(57)【要約】【課題】糖尿病を処置する方法および／または移植後の膵島の生存を促進する方法を提供すること。【解決手段】ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターを使用して、糖尿病を処置および／または予防するための方法が本明細書に開示される。ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターを使用して、移植後の器官および／または細胞（例えば膵島細胞）の生存を促進する方法もまた開示される。例えば、糖尿病を処置および／または予防する方法であって、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターの有効量を、糖尿病の処置および／または予防を必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年４月１８日に出願した米国仮出願第６１／６２５，９０４号の利益を主張する。この出願の内容全体は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、糖尿病を処置および／もしくは予防すること、ならびに／または移植後の膵島細胞の生存を促進することにおける、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用に、一般に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
糖尿病は、血液中の高レベルの糖を特徴とする代謝疾患である。２つの最も有病率が高い型の糖尿病は、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）である。１型即ちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インスリンを産生する膵島中のベータ細胞の大規模な喪失を特徴とする慢性自己免疫疾患である。２型糖尿病即ちインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、筋肉、脂肪および肝臓の細胞が、インスリンに対して正常に応答できない場合に発症する（インスリン抵抗性）。特に、２型糖尿病は、多くの国において、肥満およびセデンタリーライフスタイルの増加ならびに集団の全般的な加齢を原因として蔓延している。最近の診察では、Ｔ１ＤＭを有する多数の小児が診断の時点で体重過多であるので、Ｔ２ＤＭからＴ１ＤＭを識別することはますます困難になっており、医師に診断されたＴ２ＤＭの若者のかなりの割合が、膵臓自己免疫の証拠を有している（Badaru,  A.およびPihoker,  C.「Type  2  diabetes  in  childhood:  clinical  characteristics  and  role  of  beta-cell  autoimmunity」、Curr.  Diab.  Rep.、２０１２年、１２巻、７５〜８１頁）。２０１１年には、世界中で３億４６００万人を超える人々が、糖尿病に罹患していた。
【０００４】
最近の研究は、ＴＧＦ−βが膵島の機能および糖尿病の発症において役割を果たすことを実証している（Moritani,  M.ら「Abrogation  of  autoimmune  diabetes  in  nonobese  diabetic  mice  and  protection  against  effector  lymphocytes  by  transgenic  paracrine  TGF-β1」、J.  Clin.  Invest.、１９９８年、１０２巻、４９９〜５０６頁；Olivieri,  A.ら「Serum  transforming  growth  factor  β1  during  diabetes  development  in  non-obese  diabetic  mice  and  humans」、Clin.  Exp.  Immunol.、２０１０年、１６２巻、４０７〜４１４頁）。例えば、１週間にわたるＴＧＦ−β発現の島特異的パルスは、１型糖尿病の一般に使用される動物モデル（Roep,  B.  O.ら「Satisfaction  (not)  guaranteed:  re-evaluating  the  use  of  animal  models  of  type  1  diabetes」、Nat.  Rev.  Immunol.、２００４年、４巻、９８９〜９９７頁）であるＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を遅延させることが示されている（Wallberg,  M.ら「An  islet-specific  pulse  of  TGF-β  abrogates  CTL  function  and  promotes  β  cell  survival  independent  of  Foxp3+  T  cells」、J.  Immunol.、２０１１年、１８６巻、２５４３〜２５５１頁）。ＴＧＦ−β１は、糖尿病ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を治癒させ、島破壊的自己免疫を遮断することだけではなく、島再生を誘導する際にも、有効であった（Luo,  X.ら「Systemic  transforming  growth  factor-β1  gene  therapy  induces  Foxp3+  regulatory  cells,  restores  self-tolerance,  and  facilitates  regeneration  of  beta  cell  function  in  overtly  diabetic  nonobese  diabetic  mice」、Transplantation、２００５年、７９巻、１０９１〜１０９６頁）。従って、この経路に沿った治療的介入は、この疾患の進行を停止させ得るだけでなく、高血糖症の発症後に機能を回復させる（即ち、適切なインスリン産生）ことさえし得る。
【０００５】
ＴＧＦ−β１〜３は、細胞増殖、器官発生、線維形成、および免疫細胞の調節を含む種々の生物学的機能に関与する。ＴＧＦ−β１は、免疫系において発現される優勢な形態であり、Ｔ細胞応答を緩和させ得る、免疫応答における重要なレギュレーターとして現在十分認識されている（Li,  M.  O.およびFlavell,  R.  A.「TGF-beta:  a  master  of  all  T  cell  trades」、Cell、２００８年、１３４巻、３９２〜４０４頁）。具体的には、ＴＧＦ−β１は、２つのサブユニットＴＧＦ−β１  Ｒ１およびＴＧＦ−β１  Ｒ２を含有するヘテロダイマー膜貫通セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合する。リガンド結合の際に、ＴＧＦ−β１  Ｒ１受容体は、構成的に活性なＴＧＦ−β１  Ｒ２受容体によってリン酸化され、シグナルは、ＳＭＡＤファミリーに属するタンパク質によって核に伝搬される。活性化されたＴＧＦ−β１  Ｒ１は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３タンパク質を直接リン酸化し、次いでこれらはＳＭＡＤ４と相互作用する。ＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ３／ＳＭＡＤ４の複合体は、核に移行し、特定の遺伝子の転写をモジュレートする。ＳＭＡＤ７は、負のフィードバック機構を介してＴＧＦ−βに対する一般的アンタゴニストとして作用する、このタンパク質ファミリーの別のメンバーである（Yan,  X.およびChen,  Y.  G.「Smad7:  not  only  a  regulator,  but  also  a  cross-talk  mediator  of  TGF-beta  signalling」、Biochem.  J.、２０１１年、４３４巻、１〜１０頁）。
【０００６】
研究により、ＳＭＡＤ７が、糖尿病およびβ細胞機能において役割を果たすことが実証されている。細胞内タンパク質ＳＭＡＤ７は、ＴＧＦ−β１  Ｒ１に対するＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ３の結合を妨害して、これらのタンパク質のリン酸化および活性化を防止し、ＴＧＦ−β１媒介性のシグナル伝達の阻害を導くことが示されている。膵臓β細胞におけるＳＭＡＤ７の発現は、ＴＧＦ−βシグナル伝達を破壊し、可逆的糖尿病を誘導することが示されている（Smart,  N.  G.ら「Conditional  expression  of  Smad7  in  pancreatic  beta  cells  disrupts  TGF-beta  signaling  and  induces  reversible  diabetes  mellitus」、PLoS  Biol.、２００６年、４巻、ｅ３９頁）。さらに、ＮＯＤマウスにおける結果は、糖尿病発症（ｄｉａｂｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）における活性化樹状細胞中のＳｍａｄ２およびＴＧＦ−βシグナル伝達経路もまた暗示し、ヒト１型糖尿病におけるＳｍａｄ７の役割を支持するヒトゲノムワイド関連研究からの証拠が存在する（Hook,  S.  M.ら「Smad2:  A  candidate  gene  for  the  murine  autoimmune  diabetes  locus  Idd21.1」、J.  Clin.  Endocrinol.  Metab.、２０１１年、９６巻、Ｅ２０７２〜Ｅ２０７７頁）。ＴＧＦ−β１は、サイトカイン産生の抑制、Ｔ細胞応答の阻害、および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導に寄与することが示されているので（Kawamoto,  K.ら「Transforming  growth  factor  beta  1  (TGF-β1)  and  rapamycin  synergize  to  effectively  suppress  human  T  cell  responses  via  upregulation  of  FoxP3+  Tregs」、  Transpl.  Immunol.、２０１０年、２３巻、２８〜３３頁）、ＳＭＡＤ７モジュレーションは、移植片機能を支持し、毒性を制限し、免疫拒絶を防止することによって、島移植においても有益であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Badaru,  A.およびPihoker,  C.「Type  2  diabetes  in  childhood:  clinical  characteristics  and  role  of  beta-cell  autoimmunity」、Curr.  Diab.  Rep.、２０１２年、１２巻、７５〜８１頁
