(57)【要約】【課題】新たな機能性素材、特にプロバイオティクスとして、また発酵乳酸菌スターターとして有用な桑実に由来する乳酸球菌を提供する。【解決手段】下記の特性を有することを特徴とする、桑実由来のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に属する乳酸球菌：(1)ｐＨ２〜３の人工胃液に耐性、(2)腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に付着性を有する、(3)アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力を有する、(4)乳発酵能を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性を有することを特徴とする、桑実由来のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に属する乳酸球菌：
(1)ｐＨ２〜３の人工胃液に耐性、
(2)腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に付着性を有する、
(3)アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力を有する、
(4)乳発酵能を有する。
【請求項２】
Lactococcus lactis B30（受託番号：NITE P-02397）、当該Lactococcus lactis B30株の同属近縁株、またはこれらの継代株である、請求項１記載の乳酸球菌。
【請求項３】
請求項１または２に記載する乳酸球菌からなるか、または少なくともそれを含む乳酸菌スターター。
【請求項４】
請求項１または２に記載する乳酸球菌を含有することを特徴とする経口組成物。
【請求項５】
経口組成物が飲食物、医薬品、医薬部外品、または飼料である請求項４に記載する経口組成物。
【請求項６】
ＩＬ−１２産生誘導用途、免疫賦活用途、抗ウイルス用途、または抗アレルギー用途に使用される請求項４又は５に記載する経口組成物。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載する乳酸球菌、または請求項３に記載する乳酸菌スターターを用いて、飲食物、医薬品、医薬部外品または飼料の原料を培養する工程を有する、飲食物、医薬品、医薬部外品または飼料の製造方法。
【請求項８】
上記原料がアルギニンを含有するものであるか、または加水分解によりアルギニンを生成し得る成分を含有するものであり、後者の場合は、当該成分を加水分解してアルギニンを生成する作用を有する物質とともに培養する工程を有する、請求項７に記載する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桑の実から単離された新規乳酸球菌に関する。
また本発明は、当該新規乳酸球菌の利用に関する。詳細には、本発明は上記乳酸球菌を利用した乳酸菌スターター、経口組成物、特にヨーグルトや乳酸菌飲料といった乳製品に代表される発酵飲食物、並びにペットや家畜の発酵飼料などに関する。さらに本発明は、当該新規乳酸球菌のＩＬ−１２産生誘導作用を利用した用途に関する。詳細には、本発明は上記乳酸球菌についてＩＬ−１２産生誘導剤、免疫賦活剤、または抗ウイルス剤としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、古くから発酵食品の発酵スターターとして利用されている。近年では、整腸作用、免疫賦活作用、血中コレステロール低下作用など様々な健康機能が注目され、健康食品市場の主要な素材となっている。
【０００３】
一方、機能性食品のマーケティング調査によると「機能性食品を企画する場合、効果の実感・体感が大切である。実感・体感が満足（安心感）につながり継続使用される。」として、効果が体感できることが重要とされている。乳酸菌を発酵スターターとして用いて製造されるヨーグルトや発酵乳等による便秘や下痢の解消といった便性の改善は、古くから経験的に知られている乳酸菌の作用効果であり、こうした整腸作用（腸内環境改善作用）も機能性食品について体感できる効果の一つと言える。
【０００４】
乳酸菌による整腸作用（腸内環境改善作用）は、腸内有用細菌（Lacotobacillus、またはBifidobacteriuｍ）を腸内で増殖させ、腸内腐敗菌であるClostridium（腸炎原因菌）や大腸菌を減少させることによって、腸内環境が改善されて便秘を防ぎ、腸内腐敗菌が作り出す有害物質や発がん物質（CDトキシンやベロ毒素など）の産生を抑え、排泄を促進させる働きに基づくとされている（非特許文献１等参照）。そのため、整腸作用を示す腸内有用細菌の条件として、生きた状態で腸まで届き、腸内である程度の期間、滞留することが求められる。
【０００５】
乳酸菌は大きく乳酸球菌と乳酸桿菌に分けられ環境ストレスへの耐性、栄養要求性などに違いがみられる。乳酸菌を用いた健康食品の多くは酸耐性に優れた乳酸桿菌（植物性乳酸菌など）が用いられる。一方、乳酸球菌は一般に乳酸桿菌に比べて環境ストレスに弱いとされているものの（非特許文献２等参照）、免疫賦活作用をはじめとした様々な機能性を示し、且つ発酵乳のスターターとして優れている。
【０００６】
こうした乳酸菌の免疫賦活作用は、宿主の免疫担当細胞からインターロイキン−１２（IL-12）やインターフェロン−γ（IFN-γ）等のサイトカイン産生を誘導することによるものであり、これにより宿主の細胞性免疫が賦活化し、インフルエンザ・ウイルスなどのウイルスや細菌による感染を防御することが報告されている（例えば、非特許文献３〜５等参照）。
【０００７】
こうした乳酸菌の免疫賦活作用は、宿主の免疫担当細胞からインターロイキン−１２（IL-12）が誘導されることによる。IL-12は、樹状細胞やマクロファージのような抗原提示細胞から分泌されるサイトカインであり、ガン細胞を直接攻撃するナチュラルキラー細胞（NK細胞）やラック細胞（LAK細胞）、キラーＴ細胞（CTL細胞）を活性化したり、インターフェロン−γ（IFN-γ）の産生増強したりする非常に強力な免疫賦活物質である。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側にシフトさせる免疫調節機能を有する。例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lacotobacillus  casei）に属する乳酸菌は、こうしたIL-12産生誘導作用を有しており、宿主の細胞性免疫を賦活化し、インフルエンザ・ウイルス等の感染を防御することが報告されている（非特許文献３〜５）。このように、IL-12産生誘導作用を有する乳酸菌を経口摂取することにより、腸管免疫を担う免疫担当細胞に直接作用してIL-12産生を誘導し、これにより免疫賦活やアレルギー症状の緩和を図ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】辨野義己、「プロバイオティクスとして用いられる乳酸菌の分類と効能」、モダンメディア 57巻10号2011［その他］277-287
【非特許文献２】金子勉、「異常環境下における乳酸菌の適応」、J. Dairy Sci. 34(2) 1994
【非特許文献３】Hori, T. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2002)9:105-108
【非特許文献４】Takeda, K. et al., Clin. Exp. Immunol. (2006)146:109-115
【非特許文献５】Ogawa, T. et al., Clin. Exp. Immunol. (2006)143:103-109
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生きた状態で腸まで届き、腸内である程度の期間滞留することで、整腸作用等の生体作用を発揮し、プロバイオティクス菌として有用な新規な乳酸球菌を提供することを課題とする。また本発明は、IL-12産生誘導作用を有し、宿主の免疫を賦活化することで種々の感染を予防ないし防御することが可能な乳酸球菌を提供することを課題とする。さらに本発明は、発酵乳のスターターとして使用することができる新規な乳酸球菌、つまり発酵経口組成物（飲食物、医薬品、医薬部外品、飼料）の製造に使用することができ、且つ当該発酵経口組成物中に生きた状態で含まれる新規乳酸球菌を提供することを課題とする。また本発明は、当該新規乳酸球菌の利用方法（発酵乳等の乳酸菌スターターとしての利用、経口組成物としての利用、経口組成物の製造のための利用）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、島根県の特産である桑に注目し、鋭意検討していたところ、桑の実に存在する乳酸菌のうち、Lactobacillus lactisに属する乳酸球菌に、耐酸性と腸管上皮細胞への付着性があることを見出した。このため、当該乳酸球菌は生きた状態で腸まで届き、腸内にある程度の期間滞留し、整腸作用等の生体作用を発揮するものと考えられる。また、当該乳酸球菌は、アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力（Argininedeiminase pathway）を有することを確認した。オルニチンは疲労回復や肝機能改善等といった有用な生体作用を発揮するアミノ酸であることから、当該乳酸球菌はプロバイオティクス菌として有効に利用できるものと考えられる。さらに、当該乳酸球菌は、良好な乳発酵能を有しており、発酵乳酸菌スターターとしてヨーグルトや乳酸飲料といった発酵飲食物の製造に使用できることを確認した。
【００１１】
また本発明者は、桑実に由来する前記乳酸球菌には、IL-12産生誘導作用があることを確認した。このため、当該乳酸球菌によれば、当該IL-12産生誘導作用を通じて、免疫賦活作用、抗ウイルス作用及び／または抗アレルギー作用などを発揮することが期待される。
【００１２】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものであり、当該桑の実に由来する乳酸球菌を新たな機能性素材、特にプロバイオティクスとして、また発酵乳酸菌スターターとして提供するものである。また本発明は、桑実由来乳酸球菌をIL-12産生誘導剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、または抗アレルギー剤の有効成分として提供するものである。
