(57)【要約】【課題】細胞又は組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、凍結保存用治具を提供する。【解決手段】細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有する細胞又は組織の凍結保存用治具。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
【請求項２】
前記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
【０００３】
一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
【０００４】
細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセリン、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
【０００５】
しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
【０００６】
前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセリン、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液（保存液）をガラス化液という。
【０００７】
前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
【０００８】
ガラス化保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性がある。このため、細胞又は組織の凍結保存時には細胞又は組織周囲に存在するガラス化液が少ない方が好ましく、細胞がガラス化液に暴露される時間、つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。
【０００９】
ガラス化保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化保存法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
【００１０】
ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化保存法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
【００１１】
特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。
【００１２】
特許文献５では、卵子又は胚をガラス化液と共にガラス化保存用除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存用除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。また余分なガラス化液を除き、また細胞を載置する際の作業性を向上することが可能な凍結保存用治具として、例えば、特定のヘーズ値を有するガラス化液吸収体が特許文献６に記載され、更に特許文献７、特許文献８等には、ガラス化液吸収体として多孔質焼結形成体や特定の屈折率を有する素材で形成された多孔質構造体を有するガラス化凍結保存用治具が記載されている。
【００１３】
さらに、特許文献９には、細胞又は組織を保存液と共に凍結保存用治具に載置して凍結保存した後、細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存用治具として、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に水溶性高分子化合物を含有する層を設けた凍結保存用治具が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３０４４３２３号公報
【特許文献２】特開２００８−５８４６号公報
【特許文献３】特開２００２−３１５５７３号公報
【特許文献４】特開２００６−２７１３９５号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット
【特許文献６】特開２０１４−１８３７５７号公報
【特許文献７】特開２０１５−１４２５２３号公報
【特許文献８】国際公開第２０１５／０６４３８０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１６／０６３８０６号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：１７０−１７２（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
前記した特許文献９の凍結保存用治具によれば、細胞又は組織を載置する載置部が、ガラス化液吸収体を有している場合であっても、細胞や組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することが可能である。しかしながら、凍結保存する細胞又は組織によっては十分な剥離性が得られない場合があった。また、前記特許文献９によれば、水溶性高分子化合物を含有する層がさらに無機微粒子を含有する場合、細胞又は組織を融解する際に、良好な剥離性を有し、細胞又は組織を容易に回収することが可能になる。しかしながら、脱落した無機微粒子が融解液中に混入することによる視角的な操作の阻害や、凍結・融解後の細胞又は組織の利用方法によっては、細胞又は組織に付着した無機微粒子についてその後の洗浄作業が必要となる場合があった。これらの背景のもと、さらなる改善が求められていた。
【００１７】
本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞又は組織をガラス化液に浸漬し、細胞又は組織をガラス化液と共に該ガラス化凍結保存用治具に載置して凍結保存した後、該細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存用治具を提供することを第一の課題とする。また、前記した細胞又は組織を容易に回収できることに加え、ガラス化液の優れた吸収性を有する凍結保存用治具を提供することを第二の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織の凍結保存用治具（本明細書中、「細胞又は組織の凍結保存用治具」を、単に「凍結保存用治具」ともいう）によって、上記課題を解決できることを見出した。
【００１９】
（１）細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
（２）上記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有することを特徴とする上記（１）に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
【発明の効果】
