(57)【要約】【課題】中空糸モジュールを用いる幹細胞培養において、培養液の使用コストを低減する有効な方法を提供することを課題とする。【解決手段】中空糸膜の中空部側および外側に同じ組成の基礎培地を通液しながら細胞を培養する方法であって、前記中空糸膜において目的細胞が播種された側には、１ｖｏｌ％以上になるように血清が添加された基礎培地を通液し、前記目的細胞が未播種の側には、前記血清が無添加の基礎培地を通液することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空糸膜の中空部側および外側に同じ組成の基礎培地を通液しながら細胞を培養する方法であって、前記中空糸膜において目的細胞が播種された側には、１ｖｏｌ％以上になるように血清が添加された基礎培地を通液し、前記目的細胞が未播種の側には、前記血清が無添加の基礎培地を通液することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記中空糸膜において前記目的細胞が未播種の側には、少なくともインスリンおよび／またはインスリン様成長因子、およびセレンおよび／または亜セレン酸、およびグルタミン酸が添加された基礎培地を通液することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中空糸膜は、アルブミンのふるい係数が０．００１以上０．０５以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的細胞が播種された側に通液する培地の平均流速は、０．１〜１ｍｍ／ｍｉｎ、前記目的細胞が未播種の側に通液する培地の平均流速は、２〜５ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸膜を内挿した中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いて、効率よく細胞を培養する方法に関する。具体的には、血清添加培地および無血清培地を併用することにより、低コストで効率よく細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は万能細胞であり、全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は、全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は、患者自身から採取でき、拒絶反応の恐れがないため細胞移植治療に用いる移植用細胞として注目されている。
【０００３】
ヒトにおける体性幹細胞は、現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、これら体性幹細胞は組織中には極めて少数しか存在しない。
【０００４】
そこで、生体組織から得られた体性幹細胞を生体外で培養し、治療に必要な細胞数まで増幅した後、同一人又は他人の治療に使用するという細胞移植治療の研究が進展し、実用化され始めている。
【０００５】
しかしながら、一般に実施されている細胞培養の作業では、生物学的な汚染のリスクが高いことや、人件費によるコスト高などが課題となるため、細胞移植治療の更なる発展には安全かつ低コストで幹細胞を培養することが求められる。
【０００６】
幹細胞を効率よく、かつ低コストで培養する手段の一つとして、中空糸膜を培養基材とする培養方法が挙げられる。中空糸膜を培養基材として用いるメリットは、通常のシャーレやフラスコ培養では実現できない接着細胞の接着面からの物質交換ができることであり、栄養分や酸素の供給と老廃物除去が効率的に実施される。中空糸膜内側あるいは中空糸膜外側の何れにおいて細胞を培養しても、こうした効果が期待できる。
【０００７】
中空糸膜を用いて例えば、筒状容器の大きさに応じ、数十本〜数万本の中空糸膜を筒状容器内に格納することによりモジュールを作製することができる。このような中空糸膜モジュールは、中空糸膜内側および中空糸膜外側の何れも、モジュール容積あたりの細胞培養面積が非常に大きくなり、効率よく細胞培養を実施することが可能となる。また、中空糸膜の性質やモジュールの構造上の特性を活かし、中空糸膜モジュールを装置に組み込んで自動細胞培養装置とすることも既に行われている（例えば、特許文献１、２）。しかし、特許文献２に記載されているように、動物細胞を培養するための培地（培養液）は非常に高価である。
【０００８】
また、幹細胞等の動物細胞を培養するためには、血清を添加する必要がある。一般に、ヒト体性幹細胞の一種である間葉系幹細胞を培養する場合には、ウシ胎児血清を１０〜２０％程度添加した培養液が用いられるが、特にウシ胎児血清は高価なため、これを含む培養液は高コストであり、培養液の使用量が増大することは細胞の生産コスト増の原因となる。このため、中空糸膜モジュールを用いる幹細胞培養において、培養液の使用コストを低減する有効な手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１５−５２６０９４号公報
