(57)【要約】【課題】本発明は、脊椎固定術に用いる組成物および方法を提供することを課題とする。【解決手段】脊椎固定術における骨癒合を促進する方法であって、所望の脊椎固定部位に、生体適合性マトリックスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む溶液を含む組成物を投与することを含み、該溶液が該生体適合性マトリックスに組み込まれ、該生体適合性マトリックスが骨スキャフォールディング材料を含み、該骨スキャフォールディング材料が多孔性リン酸カルシウムまたは同種移植片を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎固定術における骨癒合を促進する方法であって、所望の脊椎固定部位に、生体適合性マトリックスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む溶液を含む組成物を投与することを含み、該溶液が該生体適合性マトリックスに組み込まれ、該生体適合性マトリックスが骨スキャフォールディング材料を含み、該骨スキャフォールディング材料が多孔性リン酸カルシウムまたは同種移植片を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで、２０１０年１２月１３日に提出した米国特許仮出願第６１／４４２，６４９号の利益を主張し、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、脊椎固定術に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊椎固定術は、脊髄奇形を矯正するため、および脊椎骨折、脊椎不安定、または慢性背痛の治療に使用される。米国整形外科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ）によれば、３２５，０００を超える脊椎固定術が２００３年に行われ、そのうちの約１６２，０００が腰椎であった（Spinal Fusion.
Your Orthopaedic Connection September ２００７年９月（２００９年１月２０日引用）；http://orthoinfo.aaos. org/topic.cfm?topic=A00348より参照可能）。脊椎固定術の１つのタイプは、椎体間固定であり、すべてまたは一部の椎間板を除去し、支持スペーサーを挿入して支持して、椎体間の骨の成長を促す。さらに、骨の成長はスペーサー内に埋植された移植材料で高められる。自家移植の骨移植片は、通常腸骨稜から取られ、脊椎固定術を促すのに一般的に使用されている。入手可能性、ドナー部位の病的状態、痛み、感染症、神経損傷、および出血を含む、その使用に関連する制限があるが、自家移植片が、その骨伝導性および骨誘導性のため、「最も信頼できる確実な基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」と考えられている（Fowler, B.L., B.E. Dall, and D.E. Rowe, Complications associated with harvesting autogeneousiliacbone graft. American Journal of
Orthopedics, 1995. 24: p. 895-903; Goulet, J., et al., Autogenousiliac crest bone graft: complications and functional assessment. Clinical Orthopedics and Related Research, 1997.339: p. 76-81 ; Vaccaro, A, The role of the osteoconductivescaffold in synthetic bone graft. Orthopedics, 2002. 25(5 Suppl): p.s571-s578）。同種移植片は、自家移植片に代わるものであり、ドナー部位の病的状態に関連する合併症を除外するが、同種移植片の加工および滅菌は、自家移植片と比較して、生物学的活性の減少をもたらしうる（Khan, S.F., et al., The biology of bone grafting. Journal of
the American Academy of Orthopaedic Surgeons, 2005. 13: p.77-86）。
【０００４】
自己および同種骨移植片に関連する困難を考えると、代替的な造骨再生系を提供することが望ましいであろう。
【０００５】
【非特許文献１】Sandhu, H.S., et al., Distractive Properties of a Threaded Interbody Fusion Device: An In Vivo Model. Spine, 1996.21(10): p.1201-1210.
【非特許文献２】Sandhu, H.S., et al., Animal models of spinal instability and spinal fusion, in Animal Models in OrthopaedicResearch, Y.H. An and R.J. Friedman, Editors. 1999, CRC Press: Boca Raton.
【非特許文献３】Toth, J.M., et al., Direct current electrical stimulation increases the fusion rate of spinal fusion cages. Spine, 2000. 25(20): p.2580-2587.
【非特許文献４】Wilke, H., A Kettler, and L. Claes, Are sheep spines a validbiomechanical model for huma spines? Spine, 1997.22(20): p.2365-2374.
【非特許文献５】Wilke, H.-J., et al., Anatomy ofthe sheep spine and its comparison to the huma spine.TheAnatomical Record, 1997.247(4): p.542-555.
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、脊椎固定術に用いる組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、脊椎骨の融合を促進する。本組成物および方法は、例えば、固定部位で骨癒合を促すことによって、脊椎固定術における治癒反応を促しうる。
【０００７】
本発明の１つの態様は、脊椎固定術における骨癒合を促進する方法であって、所望の脊椎固定部位に、生体適合性マトリックスおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む溶液を含む組成物を投与することを含み、該溶液が該生体適合性マトリックスに組み込まれ、該生体適合性マトリックスが骨スキャフォールディング材料を含み、該骨スキャフォールディング材料が多孔性リン酸カルシウムまたは同種移植片を含む方法である。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料はリン酸カルシウムを含む。幾つかの実施形態では、リン酸カルシウムはβ‐リン酸三カルシウムを含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は同種移植片を含む。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、ＰＤＧＦ‐ＣＣ、ＰＤＧＦ‐ＤＤ、またはその混合物もしくは誘導体を含む。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ‐ＢＢを含む。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ‐ＢＢからなる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢは、少なくとも６５％の完全なＰＤＧＦ‐ＢＢホモ二量体を含む。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ‐ＢＢは、組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ‐ＢＢである。幾つかの実施形態では、溶液は、バッファー中のＰＤＧＦを含む。幾つかの実施形態では、溶液は、バッファー中のＰＤＧＦからなる。幾つかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約５０ミクロン〜約５０００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約５０ミクロン〜約５０００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１００ミクロン〜約５０００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１００ミクロン〜約５０００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１００ミクロン〜約３００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１００ミクロン〜約３００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０００ミクロン〜約２０００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０００ミクロン〜約２０００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約２５０ミクロン〜約１���００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約２５０ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０００ミクロン〜約３０００ミクロンの範囲の大きさの粒子を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０００ミクロン〜約３０００ミクロンの範囲の大きさの粒子をからなる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約２５％を超える多孔率を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約４０％を超える多孔率を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約５０％を超える多孔率を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約８０％を超える多孔率を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディン
グ材料は、約９０％を超える多孔率を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料はマクロ多孔性を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、マトリックスへの細胞遊走を促す多孔性を有する。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は相互に連結した細孔を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも８０％の骨スキャフォールディング材料がインプラントした１年以内に再吸収されるように、骨スキャフォールディング材料が再吸収可能である。幾つかの実施形態では、溶液は、骨スキャフォールディング材料に吸収または吸着される。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、骨スキャフォールディングの自重の少なくとも約２５％に等しい溶液の量を吸収することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、骨スキャフォールディングの自重の少なくとも約５０％に等しい溶液の量を吸収することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、骨スキャフォールディングの自重の少なくとも約１００％に等しい溶液の量を吸収することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、骨スキャフォールディングの自重の少なくとも約２００％に等しい溶液の量を吸収することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、骨スキャフォールディングの自重の少なくとも約３００％に等しい溶液の量を吸収することができる。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、生体適合性結合剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤はコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料およびコラーゲンは、約８０：２０の比率で存在する。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスはリン酸カルシウムからなる。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスはリン酸カルシウムおよびコラーゲンからなる。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは同種移植片からなる。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは同種移植片およびコラーゲンからなる。幾つかの実施形態では、方法は、脊椎固定術を患者に行うこと；組成物を所望の脊椎固定部位に適用すること；および、部位で骨癒合が起こることを可能にすることを含む。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は椎体間固定術である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は腰椎固定術である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は頚椎固定である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は骨癒合を速めることを含む。
【０００８】
