(57)【要約】【課題】従来よりも高い確率で心不全モデル動物を作製でき、さらに得られる心不全モデル動物の心不全の程度を調整できる新規のＴＡＣ手術を提供する。【解決手段】心不全モデル動物の作製方法は、圧センサ付カテーテルの先端を動物の右頚動脈から上行大動脈にまで挿入し、動物の横行大動脈を糸で締め付けながら、圧センサ付カテーテルにより測定される動物の心臓の収縮期血圧の上昇を確認し、測定された収縮期血圧に基づいて、動物の横行大動脈を締め付ける強さを決定し、該決定した強さで狭窄を作製することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
圧センサ付カテーテルの先端を動物の右総頚動脈から挿入し、該右総頚動脈内又は上行大動脈内に配置するステップと、
前記動物の横行大動脈を糸で締め付けながら、前記圧センサ付カテーテルにより測定される前記動物の心臓の収縮期血圧の上昇を確認するステップと、
前記測定された収縮期血圧に基づいて、前記動物の横行大動脈を締め付ける強さを決定し、該決定した強さで狭窄を作製するステップとを備えていることを特徴とする心不全モデル動物の作製方法。
【請求項２】
前記圧センサ付カテーテルは、超小型光ファイバー圧センサ付カテーテル（FISO Technologies社製）であることを特徴とする請求項１に記載の心不全モデル動物の作製方法。
【請求項３】
前記動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又はブタであることを特徴とする請求項１又は２に記載の心不全モデル動物の作製方法。
【請求項４】
前記狭窄を作製するステップにおいて、前記動物の横行大動脈を締め付ける前の前記収縮期血圧の値に対する前記動物の横行大動脈を締め付けた後の前記収縮期血圧の値の比率に基づいて、前記狭窄の強さを決定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の心不全モデル動物の作製方法。
【請求項５】
前記狭窄を作製するステップにおいて、前記動物の横行大動脈を締め付ける際に、注射針を用いること無く該横行大動脈のみを締め付けることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の心不全モデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、横行大動脈狭窄（TransverseAortic Constriction：ＴＡＣ）手術を用いた心不全モデル動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全とは、心臓、特に左心室による大動脈への血液の拍出が不十分であり、全身に必要な血液循環量を保つことができない病態をいう。一般に、心不全の５年生存率は５０％程度であり、予後不良の疾患として知られている。このため、心不全の治療に関して多くの研究が行われており、特に、心不全の治療薬について、現在、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、β受容体遮断薬等が知られているが、より有効な治療薬が望まれている。心不全に対する新規治療薬の開発のために、心不全モデル動物を用いた候補薬剤のスクリーニングが行われている。
【０００３】
代表的な心不全モデル動物としては、例えば非特許文献１〜４等に開示されている横行大動脈狭窄（TransverseAortic Constriction：ＴＡＣ）手術によって心不全が誘発された心不全モデルマウスが知られている。図７を参照して、従来のＴＡＣ手術について説明する。図７は、心臓の左心室の大動脈口から延びる上行大動脈１及びそれと接続する各動脈の構成を示すモデル図である。符号１は上行大動脈、符号２は右冠動脈、符号３は左冠動脈、符号４は腕頭動脈、符号５は右鎖骨下動脈、符号６は右総頚動脈、符号７は下行大動脈、符号８は横行大動脈、符号９は左鎖骨下動脈、符号１０は左総頚動脈をそれぞれ示す。従来のＴＡＣ手術では、麻酔下で開胸されたマウスにおいて、例えば２５〜２７ゲージ程度の注射針１１（注射器本体は図示せず）と共に横行大動脈８を絹糸又はナイロン糸等の糸１２で結紮した後に、直ちに注射針１１を抜くことにより狭窄を作製する。これにより、マウスの心臓に圧負荷がかかり、数週間後に心不全となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Richard D.Patten et al., Circ Heart Fail. 2009; 2: 138-144.
【非特許文献２】Manual ofResearch Techniques in Cardiovascular Medicine, First edition(Hossein Ardehali,Roberto Bolli, Dauglas W Losordo編), 第20項、164-169頁.
