(57)【要約】【課題】均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法を提供すること。【解決手段】本発明の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法は、複数のエンドグリコシダーゼで処理し、糖鎖が切断されたＰＳＡを得る工程を有することを特徴とする。また、本発明の均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法は、均一な糖鎖を転移酵素で付加し、均一な糖鎖が結合されたＰＳＡを得る工程を有し、該糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を使用することを特徴とする。更に、本発明の糖鎖改変されたＰＳＡは、１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を有することを特徴とする。【選択図】図７Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＡを複数のエンドグリコシダーゼで処理し、糖鎖が切断されたＰＳＡを得る工程を有することを特徴とする糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項２】
上記複数のエンドグリコシダーゼが、ＥＣ３．２．１．９６に分類される基質特異性の異なるエンドグリコシダーゼの組み合わせである、請求項１に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項３】
上記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＬＬ、エンドグリコシダーゼＨ、エンドグリコシダーゼＭ、エンドグリコシダーゼＣＣ、エンドグリコシダーゼＦ２、及びエンドグリコシダーゼＦ３からなる群より選択される２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせである、請求項１又は請求項２に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項４】
上記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＦ３、並びに、エンドグリコシダーゼＭ、エンドグリコシダーゼＣＣ及びエンドグリコシダーゼＦ２からなる群より選択される少なくとも１つのエンドグリコシダーゼである、請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項５】
上記糖鎖が切断されたＰＳＡが、ＰＳＡと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が切断されたＰＳＡである、請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項６】
上記糖鎖が切断されたＰＳＡが、ＰＳＡの６９番目のアスパラギンと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が切断されたＰＳＡである、請求項１ないし請求項５の何れかの請求項に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法。
【請求項７】
更に、上記糖鎖が切断されたＰＳＡに、均一な糖鎖を転移酵素で付加し、均一な糖鎖が結合されたＰＳＡを得る工程を有する、請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を使用することを特徴とする均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法。
【請求項８】
上記均一な糖鎖が高マンノース型糖鎖又は複合型糖鎖である、請求項７に記載の均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法。
【請求項９】
上記複合型糖鎖がＧ２又はＬＤＮ２である、請求項８に記載の均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法。
【請求項１０】
所望のエンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する所望の糖鎖構造を有する対象糖鎖の定量的情報を決定する方法であって、以下の工程（ａ）ないし工程（ｄ）を有することを特徴とする方法。
（ａ）ＰＳＡをエンドグリコシダーゼと反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）後のＰＳＡをプロテアーゼで処理する工程
（ｃ）工程（ｂ）により得られた糖ペプチドのうち、対象糖鎖を有する糖ペプチドを測定する工程
（ｄ）該対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から該エンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定する工程
【請求項１１】
上記工程（ａ）において、２種類以上のエンドグリコシダーゼを使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＳＡのタンパク質部分、及びそれに直接結合したＮ−アセチルグルコサミンよりなることを特徴とする糖鎖が切断されたＰＳＡ。
【請求項１３】
１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を有することを特徴とする糖鎖改変されたＰＳＡ。