別の態様では、特に断りのない限り、または特定の文脈から明白であるように、本明細書において記載されている方法に関連して、本明細書において記載されている組成物の使用が、本明細書において提供される。また、本明細書において記載されている組成物は、本明細書において記載されている方法に用いる薬剤の調製にも使用されうる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、生体適合性マトリックス（または１つ以上の生体適合性マトリックスの構成要素）を第一のパッケージに、ＰＤＧＦを含む溶液を第二のパッケージに含む、脊椎固定術に用いるキットを提供する。さらに、キットは脊椎固定術を行う方法に用いる取扱説明書を提供しうる。幾つかの実施形態では、溶液は、所定の濃度のＰＤＧＦを含む。ＰＤＧＦの濃度は、行われる脊椎固定術の要件に応じてあらかじめ定めることができる。そのうえ、幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、キット中に所定の量で存在することができる。幾つかの実施形態では、キット中の生体適合性マトリックスは、骨スキャフォールディング材料、または骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、β‐ＴＣＰなどのリン酸カルシウムを含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は同種移植片を含む。幾つかの実施形態では、結合剤はコラーゲンを含む。キットによって提供される生体適合性マトリックスの量は、行われる脊椎固定術の要件に関連しうる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液を含有する第二のパッケージは、バイアルを含む。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液を含有する第二のパッケージは、注射器を含む。注射器は、脊椎固定術における骨癒合の部位などの手術部位に適用する生体適合性マトリックス中または上にＰＤＧＦ溶液を配置することを促すことができる。幾つかの実施形
態では、ＰＤＧＦは生体適合性マトリックスに組み込まれると、結果として生じる組成物は、所望の脊椎固定部位への送達用に注射器および／またはカニューレにセットされる。代替的に、組成物は、外科装置、スパチュラ、スプーン、ナイフ、または均等な装置などの別の適用手段を用いて、所望の部位に適用しうる。
【００１０】
くわえて、本発明は、脊椎固定術に用いる組成物を製造する方法および脊椎固定術を行う方法を提供する。幾つかの実施形態では、組成物を製造する方法が、ＰＤＧＦを含有する溶液を提供すること、生体適合性マトリックスを提供すること、およびＰＤＧＦ溶液を生体適合性マトリックスに配置または組み込むことを含む。
【００１１】
別の実施形態では、脊椎固定術を行う方法が、生体適合性マトリックスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供すること、および組成物を所望の脊椎固定部位に適用することを含む。幾つかの実施形態では、脊椎固定術を行う方法が、組成物を複数の脊椎骨における所望の骨癒合の少なくとも１つの部位に適用することを含む。幾つかの実施形態では、組成物を所望の骨癒合の部位に適用することが、組成物を所望の骨癒合の部位に注入することを含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、脊椎固定術を行う方法が、所望の脊椎固定部位に外科的にアクセスすること、生体適合性マトリックスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を組み込むこと、組成物を所望の骨癒合の部位に適用すること、軟組織を組成物の上から縫合すること、ならびに後の骨の形成に向けて、細胞遊走、内方成長、および組成物への浸潤を可能にすることを含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、脊椎固定術が椎体間固定術を含む。幾つかの実施形態では、脊椎固定術が後側方固定術を含む。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は腰椎固定術である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は頚椎固定である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は胸椎固定術である。幾つかの実施形態では、脊椎固定術は仙椎固定術である。
【００１４】
すなわち、本発明の目的は、生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦを含む組成物を提供することであり、その組成物は脊椎固定術における骨の癒合を促すのに有用である。
【００１５】
本発明の別の目的は、生体適合性マトリックス中にＰＤＧＦを含む組成物を使用する脊椎固定術を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、脊椎固定術における骨癒合に関連する治癒を速めることである。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下の記載においてより詳細に説明する。開示されている実施形態および請求項の以下の詳細な記載を検討した後、本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、処置によってグループ分けした各検査試料からの代表的なマイクロＣＴ画像を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、処置によってグループ分けした各検査試料からの代表的なマイクロＣＴ画像を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、新たに調製したＡＢＧ、正常な骨、新たに調製したＡＩＢＧならびにＡＢＧ‐、ＡＩＢＧ‐および自家移植片‐処置群の検査試料からの代表的な示差密度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）分析マイクロＣＴ画像を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、新たに調製したＡＢＧ、正常な骨、新たに調製したＡＩＢＧならびにＡＢＧ‐、ＡＩＢＧ‐および自家移植片‐処置群の検査試料からの代表的な示差密度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）分析マイクロＣＴ画像を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、各治療群からの代表的な組織学的所見の画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、各治療群からの代表的な組織学的所見の画像を示す。
【図４】図４は、ＡＢＧおよびＡＩＢＧ処置群からの代表的な組織学的所見の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
限定されないが、特許、特許出願および科学参考文献を含めた、本明細書において引用した参考文献のすべてが、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本発明は、生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦの溶液を含む組成物、および脊椎固定術における骨の固定を促進する方法を提供する。脊椎固定術は、脊椎固定術（ｓｐｏｎｄｙｌｏｄｅｓｉｓ）または脊椎癒着（ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｙｎｄｅｓｉｓ）としても知られ、２つ以上の椎骨をつなぐのに使用される手術手技である。脊椎固定術の種類としては、椎体間固定術、後側方固定術、ならびに頚椎椎間板切除（ｄｉｓｋｅｃｔｏｍｙ）および固定術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
体間固定術は、骨移植片（例えば、本発明の組成物）を脊椎骨間の通常椎間板によって占められる領域に埋植する。脊椎固定術に備えて、椎間板は完全に除去されうる。装置が脊椎骨の間に埋植され、脊椎の整合および椎間板の高さを維持しうる。椎間装置は、例えば、スペーサーでありうる。椎間装置は、例えば、プラスチック製またはチタン製でありうる。次いで、固定が脊椎端板間で起こる。椎体間固定術の種類としては、前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）、後方腰椎椎体間固定術（ＰＬＩＦ）、および経椎間孔腰椎椎体固定術（ＴＬＩＦ）が挙げられる。幾つかの実施形態では、固定は、金属のスクリュー（椎弓根スクリューはチタン製であることが多い）、ロッドもしくはプレート、スペーサー、またはケージを埋植することを意味する定着（ｆｉｘａｔｉｏｎ）と呼ばれる過程によって補われ、椎骨を安定化して骨固定を促す。固定過程の間、外部ブレイス（ｅｘｔｅｒｎａｌ
ｂｒａｃｉｎｇ）（矯正器具）が使用されうる。
【００２２】
後側方固定術は、骨移植片を脊椎の後部の横突起の間に埋植する。次いで、これらの椎骨は、椎骨の各側面の金属ロッドに付いている各椎骨の椎弓根を通してスクリューおよび／またはワイヤーで適切な位置に固定されうる。
【００２３】
定義
本明細書において使用する場合、脊椎固定を「促進する（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）」または「促す（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）」は、脊椎固定術の臨床的進展に望ましく影響を及ぼすように設計された臨床的介入を指す。臨床的介入の望ましい効果としては、例えば、固定の部位における骨密度の程度および／または骨形成の増加の割合（例えば、骨密度の増加の割合）の増加、固定の部位における骨癒合または骨架橋の度合いおよび／または骨癒合または骨架橋の増加の割合の増加、骨固定部位における骨組成および／または構造の向上（例えば、骨固定部位における、よりそっくりな自然骨への類似）の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するのに少なくとも有効な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与で提供することができる。
【００２５】
本明細書において「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメ
ータ自体を対象とする実施形態も包含（および記載）する。
【００２６】
本明細書および添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」といった単数形は、文章に明確に指示がない限り、複数対象も含む。例えば、「ＰＤＧＦホモ二量体」に言及する記述は、１つまたは複数のＰＤＧＦホモ二量体への言及であり、当業者に公知のその同等物などを包含する。
【００２７】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含し（ｉｎｃｌｕｄｅ）うることを理解すべきである。列挙された要素「から本質的になる」方法または組成物は、特定の工程または材料、ならびにそれら方法および組成物の基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないもののみを包含することを理解すべきである。
【００２８】
「骨スキャフォールディング材料」および「骨代替物質」は、本明細書において互換可能に使用される。
ＰＤＧＦ溶液
【００２９】
１つの態様では、本発明によって提供される脊椎固定術用の組成物は、ＰＤＧＦを含む溶液を生体適合性マトリックスに含み、ここでその溶液は、生体適合性マトリックスに配置または組み込まれる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。ＰＤＧＦは、溶液中に各範囲の上限値および下限値を含む、これらの定まった範囲内の任意の濃度で存在しうる。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、溶液中に次の濃度：約０．０５ｍｇ／ｍＬ；約０．１ｍｇ／ｍＬ；約０．１５ｍｇ／ｍＬ；約０．２ｍｇ／ｍＬ；約０．２５ｍｇ／ｍＬ；約０．３ｍｇ／ｍＬ；約０．３５ｍｇ／ｍＬ；約０．４ｍｇ／ｍＬ；約０．４５ｍｇ／ｍＬ；約０．５ｍｇ／ｍＬ；約０．５５ｍｇ／ｍＬ；約０．６ｍｇ／ｍＬ；約０．６５ｍｇ／ｍＬ；約０．７ｍｇ／ｍＬ；約０．７５ｍｇ／ｍＬ；約０．８ｍｇ／ｍＬ；約０．８５ｍｇ／ｍＬ；約０．９ｍｇ／ｍＬ；約０．９５ｍｇ／ｍＬ；または約１．０ｍｇ／ｍＬのいずれか１つで存在する。これらの濃度は、単に特定の実施形態の例であり、ＰＤＧＦの濃度は、各範囲の上限値および下限値を含む、上述の濃度のいずれの範囲内でありうることを理解すべきである。
【００３０】
さまざまな量のＰＤＧＦが、本発明の組成物中に使用されうる。使用されるＰＤＧＦの量としては、幾つかの実施形態では、次の範囲：約１ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、または約２５０μｇ〜約５ｍｇが挙げられる。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態におけるＰＤＧＦまたは他の成長因子の濃度は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２２１，６２５号、同第５，７４７，２７３号、および同第５，２９０，７０８号に記載の酵素結合免疫吸着法、またはＰＤＧＦ濃度を決定するのに当該技術分野において公知である他のアッセイによって決定することができる。本明細書において与えられる場合、ＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦ二量体の分子量（ＭＷ）（例えばＰＤＧＦ‐ＢＢ；ＭＷ約２５ｋＤａ）に基づいて決定される。
【００３２】
ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦホモ二量体および／またはヘテロ二量体、例えば、ＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、ＰＤＧＦ‐ＣＣ、ＰＤＧＦ‐ＤＤ、ならびにその混合物および誘導体を含みうる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ‐ＢＢを含む。別の実施形態では、ＰＤＧＦは、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢなどの組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦを含む。
【００３３】
ＰＤＧＦは、幾つかの実施形態では、天然のソースから入手できる。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、組み換えＤＮＡ技術によって作製される。他の実施形態では、ＰＤＧＦまたはその断片は、固相ペプチド合成品など、当業者に公知のペプチド合成技術を使用して作製されうる。天然のソースから入手する場合、ＰＤＧＦは、生体液に由来することができる。生体液は、幾つかの実施形態によれば、血液を含む、任意の処理済みおよび未処理の生体に関連する液を含むことができる。
【００３４】
また、生体液は、別の実施形態では、濃縮血小板（ＰＣ）、アフェレーシス血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血漿、血清、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、およびバフィーコート（ＢＣ）を含む、血液成分を含むことができる。生体液、さらなる実施形態では、血漿から分離し、生理液再懸濁した血小板を含む。
【００３５】
ＰＤＧＦを組み換えＤＮＡ技術によって作製する場合、幾つかの実施形態では、単一単量体（例えば、ＰＤＧＦ Ｂ‐鎖またはＡ‐鎖）をコードするＤＮＡ配列を、発現のために培養原核細胞または培養真核細胞に挿入して、それに続いてホモ二量体（例えば、ＰＤＧＦ‐ＢＢまたはＰＤＧＦ‐ＡＡ）を作製することができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、ヘテロ二量体の単量体の単位をコードするＤＮＡ配列を培養原核細胞または培養真核細胞に挿入すること、および翻訳された単量体のユニットを細胞にプロセスさせてヘテロ二量体（例えばＰＤＧＦ‐ＡＢ）を作製することによって、作製できる。市販のＧＭＰ組み換えＰＤＧＦ‐ＢＢは、カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州）から入手できる。研究用グレードｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、多数の供給元、例えば、Ｒ＆Ｄシステム社（ミネアポリス、ミネソタ州）、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（サンノゼ、カリフォルニア州）、およびケミコンインターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）から入手できる。
