(57)【要約】【課題】  ヒトインターロイキン−６およびそのファミリーサイトカインのシグナル伝達に重要なヒトｇｐ１３０受容体に結合し、かつ前記サイトカインのシグナル抑制が可能なアンタゴニストを提供すること。【解決手段】  ヒトｇｐ１３０受容体の、少なくともＶＩＩＬＫＹＮＩＱＹＲおよび／またはＤＬＫＰＦＴＥＹＶＦＲＩＲと結合可能な、インターロイキン−６ファミリーサイトカインに対するアンタゴニストにより、前記課題を解決する。【選択図】  図２
2018153172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体の、少なくとも以下の（１）および／または（２）に示すアミノ酸残基と結合可能な、インターロイキン−６ファミリーサイトカインに対するアンタゴニスト。
（１）配列番号１の２５２番目のバリンから２６２番目のアルギニンまでのアミノ酸残基
（２）配列番号１の２８８番目のアスパラギン酸から３００番目のアルギニンまでのアミノ酸残基
【請求項２】
アンタゴニストが抗体である、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３が、それぞれ以下に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のアンタゴニスト。
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１８、配列番号２８又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１９、配列番号２９又は配列番号３９に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号２０、配列番号３０又は配列番号４０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２３、配列番号３３又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号２４、配列番号３４又は配列番号４４に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２５、配列番号３５又は配列番号４５に記載のアミノ酸配列
【請求項４】
抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、請求項２又は３に記載のアンタゴニスト。
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｂ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｃ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号３９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号４０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４４に、及び
軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
【請求項５】
抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が、以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかである、請求項２〜４いずれかに記載のアンタゴニスト。
（Ａ）重鎖が配列番号１６に、及び軽鎖が配列番号２１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｂ）重鎖が配列番号２６に、及び軽鎖が配列番号３１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｃ）重鎖が配列番号３６に、及び軽鎖が配列番号４１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
【請求項６】
抗体の軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０の３４番目のトリプトファンから４８番目のチロシンまでのアミノ酸配列を含む、請求項２〜４いずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２〜４及び６のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１４２又は配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２〜４、６及び７のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列が、以下の（ｉ）から（ｉｘ）のいずれかである、請求項２〜４いずれかに記載のアンタゴニスト。
（ｉ）ＶＨ領域が配列番号１４０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２又は配列番号２０４の１番目から１０７番目にそれぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｖ）ＶＨ領域が配列番号１４６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖ）ＶＨ領域が配列番号１４８に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む（ｖｉ）ＶＨ領域が配列番号１５０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０又は配列番号１７２に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６４又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｘ）ＶＨ領域が配列番号１５６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｘ）ＶＨ領域が配列番号２１２の１番目から１２０番目、ＶＬ領域が配列番号２００、２０２又は２０６の１番目から１０７番目に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
【請求項１０】
配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６又は配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培養して抗体を発現させた後、前記形質転換体の培養物から発現した抗体を回収する、抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）ファミリーサイトカインに対するアンタゴニストに関する。より詳しくは、ＩＬ−６およびその他ＩＬ−６ファミリーに属するサトカインのシグナル伝達に関わるヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域に結合することでヒトｇｐ１３０受容体を通したシグナル伝達を抑制可能なアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、関節リウマチ、キャッスルマン病のような自己免疫疾患、骨格系の疾病、癌、心臓病、肥満、糖尿病、喘息、アルツハイマー病、および多発性硬化症等、多数の疾病に関与していると考えられている。これらは、ＩＬ−６シグナルの抑制がこれら疾病の治療に有益になり得る可能性を示唆している。
【０００３】
ＩＬ−６は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合し、次いで信号変換受容体であるｇｐ１３０受容体を二量体化することで伝達される（非特許文献１）。また、ＩＬ−６Ｒおよびｇｐ１３０受容体は細胞膜上だけではなく可溶形態でも存在しており生体内でＩＬ−６のシグナルを伝達、抑制していると考えられている（非特許文献２）。さらにｇｐ１３０受容体は、ＩＬ−６の他にＩＬ−６ファミリーに属するインターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン２７（ＩＬ−２７）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のシグナル伝達にも関与している（非特許文献３）。
