(57)【要約】【課題】遺伝子改変ドナー動物、組織、および細胞を提供すること。【解決手段】本発明は、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（αＧＴ）、かつ膵島異種移植の適切なドナーにする１つ以上の追加の導入遺伝子を発現する一定の動物、特にブタ動物、ならびにこれらの動物に由来する組織および細胞を提供する。このような動物に由来する細胞を用いた糖尿病の処置および予防の方法も提供される。特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの抗凝固因子である。別の特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫調節物質である。特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫抑制剤である。さらなる特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この本特許出願は、米国特許法§１１９の下、２００９年８月１４日に出願された、表題「Ｍｕｌｔｉ−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｉｇｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」の米国仮特許出願第６１／２３４，１５０号（この完全な開示は、参考として本明細書に十分に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特に異種移植治療に有用な一定のドナー動物、組織、および細胞を提供する。詳細には、本発明は、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）の一切の発現を欠き、かつ膵島異種移植のドナーに適した動物にする１つ以上の追加の導入遺伝子を発現するブタ動物、ならびにこのブタ動物に由来する組織および細胞を含む。このような動物に由来する組織および細胞を用いた糖尿病の処置および予防方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
糖尿病
インスリンは、膵臓によって産生されるホルモンであり、糖を血流から体の細胞に輸送し、そこで糖が必須のエネルギー源となる。哺乳動物では、インスリンは、ランゲルハンス島（膵島）のβ細胞（ベータ細胞）内で膵臓で合成される。健常な成人ヒト膵臓には約１００万の膵島（膵臓の全質量の約１〜２％）が存在し、膵臓のいたるところに分布している。
【０００４】
糖尿病は、体が十分なインスリンを産生しない（１型糖尿病）か、または体が産生されたインスリンに応答できない（２型糖尿病）ことによる異常に高い血糖値（高血糖）によって特徴付けられる疾患状態である。制御されない高血糖は、失明、心疾患、腎臓病、および死さえも含む重篤な合併症をもたらし得る。
【０００５】
米国だけで、２０００万超の人が糖尿病である。２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、最も一般的な型であり、運動不足および肥満に関連している。２００７年に世界保健機構（ＷＨＯ）がまとめた統計によると、世界で１億８０００万を超える人が糖尿病であり、２９０万人が死亡し（全世界の死亡率の６％）、経済負担の総額は２３００億ドルを超える。
【０００６】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、Ｔ２Ｄよりもずっと稀である。Ｔ１Ｄは、患者自身の免疫系が、体のインスリンを産生する膵β細胞を破壊する自己免疫疾患である。典型的には、若年で診断され、生涯にわたる処置を必要とする慢性疾患である。処置は、一般にインスリン補充療法の形態であり、典型的には、注射またはポンプによって送達される。インスリン管理の成功は、所定の療法が、正常な生理学的インスリン放出パターンをどの程度まで模倣できるかによって決まる。いくつかの異なる形態のインスリンが利用可能であり、特定の形態／療法の選択は、患者の好みおよび特定の処置療法を忠実に守る能力を反映させることができる。インスリンの薬理学および送達の進歩にもかかわらず、インスリン補充療法を用いた厳格な血糖コントロールの達成は、非常に要求が厳しいであろう。結果として、多くのＴ１Ｄ患者はなお、高血糖および低血糖を発症し、結果として長期にわたる合併症に悩まされる。
【０００７】
インスリン補充療法の負担から、治療代替手段が強く望まれている。移植されたヒト膵臓（同種移植）は、Ｔ１Ｄ患者を治癒する可能性がある。供給源には、最近死亡したドナーまたは生きているドナー（部分膵臓移植）を含むヒトドナーが含まれる。レシピエントの天然膵臓は、一般に所定の位置に残され、提供された膵臓は、異なる位置に取り付けられる。課題には、どの外科手術にも付いて回るリスク、ならびにほとんどの移植臓器で一般的である拒絶反応の可能性が含まれる。同種移植膵臓の拒絶反応は、移植から数秒以内（急性）から数年後（慢性）までの任意の時期に起こり得る。拒絶反応を回避するために、免疫抑制薬を無期限に摂取しなければならない。このような薬剤は、許容することが困難であり得るため、患者の感染病のリスクが増加し、高血圧、腎障害、および肝障害にも関係する。移植のリスクおよび免疫抑制薬療法の長期の使用は、糖尿病患者に特有の問題であり（すなわち、他の臓器移植レシピエントと比較して）、薬物療法が一般に選択肢として残るが、望ましくない。２００３年の研究により、腎臓が機能している患者では、膵臓のみの移植を受けた患者の生存率は、従来の治療で糖尿病を管理している患者の生存率よりも悪いことが分かった（Ｖｅｎｓｔｒｏｍら、２００３；２９０：２８１７−２８２３）。結果として、膵臓移植は、通常は、末期の腎疾患の１型糖尿病個体にのみ行われる。
【０００８】
膵島細胞のみの移植は（全膵臓に対して）、低侵襲性の移植をベースとする代替手段である。ここで、膵島は、ドナー膵臓から単離され、カテーテルによって患者の門脈に注入される（すなわち、腹部の大きな切開を必要としない）。膵島は、肝臓に移動してそこに定着し、インスリンの産生を引き継ぎ、肝臓を実質的に代替膵臓に変える。しかしながら、初期の膵島移植は、成功率が非常に低く、患者がインスリンに依存しなくて良いのは短期間のみであった。エドモントンプロトコルとそれらの初期の膵島移植処置手順との間の大きな相違は、免疫抑制薬と２つ以上の膵臓由来膵島の移植の特定の組み合わせの使用であった。具体的には、エドモントンプロトコルは、ダクリズマブ、シロリムス、およびタクロリムスを含む免疫抑制薬の組み合わせを使用する。ダクリズマブは、移植直後に静脈内に投与され、すぐに中止される。次いで、患者は、シロリムスおよびタクロリムスが無期限に投与される。
【０００９】
全膵臓移植処置手順および膵島移植処置手順の両方が、ヒト膵臓ドナーの確実な供給に依存するが、現在は存在しない。現在は、１年にわずか３０００の死体膵臓が利用可能であり、２００万を超えるＴ１Ｄ患者の要望には遠く及ばない。
【００１０】
遺伝子治療は、別の治療代替手段である。免疫拒絶反応を防止し、かつ膵島移植片の増殖および生存を改善するためのヒト膵島への導入遺伝子の導入および発現は、多くの研究の焦点である（ＭｃＣａｂｅら編、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．２００６、Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２２（３）：２４１−５２；Ｃｈｕａｎｇら、２００８；Ｍａｒｔｉｎら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｄｅｖ．、２００７；１２：２４−３２；Ｆａｉｄｅａｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００５、Ｄｅｃ；５４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ８７−９６）。ヒト膵島のｅｘ−ｖｉｖｏ形質導入による導入遺伝子の送達が研究された（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｃａｎａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８：３４３−３５１；Ｌｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、３９：３４３６−３４３７）。しかしながら、これらの系における免疫調節遺伝子の発現は、アデノウイルスに感染した膵島移植片が約１ヶ月で拒絶されるため、長期間の糖尿病管理には不十分である（Ｓａｋａｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２００８、８０：３５２−３５９を参照）。加えて、ヒトにおける遺伝子治療に使用されるアデノウイルスベクターは、一定の遺伝子を送達する能力に限られており、免疫応答を引き起こし、死さえももたらす（Ｆｌｏｔｔｅ、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００７、２１３：３０１−３０５）。代替の非ウイルス遺伝子送達システムの効率は、低くて一過性である。したがって、ヒト膵臓細胞の遺伝子改変は、Ｔ１Ｄ患者の要望に効果的に対処できなかった。
【００１１】
異種移植
異種移植（異種のドナー由来の臓器、組織、および細胞の移植）は、ヒトドナー膵臓の不足に有効に対処することができる。異種移植は、（ｉ）予測可能な緊急ベースではない供給；（ｉｉ）制御された環境での作製；および（ｉｉｉ）移植前の特徴付けおよび研究に利用可能という点でも有利である。
【００１２】
ドナー種とレシピエント種との間の関係によって、異種移植は、適合または不適合と説明され得る。適合種は、系統的に近い近縁種（例えば、マウスからラット）である。不適合種は、近縁ではない（例えば、ブタからヒト）。ブタは、ヒトと多くの解剖学的特徴および生理学的特徴を共有するため、異種移植の分野におけるほとんどの研究の焦点である。ブタはまた、比較的妊娠期間が短く、無菌環境で繁殖可能であり得、食物源として一般に使用されていない動物（例えば、霊長類）に関する同じ倫理的な問題が発生しないであろう。
【００１３】
ブタから霊長類の異種移植の分野における科学知識および専門知識がこの１０年間で急速に増加し、命を救うブタ異種移植片の霊長類レシピエントの生存期間がかなり延びた（Ｃｏｚｚｉら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１６：２０３−２１４、２００９）。近年、膵島異種移植の分野で著しい進展が報告され（Ｈｅｒｉｎｇ  ＢＪら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１２：３０１−３０３、２００６；Ｃａｒｄｏｎａ  Ｋら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１２：３０４−３０６、２００６；Ｇｉａｎｅｌｌｏ  ＰおよびＤｕｆｒａｎｅ  Ｄ、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１４：４４１、２００７）、この進展により、固形臓器ではなくこの膵島が、将来の臨床異種移植試験の最初のタイプの移植であり得ることが提案されたのであろう。
【００１４】
遺伝子改変
異種移植は、様々な方法で有利であるが、同種移植よりも複雑な免疫学的状況も発生させる。したがって、遺伝子改変による免疫障壁の対処に相当な努力が払われている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００７、Ｊｕｌ；１４（４）：２８８−９７、ＣｏｗａｎおよびＤ’Ａｐｉｃｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ
Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００８  Ａｐｒ；１３（２）：１７８−８３）。
【００１５】
異種移植片拒絶反応は、３相：超急性拒絶反応、急性体液性異種移植片拒絶反応、およびＴ細胞媒介性細胞拒絶反応に分けることができる。超急性拒絶反応（ＨＡＲ）は、不可逆的な移植片の損傷をもたらし、移植灌流後、数分から数時間以内に消失する非常に速い現象である。超急性拒絶反応は、移植時にレシピエント中に存在する異種反応性天然抗体の存在によって引き起こされる。ヒトは、ブタ細胞に見られるα１，３−ガラクトース（Ｇａｌ）エピトープに対する天然抗体を有する。この抗体は、大量に産生され、ＨＡＲの原理メディエーター（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）であると現在は考えられている（Ｓａｎｄｒｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９３、Ｄｅｃ  １；９０（２３）：１１３９１−５、１９９３；ＳａｎｄｒｉｎおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ編、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．、１９９４、Ｏｃｔ；１４１：１６９−９０）。ブタを遺伝子改変する初期の努力は、α１，３−ガラクトース（Ｇａｌ）エピトープをブタ細胞から除去することに焦点が当てられていた。２００３年に、Ｐｈｅｌｐｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３、２９９：４１１−４１４）が、異種移植における大きなブレークスルーとなる、αＧＴの一切の機能的な発現を欠く（ＧＴＫＯ）最初の生きたブタの作製を報告した（また、Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．による特許文献１およびＩｍｍｅｒｇｅ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．による特許文献２も参照）。その後の研究により、ＧＴＫＯブタ由来の臓器移植片は、ＨＡＲが起きないことが示された（Ｋｕｗａｋｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００５  Ｊａｎ；１１（１）：２９−３１、Ｙａｍａｄａら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００５  Ｊａｎ；１１（１）：３２−４）。しかしながら、Ｇａｌ媒介性ＨＡＲは、現在は全臓器の異種移植における重要因子であることが知られている。
【００１６】
成体ブタ由来の膵β細胞の純粋集団が有意なレベルの免疫原性Ｇａｌエピトープを発現しないため、ＨＡＲが、成体膵島異種移植における重要な因子であるか否かは不明である。実際、ある研究では、ＧＴＫＯブタ膵島は、破壊されやすさが野生型膵島と変わらないことが見出された（Ｒｏｏｄら、（２００７）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８３：２０２−２１０）。しかしながら、成体膵島とは異なり、新生仔膵島および新生仔膵島はＧａｌを発現する。
【００１７】
異種移植組織における補体制御因子の発現は、ＨＡＲに対処する異なる戦略として提案された（Ｓｑｕｉｎｔｏ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６、Ｄｅｃ；７（６）：６４１−５）。Ｉｍｕｒａｎによる特許文献３は、異種移植組織を、レシピエントにおける補体活性化を低減するレシピエント補体制限因子と関連付けることを提案している（また、Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、Ｄｅｃ；３（４）：３０５−１２も参照）。ヒトＤＡＦ（ｈＤＡＦ）および／またはヒトＣＤ５９（ｈＣＤ５９）を発現するトランスジェニックブタが報告された（Ｂｙｒｎｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．、１９９６、Ａｐｒ；２８（２）：７５８）。ＣＤ４６が、高いユビキタス発現用に最適化されたミニ遺伝子を用いてブタ細胞で発現され、マウス移植モデルにおいてブタ細胞を保護するようである（Ｌｏｖｅｌａｎｄら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００４、１１：１７１：１８３；ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３、Ｎｏｖ；１０（６）：６１５−２１）。しかしながら、これらの因子の発現は、変化しやすく、一般に膵臓細胞では非常に低い（Ｂｅｎｎｅｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００１、７２：３１２−３１９を参照）。
【００１８】
たとえＨＡＲが回避されても、異種移植片は、遅延型の拒絶反応、遅延異種移植片拒絶反応（ＤＸＲ）とも呼ばれる急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）を起こす。ＡＨＸＲは、一般に、非Ｇａｌ抗体を含む異種反応性抗体によって開始され、後に移植片内皮、補体、および凝固系の活性化が起こると考えられている（Ｍｉｙａｇａｗａら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１０、１：１１−２５）。
【００１９】
体液性応答によってもたらされる脅威が、血管化移植片の生存および機能に関して極めて重要であるが、細胞機構による移植片損傷のリスクも重要である。Ｔ細胞媒介性急性応答は、異種移植片拒絶反応において重要な役割を果たすが、膵島細胞の移植におけるその役割は、完全には解明されていない。今日までに同定されたいくつかのＴ細胞共刺激経路のうち、最も顕著なものは、ＣＤ２８経路および関連する細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ４）経路である。
【００２０】
今日まで、免疫抑制剤としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇに対する多くの研究は、可溶性形態のＣＴＬＡ４−Ｉｇを患者に投与することに焦点を当てている（特許文献４；特許文献５；およびをＬｕｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３、２７７：１７１−１８３を参照）。患者に対する全免疫抑制負荷を低減するために、このようなタンパク質のトランスジェニック発現が提案された。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するトランスジェニックマウスが開発された（Ｒｏｎｃｈｅｓｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、（１９９４）、１７９：８０９；Ｌａｎｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、（１９９４）、Ｍａｒ  １；１７９（３）：８１９；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０００、６９（９）：１８０６−１２）。加えて、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．による特許文献６およびＲｅｖｉｖｉｃｏｒによる特許文献７に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子のみを発現するトランスジェニックブタが開示されている。また、Ｐｈｅｌｐｓら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１６（６）：４７７−４８５、２００９も参照されたい。脳組織でＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するブタを作製したが、高血漿発現が、負の効果をもたらすことが示された（Ｍａｒｔｉｎら、（２００５）、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｓｃｈ．、１４：３７３−８４）。有蹄動物における免疫抑制導入遺伝子の長期間の発現が、有蹄動物に対して、またはこのような動物に由来する任意の組織のレシピエントに対して安全性の問題を起こすか否かについては疑問が残る。
【００２１】
細胞免疫応答および体液性免疫応答に加えて、膵島移植に関連した大きな課題は、移植された膵島の注入およびレシピエント血液との接触の直後の膵島塊の著しい初期喪失、すなわち即時血液媒介性炎症応答（ＩＢＭＩＲ）として知られる現象である（Ｂｅｎｎｅｔら、Ｕｐｓ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００、１０５：１２５−１３３）。異種移植片に対する抗凝固反応を防止するために抗凝固導入遺伝子の付加が提案された（Ｃｏｗａｎ編、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００７：１４：７−１２）。しかしながら、これらの報告は、臓器移植に関連した凝固の低減に焦点を当てている。加えて、マウスなどの小動物にさえも見られる出血表現型により、異種移植に適した抗凝固因子を発現する動物の作製が困難であることが証明された（Ｄｗｙｅｒら、（２００４）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１３：１４４０−４６を参照）。さらに、抗凝固がＩＢＭＩＲの防止に有用であるか否かについても疑問がある。異種移植モデルでは、補体枯渇または抗凝固の使用は、ＩＢＭＩＲを防止するのに不十分であることが分かった（Ｒｏｏｄら、２００７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８３：２０２−２１０）。Ｃａｂｒｉｃら、（２００６）、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌ、１５：７５９−６７および（２００７）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５６：２００８−１５）は、遺伝子治療手法が、新たなＤＮＡを膵島に導入し、炎症または適応免疫応答さえも誘導するリスクを伴い、形質導入された膵島が、グルコース刺激インスリン放出障害を示したため、この手法が、膵島におけるＩＢＭＩＲの回避には適していないと示唆している。代わりに、彼らは、ヘパリンなどの薬剤での膵島細胞の前処置を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第０４／０２８２４３号
【特許文献２】国際公開第０４／０１６７４２号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０４９５８５２号明細書
【特許文献４】米国特許第７，３０４，０３３号明細書
【特許文献５】国際公開第９９／５７２６６号
【特許文献６】国際公開第０１／３０９６６号
【特許文献７】国際公開第０７／０３５２１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
膵島、特にブタドナー由来の膵島の異種移植は、同種移植の使用の魅力的な代替手段であるが、ヒト膵島の供給および質が限定されているため、大きな障害が残っている。即時免疫応答および遅延免疫応答の両方ならびに膵島破壊には、免疫抑制療法の潜在的に有毒な併用が必要である。一定の免疫応答に対処するための遺伝子改変された動物の作製が提案されているが、この作製は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの免疫抑制剤の発現に関連した毒性のために限定的な成功である。異種移植治療に適した改善された動物および組織の要望がなお存在する。特に、大きな影響を与える免疫抑制治療または長期間の免疫抑制治療を必要としない患者の糖尿病を緩和するインスリン産生異種移植片を作製するための改善された動物および組織の要望がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、異種移植治療に特に有用な遺伝子改変ドナー動物、組織、および細胞を提供する。より詳細には、遺伝子改変ドナー動物は、著しい体液性免疫応答（ＨＡＲおよびＡＨＸＲ／ＤＸＲ）および細胞免疫応答（ＡＣＸＲ）に打ち勝つ組織および細胞の供給源として役立ち、さらに即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）を制限するため、臨床に適した免疫抑制療法を用いた糖尿病、特にＩ型糖尿病の異種移植治療に特に有用であり、長期間の免疫抑制剤または抗凝固因子の治療の必要性を低減する。
【００２５】
本発明の生存可能な遺伝子改変ブタ動物は、全体的に低減された免疫反応（すなわち、機能的α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）の発現を欠くことによる）、ならびに抗凝固因子、免疫調節物質、および細胞保護剤（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む群から選択される、移植片拒絶反応に打ち勝つのに極めて重要な導入遺伝子の発現によって特徴付けられる。本発明の前には、動物に免疫不全および血友病を引き起こし得るこれらのタイプの導入遺伝子が、動物の生存可能性を大幅に低減し得ると予想されたため、適切な移植ドナーとなり得る単一動物で発現され得るか否かが不明であった。本発明者らは、特に、機能的α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の欠如（ＧＴＫＯ）による免疫反応の全体的な減少が、一定の導入遺伝子の組織特異的な発現と組み合わせられたときに、このようなドナー動物、組織、および細胞を得ることができることを見出した。
【００２６】
本発明の一実施形態では、機能的α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。
【００２７】
特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの抗凝固因子である。別の特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫調節物質である。特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫抑制剤である。さらなる特定の実施形態では、膵臓組織で特異的に発現される導入遺伝子は、少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子である。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、複数の導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、複数の導入遺伝子は、抗凝固因子、免疫調節物質、および細胞保護導入遺伝子を含む群から選択される。
【００２９】
特定の実施形態では、少なくとも２つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、少なくとも２つの導入遺伝子は両方とも、抗凝固因子である。
【００３０】
特定の実施形態では、少なくとも３つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、この少なくとも３つの導入遺伝子には、２つの抗凝固導入遺伝子および１つの免疫抑制導入遺伝子が含まれる。
【００３１】
さらなる特有の実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつＴＦＰＩ、ＣＤ３９、およびＣＴＬＡ４を膵臓組織で特異的に発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの第１の導入遺伝子および少なくとも１つの第２の導入遺伝子を発現するブタ動物、組織、および細胞であって、この第２の導入遺伝子が膵臓組織で特異的に発現される、ブタ動物、組織、および細胞が提供される。
【００３３】
一実施形態では、少なくとも１つの第１の導入遺伝子は、免疫調節物質である。特定の実施形態では、この少なくとも１つの第１の導入遺伝子は、補体インヒビターである。
【００３４】
別の実施形態では、この少なくとも１つの第１の導入遺伝子は、補体インヒビターであり、膵臓組織で特異的に発現されるこの少なくとも１つの第２の導入遺伝子は、（ｉ）抗凝固因子；（ｉｉ）免疫抑制剤；および（ｉｉｉ）細胞保護剤を含む群から選択される。
【００３５】
一実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの補体インヒビター、ならびに抗凝固因子、免疫抑制剤、および細胞保護剤からなる群より選択される少なくとも１つの追加の導入遺伝子を発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。
【００３６】
特有の実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの補体インヒビターおよび少なくとも１つの抗凝固因子を発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、補体インヒビターはＣＤ４６であり、少なくとも１つの抗凝固因子は、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ヒルジン、トロンボモジュリン、およびＥＰＣＲからなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、少なくとも１つの補体インヒビターはＣＤ４６であり、少なくとも１つの追加の導入遺伝子は、免疫抑制剤、例えば、ＣＴＬＡ４である。
【００３７】
特有の実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、さらに少なくとも１つの補体インヒビター、少なくとも１つの抗凝固因子、および少なくとも１つの免疫抑制剤を発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。任意選択で、ブタ動物、組織、および細胞はまた、少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子も発現する。
【００３８】
一実施形態では、導入遺伝子は、膵臓細胞で特異的に発現される。特定の実施形態では、導入遺伝子は、膵島細胞で特異的に発現される。特有の実施形態では、導入遺伝子は、β細胞で特異的に発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。特定の実施形態では、細胞はカプセル化されている。
【００３９】
本発明による抗凝固因子は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、およびＣＤ３９を含む群から選択され得る。特定の実施形態では、抗凝固因子はＴＦＰＩである。別の実施形態では、抗凝固因子はＣＤ３９である。
【００４０】
本発明による免疫調節物質は、補体インヒビターまたは免疫抑制剤であり得る。特有の実施形態では、免疫調節物質は補体インヒビターである。補体インヒビターは、ＣＤ４６（またはＭＣＰ）、ＣＤ５５、ＣＤ５９、またはＣＲ１であり得る。別の特有の実施形態では、免疫調節物質は免疫抑制剤である。免疫抑制薬は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇであり得る。他の免疫調節物質は、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）およびその突然変異体、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、または腫瘍壊死因子−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）として知られている）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲであり得る。
【００４１】
本発明による細胞保護導入遺伝子は、抗アポトーシス導入遺伝子、抗酸化導入遺伝子、または抗炎症導入遺伝子であり得る。一定の実施形態では、細胞保護導入遺伝子は、Ａ２０、ＨＯ−１、ＦＡＴ−１、および可溶性ＴＮＦ−α受容体（ｓＴＮＦＲ１）を含む群から選択される。
【００４２】
特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、およびＴＦＰＩの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。
【００４３】
別の特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、およびＣＤ３９の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４６は遍在的に発現される。
【００４４】
別の特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４６は遍在的に発現される。
【００４５】
さらなる特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、ＣＤ３９の膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４６は遍在的に発現される。
【００４６】
別の特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、細胞保護導入遺伝子の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、ＣＤ３９の膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４６は遍在的に発現される。
【００４７】
別の特有の実施形態では、本発明は、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、細胞保護導入遺伝子の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、およびＣＤ３９の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞を提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４６は遍在的に発現される。
【００４８】
一実施形態では、本発明の組織または細胞をそれを必要とする宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法が提供される。特定の実施形態では、宿主は糖尿病の宿主である。
【００４９】
一実施形態では、糖尿病の宿主は、糖尿病の霊長類である。特定の実施形態では、宿主は糖尿病のヒトである。特有の実施形態では、宿主は、１型糖尿病（Ｔ１Ｂ）に罹患しているヒトである。
【００５０】
一実施形態では、組織は、ブタ膵臓組織である。別の実施形態では、細胞は、膵臓由来細胞、全膵島、または単離された膵島細胞である。特定の実施形態では、細胞は膵島である。別の特定の実施形態では、膵臓細胞はβ細胞である。一実施形態では、膵臓細胞は成熟細胞である。別の実施形態では、膵臓細胞は、胎仔細胞または新生仔細胞である。
【００５１】
一実施形態では、本発明のブタ動物から単離された膵島細胞を投与するステップを含む、糖尿病を処置または予防する方法が提供される。
【００５２】
代替の実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与することによって糖尿病の宿主が必要とするインスリンの量を減少させる方法が提供される。特定の実施形態では、宿主は、処置後、低減された外因性インスリンを必要とする、または全く必要としない。一実施形態では、宿主は、処置後、約５％〜約２５％少ないインスリンを必要とする。別の実施形態では、宿主は、処置後、約２５％〜約５０％少ないインスリンを必要とする。なお別の実施形態では、宿主は、処置後、約５０％〜約７５％少ないインスリンを必要とする。なおさらなる実施形態では、宿主は、処置後、約７５％〜約１００％少ないインスリンを必要とする。
【００５３】
特定の実施形態では、処置後、宿主は、１日に４単位未満のインスリン、１日に３単位未満のインスリン、１日に２単位未満のインスリン、または１日に１単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、処置後、宿主は、外因性インスリンを必要としない。
【００５４】
他の実施形態では、本明細書に提供される組織または細胞は、再移植処置手順に使用することができ、このような処置手順は、例えば、一定の実施形態では、長期にわたって血糖をコントロールするために十分なレベルの膵島を維持する必要があり得る。
【００５５】
本発明の一実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病に罹患している宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処理または予防の方法であって、処置後は、宿主が低減された免疫抑制治療を必要とする、または全く必要としない、方法が提供される。
【００５６】
一実施形態では、免疫抑制薬（複数可）／免疫抑制剤（複数可）の用量が、他の方法に比べて減少する。特有の実施形態では、ダクリズマブ、タクロリムス、および／またはシロリムスの１つ以上の用量は、他の方法の移植で使用される用量と比べて減少する。
【００５７】
別の実施形態では、免疫抑制薬（複数可）／免疫抑制剤（複数可）の種類が、他の方法に比べて減少する。
【００５８】
一実施形態では、免疫抑制の期間は、他の方法に比べて短縮される。
【００５９】
別の実施形態では、他の方法に比べて低い免疫抑制が使用される、または免疫抑制が全く使用されない。
【００６０】
一実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病に罹患している宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、ＩＥＱ／ｋｇ（１ｋｇ当たりの膵島当量）の必要量が他の方法に比べて減少する、方法が提供される。別の実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは１００，０００未満である。さらなる実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは５０，０００未満である。一実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは２５，０００未満である。別の実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは１０，０００未満である。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明の膵臓細胞または膵島を糖尿病に罹患している宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、組織または細胞が門脈内注入によって投与される、方法が提供される。特定の実施形態では、膵島は、門脈内注入によって投与される。一実施形態では、膵島は、腹腔内空間、腎被膜下、腎被膜、大網、または膵床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｄ）注入によって投与される。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の膵臓細胞または膵島を糖尿病に罹患している宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、組織または細胞がカプセル化されている、方法が提供される。一実施形態では、この細胞はマイクロカプセル化されている。代替の実施形態では、この細胞は、マクロカプセル化されている。別の実施形態では、細胞はカプセル化されていない。特定の実施形態では、細胞は、精製アルギン酸塩および細胞を含む薄い平面シートの形態で提供される。特有の実施形態では、膵島は、マイクロカプセル化される、マクロカプセル化される、または精製アルギン酸塩および膵島を含む薄い平面シートとして提供される。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、移植後に、宿主が、一部またはすべての機能的移植細胞を有する、方法が提供される。一実施形態では、宿主は、他の方法を行った後に存在する機能的移植膵島の数よりも多い機能的移植膵島を有する。一実施形態では、膵島の機能性は、０．３ｎｇ／ｄｌを超える基礎または刺激ブタＣ−ペプチドとして定義される。一実施形態では、膵島の機能性は、必要な外因性インスリンの５０％を超える減少と組み合わせられた検出可能なブタＣ−ペプチドとして定義され、このＣ−ペプチドは、移植された材料から産生される。特定の実施形態では、移植された膵島の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％が機能性である。
【００６４】
他の実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、移植後に、宿主が正常血糖を維持できる、方法が提供される。一実施形態では、正常血糖は、少なくとも３ヶ月間維持される。別の実施形態では、正常血糖は、少なくとも６ヶ月間または少なくとも１２ヶ月間維持される。
【００６５】
他の実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、移植後に、宿主の空腹時血糖値および非空腹時血糖値（それぞれＦＢＧおよびＮＦＢＧ）が正常値に維持される、方法が提供される。一実施形態では、正常値は、少なくとも３ヶ月間維持されるはずである。別の実施形態では、正常値は、少なくとも６ヶ月間維持されるはずである。別の実施形態では、正常値は、少なくとも１２ヶ月間維持されるはずである。特定の実施形態では、ＦＢＧは、約７０〜約１００ｍｇ／ｄＬ（３．９〜５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）に維持され得る。別の実施形態では、ＦＢＧは、約７０〜約１３０ｍｇ／ＤＬに維持され得る。別の特定の実施形態では、ＮＦＢＧは、約２００ｍｇ／ｄＬ未満に維持され得る。
【００６６】
一実施形態では、処置後、宿主は、約８．０％未満の糖化ヘモグロビンレベルを有する。別の実施形態では、処置後、宿主は、約６．５％未満の糖化ヘモグロビンレベルを有する。
【００６７】
一実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、宿主が、移植後の経静脈的グルコース負荷試験に合格する、方法が提供される。一実施形態では、この試験は、移植から１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後、および／または１２ヵ月後に行うことができる。別の実施形態では、試験の結果は、ブタＣ−ペプチドの形態のブドウ糖に対する有意な応答が、非ヒト霊長類Ｃ−ペプチドの有意な応答の非存在下で実証された場合に成功である。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病に罹患している糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、宿主が、移植後のアルギニン刺激試験に合格する、方法が提供される。一実施形態では、この試験は、移植から１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後、および／または１２ヵ月後に行うことができる。別の実施形態では、試験の結果は、ブタＣ−ペプチドの形態のブドウ糖に対する有意な応答が、非ヒト霊長類Ｃ−ペプチドの有意な応答の非存在下で実証された場合に成功である。
【００６９】
一実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、移植後に、ドナーＣ−ペプチドレベルが検出可能である、方法が提供される。別の実施形態では、ブタＣ−ペプチドレベルが、約０．３〜約０．９６である。特有の一実施形態では、ブタＣ−ペプチドレベルが、約０．２１〜約０．６３（ｎｇ／ｍｌ）である。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、宿主の移植後の組織学的分析が行われる、方法が提供される。一実施形態では、剖検後の天然膵臓の組織学的分析が、インスリン陽性β細胞の減少、非限定的な一例では、インスリン陽性β細胞が存在しないことを示す。さらなる実施形態では、肝臓または膵島移植の他の部位の組織学的検査が、複数のインスリン陽性生細胞を示す。
【００７１】
さらなる実施形態では、本発明の組織または細胞を糖尿病の宿主に投与するステップを含む、糖尿病の処置または予防のための方法であって、移植後に、移植処置手順、免疫抑制療法、耐性誘導療法、または膵島のカプセル化の１つ以上に関連した重大な致死性の合併症が少ない、方法が提供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現するトランスジェニック動物。
（項目２）
前記少なくとも１つの導入遺伝子が抗凝固因子である、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目３）
前記抗凝固因子が、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）である、項目２に記載のトランスジェニック動物。
（項目４）
前記抗凝固因子がＣＤ３９である、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目５）
前記抗凝固因子が、ヒルジン、トロンボモジュリン、および内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）からなる群より選択される、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目６）
前記少なくとも１つの導入遺伝子が免疫調節物質である、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目７）
前記免疫調節物質が免疫抑制剤である、項目６に記載のトランスジェニック動物。
（項目８）
前記免疫抑制剤がＣＴＬＡ４である、項目７に記載のトランスジェニック動物。
（項目９）
前記少なくとも１つの導入遺伝子が細胞保護導入遺伝子である、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１０）
前記細胞保護導入遺伝子が、Ａ２０、ＨＯ−１、ＦＡＴ−１、および可溶性ＴＮＦ−α受容体からなる群より選択される、項目９に記載のトランスジェニック動物。
（項目１１）
項目１に記載の動物由来の組織。
（項目１２）
項目１に記載の動物由来の細胞。
（項目１３）
前記細胞が膵臓細胞である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記細胞が膵島である、項目１２に記載の細胞。
（項目１５）
前記膵臓細胞がβ細胞である、項目１３に記載の細胞。
（項目１６）
前記細胞がカプセル化されている、項目１２に記載の細胞。
（項目１７）
前記動物が、少なくとも２つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現する、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１８）
前記少なくとも２つの導入遺伝子が抗凝固因子である、項目１７に記載のトランスジェニック動物。
（項目１９）
前記抗凝固因子がＴＦＰＩおよびＣＤ３９である、項目１７に記載のトランスジェニック動物。
（項目２０）
前記動物が、少なくとも３つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現する、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目２１）
前記少なくとも３つの導入遺伝子が、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、およびＣＴＬＡ４である、項目２０に記載のトランスジェニック動物。
（項目２２）
糖尿病の処置または予防のための方法であって、該方法は、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの導入遺伝子を膵臓組織で特異的に発現する動物に由来するブタ膵臓組織またはブタ膵臓細胞をそれを必要とする宿主に投与するステップを含む、方法。
（項目２３）
