(57)【要約】      （修正有）【課題】擬陽性を抑制することにより正確性を高めたデジタルＰＣＲの方法の提供。【解決手段】ヘリカーゼを含有したＰＣＲミックスデタルＰＣ用に０．１〜５００ｎＬに分注され、ヘリカーゼ濃度が、１０ｎＭ以下である、ＰＣＲキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０５〜５００ｎＬに分注された、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
【請求項２】
デジタルＰＣＲ用である、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
【請求項３】
デジタルＰＣＲ用である、０．１〜５００ｎＬに分注された、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
【請求項４】
ヘリカーゼがＴＫ０５６６及びＴＫ０１７８並びにこれらの改変体よりなる群より選択される、少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載のＰＣＲミックス。
【請求項５】
ヘリカーゼ濃度が１００ｎＭ以下である、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＣＲミックス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを備える、又は、請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを調製するための、ＰＣＲキット。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを用いて、ＰＣＲにより核酸を増幅する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリカーゼを用いたＰＣＲに関する。
【背景技術】
【０００２】
デジタルＰＣＲは、各サンプル中の核酸の初期量を測定する際に、増幅サイクル数に依存することなく絶対定量やレアな対立遺伝子の検出を行うことができる手法として、近年注目を集めており、例えば、遺伝子検査、特に、ＣＮＶ（コピー数多型）解析、Ｒａｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出、遺伝子発現解析などのアプリケーションに有用であると考えられている。デジタルＰＣＲ関連の研究開発も精力的に進められている（例えば特許文献１〜３）。
【０００３】
デジタルＰＣＲでは、例えば、核酸サンプル（例えば、ＤＮＡやｃＤＮＡ等のターゲット核酸を含むサンプル）を必要に応じて希釈したうえで多数のウェルに分配し、個々のウェルで（同時並行に）ＰＣＲを行う。このとき、１つあるいは複数のターゲット分子を含むウェルもあれば、ターゲット分子を全く含まないウェルも存在する。ＰＣＲ終了後にウェル毎にＰＣＲ増幅の有無を解析し、増幅があったウェルはターゲット分子が入っていたポジティブ反応として、増幅がなかったウェルはターゲットを含まないネガティブ反応として数をカウントする。このようにして、ＰＣＲ後に各ウェルのシグナルの有無を検出することで、ポジティブ反応及び／又はネガティブ反応の割合を基に、サンプル中のターゲット分子の絶対定量が可能となる。スタンダードやコントロールサンプルとの比較は必要ない。なお、サンプル中のターゲット分子はランダムに分配されるため、ポジティブ反応とされたウェルに、１分子のみ分配されたという確証はない。そこで、ターゲット核酸が複数分配された可能性のあるウェルを算出するため、統計学的処理（例えばポアソンモデルを用いた処理）により、補正係数を適用し、ターゲット核酸の絶対数を算出することができる。
【０００４】
このように、デジタルＰＣＲでは、ウェルにおいて核酸増幅が起こるか起こらないかでターゲット核酸の絶対定量を行う技術であるため、擬陽性（すなわちターゲット核酸を含まないウェルで増幅（例えば非特異的増幅）が見られること）が存在すると、その正確性が大きく損なわれるおそれがある。特に、反応液の容量が大きい（例えば１μＬ以上）場合には、反応液を電気泳動にかけて増幅産物のバンドを解析することにより、そのバンドが特異的増幅産物であるか非特異的増幅産物であるかを判断できるが、デジタルＰＣＲのように反応液の容量が小さい（例えば１μＬ未満）場合には、そのような解析ができないため、特に高い正確性及び反応効率が要求される。従って、デジタルＰＣＲのような反応液容量が小さいＰＣＲにおいて、出来る限り正確性を高めるために擬陽性を抑制することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３３１７８号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１１３８８９号
【特許文献３】国際公開第２０１４／０４３５８１号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０１３６２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、デジタルＰＣＲの正確性を高めること、特にデジタルＰＣＲにおける擬陽性を抑制すること、を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヘリカーゼをＰＣＲ反応液に含ませることにより、極微量（例えばナノリットルオーダー又はそれ以下）のＰＣＲ反応液を用いたＰＣＲにおいて擬陽性を抑制できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