【００２０】
上記（１）の発明によれば、細胞又は組織をガラス化液に浸漬し、細胞又は組織をガラス化液と共に該ガラス化凍結保存用治具に載置して凍結保存した後、該細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することが可能な凍結保存用治具を提供することができる。さらに、上記（２）の発明によれば、前記した細胞又は組織を容易に剥離、回収できることに加え、ガラス化液の優れた吸収性を有する凍結保存用治具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。
【図２】図２は、図１中の載置部の断面構造概略図である。
【図３】図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の断面構造概略図である。
【図４】図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。
【図５】図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本明細書中で細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。
【００２３】
本発明の凍結保存用治具は、凍結保存作業に用いるものであり、好ましくはガラス化凍結保存作業に用いるものである。詳細には、本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し凍結させるためのものである。また凍結保存用治具上に載置された細胞又は組織を融解する際には、細胞又は組織を凍結保存用治具と共に冷却媒体から取り出し、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織を載置した際にこれを確実に保持することができ、また融解時には容易に細胞又は組織を回収できることから、細胞又は組織の凍結保存にかかる作業を容易にかつ確実に行うことができる。本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織の凍結保存用具、細胞又は組織の保存用具、細胞又は組織の凍結保存器具、細胞又は組織の保存用器具と言い換えることができる。
【００２４】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層（以下、本発明の表面層あるいは単に表面層と記載）を有する。かかる表面層は融解液に対して可溶性であることが好ましい。ここで可溶性とは２５℃の融解液に対する表面層の溶解度が０．２質量％以上であることを意味する。本発明の凍結保存用治具は上述の通り、凍結作業時に、保存液と共に細胞又は組織を凍結保存用治具の表面層上に載置した後に、冷媒（例えば液体窒素）に浸漬、凍結し、融解時には凍結した細胞又は組織を凍結保存用治具と共に取り出し、融解液中に浸漬して融解するものである。本発明では、細胞又は組織を融解する際に、表面層の全体又は一部が融解液中に溶解することにより、細胞又は組織が凍結保存用治具の載置部に固着することなく、容易に剥離・回収することが可能となる。
【００２５】
本発明の凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有し、更に該載置部の最表面に本発明の表面層を有する場合には、上記効果に加えて、該保存液吸収体が余分な保存液を吸収するので、余分な保存液を除くためのその他の操作を特に必要とせず、作業性が格段に向上する。また、そのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においては、保存液が多量の耐凍剤を含有することによる化学的毒性が問題となるが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。
【００２６】
以下に、本発明の凍結保存用治具の構成を説明する。
【００２７】
本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する層を有する。ここで細胞又は組織を載置する載置部の最表面とは、細胞又は組織が保存液と共に載置される表面部分に相当する。本発明において載置部は、本発明の表面層を、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等の非吸収性支持体上や、保存液吸収体上に有することが好ましく、特に保存液吸収体上に本発明の表面層を有することが好ましい。なお、本発明において、該表面層は、細胞又は組織を載置する載置部全体において均一な層を形成していなくても良く、例えば海島状やストライプ状の層であっても良い。すなわち、本発明の表面層は、細胞又は組織を保存液と共に載置する箇所の最表面に存在することが重要であり、細胞又は組織が載置されない箇所においては、該表面層が存在していても、存在していなくても良い。
【００２８】
本発明の表面層が有する水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。中でも、ポリビニルアルコール、アルギン酸およびその塩、およびゼラチンは保存液に対する溶解性と適度な被膜形成作用が得られることから好ましく、ポリビニルアルコールは、非生物由来素材であり、かつ細胞又は組織に対しても低毒性であるため、特に好ましい。これらの水溶性高分子化合物は、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。
【００２９】
本発明の表面層はグリセリンを含有する。グリセリンは、水溶性高分子化合物と良好な相溶性にて混合できることから、細胞又は組織と容易に剥離できると同時に被膜性に優れた表面層を形成することができる。本発明の表面層が有するグリセリンの含有量は、表面層が含有する水溶性高分子化合物に対して、５〜５０％であることが好ましい。表面層のグリセリンの含有量が５０％を超える場合には、被膜の形成に問題が生じ、良好な剥離性が安定して得られない場合がある。一方、５％を下回る場合には、表面層の融解液中への溶解性が損なわれ、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。
【００３０】
本発明の凍結保存用治具が有する表面層は架橋剤を含有することができる。その場合、融解液に対する表面層の溶解度が０．２質量％を下回らない範囲で使用することが望ましい。
【００３１】
本発明の凍結保存用治具が有する表面層は、融解液中への混入が顕著でない範囲で無機微粒子を含有することができる。具体的には、表面層の固形分質量に対して１質量％以下であることが望ましい。
【００３２】
本発明の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ２であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｍ２である。表面層の固形分量が１００ｇ／ｍ２を超える場合には、融解液中への成分の溶出・混入が多くなり、好ましくない。一方で、表面層の固形分量が０．０１ｇ／ｍ２を下回る場合には、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。