前記宿主が霊長類である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記宿主がヒトである、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記動物が、少なくとも１つの抗凝固因子を特異的に発現する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記抗凝固因子が、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ヒルジン、トロンボモジュリン、およびＥＰＣＲからなる群より選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗凝固因子がＴＦＰＩである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記動物が、少なくとも１つの免疫調節物質を特異的に発現する、項目２２に記載の方法。
（項目２９）
前記免疫調節物質がＣＴＬＡ４である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記動物が、少なくとも１つの細胞保護剤を特異的に発現する、項目２２に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が膵臓細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記膵臓細胞が膵島である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記膵臓細胞がβ細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞がカプセル化されている、項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が、門脈内注入によって送達される、項目２２に記載の方法。
（項目３６）
処置後、前記宿主が、低減された外因性インスリンを必要とするか、または全く必要としない、項目２２に記載の方法。
（項目３７）
処置後、前記宿主が、低減されたインスリンを必要とする、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記宿主が、約５％〜約２５％少ないインスリンを必要とする、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記宿主が、約２５％〜約５０％少ないインスリンを必要とする、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記宿主が、約５０％〜約７５％少ないインスリンを必要とする、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記宿主が、約７５％〜約１００％少ないインスリンを必要とする、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
処置後、前記宿主が、少なくとも３ヶ月間、正常血糖を維持し得る、項目２２に記載の方法。
（項目４３）
処置後、前記宿主が、少なくとも約６ヶ月間、正常血糖を維持し得る、項目２２に記載の方法。
（項目４４）
処置後、前記宿主が、少なくとも約１２ヶ月間、正常血糖を維持し得る、項目２２に記載の方法。
（項目４５）
処置後、前記宿主が、最大３〜１２ヶ月間の期間にわたって約７０ｍｇ／ｄｌ〜約１３０ｍｇ／ｄｌの空腹時血糖値を維持し得る、項目２２に記載の方法。
（項目４６）
前記期間が３〜６ヶ月間である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
処置後、前記宿主が、約８．０％未満の糖化ヘモグロビンレベルを有する、項目２２に記載の方法。
（項目４８）
処置後、前記宿主が、約６．５％未満の糖化ヘモグロビンレベルを有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
処置後、前記宿主が、経静脈的グルコース負荷試験に合格する、項目２２に記載の方法。
（項目５０）
処置後、前記宿主が、アルギニン刺激試験に合格する、項目２２に記載の方法。
（項目５１）
処置後、ドナーＣ−ペプチドレベルが前記宿主で検出可能である、項目２２に記載の方法。
（項目５２）
前記ドナーＣ−ペプチドレベルが、約０．２ｎｇ／ｍｌ〜約１．０ｎｇ／ｍｌである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ドナーＣ−ペプチドレベルが、約０．２１ｎｇ／ｍｌ〜約０．６３ｎｇ／ｍｌである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
処置後、前記宿主が、処置前と比較して、または移植を含む処置の他の方法に使用される用量と比較して、低減された免疫抑制治療を必要とするか、または全く必要としない、項目２２に記載の方法。
【００７２】
本発明の他の実施形態も、本発明の説明、請求項、および当技術分野で周知のことから当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
特許または出願の包袋は、少なくとも１つのカラーの図面を含む。カラーの図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金を添えて請求すれば特許庁から提供される。
【図１】図１は、本発明に使用されるベクターの代表図である。「ｐＲＥＶ７８８」はベースベクターであり；ｐＲＥＶ７９０は、ＴＦＰＩ−ＣＤ４導入遺伝子を含むベースベクターであり；ｐＲＥＶ７９２は、ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子を含むベースベクターであり：ｐＲＥＶ８３５は、ＣＤ３９導入遺伝子を含むベースベクターである。
【図２】図２は、還元および変性条件下でのウエスタンブロット分析によって検出されたトランスジェニックブタ臓器溶解物におけるｐＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現の画像を示している。バンドは、融合タンパク質のＩｇ部分に特異的な抗体で検出された。３４７−３および３４２−１は、胎仔５４８／Ａ３の再クローンであり、３４０−２は、非トランスジェニック動物（陰性コントロールとして使用）である。
【図３】図３は、膵島での局所発現された、成体トランスジェニックマウス膵臓で観察された高レベルのｈＴＦＰＩを示すＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＦＰＩ抗体で染色された細胞の画像である。Ｈ＆Ｅ染色は、代表的な膵島形態を示している。
【図４】図４は、ＴＦＰＩおよびｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を示す、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＦＰＩ  ＡｂおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ１（ｐＣＴＬＡ４−ＩｇのヒトＩｇ部分に結合する）で染色された５４８／Ａ３由来の胎仔膵臓の画像である。
【図５】図５は、ＴＦＰＩ導入遺伝子およびｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子の両方の発現を示す、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＦＰＩ  ＡｂおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ１（ｐＣＴＬＡ４−ＩｇのヒトＩｇ部分に結合する）で染色された２．５ヶ月齢の仔ブタ３４７−３（５４８／Ａ３の再クローン）由来の膵臓の画像である。インスリンの染色は、導入遺伝子のパターンと同様のパターンを示す。野生型ブタおよびアイソタイプコントロールも示された。
【図６】図６は、ＣＤ３９の高発現を示す、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３９で染色された仔ブタ３２０−２由来の膵臓の画像である。インスリンの染色も示されている。
【図７】図７は、ＣＤ４６の高発現を示す、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４６で染色された仔ブタ３４２−３、５４８／Ａ３の再クローン由来の膵臓の画像である。
【図８】図８は、野生型膵島と比較した、ブタ３９０−１由来の膵島で放出されたリン酸レベルを例示している。
【図９】図９は、ブタ３９０−１におけるＣＤ４６、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＣＤ３９、およびインスリンの染色結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
膵島移植片に存在するドナー血管内皮細胞が、移植後のレシピエントの膵島組織の血管再生に関与する新生血管の形成に重要な役割を果たすという証拠が増えている（Ｌｉｎｎら、ＦＡＳＥＢ、（２００３）、１７：８８１−８８３；Ｂｒｉｓｓｏｖａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、（２００４）、５３：１３１８−１３２５；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｕら、Ａｍ  Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、（２００５）、５：２６３２−２６３９；Ｎｙｑｖｉｓｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、（２００５）、５４：２２８７−２２９３）。一部の新生血管は、ドナー内皮細胞で裏打ちされ、他の血管は、ドナー細胞とレシピエント細胞のキメラとして再構成され得る（Ｂｒｉｓｓｏｖａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、（２００４）、５３：１３１８−１３２５）。ドナー内皮生細胞が存在しないと、血管再生が遅延して不完全となり、多くの膵島の虚血性障害および死滅が起こる。したがって、本発明は、ＧＴＫＯ遺伝的背景と膵島移植での改善された結果を目的とする他の導入遺伝子とをもつブタを含む。他の導入遺伝子を膵臓で特異的に発現するＧＴＫＯブタ由来の膵島は、ドナー内皮細胞、したがって膵島の有意な保護を提供する。
【００７５】
「導入遺伝子」は、ある生物から別の生物に移された遺伝子または遺伝物質である。典型的には、この用語は、ある生物から単離されて別の生物に導入された遺伝子配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物でＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を維持し得る、またはトランスジェニック生物の遺伝子コードの正常な機能を変更し得る。一般に、ＤＮＡは、生物の生殖細胞系に組み込まれる。例えば、高等脊椎動物では、これは、受精卵の核に外来ＤＮＡを注入することによって達成することができる。細胞内に導入されると、導入遺伝子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のコピーであるｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）セグメントまたはゲノムＤＮＡの元の位置に存在する遺伝子自体のいずれかであり得る。導入遺伝子は、特にＢＡＣ（細菌人工染色体）またはコスミドに大きいクローンとして導入される場合、ゲノム配列であり得る。特段の記載がない限り、本明細書の文脈における導入遺伝子の「発現」は、非天然核酸由来ペプチド配列が、宿主の少なくとも１つの細胞で発現することを意味する。このペプチドは、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子から発現され得る。
【００７６】
「ドナー」は、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚、および昆虫を含む異種移植用のドナー組織または細胞の供給源として役立ち得る任意の非ヒト生物を含むものとする。ドナーは、限定されるものではないが、胎仔、新生仔、幼体、および成体を含む任意の発達段階であり得る。「動物」は、典型的には哺乳動物である。「哺乳動物」は、限定されるものではないが、ブタ、ヒツジ、ヤギ、畜牛（ウシ）、シカ、ラバ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含む任意の非ヒト哺乳動物を含むものとする。本発明の一実施形態では、遺伝子組換えブタおよびその作製方法が提供される。本発明の動物は、「遺伝子改変」または「トランスジェニック」であり、動物の少なとも１つの細胞、典型的には動物の少なくとも１つの生殖系列細胞における遺伝子型または表現型効果を媒介するように、付加または組み込まれた導入遺伝子または他の外来ＤＮＡ、あるいは標的化された、組み換えられた、中断された、欠失された、破壊された、置換された、抑制された、促進された、または他の方法で変更された内因性遺伝子を含む、改変された内因性遺伝子を有するものとする。一部の実施形態では、動物は、そのゲノムの一方の対立遺伝子に組み込まれた導入遺伝子を有し得る（ヘテロ接合トランスジェニック）。他の実施形態では、動物は、２つの対立遺伝子に導入遺伝子を有し得る（ホモ接合トランスジェニック）。
【００７７】
用語「有蹄動物」は、蹄のある哺乳動物を指す。偶蹄類は、偶数の脚の指を有する（蹄が割れた）有蹄動物であり、アンテロープ、ラクダ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ、およびヒツジが含まれる。奇蹄類は、奇数の脚の指を有する有蹄動物であり、ウマ、シマウマ、サイ、およびバクが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「有蹄動物」は、成体、胚、または胎仔の有蹄動物を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」、「ブタ動物」、「ブタ（ｐｉｇ）」、および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は、性別、サイズ、または品種を問わない同一の動物型を指す一般名である。
【００７９】
本発明の「細胞」は、動物に由来する。細胞は、成熟動物に由来し得るが、一部の実施形態では、細胞は、胎仔組織または新生仔組織に由来する。本発明の特定の実施形態では、細胞、特に膵島細胞は、トランスジェニックブタ動物、特に、成体膵島ドナーとして有用な十分なサイズに成長したトランスジェニックブタに由来する。一定の実施形態では、この動物は、離乳期を過ぎても生存する。特有の実施形態では、この動物は、少なくとも６ヶ月齢である。一定の実施形態では、この動物は、繁殖適齢期に達するまで生存する。一定の実施形態では、この動物は、少なくとも３００ポンド（約１３６．１ｋｇ）のブタ動物である。特有の実施形態では、この動物は、雌ブタであり、少なくとも１回出産している。
【００８０】
発現の「高」レベルは、表現型（検出可能な発現または治療効果）を提供するのに十分と見なされる。典型的には、発現の「高」レベルは、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）、Ｔ細胞媒介性細胞拒絶反応、および即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）を含む移植片拒絶反応を低減するのに十分である。抗凝固導入遺伝子および免疫抑制導入遺伝子が、これらのタイプの拒絶反応を低減できるレベルで膵島細胞で発現され得るか否かは以前は知られていなかった。
【００８１】
トランスジェニック動物
一実施形態では、少なくとも４つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。このような遺伝子改変には、限定されるものではないが、ノックアウトおよびノックイン、ならびに再構成を含む遺伝子の付加および／または欠失が含まれ得る。特定の実施形態では、少なくとも４つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供され、この遺伝子改変の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが導入遺伝子であり、この導入遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが遍在的に発現される。特定の実施形態では、少なくとも４つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供され、少なくとも１つの遺伝子改変がノックアウトである。
【００８２】
特定の実施形態では、少なくとも１つのノックアウト遺伝子を有し、少なくとも３つの導入遺伝子を発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、相同的組換えによってノックアウトされている。
【００８３】
一実施形態では、少なくとも５つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。このような遺伝子改変には、例えば、ノックアウトおよびノックイン、ならびに再構成を含む他の遺伝子の付加および／または欠失が含まれ得る。特定の実施形態では、少なくとも５つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供され、この遺伝子改変の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つが導入遺伝子であり、この導入遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つが遍在的に発現される。特定の実施形態では、少なくとも５つの遺伝子改変を有するブタ動物、組織、および細胞が提供され、少なくとも１つの遺伝子改変がノックアウトである。
【００８４】
特定の実施形態では、少なくとも１つのノックアウト遺伝子を有し、少なくとも４つの導入遺伝子を発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、相同的組換えによってノックアウトされている。
【００８５】
一実施形態では、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの導入遺伝子を膵臓組織で発現するブタ動物、組織、および細胞が提供される。他の実施形態では、膵臓組織で複数の導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特定の下位実施形態では、少なくとも１つの免疫調節物質を発現する動物、組織、および細胞が提供される。一定の実施形態では、２つ以上の免疫調節物質を発現する動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫調節物質および少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。一実施形態では、免疫調節物質は、免疫抑制剤である。代替の実施形態では、免疫調節物質は、補体インヒビターである。特定の実施形態では、免疫調節物質の発現は、膵臓特異的である。さらなる特定の実施形態では、免疫抑制剤の発現は、膵臓特異的である。なおさらなる特有の実施形態では、補体インヒビターの発現は、膵臓特異的である。他の下位実施形態では、この動物、組織、および細胞は、少なくとも１つの抗凝固因子を発現する。一定の実施形態では、この動物、組織、および細胞は、２つ以上の抗凝固因子を発現する。特定の実施形態では、抗凝固因子の発現は、膵臓特異的である。一実施形態では、この動物、組織、および細胞は、少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子を発現する。別の実施形態では、この動物、組織、および細胞は、２つ以上の細胞保護導入遺伝子を発現する。一実施形態では、導入遺伝子は、膵島で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。
【００８６】
一実施形態では、本発明は、機能的α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ少なくとも１つの補体インヒビター、ならびに抗凝固因子、免疫抑制剤、および細胞保護剤からなる群より選択される少なくとも１つの追加の導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の導入遺伝子の発現が、膵臓特異的である。
【００８７】
特有の実施形態では、少なくとも１つの補体インヒビター（例えば、ＣＤ４６）および少なくとも１つの抗凝固因子（例えば、ＴＦＰＩ）を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。
【００８８】
別の特有の実施形態では、少なくとも１つの補体インヒビター（例えば、ＣＤ４６）および少なくとも２つの抗凝固因子（例えば、ＴＦＩＰおよびＣＤ３９）を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。
【００８９】
別の特有の実施形態では、少なくとも１つの補体インヒビター（例えば、ＣＤ４６）および少なくとも１つの免疫抑制剤（例えば、ＣＴＬＡ４）を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。
【００９０】
なおさらなる特有の実施形態では、少なくとも１つの補体インヒビター（例えば、ＣＤ４６）および細胞保護導入遺伝子（例えば、Ａ２０）を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。
【００９１】
一定の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、および少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。さらなる特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、および少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、および少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞であって、この少なくとも１つの免疫抑制剤およびこの少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子の発現が膵臓特異的である、ＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。なお別の特有の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、および少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞であって、この少なくとも１つの免疫抑制剤およびこの少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子の発現が膵臓特異的である、ＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子は、膵島で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。
【００９２】
一実施形態では、少なくとも１つの免疫調節物質、少なくとも１つの抗凝固因子、および少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。さらなる実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子、および少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。さらなる特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子、および少なくとも１つの抗細胞保護導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子、および少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞であって、この少なくとも１つの免疫抑制剤およびこの少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子の発現が膵臓特異的である、ＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つの補体インヒビター、少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子、および少なくとも１つの細胞保護導入遺伝子を発現するＧＴＫＯ動物、組織、および細胞であって、この少なくとも１つの免疫抑制剤およびこの少なくとも２つの抗凝固導入遺伝子の発現が膵臓特異的である、ＧＴＫＯ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、抗アポトーシス導入遺伝子の発現が、膵臓特異的である。一実施形態では、導入遺伝子は、膵島で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。
【００９３】
一実施形態では、本明細書に記載されるトランスジェニックブタ動物は生存可能である。別の実施形態では、本明細書に記載される動物は繁殖可能である。さらなる実施形態では、本明細書に記載される動物は、その遺伝子改変の一部をその仔に安定的に伝えることができる。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載される動物は、その遺伝子改変のすべてをその仔に安定的に伝えることができる。一定の実施形態では、動物が自然に交配した場合、その遺伝子改変のすべてをその仔に安定的に伝えることができる。他の実施形態では、複数の導入遺伝子が、仔への同時分離を示す。特定の実施形態では、細胞は、生存可能な動物の膵臓に由来する。特定の実施形態では、細胞は膵島である。さらに特定の実施形態では、細胞は、膵β細胞である。一定の実施形態では、細胞は、インスリンを産生する。一部のさらなる実施形態では、細胞には、膵島細胞クラスターが含まれる。なおさらなる実施形態では、細胞は、膵島様細胞である。
【００９４】
特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、補体インヒビターの発現、抗凝固導入遺伝子の膵臓特異的発現、および免疫抑制導入遺伝子の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、補体インヒビターの発現、２つの抗凝固導入遺伝子の膵臓特異的発現、および免疫抑制導入遺伝子の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。一実施形態では、この導入遺伝子は、膵島細胞で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。
【００９５】
別の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、補体インヒビターの発現、細胞保護導入遺伝子の発現、抗凝固導入遺伝子の膵臓特異的発現、および免疫抑制導入遺伝子の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、補体インヒビターの発現、細胞保護導入遺伝子の発現、２つの抗凝固導入遺伝子の膵臓特異的発現、および免疫抑制導入遺伝子の膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。特有の実施形態では、細胞保護導入遺伝子の発現も、膵臓特異的である。一実施形態では、導入遺伝子は、膵島で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。
【００９６】
免疫調節物質は、補体インヒビターまたは免疫抑制剤であり得る。特有の実施形態では、免疫調節物質は補体インヒビターである。補体インヒビターは、ＣＤ４６（またはＭＣＰ）であり得る。他の実施形態では、補体インヒビターは、ＣＤ５５、ＣＤ５９、またはＣＲ１である。一定の実施形態では、導入遺伝子は、ユビキタスプロモーターから発現される。一定の他の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。
【００９７】
免疫調節物質はまた、免疫抑制剤でもあり得る。免疫抑制剤は、Ｔ細胞媒介性応答を下方制御することができる。具体的には、免疫抑制剤は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはその突然変異体であり得る。他の実施形態では、免疫抑制導入遺伝子は、ＣＤ２８活性を阻害するリガンド、例えば、Ｂ７受容体ペプチドまたはその突然変異体である。一定の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。
【００９８】
他の実施形態では、免疫調節物質は、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）およびその突然変異体、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、腫瘍壊死因子−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＲを含む群から選択され得る。一定の他の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。
【００９９】
一実施形態では、抗凝固因子は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、およびＣＤ３９を含む群から選択される。特定の実施形態では、抗凝固因子はＴＦＰＩである。別の特定の実施形態では、抗凝固因子はＣＤ３９である。一定の他の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。
【０１００】
細胞保護導入遺伝子は、抗アポトーシス導入遺伝子、抗酸化導入遺伝子、または抗炎症導入遺伝子であり得る。一定の実施形態では、細胞保護導入遺伝子は、Ａ２０、ＨＯ−１、ＦＡＴ−１、および可溶性ＴＮＦ−α受容体（ｓＴＮＦＲ１）を含む群から選択される。一定の他の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。この発現は、任意のレベルで良いが、特有の実施形態では、この発現は高レベルである。
【０１０１】
一定の実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤または抗凝固導入遺伝子は、高レベルのＣＤ４６を発現するＧＴＫＯブタ動物の膵臓組織で発現される。特定の実施形態では、ＣＤ４６を高レベルで発現し、かつ膵臓組織、特に膵島細胞でＴＦＰＩおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するＧＴＫＯ動物に由来するブタ動物、組織、および細胞が提供される。別個の実施形態では、ＣＤ４６を高レベルで発現し、かつ膵臓組織、特に膵島細胞でＣＤ３９およびＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するＧＴＫＯ動物に由来するブタ動物、組織、および細胞が提供される。
【０１０２】
一部の実施形態では、免疫調節物質は、ヒトタンパク質の配列を有する。他の実施形態では、免疫調節物質は、ブタタンパク質の配列を有する。一部の実施形態では、抗凝固因子は、ヒトタンパク質の配列を有する。他の実施形態では、抗凝固因子は、ブタタンパク質の配列を有する。一部の実施形態では、細胞保護導入遺伝子は、ブタタンパク質の配列を有する。別の実施形態では、細胞保護導入遺伝子は、ヒトタンパク質の配列を有する。特定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ヒトＣＤ４６導入遺伝子を発現する。特定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子を発現する。一定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ヒトＴＦＰＩを発現する。一定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ヒトＣＤ３９を発現する。特定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ブタＣＤ４６導入遺伝子を発現する。特定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ブタＣＴＬＡ４導入遺伝子を発現する。一定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ブタＴＦＰＩを発現する。一定の実施形態では、ブタ動物、組織、または細胞は、ブタＣＤ３９を発現する。
【０１０３】
特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。別の特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、ＣＤ３９の膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。一実施形態では、導入遺伝子は、膵島細胞で特異的に発現され、特定の実施形態では、β細胞での特異的な発現が提供される。特定の実施形態では、ＣＤ４６は、ヒトＣＤ４６であり得る。別の特定の実施形態では、ヒトＣＤ４６は、高レベルで発現され得る。
【０１０４】
別の特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、細胞保護導入遺伝子の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。別の特定の実施形態では、少なくとも次の遺伝子改変：ＧＴの発現の欠如、ＣＤ４６の発現、細胞保護導入遺伝子の発現、ＴＦＰＩの膵臓特異的発現、ＣＤ３９の膵臓特異的発現、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの膵臓特異的発現を有するブタ動物、組織、および細胞が提供される。
【０１０５】
一定の実施形態では、導入遺伝子は、主に膵臓細胞で活性なプロモーターから発現される。一定の実施形態では、このプロモーターは、膵臓または膵島特異的なプロモーター、例えば、脊椎動物由来インスリンプロモーターであり、限定されるものではないが、例えば、テラピア、ヒト、ブタ、ラット、またはマウスなどの魚または哺乳動物プロモーターが含まれる。特有の実施形態では、プロモーターは、ラット・インスリン・プロモーター（ＲＩＰ）である。一定の実施形態では、エンハンサー要素を含む追加の調節要素が、導入遺伝子発現系に組み込まれ得る。このエンハンサーは、例えば、ｐｄｘ−１エンハンサーもしくはニワトリ・アクチン・エンハンサーであり得、または導入遺伝子の発現を促進するインスレーター要素、例えば、ニワトリβグロブンインスレーターであり得る（Ｃｈｕｎｇ  ＪＨ、Ｂｅｌｌ  ＡＣ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ．、１９９７、Ｊａｎ  ２１；９４（２）：５７５−８０）。
【０１０６】
一定の実施形態では、発現は、膵臓組織のみであり、他のブタ組織ではない。加えて、発現は、胎仔組織、新生仔組織、および成熟組織で起こり得、それぞれの組織が、ドナー膵島の供給源であり得る。本発明の特定の実施形態では、細胞、特に膵島細胞は、トランスジェニックブタ動物、特に、成体膵島ドナーとして有用な十分なサイズに成長したトランスジェニックブタに由来する。一定の実施形態では、動物は、離乳時期を過ぎても生存する。特有の実施形態では、この動物は、少なくとも６ヶ月齢である。一定の実施形態では、この動物は、繁殖適齢期に達するまで生存する。一定の実施形態では、この動物は、少なくとも３００ポンド（約１３６．１ｋｇ）のブタ動物である。特定の実施形態では、カプセル化膵島を移植することができる。
【０１０７】
一実施形態では、ブタ膵臓組織、膵臓由来細胞、全膵島、または単離された膵島細胞を糖尿病に罹患している宿主（糖尿病の宿主または糖尿病患者）に投与するステップを含む糖尿病の処置または予防のための方法であって、細胞が、少なくとも１つの免疫抑制剤および少なくとも１つの抗凝固導入遺伝子を発現する、方法が提供される。別の実施形態では、本明細書に提供されるブタ動物から単離された膵島細胞を使用して糖尿病を処置する、または逆転させる。
【０１０８】
一実施形態では、本明細書に提供される膵島細胞を使用して、糖尿病の宿主に必要なインスリンの量を低減することができる。移植後、患者は、移植前に必要なインスリンよりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％少ないインスリンを必要とし得る。移植後、宿主は、移植前に必要なインスリンよりも約５％〜約２５％少ないインスリンを必要とし得る。移植後、宿主は、移植前に必要なインスリンよりも約２５％〜約５０％少ないインスリンを必要とし得る。移植後、宿主は、移植前に必要なインスリンよりも約５０％〜約７５％少ないインスリンを必要とし得る。移植後、宿主は、移植前に必要なインスリンよりも約７５％〜約１００％少ないインスリンを必要とし得る。
【０１０９】
特定の実施形態では、移植後、宿主は、１日に１キログラム（ｋｇ）当たり０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、または０．０１未満の外因性インスリン単位を必要とし得る。一実施形態では、移植後の宿主は、１日に１キログラム（ｋｇ）当たり約０．０１〜約０．１未満の任意の値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後の患者は、１日に１キログラム（ｋｇ）当たり約０．１〜約０．２５未満の任意の値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後の患者は、１日に１キログラム（ｋｇ）当たり約０．２５〜約０．５未満の任意の値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後の患者は、１日に１キログラム（ｋｇ）当たり約０．５〜約０．６未満の任意の値の外因性インスリン単位を必要とする。
【０１１０】
特定の一実施形態では、移植後に、患者は、１日に４単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後に、患者は、１日に２単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後に、患者は、１日に２単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後に、患者は、１日に１単位未満のインスリンを必要とする。別の実施形態では、移植後に、患者は、１日に１単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後に、患者は、外因性インスリンを必要としない。
【０１１１】
他の実施形態では、本明細書に提供される膵島を、再移植処置手順に使用することができ、このような処置手順は、例えば、特定の実施形態では、長期間にわたって血糖をコントロールするために膵島を十分なレベルに維持する必要があり得る。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態では、本発明の組織または細胞をそれを必要とする霊長類に投与するステップを含む、霊長類で糖尿病を処置または防止する方法が提供される。一実施形態では、霊長類は、非ヒト霊長類であり、非限定的な一例ではサルである。別の実施形態では、霊長類はヒトである。一実施形態では、膵臓細胞は、成熟細胞である。別の実施形態では、膵臓細胞は、胎仔細胞または新生仔細胞である。
【０１１３】
追加の実施形態では、動物は、免疫調節物質を発現させる遺伝子改変も含み得る。免疫調節物質は、補体経路阻害遺伝子であり、特定の実施形態では、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲ１、およびＣＤ４６（ＭＣＰ）から選択される。補体インヒビターは、ヒトＣＤ４６（ｈＣＤ４６）であり得、発現は、ミニ遺伝子コンストラクトを介したものである（Ｌｏｖｅｌａｎｄら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１１（２）：１７１−１８３、２００４を参照）。免疫調節物質はまた、ＣＴＬＡ４−ＩｇなどのＴ細胞調節効果を有する免疫抑制薬遺伝子、またはクラスＩＩ  ＭＨＣ（ＣＩＩＴＡ）のドミナントネガティブ阻害因子、またはＢ細胞の発現もしくはＴ細胞媒介性免疫機能を調節するほかの遺伝子でもあり得る。さらなる実施形態では、このような動物は、免疫機能に影響を与える遺伝子の発現を排除するためにさらに改変することができる。
【０１１４】
追加の実施形態では、動物は、抗凝固因子を発現させる遺伝子改変も含み得る。抗凝固因子には、限定されるものではないが、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９が含まれ得る。加えて、動物は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００５−０２２３４１８号を参照）、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００５−０１５５０９５号を参照）、および／またはＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００６−００６８４７９号を参照）の発現を阻害するために遺伝子改変することができる。加えて、動物は、凝固促進剤の発現を減少させるために遺伝子改変することができる。特に、一実施形態では、動物は、ＦＧＬ２（フィブリノーゲン様タンパク質２）などの凝固促進遺伝子の発現を減少させる、または排除するために遺伝子改変される（例えば、Ｍａｒｓｄｅｎら、（２００３）、Ｊ  ｄｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１１２：５８−６６；Ｇｈａｎｅｋａｒら、（２００４）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７２：５６９３−７０１；Ｍｅｎｄｉｃｉｎｏら、（２００５）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１２：２４８−５６；Ｍｕら、（２００７）、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３１（１）：５３−６２を参照）。
【０１１５】
導入遺伝子が発現される実施形態では、この発現は、ユビキタスプロモーターまたは組織特異的プロモーターを介したものであり得、追加の調節要素、例えば、エンハンサー、インスレーター、およびマトリックス付着領域（ＭＡＲ）などを含み得る。
【０１１６】
これらの追加の遺伝子改変を達成するために、一実施形態では、遺伝子改変されたブタから単離された細胞を、複数の遺伝子改変を含めるためにさらに改変することができる。一部の実施形態では、これらの細胞は、核導入によって複数の遺伝子改変を有するブタを作製するためにドナーとして使用することができる。他の実施形態では、遺伝子改変動物は、複数の遺伝子改変を達成するために交配させることができる。
【０１１７】
急性体液性拒絶反応を標的にする導入遺伝子
異種移植は、現在、深刻かつ十分に証明された拒絶反応の問題によって妨げられている。このプロセスは、異なる段階に分けることができ、第１の段階は、移植の数分以内に起こり、「超急性拒絶反応」（ＨＡＲ）と呼ばれる。ＨＡＲは、外来組織に結合する高力価の予め形成された天然抗体の遍在的な存在によって定義される。これらの天然抗体のドナー組織内皮上の標的エピトープへの結合は、ＨＡＲにおける開始現象であると考えられている。レシピエントの血液でのドナー組織の灌流の数分以内に起こるこの結合の後、補体の活性化、血小板およびフィブリンの沈着が起こり、最終的にドナー臓器に間質浮腫および出血が起こり、これらのすべてが、レシピエントの組織の拒絶反応を引き起こす（Ｓｔｒａｈａｎら、（１９９６）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １、ｅ３４−４１）。ヒトでのＨＡＲの主な経路は、ヒトおよびサルの抗体の約１％を占める天然の抗Ｇａｌ抗体である。
【０１１８】
次いで、この初期の超急性拒絶反応は、遅延血管応答（急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）、急性血管拒絶反応（ＡＶＲ）、または遅延異種移植片拒絶反応（ＤＸＲ）としても知られる）によって増強される。超急性応答中の内皮細胞の溶解および死は、浮腫および外膜細胞の露出によって達成され、外膜細胞は、その表面に組織因子（ＴＦ）を構成的に発現する。組織因子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ凝固カスケードの開始に極めて重要であと考えられ、その血漿への曝露が、凝固反応を引き起こす。トロンビンおよびＴＮＦ−αは、損傷組織の周りに局在するようになり、これにより、内皮細胞によるＴＦのさらなる合成および発現が誘導される。
【０１１９】
休止内皮細胞の周りの環境は、凝固を助けない。いくつかの天然凝固インヒビター、例えば、組織因子経路インヒビター、抗トロンビンＩＩＩ、およびトロンボモジュリンが、内皮細胞の細胞外プロテオグリカンに結合している。しかしながら、異種反応性天然抗体（ＸＮＡ）による外来組織の認識により、これらの分子が消失する。
【０１２０】
したがって、組織因子の曝露および誘導とともに、内皮細胞の周りの抗凝固環境が凝固促進となる。したがって、異種移植片の血管領域が、損傷組織に特徴的な凝血部位となる。血流が阻害され、移植臓器が虚血となる。遅延血管拒絶反応の十分な根拠が、Ｂａｃｈら、（１９９６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１９９６、Ａｕｇ；１７（８）：３７９−８４に見受けられる。
【０１２１】
本発明は、次の１つ以上：ＨＡＲ、ＡＨＸＲ／ＤＸＲ、および／またはＡＣＸＲのレベルを低〜０にするために異種移植に使用することができる動物、組織、または細胞を提供する。一実施形態では、この動物、組織、または細胞は、ＨＡＲおよびＡＨＸＲのレベルを低〜０にするために異種移植に使用することができる。別の実施形態では、この動物、組織、または細胞は、ＨＡＲ、ＡＨＸＲ、およびＡＣＸＲのレベルを低〜０にするために異種移植に使用することができる。以降のセクションで詳細に説明するように、本発明の実施形態は、ドナー組織における補体制御因子の発現、免疫抑制薬の発現、抗凝固因子の発現、および／または機能的αＧＴの発現の部分的または完全な枯渇の様々な組み合わせを含む。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書に提供されるブタ動物から単離された膵島細胞は、１つ以上の導入遺伝子を発現することが示されている。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるブタ動物由来の膵島細胞は、前記ブタ細胞に対するヒトリンパ球（ＭＬＲアッセイ）による免疫応答を低下させることができる。別の実施形態では、導入遺伝子を発現する膵島細胞は、異種移植片環境で起こる凝固および血栓を阻害することが示されている。
【０１２３】
α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）
上述したように、ヒトにおけるＨＡＲの主な経路は、ヒトおよびサルのＩｇＧ抗体の約１％を占める天然抗ガラクトースα１，３−ガラクトース（Ｇａｌ）抗体である。旧世界ザル、類人猿、およびヒトを除いて、ほとんどの哺乳動物は、Ｇａｌエピトープを含む糖タンパク質をそれらの細胞表面に有する（Ｇａｌｉｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５−１７７６２、１９８８）。ヒト、類人猿、および旧世界ザルは、Ｇａｌを発現しないが、Ｇａｌエピトープを有する動物由来組織のヒトへの異種移植時に即時超急性反応を引き起こす自然発生の抗Ｇａｌ抗体を大量に産生する（Ｓａｎｄｒｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９３、Ｄｅｃ  １；９０（２３）：１１３９１−５、１９９３；ＳａｎｄｒｉｎおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ編、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９４、Ｏｃｔ；１４１：１６９−９０）。
【０１２４】