【００１３】
本発明には、下記の態様が含まれる。
【００１４】
（Ｉ）桑実由来の乳酸球菌
（Ｉ−１）下記の特性を有することを特徴とする、桑実由来のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に属する乳酸球菌：
(1)ｐＨ２〜３の人工胃液に耐性、
(2)腸管上皮細胞（Caco-2）に付着性を有する、
(3)アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力を有する、
(4)乳発酵能を有する。
（Ｉ−２）Lactococcus lactis B30（受託番号：NITE P-02397）、当該Lactococcus lactis B30株の同属近縁株、またはこれらの継代株である、（Ｉ−１）記載の乳酸球菌。
【００１５】
（II）桑実由来の乳酸球菌の利用
（II−１）（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する乳酸球菌からなるか、または少なくともそれを含む乳酸菌スターター。
【００１６】
（II−２）（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する乳酸球菌を含有することを特徴とする経口組成物。
（II−３）上記乳酸球菌が生菌状態または死菌状態にある菌である（II−２）に記載する経口組成物。
（II−４）経口組成物が飲食物、医薬品、医薬部外品または飼料である（II−２）または（II−３）に記載する経口組成物。
（II−５）錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、及びシロップ剤からなる群から選択される製剤形態を有する飲食物、特にサプリメント、医薬品、または医薬部外品である（II−２）〜（II−４）のいずれかに記載する経口組成物。
（II−６）前記乳酸球菌が生菌状態にある菌であり、発酵飲食物または発酵飼料である（II−２）に記載する経口組成物。
【００１７】
（II−７）ＩＬ−１２産生誘導用組成物である、（II−１）〜（II−５）に記載する経口組成物。
（II−８）免疫賦活用組成物、抗ウイルス用組成物、または抗アレルギー用組成物である、（II−１）〜（II−５）または（II−７）に記載する経口組成物。
【００１８】
（III）飲食物、医薬品、医薬部外品または飼料の製造方法
（III−１）（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する乳酸球菌、または（II−１）に記載する乳酸菌スターターを用いて、飲食物、医薬品、医薬部外品または飼料の原料を培養する工程を有する、飲食物または飼料の製造方法。
（III−２）上記原料がアルギニンを含有するものである、（III−１）に記載する製造方法。
（III−３）上記原料が加水分解によりアルギニンを生成し得るペプチドまたはタンパク質を含有するものであり、上記培養工程前、または培養工程と同時に、当該原料の加水分解処理工程を有する、（III−１）に記載する製造方法。
（III−４）上記加水分解処理工程が、原料に含まれるペプチドまたはタンパク質を加水分解する酵素処理工程である、（III−３）に記載する製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の乳酸球菌は生菌状態で腸内に届き、腸管上皮細胞に付着する特性を有している。このため本発明の乳酸球菌を生菌状態で含む組成物は、整腸を始めとする腸環境改善作用等の生体に有用な生理作用を発揮することができ、例えばサプリメント、機能性表示食品、特定保健用食品等の機能性食品として有用である。また本発明の乳酸球菌は、乳発酵能を有するため、発酵乳を製造するためのスターター菌として有効に使用することができる。
【００２０】
また本発明の乳酸球菌は、アルギニンを基質として有用アミノ酸であるオルニチンを産生する作用を有する。このため、アルギニンを含む原料を本発明の乳酸球菌で培養することでオルニチンを多く含む組成物を製造することができる。また当該組成物はオルニチンが有する有用な生理作用を発揮することができ、例えばサプリメント、機能性表示食品、特定保健用食品等の機能性食品として有用である。
【００２１】
また本発明の乳酸球菌は、死菌状態であっても、免疫担当細胞に働きかけてIL-12産生を誘導する作用を発揮する。このため、IL-12やそれから派生するサイトカインの作用に基づいて、免疫賦活作用、抗ウイルス作用、または／及び抗アレルギー作用を発揮することが期待される。このため、本発明の乳酸球菌を含む経口組成物は、IL-12産生誘導剤として、また免疫賦活剤、抗ウイルス剤または／及び抗アレルギー剤として、飲食物、医薬品、または医薬部外品の用途に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】桑実由来分離乳酸球菌（L. lactis B30）について、M17 Broth（Difco）で培養した後、グラム染色し顕微鏡観察した写真画像を示す。（Ａ）は乳酸球菌（L. lactis B30）の画像（右下スケールは10μm）、（Ｂ）はその拡大図（×5）（右下スケールは2μm）である（実験例１）。
【図２】乳酸球菌（L. lactis B30）について、（Ａ）生育可能ｐＨ、及び（Ｂ）生育可能温度を評価した結果を示す（実験例２）。
【図３】本発明の乳酸球菌（（Ａ）L. lactis A37、（Ｂ）L. lactis B30）及び陽性コントロール菌（（Ｃ）Lactobacillus rhamnosus GG菌（ATCC53103））に対して行った胃液耐性試験の結果を示す（実験例３）。
【図４】本発明の乳酸球菌（L. lactis A37、L. lactis B30）及び陽性コントロール菌（Lactobacillus rhamnosus GG菌（ATCC53103））に対して行った腸管上皮細胞（Caco-2細胞）への付着性試験の結果を示す（実験例４）。付着菌数は、細胞培養ウエル面積当たりの生菌数（cfu/well）で表示する。
【図５】被験菌試料として、本発明の乳酸球菌（L. lactis A37、L. lactis B30）または陽性コントロール菌（Lactococcus lactis  NBRC12007株）の死菌体を用いて、マウスマクロファージ（J774.1）に適用した場合のＩＬ−１２産生量（pg/mL）を示す。参考として、被験菌試料に代えて刺激物質であるＬＰＳ（100ng/ml）を使用した場合、及び乳酸菌を適用しなかった場合（BLK）の結果も合わせて示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．桑実由来の乳酸球菌
本発明の乳酸球菌は、島根県江津市桜江町の特産物である桑（品種ララベリー、及び一之瀬）の実から単離されたラクトコッカス（Lactococcus）属ラクティス（lactis）種、より詳細にはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に属する乳酸球菌であり、その一つをLactococcus lactis B30（L. lactis B30）と、また別の一つをLactococcus lactis A37（L. lactis A37）と命名した。以下、本明細書において、本発明が対象とする乳酸球菌を、上記L. lactis B30およびL. lactis A37を含めて「本発明の乳酸球菌」と総称する。また、L. lactis B30を単に「Ｂ３０株」、L. lactis A37を単に「Ａ３７株」と称する場合がある。
【００２４】
なお、本発明の乳酸球菌は、島根県江津市桜江町大貫にある圃場で栽培されている桑の実（生）から下記のスクリーニング方法により単離することができ、後述する科学的性質、並びに前述する「(1)ｐＨ２〜３の人工胃液に耐性、(2)腸管上皮細胞（Caco-2）に付着性を有する、(3)アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力を有する、(4)乳発酵能を有する」といった特徴を備えている。本発明の乳酸球菌は、上記L. lactis B30およびL. lactis A37を含めて、島根県松江市北陵町1番地に所在する島根県産業技術センターにおいて分譲可能な状態で保存されている。またL. lactis B30は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に「識別の表示：Lactococcus lactis B30」という名称で2016年12月26日（受託日）付けで国内寄託されている（受託番号：NITE P-02397）。
【００２５】
（１）本発明の乳酸球菌の特徴
本発明の乳酸球菌を、Ｍ１７培地（Difco）（pH6.9：但し、滅菌前）上で、３０〜３５℃で２日間、好気的条件で静置培養した場合の科学的性質（形態的性質、生理学的特徴、炭素源資化性）は以下の通りである。Ｍ１７培地（Difco）の培地組成を表１に示す。
【表１】
2018153177.tif 000002
【００２６】
［科学的性質］
形態的性質
コロニーの色：白色
細胞形態：球状（サイズ0.52-0.63×0.52−0.63μm程度）（図１）
胞子：なし
【００２７】
生理学的特徴
グラム染色：陽性
カタラーゼ活性：陰性
運動性：なし
酵素に対する態度：通性嫌気性
生育温度範囲：少なくとも２５℃〜３５℃
至適生育温度：３５℃
増殖温度：２５℃〜４０℃
生育可能ｐＨ範囲：少なくともｐＨ５〜８
至適ｐＨ：ｐＨ６
乳酸発酵：ホモ型
【００２８】
炭素源資化性（糖資化性）
【表２】
2018153177.tif 000003
【００２９】
以上の諸性質をバージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）に照らし、また下記配列のプライマーを用いた16S rRNA遺伝子による相同性検索の結果から、本発明の乳酸球菌は登録されているラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）（株名：NCDO604）（Accession No.AB100803）と99.8％の相同性を有しており、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（L. lactis ssp. lactis）に属する菌株と同定された。L. lactis B30およびL. lactis A37のうち、L. lactis B30の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に記載する。