【非特許文献３】Proc. Natl.Acad. Sci. USA Vol.88 pp.8277-8281, 1991.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来のＴＡＣ手術では、糸で注射針と共に横行大動脈を結紮した後に、直ちに注射針を抜くことで、注射針の太さ分だけ横行大動脈にかかる締め付けの強さが弱くなり、すなわち、注射針の太さで横行大動脈にかかる締め付けの強さを調整する。しかしながら、注射針と共に横行大動脈を結紮する際の締め付けの強さによっては、同じ太さの注射針を用いても、注射針を抜いた後の横行大動脈にかかる締め付けの強さがばらついてしまい、一定にすることは困難である。従って、結紮が強すぎて手術を受けた動物が死亡したり、結紮が弱すぎて当該動物が心不全を発症しなかったりするので、所望の心不全モデル動物が得られる可能性は決して高くない。また、当該手術では、注射針と共に横行大動脈を絹糸等で結紮したときに一時的に大動脈が完全に閉塞されるため、注射針と横行大動脈とが共に結紮されている時間をできるだけ短くする必要があり、熟達した技術を要する。従って、当該手術を慣れていない者が行うと、心不全モデル動物が得られる可能性は極めて低くなる。
【０００６】
また、上述の通り、心不全になるか否かは、ＴＡＣ手術から数週間後にわかるため、必要な数の心不全モデル動物が得られるか否かが直ぐにはわからない。従って、心不全モデル動物を得られる可能性が低い従来の方法で心不全モデル動物を作製する場合、所望の数よりも多くの数の動物に対してＴＡＣ手術を行う必要があり、労力もコストも掛かることとなる。
【０００７】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、熟達した技術を有さない者であっても、従来よりも高い確率で心不全モデル動物を作製でき、さらに得られる心不全モデル動物の心不全の程度を調整できる新規のＴＡＣ手術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明では、圧センサ付カテーテルを右総頚動脈又は上行大動脈内にまで挿入して心内圧、特に収縮期血圧（Systolic Blood Pressure：ＳＢＰ）をモニタリングしながら結紮の強さを調整できるようにした。
【０００９】
具体的に、本発明に係る心不全モデル動物の作製方法は、圧センサ付カテーテルの先端を動物の右総頚動脈から挿入し、該右総頚動脈内又は上行大動脈内に配置するステップと、動物の横行大動脈を糸で締め付けながら、圧センサ付カテーテルにより測定される動物の収縮期血圧の上昇を確認するステップと、測定された収縮期血圧に基づいて、動物の横行大動脈を締め付ける強さを決定し、該決定した強さで狭窄を作製するステップとを備えていることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法によると、圧センサ付カテーテルを用いて収縮期血圧を測定し、その測定値を確認しながら横行大動脈を糸で結紮できるため、その結紮時の締め付け強さを動物が心不全を発症するのに適した強さに調整することができる。その結果、高い確率で心不全モデル動物を得ることが可能となる。また、収縮期血圧の測定値を確認しながら横行大動脈を糸で結紮できるため、動物に発症する心不全の程度を調整でき、手術を行う者が選択的に、動物に重度の心不全や軽度の心不全のみならず、心不全にまで至らない心肥大を発症させることも可能となる。また、横行大動脈を糸で結紮する際に、測定された収縮期血圧を確認しながら結紮の強度を調整するため、注射針等と共に横行大動脈を糸で結紮する必要がない。従って、結紮する際に横行大動脈が完全に閉鎖することがなく、動物への負担が小さいため、従来の方法よりも狭窄の作製に時間をかけることができる。
【００１１】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法において、圧センサ付カテーテルは、超小型光ファイバー圧センサ付カテーテル（FISO Technologies社製）であることが好ましい。
【００１２】
小型光ファイバー圧センサ付カテーテル（FISOTechnologies社製）は、現在市販されている圧センサ付カテーテルの中で最も極細のものであり、マウスのような実験動物の中でも特に小型の動物の血管に挿入するのに特に適しており、ノイズに対して強く、正確に小型動物の血管内の圧力を測定することができる。
【００１３】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法において、動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又はブタといった実験動物を用いることができる。
【００１４】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法は、狭窄を作製するステップにおいて、動物の横行大動脈を締め付ける前の収縮期血圧の値に対する動物の横行大動脈を締め付けた後の収縮期血圧の値の比率に基づいて、狭窄の強さを決定することが好ましい。
【００１５】
