味増強物質」とは、塩味物質の存在下で塩味を増強する物質をいい、より具体的には、塩味物質の塩味を増強する物質であってよい。「塩味低減物質」とは、塩味物質の存在下で塩味を低減する物質をいい、より具体的には、塩味物質の塩味を低減する物質であってよい。塩味増強物質および塩味低減物質は、いずれも、それ自体が塩味を呈してもよく、呈さなくてもよい。
【００７７】
また、TMC6タンパク質に作用する物質は、例えば、TMC6タンパク質が関与する疾病の予防薬または治療薬の有効成分の候補となり得る。すなわち、目的物質としては、TMC6タンパク質が関与する疾病の予防薬または治療薬の有効成分も挙げられる。
【００７８】
被検物質は、特に制限されない。被検物質は、単一の成分からなるもの（すなわち純物質）であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせからなるもの（すなわち混合物）であってもよい。被検物質が混合物である場合、当該混合物を構成する成分の種類
数や構成比率は、特に制限されない。被検物質は、公知物質であってもよく、新規物質であってもよい。被検物質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。被検物質としては、例えば、糖、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、生物等の天然資源由来の成分、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、その他の有機または無機の各種成分が挙げられる。被検物質としては、１種の被検物質を用いてもよく、２種またはそれ以上の被検物質を組み合わせて用いてもよい。２種またはそれ以上の成分をまとめてTMC6タンパク質に接触させて本発明の方法を実施することにより、それらの成分の組み合わせが全体として目的物質であるかを同定することができる。「２種またはそれ以上の成分をまとめてTMC6タンパク質に接触させる」場合としては、混合物である被検物質をTMC6タンパク質に接触させる場合や、２種またはそれ以上の被検物質をまとめてTMC6タンパク質に接触させる場合が挙げられる。
【００７９】
本発明の方法においては、例えば、被検物質のTMC6タンパク質への作用に基づいて、目的物質を同定する（すなわち当該被検物質が目的物質であるかを同定する）ことができる。被検物質のTMC6タンパク質への作用としては、被検物質のTMC6タンパク質への結合や、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化が挙げられる。すなわち、例えば、被検物質のTMC6タンパク質への結合、または被検物質によるTMC6タンパク質の活性化もしくは不活性化に基づいて、目的物質を同定することができる。
【００８０】
具体的には、TMC6タンパク質と被検物質を接触させた際の被検物質のTMC6タンパク質への作用に基づいて、目的物質を同定することができる。すなわち、スクリーニング工程は、具体的には、（Ａ）TMC6タンパク質と被検物質を接触させる工程、（Ｂ）前記接触の際の前記被検物質の前記TMC6タンパク質への作用を測定する工程、および（Ｃ）前記作用に基づいて目的物質を同定する工程、を含んでいてよい。言い換えると、本発明の方法は、具体的には、上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、目的物質のスクリーニング方法であってよい。
【００８１】
TMC6タンパク質と被検物質との接触は、適当な液体中で実施することができる。TMC6タンパク質と被検物質との接触が実施される液体を「反応液」ともいう。例えば、適当な反応液中でTMC6タンパク質と被検物質とを共存させることにより、TMC6タンパク質と被検物質とを接触させることができる。具体的には、例えば、TMC6タンパク質（例えばTMC6タンパク質を有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および被検物質を適当な液体媒体中に溶解、懸濁、分散等して共存させることにより、TMC6タンパク質と被検物質とを接触させることができる。液体媒体としては、水や水性緩衝液等の水性媒体が挙げられる。反応条件（TMC6タンパク質と被検物質との接触を実施する条件）は、目的物質のスクリーニングが可能である限り、特に制限されない。反応条件は、TMC6タンパク質の使用形態、被検物質の種類、被検物質のTMC6タンパク質への作用の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、タンパク質とリガンド間の相互作用等の物質間の相互作用を測定する際の公知の反応条件をそのまま、あるいは適宜改変して利用してもよい。被検物質の濃度は、例えば、0.01 nM〜500 mMであってもよい。TMC6タンパク質の濃度は、例えば、1 pg/mL〜10 mg/mLであってもよい。また、TMC6タンパク質を有する細胞を用いる場合、TMC6タンパク質を有する細胞の濃度は、例えば、10 cell/mL〜10,000,000 cell/mLであってもよい。TMC6タンパク質と被検物質との接触は、適当な時点で終了してもよいし、しなくてもよい。TMC6タンパク質と被検物質との接触の継続時間は、例えば、０．１秒以上、０．５秒以上、１秒以上、３秒以上、５秒以上、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、または５０秒以上であってもよい。反応液は、目的物質のスクリーニングが可能である限り、TMC6タンパク質（例えばTMC6タンパク質を有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および被検物質に加えて、その他の成分を含有していてよい。その他の成分は、TMC6タンパク質の使用形態、被検物質の種類、被検物質のTMC6タンパク質への作用の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。その他の成分としては、カルシ
ウム塩等の塩類、グルコース等の炭素源、ｐＨ緩衝剤が挙げられる。
【００８２】
「接触の際（TMC6タンパク質と被検物質との接触の際）」とは、測定可能な程度に被検物質のTMC6タンパク質への作用が生じている時点であれば特に制限されない。「接触の際」とは、具体的には、TMC6タンパク質と被検物質との接触が開始した時点から、被検物質のTMC6タンパク質への作用が消失する時点までの適当な時点であってよい。「接触の際」として、具体的には、例えば、被検物質のTMC6タンパク質への最大の作用が得られる時点（例えば、被検物質のTMC6タンパク質への結合量が最大となる時点や、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化の程度が最大となる時点）が挙げられる。「接触の際」とは、具体的には、例えば、TMC6タンパク質と被検物質との接触が開始した時点の０．１秒後以降、０．５秒後以降、１秒後以降、３秒後以降、５秒後以降、１０秒後以降、２０秒後以降、３０秒後以降、または５０秒後以降であってもよく、TMC6タンパク質と被検物質との接触が終了した時点（終了する場合）の１００秒後まで、５０秒後まで、または２０秒後までであってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【００８３】
被検物質のTMC6タンパク質への作用が認められた場合に、当該被検物質が目的物質であると同定してよい。
【００８４】
具体的には、TMC6タンパク質と被検物質の結合が認められた場合に、当該被検物質が目的物質であると同定してよい。すなわち、TMC6タンパク質と被検物質の結合が認められた場合に、例えば、当該被検物質がTMC6タンパク質に結合する物質であると同定してよい。
【００８５】
また、具体的には、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化が認められた場合に、当該被検物質が目的物質であると同定してよい。すなわち、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、例えば、当該被検物質がTMC6タンパク質を活性化する物質であると同定してよい。また、すなわち、被検物質によるTMC6タンパク質の不活性化が認められた場合に、例えば、当該被検物質がTMC6タンパク質を不活性化する物質であると同定してよい。
【００８６】
被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化は、TMC6タンパク質と被検物質を接触させた際の該TMC6タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）を指標として決定することができる。すなわち、上記工程（Ｂ）は、例えば、（Ｂ１）活性化の程度Ｄ１を測定する工程であってよい。また、上記工程（Ｃ）は、例えば、（Ｃ１）活性化の程度Ｄ１に基づいて目的物質を同定する工程であってよい。
【００８７】
被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化は、より具体的には、TMC6タンパク質と被検物質を接触させた際の該TMC6タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）と対照条件における該TMC6タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ２）とを比較することにより決定できる。すなわち、上記工程（Ｃ１）は、例えば、（Ｃ２）活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２との差に基づいて目的物質を同定する工程であってもよい。
【００８８】
「対照条件」とは、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−１）をいう：
（Ｃ２−１）TMC6タンパク質と被検物質を接触させない条件；
（Ｃ２−２）TMC6タンパク質と被検物質を接触させる条件であって、該被検物質の濃度が上記工程（Ａ）における該被検物質の濃度よりも低い濃度である条件。
【００８９】
言い換えると、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化は、例えば、被検物質の有無または濃度差によるTMC6タンパク質の活性化の程度の差を指標として決定できる。
【００９０】
上記条件（Ｃ２−１）としては、TMC6タンパク質と被検物質を接触させる前の条件や、