【請求項１４】
上記１種類の糖鎖が高マンノース型糖鎖又は複合型糖鎖である、請求項１３に記載の糖鎖改変されたＰＳＡ。
【請求項１５】
上記複合型糖鎖がＧ２又はＬＤＮ２である、請求項１４に記載の糖鎖改変されたＰＳＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法、該糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を使用する均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法、所望のエンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する所望の糖鎖構造を有する対象糖鎖の定量的情報を決定する方法、糖鎖が切断されたＰＳＡ、及び均一な糖鎖構造を有する糖鎖改変されたＰＳＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質のＮ結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖（ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）にマンノースのオリゴマーが結合している糖鎖）；複合型糖鎖（ジアセチルキトビオースにマンノース及びＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸の少なくとも１つが結合した糖鎖）；並びに混合（ｈｙｂｒｉｄ）型糖鎖（ジアセチルキトビオースに高マンノース型と複合型が混成している糖鎖）が存在する。さらにシアル酸（Ｓｉａ）の有無、結合様式の違い、コアフコースの有無、分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の有無等の違いがあり、これらの組み合わせで様々な種類の糖鎖が存在し得る。
【０００３】
したがって、均一糖鎖構造を有する糖タンパク質を調製することによって、糖タンパク質の機能や性質に対する糖鎖が及ぼす影響等を検討することができる。更に、医薬品等の製品として好ましい特性を糖タンパク質に付与できる可能性が考えられる。
【０００４】
様々なエンドグリコシダーゼがこれまでに報告されている（特許文献１、非特許文献１〜７）。エンドグリコシダーゼは糖鎖構造を認識し、特定の構造に対する特異性があることが知られている。特許文献２には、エンドグリコシダーゼを用いた均一糖鎖構造を有する抗体の製造方法が開示されている。また、特許文献３には、糖鎖の効率的な化学合成方法が開示されている。
【０００５】
一方、糖タンパク質の１つであるＰＳＡ（prostate specific antigen、前立腺特異抗原）は、前立腺がんのマーカーとして知られている。これまでに、前立腺がん患者と良性前立腺肥大症患者間で、ＰＳＡの糖鎖構造が異なることが報告されている（特許文献４）。
【０００６】
前立腺がん患者におけるＰＳＡの糖鎖構造解析が行われている一方、ＰＳＡ上の糖鎖が、ＰＳＡの性質に与える影響等については研究が進んでおらず、均一糖鎖構造のＰＳＡにより、糖鎖構造とＰＳＡの性質に与える影響を一義的に明らかにする研究も行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−２０８２６０号公報
【特許文献２】特開２０１６−０８２９６２号公報
【特許文献３】特開２０１４−２２４０５５号公報
【特許文献４】特開２０１１−１３７７５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. J. Goodfellow, B. G. Davis et al. J. Am. Chem. Soc., 134, 8030-8033 (2012)
【非特許文献２】W. Huang, Lai-Xi Wang et al, J. Am. Chem. Soc., 134, 12308-12318 (2012)
【非特許文献３】Kurogochi, M., et al, PLoS One, 10, e0132848 (2015)
【非特許文献４】Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotechnol Bioeng 87:614-622 (2004)
【非特許文献５】Li, T., et al, J. Biol. Chem., 291, 16508-16518 (2016)
【非特許文献６】Eshima, Y., et al, PLoS One, 10, e0132859 (2015)
【非特許文献７】Giddens, JP., et al, J. Biol. Chem., 291, 9356-9370 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、前記問題点を解決し均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定の複数のエンドグリコシダーゼを使用することにより、ＰＳＡの糖鎖がすべて切断されることを見出した。
