(57)【要約】【課題】ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる核酸増幅反応方法を提供する。【解決手段】  鋳型核酸、プライマー、プローブ、およびポリメラーゼを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、前記熱サイクルを付与する工程において、前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、  前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である、核酸増幅反応方法。  Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）【選択図】図４
2018014949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸、プライマー、プローブ、およびポリメラーゼを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である、核酸増幅反応方法。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【請求項２】
請求項１において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記プローブは、人工核酸を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記プローブは、マイナーグループバインダー分子を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記ΔＴｍ値は、−５℃以上２℃以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来し、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４に由来し、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、核酸増幅
反応方法。
【請求項９】
核酸を増幅させるための核酸増幅反応試薬であって、
プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である、核酸増幅反応試薬。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【請求項１０】
核酸を増幅させるための核酸増幅反応試薬であって、
プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である、核酸増幅反応試薬。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の核酸増幅反応試薬の使用方法であって、
前記核酸増幅反応試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液に、１サイクル当たりの時間が９秒以下である熱サイクルを付与して核酸を増幅させる、核酸増幅反応試薬の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応方法、核酸増幅反応試薬、および核酸増幅反応試薬の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応溶液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
ＰＣＲの高速化は、遺伝子検査の検査時間短縮化のために必要な技術であり、遺伝子検査の業界において非常に期待されている。
【０００５】
例えば特許文献１には、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ、プライマーが少なくとも２μＭの濃度で提供され、１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５２０６１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のようなＰＣＲにおいて、増幅された核酸を定量するために、プローブを用いている。一般的に、プローブのＴｍ値は、プライマーのＴｍ値よりも６℃〜８℃高いことが好ましいとされている。
【０００８】
プローブのＴｍ値がプライマーのＴｍ値よりも低い場合、プライマーのアニーリングがプローブのハイブリダイゼーションよりも先に起こりやすい。そうすると、ポリメラーゼによる伸長反応によって二本鎖が形成されるため、プローブがハイブリダイゼーションできない。その結果、例えば、ポリメラーゼによってプローブが加水分解されず、プローブが発光しない場合がある。
【０００９】
発明者らは、鋭意研究の結果、ＰＣＲを高速化させた場合では、プライマーのアニーリングとプローブのハイブリダイゼーションとが、ＰＣＲを高速化させない場合と異なることを見出した。
【００１０】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる核酸増幅反応方法を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光
強度を高くすることができる核酸増幅反応試薬およびその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
鋳型核酸、プライマー、プローブ、およびポリメラーゼを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００１２】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プライマーのアニーリング反応のための加熱時間は、６秒以下であってもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、人工核酸を含んでもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応方法では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、ΔＴｍ値を引いた値を上記の範囲にすることができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、マイナーグループバインダー分子を含んでもよい。
【００１８】
このような核酸増幅反応方法では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、ΔＴｍ値を引いた値を上記の範囲にすることができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記ΔＴｍ値は、−５℃以上２℃以下であってもよい。
【００２０】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度
をより高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００２１】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００２２】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００２３】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来し、
前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００２４】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００２５】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４に由来し、
前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であってもよい。
