(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞レセプター(γ9δ2TCR)を同定するための方法、特異的Ｔ細胞レセプターの提供及び癌の処置における使用。【解決手段】γ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖(δ2TCR鎖)またはそれらの断片をコードする核酸分子であって、CDR3領域のアミノ酸配列が特定のアミノ酸配列からなる核酸分子。さらに、癌の治療において使用するためのこれらの核酸分子。これらのいずれかの核酸分子を含む製薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ9T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子であって、前記コードされたγ9T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号1と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
(i)     前記コードされたγ9T細胞レセプターまたはその断片のアミノ酸配列は、配列番号12と少なくとも60％の同一性を有する；
(ii)    前記核酸分子は、配列番号11と少なくとも60％の同一性を有する核酸配列によって表される；
(iii)   配列番号1のアミノ酸残基番号122-124に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、IQ（配列番号20）である；及び
(iv)    配列番号1のアミノ酸残基番号118-132に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号16と少なくとも60％の同一性を有する
を実現する、核酸分子。
【請求項２】
前記コードされたγ9T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号12を含むアミノ酸配列によって表される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子であって、前記コードされたδ2T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号2と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
(i)     前記コードされたδ2T細胞レセプターまたはその断片のアミノ酸配列は、配列番号14と少なくとも60％の同一性を有する；
(ii)    前記核酸分子は、配列番号13と少なくとも60％の同一性を有する核酸配列によって表される；
(iii)   配列番号2のアミノ酸残基番号115-122に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号15または配列番号22と少なくとも60％の同一性を有する；及び
(iv)    配列番号2のアミノ酸残基番号112-127に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号17または配列番号18と少なくとも60％の同一性を有する
を実現する、核酸分子。
【請求項４】
前記コードされたδ2T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号14を含むアミノ酸配列によって表される、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子であって、
A.      配列番号1と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
(i)     前記アミノ酸配列は、配列番号12と少なくとも60％の同一性を有する；
(ii)    配列番号11と少なくとも60％の同一性を有する核酸配列によって表される；
(iii)   配列番号1のアミノ酸残基番号122-124に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、IQ（配列番号20）である；及び
(iv)    配列番号1のアミノ酸残基番号118-132に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号16と少なくとも60％の同一性を有する
を実現するγ9T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子；並びに
B.      配列番号2と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
(i)     前記アミノ酸配列は、配列番号14と少なくとも60％の同一性を有する；
(ii)    配列番号13と少なくとも60％の同一性を有する核酸配列によって表される；
(iii)   配列番号2のアミノ酸残基番号115-122に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号15または配列番号22と少なくとも60％の同一性を有する；及び
(iv)    配列番号2のアミノ酸残基番号112-127に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号17または配列番号18と少なくとも60％の同一性を有する
を実現するδ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子
を含む、核酸分子。
【請求項６】
γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子であって、
-   請求項１に記載のγ9T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子；及び
-   配列番号2と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
a)      配列番号2のアミノ酸残基番号115-122に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号19と少なくとも60％の同一性を有する；
b)      配列番号2のアミノ酸残基番号112-127に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号4と少なくとも60％の同一性を有する；
c)      配列番号2のアミノ酸残基番号112-114に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、ACD（配列番号25）と少なくとも60％の同一性を有する；
d)      配列番号2のアミノ酸残基番号123-127に対応するδ2T-CDR3領域のアミノ酸配列は、TDKLI（配列番号26）と少なくとも60％の同一性を有する
を実現する、δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子
を含む、核酸分子。
【請求項７】
γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子であって、
-   請求項３に記載のδ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子；及び
-   配列番号1と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって表され、少なくとも一つの以下の特徴：
a)      配列番号1のアミノ酸残基番号122-124に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、AQQ（配列番号21）である；
b)      配列番号1のアミノ酸残基番号118-132に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、配列番号3と少なくとも60％の同一性を有する；
c)      配列番号1のアミノ酸残基番号118-121に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、ALWE（配列番号23）と少なくとも60％の同一性を有する；
d)      配列番号1のアミノ酸残基番号125-132に対応するγ9T-CDR3領域のアミノ酸配列は、ELGKKIKV（配列番号24）と少なくとも60％の同一性を有する
を実現する、γ9T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸分子
を含む、核酸分子。
【請求項８】
(i)   前記コードされたγ9T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号12を含むアミノ酸配列によって表される；及び
(ii)  前記コードされたδ2T細胞レセプターまたはその断片は、配列番号14を含むアミノ酸配列によって表される
請求項５に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるレセプターまたはレセプター鎖またはその断片。
【請求項１０】
請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
【請求項１１】
請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むT細胞。
【請求項１２】
請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む製薬組成物。
【請求項１３】
癌に対する治療において使用するための、請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野にある。本発明は、免疫学および癌の処置のための細胞治療に関する。本発明はさらに、T細胞レセプター、特に抗腫瘍応答を媒介し得るT細胞レセプターの同定のための方法に関する。本発明はさらに、癌の処置における、抗腫瘍応答を媒介する特異的T細胞レセプターおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、同種幹細胞移植(allo-SCT)は、癌に罹患している患者のための、十分確立され証明された唯一の治癒的細胞治療である。これは、「高リスク」白血病を有する患者において、特にallo-SCTを用いて長期寛解が達成され得るという観察によって実証されている。しかし、治癒は、重症の毒性という犠牲を払って得られ、処置された患者のおよそ30%の全死亡率を生じる。特に低リスクの癌を有する患者は良好な全生存を有し得るので、これは広い臨床的実行を妨害し、かかる侵襲性の治療を正当化しない。従って、最終目標は依然として、非侵襲性の移植方法の開発である。これは、健康な組織を保存しつつ、癌細胞の選択的標的化を可能にする分子特徴を備えた細胞性産物の生成を意味する。これは、年齢にかかわりなく、医学的必要性を有する多数の患者に対する治癒的処置を可能にする。
【０００３】
同種または自家であり得る移植片を操作して、例えば腫瘍反応性αβT細胞の迅速な生成を促進するために、腫瘍特異的αβT細胞レセプター(TCR)またはキメラ抗原レセプターをコードする遺伝子を用いてαβT細胞を再プログラムすることが提唱されている。かかるレセプターのいくつかは、第I相臨床試験においてαβT細胞を再指向するために既に使用されている。しかし、規定されたαβTCRを用いてαβT細胞を再プログラムすることは、HLA型へのその制限によって実質的に妨害され、それによって、1つのαβ-TCRで処置され得る患者の数を制限する。さらに、導入されたαβTCR鎖と内因性αβTCR鎖とのペアリングは、生命を危うくする自己反応性を誘導し得る。
【０００４】
健康な環境を無視しながら、γ9δ2T細胞が抗腫瘍反応性を媒介する能力を使用して、高親和性TCRとの選択的抗腫瘍反応性を媒介することが提唱されている(Fischら、1990、Science 250、1269〜1273)。単離されたγ9δ2T細胞は、血液学的悪性疾患および固形腫瘍の腫瘍細胞を効率的に死滅させ得る(Kabelitzら、2007、Cancer Res. 67、5〜8)。しかし、γ9δ2T細胞の機能および増殖能は、癌患者において重度に損なわれることが頻繁であり、自家γ9δ2T細胞を、免疫介入にとってあまり魅力的でないものにしている。
【０００５】
in vitroおよびin vivoで正常な細胞は無視され得るが、αβT細胞の腫瘍特異的増殖を媒介し、腫瘍株細胞の広いパネルに対してエフェクターCD8+およびヘルパーCD4+αβT細胞サブセットの両方を再指向する規定されたγ9δ2TCRを、αβT細胞中に移入させることが提唱されている(Marcu-Malinaら、2011、Blood 118、50〜59)。しかし、γ9δ2TCRが如何にして腫瘍細胞に対する異なる活性を媒介するか、および癌細胞に対する高い活性を有するγ9δ2TCRを単離するために使用される必要がある戦略が何であるかについて、入手可能な知識はほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fischら、1990、Science 250、1269〜1273
【非特許文献２】Kabelitzら、2007、Cancer Res. 67、5〜8
【非特許文献３】Marcu-Malinaら、2011、Blood 118、50〜59
【非特許文献４】Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989
【非特許文献５】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987および定期的更新
【非特許文献６】シリーズMethods in Enzymology、Academic Press、San Diego
【非特許文献７】COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988
【非特許文献８】BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993
【非特許文献９】COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994
【非特許文献１０】SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987
【非特許文献１１】SEQUENCE ANALYSIS PRIMER;Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991
【非特許文献１２】Carillo, H.およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073
【非特許文献１３】GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994
【非特許文献１４】Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387
【非特許文献１５】Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403
【非特許文献１６】Albert L. Lehninger、Principles of Biochemistry、793〜800(Worth Pub. 1982)
【非特許文献１７】Claudio Tripodoら  Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6、707〜717(2009年12月)
【非特許文献１８】Lefranc MP. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. 2003;31:307〜310
【非特許文献１９】RiddelおよびGreenberg、1990 J Immunol Methods. 128(2):189〜201