【非特許文献２】Moritani,  M.ら「Abrogation  of  autoimmune  diabetes  in  nonobese  diabetic  mice  and  protection  against  effector  lymphocytes  by  transgenic  paracrine  TGF-β1」、J.  Clin.  Invest.、１９９８年、１０２巻、４９９〜５０６頁
【非特許文献３】Olivieri,  A.ら「Serum  transforming  growth  factor  β1  during  diabetes  development  in  non-obese  diabetic  mice  and  humans」、Clin.  Exp.  Immunol.、２０１０年、１６２巻、４０７〜４１４頁
【非特許文献４】Roep,  B.  O.ら「Satisfaction  (not)  guaranteed:  re-evaluating  the  use  of  animal  models  of  type  1  diabetes」、Nat.  Rev.  Immunol.、２００４年、４巻、９８９〜９９７頁
【非特許文献５】Wallberg,  M.ら「An  islet-specific  pulse  of  TGF-β  abrogates  CTL  function  and  promotes  β  cell  survival  independent  of  Foxp3+  T  cells」、J.  Immunol.、２０１１年、１８６巻、２５４３〜２５５１頁
【非特許文献６】Luo,  X.ら「Systemic  transforming  growth  factor-β1  gene  therapy  induces  Foxp3+  regulatory  cells,  restores  self-tolerance,  and  facilitates  regeneration  of  beta  cell  function  in  overtly  diabetic  nonobese  diabetic  mice」、Transplantation、２００５年、７９巻、１０９１〜１０９６頁
【非特許文献７】Li,  M.  O.およびFlavell,  R.  A.「TGF-beta:  a  master  of  all  T  cell  trades」、Cell、２００８年、１３４巻、３９２〜４０４頁
【非特許文献８】Yan,  X.およびChen,  Y.  G.「Smad7:  not  only  a  regulator,  but  also  a  cross-talk  mediator  of  TGF-beta  signalling」、Biochem.  J.、２０１１年、４３４巻、１〜１０頁
【非特許文献９】Smart,  N.  G.ら「Conditional  expression  of  Smad7  in  pancreatic  beta  cells  disrupts  TGF-beta  signaling  and  induces  reversible  diabetes  mellitus」、PLoS  Biol.、２００６年、４巻、ｅ３９頁
【非特許文献１０】Hook,  S.  M.ら「Smad2:  A  candidate  gene  for  the  murine  autoimmune  diabetes  locus  Idd21.1」、J.  Clin.  Endocrinol.  Metab.、２０１１年、９６巻、Ｅ２０７２〜Ｅ２０７７頁
【非特許文献１１】Kawamoto,  K.ら「Transforming  growth  factor  beta  1  (TGF-β1)  and  rapamycin  synergize  to  effectively  suppress  human  T  cell  responses  via  upregulation  of  FoxP3+  Tregs」、  Transpl.  Immunol.、２０１０年、２３巻、２８〜３３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、糖尿病および膵島移植における新たな治療の必要性は満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
開示される方法は、ＳＭＡＤ７を阻害し、従ってＴＧＦ−βシグナル伝達を回復させる、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビター、例えばＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの知見に一部基づいている。例示的なＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、医薬組成物中で使用され得る、配列番号５または配列番号６が挙げられる。開示されたＳＭＡＤ７インヒビターは、糖尿病、例えば１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠糖尿病を処置および／または予防するために使用され得る。ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、移植後の膵島細胞の生存を促進するためにも使用され得る。
【００１０】
本発明の上述の態様および実施形態は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲を参照することによって、より完全に理解され得る。本明細書で使用する場合、「含む」は、限定がないことを意味し、引用される例は非限定的である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
糖尿病を処置および／または予防する方法であって、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターの有効量を、糖尿病の処置および／または予防を必要とする患者に投与することを含む方法。
（項目２）
移植後の器官および／または細胞の生存を促進する方法であって、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターの有効量を、移植後の器官および／または細胞の生存の促進を必要とする患者に投与することを含む方法。
（項目３）
前記細胞が膵島細胞である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビターが、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５または配列番号９を含む、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号６または配列番号１０を含む、項目４または５に記載の方法。
（項目８）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが非経口投与される、項目４〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが皮下投与される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に受容可能な担体とを含む医薬組成物を投与することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５または配列番号９を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号６または配列番号１０を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１４）
前記医薬組成物が皮下投与される、項目１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病および妊娠糖尿病からなる群より選択される、項目１および項目４〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１（Ａ）は、ＳＭＡＤ７の核酸配列（配列番号１）を提供し、（Ｂ）は、ＳＭＡＤ７のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。