TMC6タンパク質と被検物質を接触させた後の条件であって、被検物質が部分的または完全に反応系から除去され、且つ被検物質のTMC6タンパク質への作用が部分的または完全に消失している条件が挙げられる。上記条件（Ｃ２−２）における被検物質の濃度は、活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２とで測定可能な程度に差が認められる濃度であれば特に制限されない。上記条件（Ｃ２−２）における被検物質の濃度は、例えば、上記工程（Ａ）における被検物質の濃度の、９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の濃度であってよい。
【００９１】
本発明の方法は、活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含んでいてもよい。活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２は、単一の反応系において時間差で測定されてもよいし、それぞれ別個の反応系において同時にあるいは時間差で測定されてもよい。活性化の程度Ｄ２は、活性化の程度Ｄ１よりも先に測定されてもよく、後に測定されてもよい。例えば、活性化の程度Ｄ２を測定した後、反応系に被検物質を添加して活性化の程度Ｄ１を測定してもよい。
【００９２】
活性化の程度Ｄ１が高い場合に、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化が認められたと判断できる。具体的には、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高い場合に、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化が認められたと判断できる。また、活性化の程度Ｄ１が低い場合に、被検物質によるTMC6タンパク質の不活性化が認められたと判断できる。具体的には、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、被検物質によるTMC6タンパク質の不活性化が認められたと判断できる。
【００９３】
本発明の方法は、具体的にはTMC6タンパク質と被検物質との接触（例えば工程（Ａ）や対照条件におけるそれらの接触）は、例えば、塩味物質の存在下で実施することができる。本発明の方法を塩味物質の存在下で実施することにより、特に、塩味増強物質または塩味低減物質をスクリーニングすることができる。具体的には、塩味物質の存在下で、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、当該被検物質が塩味増強物質であると同定してよい。また、具体的には、塩味物質の存在下で、被検物質によるTMC6タンパク質の不活性化が認められた場合に、当該被検物質が塩味低減物質であると同定してよい。
【００９４】
塩味物質は、TMC6タンパク質を活性化できるものであれば、特に制限されない。塩味物質は、公知物質であってもよく、新規物質であってもよい。被検物質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。塩味物質は、例えば、本発明の方法により見出されたものであってもよい。塩味物質としては、例えば、反応液中（例えば水性媒体中）でナトリウムイオンやカリウムイオン等のアルカリ金属陽イオンを与える（生じる）物質が挙げられる。塩味物質として、具体的には、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムが挙げられる。塩味物質としては、１種の物質を用いてもよく、２種またはそれ以上の物質を組み合わせて用いてもよい。なお、塩味物質はTMC6タンパク質に作用できる態様で反応系に存在していればよい。塩味物質は、通常、イオン化して反応系に存在していてよい。すなわち、例えば、「塩化ナトリウムの存在下」とは、塩化物イオンとナトリウムイオンの存在下を意味してよい。塩味物質の濃度は、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化を測定できる限り、特に制限されない。塩味物質の濃度は、塩味物質の種類や、被検物質のTMC6タンパク質への作用の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。塩味物質の濃度（例えば塩化ナトリウムの濃度）は、例えば、0.01 mM〜500 mMであってもよい。
【００９５】
また、本発明の方法は、具体的にはTMC6タンパク質と被検物質との接触（例えば工程（Ａ）や対照条件におけるそれらの接触）は、例えば、塩味物質の非存在下で実施することができる。本発明の方法を塩味物質の非存在下で実施することにより、特に、塩味代替物質をスクリーニングすることができる。具体的には、塩味物質の非存在下で、被検物質に
よるTMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、当該被検物質が塩味代替物質であると判断できる。「塩味物質の非存在下」とは、実質的に塩味物質が存在していない状態をいう。実質的に塩味物質が存在していない状態としては、塩味物質の濃度がTMC6タンパク質を活性化しない濃度である条件が挙げられる。実質的に塩味物質が存在していない状態として、具体的には、例えば、塩味物質の濃度（例えば塩化ナトリウムの濃度）が0.1 mM以下である条件が挙げられる。
【００９６】
被検物質のTMC6タンパク質への作用を測定する手法は特に制限されない。被検物質のTMC6タンパク質への作用を測定する手法は、測定する作用の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。すなわち、被検物質のTMC6タンパク質への作用は、例えば、被検物質のTMC6タンパク質への結合、または被検物質によるTMC6タンパク質の活性化もしくは不活性化を測定できる適当な手法により測定することができる。
【００９７】
TMC6タンパク質と被検物質の結合を測定する手法は特に制限されない。TMC6タンパク質と被検物質の結合は、例えば、タンパク質とリガンド間の結合等の物質間の結合を測定する公知の手法により測定することができる。そのような手法として、具体的には、例えば、等温滴定型熱量測定（Isothermal Titration Calorimetry；ITC）、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；SPR）、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance；NMR）蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy；FCS）が挙げられる。
【００９８】
被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化（例えば、活性化の程度Ｄ１および活性化の程度Ｄ２）を測定する手法は特に制限されない。被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化は、例えば、TMC6タンパク質を有する細胞またはTMC6タンパク質を有する細胞膜を用いて測定することができる。
【００９９】
すなわち、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化は、例えば、TMC6タンパク質を有する細胞を用いて、それぞれ、該細胞の活性化または不活性化を指標として測定することができる。細胞の活性化または不活性化は、例えば、該細胞への陽イオン流入（すなわち、細胞外から細胞内への陽イオンの流れ）を指標として測定することができる。すなわち、細胞への陽イオン流入が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、該細胞が活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞の活性化または不活性化は、例えば、該細胞の膜電位、該細胞の膜電流、該細胞内の陽イオン濃度から選択される１種またはそれ以上のパラメーターを指標として測定することもできる。すなわち、細胞の膜電位が対照条件と比較して増大（脱分極）または減少（過分極）した場合に、それぞれ、該細胞が活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞の内向きの膜電流が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、該細胞が活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞内の陽イオン濃度が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、該細胞が活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。陽イオンとしては、ナトリウムイオンやカルシウムイオンが挙げられる。言い換えると、TMC6タンパク質の活性化または不活性化は、例えば、これらのパラメーターの１種またはそれ以上を指標として測定することができる。なお、TMC6タンパク質は、直接的または間接的に上記例示したようなパラメーターに影響してよい。例えば、一態様においては、TMC6タンパク質を通してナトリウムイオンが細胞内に流入することにより細胞の膜電位が脱分極し、脱分極によりカルシウムチャネルを通してのカルシウムイオンの細胞内への流入が誘導されてもよい。
【０１００】
これらのパラメーターを測定する手法は特に制限されない。これらのパラメーターは、
例えば、公知の手法により測定することができる。例えば、細胞の膜電位、細胞の膜電流、細胞内の陽イオン濃度は、いずれも、細胞への陽イオン流入の指標でもあり得る。よって、細胞への陽イオン流入は、例えば、該細胞の膜電位、該細胞の膜電流、または該細胞内の陽イオン濃度を測定することにより、測定することができる。膜電位を測定する手法としては、パッチクランプ法や膜電位感受性色素を用いた方法が挙げられる。膜電流を測定する手法としては、パッチクランプ法や電位固定法が挙げられる。細胞内ナトリウム濃度を測定する手法としては、CoroNa Green Sodium Indicator（Thermo Fisher Scientific社）等のナトリウム指示薬を用いた方法が挙げられる。細胞内のカルシウム濃度を測定する手法としては、カルシウムイメージングが挙げられる。カルシウムイメージングにおいては、カルシウム指示薬を利用して、細胞内のカルシウム濃度を測定することができる。カルシウム指示薬としては、カルシウム感受性蛍光色素やカルシウム感受性蛍光タンパク質が挙げられる。カルシウム感受性蛍光色素としては、例えば、Fura 2、Fluo 4が挙げられる。また、カルシウム感受性蛍光タンパク質としては、例えば、Cameleon、TN-XL、GCaMP、G-GECOが挙げられる。Cameleonとして、具体的には、例えば、Yellow Cameleon 2.60（YC2.60）（PNAS vol.101:10554-10559 (2004)）が挙げられる。カルシウムイメージングにおけるシグナル（例えば蛍光）の検出は、蛍光検出器等のシグナルの種類に応じた検出器を用いて実施することができる。蛍光検出器としては、例えば、FV1200（オリンパス社製）等の共焦点レーザー顕微鏡やFDSS7000（浜松ホトニクス社製）等のハイスループットスクリーニングシステムが挙げられる。FDSS7000は、96穴や384穴プレート等のマルチウェルプレートの測定に対応しており、複数の被検物質をまとめて試験できる。