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、癌細胞に対する高い活性を有するγ9δ2TCRを提供する必要性が当該分野に存在し、かかる高度に活性なγ9δ2TCRを選択するための改善された方法を提供する必要性が当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞レセプター(γ9δ2TCR)を同定するための方法を提供する。述べたように、抗腫瘍反応性を媒介するためのγ9δ2TCRの分子的要件について入手可能な知識はほとんどない。特に、抗腫瘍応答を媒介するためのγ9δ2TCRの相補性決定領域(CDR)内の可変性の寄与は、当該分野で無視できるとみなされた。驚くべきことに、γ9-T細胞レセプター鎖(γ9TCR鎖)およびδ2-T細胞レセプター鎖(δ2TCR鎖)のCDR3領域が重要であることが、本明細書で見出された。これらの知見に基づき、コンビナトリアルγδTCR鎖交換(CTE)が、抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2TCRを同定するための効率的な方法として提唱される。本発明の方法では、γ9T細胞レセプター鎖およびδ2T細胞レセプター鎖のCDR3領域がランダムに改変され、新規γ9δ2TCRを形成するために組み合わされる。新たに設計されたγ9δ2TCRが提供され、好ましくはT細胞中に組み込まれ、このT細胞が引き続いて、細胞表面においてγ9δ2TCRを発現する。従って、CTE操作されたT細胞の抗腫瘍応答が決定される。この方法で、複数の組み合わせが試験され得、各組み合わせについて、抗腫瘍応答が決定され得る。抗腫瘍応答を決定した後、高度に活性な抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞レセプターが同定され得る。実施例に記載したような本発明の方法を使用して、参照γ9δ2TCR G115wtと比較して増加した抗腫瘍応答を媒介する既にいくつかの応答性γ9δ2TCRが同定された。従って、本発明はさらに、例えば癌の診断または処置において使用され得るγ9δ2TCRまたはその断片を提供する。本発明はさらに、本発明に従って、細胞中、好ましくはT細胞中でγ9δ2TCRを発現させるために使用され得る、核酸配列、遺伝子構築物およびレトロウイルスベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】γ9δ2TCRによって媒介される抗腫瘍反応性を示す図である。末梢血T細胞を、示された野生型γ9δ2TCRまたはCTE操作されたγ9δ2TCRでウイルスにより形質導入し、51Cr放出アッセイにおいてDaudi(A、C)に対して試験した(E:T 3:1)。特異的溶解は、5時間後に上清において測定された51Cr放出の変化倍率として示される。変化倍率は、γ9-G115wt/δ2-G115wt操作されたT細胞の反応性と比較して計算した。(B、D)示された量のパミドロネートの存在下でのIFNγELISAまたは(E)異なるE:T比でのIFNγELISA。(F)Daudiおよび示されたγ9δ2TCRで操作されたT細胞の細胞-細胞コンジュゲートの百分率を、フローサイトメトリーによって決定した。データは平均±SDを示す。一元配置ANOVAにより*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図２】クローンG115の単一アラニン変異したδ2鎖を発現する形質導入されたT細胞のγ9δ2TCR発現および機能的結合力を示す図である。末梢血T細胞を、示されたγ9TCR鎖およびδ2TCR鎖でウイルスにより形質導入し、(A)δ2-鎖特異的抗体を使用してフローサイトメトリーによって分析した。δ2-G115wtを発現する野生型コントロールと比較した平均蛍光強度(MFI)の変化倍率が示される。(C)形質導入体の溶解活性を、腫瘍標的Daudiに対する51Cr放出アッセイにおいて試験した(E:T 10:1)。特異的溶解は、5時間後に上清において測定された51Cr放出の変化倍率として示される。変化倍率は、変異していない野生型(δ2-G115wt)の反応性と比較して計算した。矢印は、レセプター発現(点線矢印)または機能的結合力(実線矢印)を損なった、δ2-G115における変異を示す。(B、D)関連するアミノ酸(矢印)を示すγ9δ2TCR G115の結晶構造。
【図３】δ2-CDR3の長さ変異を有するγ9δ2TCR G115を発現する形質導入されたT細胞のγ9δ2TCR発現および機能的結合力を示す図である。(A)示された形質導入体のγ9δ2TCR発現を、γδTCR-pan抗体を使用してフローサイトメトリーによって分析した。δ2-G115wtを発現する野生型コントロールと比較した平均蛍光強度(MFI)の変化倍率が示される。(B)腫瘍標的Daudiに対するδ2-G115LM形質導入されたT細胞のIFNγ分泌(E:T 1:1)を、100μMパミドロネートの存在下で24時間のインキュベーション後にELISAによって測定した。wtδ2-G115wtを発現する形質導入体の反応性と比較したIFNγ産生の変化倍率が示される。(C)δ2-G115LM0、1、4、12を発現する形質導入体を、示されたような漸増量のパミドロネートを用いて、腫瘍標的Daudiに対する滴定アッセイにおいて試験した。IFNγ産生を、24時間後にELISAによって測定した。(D)生成されたδ2-G115LMを、IMGTデータベースに記載されたγ9δ2TCRと、BLAST検索において一致させた。類似のδCDR3長さのδ2-G115LMと比較した引用の数が示される。(E)δ2-G115LM2、4、6を有する形質導入体を、同じδCDR3長さの個々のγ9δ2TCRを発現する形質導入体と並べて比較した。腫瘍標的Daudiに対する形質導入されたT細胞のIFNγ分泌(E:T 1:1)を、100μMパミドロネートの存在下で24時間の後にELISAによって測定した。wtδ2-G115wtを発現する形質導入体の反応性と比較したIFNγ産生の変化倍率が示される。データは平均±SDを示す。一元配置ANOVAにより**p<0.01、**p<0.001。(F)γ9δ2TCR G115の結晶構造;δCDR3内のアラニンストレッチに使用した領域は白色で示され、残りのδCDR3は緑色で示され、δ鎖は青色で示され、γ鎖は茶色で示される。
【図４】γ9-CDR3長さ変異を有するγ9δ2TCR G115を発現する形質導入されたT細胞の機能的結合力を示す図である。(A)末梢血T細胞を、示されたγ9TCR鎖およびδ2TCR鎖でウイルスにより形質導入した。形質導入体の溶解活性を、同じγ9CDR3長さの個々のγ9δ2TCRを発現するT細胞と並べて比較した。特異的溶解は、5時間後に上清において測定された51Cr放出の変化倍率として示される。データは平均±SDを示す。一元配置ANOVAにより**p<0.01。(B)アミノ酸γ9-G115A109、γ9-G115Q110およびγ9-G115Q111(赤色矢印)を含むγ9CDR3を示すγ9δ2TCR G115の結晶構造は灰色で示され、δCDR3は緑色で示され;δ鎖は青色で示され;γ鎖は茶色で示される。
【図５】in vitroでの、CTE操作されたγ9δ2TCRで形質導入されたT細胞の抗腫瘍反応性を示す図である。末梢血T細胞を、示されたγ9δ2TCRでウイルスにより形質導入し、示された腫瘍株細胞および健康なコントロール組織に対して試験した。(A)形質導入体を、10μMパミドロネートの存在下で標的細胞と共にインキュベートした(E:T 1:1)。IFNγ産生を、24時間後にELISAによって測定した。データは平均±SDを示す。一元配置ANOVAにより*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。(B)形質導入体を、51Crをロードした示された腫瘍標的と共にインキュベートした(E:T 10:1)。特異的溶解の百分率を、5時間後に上清において測定された51Cr放出によって決定した。(C)CTE操作されたT細胞を、10μMパミドロネートの存在下で、IFNγELISpotアッセイにおいて初代AML芽細胞および健康な前駆細胞に対して試験した(E:T 3:1)。データは平均±SDを示す。一元配置ANOVAにより*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図６】in vivoでの、CTE操作されたγ9δ2TCRで形質導入されたT細胞の抗腫瘍反応性を示す図である。CTE-γ9δ2TCRγ9-G115wt/δ2-cl5wtまたはコントロールγ9δ2TCR(γ9-G115wt/δ2-G115wt)を発現するT細胞の機能的結合力を、Rag2-/-γc-/-二重ノックアウトマウス(1群当たり4〜7匹のマウス)において研究した。0日目の全身照射(2Gy)の後、マウスに、1日目に、0.5×106のDaudi-ルシフェラーゼ細胞または5×106のRPMI8226/S-ルシフェラーゼ細胞および107のCTE-γ9δ2TCR形質導入されたT細胞を静脈内注射した。さらに、IFAおよびパミドロネート(10mg/kg体重)中6×105IUのIL2を、1日目に注射し、実験の最後まで3週間毎に注射した。(A、B)腫瘍成長を、両側でマウスの全面積を測定することによって、生物発光画像化(BLI)によってin vivoで評価した。データは、測定した全ての動物の平均を示す(Daudi:n=4、RPMI8226/S:n=7)。一元配置ANOVAにより*p<0.05、**p<0.01(Daudi:42日目;RPMI8226/S:35日目)。(C)処置したDaudiマウスの全生存を、72日間にわたってモニタリングした。ログランク(Mantel-Cox)検定により*p<0.05、**p<0.01。
【図７】コンビナトリアルγδTCR鎖交換(CTE)を示す図である。個々のγ9δ2T細胞クローンを単離し(A)、γ9TCR鎖およびδ2TCR鎖の配列を決定する(B)。コンビナトリアルγδTCR鎖交換によって、新規γ9δ2TCRを設計し、それにより、γ9CDR3領域およびδ2CDR3領域がランダムに改変され(例えば、アミノ酸の置換、欠失および/もしくは挿入、ならびに/またはCDR3長さの短縮もしくは引き伸ばしを介して)(C)、新たに組み合わされる(D)。引き続いて、新規γ9δ2TCRが、細胞中、好ましくはαβT細胞などのT細胞中に導入され(例えば、γ9TCR鎖およびδ2TCR鎖をコードするレトロウイルスベクターを使用する形質導入を介して)、CTE操作されたT細胞が提供される(E)。最後に、CTE操作されたT細胞が、高い抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2TCRを決定するために、機能的アッセイにおいて腫瘍細胞に対して試験される。従って、例えば最も高い抗腫瘍応答および/または最も低い副作用を有するγ9δ2TCRが選択できる(F)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義:
以下の説明および実施例において、多数の用語が使用される。明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、かかる用語に対して与えられる範囲を含めて、以下の定義が提供される。本明細書で特に定義しない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１１】
本発明の方法において使用される従来技術を実施する方法は、当業者に明らかである。分子生物学、生化学、計算機化学、細胞培養、組換えDNA、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来技術の実施は、当業者に周知であり、例えば以下の参考文献において考察されている:Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987および定期的更新;ならびにシリーズMethods in Enzymology、Academic Press、San Diego。
【００１２】
本明細書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」およびその活用は、その非限定的な意味において使用され、この用語の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味する。この動詞は、動詞「〜から本質的になる」ならびに「〜からなる」を包含する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「この(the)」は、文脈が明確に他を指定しない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、上で使用したように、「1つの(a)」DNA分子を単離するための方法は、複数の分子(例えば、10個台、100個台、1000個台、10000個台、100000個台、1000000個台またはそれ以上の分子)を単離することを含む。
【００１４】
アラインするおよびアラインメント:用語「アラインする」および「アラインメント」は、同一または類似のヌクレオチドの短いまたは長いストレッチの存在に基づいた、2つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。ヌクレオチド配列のアラインメントのためのいくつかの方法が、以下にさらに説明するように、当該分野で公知である。用語「アラインする」および「アラインメント」は、同一または類似のアミノ酸の短いまたは長いストレッチの存在に基づいた、2つ以上のアミノ酸配列の比較もまた意味する。アミノ酸配列のアラインメントのためのいくつかの方法が、以下にさらに説明するように、当該分野で公知である。
【００１５】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたDNA領域が、生物学的に活性なRNA、即ち、生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチド(または活性なペプチド断片)へと翻訳されることが可能であるRNAまたは(例えば、転写後遺伝子サイレンシングもしくはRNAiにおいて)それ自体活性であるRNAへと転写されるプロセスを指す。特定の実施形態では、活性なタンパク質とは、構成的に活性であるタンパク質を指す。コード配列は好ましくは、センス方向であり、所望の生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチドまたは活性なペプチド断片をコードする。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」とは、機能的に関連するポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連して配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、厳密に言うと転写調節配列は、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているDNA配列が、典型的には近接していること、および2つ以上のタンパク質コード領域を接続することが必要な場合、近接しかつインリーディングフレームであることを意味する。
【００１７】
用語「遺伝子構築物」は、適切な調節領域(例えば、プロモーター)に作動可能に連結された、細胞中でRNA分子(例えば、mRNA)へと転写される領域(転写領域)を含むDNA配列を意味する。従って、遺伝子構築物は、いくつかの作動可能に連結された配列、例えば、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む5'リーダー配列、(タンパク質)コード領域、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、イントロン配列およびエクソン配列、ならびに例えば転写終結配列部位を含む3'非翻訳(non-translated)配列(3'非翻訳(untranslated)配列または3'UTRとしても公知)を含み得る。
【００１８】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、これらの配列は、最高次数の一致が得られるようにアラインされる。「同一性」自体は、当該分野で認識された意味を有し、公開された技術を使用して計算できる。例えば:(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988;BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994;SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987;ならびにSEQUENCE ANALYSIS PRIMER;Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991)を参照のこと。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多数の方法が存在するが、用語「同一性」は、当業者に周知である(Carillo, H.およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073)。2つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般に使用される方法には、GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、1994、ならびにCarillo, H.およびLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073に開示された方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法は、コンピュータプログラムにおいて成文化される。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、GCSプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403)が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