【００３６】
本発明の幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ断片を含む。幾つかの実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ‐Ｂは、次の断片：Ｂ鎖全体のアミノ酸配列１〜３１、１〜３２、３３〜１０８、３３〜１０９、および／または１〜１０８を含む。ＰＤＧＦのＢ鎖の完全なアミノ酸配列（１〜１０９）は、米国特許第５，５１６，８９６号の図１５に与えられており、該特許の開示は参照してその全体が本明細書に組み込まれる。本発明のｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ組成物は、完全なｒｈＰＤＧＦ‐Ｂ（１〜１０９）およびその断片の混合物の組み合わせを含みうることを理解すべきである。米国特許第５，５１６，８９６号で開示されているようなものなど、ＰＤＧＦの他の断片が用いられうる。１つの実施形態においては、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、少なくとも６５％の完全なｒｈＰＤＧＦ‐Ｂ（１〜１０９）を含む。別の実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の完全なｒｈＰＤＧＦ‐Ｂ（１〜１０９）を含む。
【００３７】
本発明の幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦを精製することができる。精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用する場合、本発明の溶液への組み込み前で約９５重量％を超えるＰＤＧＦを有する組成物を含む。溶液は、任意の製剤として許容可能な溶液であってよい。他の実施形態では、ＰＤＧＦを実質的に精製することができる。実質的に精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用する場合、本発明の溶液への組み込み前で、約５％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。幾つかの実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液への組み込み前で、約６５％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。他の実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液への組み込み前で、約７０％〜約９５％、約７５％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、または約９０％〜約９５重量％を有する組成物を含む。精製されたＰＤＧＦおよび実質的に精製されたＰＤＧＦは、スキャホールドおよび結合剤に組み込ま
れうる。
【００３８】
さらなる実施形態では、ＰＤＧＦを部分的に精製することができる。部分的に精製されたＰＤＧＦは、本明細書において使用する場合、多血小板血漿（ＰＲＰ）、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、またはＰＤＧＦを作製するのに採集および分離を要する他の血液製剤に照らして、ＰＤＧＦを有する組成物を含む。本発明の実施形態は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、本明細書において提供されるＰＤＧＦアイソフォームのいずれも、精製または部分的に精製できることを想定している。ＰＤＧＦ混合物を含有する本発明の組成物は、部分的に精製された部分にＰＤＧＦアイソフォームまたはＰＤＧＦ断片を含有しうる。部分的に精製されたおよび精製されたＰＤＧＦは、幾つかの実施形態では、米国特許出願第１１／１５９，５３３号（公開番号（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ）：第２００６００８４６０２号）に記載のように調製することができる。
【００３９】
幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、ＰＤＧＦを水媒体または１つ以上のバッファーに可溶化することによって形成される。本発明のＰＤＧＦ溶液での使用に適したバッファーは、限定はされないが、炭酸塩、リン酸塩（例えばリン酸緩衝食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、酢酸およびＨＣｌなどの酸性緩衝液、ならびにリジン、トリスバッファー（例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ’‐２‐エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などの有機バッファーを含む。バッファーは、ＰＤＧＦとの生体適合性および望ましくないタンパク質修飾を妨げるバッファーの能力に基づいて選択することができる。くわえて、バッファーは宿主組織との適合性に基づいて選択することができる。幾つかの実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーが使用される。バッファーは異なるモル濃度、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、もしくは約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意のモル濃度で用いることができる。幾つかの実施形態では、酢酸緩衝液は、約２０ｍＭのモル濃度で用いられる。
【００４０】
別の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、凍結乾燥ＰＤＧＦを水に可溶化することによって形成され、ここで、可溶化前にＰＤＧＦを適切な緩衝バッファーから凍結乾燥される。
【００４１】
ＰＤＧＦを含む溶液は、本発明の実施形態によれば、約３．０〜約８．０の範囲のｐＨを有することができる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、約５．０〜約８．０、約５．５〜約７．０、もしくは約５．５〜約６．５、またはこれらの範囲内の任意の値の範囲のｐＨを有する。ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦまたは任意の他の望ましい生体活性物質の持続的な安定性および有効性に適合することができる。ＰＤＧＦは、酸性の環境においてより安定でありうる。したがって、１つの実施形態においては、本発明はＰＤＧＦ溶液の酸性保存製剤を含む。この実施形態においては、ＰＤＧＦ溶液は、好ましくは、約３．０〜約７．０または約４．０〜約６．０のｐＨを有する。しかし、ＰＤＧＦの生物学的活性は、中性のｐＨ範囲を有する溶液において最適化することができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明はＰＤＧＦ溶液の中性ｐＨ製剤を含む。この実施形態においては、ＰＤＧＦ溶液は、約５．０〜約８．０、約５．５〜約７．０、または約５．５〜約６．５のｐＨを有する。本発明の方法においては、酸性のＰＤＧＦ溶液が中性ｐＨ組成物に改質される。本発明の好ましい実施形態においては、溶液を利用されたＰＤＧＦはｒｈ‐ＰＤＧＦ‐ＢＢである。さらなる実施形態では、ＰＤＧＦ含有溶液のｐＨを変えて、ＰＤＧＦの生体適合性マトリックスに対する結合キネティクスを最適化することができる。
【００４２】
ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、幾つかの実施形態では、本明細書において列挙されるバ
ッファーによって制御することができる。さまざまなタンパク質が、それらが安定である異なるｐＨ範囲を示す。タンパク質安定性は、主にタンパク質の等電点および電荷によって反映される。ｐＨ範囲は、タンパク質の立体配座構造、ならびにタンパク質分解、加水分解、酸化、およびタンパク質の構造および／または生物学的活性の変更をもたらすことができる他のプロセスに対するタンパク質の感受性に影響を及ぼすことができる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、他の生体活性物質などのさらなる成分をさらに含むことができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、細胞培養培地、アルブミンなどの他の安定化タンパク質、抗菌性剤、プロテアーゼ阻害剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール‐ビス（ベータ‐アミノエチルエーテル）‐Ｎ、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、ε‐アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）など）ならびに／または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、またはＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、ＰＤＧＦ‐ＣＣおよび／もしくはＰＤＧＦ‐ＤＤの組成物を含む他のＰＤＧＦなどの他の成長因子をさらに含むことができる。
【００４４】
生体適合性マトリックス
移植材料の生体適合性マトリックスは、１つ以上の骨代替物質であり、または付加的に１つ以上の骨代替物質を含む。マトリックスは、随意に生体適合性結合剤をさらに含む。
【００４５】
骨スキャフォールディング材料
生体適合性マトリックスは、本発明の幾つかの実施形態によれば、骨スキャフォールディング材料を含む。本特許出願において、骨スキャフォールディング材料および骨代替物質という用語は、互換可能に使用されることを理解すべきである。骨スキャフォールディング材料は、新しい骨および組織成長が起こるように骨格またはスキャホールドを提供する。骨代替物質は、恒久的または一時的に骨を置換するのに使用することができるものである。移植後、骨代替物質は体に保たれることができ、または、体に再吸収され、骨と置換されることができる。例示的な骨代替物質としては、例えば、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム（例えば、β‐ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト、結晶性に乏しいヒドロキシアパタイト、非晶質リン酸カルシウム、メタリン酸カルシウム、二水和リン酸二カルシウム、リン酸ヘプタカルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、およびリン酸オクタカルシウム）、硫酸カルシウム、および同種移植片（例えば、石灰化骨、石灰化脱タンパク質異種移植片、または脱石灰化骨（例えば、脱石灰化凍結乾燥皮質骨または海綿骨））が挙げられる。骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、リン酸カルシウムを含む。幾つかの実施形態では、リン酸カルシウムはβ‐ＴＣＰを含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は同種移植片を含む。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、生体適合性結合剤含有もしくは非含有リン酸カルシウム粒子、または脱石灰化凍結乾燥骨同種移植片（ＤＦＤＢＡ）もしくは粒子状脱石灰化骨マトリックス（ＤＢＭ）などの骨同種移植片を含みうる。別の実施形態では、生体適合性マトリックスは、ＤＦＤＢＡまたはＤＢＭなどの骨同種移植片を含みうる。ある実施形態では、担体物質は生体再吸収可能である。骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、少なくとも１つのリン酸カルシウムを含む。他の実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、複数のリン酸カルシウムを含む。骨スキャフォールディング材料としての使用に適したリン酸カルシウムは、本発明の幾つかの実施形態では、０．５〜２．０の範囲のカルシウム対リンの原子比率を有する。幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、ＤＦＤＢＡまたは粒子状ＤＢＭ同種移植片を含む。
【００４６】
骨スキャフォールディング材料としての使用に適したリン酸カルシウムの非限定的な例
としては、非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、無水リン酸一カルシウム（ＭＣＰＡ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、α‐リン酸三カルシウム、β‐ＴＣＰ、ヒドロキシアパタイト（ＯＨＡｐ）、結晶性に乏しいヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、デカリン酸七カルシウム、メタリン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、炭酸化されたリン酸カルシウム（ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、またはその混合物が挙げられる。
【００４７】
別の実施形態では、骨代替物質は多孔質組成物を有する。多孔性は移植材料への細胞遊走および浸潤を促し、浸潤細胞は細胞外骨マトリックスを分泌することができるので、多孔性は望ましい特徴である。多孔性はまた、血管新生へのアクセスも提供する。また、多孔性は広い表面積を提供し、活性物質の再吸収および放出を高め、細胞‐マトリックス相互作用を増加する。組成物は、移植に適した形状（例えば、球形、円柱形、もしくはブロック）で提供することができる、または使用前に大きさおよび形を形成することができる。好ましい実施形態では、骨代替物質は、リン酸カルシウム（例えば、β‐ＴＣＰ）である。多孔質骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態によれば、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する細孔を含むことができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ細孔を含む。別の実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有するメソ細孔を含む。さらなる実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、約１０μｍ未満の直径を有するミクロ細孔を含む。本発明の実施形態は、マクロ細孔、メソ細孔、およびミクロ細孔またはその任意の組み合わせを含む骨スキャフォールディング材料を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は相互に連結した細孔を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は相互に連結しない細孔を含む。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、相互に連結する細孔および相互に連結しない細孔を含む。
