(57)【要約】【課題】ＨＳＰ９０併用療法の提供。【解決手段】本発明の方法は、（ａ）試料中に存在する１種以上の癌経路成分が、ＨＳＰ９０阻害剤またはＨＳＰ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体に結合するような条件下で、対象由来の癌細胞を含有する試料を、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはＨｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と接触させるステップと、（ｂ）ＨＳＰ９０阻害剤またはＨＳＰ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と結合している経路成分を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において検出された経路成分を解析して、ステップ（ｂ）において検出された成分およびかかる経路の追加的な成分を包含する経路を同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された経路または経路成分の阻害剤を選択するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載されている発明は、少なくとも一部には、国立癌研究所（National Cancer Institute）、保健社会福祉省（Department of Health and HumanServices）の助成金番号ＲＯＩ  ＣＡ  １５５２２６の支援の下で為された。米国政府は、かかる対象発明のいずれに対しても権利を有する。
【０００２】
本願を通して、発行済および係属中の特許出願、刊行物その他を含む多数の公文書が同定されている。これら文書の全体は、これにより参照により本願に組み込まれており、当分野の当業者に知られている技術水準の定義に役立つ。
【背景技術】
【０００３】
癌細胞の悪性表現型を維持する分子異常を理解する必要が大きい。このような理解は、腫瘍促進分子のより選択的な標的化を可能にし、より有効でより毒性の低い抗癌治療の開発に役立つ。大部分の癌は、複数の分子病変から生じ、恐らくその結果生じる重複性は、シグナル伝達分子の特異的な阻害剤の活性を制限する。活性経路の阻害の組合せは、より優れた臨床成績の見込みがあるが、発癌性経路の包括的な同定は、現在達成できていない。
【０００４】
大規模ゲノム配列決定を包含するゲノミクス技術の適用は、様々な癌における多くの遺伝子突然変異の同定をもたらし、この疾患の複雑さを強調した（Ｌｅｙら、２００８；Ｐａｒｓｏｎｓら、２００８）。しかし、これらの遺伝学的解析は、腫瘍の遺伝的構成（make-up）に関する情報の提供に有用である一方、遺伝子欠損（複数可）の結果、異常に活性化されたシグナル伝達ネットワークの機能的な複雑さを解明する能力を本質的に欠く。よって、患者および病期特異的な様式で腫瘍固有の分子病変を同定するための相補的プロテオミクス方法論の開発が行われる必要がある。
【０００５】
多くのプロテオミクス戦略は、特定の腫瘍におけるタンパク質発現の測定に限定されており、病的状況に関連する新しいタンパク質の同定を可能にするが、このような知見の機能上の意義に関する情報を提供することができない（Ｈａｎａｓｈ＆Ｔａｇｕｃｈｉ、２０１０）。一部の機能情報は、特異的なタンパク質または翻訳後修飾に対する抗体を用いて、また、ある特定の酵素の活性部位に対する小分子を用いた活性に基づくタンパク質プロファイリングにより得ることができる（Ｋｏｌｃｈ＆Ｐｉｔｔ、２０１０；Ｎｏｍｕｒａら、２０１０；Ｂｒｅｈｍｅら、２００９；Ａｓｈｍａｎ＆Ｖｉｌｌａｒ、２００９）。これらの方法は、特異的な経路または翻訳後修飾の問い合わせに有用であることを立証した一方、悪性状態に関するより網羅的な情報の捕獲には同様に適していない（Ｈａｎａｓｈ＆Ｔａｇｕｃｈｉ、２０１０）。さらに、現在のプロテオミクス方法論は、費用および時間を要する。例えば、プロテオミクスアッセイは多くの場合、試料の高価なＳＩＬＡＣ標識または二次元ゲル分離を必要とする。
【０００６】
従って、悪性状態に関する重要な情報を捕獲する、より簡便でより対費用効果の高いプロテオミクス方法論の開発が必要である。分子シャペロンタンパク質である熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ９０）は、多くの腫瘍性タンパク質を疑似（pseudo）安定的状態に維持することが認識されているため（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）、Ｈｓｐ９０は、新しいプロテオミクス方法の開発における重要なタンパク質となり得る。
【０００７】
この仮説を支持するように、多数のタンパク質を活性的立体構造に適切にフォールドするよう機能するシャペロンタンパク質である熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ９０）は、形質転換した表現型の維持において重要な役割を果たすと認識される（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）。Ｈｓｐ９０およびその関連コシャペロンは、その多くが、細胞成長、分化、ＤＮＡ損傷応答および細胞生存を制御するシグナル伝達経路のエフェクターである、「クライアント（client）タンパク質」と総称される細胞タンパク質の正確な立体構造のフォールディングを補助する。よって、調節解除されたタンパク質（即ち、突然変異、異常発現、不適切な細胞移行等による）に対する腫瘍細胞の嗜好（addiction）は、Ｈｓｐ９０に決定的に依存性となり得る（Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）。Ｈｓｐ９０は、多くの細胞型および組織で発現されるが、Ｋａｍａｌらによる研究は、正常および癌細胞Ｈｓｐ９０間の重要な区別を実証した（Ｋａｍａｌら、２００３）。彼らは特に、腫瘍が、ある特定のＨｓｐ９０阻害剤に対し高い親和性を有する多シャペロン複合体形成したＨｓｐ９０により特徴付けられるが、正常組織は、これらの阻害剤に対し低い親和性を有する潜在型の複合体形成しないＨｓｐ９０を持つことを示した。
【０００８】
Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質の多くも、癌を包含する数種の疾病における疾患発症および進行において顕著な役割を果たす（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５、５、７６１；Ｗｏｒｋｍａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００７、１１１３、２０２；Ｌｕｏら、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  ２０１０、５、２４）。その結果、癌の治療におけるＨｓｐ９０阻害剤の適用にも高い関心がある（Ｔａｌｄｏｎｅら、Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００８、８、３７０；Ｊａｎｉｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２０１０、１５、３４２）。
【０００９】
上に説明した証拠に基づき、本出願人らは、Ｈｓｐ９０と関連する重要な腫瘍性タンパク質を同定することのできるプロテオミクスアプローチが、個々の腫瘍の生物学的仕組みへの網羅的洞察を提供することができ、新しい癌治療法の開発に向けた幅広い用途を有することができると仮定する。従って、本開示は、Ｈｓｐ９０と関連する腫瘍性タンパク質を同定するためのツールおよび方法を提供する。さらに、本開示は、癌患者の治療レジメンを同定するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、腫瘍において豊富なＨｓｐ９０複合体を標的化することができる小分子（例えば、Ｈｓｐ９０阻害剤）が、Ｈｓｐ９０依存性発癌性クライアントタンパク質の親和性捕獲に用いることができるという発見に関する。バイオインフォマティクス解析と組み合わせたその後の同定は、癌化特異的な病変の詳細な分子マップの作成を可能にする。このマップは、特定の特定の患者に最適に有効な併用療法の開発を導くことができる。大部分の抗癌剤が、遺伝子ではなくタンパク質を標的とする小分子であり、特異的な分子変化を標的化する多くの小分子が、現在医薬品開発中であるため、このような分子マップは、より一般的な遺伝子サインアプローチに優るある特定の利点を有する。
【００１１】
従って、本開示は、バイオインフォマティクス解析と統合されて発癌性タンパク質および経路を発見する、Ｈｓｐ９０阻害剤に基づくケミカルバイオロジー／プロテオミクスアプローチに関する。本出願人らは、本方法が、多くの重要なシグナル伝達ネットワークを含み、かつかなりの割合の機能的悪性プロテオームを表すと考えられる、悪性細胞におけるＨｓｐ９０依存性プロテオームの腫瘍毎の（tumor-by-tumor）網羅的概要を提供できることを示す。
【００１２】
本開示は、Ｈｓｐ９０依存性発癌性クライアントタンパク質を親和性捕獲することができる小分子プローブを提供する。その上、本開示は、Ｈｓｐ９０依存性発癌性クライアントタンパク質を親和性捕獲する分子プローブの能力を、バイオインフォマティクス経路解析と組み合わせた場合に、異なる種類の癌における調節不全化となったシグナル伝達ネットワークおよび重要な腫瘍性タンパク質を同定するプロテオミクスアプローチの設計に利用する方法を提供する。
【００１３】
一側面において、本開示は、プリンおよびプリン様（例えば、ＰＵ−Ｈ７１、ＭＰＣ−３１００、Ｄｅｂｉｏ  ０９３２）、イソオキサゾール（例えば、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２）およびインダゾール−４−オン（例えば、ＳＮＸ−２１１２）化学クラス（図３を参照）に基づくＨｓｐ９０阻害剤に由来する小分子プローブを提供する。一態様において、Ｈｓｐ９０阻害剤は、ＰＵ−Ｈ７１、８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（図３を参照）である。ＰＵ−Ｈ７１分子は、繋留（tether）またはリンカーを介して固体支持体（例えば、ビーズ）に連結されていてもよい。付着部位および繋留部の長さは、分子がＨｓｐ９０に対する高親和性を維持できることを確実にするよう選ばれた。特定の態様において、ＰＵ−Ｈ７１に基づく分子プローブは、図３０に示す構造を有する。固体支持体に付着したＨｓｐ９０阻害剤の他の態様を図３２〜３５および３８に示す。当業者であれば、該分子が、ハウスキーピングＨｓｐ９０複合体よりも発癌性Ｈｓｐ９０複合体種に対しより高い親和性を維持することを認識するであろう。２種のＨｓｐ９０種は、Ｍｏｕｌｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）において定義されている。Ｈｓｐ９０と結合すると、Ｈｓｐ９０阻害剤は、クライアントタンパク質結合立体構造でＨｓｐ９０を捕捉する。
【００１４】
別の側面において、本開示は、癌の発症および進行に関係する、Ｈｓｐ９０に会合する特異的な腫瘍性タンパク質を同定する方法を提供する。このような方法は、癌を患っている対象由来の癌細胞を含有する試料を、Ｈｓｐ９０の阻害剤に接触させることと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している腫瘍性タンパク質を検出することを含む。特定の態様において、Ｈｓｐ９０の阻害剤は、ビーズ等、固体支持体に連結されている。これらの態様において、固体支持体と結合しているＨｓｐ９０タンパク質に保持される腫瘍性タンパク質を緩衝液中に溶出させて、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付すことができ、溶出されたタンパク質は、従来の手段により分離および解析することができる。本方法の一部の態様において、腫瘍性タンパク質の検出は、質量分析の使用を含む。好都合なことには、本開示の方法は、試料の高価なＳＩＬＡＣ標識または二次元分離を必要としない。
【００１５】
本発明のある特定の態様において、経路成分の解析は、例えば、該成分のネットワークの成分を定義するためのバイオインフォマティクスコンピュータプログラムの使用を含む。
【００１６】
本開示の方法は、乳癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛がん、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞がん、絨毛がん、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝癌、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、メラノーマを含む皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎癌、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫を含むリンパ腫ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等が挙げられるがこれらに限定されない、様々な種類の癌に関連する腫瘍性タンパク質の決定に用いることができる。その上、本開示は、特定の癌に関連する調節不全となったシグナル伝達ネットワークを同定するためのプロテオミクス方法を提供する。加えて、本アプローチは、新たな腫瘍性タンパク質および機序の同定に用いることができる。
【００１７】
別の側面において、本開示の方法は、癌患者に対するオーダーメイド治療を設計するための合理的根拠の提供に用いることができる。癌に対するオーダーメイド治療のアプローチは、個々の癌患者が、疾患の発症および進行に寄与する異なる因子を有するとの前提に基づく。例えば、現在利用できる方法により決定された同一種類の癌の同一進行ステージの患者を考慮する場合であっても、異なる発癌性タンパク質および／または癌関係の経路は、疾患の発症およびその後の進行の原因となり得る。さらに、腫瘍性タンパク質および癌関係の経路は、多くの場合、疾患が進行するにつれ個々の癌患者において変化する。従って、癌治療レジメンは、理想的には、患者を個別化基盤で治療するよう標的化されるべきである。このような個別化アプローチの使用から決定された治療レジメンは、より低い毒性で、より少ない化学療法または放射線照射による抗腫瘍活性の増強を可能にする。
【００１８】
従って、一側面において、本開示は、癌患者の治療レジメンを個別化基盤で同定する方法を提供する。このような方法は、癌を患っている対象由来の癌細胞を含有する試料を、Ｈｓｐ９０の阻害剤と接触させることと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している腫瘍性タンパク質を検出することと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している腫瘍性タンパク質のうち少なくとも１種を標的とする癌治療法を選択することを含む。ある特定の側面において、薬物の組合せは、Ｈｓｐ９０と結合している腫瘍性タンパク質の同定後に選択することができる。本開示の方法は、乳癌、肺癌、脳癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛がん、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛がん、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝癌、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌ならびに腎癌等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の異なる癌に対する治療レジメンの同定に用いることができる。
【００１９】
別の側面において、本方法は、癌を患っている対象由来の癌細胞を含有する試料を、Ｈｓｐ９０の阻害剤と接触させることと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している腫瘍性タンパク質を検出することと、これら腫瘍性タンパク質に関連するタンパク質ネットワーク（複数可）を決定することと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している腫瘍性タンパク質のネットワークの分子のうち少なくとも１種を標的とする癌治療法を選択することを含む。
【００２０】
ある特定の側面において、薬物の組合せは、Ｈｓｐ９０と結合している腫瘍性タンパク質の同定後に選択することができる。他の側面において、薬物の組合せは、Ｈｓｐ９０と結合している腫瘍性タンパク質に関連するネットワークの同定後に選択することができる。本開示の方法は、乳癌、肺癌、脳癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛がん、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛がん、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝癌、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌ならびに腎癌等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の異なる癌に対する治療レジメンの同定に用いることができる。
【００２１】
本発明の一態様において、上述の方法を用いて癌患者に対するオーダーメイド治療レジメンが同定された後、選択された薬物または薬物の組合せが、患者に投与される。選択された薬物または薬物組合せを服用してから十分な長さの時間が経った後、患者から別の試料を採取することができ、本発明のアッセイを再度行って、患者の発癌性プロファイルが変化したか決定することができる。必要であれば、薬物（複数可）の投薬量を変化させてもよく、あるいは新たな治療レジメンを同定してもよい。従って、本開示は、癌患者の進行を経時的にモニタリングし、必要に応じて治療レジメンを変化させる方法を提供する。
【００２２】
別の側面において、本開示の方法は、Ｈｓｐ９０阻害剤に合わせて構築された、癌患者に対するオーダーメイドの組合せ療法を設計するための合理的根拠の提供に用いることができる。このような治療レジメンは、より低い毒性で、より少ない化学療法による抗腫瘍活性の増強を可能にし得る。数例のデータは、発癌性標的を阻害する完全性が、治療活性に決定的となり得ると同時に、腫瘍が適応して薬物耐性を進化させる能力を制限することを示唆するため、Ｈｓｐ９０および相補的腫瘍推進（tumor-driving）経路の標的化は、より優れた抗腫瘍戦略を提供し得る。
【００２３】
従って、本発明は、
（ａ）対象由来の癌細胞を含有する試料を、（ｉ）Ｈｓｐ９０が試料に存在する癌経路成分と結合している場合、かかるＨｓｐ９０に結合するＨｓｐ９０の阻害剤と、または（ｉｉ）かかるＨｓｐ９０が試料中のかかる癌経路成分と結合している場合、Ｈｓｐ９０に結合するかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と、接触させるステップと、
（ｂ）Ｈｓｐ９０と結合している経路成分を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において検出された経路成分を解析して、ステップ（ｂ）において検出された成分およびかかる経路の追加的な成分を包含する経路を同定するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された経路または経路成分の阻害剤を選択するステップと
を含む、癌を患っている対象にＨｓｐ９０の阻害剤と同時投与するための、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤を選択するための方法を提供する。
【００２４】
本発明に関連して、癌関係の経路は、表１に収載されている経路等、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセスまたは生物系に関与する経路である。
【００２５】
本発明の実施において、癌関係の経路または癌関係の経路の成分は、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫ならびに卵巣、子宮頸および子宮内膜癌を含む婦人科癌からなる群から選択される癌に関与する。例えば、癌関係の経路の成分および／または経路は、図１において同定されたいかなる成分であってもよい。
【００２６】
オーダーメイド医療に関与する好ましい態様において、ステップ（ａ）において、対象は、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤が投与される対象と同一の対象であるが、本発明は、ステップ（ａ）において、対象が、癌参照対象であることも企図する。
【００２７】
本発明の実施において、ステップ（ａ）において、試料は、いずれかの腫瘍組織またはいずれかの生体液、例えば、血液を含む。
【００２８】
本発明における使用に適した試料として、破壊された癌細胞、溶解された癌細胞および超音波処理された癌細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本発明の実施に関連して、対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤は、ステップ（ａ）において、（ａ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、または（ｂ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、Ｈｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体、と同一であっても、異なっていてもよい。
【００３０】
一態様において、対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤は、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の生物活性を有するＰＵ−Ｈ７１のアナログ、ホモログもしくは誘導体である。
【００３１】
別の一態様において、ＰＵ−Ｈ７１は、ステップ（ａ）において用いたＨｓｐ９０の阻害剤である、または用いたＨｓｐ９０の阻害剤、そのアナログ、ホモログもしくは誘導体である。あるいは、Ｈｓｐ９０の阻害剤は、図３に示す化合物からなる群から選択してもよい。
【００３２】
一態様において、ステップ（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはＨｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体は、好ましくは、ビーズ等、固体支持体に固定化されている。
【００３３】
ある特定の態様において、ステップ（ｂ）において、経路成分の検出は、質量分析の使用を含み、ステップ（ｃ）において、経路成分の解析は、バイオインフォマティクスコンピュータプログラムの使用を含む。
【００３４】
本発明の一例において、癌はリンパ腫であり、ステップ（ｃ）において同定される経路成分はＳｙｋである。別の一例において、癌は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であり、ステップ（ｃ）において同定される経路または経路成分は、図１５に示すネットワークのいずれかに示す経路または成分、例えば図１５において同定される次の経路成分の１種、即ち、ｍＴＯＲ、ＩＫＫ、ＭＥＫ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、Ｒａｆ−１、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＣＡＲＭ１またはｃ−ＭＹＣである。このような一例において、ステップ（ｃ）において同定される経路成分はｍＴＯＲであり、ステップ（ｄ）において選択される阻害剤はＰＰ２４２である。このような別の一例において、ステップ（ｃ）において同定される経路は、次の経路：ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ−、ＮＦκＢ−、ＭＡＰＫ−、ＳＴＡＴ−、ＦＡＫ−、ＭＹＣおよびＴＧＦ−βに媒介されるシグナル伝達経路から選択される経路である。さらに別の一例において、癌はリンパ腫であり、ステップ（ｃ）において同定される経路成分はＢｔｋである。さらにまた別の一例において、癌は膵癌であり、ステップ（ｃ）において同定される経路または経路成分は、図１６のネットワーク１〜１０のいずれかおよび図２４のネットワークに示す経路または経路成分である。別の一例において、ステップ（ｃ）において同定される経路または経路成分はｍＴＯＲであり、その一例において、ステップ（ｄ）において選択されるｍＴＯＲの阻害剤はＰＰ２４２である。本発明は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）癌関係の経路の成分の阻害剤、を同時投与することを含む、癌を患っている対象を治療する方法をさらに提供し、（Ｂ）において、必ずしもそうである必要はないが、本明細書に記載されている方法により選択してもよい。よって、本発明は、同時投与が、（Ａ）における阻害剤および（Ｂ）における阻害剤を同時に、付随的に、逐次的にまたは付属的に投与することを含む治療方法を提供する。癌を患っている対象を治療する方法の一例は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）Ｂｔｋの阻害剤を同時投与することを含む。癌を患っている対象を治療する方法の別の一例は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）Ｓｙｋの阻害剤を同時投与することを含む。このような方法において、癌は、リンパ腫であってよい。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を患っている対象を治療する方法の別の一例は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）ｍＴＯＲ、ＩＫＫ、ＭＥＫ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、Ｒａｆ−１、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＭＫＩＩまたはｃ−ＭＹＣのいずれかの阻害剤を同時投与することを含む。本発明の一態様において、（Ｂ）における阻害剤は、ｍＴＯＲの阻害剤である。上述の方法のさらに別の態様において、（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体の結合は、癌経路成分に結合した状態でＨｓｐ９０を捕捉する。さらにまた、本発明は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図１６および２４に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤を同時投与する���とを含む、膵癌を患っている対象を治療する方法を提供する。本発明は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図２２に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤を同時投与することを含む、乳癌を患っている対象を治療する方法も提供する。さらにまた、本発明は、対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図２３に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤を同時投与することを含む、リンパ腫を患っている対象を治療する方法を提供する。直前の（immediately preceeding）方法において、（Ｂ）における阻害剤はｍＴＯＲの阻害剤、例えばＰＰ２４２であってもよい。さらにまた、本発明は、対象にＣＡＲＭ１の阻害剤を投与することを含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を患っている対象を治療する方法を提供する。別の一態様において、本発明は、
（ａ）対象由来の癌細胞を含有する試料を、（ｉ）Ｈｓｐ９０が試料に存在する癌経路成分と結合している場合、かかるＨｓｐ９０に結合するＨｓｐ９０の阻害剤と、または（ｉｉ）かかるＨｓｐ９０が試料中の癌経路成分と結合している場合、Ｈｓｐ９０に結合するかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と、接触させることと、  （ｂ）Ｈｓｐ９０と結合している経路成分を検出して、これにより癌関係の経路または前記１種以上の経路成分を同定することと
を含む、癌を患っている対象における癌関係の経路または癌関係の経路の１種以上の成分を同定するための方法を提供する。本態様において、癌関係の経路または癌関係の経路の成分は、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫ならびに卵巣、子宮頸および子宮内膜癌を含む婦人科癌からなる群から選択されるいかなる癌に関与してもよい。さらに、ステップ（ａ）において、試料は、腫瘍組織または生体液、例えば、血液を含んでいてもよい。ある特定の態様において、ステップ（ａ）において、試料は、破壊された癌細胞、溶解された癌細胞または超音波処理された癌細胞を含んでいてもよい。しかし、他の形態の細胞が用いられてもよい。
【００３５】
本方法の実施において、Ｈｓｐ９０の阻害剤は、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１のアナログ、ホモログもしくは誘導体であってもよいが、ＰＵ−Ｈ７１が現在、好ましい阻害剤である。しかし、本発明の実施において、Ｈｓｐ９０の阻害剤は、図３に示す化合物からなる群から選択してもよい。一態様において、ステップ（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはＨｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体は、ビーズ等、固体支持体に固定化されているおよび／またはステップ（ｂ）において、経路成分の検出は、質量分析の使用を含むおよび／またはステップ（ｃ）において、経路成分の解析は、バイオインフォマティクスコンピュータプログラムの使用を含む。
【００３６】
本発明の望ましい一態様において、（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体の結合は、癌経路成分に結合した状態でＨｓｐ９０を捕捉する。
【００３７】
本発明は、ビーズ等、固体支持体に固定化されたＨｓｐ９０の阻害剤を含む、本方法を実施するためのキットをさらに提供する。通常、このようなキットは、対照ビーズ、緩衝溶液および使用説明書をさらに含む。本発明は、本明細書に記載されている方法に有用な、固体支持体に固定化されたＨｓｐ９０の阻害剤をさらに提供する。一例において、阻害剤はＰＵ−Ｈ７１である。別の側面において、本発明は、次の構造：
【化１】
2018153194.tif 000002
【００３８】
を有する化合物を提供する。
【００３９】
さらにまた、本発明は、記載の方法に従って癌関係の経路またはかかる経路の１種以上の成分を同定することと、次いで、かかる経路またはかかる成分の阻害剤を選択することとを含む、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤を選択するための方法を提供する。加えて、本発明は、記載の方法に従って阻害剤を選択することと、阻害剤を単独で、あるいは経路成分の阻害剤の投与に加えて対象に投与することとを含む、対象を治療する方法を提供する。より一般には、前記投与は、反復して行われる。さらにまた、経路成分の同定または阻害剤の選択に関して記載されている方法は、同一対象について少なくとも２回行われてよい。さらになお別の一態様において、本発明は、癌に関係する経路の成分であるバイオマーカーの変化を測定することを含む、Ｈｓｐ９０阻害剤による癌の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。例えば、用いたバイオマーカーは、本明細書に記載されている方法により同定される成分であってよい。加えて、本発明は、経路の成分であるバイオマーカーの変化をモニタリングすることを含む、Ｈｓｐ９０阻害剤と、Ｈｓｐ９０が阻害する癌に関係する経路の成分の第２の阻害剤の両方による癌の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。例えば、用いたバイオマーカーは、第２の阻害剤により阻害される経路の成分であってよい。最後に、本発明は、本明細書に記載されている方法により癌に関係する経路の成分を同定することを含む、癌の治療法のための新たな標的を同定するための方法であって、このように同定された成分が、かかる癌に以前には関係付けられていなかった方法を提供する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
（ａ）対象由来の癌細胞を含有する試料を、（ｉ）Ｈｓｐ９０が試料に存在する癌経路成分と結合している場合、かかるＨｓｐ９０に結合するＨｓｐ９０の阻害剤と、または（ｉｉ）かかるＨｓｐ９０が試料中のかかる癌経路成分と結合している場合、Ｈｓｐ９０に結合するかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と、接触させるステップと、
（ｂ）Ｈｓｐ９０と結合している経路成分を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において検出された経路成分を解析して、ステップ（ｂ）において検出された成分およびかかる経路の追加的な成分を包含する経路を同定するステップと、および
（ｄ）ステップ（ｃ）において同定された経路または経路成分の阻害剤を選択するステップとを含む、癌を患っている対象にＨｓｐ９０の阻害剤と同時投与するための、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤を選択するための方法。
（項目２）
癌関係の経路が、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセスまたは生物系に関与する経路である、項目１に記載の方法。
（項目３）
癌関係の経路が、表１に収載されている経路である、項目２に記載の方法。
（項目４）
癌関係の経路または癌関係の経路の成分が、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫ならびに卵巣、子宮頸および子宮内膜癌を含む婦人科癌からなる群から選択される癌に関与する、項目１に記載の方法。
（項目５）
癌関係の経路の成分および／または経路が、図１において同定される、項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）において、対象が、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤が投与される対象と同一の対象である、項目１に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ａ）において、対象が、癌参照対象である、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ａ）において、試料が、腫瘍組織を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ａ）において、試料が、生体液を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
生体液が血液である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ａ）において、試料が、破壊された癌細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
破壊された癌細胞が、溶解された癌細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
破壊された癌細胞が、超音波処理された癌細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤が、ステップ（ａ）において、（ａ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、または（ｂ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、Ｈｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体、と同一である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤が、ステップ（ａ）において、（ａ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、および（ｂ）用いたＨｓｐ９０の阻害剤、そのアナログ、ホモログまたは誘導体、とは異なる、項目１に記載の方法。
（項目１６）
対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１の生物活性を有するＰＵ−Ｈ７１のアナログ、ホモログもしくは誘導体である、項目１、１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
対象に投与されるＨｓｐ９０の阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ＰＵ−Ｈ７１が、ステップ（ａ）において用いたＨｓｐ９０の阻害剤である、または用いたＨｓｐ９０の阻害剤、そのアナログ、ホモログもしくは誘導体である、項目１、１
４または１５に記載の方法。
（項目１９）
Ｈｓｐ９０の阻害剤が、図３に示す化合物からなる群から選択される、項目１、１４または１５に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはＨｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体が、固体支持体に固定化されている、項目１に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｂ）において、経路成分の検出が、質量分析の使用を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｃ）において、経路成分の解析が、バイオインフォマティクスコンピュータプログラムの使用を含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
癌がリンパ腫であり、ステップ（ｃ）において同定される経路成分がＳｙｋである、項目１に記載の方法。
（項目２４）
癌が慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）であり、ステップ（ｃ）において同定される経路または経路成分が、図１５に示すネットワークのいずれかに示す経路または成分である、項目１に記載の方法。
（項目２５）
ステップ（ｃ）において同定される経路成分が、ｍＴＯＲ、ＩＫＫ、ＭＥＫ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、Ｒａｆ−１、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＣＡＲＭ１またはｃ−ＭＹＣである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｃ）において同定される経路成分がｍＴＯＲであり、ステップ（ｄ）において選択される阻害剤がＰＰ２４２である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
ステップ（ｃ）において同定される経路が、次の経路：ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ−、ＮＦκＢ−、ＭＡＰＫ−、ＳＴＡＴ−、ＦＡＫ−、ＭＹＣおよびＴＧＦ−βに媒介されるシグナル伝達経路から選択される経路である、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
癌がリンパ腫であり、ステップ（ｃ）において同定される経路成分がＢｔｋである、項目１に記載の方法。
（項目２９）
癌が膵癌であり、ステップ（ｃ）において同定される経路または経路成分が、図１６のネットワーク１〜１０のいずれかおよび図２４のネットワークに示す経路または経路成分である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
ステップ（ｃ）において同定される経路および経路成分がｍＴＯＲである、項目１に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ｄ）において選択されるｍＴＯＲの阻害剤が、ＰＰ２４２である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）癌関係の経路の成分の阻害剤を同時投与することを含む、癌を患っている対象を治療する方法。
（項目３３）
（Ｂ）における阻害剤が、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法により選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
同時投与が、（Ａ）における阻害剤および（Ｂ）における阻害剤を同時に、付随的に、逐次的にまたは付属的に投与することを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）Ｂｔｋの阻害剤を同時投与することを含む、癌を患っている対象を治療する方法。
（項目３６）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）Ｓｙｋの阻害剤を同時投与することを含む、癌を患っている対象を治療する方法。
（項目３７）
癌がリンパ腫である、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）ｍＴＯＲ、ＩＫＫ、ＭＥＫ、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、Ｒａｆ−１、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＭＫＩＩまたはｃ−ＭＹＣのいずれかの阻害剤、を同時投与することを含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を患っている対象を治療する方法。
（項目３９）
（Ｂ）における阻害剤が、ｍＴＯＲの阻害剤である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体の結合が、癌経路成分に結合した状態でＨｓｐ９０を捕捉する、項目１に記載の方法。
（項目４１）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図１６および２４に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤、を同時投与することを含む、膵癌を患っている対象を治療する方法。
（項目４２）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図２２に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤、を同時投与することを含む、乳癌を患っている対象を治療する方法。
（項目４３）
対象に、（Ａ）Ｈｓｐ９０の阻害剤および（Ｂ）図２３に示すネットワークのいずれかに示す経路または経路成分の阻害剤、を同時投与することを含む、リンパ腫を患っている対象を治療する方法。
（項目４４）
（Ｂ）における阻害剤がｍＴＯＲの阻害剤である、項目４１、４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
ｍＴＯＲの阻害剤がＰＰ２４２である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
対象にＣＡＲＭ１の阻害剤を投与することを含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を患っている対象を治療する方法。
（項目４７）
（ａ）対象由来の癌細胞を含有する試料を、（ｉ）Ｈｓｐ９０が試料に存在する癌経路成分と結合している場合、かかるＨｓｐ９０に結合するＨｓｐ９０の阻害剤と、または（ｉｉ）かかるＨｓｐ９０が試料中の癌経路成分と結合している場合、Ｈｓｐ９０に結合するかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体と、接触させることと、  （ｂ）Ｈｓｐ９０と結合している経路成分を検出することとを含み、これにより癌関係の経路または前記１種以上の経路成分を同定する、癌を患っている対象における癌関係の経路または癌関係の経路の１種以上の成分を同定するための方法。
（項目４８）
癌関係の経路または癌関係の経路の成分が、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫ならびに卵巣、子宮頸および子宮内膜癌を含む婦人科癌からなる群から選択される癌に関与する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ａ）において、試料が、腫瘍組織を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ａ）において、試料が、生体液を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
生体液が血液である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ａ）において、試料が、破壊された癌細胞を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
破壊された癌細胞が、溶解された癌細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
破壊された癌細胞が、超音波処理された癌細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
Ｈｓｐ９０の阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１またはＰＵ−Ｈ７１のアナログ、ホモログもしくは誘導体である、項目４７〜５４のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
Ｈｓｐ９０の阻害剤が、ＰＵ−Ｈ７１である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
Ｈｓｐ９０の阻害剤が、図３に示す化合物からなる群から選択される、項目４７〜５５のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはＨｓｐ９０の阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体が、固体支持体に固定化されている、項目４７〜５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
ステップ（ｂ）において、経路成分の検出が、質量分析の使用を含む、項目４７〜５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
ステップ（ｃ）において、経路成分の解析が、バイオインフォマティクスコンピュータプログラムの使用を含む、項目４７〜５９のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
（ａ）において、Ｈｓｐ９０の阻害剤またはかかるＨｓｐ９０阻害剤のアナログ、ホモログもしくは誘導体の結合が、癌経路成分に結合した状態でＨｓｐ９０を捕捉する、項目４７に記載の方法。
（項目６２）
固体支持体に固定化されたＨｓｐ９０の阻害剤を含む、項目１〜２２または４７〜６０のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
（項目６３）
対照ビーズ、緩衝溶液および使用説明書をさらに含む、項目６２に記載のキット。
（項目６４）
項目１または４７に記載の方法に有用な、固体支持体に固定化されたＨｓｐ９０の阻害剤。
（項目６５）
阻害剤がＰＵ−Ｈ７１である、項目６４に記載の阻害剤。
（項目６６）
固体支持体に固定化されたＰＵ−Ｈ７１。
（項目６７）
次の構造：
【化１】
2018153194.tif 000003
を有する化合物。
（項目６８）
項目４４に記載の方法に従って癌関係の経路またはかかる経路の１種以上の成分を同定することと、次いで、かかる経路またはかかる成分の阻害剤を選択することとを含む、癌関係の経路または癌関係の経路の成分の阻害剤を選択するための方法。
（項目６９）
項目６８に記載の方法に従って阻害剤を選択することと、前記阻害剤を対象に投与することを含む、対象を治療する方法。
（項目７０）
対象に前記阻害剤およびＨｓｐ９０の阻害剤を投与することをさらに含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記投与が反復して行われる、項目６８または項目６９に記載の方法。
（項目７２）
