(57)【要約】【課題】ストレス耐性を有し、遺伝子の操作により製造できる藻類、及びその製造方法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子。（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子。以下の（ａ）及び／又は（ｃ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子。（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子。【選択図】 図１
2018014923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【請求項２】
以下の（ａ）及び／又は（ｃ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の遺伝子のそれぞれにおいて、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【請求項４】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）及び／又は前記（ｂ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）及び／又は前記（ｂ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【請求項５】
以下の（ａ）及び／又は（ｃ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）及び／又は前記（ｃ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）及び／又は前記（ｃ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の遺伝子のそれぞれにおいて、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、
シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）、前記（ｂ）及び前記（ｃ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）、前記（ｂ）及び前記（ｃ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は藻類及び藻類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微細藻類を用いて、バイオ燃料、化成品代替原料等の目的物質を生産することが行われている。目的物質は、微細藻類にとってストレスとなり、微細藻類の増殖を阻害することがある。目的物質の生産性を向上させるためには、ストレス耐性株を取得する必要がある。これまでは、突然変異法により、ストレス耐性株を取得することが試みられている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Microbial cell factories, 2014, 13:151
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
突然変異法は確率に依存する方法であるから、ストレス耐性株を取得するために長期間を要することがある。本開示は、ストレス耐性を有し、遺伝子の操作により製造できる藻類、及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の一態様は、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類である。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
本開示の藻類は、ストレス耐性を有し、遺伝子の操作により製造することができる。
【０００６】
本開示の別の一態様は、以下の（ａ）及び／又は（ｃ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類である。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子  
本開示の藻類は、ストレス耐性を有し、遺伝子の操作により製造することができる。
【０００７】
本開示の別の一態様は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の遺伝子のそれぞれにおいて、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類である。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
本開示の藻類は、ストレス耐性を有し、遺伝子の操作により製造することができる。
【０００８】
本開示の別の一態様は、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）及び／又は前記（ｂ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）及び／又は前記（ｂ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法である。
【０００９】
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
本開示の藻類の製造方法によれば、ストレス耐性を有する藻類を遺伝子操作によって容易に製造することができる。
【００１０】
本開示の別の一態様は、以下の（ａ）及び／又は（ｃ）の遺伝子において、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）及び／又は前記（ｃ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）及び／又は前記（ｃ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法である。
【００１１】
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
本開示の藻類の製造方法によれば、ストレス耐性を有する藻類を遺伝子操作によって容易に製造することができる。
【００１２】
本開示の別の一態様は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の遺伝子のそれぞれにおいて、少なくとも一部が欠失又は変異している藻類の製造方法であって、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株における前記（ａ）、前記（ｂ）及び前記（ｃ）の遺伝子に変異導入するか、前記（ａ）、前記（ｂ）及び前記（ｃ）の遺伝子の少なくとも一部を欠失させる藻類の製造方法である。
【００１３】
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
本開示の藻類の製造方法によれば、ストレス耐性を有する藻類を遺伝子操作によって容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本培養におけるイソブタノールの終濃度と、比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図２】本培養におけるエタノールの終濃度と、比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図３】本培養における1-ブタノールの終濃度と、比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図４】本培養におけるイソペンタノールの終濃度と、比増殖速度との関係を表すグラフである。
【図５】6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株と、6803/EtOH株とのエタノール生産量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の実施形態を説明する。本開示の藻類は、遺伝子を改変する前の状態において、以下の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の遺伝子のうち、少なくとも1つを有する。
（ａ）slr0369遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｂ）slr1044遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
（ｃ）slr0322遺伝子又はそれとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子
藻類は、微細藻類であってもよいし、それ以外の藻類であってもよい。藻類の株は適宜選択できる。藻類の株の例として、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株が挙げられる。藻類は、物質を生産する機能を有することが好ましい。生産する物質としては、例えば、アルコール、油類等が挙げられる。
【００１６】
