(57)【要約】【課題】高速化を図ることできる核酸増幅反応方法を提供する。【解決手段】プライマーおよびプローブを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、前記熱サイクルを付与する工程において、前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上であって８０℃以下である、核酸増幅反応方法。【選択図】図４
2018014948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーおよびプローブを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上であって８０℃以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項４】
請求項３において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項５】
請求項３において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上７５℃以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記プライマーは、人工核酸を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う、核酸増幅反応方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記プローブは、加水分解プローブである、核酸増幅反応方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、
前記プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項１１】
核酸を増幅させるための核酸増幅試薬であって、
プライマーと、プローブと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上で８０℃以下であり、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応試薬。
【請求項１２】
核酸を増幅させるための核酸増幅試薬であって、
プライマーと、プローブと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上で８０℃以下であり、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、核酸増幅反応試薬。
【請求項１３】
請求項１１または１２において、
凍結乾燥されている、核酸増幅反応試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応方法および核酸増幅反応試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応溶液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
ＰＣＲの高速化は、遺伝子検査の検査時間短縮化のために必要な技術であり、遺伝子検査の業界において非常に期待されている。
【０００５】
例えば特許文献１には、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ、プライマーが少なくとも２μＭの濃度で提供され、１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５２０６１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、ポリメラーゼを大量に使用するため、検査コストの観点で好ましくない。発明者らは、鋭意研究の結果、ポリメラーゼを大量に使用しなくても、ＰＣＲの高速化を図ることができる方法を見出した。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、高速化を図ることできる核酸増幅反応方法を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、高速化を図ることできる核酸増幅反応試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
プライマーおよびプローブを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上であって８０℃以下である。
【００１０】
このような核酸増幅反応方法では、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅をより確実に抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下であってもよい。
【００１２】
このような核酸増幅反応方法では、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅をより確実に抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である。
【００１８】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００１９】
このような核酸増幅方法では、２価の陽イオンの種類によって伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制するのに最適な濃度範囲が異なってくる。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上７５℃以下であってもよい。
【００２１】
このような核酸増幅反応方法では、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅をより確実に抑制することができる。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーは、人工核酸を含んでもよい。
【００２３】
このような核酸増幅反応方法では、塩基数を多くすることなく、プライマーのＴｍ値を７０℃以上であって８０℃以下にすることができ、プライマーダイマーの非特異吸着を抑制することができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行ってもよい。
【００２５】
このような核酸増幅反応方法では、プライマーのアニーリング反応のための加熱と、伸長反応のための加熱と、を別々に行う場合に比べて、高速化を図ることができる。
【００２６】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、プローブを含み、
前記プローブは、加水分解プローブであってもよい。
【００２７】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼによってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消してレポーター色素が発光することにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００２８】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含んでもよい。
【００２９】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲにおいて、プローブの塩基数を多くすることなく、プローブのＴｍ値を高くすることができる。
【００３０】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
核酸を増幅させるための核酸増幅試薬であって、
