(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する又は導入するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの提供。【解決手段】哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する又は導入する方法であって、異種ポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に投与して、前記異種ポリヌクレオチド配列を前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に送達する又は導入する段階を備える、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する又は導入する方法であって、異種ポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に投与して、前記異種ポリヌクレオチド配列を前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に送達する又は導入する段階を備える、方法。
【請求項２】
前記異種ポリヌクレオチド配列は、前記異種ポリヌクレオチド配列の転写を付与する発現制御要素に操作可能に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質の発現又は機能が欠乏している哺乳動物を治療する方法であって、（ａ）欠乏している前記タンパク質の発現又は機能を修正することができるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する段階であって、前記異種ポリヌクレオチドの配列は、当該異種ポリヌクレオチド配列の転写を付与する発現制御要素に操作可能に結合されている、前記ＡＡＶベクターを提供する段階と、（ｂ）前記ポリペプチドを前記哺乳動物内で発現させるべく、前記哺乳動物に前記ＡＡＶベクターを所定量投与する段階と、を備える方法。
【請求項４】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＱＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＳＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬの配列と９０％若しくは９０％を超える一致率を有する、又は、当該配列に１−５０のアミノ酸が置換、削除若しくは付加された、ＶＰ１配列、
ＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦ
ＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬの配列と９０％若しくは９０％を超える一致率を有する、又は、当該配列に１−５０のアミノ酸が置換、削除若しくは付加された配列、ＶＰ２配列、及び／又は、
ＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬの配列と９０％若しくは９０％を超える一致率を有する、又は、当該配列に１−５０のアミノ酸が置換、削除若しくは付加された、ＶＰ３配列、を有するＡＡＶを含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９５％の又は９５％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を有するＡＡＶを含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９６％の又は９６％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９７％の又は９７％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９８％の又は９８％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項９】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９９％の又は９９％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列の一つ又は複数と９９．５％の又は９９．５％を超える一致率を有するＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１１】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、図３に記載されたＡＡＶ−Ｒｈ７４のＶＰ１、ＶＰ２若しくはＶＰ３配列、ＡＡＶ−Ｒｈ７４関連ＡＡＶベクター、又は、ＡＡ
Ｖ−Ｒｈ７４を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種ポリヌクレオチド配列又は前記タンパク質は、前記哺乳動物に対して治療的効果を有するレベルで発現する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
前記アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ８よりも高い肝細胞に対する指向性を有する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種ポリヌクレオチド配列又は前記タンパク質は、前記哺乳動物の細胞、組織又は臓器において発現する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、分泌細胞を含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、内分泌細胞を含む請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、肝細胞、神経細胞、グリア細胞、網膜細胞、上皮細胞、肺細胞、又は、全能性、多能性若しくは多分化能性幹細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物の組織又は器官は、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜又は肺を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物は、不十分な量のタンパク質、又は、欠陥を伴う若しくは異常なタンパク質を生成する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質は、嚢胞性線維性膜貫通調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、血液凝固（凝血）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、タンパク質Ｃ等）、血液凝固因子の機能獲得、抗体、網膜色素上皮固有の６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、βグロビン、αグロビン、スペクトリン、αアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、ライソゾーム蓄積症に関係する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子、インシュリン様成長因子１若しくは２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来の成長因子、形質転換成長因子α及びβ、サイトカイン、αインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ-Ｌｉｎ
ｄａｕ（ＶＨＬ）、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ））、免疫調整性、免疫寛容原性若しくは免疫原性ペプチド又はタンパク質Ｔレギトープ又はｈＣＤＲ１、インシュリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰのＡＲ型：網膜色素変性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色盲）、ＰＫＤ−１又はＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎疾患）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、ライソゾーム蓄積症に関係する遺伝子産物（例えば、スルファター
ゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸塩転移酵素、カプテシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２，スフィンゴ脂質活性化タンパク質）、又は、ゲノム編集のための一の若しくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は、ゲノム編集のための修復テンプレートとして使用されるドナー配列、を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記異種ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド、ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子が、治療用ペプチド又はタンパク質をコードする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子は、嚢胞性線維性膜貫通調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、血液凝固（凝血）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、タンパク質Ｃ等）、血液凝固因子の機能獲得、抗体、網膜色素上皮固有の６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、βグロビン、αグロビン、スペクトリン、αアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、ライソゾーム蓄積症に関係する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子、インシュリン様成長因子１若しくは２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来の成長因子、形質転換成長因子α及びβ、サイトカイン、αインターフェロン、βインターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ-Ｌｉｎｄａｕ
（ＶＨＬ）、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ））、免疫調整性、免疫寛容原性若しくは免疫原性ペプチド又はタンパク質Ｔレギトープ又はｈＣＤＲ１、インシュリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰのＡＲ型：網膜色素変性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色盲）、ＰＫＤ−１又はＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎疾患）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、ライソゾーム蓄積症に関係する遺伝子産物（例えば、スルファターゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸塩転移酵素、カプテシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２，スフィンゴ脂質活性化タンパク質）、又は、ゲノム編集のための一の若しくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は、ゲノム編集のための修復テンプレートとして使用されるドナー配列、を含む又はコードする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記異種ポリヌクレオチド配列は、阻害性核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記阻害性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又は三重鎖構造ＲＮＡを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記阻害性核酸は、病原性遺伝子、病原性遺伝子の転写物、又は、ヌクレオチドリピート病と関連する遺伝子転写物、ハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症と関連する遺伝子（アトロフィン１、ＡＴＮ１）、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染
色体上のアンドロゲン受容体、ヒト  アタキシン−１、−２、−３及びー７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によりコードされたＣａv２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル、ＴＡＴ
Ａ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとも称されるアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ  ５５  ｋＤａ調節サブユニットＢベータイソ型、脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー；筋強直性ジストロフィーにおける筋強直性プロテインキナーゼ（ＭＴ−ＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン、筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子；アポリポタンパクＢ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  ＴＡＲ，ヒト免疫不全ウイルストランス活性化活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染症におけるＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染症におけるＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝臓固有のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）；ｐ５３の、急性腎障害又は腎臓移植後臓器機能障害又は腎臓障害による急性腎不全；進行性、再発性又は転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；プロテアソームサブユニットベータ型９（ＰＳＭＢ９）転移性黒色腫としても知られるＬＭＰ２；プロテアソームサブユニットベータ型８（ＰＳＭＢ８）転移性黒色腫としても知られるＬＭＰ７；プロテアソームサブユニットベータ型１０（ＰＳＭＢ１０）転移性黒色腫としても知られるＭＥＣＬ１；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドルタンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ−細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフーリン；肝腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１），家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）又は加齢黄斑変性におけるＤＡＮ損傷誘導性転写産物４タンパク質として知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性症又は脈絡膜血管新生における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染症におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるＳＡＲＳコロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳ）感染症におけるＲＳウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染におけるＢ型及���Ｃ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）、ｐａｎ−ｃｌａｓｓＩ及び移植において特定のＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子を狙ったサイレンシング）；又は、遺伝子常染色体優性遺伝網膜色素変性（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）と結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物は、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、出血性疾患（例えば、インヒビターを伴う又は伴わない血友病Ａ又は血友病Ｂ）、サラセミア、血液疾患（例えば、貧血）、アツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、ライソゾーム蓄積症、銅又は鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病又はメンケス病）リソソーム酸リパーゼ欠損症、神経障害又は神経変性疾患、癌、１型又は２型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えば、グリコ