【０１０１】
TMC6タンパク質を有する細胞を用いたTMC6タンパク質の活性化または不活性化の測定についての記載は、TMC6タンパク質を有する細胞膜を用いたTMC6タンパク質の活性化または不活性化の測定、特に、細胞膜が２つの空間を区分するように使用される場合、すなわち、細胞膜が、２つの空間を備える反応系であって、当該２つの空間が当該細胞膜によって互いに区分されている反応系を提供するように使用される場合、にも準用できる。そのような場合、それらの空間の内、一方を細胞の内部（「内部空間」ともいう）とみなすことができ、他方を細胞の外部（「外部空間」ともいう）とみなすことができる。それらの空間の内、被検物質を含有する方を外部空間とみなすことができる。TMC6タンパク質を有する細胞膜を用いる場合、「細胞への陽イオン流入」、「細胞の膜電位」、「細胞の膜電流」、「細胞内の陽イオン濃度」は、それぞれ、「細胞膜により区分される空間の内の一方の空間（すなわち内部空間）への陽イオン流入」、「細胞膜の膜電位」、「細胞膜の膜電流」、「細胞膜により区分される空間の内の一方の空間（すなわち内部空間）における陽イオン濃度」と読み替えることができる。
【０１０２】
なお、「或るパラメーターを測定し、被検物質のTMC6タンパク質への作用を測定するための指標として利用する」という場合、当該作用を測定できる（すなわち、当該作用が認められるかを判定できる）限り、当該パラメーターを反映するデータを取得して利用することで足り、当該パラメーターの値自体を取得することは必要としない。すなわち、或るパラメーターを反映するデータを取得した場合、当該データから当該パラメーターの値自体を算出することは必要としない。具体的には、例えば、カルシウムイメージングにより細胞内のカルシウム濃度を測定し、被検物質によるTMC6タンパク質の活性化または不活性化（例えば、活性化の程度Ｄ１および活性化の程度Ｄ２）を測定するための指標として利用する場合、当該活性化または不活性化を測定できる（すなわち、当該活性化または不活性化が認められるかを判定できる）限り、細胞内のカルシウム濃度を反映するデータ（例えば、カルシウム指示薬のシグナル強度やシグナル強度比率）を取得して利用することで足り、当該データから細胞内のカルシウム濃度自体を算出することは必要としない。
【０１０３】
このようにして目的物質を同定することができる。本発明の方法は、さらに、同定された目的物質の塩味における効果を評価する工程、すなわち、同定された目的物質が塩味に
影響する（例えば、塩味を呈する、増強する、または低減する）かを評価する工程、を含んでいてもよい。評価方法は特に制限されない。評価は、例えば、呈味を評価する公知の手法により実施することができる。そのような手法としては、官能評価（官能試験による評価）が挙げられる。評価は、塩味物質の存在下または非存在下で実施することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０１０５】
実施例１：ノックアウトマウスの作製
本実施例では、マウスの味細胞に発現しているTMC6遺伝子、TMC3遺伝子、およびTMC8遺伝子について、遺伝子機能の解析を行うため、それぞれノックアウトマウスを作製した。
【０１０６】
（１）TMC6遺伝子のノックアウトマウスの作製
CRISPR/Cas9技術（Science 337:816-821 (2012)）を用いて、C57BL/6Jマウスの受精卵に対してゲノム編集を行い、TMC6遺伝子に変異を有するマウス（変異型マウス）を作製した。作製方法を以下に述べる。
【０１０７】
Cas9タンパク質を発現させるためのメッセンジャーRNA（mRNA）は、プラスミドpT7-Cas9（ORIGENE社）を用いて合成した。すなわち、pT7-Cas9に組み込まれているT7プロモーターからの転写により、Cas9 mRNAを合成した。合成したCas9 mRNAを、MEGAclear kit（Ambion社）でメーカープロトコールに従って精製し、567 ng/μLのCas9 mRNAを100 μL得た。
【０１０８】
遺伝子変異を施すターゲット配列の設計は、ソフトウエアCRISPR direct（Bioinformatics, 31, 1120-1123.(2015)）とGuide RNA Target Design Tool（Blue Heron社）を用いた。TMC6遺伝子の変異型マウス作製に用いたターゲット配列は（agcatgcccagccgtaccattgg；配列番号４８）である。ターゲット配列の3’末端のtggは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列である。ターゲット配列をDNA合成し、プラスミドpT7-Guide-IVT（ORIGENE社）にクローニングした。得られたプラスミドからの転写によりガイドRNA（gRNA）を合成した。合成したgRNAを、MEGAclear kitで精製し、455 ng/μLのgRNAを得た。
【０１０９】
次いで、C57BL/6Jマウスの前核期受精卵（アークリソース社）の前核または細胞質中に、Cas9 mRNAとgRNAの混合物をマイクロインジェクションした（マウス胚の操作マニュアル＜第三版＞近代出版）。インジェクションに用いたRNAの濃度は、Cas9 mRNAが50 ng/μL、gRNAが40 ng/μLであった。インジェクション後、受精卵を仮親マウスの子宮内に移植した。約19日後に生まれた仔マウス（変異型マウス）の体組織よりゲノムDNAを調製した。ゲノムDNAを鋳型にしてTMC6遺伝子の変異部位とその周辺の塩基配列をPCR増幅し、シーケンス解析を行った。
【０１１０】
結果を図８（Ａ）に示す。野生型マウスのTMC6遺伝子の塩基配列と比較すると、変異型マウスのTMC6遺伝子は、片方のアレルにおいて16塩基が欠失していた。16塩基の欠失部位は、第4エクソンとその下流のイントロンとの境界部分であった。16塩基の欠失によりスプライシングに必要な5'-スプライス部位が失われたため、第4エクソンの下流のイントロンはスプライシングで除去されず、したがって、当該変異型マウスのTMC6遺伝子から転写された核内mRNA前駆体からは、正常な成熟TMC6 mRNAは産生されず、変異型mRNAが産生する。仮に当該変異型mRNAからタンパク質の翻訳が行われたとすると、除去されないイントロン部分にストップコドンが存在するため、タンパク質の合成はそこで停止する。すなわち、当該変異型mRNAから合成されるTMC6タンパク質は、N末端の87アミノ酸は野生型TMC6
タンパク質と同一であるが、それより下流のアミノ酸は野生型TMC6タンパク質とは異なるものになり、さらに15個目のコドンにストップコドンが現れるため、それ以降のアミノ酸残基を欠失する。このように、正常なアミノ酸配列を有するTMC6タンパク質は合成されず、すなわち、TMC6遺伝子は16bpの欠失によりノックアウトされたものとみなすことができる。すなわち、TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウス（Tmc6 +/-）が得られた。
【０１１１】
次いで、TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウスのオスとメスを交配させて、両アレルに上記変異を有するTMC6遺伝子のホモノックアウトマウス（Tmc6 -/-）を作製した。
【０１１２】
（２）TMC3遺伝子およびTMC8遺伝子のノックアウトマウスの作製
同様にして、TMC3遺伝子およびTMC8遺伝子それぞれに変異を有するマウス（変異型マウス）を作製した。変異型マウス作製に用いたターゲット配列は、TMC3遺伝子についてcagctggaagtatcaccacgggg（配列番号４９）、TMC8遺伝子についてgtcgcaagcgttgtagccgtagg（配列番号５０）である。変異型マウスのTMC3遺伝子およびTMC8遺伝子の変異部位とその周辺の塩基配列を、それぞれ、図８（Ｂ）および（Ｃ）に示す。変異型TMC3遺伝子においては、野生型TMC3遺伝子の塩基配列に比較して5塩基が欠失していた。そのため、コドンのフレームシフトが起こり、正常なアミノ酸配列を有するTMC3タンパク質が合成されない。したがって、TMC3遺伝子はノックアウトされたとみなされる。また、変異型TMC8遺伝子においては、野生型TMC8遺伝子には存在しない7塩基が挿入されていた。そのため、コドンのフレームシフトが起こり、正常なアミノ酸配列を有するTMC8タンパク質が合成されない。したがって、TMC8遺伝子はノックアウトされたとみなされる。すなわち、TMC3遺伝子およびTMC8遺伝子それぞれのヘテロノックアウトマウスが得られた。
【０１１３】
次いで、それぞれの遺伝子について、ヘテロノックアウトマウスのオスとメスを交配させ、両アレルに上記変異を有するホモのノックアウトマウス（Tmc3 -/-およびTmc8 -/-）を作製した。
【０１１４】
実施例２：塩味受容体遺伝子の同定
本実施例では、野生型マウスとノックアウトマウスを用いて塩化ナトリウム（NaCl）等の呈味に対する嗜好性の試験を行い、塩味受容体遺伝子の同定を行った。
【０１１５】
（１）NaCl嗜好性の試験
マウスには、上皮性ナトリウムチャネル（epithelial sodium channel、「ENaC」ともいう）を介する塩味受容機構と、それ以外の未知の塩味受容機構（具体的には、ENaC以外の未知の塩味受容体を介する塩味受容機構）が存在することが知られている（Eur J Physiol (2015) 467:457-463）。ENaCは、アミロライドによってチャネルとしての機能を阻害される。そこで、NaCl嗜好性の試験は、アミロライドの存在下で、すなわちENaCの働きが阻害され、未知の塩味受容機構のみが機能する条件下で行った。或る遺伝子がENaC以外の未知の塩味受容体をコードする遺伝子であれば、当該遺伝子のホモノックアウトマウスにおいては当該未知の塩味受容体を介する塩味受容機構が機能せず、よって、当該ノックアウトマウスはアミロライドの存在下で野生型マウスとは異なるNaCl応答性（例えばNaCl嗜好性）を示すと予測される。