【００４８】
多孔質骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、約２５％を超えるまたは約４０％を超える多孔率を有する。別の実施形態では、多孔質骨スキャフォールディング材料は、約５０％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、または約８５％を超える多孔率を有する。さらなる実施形態では、多孔質骨スキャフォールディング材料は、約９０％を超える多孔率を有する。幾つかの実施形態では、多孔質骨スキャフォールディング材料は、スキャフォールディング材料への細胞遊走を促す多孔性を含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、複数の粒子を含む。骨スキャフォールディング材料は、例えば、複数のリン酸カルシウム粒子を含むことができる。骨スキャフォールディング材料の粒子は、幾つかの実施形態では、本明細書における骨スキャフォールディングの、いずれの細孔直径および多孔率を個々に示すことができる。他の実施形態では、骨スキャフォールディング材料の粒子はつながりを形成して、本明細書における骨スキャフォールディング材料の、いずれの細孔直径および多孔率を有するマトリックスを作製することができる。
【００５０】
骨スキャフォールディング粒子は、ｍｍ、μｍまたはサブミクロン（ｎｍ）のサイズでありうる。骨スキャフォールディング粒子は、幾つかの実施形態では、約１μｍ〜約５ｍｍの範囲の平均直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約２５０μｍ〜約７５０μｍの範囲の平均直径を有する。骨スキャフォールディング粒子は、別の実施形態では、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、粒子は、約７５μｍ〜約３００μｍの範囲の平均
直径を有する。さらなる実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約２５μｍ未満、約１μｍ未満および、場合によっては、約１ｍｍ未満の平均直径を有する。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約１００μｍ〜約５ｍｍまたは約１００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。他の実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約２５０μｍ〜約２ｍｍ、約２５０μｍ〜約１ｍｍ、約２００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。また、粒子は約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ未満または約２５０ｎｍ未満の範囲にありうる。
【００５１】
骨スキャフォールディング粒子は、幾つかの実施形態では、約１μｍ〜約５ｍｍの範囲の直径を有する。他の実施形態では、粒子は、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約１ｍｍ〜約３ｍｍ、または約２５０μｍ〜約７５０μｍの範囲の直径を有する。骨スキャフォールディング粒子は、別の実施形態では、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲の直径を有する。さらなる実施形態では、粒子は、約７５μｍ〜約３００μｍの範囲の直径を有する。さらなる実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約２５μｍ未満、約１μｍ未満および、場合によっては、約１ｍｍ未満の直径を有する。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約１００μｍ〜約５ｍｍまたは約１００μｍ〜約３ｍｍの範囲の直径を有する。他の実施形態では、骨スキャフォールディング粒子は、約２５０μｍ〜約２ｍｍ、約２５０μｍ〜約１ｍｍ、約２００μｍ〜約３ｍｍの範囲の直径を有する。また、粒子は約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ未満または約２５０ｎｍ未満の範囲にありうる。
【００５２】
骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態によれば、移植に適した形状（例えば、球形、円柱形、またはブロック）で提供されることができる。他の実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、成形可能、押出成形可能、および／または注射可能である。成形可能、押出成形可能、および／または注射可能な骨スキャフォールディング材料は、脊椎固定術の間、骨癒合したい骨および骨の間の標的部位およびそのまわりにおける本発明の組成物の効率的な埋植を促す。幾つかの実施形態では、成形可能な骨スキャフォールディング材料は、スパチュラまたは均等な装置を用いて、骨癒合の部位に適用することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は流動可能である。流動可能な骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、注射器および針またはカニューレを通して骨癒合の部位に適用することができる。幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、生体内で固まる。
【００５３】
幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は生体再吸収可能である。骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％が生体内移植後１年以内に再吸収されることができる。別の実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％が生体内移植後の１、３、６、９、１２、または１８ヶ月以内に再吸収されることができる。生体再吸収可能性は、（１）マトリックス材料の性質（すなわち、その化学的組成、物理的構造およびサイズ）；（２）マトリックスが埋植される体内での位置；（３）使用されるマトリックス材料の量；（４）患者の代謝の状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗しょう症、喫煙者、高齢、ステロイド使用など）；（５）治療される傷害の範囲および／またはタイプ；ならびに（６）他の骨同化作用、異化作用および抗異化作用因子などの、マトリックス以外の他の材料の使用に依存することになる。
【００５４】
骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤
別の実施形態では、生体適合性マトリックスは、骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む。生体適合性結合剤をさらに含む生体適合性マトリックスの幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、上記に提供されたものと一致する
。
【００５５】
生体適合性結合剤は、幾つかの実施形態によれば、合わせた物質間の凝集を促進する働きをする材料を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、生体適合性マトリックスの形成における骨スキャフォールディング材料の粒子間の接着を促進する。ある幾つかの実施形態では、同一の材料が、合わせた物質間の凝集を促進し、新しい骨の成長が起こるように骨格を提供するように作用する場合、そのような材料は、スキャフォールディング材料および結合剤の両方としての機能を果たしうる。
【００５６】
生体適合性結合剤は、幾つかの実施形態では、コラーゲン、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、合成ポリマー、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリウレタン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物‐ｃｏ‐イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α‐ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ‐ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ‐ラクチド‐ｃｏ‐Ｄ，Ｌ‐ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ‐ラクチド‐ｃｏ‐炭酸トリメチレン）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ポリ（ε‐カプロラクトン）、ポリ（δ‐バレロラクトン）、ポリ（γ‐ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（アクリル酸）、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル、炭素繊維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾｉｎｅ）、ポリ（エチレンオキシド）‐ｃｏ‐ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、ならびにこれらの共重合体および混合物を含むことができる。
【００５７】
生体適合性結合剤は、他の実施形態では、アルギン酸、アラビアゴム、グアーガム、キサンタン（ｘａｎｔｈａｍ）ガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサンアセテート、キトサンラクテート、コンドロイチン硫酸、レシチン、Ｎ，Ｏ‐カルボキシメチルキトサン、ホスファチジルコリン誘導体、デキストラン（例えば、α‐シクロデキストリン、β‐サイクロデキストリン、γ‐サイクロデキストリン、またはデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリン接着剤、レシチン、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプンまたは可溶性デンプン）、乳酸、プルロン酸、グリセロリン酸ナトリウム、グリコーゲン、ケラチン、絹、ならびにこれらの誘導体および混合物を含むことができる。
【００５８】
幾つかの実施形態では、結合剤はコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンはＩ型コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンはウシＩ型コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤はヒアルロン酸を含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤は水溶性である。水溶性結合剤は、移植後間もなく、生体適合性マトリックスから溶け出すことができるので、マクロ多孔性を生体適合性マトリックスに取り入れることができる。マクロ多孔性は、本明細書において述べるように、移植部位での、破骨細胞および骨芽細胞のアクセス、およびその結果として再形成活性を高めることによって、移植材料の骨伝導性を増加することができる。
【００６０】
幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックス中に、生体適合
性マトリックスの約１重量％〜約７０重量％、約５重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約４０重量％、約１５重量％〜約３５重量％、または約１５重量％〜約２５重量％の範囲の量で存在することができる。さらなる実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約２０重量％の量で存在することができる。
【００６１】
骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態によれば、流動可能、成形可能および／または押出成形可能であることができる。そのような実施形態では、生体適合性マトリックスは、ペーストまたはパテの形態であることができる。ペーストまたはパテの形態の生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、生体適合性結合剤によって互いに接着した、骨スキャフォールディング材料の粒子を含むことができる。
【００６２】
ペーストまたはパテ形態の生体適合性マトリックスは、所望の移植形状に成形でき、または移植部位の外形に成形できる。幾つかの実施形態では、ペーストまたはパテ形態の生体適合性マトリックスは、注射器またはカニューレを用いて移植部位に注射することができる。
【００６３】
幾つかの実施形態では、ペーストまたはパテ形態の生体適合性マトリックスは、移植後、固まらずに流動可能および成形可能な形態を保持する。他の実施形態では、ペーストまたはパテは、移植後に固まることができるので、マトリックスの流動性および成形性を減じることができる。
【００６４】
骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、ブロック、球、円柱形または例えば型または適用部位によって決められる所望の形を含む決まった形で提供されることもできる。
【００６５】
骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、上記のように生体再吸収可能である。そのような実施形態では、生体適合性マトリックスは、生体内移植の１年以内に再吸収されることができる。別の実施形態では、骨スキャフォールディング材料および生体適合性結合剤を含む生体適合性マトリックスは、生体内移植の１、３、６、または９ヶ月以内に再吸収されることができる。生体再吸収可能性は、（１）マトリックス材料の性質（すなわち、その化学的組成、物理的構造およびサイズ）；（２）マトリックスが埋植される体内での位置；（３）使用されるマトリックス材料の量；（４）患者の代謝の状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗しょう症、喫煙者、高齢、ステロイド使用など）；（５）治療される傷害の範囲および／またはタイプ；ならびに（６）他の骨同化作用、異化作用および抗異化作用因子などの、マトリックス以外の他の材料の使用に依存することになる。
【００６６】
以下に、β‐ＴＣＰを含む骨スキャフォールディング材料および／またはコラーゲンを含む生体適合性結合剤を参照して特定の実施形態を説明するが、β‐ＴＣＰの代わりに他の骨スキャフォールディング材料（例えば、別のリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、または同種移植片）を用いること、および／またはコラーゲンの代わりに他の結合剤を用いることによって、本発明の他の実施形態を作りうることを理解すべきである。
【００６７】
β‐リン酸三カルシウムを含む骨スキャフォールディング
幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスとして用いる骨スキャフォールディング材料は、β‐ＴＣＰを含むことができる。β‐ＴＣＰは、幾つかの実施形態によれば、種々の直径の、多方向の相互に連結した細孔を有する多孔質構造を含むことができる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰは、相互に連結した細孔にくわえて、種々の直径のポケットおよび相互に連結しない細孔を複数含む。β‐ＴＣＰの多孔質構造は、幾つかの実施