【０００４】
近年、モノクローナル抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発が進められている。例えば、リウマチによる炎症に対する抗体医薬品として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）やＩＬ−６Ｒに対する抗体医薬品が販売され高い治療効果を上げている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５８、５７３−５８１（１９８９）
【非特許文献２】Ｎａｒａｚａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８２，１１２０−１１２６（１９９３）
【非特許文献３】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３４，２９７−３１４（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ヒトインターロイキン−６およびそのファミリーサイトカインのシグナル伝達に重要なヒトｇｐ１３０受容体に結合し、かつ前記サイトカインのシグナル抑制が可能なアンタゴニストを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域の特定領域に結合することでＩＬ−６ファミリーサイトカインのシグナルを抑制するアンタゴニストを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明の第一の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むヒトｇｐ１３０受容体の、少なくとも以下の（１）および／または（２）に示すアミノ酸残基と結合可能な、インターロイキン−６ファミリーサイトカインに対するアンタゴニストである。
（１）配列番号１の２５２番目のバリンから２６２番目のアルギニンまでのアミノ酸残基
（２）配列番号１の２８８番目のアスパラギン酸から３００番目のアルギニンまでのアミノ酸残基
また本発明の第二の態様は、アンタゴニストが抗体である、第一の態様に記載のアンタゴニストである。
【０００９】
また本発明の第三の態様は、抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３が、それぞれ以下に示すアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、第二の態様に記載のアンタゴニストである。
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１８、配列番号２８又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１９、配列番号２９又は配列番号３９に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号２０、配列番号３０又は配列番号４０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２３、配列番号３３又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号２４、配列番号３４又は配列番号４４に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２５、配列番号３５又は配列番号４５に記載のアミノ酸配列
また本発明の第四の態様は、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、第二又は三の態様に記載のアンタゴニストである。
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｂ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｃ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号３９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号４０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４４に、及び
軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
また本発明の第五の態様は、抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が、以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかである、第二〜四の態様いずれかに記載のアンタゴニストである。
（Ａ）重鎖が配列番号１６に、及び軽鎖が配列番号２１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｂ）重鎖が配列番号２６に、及び軽鎖が配列番号３１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｃ）重鎖が配列番号３６に、及び軽鎖が配列番号４１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
また本発明の第六の態様は、抗体の軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０の３４番目のトリプトファンから４８番目のチロシンまでのアミノ酸配列を含む、第二〜四の態様いずれかに記載のアンタゴニストである。
【００１０】
また本発明の第七の態様は、抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を含む、第二〜四及び六の態様いずれかに記載のアンタゴニストである。
【００１１】
また本発明の第八の態様は、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１４２または配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を含む、第二〜四、六及び七の態様いずれかに記載のアンタゴニストである。
【００１２】
また本発明の第九の態様は、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列が、以下の（ｉ）から（ｉｘ）のいずれかである、第二〜四の態様いずれかに記載のアンタゴニストである。
（ｉ）ＶＨ領域が配列番号１４０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２又は配列番号２０４の１番目から１０７番目に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｖ）ＶＨ領域が配列番号１４６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖ）ＶＨ領域が配列番号１４８に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む（ｖｉ）ＶＨ領域が配列番号１５０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０又は配列番号１７２に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６４又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｘ）ＶＨ領域が配列番号１５６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｘ）ＶＨ領域が配列番号２１２の１番目から１２０番目、ＶＬ領域が配列番号２００、２０２又は２０６の１番目から１０７番目に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