心臓への負荷を規定する因子としては、収縮期血圧や心拍数が挙げられるが、この中でも糸による横行大動脈の締め付け前に対する締め付け後の収縮期血圧の比率が、他の因子と比較して左室内径短縮率（Fractional Shortening：ＦＳ）や左室拡張末期径（leftventricular end-diastolic dimension：ＬＶＤｄ）といった心臓機能を示す値と相関が強い。従って、結紮前に対する結紮後の収縮期血圧の比率に基づいて、狭窄の強さを決定することにより、高い確率で心不全モデル動物を作製することができる。
【００１６】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法は、狭窄を作製するステップにおいて、動物の横行大動脈を締め付ける際に、該横行大動脈のみを締め付けることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法では、上述の通り、測定された収縮期血圧を確認しながら結紮の強度を調整するため、注射針等と共に横行大動脈を糸で結紮する必要がなく、従って、結紮する際に横行大動脈が完全に閉鎖することがなく、動物への負担が小さいため、従来の方法よりも狭窄の作製に時間をかけることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る心不全モデル動物の作製方法によると、高い確率で心不全モデル動物を得ることが可能となり、また、動物に発症する心不全の程度を調整でき、手術を行う者が選択的に、動物に重度の心不全や軽度の心不全のみならず、心不全にまで至らない心肥大を発症させることも可能となる。さらに、狭窄作製時における動物への負担を小さくできるので、従来の方法よりも狭窄の作製に時間をかけることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る心不全モデル動物の作製方法を説明するためのモデル図である。
【図２】マウスの横行大動脈に狭窄作製する前の心拍数に対する狭窄作製後の心拍数の比率を横軸にとり、狭窄作製の手術の４週間後におけるマウスの左室内径短縮率（ＦＳ）を縦軸にとったグラフである。
【図３】マウスの横行大動脈に狭窄作製する前の心拍数に対する狭窄作製後の心拍数の比率を横軸にとり、狭窄作製の手術の４週間後におけるマウスの左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を縦軸にとったグラフである。
【図４】マウスの横行大動脈に狭窄作製する前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率を横軸にとり、狭窄作製の手術の４週間後におけるマウスの左室内径短縮率（ＦＳ）を縦軸にとったグラフである。
【図５】マウスの横行大動脈に狭窄作製する前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率を横軸にとり、狭窄作製の手術の４週間後におけるマウスの左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を縦軸にとったグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｄ）はマウスに対して実施例の手術をし、その４週間後の心臓の切片をマッソントリクローム染色した写真を示し、（ａ）はマウスの横行大動脈を締め付けず、収縮期血圧を上昇させなかったマウス（コントロール）の心臓であり、（ｂ）はマウスの横行大動脈に狭窄作製する前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率（SBP ratio）を約１．１５〜１．２０にしたマウスの心臓であり、（ｃ）はその比率を約１．３５〜１．４０にしたマウスの心臓であり、（ｄ）はその比率を約１．４５〜１．５０にしたマウスの心臓である。
【図７】従来のＴＡＣ手術を説明するためのモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２１】
まず、本発明の一実施形態に係る心不全モデル動物の作製方法について図１を参照しながら説明する。図１は、図７と同様に心臓の左心室の大動脈口から延びる上行大動脈１及びそれと接続する各動脈の構成を示し、図７で示した符号と同一の符号は同一の動脈又は部材を示す。
【００２２】
図１に示すように、本実施形態では、図７に示す従来のＴＡＣ手術と同様に横行大動脈８に糸１２で狭窄を作製するが、その前に動物の圧センサ付カテーテル１３の先端を右総頚動脈６から挿入し、右総頚動脈６又は上行大動脈１に配置する。圧センサ付カテーテル１３としては、右総頚動脈６に挿入できる大きさのカテーテルであり、心臓の収縮期血圧を測定できる圧センサを備えていれば特に限定されないが、極細のカテーテルの先端に極小の圧センサが配されたFISO Technologies社の光ファイバー圧センサ付カテーテル（ＦＩＳＯ−ＬＳ−ＰＴ９）を用いることが最も好ましい。これは、現在市販されている圧センサ付カテーテルの中で最も極細のものであり、マウスのような実験動物の中でも特に小型の動物の血管に挿入するのに特に適しており、ノイズに対して強く、正確に小型動物の血管内の圧力を測定することができる。当該圧センサ付きカテーテル１３を右総頚動脈６又は上行大動脈１にまで挿入することにより、心内圧、特に左心室の収縮期血圧を測定することが可能となる。