形態では、約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ細孔、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有するメソ細孔、および約１０μｍ未満の直径を有するミクロ細孔を含む。β‐ＴＣＰのマクロ細孔およびミクロ細孔は、骨誘導および骨伝導を促すことができる一方で、マクロ細孔、メソ細孔、およびミクロ細孔はβ‐ＴＣＰ生体適合性マトリックスにわたって、流体連通（ｆｌｕｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）および栄養素輸送を可能にし、骨の再生を助けることができる。
【００６８】
多孔質構造を含む場合、β‐ＴＣＰは、幾つかの実施形態では、２５％を超えるまたは約４０％を超える多孔率を有することができる。他の実施形態では、β‐ＴＣＰは、約５０％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、または約８５％を超える多孔率を有することができる。さらなる実施形態では、β‐ＴＣＰは、約９０％を超える多孔率を有することができる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰは、β‐ＴＣＰへの細胞遊走を促す多孔性を有することができる。
【００６９】
幾つかの実施形態では、骨スキャフォールディング材料は、β‐ＴＣＰ粒子を含む。β‐ＴＣＰ粒子は、幾つかの実施形態では、本明細書においてβ‐ＴＣＰに提供される、いずれの細孔直径および多孔率を個々に示すことができる。他の実施形態では、骨スキャフォールディング材料のβ‐ＴＣＰ粒子はつながりを形成して、本明細書において骨スキャフォールディング材料に提供される、いずれの細孔直径および多孔率を有するマトリックスを作製することができる。多孔性は、その後の骨形成に向かってマトリックスへの細胞遊走および浸潤を促しうる。
【００７０】
β‐ＴＣＰ粒子は、幾つかの実施形態では、約１μｍ〜約５ｍｍの範囲の平均直径を有する。他の実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子は、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約１ｍｍ〜約３ｍｍ、約２５０μｍ〜約７５０μｍ、約２５０μｍ〜約１ｍｍ、約２５０μｍ〜約２ｍｍ、または約２００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子は、約７５μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子は、約２５μｍ未満の平均直径、約１μｍ未満および、または約１ｍｍ未満の平均直径を有する。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ〜約５ｍｍまたは約１００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。
【００７１】
β‐ＴＣＰ粒子を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、移植に適した形状（例えば、球形、円柱形、またはブロック）で提供することができる。他の実施形態では、β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、成形可能、押出成形可能、および／または注射可能であるので、脊椎固定術の間の所望の骨癒合の標的部位およびそのまわりへの、マトリックスの効率的な埋植を促すことができる。流動可能なマトリックスは、注射器、チューブ、もしくはスパチュラまたは均等な装置を通して適用しうる。流動可能なβ‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態では、注射器および針またはカニューレを通して骨癒合の部位に適用することができる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、生体内で固まる。
【００７２】
β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、幾つかの実施形態によれば、生体再吸収可能である。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％が生体内移植後１年で再吸収されることができる。別の実施形態では、β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、約９０％を超えて、生体内移植後１年で再吸収されることができる。
【００７３】
β‐ＴＣＰおよびコラーゲンを含む生体適合性マトリックス
幾つかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、β‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料および生体適合性コラーゲン結合剤を含むことができる。コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ骨スキャフォールディング材料は、上記に提供されたものと一致する。
【００７４】
コラーゲン結合剤は、幾つかの実施形態では、いずれのタイプのコラーゲン、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲンを含むことができる。幾つかの実施形態では、コラーゲン結合剤は、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物などのコラーゲンの混合物を含む。他の実施形態では、コラーゲン結合剤は、生理学的条件下で可溶である。骨または筋骨格系組織に存在する他の型のコラーゲンを用いてもよい。コラーゲンの組み換え、合成、および天然形態が本発明において使用されうる。
【００７５】
生体適合性マトリックス、幾つかの実施形態によれば、コラーゲン結合剤で互いに接着した、複数のβ‐ＴＣＰ粒子を含むことができる。コラーゲン結合剤との使用に適したβ‐ＴＣＰ粒子は、本明細書において記載されているいずれのβ‐ＴＣＰ粒子を含むことができる。幾つかの実施形態では、コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ粒子は、約１μｍ〜約５ｍｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ粒子は、約１μｍ〜約１ｍｍ、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約１ｍｍ〜約３ｍｍ、約２５０μｍ〜約７５０μｍ、約２５０μｍ〜約１ｍｍ、約２５０μｍ〜約２ｍｍ、約２００μｍ〜約１ｍｍ、または約２００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。β‐ＴＣＰ粒子は、他の実施形態では、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ粒子は、約７５μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有する。さらなる実施形態では、コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ粒子は、約２５μｍ未満、および約１ｍｍ未満または約１μｍ未満の平均直径を有する。幾つかの実施形態では、コラーゲン結合剤との組み合わせに適したβ‐ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ〜約５ｍｍまたは約１００μｍ〜約３ｍｍの範囲の平均直径を有する。
【００７６】
β‐ＴＣＰ粒子は、幾つかの実施形態では、多孔質構造を有する生体適合性マトリックスを作るように、コラーゲン結合剤によって互いに接着することができる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する細孔を含むことができる。β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ細孔、約１０μｍ〜１００μｍの範囲の直径を有するメソ細孔、および約１０μｍ未満の直径を有するミクロ細孔を含むことができる。
【００７７】
β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、２５％を超えるまたは約４０％を超える多孔率を有することができる。別の実施形態では、その生体適合性マトリックスは、約５０％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、または約８５％を超える多孔率を有することができる。さらなる実施形態では、その生体適合性マトリックスは、約９０％を超える多孔率を有することができる。多孔性は、その後の骨形成に向かってマトリックスへの細胞遊走および浸潤を促す。
【００７８】
β‐ＴＣＰ粒子を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、コラーゲン結合剤を、生体適合性マトリックスの約１重量％〜約７０重量％、約５重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約４０重量％、約１５重量％〜約３５重量％、または約１５重量％〜約２５重量％の範囲の量で含むことができる。さらなる実施形態では、コラーゲン結合剤は、生体適合性マトリックスの約２０重量％の量で存在することができる。
【００７９】
β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態によれば、流動可能、成形可能および／または押出成形可能であることができる。そのような実施形態では、その生体適合性マトリックスは、ペーストまたはパテの形態であることができる。ペーストまたはパテは、所望の移植形状に成形でき、または移植部位の外形に成形できる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含むペーストまたはパテ形態の生体適合性マトリックスは、注射器またはカニューレを用いて移植部位に注射することができる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含むペーストまたはパテ形態の生体適合性マトリックスは、移植した際、流動可能および成形可能形態を保つことができる。他の実施形態では、そのペーストまたはパテは、移植後に固まることができるので、マトリックスの流動性および成形性を減じることができる。
【００８１】
β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、幾つかの実施形態では、ブロック、球形、または円柱形などの所定の形状で提供することができる。
【００８２】
β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、再吸収可能であることができる。幾つかの実施形態では、β‐ＴＣＰ粒子およびコラーゲン結合剤を含む生体適合性マトリックスは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または９０％が生体内移植後１年で再吸収されることができる。別の実施形態では、このマトリックスは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％または９０％が生体内移植後の１、３、６、９、１２、または１８ヶ月以内に再吸収されることができる。
【００８３】
ＰＤＧＦを含む溶液は、生体適合性マトリックスに配置され、本発明の実施形態による脊椎固定術における骨固定を促進する組成物を作製することができる。
【００８４】
生体適合性マトリックスへのＰＤＧＦ溶液の組み込み
本発明は、脊椎固定術に用いる組成物を作製する方法を提供する。幾つかの実施形態では、骨の固定を促進する組成物を作製する方法は、ＰＤＧＦを含む溶液を提供すること、生体適合性マトリックスを提供すること、およびその溶液を生体適合性マトリックスに組み込むことを含む。組み合わせに適したＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリックスは、上記に記載されたものと一致する。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、生体適合性マトリックスをＰＤＧＦ溶液に浸すことによって、生体適合性マトリックスに組み込むことができる。ＰＤＧＦ溶液は、別の実施形態では、生体適合性マトリックスをＰＤＧＦ溶液とともに注射することによって、生体適合性マトリックスに組み込むことができる。幾つかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液を注射することは、注射器にＰＤＧＦ溶液を組み込むこと、およびＰＤＧＦ溶液を生体適合性マトリックスに放出して生体適合性マトリックスを飽和することを含むことができる。
【００８６】
生体適合性マトリックス、幾つかの実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液を与えられる前、れんが形または円柱形などの所定の形状であることができる。ＰＤＧＦ溶液を与えられた後、生体適合性マトリックスは、流動可能、押出成形可能、および／または注射可能であるペーストまたはパテ形態を有することができる。他の実施形態では、生体適合性マトリックスは、ＰＤＧＦ溶液を与えられる前に、すでに流動可能なペーストまたはパテ形態を示すことができる。
【００８７】
生体活性物質をさらに含む組成物
本明細書において記載されている、脊椎固定術における骨固定を促進および／または容易にする組成物は、幾つかの実施形態によれば、ＰＤＧＦにくわえて、１つ以上の生体活性薬品をさらに含むことができる。ＰＤＧＦにくわえて本発明の組成物に組み込まれることができる生体活性物質は、有機分子、無機材料、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、小挿入（ｓｍａｌｌ ｉｎｓｅｒｔ）リボ核酸（ｓｉ‐ＲＮＡ）、遺伝子調節配列、核内転写因子、およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖類（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質、ならびにリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗がん剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋弛緩薬、プロスタグランジン、栄養素、骨誘導タンパク質、成長因子、およびワクチンを含む、本発明の組成物に組み込まれることができる生体活性化合物の非限定的な例は、米国特許出願第１１／１５９，５３３号（公開番号（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ）：第２００６００８４６０２号）に開示されている。幾つかの実施形態では、本発明の組成物に組み込まれることができる生体活性化合物としては、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、または他のＰＤＧＦなどの骨誘導因子が挙げられる。他の実施形態においては、本発明の組成物に組み込まれることができる生体活性化合物としては、好ましくは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ模倣剤、カルシトニン、カルシトニン模倣剤、スタチン、スタチン誘導体、または副甲状腺ホルモンなどの、骨誘導および骨刺激（ｏｓｔｅｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）因子が挙げられる。また、好ましい因子としては、プロテアーゼ阻害剤、ビスホスホネート含む骨再吸収を減じる骨粗しょう症治療薬、およびＮＦ‐ｋＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫ）に対する抗体リガンドが挙げられる。