０．０５〜５００ｎＬに分注された、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
項２．
デジタルＰＣＲ用である、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
項３．
デジタルＰＣＲ用である、０．１〜５００ｎＬに分注された、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス。
項４．
ヘリカーゼがＴＫ０５６６及びＴＫ０１７８並びにこれらの改変体よりなる群より選択される、少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載のＰＣＲミックス。
項５．
ヘリカーゼ濃度が１００ｎＭ以下である、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＣＲミックス。
項６．
請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを備える、又は、請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを調製するための、ＰＣＲキット。
項７．
請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを用いて、ＰＣＲ（好ましくはデジタルＰＣＲ）により核酸を増幅する方法。（好ましくは、請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲミックスを用いて、アニーリング温度が５５〜６３℃であるＰＣＲにより核酸を増幅する方法。）
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、特に極微量（例えばナノリットルオーダー又はそれ以下）のＰＣＲ反応液を用いたＰＣＲにおいても、擬陽性を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で用いたプローブ（ＰＣＲプライマー）の配列を示す。下線部がＧであるプローブには蛍光色素ＶＩＣが、Ａであるプローブには蛍光色素ＦＡＭが結合している。
【図２】実施例において、アニーリング温度を５６℃でデジタルＰＣＲを行ったときの、各ウェルの蛍光の分布を示す。
【図３】実施例において、アニーリング温度を６０℃でデジタルＰＣＲを行ったときの、各ウェルの蛍光の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、極微量に分注された、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスを包含する。当該ＰＣＲミックスは、０．０５〜５００ｎＬに分注されていることが好ましく、０．１〜１００ｎＬに分注されていることがより好ましく、０．５〜５０ｎＬに分注されていることがより好ましい。
【００１３】
また、ＰＣＲミックスとは、ターゲット核酸が増幅するＰＣＲ反応に必要な成分が少なくとも１種含まれる溶液（特に水溶液）をいう。ＰＣＲミックスは、ＰＣＲ反応液（ターゲット核酸が増幅するＰＣＲ反応に必要な成分が全て含まれており、適切に温度を変化させればＰＣＲを行うことができる）又はＰＣＲ反応液調製途中液（温度を変化させてもＰＣＲは起こらないが、ＰＣＲ反応に必要な成分が１種以上含まれている）を包含する。ＰＣＲに必要な成分とは、その成分が欠けるとターゲット核酸が増幅するＰＣＲが起こらない成分をいい、ポリメラーゼ（特にＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、オリゴヌクレオチド（プライマー）、ターゲット核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が挙げられる。これらの成分の含有量は、適宜設定することができる。特に制限されるわけではないが、例えば、プライマー濃度はミックス内の濃度が０．０５〜０．５μＭ程度が好ましく、０．１〜０．４μＭ程度がより好ましく、０．１〜０．３μＭ程度がさらに好ましい。
【００１４】
なお、本発明のＰＣＲミックスはヘリカーゼを含む（すなわち、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスである）。また、ターゲット核酸は、いわゆるテンプレートとして働く核酸であればよく、増幅対象核酸を有する核酸が好ましい。また、核酸の中でも、ＤＮＡであることが好ましい。
【００１５】
ＰＣＲミックスが含有するヘリカーゼとしては、公知のヘリカーゼを用いることができ、例えば、高熱性アーキア由来ＤＥＡＤ−ｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼ及びその改変体を用いることができる。より具体的には例えば、国際公開第２０１６／０１３６２０号に記載の高熱性アーキア由来ＤＥＡＤ−ｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼ及びその改変体を用いることができる。
【００１６】