【００３３】
本発明において載置部は、細胞又は組織を凍結保存する際に、これらを支持する目的で支持体を有し、載置部が保存液吸収体を有さない場合、該支持体は表面層を有する。かかる支持体（非吸収性支持体）としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等が挙げられる。このような支持体は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また支持体の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。さらに、温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属製支持体も好適に用いることができる。金属製支持体の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した支持体の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また、目的に応じて、支持体の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することもでき、さらには粗面化することもできる。さらに、支持体と表面層の間に別の層を一又は複数有していても良いし、支持体の裏側に、別の層を一又は複数有していても良い。また、表面層を支持体の表裏に設けることもできる。支持体は後述する保存液吸収体であっても良い。
【００３４】
次に、本発明の凍結保存用治具が保存液吸収体上に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する表面層を有する場合について説明する。
【００３５】
前述の通り、本発明の細胞又は組織の載置部が保存液吸収体を有する場合、細胞又は組織に付着した保存液の量が多くても保存液吸収体が保存液を除くことができるため、保存液の除去操作が不要となり作業性が格段に向上する。またそのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においてはグリセリン、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液が保存液として利用され、この保存液には多量の耐凍剤による化学的毒性が存在するが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。したがって保存液吸収体上に該表面層を有する凍結保存用治具は、ガラス化凍結保存用治具として好適である。
【００３６】
本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、該保存液吸収体が有する細孔を閉塞することなく、載置部の最表面に表面層を設けることが好ましい。また、保存液吸収体の吸収性が著しく低下しない範囲であれば、保存液吸収体の細孔内部に、表面層が存在することも可能である。
【００３７】
本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、表面層の固形分量が多くなるほど、保存液吸収体が有する細孔が狭くなるために、保存液の吸収性は低下する傾向にある。一方、融解作業の際の細胞又は組織の剥離性は、表面層の固形分量が多くなるほど優位である。用いる保存液吸収体の厚み、細孔径、空隙率によるが、載置部が保存液吸収体を有する場合における表面層の固形分量は、上記性能のバランスを考え、適宜調整でき、好ましくは０．１〜５ｇ／ｍ２である。
【００３８】
本発明の凍結保存用治具が有する保存液吸収体としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の各種シートが挙げられる。本発明における「多孔性」とは、上記したシートが表面に気孔（細孔）を有する構造体であることを意味し、シート表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体であることがより好ましい。また保存液吸収体（上記した各種シート）の厚みは１０μｍ〜５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ〜２．５ｍｍである。保存液吸収体が、薄いシートである場合には、補強部材として前記した支持体を用いることができる。
【００３９】
本発明において、保存液吸収体として用いる繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が例示され、紙はバインダーなどの結着剤成分の紙全体に占める割合が１０質量％以下である紙が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である紙が好ましい。これにより優れた保存液の吸収性が得られる。また、該紙に含まれる製紙用薬品の紙全体に占める割合は１質量％以下であることが好ましい。通常紙に含まれている製紙用薬品のうち、例えば蛍光増白剤や染料、カチオン系のサイズ剤などには細胞への影響が懸念される場合がある。
【００４０】
繊維からなるシートが紙である場合、密度が０．１〜０．６ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ２である紙は、保存液の吸収性に優れ、さらには、透過型顕微鏡を用いて本体部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
【００４１】
繊維からなるシートが不織布である場合、該不織布が含有する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。
【００４２】
繊維からなるシートが不織布である場合、密度が０．１〜０．４ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ２である不織布は、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
【００４３】
保存液吸収体として用いられる不織布においても前記した紙と同様に、バインダーなどの結着剤成分の不織布に占める割合が１０質量％以下である不織布が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である不織布が好ましい。特に結着剤を含有しない不織布が好ましい。
【００４４】
不織布は紙と異なり様々な製造方法があるが、上記した結着剤成分が低減された不織布としては、スパンボンド法、メルトブロー法で製造された不織布、更には湿式法又は乾式法で繊維を並べて後、水流交絡法又はニードルパンチ法で製造された不織布が好適に使用できる。また上記した通り、本発明において不織布が含有する好ましい繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が挙げられるが、これら繊維を用いて製造する場合は、湿式法、乾式法関わらず水流交絡法又はニードルパンチ法での製造方法が好適である。