【００８８】
さらなる生体活性物質を送達するための標準的なプロトコルおよびレジメンは、当該技術分野において公知である。さらなる生体活性物質は、移植部位への適切な投与量の物質の送達を可能にする量で本発明の組成物に導入することができる。ほとんどの場合、投与量は、専門家に公知であり、問題になっている特定の物質に適用可能なガイドラインを使用して決定される。本発明の組成物に含まれるべき、さらなる生体活性物質の量は、病態の型および程度、特定の患者の総合的な健康状態、生体活性物質の組成、放出動態、および生体適合性マトリックスの生体再吸収性などの変数に依存しうる。標準的な治療を使用して、任意の特定のさらなる生体活性物質に関する投与量および投与頻度を最適化しうる。
【００８９】
脊椎固定術における骨固定を促進する組成物は、幾つかの実施形態によれば、例えば、自家骨髄、自家血小板抽出物、および合成骨マトリックス材料を含めた他の骨移植材料をＰＤＧＦとともに加えることをさらに含むことができる。
【００９０】
脊椎固定術を行う方法
本発明はまた、脊椎固定術を行う方法を提供する。幾つかの実施形態では、脊椎固定術を行う方法が、生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供すること、および組成物を所望の脊椎固定部位に適用することを含む。生体適合性マトリックスに組み込まれたＰＤＧＦ溶液を含む組成物は、例えば、所望の脊椎固定部位に充てんされることができる。幾つかの実施形態では、その組成物が骨固定部位における骨の表面領域全体に接触するように、組成物が充てんされうる。くわえて、その組成物は、骨固定部位の近くに適用されて、固定された骨をさらに強化しうる。
【００９１】
頸部、胸部、腰部、および仙骨部を含めた、脊椎の任意の部分における椎骨は、本発明の組成物および方法を使用して固定されうる。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の方法は、脊椎固定術における骨固定を速めることを含み、
ここで、骨固定を速めることは、生体適合性マトリックスに配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供すること、および組成物を少なくとも１つの脊椎固定の部位に適用することを含む。
【００９３】
以下の例は、本発明をさらに説明する働きをするが、同時に、本発明のいかなる制限も構成しない。それどころか、当業者には本明細書における説明を読んだ後に本発明の趣旨から逸脱することなくそれ自体が示唆されうる、さまざまな実施形態、変更およびその同等物に頼らなければならない場合があることを明確に理解すべきである。
【実施例】
【００９４】
＜実施例１＞
ＰＤＧＦの溶液および生体適合性マトリックスを含む組成物の調製
ＰＤＧＦの溶液およびβ‐ＴＣＰの生体適合性マトリックスを含む組成物を、以下の手順に従って調製した。β‐ＴＣＰは、約１０００μｍ〜約２０００μｍの範囲の平均直径を有するβ‐ＴＣＰ粒子を含んでいた。
【００９５】
ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢを含む溶液を入手した。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、ナトリウム酢酸バッファー中に１０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、Ｌｏｔ＃ＱＡ２２１７）のストック濃度でカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より市販されている。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって酵母発現系で製造され、アメリカ食品医薬品局によってヒトへの使用が認可されている、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（ジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ））およびＧＥＭ２１Ｓ（ＢｉｏＭｉｍｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）製品中で利用されているｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢと同じ製造施設に由来する。また、このｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、欧州連合およびカナダでもヒトへの使用が認可されている。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、酢酸バッファーで０．３ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、本発明の実施形態に従って１．０ｍｇ／ｍＬを含む任意の所望の濃度に希釈することができる。
【００９６】
約３ｍＬのｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液に対して、約１ｇ乾燥重量の比率でβ‐ＴＣＰ生体適合性マトリックスを使用して組成物を製造した。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、注射器を用いて生体適合性マトリックスのβ‐ＴＣＰ粒子上に放出し、結果として生じた組成物を混合、成型した。
【００９７】
＜実施例２＞
ＰＤＧＦの溶液、生体適合性マトリックスおよび生体適合性結合剤を含む組成物の調製
ＰＤＧＦの溶液および生体適合性結合剤、コラーゲンを含有する生体適合性マトリックスを含む組成物を、以下の手順に従って調製した。
【００９８】
予め重量を量った、β‐ＴＣＰおよびコラーゲンを含有する生体適合性マトリックスの塊を入手した。β‐ＴＣＰは、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲の平均直径を有するβ‐ＴＣＰ粒子を含んだ。β‐ＴＣＰ粒子は、約２０重量パーセントの可溶性ウシコラーゲン結合剤を配合した。β‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスは、Ｋｅｎｓｅｙ Ｎａｓｈ（Ｅｘｔｏｎ、ペンシルベニア州）より商業的に入手することができる。
【００９９】
ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢを含む溶液を得た。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、ナトリウム酢酸バッファー中に１０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、Ｌｏｔ＃ＱＡ２２１７）のストック濃度でカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より市販されている。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって酵母発現系で製造され、アメリカ食品医薬品局によってヒトへの使用が認可されている、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（ジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ））およびＧＥＭ
２１Ｓ（ＢｉｏＭｉｍｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）製品中で利用されているｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢと同じ製造施設に由来する。また、このｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、欧州連合およびカナダでもヒトへの使用が認可されている。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、酢酸バッファーで０．３ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、本発明の実施形態に従って１．０ｍｇ／ｍＬを含む任意の所望の濃度に希釈することができる。
【０１００】
約３ｍＬのｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液に対して、約１ｇ乾燥重量の比率でβ‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを使用して組成物を製造した。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を、注射器を用いてβ‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックス上に放出し、結果として生じた組成物を混合、成型した。
【０１０１】
＜実施例３＞
Ａｕｇｍｅｎｔ骨移植片の調製および投与
Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）骨移植片（ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ／ｐ‐ＴＣＰ）は、組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ（２０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー中に０．３ｍｇ／ｍＬ）およびベータ‐リン酸三カルシウム顆粒から構成される完全合成骨移植片代用品である。ベータ‐リン酸三カルシウムの粒径は、約１０００〜２０００ミクロンの範囲の直径である（Ｃａｍ Ｂｉｏｃｅｒａｍｉｃｓ（Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）から購入）。
【０１０２】
Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）骨移植片の構成要素を２つの滅菌したトレイに準備した：大トレイには、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を無菌充てんしたバイアル（３ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ）、使い捨て注射器および使い捨て針を入れた。大トレイを酸化エチレンによって滅菌した。小トレイには、乾燥β‐ＴＣＰ顆粒を充てんした密閉カップを入れた。小トレイをガンマ放射線によって滅菌した。
【０１０３】
組成物を次のように調製した：
【０１０４】
１）無菌操作を使用して、（β‐ＴＣＰ顆粒の入った）カップおよび（ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液の入った）バイアルを無菌野に移した。
【０１０５】
２）カップを開け、β‐ＴＣＰ顆粒を滅菌外科用ボウルに移した。
【０１０６】
３）注射器および針を使用して、バイアルの中身をすべて吸い上げ、全液をβ‐ＴＣＰ顆粒の入った外科用ボウルに移した。多数のキットを使用し（９ｃｃを超えない）、中身を合わせた。
【０１０７】
４）２つの構成要素を、スパチュラ、キュレットまたは同様の道具を使用してゆっくりと約３０秒間撹拌した。
【０１０８】
５）β‐ＴＣＰ粒子の最適な飽和を確実にするのに、移植する前に混合物を１０分間そのままにしておいた。
【０１０９】
６）生成物を、２つの構成要素を混合した後１時間以内に移植した。
【０１１０】
組成物を次のように投与する：
【０１１１】
使用時に、２つの主要構成要素をすべて合わせ、上記のように混合し、術部に適用する。
【０１１２】
・関節表面を、創面切除および剥皮して生骨を見えるようにする。
【０１１３】
・差し支えなければ、移植材料を移植前に移植部位の外科的処置を完了する。
【０１１４】
・手術部位を洗浄する。
【０１１５】
・Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）骨移植片を、間節全体にわたって、すべての軟骨下空隙および表面の凹凸に手作業で充てんする。材料の十分な固定、閉鎖、および封じ込めを達成するために骨欠損の過剰充てんは避ける。
【０１１６】
・関節を整復し、強固な固定を適用する。
【０１１７】
・残りのＡｕｇｍｅｎｔ（商標）骨移植片全部を関節周囲に充てんする。
【０１１８】
・残りのｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液すべてを手術部位に適用して、確実に移植片が水和されたままにする。
【０１１９】
・骨膜の軟組織および付加的な（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）軟組織を注意深く層状にして、移植材料を入れて、封じ込める。移植部位は、Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）骨移植片の移植後、洗浄しない。
【０１２０】
＜実施例４＞
Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片の調製および投与
Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）注射用骨移植片（ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ／ｐ‐ＴＣＰウシＩ型コラーゲン）は、組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ、ベータ‐リン酸三カルシウム顆粒および可溶性ウシＩ型コラーゲンから構成される合成骨移植片代用品である。ベータ‐リン酸三カルシウムの粒径は、約１００〜３００ミクロンの範囲の直径である。ベータ‐リン酸三カルシウムおよびコラーゲンは、Ｋｅｎｓｅｙ Ｎａｓｈから購入した。ベータ‐リン酸三カルシウムのコラーゲンに対する比率は、８０：２０（ｗ／ｗ）であった。ウシＩ型コラーゲン成分を加えて生成物の取扱適性を高めた。コラーゲン成分は、生成物が０．３ｍｇ／ｍＬ ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中）溶液と配合可能にし、流動可能なペーストを得る。
【０１２１】
Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）注射用骨移植片の成分は、２つの滅菌容器からなる「キット」中に提供された：（１）ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液（３ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ）が無菌充てんされたバイアルの入ったトレイ。トレイを酸化エチレンによって滅菌した。（２）１グラムのβ‐ＴＣＰ／ウシＩ型コラーゲンマトリックスの入った二層箔／透明ポーチ。ポーチをガンマ放射線によって滅菌した。
【０１２２】
組成物を次のように調製した：
【０１２３】
１．無菌操作のもとで、滅菌外科用ボウル中、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液でβ‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを完全に飽和することによって調製した。多数のキットが必要な場合は（キットは合わせて３つを超えない）、中身を合わせた。
【０１２４】