また、特定のエンドグリコシダーゼ及び転移酵素を使用することによって、均一糖鎖構造を持つＰＳＡを調製できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ＰＳＡを複数のエンドグリコシダーゼで処理し、糖鎖が切断されたＰＳＡを得る工程を有することを特徴とする糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、更に、上記糖鎖が切断されたＰＳＡに、均一な糖鎖を転移酵素で付加し、均一な糖鎖が結合されたＰＳＡを得る工程を有する、上記糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を使用することを特徴とする均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、所望のエンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する所望の糖鎖構造を有する対象糖鎖の定量的情報を決定する方法であって、以下の工程（ａ）ないし工程（ｄ）を有することを特徴とする方法を提供するものである。
（ａ）ＰＳＡをエンドグリコシダーゼと反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）後のＰＳＡをプロテアーゼで処理する工程
（ｃ）工程（ｂ）により得られた糖ペプチドのうち、対象糖鎖を有する糖ペプチドを測定する工程
（ｄ）該対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から該エンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定する工程
【００１４】
また、本発明は、ＰＳＡのタンパク質部分、及びそれに直接結合したＮ−アセチルグルコサミンよりなることを特徴とする糖鎖が切断されたＰＳＡを提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を有することを特徴とする糖鎖改変されたＰＳＡを提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、前記問題点や上記課題を解決し、糖鎖がすべて切断されたＰＳＡを調製することができる。更に、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有するＰＳＡを調製することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、酵素処理という簡単なステップにより、効率的かつ低コストで、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有するＰＳＡを、簡単なステップにより、効率的かつ低コストで高純度に調製することができる。
【００１８】
また、本発明のＰＳＡは、均一の糖鎖構造を有することにより、「特定の糖鎖構造を有するＰＳＡによる生体内に及ぼす影響」等の検討に、本発明の糖鎖が切断されたＰＳＡや糖鎖改変されたＰＳＡを利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法の概略を示す図である。
【図２】複合型糖鎖（複合型糖鎖の具体的な構造）を示した図である。
【図３】本実施例で使用したＰＳＡの糖鎖プロファイルを示す図である。
【図４】ＰＳＡ、及びＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＨ又はＥｎｄｏＬＬによる糖鎖加水分解後のＰＳＡを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図５】ＰＳＡ、及びＥｎｄｏＣＣ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＦ２又はＥｎｄｏＦ３による糖鎖加水分解後のＰＳＡを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図６】ＰＳＡ、及びＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＭ＋ＥｎｄｏＦ３又はＥｎｄｏＦ３による糖鎖加水分解後のＰＳＡを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図７Ａ】未処理のＰＳＡの糖ペプチド（黒色、右）とＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＭ又はＥｎｄｏＨ処理後のＰＳＡの糖ペプチド（灰色、左）の量比を示す。縦軸はＰＳＡ中の糖ペプチド割合（％）である。横軸は糖ペプチドの種類を示す。
【図７Ｂ】未処理のＰＳＡの糖ペプチド（黒色、右）とＥｎｄｏＬＬ、ＥｎｄｏＳ２又はＥｎｄｏＣＣ処理後のＰＳＡの糖ペプチド（灰色、左）の量比を示す。縦軸はＰＳＡ中の糖ペプチド割合（％）である。横軸は糖ペプチドの種類を示す。
【図７Ｃ】未処理のＰＳＡの糖ペプチド（黒色、右）とＥｎｄｏＦ２又はＥｎｄｏＦ３処理後のＰＳＡの糖ペプチド（灰色、左）の量比を示す。縦軸はＰＳＡ中の糖ペプチド割合（％）である。横軸は糖ペプチドの種類を示す。
【図７Ｄ】未処理のＰＳＡの糖ペプチド（黒色、右）とＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ３又はＥｎｄｏＭ＋ＥｎｄｏＦ３処理後のＰＳＡの糖ペプチド（灰色、左）の量比を示す。縦軸はＰＳＡ中の糖ペプチド割合（％）である。横軸は糖ペプチドの種類を示す。
【図８】ＰＳＡアクセプター及びＧ２−Ｏｘａを転移させたＰＳＡ（０、１０、３０、６０、９０分間）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図９】ＰＳＡアクセプター及びＬＤＮ２−Ｏｘａを転移させたＰＳＡ（０、１０、３０、６０、９０分間）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものでなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００２１】
