(57)【要約】【課題】発色系で汎用される色素との反応性、および、色素共存下での安定性に優れたジアホラーゼを用いた、成分分析方法および成分分析試薬を提供する。【解決手段】Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体により、ＮＡＤＨを酸化させると同時に、テトラゾリウム塩を還元させホルマザン色素を生成させ、次いで、前記工程で生成したホルマザン色素の濃度を定量する工程を含むＮＡＤＨの測定方法。。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）および（２）を含むＮＡＤＨの測定方法。
工程（１）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体により、ＮＡＤＨを酸化させると同時に、テトラゾリウム塩を還元させホルマザン色素を生成させる。
工程（２）工程（１）で生成したホルマザン色素の濃度を定量する。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＡＤＨの測定方法であって、テトラゾリウム塩がＮＢＴ、ＭＴＴ、ＩＮＴ、ＷＳＴ−１から選択される、ＮＡＤＨの測定方法。
【請求項３】
分析対象成分の測定方法であって、以下の工程（３）を含み、前記工程（３）で得られたＮＡＤＨを請求項１または請求項２に記載の方法で測定する、分析対象成分の測定方法。
工程（３）分析対象成分及び酸化還元酵素の共存下で、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する反応を行う。
【請求項４】
請求項３に記載の分析対象成分の測定方法であって、分析対象成分が酸化還元酵素および酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり得るものであり、工程（３）において前記酸化還元酵素の作用によりＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成する、分析対象成分の測定方法。
【請求項５】
以下の（Ａ）ないし（Ｃ）を含むＮＡＤＨ測定試薬。
（Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体
（Ｂ）ＮＡＤ＋
（Ｃ）テトラゾリウム塩
【請求項６】
請求項５に記載のＮＡＤＨ測定試薬、および、以下の（Ｄ）を含む、分析対象成分の測定試薬。
（Ｄ）酸化還元酵素であって、前記分析対象成分が前記酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり、かつ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成することができる、酸化還元酵素
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアホラーゼを用いるＮＡＤＨの定量方法、および、前記方法を応用した成分分析方法および成分分析試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアホラーゼ（［ＥＣ．１．６．９９．−］）は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）をフェリシアン化カリウム、メチレンブルー、２，６−ジクロルインドフェノール、テトラゾリウム塩等の色素で酸化する反応を触媒する活性（ジアホラーゼ活性）を持つ酵素であり、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（非特許文献２）、または、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（特許文献１）に属する微生物から単離・精製されたものが市販されている。特許文献１で記載のジアホラーゼを生産するバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は、２００１年にゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）として再分類された（非特許文献３）。ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス由来のものについては、さらにそれらを改変したものも知られており、その遺伝子配列、アミノ酸配列および理化学的特性が調べられている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）
【０００３】
ジアホラーゼを用いるＮＡＤＨの定量方法は、各種の成分分析に利用されている。例えば、臨床診断の分野では、ジアホラーゼがＮＡＤＨを前記の各種色素で酸化する反応を利用して、種々の体外診断用試薬などに使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許３９５３５７８号
【特許文献２】特開２００７−１４３４９３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．  ２０１０  Ｏｃｔ  １５；２６（２）：４５２−７．  Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ａｕｇ  ３．
【非特許文献２】Ｋａｐｌａｎ，  Ｎ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  ｖｏｌ１３２，  ｐ９１−９８，  １９６９
【非特許文献３】Ｔ．Ｎ．Ｎａｚｉｎａ．，  Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．５１：４３３−４４６．  ２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者らが、ジアホラーゼがＮＡＤＨを前記の各種色素で酸化する反応を利用して、各種成分分析方法への適用を検討していたところ、用いる色素によっては、ジアホラーゼによる酸化反応速度が低く、ジアホラーゼ濃度を上げなければ迅速に検出することができないという問題や、ジアホラーゼと当該色素共存下においてジアホラーゼ活性の安定性が低いといった問題が生ずることが明らかになった。