ーゲン蓄積症）、網膜変性疾患（例えば、ＲＰＥ６５欠乏症、先天性脈絡膜欠如、及び、その他の眼の疾患）、実質臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患、又は、感染性ウィルス疾患（例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶ等）、細菌性疾患若しくは真菌性疾患を有する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現制御要素は、構成型の又は調整可能な制御要素を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現制御要素は、組織固有の発現制御要素又はプロモーターを含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＡＶベクターは、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、皮下に、経口的に、挿管によって、カテーテルを介して、経皮的に、頭蓋内に、吸入により、体腔内に、又は、粘膜を介して、送達される請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳類は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４以外のＡＡＶ血清型に対して血清学的に陽性である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳類は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０又はＡＡＶ１１に対して血清学的に陽性である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４に対して血清学的に陰性である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３５】
空のキャプシドＡＡＶを投与する段階を更に備える、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３６】
空のキャプシドＡＡＶ−Ｒｈ７４を投与する段階を更に備える、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９，又は１０の保存的、非保存的、又は、保存的及び非保存的なアミノ酸置換を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＡＶは、医薬組成物を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項３９】
前記医薬組成物は、空のキャプシドＡＡＶを含む請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物は、空のキャプシドＡＡＶ−Ｒｈ７４を含む請求項３８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１２年２月１７日出願の米国特許仮出願第６１／６００，４１５号に基づく優先権を主張するものであり、この米国特許仮出願の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
望ましい遺伝子における欠如若しくは欠陥（機能喪失）、又は、望ましくない若しくは欠陥を有する遺伝子の発現（機能獲得）によって引き起こされる遺伝性疾患は、様々な病気につながる。機能喪失による遺伝性疾患の一例としては、血友病が挙げられ、これは、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ、血友病Ａ）又は第ＩＸ凝固因子（ＦＩＸ、血友病Ｂ）の欠乏により引き起こされる遺伝性出血性疾患である。機能獲得による遺伝性疾患の一例としては、ハンチントン病が挙げられ、これは、変異タンパク質をコードする病態“ＨＴＴ”遺伝子（ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）タンパク質をコードする）によって引き起こされる病気であり、変異タンパク質が特に大脳基底核及び大脳皮質に蓄積して、次第に神経細胞破壊につながる。
【０００３】
血友病の現在の治療方法では、出血が発生した場合に必要に応じて又は予防的に、組み換え型凝固因子を静脈内投与する。しかしながら、この治療方法には幾つかの欠点があり、例えば、点滴を繰り返し行う必要性、治療費の問題、抗治療因子免疫応答を発現するリスク、及び、命を奪うような出血につながるリスクが存在する。このような制約が存在することから、血友病に対する遺伝子ベースの治療法の開発が進められてきた。上記の観点において、血友病には、遺伝子導入ベースの治療法が適しており、理由として、まず、１）治療可能時間域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）が非常に広いことが挙げられ、通常の１％をわずかに超えるレベルで、すでに、表現型が重症から中程度へと変化し、１００％のレベルであらゆる副作用と関係しないこと、更に、２）組織を特定した治療的導入遺伝子の発現を厳密に要求されないこと、及び、３）治療効果の終点の測定について相当量の実施実績があること、が挙げられる。更に、凝固因子の肝発現により、凝固因子そのものに対する免疫寛容が誘起されることが分かっており、有害となり得る凝固因子に対する免疫反応の可能性を下げている。
【０００４】
現在、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子導入ベクターとして最適であると認識されているが、これは、生体内において優れた遺伝子送達の安全性及び有効性プロファイルを有しているからである。これまでに分離されているＡＡＶ血清型のうち、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８が、重度の血友病Ｂの患者の肝臓を標的として使用されてきた。いずれのベクターも有効に働くことが知られており、ＡＡＶ８の場合、治療的導入遺伝子が長期的に発現することが報告されている。人体での最近のデータによれば、ＡＡＶベクターを使用して肝臓を標的とすることにより、治療レベルのＦＩＸ導入遺伝子が長期的に発現することが示されている。
【０００５】
これらのデータから上記の血清型は将来も有望であると考えられるが、肝臓に対して高い指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有すると共に人体内で低い血清陽性率（ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を有するＡＡＶ血清型（野生型ＡＡＶの自然宿主）を新たに特定することは、次の２点を達成するために重要である。１）抗ＡＡＶキャプシド免疫反応を引き起こすリスクを低減させるべく可能な限り低いベクター投与量で、肝臓における治療レベルの導入遺伝子の発現を達成すること、及び、２）ＡＡＶに対する既存の液性免疫を有するた
めにＡＡＶ遺伝子導入ができない患者群に対する治療を、固有の血清陽性率を有する代替ＡＡＶ血清型により可能とすること。本発明は、上記のような要望に対処し、更なる利点をもたらす。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター、及び、関連ＡＡＶベクターを提供する。このようなベクターとして、様々な細胞種のうち、肝臓の肝細胞を標的とするＡＡＶ−Ｒｈ７４を含む。ポリヌクレオチド配列を送達するベクターとして、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターは、細胞中のポリヌクレオチドの発現を活発にする。治療に使用されるタンパク質のようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、投与後に、治療レベルで発現させることができる。更に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターは、前臨床及び臨床設定で研究されているその他の幾つかの血清型よりも大幅に高かったポリヌクレオチドの導入で生成されるタンパク質の発現レベルを調整する（例えば、図１及び図２を参照）。特に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、マウス及び血友病Ｂの犬において、肝臓形質転換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）の代表例であるＡＡＶ８に少なくとも劣らない又はそれを超える効率で、肝臓のポリヌクレオチドを標的とすることができる。したがって、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、遺伝子コード配列のようなポリヌクレオチドを送達するのに使用することができ、所望の又は治療的な利点を提供できるタンパク質を発現させることができると共に、望ましくない又は欠陥を有する遺伝子の発現を低減する又は抑制する阻害ヌクレオチドについても使用できることから、様々な疾患を治療することができる。例えば、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、血友病Ａ、Ｂを治療するべく治療遺伝子（例えば、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ）を送達するのに、及び、その他の代謝異常又は血漿タンパク質欠乏等の幅広い疾患のために遺伝子を送達するのに使用することができる。又は、その他の治療目的で使用される遺伝子を送達するのに使用することができ、例えば、これに限定されないが、肝臓でゲノム編集を実行するのに使用されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）をコードする遺伝子、肝炎ウィルス感染を治療するためのアルファインターフェーロンのような免疫調整薬の局所的（肝臓）送達、又は、肝臓形質転換を必要とする若しくは血流に治療的導入遺伝子生成物を存在させること（肝臓で発現させるための導入遺伝子を標的とすることによって達成することができる）を必要とするあらゆる疾患に対する治療に使用することができる。
【０００７】
インビトロ、生体内及び生体外でのＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連ベクターによるポリヌクレオチドの細胞への効率的な送達に加えて、ヒトにおける抗ＡＡＶ−Ｒｈ７４抗体の有病率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、抗ＡＡＶ２抗体の有病率よりも低く、抗ＡＡＶ８抗体の有病率とは異なる（表１）。血清有病率が低いために、ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連ベクターを、例えば、その他のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１等）に対して血清学的に陽性であるヒトに対する遺伝子導入を含む、多くの人に使用可能である。加えて、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、高い力価（ｔｉｔｅｒ）で効率的に生成することができる（表２）。したがって、ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連するベクターを、より広い臨床疾患に対して大量に生成することができる。
【０００８】
本発明によれば、哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する又は導入する方法を提供する。一実施形態において、方法は、異種ポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、好適な条件の下で、哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に投与する段階を含み、異種ポリヌクレオチド配列を当該哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に送達又は導入することにより、異種ポリヌクレオチドを送達又は導入する。一実施態様では、方法は、異種ポリヌクレオチドを哺乳動物及び／又は細胞へと導入／送達することを可能にする。別の態様では、方法は、異種ポリヌクレオチドの哺乳動物及び／又は細胞への導入／送達を可能とし、次いで、異種ポリヌクレオチドの転写により
、転写物を形成する。更なる態様では、方法は、異種ポリヌクレオチドの細胞への導入／送達を可能とし、次いで、転写により転写物を形成して、次いで、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を行って遺伝子産物（タンパク質）を形成する。より詳細には、例えば、後述の２つの態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列の転写を付与する発現制御要素と操作可能に結合され、必要に応じて更に、転写物の翻訳が行われる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】尾静脈からＡＡＶベクターを注入し、肝臓固有のプロモータの制御の下でＦＩＸ導入遺伝子を発現したＣ５７ＢＬ／６マウス（１グループｎ＝５）におけるヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）血漿中濃度を示している。ベクター投与量は、マウス１匹あたり２．５10ベクターゲノム（ｖｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ）である。ＦＩＸ導入遺伝子産物（ＦＩＸタンパク質）血漿中濃度は、遺伝子導入の後、第１週、第２週及び第４週にＥＬＩＳＡによって測定された。ＡＡＶ−Ｒｈ７４により、高い水準のＦＩＸ導入遺伝子の発現が提供された。
【００１０】
【図２】１キログラム（ｋｇ）重量あたり３12ベクターゲノムの送達を行った後の、血友病Ｂの犬におけるイヌＦＩＸ血漿中濃度を示している。ＡＡＶベクターは、伏在静脈を介して静脈内（ＩＶ）注入されて、ＦＩＸ濃度はＥＬＩＳＡによってモニタされた。治療的ＦＩＸ導入遺伝子の発現は、肝臓固有のプロモータによって活性化された。ＡＡＶ８ベクター及びＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクターは、血友病Ｂのイヌにおいてほぼ等しく機能して、ＡＡＶ６を超える成績となった。
【００１１】
【図３】ＡＡＶ−Ｒｈ７４  ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列、及び、ＶＰ１については、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（配列ＩＤ番号：１−４）を示す。
【００１２】
【図４】ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を発現するＡＡＶ８及びＡＡＶｒｈ７４ベクターのアカゲザル、非ヒト霊長類への投与（肝臓固有のプロモータの制御の下で）、及び、動物におけるＦＩＸの発現を示した図である。同量が投与されたその他のグループの動物と比較して、ＡＡＶｒｈ７４−ＦＩＸベクターを投与された動物（右の余白に向かって少なくとも２つの棒）は、高レベルのＦＩＸ導入遺伝子を発現した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、少なくとも部分的に、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型ＡＡＶ−Ｒｈ７４が、肝臓の細胞である肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）に対して高い指向性を有することを示すデータに基づく。ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、阻害性核酸等）のベクターが細胞に導入／送達されると、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、静脈内投与の後に、治療レベルの発現を引き起こすことができる。更に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、他の幾つかの血清型よりも大幅に高くなっている遺伝子導入／送達で生成されたタンパク質の発現レベルを調整している（例えば、図１及び図２参照）。特に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、マウス及び血友病Ｂの犬の両方において、肝臓形質転換の代表例であるＡＡＶ８に少なくとも劣らない又はそれを超える効率で、肝臓のポリヌクレオチドを標的とすることができる。したがって、ＡＡＶ−Ｒｈ７４を、所望の又は治療的利点をもたらすタンパク質のコード配列（遺伝子）のようなポリヌクレオチド、及び、望ましくない又は欠陥を有する（例えば、病理的）遺伝子の発現を低減する又は抑制する阻害（例えば、アンチセンス）ヌクレオチドを導入／送達するのに使用することができることから、様々な疾患を治療することができる。例えば、ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、血友病Ａ、Ｂを治療するべく治療遺伝子を送達するのに、及び、その他の代謝異常又は血漿タンパク質欠乏等の幅広い疾患のために遺伝子を送達するのに使用することができる。又は、その他の治療目的で使用される遺伝子を送達するのに使用することができ、例えば、肝臓でゲノム編集を実行するのに使用されるジンクフィンガ
ーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）をコードする遺伝子、肝炎ウィルス感染を治療するためのアルファインターフェーロンのような免疫調整薬の局所的（肝臓）送達、又は、肝臓形質転換を必要とする若しくは血流に治療的導入遺伝子生成物を存在させること（肝臓で発現させるための導入遺伝子を標的とすることによって達成することができる）を必要とする実質的にあらゆる疾患に対する治療に使用することができる。
【００１４】
