(57)【要約】【課題】本発明は、獲得免疫系リンパ球にＩ型インターフェロンを産生させる、該リンパ球の増殖を抑制する、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための組成物または医薬組成物を提供する。【解決手段】ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞にＩ型インターフェロンを産生させることに用いるための組成物、およびＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制剤が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物。
【請求項２】
獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態が、自己免疫疾患または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態の発症を予防的に処置するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＳＴＩＮＧリガンドが、サイクリックＧＭＰ−ＡＭＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞にＩ型インターフェロンを産生させることに用いるための組成物。
【請求項６】
ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化免疫細胞の制御技術、特に獲得免疫系リンパ球にＩ型インターフェロンを産生させる、該リンパ球の増殖を抑制する、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための組成物または医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な自己免疫疾患の研究とその治療法の開発が進められている。自己免疫疾患においては獲得免疫が自己抗原に対して活性化し、自己を攻撃しうる。従って、自己免疫疾患は、免疫抑制剤によって治療がなされている。
【０００３】
自然免疫の研究が進み、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌）が生体内に侵入するとパターン認識により病原体が認識され、自然免疫により排除されることが分かっている。これらのパターン認識に関わる因子としてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が発見され、細胞表面における病原体の認識機構が明かされた。細胞内でも病原体の構成成分に対するセンサーが発見された。例えば、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）は自然免疫系細胞の細胞内ＲＮＡのセンサーとして見出され、ＳＴＩＮＧは自然免疫系細胞の細胞内核酸センサーとして見出された。
【０００４】
ＳＴＩＮＧは、自然免疫系細胞の細胞内核酸認識に関与し、病原体の核酸が細胞内で処理されて生じる環状のジヌクレオチドを認識することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science, Vol. 339(6121), 786-791, 2013
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、活性化免疫細胞の制御技術、特に獲得免疫系リンパ球にＩ型インターフェロンを産生させる、該リンパ球の増殖を抑制する、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための組成物または医薬組成物を提供する。本発明は特に活性化免疫細胞の制御技術を提供する。
【０００７】
本発明者らは、自然免疫系を活性化するＳＴＩＮＧリガンドが、獲得免疫系リンパ球の増殖を抑制する作用を有すること、獲得免疫系リンパ球にＩ型インターフェロンを産生させる作用を有すること、およびこれらがＴＣＲシグナルによる増殖刺激存在下で顕著であることを発見してなされた発明である。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物。
（２）獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態が、自己免疫疾患または移植片対宿主病である、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態の発症を予防的に処置するための、上記（１）または（２）に記載の医薬組成物。
（４）ＳＴＩＮＧリガンドが、サイクリックＧＭＰ−ＡＭＰである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞にＩ型インターフェロンを産生させることに用いるための組成物。
（６）ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激下でナイーブＣＤ４細胞をｃＧＡＭＰによって処理した際の細胞増殖に与える影響、およびそれに対するＳＴＩＮＧの関与を示す図である。