さらに本発明の第十の態様は、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６又は配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
さらに本発明の第十一の態様は、第十の態様に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含む、ベクターである。
【００１４】
さらに本発明の第十二の態様は、第十一の態様に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体である。
【００１５】
さらに本発明の第十三の態様は、第十二の態様に記載の形質転換体を培養して抗体を発現させた後、前記形質転換体の培養物から発現した抗体を回収する、抗体の製造方法であ
る。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明のアンタゴニストは、ヒトＩＬ−６およびその他ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカインのシグナル伝達に関わる、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体の、細胞外領域の少なくとも以下の（１）及び／又は（２）：
（１）２５２番目のバリンから２６２番目のアルギニンまでのアミノ酸残基（具体的にはＶＩＩＬＫＹＮＩＱＹＲからなるアミノ酸残基）または、
（２）２８８番目のアスパラギン酸から３００番目のアルギニンまでのアミノ酸残基（具体的にはＤＬＫＰＦＴＥＹＶＦＲＩＲ）
に示すアミノ酸残基と結合することでヒトｇｐ１３０受容体を通したシグナル伝達を抑制可能なアンタゴニストであり、好ましくは前記（１）の残基および前記（２）の残基の両方に結合可能なアンタゴニストである。本発明のアンタゴニストはヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域に結合し、かつヒトｇｐ１３０受容体を通したシグナル伝達の抑制効果がある物質であれば特に制約はなく、その一例として低分子化合物、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、抗体、低分子化抗体が挙げられる。中でも抗体または低分子化抗体が好ましく、さらに好ましくは抗体である。
【００１８】
低分子化合物やＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーを本発明のアンタゴニストとする場合は、有機合成反応を用いて製造することができ、化学反応後、各種クロマトグラフィーを用いることで精製することができる。
【００１９】
本明細書において抗体とは、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖、および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を意味する。重鎖はそれぞれ、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる高度に保存された領域とに分類される。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第５版）、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔの定義が最も一般的に使用されており、本明細書中のＣＤＲはＫａｂａｔの定義に基づいている。ＶＨ領域およびＶＬ領域はそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端への方向でＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。なお本発明の抗体はマウス、ラット、ヒト、ウサギ、トリ、ヤギ等由来の抗体でもよく、ＣＤＲを保存しＦＲを別の動物由来のアミノ酸残基に変更した改良抗体や、一つの抗体分子の中に二つの特異性を有する二重特異性抗体なども使用できる。さらにラクダ科動物由来の重鎖のみからなるＶＨＨ抗体も使用することができる。
【００２０】
本明細書において低分子化抗体とは、抗原（例えば、ヒトｇｐ１３０受容体）に特異的に結合する能力を保持する、抗体のフラグメントを意味する。例としては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＬ１ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含むフラグメント
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ領域およびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一のアームのＶＬ領域およびＶＨ領域からなるフラグメント
が挙げられる。このうち（ｉｖ）Ｆｖフラグメントの２つの領域であるＶＬ領域およびＶＨ領域は通常別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし、かつ合成リンカーを介して両領域が結合した態様（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
【００２１】
本発明の抗体は、サブクラス（例えばヒトであれば４種類：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在）による限定は特になく、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の必要性に応じ、適宜選択すればよい。ＡＤＣＣやＣＤＣで目的細胞を死滅させることを目的とした抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが高くなるサブクラスを選択すればよく、またＡＤＣＣやＣＤＣが不要な抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが低くなるサブクラスを選択すればよい。なお抗体におけるＡＤＣＣやＣＤＣの増強または減少は、抗体の定常領域のアミノ酸残基を置換および、抗体に付加する糖鎖を変更することで行なってもよい。
【００２２】
前述した抗体や低分子化抗体はタンパク質であることから、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのまま宿主細胞に導入しても構わないが、プロモーターやシグナルぺプチドを含む発現ベクターにクローニングし、当該ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで製造すると好ましい。抗体や低分子化抗体をコードするポリヌクレオチドを設計する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。前記宿主細胞には特に限定はなく、一例として、哺乳動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）が挙げられる。中でも、抗体分子を発現させる場合は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
【００２３】
前記発現ベクターは、宿主に応じたプロモーターやシグナルペプチドを含んでいればよい。一例をあげると、哺乳動物を宿主として用いた場合、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーターが例示でき、さらに各種分泌タンパク質に付加されているシグナルペプチドを組合せればよい。また宿主細胞に大腸菌を用いる場合にはＴ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが例示でき、シグナルペプチドはＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥおよびＴｏｒＴが例示できる。また発現タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を選択するために、必要であれば抗生物質のような薬剤マーカーを前記発現ベクターに導入してもよい。さらにＣＨＯ細胞で高発現細胞株を作製するときに行なわれる遺伝子増幅のためのマーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子）を前記発現ベクターに含んでいてもよい。