【００２６】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００２７】
このような核酸増幅方法では、２価の陽イオンの種類によって伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制するのに最適な濃度範囲が異なってくる。
【００２８】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
核酸を増幅させるための核酸増幅反応試薬であって、
プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ＭｇＣｌ２と、を含み、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）
であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００２９】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる。
【００３０】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
核酸を増幅させるための核酸増幅反応試薬であって、
プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ＭｇＳＯ４と、を含み、
前記核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となった場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、
前記プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記プローブの実測Ｔｍ値から前記プライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下であり、
前記算出Ｔｍ値は、下記式（１）から算出したものであり、
前記実測Ｔｍ値は、実測で求めた実測値である。
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
なお、式（１）において、
ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、
ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、
Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、
Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、
Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００３１】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる。
【００３２】
本発明に係る核酸増幅反応試薬の使用方法は、
本発明に係る核酸増幅反応試薬の使用方法であって、
前記核酸増幅反応試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液に、アニーリング反応のための加熱時間が４秒以下である熱サイクルを付与して核酸を増幅させる。
【００３３】
このような核酸増幅反応試薬の使用方法では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフ。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図３】本実施形態に係る反応溶液に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置を模式的に示す断面図。
【図４】プローブのＴｍ値からプライマーのＴｍ値を引いた値と、相対蛍光強度と、の関係を示すグラフ。
【図５】ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図６】ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３６】
１．  核酸増幅反応試薬
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬について説明する。核酸増幅反応試薬は、核酸増幅反応（ＰＣＲ）において、核酸を増幅させるための試薬である。核酸増幅反応試薬は、例えば、液状であってもよいし、凍結乾燥された状態であってもよい。例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応試薬は、容器（図示せず）内に固定されており、該容器に、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）やＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含む鋳型核酸溶液を導入して、鋳型核酸溶液と核酸増幅反応用試薬とを接触させる。核酸増幅反応用試薬は、鋳型核酸溶液の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液に取り込まれ、反応溶液となる。したがって、反応溶液は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００３７】
核酸増幅反応試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、プローブと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００３８】
１．１．  プライマー
プライマーは、鋳型核酸（テンプレート）にアニールするよう設計されている。アニール（アニーリング）とは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。核酸増幅反応用試薬は、プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応溶液に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上６．４μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応溶液に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００３９】
プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）の算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、好ましくは７０℃以上７５℃以下である。これにより、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬は、高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。Ｔｍ値は、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする温度の指標であり、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値以上の温度であれば、半数以上のプライマーが鋳型核酸にアニーリングする。フォワードプライマーのＴｍ値と、リバースプライマーのＴｍ値とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４０】
Ｔｍ値の算出方法としては、例えば、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法が挙げられ、下記式（１）によって算出することができる。「算出Ｔｍ値」とは、下記式（１）によって算出したＴｍ値のことである。
【００４１】
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
【００４２】
