(57)【要約】      （修正有）【課題】原因不明の脳血管疾患であるもやもや病の診断方法の提供。【解決手段】正常人及び動脈硬化症患者に比べて、もやもや病の患者の血液試料では、カベオリン−１の水準が特異的に減少するという事実を確認することによる、カベオリン−１を含む、もやもや病の診断用バイオマーカー組成物、診断用組成物、診断キット、診断情報提供方法、及び治療剤スクリーニング方法。カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する製剤であり、前記ｍＲＮＡ発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブを含む組成物を含む、もやもや病の診断用キット。前記キットは、ＤＮＡマイクロアレイチップまたはタンパク質チップであることが好ましい、診断用キット。【選択図】図６
2018014933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を含む、もやもや病の診断用バイオマーカー組成物。
【請求項２】
前記カベオリン−１は、もやもや病の個体においてｍＲＮＡまたはタンパク質水準が減少していることを特徴とする請求項１に記載のバイオマーカー組成物。
【請求項３】
カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、もやもや病の診断用組成物。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡ発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブを含むことを特徴とする請求項３に記載の診断用組成物。
【請求項５】
前記タンパク質発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする請求項３に記載の診断用組成物。
【請求項６】
請求項３に記載の組成物を含む、もやもや病の診断用キット。
【請求項７】
前記キットは、ＤＮＡマイクロアレイチップまたはタンパク質チップであることを特徴とする請求項６に記載の診断用キット。
【請求項８】
個体の試料からカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する段階を含む、もやもや病診断のための情報提供方法。
【請求項９】
前記個体の試料からカベオリン−１発現水準を測定した結果、正常対照群より減少した場合、もやもや病であると判定する段階をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１０】
前記カベオリン−１のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階は、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、またはノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を利用することを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１１】
前記カベオリン−１のタンパク質発現水準を測定する段階は、抗原−抗体反応を利用することを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１２】
前記抗原−抗体反応は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析法で行うことを特徴とする請求項１１に記載の情報提供方法。
【請求項１３】
前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液または小便であることを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１４】
下記の段階を含む、もやもや病治療剤のスクリーニング方法：
（ａ）個体から得られた試料に候補薬物を処理する段階；及び
（ｂ）カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）の発現プロファイルを検出する段階。
【請求項１５】
前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液または小便であることを特徴とする請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を含む、もやもや病の診断用バイオマーカー組成物、診断用組成物、診断キット、診断情報提供方法、及び治療剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
もやもや病（ｍｏｙａｍｏｙａ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、原因不明の脳血管疾患であって、大脳に入る両側の内頸動脈の末端部及び主要分岐（中大脳動脈、前大脳動脈）の漸進的な狭窄と狭くなった動脈の隣接部位である脳基底部で細い異常血管が成長して集まっている血管網（基底の側部循環血管；もやもや血管）が脳血管造影上で現われることを特徴とする（図１参照）。主として、韓国を含めて、中国、日本国等極東アジアで好発する比較的珍しい稀な疾患であって、小児の場合、繰り返し的な一過性脳虚血発作の形態で現われ、大人では、脳出血がよく現われる。
【０００３】
もやもや病の診断と関連して、その発病原因が明らかにされていないため、現在としては、侵襲的な血管撮影術を用いた診断が唯一の方法である。しかし、血管撮影上、特徴的なもやもや血管（ｍｏｙａｍｏｙａ  ｖｅｓｓｅｌ）は、特異的な所見であるが、すべての患者において観察されるものではなく、特に大人のもやもや病では、小児とは異なって、このようなもやもや血管が観察されない場合が有り勝ちであるため、動脈硬化症による狭窄と鑑別しにくい場合が多い。また、もやもや血管は、疾病の経過によって、初期には観察されない場合が多いため、順次的な血管撮影術が必要なことがある。
【０００４】
もやもや病を動脈硬化症のような血管狭窄を起こす他の疾患と鑑別して診断することは、患者の治療において非常に重要である。すなわち、動脈硬化症の場合、抗血小板剤であるスタチン（ｓｔａｔｉｎ）の使用が狭窄の進行や脳梗塞の発病を効果的に予防し、ステント挿入術が役に立つが、もやもや病の場合、薬物治療が疾病の経過に役に立たず、ステント挿入術後にも、大部分ステントの閉塞が起きるからである。反対に、もやもや病の治療法において現在まで知られたバイパス手術（ｂｙｐａｓｓ  ｓｕｒｇｅｒｙ）は、動脈硬化症による閉塞患者には勧告されないことが現況である。
【０００５】