【００４５】
本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２−１３５６０号公報や、特開平０８−２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９−２３５４１７号公報に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。多孔性樹脂シートを保存液吸収体として用いた場合、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
【００４６】
上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニルジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン−アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。中でもポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂は、細胞又は組織をガラス化液と共に載置部に載置した場合、該多孔性樹脂シートの光透過性が高くなり、透過顕微鏡観察下での細胞又は組織の視認性が飛躍的に高まり、細胞又は組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好適である。また多孔性樹脂シートとしては、理化学実験用途や研究用途として市販されている、濾過用のメンブレンフィルターも使用できる。
【００４７】
本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シートとしては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレス等の金属からなる多孔性金属シートが挙げられる。また多孔性金属酸化物シートとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニウム、石英ガラスなどの金属酸化物からなる多孔性金属酸化物シートを好ましく利用することができる。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートは、上記した金属および金属酸化物をそれぞれ２種類以上含有する多孔性シートであっても良い。中でも多孔性金属酸化物シートは、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
【００４８】
本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シートの製造方法としては、一般に知られた方法を使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属シートの場合には、粉末冶金法、スペーサー法などの方法を使用することができる。また、樹脂射出成型と粉末冶金法を組み合わせた所謂パウダースペースホルダー法も好ましく使用できる。例えば、国際公開第２００６／０４１１１８号パンフレットや特許第４５７８０６２号公報に記載された方法などを用いることができる。より具体的には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂を混合後、圧力をかけて成型した後、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる樹脂を気化させて、多孔性金属シートを得ることができる。パウダースペースホルダー法等を用いる場合には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂に加えて、樹脂のバインダーを混合することができる。また、金属粉末を高温で加熱した後に、ガスを注入して空隙を作製する発泡溶融法、ガス膨張法などの金属多孔質体の製造方法も使用することができる。さらには、発泡剤を用いて金属多孔質体を製造するスラリー発泡法のような製造方法も使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属酸化物シートの場合には、例えば、特開２００９−２９６９２号公報や特開２００２−１６０９３０号公報に記載された方法などを用いることができる。
【００４９】
上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体の表面は、表面層との親和性を高めるために、親水化処理することもできる。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、非溶出性の親水性物質を塗布することによるコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種エネルギーを用いた一般的な表面改質方法を使用することができる。
【００５０】
保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合には、該多孔質体の細孔径は、０．０２〜１３０μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５〜６０μｍである。細孔径が０．０２μｍ未満の場合、保存液の滴下時に保存液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔性シートの製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が１３０μｍを超える場合、保存液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質体の細孔径は、多孔性樹脂シートの場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートの場合には、該多孔質体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。
【００５１】
保存液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは３０容量％以上である。また保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合、多孔質体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に対しても連続的な構造であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質体内部の気孔を有効に用いることができるために、保存液の高い吸収性能が得られる。保存液吸収体の厚み、多孔質体の空隙率は、用いる細胞又は組織の種類や細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて、適宜選択することができる。
【００５２】