【００１０】
【図２】図２は、ナイーブＣＤ４細胞に対してｃＧＡＭＰ、細胞死誘導剤であるエトポシドを反応させて細胞生存率を測定した結果を示す。
【００１１】
【図３】図３は、ｃＧＡＭＰ処理後のナイーブＣＤ４細胞における細胞周期制御因子の遺伝子発現の変化を示す図である。
【００１２】
【図４】図４は、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後の細胞内シグナルの変動に対するｃＧＡＭＰの影響を示す図である。
【００１３】
【図５】図５は、ｃＧＡＭＰ処理後のナイーブＣＤ４細胞における脂質代謝関連遺伝子の発現の変化を示す図である。
【００１４】
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後のナイーブＣＤ４細胞におけるＩ型インターフェロンの産生に対するｃＧＡＭＰの影響と、それに対するＴｂｋ１の関与を示す図である。
【００１５】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後のナイーブＣＤ４細胞における細胞増殖に対するｃＧＡＭＰの影響と、それに対するＴｂｋ１の関与を示す図である。
【００１６】
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後のナイーブＣＤ４細胞における細胞増殖に対するｃＧＡＭＰの影響と、それに対するＩＲＦ３およびＩＲＦ７の関与を示す図である。
【００１７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後のナイーブＣＤ４細胞におけるＩ型インターフェロンの産生に対するｃＧＡＭＰの影響と、それに対するＩＲＦ３およびＩＲＦ７の関与を示す図である。
【００１８】
【図８】図８は、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激後のナイーブＣＤ４細胞における脂質代謝関連遺伝子の発現に対するｃＧＡＭＰの影響と、それに対するＩＲＦ３およびＩＲＦ７の関与を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１９】
本明細書では、「対象」は、哺乳動物を意味し、特にヒトであり得る。
【００２０】
本明細書では、「処置」とは、治療（治療的処置）と予防（予防的処置）とを含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減を意味する。本明細書では、「予防」とは、疾患もしくは病態の発症の可能性を低下させる、または疾患もしくは病態の発症を遅らせることを意味する。
【００２１】
本明細書では、「疾患」とは、治療が有益な症状を意味する。本明細書では、疾患は、慢性および急性の疾患を含む。
【００２２】
本明細書では、「獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態」とは、獲得免疫系の異常または免疫系の不適合により起こる疾患または症状であって、特に獲得免疫が亢進したことで状態が悪化する疾患または症状を含む意味で用いられる。「獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態」は、獲得免疫が亢進した状態を伴う疾患または症状を含む意味でも用いられる。獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態としては、例えば、自己免疫疾患、組織移植後の免疫拒絶反応、造血幹細胞移植後または輸血後の免疫拒絶反応（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））、および異物移入時の免疫拒絶反応が挙げられる。
【００２３】
本明細書では、「自己免疫疾患」とは、自己に対する免疫反応が亢進して生じる疾患を意味する。自己免疫疾患としては、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、ループス、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、多発性筋肉炎、皮膚筋炎、自己免疫血球減少症、脈管炎症候群、全身紅斑性狼瘡などが挙げられる。
【００２４】
本明細書では、「治療上有効量」とは、疾患や状態を処置（予防または治療）するために有効な薬剤の量を意味する。治療上有効量の薬剤は、疾患または状態の症状の悪化速度を低下させること、前記症状の悪化を止めること、前記症状を改善すること、前記症状を治癒すること、または前記症状の発症または発展を抑制することが可能である。
【００２５】