上記したように、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連ＡＡＶベクターは、生体外、インビトロ及び生体内において、ポリヌクレオチド配列の細胞への送達を提供する。このようなポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドが送達される細胞が、コードされたタンパク質を発現するように、タンパク質をコードすることができる。例えば、ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連ＡＡＶベクターは、所望のタンパク質若しくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、転写された場合に阻害配列（例えば、ＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド、例えば、発現を阻害する遺伝子を標的とする配列、を含むことができる。したがって、対象（例えば、哺乳動物）へのベクター送達及び投与は、タンパク質及びペプチドをコードするポリヌクレオチドだけでなく、対象における発現又は機能を阻害するための遺伝子を標的とする阻害性核酸（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）を対象に提供する。
【００１５】
したがって、本発明によれば、ペプチド及びタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、並びに、発現又は機能の阻害のための遺伝子を標的とする阻害性核酸を直接含む又は転写された場合に含むポリヌクレオチド配列を含む、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型ＡＡＶ−Ｒｈ７４ベクター及び関連ＡＡＶベクターが提供される。このようなＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクター血清型（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列）は、例えば、ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１又はＲｈ１０を含むそのほかのＡＡＶ血清型とは異なる（例えば、ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１又はＲｈ１０血清型のうちの何れかのＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列とは異なる）。
【００１６】
本明細書において使用されている“血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）”という言葉は、その他のＡＡＶ血清型とは、血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶを指すのに使用されている。血清学的な区別は、一のＡＡＶと別のＡＡＶとを比較した場合に、抗体間に交差反応がないことに基づいて決定される。このような交差反応の違いは通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基における違いによるものである（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列の違い）。
【００１７】
ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４の配列特徴と同一の遺伝子／タンパク質配列を有する（例えば、図３のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３参照）。本明細書で使用されている“ＡＡＶ−Ｒｈ７４に関連ＡＡＶベクター”という言葉及びその同意語は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４を含む一の又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と、大部分が同一の配列を有する一の又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列）を指す。したがって、このようなＡＡＶ−Ｒｈ７４関連のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−Ｒｈ７４とは異なる一の又は複数の配列を有する場合があるが、ＡＡＶ−Ｒｈ７４の一の又は複数の遺伝子と実質的に同一である配列を示す、及び／又は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４の一の又は複数の機能的特徴を有する（例えば、細胞／組織の指向性）。ＡＡＶ−Ｒｈ７４配列の例としては、図３に記載されるＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３が含まれる。非制限的な実施形態の一例では、ＡＡＶ−Ｒｈ７４関連のＡＡＶベクターは、図３に記載されるＡＡＶ−Ｒｈ７４  ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列のうちの一つ又は複数と少なくとも８０％又は８０％を超える割合で（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含む又は同一の配列で構成されるポリヌクレオチド、ポリペプチド又は部分配列を有する。
【００１８】
本発明によれば、方法及び使用は、ＡＡＶ−Ｒｈ７４配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）及びその部分配列を含み、部分配列は、標準ＡＡＶ−Ｒｈ７４遺伝子又はタンパク質配列（例えば、図３に記載のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列）と１００％未満の一致率を呈するが、ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１、ＡＡＶ−Ｒｈ１０の遺伝子又はタンパク質のような周知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質とは異なる及び同一ではない。一実施形態では、ＡＡＶ−Ｒｈ７４ポリペプチド又はその部分配列は、任意の標準ＡＡＶ−Ｒｈ７４配列又はその部分配列（例えば、図３に記載されるＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列）と少なくとも８０％一致する又は８０％を超えて最高で１００％まで（例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％）の一致する配列を含む又はそのような配列から構成される。
【００１９】
ＡＡＶ−Ｒｈ７４を含むＡＡＶベクター及びＡＡＶ−Ｒｈ７４関連ベクターは、当業者に周知の遺伝子組み換え技術を使用して、機能ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接する一の又は複数の異種ポリヌクレオチド配列を含めることにより、構築することができる。異種ポリヌクレオチドを組み込むことにより、ＡＡＶが組み換えベクターとなる、すなわち、“ｒＡＡＶベクター”と定義する。このようなベクターは、例えば、ｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子のように、全体が欠損している又は部分的に欠損している野生型ＡＡＶ遺伝子の一つ又は複数を有することができるが、ＡＡＶ粒子の回復、複製及びパッケージングに必要な少なくとも一つの機能性隣接ＩＴＲ配列（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ＩＴＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を保持する。したがって、ＡＡＶベクターは、ウィルス複製及びパッケージングのためにシス型（ｃｉｓ）で必要とされる配列を含む（例えば、機能性ＩＴＲ）。
【００２０】
本明細書では、“ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”及び“核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）”を交換可能な言葉として使用しており、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドのすべての形態を指す。ポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びに、スプライスされた又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、並びに、抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子ヘアピン型若しくはショートヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ，低分子干渉型若しくは短干渉型（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又は、アンチセンスＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドとしては、自然に発生した、合成の及び意図して変更又は修飾されたポリヌクレオチド、並びに、類似体及び派生物を含む。ポリヌクレオチドは、単体、２倍の若しくは３倍で、又は、線形若しくは円形で存在してもよく、任意の長さを有し得る。
【００２１】
”異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）”ポリヌクレオチドとは、単に、ＡＡＶが仲介するポリヌクレオチドの導入／送達を目的としてＡＡＶに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種ポリヌクレオチドは、典型的には、ＡＡＶ核酸とは区別される。一旦細胞に導入／送達されると、異種ポリヌクレオチドは、ｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ  ｖｉｒｉｏｎ）に収容され、発現可能（例えば、転写及び適切な場合には翻訳）となる。これに代えて、細胞に導入された／送達された異種ポリヌクレオチドは、ｒＡＡＶビリオンに収容されるが、必ずしも発現させる必要がない。本明細書では、“異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）”という言葉は、常にポリヌクレオチドを参照して使用されていないが、“異種の”という修飾語がなくとも省略されているとして、ポリヌクレオチドという言葉は、異種ポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
“ポリヌクレオチド配列”によってコードされた“ポリペプチド”、“プロテイン”及
び“ペプチド”は、自然発生的なタンパク質と同様に、完全長の天然型配列（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含み、また、機能性部分配列、修飾型若しくは変形型配列が完全長の天然型タンパク質の機能をある程度保持している限りにおいて、これら機能性部分配列、改変型若しくは多様型配列も含む。本発明の方法及び使用において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるこのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、治療対象の哺乳動物において欠損している、又は、その発現が不十分である又は不完全であるような内在性タンパク質と同一であってもよいが、同一であることを必要条件としているわけではない。
【００２３】
本発明のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）血清型ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターは、ポリヌクレオチドを安定して又は一時的に細胞へと及び子孫細胞へと導入／送達するのに使用することができる。”導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）”という言葉は、便宜上、このような細胞又は臓器に導入された異種ポリヌクレオチドを指すのに使用される。導入遺伝子とは、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、阻害性ポリヌクレオチドへと転写されるポリヌクレオチド、又は、転写されないポリヌクレオチド（例えば、転写を活性化するプロモータのような発現制御要素が存在しない場合）といった、あらゆるポリヌクレオチドを含む。例えば、導入遺伝子を有する細胞においては、細胞のＡＡＶ“形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）”によって導入遺伝子が導入／送達されている。導入遺伝子が導入された細胞又はその子孫細胞は、“形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ）”又は“形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）”と称される。典型的には、導入遺伝子は、形質転換体の子孫に取り込まれる、又は、その細胞から生成された臓器の一部となる。したがって、“形質転換された”又は“遺伝子導入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）”細胞（例えば、哺乳動物では、細胞又は組織又は臓器細胞）とは、外因性分子の組み込み、例えば、ポリヌクレオチド又はタンパク質（例えば、導入遺伝子）を細胞に組み込むことに続いて当該細胞で発生する遺伝子的な変化を意味する。したがって、“遺伝子導入された”又は“形質転換された”細胞は、例えば、外因性分子が導入された細胞又はその子孫細胞である。これら細胞は、増殖されてもよく、導入されたタンパク質が発現する又は核酸が転写される。
【００２４】
本発明において有用なポリヌクレオチドエンコーディング遺伝子産物（タンパク質）の非制限的な具体例としては、以下に限定されないが、例えば、嚢胞性線維性膜貫通調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、血液凝固因子の機能獲得を含む血液凝固（凝血）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、タンパク質Ｃ等）、抗体、網膜色素上皮固有の６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）、βグロビン、アルファグロビン、スペクトリン（ｓｐｅｃｔｒｉｎ）、αアンチトリプシン（α−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ：ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ  ｏｒ  ＡＴＰ７）、スルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）、ライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）に関係する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β２５グルコセレブロシダーゼ（β−２５  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、スフィンゴミエリナーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）、リソソームヘキソサミニダーゼ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、分枝鎖ケト酸脱水素酵素（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ｋｅｔｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ホルモン、成長因子（例えば、インシュリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子、神経栄養因子３及び４（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ−３，
４）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来の成長因子（ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、形質転換成長因子アルファ及びベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ
ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等）、サイトカイン（例えば、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、インターフェロンガンマ、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）等）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅ）、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ジフテリア毒素、シトクロムＰ−４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）、デオキシシチジンキナーゼ  （ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば、癌治療で使用される薬剤に対する耐性を付与するタンパク質）、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ-Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）、腺腫様多発結腸ポリープ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ
ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ  ：ＡＰＣ））、免疫調整特性を有するペプチド、免疫寛容原性若しくは免疫原性ペプチド又はタンパク質Ｔレギトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ［ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ  ２００８年１０月１５日；１１２（８）：３３０３］）若しくはｈＣＤＲ１［Ｓｈａｒａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６年６月６日；１０３（２３）：８８１０−５］、インシュリン、グルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、グアニル酸シクラーゼ
２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（Ｒａｂ  ｅｓｃｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（コロイデレミア：Ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｅｍｉａ）、ＬＣＡ  ５（ＬＣＡ−レベルシリン（Ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ））、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｋｅｔｏａｃｉｄ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（脳回転状萎縮症（Ｇｙｒａｔｅ  Ａｔｒｏｐｈｙ））、レチノスキシン１（Ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｎ１）（Ｘ連鎖性網膜分離症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｉｓ））、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性ＧＴＰアーゼ（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ＧＴＰａｓｅ：ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰのＡＲ型：網膜色素変性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ）２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３及び４（色盲）、ＰＫＤ−１又はＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎疾患）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、ライソゾーム蓄積症を引き起こす遺伝子欠乏（例えば、スルファターゼ（ｓｕｌｆａｔａｓｅｓ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１‐リン酸塩転移酵素（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、カプテシンＡ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ａ）、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２，スフィンゴ脂質活性化タンパク質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等）、ゲノム編集のための一の若しくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、又は、ゲノム編集のための修復テンプレートとして使用されるドナー配列を含む、又は、これらをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２５】
明細書に開示される非制限的な遺伝子及びタンパク質を含む、全ての哺乳動物及び非哺乳動物の形態のポリヌクレオチドエンコーディング遺伝子産物が、既知であれ未知であれ、明示的に含まれる。したがって、本発明は、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物及びヒトからの遺伝子及びタンパク質を含み、その遺伝子及びタンパク質は、以下に記載するヒトの遺伝子及びタンパク質と実質的に同様に機能する。非哺乳動物の遺伝子の非制限的な例としては、細菌由来であるＦｏｋヌクレアーゼドメイン（Ｆｏｋ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物のＦＩＸ配列の非制限的な例は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５年、前出；Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５年、前出；Ｊａｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、前出；Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ
ａｌ．、１９８２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：
６４６１−６４６４；Ｊａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１：２３２５−２３３５；Ａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４年、ＥＭＢＯ
Ｊ．３：１０５３−１０６０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、Ｇｅｎｅ  ８６：２７５−２７８；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１００９５（１９８９年）、Ｂｌｏｏｄ  ７４：２０７−２１２；Ｐｅｎｄｕｒｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６５：１７７−１８６；Ｓａｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９０年、６：１３３−１４３；及び、Ｋａｔａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．、１９７９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９９０−４９９４に記載されている。
【００２６】
上記文献に記されたポリヌクレオチド、ポリペプチド及びこれらの部分列は、改変された形態及び変異型を含む。本明細書で使用されている“改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）”又は“多様型（ｖａｒｉａｎｔ）”という言葉及びこれらの同意語は、ポチヌクレオチド、ポリペプチド又はこれらの部分配列が、標準配列から外れた配列であることを意味する。したがって、改変された及び多様型の配列は、標準配列とほぼ同じ、より多くの又は少ない活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）又は機能を有してもよいが、少なくとも部分的に当該標準配列の活性又は機能を有する。
【００２７】
また、本発明は、天然型又は非天然型の多様体を含む。このような多様体としては、機能獲得型及び機能喪失型の多様体を含む。例えば、タンパク質多様体又は変異体が活性を保持する野生種のヒトＦＩＸ  ＤＮＡ配列は、本発明の方法及び使用において、治療上有効である、又は、不変異体であるヒトＦＩＸと同等の若しくはそれを超える治療的活性を有する。具体的な例では、コラーゲンＩＶは、ＦＩＸを捉える役割を果たし、哺乳動物の筋肉組織に取り込まれると、ＦＩＸの一部は筋肉組織の間質腔に保持されるために、血液凝固に参加できなくなる。コラーゲンＩＶへの結合が低減されたタンパク質へと変わるようなＦＩＸ配列の変異（例えば、機能喪失）は、例えば、血友病の治療の場合に、発明の方法において有用な変異である。このような変異型ヒトＦＩＸ遺伝子の一例は、ヒトＦＩＸタンパク質を、成熟タンパク質の開始から５番目のアミノ酸の位置におけるリシンを、アミノ酸のアラニンへとコードする。
【００２８】
改変の非制限的な例としては、一の又は複数のアミノ酸置換（例えば、１−３、３−５、５−１０、１０−１５、１５−２０、２０−２５、２５−３０、３０−４０、４０−５０、又は、更なる残基（ｒｅｓｉｄｕｅｓ））、標準配列の付加（例えば、挿入又は１−３、３−５、５−１０、１０−１５、１５−２０、２０−２５、２５−３０、３０−４０、４０−５０若しくは更なる残基）及び削除（例えば、部分配列又はフラグメント）が含まれる。具体的な実施形態では、改変された配列又は多様型の配列は、改変されていない配列の機能又は活性を少なくとも部分的に保持する。このような改変形及び多様体は、例えば以下に記載するような標準配列の機能又は活性よりも少ない、同じ又は超える機能又は活性を有し得るが、少なくとも標準配列の機能又は活性を部分的に保持する。
【００２９】
多様体は、一の又は複数の非保存的又は保存的アミノ酸配列の差異若しくは改変、又は、その両方を有することができる。“保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”とは、生物学的に、化学的に又は構造的に同様な残基によって、一つのアミノ酸を置換することである。“生物学的に同様な”とは、置換によって生物学的活性が失われないことを意味する。“構造的に同様な”とは、アミノ酸が同様な長さの側鎖を有することを意味し、例えば、アラニン、グリシン及びセリン又は同様なサイズを有する。化学的に同様であるとは、残基が同じ電荷を有する、又は、共に親水性又は疎水性を有することを意味する。具体的な例としては、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような一の疎水性残基による置換、又は、リシンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、アスパラギンのグルタミンによる置換
のような一の極性残基による置換、又は、スレオニンのセリンによる置換等が含まれる。保存的置換の具体的な例としては、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような一の疎水性残基による置換、又は、リシンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、アスパラギンのグルタミンによる置換のような一の極性残基による置換等が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、典型的には、次に列挙するようなグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及び、フェニルアラニン、チロシン。“保存的置換”はまた、非置換型の親アミノ酸に代えて、置換型アミノ酸を使用することを含む。
【００３０】
このように、本発明は、一の又は複数の生物学的活性（例えば、血液凝固における機能等）を保持する遺伝子及びタンパク質多様体（例えば、以下に記載するようなポリヌクレオチドエンコーディングタンパク質の多様体）を含む。このようなタンパク質又はポリペプチドの多様体は、タンパク質又はポリペプチドが変更された又は付加された特性を有するようにＤＮＡ組み換え技術を使用して改変された又は改変されてもよいタンパク質又はポリペプチドを含み、例えば、血漿中における強化されたタンパク質安定性、又は、強化されたタンパク質活性を付与する多様体が含まれる。多様体は、天然型ポリヌクレオチド、タンパク質又はペプチドのような標準配列とは、異なっていてもよい。
【００３１】
ヌクレオチド配列レベルでは、天然型及び非天然型多様体遺伝子は、典型的には、標準配列と、少なくとも約５０％、より典型的には約７０％、更に典型的には約８０％一致（９０％又はそれを超える一致）する。アミノ酸配列レベルでは、天然型及び非天然型多様体タンパク質は、典型的には、標準タンパク質と、少なくとも約７０％、より典型的には約８０％、更に典型的には約９０％又はそれを超える一致率を有するが、非保存的領域では、大部分が一致しない領域であっても許容される（例えば、６０％、５０％又は４０％未満といった、７０％未満の一致率）。別の実施形態では、標準配列に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％又はそれを超える一致率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える一致率）を有する。ポリヌクレオチド、タンパク質又はポリペプチド内におけるヌクレオチド及びアミノ酸の変化の導入プロセスは、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９年）参照）。
【００３２】
“同一（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）”、“相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）”及びその同意語は、”整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）”配列の場合に、２つ又は２つを超える対象エンティティ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が同じであることを意味する。一例として、２つのポリペプチドが同一であるという場合、少なくとも標準領域又はタンパク質内において、同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチドが同一であるという場合、少なくとも標準領域又はタンパク質内において、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性が、配列の規定されたエリア（領域又はドメイン）を超えて存在してもよい。同一な“エリア（ａｒｅａ）”又は“領域（ｒｅｇｉｏｎ）”とは、同一の２つ又は２つを超える対象エンティティの一部分を指す。したがって、２つのタンパク質配列又は核酸配列が、一の又は複数の配列エリア又は領域に渡って一致する場合、これらの配列は、その領域内において同一性を有する。“整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）”配列とは、多くの場合、標準配列と比較して欠けている又は余分な塩基又はアミノ酸（ギャップ）の修正を含む複数のポリヌクレオチド又はタンパク質（アミノ酸）の配列を指す。
【００３３】
配列の全長にわたって一致する場合、又は、配列の一部分が一致する場合が存在する。特定の態様では、パーセント一致率を共有する配列の長さは、２、３、４、５つ又はそれを超える連続したポリヌクレオチド又はアミノ酸であり、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等の連続したアミノ酸
である。別の特定の態様において、一致する配列の長さは、２０又は２０を超える連続したポリヌクレオチド又はアミノ酸であり、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５等の連続したアミノ酸である。更なる別の特定の態様において、一致する配列の長さは、３５又は３５を超える連続したポリヌクレオチド又はアミノ酸であり、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０等の連続したアミノ酸である。更なる別の特定の態様において、一致する配列の長さは、５０又は５０を超える連続したポリヌクレオチド又はアミノ酸であり、例えば、５０−５５、５５−６０、６０−６５、６５−７０、７５−８０、８０−８５、８５−９０、９０−９５、９５−１００、１００−１１０等の連続したポリヌクレオチド又はアミノ酸である。
【００３４】
“相同である（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）”及び“相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）”という言葉は、２つ又は２つを超える対象エンティティが、所定の領域又は部分において少なくとも部分的に一致していることを意味する。相同である又は一致する“エリア、領域又はドメイン”とは、２つの又は２つを超える対象エンティティの一部が相同である又は同一であることを意味する。したがって、２つの配列が、一の又は複数の配列領域に渡って一致する場合、これらの配列は、その領域内において同一性を有する。“実質的な相同性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）”とは、標準分子の又は相同性を有する標準分子の関係する／対応する領域若しくは部分の、構造又は機能（例えば、生物学的機能又は活性）の一つ又は複数のうちの少なくとも部分的な構造又は機能を、分子が有する又は有すると予測されるように、当該分子が構造的又は機能的に保存されることを意味する。
【００３５】