なお、式（１）において、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合
計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００４３】
Ｔｍ値は、実測により求めることもできる。実測でＴｍ値を求める場合は、プライマーと相補鎖が形成する二本鎖ＤＮＡに所定の蛍光物質を結合させ、熱変性による該蛍光物質の発光強度の低下を温度に対してプロットする。このグラフの一次微分の負の値がピークになった温度を「実測Ｔｍ値」として測定することができる（詳細は、「３．  実験例」参照）。
【００４４】
プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、プライマーの塩基数を多くすることなく、プライマーの算出Ｔｍ値を上記の範囲にすることができる。プライマーの塩基数が多くなると、非特異的吸着や、プライマー同士がプライマーダイマー（二本鎖）を形成してしまい、目的の核酸を増幅することができない場合がある。プライマーダイマーには、１つのプライマーにおいて二本鎖を形成するセルフダイマーと、フォワードプライマーとリバースプライマーとにおいて二本鎖を形成するクロスダイマーとがある。
【００４５】
人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が挙げられる。ＬＮＡの化学式を下記式（２）に示す。
【００４６】
【化１】
2018014949.tif 000003
【００４７】
なお、式（２）において、Ｂａｓｅ（塩基）は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）等が挙げられるが、特に限定されない。また、塩基は、メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。
【００４８】
人工核酸は、ＬＮＡを修飾したＬＮＡアナログであってもよく、具合的には、３’アミノ− ２’，４’− ＢＮＡ、２’，４’− ＢＮＡＣＯＣ、または２’，４’− ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）であってもよい。また、修飾蛍光プローブに含まれる人工核酸は、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、またはこれらを修飾したアナログであってもよい。プローブに含まれる人工核酸の数は、特に限定されず、１つのプローブは、複数の人工核酸を含んでいてもよい。
【００４９】
プライマーの塩基数を多くすることによりプライマーのＴｍ値を高くする場合は、プラ
イマーを増幅領域の内側（プライマーを鋳型核酸の５´末端側）に伸ばすように設計することで、伸長反応による核酸の増幅領域を増やすことなく、Ｔｍ値を高くすることができる。これにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００５０】
１．２．  ポリメラーゼ
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させる加水分解型と、ＫＯＤポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させない非加水分解型とが、存在する。ＫＯＤは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１であり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のＤＮＡポリメラーゼである。反応溶液に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００５１】
ここで、図１は、Ｔａｑポリメラーゼにおける温度と相対活性効率との関係を示すグラフである。縦軸は、温度を変化させたときにポリメラーゼの活性効率が最大となる値を１００％とした相対活性効率である。各温度におけるポリメラーゼの活性効率は、ｄＮＴＰに、ｄＮＴＰが伸長反応に取り込まれる際に発光するような工夫を行い、一定の時間経過後、ｄＮＴＰによる蛍光強度（蛍光輝度）を測定することにより、求めることができる。蛍光強度が高いほど、ポリメラーゼの活性効率は、高くなる。図１に示す例では、Ｔａｑポリメラーゼは、７０℃付近のときに、相対活性効率が最大となっている。
【００５２】
１．３．  ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。反応溶液に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００５３】
１．４．  プローブ
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。反応溶液に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上２．４μＭ以下であり、好ましくは０．５μＭ以上１．８μＭ以下である。
【００５４】
プローブは、例えば、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブである。より具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＴａｑポリメラーゼを用いる。
【００５５】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には
、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＫＯＤポリメラーゼを用いる。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５６】
プローブが非加水分解プローブの場合は、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールする増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５７】
プローブの実測Ｔｍ値からプライマーの実測Ｔｍ値を引いた値（ΔＴｍ値）は、−１１℃以上２℃以下である。すなわち、プライマーの実測Ｔｍ値が７５℃の場合、プローブの実測Ｔｍ値は、６４℃以上７７℃以下である。これにより、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬は、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。ΔＴｍ値は、好ましくは−５℃以上２℃以下であり、より好ましくは−４．５℃以上１℃以下である。
【００５８】
なお、フォワードプライマーの実測Ｔｍ値とリバースプライマーの実測Ｔｍ値とが異なる場合は、ΔＴｍ値は、プローブの実測Ｔｍ値からフォワードプライマーの実測Ｔｍ値とリバースプライマーの実測Ｔｍ値との平均値を引いた値である。
【００５９】
プローブは、人工核酸を含んでいてもよい。プローブは、マイナーグループバインダー（ＭＧＢ）分子を含んでもよい。プローブが人工核酸やＭＧＢ分子を含むことにより、プローブの塩基数が多くなることを抑制しつつ（塩基長が長くなることを抑制しつつ）、ΔＴｍ値を上記の範囲にすることができる。プローブの塩基数が多くなると、例えばプローブを分解するための時間が長くなり、ＰＣＲの高速化が困難になる場合がある。人工核酸としては、「１．１．  プライマー」で列挙したものを用いることができる。
【００６０】
１．５．  バッファー
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。
【００６１】
バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。２価の陽イオンの濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる（具体的には熱サイクルの１サイクル当たりの時間を９秒以下にすることができる）。２価の陽イオンの濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００６２】