例示として、特定の配列のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば95%の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の各100ヌクレオチド当たり最大5つの点変異を含み得ることを除き、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを意図する。従って、参照ヌクレオチド配列に対するあるヌクレオチド配列の同一性の百分率は、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを取得するために、参照配列中の最大5%のヌクレオチドが、欠失され得るおよび/もしくは別のヌクレオチドで置換され得る、ならびに/または参照配列中の総ヌクレオチドの最大5%までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'末端または3'末端の位置、あるいは参照配列中のヌクレオチド間に個々にまたは参照配列内の1つもしくは複数の近接群中でのいずれかで散在するこれらの末端位置の間の任意の場所に存在し得る。
【００２０】
同様に、配列番号1または配列番号2の参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば95%の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、このポリペプチド配列が配列番号1または配列番号2の参照アミノ酸の各100アミノ酸当たり最大5つのアミノ酸変更を含み得ることを除き、このポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に対して同一であることを意図する。従って、参照アミノ酸配列に対するあるアミノ酸配列の同一性の百分率は、参照アミノ酸配列の全長にわたって計算される。言い換えると、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを取得するために、参照配列中の最大5%のアミノ酸残基が、欠失され得るもしくは別のアミノ酸で置換され得る、または参照配列中の総アミノ酸残基の最大5%までの多数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置、あるいは参照配列中の残基間に個々にまたは参照配列内の1つもしくは複数の近接基中でのいずれかで散在するこれらの末端位置の間の任意の場所に存在し得る。
【００２１】
本発明に従う「核酸」または「核酸配列」は、それぞれピリミジン塩基およびプリン塩基、好ましくはシトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンならびにグアニンの任意のポリマーまたはオリゴマーを含み得る(全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Albert L. Lehninger、Principles of Biochemistry、793〜800(Worth Pub. 1982)を参照のこと)。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸構成成分、およびそれらの任意の化学的バリアント、例えばこれらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化またはグリコシル化形態などを企図する。これらのポリマーまたはオリゴマーは、組成物中で異種または同種であり得、天然に存在する供給源から単離され得るか、または人工的にもしくは合成により産生され得る。さらに、核酸は、DNAもしくはRNAまたはそれらの混合物であってもよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリッド状態を含む一本鎖形態または二本鎖形態で、永続的にまたは一過的に存在し得る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置付けられる、1つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸配列を指し、DNA依存的RNAポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、ならびに、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を直接的または間接的に調節するように作用する当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列が含まれるがこれらに限定されない任意の他のDNA配列の存在によって構造的に同定される。任意選択で、用語「プロモーター」は、本明細書で、5'UTR領域(5'非翻訳領域)もまた含み得る(例えば、プロモーターは、本明細書で、遺伝子の翻訳開始コドンの上流(5')の1つまたは複数の部分を含み得るが、これはこの領域が、転写および/または翻訳を調節することにおいて役割を有し得るからである)。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件下および発生条件下でほとんどの組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的に(例えば、特定の化合物の外的適用によって)または発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の組織または細胞でのみ活性である。「特定の細胞型、特にT細胞において活性なプロモーター」とは、かかる細胞型内で転写を駆動する、プロモーターの一般的な能力を指す。プロモーターの時空的活性に関しては何も暗示されていない。
【００２３】
用語「アミノ酸配列」または「タンパク質」または「ペプチド」とは、特定の様式の作用、サイズ、3次元構造または起源を参照しない、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。従って、その「断片」または「一部分」もまた、「アミノ酸配列」または「タンパク質」または「ペプチド」として言及され得る。「単離されたアミノ酸配列」は、例えばin vitroのまたは組換え細菌もしくはヒト宿主細胞中の、その天然の環境中にもはや存在しないアミノ酸配列を指すために使用される。
【００２４】
「操作された細胞」とは、本明細書で、例えば、外因性核酸配列の導入または内因性遺伝子配列の特異的変更によって操作された細胞を指す。かかる細胞は、例えば、内因性遺伝子における例えば1つまたは複数の変異、挿入および/または欠失の導入によって、ならびに/あるいはゲノムにおける遺伝子構築物の挿入によって、遺伝子改変されている。操作された細胞は、単離されたまたは培養物中の細胞を指し得る。操作された細胞は、「形質導入された細胞」であり得、この細胞は、例えば改変されたウイルスに感染しており、例えば実施例において記載されたような、レトロウイルスが使用され得るが、レンチウイルスなどの他の適切なウイルスもまた企図され得る。トランスフェクションなどの非ウイルス方法もまた使用され得る。操作された細胞は、従って、「安定にトランスフェクトされた細胞」または「一過的にトランスフェクトされた細胞」でもあり得る。トランスフェクションとは、遺伝子が発現されるように細胞にDNA(またはRNA)を移入するための非ウイルス方法を指す。核酸のリン酸カルシウムトランスフェクション、PEGトランスフェクション、およびリポソームまたはリポプレックストランスフェクションなどのトランスフェクション方法は、当該分野で広く公知である。かかるトランスフェクションは、一過的であり得るが、安定なトランスフェクションであってもよく、ここでは、そのゲノム中に組み込まれた遺伝子構築物を有する細胞が選択され得る。
【００２５】
「ランダムに改変する」とは、実施例のセクションに記載したように、ランダム配列を生成することを含み、天然に存在する、ヒトなどの被験体から誘導されるγ9δ2T細胞レセプター配列から誘導され得るδ2-CDR3コード領域および/またはγ9-CDR-3コード領域を選択することもまた含み、かかるγ9-CDR3配列およびδ2-CDR3配列は、データベースから選択した。ランダム配列を生成することは、最大で出発配列由来の全てのアミノ酸が改変され得る点まで、出発γ9-CDR-3配列およびδ2-CDR-3配列中の1つまたはいくつかのアミノ酸を改変することを含む。アミノ酸配列を改変することは、そのコドンによってコードされるアミノ酸が変更されるように、コドンのヌクレオチド配列を変化させることによって行われ得る。
【００２６】
アミノ酸配列に関して用語「〜に対応する」とは、1つの配列が、対応する配列、例えばアミノ酸残基50〜70を含む参照配列とアラインされる場合に、この例のアミノ酸残基50〜70とアラインするアミノ酸が、1つの配列の対応するアミノ酸残基であることを意味する。対応するアミノ酸がγ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域からアラインされるアラインメントの例は、table 3(表3)に示される。
【００２７】
用語「選択可能なマーカー」は、当業者に知られた用語であり、発現された場合に、この選択可能なマーカーを含む細胞(単数または複数)を選択するために使用され得る任意の遺伝的実体を記述するために本明細書で使用される。選択可能なマーカーの遺伝子産物は、例えば抗生物質耐性、または別の選択可能な形質もしくは栄養要求性を付与する。当該分野で周知のような選択可能なマーカーには、緑色蛍光タンパク質(GFP)、eGFP、ルシフェラーゼ、GUSなどが含まれる。
【００２８】
発明の詳細な説明
第1の態様では、本発明は、抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞レセプターを同定するための方法に関し、この方法は、
a)T細胞を用意する工程;
b)γ9-CDR3コード領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列とδ2-CDR3コード領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列とを用意する工程であって、このγ9-CDR3コード領域がランダムに改変され、このδ2-CDR3コード領域がランダムに改変される、工程;
c)工程b)の核酸配列をT細胞中に導入して、工程b)のγ9-T細胞レセプター鎖および工程b)のδ2-T細胞レセプター鎖を含むγ9δ2T細胞レセプターを有する操作されたT細胞を用意する工程;
d)任意選択で、工程b)および工程c)を反復する工程;
e)工程c)および工程d)において用意される操作されたT細胞の抗腫瘍応答を決定する工程;
f)抗腫瘍応答を媒介する、操作されたT細胞のγ9δ2T細胞レセプターを同定する工程、
を含む。
【００２９】
T細胞またはTリンパ球は、細胞媒介性免疫において役割を果たす、リンパ球と称される白血球の群に属する。T細胞は、骨髄中の造血幹細胞に起源し、胸腺(即ち、Tが誘導される場所)において成熟し、末梢リンパ組織においてその完全な機能を獲得する。T細胞の発生の間に、CD4-CD8-T細胞(CD4およびCD8コレセプターの両方について陰性)は、初期のβまたはδTCR遺伝子再編成の結果として、αβ運命またはγδ運命のいずれかに傾倒する。早期β鎖再編成を受ける細胞は、細胞表面上に完全β鎖およびプレ-TCRα鎖から構成されるプレ-TCR構造を発現する。かかる細胞は、CD4+CD8+T状態に切り替わり、TCRα鎖遺伝子座を再編成し、その表面上に成熟αβTCRを発現する。β遺伝子の再編成の前にγ遺伝子の再編成を首尾よく完了させるCD4-CD8-T細胞は、機能的γδTCRを発現し、CD4-CD8-のままである(Claudio Tripodoら  Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6、707〜717(2009年12月))。T細胞レセプターは、CD3タンパク質複合体と会合する。成熟T細胞、即ち、αβTCRまたはγδTCRを発現するT細胞は、細胞表面上にT細胞レセプター複合体を発現する。T細胞の総集団の約1〜5%を構成するγδT細胞は、さらなる下位集団に分割され得る。γδT細胞の下位集団は、γ9δ2TCRを発現するγ9δ2T細胞を構成する。T細胞レセプターの細胞外ドメイン内には、3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、CDR3)が位置付けられる。これらの領域は一般に、最も可変性のドメインであり、TCR間の多様性に顕著に寄与する。CDR領域は、いわゆるVariable-(V)、Diverse-(D)およびJoining-(J)遺伝子セグメントがランダムに組み合わされて多様なTCRを生成する、T細胞の発生の間に構成される。
【００３０】
αβT細胞は、種々の細胞の表面上に発現されるMHC分子(主要組織適合性複合体)に結合したペプチドを認識するαβTCRを発現するTリンパ球としての機能に関して規定され得る。MHCは、細胞のタンパク質由来のペプチドを提示する。例えば細胞がウイルスに感染する場合、MHCはウイルスペプチドを提示し、αβTCRとMHC複合体との間の相互作用は、感染細胞を排除する免疫応答を開始させる特定の型のT細胞を活性化する。従って、αβT細胞は、MHC分子に結合したペプチドを認識することが可能な細胞として機能的に規定され得る。αβT細胞は、例えば以下および実施例に記載されるようにCD3抗原を介して末梢血から選択され得るが、これは、T細胞の大部分がαβTCRを有するからである。αβT細胞は、以下に記載するように、αβTCRに対して特異的な抗体を用いても選択され得る。かかる選択された細胞から、αT細胞レセプター鎖およびβT細胞レセプター鎖に対応する核酸(またはアミノ酸)配列が決定され得る。従って、αβT細胞は、αT細胞レセプター鎖および/またはβT細胞レセプター鎖に対応する核酸(またはアミノ酸)配列を含む細胞としても規定され得る。
【００３１】
γ9δ2T細胞は、集合的にリン酸化抗原(phosphoantigen)と称される非ペプチド性リン酸化イソプレノイド前駆体のセットによって特異的かつ迅速に活性化されるという点で、機能的に規定され得る。リン酸化抗原は、事実上全ての生存細胞によって産生される。動物およびヒトの細胞(癌細胞を含む)において見出される最も一般的なリン酸化抗原は、イソペンテニルピロリン酸(IPP)およびその異性体ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)である。γ9δ2T細胞の活性化は、クローン増殖、細胞傷害活性およびサイトカインの発現を含む。γ9δ2T細胞は、γ9δ2T細胞レセプターの発現によっても規定される。例えば、細胞は、以下に記載されるように、γ9δ2T細胞レセプターに対して特異的な抗体を使用して選択され得る。かかる選択された細胞から、γ9T細胞レセプター鎖および/またはδ2T細胞レセプター鎖に対応する核酸(またはアミノ酸配列)配列が決定され得る。従って、γ9δ2T細胞は、γ9T細胞レセプター鎖および/またはδ2T細胞レセプター鎖に対応する核酸(またはアミノ酸)配列を含む細胞としても規定され得る。
【００３２】