【００２４】
形質転換体を培養することで発現した抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせることで、前記形質転換体の培養物から精製・回収することができる。
【００２５】
本発明の抗体の好ましい態様として、抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３が、それぞれ以下に示すアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
重鎖ＣＤＲ１：配列番号１８、配列番号２８又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ２：配列番号１９、配列番号２９又は配列番号３９に記載のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ３：配列番号２０、配列番号３０又は配列番号４０に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ１：配列番号２３、配列番号３３又は配列番号４３に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ２：配列番号２４、配列番号３４又は配列番号４４に記載のアミノ酸配列
軽鎖ＣＤＲ３：配列番号２５、配列番号３５又は配列番号４５に記載のアミノ酸配列
なお、本発明の抗体が前述したヒトｇｐ１３０受容体中の特定領域（具体的には、配列番号１の２５２番目のバリンから２６２番目のアルギニンまでのアミノ酸残基および／または配列番号１の２８８番目のアスパラギン酸から３００番目のアルギニンまでのアミノ酸残基）への結合能を有している限り、前記例示したアミノ酸配列において、アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加が生じていてもよく、具体的には、抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、前記例示したアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってよい。
【００２６】
また本発明の抗体のより好ましい態様として、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかである抗体が挙げられる。
（ａ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号１８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号１９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｂ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号３０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｃ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号３８に、重鎖ＣＤＲ２が配列番号３９に、重鎖ＣＤＲ３が配列番号４０に、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号４３に、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号４４に、及び軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４５に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
また本発明の抗体のさらにより好ましい態様として、抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が、以下の（Ａ）から（Ｃ）のいずれかである抗体が挙げられる。
（Ａ）重鎖が配列番号１６に、及び軽鎖が配列番号２１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｂ）重鎖が配列番号２６に、及び軽鎖が配列番号３１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（Ｃ）重鎖が配列番号３６に、及び軽鎖が配列番号４１に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
また本発明の抗体の別の態様として、抗体の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ以外のアミノ酸配列を、マウス抗体のアミノ酸配列からヒト抗体のアミノ酸配列へと変更した抗体（ヒト化抗体）が挙げられる（図４）。抗体全体におけるヒト抗体のアミノ酸配列の割合を増加させることにより、ヒト体内に適用した際に異物として排除されにくくなるというメリットが得られる。
【００２７】
具体的には、抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域中のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０の３４番目のトリプトファンから４８番目のチロシンまでのアミノ酸配列（具体的にはＷＦＱＱＲＰＧＱＡＰＫＶＬＩＹ）を含む抗体が挙げられる。
【００２８】
また本発明の抗体の別の好ましい態様として、抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１７０に記載のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
【００２９】
また本発明の抗体のさらに別の態様として、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列が、少なくとも配列番号１４２又は配列番号１５２に記載のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
【００３０】
また本発明の抗体のさらに別の好ましい態様として、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列が、以下の（ｉ）から（ｉｘ）のいずれかである抗体が挙げられる。
（ｉ）ＶＨ領域が配列番号１４０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２又は配列番号２０４の１番目から１０７番目に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１４４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｖ）ＶＨ領域が配列番号１４６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖ）ＶＨ領域が配列番号１４８に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む（ｖｉ）ＶＨ領域が配列番号１５０に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５２に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０又は配列番号１７２に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｖｉｉｉ）ＶＨ領域が配列番号１５４に、ＶＬ領域が配列番号１５８、配列番号１６４又は配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