【特許文献２】特表２００３−５１００６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
中空糸膜モジュールを用いる幹細胞培養において、培養液の使用コストを低減する有効な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．中空糸膜の中空部側および外側に同じ組成の基礎培地を通液しながら細胞を培養する方法であって、前記中空糸膜において目的細胞が播種された側には、１ｖｏｌ％以上になるように血清が添加された基礎培地を通液し、前記目的細胞が未播種の側には、前記血清が無添加の基礎培地を通液することを特徴とする方法。
２．前記中空糸膜において前記目的細胞が未播種の側には、少なくともインスリンおよび／またはインスリン様成長因子、およびセレンおよび／または亜セレン酸、およびグルタミン酸が添加された基礎培地を通液することを特徴とする（１）に記載の方法。
３．前記中空糸膜は、アルブミンの篩い係数が０．００１以上０．０５以下であることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。
４．前記目的細胞が播種された側に通液する培地の平均流速は、０．１〜１ｍｍ／ｍｉｎ、前記目的細胞が未播種の側に通液する培地の平均流速は、２〜５ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いて体性幹細胞を培養する際に、前記幹細胞が播種された側にのみ血清を含む培養液を用いることにより、非常に高価である血清の使用量を減らすことができるため、培養コストを低減することができ、高効率に体性幹細胞を培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】細胞培養容器の一例を示す模式図である。
【図２】細胞培養容器を用いた細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【図３】細胞培養実験後（実施例、比較例）の回収生細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
幹細胞等の接着細胞を培養する際に、中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いることにより、容積あたりの膜面積を大きくすることができるので、省スペースで大量培養ができるメリットがある。中空糸膜モジュールを用いた細胞培養においては、中空糸膜の中空部側表面および外側表面のいずれの面も用いることができるが、外側表面で培養する場合には、培地（培養液）の偏流により細胞の生育や増殖に不均一性をもたらすことがある。また、中空部側表面で培養する場合には、培地の偏流の問題はなくなる一方で、用いる中空糸膜素材や表面構造によっては不透明になり、細胞の生育や増殖状態を確認しにくいことがある。
【００１６】
本発明は、中空糸膜の中空部側表面および外側表面のいずれの面で培養する場合にも適用可能であるが、前記したように外側表面を用いて培養を行う際には、培地の偏流を抑制するために培地流速を高める必要が生じ、そうすると培養環境の不安定化や剪断応力の影響、培養コスト上昇の問題が生じやすくなる。そのため、中空部側表面を用いた培養がより好ましい。
【００１７】
（中空糸膜）
本発明において、中空糸膜の素材については、細胞を中空糸膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過できる構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロース等のセルロース系材料、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等のポリスルホン系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等の水不溶性材料が好適に利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、中空糸膜は、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されていてもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をポリビニルピロリドンやエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。また、使用する細胞に応じて、中空糸膜への接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコーティングしたものでも良い。
【００１８】
本発明において、中空糸膜の内径は、好ましくは１００〜１０００μｍ、より好ましくは１５０〜５００μｍ程度のものが利用される。膜厚は、中空糸膜が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲で設定すればよく、例えば１０〜１５０μｍ程度が好ましい。中空糸膜の中空部側表面に細胞を播種し、培養液（液体培地）を還流して培養を行う場合は、中空糸膜の内径は、二次元的な効果として、細胞の播種、増殖する面積、細胞密度だけでなく、三次元的な効果である、コンパクト性のみならず、培地との接触容積、培地の流れ、線速度、せん断力などに影響する設計や操作条件と関わる事項となることから、中空糸膜培養のメリットを活かす要件となる。