プライマーと、プローブと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液のＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００３１】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００３２】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
核酸を増幅させるための核酸増幅試薬であって、
プライマーと、プローブと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上で８０℃以下であり、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である。
【００３３】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる。
【００３４】
本発明に係る核酸増幅反応試薬において、
凍結乾燥されていてもよい。
【００３５】
このような核酸増幅反応試薬では、安定して保存されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフ。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図３】本実施形態に係る反応溶液に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置を模式的に示す断面図。
【図４】ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図５】ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図６】電気泳動の結果。
【図７】電気泳動の結果。
【図８】蛍光強度を示すグラフ。
【図９】蛍光強度を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３８】
１．  核酸増幅反応試薬
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬について説明する。核酸増幅反応試薬は、ＰＣＲにおいて、核酸を増幅させるための試薬である。核酸増幅反応試薬は、例えば、液状であってもよいし、凍結乾燥された状態であってもよい。例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応試薬は、容器（図示せず）内に固定されており、該容器に、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）やＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含む鋳型核酸溶液を導入して、鋳型核酸溶液と核酸増幅反応用試薬とを接触させる。核酸増幅反応用試薬は、鋳型核酸溶液の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液に取り込まれ、反応溶液となる。したがって、反応溶液は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００３９】
核酸増幅反応試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、プローブと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００４０】
１．１．  プライマー
プライマーは、鋳型核酸（テンプレート）にアニールするよう設計されている。アニール（アニーリング）とは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。核酸増幅反応用試薬は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応溶液に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上６．４μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応溶液に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、例えば、同じである。
【００４１】
プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、好ましくは７０℃以上７５℃以下であり、より好ましくは７５℃である。これにより、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬は、高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。Ｔｍ値は、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする温度の指標であり、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値以上の温度であれば、半数以上のプライマーが鋳型核酸にアニーリングする。フォワードプライマーのＴｍ値と、リバースプライマーのＴｍ値とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４２】
Ｔｍ値の算出方法としては、例えば、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法が挙げられ、下記式（１）によって算出することができる。
【００４３】
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
【００４４】
なお、式（１）において、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００４５】
プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、プライマーの塩基数を多くすることなく、プライマーのＴｍ値を上記の範囲にすることができる。プライマーの塩基数が多くなると、非特異的吸着や、プライマー同士がプライマーダイマー（二本鎖）を形成してしまい、目的の核酸を増幅することができない場合がある。プライマーダイマーには、１つのプライマーにおいて二本鎖を形成するセルフダイマーと、フォワードプライマーとリバースプライマーとにおいて二本鎖を形成するクロスダイマーとがある。
【００４６】
人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が挙げられる。ＬＮＡの化学式を下記式（２）に示す。
【００４７】
【化１】
2018014948.tif 000003
【００４８】
なお、式（２）において、Ｂａｓｅ（塩基）は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）等が挙げられるが、特に限定されない。また、塩基は、メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。
【００４９】
人工核酸は、ＬＮＡを修飾したＬＮＡアナログであってもよく、具合的には、３’アミノ− ２’，４’− ＢＮＡ、２’，４’− ＢＮＡＣＯＣ、または２’，４’− ＢＮＡＮＣであってもよい。また、修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸は、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、またはこれらを修飾したアナログであってもよい。プローブに含まれる人工核酸の数は、特に限定されず、１つのプローブは、複数の人工核酸を含んでいてもよい。
【００５０】