当業者には、本明細書中に記載されるような細胞の表面上での抗原またはレセプターの発現によって特徴付けられる細胞集団を選択および/または同定することが十分に可能である。CD3、CD4、CD8、αβTCR、γδTCRおよびγ9δ2TCRなどの細胞の表面上での発現に関して、より低いレベルの発現を有する細胞と比較した場合、細胞の一部分がかなり高いレベルの発現の抗原を有する細胞の集団において、これが典型的に行われることが理解される。しかし、用語陽性または陰性は、相対的であると理解すべきである、即ち、陽性細胞は、陰性である細胞と比較してかなり高い発現レベルを有する。従って、この意味において陰性である細胞は、検出され得る発現レベルをなおも有し得る。細胞の表面上での発現は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を使用して分析され得、実施例において記載され入手可能な、かかるFACS分析に適切な、例えばCD3、CD4、CD8、αβTCR、γδTCRおよびγ9δ2TCRに対する抗体などの多くの特異的抗体が市販されている。従って、γ9δ2T細胞は、FACSにおいてγ9δ2TCRに対して陽性であるとして規定および選択することもできる。FACSまたは類似の分離技術に適した抗体(例えば、磁気ビーズにコンジュゲート化された抗体など)は、広く入手可能である。陰性細胞および/または陽性細胞の選択を可能にする、抗体製造業者によって提供されるような条件が選択される。BD Pharmingen(BD、1 Becton Drive、Franklin Lakes、NJ USA)から入手可能なものなどの、γ9δ2-T細胞または操作されたγ9δ2T細胞の選択に適し得る抗体の例は、Vγ9-PE(クローンB3、#555733)、Vδ2-FITC(クローンB6、#555738)、γδTCR-APC(クローンB1、#555718)であり、またはBeckman Coulterから入手可能なものなどの、pan-γδTCR-PE(クローンIMMU510、#IM1418U)である。同様に、αβ-T細胞選択に適した抗体、例えばBD Pharmingenから入手可能なものなどであり得る抗CD3抗体は、CD3-FITC(#345763)であり、またはBeckman Coulterから入手可能なものなどの抗αβTCR抗体は、pan-αβTCR-PE(#A39499)またはpan-αβTCR-PC5(#A39500)である。
【００３３】
従って、本発明の方法では、最初にT細胞が提供される。このT細胞は、ヒト被験体について実施例に記載されるように、例えば被験体由来の初代細胞であり得る。このT細胞はαβT細胞であり得る。このT細胞は、株細胞、例えばSupT-1、JurkatもしくはRaji細胞または任意の他の広く入手可能な株細胞であってもよい。細胞集団またはその実質的な部分がT細胞レセプターを発現する限り、即ち、例えば上記のようなFACSソーティングなどにおいてαβT細胞レセプターについて陽性である限り、初代細胞または任意の他の株細胞である任意の細胞型が十分であり、かかる細胞集団が企図され得る。また、本発明に従うγ9δ2TCRレセプターが提供された場合、機能的TCR複合体を形成することが可能であり、かつ例えば、機能的細胞傷害応答および/またはサイトカイン産生を発揮することが可能である、任意の細胞または細胞集団が企図され得る。前駆細胞、好ましくは血液前駆細胞、例えば胸腺細胞または血液幹細胞でもあり得る細胞が提供され、これは、正しい刺激が提供された後、T細胞または操作されたT細胞へと発生し得る。従って、T細胞を提供し、これらに本発明に従うγ9δ2TCRレセプターを提供することは、前駆細胞を提供し、これらにγ9δ2TCRレセプターを提供し、操作されたT細胞に発生するようにこれらの前駆細胞を刺激することも含み得ることが理解される。
【００３４】
また、γ9-CDR3コード領域がランダムに改変されたγ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列と、δ2-CDR3コード領域がランダムに改変されたδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列とが提供される。好ましくは、このγ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖はヒト起源のものである。γ9およびδ2のヒトCDR3領域は、十分に規定されている。例えば、アミノ酸配列配列番号1のγ9-TCR鎖のヒトCDR3領域は、International Immunogenetics Information System(IMGT)に従うアミノ酸残基γ105〜γ107に対応するアミノ酸残基118〜132に対応する。アミノ酸配列配列番号2のδ2TCR鎖のヒトCDR3領域は、IMGTに従うアミノ酸残基δ105〜δ117に対応するアミノ酸残基112〜127に対応する。International Immunogenetics Information System(IMGT)(参照によって本明細書に組み込まれるLefranc MP. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. 2003;31:307〜310)によれば、ヒトCDR3領域は、各鎖についてγC104およびγF118ならびにδC104およびδF118と言及されるアンカー位置C104およびF118によって範囲を定められ得るがこれらを含まない、table 3(表3)もまた参照のこと。アンカー位置γC104は、配列番号1中のC117に対応し、γF118は配列番号1中のF133に対応する。アンカー位置δC104は、アミノ酸配列配列番号2のC111に対応し、アンカー位置δF118は、アミノ酸配列配列番号2のF128に対応する。IMGTは、例えばヒトT細胞レセプターを含む異なる種のT細胞レセプターの配列、ゲノムおよび構造に対する一般的なアクセスを提供し、例えばアンカー位置を介して、CDR3領域を含むγ9T細胞レセプター鎖およびδ2T細胞レセプター鎖の同定を可能にする。
【００３５】
IMGTによれば、CDR3は、アンカー位置第2CYS 104およびJ-PHEまたはJ-TRP 118によって範囲を定められる(がこれらは含まない)。JUNCTIONは、第2CYS 104およびJ-PHEまたはJ-TRP 118を含み、従って、CDR3よりも2アミノ酸長い。CDR3の番号付けは、105から117におよび、必要に応じて、ギャップまたはさらなる位置が、ループの上部に付加される。J-PHEまたはJ-TRPは、位置118〜121において特徴的なJ-REGIONモチーフ「F/W-G-X-G」に属すること、および、レセプターの型(IGもしくはTR)、鎖の型(IGについては重鎖または軽鎖;TRについてはアルファ、ベータ、ガンマまたはデルタ)または種が何であれ、CDR3は、同じアンカー位置(第2CYS 104およびJ-PHEまたはJ-TRP 118)によって範囲が定められることに留意のこと。IMGT番号付けの説明については、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTIGVLsuperfamily.htmlも参照のこと。このIMGT番号付けは、実施例においても使用される。
【００３６】
従って、IMGT標準に従うアンカー位置を使用することによって、CDR3領域は、容易に同定することができる。例えば、IMGTによって提供されるような利用可能なオンラインツール(例えばIMGT/V-QUEST)を使用してアミノ酸配列(または核酸配列)を入力することを介して、γ9T細胞レセプター鎖配列またはδ2T細胞レセプター鎖配列、ならびに正確なCDR3領域が、容易に同定され得る。あるいは、既に公に入手可能なγ9T細胞レセプター鎖配列またはδ2T細胞レセプター鎖配列は、IMGTにおいて見出すことができ、従って、CDR3領域は、そこから容易に同定することができる。あるいは、参照配列として配列番号1および配列番号2を使用し、その中のアンカーアミノ酸残基位置を使用して、他のγ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖のCDR3領域が、異なるCDR3領域についてtable3(表3)中に示されるように、アラインメントを介して容易に同定される。従って、当業者は、配列番号1由来のCDR3領域に対応する任意のγ9T細胞レセプター鎖配列から任意のCDR3領域を容易に同定でき、また、当業者は、配列番号2由来のCDR3領域に対応する任意のδ2T細胞レセプター鎖配列から任意のCDR3領域を容易に同定できる。従って、当業者は、任意の9-T細胞レセプター鎖および/またはδ2-T細胞レセプター鎖由来のどのアミノ酸をランダムに改変する必要があるかを知っている。
【００３７】
従って、δ2-T細胞レセプター鎖核酸配列中のδ2-CDR3コード領域を改変することは、配列番号4の核酸配列を目的のδ2-T細胞レセプター鎖核酸配列とアラインさせること、配列番号4中のアンカー位置をコードするコドンに対応するδ2-T細胞レセプター鎖核酸配列中のコドンを同定すること、および目的のδ2-T細胞レセプター鎖核酸配列において同定されたアンカー位置のコドン間でこの核酸配列をランダムに改変することを含み得る。また、γ9-T細胞レセプター鎖核酸配列中のγ9-CDR3コード領域を改変することは、配列番号3の核酸配列を目的のγ9-T細胞レセプター鎖核酸配列とアラインさせること、配列番号3中のアンカー位置をコードするコドンに対応するγ9-T細胞レセプター鎖核酸配列中のコドンを同定すること、および目的のγ9-T細胞レセプター鎖核酸配列において同定されたアンカー位置のコドン間でこの核酸配列をランダムに改変することを含み得る。CDR3コード領域の核酸配列のランダム改変は、この核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が改変されるような改変、即ち、少なくとも1つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基において変化されるような改変、または少なくとも1つのアミノ酸残基が挿入もしくは欠失されるような改変である。
【００３８】
γ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、γ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖を含むγ9δ2T細胞レセプターを有する操作されたT細胞を提供するために、T細胞中に導入され得る。CDR3領域がランダムに改変されたγ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖を発現させることによって、特異的γ9δ2-T細胞レセプターが、この細胞において発現される。任意選択で、CDR3がランダムに改変されたγ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖を用意する工程、ならびに引き続くT細胞中への導入は、反復され得る。例えば、これが行われるたびに、異なる組み合わせのランダムに改変されたCDR3領域が使用される。例えば異なる組み合わせのランダムに改変されたCDR3領域を用いてこれらの工程を反復する工程が、少なくとも一部は同時に実施され得ることも想定される。例えば、γ9-CDR3コード領域がランダムに改変されたγ9-T細胞レセプター鎖をコードする複数の核酸配列およびδ2-CDR3コード領域がランダムに改変されたδ2-T細胞レセプター鎖をコードする複数の核酸配列が提供され得、この複数の核酸配列は、T細胞中に導入され得、それにより、複数の操作されたT細胞を提供する。
【００３９】
抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞レセプターまたは操作されたγ9δ2T細胞レセプターを発現している用意される操作されたT細胞の抗腫瘍応答が同定される。核酸配列を用意する工程およびT細胞中への導入が別々の工程で実施される場合、抗腫瘍応答を決定する工程および操作されたγ9δ2T細胞レセプターを同定する工程が組み合わされ得るが、これは、対応する操作されたγ9δ2T細胞の各々においてどの核酸配列が導入されたかが知られているからである。従って、抗腫瘍応答を決定する工程は、各操作されたγ9δ2T細胞に対して別々に実施され得る。あるいは、例えば操作されたγ9δ2T細胞が組み合わされる場合、例えば、上記のような工程を反復することが同時に実施され、複数の操作されたT細胞が提供される場合、この操作されたT細胞は分離され得、抗腫瘍応答が、分離された操作されたT細胞の各々について決定され得る。この操作されたT細胞は、異なる区画を越えて分離され得、区画の各々において、抗腫瘍応答が決定され得る。かかるシナリオでは、抗腫瘍応答を媒介する操作されたT細胞を同定する工程は、例えば、γ9δ2TCRのCDR3領域の各々をコードする核酸配列の配列決定を介して、配列を決定することを含み得る。従って、任意選択で最終工程として、抗腫瘍応答を媒介する操作されたT細胞を同定する工程は、γ9-CDR3コード領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列およびδ2-CDR3コード領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列を決定することを含む。γ9-CDR3コード領域およびδ2-CDR3コード領域の両方の核酸配列だけを決定することも、想定され得る、即ち、γ9-T細胞レセプター鎖および/またはδ2-T細胞レセプター鎖の完全核酸配列を決定することは必要とされない。核酸配列を決定することの代替法として、γ9-CDR3およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列もまた決定され得る。
【００４０】
好ましくは、γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、δ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70、80、90、95または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。δ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも70、80、90、95または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。当業者は、機能に関してγ9δ2-T細胞レセプターを規定することが可能である。好ましくは、配列同一性の百分率は、配列番号1または配列番号2の全長にわたって計算される。
【００４１】
γ9-CDR3およびδ2-CDR3のCDR3領域のランダム改変は、アミノ酸残基の自由裁量の選択を含み得る。かかる自由裁量の選択は、化学合成を使用してSloning Biotechnologyによって提供されるように(Sloning BioTechnology GmbH-A Division of MorphoSys、Zeppelinstrasse 4、82178 Puchheim、Germany)、例えばランダム化学合成によってin vitroでランダム配列を生成することによって行うことができる。γ9-CDR3およびδ2-CDR3のCDR3領域のランダム改変は、天然CDR3領域中に見出される配列からの自由裁量の選択もまた含み得る。かかる天然CDR3のアミノ酸配列は、元来、ランダムに生成される、即ち、自由裁量で選択される。
【００４２】
ランダム改変に関して、ランダムに改変されたγ9-CDR3コード領域は、好ましくは、配列番号1のアミノ酸残基118〜132に対応するアミノ酸配列において改変され得る。ランダム改変に関して、ランダムに改変されたγ9-CDR3コード領域は、好ましくは、配列番号1のアミノ酸残基122〜124に対応するアミノ酸配列において改変され得る。述べたように、γ9-CDR3コード領域は、例えば、アラインメントを介しておよび/またはIMGTによって提供された情報から、容易に同定され、従って、配列番号1のアミノ酸残基118〜132に対応するγ9-CDR3コード領域由来のアミノ酸残基も同様である。任意選択で、配列番号1のアミノ酸残基C117およびF133が、対応するアミノ酸残基を同定するためにさらに使用され得る。アラインメントでは、table 3(表3)に示したように、アミノ酸配列配列番号1のアミノ酸残基118〜132に対応するγ9-CDR3コード領域のアミノ酸残基は、容易に同定され得、従って、配列番号1のアミノ酸残基122〜124に対応するアミノ酸残基も同様である。従って、対応する配列は、目的のアミノ酸配列を参照アミノ酸配列(配列番号1)とアラインさせ、アンカーアミノ酸残基C117およびF133を同定することを介して容易に同定され得、その結果、CDR3領域が同定される。次に、これらのCDR3領域がアラインされ、配列番号1の118〜132に対応するアミノ酸配列のアミノ酸残基が同定される。ランダム改変に関して、ランダムに改変されたδ2-CDR3コード領域は、配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するアミノ酸配列において改変され得る。ランダム改変に関して、ランダムに改変されたδ2-CDR3コード領域は、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するアミノ酸配列において改変され得る。δ2-CDR3コード領域は、例えば、アラインメントを介しておよび/またはIMGTによって提供された情報から、容易に同定され得、従って、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2-CDR3コード領域由来のアミノ酸残基も同様である。任意選択で、配列番号2のアミノ酸残基C111およびF128が、対応するアミノ酸残基を同定するためにさらに使用され得る。アラインメントでは、table 3(表3)に示したように、アミノ酸配列配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2CDR3コード領域のアミノ酸残基が、容易に同定され得る。従って、対応する配列は、目的のアミノ酸配列を参照アミノ酸配列(配列番号2)とアラインさせ、アンカーアミノ酸残基C111およびF128を同定することを介して容易に同定され得、その結果、CDR3領域が同定される。次に、これらのCDR3領域がアラインされ、配列番号2の112〜127に対応するアミノ酸配列のアミノ酸残基が同定され得、従って、アミノ酸残基115〜122に対応するアミノ酸配列も同様である。