【００３０】
本発明の乳酸球菌は、上記の科学的性質に加えて、後述する実験例３に示すように、胃液を模したｐＨ２〜３の人工胃液に抵抗性があり（(1)の特性）、しかも腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に対する付着性を有している（(2)の特性）。このため、本発明の乳酸球菌を経口摂取すると、生きた状態で腸まで届き、腸内に一定期間滞留するため、整腸作用が期待される。よって本発明の乳酸球菌はプロバイティクス菌として有用である。
【００３１】
なお、対象とする乳酸球菌がｐＨ２〜３の人工胃液に対して抵抗性があるか否かの判断は、後述する実験例３（１）に記載する方法に従って行うことができる。具体的には、対象とする乳酸球菌を、胃液を模倣した０.３％ペプシン(100 units/100ml)含有ＭＲＳ液体培地（pH2.0、pH2.5、pH3.0）（人工胃液）中で３７℃４時間培養した後、コロニーカウント法により生菌数を計測することで評価することができる。培養後の乳酸球菌の生菌数が、陽性コントロール菌（Lactobacillus rhamnosus GG菌（ATCC53103））と同程度またはそれ以上の生菌数を示す場合に、当該乳酸球菌は「ｐＨ２〜３の人工胃液に対して抵抗性がある」と判断することができる。また、上記条件を満たさない場合であっても、人工胃液中で３７℃４時間培養した後の生菌数（CFU）が、培養前の生菌数（CFU）１００％に対して１％以上である場合、好ましくは５０％以上である場合に、「ｐＨ２〜３の人工胃液に対して抵抗性がある」と判断することができる。
【００３２】
また対象とする乳酸球菌が腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に対する付着性を有するか否かの判断も実験例３（２）に記載する方法に従って行うことができる。具体的には、腸管上皮細胞を播種培養し十分に膜形成した状態に調製した２４穴プレートのウエルに、抗生物質を含まない培地で前培養した対象の乳酸球菌（1.5×108  CFU/ml）を１ｍＬの割合で添加し、３７℃で５％炭酸ガス雰囲気下、１時間培養した後、PBSで洗浄し、次いで腸管上皮細胞に付着した乳酸球菌の生菌数（CFU／well）を計測することで評価することができる。このとき腸管上皮細胞に付着した乳酸球菌の生菌数（CFU／well）が、同試験によってLactobacillus rhamnosus GG ATCC53103に付着した当該菌の生菌数と比較して、有意水準5％で有意な差がなく、且つ生菌数が105(CFU/well)以上の場合に当該乳酸球菌は「腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に対して付着性がある」と判断することができる（スチューデントのｔ検定）。
【００３３】
また本発明の乳酸球菌は、後述するようにアルギニンを基質にしてオルニチンを生成する性質を有している(実験例４及び５参照)（(3)の特性）。オルニチンは、腸で吸収され、肝臓に運ばれると肝臓のオルニチンサイクル（尿路回路）を活性化し、体内で有毒な働きをするアンモニアの代謝解毒を促進する。アンモニアは生命活動のエネルギーとなるＡＴＰの産生や、脳を動かす主要なエネルギーであるグルコースの生成を妨げる物質であるため（岡田美津子、栄養と食糧 vol.21 (1968)No.2 p71-73, ；T.SUGINO, Nutr Res vol.28 No.11 Page738-743など参照）、その解毒を助けることでオルニチンはスムーズなエネルギー産生に貢献している。またオルニチンは、オルニチンサイクルの働きを活発にし、ミトコンドリアの働きを助けることで肝臓の本来の機能を保つ役割を担っていると考えられている。このため、エネルギー産生や糖新生といった代謝、及び有毒物質の解毒をスムーズにし、肝臓疲労、ひいては全身疲労を回復させることができると期待されている。さらに、アルコール摂取によって量が増加するＮＡＤＨも、オルニチンの働きでアンモニア解毒が円滑に進むことで効果的に消費され、脳がエネルギーを作り出すための阻害要因が取り除かれる結果、疲労（アルコール性疲労）が防止できると考えられる。その他、オルニチンには、肝臓保護作用、腎臓保護作用、成長ホルモン分泌促進作用（新陳代謝の活発化、免疫力増強作用、筋力アップ作用、ダイエット作用、美肌作用）、二日酔い解消作用、体臭予防（アンモニア解毒作用）、及びデトックス作用等があることが知られている。このため、本発明の乳酸球菌は、この点からもプロバイティクス菌として有用である。
【００３４】
対象とする乳酸球菌がアルギニンを基質にしてオルニチンを生成する性質を有するか否かの判断は実験例５に記載する方法に従って行うことができる。実験例５の方法に従って判断する場合は、同条件で培養した場合に、得られた培養物に含まれるオルニチン含量が、豆乳に含まれるオルニチン含量よりも多い場合に、当該乳酸球菌は「アルギニンを基質にしてオルニチンを生成する性質がある」と判断することができる。またこの評価は、実験例５に代えて、Ｍ１７培地（表１参照）で前培養した対象の乳酸球菌をアルギニン含有Ｍ１７培地に植菌し、３５℃で１６時間培養し、得られた培養物に含まれるオルニチン含量を測定することによっても評価することができる。このとき培養物に含まれるオルニチン含量が、Ｍ１７培地に当初から含まれているオルニチン含量よりも多い場合に、当該乳酸球菌は「アルギニンを基質にしてオルニチンを生成する性質がある」と判断することができる。なお、ここでアルギニン含有Ｍ１７培地としては、０．１質量％以上の割合でアルギニンを含有するＭ１７培地を用いることが望ましい。
【００３５】
さらに本発明の乳酸球菌は、後述する実験例６に示すように、乳発酵能を有している（(4)の特性）。具体的には本発明の乳酸球菌は、牛乳を主とした原料と一緒に培養することで乳酸を生産し、その乳酸の作用により原料に含まれるタンパク質を凝固（ゲル化）し、ヨーグルト状の乳酸発酵物を製造する能力を有している。また実験例５に示すように、豆乳を主とした原料と一緒に培養することでも乳酸を生産し、その乳酸の作用により豆乳原料に含まれるタンパク質を凝固（ゲル化）し、ヨーグルト状の乳酸発酵物を生産する。このため、本発明の乳酸球菌は、牛乳や豆乳を原料とするタンパク質含有乳製品を原料として、発酵製品（発酵飲食物や発酵飼料）を製造するために使用される乳酸菌スターターとしても有用である。
【００３６】
対象とする乳酸球菌が乳発酵能を有するか否かの判断は実験例６に記載する方法に従って行うことができる。具体的には、対象とする乳酸球菌にて調製した菌液を、１０質量％スキムミルク（pH6）に植菌し、３０℃で１週間静置培養し、スキムミルクの凝固の有無を観察することで評価することができる。このとき培養したスキムミルクが凝固（ゲル化）し、凝固後にみられる再溶解（液化）は観察されない場合に、当該乳酸球菌は「乳発酵能がある」と判断することができる。
【００３７】
本発明の乳酸球菌は、上記の科学的性質、及び（1）〜（4）の性質に加えて、後述する実験例７に示すように、死菌状態で、免疫担当細胞に作用してＩＬ−１２産生誘導作用を発揮する。前述するように、ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞を活性化してＩＦＮ−γの産生を誘導し、細胞性免疫に関わる１型ヘルパーＴ細胞（Th1）の分化を誘導することで、免疫賦活化し、ウイルスや細菌に対する感染を防御したり、がん等に対する免疫反応の開始に重要な役割を担うことが知られている。またＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側にシフトさせる免疫調節機能を有し、アレルギー症状の緩和に寄与することが知られている。このため、本発明の乳酸球菌は死菌状態であっても、これを経口摂取することで、体内でＩＬ−１２産生誘導作用を発揮し、それにより免疫が賦活されて、抗ウイルス作用（感染予防作用）、抗アレルギー作用、または／および抗がん作用を期待することができる。
【００３８】
なお、対象とする乳酸球菌がＩＬ−１２産生誘導作用を有するか否かの判断は、後述する実験例７（１）に記載する方法に従って行うことができる。具体的には、対象とする乳酸球菌を加熱処理して死菌状態にした後、マウスマクロファージ（J774.1）に適用し、２４時間培養した後に当該培養物に含まれるＩＬ−１２量、つまりマウスマクロファージによるＩＬ−１２の産生量を測定することで評価することができる。培養物中のＩＬ−１２の量は、市販の試薬キットである「レビス（登録商標）Mouse IL-12 ELISA Kit」（株式会社シバヤギ製）を用いることで簡便に測定することができる。培養物中のＩＬ−１２量が、乳酸球菌等を適用せず、マウスマクロファージだけを培養した場合の培養物中のＩＬ−１２量（ブランク）と比較して、有意に多い場合に、当該乳酸球菌は「ＩＬ−１２産生誘導作用を有する」と判断することができる。特に、培養物中のＩＬ−１２量が、乳酸球菌に代えて陽性コントロール菌であるLactococcus lactis NBRC12007菌（死菌）または／及び刺激物質であるリポ多糖類（LPS）を適用した場合の培養物中のＩＬ−１２量と比較して有意に多い場合に、当該乳酸球菌は「高いＩＬ−１２産生誘導作用を有する」と判断することができる。
【００３９】
（２）本発明の乳酸球菌のスクリーニング方法
本発明の乳酸球菌は、下記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング操作を行うことで、桑の実から単離することができる。
【００４０】
（ａ）桑の実（生）を破砕し、当該破砕物の水抽出液を、炭酸カルシウムを含む乳酸菌培養寒天培地（MRS）で、３７℃で７２時間培養し、周囲にハローを形成する白色コロニーを選択する。これをグラム染色にて検鏡し、乳酸球菌であることを確認する。詳細は、後述する実験例１（１）（１−１）の記載を参考にすることができる。
【００４１】
（ｂ）上記（ａ）で単離した乳酸球菌について科学的性質（形態学的性質［コロニーの色、細胞形態、胞子］、生理的特徴［グラム染色、カタラーゼ活性、運動性、酸素に対する態度、生育温度、生育ｐＨ、乳酸発酵形式］、並びに炭素源資化性［糖資化性］）を試験し、また16SrRNA遺伝子による相同性検索を行い、前述する科学的性質を備えているL. lactis ssp. lactisに属する乳酸球菌を選択する。なお、上記の科学的性質は、簡便には市販の細菌同定検査用キット（例えば「アピ50CH」（グラム陰性桿菌、乳酸菌、バシラス属細菌の３菌群に対応の同定キット）シスメックス社製）等の検査試薬によって評価することができる。詳細は、後述する実験例１（２）の記載を参考にすることができる。