本明細書では、「ＳＴＩＮＧ」とは、小胞体の膜タンパク質であり、細胞質内ＤＮＡセンサーとして知られる。ＳＴＩＮＧは、病原体由来の核酸または核酸誘導体を認識して、下流シグナルを活性化させる。また、ＳＴＩＮＧは、サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（２’３’−ｃＧＡＭＰまたは単にｃＧＡＭＰともいう）、サイクリックジグアノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰともいう）、サイクリックジアデノシン一リン酸（ｃ−ｄｉ−ＡＭＰともいう）、およびサイクリック［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（２’３’−ｃＧＡＭＰともいう）などのＳＴＩＮＧに結合するＳＴＩＮＧリガンドを認識し、活性化される。ＳＴＩＮＧが活性化されると、ＴＢＫ１の活性化、ＩＲＦ３の活性化、およびＩＲＦ７の活性化が生じ、シグナルが核に伝達されて細胞の遺伝子発現が変化する。
【００２６】
本明細書では、「獲得免疫」とは、抗体による体液性免疫とリンパ球などの細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞）による細胞性免疫によって担われる免疫である。本明細書では、獲得免疫系のリンパ球とは、Ｂ細胞および抗原特異性を有するＴ細胞を意味する。本明細書では、「抗原特異性」とは、特定の抗原に対して他の抗原に対するよりも強く反応することを意味する。抗原特異性は、Ｔ細胞ではＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により担われ、Ｂ細胞ではＢ細胞受容体（ＢＣＲ）により担われる。獲得免疫は、抗原特異的な免疫であり、免疫応答には時間がかかるが、記憶細胞によって保持され、同じ異物に再び遭遇したときには即座に異物を排除することができる、という意味で異物に適応して異物排除能を獲得するタイプの免疫である。
本明細書では、「自然免疫」とは、異物に対する最初の生体反応として生じる免疫であり、マクロファージ、顆粒球またはＮＫ細胞などによる貪食作用により担われている。
【００２７】
本明細書では、「Ｉ型インターフェロン」とは、インターフェロンのうち、インターフェロンα（ＩＮＦ−α）およびインターフェロンβ（ＩＮＦ−β）などの抗ウイルス性のサイトカインを意味する。インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）は、ＩＩ型インターフェロンに分類され、Ｉ型インターフェロンとは区別される。Ｉ型インターフェロンは、抗ウイルス作用で知られ、ウイルス複製の抑制、非感染細胞の保護および感染細胞に対するＮＫ細胞による除去の促進により、体内からウイルスを排除する。
【００２８】
本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系のリンパ球の増殖を抑制することができる。従って、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制剤が提供される。本発明の増殖抑制剤は、強い抑制作用を有し、細胞に増殖刺激（特にＴ細胞受容体刺激若しくはＴ細胞刺激、またはＢ細胞受容体刺激若しくはＢ細胞刺激）が加わったときにも細胞増殖抑制作用を発揮し得る。従って、本発明の獲得免疫系リンパ球の増殖抑制剤は、細胞増殖刺激存在下で用いられ得る。
【００２９】
Ｔ細胞の増殖刺激としては、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体などのアゴニストによるＴ細胞補助受容体刺激によるＴ細胞刺激、イオノマイシンによるＴ細胞刺激、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）および／またはホルボールエステル、例えば、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）や１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセテート（ＴＰＡ）によるＴ細胞刺激が挙げられる。ＴＣＲ刺激は、抗原を提示する腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣまたはＨＬＡ）により行い得る。Ｂ細胞の増殖刺激としては、例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激、ＣＤ２１、ＣＤ１９、ＣＤ８１などのＢ細胞補助受容体の刺激によるＢ細胞刺激、ＣＤ４０刺激、ＢＡＦＦ受容体刺激等が挙げられる。ＢＣＲは、抗原や抗イムノグロブリン抗体等により刺激することができる。ＣＤ４０は、ＣＤ４０リガンドや抗ＣＤ４０抗体により刺激することができる。ＢＡＦＦ受容体は、ＢＡＦＦにより刺激することができる。
【００３０】