【００４３】
1実施形態では、配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するアミノ酸配列をランダムに改変することは、長さにおける改変を含む。
【００４４】
1実施形態では、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するアミノ酸配列をランダムに改変することは、長さにおける改変を含む。
【００４５】
1実施形態では、アミノ酸配列をランダムに改変することは、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を導入することを含む。
【００４６】
ランダム改変に関して、これは、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入などの任意の改変を含み得る。従って、ランダム改変は、配列および/または長さにおける改変を含み得る。従って、これらのCDR3領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸残基の範囲で、長さが変動し得る。好ましくは、δ2-CDR3コード領域は、IGMTアノテーションに従って位置δL109とδT113との間で、5〜7アミノ酸の範囲で長さが変動し得る。従って、好ましくは、配列番号2のアミノ酸配列112〜127に対応するδ2-CDR3コード領域は、この領域中に5〜7アミノ酸を含むように、配列番号2のL116とT123との間でランダムに改変される。従って、δ2-CDR3コード領域全体は、好ましくは、15〜17アミノ酸残基の範囲で長さが変動する。アミノ酸置換には、1つの群由来の1つのアミノ酸がその群の別のアミノ酸残基に変化している、例えば、1つの脂肪族アミノ酸残基が別の脂肪族アミノ酸残基に交換されている、保存された置換、あるいは1つの群由来の1つのアミノ酸が異なる群の別のアミノ酸残基に変化している、例えば、1つの脂肪族アミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基に交換されている、保存されていない置換などの、任意の置換が含まれ得る。
【００４７】
核酸を提供することに関して、核酸は、それが発現され得る細胞中に導入された場合、それがコードするアミノ酸配列が細胞の表面上に発現されるように提供されることが理解される。好ましくは、これは、細胞のゲノム中に核酸(単数または複数)を組み込むことによって行われる。好ましくは、γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、1つの遺伝子構築物中に提供され、δ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、1つの遺伝子構築物中に提供される。これらの遺伝子構築物は、別々のベクター上に提供され得る。これらの遺伝子構築物は、単一のベクター上に提供されてもよい。γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列およびδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、単一の遺伝子構築物中に提供されてもよい。例えば、単一の遺伝子構築物は、実施例に記載されるように、各レセプター鎖が同じmRNAから転写され得るように、内部リボソーム侵入部位を含む単一のmRNAを発現し得る。
【００４８】
この遺伝子構築物および/またはベクターは、選択可能なマーカーもまた含み得る。選択可能なマーカーは、それが提供された細胞が選択されるのを可能にする任意の核酸配列および/またはアミノ酸配列として定義され得る。例えば、選択可能なマーカーは、実施例に記載されるような、ネオマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子であり得る。遺伝子構築物および/またはベクターが移入された細胞の選択は、むしろ、ネオマイシンまたはピューロマイシンの存在下でインキュベートすることによって、実施され得る。他の選択可能なマーカーは、例えば、緑色、赤色および黄色蛍光タンパク質のうちいずれか1つであり得る。選択することは、むしろ、FACSを使用することによって実施され得る。γ9δ2T細胞レセプターを発現する場合、細胞は、例えば、上記のようなこのレセプターに対する抗体を用いた選択を介して、それ自体上の発現に基づいて選択され得るので、選択可能なマーカーを有することは必要とされない。宿主細胞は、操作されたγ9δ2T細胞の選択を可能にするために、実質的な量のγ9δ2T細胞レセプターを発現しない、即ち、内因性γ9δ2-T細胞レセプターの発現は、操作されたγ9δ2-T細胞レセプターと比較してかなり低くなければならないことを条件とし得る。
【００４９】
好ましくは、γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、1つのレトロウイルスベクター中に提供され、δ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、1つのレトロウイルスベクター中に提供され、これらの核酸配列をT細胞中に導入する工程は、このT細胞のレトロウイルスベクター形質導入を含む。形質導入は、同時にまたは引き続く工程において実施され得る。あるいは、γ9-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列およびδ2-T細胞レセプター鎖をコードする核酸配列は、単一のレトロウイルスベクター中に提供され、これらの核酸配列をT細胞中に導入する工程は、このT細胞のレトロウイルスベクター形質導入を含む。実施例に記載されるようなレトロウイルスベクターは、操作されたT細胞が提供できるように、T細胞に核酸配列を移入するのに高度に効率的である。多くのレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、公知であるか、または実施例に記載される通りである。レトロウイルスベクターは、細胞中に進入する場合、宿主ゲノム中に引き続いて組み込まれるDNAへと逆転写されるRNAゲノムを有する。組込みは、遺伝子構築物を含むウイルスベクターゲノムを維持しつつ形質導入された細胞の増殖を可能にするので、有利である。
【００５０】
1実施形態では、抗腫瘍反応性を決定する工程は、細胞を腫瘍細胞と接触させる工程を含む。腫瘍細胞は、任意の種類の腫瘍細胞、例えば、患者由来の初代腫瘍細胞であり得る。これらの腫瘍細胞は、当該分野で周知の、実施例に列挙された株細胞、名称Daudi、RPMI8226/S、OPM2、LME1、K562、Saos2、MZ1851RC、SCC9、Fadu、MDA-MB231、MCF7、BT549、SW480などの株細胞由来の腫瘍細胞であり得る。腫瘍株細胞は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、Virginia)などから容易に取得され得る。抗腫瘍活性を決定する工程は、腫瘍細胞分裂速度、即ち腫瘍細胞が分裂する速度、細胞死、腫瘍細胞に対する結合などに対する影響を有するなどの抗腫瘍効果が決定され得る、任意のアッセイを含み得る。
【００５１】
抗腫瘍応答を決定する工程は、操作されたT細胞を腫瘍細胞と接触させる工程、ならびに腫瘍細胞を溶解させるおよび/またはIFN-γ産生を誘導するその能力を測定する工程、を含む。腫瘍細胞を溶解させる能力は、操作されたγ9δ2T細胞、即ち、γ9δ2TCRを発現する操作されたT細胞が接触される一定量の腫瘍細胞を提供することを含み、インキュベーション期間後に生存腫瘍細胞の数が計数される。計数された生存細胞の数は、操作されたγ9δ2T細胞と接触していないコントロールと比較され、この数がより低い場合、かかる操作されたγ9δ2T細胞は、抗腫瘍応答を有するとみなすことができる。生存細胞を計数することに加えて、実施例に記載されたものと同様に51クロム放出アッセイを実施することもできる。51クロム放出の量は、溶解された細胞の数の尺度である。
【００５２】
同様に、IFN-γ産生は、例えば、発現されたmRNAに対する抗体染色、ELISAおよび/または定量的PCRを介しても、決定され得る。IFN-γを決定するためのアッセイは、実施例に記載されたように、広く市販されている。操作されたγ9δ2T細胞を、腫瘍細胞と接触させる。接触させる工程は、パミドロネートなどのリン酸化抗原の存在下であり得る。従って、産生されたIFN-γの量が、操作されたγ9δ2T細胞と接触していない細胞と比較して高かった場合、かかる操作されたγ9δ2T細胞は、抗腫瘍応答を有するとみなされ得る。コントロール、即ち、操作されたγ9δ2T細胞と接触していない細胞と比較することに加えて、参照値とも比較することができる。任意の場合において、γ9δ2T細胞を腫瘍細胞と接触させることを含む、腫瘍細胞に対する影響が決定され得る任意のアッセイが、企図され得る。抗腫瘍効果、例えば細胞死の誘導、細胞生存度、腫瘍細胞に対する結合および/またはIFN-γ産生が決定され得る限り。
【００５３】
さらに、上記方法に関して、T細胞は、操作されたγ9δ2T細胞レセプター、即ちランダムに改変されたCDR3領域を有するγ9δ2T細胞レセプターをコードする核酸の移入の前または後に、増殖され得る。好ましくは、この増殖は、比較的少ない核酸が移入される必要があるように、移入後である。T細胞のこの増殖は、IL-2の存在下でα-CD3/CD28 Dynabeadsを用いた刺激によって実施され得る。実施例に記載されるような迅速な増殖プロトコールもまた使用され得る。例えば、上記のものなどの選択可能なマーカーを介して選択され得る、操作されたγ9δ2T細胞レセプターを含む増殖した細胞は、例えば、実施例に記載されるようなMACS分離システムを使用して、CD4抗原およびCD8抗原の存在についてさらに選択され得る。操作されたT細胞は、参照によって本明細書に組み込まれるRiddelおよびGreenberg、1990 J Immunol Methods. 128(2):189〜201に記載されるREPプロトコールを使用して、またはそれに類似するさらなる増殖方法を使用して、引き続いてさらに増殖され得る。簡潔に述べると、この増殖方法は、TCR、CD3およびCD28などのT細胞活性化分子に対する抗体ならびに/またはフィーダー細胞ならびに/または刺激性サイトカインを使用することを含む。
【００５４】
別の実施形態では、γ9-CDR3領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖とδ2-CDR3領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖とを含むγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片が提供され、配列番号1のアミノ酸残基122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列が改変され、配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列が改変され、γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片内のアミノ酸改変の組み合わせは、Table1(表1)中に列挙される通りである。置換は、table 1(表1)中に列挙されるものなどの組み合わせを含み得る。それぞれのγ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列は、アミノ酸配列の組み合わせAQQ(γ9)およびALKRTD(δ2);AQQ(γ9)およびLLGY(δ2);IQ(γ9)およびALKRTD(δ2);ならびに;IQ(γ9)およびTLGMGGEY(δ2)からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換される。これら特定の組み合わせのCDR3領域を含むγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片は、上記されるようなおよび実施例に記載されるような、本発明に従う方法を使用して同定した。
【００５５】
好ましく組み合わされ得るγ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列の組み合わせが、抗腫瘍効果を示すので、table 1(表1)中に以下に列挙される。Table 1(表1)。γ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列の組み合わせ。置換されている、即ち改変されている、配列番号1の番号122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸残基に対応する領域が列挙され、置換されている、配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸残基に対応する領域も同様に列挙される。γ9-CDR3およびδ2-CDR3の異なる組み合わせは、1〜4と番号付けされる。例えば、2番は、配列番号1の番号122〜124に対応するγ9-CDR3領域がAQQで置換されているγ9-T細胞レセプター鎖と、配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域がALKRTDで置換されているδ2T細胞レセプター鎖とを有するγ9δ2TCRに対応する。
【００５６】
【表１】
2018153200.tif 000002
【００５７】
別の実施形態では、γ9-CDR3領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖とδ2-CDR3領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖とを含むγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片が提供され、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基118〜132に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列が改変され、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列が改変され、γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片内のアミノ酸改変の組み合わせは、Table 2(表2)中に列挙される通りである。置換は、table 2(表2)中に列挙されるものなどの組み合わせを含み得る。それぞれのγ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列は、アミノ酸配列の組み合わせALWEIQELGKKIKV(γ9)およびACDALKRTDTDKLI(δ2);ALWEAQQELGKKIKV(γ9)およびACDALKRTDTDKLI(δ2);ALWEIQELGKKIKV(γ9)およびACDTLGMGGEYTDKLI(δ2);ALWEAQQELGKKIKV(γ9)およびACDLLGYTDKLI(δ2)からなる群より選択されるアミノ酸配列で置換される。これら特定の組み合わせのCDR3領域を含むγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片は、上記されるようなおよび実施例に記載されるような、本発明に従う方法を使用して同定した。
【００５８】
好ましく組み合わされ得るγ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列の組み合わせが、強い抗腫瘍効果を示すので、table 2(表2)中に以下に列挙される。Table 2(表2)。γ9-CDR3領域およびδ2-CDR3領域のアミノ酸配列の組み合わせ。置換されている、即ち改変されている、配列番号1の番号118〜132に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸残基に対応する領域が列挙され、置換されている、即ち改変されている、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸残基に対応する領域も同様に列挙される。γ9-CDR3およびδ2-CDR3の異なる組み合わせは、table 2(表2)中に1〜4と番号付けされる。例えば、2番は、配列番号1の番号118〜132に対応するγ9-CDR3領域がALWEAQQELGKKIKVに改変(で置換)されているγ9-T細胞レセプター鎖と、配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2-CDR3領域がACDALKRTDTDKLIに改変(で置換)されているδ2T細胞レセプター鎖とを有するγ9δ2TCRに対応する。