【００１９】
本発明において、中空糸膜の孔径は、細胞は通過させないが、水、塩類、低分子量タンパクなどの培養液成分を透過させる孔であれば、特に限定されるものではないが、細胞の培養を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が望ましい。例えば、３７℃の水溶液系で測定したアルブミンの篩い係数（ＳＣａｌｂ）が０．００１以上０．０５以下であるような孔径が好ましい。アルブミンの篩い係数が大きすぎると、血清中の有用成分が漏出してしまい、細胞の成育や増殖速度が低下することがある。一方、アルブミンの篩い係数が小さすぎると、老廃物等の除去性が低下し、細胞の成育や増殖速度が低下することがある。アルブミンの篩い係数は、より好ましくは０．００２以上０．０３以下である。本発明において、このような分画特性（孔径）を有する中空糸膜を用いることにより、血清中の有用成分が中空糸膜外に漏出することを抑制でき、かつ細胞未播種側に通液する培地中のインスリン／インスリン様成長因子、セレン／亜セレン酸、グルタミン酸等の低分子量成分を細胞播種側に効率よく供給することが可能となる。なお、本発明において、中空糸膜の構造は、特に限定されるものではなく、均質構造でもよいし、不均質（非対称）構造でもよい。
【００２０】
中空糸膜の中空部側に通液する基礎培地は、細胞に直接栄養分を届ける役割を果たす。一方、中空糸膜外側に通液する基礎培地は、中空糸膜を介して中空部を流れる基礎培地と接しているため常時物質交換が行われ、中空糸膜の長さ方向において老廃物濃度や酸素および二酸化炭素濃度をほぼ一定に保つ役割を果たす。そのため、後述するように中空糸膜外側に通液する基礎培地の流速は、中空糸膜内側に通液する基礎培地の流速よりも速くすることが好ましい。
【００２１】
本発明において、３７℃における純水の透水量が１〜５００ｍＬ／ｍ2／ｈｒ／ｍｍＨｇである中空糸膜を用いるのが好ましい。透水量が小さすぎると、培地間において十分な物質交換が行われず、細胞の成育および増殖が進まないことがある。一方、透水量が大きすぎると、培地間の物質交換が進みすぎて細胞周囲の環境が安定しないことがある。
【００２２】
（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器として用いる中空糸膜モジュールは、例えば、筒状容器に数十本〜数万本の中空糸膜を格納することにより作製することができる。このような中空糸膜モジュールは、容積あたりの培養面積を大きくすることができるため細胞培養容器として適している。また、培養操作も簡便化することが出来、効率よく細胞培養を実施することが出来る。
【００２３】
このような中空糸膜を用いたモジュールの構成は特に限定されないが、例えば、図１に示されるように、４つの出入口を有するモジュールケース３に中空糸膜４が適宜必要な本数束ねられて内挿された形態が挙げられる。より具体的には、中空糸膜の両端において各中空糸膜の中空部側と外側を分離した状態かつ中空糸膜の中空部が開口した状態で、適当なシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤やエポキシ系ポッティング剤など）によりモジュールケース端部に接着固定されており、前記出入口１ａまたは１ｂの一方から導入された培養液などが中空糸膜内腔を通ってもう一方の出入口１ｂまたは１ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記出入口のうち、残りの２つの出入口２ａまたは２ｂは、前記モジュールケース３の内側かつ前記中空糸膜の外側である空間と連通しており、前記出入口２ａまたは２ｂの一方から導入された培養液などが中空糸膜の外側を通ってもう一方の出入口２ｂまたは２ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。
【００２４】
前記中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いる場合、細胞培養は、中空糸膜の中空部側または外側のいずれにおいて行っても良いが、中空部側で培養を行うことが好ましい。たとえば、中空部側にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を出入口１ａまたは１ｂより注入することにより播種し、播種終了後、細胞懸濁液を培地に切り換えて灌流させ、中空部側にて一定期間培養を行う。この間、同時に、外側へも培地を側部導管より注入し灌流させることが好ましい。
【００２５】