同一対象について少なくとも２回行われる、項目４７または６８に記載の方法。
（項目７３）
癌に関係する経路の成分であるバイオマーカーの変化を測定することを含む、Ｈｓｐ９０阻害剤による癌の治療の有効性をモニタリングするための方法。
（項目７４）  バイオマーカーが、項目４７に記載の方法により同定される成分である、項目７３
に記載の方法。
（項目７５）
経路の成分であるバイオマーカーの変化をモニタリングすることを含む、Ｈｓｐ９０阻害剤と、Ｈｓｐ９０が阻害する癌に関係する経路の成分の第２の阻害剤と、の両方による癌の治療の有効性をモニタリングするための方法。
（項目７６）
バイオマーカーが、第２の阻害剤により阻害される経路の成分である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
項目４７に記載の方法により癌に関係する経路の成分を同定することを含む、癌の治療法のための新たな標的を同定するための方法であって、このように同定された成分が、かかる癌に以前には関係付けられていなかった方法。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒトにおける例示的な癌関係の経路およびそれらの成分を示す図。
【図２】タンパク質キナーゼ阻害剤のいくつかの例を示す図。
【図３−１】ＰＵ−Ｈ７１およびいくつかの他の既知のＨｓｐ９０阻害剤の構造を示す図。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図３−５】図３−４の続き。
【図３−６】図３−５の続き。
【図４】ＰＵ−Ｈ７１は癌細胞において十分に豊富であるＨｓｐ９０の制限された断片と相互作用することを示す図。（ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物中のＨ９０１０、抗Ｈｓｐ９０抗体、枯渇Ｈｓｐ９０を用いた連続的な免疫精製ステップを示す図。溶解物＝対照細胞抽出物。（ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８抽出物由来のＨｓｐ９０を、連続的な化学および免疫精製ステップにより単離した図。各プールにおけるＨｓｐ９０の量を濃度測定により定量し、値を内部標準に正規化した。（ｃ）示した細胞中で131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１を用いて飽和研究を実施した図。全ての単離した細胞試料を計数し、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の特異的取り込みを求めた。これらのデータを131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットして飽和結合曲線を得た。４つの別々の反復の代表的データを提示する（下側）。示した細胞におけるＨｓｐ９０の発現をウエスタンブロットにより解析した（上側）。
【図５】ＰＵ−Ｈ７１は、腫瘍性タンパク質およびコシャペロンとの複合体中のＨｓｐ９０に対して選択的であり、それを単離することを示す図。（ａ）Ｋ５６２抽出物中のＨｓｐ９０複合体を、Ｈ９０１０、非特異的ＩｇＧを用いた、またはＰＵ−Ｈ７１−もしくは対照−ビーズによる沈殿により単離した図。対照ビーズは、エタノールアミン、Ｈｓｐ９０−不活性分子を含有する。プルダウン中のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。（ｂ、ｃ）示した単一または連続的な免疫および化学沈殿を、示した頻度でおよび示した順序においてＨ９０１０およびＰＵ−ビーズを有するＫ５６２抽出物中で実施した図。プルダウン中および残存上清中のタンパク質をＷＢにより解析した。ＮＳ＝非特異的。（ｄ）Ｋ５６２細胞を、ビヒクル（−）またはＰＵ−Ｈ７１（＋）を用いて２４時間処理し、タンパク質をウエスタンブロットにより解析した図。（ｅ）Ｈｓｐ７０−ノックダウン細胞中のタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析し（左）、タンパク質レベルの変化を相対蛍光単位（ＲＬＵ）で提示した（右）図。対照＝スクランブルｓｉＲＮＡ。（ｆ）示した連続的な化学沈殿を、示した頻度にておよび示した順序においてＧＭ−、ＳＮＸ−およびＮＶＰ−ビーズを含むＫ５６２抽出物中で実施した図。プルダウン中および残存上清中のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。（ｇ）Ｋ５６２細胞中のＨｓｐ９０が、異常なＢｃｒ−Ａｂｌと正常なｃ−Ａｂｌの両方のタンパク質との複合体中に存在する図。Ｈ９０１０ではなくＰＵ−Ｈ７１が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ腫瘍性タンパク質が結合しているＨｓｐ９０集団を選択する。
【図６−１】ＰＵ−Ｈ７１はＣＭＬ細胞中で異常シグナロソームを同定することを示す図。（ａ）タンパク質複合体を、Ｋ５６２抽出物とＰＵ−ビーズとをインキュベートすることによって化学沈殿により単離し、タンパク質の同定をＭＳにより調べた図。これらのタンパク質の中の結合性をＩＰＡにおいて解析し、タンパク質ネットワークを生成した。ＰＵ−ビーズにより同定したタンパク質ネットワーク（ネットワーク１から１３）は、既知の標準的な骨髄性白血病シグナル伝達（ＩＰＡにより提供される）と十分に重複する。同定したタンパク質ネットワークおよびタンパク質成分の詳細なリストを表５ｆおよび図１５に示す。（ｂ）ＰＵ−ビーズを強調している経路図が、ネットワーク１（Ｒａｆ−ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路）、２（ＮＦ−κＢ経路）および８（ＳＴＡＴ５−経路）に焦点を当てているＣＭＬシグナロソームを同定した図。同定したネットワークにおける重要なｎｏｄａｌタンパク質を黄色で表現する。（ｃ）ＭＳ結果をウエスタンブロットにより検証した図。（左）タンパク質複合体を、Ｋ５６２抽出物とＰＵ−または対照−ビーズとをインキュベートすることによって化学沈殿により単離し、タンパク質をウエスタンブロットにより解析した。タンパク質は対照−ビーズプルダウン中で検出せず、これらのデータは提示の簡潔さのために省略している。（右）Ｋ５６２細胞を、ビヒクル（−）またはＰＵ−Ｈ７１（＋）を用いて２４時間処理し、タンパク質をＷＢにより解析した。（ｄ）単一の化学沈殿を、ＰＵ−および対照−ビーズを含む一次ＣＭＬ細胞抽出物中で実施した。プルダウン中のタンパク質をＷＢにより解析した。
【図６−２】図６-１の続き。
【図７】ＰＵ−Ｈ７１が同定したタンパク質およびネットワークは悪性の表現型に重要なものであることを示す図。（ａ）Ｋ５６２細胞を、示した阻害剤を用いて７２時間処理し、細胞増殖をアラマーブルーアッセイにより解析した図。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として提示する。（ｂ）示した連続的な化学沈殿を、示した頻度にてＰＵ−ビーズを含むＫ５６２抽出物中で実施した図。プルダウン中および残存上清中のタンパク質をＷＢにより解析した。（ｃ）トリプタンブルー（左）またはアクリジンオレンジ／エチジウムブロマイド（右）染色を使用して細胞生存に対するＣＡＲＭ１ノックダウンの効果をＫ５６２細胞中で評価した図。（ｄ）選択した潜在的なＨｓｐ９０相互作用タンパク質の発現を、Ｋ５６２白血病およびＭｉａ−ＰａＣａ−２膵臓癌細胞中でＷＢにより解析した図。（ｅ）Ｋ５６２およびＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞抽出物からそれぞれＰＵ−ビーズ上で単離し、続いてＭＳにより同定した選択タンパク質を表にした図。＋＋＋、非常に高い；＋＋、高い；＋、中および−、なしと同定したペプチドをＭＳ解析において見出した。（ｆ）単一の化学沈殿を、ＰＵ−および対照−ビーズを含むＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞抽出物中で実施した図。プルダウン中のタンパク質をＷＢにより解析した。（ｇ）Ｍｉａ−ＰａＣａ−２細胞増殖に対する選択阻害剤の効果をパネル（ａ）のように解析した。
【図８】Ｈｓｐ９０はＣＭＬ中で増強されたＳＴＡＴ５活性を促進することを示す図。（ａ）Ｋ５６２細胞を、ＰＵ−Ｈ７１（５μＭ）、グリベック（０．５μＭ）またはＤＭＳＯ（ビヒクル）を用いて、示した時間処理し、タンパク質をＷＢにより解析した図。（ｂ）連続的な化学沈殿を、示したＰＵ−および対照−ビーズを含むＫ５６２細胞中で実施した図。プルダウン中および残存上清中のタンパク質をＷＢにより解析した。（ｃ）ビヒクルまたはＰＵ−Ｈ７１で前処理した細胞からのＳＴＡＴ５免疫複合体を、トリプシンを用いて、示した時間処理し、タンパク質をＷＢにより解析した図。（ｄ）Ｋ５６２細胞を、ＰＵ−Ｈ７１（５μＭ）の存在下および非存在下でバナジウム酸塩（１ｍＭ）を用いて、示した時間処理した図。タンパク質をＷＢにより解析し（上側）、濃度測定により定量し、処理時間に対してグラフ化した（下側）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として提示する。（ｅ）ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂのＤＮＡ結合能を、示した濃度のＰＵ−Ｈ７１を用いて、２４時間処理したＫ５６２細胞中でＥＬＩＳＡベースのアッセイによって評価した図。（ｆ）定量的クロマチン免疫沈降アッセイ（ＱＣｈＩＰ）を、２つの既知のＳＴＡＴ５標的遺伝子（ＣＣＮＤ２およびＭＹＣ）についてＳＴＡＴ５またはＨｓｐ９０抗体対ＩｇＧ対照を用いて実施した図。遺伝子間領域を増幅するプライマーを陰性対照として使用した。結果は、それぞれのＩｇＧ対照にわたって特異的抗体（ＳＴＡＴ５またはＨｓｐ９０）についてのインプットの割合として表す。（ｇ）ＣＣＮＤ２およびＭＹＣの転写産物量を、１μＭのＰＵ−Ｈ７１に曝露したＫ５６２細胞中でＱＰＣＲにより測定した図。結果はベースライン（時間０ｈ）と比較した倍変化として表し、ＲＰＬ１３Ａに正規化した。ＨＰＲＴを陰性対照として使用した。実験を５倍の生物製剤中で、２回の実験で実施した。データは平均±ＳＥＭとして提示する。（ｈ）提案した機構およびＣＭＬ中のＨｓｐ９０により促進された増加したＳＴＡＴ５シグナル伝達を示す図。Ｈｓｐ９０は、ＳＴＡＴ５の立体配座に結合し、影響を与え、ＳＴＡＴ５を含有する転写複合体内で、直接、活性立体配座にＳＴＡＴ５を維持する。
【図９】腫瘍癌タンパク質を調査するための化学プロテオミクス法の概略図。Ｈｓｐ９０は癌細胞中で生化学的に異なった複合体を形成する。癌細胞Ｈｓｐ９０の主要画分は、正常細胞（緑）と同様の「ハウスキーピング」シャペロン機能を保持しているが、癌細胞中で濃縮または増殖した機能的に異なったＨｓｐ９０プールは、腫瘍細胞生存（黄）を維持するのに必要な発癌性タンパク質と特異的に相互作用する。ＰＵ−Ｈ７１は、Ｈｓｐ９０と特異的に相互作用し、ＷＴタンパク質（緑）／Ｈｓｐ９０種ではなく、腫瘍性タンパク質（黄）／Ｈｓｐ９０種を優先的に選択し、クライアント結合立体配座においてＨｓｐ９０を捕捉する。従って、ＰＵ−Ｈ７１ビーズを使用して、癌タンパク質／Ｈｓｐ９０種を単離できる。開始ステップにおいて、癌細胞抽出物をＰＵ−Ｈ７１ビーズ（１）とインキュベートする。この開始の化学沈殿ステップは、ＰＵ−ビーズが結合したＨｓｐ９０複合体の一部として異常なタンパク質集団を精製し、濃縮する（２）。次いでＰＵ−ビーズプルダウンからのタンパク質カーゴをＳＤＳ緩衝液中で溶出し、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し（３）、次いで分離したタンパク質を抽出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析のためにトリプシン処理する（４）。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを使用して開始タンパク質同定を実施し、Ｓｃａｆｆｏｌｄプロテオームソフトウェアを使用してさらに評価する（５）。次いでＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して、同定したタンパク質から生物学的ネットワークを構築する（６、７）。生成したタンパク質ネットワークマップは、特異的腫瘍に最適に効果的な個別治療を開発するための貴重なテンプレートを提供する。方法は、（ａ）腫瘍毎（ｔｕｍｏｒ−ｂｙ−ｔｕｍｏｒ）の様式で分子変化のマップを確立でき、（ｂ）新規癌タンパク質および癌機構を同定でき、（ｃ）Ｈｓｐ９０に相補的な治療標的を同定でき、合理的な組合せ標的治療を開発でき、（ｄ）Ｈｓｐ９０治療から利益を得る可能性のある患者を選択するため、および臨床試験の間、Ｈｓｐ９０阻害剤有効性の薬理学をモニターするための腫瘍特異的バイオマーカーを同定できる。
【図１０】（ａ、ｂ）乳癌およびＣＭＬ細胞抽出物（１２０μｇ）由来のＨｓｐ９０を、示した一連の化学および免疫精製ステップにより単離した図。上清を単離して残余のＨｓｐ９０を解析した。各画分中のＨｓｐ９０をウエスタンブロットにより解析した。溶解物＝内因性タンパク質含有量；ＰＵ−、ＧＭ−および対照−ビーズは特定のビーズ上で単離されたタンパク質を示す。Ｈ９０１０およびＩｇＧは特定のＡｂにより単離されたタンパク質を示す。対照ビーズはＨｓｐ９０不活性分子を含有する。データは多重反復実験（ｎ≧２）から得たものと一致する。（ｃ）連続化学−および免疫−精製ステップを末梢血白血球（ＰＢＬ）抽出物（２５０μｇ）中で実施してＰＵ−Ｈ７１およびＨ９０１０特異的Ｈｓｐ９０種を単離した図。全ての試料をウエスタンブロットにより解析した。（上側）。ＰＢＬ中のＨｓｐ９０に対する結合を、Ｈｓｐ９０−ＰＥ抗体およびＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣを使用してフローサイトメトリーにより評価した。ＦＩＴＣ−ＴＥＧ＝非特異的結合についての対照（下側）。
【図１１】（ａ）正常細胞内で、Ｈｓｐ９０の構成的発現が、細胞内タンパク質をそれらの適切な細胞内コンパートメント（「ハウスキーピング複合体」）へ折り畳み、転移するその進化的に保存されたハウスキーピング機能に必要とされる図。悪性転換時に、細胞内タンパク質は、不正確な細胞内コンパートメントまたは他の手段における突然変異、活動亢進、保持により乱される。これらの機能的に変化したタンパク質の存在は、悪性の表現型を開始し、維持するのに必要とされ、それは、ストレス修飾性Ｈｓｐ９０（「発癌複合体」）のサブセットにより特異的に維持されるこれらの発癌性タンパク質である。ＰＵ−Ｈ７１は、発癌性タンパク質（「発癌性複合体」）に介添するＨｓｐ９０の画分に特異的に結合する。（ｂ）Ｈｓｐ９０およびその相互作用するコシャペロンを、ＰＵ−および対照−ビーズ、ならびにＨ９０１０およびＩｇＧ−固定化Ａｂｓを使用してＫ５６２細胞抽出物中で単離した図。対照ビーズはＨｓｐ９０不活性分子を含有する。（ｃ）Ｋ５６２細胞抽出物からＨｓｐ９０を、Ｈ９０１０  Ｈｓｐ９０特異的抗体を用いて３つの連続した免疫精製ステップにより単離した図。残存上清を単離して、残余のタンパク質を解析した。各画分中のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。溶解物＝内因性タンパク質含有量。データは多重反復実験（ｎ≧２）から得たものと一致する。
【図１２】ＧＭおよびＰＵ−Ｈ７１は異常タンパク質／Ｈｓｐ９０種に選択的であることを示す図。（ａ）一定容積のＰＵ−Ｈ７１ビーズ（８０μＬ）を、示した量のＫ５６２細胞溶解物（左）を用いて調べた実験、または一定量の溶解物（１ｍｇ）を、示した容積のＰＵ−Ｈ７１ビーズ（右）を用いて調べた実験において、Ｂｃｒ−ＡｂｌおよびＡｂｌが結合したＨｓｐ９０種をモニターした図。（ｂ）（左）ＰＵ−およびＧＭ−ビーズ（８０μＬ）は、ＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞抽出物（３００μｇ）中のＨｓｐ９０−突然変異体Ｂ−Ｒａｆ複合体を認識するが、正常な結腸線維芽細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ抽出物（３００μｇ）中に見出されたＨｓｐ９０−ＷＴ  Ｂ−Ｒａｆ複合体と相互作用しない図。Ｈ９０１０  Ｈｓｐ９０  Ａｂは、両方のＨｓｐ９０種を認識する。（ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物（３００μｇ）において、ＰＵ−およびＧＭ−ビーズ（８０μｌ）は、ＨＥＲ３およびＲａｆ−１キナーゼと相互作用するが、非発癌チロシン−タンパク質キナーゼＣＳＫ、ｃ−Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼ、およびｐ３８と相互作用しない図。（ｄ）（右）ＰＵ−ビーズ（８０μＬ）は、ｖ−Ｓｒｃ／Ｈｓｐ９０と相互作用するが、ｃ−Ｓｒｃ／Ｈｓｐ９０種と相互作用しない図。ｃ−Ｓｒｃ検出を促進するために、ｖ−Ｓｒｃ形質転換３Ｔ３細胞（２５０μｇ）と比較して、ｖ−Ｓｒｃより少量のタンパク質、３Ｔ３細胞溶解物（１，０００μｇ）を発現する多量のｃ−Ｓｒｃを使用し、３Ｔ３細胞中で検出した、より高いＨｓｐ９０レベルに対する解釈を提供する（溶解物、３Ｔ３線維芽細胞対ｖ−Ｓｒｃ  ３Ｔ３線維芽細胞）。溶解物＝内因性タンパク質含有量；ＰＵ−、ＧＭ−および対照−ビーズは特定のビーズ上で単離したタンパク質を示す。Ｈｓｐ９０  ＡｂおよびＩｇＧは特定のＡｂにより単離したタンパク質を示す。対照ビーズはＨｓｐ９０不活性分子を含有する。データは多重反復実験（ｎ≧２）から得たものと一致する。
【図１３】単一の化学沈殿を、ＰＵ−および対照−ビーズを用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現するＣＭＬ細胞株（ａ）および一次ＣＭＬ細胞抽出物（ｂ）において実施した図。プルダウン中のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。いくつかのＢｃｒ−Ａｂｌ分解産物が、報告されている（Ｄｉｅｒｏｖら、２００４）ように一次ＣＭＬ試料中に示される。Ｎ／Ａ＝入手不可。
【図１４】ＰＵ−Ｈ７１はＨｓｐ９０に選択的であることを示す図。（ａ）いくつかのＨｓｐ９０阻害剤ビーズ−プルダウンのクマシー染色したゲルの図。Ｋ５６２溶解物（６０μｇ）を、２５μＬの示したビーズとインキュベートした。示した緩衝液で洗浄した後、プルダウン中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付与した。（ｂ）ＰＵ−Ｈ７１（１０μＭ）を、３５９キナーゼに対してｓｃａｎＭＡＸスクリーン（Ａｍｂｉｔ）中で試験した。ＰＵ−Ｈ７１についてのＴＲＥＥｓｐｏｔ（商標）相互作用マップを提示する。ＳＮＡＲＫ（ＮＵＡＫファミリーＳＮＦ１様キナーゼ２）（キナーゼツリー上の赤い点）のみが、小分子の潜在的な低親和性キナーゼヒットのように見える。
【図１５ａ】ＰＵ−ビーズで濃縮し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアの使用によりバイオインフォマティクス経路解析によって生成した場合のトップスコアのネットワークを示す図。Ｋ５６２慢性骨髄白血病細胞において解析を実施した。（ａ）ネットワーク１、スコア＝３８、ｍＴＯＲ／ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ経路を示す図。（ｂ）ネットワーク２、スコア＝３６、ＮＦκＢ経路を示す図。（ｃ）ネットワーク８、スコア＝１４、ＳＴＡＴ経路を示す図。（ｄ）ネットワーク１２、スコア＝１３、焦点接着ネットワークを示す図。（ｅ）ネットワーク７、スコア＝２２、ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子により駆動される経路を示す図。（ｆ）ネットワーク１０、スコア＝１８、ＴＧＦβ経路を示す図。２またはそれより高いスコアは偶然のみにより生成されない少なくとも９９％の信頼度を有する。
【００４１】
遺伝子発現、細胞周期および細胞集合個体タンパク質は節点として表示し、タンパク質がこの研究において同定したことを表すために灰色を利用する。ＩＰＡのみにより同定されるタンパク質は白色の節点として表す。異なる形状を使用して遺伝子産物の機能別のクラスを表す。タンパク質は、ネットワークにおいて、実体が複合体の一部である場合、２つの円として、１つのみのユニットが存在する場合、１つの円として、ホスファターゼまたはキナーゼをそれぞれ表現するために上または下に向いている三角形として、転写因子を表現するために水平楕円形により、および「他の」機能を表現するために円により示す。端部は節点間の関係の性質を表現する：矢じりを有する端部は、タンパク質Ａがタンパク質Ｂに作用することを意味するのに対して、矢じりを有さない端部は、２つのタンパク質間の結合のみを表す。直接相互作用は、ネットワーク図において、実線のように見えるのに対して、間接相互作用は破線のように見える。一部の場合、関係は、１つの分子に由来し、同じ分子に戻る円形矢印または線として存在し得る。このような関係は「自己参照」と称され、それ自体に作用する分子の能力に起因する。
【図１５ｂ】図１５ａの続き。
【図１５ｃ】図１５ｂの続き。
【図１５ｄ】図１５ｃの続き。
【図１５ｅ】図１５ｄの続き。
【図１５ｆ】図１５ｅの続き。
【図１６ａ】ＰＵ−ビーズで濃縮し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアの使用によるバイオインフォマティクス経路解析によって生成したトップスコアネットワークを示す図。ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞において解析を実施した。
【図１６ｂ】図１６ａの続き。
【図１６ｃ】図１６ｂの続き。
【図１６ｄ】図１６ｃの続き。
【図１６ｅ】図１６ｄの続き。
【図１６ｆ】図１６ｅの続き。
【図１６ｇ】図１６ｆの続き。
【図１６ｈ】図１６ｇの続き。
【図１６ｉ】図１６ｈの続き。
【図１６ｊ】図１６ｉの続き。
【図１７】ｍＴＯＲ阻害剤ＰＰ２４２はＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞中でＨｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１と相乗作用することを示す図。膵臓細胞（Ｍｉａ−ＰａＣａ−２）を７２時間、単一薬剤またはＰＰ２４２とＰＵ−Ｈ７１との組合せを用いて処理し、アラマーブルーアッセイにより細胞毒性を決定した。Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法を使用して薬物組合せ研究における相乗作用および／または拮抗作用のコンピュータシミュレーションを解析した。（ａ）中央値−効果方程式において、ｆａは、影響を受けた細胞の分率、例えばわずかな阻害であり、ｆｕ＝（１−ｆａ）は、影響を受けていない細胞の分率であり、Ｄはｆａを生じるのに必要な用量である図。（ｂ）実際の実験データに基づいて、全範囲の効果レベル（Ｆａ）についての一連のＣＩ値を計算して、Ｆａ−ＣＩプロットを生成した図。ＣＩ＜１、＝１、および＞１は、それぞれ相乗作用、相加効果、および拮抗作用を示す。（ｃ）正規化した用量の薬物１（ＰＵ−Ｈ７１）および薬物２（ＰＰ２４２）を示す正規化したアイソボログラムを示す図。ＰＵ＝ＰＵ−Ｈ７１、ＰＰ＝ＰＰ２４２。
【００４２】
ｍＴＯＲとＨｓｐ９０阻害剤との間の相乗作用の定量的解析：ｐｐ２４２（ｍＴＯＲ阻害剤）とＰＵ−Ｈ７１（Ｈｓｐ９０阻害剤）との間の薬物間相互作用を決定するため、以前に記載された通りにＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの併用指数（ＣＩ）アイソボログラム方法を用いた。質量作用の法則の中央値−効果原理に基づくこの方法は、コンピュータシミュレーションにより、各薬物の機序に関係なく２種以上の薬物組合せの相乗作用または拮抗作用を定量する。アルゴリズムに基づいて、コンピュータソフトウェアは、中央値−効果プロット、併用指数プロットおよび正規化したアイソボログラム（２種の薬物の非定率的組合せが用いられる場合）を表示する。ＰＵ−Ｈ７１（０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１２５μＭ）およびｐｐ２４２（０．５、０．１２５、０．０３１２５、０．０００８、０．００２、０．００１μＭ）を、言及されている濃度の単剤として、または非定率の組合せとして（ＰＵ−Ｈ７１：ｐｐ２４２；１：１、１：２、１：４、１：７．８、１：１５．６、１：１２．５）用いた。式Ｆａ＝１−Ｆｕを用いてＦａ（死滅細胞分率）を計算した；Ｆｕは影響を受けていない細胞の分率であり、コンピュータソフトウェア（ＣｏｍｐｕＳｙｎ、米国ニュージャージー州パラマス）を用いた用量効果解析に用いた。
【図１８】Ｂｃｌ−６はＢｃｌ−６依存性ＤＬＢＣＬ細胞中のＨｓｐ９０のクライアントであり、Ｈｓｐ９０阻害剤とＢｃｌ−６阻害剤との組合せは各阻害剤単独より有効であることを示す図。ａ）示した濃度のＰＵ−Ｈ７１を用いて細胞を２４時間処理し、タンパク質をウエスタンブロットにより解析した図。ｂ）ＰＵ−Ｈ７１ビーズは、Ｈｓｐ９０が核中のＢｃｌ−６と相互作用することを示す図。ｃ）Ｈｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１とＢｃｌ−６阻害剤ＲＩ−ＢＰＩとの組合せが、各阻害剤単独よりＢｃｌ−６依存性ＤＬＢＣＬ細胞においてより有効である図。
【図１９】本発明の方法の数回の反復が、方法の頑強性（ｒｏｂｕｓｔｍｅｎｓｓ）および正確性を実証し、検証するためにＯＣＩ−Ｌｙ１細胞における主要経路としてＢ細胞受容体ネットワークを同定する図。
【図２０】ＯＣＩ−ＬＹ１およびＯＣＩ−ＬＹ７  ＤＬＢＣＬ細胞におけるＨｓｐ９０依存性ネットワークとしてのＢ細胞受容体ネットワークの検証を示す図。ａ）Ｈｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１を用いて細胞を処理し、タンパク質をウエスタンブロットにより解析した図。ｂ）ＰＵ−Ｈ７１ビーズは、Ｈｓｐ９０がＯＣＩ−ＬＹ１およびＯＣＩ−ＬＹ７  ＤＬＢＣＬ細胞中のＢＴＫおよびＳＹＫと相互作用することを示す図。ｃ）Ｈｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１とＳＹＫ阻害剤Ｒ４０６との組合せは、Ｂｃｌ−６依存性ＯＣＩ−ＬＹ１、ＯＣＩ−ＬＹ７、各阻害剤単独よりＦａｒａｇｅおよびＳＵＤＨＬ６  ＤＬＢＣＬ細胞においてより有効である図。
【図２１】ＣＡＭＫＩＩ阻害剤ＫＮ９３およびｍＴＯＲ阻害剤ＰＰ２４２は、Ｋ５６２ＣＭＬ細胞においてＨｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１と相乗作用する図。
【図２２ａ】ＰＵ−ビーズで濃縮し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアの使用によりバイオインフォマティクス経路解析によって生成した場合のトップスコアネットワークを示す図。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８トリプルネガティブ乳癌細胞において解析を実施した。方法により同定した主要なシグナル伝達ネットワークは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＮＲＦ２−媒介性酸化的ストレス応答性、ＭＹＣ、ＰＫＡおよびＩＬ−６シグナル伝達経路であった。（ａ）ＰＵ−ビーズプロテオミクスおよびバイオインフォマティクス法によりＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞において同定したネットワークの簡略図。（ｂ）ＩＬ−６経路を示す図。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞においてＰＵ−ビーズ法により同定した重要なネットワーク成分を灰色で示す。
【図２２ｂ】図２２ａの続き。
【図２３ａ】ＰＵ−ビーズで濃縮し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアの使用によりバイオインフォマティクス経路解析によって生成した場合のトップスコアネットワークを示す図。ＯＣＩ−Ｌｙ１びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞において解析を実施した。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株ＯＣＩ−ＬＹ１において、方法により同定した主要なシグナル伝達ネットワークは、Ｂ受容体、ＰＫＣｔｅｔａ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＣＤ４０、ＣＤ２８およびＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路であった。（ａ）Ｂ細胞受容体経路を示す図。ＰＵ−ビーズ法により同定した重要なネットワーク成分を灰色で示す。（ｂ）ＣＤ４０シグナル伝達経路を示す図。ＰＵ−ビーズ法により同定した重要なネットワーク成分を灰色で示す。（ｃ）ＣＤ２８シグナル伝達経路を示す図。ＰＵ−ビーズ法により同定した重要なネットワーク成分を灰色で示す。
【図２３ｂ】図２３ａの続き。
【図２３ｃ】図２３ｂの続き。
【図２４ａ】ＰＵ−ビーズで濃縮し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアの使用によりバイオインフォマティクス経路解析によって生成した場合のトップスコアネットワークを示す図。Ｍｉａ−ＰａＣａ−２膵臓癌細胞において解析を実施した。（ａ）ＰＵ−ビーズがＭｉａ−ＰａＣａ−２癌細胞中で異常シグナロソームを同定する図。タンパク質経路の中で、ＰＵ−ビーズにより同定したのは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ＮＦｋＢ−経路、ＴＧＦ−ベータ経路、Ｗｎｔ−ベータ−カテニン経路、ＰＫＡ−経路、ＳＴＡＴ３−経路、ＪＮＫ−経路およびＲａｃ−ｃｄｃ４２−ｒａｓ−ＥＲＫ経路のものである。（ｂ）細胞周期−Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡがチェックポイント調節を損傷する図。ＰＵ−ビーズ法により同定した重要なネットワーク成分を灰色で示す。
【図２４ｂ】図２４ａの続き。
【図２５】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（上側パネル）およびＨＣＣ１９３７（下側パネル）乳癌細胞のクローン原性生存の阻害においてＰＵ−Ｈ７１がＰＡＲＰ阻害剤オラパリブと相乗作用をする図。
【図２６】Ｈｓｐ９０阻害剤の構造を示す図。
【図２７】Ａ）Ｈｓｐ９０α（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＦＷＺ）とＰＵ−Ｈ７１（球棒モデル）および化合物５（管モデル）との相互作用を示す図。Ｂ）Ｈｓｐ９０α（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＣＩ）とＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（球棒モデル）および化合物１０（管モデル）との相互作用を示す図。Ｃ）Ｈｓｐ９０α（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｄ０Ｂ）と化合物２７（球棒モデル）および化合物２０（管モデル）との相互作用を示す図。水素結合は黄色の点線として示し、重要な活性部位アミノ酸残基および水分子は棒として表す。
【図２８】Ａ）Ｋ５６２抽出物（２５０μｇ）中のＨｓｐ９０を、ＰＵ−、ＳＮＸ−およびＮＶＰ−ビーズまたは対照−ビーズ（８０μＬ）を用いた沈殿により単離した図。対照ビーズは２−メトキシエチルアミン、Ｈｓｐ９０−不活性分子を含有する。プルダウン中のタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物（３００μｇ）において、ＰＵ−ビーズが、その癌−クライアントタンパク質（ｏｎｃｏ−ｃｌｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｃ−ＫｉｔおよびＩＧＦ−ＩＲとの複合体中のＨｓｐ９０を単離する図。Ｈｓｐ９０癌−クライアントタンパク質の定常状態レベルに対するＰＵ−Ｈ７１の効果を評価するために、ＰＵ−Ｈ７１（５μＭ）を用いて細胞を２４時間処理した。Ｃ）Ｋ５６２細胞抽出物において、ＰＵ−ビーズ（４０μＬ）が、Ｒａｆ−１およびＢｃｒ−Ａｂｌ腫瘍性タンパク質との複合体中のＨｓｐ９０を単離する図。溶解物＝内因性タンパク質含有量；ＰＵ−および対照−ビーズは特定のビーズ上で単離したタンパク質を示す。データは多重反復実験（ｎ≧２）から得たものと一致する。
【図２９】Ａ）ＪＮＰＬ３マウス、アルツハイマー病トランスジェニックマウスモデルの脳由来のＨｓｐ９０を含有するタンパク質複合体を、ストレプトアビジンで固定化したＰＵ−Ｈ７１−ビオチン構築物または対照ストレプトアビジンで固定化したＤ−ビオチンを含有するビーズを用いた化学沈殿により単離した図。異常タウ種を矢印により示す。ｃ１、ｃ２およびｓ１、ｓ２、皮質および皮質下脳ホモジネートをそれぞれ、６カ月齢のメスのＪＮＰＬ３マウスから抽出した（右）。脳溶解物タンパク質含有量のウエスタンブロット解析（左）。Ｂ）ＰＵ−Ｈ７１−ビオチンにより検出した場合のＭＶ４−１１白血病細胞中の細胞表面Ｈｓｐ９０を示す図。データは多重反復実験（ｎ≧２）から得たものと一致する。
【図３０】ＰＵ−Ｈ７１ビーズ（６）の合成を示す図。
【図３１】ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン（７）の合成を示す図。
【図３２】ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２ビーズ（１１）の合成を示す図。
【図３３】ＳＮＸ−２１１２ビーズ（２１）の合成を示す図。
【図３４】ＳＮＸ−２１１２の合成を示す図。
【図３５】プリンおよびプリン様Ｈｓｐ９０阻害剤ビーズの合成を示す図。ピリミジンとイミダゾピリジン（即ちＸ＝ＮまたはＣＨ）種類の阻害剤の両方を記載している。試薬および条件：（ａ）Ｃｓ2ＣＯ3、１，２−ジブロモエタンまたは１，３−ジブロモプロパン、ＤＭＦ、室温；（ｂ）ＮＨ2（ＣＨ2）6ＮＨＢｏｃ、ＤＭＦ、室温、２４時間；（ｃ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間；（ｄ）Ａｆｆｉｇｅｌ−１０、ＤＩＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ。
【００４３】
９−（２−ブロモエチル）−８−（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（２ａ）。ＤＭＦ（０．６ｍＬ）中の１ａ（２９ｍｇ、０．０８７８ｍｍｏｌ）、Ｃｓ2ＣＯ3（４２．９ｍｇ、０．１３１７ｍｍｏｌ）、１，２−ジブロモエタン（８２．５ｍｇ、３７．８μＬ、０．４３９ｍｍｏｌ）を室温にて１．５時間撹拌した。次いでさらなるＣｓ2ＣＯ3（１４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに２０分間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥させ、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）により精製して２ａ（２４ｍｇ、６３％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3/MeOH-d4)δ 8.24 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.96 (s, 2H), 4.62 (t, J = 6.9 Hz,2H), 3.68 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.70 (s, 6H); MS (ESI) m/z 437.2/439.1 [M+H]+.
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（（２−（６−アミノ−８−（（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ヘキシル）カルバメート（３ａ）。ＤＭＦ（７ｍＬ）中の２ａ（０．１８５ｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル６−アミノヘキシルカルバメート（０．９１５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を２４時間室温にて撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：７：３］にかけて０．２０６ｇ（８５％）の３ａを得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５７３．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００４４】
（４ａ）。３ａ（０．２５８ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これをＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の２５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×５０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２２５μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（０．０８５ｇ、９７μｌ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（９：１、４×５０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５０ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×５０ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ４ａを−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【００４５】
９−（３−ブロモプロピル）−８−（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（２ｂ）。ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１ａ（６０ｍｇ、０．１８１８ｍｍｏｌ）、Ｃｓ2ＣＯ3（８８．８ｍｇ、０．２７２７ｍｍｏｌ）、１，３−ジブロモプロパン（１８４ｍｇ、９３μＬ、０．９０９ｍｍｏｌ）を室温にて４０分間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥させ、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）により精製して２ｂ（６０ｍｇ、７３％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.26 (s, 1H), 6.84 (br s, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 4.35(t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.37 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.68 (s, 6H), 2.34 (m, 2H); MS(ESI) m/z 451.1/453.1 [M+H]+.
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（（３−（６−アミノ−８−（（６−ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）アミノ）ヘキシル）カルバメート（３ｂ）。ＤＭＦ（７ｍＬ）中の２ｂ（０．１９０ｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル６−アミノヘキシルカルバメート（０．９１５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：７：３］にかけて０．２１８ｇ（８８％）の３ｂを得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５８７．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００４６】
（４ｂ）。３ｂ（０．２６４ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これをＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の２５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×５０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２２５μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（０．０８５ｇ、９７μＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（９：１、４×５０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５０ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×５０ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ４ｂを−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【００４７】
１−（２−ブロモエチル）−２−（（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−アミン（５ａ）。ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１ｂ（２５２ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ2ＣＯ3（３７３ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）、１，２−ジブロモエタン（７１８ｍｇ、３２９μＬ、３．８２ｍｍｏｌ）を室温にて１．５時間撹拌した。次いでさらなるＣｓ2ＣＯ3（１２４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに２０分間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥させ、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、１０：１）により精製して５ａ（２１１ｍｇ、６３％）を得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４３６．０／４３８．０［Ｍ＋Ｈ］+。
【００４８】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（（２−（４−アミノ−２−（（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）エチル）アミノ）ヘキシル）カルバメート（６ａ）。ＤＭＦ（７ｍＬ）中の５ａ（０．１８４ｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル６−アミノヘキシルカルバメート（０．９１５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：７：３］にかけて０．１０９ｇ（４５％）の６ａを得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５７２．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００４９】
（７ａ）。６ａ（０．２５７ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ
（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これをＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の２５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌビーズ（予め洗浄した、３×５０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２２５μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（０．０８５ｇ、９７μｌ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（９：１、４×５０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５０ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×５０ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ７ａを−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【００５０】
７ａについて上記に記載したものと同様にビーズ７ｂを調製した。
【図３６】ビオチン化プリンおよびプリン様Ｈｓｐ９０阻害剤の合成を示す図。試薬および条件：（ａ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン、ＤＭＦ、室温。
【００５１】
（８ａ）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の２ａ（３．８ｍｇ、０．００８６ｍｍｏｌ）およびＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン（５．４ｍｇ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１］にかけて２．３ｍｇ（３５％）の８ａを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ７７５．２［Ｍ＋Ｈ］+。
【００５２】
（９ａ）。ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の５ａ（３．７ｍｇ、０．００８６ｍｍｏｌ）およびＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン（５．４ｍｇ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１］にかけて１．８ｍｇ（２７％）の９ａを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ７７４．２［Ｍ＋Ｈ］+。
【００５３】
ビオチン化化合物８ｂおよび９ｂをそれぞれ２ｂおよび５ｂと同様に調製した。
【図３７】ビオチン化プリンおよびプリン様Ｈｓｐ９０阻害剤の合成を示す図。試薬および条件：（ａ）Ｎ−（２−ブロモエチル）−フタルイミドまたはＮ−（３−ブロモプロピル）−フタルイミド、Ｃｓ2ＣＯ3、ＤＭＦ、室温；（ｂ）ヒドラジン水和物、ＭｅＯＨ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温；（ｃ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温；（ｄ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温。
【００５４】
２−（３−（６−アミノ−８−（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）イソインドリン−１，３−ジオン。ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の１ａ（０．７２０ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）、Ｃｓ2ＣＯ3（０．８５１ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、２−（３−ブロモプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（２．０５ｇ、７．６４ｍｍｏｌ）を室温にて２時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１５：１：０．５）により精製して０．７２ｇ（６３％）の標題化合物を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3/MeOH-d4):δ 8.16 (s, 1H), 7.85-7.87 (m, 2H), 7.74-7.75 (m, 2H), 6.87 (s, 1H), 6.71 (s,1H), 5.88 (s, 2H), 4.37 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.69 (s,6H), 2.37-2.42 (m, 2H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ 計算値C25H24N7O4S,518.1610; 実測値518.1601.