本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドは、Ｔ細胞受容体シグナルにおけるｍＴＯＲＣ１に作用し、脂質代謝および／または細胞周期制御因子の発現を抑制し、これにより細胞増殖を抑制する。従って、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞受容体シグナル存在下において活性化される脂質合成関連因子（例えば、Ｓｃｄ１、Ａｃｓｌ６、Ｅｌｏｖｌ６、Ｌｓｓ、Ｓｑｌｅ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｓｃ４ｍｏｌ、およびＣｙｐ５１）および／または細胞周期制御因子（例えば、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ３、Ｃｄｋ１、およびＣｄｋ４）の発現をそれぞれ、抑制することに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。また、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞受容体シグナル存在下において抑制される脂質代謝および／または細胞周期制御因子（例えば、ｐ２１）の発現をそれぞれ、活性化することに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。ここでは、Ｔ細胞受容体シグナルには、ＴＣＲを刺激することにより活性化するＴＣＲシグナルに加えて、ＴＣＲの補助因子を刺激することにより活性化するＴＣＲの下流のシグナル、Ｔ細胞を刺激することにより活性化するＴＣＲの下流のシグナルが含まれる。本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｔ細胞の細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３１】
また、Ｔ細胞受容体シグナルは、Ｂ細胞におけるＢ細胞受容体シグナルと対応する。Ｂ細胞とＴ細胞は、活性化シグナル経路が類似していることが知られている。これらのシグナルはいずれも、ＴＣＲ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）またはＢＣＲ（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に会合するＩＴＡＭアダプター（ＣＤ３、ＣＤ７９）がＳｒｃキナーゼによってリン酸化されて活性化が始まる。ＩＴＡＭアダプターのリン酸化により、リン酸化アダプターに結合するキナーゼ（ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ）が活性化されて、下流の更なるアダプター（ＬＡＴ／ＳＬＰ７６、ＢＬＮＫ）を活性化させ、ＮＦＡＴ／Ｃａ2+経路、ＮＦ−κＢ経路、およびＲａｓ−ＭＡＰＫ経路などを活性化させる。また、Ｔ細胞と同様に、Ｂ細胞の活性化と機能分化にｍＴＯＲＣ１が重要な役割を果たすことが報告されている。従って、本発明によれば、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｂ細胞受容体シグナル存在下において活性化される脂質合成関連因子（例えば、Ｓｃｄ１、Ａｃｓｌ６、Ｅｌｏｖｌ６、Ｌｓｓ、Ｓｑｌｅ、Ｈｍｇｃｓ１、Ｓｃ４ｍｏｌ、およびＣｙｐ５１）および／または細胞周期制御因子（例えば、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ３、Ｃｄｋ１、およびＣｄｋ４）の発現をそれぞれ、抑制することに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。また、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｂ細胞受容体シグナル存在下において抑制される脂質代謝および／または細胞周期制御因子（例えば、ｐ２１）の発現をそれぞれ、活性化することに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。ここでは、Ｂ細胞受容体シグナルには、ＢＣＲを刺激することにより活性化するＢＣＲシグナルに加えて、ＢＣＲの補助因子を刺激することにより活性化するＢＣＲの下流のシグナル、Ｂ細胞を刺激することにより活性化するＢＣＲの下流のシグナルが含まれる。本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、Ｂ細胞の細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３２】
また、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系リンパ球においてＩ型インターフェロンの産生を促進する。従って、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含み、獲得免疫系リンパ球にＩ型インターフェロンの産生を促進させることに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。本発明によれば、ｃＧＡＭＰは、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激下で用いることができる。
【００３３】