【０１１６】
野生型のC57BL/6Jマウスは、正常な成長に必要とされる推奨量（0.05%ナトリウム）の約2倍のナトリウムを含有する飼料（0.1％ナトリウム含有：D12450B；リサーチダイエット社、USA）を与えて飼育した場合、水に比べてNaCl水溶液に対する嗜好性は同程度またはわずかに大きいだけである。しかし、本発明者らは、30 μMアミロライドを添加した水を与えて飼育することにより、野生型のC57BL/6Jマウスが顕著なNaCl嗜好性を示すことを見出した。そこで、野生型C57BL/6Jマウスおよび実施例１で得られたノックアウトマウスを用いて、NaCl嗜好性の試験を行った。
【０１１７】
NaCl嗜好性の試験は、96時間の2瓶選択法（略して「2瓶法」ともいう）により行った。すなわち、2本の11 mLプラスチックボトル（飲水ボトル）に試験水溶液を充填し、周囲の水分を拭き取って乾燥させた後に、重量（ボトル＋ステンレス製飲水チューブ＋水溶液）を測定して、飼育ケージの金属蓋に水平から約30度の角度で挿入した。試験水溶液として、最初の4日間は2本のボトル共に試験水溶液Ａ（対照水溶液；30 μMアミロライドを添加した脱イオン水）を充填してマウスに与え、その後の4日間は、片方のボトルに試験水溶液Ｂ（NaCl水溶液；30 μMアミロライドを添加した100 mM NaCl水溶液）を充填し、もう片方のボトルには試験水溶液Ａ（対照水溶液）を充填して与えた。2本のボトルの左右の位置は、毎日入れ替えた。2本のボトルの重量を24時間ごとに測定することにより、各水溶液の減少量（g）を求めた。並行して、空の飼育ケージに脱イオン水を充填した飲水ボトル4本を設置し、毎日重量変化を測定することにより、水溶液の蒸発量と実験操作による水溶液のこぼれ量の総和の平均値（約0.05〜0.06 g）を求めた。なお、マウスが飼育ケージ蓋やボトルを揺らして水溶液がこぼれることを防ぐため、ボトルの上に透明アクリル板（10 cm x 15 cm x 1 cm、180 g）を載せて重石とした。各水溶液の減少量から蒸発量およびこぼれ量の総和の平均値を減算し、各水溶液の摂取量とした。対照水溶液とNaCl水溶液の総摂取量に対するNaCl水溶液の摂取量の比率を算出し、NaCl嗜好性とした。
【０１１８】
結果を図９に示す。野生型マウス、TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウス（Tmc6 +/-）、並びにTMC3遺伝子およびTMC8遺伝子それぞれのホモノックアウトマウス（Tmc3 -/-およびTmc8 -/-）は、いずれも、高いNaCl嗜好性を示した。一方、TMC6遺伝子のホモノックアウトマウス（Tmc6 -/-）は、他の被験マウスと比較して、NaCl嗜好性が著しく減少した（P < 0.05またはP < 0.01）。この実験結果から、TMC6遺伝子のホモノックアウトマウスにおいてはENaCを介する塩味受容機構以外の未知の塩味受容機構が機能せず、よって、当該ノックアウトマウスは塩味を正常に感じることができなかったと考えられる。よって、TMC6遺伝子は、ENaC以外の未知の塩味受容体をコードする遺伝子であることが示唆された。
【０１１９】
（２）NaCl以外の呈味物質嗜好性の試験
次いで、野生型C57BL/6JマウスおよびTMC6遺伝子のホモノックアウトマウスについて、48時間の2瓶法によりNaCl以外の各種呈味物質に対する嗜好性の試験を行った。2瓶法においては、試験水溶液Ａ（対照水溶液）として脱イオン水を、試験水溶液Ｂとして呈味物質水溶液（下記）を、それぞれ用いた。なお、呈味物質水溶液がアミロライドを含有する場合は、対照水溶液にも同濃度のアミロライドを添加した。
【０１２０】
＜呈味物質水溶液＞
MSG：100 mM グルタミン酸ナトリウム
MSG + AMIL：100 mM グルタミン酸ナトリウム＋30 μM アミロライド
MSG + IMP：100 mM グルタミン酸ナトリウム＋1 mM イノシン酸
MSG + IMP + AMIL：100 mM グルタミン酸ナトリウム＋1 mM イノシン酸＋30 μM アミロライド
Citric Acid：10 mM クエン酸
Quinine HCl：0.3 mM キニーネ塩酸塩
Glucose：300 mM ブドウ糖
Fructose：300 mM 果糖
Sucrose：300 mM ショ糖
【０１２１】
結果を図１０に示す。TMC6遺伝子のホモノックアウトマウス（Tmc6 -/-）は、野生型マウスと比較して、うま味（MSG、MSG + AMIL、MSG + IMP、MSG + IMP + AMIL）および甘味（Glucose、Fructose、Sucrose）に対する嗜好性、並びに酸味（Citric acid）および苦
味（Quinine HCl）に対する忌避性のいずれにも差が認められなかった。この実験結果から、TMC6遺伝子のホモノックアウトマウスは、塩味以外の基本味に対する嗜好性は正常であることがわかった。すなわち、TMC6遺伝子は塩味受容体をコードする遺伝子であることが強く示唆された。
【０１２２】
実施例３：TMC6遺伝子ノックアウトが味蕾や味細胞に与える影響の評価
本実施例では、野生型マウスとTMC6遺伝子のノックアウトマウスの味蕾および味細胞の形態について解析した。
【０１２３】
野生型C57BL/6Jマウス、TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウス、およびTMC6遺伝子のホモノックアウトマウスをそれぞれ安楽殺し、心室から氷冷PBSを流速5 mL/分で2分間灌流し脱血した。その後、氷冷4%-パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（ナカライテスク株式会社）で5分間灌流して全身を固定した後に舌を採取した。採取した舌から有郭乳頭を含む領域をブロック状に切り出してサンプルとし、4%-パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液中で4℃90分間インキュベーションした。次いで、サンプルをPBSで２回リンスし、10％スクロースを含むPBS中でインキュベーションした。次いで、PBS中のスクロース濃度を10％から30％まで徐々に上げて、サンプルを30％スクロースを含むPBS中で2時間インキュベーションした。その後、サンプルを包埋剤ティシュー・テックO.C.T.コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に包埋し、液体窒素の気相に置き凍結した。クライオスタット（ライカマイクロシステムズ株式会社）を用いて、切片面が舌の長軸に対して垂直になるように、凍結物から10μmの厚さの切片を切り出した。切り出した凍結切片をスライドグラス上に回収し、PBSでリンス後、微分干渉顕微鏡での観察に供した。
【０１２４】
結果を図１１に示す。図１１Ａは、野生型C57BL/6Jマウスの有郭乳頭の切片像を示す。図１１Ａから、有郭乳頭の溝に沿って複数の味蕾が並んでおり、それぞれの味蕾は細長い味細胞の集合として形作られていることが観察できる。図１１ＢおよびＣは、それぞれ、TMC6遺伝子のヘテロノックアウトマウスおよびTMC6遺伝子のホモノックアウトマウスの有郭乳頭の切片像を示す。図１１ＢおよびＣに示すTMC6遺伝子のノックアウトマウスの味蕾および味細胞は、図１１Ａに示す野生型マウスのものと形態的に違いは無く、すなわち形態的に完全に正常であった。これは、TMC6遺伝子をノックアウトしても、味蕾や味細胞に形態的な変化やダメージが無いことを示している。
【０１２５】
なお、TMC6遺伝子のホモノックアウトマウスは甘味、酸味、苦味、およびうま味に対する嗜好性において野生型マウスと差が認められないこと（実施例２）から、TMC6遺伝子のホモノックアウトマウスにおいても甘味、酸味、苦味、およびうま味の受容機構は正常に機能していることがわかる。これは、TMC6遺伝子のノックアウトマウスの味蕾や味細胞の形態が正常であるという観察結果（図１１）と一致している。
【０１２６】
実施例４：TMC6タンパク質の機能解析
本実施例では、TMC6遺伝子を動物細胞で発現させ、刺激による当該細胞の活性化を測定し、TMC6遺伝子がコードするタンパク質（TMC6タンパク質）の機能を解析した。
【０１２７】
（１）発現プラスミドの構築
V5エピトープ配列（ggtaagcctatccctaaccctctgctgggcctggattctacc；配列番号５１）を全合成し、プラスミドpcDNA3.1（Thermo Fisher Scientific社）のクローニングサイトにクローニングし、プラスミドpcDNA3.1-V5を得た。
【０１２８】
細胞の活性化の測定に利用するカルシウムイメージングのプローブとして、GECI（Genetically Encoded Calcium Indicator）の一種であるYellow Cameleon 2.60（YC2.60）を選択した。YC2.60をコードする遺伝子（YC2.60遺伝子）の発現プラスミドYC2.60-pcDNAを
以下のように構築した。YC2.60遺伝子を、公知の配列情報を参考にして全合成した（GenScript社）。合成したYC2.60遺伝子を鋳型としたPCRにより、YC2.60遺伝子を含むDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片を、pcDNA3.1のCMVプロモーターの下流にクローニングし、YC2.60-pcDNAを得た。YC2.60-pcDNAの塩基配列を、配列番号５２に示す。配列番号５２中、5104〜7065位の塩基配列がYC2.60遺伝子に相当する。なお、元のYC2.60の634位のアミノ酸残基はThrであるが、YC2.60-pcDNAから発現するYC2.60ではMetに変異している。
【０１２９】
また、マウスのTMC6遺伝子の発現プラスミドTMC6-pcDNA3.1を以下のように構築した。マウスの有郭乳頭を含む組織を採取し、常法に従いtotal RNAを調製し、逆転写してcDNAを得た。プライマー（配列番号５３および５４）を用い、得られたcDNAを鋳型にしてPCRを行い、マウスのTMC6遺伝子のコーディング配列（CDS）を増幅した。マウスのTMC6遺伝子のCDSを、pcDNA3.1-V5のCMVプロモーターとV5エピトープ配列の間のクローニングサイトにV5エピトープとフレームが合うようにクローニングし、TMC6-pcDNA3.1を得た。TMC6-pcDNA3.1でEscherichia coli OmniMAX（Thermo Fisher Scientific社）形質転換してアンピシリン存在下で液体培養し、菌体からTMC6-pcDNA3.1を精製（307.9 ng/μL）した。TMC6-pcDNA3.1にクローニングされたTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シークエンス解析により、NCBIに登録されたマウスのTMC6遺伝子のtranscript variant 1のmRNA（NM_145439）の塩基配列と同一であることを確認した。TMC6-pcDNA3.1の塩基配列を配列番号５５に示す。配列番号５５中、907〜3336位の塩基配列がマウスのTMC6遺伝子のCDSに相当する。