なお、カベオラ（Ｃａｖｅｏｌａｅ）は、細胞内エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）において重要な機能をする５０〜１００ｎｍサイズのフラスコ状溝であって、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に豊かであり、内皮細胞の小胞輸送（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）と信号伝逹において重要な役目をするものと知られている（図２参照）。
【０００６】
この際、カベオラ（Ｃａｖｅｏｌａｅ）を形成／維持するのに必須な膜タンパク質であるカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）は、単純にカベオラ骨格タンパク質としての機能を超えて、骨髄から血管前駆細胞の動員において重要な役目をするだけでなく、腫瘍等疾患の発病に関与するという報告があるが（Ｆｒａｎｋ  ＰＧ等、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２３：１１６１−８）、未だ、もやもや病との関連性については、報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者は、正常人及び動脈硬化症患者に比べて、もやもや病の患者の血液試料では、カベオリン−１の水準が特異的に減少するという事実を確認することによって、本発明を完成するように至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を含む、もやもや病の診断用バイオマーカー組成物、診断用組成物、診断キット、診断情報提供方法、及び治療剤スクリーニング方法を提供することにある。
【０００９】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を含む、もやもや病の診断用バイオマーカー組成物を提供する。
【００１１】
本発明の一具現例において、前記カベオリン−１は、もやもや病の個体においてｍＲＮＡまたはタンパク質水準が減少していることを特徴とする。
【００１２】
本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、もやもや病の診断用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一具現例において、前記ｍＲＮＡ発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブを含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の他の具現例において、前記タンパク質発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明は、前記診断用組成物を含む、もやもや病の診断用キットを提供する。
【００１６】
本発明の一具現例において、前記キットは、ＤＮＡマイクロアレイチップまたはタンパク質チップであることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、個体の試料からカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する段階を含む、もやもや病診断のための情報を提供する方法を提供する。
【００１８】
本発明の一具現例において、前記個体の試料からカベオリン−１発現水準を測定した結果、正常対照群より減少した場合、もやもや病であると判定する段階をさらに含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の他の具現例において、前記カベオリン−１のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階は、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、またはノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を利用することを特徴とする。
【００２０】
本発明のさらに他の具現例において、前記カベオリン−１のタンパク質発現水準を測定する段階は、抗原−抗体反応を利用することを特徴とする。
【００２１】
本発明のさらに他の具現例において、前記抗原−抗体反応は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析法で行うことを特徴とする。
【００２２】
本発明のさらに他の具現例において、前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液または小便であることを特徴とする。
【００２３】
本発明は、（ａ）個体から得られた試料に候補薬物を処理する段階と；（ｂ）カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）の発現プロファイルを検出する段階とを含む、もやもや病治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
本発明の一具現例において、前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液または小便であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のもやもや病の診断方法による場合、類似脳血管狭窄疾患である動脈硬化症と区別され、もやもや病に特異的な治療が可能であるため、不要であるかまたは副作用が同伴され得る危険要素を回避できるので、効果的なもやもや病の治療療法に適用できる。
【００２６】
また、本発明は、もやもや病の患者の血液試料で特異的に変化するカベオリン−１の量を測定して診断する方法であって、簡便で、非侵襲的であり、且つ正確度が高いという長所を持っている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】正常人ともやもや病の患者の脳血管造影写真である。
【図２】カベオラ（Ｃａｖｅｏｌａｅ）とカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を示す写真及び模式図である。
【図３】もやもや病の患者（ＭＭＤ）においてカベオリン−１血清水準が正常群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と動脈硬化性狭窄患者群（ＩＣＡＳ）に比べて減少していることを示す結果である。
【図４】血管撮影術で診断したもやもや病の患者においてカベオリン−１がバイオマーカーとして有用であることを示すＲＯＣ  ｃｕｒｖｅである。
【図５】遺伝的に診断したもやもや病の患者においてカベオリン−１がバイオマーカーとして有用であることを示すＲＯＣ  ｃｕｒｖｅである。