２つの配列の間の一致（相同性）の範囲は、コンピュータプログラム及び数値計算アルゴリズムを使用して確かめることができる。このような配列パーセント一致率（相同性）を計算するアルゴリズムは、通常、比較領域又はエリアにおける配列ギャップ及び不一致を計算する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）探索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０年（ＮＣＢＩを通じて入手可能）を参照）は、例として、次のような検索パラメータを使用している：Ｍｉｓｍａｔｃｈ−２；ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ５；ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２。ポリペプチド配列を比較する場合には、典型的には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ  ２５０、ＢＬＯＳＵＭ  ６２又はＢＬＯＳＵＭ  ５０のようなスコアリング行列と組み合わせて使用する。一致の程度を定量化するのに、ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも使用されている（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ．１３２：１８５（２０００年）；及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１年））。ドロネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）ベースの位相マッピングを使用して、タンパク質構造類似性を定量化するプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３年））。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、例えば、異種ドメインである付加物及び挿入物を含む。付加物（例えば、異種ドメイン）は、任意の種類の分子の化合物に対する共有結合又は非共有結合であってもよい。通常、付加物及び挿入物（例えば、異種ドメイン）は、相補的な又は異なる機能又は活性を付与する。
【００３７】
付加物及び挿入物としては、標準天然（野生種）配列に通常存在しない一の又は複数の分子が配列に共有結合しているポリヌクレオチド配列又はタンパク質配列である、キメラ配列及び融合配列を含む。“融合（ｆｕｓｉｏｎ）”又は“キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）
”という言葉及びその同意語は、分子について使用される場合には、分子の部分又は一部が、当該分子とは区別される（異種の）異なるエンティティを含むことを意味しており、当該部分は通常自然な状態では一緒に存在することがない。すなわち、融合又はキメラの部分は、通常では共存しない部分を含む又は通常では共存しない部分によって構成され、構造的に区別される。
【００３８】
以下に記載するように、ポリヌクレオチド配列は、抑制性及びアンチセンス核酸配列を含む。抑制性、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＲＮＡｉ核酸は、標的遺伝子の発現を調節することができる。アンチセンスは、ＲＮＡ転写物又はＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を結合する一本鎖、二本鎖又は三本鎖ポリヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。標的遺伝子の転写開始部位、例えば、開始部位から−１０から＋１０の間の位置、から得られたオリゴヌクレオチドは、別の具体例である。三重鎖構造（ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ）のアンチセンスは、二本鎖構造のＤＮＡと結合して、遺伝子の転写を阻害することができる。“ＲＮＡｉ”は、遺伝子の発現を阻害するための一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ配列の利用である（例えば、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７（１９９８年）；及びＦｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６（１９９８年）参照）。したがって、本発明の方法及び利用において、標的遺伝子コード領域からの二本鎖ＲＮＡ配列を、遺伝子発現／転写を阻害する又は防ぐのに使用してもよい。アンチセンス及びＲＮＡｉは、核酸コード哺乳動物及びヒトＨＴＴのような標的遺伝子配列（例えば、ＨＴＴ）に基づいて生成可能である。例えば、一本鎖又は二本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ＨＴＴ転写（例えば、ｍＲＮＡ）を標的とすることができる。
【００３９】
本発明に係る阻害性核酸配列を使用して標的としてもよい遺伝子（例えば、ゲノムＤＮＡ）又は病原性遺伝子（ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の転写物の非制限的な例としては、これに限定されないが、次のようなものが挙げられる。ハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子のようなヌクレオチドリピート病と関連する病原性遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｓｙａｎ  ａｔｒｏｐｙ）（例えば、アトロフィン（ａｔｒｏｐｈｉｎ）１、ＡＴＮ１）；球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒト  アタキシン（Ａｔａｘｉｎ）−１、−２、−３及びー７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によりコードされたＣａv２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル、Ｔ
ＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８ＯＳとも称されるアタキシン８逆鎖、脊髄小脳失調症（１、２、３、６、７、８、１２、１７型）におけるセリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ  ５５  ｋＤａ調節サブユニットＢベータイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、脆弱Ｘ症候群  におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱Ｘ関連振戦（ｔｒｅｍｏｒ）／運動失調症におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（  脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー；筋強直性ジストロフィーにおける筋強直性プロテインキナーゼ（Ｍｙｏｔｏｎｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：ＭＴ−ＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン（Ｆｒａｔａｘｉｎ）、筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病因に関与する遺伝子；アポリポタンパクＢ（ＡＰＯＢ）及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）／ケキシン（ｋｅｘｉｎ）９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｏｌｏｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ  ＴＡＲ，ヒト免疫不全ウイルストランス活性化活性化因子応答エレメント遺伝子；ＨＩＶ感染症におけるＣＣケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）受容体（ＣＣＲ５）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染症におけるＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝臓固有のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）；ｐ５３の、急性腎障害又は腎臓移植
後臓器機能障害又は腎臓障害による急性腎不全；進行性、再発性又は転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、これは、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）サブユニットベータ型９（ＰＳＭＢ９）転移性黒色腫としても知られる；ＬＭＰ７、これは、プロテアソームサブユニットベータ型８（ＰＳＭＢ８）転移性黒色腫としても知られる；ＭＥＣＬ１、これは、プロテアソームサブユニットベータ型１０（ＰＳＭＢ  １０）転移性黒色腫としても知られる；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシンスピンドル（ｋｉｎｅｓｉｎ  ｓｐｉｎｄｌｅ）タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ−細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍ２：ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフーリン（Ｆｕｒｉｎ）；肝腫瘍におけるポロ様キナーゼ（ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ）１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）１（ＤＧＡＴ１），家族性大腸腺腫症におけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）や加齢黄斑変性におけるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１として知られるＤＡＮ損傷誘導性転写産物４タンパク質；加齢性黄斑変性症又は脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｉｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）における血管内皮増殖因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）；非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６ＡＮ１７Ｋ変異タンパク質；インフルエンザ感染症におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるコロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳ）感染症におけるＲＳウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症における単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）Ｂ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシン（ｔｏｒｓｉｎ）Ａ（ＴＯＲ１Ａ）、ｐａｎ−ｃｌａｓｓＩ及び移植において特定のＨＬＡ対立遺伝子のような遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子を狙ったサイレンシング）；又は、遺伝子常染色体優性遺伝網膜色素変性（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）。
【００４０】
本明細書において、例えば、組み換えＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターのようにＡＡＶの修飾語として使用されている、及び、ポリヌクレオチド並びにポリペプチドのような配列の修飾語として使用されている“組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）”という言葉は、通常自然に起きることのない態様で構成物が操作されている（すなわち、設計されている）ことを意味する。組み換えＡＡＶの具体的な一例としては、野生型ＡＡＶでは通常存在しないポリヌクレオチドが、ＡＡＶ粒子及び／又はゲノム内に存在する箇所が挙げられる。例えば、組み換えポリヌクレオチドの具体的な一例としては、遺伝子が通常、ＡＡＶゲノム内で関連付けられる５’、３’及び／又はイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）領域が存在する又はしないに関わらず、タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）がベクターにクローンされる箇所が挙げられられる。“組み換え”という言葉が、常に、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターのようなＡＡＶ、及び、ポリヌクレオチド並びにポリペプチドのような配列を参照して使用されるわけではないが、ＡＡＶ、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクター、及び、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む配列の組み換え形態についても、組み換えと記載されていなくとも明示的に含まれる。
【００４１】
本発明に係るポリヌクレオチド配列を、ベクターに挿入することができる。“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”という言葉は、ポリヌクレオチドの挿入又は組み込みによって操作可能なプラスミド、ウィルス（例えば、ＡＡＶ）又はその他のビークルを指す。このような
ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入／移送する、及び、挿入されたポリヌクレオチドを細胞に転写する又は翻訳する遺伝子操作（すなわち、“クローニングベクター”）のために使用される。ベクターは、通常、細胞内で増殖させるための少なくとも一つの複製開始点、及び、発現制御要素（例えば、プロモータ）を含む。ベクター内に存在する以下に記載するような発現制御要素を含めた制御要素は、適切な転写及び可能な場合には翻訳を行うべく含められる（例えば、イントロンのスプライス信号、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の維持、終止コドン等）。
【００４２】
本発明のＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターを含むベクターは、一の又は複数の“発現制御要素”を含むことができる。典型的には、発現制御要素は、操作可能に結合されたポリヌクレオチドの発現に影響を与えるプロモータ及びエンハンサ（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような核酸配列である。このような要素は、通常、シス（ｃｉｓ）型で作用するが、トランス（ｔｒａｎｓ）型で作用してもよい。
【００４３】
発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで有効とすることができる。典型的には、転写を調整する発現制御要素は、転写されたポリヌクレオチド末端である５’付近（すなわち“上流”）に並置される。発現制御要素はまた、転写された配列（すなわち、“下流”）の末端３’に又は転写物（例えば、イントロン内）内に位置させることができる。発現制御要素は、転写された配列から一定距離分、又は、長距離分、（例えば、ポリヌクレオチドから、１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、５０００〜１０、０００又はこれより多いヌクレオチド分）離れて位置させることができる。しかしながら、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターのポリヌクレオチドの長さの制限により、このような発現制御要素は、典型的には、ポリヌクレオチドから、１個から１０００個のヌクレオチドの範囲内に位置する。
【００４４】
発現制御要素（例えば、プロモータ）がポリヌクレオチドの転写を調整する、及び、可能な場合には、転写の翻訳を調整するといった態様で、操作可能に結合されるポリヌクレオチドの発現を要素により少なくとも部分的に制御可能である。発現制御要素の具体的な一例として、典型的には、転写される配列の５’に位置するプロモータが挙げられる。発現制御要素の別の例としては、エンハンサが挙げられ、これは、転写される配列の５’、３’に位置する又は転写される配列内に位置してもよい。
【００４５】
発現制御要素及びプロモータは、特定の組織又は特定の種類の細胞で活性を有する発現制御要素及びプロモータを含み、これらを以下では、“組織固有発現制御要素／プロモータ”と称する。組織固有の発現制御要素は、典型的には、特定の細胞又は組織内（例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、目、網膜又は肺）において活性を有する。発現制御要素は、特定の種類の細胞、組織又は臓器に固有の転写活性化タンパク質又はその他の転写制御因子によって認識されるので、通常は、このような細胞、組織又は臓器内で活性を有する。
【００４６】
また、発現制御要素として、偏在する又は無差別なプロモータ／エンハンサを含み、これらは、数多くの異なる細胞の種類における発現を駆動することができる。このような要素としては、これに限定されないが、サイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）の前初期プロモータ／エンハンサ配列、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータ／エンハンサ配列、及び、様々な哺乳動物の細胞の種類又は天然で存在しない合成要素において活性を有するその他のウィルスプロモータ／エンハンサが含まれる。
【００４７】
発現制御要素は、調整可能な態様で発現を付与することができ、すなわち、操作可能に結合されたポリヌクレオチドを増加させる又は減少させる信号又は刺激であってもよい。