異種移植によって引き起こされる抗Ｇａｌ体液性応答を排除または調節するために様々な戦略が実施された。この戦略には、α−ガラクトシダーゼを用いたエピトープの酵素的除去（Ｓｔｏｎｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：６４０−６４５、１９９７）、特定の抗ｇａｌ抗体の除去（Ｙｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３３０−３３７、１９９４）、αＧＴ発現を排除できなかった、他の糖部分を用いたエピトープのキャッピング（Ｔａｎｅｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３２１：１６４２１−１６４２５、１９９８、およびＫｏｉｋｅら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：１４７−１５３、１９９７）、および補体阻害タンパク質の導入（Ｄａｌｍａｓｓｏら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８６：３１−３５、１９９１、Ｄａｌｍａｓｓｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５２：５３０−５３３、（１９９１））が含まれる。Ｃ．Ｃｏｓｔａら（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １３、１７６２、（１９９９））が、トランスジェニックブタにおけるαＧＴの競合的阻害は、エピトープの数が一部減るだけであることを報告した。同様に、Ｓ．Ｍｉｙａｇａｗａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
２７６、３９３１０、（２０００））が、トランスジェニックブタにおけるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩのｇａｌエピトープの発現を阻害する試みも同様に、ｇａｌエピトープの数が一部減るだけであり、霊長類レシピエントにおける移植片の生存を有意に延長することができなかったことを報告した。
【０１２５】
ブタ細胞および生きた動物におけるαＧＴ遺伝子座の一方の対立遺伝子のノックアウトが報告されている。Ｄｅｎｎｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：５５９−５６２、２００１）が、ヒツジにおけるαＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子の標的遺伝子の欠失を報告した。Ｈｒｒｉｓｏｎら（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１４３−１５０、２００２）が、ヘテロ接合性αＧＴノックアウト体細胞ブタ胎仔線維芽細胞の産生を報告した。２００２年に、Ｌａｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１０８９−１０９２、２００２）およびＤａｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２５１−２５５、２００２）が、αＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子の不活化に成功したブタの作製を報告した。Ｒａｍｓｏｏｎｄａｒら（Ｂｉｏｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃ  ６９、４３７−４４５（２００３）が、ＨＴエピトープおよびαＧＴエピトープの両方を発現した、ヒトα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ（ＨＴ）も発現するヘテロ接合性αＧＴノックアウトブタの作製を報告した。ミズーリ大学のＣｕｒａｔｏｒｓによる国際公開第ＷＯ０３／０５５３０２号は、機能的αＧＴの発現が野生型と比較して減少した、異種移植に使用されるヘテロ接合性αＧＴノックアウトミニブタの作製を裏付けている。
【０１２６】
Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる国際公開第ＷＯ９４／２１７９９号および米国特許第５，８２１，１１７号；Ｂｒｅｓａｔｅｃによる国際公開第ＷＯ９５／２０６６１号；ならびにＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，Ｉｎｃ．およびＴｈｅ
Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる国際公開第ＷＯ９５／２８４１２号、米国特許第６，１５３，４２８号、同第６，４１３，７６９号、および米国特許出願公開第２００３／００１４７７０号に、αＧＴ遺伝子のｃＤＮＡに基づいたαＧＴネガティブブタ細胞の作製についての考察が記載されている。
【０１２７】
近年、異種移植の分野での大きなブレークスルーは、αＧＴの機能的な発現の一切を欠いた最初の生きたブタの作製であった（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：４１１−４１４、（２００３）；また、Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．による国際公開第０４／０２８２４３号およびＩｍｍｅｒｇｅ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．による国際公開第ＷＯ０４／０１６７４２号を参照）。
【０１２８】
一実施形態では、機能的αＧＴの一切の発現を欠き（ＧＴＫＯ）、かつ膵臓組織で少なくとも１つの追加の導入遺伝子を発現する動物、組織、および細胞が提供される。追加の導入遺伝子は、典型的には、（１）補体インヒビター（すなわち、ＣＤ４６（ＭＣＰ）、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＣＲ１など）または免疫抑制薬（すなわち、ＣＴＬＡ−４およびＢ７など）を含む免疫調節物質、または（２）抗凝固因子（すなわち、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９など）から選択される。他の実施形態では、機能的αＧＴの一切の発現を欠き、かつ少なくとも１つの免疫調節物質および少なくとも１つの抗凝固因子の両方を膵臓組織で発現する動物、組織、および細胞が提供される。一部の実施形態では、この膵臓組織は、ブタの膵臓組織である。さらなる実施形態では、この膵臓組織には、膵島細胞、膵島、または膵島細胞クラスターが含まれる。特定の実施形態では、細胞は膵島である。さらに特定の実施形態では、この細胞は膵β細胞である。一定の実施形態では、この細胞は、インスリンを産生する。なおさらなる実施形態では、この細胞は膵島様細胞である。膵島細胞クラスターは、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、またはε細胞のいずれか１つ以上を含み得る。一般に、グルカゴンを産生するα細胞は、天然膵臓の全膵島細胞の約１５〜２０％を占め、インスリンおよびアミリンを産生するβ細胞は、天然膵臓の膵島細胞の約６５〜８０％を占め、ソマトスタチンを産生するδ細胞は、天然膵臓の全膵島細胞の約３〜１０％を占め、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞は、天然膵臓の全膵島細胞の約３〜５％を占め、グレリンを産生するε細胞は、天然膵臓の全膵島細胞の＜１％を占める（Ｅｌａｙａｔら、（１９９５）、Ｊ．Ａｎａｔ、１８６：６２９−３７を参照）。
【０１２９】
膵臓組織で次の少なくとも１つ：（１）補体インヒビター（すなわち、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＣＲ１など）または免疫抑制剤（すなわち、ＣＴＬＡ−４およびＢ７など）を含む免疫調節物質、または（２）抗凝固因子（すなわち、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９など）を同時に発現する、機能的αＧＴの発現レベルが低減された動物、組織、および細胞も、本発明に含まれる。一部の実施形態では、機能的αＧＴの発現レベルが低減され、かつ膵臓組織で少なくとも１つの免疫調節物質および少なくとも１つの抗凝固因子の両方を発現する動物、組織、および細胞が提供される。一部の実施形態では、この膵臓組織は、ブタの膵臓組織である。さらなる実施形態では、膵臓組織には、膵島細胞が含まれる。機能的αＧＴの発現は、例えば、少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％低減され得る。
【０１３０】
機能的αＧＴの完全または低減されたレベルの発現は、当業者に周知の任意の手段によって達成することができる。本発明の一態様では、αＧＴ遺伝子の対立遺伝子の一方が遺伝子ターゲティング事象によって不活化されたブタ動物が提供される。本発明の別の態様では、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝子ターゲティング事象によって不活化されたブタ動物が提供される。一実施形態では、この遺伝子は、相同組換えによって標的にすることができる。他の実施形態では、この遺伝子は、破壊され得る、すなわち、遺伝コードの一部が変更され得、遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳が影響を受ける。例えば、遺伝子の破壊は、置換、欠失（「ノックアウト」）、または挿入（「ノックイン」）技術によって起こすことができる。存在する配列の転写を調節する望ましいタンパク質または調節配列のための追加の遺伝子を挿入することができる。
【０１３１】
本発明の実施形態では、αＧＴ遺伝子の対立遺伝子は、得られるαＧＴ酵素が細胞表面にＧａｌを産生できなくなるように不活化される。一実施形態では、αＧＴ遺伝子は、ＲＮＡに転写され得るが、タンパク質に翻訳されない。別の実施形態では、αＧＴ遺伝子は、切断型に転写され得る。このような切断ＲＮＡは、翻訳されないか、または非機能性タンパク質に翻訳され得る。代替の実施形態では、αＧＴ遺伝子は、この遺伝子の転写が一切起こらないように不活化することができる。さらなる実施形態では、αＧＴ遺伝子は、転写され、次いで非機能性タンパク質に翻訳され得る。一部の実施形態では、活性なαＧＴの発現は、代替の方法、例えば、この遺伝子の転写または翻訳を標的とする方法によって低減することができる。例えば、この発現は、天然αＧＴ遺伝子またはそのｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによって低減することができる。他の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼを使用して、組換えのゲノム領域を標的にする。このような系の例として、ＣＲＥ−ｌｏｘ系およびＦｌｐ−Ｆｒｔ系が挙げられる。
【０１３２】
αＧＴ遺伝子の２つの不活性な対立遺伝子を有するブタは、自然には発生しない。遺伝子ターゲティング事象によってαＧＴ遺伝子の第２の対立遺伝子をノックアウトする試みの際に、点突然変異が同定され、この点突然変異が、第２の対立遺伝子が機能的αＧＴ酵素の産生を防止することが既に見出された。
【０１３３】
したがって、本発明の別の態様では、αＧＴ遺伝子を、少なくとも１つの点突然変異によって不活化することができる。一実施形態では、αＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子を、少なくとも１つの点突然変異によって不活化することができる。別の実施形態では、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子を、少なくとも１つの点突然変異によって不活化することができる。一実施形態では、この点突然変異は、遺伝子ターゲティング事象によって起こすことができる。別の実施形態では、この点突然変異は、自然に起こり得る。さらなる実施形態では、突然変異は、突然変異誘発物質によってαＧＴ遺伝子に誘発することができる。
【０１３４】
特有の一実施形態では、点突然変異は、αＧＴ遺伝子のエキソン９の第２の塩基におけるＴからＧへの突然変異であり得る。αＧＴ遺伝子に自然発生の点突然変異を有するブタは、抗生物質耐性遺伝子を含まないαＧＴ欠損ブタの作製を可能にし、これによりヒトに使用されるより安全な産物を作製する可能性が生まれる。他の実施形態では、αＧＴ遺伝子を不活化させるために、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも２０の点突然変異が存在し得る。他の実施形態では、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が機能的なαＧＴ酵素の一切の発現を防止する点突然変異を含むブタが提供される。特有の実施形態では、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子のエキソン９の第２の塩基におけるＴからＧへの突然変異を含むブタが提供される。
【０１３５】
本発明の別の態様は、αＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子が遺伝子ターゲティング事象によって不活化され、他方の対立遺伝子が突然変異によって不活化された、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されたブタ動物を提供する。一実施形態では、αＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子が遺伝子ターゲティング事象によって不活化され、他方の対立遺伝子が、エキソン９の第２の塩基におけるＴからＧへの点突然変異の存在によって不活化された、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されたブタ動物が提供される。特有の実施形態では、αＧＴ遺伝子の一方の対立遺伝子がエキソン９に向けられた標的コンストラクトによって不活化され、他方の対立遺伝子が、エキソン９の第２の塩基におけるＴからＧへの点突然変異の存在によって不活化された、αＧＴ遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化されたブタ動物が提供される。
【０１３６】
免疫調節物質
免疫調節物質には、補体調節剤および免疫抑制剤が含まれる。
【０１３７】
（ｉ）補体調節剤
補体は、一連の血液タンパク質の総称であり、免疫系の重要なエフェクター機構である。補体の活性化および標的構造上へのその堆積は、直接的な補体媒介性細胞溶解を引き起こし得る、または炎症の強力な調節物質の産生ならびに免疫エフェクター細胞の動員および活性化による、間接的な細胞もしくは組織の破壊を引き起こし得る。組織傷害を媒介する補体活性化産物が、補体経路における様々な点で産生される。宿主組織における不適切な補体活性化は、多くの自己免疫疾患および炎症性疾患の病理に重要な役割を果たし、生体不適合性、例えば、術後の心肺炎症および移植片拒絶反応に関連した多くの疾患状態にも関与する。宿主細胞膜への補体の堆積は、細胞表面で発現される補体阻害タンパク質によって防止される。
【０１３８】
補体系は、一群の約３０のタンパク質を含み、免疫系の主要エフェクター機構の１つである。補体カスケードは、古典経路（通常は抗体に依存）または代替経路（通常は抗体に依存しない）のいずれかによって主に活性化される。いずれかの経路による活性化は、Ｃ３コンバターゼの産生をもたらし、このＣ３コンバターゼは、カスケードの中心酵素複合体である。Ｃ３コンバターゼは、血清Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断し、Ｃ３ｂは、活性化部位に共有結合し、Ｃ３コンバターゼのさらなる産生をもたらす（増幅ループ）。活性化産物Ｃ３ｂ（および古典的経路によってのみ生成されるＣ４ｂも）およびその分解産物は、重要なオプソニンであり、標的細胞の細胞媒介性溶解（食細胞およびＮＫ細胞によって）の促進、ならびに免疫複合体輸送および可溶化に関与する。また、免疫系の様々な細胞上のＣ３／Ｃ４活性化産物およびそれらの受容体も、細胞免疫応答の調節に重要である。Ｃ３コンバターゼは、Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂに切断する複合体であるＣ５コンバターゼの形成に関与する。Ｃ５ａは、強力な炎症誘発性および走化性を有し、免疫エフェクター細胞を動員して活性化し得る。Ｃ５ｂの形成により、終末補体経路が開始され、補体タンパク質Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、および（Ｃ９）ｎの連続的な集合が起こり、膜攻撃複合体（ＭＡＣまたはＣ５ｂ−９）が形成される。標的細胞膜におけるＭＡＣの形成は、直接的な細胞溶解をもたらし得るが、細胞活性化および様々な炎症調節物質の発現／放出も引き起こし得る。
【０１３９】
膜補体インヒビターの２つの大きなクラス：補体活性化経路のインヒビター（Ｃ３コンバターゼの形成を阻害する）および終末補体経路のインヒビター（ＭＡＣの形成を阻害する）が存在する。補体活性化の膜インヒビターには、補体受容体１（ＣＲ１）、分解促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、および膜タンパク質補助因子（ＭＣＰまたはＣＤ４６）が含まれる。膜インヒビターはすべて、Ｃ３／Ｃ４結合タンパク質の共通の特徴であるショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）と呼ばれる、約６０〜７０のアミノ酸の様々な数の反復単位からなるタンパク質構造を有する。ヒト補体活性化インヒビターのげっ歯類相同体が同定された。げっ歯類タンパク質Ｃｒ１は、ＤＡＦおよびＭＣＰの両方と同様に機能する、広く分布する補体活性化のインヒビターである。げっ歯類はまた、ＤＡＦおよびＭＣＰも発現するが、Ｃｒ１が、げっ歯類における補体活性化の機能的に最も重要な制御因子であると思われる。ヒトに見られるＣｒ１の相同体が存在しないが、動物モデルにおけるＣｒ１の研究およびその使用は、臨床的に適切である。
【０１４０】
宿主細胞膜における終末補体経路およびＭＡＣ形成の制御は、グルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって原形質膜に付着された広く分布する２０ｋＤの糖タンパク質であるＣＤ５９の活性によって主に行われる。ＣＤ５９は、ＭＡＣが構築される際にＣ８およびＣ９に結合して膜挿入を防止する。
【０１４１】
宿主細胞は、ＤＡＦ、ＭＣＰ、およびＣＤ５９のような膜結合補体調節タンパク質によってそれ自体の補体から保護されている。臓器が別の種に移植されると、レシピエントにおける天然の抗体がドナー臓器の内皮に結合して補体を活性化し、これにより急速な拒絶反応が開始される。ヒト細胞とは対照的に、ブタの細胞は、ヒト補体の影響を非常に受けやすいことが既に示され、これは、ブタの細胞表面補体調節タンパク質がヒト補体に対して無効であるためであると考えられた。臓器が別の種に移植されると、レシピエントにおける天然抗体がドナー臓器の内皮に結合して補体を活性化し、これにより急速な拒絶反応が開始される。ＩｇＭ天然抗体の除去およびｓＣＲ１、ヘパリン、またはＣ１インヒビターを用いた補体の全身補体除去（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）または阻害を含む、いくつかの戦略が、拒絶反応を防止または遅延することが示された。
【０１４２】
拒絶反応の問題に対する代替の手法は、トランスジェニックブタでヒト膜結合補体調節分子を発現させることである。分解促進因子ＤＡＦ（ＣＤ５５）、膜タンパク質補助因子ＭＣＰ（ＣＤ４６）、および反応性溶解の膜インヒビター、ＭＩＲＬ（ＣＤ５９）を発現するトランスジェニックブタが作製された（Ｋｌｙｍｉｕｍら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ、（２０１０）７７：２０９−２２１を参照）。これらのヒトインヒビターは、ブタ血管内皮で豊富に発現されることが示された。ヒト血液を用いたコントロール動物由来の心臓のｅｘ  ｖｉｖｏ灌流は、数分以内に臓器の補体媒介性破壊を引き起こすが、トランスジェニック動物から得た心臓は、補体に反応せず、数時間生存した。
【０１４３】
上で概説したようにヒト補体調節タンパク質をブタ臓器で発現させてブタ臓器を「ヒト化」する原理は、内因性ブタ調節タンパク質がヒト補体の阻害に効果がないため、異種移植の文脈における臓器の生存にはほとんど寄与しないという仮定に基づいている。非ヒト霊長類でのブタ膵島異種移植に関する研究により、移植後１２〜２４時間以内に膵島移植片で観察されたＩｇＭの有意な結合および補体成分（Ｃ３、Ｃ５、Ｃ９、ＳＣ５ｂ−９）の堆積を含む、補体活性化の重要性が示された。補体活性化は、注入された膵島の大部分の生着を防げるＩＢＭＩＲに関連した炎症反応で重要な役割を果たす（Ｃａｎｔａｒｏｖｉｃｈら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９：２５、２００２；Ｋｉｒｃｈｈｏｆら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １１（５）、３９６、２００４；Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００８、Ａｐｒ  ２７；８５（８）：１１９３−９）。加えて、可溶性補体インヒビターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵島の補体媒介性溶解を防止することができる（Ｂｅｎｎｅｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９（５）：７１１、２０００）。
【０１４４】
Ｍｏｒｇａｎらによる米国特許第７，４６２，４６６号に、いくつかのヒト補体調節タンパク質（ＣＲＰ）のブタ類似体の単離および特徴付けが記載されている。この研究により、ヒト補体調節タンパク質分子を発現しているブタ臓器が、ヒトＣＲＰ分子を発現するからではなく、大幅に増加した量の機能的ＣＲＰ分子を発現するため、補体損傷に耐性があることが説明された。Ｍｏｒｇａｎらは、ブタＣＲＰの発現の増加が、ヒト補体調節タンパク質を発現するドナー臓器と等しく、超急性拒絶反応をもたらす補体損傷からのドナー臓器の保護で有効であり得ることを見出した。
【０１４５】
ＣＤ４６は、古典経路および代替経路の両方によって活性化される補体媒介性攻撃から宿主細胞を保護することができる調節性のタンパク質として特徴付けられた（Ｂａｒｉｌｌａ−ＬａＢａｒｃａ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８、６２９８−６３０４（２００２））。ｈＣＤ４６は、低レベルの天然または誘導抗Ｇａｌ抗体または抗非Ｇａｌ抗体によって媒介される炎症および体液性拒絶反応の際に補体溶解から保護し得る。結果として、より多くの膵島が生着して拒絶反応からより良好に保護され、これにより免疫抑制の必要性が低減される。
【０１４６】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの補体制御因子を発現し、かつ機能的αＧＴの一切の発現を欠くか、または膵臓組織で（１）免疫抑制薬（すなわち、ＣＴＬＡ−４およびＢ７など）または（２）抗凝固因子（すなわち、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９など）の少なくとも１つを発現する動物、組織、および細胞が提供される。
【０１４７】
他の実施形態では、少なくとも１つの補体制御因子を発現し、機能的αＧＴの一切の発現を欠き、かつ膵臓組織で（１）免疫抑制薬（すなわち、ＣＴＬＡ−４およびＢ７など）または（２）抗凝固因子（すなわち、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９など）の少なくとも１つを発現する動物、組織、および細胞が提供される。
【０１４８】
一実施形態では、補体インヒビター（例えば、ＣＤ４６、ＤＡＦ）が、この補体インヒビターが正常に発現されるどの細胞でも発現される。別の実施形態では、補体インヒビターは、遍在的に発現される。
【０１４９】
なおさらなる実施形態では、少なくとも１つの補体制御因子を発現し、機能的αＧＴの一切の発現を欠き、膵臓組織において、少なくとも１つの免疫抑制剤（すなわち、ＣＴＬＡ−４およびＢ７など）を発現し、かつ少なくとも１つの抗凝固因子（すなわち、ＴＦＰＩ、ヒルジン、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９など）を発現する動物、組織、および細胞が提供される。一部の実施形態では、この膵臓組織は、ブタの膵臓組織である。さらなる実施形態では、この膵臓組織には、膵島細胞が含まれる。
【０１５０】
一部の実施形態では、補体制御因子は、補体インヒビターであり得る。さらなる実施形態では、補体インヒビターは、膜補体インヒビターであり得る。膜補体インヒビターは、補体活性化経路のインヒビター（Ｃ３コンバターゼの形成を阻害する）または終末補体経路のインヒビター（ＭＡＣの形成を阻害する）のいずれかであり得る。補体活性化の膜インヒビターには、補体受容体１（ＣＲ１）、分解促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、および膜タンパク質補助因子（ＭＣＰまたはＣＤ４６）などが含まれる。終末補体経路の膜インヒビターには、ＣＤ５９などが含まれ得る。補体制御因子が発現される場合には、２つ以上の異なる補体制御因子が発現され得る。
【０１５１】
本発明の一部の実施形態では、補体制御因子は、ヒト補体制御因子である。他の実施形態では、補体制御因子は、ブタ補体制御因子である。
【０１５２】
一実施形態では、本発明による動物、組織、または細胞を改変して、１つ以上の補体制御因子を遺伝子組換え的に発現させることができる。動物、組織、または細胞を改変して、補体制御因子ペプチド、生物学的に活性な断片、またはその誘導体を発現させることができる。一実施形態では、補体制御因子ペプチドは、完全長補体制御因子である。さらなる実施形態では、補体制御因子ペプチドには、完全長よりも短い補体制御因子タンパク質も含まれ得る。
【０１５３】
当業者に周知の任意のヒトまたはブタ補体制御因子配列またはその生物学的活性な部分もしくは断片を、本発明の組成物および方法にしたがって使用することができる。追加の実施形態では、任意のコンセンサス補体制御因子ペプチドを、本発明にしたがって使用することができる。別の実施形態では、核酸配列および／またはペプチド配列は、本明細書に記載されている補体制御因子ペプチドおよびヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％相同である。さらなる実施形態では、補体制御因子と同様の活性を示す任意の断片または相同配列を使用することができる。
【０１５４】
（ｉｉ）免疫抑制剤
「免疫抑制」導入遺伝子は、免疫応答を下方制御することができる。あらゆる種類の移植処置手順では、有効性と毒性との間のバランスが、臨床許容性の重要な因子である。膵島移植に関して、さらなる懸念は、現在の免疫抑制剤の多く、特に糖質コルチコイドまたはカルシニュリンインヒビター、例えば、タクロリムス（Ｔａｒｃｏｌｉｍｕｓ）が、β細胞に損傷を与える、または末梢インスリン耐性を誘導することである（Ｚｅｎｇら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、（１９９３）、１１３：９８−１０２）。シロリムス、低用量タクロリムス（Ｔａｒｃｏｌｉｍｕｓ）、およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むステロイドフリー免疫抑プロトコル（「エドモントンプロトコル」）が、１型糖尿病の患者の膵島移植のみの臨床に使用された（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ａ．Ｍ．Ｊ．ら、（２０００）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４３：２３０−２３８）。「エドモントンプロトコル」を用いた近年の成功により、糖尿病の処置で膵島移植を使用する意欲が取り戻された。しかしながら、タクロリムスの毒性に関する懸念は、ヒトにおけるこの治療の適用を制限し得る。
【０１５５】
重要なＴ細胞共刺激シグナル、特にＣＤ２８経路を遮断する生物学的作用物質は、膵島を保護する潜在的な代替手段である。ＣＤ２８経路を遮断する作用物質の例として、限定されるものではないが、突然変異ＣＴＬＡ４分子を含む可溶性ＣＴＬＡ４が挙げられる。
【０１５６】
Ｔ細胞活性化は、移植片拒絶反応の発症機序に関与する。Ｔ細胞の活性化には、少なくとも２組のシグナル伝達事象が必要である。最初のシグナル伝達事象は、抗原提示細胞（ＡＰＣ５）上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原性ペプチドのＴ細胞受容体による特異的認識によって開始される。第２の組のシグナルは、抗原非特異的であり、ＡＰＣ上のリガンドと相互作用するＴ細胞共刺激受容体によって開始される。共刺激が存在しないと、Ｔ細胞活性化が損なわれる、または中止され、これによりクローンアネルギーの抗原特異的な無反応状態となるか、またはアポトーシス死による排除が起こり得る。したがって、Ｔ細胞共刺激の遮断により、正常な免疫機能を維持したまま、抗原特異的に望ましくない免疫応答を抑制する手法が提供され得る（Ｄｕｍｏｎｔ，Ｆ．Ｊ．、２００４、Ｔｈｅｒａｐｙ  １、２８９−３０４）。
【０１５７】
今日までに同定されたいくつかのＴ細胞共刺激経路のうち、最も顕著な経路は、ＣＤ２８経路である。樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞に存在するＣＤ２８、Ｔ細胞上で発現される細胞表面分子、およびその対抗受容体、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）分子が、Ｔ細胞共刺激シグナルを中断する魅力的な標的として特徴付けられ同定された。ＣＤ２８に相同な第２のＴ細胞表面分子は、細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ４）として知られている。ＣＴＬＡ４は、細胞表面シグナル伝達分子であるが、ＣＤ２８の作用とは対照的に、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞機能を負に調節する。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７リガンドに対して、ＣＤ２８よりも２０倍高い親和性を有する。ヒトＣＴＬＡ４の遺伝子は、１９８８年にクローニングされ、１９９０年に染色体マッピングされた（Ｄａｒｉａｖａｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８：１９０１−１９０５、（１９８８）；Ｌａｆａｇｅ−Ｐｏｃｈｉｔａｌｏｆｆら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３１：１９８−２０１、（１９９０）；米国特許第５，９７７，３１８号）。
【０１５８】
ＣＤ２８／Ｂ７経路は、Ｔ細胞共刺激シグナルを中断するための魅力的な標的になった。ＣＤ２８／Ｂ７インヒビターのデザインは、この系の内因性の負の制御因子、ＣＴＬＡ４を利用した。ＣＴＬＡ４免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）融合タンパク質が、Ｔ細胞共刺激を阻害する手段として広範囲にわたって研究された。免疫抑制治療ではバランスを取るのが困難なはずである；疾患または拒絶反応に打ち勝つために十分に抑制しなければならないが、過度の免疫抑制は、全免疫系を抑制してしまう。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの免疫抑制活性が、臓器移植および自己免疫疾患の動物モデルの前臨床研究で実証された。可溶性ＣＴＬＡ４が、近年、腎不全、乾癬、および関節リウマチのヒト患者で試験され、関節リウマチの処置用として承認されているＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発された薬物（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）として処方された。この薬物は、選択的Ｔ細胞共刺激調節因子の新たなクラスの最初の薬物である。Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂは、同種腎臓移植に対して、Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ（ＬＥＡ２９Ｙ）を用いてフェーズＩＩ臨床試験も行っている。ＬＥＡ２９Ｙは、Ｂ７受容体に対して野生型ＣＴＬＡ４よりも高い親和性を有するように操作された、免疫グロブリンに融合されたＣＴＬＡ４の突然変異型である。Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎもまた、特発性血小板減少性紫斑病に対して、そのＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いて臨床試験を行っている。「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＴＬＡ４  ｍｕｔａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」という名称の米国特許第５，７３０，４０３号に、同種膵島移植を保護するための可溶性ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＴＬＡ４突然変異分子の使用が記載されている。
【０１５９】
ある生物由来のＣＴＬＡ−４は、別の生物由来のＢ７に結合することができるが、最も高い結合活性は、同種Ｂ７で見られる。したがって、ドナー生物由来の可溶性ＣＴＬＡ−４は、レシピエントＢ７（正常細胞上の）およびドナーＢ７（異種移植された細胞上の）の両方に結合できるが、ドナー生物由来の可溶性ＣＴＬＡ−４は、異種移植片上のＢ７に優先的に結合する。したがって、異種移植用のブタ動物または細胞を含む本発明の実施形態では、ブタＣＴＬＡ４が典型的である。Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅによる国際公開第ＷＯ９９／５７２６６号に、ブタＣＴＬＡ４配列、および異種移植治療用の可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇの投与が記載されている。Ｖａｕｇｈｎ  Ａ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）、３１７５−３１８１に、可溶性ブタＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合および機能が記載されている。ブタＣＴＬＡ４−Ｉｇは、ブタ（ヒトではない）Ｂ７に結合し、レシピエントＴ細胞上のＣＤ２８を遮断し、全体的なＴ細胞の免疫抑制を引き起こすことなく、これらの局所Ｔ細胞をアネルギー状態にする（Ｍｉｒｅｎｄａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：１０４８−１０５５、２００５を参照）。
【０１６０】
今日まで、免疫抑制剤としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇに対する多くの研究は、可溶型のＣＴＬＡ４−Ｉｇの患者への投与に焦点が当てられてきた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するように操作されたトランスジェニックマウスが作製され、いくつかの系統の実験が行われた。Ｒｏｎｃｈｅｓｅらは、マウスでのＣＴＬＡ４の発現の後に免疫系の機能を全般的に検査した（Ｒｏｎｃｈｅｓｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９４）、１７９：８０９；Ｌａｎｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、（１９９４）、Ｍａｒ  １；１７９（３）：８１９）。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０００、６９（９）：１８０６−１２）は、遺伝子組換え的に発現されるＣＴＬＡ４−Ｉｇの同種膵島移植に対する効果を試験するためにマウスにおけるトランスジェニック胎仔膵臓同種移植片によって分泌されるＣＴＬＡ４−Ｉｇの保護効果を記載した。Ｌｕｉら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３、２７７：１７１−１８３）は、バイオリアクターとして使用されるトランスジェニック動物の乳中の可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を誘導する哺乳動物特異的プロモーターの制御下でＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するトランスジェニックマウスの作製を報告した。
【０１６１】
Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．による国際公開第ＷＯ０１／３０９６６号に、補体タンパク質ＣＤ５９に付着したＴ細胞インヒビターＣＴＬＡ−４を含むキメラＤＮＡコンストラクト、ならびに同じものを含むトランスジェニックブタ細胞、組織、および臓器が記載されている。国際公開第ＷＯ２００７０３５２１３号（Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ）に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するように遺伝子改変されたトランスジェニックブタ動物が記載されている。
【０１６２】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する動物の開発が提案されたが、これらの動物は、重度の免疫不全である。近年、ＣＡＧエンハンサー／プロモーターを用いて遍在的にＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する、Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．によって作製されたブタは、免疫不全表現型を有し、典型的な畜産環境では生存できないことが分かった（実施例１１を参照）。
【０１６３】
本発明では、胎仔膵島および成体膵島の両方で直接遺伝子発現を導くことが知られている、Ｐｄｘ−１遺伝子由来の膵島系譜特異的エンハンサー（Ｌｏｍｅｄｉｃｏら、１９７９）をラットＩｎｓ２遺伝子由来のプロモーター（Ｇｅｒｒｉｓｈら、２００４）と共に用いて、得られるトランスジェニック動物の膵島で局所的または特異的に免疫抑制導入遺伝子の発現を駆動するベクターを構築した。
【０１６４】
追加の免疫調節物質、特に免疫抑制薬を、動物、組織、または細胞で発現させることができる。例えば、免疫不全表現型を作製するためにマウスで不活化された遺伝子をクローニングし、ブタでの遺伝子ターゲティングによって破壊することができる。マウスで標的化され、免疫不全ブタを作製するために標的化できる一部の遺伝子には、β２−ミクログロブリン（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｋｏｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：１２２７−１２３０）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６０：２２５−２３１）、ＲＡＧ−１、およびＲＡＧ−２（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、（１９９２）、Ｃｅｌｌ  ６８、８６９−８７７、Ｓｈｉｎｋａｉら、（１９９２）、Ｃｅｌｌ  ６８、８５５−８６７、米国特許第５，８５９，３０７号）が含まれる。
【０１６５】
一実施形態では、本発明による動物または細胞を、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４−免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４）を遺伝子組換え的に発現するように改変することができる。動物または細胞を、ＣＴＬＡ４ペプチドまたはその生物学的に活性な断片（例えば、細胞外ドメイン、少なくとも膜貫通ドメインが除去された切断型のペプチド）もしくは誘導体を発現するように改変することができる。このペプチドは、例えば、ヒトまたはブタであり得る。ＣＴＬＡ４ペプチドは、突然変異であり得る。突然変異ペプチドは、ブタおよび／またはヒトＢ７分子に対して野生型よりも高い親和性を有し得る。特有の一実施形態では、突然変異ＣＴＬＡ４は、ＣＴＬＡ４（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）であり得る。ＣＴＬＡ４ペプチドは、細胞内で発現されるように改変することができる。ＣＴＬＡ４ペプチドの他の改変には、Ｎ末端またはＣ末端への小胞体残留シグナルの追加が含まれる。小胞体残留シグナルは、例えば、配列ＫＤＥＬであり得る。ＣＴＬＡ４ペプチドは、ペプチド二量化ドメインまたは免疫グロブリン（Ｉｇ）分子に融合させることができる。ＣＴＬＡ４融合ペプチドには、２つのペプチドを結合できるリンカー配列が含まれ得る。別の実施形態では、本発明にしたがって作製された、機能的免疫グロブリンの発現を欠いた動物に、そのＴ細胞応答を抑制するために薬物としてＣＴＬＡ４ペプチドまたはその変異体（ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ、またはｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ、またはＢｅｌａｔａｃｅｐｔ）を投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「ＣＴＬＡ４」は、ＣＴＬＡ４またはそのあらゆる変異体、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、または当技術分野で周知の他の変異体を指すために使用される。
【０１６６】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、完全長ＣＴＬＡ４である。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、完全長未満のＣＴＬＡ４タンパク質を含み得る。一実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ＣＴＬＡ−４ペプチドの細胞外ドメインを含み得る。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインである。なおさらなる実施形態では、本発明は、突然変異型のＣＴＬＡ４を提供する。一実施形態では、突然変異型のＣＴＬＡ４は、ブタおよび／またはヒトＢ７に対して野生型よりも高い親和性を有し得る。特有の一実施形態では、突然変異ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）であり得る。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＴＬＡ４は、タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインが除去された切断型のＣＴＬＡ４であり得る。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、細胞内で発現されるように改変することができる。一実施形態では、ゴルジ残留シグナルを、ＣＴＬＡ４ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加することができる。一実施形態では、ゴルジ残留シグナルは、配列ＫＤＥＬであり得、この配列ＫＤＥＬを、ＣＴＬＡ４ペプチドのＣ末端またはＮ末端に付加することができる。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ペプチド二量化ドメインに融合させることができる。一実施形態では、ＣＴＬＡ４ペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）に融合させることができる。別の実施形態では、ＣＴＬＡ４融合ペプチドは、２つのペプチドを結合することができるリンカー配列を含み得る。
【０１６８】
あらゆるヒトＣＴＬＡ４配列または当技術分野で周知のその生物学的に活性な部分もしくは断片は、本発明の組成物および方法にしたがって使用することができる。非限定的な例として、限定されるものではないが、ヒトＣＴＬＡ４配列を表す次のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００５２１４．２；ＢＣ０７４８９３．２；ＢＣ０７４８４２．２；ＡＦ４１４１２０．１；ＡＦ４１４１２０；ＡＹ４０２３３３；ＡＹ２０９００９．１；ＢＣ０７０１６２．１；ＢＣ０６９５６６．１；Ｌ１５００６．１；ＡＦ４８６８０６．１；ＡＣ０１０１３８．６；ＡＪ５３５７１８．１；ＡＦ２２５９００．ｌ；ＡＦ２２５９００；ＡＦ４１１０５８．ｌ；Ｍ３７２４３．１；Ｕ９０２７３．１；および／またはＡＦ３１６８７５．１が挙げられる。ＣＴＬＡ４ペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、ＥＳＴデータベースの次のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号；ＣＤ６３９５３５．１；Ａ１７３３０１８．１；ＢＭ９９７８４０．１；ＢＧ５３６８８７．１；ＢＧ２３６２１１．１；ＢＧ０５８７２０．ｌ；Ａ１８６０ｉ９９．ｌ；ＡＷ２０７０９４．ｌ；ＡＡ２１０９２９．１；Ａ１７９１４１６．１；ＢＸ１１３２４３．１；ＡＷ５１５９４３．１；ＢＥ８３７４５４．１；ＡＡ２１０９０２．１；ＢＦ３２９８０９．１；Ａ１８１９４３８．１；ＢＥ８３７５０１．１；ＢＥ８３７５３７．１；および／またはＡＡ８７３１３８．１を含むヌクレオチド配列から選択される。
【０１６９】
追加の実施形態では、あらゆるコンセンサスＣＴＬＡ４ペプチドを、本発明にしたがって使用することができる。別の実施形態では、核酸および／またはペプチド配列は、天然ＣＴＬＡ４ペプチドおよびヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％相同である。さらなる実施形態では、ＣＴＬＡ４と同様の活性を有するあらゆる断片または相同配列を使用することができる。
【０１７０】
他の実施形態では、Ｔ細胞阻害活性を示すアミノ酸配列は、ブタＣＴＬＡ４配列のアミノ酸３８〜１６２またはヒトＣＴＬＡ４配列のアミノ酸３８〜１６１であり得る（例えば、国際公開第ＷＯ０１／３０９６６号を参照）。一実施形態では、使用される部分は、親分子の活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％を有するべきである。
【０１７１】
他の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４核酸およびペプチドを、免疫グロブリン遺伝子および分子またはそれらの断片もしくは領域に融合させることができる。本発明のＣＴＬＡ４配列と言う場合には、免疫グロブリンに融合されたＣＴＬＡ４配列も含まれる。
【０１７２】
一実施形態では、Ｉｇは、ヒトＩｇであり得る。別の実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１であり得る。別の実施形態では、Ｉｇは、ＩｇＧの定常領域であり得る。特定の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＣγ１鎖であり得る。本発明の特定の一実施形態では、ブタＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、ヒトＣγ１  Ｉｇに融合させることができる。別の実施形態では、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４に融合させることができる。さらなる特定の実施形態では、突然変異ＣＴＬＡ４（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）の細胞外ドメインを、ＩｇＧ１に融合させることができる。
【０１７３】
（ｉｉｉ）他の免疫調節物質
使用できる他の免疫調節物質には、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）およびその突然変異体、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、腫瘍壊死因子−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＲが含まれる。