＜糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法＞
本発明の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法は、ＰＳＡを複数のエンドグリコシダーゼで処理し、糖鎖が切断されたＰＳＡを得る工程を有することを特徴とする。
【００２２】
本明細書中において、「ＰＳＡ（prostate specific antigen）」とは、前立腺特異抗原であり、約２６ｋＤａの分子量を有する２３７個のアミノ酸残基からなるタンパク質部分を示し、該タンパク質部分に結合する糖鎖構造の有無や違いは問わない。ＰＳＡのタンパク質部分の構造は、例えば、Stamey et al., N. Engl. J. Med., 317, 909-916 (1987)等に開示されている。
【００２３】
エンドグリコシダーゼとは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであって、「『Ｎ−アセチルグルコサミン』に結合している糖鎖」を加水分解する酵素である。すなわち、「エンドグリコシダーゼ」とは、特定の糖鎖の構造を認識して、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。
【００２４】
上記複数のエンドグリコシダーゼは、ＥＣ３．２．１．９６に分類される基質特異性の異なるエンドグリコシダーゼの組み合わせであることが好ましい。
ＥＣ３．２．１．９６に分類されるエンドグリコシダーゼの例は、エンドグリコシダーゼＬ（以下、「Ｅｎｄｏ−ＬＬ」又は「ＥｎｄｏＬＬ」と略記する場合がある）、エンドグリコシダーゼＭ（以下、「Ｅｎｄｏ−Ｍ」又は「ＥｎｄｏＭ」と略記する場合がある）、エンドグリコシダーゼＣＣ（以下、「Ｅｎｄｏ−ＣＣ」又は「ＥｎｄｏＣＣ」と略記する場合がある）、エンドグリコシダーゼＦ２（以下、「Ｅｎｄｏ−Ｆ２」又は「ＥｎｄｏＦ２」と略記する場合がある）、エンドグリコシダーゼＦ３（以下、「Ｅｎｄｏ−Ｆ３」又は「ＥｎｄｏＦ３」と略記する場合がある）等がある。
【００２５】
Ｅｎｄｏ−ＬＬ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−ＣＣ、Ｅｎｄｏ−Ｆ２及びＥｎｄｏ−Ｆ３についてはそれぞれ、特許文献１、非特許文献４、非特許文献６、非特許文献５及び非特許文献６に開示されている。
【００２６】
また、上記のエンドグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＦ３、並びに、エンドグリコシダーゼＭ、エンドグリコシダーゼＣＣ及びエンドグリコシダーゼＦ２から選ばれる少なくとも１つのエンドグリコシダーゼであることが好ましい。
【００２７】
上記糖鎖が切断されたＰＳＡは、ＰＳＡと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が切断されたＰＳＡであることが好ましく、ＰＳＡの６９番目のアスパラギンと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が切断されたＰＳＡであることがより好ましい。
【００２８】
糖鎖が切断される前のＰＳＡと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖の量に対する、本発明の糖鎖が切断されたＰＳＡと直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖の量の割合が、２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることがとりわけ好ましい。
【００２９】
＜均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法＞
本発明の均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法は、上記糖鎖が切断されたＰＳＡに、均一な糖鎖を転移酵素で付加し、均一な糖鎖が結合されたＰＳＡを得る工程を有する、上記糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法を使用することを特徴とする。
該均一な糖鎖構造を有するＰＳＡの製造方法の概略を図１に示す。
【００３０】
本明細書において、「均一な糖鎖」とは、「ＰＳＡに結合している糖鎖構造が同一である」ことを言う。
【００３１】
例えば、上記「糖鎖が切断されたＰＳＡ」をアクセプターとして、均一な糖鎖をドナーとして、両者を、転移酵素を用いて反応させることにより、均一な（同一の）糖鎖を付加させることができる。
例えば、均一な糖鎖に対してオキサゾリンを結合させて得られた誘導体（糖鎖−オキサゾリン）等を糖鎖ドナーとして用いることができる。
【００３２】
糖鎖が切断されたＰＳＡに付加される均一な糖鎖の構造は、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、均一な糖鎖の構造の例として、Ｍ２型糖鎖（ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）に、２個のマンノースが結合している糖鎖）、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖等が挙げられる。
本発明の製造方法においては、該均一な糖鎖は高マンノース型糖鎖又は複合型糖鎖であることが好ましい。
【００３３】