【００２３】
本実施形態では、圧センサによる測定値をモニタリングしながら横行大動脈８に糸１２で狭窄を作製する。具体的に、超小型光ファイバー圧センサ付カテーテル１３を上行大動脈１にまで挿入した後に、圧センサによる測定値をモニタリングしながら、横行大動脈８を糸１２で締め付け、その強さを調整する。心内圧は糸１２による横行大動脈８の締め付けを強くすれば大きくなり、弱くすれば小さくなる。従って、このようにすることで、複数の動物に対して、各動物の横行大動脈８を一定の強さで締め付けることが可能となり、動物に心不全を発症させるのに適する強さで締め付けることができる。さらに、個体ごとの締め付けの強さのばらつきを減少することができるため、結果として、高い確率で心不全モデル動物が得られる。
【００２４】
また、本実施形態では、図１に示すとおり、糸１２で横行大動脈８を締め付ける際に注射針等と共に横行大動脈８を締め付ける必要はない。従来のＴＡＣ手術では、上述したとおり注射針１１によって横行大動脈８の締め付けの強さを調整していたが、本実施形態では、上述の通り、圧センサによる心内圧の測定値に基づいて、より正確に横行大動脈８の締め付けの強さを調整できるため、注射針１１を用いる必要はない。また、注射針１１を用いると、注射針と共に横行大動脈を絹糸等で結紮したときに一時的に大動脈が完全に閉塞されるおそれがあり、できるだけ早く注射針を抜く作業が必要となるので、注射針１１を用いない方が好ましい。
【００２５】
また、本実施形態において、当該方法が適用される動物は、以下に限定されないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、又はブタであり、特にマウスが好ましい。
【００２６】
また、本実施形態では、上述の通り、圧センサによる心内圧の測定値に基づいて、横行大動脈８の締め付けの強さを調整するが、特に収縮期血圧を基準とすることが好ましい。さらに、締め付け前の収縮期血圧の値に対する締め付け後の収縮期血圧の値の比率を基準とすることがより好ましい。例えば所定の種類のマウスを用いる場合、予め実験により当該マウスに心不全を発症させる確率が高い上記収縮期血圧の比率を決定しておく。例えば、その比率が１．５である場合、横行大動脈を糸で締め付ける前の収縮期血圧が５０ｍｍＨｇとすると、収縮期血圧が７５ｍｍＨｇとなるように糸で横行大動脈を締め付けて狭窄を作製する。このようにすると、個体ごとに一定に所望の強さで横行大動脈を締め付けることが可能となる。
【００２７】
なお、本実施形態の心不全モデル動物の作製方法では、上述のとおり、圧センサによる心内圧の測定値に基づいて、横行大動脈８の締め付けの強さを調整できるため、動物に発症する心不全の程度を調整でき、手術を行う者が選択的に、動物に重度の心不全や軽度の心不全のみならず、心不全にまで至らない心肥大を発症させることも可能となる。なお、上記理由から本発明の心不全モデル動物の作製方法には、心肥大モデル動物の作製方法も含まれる。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明に係る心不全モデル動物の作製方法を詳細に説明するための実施例を示す。なお、本実施例では、動物としてマウス（Ｃ５７Ｂ６／Ｊ）を用いた。
【００２９】
心臓、特に左室への負荷を規定する因子としては、収縮期血圧や心拍数が挙げられるが、この中から以下に説明する実験の結果から収縮期血圧を基準とすることが最も好ましいことがわかった。その実験及び結果について以下に説明する。
【００３０】
まず、Ｃ５７Ｂ６／Ｊマウス（６〜１０週齢の雄）をトリブロモエタノール３００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて麻酔し背臥位に保定し、２４Ｇカテーテルを気管内に挿管し、人工呼吸器にて呼吸管理を行った。続いて、前胸部皮膚を消毒液により消毒した後に、正中線頚部から胸骨中間部分にかけてハサミで約１．５ｃｍの皮膚切開を行い、止血目的で胸骨正中線上の軟部組織を焼灼した後にミニルーター（小型電動丸ノコギリ）を用いて胸骨正中切開を行った。次に、胸骨切断面からの出血を焼灼器によって止血し、ピンセットで胸腺を剥離しながら大動脈弓部を剖出した。その後、横行大動脈部分に６−０絹糸を通すとともに、右総頸動脈の遠位端を６−０絹糸で結紮後に近位部を血管クリップでクランプした。続いて、右総頸動脈遠位結紮部直下にハサミで約２ｍｍ切開し、超小型光ファイバー圧力センサ付カテーテル（FISO-LS-PT9、FISO Technologies社）を先端が大動脈近傍付近になるように挿入して固定し、麻酔深度の調節により収縮期血圧が７０−９０ｍｍＨｇの範囲（覚醒時のマウス尾での収縮期血圧とほぼ同じ範囲）にあることを確認し、このときの収縮期血圧及び心拍数（回／ｍｉｎ）を測定した。その後に横行大動脈にかけた６−０絹糸を締め付けることによって収縮期血圧を上昇させ、６−０絹糸を２重に結ぶことにより狭窄を完成させた。また、この際の、収縮期血圧及び心拍数を測定した。以下、上記手術を本実施例の手術と呼ぶ。