（ｉｘ）ＶＨ領域が配列番号１５６に、ＶＬ領域が配列番号１７０に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
また、上記のヒト化抗体の重鎖および軽鎖の可変領域以外の定常領域はヒト抗体のサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のアミノ酸配列から選択し使用すればよい。
（ｘ）ＶＨ領域が配列番号２１２の１番目から１２０番目、ＶＬ領域が配列番号２００、２０２又は２０６の１番目から１０７番目に、それぞれ記載のアミノ酸配列を含む
さらに本発明の抗体は前述したアミノ酸配列に限定されるものではなく、機能特性が実質的に変化していない置換体（保守的アミノ酸置換体）も本発明の抗体に含まれる。保守的アミノ酸置換の一例として、バリン−ロイシン−イソロイシン間の置換、フェニルアラニン−チロシン間の置換、リシン−アルギニン間の置換、アラニン−バリン間の置換、グルタミン酸−アスパラギン酸間の置換、アスパラギン−グルタミン間の置換が挙げられる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のアンタゴニストは、ヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域の特定領域に結合することでＩＬ−６およびその他ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカインのシグナルを抑制できるため、ＩＬ−６ファミリーサイトカインの異常によって引き起こされる疾病（例えば関節リウマチ等の自己免疫疾患）の治療に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の抗体のヒトｇｐ１３０受容体に対する結合性評価結果を示す図である。
【図２】本発明の抗体（抗体Ａ）のＩＬ−６シグナル抑制確認結果を示す図である。
【図３】本発明の抗体（抗体Ｂ）のＩＬ−６シグナル抑制確認結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施態様に係る、ヒト化抗体の模式図を示す図である。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  可溶性ヒトｇｐ１３０受容体の調製
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから６１９番目のグルタミン酸までの領域）を発現させるためのベクターを以下の方法で構築した。
（１−１）配列番号２に記載のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）プラスミドにクローニングした。
（１−２）（１−１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ−Ｐ１と命名した。
（１−３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号３（５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ−３’）および配列番号４（５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
【００３５】
【表１】
2018153172.tif 000003
【００３６】
（１−４）（１−３）で作製したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（１−２）で調製したｄｈｆｒ−ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ−Ｐ１とライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだ発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを得た。
【００３７】
（２）（１）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒを鋳型として配列番号５（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣ−３’）および配列番号６（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で７分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒベクターのＣＭＶプロモーター遺伝子を除いた領域を増幅し、ｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒ−Ｐ１と命名した。
【００３８】
【表２】
2018153172.tif 000004
【００３９】
（３）ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ（和光純薬工業社製）を鋳型として、配列番号７（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ−３’）および配列番号８（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏに含まれるＣＡＧプロモーター（特許第２８２４４３３号公報）をコードする遺伝子を増幅し、ＣＡＧ−Ｐ１と命名した。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
（４）（２）で作製したｐＩＲＥＳ−ｄｈｆｒ−Ｐ１および（３）で作製したＣＡＧ−Ｐ１をそれぞれ制限酵素ＳａｌＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＣＡＧプロモーター遺伝子を含んだ発現ベクターｐＣＡＧ−ｄｈｆｒを得た。
【００４２】
（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから６１９番目のグルタミン酸までの領域）をコードするポリヌクレオチドに、６個のヒスチジンをコードするオリゴヌクレオチド並びに制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ認識配列を付加したポリヌクレオチド（配列番号９）を全合成し（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）プラスミドにクローニング後、当該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出後、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し精製することでヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域をコードする遺伝子を得た。
【００４３】
（６）（４）で作製したｐＣＡＧ−ｄｈｆｒを制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、（５）で作製したヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をライゲーション後、当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。前記形質転換体の培養物からプラスミドを抽出することで、ヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域を発現するための発現ベクターｐＣＡＧ−ｈｇｐ１３０を得た。
【００４４】
（７）（６）で作製したｐＣＡＧ−ｈｇｐ１３０をＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で形質転換細胞を培養し、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて遺伝子増幅を行なった後、限外希釈法により安定な
可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質の生産細胞株を得た。
【００４５】