細胞培養容器として中空糸膜モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地および酸素等を連続的または断続的に供給することができ、細胞培養容器としてシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な交換作業は不要となり、作業者の手間や拘束時間を減らすことができる。
【００２６】
（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる目的細胞は、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
【００２７】
（中空糸膜モジュールにおける細胞の培養）
本発明において、中空糸膜の中空部側において細胞を培養する場合には、前述の中空糸膜モジュールを用い、出入口の一方から細胞を懸濁した液を中空糸膜の中空部側に流入させることにより、細胞を播種することが出来る。一定時間静置することにより、細胞を中空糸膜の内表面に接着させた後、インキュベーター内に設置した細胞培養容器（中空糸膜モジュール）に、連続的あるいは断続的に培地（培養液）を送液することにより細胞を培養、増殖させることが出来る。培養液は、細胞に必要な養分や酸素・二酸化炭素などのガスを供給する役割を有する。培養液は、目的細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培養液として通常用いられるものであればよい。
【００２８】
（培養液）
本発明において、培地（培養液）は、細胞を生育および増殖させるためのものであり、栄養素としてアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖などが含まれている、いわゆる基礎培地を指す。このような培地としては、例えば、Minimum Essential Medium（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、Media199、Dulbecco's Modified Eagle Medium（D-MEM）、α−Minimum Essential Medium（α-MEM）、Ham's F-10 Nutrient Mixture（Ham's F-10）、Ham's F-12 Nutrient Mixture（Ham's F-12）、RPMI 1640、L-15、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）、ES medium、MCDB 131 Medium、CMRL 1066 Media、DM-160 Medium、Fisher's Medium、StemSpan Medium、StemPro Medium、Hybridoma Serum Free Medium（Hybridoma SFM）、mTeSR1（modified Tenneille Serum Replacer 1）、Essential 8、Repro FF/FF2/XF、StemSure（登録商標）、CELRENA、S-Mediumと呼ばれる市販の細胞培養液およびこれらの混合物を用いることができるが、培養の目的とする細胞に最適な細胞培養液を使用すれば良く、これらに限定されない。
【００２９】
また、培地に添加する血清としては、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清などの血清を用いるのが好ましい。添加量としては、基礎培地に対して１ｖｏｌ％以上が好ましい。添加量が少なすぎると、細胞が生育および増殖しないので、５ｖｏｌ％以上添加するのがより好ましく、１０ｖｏｌ％以上添加するのがさらに好ましい。添加量を必要以上に増やしても培養コストが上昇するだけであり、２０ｖｏｌ％程度を上限とするのが好ましい。
【００３０】
また、本発明において、前記目的細胞が未播種の側には、少なくともインスリンおよび／またはインスリン様成長因子、およびセレンおよび／または亜セレン酸、およびグルタミン酸を添加するのが好ましい。インスリン／インスリン様成長因子、セレン／亜セレン酸、グルタミン酸は、何れも細胞の基礎代謝、機能維持に必須の物質である。本発明においては、細胞未播種の側に流す培養液は血清を含まないため、通常は血清添加により供給されるインスリン／インスリン様成長因子をそれぞれ単独で培養液に添加することによりこれを補うのが好ましい。また、必須アミノ酸の一つであるグルタミン酸も同様に、単独で培養液に添加することにより補うのが好ましい。それぞれの添加濃度は、基礎培地に対してインスリンは０．０１〜１μＭが好ましく、０．０５μＭ〜０．５μＭがより好ましい。インスリン様成長因子は０．１〜１０ｎＭが好ましく、０．５〜５ｎＭがより好ましい。セレンは、同様に１ｎＭ〜１μＭが好ましく、５ｎＭ〜５００ｎＭがより好ましい。グルタミン酸は１μＭ〜１ｍＭが好ましく、２５μＭ〜２５０μＭがより好ましい。
【００３１】
（培養液の流速）