【００４２】
（ｃ）上記（ａ）で得られた乳酸球菌を、人工胃液（100unit/ml ペプシン含有ＭＲＳ、pH2.5）中で３７℃で４時間インキュベートし、インキュベート後の生菌数を、細胞内エステラーゼにより蛍光を発するCFDA（carboxyfluosein diacetate）で検出し、顕微鏡下でカウントして求める。同様にして人工胃液処理前の乳酸球菌の生菌数を求め、処理前後の生菌数の対比から、人工胃液に抵抗性を有する乳酸球菌株を選択する。詳細は、後述する実験例１（１）（１−２）の記載を参考にすることができる。
【００４３】
（ｄ）上記（ａ）で得られた乳酸球菌について、腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に対する付着性を評価する。ここで腸管上皮細胞（Caco-2細胞）は、十分に膜形成した状態のものを使用する。抗生物質を含まない培地で前培養した乳酸球菌を、Caco-2細胞と一緒に１時間培養した後、培養したCaco-2細胞をPBSで洗浄し、次いで当該細胞に付着した乳酸球菌の生菌数（CFU／well）を測定し、Lactobacillus rhamnosus GG ATCC53103の値と比較し有意水準5％で有意な差がなく、且つ生菌数が105(CFU/well)以上のものを選択する（スチューデントのｔ検定）。詳細は、前述の記載並びに後述する実験例３（２）の記載を参考にすることができる。
【００４４】
（ｅ）上記（ａ）で得られた乳酸球菌について、アルギニンを基質にして培養し、オルニチン生成の有無を確認し、オルニチンを生成する乳酸球菌を選択する。詳細は、後述する実験例５の記載を参考にすることができる。
【００４５】
なお、上記（ｂ）〜（ｅ）の順番は、特に制限されず、順不同である。例えば（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の順番でスクリーニングしてもよく、その他（ｃ）→（ｂ）→（ｄ）→（ｅ）、（ｃ）→（ｄ）→（ｂ）→（ｅ）、（ｃ）→（ｄ）→（ｂ）→（ｅ）、（ｅ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｂ）、または（ｅ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）のいずれの方法であってもよい。
【００４６】
本発明の乳酸球菌には、前述するL. lactis B30またはL. lactis A37のみならず、その継代株、並びにL. lactis B30またはL. lactis A37の同属近縁株、およびその継代株も含まれる。
【００４７】
ここでL. lactis B30またはL. lactis A37の同属近縁株とは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）に属する乳酸球菌であって、前述する特徴（1）ｐＨ２〜３の人工胃液に耐性、（2）腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に付着性を有する、(3)アルギニンを基質としてオルニチンを産生する能力を有する、及び(4)乳発酵能を有するという特徴を有するものであり、またL. lactis B30の16S rRNA遺伝子の塩基配列と高度の相同性を有する菌株を意味する。ここで相同性の程度としては９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．８％以上（小柳津広志、日本細菌学会誌、49, 5/6, 812-822,（1994））である。
【００４８】
なお、乳酸球菌の継代は、定法に従って行うことができ、特に制限されない。例えば、Ｍ１７培地（表１）を入れた試験管に乳酸球菌を植菌して、３０℃程度で１８〜４８時間程度培養する方法を挙げることができる。培養により継代された乳酸球菌は、最終濃度が１０〜３０w/v％となるようにグリセロールを添加し、使用するまで−８０℃で保存することができる。
【００４９】
本発明の乳酸球菌の培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じ有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源としては、資化可能な炭素源を含有するものであればよく（表２参照）、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マルトース、及びＤ−ラクトースなどの炭水化物が良好に用いられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、硫安、カザミノ酸、ペプトンなどが使用される。また、リン酸、鉄、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、銅、カルシウムなどの無機塩類を適宜使用することができる。さらに必要に応じて、菌の生育に必要なアミノ酸、ビオチン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、チアミンなどのビタミン類などを培地に添加して用いることができる。
【００５０】
使用できる培地としては、乳酸菌、特に乳酸球菌の生育及び増殖に適した培地であればよく、例えばＭ１７培地（Difco）など、定法に従って使用することができる。
【００５１】
培養は、温度２５〜３５℃程度、好ましくは３０℃程度で、ｐＨ５〜８程度、好ましくはｐＨ６程度で行われる。乳酸球菌の培養は、好気条件下での静置培養または嫌気条件下での静置培養を適宜選択して行うことができる。
【００５２】
２．乳酸菌スターター
本発明の乳酸球菌は、前述する発酵能を利用して、乳酸菌スターターとして使用することができる。当該乳酸菌スターターは主として、牛乳または豆乳を主とした原料の発酵に使用されるものであり、当該発酵によりヨーグルト様の牛乳発酵製品（飲食物、飼料）または豆乳発酵製品（飲食物、飼料）が製造される。ここで牛乳または豆乳を主とした原料（牛乳原料、豆乳原料）としては、牛乳または豆に由来するタンパク質を含有するものであればよく、牛乳または豆乳そのものであってもよいし、また脂質を除去または軽減したスキムミルクや脱脂粉乳などであってもよい。
【００５３】
本発明の乳酸菌スターターは、牛乳発酵製品または豆乳発酵製品の製造に際して、前述する本発明の乳酸球菌の菌体濃度が１０４−１０６CFU/g程度となるように接種されることが好ましい。このため、使用に際しては、本発明の乳酸球菌を、予め例えば牛乳原料または豆乳原料を用いて培養し、１０７−１０9 CFU/g培養物程度の菌濃度に調製しておくことが好ましい（種菌）。具体的には、制限されないものの、例えば、予め９０〜１２１℃で５〜２０分間程度、殺菌処理を行った発酵用原料物質、または酵母エキスを添加した１０％脱脂粉乳などに、本発明の乳酸球菌を接種して培養し、上記菌濃度に調製したものを例示することができる。
【００５４】
本発明の乳酸菌スターターは、本発明の乳酸球菌だけからなるものであってもよいし、本発明の効果を妨げないものであれば、乳発酵能を有する他の乳酸菌を併用することもできる。他の乳酸菌としては、制限されないが、例えばラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ディアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）、及びラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）などを挙げることができる。ここでラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、及びラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ（Lactobacillus casei subsp. casei）は乳酸高生産能を有する、主として酪農ヨーグルト製造に使用される中温性乳酸菌である。ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ディアセチラクティスは、ジアセチル、ＣＯ2、酢酸など芳香性物質の高生産能を有する乳酸菌で、豆由来のタンパク質を凝固させる機能を有する乳酸菌である。
【００５５】
また後述する実験例４及び５に示すように、本発明の乳酸球菌は、アルギニンを基質としてオルニチンを生産する能力を有することから、牛乳または豆由来のタンパク質を分解してアルギニンを生成する能力を有する乳酸菌を本発明の乳酸球菌と組み合わせて乳酸菌スターターとすることで、有用アミノ酸であるオルニチンを高濃度含有する発酵製品を製造することが可能になる。
【００５６】
なお、本発明の乳酸球菌を用いた乳酸菌スターターによる発酵条件（培養条件）としては、培養温度２５〜３５℃、好ましくは３０℃程度；培養ｐＨ条件５〜８程度、好ましくはｐＨ６程度；培養時間３〜２４時間程度、好ましくは５〜７時間程度を挙げることができる。
【００５７】
３．経口組成物
本発明の経口組成物は、本発明の乳酸球菌を含有することを特徴とする。当該経口組成物は、通常の飲食物と同様に、適当な可食性担体（飲食物素材）を利用して、飲食物形態または飼料形態に調製される。また、当該組成物は、適当な製剤学的に許容される賦形剤または希釈剤等の製剤用原料を利用して、製剤形態（サプリメント形態、医薬品形態、医薬部外品形態）に調製される。
【００５８】
本発明の乳酸球菌は、前述するように、生菌として摂取されることによって生きた状態で腸まで届き、腸管に付着し、一定期間腸内に滞留することができる。このため、整腸作用や腸内細菌叢改善作用などによる健康維持に寄与することが期待される。このため、本発明の乳酸球菌も生菌として本発明の経口組成物に配合されるのが好ましい。但し、本発明の乳酸球菌は、前述するように、アルギニンを基質として有用アミノ酸であるオルニチンを産生する作用を有する。このため、本発明の経口組成物は、本発明の乳酸球菌を利用してアルギニンを含む原料から製造された発酵組成物であって、本発明の乳酸球菌の上記作用に基づいてオルニチンを含有するものであればよい。この場合、最終製品に含まれている乳酸球菌の状態は特に制限されず、死菌の状態であってもよい。