９−（３−アミノプロピル）−８−（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１０ｂ）。ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（４ｍＬ：２８ｍＬ）中の２−（３−（６−アミノ−８−（６−（ジメチルアミノ）ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（０．７２ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、ヒドラジン水和物（２．８６ｇ、２．７８ｍＬ、２０．７５ｍｍｏｌ）を室温にて２時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、２０：１）により精製して４３０ｍｇ（８０％）の１０ｂを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ６．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ６．４９  （ｓ，  １Ｈ），  ５．９１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．８５  （ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ），  ４．３０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６９  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．６５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．８９−１．９５  （ｍ，  ２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １５４．５，  １５３．１，  １５１．７，  １４８．１，  １４７．２，  １４６．４，  １４４．８，  １２０．２，  １２０．１，  １０９．３，  １０９．２，  １０１．７，  ４５．３，  ４５．２，  ４０．９，  ３８．６，  ３３．３；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値Ｃ１７Ｈ２２Ｎ７Ｏ２Ｓ，  ３８８．１５５６；  実測値３８８．１５４４。
【００５５】
（１２ｂ）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の１０ｂ（１３．６ｍｇ、０．０３５２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（２２．０ｍｇ、０．０３８７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．１ｍｇ、１２．３μＬ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製して２２．７ｍｇ（７７％）の１２ｂを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ８４０．２［Ｍ＋Ｈ］+。
【００５６】
（１４ｂ）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の１０ｂ（１４．５ｍｇ、０．０３７４ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン（２４．２ｍｇ、０．０４１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．７ｍｇ、１３μＬ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製して、２４．１ｍｇ（７５％）の１４ｂを得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ８６１．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００５７】
ビオチン化化合物１２ａ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１５ａおよび１５ｂを、１２ｂおよび１４ｂについて記載されているものと同様に調製した。
【図３８】Ｄｅｂｉｏ０９３２タイプのビーズの合成を示す図。試薬および条件：（ａ）Ｃｓ2ＣＯ3、ＤＭＦ、室温；（ｂ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温；（ｃ）６−（ＢＯＣ−アミノ）カプロン酸、ＥＤＣＩ、ＤＭＡＰ、室温、２時間；（ｄ）Ａｆｆｉｇｅｌ−１０、ＤＩＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ。
【００５８】
８−（（６−ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−９−（２−（ピペリジン−４−イル）エチル）−９Ｈ−プリン−６−アミン（１８）。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１６（３００ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）、Ｃｓ2ＣＯ3（５３４ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）、１７（７１８ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を室温にて１．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下で乾燥させ、クロマトグラフ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、１０：１］にかけてＢｏｃ−保護Ｎ９／Ｎ３異性体の混合物を得た。２０ｍＬのＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）を室温にて加え、６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥させ、分取ＨＰＬＣにより精製して１８（８７ｍｇ、２２％）を得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４７７．０［Ｍ＋Ｈ］+。
【００５９】
６−アミノ−１−（４−（２−（６−アミノ−８−（（６−ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）チオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）ピペリジン−１−イル）ヘキサン−１−オン（１９）。ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍｌ）中の１８（１５０ｍｇ、０．３１４ｍｍｏｌ）の混合物に、６−（Ｂｏｃ−アミノ）カプロン酸（１４５ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１２０ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．９ｍｇ、０．０１５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮して、残渣を分取ＴＬＣ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１５：１］により精製して１６１ｍｇ（７４％）の１９を得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ６９０．１［Ｍ＋Ｈ］+。
【００６０】
（２０）。１９（０．２６４ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これをＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の２５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×５０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２２５μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（０．０８５ｇ、９７μｌ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（９：１、４×５０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５０ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×５０ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ２０を−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【図３９】ビオチンに結合したＤｅｂｉｏ０９３２の合成を示す図。試薬および条件：（ａ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、３５℃；（ｂ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、３５℃。
【００６１】
（２１）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の１８（１３．９ｍｇ、０．０２９２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（１８．２ｍｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７．５ｍｇ、１０．２μＬ、０．０５８４ｍｍｏｌ）を３５℃にて６時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製して７．０ｍｇ（２６％）の２１を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ９２９．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００６２】
（２２）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の１８（１３．９ｍｇ、０．０２９２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン（１８．９ｍｇ、０．０３２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（７．５ｍｇ、１０．２μＬ、０．０５８４ｍｍｏｌ）を３５℃にて６時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製して８．４ｍｇ（３０％）の２２を得た；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ９５０．２［Ｍ＋Ｈ］+。
【図４０】ビオチンに結合したＳＮＸ  ２１１２タイプのＨｓｐ９０阻害剤の合成を示す図。試薬および条件：（ａ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温；（ｂ）ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、室温。
【００６３】
（２４）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の２３（１６．３ｍｇ、０．０３５２ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（２２．０ｍｇ、０．０３８７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．１ｍｇ、１２．３μＬ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、１０：１）により精製して２６．５ｍｇ（８２％）の２４を得た；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ９１６．４［Ｍ＋Ｈ］+。
【００６４】
（２５）。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の２３（１７．３ｍｇ、０．０３７４ｍｍｏｌ）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン（２４．２ｍｇ、０．０４１１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．７ｍｇ、１３μＬ、０．０７０４ｍｍｏｌ）を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ、１０：１）により精製して３０．１ｍｇ（７８％）の２５を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ９３７．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本開示は、癌の発症および進行に関係する、Ｈｓｐ９０と関連する癌関係の経路および癌関係の経路の特異的な成分（例えば、腫瘍性タンパク質）を同定する方法を提供する。このような方法は、癌を患っている対象由来の癌細胞を含有する試料をＨｓｐ９０の阻害剤と接触させることと、Ｈｓｐ９０の阻害剤と結合している癌関係の経路の成分を検出することを含む。
【００６６】
本明細書において、ある特定の用語は、次の通り、かかる用語それぞれに続いて説明される意味を有する。
【００６７】
「癌関係の経路」は、その変動が、細胞の正常から癌表現型への形質転換に関与する任意の分子経路を意味する。癌関係の経路は、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセスおよび生物系に関与する経路を包含してよい。多くのこのような経路のリストは、表１に表記されており、このような経路に関するより詳細な情報は、オンラインにおけるＫＥＧＧ経路データベースおよび国立癌研究所の経路相互作用データベース（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に見出すことができよう。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ベバリー；ＢｉｏＣａｒｔａ、カリフォルニア州サンディエゴ；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッドのウェブサイトも参照されたい。加えて、図１は、癌に関与すると認識される経路を描写する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2018153194.tif 000009
【表１−７】
2018153194.tif 000010
【表１−８】
2018153194.tif 000011
【表１−９】
2018153194.tif 000012
【表１−１０】
2018153194.tif 000013
【表１−１１】
2018153194.tif 000014
【００６８】
「癌関係の経路の成分」とは、癌関係の経路に位置する分子実体であって、経路の阻害と、経路に関連し経路における活性に起因した癌表現型の変化とを達成するために標的化され得る分子実体を意味する。このような成分の例として、図１に収載されている成分が挙げられる。
【００６９】
「癌関係の経路の成分の阻害剤」は、癌関係の経路または癌関係の経路の成分と相互作用して、経路の阻害と、経路における活性に起因した癌表現型の変化とを達成する化合物（Ｈｓｐ９０の阻害剤以外の）を意味する。特異的な成分の阻害剤の例は広く知られている。単なる例として、次の米国特許および米国特許出願公開は、次に挙げる経路成分の阻害剤の例を記載する。
【００７０】
ＳＹＫ：米国特許出願公開第２００９／０２９８８２３（Ａ１）号、第２０１０／０１５２１５９（Ａ１）号、第２０１０／０３１６６４９（Ａ１）号明細書ＢＴＫ：米国特許第６，１６０，０１０号明細書；米国特許出願公開第２００６／０１６７０９０（Ａ１）号、第２０１１／０００８２５７（Ａ１）号明細書ＥＧＦＲ：米国特許第５，７６０，０４１号；第７，４８８，８２３（Ｂ２）号；第７，５４７，７８１（Ｂ２）号明細書ｍＴＯＲ：米国特許第７，５０４，３９７（Ｂ２）号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００１５１９７（Ａ１）号明細書ＭＥＴ：米国特許第７，０３７，９０９（Ｂ２）号明細書；米国特許出願公開第２００５／０１０７３９１（Ａ１）号、第２００６／０００９４９３（Ａ１）号明細書ＭＥＫ：米国特許第６，７０３，４２０（Ｂ１）号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２８７７３７（Ａ１）号明細書ＶＥＧＦＲ：米国特許第７，７９０，７２９（Ｂ２）号明細書；米国特許出願公開第２００５／０２３４１１５（Ａ１）号、第２００６／００７４０５６（Ａ１）号明細書ＰＴＥＮ：米国特許出願公開第２００７／０２０３０９８（Ａ１）号、第２０１０／０１１３５１５（Ａ１）号明細書ＰＫＣ：米国特許第５，５５２，３９６号；第７，６４８，９８９（Ｂ２）号明細書Ｂｃｒ−Ａｂｌ：米国特許第７，６２５，８９４（Ｂ２）号明細書；米国特許出願公開第２００６／０２３５００６（Ａ１）号明細書
さらにまた、数例のプロテインキナーゼの阻害剤を図２に示す。
【００７１】
「Ｈｓｐ９０の阻害剤」は、シャペロン、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）と相互作用し、その活性を阻害する化合物を意味する。ＰＵ−Ｈ７１を包含する数種の公知のＨｓｐ９０阻害剤の構造を図３に示す。多くの追加的なＨｓｐ９０阻害剤が記載されてきた。例えば、米国特許第７，８２０，６５８（Ｂ２）号；第７，８３４，１８１（Ｂ２）号；および第７，９０６，６５７（Ｂ２）号明細書を参照されたい。次の文献も参照されたい。
【００７２】
Ｈａｒｄｉｋ  Ｊ  Ｐａｔｅｌ、Ｓｈａｎｕ  Ｍｏｄｉ、Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｃｈｉｏｓｉｓ、Ｔｏｎｙ  Ｔａｌｄｏｎｅ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１１年５月、６巻、５号、５５９〜５８７頁：５５９〜５８７；Ｐｏｒｔｅｒ  ＪＲ、Ｆｒｉｔｚ  ＣＣ、Ｄｅｐｅｗ  ＫＭ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１０年６月；１４（３）：４１２〜２０；Ｊａｎｉｎ  ＹＬ．ＡＴＰａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０，  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅａｓｏｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２０１０年５月；１５（９〜１０）：３４２〜５３；Ｔａｌｄｏｎｅ  Ｔ、Ｃｈｉｏｓｉｓ  Ｇ．Ｐｕｒｉｎｅ−ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｈｓｐ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００９年；９（１５）：１４３６〜４６；およびＴａｌｄｏｎｅ  Ｔ、Ｓｕｎ  Ｗ、Ｃｈｉｏｓｉｓ  Ｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００９年３月１５日；１７（６）：２２２５〜３５。
【００７３】
小分子Ｈｓｐ９０プローブ
固体支持体への小分子の付着は、その標的および標的の相互作用パートナーの探索に非常に有用な方法である。実際に、固体支持体に付着させたゲルダナマイシンは、その標的としてＨｓｐ９０の同定を可能にした。恐らく、このような化学プローブの設計における最も重大な側面は、小分子リガンドの付着に適切な部位を決定し、分子と固体支持体との間に適切なリンカーを設計することである。Ｈｓｐ９０化学プローブを設計するための本出願人らの戦略は、いくつかのステップを必要とする。第一に、最適なリンカー長およびそのＨｓｐ９０リガンドへの付着部位を検証するために、リンカー修飾リガンドを、適切なＸ線結晶構造のＨｓｐ９０αにドッキングさせた。第二に、癌細胞抽出物に由来するＨｓｐ９０との競合的結合を測定する蛍光偏光（ＦＰ）アッセイにおいて、リンカー修飾リガンドを評価した。このアッセイは、ＦＰ最適化Ｈｓｐ９０リガンドとしてＣｙ３ｂ標識ゲルダナマイシンを用いる（Ｄｕら、２００７）。これらのステップは、固体支持体に固定化された分子が、Ｈｓｐ９０に対し強い親和性を維持することを確実にするために重要である。最後に、リンカー修飾小分子を固体支持体に付着させ、そのＨｓｐ９０との相互作用を、Ｈｓｐ９０含有細胞抽出物とのインキュベーションにより検証した。
【００７４】
プローブが、その癌−クライアントタンパク質と複合体形成したＨｓｐ９０の同定に必要とされる場合、さらに別の重要な要件は、（１．）プローブが、「発癌性Ｈｓｐ９０種」に対する選択性を保持し、（２．）Ｈｓｐ９０との結合後に、プローブが、Ｈｓｐ９０をクライアントタンパク質と結合した立体構造にロックすることである。「発癌性Ｈｓｐ９０」の概念は、本願および図１１においてさらに定義されている。
【００７５】
プローブが、その癌−クライアントタンパク質と複合体形成したＨｓｐ９０の、質量分析技法による同定に必要とされる場合、さらに別の重要な要件は、（１．）プローブが、十分なタンパク質材料を単離し、（２．）それぞれＨｓｐ９０腫瘍クライアントおよび非特異的に樹脂結合したタンパク質の量により定義されるシグナルノイズ比（signal to ratio）が十分に大きく、質量分析により同定可能となることである。本願は、このようなプローブの作製の例を提供する。
【００７６】
本出願人らは、リガンド付着のためにＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０（ＢｉｏＲａｄ）を選んだ。このアガロースビーズは、１０Ｃスペーサー腕（arm）の末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有し、その結果、各リンカーは、遠心性アミン官能性を含有するよう設計された。ＰＵ−Ｈ７１へのリンカー付着部位は、ヒトＨｓｐ９０αのＮ末端ドメインと結合しているその共結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＦＷＺ）により補助された。この構造は、プリンのＮ９アミンがタンパク質と直接接触せず、溶媒に向けられていることを示す（図２７Ａ）（Ｉｍｍｏｒｍｉｎｏら、２００６）。同様に、以前のＳＡＲは、これが以前に水溶性化の化学基の導入に用いられたために、魅力的な部位であることを示した（Ｈｅら、２００６）。化合物５（ＰＵ−Ｈ７１−Ｃ6リンカー）を設計し、Ｈｓｐ９０活性部位にドッキングさせた（図２７Ａ）。ＰＵ−Ｈ７１の相互作用は全て保存されており、コンピュータモデルは、リンカーが溶媒曝露領域に向かって方向づけられたことを明示した。従って、固体支持体への付着のための直接前駆物質として化合物５を合成した（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、図３０を参照）。ＦＰアッセイにおいて、５は、Ｈｓｐ９０に対する親和性を保持しており（ＩＣ50＝１９．８ｎＭ、ＰＵ−Ｈ７１に対する２２．４ｎＭと比較、表８）、この結果から、次に、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０への付着による固体支持体に固定化されたＰＵ−Ｈ７１プローブ（６）の合成へと、自信を持って進むことができた（図３０）。
【００７７】
本出願人らは、ビオチン化されたＰＵ−Ｈ７１誘導体も設計した。固体支持された薬剤に優るビオチン化された薬剤の一利点は、細胞またはｉｎ  ｖｉｖｏ系において直接的にプローブ結合に用いることができる点である。その後、リガンド−Ｈｓｐ９０複合体は、ビオチンと結合するアビジンまたはストレプトアビジン含有ビーズにおいて捕獲することができる。通常、このプロセスは、細胞抽出物からの化学沈殿に伴う非特異的な結合を低下させる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験において、標識されたストレプトアビジンコンジュゲート（即ち、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジン）の使用により、活性部位（この場合はＨｓｐ９０）の存在は、特異的な組織（即ち、癌における腫瘍体積）において検出することができる。ビオチニル−３，６，９−トリオキサウンデカンジアミン（trioxaundecanediamine）（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン）と２との反応により、ビオチン化ＰＵ−Ｈ７１（７）を得た（図３１）。７は、Ｈｓｐ９０に対する親和性を保持し（ＩＣ50＝６７．１ｎＭ）、親和性精製のためにストレプトアビジンと相互作用することができる露出したビオチンを含有する。
【００７８】
Ｈｓｐ９０αとＮＶＰ−ＡＵＹ９２２の利用できる共結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＣＩ、図２７Ｂ）およびＨｓｐ９０αと関連する３，４−ジアリールピラゾールの共結晶構造と共に、ＳＡＲから、４−アリール環のパラ位における置換基に対する相当な寛容性が存在したことは明らかであった（Ｂｒｏｕｇｈら、２００８；Ｃｈｅｕｎｇら、２００５；Ｄｙｍｏｃｋら、２００５；Ｂａｒｒｉｌら、２００６）。４−アリール置換基の大部分は、溶媒に向けられており、パラ位における置換は、結合親和性に殆ど影響がないと思われるため、本出願人らは、この位置で分子を固体支持体に付着させることを決断した。付着を達成するために、モルフォリン基を１，６−ジアミノヘキシル基に変えて、固体支持体への付着のための直接前駆物質として１０を得た。活性部位への１０のドッキング（図２７Ｂ）は、これによりＮＶＰ−ＡＵＹ９２２の全相互作用が維持され、リンカーが溶媒曝露領域に方向づけられていることを示す。結合アッセイにおいて１０を検査したところ、これも、親和性を保持しており（ＩＣ50＝７．０ｎＭ、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２の４．１ｎＭと比較、表８）、その後、固体支持体への付着に用いた（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、図３２を参照）。
【００７９】
Ｈｓｐ９０とＳＮＸ−２１１２の共結晶構造は公開されていないが、Ｈｓｐ９０αと結合している関連テトラヒドロ−４Ｈ−カルバゾール−４−オン（２７）の共結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｄ０Ｂ、図２７Ｃ）は公開されている（Ｂａｒｔａら、２００８）。これは、報告された２７のＳＡＲと共に、トランス−４−アミノシクロヘキサノール置換基のヒドロキシルへのリンカー付着を示唆する。エステル結合による６−アミノ−カプロン酸の直接的な付着は、溶解物混合物における遍在するエステラーゼによるこのような結合の潜在的不安定性のため、望ましいとは考えられない。従って、ヒドロキシルをアミノに置換して、トランス−１，４−ジアミノシクロヘキサン誘導体１８を得た（図３３）。このような変化は、ＳＮＸ−２１１２と比較して、効力のほぼ１４分の１の減少をもたらした（表８）。６−（Ｂｏｃ−アミノ）カプロン酸を１８に付着させ、脱保護した後に、ビーズへの付着のための直接前駆物質として２０を得た（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、図３３を参照）。ドッキングは、２０が、同様に２７と相互作用し（図２７Ｃ）、リンカーが、溶媒曝露領域に方向づけられていることを示唆した。２０は、Ｈｓｐ９０に対し優れた親和性（ＩＣ50＝２４．７ｎＭ、ＳＮＸ−２１１２の１５．１ｎＭおよび１８の２１０．１ｎＭと比較、表８）を有し、１８により失われた親和性のほぼ全てを回復したことが決定された。化合物２０（−Ｃ＝Ｏ、図２７Ｃ）およびＳＮＸ−２１１２（−ＯＨ、図示せず）は、Ｌｙｓ５８の側鎖アミノと水素結合を形成するため、１８と、２０とＳＮＸ−２１１２の両方との間の活性における差は、本出願人らの結合モデルにより十分に説明される。１８は、強塩基性アミノ基を含有し、Ｌｙｓ５８側鎖（ＮＨ2、図示せず）と水素結合を形成することができない。このことは、この位置における塩基性アミンが好まれないというＨｕａｎｇらによる観察と十分に一致する。ＳＮＸ−２１１２のヒドロキシルと同様に、２０のアミド結合は、１８の塩基性アミノを、Ｌｙｓ５８とのＨ結合アクセプターとして作用することができる非塩基性アミド基に転換する。
【００８０】
ＰＵ−Ｈ７１ビーズ（６）の合成は、図３０に示されており、１，３−ジブロモプロパンによる８−アリールスルファニルプリン（１）（Ｈｅら、２００６）の９−アルキル化で始まり、２を３５％収率で生じる。２の生成における低収率は、主として不可避の競合する３−アルキル化に起因し得る。５当量の１，３−ジブロモプロパンを用いて、１の完全な反応を確実にし、二量体形成等、低収率に寄与し得る他の望ましくない副反応を制限した。２を、ｔｅｒｔ−ブチル６−アミノヘキシルカルバメート（３）と反応させて、Ｂｏｃ保護されたアミノプリン４を９０％収率で得た。ＴＦＡにより脱保護し、続いてＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０と反応させて、６を得た。２をＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチンと反応させることにより、ビオチン化ＰＵ−Ｈ７１（７）も合成した（図３１）。
【００８１】
アルデヒド８（Ｂｒｏｕｇｈら、２００８）からＮＶＰ−ＡＵＹ９２２ビーズ（１１）の合成を図３２に示す。７５％収率で、Ｂｏｃ基の検出可能な損失を生じず、３による８の還元的アミノ化から９を得た。ＢＣｌ3により、一段階でＢｏｃとベンジル保護基の両方を除去して、イソキサゾール１０を７８％収率で得て、続いてこれをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０と反応させて、１１を得た。
【００８２】
ＳＮＸ−２１１２ビーズ（２１）の合成は、図３３に示されており、化合物１７および１８は、特許文献（Ｓｅｒｅｎｅｘら、２００８、国際公開第２００８１３０８７９（Ａ２）号パンフレット；Ｓｅｒｅｎｅｘら、２００８、米国特許出願公開第２００８０２６９１９３（Ａ１）号明細書）に参照されているが、そのどちらも適切に特性評価されておらず、その合成も十分には説明されていない。従って、本出願人らは、その合成を詳細に説明することには価値があると感じた。ジメドン（１３）によるトシルヒドラジド（１２）の縮合から、トシルヒドラゾン１４を８９％収率で得た。トリフルオロ無水酢酸（trifluroacetic anhydride）処理により生成された中間体トリフルオロアシル誘導体の塩基促進性環化縮合後に、１４からテトラヒドロインダゾロン１５へのワンポット転換が５５％収率で生じた。ＤＭＦにおいて１５を２−ブロモ−４−フルオロベンゾニトリルと反応させて、１６を９１％収率で得た。アリール化はＮ１で選択的に生じるため、この反応の位置選択性に留意すると興味深い。１５と同様のインダゾール−４−オンの計算的研究において、１Ｈと２Ｈ互変異性体の両方が平衡して存在することが知られているが、しかし、そのより高い双極子モーメントのため、極性溶媒において１Ｈ互変異性体が好まれる（Ｃｌａｒａｍｕｎｔら、２００６）。トランス−１，４−ジアミノシクロヘキサンによる１６のアミノ化を、ｔｒｉｓ（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム［Ｐｄ2（ｄｂａ）3］および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ビフェニル（ＤａｖｅＰｈｏｓ）を用いたＢｕｃｈｗａｌｄ条件下で（Ｏｌｄら、１９９８）達成して、アミド１８（１７％）と共にニトリル１７（２４％）を得て、組み合わせた収率は４１％であった。１７の完全加水分解後に、ＥＤＣＩ／ＤＭＡＰにより１８を６−（Ｂｏｃ−アミノ）カプロン酸とカップリングさせて、１９を９１％収率で得た。脱保護の後、２０を得て、次にこれをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０と反応させて、２１を得た。
【００８３】
いくつかの方法を用いて、最終プローブ合成反応の進行を測定した。化合物毎のλmaxの減少を測定することによる、液体のＵＶモニタリングを用いた。全般的に、１．５時間後にλmaxのさらなる減少がないことが観察されると、反応完了を示した。反応進行の大まかな測定としてＴＬＣを用い、一方、液体のＬＣ−ＭＳモニタリングを用いて、完全な反応を確認した。過剰な化合物を用いた（１．２ｅｑ．）ため、ＴＬＣにおいてスポットは消失しないが、明らかな強度減少が、反応進行を示した。
【００８４】
Ｈｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１（Ｈｅら、２００６）およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（Ｂｒｏｕｇｈら、２００８）の合成および十分な特性評価は、他の文献で報告されている。ＳＮＸ−２１１２は、特許文献（Ｓｅｒｅｎｅｘら、２００８、国際公開第２００８１３０８７９（Ａ２）号パンフレット；Ｓｅｒｅｎｅｘら、２００８、米国特許出願公開第２００８０２６９１９３（Ａ１）号明細書）において以前に言及されたことがあり、ごく最近になって十分に特性評価されて、その合成が適切に説明された（Ｈｕａｎｇら、２００９）。本研究プロジェクトが開始された時点では、その合成に関する特定の詳細を欠いていた。その上、本出願人らは、同様の化合物に対して報告された条件下［Ｐｄ（ＯＡｃ）2、ＤＰＰＦ、ＮａＯｔＢｕ、トルエン、１２０℃、マイクロ波］における、トランス−４−アミノシクロヘキサノールによる１６のアミノ化の再現に困難を抱えていた。本出願人らでは、よくてもごく微量の生成物しか検出されなかった。触媒をＰｄＣｌ2、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4またはＰｄ2（ｄｂａ）3に、あるいは溶媒をＤＭＦまたは１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）に、あるいは塩基をＫ3ＰＯ4に変えても、全く改善は見られなかった。従って、本出願人らは、このステップを修正し、ＤＭＥにおけるＰｄ2（ｄｂａ）3およびＤａｖｅＰｈｏｓを用いたＢｕｃｈｗａｌｄ条件下で（Ｏｌｄら、１９９８）、１６をトランス−４−アミノシクロヘキサノールテトラヒドロピラニルエーテル（２４）とカップリングさせることができ、アミド２６（１７％）と共にニトリル２５（２８％）を得て、組み合わせた収率は４５％であった（図３４）。これらは、１６とトランス−１，４−ジアミノシクロヘキサンのカップリングに用いた条件であり、同様に、２５の一部は、反応過程において加水分解されて２６となった。本出願人らの目的において不必要であったため、本出願人らは、この反応を２５に対して最適化しなかった。本出願人らは、主な反応妨害が、トルエンにおけるトランス−４−アミノシクロヘキサノールの低い溶解性であり、ＴＨＰ保護したアルコール２４を用いることにより、溶解性をごくわずかに増加させたと推察した。ＳＮＸ−２１１２が得られ、２６からＴＨＰ基を除去した後に十分な特性評価を行った（1Ｈ、13Ｃ−ＮＭＲ、ＭＳ）。
【００８５】
次に、本出願人らは、合成したビーズが、癌細胞においてＨｓｐ９０との相互作用を保持するか調査した。ＰＵ−Ｈ７１、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２、ＳＮＸ−２１１２または２−メトキシエチルアミンのいずれかと共有結合したアガロースビーズ（それぞれＰＵ−、ＮＶＰ−、ＳＮＸ−、対照ビーズ）を、Ｋ５６２慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞抽出物とインキュベートした。図２８Ａから分かる通り、対照ビーズではなくＨｓｐ９０阻害剤が、癌細胞溶解物におけるＨｓｐ９０を効率的に単離した。対照ビーズは、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０にコンジュゲートしたＨｓｐ９０不活性化学物質（２−メトキシエチルアミン）を含有し（実験を参照）、固体支持体と細胞抽出物におけるタンパク質との潜在的な非特異的結合に対する実験的対照を提供する。
【００８６】
さらに、これら化学的ツールの、腫瘍細胞における正真のＨｓｐ９０クライアントタンパク質を単離する能力を探索するため、本出願人らは、固体支持体に付着させたＰＵ−Ｈ７１（６）を癌細胞抽出物とインキュベートした。本出願人らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＨｓｐ９０／ｃ−ＫｉｔおよびＨｓｐ９０／ＩＧＦ−ＩＲ複合体（図２８Ｂ）ならびにＫ５６２細胞におけるＨｓｐ９０／Ｂｃｒ−ＡｂｌおよびＨｓｐ９０／Ｒａｆ−１複合体（図２８Ｃ）の用量依存的単離を実証することができた。これらは、それぞれ三種陰性乳癌およびＣＭＬにおける形質転換表現型の推進に重要な役割を有する、Ｈｓｐ９０依存性腫瘍性タンパク質である（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ＆Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、２００５；Ｈｕｒｖｉｔｚ＆Ｆｉｎｎ、２００９；Ｌａｗら、２００８）。Ｈｓｐ９０媒介性のｃ−ＫｉｔおよびＩＧＦ−ＩＲ調節と合致して、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をＰＵ−Ｈ７１で処理すると、これらタンパク質の定常状態レベルの低下をもたらした（図２８Ｂ、溶解物、−および＋ＰＵ−Ｈ７１を比較）。ＰＵ−ビーズ（６）を用いて、本出願人らは、近年、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫における転写リプレッサーＢＣＬ−６（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９）および突然変異体ＪＡＫ２推進性の骨髄増殖性障害におけるＪＡＫ２（Ｍａｒｕｂａｙａｓｈｉら、２０１０）等、新規Ｈｓｐ９０クライアントを単離および同定することができた。本出願人らは、三種陰性乳癌に特異的なＨｓｐ９０腫瘍クライアントを同定することもできた（Ｃａｌｄａｓ−Ｌｏｐｅｓら、２００９）。これらの腫瘍におけるＨｓｐ９０の作用機序に光を当てることに加えて、同定されたタンパク質は、重要な腫瘍特異的な腫瘍クライアントであり、臨床試験の際にこれらの癌におけるＰＵ−Ｈ７１およびＨｓｐ９０阻害剤の臨床有効性のモニタリングにおけるバイオマーカーとして導入されることになる。
【００８７】
ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン（７）による同様の実験も可能であるが（図２９Ａ）、ＰＵ−Ｈ７１−ビーズは、クライアントタンパク質との複合体におけるＨｓｐ９０の単離においてＰＵ−Ｈ７１−ビオチンビーズよりも優れていた。
【００８８】
固体支持体固定化ＧＭを用いてＨｓｐ９０／クライアントタンパク質複合体を単離する以前の試みが、殆ど成功しなかった（Ｔｓａｙｔｌｅｒら、２００９）ことに留意することが重要である。この場合、Ｈｓｐ９０と結合しているタンパク質は、調製段階において洗い流されていた。Ｈｓｐ９０相互作用タンパク質の損失を防ぐため、著者らは、癌細胞抽出物を、ホモ二官能性（homobifunctional）アミノ反応性ＤＴＴ可逆的クロスリンカーであるＤＳＰとの架橋に付す必要があり、ＧＭが、ＰＵ−Ｈ７１とは異なり、Ｈｓｐ９０／クライアントタンパク質相互作用を安定化することができないことを示唆した。ＧＭをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０樹脂と直接的に共有結合させたビーズを用いた場合、本出願人らは、同様のプロファイルを観察した。結晶学的および生化学的調査は、ＧＭが、アポ状態で（apo）オープン構造のＨｓｐ９０と優先的に相互作用することを示唆し、これは、ある特定のクライアントタンパク質結合にとっては好ましくなく（Ｒｏｅら、１９９９；Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、１９９７；Ｎｉｓｈｉｙａら、２００９）、Ｈｓｐ９０／クライアントタンパク質複合体を捕獲するＧＭ−ビーズの制限された能力に対し可能性のある説明を提供する。いかなるＨｓｐ９０立体構造が他のＨｓｐ９０化学型（chemotype）に好まれるのか現在不明であるが、本明細書に報告する通り、ＮＶＰ−およびＳＮＸ−ビーズによっても利用でき、現在同様の評価が可能であり、これら薬剤とＨｓｐ９０との相互作用およびこれら相互作用の生物学意義のより良い理解をもたらす。
【００８９】
本明細書において設計された化学的ツールの別の応用において、本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン（７）を用いて、細胞表面に発現された場合のＨｓｐ９０を特異的に検出してもよいことを示す（図２９Ｂ）。主にサイトゾルタンパク質であるＨｓｐ９０は、ある特定の事例において、細胞表面に移行することが報告された。例えば乳癌において、膜Ｈｓｐ９０は、癌細胞浸潤の補助に関与する（Ｓｉｄｅｒａ＆Ｐａｔｓａｖｏｕｄｉ、２００８）。ビオチンコンジュゲートしたＨｓｐ９０阻害剤は、細胞に進入する潜在能力を有し得るが、ビオチンの検出に用いるストレプトアビジンコンジュゲートは、細胞不透過性であるため、ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン（７）の使用により、生細胞における膜Ｈｓｐ９０の特異的な検出が可能である。図２９Ｂは、Ｄ−ビオチンではなくＰＵ−Ｈ７１−ビオチンが、白血病細胞の表面におけるＨｓｐ９０発現を検出できることを示す。
【００９０】
要約すると、本出願人らは、それぞれ異なる化学型の３種の異なるＨｓｐ９０阻害剤に基づく有用な化学的ツールを調製した。ＰＵ−Ｈ７１（プリン）、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（イソキサゾール）およびＳＮＸ−２１１２（インダゾール−４−オン）−ビーズ等、固体支持体への付着またはビオチン化（ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン）のいずれかにより、これらを調製した。これらプローブの有用性は、Ｈｓｐ９０を効率的に単離する、ＰＵ−Ｈ７１ビーズ（６）の場合は、癌細胞抽出物からＨｓｐ９０腫瘍性タンパク質含有複合体を単離するこれらの能力により実証された。利用可能な共結晶構造およびＳＡＲをその設計において利用し、リンカーの付着部位の検証に用いたＨｓｐ９０αの適切なＸ線結晶構造とドッキングさせた。これらは、Ｈｓｐ９０の生物学的仕組みをより良く理解し、最も好ましい臨床プロファイルを有するＨｓｐ９０阻害剤を設計するための重要な化学的ツールである。
【００９１】
Ｈｓｐ９０プローブを用いた腫瘍性タンパク質および経路の同定
本開示は、上述のＨｓｐ９０プローブを用いて癌関係の経路の成分（例えば、腫瘍性タンパク質）を同定する方法を提供する。本発明の一態様において、癌関係の経路は、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセスまたは生物系に関与する経路である。例えば、癌関係の経路は、表１に収載されている経路であってよい。
【００９２】
より具体的には、癌関係の経路または癌関係の経路の成分は、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む白血病、基底細胞がん、メラノーマ、腎細胞がん、膀胱癌、前立腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、骨髄増殖性障害、消化管間質性腫瘍を含む消化管癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、肛門癌、グリオーマを含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫ならびに卵巣、子宮頸および子宮内膜癌を含む婦人科癌からなる群から選択される癌等、癌に関与する。
【００９３】
次のサブセクションは、癌細胞におけるＨｓｐ９０の特性を決定し、腫瘍性タンパク質および癌関係の経路を同定するための、本開示のＨｓｐ９０プローブの使用について記載する。
【００９４】
癌細胞における不均一なＨｓｐ９０提示
腫瘍Ｈｓｐ９０複合体と小分子Ｈｓｐ９０阻害剤との相互作用を調査するため、本出願人らは、ゲルダナマイシン（ＧＭ）またはＰＵ−Ｈ７１のいずれかと共有結合したアガロースビーズ（それぞれＧＭ−およびＰＵ−ビーズ）を利用した（図４、５）。化学的に異なる薬剤であるＧＭとＰＵ−Ｈ７１は両者共に、Ｈｓｐ９０のＮ末端ドメイン調節ポケットに結合することによりＨｓｐ９０と相互作用し、これを阻害する（Ｊａｎｉｎ、２０１０）。比較のため、本出願人らは、抗Ｈｓｐ９０抗体（Ｈ９０１０）とカップリングさせたＧタンパク質アガロースビーズも作製した。
【００９５】
先ず、本出願人らは、乳癌および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞溶解物におけるＨｓｐ９０とこれらの薬剤との結合を評価した。非特異的なＩｇＧではなくＨ９０１０による４回の連続的免疫沈降（ＩＰ）ステップにより、これらの抽出物からＨｓｐ９０を効率的に枯渇させた（図４ａ、４×Ｈ９０１０および図示せず）。対照的に、ＰＵ−またはＧＭ−ビーズによる逐次的プルダウンは、ごくわずかな総細胞Ｈｓｐ９０しか除去しなかった（図４ｂ、１０ａ、１０ｂ）。特に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞において、組み合わせたＰＵ−ビーズ画分は、総細胞Ｈｓｐ９０プールのおよそ２０〜３０％を表し、新鮮なＰＵ−ビーズアリコートをさらに添加しても、溶解物における残りのＨｓｐ９０を沈殿させることはできなかった（図４ｂ、ＰＵ−ビーズ）。このＰＵ枯渇させた残りのＨｓｐ９０画分は、小分子には近づきにくいが、Ｈ９０１０に対する親和性を維持した（図４ｂ、Ｈ９０１０）。この結果から、本出願人らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞抽出物におけるかなりの割合のＨｓｐ９０が、依然として未変性の立体構造であったが、ＰＵ−Ｈ７１と反応性でなかったと結論づける。
【００９６】
細胞溶解物におけるＨｓｐ９０立体配置の変化が、抗体ではなく固定化されたＰＵ−Ｈ７１との結合にこれを利用できなくする可能性を除外するため、本出願人らは、インタクトな癌細胞におけるＨｓｐ９０と放射標識された131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の結合を解析した（図４ｃ、下）。131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１の化学構造は同一である。ＰＵ−Ｈ７１は安定的ヨウ素原子（127Ｉ）を含有し、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は放射性ヨウ素を含有する。よって、同位体的に標識された131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は、非標識ＰＵ−Ｈ７１と同一の化学的および生物学的特性を有する。数種の癌細胞株におけるＨｓｐ９０と131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の結合は、１細胞当たり十分に定義された（ただし異なる）数の部位において飽和状態になる（図４ｃ、下）。本出願人らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＰＵ−Ｈ７１に結合された細胞Ｈｓｐ９０の分率を定量した。先ず、本出願人らは、Ｈｓｐ９０が、これらの細胞における総細胞タンパク質の２．６６〜３．３３％を表したことを決定し、この値は、報告された他の腫瘍細胞におけるＨｓｐ９０存在量と近似していた（Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）。およそ４１．６５×１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を溶解して、３８７５μｇのタンパク質を得、そのうち１０３．０７〜１２９．０４μｇがＨｓｐ９０であった。従って、１個の細胞は、（２．４７〜３．０９）×１０-6μｇ、（２．７４〜３．４３）×１０-11μｍｏｌまたは（１．６４〜２．０６）×１０7分子のＨｓｐ９０を含有した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１は、最大で５．５×１０6個の利用できる細胞結合部位に結合し（図４ｃ、下）、これは総細胞Ｈｓｐ９０の２６．６〜３３．５％に達する（５．５×１０6／（１．６４〜２．０６）×１０7＊１００として計算）。この値は、細胞抽出物におけるＰＵ−ビーズプルダウンにより得られた値と著しく類似しており（図４ｂ）、ＰＵ−Ｈ７１が、総Ｈｓｐ９０プールのおよそ３０％を表すＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＨｓｐ９０の画分と結合することを確認し、ＰＵ−ビーズの使用が、このプールを効率的に単離することを検証する。Ｋ５６２および他の樹立されたｔ（９；２２）＋ＣＭＬ細胞株において、ＰＵ−Ｈ７１は、総細胞Ｈｓｐ９０の１０．３〜２３％と結合した（図４ｃ、１０ｂ、１０ｃ）。
【００９７】
総合すると、これらのデータは、ＰＵ−Ｈ７１等、ある特定のＨｓｐ９０阻害剤が、正常細胞よりも癌細胞に豊富なＨｓｐ９０種のサブセットに優先的に結合することを示唆する（図１１ａ）。
【００９８】
腫瘍型およびＷＴタンパク質に結合したＨｓｐ９０種は癌細胞において共存するが、ＰＵ−Ｈ７１は、腫瘍性タンパク質／Ｈｓｐ９０種を選択する
これらＨｓｐ９０種に関連する生化学的機能を探究するため、本出願人らは、それぞれ抗体およびＨｓｐ９０阻害剤ビーズによる免疫沈降（ＩＰ）および化学沈殿（ＣＰ）を行い、これらの背景において結合したＨｓｐ９０が、公知のクライアントの選ばれたサブセットと共沈殿する能力を解析した。Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞を先ず調査したが、その理由として、この細胞株は、構成的に活性を有するキナーゼである異常Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質と、その正常型対応物ｃ−Ａｂｌとを同時発現するからである。これら２種のＡｂｌ種は、分子量により明確に分離することができ、よってウエスタンブロットにより容易に区別することができ（図５ａ、溶解物）、同一細胞状況におけるＨｓｐ９０腫瘍型および野生型（ＷＴ）クライアントの解析を容易にする。本出願人らは、非特異的なＩｇＧではなくＨ９０１０が、Ｂｃｒ−ＡｂｌとＡｂｌの両方との複合体におけるＨｓｐ９０を単離したことを観察した（図５ａおよび１１、Ｈ９０１０）。上清に残存する各タンパク質の画分（図５ｂ、左、残存上清）と、免疫沈降されたＢｃｒ−ＡｂｌおよびＡｂｌ（図５ａおよび５ｂ、左、Ｈ９０１０）の比較は、抗体が、Ｋ５６２細胞におけるＡｂｌの突然変異体またはＷＴ型のいずれかと結合しているＨｓｐ９０を優先的に濃縮しなかったことを示した。
【００９９】
対照的に、ＰＵと結合したＨｓｐ９０は、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質を優先的に単離した（図５ａおよび５ｂ、右、ＰＵ−ビーズ）。Ｈｓｐ９０／Ｂｃｒ−Ａｂｌ種のＰＵ−ビーズ枯渇の後（図５ｂ、右、ＰＵ−ビーズ）、Ｈ９０１０は、残存するＨｓｐ９０／Ａｂｌ種を沈殿させた（図５ｂ、右、Ｈ９０１０）。ＰＵ−ビーズは、実質的な飽和条件（即ち、過剰な溶解物、図１２ａ、左、およびビーズ、図１２ａ、右）においてＨｓｐ９０／Ｂｃｒ−Ａｂｌ種に対する選択性を保持した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈｓｐ９０種に対するＰＵ−Ｈ７１の生化学的選択性のさらなる確認として、Ｂｃｒ−Ａｂｌは、ＰＵ−Ｈ７１による分解に対する感受性がＡｂｌよりもはるかに高かった（図５ｄ）。異常Ａｂｌ種に対するＰＵ−Ｈ７１の選択性は、他の樹立されたｔ（９；２２）＋ＣＭＬ細胞株（図１３ａ）と共に、初代ＣＭＬ試料（図１３ｂ）にまで及んだ。
【０１００】
ＷＴではなく腫瘍型タンパク質と結合したＨｓｐ９０種は、Ｈｓｐ９０によるクライアントタンパク質調節のためのコシャペロン動員に最も依存性である
ＰＵ−Ｈ７１会合および抗体会合Ｈｓｐ９０画分の間をさらに区別するため、本出願人らは、逐次的枯渇実験を行い、該２種のコシャペロン構成成分（constituency）を評価した（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０）。Ｈｓｐ９０／Ｂｃｒ−Ａｂｌ複合体を含有するＨｓｐ９０の画分は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、ＨＯＰおよびＨＩＰ等、数種のコシャペロンと結合した（図５ｃ、ＰＵ−ビーズ）。ＰＵ−ビーズプルダウンも、数種の追加的なＨｓｐ９０コシャペロン種を濃縮した（表５ａ〜ｄ）。これらの知見は、ＰＵ−Ｈ７１が、コシャペロンと結合したＨｓｐ９０を認識することを強く示唆する。Ｈｓｐ９０／Ａｂｌ種を包含することが示された、ＰＵ−ビーズ枯渇により残存するＨｓｐ９０プールは、コシャペロンと会合しなかった（図５ｃ、Ｈ９０１０）が、その豊富な発現が溶解物において検出された（図５ｃ、残存上清）。しかし、コシャペロンは、総細胞抽出物においてＨ９０１０により単離される（図１１ｂ、１１ｃ）。
【０１０１】
これらの知見は、ＣＭＬ細胞におけるＢｃｒ−ＡｂｌまたはＡｂｌのいずれかと優先的に結合しているＨｓｐ９０の別個のプールの存在を示唆する（図５ｇ）。Ｈ９０１０は、Ｈｓｐ９０種を含有するＢｃｒ−ＡｂｌとＡｂｌの両方と結合するが、一方、ＰＵ−Ｈ７１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈｓｐ９０種に選択的である。本出願人らのデータは、Ｈｓｐ９０が、正常（即ち、Ａｂｌ）ではなく異常（即ち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）タンパク質の活性をモジュレートする場合、古典的なコシャペロンＨｓｐ７０、Ｈｓｐ４０およびＨＯＰを利用しこれをより強く必要とし得ることも示唆する（図１１ａ）。この仮説と合致して、本出願人らは、Ｂｃｒ−Ａｂｌが、Ｋ５６２細胞において、Ｈｓｐ９０コシャペロンであるＨｓｐ７０のノックダウンに対しＡｂｌよりも感受性であることを見出した（図５ｅ）。
【０１０２】
ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍性タンパク質／Ｈｓｐ９０種選択性および複合体捕捉能力は、あらゆるＨｓｐ９０阻害剤により共有されるとは限らない