信号又は刺激に応答して、操作可能に結合されたポリヌクレオチドの発現を増加させる調整可能要素は、“誘導性要素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）”（すなわち、信号によって誘導される）とも称される。具体的な例としては、これに限定されないが、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモータが含まれる。信号又は刺激に応答して、操作可能に結合されたポリヌクレオチドの発現を減少させる調整可能要素は、“抑制要素（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）”とも称される（すなわち、信号が除去される又は存在しない場合に発現が増加するような態様で、信号が発現を減少させる）。典型的には、このような要素によって増加する又は減少する量は、存在する信号又は刺激の量に比例し、信号又は刺激の量が大きくなると、発現の増加量及び減少量も大きくなる。
【００４８】
本明細書で使用されている“操作可能な結合（ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）”又は“操作可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）に結合されている”という言葉は、構成要素が意図された態様で機能可能となるように表記された構成要素の物理的又は機能的な並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を指す。ポリヌクレオチドとの操作可能な結合における発現制御の例では、制御要素が、核酸の発現を調整するような関係となっている。具体的には、例えば、操作可能に連結された２つのＤＮＡ配列とは、２つのＤＮＡが、２つのＤＮＡ配列のうちの少なくとも一方が、他方の配列に生理学的作用を及ぼすことができるような関係に配置されている（シス又はトランス）ことを意味する。
【００４９】
本発明のＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連ＡＡＶベクターを含むベクターは、一の又は複数の“発現制御要素”を含むことができる。以下に限定されないが、これらの要素としては、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、プロモータ／エンハンサ要素、転写終結信号、ポリヌクレオチド配列に隣接する５’又は３’未翻訳領域（例えば、ポリアデニル化配列）、又は、イントロンＩの全体又は一部が、含まれる。このような要素はまた、必要に応じて、転写終結信号を含む。転写終結信号の非制限的な具体例として、ＳＶ４０転写終結信号が挙げられる。
【００５０】
イントロン要素を含めることは、イントロン要素が存在しない場合と比較して、発現を強化させる場合がある（Ｋｕｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５年、前出）。ＡＡＶベクターは、通常、典型的には、約４ｋｂから約５．２ｋｂ又はこれよりわずかに大きい範囲の規定されたサイズを有するＤＮＡの挿入を受け付ける。したがって、これより短い配列の場合、ＡＡＶベクターが必要とする長さを達成するべく、挿入部分に更なる核酸を含める必要がある場合がある。イントロン及びイントロン断片（例えば、ＦＩＸのイントロンＩの部分）は、この条件を満たすと同時に、発現を強化する。したがって、本発明は、ＡＡＶベクターにイントロンＩ配列を含めることだけに限定されず、イントロンＩの部分に代えて、その他のイントロン又はその他のＤＮＡ配列を含む。したがって、核酸のその他の５’及び３’未翻訳領域を、ヒトＦＩＸについて挙げたものの代わりに使用することができ、特に、ヒトＦＩＸ以外のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが本発明のＡＡＶ−Ｒｈ７及び関連ＡＡＶベクターで使用される場合に、使用してもよい。
【００５１】
本明細書で使用されている“イントロンＩの一部”という言葉は、イントロンＩの一部が存在しない場合のＦＩＸ発現と比較して、プラスミド又はウィルスベクターテンプレートにおいて、１．５倍又は１．５倍を超えてＦＩＸの発現を強化する領域である、約０．１ｋｂから約１．７ｋｂの長さヌクレオチドを有するイントロンＩの領域を意味する。より具体的には、イントロンＩの１．３ｋｂの部分である。
【００５２】
改変された形態を含むポリヌクレオチド及びポリペプチドは、細胞発現又はインビトロ翻訳及び化学合成技術を介した様々な標準的な複製、組み換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動等により決定可能である。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）又はコンピュータベースのデータベーススクリーニング技術を使用して単離すること
ができる。このような技術は、以下に限定されないが、次のようなものが含まれる。（１）プローブを使用して同種のヌクレオチド配列を検出するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリを使用して共通の構造的特徴を有するポリヌクレオチドを検出する抗体スクリーニング；（３）対象の核酸配列のアニーリングを行うことが可能なプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＭＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連する配列の配列データベースのコンピュータによる検索；及び（５）サブトラクトされた核酸ライブラリの差異スクリーニング。
【００５３】
改変された形態を含むポリヌクレオチド及びポリペプチドは、例えば、自動合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ参照）のような当技術分野で周知の方法を使用した化学合成により生成することができる。化学的な方法（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５；Ｈｏｒｎ（１９８０年）；及びＢａｎｇａ、Ａ．Ｋ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５年）Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ参照）を使用して、ペプチド全体を又は部分的に合成することができる。ペプチドの合成は、様々な固相法（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２（１９９５年）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３（１９９７年）参照）を用いて行うことができ、また、製造者の指示に従って、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化合成を実現してもよい。
【００５４】
組成物の修飾語として使用される“単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）”という言葉は、組成物が人の手によって生成されている、又は、生体内環境で自然に発生するものとは、完全に又は部分的に別のものであることを意味する。一般的に、単離組成物は、自然の状態において、例えば、一の又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜に関連付けられている一の又は複数の材料を実質的に含まない。“単離”という言葉は、組成物の別の物理形態を除外するものではなく、例えば、融合／キメラ、マルチマー／オリゴマー、改変体（例えば、リン酸化、グルコシル化、脂質化）又は誘導体化された形態、又は、人の手によって生成された宿主細胞において発現した形態等を除外しない。
【００５５】
本発明によれば、治療学的方法及び使用を含む治療方法及び使用が提供される。本発明の方法及び使用は、例えば、遺伝子付加又は置換による、タンパク質をコードする遺伝子の導入、又は、遺伝子の発現又は機能を増大させる又は刺激することによる治療の影響を受けやすい疾患に広く適用可能である。本発明の方法及び使用はまた、例えば、遺伝子ノックアウト又は遺伝子発現の低減のような、遺伝子発現又は機能の低減又は削減による治療の影響を受けやすい疾患に広く適用可能である。
【００５６】
本発明に従って治療可能な疾患の非制限的な具体例としては、本明細書に記載されている疾患に加えて、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、血液凝固又は出血性疾患（例えば、インヒビターを伴う又は伴わない血友病Ａ又は血友病Ｂ）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）、血液疾患（例えば、貧血）、アツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、ライソゾーム蓄積症、銅又は鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病やメンケス病）リソソーム酸リパーゼ欠損症、神経学的又は神経変性疾患、癌、１型又は２型糖尿病、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害（例えば、グリコーゲン蓄積症）、網膜変性疾患（例えば、ＲＰＥ６５欠乏症、先天性脈絡膜欠如、及び、その他の眼の疾患）、及び、実質臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患が挙げられる。
【００５７】
したがって、一実施形態において、本発明の方法は、（ａ）欠乏している前記タンパク質発現又は機能を修正することができるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する段階であって、前記異種ポリヌクレオチドの配列は、当該異種ポリヌクレオチド配列の転写を付与する発現制御要素に操作可能に結合されている、前記ＡＡＶベクターを提供する段階と、（ｂ）前記ポリペプチドを前記哺乳動物内で発現させるべく、前記哺乳動物に前記ＡＡＶベクター所定量投与する段階と、を備える。特定の態様では、前記タンパク質の発現により、前記哺乳動物に治療効果をもたらす。
【００５８】
本発明の方法は、治療学的又は有益な効果をもたらす治療方法を含む。方法の様々な実施形態において、本発明の方法は更に、疾患によって又は疾患に関連して引き起こされる一の又は複数の有害な（例えば、物理的な）症状、障害、病気、疾患又は合併症を抑制する、低減させる又は減少させる段階を備え、例えば、血液凝固時間を短くする、補助凝固因子タンパク質の投与量を低減する段階を備える。
【００５９】
したがって、治療の治療学的又は有益な効果は、任意の客観的若しくは主観的測定可能な値である、又は、特定の対象に与えられる検出可能な改善若しくは利益である。治療的又は有益な効果とは、有害な症状、障害、疾患又は病気の合併症の全て又は特定のものを必ずしも完全に取り除くことを意味しないが、完全に取り除くことが可能な場合もある。したがって、満足できる臨床的終点とは、疾患によって又は疾患に関連して引き起こされる一の若しくは複数の有害な症状、障害、病気、疾患若しくは合併症における漸進的な改善若しくは部分的な減少が見られた時、又は、短期間に又は長期間にわたって（数時間、数日、数週間、数か月等）疾患によって又は疾患に関連して引き起こされる一の若しくは複数の有害な症状、障害、病気、疾患若しくは合併症における悪化又は進行が、阻害、低減、減少、抑制、防止、制限又は制御された時に、達成される。
【００６０】
本発明の組成物、方法及び使用は、それを必要とする対象に対して、十分な量又は有効量を投与することができる。“有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）”又は“十分な量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｏｕｎｔ）”とは、一回の投与又は複数回の投与において、単独、又は、一の又は複数のその他の組成物（薬物のような治療剤）、処置、プロトコル若しくは治療レジメン（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ）剤と組み合わせて、任意の期間（長期又は短期）検出可能な反応が得られる、又は、期待される若しくは所望の結果若しくは利益が対象物に測定可能な若しくは検出可能な期間（例えば、数分、数時間、数日、数か月、数年又は治癒）与えられる量を指す。
【００６１】
治療効果を得られるＡＶＶベクターの投与量、例えば、ベクターゲノム／体重１ｋｇあたり（ｖｇ／ｋｇ）の単位の投与量は、幾つかの因子に依存して変化するが、因子としては、以下に限定されないが：投与経路、治療効果を得るのに必要とされる異種ポリヌクレオチド発現のレベル、治療を行う疾患の種類、ＡＡＶベクターに対する宿主の免疫反応、異種ポリヌクレオチド又は発現産物（タンパク質）に対する宿主の免疫反応、及び、発現したタンパク質の安定性が挙げられる。当業者であれば、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するためのＡＡＶビリオン投与量を、上記の因子及びその他の因子に基づいて決定することができる。一般的に、治療効果を得られる投与量は、少なくとも、１×１０8
ベクターゲノム／対象物の体重の１ｋｇあたり（ｖｇ／ｋｇ）又はこれを超える範囲であり、例えば、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12、１×１０13、１×１０14又はこれを超える範囲である。
【００６２】
一例として血友病を取り上げると、一般的に、治療効果を得るべく、疾患の表現型が重症から中程度へと変化させるのには、血液凝固因子が、健康な人を基準として濃度が１％
を超える必要がある。表現型が重症であるとは、関節の損傷及び生命を脅かすような出血を特徴とする。表現型が中程度の疾患を軽度なものへと変えるには、血液凝固因子の濃度が、健康な人を基準として５％を超える必要がある。血友病に罹患している対象の治療に関して、典型的な投与量は、少なくとも、当該対象の体重１キログラム当たりのベクターゲノム（ｖｇ）を単位として１×１０10（ｖｇ／ｋｇ）である、又は、所望の治療効果を減るべく、約１×１０10から１×１０11ｖｇ／ｋｇの範囲で対象の体重分、又は、約１×１０11から１×１０12ｖｇ／ｋｇの範囲で対象の体重分、又は、約１×１０12から１×１０13ｖｇ／ｋｇの範囲で対象の体重分である。
【００６３】
治療（例えば、回復させる、又は、治療的利益を提供する又は改善を提供する）のための投与の“有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）”又は“十分な量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｏｕｎｔ）”とは、一般的に、疾患の有害な症状、結果又は合併症の一つ、複数若しくは全てに対する、又は、疾患によって引き起こされる若しくは疾患と関連する一の若しくは複数の有害な症状、病気、病態若しくは合併症に対する、測定可能な程度の反応を提供するのに有効な量であり、無論、疾患の進行又は悪化を低減する、減少させる、阻害する、抑制する、制限する又は制御できることが望ましい投与結果であると言える。
【００６４】
有効量又は十分な量は、一回の投与で提供されても良いが、必ずしもそうでなく、複数回の投与が必要な場合もあるし、また、単独で又は別の成分（例えば、作用物質）、処置、プロトコル又は治療レジメンと組み合わせて投与が行われても良い。例えば、治療すべき疾患の対象、種類、ステータス及び重症度又は（存在する場合）治療の副作用の必要性に比例させて、有効量を増加させても良い。加えて、第２の組成物（例えば、別の薬物又は作用物質）、処置、プロトコル又は治療レジメンが存在せずに一回の又は複数回の投与で与えられる場合には、有効量又は十分な量が必ずしも有効である又は十分でなくてもよく、これは、所定の対象において有効である及び十分であることを確かめるべく、上記の投与を超える追加的な投与、量若しくは期間、又は、更なる成分（例えば、薬物又は作用物質）、処置、プロトコル又は治療レジメンが含まれ得るからである。有効であると考えられる量としては更に、例えば、凝固障害（例えば、血友病Ａ又はＢ）の治療のための組換え凝固因子タンパク質の投与などの別の治療、治療レジメン又はプロトコルの使用の減少をもたらす量が含まれる。
【００６５】
有効量又は十分な量は、必ずしも、治療対象の全て及び各々において有効である必要なく、また、所定のグループ又は集団における治療対象の大半で有効である必要もない。有効量又は十分な量とは、グループ又は一般集団における有効性又は十分であることを意味するのではなく、特定の対象（患者）において有効又は十分であることを意味する。このような方法においては典型的であるが、所与の治療方法又は使用に対して、ある対象は大きな反応を示すが、別の対象は、反応が少ない又は全く反応を示さないといった場合がある。したがって、適切な量というのは、治療すべき状態、望まれる治療効果、及び、個々の対象（例えば、対象の生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）、性別、年齢等）に依存する。
【００６６】
“回復する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）”という言葉は、対象の疾患又はその症状、又は、根底にある細胞反応における検出可能な又は測定可能な改善を意味する。検出可能な又は測定可能な改善とは、疾患の発生、頻度、重症度、進行又若しくは期間、又は、疾患と関連する若しくは疾患によって引き起こされる合併症における主観的又は客観的減少、阻害、抑制、制限又は制御を含む、又は、疾患の症状若しくは根本的な原因若しくは結果における改善、又は、疾患の回復を含む。
【００６７】
したがって、成功した治療の結果は、疾患の発生、頻度、重症度、進行若しくは期間、
又は、対象における疾患の一の又は複数の有害な症状若しくは根本的な原因若しくは結果、を減少、低下、阻害、抑制、制限、制御又は予防するという“治療効果”又は“利益”につながり得る。上記で述べたように、疾患又は有害な症状の一の又は複数の根本的な原因に影響を与える治療方法及び使用は、有益であると考えられる。疾患又は疾患の有害な症状が安定することのように、悪化の減少又は低減も、治療成功の結果であると言える。