２．β‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスを完全に飽和した後、混合物を約２分間静置した。次に、滑らかなペーストが形成されるまで、混合物をガラス製でないスパチュラで３分間混ぜた。適切に混ぜた材料は、固体材料の大きな塊やかけらがなく、均一な稠度を有した。
【０１２５】
組成物を次のように投与する：
【０１２６】
使用時に、２つの主要構成要素をすべて合わせ、上記のように混合し、術部に適用する。骨欠損を見えるようにした後、標準的な骨移植術に従って、骨空洞を適切に創面切除し準備する。
【０１２７】
１．飽和マトリックスを注意深く骨移植部位に適用する。より正確な埋植のために、Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片をカニューレまたは大口径針（１６ゲージもしくはそれより太いサイズ）を使用して滅菌注射器に充てんし、標的領域に注入する／押し出す。
【０１２８】
２．新しい骨の形成を高めるために、Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片を血管に富んだ骨に直接接触して埋植する。Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片材を埋植する前に、皮質骨に穴を開ける。
【０１２９】
３．移植材料が骨表面全体に接触して結合するように、材料を骨欠損に手作業で埋植する。
【０１３０】
４．成長因子が骨膜の骨形成を高めうるように、固定した後、Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片を固定部位の周りにも埋植する。
【０１３１】
５．Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）注射用骨移植片材料を確実に結合空隙内に封じ込むように注意する。
【０１３２】
６．Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片材料を欠損部位に充填された、骨膜の軟組織および付加的な（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）軟組織を注意深く層状にし、移植材料を入れて、封じ込める。これにより、手術部位での流出、骨膜下再吸収、外骨腫症、および潰瘍形成が最小限になる。Ａｕｇｍｅｎｔ（商標）注射用骨移植片材料の移植後に、移植部位に水がかからないように注意する。
【０１３３】
７．標準的な手術手技を用いて、処置を完了する。
【０１３４】
＜実施例５＞
Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片の調製および投与
Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片（ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ／流動可能なβ‐ＴＣＰ）は、組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ、ベータ‐リン酸三カルシウム顆粒および可溶性ウシＩ型コラーゲンから構成される合成骨移植片代用品である。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは、２０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファーの溶液に０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。ベータ‐ＴＣＰの粒径は、約１００〜３００ミクロンの範囲の直径である。細断ウシＩ型コラーゲンを加えて、生成物の取扱適性を高めた。ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液で水和すると、コラーゲンは、β‐ＴＣＰとともに流動可能なペーストを生じる。コラーゲンおよびベータ‐ＴＣＰは、Ｋｅｎｓｅｙ Ｎａｓｈから購入する。
【０１３５】
Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片は、２つの主要な滅菌構成要素を包む：（１）ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液（３ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ）で無菌充てんしたバイアルの入っているトレイ。トレイを酸化エチレンによって滅菌する。（２）１０ｃｃのポリプロピレン注射器中の１グラムのβ‐ＴＣＰウシＩ型コラーゲンマトリックス（８０％／２０％ ｗ／ｗ）、空のポリプロピレン注射器、１つの１８ゲージ丸針、１つの１４ゲージ丸針およびメス／メスルアーコネクターの入った箔／透明ポーチ。ポーチをガンマ放射線によって滅菌する。
【０１３６】
組成物を次のように調製し投与する：
【０１３７】
使用時に、２つの主要構成要素をすべて合わせ、混合し、術部位に適用する。
【０１３８】
手術部位を見えるようにした後、標準的な手術手技に従って、関節を適切に創面切除し準備する。残りの軟骨はすべて除去し、反対側の骨表面を適切に調製し、健常な、血管が新生された骨の付加を最適化する。これは、移植片の挿入の前に見えるようにした出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）骨の表面積を最大にする手段として、キュレット、バー（ｂｕｒｒ）、ドリルビットまたは骨刀を標準的に用いて、残りの軟骨下板を細く削ることおよび／または穴を開けることによってなされる。
【０１３９】
次に、Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片を、以下の略図に示すように、β‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスをｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液で完全に飽和することによって調製し、つぎのように投与する：
【０１４０】
【化１】
2018161541.tif 000002
【０１４１】
１．ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液の入っているバイアルの中身を、空の注射器および１８ゲージ針を使用して、完全に吸引する。全液をバイアルから抽出した後、針を除去し、注射器中に残っている空気を除く。
【０１４２】
２．β‐ＴＣＰ／コラーゲンマトリックスの入っている注射器のキャップを取る。プランジャーを１０ｍＬの印（ｍａｒｋ）まで引き、注射器を軽くたたいてマトリックスをほぐす。プランジャーを８ｍＬの印（ｍａｒｋ）まで戻す。
【０１４３】
３．メス‐メスルアーロックコネクターを使用して、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液の入っている注射器をマトリックスの入っている注射器とつなげる。
【０１４４】
４．ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液をマトリックスの入っている注射器に移す。全ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ溶液を移した後、水和したマトリックスの入っている注射器のプランジャーを１０ｍＬの印（ｍａｒｋ）まで引く。
【０１４５】
５．水和したマトリックスの入っている注射器のプランジャーを取り外す。注射器を最小９０秒間そのままにする。
【０１４６】
６．マトリックスを水和した後、中身を２０サイクル以上２つの注射器間を往復して移動する。１サイクルは、マトリックスを空の注射器に通して戻すことと定義される。完了すると、マトリックスは、均質なペーストを形成する。
【０１４７】
７．全ペーストを注射器の１つに移し、マトリックスを含有するプランジャーをゆっくりと引くことによって、混合プロセス中に増大した圧力を取り除く。
【０１４８】
８．空の注射器およびメス‐メスルアーロックコネクターをペーストの入っている注射器から外す。注射器内に残っている空気を除き、１４ゲージ針をつなぐ。水和したマトリックスを空隙に注ぐ。必要ならば、最初に力をかけて、ペーストが１４ゲージ針を流れるようにする。しかし、いったんペーストが流れ始めたら、流れを維持するのに必要な力を減らす。
【０１４９】
９．関節整復および固定部位のスクリュー固定の直後に、水和したマトリックスを注意深く手術部位（すなわち、軟骨下空隙、および関節全体にわたって見られる表面の凹凸）に適用する。残りの（未使用の）Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片を、固定作成物（ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の外周まわりに充てんする。
【０１５０】
１０．新しい骨の形成を高めるために、Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片を血管に富んだ骨に直接接触して埋植する。Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片材を埋植する前に、皮質骨に穴を開ける。
【０１５１】
１１．Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片材料を欠損部位に充填された、骨膜の軟組織および付加的な（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）軟組織を注意深く層状にし、移植材料を入れて、封じ込める。これにより、手術部位での流出、骨膜下再吸収、外骨腫症、および潰瘍形成が最小限になる。Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片材料の移植後に、移植部位に水がかからないように注意する。
【０１５２】
１２．標準的な手術手技を用いて、処置を完了する。
【０１５３】
１３．残りの移植材料を破棄する。
【０１５４】
＜実施例６＞
Ａｕｇｍｅｎｔ骨移植片およびＡｕｇｍｅｎｔ（商標）注射用骨移植片での治療後の椎体間腰椎固定の決定
本試験の目的は、ヒツジ脊髄固定モデルにおける、自家移植片と比較した、ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ（β‐ＴＣＰ、β‐ＴＣＰ／コラーゲン）を含有する異なるマトリックスの、Ｌ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ５椎体の椎体間固定（骨架橋）を促進する能力を決定することであった。
【０１５５】
試験施設
手術、生存追跡調査、放射線画像および剖検などの本試験の生体内の部分は、Ｆｏｒｔ
Ｃｏｌｌｉｎｓ、コロラド州にあるコロラド州立大学の臨床科学科のＳｍａｌｌ Ｒｕｍｉｎａｎｔ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行った。マイクロＣＴ画像撮影ならびに組織学過程および評価は、ＢｉｏＭｉｍｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ． Ｆｒａｎｋｌｉｎ、テネシー州の施設のＲ＆Ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行った。
【０１５６】
試験デザイン
２２頭のヒツジが、脊椎スペーサーとしてポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）ス
ペーサーを使用した、固定具を装着しない、２椎間、側方椎体間腰椎固定術を受ける予定であった。
【０１５７】
ＰＥＥＫ脊椎スペーサーを、次のマトリックスの１つで充てんした：群１‐空（Ｅｍｐｔｙ）；群２‐腸骨稜自家移植片；群３‐Ａｕｇｍｅｎｔ骨移植片（ＡＢＧ；β‐ＴＣＰ＋０．３ｍｇ／ｍＬ ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ）；群４‐Ａｕｇｍｅｎｔ注射用骨移植片（ＡＩＢＧ；β‐ＴＣＰ／コラーゲン＋０．３ｍｇ／ｍＬ ｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢ）。群３および４が評価される被験物質であり；ならびに群２が陽性対照群および群１が陰性対照群であった。
【０１５８】
レベル間の拡散の可能性、または生体材料全身への影響を避けるために、各ヒツジで、同一の処置をＬ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ５レベルの両方に使用した。群２〜４では評価される１０固定レベルに相当する５頭の動物が、群１では評価される１４固定レベルに相当する７頭の動物が存在した。腰椎のＬ１〜Ｌ６の放射線写真側面像および前後像を、術後０、１２および２４週に撮った。動物は全頭、術後２４週で犠牲にし、固定部位をひとまとめにして摘出した。固定をマイクロＣＴおよび組織学的分析によって評価した。
【０１５９】
種
２２頭の成長した、雌のランブイエ（Ｒａｍｂｏｕｉｌｌｅｔ）×コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）ヒツジを本試験に使用した。ヒツジは全頭、単一の商業的供給源から入手し、試験に参加する前に最短２８日の順応期間を有した。ヒツジには、個体各々の動物識別用に耳標をつけた。身体検査を行って、健康でない動物を特定し、入れ替えた。動物は全頭、駆虫され、手術の時間前後は大きな動物研究小屋（ｂａｒｎ）で飼い、その後は牧場で飼った。動物全頭には、順応および試験期間を通して、牧草／アルファルファの干し草ミックスの餌を与えた。ＳＲＣＯＬ職員およびＣＳＵ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓのグループが、日々の動物の世話をした。
【０１６０】
生きた動物の使用にかかわる全手順は、コロラド州立大学ＩＡＣＵＣによって承認された。
【０１６１】
サンプルサイズ
計２２頭の動物が、脊椎スペーサーとしてポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）スペーサーを使用した脊椎固定術を受けた。動物に、Ｌ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ５レベルの両方に同じ処置で、次の１つを充てんしたＰＥＥＫスペーサーを入れた：群１‐空（Ｅｍｐｔｙ）（ｎ＝７頭の動物；１４固定部位）；群２‐自家移植片（ｎ＝５頭の動物；１０固定部位）；群３‐ＡＢＧ（ｎ＝５頭の動物；１０固定部位）；群４‐ＡＩＢＧ（ｎ＝５頭の動物；１０固定部位）。
【０１６２】
外科手技
外科手術は研究施設の場所で行った。試験依頼者からの代表者が外科手術に立ち会った。術中記録データ記入用紙を手術時に完成させ、執刀医、処置割当群、切開から閉鎖までの時間、および手術時のいかなる異常な所見／イベントを収録した。
【０１６３】
手術当日、マレイン酸アセプロマジン（０．０５ｍｇ／ｋｇ １Ｍ）およびブプレノルフィン（０．００５〜０．０１ｍｇ／ｋｇ １Ｍ）を、麻酔導入前に投与した。全身麻酔の導入に、ジアゼパム（０．２２ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）からなる静脈注射をした。カフ付き気管内チューブを埋植し、再呼吸システムを通して１００％酸素（２Ｌ／分）中でハロタン（１．５％〜３．０％）を用いて、全身麻酔を維持した。動物を人工呼吸器につなぎ、呼吸を補助した。
【０１６４】
動物を右側臥位にして、腰左外側領域から羊毛を取り除いた。腰左外側領域および腸骨稜領域（自家移植片群のみ）を覆う皮膚を、ポビドン‐ヨウ素（ベタジン）およびアルコールの消毒を交互に行って、無菌手術の準備をした。次いで、その領域に無菌手術用カバーをして、Ｌ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ５の椎間板隙に対する側後腹膜法を施した。初めに、Ｌ４／Ｌ５の椎間板隙を特定し、アニュロトミー（ａｎｕｌｏｔｏｍｙ）を行った。ミダス・レックス（Ｍｉｄａｓ‐Ｒｅｘ）バー（ｂｕｒｒ）を使用して、端板を脊椎スペーサー（Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｓｐａｃｅｒ）‐ＣＲスペーサーを受け入れる大きさに準備した。