本出願人らは、次に、合成阻害剤ＳＮＸ−２１１２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２ならびに天然物のＧＭ（Ｊａｎｉｎ、２０１０）等、ＰＵ−Ｈ７１と同様の様式でＨｓｐ９０のＮ末端調節ポケットと相互作用する他の阻害剤が、同様のＨｓｐ９０種を選択的に単離することができるか評価した（図５ｆ）。ＳＮＸ−ビーズは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈｓｐ９０に対する選択性を実証したが、一方、ＮＶＰ−ビーズは、Ｈ９０１０と同様の挙動を示し、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈｓｐ９０とＡｂｌ／Ｈｓｐ９０種の間を識別しなかった（それぞれＳＮＸ−対ＮＶＰ−ビーズを参照；図５ｆ）。ＧＭ−ビーズも、細胞溶解物におけるＨｓｐ９０の亜集団を認識したが（図１０ａ）、Ｂｃｒ−Ａｂｌの共沈殿においてＰＵ−ビーズよりもはるかに効率が低かった（図５ｆ、ＧＭ−ビーズ）。Ｈｓｐ９０／クライアントタンパク質複合体の捕捉におけるＧＭの同様の無効性は、以前に報告された（Ｔｓａｙｔｌｅｒら、２００９）。
【０１０３】
ＰＵ−Ｈ７１の腫瘍性タンパク質／Ｈｓｐ９０種選択性および複合体捕捉能力は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈｓｐ９０種に制限されない
腫瘍性タンパク質に対する選択性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌに限定されていないか決定するため、本出願人らは、他の腫瘍細胞株における数種の追加的な十分に定義されたＨｓｐ９０クライアントタンパク質を検査した（図１２ｂ〜ｄ）（ｄａ  Ｒｏｃｈａ  Ｄｉａｓら、２００５；Ｇｒｂｏｖｉｃら、２００６）。Ｋ５６２細胞における本出願人らの結果と一致して、Ｈ９０１０は、ＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞において発現された突然変異体Ｂ−Ｒａｆと、ＣＣＤ１８Ｃｏ正常結腸線維芽細胞において発現されたＷＴ  Ｂ−Ｒａｆの両方と複合体形成したＨｓｐ９０を沈殿させた（図１２ｂ、Ｈ９０１０）。しかし、ＰＵ−およびＧＭ−ビーズは、Ｈｓｐ９０／突然変異体Ｂ−Ｒａｆを選択的に認識し、Ｈｓｐ９０／ＷＴ  Ｂ−Ｒａｆの認識を殆ど示さなかった（図１２ｂ、ＰＵ−ビーズおよびＧＭ−ビーズ）。しかし、Ｋ５６２細胞の場合と同様に、ＧＭ−ビーズは、突然変異体クライアントタンパク質の共沈殿においてＰＵ−ビーズよりも効率が有意に低かった。他のＨｓｐ９０クライアントに対しても同様の結果が得られた（図１２ｃ、１２ｄ；Ｔｓａｙｔｌｅｒら、２００９）。
【０１０４】
ＰＵ−Ｈ７１−ビーズは、ＣＭＬにおける異常シグナロソームを同定する
上に提示されているデータは、Ｈｓｐ９０と特異的に相互作用するＰＵ−Ｈ７１が（図１４；Ｔａｌｄｏｎｅ＆Ｃｈｉｏｓｉｓ、２００９）、腫瘍性タンパク質／Ｈｓｐ９０種を優先的に選択し、クライアントと結合した立体構造でＨｓｐ９０を捕捉することを示唆する（図５）。従って、本出願人らは、発癌性Ｈｓｐ９０クライアントタンパク質の細胞相補体を調査するためのツールとして、ＰＵ−Ｈ７１ビーズを用いることができるか検査した。異常Ｈｓｐ９０クライアント（clientele）は、腫瘍表現型の維持に最も決定的な様々なタンパク質を含むと仮定されるため（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７；Ｄｅｚｗａａｎ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、２００８）、このアプローチは、決定的なシグナル伝達経路を腫瘍特異的な様式で潜在的に同定することができる。この仮説を検査するため、本出願人らは、重要な機能的病変の少なくとも一部が知られている（Ｒｅｎ、２００５；Ｂｕｒｋｅ＆Ｃａｒｒｏｌｌ、２０１０）Ｋ５６２細胞におけるＰＵ−Ｈ７１ビーズにより単離されたタンパク質カーゴの先入観のない解析を行った。
【０１０５】
ＰＵ−ビーズまたは対照ビーズにより細胞溶解物から単離されたタンパク質カーゴを、タンデム質量分析と連結したナノ（nano）液体クロマトグラフィー（ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるプロテオミクス解析に付した。最初のタンパク質同定は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを用いて行い、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてさらに評価した（表５ａ〜ｄ）。ＰＵ−ビーズ相互作用タンパク質の中から、Ｂｃｒ−Ａｂｌが同定され（ＢｃｒおよびＡｂｌ１、表５ａおよび図６を参照）、以前のデータを確認した（図５）。
【０１０６】
次に、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を用いて、同定されたタンパク質から生物学的ネットワークを構築した（図６ａ、６ｂ、１５；表５ｅ、５ｆ）。ＩＰＡは、ＰＵ−Ｈ７１に単離されたタンパク質を、細胞死、細胞周期、細胞成長および増殖に関連する１３種のネットワークに割り当てた。これらのネットワークは、公知の正準ＣＭＬシグナル伝達経路と十分に重複する（図６ａ）。
【０１０７】
シグナル伝達タンパク質に加えて、本出願人らは、炭水化物および脂質代謝、タンパク質合成、遺伝子発現ならびに細胞集合および組織化を調節するタンパク質を同定した。これらの知見は、細胞の恒常性維持におけるおよび細胞形質転換の重要なメディエータとしてのＨｓｐ９０の推論された広範な役割と合致する（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７；Ｄｅｚｗａａｎ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、２００８；ＭｃＣｌｅｌｌａｎら、２００７）。
【０１０８】
ＭＳによる同定に続き、化学沈殿およびウエスタンブロットにより、Ｋ５６２細胞と初代ＣＭＬ芽球の両方において、多数の重要なタンパク質をさらに検証した（図６ｃ、左、図６ｄ、１３ａ、１３ｂ）。これらタンパク質の定常状態レベルにおけるＰＵ−Ｈ７１の効果も照会して、これらのＨｓｐ９０調節性発現／安定性をさらにサポートした（図６ｃ、右）（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０）。
【０１０９】
ＰＵ−ビーズにおいて濃縮されたトップスコアのネットワークは、Ｂｃｒ−ＡｂｌによりＣＭＬにおける異常シグナル伝達の伝播に用いられたネットワークである：ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫおよびＮＦκＢ媒介性のシグナル伝達経路（ネットワーク１、２２フォーカス分子、スコア＝３８およびネットワーク２、２２フォーカス分子、スコア＝３６、表５ｆ）。これらネットワークの連結性マップを作成して、成分タンパク質間の関係性を調査した（図１５ａ、１５ｂ）。これらのマップは、明確性のため単純化されており、主要な経路成分および関係性のみ保持されている（図６ｂ）。
【０１１０】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の活性化は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ白血病誘発における必須のシグナル伝達機構の１種として出現した（Ｒｅｎ、２００５）。この経路内で特に興味深いものは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換細胞において構成的に活性化され、翻訳の調節不全をもたらし、白血病誘発に寄与する、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）である。近年の研究は、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２複合体の両方が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ細胞において活性化され、分裂促進的応答を媒介する遺伝子産物のｍＲＮＡ翻訳ならびに細胞増殖および生存における重要な役割を果たすという証拠を提供した（Ｃａｒａｙｏｌら、２０１０）。ｍＴＯＲならびにＲＩＣＴＯＲ、ＲＡＰＴＯＲ、Ｓｉｎ１（ＭＡＰＫＡＰ１）、クラス３のＰＩ３ＫであるＰＩＫ３Ｃ３（ｈＶｐｓ３４とも称される）およびＰＩＫ３Ｒ４（ＶＳＰ１５）（Ｎｏｂｕｋｕｎｉら、２００７）等、ｍＴＯＲの重要な活性化因子を、ＰＵ−Ｈｓｐ９０プルダウンにおいて同定した（表５ａ、５ｄ；図６ｃ、６ｄ、１３ｂ）。
【０１１１】
ＮＦ−κＢ経路
核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化は、一次骨髄細胞のＢｃｒ−Ａｂｌ形質転換およびＢｃｒ−Ａｂｌ形質転換造血細胞がヌードマウスにおいて腫瘍を形成するために必要とされる（ＭｃＣｕｂｒｅｙら、２００８）。この経路において濃縮された、ＰＵ−単離されたタンパク質として、ＮＦ−κＢと共にＮＦ−ｋＢの活性化因子が挙げられ、該活性化因子には、別個のドメインによりＮＦ−カッパーＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）およびＩＫＫと結合し、これらを活性キナーゼ複合体に集合させるＩＫＢＫＡＰならびに両者共にＩ−カッパーＢキナーゼ／ＮＦ−カッパーＢカスケードの正の調節因子であるＴＢＫ−１（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１）およびＴＡＢ１（ＴＡＫ１結合タンパク質１）等がある（Ｈａｃｋｅｒ＆Ｋａｒｉｎ、２００６）（表５ａ、５ｄ）。近年、骨髄性白血病細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ誘導性のＮＦ−κＢカスケード活性化が、チロシンリン酸化されたＰＫＤ２（またはＰＲＫＤ２）により多くの場合媒介されることが実証され（Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃら、２００４）、これは本明細書において、本出願人らにより、ＰＵ−Ｈ７１／Ｈｓｐ９０相互作用物質であると同定される（表５ａ、５ｄ；図６ｃ、６ｄ、１３ｂ）。
【０１１２】
Ｒａｆ／ＭＡＰＫ経路
Ｒａｆ−１、Ａ−Ｒａｆ、ＥＲＫ、ｐ９０ＲＳＫ、ｖａｖおよび数種のＭＡＰＫ等、ＣＭＬにおいて活性化される別の重要な経路であるＭＡＰＫ経路の主要なエフェクターも（Ｒｅｎ、２００５；ＭｃＣｕｂｒｅｙら、２００８）、ＰＵ−Ｈｓｐ９０結合プールに包含される（表５ａ、５ｄ；図６ｃ、６ｄ、１３ｂ）。ＥＲＫシグナル伝達カスケードに加えて、本出願人らは、ＭＥＫＫ４およびＴＡＢ１等、Ｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化において作用する成分を同定する。ＩＰＡは、ＭＡＰＫ経路を、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ、ＳＴＡＴおよび焦点接着経路等、多くの異なるシグナル伝達経路の重要な要素に連結する（図１５ａ〜ｄ、６ｂ）。
【０１１３】
ＳＴＡＴ経路
ＳＴＡＴ経路もＣＭＬにおいて活性化され、サイトカイン独立性およびアポトーシスからの保護を与え（ＭｃＣｕｂｒｅｙら、２００８）、ＰＵ−Ｈ７１化学沈殿により濃縮される（ネットワーク８、２０フォーカス分子、スコア＝１４、表５ｆ、図１５ｃ）。ＳＴＡＴ５とＳＴＡＴ３の両方は、ＰＵ−Ｈ７１−Ｈｓｐ９０複合体と会合した（表５ａ、５ｄ；図６ｃ、６ｄ、１３ｂ）。ＣＭＬにおいて、リン酸化によるＳＴＡＴ５活性化は、Ｂｃｒ−Ａｂｌにより推進される（Ｒｅｎ、２００５）。前駆Ｂリンパ芽球性白血病細胞においてＢｃｒ−Ａｂｌにより構成的にリン酸化および活性化されるブルトン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ＆Ｋｅｒｓｓｅｂｏｏｍ、２００６）も、ＳＴＡＴ５によりシグナル伝達することができる（Ｍａｈａｊａｎら、２００１）。ＢＴＫは、ＣＭＬにおいて本出願人らが同定した別のＨｓｐ９０調節性タンパク質である（表５ａ、５ｄ；図６ｃ、６ｄ、１３ｂ）。リン酸化に加えて、ＳＴＡＴは、骨髄性細胞において、切断型ＳＴＡＴ種を生じるカルパイン（ＣＡＰＮ１）媒介性のタンパク分解性開裂により活性化され得る（Ｏｄａら、２００２）。ＣＡＰＮ１もまた、Ｂｃｒ−Ａｂｌによっても活性化される活性化Ｃａ（２＋）／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩガンマ（ＣａＭＫＩＩガンマ）として、ＰＵ結合型Ｈｓｐ９０プルダウンにおいて見出された（Ｓｉ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ、２００８）（表５ａ、５ｄ）。ＣＭＬにおけるＣａＭＫＩＩガンマ活性は、ＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ経路に関与する複数の決定的シグナル伝達ネットワークの活性化を伴う。特に、骨髄性白血病細胞において、ＣａＭＫＩＩガンマはまた、ＳＴＡＴ３を直接的にリン酸化し、その転写活性を増強する（Ｓｉ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ、２００８）。
【０１１４】
焦点接着経路
骨髄微小環境への前駆血液細胞の保持およびホーミングは、生存および増殖の受容体およびアゴニストにより調節される。Ｂｃｒ−Ａｂｌは、骨髄から造血幹細胞の異常放出を生じ、リガンド結合の非存在下で接着受容体シグナル伝達経路の活性化をもたらす接着独立を誘導する。焦点接着経路は、ＰＵ−Ｈ７１プルダウンにおいて十分に表された（ネットワーク１２、１６フォーカス分子、スコア＝１３、表５ｆ、図１５ｄ）。焦点接着関連タンパク質のパキシリン、ＦＡＫ、ビンキュリン、タリンおよびテンシンは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子導入細胞株において構成的にリン酸化されており（Ｓａｌｇｉａら、１９９５）、これらもまた、ＰＵ−Ｈｓｐ９０複合体において単離された（表５ａ、５ｄおよび図６ｃ）。ＣＭＬ細胞において、ＦＡＫは、ＳＴＡＴ５を活性化することができる（Ｌｅら、２００９）。
【０１１５】
ＭＹＣ（Ｓａｗｙｅｒｓ、１９９３）（ネットワーク７、１５フォーカス分子、スコア＝２２、図６ａおよび１５ｅ、表５ｆ）およびＴＧＦ−β（Ｎａｋａら、２０１０）（ネットワーク１０、１３フォーカス分子、スコア＝１８、図６ａおよび１５ｆ、表５ｆ）により駆動される、ＣＭＬにおける他の重要な形質転換経路も同様に、本明細書において同定された。同定されたネットワークの中で、ＣＭＬの疾患進行ならびに異常細胞周期および増殖に重要なネットワークも挙げられる（ネットワーク３、２０フォーカス分子、スコア＝３３、ネットワーク４、２０フォーカス分子、スコア＝３３、ネットワーク５、２０フォーカス分子、スコア＝３２、ネットワーク６、１９フォーカス分子、スコア＝３０、ネットワーク９、１４フォーカス分子、スコア＝２０、ネットワーク１１、１２フォーカス分子、スコア＝１７およびネットワーク１３、１０フォーカス分子、スコア＝１２、図６ａおよび表５ｆ）。
【０１１６】
要約すると、ＰＵ−Ｈ７１は、ＣＭＬにおける悪性表現型に重要なシグナル伝達経路に関与する幅広い種類のタンパク質を濃縮する（図６）。異常ＣＭＬシグナロソームとＰＵ結合型Ｈｓｐ９０との相互作用は、初代ＣＭＬ試料において保持された（図６ｄ、１３ｂ）。
【０１１７】
ＰＵ−Ｈ７１で同定されたタンパク質およびネットワークは、悪性表現型に重要なものである
本出願人らは、ＰＵ−ビーズプルダウンにおけるこれらタンパク質の存在が、機能的に重要であり、ＣＭＬ細胞における悪性シグナロソームの広範な支持におけるＨｓｐ９０の役割を示唆することを実証（demomstrate）する。
【０１１８】
ＰＵ−ビーズにより同定されたネットワークが、Ｋ５６２における形質転換に重要であることを実証するため、次に本出願人らは、個々のネットワーク由来の主要ｎｏｄａｌタンパク質（図６ｂ、黄色のボックス  −  Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＮＦκＢ、ｍＴＯＲ、ＭＥＫおよびＣＡＭＩＩＫ）の阻害剤が、Ｋ５６２細胞の成長および増殖潜在能力を縮小させることを示した（図７ａ）。
【０１１９】
次に、本出願人らは、ＣＭＬにおける役割が未だ割り当てられていない、ＰＵ−ビーズで同定されたＨｓｐ９０相互作用物質も、形質転換表現型に寄与することを実証した。多くの遺伝子の転写共活性化因子であるヒストンアルギニンメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１（Ｂｅｄｆｏｒｄ＆Ｃｌａｒｋｅ、２００９）を、ＣＭＬ細胞株および初代ＣＭＬ細胞のＰＵ−ビーズプルダウンにおいて検証した（図６ｃ、６ｄ、１３）。ＰＲＭＴ５等、他のアルギニンメチルトランスフェラーゼは、卵巣癌細胞におけるＨｓｐ９０クライアントであることが示されているが（Ｍａｌｏｎｅｙら、２００７）、これは、Ｈｓｐ９０とＣＡＲＭ１との間で初めて報告された関連である。ＣＡＲＭ１レベルの上昇は、前立腺および乳癌の発症に関係するが、ＣＭＬ白血病誘発（leukomogenesis）におけるＣＡＲＭ１の重要性については殆ど分かっていない（Ｂｅｄｆｏｒｄ＆Ｃｌａｒｋｅ、２００９）。本出願人らは、ＰＵ−ビーズに認識されるＨｓｐ９０種により基本的に完全に捕獲され（図７ｂ）、ＰＵ−Ｈ７１による分解に対して感受性でもある（図６ｃ、右）ＣＡＲＭ１を見出した。従って、ＣＡＲＭ１は、ＣＭＬにおける新規Ｈｓｐ９０腫瘍性タンパク質となり得る。実際に、対照ｓｈＲＮＡではなくＣＡＲＭ１によるノックダウン実験（図７ｃ）は、Ｋ５６２細胞における生存率低下およびアポトーシス誘導を実証し、この仮説を支持する。
【０１２０】
ＰＵプルダウンにおけるタンパク質の存在が、その異常活性化シグナル伝達への関与によるものであり、単にその豊富な発現によるものではないことを実証するため、本出願人らは、Ｋ５６２および膵癌細胞株であるＭｉａ−ＰａＣａ−２由来のＰＵ−ビーズプルダウンを比較した（表５ａ）。どちらの細胞も高レベルのＳＴＡＴ５タンパク質を発現するが（図７ｄ）、ＳＴＡＴ５リン酸化により実証されるＳＴＡＴ５経路の活性化（図７ｄ）およびＤＮＡ結合（Ｊａｇａｎａｔｈａｎら、２０１０）は、Ｋ５６２細胞においてのみ指摘された。それに合致して、このタンパク質は、Ｋ５６２  ＰＵ−ビーズプルダウンにおいてのみ同定された（表５ａおよび図７ｅ）。対照的に、活性化ＳＴＡＴ３は、Ｋ５６２（図６ｃ、７ｅ）とＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞抽出物（図７ｅ、７ｆ）の両方に由来するＰＵ−Ｈｓｐ９０複合体において同定された。
【０１２１】
Ｋ５６２とＭｉａ−ＰａＣａ−２細胞の両方におけるＰＵ−ビーズによりｍＴＯＲ経路を同定したところ（図７ｅ、７ｆ）、実際に、ｍＴＯＲのＡＴＰドメインを標的化する選択的阻害剤であるＰＰ２４２によるその薬理学的阻害（Ａｐｓｅｌら、２００８）は、両方の細胞に対し毒性がある（図７ａ、７ｇ）。他方では、Ａｂｌ阻害剤Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ＆Ｄｒｕｋｅｒ、２００３）は、Ｋ５６２細胞に対してのみ毒性があった（図７ａ、７ｇ）。どちらの細胞もＡｂｌを発現するが、Ｋ５６２のみが発癌性Ｂｃｒ−Ａｂｌを有し（図７ｄ）、ＰＵ−ビーズは、Ｋ５６２においてＢｃｒ−ＡｂｌとしてＡｂｌを同定するが、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２細胞においては同定しない（図７ｅ）。
【０１２２】
ＰＵ−Ｈ７１は、発癌性ＳＴＡＴ活性化の新規機序を同定する
ＰＵ−ビーズプルダウンは、ＣＭＬ白血病誘発において構成的に活性化されている、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｒｅｎ、２００５）、ＣＡＭＫＩＩγ（Ｓｉ＆Ｃｏｌｌｉｎｓ、２００８）、ＦＡＫ（Ｓａｌｇｉａら、１９９５）、ｖａｖ−１（Ｋａｔｚａｖ、２００７）およびＰＲＫＤ２（Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃら、２００４）等、数種のタンパク質を含有する。これらの定常状態レベルは、Ｈｓｐ９０阻害により減少することから、これらは、自身の安定性のためにＨｓｐ９０に依存する古典的なＨｓｐ９０調節性クライアントである（図６ｃ）（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の構成的活性化もＣＭＬにおいて報告されている（Ｒｅｎ、２００５；ＭｃＣｕｂｒｅｙら、２００８）。しかし、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３レベルは、Ｈｓｐ９０阻害において基本的に無修飾のままであるため、これらのタンパク質は、古典的クライアントタンパク質の判断基準に適合しない（図６ｃ）。ＰＵ−プルダウンも、ｍＴＯＲ、ＶＳＰ３２、ＶＳＰ１５およびＲＡＰＴＯＲ等、活性シグナル伝達巨大複合体の一部として潜在的に単離されるタンパク質を含有する（Ｃａｒａｙｏｌら、２０１０）。ｐ−ｍＴＯＲの細胞レベルにより測定されるｍＴＯＲ活性も、複合体成分よりもＨｓｐ９０阻害に対し感受性であると考えられる（即ち、ＰＵ−Ｈ７１処理細胞におけるｐ−ｍＴＯＲおよびＲＡＰＴＯＲの相対的な減少を比較、図６ｃ）。さらに、ＰＵ−Ｈｓｐ９０複合体は、Ｂｃｒ−Ａｂｌを、Ｋ５６２における複数の異常活性化シグナル伝達経路の重要なエフェクターにリンクさせる、ＧＲＢ２、ＤＯＣＫ、ＣＲＫＬおよびＥＰＳ１５等、アダプタータンパク質を含有する（Ｂｒｅｈｍｅら、２００９；Ｒｅｎ、２００５）（図６ｂ）。これらの発現も、Ｈｓｐ９０阻害後に未変化のままである（図６ｃ）。従って、本出願人らは、ある特定の発癌性経路へのＨｓｐ９０の寄与が、その古典的フォールディング作用を超えて拡大されるのではないかと考えた。特に、本出願人らは、以前に推論された通り、Ｈｓｐ９０が、シグナル伝達複合体をその活性立体配置に維持するスキャフォールディング分子としても作用できると仮定した（Ｄｅｚｗａａｎ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、２００８；Ｐｒａｔｔら、２００８）。
【０１２３】
Ｈｓｐ９０はＳＴＡＴ５と結合し、その立体構造に影響を及ぼす
この仮説をさらに調査するため、本出願人らは、ＣＭＬにおいて構成的にリン酸化されているＳＴＡＴ５に着目した（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、１９９９）。ｐ−ＳＴＡＴ５の全体的なレベルは、リン酸化および脱リン酸化現象のバランスにより決定される。よって、Ｋ５６２細胞における高レベルのｐ−ＳＴＡＴ５は、上流のキナーゼ活性の増加またはタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性の減少のいずれかを反映し得る。Ｈｓｐ９０とｐ−ＳＴＡＴ５の間の直接的な相互作用も、ｐ−ＳＴＡＴ５の細胞レベルをモジュレートすることができる。
【０１２４】
これらの潜在的な機序の相対的寄与を精査するため、本出願人らは先ず、Ｋ５６２細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を調節する主要なキナーゼおよびＰＴＰａｓｅにおけるＰＵ−Ｈ７１の効果を調査した。Ｂｃｒ−Ａｂｌは、ＪＡＫリン酸化を必要とせずにＳＴＡＴ５を直接的に活性化する（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、１９９９）。それと一致して、ＳＴＡＴ５リン酸化は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤Ｇｌｅｅｖｅｃの存在下で急速に減少した（図８ａ、左、Ｇｌｅｅｖｅｃ）。Ｈｓｐ９０はＢｃｒ−Ａｂｌ安定性を調節するが、Ｈｓｐ９０阻害後の定常状態Ｂｃｒ−Ａｂｌレベルの低下は、３時間超を要する（Ａｎら、２０００）。実際に、ＣＲＫＬリン酸化の減少がない（図８ａ、左、ＰＵ−Ｈ７１、ｐ−ＣＲＫＬ／ＣＲＫＬ）ことに証明される通り、ＰＵ−Ｈ７１により、ｐ−ＳＴＡＴ５レベルを低下させた時間間隔において（図８ａ、左、ＰＵ−Ｈ７１、ｐ−ＳＴＡＴ５）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現（図８ａ、左、ＰＵ−Ｈ７１、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）または機能に変化がないことが観察された。また、Ｂｃｒ−Ａｂｌを遺伝子導入した３２Ｄｃｌ３細胞において、ＳＴＡＴ５のキナーゼ活性化因子であるＨＣＫの活性および発現に変化がないこと（Ｋｌｅｊｍａｎら、２００２）に注目した（図８ａ、右、ＨＣＫ／ｐ−ＨＣＫ）。
【０１２５】
よって、０〜９０分間隔におけるＰＵ−Ｈ７１によるｐ−ＳＴＡＴ５リン酸化の低下（図８ｃ、左、ＰＵ−Ｈ７１）は、Ｂｃｒ−Ａｂｌまたは他のキナーゼの不安定化により説明される見込みは低い。
【０１２６】
従って、本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１の存在下におけるｐ−ＳＴＡＴ５レベルの急速な減少が、ＰＴＰａｓｅ活性の増加により説明できるか検査した。主要なサイトゾルＳＴＡＴ５ホスファターゼであるＳＨＰ２（Ｘｕ＆Ｑｕ、２００８）の発現および活性も、この時間間隔内では変化しなかった（図８ａ、右、ＳＨＰ２／ｐ−ＳＨＰ２）。同様に、ＳＴＡＴシグナル伝達のスイッチを切る負のフィードバックループを形成するＳＯＣＳ１およびＳＯＣＳ３（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ＆Ｄｒｕｋｅｒ、２００３）のレベルは、ＰＵ−Ｈ７１により影響されなかった（図８ａ、右、ＳＯＣＳ１／３）。
【０１２７】
よって、間隔０〜９０分間でのＳＴＡＴ５における効果のうち、ＳＴＡＴ５に対するキナーゼまたはホスファターゼ活性の変化に起因する可能性のあるものはない。代替的な機序として、また、ＳＴＡＴ５ではなく大部分のｐ−ＳＴＡＴ５は、ＣＭＬ細胞においてＨｓｐ９０に結合しているため（図８ｂ）、本出願人らは、活性化ＳＴＡＴ５の細胞レベルが、Ｈｓｐ９０との直接的な結合により微調整されると仮定した。
【０１２８】
ＳＴＡＴの活性化／不活性化サイクルは、その異なる二量体立体構造間の移行を必要とする。ＳＴＡＴのリン酸化は、逆平行二量体立体構造において生じ、リン酸化により平行二量体立体構造を誘発する。他方では、ＳＴＡＴの脱リン酸化は、広範な空間的再配向を必要とし、該再配向は、チロシンリン酸化されたＳＴＡＴ二量体は、平行から逆平行立体配置へとシフトして、ホスファターゼのより良い標的としてリン酸チロシンを露出する必要がある（Ｌｉｍ＆Ｃａｏ、２００６）。本出願人らは、ＳＴＡＴ５が、Ｈｓｐ９０と結合していると、トリプシン開裂に対しより感受性である（図８ｃ）ことを見出し、この結果は、Ｈｓｐ９０の結合が、ＳＴＡＴ５の立体構造状態を直接的にモジュレートして、ＳＴＡＴ５を脱リン酸化に好ましくないおよび／またはリン酸化に好ましい立体構造に維持する可能性があることを示す。
【０１２９】
この可能性を調査するため、本出願人らは、非特異的なＰＴＰａｓｅ阻害剤であるオルトバナジン酸（Ｎａ3ＶＯ4）を細胞に加えてＳＴＡＴ５の脱リン酸化を遮断する、パルスチェイス戦略を用いた。続いて、後のいくつかの時点において残渣レベルのｐ−ＳＴＡＴ５を決定した（図８ｄ）。ＰＵ−Ｈ７１の非存在下で、ｐ−ＳＴＡＴ５は急速に蓄積したが、その存在下では、細胞ｐ−ＳＴＡＴ５レベルは縮小した。この過程の動態（図８ｄ）は、ｐ−ＳＴＡＴ５定常状態低下の速度と同様であった（図８ａ、左、ＰＵ−Ｈ７１）。
【０１３０】
Ｈｓｐ９０は、ＳＴＡＴ５を活性立体構造でＳＴＡＴ５含有転写複合体内に直接的に維持する
ＳＴＡＴ５リン酸化および二量体形成に加えて、ＳＴＡＴ５の生物活性は、核移行およびその様々な標的遺伝子への直接的な結合を必要とする（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、１９９９；Ｌｉｍ＆Ｃａｏ、２００６）。従って、本出願人らは、Ｈｓｐ９０がＳＴＡＴ５遺伝子の転写活性化を促進し、これによりプロモーター関連ＳＴＡＴ５転写複合体に関与することもできるか考えた。ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを用いて、本出願人らは、ＳＴＡＴ５（図８ｅ）が、Ｋ５６２細胞において構成的に活性を有し、ＳＴＡＴ５結合コンセンサス配列（５’−ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）に結合することを見出した。ＳＴＡＴ５活性化およびＤＮＡ結合は、ＰＵ−Ｈ７１によるＨｓｐ９０阻害により、用量依存的様式で部分的に抑止される（図８ｅ）。さらに、Ｋ５６２細胞における定量的ＣｈＩＰアッセイは、重大なＳＴＡＴ５標的ＭＹＣおよびＣＣＮＤ２におけるＨｓｐ９０とＳＴＡＴ５の両方の存在を明らかにした（図８ｆ）。どちらのタンパク質も遺伝子間制御領域には存在しなかった（図示せず）。従って、ＰＵ−Ｈ７１（１μＭ）は、ＳＴＡＴ５標的遺伝子ＣＣＮＤ２、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＢＣＬ−ＸＬおよびＭＣＬ１（Ｋａｔｚａｖ、２００７）のｍＲＮＡ存在量を減少させたが、対照遺伝子ＨＰＲＴおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ存在量は減少させなかった（図８ｇおよび図示せず）。
【０１３１】
総合すると、これらのデータは、ＳＴＡＴ５活性が、ＣＭＬ細胞においてＨｓｐ９０により正に調節されることを示す（図８ｈ）。本出願人らの知見は、ＳＴＡＴ５と結合しているＨｓｐ９０が、タンパク質の立体構造をモジュレートし、この機序によりＳＴＡＴ５リン酸化／脱リン酸化動態を変化させ、ｐ−ＳＴＡＴ５のレベル増加に向けてバランスをシフトするというシナリオと一貫性がある。加えて、Ｈｓｐ９０は、ＳＴＡＴ５を活性立体構造でＳＴＡＴ５含有転写複合体内に直接的に維持する。しかし、ＳＴＡＴ経路の複雑さを考慮すると、他の潜在的な機序を除外することはできない。従って、タンパク質安定性促進におけるその役割に加えて、Ｈｓｐ９０は、クライアントタンパク質を活性立体配置に維持することにより、発癌を促進する。
【０１３２】
より広範には、データは、細胞Ｈｓｐ９０のＰＵ−Ｈ７１−Ｈｓｐ９０画分が、腫瘍細胞における発癌性タンパク質機能の支持に最も密接に関与し、ＰＵ−Ｈ７１−Ｈｓｐ９０プロテオミクスを用いて、特異的な腫瘍細胞における悪性表現型の維持に必要とされる幅広い種類のタンパク質経路を同定することができることを示唆する（図９）。
【０１３３】
考察
現在、腫瘍細胞の生存維持に必要とされる多くのタンパク質は、そのコード配列に突然変異を示さない可能性があることが認められているが、それでもなお、これらのタンパク質を同定することは、個々の腫瘍が機能する仕方を理解するためにきわめて重要である。多くの遺伝子にとって、腫瘍細胞生存を支持するために突然変異が必要とされないため（例えば、多発性骨髄腫におけるＩＲＦ４およびＢ細胞リンパ腫におけるＢＣＬ６）、ゲノムワイドな突然変異研究は、これらの腫瘍性タンパク質を同定しない可能性がある（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９）。ＲＮＡｉスクリーニング等、高度に複雑、高価で大規模な方法は、様々な腫瘍における発癌性タンパク質の相補体を同定するための主要な手段であった（Ｈｏｒｎら、２０１０）。本明細書において、本出願人らは、突然変異の有無に関係なく腫瘍の腫瘍性タンパク質を調査するための、迅速かつ簡便な化学的プロテオミクス方法を提示する（図９）。この方法は、ｉ）発癌性クライアントタンパク質と会合するＨｓｐ９０の画分に優先的に結合し、ｉｉ）Ｈｓｐ９０を腫瘍クライアントと結合した立体配置にロックするという、ＰＵ−Ｈ７１のいくつかの特性を活用する。これらの特色を合わせることにより、質量分析による腫瘍関連タンパク質クライアントの化学的親和性精製が大幅に容易になる（図９）。本出願人らは、本アプローチが、別個の癌に特有の病変の腫瘍毎の精査における強力なツールを提供することを提案する。異常タンパク質集団をＰＵ−ビーズと結合したＨｓｐ９０複合体の一部として精製および濃縮する最初の化学沈殿ステップのため、本方法は、試料の高価なＳＩＬＡＣ標識または２Ｄゲル分離を必要としない。その代わりに、ＰＵ−ビーズプルダウンから得られたタンパク質カーゴをＳＤＳ緩衝液に単純に溶出し、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いて分離されたタンパク質を抽出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析のためにトリプシン処理する。
【０１３４】
この方法は、腫瘍細胞の悪性表現型を維持する腫瘍性タンパク質を同定するための独自のアプローチを提示するが、他の化学物質または抗体に基づくプロテオミクス技法と同様に、このアプローチも潜在的な制約を有することに気づく必要がある（Ｒｉｘ＆Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ、２００９）。例えば、「粘着性」または豊富なタンパク質も、非差別的な仕方で、ＰＵ−Ｈ７１ビーズにより単離されるタンパク質と結合することができる。このようなタンパク質は、数名の研究者により分類されており（Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、２００８）、本出願人らは、これらタンパク質の一部が、実際に真のＨｓｐ９０クライアントである可能性をはっきりと理解しつつ、これらのリストを用いて、プルダウンからこれらのタンパク質を除いた。第二に、本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１がＨｓｐ９０に特異的であることの数例の証拠を提示したが（図１１；Ｔａｌｄｏｎｅ＆Ｃｈｉｏｓｉｓ、２００９）、ビーズ上に高濃度のＰＵ−Ｈ７１が存在すると、この薬物と少数のタンパク質との非特異的で直接的な結合が不可避であることも考慮されたい。
【０１３５】
前段落に記載した潜在的な制約にもかかわらず、本出願人らは、この方法を用いて、ＣＭＬにおけるＨｓｐ９０促進性異常シグナル伝達経路の最初の網羅的評価を行った。ＰＵ−Ｈ７１親和性精製により同定されるＨｓｐ９０インタラクトームは、十分に特徴付けられたＣＭＬシグナロソームと有意に重複し（図６ａ）、この方法が、この形態の白血病の分子基盤を定義する複雑なクモの巣状の経路およびタンパク質を同定することができることを示す。本出願人らは、個々の腫瘍において悪性表現型を駆動する異常シグナル伝達ネットワークを同定するために、ＰＵ−Ｈ７１化学的プロテオミクスアッセイを、他の形態の癌に拡張することができることを示唆する（図９）。例えば、本出願人らは、さらに本明細書において、本方法を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８三種陰性乳癌細胞、ＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞における異常タンパク質ネットワークを同定するための仕方を示す。
【０１３６】
単剤療法は、癌において治癒的となる可能性が低いため、合理的な組合せ療法アプローチを設計する必要がある。発癌性Ｈｓｐ９０スキャフォールドシグナル伝達ネットワークのプロテオミクス同定は、特異的な小分子阻害剤を用いてさらに標的化され得る追加的な腫瘍性タンパク質を同定することができる。実際に、本出願人らの方法により、Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞の形質転換に寄与し、個々のネットワークにおける重要なｎｏｄａｌタンパク質であると同定されたｍＴＯＲおよびＣＡＭＫＩＩ（図６ｂ、黄色のボックス）の阻害剤は、単剤として活性を有し（図７ａ）、これら白血病細胞の成長に与える影響においてＨｓｐ９０阻害と協同する（図２１）。
【０１３７】
特性評価が十分でない腫瘍型に適用された場合、ＰＵ−Ｈ７１化学的プロテオミクスは、組合せ療法のためにより不明確で、より影響力の強い候補標的を提供し得る。本出願人らは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８三種陰性乳癌細胞、ＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞およびＯＣＩ−ＬＹ１びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞においてこの概念を例証する。
【０１３８】
三種陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において、本方法により同定された主要なシグナル伝達ネットワークは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＮＲＦ２媒介性酸化ストレス応答、ＭＹＣ、ＰＫＡおよびＩＬ−６シグナル伝達経路であった（図２２）。本方法により同定された経路成分を表３に収載する。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【０１３９】
ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路
ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、そのイノシトール脂質産物が、サイトカイン、増殖因子および他の細胞外マトリクスタンパク質のシグナル伝達経路において中心的役割を果たす、脂質キナーゼのファミリーである。ＰＩ３Ｋは、３クラス：クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩに分けられ、そのうちクラスＩが最も研究されている。これは、触媒および調節サブユニットからなるヘテロ二量体である。これらサブユニットは通常、ｐ１１０およびｐ８５であることが判明している。クラスＩのＰＩ３Ｋによるホスホイノシチド（４，５）二リン酸（ＰＩＰ２）のリン酸化は、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３を生じる。様々なＰＩ３ｋが、種々のシグナル伝達経路に関与する。これは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、アダプター分子ＧＡＢ１−ＧＲＢ２およびキナーゼＪＡＫ等の分子との相互作用により媒介される。これは、活性化ＰＤＫ１へと収束し、続いてＡＫＴをリン酸化する。ＡＫＴは、次の別個の２経路をたどる。１）阻害的役割  −  例えば、ＡＫＴは、Ｂａｄ／Ｂｃｌ−ＸＬ複合体のＢａｄ成分をリン酸化することによりアポトーシスを阻害して、細胞を生存させる。２）活性化の役割  −  ＡＫＴは、ＩＫＫを活性化し、ＮＦ−κＢ活性化および細胞生存をもたらす。その阻害的および活性化の役割により、ＡＫＴは、エネルギー貯蔵、細胞周期進行、タンパク質合成および血管新生等、多数の細胞プロセスに関与する。
【０１４０】
本経路は、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、１４−３−３、１４−３−３−Ｃｄｋｎ１ｂ、Ａｋｔ、ＢＡＤ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＣ３７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、シトルリン、ＣＴＮＮＢ１、ＥＩＦ４Ｅ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＲＫ１／２、ＦＫＨＲ、ＧＡＢ１／２、ＧＤＦ１５、グリコーゲンシンターゼ、ＧＲＢ２、Ｇｓｋ３、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、ＩＫＫ（複合体）、ＩＬＫ、インテグリン、ＪＡＫ、Ｌ−アルギニン、ＬＩＭＳ１、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫ８ＩＰ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＴＯＲ、ＮＡＮＯＧ、ＮＦｋＢ（複合体）、一酸化窒素、ＮＯＳ３、Ｐ１１０、ｐ７０  Ｓ６ｋ、ＰＤＰＫ１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ＰＩ３Ｋ  ｐ８５、ＰＰ２Ａ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＦ１、Ｒａｓ、ＲＨＥＢ、ＳＦＮ、ＳＨＣ１（ＥＧ：２０４１６を包含）、ＳＨＩＰ、Ｓｏｓ、ＴＨＥＭ４、ＴＰ５３（ＥＧ：２２０５９を包含）、ＴＳＣ１、Ｔｓｃ１−Ｔｓｃ２、ＴＳＣ２、ＹＷＨＡＥで構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１４１】
ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達ネットワーク
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、成長ホルモンの制御下にあるペプチドホルモンである。ＩＧＦ−１は、細胞増殖、成長および生存を促進する。６種の特異的結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ１〜６は、ＩＧＦ活性のより繊細な制御を可能にする。ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、膜貫通チロシンキナーゼタンパク質である。ＩＧＦ−１誘導性の受容体活性化は、自己リン酸化と、続く下流経路の活性化能力の増強をもたらす。活性化されたＩＧＦ−１Ｒは、ＳＨＣおよびＩＲＳ−１をリン酸化する。ＳＨＣは、アダプター分子ＧＲＢ２およびＳＯＳと共に、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を活性化するシグナル伝達複合体を形成する。ＥＲＫの核移行は、転写調節因子ＥＬＫ−１、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓの活性化をもたらし、これらは、細胞増殖および分化を促進する遺伝子を誘導する。ＩＲＳ−１は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴ／ＢＡＤ経路を介して細胞生存のための経路を活性化する。ＩＲＳ−１は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ｐ７０ＲＳＫ経路を介して細胞増殖のための経路も活性化する。ＩＧＦ−１はまた、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２およびＳＴＡＴ−３のチロシンリン酸化を誘導することにより、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達する。ＳＯＣＳタンパク質は、ＪＡＫを阻害し、これによりこの経路を阻害することができる。アダプタータンパク質ＧＲＢ１０は、ＩＧＦ−ＩＲと相互作用する。ＧＲＢ１０はまた、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮＥＤＤ４と結合し、シグナル伝達の長期減弱の手段として、リガンド刺激によるＩＧＦ−ＩＲのユビキチン化、内部移行および分解を促進する。
【０１４２】
本経路は、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、１４−３−３、１４−３−３−Ｂａｄ、Ａｋｔ、非定型プロテインキナーゼＣ、ＢＡＤ、ＣＡＳＰ９（ＥＧ：１００１４０９４５を包含）、Ｃｋ２、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１／２、ＦＫＨＲ、ＦＯＳ、ＧＲＢ１０、ＧＲＢ２、ＩＧＦ１、Ｉｇｆ１−Ｉｇｆｂｐ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｉｇｆｂｐ、ＩＲＳ１／２、ＪＡＫ１／２、ＪＵＮ、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰＫ８、ＮＥＤＤ４、ｐ７０  Ｓ６ｋ、ＰＤＰＫ１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ＰＩ３Ｋ（複合体）、Ｐｋａ、ＰＴＫ２（ＥＧ：１４０８３を包含）、ＰＴＰＮ１１、ＰＸＮ、ＲＡＦ１、Ｒａｓ、ＲＡＳＡ１、ＳＨＣ１（ＥＧ：２０４１６を包含）、ＳＯＣＳ、ＳＯＣＳ３、Ｓｏｓ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ３、Ｓｔａｔ３−Ｓｔａｔ３で構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１４３】
ＮＲＦ２媒介性の酸化ストレス応答
酸化ストレスは、活性酸素の産生と、反応性中間体の解毒と間の不均衡に起因する。過酸化物およびフリーラジカル等、反応性中間体は、タンパク質、脂質およびＤＮＡ等、細胞の多くの部分にとって非常に傷害性となり得る。重度の酸化ストレスは、アポトーシスおよび壊死を誘発し得る。酸化ストレスは、粥状動脈硬化、パーキンソン病およびアルツハイマー病等、多くの疾患に関与する。酸化ストレスは、老化にも関連付けられてきた。酸化ストレスに対する細胞防御応答は、解毒酵素および抗酸化酵素の誘導を包含する。核内因子赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）は、これら酵素のプロモーター内の抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）と結合し、これらの転写を活性化する。不活性Ｎｒｆ２は、アクチン結合タンパク質Ｋｅａｐ１との会合により、細胞質に保持される。細胞を酸化ストレスに曝露すると、Ｎｒｆ２は、プロテインキナーゼＣ、ホスファチジルイノシトール３キナーゼおよびＭＡＰキナーゼ経路に応答してリン酸化される。リン酸化の後、Ｎｒｆ２は、核に移行し、ＡＲＥと結合し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チトクロムＰ４５０、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素、ヘムオキシゲナーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ等、解毒酵素および抗酸化酵素をトランス活性化する。
【０１４４】
本経路は、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４（ＥＧ：１０２５７を包含）、アクチン、アクチン−Ｎｒｆ２、Ａｆａｒ、ＡＫＲ１Ａ１、ＡＫＴ１、ＡＯＸ１、ＡＴＦ４、ＢＡＣＨ１、ＣＡＴ、Ｃｂｐ／ｐ３００、ＣＢＲ１、ＣＣＴ７、ＣＤＣ３４、ＣＬＰＰ、ＣＵＬ３（ＥＧ：２６５５４を包含）、Ｃｕｌ３−Ｒｏｃ１、Ｃｙｐ１ａ／２ａ／３ａ／４ａ／２ｃ、ＥＩＦ２ＡＫ３、ＥＮＣ１、ＥＰＨＸ１、ＥＲＫ１／２、ＥＲＰ２９、ＦＫＢＰ５、ＦＭＯ１（ＥＧ：１４２６１を包含）、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１、ＦＴＨ１（ＥＧ：１４３１９を包含）、ＦＴＬ、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＰＸ２、ＧＳＫ３Ｂ、ＧＳＲ、ＧＳＴ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＭＯＸ１、Ｈｓｐ２２／Ｈｓｐ４０／Ｈｓｐ９０、ＪＩＮＫ１／２、Ｊｎｋｋ、ＪＵＮ／ＪＵＮＢ／ＪＵＮＤ、ＫＥＡＰ１、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２、ＭＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰ２Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ７（ＥＧ：１７２８４２を包含）、ＭＡＰＫ１４、ＭＡＰＫ７、ＭＫＫ３／６、筋腱膜性線維肉腫癌遺伝子、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＱＯ、ＰＩ３Ｋ（複合体）、Ｐｋｃ（複数可）、ＰＭＦ１、ＰＰＩＢ、ＰＲＤＸ１、Ｐｓｍ、ＰＴＰＬＡＤ１、ＲＡＦ１、Ｒａｓ、ＲＢＸ１、活性酸素種、ＳＣＡＲＢ１、ＳＬＣ３５Ａ２、Ｓｏｄ、ＳＱＳＴＭ１、ＳＴＩＰ１、ＴＸＮ（ＥＧ：１１６４８４を包含）、ＴＸＮＲＤ１、ＵＢＢ、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｋ、ＵＳＰ１４、ＶＣＰで構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１４５】
プロテインキナーゼＡシグナル伝達経路
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、成長、発生、記憶および代謝にわたる多様な過程を調節する。これは、２個の触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）と１個の調節（ＰＫＡ−Ｒ）サブユニット二量体からなる四量体の複合体として存在する。ＩＩ型ＰＫＡは、ＡＫＡＰにより特異的な細胞内局在に繋留される。神経伝達物質、ホルモン、炎症性刺激、ストレス、エピネフリンおよびノルエピネフリン等、細胞外刺激は、ＧＰＣＲおよびＡＤＲ−α／β等、受容体を介してＧタンパク質を活性化する。これらの受容体は、ＣＲＨＲ、ＧｃｇＲおよびＤＣＣ等、他のものと共に、ＰＫＡの活性化をもたらすｃＡＭＰ蓄積の原因である。ＡＴＰのｃＡＭＰへの転換は、９種の膜貫通ＡＣ酵素および１種の可溶性ＡＣにより媒介される。膜貫通ＡＣは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、Ｇαｓ、ＧαｑおよびＧαｉにより調節される。ＧαｓおよびＧαｑは、ＡＣを活性化し、一方、Ｇαｉはそれを阻害する。ＧβおよびＧγサブユニットは、ＧαｓおよびＧαｑと相乗的に作用して、ＡＣＩＩ、ＩＶおよびＶＩＩを活性化する。しかし、βおよびγサブユニットは、Ｇαｉと共に、ＡＣＩ、ＶおよびＶＩの活性を阻害する。
【０１４６】
Ｇタンパク質は、ＰＬＣを活性化してＤＡＧおよびＩＰ３を生じることにより、ｃＡＭＰシグナル伝達に間接的に影響する。次に、ＤＡＧは、ＰＫＣを活性化する。ＩＰ３は、ＩＰ３ＲによりＥＲからＣａ２＋を放出させることにより、ｃＡＭＰシグナル伝達上流のタンパク質をモジュレートする。Ｃａ２＋は、ＣａＣｎおよびＣＮＧによっても放出される。Ｃａ２＋放出は、ＡＣＩを活性化することによりｃＡＭＰモジュレーションに関与するカルモジュリン、ＣａｍＫＫおよびＣａｍＫを活性化する。Ｇα１３は、ＩκＢαのリン酸化および分解を誘導し、ＰＫＡを活性化する２種の非依存性経路を介してＭＥＫＫ１およびＲｈｏＡを活性化する。低酸素、虚血および熱ショック等のストレス条件下における高レベルのｃＡＭＰも、ＰＫＡを直接的に活性化する。ＴＧＦ−βは、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化により、ｃＡＭＰとは無関係にＰＫＡを活性化する。ＰＫＡは、心筋収縮を生じるＳＥＲＣＡ２の活性を調節するホスホランバンをリン酸化し、一方ＴｎｎＩのリン酸化は、弛緩を媒介する。ＰＫＡは、ＫＤＥＬＲも活性化してタンパク質回収を促進し、これにより細胞の定常状態を維持する。Ｃａ２＋濃度の増加と、続くＰＫＡ活性化は、心血管恒常性に必須のｅＮＯＳ活性を増強する。活性化されたＰＫＡは、Ｒａｆ１の阻害によりＥＲＫ活性化を抑圧する。ＰＫＡは、ＢＡＤおよびＮＦＡＴと１４−３−３タンパク質との相互作用を阻害して、細胞生存を促進する。ＰＫＡは、内皮ＭＬＣＫをリン酸化し、基底ＭＬＣリン酸化の減少をもたらす。これは、フィラミン、アデュシン、パキシリンおよびＦＡＫもリン酸化し、膜ラッフル（membrane ruffles）におけるストレスファイバーの消失およびＦ−アクチン蓄積に関与する。ＰＫＡはまた、特異的なＰＰｔａｓｅ１阻害剤、ＤＡＲＰＰ３２のリン酸化により、ホスファターゼ活性を制御する。ＰＫＡの他の基質として、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２ＢおよびＣＲＥＢが挙げられる。
【０１４７】
本経路は、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、１４−３−３、ＡＤＣＹ、ＡＤＣＹ１／５／６、ＡＤＣＹ２／４／７、ＡＤＣＹ９、アデュシン、ＡＫＡＰ、ＡＰＣ、ＡＴＦ１（ＥＧ：１０００４０２６０を包含）、ＡＴＰ、ＢＡＤ、ＢＲＡＦ、Ｃａ２＋、カルシニューリンタンパク質（複数可）、カルモジュリン、ＣａＭＫＩＩ、ＣＨＵＫ、Ｃｎｇチャネル、Ｃｒｅｂ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＥＭ、ＣＴＮＮＢ１、サイクリックＡＭＰ、ＤＣＣ、ジアシルグリセロール、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１／２、フィラミン、焦点接着キナーゼ、Ｇタンパク質アルファｉ、Ｇタンパク質ベータガンマ、Ｇ−タンパク質ベータ、Ｇタンパク質ガンマ、ＧＬＩ３、グリコーゲン、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲンシンターゼ、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＲＫ１／７、Ｇｓｋ３、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ヒストンＨ１、ヒストンｈ３、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、イノシトール三リン酸、ＩＴＰＲ、ＫＤＥＬＲ、ＬＩＰＥ、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰ３Ｋ１、Ｍｌｃ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ミオシン２、Ｎｆａｔ（ファミリー）、ＮＦｋＢ（複合体）、ＮＧＦＲ、ＮＯＳ３、ＮＴＮ１、Ｐａｔｃｈｅｄ、Ｐｄｅ、Ｐｈｋ、Ｐｋａ、Ｐｋａ触媒サブユニット、ＰＫＡｒ、Ｐｋｃ（複数可）、ＰＬＣ、ＰＬＮ、ＰＰ１タンパク質複合体グループ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＴＰａｓｅ、ＰＸＮ、ＲＡＦ１、Ｒａｐ１、ＲＨＯ、ＲＨＯＡ、Ｒｏｃｋ、Ｒｙｒ、ＳＭＡＤ３、Ｓｍａｄ３−Ｓｍａｄ４、ＳＭＡＤ４、ＳＭＯ、ＴＣＦ／ＬＥＦ、Ｔｇｆベータ、Ｔｇｆベータ受容体、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨ、Ｔｎｉ、ＶＡＳＰで構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１４８】
ＩＬ−６シグナル伝達経路
ＩＬ−６は、炎症におけるその中心的役割から、癌に関連する炎症の管理に対する重要な標的となっている。ＩＬ−６応答は、全ＩＬ−６関連サイトカインの普遍的シグナル伝達性受容体サブユニットとして機能する糖タンパク質１３０（ＧＰ１３０）を介して伝達される。ＩＬ−６型サイトカインは、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーのチロシンキナーゼおよびシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）ファミリーをシグナル伝達の主要メディエータとして利用する。ＩＬ−６による受容体刺激後に、ＧＰ１３０と会合したＪＡＫファミリーのキナーゼが活性化され、ＧＰ１３０のリン酸化を生じる。ＧＰ１３０の数個のリン酸化チロシン残基は、ＳＴＡＴ因子、主にＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１のドッキング部位として機能する。その後、ＳＴＡＴはリン酸化され、二量体を形成し、核に移行し、そこで標的遺伝子の転写を調節する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のシグナル伝達に加えて、ＩＬ−６は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）も活性化する。ＥＲＫ１／２の上流活性化因子は、ＲＡＳならびにｓｒｃ相同性−２含有タンパク質ＧＲＢ２およびＳＨＣを包含する。ＳＨＣタンパク質は、ＪＡＫ２により活性化されるため、ＩＬ−６活性化ＪＡＫ／ＳＴＡＴとＲＡＳ−ＭＡＰＫ経路との間のリンクとして機能する。ＩＬ−６活性化ＲＡＳに応答したＭＡＰＫのリン酸化は、核内因子ＩＬ−６（ＮＦ−ＩＬ６）の活性化をもたらし、次にこれは、ＩＬ−６遺伝子の転写を刺激する。ＩＬ−６遺伝子の転写は、核内因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）によっても刺激される。