プライマーの塩基数を多くすることによりプライマーのＴｍ値を高くする場合は、プライマーを増幅領域の内側（プライマーを鋳型核酸の５´末端側）に伸ばすように設計することで、伸長反応による核酸の増幅領域を増やすことなく、Ｔｍ値を高くすることができ
る。これにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００５１】
１．２．  ポリメラーゼ
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させる加水分解型と、ＫＯＤポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させない非加水分解型とが、存在する。ＫＯＤは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１であり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のＤＮＡポリメラーゼである。反応溶液に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００５２】
ここで、図１は、Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフである。縦軸は、温度を変化させたときにポリメラーゼの活性効率が最大となる値を１００％とした相対活性効率である。各温度におけるポリメラーゼの活性効率は、ｄＮＴＰに、ｄＮＴＰが伸長反応に取り込まれる際に発光するような工夫を行い、一定の時間経過後、ｄＮＴＰによる蛍光強度（蛍光輝度）を測定することにより、求めることができる。蛍光強度が高いほど、ポリメラーゼの活性効率は、高くなる。図１に示す例では、Ｔａｑポリメラーゼは、７０℃付近のときに、相対活性効率が最大となっている。
【００５３】
１．３．  ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。反応溶液に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００５４】
１．４．  プローブ
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。より具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。反応溶液に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上２．４μＭ以下であり、好ましくは０．５μＭ以上１．８μＭ以下である。
【００５５】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラー
ゼとしてＫＯＤポリメラーゼを用いる。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５６】
プローブが非加水分解プローブの場合は、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールする増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５７】
プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含んでもよい。これにより、プローブの塩基数を多くすることなく、プローブのＴｍ値を高くすることができる。プローブの塩基数が多くなると、プローブを分解するために伸長反応の時間が長くなり（伸長反応において増幅される核酸の領域が増えてしまい）、ＰＣＲの高速化が困難になる場合がある。人工核酸としては、上述したものを用いることができる。
【００５８】
本実施形態では、プライマーのＴｍ値が７０℃以上と高く、基本的には塩基数の多く（塩基長が長く）なる。通常、塩基数が多くなると、非特異増幅の発生割合も高くなり、ＰＣＲ自体の特異が低下する。しかしながら、本実施形態では、プローブによって得異度を上げることができる。
【００５９】
本実施形態では、核酸増幅反応の検出のためにプローブを用いているが、ＰＣＲを高速化するために、プローブの代わりにインターカレータを用いる場合がある。このインターカレータ法は、プローブの加水分解工程をなくすことができるため、増幅反応時間の短縮が期待できる。しかしながら、インターカレータ法では、ＰＣＲ反応の課題の一つである非特異アニールが起き、これにより、目的以外の核酸が増幅した場合でも、蛍光輝度として検出されてしまう。反応時間を高速化することで、前述した非特異増幅はある程度は抑えられるが、非特異増幅が起きやすい条件、例えばヒトゲノムＤＮＡが混入しているような場合では完全に抑えることができず、結果として検出系の特異性が低下してしまう。一方、プローブを用いることで、前述した非特異増幅が起きやすい反応条件であって、増幅の段階で非特異増幅が起こったとしても、プローブによる配列特異性があるため、検出系の特異性は担保されることになる。
【００６０】
１．５．  バッファー
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。
【００６１】
バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。２価の陽イオンの濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる（具体的には熱サイクルの１サイクル当たりの時間を９秒以下にすることができる）。２価の陽イオンの濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００６２】
具体的には、バッファーは、２価の陽イオン化合物と、ＫＣＬと、Ｔｒｉｓと、を含む。より具体的には、バッファーは、ＭｇＣｌ２を含み、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来する。すなわち、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２が電離して生成される。２価の陽イ
オンがＭｇＣｌ２に由来する場合は、Ｍｇ２＋の濃度は、ポリメラーゼの活性に起因する。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、好ましくは５ｍＭ以上７ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭである。ＭｇＣｌ２の濃度を４ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＣｌ２の濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。なお、核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている状態では、核酸増幅反応試薬は、固形の状態で、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ、賦形剤、例えばトレハロースを含む。
【００６３】
２価の陽イオン化合物は、ＭｇＳＯ４に由来していてもよい。この場合は、バッファーは、ＭｇＣｌ２の代わりにＭｇＳＯ４を含み、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭである。ＭｇＳＯ４の濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＳＯ４の濃度を３ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００６４】
１．６．  その他の成分
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、核酸増幅反応試薬は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００６５】