【００５９】
本発明の乳酸球菌は、死菌状態で摂取された場合でも、免疫担当細胞に作用しＩＬ−１２の産生を誘導することができる（実験例７）。したがって、ＩＬ−１２産生誘導作用に基づいて免疫賦活作用、抗ウイルス作用、抗アレルギー作用、または／及び抗がん作用を期待する場合は、経口組成物中に含まれる乳酸球菌は死菌の状態であってもよい。
【００６０】
本発明の乳酸球菌は、その培養物、培養物の粗精製品乃至精製品、それらの凍結乾燥品などとして、本発明の経口組成物中に配合することも可能である。また目的や用途に応じて、加熱等の死菌処理を施したものであってもよい。上記培養物は、例えば代表的には、本発明の乳酸球菌に適した培地、例えばＭ１７培地などを用いて、２５〜３５℃、好ましくは３０℃程度で、３〜７時間程度培養することにより得ることができる。また乳酸球菌の菌体は、上記培養後、培養物を例えば、３,０００rpmで１０分間程度遠心分離して集菌することによって得ることができる。これらは常法に従い精製することもできる。更に、上記菌体は凍結乾燥することもできる。かくして得られる凍結乾燥菌体も本発明の経口組成物の有効成分として利用することができる。本明細書において、本発明の乳酸球菌、その培養物、培養物の粗精製品乃至精製品、必要に応じて死菌処理物、及びこれらの凍結乾燥品を総括して「本発明の乳酸球菌及びその培養物」と称する。
【００６１】
本発明の経口組成物中には、必要に応じて更に、本発明の乳酸球菌の維持や増殖などに適した栄養成分の適量を含有させることができる。該栄養成分の具体例としては、各微生物の培養のための培養培地に利用される例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源；例えば酵母エキス、ペプトンなどの窒素源；ビタミン類、ミネラル類、微量金属元素、その他の栄養成分などの各成分を挙げることができる。ビタミン類としては、例えばビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどが例示できる。微量金属元素としては、例えば亜鉛、セレンなどが例示できる。その他の栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などの各種オリゴ糖が例示できる。これらのオリゴ糖の配合量は、特に限定されるものではないが、通常、本発明の経口組成物中に１〜３重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。
【００６２】
本発明の経口組成物の飲食品形態、医薬品形態、医薬部外品形態、及び飼料形態への調製は、常法に従うことができる。またこれら各形態への調製に当たって用いられる担体は、可食性担体乃至製剤学的に許容される賦形剤、希釈剤などの担体のいずれでもよい。飲食品形態への調製およびその際利用できる可食性担体の詳細は、後記「飲食品形態組成物」の項において記述する。特に飲食品形態の場合は、口当たりのよい味覚改善効果のある担体が好ましい。
【００６３】
本発明の経口組成物中への乳酸球菌の配合量は、一般には、本発明の経口組成物１００ｇ中に、菌数が１０8〜１０11cfu前後となる量から適宜選択することができる。菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を混釈して３０℃下で培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより算出する。この菌数と濁度とは相関するため、予め菌数と濁度（波長600nmにおける吸光度）との相関を求めておくと、濁度を測定することによって上記菌数を計数することができる。乳酸球菌が死菌である場合、経口組成物１００ｇ中への乳酸球菌の配合量は、前記「cfu」の記載を「細胞数」に置き換えることができる。上記乳酸球菌の配合量は、上記量を目安として、調製される本発明の経口組成物の形態、及び目的とする作用効果などに応じて適宜変更することができる。
【００６４】
本発明の経口組成物は、使用する目的や用途に応じて、有効成分として配合する本発明の乳酸球菌の状態を選択することができる。例えば、本発明の経口組成物を整腸を始めとする腸内環境改善用途に使用する場合、有効成分である乳酸球菌は生菌であることが望ましい。また本発明の経口組成物をオルニチンの作用に基づいて各種用途に使用する場合も、有効成分である乳酸球菌は生菌であることが望ましい。この場合、該経口組成物を製剤化するに当たり、加熱や加圧などの乳酸菌に対して過酷な条件を採用することを避けることが好ましい。例えば、固形形態の経口組成物を調製するに当たっては、本発明の乳酸球菌を凍結乾燥菌体として直接処方するか、凍結乾燥菌体を適当なコーティング剤で加工して用いることが好ましい。一方、本発明の経口組成物を、乳酸球菌のＩＬ−１２産生誘導作用に基づいて各種用途（ＩＬ−１２産生誘導、免疫賦活、抗ウイルス、抗アレルギー、抗がん等）に使用する場合は、有効成分である乳酸球菌は死菌であってもよい。
【００６５】
飲食品形態組成物
飲食品形態の本発明の経口組成物の具体例としては、発酵乳や乳酸菌飲料などの牛乳を原料として製造される牛乳発酵飲食物、及び発酵豆乳飲料などの豆を原料として製造される豆乳発酵飲食物を例示することができるが、これに制限されるものではない。その他、本発明の乳酸球菌を含有する固形製剤（錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、マイクロカプセル及びカプセル剤等）、及び液状製剤（液剤、懸濁剤、シロップ及び乳剤等）などの製剤形態を有する飲食物も含まれる。また、本発明の乳酸球菌入りのガム、キャラメル、グミ、ヌガー、及びチョコレートなどの菓子類；発酵野菜飲料や発酵果実飲料等の発酵飲食物；プディング及びババロア等の上記発酵飲食物以外の乳製品などを挙げることができる。なお、本明細書において、「発酵乳」および「乳酸菌飲料」なる用語は、旧厚生省「乳及び乳製品の成分などに関する省令」第二条37「発酵乳」および38「乳酸菌飲料」の定義に従うものとする。即ち、「発酵乳」とは、乳または乳製品を乳酸菌で発酵させた糊状または液状にしたものをいう。従って該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳または乳製品を乳酸菌で発酵させた糊状または液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。
【００６６】
かかる発酵飲食物は、定法に従って製造することができ、例えば、本発明の乳酸球菌の栄養源を含む適当な発酵用原料物質、例えば牛乳、豆乳（大豆乳化液）、野菜類、果実類などの液中で、本発明の乳酸球菌を培養して該原料物質を発酵させることによって製造することができる。
【００６７】
乳酸球菌を利用した発酵は、予めスターターを用意し、これを発酵用原料物質に接種して発酵させる方法が好ましい。ここでスターターとしては、前述する本発明の乳酸菌スターターを挙げることができる。このようにして得られるスターターは、通常、本発明の乳酸球菌を１０７〜１０9  cfu/g培養物程度含んでいる。
【００６８】
上記の発酵用原料物質には、必要に応じて本発明の乳酸球菌の良好な生育のための発酵促進物質、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フラクトースなどの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源、ビタミン類、ミネラル類などを加えることができる。
【００６９】
乳酸球菌の接種量は、一般には発酵用原料物質含有液１ｍＬ中に菌体が約１×１０4 cfu/g以上、好ましくは１×１０4〜１×１０6 cfu/g前後含まれるものとなる量から選ばれるのが適当である。培養条件は、一般に、発酵温度２５〜３５℃程度、好ましくは３０℃程度、発酵時間５〜７２時間程度から選ばれる。
【００７０】
尚、上記の如くして得られる乳酸発酵物は、カード状形態（ヨーグルトまたはプディング様の形態）を有している場合があり、このものはそのまま固形食品として摂取することもできる。該カード状形態の乳酸発酵物は、これを更に均質化することにより、所望の飲料形態とすることができる。この均質化は、一般的な乳化機（ホモジナイザー）を用いて実施することができる。こうした均質化によって、滑らかな食感を有する飲料を得ることができる。尚、この均質化にあたっては、必要に応じて適当に希釈したり、ｐＨ調整のための有機酸類を添加したり、また、糖類、果汁、増粘剤、界面活性剤、香料などの飲料の製造に通常用いられる各種の添加剤を適宜添加することもできる。かくして得られる飲料は、適当な容器に無菌的に充填して最終製品とすることができる。
【００７１】
その摂取（投与）量は、これを摂取する生体の年齢、性別、体重、疾患の程度などに応じて適宜決定され、特に限定されるものではない。一般には本発明の乳酸球菌量が約１０6〜１０9 cfu／mlとなる範囲から選ばれるのがよい。乳酸球菌が死菌である場合、前記「cfu」の記載を「細胞数」に置き換えることができる。該製品は一般にその約５０〜１,０００ｍＬを１日ヒト１人あたりに摂取されるように調製することができる。
【００７２】
飲食品形態の本発明の経口組成物の好適な具体例としては、サプリメント形態、具体的には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、マイクロカプセル及びカプセル剤等の固形製剤、並びに液剤、懸濁剤、シロップ及び乳剤等の液状製剤の形態を有する飲食品を挙げることができる。
【００７３】
当該サプリメント形態の飲食品は、医薬形態組成物と同様に、製剤担体として、通常、この分野で使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤あるいは賦形剤を用いて製造することができる。
【００７４】
飲食品形態の経口組成物に配合される本発明の乳酸球菌の量は、当該乳酸球菌の作用が発揮される量であればよく、その限りにおいて、広範囲より適宜選択することができる。通常、１摂取（投与）単位形態中に約１０7−１０12 cfu程度含有されることが好ましい。乳酸球菌が死菌である場合、前記「cfu」の記載を「細胞数」に置き換えることができる。
【００７５】
上記組成物は経口的に摂取されるものであれば、その投与方法は特に制限がなく、各種形態、対象者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【００７６】