【０１４９】
本明細書に記載されている方法による知見に基づき、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＫＫ、Ｂｃｌ２、ＰＫＡ複合体、ホスホジエステラーゼ（これらに限定されない）を標的化する阻害剤等、これら同定された経路の成分の阻害剤の組合せが、Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせて用いた場合に効果的であると提案される。
【０１５０】
ＡＫＴ阻害剤の例は、ＰＦ−０４６９１５０２、リン酸トリシリビン（ＮＳＣ−２８０５９４）、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＴ７８６７、ＰＨＴ−４２７、ＧＳＫ６９０６９３、ＭＫ−２２０６である。
【０１５１】
ＰＩ３Ｋ阻害剤の例は、２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−（４−メタンスルホニルピペラジン−１−イルメチル）−４−モルフォリン−４−イルチエノ（３，２−ｄ）ピリミジン、ＢＫＭ１２０、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＸ−８６６、ＳＦ  １１２６、ＸＬ１４７である。
【０１５２】
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、デフォロリムス、エベロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、タクロリムス、テムシロリムス、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＰＰ２４２、ＯＳＩ−０２７、ＧＳＫ２１２６４５８、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２である。
【０１５３】
Ｂｃｌ２阻害剤の例は、ＡＢＴ−７３７、オバトクラックス（ＧＸ１５−０７０）、ＡＢＴ−２６３、ＴＷ−３７である。
【０１５４】
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤の例は、ＮＶＰ−ＡＤＷ７４２、ＢＭＳ−７５４８０７、ＡＶＥ１６４２、ＢＩＩＢ０２２、シクスツムマブ、ガニツマブ、ＩＧＦ１、ＯＳＩ−９０６である。
【０１５５】
ＪＡＫ阻害剤の例は、クエン酸トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＡＴ９２８３、ＡＧ−４９０、ＩＮＣＢ０１８４２４（ルクソリチニブ）、ＡＺＤ１４８０、ＬＹ２７８４５４４、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、ＴＧ１０１２０９、ＴＧ−１０１３４８である。
【０１５６】
ＩｋＫ阻害剤の例は、ＳＣ−５１４、ＰＦ  １８４である。
【０１５７】
ホスホジエステラーゼの阻害剤の例は、アミノフィリン、アナグレリド、アロフィリン（arofylline）、カフェイン、シロミラスト、ジピリダモール、ジフィリン、Ｌ  ８６９２９８、Ｌ−８２６，１４１、ミルリノン、ニトログリセリン、ペントキシフィリン、ロフルミラスト、ロリプラム、テトミラスト（tetomilast）、テオフィリン、トルブタミド、アムリノン、アナグレリド、アロフィリン、カフェイン、シロミラスト、Ｌ  ８６９２９８、Ｌ−８２６，１４１、ミルリノン、ペントキシフィリン、ロフルミラスト、ロリプラム、テトミラストである。
【０１５８】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株ＯＣＩ−ＬＹ１において、本方法により同定された主要なシグナル伝達ネットワークは、Ｂ細胞受容体、ＰＫＣｔｅｔａ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＣＤ４０、ＣＤ２８およびＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路であった（図２３）。本方法により同定された経路成分を表４に収載する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
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【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【表３−３１】
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【表３−３２】
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【表３−３３】
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【表３−３４】
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【表３−３５】
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【表３−３６】
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【０１５９】
Ｂ細胞受容体シグナル伝達
Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）を介して伝播したシグナルは、Ｂリンパ球の発生、生存および活性化に決定的に重要である。これらのシグナルは、潜在的に自己反応性のＢリンパ球の除去においても中心的役割を果たす。ＢＣＲは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）と呼ばれるサイトゾルモチーフを介してシグナル伝達することができる、表面結合した抗原認識膜抗体ならびに会合したＩｇ−αおよびＩｇ−βヘテロ二量体で構成される。Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）による多価抗原の認識は、結果的に細胞応答となる一連の連結されたシグナル伝達現象を惹起する。ＢＣＲの係合は、ＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化を誘導する。ＩＴＡＭのリン酸化は、ＳＹＫキナーゼならびにＬＹＮ、ＦＹＮおよびＢＬＫを包含するＳＲＣファミリーのキナーゼにより媒介される。リン酸化ＩＴＡＭにより相互に活性化されたこれらキナーゼは、次に、連結されたシグナル伝達経路のカスケードを誘発する。ＢＣＲの活性化は、核内因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）の刺激をもたらす。ＮＦ−ｋＢを介したＢＣＲシグナル伝達の中心となるのは、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、アダプターＢ細胞リンカー（ＢＬＮＫ）およびホスホリパーゼＣガンマ２（ＰＬＣγ２）により形成された複合体である。チロシンリン酸化アダプタータンパク質は、ＢＣＲ関連チロシンキナーゼと下流のエフェクター分子との間の橋として機能する。ＢＬＮＫは、ＢＣＲ活性化においてリン酸化され、チロシンキナーゼＳＹＫとＰＬＣγ２活性化の共役に役立つ。ＰＬＣγ２の完全な刺激は、ＢＴＫにより促進される。刺激されたＰＬＣγ２は、ＤＡＧおよびＣａ２＋媒介性のプロテインキナーゼ（ＰＫＣ）活性化を誘発し、これは次に、ＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）と、その後にＮＦκＢを活性化する。ＮＦκＢの活性化に加えて、ＢＬＮＫは、ＶＡＶおよびＧＲＢ２等、他のタンパク質とも相互作用し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化をもたらす。これは、ｃ−ＪＵＮ、転写因子の活性化（ＡＴＦ）およびＥＬＫ６等、数種の因子のトランス活性化を生じる。別のアダプタータンパク質、ＢＣＡＰと称するホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のＢ細胞アダプターは、ＳＹＫにより活性化されるとＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の誘発へと進む。この経路は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）を阻害し、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）等、転写因子の核蓄積およびタンパク質合成の増強を生じる。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性化は、Ｂ細胞におけるアポトーシスの阻害ももたらす。この経路は、Ｂ細胞受容体抗原シグナル伝達の重要な成分を強調する。
【０１６０】
本経路は、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、ＡＢＬ１、Ａｋｔ、ＡＴＦ２、ＢＡＤ、ＢＣＬ１０、Ｂｃｌ１０−Ｃａｒｄ１０−Ｍａｌｔ１、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ６、ＢＬＮＫ、ＢＴＫ、カルモジュリン、ＣａＭＫＩＩ、ＣＡＲＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、Ｃｒｅｂ、ＣＳＫ、ＤＡＰＰ１、ＥＧＲ１、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１／２、ＥＴＳ１、Ｆｃｇｒ２、ＧＡＢ１／２、ＧＲＢ２、Ｇｓｋ３、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、ＩＫＫ（複合体）、ＪＩＮＫ１／２、Ｊｎｋｋ、ＪＵＮ、ＬＹＮ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰ３Ｋ、ＭＫＫ３／４／６、ＭＴＯＲ、ＮＦＡＴ（複合体）、ＮＦｋＢ（複合体）、Ｐ３８  ＭＡＰＫ、ｐ７０  Ｓ６ｋ、ＰＡＧ１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ＰＩ３Ｋ（複合体）、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＫＣ（β，θ）、ＰＬＣＧ２、ＰＯＵ２Ｆ２、Ｐｐ２ｂ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２、ＲＡＦ１、Ｒａｓ、ＳＨＣ１（ＥＧ：２０４１６を包含）、ＳＨＩＰ、Ｓｏｓ、ＳＹＫ、ＶＡＶで構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１６１】
ＰＫＣｔｅｔａ経路
有効な免疫応答は、外来分子を同定し、成熟エフェクター細胞への分化により応答する特殊化した白血球の能力に依存する。細胞表面抗原認識装置および複雑な細胞内受容体と共役したシグナル伝達性機構は、高い忠実度で作動して非自己抗原から自己抗原を識別する、堅固に調節された過程を媒介する。Ｔ細胞の活性化は、免疫シナプスまたは超分子活性化クラスターと称される特殊化した領域であるＴ細胞−ＡＰＣ接触領域における複数の細胞構成要素の時間的および空間的再構築をもたらす、ＭＨＣ提示されたペプチド抗原とＴＣＲの持続的な物理的相互作用を必要とする。近年の研究は、ＩＬ−２遺伝子誘導により細胞活性化、分化および生存をもたらすＴＣＲシグナル伝達における数種の決定的な機能を媒介するＴ細胞超分子活性化クラスターの必須成分として、Ｃａ非依存性ＰＫＣファミリーのメンバーであるＰＫＣθを同定した。高レベルのＰＫＣθは、骨格筋およびリンパ系組織、主に胸腺およびリンパ節において発現され、脾臓においてはより低レベルで発現される。Ｔ細胞は、ＰＫＣθ発現の原発部位（primary location）を構成する。Ｔ細胞のうち、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋シングルポジティブ末梢血Ｔ細胞およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞は、高レベルのＰＫＣθを発現することが判明している。Ｔ細胞の表面において、ＴＣＲ／ＣＤ３係合は、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０およびＴｅｃファミリーＰＴＫの活性化を誘導し、ＰＬＣγ１、ＰＩ３ＫおよびＶａｖの刺激および膜動員をもたらす。Ｒａｃおよびアクチン細胞骨格再構築ならびにＰＩ３Ｋに依存するＶａｖ媒介性の経路は、超分子活性化クラスターへのＰＫＣθの選択的動員の原因である。ＰＬＣγ１産生ＤＡＧも、ＰＫＣθの初期動員において役割を果たす。転写因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１は、ＰＫＣθの主たる生理学的標的である。ＰＫＣθによるこれらの転写因子の効率的活性化は、ＴＣＲおよびＣＤ２８同時刺激シグナルの統合を必要とする。ＣＤ２８と、ＡＰＣにおけるそのＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７−１／Ｂ７−２）リガンドは、超分子活性化クラスターに特異的なＰＫＣθの動員に必要とされる。ＴＣＲ／ＣＤ２８同時刺激の標的として機能する転写エレメントは、ＩＬ−２プロモーターにおけるＣＤ２８ＲＥである。ＣＤ２８ＲＥは、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の組合せ結合部位である。近年の研究は、ＰＫＣθによりＮＦ−κＢと共役するＴＣＲの調節が、種々の別個の機序により影響されることを示唆する。ＰＫＣθは、ＩＫＫ複合体と直接的に会合および調節してよい。ＰＫＣθは、ＣａＭＫＩＩを介して間接的にＩＫＫ複合体を調節してもよい。これは、ＩＫＫ複合体によりＮＦ−κＢおよびＩκＢを共に調節する、ＢＣＬ１０およびＭＡＬＴ１に関与する新たに記載された経路の上流に作用し得る。ＰＫＣθは、特異的病原体が排除された後に、活性化された抗原特異的なＴ細胞の拡大を制限し、免疫応答の終結を確実にする重要な過程である、活性化誘導Ｔ細胞死（ＡＩＣＤ）を促進することが判明した。酵素的に活性を有するＰＫＣθは、カルシニューリンと選択的に協同して、カスパーゼ８媒介性のＦａｓ／ＦａｓＬ依存性ＡＩＣＤを活性化する。ＣＤ２８同時刺激は、ＴＣＲ媒介性のＩＬ−２産生において必��の役割を果たし、その非存在下において、Ｔ細胞は、アネルギーと称する無応答性の安定状態に入る。ＰＫＣθ媒介性のＣＲＥＢリン酸化と、ＩＬ−２プロモーターにおけるｃＡＭＰ応答エレメントとのその後の結合は、ＩＬ−２転写を負に調節し、これにより、応答しているＴ細胞をアネルギー性状態に駆動する。Ｔ細胞におけるＰＫＣθの選択的発現と、成熟Ｔ細胞活性化におけるその必須の役割は、移植および自己免疫疾患における免疫抑制のための魅力的な薬物標的としてこれを確立する。
【０１６２】
本経路は、Ａｐ１、ＢＣＬ１０、Ｂｃｌ１０−Ｃａｒｄ１１−Ｍａｌｔ１、カルシニューリンタンパク質（複数可）、ＣａＭＫＩＩ、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３−ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８０（ＥＧ：１２５１９を包含）、ＣＤ８６、ジアシルグリセロール、ＥＲＫ１／２、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＧＲＡＰ２、ＧＲＢ２、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、Ｉｋｋ（ファミリー）、ＩＬ２、イノシトール三リン酸、ＪＵＮ、ＬＡＴ、ＬＣＫ、ＬＣＰ２、ＭＡＬＴ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ、ＭＡＰＫ８、ＭＨＣクラスＩＩ（複合体）、Ｎｆａｔ（ファミリー）、ＮＦｋＢ（複合体）、ホルボールミリステートアセテート、ＰＩ３Ｋ（複合体）、ＰＬＣガンマ、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＲＫＣＱ、Ｒａｃ、Ｒａｓ、Ｓｏｓ、ＴＣＲ、ＶＡＶ、電位開口型カルシウムチャネル、ＺＡＰ７０で構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１６３】
ＣＤ４０シグナル伝達
ＣＤ４０は、Ｂ細胞に生存シグナルを伝達する、細胞表面受容体の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである。リガンド結合すると、細胞表面ＣＤ４０により誘起された正準シグナル伝達は、細胞質アダプター（脂質ラフトにおいてＣＤ４０により動員されるＴＮＦ受容体関連因子［ＴＲＡＦ］と呼ばれる）およびＩＫＫ複合体を必要とする多段階のカスケードをたどる。ＮＦ−κＢ活性化により、ＣＤ４０シグナロソームは、Ｂ細胞増殖および生存に関与する複数の（mutiple）遺伝子の転写を活性化する。ＣＤ４０シグナロソームは、高悪性度のリンパ腫において活性を有し、腫瘍成長に寄与するため、ＣＤ４０に対する免疫療法戦略が計画されており、現在、臨床治験において試験されている［Ｂａｙｅｓ  ２００７およびＦａｎａｌｅ  ２００７）。
【０１６４】
ＣＤ４０媒介性のシグナル伝達は、病原体に対する宿主防御に関係する多数の遺伝子の転写を誘導する。これは、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＲｅｌ転写因子の活性化により遺伝子発現を調節する、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ３を包含する複数の経路の活性化により達成される。ＣＤ４０Ｌの受容体クラスター形成は、ｐ５３とリガンドの会合、ＡＳＭの細胞膜への移行、ＡＳＭの活性化およびセラミドの形成により媒介される。セラミドは、ＣＤ４０Ｌおよび数種のＴＲＡＦタンパク質（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６を包含）とＣＤ４０とのクラスター形成に役立つ。ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ６は、ＣＤ４０と直接的に結合する。ＴＲＡＦ１は、ＣＤ４０と直接的に結合しないが、ＴＲＡＦ２とのヘテロ二量体形成により膜マイクロドメインに動員される。ＴＲＡＦ１動員と類似して、ＴＲＡＦ５も、ＴＲＡＦ３依存性様式でＣＤ４０に間接的に動員される。Ａｃｔ１は、ＴＲＡＦタンパク質をＴＡＫ１／ＩＫＫにリンクさせて、ＮＦ−κＢ／Ｉ−κＢおよびＭＫＫ複合体を活性化し、ＪＮＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２を活性化する。ＮＩＫも、ＩＫＫ活性化において主要な役割を果たす。Ａｃｔ１依存性ＣＤ４０媒介性のＮＦ−κＢ活性化は、ＣＤ４０Ｌ誘導性のアポトーシスから細胞を保護する。ＣＤ４０Ｌまたは他の炎症性メディエータによる刺激後に、Ｉ−κＢタンパク質は、ＩＫＫによりリン酸化され、ＮＦ−κＢは、Ａｃｔ１−ＴＡＫ１経路を介して活性化される。次に、リン酸化Ｉ−κＢは、急速にユビキチン化され、分解される。遊離ＮＦ−κＢは、核に移行し、転写を活性化する。ＴＮＦにより誘導されるＡ２０は、ＮＦ−κＢ活性化と共にＴＮＦ媒介性アポトーシスを阻害する。ＴＲＡＦ３は、ｐ３８およびＪＮＫの活性化をもたらすシグナル伝達経路を惹起するが、Ａｃｔ１依存性ＣＤ４０媒介性のＮＦ−κＢ活性化を阻害し、ＣＤ４０Ｌ誘導性アポトーシスを惹起する。ＴＲＡＦ２は、ＳＡＰＫ経路の活性化に必要とされ、ＣＤ４０媒介性表面上方制御、Ｂ細胞におけるＩｇＭ分泌およびＩＣＡＭ１の上方制御における役割も果たす。ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０ライゲーションは、ヒト近位尿細管細胞の初代培養物におけるＭＣＰ１およびＩＬ−８産生を刺激し、これは、主としてＴＲＡＦ６の動員ならびにＥＲＫ１／２、ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化により生じる。ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化は、ＴＲＡＦ６により媒介され、一方、ＥＲＫ１／２活性は、他のＴＲＡＦメンバーにより潜在的に媒介される。しかし、全３種のＭＡＰＫ経路の刺激が、ＭＣＰ１およびＩＬ−８産生に必要とされる。ＣＤ４０刺激により活性化される他の経路は、ＣＤ４０ＬによりＢ細胞に与えられる抗アポトーシス特性に寄与する、ＪＡＫ３−ＳＴＡＴ３およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を包含する。ＣＤ４０は、ＪＡＫ３に直接的に結合し、ＳＴＡＴ３活性化を媒介し、続いてＩＣＡＭ１、ＣＤ２３およびＬＴ−αを上方制御する。
【０１６５】
本経路は、Ａｃｔ１、Ａｐ１、ＡＴＦ１（ＥＧ：１０００４０２６０を包含）、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬＧ、ＥＲＫ１／２、ＦＣＥＲ２、Ｉカッパーｂキナーゼ、ＩＣＡＭ１、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、ＪＡＫ３、Ｊｎｋ、ＬＴＡ、ＭＡＰ３Ｋ１４、ＭＡＰ３Ｋ７（ＥＧ：１７２８４２を包含）、ＭＡＰＫＡＰＫ２、Ｍｅｋ、ＮＦｋＢ（複合体）、Ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ（複合体）、ＳＴＡＴ３、Ｓｔａｔ３−Ｓｔａｔ３、ＴＡＮＫ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６で構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１６６】
ＣＤ２８シグナル伝達経路
ＣＤ２８は、ＴＣＲ／ＣＤ３の共受容体であり、主要な正の同時刺激分子である。ＣＤ８０およびＣＤ８６によるライゲーションにより、ＣＴＬＡ４は、活性化の終結のための負の同時刺激シグナルを生じる。クラスＩ調節ＰＩ３ＫとＣＤ２８のさらなる結合は、ＰＩ３Ｋを膜に動員し、ＰＩＰ３の生成と、ＰＩＫ３Ｃ３等、プレクストリン相同性ドメインを含有するタンパク質の細胞膜への動員をもたらす。ＰＩ３Ｋは、Ａｋｔの活性化に必要とされ、次にＡｋｔは、細胞生存を促進する多くの下流の標的を調節する。ＮＦＡＴに加えて、ＮＦ−κＢは、ＩＬ−２プロモーターおよび抗アポトーシス因子の転写調節において決定的な役割を有する。このために、ＰＬＣ−γは、基質としてＰＩＰ２を利用して、ＩＰ３およびＤＡＧを生成する。ＩＰ３は、ＩＰ３Ｒを介してＣａ２＋の放出を誘発し、ＤＡＧは、ＰＫＣ−θを活性化する。ＲＬＫ、ＰＬＣ−γおよびＣａ２＋の影響下において、ＰＫＣ−θは、直接的および間接的相互作用によりＩＫＫ複合体のリン酸化状態を調節する。さらに、ＣＡＲＭＡ１の活性化は、ＢＣＬ１０をリン酸化し、ＭＡＬＴ１を二量体形成し、この現象はＩＫＫの活性化に十分である。ＩＬ−２プロモーターにおける２種のＣＤ２８応答性エレメントは、ＮＦ−κＢ結合部位を有する。ＮＦ−κＢ二量体は、正常には、阻害Ｉ−κＢとの結合により細胞質に保持される。Ｉ−κＢのリン酸化は、そのユビキチン化および分解を惹起し、これにより、ＮＦ−κＢの核移行を自由化する。同様に、カルモジュリン−カルシニューリン相互作用の結果としてのＮＦＡＴの核移行は、ＩＬ−２発現を有効に促進する。ＴＣＲ−ＣＤ２８−ＰＩ３Ｋシグナル伝達によるＶａｖ１の活性化は、ＲａｃおよびＣＤＣ４２の活性化とＣＤ２８を連結し、これは、ＴＣＲ−ＣＤ３−ＣＤ２８による細胞骨格再構築を増強する。Ｒａｃは、アクチン重合を調節して、葉状仮足突起および膜ラッフリングを推進するが、一方、ＣＤＣ４２は、極性を生じ、糸状仮足およびマイクロスパイクの形成を誘導する。ＣＤＣ４２およびＲａｃ  ＧＴＰａｓｅｓは、逐次的に機能して、ＷＡＳＰおよびＰＡＫ１等、下流のエフェクターを活性化して、細胞骨格再構成をもたらすＡＲＰの活性化を誘導する。ＣＤ２８は、その後のＭＥＫＫ１、ＭＫＫおよびＪＮＫの活性化により、Ｒａｃ／ＰＡＫ１媒介性ＩＬ−２転写に作用する。ＪＮＫは、ＩＬ−２の転写に必須のｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓをリン酸化し活性化する。ＣＤ２８を介したシグナル伝達は、サイトカインＩＬ−２  ｍＲＮＡ産生を促進し、細胞周期、Ｔ細胞生存、Ｔヘルパー細胞分化および免疫グロブリンアイソタイプスイッチに進入する。
【０１６７】
本経路は、１，４，５−ＩＰ３、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、Ａｋｔ、Ａｐ１、Ａｒｐ２／３、ＢＣＬ１０、Ｃａ２＋、カルシニューリンタンパク質（複数可）、カルモジュリン、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３−ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８０（ＥＧ：１２５１９を包含）、ＣＤ８６、ＣＤＣ４２、ＣＳＫ、ＣＴＬＡ４、ジアシルグリセロール、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＧＲＡＰ２、ＧＲＢ２、Ｉｋｂ、ＩｋＢ−ＮｆｋＢ、ＩＫＫ（複合体）、ＩＬ２、ＩＴＫ、ＩＴＰＲ、Ｊｎｋ、ＪＵＮ、ＬＡＴ、ＬＣＫ、ＬＣＰ２、ＭＡＬＴ１、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＨＣクラスＩＩ（複合体）、Ｎｆａｔ（ファミリー）、ＮＦｋＢ（複合体）、ＰＡＫ１、ＰＤＰＫ１、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ＰＩ３Ｋ（複合体）、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＴＰＲＣ、ＲＡＣ１、ＳＨＰ、ＳＹＫ、ＴＣＲ、ＶＡＶ１、ＷＡＳ、ＺＡＰ７０で構成されるが、これらに制限されるものではない。
【０１６８】
ＥＲＫ−ＭＡＰＫ経路
ＥＲＫ（細胞外調節キナーゼ）／ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路は、細胞内の減数分裂／有糸分裂、成長、分化および発がんに関する細胞情報を伝達する重要な経路である。多くの場合増殖因子受容体である膜結合型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、この経路の起始点である。ＲＴＫへのリガンドの結合は、ＲＴＫの内因性チロシンキナーゼ活性を活性化する。増殖因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）、セブンレスの息子（son of sevenless）（ＳＯＳ）およびＳｈｃ等、アダプター分子は、チロシンリン酸化ＲＴＫにおけるシグナル伝達複合体を形成し、Ｒａｓを活性化する。活性化Ｒａｓは、ＭＥＫ（ＭＡＰＫキナーゼ）を活性化しリン酸化するＲａｆ（ＭＡＰＫキナーゼキナーゼ）から始まるキナーゼカスケードを惹起する。ＭＥＫは、ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）を活性化しリン酸化する。細胞質におけるＥＲＫは、細胞骨格タンパク質、イオンチャネル／受容体および翻訳調節因子を包含する種々の標的をリン酸化することができる。ＥＲＫも核へと移行し、そこでＥＬＫ−１、ＳＴＡＴ−１および−３、ＥＴＳならびにＭＹＣ等の転写調節因子と相互作用することにより遺伝子転写を誘導する。細胞質におけるｐ９０ＲＳＫのＥＲＫ活性化は、その核移行をもたらし、そこで転写調節因子、ＣＲＥＢ、ｃ−ＦｏｓおよびＳＲＦとの相互作用により遺伝子転写を間接的に誘導する。ＲａｓおよびＲａｆのＲＴＫ活性化は、代わりの経路を採る場合もある。例えば、インテグリンは、ＦＡＫ媒介性経路によりＥＲＫを活性化する。ＥＲＫは、Ｂ−ＲａｆのＣＡＳ−ＣＲＫ−Ｒａｐ１媒介性活性化およびＥＲＫのＰＬＣγ−ＰＫＣ−Ｒａｓ−Ｒａｆ活性化により活性化することもできる。
【０１６９】
本経路は、１，４，５−ＩＰ３、１−ホスファチジル−Ｄ−ミオイノシトール４，５−二リン酸、１４−３−３（β、γ、θ、η、ζ）、１４−３−３（η、θ、ζ）、ＡＲＡＦ、ＡＴＦ１（ＥＧ：１０００４０２６０を包含）、ＢＡＤ、ＢＣＡＲ１、ＢＲＡＦ、ｃ−Ｍｙｃ／Ｎ−Ｍｙｃ、ｃＡＭＰ−Ｇｅｆ、ＣＡＳ−Ｃｒｋ−ＤＯＣＫ１８０、Ｃｐｌａ２、Ｃｒｅｂ、ＣＲＫ／ＣＲＫＬ、サイクリックＡＭＰ、ジアシルグリセロール、ＤＯＣＫ１、ＤＵＳＰ２、ＥＩＦ４Ｅ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＬＫ１、ＥＲＫ１／２、Ｅｒｋ１／２二量体、ＥＳＲ１、ＥＴＳ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＧＲＢ２、ヒストンｈ３、Ｈｓｐ２７、インテグリン、ＫＳＲ１、ＬＡＭＴＯＲ３、ＭＡＰ２Ｋ１／２、ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＭＫＰ１／２／３／４、ＭＮＫ１／２、ＭＯＳ、ＭＳＫ１／２、ＮＦＡＴＣ１、Ｐａｋ、ＰＩ３Ｋ（複合体）、Ｐｋａ、ＰＫＣ（α、β、γ、δ、ε、ι）、ＰＬＣガンマ、ＰＰ１／ＰＰ２Ａ、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＫ２（ＥＧ：１４０８３を包含）、ＰＴＫ２Ｂ（ＥＧ：１９２２９を包含）、ＰＸＮ、Ｒａｃ、ＲＡＦ１、Ｒａｐ１、ＲＡＰＧＥＦ１、Ｒａｓ、ＲＰＳ６ＫＡ１（ＥＧ：２０１１１を包含）、ＳＨＣ１（ＥＧ：２０４１６を包含）、Ｓｏｓ、ＳＲＣ、ＳＲＦ、Ｓｔａｔ１／３、タリン、ＶＲＫ２で構成されているが、これらに制限されない。
【０１７０】
本明細書に記載されている方法による知見に基づき、ＤＬＢＣＬ  ＯＣＩ−ＬＹ１において、ＳＹＫ、ＢＴＫ、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、Ｉｋｋ、ＣＤ４０、ＭＥＫ、Ｒａｆ、ＪＡＫ、ＭＨＣ複合体成分、ＣＤ８０、ＣＤ３（これらに限定されない）を標的化する阻害剤等、これら経路の成分の阻害剤の組合せが、Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせて用いる場合に効果的であると提案される。
【０１７１】
ＢＴＫ阻害剤の例はＰＣＩ−３２７６５である。
【０１７２】
ＳＹＫ阻害剤の例は、Ｒ−４０６、Ｒ４０６、Ｒ９３５７８８（ホスタマチニブ二ナトリウム（Fostamatinib disodium））である。
【０１７３】
ＣＤ４０阻害剤の例は、ＳＧＮ−４０（抗ｈｕＣＤ４０ｍＡｂ）である。
【０１７４】
ＣＤ２８経路の阻害剤の例は、アバタセプト、ベラタセプト、ブリナツモマブ（blinatumomab）、ムロモナブ−ＣＤ３、ビジリズマブである。
【０１７５】
主要組織適合複合体クラスＩＩの阻害剤の例は、アポリズマブである。
【０１７６】
ＰＩ３Ｋ阻害剤の例は、２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−（４−メタンスルホニルピペラジン−１−イルメチル）−４−モルフォリン−４−イルチエノ（３，２−ｄ）ピリミジン、ＢＫＭ１２０、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＸ−８６６、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７である。
【０１７７】
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、デフォロリムス、エベロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、タクロリムス、テムシロリムス、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＰＰ２４２、ＯＳＩ−０２７、ＧＳＫ２１２６４５８、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２である。
【０１７８】
ＪＡＫ阻害剤の例は、クエン酸トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＡＴ９２８３、ＡＧ−４９０、ＩＮＣＢ０１８４２４（ルクソリチニブ）、ＡＺＤ１４８０、ＬＹ２７８４５４４、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、ＴＧ１０１２０９、ＴＧ−１０１３４８である。
【０１７９】
ＩｋＫ阻害剤の例は、ＳＣ−５１４、ＰＦ１８４である。
【０１８０】
Ｒａｆの阻害剤の例は、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ）、ＮＶＰ−ＢＨＧ７１２、ＳＢ５９０８８５、ＡＺ６２８、ＺＭ３３６３７２である。
【０１８１】
ＳＲＣの阻害剤の例は、ＡＺＭ−４７５２７１、ダサチニブ、サラカチニブ（saracatinib）である。
【０１８２】
ＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞株において、本方法により同定された主要なシグナル伝達ネットワークは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＩＧＦ１、細胞周期Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント調節、ＥＲＫ／ＭＡＰＫおよびＰＫＡシグナル伝達経路（図２４）であった。
【０１８３】
数種のネットワーク成分タンパク質間の相互作用を図１６において例証する。
【０１８４】
膵臓腺癌は、米国における癌死亡の４番目に多い原因を表す、最も致死性の癌の一つであり続けている。８０％を超える患者が、診断時に進行した疾患を呈し、従って、治癒の可能性がある外科的切除の候補ではない。ゲムシタビンに基づく化学療法は、１９９７年の中心的第ＩＩＩ相治験以来、局所的に進行したまたは転移性膵臓腺癌の主な治療であり続けている。確かにゲムシタビンによる治療は、進行した膵癌患者における有意な症状制御を達成するが、その奏効率は未だに低く、およそ６カ月の中位生存を伴う。これらの結果は、この腫瘍型に対する現行の治療戦略の不適切性を反映し、膵癌患者に対する新たなより有効な治療法の開発には協奏的な試みが必要とされる。
【０１８５】
Ｐｕｂ  Ｍｅｄ．文献の現在の総説、臨床治験データベース（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）、米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）および米国癌学会（ＡＡＣＲ）ウェブサイトは、膵癌の分子病変形成が、複数の経路および定義された突然変異に関与することを結論づけ、この疾患における標的化治療法の失敗の主要な根拠としての複雑さを示唆する。細胞増殖、生存および転移を調節する発癌性経路の活性化の複雑な機序に直面したことで、単一の活性化分子を標的とする治療法は、多数の異常細胞プロセスを制圧することができず、進行した疾患において限定的な治療利益しか得られないと思われる。
【０１８６】
本明細書に記載されている方法による知見に基づき、ＭｉａＰａＣａ２細胞において、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ３、ＩＫＫ、Ｂｃｌ２、ＰＫＡ複合体、ホスホジエステラーゼ、ＥＲＫ、Ｒａｆ、ＪＮＫ（これらに限定されない）を標的化する阻害剤等、これら同定された経路の成分の阻害剤の組合せが、Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせて用いる場合に効果的であると提案される。
【０１８７】
ＡＫＴ阻害剤の例は、ＰＦ−０４６９１５０２、リン酸トリシリビン（ＮＳＣ−２８０５９４）、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、ＡＴ７８６７、ＰＨＴ−４２７、ＧＳＫ６９０６９３、ＭＫ−２２０６二塩酸塩である。
【０１８８】
ＰＩ３Ｋ阻害剤の例は、２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−（４−メタンスルホニルピペラジン−１−イルメチル）−４−モルフォリン−４−イルチエノ（３，２−ｄ）ピリミジン、ＢＫＭ１２０、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＸ−８６６、ＳＦ１１２６、ＸＬ１４７である。
【０１８９】
ｍＴＯＲ阻害剤の例は、デフォロリムス、エベロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、タクロリムス、テムシロリムス、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＰＰ２４２、ＯＳＩ−０２７、ＧＳＫ２１２６４５８、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２である。
【０１９０】
Ｂｃｌ２阻害剤の例は、ＡＢＴ−７３７、オバトクラックス（ＧＸ１５−０７０）、ＡＢＴ−２６３、ＴＷ−３７である。
【０１９１】
ＪＡＫ阻害剤の例は、クエン酸トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＡＴ９２８３、ＡＧ−４９０、ＩＮＣＢ０１８４２４（ルクソリチニブ）、ＡＺＤ１４８０、ＬＹ２７
８４５４４、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、ＴＧ１０１２０９、ＴＧ−１０１３４８である。
【０１９２】
ＩｋＫ阻害剤の例は、ＳＣ−５１４、ＰＦ１８４である。
【０１９３】
ホスホジエステラーゼの阻害剤の例は、アミノフィリン、アナグレリド、アロフィリン、カフェイン、シロミラスト、ジピリダモール、ジフィリン、Ｌ  ８６９２９８、Ｌ−８２６，１４１、ミルリノン、ニトログリセリン、ペントキシフィリン、ロフルミラスト、ロリプラム、テトミラスト、テオフィリン、トルブタミド、アムリノン、アナグレリド、アロフィリン、カフェイン、シロミラスト、Ｌ  ８６９２９８、Ｌ−８２６，１４１、ミルリノン、ペントキシフィリン、ロフルミラスト、ロリプラム、テトミラストである。
【０１９４】
実際に、ＭｉａＰａＣａ２細胞の形質転換に潜在的に寄与すると本出願人らの方法により同定されたｍＴＯＲの阻害剤（図７ｅ）は、単剤として活性を有し（図７ｆ）、これら膵癌細胞の成長への影響においてＨｓｐ９０阻害と協同する（図１７）。
【０１９５】
ｍＴＯＲとＨｓｐ９０阻害剤の間の相乗作用の定量的解析：ｐｐ２４２（ｍＴＯＲ阻害剤）とＰＵ−Ｈ７１（Ｈｓｐ９０阻害剤）との間の薬物相互作用を決定するため、以前に記載された通りにＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの併用指数（ＣＩ；combination index）アイソボログラム方法を用いた。質量作用の法則の中央値−効果原理に基づくこの方法は、コンピュータシミュレーションにより、各薬物の機序に関係なく２種以上の薬物組合せの相乗作用または拮抗作用を定量する。アルゴリズムに基づいて、コンピュータソフトウェアは、中央値−効果プロット、併用指数プロットおよび正規化アイソボログラム（２種の薬物の非定率的組合せが用いられる場合）を表示する。ＰＵ−Ｈ７１（０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１２５μＭ）およびｐｐ２４２（０．５、０．１２５、０．０３１２５、０．０００８、０．００２、０．００１μＭ）を、言及されている濃度の単剤として、または非定率の組合せとして（ＰＵ−Ｈ７１：ｐｐ２４２；１：１、１：２、１：４、１：７．８、１：１５．６、１：１２．５）用いた。式Ｆａ＝１−Ｆｕを用いてＦａ（死滅細胞分率）を計算した；Ｆｕは、影響を受けていない細胞の分率であり、コンピュータソフトウェア（ＣｏｍｐｕＳｙｎ、米国ニュージャージー州パラマス）を用いた用量効果解析に用いた。
【０１９６】
同様の様式で、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の形質転換に寄与すると本出願人らの方法により同定されたＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせた場合にＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞においてより効果的である。
【０１９７】
細胞周期：Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイント調節
Ｇ２／Ｍチェックポイントは、細胞周期内における第２のチェックポイントである。このチェックポイントは、損傷ＤＮＡを有する細胞がＭ期に移行するのを防ぎつつ、ＤＮＡ修復が行われるように休止させる。この調節は、ゲノム安定性を維持し、細胞が悪性形質転換するのを防ぐために重要である。血管拡張性失調症突然変異（ＡＴＭ）ならびに血管拡張性失調症突然変異およびｒａｄ３関連（ＡＴＲ）は、ＤＮＡ損傷に応答する重要なキナーゼである。ＡＴＲは、ＵＶ損傷に応答し、一方ＡＴＭは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する。ＡＴＭおよびＡＴＲは、キナーゼＣｈｋ１およびＣｈｋ２を活性化し、これらは次に、正常にはＣｄｃ２を活性化するホスファターゼであるＣｄｃ２５を阻害する。サイクリン依存性キナーゼであるＣｄｃ２は、Ｍ期移行に必要とされる重要な分子である。これは、その活性のためにサイクリンＢ１との結合を必要とする。腫瘍抑制因子遺伝子ｐ５３は、Ｇ２／Ｍチェックポイント調節において重要な分子である。ＡＴＭ、ＡＴＲおよびＣｈｋ２は、ｐ５３の活性化に寄与する。さらに、ｐ１９Ａｒｆは、機構的に機能して、ＭＤＭ２のｐ５３中和を防ぐ。Ｍｄｍ４は、ｐ５３の転写阻害剤である。ＤＮＡ損傷誘導性Ｍｄｍ４リン酸化は、Ｍｄｍ４を分解の標的とすることにより、ｐ５３を活性化する。Ｇａｄｄ４５およびｐ２１等、よく知られたｐ５３標的遺伝子は、Ｃｄｃ２の阻害に関与する。別のｐ５３標的遺伝子、１４−３−３σは、それを不活性するＣｄｃ２−サイクリンＢ複合体と結合する。ｐ５３によるサイクリンＢ１遺伝子の抑圧は、有糸分裂への移行の遮断にも寄与する。このようにして、細胞がＭ期へと移行される前に、多数のチェックが施行される。
【０１９８】
本経路は、１４−３−３、１４−３−３（β、ε、ζ）、１４−３−３−Ｃｄｃ２５、ＡＴＭ、ＡＴＭ／ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｄｃ２−サイクリンＢ、Ｃｄｃ２−サイクリンＢ−Ｓｆｎ、Ｃｄｃ２５Ｂ／Ｃ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ７、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、Ｃｄｋｎ２ａ−Ｍｄｍ２、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＫＳ２、サイクリンＢ、ＥＰ３００、Ｅｐ３００／Ｐｃａｆ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＤＭ２、Ｍｄｍ２−Ｔｐ５３−Ｍｄｍ４、ＭＤＭ４、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ１、ＰＲＫＤＣ、ＲＰＲＭ、ＲＰＳ６ＫＡ１（ＥＧ：２０１１１を包含）、Ｓｃｆ、ＳＦＮ、Ｔｏｐ２、ＴＰ５３（ＥＧ：２２０５９を包含）、ＷＥＥ１で構成されているが、これらに限定されない。
【０１９９】
本明細書に記載されている方法による知見に基づき、ＣＤＫ１、ＣＤＫ７、ＣＨＥＫ１、ＰＬＫ１およびＴＯＰ２Ａ（Ｂ）を標的化する阻害剤等、本経路の成分の阻害剤の組合せが、Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせて用いる場合に効果的であると提案される。
【０２００】
阻害剤の例は、ＡＱ４Ｎ、ベカテカリン（becatecarin）、ＢＮ８０９２７、ＣＰＩ−０００４Ｎａ、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドキソルビシン、エルサミトルシン（elsamitrucin）、エピルビシン、エトポシド、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ミトキサントロン、ナリジクス酸、ネモルビシン（nemorubicin）、ノルフロキサシン、ノボビオシン、ピクサントロン、タフルポシド（tafluposide）、ＴＡＳ−１０３、チラパザミン、バルルビシン、ＸＫ４６９、ＢＩ２５３６である。
【０２０１】
ＰＵ−ビーズも、選択ＣＭＬ、膵癌および乳癌細胞におけるＨｓｐ９０調節性経路としてＤＮＡ損傷、複製および修復、相同組換えならびに電離放射線に対する細胞応答のタンパク質を同定する。ＰＵ−Ｈ７１は、これらの経路に作用する薬剤と協同した。
【０２０２】
特に、Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞およびＭｉａ−ＰａＣａ−２膵癌細胞において同定されたＨｓｐ９０調節性経路のうち数種が、ＤＮＡ損傷、複製および修復応答および／または相同組換えに関与した（表３、５ａ〜５ｆ）。Ｈｓｐ９０阻害は、ＤＮＡ損傷および／または相同組換えに作用する薬剤（即ち、誤りのない相同組換え修復経路による二本鎖ＤＮＡ切断の修復に重要なタンパク質に作用するＰＡＲＰ阻害剤等、ＩＲ／化学療法または他の薬剤による治療後に持続するＤＮＡ損傷を増強する）と協同し得るまたは相加的となり得る。実際に、本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１が、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２ヒト膵癌細胞を放射線増感したことを見出した。本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨＣＣ１９３７乳癌細胞においてＰＡＲＰ阻害剤オラパリブ（olaparib）と協同することも見出した（図２５）。
【０２０３】
腫瘍細胞生存に必要とされるＨｓｐ９０クライアントの同定も、Ｈｓｐ９０治療法から恩恵を受ける可能性の高い患者を選択するためおよび臨床治験におけるＨｓｐ９０阻害剤有効性の薬力学的モニタリングのための腫瘍特異的なバイオマーカーとして機能し得る（即ち、その発現またはリン酸化がＨｓｐ９０阻害により変化する、図６、２０におけるクライアント）。腫瘍特異的なＨｓｐ９０クライアントプロファイリングは、腫瘍のオーダーメイド治療標的化のためのアプローチを最終的に達成することができた（図９）。
【０２０４】
本研究は、Ｋａｍａｌらの研究を実証し、顕著に拡張し、腫瘍におけるＨｓｐ９０が、多シャペロン複合体に完全に存在する一方、正常組織のＨｓｐ９０が、潜在型の複合体形成しない状態で存在するものとして記載する、元来のモデルのより洗練された理解を提供する（Ｋａｍａｌら、２００３）。本出願人らは、Ｈｓｐ９０が、癌細胞において生化学的に別個の複合体を形成することを提案する（図１１ａ）。この観点から考えると、癌細胞Ｈｓｐ９０の主要画分は、正常細胞と同様の「ハウスキーピング」シャペロン機能を保持する一方、癌細胞において濃縮または拡張された機能的に別個のＨｓｐ９０プールは、腫瘍細胞生存の維持に必要とされる発癌性タンパク質と特異的に相互作用する。恐らく、このＨｓｐ９０画分は、腫瘍細胞状況で拡張され、構成的に維持される細胞ストレス特異的な形態のシャペロン複合体を表す。本出願人らのデータは、これが悪性表現型の維持に必要とされる機能を実行し得ることを示唆する。このような役割の一つは、突然変異した（即ち、ｍＢ−Ｒａｆ）またはキメラタンパク質（即ち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）のフォールディングを調節することである（Ｚｕｅｈｌｋｅ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１０；Ｗｏｒｋｍａｎら、２００７）。ここで、本出願人らは、追加的な役割、即ち、異常に活性化されたシグナル伝達複合体に関与する分子のスキャフォールディングおよび複合体形成を促進することの実験的証拠を提示する。本明細書において、本出願人らは、ＣＭＬにおける構成的ＳＴＡＴ５シグナル伝達の維持におけるＨｓｐ９０のこのような役割について記載する（図８ｈ）。これらのデータは、Ｈｓｐ９０が、Ｂ細胞リンパ腫細胞においてＢＣＬ６発癌性転写リプレッサーによる機能的転写抑圧複合体の維持に必要とされることを示した、本出願人らによる以前の研究と一貫性がある（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９）。
【０２０５】
要するに、本出願人らの研究は、化学的ツールを用いて、腫瘍関連Ｈｓｐ９０の不均一性への新たな洞察を提供し、特定のＨｓｐ９０阻害剤の生化学的特色を利用して、腫瘍特異的な生物学的経路およびタンパク質を同定する（図９）。本出願人らは、本明細書に記載されている機能的プロテオミクス方法が、別個の腫瘍において調節不全となる重大なプロテオームサブセットの同定を可能にすると考える。これは、本明細書に記載されているＳＴＡＴ機序により例証される新たな癌機序の同定、本明細書に記載されているＣＡＲＭ１により例証される新たな腫瘍性タンパク質の同定およびＨｓｐ９０に相補的な合理的に組み合わせた標的化治療法の開発のための治療標的の同定を可能にする。
【０２０６】
材料と方法細胞株および初代細胞
ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２、Ｋａｓｕｍｉ−４、ＭＥＧ−０１およびＫＵ１８２、三種陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＳＫＢｒ３、メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５、膵癌細胞株Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、結腸線維芽細胞、ＣＣＣＤ１８Ｃｏ細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手した。ＣＭＬ細胞株ＫＣＬ−２２は、医薬基盤研究所細胞バンク（JapaneseCollection of Research Bioresources）から入手した。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を以前に記載された通りに遺伝子導入した（Ａｎら、２０００）。細胞を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢｒ３およびＭｉａ−ＰａＣａ−２）、ＲＰＭＩ（Ｋ５６２、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＮＩＨ−３Ｔ３）またはＭＥＭ（ＣＣＤ１８Ｃｏ）において培養した。Ｋａｓｕｍｉ−４細胞は、２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補給したＩＭＤＭにおいて維持した。ＰＢＬ（ヒト末梢血白血球）および臍帯血は、ニューヨーク血液センター（NewYork Blood Center）から購入した患者血液から得た。３５ｍｌの細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に重層した。試料を２，０００ｒｐｍにて４０分間、４℃で遠心分離し、白血球界面を収集した。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地に細胞を蒔き、表示の通りに用いた。初代ヒト急性転化ＣＭＬおよびＡＭＬ細胞は、インフォームドコンセントにより得た。検体の操作および解析は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの施設内審査委員会（InstitutionalReview Boards）により承認された。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニューヨーク州ピスカタウェイ）密度勾配分離を用いて単核細胞を単離した。細胞を、Ｉｓｃｏｖｅの変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、４０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結培地またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ−１０（Ｂｉｏｌｉｆｅ）において凍結保存した。培養の際には、５％ＣＯ2の加湿雰囲気において３７℃で細胞を維持した。
【０２０７】
化学沈殿および免疫沈降のための細胞溶解
１μｇ／μＬのプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチンおよびアプロチニン）を添加したＦｅｌｔｓ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ、ＮＰ４０  ０．０１％、新たに調製したＮａ2ＭｏＯ4  ２０ｍＭ、ｐＨ７．２〜７．３）に細胞を収集し、続いて３回連続して凍結（ドライアイス中）および融解ステップを行うことにより、細胞を溶解した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、メーカーの説明書に従って総タンパク質濃度を決定した。
【０２０８】
免疫沈降
１０μＬ容量のＨｓｐ９０抗体（Ｈ９０１０）または正常ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、４０μＬのプロテインＧアガロースビーズ（Ｕｐｓｔａｔｅ）と共に表示量の細胞溶解物に添加し、この混合物を４℃で一晩インキュベートした。ビーズをＦｅｌｔｓ溶解緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いて標準ウエスタンブロッティング手順に付した。
【０２０９】
化学沈殿
Ｈｓｐ９０阻害剤ビーズまたは、アガロースビーズにコンジュゲートしたＨｓｐ９０不活性化学物質（エタノールアミン）を含有する対照ビーズを溶解緩衝液において３回洗浄した。他に断りがなければ、次に、ビーズコンジュゲート（８０μＬ）を、表示量の細胞溶解物（１２０〜５００μｇ）と共に４℃でインキュベートし、容量を溶解緩衝液で２００μＬに調整した。インキュベーション後に、ビーズコンジュゲートを溶解緩衝液で５回洗浄し、プルダウンにおけるタンパク質をウエスタンブロットにより解析した。枯渇試験のため、２〜４回の連続的化学沈殿を行い、表示されている場合、続いて免疫沈降ステップを行った。
【０２１０】
追加的な方法も、本明細書の１７３〜１８３頁に記載されている。
【０２１１】
補足材料表５の説明