具体的には、バッファーは、２価の陽イオン化合物と、ＫＣＬと、Ｔｒｉｓと、を含む。より具体的には、バッファーは、ＭｇＣｌ２を含み、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来する。すなわち、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２が電離して生成される。２価の陽イオンがＭｇＣｌ２に由来する場合は、Ｍｇ２＋の濃度は、ポリメラーゼの活性に起因する。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含
まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、好ましくは５ｍＭ以上７ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭである。ＭｇＣｌ２の濃度を４ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＣｌ２の濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。なお、核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている状態では、核酸増幅反応試薬は、固形の状態で、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ、賦形剤、例えばトレハロースを含む。
【００６３】
２価の陽イオン化合物は、ＭｇＳＯ４に由来していてもよい。この場合は、バッファーは、ＭｇＣｌ２の代わりにＭｇＳＯ４を含み、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭである。ＭｇＳＯ４の濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＳＯ４の濃度を３ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００６４】
１．６．  その他の成分
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、核酸増幅反応試薬は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００６５】
核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている場合、核酸増幅反応試薬（凍結乾燥試薬）は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応試薬の各成分と、糖と、を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００６６】
１．７．  使用方法
本実施形態に係る核酸増幅反応試薬の使用方法では、核酸増幅反応試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて反応溶液を調整し、反応溶液に、アニーリング反応のための加熱時間が４秒以下である熱サイクルを付与して核酸を増幅させる。
【００６７】
本実施形態に係る核酸増幅反応試薬は、例えば、以下の特徴を有する。
【００６８】
核酸増幅反応試薬では、プライマーの算出Ｔｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、プローブの実測Ｔｍ値からプライマーの実測Ｔｍ値を引いたΔＴｍ値は、−１１℃以上２℃以下である。そのため、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲを高速化（ＰＣＲにかける時間を短縮化）させつつ、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、核酸の増幅量を高感度で定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００６９】
核酸増幅反応試薬では、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲ
の高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００７０】
核酸増幅反応試薬では、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である。そのため、核酸増幅反応試薬では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、Ｍｇ２＋が多すぎて非特異的増幅の増加による特異的な増幅産物の収量低下が起こることを抑制することができる。
【００７１】
核酸増幅反応試薬では、プローブは、人工核酸を含んでいてもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、ΔＴｍ値を上記の範囲にすることができる。
【００７２】
核酸増幅反応試薬では、プローブは、ＭＧＢ分子を含んでいてもよい。そのため、核酸増幅反応試薬では、プローブの塩基数が多くなることを抑えつつ、ΔＴｍ値を上記の範囲にすることができる。
【００７３】
核酸増幅反応試薬では、ΔＴｍ値は、−５℃以上２℃以下であってもよい。これにより、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲを高速化させつつ、プローブによる蛍光強度をより高くすることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００７４】
２．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。
【００７５】
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する（ステップＳ１）。具体的には、核酸増幅反応試薬が収容されている容器に、ピペット等を用いて鋳型核酸溶液を導入し、核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する。反応溶液は、例えば、鋳型核酸、プライマー、プローブ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびバッファーを含む。
【００７６】
鋳型核酸溶液は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００７７】
次に、反応溶液に、核酸を増幅させるための（ＰＣＲのための）熱サイクルを付与する（ステップＳ２）。ここで、図３は、本実施形態に係る反応溶液６に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置１００を模式的に示す断面図である。
【００７８】
熱サイクル装置１００は、図３に示すように、第１ホットプレート１０と、第２ホットプレート１２と、第１ビーカー２０と、第２ビーカー２２と、アーム３０と、固定部３２と、を含む。
【００７９】
第１ホットプレート１０は、第１ビーカー２０に収容されている液体２を第１温度に加熱する。第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。液体２は、第１ホットプレート１０により第１温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８０】
第２ホットプレート１２は、第２ビーカー２２に収容されている液体４を第２温度に加熱する。第２温度は、第１温度よりも低い温度である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。すなわち、本工程では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。つまり、アニーリング反応と伸長反応とを同じ温度で行う。上述した図１より、ポリメラーゼの活性効率の観点からは、第２温度は、７０℃程度が最適であるといえる。液体４の種類は、第２ホットプレート１２により第２温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８１】