【図６】もやもや病発病においてカベオリン−１と、もやもや病関連遺伝型、血管生成関連成長因子等との関連性を分析したｐａｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、カベオリン−１がもやもや病（ＭＭＤ）患者の試料で特異的に減少するという知見に基づくものであって、前記カベオリン−１をバイオマーカーとして利用してもやもや病を診断する技術を提供する。
【００２９】
本発明においては、もやもや病の患者（ＭＭＤ）、頭蓋内動脈硬化性狭窄患者（ＩＣＡＳ；ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）、正常群（ｃｏｎｔｒｏｌ）から血清を採取し、多様なタンパク質の発現水準を測定して比較評価することによって、動脈硬化症と区別されるもやもや病だけの特異的なバイオマーカーであるカベオリン−１を選定した。
【００３０】
また、従来、もやもや病の患者の一部が家族歴（遺伝歴）を示したため、もやもや病と関連した遺伝子として明らかにされたＲＮＦ２１３（Ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ２１３）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１２５６０７１．１）変異群とカベオリン−１水準との関連性を調査して、遺伝的素因との相関関係を評価した。
【００３１】
また、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１水準変化が、もやもや病の発病において、ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ因子（ＡＤＭＡ、ＮＯ、ｎｉｔｒｉｔｅ、ｎｉｔｒａｔｅ）の作用を媒介するかを評価するために、ｐａｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。
【００３２】
本発明において、カベオリン−１タンパク質は、公知されたデータベースでその配列情報を確認できる。例えば、ヒトカベオリン−１タンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ０３１３５で確認できる。このようなカベオリン−１は、もやもや病の患者群の試料で特異的な／有意性ある発現変化を示すため、もやもや病を診断する診断マーカーとして活用できる。
【００３３】
本発明において用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、もやもや病の発病有無を確認するか、ひいては、疾患の進行可否または深化可否を確認するものである。
【００３４】
本発明において「マーカー」とは、もやもや病を診断できる物質であって、もやもや病と関連したポリペプチド、核酸（例：ｍＲＮＡ等）、脂質、糖脂質、糖蛋白質、糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類等）等のような有機生体分子等を含む。本発明の目的上、マーカーは、カベオリン−１であって、もやもや病の患者において著しく発現が減少するカベオリン−１ｍＲＮＡまたはタンパク質である。
【００３５】
また、本発明は、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、もやもや病の診断用組成物を提供する。
【００３６】
本発明においてｍＲＮＡ発現水準測定というのは、もやもや病を診断するために、生物学的試料でもやもや病関連遺伝子ｃａｖｅｏｌｉｎ−１のｍＲＮＡ存在有無と発現程度を確認する過程であって、ｍＲＮＡの量を測定して行われる。このための分析方法としては、例えば、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップ等があるが、これに制限されるものではない。本発明において遺伝子のｍＲＮＡ水準を測定する製剤は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対またはプローブである。
【００３７】
本発明において「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対の形成によってＲＮＡ内の標的配列と混成化され、標的配列内で、典型的にｍＲＮＡとＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二量体の形成を許容する、ヌクレオチド塩基の配列及びサブユニット間のバックボーンを有するオリゴマーを指称する。オリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性または近似相補性を有することができる。このアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断または阻害し、ｍＲＮＡのスプライス変異体を生産するｍＲＮＡのプロセッシング過程を変化させることができる。
【００３８】
本発明において「プライマー」は、短い自由３末端水酸化基を有する核酸配列であって、相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成でき、鋳型鎖コピーのための開始地点として機能をする短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬及び異なる４種のヌクレオシドトリホスフェートの存在の下でＤＮＡ合成が開始できる。
【００３９】
本発明において「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合を達成できる、短くは数塩基乃至長くは数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸断片を意味し、標識（Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）されていて、特定のｍＲＮＡの存在有無を確認できる。プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブ等の形態で製作され得る。適当なプローブの選択及び混成化の条件は、当業界に公知されたものを基に変形できる。
【００４０】
本発明のもやもや病関連ｃａｖｅｏｌｉｎ−１の核酸配列は、遺伝子銀行にＧｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＣ＿０００００７．１４、ＮＣ＿０１８９１８．２、ＮＴ＿００７９３３．１６として登録されているので、当業者は、前記配列に基づいてこれら遺伝子の特定領域を特異的に増幅するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマー対またはプローブをデザインできる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体方法、またはその他広く公知された方法を使用して化学的に合成できる。
