(57)【要約】【課題】  基質および生成物が脂溶性であり、かつ、脂溶性膜結合タンパク質である酵素活性の測定において、より簡便で迅速なアッセイ法および阻害剤評価法の提供を課題とする。【解決手段】  基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の活性を測定する方法であって、界面活性剤の存在下、酵素と基質とを反応させて、酵素反応により基質が減少し、生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、酵素反応速度あるいは阻害剤効果に関する物理量を算出する工程とを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の活性を測定する方法であって、
界面活性剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各反応時間とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記有機溶媒が重水素化した有機溶媒、または、1Ｈ-ＮＭＲピーク数が２以下の構造を有する有機溶媒である、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記酵素が、ステロール合成酵素である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記酵素がオキシドスクアレン閉環酵素であり、前記基質が２，３−オキシドスクアレンであり、かつ、前記生成物がラノステロールである、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記有機溶媒が、重水素化クロロフォルム、重水素化メタノール、重水素化ジメチルスルホキシド、メタノールと重水との混合液、および、アセトンからなる群より選択される少なくとも一つの溶媒である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記界面活性剤が、Triton X-100、Nonidet P40、Tween 80、および、β-octylglycosideからなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記核磁気共鳴による測定工程の前に、前記有機溶媒と前記界面活性剤とを分離する工程を含まない、方法。
【請求項８】
基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の阻害剤の阻害活性を測定する方法であって、
前記界面活性剤および前記阻害剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各阻害剤濃度とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、阻害剤濃度と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程と
を含む方法。
【請求項９】
基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の複数種の阻害剤の阻害活性を測定する方法であって、
前記界面活性剤および前記阻害剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各阻害剤種とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、阻害剤の種類と関連付けられた単一または複数の物理量を算出して阻害強度を比較評価する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＭＲ検出を用いた酵素活性の測定方法または酵素活性阻害剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキシドスクアレン閉環酵素(ラノステロール合成酵素)はステロール合成系において重要な反応を触媒する必須酵素である。基質である２、３−オキシドスクワレンを閉環し、ラノステロールを生成するが、これは、さらに他の酵素の働きにより、コレステロールあるいはエルゴステロールとなる。この酵素を阻害することにより、コレステロールの生成量を抑制し、また、寄生原虫や真菌類などの病原体を死滅させることが期待できることから、創薬における標的タンパク質として重要である。
阻害剤開発においては、酵素の活性を定量化し、阻害剤の効果を評価する必要がある。このためには、１）酵素反応を進行させ、２）基質あるいは生成物を検出・定量し、３）その時間や阻害剤濃度に対する依存性を評価するというプロセスを経る。しかし、本酵素は、ａ）水溶性の低い膜結合タンパク質であるため、酵素反応時には大量の界面活性剤等を含む水溶液で行う必要があること、ｂ）一方で、基質や生成物も脂溶性であるため、これらの検出には有機溶媒を用いる必要があること、ｃ）有効な蛍光標識が存在しないなどの理由から、簡便な評価法を組み立てることは容易ではない。
現状では、主として、以下のような手順で酵素活性の検出・評価が行われる(非特許文献1,2)。Tween 80やTriton X-100などの界面活性剤あるいはウシ血清アルブミンの存在下の水溶液中で、[14C]2,3-oxidosqualeneや[14C]monooxidosqualeneなど放射性同位体標識を行った基質を用いて酵素反応を進行させる。これを、水酸化カリウムとメタノールを加えて加熱した後、石油エーテルやヘキサンなど有機溶媒によって脂溶性成分を抽出する。ここに生成物であるラノステロールが含まれるが、より純化するために、抽出操作を繰り返し行う。これを、薄層クロマトグラフィーを用いて、さらに分離し、シンチレーションカウンターによって定量評価する。
このように、基質および生成物が脂溶性であり、また、酵素自体も脂溶性の膜結合型タンパク質である場合、従来の酵素アッセイ法は、極めて煩雑で、実験時間および人的労力を要し、さらに放射線被曝の危険性があった。したがって、創薬、特にfragment-based drug discovery(ＦＢＤＤ)におけるスクリーニングのような多数の試料の解析を要する系に適するとは言い難かった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Milla et al. (2002) Lipids 37, 1171-1176.