「高マンノース型糖鎖」とは、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃに、マンノースのオリゴマーが結合している糖鎖のことである。高マンノース型糖鎖の例として、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のマンノースよりなるマンノースオリゴマーが、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃに結合している、Ｍ３型、Ｍ４型、Ｍ５型、Ｍ６型、Ｍ７型、Ｍ８型、Ｍ９型等が挙げられる。
「複合型糖鎖」とは、ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）に、マンノース、及びＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸の少なくとも１つが結合した糖鎖のことである。
複合型糖鎖の例として、Ａ２型、Ｇ２型、Ｇ０型、Ｇ１ａ型、Ｇ１ｂ型、ＬＤＮ２型等が挙げられる。複合型糖鎖の具体的な構造を図２に示す。
本発明の製造方法においては、該複合型糖鎖はＧ２型糖鎖又はＬＤＮ２型糖鎖であることが好ましい。
【００３４】
上記転移酵素は、上記「糖鎖が切断されたＰＳＡ」に、上記均一な糖鎖を付加する作用を有する酵素であればよい。
転移酵素の例として、実施例で用いられたＥｎｄｏＦ３の変異型酵素（Ｅｎｄｏ−Ｆ３  Ｄ１６５Ａ）等の糖転移酵素（グライコシンターゼ）等が挙げられる。
【００３５】
＜酵素処理されたＰＳＡに結合する糖鎖構造の定量的情報を決定する方法＞
本発明の別の形態は、所望のエンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する所望の糖鎖構造を有する対象糖鎖の定量的情報を決定する方法であって、以下の工程（ａ）ないし工程（ｄ）を有することを特徴とする方法である。
（ａ）ＰＳＡをエンドグリコシダーゼと反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）後のＰＳＡをプロテアーゼで処理する工程
（ｃ）工程（ｂ）により得られた糖ペプチドのうち、対象糖鎖を有する糖ペプチドを測定する工程
（ｄ）該対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から該エンドグリコシダーゼで処理されたＰＳＡに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定する工程
【００３６】
上記工程（ａ）において、２種類以上のエンドグリコシダーゼを使用することが好ましい。該２種類以上のエンドグリコシダーゼの好ましい組み合わせは、上述の糖鎖が切断されたＰＳＡの調製方法で用いるエンドグリコシダーゼの好ましい組み合わせと同様である。
【００３７】
上記工程（ｂ）で用いるプロテアーゼは特に限定はなく、ＰＳＡを切断し、ＰＳＡに結合する糖鎖構造に影響を与えないプロテアーゼであればよい。プロテアーゼの例は、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン等である。
【００３８】
上記工程（ｃ）の対象糖鎖を有する糖ペプチドを測定する方法は特に限定はなく、例えば、該対象糖鎖を有する糖ペプチドに対してレクチンを作用させる方法、該対象糖鎖を有する糖ペプチドに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー若しくは質量分析法、又はこれらを組み合わせた方法等がある。
【００３９】
上記工程（ｄ）により、エンドグリコシダーゼによる糖鎖切断後に残存する、ＰＳＡに結合する糖鎖の量に関する情報を得ることができる。
【００４０】
＜糖鎖が切断されたＰＳＡ＞
本発明の別の形態は、ＰＳＡのタンパク質部分、及びそれに直接結合したＮ−アセチルグルコサミンよりなることを特徴とする糖鎖が切断されたＰＳＡである。
本発明の糖鎖が切断されたＰＳＡは、例えば、上述の調製方法によって得ることができる。
【００４１】
＜糖鎖改変されたＰＳＡ＞
本発明の別の形態は、１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を有することを特徴とする糖鎖改変されたＰＳＡである。
本発明の糖鎖改変されたＰＳＡは、例えば、上述の製造方法によって得ることができる。
【００４２】
本発明における糖鎖改変されたＰＳＡにおいて、上記１種類の糖鎖は高マンノース型又は複合型糖鎖であることが好ましく、該複合型糖鎖はＧ２又はＬＤＮ２であることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例１＞ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＬＬ、ＥｎｄｏＳ２、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＣＣ及びＥｎｄｏＦ３によるヒト精漿由来ＰＳＡの加水分解反応とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
ＢＢＩｓｏｌｕｔｉｏｎ社製のヒト精漿由来ＰＳＡ（５μｇ）とＥｎｄｏＳ（非特許文献１〜３、０．５μｇ）、ＥｎｄｏＭ（非特許文献４、東京化成工業株式会社製、０．５μｇ）、ＥｎｄｏＨ（ＮＥＢ社、０．５μｇ）、ＥｎｄｏＬＬ（特許文献１及び非特許文献３、０．５μｇ）、ＥｎｄｏＳ２（非特許文献５、２．０μｇ）、ＥｎｄｏＦ２（ＱＡｂｉｏ社製、０．２μｇ）、ＥｎｄｏＣＣ（非特許文献６、株式会社伏見製薬所製、０．２μｇ）及びＥｎｄｏＦ３（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、０．２μｇ）をそれぞれ５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量１０μＬとして４℃で２１０分間反応させた。この反応液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した。実施例で用いたヒト精漿由来ＰＳＡの糖鎖プロファイルを図３に示す。