また、ＴＫ０５６６及びＴＫ０１７８並びにこれらの改変体を特に好適に用いることができる。ＴＫ０５６６及びＴＫ０１７８は、いずれもサーモコッカス属に属する好熱菌サーモコッカス・コダカレンシス由来のへリカーゼである。ＴＫ０５６６のアミノ酸配列を配列１に、ＴＫ０１７８のアミノ酸配列を配列２に、それぞれ示す。ここでの改変体とは、アミノ酸配列は同一ではないが、同一性が高く、且つヘリカーゼ活性を有するものをいう。ＴＫ０５６６の改変体は、ＴＫ０５６６のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼである。ＴＫ０１７８の改変体は、ＴＫ０１７８のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼである。ここで、「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加」における「１又は２以上」とは、好ましくは１〜３０（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、よりさらに好ましくは１〜５、特に好ましくは１、２又は３をいう。ＴＫ０５６６の改変体のアミノ酸配列は、ＴＫ０５６６のアミノ酸配列と、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。ＴＫ０１７８の改変体のアミノ酸配列は、ＴＫ０１７８のアミノ酸配列と、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
【００１７】
なお、本明細書において、ヘリカーゼ活性を有するとは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて二本鎖核酸のらせんを不安定にし、二本鎖核酸を一本鎖核酸に巻き戻す活性を示すことをいう。二本鎖核酸の巻き戻し活性、及びＡＴＰ加水分解活性は、国際公開第２０１６／０１３６２０号に記載の手法により測定できる。
【００１８】
ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスにおけるヘリカーゼの含有割合（濃度）は、適宜設定することができ、通常１００ｎＭ以下であり、例えば１〜１００ｎＭが好ましく、５〜７５ｎＭがより好ましく、１０〜５０ｎＭがさらに好ましい。ヘリカーゼ種類及びその含有割合（濃度）により、ＰＣＲにおける擬陽性の抑制効率が変動し得るため、ヘリカーゼ種類及びその含有割合（濃度）を調整することが重要となる場合がある。特に、ヘリカーゼとしてＴＫ０５６６又はその改変体を用いる場合は、１０〜３０ｎＭが好ましい。また特に、ヘリカーゼとしてＴＫ０１７８又はその改変体を用いる場合は、１５〜４５ｎＭが好ましい。
【００１９】
上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス（特にＰＣＲ反応液）は、デジタルＰＣＲ用として特に好ましく用いることができる。また、その他、極微量のＰＣＲミックスを用いてＰＣＲを行う必要がある場合に、そのＰＣＲ用として好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明は、上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス（特にＰＣＲ反応液）を用いてＰＣＲを行い、核酸を増幅する方法も包含する。ＰＣＲの温度サイクル（変性、アニーリング、及び伸張反応の各温度）やサイクル数など、反応条件は適宜設定することができる。例えば、変性を９０〜９７℃で１０〜５０秒、アニーリングを５０〜６５℃で１〜５分、伸張反応温度を６５〜７５℃で１〜５分、程度の条件で行うことができる。また、サイクル数としては、例えば、３５〜４５サイクル程度を挙げることができる。
【００２１】
ＰＣＲにおける擬陽性を抑制するためには、各種条件のなかでもアニーリング温度の調整が重要である。アニーリング温度は、用いるプライマーにもよるが、特に５５〜６３℃（５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は６３℃）程度であることが好ましい。
【００２２】
本発明は、（ｉ）上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスを備えるＰＣＲキット、又は、（ｉｉ）上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスを調製するためのＰＣＲキット、をも包含する。（ｉ）のキットは、ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス（ＰＣＲ反応液でもＰＣＲ反応液調整途中液でもよい）を備えており、その他にＰＣＲに必要又は便利な器具及び／又は試薬等が備えられる。（ｉ）のキットに備えられる器具や試薬としては、ＰＣＲチューブ、ＰＣＲ用マイクロチップ、ヘリカーゼ（特にＴＫ０５６６又はＴＫ０１７８、あるいはそれらの改変体）、ポリメラーゼ（特にＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、オリゴヌクレオチド（フォワードプライマー及び／又はリバースプライマー）、増幅ターゲット核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）などが例示できるが、特に限定はされない。なお、本発明に用いるプライマーは標識されていることが好ましく、当該標識としては蛍光標識やＲＩ（ラジオアイソトープ）標識等が例示できる。また、（ｉｉ）のキットは、上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックス（特にＰＣＲ反応液）を調整するための器具及び／又は試薬等が備えられたキットであり、当該器具及び／又は試薬を用いて上記ヘリカーゼ含有ＰＣＲミックスを調製することができるキットである。（ｉｉ）のキットにえられる器具や試薬としては、例えば、上記（ｉ）のキットに備えられる器具や試薬と同じ物を用いることができる。