核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている場合、核酸増幅反応試薬（凍結乾燥試薬）は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応試薬の各成分と、糖と、を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００６６】
核酸増幅反応試薬は、例えば、以下の特徴を有する。
【００６７】
核酸増幅反応試薬では、プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下である。そのため、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅（目的の領域以外の領域にプライマーがアニーリングして核酸が増幅すること）を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。さらに、核酸増幅反応試薬では、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。そのため、核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼを大量に使用しなくてもよいので、高速化のための試薬の大幅なコストアップを避けることができる。
【００６８】
核酸増幅反応試薬では、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になっ
た場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼを大量に使用しなくてもよいので、高速化のための試薬の大幅なコストアップを避けることができる。
【００６９】
核酸増幅反応試薬では、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼを大量に使用しなくてもよいので、高速化のための試薬の大幅なコストアップを避けることができる。
【００７０】
核酸増幅反応試薬では、プライマーのＴｍ値は、７０℃以上７５℃以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅をより確実に抑制することができる。
【００７１】
核酸増幅反応試薬では、プライマーは、人工核酸を含んでいてもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、塩基数を多くすることなく、プライマーのＴｍ値を７０℃以上であって８０℃以下にすることができ、プライマーダイマーの非特異吸着を抑制することができる。
【００７２】
核酸増幅反応試薬では、プローブは、加水分解プローブであってもよい。そのため、核酸増幅反応試薬は、ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼによってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消してレポーター色素が発光することにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００７３】
核酸増幅反応試薬では、プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含んでもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、プローブの塩基数を多くすることなく、プローブのＴｍ値を高くすることができる。
【００７４】
核酸増幅反応試薬は、凍結乾燥されていてもよい。そのため、核酸増幅反応試薬は、安定して保存されることができる。
【００７５】
２．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。
【００７６】
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する（ステップＳ１）。具体的には、核酸増幅反応試薬が収容されている容器に、ピペット等を用いて鋳型核酸溶液を導入し、核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する。
【００７７】
鋳型核酸溶液は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００７８】
次に、反応溶液に、核酸を増幅させるための（ＰＣＲのための）熱サイクルを付与する（ステップＳ２）。ここで、図３は、本実施形態に係る反応溶液６に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置１００を模式的に示す断面図である。
【００７９】
熱サイクル装置１００は、図３に示すように、第１ホットプレート１０と、第２ホットプレート１２と、第１ビーカー２０と、第２ビーカー２２と、アーム３０と、固定部３２と、を含む。
【００８０】
第１ホットプレート１０は、第１ビーカー２０に収容されている液体２を第１温度に加熱する。第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。液体２の種類は、第１ホットプレート１０により第１温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８１】
第２ホットプレート１２は、第２ビーカー２２に収容されている液体４を第２温度に加熱する。第２温度は、第１温度よりも低い温度である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。すなわち、本工程では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。つまり、アニーリング反応と伸長反応とを同じ温度で行う。上述した図１より、ポリメラーゼの活性効率の観点からは、第２温度は、７０℃程度が最適であるといえる。液体４の種類は、第２ホットプレート１２により第２温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８２】
アーム３０は、一端３０ａが固定部３２によって固定されており、他端３０ｂが自由端となっている。アーム３０の他端３０ｂは、反応溶液６が収容されている容器８を支持している。アーム３０は、図示せぬモーターにより、一端３０ａが固定された状態で、他端３０ｂが円弧状に往復運動する。
【００８３】
アーム３０の往復運動により、反応溶液６は、第１温度に加熱された液体２中と、第２温度に加熱された液体４中とに、交互に配置される。これにより、反応溶液６に、ＰＣＲのための熱サイクルを付与することができる。本工程における熱サイクル数は、モーターの駆動および停止により適宜設定することができ、例えば、２０サイクル以上６０サイクル以下である。反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間は、短ければ短いほどよいが、例えば、０．５秒程度である。
【００８４】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりの変性反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体２中に配置されている時間）は、例えば、０．３秒以上５秒以下であり、好ましくは０．５秒以上２秒以下である。変性反応のための加熱時間を０．３秒以上とすることにより、変性反応の時間が短すぎて変性が十分に行われないことを抑制することができる。変性反応のための加熱時間を５秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００８５】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりのアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体４中に配置されている時間）は、例えば、６秒以下であり、好ましくは４秒以下であり、より好ましくは１秒以上３秒以下であり、さらにより好ましくは１秒以上１．５秒以下である。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を６秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００８６】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、好ましくは７秒以下であり、より好ましくは６秒以下である