アーム３０は、一端３０ａが固定部３２によって固定されており、他端３０ｂが自由端となっている。アーム３０の他端３０ｂは、反応溶液６が収容されている容器８を支持している。アーム３０は、図示せぬモーターにより、一端３０ａが固定された状態で、他端３０ｂが円弧状に往復運動する。
【００８２】
アーム３０の往復運動により、反応溶液６は、第１温度に加熱された液体２中と、第２温度に加熱された液体４中とに、交互に配置される。これにより、反応溶液６に、ＰＣＲのための熱サイクルを付与することができる。本工程における熱サイクル数は、モーターの駆動および停止により適宜設定することができ、例えば、２０サイクル以上６０サイクル以下である。反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および反応溶液６の液体４から液体２への移動時間は、例えば、０．５秒程度である。
【００８３】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりの変性反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体２中に配置されている時間）は、例えば、０．３秒以上５秒以下であり、好ましくは０．５秒以上２秒以下である。変性反応のための加熱時間を０．３秒以上とすることにより、変性反応の時間が短すぎて変性が十分に行われないことを抑制することができる。変性反応のための加熱時間を５秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００８４】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりのアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体４中に配置されている時間）は、例えば、６秒以下であり、好ましくは４秒以下であり、より好ましくは３秒以下であり、さらにより好ましくは１秒以上１．５秒以下である。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を６秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００８５】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、好ましくは７秒以下であり、より好ましくは６秒以下である。１サイクル当たりの時間を９秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。なお、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、変性反応、アニーリング反応、および伸長反応にかかる時間と、これらの反応を行うための反応溶液の移動時間（例えば、反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間）と、を含む。
【００８６】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、反応溶液の高温から低温への降温速度および低温から高温への昇温速度は、例えば、８℃／秒以上１１℃／秒以下であり、好ましくは９℃／秒以上１０℃／秒以下であり、より好ましくは９．２℃／秒以上９．６秒／℃以下である。
【００８７】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、増幅される核酸の塩基数は、２
００以下であってもよい。これにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００８８】
次に、反応溶液の蛍光強度を測定する（ステップＳ３）。例えば、熱サイクルを付与した反応溶液を、透光性の容器に移し、該透光性の容器に光を照射して蛍光強度を測定する。これにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００８９】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【００９０】
３．１．  第１実験例
３．１．１．  反応溶液の調整および実験方法
（１）実施例
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【００９１】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）    ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）      ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ４．８１μＬ
【００９２】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【００９３】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【００９４】
プライマーのＴｍ値および配列は、下記表１のとおりである。
【００９５】
【表１】
2018014949.tif 000004
【００９６】
Ｔｍ値が異なるプローブを５種類用意した。プローブのＴｍ値および配列は、下記表２のとおりである。表２では、配列において人工核酸に下線を引き、人工核酸の種類を示している。なお、Ｔｍ値は、後述する「３．１．３．  実測Ｔｍ値の測定」に記載の方法で測定した。
【００９７】
【表２】
2018014949.tif 000005
【００９８】
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、図３に示すような装置において、高温領域（９０℃）と低温領域（６６℃）とを往復運動させて、ＰＣＲを行った。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度（エンドポイントの蛍光強度）を測定した。
【００９９】
第１実験例では、ＰＣＲ条件を下記表３のように振った。
【０１００】
【表３】
2018014949.tif 000006
【０１０１】
なお、表３において、「ホットスタート」とは、ポリメラーゼを活性させるために、初めに高温（９０℃）で加熱することをいう。反応溶液の高温から低温への降温速度および低温から高温への昇温速度を、条件１（高温２秒／低温２秒）の場合は９．２℃／秒とし、条件２（高温１秒／低温１秒）の場合は９．６℃／秒とした。
【０１０２】
（２）比較例
比較例として、下記の反応溶液を調製した。
【０１０３】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
１０×Ｇｅｎｅ  ＴａｑＮＴ  ｂｕｆｆｅｒ                    １．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      ０．４μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        ０．４μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．２μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ６．３５μＬ
【０１０４】
プライマーのＴｍ値および配列は、下記表４のとおりである。なお、プローブは、表２と同様に、Ｔｍ値が異なるものを５種類用意した。
【０１０５】
【表４】
2018014949.tif 000007
【０１０６】
上記のような反応溶液１０μＬを、Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍにおいて、ホットスタート２分、高温（９５℃）５秒、低温（６０℃）２０秒の４０サイクルでＰＣＲを行い、で蛍光強度（エンドポイントの蛍光強度）を測定した。反応溶液の降温速度および昇温速度を、２．３℃／秒とした。