【図１Ｂ】図１（Ａ）は、ＳＭＡＤ７の核酸配列（配列番号１）を提供し、（Ｂ）は、ＳＭＡＤ７のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。
【図２Ａ】図２（Ａ）は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＮＦ−αセンサー細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＧＦβおよびＧＥＤ−０３０１（ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド、配列番号６）の効果を示すグラフであり、（Ｂ）は、それぞれＴＮＦ−αおよびＣＤ４０ＬによってチャレンジされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＣＤ４０Ｌセンサー細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＧＦβおよびＧＥＤ−０３０１の効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２（Ａ）は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＮＦ−αセンサー細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＧＦβおよびＧＥＤ−０３０１（ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド、配列番号６）の効果を示すグラフであり、（Ｂ）は、それぞれＴＮＦ−αおよびＣＤ４０ＬによってチャレンジされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＣＤ４０Ｌセンサー細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＧＦβおよびＧＥＤ−０３０１の効果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３（Ａ）は、マウスにおける種々の経路による投与後のフルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１の器官特異的取り込みに関するフローサイトメトリー結果の分析において使用したゲーティング方法論を示すパネルであり、図３（Ｂ）は、示された器官組織中の生存細胞における対応する取り込みパーセント（ＦＩＴＣ＋）を示す。
【図３Ｂ−１】図３（Ａ）は、マウスにおける種々の経路による投与後のフルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１の器官特異的取り込みに関するフローサイトメトリー結果の分析において使用したゲーティング方法論を示すパネルであり、図３（Ｂ）は、示された器官組織中の生存細胞における対応する取り込みパーセント（ＦＩＴＣ＋）を示す。
【図３Ｂ−２】図３（Ａ）は、マウスにおける種々の経路による投与後のフルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１の器官特異的取り込みに関するフローサイトメトリー結果の分析において使用したゲーティング方法論を示すパネルであり、図３（Ｂ）は、示された器官組織中の生存細胞における対応する取り込みパーセント（ＦＩＴＣ＋）を示す。
【図４】図４は、フルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１が皮下投与された、対照マウスおよびマウス（投与の４時間後）由来の膵臓の切片を示す多重チャネル高解像度顕微鏡画像である。色の脚注：緑色−蛍光ＧＥＤ−０３０１、灰色−ＤＡＰＩ（細胞核のマーカー）、赤色−インスリン（インスリン産生β細胞を示す）および青色−ＣＤ４５（免疫および炎症の細胞を含む循環血液系の要素である白血球のマーカーであるＣＤ４５即ち白血球共通抗原ＬＣＡを示す）。
【図５Ａ】図５（Ａ）は、高血糖症の発症後にＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＥＤ−０３０１（ＡＳ  ＧＥＤ−０３０１）、対応するセンス対照（Ｓ対照）および生理食塩水（対照）（１２５μｇ／動物、皮下（ｓ．ｃ．）、毎日）で処置したＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルを示すグラフであり、図５（Ｂ）は、糖尿病のない状態を維持する動物のパーセントを時間の関数として示す対応するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。
【図５Ｂ】図５（Ａ）は、高血糖症の発症後にＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＥＤ−０３０１（ＡＳ  ＧＥＤ−０３０１）、対応するセンス対照（Ｓ対照）および生理食塩水（対照）（１２５μｇ／動物、皮下（ｓ．ｃ．）、毎日）で処置したＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルを示すグラフであり、図５（Ｂ）は、糖尿病のない状態を維持する動物のパーセントを時間の関数として示す対応するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。
【図６】図６は、研究の終了時（１５０日目）までに糖尿病にならなかったＧＥＤ−０３０１処置されたＮＯＤマウスおよび対照マウスにおいて実施された経口グルコース負荷試験の結果を比較するグラフである。
【図７】図７は、研究の終了時（１５０日目）までに糖尿病にならなかったＧＥＤ−０３０１処置されたＮＯＤマウス由来の膵臓の代表的な島含有切片を対応する対照のものと比較する共焦点顕微鏡画像の多重チャネル高解像度Ｚスタックを示す。色の脚注：青色−ＤＡＰＩ（細胞核のマーカー）、赤色−インスリン（インスリン産生β細胞を示す）および緑色−グルカゴン（グルカゴン産生α細胞を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本開示は、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに糖尿病を処置および／もしくは予防すること、ならびに／または移植後の膵島細胞の生存を促進することにおけるその使用に、一般に関する。
【００１３】
抗ＳＭＡＤ７治療
開示された方法は、糖尿病を処置および／もしくは予防するための、ならびに／または移植後の膵島細胞の生存を促進することにおける、小さい結合分子、例えば、天然および合成の化合物、抗体、アプタマー、イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）、ＲＮＡｉ（二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）ならびに抗ＳＭＡＤ７アンチセンス分子からなる群より選択される特異的ＳＭＡＤ７インヒビターの使用に関する。ＳＭＡＤ７インヒビターは、ＳＭＡＤ７を妨害し、それによってＳＭＡＤ７の機能を阻害する、短縮型および／または変異型のＳＭＡＤ７分子もまた包含し得る。
【００１４】
例えば、抗ＳＭＡＤ７治療には、ＳＭＡＤ７に対する標的化治療（例えば、抗ＳＭＡＤ７アンチセンス治療、即ちＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＳＭＡＤ７に対する抗体）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的タンパク質（例えば、ＳＭＡＤ７）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して相補的な短い合成オリゴヌクレオチド配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、このｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を分解し従ってタンパク質翻訳を防止する遍在性触媒酵素、例えばＲＮａｓｅ  Ｈの活性化を導き得る二本鎖ハイブリッドを生じる。
【００１５】
特定の実施形態では、抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（例えば、配列番号１の）ヒトＳＭＡＤ７  ｍＲＮＡの部位４０３、２３３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９および／または５３３（即ち、それぞれヌクレオチド４０３、２３３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９および５３３）を標的化し得る（図１を参照のこと）。例示的な実施形態では、この抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＭＡＤ７  ｍＲＮＡの核酸４０３〜４２３を標的化する。
【００１６】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３）に由来し得る。
【００１７】
ＳＭＡＤ７を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ対中のシトシン残基が５’−メチルシトシン（Ｍｅ−ｄＣと略す）によって置き換えられた混合骨格を含み得ることが、本明細書で企図される。メチルホスホネート連結は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にも配置され得る（ＭｅＰと略す）。企図された抗ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのホスホネート骨格は、１、２、３、４またはそれより多くのホスホロチオエート結合を必要に応じて含み得る（例えば、ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合と置き換わる）。一実施形態では、全てのホスホネート結合は、ホスホロチオエート結合であり得る。