（８）（７）で得られた細胞株をＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍおよび三角フラ
スコを用いてＣＯ２インキュベーター中で振盪培養（３７℃、８％のＣＯ２）し、可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を分泌発現させた。遠心分離によって細胞および不純物を除去し得られた上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、あらかじめ２０ｍＭのイミダゾールと１５０ｍＭの塩化ナトリウムとを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に流速１ｍＬ／分でアプライした。前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍのイミダゾール、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を限外ろ過膜で１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換することで高純度な可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を得た。
【００４６】
実施例２  抗ｇｐ１３０受容体抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）実施例１で作製した可溶性ｇｐ１３０受容体タンパク質を、１０日に１回５０μｇずつ、合計４回に渡りＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射することで免疫を行なった。
【００４７】
（２）マウスから脾臓細胞を摘出し、マウス由来のミエローマ細胞（ＳＰ２／０株）とポリエチレングリコールを用いて融合させた。細胞融合後、ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ社製）および１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて培養することでハイブリドーマを作製した。
【００４８】
（３）（２）で作製したハイブリドーマを９６穴プレートにて培養し、その培養上清を下記に示すＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を用いることでヒトｇｐ１３０受容体タンパク質に結合する抗体を分泌しているハイブリドーマが存在するウェルを選択した。
（３−１）実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（３−２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体を含んだハイブリドーマ上清を添加し、抗体と固定化組換えヒトｇｐ１３０受容体タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（３−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（３−４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高いハイブリドーマを選択した。
【００４９】
（４）（３）で選択したハイブリド−マについて、以下の操作を行なった。
（４−１）９６穴プレートの各ウェルにマウス由来の抗ヒトｇｐ１３０受容体モノクローナルＡＭ６４抗体（特開平３−２１９８９４号公報）を固定化した。
（４−２）各ウェルに、実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を加えて前記ヒトｇｐ１３０受容体抗体と結合させた。
（４−３）各ウェルに、組換えヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）（和光純薬社製）と組換えヒトＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）との混合物、および各ハイブリド−マの培養液上清を同時に添加した。
（４−４）前記条件下でＡＭ６４抗体および可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を介して固定化されたＩＬ−６Ｒに、モルモットにＩＬ−６Ｒを免疫して製造した抗ＩＬ−６Ｒポリクローナル抗体およびアルカリフォスファターゼで標識した抗モルモットイムノグロブリン抗体を添加し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質を添加することにより、添加した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質に対する抗体のＩＬ−６の結合阻害効果を測定した。
【００５０】
ＩＬ−６の結合阻害効果を示した３ウェルの細胞を限外希釈法にてモノクローン化し、３種類のハイブリドーマを得た。
【００５１】
実施例３  抗体各鎖の配列解析
（１）実施例２で得られた３種類のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体をそれぞれ抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃと名付けた。前記３種類のハイブリドーマをそれぞれ１００μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬを添加した、９０ｍｍφの培養ディッシュにて培養した。培養上清をＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いて各抗体のサブクラスを確認したところ、抗体ＡはＨ鎖がＩｇＧ１でＬ鎖がκ、抗体ＢはＨ鎖がＩｇＧ２ｂでＬ鎖がκ、抗体ＣはＨ鎖がＩｇＧ２ａでＬ鎖がκであることを確認した。
【００５２】
（２）培養した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５３】
（３）（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲにより抗体遺伝子を増幅した。
具体的には、抗体Ａの重鎖（Ｈ鎖）遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ａを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０（５’−ＧＣＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧ−３’）および配列番号１１（５’−ＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
また抗体Ｂおよび抗体Ｃの重鎖遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ｂまたは抗体Ｃを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０および配列番号１２（５’−ＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＷＣＣＧＧＧＡＧＡＷＧＳＴＣＴＴＭＫＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
また抗体Ａ、抗体Ｂおよび抗体Ｃの軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子の増幅には、鋳型として各抗体を発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０および配列番号１３（５’−ＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
ＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００５４】
【表４】
2018153172.tif 000006
【００５５】