【０１７４】
（ａ）ＣＩＩＴＡ：クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）は、転写活性化因子として機能し、かつＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現に極めて重要な役割を果たす二官能性または多官能性ドメインタンパク質である。アミノ末端の１５１のアミノ酸を欠いたタンパク質をコードするヒトＣＩＩＴＡ遺伝子の突然変異型が、ＨＬＡクラスＩＩ発現の強力なドミナントネガティブ抑制因子として機能することが既に実証されている（Ｙｕｎら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、Ｏｃｔ；９（１０）：１５４５−５３）。ブタＭＨＣクラスＩＩ抗原は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による直接のＴ細胞認識の強力な刺激装置であるため、臨床異種移植におけるトランスジェニック・ブタ・ドナーに対する拒絶反応で重要な役割を果たす可能性が高い。１つの突然変異ヒトＣＩＩＴＡコンストラクトが、ブタ細胞で有効であり、ＩＦＮ［γ］誘導および構成的なブタＭＨＣクラスＩＩの発現を顕著に抑制することが報告された。さらに、突然変異ヒトＣＩＩＴＡコンストラクトを有する、安定的にトランスフェクトされたブタ血管内皮細胞系は、精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による直接のＴ細胞異種認識を刺激することができなかった（Ｙｕｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０００、Ｍａｒ  １５；６９（５）：９４０−４）。ＣＩＩＴＡ−ＤＮトランスジェニック動物由来の臓器、組織、および細胞は、ヒトレシピエントに大幅に低減されたＴ細胞拒絶反応を誘導することができる。他の導入遺伝子と組み合わせた、突然変異ＣＩＩＴＡの導入遺伝子の発現は、臨床的に許容され得るレベルの免疫抑制を用いて長期の異種移植片の生存を可能にし得る。
【０１７５】
（ｂ）ＰＤＬ１、ＰＤＬ２：Ｔ細胞活性化の典型的な共刺激分子は、ＣＤ８０／８６またはＣＤ４０である。これらのポジティブ共刺激経路に加えて、過去数年間で、ネガティブシグナルを媒介し、かつＴ細胞活性化の制御に重要である新たな共刺激経路が見出された。これらの新たな経路の１つは、プログラム死１（ＰＤ−１）受容体およびそのリガンド、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２からなる経路である。ＰＤ−１受容体は、休止細胞では発現されないが、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化後に上方制御される。ＰＤ−１は、細胞質免疫受容スイッチ・チロシン・モチーフ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ）を含み、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１との結合により、Ｔ細胞の抑制シグナルがもたらされる。最近のデータは、ＰＤ１／ＰＤＬｉｇａｎｄ経路が、制御活性を示すＴ細胞のサブセットの制御において重要な役割を果たし得ることを示唆している。マウスでは、ＰＤ−１シグナルは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性および適応Ｔｒｅｇの産生に必要であることが示された。これらの知見は、ＰＤ−１／ＰＤＬｉｇおよび相互作用が、Ｔ細胞応答を抑制しないばかりか、免疫調節を引き起こし得ることも示唆している。いくつか系統の証拠が、ＰＤ−１／ＰＤＬｉｇａｎｄ経路が同種移植片の生着および拒絶反応を制御できることを実証し、これらの分子が臓器移植後の免疫調節の魅力的な標的であることを示唆している。実際に、同種移植片生存の延長は、ラット移植モデルのドナー心臓へのＰＤＬ１Ｉｇ遺伝子の導入によって達成することができる。さらに、ＰＤ−Ｌ１Ｉｇの注入によるＰＤ−１シグナル伝達の増強が、マウスにおいて移植片を拒絶反応から保護することが報告された。最近のデータは、マウスでの膵島移植片でのＰＤ−Ｌ１ＩＧの過剰発現が、膵島移植片の生存をある程度延長し得ることを示している。ブタ細胞および組織におけるヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のトランスジェニック発現は、感作の直接経路によって開始される初期ヒト抗ブタＴ細胞応答を低減するはずである（Ｐｌｅｇｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９、Ａｐｒ  １５；８７（７）：９７５−８２）。Ｔｒｅｇの誘導により、長期にわたる寛容を達成するために必要な間接経路によって異種移植片に感作されたＴ細胞を制御することも可能であろう。
【０１７６】
（ｃ）ＴＲＡＩＬ／Ｆａｓ  Ｌ：アポトーシス誘導リガンド、例えば、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）または腫瘍壊死因子−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２Ｌ）の発現は、Ｔ細胞の異種移植片への攻撃を排除し得る。ＴＲＡＩＬは、ＦａｓＬに対して最も高いアミノ酸同一性（２８％）を示す他の腫瘍壊死因子ファミリーメンバーの細胞外ドメインに相同な細胞外ドメインを有するＩＩ型膜タンパク質である。ＴＲＡＩＬは、優先的に腫瘍細胞にアポトーシス誘導作用をもたらす。正常細胞では、ＴＲＡＩＬ受容体の結合は、細胞死をもたらさない。最近の研究により、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む免疫細胞の細胞傷害効果が、ＴＲＡＩＬによって少なくとも部分的に媒介されることが示された。トランスジェニックブタにおけるヒトＴＲＡＩＬの発現は、霊長類への異種移植後の細胞媒介性拒絶反応からブタ組織を保護する適切な戦略となり得る。ヒトＴＲＡＩＬの安定発現が、トランスジェニックブタで達成され、発現されたＴＲＡＩＬは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的に機能することが示された（Ｋｌｏｓｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００５、Ｊｕｌ  ２７；８０（２）：２２２−３０）。
【０１７７】
（ｄ）ＣＤ４７：ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質として知られ、遍在的に発現される５０−ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）α（ＣＤ１７２ａ、ＳＨＰＳ−１としても知られている）、マクロファージ上の免疫抑制受容体のリガンドとして機能する。ＣＤ４７およびＳＩＲＰαは、細胞遊走、Ｂ細胞の付着、およびＴ細胞の活性化を含む様々な細胞プロセスで重要な役割を果たす細胞間の情報伝達系（ＣＤ４７−ＳＩＲＰα系）を構成する。加えて、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα系は、マクロファージによる食作用の負の調節に関与する。いくつかの細胞型（すなわち、赤血球、血小板、または白血球）の表面上のＣＤ４７は、抑制性マクロファージ受容体ＳＩＲＰαに結合することによってマクロファージによる食作用から保護することができる。自己の認識および食作用の抑制におけるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の役割は、野生型マウス原発性マクロファージが、ＣＤ４７−欠損マウスから得られたオプソニン作用のないＲＢＣを迅速に食作用するが、野生型マウス由来のものに対して食作用しないという観察によって説明される。そのＳＩＲＰα受容体によって、ＣＤ４７が、Ｆｃγ媒介性食作用および補体受容体媒介性食作用の両方を阻害することが報告された。ブタＣＤ４７は、ヒトマクロファージ様細胞系においてＳＩＲＰαチロシンリン酸化を誘導せず、可溶性ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質は、ブタ細胞に対するヒトマクロファージの食作用活性を阻害することが実証された。また、ヒトＣＤ４７の発現のためのブタ細胞の操作は、ヒトマクロファージによる細胞の食作用のされやすさを急速に低下させることも示された（Ｉｄｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、２００７、Ｍａｒ  ２０；１０４（１２）：５０６２−６）。ブタ細胞におけるヒトＣＤ４７の発現は、ヒトマクロファージ上のＳＩＲＰαに抑制シグナルを伝達することができ、マクロファージ媒介性異種移植片拒絶反応を防止する手法を提供する。
【０１７８】
（ｅ）ＮＫ細胞応答。ＨＬＡ−Ｅ／β２ミクログロブリンおよびＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ：
ヒト・ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでヒト血液によって灌流されたブタ臓器に浸潤し、ブタ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接的に溶解し、かつヒト血清の存在下では抗体依存細胞媒介細胞傷害性によっても溶解するため、ブタのヒトへの異種移植の成功における潜在的なハードルとなる。ＮＫ細胞の自己反応性は、正常自己細胞上の抑制性ＮＫ受容体の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩリガンドの発現によって防止される。ほとんどの活性化ヒトＮＫ細胞で発現される抑制性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｅに特異的に結合する。非古典的ヒトＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを有するＮＫ細胞の強力な抑制リガンドであり、古典的ＭＨＣ分子とは異なり、同種Ｔ細胞応答を誘導しない。ＨＬＡ−Ｅは、小胞体で構築され、ＨＬＡ−Ｅ重鎖、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）、および一部のＭＨＣクラスＩ分子のリーダー配列に由来するペプチドからなる安定三量体複合体として細胞表面に輸送される。ＨＬＡ−Ｅの発現は、異種ヒトＮＫ細胞傷害性対してある程度の保護を提供することが示された（Ｗｅｉｓｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９、Ｊａｎ  １５；８７（１）：３５−４３）。ブタ臓器におけるＨＬＡ−Ｅのトランスジェニック発現は、同種免疫反応のリスクを伴わずにブタ異種移植片のヒトＮＫ細胞媒介性拒絶反応を実質的に緩和する可能性がある。加えて、他のＨＬＡ遺伝子を有するトランスジェニックブタは、ブタ臓器、組織、および細胞の「ヒト化」を目標とした作製に成功した（Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００６、Ｎｏｖ；６（２１）：５８１５−２５、また米国特許第６，６３９，１２２号を参照）。
【０１７９】
抗凝固因子
膵島と血液の反応は、最初の４８時間に膵島塊の８０〜９０％が消失をもたらす凝固の促進と血小板の消費によって特徴付けられ、補体溶解系の活性化、および膵島における組織因子の上方制御に関連することが示された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００５、５４：１７５５；Ｍｏｂｅｒｇら、Ｌａｎｃｅｔ、２００２、３６０：１９９９−２０００；Ｂｅｒｍａｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ、２００７、８４：３０８−３１３）。既に、これらの抗凝固導入遺伝子は、臓器異種移植のためにブタ内皮でこれらの導入遺伝子を発現させることを目標として動物に導入された。本発明では、胎仔膵島および成体膵島の両方で直接遺伝子発現を導くことが知られているＰｄｘ−１遺伝子由来の膵島系譜特異的エンハンサー（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ  Ｐら、Ｃｅｌｌ、１９７９、１８：５４５）を、ラットＩｎｓ２遺伝子由来のプロモーター（Ｇｅｒｒｉｓｈ  Ｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００４、１８（３）：５３３）と組み合わせて利用して、得られるトランスジェニック動物の膵島で局所的および特異的に抗凝固因子の発現を駆動するベクターを構築した。
【０１８０】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、因子Ｘａ（Ｘａ）およびトロンビン（因子ＩＩａ）を可逆的に阻害し、したがってＴＦ依存性凝固を阻害することができる１本鎖ポリペプチドである。ＴＦＰＩの再考のためにＣｒａｗｌｅｙおよびＬａｎｅ（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．、２００８、２８（２）：２３３−４２）を参照されたい。Ｄｏｒｌｉｎｇおよび同僚らは、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン／細胞質ドメインに連結されたヒトＴＦＰＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメインからなり、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ細胞内貯蔵顆粒を標的とするＰ−セレクチン尾部を有する融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製した（Ｃｈｅｎ  Ｄら、Ａｍ  Ｊ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００４；４：１９５８−１９６３）。結果として生じる内皮におけるＴＦＰＩの活性化依存性表示は、シクロスポリン処置ラットによるマウス心臓異種移植の血栓媒介性急性体液性拒絶反応を完全に抑制するのに十分であった。また、凝固の効果的な制御が慢性拒絶反応を防止し得るという提案も存在した。ヒルジン／ＣＤ４／Ｐ−セレクチン融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウス心臓でも同様の結果が得られ、トロンビンの産生または活性の抑制が、このモデルの保護にとって鍵であることが示された。
【０１８１】
ヒルジンは、薬用ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓなど）の唾液腺で自然に発生するペプチドであり、トロンビンの強力なインヒビターである。Ｄｏｒｌｉｎｇおよび同僚ら（Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００４、Ｄｅｃ；４（１２）：１９５８−６３）はまた、膜繋留ヒルジン融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスも作製し、その心臓をラットに移植した（マウス−ラットＸｅｎｏ−Ｔｘ）。３日以内にすべてが拒絶されたコントロール非トランスジェニックマウス心臓とは対照的に、両方の系統のトランスジェニックマウスからの臓器の１００％が、体液性拒絶反応に対して完全に耐性があり、Ｔ細胞媒介性拒絶反応がシクロスポリンＡの投与によって抑制された場合は１００日を超えて生存した。Ｒｉｅｓｂｅｃｋら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８、Ｄｅｃ  １５；９８（２４）：２７４４−５２）は、血管内血栓形成の予防の戦略として哺乳動物細胞でのヒルジン融合タンパク質の発現も利用した。細胞での発現は、局所トロンビンレベルを低下させ、フィブリン形成を抑制した。したがって、ヒルジンは、異種移植に見られる血栓の影響を防止するための魅力的な別の抗凝固導入遺伝子である。
【０１８２】
トロンボモジュリン（ＴＭ）は、トロンビンと１：１の化学量論複合体を形成することによって抗凝固経路におけるプロテインＣのトロンビン誘導活性化の補助因子として機能する。内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）は、プロテインＣの活性化を促進するＮ−グリコシル化Ｉ型膜タンパク質である。プロテインＣ抗凝固系におけるこれらのタンパク質の役割は、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｏｕｗｅｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．、２００４、Ａｕｇ；２４（８）：１３７４−８３によって再検討された。これらおよび他の抗凝固導入遺伝子の発現は、異種移植における凝固の障害に潜在的に対処するために様々なグループによって利用された（ＣｏｗａｎおよびＤ’Ａｐｉｃｅ編、Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００８、Ａｐｒ；１３（２）：１７８−８３）。Ｅｓｍｏｎおよび同僚ら（Ｌｉら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２００５、Ｊｕｌ；３（７）：１３５１−９）は、トランスジェニックマウスの内皮でＥＰＣＲを過剰発現させ、このような発現がマウスを血栓誘発から保護することを示した。Ｉｉｎｏら（Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、２００４、Ｍａｙ；２（５）：８３３−４）は、膵島移植における血栓合併症を防止する手段として、遺伝子治療によるｅｘ−ｖｉｖｏでのドナー膵島のＴＭ過剰発現を提案した。
【０１８３】
ＣＤ３９は、主要血管ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ（ＮＴＰＤａｓｅ）であり、ＡＴＰをＡＤＰそしてＡＭＰ、最終的にアデノシンに変換する。細胞外アデノシンは、血栓形成および炎症において重要な役割を果たすため、移植におけるその有用な役割について研究された（Ｒｏｂｓｏｎら編、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２００５、Ａｐｒ；３１（２）：２１７−３３）。最近の研究により、ＣＤ３９が、炎症反応の抑制に大きな効果を有することが示された（Ｂｅｌｄｉら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、２００８、１３：２５８８−２６０３）。ｈＣＤ３９を発現するトランスジェニックマウスは、心臓移植モデルにおいて血小板凝集障害、長期の出血時間、および全身性血栓塞栓症に対する耐性を示した（Ｄｗｙｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、２００４、Ｍａｙ；１１３（１０）：１４４０−６）。トランスジェニックマウスはまた、膵島でＣＤ３９を発現し、ヒト血液と共にインキュベートされると、これらの膵島が、野生型膵島と比べて凝固時間が有意に遅らせることも示した（Ｄｗｙｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００６、Ａｕｇ  １５；８２（３）：４２８−３２）。トランスジェニックブタの構成プロモーター系から高レベルでｈＣＤ３９を発現させる予備的な試みは、出生後の高い死亡率を示した（Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．、未公表データ）。したがって、動物の健康を損なうことなく、しかも臨床異種移植において有用となる十分な発現レベルを提供するように、ブタで抗凝固導入遺伝子を発現させる必要がある。
【０１８４】
細胞保護導入遺伝子
本発明は、細胞保護導入遺伝子（「細胞保護剤」）を含む。細胞保護導入遺伝子は、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を含むと見なされる。以下に例を挙げる。
【０１８５】
（ａ）Ａ２０：Ａ２０は、抗炎症活性および抗アポトーシス活性を提供する。血管新生化移植臓器は、抗炎症分子、抗凝固分子、および／または抗アポトーシス分子によって内皮細胞の活性化および細胞損傷から保護され得る。急性血管拒絶反応（ＡＶＲ）の調節において大きな可能性のある遺伝子の中に、ヒト臍静脈内皮細胞において腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α誘導因子として最初に同定されたヒトＡ２０遺伝子（ｈＡ２０）がある。ヒトＡ２０は、いくつかのカスパーゼおよび転写因子核因子−κＢのそれぞれの遮断によりＴＮＦ媒介性アポトーシスおよび炎症から内皮細胞を保護することによる二重細胞保護機能を有する。生存可能なＡ２０トランスジェニック子ブタが作製され、これらの動物でのｈＡ２０の発現が、ｈＡ２０の発現によるＴＮＦ媒介性アポトーシスから保護され、かつＣＤ９５（Ｆａｓ）Ｌ媒介性細胞死から少なくともある程度保護される骨格筋、心臓、およびＰＡＥＣに制限された。加えて、ｈＡ２０−トランスジェニック−クローンブタ由来の心筋細胞が、心臓発作からある程度保護された（Ｏｒｏｐｅｚａら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９、Ｎｏｖ；１６（６）：５２２−３４）。
【０１８６】
（ｂ）ＨＯ−１：ＨＯは、抗炎症活性、抗アポトーシス活性、および抗酸化活性を提供する。ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）、ヘム異化における律速酵素は、ＨＳＰ３２とも呼ばれ、熱ショックタンパク質のメンバーに属し、ヘム環は、第一鉄、一酸化炭素（ＣＯ）、およびビリベルジンに切断され、ビリベルジンは、次いでビリベルジンレダクターゼによってビリルビンに変換される。ＨＯ−１、ＨＯ−２、およびＨＯ−３を含むＨＯの３つのアイソフォームがクローニングされた。ＨＯ−１の発現は、高度に誘導性であるが、ＨＯ−２およびＨＯ−３は、構成的に発現される（Ｍａｉｎｅｓ  Ｍ  Ｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、１９９７；３７：５１７−５５４、およびＣｈｏｉ  Ａ  Ｍら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６；１５：９−１９）。ＨＯ−１−／−マウスの分析により、ＨＯ−１をコードする遺伝子が、鉄の恒常性を調節し、強力な抗酸化効果、抗炎症効果、および抗アポトーシス効果を有する細胞保護遺伝子として機能することが示唆される（Ｐｏｓｓ  Ｋ  Ｄら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９９７；９４：１０９２５−１０９３０、Ｐｏｓｓ  Ｋ  Ｄら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９９７；９４：１０９１９−１０９２４、およびＳｏａｒｅｓ  Ｍ  Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８；４：１０７３−１０７７）。同様の知見が、最近、ヒトにおけるＨＯ−１欠損の症例報告に記載された（Ｙａｃｈｉｅ  Ａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９９；１０３：１２９−１３５）。抗炎症性、抗酸化性、および抗アポトーシス性を含むＨＯ−１の細胞保護効果に関与する分子機序が、その反応産物によって媒介される。ＨＯ−１の発現は、異なる金属をもつプロトポルフィリンによってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで調節され得る。コバルトプロトポルフィリン（ＣｏＰＰ）および鉄プロトポルフィリン（ＦｅＰＰ）は、ＨＯ−１の発現を上方制御することができる。対照的に、錫プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）および亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）は、タンパク質レベルでＨＯ−１の活性を抑制する。最近、ＨＯ−１の発現が、マウスからラットへの心臓移植の拒絶反応を抑制し（Ｓａｔｏ  Ｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１；１６６：４１８５−４１９４）、アポトーシスから膵島細胞を保護し、かつ移植後の膵島細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能を改善する（Ｐｉｌｅｇｇｉ  Ａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００１；５０：１９８３−１９９１）ことが証明された。また、遺伝子導入によるＨＯ−１の投与が、酸素過剰−誘導肺損傷から保護し（Ｏｔｔｅｒｂｅｉｎ  Ｌ  Ｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９９；１０３：１０４７−１０５４）、ＨＯ−１の上方制御が、虚血／再灌流傷害から遺伝的肥満のＺｕｃｋｅｒラットの肝臓を保護し（Ａｍｅｒｓｉ  Ｆら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９９；１０４：１６３１−１６３９）、ＨＯ−１遺伝子の除去または発現が、シスプラチン誘導腎尿細管アポトーシスを調節する（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｆら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０００；２７８：Ｆ７２６−Ｆ７３６）ことも証明された。トランスジェニック動物モデルでは、ＨＯ−１の過剰発現が、肺の炎症および低酸素に対する血管反応を防止し（Ｍｉｎａｍｉｎｏ  Ｔ  ｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、２００１；９８：８７９８−８８０３）、かつ虚血および再灌流障害から心臓を保護する（Ｙｅｔ  Ｓ  Ｆら、Ｃｉｒ  Ｒｅｓ、２００１；８９：１６８−１７３）ことが示された。ＨＯ−１導入遺伝子を有するブタが作製されたが、異種移植におけるこのブタの使用に関連した臨床効果が報告されなかった（米国特許第７，３７８，５６９号）。
【０１８７】
（ｃ）ＦＡＴ−１：ＦＡＴ−１は、抗炎症活性を提供する。ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、炎症の抑制（ｎ−３クラス）で一定の役割を果たす。哺乳動物細胞は、ｎ−６をｎ−３  ＰＵＦＡに変換するデサチュラーゼを有していない。結果的に、必須ｎ−３脂肪酸は、食事で摂取しなければならない。しかしながら、哺乳動物とは異なり、自由生活性の線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓは、炭化水素鎖のｎ−３位置にあるｎ−６脂肪酸に二重結合を導入してｎ−３  ＰＵＦＡを形成するｎ−３脂肪酸デサチュラーゼを発現する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｆａｔ−１遺伝子を発現し、結果として食事由来の６系のＰＵＦＡを３系のＰＵＦＡ、例えば、ＥＰＡ（２０：５  ｎ−３）およびＤＨＡ（２２−６  ｎ−３）に効率的に変換するトランスジェニックマウスが作製された。（Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４、Ｆｅｂ  ５；４２７（６９７４）：５０４）。別のグループは、ｆａｔ−１  ｃＤＮＡのコドンが、哺乳動物系の効率的な翻訳のためにさらに最適化され；ｎ−３  ＰＵＦＡの内因性産生が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎ−３脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子、ｍｆａｔ−１の過剰発現によって達成されるトランスジェニック・マウス・モデルを作製した。このグループは、ｍｆａｔ−１のトランスジェニック発現による細胞内でのｎ−３  ＰＵＦＡの増加およびｎ−６  ＰＵＦＡの減少が、マウスの単離された膵島でのグルコース刺激、アミノ酸刺激、およびＧＬＰ−１刺激インスリン分泌を促進し、サイトカイン誘導性細胞死に対する膵島の耐性を強くしたことを示した（Ｗｅｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２０１０、Ｆｅｂ；５９（２）：４７１−８）。
【０１８８】
（ｄ）可溶性ＴＮＦ−α受容体（ｓＴＮＦＲ１）：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、カケキシン（ｃａｃｈｅｘｉｎ）、またはカケクチン、以前は腫瘍壊死因子αとして知られていた）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激するサイトカイン群のメンバーである。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の調節においてである。ＴＮＦは、アポトーシス細胞死を誘導し、炎症を誘導することができる。可溶性ＴＮＦ−α受容体１（ｓＴＮＦＲ１）は、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインであり、ＴＮＦ−αに対する拮抗薬である（Ｓｕら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、４１，１３９−１４９）。異種移植片におけるｓＴＮＦＲ１のトランスジェニック発現は、有利な抗炎症効果を有し得る。
【０１８９】
適切な抗酸化特性を有する他の細胞保護剤には、限定されるものではないが、ＳＯＤおよびＣａｔａｌｙｓｅが含まれる。酸素は、すべての好気性生物にとって必須の分子であり、ＡＴＰ産生、すなわち酸化的リン酸化において中心的な役割を果たす。このプロセス中に、スーパーオキシドアニオン（Ｏ（２）（−））および過酸化水素（Ｈ（２）Ｏ（２））を含む活性酸素種（ＲＯＳ）が、副産物として産生される。ヒトでは、抗酸化防御系が、ＲＯＳ産生のバランスをとる。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼは、抗酸化特性を有する２つの酵素である。ＳＯＤは、スーパーオキシドラジカルの過酸化水素への不均化を触媒し、過酸化水素が、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼによって水に変換される。ＲＯＳの産生がもたらす細胞損傷は、移植環境で起こり得る。抗酸化防御の低下により、膵β細胞は、特にフリーラジカルおよび炎症性傷害に対して弱い。一般的に使用される拒絶反応抑制剤は、適応免疫応答の抑制では優れているが、ほとんどが、膵島に対して有害であり、膵島の単離および虚血−灌流傷害から生じる炎症ならびに活性酸素種から十分に保護しない。したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏでの膵島の抗酸化剤での処置、または遺伝子治療もしくはドナー組織でのトランスジェニック発現による抗酸化遺伝子の発現の関心が高い。ｅｘ  ｖｉｖｏでのＥＣ−ＳＯＤおよびカタラーゼの遺伝子導入は、抗原誘導関節炎のラットモデルで抗炎症性であった（Ｄａｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００３、Ａｐｒ；１０（７）：５５０−８）。加えて、門脈からのＥＣ−ＳＯＤおよび／またはカタラーゼ遺伝子の送達は、マウスモデルにおける肝臓Ｉ／Ｒ損傷を著しく減少させた（Ｈｅら、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、２００６、Ｄｅｃ；１２（１２）：１８６９−７９）。最近のマウスの研究で、同系移植、準最適同系移植、または異種移植の前の触媒抗酸化剤で処置された膵島は、未処置のコントロールと比較して優れた機能を示した。この同じ研究で、触媒抗酸化剤で処置した同種膵島の糖尿病マウスレシピエントは、移植後に、改善された血糖コントロールを示し、同種移植片拒絶反応の遅延を実証した（Ｓｋｌａｖｏｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２０１０、Ｊｕｌ；５９（７）：１７３１−８、Ｅｐｕｂ、２０１０、Ａｐｒ  ２２）。別のマウスの研究では、ＭｎＳＯＤを過剰発現する膵島移植片は、コントロール移植片よりも約５０％長く機能した（Ｂｅｒｔｅｒａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００３、Ｆｅｂ；５２（２）：３８７−９３）。
【０１９０】
さらに、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９を含む一定の抗凝固因子は、抗炎症活性も提供する。
【０１９１】
遺伝子改変動物の作製
遺伝子改変動物は、限定されるものではないが、選択育種、核導入、ＤＮＡの卵母細胞、精子、受精卵、もしくは割球への導入、または胚性幹細胞の使用を含む当業者に周知の任意の方法で作製することができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、遺伝子改変は、動物で確認することができ、確認された動物を互いに交配させて、望ましい遺伝子改変の組（または１つの遺伝子改変）を有する動物の群れを形成する。これらの子孫をさらに交配して、さらなる子孫に遺伝子改変の異なる組または同じ組（または１つの遺伝子改変）を作製することができる。望ましい遺伝子改変（複数可）を有する動物のこの交配サイクルを、望む限り続けることができる。この文脈における「群れ」には、同じまたは異なる遺伝子改変（複数可）を有する、長い期間をかけて作製された動物の複数の世代が含まれ得る。「群れ」は、同じまたは異なる遺伝子改変（複数可）を有する一世代の動物を指しても良い。
【０１９３】
遺伝子改変（例えば、限定されるものではないが、相同組換えによる）に有用な細胞には、ほんの例として、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、および他の筋細胞などが含まれる。さらに、遺伝子改変動物の作製（例えば、限定されるものではないが、核導入による）に使用される細胞は、様々な器官、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道、および他の泌尿器などから得ることができる。細胞は、すべての体細胞または生殖細胞を含む体の任意の細胞または器官から得ることができる。
【０１９４】
加えて、遺伝子改変できる動物細胞は、様々な異なる器官および組織、例えば、限定されるものではないが、皮膚、間充組織、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、および胚、胎仔、または成体動物のすべてまたは一部の分解された標本から得ることができる。本発明の一実施形態では、細胞は、限定されるものではないが、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、成体幹細胞、間葉幹細胞、肝実質細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュヴァン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、気泡細胞、腎細胞、網膜細胞、杆体細胞、錐状体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞からなる群より選択され得る。代替の一実施形態では、胚性幹細胞を使用することができる。胚性幹細胞系を利用しても良いし、または胚性幹細胞を、宿主、例えば、ブタ動物から新たに得ても良い。胚性幹細胞は、適切な線維芽細胞フィーダー層で増殖させるか、または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させることができる。
【０１９５】
胚性幹細胞は、好ましい生殖細胞型であり、胚性幹細胞系を利用しても良いし、または胚性幹細胞を、宿主、例えば、ブタ動物から新たに得ても良い。胚性幹細胞は、適切な線維芽細胞フィーダー層で増殖させるか、または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖させることができる。
【０１９６】
特に興味深い細胞には、他の系譜として、幹細胞、例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、間充織幹細胞など、ランゲルハンス島、ドーパミンを分泌し得る副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球、例えば、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、骨髄単核細胞など、ニューロン、グリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、肝細胞、例えば、肝実質細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、毛嚢細胞、および筋芽（筋）細胞が含まれる。
【０１９７】
特定の実施形態では、細胞は、線維芽細胞または線維芽細胞様細胞であり得、この線維芽細胞様細胞は、線維芽細胞と区別できない形態もしくは表現型、または少なくとも１０日、少なくとも１２日、少なくとも１４日、少なくとも１８日、もしくは少なくとも２０日の老化前の寿命、または相同組換えおよび非老化核の核導入を可能にする十分な寿命を有する；特有の一実施形態では、細胞は、胎仔線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、発達中の胎仔および成体動物から大量に得ることができるため、適した体細胞型である。これらの細胞は、短い倍加時間で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に増殖させることができ、かつ遺伝子ターゲティング処置手順に使用するためにクローン的に増殖させることができる。使用される細胞は、胎仔動物から得ても良いし、または新生仔もしくは成体動物由来でも良い。細胞は、成熟または非成熟であり得、分化細胞または未分化細胞であり得る。
【０１９８】
相同組換え
相同組換えは、内因性遺伝子における部位特異的改変を可能にするため、新規の変更をゲノムに加えることができる。相同組換えの第１のステップは、ＤＮＡ鎖の交換であり、ＤＮＡ２本鎖を相補的な配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ鎖と対合させて、ヘテロ２本鎖ＤＮＡを含む中間組換え構造を形成する（例えば、Ｒａｄｄｉｎｇ，Ｃ．Ｍ．、（１９８２）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１６：４０５；米国特許第４，８８８，２７４号を参照）。ヘテロ２本鎖ＤＮＡは、１本の相補鎖がＤＮＡ２本鎖に侵入している三重鎖形態を含む３本のＤＮＡ鎖（Ｈｓｉｅｈら、（１９９０）、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、４：１９５１；Ｒａｏら、（１９９１）、ＰＮＡＳ  ８８：２９８４））を含むいくつかの形態をとることができ、２本の相補的なＤＮＡ鎖がＤＮＡ２本鎖と対を形成すると、古典的Ｈｏｌｌｉｄａｙ組換え接合部またはカイ構造（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｒ．、（１９６４）、Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．５：２８２）が形成される、または二重Ｄループであり得る（「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  Ｌｏｏｐ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、米国特許出願第０７／７５５，４６２号、Ｓｅｐ．４、１９９１に出願）。形成されると、ヘテロ２本鎖構造は、鎖の切断と交換によって変化され得るため、侵入ＤＮＡ鎖のすべてまたは一部が、レシピエントＤＮＡ２本鎖にスプライシングされ、レシピエントＤＮＡ２本鎖のセグメントが付加または置換される。別法では、ヘテロ２本鎖構造は、遺伝子変換となり、侵入鎖の配列が、鋳型として侵入鎖を用いたミスマッチ塩基の修復によってレシピエントＤＮＡ２本鎖に移入される（Ｇｅｎｅｓ、第３版、（１９８７）、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｌｏｐｅｚら、（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：５６４３）。切断と再結合の機序によるか、または遺伝子変換の機序（複数可）によるかにかかわらず、相同的に対合した接合部におけるヘテロ２本鎖ＤＮＡの形成が、あるＤＮＡ分子から別のＤＮＡ分子への遺伝子配列情報の伝達に役立ち得る。
【０１９９】
遺伝子配列情報をＤＮＡ分子間で伝達する相同組換え（遺伝子変換および古典的な鎖切断／再結合）の能力は、標的相同組換えを、遺伝子工学および遺伝子操作における強力な方法にする。
【０２００】
相同組換えでは、入力ＤＮＡが、実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノムの部位と相互作用してその部位に組み込まれる。非相同（「ランダム」または「不正（ｉｌｌｉｃｉｔ）」）組み込みでは、入力ＤＮＡは、ゲノムの相同配列に見られないが、他の場所、多数の潜在的な位置の１つに組み込まれる。一般に、高等真核細胞での研究により、相同組換えの頻度は、ランダム組み込みの頻度よりも相当低いことが明らかにされた。これらの頻度の比は、相同組換え（すなわち、異種「ターゲティングＤＮＡ」とゲノムの対応する「標的ＤＮＡ」との間の組換え）による組み込みに依存する「遺伝子ターゲティング」に対して直接的な影響がある。本発明は、相同組換えを用いて遺伝子またはインサートを不活化し、細胞、例えば、上記の細胞における遺伝子を上方制御または活性化することができる。ＤＮＡは、機能的遺伝子産物の発現を防止するために、天然遺伝子（複数可）の少なくとも１つ、任意選択で２つのコピーに変更が導入された特定の遺伝子座における遺伝子（複数可）の少なくとも一部を含み得る。この変更は、挿入、欠失、置換、突然変異、またはこれらの組み合わせであり得る。変更が、不活化されている遺伝子の一方のコピーのみに導入される場合、標的遺伝子の１つの非突然変異コピーを有する細胞を増幅し、第２のターゲティングステップを行うことができ、この変更は、通常は第１の変更と異なるが、同じでも良く、欠失または置換が含まれる場合は、初めに導入された変更の少なくとも一部と重複し得る。この第２のターゲティングステップでは、相同の同じアームを有するが、異なる哺乳動物選択マーカーを含むターゲティングベクターを使用することができる。得られる形質転換細胞を、機能的標的抗原の非存在についてスクリーニングし、この細胞のＤＮＡを、野生型標的遺伝子の非存在を確認するためにさらにスクリーニングすることができる。別法では、表現型についてのホモ接合性は、突然変異がヘテロ接合性の宿主を交配して達成することができる。
【０２０１】
哺乳動物細胞における相同組換えの使用が多数の論文に記載されている。これらの論文の例として、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８１：３１５３−３１５７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、５：７１４−７２０；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２３０−２３４；Ｗａｋｅら、（１９８５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、８：２０８０−２０８９；Ａｙａｒｅｓら、（１９８５）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１１：３７５−３８８；Ａｙａｒｅｓら、（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、７：１６５６−１６６２；Ｓｏｎｇら、（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８４：６８２０−６８２４；Ｔｈｏｍａｓら、（１９８６）、Ｃｅｌｌ、４４：４１９−４２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、（１９８７）、Ｃｅｌｌ、５１：５０３−５１２；Ｎａｎｄｉら、（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５：３８４５−３８４９；およびＭａｎｓｏｕｒら、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２；ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ、（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ、２９４：１４６−１５４；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５７６−５７８；ＴｈｏｍａおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、（１９８７）、Ｃｅｌｌ、５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９８９）、Ｃｅｌｌ、５６：３１６−３２１が挙げられる。
【０２０２】
ランダム挿入
一実施形態では、導入遺伝子配列をコードするＤＮＡを、細胞の染色体にランダムに挿入することができる。ランダム組み込みは、当業者に周知のＤＮＡを細胞に導入する任意の方法によって行うことができる。これには、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターの使用、およびグループＩＩリボザイムが含まれ得る。一実施形態では、導入遺伝子をコードするＤＮＡは、レポーター遺伝子の活性化によって導入遺伝子およびその発現産物の存在を検出できるようにレポーター遺伝子を含むようにデザインすることができる。当技術分野で周知の任意のレポーター遺伝子、例えば、上記のレポーター遺伝子を使用することができる。細胞培養物中で、レポーター遺伝子が活性化された細胞を選択することにより、導入遺伝子を含む細胞を選択することができる。他の実施形態では、導入遺伝子をコードするＤＮＡは、エレクトロポレーションによって細胞に導入することができる。他の実施形態では、このＤＮＡは、リポフェクション、感染、または形質転換によって細胞に導入することができる。一実施形態では、エレクトロポレーションおよび／またはリポフェクションを使用して、線維芽細胞をトランスフェクトすることができる。特定の実施形態では、トランスフェクト線維芽細胞を、核導入用の核ドナーとして使用して、当技術分野で周知の、以下に記載されるトランスジェニック動物を作製することができる。
【０２０３】
次いで、レポーター遺伝子の存在確認のために染色された細胞を、ＦＡＣＳによって分類して細胞集団を濃縮し、目的の導入遺伝子をコードするＤＮＡを含む細胞の割合を高めることができる。他の実施形態では、次いで、ＦＡＣＳで分類された細胞を、一定期間、例えば、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間以上、またはこのような期間にわたって培養して、ＤＮＡを組み込んで安定なトランスフェクト細胞集団を得ることができる。
【０２０４】
トランスジェニック動物作製用のベクター
核酸ターゲティング・ベクター・コンストラクトを、細胞での相同組換えを達成するためにデザインすることができる。一実施形態では、ターゲティングベクターは、「ポリ（Ａ）トラップ」を用いてデザインされる。プロモータートラップとは異なり、ポリ（Ａ）トラップベクターは、標的細胞（すなわち、線維芽細胞またはＥＳ細胞）で発現されない遺伝子を含む多様な遺伝子を捕捉する。ポリ（Ａ）トラップベクターは、ポリＡシグナル欠損選択マーカー遺伝子の発現を駆動する構成的プロモーターを含む。ポリＡシグナルの置換は、下流エキソンにスプライシングされるようにデザインされたスプライシングドナー部位である。この戦略では、選択可能なマーカー遺伝子のｍＲＮＡを、内因性遺伝子の標的細胞での発現状態に関係なく、内因性遺伝子のポリＡシグナルの捕捉時に安定させることができる。一実施形態では、ポリアデニル化のシグナルが欠損した選択マーカーを含むターゲティングベクターが構築される。