本明細書におけるslr0369遺伝子、slr1044遺伝子、slr0322遺伝子の名称は、CyanoBase及びKEGGで公開されたシアノバクテリアのゲノムデータに基づいて記載されている。KEGGは、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesの略称である。CyanoBase及びKEGGは周知のデータベースである。E-valueとは、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）の手法において、２つの遺伝子間の相同性の高さを表す周知の指標である。
【００１７】
本明細書において変異しているとは、遺伝子に変異が導入された状態を意味する。変異の導入は、例えば、Kunkel法、Gapped duplex法等により行うことができる。
遺伝子の欠失は、遺伝子工学の技術分野において公知の方法を用い、目的遺伝子を改変することで実現できる。欠失している部分は、目的遺伝子の全てでもよいし、一部でもよい。
【００１８】
本明細書において制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。制御領域は、例えば、発現を制御する対象である遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域である。
【００１９】
上記の「制御領域の制御下に配置する」とは、制御領域による目的遺伝子の発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子を制御領域の制御下に配置する方法としては、当該制御領域の制御の及ぶ下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
【００２０】
上記の上流とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側に続く領域を意味する。また、下流とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の３’側に続く領域を意味する。
（実施例１）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、slr1044遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、slr1044遺伝子が欠失したSynechocystis変異株（以下では6803Δslr1044株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００２１】
Synechocystis sp. PCC 6803株から抽出したゲノムDNA（以下では第１のゲノムDNAとする）を鋳型とし、プライマーslr1044_upper_F（配列番号１）及びslr1044_upper_R_Km（配列番号２）を用いて、断片（１Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（１Ａ）はslr1044遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００２２】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr1044_down_F_Km（配列番号３）及びslr1044_down_R（配列番号４）を用いて、断片（１Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（１Ｂ）はslr1044遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００２３】
さらに、プラスミドpHSG298を鋳型とし、プライマーKm_F（配列番号１７）及びKm_R（配列番号１８）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（１Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００２４】
次に、得られた断片（１Ａ）、断片（１Ｃ）及び断片（１Ｂ）をこの順となるように、プライマーslr1044_upper_F（配列番号１）及びslr1044_down_R（配列番号４）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。
【００２５】
この最終ＤＮＡ断片を用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、カナマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr1044株である。6803Δslr1044株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００２６】
形質転換の確認は、プライマーslr1044_check_F（配列番号２１）、slr1044_check_R（配列番号２２）、slr1044_check_internal_F（配列番号２３）、及びKm_internal_F（配列番号３０）を用いて行った。
【００２７】
なお、配列番号について、以下に補足する。配列番号１７、１８、３０はプラスミドpHSG298のカナマイシン耐性遺伝子に相補する配列である。カナマイシン耐性部分はトランスポゾンTn903に由来する。配列番号１９、２０はプラスミドpCDFDuet-1のストレプトマイシン耐性遺伝子に相補する配列である。ストレプトマイシン耐性部分はTn21である。配列番号３７、３８はプラスミドpUC19のアンピシリン耐性遺伝子に相補する配列である。アンピシリン耐性部分はトランスポゾンTn3に由来する。配列番号３９、４０、４１、４２の起源はZymomonas mobilisである。それ以外の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４３、４４、４５、４６の起源はSynechocystis sp. PCC 6803である。
（実施例２）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、slr0322遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、slr0322遺伝子が欠失したSynechocystis変異株（以下では6803Δslr0322株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００２８】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0322_upper_F（配列番号５）及びslr0322_upper_R_Km（配列番号６）を用いて、断片（２Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（２Ａ）はslr0322遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００２９】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0322_down_F_Km（配列番号７）及びslr0322_down_R（配列番号８）を用いて、断片（２Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（２Ｂ）はslr0322遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００３０】
さらに、プラスミドpHSG298を鋳型とし、プライマーKm_F（配列番号１７）及びKm_R（配列番号１８）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（２Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００３１】
次に、得られた断片（２Ａ）、断片（２Ｃ）及び断片（２Ｂ）をこの順となるように、プライマーslr0322_upper_F（配列番号５）及びslr0322_down_R（配列番号８）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。この最終ＤＮＡ断片を用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、カナマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr0322株である。6803Δslr0322株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００３２】
形質転換の確認は、プライマーslr0322_check_F（配列番号２４）、slr0322_check_R（配列番号２５）、slr0322_check_internal_F（配列番号２６）、及びKm_internal_F（配列番号３０）を用いて行った。
（実施例３）