【０１０７】
なお、表１，２，４のＴｍ値は、Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍを用いて実測したものである。プライマーと相補鎖が形成する二本鎖ＤＮＡに所定の蛍光物質を結合させ、熱変性による該蛍光物質の発光強度の低下を温度に対してプロットする。このグラフの一次微分の負の値がピークになった温度をＴｍ値とした。
【０１０８】
３．１．２．  蛍光強度測定の結果
上記の実施例（高温２秒／低温２秒、高温１秒／低温１秒）および比較例（高温５秒／低温２０秒）についての蛍光強度測定の結果を示す。図４は、プローブのＴｍ値からプライマーのＴｍ値を引いた値（ΔＴｍ値）と、相対蛍光強度と、の関係を示すグラフである。ΔＴｍ値は、プローブのＴｍ値から、フォワードプライマーのＴｍ値とリバースプライマーのＴｍ値との平均値を引いた値である。
【０１０９】
図４の縦軸の相対蛍光強度とは、熱サイクル（温度サイクル）を付与していない未反応溶液の蛍光強度（バックグラウンド）を、エンドポイントの蛍光強度から引き、測定点で最も強度が高かった値を１００％とした相対強度である。
【０１１０】
図４に示すように、高温５秒／低温２０秒の場合では、相対蛍光強度が６０％以上となったのは、ΔＴｍ値＝４．０２℃以上７．５２℃以下の範囲であった。
【０１１１】
一方、高温２秒／低温２秒の場合では、相対蛍光強度が６０％以上となったのは、ΔＴｍ値＝−４．７１℃以上１．２８℃以下の範囲であり、高温１秒／低温１秒の場合では、ΔＴｍ値＝−１０．４７℃以上１．２８℃以下の範囲であった。また、相対蛍光強度が７０％以上となったのは、高温２秒／低温２秒の場合では、ΔＴｍ値＝−４．７１℃以上１．２８℃以下の範囲であり、高温１秒／低温１秒の場合では、ΔＴｍ値＝−４．７１℃以上−１．４８℃以下の範囲であった。
【０１１２】
したがって、ＰＣＲを高速化（反応時間を短縮化）させた場合は、ΔＴｍ値を、−１１以上２以下とし、好ましくは−５以上２以下とすることにより、プローブによる蛍光強度を高くできることがわかった。
【０１１３】
プローブのＴｍ値がプライマーのＴｍ値より低い方が蛍光強度が高くなることは、驚くべきことである。なぜなら、上述したように、プライマーのアニーリングがプローブのハイブリダイゼーションより先に起こると、ポリメラーゼによる伸長反応によりプローブがハイブリダイゼーションできなくなるためである。ＰＣＲを高速化させない場合（高温５秒／低温２０秒の場合）、図４では、プローブのＴｍ値がプライマーのＴｍ値より低いと（ΔＴｍ値がマイナスだと）、相対蛍光強度は、わずか２０％程度である。一方、ＰＣＲを高速化させた場合（高温２秒／低温２秒の場合、高温１秒／低温１秒の場合）、ΔＴｍ
値は、むしろマイナスである方が、蛍光強度が高い。
【０１１４】
このような現象の原因としては、例えば、次のようなことが推察される。高速ＰＣＲでは、降温速度が大きく、プライマーがアニーリングしてもポリメラーゼによる伸長が、プローブ結合領域（プローブがハイブリダイゼーションする領域）に達する前に、プローブがハイブリダイゼーションできる温度まで反応溶液の温度が低下する。そのため、プローブは、ポリメラーゼによる伸長が、プローブ結合領域に達する前にハイブリダイゼーションし、加水分解される。ＰＣＲを高速化させない場合は、（ｉ）プローブのハイブリダイゼーション、（ｉｉ）プライマーのアニーリング、（ｉｉｉ）ポリメラーゼのプライミング、（ｉｖ）ポリメラーゼによる伸長、の順に起こるが、ＰＣＲを高速化させると、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｖ）の順に反応が進むと考えられる。ただし、この推察は仮説にすぎず、原因解明には追加の実験が必要であると考えられる。
【０１１５】
３．１．３．  実測Ｔｍ値の測定
第１実験で用いたＴｍ値（実測Ｔｍ値）は、下記方法で求めた実測値である。
【０１１６】
＜反応溶液の組成＞
Ｔｍ値を測定したいプローブまたはプライマー（１０μＭ）      ５．０μＬ
相補鎖（１００μＭ）                                        ０．５μＬ
ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（２５ｎＭ）                              ０．２μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
蒸留水                                                      ２．３μＬ
【０１１７】
なお、上記「相補鎖」とは、上記「Ｔｍ値を測定したいプローブまたはプライマー」の相補鎖のことである。また、バッファーは、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１１８】
反応溶液をサンプルチューブに入れ、Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍにおいてＴｍ値を実測した。具体的には、反応溶液を９９℃で２分間加熱し、次に４５℃で１分間加熱し、次に９９℃で１５秒間加熱した。なお、４５℃から９９℃に温度を上昇させる条件は０．５℃／秒であり、この間に蛍光強度を測定した。蛍光強度と温度をグラフにし、このグラフの一次微分の負の値がピークになった温度を実測のＴｍ値（実測Ｔｍ値）とした。
【０１１９】
３．２．  第２実験
３．２．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１２０】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μ）            ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ３．０５μＬ
【０１２１】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商
標）プローブを用いた。
【０１２２】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１２３】
本実験では、Ｔｍ値が異なるプライマーを用いた。具体的には、Ｔｍ値が約６０℃（Ｔｍ６０）、約７０℃（Ｔｍ７０）、約７５℃（Ｔｍ７５）、約８０℃（Ｔｍ８０）、および約８５℃（Ｔｍ８５）のプライマーを用いた。Ｔｍ値が約６０℃、約７０℃、および約７５℃プライマーのＴｍ値および配列は、下記表５のとおりである。なお、プローブのＴｍ値および配列は、表２の「Ｎｏ．１」と同様である。
【０１２４】
【表５】
2018014949.tif 000008
【０１２５】
なお、表５に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。また、プローブは、表２に示す「Ｎｏ．１」を用いた。
【０１２６】
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、図３に示すような装置において、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光強度を測定した。
【０１２７】