【０２０５】
これらのターゲティングベクターは、限定されるものではないが、トランスフェクション、形質転換、ウイルス媒介性形質導入、またはウイルスベクター感染を含む任意の適切な方法によって哺乳動物細胞に導入することができる。一実施形態では、ターゲティングベクターは、目的のゲノム配列に相同な３’組換えアームおよび５’組換えアーム（すなわち、フランキング配列）を含み得る。３’組換えアームおよび５’組換えアームは、このゲノム配列の少なくとも１つの機能的領域の３’末端および５’末端に隣接するようにデザインすることができる。機能的領域のターゲティングは、機能的領域を不活化させて、細胞が機能タンパク質を産生できなくすることができる。別の実施形態では、相同ＤＮＡ配列は、１つ以上のイントロン配列および／またはエキソン配列を含み得る。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー配列、例えば、高度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始および／またはエンハンサー配列、ポリＡ尾部配列、および／または原核および／または真核宿主細胞でコンストラクトを発現させる核酸配列を含み得る。選択マーカーは、５’組換えアーム配列と３’組換えアーム配列との間に位置し得る。
【０２０６】
細胞の標的遺伝子座の改変は、ＤＮＡを細胞に導入することによって行うことができ、このＤＮＡは、標的遺伝子座に相同であり、組み込まれたコンストラクトを含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。標的ベクターの相同なＤＮＡは、標的遺伝子座で染色体ＤＮＡと組換えられる。マーカー遺伝子は、その両側に、相同ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームが隣接し得る。ターゲティングベクターの構築方法は、例えば、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：２５１−２５５、２００２；国際公開第ＷＯ００／５１４２４号に記載されている。
【０２０７】
様々な酵素が、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入を触媒することができる。ウイルスインテグラーゼ、トランスポザーゼ、および部位特異的リコンビナーゼが、ウイルスゲノム、トランスポゾン、またはバクテリオファージの宿主ゲノム内への組み込みを媒介する。これらの特性を有する広範な酵素群は、多様な供給源に由来し得る。レトロウイルスは、ゲノムの相対単純性、使いやすさ、および形質導入細胞またはその子孫での導入遺伝子の長期の発現を可能にする宿主細胞のゲノムへの組み込み能力を含む、いくつかの有用な特徴を併せもっている。したがって、レトロウイルスは、数々の遺伝子治療プロトコルに使用されている。レンチウイルスベクターをベースとするベクターは、アデノ関連ウイルス（ｓｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）と同様に遺伝子治療およびトランスジェニック用途の両方の魅力的な候補である。このアデノ関連ウイルスは、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはヒトサイトメガロウイルスと共に哺乳動物細胞で同時に複製される小ＤＮＡウイルス（パルボウイルス）である。ウイルスゲノムは、本質的に２つだけのＯＲＦ（ｒｅｐ、非構造タンパク質、およびｃａｐ、構造タンパク質）からなり、このＯＲＦから、選択的スプライシングおよび選択的プロモーターの使用によって（少なくとも）７つの異なるペプチドが誘導される。ヘルパーウイルスの存在下で、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製を媒介する。組み込み、したがって潜在ウイルス感染が、ヘルパーウイルスの非存在下で起こる。トランスポゾンも興味深い。様々な生物で見られる移動ＤＮＡ（ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ）のセグメントが存在する。活性トランスポゾンは、多くの原核細胞系および昆虫で見られるが、機能的天然トランスポゾンは、脊椎動物には一切存在しない。ショウジョウバエＰ因子トランスポゾンは、ゲノム工学ツールとして長年使用されてきた。「眠れる森の美女」トランスポゾン（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）は、サケ科魚類で見られる非機能的トランスポゾンコピーから確立され、原核細胞または昆虫トランスポゾンよりも哺乳動物細胞で有意に活性である。部位特異的リコンビナーゼは、限られた配列相同性のみを有するＤＮＡセグメント間でのＤＮＡ鎖交換を触媒する酵素である。部位特異的リコンビナーゼは、３０〜２００のヌクレオチド長である認識配列に結合し、ＤＮＡ骨格を切断し、関連する２つのＤＮＡ二重らせんを交換し、ＤＮＡを再結合する。一部の部位特異的組換え系では、これらの反応のすべてを行うのに１つのポリペプチドで十分であるが、他のリコンビナーゼは、これらの課題を遂行するために多数のアクセサリータンパク質を必要とする。部位特異的リコンビナーゼは、異なる生化学特性を有する２つのタンパク質ファミリー、すなわちチロシンリコンビナーゼ（ＤＮＡがチロシン残基に共有結合する）およびセリンリコンビナーゼ（セリン残基で共有結合が起こる）に分類され得る。ゲノム改変手法に使用される最も人気の酵素は、Ｃｒｅ（大腸菌バクテリオファージＰ１由来のチロシンリコンビナーゼ）およびｆＣ３１インテグラーゼ（ストレプトミセスファージｆＣ３１由来の���リンリコンビナーゼ）である。部位特異的リコンビナーゼ由来のいくつかの他のバクテリオファージ（Ｆｌｐ、λインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼ、およびファージＴＰ９０１−１インテグラーゼを含む）が、哺乳動物ゲノムへの安定した遺伝子挿入を首尾よく媒介するために使用された。最近、部位特異的リコンビナーゼが、ストレプトミセスバクテリオファージから精製された。ｆＣ３１リコンビナーゼは、リゾルバーゼファミリーのメンバーであり、ファージの組み込みを媒介する。このプロセスでは、バクテリオファージａｔｔＰ部位が、細菌ゲノムの対応するａｔｔＢ部位に組換えられる。このクロスオーバーが、アクセサリータンパク質の非存在下で、もはやリコンビナーゼ作用の標的ではない２つの部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲを形成する。この反応は、哺乳動物細胞でも起こるため、治療遺伝子の部位特異的な組み込みを媒介するために使用することができる。チロシン−リコンビナーゼの部位特異性は、触媒ドメインとＤＮＡ認識ドメインが密接に絡み合っているため、直接のタンパク質操作による改変が困難である。したがって、特異性の変化は、活性の喪失によって達成される場合が多い。セリンリコンビナーゼは、より操作しやすく、Ｔｎ３リゾルバーゼの高活性誘導体は、ヒトＺｉｎｃフィンガー転写因子Ｚｉｆ２６８のＺｉｎｃフィンガードメインとの天然ＤＢＤの交換によって改変された。Ｚリゾルバーゼと呼ばれる得られたキメラタンパク質のＤＮＡ部位特異性は、Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ部位特異性に切り替わった。Ｚｉｎｃフィンガータンパク質は、あらゆるＤＮＡ配列を認識するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質進化によって改変することができるため、この手法は、治療遺伝子を正確なゲノム位置に組み込むことができるキメラリコンビナーゼの開発を可能にし得る。組換えの促進または媒介の方法には、部位特異的な組換えと相同組換えの組み合わせ、ＡＡＶベクター媒介組換え、およびＺｉｎｃフィンガーヌクレアーゼ媒介組換えが含まれる（参考文献：Ｇｅｕｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２５：４３３、２００９）。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、挿入された核酸に有用な生物学的特性または生化学的特性を与える核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を指す。本発明による「発現ベクター」には、ベクターで細胞が形質転換されると、ベクターに挿入またはクローニングされた１つ以上の分子の発現を促進できるベクターが含まれる。このような発現ベクターの例として、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは細胞で複製し得る、または複製され得る、あるいは望ましい核酸セグメントを動物の細胞内の望ましい位置に送達できる他の配列が挙げられる。本発明に有用な発現ベクターには、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクター、およびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、およびそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミドおよびファージミド、またはウイルスベースのベクター、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスが含まれる。ベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができ、この部位で、その配列が、ベクターの必須の生物学的機能を喪失することなく確実に切断され得、その複製およびクローニングをもたらすために、この部位に核酸断片をスプライシングすることができる。ベクターは、例えば、ＰＣＲ用のプライマー部位、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供することができる。明らかに、相同組換え、転位、または制限酵素の使用を必要とすることなく望ましい核酸断片を挿入する方法（例えば、限定されるものではないが、ＰＣＲ断片のＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号）、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｇｎ（登録商標）ブランドＰＣＲクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を利用して、本発明にしたがって使用されるベクターに核酸をクローニングすることができる。
【０２０９】
ＤＮＡを細胞に導入することによって、ホモ接合性の細胞を標的遺伝子座に作製することができ、このＤＮＡは、標的遺伝子座に相同であり、組み込まれたコンストラクトを含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。標的ベクターにおける相同ＤＮＡは、標的遺伝子座で染色体ＤＮＡと組換わる。マーカー遺伝子は、その両側に、相同ＤＮＡ配列、３’組換えアーム、および５’組換えアームが隣接し得る。ターゲティングベクターの構築方法は、当技術分野に記載されており、例えば、Ｄａｉら、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：２５１−２５５；国際公開第ＷＯ００／５１４２４号、図６；およびＧｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ；第２版、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５、２０００を参照されたい。
【０２１０】
様々なコンストラクトを、標的遺伝子座での相同組み換え用に調製することができる。通常は、コンストラクトは、標的遺伝子座と相同な、少なくとも２５ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐの配列を含み得る。
【０２１１】
様々な検討事項が、標的ＤＮＡ配列の相同性の程度、例えば、標的遺伝子座のサイズ、配列の有効性、標的遺伝子座における二重クロスオーバー事象の相対的効率、および標的配列の他の配列との類似性などの決定に関与し得る。ターゲティングＤＮＡは、実質的に同質遺伝子のＤＮＡが望ましい配列改変に隣接し、ゲノムの対応する標的配列が改変される配列を含み得る。実質的に同質遺伝子の配列は、対応する標的配列に対して少なくとも約９５％、９７〜９８％、９９．０〜９９．５％、９９．６〜９９．９％、または１００％同一であり得る（望ましい配列改変を除いて）。ターゲティングＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、好ましくは、１００％同一である少なくとも約７５、１５０、または５００塩基対のＤＮＡストレッチを共有し得る。したがって、ターゲティングＤＮＡは、標的にされる細胞系に密接に関連した細胞に由来しても良いし；またはターゲティングＤＮＡは、標的にされる細胞と同じ細胞系または動物の細胞に由来しても良い。
【０２１２】
適切な選択マーカー遺伝子には、限定されるものではないが：一定の培地基質で増殖できるようにする遺伝子、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）で増殖できるようにするｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）またはｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン、およびキサンチン）で増殖できるようにする細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）が含まれる。Ｓｏｎｇら、（１９８７）、Ｐｒｏｃ．、Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：６８２０−６８２４を参照されたい。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、第１６章も参照されたい。選択マーカーの他の例として：抗生物質などの化合物に対して耐性を付与する遺伝子、選択された基質で増殖できるようにする遺伝子、検出可能なシグナル、例えば、発光を生成するタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、高度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．およびＰ．Ｂｅｒｇ、（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：３２７−３４１）；およびハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１：６８９５−６９１１、（１９８３）、およびＴｅ  Ｒｉｅｌｅら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：６４９−６５１）を含む様々なこのようなマーカーが知られており、利用可能である。本発明の方法に有用な追加のレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびこれらの誘導体が含まれる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。レポーター遺伝子の抑制を決定する方法は、当技術分野で周知であり、この方法には、限定されるものではないが、蛍光定量法（例えば、蛍光分析法、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡検査法）、抗生物質耐性判定が含まれる。
【０２１３】
選択マーカーの組み合わせを使用することもできる。マーカーの組み合わせを使用するためには、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を、ターゲティングＤＮＡの外側に来るようにクローニングすることができる（望ましい場合は、別の選択マーカーを反対側に配置することができる）。ＤＮＡコンストラクトを標的にされる細胞に導入したら、細胞を、適切な抗生物質で選択することができる。選択マーカーを負の選択に使用することもできる。負の選択マーカーは、一般に、負の選択マーカーを発現する細胞を、その発現自体が有毒であるため、または有毒代謝物、例えば、単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）またはジフテリア毒素Ａをもたらす触媒を産生するために死滅させる。一般に、負の選択マーカーは、正確な組換え事象の後に消失するようにターゲティングベクターに組み込まれる。同様に、従来の選択マーカー、例えば、ＧＦＰは、例えば、ＦＡＣＳ分類を用いて負の選択に使用することができる。
【０２１４】
欠失は、少なくとも約５０ｂｐ、普通は少なくとも約１００ｂｐ、一般的には約２０ｋｂｐ以下であり得、この欠失は、通常は、エキソンの一部または１つ以上、イントロンの一部または１つ以上を含むコーディング領域の少なくとも一部を含み得、フランキング非コーディング領域の一部、特に５−非コーディング領域（転写調節領域）を含んでも含まなくても良い。したがって、相同領域は、コーディング領域を越えて５’−非コーディング領域まで、別法では３−非コーディング領域まで延長され得る。挿入は、一般に、１０ｋｂｐを超えない、通常は５ｋｂｐを超えない、一般に少なくとも５０ｂｐ、普通は少なくとも２００ｂｐであり得る。
【０２１５】
相同の領域（複数可）は、突然変異を含み得、突然変異は、フレームシフトの提供または重要なアミノ酸の変更において、標的遺伝子をさらに不活化することができ、または突然変異は、機能不全対立遺伝子の修正などを行うことができる。通常は、突然変異は、ほんの僅かな変化、相同フランキング配列の約５％以下、またはエキソンの活性部位における点突然変異などの１つのヌクレオチドの変化でさえもあり得る。遺伝子の突然変異が望ましい場合は、マーカー遺伝子は、転写時に標的遺伝子から切断されるようにイントロンに導入することができる。
【０２１６】
様々な検討事項が、標的ＤＮＡ配列の相同性の程度、例えば、標的遺伝子座のサイズ、配列の有効性、標的遺伝子座における二重クロスオーバー現象の相対的効率、および標的配列の他の配列との類似性などの決定に関与し得る。ターゲティングＤＮＡは、実質的に同質遺伝子のＤＮＡが望ましい配列改変に隣接し、ゲノムの対応する標的配列が改変される配列を含み得る。実質的に同質遺伝子の配列は、対応する標的配列に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９５〜１００％、９７〜９８％、９９．０〜９９．５％、９９．６〜９９．９％、または１００％同一であり得る（望ましい配列改変を除いて）。特定の実施形態では、ターゲティングＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、１００％同一である少なくとも約７５、１５０、または５００塩基対のＤＮＡストレッチを共有し得る。したがって、ターゲティングＤＮＡは、標的にされる細胞系に密接に関連した細胞に由来しても良いし；またはターゲティングＤＮＡは、標的にされる細胞と同じ細胞系または動物の細胞に由来しても良い。
【０２１７】
コンストラクトは、当技術分野で周知の方法にしたがって調製することができ、様々な断片を、互いに結合して適切なベクターに導入し、クローニングし、分析し、望ましいコンストラクトが達成されるまでさらに操作することができる。限定解析、切除、プローブの同定などを可能にするために、配列に様々な改変を加えることができる。望ましい場合は、サイレント突然変異を導入することができる。様々な段階で、限定解析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅、プライマー修復、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異生成などを利用することができる。
【０２１８】
コンストラクトは、細菌ベクターを用いて調製することができ、原核生物複製系、例えば、大腸菌によって認識可能な開始点を含み、各段階でコンストラクトをクローニングし、分析することができる。挿入に使用されるマーカーと同じまたは異なるマーカーを利用することができ、このマーカーは、標的細胞に導入する前に除去することができる。コンストラクトを含むベクターが完成したら、このベクターを、細菌配列の除去、線状化、相同配列への短い欠失の導入などによってさらに操作することができる。最後の操作の後に、コンストラクトを細胞に導入することができる。
【０２１９】
ＤＮＡコンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトの宿主細胞への導入を可能にするために使用できる技術には、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、ＤＮＡの核へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染、微粒子銃、精子媒介遺伝子導入、または当業者に周知の任意の他の技術が含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、１本鎖または２本鎖、線状または環状、弛緩または高次コイルＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞をトランスフェクトする様々な技術については、例えば、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８５、ｐｐ．５２７−５３７、（１９９０）を参照されたい。
【０２２０】
以下のベクターは、例として示すものである。細菌：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ファージスクリプト、ＰｓｉＸｌ７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨｌ６ａ、ｐＮＨｌ８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４Ｏ、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。また、任意の他のプラスミドおよびベクターは、宿主で複製可能かつ生存可能である限り使用することができる。当技術分野で周知のベクターおよび市販されているベクター（およびそれらの変異体または誘導体）は、本発明にしたがって操作して、本発明の方法に使用される１つ以上の組換え部位を含めることができる。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手可能である。対象となる他のベクターには、真核細胞発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２ｌ、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ  Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐ．）、およびそれらの変異体または誘導体が含まれる。
【０２２１】
他のベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ’ｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ’ｓ（細菌人工染色体）、Ｐ１（大腸菌ファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０、ｐＳＹ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびそれらの変異体または誘導体が含まれる。ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターも使用することができる（例えば、国際公開第ＷＯ０３／０５９９２３号；Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、ＰＮＡＳ、１００：１８４４−１８４８（２００３）を参照のこと）。
【０２２２】
対象となる追加のベクターには、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８ｌＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯｌ．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のλＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ；Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２Ｌ１Ｃ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴｌ２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−ｌ７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ  ＧＬ、ｐＧＡＤ  ＧＨ、ｐＧＡ��１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐｌＥｘ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４  Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ  ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ  Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ  ＫＳ＋／−、ｐＢＣ  ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−ｌ、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３  ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ  Ａ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４ｌ５、およびｐＲＳ４ｌ６が含まれる。
【０２２３】
追加のベクターには、例えば、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、およびこれらの変異体または誘導体が含まれる。
【０２２４】
プロモーター
本発明の動物を作製するために使用されるベクターコンストラクトは、例えば、配列に機能的に連結されるプロモーターを含む調節配列を含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に周知であり、市販されている。
【０２２５】
特有の実施形態では、本発明は、膵臓組織で導入遺伝子、特に免疫調節物質または抗凝固導入遺伝子を発現する動物、組織、および細胞を提供する。特定の組織を標的とする発現にするために、腎臓の遺伝子発現用のプロモーターを含むベクターを用いて動物を開発する。
【０２２６】
一実施形態では、核酸コンストラクトは、発現される導入遺伝子配列に機能的に連結された調節配列を含む。一実施形態では、調節配列は、プロモーター配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、調節可能なプロモーターであり得る。このような系では、例えば、薬物を使用して、ペプチドが動物、組織、または器官で発現されるか否かを制御することができる。例えば、発現は、器官または組織がブタの一部である場合は防止され得るが、ブタがヒトに長期にわたって移植されて細胞免疫応答に打ち勝つと、発現が誘導される。加えて、発現のレベルは、レシピエントの免疫系の免疫抑制が起こらないように調節可能なプロモーター系によって制御することができる。調節可能なプロモーター系は、限定されるものではないが、次の遺伝子系：金属、例えば、銅によって誘導可能なメタロチオネインプロモーター（ＬｉｃｈｔｌｅｎおよびＳｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ．、２００１、１３１、（４５−４６）：６４７−５２を参照）；テトラサイクリン調節系（Ｉｍｈｏｆら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、２０００、２（２）：１０７−１６を参照）；エクジソン調節系（Ｓａｅｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、２０００、９７（２６）：１４５１２−７を参照）；チトクロームＰ４５０誘導プロモーター、例えば、ＣＹＰ１Ａ１プロモーター（Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１９９２、６（２）：７０６−１０を参照）；ミフェプリストーン誘導系（ＳｉｒｉｎおよびＰａｒｋ、Ｇｅｎｅ．、２００３、３２３：６７−７７を参照）；クマリン活性系（Ｚｈａｏら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００３、１４（１７）：１６１９−２９を参照）；マクロライド誘導系（マクロライド抗生物質、例えば、ラパマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン（ｒｏｘｉｔｉｒｏｍｙｃｉｎ）に対して応答性）（Ｗｅｂｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２、２０（９）：９０１−７；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２００３、７（６）：７９０−８００を参照）；エタノール誘導系（Ｇａｒｏｏｓｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．、２００５、５６（４１６）：１６３５４２；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００５、１３８（３）：１２５９−６７を参照）；ストレプトグラミン誘導系（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、１８（１１）：１２０３−８を参照）；求電子試薬誘導系（ＺｈｕおよびＦａｈｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１、２８９（１）：２１２−９を参照）；およびニコチン誘導系（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５、３３（１２）：ｅ１０７を参照）から選択され得る。
【０２２７】
特定の実施形態では、プロモーターは、特に抗凝固因子または免疫抑制剤の発現における組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターは、最も好ましくは膵臓特異的プロモーターである（Ｅｄｌｕｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２３０：９１２−９１６）。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、ｉｎｓ２である（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ  Ｐら、Ｃｅｌｌ、１９７９、１８：５４５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ００７４７およびＪ００７４８。
【０２２８】
他の実施形態では、エンハンサー要素は、組織特異的に導入遺伝子の発現の増加を促進するために核酸コンストラクトに使用される。エンハンサーは、遺伝子転写効率を大幅に変更する外部要素である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、ｐｐ．７０８−７１０、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、１９８７（著作権））。特定の実施形態では、ｐｄｘ−１エンハンサー（ＩＰＦ−１、ＳＴＦ−１、およびＩＤＸ１としても知られている（Ｇｅｒｒｉｓｈ  Ｋら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２００４、１８（３）：５３３；Ｏｈｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９３、Ｎｏｖ、１２（１１）：４２５１−９；Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９９３、７（１０）：１２７５−８３；Ｍｉｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９４、１３（５）：１１４５−５６；Ｓｅｒｕｐら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９６、９３（１７）：９０１５−２０；Ｍｅｌｌｏｕｌら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．、２００２、５１  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ３２０−５；Ｇｌｉｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２０００、２７５（３）：２１９９−２０４；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３３４６１５））は、導入遺伝子（複数可）の膵臓特異的な発現のためにｉｎｓ２プロモーターと組み合わせて使用される。一定の実施形態では、動物は、エンハンサー要素と組み合わせられたプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する。特定の実施形態では、動物は、膵臓組織特異的プロモーター要素、例えば、インスリンプロモーターを含み、エンハンサー要素をさらに含む。一部の実施形態では、エンハンサー要素はＰＤＸ１である。特定の実施形態では、動物、組織、または細胞は、ＰＤＸ１エンハンサーと組み合わせられたＲＩＰプロモーターを含む。他の実施形態では、プロモーターは、ユビキタスプロモーターであり得る。ユビキタスプロモーターには、限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０のようなウイルスプロモーターが含まれる。適切なプロモーターには、β−アクチンプロモーター、γ−アクチンプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、Ｈ２Ｋ、ユビキチン、およびｒｏｓａプロモーターも含まれる。
【０２２９】
トランスジェニック細胞の選択
ある場合には、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノムへの標的導入遺伝子の挿入または組み込み（すなわち、相同組換えによる）の結果である遺伝子改変を有する。ある場合には、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノムへの非標的（ランダム）組み込みの結果である遺伝子改変を有する。細胞は、適切な組み込みをもたらす細胞を同定するために適切に選択された培地で増殖させることができる。次いで、望ましい表現型を示す細胞を、限定解析、電気泳動法、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、または当技術分野で周知の別の技術によってさらに分析することができる。標的遺伝子部位における適切な挿入を示す断片を同定することにより、（または、ランダム組み込み技術が望ましい結果を生む非標的の例では）、相同組換え（または望ましい非標的組み込み事象）が起きて標的遺伝子が不活化または他の方法で改変された細胞を同定することができる。
【０２３０】
選択マーカー遺伝子の存在は、標的コンストラクトの宿主ゲノムへの組み込みを立証する。次いで、望ましい表現型を示す細胞を、相同または非相同組換えが起きたか否かを立証するために、限定解析、電気泳動法、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析してＤＮＡを分析することができる。これは、挿入断片用のプローブを利用して、次いでコンストラクトの隣接領域を越えて伸長した遺伝子の存在について、挿入断片に隣接した５’および３’領域の配列を決定することによって、また欠失が導入されている場合にはこの欠失の存在を同定することによって決定することができる。コンストラクト内の配列に相補的であり、コンストラクトの外部および標的遺伝子座にある配列に相補的であるプライマーも使用することができる。このようにして、相同組換えが起きた場合にのみ、両方のプライマーが相補鎖中に存在するＤＮＡ２本鎖を得ることができる。例えば、プライマー配列または予想されるサイズの配列の存在を実証することによって、相同組換えの発生が裏付けられる。
【０２３１】
相同組換え事象のスクリーニングに使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、（１９８８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：８８８７−８９０３；およびＪｏｙｎｅｒら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：１５３−１５６に記載されている。
【０２３２】
第１ラウンドのターゲティングから（またはゲノムへの非標的（ランダム）組み込みから）得られる細胞系は、組み込まれた対立遺伝子がヘテロ接合性である可能性が高い。両方の対立遺伝子が改変されているホモ接合性は、様々な方法で達成することができる。１つの手法では、１つのコピーが改変された多数の細胞を増殖させ、次いでこれらの細胞に対して、異なる選択マーカーを用いて別のラウンドのターゲティング（または非標的（ランダム）組み込み）を行う。別法では、ホモ接合性は、改変された対立遺伝子がヘテロ接合性である動物を交配させて得ることができる。場合によっては、２つの異なる改変対立遺伝子を有することが望ましいであろう。これは、一連のラウンドの遺伝子ターゲティング（またはランダム組み込み）の成功によって、またはそれぞれが望ましい改変対立遺伝子の一方を有するヘテロ接合体の交配によって得ることができる。一定の実施形態では、動物の少なくとも１つの要素が、特にホモ接合性動物を開発する際の、対立遺伝子における自然発生の突然変異の選択によって得られる。一定の実施形態では、選択技術を使用して、非常に高いレベルの選択剤に曝露することによってヘテロ接合性細胞から相同なノックアウト細胞を得る。このような選択は、例えば、ジェネティシン（Ｇ４１８）などの抗生物質の使用によって行うことができる。
【０２３３】
次いで、トランスフェクトされた細胞または他の方法で適切なベクターが組み込まれた細胞を、遺伝子型分析または表現型分析によって選択または同定することができる。一実施形態では、細胞をトランスフェクトし、適切に選択された培地で増殖させて組み込みベクターを含む細胞を同定する。選択マーカー遺伝子の存在は、トランスフェクト細胞における導入遺伝子コンストラクトの存在を示唆する。次いで、望ましい表現型を示す細胞を、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子（複数可）の組み込みを確認するために、ＤＮＡを分析する限定解析、電気泳動法、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析することができる。導入遺伝子配列（複数可）に相補的なプライマーも使用することができる。相同組換えおよびランダム組み込み事象のスクリーニングに使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、当技術分野で周知であり、例えば、ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：８８８７−８９０３、１９８８；およびＪｏｙｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：１５３−１５６、１９８９を参照されたい。ネオマイシン遺伝子を駆動する突然変異体ポリオーマエンハンサーとチミジンキナーゼプロモーターの特定の組み合わせが、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ、上記、１９８７；ＮｉｃｈｏｌａｓおよびＢｅｒｇ、（１９８３）、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、Ｓｉｖｅｒ、Ｍａｒｔｉｎ、およびＳｔｒｉｋｌａｎｄ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（ｐｐ．４６９−４９７））；ならびにＬｉｎｎｅｙおよびＤｏｎｅｒｌｙ、Ｃｅｌｌ、３５：６９３−６９９、１９８３によって胚性幹細胞およびＥＣ細胞の両方において活性であることが示された。
【０２３４】
相同組換えを受けた細胞は、様々な方法によって同定することができる。一実施形態では、選択方法は、細胞に対する免疫応答の非存在を、例えば、ヒト抗ｇａｌ抗体によって検出することができる。他の実施形態では、選択方法は、細胞または組織に暴露されたときにヒト血液中の凝固のレベルを評価することを含み得る。抗生物質耐性による選択が、スクリーニングでは最も一般的に使用されている。この方法は、ターゲティングベクターにおける耐性遺伝子の存在を検出することができるが、組み込みが標的組換え事象であるかまたはランダム組み込みであるかどうかを直接は示さない。別法では、マーカーは、ＧＦＰもしくはＲＦＰなどの蛍光マーカー遺伝子、または細胞分類もしくはＦＡＣ分析によって細胞表面上で検出可能な遺伝子であり得る。ある技術、例えば、ポリＡおよびプロモータートラップ技術は、標的事象の可能性を高めるが、望ましい表現型が達成されたという直接の証拠は示さない。加えて、負の形態の選択を用いて、標的組み込みについて選択することができる；これらの場合、細胞に対して致死性の因子である遺伝子（例えば、ＴｋまたはジフテリアＡ毒素）が、標的事象のみが細胞の死を回避させることができるように挿入される。次いで、これらの方法によって選択された細胞を、遺伝子破壊、ベクターの組み込み、および最終的な遺伝子の欠失についてアッセイすることができる。これらの場合、選択が、変更された表現型においてではなく、ターゲティングベクターの組み込みの検出に基づいているため、点突然変異ではない標的ノックアウト、遺伝子の再編成もしくは切断、または他のこのような改変のみを検出することができる。
【０２３５】
特徴付けは、限定されるものではないが、次の技術：ＰＣＲ分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、特異的レクチン結合アッセイ、および／または配列決定分析によってさらに達成することができる。表現型の特徴付けは、免疫蛍光法、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲなどによる細胞におけるＲＮＡの転写についての検査を含む様々なアッセイにおける抗マウス抗体の結合によっても達成することができる。
【０２３６】
他の実施形態では、ＧＴＫＯ動物または細胞は、追加の遺伝子改変を含む。遺伝子改変には、単に相同ターゲティングだけではなく、外来性遺伝子のランダム組み込み、あらゆる種類の遺伝子の突然変異、欠失、および挿入も含まれ得る。追加の遺伝子改変は、本明細書に記載されるトランスジェニック細胞および動物から得た細胞をさらに遺伝子改変することによって、または本明細書に記載される動物をさらに遺伝子改変された動物と交配させることによって行うことができる。このような動物は、αＧＴ遺伝子、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子（例えば、米国特許第７，３６８，２８４号を参照）、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１５５０９５号を参照）、および／またはＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００６／００６８４７９号を参照）の少なくとも１つの対立遺伝子の発現を排除するために改変することができる。追加の実施形態では、本明細書に記載される動物は、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、および／またはグルコシルトランスフェラーゼのファミリーの任意のメンバーを発現させるために遺伝子改変も含み得る。これらの追加の遺伝子改変を達成するために、一部の実施形態では、複数の遺伝子改変を含むように細胞を改変することができる。他の実施形態では、複数の遺伝子改変を達成するために動物を互いに交配することができる。特有の一実施形態では、本明細書に記載されるプロセス、配列、および／またはコンストラクトにしたがって作製された、機能的免疫グロブリンの発現を欠いた動物、例えば、ブタを、αＧＴの発現を欠いた動物（例えば、国際公開第ＷＯ０４／０２８２４３号に記載されている）、例えば、ブタと交配させることができる。
【０２３７】
別の実施形態では、異種移植片拒絶反応に関与する追加の遺伝子の発現を、排除または減少させることができる。このような遺伝子には、限定されるものではないが、ＣＭＰ−ＮＥＵＡｃヒドロキシラーゼ遺伝子、ｉｓｏＧｌｏｂｏｓｉｄｅ３シンターゼ遺伝子、およびＦｏｒｓｓｍａｎシンターゼ遺伝子が含まれる。
【０２３８】
加えて、補体媒介溶解の抑制に関与する、遺伝子または補体関連タンパク質をコードするｃＤＮＡを、本発明の動物および組織で発現させることもできる。このような遺伝子には、限定されるものではないが、ＣＤ５９、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、およびＣＤ４６（例えば、国際公開第ＷＯ９９／５３０４２号；Ｃｈｅｎら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第６巻、第３刷、１９４頁、Ａｕｇｕｓｔ  １９９９、これにはＣＤ５９／ＤＡＦ導入遺伝子を発現するブタが記載されている；Ｃｏｓｔａ  Ｃら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２  Ｊａｎｕａｒｙ；９（１）：４５−５７、これにはヒトＣＤ５９およびＨ−トランスフェラーゼを発現するトランスジェニックブタが記載されている；Ｚｈａｏ  Ｌら；Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌ  Ｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００１  Ｊａｎ．１５；７１（１）：１３２−４２、これにはヒトＣＤ４６トランスジェニックブタが記載されている）が含まれる。
【０２３９】
追加の改変には、例えば、「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」という名称の国際公開第ＷＯ００／３１１２６号に記載されているような、細胞によって細胞付着分子の発現を下方制御する抗体などの化合物、および、例えば、「Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ２（Ｂ７／ＣＤ２８  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」という名称の国際公開第ＷＯ９９／５７２６６号に記載されているような、シグナル２による共刺激が異種ドナー生物由来の可溶型のＣＴＬＡ−４の臓器レシピエントへの投与などによって防止される化合物の発現が含まれ得る。
【０２４０】
核導入
本明細書に記載される有蹄動物またはブタなどの操作されたトランスジェニック動物を、当技術分野で周知の任意の適切な技術を用いて作製することができる。これらの技術には、限定されるものではないが、マイクロインジェクション（例えば、前核の）、精子媒介遺伝子導入、卵子または接合子のエレクトロポレーション、および／または核移植術が含まれる。
【０２４１】
一定の実施形態では、精子媒介遺伝子導入を使用して、本明細書に記載される遺伝子改変された有蹄動物を作製することができる。導入遺伝子を挿入するための本明細書に記載される方法および組成物を使用して、本明細書に記載される、または当技術分野で周知の任意の技術によって精子細胞を遺伝子改変することができる。次いで、遺伝子改変された精子を使用して、人工授精、卵細胞質内精子注入法、または任意の他の周知の技術によって雌レシピエントを妊娠させることができる。一実施形態では、精子および／または精子頭部を、異種核酸と共に十分な時間インキュベートすることができる。十分な時間には、例えば、約３０秒〜約５分、典型的には約４５秒〜約３分、より典型的には約１分〜約２分が含まれる。