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、slr0369遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、slr0369遺伝子が欠失したSynechocystis変異株（以下では6803Δslr0369株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００３３】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0369_upper_F（配列番号９）及びslr0369_upper_R_Km（配列番号１０）を用いて、断片（３Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（３Ａ）はslr0369遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００３４】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0369_down_F_Km（配列番号１１）及びslr0369_down_R（配列番号１２）を用いて、断片（３Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（３Ｂ）はslr0369遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００３５】
さらに、プラスミドpHSG298を鋳型とし、プライマーKm_F（配列番号１７）及びKm_R（配列番号１８）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（３Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００３６】
次に、得られた断片（３Ａ）、断片（３Ｃ）及び断片（３Ｂ）をこの順となるように、プライマーslr0369_upper_F（配列番号９）及びslr0369_down_R（配列番号１２）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。この最終ＤＮＡ断片を用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、カナマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr0369株である。6803Δslr0369株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００３７】
形質転換の確認は、プライマーslr0369_check_F（配列番号２７）、slr0369_check_R（配列番号２８）、slr0369_check_internal_F（配列番号２９）、及びKm_internal_F（配列番号３０）を用いて行った。
（実施例４）
実施例３で構築した6803Δslr0369株を宿主として、slr1044遺伝子をストレプトマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、slr0369遺伝子とslr1044遺伝子とが欠失したSynechocystis変異株（以下では6803Δslr0369Δslr1044株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００３８】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr1044_upper_F（配列番号１）及びslr1044_upper_R_Sm（配列番号１５）を用いて、断片（４Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（４Ａ）はslr1044遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００３９】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr1044_down_F_Sm（配列番号１３）及びslr1044_down_R（配列番号４）を用いて、断片（４Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（４Ｂ）はslr1044遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００４０】
さらに、プラスミドpCDFDuet-1を鋳型とし、プライマーSm_F（配列番号１９）及びSm_R（配列番号２０）を用いて、ストレプトマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（４Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００４１】
次に、得られた断片（４Ａ）、断片（４Ｃ）及び断片（４Ｂ）をこの順となるように、プライマーslr1044_upper_F（配列番号１）及びslr1044_down_R（配列番号４）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。この最終ＤＮＡ断片を用いて、実施例３で構築した6803Δslr0369株の形質転換を行い、カナマイシンとストレプトマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が6803Δslr0369Δslr1044株である。6803Δslr0369Δslr1044株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００４２】
形質転換の確認は、プライマーslr1044_check_F（配列番号２１）、slr1044_check_R（配列番号２２）、slr1044_check_internal_F（配列番号２３）、slr0369_check_F（配列番号２７）、slr0369_check_R（配列番号２８）、slr0369_check_internal_F（配列番号２９）、及びKm_internal_F（配列番号３０）を用いて行った。
（実施例５）
実施例３で構築した6803Δslr0369株を宿主として、slr0322遺伝子をストレプトマイシン耐性遺伝子に置き換えることで、slr0369遺伝子とslr0322遺伝子とが欠失したSynechocystis変異株（以下では6803Δslr0369Δslr0322株とする）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００４３】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0322_upper_F（配列番号５）及びslr0322_upper_R_Sm（配列番号１６）を用いて、断片（５Ａ）をPCRにより増幅した。この断片（５Ａ）はslr0322遺伝子の開始コドンの上流に隣接する領域を含む。
【００４４】
また、第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーslr0322_down_F_Sm（配列番号１４）及びslr0322_down_R（配列番号８）を用いて、断片（５Ｂ）をPCRにより増幅した。この断片（５Ｂ）はslr0322遺伝子の終止コドンの下流に隣接する領域を含む。
【００４５】
さらに、プラスミドpCDFDuet-1を鋳型とし、プライマーSm_F（配列番号１９）及びSm_R（配列番号２０）を用いて、ストレプトマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（５Ｃ）をPCRにより増幅した。
【００４６】
次に、得られた断片（５Ａ）、断片（５Ｃ）及び断片（５Ｂ）をこの順となるように、プライマーslr0322_upper_F（配列番号５）及びslr0322_down_R（配列番号８）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。この最終ＤＮＡ断片を用いて、実施例３で構築した6803Δslr0369株の形質転換を行い、カナマイシンとストレプトマイシンを含むBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr0369Δslr0322株である。6803Δslr0369Δslr0322株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００４７】
形質転換の確認は、プライマーslr0322_check_F（配列番号２４）、slr0322_check_R（配列番号２５）、slr0322_check_internal_F（配列番号２６）、slr0369_check_F（配列番号２７）、slr0369_check_R（配列番号２８）、slr0369_check_internal_F（配列番号２９）、及びKm_internal_F（配列番号３０）を用いて行った。
（実施例６）
（１）6803/EtOH株の構築
Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として、Zymomonas mobilis由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）とアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhII）とを導入したSynechocystis変異株（以下では6803/EtOH株とする）を構築した。この構築方法は、以下の公知文献に開示されている。
著者:Yoshikawa Katsunori, Hirasawa Takashi, Shimizu Hiroshi.