【００３１】
本実施例の手術の４週間後に、心臓超音波画像診断装置（Xario, TOSHIBA社製）を用いてマウスの左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を測定した。ＦＳの測定結果を縦軸とし、横行大動脈に狭窄作製前の心拍数に対する狭窄作製後の心拍数の比率を横軸としたグラフを図２に示す。同様に、ＬＶＤｄの測定結果を縦軸としたグラフを図３に示す。さらに、ＦＳの測定結果を縦軸とし、横行大動脈に狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率を横軸としたグラフを図４に示し、ＬＶＤｄの測定結果を縦軸としたグラフを図５に示す。なお、以上の各結果を示すグラフにおいて、縦軸に示す測定値と横軸に示す測定値との相関の強さを明らかにするために、最小二乗法により各結果から回帰直線、相関係数（Ｒ２）を算出した。
【００３２】
まず、ＦＳの測定結果を縦軸とした図２及び図４を比較すると、心拍数の比率を横軸にとった図２はＲ２の値が低く、心拍数と手術４週後のＦＳとの相関は低いことがわかる。これと比較して、収縮期血圧の比率を横軸にとった図４のＲ２の値が顕著に高いことがわかる。
【００３３】
また、ＬＶＤｄの測定結果を縦軸とする図３及び図５においても同様に、収縮期血圧の比率を横軸にとった図５のＲ２の値が顕著に高いことがわかる。従って、心拍数と収縮期血圧とを比較すると、収縮期血圧が手術の４週間後のＦＳ及びＬＶＤｄとの相関が高く、収縮期血圧が横行大動脈の締め付けの強さを決めるための指標に適するといえる。
【００３４】
次に、狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値を変えて、上記本実施例の手術をした場合の手術の４週間後のマウスの心臓の状態について検討した。具体的に、上記本実施例の手術において、狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値（SBP ratio）を１．００（コントロール）、約１．１５〜１．２０、約１．３５〜１．４０、又は約１．４５〜１．５０となるように調整した。これらの条件で得られたマウスを上記手術の４週間後に解剖し心臓を取り出し、常法で切片を作製し、マッソントリクローム染色して顕微鏡観察した結果をそれぞれ図６に示す。
【００３５】
図６に示すように、横行大動脈を締め付けずに収縮期血圧を増大させていないコントロール（図６（ａ））と比較して、横行大動脈を締め付けて狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値を約１．１５〜１．２０にした場合（図６（ｂ））、コントロールと比較して心筋が厚くなっており心肥大を発症している。また、狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値を約１．３５〜１．４０にした場合（図６（ｃ））、心筋の厚さはコントロールとほぼ同じであるが、心室拡大傾向にあるため軽度の心不全を発症していると考えられる。さらに、狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値を約１．４５〜１．５０にした場合（図６（ｄ））、コントロールと比較して心筋は菲薄化し、心室が著明に拡大しているため、重度の心不全を発症していると考えられる。
【００３６】
以上の結果から、狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値を１．３５〜１．５０程度にすれば調整することにより、少なくともＣ５７Ｂ６／Ｊマウス（６〜１０週齢の雄）では、心不全を発症するため、この値を基準にすれば、上記手術により高い確率で心不全モデルマウスを作製することができることが示唆された。また、その比率をより細かく調整することで、心肥大、軽度の心不全又は重度の心不全とその程度を調整することもできると考えられる。
【００３７】
上記実施例では、Ｃ５７Ｂ６／Ｊマウス（６〜１０週齢の雄）を用いたが、他のマウスや、ラット、ウサギ、イヌ又はブタであっても、予め狭窄作製前の収縮期血圧に対する狭窄作製後の収縮期血圧の比率の値をどの程度にすれば心不全を発症するかを試験及び検討し、その比率の値を得れば、その値を用いて上記実施例の手術を行うことにより、容易に心不全モデル動物を得ることができる。
【符号の説明】
【００３８】
１    上行大動脈
２    右冠動脈
３    左冠動脈
４    腕頭動脈
５    右鎖骨下動脈
６    右総頚動脈
７    下行大動脈
８    横行大動脈
９    左鎖骨下動脈
１０  左総頚動脈
１１  注射針
１２  糸
１３  圧センサ付きカテーテル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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