。１サイクル当たりの時間を９秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。なお、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、変性反応、アニーリング反応、および伸長反応にかかる時間と、これらの反応を行うための反応溶液の移動時間（例えば、反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間）と、を含む。
【００８７】
次に、反応溶液の蛍光強度を測定する（ステップＳ３）。例えば、熱サイクルを付与した反応溶液を、透光性の容器に移し、該透光性の容器に光を照射して蛍光強度を測定する。これにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００８８】
核酸増幅反応方法では、熱サイクルを付与する工程において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下である。そのため、核酸増幅反応方法では、高速化を図りつつ、非特異的な核酸の増幅を抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００８９】
核酸増幅反応方法では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。そのため、核酸増幅反応方法では、プライマーのアニーリング反応のための加熱と、伸長反応のための加熱と、を別々に行う場合に比べて、高速化を図ることができる。
【００９０】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【００９１】
３．１．  第１実験例
３．１．１．  反応溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【００９２】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ３．０５μＬ
【００９３】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【００９４】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【００９５】
本実験では、Ｔｍ値が異なるプライマーを用いた。具体的には、Ｔｍ値が約６０℃（Ｔｍ６０）、約７０℃（Ｔｍ７０）、約７５℃（Ｔｍ７５）、約８０℃（Ｔｍ８０）、および約８５℃（Ｔｍ８５）のプライマーを用いた。プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表１のとおりである。
【００９６】
【表１】
2018014948.tif 000004
【００９７】
なお、表１に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。
【００９８】
３．１．２．  実験結果
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った（図３参照）。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度を測定した。
【００９９】
各プライマー（Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５）を用いたＰＣＲにおいて、変性反応のための加熱温度（高温温度）は、８７℃とした。Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５を用いたＰＣＲにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱温度（低温温度）は、それぞれ、６０℃、６３℃、６６℃、６９℃、７２℃とした。ＰＣＲにおける、１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表２に示す。なお、ポリメラーゼを活性化させるため、初めに１０秒間高温温度で加熱した（ホットスタート）。反応時間は、ポリメラーゼ活性時間に加え、高温時間および低温時間にサイクル数４０を掛け、さらに、反応溶液の移動時間を足したものである。また、表２において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間と低温時間との和に、高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）および低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）を足したものである。例えば、反応時間３７０秒の場合、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間（２秒）＋高温時間（６秒）＋高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）＋低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）＝９秒となる。
【０１００】
【表２】
2018014948.tif 000005
【０１０１】
図４は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図４に示すように
、低温時間が６秒の場合（１サイクル当たりの時間が９秒の場合）は、Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認されたが、低温時間が４秒以下の場合（１サイクル当たりの時間が７秒の場合）は、Ｔｍ６０では核酸の増幅が確認されず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認された。したがって、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上であって、８０℃未満とすることにより、低温時間が４秒以下という高速ＰＣＲでも、核酸を増幅できることがわかった。これは、Ｔｍ値が高いプライマーの方が鋳型核酸に速くアニーリングするので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。また、上述した図１から、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方が、Ｔｍ６０よりも、ポリメラーゼの活性効率が高く、伸長反応を速めることができるので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。なお、本実験例で用いた装置のばらつきを考慮すると、蛍光強度が３万５千以上であると、確実に核酸が増幅されているといえる。そのため、１サイクル当たりの時間が９秒の場合に、Ｔｍ６０は確実に核酸が増幅されているとはいえず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５は確実に核酸が増幅されているといえる。
【０１０２】
さらに、図４より、低温時間を２秒以上４秒以下とし、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上７５℃以下とすることにより、低温時間が４秒以下という高速ＰＣＲでも、より確実に、核酸を増幅できることがわかった。また、図４より、Ｔｍ８０およびＴｍ８５では、核酸の増幅が確認されなかった。これは、Ｔｍ値が高すぎて、プライマーダイマーなどが生じたためであると考えられる。