【００４１】
本発明において「タンパク質発現水準測定」というのは、もやもや病を診断するために、生物学的試料で発現されたタンパク質の存在有無と発現程度を確認する過程であって、タンパク質の量を測定して行われる。このための分析方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、蛍光活性化セルソーター （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）等があるが、これに制限されるものではない。本発明においてタンパク質発現水準を測定する製剤は、好ましくは、抗体である。
【００４２】
ここで、「抗体」とは、当該分野で公知された用語であって、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、本発明のカベオリン−１マーカーに対して特異的に結合する抗体を意味し、本発明の抗体の形態は、特に制限されず、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体または抗原結合性を有するものであれば、その一部も本発明の抗体に含まれることができる。しかも、本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等の特殊抗体をも含まれる。本発明に使用される抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片というのは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ等がある。
【００４３】
また、本発明は、前記診断用組成物を含む、もやもや病の診断用キットを提供する。本発明のキットは、カベオリン−１の定量手段（プライマー、プローブ、抗体等）だけでなく、分析方法に適した一種類以上の他の構成成分組成物、溶液または装置がさらに含まれることができ、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲキット、マイクロアレイチップキット、ＤＮＡチップキット、タンパク質チップキット、ＥＬＩＳＡキットの形態であることができるが、これに制限されない。
【００４４】
例えば、ＲＴ−ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対以外にも、テストチューブまたは他の適切なコンテーナ、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−重合酵素及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ−水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水等を含むことができる。ＥＬＩＳＡキットの場合、抗原−抗体複合体の免疫学的検出のために、基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された２次抗体、及び発色基質等を含むことができる。
【００４５】
また、本発明は、個体の試料からカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する段階を含む、もやもや病診断のための情報提供方法を提供する。本発明においては、前記個体の試料からカベオリン−１の発現水準を測定した結果、正常対照群より減少した場合、もやもや病であると判定する段階をさらに含むことができる。
【００４６】
本発明においてｍＲＮＡ発現水準を測定する方法は、逆転写重合酵素反応（ＲＴＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップ等があるが、これに制限されない。
【００４７】
本発明においてタンパク質の発現水準を測定する方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ＦｉｘａｔｉｏｎＡｓｓａｙ）、蛍光活性化セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）等があるが、これに制限されない。
【００４８】
また、本発明は、（ａ）個体から得られた試料に候補薬物を処理する段階と；（ｂ）カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）の発現プロファイルを検出する段階とを含む、もやもや病治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００４９】
本発明において用語「試料」とは、もやもや病によってカベオリン−１の水準が異なる組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、または小便のような試料等を含むが、これに制限されない。好ましい例としては、血液、血清、血漿試料であることができる。
【００５０】
本発明において用語「個体」とは、被検体を意味するものであって、すべての動物、好ましくは、哺乳類、さらに好ましくは、ヒトであることができる。
【００５１】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１：もやもや病バイオマーカー選別
１−１．タンパク質発現水準測定
動脈硬化症と区別されるもやもや病だけの特異的なバイオマーカーを選別するために、血管撮影術によって区分されたもやもや病（ＭＭＤ）の患者１３９人、頭蓋内動脈硬化性狭窄患者（ＩＣＡＳ）６１人、正常群（ｃｏｎｔｒｏｌ）６８人からそれぞれ血清を採取した後、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ）キットを使用して下記のタンパク質の発現水準を測定した。
【００５３】
ｃａｖｅｏｌｉｎｅ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｅ０２１４ｈ；ＥＩＡａｂ）、
ＡＤＭＡ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｋ７８２８；Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）、
ｈｕｍａｎｓ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＢＥＫ−２０８９−２Ｐ；Ｂｉｏｓｅｎｓｉｓ）、
ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ｃａｔａｌｏｇ  ＃ＤＮＳＴ０；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、
ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ｃａｔ  ＃ＳＥＡ８６７Ｈｕ；Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．）
【００５４】
この際、ＥＬＩＳＡは、製造社のプロトコルによって行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０ＰＣ３８４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ及びＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して分析した。
【００５５】
その結果、図３から確認できるように、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１の血中水準は、もやもや病の患者において統計的に有意に減少し、もやもやの類型（虚血性、出血性）と関系なく、また、症状発病の時期と関系なく、このような特徴は維持していることが分かった。
【００５６】
１−２．ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ
ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）カーブは、特定検査の性能を評価するためのモデルであって、敏感度と特異度の相関関係を表現したグラフである。グラフのＸ軸は、Ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅを示し、Ｙ軸は、Ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅを示し、ＲＯＣカーブが左側の頂点に近く描かれるほど、ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ性能に優れていることを意味する。
【００５７】
ＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）は、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒの合理性を示す指標であって、ＲＯＣカーブの下部の面積を意味する。ＡＵＣの最大値は、１であり、１に近い値であるほど、敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）がすべて高いことを意味するので、優れたｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎを示す。
【００５８】
ＲＯＣカーブで、ＭＭＤとＩＣＡＳのｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｌｅｖｅｌの差異を示す最も適合な濃度は、Ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ≦０．７９（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［９５％  ＣＩ］、８１．９５［７４．４−８８．１］、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ［９５％  ＣＩ］、６０．６６［４７．３−７２．９］）である。
【００５９】
具体的に、ＲＯＣカーブ作成のために、ＳＴＡＴＡ、ｖｅｒｓｉｏｎ  １３．１；Ｓｔａｔａ  Ｃｏｒｐ、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡプログラムを使用し、ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ選定と敏感度、特異度計算のために、ロジスティック回帰分析技法を活用した。
【００６０】
その結果、図４に示されたように、血管撮影術で鑑別診断されるもやもや病と動脈硬化性狭窄において、カベオリン−１がこれらを区分できるバイオマーカーとして有用であることが確認できた。
【００６１】
実施例２：もやもや病と関連した遺伝型ＲＮＦ２１３  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ分析
２−１．ＲＮＦ２１３変異とｃａｖｅｏｌｉｎ−１水準の相関関係評価
前記実施例１のように、血管撮影術によって区分されたもやもや病と動脈硬化性狭窄をカベオリン−１の血中水準で鑑別する以外に、もやもや病の遺伝的素因によってカベオリン−１の血中水準に差異があるかを確認するために、頭蓋内狭窄がある患者及び正常人から血清を採取し、カベオリン−１水準を確認した。すなわち、もやもや病と関連した遺伝子として明らかにされたＲＮＦ２１３（Ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ２１３）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１２５６０７１．１）変異群とカベオリン−１水準との関連性を調査した。
【００６２】
このために、まず、末梢血液白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）からＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してゲノムＤＮＡを抽出した後、下記のプライマー対を利用して、ＲＮＦ２１３  ｇｅｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１２５６０７１．１）のｃ．１４４２９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｒｇ４８１０Ｌｙｓ）ｍｕｔａｔｉｏｎをＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ９７００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡ−３’
【００６３】
その後、ＰＣＲ増幅産物は、Ｂｉｇ−Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｏｎ  ａｎ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３０ｘｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してシーケンシングし、ＲＮＦ２１３変異体を検証した。
【００６４】
検証されたＲＮＦ２１３変異群（遺伝的に診断したもやもや病の患者）で血中カベオリン−１の発現水準を測定（ｃａｖｅｏｌｉｎｅ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｅ０２１４ｈ、ＥＩＡａｂ）した結果、カベオリン−１の水準が顕著に減少していることを確認した。