タイトル：Effect of malic enzyme on ethanol production by Synechocystis  sp. PCC 6803.
雑誌：Journal of Bioscience and Bioengineering
発行年：2015
巻号：119巻1号
ページ：82-84
6803/EtOH株の構築方法は以下のとおりである。
【００４８】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーndhB_F1（配列番号３１）及びndhB_R1（配列番号３２）を用いて断片（６Ａ）をPCRにより増幅した。
また、プライマーndhB_F2（配列番号３３）及びndhB_R2（配列番号３４）を用いて断片（６Ｂ）をPCRにより増幅した。断片（６Ａ）と断片（６Ｂ）とを、プライマーndhB_F1（配列番号３１）及びndhB_R2（配列番号３４）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をプラスミドpHSG298のPstI-EcoRIサイトに挿入し、プラスミドpNdhBを作成した。
【００４９】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーpsbA2p_F（配列番号３５）及びpsbA2p_R（配列番号３６）を用いて断片（６Ｃ）をPCRにより増幅した。プラスミドpUC19（TAKARA BIO. Inc., Japan）を鋳型とし、プライマーAm_F（配列番号３７）及びAm_R（配列番号３８）を用いて断片（６Ｄ）をPCRにより増幅した。断片（６Ｃ）と断片（６Ｄ）とを、プライマーpsbA2p_F（配列番号３５）及びAm_R（配列番号３８）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をプラスミドpNdhBのXhoI-SacIサイトに挿入し、プラスミドpNdhB-psbA2pを作成した。
【００５０】
Z. mobilisから抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするpdc遺伝子の断片と、アルコール脱水素酵素IIをコードするadh遺伝子の断片とを、それぞれ、プライマーpdc_F（配列番号３９）、pdc_R（配列番号４０）、adh_F（配列番号４１）、及びadh_R（配列番号４２）を用いてPCRにより増幅した。増幅した２つの断片を、プライマーpdc_F（配列番号３９）及びadh_R（配列番号４２）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させた。結合させた断片をプラスミドpNdhB-psbA2pのNdeI-BamHIサイトに挿入し、プラスミドpNdhB-psbA2p-EtOHを作成した。
【００５１】
第１のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーnblAp_F（配列番号４３）及びnblAp_R（配列番号４４）を用いてnblA遺伝子のプロモーター配列部位である断片をPCRにより増幅した。増幅した断片を、プラスミドpNdhB-psbA2p-EtOHのXhoI-NdeIサイトに挿入し、プラスミドpNdhB-nblAp-EtOHを構築した。
【００５２】
構築したプラスミドpNdhB-nblAp-EtOHを用いて、Synechocystis sp. PCC 6803株の形質転換を行い、アンピシリンを拭くBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803/EtOH株である。
【００５３】
形質転換の確認は、プライマーndhB_check_F（配列番号４５）及びndhB_check_R（配列番号４６）を用いて行った。
（２）slr0369遺伝子とslr1044遺伝子とが欠失し、エタノール生合成経路の遺伝子を導入したSynechocystis変異株（6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株）の構築
実施例４で構築した6803Δslr0369Δslr1044株を宿主として、Z. mobilis由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）とアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhII）とを導入したSynechocystis変異株（6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株）を構築した。具体的には、以下の操作を行った。
【００５４】