【００１８】
ＳＭＡＤ７を標的化する例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチド治療としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
５’−ＧＴＸＹＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＹＣＡＧ−３’（配列番号４）（Ｘは、シトシンおよび５−メチルシトシンからなる群より選択される窒素含有塩基または２’−Ｏ−メチルシトシンヌクレオシドを含むヌクレオチドであり、Ｙは、グアニンおよび５−メチルグアニンからなる群より選択される窒素含有塩基または２’−Ｏ−メチルグアニンヌクレオシドを含むヌクレオチドであり、ただし、ヌクレオチドＸまたはＹのうち少なくとも一方が、メチル化窒素含有塩基を含むことを条件とする）；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’（配列番号５）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートである）；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ−３’（配列番号６）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートである）；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’（配列番号７）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’（配列番号８）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルホスホネートである）。
【００１９】
特定の実施形態では、企図されたＳＭＡＤ７アンチセンスは、以下のうち１つを含む配列であり得る：
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧ−３’（配列番号９）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスホロチオエートである）；
５’−ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１０）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスホロチオエートである）；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺ−３’（配列番号１１）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルチオホスホネートである）；
５’−ＺＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＺＣ−３’（配列番号１２）（Ｘは５−メチル２’−デオキシシチジン５’−モノホスフェートであり、Ｚは２’−デオキシグアノシンメチルチオホスホネートである）。
【００２０】
例えば、配列番号９〜１２は、１、２、３、４またはそれより多くのホスホロチオエート結合を含む。一実施形態では、配列番号９〜１２の全てのＯ，Ｏホスホネート結合が、ホスホロチオエート結合である。
【００２１】
処置の方法
本明細書では、移植後の器官および／または細胞（例えば膵島細胞）の生存を促進する方法であって、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビター（例えばＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）の有効量を、移植後の器官および／または細胞（例えば膵島細胞）の生存の促進を必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
【００２２】
本明細書ではさらに、糖尿病（例えば、１型糖尿病および２型糖尿病）を処置および／または予防する方法であって、ＳＭＡＤ７の発現または機能の特異的インヒビター（例えばＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）の有効量を、糖尿病（例えば、１型糖尿病および２型糖尿病）の処置および／または予防を必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
【００２３】
糖尿病には、高血糖またはケトアシドーシスを特徴とする代謝疾患の群、ならびに長期の高血糖状態または耐糖能の減少から生じる、慢性の全身代謝異常が包含される。糖尿病には、この疾患の１型形態および２型形態の両方、妊娠糖尿病、ならびにインスリン欠乏症の他の状態が包含される。
【００２４】
開示された方法は、潜在性自己免疫性糖尿病（即ち、１．５型糖尿病）、代謝不均衡、前糖尿病状態、メタボリックシンドローム、脂質またはグルコース関連の障害、例えば、高脂血症および／または高コレステロール血症、ならびに他の関連障害を処置および予防するためにも適用可能であることが理解される。
【００２５】
代謝不均衡は、上昇した血漿グルコースと関連する任意の障害または疾患状態または状態を含み得る。代謝不均衡は、例えば、糖尿病、妊娠糖尿病、β細胞機能の遺伝的欠損、インスリン作用における遺伝的欠損、外分泌膵臓の疾患、内分泌疾患、薬物または化学物質誘導性の感染、糖尿病、前糖尿病状態およびメタボリックシンドロームと関連する他の遺伝的症候群を含む。
【００２６】
メタボリックシンドロームは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＨＡ）によって記載されるように、１人の人物における一群の代謝リスクファクターを特徴とする。メタボリックシンドロームは、メタボリックシンドロームＸ、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、Ｒｅａｖｅｎ症候群またはＣＨＡＯＳとしても公知である。リスクファクターには、腹部肥満、アテローム生成的脂質異常症、高血圧症、インスリン抵抗性または耐糖能障害、血栓形成促進性状態（高いフィブリノーゲンまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１）および炎症促進性状態（上昇したＣ反応性タンパク質）が包含されるが、これらに限定されない。
【００２７】
用語「処置する」、「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的な効果を得ることを一般に意味するために、本明細書で使用される。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害効果を部分的にもしくは完全に治癒することに関して治療的であり得る。用語「処置」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、以下を含む：（ａ）その疾患にかかりやすい可能性があるが、その疾患を有すると未だ診断されていない対象において、その疾患が発生することを予防すること；（ｂ）その疾患を阻害すること、即ち、その発達を停止させること；または（ｃ）その疾患を軽減すること、即ち、その疾患の退縮を引き起こすこと。
【００２８】
特定の実施形態では、抗ＳＭＡＤ７治療による処置に対する対象の応答性は、処置前に対象から取得された対照試料（以下に記載する）に関して解釈され得る。対象は、ＳＭＡＤ７発現における低減が存在する場合；総膵臓インスリン含量における増加が存在する場合；β細胞機能が維持および／もしくは回復される場合（例えば、静脈内グルコース負荷試験ＩＶＧＴＴなどの標準的な方法を介して評価される）；ならびに／または正常血糖、即ち、血液の正常なグルコース含量が維持および／もしくは回復される場合に、抗ＳＭＡＤ７治療による処置に対して応答していると同定され得る。他の実施形態では、島移植片、例えば、同種異系島移植片を受けた対象は、島の拒絶の予防および／または島の長期生存が存在する場合に、抗ＳＭＡＤ７治療による処置に対して応答していると同定され得る。
【００２９】
試験試料は、処置に対する感受性を決定するために、治療の開始後、例えば、１週間、２週間、４週間、８週間、１０週間またはそれより後の時点で、患者から取得され得る。いくつかの実施形態では、試験試料は、処置に対する感受性をモニタリングするために、治療の開始後、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、５か月間、６か月間および／または１年間あるいはそれより後に、取得され得る。
【００３０】
対照試料には、抗ＳＭＡＤ７治療による処置の前に対象から取得された試料（例えば、血液または組織試料）が含まれ得る。この対照試料は、処置に対する対象の進行をモニタリングするためのベースラインを提供する。対照試料は、抗ＳＭＡＤ７治療が最初に投与された日（例えば、処置レジメンの１日目）に、対象から取得され得る。他の実施形態では、対照試料は、抗ＳＭＡＤ７治療の開始の１日前（例えば、処置レジメンの０日目）に、対象から取得され得る。あるいは、対照試料は、抗ＳＭＡＤ７治療の開始の２、３、４、５、６、７日前またはそれよりも多くの日数前の日に、対象から取得され得る。例えば、特定の細胞試料の上方調節または下方調節は、治療、例えば抗ＳＭＡＤ７治療に対する対象の応答をモニタリングするために、処置前に（例えば、対照試料）、処置中に、および／または処置後に測定され得る。
【００３１】
対照試料には、例えば、対象のグルコースレベルをモニタリングするための試料が含まれ得、この試料は、抗ＳＭＡＤ７治療による処置の前に対象から取得した。