【０１３０】
同様に、ヒトのTMC6遺伝子の発現プラスミドhTMC6-pcDNA3.1を以下のように構築した。プライマー（配列番号５６および５７）を用い、ヒトのTMC6遺伝子のcDNAクローン（I.M.A.G.E/MGC Clone；株式会社ダナフォーム）を鋳型にしてPCRを行い、ヒトのTMC6遺伝子のCDSの５’側断片を増幅した。また、プライマー（配列番号５８および５９）を用い、ヒトのTMC6遺伝子のcDNAクローン（I.M.A.G.E/MGC Clone；株式会社ダナフォーム）を鋳型にしてPCRを行い、ヒトのTMC6遺伝子のCDSの３’側断片を増幅した。両断片をGibson Assembly Master Mix（New England BioLabs社）で連結してpcDNA3.1-V5のCMVプロモーターとV5エピトープの間のクローニングサイトにV5エピトープとフレームが合うようにクローニングし、ヒトのTMC6遺伝子のCDSの全長配列がクローニングされたhTMC6-pcDNA3.1を得た。hTMC6-pcDNA3.1でEscherichia coli OmniMAX（Thermo Fisher Scientific社）を形質転換してアンピシリン存在下で液体培養し、菌体からhTMC6-pcDNA3.1を精製（293.1 ng/μL）した。hTMC6-pcDNA3.1にクローニングされたTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シークエンス解析により、NCBIに登録されたヒトのTMC6遺伝子のtranscript variant 2のmRNA（NM_007267）の塩基配列と同一であることを確認した。hTMC6-pcDNA3.1の塩基配列を配列番号６０に示す。配列番号６０中、901〜3315位の塩基配列がヒトのTMC6遺伝子のCDSに相当する。
【０１３１】
（２）マウスのTMC6タンパク質の機能解析
CHO-K1細胞にTMC6-pcDNA3.1またはpcDNA3.1、およびYC2.60-pcDNAをトランスフェクションし、TMC6発現細胞（マウスのTMC6遺伝子とYC2.60遺伝子を発現する細胞）と対照細胞（YC2.60遺伝子を発現する細胞）を調製した。調製した細胞を刺激し、細胞の活性化を測定した。手順を以下に示す。
【０１３２】
すなわち、まず、直径60 mmの培養ディッシュに60％コンフルエントになるように細胞数を調製したCHO-K1細胞（ATCC）を播種し、8時間培養した。培地としては、10％のウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むHam's F-12K (Kaighn's)（Life Technologies社）を5 mL用いた。235 μLのOpti-MEM（Thermo Fisher Scientific社）にFuGENE 6（プロメガ）を15 μL添加し、室温で5分間インキュベーションした。さらに、TMC6-pcDNA3.1とYC2.60-pcDNAをそれぞれ0.625 μgおよび2.5 μg添加し、室温で15分間インキュベーションした。次いで、混合物全量を上記CHO-K1細胞の培養液中に滴下し穏やかに培養液を撹拌
した。その後、細胞を37℃、5％CO2の条件下でさらに18時間培養し、TMC6発現細胞を得た。同様に、TMC6-pcDNA3.1に代えてpcDNA3.1をトランスフェクションし、対照細胞を得た。
【０１３３】
培養後、培養液を除去し、低濃度NaCl液（27 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl2, 0.2 mM MgCl2, 2 mM Hepes (pH7.3), 1 mM NaHCO3, 2 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 112 mM NMDG・Cl）を培養ディッシュに添加して5分間静置後、細胞の刺激および観察を開始した。最初に、約80秒間、低濃度NaCl液を潅流し、基底状態とした。次いで、約60秒間、低濃度NaCl液に代えて高濃度NaCl液（135 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl2, 0.2 mM MgCl2, 2 mM Hepes (pH7.3), 1 mM NaHCO3, 2 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate）を潅流して細胞を刺激した。次いで、低濃度NaCl液の潅流を再開し、細胞がほぼ基底状態に戻った（後述するYFP/CFP値がほぼ基底状態に戻った）後、ATP刺激液（50 μM ATP、27 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl2, 0.2 mM MgCl2, 2 mM Hepes (pH7.3), 1 mM NaHCO3, 2 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 112 mM NMDG・Cl）により細胞を刺激した。潅流は、低濃度NaCl液または高濃度NaCl液を1 mL/minで培養ディッシュに添加しつつ、古い液を培養ディッシュの縁より吸引除去することにより、細胞が常に新しい液に晒されるようにして行った。ATP刺激液による刺激は、ATP刺激液600 μLをピペットで3秒以内に培養ディッシュの測定細胞近傍に滴下することにより行った。
【０１３４】
細胞の観察は、共焦点レーザー顕微鏡FV1200（オリンパス社）を用いて行った。細胞の観察の際には、細胞への光毒性を最小限に抑えるため、励起用440nmレーザーの出力を0.3〜4.5％に設定し、NDフィルターで1/100に減光した。細胞の活性化は、細胞内カルシウム濃度を指標として測定した。細胞内カルシウム濃度は、YC2.60を利用したカルシウムイメージングにより測定した。YC2.60は蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer；FRET）を利用したカルシウム感受性蛍光タンパク質の１種である。YC2.60はシアン蛍光タンパク質（CFP）とイエロー蛍光タンパク質（YFP）を含み、通常は比較的CFPの蛍光が強く、YFPの蛍光が弱いが、カルシウムイオンとの結合時にはCFPからYFPへのFRETが生じCFPの蛍光が減弱し、YFPの蛍光が増大する。すなわち、細胞内カルシウム濃度が高い程、細胞のCFPの蛍光強度に対するYFPの蛍光強度の比率（YFP/CFP）が増大する。細胞内カルシウム濃度の変化は、FV1200に備わっている解析ソフトを用いて、メーカーマニュアルに従って測定した。すなわち、蛍光画像の各ピクセルのCFPおよびYFPの輝度を測定し、各ピクセルのCFPの輝度に対するYFPの輝度の比率（YFP/CFP）を取得した。そして、個々の細胞画像を構成するピクセルをROI（region of interest）として規定し、ROIに含まれるピクセルのYFP/CFPの変化値の平均値を算出し、個々の細胞のデータとした。なお、測定した細胞ごとにYC2.60の発現量が異なり、またYFP/CFP値が異なるため、個々の細胞の各測定時のYFP/CFP値を、測定時間全体のYFP/CFP値の平均値で割ることにより、データの標準化を行った。
【０１３５】
マウスのTMC6発現細胞の結果を図１２Ａに、対照細胞の結果を図１２Ｂに、それぞれ示す。図中、それぞれのグラフ線は、個々の細胞のデータを示す。また、図中、縦軸は、YFP/CFP値の相対値を示す。縦軸の値が大きい程、細胞内カルシウム濃度が高く、すなわち細胞が活性化されていることを示す。また、縦軸の値が小さい程、細胞内カルシウム濃度が低く、すなわち細胞が活性化されていないことを示す。TMC6発現細胞においては、高濃度NaCl液での刺激により、細胞が活性化され、細胞内カルシウム濃度が上昇したことによるYFP/CFP値の増大が観察された（図１２Ａ）。一方、対照細胞においては、高濃度NaCl液での刺激によるYFP/CFP値の変化は観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０１３６】
また、図１２Ａで示したTMC6発現細胞のデータの中の、典型的な1細胞についての詳細データを、図１３〜１６に示す。
【０１３７】
図１３Ａは、FV1200のYFP波長による観察画像の一部を示す。視野内に約20個の細胞が見える。未刺激時の細胞は、細胞内カルシウム濃度が低く基底状態であるが、YC2.60の発現量が多い細胞は白く見え、発現量が中程度の細胞はグレーに見え、発現量が低い細胞は暗くほとんど見えない。本視野の右上の四角で選択した領域内の高濃度NaCl液での刺激に応答した細胞についての詳細データを図１３ＢおよびＣ、並びに図１４〜１６に示す。この細胞は図１３Ａ右上の楕円で示したものであり、「ROI-1」とした。図１３Ｂおよび図１４〜１６は、上記選択領域について、YFP/CFP値（「FRET値」ともいう）を画像化したものを示す。FRET値が小さい場合は暗く（黒で）示し、FRET値が大きい場合を明るく（白で）示す。図１３Ｂには、324枚の連続撮像図の中から、フレーム１、84、250、および276の4枚を示し、それぞれにROI-1の楕円を示す。図１３Ｃは、ROI-1の細胞について、FRET値の時間経過のグラフを示す。図中、縦軸は、FRET値の相対値を示す。縦軸の値が大きい程、細胞内カルシウム濃度が高く、すなわち細胞が活性化されていることを示す。図１３Ｂのフレーム１は、連続撮像図の最初の1枚であり、高濃度NaCl液での刺激を行う前の細胞の様子を示す。フレーム１でのROI-1細胞は暗く、活性化されていないことがわかる。図１３Ｂのフレーム84は、高濃度NaCl液で刺激した時の細胞の様子を示す。フレーム84でのROI-1細胞は明るく、高濃度NaCl液での刺激により活性化されたことがわかる。図１３Ｃのグラフにおいても、高濃度NaCl液での刺激により縦軸の値が約1.2まで上昇した。図１３Ｂのフレーム250は、低濃度NaCl液の潅流を再開し、しばらく時間が経過した後の細胞の様子を示す。フレーム250でのROI-1細胞は暗く、図１３Ｃの縦軸の値は1以下になっており、ほぼ基底状態に戻ったことがわかる。図１３Ｂのフレーム276は、ATP刺激液で刺激した時の細胞の様子を示す。フレーム276のROI-1細胞は明るく、図７Ｃの縦軸の値は1.3以上になっており、ATP刺激液での刺激により強く活性化されたことがわかる。