本発明において、細胞培養における培養液、特に中空糸膜の中空部側を流れる培養液の流速については、流速を厳密に制御することが好ましい。流速が遅すぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流速が速すぎても、細胞周囲の環境変化が激しく、細胞が周りの環境に馴染めず、細胞が増殖しにくくなる。このように、培養液、特に中空糸膜の中空部側を流れる培養液の流速は、細胞増殖度合いや環境に応じて、調整することが好ましい。細胞増殖度合いを調べる方法は、特に限定されないが、培養液中のグルコースや乳酸塩の濃度等の測定結果をもとに行うことが出来る。細胞が播種された中空糸膜の中空部側に通液する培養液の好ましい平均流速は、０．１〜１ｍｍ／ｍｉｎである。一方、細胞が播種されていない中空糸膜の外側に通液する培養液の好ましい平均流速は、２〜５ｍｍ／ｍｉｎである。
なお、中空糸膜の中空部側に通液する培養液の平均流速は、中空糸膜の平均内径と中空部側に導入する培養液の流量から算出する。一方、中空糸膜の外側に通液する培養液の平均流速は、中空糸膜の外側空間の水力相当直径と中空糸膜の外側に導入する培養液の流量から算出する。
【００３２】
（細胞の回収）
中空糸膜を用いて培養した細胞を回収するための手段を例を挙げて説明する。中空糸膜モジュールを用いて細胞を培養した場合には、培養液の通液を停止した後、中空糸膜の中空部側および外側に存在する培養液を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間灌流させ、培養液を十分ＰＢＳに置換する。次に、ＰＢＳを除去し、トリプシン等のプロテアーゼを中空糸膜の中空部側と外側へ充填し、一定時間インキュベートする。また、このような処理の後、中空糸膜モジュールに接触させた振動モーターを駆動させるなどして中空糸膜モジュールに振動を与えることにより、培養細胞を中空糸膜表面から剥離させる処理を併用してもよい。その後、培養液などを中空糸膜の中空部側へ流入することにより、中空糸膜の中空部側から流し出した細胞を回収することが出来る。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下に代表的な中空糸膜モジュールからの細胞回収方法を記載する。
【００３４】
（細胞回収数の測定）
中空糸膜モジュールからの細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ2エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算方法：
Ｃ＝Ｎ×１０4
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０4：１ｍｍ2に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量
【００３５】
（内径、膜厚の測定）
中空糸膜の内径、外径および膜厚は、中空糸膜をスライドグラスの中央に開けられたφ３ｍｍの孔に中空糸膜が抜け落ちない程度に適当本数通し、スライドグラスの上下面でカミソリによりカットし、中空糸膜断面サンプルを得た後、投影機Ｎｉｋｏｎ−Ｖ−１２Ａを用いて中空糸膜断面の短径、長径を測定することにより求めた。中空糸膜断面１個につき２方向の短径、長径を測定し、それぞれの算術平均値を中空糸膜断面１個の内径および外径とし、膜厚は（外径−内径）／２で算出した。５断面について同様に測定を行い、平均値を内径、膜厚とした。
【００３６】
（透水性の測定）
中空糸膜にグリセリンが付与されているモジュールに対し、純水を中空糸膜の中空部側へ連通する出入口（図１での１ａ）から導入し、他方の出入口（１ｂ）から流出させ、膜を十分に洗浄し、グリセリンの除去と膜孔内と中空部を純水に置換した。その後、中空糸膜の外側も同様に図１の２ａから２ｂに通水することにより洗浄を実施した。出口部回路（圧力測定点よりも出口側）を鉗子で挟んで封止した。３７℃に保温した純水を加圧タンクに入れ、レギュレーターにより圧力を制御しながら、３７℃恒温槽で保温したモジュール流路側（中空糸膜の中空部入口（１ａ））へ純水を送り、出口（１ｂ）および透過側出口（２ｂ）を閉じることにより、膜の透過側（中空糸膜外側２ｂ）から流出するろ液量を一定時間測定した。膜間圧力差は、モジュール入口側への加圧圧力（タンクへの加圧と同一）とし、１００ｍｍＨｇで測定した。使用モジュールの膜透過部分（中空糸膜の内径基準）の面積を用いて、中空糸膜の透水性（ｍＬ／ｍ2／ｈｒ／ｍｍＨｇ）を算出した。
【００３７】
（篩い係数の測定）
中空糸膜が所定本数充填された、図１に示されるような中空糸膜モジュールを準備した。測定前に予め純水でプライミング処理を行い、モジュール内の空気を除去した後、３７℃で保温した。Ｆｅｅｄ液として、ｐＨ７．５±１に調整したリン酸緩衝液に１．０ｗｔ％の濃度となるようアルブミン（ナカライテスク社 アルブミン、ウシ由来（Ｆ−Ｖ））を溶解した溶液（Ｆｅｅｄ液）を準備し、３７℃に保温した。中空糸膜中空部に連通する入口より、Ｆｅｅｄ液を中空糸膜内径基準の膜面積１ｍ2あたり２００ｍＬ／ｍｉｎで送液し、同膜面積１ｍ2あたり３０ｍＬ／ｍｉｎの割合でろ過した。ろ液は、中空糸膜外側に連通する出入口より外部に流出させた。この時、２つある出入口の一方は閉止しておいた。ろ過されなかったＦｅｅｄ液はＦｅｅｄ液出口から外部に流出させた。ろ過開始より３０ｍｉｎ後に、Ｆｅｅｄ液入口濃度（Ｃｉ）、Ｆｅｅｄ液出口濃度（Ｃｏ）、濾液濃度（Ｃｆ）を測定し、以下の式により篩い係数（ＳＣ）を算出した。なお、アルブミンの濃度は、波長２８０ｎｍのＵＶ吸光度により測定した。