【００３２】
いくつかの実施形態では、対照レベルは、対象における特定の細胞集団の長期モニタリングに基づいて、対象について確立され得る。かかる例では、対象が、複数回の抗ＳＭＡＤ７治療による処置を受け得ることが企図される。複数回の処置の後に検出される特定の細胞集団の量は、その対象が治療に応答したかどうかおよび／または抗ＳＭＡＤ７治療によるさらなる処置に対して応答する可能性があるかどうかを決定するために、その対象についての以前の対照レベルと比較され得る。他の実施形態では、対象についての対照レベルまたはベースラインレベルは、経時的に取得された（例えば、数週間、数か月間または数年間の経過にわたって取得された）複数のベースライン試料から決定された特定の細胞集団の平均測定値に基づいて確立され得る。従って、本明細書に開示されるように実施される任意の試験またはアッセイは、以前のまたは確立された対照レベルと比較され得、例えばその対象が抗ＳＭＡＤ７治療による１回より多い処置を受けている場合、比較のために対象から新たな対照試料を取得する必要がない可能性がある。
【００３３】
投与および製剤
いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ７に対する企図されたアンチセンスオリゴヌクレオチドと薬学的に受容可能な担体とを含む医薬組成物が、本明細書で企図される。例えば、この医薬組成物は皮下投与され得る。あるいは、この医薬組成物は経口投与され得る。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「薬学的に受容可能な担体」とは、合理的な利益／危険度比と釣り合った、過剰な毒性も、刺激も、アレルギー応答も、他の問題も、合併症も有さない、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に適した、バッファー、担体および賦形剤を意味する。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合性であり、かつレシピエントに対して有害でないという意味において、「受容可能」であるべきである。薬学的に受容可能な担体には、医薬品投与と適合する、バッファー、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で公知である。
【００３５】
一実施形態では、ＳＭＡＤ７に対する企図されたアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその任意の医薬組成物は、経口的、局所的（topically）、非経口的、例えば、皮下注射、吸入スプレーによるまたは直腸的をはじめとする１つまたはいくつかの経路によって、投与され得る。用語非経口には、本明細書で使用する場合、皮下注射、膵臓内投与、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内（intrasternal）の注射または注入の技術が包含される。例えば、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象に皮下投与され得る。別の例では、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象に経口投与され得る。
【００３６】
本明細書に開示されるものなどのＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投薬単位形態で提示され得、任意の適切な方法によって調製され得る。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性であるように製剤化すべきである。有用な製剤は、医薬品分野で周知の方法によって調製され得る。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１８版（Mack  Publishing  Company、１９９０年）を参照のこと。
【００３７】
医薬製剤は、好ましくは無菌である。無菌化は、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、フィルター無菌化は、凍結乾燥および再構成の前または後に実施され得る。
【００３８】
例示的な実施形態では、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下投与のための医薬組成物は、配列番号６によって示されるものなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に受容可能な塩（例えばナトリウム塩）と、薬学的に受容可能な担体とを含む。
【００３９】
別の実施形態では、ＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口投与のための医薬錠剤製剤は、粒内（ｉｎｔｒａｇｒａｎｕｌａｒ）相を含み、かつ粒外（ｅｘｔｒａ−ｇｒａｎｕｌａｒ）相もまた含み得、この粒内相は、配列番号６によって示されるものなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に受容可能な塩（例えばナトリウム塩）と、薬学的に受容可能なフィラーとを含み、粒外相は、崩壊剤などの薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。例えば、経口使用のための薬学的に受容可能な錠剤は、約５〜約１０重量％の配列番号６によって示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に受容可能な塩、約４０重量％のマンニトール、約８重量％の微結晶セルロース、約５重量％のヒドロプロピルメチルセルロース（hydropropylmethyl  cellulose）および約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む粒内相と；約１７重量％の微結晶セルロース、約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウム、約０．４重量％のステアリン酸マグネシウムを含む粒外相と；約１３重量％のＡｃｙｒｌＥＺＥ（登録商標）を含む、錠剤を覆う腸溶コーティング（例えば、その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開公報ＷＯ／２０１０／０５４８２６号を参照のこと）とを含み得る。
【００４０】
例示的な製剤には、約３５ｍｇ〜約５００ｍｇのＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むかまたは約３５ｍｇ〜約５００ｍｇのＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドから本質的になる投薬形態が含まれる。例えば、約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇまたは２５０ｍｇのＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤が、本明細書で企図される。一実施形態では、製剤は、約４０ｍｇ、８０ｍｇまたは１６０ｍｇのＳＭＡＤ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。投与される量は、処置される疾患または適応症のタイプおよび程度、患者の全体的健康、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力、医薬製剤ならびに投与経路などの変数に依存する。開始投薬量は、所望の血中レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、上限レベルを超えて増加され得る。あるいは、この開始投薬量は、最適よりも少なくてもよく、この投薬量は、処置の過程の間に漸進的に増加され得る。ヒト投薬量は、例えば、４０ｍｇから１６０ｍｇまでで実施するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増研究において、最適化され得る。投薬頻度は、投与経路、投薬の量および処置される疾患などの因子に依存して変動し得る。例示的な投薬頻度は、１日１回、１週間に１回および２週間毎に１回である。いくつかの実施形態では、投薬は、７日間にわたって１日１回である。好ましい投与経路は皮下である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、本明細書に開示される疾患および障害の処置に向けられる少なくとも１つの他の薬剤を投与することを、さらに含み得る。一実施形態では、企図された他の薬剤は、（例えば、逐次的にまたは同時に）共投与され得る。
【００４２】
企図された薬剤には、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレートおよび小さい生物学的薬剤を含む免疫抑制剤が包含される。例えば、企図された免疫抑制剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ−ＣＤ３、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブおよびエタネルセプト。
【００４３】
企図された薬剤には、血糖降下剤および／または経口抗糖尿病剤による経口治療、注射可能な治療などを含む、血糖レベルを調節するための薬物治療が含まれる。血糖レベルを調節するための非薬物治療には、食事療法（diatetic）および／または運動管理措置が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