【非特許文献２】Lenhart et al. (2003) J. Med. Chem. 46, 2083-2092.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のような従来のアッセイ法は、極めて煩雑で人的労力を要し、また、RI施設を必要とするため、創薬、例えば、fragment-based drug discovery(ＦＢＤＤ)におけるスクリーニングのような多数の試料の解析を要する系には全く適さない。したがって、本発明は、この酵素を標的とした創薬のためのスクリーニングに使用可能な、より簡便で迅速なアッセイ法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、酵素反応速度や阻害活性をＮＭＲ測定と測定により得られたスペクトルデータの因子分析とを組み合わせることにより精度高く、酵素反応速度等を評価する方法を開発した。なお、酵素反応速度を測定するためには、基質量の減少あるいは生成物量の増加を定量する必要があるが、このためには、基質と生成物を区別して観察する必要がある。そのため、一般的にはクロマトグラフィー等による分離工程を必要とする。特に、膜結合型タンパクを対象とした場合、反応溶液に界面活性剤の添加が必要となるため、それによる影響も考慮する必要がある。
基質および生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合型タンパク質である酵素を標的とした創薬のためのスクリーニングを行うにあたっては、より簡便・迅速で安全なアッセイ法の開発が必要である。上記課題に鑑み、本発明者らは、酵素反応後に生じる生成物を、有機溶媒を用いて可溶化・検出する際、酵素反応時に必要とした界面活性剤等との分離の必要性について着目した。ここで、ＮＭＲスペクトルは、様々な分子が固有の共鳴周波数を与えることから、そのスペクトル上で分子を分離・観察できるという特質を有するものである。本発明者らは、反応混合物のスペクトル測定等の検討を行った結果、適切な溶媒および界面活性剤を選ぶことにより、界面活性剤がＮＭＲ測定試料に混在しても、脂溶性の生成物を検出して定量評価することが可能であることを見出した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００６】
本発明は、一態様において、
〔１〕基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の活性を測定する方法であって、
界面活性剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各反応時間とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程と、
を含む方法に関する。
ここで、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の方法であって、
前記有機溶媒が重水素化した有機溶媒、または、1Ｈ-ＮＭＲピーク数が２以下の構造を有する有機溶媒であることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の方法であって、
前記酵素が、ステロール合成酵素であることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法であって、
前記酵素がオキシドスクアレン閉環酵素であり、前記基質が２、３−オキシドスクアレンであり、かつ、前記生成物がラノステロールであることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法であって、
前記有機溶媒が、重水素化クロロフォルム、重水素化メタノール、重水素化ジメチルスルホキシド、メタノールと重水との混合液、および、アセトンからなる群より選択される少なくとも一つの溶媒であることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法であって、
前記界面活性剤が、Triton X-100、Nonidet P40、Tween 80、および、β-octylglycosideからなる群より選択される少なくとも一つの化合物であることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法であって、
前記核磁気共鳴による測定工程の前に、前記有機溶媒と前記界面活性剤とを分離する工程を含まないことを特徴とする。
【０００７】
また、本発明は、別の態様において、
〔８〕基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の阻害剤の阻害活性を測定する方法であって、