本発明は、上記問題点を解決し、発色系で汎用される色素との反応性、および、色素共存下での安定性に優れたジアホラーゼを用いた、成分分析方法および成分分析試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
項１．以下の工程（１）および（２）を含むＮＡＤＨの測定方法。
工程（１）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体により、ＮＡＤＨを酸化させると同時に、テトラゾリウム塩を還元させホルマザン色素を生成させる。
工程（２）工程（１）で生成したホルマザン色素の濃度を定量する。
項２．項１に記載のＮＡＤＨの測定方法であって、テトラゾリウム塩がＮＢＴ、ＭＴＴ、ＩＮＴ、ＷＳＴ−１から選択される、ＮＡＤＨの測定方法。
項３．分析対象成分の測定方法であって、以下の工程（３）を含み、前記工程（３）で得られたＮＡＤＨを項１または項２に記載の方法で測定する、分析対象成分の測定方法。
工程（３）分析対象成分及び酸化還元酵素の共存下で、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する反応を行う。
項４．項３に記載の分析対象成分の測定方法であって、分析対象成分が酸化還元酵素および酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり得るものであり、工程（３）において前記酸化還元酵素の作用によりＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成する、分析対象成分の測定方法。
項５．以下の（Ａ）ないし（Ｃ）を含むＮＡＤＨ測定試薬。
（Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体
（Ｂ）ＮＡＤ＋
（Ｃ）テトラゾリウム塩
項６．項５に記載のＮＡＤＨ測定試薬、および、以下の（Ｄ）を含む、分析対象成分の測定試薬。
（Ｄ）酸化還元酵素であって、前記分析対象成分が前記酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり、かつ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成することができる、酸化還元酵素
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＮＡＤＨの比色定量法で汎用されるホルマザン色素の種類に依存することなく、迅速に検出されるため、対象成分の分析に適した色素を選択することができる。
また、低濃度でも反応性・安定性に優れることから、成分分析試薬、例えば体外診断薬に対するジアホラーゼ添加量を低減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】テトラゾリウム塩としてＮＢＴを用いたジアホラーゼ活性の測定結果を示す。図中の数字は、表１に示すそれぞれのジアホラーゼに対応する。
【図２】テトラゾリウム塩としてＷＳＴ−１を用いたジアホラーゼ活性の測定結果を示す。図中の数字は、表１に示すそれぞれのジアホラーゼに対応する。
【図３】テトラゾリウム塩としてＩＮＴを用いたジアホラーゼ活性の測定結果を示す。図中の数字は、表１に示すそれぞれのジアホラーゼに対応する。
【図４】テトラゾリウム塩としてＭＴＴを用いたジアホラーゼ活性の測定結果を示す。図中の数字は、表１に示すそれぞれのジアホラーゼに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施形態の一つは、以下の工程（１）および（２）を含むＮＡＤＨの測定方法である。
工程（１）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体により、ＮＡＤＨを酸化させると同時に、テトラゾリウム塩を還元させホルマザン色素を生成させる。
工程（２）工程（１）で生成したホルマザン色素の濃度を定量する。
【００１１】
（ジアホラーゼ）
本発明のＮＡＤＨの測定方法には、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体を用いる。
【００１２】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１で示される。なお、前記微生物は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
【００１３】
また、前記のジアホラーゼの１１９位改変体とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の第１１９番目のシステインが他のアミノ酸に置換されているものである。１１９位をどのアミノ酸に置換するかはジアホラーゼ活性を保持する置換であれば特に限定されないが、イソチアゾリン系防腐剤が作用するシステインあるいはメチオニンを除くその他のアミノ酸への置換が好ましく、アラニンへの置換がより好ましい。
【００１４】
なお、前記の１１９位改変体において、さらに、１１９位以外の１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ジアホラーゼ活性を保持する改変体を用いることもできる。
【００１５】
前記（２）における「数個」の下限は２個である。上限はジアホラーゼ活性が維持される限り数は制限されないが、例えば、全アミノ酸の２０％未満に相当する数であり、好ましくは１５％未満に相当する数、さらに好ましくは１０％未満に相当する数、さらに好ましくは５％未満に相当する数、さらに好ましくは１％未満に相当する数である。別の見方では、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、４０個以下、好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、さらに好ましくは４個以下、さらに好ましく３個以下である。
【００１６】