血糖レベルを調節するための経口薬物治療には、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない血糖降下剤が含まれる：アカルボース、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ダルグリタゾンナトリウム、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、レパグリニド、トログリタゾン、トラザミドおよびトルブタミド。
【００４５】
血糖レベルを調節するための経口薬物治療には、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない抗糖尿病剤が含まれる：アカルボース、アセトヘキサミド、ブホルミン、ブトキサミン塩酸塩、カミグリボース（Ｃａｍｉｇｌｉｂｏｓｅ）、クロルプロパミド、シグリタゾン、エングリタゾンナトリウム、エトホルミン塩酸塩（Ｅｔｏｆｏｒｍｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、グリアミリド（Ｇｌｉａｍｉｌｉｄｅ）、グリボルヌリド、グリセタニルグリクラジドナトリウム（Ｇｌｉｃｅｔａｎｉｌｅ  Ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）、グリフルミド（Ｇｌｉｆｌｕｍｉｄｅ）、グリピジド、グルカゴン、グリブリド、グリヘキサミド（Ｇｌｙｈｅｘａｍｉｄｅ）、グリミジンナトリウム、グリオクタミド（Ｇｌｙｏｃｔａｍｉｄｅ）、グリパラミド（Ｇｌｙｐａｒａｍｉｄｅ）、インスリンイソフェン（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉｓｏｐｈａｎｅ）、インスリンヒト亜鉛（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｚｉｎｃ）、持続型インスリン（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）、インスリンリスプロ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｌｉｓｐｒｏ）、リノグリリド（Ｌｉｎｏｇｌｉｒｉｄｅ）、フマル酸リノグリリド、メトホルミン、メチルパルモキシレート（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐａｌｍｏｘｉｒａｔｅ）、パルモキシレートナトリウム、ピオグリタゾン塩酸塩、ピログリリド酒石酸塩（Ｐｉｒｏｇｌｉｒｉｄｅ  Ｔａｒｔｒａｔｅ）、プロインスリンヒト（Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  Ｈｕｍａｎ）、レパグリニド、セグリチド酢酸塩（Ｓｅｇｌｉｔｉｄｅ  Ａｃｅｔａｔｅ）、トラザミド、トルブタミド、トルピラミド（Ｔｏｌｐｙｒｒａｍｉｄｅ）、トログリタゾンおよびゾポルレスタット。
【００４６】
血糖レベルを調節するための注射可能な治療には、速効性インスリン、長時間作用性インスリンおよび関連のインスリンが挙げられ得るが、これらに限定されない。速効性インスリンには、レギュラーインスリン、即効型インスリン亜鉛懸濁物（Ｐｒｏｍｐｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｚｉｎｃ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）およびＳｅｍｉｌｅｎｔｅ（登録商標）インスリン、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｒ、Ｉｌｅｔｉｎ  ＩＩ、Ｎｏｖｏｌｉｎ  Ｒ、精製ブタレギュラーインスリン（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｏｒｋ  Ｒｅｇｕｌａｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）ならびにベロスリンBRヒトインスリン（Ｖｅｌｏｓｕｌｉｎ  ＢＲ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）が含まれる。長時間作用性インスリンには、プロタミン亜鉛インスリン懸濁物（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ  Ｚｉｎｃ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、持続型インスリン亜鉛懸濁物（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｚｉｎｃ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、Ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅ（登録商標）ＩｎｓｕｌｉｎおよびＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）Ｕが含まれる。他のインスリンには、イソフェンインスリン懸濁物（Ｉｓｏｐｈａｎｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、ＮＰＨ  インスリン、イソフェン（ｉｓｏｐｈａｎｅ）インスリン；インスリン亜鉛懸濁物（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｚｉｎｃ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）  Ｌｅｎｔｅ（登録商標）Ｉｎｓｕｌｉｎ、ヒトインスリンイソフェン懸濁液／ヒトインスリン懸濁物（Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉｓｏｐｈａｎｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ／Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）５０／５０、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）７０／３０およびＮｏｖｏｌｉｎ（登録商標）７０／３０が含まれる。
【実施例】
【００４７】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲または内容を限定するとは決して解釈すべきではない。
【００４８】
（実施例１）
ＮＦ−κＢ活性化に対するＳＭＡＤ７アンチセンスの効果
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）ＴＮＦ−α／ＩＬ−１βセンサー細胞を、ＮＦ−κＢ経路の活性化をモニタリングすることによって生理活性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを検出するために、設計する。これらの細胞を、５つのＮＦ−κＢ結合部位および５つのＡＰ−１結合部位に融合したＩＦＮ−βミニマルプロモーターの制御下にあるＳＥＡＰレポーター遺伝子による、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３細胞の安定なトランスフェクションによって生成した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）ＣＤ４０Ｌセンサー細胞を使用して、ＣＤ４０刺激後のＮＦ−κＢ活性化に対する胎児アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌を介して、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）の生理活性を測定する。これらの細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子およびＮＦ−κＢ誘導性ＳＥＡＰ構築物による、ＨＥＫ２９３細胞の安定なトランスフェクションによって生成した。従って、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、ＴＮＦＲ／ＣＤ４０刺激後のＮＦ−κＢ活性化の際の胎児アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌を介して、ＴＮＦα／ＣＤ４０Ｌの生理活性を測定する。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、全身炎症および免疫細胞の調節に関与する公知のサイトカインである。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞活性化および有効な免疫応答の発達に関与する補助刺激タンパク質であり、Ｔ１ＤＭを含む自己免疫疾患の発症に関与すると考えられている（Margolles-Clark,  E.ら「Small  molecule  costimulatory  blockade:  organic  dye  inhibitors  of  the  CD40-CD154  interaction」、J.  Mol.  Med.、２００９年、８７巻、１１３３〜１１４３頁）。
【００４９】
ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ  ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌセンサー細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（５０，０００／ウェル）を、リポフェクタミン（ＬＰＦ）の存在下でＧＥＤ−０３０１アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドまたは対照センス（Ｓ）オリゴヌクレオチド（ＯＧＮ；４μｇ／ｍＬ）と共に６時間、次いで、培地と共に１８時間インキュベートし、その後、ＴＧＦ−β（２００ｎｇ／ｍＬ；２４時間、ＤＭＥＭ  Ｐ／Ｓ  ２％血清）の存在下または非存在下でＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）またはＣＤ４０Ｌ（２５ｎｇ／ｍＬ）によるチャレンジを行った。ＧＥＤ−０３０１は、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＧＴＸＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＸＧＣＡＧＣ（Ｘは５−メチル−２’−デオキシシチジン５’モノホスフェート（５−Ｍｅ−ｄＣ）である）（配列番号６））である。これらの細胞においてＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌによって誘導されるＳＥＡＰの分泌は、６２５〜６５５ｎｍにおいてＯＤを読み取ることによって定量され得る、ＳＥＡＰの存在下で青紫色に変化する培地と共に、製造業者によって提供されたこの目的のために特に開発された比色酵素アッセイＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）を使用して、定量した。データは、未処置の対照細胞における刺激された応答（ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌ単独）に対して正規化された値を使用して、１プレート当たり４つ組を用いた３回の独立した実験の平均である。
【００５０】
ＴＮＦαおよびＣＤ４０ＬによるＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するＴＧＦ−βおよびＧＥＤ−０３０１の効果を、それぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示す。結果は、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌの両方が、かなりのＮＦ−κＢ活性化（ＳＥＡＰ発現によって測定される）を生じ、これらが共にＴＧＦ−βによって抑制されたことを示している。この抑制は、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチドＧＥＤ−０３０１による処置によってさらにかなり増強されたが、このことは、この処置が、ＴＧＦ−βの効果を増強および／または回復し得ることを示している。細胞培養系では、ＴＧＦ−βは、使用される細胞型に依存して、ＮＦ−κＢ活性化を促進または阻害し得る（Hong,  S.ら「Smad7  sensitizes  tumor  necrosis  factor  induced  apoptosis  through  the  inhibition  of  antiapoptotic  gene  expression  by  suppressing  activation  of  the  nuclear  factor-kappaB  pathway」、Cancer  Res.、２００７年、６７巻、９５７７〜９５８３頁およびその中の参考文献）。ＴＧＦ−βは、Ｂ細胞およびヒト腸粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）におけるＮＦ−κＢの負のレギュレーターであった。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞についての結果は、ＬＰＭＣについて観察された結果と類似であり、このとき、ＴＧＦ−β１が、正常なＬＰＭＣにおいてＮＦ−κＢ活性化を負に調節すること（ＴＧＦ−β１による事前処理が、ＴＮＦ−α誘導されたＮＦ−κＢ活性化を抑制したので）、および特異的Ｓｍａｄ７アンチセンスによるＩＢＤ  ＬＰＭＣの処理が、ＮＦ−κＢ活性化の阻害を生じたことが示されている（Monteleone,  G.ら「A  failure  of  transforming  growth  factor-β1  negative  regulation  maintains  sustained  NF-κB  activation  in  gut  inflammation」、J.  Biol.  Chem.、２００４年、２７９巻、３９２５〜３９３２頁）。
【００５１】
ＧＥＤ−０３０１がアッセイした細胞に浸透できることを確認するために、ＨＥＫ  Ｂｌｕｅセンサー細胞（５０，０００／ウェル）を、リポフェクタミン（ＬＰＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下または非存在下で、フルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１  ＡＳ  ＯＧＮと共に４８時間インキュベートし、次いで細胞取り込みについて分析した。顕微鏡画像化により、リポフェクタミンの存在下でフルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１と共にインキュベートされたＨＥＫ  Ｂｌｕｅセンサー細胞が、リポフェクタミンで処理されていない細胞よりも良好なフルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１の取り込みを示したことが確認された。
【００５２】
（実施例２）
マウスにおけるＳＭＡＤ７アンチセンスの分布研究
複数回の低用量ストレプトゾトシンで誘導された糖尿病（ＳＴＺ、β細胞特異的毒素；５日間連続して４０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を有する通常のＢ６マウス（６週齢、雄；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．）に、３つの異なる経路：経口（ｐ．ｏ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）および皮下（ｓ．ｃ．）によって、フルオレセイン標識されたＧＥＤ−０３０１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＴｒｉＬｉｎｋ）を投与した（１２５μｇ／マウス＝５ｍｇ／ｋｇ；胃での分解から保護するために、５００μＬビカーボネート溶液、ｐＨ９．５を使用した経口経管栄養によってｐ．ｏ．）。２つの異なる時点（４時間および２４時間）において、２匹の異なる動物から器官を収集し、処理した（１つは顕微鏡法のため、１つはフローサイトメトリーのため）。以下の器官を収集した：膵臓、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、腸、脳、血液、膵臓リンパ節、上腕リンパ節、腸管関連リンパ組織。フローサイトメトリー分析のために、器官を、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して消化し、細胞ストレーナー（７０μｍ；ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通過させ、ＨＢＳＳ中に再懸濁し、生存細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）固定可能バイオレット死細胞染色キット（ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉｏｌｅｔ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および白血球（抗マウスＣＤ４５  ＡＰＣ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について染色した。これらを次いで、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびソフトウェアＦｌｏｗＪｏバージョン７．２．２（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用することによって、生存細胞中のフルオレセイン含量について分析した。図３Ａは、フローサイトメトリー結果を分析するために使用したゲーティング方法論を示す一例を示す。図３Ｂは、特定の器官中の生存細胞における対応する取り込みパーセントについて取得された例示的なフローサイトメトリー結果を含み、これらの結果は、特にｓ．ｃ．投与の後に、膵臓、膵臓リンパ節および他の器官（共に、白血球ではＣＤ４５＋／ＦＩＴＣ＋、他の細胞ではＣＤ４５−／ＦＩＴＣ＋）による顕著なアンチセンスオリゴヌクレオチド取り込み（ＦＩＴＣ＋パーセント）を実証している。脳などのいくつかの器官は、顕著な取り込みを示さなかった。これらの結果により、ＧＥＤ−０３０１が、皮下投与を含む臨床的に受容可能な投与経路を使用して、特定の器官に送達され得ることが確認される。
【００５３】
多重チャネル高解像度顕微鏡画像（図４）により、フローサイトメトリー結果（図３Ｂ）と一致した、蛍光標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下投与後のマウスの膵臓中へのＧＥＤ−０３０１の分布が確認された。色の脚注：緑色−蛍光ＧＥＤ０３０１、灰色−ＤＡＰＩ（細胞核のマーカー）、赤色−インスリン（インスリン産生β細胞を示す）および青色−ＣＤ４５（免疫および炎症の細胞を含む循環血液系の要素である白血球のマーカーであるＣＤ４５即ち白血球共通抗原ＬＣＡを示す）。
【００５４】
（実施例３）
ＳＭＡＤ７アンチセンスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究
さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究を使用して、動物モデルにおける処置の効果を確立することができる。
【００５５】
ＮＯＤマウスにおけるＳＭＡＤ７アンチセンスの高血糖症逆転研究