本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制を介して、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することができる。従って、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドは、増殖刺激存在下においても、獲得免疫系リンパ球の増殖抑制作用を発揮する。従って、本発明によれば、ＳＴＩＮＧリガンドを含む、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物は、細胞増殖刺激の前、最中、または後で用いることができる。この意味では、本発明の上記医薬組成物は、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態が発症する前に（例えば、予防的に）投与することができる。本発明の上記医薬組成物は、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態が発達しているときに（例えば、予防的または治療的に）投与することができる。さらには本発明の上記医薬組成物は、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を治療的に処置することができる。
【００３５】
本発明の上記医薬組成物の予防的投与に適した疾患または状態としては、例えば、組織移植後の免疫拒絶反応、造血幹細胞移植後の免疫拒絶反応（例えば、移植片宿主病（ＧＶＨＤ））、および異物移入時の免疫拒絶反応が挙げられる。これらの疾患または状態は、人為的介入後に生じる現象であるから、疾患または状態の発生を予測することができ、ＳＴＩＮＧリガンドを、人為的介入の前、途中または後で予防的に投与することに適しているといえる。その他、免疫疾患（自己免疫疾患を含む）に対しても、本発明の上記医薬組成物は、有用であり得る。
【００３６】
本発明によれば、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態をその必要のある対象において処置する方法であって、前記対象に治療上有効量のＳＴＩＮＧリガンドを投与することを含む、方法が提供される。本発明によればまた、その必要のある対象においてＴ細胞にＩ型インターフェロンを産生させる方法であって、前記対象に有効量のＳＴＩＮＧリガンドを投与することを含む、方法が提供される。本発明によればまた、その必要のある対象において獲得免疫系リンパ球の増殖を抑制する方法であって、前記対象に有効量のＳＴＩＮＧリガンドを投与することを含む、方法が提供される。
【００３７】
本発明によれば、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるための医薬組成物の製造におけるＳＴＩＮＧリガンドの使用が提供される。本発明によればまた、Ｔ細胞にＩ型インターフェロンを産生させることに用いるための医薬組成物の製造におけるＳＴＩＮＧリガンドの使用が提供される。本発明によればさらに、獲得免疫系リンパ球の増殖を抑制することに用いるための医薬組成物の製造におけるＳＴＩＮＧリガンドの使用が提供される。本発明によればまた、獲得免疫の亢進を伴う疾患または状態を処置することに用いるためのＳＴＩＮＧリガンドの使用が提供される。
【００３８】
以下、実施例に従って本発明を説明する。以下で説明される実施例は、本発明の実施形態の１つとなりうる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：獲得免疫とＳＴＩＮＧリガンド
本実施例では、獲得免疫系のリンパ球のＳＴＩＮＧリガンドに対する反応を調べた。
【００４０】
（１）細胞増殖抑制効果
野生型マウスおよびＳＴＩＮＧ欠損マウスを用いた。獲得免疫系リンパ球としては、Ｔ細胞（特にナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞）を用いた。ナイーブ型ＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞は、マウスの脾臓からＣＤ４+ＣＤ２５-ＣＤ６２Ｌ+画分としてFACSAriaを用いてソーティングして得た。ＳＴＩＮＧリガンドとしては、サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（以下、単に「ｃＧＡＭＰ」とよぶ）を用いた。ｃＧＡＭＰ（Invitrogen社製、Cat. No.: tlrl-nacga23-1）は、使用濃度３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬまたは３０μｇ／ｍＬで用いた。得られたＴ細胞をｃＧＡＭＰ存在下若しくは非存在下で抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。対照としては、エトポシド（Calbiochem社製、Cat. No.: 341205-25MGCN）を１０μMの濃度で用いた。４８時間処理し、その後、細胞増殖を光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）で測定した。結果は図１に示される通りであった。
【００４１】