また、前記の１１９位改変体において、さらに、１１９位以外の箇所が改変されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。）であり、かつ、ジアホラーゼ活性を保持する改変体を用いることもできる。
【００１７】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ。（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出する。
【００１８】
ジアホラーゼのアミノ酸配列の改変は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のジアホラーゼをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントジアホラーゼを得ることができる。
【００１９】
（ジアホラーゼの製造）
前記の、本発明に用いるジアホラーゼは、例えば、前記の本発明に用いるジアホラーゼが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、適当な宿主ベクター系に導入し、得られた形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ジアホラーゼを蓄積させ、蓄積したジアホラーゼを回収することにより製造することができる。
【００２０】
本発明のジアホラーゼが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、例えば以下のものが挙げられる。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１の１１９位が他のアミノ酸に置換されている改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【００２１】
前記宿主ベクター系としては特に限定されない。前記宿主としては特に限定されない。好ましくは大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、糸状菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等を用いることができる。前記ベクターとしては特に限定されない。大腸菌由来のプラスミドであれば、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（-）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）など、酵母由来プラスミドであれば、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドであれば、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００２２】
本発明に用いるジアホラーゼを製造するのに好ましい宿主−ベクター系としては、大腸菌とｐＵＣ１９の組み合わせ、酵母とｐＳＨ１９の組み合わせなどが挙げられる。中でも好ましい組み合わせは大腸菌とｐＵＣ１９である。
【００２３】
組換えプラスミドを導入する方法としてはエレクトロポレーションによる導入のほか、塩化カルシウム等薬品処理によりコンピテント化した宿主であればヒートショックによる導入も可能である。宿主ベクターへの目的組換えプラスミドの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの各種薬剤耐性遺伝子に代表されるマーカーとジアホラーゼ活性とを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつジアホラーゼを発現する微生物を選択すればよい。
【００２４】
本発明に用いるジアホラーゼは、上記のようにして調製されるジアホラーゼ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からジアホラーゼを回収することによって製造することができる。培養は当分野において知られている方法により行われる。培地および培養条件は何ら限定されず、宿主細胞に応じて適宜設定すればよい。
【００２５】
本発明に用いるジアホラーゼの精製は、ジアホラーゼ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、遠心分離、濾過、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などが挙げられる。ジアホラーゼが細胞質に存在する場合は、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、前記各種分離技術を利用して単離精製することができる。
【００２６】
（ジアホラーゼの活性測定方法）
ジアホラーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。例えば、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができ、本明細書ではこの方法で測定した値を用いる。
＜試薬＞
蒸留水
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
３６．０ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液
２．４ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
酵素希釈溶液：０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
＜手順１＞
ジアホラーゼ溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で０．１〜０．３Ｕ／ｍＬに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
＜手順２＞
上記蒸留水２．４ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．３ｍＬ、ＮＡＤＨ水溶液０．１ｍＬを混合し、３７℃にて４分間予備加温した後、前記酵素溶液を０．１ｍＬ添加してさらに１分間予備加温したものを反応混液とする。