前記界面活性剤および前記阻害剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各阻害剤濃度とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程と、
を含む方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の複数種の阻害剤の阻害活性を測定する方法であって、
前記界面活性剤および前記阻害剤の存在下、前記酵素と前記基質とを反応させて、酵素反応により前記基質が減少し、前記生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程と、
前記工程により調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程と、
前記有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程と、
前記核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において前記界面活性剤および前記有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、前記複数の化学シフト値と各阻害剤種とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、阻害剤の種類と関連付けられた単一または複数の物理量を算出して阻害強度を比較評価する工程と、
を含む方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
ＮＭＲ測定を活用することにより、従来煩雑で放射線被曝の危険性を伴う作業であった当該酵素の反応速度および阻害剤強度の評価について、迅速かつ安全に行うことができるようになった。
特に、膜結合型タンパクである酵素であって、基質および生成物が脂溶性の酵素の活性測定を対象とした場合であっても、クロマトグラフィー等の分離操作を経ることなく、簡便かつ精度高く活性を評価することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＮＭＲによるoxidosqualene cyclaseの酵素活性の検出結果を示す。酵素反応を進行させた後、生成物であるlanosterolを重水素化chloroform(A)、重水素化methanol(B)、あるいは重水素化DMSO(C)を用いて可溶化し、ＮＭＲスペクトルを測定した。矢印はlanosterol由来のピーク(左はＨ28、右はＨ19に由来する)。(B),(C)で0.85-0.9 ppmのピークは界面活性剤に由来する。
【図２】図２は、ＮＭＲによるoxidosqualene cyclaseの酵素活性の定量結果を示す。Ａ：ヒト由来酵素、Ｂ：T.cruzi由来酵素。反応時間を変えた溶液に対して、ＮＭＲ測定を行い、lanosterol由来のピークを含む領域に対して因子分析計算を適用した。左が第１因子のスコアベクターで時間依存性を示す。右は第１因子のローディングベクターで、周波数依存性(スペクトル)を示す。
【図３】図３は、ＮＭＲによる阻害剤Ro48-8071のoxidosqualene cyclaseに対する阻害活性の定量評価を示す。Ａ：ヒト由来酵素、Ｂ：T.cruzi由来酵素。阻害剤濃度を変えた溶液に対して、ＮＭＲ測定を行い、lanosterol由来のピークを含む領域に対して因子分析計算を適用した。左が第１因子のスコアベクターで阻害剤濃度依存性を示す。右は第1因子のローディングベクターで、周波数依存性(スペクトル)を示す。
【図４】図４は、ＮＭＲによる阻害剤のoxidosqualene cyclaseに対する阻害活性の予備的評価法を示す。図４Ａは、ヒト由来酵素の測定結果を示し、図４Ｂは、T.cruzi由来酵素の測定結果を示す。同程度の濃度の異なる阻害剤の溶液に対して、ＮＭＲ測定を行い、lanosterol由来のピークを含む領域に対して因子分析計算を適用した。左が第１因子のスコアベクターで、阻害剤の種類に依存した変化である。値が小さい方が阻害の程度が強いことを示す。右は第１因子のローディングベクターで、周波数依存性(スペクトル)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、基質および／または生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の活性を測定する方法を提供する。
ここで、本発明の酵素の活性の測定方法の対象となる「膜結合タンパク質」とは、生体内で膜画分に存在し、可溶化するために界面活性剤等の両親媒性添加物を必要とするタンパク質である。
また、本発明の測定方法の対象となる酵素は、基質あるいは生成物が脂溶性のものを対象とすることができる。基質あるいは生成物が脂溶性であるとは、基質あるいは生成物が有機溶媒中に溶解可能なものであることを意味する。