【０１３８】
図１４〜１６には、フレーム1からフレーム324までの全てを示す（図１４：フレーム1〜108、図１５：フレーム109〜216、図１６：フレーム217〜324）。図１４〜１６から、ROI-1細胞の活性化度合いの全変化がわかる。
【０１３９】
以上の通り、TMC6発現細胞を高濃度NaCl液で刺激することにより、同細胞を活性化できた。よって、TMC6タンパク質は、塩化ナトリウム等の塩味物質の刺激に応答すること、すなわち、塩味受容体であることが明らかとなった。TMC6タンパク質は、具体的には、細胞膜に発現するナトリウムチャネルであると考えられる。すなわち、TMC6発現細胞を高濃度NaCl液で刺激すると、TMC6タンパク質を通してナトリウムイオンが細胞内に流入し、細胞膜の膜電位が脱分極することにより、細胞が活性化したと考えられる。また、塩味物質に対するTMC6タンパク質の応答（例えばTMC6発現細胞の活性化度合いの大小や変化）を、画像化および数値化することができた。したがって、TMC6タンパク質の応答（例えばTMC6発現細胞の活性化度合い）を指標にして、TMC6タンパク質に作用する物質をスクリーニングすることができる。
【０１４０】
（３）ヒトのTMC6タンパク質の機能解析
CHO-K1細胞にhTMC6-pcDNA3.1またはpcDNA3.1、およびYC2.60-pcDNAをトランスフェクションし、TMC6発現細胞（ヒトのTMC6遺伝子とYC2.60遺伝子を発現する細胞）と対照細胞（YC2.60遺伝子を発現する細胞）を調製した。調製した細胞を刺激し、細胞の活性化を測定した。手順は、TMC6-pcDNA3.1に代えてhTMC6-pcDNA3.1を用いたこと以外は、マウスのTMC6タンパク質の機能解析の手順と同一である。
【０１４１】
ヒトのTMC6発現細胞の結果を図１７Ａに、対照細胞の結果を図１７Ｂに、それぞれ示す。TMC6発現細胞においては、高濃度NaCl液での刺激により、細胞が活性化され、細胞内カルシウム濃度が上昇したことによるYFP/CFP値の増大が観察された（図１７Ａ）。一方、対照細胞においては、高濃度NaCl液での刺激によるYFP/CFP値の変化は観察されなかった（図１７Ｂ）。
【０１４２】
上記の実験結果は、マウスのTMC6遺伝子を発現させたCHO-K1細胞と同様に、ヒトのTMC6遺伝子を発現させたCHO-K1細胞が、高濃度NaCl液による刺激に応答することを示している。すなわち、複数の生物種において、TMC6タンパク質は同じ機能を有していることが明らかになった。
【０１４３】
（４）アカゲザルのTMC6タンパク質、オランウータンのTMC6タンパク質、およびマウス／ヨザルのキメラTMC6タンパク質の機能解析
【０１４４】
アカゲザル（Macaca mulatta）、オランウータン（Pongo abelii）、ヨザル（Autos nancymaae）、およびマウスのTMC6遺伝子のmRNAの塩基配列は、それぞれNCBIに、アクセッション番号XM_015120470、XM_002827886、XM_012453598、およびNM_145439で登録されている。当該配列情報に基づき、アカゲザルのTMC6遺伝子、オランウータンのTMC6遺伝子、およびマウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社）。また、YC2.60をコードするDNA（YC2.60遺伝子）と2AペプチドをコードするDNA（2Aペプチド遺伝子）を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社）。
【０１４５】
合成したDNAをPCR増幅し、プラスミドpcDNA3.1にクローニングし、プラスミドMacaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、およびMouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)を得た。それぞれのプラスミドDNAでEscherichia coli OmniMAX（Thermo Fisher Scientific社）を形質転換し、アンピシリン存在下で液体培養した。菌体から、それぞれ、246.4 ng/μLのMacaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、314.2 ng/μLのPongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、および335.1 ng/μLのMouse-Aotus nancymaae chimera TMC6
2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)をそれぞれ精製した。
【０１４６】
Macaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)にクローニングされたTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シーケンス解析により、NCBIに登録されたMacaca mulattaのTMC6遺伝子のmRNAの塩基配列（XM_015120470）と同一であることを確認した。Macaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)の塩基配列を配列番号６１に示す。配列番号６１中、９０７〜３３２４位の塩基配列がMacaca mulattaのTMC6遺伝子のCDSに相当し、３３２５〜３３８７位の塩基配列が2Aペプチドをコードする配列に相当し、３３８８〜５４２１位の塩基配列がYC2.60をコードする配列に相当する。
【０１４７】
Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)にクローニングされたTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シーケンス解析により、NCBIに登録されたPongo abeliiのTMC6遺伝子のmRNAの塩基配列（XM_002827886）と同一であることを確認した。Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)の塩基配列を配列番号６２に示す。配列番号６２中、９０７〜３３２１位の塩基配列がPongo abeliiのTMC6遺伝子のCDSに相当し、３３２２〜３３８４位の塩基配列が2Aペプチドをコードする配列に相当し、３３８５〜５４１８位の塩基配列がYC2.60をコードする配列に相当する。
【０１４８】
Mouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)にクローニングされたキメラTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シーケンス解析により、NCBIに登録されたマウスのTMC6遺伝子のmRNAの塩基配列（NM_145439）の１〜４５位と同一な上流部分と、NCBIに登録されたAotus nancymaaeのTMC6遺伝子のmRNAの塩基配列（XM_012453598）の５２〜２４２１位と同一な下流部分からなることを確認した。このキメラTMC6遺伝子は、マウスのTMC6タンパク質（配列番号２６）の１〜１５位のアミノ酸配列と、Aotus nancymaaeのTMC6タンパク質（配列番号１）の１８〜８０７位のアミノ酸配列からなるキメラTMC6タンパク質をコードする。Mouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)
の塩基配列を配列番号６３に示す。配列番号６３中、９０７〜９５１位の塩基配列がマウスのTMC6遺伝子のCDSの上流部分に相当し、９５２〜３３２１位の塩基配列がAotus nancymaaeのTMC6遺伝子のCDSの下流部分に相当し、３３２２〜３３８４位の塩基配列が2Aペプチドをコードする配列に相当し、３３８５〜５４１８位の塩基配列がYC2.60をコードする配列に相当する。
【０１４９】
CHO-K1細胞に、Macaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、Mouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、またはYC2.60-pcDNAをトランスフェクションし、TMC6発現細胞（アカゲザルのTMC6遺伝子、オランウータンのTMC6遺伝子、またはマウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子と、YC2.60遺伝子を発現する細胞）と対照細胞（YC2.60遺伝子を発現する細胞）を調製した。調製した細胞を刺激し、細胞の活性化を測定した。測定は、マウスおよびヒトのTMC6タンパク質の機能解析の手順に倣い、以下の手順で行った。
【０１５０】
まず、直径100 mmの培養ディッシュの底に滅菌処理をした18×32 mmのカバーガラス（松浪硝子工業）を複数枚重ならないように配置した。そこに60％コンフルエントになるように細胞数を調製したCHO-K1細胞（ATCC）を播種し、24時間培養し、その後培地交換を行った。培地としては、10％のウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むHam's F-12K (Kaighn's)（Life Technologies社）を12 mL用いた。460 μLのOpti-MEMに Polyethylenimine "Max"（Polysciences社）1 mg/mLを30 μL 添加し、室温で5分間インキュベーションした。さらに、Macaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)、Mouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)をそれぞれ10 μg添加し、室温で10分間インキュベーションした。次いで、混合物全量を上記CHO-K1細胞の培養液中に滴下し穏やかに培養液を撹拌した。その後、細胞を37℃、5％CO2の条件下でさらに18時間培養し、TMC6発現細胞を得た。同様にYC2.60-pcDNAをトランスフェクションし、対照細胞を得た。
【０１５１】