【００５９】
【表２】
2018153200.tif 000003
【００６０】
1実施形態では、このγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片は、γ9-CDR3領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖とδ2-CDR3領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖とを含み、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列はAQQであり、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列はALKRTDである。さらなる実施形態では、このγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片は、γ9-CDR3領域を含むγ9-T細胞レセプター鎖とδ2-CDR3領域を含むδ2-T細胞レセプター鎖とを含み、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基118〜132に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列はALWEAQQELGKKIKVであり、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基112〜128に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列はACDALKRTDTDKLIである。γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片中のCDR3領域のこの特定の組み合わせは、特に高い抗腫瘍活性を示しており、従って好ましい可能性がある。
【００６１】
1実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基118〜121に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列がALWEであり、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基125〜132に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列がELGKKIKVであり、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基112〜114に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列がACDであり、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基123〜127に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列がTDKLIである、本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片。これらのアミノ酸配列は、上に列挙したようなアミノ酸配列によって置換されるアミノ酸配列に隣接する配列に対応することが理解される。
【００６２】
さらなる実施形態では、γ9-T細胞レセプター鎖が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および/またはδ2-T細胞レセプター鎖が、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片が提供される。この実施形態では、配列番号1のアミノ酸残基番号122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列および配列番号2アミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列が、Table 1(表1)に従って置換されることが理解される。
【００６３】
1実施形態では、γ9-T細胞レセプター鎖が、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜121および125〜315を含むアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸残基122〜124が、Table 1(表1)に規定する通りであり、δ2-T細胞レセプター鎖が、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜114および123〜292を含むアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸残基115〜122が、Table 1(表1)に規定する通りである、γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片が提供される。この実施形態では、配列番号1のアミノ酸残基番号122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列および配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列が、Table 1(表1)に従って置換されることが理解される。
【００６４】
アミノ酸配列配列番号1および配列番号2は各々、リーダー配列を含むと理解される。アミノ酸配列配列番号1のリーダー配列は、配列番号1のアミノ酸番号1〜20由来である。アミノ酸配列配列番号2のリーダー配列は、配列番号2のアミノ酸番号1〜19由来である。このリーダー配列は、細胞の表面へとアミノ酸鎖を指向させ得る。このリーダー配列は、新生アミノ酸鎖から切断され得、最終タンパク質中には存在しない。従って、1実施形態では、γ9-T細胞レセプター鎖が、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基21〜121および125〜315を含むアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸残基122〜124が、Table 1(表1)に規定する通りであり、δ2-T細胞レセプター鎖が、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基20〜114および123〜292を含むアミノ酸配列を含み、改変されたアミノ酸残基115〜122が、Table 1(表1)に規定する通りである、γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片が提供される。この実施形態では、配列番号1のアミノ酸残基番号122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列および配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域のアミノ酸配列が、Table 1(表1)に従って置換されることが理解される。代替的リーダー配列を使用することが任意選択であり得ることもまた理解され、配列番号1および配列番号2由来のこのリーダー配列が、例えば、配列を比較する場合ならびに/対応する配列および/もしくはアラインメントを決定する場合、ならびに/または同一性の百分率を決定する場合に、無視され得ることもまた理解される。
【００６５】
別の実施形態では、上記のようなγ9δ2T細胞レセプターのいずれか1つに従うγ9δ2T細胞レセプターの可溶性断片を含むコンジュゲートが提供される。γ9δ2-T細胞レセプターの細胞外ドメインは、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基21〜263に対応するγ9-T細胞レセプター鎖のアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸残基20〜249に対応するδ2-T細胞レセプター鎖のアミノ酸配列とを含む。このコンジュゲートは、薬剤に連結され得る。好ましくは、この薬剤は、診断剤、治療剤、抗癌剤、化学物質、ナノ粒子、化学療法剤または蛍光色素からなる群より選択される。基質(例えば、化学物質、ナノ粒子)に連結され得るかかるコンジュゲートは、例えば、目的の標的に化学療法を送達するために使用され得る。さらに、診断では、染色ツールとしてまたはリガンドの生化学的単離のために次いで使用される蛍光色素に連結された可溶性TCRを利用することによって、規定されたリガンドの発現が試験され得る。
【００６６】
さらに、この実施形態では、本発明は、アミノ酸配列配列番号2のアミノ酸残基115〜122に対応するδ2-CDR3領域が、アミノ酸残基ALKRTDまたはLLGYで置換される、本発明に従うδ2-T細胞レセプター鎖またはその断片をコードする単離された核酸配列を提供する。従って、アミノ酸配列配列番号2のアミノ酸残基112〜127に対応するδ2-CDR3領域が、配列番号2のD114とT123との間で、アミノ酸残基ALKRTDまたはLLGYで置換される。本発明はさらに、アミノ酸配列配列番号1のアミノ酸残基122〜124に対応するγ9-CDR3領域のアミノ酸配列が、アミノ酸残基IQで置換される、本発明に従うγ9-T細胞レセプター鎖またはその断片をコードする単離された核酸配列を提供する。従って、アミノ酸配列配列番号1のアミノ酸残基118〜132に対応するγ9-CDR3領域が、配列番号1のE121とE125との間で、アミノ酸残基IQで置換される。
【００６７】
本発明に従う単離された核酸配列を含む遺伝子構築物、およびこの遺伝子構築物を含むレトロウイルスベクターもまた、提供される。
【００６８】
例えば、単離された核酸配列は、配列番号3および配列番号4として列挙され、実施例において記載されるように、G115wtクローンのγ9-T細胞レセプター鎖(対応するアミノ酸配列配列番号1をコードする)およびδ2-T細胞レセプター鎖(対応するアミノ酸配列配列番号2をコードする)のオープンリーディングフレームにそれぞれ対応する。これらの単離された核酸配列は、発現カセットの一部である場合、例えばイントロンコード配列によって散在され得、5'非コード領域および3'非コード領域を有する。かかる配列が発現される場合、対応するγ9-T細胞レセプター鎖およびδ2-T細胞レセプター鎖のアミノ酸配列が、細胞中で作製される。従って、配列番号3の核酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードする。配列番号4の核酸配列は、配列番号2のアミノ酸配列をコードする。配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列は、細胞中で形成される場合、各々リーダー配列を含む。アミノ酸配列配列番号1のリーダー配列は、配列番号1のアミノ酸番号1〜20由来である。アミノ酸配列配列番号2のリーダー配列は、配列番号2のアミノ酸番号1〜19由来である。このリーダー配列は、細胞の表面へとアミノ酸鎖を指向させ得る。このリーダー配列は、新生アミノ酸鎖から切断され得、最終タンパク質中には存在しない。操作されたγ9δ2T細胞レセプターの定常ドメインは、システイン残基が、γ9-TCR鎖とδ2-TCR鎖との間の連結を形成するジスルフィド結合を形成する、短い接続配列を有し得る。例えば、G115wtのγ9-TCR鎖に対応するアミノ酸配列配列番号1のC263と、G115wtのδ2-TCR鎖に対応するアミノ酸配列配列番号2のC249とが、ジスルフィド結合を形成し得る。ジスルフィド結合は、システインの2つのチオール基のカップリングによって形成される共有結合である。
【００６９】
別の実施形態では、本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターまたはその断片をコードする核酸配列、ならびに本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターをコードする遺伝子構築物(複数または単数)を含む核酸配列が提供される。この実施形態では、γ9δ2T細胞レセプターをコードする核酸配列は、単一の核酸配列中に含まれることが理解される。好ましくは、遺伝子構築物(単数または複数)を含む核酸配列は、レトロウイルスベクター中に含まれる。
【００７０】
1実施形態では、本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターの可溶性断片を発現する細胞が提供される。
【００７１】
1実施形態では、本発明に従うγ9δ2T細胞レセプター、即ち、CDR3領域が、上に列挙され示されたように、特定のアミノ酸配列で置換された、特異的γ9δ2T細胞レセプターに対応するγ9δ2T細胞レセプターを含むT細胞が提供される。さらなる実施形態では、このT細胞は、上に列挙されたような単離された核酸配列、上に列挙された通りの遺伝子構築物(単数または複数)、または上に列挙されたようなレトロウイルスベクター(単数または複数)を含む。
【００７２】
さらに、上記のような本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターもしくはその断片、あるいは上に列挙されたようなコンジュゲート、単離された核酸配列、または遺伝子構築物、またはレトロウイルスベクター、またはT細胞は、医薬として使用するためのものである。好ましくは、上記のような本発明に従うγ9δ2T細胞レセプターもしくはその断片、あるいは上に列挙されたようなコンジュゲート、単離された核酸配列、または遺伝子構築物、またはレトロウイルスベクター、またはT細胞は、癌の処置において医薬として使用するためのものである。
【００７３】
本発明に従う特異的γ9δ2T細胞レセプターまたはその断片、即ち、CDR3領域が、上に列挙され示されたように、特定のアミノ酸配列で置換された、特異的γ9δ2T細胞レセプターに対応するγ9δ2T細胞レセプターが、医学的処置および/または診断において特に有用であることが理解される。例えば、免疫細胞は、例えば、列挙された特異的γ9δ2T細胞レセプターのうち1つを患者のαβT細胞中にex vivo移入させ、その後増殖させ、これらの操作されたT細胞を患者に戻して養子移入することによって、癌細胞に対して再指向され得る。従って、免疫細胞は、癌細胞に対して再指向され得る。これは、抗癌反応性を増加させるために、免疫細胞中で任意の他のレセプター(例えば、NKG2D)と組み合わせて実施されてもよい。
【実施例】
【００７４】
材料および方法
細胞および株細胞
PBMCを、Sanquin Blood Bank(Amsterdam、The Netherlands)から取得したバフィーコートから単離した。初代AML芽細胞は、LML biobank UMC Utrechtから、インフォームドコンセントを得た後に受け取った、Matthias Theobald(Mainz、Germany)からの厚意による贈与であり、GCPおよびHelsinki宣言に従って収集された。株細胞は、補足の材料および方法において記載される。
【００７５】
TCR変異誘発、クローニングおよび配列決定
γ9δ2TCR改変は、NcoI制限部位およびBamHI制限部位が隣接したγ9-TCR鎖またはδ2-TCR鎖G115の、コドン最適化された遺伝子に基づく(GeneArt、Regensburg、Germanyによって合成された)。アラニン変異を生成するために、部位特異的変異誘発を、プルーフリーディングポリメラーゼ(Phusion、Bioke)を使用して、重複伸長PCR(overlap extension PCR)21または全プラスミド変異誘発(whole plasmid mutagenesis)22;23によって実施した。変異したNcoI-BamHI消化したγ9-TCR鎖またはδ2-TCR鎖を、レトロウイルスベクターpBullet中にライゲーションし、BaseClear(Leiden、The Netherlands)によって配列決定した。
【００７６】
フローサイトメトリー
γ9δ2TCR発現を、Vδ2-FITC(クローンB6、BD)またはpan-γδTCR-PE抗体(クローンIMMU510、Beckman Coulter)を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。変化倍率は、γ9-G115wt/δ2-G115wt形質導入されたT細胞の1に設定したMFI値およびモック形質導入されたT細胞の0に設定したMFI値に基づいて計算した。
【００７７】