ＳＣ＝２×Ｃｆ／（Ｃｉ＋Ｃｏ）
【００３８】
（中空糸膜Ａの作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０ｗｔ％、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）３６ｗｔ％、トリエチレングリコール（三井化学社製）４４ｗｔ％を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン１３．５ｗｔ％、トリエチレングリコール１６．５ｗｔ％、水７０ｗｔ％の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に、束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰なグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。乾燥後の中空糸膜が、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。
【００３９】
（中空糸膜Ｂの作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）４３ｗｔ％、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）２５．６５ｗｔ％、トリエチレングリコール（三井化学社製）３１．３５ｗｔ％を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン４．５ｗｔ％、トリエチレングリコール５．５ｗｔ％、水９０ｗｔ％の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に、束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰なグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。乾燥後の中空糸膜が、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。
【００４０】
（細胞培養容器の作製）
試験用の中空糸膜モジュールを以下のようにして作製した。内径１ｃｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に、得られた中空糸膜Ａを１００本内挿し、ポリウレタン系ポッティング剤で中空糸膜の両末端をモジュールケースに固定した後、ポッティング部の一部を切削して、中空糸膜の中空部を開口させた。このようにして、図１に示すような形状の細胞培養容器Ａ（中空糸膜モジュールＡ）を作製し、滅菌処理を行った。
また、中空糸膜Ｂを用いて同様にして細胞培養容器Ｂ（中空糸膜モジュールＢ）を作製し、滅菌処理を行った。
中空糸膜の内径基準の膜面積は、およそ５５ｃｍ2であった。
また、中空糸膜モジュールＡ、Ｂを用いて中空糸膜Ａ、Ｂの純水透水性およびＳＣａｌｂを測定したところ、中空糸膜Ａの純水透水性は４６０ｍＬ／ｍ2／ｈｒ／ｍｍＨｇ、ＳＣａｌｂは０．０３８であった。一方、中空糸膜Ｂの純水透水性は１４ｍＬ／ｍ2／ｈｒ／ｍｍＨｇ、ＳＣａｌｂは０．００３であった。
【００４１】
［実施例１］
得られた中空糸膜モジュールＡを細胞培養容器として用い、図２に示すような細胞培養装置を構成した。まず、中空糸膜に付着しているグリセリンを除去するために、培養液貯留容器５、６に滅菌した注射用蒸留水を入れ、ポンプ８、９を起動し、中空糸膜モジュールＡ内に充分量流して洗浄した。その後、培養液貯留容器５を、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。また、培養液貯留容器６を、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。この後、ポンプ８、９を起動してプライミング処理を行い、中空糸膜モジュールＡ内の水を培養液に置換した。
【００４２】
（細胞培養実験）
前記培養液貯留容器５内の培養液に、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を懸濁し、中空糸膜の中空部側に充填して１晩放置し、中空糸膜内表面に細胞を接着させた。細胞播種密度が１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように調整した。培養液貯留容器５を培養液のみの容器に交換した後、中空糸膜の中空部側の流速０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外側の流速３．４６ｍｍ／ｍｉｎで送液を開始した。この時、中空糸膜の中空部側に通液する培養液は、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地を用い、中空糸膜の外側に通液する培養液は、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。なお、本細胞培養実験は、ＣＯ2インキュベーター内で３７℃、７日間行った。