前記（１）で構築したプラスミドpNdhB-nblAp-EtOHを用いて、実施例４で構築した6803Δslr0369Δslr1044株の形質転換を行い、アンピシリンを拭くBG11寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。分離した形質転換体が、6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株である。6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株は、藻類に対応し、微細藻類に対応する。
【００５５】
形質転換の確認は、プライマーndhB_check_F（配列番号４５）及びndhB_check_R（配列番号４６）を用いて行った。
（実施例７）
Synechocystis sp. PCC 6803株、6803Δslr1044株、6803Δslr0322株、6803Δslr0369Δslr1044株、及び6803Δslr0369Δslr0322株について、イソブタノール耐性効果を確認した。
（１）試験方法
それぞれの株について、前々培養、前培養、及び本培養を順次行った。いずれの培養においても、100 mL容の三角フラスコを使用し、20 mLのBG11培地を用いた。BG11培地の組成は以下のとおりである。
【００５６】
BG11培地：2.7 μM EDTA disodium salt、18 mM NaNO3、46 μM H3BO3、20 mM HEPES (pH 7.5)、1.6 μM Na2MoO4・2H2O、220 μM K2HPO4、300 μM MgSO4・7H2O、260 μM CaCl2、9.1 μM MnCl2・4H2O、0.77 μM ZnSO4・7H2O、0.32 μM CuSO4・5H2O、0.17 μM Co(NO3)2・6H2O、16 μM FeCl2・4H2O、25 μM NH4Cl
また、いずれの培養においても、LEDプレート（LC-LED 450W、TAITEC）付き振盪インキュベーター(TAITEC、BR-43FL・MR）を用いて150rpm、34℃で振盪培養を行った。三角フラスコ底面における光強度が約40μmol/m2/sになるようにLEDプレートの光量を調節した。光強度は光量子計 (LI-COR、LI-190SA光量子センサー/LI-COR、LI-250Aライトメーター) を用いて測定した。
【００５７】
前々培養では、平板培地に植菌した菌体を、波長730nmにおける培養液の濁度（OD730）が0.03となるようにBG11培地に植菌し、3〜7日間培養した。前培養では、OD730が0.05になるように前々培養液を植菌し、3日間培養した。本培養では、OD730が0.03になるように前培養液を植菌した。
【００５８】
前々培養、及び前培養では通気性のあるシリコン栓(PLUG SILICON、上径:28 mm、下径:17 mm、高さ:45mm) を用いた。本培養ではイソブタノールの気化を抑えるために、通気性のないシリコン栓(SILICON PLUG、上径:28 mm、下径:23 mm、高さ:30 mm)を使用した。本培養の際、99%(w/w)イソブタノール(和光純薬工業)を、終濃度が0 g/L、2 g/L、5g/LになるようにBG11培地に添加した。
【００５９】
培養開始時、24時間経過時、48時間経過時のOD730を分光光度計(島津製作所，UVmini-1240) を使用して測定し、比増殖速度を求めた。
（２）試験結果
試験結果を図１に示す。イソブタノールの終濃度が0g/Lである場合、6803Δslr1044株、6803Δslr0322株、6803Δslr0369Δslr1044株、及び6803Δslr0369Δslr0322株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度と同程度であった。
【００６０】
イソブタノールの終濃度が2g/Lである場合、6803Δslr1044株、6803Δslr0322株、6803Δslr0369Δslr1044株、及び6803Δslr0369Δslr0322株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも顕著に高かった。
【００６１】
イソブタノールの終濃度が5g/Lである場合、6803Δslr0369Δslr1044株、及び6803Δslr0369Δslr0322株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも顕著に高かった。比増殖速度が高いことは、ストレス耐性が高いことに対応する。
(実施例８）  
Synechocystis sp. PCC 6803株及び6803Δslr0369Δslr1044株について、様々なアルコールに対する耐性効果を確認した。
（１）試験方法
基本的には実施例７と同様に培養を行った。ただし、本培養の際、99%(w/w)イソブタノールではなく、99.5% (w/w) エタノール (和光純薬工業)、99% (w/w) 1-ブタノール (和光純薬工業)、98% (w/w) イソペンタノール (和光純薬工業) のうちのいずれか１つを、目的の終濃度となるようにBG11培地に添加した。エタノールの終濃度は0g/L、12g/L、16g/Lとした。1-ブタノールの終濃度は0g/L、1g/L、3g/Lとした。イソペンタノールの終濃度は0g/L、0.8g/L、1g/Lとした。