上記した空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称 Ａｕｔｏｐｏｒｅ ＩＩ ９２２０ 製造者 ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ２）
Ｔ：厚み（μｍ）
【００５３】
本発明において、載置部が保存液吸収体に加えて補強部材として前記した支持体（非吸収性支持体）を有する場合には、保存液吸収体と非吸収性支持体との間に、接着層を設けることができる。接着層としては、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着組成物、ホットメルト接着組成物、光硬化性接着組成物などを含有することが可能であり、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性高分子化合物、酢酸ビニル系樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、エラストマー系樹脂、シアノアクリレート系樹脂、フッ素系樹脂、シリコン系樹脂、ニトロセルロース系樹脂、ニトリルゴム系樹脂、スチレン―ブタジエン系樹脂、ユリア系樹脂、スチレン系樹脂、フェノール系樹脂、ポリイミド系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ビスマレイミド系樹脂、オレフィン系樹脂、ＥＶＡ系樹脂などの非水溶性樹脂を含有する組成物が好ましく利用できる。接着層は、一種類の樹脂を含有してもよいし、複数種類の樹脂を含有してもよい。接着層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ２の範囲が好ましく、更に０．１〜５０ｇ／ｍ２の範囲がより好ましい。
【００５４】
本発明の凍結保存用治具が有する載置部の面積は、細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、滴下する保存液１μＬにつき１ｍｍ２以上とすることが好ましく、２〜４００ｍｍ２とすることがより好ましい。また、同一の凍結保存用治具において、載置部が、非吸収性支持体上に保存液吸収体を複数有する形態である場合には、連続している１つの保存液吸収体部分が前記した面積であることが好ましい。
【００５５】
以上、本発明の凍結保存用治具の載置部について説明してきた。本発明の凍結保存用治具は、載置部と共に把持部を有していても良い。把持部を有すると、凍結保存作業時及び融解作業時の作業性が良好となるため、好ましい。
【００５６】
図１は本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において凍結保存用治具７は、把持部１と載置部２から構成される。
【００５７】
把持部１は耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。図１中、把持部１は円柱形であるが、その形状は任意である。また、後述するように、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないことを目的に、凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部２にキャップを被せることがあるが、この場合、把持部１を、載置部２を有さない側から、載置部２を有する側に向かって、円柱の径が連続的に小さくなる形状とすることで、キャップを被せる際の作業性を向上させることも可能である。載置部２の形状は、ハンドリング上、短冊状又はシート状であることが好ましい。
【００５８】
図１の把持部１と載置部２の接続方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工する時にインサート成形により載置部２を把持部１に接続することができる。更に、把持部１に図示しない構造体挿入部を作製して接着剤にて載置部２を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤が好適に用いることができる。
【００５９】
図２は、図１中の載置部の断面構造概略図である。図２中、載置部２ａは、支持体４上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ａを得るためには、例えば、支持体上に、少なくとも水溶性高分子化合物とグリセリンを含有する塗布液をスライドホッパー方式で塗布する方法や、ディップコーティングで塗布する方法などの製造方法を用いることができる。
【００６０】
図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の断面構造概略図である。図３中、載置部２ｂは、保存液吸収体５と保存液吸収体５上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ｂを得るためには、例えば、前記した塗布液をスライドホッパー方式で塗布する製造方法を用いることができる。
【００６１】
図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図４中、載置部２ｃは、保存液吸収体５の多孔体全体にわたって表面層３を有する構造である。このように、保存液吸収体上に表面層が存在する場合、表面層は保存液吸収体表面において連続した層を形成する必要はなく、保存液吸収体の孔表面に存在しても良い。この構造は、多孔体の細孔を閉塞しないため、凍結時のガラス化液の吸収性と融解時の細胞又は組織の剥離性を両立することができるため好ましい。この態様においても、微視的には載置部の最表面には本発明の表面が存在するので、図４は本発明の一例を示すものであるといえる。このような構造の載置部２ｃを得るためには、例えば、ディップコーティングで塗布する製造方法を用いることができる。
【００６２】
図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図５中、載置部２ｄは、保存液吸収体５の多孔体全体にわたって表面層３を有する図４の形態に加えて、支持体４と接着層６を有する。この構造の場合、例えば保存液吸収体５に用いる多孔体が自立性に乏しい場合であっても、凍結時・融解時の操作をより確実に行うことができる。
【００６３】
本発明の、細胞又は組織の凍結保存用治具により、細胞又は組織を長期凍結保存する場合、前述の通り、細胞又は組織を外界と遮断するためにキャップを被せる、又は該凍結保存用治具を任意の形状の容器に入れて密閉することも可能である。液体窒素が滅菌されておらず、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部にキャップをして、又は凍結保存用治具を容器中に密閉して、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、欧州など海外先進国では前記の様に液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。このような理由からキャップ及び容器は耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては特に限定されず、例えば、キャップは、鉛筆用のキャップのような半紡錘状又はドーム状等のキャップ、円柱状のストローキャップなど本体部と接触せず、細胞又は組織を外界と遮断できるような形状ならどのような形状でもよい。容器は、載置された細胞又は組織に接触せずに、凍結保存用治具を被包又は収納して密閉できるものであればよく、その形状は特に限定されない。