【０２４２】
遺伝子導入用のベクターとしての精子細胞の使用の可能性が、最初にＢｒａｃｋｅｆｆら、Ｐｒｏｃ．、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、６８：３５３−３５７（１９７１）によって提案された。続いて、裸ＤＮＡによってインキュベートされた卵母細胞と精子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精後のトランスジェニックマウスおよびブタの作製が報告されたが（例えば、Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ、５７：７１７−７２３、（１９８９）、およびＧａｎｄｏｌｆｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４、１０（１９８９）を参照）、他の研究室は、これらの実験を繰り返すことができなかった（例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ、５９：２３９−２４１（１９８９）、およびＧａｖｏｒａら、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１：２８７−２９１、（１９９１）を参照）。その後、精子媒介遺伝子導入が、ニワトリ（例えば、ＮａｋａｎｉｓｈｉおよびＩｒｉｔａｎｉ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、３６：２５８−２６１、（１９９３））；マウス（例えば、Ｍａｉｏｎｅ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、５９：４０６、（１９９８））；およびブタ（例えば、Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．、２９：３５０８−３５０９、（１９９７）；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９９：１４２３０−５、（２００２）；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、６４−２８４−９１、（２００３）を参照）で成功した。同様の技術が、米国特許第６，３７６，７４３号；２００２年４月２３日発行、米国特許出願公開第２００１００４４９３７号；２００１年１１月２２日公開、および同第２００２０１０８１３２号；２００２年８月８日に公開にも記載されている。
【０２４３】
一部の実施形態では、卵細胞質内精子注入法を使用して、本明細書に記載される遺伝子改変有蹄動物を作製することができる。これは、未受精卵母細胞の細胞質内に外来性核酸および精子を同時に挿入してトランスジェニック受精卵母細胞を作製し、トランスジェニック受精卵母細胞がトランスジェニック胚に発達して、望ましい場合は生きた仔に発育させることによって達成することができる。精子は、膜が破壊された精子頭部または除膜精子頭部とすることができる。同時挿入ステップは、精子を外来性核酸と共に十分な時間、例えば、約３０秒〜約５分、典型的には約４５秒〜約３分、より典型的には約１分〜約２分プレインキュベートするサブステップを含み得る。卵母細胞への精子と外来性核酸の同時挿入は、マイクロインジェクションによって行うことができる。精子と混合される外来性核酸は、本明細書に記載されるように２つ以上の導入遺伝子が導入されたトランスジェニック胚を作製するために２つ以上の導入遺伝子を含み得る。卵細胞質内精子注入法は、当技術分野で周知の任意の技術によって達成することができ、例えば、米国特許第６，３７６，７４３号を参照されたい。
【０２４４】
当技術分野で周知の任意の追加の技術を使用して、導入遺伝子を動物に導入することができる。このような技術には、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（例えば、Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．およびＷａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．、１９８９、米国特許第４，８７３，１９１号を参照）；生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８２：６１４８−６１５２を参照）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：３１３−３２１；Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．、１９９４、国際公開第９４／２６８８４号を参照）；胚のエレクトロポレーション（例えば、Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：１８０３−１８１４を参照）；細胞銃；トランスフェクション；形質導入；レトロウイルス感染；アデノウイルス感染；アデノウイルス関連感染；リポソーム媒介遺伝子導入；裸ＤＮＡの導入；および精子媒介遺伝子導入（例えば、Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９、Ｃｅｌｌ、５７：７１７−７２３）；などが含まれる。このような技術の評価については、例えば、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｔｈａｌｓ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．、１１５：１７１−２２９を参照されたい。特定の実施形態では、有蹄動物におけるＣＴＬＡ４および／またはＣＴＬＡ４−ＩＧ融合遺伝子の発現は、これらの技術によって達成することができる。
【０２４５】
一実施形態では、導入遺伝子をコードするコンストラクトのマイクロインジェクションを使用してトランスジェニック動物を作製することができる。一実施形態では、核酸コンストラクトまたはベクターは、接合子の前核に顕微注入することができる。一実施形態では、このコンストラクトまたはベクターを、接合子の雄性前核に注入することができる。別の実施形態では、このコンストラクトまたはベクターを、接合子の雌性前核に注入することができる。さらなる実施形態では、このコンストラクトまたはベクターを、精子媒介性遺伝子導入によって注入することができる。
【０２４６】
導入遺伝子コンストラクトまたはベクターのマイクロインジェクションは、次のステップ：雌ドナーの過剰排卵；卵子の外科的除去、卵子の受精；導入遺伝子転写単位の胚の前核への注入；および通常は同じ種である偽妊娠代理母の生殖器管へのトランスジェニック胚の導入を含み得る。例えば、米国特許第４，８７３，１９１号、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５、ＰＮＡＳ、８２：４４３８；Ｈｏｇａｎら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、“Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｖｎｓｈａｍ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０、“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ−−Ａ  Ｖｉｄｅｏ  Ｇｕｉｄｅ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。トランスジェニックブタは、導入遺伝子コンストラクトまたはベクターのブタ胚へのマイクロインジェクションによって日常的に作製される。一実施形態では、導入遺伝子の存在は、各仔ブタの尻尾の組織からゲノムＤＮＡを単離して、約５マイクログラムのこのゲノムＤＮＡを導入遺伝子特異的プローブを用いて核酸ハイブリダイゼーション分析を行って検出することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、例えば、Ｂｌｅｃｋら、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．、７６：３０７２［１９９８］に開示され；また、米国特許第６，８７２，８６８号；同第６，０６６，７２５号；同第５，５２３，２２６号；同第５，４５３，４５７号；同第４，８７３，１９１号；同第４，７３６，８６６号；および／または国際公開第ＷＯ／９９０７８２９号に記載されているように、当業者に周知の任意の方法にしたがって作製することができる。
【０２４７】
一実施形態では、前核マイクロインジェクション法は、本発明のコンストラクトまたはベクターを含む導入遺伝子の少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、または５００のコピーを、例えば、本明細書に開示される最適なプロモーターに連結するステップ、次いで外来ＤＮＡを細いガラス針で受精卵に注入することができるステップを含み得る。一実施形態では、ＤＮＡを、接合子の雄性前核に注入することができる。ブタ接合子は、不透明であるため、核構造の視覚化は困難であり得る。一実施形態では、ブタ接合子の前核または核は、例えば、１５０００ｇで３ｍｍの遠心分離後に視覚化することができる。前核の注入は、標準的なマイクロインジェクション装置を使用して拡大して行うことができる。接合子を、尖っていない保持ピペットで保持することができ、注入ピペットで透明帯、原形質膜、および前核膜に刺入することができる。尖っていない保持ピペットは、例えば、約５０μｍの小口径を有し得る。注入ピペットは、例えば、約１５μｍの、保持ピペットよりも小さい口径を有し得る。ＤＮＡの組み込みは、宿主ＤＮＡの修復機能として複製中に起こる。次いで、外来ＤＮＡを含むこれらの卵子を、当業者に周知の任意の技術にしたがって、胚の妊娠のために代理母に移植することができる。
【０２４８】
一部の実施形態では、前核マイクロインジェクションを、受精の１２時間後に接合子に対して行うことができる。このような遺伝子の取り込みは、数回の細胞周期遅れ得る。この結果は、取り込みの細胞周期によって決まり、一部の細胞系譜のみが、導入遺伝子を有し得、モザイクの子孫となる。望ましい場合は、モザイク動物を交配して、本当の生殖系列トランスジェニック動物を作製することができる。
【０２４９】
他の実施形態では、導入遺伝子を含むブタ細胞などの有蹄動物細胞をドナー細胞として使用して、クローントランスジェニック動物を作製するための除核卵母細胞への核導入用の核を提供することができる。一実施形態では、有蹄動物細胞は、核導入用のドナー細胞として有用にするために、導入遺伝子タンパク質を発現する必要がない。一実施形態では、ブタ細胞を操作して、プロモーターを含む核酸コンストラクトまたはベクターから導入遺伝子を発現させることができる。別法では、ブタ細胞を操作して、相同組換えによって内因性プロモーターの制御下で導入遺伝子を発現させることができる。一実施形態では、導入遺伝子核酸配列を、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、または両方の制御下でゲノムに挿入することができる。別の実施形態では、導入遺伝子核酸配列を、ユビキタスプロモーターの制御下でゲノムに挿入することができる。一定の実施形態では、体細胞における標的相同組換えを可能にするようにデザインされたターゲティングベクターが提供される。相同組換えによって目的の内因性遺伝子を標的にするために、これらのターゲティングベクターを哺乳動物細胞に転換することができる。一実施形態では、ターゲティングコンストラクトは、上流配列と共に読み枠に入り、活性な融合タンパク質が産生されるように、導入遺伝子ヌクレオチド配列および選択マーカー遺伝子の両方を内因性遺伝子に挿入する。細胞を、本発明の方法を用いてコンストラクトで形質転換することができ、選択マーカーによって選択し、次いで組み換え体の存在についてスクリーニングする。
【０２５０】
本発明は、体細胞核導入によって、一定の導入遺伝子を含むブタなどの有蹄動物をクローニングする方法を提供する。一般に、ブタは、次のステップ：ドナー核の供給源として使用するのに望ましい分化ブタ細胞を得るステップ；ブタから卵母細胞を得るステップ；前記卵母細胞を除核するステップ；例えば、融合または注入によって、望ましい分化細胞または細胞核を除核卵母細胞に導入して核導入（ＮＴ）単位を作製するステップ；得られたＮＴ単位を活性化させるステップ；およびＮＴ単位が胎仔で発生するように前記培養ＮＴ単位を宿主ブタに導入するステップを含む、核導入プロセスによって作製することができる。
【０２５１】
核導入技術または核移植術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：２５１−２５５；Ｐｏｌｅｊａｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：８６−９０、（２０００）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ６８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２１４−３  １、（２００７）；Ｖａｊｔａら、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ、１９（２）：４０３−２３、（２００７）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９５）、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、４３：１８１；Ｃｏｌｌａｓら、（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ  Ｄｅｖ．、３８：２６４−２６７；Ｋｅｅｆｅｒら、（１９９４）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、５０：９３５−９３９；Ｓｉｍｓら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：６１４３−６１４７；国際公開第９４／２６８８４号；同第Ｗｏ９４／２４２７４号、および同第ＷＯ９０／０３４３２号、米国特許第４，９４４，３８４号、同第５，０５７，４２０号、国際公開第ＷＯ９７／０７６６９号、同第ＷＯ９７／０７６６８号、同第ＷＯ９８／３０６８３号、同第ＷＯ００／２２０９８号、同第ＷＯ００４２１７号、同第ＷＯ００／５１４２４号、同第ＷＯ０３／０５５３０２号、同第ＷＯ０３／００５８１０号、米国特許第６，１４７，２７６号、同第６，２１５，０４１号、同第６，２３５，９６９号、同第６，２５２，１３３号、同第６，２５８，９９８号、同第５，９４５，５７７号、同第６，５２５，２４３号、同第６，５４８，７４１号、およびＰｈｅｌｐｓら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：４１１−４１４、（２００３）を参照）。
【０２５２】
本発明の導入遺伝子を含むように改変されたドナー細胞核が、レシピエントブタ卵母細胞に導入される。この方法の使用は、特定のドナー細胞型に限定されない。ドナー細胞は、Ｗｉｌｍｕｔら、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６；またはＣｉｂｅｌｌｉら、（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１２５６−１２５８に記載されている通りであり得る。核導入にうまく使用することができる胚、胎仔、および成体の体細胞を含むすべての正常な核型の細胞を原則として使用することができる。胎仔線維芽細胞は、ドナー細胞の特に有用なクラスである。核導入の一般的に適切な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９５）、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、４３：１８１、Ｃｏｌｌａｓら、（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、３８：２６４−２６７、Ｋｅｅｆｅｒら、（１９９４）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０：９３５−９３９、Ｓｉｍｓら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’Ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：６１４３−６１４７、国際公開第ＷＯ−Ａ−９４２６８８４号、同第ＷＯ−Ａ−９４２４２７４号、同第ＷＯ−Ａ−９８０７８４１号、同第ＷＯ−Ａ−９００３４３２号、米国特許第４，９９４，３８４号、および同第５，０５７，４２０号、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（２００７）、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ６８  Ｓｕｐｐｌ  １、Ｓ２１４−２３１、Ｖａｔｊａら、（２００７）、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  １９、４０３−４２３に記載されている。分化したドナー細胞または少なくとも部分的に分化したドナー細胞を使用することができる。ドナー細胞はまた、培養下であり得るが、必ずしも培養下でなくても良く、静止状態であり得る。静止状態である核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで静止状態に入る、または静止状態を出るように誘導され得る細胞である。従来技術の方法は、クローニング処置手順において胚細胞型も使用した（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６８、およびＳｔｉｃｅら、（１９９６）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２０、５４：１００−１１０を参照）。特定の実施形態では、線維芽細胞、例えば、ブタ線維芽細胞を、目的の導入遺伝子を含むように遺伝子改変することができる。
【０２５３】
卵母細胞の単離方法は、当技術分野で公知である。本質的に、この方法は、卵母細胞をブタの卵巣または生殖管から単離するステップを含み得る。入手しやすいブタ卵母細胞の供給源は、屠殺場の材料である。遺伝子操作、核導入、およびクローニングなどの技術の組み合わせでは、卵母細胞は、一般に、これらの細胞を核導入用のレシピエント細胞として使用できるようになる前、かつこれらの細胞を胚に発達させるために精子細胞で受精され得る前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させなければならない。このプロセスは、一般に、哺乳動物卵巣、例えば、屠殺場で得たウシ卵巣から未成熟（前期Ｉ）卵母細胞を採取し、受精または除核の前に卵母細胞が中期ＩＩ段階に達するまで成熟培地で卵母細胞を成熟させる必要がある。この中期ＩＩ段階になるには、ウシ卵母細胞の場合は、一般に吸引から約１８〜２４時間かかり、ブタ卵母細胞の場合は、一般に約３５〜５５時間かかる。この期間は、成熟期間として知られている。
【０２５４】
中期ＩＩ段階卵母細胞は、レシピエント卵母細胞であり得、この段階で、卵母細胞は、受精精子を処置するのと同様に導入された核を処置するのに十分な「活性化した状態」になり得る、または「活性化した状態」である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した中期ＩＩ段階卵母細胞は、核導入技術での使用に成功した。本質的に、成熟中期ＩＩ卵母細胞は、発情期の開始から、またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは同様のホルモンの注入から３５〜４８時間後または３９〜４１時間後の非過剰排卵または過剰排卵ブタから外科的に採取することができる。
【０２５５】
一定時間の成熟期間の後、卵母細胞を除核することができる。除核の前に、卵母細胞を取り出して、卵丘細胞の除去の前に、適切な培地、例えば、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＨＥＣＭまたはＴＣＭ１９９に入れることができる。次いで裸の卵母細胞を、極体についてスクリーニングすることができ、次いで極体の存在によって決定される、選択された中期ＩＩ卵母細胞を核導入に使用する。次いで、除核を行う。
【０２５６】
除核は、米国特許第４，９９４，３８４号に記載されているような周知の方法によって行うことができる。例えば、中期ＩＩ卵母細胞を、任意選択で７〜１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む即時除核用のＨＥＣＭに移すか、または適切な培地、例えば、１０％発情期ウシ血清が添加されたＣＲ１ａａなどの胚培養培地に移すことができ、次いで、例えば、２４時間以内、または１６〜１８時間以内に除核する。
【０２５７】
除核は、極体および近接する細胞質を除去するためにマイクロピペットを用いて顕微手術で行うことができる。次いで、卵母細胞を、除核に成功したものを同定するためにスクリーニングすることができる。卵母細胞をスクリーニングする１つの方法では、卵母細胞を、適切な維持倍地中で、３〜１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２染色剤で染色し、次いで卵母細胞を紫外線照射下で１０秒未満観察する。次いで、うまく除核できた卵母細胞を、適切な培養培地、例えば、ＣＲ１ａａ＋１０％血清中に移すことができる。
【０２５８】
次いで、除核卵母細胞と同種の１つの哺乳動物細胞を、ＮＴ単位を形成するために使用される除核卵母細胞の卵黄周囲腔に導入することができる。この哺乳動物細胞および除核卵母細胞を使用して、当技術分野で周知の方法にしたがってＮＴ単位を形成することができる。例えば、この細胞を、電気融合によって融合させることができる。電気融合は、原形質膜の一過性の破壊を引き起こすのに十分な電気パルスを供給することによって達成される。この原形質膜の破壊は、この膜が迅速に再生するため非常に短時間である。したがって、２つの近接する膜が破壊されるように誘導され、再生時に、脂質二重層が混ざり合い、小さなチャネルが、２つの細胞間で開き得る。このような小さな開口部の熱力学的不安定性により、この開口部は、２つの細胞が１つになるまで大きくなる。例えば、Ｐｒａｔｈｅｒらによる米国特許第４，９９７，３８４号を参照されたい。例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、およびリン酸緩衝溶液を含む様々な電気融合培地を使用することができる。例えば、この融合培地は、０．０５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．００１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２８０ミリモル（ｍＭ）のマンニトール溶液を含み得る（Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００２；４（２）：１０５−１２）。融合は、融合誘導剤としてＳｅｎｄａｉウイルスを用いても達成することができる（Ｇｒａｈａｍ、Ｗｉｓｔｅｒ  Ｉｎｏｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．、９、１９、１９６９）。また、核は、エレクトロポレーション融合を使用するのではなく、卵母細胞に直接注入することもできる。例えば、Ｃｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、３８：２６４−２６７を参照されたい。融合後、得られた融合ＮＴ単位は、活性化するまで適切な培地、例えば、ＣＲ１ａａ培地に入れておく。典型的には、活性化は、融合後まもなく、例えば、２４時間未満の後、またはウシＮＴの場合は約４〜９時間後、ブタＮＴの場合は１〜４時間後に起こり得る。
【０２５９】
ＮＴ単位は、周知の方法により活性化させることができる。このような方法は、例えば、本質的に、低温または実際に冷たい温度ショックをＮＴ単位に加えることによって、生理学的温度未満でＮＴ単位を培養するステップを含む。これは、胚が通常曝露される生理学的温度条件より低い室温でＮＴ単位を培養することによって最も簡便に行うことができる。別法では、活性化は、既知の活性化剤の添加によって達成することができる。例えば、授精の際の精子の卵母細胞への進入は、融合前（ｐｒｅｌｕｓｉｏｎ）卵母細胞を活性化して、核導入後に多数の生存可能な妊娠および多数の遺伝的に同一のウシをもたらすことができることを示した。また、電気ショックおよび化学ショックなどの処置は、融合後にＮＴ胚を活性化させるために使用することができる。例えば、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらによる米国特許第５，４９６，７２０号を参照されたい。加えて、活性化は、卵母細胞における二価カチオンのレベルを同時にまたは連続的に増加させ、その卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化を減少させることによっても起こり得る。これは、一般に、二価カチオン、例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、またはカルシウムを、例えば、イオノフォアの形態で、卵母細胞細胞質へ導入することによって起こり得る。二価カチオンレベルを増加させる他の方法には、電気ショックの使用、エタノールでの処置、およびケージ化キレート剤での処置が含まれる。リン酸化は、周知の方法、例えば、キナーゼインヒビター、例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシンなどのセリン−トレオニンキナーゼインヒビターの添加によって減少させることができる。別法では、細胞タンパク質のリン酸化を、ホスファターゼ、例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂの卵母細胞への導入によって阻害することができる。
【０２６０】
次いで、活性化ＮＴ単位を、レシピエント雌に導入するのに適切なサイズに達するまで培養しても良いし、別法では、レシピエント雌に即座に導入しても良い。胚の培養および成熟に適した培養培地は、当技術分野で公知である。胚の培養および維持に使用することができる周知の培地の例には、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％ウシ胎仔血清、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地、ＰＺＭ、ＮＣＳＵ２３、およびＮＣＳＵ３７が含まれる。Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｋ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｃ、Ｔａｎａｋａ  Ａ、Ａｎａｓ  Ｉ  Ｍ、Ｉｗａｍｕｒａ、Ｓ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ、（２００２）、Ｊａｎｕａｒｙ；６６（１）：１１２−９、およびＰｅｔｔｅｒｓ  Ｒ  Ｍ、Ｗｅｌｌｓ  Ｋ  Ｄ．Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ．、１９９３；４８：６１−７３を参照されたい。
【０２６１】
その後、１つまたは複数の培養ＮＴ単位を洗浄し、次いで、任意選択で適切なコンフルエントなフィーダー層を含み得るウェルプレートに含められた適切な培地に入れることができる。適切なフィーダー層には、例として、線維芽細胞および上皮細胞が含まれる。ＮＴ単位がレシピエント雌への導入に適したサイズに達するまで、または細胞コロニーを産生するために使用することができる細胞を得るために、ＮＴ単位をフィーダー層上で培養する。ＮＴ単位は、少なくとも約２〜４００の細胞、約４〜１２８の細胞、または少なくとも約５０の細胞になるまで培養することができる。別法では、ＮＴ単位は、レシピエント雌に直に導入しても良い。
【０２６２】
本発明における胚導入およびレシピエント動物管理の方法は、胚導入分野で使用される標準的な処置手順である。同期導入が、本発明の成功にとって重要である、すなわち、ＮＴ胚の発達段階が、レシピエント雌の発情周期と同期している。例えば、Ｓｉｅｄｅｌ，Ｇ．Ｅ．，Ｊｒ．、（１９８１）、“Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｔｔｌｅ  ｉｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ”、Ｌ．Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ，Ｊｒ．およびＪ．Ｄ．Ｂｉｇｇｅｒｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｐａｇｅ  ３２３を参照されたい。ブタ胚導入は、当技術分野で周知の方法にしたがって行うことができる。参考のために、Ｙｏｕｎｇｓら、“Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｉｇ，”、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、（２００２）、５６：１３１１―１３２０を参照されたい。
【０２６３】
膵島関連細胞の作製
膵臓は、脊椎動物の消化器系および内分泌系における腺器官である。膵臓は、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンを含むいくつかの重要なホルモンを産生する内分泌腺、ならびに小腸に送られる消化酵素を含む膵液を分泌する外分泌腺の両方である。膵臓の大部分は、膵外分泌細胞および膵外分泌細胞に関連する管から構成されている。この外分泌組織の中には、ランゲルハンス島と呼ばれる約１００万の細胞の小クラスターが埋め込まれている。ランゲルハンス島は、膵臓の内分泌細胞であり、インスリン、グルカゴン、およびいくつかの他のホルモンを分泌する。
【０２６４】
ヒト膵臓は、約１００万のランゲルハンス島を含む。ランゲルハンス島は、細胞の小さい球状クラスターであり、器官中に分布している。ランゲルハンス島は、大きさがまちまちであり、数十細胞から数千細胞の範囲である。「膵島細胞」には、ランゲルハンス島で見られる細胞型の集合体が含まれる。膵島細胞は、Ａ細胞、Ｂ細胞、Ｃ細胞、Ｄ細胞、およびＰＰ細胞を含み、これらの細胞は、標準的な染色技術では区別するのが比較的困難であり得る。α細胞は、グルカゴンを分泌し（血糖値を上昇させる）、β細胞は、インスリンを分泌し（血糖値を低下させる）、δ細胞は、ソマトスタチンを分泌し（α細胞およびβ細胞を調節／停止する）、ＰＰ細胞は、膵臓ポリペプチドを分泌する。
【０２６５】
一実施形態では、遺伝子変更されたブタは、膵島および／または膵島細胞を含む膵臓組織のドナーとして使用される。膵臓組織またはこのような組織に由来する膵臓細胞には、膵島細胞、膵島、または膵島細胞クラスターが含まれ得る。特定の実施形態では、細胞は、膵島である。さらに特定の実施形態では、細胞は、膵β細胞である。一定の実施形態では、細胞は、インスリンを産生する。なおさらなる実施形態では、細胞は、膵島様細胞である。膵島細胞クラスターは、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、またはε細胞のいずれか１つ以上を含み得る。一般に、グルカゴンを産生するα細胞は、天然膵臓における全膵島細胞の約１５〜２０％を占め、インスリンおよびアミリンを産生するβ細胞は、天然膵臓における膵島細胞の約６５〜８０％を占め、ソマトスタチンを産生するδ細胞は、天然膵臓における全膵島細胞の約３〜１０％を占め、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞は、天然膵臓における全膵島細胞の約３〜５％を占め、グレリンを産生するε細胞は、天然膵臓における全膵島細胞の＜１％を占める（Ｅｌａｙａｔら、（１９９５）、Ｊ．Ａｎａｔ．１８６：６２９−３７を参照）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ１１６７０２０／
ドナーブタは、限定されるものではないが、胎仔、新生仔、幼体、および成体を含む任意の発達段階であり得る。一部の実施形態では、膵島細胞は、成体ブタトランスジェニック動物から単離される。代替の実施形態では、膵島細胞は、胎仔または新生仔ブタトランスジェニック動物から単離される（例えば、Ｍａｎｄｅｌ、（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７７：１５５−６０；Ｃａｒｄｏｎａら、（２００６）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：３０４−６を参照）。ドナーブタは、１０歳未満、９歳未満、８歳未満、７歳未満、６歳未満、５歳未満、４歳未満、３歳未満、２歳未満、１歳未満であり得る。一実施形態では、膵島細胞は、６歳未満のトランスジェニックブタから単離される。別の実施形態では、膵島細胞は、３歳未満のトランスジェニックブタから単離される。ドナーブタは、０〜２歳、２〜４歳、４〜６歳、６〜８歳、または８〜１０歳の任意の年齢であり得る。場合によっては、ドナーブタは、１０歳を超えている。別実施形態では、膵島細胞は、新生仔から２歳のトランスジェニックブタから単離される。一実施形態では、膵島細胞は、胎仔から２歳のトランスジェニックブタから単離される。特定の実施形態では、膵島細胞は、６ヶ月〜２歳のトランスジェニックブタから単離され、さらに特定の実施形態では、７ヶ月〜１歳のトランスジェニックブタから単離される。一実施形態では、膵島細胞は、２〜３歳のトランスジェニックブタから単離される。場合によっては、ドナーブタは、０歳未満（すなわち、胎仔または胚）である。新生仔膵島は、単離後、成体膵島よりも元気で安定しており、酸化ストレスにより強く、著しい増殖の可能性を有する（新生仔膵島幹細胞亜集団に由来し得る）ため、移植後の増殖および移植部位での生着の能力を有する。新生仔膵島は、十分に成熟して有意なレベルのインスリンを産生するようになるまで４〜６週間かかり得るという不都合があるが、この不都合は、新生仔膵島の成熟に十分な期間にわたって外因性インスリンで処置することによって克服される。新生仔膵島の生存および機能的な生着は、ブタ特異的Ｃ−ペプチドレベルを測定することによって決定することができ、このブタ特異的ｃ−ペプチドは、どの潜在的な内因性ｃ−ペプチドとも容易に区別できる。
【０２６６】
成体ブタ膵島は、既に記載されているように（Ｂｏｔｔｉｎｏ、２００２、２００４；Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ、２００３、２００５）、ブタ用に最適となるように変更された（Ｔｏｓｏ、２０００；Ｙｏｎｅｋａｗａ、２００５）、ヒト膵島について記載された方法にしたがって単離することができる。膵島サンプルのジチゾン染色後に純度を評価して、膵島／全組織の割合として表すことができる（Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ、２００５）。外分泌組織を汚染する標本を枯渇させるために、膵島を、移植前の１〜３日間培養することができる。Ｔｘの前に、ブタ膵島をカウントし、二重蛍光カルセイン−ＡＭおよびヨウ化プロピジウム染色によって生存可能性を評価することができる（Ｌｏｒｅｎｚｏ、１９９４）。膵島細胞の生存可能性がすべての標本で＞７５％であり、純度（全組織中の膵島の割合）が＞８０％であることが推奨される。動的な灌流および生存可能性を含む膵島の機能特性は、Ｔｘの前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することができる（Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ、２００６）。一部の実施形態では、トランスジェニックブタ膵島細胞は、移植術に適するように、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養して増殖、成熟、および／または精製する。
【０２６７】
一定の実施形態では、ドナートランスジェニック膵臓組織を外科的に取り出す。膵臓組織を外科的に取り出したら、ドナー膵臓を、０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が添加された冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を含む５０ｍｌチューブの冷プラスチック容器でさらに処理するためにクリーンルーム施設に移す。各ドナー由来の血液サンプルを、ウイルス学的検査およびトキソプラズマ血清学的検査のために送る。各器官由来のサンプルを、必要に応じてのちの検査のために−８０℃で凍結保存する。
【０２６８】
膵島細胞を、多少の変更が加えられたが、Ｒｉｃｏｒｄｉら（１９９０）によって文書化された処置手順によってミンチされた膵臓の標準的なコラゲナーゼ消化によって単離することができる。無菌技術を用いて、腺をＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）（げっ歯類膵臓の迅速な解離のため、ならびに正常で無傷の機能的なランゲルハンス島の最も効果的な回復のために処方された精製酵素の混合物であって、これらの酵素の標的物質は完全には同定されていないが、膵腺房組織の細胞内マトリックスを含むコラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質であると推定される）（１．５ｍｇ／ｍｌ）で膨張させ、過剰な脂肪、血管、および結合組織を切り落とし、切り刻み、振盪水槽内で、３７℃で、１２０ｒｐｍで１５分間消化する。この消化は、消化中の細胞傷害を回避するためにＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）溶液と混合したリグノカインを用いて達成する。消化プロセスの後、細胞を、滅菌４００ｍｍメッシュに通して滅菌ビーカーに入れる。残りの未消化組織を消化するために、第２の消化プロセスを使用する。
【０２６９】
別法では、Ｖｉｔａｃｙｔｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＭＡ（７．５  Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇの膵臓組織）およびＶｉｔａｃｙｔｅ  ＢＰプロテアーゼ（０．１３ｍｇ／ｇの膵臓組織）を使用することができる。
【０２７０】
一定の実施形態では、コラゲナーゼ（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｉｇ  Ｉｓｌｅｔ  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｐ１  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｌｅｎｄ”、Ｔ  Ｊ  Ｃａｖａｎａｇｈら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ３０、３６７、（１９９８）、および“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｉｎ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｉｓｌｅｔｓ  Ｍａｓｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＨＩ  Ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌｏｗ−Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ”、Ｈ．Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第６８巻、３５５−３６１、Ｎｏ．３、Ａｕｇ．１５、１９９９を参照）ではなく、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）（例えば、Ｎｅｗ  ＺｅａｌａｎｄのＲｏｃｈｅが供給元）を使用する。消化された組織を３回洗浄し、２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１０ｎｍｏｌ／Ｌニコチンアミド、および抗生物質（Ｃｉｐｒｏｘｉｎ）が添加された細胞培養培地ＲＰＭＩ  １６４０に播種する。
【０２７１】
組織のあらゆる汚染を排除するために、単離後かつカプセル化前に細胞培養サンプルに対して品質管理処置手順がとられる。単離の３日後に、細胞培養物が、認定研究施設によって微生物汚染について検査される。ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）の検査は、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで行うことができる。
【０２７２】
膵島の収量を、細胞のジチゾン（ＤＴＺ）染色によって決定する。ジチゾンは、亜鉛−キレート剤であり、ランゲルハンス島の亜鉛を選択的に染色して独特の赤色を生成する超成体染色である。
【０２７３】
膵島細胞の生存可能性は、アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウムを用いて決定することができる。アクリジンオレンジは、すべての細胞膜を迅速に通過して細胞質および核を染色する蛍光染色剤である。紫外（ＵＶ）光に曝露された時の核および細胞質の両方の鮮緑色蛍光は、無傷の生細胞を意味する。逆に、ヨウ化プロピジウムは、無傷の膜を通過できない蛍光染色剤である。ヨウ化プロピジウムは、ＬＩＶ光に曝露されると鮮赤色光蛍光を発し、細胞核におけるヨウ化プロピジウムの存在は、細胞の重度の傷害または死を示唆する。
【０２７４】
静的グルコース刺激（ＳＧＳ）を使用して、ブタ膵島を低濃度および高濃度のグルコースおよびテオフィリンに曝露することによってブタ膵島のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を評価する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏインスリン分泌能の決定を、遊離膵島（培養の３日後）およびその後のカプセル化の後の両方で行う。
【０２７５】
未成熟ブタ膵島が使用される場合は、ＩｇＦ−１（ヒトインスリン様成長因子Ｉ）を、未成熟細胞をインスリン産生型に成熟させるために使用することができる。ＩｇＦ−１は、出生後に成長ホルモンの成長促進活性を媒介する強力な分裂促進因子である。ＩｇＦ−１およびＩｇＦ−２は共に、多くの細胞型で発現され、内分泌機能、自己分泌機能、およびパラクリン機能を有し得る。ＩｇＦ−１の好ましい型は、ＩｇＦ−１のアミノ末端トリペプチドグリシン−プロリン−グルタミン酸（ＧＰＥ）である。
【０２７６】
移植前に膵島が精製されるプロセスは、これらの高度に特殊化された組織にとって外傷性である。このような外傷は、壊死またはアポトーシスを引き起こし得る。最新技術として周知の膵島を調製してカプセル化する任意の方法を本発明に使用することができる。これらの技術には、個々の膵島のマイクロカプセル化、または複数の膵島／膵臓組織のマクロカプセル化が含まれる。これらの例として、次のものが挙げられる。
【０２７７】
Ｓｃｈａｒｐらによる米国特許第７，４２７，４１５号に、次のステップ；第１の緩衝液を含む溶液を生物学的材料に添加するステップ；生物学的材料を遠心分離してペレット型生物学的材料を形成するステップ；上清を除去するステップ；細胞吸着物質に結合された光開始染色剤を含む溶液をペレット型生物学的材料に添加するステップ；細胞吸着物質に結合された光開始染色剤を含む溶液でペレット型生物学的材料を再懸濁し、効果のある時間インキュベートするステップ；混合物を遠心分離するステップ；細胞吸着物質に結合された光開始染色剤を含む溶液を除去するステップ；第２の緩衝液を含む第２の溶液でペレット型生物学的材料を再懸濁するステップ；遠心分離して第２の緩衝液を除去するステップ；光活性ポリマー溶液で生物学的材料を再懸濁して混合するステップ；および光活性ポリマー溶液で再懸濁された生物学的材料をエネルギー源を用いて照射してカプセル化生物学的材料を形成するステップ、を含む生物学的材料をカプセル化する方法が開示されている。好ましくは、カプセル化生物学的材料は、ＰＥＧ共形被覆膵島同種移植片である。
【０２７８】
他の処置手順では、温虚血を確実にゼロにし（ほとんどのヒト膵島標本と数時間比較して）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ外植の成功の可能性を高めるためにニコチンアミドを使用し、コラゲナーゼまたはＬｉｂｅｒａｓｅを用いた最少インキュベーション時間を有し、迅速な非外傷性カプセル化技術を使用し、ＩｇＦ−１（またはそのＧＰＥトリペプチド）を使用し、リグノカインなどの麻酔薬を使用し、かつシプロプロキシン（ｃｉｐｒｏｐｒｏｘｉｎ）などの抗生物質を使用する。
【０２７９】
Ｅｌｌｉｏｔｔらによる米国特許第７，１２２，１７７号に、膵島をカプセル化する方法が開示されている。この処置手順に使用されるアルギン酸ナトリウムが、原料源（海藻）から抽出され、粉末の超高純度形態に調製される。次いで、滅菌アルギン酸ナトリウム溶液（１．６％）が、カプセル化膵島を製造するためにＤｉａｔｒａｎｚ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｃｅｎｔｒｅで利用される。一般に、各カプセル化では、膵島および適切なアルギン酸塩溶液（通常はアルギン酸ナトリウム）が適合性カチオンの供給源に供給され、これによりカチオン−アルギン酸ゲル（通常はカルシウム−アルギン酸ゲル）に膵島が封入される。
【０２８０】
カプセル化処置手順では、膵島およびアルギン酸ナトリウム溶液（１．６％ｗ／ｗ）の混合物を液滴生成針から押し出してゲル化カチオン（塩化カルシウム）の槽の中に入れる。次いで、カルシウム−アルギン酸ゲル中に封入された膵島を、正に帯電したポリ−Ｌ−オルニチンで被覆し、次いでその外側をアルギン酸塩（０．０５％）で被覆する。次いで、アルギン酸塩の中核を、クエン酸ナトリウムの添加によって液化する。ほとんどのカプセルは、３つの膵島を含み、３００〜４００μｍの直径を有する。
【０２８１】
膵島を封入しているアルギン酸塩の液化後、「カプセル」を洗浄し、アルギン酸塩で再び被覆し、ポリ−Ｌ−オルニチン被覆上のあらゆる残留電荷を中和し、カプセル全体が移植されたときの組織のポリ−Ｌ−オルニチンとの直接接触を防止する。カプセル化膵島は、細胞培養中に維持され、次いで移植の前に汚染、インスリン放出、および生存可能性がチェックされる。カプセル化膵島は、すべての品質管理検査が陰性の場合にのみ移植用に発売される。
【０２８２】
Ｏｐａｒａによる米国特許第６，３０３，３５５号に、抗酸化剤、抗サイトカイン、抗エンドトキシン、または抗生物質の少なくとも１つ（またはこれらの組み合わせ）を含む培地で単離された生細胞を最初に培養することによって生細胞を処置する方法が開示されている。次いで、細胞は、内部に生細胞を含むマイクロカプセルを提供するために、ヒドロゲル核および半透過性外膜を含む生体適合性マイクロカプセルの中に封入される。
【０２８３】
Ｃｏｃｈｒｕｍらによる米国特許第５，５７８，３１４号に、均一な超薄膜の精製アルギン酸ゲルからなる複数の被覆層で被覆された機能的な細胞および組織移植片の生産方法が開示されている。この方法は、宿主内での機械的な破壊、化学的な破壊、または免疫による破壊に耐えることができ、移植片の機能を障害する線維形成性反応を引き起こさず、栄養物および分泌性老廃物の自由な透過を可能にする均一で制御可能な厚みの被覆を提供することができる。均一な被覆は、約２０〜２００μｍの厚みを有し、この厚みが、移植片の機能を障害する線維形成性反応および／または免疫反応を排除し、生物学的組織の核の実質的に完全な覆いとなり、これらの細胞または組織の長期移植を成功させる。Ｃｏｃｈｒｕｍらは、彼らの方法は、ポリリシンもしくは他のアミノ酸またはポリカチオンによる第１の被覆および次の被覆の安定化が必要ないという点で独特であると述べている。この方法は、任意選択でハロー層を形成して、生物学的組織の露出部分を均一に覆う、内側被覆と外側被覆との間の中間層を提供することが可能である。
【０２８４】
膵島細胞の単離に関するさらなる方法は、次の参考文献に見られる：Ｑｉら、Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ  Ｉ：ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｔ  ＩＩ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔｓ、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ、２７．Ｍａｙ  ２００９。