培養後、細胞を播種したカバーガラスを取出し、共焦点レーザー顕微鏡FV1200のステージにセットした。低濃度NaCl液をカバーガラス全体に添加して約5分間静置後、細胞の刺激および観察を開始した。最初に、60秒間、低濃度NaCl液を潅流し、基底状態とした。次いで、60秒間、低濃度NaCl液に代えて高濃度NaCl液を潅流して細胞を刺激した。次いで、低濃度NaCl液の潅流を再開し、細胞がほぼ基底状態に戻った後、ATP刺激液を60秒間、潅流し細胞を刺激した。潅流は、カバーガラスの長手方向に沿って、カバーガラスの一方の端に新しい液を添加しつつ、古い液をカバーガラスの他方の端より吸引除去することにより実施した。
【０１５２】
細胞内カルシウム濃度の変化は、FV1200付属の解析ソフトを用いて、測定及び解析をした。ATP刺激液でYFP/CFP値の変化が観察された全ての細胞の各測定時のYFP/CFP値の平均値を求めた。
【０１５３】
結果を図１８に示す。図１８Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ、マウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子、アカゲザルのTMC6遺伝子、オランウータンのTMC6遺伝子の発現細胞について、YFP/CFP値の平均値の変化を示す。図１８Ｄは、対照細胞について、YFP/CFP値の平均値の変化を示す。それぞれの解析に用いた細胞数は、マウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子の発現細胞が21個、アカゲザルのTMC6遺伝子の発現細胞が28個、オランウータンのTMC6遺伝子の発現細胞が31個、対照細胞が34個である。実験の結果、すべてのTMC6発現細胞において、高濃度NaCl液での刺激により、細胞が活性化され、細胞内カルシウム濃度が上昇したことによるYFP/CFP値の増大が観察された（図１８Ａ、Ｂ、Ｃ）。一方、対照細胞においては、高濃度NaCl液での刺激によるYFP/CFP値の変化は観察されなかった（図１８Ｄ）。
【０１５４】
上記の実験結果は、マウスまたはヒトのTMC6遺伝子を発現させたCHO-K1細胞と同様に、マウス／ヨザルのキメラTMC6遺伝子、アカゲザルのTMC6遺伝子、またはオランウータンのTMC6遺伝子を発現させたCHO-K1細胞が、高濃度NaCl液による刺激に応答することを示している。すなわち、哺乳類の広い範囲の種において、TMC6タンパク質は同じ機能を有していることが明らかになった。
【０１５５】
実施例５：TMC6タンパク質の電気生理学的機能解析
本実施例では、TMC6遺伝子を昆虫細胞で発現させ、同細胞からTMC6タンパク質を含む膜分画を粗精製して人工細胞膜を調製し、同人工細胞膜を用いて電気生理学的にTMC6タンパク質の機能解析を行った。
【０１５６】
昆虫細胞における遺伝子発現は、O’Reilly, D. et al. (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. W. H. Freeman & Co., New York.およびKing, L. et
al. (1992) The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide. Chapman & Hall, New York.を参照して実施した。具体的な方法を以下に示す。
【０１５７】
（１）プラスミドの構築
バキュロウイルス・トランスファー・ベクターpVL1392（BD Biosciences社）のマルチクローニングサイトに、マウスTMC6遺伝子のCDSと、その下流の2xGlyと6xHis（すなわちGly-Gly-His-His-His-His-His-His）をコードするDNAをクローニングし、プラスミドm-Tmc6 6xHis in pVL1392を作成した。m-Tmc6 6xHis in pVL1392でEscherichia coli OmniMAX（Thermo Fisher Scientific社）を形質転換し、アンピシリン存在下で液体培養した。菌体からm-Tmc6 6xHis in pVL1392を精製（110.3 ng/μL）した。m-Tmc6 6xHis in pVL1392にクローニングされたTMC6遺伝子のCDSの塩基配列は、シークエンス解析により、NCBIに登録されたマウスのTMC6遺伝子のtranscript variant １のmRNA（NM_145439）の塩基配列と同一であることを確認した。m-Tmc6 6xHis in pVL1392の塩基配列を配列番号６４に示す。配列番号６４中、4161〜6590位の塩基配列がマウスのTMC6遺伝子のCDSに相当し、6591〜6596位の塩基配列が2xGlyに相当し、6597〜6614位の塩基配列が6xHisに相当する。
【０１５８】
（２）バキュロウイルスの作成
BacPAK 6 DNA (Bsu36 I digest)（Clontech社、製品番号631401、Kitts, P. A. & Possee, R. D. (1993) BioTechniques 14:810-817.）を用い、m-Tmc6 6xHisカセット（マウスTMC6遺伝子のCDSと、その下流の2xGlyと6xHisをコードするDNAを含む）を、m-Tmc6 6xHis
in pVL1392からウイルスDNAへ相同組換えにより移し、マウスTMC6遺伝子の発現用の組換えバキュロウイルスを作製した。手順を以下に示す。
【０１５９】
Sf9細胞（Sf9 cells in Sf-900 III SFM, Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12659017）へ、m-Tmc6 6xHis in pVL1392とBacPAK 6 DNA (Bsu36 I digest)を、製造元のプロトコールに従ってコトランスフェクションした。コトランスフェクション後、Sf9細胞を、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で72時間培養し、ウイルス粒子を含む2mLの培養上清（培養上清Ａ）を回収した。
【０１６０】
組換えウイルスの増幅は、以下の通りに行った。Sf9細胞を、培養フラスコ（SUMILON社
MS-21050）を用い、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で静置培養した。続いて、約50−60％コンフルエントのSf9細胞に、培地4 mLに対して、培養上清Ａを1 mL加え、27℃で約96時間培養を行った。その後、1,000 x g, 5 min, 4℃で培養液の遠心を行い、ウイルス粒子を含む培養上清を回収した。この操作を再度繰返し、ウイルス粒子を含む培養上清の追加で得た。得られた２回分の培養上清を混合し、「培養上清Ｂ」とした。
【０１６１】
タンパク質発現用の組換えウイルスを含む培養上清の取得は、以下の通りに行った。Sf9細胞を、培養フラスコ（SUMILON社  MS-21250）を用い、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で静置培養した。続いて、約50−60％コンフルエントのSf9細胞に、培地約15 mLに対して、培養上清Ｂを1 mL加え、27℃で約96時間培養を行った。その後、1,000 x g, 5 min, 4℃で培養液の遠心を行い、ウイルス粒子を含む培養上清（培養上清Ｃ）を回収した。そして、培養上清Ｃは、1 mLずつクライオチューブに分注し、使用時まで-80℃で凍結保存した。
【０１６２】
組換えウイルスDNA内へのm-Tmc6 6xHisカセットの挿入確認は、以下の通りに行った。まず、Sf9細胞を、培養フラスコ（SUMILON社  MS-21250）を用い、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で静置培養した。続いて、約70−80％コンフルエントのSf9細胞に、培地約12 mLに対して、培養上清Ｃを100 μL加え、27℃で約96時間培養を行った。組換えウイルスの回収は、K. Kamiya et al. Biomaterials, 32, 9899-9907 (2011)の方法に従って行った。すなわち、1,000 x g, 5 min, 15℃で培養液の遠心を行い、組換えウイルス粒子を含む培養上清（培養上清Ｄ）を回収した。培養上清Ｄを100,000 x g, 60 min, 15℃で遠心し、組換えウイルス粒子を沈殿させた。沈殿させた組換えウイルス粒子をPBS（1 mM Na2HPO4, 10.5 mM KH2PO4,140 mM NaCl,
40 mM KCl, pH 6.2）に懸濁し、ショ糖密度勾配遠心（40,000xg, 30 min, 15℃）により、組換えウイルス画分を回収した。組換えウイルス画分を100,000xg, 60 min, 15℃で遠心し、組換えウイルス粒子を沈殿させた。沈殿させた組換えウイルス粒子をPBSに懸濁した。組換えウイルス粒子から、フェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿によりDNAを精製した。精製したDNAを鋳型として、配列番号６５と６６のプライマー（pVL1392のMCSを挟むように設計されている）を用いて、PCRを行った。得られた増幅産物をシーケンス解析に供した。その結果、C末に6xHisが付加されたマウスのTMC6タンパク質をコードする遺伝子がMCSに挿入されていることを確認した。
【０１６３】
（３）昆虫細胞でのTMC6タンパク質の発現
Sf9細胞（Sf9 cells in Sf-900 III SFM, Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12659017）を、培養フラスコ（SUMILON社  MS-21250）を用い、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で静置培養した。続いて、約70−80％コンフルエントのSf9細胞に、培地12 mLに対して、100 μLの培養上清Ｃ（組換えによってDNAにm-Tmc6 6xHisカセットが挿入された組み換えウイルスを含む）を添加して細胞にウイルスを感染させ、静置培養し、TMC6タンパク質を有するSf9細胞を得た。
【０１６４】
TMC6タンパク質のSf9細胞膜への局在確認は、以下の通りに、免疫蛍光抗体法によって行った。培養液を1,000xg, 5 min, 15℃で遠心することにより細胞沈殿を得た。細胞沈殿をPBSで懸濁した。細胞懸濁液500 μLに対してAlexa Flour 488-conjugated  monoclonal
mouse anti-His（MBL  製品番号:D291-A48）を1 μL、polyclonal chicken anti- m-Tmc6（株式会社スクラム）を1 μL加え、25℃で1時間振とうした。1,000xg, 5 min, 15℃で遠心を行い、細胞沈殿を回収し、500 μLのPBSで懸濁した。2次抗体として、Alexa Flour