【００２３】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、ＴＫ０５６６は国際公開第２０１６／０１３６２０号の実施例に記載される方法により発現及び精製した。また、ＴＫ０１７８は、ＴＫ０１７８遺伝子を増幅させるために用いたプライマーセット（下記表１参照）、及び増幅させた核酸を処理する制限酵素をBamHI及びNotIに変更した以外は、当該ＴＫ０５６６の発現及び精製方法と同様にして調製した。
【００２５】
【表１】
2018014924.tif 000002
【００２６】
ヘリカーゼのデジタルＰＣＲに対する効果の検討
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ  ３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に、以下のヘリカーゼ、ターゲット核酸（テンプレート核酸）、プローブ（ＳＮＰ検出用ＰＣＲプライマーセット）を加え、検討に用いるＰＣＲミックスを調製した。なお、ポリメラーゼは当該Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに含まれる。
【００２７】
へリカーゼ：ＴＫ０５６６またはＴＫ０１７８を、  終濃度０、２０、又は４０ｎＭ    
ターゲット核酸（ヒトゲノムＤＮＡ）：  ５ｎｇ
プローブ（ＰＣＲプライマー）：Ｃ＿＿＿１２０２８８３＿２０  ｒｅｔｕｒｎｅｄ  １  ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を終濃度０．２μＭ
【００２８】
そして、得られたＰＣＲミックスを用い、以下の反応条件で、デジタルＰＣＲを行った。
温度条件：「９５℃  ３０秒、５６℃又は６０℃  ２分、７２℃  ３０秒」を３９サイクル
デジタルＰＣＲ用装置：  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ３Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
デジタルＰＣＲ用チップ：  ２０，０００ウェルのチップ
【００２９】
なお、調製したＰＣＲミックス量は１４．５μＬであり、これを２０，０００ウェルに等しく分注した。従って、１ウェルあたり０．７２５ｎＬ分注されたことになる。また、用いたプローブ（Ｃ＿＿＿１２０２８８３＿２０）は、ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）遺伝子のＳＮＰ（ＩＤ：ｒｓ１８０１１３３）を検出するためのプローブである。ＶＩＣ又はＦＡＭで標識された当該プローブ（ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ）の配列を図１に示す。ＳＮＰのＣを検出するプローブ（ＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧ[Ｇ] ＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡ）には蛍光色素ＶＩＣが、ＳＮＰのＴであるプローブ（ＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧ[Ａ] ＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡ）には蛍光色素ＦＡＭが結合している。よって、デジタルＰＣＲにより、ＶＩＣの蛍光が検出されたウェルにはＳＮＰがＣであるＤＮＡが含まれており、ＦＡＭの蛍光が検出されたウェルにはＳＮＰがＴであるＤＮＡが含まれていることが分かる。なお、Ｃ＿＿＿１２０２８８３＿２０には、当該２種類の蛍光色素標識プローブをフォワードプライマーとして核酸増幅が可能なリバースプライマーも含まれている。
【００３０】
アニーリング温度５６℃での結果を図２に示す。ＴＫ０５６６とＴＫ０１７８のいずれも、２０ｎＭを反応液に添加することによりポジティブなサンプルの蛍光強度が増加し、ポジティブとネガティブの判定における改善が見られた。
【００３１】
アニーリング温度６０℃での結果を図３に示す。反応液にＴＫ０５６６を２０ｎＭを添加することにより同様の改善が見られた。しかし、４０ｎＭ添加した場合にはそのような改善が見られなかった。また、反応液にＴＫ０１７８を２０ｎＭ添加した場合には、同様の改善が見られ、４０ｎＭ添加した場合には同様の改善が顕著に見られた。
【００３２】
なお、図２及び図３は、各ウェルにおける蛍光強度を測定し、ＶＩＣ蛍光強度（横軸）及びＦＡＭ蛍光強度（縦軸）に従ってプロットを行った図である。プロットされた各点は４色（黄・青・赤・緑）で色分けされている。赤はＶＩＣの蛍光が検出され、ＦＡＭの蛍光が検出されなかったウェル、青はＦＡＭの蛍光が検出され、ＶＩＣの蛍光が検出されなかったウェル、黄はＶＩＣとＦＡＭの蛍光がともに検出されなかったウェル、緑はＶＩＣとＦＡＭの蛍光がともに検出されたウェルを示す。これら色分けされた点の分布が、同じ色の点は出来るだけ一カ所に固まっており、異なる色の点はできるだけ離れていればいるほど、ターゲット核酸の増幅の有無の区別が付きやすいこととなり、よって擬陽性を減らすことができる。 
【図１】
2018014924.tif 000003
【図２】
2018014924.tif 000004
【図３】
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【配列表】
2018014924000001.app