【００６２】
培養開始時、24時間経過時、48時間経過時のOD730を分光光度計(島津製作所，UVmini-1240) を使用して測定し、比増殖速度を求めた。
（２）試験結果
試験結果を図２〜図４に示す。図２に示すように、エタノールを添加し、その終濃度が0g/L、12g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803の比増殖速度と同程度であった。また、エタノールを添加し、その終濃度が16g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも顕著に高かった。
【００６３】
図３に示すように、1-ブタノールを添加し、その終濃度が0g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度と同程度であった。また、1-ブタノールを添加し、その終濃度が1g/L、3g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも高く、特に、終濃度が3g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも顕著に高かった。
【００６４】
図４に示すように、イソペンタノールを添加し、その終濃度が0g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度と同程度であった。また、イソペンタノールを添加し、その終濃度が0.8g/L、1g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも高く、特に、終濃度が1g/Lの場合、6803Δslr0369Δslr1044株の比増殖速度は、Synechocystis sp. PCC 6803株の比増殖速度よりも顕著に高かった。
（実施例９）
6803/EtOH株、及び6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株について、エタノール生産量を測定した。
（１）試験方法
基本的には実施例７と同様に培養を行った。ただし、本培養においてアルコールを培地に添加しなかった。培養開始時、24時間経過時、48時間経過時に、エタノール濃度をガスクロマトグラフ (Agilent 7890A GC) により測定した。エタノール濃度は、エタノール生産量に対応する。
（２）試験結果
図５に示すように、6803Δslr0369Δslr1044/EtOH株のエタノール生産量は、6803/EtOH株のエタノール生産量より多かった。
＜他の実施形態＞
以上、本開示を実施するための形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
【００６５】
（１）宿主となる藻類は、Synechocystis sp. PCC 6803株以外のものであってもよく、適宜選択することができる。
（２）遺伝子を欠失、変異させる方法は、公知の方法の中から適宜選択することができる。
【００６６】
（３）実施例１〜６において欠失又は変異させる遺伝子は、slr0369遺伝子、slr1044遺伝子、slr0322遺伝子と完全に同一の遺伝子ではなく、それらと相同性が高い遺伝子であってもよい。相同性が高い遺伝子とは、例えば、slr0369遺伝子、slr1044遺伝子、slr0322遺伝子のうちのいずれかとの間のE-valueが1e-10以下である遺伝子、好ましくは、E-valueが1e-30以下である遺伝子である。上記の相同性が高い遺伝子を欠失又は変異させた場合でも、slr0369遺伝子、slr1044遺伝子、slr0322遺伝子を欠失又は変異させた場合と略同様の効果を奏することができる。
【００６７】
（４）シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803株において、slr0369遺伝子、slr1044遺伝子、及びslr0322遺伝子を欠失又は変異させてもよい。
（５）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言のみによって特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本発明の実施形態である。
【００６８】
（６）上述した藻類の他、当該藻類の培養方法、当該藻類を用いて物質を製造する方法、当該藻類を用いて物質を製造するシステム等、種々の形態で本発明を実現することもできる。
【図１】
2018014923.tif 000003
【図２】
2018014923.tif 000004
【図３】
2018014923.tif 000005
【図４】
2018014923.tif 000006
【図５】
2018014923.tif 000007
【配列表】
2018014923000001.app