このような膜結合タンパクである酵素は、具体的には、以下に限定されないが、例えば、オキシドスクアレン閉環酵素、スクアレンモノオキシゲナーゼ、ラノステロールC14脱メチル化酵素、ステロール 24-C-メチルトランスフェラーゼなどステロール合成系酵素を挙げることができる。
【００１１】
本発明の酵素の活性の測定方法は、「界面活性剤の存在下、酵素と基質とを反応させて、酵素反応により基質が減少し、生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程」を含む。
ここで、本発明に使用される界面活性剤は、膜結合タンパク質を細胞膜から分離して可溶化でき、酵素反応を阻害せず、かつ、界面活性剤の存在下であっても基質あるいは生成物のＮＭＲシグナルの検出が可能であるものであれば特に制限されず、対象となる膜結合タンパク質などの条件により適宜選択することができる。界面活性剤として具体的には、以下に限定されないが、例えば、Triton X-100、Nonidet P40、Tween 80、β-octylglycosideなどを挙げることができる。界面活性剤の量は、0.1〜5％(v/v)、好ましくは0.1〜0.2％(v/v)とすることができる。
酵素と基質とを反応させる溶媒としては、ｐＨを安定化する性質を持ち、上記膜結合タンパクを界面活性剤等により可溶化する際に、変性などの悪影響を持たないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳなどを用いることができる。酵素と基質との反応工程における温度や時間、ｐＨなどの反応条件は、測定対象とする酵素などにより適宜好ましい条件を設定することができる。
また、「反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する」とは、反応時間や酵素などの濃度が異なる条件で複数の反応溶液を調製することを意味する。好ましい一実施の形態においては、反応時間の異なる複数の反応溶液を用意する実施形態である。これにより、反応時間ごとの基質または生成物における化学シフト値のシグナル強度を測定することが可能となり、複数の化学シフト値のシグナル強度の経時的な変動情報から、酵素活性や阻害剤の活性を求めることが可能となる。
【００１２】
本発明の酵素の活性の測定方法は、上記「反応溶液を調製する工程」の後、「当該反応溶液を調製する工程において調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程」を含む。
「複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程」とは、例えば、界面活性剤を含む、酵素と基質との反応溶液中に有機溶媒を添加することにより実施することができる。なお、有機溶媒は、生成物を有機溶媒中に溶解するのに十分な量で添加すればよい。
ここで、有機溶媒とは、脂溶性である基質あるいは生成物を遊離した形で溶解し、これらのＮＭＲシグナルの検出を可能とするものであれば制限されず、公知の有機溶媒を用いることができる。特に、本発明に用いられる有機溶媒としては、ｉ）粘性や揮発性が高くなく、ｉｉ）磁性を有しておらず、かつ、ｉｉｉ）重水素化した有機溶媒(すなわち、1Ｈ-ＮＭＲピークが生じないもの)、あるいは、1Ｈ-ＮＭＲピーク数が２以下の単純な構造を有する有機溶媒であることが好ましい。
なお、一実施の形態においては、有機溶媒は重水素化した有機溶媒である。重水素化した有機溶媒とは、有機溶媒に含まれる水素原子が重水素に置換された有機溶媒をいう。本発明の酵素活性の測定方法に用いられる重水素化した有機溶媒は、酵素反応に伴って減少する脂溶性の基質あるいは酵素反応により生じた脂溶性の生成物を溶解することができ、かつ、基質あるいは生成物が溶解した状態で当該生成物の核磁気共鳴のスペクトルを測定可能な有機溶媒である。このような有機溶媒としては、以下に限定されないが、例えば、重水素化クロロフォルム、重水素化メタノール、重水素化ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、メタノールと重水との混合液(例えば、混合比10:1〜4:1)、アセトンを挙げることができる。なお、重水素化メタノール、重水素化ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、メタノールと重水の混合物、アセトンを使用した際には、生成物を含む有機溶媒と水層とを分離する工程を経ることなく、核磁気共鳴の測定に供することができる点において好ましい。一方で、例えば、重水素化クロロフォルムなどを使用する際には、生成物を重水素化した有機溶媒に移した後、生成物を含む有機溶媒と水層とに分離する工程を含んでもよい。なお、重水素化した有機溶媒であれば、1Ｈ-ＮＭＲピークが生じないため、上記に列挙する単純な構造の有機溶媒に限定されない。