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、例えばＮＯＤマウスを、高血糖症の発症に際してのみ開始される処置を用いた介入型糖尿病予防試験のために使用した。ＮＯＤマウスは、１型糖尿病の一般に使用される動物モデルであり（Roep,  B.  O.ら、Satisfaction  (not)  guaranteed:  re-evaluating  the  use  of  animal  models  of  type  1  diabetes.  Nat.  Rev.  Immunol.、２００４年、４巻、９８９〜９９７頁）、多数の可能性のある処置を評価するために使用されてきた（Shoda,  L.  K.ら「A  comprehensive  review  of  interventions  in  the  NOD  mouse  and  implications  for  translation」、Immunity、２００５年、２３巻、１１５〜１２６頁）。８週齢の前糖尿病雌性動物を取得し（Ｔａｃｏｎｉｃ）、（馴化後）１０週目から開始して、糖尿を１週間に２回モニタリングした。陽性になった動物において、血中グルコースレベル（糖血症）を、１週間に３回モニタリングした。連続する２日間で上昇したグルコースレベル（非空腹時糖血症＞２００ｍｇ／ｄＬ）を有する動物は、１個の徐放性インスリンペレットインプラント（ＬｉｎＢｉｔ、ＬｉｎＳｈｉｎ  Ｃａｎａｄａ，Ｉｎｃ．）を受けて、重症の高血糖症および残りのβ細胞の消耗／酷使を回避し、処置を開始した。処置をｓ．ｃ．投与したが、これは、この経路が臨床的に適切であり、上記分布研究が、膵臓、膵臓ＬＮおよび他の可能性のある対象の器官を標的とするのにこの経路が有効であることを示したからである。動物を、その高血糖症発症の順に、予め規定された交代パターンに従って３つの処置アームのうち１つに割り当てた。処置（ＧＥＤ−０３０１＝Ｓｍａｄ７  ＡＳ  ＯＧＮ；１２５μｇ／マウス）および対応する対照（Ｓ  ＯＧＮおよび生理食塩水のみ）を、毎日投与した。動物を、１週間に２回モニタリングし、正常血糖を維持する能力について評価した。埋め込まれたインスリンペレットの効果（およそ２５日間）の消失の後、３回連続して＞２５０ｍｇ／ｄＬのグルコース読み取り値を有する動物を糖尿病とみなして屠殺し、代表的な器官（膵臓、ＰＬＮ）を収集した。糖尿病にならなかった動物では、毎日の処置を１０週間後に停止させ、さらに１２週間にわたってモニタリング（最大で合計１５０日間）して、持続する効果が存在するかどうかを確立した。最後に、全ての動物を屠殺し、代表的な器官（膵臓、ＰＬＮなど）を収集した。
【００５６】
この研究からの結果を図５に示し、血中グルコースレベルは図５Ａに、糖尿病のない状態を維持する動物のパーセントを時間の関数として示す対応するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図５Ｂに示す。処置を、β細胞損傷が既に生じていた場合、高血糖症の発症後に開始した。従って、重症の高血糖症が非常に迅速に発症し得る。生理食塩水またはセンスオリゴヌクレオチド対照で処置した全ての動物が、２０〜２５日目までに、徐放性インスリンを有するＬｉｎＢｉｔインプラントの消耗後、その高血糖症（血中グルコース＞２５０ｍｇ／ｄＬ）によって示されるように、糖尿病を発症した（それぞれｎ＝７および６）。活性ＧＥＤ−０３０１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した動物について、処置した１１匹のうち６匹は、高血糖症を発症せず、処置を停止した（７０日目）ずっと後である、最大で研究の終了時（１５０日目）まで糖尿病のない状態を維持した。
【００５７】
研究の終了時（１５０日目）での非糖尿病動物のグルコース応答を検証するために、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を、数匹のＧＥＤ−０３０１処置したマウスならびに対照マウスにおいて実施した。１５０ｍｇのグルコース用量を、１６時間にわたって絶食させたマウスに、経口経管栄養によって投与し、血液試料を、最大で１５０分間にわたり予め規定された時間間隔で収集した。図６に示される結果により、グルコース応答および従ってインスリン分泌能が、健康な動物のものと匹敵していたことが確認される。血中グルコースレベルは、全ての動物において、経口チャレンジの１５０分間以内に正常に戻った。
【００５８】
研究の終了時（１５０日目）までに糖尿病にならなかったＧＥＤ−０３０１処置したＮＯＤマウス由来の膵臓切片の高解像度共焦点顕微鏡画像化を実施して、インスリン産生β細胞の存在を確認した。図７は、ＧＥＤ−０３０１処置したマウスおよび対応する対照由来の膵臓の代表的島含有切片の一連の多重チャネルＺスタック画像を示す。異なる色（列）は以下のとおりである：青色はＤＡＰＩ（細胞核のマーカー）であり、赤色はインスリン（インスリン産生β細胞を示す）であり、緑色はグルカゴン（グルカゴン産生α細胞を示す）である。スケールバーは１００μｍを示す。正常な非糖尿病対照動物は、インスリン産生細胞およびグルカゴン産生細胞の両方を含有する正常な島を有したが（上の行）、研究中に糖尿病になったＮＯＤマウスは、その島からインスリン産生β細胞を喪失した（下の行；正常血糖に復帰しなかったセンスオリゴヌクレオチド処置したマウス由来）。高血糖症の発症時に開始した処置後に糖尿病にならなかったＧＥＤ−０３０１アンチセンス（ＡＳ）処置した動物は、そのインスリン産生細胞を喪失したいくつかの島を有したが（グルカゴンの存在を示すがインスリンを示さない、上から２行目）、保存されたインスリン産生細胞を有する島もまた有した（上から３行目）。従って、高血糖症の発症時に開始されたＧＥＤ−０３０１処置は、ＮＯＤマウスにおいて自己免疫攻撃の影響に対抗でき、正常な血中グルコース応答を維持しかつ高血糖症の発症を回避するのに十分な数でインスリン産生β細胞を保つことができると思われた。
【００５９】
島移植におけるＳＭＡＤ７アンチセンスの研究  局所微小環境におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の回復は、基礎をなす自己免疫疾患の存在下を含め、実験的同種異系島移植モデルにおける有望さを示している。ＧＥＤ−０３０１による処置を実施して、生存および／または同種異系島移植片に対する寛容に対する、ＳＭＡＤ７を標的化するアンチセンスの効果を確立することができる。具体的には、ベータ細胞特異的毒素（ＳＴＺ）の投与によって糖尿病にされたげっ歯類における同種異系移植のモデルにおいて島の拒絶を予防するおよび／または生存を延長させることにおけるＧＥＤ−０３０１の効果が、決定され得る。主要エンドポイントには、移植部位におけるＳｍａｄ７発現／モジュレーションとの相関としての、島同種異系移植片の生存、Ｔリンパ球、樹状細胞上の活性化マーカー、Ｔｒｅｇおよび他のサプレッサー細胞の頻度および抑制機能が含まれ得る。
【００６０】
２型糖尿病におけるＳＭＡＤ７アンチセンスおよび軽度炎症の研究
低度の全身および局所の炎症は、前糖尿病および２型糖尿病を特徴付けるので、膵島内の低度炎症の発症におけるＳＭＡＤ７の潜在的な役割が決定され得る。さらに、糖尿病における島血管合併症におけるＳＭＡＤ７の役割が研究され得る。
【００６１】
糖尿病性腎症におけるＳＭＡＤ７アンチセンスの研究
ヒト糖尿病性腎症および他のタンパク尿糸球体疾患では、Ｓｍａｄ７は、強く上方調節される。この上方調節は、糸球体濾過障壁の完全性を担いかつ一般集団における心血管転帰の独立した予測因子であるアルブミン尿の予防を担う糸球体細胞である有足細胞において主に生じる。ＴＧＦ−ベータの標的化は、強力な橋渡しの試み（ピルフェニドンによる試験）の主題になってきた。これらの試みにおいて、結果は、糖尿病性腎症および他の慢性腎臓疾患の治癒にとって思いがけなく否定的であった。Ｓｍａｄ７阻害による適切なＴＧＦ−βシグナル伝達の回復は、これらの状態を処置するための、見込みのある新規アプローチであり得る。ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓによって開発された糖尿病性腎症の確立された実験モデルは、穏やかなおよび厳しい腎転帰（アルブミン尿、糸球体濾過速度、糸球体硬化症）に関する予備的ｉｎ  ｖｉｖｏデータを生成するために使用され得る。引き続く臨床研究は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙクリニックで開発され得る。
【００６２】
グルコース刺激されたインスリン分泌に対するＳＭＡＤ７アンチセンスの研究
Ｓｍａｄ７過剰発現を有する膵臓β細胞を有するマウスは、インスリン放出の障害および増加した空腹時グルコースを特徴とする。従って、Ｓｍａｄ７阻害は、膵臓β細胞機能の改善を生じ得る。異なるレベルのＳＭＡＤ７を発現するように遺伝子操作されたヒト島におけるグルコース刺激されたインスリン放出実験が実施され得る。さらなる研究では、ヒト患者は、前糖尿病対象における耐糖能障害におけるＳｍａｄ７阻害の役割を決定するために、研究され得る。
【００６３】
参照による援用
本明細書で引用された特許文献および科学論文の各々の全開示は、全ての目的のために参照によって組み込まれる。
【００６４】
均等物
本発明は、その本質的な特徴から逸脱した他の特定の形態で実現され得る。従って、上述の実施形態は、本明細書に記載される発明に対する限定ではなく、例示とみなすべきである。本発明の範囲は、上述の明細書ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等物の意図および範囲内に入る全ての変更は、本発明に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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