【００６８】
このように、治療的利益又は改善とは、必ずしも、疾患の完全な除去、又は、疾患に関連する有害な症状、合併症、結果又は根本的な原因の一つ、大半又は全てを除去することを必要としない。したがって、満足できる臨床的終点とは、対象の疾患における漸進的な改善、又は、短期間に又は長期間（数時間、数日、数週間、数か月等）にわたる、疾患の発生、頻度、重症度、進行若しくは期間の部分的な減少、低下、阻害、抑制、制限、制御若しくは予防若しくは反転（例えば、一の又は複数の症状又は合併症が安定すること）が見られた時である。潜在的な治療的利益又は疾患の改善をもたらす処置のような、方法又は使用の有効性は、様々な方法によって確かめることができる。
【００６９】
本発明の方法及び使用は、望ましい治療的有利な、付加的な、相乗的な又は相補的な活性又は効果を有する任意の化合物、作用物質、薬物、処置又はその他の治療レジメン又はプロトコルと組み合わせてもよい。組み合わせされる組成物及び処置の例として、生物製剤（タンパク質）、作用物質及び薬物のような、第２の活性物質が含まれる。このような生物製剤（タンパク質）、作用物質、薬物、処置及び療法は、その他の方法、又は、例えば、血液凝固疾患の対象を治療する治療的方法のような、本発明の使用の前に、実質的に同時に又は後に、投与することができる又は実行することができる。
【００７０】
化合物、作用物質、薬物、処置又はその他の治療レジメン若しくはプロトコルは、組み合わせ要素として投与されても良いし、別個に投与されてもよく、例えば、本発明のＡＡＶベクターと同時に又は連続して若しくは順次（前に又は後に）投与することができる。したがって、本発明は、本発明の方法及び使用が、本明細書に記載される又は当業者に周知の任意の化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、治療薬又は組成物と組み合わせられた組み合わせを提供する。化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、レムディ又は組成物は、本発明のＡＡＶベクターの投与の前に、実質的に同時に又は後に、対象に投与することができる。組み合わせの実施形態の非制限的な具体例としては、上記の又はその他の化合物、作用物質、薬物、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス、治療薬又は組成物を含む。
【００７１】
本発明の方法及び使用は、とりわけ、別の化合物、作用物質、薬剤、治療レジメン、治療プロトコル、プロセス又は治療薬の使用又は必要性を低減する結果となる方法及び使用を含む。例えば、血液凝固疾患の場合、本発明の方法又は使用は、所定の対象において欠乏している又は欠如している（異常又は変異）内因性凝固因子を補うべく行う組み換え凝固因子タンパク質の投与の回数を減らす又は投与量を減らす又は投与を行わなくて良くなるといった、治療的利点を有する。したがって、本発明によれば、別の治療又は療法の必要性又は使用を低減する方法及び使用が提供される。
【００７２】
“対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）”という言葉は、典型的には、ヒト、非ヒト霊長類（サル、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（イヌ及びネコ）、家畜（例えば、ニワトリやアヒル等の家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）などの哺乳動物を指し、更に、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を含む動物を指す。対象は、動物疾患モデルを含み、例えば、血液凝固疾患のマウス及びその他の動物モデル、及び、当業者に周知のその他の動物疾患モデルを含む。
【００７３】
本発明に係る治療に適した対象としては、機能性遺伝子産物（タンパク質）が欠損して
いる若しくは生産量が不十分である又はそのようなリスクを有する対象、又は、疾患につながり得る異常な、部分的に機能性を有する又は非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を生成する対象が含まれる。本発明に係る治療に適した対象としては、更に、疾患につながる異常な又は欠陥を有する（変異）遺伝子産物（タンパク質）を有する又は生成するリスクを有する対象が含まれ、このような異常な又は欠陥を有する（変異）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現又は機能を低減させることにより、当該疾患の治療につながる、又は、当該疾患の一の又は複数の症状を軽減し、疾患から回復させることができる。したがって、標的とする対象としては、疾患の種類、発病のタイミング又は程度、進行、重症度、頻度又は症状の種類若しくは期間に関わらず、上記のような欠陥を有する対象が含まれる。
【００７４】
本発明に係る治療に適した対象としては更に、ＡＡＶに対する抗体を有する又は生成するリスクがある対象が含まれる。幾つかの技術を用いて、ＡＡＶベクターを、このような対象に投与又は送達することができる。例えば、空のキャプシドＡＡＶ（すなわち、異種ポリヌクレオチドを有さないＡＡＶ）を送達して、ＡＡＶ抗体と結合させることにより、異種ポリヌクレオチドを有するＡＡＶベクターを、対象の細胞に形質変換させることが可能となる。投与すべき空のキャプシドＡＡＶの量は、特定の対象で生成されるＡＡＶ抗体の量に基づいて決定することができる。これに替えて又は加えて、ＡＡＶベクターを、直接筋肉内注射（例えば、筋肉の一の又は複数の遅筋繊維）によって送達することができる。別の形態としては、大腿動脈に導入したカテーテルを使用して、肝動脈を経由して肝臓へとＡＡＶベクターを送達することができる。非外科的手段を用いることもでき、例えば、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）を使用して、血流及びＡＡＶ抗体をバイパスして、直接肝臓にＡＡＶベクターを送達することができる。顎下腺の管のような他の管系もまた、既存の抗ＡＡＶ抗体を有する対象へのＡＡＶベクターの送達のためのポータルとして使用することができる。
【００７５】
“予防（Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）”という言葉及びその同意語は、対象への接触、投与又は生体内送達が、疾患より前に行われる方法を意味する。疾患によって又は疾患に関連して引き起こされる有害な症状、状態、合併症等が発症する前に、対象への投与又は生体内送達を行うことができる。例えば、本発明の方法及び使用を適用する候補としての対象を特定するのに、（例えば、遺伝子の）スクリーニングを行うことができるが、疾患が顕在していない対象も存在する。このような対象としては、疾患の症状が顕在化していなくとも、機能性遺伝子産物（タンパク質）の欠損又は不十分な量のスクリーニングで陽性を示した対象、疾患につながり得る異常な、部分的に機能性を有する又は非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を生成する対象、及び、疾患につながる異常な又は欠陥を有する（変異）遺伝子産物（タンパク質）のスクリーニングで陽性を示した対象が含まれる。
【００７６】
本発明の方法及び使用は、全身的に、局部的に若しくは局所的に又は任意の経路により送達及び投与することを含み、例えば、注射、点滴、経口（例えば、経口摂取又は吸入）により、又は、局所的に（例えば、経皮的に）送達及び投与することを含む。このような送達及び投与として、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、腔内、頭蓋内、経皮（局所）投与、及び、例えば、粘膜又は直腸を介した非経口投与、投与が含まれる。典型的な投与及び送達経路としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、筋肉内、腸管外、皮下、胸膜内、局所、真皮、皮内、経皮、非経口、例えば、経粘膜、頭蓋内、髄腔内、経口（消化）、粘膜、呼吸、鼻腔内、気管内挿管、肺内、肺内点滴、口腔、舌下、血管内、クモ膜下、体腔内、イオン導入、眼内、点眼、光学、腺内、臓器内、リンパ内が含まれる。
【００７７】
送達及び投与のための用量は、動物疾患モデルを使用して又は必要に応じてヒトの臨床試験において経験的に決定された現在存在するプロトコルに基づいてもよい。初期研究用
量は、以下に記載する、例えば、マウス又は犬である動物に対する研究に基づいてもよい。
【００７８】
処置が予防的措置であるか又は治療であるか、治療対象の疾患の種類、発症、進行、重症度、頻度、期間又は確率、望ましい臨床的終点、以前に又は同時に行われた治療、対象の全身の健康状態、年齢、性別、人種又は免疫能力、及び、当業者であれば理解できるその他の因子に、用量は依存する及び変化する。投与の量、回数、頻度又は期間は、あらゆる有害な副作用、合併症、又は、処置若しくは治療のその他のリスク因子及び対象の状態に応じて、比例的に増加させる又は減少させることができる。当業者であれば、治療的又は予防的利益を提供するのに十分な量を供給するのに必要となる用量及びタイミングに影響を与える因子を理解できる。
【００７９】
本明細書に開示する本発明の方法及び使用は、対象が治療対象の疾患を有すると特定されてから、対象が疾患の一の又は複数の症状を有してから、又は、対象が疾患の一の又は複数の症状を有さないが以下に記載するようにスクリーニングによって陽性であると判断されてから１−２、２−４、４−１２、１２−２４又は２４−７２時間以内に実行することができる。無論、本発明の方法及び使用は、対象が治療対象の疾患を有すると特定されてから、対象が疾患の一の又は複数の症状を有してから、又は、対象がスクリーニングによって陽性であると判断されてから１−７、７−１４、１４−２１、２１−４８日又は４８日を超えて、数か月又は数年後に実行することもできる。
【００８０】
ＡＡＶベクター及びその他の組成物、作用物質、薬物、生物製剤（タンパク質）を、例えば、薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤のような医薬組成物に組み込むことができる。このような医薬組成物は、とりわけ、生体内又は生体外で対象に投与及び送達するのに有用である。
【００８１】
本明細書で使用されている“薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ
ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）”及び“生理学的に許容される（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）”という言葉は、生体内送達又は接触において、一の又は複数の投与経路に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体又は固体又はこれらの組み合わせを意味する。このような製剤としては、医薬投与又は生体内接触若しくは送達に適した（水溶性又は非水溶性）溶媒、（水溶性又は非水溶性）溶液、エマルジョン（例えば、水中油又は油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、分散液、懸濁液、コーティング、等張及び吸収促進剤又は遅延剤が含まれる。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい。このような薬学的に許容されるキャリアとしては、（コーティング又は非コーティング）錠剤、（ハード又はソフト）カプセル、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶が含まれる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）も組成物に組み込むことができる。
【００８２】
以下に記載するように又は当業者に周知のように、医薬組成物は、投与又は送達の特定の経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、さまざまな経路による投与に適したキャリア、希釈剤又は賦形剤を含む。
【００８３】
非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性溶液、懸濁液又は活性化合物のエマルジョンを含み、これらの調剤は、通常無菌であり、意図されたレシピエントの血液と等張とすることができる。非限定的な具体的な例としては、水、生理食塩水、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。
【００８４】
経粘膜投与又は経皮投与（例えば、局所接触）のために、浸透剤を、医薬組成物中に含めることができる。浸透剤は、当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面
活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が含まれる。経皮投与の場合、活性成分は、当技術分野において一般に知られているようなエアロゾル、スプレー、軟膏、膏薬、ゲル又はクリームとして処方することができる。皮膚との接触のために、医薬組成物としては、典型的には、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又は油を含む。使用することができるキャリアとしては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮促進剤、及び、これらの組合せが挙げられる。
【００８５】
共溶媒（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ）及びアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を、製剤に加えてもよい。共溶媒の非制限的な例は、ヒドロキシル基又は他の極性基を含有し、イソプロピルアルコールなどのアルコール類；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール類；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含有する。アジュバントとしては、例えば、大豆レシチン、オレイン酸などの界面活性剤；トリオレイン酸ソルビタンなどのソルビタンエステル；及びポリビニルピロリドンが含まれる。
【００８６】
本発明の組成物及び方法に適した医薬製剤及び送達システムは、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３年）２０th  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）１８th  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６年）１２th  ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３年）、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｌｏｓａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１年）１１th
ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０年）、Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．２５３−３１５を参照）。
【００８７】
本明細書で使用される“単位投与形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）”という言葉は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に分離される単位を指す。各単位は、必要に応じて医薬キャリア（賦形剤、希釈剤、ビークル又は充填剤）も含めて、一回又は複数回の服用で投与した場合、（例えば、予防効果又は治療効果）所望の効果を生じるように計算された所定量を含む。単位投与形態は、液体組成物又は凍結乾燥又は凍結乾燥状態の組成物を含んでもよいアンプル及びバイアルに封入されてもよく、生体内への投与又は送達の前に、例えば、滅菌液体キャリアを添加することができる。単位投与形態をそれぞれ、複数用量キット又は容器に収容することができる。医薬製剤を、投与を容易にするために及び投与量の均一性のために、単一又は単位投与形態にパッケージ化することができる。
【００８８】
本発明は、一の又は複数のコンポーネント及び当該コンポーネントが封入されるパッケージ材を含むキットを提供する。キットは、典型的には、コンポーネントを、インビトロ、生体内又は生体外で使用するための使用説明書又はコンポーネントの説明書を含むラベル又はパッケージ挿入物を含む。キットは、コンポーネントの集合体を収容してもよく、例えば、ＡＡＶベクター、及び、その他の化合物、作用物質、薬物又は組成物のような第２の活性物質を必要に応じて第含めることができる。
【００８９】
“パッケージ材（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）”とは、キットのコンポー
ネントを収容する物理的構造を指す。パッケージ材は、成分を無菌状態で維持することができ、一般的にそのような目的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。
【００９０】
ラベル又は挿入物には、一の又は複数のコンポーネントを識別する情報を含めることができ、例えば、ドーズ量、作用メカニズムを含む有効成分の臨床薬理学、薬物動態及び薬力学の情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、製造業者、ロット番号、製造場所及び日付、有効期限を特定する情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、製造業者情報、ロット番号、製造場所及び日付を特定する情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、キットのコンポーネントを使用することができる疾患に関する情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、方法、使用又は治療プロトコル若しくは治療レジメンにおけるキットのコンポーネントの一つ又は複数を使用する臨床医又は対象のための使用説明書を含めることができる。使用説明書には、投与量、頻度又は期間、及び本明細書に記載の方法、使用、治療プロトコル又は予防的レジメン若しくは治療レジメンのいずれかを実施する際の指示を含めることができる。