表５．（ａ〜ｄ）ＰＵ−ビーズプルダウンにおいて単離され、補足材料と方法に示す通りに同定されたタンパク質のリスト。（ｅ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙにおける解析に用いたマッピングタンパク質のデータセット。（ｆ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアを用いたバイオインフォマティクス経路解析により作成されたタンパク質調節ネットワーク。表５ｅに収載するタンパク質は、ＩＰＡにより解析された。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
2018153194.tif 000082
【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０２１２】
補足材料と方法試薬
以前に報告された通りに（Ｔａｌｄｏｎｅら、２０１１、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ…；Ｔａｌｄｏｎｅら、２０１１、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ…；Ｈｅら、２００６）、Ｈｓｐ９０阻害剤、固体支持体に固定化されたおよびフルオレセインで標識された誘導体を合成した。本出願人らは、ＬＣ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＧｌｅｅｖｅｃを、ＳｅｌｌｅｃｋからＡＳ７０３０２６を、ＴｏｃｒｉｓからＫＮ−９３を、ＳｉｇｍａからＰＰ２４２、ＢＭＳ−３４５５４１およびバナジン酸ナトリウムを購入した。全化合物は、ＤＭＳＯストックとして用いた。
【０２１３】
ウエスタンブロッティング
細胞をＰＵ−Ｈ７１またはＤＭＳＯ（ビヒクル）のいずれかで２４時間処理し、ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびアプロチニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補給した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ＮＰ４０溶解緩衝液に溶解した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、メーカーの説明書に従ってタンパク質濃度を決定した。タンパク質溶解物（１５〜２００μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより電気泳動的に分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、次の抗原に対する一次抗体を用いて精査した：Ｈｓｐ９０（１：２０００、ＳＭＣ−１０７Ａ／Ｂ；ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（１：７５、５５４１４８；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ３Ｋ（１：１０００、０６−１９５；Ｕｐｓｔａｔｅ）、ｍＴＯＲ（１：２００、Ｓｃ−１５４９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ−ｍＴＯＲ（１：１０００、２９７１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＳＴＡＴ３（１：１０００、９１３２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ−ＳＴＡＴ３（１：２０００、９１４５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＳＴＡＴ５（１：５００、Ｓｃ−８３５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ−ＳＴＡＴ５（１：１０００、９３５１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＲＩＣＴＯＲ（１：２０００、ＮＢ１００−６１１；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＲＡＰＴＯＲ（１：１０００、２２８０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐ９０ＲＳＫ（１：１０００、９３４７；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｒａｆ−１（１：３００、Ｓｃ−１３３；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＡＲＭ１（１：１０００、０９−８１８；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＲＫＬ（１：２００、Ｓｃ−３１９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＧＲＢ２（１：１０００、３９７２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＦＡＫ（１：１０００、Ｓｃ−１６８８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＢＴＫ（１：１０００、３５３３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ａ−Ｒａｆ（１：１０００、４４３２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＲＫＤ２（１：２００、ｓｃ−１００４１５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＨＣＫ（１：５００、０６−８３３；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、ｐ−ＨＣＫ（１：５００、ａｂ５２２０３；Ａｂｃａｍ）およびβ−アクチン（１：２０００、Ａ１９７８；Ｓｉｇｍａ）。次に、このメンブレンを、１：３０００希釈の対応する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、メーカーの説明書に従って検出を行った。
【０２１４】
濃度測定
Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０．１においてゲルを走査し、Ｕｎ−Ｓｃａｎ−Ｉｔ  ５．１ソフトウェア（Ｓｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量的濃度測定解析を行った。
【０２１５】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
上に言及される通りに調製された溶解物を先ず、一晩４℃で対照ビーズとインキュベーションすることにより前清浄化（pre-cleaned）した。２００μｌのＦｅｌｔｓ溶解緩衝液における前清浄化したＫ５６２細胞抽出物（１，０００μｇ）を、ＰＵ−Ｈ７１または対照ビーズ（８０μｌ）と共に２４時間４℃にてインキュベートした。溶解緩衝液によりビーズを洗浄し、２％ＳＤＳにおいて煮沸することによりタンパク質を溶出させ、変性ゲルにおいて分離し、メーカーの手順（Ｂｉｏｒａｄ）に従ってクーマシー染色した。ゲルにより分離したプルダウン由来のタンパク質を、記載されている通りに（Ｗｉｎｋｌｅｒら、２００２）トリプシンで消化した。ゲル内（In-gel）トリプシン消化物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆゲルローディングチップに充填された２μＬベッド容量のＰｏｒｏｓ  ５０  Ｒ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  −  「ＡＢ」）逆相ビーズにおけるマイクロクリーンアップ（micro-clean-up）手順（Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅら、１９９８）に付し、溶離液を０．１％ギ酸（ＦＡ）で希釈した。ナノスプレーイオン源を備えるＱＳＴＡＲ−Ｅｌｉｔｅハイブリッド四重極飛行時間型質量分析器（ＱＴｏｆ  ＭＳ）（ＡＢ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて、バッチ精製したプールの解析を行った。流速２０μＬ／分のＥｋｓｉｇｅｎｔナノＭＤＬＣシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）を用いるトラッピングガードカラム（０．３×５ｍｍ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８  １００カートリッジ、ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ製）に、ペプチド混合物（２０μＬ容量）をローディングする。洗浄後に、ガードカラムを通して流れを反転させ、５〜４５％ＭｅＣＮ勾配（０．１％ＦＡにおける）により、８５分間かけて流速２００ｎＬ／分でペプチドを溶出させ、７５ミクロン×１５ｃｍ融解石英キャピラリーＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８カラム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ）の上に置いた；溶離液は、７５ミクロン（１０ミクロン開口部を備える）融解石英ナノエレクトロスプレー針（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に向けられる。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）針電圧は、約１８００Ｖに設定する。質量分析器は、自動的にデータ依存性ＭＳ／ＭＳ取得モードで作動し、閾値は、断片化走査に選択された二重または三重に電荷を有する前駆イオンの１０カウント毎秒に設定される。０．２５秒間の調査的走査を４００〜１８００ａｍｕで記録する；続いて、選択された前駆イオンに対し最大３回のＭＳ／ＭＳ走査を逐次的に収集し、１００〜１８００ａｍｕで記録する。衝突エネルギーは、ＭＳ／ＭＳに選択された前駆イオンのｍ／ｚ値に応じて自動的に調整される。選択された前駆イオンは、対応する断片化デューティサイクルの終了後に６０秒間の反復的選択から除外される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータからの最初のタンパク質同定は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、バージョン２．２．０４；ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）ならびにＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＮＩＨ  −  ２２３，６９５種のタンパク質配列を含有するヒト分類学）およびＩＰＩ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ、ＥＢＩ、英国ヒンクストン  −  ８３，９４７種のタンパク質配列を含有するヒト分類学）データベースを用いて行った。１個の欠失トリプシン開裂部位が認められ、前駆イオン質量耐容能（masstolerance）＝０．４Ｄａ断片イオン質量耐容能＝０．４Ｄａ、タンパク質修飾が、Ｍｅｔ酸化物、ＣｙｓアクリルアミドおよびＮ末端アセチル化に認められた。ＭｕｄＰｉｔスコアリングは通常、「赤太字を要求する（requirebold red）」活性化で、有意性閾値スコアｐ＜０．０５を用いて適用された。同定された全タンパク質の独自のペプチドカウント（または「スペクトルカウント」）およびパーセント配列包括度を、さらなるバイオインフォマティクス解析のためＳｃａｆｆｏｌｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２＿０６＿０１、ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）にエクスポートした（表５ａ）。Ｍａｓｃｏｔからの出力結果を用いて、Ｓｃａｆｆｏｌｄは、質量分析データを検証、組織化および解釈して、大量のデータの管理、試料の比較およびタンパク質修飾の探索をより容易に達成する。第２のＭＳシステム、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＱＴｏｆ  ＭＳ機器において知見を検証した（表５ｄ）。指示される通りに（Ｔｒｉｎｋｌｅ−Ｍｕｌｃａｈｙら、２００８）、潜在的な非特異的相互作用物質を同定し、さらなる解析から除去した。
【０２１６】
バイオインフォマティクス経路解析
タンパク質を、バイオインフォマティクス経路解析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ８．７［ＩＰＡ］；Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）によりさらに解析した（Ｍｕｎｄａｙら、２０１０；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２０１０）。ＩＰＡは、定期的にアップデートされる「Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ」に基づき仮説上のタンパク質相互作用クラスターを構築する。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅは、生物学の文献から選別されたタンパク質間の何百万もの個々の関係性からなる、非常に膨大な精選されたデータベースである。これらの関係性は、物理的結合相互作用、酵素基質関係性および翻訳制御におけるシス−トランス関係性を包含する直接的なタンパク質相互作用に関与する。ネットワークは、ノード（個々のタンパク質）およびエッジ（ノード間の生物学的関係性）として図表により表示される。２分子を連結する線は、関係性を表す。よって、結合し相互に作用する、あるいはその他の様式で互いに関与し合う任意の２分子は、両者の間に関係性を有すると考慮される。分子間の各関係性は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅに含有される科学的情報を用いて作成される。関係性は、分子間の線または矢印として示される。分子ＡからＢへの矢印が、分子ＡがＢに作用することを示すように、矢印は、関係性の方向性を示す。ネットワーク図表において、直接的な相互作用は実線として、一方、間接的な相互作用は破線として現れる。一部の事例において、関係性は、ある分子から始まりその同一分子に戻る、輪になった矢印または線として存在し得る。このような関係性は、「自己関連性（self-referential）」と命名され、自身に作用する分子の能力に起因する。実際には、差次的に発現されるタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子を含有するデータセットが、ＩＰＡにアップロードされる。次いで、ＩＰＡは、これらのタンパク質およびタンパク質クラスターの書き込みが必要とされるデータベース由来の他のタンパク質から仮説上のネットワークを構築する。ネットワーク作成は、インプットされた発現プロファイルから可能な限り多くのタンパク質を包含するよう最適化され、高度に連結されたネットワークを目標とする。タンパク質は、ネットワークにおいて、その実体が複合体の一部である場合は２個の丸として；１ユニットのみが存在する場合は１個の丸として；それぞれホスファターゼまたはキナーゼを説明するために上または下を指す三角形として；転写因子を説明するために水平的な楕円形により；および、「他の」機能を描写するために丸により描写される。ＩＰＡは、可能なネットワーク毎に、インプットされたタンパク質と該ネットワークの適合に従ってスコアをコンピュータ処理する。スコアは、所定のネットワークにおけるインプットされたタンパク質が偶然により共に発見される尤度を示すｐ値の負の１０進法対数として計算される。従って、２以上のスコアは、偶然のみにより生じないことの少なくとも９９％の信頼度を有する。本明細書に提示するあらゆるネットワークは��１０以上のスコアを割り当てられた（表５ｆ）。
【０２１７】
放射性同位体結合試験およびＨｓｐ９０定量試験
131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１および細胞（Ｋ５６２、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＢｒ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５、ＭＲＣ−５およびＰＢＬ）を用いて飽和試験を行った。即ち、３回複製した細胞試料を、１μＭ非標識ＰＵ−Ｈ７１有りまたは無しのいずれかにおいて増加量の131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１と混合した。この溶液を軌道回転式振盪機において振盪し、１時間後に、Ｂｒａｎｄｅｌ細胞収穫器を用いて細胞を単離し、氷冷Ｔｒｉｓ緩衝食塩水で洗浄した。単離された細胞試料を全てカウントし、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の特異的な取り込みを決定した。これらのデータを、131Ｉ−ＰＵ−Ｈ７１の濃度に対してプロットして、飽和結合曲線を得た。ＰＵに結合したＨｓｐ９０の定量のため、９．２×１０7個のＫ５６２細胞、６．５５×１０7個のＫＣＬ−２２細胞、２．５５×１０7個のＫＵ１８２細胞および７．８×１０7個のＭＥＧ−０１細胞を溶解して、それぞれ６３８２、３２２５、１３４９および３４１４μｇの総タンパク質を得た。Ｈｓｐ９０のパーセンテージを計算するため、ＨｅＬａ細胞から精製された組換えＨｓｐ９０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ＃ＡＤＩ−ＳＰＰ−７７０）から作成された検量線を用いることにより、細胞Ｈｓｐ９０発現を定量した。
【０２１８】
パルスチェイス
Ｋ５６２細胞を、表示の通りＰＵ−Ｈ７１（５μＭ）有りまたは無しにおいてＮａ3ＶＯ4（１ｍＭ）で処理した。表示時間にて細胞を収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ＮＰ−４０溶解緩衝液に溶解し、次にウエスタンブロッティング手順に付した。
【０２１９】
トリプシン消化
Ｋ５６２細胞を、ビヒクルまたはＰＵ−Ｈ７１（５０μＭ）で３０分間処理した。細胞を収集し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液に溶解した。５００μｇの総タンパク質溶解物から、抗ＳＴＡＴ５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−８３５）を用いてＳＴＡＴ５タンパク質を免疫沈降した。プロテインＧアガロースビーズと結合しているタンパク質沈殿物をトリプシン緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＣａＣｌ2）で洗浄し、３３ｎｇのトリプシンを各試料に添加した。試料を３７℃でインキュベートし、表示時点にてアリコートを収集した。タンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＳＴＡＴ５を調べるためにブロッティングした。
【０２２０】
活性化ＳＴＡＴ５  ＤＮＡ結合アッセイ
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（ＴｒａｎｓＡＭ、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、カリフォルニア州カールスバッド）により、メーカーの説明書に従ってＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂのＤＮＡ結合能力をアッセイした。即ち、５×１０6個のＫ５６２細胞を、１および１０μＭのＰＵ−Ｈ７１または対照で２４時間処理した。前吸着させたＳＴＡＴコンセンサスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＣＣＣＧＧＡＡ−３’）を含有するウェルに、１０マイクログラムの細胞溶解物を添加した。対照処理細胞のため、野生型または突然変異型ＳＴＡＴコンセンサス結合部位のいずれか含有する２０ｐｍｏｌの競合オリゴヌクレオチドの非存在または存在下でアッセイを行った。インターフェロン処理ＨｅＬａ細胞（ウェル当たり５μｇ）をアッセイの陽性対照として用いた。インキュベーションおよび洗浄の後、ウサギポリクローナル抗ＳＴＡＴ５ａまたは抗ＳＴＡＴ５ｂ抗体（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、次いでＨＰＲ−抗ウサギ二次抗体（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を各ウェルに添加した。ＨＲＰ基質を添加した後、参照波長６５５ｎｍにて４５０ｎｍの吸光度を読み取った（Ｓｙｎｅｒｇｙ４、Ｂｉｏｔｅｋ、バーモント州ウィヌースキ）。本アッセイにおいて、吸光度は、試料中に存在するＤＮＡと結合した転写因子の含量に正比例する。４回複製して実験を行った。結果は、平均吸光度値とＳＥＭの任意の単位（ＡＵ）として表した。
【０２２１】
定量的クロマチン免疫沈降（Ｑ−ＣｈＩＰ）
以前に記載されたもの（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９）に修正を加えつつＱ−ＣｈＩＰを行った。即ち、１０8個のＫ５６２細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、溶解し、超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ超音波処理器、Ｂｒａｎｓｏｎ）。ＳＴＡＴ５  Ｎ２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＨｓｐ９０（Ｚｙｍｅｄ）抗体を前清澄化した試料に添加し、一晩４℃でインキュベートした。次に、プロテインＡまたはＧビーズを添加し、ビーズから試料を溶出させ、次いで脱架橋（de-crosslinking）した。ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ）により、ＣｈＩＰ産物の定量を行った。次のプライマーを用いて、ＳＴＡＴ結合部位を含有する標的遺伝子を検出した：ＣＣＮＤ２（５−ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＴＴＴＡＡＴＣＧおよび５−ＡＣＣＴＣＧＣＡＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡ）、ＭＹＣ（５−ＡＴＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴおよび５−ＣＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＡＧＴＧ）および遺伝子間制御領域（５−ＣＣＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＧおよび５−ＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣ）。
【０２２２】
リアルタイムＱＰＣＲ
ＰＵ−Ｈ７１処理および対照Ｋ５６２細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカーの説明書に従ってＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成した。本出願人らは、次のプライマーを用いて特異的な遺伝子を増幅した：ＭＹＣ（５−ＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣおよび５−ＣＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣ）、ＣＣＮＤ２（５−ＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＣＡおよび５−ＡＣＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴ）、ＢＣＬ−ＸＬ（５−ＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡおよび５−ＣＡＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴ）、ＭＣＬ１（５−ＡＧＡＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＧおよび５−ＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣ）、ＣＣＮＤ１（５−ＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＣＴＣＡおよび５−ＧＧＣＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧ）、ＨＰＲＴ（５−ＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＧおよび５−ＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＧ）、ＧＡＰＤＨ（５−ＣＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡおよび５−ＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴ）、ＲＰＬ１３Ａ（５−ＴＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧおよび５−ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡ）。Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ条件（最初のステップの２０秒９５℃、続いて４０サイクルの１秒９５℃および２０秒６０℃）を用いて転写産物存在量を検出した。対応する対象遺伝子からハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ１３Ａ）のＣT値を引いた（ΔＣT）。ＣT値（複製）の標準偏差から差の標準偏差を計算した。次に、ＰＵ−Ｈ７１処理細胞のΔＣT値を、ΔΔＣT方法を用いてその各対照処理細胞と相対的に表した。対照処理細胞と相対的な、薬物で処理した細胞における各遺伝子の倍数発現は、数式：２-ΔΔCTにより決定される。結果は、複製の平均の倍数発現と標準誤差として表した。
【０２２３】
Ｈｓｐ７０ノックダウン
エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ａｍａｘａ）により、メーカーの説明書に従って遺伝子導入を行った。以前に報告された通りに（Ｐｏｗｅｒｓら、２００８）設計したＨｓｐ７０のオープンリーディングフレーム（ＨＳＰＡ１Ａ；受託番号ＮＭ＿００５３４５）に対するｓｉＲＮＡを用いて、Ｈｓｐ７０ノックダウン試験を行った。陰性対照細胞には、逆方向の対照ｓｉＲＮＡ配列（Ｈｓｐ７０Ｃ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を遺伝子導入した。本試験に用いたＨｓｐ７０に対し活性を有する配列は、Ｈｓｐ７０Ａ（５’−ＧＧＡＣＧＡＧＵＵＵＧＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’）およびＨｓｐ７０Ｂ（５’−ＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＵＣＵＵ−３’）である。対照用配列は、Ｈｓｐ７０Ｃ（５’−ＧＧＡＣＧＡＧＵＵＧＵＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’）である。メーカーの説明書に従い、２ｍＬの培地（１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ）における３百万個の細胞に、０．５μＭ  ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を６ウェルプレートにおいて８４時間維持し、溶解し、続いて標準ウエスタンブロット手順を行った。
【０２２４】
キナーゼスクリーニング（Ｆａｂｉａｎら、２００５）
大部分のアッセイのため、キナーゼのタグ付きＴ７ファージ株を、２４ウェルブロックにおいて並行して、ＢＬ２１株に由来する大腸菌宿主において培養した。大腸菌を対数期になるよう培養し、凍結ストックのＴ７ファージに感染させ（感染多重度＝０．４）、振盪しつつ３２℃で溶菌が起こるまでインキュベートした（９０〜１５０分間）。溶菌液を遠心分離し（６，０００×ｇ）、濾過して（０．２μｍ）、細胞デブリを除去した。ＨＥＫ−２９３細胞において残りのキナーゼを産生し、その後、ｑＰＣＲ検出のためのＤＮＡをタグ付けした。ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを、ビオチン化小分子リガンドで３０分間室温にて処理して、キナーゼアッセイのための親和性樹脂を作製した。リガンド化ビーズを過剰なビオチンでブロッキングし、ブロッキング緩衝液（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１％ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄して、非結合リガンドを除去し、非特異的なファージ結合を低下させた。１×結合緩衝液（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ  ＤＴＴ）においてキナーゼ、リガンド化親和性ビーズおよび被験化合物を組み合わせることにより、結合反応を構築した。１００％ＤＭＳＯにおける４０×ストックとして被験化合物を調製し、アッセイへと直接的に希釈した。全反応は、ポリプロピレン３８４ウェルプレートにおいて最終容量０．０４ｍｌで行った。アッセイプレートを室温で振盪しつつ１時間インキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次に、ビーズを溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μｍ非ビオチン化親和性リガンド）に再懸濁し、室温で振盪しつつ３０分間インキュベートした。溶出物におけるキナーゼ濃度をｑＰＣＲにより測定した。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎの選択性スコア（Ｓ）は、化合物選択性の定量的尺度である。これは、化合物に結合するキナーゼの数を、突然変異体バリアントを除く検査した別個のキナーゼの総数で割ることにより計算される。ＴＲＥＥｓｐｏｔ（商標）は、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（Ｆａｂｉａｎら、２００５）により開発された所有権のあるデータ可視化ソフトウェアツールである。結合することが判明したキナーゼは、赤い丸でマークされ、大きな丸ほどより高い親和性結合を示す。キナーゼデンドログラムを適応させ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．の許可の下に複製する。
【０２２５】
レンチウイルスベクター、レンチウイルス産生およびＫ５６２細胞形質導入
ＣＡＲＭ１のｓｈＲＮＡノックダウンのレンチウイルスコンストラクトを、ＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍのＴＲＣレンチウイルスｓｈＲＮＡライブラリーから購入した：ｐＬＫＯ．１−ｓｈＣＡＲＭ１−ＫＤ１（カタログ番号：ＲＨＳ３９７９−９５７６１０７）およびｐＬＫＯ．１−ｓｈＣＡＲＭ１−ＫＤ２（カタログ番号：ＲＨＳ３９７９−９５７６１０８）。対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡスクランブル）は、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１８６４であった。ピューロマイシンと置きかえて選択マーカーとしてＧＦＰをクローニングした。以前に記載されたプロトコール（Ｍｏｆｆａｔら、２００６）の通りに、２９３Ｔの一過的遺伝子導入によりレンチウイルスを作製した。ウイルス上清を収集し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、濃縮した。８μｇ／ｍｌポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、Ｋ５６２細胞を高力価レンチウイルス濃縮懸濁液により感染させた。遺伝子導入７２時間後に、形質導入したＫ５６２細胞を緑色蛍光（ＧＦＰ）により選別した。
【０２２６】
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ｑＲＴ−ＰＣＲのため１０6個の細胞から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を用いて全ＲＮＡを単離し、次いでランダムヘキサマーを用いた逆転写に付した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＡＢＩ  ７５００配列検出システムを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ化学またはＴａｑＭａｎ方法論（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、コネチカット州ノーウォーク）のいずれかを用いてＰＣＲ産物を検出した。リアルタイムＰＣＲアッセイの詳細は、他の文献に記載されている（Ｚｈａｏら、２００９）。ＣＡＲＭ１  ｑＰＣＲのプライマー配列は、ＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧ（フォワード）およびＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧ（リバース）である。
【０２２７】
細胞生存率、アポトーシスおよび増殖アッセイ
遺伝子導入しないまたはＣＡＲＭ１  ｓｈＲＮＡもしくはスクランブルを遺伝子導入したＫ５６２細胞における生存率評価を、トリパンブルーを用いて行った。この発色団は負の電荷を有し、細胞膜が破損しない限り細胞と相互作用しない。従って、この色素を寄せ付けないあらゆる細胞は生存可能である。アポトーシス解析は、２μＬのアクリジンオレンジ（１００μｇ／ｍＬ）、２μＬのエチジウムブロマイド（１００μｇ／ｍＬ）および２０μＬの細胞懸濁液を混合することにより、蛍光顕微鏡を用いて評価した。少なくとも５個のランダムに選んだ視野における最小２００細胞をカウントした。生きたアポトーシス細胞は、特徴的な核および細胞質蛍光に基づく細胞形態の変化を検査することにより、死んだアポトーシス、壊死および正常細胞から区別された。生細胞は、無傷の細胞膜（緑色）を表示し、一方、死細胞は、破損した細胞膜（橙色）を表示する。縮み、ヘテロクロマチン凝縮および核脱顆粒を包含する超微細構造的変化の出現は、アポトーシスと、壊死により破壊された細胞質膜（cytoplasmic membrane）と一致する。アポトーシス細胞のパーセンテージ（アポトーシス指数）を次の通りに計算した：％アポトーシス細胞＝（アポトーシス核を有する細胞の総数／カウントした細胞の総数）×１００。増殖アッセイのため、５×１０3個のＫ５６２細胞を、９６ウェル固体ブラックプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔いた。メーカーの指示（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってアッセイを行った。全実験は、３回反復した。指示がある場合は、アラマーブルーアッセイを用いて増殖阻害試験を行った。この試薬は、細胞培養物における細胞生存率の迅速な客観的測定を提供し、指標色素レサズリンを用いて、細胞生存率の指標である細胞の代謝能力を測定する。即ち、指数増殖細胞をマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６０３）に蒔き、表示時間３７℃でインキュベートした。薬物を表示濃度で３回複製して添加し、プレートを７２時間インキュベートした。レサズリン（５５μＭ）を添加し、Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ（蛍光強度モード、励起５３０ｎｍ、発光５８０ｎｍ、５６０ｎｍダイクロイックミラーによる）を用いてプレートを６時間後に読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰｒｏおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結果を解析した。処理対、対照細胞から得られた蛍光読み取り値を比較することにより、パーセンテージ細胞増殖阻害を計算した。細胞増殖を５０％阻害する薬物濃度としてＩＣ50を計算した。
【０２２８】
ｍＴＯＲおよびＨｓｐ９０阻害剤の間の相乗作用の定量的解析
ｐｐ２４２（ｍＴＯＲ阻害剤）およびＰＵ−Ｈ７１（Ｈｓｐ９０阻害剤）の間の薬物相互作用を決定するため、以前に記載された通りに（Ｃｈｏｕ、２００６；Ｃｈｏｕ＆Ｔａｌａｌａｙ、１９８４）Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの併用指数（ＣＩ）アイソボログラム方法を用いた。この方法は、質量作用の法則の中央値−効果原理に基づき、コンピュータシミュレーションにより、各薬物の機序に関係なく２種以上の薬物組合せの相乗作用または拮抗作用を定量する。アルゴリズムに基づいて、コンピュータソフトウェアは、中央値−効果プロット、併用指数プロットおよび正規化アイソボログラム（２種の薬物の非定率的組合せが用いられる場合）を表示する。ＰＵ−Ｈ７１（０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１２５μＭ）およびｐｐ２４２（０．５、０．１２５、０．０３１２５、０．０００８、０．００２、０．００１μＭ）を、言及されている濃度の単剤として、または非定率の組合せとして（ＰＵ−Ｈ７１：ｐｐ２４２；１：１、１：２、１：４、１：７．８、１：１５．６、１：１２．５）用いた。式Ｆａ＝１−Ｆｕを用いてＦａ（死滅細胞分率）を計算した；Ｆｕは、影響を受けていない細胞の分率であり、コンピュータソフトウェア（ＣｏｍｐｕＳｙｎ、米国ニュージャージー州パラマス）を用いた用量効果解析に用いた。
【０２２９】
フローサイトメトリー
ＣＤ３４単離  −  ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔおよび自動磁気セルソーターａｕｔｏＭＡＣＳを用いて、メーカーの説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州オーバーン）に従ってＣＤ３４＋細胞単離を行った。生存率アッセイ  −  ４８ウェルプレートに５×１０5細胞／ｍｌ密度でＣＭＬ細胞株を蒔き、表示用量のＰＵ−Ｈ７１で処理した。２４時間毎に細胞を収集し、アネキシンＶ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2）におけるアネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および７−ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞生存率を解析した。患者試料のため、４８ウェルプレートに２×１０6細胞／ｍｌで初代ＣＭＬ細胞を蒔き、表示用量のＰＵ−Ｈ７１で最大９６時間処理した。アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色に先立ち、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ＦＢＳ）におけるＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を４℃で３０分間染色した。ＰＵ−Ｈ７１結合アッセイ  −  ４８ウェルプレートに５×１０5細胞／ｍｌ密度でＣＭＬ細胞株を蒔き、１μＭ  ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで処理した。処理後４時間目に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。生細胞におけるＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合を測定するため、細胞をＦＡＣＳ緩衝液における７−ＡＡＤで室温にて１０分間染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により解析した。あるいは、細胞を固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃にて３０分間固定し、Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において氷上で３０分間透過処理し、次にフローサイトメトリーにより解析した。ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ処理後９６時間目に、アネキシンＶ緩衝液におけるアネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および７−ＡＡＤで細胞を染色し、フローサイトメトリーに付して、生存率を測定した。白血病患者試料とＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣとの結合を評価するため、４８ウェルプレートに２×１０6細胞／ｍｌで初代ＣＭＬ細胞を蒔き、１μＭ  ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで処理した。処理後２４時間目に細胞を２回洗浄し、７−ＡＡＤ染色に先立ち、ＦＡＣＳ緩衝液におけるＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体で４℃にて３０分間染色した。処理後９６時間目に、ＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰＥ−ＣＹ７およびＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７抗体で細胞を染色し、続いてアネキシンＶ−Ｖ４５０および７−ＡＡＤ染色を行って細胞生存率を測定した。競合試験のため、５×１０5細胞／ｍｌ密度のＣＭＬ細胞株または２×１０6細胞／ｍｌ密度の初代ＣＭＬ試料を、１μＭ非コンジュゲートＰＵ−Ｈ７１で４時間処理し、続いて１μＭ  ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで１時間処理した。細胞を収集し、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液における７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。Ｈｓｐ９０染色  −  細胞を固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃にて３０分間固定し、Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩ���（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において氷上で３０分間透過処理した。抗Ｈｓｐ９０フィコエリトリンコンジュゲート（ＰＥ）（Ｆ−８クローン、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＣＡ）で細胞を６０分間染色した。細胞を洗浄し、次にフローサイトメトリーにより解析した。正常マウスＩｇＧ２ａ−ＰＥをアイソタイプ対照として用いた。
【０２３０】
統計学的解析
他に断りがなければ、データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン４；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）において実行される独立両側ｔ検定により解析した。０．０５未満のＰ値を有意と考慮した。他に記述がなければ、データは、２回複製または３回複製の平均±ＳＤまたは平均±ＳＥＭとして提示される。エラーバーは、平均のＳＤまたはＳＥＭを表す。単一のパネルが提示されている場合、データは、２または３回の個々の実験の代表である。
【０２３１】
Ｈｓｐ９０によるＢ細胞受容体経路およびＣＯＰ９シグナロソームの維持は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫における新規治療標的を明らかにする実験概略
熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）は、豊富な分子シャペロンであり、その基質タンパク質は、細胞生存、増殖および血管新生に関与する。Ｈｓｐ９０は、構成的に発現され、また、熱ショック等、細胞ストレスにより誘導することもできる。悪性表現型の維持に必要な基質タンパク質に介添えする（chaperone）ことができるため、Ｈｓｐ９０は、癌における魅力的な治療標的である。実際に、Ｈｓｐ９０の阻害は、その基質タンパク質の多くの分解をもたらす。Ｈｓｐ９０の阻害剤であるＰＵＨ７１は、腫瘍性タンパク質の介添えに関与する発癌性Ｈｓｐ９０複合体を選択的に阻害し、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）における強力な抗腫瘍活性を有する。ＰＵＨ７１を固体支持体に固定化することによりＨｓｐ９０複合体を沈殿させ、解析してＨｓｐ９０の基質腫瘍性タンパク質を同定し、公知および新規治療標的を明らかにすることができる。本方法を用いた予備データは、ＤＬＢＣＬにおけるＨｓｐ９０の基質タンパク質としてＢ細胞受容体（ＢＣＲ）経路の多くの成分を同定した。ＢＣＲ経路活性化は、ＤＬＢＣＬのリンパ腫形成（lymphomagenesis）および生存と関係付けられてきた。これに加えて、ＣＯＰ９シグナロソーム（ＣＳＮ）の多くの成分が、ＤＬＢＣＬにおけるＨｓｐ９０の基質として同定された。ＣＳＮは、ＤＬＢＣＬの生存機序である発癌およびＮＦ−κＢの活性化と関係付けられてきた。これらの知見に基づき、本出願人らは、Ｈｓｐ９０ならびにＢＣＲ経路成分および／またはＣＳＮの阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同することを仮定する。従って、次に本出願人らの特定の目標を記す。
【０２３２】
特定の目標１：Ｈｓｐ９０およびＢＣＲ経路の同時的モジュレーションが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＬＢＣＬ細胞の死滅において協力するか決定すること
固定化したＰＵ−Ｈ７１が、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＨｓｐ９０複合体のプルダウンに用いられて、Ｈｓｐ９０とＢＣＲ経路成分との間の相互作用が検出される。増加用量のＰＵ−Ｈ７１で処理したＤＬＢＣＬ細胞株は、ＢＣＲ経路成分の分解に関して解析される。ＤＬＢＣＬ細胞株は、ＢＣＲ経路成分の阻害剤単独およびＰＵ−Ｈ７１と組み合わせて処理されて、生存率が評価される。有効な組合せ処置が、ＤＬＢＣＬ異種移植マウスモデルにおいて調査される。
【０２３３】
特定の目標２：ＤＬＢＣＬにおけるＣＳＮの役割を評価すること副目標（Subaim）１：ＣＳＮが、ＤＬＢＣＬにおける治療標的となり得るか決定すること
ＣＰおよびＰＵ−Ｈ７１による処理は、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＨｓｐ９０の基質としてＣＳＮを検証する。ＣＳＮは、ＤＬＢＣＬ細胞株において単独およびＰＵ−Ｈ７１と組み合わせて遺伝子破壊されて、生存に対するＣＳＮへのＤＬＢＣＬの依存を実証する。マウス異種移植モデルは、ＣＳＮ阻害単独およびＰＵ−Ｈ７１と組み合わせて処理されて、腫瘍成長および動物生存における効果を示す。
【０２３４】
副目標２：ＤＬＢＣＬの生存におけるＣＳＮの機序を決定すること
ＣＳＮの免疫沈降（ＩＰ）が用いられて、ＣＳＮ−ＣＢＭ相互作用を実証する。ＣＳＮの遺伝子破壊が用いられて、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＢｃｌ１０の分解およびＮＦ−κＢ活性の破壊を実証する。
【０２３５】
背景および意義１．ＤＬＢＣＬ分類
ＤＬＢＣＬは、最も一般的な形態の非ホジキンリンパ腫である。ＤＬＢＣＬの診断および治療を改善するために、この分子的に不均一な疾患を分類するための多くの研究が試みられてきた。一遺伝子発現プロファイリング研究は、ＤＬＢＣＬを２種の主要なサブタイプに分けた（Ａｌｉｚａｄｅｈら、２０００）。胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞様（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬは、ＢＣＬ６およびＣＤ１０を包含する胚中心分化に重要な遺伝子の発現により特徴付けることができるが、一方、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬは、活性化末梢血Ｂ細胞に似た遺伝子発現プロファイルにより区別することができる。ＮＦ−κＢ経路はより活性が高く、多くの場合、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおいて突然変異を有する。遺伝子発現プロファイリングを用いた別の分類努力は、ＤＬＢＣＬの３種の主要なクラスを同定した。ＯｘＰｈｏｓ  ＤＬＢＣＬは、酸化的リン酸化、ミトコンドリア機能および電子伝達系に関与する遺伝子の有意な濃縮を示す。ＢＣＲ／増殖ＤＬＢＣＬは、細胞周期調節に関与する遺伝子の発現増加により特徴付けることができる。宿主応答（ＨＲ）ＤＬＢＣＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の複数の成分およびＴ細胞活性化に関与する他の遺伝子の発現増加に基づき同定される（Ｍｏｎｔｉら、２００５）。
【０２３６】
これらの前向き分類は、患者試料を用いて行われ、患者の診断または治療の最終解答ではなかった。患者試料は不均一な細胞集団で構成され、腫瘍微小環境は疾患における役割を果たすため（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｂｌａｄ、２００８）、ＤＬＢＣＬ細胞株は、患者試料と同様に分類されない。しかし、十分に特徴付けられた細胞株を、異なるサブタイプのＤＬＢＣＬのモデルとして用いて、疾患の裏にある分子機序を調査することができる。
【０２３７】
２．ＤＬＢＣＬ：新規治療法の必要性
シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾンの組合せ（ＣＨＯＰ）等、標準化学療法レジメンは、ＤＬＢＣＬ患者の約４０％を治癒し、ＧＣＢおよびＡＢＣ患者の５年間の全生存率は、それぞれ６０％および３０％である（Ｗｒｉｇｈｔら、２００３）。この治療スケジュールにリツキシマブ免疫療法を追加すると（Ｒ−ＣＨＯＰ）、ＤＬＢＣＬ患者の生存を１０〜１５％増加させる（Ｃｏｉｆｆｉｅｒら、２００２）。しかし、ＤＬＢＣＬ患者の４０％は、Ｒ−ＣＨＯＰに応答せず、この併用化学免疫療法の副作用は、十分な耐容性を示さず、この疾患に対する新規標的および治療を同定する必要性を強調する。
【０２３８】
患者腫瘍の分類は、ＤＬＢＣＬの根底にある分子機序の理解をある程度まで前進させた。これらの詳細がより良く理解されるまで、治療を個々の目的に合わせることができなかった。ＤＬＢＣＬにおける新薬単独または併用治療による治療の前臨床試験および新しい標的の調査は、疾患の裏にある分子機序に関する新しい洞察を提供する。
【０２３９】
３．Ｈｓｐ９０：有望な標的
Ｈｓｐ９０は、癌に対する新興の治療標的である。このシャペロンタンパク質は、構成的に発現されるが、熱ショック等、細胞ストレスにより誘導することもできる。Ｈｓｐ９０は、生存、増殖および血管新生等、細胞プロセスに関与する多種多様な基質タンパク質の安定性を維持する（Ｎｅｃｋｅｒｓ、２００７）。Ｈｓｐ９０の基質タンパク質は、未分化大細胞リンパ腫におけるＮＰＭ−ＡＬＫおよび慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＣＬ等、腫瘍性タンパク質を包含する（Ｂｏｎｖｉｎｉら、２００２；Ｇｏｒｒｅら、２００２）。Ｈｓｐ９０は、疾患維持に必要な発癌性基質タンパク質の安定性を維持するため、魅力的な治療標的である。実際に、Ｈｓｐ９０の阻害は、その基質タンパク質の多くの分解をもたらす（Ｂｏｎｖｉｎｉら、２００２；Ｃａｌｄａｓ−Ｌｏｐｅｓら、２００９；Ｃｈｉｏｓｉｓら、２００１；Ｎｅｃｋｅｒｓ、２００７；Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉら、２００１）。その結果、多くのＨｓｐ９０阻害剤が、臨床用に開発された（Ｔａｌｄｏｎｅら、２００８）。
【０２４０】
４．ＰＵ−Ｈ７１：新規Ｈｓｐ９０阻害剤
新規プリンスキャフォールドＨｓｐ９０阻害剤、ＰＵ−Ｈ７１は、改善された薬力学的プロファイルと、他のＨｓｐ９０阻害剤よりも低い毒性により、強力な抗腫瘍効果を有することを示した（Ｃａｌｄａｓ−Ｌｏｐｅｓら、２００９；Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２０１０ａ；Ｃｈｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋｅｒｓ、２００６）。本出願人らの研究室による研究は、ＰＵ−Ｈ７１が、一部にはＤＬＣＢＬ増殖および生存に関与する転写リプレッサーであるＢＣＬ−６の分解により、ＤＬＢＣＬ細胞株、異種移植片およびｅｘ  ｖｉｖｏ患者試料を強力に死滅させることを示した（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２０１０ａ）。
【０２４１】
ＰＵ−Ｈ７１独自の特性は、腫瘍関連のＨｓｐ９０に対するその高親和性であり、これは、この薬物が腫瘍に優先的に蓄積することを示した理由を説明する（Ｃａｌｄａｓ−Ｌｏｐｅｓら、２００９；Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２０１０ａ）。ＰＵ−Ｈ７１は、自身のこのような特性により、癌治療法の新規標的の同定における有用なツールとなる。ＰＵ−Ｈ７１を固体支持体に固定化することにより、腫瘍特異的なＨｓｐ９０複合体の化学沈殿（ＣＰ）を得ることができ、プロテオミクスアプローチを用いてＨｓｐ９０の基質タンパク質を同定することができる。ＤＬＢＣＬ細胞株におけるこの方法を用いた予備実験は、ＤＬＢＣＬ細胞においてＨｓｐ９０により安定化される、少なくとも２種の潜在的な標的を明らかにした：ＢＣＲ経路およびＣＯＰ９シグナロソーム（ＣＳＮ）。
【０２４２】
５．癌における併用療法
単剤療法は治癒的ではないため、癌に対する合理的併用治療の同定が必須である（表６）。腫瘍細胞不均一性のため、単独療法は、癌において有効ではない。腫瘍は、単一細胞から増殖するが、その遺伝的不安定性は多くの場合、アポトーシスに対する抵抗性、正常増殖因子への依存の低下およびより高い増殖能力の形態における生存能力の増強に対して選択される、娘細胞の不均一な集団を生じる（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、２０００）。腫瘍は、細胞の不均一な集団で構成されるため、単一の薬物は、所定の腫瘍における全細胞を死滅させるとは限らず、生存細胞は、腫瘍再発の原因となる。腫瘍不均一性は、潜在的な薬物標的の数の増加をもたらし、従って、治療を組み合わせる必要がある。