本発明の酵素活性の測定方法における好ましい一実施の形態は、「核磁気共鳴による測定工程の前に、前記生成物を含む有機溶媒層と水層との分離工程を含まない」方法である。
【００１３】
本発明の酵素活性の測定方法は、「複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程」の後、「有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程」を含む。
本発明の酵素活性の測定方法によれば、上述する特定の有機溶媒に基質あるいは生成物を溶解させることにより、そのまま核磁気共鳴の測定を可能とする。
また、本発明の酵素活性の測定方法は、「核磁気共鳴の測定工程」の後、「核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において界面活性剤および有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、複数の化学シフト値と各反応時間とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程」を含む。
ここで、「磁気共鳴により得られたデータを分析する工程」における分析手法は、核磁気共鳴により得られたデータから基質または生成物の単一または複数の物理量を算出できる限りにおいて特に制限されないが、好ましくは、核磁気共鳴により得られた行列のデータを因子分析する手法である。
「行列変換によって得られる数値データを用いて、反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する」というとき、「数値データ」は、行列における一つまたは複数の成分を用いて行列を変換することにより算出されるデータをいう。
また、「反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量」における「物理量」とは、例えば、酵素の活性評価における反応速度などを意味する。また、「複数の物理量」とは、以下の形態に限定されないが、例えば、反応系の反応機序が２段階存在している際に、２つの反応速度が得られるような場合を意味する。
「基質または生成物由来の化学シフト値において界面活性剤および有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択する」とは、ＮＭＲにより測定された化学シフト値が、基質または生成物由来であると明確な化学シフト値を２つ以上選択することであり、選択する化学シフト値は多いほど好ましく、好適な実施形態としては１０点以上、より好適な実施形態として１００点以上選択する形態である。
このように、酵素と基質との反応時間を変えて複数の反応溶液を調製し、基質または生成物由来のＮＭＲシグナル強度変化の反応時間依存性を解析することにより、酵素活性をより正確に定量することが可能となる。
また、操作の省力化のため、反応を96-wellプレート中でバッチ処理として行い、ＮＭＲ測定を、試料交換機を用いて自動的に行うこともできる。さらにＮＭＲにより測定したスペクトルを公知の因子分析のアルゴリズムによって解析することができる。
【００１４】
また、本発明は、別の態様として、基質および生成物が脂溶性であり、かつ、膜結合タンパク質である酵素の阻害剤の阻害活性を測定する方法を含む。
本発明の酵素の阻害剤の阻害活性を測定する方法は、「界面活性剤および阻害剤の存在下、酵素と基質とを反応させて、酵素反応により基質が減少し、生成物が生じた反応溶液を調製する工程であって、反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程」を含む。
ここで、「反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する」とは、反応時間の条件や阻害剤などの濃度が異なる条件で複数の反応溶液を調製することを意味する。
また、阻害剤とは、対象の酵素と基質との反応を阻害するために用いられる物質であり、対象となる酵素および基質により適宜選択することができる。また、対象となる酵素に対する阻害剤の候補物質から選択して使用することもできる。例えば、オキシドスクアレン閉環酵素に対する阻害剤としては、例えば、阻害剤としてRo48-8071(Cayman Chemical Companyなど)を使用することができる。使用する界面活性剤、阻害剤、有機溶媒は、対象となる酵素により適宜選択することができ、酵素と基質との反応条件(温度、時間、ｐＨなど)も適宜設定することができる。