【００４５】
その結果、糖鎖が切断されたために低分子側にシフトする酵素を確認したが、すべての糖鎖が切断できる酵素は無いことが確認された（図４及び５）。
【００４６】
＜実施例２＞ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ３の同時加水分解によるヒト精漿由来ＰＳＡアクセプターの調製とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
ＢＢＩｓｏｌｕｔｉｏｎ社製のヒト精漿由来ＰＳＡ（５００ μｇ）とＥｎｄｏＭ（東京化成工業株式会社製、１．０μｇ）、ＥｎｄｏＦ３（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製、０．５μｇ）を５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に加え、総量２５０μＬとして４℃で４８時間静置した。反応後のヒト精漿由来ＰＳＡ（０．５μｇ）を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した。反応溶液をＮｉ−ＮＴＡアガロース（wet vol. ２０μＬ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を加えて、４℃で２時間撹拌した後にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３を除去し、溶出液をアミコンウルトラ−０．５（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）で濃縮しながら２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にバッファー置換した。
【００４７】
エンドグリコシダーゼ単体で加水分解を行った場合は切れ残りが多数存在することが確認されたが（図４及び５）、ＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３の同時加水分解産物は切れ残りが少なくほとんどすべてが低分子側にシフトしていた（図６）。これにより、ＰＳＡアクセプターの調製を行った。
【００４８】
＜実施例３＞ヒト精漿由来ＰＳＡ糖ペプチドＩｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号１）の解析
ヒト精漿由来ＰＳＡ（３μｇ）及びエンドグリコシダーゼによって糖鎖切断処理が施されたヒト精漿由来ＰＳＡ（３μｇ）を３００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）＋５０ｍＭ塩化カルシウム（５０μＬ）に溶かし、サーモリシン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、１４２ｍｇ／ｍＬ、３．０μＬ）を加え、５７℃で２４時間反応させた。反応溶液をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ、３ｍＬ）で脱塩し、濃縮した。
【００４９】
上記濃縮物それぞれに水（１０μＬ）とピリジン（５μＬ）を加え、エンドグリコシダーゼによって処理が施されたヒト精漿由来ＰＳＡには２００ｍＭ軽水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、エンドグリコシダーゼ処理していないヒト精漿由来ＰＳＡには２００ｍＭ重水素標識の安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（１０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。
【００５０】
上記反応物を、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料を水に溶かし、ヒト精漿由来ＰＳＡの重水素標識された糖ペプチドとエンドグリコシダーゼ処理を行ったヒト精漿由来ＰＳＡの軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で１：１に混ぜ合わせ、２００ｎｇ分をＺｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ  カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行った。
【００５１】