各プライマー（Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５）を用いたＰＣＲにおいて、変性反応のための加熱温度（高温温度）は、８７℃とした。Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５を用いたＰＣＲにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱温度（低温温度）は、それぞれ、６０℃、６３℃、６６℃、６９℃、７２℃とした。ＰＣＲにおける、１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表６に示す。なお、ポリメラーゼを活性化させるため、初めに１０秒間高温温度で加熱した（ホットスタート）。反応時間は、ポリメラーゼ活性時間に加え、高温時間および低温時間にサイクル数４０を掛け、さらに、反応溶液の移動時間を足したものである。また、表６において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間と低温時間との和に、高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）および低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）を足したものである。例えば、反応時間３７０秒の場合、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間（２秒）＋高温時間（６秒）＋高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）＋低温領域から高温領域への移動
時間（０．５秒）＝９秒となる。
【０１２８】
【表６】
2018014949.tif 000009
【０１２９】
３．２．２．  蛍光強度測定の結果
図５は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図５に示すように、低温時間が６秒の場合（１サイクル当たりの時間が９秒の場合）は、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認されたが、低温時間が４秒以下の場合（１サイクル当たりの時間が７秒の場合）は、Ｔｍ６０では核酸の増幅が確認されず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認された。したがって、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上であって、８０℃未満とすることにより、４秒以下という高速ＰＣＲでも、核酸を増幅できることがわかった。これは、Ｔｍ値が高いプライマーの方が鋳型核酸に速くアニーリングするので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。また、上述した図１から、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方が、Ｔｍ６０よりも、ポリメラーゼの活性効率が高く、伸長反応を速めることができるので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。なお、本実験例で用いた装置のばらつきを考慮すると、蛍光強度が３万５千 以上であると、確実に核酸が増幅されているといえる。そのため、１サイクル当たりの時間が９秒の場合に、Ｔｍ６０は確実に核酸が増幅されているとはいえず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５は確実に核酸が増幅されているといえる。
【０１３０】
さらに、図５より、低温時間を２秒以上４秒以下とし、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上７５℃以下とすることにより、低温時間が４秒以下でも、より確実に、核酸を増幅できることがわかった。また、図５より、Ｔｍ８０およびＴｍ８５では、核酸の増幅が確認されなかった。これは、Ｔｍ値が高すぎて、プライマーダイマーなどが生じたためであると考えられる。
【０１３１】
なお、図５では、熱サイクルを付与していない未反応溶液の蛍光強度（バックグラウンド）を、エンドポイントの蛍光強度から引いた値をプロットしている。蛍光強度がマイナスを示しているプロットは、測定誤差であると考えられる。
【０１３２】
３．３．  第３実験例
３．３．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、百日咳菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１３３】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
百日咳菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）            ０．３２μＬ
百日咳菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）              ０．３２μＬ
百日咳菌蛍光標識プローブ（１０μＭ）                        ０．９μＬ
百日咳菌ＤＮＡ（２０コピーまたは１００コピー／μＬ）        １．０μＬ
蒸留水                                                      ４．８１μＬ
【０１３４】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１３５】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【０１３６】
プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表７のとおりである。表７に示すＴｍ値は、表５に示すＴｍ値と同様の方法で算出した。
【０１３７】
【表７】
2018014949.tif 000010
【０１３８】
上記のような反応溶液１０μＬに対して、第１実験例と同様に、ホットスタートを１０秒間行ってＰＣＲを行った。高温温度を９０℃とし、低温温度を６０℃とした。１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表８に示す。
【０１３９】
【表８】
2018014949.tif 000011
【０１４０】
３．３．２．  蛍光強度測定の結果
図６は、ＰＣＲの反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。図６に示すように、プライマーのＴｍ値が約８０℃であっても、核酸の増幅を確認することができた。
【０１４１】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１４２】
２，４…液体、６…反応溶液、８…容器、１０…第１ホットプレート、１２…第２ホットプレート、２０…第１ビーカー、２２…第２ビーカー、３０…アーム、３０ａ…一端、３０ｂ…他端、３２…固定部、１００…熱サイクル装置
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号６は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号７は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号８は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号９は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１０は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１６は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１７は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１８は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号１９は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの蛍光標識プローブの配列である。
【図１】
2018014949.tif 000012
【図２】
2018014949.tif 000013
【図３】
2018014949.tif 000014
【図４】
2018014949.tif 000015
【図５】
2018014949.tif 000016
【図６】
2018014949.tif 000017
【配列表】
2018014949000001.app