また、本発明の酵素の阻害剤の阻害活性を測定する方法は、「反応溶液を調製する工程」の後、「調製した複数の反応溶液を、それぞれ有機溶媒に移す工程」、「有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程」、および、「核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程であって、基質または生成物由来の化学シフト値において界面活性剤および有機溶媒由来の化学シフト値と重ならない値を複数選択し、複数の化学シフト値と各反応時間とにおけるシグナル強度を行列として扱い、行列変換によって得られる数値データを用いて、阻害剤濃度と反応時間と関連付けられた単一または複数の物理量を算出する工程」とを含む。
なお、「阻害剤濃度と関連付けられた単一または複数の物理量」における「物理量」とは、例えば、酵素阻害剤の活性評価におけるＩＣ50値などを意味する。
上記工程により、阻害剤の存在下で生じた生成物の量を測定することができる。また、酵素反応溶液に阻害剤を様々な濃度で加え、一定時間反応後のＮＭＲシグナルを測定することにより、阻害剤の濃度と生成物の測定値との相関関係から、阻害剤の効果について、ＩＣ50値を算出することにより、定量評価することが可能である。
【００１５】
なお、本発明は、別の態様として、酵素に対する複数種の阻害剤の阻害活性を測定する方法を提供する。当該態様は、上記酵素に対する阻害剤の阻害活性を測定する方法における「反応条件の異なる複数の反応溶液を調製する工程」を、異なる種類の阻害剤の存在下で酵素反応を行う条件とすることで、複数の反応溶液を調製するものである。得られた複数の反応溶液は、他の実施の態様と同様に、「それぞれ有機溶媒に移す工程」、「有機溶媒中の基質または生成物を核磁気共鳴により測定する工程」、「核磁気共鳴により得られたデータを分析する工程」を経ることができる。
当該方法によれば、阻害剤の種類と関連付けられた単一または複数の物理量を算出することができ、これにより、各阻害剤の阻害強度を比較評価することができる。
【実施例】
【００１６】
下記実施例では、本発明の方法を用いたオキシドスクアレン閉環酵素の活性測定および阻害剤を用いた阻害剤評価を行った。オキシドスクアレン閉環酵素としては、ヒト由来およびTrypanosoma cruzi由来のものを用いた。
【００１７】
(オキシドスクアレン閉環酵素(oxidosqualene cyclase：OSC)の調製)
ヒト由来OSC(732残基；NCBI code AAB36220)および寄生原虫Trypanosoma cruzi由来のOSC(902残基；NCBI code XP_820967.1)をコードするDNAをカスタム合成によって入手し、Pichia pastorisの発現ベクターpRICZ B(インビトロジェン)にmycエピトープおよびHis6タグとともに組み入れた。これらをP.pastoris GS115株を用いて発現させた後、界面活性剤(0.2％ Triton X-100あるいは0.2-1.2％ β-octylglucoside)を添加した緩衝液(TrisHCl, pH7.5-8.0)を用い、HisTrapHP、Resource Q、Superdex 200(いずれもGE healthcare)を用いたカラムクロマトグラフィーにより、精製した。
【００１８】
(実施例１：ＮＭＲによる酵素活性検出)
100μMの2,3-oxidosqualeneを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.2％Triton X-100に溶解し、50nM Trypanosoma cruzi OSCを加え、37℃で30分反応させた。この反応液200μLに対し、600μLの重水素化クロロフォルムを加え、1000g 10minの遠心を行って、水層を除去した。再び200μLの2H2Oを加えて、1000g 10minの遠心後に水層を除去した。残ったクロロフォルム液をＮＭＲ測定し、生成物であるlanosterolを検出した(図１Ａ)。
【００１９】
(実施例２：ＮＭＲによる酵素活性検出)
100μMの2,3-oxidosqualeneを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.2％ Triton X-100に溶解し、50nM Trypanosoma cruzi OSCを加え、37℃で30分反応させた。この反応液100μLに対し、400μLの重水素化メタノールを加え、そのままＮＭＲ測定し、生成物であるlanosterolを検出した(図１Ｂ)。
【００２０】
(実施例３：ＮＭＲによる酵素活性検出)
100μMの2,3-oxidosqualeneを10 mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.2 ％Triton X-100に溶解し、50nM Trypanosoma cruzi OSCを加え、37℃で30分反応させた。80℃で30秒加熱して反応を止めた後、この溶液100μLに対し、400μLの重水素化dimethyl sulfooxide(DMSO)を加え、ＮＭＲ測定し、生成物であるlanosterolを検出した(図１Ｃ)。