上記組成物の摂取量は、その用法、対象者の年齢、性別その他の条件などにより適宜選択されるが、前述するように本発明の乳酸球菌を１摂取（投与）あたり約１０7−１０12 cfu程度（または約１０7−１０12 個程度）の割合で服用されることが好ましい。より好ましくは、有効成分である本発明の乳酸球菌の摂取量は１日当り２×１０９〜３×１０９ cfu程度（または２×１０９〜３×１０９ 個程度）とするのがよく、１日に１−４回に分けて摂取することができる。また、本発明の組成物は、その効果を効果的に得るためには継続して摂取されることが好ましい。例えば、連続または間歇的に２週間以上に亘って摂取する態様を例示することができる。
【００７７】
本発明の乳酸球菌を生菌状態で含有する経口組成物は、摂取（投与）されると、生きた状態で腸管に届き、そこで一定時間滞留する。このため、整腸作用及び腸管環境改善作用を期待することができる。つまり、当該本発明の経口組成物は、その整腸作用や腸管環境改善作用に基づいて健康増進剤として有効に使用することが可能である。
【００７８】
また本発明の乳酸球菌の作用により多くのオルニチンを含む経口組成物は、それを摂取（投与）することによってオルニチンに基づく有用な生体作用を得ることができる。つまり、本発明の飲食品形態を有する経口組成物は、疲労回復作用、肝臓保護作用、腎臓保護作用、二日酔い解消作用、体臭予防、デトックス作用、成長ホルモン分泌促進作用に基づく種々の作用（新陳代謝の活性化、免疫力増強作用、筋力アップ作用、ダイエット作用、美肌作用）を目的（効能・効果）とする総合的な製剤として有効に使用することができる。なお、かかる経口組成物に含まれるオルニチンの量としては、制限されないが、オルニチンの機能発現には一般に４００〜８００mg/日程度必要といわれているので(オルニチン研究会ＨＰ［<http://ornithine.jp/>］参照)、１日投与単位形態あたりにオルニチンが４００〜８００mg程度、またはそれ以上の量含まれるように調製することが望ましい。
【００７９】
斯くして本発明の経口組成物には、特定の機能を有し、健康維持などを目的として摂食される飲食物が含まれる。具体的には、整腸、腸内環境改善、疲労回復、肝臓保護、腎臓保護、二日酔い解消、体臭予防、デトックス、新陳代謝活性、免疫力増強、筋力アップ、ダイエット、および／または美肌の機能を有し、これをヘルスクレームとして当該用途に用いられる健康補助食品、健康機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品、またはサプリメント等の飲食物が含まれる。
【００８０】
本発明の乳酸球菌を死菌状態で含有する経口組成物は、摂取（投与）されると体内で免疫担当細胞に作用してＩＬ−１２産生が誘導される。このため、免疫賦活作用、抗ウイルス作用、抗アレルギー作用などを期待することができる。好ましくは免疫賦活作用、または抗ウイルス作用であり、より好ましくは免疫賦活作用である。つまり、当該本発明の経口組成物は、本発明の乳酸球菌のＩＬ−１２産生誘導作用に基づいて、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、抗アレルギー剤などとして有効に使用することが可能である。このため、飲食物形態を有する本発明の経口組成物は、免疫賦活用（免疫活性化用）、抗ウイルス用（感染予防用）、または抗アレルギー用などの用途が表示された飲食物（機能性表示食品、特定保健用食品など）として調製し、提供することができる。
【００８１】
医薬品または医薬部外品形態組成物
本発明の乳酸球菌を生菌状態で含有する医薬品または医薬部外品は、前述の通り、本発明の乳酸球菌の整腸作用や作用に基づいて、整腸剤または腸管環境改善剤として有効に使用することが可能である。また本発明の乳酸球菌を死菌状態で含有する医薬品または医薬部外品は、前述の通り、本発明の乳酸球菌のＩＬ−１２産生誘導作用に基づいて免疫賦活作用を有しており、IL-12産生が促進されること、又は免疫が賦活されることによって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療に使用することができる。「治療」には、改善も含まれる。
【００８２】
本発明の医薬品または医薬部外品の適用として具体的には、例えば、アレルギー症状の予防や緩和（抗アレルギー）、例えば食物アレルギー、気管支喘息、じんま疹、鼻炎、花粉症、アナフィラキシーショック等の緩和：感染症に対する抵抗力の増進：癌の予防、進行の防止等が挙げられる。また本発明の医薬品または医薬部外品は、他の態様として抗ウイルス剤として使用することができる。抗ウイルス剤の対象となるウイルスは、本発明の乳酸球菌のＩＬ−１２産生促進作用またはそれを介した免疫賦活作用により、宿主への感染又は宿主生体内での増殖を低減することができるウイルスであれば特に制限されない。
【００８３】
医薬品または医薬部外品形態の経口組成物に配合される本発明の乳酸球菌の量は、当該乳酸球菌の作用が発揮される量であればよく、その限りにおいて、広範囲より適宜選択することができる。通常、１摂取（投与）単位形態中に約１０7−１０12 cfu程度含有されることが好ましい。乳酸球菌が死菌である場合、前記「cfu」の記載を「細胞数」に置き換えることができる。上記医薬品または医薬部外品は経口的に摂取されるものであれば、その投与方法は特に制限がなく、各種形態、対象者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【００８４】
飼料形態組成物
本発明の飼料形態の経口組成物としては、ペットフード（愛玩動物用飼料）、家畜飼料、及び養魚飼料等が例示される。本発明の飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、又は酵母類等に、本発明の乳酸球菌を混合することにより製造することができる。また、例えばサイレージの様に、添加した乳酸球菌による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、及び愛玩動物等に経口的に投与することが可能である。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実験例などを用いて説明する。但し、これらの実験例は本発明の構成及び効果を容易に理解するための例示であって、本発明はこれらの実験例になんら制限されるものではない。また特に言及しない限り、下記の実験は常温（２５±５℃）及び大気圧条件で実施した。また、特に言及しない限り、「％」は「質量％」を意味するものとする。
【００８６】
実験例１
（１）桑の実由来乳酸球菌の分離
本発明の乳酸球菌は、次の方法で桑の実より分離した。
【００８７】
（１−１）乳酸菌の分離
島根県江津市桜江町の圃場で栽培されている桑の実（品種：ララベリー、一之瀬）を採取し、この実（生）全体を破砕し、当該破砕物をＭＲＳ液体培地に１％程度加え２４時間培養した。培養液を生理食塩水で希釈し、沈降性炭酸カルシウムを５％程度含む乳酸菌培養用寒天培地（ＭＲＳ寒天）で混釈し、これを３７℃で４８時間培養した。この条件で生育し、ハロー形成した白色コロニーを釣菌し、ＭＲＳ液体培地を用い、上記と同条件で培養した。そのうち、グラム陽性及びカタラーゼ陰性、桿菌及び球菌と判断されたものを乳酸菌として５０株分離した。桑の実の採取場所（いずれも江津市桜江町内の圃場）を変えて、上記の操作を合計３回行い、乳酸菌を１５０株分離した。
【００８８】
（１−２）胃酸耐性菌の分離（一次スクリーニング）
上記で分離した乳酸菌１５０株を、人工胃液（100 unit/mlペプシン含有ＭＲＳ、pH2.5）に播種し、３７℃の条件で４時間インキュベートした。ＭＲＳ液体培地の組成は下記の通りである。
【００８９】
【表３】
2018153177.tif 000004
【００９０】
インキュベート後の生菌数を、ＣＦＤＡ（carboxyfluosein diacetate）を利用した活性染色法により測定した。ＣＦＤＡは乳酸菌の細胞内に浸透し、当該細胞内に存在するエステラーゼによって蛍光性のcarboxyfluoresceinに加水分解されて波長488 nm付近の青色励起光下で緑色蛍光を発する試薬である。加水分解されたcarboxyfluoresceinは極性をもつために生細胞内に蓄積される。このためエステラーゼ活性をもつ生細胞をＣＦＤＡ処理後、上記波長488 nm付近の青色励起光を照射するとcarboxyfluorescein由来の緑色蛍光を発する。一方、エステラーゼ活性を有さない細胞、つまり死細胞ではＣＦＤＡは加水分解されないために，蛍光性のcarboxyfluoresceinを生じない（緑色蛍光を発しない）。
【００９１】
上記のように緑色蛍光を指標として、顕微鏡下で乳酸菌の生菌数をカウントした。
上記で分離した１５０株の乳酸菌について、人工胃液処理に供する前の生菌数を同様の方法で求め、それに対する人工胃液処理後の生菌数の割合から生存率（胃酸耐性生存率）を算出し、１５０株のうち最も生存率の高いほうから２株を選択した。これらのうち、最も高い胃酸耐性を有する菌株をＡ３７株、２番目に高い胃酸耐性を有する菌株をＢ３０株と命名した。
【００９２】
（２）桑実由来乳酸菌の同定
上記方法で選択単離した胃酸耐性の乳酸菌（A37株、B30株）の分類学的な性質（科学的性質：形態的性質、生理的特徴、炭素源資化性）は次のとおりであった。なお、これらの性質は、上記で単離した乳酸菌をＭ１７培地（Difco）（表１）（滅菌前のｐＨは6.9）を用いて３０〜３５℃で好気的条件で２日間培養した後に評価した。
【００９３】
（２−１）科学的性質
（i）形態的性質
（a）コロニーの色：白色
（b）細胞形態：球状（大きさ：0.52〜0.63μm×0.52〜0.63μm程度）（図１）
（c）胞子：なし
【００９４】
（ii）生理学的特徴
（a）グラム染色：陽性
（b）カタラーゼ活性：陰性
（c）運動性：なし
（d）酵素に対する態度：通性嫌気性
（e）生育温度（至適生育温度）：少なくとも２５〜３５℃（３５℃）
（f）生育ｐＨ（至適ｐＨ）：少なくともｐＨ５〜８（ｐＨ６）
（g）乳酸発酵：ホモ発酵
【００９５】
（iii）炭素源資化性
酵母同定検査キット（「アピID32シリーズ（ID32C）」シスメックス（株）製）を用い、３０℃で２日間培養して表４に記載する炭素源の資化性を評価した。結果を表４に示す。表４中、「＋」は資化性があることを、「−」は資化性がないことを意味する。
【００９６】
【表４】
2018153177.tif 000005
【００９７】
（２−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子による相同性検索