図１に示されるように、野生型マウス（ＳＴＩＮＧ＋／＋）においてｃＧＡＭＰ処理群ではナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞の数が濃度依存的に減少した。ＳＴＩＮＧ欠損マウス（ＳＴＩＮＧ−／−）では、ナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞の数に対するｃＧＡＭＰの影響は限定的であった。このことから、ＳＴＩＮＧリガンドであるｃＧＡＭＰは、獲得免疫系リンパ球においてＳＴＩＮＧを介して細胞増殖抑制効果を発揮することが明らかとなった。
また、アポトーシス誘導剤であるエトポシド処理群では、ＳＴＩＮＧの遺伝子型によらず細胞数が減少したが、ｃＧＡＭＰによる処理は、エトポシドと同等程度であった。
【００４２】
（２）アポトーシス誘導作用
上記（１）の通りナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞を１０μｇ／ｍＬ若しくは３０μｇ／ｍＬのｃＧＡＭＰ、１０μＭのエトポシドまたは１０μｇ／ｍＬのＩＬ−７（PEPROTECH社製、Cat. No.: 217-17）で１５時間刺激した。その後、細胞を回収し、細胞生存率を測定した。結果は、図２Ａに示される通りであった。
【００４３】
図２に示されるように、エトポシドではアポトーシスにより細胞が大量に死滅した一方で、ｃＧＡＭＰでは、多少細胞生存率が濃度依存的に減少したものの、顕著なアポトーシスの誘導作用は認められなかった。このことから、ｃＧＡＭＰのＴ細胞に対する作用は、細胞死の誘導よりも、細胞増殖の抑制にあることが示唆された。
【００４４】
（３）遺伝子発現の変動
上記（１）の通りナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞をｃＧＡＭＰ存在下または非存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で２４時間刺激した。その後、常法に従って定量的ＰＣＲにより細胞周期関連因子の遺伝子発現を確認した。結果は、図３に示される通りであった。
【００４５】
図３に示されるように、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＤ３、Ｃｄｋ１およびＣｄｋ４は、ｃＧＡＭＰにより発現が抑制された。一方で、ｐ２１は、ｃＧＡＭＰにより発現が増強された。このことから、ｃＧＡＭＰは、Ｔ細胞刺激下において、細胞周期を正に制御する因子の発現を抑制し、負に制御する因子の発現を増強させることが明らかとなった。このことから、Ｔ細胞におけるＳＴＩＮＧの役割は、細胞周期を負に制御し、細胞増殖を阻害することであることが示唆された。
【００４６】
（４）ｍＴＯＲ複合体１シグナルとの関係
細胞増殖関連遺伝子の発現に関わるシグナル分子としてｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）のシグナル伝達の活性化レベルを分析した。具体的には、上記（１）の通りナイーブＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞をｃＧＡＭＰ存在下または非存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で２４時間刺激し、その後、ウェスタンブロット法により、リン酸化形態特異的抗体を用いて表示されたそれぞれの因子のリン酸化レベルを評価した。１次抗体としては、下記に記載の抗体を用いた。下記１次抗体はCell Signaling Technology社製であり、括弧内にカタログ番号が示されている。
Anti-phospho-S6K (#9205)
Anti-phospho-4E-BP1 (#9459)
Anti-phospho-Akt (#9271)
Anti-phospho-IRF3 (#4947) 
Anti-phospho-STAT5 (#9351)
Anti-phospho-Jak3 (#5031)
Anti-phospho-STING (#13647)
２次抗体としては、Thermo Fisher SCIENTIFIC社のGoat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPを用いた。製造者マニュアルに従ってリン酸化タンパク質を検出した。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、Ｔ細胞受容体刺激によりリン酸化形態が誘導されるシグナル分子（Ｓ６Ｋおよび４Ｅ−ＢＰ１）のレベルがｃＧＡＭＰにより減少した。
【００４７】
また、ｍＴＯＲＣ１の活性化により誘導される脂質合成関連遺伝子の発現レベルを定量的ＰＣＲにより解析した。結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、脂質合成関連遺伝子の発現レベルがｃＧＡＭＰにより減少した。
【００４８】
これらのことから、ＳＴＩＮＧは、ｍＴＯＲＣ１の活性化を抑制することにより、Ｔ細胞の細胞周期を負に制御し、細胞増殖を阻害することが明らかとなった。
【００４９】
実施例２：獲得免疫系リンパ球におけるＩ型インターフェロン産生