【００４３】
（中空糸膜モジュールからの細胞回収）
７日間培養後、培養液灌流を停止し、中空糸膜モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、中空糸膜の中空部側および外側に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間灌流させ、培養液を十分ＰＢＳに置換した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を中空糸膜の中空部側と外側へ静かに充填し、室温で１５分間インキュベートした。
この後、培養液を図１の１ａより中空糸膜の中空部側へ流し入れ、１ｂより流し出した細胞を回収した。回収した細胞について、生細胞数および細胞増殖率を計測した。
【００４４】
［実施例２］
実施例１と同様の細胞培養装置において、中空糸膜の中空部側に通液する培養液を、ウシ胎児血清を１ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地とした以外は、実施例１と同じ条件で細胞培養実験を実施した。
【００４５】
［実施例３］
実施例１と同様の細胞培養装置において、中空糸膜の中空部側に通液する培養液を、ウシ胎児血清を２０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地とした以外は、実施例１と同じ条件で細胞培養実験を実施した。
【００４６】
［実施例４］
実施例１と同様の細胞培養装置において、中空糸膜の外側に通液する培養液をダルベッコ改変イーグル培地のみとした以外は、実施例１と同じ条件で細胞培養実験を実施した。
【００４７】
［実施例５］
細胞培養容器として中空糸膜モジュールＢを用いた以外は、実施例１と同様にして細胞培養実験を行った。
【００４８】
［実施例６］
中空糸膜の中空部側に通液する平均流速を０．１ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外側に通液する平均流速を２ｍｍ／ｍｉｎとした以外は、実施例１と同様にして細胞培養実験を行った。
【００４９】
［実施例７］
中空糸膜の中空部側に通液する培地の平均流速を１ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外側に通液する培地の平均流速を５ｍｍ／ｍｉｎとした以外は、実施例１と同様にして細胞培養実験を行った。
【００５０】
［比較例１］
中空糸膜の中空部側に通液する培養液として、ウシ胎児血清を０．５ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地を用い、中空糸膜外側に通液する培養液として、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。その他の実験条件は、実施例１と同様にして細胞培養実験を実施した。
【００５１】
［比較例２］
中空糸膜の中空部側に通液する培養液として、血清無添加のダルベッコ改変イーグル培地を用い、中空糸膜外側に通液する培養液として、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞培養実験を行った。
【００５２】
実施例１〜７、比較例１、２の細胞培養実験をそれぞれ８回行った。その生細胞回収数の測定結果を表１に示した。また、細胞増殖率を表２に示した。実施例１〜７においては、良好な細胞増殖率の結果を得ることができた。一方、比較例１、２においては、実施例に比べ、細胞増殖率が見劣りする結果となった。比較例１では、培養液への血清添加量が少ないためか、細胞増殖率が低い結果となった。また、比較例２では、細胞播種側に通液する培地に血清を添加していないことと、中空糸膜の細孔径が小さいため中空糸膜の外側に通液する培地から血清成分が十分入り込まなかったことが原因と考えられる。
【００５３】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、中空糸膜モジュール内を流れる培養液等の流れを滞留させる原因を取り除くことができるため、細胞を効率よく増殖させることが可能となる。
【符号の説明】
【００５５】
１        出入口（中空部側）
２        出入口（外側）
３        モジュールケース
４        中空糸膜
５、６    培養液貯留容器
７        細胞培養容器（中空糸膜モジュール）
８、９    送液ポンプ
１０      廃液回収容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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