【００２１】
(Lanosterol検出における溶媒の比較)
実施例１に記載した重水素化chloroformを用いる場合、有機溶媒層と水槽が分離し、そのままではＮＭＲ測定を行うことが困難である。したがって、有機溶媒層の抽出という操作を繰り返し行う必要があり、その分操作が煩雑となる。しかし、得られるスペクトルは、非常に分離が良く、容易にlanosterol由来のピークを検出することができる。
実施例2に記載した重水素化methanolを用いる場合、水と任意の割合で混和するため、抽出の操作を行う必要がない。界面活性剤に由来する強度の大きいピークがあるが、lanosterol由来のピークを、これと分離して観察することが可能である。
実施例3に記載した重水素化DMSOを用いる場合、methanolと同様に水と混和するため、抽出の操作を行う必要がない。界面活性剤に由来する強度の大きいピークとlanosterol由来のピークが近くなるため、前者のピークが後者のピーク強度に影響を与えやすい状況が生じている。
【００２２】
(実施例４：ＮＭＲによる酵素活性の定量評価)
100μMの2,3-oxidosqualeneを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1％Triton X-100、100μM sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate (DSS)、5％ 重水素化DMSOに溶解し、19nMのヒトOSCを加え、37℃で10〜80分反応させ、10分毎に分取した。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのH19およびH28のピークを含むスペクトル領域に対し、参考文献(Kazuhiko Yamasaki et.al., J. Med. Chem. 2016, 59, 2261-2266のexperimental sectionの記載)に従って因子分析計算を適用した。基質あるいは生成物の増減に対応する因子のスコアベクトルにおけるＮＭＲ強度の時間依存性を指数関数にフィッティングすることにより、反応速度定数(k=0.017min-1)を得た(図２Ａ)。なお、基質あるいは生成物の増減に対応する因子は、そのローディングベクトルが基質あるいは生成物のスペクトルを再現していることを指標に選択できる(図２右)。因子分析計算は具体的には下記のようにして行った。
因子分析
ＮＭＲシグナル強度の反応時間依存性をデータ行列Ｄとする。ここで、行は同じ化学シフト値、列は同じ反応時間に相当する。強度は時間軸における平均値を差し引いたものとし、ノイズ値の二乗平均値の２倍以下の変化しかしないデータポイントは除外する。規格化のため、行列の要素はノイズ値の二乗平均平方根で割っておく。共分散行列Ｚは、
【化１】
2018121595.tif 000002
によって与えられる。ここで、ＤTはＤ転置行列を示す。これに対して固有値解析を行い、それぞれの固有値と固有ベクトルのセットに対応する各因子を得る。このうち意味を持つと考える(※通常固有値の大きいものが有意)固有ベクトルのみを選択し、行列Ｃの形でまとめる。ここで、行は同じ因子、列は同じ反応時間に相当する。
【化２】
2018121595.tif 000003
の計算により、行列Ｒを得る。ここでは、行は同じ化学シフト値、列は同じ因子である。ＣTは、Ｃの転置行列である。
【化３】
2018121595.tif 000004
の計算により、選択した因子のみからなる再構成データ行列Ｄ’を得る。
行列Ｃの行ベクトルは、各因子の時間依存性を示し、ここではスコアベクトルと呼ぶ。行列Ｒの列ベクトルは各因子のスペクトル特性を示し、ここではローディングベクトルと呼ぶ。基質→生成物の変換に相当するスコアベクトルを指数関数でフィッティングすることにより、酵素反応速度を決定した。
【００２３】
(実施例５：ＮＭＲによる酵素活性の定量評価)
100μMの2,3-oxidosqualeneを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1 ％Triton X-100、100μM DSS、5％ 重水素化DMSOに溶解し、19nMのT.cruzi OSCを加え、37℃で10−80分反応させ、10分毎に分取した。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのH19およびH28のピークを含むスペクトル領域に対し、上記参考文献に従って因子分析計算を適用した。スコアベクトルにおけるＮＭＲ強度の時間依存性を指数関数にフィッティングすることから、反応速度定数(k=0.083min-1)を得た(図2B)。
【００２４】
(実施例６：ＮＭＲによる阻害剤活性の定量評価)