568-conjugated anti-chicken IgY（Invitrogen、A11041）を1 μL加え、25℃で1時間振とうした。1,000xg, 5 min, 15℃で遠心を行い、細胞沈殿を回収し、500 μLのPBSで懸濁した。共焦点レーザー顕微鏡（FV-1200, Olympus）にて細胞の観察を行った。
【０１６５】
結果を図１９に示す。図１９ＡおよびＢは、Sf9細胞が発現しているC末端に6xHisが付加されたTMC6タンパク質を、それぞれ、抗His-tag抗体（Alexa488）および抗TMC6抗体＋抗chicken IgY抗体（Alexa568）で染色した蛍光免疫染色像である。図１９Ｃは、図１９ＡおよびＢのマージ画像である。図１９Ｄは、明視野の微分干渉像である。図１９Ａ、Ｂ、およびＣから、TMC6タンパク質は、Sf9細胞の細胞膜上に局在していることが示された。
【０１６６】
次に、TMC6タンパク質を含む、あるいは含まない、Sf9細胞の細胞膜の粗精製画分を調製した。Sf9細胞（Sf9 cells in Sf-900 III SFM, Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12659017）を、培養フラスコ（SUMILON社  MS-21250）を用い、培地Sf-900 III SFM（Thermo Fisher Scientific社  製品番号: 12658019）中で、27℃で静置培養した。続いて、約70−80％コンフルエントのSf9細胞に、培地12 mLに対して、100 μLの培養上清Ｃ（組換えによってDNAにm-Tmc6 6xHisカセットが挿入された組み換えウイルスを含む）を添加して細胞にウイルスを感染させ、静置培養し、TMC6タンパク質を有するSf9細胞を得た。同様に、ネガティブコントロールとして、培養上清Ｃに代えて野生型ウイルスを用い、TMC6タンパク質を有さないSf9細胞を得た。感染の約９６時間後に、培養液を1,000xg, 5 min, 15℃で遠心することにより細胞沈殿を得た。細胞沈殿をリン酸ナトリウム水溶液（pH7.0）で懸濁した。細胞懸濁液を超音波破砕した後に、遠心し、細胞膜の粗精製画分を採取した。
【０１６７】
（４）TMC6タンパク質の電気生理学的機能解析
TMC6タンパク質の機能を、R. Kawano et al., Scientific Reports, 3, 1995 (2013)に記載のイオンチャネル測定デバイスを用いて、電気生理学的に解析した。このデバイスは、電圧印加側ウェルとグランド（アース）側ウェルを備える。両ウェルは細孔により互いに連通しており、同細孔を塞ぐように人工脂質二重膜を形成することができる。20 mg/mLのリン脂質をそれぞれのウェルに3.7 μLずつ加えた。次いで、電圧印加側ウェルに、粗精製膜画分を含む140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4を21 μL加えた。一方、グランド（アース）側ウェルに、140 mM CsCl, 5 mM EGTA, 2 mM ATP, 10 mM HEPES, pH 7.2を21 μL加えた。これにより、ウェル間に人工脂質二重膜を形成させた。粗精製膜画分中の細胞膜は、人工脂質二重膜に組み込まれたと考えられる。ウェル間に生じたイオンチャネル由来の電流を、multi-patch-clamp amplifier（JET-Bilayer, Tecella社）を用いて計測した。詳細な計測条件は以下の通りである：印加電圧は60 mVあるいは-60 mV, データ取得頻度は5,000 Hz, ローパスフィルターは1,000 Hz, 約2時間測定を行った。
【０１６８】
結果を図２０および２１に示す。TMC6タンパク質を含む粗精製膜画分を添加した場合、約2pAの振れ幅で、シングルチャネルの開閉とイオンの流れを示すシグナルが得られた（図２０Ａ、Ｂ、Ｃ）。一方、野生型ウイルスを感染させて得られたTMC6タンパク質を含まない粗精製膜画分を添加した場合、図２１に示すように電流は一定値を示し、図２０に見られるようなシングルチャネルの開閉とイオンの流れに相当するシグナルは観察されなかった。
【０１６９】
以上より、TMC6タンパク質を含む粗精製膜画分は、イオンチャネル様機能を有するタンパク質を含むことが明らかになった。具体的には、溶液中のナトリウムイオンが、粗精製膜画分中のTMC6タンパク質を介して流れたと考えられる。
【０１７０】
〔配列表の説明〕
配列番号１〜４７：哺乳類のTMC6タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４８〜５０：遺伝子変異のターゲット配列
配列番号５１：V5エピトープ配列
配列番号５２：YC2.60-pcDNAの塩基配列
配列番号５３、５４：プライマー
配列番号５５：TMC6-pcDNA3.1の塩基配列
配列番号５６〜５９：プライマー
配列番号６０：hTMC6-pcDNA3.1の塩基配列
配列番号６１：Macaca mulatta TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)の塩基配列
配列番号６２：Pongo abelii TMC6-2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)の塩基配列
配列番号６３：Mouse-Aotus nancymaae chimera TMC6 2A-YC260TM in pcDNA3.1(-)の塩基配列
配列番号６４：m-Tmc6 6xHis in pVL1392の塩基配列
配列番号６５〜６６：プライマー
【図１】
2018014999.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月1日(2017.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMC6タンパク質を利用して目的物質を同定する工程を含む、物質のスクリーニング方法であって、
前記工程が、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含み：
（Ａ）前記TMC6タンパク質と被検物質を接触させる工程；
（Ｂ）前記接触の際の前記被検物質の前記TMC6タンパク質への作用を測定する工程；および
（Ｃ）前記作用に基づいて目的物質を同定する工程、
前記目的物質が、塩味代替物質、塩味増強物質、または塩味低減物質であり、
前記TMC6タンパク質が、細胞または細胞膜に担持された形態で用いられ、
前記作用が、前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化であり、
前記TMC6タンパク質の活性化または不活性化が、前記細胞または細胞膜の膜電位、前記細胞または細胞膜の膜電流、および前記細胞内の陽イオン濃度または前記細胞膜により区分される空間の内の一方の空間における陽イオン濃度から選択される１種またはそれ以上のパラメーターを指標として測定され、
前記陽イオンが、ナトリウムイオンまたはカルシウムイオンであり、
下記（Ｘ）〜（Ｚ）のいずれかを満たす、方法：
（Ｘ）前記工程（Ａ）が塩味物質の存在下で実施され、且つ、前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味増強物質であると同定される；
（Ｙ）前記工程（Ａ）が塩味物質の存在下で実施され、且つ、前記被検物質による前記TMC6タンパク質の不活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味低減物質であると同定される；
（Ｚ）前記工程（Ａ）が塩味物質の非存在下で実施され、且つ、前記被検物質による前記TMC6タンパク質の活性化が認められた場合に、該被検物質が塩味代替物質であると同定される。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）である、請求項１に記載の方法：
（Ｂ１）前記接触の際の該TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて目的物質を同定する工程。
【請求項３】
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）である、請求項２に記載の方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記TMC6タンパク質の活性化の程度Ｄ２との差に基づいて目的物質を同定する工程。
【請求項４】
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）である、請求項３に記載の方法：
（Ｃ２−１）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させない条件；
（Ｃ２−２）前記TMC6タンパク質と前記被検物質を接触させる条件であって、該被検物質の濃度が前記工程（Ａ）における該被検物質の濃度よりも低い濃度である条件。
【請求項５】
前記塩味物質が、水性媒体中でナトリウムイオンを与える物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記塩味物質が、塩化ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記TMC6タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のTMC6タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のTMC6タンパク質のキメラタンパク質。
【請求項８】
前記TMC6タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列を含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列において、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列に対して、または配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、塩味受容体としての機能を有するタンパク質。
【請求項９】
前記細胞が、生物の細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、動物細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。