【０２８５】
また、免疫隔離膜装置、例えば、ＴｈｅｒａＣｙｔｅマクロカプセル化装置での細胞移植片のカプセル化を使用することもできる（Ｒａｆａｅｌら、（２０００）、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、９：１０７−１３を参照）。別の技術は、Ｖａｌｄｅｓ、（１９９８）、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ”、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄ、３０：４８１に記載されている「Ｖａｌｄｅｚカプセル」である。アルギン酸シートも、β細胞の包埋ができるようにカプセル化に使用することができる。アルギン酸シートの生産にかかわる技術では、膵島シートが、高度に精製されたアルギン酸塩およびランゲルハンス島をゲル化することによって形成される薄い平面状のバイオ人工内分泌膵臓として提供される。細胞アルギン酸層は、カプセル化細胞の宿主拒絶反応に対する均一な免疫保護障壁を形成し、組織は、近接宿主組織からの受動核酸によって栄養が与えられる（Ｓｔｏｒｓら、（２００６）、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃ．Ｓｃｉ．、９４４：２５２−２６６を参照）。
【０２８６】
トランスジェニック膵島は、他の細胞型、例えば、セルトリ細胞、または特定の間葉幹細胞を含む幹細胞と共に同時移植することもできる（Ｏｓｉｒｉｓ  Ｉｎｃ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｓｉｒｉｓｔｘ．ｃｏｍ／を参照）。
【０２８７】
処置方法
本明細書に記載される本発明は、糖尿病または前糖尿病の処置または予防のための方法を包含する。この方法は、限定されるものではないが、本明細書に記載されるドナー動物由来の１つ以上の膵島細胞（複数可）をそれを必要とする宿主に投与するステップを含む。この方法は、移植、場合によっては異種移植であり得る。ドナー動物は、ブタとすることができる。宿主は、霊長類、例えば、限定されるものではないが、サルを含む非ヒト霊長類とすることができる。宿主は、ヒト、場合によっては糖尿病または前糖尿病のヒトとすることができる。
【０２８８】
本発明の１つの方法は、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類が、低減された外因性インスリンを必要とするか、全く必要としない異種移植の方法である。別の実施形態では、霊長類は、移植後に、低レベルの外因性インスリンを必要とするか、全く必要としない。一般に、移植後は、正常血糖の状態を確立した（例えば、約４または１２週間かかり得る）後の期間を指すことを理解されたい。移植後、霊長類は、移植の前に必要であったインスリンの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％未満のインスリンを必要とし得る。移植後、霊長類は、移植の前に必要であったインスリンの約５％〜約２５％未満のインスリンを必要とし得る。移植後、霊長類は、移植の前に必要であったインスリンの約２５％〜約５０％未満のインスリンを必要とし得る。移植後、霊長類は、移植の前に必要であったインスリンの約５０％〜約７５％未満のインスリンを必要とし得る。移植後、霊長類は、移植の前に必要であったインスリンの約７５％〜約１００％未満のインスリンを必要とし得る。移植後、霊長類は、１日に体重１ｋｇに付き０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、または０．０１未満の外因性インスリン単位を必要とし得る。一実施形態では、移植後の霊長類は、１日に体重１キログラム（ｋｇ）に付き約０．０１〜約０．１未満の任意の数値の外因性インスリン単位を必要とし得る。一実施形態では、移植後の霊長類は、１日に体重１キログラム（ｋｇ）に付き約０．１〜約０．２５未満の任意の数値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後の霊長類は、１日に体重１キログラム（ｋｇ）に付き約０．２５〜約０．５未満の任意の数値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後の霊長類は、１日に体重１キログラム（ｋｇ）に付き約０．５〜約０．６未満の任意の数値の外因性インスリン単位を必要とする。一実施形態では、移植後、霊長類は、１日に付き４単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後、霊長類は、１日に付き２単位未満のインスリンを必要とする。一実施形態では、移植後、霊長類は、外因性インスリンを全く必要としない。一実施形態では、移植後、霊長類は、１日に体重１ｋｇに付き１  ＩＵ未満のインスリンを必要とする。別の特定の実施形態では、霊長類は、１日に体重１ｋｇに付き０．５０  ＩＵ未満を必要とする。
【０２８９】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類が、最小限の免疫抑制治療を必要とするか、または全く必要としない異種移植の方法も含む。少ないまたはゼロの免疫抑制治療には、限定されるものではないが、他の方法に必要な用量と比較して少ない（または完全にゼロの）用量の免疫抑制薬（複数可）／免疫抑制剤（複数可）；他の方法に必要な種類数と比較して少ない（または完全にゼロの）種類数の免疫抑制薬（複数可）／免疫抑制剤（複数可）；他の方法に必要な期間と比較して短い（または完全にゼロの）期間の免疫抑制処置；および／または他の方法に必要な免疫抑制の維持と比較して少ない（または完全にゼロの）免疫抑制の維持が含まれる。
【０２９０】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、ＩＥＱ／ｋｇ（１ｋｇ当たりの膵島当量）の必要量が他の方法と比較して減少する異種移植の方法も含む。本明細書に記載される新規な発明に必要なＩＥＱ／ｋｇは、限定されるものではないが、約１００，０００；９０，０００；８０，０００；７０，０００；６０，０００；５０，０００；４０，０００；３０，０００；２０，０００；１０，０００、または５，０００未満であり得る。本明細書に記載される新規な発明に必要なＩＥＱ／ｋｇは、約５，０００〜約１０，０００；約１０，０００〜約１５，０００；約１５，０００〜約２０，０００；約２０，０００〜約２５，０００；約２５，０００〜約３０，０００；約３０，０００〜約３５，０００；約３５，０００〜約４０，０００；約４０，０００〜約４５，０００；約４５，０００〜約５０，０００；約５０，０００〜約５５，０００；約５５，０００〜約６０，０００；約６０，０００〜約６５，０００；約６５，０００〜約７０，０００；約７０，０００〜約７５，０００；約７５，０００〜約８０，０００；約８０，０００〜約８５，０００；約８５，０００〜約９０，０００；約９０，０００〜約９５，０００；約９５，０００〜約１００，０００であり得る。一実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは、１００，０００未満である。一実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは、５０，０００未満である。一実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは、２５，０００未満である。一実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇは、１０，０００未満である。
【０２９１】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類が、一部またはすべての機能性移植膵島を有する、糖尿病を処置または予防する方法も含む。移植された霊長類は、移植前のレベルと比較した場合または他の方法を用いて達成されるレベルと比較した場合よりも多くの機能性移植膵島を有し得る。膵島は、限定されるものではないが、インスリンを産生する能力、宿主の外因性インスリンの必要量を減らす能力、および／またはドナーＣ型−ペプチドを産生する能力を含む当業者に周知の任意の定義を用いて機能性として特徴付けられ得る。一実施形態では、膵島機能性は、０．３ｎｇ／ｄｌよりも多い基礎または刺激ブタＣ−ペプチドとして定義される。一実施形態では、膵島機能性は、必要な外因性インスリンの５０％を超える減少と組み合わせられた検出可能なＣ−ペプチドとして定義され、Ｃ−ペプチドは、移植された材料から産生される。
【０２９２】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類の空腹時および非空腹時の血糖値が正常値に維持される、糖尿病を処置または予防する方法も含む。これらの正常値は、限定されるものではないが、移植から少なくとも約３ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２４ヶ月間、または３６ヶ月間を含む、任意の期間にわたって維持され得る。一実施形態では、正常値は、少なくとも３ヶ月間維持されるべきである。別の実施形態では、正常値は、少なくとも６ヶ月間維持されるべきである。別の実施形態では、正常値は、少なくとも１２ヶ月間維持されるべきである。限定されるものではないが、ヒトおよびサルを含む霊長類の正常な空腹時および非空腹時の血糖値は、当業者には周知である。特定の実施形態では、ＦＢＧは、約７０〜約１００ｍｇ／ｄＬ（３．９〜５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）に維持され得る。別の特定の実施形態では、ＮＦＢＧは、約２００ｍｇ／ｄＬ未満に維持され得る。
【０２９３】
場合によっては、正常血糖値は、ランダムに（空腹状態および非空腹状態にかかわらず）検査して平均すると約７０〜１３０ｍｇ／ｄｌまたは３．９〜７．２ｍｍｏｌ／ｌである。場合によっては、正常血糖値は、絶食後は約６５〜７０ｍｇ／ｄｌである。一定の実施形態では、移植後の血糖値は、概ね、約２００ｍｇ／ｄｌ未満、１７５ｍｇ／ｄｌ未満、１５０ｍｇ／ｄｌ未満、１２５ｍｇ／ｄｌ未満、１００ｍｇ／ｄｌ未満、７５ｍｇ／ｄｌ未満、または５０ｍｇ／ｄｌ未満に維持される。一実施形態では、移植後は、一晩絶食した後の血糖値は、１４０ｍｇ／ｄｌ未満であり、この絶食後の値は、少なくとも１ヶ月間にわたって、少なくとも週に１回は達成される。
【０２９４】
一実施形態では、移植後の平均血糖値（朝と夜の平均値）は、約２〜５ｍｍｏｌ／ｌまたは約３〜４ｍｍｏｌ／ｌである。
【０２９５】
一実施形態では、移植後は、霊長類は、血糖コントロールが十分である。一実施形態では、移植後は、糖化ヘモグロビンレベルは、約８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、または３％未満である。特定の実施形態では、移植後の糖化ヘモグロビンレベルは、６．５％未満である。
【０２９６】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類が、経静脈的グルコース負荷試験に合格する、糖尿病を処置または予防する方法も含む。この試験は、例えば、限定されるものではないが、移植から１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後、および／または１２ヵ月後などの移植後の任意の時期に行うことができる。場合によっては、試験の結果は、ドナー（例えば、ブタ）Ｃ−ペプチドの形態のブドウ糖に対する有意な応答が、宿主（例えば、霊長類）Ｃ−ペプチドの有意な応答の非存在下で実証された場合に成功である。
【０２９７】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、霊長類が、アルギニン刺激試験に合格する、糖尿病を処置または予防する方法も含む。この試験は、例えば、限定されるものではないが、移植から１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後、および／または１２ヵ月後などの移植後の任意の時期に行うことができる。場合によっては、試験の結果は、ドナー（例えば、ブタ）Ｃ−ペプチドの形態のブドウ糖に対する有意な応答が、宿主（例えば、霊長類）Ｃ−ペプチドの有意な応答の非存在下で実証された場合に成功である。
【０２９８】
本発明の方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック膵臓組織または細胞を霊長類に移植し、移植後に、ドナーＣ−ペプチドレベルが検出可能である、異種移植の方法も含む。場合によっては、ドナーＣ−ペプチドレベルは、ブタＣ−ペプチドレベルであり、ある場合には、ブタのＣ−ペプチドレベルは、約０．２〜約１．０、約０．２〜約０．７５、約０．２〜約０．６５、約０．２〜約０．５５、約０．２〜約０．４５、または約０．２〜約０．３５ｎｇ／ｍｌである。ドナーブタＣ−ペプチドレベルは、移植後に、約０．２ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、または１．０ｎｇ／ｍｌであり得る。場合によっては、ドナーブタＣ−ペプチドレベルは、１．０ｎｇ／ｍｌよりも高い。場合によっては、ドナーブタＣ−ペプチドレベルは、０よりも高い。一実施形態では、ドナーブタＣ−ペプチドレベルは、約０．５ｎｇ／ｍｌである。
【０２９９】
本発明の方法はまた、トランスジェニック膵臓組織または細胞の移植後に、宿主霊長類の組織学的分析を行う、糖尿病を処置または予防する方法も含む。場合によっては、剖検後の天然膵臓の組織学的分析は、インスリン陽性β細胞の減少を示し、限定されない一例では、インスリン陽性β細胞が全く存在しないことを示す。これらの場合、または天然膵臓が検査されない他の場合には、膵島移植の肝臓または他の部位の組織学的検査は、複数の生存可能なインスリン陽性細胞を示す。
【０３００】
本発明の方法はまた、トランスジェニック膵臓組織または細胞の移植後に、移植処置手順、免疫抑制療法、耐性誘導療法、および／または膵島のカプセル化に関連した重大な致死性の合併症が少ない、糖尿病を処置または予防する方法も含む。
【０３０１】
本発明の方法はまた、トランスジェニック膵臓組織または細胞の移植後に、移植が繰り返される、糖尿病を処置または予防する方法も含む。移植は、１匹の霊長類で２回、３回、またそれ以上行うことができる。移植は、適切なインスリンのレベルを維持するために一定間隔で行うことができる。移植は、１年に１回行うことができる。移植は、１年に２回行うことができる。移植は、１年に３回行うことができる。移植は、１年に４回以上行うことができる。移植は、数年の間に何回も行うことができる。限定されるものではないが、外科処置手順、送達方法、使用されるドナー組織および／または細胞、ならびに使用される免疫抑制療法などを含む、いずれか１つの移植パラメーターは、同一の霊長類で行われる他の移植と比較して異なるまたは同じであり得る。
【０３０２】
一部の実施形態では、この方法は、抗炎症剤の宿主への投与の必要性を低減する。他の実施形態では、この方法は、抗凝固因子の宿主への投与の必要性を低減する。一定の実施形態では、この方法は、免疫抑制剤の宿主への投与の必要性を低減する。一部の実施形態では、膵島細胞の投与後、３０日未満、２０日未満、１０日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満、宿主に抗炎症剤が投与される。一部の実施形態では、膵島細胞の投与後、３０日未満、２０日未満、１０日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満、宿主に抗凝固因子が投与される。一部の実施形態では、膵島細胞の投与後、３０日未満、２０日未満、１０日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満、宿主に免疫抑制剤が投与される。
【０３０３】
レシピエント（宿主）は、移植時に、部分的にまたは完全に免疫抑制される、あるいは全く免疫抑制されない。移植の前、最中、および／または後に使用できる免疫抑制剤／免疫抑制薬は、当業者に周知である。このような免疫抑制剤／免疫抑制薬には、限定されるものではないが、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスペルグアリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４−Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、およびヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体が含まれる。１つまたは２つ以上の免疫抑制剤／免疫抑制薬を、一緒にまたは連続的に使用することができる。１つまたは２つ以上の免疫抑制剤／免疫抑制薬を、導入療法または維持療法に使用することができる。同じまたは異なる薬物を、導入段階および維持段階の最中に使用することができる。一実施形態では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が導入療法に使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が維持療法に使用される。別の実施形態では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が導入療法に使用され、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が維持療法に使用される。一実施形態では、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）が導入両方に使用される。Ｔｅｕｔｅｂｅｒｇら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１０（２）：３８２−３８８、２０１０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔら、２００９、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、９（１２）：２７１６−２７２６、２００９；Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、２０（５）：４３、２００６；Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３５５：１３１８−１３３０、２００６を参照されたい。免疫抑制はまた、限定されるものではないが、全身照射、胸腺照射、ならびに完全および／または部分脾臓摘出を含む非薬物療法を用いて達成することもできる。これらの技術は、１つ以上の免疫抑制薬／免疫抑制剤と併用することもできる。
【０３０４】
トランスジェニック膵島細胞は、限定されるものではないが、レシピエント生物の腎被膜の下側の門脈を介した、胸鎖乳突筋、腹腔内、胃粘膜下組織、精巣、または脾臓への導入を含む当技術分野で周知の任意の手段を用いて移植することができ（Ｒｏｏｄら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１５：８９−１０４、２００６；ＤｕｆｒａｎｅおよびＧｉａｎｅｌｌｏ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８６：７５３−７６０、２００８；Ｈｅｒｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、オンラインで公表、１９  Ｆｅｂｒｕａｒｙ、２００６；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００８；１７（９）：１００５−１４を参照）、トランスジェニック膵島細胞はまた、セルトリ細胞と組み合わせて移植することもでき、セルトリ細胞は、膵島同種移植片に免疫抑制効果をもたらすことが示唆されている（Ｙｉｎら、２００９、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９、Ａｕｇ  １５；８８（３）：３３９−４５）。一実施形態では、本明細書に提供される膵臓細胞を霊長類に移植する異種移植の方法であって、膵島が門脈内注入によって投与される、方法が提供される。一実施形態では、本明細書に提供される膵臓細胞を霊長類に移植する異種移植の方法であって、膵島が、腹膜内腔、腎被膜、大網を介して、または膵床注入によって投与される、方法が提供される。
【０３０５】
本発明の方法はまた、膵島をカプセル化する異種移植の方法も含む。膵島は、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、または両方の組み合わせであり得る。すべてまたは一部の膵島を、カプセル化しなくても良い。カプセルの形成に使用される材料は、限定されるものではないが、ニトロセルロース、アルギン酸塩、アクリロニトリル、アガロース、およびポリテトラフルオロエチレンを含む当業者に周知の任意の材料とすることができる。カプセルは、透過性でも良いし、半透過性でも良い。
【０３０６】
生着に十分な時間（例えば、１週間および３週間など）が与えられ、生着の成功は、当業者に周知の任意の技術を用いて決定される。これらの技術には、限定されるものではないが、ドナーＣ−ペプチドレベルの評価、組織学的検査、経静脈的グルコース負荷試験、外因性インスリン必要量試験、アルギニン刺激試験、グルカゴン刺激試験、ＩＥＱ／ｋｇ（膵島当量／ｋｇ）必要量の試験、レシピエントにおける正常血糖の持続性試験、免疫抑制の必要性の試験、移植された膵島の機能性の試験が含まれ得る（Ｒｏｏｄら、Ｃｅｌｌ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１５：８９−１０４、２００６；Ｒｏｏｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８３：２０２−２１０、２００７；ＤｕｆｒａｎｅおよびＧｉａｎｅｌｌｏ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８６：７５３−７６０、２００８；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔら、２００９、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、９（１２）：２７１６−２７２６、２００９を参照）。
【０３０７】
１つ以上の技術を用いて、生着が成功したか否かを決定することができる。生着の成功は、未処置に対して使用することができ、一部の実施形態では、移植の他の手法に対して使用することができる（すなわち、生着は、移植の他の方法／組織を用いた場合よりも成功しやすい）。場合によっては、生着の成功は、ドナーＣ−ペプチドレベルの評価によって決定される。ブタ動物、組織、または細胞が使用される場合、一実施形態では、生着は、ブタＣ−ペプチドレベルが約０．２〜１．０（ｎｇ／ｍｌ）またはより具体的には約０．２〜０．６５（ｎｇ／ｍｌ）であるときに成功と見なされ得る（ＣｏｏｐｅｒおよびＣａｓｕ、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１６：２２９−２３８、２００９；Ｒｏｏｄら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１５：８９−１０４、２００６を参照）。別の実施形態では、ＩＥＱ／ｋｇ（１ｋｇ当たりの膵島当量）必要量の試験が使用される。この実施形態では、移植の他の方法／組織を用いた場合に必要なＩＥＱ／ｋｇよりも、必要とされるＩＥＱ／ｋｇが少ない。場合によっては、ＩＥＱ必要量は、新生仔ブタ質量の約５０，０００ＩＥＱ／ｋｇ未満、または成体ブタ質量の約２５，０００ＩＥＱ／ｋｇ未満であり得る（ＤｕｆｒａｎｅおよびＧｉａｎｅｌｌｏ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８６：７５３−７６０、２００８）。場合によっては、ＩＥＱ必要量は、成体ブタ質量の約１００，０００ＩＥＱ／ｋｇ未満であり得る。低レベルのＩＥＱ／ｋｇでの血糖制御の達成は、生着の成功の１つの指標であり得る。場合によっては、レシピエント（宿主）における正常血糖の持続性は、生着の成功の証明である。移植後の一定期間にわたる外因性インスリン依存の長期の減少（またはゼロ）は、生着の成功の１つ指標である。この一定期間は、３ヶ月、６ヶ月、１年、または１年以上とすることができる。この一定期間は、最初の移植からの期間、または次の移植からの期間とすることができる。場合によっては、生着の成功は、免疫抑制の必要性の低下によって示される。この免疫抑制の必要性の低下には、１つ以上の免疫抑制薬／免疫抑制剤の用量の減少、必要な免疫抑制薬／免疫抑制剤の種類数の減少、免疫抑制の期間の短縮、および／または免疫抑制の維持の減少または不要が含まれ得る。一実施形態では、生着の成功は、移植組織の機能性（部分またはすべて）の試験によって評価することができる。これには、必要な外因性インスリンの５０％を超える削減と組み合わせられたドナーＣ−ペプチド（例えば、ブタＣ−ペプチド）の検出が含まれ得る。別の例では、移植された組織の機能性は、０．３ｎｇ／ｄｌを超える基礎または刺激Ｃ−ペプチドとして定義することができる。
【０３０８】
膵島細胞移植に関するさらなる用法が、次の参考文献に見られる：Ｂｅｒｔｕｚｚｉら、Ｃｕｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、６（４）：３６９−７４、Ｊｕｎｅ  ２００６；Ｒｉｃｏｒｄｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３５：６４９、１９８６；Ｋｏｒｓｇｒｅｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４５：５０９、１９８８；Ｄｕｆｒａｎｅら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１３（３）：２０４−１４、Ｍａｙ  ２００６；Ｔｏｓｏら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、９：２９７、２０００；ＣｏｚｚｉおよびＢｏｓｉｏ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１３（２）：１５５−８、Ａｐｒｉｌ  ２００８；ＢｏｔｔｉｎｏおよびＣｏｏｐｅｒ、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１５（２）：１０４−６、Ｍａｒｃｈ  ２００８。
【０３０９】
糖尿病の処置または予防の必要な宿主は、糖尿病、前糖尿病、または糖尿病関連疾患であると確認された宿主とすることができる。宿主は、渇きまたは空腹の増加、口渇、頻尿、不明な体重減少、疲労、視界のぼやけ、頭痛、意識喪失（稀）、創傷または切傷の遅い治癒、皮膚の痒み、頻繁なイースト菌感染、最近の体重増加、頸部、腋窩および鼠径部の柔らかい暗色皮膚の変化、いわゆる黒色表皮腫、手足の麻痺および刺痛、視力低下、インポテンツに罹患していることがある。「耐糖能障害」としても知られている前糖尿病は、症状がほとんどない健康状態であるが、個人がより深刻な２型糖尿病を発症する前にほぼ必ず存在する。米国では、２０歳以上の５０００万人以上が、血糖値が正常よりも高いが糖尿病として分類するほどではない前糖尿病である。前糖尿病を判定する際には、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）試験および経口的グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の２つの血液検査の一方が使用される。ＦＰＧ血液試験では、８時間の絶食後に血糖値が測定される。ＦＰＧ試験では、１００ｍｇ／ｄＬ〜１２５ｍｇ／ｄＬの測定値は、前糖尿病を示唆し、２つ以上の試験で１２６ｍｇ／ｄＬを超える測定値は、糖尿病を示唆する。ＯＧＴＴ試験では、絶食後、大量のグルコースを含む飲料を摂取して２時間後に血糖値が測定される。ＯＧＴＴ試験では、１４０ｍｇ／ｄＬ〜１９９ｍｇ／ｄＬの測定値は、前糖尿病を示唆し、２００ｍｇ／ｄＬを超える測定値は、糖尿病を示唆する。
【実施例】
【０３１０】
実施例
実施例１：膵島特異的発現ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、膵島特異的発現カセットの背景として結合した。このベクターは、ファージｆ１領域、ＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター、ＳＶ４０最小複製起点、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む１９６７塩基対（ｂｐ）断片のＣｌａ１切除によって改変した。加えて、ＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーターを、インスリンＩＩプロモーターがこのベクター内に挿入されたときに、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いて切除した。
【０３１１】
膵臓特異的発現ベクターのプロモーター要素として機能する配列の選択は、ラットインスリンＩＩ遺伝子ＣＤＳの上流の近位配列から増幅された２つのクローン配列の比較によって行った。これらの増幅産物は、長さが４９７ｂｐ〜７６７ｂｐと様々であり；最も短い増幅産物が、参考文献で以前に使用されたものに最も一致していた。どのプロモーター配列増幅プライマーが最適な選択であるかを決定するために、ＧＦＰのｃＤＮＡを各プロモーター配列下流に導入し、これらの試験ベクターを、β−ＴＣ−６マウス膵臓インスリノーマ細胞のトランスフェクションに使用した。ＦＡＣＳ分析を、トランスフェクト細胞における導入遺伝子（ＧＦＰ）の発現を試験するために行った。この分析は、最も長い増幅プライマー（７６７ｂｐ）がＧＦＰの良好な発現をもたらすことを示したため；膵島特異的発現をもたらすために使用されるすべてのベクターが、この最も長いプロモーター要素を含む。
【０３１２】
ラットインスリンＩＩ遺伝子コーディング領域の５’側の７６７ｂｐ領域を、鋳型としての精製高分子量ラットＤＮＡ、ＰＦｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
【０３１３】
【化１】
2018121663.tif 000002
この断片は、導入遺伝子が膵臓特異的に発現するブタおよびマウスを作製するために使用されるすべてのベクターにおいてプロモーターとして機能する。
【０３１４】
このラットインスリンＩＩ（ｒＩｎｓ２）プロモーター領域は、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩでの消化によってＣｌａＩ欠失ｐＣＩｎｅｏベクターに挿入した。この消化と同時に、ＣＭＶエンハンサープロモーター（７６５ｂｐ断片）がｐＣＩｎｅｏから除去される。
【０３１５】
マウスＰＤＸ−１遺伝子遠位エンハンサー（４８３ｂｐ）を、鋳型としての精製高分子量マウスＤＮＡ、ＰＦｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、および以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
【０３１６】
【化２】
2018121663.tif 000003
マウスＰＤＸ−１エンハンサーをｒＩｎｓＩＩプロモーターのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片５’として、ＢｇｌＩＩ制限部位に挿入して中間ｐＩｎｓＩＩベクターを作製した。
【０３１７】
複数のニワトリβ−グロビンインスレーター断片を、エンハンサー／プロモーター／導入遺伝子部位に隣接した位置でベクターに挿入した。ニワトリβ−グロビンインスレーター（２７７ｂｐ）を、インスレーター配列、ＰＦｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、および以下のプライマーを含むインハウスベクターを用いてＰＣＲによって増幅した。
【０３１８】
【化３】
2018121663.tif 000004
ＣｆｌａＩ／ＸｂａＩインスレーター断片およびＳｐｅＩ／ＣｌａＩインスレーター断片を、この増幅から作製し、３−断片連結部にマウスＰＤＸ−１エンハンサーを含むｐＩｎｓＩＩベクターの３’末端のＣｌａＩ部位に導入した。合計４つのインスレーター断片をこの部位に導入した。
【０３１９】
４つの３’インスレーター断片（上記）を含むベクターから一対のインスレーター断片をＣｌａＩ消化で切除して、このＣｌａＩ断片をＤＮＡポリメラーゼＩ、大きい（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で平滑にして、そしてこの平滑末端断片を、プロモーター、エンハンサー、および３’隣接インスレーターを既に含むｒＩｎｓＩＩベクターの平滑ＢｇｌＩＩ部位に挿入することによって、カセットの５’末端のインスレーターを調製した。
【０３２０】
このベースベクターは、ｐＲＥＶ７８８と呼ばれ、膵島特異的発現用の導入遺伝子の後のすべての導入に使用した。導入された導入遺伝子を含むベクターが図１に示されている。以下の実施例に利用されるベクターは次の通りである。
【０３２１】
ｐＲＥＶ７８８：膵島特異的ベクターカセットが、ニワトリβ−グロビンインスレーターおよびマウスＰＤＸ−１エンハンサーが隣接したラットインスリンＩＩプロモーターを含む。上流にキメライントロン、下流にＳＶ４０ｐＡシグナルを有する複数のクローニング部位（ＭＣＳ）が、導入遺伝子の挿入および発現のために用意されている。
【０３２２】
ｐＲＥＶ７９０：ヒトＣＤ４のドメイン３および４をコードするｃＤＮＡに融合されたヒトＴＦＰＩ  ｃＮＤＡおよびＣ末端配列を含む１８４１ｂｐ  Ｘｈｏｌ／Ｎｏｔ１断片を、Ｘｈｏｌ／Ｎｏｔ１消化ベクターカセットに挿入した。
【０３２３】
ｐＲＥＶ７９２：フレキシブルリンカーによってヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域に融合されたブタＣＴＬＡ４細胞外領域ｃＤＮＡを含む１６３７ｂｐ  Ｓａｌｌ／Ｎｏｔ１断片を、Ｓａ１１／Ｎｏｔ１消化ベクターカセットに挿入した。
【０３２４】
ｐＲＥＶ８３５：ヒトＣＤ３９  ｃＤＮＡを含む１６０９ｂｐ  Ｘｈｏｌ／Ｘｈｏｌ断片を、Ｘｈｏｌ消化ベクターカセットに挿入した。
【０３２５】
ｐＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＴＦＰＩの配列は、その一部が、米国特許第７，４３２，３４４号および同第６，４２３，３１６号に記載されている配列に由来する。
【０３２６】
これらのベクターを、２つの異なる初代ブタ胎仔細胞系にトランスフェクトした（実施例３を参照）。細胞系１８３−６−６を、遺伝子型ホモ接合性ＧＴＫＯであってＣＤ４６発現ヘテロ接合性トランスジェニックであるメス胎仔から単離した。細胞系２２７−３を、ホモ接合性ＧＴＫＯであってＣＤ４６発現ホモ接合性トランスジェニックである雌ブタから単離した（耳生検）。
【０３２７】
トランスジェニックマウスを作製して、ＴＦＰＩが導入遺伝子として導入された膵臓発現ベクターを試験した。その後、ＣＤ３９の膵臓発現を示すブタ（例えば、ブタ３２０−２）を作製し、胎仔（５４８／Ａ３）を作製し、その後、再クローニングして、ｐＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＴＦＰＩ導入遺伝子の両方の膵臓発現を示すブタ（例えば、ブタ３４７−３）を作製した。以下の実施例で具体化されるブタはすべて、ホモ接合性ＧＴＫＯおよびＣＤ４６トランスジェニックである遺伝的背景を基に作製された（使用した細胞系は、１８３−６−６または２２７−３であった）。したがって、これらの得られたブタのゲノムは、異種移植に関連した３〜４の遺伝子改変を有し、そのうちの少なくとも１つの遺伝子改変が、膵島移植に有用となる膵臓での特異的な導入遺伝子の発現をもたらす。
【０３２８】
実施例２：膵臓特異的発現ベクターｐＲＥＶ７９０を用いたＴＦＰＩトランスジェニックマウスの作製
接合糸期マウス胚を、Ｂ６Ｃ３Ｆ１雄と交配したＢ６Ｃ３Ｆ１雌から得た（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＶＡ）。この雌は、４４〜４８時間後に７．５  ＩＵ  ＰＭＳＧ（腹腔内投与、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および５．０  ＩＵ  Ｈｃｇ（腹腔内投与、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＤＥ）を用いて過剰排卵させた。接合子を収集して、標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９９４）によってＦＨＭ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ、Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ、ＮＪ）で操作した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚培養を、ＫＳＯＭ培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）で、３７℃、５．０％ＣＯ２、加湿空気中で行った。ｐＲＥＶ７９０コンストラクトの前核のマイクロインジェクションを、既に記載された方法（Ｐａｇｅら、１９９５、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．４：１２−１７）を用いて行った。注入された胚をＫＳＯＭから取り出してＦＨＭに入れ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで一晩培養した。生存可能な２細胞胚を、既知の技術（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、第２版、２００４）を用いて偽妊娠ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）の卵管に導入し、仔を自然に出産させた。生後２１日目に、仔を離乳させ、雌雄を鑑別し、足指に切れ目を入れて識別できるようにした。遺伝子型分析のために尾端生検を行った。
【０３２９】
１２０の接合子を顕微注入し、８７を一晩培養し、得られた７６の２細胞胚を偽妊娠レシピエントに移植した。１９匹の仔マウスが生まれ、そのうちの４匹を、ＰＣＲおよびサザン分析によってスクリーニングし、ｐＲＥＶ７９０コンストラクトを含むトランスジェニックであることが分かった（２１％のトランスジェニック率）。このトランスジェニック率は、マイクロインジェクション技術を用いた場合に通常予想される範囲内であろう。
【０３３０】
実施例３：核導入用細胞系の調製
細胞系の単離：
２つの細胞系（１８３−６−６および２２７−３）を、追加の導入遺伝子を追加するためのトランスフェクションのため、および最終的に核導入によってブタを作製するための遺伝的背景として使用した。両方の細胞系は、ＧＴＫＯブタ（Ｄａｉら、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０、２５１−２５５；Ｐｈｅｌｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００３）、２９９：４１１−４１４）を遍在的にｈＣＤ４６を発現するトランスジェニックブタ系（Ｌｏｖｅｌａｎｄら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００４、１１：１７１：１８３）と交配させることによって作製した。両方の細胞系は、遺伝子型および表現型によってホモ接合性ＧＴＫＯおよびｈＣＤ４６トランスジェニックとして確認された。細胞系は、次の通りＮＴで使用するために調製した：胎仔線維芽細胞系を、妊娠３６日目の胎仔１８３−６−６から単離した。胎仔を、湾曲した手術用鉗子を用いて、過度の熱が発生しないようにゆっくりと６０メッシュ金属スクリーンに通してすりつぶした。次いで、細胞懸濁液をペレットにし、２０％ウシ胎仔血清およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで再懸濁した。細胞を３日間培養し、凍結保存した。
【０３３１】
耳線維芽細胞系を、耳パンチによって生後４８日のブタ（２２７−３）から単離した。耳パンチを、２００プルーフエタノールで洗浄し、次いでＰＢＳで洗浄した。組織を手術用鋏で切り刻み、凍結保存の前に１２日間培養した。胎仔５４８／Ａ３を、妊娠７３日目に取り出し、膵臓サンプルを発現分析（実施例６〜７）のために単離した。加えて、胎仔細胞を単離し（上記したように）、後の再クローニング（実施例４）のために保存した。
【０３３２】
トランスフェクション用のプラスミド断片の調製：
ｐＲＥＶ７９０プラスミド断片を、ＡａｔＩＩおよびＡｈｄＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた制限酵素消化によってトランスフェクション用に調製した。ｐＲＥＶ７９２を、ＡｓｅＩおよびＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた消化によって調製した。消化によって作製されたプラスミド断片を、１％低融点アガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ）で分離して、プラスミド骨格を除去した。目的の導入遺伝子含有カセット断片を切除し、氷上で１５分間、２倍量の１×アガラーゼ緩衝液で２回インキュベートした。緩衝液の除去後、ゲルを６５℃で、１０分間融解した。４２℃で１０分間の後、ゲル溶融液１００μＬ当たりＡｇａｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１ｕＬとし、４２℃で少なくとも１時間インキュベートした。１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムをゲル溶融液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。４℃で１５分間の１５０００ｒｐｍでの遠心分離によって、すべての未消化アガロースを分離した。２倍量の１００％エタノールを上清に添加し、遠心分離を用いてＤＮＡ断片をペレットにした。７０％エタノールを使用してペレットを洗浄してから、３７℃で乾燥させた。ペレットをＴＥで再懸濁した。
【０３３３】
スクリーニングのためのトランスフェクション、選択、コロニーの回収：
ブタ２２７−３由来のブタ耳線維芽細胞を、ｐＲＥＶ７９０（Ｐｄｘ−ｒＩｎｓＩＩ−ｈＴＦＰＩ）、ｐＲＥＶ７９２（Ｐｄｘ−ｒＩｎｓＩＩ−ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、およびｐＲＥＶ８２８（ピューロマイシン選択マーカー遺伝子ベクター）でトランスフェクトした。約５００万の細胞に、それぞれの導入遺伝子ベクター３μｇと選択マーカーベクター０．５μｇを同時にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの４８時間後に、約２５，０００細胞／皿の密度の２０×１０ｃｍ皿に０．５ｍｇ／ｍｌの抗生物質ピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加して、トランスフェクト細胞を選択した。ピューロマイシン選択の開始から７２時間後に培地を交換した。選択の開始から７日後にコロニーを回収した。７０のピューロマイシン耐性コロニーを回収し、さらに３日間培養した。７０のうちの４５のコロニーを増殖させ、２つのサンプルに分けた：１つがＰＣＲ分析用で、もう１つが増殖用。実施例５に記載されているように、ｐＲＥＶ７９０およびｐＲＥＶ７９２の両方のＰＣＲ分析を行った。３７のダブルＰＣＲポジティブコロニーをプールし、後の核導入での使用のために凍結保存した。
【０３３４】
ｐＲＥＶ８３５（Ｐｄｘ−ｒＩｎｓＩＩ−ＣＤ３９）ベクターをｐＲＥＶ８２８およびｐＲＥＶ７９２と組み合わせて用いた同時トランスフェクション、選択、およびコロニーの回収に同じ処置手順を使用したが、この場合は、トランスフェクションに細胞系１８３−６−６を使用した点が異なる。
【０３３５】
実施例４：核導入（ＮＴ）によるマルチ・トランスジェニック・ブタの作製
様々な方法を使用して、本発明のマルチ・トランスジェニック・ブタを作製することができる。以下は、使用したドナー細胞（系２２７−３および系１８３−６−６）が、ホモ接合性ＧＴＫＯ（あらゆる機能的αＧＴを欠く）の遺伝的背景であり、かつＣＤ４６（およびＣＤ４６を膵臓で発現；図７）トランスジェニックである一例である。ＮＴに使用する前に、実施例３に記載されているように、ドナー細胞を、トランスフェクトし、選択し、ｐＲＥＶ７９０、ｐＲＥＶ７９２、および／またはｐＲＥＶ８３５ベクターに対して陽性についてスクリーニングした。場合によっては、導入遺伝子（複数可）に対してすべてのスクリーニングで陽性の、トランスフェクトされて選択された細胞の複数のコロニーを、ＮＴで使用するまで一緒にプールした。
【０３３６】
ＮＴ用のドナー細胞（胎仔または成体線維芽細胞）を、１０〜２０％ウシ胎仔血清および０〜４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１９９５−０６５）に入れ、加湿インキュベーターで、５％Ｏ２、５％ＣＯ２、窒素平衡、３７℃で培養した。培養のために、核導入処置手順の３〜７日前に、核導入の２４〜４８時間前にコンフルエントに達するように適切な希釈で細胞を播種した。核導入の日に、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃２５３００−０５４）を用いて、胚再構築で使用する約３０〜４５分前にドナー細胞を回収し、適切な保持培地（例えば、Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｍ１９９、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１２３５０−０３９）に単一細胞を懸濁した。
【０３３７】
ＮＴ処置手順を、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｐｏｌｅｊａｅｖａら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０７、８６−９０、Ｄａｉら、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０、２５１−２５５、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（２００７）、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ６８  Ｓｕｐｐｌ  １、Ｓ２１４−２３１、Ｖａｔｊａら、（２００７）、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  １９、４０３−４２３を参照）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟卵母細胞（Ｄｅｓｏｔｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｂｕｒｇ、ＶＡ）に対して行った。再構築された卵母細胞の電気融合および活性化を、ＥＣＭ２００１  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を用いて行った。融合され活性化された核導入胚を、リン酸緩衝ＮＣＳＵ−２３培地（Ｊ  Ｒｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ．、１９９３；４８：６１−７３）で、１〜４時間、３８．５℃で培養し、次いで、発情期が同期されたレシピエント雌ブタの卵管に移した。異種交配雌ブタ（ｌａｒｇｅ  ｗｈｉｔｅ／Ｄｕｒｏｃ／Ｌａｎｄｒａｃｅ）（２８０〜４００ポンド（約１２７〜１８１ｋｇ））を、餌に混ぜた１８〜２０ｍｇのＭａｔｒｉｘ（Ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、Ｗａｒｒｅｎ、ＮＪ）の経口投与によってレシピエント動物と同期させた。Ｍａｔｒｉｘは、１４日間連続して投与した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、１０００単位；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＤＥ）を、最後のＲｅｇｕ−Ｍａｔｅ処置から１０５時間後に筋内投与した。胚導入を、ｈＣＧ注射の２２〜２６時間後に腹中線開腹術によって行った。妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、１０００  ＩＵ）およびｈＣＧ（５００  ＩＵ）を、妊娠維持のために導入の１０日後および１３日後に使用した。導入の２８日後に超音波検査によって妊娠を確認した。その後、週に１度妊娠をモニタリングした。すべての仔ブタが、自然分娩で出産された。