＜測定条件＞
前記反応混液２．９ｍＬにＤＣＰＩＰ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、６００ｎｍの吸光度変化を２〜３分間記録し、その後直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりにジアホラーゼを溶解する酵素希釈溶液とＤＣＰＩＰ溶液を反応混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってジアホラーゼ活性を求める。ここでジアホラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間に１μＭのＤＣＰＩＰを減少させる酵素量である。
活性（Ｕ／ｍＬ）
＝｛（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝÷｛２０．１×１．０×０．１｝
＝（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×希釈倍率×１．４９
なお、式中の３．０は反応溶液の全量（ｍＬ）、２０．１はＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数、１．０は光路長（ｃｍ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）を示す。後述の実施例において、ジアホラーゼ活性の測定は本測定方法にて行った。
【００２７】
（ＮＡＤＨの測定方法）
本発明のＮＡＤＨの測定方法は以下の工程を含む。
工程（１）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体により、ＮＡＤＨを酸化させると同時に、テトラゾリウム塩を還元させホルマザン色素を生成させる。
工程（２）工程（１）で生成したホルマザン色素の濃度を定量する。
【００２８】
本発明で用いるテトラゾリウム塩は特に限定されない。たとえば、
ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、
ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、
ＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、
ＷＳＴ−１（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、
ＷＳＴ−３（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、などが挙げられる。
また、上記のほか、ｐＡＢＴ（ｐ−アニシルブルーテトラゾリウムクロリド）；ｐＡｐＮＢＴ、ｐ−アニシル−ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＢＳＰＴ、チアゾリルブルー（２−２’−ベンゾチアゾリル−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムクロリド）；ＢＴ、ブルーテトラゾリウムクロリド；ＢＴＳＰＴ、２−（２’−ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）−テトラゾリウムクロリド；ＣＴＣ、（５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド）；ＤＭＤＰＴ、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル］臭化テトラゾリウム、１−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム；ＤＳＮＢＴ、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロリド；（１Ｈ）−テトラゾール；ＩＤＮＴＴ、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ＩＮＴ、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットクロリド、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド；ＩｎｐＴ、２−（ｐ−ヨードフェニル）−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド；ｍＮＢＴ、ｍ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ｍＮＮＴ、ｍ−ニトロネオテトラゾリウムクロリド；ＭＮＳＴＣ、２，２−ビス（２−メトキシル−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド；ＭＴＳ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−−２Ｈ−テトラゾリウム塩；ＭＴＴ、臭化テトラゾリウム、チアゾリルブルー臭化テトラゾリウム、（３−＞４，５−ジメチルチアゾール−２−イル−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム）；ＮＢＭＴ、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロリド；ＮＢＴ、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（２，２’−ジ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド）；ＮＴ、ネオテトラゾリウムクロリド（２，２’，５，５’−テトラフェニル−３，３’（ｐ−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド；ＮＴＶ、ニトロテトラゾリウムバイオレット；チアゾリルブルー；ＴＢ、テトラゾリウムブルークロリド（３，３’−＞３，３’−ジメトキシ（１，１，−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