【０１０３】
なお、図４では、明らかに核酸が増幅されていない状態（例えば１サイクル終了後）の蛍光強度を、４０サイクル終了後の蛍光強度から引いた値をプロットしている。蛍光強度がマイナスを示しているプロットは、測定誤差であると考えられる。
【０１０４】
３．２．  第２実験例
３．２．１．  反応溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、百日咳菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１０５】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
百日咳菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）            ０．３２μＬ
百日咳菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）              ０．３２μＬ
百日咳菌蛍光標識プローブ（１０μＭ）                        ０．９μＬ
百日咳菌ＤＮＡ（２０コピーまたは１００コピー／μＬ）        １．０μＬ
蒸留水                                                      ４．８１μＬ
【０１０６】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１０７】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１０８】
プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表３のとおりである。表３に示すＴｍ値は、表１に示すＴｍ値と同様の方法で算出した。
【０１０９】
【表３】
2018014948.tif 000006
【０１１０】
３．２．２．  実験結果
上記のような反応溶液１０μＬに対して、第１実験例と同様に、ホットスタートを１０秒間行ってＰＣＲを行った。高温温度を９０℃とし、低温温度を６０℃とした。１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表４に示す。
【０１１１】
【表４】
2018014948.tif 000007
【０１１２】
図５は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図５に示すように、プライマーのＴｍ値が約８０℃であっても、核酸の増幅を確認することができた。
【０１１３】
３．３．  第３実験例
３．３．１．  反応溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の第１反応溶液および第２反応溶液を調製した。
【０１１４】
＜第１反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．２μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      ０．４μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        ０．４μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．２μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ５．６μＬ
【０１１５】
＜第２反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ３．０５μＬ
【０１１６】
なお、第１反応溶液および第２反応溶液ともに蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１１７】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１１８】
第１反応溶液では、第１実験例で用いたＴｍ値が約６０℃のプライマーを用い、第２反応用液では、第１実験例で用いたＴｍ値が約７０℃のプライマーを用いた（表１参照）。
【０１１９】
上記のような反応溶液に夾雑物として、リゾチームを混入させた。具体的には、リゾチームの終濃度が２００ｎｇ／ｇＬ、２０ｎｇ／Ｌ、２ｎｇ／Ｌとなるように反応溶液に混入した。
【０１２０】
３．３．２．  実験結果
上記のような反応溶液に対して、標準サイクル条件として、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍを用いてＰＣＲを行った。標準サイクル条件では、高温温度を９５℃、高温時間を１５秒、低温温度を５８℃、低温温度を３０秒とした。
【０１２１】
また、上記のような反応溶液に対して、高速サイクル条件として、第１実験例と同様の装置で（図３参照）、ＰＣＲを行った。高温サイクル条件では、高温温度を８９℃、高温時間を２秒、低温温度を６５℃、低温温度を２秒とした。
【０１２２】
図６は、第１反応溶液に対して標準サイクル条件でＰＣＲを行った場合、第２反応溶液に対して標準サイクル条件でＰＣＲを行った場合、および第２反応溶液に対して高速サイクル条件でＰＣＲを行った場合における電気泳動の結果である。
【０１２３】
図６に示すように、第１反応溶液に対して標準サイクル条件でＰＣＲを行った場合では、夾雑物の濃度２０（ｎｇ／μＬ）以上、目的バンドが確認されなかった。第２反応溶液に対して標準サイクル条件でＰＣＲを行った場合では、夾雑物が混入していない状態（濃度０）の場合でも非特異的なバンド（目的となるバンド以外のバンド）が確認された。第２反応溶液に対して高速サイクル条件でＰＣＲを行った場合では、非特異的なバンドは確認されず、夾雑物の濃度２０（ｎｇ／μＬ）でも目的バンドが確認された。これにより、プライマーのＴｍ値を７０℃以上とし、ＰＣＲを高速化することで、非特異的な核酸の増幅を減らすことができることがわかった。
【０１２４】
一般的に、Ｔｍ値が高いプライマーはアニーリングしやすいが、Ｔｍ値が高いと非特異的な増幅が起こり易いため、Ｔｍ値が６０℃程度のプライマーが使用されている。しかしながら、本実験例では、ＰＣＲを高速化することにより、Ｔｍ値が７０℃以上であっても、非特異的な増幅を減らすことができた。なお、図６では、実線で目的となるバンドを囲い、破線で非特異的なバンドを囲っている。
【０１２５】
さらに、第１反応溶液を用いた場合は、夾雑物の濃度１／５０で目的となるバンドが確認されなかったが、第２反応溶液を用いた場合は、夾雑物の濃度１／５０で目的となるバンドを確認することができた。これにより、プライマーのＴｍ値を７０℃以上とすることで、夾雑物に対する耐性が向上していることがわかった。
【０１２６】
３．４．  第４実験例
３．４．１．  反応溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマＤＮＡを用いた。この鋳型核
酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１２７】
＜第１反応溶液の組成＞プローブ法
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）      ０．４  μＬ