機能的T細胞アッセイ
細胞媒介性細胞傷害に関する51クロム放出アッセイは、以前に記載されている。標的細胞を、100μCuの51Cr(初代細胞について150μCu)で一晩標識し、30:1と0.3:1との間の5つのエフェクター-対-標的比(E:T)において、形質導入されたT細胞と共に5時間インキュベートした。変化倍率は、変異していないγ9δ2TCRを発現する操作されたT細胞の反応性と比較して計算した。IFN-γELISpotを、抗huIFN-γmAb1-D1K(I)およびmAb7-B6-1(II)(Mabtech-Hamburg、Germany)を製造業者の推奨手順に従って使用して実施した。標的細胞およびエフェクター細胞(E:T 3:1)を、示されたようなパミドロネート(Calbiochem、Germany)の存在下で24時間インキュベートした。IFNγELISAを、製造業者の指示に従ってELISA-ready-go! Kit(eBioscience)を使用して実施した。エフェクター細胞および標的細胞(E:T 1:1)を、示されたようなパミドロネートの存在下で24時間インキュベートした。特定した場合、変化倍率は、変異していないγ9δ2TCRを発現する操作されたT細胞の反応性と比較して計算した。
【００７８】
T細胞のレトロウイルス形質導入
γ9δ2TCRを、以前に記載されたように(Marcu-Malinaら、2011)、αβT細胞中に形質導入した。簡潔に述べると、Fugene6試薬(Takara、Gennevilliers、France)を使用して、パッケージング細胞(phoenix-ampho)を、gag-pol(pHIT60)、env(pCOLT-GALV)(Stanislawskiら、2001)、およびγ9-鎖-IRES-ネオマイシンまたはδ2-鎖-IRES-ピューロマイシンのいずれかを含む2つのレトロウイルス構築物(pBullet)でトランスフェクトした。αCD3(30ng/ml)(Orthoclone OKT3、Janssen-Cilag、Tilburg、The Netherlands)およびIL2(50IU/ml)(Proleukin、Novartis、Arnhem、The Netherlands)で活性化させたヒトPBMCを、50IU/ml IL-2および4μg/mlポリブレン(Sigma-Aldrich、Zwijndrecht、The Netherlands)の存在下で、48時間以内にウイルス上清で2回形質導入した。形質導入されたT細胞を、αCD3/CD28 Dynabeads(0.5×106ビーズ/106細胞)(Invitrogen)およびIL-2(50IU/ml)を用いた刺激によって増殖させ、800μg/mlジェネテシン(Gibco、Karlsruhe、Germany)および5μg/mlピューロマイシン(Sigma-Aldrich、Zwijndrecht、The Netherlands)を用いて1週間選択した。示された場合、ポリクローナルCD4+およびCD8+のTCRで形質導入されたT細胞を、CD4およびCD8 MACS分離システム(Miltenyi Biothech、Bergish Gladbach、Germany)を使用して、CD4またはCD8の発現に基づいて選別した。選択後、TCR形質導入されたT細胞を、以前に記載されたREPプロトコール(RiddellおよびGreenberg、1990)に基づいてin vitroで増殖させた。
【００７９】
機能的T細胞アッセイ
細胞媒介性細胞傷害のための51クロム放出アッセイは、以前に記載されている(Kuballら、2004)。標的細胞を、100μCuの51Cr(初代細胞について150μCu)で一晩標識し、30:1と0.3:1との間の5つのエフェクター対標的比(E:T)において、形質導入されたT細胞と共に引き続いてインキュベートした。4〜6時間後、51Cr放出を、上清において測定した。変化倍率は、1に正規化したγ9-3wt/δ9-3wt、γ9-5wt/δ9-5wtまたはγ9-G115wt/δ9-G115wtに基づく比較実験のために、1に正規化したγ9-G115wt/δ9-G115wt形質導入されたT細胞の51Cr放出に基づいて計算した。
【００８０】
IFNγELISpotを、製造業者の推奨手順に従って、Mabtech(Hamburg、Germany)からの抗hu IFN-γ  mAb1-D1K(I)およびmAb7-B6-1(II)を使用して実施した(Besoldら、2007)。全てのアッセイにおいて、標的細胞およびエフェクター細胞(E:T 3:1)を、示されたようなパミドロネート(Calbiochem、Germany)の存在下で24時間インキュベートした。
【００８１】
IFN-γELISAを、製造業者の指示に従ってELISA-ready-go! Kit(eBioscience)を使用して実施した。エフェクター細胞および標的細胞(E:T 1:1)を、示されたようなパミドロネートの存在下で24時間インキュベートした。特定した場合、変化倍率は、1に正規化したγ9-3wt/δ9-3wt、γ9-5wt/δ9-5wtまたはγ9-G115wt/δ9-G115wtに基づく比較実験のために、1に正規化したγ9-G115wt/δ9-G115wt形質導入されたT細胞のIFN-γ分泌に基づいて計算した。
【００８２】
動物モデル
腫瘍異種移植片を誘導するために、致死量以下の全身照射を与え(2Gy)、11〜17週齢のRAG-2-/-/γc-/--BALB/Cマウスに、107のγ9δ2TCR+形質導入されたT細胞と共に、0.5×106のDaudi-Luc細胞(Genmab Utrecht、The Netherlandsからの厚意による贈与)または5×106のRPMI8226/S-Luc細胞(Anton Martens、Utrecht、The Netherlands)を静脈内注射した。このRAG-2-/-/γc-/--BALB/Cマウスは元々、AMCAS b.v.(Amsterdam、the Netherlands)から得たものである。マウスを、Central Animal Facility of the University of Utrechtの特定病原体除去(SPF)飼育ユニットにおいて飼育および収容した。全ての動物実験は、動物実験のための地域倫理委員会から許可を得た後施設のガイドラインに従って、および動物実験に関する現行のオランダの法律に従って、実施した。全てのマウスは、Biospace生物発光画像化によって週に1回in vivoで可視化した骨髄において主に成長する腫瘍を発生させた。マウスを、イソフルラン吸入によって麻酔し、その後25mg/ml Beetle Luciferin(Promega、USA)100μlの腹腔内注射を与えた。生物発光画像を、Photo Visionソフトウェアによって制御される第3世代冷却GaAs高感度電荷結合素子カメラ(cooled GaAs intensified charge-coupled device camera)を使用して獲得し、M3Visionソフトウェアを用いて分析した(全てPhoton Imager;Biospace Laboratoryから)。マウスに、1日目に、(腫瘍細胞と共に)IFA中0.6×106IUのIL2(Proleukin(登録商標)、Novartis)を皮下で与え、実験の最後まで21日毎に与えた。パミドロネート(10mg/kg体重)を、1日目に静脈内で、21日毎に腹腔内で、示された群において適用した。成長する腫瘍を、Biospace生物発光画像化(BLI)によってin vivoで可視化した。マウスを、イソフルランによって麻酔し、その後25mg/ml Beetle Luciferin(Promega)の腹腔内注射(100μl)を与えた。生物発光画像を獲得し、M3Visionソフトウェア(Photon Imager、Biospace Laboratory)を用いて分析した。
【００８３】
結果
個々のγ9δ2T細胞クローンの抗腫瘍反応性
個々のγ9δ2T細胞クローンが、親γ9δ2T細胞集団と比較して、腫瘍細胞に対する示差的な活性を媒介するかどうかを調査するために、健康なドナー由来のγ9δ2T細胞を、限界希釈によってクローニングし、IFNγELISpotにおいて腫瘍細胞の広いパネルに対して試験した。特異性および機能的結合力に関して腫瘍認識における高い可変性が、個々のγ9δ2T細胞クローン(cl)間で観察された;元のバルク集団と比較して、cl5およびcl13は、Daudiに応答して2倍多くのIFNγスポットを生じ、K562、BT549およびMCF-7でチャレンジした場合、顕著な量のIFNγを選択的に生成した。対照的に、cl3およびcl15は、Daudi細胞のみを認識した。γ9δ2TCR、NKG2D、CD158a、NKAT-2およびNKB-1の表面発現を試験した。
【００８４】
個々のγ9δ2TCRによって媒介される抗腫瘍反応性
腫瘍反応性クローンのγ9δ2TCR間の差異を解明するために、cl3(γ9-cl3wt/δ2-cl3wt)およびcl5(γ9-cl5wt/δ2-cl5wt)の野生型(wt)γ9-TCR鎖およびδ2-TCR鎖の配列を決定し、γ9δ2TCR G115とアラインさせた。3つ全てのγ9δ2TCRが、そのCDR3ドメインにおいて異なっていた:γCDR3中の位置γ109とγ111との間で1〜3アミノ酸、ならびにδCDR3中のδ108とδ112との間で4〜8アミノ酸。別個のγ9δ2TCRが示差的な抗腫瘍反応性を媒介するかどうかを決定するために、個々のγ9δ2TCR鎖を、レトロウイルスベクターpBullet中にクローニングし、記載されるような選択マーカーに連結した。野生型の組み合わせγ9-cl3wt/δ2-cl3wt、γ9-cl5wt/δ2-cl5wtおよびγ9-G115wt/δ2-G115wtを、末梢血αβT細胞中に形質導入し、抗生物質によって選択し、さらに増殖させた。γ9δ2TCR G115(γ9-G115wt/δ2-G115wt)はコントロールとして機能し、空のベクターカセット(モック)で形質導入した細胞もコントロールとして機能した。γ9δ2TCR形質導入されたT細胞は、類似のγ9δ2TCR発現を示し、51Cr放出アッセイにおいて腫瘍標的Daudiに対する溶解活性について、これらをさらに試験した(図1A)。γ9-cl3wt/δ2-cl3wtを発現するT細胞は、腫瘍細胞を溶解させる能力が50%低減していたが(p<0.01)、γ9-cl5wt/δ2-cl5wtを有するT細胞は、コントロールγ9-G115wt/δ2-G115wtのほぼ2倍強力であった(p<0.01)。減少または増加した機能的結合力を有するγ9δ2TCR形質導入された細胞の表現型が、サイトカインレベル上に対しても存在するかどうかを決定するために、パミドロネート-滴定アッセイを実施した。Daudi細胞のパミドロネート処理は、IPPの下流でメバロン酸経路を遮断し、IPPの蓄積および応答性T細胞の増強されたサイトカイン分泌を引き起こす。NK様の活性化CD4+を排除するために、NKG2Dなどの主要NKレセプターの発現を欠く、γ9δ2TCR形質導入されたT細胞を、MACSソーティングによって選択した。形質導入体を、腫瘍標的Daudiに対して、異なる濃度のパミドロネートで試験した。等価な刺激を受けたが無関係のαβTCRを発現するモック形質導入されたT細胞が、コントロールとして機能した。IFNγ分泌を、ELISAによって測定し、半数効果濃度(EC50)を計算した(図1B)。溶解能について観察された変化と一致して、コントロールγ9-G115wt/δ2-G115wt(最大800pg/ml)と比較して、γ9-cl3wt/δ2-cl3wtで形質導入されたT細胞は、より低い量のIFNγ(最大600pg/ml)を分泌したが、γ9-cl5wt/δ2-cl5wtを発現するT細胞は、全てのパミドロネート濃度でより高い量のIFNγ(最大1300pg/ml)を産生した。IFNγ分泌における異なるプラトーにもかかわらず、全ての選択された変異体および野生型コントロールは、匹敵するパミドロネート-EC50を有した(約30pg/ml)。これらの結果は、別個のγ9δ2TCRクローンが異なる機能的結合力を媒介し、腫瘍認識における親γ9δ2T細胞クローン間での高い可変性が、個々のγ9δ2T細胞レセプターのCDR3ドメインによって実質的に調節されると考えられることを、示している。
【００８５】
操作されたT細胞の機能的結合力を媒介するための迅速な方法としての、コンビナトリアル-γδTCR鎖交換(CTE)
上記決定を行うために、本発明者らは、操作されたT細胞上での新たに組み合わされたγ9-TCR鎖およびδ2-TCR鎖の発現を生じる、コンビナトリアルγδTCR鎖交換(CTE)と命名した戦略を考案した。このプロセスの間に、γ9-G115wtをδ2-cl3wtまたはδ2-cl5wtと組み合わせ、δ2-G115wtをγ9-cl3wtまたはγ9-cl5wtと組み合わせた。これらの組み合わせを、αβT細胞中にレトロウイルスにより形質導入した。全ての形質導入体において、等価なγδTCR発現が検出されたが、内因性αβTCRは明らかに下方調節された。これは、モック形質導入された細胞と比較した場合、γ9-G115wt/δ2-G115wtを発現するαβT細胞のほとんど破壊されたallo-反応性だけでなく、選択されたCTE操作されたαβT細胞のほとんど破壊されたallo-反応性もまた生じた。従って、CTE操作されたT細胞の反応性は、発現されたγδTCRに主として依存するが、残りの内因性αβTCRには依存しない。次に、形質導入体を、51Cr放出アッセイにおいて腫瘍標的Daudiに対して機能的に試験した(図1C)。γ9-鎖またはδ2-鎖の交換は、著名な差異を実際に引き起こした。元のTCRγ9-G115wt/δ2-G115wtと比較して、γ9-G115wt/δ2-cl3wt、γ9-G115wt/δ2-cl5wtまたはγ9-cl5wt/δ2-G115wtの組み合わせは、腫瘍細胞の、40〜70%増加した特異的溶解を媒介した(全てp<0.05)。同じ大きさの認識が、CD4+γδTCR形質導入されたT細胞のIFNγ産生をパミドロネート滴定アッセイで試験した場合に観察された(図1D)。さらに、コントロールTCRγ9-G115wt/δ2-G115wt(最大800pg/ml)と比較して、組み合わせγ9-cl3wt/δ2-G115wtのみが、全てのパミドロネート濃度において、形質導入された細胞の減少したIFNγ産生を導いたが(最大100pg/ml)、他の全てのCTE-γ9δ2TCRは、増加したIFNγ分泌を媒介した(最大≧1000pg/ml)。約30pg/mlの等しいパミドロネート-EC50が、全ての応答性のγ9δ2TCR形質導入された細胞について計算された。
【００８６】
細胞-細胞相互作用がパミドロネート刺激とは異なって応答-動態学に影響を与えるかどうかを決定するために、改善された機能的結合力を媒介するCTE-γ9δ2TCRγ9-G115wt/δ2-cl5wtおよびコントロールTCRγ9-G115wt/δ2-G115wtを、エフェクター-対-標的比(E:T)滴定アッセイにおいて試験し(図1E)、E:T-50を計算した。興味深いことに、γ9-G115wt/δ2-G115wtを発現するコントロール細胞について計算された1:1のE:T-50と比較して、γ9-G115wt/δ2-cl5wtを有するT細胞は、0.3:1のE:T-50で示差的に応答した。異なるTCRとリガンドとの間の相互作用、従って親和性が実際に増加するかどうかを試験するために、Daudiと、潜在的に高い(γ9-G115wt/δ2-cl5wt)または低い(γ9-cl3wt/δ2-G115wt)親和性のTCRのいずれかを発現するT細胞との間の細胞-細胞コンジュゲートを、フローサイトメトリーによって測定した。顕著なことに、γ9-G115wt/δ2-cl5wtを発現させた場合、γ9-cl3wt/δ2-G115wtおよびモック形質導入されたT細胞と比較して、より多くの細胞-細胞相互作用が観察された(図1F)。この効果は、パミドロネートの存在に依存しなかった。従って、G115wt/δ2-cl5wtは、高い親和性のγ9δ2TCRである。従って、CTEは、形質導入されたT細胞において改善された機能的結合力を媒介する、増加した親和性を有するγ9δ2TCRを迅速に操作するための効率的な方法である。
【００８７】
δCDR3およびJδ1中の残基は、γ9δ2TCRの安定性および操作されたαβT細胞の機能的結合力の媒介に関与する
重要な残基がJγ1内でも報告されているので、δCDR3が最適な機能的結合力を媒介する分子的要件を解明するために、Jδ1セグメント全体を含むモデルδCDR3(クローンG115)のアラニン変異誘発を実施した。初期スクリーニングの間に、5つの配列エリアが、γ9δ2TCR形質導入されたT細胞のTCR発現または機能的結合力のいずれかに影響を与えることが見出された。損なわれたγ9δ2TCR発現およびより低いTCR媒介性の機能的結合力を単一残基が担う程度を明確にするために、単一アラニン変異を生成した。変異したおよび野生型のδ2-G115鎖を、αβT細胞においてγ9-G115wtと組み合わせて発現させ、δ2-鎖特異的抗体を使用してγ9δ2TCR発現について試験した(図2A)。3つの単一アラニン変異、即ちδ2-G115L116A、δ2-G115F118Aおよびδ2-G115V124Aが、変異していないδ2-G115wtと比較した場合、70%低いTCR発現を引き起こした(Table 3(表3))。匹敵する結果が、γ9-鎖またはγδTCRの定常ドメインに対する抗体を使用して観察され、安定なTCR発現のためのδ2-G115L116、δ2-G115F118およびδ2-G115V124の重要性を示している。γ9δ2TCR G115の結晶構造は本発明者らの知見を支持している:δ2-G115L116、δ2-G115F118およびδ2-G115V124は、疎水性コア中に位置付けられ(図2B)、従って、γ9δ2TCR G115の構造的安定性にとって重要であり得る。