上記方法で選択単離した胃酸耐性の乳酸球菌（A37株、B30株）について、定法に従って１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析を行った。得られた乳酸球菌（A37株、B30株）の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ（NCBIのDNAデータベース）を用いてホモロジー検索を行った。その結果、これらの乳酸球菌株はいずれも登録されているラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）（株名：NCDO604）（Accession No.AB100803）と９９．８％の相同性を有していた。これらの乳酸球菌（A37株、B30株）を代表して、Ｂ３０株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００９８】
（２−３）まとめ
以上、乳酸球菌（A37株、B30株）の上記諸性質をバージィーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）に照らし、また上記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子による相同性検索の結果から、前述の方法で桑実から単離された乳酸球菌（A37株、B30株）は、いずれもラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシース・ラクティス（L. lactis ssp. lactis）に属する菌株であると同定された。そこで、乳酸球菌（A37株）をLactococcus lactis A37（L. lactis A37）、及び乳酸球菌（B30株）をLactococcus lactis B30（L. lactis B30）と命名し、島根県松江市北陵町1番地に所在する島根県産業技術センターにおいて分譲可能な状態で保存した。また後者のL. lactis B30については、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に「識別の表示：Lactococcus lactis B30」という名称で2016年12月26日（受託日）付けで国内寄託した（受託番号：NITE P-02397）。
【００９９】
実験例２  桑実由来乳酸球菌の生理的性質に関する実験
本発明の桑実由来乳酸球菌（A37株：L. lactis A37、B30株：L. lactis B30）について、生理的性質（生育可能温度、生育可能ｐＨ）を評価した。
【０１００】
１．生育可能ｐＨの測定
（１）測定方法
Ｍ１７培地に酸またはアルカリを加えてｐＨ２〜８に調整した培地溶液（10mL）を試験管に入れて殺菌し、これに、Ｍ１７培地にて液体培養した桑実由来乳酸球菌（A37株またはB30株）の懸濁液を0.5mL、無菌的に移植し、35℃にて培養を行った。培養から2、4、5、6、8時間目及び10時間目に、培養液を採取して菌体濃度を測定して、桑実由来乳酸球菌の発育状況から、生育可能ｐＨを評価した。なお、培養液中の菌体濃度の測定は、経時的に採取した培養液を96穴プレートに200μLを取り、マルチラベルカウンタ（Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ：PerkinElmer）で600nmの吸光度（OD600）を計測することにより行った（サンプルOD600）。
【０１０１】
（２）測定結果
Ｂ３０株について行った結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）に示すように、桑実由来乳酸球菌はｐＨ５〜８のいずれのｐＨ条件でも生育可能であった。最も良好に増殖するｐＨ条件はｐＨ６〜７であった。
【０１０２】
２．生存可能温度の評価
（１）測定方法
ＭＲＳ液体培地（組成は表３参照）５０ｍＬを入れて殺菌した１００ｍＬ容三角フラスコに、予め同ＭＲＳ液体培地にて液体培養した桑実由来乳酸球菌（A37株、B30株）の懸濁液（1mL）を加え、１５℃〜４０℃の温度条件（15℃、25℃、30℃、35℃、40℃）で培養し、経時的に培養液を採取して上記１と同様に菌体濃度を測定し、桑実由来乳酸球菌の発育状況を確認した。
【０１０３】
（２）測定結果
Ｂ３０株について行った結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）に示すように、桑実由来乳酸球菌は３５℃の培養温度で最も増殖の立ち上がりが早かった。３０℃、２５℃、及び１５℃と培養温度が低くなるにつれて増殖速度に遅延が見られたが、２５℃及び３０℃ではいずれも少なくとも６時間培養することで、３５℃での培養と同程度の菌体濃度に達することが確認された。この結果から、桑実由来乳酸球菌は少なくとも２５℃〜４０℃のいずれの温度条件でも生育可能であること、好ましい生育温度は２５℃〜３５℃、至適生育温度は３５℃であることが確認された。
【０１０４】
実験例３  プロバイオティクスの評価
プロバイオティクス菌は生きた状態で腸まで届き、宿主に対し良好な働きをすることと定義されている。そこで、プロバイオテクスであるためには、経口摂取した乳酸菌が胃液に対して耐性であり、また腸管にて一定期間滞留する必要がある。
【０１０５】
そこで、上記実験例１で単離した桑実由来乳酸球菌（A37株、B30株）が、プロバイオティクス菌であることを確認するために、胃液耐性試験、および腸管上皮細胞（Caco-2細胞）への付着性試験を行った。
【０１０６】
（１）胃液耐性試験
胃液耐性試験として、コロニーカウント法を用いて、人工胃液（pH2.0、pH2.5、pH3.0）に対する耐性を評価する試験を行った。なお、ｐＨ２.０は空腹時の胃内の胃液ｐＨ、ｐＨ２.５は食事中の胃内の胃液ｐＨ、及びｐＨ３.０は食後の胃内の胃液ｐＨに相当するｐＨである。
【０１０７】
具体的には、まず乳酸球菌（A37株、B30株）を、ＭＲＳ液体培地で３７℃、４時間培養し、３回継代を繰り返した。得られた乳酸球菌（A37株、B30株）を、ｐＨ２.０、ｐＨ２.５、またはｐＨ３.０にそれぞれ調整した０.３％ ペプシン(100 units/100ml)含有ＭＲＳ液体培地で、３７℃で４時間培養し、生菌数をＭＲＳ寒天培地を用いて測定した。また陽性対照試験として、上記乳酸球菌に代えて、陽性コントロール菌としてLactobacillus rhamnosus GG菌（ATCC53103）を用いて、同様に胃液耐性試験を行った。
【０１０８】
胃液耐性試験の結果を、図３に示す。Ａ３７株及びＢ３０株のいずれも、空腹〜食後の胃内の胃液ｐＨに相当するｐＨ２.０〜３.０の条件下、培養時間４時間後でも、陽性コントロール菌（GG菌）と同程度の生菌数を示し、人工胃液耐性を示した。
【０１０９】
（２）腸管上皮細胞への付着性試験
乳酸球菌の腸管上皮細胞に対する付着性を評価する試験を、下記方法により行った。
【０１１０】
具体的には、まず腸管上皮細胞（CaCo-2細胞）を1.25×105/mlの濃度で２４穴プレートのウエルに１ｍＬ播種し、コンフルエント後１５日間培養した。この腸管上皮細胞含有ウエルに、乳酸球菌（A37株、B30株）(1.5×1010/ml)を予め抗生物質不含培地で１００倍に希釈したものを１ｍＬ加え、３７℃で５％炭酸ガス雰囲気下で１時間培養し、細胞に付着させた。なお、試験菌として、乳酸球菌（A37株、B30株）、及び腸管上皮細胞への付着性が高いとされるLactobacillus rhamnosus GG菌（ATCC53103）を陽性コントロール菌として使用した。
【０１１１】
培養後、細胞培養ウエルから培地上清を除き、ＰＢＳで洗浄した後、0.05% Trypsin−EDTA溶液で細胞から試験菌をはがして、ＭＲＳ寒天培地で菌数を測定した。
【０１１２】
腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に付着した生菌数を図４に示す。なお、付着生菌数は、細胞培養ウエル面積当たりの菌数（CFU /well）で表示する。図４に示すように、桑実から単離した乳酸球菌（A37株、B30株）は、陽性コントロール菌である乳酸菌（L. rhamnosus GG菌）より劣るものの、いずれも腸管上皮細胞に対して付着性を有していた。
このことから乳酸球菌（A37株、B30株）には、腸管上皮細胞（Caco-2細胞）に対して付着性があることが確認された。特にＢ３０株の腸管上皮細胞への付着性は強く、陽性コントロールの腸付着性に及ばないものの類似するものであった。
【０１１３】
上記（１）と（２）の結果から、本発明の桑実由来乳酸球菌（A37株、B30株）は、胃酸耐性を有し生きた状態で腸まで届き、また腸管上皮細胞に付着して腸管にて一定期間滞留するものと考えられる。このことから、本発明の乳酸球菌には整腸作用が期待される。
【０１１４】
実験例４  プロバイオティクスの評価（アミノ酸生産能の評価）
上記の実験で胃酸耐性及び腸管上皮細胞への付着性が認められた本発明の乳酸球菌（A37株、B30株）について、アミノ酸生産能を評価した。具体的には、下記に示すように、豆乳を本発明の乳酸球菌（A37株、B30株）を用いて発酵させ、発酵の前後で豆乳に含まれるアミノ酸含量を比較評価した。
【０１１５】
（１）実験方法
（１−１）種菌の調製
乳酸球菌（A37株、B30株）を、Ｍ１７培地（Lactococcus用培地）で３０℃で一晩静置培養を行った後、豆乳（キッコーマン成分無調整豆乳）１０ｍＬに１白金耳植菌し、さらに３０℃で一晩静置培養を行い、得られた培養菌を種菌として、下記の実験に使用した。
【０１１６】
（１−２）発酵処理
豆乳（キッコーマン成分無調整豆乳）５０ｍＬに上記で調製した種菌を３００μＬ接種し、３５℃で１６時間培養した。得られた培養物（発酵物）及び培養前の豆乳について、定法に従ってアミノ酸分析をし、培養前後のアミノ酸含量の変化から本発明の乳酸球菌のアミノ酸生産能を評価した。
【０１１７】
（２）実験結果
培養前後のアミノ酸含量を表５に示す。
【表５】
2018153177.tif 000006
【０１１８】