【００６４】
本発明においては、本発明の効果を損なわない限り、凍結保存用治具をこのような載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップ又は容器と組み合わせて使用することができる。また、このようなキャップ又は容器と組み合わせて使用される凍結保存用治具も、本発明に包含される。
【００６５】
本発明の凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。また、従来のクライオトップ法は、通常、単一の細胞又は細胞集団は１０個未満の少数の細胞又は細胞集団の保存に用いられるが、本発明の凍結保存用治具は、より多くの細胞又は細胞集団の保存（例えば、１０〜１００００００個の細胞又は細胞集団の保存）においても好適に用いることができる。さらには、複数の細胞からなるシート状の細胞（所謂細胞シート）の保存にも好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織の凍結保存作業において、細胞又は組織を凍結後に融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することができる。また、載置部が保存液吸収体を有することにより、上記した効果に加えて、細胞又は組織を凍結する際に、細胞又は組織の外周に付着した余分なガラス化液を吸収することから、細胞又は組織の凍結時及び融解時に細胞外のガラス化液による損傷を受けにくく、細胞又は組織を優れた生存率で凍結保存することができる。
【００６６】
本発明の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下し、該細胞又は該組織の周囲に付着している余分な保存液をピペットなどを用いて可能な限り除く。この時、該凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有する場合には、上記操作は必要なく、自動的に余分な保存液が除かれる。次いで、前記細胞又は前記組織を載置部に保持させたまま液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結することができる。この際、前記した載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップを載置部に装着して、又は凍結保存用治具を前記した容器に密閉して、液体窒素等の中に浸漬することもできる。保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、上述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセリン、エチレングリコール等）を含有させることで得られた保存液や、グリセリンやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含むガラス化液を使用できる。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該凍結保存用治具を取り出し、凍結された細胞又は組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、その後、細胞又は組織を回収する。融解液は、通常卵子、胚等の細胞の融解のために使用されるものや、培養液を融解液として使用することができ、例えば、上述したリン酸緩衝生理食塩水等のようなｐＨ５〜９である生理的溶液を使用できる。前記融解液は、凍結・融解時の細胞の急激な体積変化による細胞膜の損傷を避けるため、浸透圧緩衝を目的として、スクロースやトレハロースなどの糖類を添加・溶解し、浸透圧を調整することができる。また、血清などのタンパク質成分を含有することができる。
【００６７】
本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織など）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。
【実施例】
【００６８】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％、厚さ２００μｍ）を用い、該支持体上に、ポリビニルアルコールである（株）クラレ社製のＰＶＡ１０３（ケン化度９８．５ｍｏｌ％、重合度３００）を１．８質量％、グリセリンを０．２質量％含有する塗布液を乾燥時の固形分量が１ｇ／ｍ２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、支持体上に表面層を有する図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１の凍結保存用治具を作製した。
【００７０】
（実施例２）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％、厚さ２００μｍ）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）社製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ  ＱＲ  １７０−７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）社製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、前記ＰＶＡ１０３を１．８質量％、グリセリンを０．２質量％含有する塗布液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、図５に示す形態の表面層を有する載置部を作製した。なお、表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。実施例１と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２の凍結保存用治具を作製した。
【００７１】
（実施例３）
前記ＰＶＡ１０３を１．３質量％、グリセリンを０．７質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例３の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７２】
（実施例４）
ポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）社製のゴーセノールＥＧ０５Ｐ（ケン化度８７．８ｍｏｌ％、重合度５００）を１．８質量％、グリセリンを０．２質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例４の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７３】