標識されたペプチド鎖（Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）に糖鎖が結合した糖ペプチドの［Ｍ−２Ｈ］２−を検出して、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンドグリコシダーゼ処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを比較した。酵素処理前のＡ２Ｆ、Ａ２＋ＬａｃｄｉＮＡｃＦ、Ａ２、Ａ２＋ＬａｃｄｉＮＡｃ、Ａ１Ｆ、Ａ１＋ＬａｃｄｉＮＡｃＦ＋ＳＯ３、Ａ１−Ｈｙｂｒｉｄの糖鎖がペプチド鎖に結合したｍ／ｚ＝１５８６．５（Ｈ）／１５９１．５（Ｄ）、１６０７．０（Ｈ）／１６１２．０（Ｄ）、１５１３．５（Ｈ）／１５１８．５（Ｄ）、１５３４．０（Ｈ）／１５３９．０（Ｄ）、１４４０．７（Ｈ）／１４４５．７（Ｄ）、１５０１．２（Ｈ）／１５０６．２（Ｄ）、１３４７．５（Ｈ）／１３５２．５（Ｄ）、並びにエンドグリコシダーゼによって糖鎖が切断されたＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）ｍ／ｚ＝１０２６．０（Ｈ）／１０３６．０（Ｄ）及びＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）ｍ／ｚ＝１１７２．０（Ｈ）／１１８２．０（Ｄ）をモニタリングした。これらのイオン量を比較して棒グラフを作成する事によって、糖鎖切断の割合を算出した。結果を図７Ａ〜Ｄに示す。
【００５２】
図７Ａ〜Ｄ中、左側の灰色の棒が、各種エンドグリコシダーゼ処理後のＰＳＡの糖ペプチドの割合（％）、右側の黒色の棒が、未処理のＰＳＡの糖ペプチドの割合（％）を示す。
図７Ａ〜Ｄ中、「Ｇｎ」は「ｐｅｐ＋Ｇｎ（糖鎖が切断された側のＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド）」、「ＧｎＦ」は「ｐｅｐ＋ＧｎＦ（糖鎖が切断された側のＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド）」を示す。「Ｇｎ」及び「ＧｎＦ」の合計が１００％のとき、ＰＳＡの糖鎖がすべて切断されたことを示す。
【００５３】
ＢＢＩｓｏｌｕｔｉｏｎ社製のヒト精漿由来ＰＳＡは糖鎖が１００％付加しており、そのうちフコースが結合している糖鎖（Ａ２Ｆ、Ａ２＋ＬａｃｄｉＮＡｃＦ、Ａ１Ｆ、Ａ１＋ＬａｃｄｉＮＡｃＦ＋ＳＯ３）は約７０％であった（図７Ａ〜Ｄ、黒色）。
ＥｎｄｏＨ及びＥｎｄｏＬＬで処理したヒト精漿由来ＰＳＡは、Ａ１−Ｈｙｂｒｉｄの糖鎖だけが切断されており、糖鎖が切断された側のＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）は、約５％であった（図７Ａ、図７Ｂ）。
【００５４】
一方、ＥｎｄｏＭのみで処理したヒト精漿由来ＰＳＡは、フコースが結合していない糖鎖が選択的に切断されており、糖鎖が切断された側のＧｌｃＮＡｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋Ｇｎ）は、約２０％であった（図７Ｄ）。また、ＥｎｄｏＦ３のみで処理したヒト精漿由来ＰＳＡは、フコースが結合している糖鎖だけを選択的に切断しており、糖鎖が切断された側のＧｌｃＮＡｃＦｕｃが１個付いたペプチド（ｐｅｐ＋ＧｎＦ）は、約６０％であった（図７Ｄ）。
【００５５】
また図７Ｄより、ヒト精漿由来ＰＳＡはＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３で同時に処理する事によって、ほとんどすべての糖鎖が切断されて、ＧｌｃＮＡｃが１個付いたＰＳＡアクセプターの調製が出来た。
また、ＥｎｄｏＦ２単独の結果（図７Ｃ上）と、ＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３で同時に処理した結果（図７Ｄ下）を比較すると、Ａ２とＡ１−Ｈｙｂｒｉｄの量がＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３で同時に処理した時の方が減少しており、ＥｎｄｏＭとＥｎｄｏＦ３で同時に処理した方がよいことが分かった。
【００５６】
＜実施例４＞ヒト精漿由来ＰＳＡの糖鎖改変
実施例２で調製したヒト精漿由来ＰＳＡ（５００μｇ、１６．５ｎｍｏｌ）、糖供与体として糖オキサゾリン（７５μｇ、２４７．５ｎｍｏｌ、Ｇ２又はＬＤＮ２−ＯＸａ、特許文献３と非特許文献３参照）及び糖転移酵素としてＥｎｄｏ−Ｆ３  Ｄ１６５Ａ（１０μｇ、非特許文献６参照）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に加え、総量８５μＬとして４℃で１５０分間静置した。なお、ＬＤＮ２は、特許文献３に開示されている糖鎖の合成方法を利用して合成した。
上記溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニタリングした。反応後、この反応液をアミコンウルトラ−０．５（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）で濃縮しながら２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）にバッファー置換した。
【００５７】
その結果、糖オキサゾリンがＰＳＡアクセプターに転移されたために高分子側にシフトしたことが確認された（図８及び９）。
以上より、糖鎖が切断されたＰＳＡを、糖オキサゾリン（Ｇ２又はＬＤＮ２−ＯＸａ）を糖供与体（ドナー）として、転移酵素により、Ｇ２（図８）又はＬＤＮ２（図９）のみが結合されたＰＳＡを得ることができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、糖鎖が切断されたＰＳＡや、均一な糖鎖構造を有するＰＳＡを調製・製造することができる。したがって、糖鎖が与える影響や、特定の糖鎖構造を有するＰＳＡによる生体内に及ぼす影響等の検討が可能になるので、医薬品業界等において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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