【００８８】
機能的結合力に対する単一アラニン変異の影響に取り組むために、51Cr放出アッセイを実施した(図2C)。低いTCR発現を有する形質導入体(δ2-G115L116A、δ2-G115F118Aおよびδ2-G115V124A)は、δ2-G115wtで形質導入された細胞と比較した場合、80%低い溶解能を実証したので、腫瘍細胞を効果的に溶解させることができなかった。変異δ2-G115L109Aおよびδ2-G115I117Aを有するT細胞(Table 3(表3))は、TCRを適切に発現したが、δ2-G115wt発現細胞と比較した場合、70%低減した溶解活性を示した。TCR変異体をCD4+Jurkat細胞中に形質導入し、IL-2産生を測定した場合に、同様の結果が得られた(データ示さず)。アラニン置換δ2-G115L109Aおよびδ2-G115I117Aを、γδTCRクローン3のδ2-鎖中に導入した場合、溶解活性の低減もまた見られた。これらの結果は、δCDR3中の残基δL109だけでなくδI117もまた、機能的結合力を媒介するために、γ9δ2TCRにとって一般に重要であり得ることを示している(図2D)。クローン3、5およびG115のδ2-鎖間の配列アラインメントは、δL109およびδI117が保存されている可能性があることを示した(Table 2(表2))。
【００８９】
【表３】
2018153200.tif 000004
【００９０】
上記表は、3つのクローンのアラインメントを示し、列挙された番号付けは、IGMTに従う。列挙されたγ9-G115wt配列は、アミノ酸配列配列番号1のアミノ酸C117〜T142に対応する。従って、クローン3、5またはG115wtのいずれかのγ112.1Lは、アミノ酸配列配列番号1のL126に対応する。列挙されたδ2-G115wt配列は、アミノ酸配列配列番号2のアミノ酸C111〜C138に対応する。従って、このアラインメントが示すように、クローン3および5の対応するCDR3領域は、アラインメントを介して容易に同定され得る。
【００９１】
γ9δ2TCR形質導入されたT細胞の機能的結合力に対するCDR3の長さの影響
γ9δ2TCR G115のアラニンスキャニング変異誘発の間のアラニン置換は、機能的結果を有さないδCDR3ドメインの大きい部分を置き換えることができた。これにより、別個のγ9δ2TCR組み合わせの異なる機能的結合力にとって重要な因子には、機能的に重要な残基δ2-G115L109と構造的に重要な残基δ2-G115L116との間の相対的長さもまた含まれ得るという可能性が生じる。従って、異なるδ2-G115の長さ変異体を生成した。三重δ2-G115T113〜K115もまた、安定な表面発現にとって重要であるので(データ示さず)、δ2-G115L109とδ2-G115T113との間に0個〜12個のアラニンを有する9つの長さ変異体(δ2-G115LM)を生成し、γ9-G115wtと再度組み合わせて、αβT細胞中で同様に発現させた(図3A)。δ2-G115LM形質導入されたT細胞の機能的結合力を試験するために、CD4+TCR形質導入されたT細胞を、MACSソーティングによって選択し、Daudiに応答したIFNγELISAを、パミドロネートの存在下で実施した(図3B)。δ2-G115LM0およびδ2-G115LM1を発現する操作されたT細胞は、IFNγを産生できず、δ-G115LM4またはδ-G115LM12を発現するT細胞は、δ2-G115wt形質導入された細胞と比較して、約半分の量だけのIFNγを分泌した。他の全ての変異体(δ2-G115LM2、3、5、6、9)は、δ2-G115wtを発現する形質導入体と比較して、操作されたT細胞において匹敵する量のIFNγを誘導した。機能的障害を有する変異体(δ2-G115LM0、1、4、12、Table4(表4))を、漸増するパミドロネート濃度に対してさらに試験して、EC50を計算した。最大IFNγ分泌における異なるプラトーにもかかわらず、全ての選択されたδ2-G115LM形質導入された細胞および野生型コントロールは、匹敵するパミドロネート-EC50(約30pg/ml)を有した(図3C)。長さ変異もまた、γ9-G115E108とγ9-G115E111.1との間の1〜6個のアラニンのストレッチ(γ9-G115LM1〜6)を操作することによって、γ9δ2TCR G115のγCDR3において研究した。しかし、これは、機能的結合力に影響を与えなかった。
【００９２】
これは、γ9CDR3ドメインおよびδ2CDR3ドメイン内のかなりのアラニンストレッチが許容され得ることを示している。しかし、特にδ2-G115L109とδ2-G115T113との間の短すぎるアラニンストレッチおよび非常に長いアラニンストレッチ、ならびに4つのアラニンを有するストレッチは、γ9δ2TCRの低減したまたは存在しない機能と関連し得る(図3Bおよび図3C)。
【００９３】
生理学的γ9δ2T細胞レパートリーに関する結果
ImMunoGeneTics(IMGT)データベースを、γ9-G115E109とγ9-G115E111.1との間ならびにδ2-G115L109とδ2-G115T113との間の報告されたストレッチについて検索した。報告されたγ9-鎖についての優先的な長さは、γ9-G115LM2およびγ9-G115LM3に対応するCDR3領域について見出されたが、より短いストレッチもまた報告された。対照的に、かかる鎖が機能的でない可能性があるという本発明者らの観察と一致して、短いδCDR3ドメインを有するδ2-鎖、例えばδ2-G115LM1またはδ2-G115LM0は報告されなかった(図3D)。列挙されたγ9δ2TCRの大部分は、δ2-G115LM5、6、7に対応するδCDR3長さを含む。これらの知見は、δ2-G115L109とδ2-G115T113との間に5〜7残基のδCDR3長さを有するγ9δ2TCRを選択する優先性を支持する。それにもかかわらず、個々の配列の差異は、γ9δ2TCR媒介される機能的結合力においてなおも役割を果たし得る。
【００９４】
γ9δ2TCR媒介される機能的結合力に対するCDR3配列の影響
最適な機能的結合力を媒介することに関してδCDR3の長さおよび配列の両方を試験するために、γ9δ2TCR長さ変異体δ2-G115LM2、δ2-G115LM4およびδ2-G115LM6を、γ9-G115wtと組み合わせてαβT細胞中に形質導入した。Daudiに応答した形質導入体のIFNγ分泌を、δ2-cl3wt(長さがδ2-G115LM2に対応する)、δ2-cl5wt(長さがδ2-G115LM4に対応する)およびδ2-G115wt(長さがδ2-G115LM6に対応する)由来の野生型配列で形質導入した細胞と比較した(Table 3(表3))。δ2-G115LM6およびδ2-G115wtで形質導入したT細胞は、サイトカイン分泌の量において異ならなかったが、他の全ての組み合わせの野生型鎖は、選択的にアラニンを含んだ長さ変異体と比較した場合、IFNγにおいて2倍よりも多い増加を示した(図3E)。これらの結果は、形質導入された細胞の溶解能を試験した場合に確認された。従って、δCDR3中の配列もまた、γ9δ2TCRの機能にとって重要な因子であり得る。
【００９５】
従って、γCDR3の逐次的な重要性を研究した。それにより、γ9-G115LM1〜3を、δ2-G115wtと組み合わせてT細胞中に形質導入した。Daudiに応答した形質導入体のIFNγ分泌を、γ9-cl3wt(長さがγ9-G115LM1に対応する)、γ9-cl5wt(長さがγ9-G115LM2に対応する)およびγ9-G115wt(長さがγ9-G115LM3に対応する)で形質導入した細胞と比較した(Table 3(表3))。γ9-cl3wt/δ2-G115wtを発現するT細胞は、それらの等価なγ9-G115LM1と比較した場合、より低い量のIFNγを選択的に産生した(図4A)。以前に、同じγ9δ2TCRの組み合わせもまた、低減した機能的結合力を媒介することが見出された(図1Cおよび図1D)。活性の喪失は、γ9-cl3wt中のγCDR3E109をγCDR3A109に変異させることによって、正常レベル(γ9δ2TCR G115wtを参照して)に回復され得、これは、γ9CDR3の可変配列中の単一の変化が、本明細書で試験したγ9δ2TCR形質導入されたT細胞の機能的結合力を調節するのに十分であり得ることを実証している。
【００９６】
まとめると、L109とT113との間のδ2CDR3ドメインの長さおよび配列(Table 3(表3))は、γ9δ2TCR媒介性の機能的結合力において役割を果たし得る。さらに、γ9CDR3中のE108とE111.1との間の個々の配列は、γ9δ2TCRの活性を妨害し得、G115では、γCDR3A109がリガンド相互作用にとって重要であり得る(Table 3(表3)および図4B)。組み合わせると、これは、CTE操作されたγ9δ2TCRに論理的根拠を提供するが、γ9CDR3領域およびδ2CDR3領域の両方内でのランダム変異誘発にも論理的根拠を提供する。
【００９７】
癌免疫療法のためのツールとしてのCTE操作されたT細胞
腫瘍細胞に対する増加した活性を有するCTE操作されたγ9δ2TCRは、TCR遺伝子治療戦略のための興味深い候補である。CTE-γ9δ2TCRによって媒介される機能的結合力における変化は、Bリンパ芽球性株細胞Daudiに応答した規定されたγ9δ2TCR対の独自の現象を構成し得、またはこれは、ほとんどの腫瘍標的に対する一般的な応答であり得る。従って、増加した活性を媒介したCTE-γ9δ2TCR(γ9-G115wt/δ2-cl5wt)または減少した活性を媒介したCTE-γ9δ2TCR(γ9-cl3wt/δ2-G115wt)を、薬理学的濃度のパミドロネート(10μM)の存在下でIFNγELISAにおいて種々の腫瘍に対して試験した(図5A)。腫瘍反応性は、γ9-G115wt/δ2-cl5wtを利用した場合、γ9-G115wt/δ2-G115wtと比較して、他の血液学的癌、例えばRPMI8226/S、OPM2、LME1(全ての多発性骨髄腫)、K562(骨髄性白血病)、ならびに固形癌株細胞、例えばSaos2(骨肉腫)、MZ1851RC(腎細胞癌腫)、SCC9、Fadu(頭頸部癌)、MDA-MB231、MCF7、BT549(全ての乳癌)およびSW480(結腸癌腫)を含む全範囲の異なる腫瘍実体に対して顕著に増加し、γ9-cl3wt/δ2-G115wtを使用した場合、他の全ての標的に対しては顕著に低減したまたはさらには存在しなかった。さらに、腫瘍細胞に対する増加した活性を有するCTE操作されたT細胞は、PBMCおよび線維芽細胞などの健康な組織に対して反応性をなおも全く有さなかった。γ9-G115wt/δ2-cl5wtで操作されたT細胞の優れた溶解活性もまた、γ9-G115wt/δ2-G115wtを発現するコントロールT細胞と比較した場合、RPMI8226/S、OPM2、L363などの血液学的癌細胞ならびに固形癌株細胞Saos2、MZ1851RC、SCC9、MDA-MB231およびSW480について観察された(図5B)。従って、CTE操作されたγ9δ2TCRは、正常組織に影響を与えずに、広いパネルの腫瘍細胞に対してより高い抗腫瘍応答を提供し得、従って、TCR操作されたT細胞の効力を増加させる潜在力を有する。
【００９８】
CTE操作されたγ9δ2TCRの潜在的な臨床的影響を評価するために、AML患者の初代芽細胞を標的として選択した場合に、CTE-γ9δ2TCRの増加した効力もまた存在し得るかどうかを試験した。従って、CTE-γ9δ2TCR形質導入されたT細胞を、IFNγ-ELISpotにおいて、11個の初代AML芽細胞および健康なCD34+前駆細胞に対して試験した(図5C)。γ9-G115wt/δ2-cl5wtを発現する形質導入体は、コントロールγ9-G115wt/δ2-G115wtと比較して同等にまたは優れて、11個の初代AMLサンプルのうち8個を認識した。さらに、CD34+前駆細胞は、γ9-G115wt/δ2-cl5wtまたはγ9-G115wt/δ2-G115wtのいずれかを発現するT細胞によって認識されなかった。これらの知見を考慮すると、CTE操作されたTCRγ9-G115wt/δ2-cl5wtは、臨床適用のための見込みのある候補であると思われる。
【００９９】
最後に、CTE-γ9δ2TCRが、安全であり、in vivoで元の構築物と比較して増加した効力で機能することを実証するために、CTE-TCRで操作されたT細胞の養子移入を、ヒト化マウスモデル:Rag2-/-γc-/-二重ノックアウトマウスにおけるDaudiまたはRPMI8226/Sの成長に対する保護、において研究した。従って、末梢血αβT細胞を、CTE-TCRγ9-G115wt/δ2-cl5wtまたはコントロールTCRγ9-G115wt/δ2-G115wtで形質導入した。CTE-TCR形質導入されたT細胞は、L-セレクチンおよびCCR7を含むホーミングマーカーの類似の発現を示した。照射したRag2-/-γc-/-マウスに、静脈内注射によってルシフェラーゼ形質導入されたDaudi(0.5×106)またはRPMI8226/S細胞(5×106)および107のCTE操作されたT細胞を与えた。最適以下の条件下でCTE-TCR形質導入されたT細胞の優位性を試験するために、T細胞注入の頻度は、2回の注入が与えられた以前に報告した本発明者らのモデルと比較して、1回の静脈内注射まで低減させた。結果として、これは、生物発光画像化(BLI)によって腫瘍成長を測定した場合、TCR G115wt操作されたT細胞による保護の喪失を生じた(図6Aおよび図6B)。しかし、γ9-G115wt/δ2-cl5wtを発現するCTE操作されたT細胞は、TCR G115wt操作されたT細胞(Daudi:180.000カウント/分、42日目;RPMI8226/S:210.000カウント/分、35日目)と比較して、Daudi(20.000カウント/分、42日目、n=4)およびRPMI8226/S(80.000カウント/分、35日目、n=7)について明らかに腫瘍成長を低減させた。T細胞は、マウスにおいて注入の1〜2週間後まで末梢において見出すことができたが、T細胞の頻度は腫瘍退縮と相関しなかった。最後に、迅速に致死となるDaudiモデルでは、CTE操作されたT細胞で処置されたマウスのみが、γ9-G115wt/δ2-G115wtを発現するT細胞で処置されたマウスと比較して、約2か月間の顕著に増加した全生存を有した(図6C)。これらの結果は、CTE操作されたγ9δ2TCRが、抗腫瘍反応性をin vivoで効率的に媒介することを示し、臨床適用のためにγ9δ2TCRを最適化するための潜在的なツールとしてCTEを指し示している。
【０１００】
以下のtable 4(表4)では、本発明に従って実施された方法に関する結果が列挙される。デルタ-CDR3ドメインを、十分に研究されたクローンG115のCDR3ドメイン(Jセグメント全体を含む)のアラニン変異誘発(Table 4(表4)、変異)によってTCR機能について試験したところ、TCR安定性およびTCR機能に適している可能性があるアミノ酸が見出されている。さらに、γ9-鎖のγE108とγE111.1との間およびδ2-鎖のδL109とδT113との間のアミノ酸配列長さ(Table 4(表4)、長さ変異)を試験した。γ9-CDR3ドメインおよびδ2-CDR3ドメインの個々の配列が、機能に重要である(Table 4(表4)、配列)。CTE操作することによって、クローンG115のγ9-TCR鎖およびδ2-TCR鎖を、それぞれクローン3およびクローン5のγ9-TCR鎖およびδ2-TCR鎖と組み合わせた。CTE操作は、4つの新たに設計されたγδTCRを生じた。元のTCRおよび新たなCTE操作されたTCR(Table 4(表4)、組み合わせ)を、αβT細胞中に形質導入し、その機能について試験した。
【０１０１】
【表４Ａ】
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【０１０２】
【表４Ｂ】
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【０１０３】
【表４Ｃ】
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【０１０４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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