【００９１】
ラベル又は挿入物には、コンポーネントが、提供し得ることが何らかの利益についての情報、例えば、予防的利益又は治療的利益についての情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、可能性のある副作用、合併症や反応に関する情報を含めることができ、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関して、対象又は臨床医に警告する情報を含めることができる。対象が、当該組成物と適合しない可能性がある一の又は複数の他の薬を服用している、服用する予定がある又は有している、又は、対象が、現在、当該組成物と適合しない別の治療プロトコル又は治療レジメンを受けている、受ける予定がある又は有している場合に、有害な副作用や合併症が発生することがあるため、説明書には、このような不適合性に関する情報を含めることができる。
【００９２】
ラベル又は挿入物としては、コンポーネント、キット又はパッケージ材（例えば、箱）とは別に又は貼り付けられた、又は、キットのコンポーネントを収容するアンプル、管若しくはバイアルに取り付けらえた、例えば、紙やボール紙である“印刷物”が含まれ得る。ラベル又は挿入物としては更に、バーコード印刷されたラベル、ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ又はＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤのような光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ又は電気記憶媒体のようなコンピュータ可読媒体が含まれてもよく、電気記憶媒体としては、ＲＡＭ及びＲＯＭ又はこれらのような混合が存在し、例えば、磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体又はメモリタイプのカードが挙げられる。
【００９３】
そうでないとの定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様な又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料について、以下に記載する。
【００９４】
本明細書で引用した全ての出願、刊行物、特許及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、その全体が援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
【００９５】
本明細書に開示された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。明細書に開示された各特徴は、同一、等価又は類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。別段の記載がない限り、開示された特徴（例えば、化合物の構造）は、等価又は類似の特徴からなる属の一例である。
【００９６】
本明細書で使用されている単数形であることを示す“一の（ａ）”、“及び（ａｎｄ）
”、“その（ｔｈｅ）”との言葉は、そうでないと明示されない限り、複数のものも含む。したがって、例えば、“一のポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”との言及は、複数の遺伝子のように、複数の同様なポリヌクレオチドも含む。
【００９７】
本明細書で、文脈がそうでないと明示していない限り、全ての数値又は数値範囲がこのような範囲の整数値及び範囲内の値又は整数値の分数部分を含む。例として、少なくとも９０％の一致率という場合、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％等、及びに、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％等、及び、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％等を含む。
【００９８】
ある数字に対してこれよりも多い（大きい）又は少ないとの言及は、言及された数よりも大きい又は小さい任意の数を含む。したがって、例えば、１０００よりも小さいとの言及は、９９９、９９８、９９７、…、１までの数字、１００よりも小さいとの言及は、９９、９８、９７、…、１までの数字を含む。
【００９９】
本明細書で、文脈がそうでないと明示していない限り、全ての数値又は数値範囲が、このような値の分数部分、及び、このような範囲内の整数値、並びに、このような範囲内の整数値の分数部分を含む。例として、９０−１００％のパーセンテージ範囲のという数値範囲と言う場合、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％等、及び、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％等、及び、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％等を含む。１−５０の範囲と言う場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、及び、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等が含まれる。
【０１００】
一連の範囲と言う場合、連続した異なる複数の範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。例として、２−７２時間、２−４８時間、４−２４時間、４−１８時間及び６−１２時間の一連の範囲と言う場合、２−６時間、２−１２時間、２−１８時間、２−２４時間等、及び、４−２７時間、４−４８時間、４−６時間等が含まれる。
【０１０１】
本発明は、多くの実施形態及び態様を記述するために断定的な言語を使用して、本明細書に開示されている。本発明はまた、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコル、手順などの特定の主題が完全に又は部分的に除外される実施形態を含む。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様において、材料及び／又は方法の段階が除外される。したがって、本発明が、本発明が含まないものとしての観点で明示的に表現されていないが、本発明に明示的に含まれないものの態様は、開示されている。
【０１０２】
本発明の幾つかの実施形態が記載された。当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適合させるべく、本発明に様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、以下に記載する実施例は、本発明を例示するものであって、特許請求される本発明の範囲を制限するものではない。
［実施例］
実施例１
以下の実施例は、様々な材料及び方法の説明を含む。
【０１０３】
マウス：オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウス８〜１０週齢で、実験群当たりｎ＝５。犬は、ノースカロライナ州チャペルヒル大学のＦＩＸ遺伝子におけるミスセンス変異を有するコロニーのからのＨＢ犬である（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：１００９５（１９８９年））。
【０１０４】
ＡＡＶベクター構築：マウスを使用した生体内の研究では、ＡｐｏＥ−ｈＡＡＴ肝臓固有プロモーターの制御下にヒトＦＩＸを発現する構築物を用いて行った。犬についても、ほぼ同一のプロモータ及びイヌＦＩＸ導入遺伝子を使用して行った。
【０１０５】
遺伝子導入方法：全てのベクターは、静脈内に送達された。マウスでは尾静脈を介して送達した（マウス一匹当たり２００マイクロリットルの量を投与し、ベクターはＰＢＳ中に希釈した）。犬では、ベクターを伏在静脈を介して送達した。
【０１０６】
ＦＩＸ発現判断：ＦＩＸレベルを測定すのに、ＥＬＩＳＡを使用した。マウスでは、ヒトＦＩＸ  ＥＬＩＳＡ抗体対（補足抗体及び二次抗体）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからのものである。犬においても、Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１３１８（２０１０年））に記載されるように、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの抗体対が使用された。
【０１０７】
統計解析：標本が対になっていない、両側ｔ検定について、統計解析を行った。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
【０１０８】
ＡＡＶ抗体測定：抗体測定には、Ｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２：３４２（２００６年））及びＭｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３：４１９（２００７年））に記載されたインビトロでの中和測定を使用した。簡単に説明すると、２つのＡＡＶベクター構築物が測定で使用され、ＣＭＶプロモーター（ｓｓＡＡＶ−ＬａｃＺ）による制御の下でベータ−ガラクトシダーゼ発現する一本鎖ベクター、又は、チキンβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡ）による制御の下でウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）レポーター遺伝子を発現する自己相補ベクター、ＡＡＶ−Ｒｈ７４−ＣＢＡ−Ｒｅｎｉｌｌａが使用された。インビトロでのＡＡＶベクターの形質導入の効率を高めるために、２Ｖ６．１１細胞（ＡＴＣＣ）を使用し、誘導性プロモーターの制御下にアデノウイルス遺伝子Ｅ４を発現させた。１ウェルあたり１．２５ｘ１０4細胞の濃度で、細胞
を９６ウェルプレートに播種し、１：１０００希釈のポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加して、Ｅ４発現を引き起こした。測定の日に、熱不活性化テスト血清の３．２倍希釈列（ｓｅｒｉａｌ  ｈａｌｆ−ｌｏｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）を、ウイルスを含む培地と混合した。ｓｓＡＡＶ−ＬａｃＺベクターに対しては、測定で使用されたウイルス濃度は、ＡＡＶ２の場合には約１ｘ１０10ｖｇ／ｍｌ、及び、ＡＡＶ５，６又は８の場合には約５．５ｘ１０10ｖｇ／ｍｌであった。ｓｃＡＡＶ−Ｌｕｃベクターの場合、測定におけるウイルス濃度は、約５０から約１５０倍低かった。レポーター導入遺伝子の残存活性は、比色分析法（ｓｓＡＡＶ−ＬａｃＺ）又はルミノメータ（ｓｃＡＡＶ−Ｌｕｃ）を使用して測定された。
【０１０９】
抗ＡＡＶキャプシド全ＩｇＧ又はＩｇサブクラスは、捕獲アッセイ（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＡＡＶの空のキャプシドの５×１０10キャプシド粒子／ｍｌで被覆した。プレートを、室温で２時間、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でブロックして、試料の連続希釈液をウェルに充填し、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン結合抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４抗体又はＩｇＭ抗体（Ｓｉｇｍａ）を抗体の検出に使用し、ストレプトアビジン−ＨＲＰは、基質の検出のために添加した。Ｉｇの濃度は、精製ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ抗体（Ｓｉｇｍａ）での段階希釈で作成した標準曲線に対して判定された。
【０１１０】
ＡＡＶ生成：ベクター産生のためのプロセスはＡｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７：５０３（２０１０年））に詳細に記載されている。
実施例２
本例は、ヒトＦＩＸ遺伝子導入動物（マウス）の研究及び遺伝子導入の後のＦＩＸ発現の説明が含まれている。
【０１１１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１グループ当たりｎ＝５）に、肝臓特異的プロモーターの制御下で（１マウスあたり２．５10ベクターゲノムの）第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子を有するＡＡＶベクターを尾静脈から注入した。マウスにおけるヒトＦＩＸの導入遺伝子産物（タンパク質）の血漿中濃度は、遺伝子導入後、第１週、第２週及び第４週目にＥＬＩＳＡによって測定され、その結果が図１に示されている。ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、動物における最高レベルの導入遺伝子発現を示した。
実施例３
本例には、血友病の犬における治療レベルのＦＩＸの効果的なＡＡＶ−Ｒｈ７４の調整による送達を実証する動物実験及びデータの記述が含まれる。
【０１１２】
概略的には、血友病Ｂの犬に、伏在静脈を介して、体重１ｋｇ当たり３×１０12ベクターゲノムを静脈内注入（ＩＶ）した。治療的ＦＩＸ導入遺伝子の発現は、肝臓固有のプロモータによって活性化された。ベクターのレベル及びＦＩＸレベルは、ＥＬＩＳＡによってモニタされた。イヌＦＩＸの血漿中濃度が、図２に示されている。ＡＡＶ−Ｒｈ７４及びＡＡＶ８は血友病Ｂのイヌにおいて同等に効果を発揮し、共にＡＡＶ６よりも優れていた。
実施例４
本例は、ヒトにおける抗ＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）の存在を示す研究の説明を含む。
【０１１３】
表１のデータは、インビトロ測定でヒトで測定された抗ＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）を示す。１：１のＮＡｂ力価を有する対象を、実験に使用されていない又は抗ＡＡＶ抗体の力価が低いと定義され、そのＡＡＶ血清型（灰色で強調されている部分）の遺伝子導入の対象であるとする。ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、ＡＡＶ  −２及びＡＡＶ−８と比較して、抗ＡＡＶのＮａｂの最も低い有病率を示した。
【表１】
2018121655.tif 000002
実施例５
本例では、ＡＡＶ−Ｒｈ７４を含む様々なＡＡＶ血清型の生成量を示すデータの説明が含まれる。
【０１１４】
表２のデータは、様々なＡＡＶ血清型の生成量が示されている。報告されているデータには、ローラボトルにおけるウイルスバッチサイズ、合計ベクター生成量、及び、ボトル一本あたりの生成量（ｙｉｅｌｄ）が示されている。全ての血清型を同じ発現カセットでパッケージ化した。ＡＡＶ−Ｒｈ７４は、評価を行った他の血清型、すなわちＡＡＶ−８、ＡＡＶ−ｄｊ及びＡＡＶ−２に匹敵する又は超える生成量を有する。
【表２】
2018121655.tif 000003
実施例６
この例では、肝臓特異的プロモーターの制御下で、ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を発現するＡＡＶｒｈ７４ベクターをアカゲザルに投与し、同じ量のＡＡＶ８ベクター投与した場合よりも高いレベルでの、動物におけるＦＩＸの生産量につながったことを示すデータの詳細が含まれる。
【０１１５】
簡単に説明すると、動物には、ＡＡＶ８又はＡＡＶｒｈ７４が、体重１ｋｇあたり、２×１０12ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与された。ベクターは、生理食塩水中又はベクターと空のＡＡＶキャプシド（ＥＣと表記される）の混合物中で製剤化された。
【０１１６】
図４は、アカゲザル血漿中のヒトＦＩＸを検出ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＦＩＸの平均（ａｖｅｒａｇｅ）（２〜８週）及び標準誤差又は算術平均（ｍｅａｎ）のヒストグラムプロットである。ＡＡＶｒｈ７４−ＦＩＸベクターを受けた動物は、右の余白に向かって最後の二つのバーに表示されている。データは、ＡＡＶｒｈ７４ベクターを受けた動物（右余白に向かって最後の二つのバー）は、同じ用量で注射した動物の他のグループ（黒と灰色のバー）と比較してより高いレベルでＦＩＸ導入遺伝子を発現したことを示している。平均レベルは、標本が対になっていない、両側スチューデントｔ検定を用いて比較した。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
【図１】
2018121655.tif 000004
【図２】
2018121655.tif 000005
【図３】
2018121655.tif 000006
【図４】
2018121655.tif 000007
【配列表】
2018121655000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月13日(2018.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に又は哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する又は導入する方法であって、異種ポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に投与して、前記異種ポリヌクレオチド配列を前記哺乳動物に又は前記哺乳動物の細胞に送達する又は導入する段階を備える、方法。
【外国語明細書】
2018121655000001.pdf