【表１０】
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【０２４３】
化学療法への曝露は、薬物の存在下で生存することができる腫瘍細胞の抵抗性集団を生じ得る。この治療抵抗性の回避は、併用治療の別の重要な理論的根拠である。
【０２４４】
非重複的副作用を有する薬物の組合せは、より低用量の各薬物による相加的または相乗的抗腫瘍効果をもたらすことができ、よって副作用を低下させることができる。従って、相乗作用または増強のための可能な好ましい成績は、ｉ）治療効果の有効性の増加、ｉｉ）投薬量を減少させても同じ有効性を増加または維持して毒性を回避、ｉｉｉ）薬物耐性の発生の最小化、ｉｖ）標的に対する選択的相乗作用（または有効性相乗作用）対宿主の提供を包含する。薬物組合せは、これらの治療利益のため、癌および感染性疾患等、複合的な疾患の治療に広く用いられてきた。
【０２４５】
Ｈｓｐ９０の阻害は、悪性細胞を死滅させ、その基質タンパク質の多くの分解をもたらすため、腫瘍Ｈｓｐ９０基質タンパク質の同定は、追加的な治療標的を明らかにすることができる。本研究において、本出願人らは、Ｈｓｐ９０阻害との併用療法の潜在的な標的として、ＤＬＢＣＬ生存における、Ｈｓｐ９０の基質であるＢＣＲ経路およびＣＳＮを調査することを目標とする。本出願人らは、Ｈｓｐ９０およびその基質タンパク質の阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同し、患者応答の増加と毒性の減少をもたらすことを予測する。
【０２４６】
６．Ｈｓｐ９０およびその基質ＢＣＬ６の阻害の間の相乗作用：原理証明
ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ遺伝子発現のサインである転写リプレッサーＢＣＬ６は、ＤＬＢＣＬに最も一般的に関与する癌遺伝子である。ＢＣＬ６は、転写抑圧的複合体を形成して、ＧＣ  Ｂ細胞のＤＮＡ損傷応答および形質細胞分化に関与する遺伝子の発現を負に調節する。ＢＣＬ６は、Ｂ細胞の免疫グロブリン親和性成熟と（Ｙｅら、１９９７）、胚中心における体細胞高頻度突然変異に必要とされる。ＢＣＬ６の異常な構成的発現（Ｙｅら、１９９３）は、動物モデルに示す通りＤＬＢＣＬをもたらし得る。ＢＣＬ６のペプチド模倣阻害剤であるＲＩＢＰＩは、ＢＣＬ−６依存性ＤＬＢＣＬ細胞を選択的に死滅させ（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２０１０ａ；Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９ｂ）、臨床用に開発中である。
【０２４７】
ＰＵ−Ｈ７１ビーズを用いるＣＰは、ＢＣＬ６が、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＨｓｐ９０の基質タンパク質であることを明らかにし、ＰＵ−Ｈ７１による処理は、ＢＣＬ６の分解を誘導する（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９ａ）（図１８）。ＲＩ−ＢＰＩは、ＰＵ−Ｈ７１処理と協同して、ＤＬＢＣＬ細胞株および異種移植片を死滅させる（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２０１０ｂ）（図１８）。この知見は、腫瘍Ｈｓｐ９０のＣＰによりＤＬＢＣＬにおける標的を同定することができること、Ｈｓｐ９０およびその基質タンパク質の阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同することの原理証明として作用する。
【０２４８】
７．ＢＣＲシグナル伝達
ＢＣＲは、大型の膜貫通受容体であり、そのリガンド媒介性の活性化は、Ｂ細胞における広範な下流のシグナル伝達カスケードをもたらす（図１９において概略記載）。ＢＣＲの細胞外リガンド結合ドメインは、膜免疫グロブリン（ｍＩｇ）、殆どの場合はｍＩｇＭまたはｍＩｇＤであり、これはあらゆる抗体と同様に、２本の重鎖Ｉｇ（ＩｇＨ）および２本の軽鎖Ｉｇ（ＩｇＬ）を含有する。Ｉｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体は、ｍＩｇと会合し、受容体のシグナル伝達部として作用する。ＢＣＲのリガンド結合は、受容体の凝集を引き起こし、ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｆｙｎ）によるＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂの細胞質テイル部に存在する免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を誘導する。細胞質チロシンキナーゼであるＳｙｋは、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂにおける二重にリン酸化されたＩＴＡＭに動員され、そこで活性化され、ブルトン型のチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）およびプロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣ−β）に関与するシグナル伝達カスケードを生じる。ＢＬＮＫは、ＰＬＣγ、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）およびＶａｖを動員することができる重要なアダプター分子である。ＢＣＲ凝集によるこれらのキナーゼの活性化は、ＢＣＲ、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体、ｓｒｃファミリーキナーゼ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、ＢＬＮＫおよびその関連するシグナル伝達酵素で構成される、膜におけるＢＣＲシグナロソームの形成をもたらす。ＢＣＲシグナロソームは、膜における受容体から、下流のシグナル伝達エフェクターへのシグナル伝達を媒介する。
【０２４９】
ＢＣＲシグナロソームからのシグナルは、Ｒａｓを介して細胞外シグナル関連のキナーゼ（ＥＲＫ）ファミリータンパク質へと、また、Ｒａｃ／ｃｄｃ４３を介してマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーへと伝達される。ＰＬＣγの活性化は、細胞カルシウム（Ｃａ2+）の増加を引き起こし、Ｃａ2+−カルモジュリンキナーゼ（ＣａｍＫ）およびＮＦＡＴの活性化をもたらす。顕著なことに、細胞Ｃａ2+の増加はＰＫＣ−βを活性化し、これは、ＢＣＬ１０およびＭＡＬＴ１と複合体を形成するアダプタータンパク質であるＣａｒｍａ１（ＣＡＲＤ１１）をリン酸化する。このＣＢＭ複合体は、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）を活性化し、ＮＦ−κＢサブユニットをサイトゾルに隔絶するＩκＢのリン酸化をもたらす。リン酸化されたＩκＢはユビキチン化され、その分解と、ＮＦ−κＢサブユニットの核への局在化を引き起こす。この複合体経路における多くの他の下流エフェクター（ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２、ＣａＭＫ）は、核に移行して、細胞生存、増殖、成長および分化に関与する遺伝子の転写の変化に影響を及ぼす（ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ）。Ｓｙｋは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）も活性化し、細胞ＰＩＰ3の増加をもたらす。この二次メッセンジャーは、細胞成長および生存を促進する急性的形質転換レトロウイルス（Ａｋｔ）／ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路を活性化する（Ｄａｌ  Ｐｏｒｔｏら、２００４）。
【０２５０】
８．ＤＬＢＣＬにおける異常ＢＣＲシグナル伝達
ＢＣＲシグナル伝達は、Ｂ細胞の生存および成熟（Ｌａｍら、１９９７）に必要であり、特に、ＮＦ−κＢを介した生存シグナル伝達がある。実際に、構成的ＮＦ−κＢシグナル伝達は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬの特質である（Ｄａｖｉｓら、２００１）。さらに、ＢＣＲおよびそのエフェクターにおける突然変異は、ＤＬＢＣＬ、特にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおけるＮＦ−κＢの活性の増強に寄与する。
【０２５１】
ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体のＩＴＡＭにおける突然変異が、ＤＬＢＣＬにおける応答性亢進ＢＣＲ活性化および受容体内部移行の減少に関連することが示された（Ｄａｖｉｓら、２０１０）。ＣＤ７９  ＩＴＡＭ突然変異は、Ｌｙｎキナーゼによる負の調節も遮断した。Ｌｙｎは、ＣＤ２２およびＢＣＲと連絡する膜受容体であるＦｃγ−受容体における免疫受容不活性化チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）をリン酸化する。リン酸化ＩＴＩＭにおけるドッキング後に、ＳＨＰ１は、ＣＤ７９  ＩＴＡＭを脱リン酸化し、ＢＣＲシグナル伝達の下方制御を引き起こす。Ｌｙｎは、負の調節部位におけるＳｙｋもリン酸化し、その活性を減少させる（Ｃｈａｎら、１９９７）。これらをまとめると、ＣＤ７９  ＩＴＡＭにおける突然変異は、ＡＢＣとＧＣＢ  ＤＬＢＣＬの両方に見られる、Ｌｙｎキナーゼ活性の減少およびＢＣＲを介したシグナル伝達の増加をもたらす。
【０２５２】
ＢＣＲ経路成分におけるある特定の突然変異は、ＮＦ−κＢ活性を直接的に増強する。ＣＡＲＤ１１アダプタータンパク質における体細胞突然変異は、ＩＫＫの構成的活性化をもたらし、ＢＣＲ係合の非存在下であってもＮＦ−κＢ活性の増強を引き起こす（Ｌｅｎｚら、２００８）。ユビキチン編集酵素であるＡ２０は、ＩＫＫからユビキチン鎖を除去することにより、ＮＦ−κＢシグナル伝達を終結する。Ａ２０における突然変異の不活性化は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおけるＮＦ−κＢシグナル伝達からこのブレーキを除去する（Ｃｏｍｐａｇｎｏら、２００９）。
【０２５３】
ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおけるこの構成的ＢＣＲ活性は、「慢性活動性（chronic active）ＢＣＲシグナル伝達」と称されて、これを「持続性（tonic）ＢＣＲシグナル伝達」から区別してきた。ＣＢＭ成分が欠損したマウスは、正常な数のＢ細胞を有するため、持続性ＢＣＲシグナル伝達は、成熟Ｂ細胞を維持し、ＣＡＲＤ１１を必要としない（Ｔｈｏｍｅ、２００４）。しかし、慢性活動性ＢＣＲシグナル伝達は、ＣＢＭ複合体を必要とし、休止中のＢ細胞ではなく抗原刺激Ｂ細胞に特徴的な顕著なＢＣＲクラスター形成により区別される。実際に、ＣＡＲＤ１１、ＭＡＬＴ１およびＢＣＬ１０のノックダウンは、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ細胞株と比較してＡＢＣに対し優先的に毒性を有する（Ｎｇｏら、２００６）。慢性活動性ＢＣＲシグナル伝達は、主にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬに関連するが、ＣＡＲＤ１１およびＣＤ７９  ＩＴＡＭ突然変異は、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬにおいて生じ（Ｄａｖｉｓら、２０１０；Ｌｅｎｚら、２００８）、ＢＣＲシグナル伝達が、ＤＬＢＣＬのサブタイプにわたる潜在的な標的であることを示唆する。
【０２５４】
９．ＤＬＢＣＬにおけるＢＣＲ経路の標的化
ＢＣＲシグナル伝達は、細胞成長、増殖および生存を促進するため、癌における明らかな標的である。ＤＬＢＣＬにおけるＢＣＲ経路（上述の）における突然変異は、疾患における標的としてのその関連性を強調する。実際に、多くのＢＣＲ成分は、ＤＬＢＣＬにおいて標的とされており、これら治療の一部は、既に患者に適用されている。
【０２５５】
Ｓｙｋの負の調節因子であるタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）受容体型Ｏ切断（ＰＴＰＲＯｔ）の過剰発現は、ＤＬＢＣＬにおいて増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することから、ＤＬＢＣＬにおける標的としてＳｙｋを同定する（Ｃｈｅｎら、２００６）。小分子ホスタマチニブ二ナトリウム（Ｒ４０６）によるＳｙｋの阻害は、ＤＬＢＣＬ細胞株において増殖を遮断し、アポトーシスを誘導する（Ｃｈｅｎら、２００８）。この経口利用可能な化合物は、ＤＬＢＣＬ患者において優れた耐性で有意な臨床活性も示した（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら、２０１０）。
【０２５６】
ＲＮＡ干渉スクリーニングは、ＤＬＢＣＬにおける潜在的な標的としてＢｔｋを明らかにした。Ｂｔｋを標的化する低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＤＬＢＣＬ細胞株、特にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬに対し非常に毒性が高い。Ｂｔｋの小分子不可逆的阻害剤であるＰＣＩ−３２７６５（Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇら、２０１０）は、ＤＬＢＣＬ細胞株、特にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬを強力に死滅させる（Ｄａｖｉｓら、２０１０）。この化合物は、臨床治験下にあり、Ｂ細胞悪性腫瘍において優れた耐容性で有効性を示した（Ｆｏｗｌｅｒら、２０１０）。
【０２５７】
ＮＦ−κＢは、その構成的活性により、ＤＬＢＣＬにおける合理的標的となる。ＮＦ−κＢは、様々なアプローチにより標的化することができる。ＩＫＫの阻害は、ＩκＢのリン酸化を遮断し、ＮＦ−κＢサブユニットの放出および核移行を防ぐ。選択的ＩＫＫ阻害剤であるＭＬＸ１０５は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ細胞株を強力に死滅させる（Ｌａｍら、２００５）。ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）は、リン酸化ＩκＢのＣＲＬ１βTRCPユビキチン化を調節し、その分解およびＮＦ−κＢサブユニットの放出をもたらす。ＭＬＮ４９２４等、小分子によるＮＡＥの阻害は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおいてアポトーシスを誘導し、ＤＬＢＣＬおよび患者異種移植モデルにおける強い腫瘍負荷退縮を示す。ＭＬＮ４９２４は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおいてより強い効力を示し、この結果は、このサブタイプにおける生存に対する構成的ＮＦ−κＢ活性へのより高い依存のため予想される（Ｍｉｌｈｏｌｌｅｎら、２０１０）。ＰＫＣ−βの阻害は、ＩＫＫを活性化するため、ＮＦ−κＢ活性を遮断する別のアプローチである。Ｌｙ３７９１９６等、特異的なＰＫＣ−β阻害剤は、高用量ではあるがＡＢＣとＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ細胞株両方を死滅させる（Ｓｕら、２００２）。
【０２５８】
ＮＦ−κＢ活性を標的化するためのこれらのアプローチは、ＤＬＢＣＬの有望な治療法である。ＩＫＫおよびＮＡＥの阻害は、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおいて最も強力であるが、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬにおいてより低い効力の効果も観察された。これらの研究は、ＮＦ−κＢ活性と他の標的化治療法との組合せが、ＤＬＢＣＬサブタイプにわたるより頑強な効果を生じ得ることを示唆する。
【０２５９】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路は、多くのヒト疾患において調節解除され、ＤＬＢＣＬにおいて構成的に活性化される（Ｇｕｐｔａら、２００９）。悪性細胞は、この経路を活用して細胞成長および生存を促進するため、この経路の小分子阻害剤は大いに研究されてきた。ｍＴＯＲを標的化するマクロライド抗生物質であるラパマイシン（シロリムス）は、ＦＤＡに認可された経口免疫抑制剤である（Ｙａｐら、２００８）。経口利用可能なラパマイシンアナログであるエベロリムスも、移植用免疫抑制剤として認可された（Ｈｕｄｅｓら、２００７）。これらの化合物は、ＤＬＢＣＬ細胞株および患者試料において抗腫瘍活性を有するが（Ｇｕｐｔａ  ２００９）、これらの効果は主に抗増殖性であり、細胞傷害性はごくわずかである。細胞傷害性を達成するため、ラパマイシンおよびエベロリムスは、多くの他の治療剤と組み合わせて評価された（Ａｃｋｌｅｒら、２００８；Ｙａｐら、２００８）。ＤＬＢＣＬにおけるエベロリムスの第ＩＩ相臨床試験は、３５％のＯＲＲにより中程度に成功した（Ｒｅｅｄｅｒ  Ｃ、２００７）。エベロリムスは、ＤＬＢＣＬ細胞株を他の細胞傷害性薬剤に対して感作させることも示した（Ｗａｎｎｅｒら、２００６）。これらの知見は、ＤＬＢＣＬにおけるｍＴＯＲ阻害の、特に併用療法における治療潜在能力を明らかに実証する。
【０２６０】
Ａｋｔの阻害も有望な癌治療法であり、多くの仕方で標的化することができる。脂質に基づく阻害剤は、ＡｋｔのＰＩＰ３結合ＰＨドメインを遮断して、その膜移行を防ぐ。このような薬物の一種であるペリフォシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で抗腫瘍活性を示した。
【０２６１】
全体的に見て、化合物は部分的な応答しか示さず、他の標的化治療法との組合せを促す（Ｙａｐら、２００８）。ＧＳＫ６９０６９３等、Ａｋｔの小分子阻害剤は、リンパ腫および白血病、特にＡＬＬにおいて成長阻害およびアポトーシスを引き起こし（Ｌｅｖｙら、２００９）、単独療法としてまたは他の標的化治療法と組み合わせてのＤＬＢＣＬの死滅において有効となり得る。
【０２６２】
ＭＡＰＫ経路は、癌治療法における別の興味深い標的である。癌遺伝子ＭＣＴ−１は、ＤＬＢＣＬ患者試料において高度に発現され、ＥＲＫにより調節される。ＥＲＫの阻害は、ＤＬＢＣＬ異種移植モデルにおいてアポトーシスを引き起こす（Ｄａｉら、２００９）。ＥＲＫおよびＭＥＫの小分子阻害剤が開発され、臨床における優れた安全性プロファイルおよび腫瘍抑制性活性を実証する。しかし、これらの薬物に対する応答は、頑強ではなく、４例の部分的患者応答が観察され、安定的疾患が２２％の患者において報告された（Ｆｒｉｄａｙ  ａｎｄ  Ａｄｊｅｉ、２００８）。ＭＡＰＫ経路の上流調節因子、即ち、ＲａｓおよびＲａｆは、癌において最も高頻度に突然変異しており、ＭＥＫ阻害にかかわらず細胞生存を維持する他のキナーゼを調節し得るため、ＭＥＫ単独の阻害は、細胞傷害性を引き起こすには不十分となり得る。これらの落とし穴に直面しつつ、ＡＺＤ６２４４等、ＭＥＫ阻害剤は臨床に進んだ。ＭＥＫ阻害に対する部分的応答は、これら阻害剤と他の標的化治療法との組合せが、より頑強な患者応答を明らかにし得ることを示唆する（Ｆｒｉｄａｙ  ａｎｄ  Ａｄｊｅｉ、２００８）。
【０２６３】
１０．ＣＳＮ：構造および機能
ＣＳＮは、１９９６年にシロイヌナズナ（Aradopsis）において光形態形成の負の調節因子として最初に発見された（Ｃｈａｍｏｖｉｔｚら、１９９６）。この複合体は、酵母からヒトまで高度に保存されており、８個のサブユニット、ＣＳＮ１〜ＣＳＮ８（大から小のサイズ順に番号を振ってある）で構成される（Ｄｅｎｇら、２０００）。ＣＳＮサブユニットの大部分は、８サブユニットホロ複合体の一部としてより安定的であるが、ＣＳＮ４〜７を含有するミニＣＳＮ等、いくつかのより小さい複合体が報告されている（Ｏｒｏｎら、２００２；Ｔｏｍｏｄａら、２００２）。Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質（Ｊａｂ１）として最初に同定されたＣＳＮ５は、ホロＣＳＮとは独立的に機能し、多くの細胞シグナル伝達メディエータと相互作用することが示された（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｙｏｎｅｄａ−Ｋａｔｏ、２００９）。これらの複合体の分子構成および機能性は、未だ明らかに理解されていない。
【０２６４】
ＣＳＮ５およびＣＳＮ６はそれぞれ、ＭＰＲ１−ＰＡＤ１−Ｎ末端（ＭＰＮ）ドメインを含有するが、ＣＳＮ５のみが、ＪＡＢ１  ＭＰＮドメイン金属酵素モチーフ（ＪＡＭＭ／ＭＰＮ＋モチーフ）を含有する。他の６種のサブユニットは、プロテアソーム−ＣＯＰ９シグナロソーム開始因子３ドメイン（ＰＣＩ（またはＰＩＮＴ））を含有する（Ｈｏｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｕｃｈｅｒ、１９９８）。これらのドメインの正確な機能は、未だ完全には理解されていないが、これらは、プロテアソームの蓋部（lid）複合体およびｅＩＦ３複合体と非常に類似した相同性を有し（Ｈｏｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｕｃｈｅｒ、１９９８）、ＣＳＮの機能が、タンパク質合成および分解に関係することを示唆する。
【０２６５】
ＣＳＮの最もよく特徴付けられた機能は、タンパク質安定性の調節である。ＣＳＮは、カリンの脱ＮＥＤＤ化によりタンパク質分解を調節する。カリンは、ユビキチンＥ３リガーゼの中心におけるタンパク質スキャフォールドである。これは、ユビキチンＥ２コンジュゲート酵素および分解の標的にされたタンパク質基質のドッキング部位としても機能する。カリン−ＲＩＮＧ−Ｅ３リガーゼ（ＣＲＬ）は、ユビキチンリガーゼの最大のファミリーである。Ｎｅｄｄ８のコンジュゲーションによるＣＲＬのカリンサブユニットの翻訳後修飾は、ＣＲＬ活性に必要とされる（Ｃｈｉｂａ  ａｎｄ  Ｔａｎａｋａ、２００４；Ｏｈｈら、２００２）。ＣＳＮ５  ＪＡＭＭモチーフは、ＣＲＬからＮｅｄｄ８の除去を触媒する；この脱ＮＥＤＤ化反応は、インタクトなＣＳＮホロ複合体を必要とする（Ｃｏｐｅら、２００２；Ｓｈａｒｏｎら、２００９）。カリン脱ＮＥＤＤ化は、ＣＲＬを不活性化するが、ＣＳＮは、ＣＲＬ活性化に必要とされ（Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇ、２００１）、自己ユビキチン化によるＣＲＬ成分の自己破壊を防ぎ得る（Ｐｅｔｈら、２００７）。
【０２６６】
ＣＳＮは、アポトーシスおよび細胞増殖を包含する多くの他の生物学的機能を有する。マウスにおけるＣＳＮ成分２、３、５および８のノックアウトは、大量アポトーシスによる初期胚致死を引き起こし、ＣＳＮ５ノックアウトは、最も重度の表現型を示す（Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００３；Ｍｅｎｏｎら、２００７；Ｔｏｍｏｄａら、２００４；Ｙａｎら、２００３）。これらのノックアウト動物における表現型は、ＮＡＥノックアウトマウス（Ｔａｔｅｉｓｈｉら、２００１）および様々なカリンのノックアウトマウス（Ｄｅａｌｙら、１９９９；Ｌｉら、２００２；Ｗａｎｇら、１９９９）の表現型に似ているため、これらの機能は、タンパク質安定性および分解における複合体の役割に関係し得る。
【０２６７】
胸腺細胞におけるＣＳＮ５の破壊は、アポトーシス促進性ＢＣＬ２関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ）の発現増加および抗アポトーシスＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現減少の結果としてアポトーシスをもたらす（Ｐａｎａｔｔｏｎｉら、２００８）。ＣＳＮ５とサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２７との相互作用は、細胞増殖におけるその役割を示唆する（Ｔｏｍｏｄａら、１９９９）。ＣＳＮ５ノックアウト胸腺細胞は、Ｇ２停止を表示し（Ｐａｎａｔｔｏｎｉら、２００８）、一方、ＣＳＮ８は、Ｔ細胞の静止状態から細胞周期への移行における役割を果たす（Ｍｅｎｏｎら、２００７）。
【０２６８】
１１．ＣＳＮおよび癌
アポトーシス、増殖および細胞周期調節等の細胞機能におけるＣＳＮの関与は、ＣＳＮが、癌における役割を果たし得ることを示唆する。実際に、種々の腫瘍においてＣＳＮ５の過剰発現が観察され（表７）、ＣＳＮ５のノックダウンは、腫瘍細胞の増殖を阻害する（Ｆｕｋｕｍｏｔｏら、２００６）。ＣＳＮ５は、細胞増殖、浸潤および血管新生に関与する遺伝子のｍｙｃ媒介性転写活性化にも関与する（Ａｄｌｅｒら、２００６）。ＣＳＮ２およびＣＳＮ３は、それぞれ老化を克服する能力のため、推定腫瘍抑制因子として同定され（Ｌｅａｌら、２００８）、マウス線維芽細胞の増殖を阻害する（Ｙｏｎｅｄａ−Ｋａｔｏら、２００５）。
【表１１】
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【０２６９】
異種移植モデルにおけるＣＳＮ５のノックダウンは、腫瘍成長を有意に減少させた（Ｓｕｐｒｉａｔｎｏら、２００５）。天然物クルクミンの誘導体は、ＣＳＮ５の阻害により膵癌細胞の成長を阻害する（Ｌｉら、２００９）。これらをまとめると、これらの知見は、ＣＳＮが癌における優れた治療標的であることを示す。
【０２７０】
１２．ＣＳＮおよびＮＦ−κＢ活性化：ＤＬＢＣＬにおける役割？
ＣＳＮは、異なる細胞状況において異なるようにＮＦ−κＢ活性を調節する。関節リウマチ患者のＴＮＦα刺激滑膜細胞（synviocytes）において、ＣＳＮ５のノックダウンは、ＴＮＦＲ１ライゲーション依存性ＩκＢα分解およびＮＦ−κＢ活性化を抑止する（Ｗａｎｇら、２００６）。しかし、ＴＮＦα刺激内皮細胞におけるＣＳＮサブユニットの破壊は、ＩκＢαの安定化およびＮＦ−κＢの持続性の核移行をもたらす（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｕｍａｎｎ、２０１０）。
【０２７１】
Ｔ細胞におけるＣＳＮの研究は、Ｔ細胞発生および生存におけるその決定的役割を実証する。ＣＳＮ５ヌルマウス由来の胸腺細胞は、細胞周期停止およびアポトーシス増加を表示する。重要なことに、これらの細胞は、ＩκＢαの蓄積、核ＮＦ−κＢ蓄積低下および抗アポトーシスＮＦ−κＢ標的遺伝子の発現減少を示し（Ｐａｎａｔｔｏｎｉら、２００８）、ＣＳＮ５が、Ｔ細胞活性化を調節することを示唆する。実際に、ＣＳＮは、活性化Ｔ細胞においてＣＢＭ複合体と相互作用する。Ｔ細胞活性化は、ＣＳＮと、ＭＡＬＴ１およびＣＡＲＤ１１とのならびにＭＡＬＴ１を介したＢＣＬ１０との相互作用を刺激する。ＣＳＮ２およびＣＳＮ５は、ＢＣＬ１０を脱ユビキチン化することによりＣＢＭを安定化する。いずれかのサブユニットのノックダウンは、ＴＣＲ刺激Ｔ細胞においてＢｃｌ１０の急速分解を引き起こし、ＩＫＫ活性化も遮断し、ＣＳＮが、この機序によりＮＦ−κＢ活性を調節し得ることを示唆する（Ｗｅｌｔｅｋｅら、２００９）。
【０２７２】
ＮＦ−κＢ調節におけるＣＳＮの正確な機能は十分に定義されておらず、細胞型に応じて異なっていてよい。特にＴ細胞における、ＣＢＭの安定化によるＮＦ−κＢ調節におけるＣＳＮの関与は、これがＤＬＢＣＬ疾病における役割を果たし得ることを示唆する。
【０２７３】
予備結果
ＯＣＩ−Ｌｙ１およびＯＣＩ−Ｌｙ７  ＤＬＢＣＬ細胞株においてＣＰを行った。細胞を溶解し、サイトゾルおよび核溶解物を抽出した。溶解物を、対照またはＰＵＨ７１でコートしたアガロースビーズのいずれかと共に一晩インキュベートし、次に洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝液において煮沸することにより、堅固に結合しているタンパク質を溶出し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、コロイドブルー染色により可視化した。ゲルレーンを区分毎に切り出し、共同研究者らによる質量分析により解析した。対照プルダウンにはなくＰＵＨ７１プルダウンにおいて高度に表された（ペプチドの数により決定）タンパク質は、候補ＤＬＢＣＬ関連Ｈｓｐ９０基質タンパク質である。共通タンパク質混入物およびアガロースプロテオームを除外した後、本出願人らは、複数のペプチドにより表される、両細胞株において８０％重複する推定クライアントタンパク質（Ｎ＝ほぼ２００）を得た。これらの実験におけるＰＵ−Ｈ７１  Ｈｓｐ９０クライアントの間で高度に表された経路の一つは、ＢＣＲ経路である（２００種のうち２３種のタンパク質、図１９および図２３において灰色で示す）。本出願人らは、この知見の検証を始めた。予備データは、ＳｙｋおよびＢｔｋが、両者共に増加ＰＵ−Ｈ７１により分解され、両者共にＤＬＢＣＬのＣＰにおいてＰＵ−Ｈ７１によりプルダウンされることを示す。ＰＵ−Ｈ７１は、Ｓｙｋ阻害剤であるＲ４０６と協同して、ＤＬＢＣＬ細胞株を死滅させる（図２０）。
【０２７４】
実験アプローチ目標１：Ｈｓｐ９０およびＢＣＲ経路の同時的モジュレーションが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＬＢＣＬ細胞の死滅において協力するか決定すること
本出願人らの予備データは、ＤＬＢＣＬにおけるＨｓｐ９０の基質タンパク質として、ＢＣＲ経路の多くの成分を同定した。ＢＣＲ経路は、発癌およびＤＬＢＣＬ生存に関係付けられてきた。本出願人らは、Ｈｓｐ９０およびＢＣＲ経路の成分の阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同することを仮定する。
【０２７５】
実験設計および予想される成績
ＤＬＢＣＬ細胞株は、培養において維持される。ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ細胞株は、ＯＣＩ−Ｌｙ１、ＯＣＩ−Ｌｙ７およびＴｏｌｅｄｏを包含する。ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ細胞株は、ＯＣＩ−Ｌｙ３、ＯＣＩ−Ｌｙ１０、ＨＢＬ−１、ＴＭＤ８を包含する。細胞株ＯＣＩ−Ｌｙ１、ＯＣＩ−Ｌｙ７およびＯＣＩ−Ｌｙ１０は、１０％ＦＢＳを含有しペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した９０％Ｉｓｃｏｖｅの変法培地において維持される。細胞株Ｔｏｌｅｄｏ、ＯＣＩ−Ｌｙ３およびＨＢＬ−１は、ペニシリンおよびストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンならびにＨＥＰＥＳを補給した９０％ＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳにおいて培養される。ＴＭＤ８細胞株は、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した９０％ｍｅｍ−アルファおよび１０％ＦＢＳを含有する培地において培養される。
【０２７６】
２種のＤＬＢＣＬ細胞株におけるＰＵ−Ｈ７１  ＣＰのプロテオミクス解析の予備実験において、ＢＣＲ経路の成分が、Ｈｓｐ９０の基質タンパク質として同定された。ＢＣＲ経路の成分が、Ｈｓｐ９０により安定化されることを検証するため、ＤＬＢＣＬ細胞株を用いたＣＰが行われ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＰＬＣγ２、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＣＡＭＫＩＩ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ｐ４０  ＥＲＫ１／２、ｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ６を包含するＢＣＲ経路成分に対する市販の抗体を用いたウエスタンブロットにより解析される。ＣＰは、増加塩濃度により行われて、これら基質タンパク質に対するＨｓｐ９０の親和性を示す。一部のタンパク質は低レベルで発現されるため、細胞溶解物の核／サイトゾル分離が行われて、細胞全体の溶解物を用いては容易に検出されないＨｓｐ９０基質タンパク質を濃縮する。
【０２７７】
ＢＣＲ経路成分のＨｓｐ９０安定化は、増加用量のＰＵ−Ｈ７１によるＤＬＢＣＬ細胞株の処理によっても実証される。上記の基質タンパク質のレベルは、ウエスタンブロットにより決定される。基質タンパク質は、用量依存的および時間依存的様式でＰＵ−Ｈ７１への曝露により分解されることが予想される。
【０２７８】
ＤＬＢＣＬ細胞株の生存率は、ＰＵ−Ｈ７１またはＢＣＲ経路成分（Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＰＬＣγ２、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ｐ４０  ＥＲＫ１／２、ＮＦ−κＢ）の阻害剤による処理後に評価される。ＢＣＲ経路成分の阻害剤は、ＤＬＢＣＬにおいて報告されたデータおよび臨床治験における使用に基づき選択され、優先順位をつけられる。例えば、Ｍｅｌｎｉｃｋ  ｌａｂは、ＰＣＩ−３２７６５およびＭＬＮ４９２４（上述の）を使用する代わりにＭＴＡを有する。細胞は、９６ウェルプレートに、薬物処理期間において未処理細胞を指数関数的増殖で維持するのに十分な濃度で蒔かれる。薬物は、６種の異なる濃度で３回複製したウェルにおいて４８時間投与される。細胞生存率は、蛍光定量的レサズリン還元方法（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定される。
【０２７９】
蛍光（５６０励起／５９０発光）は、Ｍｅｌｎｉｃｋ  ｌａｂにおけるＳｙｎｅｒｇｙ４マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて測定される。処理細胞の生存率は、適切なビヒクル対照、例えば、ＰＵ−Ｈ７１の場合は水に対して正規化される。用量効果曲線および対照と比較して細胞株の増殖を５０％阻害する薬物濃度（ＧＩ５０）の計算は、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて行われる。これらの知見の多くは、公表されたデータに確証的となり得るが、これらの阻害剤による有効な方法を設定し、本出願人らの細胞株においてこれらの用量反応を決定することは、Ｈｓｐ９０およびＢＣＲ経路の阻害の組合せ効果を実証する、後の組合せ処理実験に必要となる。
【０２８０】
ＢＣＲ経路阻害剤の個々の用量反応曲線およびＧＩ５０が確立された後、ＤＬＢＣＬ細胞は、ＰＵ−Ｈ７１と単一のＢＣＲ経路阻害剤の両方で処理されて、細胞死滅における組合せの効果を実証する。実験は、９６ウェルプレートにおいて、上述の条件を用いて行われる。細胞は、３回複製して定率の６種の異なる濃度の薬物組合せで処理され、最高用量は、個々の用量反応実験において測定される各薬物のＧＩ５０の２倍となる。最も有効な処理スケジュールを決定するため、薬物は、異なる順序で投与される：ＰＵ−Ｈ７１に続いて２４時間後に薬物Ｘ、薬物Ｘに続いて２４時間後にＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１と共に薬物Ｘ。生存率は、上に言及されたアッセイを用いて４８時間後に決定される。細胞生存率のアイソボログラム解析は、Ｃｏｍｐｕｓｙｎソフトウェアを用いて行われる。
【０２８１】
上に提案されたＤＬＢＣＬ細胞株における組合せ処理は、用量およびスケジュールの観点から異種移植モデルにおける実験を導く。最良の細胞死滅効果を示す薬物スケジュールは、異種移植モデルに適用される。ＤＬＢＣＬ細胞株は、薬物に対し応答することが予想される２種の細胞株と、陰性対照として応答しないことが予想される１種の細胞株を用いて、ＳＣＩＤマウスに皮下注射される。腫瘍成長は、触知できるようになるまで（約７５〜１００ｍｍ3）１日置きにモニターされる。動物（ｎ＝２０）は、１群当たり５匹の動物で次の群にランダムに分けられる：対照、ＰＵ−Ｈ７１、ＢＣＲ経路阻害剤（薬物Ｘ）およびＰＵ−Ｈ７１＋薬物Ｘ。腫瘍成長における薬物効果を測定するため、腫瘍体積は、薬物投与後にＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステムにより１日置きに測定される。１０日後に、全動物は屠殺され、腫瘍は、ＴＵＮＥＬによりアポトーシスに関してアッセイされる。生存における薬物効果を評価するため、上に述べた動物の第２コホートは、処理され、腫瘍が１０００ｍｍ3のサイズに達したときに屠殺される。腫瘍は、生化学的に解析されて、例えば、ＮＦ−κＢ活性または下流の標的のリン酸化に対するＥＬＩＳＡにより、薬物がその標的に命中したことを実証する。本出願人らは、処理マウスにおいて、身体検査、巨視的および顕微鏡的組織検査、血清化学ならびにＣＢＣを包含する、Ｍｅｌｎｉｃｋ  ｌａｂ（Ｃｅｒｃｈｉｅｔｔｉら、２００９ａ）において確立された毒性試験を行う。
【０２８２】
代替法および落とし穴
細胞生存率の検出に用いた蛍光アッセイが、一部の細胞株と不適合である場合（例えば、培地の酸性度により）、ＡＴＰに基づくルミネセンス方法（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）が用いられる。また、一部の薬物は、細胞を４８時間で死滅させない可能性があるため、より高い薬物用量およびより長い薬物インキュベーションが必要に応じて行われて、最適薬物処理を決定する。一部のＢＣＲ経路成分の阻害は、Ｈｓｐ９０の阻害と組み合わせた場合に、ＤＬＢＣＬの死滅における効果の改善を実証しない可能性もあるが、上に示す予備データに基づき、本出願人らは、一部の組合せは、いずれかの薬物単独よりも有効となると考える。
【０２８３】
目標２：ＤＬＢＣＬにおけるＣＳＮの役割を評価すること副目標１：ＣＳＮが、ＤＬＢＣＬにおける治療標的となり得るか決定すること
本出願人らの予備データは、ＤＬＢＣＬにおけるＨｓｐ９０の基質タンパク質としてＣＳＮのサブユニットを同定した。ＣＳＮは、癌に関係付けられおり、ＤＬＢＣＬ生存における役割を果たし得る。本出願人らは、ＤＬＢＣＬが、生存にＣＳＮを必要とし、Ｈｓｐ９０およびＣＳＮの阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同すると仮定する。
【０２８４】
実験設計および予想される成績
ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＣＳＮサブユニット（上述の）の発現が、検証される。ＤＬＢＣＬ細胞株は、タンパク質回収のために溶解され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＣＳＮサブユニットおよびローディング対照としてアクチンに対する市販の抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析される。
【０２８５】
２種のＤＬＢＣＬ細胞株におけるＰＵ−Ｈ７１  ＣＰの予備プロテオミクス解析において、ＣＳＮは、Ｈｓｐ９０の基質タンパク質として同定された。Ｈｓｐ９０が、ＣＳＮを安定化することを検証するため、上述の通り、ＤＬＢＣＬ細胞株を用いたＣＰが行われ、ウエスタンブロットにより解析される。増加ＰＵ−Ｈ７１濃度によるＤＬＢＣＬ細胞株の処理により、ＣＳＮのＨｓｐ９０安定化も実証される。タンパク質レベルのＣＳＮサブユニットが、ウエスタンブロットにより決定される。ＣＳＮサブユニットは、ＰＵ−Ｈ７１への曝露後に用量依存的および時間依存的様式で分解されることが予想される。
【０２８６】
ＤＬＢＣＬ細胞株は、ＣＳＮ２またはＣＳＮ５を標的化する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡを含有するレンチウイルス性ｐＬＫＯ．１ベクターに感染され、ピューロマイシン抵抗性により選択される。これらのベクターは、ＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより市販されている。ある１種のＣＳＮサブユニットのノックダウンは、他のＣＳＮサブユニットの発現に影響を与えることができ（Ｍｅｎｏｎら、２００７；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、２００７；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｕｍａｎｎ、２０１０）、ＣＳＮ２のノックダウンは、ＣＳＮホロ複合体の形成を破壊するため、これらのサブユニットが用いられる。ＣＳＮ５サブユニットは、ＣＳＮの酵素ドメインを含有するため、ＣＳＮ５ノックダウンが用いられる。３〜５種のｓｈＲＮＡのプールが各標的に対し検査されて、標的タンパク質の最適ノックダウンの配列を得る。空のベクターおよびスクランブルしたｓｈＲＮＡが対照として用いられる。本出願人らは、ＣＳＮサブユニットのノックダウンが、ＤＬＢＣＬ細胞を死滅させることを予測し、また、細胞生存率を測定することを目標とするため、テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導性コンストラクトが用いられる。この方法により、ｓｈＲＮＡ誘導の滴定（titration）を用いて、ＣＳＮサブユニットの用量依存的ノックダウンのための条件を確立することもできる。ノックダウン効率は、感染およびｔｅｔ誘導後のウエスタンブロットにより評価される。細胞は、目標１に記載されている方法を用いて、感染後に生存率に関して評価される。本出願人らは、ＣＳＮのノックダウンが、ＤＬＢＣＬを死滅させると予測し、ＣＢＭ複合体の安定化におけるＣＳＮの役割のため、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬは、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬよりも生存のためにＣＳＮに依存すると予想される。
【０２８７】
ＤＬＢＣＬにおけるＣＳＮ単独療法実験に続いて、ＤＬＢＣＬ細胞株においてＣＳＮノックダウンの誘導が、ＰＵ−Ｈ７１処理と組み合わせられる。４８時間の細胞生存率実験を行うため、４８時間における有効な用量依存的ＣＳＮノックダウンを実証するｓｈＲＮＡコンストラクト（以前の実験において評価）が用いられる。上述の対照ｓｈＲＮＡが用いられる。対照細胞およびＣＳＮサブユニットを標的化するｔｅｔ誘導性ｓｈＲＮＡコンストラクトに感染した細胞は、３回複製して定率の異なる用量のｔｅｔおよびＰＵ−Ｈ７１で処理される。最も有効な処理スケジュールを決定するため、薬物は、異なる順序で投与される：ＰＵ−Ｈ７１に続いてｔｅｔ、ｔｅｔに続いてＰＵ−Ｈ７１およびＰＵ−Ｈ７１と共にｔｅｔ。細胞生存率は、目標１に記載されている通りに測定される。ＣＳＮおよびＨｓｐ９０の阻害の組合せは、ＤＬＢＣＬ、特にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬの死滅において協同することが予想される。
【０２８８】
上に提案されたＤＬＢＣＬ細胞株におけるＣＳＮおよびＨｓｐ９０の阻害の組合せは、異種移植モデルにおける実験を導く。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から得られたＰＵ−Ｈ７１およびＣＳＮノックダウンの最も有効な組合せが、異種移植実験において用いられる。処理に応答することが予想される２種の細胞株および陰性対照として処理に応答しないことが予想される１種の細胞株を用いて、対照および誘導性ノックアウトＣＳＮ  ＤＬＢＣＬ細胞が異種移植に用いられる。動物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により決定されたＰＵ−Ｈ７１およびｔｅｔの最も有効な組合せの用量およびスケジュールを用いて、ビヒクル、ＰＵ−Ｈ７１またはｔｅｔで処理される。腫瘍成長、動物生存および毒性は、目標１に記載されている通りにアッセイされる。
【０２８９】
代替法および落とし穴
テトラサイクリン誘導の滴定によるＣＳＮの用量依存的ノックダウンの達成は、困難さを証明し得る。これが行われる場合、原理証明を実証するために、異なるノックダウン効率によるｓｈＲＮＡが用いられて、単独療法としておよび異なる用量のＰＵ−Ｈ７１と組み合わせてＣＳＮの阻害の増加をシミュレートする。
【０２９０】
副目標２：ＣＳＮへのＤＬＢＣＬの依存の機序を決定すること
ＣＳＮは、刺激Ｔ細胞においてＣＢＭ複合体と相互作用し、ＩＫＫを活性化することを示したため、本出願人らは、ＣＳＮが、ＤＬＢＣＬにおいてＣＢＭと相互作用し、Ｂｃｌ１０を安定化し、ＮＦ−κＢを活性化すると仮定する。
【０２９１】
実験設計および予想される成績
ＤＬＢＣＬ細胞溶解物は、ＣＳＮ複合体全体を効果的に沈殿させるＣＳＮ１に対する抗体と共にインキュベートされる（ｄａ  Ｓｉｌｖａ  Ｃｏｒｒｅｉａら、２００７；Ｗｅｉ  ａｎｄ  Ｄｅｎｇ、１９９８）。沈殿したＣＳＮ１複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＣＢＭの異なる成分：ＣＡＲＤ１１、ＢＣＬ１０および  ＭＡＬＴ１に対する市販の抗体を用いたウエスタンブロットにより、ＣＢＭ成分との相互作用に関して解析される。Ｔ細胞において報告された実験に基づき、本出願人らは、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおける慢性活動性ＢＣＲシグナル伝達のため、ＣＳＮが、ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ細胞株とは対照的に、ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ細胞株においてＣＡＲＤ１１およびＭＡＬＴ１と優先的に相互作用することを予想する。
【０２９２】
ＣＳＮ、特にＣＳＮ５は、活性化Ｔ細胞におけるＢｃｌ１０安定性および分解を調節することを示したため、本出願人らは、ＣＳＮが、ＤＬＢＣＬにおいてＢｃｌ１０を安定化すると仮定する。ＤＬＢＣＬ細胞株は、上述のＣＳＮサブユニットを標的化する低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡに感染される。細胞は、ｔｅｔで処理されて、ＣＳＮサブユニットノックダウンを誘導し、感染および誘導された細胞におけるＢｃｌ１０タンパク質レベルは、ウエスタンブロットにより定量される。本出願人らは、Ｂｃｌ１０レベルが、ＣＳＮサブユニットノックダウンにより用量依存的および時間依存的様式で分解されることを予想する。Ｂｃｌ１０タンパク質の低下が、細胞死の結果ではないことを実証するため、細胞溶解前にトリパンブルーにより生細胞をカウントすることにより、細胞生存率が測定される。ＣＳＮサブユニットノックダウンは、プロテアソーム阻害と組み合わされて、Ｂｃｌ１０分解が、ＣＳＮ破壊の特異的な効果であることを実証する。
【０２９３】
ＣＳＮ２またはＣＳＮ５のノックダウンは、ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＮＦ−κＢ活性を抑止することが予想される。対照ｓｈＲＮＡまたはＣＳＮ２もしくはＣＳＮ５に対するｓｈＲＮＡに感染したＤＬＢＣＬ細胞株を用いて、対照および感染細胞は、数通りの仕方でＮＦ−κＢ活性に関してアッセイされる。第一に、溶解物は、ウエスタンブロットにより解析されて、ＩκＢαタンパク質のレベルを決定する。第二に、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５およびｃ−Ｒｅｌの核移行は、溶解細胞の核およびサイトゾル画分のウエスタンブロットにより、または対照および感染細胞の核のプレートベースのＥＭＳＡにより測定される。最後に、これらの細胞のＮＦ−κＢ標的遺伝子発現は、それぞれ逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により調製されたｃＤＮＡの定量的ＰＣＲおよびウエスタンブロットにより、転写産物およびタンパク質レベルで評価される。
【０２９４】
代替法および落とし穴
ＣＳＮは、ＴＣＲ刺激Ｔ細胞においてＣＢＭと相互作用することが示されたため、本出願人らは、ＣＳＮが、ＤＬＢＣＬ、特にＡＢＣ  ＤＬＢＣＬにおいてＣＢＭと相互作用することを予測する（このサブタイプは、慢性活動性ＢＣＲシグナル伝達を示すため）。ＤＬＢＣＬにおいてＣＳＮ−ＣＢＭ相互作用が明らかでない場合、次に、ＢＣＲ経路を活性化し、ＣＢＭの形成を刺激するため、細胞はＩｇＭで刺激される。ＣＢＭとＣＳＮの相互作用の動態を決定するため、ＩｇＭ刺激時点からの時間経過にわたり、上述の細胞ＩＰが行われる。ＣＳＮ−ＣＢＭ相互作用をＣＢＭ形成の動態と相関させるため、ＢＣＬ１０  ＩＰが行われて、同じ時間経過にわたるＢＣＬ１０−ＣＡＲＤ１１相互作用を実証する。
【０２９５】
結論および将来的な方向性
ＤＬＢＣＬに対する新たな治療法としてのＰＵ−Ｈ７１の開発は有望であるが、併用治療はより強力でより毒性が低い可能性がある。ＰＵ−Ｈ７１は、Ｈｓｐ９０の基質タンパク質を同定するためのツールとして用いることもできる。本方法を用いた実験において、ＤＬＢＣＬにおいてＨｓｐ９０の基質としてＢＣＲ経路およびＣＳＮが同定された。
【０２９６】
ＢＣＲは、ＤＬＢＣＬ発癌および生存における役割を果たし、この経路の成分を標的化するための努力が成功した。本出願人らは、ＰＵ−Ｈ７１およびＢＣＲ経路成分の阻害の組合せが、より強力でより毒性の低い治療アプローチとなると予測する。細胞および異種移植モデルにおいて同定された相乗的組合せが、臨床治験への適用に評価され、最終的に、化学療法から離れて、合理的に設計された標的化治療法へと患者治療を進める。
【０２９７】
ＣＳＮは、癌およびＮＦ−κＢ活性化に関係付けられており、ＤＬＢＣＬにおける優れた標的となり得ることを示す。本出願人らは、ＣＳＮが、ＣＢＭ複合体を安定化し、ＮＦ−κＢ活性化およびＤＬＢＣＬ生存を促進すると仮定する。従って、本出願人らは、Ｈｓｐ９０およびＣＳＮの阻害の組合せが、ＤＬＢＣＬの死滅において協同すると予測する。これらの研究は、新たな治療標的が、本提案に記載されているプロテオミクスアプローチを用いて同定できることの原理証明として作用する。
【０２９８】
将来的研究は、ＣＳＮを標的とする化合物を同定し、最終的に、ＤＬＢＣＬの革新的治療法としてＣＳＮ阻害剤を臨床にもたらす。ＣＢＭ安定化およびＮＦ−κＢ活性化等、ＣＳＮ阻害の下流の効果の決定は、３種の薬物の追加的な組合せ薬物レジメンの新たな機会を明らかにできる。将来的研究は、Ｈｓｐ９０、ＣＳＮおよびその下流の標的を共に阻害する３種の薬物の組合せレジメンを評価する。
【０２９９】
本研究において見出されたＰＵ−Ｈ７１との最も有効な薬物組合せが、１７−ＤＭＡＧ等、他のＨｓｐ９０阻害剤を用いた臨床開発において行われて、同定された有効な薬物組合せの広範な臨床適用性を実証する。
【０３００】
最も一般的な形態の非ホジキンリンパ腫であるＤＬＢＣＬは、依然として治癒されていない高悪性度の疾患である。本明細書において提案される本研究は、ＤＬＢＣＬの裏にある分子機序の理解を進め、患者治療法を改善する。
【０３０１】
本明細書において、本出願人らは、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０ビーズに付着した、プリン、プリン様イソキサゾールおよびインダゾール−４−オン化学クラスに基づく分子の設計および合成（図３０、３２、３３、３５、３８）ならびにビオチン化プリン、プリン様、インダゾール−４−オンおよびイソキサゾール化合物の合成（図３１、３６、３７、３９、４０）に関して報告する。これらは、Ｈｓｐ９０阻害剤の別個の挙動の分子基盤を調査および理解するための化学的ツールである。これらは、結合したクライアントタンパク質およびコシャペロンを検査することによりＨｓｐ９０腫瘍生物学をより良く理解するために用いることもできる。多くの場合各Ｈｓｐ９０阻害剤によりモジュレートされたＨｓｐ９０の腫瘍特異的なクライアントの理解は、薬力学的マーカーのより良い選択と、従ってより良い臨床設計をもたらすことができる。最後ではないが、これらＨｓｐ９０阻害剤の間の分子的差異の理解は、最も好ましい臨床プロファイルを有するＨｓｐ９０阻害剤の設計を導くことのできる特徴の同定をもたらし得る。
【０３０２】
Ｈｓｐ９０プローブを合成する方法６．１．概要
1Ｈおよび13ＣのＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ５００ＭＨｚ機器で記録した。化学シフトは、内部標準としてＴＭＳからダウンフィールドしたδ値（ｐｐｍ）で報告した。1Ｈデータは以下のように報告した：化学シフト、多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｂｒ＝広域、ｍ＝多重項）、結合定数（Ｈｚ）、積分。13Ｃ化学シフトは、内部標準としてＴＭＳからダウンフィールドしたδ値（ｐｐｍ）で報告した。低分解能質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化およびＳＱ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣで得た。ＰＤＡ、ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＺＱおよびＥＬＳＤ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ自動精製システムならびに１．２ｍＬ／分にて１０分にわたる（ａ）Ｈ2Ｏ＋０．１％ＴＦＡおよび（ｂ）ＣＨ3ＣＮ＋０．１％ＴＦＡ、５〜９５％ｂの勾配を使用した逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）で高速液体クロマトグラフィー解析を実施した。２３０〜４００メッシュのシリカゲル（ＥＭＤ）を使用してカラムクロマトグラフィーを実施した。全ての反応はアルゴン保護下で実施した。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０ビーズはＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチンはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）から購入した。ＰＵ−Ｈ７１（Ｈｅら、２００６）およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（Ｂｒｏｕｇｈら、２００８）は以前に公開されている方法に従って合成した。
ＧＭはＡｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０３０３】
６．２合成６．２．１．  ９−（３−ブロモプロピル）−８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−６−アミン（２）
１（Ｈｅら、２００６）（０．５００ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解した。Ｃｓ2ＣＯ3（０．４３４ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）および１，３−ジブロモプロパン（１．２２ｇ、０．６１７ｍＬ、６．０５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて４５分間撹拌した。次いでさらなるＣｓ2ＣＯ3（０．０７９ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をクロマトグラフ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、１２０：１：０．５〜８０：１：０．５）にかけて０．２２６ｇ（３５％）の２を白色固体として得た。1H NMR (CDCl3/MeOH-d4)δ 8.24 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 4.37 (t, J = 7.1 Hz,2H), 3.45 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.41 (m, 2H); MS (ESI): m/z 534.0/536.0 [M+H]+.６．２．２．  ｔｅｒｔ−ブチル６−アミノヘキシルカルバメート（３）（Ｈａｎｓｅｎら、１９８２）