100μMの2,3-oxidosqualeneおよび1nM〜100μMの阻害剤Ro 48-8071を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1 ％Triton X-100、100μM DSS、5％ 重水素化DMSOに溶解し、19nMのヒトOSCを加え、37℃で90分反応させた。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのＨ19およびＨ28のピークを含むスペクトル領域に対し、上記参考文献に従って因子分析計算を適用した。スコアベクトルにおけるＮＭＲ強度の阻害剤濃度依存性から、阻害強度(ＩＣ50=0.0075μM)を得た(図３Ａ)。阻害剤の評価は、具体的には下記のようにして行った。
【００２５】
阻害剤評価
阻害剤のＩＣ50値を見積もるにあたっては、ＮＭＲシグナル強度の阻害剤濃度依存性をデータマトリックスＤとし、上記の因子分析計算を行った(※「時間依存性」を「阻害剤濃度」に読み替える)。基質→生成物の変換(の阻害剤濃度依存性)に相当するスコアベクトルに対して、反応速度Ｖと阻害剤濃度[Ｉ]の関係について、ChengとPrusoffの論文(Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973)から演繹される式
【化４】
2018121595.tif 000005
および
【化５】
2018121595.tif 000006
を用いてフィッティングを行った。ここで、Ｖ0は阻害剤がない時の反応速度で、Vは阻害剤濃度依存的速度、Ｙはスコアベクトルの強度、ｔは反応時間(一定)、Ａ,Ｂは強度値に関する変数である。また、Ｖ0は変数ではなく、上記の方法で決定した値を定数として用いる。
【００２６】
(実施例７：ＮＭＲによる阻害剤活性の定量評価)
100μMの2,3-oxidosqualeneおよび10nM〜400nMの阻害剤Ro48-8071を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1％ Triton X-100、100μM DSS、5％ 重水素化DMSOに溶解し、19nMのT.cruzi OSCを加え、37 ℃で20分反応させた。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのＨ19およびＨ28のピークを含むスペクトル領域に対し、上記参考文献に従って因子分析計算を適用し、阻害剤評価を行った。
スコアベクトルにおけるＮＭＲ強度の阻害剤濃度依存性から、阻害強度(IC50=0.022μM)を得た(図３Ｂ)。
【００２７】
(実施例８：ＮＭＲによる阻害剤活性の同時評価)
100μMの2,3-oxidosqualene、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1 ％Triton X-100、100μM DSS、5％ 重水素化DMSOに対して、１)阻害剤なし、２)0.63μMのRo48-8071、３)0.63μMのBIBB 515 (Cayman Chemical Companyなど)、あるいは４)0.98μMのdronedarone(Chemscene LLC)を溶解し、60nMのヒトOSCを加え、25℃で30分反応させた。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのH28のピークを含むスペクトル領域に対し、上記参考文献に従って因子分析計算を適用した(※「時間依存性」を「阻害剤の種類」に読み替える)。(図4A)。
【００２８】
(実施例９：ＮＭＲによる阻害剤活性の同時評価)
100μMの2,3-oxidosqualene、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1 ％Triton X-100、100μM DSS、5％ 重水素化DMSOに対して、１)阻害剤なし、２)0.63μMのRo 48-8071、３)0.63μMのBIBB 515、あるいは４)0.98μMのdronedaroneを溶解し、40nMのT.cruzi OSCを加え、25℃で30分反応させた。これらの反応液100μLに対し、500μLのメタノール：重水混合液(混合比10:1)を加え、反応を止めると同時にlanosterolを可溶化し、ＮＭＲ測定を行った。測定に際しては、軽水(1H2O)由来のシグナルとメタノール由来の２つのシグナルに対して、溶媒消去を行った。生成物であるlanosterolのＨ28のピークを含むスペクトル領域に対し、上記参考文献に従って因子分析計算を適用した(※「時間依存性」を「阻害剤の種類」に読み替える)。(図４Ｂ)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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