【０１６５】
脊椎スペーサーの挿入の前に、脊椎スプレッダー（ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｓｐｒｅａｄｅｒ）を使用して、椎間板隙を開いた。スペーサー、さらにその中身（０．４ｍＬ）を所定の位置に押し込めた。実験計画に基づいて、Ｌ４／Ｌ５レベルに使用したものと同一の被験物質を用いて、同一の手術をＬ２／Ｌ３に施した。定められた通り外筋膜（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｆａｓｃｉａ）（０ Ｐｏｌｙｓｏｒｂ吸収性縫合糸、皮下組織（２／０ Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）および皮膚（２／０ モノフィラメント非吸収性縫合糸、Ｆｏｒｄ連結パターン（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ）の閉鎖を行った。術前抗生物質（セファゾリンナトリウム）を投与した。
【０１６６】
材料の調製
腸骨稜自家移植片採取
背面および側背面腰および腸骨稜領域を、ポビドン‐ヨウ素とイソプロピルアルコールとで交互に重複消毒して、無菌手術の準備をした。その領域を覆い、腸骨稜の上を３ｃｍ切開した。臀部の筋肉の部分反射に続いて、キュレットを使用して、後に陽性対照ヒツジのＬ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ５において脊椎スペーサー（Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｓｐａｃｅｒ）‐ＣＲスペーサーに挿入する自家海綿骨を約１ｃｃ摘出した。腸骨稜切開を閉鎖する前に、病巣内（Ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）に硫酸モルヒネ（１．５ｍＬ （計２２．５ｍｇ））を投与した。腸骨稜上の切開を定められた通り、皮下組織には２／０ Ｐｏｌｙｓｏｒｂおよび皮膚にはステンレス鋼ステープルを使用して閉鎖した。
【０１６７】
ＡＢＧ． 移植前に、ＡＢＧ移植材料を実施例３に従って調製した。水和したＡＢＧを室温で５〜１５分静置し、次に端を取り外した注射器に移した。注射器を使用して正確なボリュームをＰＥＥＫスペーサー（０．４ｍＬ）の内部に分注した。
【０１６８】
ＡＩＢＧ． 移植前に、ＡＩＢＧ移植材料を実施例４に従って調製した。水和したＡＩＢＧを室温で５〜１５分静置し、次に端を取り外した注射器に移した。注射器を使用して正確なボリュームをＰＥＥＫスペーサー（０．４ｍＬ）の内部に分配した。
【０１６９】
アフターケア
手術後直ちに、ヒツジを、腰椎術後放射線写真のために手術台から放射線科に移し、適切なＰＥＥＫスペーサーインプラント埋植を確認し、固定評価用のベースライン放射線画像を得た。次に、胸臥位にさせ、アルミニウムの家畜用トレーラー（ｓｔｏｃｋ ｔｒａｉｌｅｒ）に載せた。その日の終わりには、手術したヒツジの全頭を獣医学病院（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の研究小屋（ｒｅｓｅａｒｃｈ ｂａｒｎ）に移した。ヒツジは全頭、手術および麻酔から何事もなく回復した。ヒツジを試験の初めの２週間屋内で飼って、切開部位の治癒をモニターした。術後鎮痛には、フェンタニルパッチおよび３日間の経口フェニルブタゾンを与えた。２４週間の試験期間中、動物は普通に歩き回ることができた。
【０１７０】
生存中観察およびイメージング
臨床的観察
ヒツジは全頭、手術および麻酔から何事もなく回復した。術後試験期間を通して、一般的態度、食欲、手術部位の状況外観、神経的兆候および呼吸窮迫（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅｓｓ）について、動物を１日２回観察した。ＳＲＣＯＬスタッフは、日々の観察およびいかなる有害事象をもエクセルスプレッドシートに記録した。動物は全頭、２４週間の試験期間生存し、本試験中に予定外の動物死亡はなかった。
【０１７１】
放射線写真
術後直ちに、腰椎の側方および前後放射線写真を撮り、ベースライン測定として２つの手術部位（Ｌ２／Ｌ３およびＬ４／Ｌ４）を収録し、インプラント埋植を評価した。また、放射線写真を、術後１２週目に（生体内）および２４週目に（移植脊椎）で撮った。撮影後、動物は全頭、飼育ユニットに戻した。
【０１７２】
剖検ならびの標本採集および取り扱い
術後２４週に、ＡＶＭＡ２００７ガイドラインに準拠してペントバルビトンナトリウムの静脈内過剰投与によって、動物全頭を安楽死させた。安楽死の後、腰椎を外植し、軟組織を摘出した。上記のように各脊椎ユニットを放射線撮影した。
【０１７３】
マイクロＣＴ分析
マイクロＣＴスキャンおよび分析を、製造元の分析ソフトウェアを使用してμＣＴ８０システム（ＳＣＡＮＣＯ ＵＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ、ペンシルベニア州）上で行った。マイクロＣＴ分析の評価項目には、脊椎スペーサーの中心腔全域の骨架橋の評価、および中心腔の骨ボリューム／総ボリューム（ＢＶ／ＴＶ）が含まれる。
【０１７４】
くわえて、示差密度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）分析を、群２（自家移植片）、群３（ＡＢＧ）、および群４（ＡＩＢＧ）で行って、修復組織における残留β‐ＴＣＰを突き止めた。
【０１７５】
組織学的分析
採取して、切り取って整えた標本を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に一晩入れ、新しい１０％ＮＢＦに交換し、次いで、ＢｉｏＭｉｍｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＢＭＴＩ）に翌日配達で発送して、完全に固定し非脱灰組織学（ｕｎｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）に備えた。
【０１７６】
ＢＭＴＩに到着したら、標本を目録に載せ、必要な場合は再度切り取って整えられ、新しい１０％ＮＢＦに交換して、真空下で約１週間そのままにした。標本を、段階的なＥｔＯＨ溶液を数回交換して乾燥し、キシレンおよびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）できれいにした。次いで、標本を、ＭＭＡおよびフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）を含有する３つの溶液（浸潤溶液Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）を使用して、真空下で浸潤した。完了したら、標本をＭＭＡ＋ＤＢＰの新しい溶液およびペルカドックス（Ｐｅｒｋａｄｏｘ）‐１６に埋め込み、重合させた。
【０１７７】
ＥＸＡ Ｔ Ｃｕｔｔｉｎｇ／Ｇｒｉｎｄｉｎｇシステム（ＥＸＡＫＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、オクラホマシティ、オクラホマ州）を使用して各レベルから、脊椎スペーサーの中央部全体にわたる代表的な組織切片（主要評価項目）を得た。さらなる切片を、脊椎スペーサーを取り囲んでいる領域から採った（副次的評価項目）。次に、全切片を適切な厚さに「細かくし」、異染性染色（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ’ｓ Ｒａｐｉｄ Ｂｏｎｅ Ｓｔａｉｎ）のみ、および／または対比染色（Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ ピクロフクシン（ｐｉｃｒｏｆｕｓｃｈｉｎ））と組み合わせを使用して染色して、骨形態の評価に使用する従来型の三重染色を得た。
【０１７８】
加工、切片化、および染色に続いて、（固有の識別番号で）個々にラベルした切片を以下のスコア化法に基づいて採点した（Toth, J., et al., Evaluation of 70/30 poly (L-lactide-co-D,L-Iactide) for use as a resorbableinterbody fusion cage. Journal of
Neurosurgery: Spine, 2002. 97(4 Suppl): p.423-432; Sandhu, H.S., et al., Histologic evaluation of the efficacy of rhBMP-2 compared with autograft bone in sheep
spinal anterior interbodyfusion. Spine, 2002. 27(6): p.567575; Toth, J.M., Wang, M., Estes, B.T., Scifert, J.L., Seim, H.B., Turner, AS., Polyetheretherketoneas a biomaterial for spinal applications. Biomaterials, 2006. 27(3 (Special Issue)): p.324-334.）：
【０１７９】
総固定：５０％を超えるスライドが連続した骨架橋を示した。
【０１８０】
部分固定：５０％未満のスライドが連続した骨架橋を示した。
【０１８１】
無固定：連続した骨架橋無し。
【０１８２】
統計的手法
ノンパラメトリックデータ（マイクロＣＴおよび組織学的癒合スコア）については、順位での分散分析（ＡＮＯＶＡ ｏｎ ｒａｎｋｓ）とポストホックダン検定（Ｄｕｎｎ’ｓ
ｔｅｓｔ）で、パラメトリックデータ（総ボリューム分の骨ボリュームおよびミネラルの密度）については、一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とホルム‐シダック（Ｈｏｌｍ‐Ｓｉｄａｋ）ポストホックテストを使用して、処置群の比較を実施して、群間の差を決定した。
【０１８３】
結果
マイクロＣＴ
統計的分析により、群間で差があることが明らかになり（順位での分散分析（ＡＮＯＶＡ ｏｎ ｒａｎｋｓ）；ｐ＝０．０２１）、空（Ｅｍｐｔｙ）対照と比べて、ＡＢＧは有意に高い固定率を有した（ポストホックダン検定（Ｄｕｎｎ’ｓ ｔｅｓｔ）。自家移植片、ＡＢＧまたはＡＩＢＧの癒合スコアの間には、有意差は見られなかった。
【０１８４】
治療群は、少なくとも１つの固定成功標本を有した（２．００のスコア）。ＡＢＧ処置群およびＡＩＢＧ処置群ではともに、完全に固定されたとしてスコアを得た標本が６つあった一方で（表２）、空（Ｅｍｐｔｙ）群および自家移植片群ではそれぞれ２および３標本であった。
【０１８５】
各処置群についてのマイクロＣＴ癒合スコアのまとめを表１に示し、個々のマイクロＣＴ癒合スコアを表２に示す。各標本からの代表的なマイクロＣ画像を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【０１８６】
【表１】
2018161541.tif 000003
【０１８７】
【表２】
2018161541.tif 000004
ＰＥＥＫスペーサー内の総ボリューム分の骨ボリューム（ＢＶ／ＴＶ；％）の分析により、処置群の間に差がないことが明らかになった（一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、ｐ＝０．３０８）。各処置群についての値のまとめを表３に示し、個々のＢＶ／ＴＶ値を表４に示す。
【０１８８】
【表３】
2018161541.tif 000005
【０１８９】
【表４】
2018161541.tif 000006
【０１９０】
スペーサー内の骨の密度の分析により、処置群の間に差があることが明らかになった（一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜ ０．００１）。ＡＢＧ群での密度は、他の群（ポストホックホルム‐シダック（Ｈｏｌｍ‐Ｓｉｄａｋ）テスト）とくらべて高く、ＡＩＢＧおよび自家移植片では、密度は空（Ｅｍｐｔｙ）より低く、相互には差はなかった。個々の骨密度値（ｍｇＨＡ／ｃｍ３）を表５に示し、各群についての値のまとめを表６に示す。
【０１９１】
【表５】
2018161541.tif 000007
【０１９２】
【表６】
2018161541.tif 000008
【０１９３】
ＰＥＥＫスペーサー内の骨のミネラルの密度の詳細な分析（表７ならびに図２Ａおよび２Ｂ）より、ＡＢＧ処置標本が、恐らく残留β‐ＴＣＰに相当すると思われる、高いミネラルの密度（＞９００ｍｇＨＡ／ｃｍ３）の領域を示すことが明らかとなった。これらの領域は、ＡｌＢＧ処置標本では顕著ではなく、自家移植片処置標本にも空（Ｅｍｐｔｙ）標本にも存在しなかった。ＡＢＧ処置標本の物質密度は、正常な骨の物質密度の最もよく似たものである。表７は、自家移植片、ＡＢＧ、およびＡＩＢＧ処置群、ならびに新たに調製したＡＢＧおよびＡＩＢＧにおける密度の比較を示す。
【０１９４】
【表７】
2018161541.tif 000009
【０１９５】
組織学
統計的分析により、群間で差があることが明らかになり（順位での分散分析（ＡＮＯＶＡ ｏｎ ｒａｎｋｓ）；ｐ＝０．００８）、空（Ｅｍｐｔｙ）対照の癒合スコアと比べて、ＡＢＧ処置群の癒合スコアは有意に高かった（ポストホックダン検定（Ｄｕｎｎ’ｓ ｔｅｓｔ））。
【０１９６】
治療群は、少なくとも１つの固定成功標本を有した（２．００のスコア）。ＡＢＧ処置群では、完全に固定されたとしてスコアを得た標本が７つあり（表９）、ＡＩＢＧ処置群および自家移植片処置群では、この標本が５つあり、空（Ｅｍｐｔｙ）群では、１４標本中１つであった。また、空（Ｅｍｐｔｙ）群は、零点を付けられた標本があった唯一の群であった。各処置群からの代表的な組織画像を図３Ａおよび３Ｂに示す。ＡＢＧ処置群およびＡＩＢＧ処置群では、残留β‐ＴＣＰ 粒子を目で見ることができた。これらの粒子は、修復組織の特定の領域に選択的に位置しているではなく、ランダムに位置しているように見えた。粒子は、線維性被包の兆候なしに、骨に取り囲まれていた（図４）。幾つかのケースでは、β‐ＴＣＰ粒子は、固定が不成功であった領域で見られた。これは、ＡＢＧ処置群で２つの標本にあったケースであり、この領域で見られた粒子は、非常に大きいサイズであるように思われた。ＡＩＢＧ処置標本において固定しなかった領域の幾つかでは、軟骨組織が見つかり、そのうち１つの標本では、この組織は、β‐ＴＣＰ粒子のまわりに見られた。
【０１９７】
各処置群についての組織学的癒合スコアのまとめを表８に示し、個々の組織学的癒合スコアを表９に示す。
【０１９８】
【表８】
2018161541.tif 000010
【０１９９】
【表９】
2018161541.tif 000011
【０２００】
結論
ＡＢＧ処置標本は、評価された全群の中で、癒合スコアが最も高かった。ＡＢＧは、空のＰＥＥＫスペーサーに比較して、有意に椎体間脊椎固定を促進する。
【０２０１】
上に引用されたすべての特許、文献および要約は、参照によりそれら全体が本明細書に取り込まれる。前述の内容は本発明の好ましい実施形態にのみ関連し、数多くの変更および修正形態が、以下の特許請求の範囲に規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明中でなされうることを理解すべきである。
【図１Ａ】
2018161541.tif 000012
【図１Ｂ】
2018161541.tif 000013
【図２Ａ】
2018161541.tif 000014
【図２Ｂ】
2018161541.tif 000015
【図３Ａ】
2018161541.tif 000016
【図３Ｂ】
2018161541.tif 000017
【図４】
2018161541.tif 000018