（実施例５）
前記ゴーセノールＥＧ０５Ｐを１．３質量％、グリセリンを０．７質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例５の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例５の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７４】
（実施例６）
ポリビニルアルコールである（株）クラレ社製のＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％、重合度５００）を１．８質量％、グリセリンを０．２質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例６の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例５の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７５】
（実施例７）
前記ＰＶＡ５０５を１．３質量％、グリセリンを０．７質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例７の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例７の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７６】
（実施例８）
ゼラチンであるゼライス（株）社製ＰＮ５０５を１．８質量％、グリセリンを０．２質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、実施例８の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例８の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７７】
（比較例１）
実施例２と同様にして積層体を得た後に、コーティングをせずに、積層体を載置部とし、２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で比較例１の凍結保存用治具を作製した。
【００７８】
（比較例２）
前記ＰＶＡ１０３を２質量％含有する塗布液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例２と同様にして、比較例２の凍結保存用治具を作製した。なお、比較例２の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ２である。
【００７９】
＜スフェロイドの調整＞
細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェロイドは以下のように調整した。肝ガン由来セルラインであるＨｅｐＧ２細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト（株）社製ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ９６Ｕプレートに１００細胞／ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェロイド形成を誘導した。培養３日後に直径約１００μｍのスフェロイドを得た。
【００８０】
＜スフェロイドの凍結＞
上記方法により調整したスフェロイドを回収し、ガラス化液（１５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、１５容量％エチレングルコール、１４容量％ウシ胎児血清、５６容量％修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭ  グルコース、０．３ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ  硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ  ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ  トレハロース）、０．５Ｍスクロース）に２０秒間浸漬させた後に、スフェロイドを実施例１〜８又は比較例１、２の凍結保存用治具の載置部上にそれぞれ載置し、透過型顕微鏡観察下で余分なガラス化液を除いた。この際、実施例１については、ピペットを用いてスフェロイド周辺の余分なガラス化液をできるだけ除いた。実施例２〜８および比較例１、２は、ガラス化液吸収体により、余分なガラス化液が自発的に吸収された。その後、液体窒素中に浸漬し、スフェロイドをガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
【００８１】
＜細胞又は組織の剥離性の評価＞
スフェロイドを載置した実施例１〜８および比較例１、２の凍結保存用治具を液体窒素中からそれぞれ取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のスフェロイドの様子を透過型光学顕微鏡で観察しながら、ピペットを用いてスフェロイドの回収を試み、以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。なお、実施例１〜８および比較例２の凍結保存用治具の表面層の融解液に対する溶解度は、いずれも０．２％以上であった。
【００８２】
細胞又は組織の剥離性は以下の基準で評価した。
○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆする又はピペットを用いた吸引操作によりスフェロイドを回収することができた。
△：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆする又はピペットを用いた吸引操作では剥離することができなかったが、ピペットの先端で触れることでスフェロイドを回収することができた。
×：スフェロイドを回収することが容易にできないほどに固着してしまい、回収の際にスフェロイドを構成する細胞がバラバラになってしまった。
【００８３】
【表１】
2018121581.tif 000003
【００８４】
表１の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。
【符号の説明】
【００８６】
１  把持部
２、２ａ〜２ｄ  載置部
３  表面層
４  支持体
５  保存液吸収体
６  接着層
７  凍結保存用治具
【図１】
2018121581.tif 000004
【図２】
2018121581.tif 000005
【図３】
2018121581.tif 000006
【図４】
2018121581.tif 000007
【図５】
2018121581.tif 000008