バッファー                                                    ２．０  μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                          ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）      ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）        ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）            ０．９  μＬ
ヒトゲノムＤＮＡ  （１０ｎｇ／μＬ）                          １．０  μＬ
蒸留水                                                        ４．８１μＬ
【０１２８】
＜第２反応溶液の組成＞インターカレータ法
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）      ０．４  μＬ
バッファー                                                    ２．０  μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                          ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）      ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）        ０．３２μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（２５ｎＭ）                               ０．２  μＬ
ヒトゲノムＤＮＡ（10ｎｇ／μＬ）                              １．０  μＬ
蒸留水                                                        ６．５３μＬ
【０１２９】
なお、第１反応溶液の蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１３０】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１３１】
第１反応溶液、第２反応溶液では、第１実験例で用いたＴｍ値が約７５℃のプライマーを用いた（表１参照）。
【０１３２】
第１反応溶液、第２反応溶液のポジティブコントロール条件では、マイコプラズマ菌ＤＮＡを反応液あたり１００コピー入れており、ヒトゲノムＤＮＡは入れていない。また、反応時間条件は、高温２秒、低温４秒である。
【０１３３】
第１反応溶液、第２反応溶液のネガティブコントロール条件では、ヒトゲノムＤＮＡ、マイコプラズマ菌ＤＮＡ両方とも入れていない。反応時間条件は、高温２秒、低温４秒である。
【０１３４】
３．４．２．  実験結果
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度を測定した。
【０１３５】
また、蛍光強度測定後、増幅させたサンプル ５μＬを使用し、６×ローディングバッファー１μＬを加えた６μＬを電気泳動ゲルに導入し、電気泳動にかけゲル撮影装置でバ
ンドを確認した。
【０１３６】
図７は電気泳動の結果である。プローブを使用した第１反応溶液、インターカレータを使用した第２反応溶液、共に、電気泳動のバンドは、ほぼ同じ様にでている。ポジティブコントロールのレーンで１００ｂｐ付近に強いバンドがでており、これは目的の増幅長のバンドである。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）のレーンでは、目的のバンドは確認されず、６０ｂｐ付近の短い増幅長の非特異増幅のバンドが確認された。また、ヒトゲノムＤＮＡ の夾雑物を入れて反応確認したレーン（高温２秒、低温２秒〜高温２秒、低温６秒）すべてにおいて、非特異的な増幅によるバンドが確認された。テンプレートＤＮＡがないにもかかわらず増幅が確認された原因としては、反応高速化のために、２価の陽イオン濃度を高い濃度で使用することで酵素活性を上げて反応効率を上げたこと、プライマーのＴｍ値を上げたために非特異吸着が起こり易くなったこと、が挙げられる。
【０１３７】
特に、ヒトゲノムＤＮＡがある非特異吸着が起こり易い条件では、多くの非特異増幅が確認され、電気泳動でバンドの分離を行っているにも関わらず、目的のバンドなのか非特異のバンドなのか見分けがつかない結果となってしまっている。増幅長で分離する電気泳動で見分けがつかないとなると、特異度が悪い状態で増幅後の分析によってなんとか分析するのではなく、増幅時から系の特異度を向上させる必要があることがわかった。
【０１３８】
アニーリング時間を短くし、反応を高速にすることで、非特異的なバンドが減っていることから、反応速度を上げることで非特異吸着が防げていることがわかる。しかしながら、２秒、２秒であっても、少なくなったとはいえ、完全になくすことはできなかった。
【０１３９】
なお、図７において、「２´´２´´」、「２´´４´´」、「２´´６´´」とは、それぞれ、「高温２秒／低温２秒」、「高温２秒／低温４秒」、「高温２秒／低温６秒」を示している。このことは、下記の図８および図９においても同じである。
【０１４０】
図８は、第１反応溶液の蛍光強度を示すグラフである。図９は、第２反応溶液の蛍光強度を示すグラフである。図８および図９の増幅後の輝度値変化の結果から、インターカレータ法では、全ての条件で蛍光輝度変化が得られてしまっており特異度が低いことが判る、一方、プローブ法ではポジティブコントロールだけが優位な蛍光輝度変化となって現れていることから、プローブを用いることで特異度向上が図れていることがわかる。
【０１４１】
高速反応にするためには、反応効率を優先するために反応系の特異度低下は避けては通れない。高速化することで特異度は向上するが、非特異増幅が起きやすい状況ではその対策だけでは十分でない。プローブを用いることで、プローブの持つ配列選択制から特異度が向上し、増幅反応系の高速と特異度の両立が取れる様になる。
【０１４２】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１４３】
２，４…液体、６…反応溶液、８…容器、１０…第１ホットプレート、１２…第２ホットプレート、２０…第１ビーカー、２２…第２ビーカー、３０…アーム、３０ａ…一端、３０ｂ…他端、３２…固定部、１００…熱サイクル装置
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
配列番号１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号６は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号７は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号８は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号９は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１０は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号１２は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１３は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号１４は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの蛍光標識プローブの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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