１，６−ジアミノヘキサン（１０ｇ、０．０８６ｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（１３．０５ｇ、１８．１３ｍＬ、０．１２９ｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）中に懸濁した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（９．３９ｇ、０．０４３ｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中溶液を室温にて９０分にわたって滴下して加え、撹拌を１８時間継続した。反応混合物を分液（ｓｅｐｅｒａｔｏｒｙ）漏斗に加え、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、７０：１〜２０：１］にかけて７．１ｇ（７６％）の３を得た。1H NMR (CDCl3) δ 4.50 (brs, 1H), 3.11 (br s, 2H), 2.68 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 13H), 1.33 (s, 4H);MS (ESI): m/z 217.2 [M+H]+.６．２．３．  ｔｅｒｔ−ブチル６−（３−（６−アミノ−８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピルアミノ）ヘキシルカルバメート（４）
ＤＭＦ（７ｍＬ）中の２（０．２２６ｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）および３（０．９１５ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：７：３］にかけて０．２５５ｇ（９０％）の４を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.32 (s,1H), 7.31 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.99 (s, 2H), 5.55 (br s, 2H), 4.57 (br s,1H), 4.30 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.58 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.52 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.44 (s, 13H), 1.30 (s, 4H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 156.0, 154.7, 153.0, 151.6, 149.2, 149.0, 146.3,127.9, 120.1, 119.2, 112.4, 102.3, 91.3, 79. 0, 49.8, 46.5, 41.8, 40.5, 31.4,29.98, 29.95, 28.4, 27.0, 26.7; HRMS (ESI) m/z [M+H]+ 計算値C26H37IN7O4S,670.1673; 実測値670.1670; HPLC: tR = 7.02分.６．２．４．  Ｎ1−（３−（６−アミノ−８−（６−ヨードベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルチオ）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロピル）ヘキサン−１，６−ジアミン（５）
４（０．３１０ｇ、０．４６３ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、２０：１〜１０：１］にかけて０．３７ｇの白色固体を得た。これを水（４５ｍＬ）中に溶解し、ｐＨが約１２になるまで固体のＮａ2ＣＯ3を加えた。これをＣＨ2Ｃｌ2（４×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、０．２００ｇ（７６％）の５を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (s,1H), 7.31 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.99 (s, 2H), 5.52 (br s, 2H), 4.30 (t, J =6.3 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 7. 0 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.53 (t, J =7.1 Hz, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.44 (s, 4H), 1.28 (s, 4H); 13C NMR (125MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 154.5, 152.6, 151.5, 150.0, 149.6,147.7, 125.9, 119.7, 119.6, 113.9, 102.8, 94.2, 49.7, 46.2, 41.61, 41.59, 32.9,29.7, 29.5, 27.3, 26.9; HRMS (ESI) m/z [M+H]+ 計算値C21H29IN7O2S,570.1148; 実測値570.1124; HPLC: tR = 5.68分.６．２．５．  ＰＵ−Ｈ７１−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（６）
４（０．３０１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これをＤＭＦ（１２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の２５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×５０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２２５μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを２．５時間室温にて振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（０．０８５ｇ、９７μｌ、１．１３ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（９：１、４×５０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５０ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×５０ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ６を−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【０３０４】
６．２．６．  ＰＵ−Ｈ７１−ビオチン（７）
ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の２（４．２ｍｇ、０．００８６ｍｍｏｌ）およびＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）アミン−ＰＥＯ3−ビオチン（５．４ｍｇ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフ［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、５：１］にかけて１．１ｍｇ（１６％）の７を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.30 (s,1H), 8.10 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.73 (br s, 1H), 6.36 (br s,1H), 6.16 (br s, 2H), 6.00 (s, 2H), 4.52 (m, 1H), 4.28-4.37 (m, 3H), 3.58-3.77(m, 10H), 3.55 (m, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.16 (m, 1H), 2.92 (m, 1H), 2.80 (m, 2H),2.72 (m, 1H), 2.66 (m, 2H), 2.17 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.04 (m, 2H), 1.35-1.80(m, 6H); MS (ESI): m/z 872.2 [M+H]+.６．２．７．  ｔｅｒｔ−ブチル６−（４−（５−（２，４−ビス（ベンジルオキシ）−５−イソプロピルフェニル）−３−（エチルカルバモイル）イソオキサゾール−４−イル）ベンジルアミノ）ヘキシルカルバメート（９）
ＡｃＯＨ（０．２６ｇ、０．２５ｍＬ、４．３５ｍｍｏｌ）を、８（Ｂｒｏｕｇｈら、２００８）（０．５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、３（０．５６ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）、ＮａＣＮＢＨ3（０．１１ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）、ＣＨ2Ｃｌ2（２１ｍＬ）および３Å分子篩（３ｇ）の混合物に加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌した。次いでそれを減圧下で濃縮し、クロマトグラフ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１００：１〜６０：１］にかけて０．５０ｇ（７５％）の９を得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.19-7.40(m, 12H), 7.12-7.15 (m, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.81 (s,2H), 3.75 (s, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.10 (m, 3H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H),1.41-1.52 (m, 13H), 1.28-1.35 (m, 4H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.04 (d, J =6.9 Hz, 6H); MS (ESI): m/z 775.3 [M+H]+.６．２．８．  ４−（４−（（６−アミノヘキシルアミノ）メチル）フェニル）−５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピルフェニル）−Ｎ−エチルイソオキサゾール−３−カルボキサミド（１０）
９（０．５ｇ、０．６４６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）中溶液に、ＢＣｌ3（１．８ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ、ＣＨ2Ｃｌ2中に１．０Ｍ）溶液を加え、これを室温にて１０時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ3を加え、ＣＨ2Ｃｌ2を減圧下で蒸発させた。水を注意深くデカントし、残存している黄色の沈殿物をＥｔＯＡｃおよびＣＨ2Ｃｌ2を用いて数回洗浄して０．２４８ｇ（７８％）の１０を得た。1H NMR (CDCl3/MeOH-d4)δ 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.25 (s, 1H),3.74, (s, 2H), 3.41 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 3.08 (m, 1H), 2.65 (t, J = 7.1 Hz,2H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.40-1.56 (m, 4H), 1.28-1.35 (m, 4H), 1.21 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d4)δ 168.4, 161.6, 158.4, 157.6, 155.2, 139.0, 130.5, 129.5, 128.71, 128.69,127.6, 116.0, 105.9, 103.6, 53.7, 49.2, 41.8, 35.0, 32.7, 29.8, 27.6, 27.2,26.4, 22.8, 14.5; HRMS (ESI) m/z [M+H]+ 計算値C28H39N4O4,495.2971; 実測値495.2986; HPLC: tR = 6.57分.６．
２．９．  ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（１１）
１０（４６．４ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×８ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。４５μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（１７．７ｍｇ、２１μｌ、０．２３５ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×８ｍＬ）、ＤＭＦ（３×８ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（３×８ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×８ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ１１を−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ、（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【０３０５】
６．２．１０．  Ｎ’−（３，３−ジメチル−５−オキソシクロヘキシリデン）−４−メチルベンゼンスルホノヒドラジド（１４）（Ｈｉｅｇｅｌ  ＆  Ｂｕｒｋ，１９７３）  １０．００ｇ（７１．４ｍｍｏｌ）のジメドン（１３）、１３．８ｇ（７４．２ｍｍｏｌ）のトシルヒドラジド（１２）およびｐ−トルエンスルホン酸（０．１４０ｇ、０．７３６ｍｍｏｌ）をトルエン（６００ｍＬ）中に懸濁し、これを１．５時間撹拌しながら還流した。まだ熱い状態で、反応混合物を濾過し、トルエン（４×１００ｍＬ）、氷冷酢酸エチル（２×２００ｍＬ）およびヘキサン（２×２００ｍＬ）を用いて固体を洗浄し、乾燥させて、固体として１９．５８ｇ（８９％）の１４を得た。ＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）Ｒf＝０．２３；1H NMR (DMSO-d6) δ 9.76 (s, 1H), 8.65 (br s, 1H), 7.69 (d,J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 5.05 (s, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.07 (s,2H), 1.92 (s, 2H), 0.90 (s, 6H); MS (ESI): m/z 309.0 [M+H]+.６．２．１１．  ６，６−ジメチル−３−（トリフルオロメチル）−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾール−４（５Ｈ）−オン（１５）
ＴＨＦ（９０ｍＬ）およびＥｔ3Ｎ（３０ｍＬ）中の５．０ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）の１４に、トリフルオロ酢酸無水物（３．４ｇ、２．２５ｍＬ、１６．２ｍｍｏｌ）を一度に加えた。得られた赤色溶液を５５℃にて３時間加熱した。室温まで冷却した後、メタノール（８ｍＬ）および１Ｍ  ＮａＯＨ（８ｍＬ）を加え、溶液を室温にて３時間撹拌した。反応混合物を２５ｍＬの飽和ＮＨ4Ｃｌで希釈し、分液漏斗内に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機層をブライン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して赤色の油状残渣を得て、それをクロマトグラフ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、８０：２０〜６０：４０）にかけて橙色固体として２．０８ｇ（５５％）の１５を得た。ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：４）Ｒf＝０．３７；1H NMR (CDCl3) δ 2.80 (s, 2H), 2.46 (s, 2H), 1.16 (s, 6H);MS (ESI): m/z 231.0 [M-H]-.６．２．１２．  ２−ブロモ−４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ベンゾニトリル（１６）
ＤＭＦ（８ｍＬ）中の１５（０．１００ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（１５．５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の混合物に、２−ブロモ−４−フルオロベンゾニトリル（８６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加え、９０℃にて５時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をクロマトグラフ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１０：１〜１０：２）にかけて０．１６２ｇ（９１％）の１６を白色固体として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.97 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 8.4, 2.1 Hz, 1H), 2.89(s, 2H), 2.51 (s, 2H), 1.16 (s, 6H); MS (ESI): m/z 410.0/412.0 [M-H]-.６．２．１３．  ２−（トランス−４−アミノシクロヘキシルアミノ）−４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ベンゾニトリル（１７）
１，２−ジメトキシエタン（１５ｍＬ）中の１６（０．２００ｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）、ＮａＯｔＢｕ（９３．３ｍｇ、０．９７０４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ2（ｄｂａ）3（８８．８ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）およびＤａｖｅＰｈｏｓ（３８ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、アルゴンで数回フラッシュした。トランス−１，４−ジアミノシクロヘキサン（０．１６６ｇ、１．４５６ｍｍｏｌ）を加え、フラスコを再び脱気し、アルゴンでフラッシュし、その後、反応混合物を５０℃にて一晩加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１）により精製して５２．５ｍｇ（２４％）の１７を得た。さらに、３８．５ｍｇ（１７％）のアミド１８を４１％の全収率で単離した。1H NMR (CDCl3) δ 7.51 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 4.64(d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.84 (s, 2H), 2.81 (m, 1H), 2.49 (s, 2H),2.15 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 1.99 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 1.25-1.37 (m, 4H), 1.14(s, 6H); MS (ESI): m/z 446.3 [M+H]+.６．２．１４．  ２−（トランス−４−アミノシクロヘキシルアミノ）−４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ベンズアミド（１８）
ＤＭＳＯ（１４７μｌ）、ＥｔＯＨ（５９０μｌ）、５Ｎ  ＮａＯＨ（７５μｌ）およびＨ2Ｏ2（８８μｌ）中の１７（８０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、１０：１］により精製して６４．３ｍｇ（７８％）の１８を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.06 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.62 (dd, J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.60 (br s, 2H), 3.29 (m, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.77 (m, 1H),2.49 (s, 2H), 2.13 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 1.95 (d, J = 11.8 Hz, 2H), l.20-1.42(m, 4H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 464.4 [M+H]+; HPLC: tR =7.05分.６．２．１５．  ｔｅｒｔ−ブチル６−（トランス−４−（２−カルバモイル−５−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）フェニルアミノ）シクロヘキシルアミノ）−６−オキソヘキシルカルバメート（１９）  ＣＨ2Ｃｌ2（１ｍｌ）中の１８（３０ｍｇ、０．０６４７ｍｍｏｌ）の混合物に、６−（Ｂｏｃ−アミノ）カプロン酸（２９．９ｍｇ、０．１２９４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２４．８ｍｇ、０．１２９４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．８ｍｇ、０．００６４７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ［ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、２：２：１：０．５］により精製して４０ｍｇ（９１％）の１９を得た。1HNMR (CDCl3/MeOH-d4)δ 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.31 (m, 1H), 3.06(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.88 (s, 2H), 2.50 (s, 2H), 2.15 (m, 4H), 2.03 (d, J =11.5 Hz, 2H), 1.62 (m, 2H), l.25-1.50 (m, 17H), 1.14 (s, 6H); 13CNMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d4) δ 191.5, 174.1, 172.3,157.2, 151.5, 150.3, 141.5, 140.6 (q, J = 39.4 Hz), 130.8, 120.7 (q, J = 268.0Hz), 116.2, 114.2, 109.5, 107.3, 79.5, 52.5, 50.7, 48.0, 40.4, 37.3, 36.4,36.0, 31.6, 31.3, 29.6, 28.5, 28.3, 25.7, 25.4; HRMS (ESI) m/z [M+Na]+計算値C34H47F3N6O5Na,699.3458; 実測値699.3472; HPLC: tR = 9.10分.６．２．１６．  ２−（トランス−４−（６−アミノヘキサンアミド）シクロヘキシルアミノ）−４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）ベンズアミド（２０）
１９（３３ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて４５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取ＴＬＣ［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、６：１］により精製して２４ｍｇ（８６％）の２０を得た。1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ 7.69 (d, J = 8.4 Hz,1H), 6.78 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 3.74 (m, 1H),3.36 (m, 1H), 2.92 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.91 (s, 2H), 2.51 (s, 2H), 2.23 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.18 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 1.61-1.75(m, 4H), l.34-1.50 (m, 6H), 1.15 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, MeOH-d4)δ 191.2, 173.6, 172.2, 151.8, 149.7, 141.2, 139.6 (q, J = 39.5 Hz), 130.3,120.5 (q, J = 267.5 Hz), 115.5, 114.1, 109.0, 106.8, 51.6, 50.0, 47.8, 39.0,36.3, 35.2, 35.1, 31.0, 30.5, 26.8, 26.7, 25. 4, 24.8; HRMS (ESI) m/z [M+H]+計算値C29H40F3N6O3,577.3114; 実測値577.3126; HPLC: tR = 7.23分.６．２．１７．  ＳＮＸ−２１１２−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（２１）
１９（６７ｍｇ、０．０９９２ｍｍｏｌ）を３．５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（４：１）中に溶解し、溶液を室温にて２０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で２時間乾燥させた。これをＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解し、固相ペプチド合成容器中の５ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×８ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。４５μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで２−メトキシエチルアミン（１８．６ｍｇ、２２μｌ、０．２４８ｍｍｏｌ）を加え、振盪を３０分間継続した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×８ｍＬ）、ＤＭＦ（３×８ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×８ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズ２１を−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ、（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【０３０６】
６．２．１８．  Ｎ−Ｆｍｏｃ−トランス−４−アミノシクロヘキサノール（２２）（Ｃｒｅｓｔｅｙら、２００８）
ジオキサン：水（２６：６．５ｍＬ）中のトランス−４−アミノシクロヘキサノール塩酸塩（２．０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ3Ｎ（１．０８ｇ、１．４９ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）を加え、これを１０分間撹拌した。次いでＦｍｏｃ−ＯＳｕ（３．００ｇ、８．９１ｍｍｏｌ）を５分にわたって加え、得られた懸濁液を室温にて２時間撹拌した。反応混合物を約５ｍＬに濃縮し、次いでいくらかのＣＨ2Ｃｌ2を加えた。これを濾過し、固体をＨ2Ｏ（４×４０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させて、白色固体として２．８５ｇ（９５％）の２２を得た。濾液をＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）で抽出することによってさらなる０．１００ｇ（３％）の２２を得て、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、濾過し、合わせて９８％の収率のために溶媒を除去した。ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２０：８０）Ｒf＝０．４２；1H NMR (CDCl3) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J =7.4 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.54 (br s,1H), 4.40 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.61 (m, 1H), 3.48 (m,1H), 1.9-2.1 (m, 4H), 1.32-1.48 (m, 2H), 1.15-1.29 (m, 2H); MS (ESI): m/z 338.0[M+H]+.６．２．１９．  Ｎ−Ｆｍｏｃ−トランス−４−アミノシクロヘキサノールテトラヒドロピラニルエーテル（２３）
１．０３ｇ（３．０５ｍｍｏｌ）の２２および０．９９８ｇ（１．０８ｍＬ、１１．８６ｍｍｏｌ）の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（ＤＨＰ）をジオキサン（１０ｍＬ）中に懸濁した。ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（０．１５３ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を室温にて撹拌した。１時間後、さらなるＤＨＰ（１．０８ｍＬ、１１．８６ｍｍｏｌ）およびジオキサン（１０ｍＬ）を加え、撹拌を継続した。９時間後、さらなるＤＨＰ（１．０８ｍＬ、１１．８６ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を一晩継続した。得られた溶液を濃縮し、残渣をクロマトグラフ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、７５：２５〜６５：３５）にかけて白色固体として１．２８ｇ（１００％）の２３を得た。ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、７０：３０）Ｒf＝０．２６；1H NMR (CDCl3) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J =7.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (dt, J = 7.5, 1.1 Hz, 2H), 4.70 (m,1H), 4.56 (m, 1H), 4.40 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.90 (m,1H), 3.58 (m, 1H), 3.45-3.53 (m, 2H), 1.10-2.09 (m, 14H); MS (ESI): m/z 422.3[M+H]+.６．２．２０．  トランス−４−アミノシクロヘキサノールテトラヒドロピラニルエーテル（２４）
１．２８ｇ（３．０ｍｍｏｌ）の２３をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）中に溶解し、ピペリジン（２ｍＬ）を加え、溶液を室温にて５時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー［ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、８０：１〜３０：１］により精製して、ゆっくり結晶化する油状残渣として０．５７４ｇ（９６％）の２４を得た。1H NMR (CDCl3) δ 4.70 (m,1H), 3.91 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 1.07-2.05 (m,14H); MS (ESI): m/z 200.2 [M+H]+.６．２．２１．  ４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−２−（トランス−４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）シクロヘキシルアミノ）ベンゾニトリル（２５）  １，２−ジメトキシエタン（２０ｍＬ）中の１６（０．２７０ｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）、ＮａＯｔＢｕ（０．１２６ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ2（ｄｂａ）3（０．１２０ｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）およびＤａｖｅＰｈｏｓ（０．０５１ｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、アルゴンで数回フラッシュした。２４（０．３９０ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を加え、フラスコを再び脱気し、アルゴンでフラッシュし、その後、反応混合物を６０℃にて３．５時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ［ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、７：６：３：１．５］により精製して９７．９ｍｇ（２８％）の２５を得た。さらに、６０．５ｍｇ（１７％）のアミド２６を４５％の全収率で単離した。1HNMR (CDCl3) δ 7.52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.7 Hz, 1H),6.72 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.91(m, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 2.84 (s, 2H), 2.49 (s, 2H),2.06-2.21 (m, 4H), 1.30-1.90 (m, 10H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 529.4 [M-H]-.６．２．２２．  ４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−２−（トランス−４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）シクロヘキシルアミノ）ベンズアミド（２６）
ＤＭＳＯ（２２０μｌ）、ＥｔＯＨ（８８５μｌ）、５Ｎ  ＮａＯＨ（１１２μｌ）およびＨ2Ｏ2（１３２μｌ）中の２５（１２０ｍｇ、０．２２６４ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて４時間撹拌した。次いで３０ｍＬのブラインを加え、これをＥｔＯＡｃ（５×１５ｍＬ）で抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ［ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、７：６：３：１．５］により精製して１０２ｍｇ（８２％）の２６を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.13 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.63 (dd, J= 8.4, 2.0 Hz, 1H), 5.68 (br s, 2H), 4.72 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.70 (m, 1H),3.50 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 2.85 (s, 2H), 2.49 (s, 2H), 2.05-2.19 (m, 4H),1.33-1.88 (m, 10H), 1.14 (s, 6H); MS (ESI): m/z 547.4 [M-H]-.６．２．２３．  ４−（６，６−ジメチル−４−オキソ−３−（トリフルオロメチル）−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−インダゾール−１−イル）−２−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシルアミノ）ベンズアミド（ＳＮＸ−２１１２）
ＥｔＯＨ（４．５ｍＬ）中の２６（１４０ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）およびピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（６．４ｍｇ、０．０２５５ｍｍｏｌ）を６５℃にて１７時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ［ヘキサン：ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ−ＮＨ3（７Ｎ）、２：２：１：０．５］により精製して１０１ｍｇ（８５％）のＳＮＸ−２１１２を得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.10 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 6.60 (dd, J= 8.4, 1.6 Hz, 1H), 5.97 (br s, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.35 (m, 1H), 2.85 (s, 2H),2.48 (s, 2H), 2.14 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 2.04 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 1.33-1.52(m, 4H), 1.13 (s, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3/MeOH-d4)δ 191.0, 171.9, 151.0, 150.0, 141.3, 140.3 (q, J = 39.6 Hz), 130.4, 120.3 (q, J= 270.2 Hz), 115.9, 113.7, 109.2, 107. 1, 69.1, 52.1, 50.2, 40.1, 37.0, 35.6,33.1, 30.2, 28.0; MS (ESI): m/z 463.3 [M-H]-, 465.3 [M+H]+;HPLC: tR = 7.97分.６．２．２４．  対照ビーズの調製
ＤＭＦ（８．５ｍＬ）を、固相ペプチド合成容器中の２０ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０ビーズ（予め洗浄した、３×４０ｍＬ  ＤＭＦ）に加えた。２−メトキシエチルアミン（１１３ｍｇ、１２９μＬ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰのいくつかの結晶を加え、これを室温にて２．５時間振盪した。次いで溶媒を除去し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×３５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×３５ｍＬ）、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（２×３５ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（４×３５ｍＬ）を用いてビーズを毎回１０分間洗浄した。ビーズを−８０℃にてｉ−ＰｒＯＨ（ビーズ：ｉ−ＰｒＯＨ（１：２）、ｖ／ｖ）中で保存した。
【０３０７】
６．３．競合アッセイ
競合研究のために、以前に報告されている（Ｄｕら、２００７）ように蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを実施した。簡潔に述べると、Ａｎａｌｙｓｔ  ＧＴ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）でＦＰ測定を実施した。測定は、励起と発光の両方がウェルの上部から生じる黒色９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６５０）中で行った。１０μＭのＧＭ−ｃｙ３ＢのストックをＤＭＳＯ中で調製し、Ｆｅｌｔｓ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｋ）、ｐＨ７．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２０ｍＭのＮａ2ＭｏＯ4、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＧＧを含む０．０１％のＮＰ４０）で希釈した。各９６ウェルに６ｎＭの蛍光ＧＭ（ＧＭ−ｃｙ３Ｂ）、３μｇのＳＫＢｒ３溶解物（全タンパク質）を加え、最終体積１００μＬのＨＦＢ緩衝液中の阻害剤（ＤＭＳＯ中の開始ストック）を試験した。薬物を３連のウェルに加えた。各アッセイに関して、バックグラウンドウェル（緩衝液のみ）、トレーサー対照（遊離蛍光ＧＭのみ）および結合ＧＭ対照（ＳＫＢｒ３溶解物の存在下での蛍光ＧＭ）が各アッセイプレート上に含まれた。陽性対照としてＧＭを使用した。アッセイプレートを４℃にて２４時間振盪器でインキュベートし、ＦＰ値（ｍＰ）を測定した。Ｈｓｐ９０に結合したトレーサーの割合をｍＰ値に関連付け、競合相手濃度の値に対してプロットした。結合ＧＭの５０％が置きかわる阻害剤濃度を、データを適合することにより得た。ＳＯＦＴｍａｘ  Ｐｒｏ４．３．１を使用して全ての実験データを解析し、Ｐｒｉｓｍ  ４．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してプロットした。
【０３０８】
６．４．化学沈殿、ウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー
白血病細胞株Ｋ５６２およびＭＶ４−１１ならびに乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８はアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ（Ｋ５６２）中、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＭＶ４−１１）中またはＤＭＥ／Ｆ１２（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）中で細胞を培養し、３７℃にて５％ＣＯ2の加湿雰囲気中に維持した。１０μｇ／μＬのプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチンおよびアプロチニン）を加えたＦｅｌｔｓ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ、ＮＰ４０  ０．０１％、新しく調製したＮａ2ＭｏＯ4  ２０ｍＭ、ｐＨ７．２〜７．３）中で細胞を回収することによって細胞を溶解し、続いて３回連続して凍結（乾燥氷中）および解凍ステップを行った。製造業者の指示書に従ってＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して全タンパク質濃度を求めた。
【０３０９】
Ｈｓｐ９０阻害剤ビーズまたはアガロースビーズにコンジュゲートしたＨｓｐ９０不活性化学物質（２−メトキシエチルアミン）を含有する対照ビーズを溶解緩衝液中で３回洗浄した。次いでビーズコンジュゲート（８０μＬまたは示したような）を４℃にて一晩、細胞溶解物（２５０μｇ）とインキュベートし、体積を溶解緩衝液と共に２００〜３００μＬに調整した。インキュベーション後、ビーズコンジュゲートを溶解緩衝液で５回洗浄し、以下に示したようにウエスタンブロットにより解析した。
【０３１０】
ＰＵ−Ｈ７１での処理のために、細胞を６０〜７０％コンフルエンスまで増殖させ、阻害剤（５μＭ）で２４時間処理した。タンパク質溶解物を５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％のＮＰ−４０溶解物緩衝液中で調製した。
【０３１１】
ウエスタンブロッティングのために、タンパク質溶解物（１０〜５０μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより電気泳動的に分解し、ニトロセルロース膜に移し、Ｈｓｐ９０（１：２０００、ＳＭＣ−１０７Ａ／Ｂ、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ）、抗ＩＧＦ−ＩＲ（１：１０００、３０２７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗ｃ−Ｋｉｔ（１：２００、６１２３１８、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して一次抗体でプローブした。次いで膜を、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートした二次抗体の１：３０００希釈物とインキュベートした。製造業者の指示書に従って増幅化学発光検出システム（ＥＣＬ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検出を実施した。
【０３１２】
細胞表面Ｈｓｐ９０に対するＰＵ−Ｈ７１の結合を検出するために、５００，０００個の細胞／ｍｌにてＭＶ４−１１細胞を、示した濃度のＰＵ−Ｈ７１−ビオチンまたは対照としてＤ−ビオチンと共に３７℃にて２時間インキュベートし、続いて４℃にて３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）中でフィコエリトリン（ＰＥ）がコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の染色を行った。次いでＢＤ−ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して細胞を解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、細胞に対するＰＵ−Ｈ７１−ビオチンの結合を算出し、値をＳＡ−ＰＥで染色した未処理の細胞のＭＦＩに正規化した。
【０３１３】
６．５．ドッキング
Ｇｌｉｄｅ５．０（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ）を使用してＵｂｕｎｔｕ８．１０作動システムを備えたＨＰワークステーションｘｗ８２００において分子ドッキング計算を実施した。結合した阻害剤ＰＵ−Ｈ７１（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＦＷＺ）、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＣＩ）および２７（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｄ０Ｂ）とのＨｓｐ９０α複合体についてのコーディネートはＲＣＳＢタンパク質データバンクからダウンロードした。ドッキング実験のために、Ｍａｅｓｔｒｏ８．５の断片ディクショナリーを使用して化合物ＰＵ−Ｈ７１、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２、５、１０、２０および２７を構築し、最急降下を用いた液体シミュレーションのための最適化ポテンシャル−全原子（ＯＰＬＳ−ＡＡ：Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ−Ａｌｌ  Ａｔｏｍ）力場（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、１９９６）、続いてＭａｃｒｏｍｏｄｅｌ９．６に実装されている切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｎｅｗｔｏｎコンジュゲート勾配プロトコルを使用して形状を最適化し、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣにより提供されるＬｉｇＰｒｅｐ２．２ユーティリティのデフォルトパラメータを使用してリガンド調製にさらに供した。Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣにより提供されるタンパク質調製ウィザードを使用した後の格子生成およびドッキングのために各タンパク質を最適化した。このツールを使用して、水素原子をタンパク質に加え、結合次数を割り当て、リガンド結合に重要でないとみなした結晶水分子は除去し、全タンパク質を最小化した。ＯＰＬＳ−２００５力場に従ってタンパク質についての粒子原子荷電を割り当てた。次に、Ｇｌｉｄｅにおける受容体格子生成ツール（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｒｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）を使用して格子を調製した。所定の位置にそれぞれ結合した阻害剤を用いて、作用空間リガンドの重心を選択して格子ボックスを規定した。作用空間リガンドと同様のサイズにおいてリガンドをドッキングする選択肢を、格子サイジングを求めるために選択した。
【０３１４】
次に、追加の正確な（ＸＰ）Ｇｌｉｄｅドッキング法を使用して、化合物ＰＵ−Ｈ７１および５（から２ＦＷＺ）、ＮＶＰ−ＡＵＹ９２２および１０（から２ＶＣＩ）、ならびに２０および２７（から３Ｄ０Ｂ）をそれらのそれぞれの結合部位に柔軟にドッキングした。Ｇｌｉｄｅにより使用される方法についての詳細は他（Ｐａｔｅｌら、２００８、Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４、Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４）に記載されているが、使用されるパラメータについての簡単な説明を以下に示す。ファンデルワールス半径についてのスケール係数のデフォルト設定を、リガンドおよびタンパク質のそれぞれについて０．１５（０．８のスケール係数）および０．２５（１．０のスケール係数）電子以下の絶対部分電荷を有するこれらの原子に適用した。ドッキング実行についての制約は定義しなかった。各ドッキング計算の完了時に、一つのリガンドにつき多くても１００個のポーズを生成させた。Ｇｌｉｄｅスコア付け機能（Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、１９９７）に基づいたトップスコアのドッキングポーズを我々の解析のために使用した。ＸＰ  Ｇｌｉｄｅドッキング手順を検証するために、結晶結合阻害剤（ＰＵ−Ｈ７１またはＮＶＰ−ＡＵＹ９２２または２７）を結合部位から抽出し、そのそれぞれの結合部位に再びドッキングした。０．０９８Å（２ＦＷＺ）、０．３１３Å（２ＶＣＩ）および０．１４９Å（３Ｄ０Ｂ）標準偏差から明らかなようにドッキング時の阻害剤と結晶構造との位置は非常に一致した。従って、この研究により、Ｈｓｐ９０阻害剤についての実験的に観察された結合様式を複製する際のＧｌｉｄｅの高いドッキング信頼性およびＸ線構造を合理的に複製するＧｌｉｄｅドッキングについてのパラメータ設定が示唆される。
【表１２】
2018153194.tif 000139
【０３１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１６ｅ】
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【図１６ｆ】
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【図１６ｇ】
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【図１６ｈ】
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【図１６ｉ】
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【図１６ｊ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
2018153194000001.app
【外国語明細書】
2018153194000001.pdf