Ｔ細胞やＢ細胞においては、ｍＴＯＲＣ１を活性化してもＩ型インターフェロンが産生されることはない。本実施例では、ＳＴＩＮＧが、Ｉ型インターフェロン産生を増強することを示す。
【００５０】
１×１０5細胞のナイーブ型ＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍＬ）を固定したプレート上で４８時間刺激した。細胞上清を回収し、抗ＩＮＦ−α抗体（メーカー名商品番号等）を用いたＥＬＩＳＡにより、Ｉ型インターフェロンであるＩＮＦ−αの産生を確認した。自然免疫系細胞では、Ｉ型インターフェロンは、ＴＢＫ１とその下流のＩＲＦ３およびＩＲＦ７の活性化により産生される。従って、ＴＢＫ１ヘテロマウス（Ｔｂｋ１＋／−）およびＴＢＫ１欠損マウス（Ｔｂｋ１−／−）由来のＴ細胞を用いた（J Exp Med, Vol. 199, 1641-1650, 2004参照）。結果は、図６Ａに示される通りであった。図６Ａに示されるように、ｃＧＡＭＰにより意外にもＴ細胞においてＩＦＮ−α産生の顕著な増強が確認された。また、ＩＦＮ−α産生の増強効果は、ＴＢＫ１ノックアウトにより低下した。従って、Ｔ細胞におけるｃＧＡＭＰによるＩＦＮ−α産生増強には、ＴＢＫ１の活性化が関与していることが明らかとなった。
【００５１】
また、ｃＧＡＭＰによる細胞増殖抑制機能へのＴＢＫ１の関与をＴＢＫ１ヘテロマウスおよびＴＢＫ１ノックアウトマウスを用いて調べた。結果は図６Ｂに示される通りであった。図６Ｂに示されるように、細胞増殖に対してはＴｂｋ１のノックアウトは影響がほとんど認められなかった。
【００５２】
これらの結果から、ＴＢＫ１は、ｃＧＡＭＰによるＩＮＦ−αの産生増強作用には、部分的に関与するが、ｃＧＡＭＰによる細胞増殖抑制作用には関与しないことが明らかとなった。
【００５３】
次に、ＳＴＩＮＧを介した細胞増殖抑制作用およびＩＮＦ−αの産生増強作用におけるＩＲＦ３およびＩＲＦ７の関与を調べた。具体的には、ＩＲＦ３欠損マウスまたはＩＲＦ３／ＩＲＦ７二重欠損マウス（Immunity, Vol. 13, 539-548, 2000、Nature, Vol. 434, 772-777, 2005参照）由来のＴ細胞をｃＧＡＭＰ存在下または非存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により刺激した。４８時間後、上記の通りに細胞の増殖とＩＮＦ−αの産生を調べた。結果は、図７Ａおよび７Ｂに示される通りであった。
【００５４】
図７Ａに示されるように、ｃＧＡＭＰによる細胞増殖抑制作用は、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７二重欠損マウスにおいて大幅に減弱した。また、図７Ｂに示されるように、ｃＧＡＭＰによるＩＦＮ−α産生増強作用は、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７二重欠損マウスにおいてほとんど完全に消失した。また、図７Ａに示されるように、ＩＲＦ３欠損マウスでは、ｃＧＡＭＰによる細胞増殖抑制作用は、部分的に減弱した。図７Ｂに示されるように、ｃＧＡＭＰによるＩＦＮ−α産生増強作用は、ＩＲＦ３欠損マウスではほとんど完全に消失した。
【００５５】
これらの結果から、ＳＴＩＮＧによる細胞の増殖抑制作用には、ＩＦＲ３とＩＦＲ７を介したｍＴＯＲＣ１シグナルの活性化抑制が関与していることが明らかとなった。
【００５６】
ＳＴＩＮＧリガンドは、自然免疫系だけで無く獲得免疫系リンパ球において、細胞刺激による細胞増殖を抑制し、Ｔ細胞ではＩ型インターフェロン産生の増強作用を示した。本実施例では、Ｔ細胞にＴ細胞受容体シグナルと類似した刺激である、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を加えた際の細胞増殖に対するＳＴＩＮＧリガンドの効果を確認した。そして、Ｔ細胞では、ｍＴＯＲＣ１およびその下流のＩＲＦ３およびＩＲＦ７を介してＳＴＩＮＧリガンドはその生理作用を発揮した。Ｂ細胞においても同様のｍＴＯＲＣ１シグナル伝達経路が存在し、Ｂ細胞受容体刺激下で活性化されるので、ＳＴＩＮＧリガンドはＢ細胞でも同様の機能を有することが示唆される。
【００５７】
かくして、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系リンパ球の細胞増殖抑制効果やＩ型インターフェロン産生増強効果を奏することとなる。従って、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系の免疫抑制剤として有用であり得、獲得免疫系の過剰亢進による疾患や状態の処置に有用であると考えられる。また、ＳＴＩＮＧリガンドは、獲得免疫系リンパ球の細胞増殖抑制効果が高いことから、疾患発症後のみならず、発症前または疾患進行中の状態の予防的処置において特に有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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