【００６５】
２−２．ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ
実施例２−１の検査性能を評価するために、ＳＴＡＴＡ  ｖｅｒ．１３．１プログラムのロジスティック回帰分析（ｃｏｄｅ：ｌｒｏｃ、ｎｏｇｒａｐｈ）方法でＲＯＣ  ｃｕｒｖｅを作成した。
【００６６】
その結果、図５に示されたように、本発明のカベオリン−１バイオマーカーは、個体がもやもや病関連遺伝型を有しているかを鑑別診断するにあたって有用であることが分かった。このような結果は、遺伝的に診断したもやもや病の患者においてカベオリン−１がバイオマーカーとして有用であることを意味する。
【００６７】
２−３．ｐａｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ
カベオリン−１水準変化が、もやもや病の発病において、ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ因子（ＡＤＭＡ、ＮＯ、ｎｉｔｒｉｔｅ、ｎｉｔｒａｔｅ）の作用を媒介するかを評価するために、ｐａｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。
【００６８】
すなわち、もやもや病の患者（ＭＭＤ）、頭蓋内動脈硬化性狭窄患者（ＩＣＡＳ；ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）、正常群（ｃｏｎｔｒｏｌ）の間に、遺伝的マーカー（ＲＮＦ２１３変異）と；タンパク質バイオマーカーとしてｃａｖｅｏｌａｅ因子（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）、ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ因子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ因子（ＡＤＭＡ、ＮＯ、ｎｉｔｒｉｔｅ、ｎｉｔｒａｔｅ）間の相関関係を評価した。
【００６９】
具体的に、ｐａｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓは、ＳＴＡＴＡ  ｖｅｒ．１３．１プログラムを活用して分析し、２個以上の回帰分析の複合形態である。ＳＴＡＴＡ  ｖｅｒ．１３．１プログラムの「ｐａｔｈｒｅｇ」コードを利用した詳しい事項は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｓ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ｓｔａｔ／ｓｔａｔａ／ｆａｑ／ｐａｔｈｒｅｇ．ｈｔｍに記述されている。
【００７０】
その結果、図６に示されたように、カベオリン−１水準変化は、もやもや病遺伝型（ＲＮＦ２１３）と血管生成と関連した成長因子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）水準と連関性があることを確認した（Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．００１）．また、もやもや病は、ＲＮＦ２１３遺伝型とカベオリン−１水準が同時に連関性があることを確認した（Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．００１）。
【００７１】
したがって、本発明によれば、血液内カベオリン−１水準を測定することによって、高い敏感度／特異度でもやもや病を診断できることが分かる。
【００７２】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであって、限定的ではないものと理解すべきである。
【図１】
2018014933.tif 000003
【図２】
2018014933.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月6日(2017.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、もやもや病の診断用組成物。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブを含むことを特徴とする請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項３】
前記タンパク質発現水準を測定する製剤は、カベオリン−１タンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物を含む、もやもや病の診断用キット。
【請求項５】
前記キットは、ＤＮＡマイクロアレイチップまたはタンパク質チップであることを特徴とする請求項４に記載の診断用キット。
【請求項６】
個体の試料からカベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現水準を測定する段階を含む、もやもや病診断のための情報提供方法。
【請求項７】
前記個体の試料からカベオリン−１発現水準を測定した結果、正常対照群より減少した場合、もやもや病であると判定する段階をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の情報提供方法。
【請求項８】
前記カベオリン−１のｍＲＮＡ発現水準を測定する段階は、逆転写重合酵素反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競争的逆転写重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素反応（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、またはノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を利用することを特徴とする請求項６に記載の情報提供方法。
【請求項９】
前記カベオリン−１のタンパク質発現水準を測定する段階は、抗原−抗体反応を利用することを特徴とする請求項６に記載の情報提供方法。
【請求項１０】
前記抗原−抗体反応は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析法で行うことを特徴とする請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項１１】
前記試料は、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液または小便であることを特徴とする請求項６に記載の情報提供方法。
【外国語明細書】
2018014933000001.pdf