）ジクロリド）；ＮＢＴ、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ｏＴＴＲ、ｏ−トリルテトラゾリウムレッド；ＰＣＴＭＢ、ナトリウム３’−［１−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム］−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼン−スルホン酸水和物；ＰＮＢＴ、ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＰＴＢ、ピペロニルテトラゾリウムブルー；ｐＴＴＲ、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド；ＴＣ−ＮＢＴ、チオカルバモイルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジ−ｐ−チオカルバモイルフェニル−３，３’［３，３’−ジメトキシ−４−，４’−ビフェニレン］−ジテトラゾリウムクロリド；ＴＮＢＴ、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；ＴＰＴＴ、１，３，５−トリフェニルテトラゾリウム；ＴＲ、ＴＴＣ、ＴＰＴ、テトラゾリウムレッド（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド）；ＴＶ、テトラゾリウムバイオレット、バイオレットテトラゾリウム、２，３，５−トリフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド、２，５−ジフェニル−３−［α−ナフチル］−テトラゾリウムクロリド、２，５−ジフェニル−３−［１−ナフチル］−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド；ＶＴＢ、ベラトリルテトラゾリウムブルー；ＷＳＴ−１：４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリウム］−１，３−二硫酸ベンゼン；ＸＴＴ、２，２−ビス（２−メトキシル−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、及び当分野で知られているであろう上記以外のテトラゾリウム化合物からなる群のうちいずれかを用いてもよい。
好ましくは、ＮＢＴ、ＭＴＴ、ＩＮＴおよびＷＳＴ−１からなる群のうちいずれかである。さらに好ましくはＷＳＴ−１またはＩＮＴである。
【００２９】
（分析対象成分の測定方法）
ＮＡＤＨの測定方法を応用した、種々の成分測定方法（例えば体外診断用途や細胞傷害の測定）などが知られており、上記の本発明のＮＡＤＨ測定方法をこれらの方法に適用することができる。
すなわち、分析対象成分の測定方法であって、以下の工程（３）を含み、前記工程（３）で得られたＮＡＤＨを前記の方法で測定する、分析対象成分の測定方法も、また、本発明の実施形態の一つである。
工程（３）分析対象成分及び酸化還元酵素の共存下で、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する反応を行う。
【００３０】
前記の分析対象成分の測定方法は、分析対象成分が酸化還元酵素および酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり得るものであり、工程（３）において前記酸化還元酵素の作用によりＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成する方法を含む。
【００３１】
前記の成分測定方法は既に当該技術分野において多数の方法が確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＮＡＤＨの測定方法を用いて、各種試料中の生体成分などの分析対象成分の量又は濃度を測定することができる。
【００３２】
本発明のＮＡＤＨの測定方法を用いて分析対象成分の濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば体外診断用途では、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、胆汁酸、総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）、グルコース、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）または中性脂肪（ＴＧ）などの生体成分等を測定するための試薬、キット、センサなど種々の形態が例示できる。
【００３３】
ＬＤＨを測定する場合は、ＬＤＨ反応により生じたＮＡＤＨが、ジアホラーゼを介して、ニトロテトラゾリウムブルーなどを還元させ自身はＮＡＤ＋に戻りホルマザン色素を生成させるので、これを比色定量することによりＬＤＨの活性値を求めることができる。
胆汁酸を測定する場合においても、３−α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素が胆汁酸を基質として反応が進みＮＡＤＨが発生するので、これを上記と同様の方法により比色定量することで胆汁酸の濃度を求めることができる。
ＢＣＡＡを測定する場合においても、ロイシンデヒドロゲナーゼがＢＣＡＡを基質として反応が進みＮＡＤＨが発生するので、これを上記と同様の方法により比色定量することでＢＣＡＡの濃度を求めることができる。
グルコースを測定する場合においても、グルコースデヒドロゲナーゼがグルコースを基質として反応が進みＮＡＤＨが発生するので、これを上記と同様の方法により比色定量することでＢＣＡＡの濃度を求めることができる。
【００３４】
ＣＫを測定する場合は、ＣＫ反応においてはＮＡＤＨを直接生じないので、ＣＫ反応で発生したＡＴＰを、予め試薬に添加したグルコースと共にグルコキナーゼと反応させてグルコース６リン酸を生じさせ、さらに、グルコース６リン酸を、予め試薬に添加したＮＡＤ＋と共にグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと反応させてＮＡＤＨを生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、ジアホラーゼによるＣＫ活性値の定量が可能になる。