【０３３８】
ピューロマイシン選択され、ｐＲＥＶ７９２およびｐＲＥＶ８３５導入遺伝子に対するスクリーニングで陽性であった１８３−６−６細胞を用いた核導入により、これまでに同腹仔の３匹の仔ブタが得られた；ある仔ブタは、ｐＲＥＶ７９２およびｐＲＥＶ８３５導入遺伝子の両方に対して遺伝子型陽性であった。このうちの１匹の仔ブタ、＃３２０−２を、表現型分析に使用した（実施例７を参照）。仔ブタ３２０−２から単離した線維芽細胞も、後に核導入（再クローニング）に使用し、同腹仔の生きた子孫を得た。
【０３３９】
ピューロマイシン選択され、ｐＲＥＶ７９０およびｐＲＥＶ７９２導入遺伝子に対するスクリーニングで陽性であった２２７−３細胞を用いた核導入により胎仔５４８／Ａ３が得られ、この胎仔５４８／Ａ３は、ｐＲＥＶ７９０およびｐＲＥＶ７９２導入遺伝子の両方に対して遺伝子型陽性であり、さらに親細胞系由来のＧＴＫＯおよびＣＤ４６遺伝子改変を有していた。胎仔５４８／Ａ３から単離した細胞を、再クローニングに使用し、これまでに同腹仔の７匹の仔が得られた（表１を参照）。同腹仔の１匹の仔ブタ３４７−３を、実施例６〜７の表現型分析に使用した。これらの再クローニングされた仔ブタのすべてが、５４８／Ａ３胎仔と同じ遺伝子型を有することが確認された、すなわち、これらの仔ブタは、ｐＲＥＶ７９０（ＴＦＰＩ）およびｐＲＥＶ７９２（ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ）導入遺伝子（膵臓特異的発現）を含むトランスジェニックであり、さらにＣＤ４６トランスジェニックおよびＧＴＫＯ（トランスフェクションに使用された細胞系；２２７−３の遺伝的背景による）でもあった。本発明者らの知る限りでは、４つ以上の遺伝子改変を有するブタが作製されたのはこれが初めてである。
【０３４０】
【表１】
2018121663.tif 000005
実施例５：ＰＣＲおよびサザンブロット分析による細胞およびトランスジェニック動物の遺伝子型決定
遺伝子型分析：
ゲノムＤＮＡを、検査される各マウスまたは仔ブタ由来のトランスフェクト細胞および血液または組織サンプルから抽出した。簡単に述べると、組織サンプルを、組織１７５ｍｇに付き約１ｍｌの溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣ１、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、２５％過塩素酸ナトリウム、および１％のβ−メルカプトエタノールおよびプロテイナーゼＫ）を用いて振盪インキュベーター内で、６０℃で一晩溶解した。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出の後でイソプロピルアルコールで沈殿させた。可溶化ＤＮＡを、ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）＋ＲＮａｓｅ  Ｔ１（１０００Ｕ／μｌ）を用いて３７℃で１時間処置し、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を用いて５５℃で１時間処置し、フェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させ、トリスエチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＤＮＡを、哺乳動物血液用のＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて全血サンプルから単離した。
【０３４１】
サザンブロット分析のために、約１０μｇのＤＮＡを適切な制限酵素（詳細は後述）で消化し、１％アガロースゲル上で分離した。電気泳動の後、ＤＮＡをナイロン膜に移し、３’末端ジゴキシゲニン標識プローブ（プローブ配列は以下に示す）でプロービングした。バンドを、化学発光基質系（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて検出した。
【０３４２】
ｐＲＥＶ７９０−ＴＦＰＩ
組み込まれたｐＲＥＶ７９０コンストラクトの存在を、ラットインスリンＩＩプロモーターからＴＦＰＩコーディング配列の５’領域まで伸長した１０００ｂｐの断片を標的とするプライマー７９０．５Ｌおよび７９０．５Ｒを用いたＰＣＲによって決定した。
【０３４３】
【化４】
2018121663.tif 000006
組み込まれたｐＲＥＶ７９０コンストラクトの存在を、ＢａｍＨＩ消化を用いたサザンブロット分析およびプローブＴＦＰＩ５’／３’を用いたプロービングによって確認した。
【０３４４】
ＴＦＰＩ５’／３’プローブ配列：
【０３４５】
【化５】
2018121663.tif 000007
ｐＲＥＶ７９２−ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ
組み込まれたｐＲＥＶ７９２コンストラクトの存在を、ラットインスリンＩＩプロモーターからＣＴＬＡ４コーディング配列の５’領域まで伸長した４７３ｂｐの断片を標的とするプライマー（７９２．ｓおよび７９２．ａ）を用いたＰＣＲによって決定した。これらのプライマーの配列は次の通りである。
【０３４６】
【化６】
2018121663.tif 000008
組み込まれたｐＲＥＶ７９２コンストラクトの存在を、ＢａｍＨＩ消化を用いたサザンブロット分析およびプローブ７９２．ｓ１７９２／ａ２２６５を用いたプロービングによって確認した。
７９２ｓ１７９２／ａ２２６５プローブ配列：
【０３４７】
【化７】
2018121663.tif 000009
ｐＲＥ’Ｖ８３５−ＣＤ３９
組み込まれたｐＲＥＶ８３５コンストラクトの存在を、ＣＤ３９コーディング領域内の５８４ｂｐの断片を標的とするプライマーＣＤ３９Ｒ３およびＣＤ３９Ｌ３を用いたＰＣＲによって決定した。
【０３４８】
【化８】
2018121663.tif 000010
組み込まれたｐＲＥＶ８３５コンストラクトの存在を、Ｓａｄ消化を用いたサザンブロット分析およびプローブＣＤ３９Ｌ３／Ｒ３を用いたプロービングによって確認した。
ＣＤ３９Ｌ３／Ｒ３プローブ配列：
【０３４９】
【化９】
2018121663.tif 000011
実施例６：トランスジェニックブタ由来の組織の表現型分析（ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ）
ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現についてのウエスタンブロット：
組織および細胞溶解物を、プロテアーゼインヒビター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の存在下での均質化、続くＳＤＳ（１％最終濃度）の添加、および残った細胞デブリを除去する遠心分離によって調製した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。熱変性およびβ−メルカプトエタノール還元サンプル（１０〜２０ｇタンパク質）を、４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓ  ＳＤＳ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で分画した。組換えヒトＣＴＬＡ４−Ｉｇ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、標準的なコントロールタンパク質として使用した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、全タンパク質可視化のためにＭｅｍｃｏｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、カゼインブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でブロッキングした。ブロッキングされた膜を、ｐＣＴＬＡ４−ＩｇのヒトＩｇＧ１重鎖領域を認識するウサギ抗ヒトＩｇＧ１西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でインキュベートした。免疫反応性バンドを、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および写真画像で検出した。
【０３５０】
胎仔５４８／Ａ３、および５４８／Ａ３細胞由来再クローン仔ブタ（仔ブタ３４７−３）は、ウエスタンによって、特に膵臓での５６ｋＤａのｐＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の発現を示した（図２）。
【０３５１】
実施例７：腎臓で導入遺伝子を発現する動物の表現型分析
組織学および免疫蛍光：
マウスまたはブタ膵臓を取り出し、１０％ホルマリン固定するか、またはＯＣＴ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）のブロックに凍結させた。ホルマリン固定組織を、パラフィンに固定して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）染色で染色するために５μｍにカットした。ＨおよびＥ染色は、標準的な処置手順を用いて行った。凍結切片を、クリオスタット上で５μｍにカットし、ウサギ抗ヒトＴＦＰＩ（ポリクローナル、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ、＃４９０１）、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ１（ポリクローナル、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ、＃ＡＵＯＯ６）、マウス抗ヒトＣＤ４６（クローンＯ．Ｎ．１３７、ｍＩｇＧ２ａ、Ｕ．Ｓ．、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）、マウス抗ヒトＣＤ３９（クローンＢＵ６Ｉ、ｍＩｇＧ１、Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）、またはマウス抗ラットインスリン／プロインスリン（クローンＤ３Ｅ７、ｍＩｇＧ１、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で染色した。アイソタイプコントロールを、ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、ヒツジＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）、マウスＩｇＧ２ａ（クローンＭＲＣ  ＯＸ−３４、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、およびマウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ−３１Ｃ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）のそれぞれに曝露した。免疫蛍光（ＩＦ）染色を、３ステップ処置手順を用いて行った。凍結切片を乾燥させ、冷アセトン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に固定し、次いでアビジン−ビオチンブロッキング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を行った。二次Ａｂ宿主種血清ブロッキングステップも含んでいた（１０％ロバ血清、Ｊａｃｋｓｏｎ）。一次ＡｂをＰＢＳで希釈し、加湿チャンバー内で、室温で１時間インキュベーションを行った。使用した二次Ａｂは、４５ｍｍに対してはビオチン化ロバ抗（ウサギ、ヒツジ、またはマウス）ＩｇＧであり、使用した三次Ａｂは、３０ｍｍに対してはフルオレセイン結合ストレップアビジンであった（Ｊａｃｋｓｏｎ）。スライドをステップとステップとの間にＰＢＳで洗浄し、２２×３０ｍｍカバースリップ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を用いてカバースリップし、ＤＡＰＩを含むＳｌｏｗｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で保存した。代表的な組織学およびＩＦ写真を、Ｐｒｏｖｉｓ顕微鏡のＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７１カメラを用いて撮影し、倍率が２００倍のＤＰコントローラーソフトウエア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を用いて分析した。
【０３５２】
結果：
ｐＲＥＶ７９０（ＴＦＰＩ）導入遺伝子マウス：
１歳のマウスは、代表的なＨ＋Ｅ組織学で示されているように、十分にクラスター化された膵島を有していた。これらのマウスは、膵島特異的にｈＴＦＰＩを発現し、染色は、インスリンの局在と同様に局在していた（図３）。ｈＴＦＰＩ染色は、インスリンよりも強く、現在記載されている系を用いた効率的な膵島特異的な発現を示した。
【０３５３】
ｐＲＥＶ７９０／ｐＲＥＶ７９２トランスジェニックブタ：
胎仔５４８／Ａ３を、妊娠の７３日目に組織学によって特徴付けた（図４）。仔ブタ３４７−３（５４８／Ａ３の再クローン）を、約２．５ヶ月齢で特徴付けた（図５）。β細胞が、胎仔腎臓で分散し拡散しており、これが、代表的な写真に見られる。ｈＴＦＰＩおよびｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ｈＩｇＧＩ  Ａｂ）の染色パターンは、インスリンに類似していた。染色は、インスリンよりもｈＴＦＰＩおよびｐＣＴＬＡ４−Ｉｇで強かった。２．５ヶ月齢の仔ブタ３４７−３は、より発達した膵島クラスターを有し、内部で強い染色を示した。仔ブタ３４７−３における膵島特異的な発現は、ｈＴＦＰＩで最も強く、ｐＣＴＬＡ−４−Ｉｇでやや弱く、インスリンで弱かった。
【０３５４】
ｐＲＥＶ８３５（ＣＤ３９）トランスジェニックブタ：
約３．５ヶ月齢の仔ブタ３２０−２は、完全に発達した膵島クラスターを有し、内部でＣＤ３９の強い染色を示した。３２０−２でのｈＣＤ３９の膵島特異的な発現は、前のマウスおよびブタの実施例で示されているようにインスリンでより強かった（図６）。
【０３５５】
実施例８：トランスジェニックマウスおよびブタ膵島の膵島単離およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイ
ブタおよびマウス膵島を、当技術分野で周知の研究室プロトコルを用いて単離し、クラスター化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固（凝固時間）の検査を行うことができ、これらの例が以下に記載される。
【０３５６】
膵島単離および培養の溶液：
２５％フィコールストック溶液：
３３．３ｇのＦｉｃｏｌｌ４００、Ｔｙｐｅ４００、Ｓｉｇｍａ＃Ｆ−４３７５
１００ｍｌ  ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ
撹拌しながら混合し、フィコールが溶液になるまで低温加熱する。
フィルター滅菌する。４０℃で保存する。２５％溶液から勾配をつける。
５０ｍｌの場合：２５％フィコール  ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ
２３％溶液＝    ４６ｍｌ          ４ｍｌ
２０．５％溶液＝４１ｍｌ          ９ｍｌ
１１％溶液＝    ２２ｍｌ          ２８ｍｌ
これらを完全に混合する。４０℃で保存する。
【０３５７】
ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ：
カルシウムおよびマグネシウムを含む５００ｍｌのＨＢＳＳ
１０ｍｌのＨｅｐｅｓ  １Ｍ
完全に混合する。４０℃で保存する。
【０３５８】
ＨＢＳＳ／ＢＳＡ：
カルシウムおよびマグネシウムを含む５００ｍｌのＨＢＳＳ
１０ｍｌのＨｅｐｅｓ  １Ｍ
２．５ｇのＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ
ＢＳＡを添加してからフィルター滅菌する。完全に混合する。４０℃で保存する。
【０３５９】
コラゲナーゼ：
１．９５ｍｇのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  Ｖ  Ｓｉｇｍａ＃Ｃ−９２６３
１ｍｌのＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ
穏やかに混合する。過度の撹拌は酵素作用を破壊する。４０℃に維持する。溶液は、新鮮なものを使用するのが最適であるが、４０℃に維持されていれば最大３日まで使用しても良い。溶液は、時間が経つにつれて弱くなるため、凍結しても良いが、解凍後に活性が低下する。
【０３６０】
マウス膵島培養培地：
５００ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０
５０ｍｌのウシ胎仔血清（熱不活化）
１０ｍｌのＨｅｐｅｓ  １Ｍ５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／１０，０００ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）
５００μｌの２−メルカプト−エタノール  ５０ｍＭ（ストック：５５ｍｌのＰＢＳ中に０．２ｍｌ）
フィルター滅菌し、４０℃で保存する。
【０３６１】
マウス膵島単離プロトコル：
膵臓を摘出する直前にマウスを屠殺する。フローフード内で、滅菌条件下で摘出および単離の処置手順を行う。開腹術を行い、皮膚を引っ張り、頭部に向かって体壁を引き上げる。肝臓を、横隔膜に対して裏返す。総胆管を探し、次いで腸との接合部を探す。鉗子を十二指腸の周りおよび胆管の端部の上に配置して、胆管から腸への流れを遮断する。
【０３６２】
３ｍｌまたは５ｍｌシリンジに冷コラゲナーゼ溶液を充填し、３０Ｇ針を取り付ける。針をシャフトのほぼ真ん中で曲げて、９０度の角度を付ける。針を、腸に向けて、肝臓に近い胆管に刺入する。胆管にさらなる損傷を与えることなく（さらなる刺入をしない）、針を、可能な限り胆管に滑らせる。膵臓が完全に膨張するまでコラゲナーゼを膵臓に注入する。初めは、腸に漏れないことを確認するために少量注入する。漏れがあったら、鉗子を再調整する。動物のサイズによって、膨張には、２〜５ｍｌのコラゲナーゼが必要であろう。膵臓の膨張後、針および鉗子を取り除く。膵臓を、付着した組織および管から切り離して摘出する。最大収量を得るために、全膵臓を摘出する。切除した膵臓を冷コラゲナーゼ溶液中で洗浄し、次いで２５ｃｍ２のフラスコに入れて、他のすべての膵臓が摘出されるまで氷上に置く。４つ以下の膵臓を１つのフラスコに入れる。インキュベーションの前に、フラスコに１〜２ｍｌ追加する。振盪しないでフラスコを３７℃で１８〜２０分間インキュベートする。
【０３６３】
インキュベーション後、フラスコを、約１０秒間または組織が均質になるまで強く振盪する。１０ｍｌの冷ＨＢＳＳ−ＢＳＡをフラスコに添加することによって酵素の作用を停止させる。キャップを交換して、フラスコをさらに２〜３秒間、強く振盪する。組織スラリーを５０ｍｌの円錐管に注ぎ、５０ｍｌまでＨＢＳＳ−ＢＳＡで満たす。混合し、次いで５分間、重力によって沈降させる。これは、膵島ではない組織の微粒子を除去するために行う。膵島は大きいため、遠心分離を行わなくても底に沈降する。散漫に沈降したペレットを乱さずに上清を除去する。ペレットを、ピペット操作または振盪によって混合し、再び洗浄する。上清が比較的透明になるまで洗浄ステップを２〜５回繰り返す。洗浄の量は、使用する組織のサイズによって異なる。２回目または３回目の洗浄の際にワイヤ２０メッシュスクリーンに組織を通して未消化組織の塊を除去することができる。
【０３６４】
最後の洗浄後、１つの膵臓当たりＨＢＳＳ−ＢＳＡ  ５ｍｌの割合でペレットを再懸濁する。消化された組織を分割して、１７×１００ｍｍ（１４ｍｌ）丸底ポリスチレン管に入れる。２つ以下の膵臓を管に入れる。管を１０００ｒｐｍで１分間、軽く遠心分離して、組織をペレットにする。フィコール勾配を希釈しないように、ペレットからできだけ多くの上清を除去する。２５％フィコール溶液４ｍｌを管に添加し、５〜１０秒間ボルテックスして組織を再懸濁する。２３％から始め、２０．５％、最終的に１１％の残りのフィコール勾配（それぞれ２ｍｌ）に積層する。層または界面を乱したり混合したりしない。管を１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【０３６５】
遠心分離後、膵島は、ほとんどが１１％と２０．５％の層間および２０．５％と２３％の層間の界面に存在する。すべての層および界面を別個に取り出して、１５ｍｌの円錐管に入れる。廃棄する前にどの層も膵島について調べる。層をＨＢＳＳ−ＢＳＡで１回洗浄する。１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清をピペットで除去する。完全培地でもう１回洗浄し、３〜５分間、重力によって沈降させる。上清をピペットで除去する。緩いペレットを乱さないようにする。管に残ったものを収集し、６０ｍｍの非組織培養滅菌ペトリ皿に入れる。ここで、膵島を手で摘んでカウントすることができる。
【０３６６】
コラゲナーゼを用いたブタ膵臓の消化：
コラゲナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＰＩまたはＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｐ、Ｒｏｃｈｅ）を用意する。１ｍｇ／コラゲナーゼ／ｍｌを含むＨＢＳＳ溶液を用意する。使用するまで氷上に置いておく。使用前に、２４℃に温める。成体ブタの全膵臓の場合は、５００ｍｌの溶液を作製する。
１．氷上の滅菌バケツで、膵臓から結合組織、脂肪、血液を取り除く。
２．氷から臓器を取り出す。
３．膵管を探し（全膵臓を使用する場合）、次いでこの膵管からコラゲナーゼを注入する。別法では、部分臓器サンプルの場合、または膵管が見つからない場合は、コラゲナーゼを実質に直接注入する。
４．注入は、最大５分間続けることができる。
５．臓器を分割し（それぞれ１／２インチ（１２．７ｍｍ））、予め温められたコラゲナーゼ（すべての片を覆うのに十分な量）が入ったビーカーに入れる。
６．３７℃の水槽に入れ、手動で振盪を続ける。
７．数分後、組織が分解し始める。片全体は、消化されないこともある。遊離した細胞の過度の消化を回避するために、振盪の１０分後に、溶液が濁ってきた場合は、遊離細胞をピペットで回収して、細胞を、血清（５％）を含む大量の冷ＲＰＭＩ溶液が入ったビンまたはビーカー（氷上）に移す。
８．十分な細胞を回収するまで加温消化を続けるが、組織は、３０分を超えて温かいコラゲナーゼに曝露してはならない。
９．細胞を冷ＲＰＭＩ＋血清で数回洗浄してコラゲナーゼを除去する。
１０．１０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
１１．単離された膵島を得るために、フィコール勾配にかける。
１２．組織ペレットが少量の場合は、５０ｍｌの円錐管を使用する。
１３．密度勾配を作る：ストック１．１３２、層１．１０８、１．０９６、１．０３７
１４．ストックフィコール１０ｍｌに分散されたペレット２ｍｌを底に入れる。その上に８ｍｌの１．１０８、次いで８ｍｌの１．０９６、次いで８ｍｌの１．０３７、次いで５ｍｌのＨＢＳＳを積層する。
１５．８００ｇまたは２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。
１６．膵島は、第２の界面および第３の界面にあるはずであるが、念のため他の層も調べる。
１７．フィコールを十分に洗浄し（ＲＰＭＩ＋血清で、１２００ｒｐｍで３分間、少なくとも３回洗浄）、次いで、必要に応じて細胞を培養または固定する。
【０３６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固（凝固時間）アッセイのプロトコル：
材料
・３７℃のＣＭＲＬ−１０６６培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）
・３７℃のインキュベーターシェーカー
・ポリスチレン未処置２４ウェルプレート
・ピペット
・１ｍＬのシリンジ
・Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒセット：針、ゴムバンド
・アルコールスワブ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｗａｐ）
・バンドエイド
・ゴミ箱
・タイマー
方法
・手で摘んだ１００の膵島を、各ウェルの３７℃の２００μＬのＣＭＲＬ培地にプレーティングする。
・３７℃の２００μＬのＣＭＲＬ培地を、血液のみが入ったコントロールウェルにプレーティングする。
・２００μＬの新たに採血されたヒト血液を各ウェルに添加する。
・プレートを振盪して穏やかに混合し、プレートをインキュベーターシェーカーに入れる。
・凝固時間について実験を観察する。
【０３６８】
上述のような方法を用いて膵島を単離した。正常な野生型（ＷＴ）マウスまたはブタ膵島をコントロールとして使用した。ＴＦＰＩ−トランスジェニックマウス系（ｐＲＥＶ７９０；実施例２を参照）由来の膵島も調製した。ＴＦＰＩトランスジェニックブタ膵島を、実施例４に記載されている５４８／Ａ３ブタ系から得た。膵島を、新たに単離されたヒト血液と混合し、凝固時間を、血栓形成のために決定した。ヒト血液に曝露されたトランスジェニックマウスおよびブタの膵島のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固時間（分単位）が、以下の表２に示されている（２つの別個の実験）。
【０３６９】
【表２】
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膵島での導入遺伝子の発現は、マウス膵島での凝固時間を３３％長くし、ブタ膵島での凝固時間を３８％長くする。
【０３７０】
実施例９：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）移植におけるトランスジェニックブタ膵島異種移植のｉｎ  ｖｉｖｏ機能性の決定
ＮＨＰにおける糖尿病および免疫抑制の誘導：
非ヒト霊長類モデルでは、糖尿病は、カニクイザルに適応された、近年開発されたストレプトゾトシンプロトコルを用いて糖尿病を化学的に誘導することができ、糖尿病状態およびドナー膵島の生存／機能を、インスリンならびに霊長類特異的およびブタ特異的Ｃ−ペプチドアッセイ（Ｒｏｏｄら、２００６、Ｃａｓｕら、２００８、Ｂｏｔｔｉｎｏら、２００９）を用いてモニタリングすることができる。
【０３７１】
ヒト抗ＣＤ１５４ｍＡＢと同様の活性をもつ共刺激遮断薬、ヒトＣＴＬＡ４Ｉｇを、ＡＴＧ誘導治療およびＭＭＦを用いる維持療法と組み合わせて用いることができる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、現在、ＣＤ１５４ｍＡＢの潜在的な代替手段であり、ブタから非ヒト霊長類の膵島Ｔｘのために１つのグループによって既に使用されている（Ｃａｒｄｏｎａら、２００６）。このＣＴＬＡ４Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）は、抗ＣＤ１５４ｍＡｂと同じ時間間隔で（トラフ濃度を＞３００ｎｇ／ｍｌに維持するために、−１日、０日、４日、７日、１０日、１４日、１９日、そして毎週）、ＳＴＺ誘導糖尿病サルに１２．５〜２５ｍｇ／ｋｇを静脈投与することができる。ＡＴＧおよびＭＭＦと組み合わせられたこの投与計画が、ＧＴＫＯブタ動脈移植片（Ｅｚｚｅｌａｒａｂら、原稿は準備中）が移植されたヒヒで感作を防止するのに十分であることが予備研究で実証された。
【０３７２】
要約すると、膵島移植のためのＮＨＰの免疫抑制は、次の通りとすることができる。
誘導：
・１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）を２回（−３日目と−１日目）静脈投与して、０日目のＴ細胞数を＜５００細胞／ｍｍ３にする。
維持：
・ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与して、全血トラフ濃度を３〜６μｇ／ｍｌに１２時間維持する。
・２５ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇを、−１日目、０日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、そして毎週、静脈投与する。
【０３７３】
ブタ膵島の調製および移植：
ブタ膵島の単離を、安楽死させたブタドナーから腎臓を摘出してすぐに行う。ブタ膵島は、ブタ用にデザインされた特定のコラゲナーゼブレンド、低い消化温度、酵素の穏やかな注入を用い、実質的に機械的に振盪させずに、Ｒｉｃｏｒｄｉによって記載された半自動方法に改良を加えた方法で得る（Ｂｏｔｔｉｎｏら、２００７）。膵島の精製は、不連続勾配における細胞プロセッサー装置（ＣＯＢＥ  ２９９１１）での遠心分離によって達成した（Ｂｏｔｔｉｎｏら、２００７、２００９）。単離膵島の機能特性および生存度を、各膵島バッチについて評価する。自己免疫Ｉ型糖尿病の非ヒト霊長類モデルの非存在下で、高血糖を、ストレプトゾトシンの静脈注射（ＳＴＺ、Ｚａｎｏｓａｒ、１２５〜１５０ｍｇ／ｋｇ）によって誘導する。サルの頸動脈および頸静脈に挿入され、繋留系に接続された血管系により、薬物送達および採血が容易になり、糖尿病誘導後の最適なインスリン静脈投与が可能となる。経静脈的グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）およびアルギニン刺激試験（ＡＳＴ）を、ストレプトゾトシンの投与の前後で行って糖尿病の状態を確認し、そして移植後に分泌促進物質に対する移植片の応答を評価する。移植の日に、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１０ｍＭニコチンアミド、２ｍＭグルタミン、およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏが添加されたＣＭＲＬ−１０６６培地で一晩培養した後に膵島をカウントし、Ｄｅｘｔｒａｎｅ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ  ４ｍｇを含むＣＭＲＬに再懸濁して凝固を防止し、５〜１０分の時間、重力により門脈に注入する。膵島細胞破壊の指標であるブタＣ−ペプチドの放出を、膵島注入の１時間後および２時間後に測定し、ピークが、ＩＢＭＩＲによる初期の膵島細胞の消失の程度を示唆する。前の実験で得た組織学的データを使用して、導入遺伝子の初期膵島消失を防止する能力を評価することができる。血清Ｃ−ペプチド濃度は、互いに交差反応しない特異的なブタおよびヒト抗体を用いて決定し、内因性のインスリン産生と異種移植後の移植片のインスリン産生とを区別できるようにする（Ｃａｓｕら、２００８）。
【０３７４】
膵島のＩＢＭＩＲからの初期消失は、（ｉ）最初の２４時間以内のＣ−ペプチドレベルの測定（膵島破壊のマーカーとして）、（ｉｉ）血糖値、（ｉｉｉ）Ｔｘ後の外因性インスリンの必要量（正常血糖状態の維持における移植の成功の指標として）、（ｉｖ）肝臓における多数の生きた膵島（インスリン陽性）の存在、および（ｖ）剖検後の組織学的検査における移植片の細胞浸潤の程度によってモニタリングすることができる。
【０３７５】
実施例１０：糖尿病サルにおけるＣＤ４６トランスジェニックブタ膵島のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能
霊長類での糖尿病の処置におけるＣＤ４６発現細胞の有用性を決定するために、実施例９に記載されているようにカニクイザルに糖尿病を化学的に誘導した。
【０３７６】
ｈＣＤ４６＋ブタ膵島ドナーを、ｈＣＤ４６導入遺伝子、その内因性プロモーターの制御下のミニ遺伝子を有する祖先系の異系交配によって得た。偏在性ｈＣＤ４６発現を、分析されたすべての組織および単離された膵島の免疫蛍光顕微鏡によって観察した（Ｌｏｖｅｌａｎｄら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００４、１１：１７１：１８３）。糖尿病は、実施例９に記載されているように９匹のサルレシピエントに誘導して確認した。群Ａのレシピエント（ｎ＝４）に、体重１ｋｇ当たり８５，０００〜１００，０００ＩＥＱ／ｋｇの数の野生型ブタ膵島（ｎ＝２）またはＧＴＫＯブタ（ｎ＝２）から単離した膵島のいずれかを移植した。群Ｂのレシピエント（ｎ＝５）に、同数のｈＣＤ４６＋ブタ由来の膵島を移植した。２匹の群Ｂの動物に、４９日後および９１日後のそれぞれに再移植した。免疫抑制は、両方の群で同一であり、誘導用の抗胸腺グロブリン、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）からなっていた。１年以上経過観察される１匹の群Ｂの動物を除いて、サルは、移植片機能が喪失するまで、または移植後最大３ヶ月経過観察した。
【０３７７】
検出可能なブタＣ−ペプチドと外因性インスリン必要量の５０％を超える減少によって決定される機能性ブタ膵島の生存が、すべてのサルで達成された。群Ａでは、膵島は、７日間、２０日間、３１日間、および４６日間生存した。群Ｂでは、ｈＣＤ４６＋膵島の使用により、機能性ブタ膵島の生存が、全３ヶ月または１年の経過観察を越えてそれぞれ有意に延命された（ログランク検定、ｐ＝０．００４２）。移植後の週に１度の空腹時ブタＣ−ペプチドレベルは、最初の４５日間は群Ａと群Ｂで同等であった（１．１０±０．４１対１．１９±０．８８ｎｇ／ｍＬ、スチューデントのｔ検定  Ｐ＝０．８６０）。４５日後、Ｃ−ペプチド陽性は、群Ｂのレシピエントのみで０．８７±０．４１ｎｇ／ｍＬに維持された。
【０３７８】
インスリン非依存性が、４匹の群Ａのサルのうちの３匹でそれぞれ、５日間、１７日間、および３６日間達成された。５匹の群Ｂのサルのうちの４匹がそれぞれ、８７日間、９１日間、９２日間、および＞３９６日間、インスリン非依存性になった。インスリン非依存性の期間中、空腹時血糖値は、十分にコントロールされた（群Ａ：９１±１８ｍｇ／ｄＬ；群Ｂ：１１２±２２ｍｇ／ｄＬ、スチューデントのｔ検定  Ｐ＝０．２５０）。いずれのサルも、内因性β細胞機能を回復しなかった。
【０３７９】
移植後の肝臓の組織学的評価により、群Ｂの動物における多数の生存可能なブタ膵島が明らかにされた。Ｔ細胞浸潤がうまく防止された。抗Ｇａｌおよび／または抗非Ｇａｌ抗体の血中濃度は、群Ａのサルでも群Ｂのサルでも、再移植後も上昇しなかった。これにもかかわらず、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＣ４ｄが、群Ａの肝臓の組織学的分析によって生着膵島に見られたが、群Ｂの肝臓の膵島では最小限しか見られなかった。
【０３８０】
ＣＤ４６のみが導入遺伝子の場合、膵島の大量投与がなお必要であり（７５，０００〜１００，０００  ＩＥＱ／ｋｇ）、ｈＣＤ４６異種移植片に関連した有意な初期移植片消失が起きた。加えて、利用した異種免疫抑制療法は、ヒト患者には使用できない（ｖａｎ
ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、９（１２）：２７１６−２７２６、２００９を参照）。
【０３８１】
実施例１１：ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するブタの表現型
ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現する動物の開発が提案されたが、これらの動物は、重度の免疫不全である。ＣＡＧエンハンサー／プロモーターを用いて遍在的にｐＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するブタは、免疫不全表現型を有することが分かり、典型的な畜産環境では生存できなかった。
【０３８２】
ＷＴブタまたはＧＴＫＯブタ由来の初代胎仔線維芽細胞（Ｌａｎｄｒａｃｅ／Ｄｕｒｏｃ／Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅの交配を起源とする）を、線状化ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇコンストラクトとｐｇｋピューロマイシンｒベクターまたはｐｇｋネオマイシンｒ（ｐｇｋｎｃｏｍｙｃｉｎｒ）ベクターとが１０：１の割合でのエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。４８時間目に、細胞を、１００〜５００細胞／ｃｍ２の濃度で４８ウェルプレートに蒔き、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）または０．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で選択した。選択したクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子についてスクリーニングし、陽性クローン（８つがＷＴ背景、７０がＧＴＫＯ背景）をプールし、核導入に使用した。これらの細胞に、上記のように核導入した。動物は、病原体への曝露を最小限にするために隔離された部屋で出産させ、テトラサイクリンを含む餌（餌１ｋｇに付き１１０ｇ）を出生時から開始し、安楽死させるまで続けた。ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現をウエスタンブロットによって評価し、免疫蛍光は、強い発現を示した。ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇの血清濃度は、約３８０〜１，６００μｇ／ｍｌ血清と高かった。
【０３８３】
ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇトランスジェニックブタおよび非トランスジェニック同腹仔は、約２ヶ月間健康に見えた。その時点で、トランスジェニック仔ブタは、発熱、全身倦怠感、異常毛髪成長、および場合によっては皮膚病変を含む疾病の徴候を示し始めた。雌ブタ（母親）から引き離され、飼育場で群れで飼われたＷＴ／ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇブタでは、これらの疾病は急性であり、症状が明らかになるとすぐに死んだ。ほとんどのトランスジェニックブタは、１０〜１１週齢で疾病で死んだか、または安楽死が必要であった。これらの同腹仔における非トランスジェニック同腹仔は健康を維持した。組織学的分析により、予防処置をしないと、トランスジェニックブタは、それらの非トランスジェニック同腹仔とは対照的に、白血球（ＷＢＣ）の数が少なく、正常値の５３％〜７１％の範囲であることが示唆された。これらの動物では、全リンパ球の数も正常以下であり、正常値の１４％〜６１％の範囲であった。
【０３８４】
ホモ接合性ＧＴＫＯ背景で作製されたＣＡＧ−ｐＣＴＬＡ４−Ｉｇトランスジェニックブタは、より慢性の疾病を発症し、抗生物質での処置にもかかわらず、これらのブタの健康状態は悪くなり続け、これらのブタの最後の１匹を約１０週齢で安楽死させた。それらのＣＴＬＡ４−トランスジェニック兄弟と共に飼育された４匹の非トランスジェニック同腹仔は、健康で元気なままであった（参照：Ｐｈｅｌｐｓら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１６（６）：４７７−４８５、２００９）。
【０３８５】
実施例１２．５つの遺伝子改変（ＧＴＫＯ、ＣＤ４６、膵島特異的ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびＣＤ３９）を含むブタの作製
ｐＲＥＶ８３５（ＣＤ３９）導入遺伝子を追加するために胎仔５４８／Ａ３（遺伝子改変：ホモ接合性ＧＴＫＯ／ＣＤ４６／ＴＦＰＩ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）由来の細胞のトランスフェクションを行った。実施例３に記載されている処置手順と同様の処置手順を用いて、胎仔線維芽細胞をｐＲＥＶ８３５導入遺伝子でトランスフェクトした。９９のコロニーを回収し、実施例５に記載されている処置手順を用いてｐＲＥＶ８３５導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。１０の陽性コロニーの細胞をプールし、核導入での使用に備えた。プールされたｐＲＥＶ８３５陽性細胞を核ドナーとして用いて核導入を行い、続いて実施例４に記載されている処置手順にしたがった。胚を４匹のレシピエント雌ブタに移し、２匹が妊娠した。１０匹の仔ブタが生まれ；これらのうちの４匹が生きて生まれた。遺伝子型分析により、４匹の生きて生まれたブタの内の３匹が、５４８／Ａ３系由来の４つの遺伝子改変（ＧＴＫＯ／ＣＤ４６／ＴＦＰＩ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）に加えてｐＲＥＶ８３５（ＣＤ３９）導入遺伝子を含んでいることが示された。本発明者らの知る限りでは、これは、５つ以上の遺伝子改変を有するブタが作製された最初である。
【０３８６】
実施例１３．マルチ・トランスジェニック・ブタが自然に交配されたときのマルチ・トランスジェニック・ブタの受胎能力ならびに複数の導入遺伝子の仔への安定した伝達および同時分離
雌ブタ３４７−２（５４８／Ａ３ドナー細胞を用いてＮＴによって作製されたブタ）のホモ接合性ＧＴＫＯ雄ブタとの自然交配により、自然妊娠して同腹仔の１１匹のブタが産まれたため、このマルチトランスジェニック動物の受胎能が実証された。これらのブタの５匹が生きたまま生まれた。生きて生まれたブタの２匹は、親細胞系に固有のＧＴＫＯおよびＣＤ４６遺伝子改変はもちろん、雌親から伝達された２つの追加の膵島特異的（５４８／Ａ３系）導入遺伝子（ＴＦＰＩおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ）を有していた。他の３匹の仔は、ＧＴＫＯおよびＣＤ４６のみに対して陽性であった。以下の表は、３４７−２の仔の遺伝子型（サザン分析によって決定）のまとめである。
【０３８７】
【表３】
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サザン分析により、ＴＦＰＩについてトランスジェニックのすべての動物は、ＣＴＬＡ４Ｉｇについてもトランスジェニックであることが示されている；これは、ＴＦＰＩ導入遺伝子およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ導入遺伝子が、ブタゲノムに同時に組み込まれ、減数分裂の際に同時に分離され、交配により一緒に伝達されたことを示唆している。５４８Ａ３系の交配によって得られる仔は、２つの膵島特異的導入遺伝子を共に有するか、またはいずれの膵島特異的導入遺伝子も有していない。仔動物４１７−４の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析は、この同時組み込みをさらに分析するために進行中である。この分析では、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩのプローブに特有の蛍光タグを標識して、このプローブを、染色体ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。単一遺伝子座での両方のプローブのハイブリダイゼーションは、これらの導入遺伝子が同時に組み込まれたことを示唆し、次世代のブタに一緒に受け継がれる。動物４１７−４は、後の交配のためにも飼育される。
【０３８８】
実施例１４．ＣＤ３９陽性ブタ膵島細胞のＡＴＰアーゼ機能的アッセイ
ブタ３９０−１からのブタ膵島の単離：
膵臓組織を、動物３９０−１、実施例１２で作製された５つの遺伝子改変を有するブタから得た。膵臓から脂肪を切り取り、冷ＨＢＳＳ＋０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を注入した。膵臓を３０分間、３７℃に温めた。次いで、膵臓を冷ＨＢＳＳの中に入れ、臓器を鉗子で切り裂いた。分散した組織を、メッシュスクリーン（３０メッシュ）に通して大きい組織片を取り除いた。膵島を、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）プロトコルを用いて精製した。組織ペレットを、ＲＰＭＩ  ２０ｍｌおよびＯｐｔｉｐｒｅｐ希釈標準液１０ｍｌ（最終濃度１．１ｇ／ｍｌ）で再懸濁した。１．０８５  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）８ｍｌを積層し、次いでＲＰＭＩ  １０ｍｌを積層した。管を、４℃で、５００×ｇで５分間回転させた。最も上の界面に存在する膵島を取り出し、サンプルを染色して膵島の存在を確認した。ＡＴＰアーゼアッセイの準備として、膵島を９６ウェルプレートに入れた。
【０３８９】
３９０−１膵島に対するＡＴＰアーゼアッセイ：
ＣＤ３９は、ＡＴＰおよびＡＤＰのＡＭＰへの変換を触媒する（したがって、リン酸塩を遊離させる）細胞外酵素である。したがって、リン酸塩の遊離を測定するＡＴＰアーゼ発色アッセイ（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）ＡＴＰａｓｅ／ＧＴＰａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ））を使用して、野生型ブタから単離した膵島と比較した、ブタ膵島におけるＣＤ３９導入遺伝子の機能性を決定した。ＣＤ３９を高レベルで遍在的に発現するブタ（動物３２５．１）由来の胎仔線維芽細胞を陽性コントロールとして使用した。
【０３９０】
９６ウェルプレートの一行のウェルに密集度が得られるように細胞を希釈し、２行目のウェルは１：１０に希釈した。すべての細胞を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で１回洗浄した。細胞を一晩凍結させ、解凍し、６つのコンフルエントなウェルの内容物をプールし、１００μｌの最終量のＴＢＳで再懸濁した。この最終量を、２１．５ｍｌのエッペンドルフ管に分けた（それぞれ５０μｌ）。それぞれの管に以下のものを添加した。
９０μｌの２×サンプル希釈液
１．８μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰ（最終１ｍＭ濃度）またはＨ２Ｏ
３８．２μｌのＨ２Ｏ  。
【０３９１】
反応混合物を、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、次いで８０００ｒｐｍで遠心分離した。上清１０μｌをＨ２Ｏ  １９０μｌと混合した（１：２０の希釈）。この希釈液８０μｌを、９６ウェルプレートの最初の行のウェルに加えた。ウェルの列を下に向かって１：２０から１：２５６０に２倍連続希釈を行った。リン酸希釈液（０〜５０μＭ）を調製し、標準曲線として役に立つようにプレートに添加した。ＡＴＰアーゼキットのマラカイトグリーン試薬（２００μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で４５分間インキュベートした。ＯＤ６２０で読み取りを行い、遊離リン酸塩の濃度を、リン酸塩標準曲線からの補間により決定した。
【０３９２】
図８に示されているように、ブタ３９０−１由来の膵島は、野生型膵島よりも高レベルの遊離リン酸塩を有しており、発現されたＣＤ３９導入遺伝子の機能性を示唆している。
【０３９３】
実施例１５．マルチ・トランスジェニック・ブタ由来の膵臓組織の免疫蛍光
膵臓組織のサンプルを、約３ヶ月齢の仔ブタ３９０−１（遺伝子型：ＧＴＫＯ、ＣＤ４６、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびＣＤ３９トランスジェニック）から採取して、実施例７に記載されているようにＩＦによって表現型を特徴付けた。膵臓におけるすべてのトランスジェニックタンパク質に強い染色が現れ：ＣＤ４６、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびＣＤ３９（図９）；膵島細胞成分で顕著であった。検査した組織における膵島のインスリン染色も示される。ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびＣＤ３９の発現は、膵島特異的であり、試験した他組織／臓器（図示しない）では見られなかった。すべてのアイソタイプコントロールは、染色が陰性であった（図示しない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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