表５から分かるように、本発明の乳酸球菌（A37株、B30株）による発酵により、セリン(Ser)、グルタミン酸（Glu）、及びオルニチン（Orn）が顕著に増加したことが確認された。一方、アルギニン（Arg）は顕著に減少し、またGABAの生成は認められなかった。このことから、本発明の乳酸球菌は、アルギニンを基質としてオルニチンを生成する能力（Argininedeiminiase Pathway）を有すると考えられた。また本発明の乳酸球菌は、豆乳に含まれるタンパク質を分解してグルタミン酸を生成する能力（protease）はあるものの、生成したグルタミン酸を基質としてGABAを産生する能力（Glutamic acid decarboxylase）はないことが確認された。また、本発明の乳酸球菌は乳酸発酵によりアンモニアや、特有の臭いと味を有するシステインを生産しないことから、飲食物の製造に使用して臭いや味の点で不都合な問題を有しないと考えられる。
【０１１９】
実験例５  プロバイオティクスの評価（アミノ酸生産能の評価）
実験例４に示すように、本発明の乳酸球菌にはオルニチン生成能（Argininedeiminiase Pathway）があることが判明したことから、豆乳を原料としてオルニチンの生成量を増大する方法を検討した。具体的には、下記に挙げるサンプル１〜３を調製し、各サンプルに含まれるオルニチン含量を定量した。なお、サンプル２と３において、酵素としてプロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、及びペプチダーゼＲ（いずれも、天野エンザイム社製）を用いた。
【０１２０】
［サンプル名と処理内容］
サンプル１：乳酸発酵のみ実施（酵素処理なし）。
サンプル２：酵素処理と乳酸発酵を同時に実施。
サンプル３：酵素処理した後に乳酸発酵を実施。
【０１２１】
（１）実験方法
（１−１）種菌の調製
乳酸球菌（B30株）を、Ｍ１７培地（Lactococcus用培地）を用いて３０℃で一晩静置培養を行った後、豆乳（キッコーマン成分無調整豆乳）１０ｍＬに１白金耳植菌し、さらに３０℃で一晩静置培養を行い、得られた培養菌を種菌として、下記の実験に使用した。
【０１２２】
（１−２）各サンプルの処理
サンプル１：豆乳（キッコーマン成分無調整豆乳）５０ｍＬに上記で調製した種菌を３００μＬ接種し、３５℃で１６時間培養した。
【０１２３】
サンプル２：豆乳（同上）５０ｍＬに上記で調製した種菌を３００μＬ接種するとともに、酵素（プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ及びペプチダーゼＲの同量混合物）を最終濃度が０．３ｗ／ｖ％となる割合で添加し、３５℃で１６時間培養した。
【０１２４】
サンプル３：豆乳（同上）５０ｍＬに酵素（プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ及びペプチダーゼＲの同量混合物）を最終濃度が０．３ｗ／ｖ％となる割合で添加し、３５℃で４時間酵素処理した後、上記で調製した種菌を３００μＬ接種して３５℃で１６時間培養した。
【０１２５】
（１−３）オルニチン含量の測定
上記方法で培養した各サンプルをアミノ酸分析に供して、定法に従ってオルニチン含量を測定した。比較対照として、原料として使用した豆乳（キッコーマン成分無調整豆乳）についても同様にしてオルニチン含量を測定した。
【０１２６】
（２）実験結果
（１−１）オルニチン含量
培養後の各サンプルに含まれているオルニチン量を表６に示す。
【表６】
2018153177.tif 000007
【０１２７】
上記表に示すように、単位量あたりのオルニチン含量は豆乳を酵素処理することで約４０倍も増加することが判明した。酵素処理により豆乳に含まれるタンパク質が分解され、オルニチンを生成する発酵基質であるアルギニンが生成増量したためと考えられる。オルニチンが豊富といわれるシジミ１００ｇ中に含まれるオルニチン含量は１０〜１５ｍｇ（10-15mg/100g）である。それと比較すると、豆乳を原料として、本発明の乳酸球菌による乳酸発酵とタンパク分解酵素処理とを組み合わせて行うことで、豆乳中非常に高濃度のオルニチンを蓄積できることが確認された。また、乳酸発酵とタンパク分解酵素処理とを同時に平衡して実施した場合と、タンパク分解酵素処理後に乳酸発酵を順次行った場合とでは得られたオルニチン含量に差は見られなかった。このことから作業効率とコンタミネーション防止等の観点から乳酸発酵とタンパク分解酵素処理とを同時に並行して行うことが適していると考えられる。
【０１２８】
（１−２）豆乳発酵物の評価
豆乳を乳酸発酵すると、牛乳と同様に、乳酸発酵時に生成する乳酸によりタンパク変性を起こしてヨーグルト様に凝固することが確認された。凝固は発酵処理時に振盪することでは阻止することができ、一部固形物が観察されたものの、ほぼ液状の豆乳発酵物を得ることができた。一方、豆乳を、乳酸発酵に加えてタンパク分解酵素処理することで、固形物はなくなり、液状の豆乳発酵物を得ることができた。ただ、これをしばらく静置すると固液分離が見られた。これは酵素によりタンパク質が加水分解されたため、タンパク質の乳化作用が失われたためと考えられる。
【０１２９】
以上、説明するように、豆乳を本発明の乳酸球菌で発酵することで、酵素処理ありなしのいずれの場合でも、液状化した豆乳発酵物を得ることができた。液状物は噴霧乾燥装置を用いた粉末化に適した性状である。このため、上記で製造した豆乳発酵物、特にオルニチン含量の多いサンプル２及び３の豆乳発酵物は、噴霧乾燥装置を用いて粉末化することでオルニチンを高濃度含む発酵飲食物（サプリメント）として利用できると考えられる。
【０１３０】
実験例６  乳発酵能の評価
上記の実験で胃酸耐性、腸管上皮細胞への付着性、及び有用アミノ酸産生作用が確認された乳酸球菌（A37株、B30株）について、乳原料を用いて発酵性試験を行い、乳発酵能を評価した。
【０１３１】
（１）実験方法
乳酸球菌（A37株、B30株）を、ＭＲＳ液体培地で一晩培養し、培地を除いた後、これに同量の滅菌水をいれて懸濁し、菌液とした。これをｐＨ６に調整した１０％スキムミルクに植菌し、３０℃で１週間静置培養し、スキムミルクの凝固を観察した。
【０１３２】
（２）実験結果
乳酸球菌（A37株、B30株）の培養物はいずれも凝固（ゲル化）し、凝固後にみられる再溶解（液化）は観察されなかった。このことから、乳酸球菌（A37株、B30株）はいずれも乳発酵能を有していることが確認された。一般に、Lactococcus lactisに属する乳酸球菌は、発酵乳製品を製造する際に用いられる乳発酵スターターとして利用され、食経験豊富である。このことから、本発明の乳酸球菌（A37株、B30株）も安全に、乳発酵スターターとして利用できるものと考えられる。
【０１３３】
実験例７  ＩＬ−１２産生誘導作用の評価
上記の実験で胃酸耐性、腸管上皮細胞への付着性、有用アミノ酸産生作用、及び乳発酵能が確認された乳酸球菌（A37株、B30株）について、インターロイキン-12（IL-12）誘導活性を評価した。
【０１３４】
（１）実験方法
（１−１）被験菌の調製
被験菌として桑実由来乳酸球菌（A37株、B30株）、また陽性コントロール菌としてLactococcus lactis  NBRC12007株を用いた。これらの被験菌は、Ｍ１７培地で２日間培養した後、培地を除去して集菌し、蒸留水で１回洗浄したのち凍結乾燥した。調製した乾燥菌体を１０ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水に懸濁し、沸騰水浴中で１０分間加熱処理（死菌処理）した。これをＰＲＭＩ１６４０培地で最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌになるように希釈し、これを被験菌試料とした。
【０１３５】
（１−２）実験
マウスマクロファージ（J774.1）をＲＰＭＩ１６４０培地で、７０％コンフルエント状態になるまで５日間培養し、次いで９６穴プレートのウエルに1.2×104/wellの割合になるよう100μＬ播種した。３時間後、これらのウエルに前記方法で調製した被験菌試料（50ng/ml）をそれぞれ添加した。また、被験菌試料に代えてウエルに刺激物質としてＬＰＳ（100ng/ml）を添加した系も作製した。
【０１３６】
被験菌試料等を添加した後、５％ＣＯ２、３７℃条件下で２４時間培養した後に培地を回収し、これらの培地に含まれるＩＬ−１２量を、「レビス（登録商標）Mouse IL-12 ELISA Kit」（株式会社シバヤギ製）を用いて測定した。これはマウス血清／血漿中のＩＬ−１２（IL-12 p70）量を測定する試薬キットである。具体的には、当該試薬キットのマニュアル記載の操作法に従って、下記の操作を実施した。
１）キット付属の抗体固相化９６ウェルプレートに各被験試料及び標準試料を１００μＬ添加し、撹拌して室温（20〜25℃）で２時間静置反応させた後、４回洗浄する。なお、標準試料としてはキット付属の「マウスＩＬ−１２標準品」をマニュアルに従って調製したものを使用した。
２）これにキット付属のビオチン結合抗ＩＬ−１２抗体１００μＬを添加し、再び撹拌して室温で２時間静置反応させた後、４回洗浄する。
３）これにキット付属のペルオキシダーゼ・アビジン結合物１００μＬを添加し、再び撹拌して室温で３０分間静置反応させた後、４回洗浄する。
４）これにキット付属の発色液（TMB）１００μＬを添加し、再び撹拌して室温で２０分間静置反応させた後、キット付属の反応停止液（1M H2SO4）１００μＬを添加し、撹拌して反応を停止させる。
５）斯くして調製した反応液の吸光度（主波長450nm、副波長620nm）を測定し、得られた吸光度から、標準試料で作成する検量線に基づいて、被験試料中のＩＬ−１２量を算出する。
【０１３７】
（２）実験結果
結果を図５に示す。図５からわかるように、本発明の桑実由来乳酸球菌（A37株、B30株）はいずれも死菌であるにも関わらず、ともにＩＬ−１２の誘導活性が確認された。またこれらの乳酸球菌のＩＬ−１２の誘導活性は、陽性コントロール菌であるLacotcoccsu lactis NBRC12007株や、刺激物質であるＬＰＳに比べて３倍以上も高いことが確認された。
【受託番号】
【０１３８】
NITE  P-02397
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号１は、本発明の乳酸球菌（L. lactis B30）の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示す。
【図１】
2018153177.tif 000008
【図２】
2018153177.tif 000009
【図３】
2018153177.tif 000010
【図４】
2018153177.tif 000011
【図５】
2018153177.tif 000012
【配列表】
2018153177000001.app