ＴＧを測定する場合は、ＴＧを基質とするリポプロテインリパーゼ、および、共役酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤＨを生じさせることにより、ジアホラーゼによるＴＧ濃度の定量が可能になる。
このような共役反応を適宜設計することにより、上記以外の生体成分の濃度又は量を測定することも可能である。
【００３５】
細胞傷害の測定方法としては、例えば、細胞から放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を高感度に測定することにより細胞傷害を測定する方法が知られている。ＬＤＨは乳酸の脱水素化を触媒し、ピルビン酸とＮＡＤＨを生成する。このＮＡＤＨはジアホラーゼによりテトラゾリウム塩（例えば、ＩＮＴ）を還元し、４９０ｎｍ付近に吸収をもつ赤色のホルマザン色素を形成する。したがって、ＬＤＨ活性を４９０ｎｍ付近の吸光度量の増大で測定することができる。
【００３６】
（ＮＡＤＨの測定試薬、分析対象成分の測定試薬）
本発明の別の実施形態は、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）を含むＮＡＤＨ測定試薬である。
（Ａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  Ｙ４．１ＭＣ１に由来するジアホラーゼまたはその１１９位改変体
（Ｂ）ＮＡＤ＋
（Ｃ）テトラゾリウム塩
また、本発明のさらに別の実施形態は、前記のＮＡＤＨ測定試薬、および、以下の（Ｄ）を含む、分析対象成分の測定試薬である。
（Ｄ）酸化還元酵素であって、前記分析対象成分が前記酸化還元酵素の基質あるいは阻害剤となり、かつ、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成することができる、酸化還元酵素
【００３７】
前記の本発明の測定試薬は、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、キットの形態であっても良い。
【００３８】
前記の本発明の測定試薬には、緩衝液成分を含有させることが好ましい。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。その使用量や設定ｐＨ、添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
【００３９】
また、前記の本発明の測定試薬には、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、テトラゾリウム塩安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
テトラゾリウム塩安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実施例１］各種テトラゾリウム塩とジアホラーゼの反応性評価
（１）ジアホラーゼ                                             
以下の表１に示す各ジアホラーゼを用意した。番号１および２が実施例、他は比較例である。 
【００４２】
【表１】
2018153131.tif 000002
【００４３】
（２）テトラゾリウム塩
以下の表２に示す各テトラゾリウム塩を用意した。   
【００４４】
【表２】
2018153131.tif 000003
【００４５】
（３）テトラゾリウム塩、ＮＡＤＨおよびジアホラーゼの各終濃度が以下のとおりになるよう試薬を調製し、調製直後と３７℃１週間（１Ｗ）後の吸光度変化のタイムコースを測定した。
【００４６】
【表３】
2018153131.tif 000004
【００４７】
タイムコースの測定は日立製Ｈ７０６０自動分析機を用いた。表３記載の記載の終濃度になるよう、テトラゾリウム塩とジアホラーゼを含む緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）２５０μＬに対し、同緩衝液に溶解したＮＡＤＨ溶液５０μＬを添加した後、１５分間のタイムコースを取った。測定波長は表３に記載のとおり（各種テトラゾリウム塩から生成するホルマザン色素に依存する）。
【００４８】
結果を図１〜図４に示す。
図１に示すように、テトラゾリウム塩としてＮＢＴを用いた場合、本発明のジアホラーゼは３７℃１Ｗ経過後も他のジアホラーゼよりも高い感度を示しており（すなわち高い活性を維持しており）ＮＢＴ共存下で安定であった。また、反応の立ち上がりも早かった。
図２に示すように、テトラゾリウム塩としてＷＳＴ−１を用いた場合、本発明のジアホラーゼは３７℃１Ｗ経過後も他のジアホラーゼよりも反応の立ち上がりが早かった。
図３に示すように、テトラゾリウム塩としてＩＮＴを用いた場合、本発明のジアホラーゼは３７℃１Ｗ経過後も他のジアホラーゼよりも高い感度を示していた（すなわち高い活性を維持していた）。
図４に示すように、テトラゾリウム塩としてＮＢＴを用いた場合、本発明のジアホラーゼは３７℃１Ｗ経過後も他のジアホラーゼよりも高い感度を示していた（すなわち高い活性を維持していた）。
以上のことから、本発明のジアホラーゼは、ＮＢＴ、ＷＳＴ−１、ＩＮＴまたはＭＴＴの各ホルマザン色素との反応性が優れており、また、これらの各テトラゾリウム塩との共存下においても安定性が優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、ＮＡＤＨの比色定量法で汎用されるテトラゾリウム塩の種類に依存することなく、迅速に検出されるため、対象成分の分析に適した色素を選択することができる。
また、低濃度でも反応性・安定性に優れることから、成分分析試薬、例えば体外診断薬に対するジアホラーゼ添加量を低減することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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