（４）（３）で得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した発現ベクターｐＡＰ３ｎｅｏ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００５６】
（５）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、各抗体の重鎖または軽鎖を発現可能なベクターｐＡＰ−ＡＨ（抗体Ａ重鎖）、ｐＡＰ−ＡＬ（抗体Ａ軽鎖）、ｐＡＰ−ＢＨ（抗体Ｂ重鎖）、ｐＡＰ−ＢＬ（抗体Ｂ軽鎖）、ｐＡＰ−ＣＨ（抗体Ｃ重鎖）およびｐＡＰ−ＣＬ（抗体Ｃ軽鎖）を抽出した。
【００５７】
（６）（５）で作製した発現ベクターのうち、抗体各鎖をコードする遺伝子周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１４（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号１５（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００５８】
発現ベクターｐＡＰ−ＡＨで発現される抗体Ａ重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に、それぞれ示す。なお配列番号１６に記載の配列からなる抗体Ａ重鎖ポリペプチドのうち相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）は、５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から５４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（配列番号１８、ＣＤＲ１）、６９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から８５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（配列番号１９、ＣＤＲ２）および１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）から１２８番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号２０、ＣＤＲ３）である。
【００５９】
発現ベクターｐＡＰ−ＡＬで発現される抗体Ａ軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２２に、それぞれ示す。なお配列番号２１に記載の配列からなる抗体Ａ軽鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、４６番目のアスパラギン（Ａｓｎ）から５５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号２３、ＣＤＲ１）、７１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から７７番目のセリン（Ｓｅｒ）までの領域（配列番号２４、ＣＤＲ２）および１１０番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域（配列番号２５、ＣＤＲ３）である。
【００６０】
発現ベクターｐＡＰ−ＢＨで発現される抗体Ｂ重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２７に、それぞれ示す。なお配列番号２６に記載の配列からなる抗体Ｂ重鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から５４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）までの領域（配列番号２８、ＣＤＲ１）、６９番目のアルギニン（Ａｒｇ）から８５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（配列番号２９、ＣＤＲ２）および１１６番目のアラニン（Ａｌａ）から１２７番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号３０、ＣＤＲ３）である。
【００６１】
発現ベクターｐＡＰ−ＢＬで発現される抗体Ｂ軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３２に、それぞれ示す。なお配列番号３１に記載の配列からなる抗体Ｂ軽鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、４４番目のアルギニン（Ａｒｇ）から５８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までの領域（配列番号３３、ＣＤＲ１）、７４番目のバリン（Ｖａｌ）から８０番目のセリン（Ｓｅｒ）までの領域（配列番号３４、ＣＤＲ２）および１１３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１２１番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域（配列番号３５、ＣＤＲ３）である。
【００６２】
発現ベクターｐＡＰ−ＣＨで発現される抗体Ｃ重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３７にそれぞれ示す。なお配列番号３６に記載の配列からなる抗体Ｃ重鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、５０番目のアラニン（Ａｌａ）から５４番目のセリン（Ｓｅｒ）までの領域（配列番号３８、ＣＤＲ１）、６９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）から８５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までの領域（配列番号３９、ＣＤＲ２）および１１８番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から１２４番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号４０、ＣＤＲ３）である。
【００６３】
発現ベクターｐＡＰ−ＣＬで発現される抗体Ｃ軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４２にそれぞれ示す。なお配列番号４１に記載の配列からなる抗体Ｃ軽鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、４４番目のリジン（Ｌｙｓ）から５２番目のアラニン（Ａｌａ）までの領域（配列番号４３、ＣＤＲ１）、７０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から７６番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域（配列番号４４、ＣＤＲ２）および１０９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１１７番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域（配列番号４５、ＣＤＲ３）である。
【００６４】
実施例４  組換え抗体のｇｐ１３０受容体への結合性評価
（１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した６ウェルプレートを用いて、各ウェルにＣＯＳ１細胞株を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
【００６５】
（２）細胞がコンフルエントになった後、各ウェル内の培地を０．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換した。
【００６６】
（３）培地交換後、実施例３で得た抗体Ａの重鎖遺伝子を含んだ発現ベクターおよび軽鎖遺伝子を含んだ発現ベクター（ｐＡＰ−ＡＨ、ｐＡＰ−ＡＬ）、抗体Ｂの重鎖遺伝子を含んだ発現ベクターおよび軽鎖遺伝子を含んだ発現ベクター（ｐＡＰ−ＢＨ、ｐＡＰ−ＢＬ）または抗体Ｃの重鎖遺伝子を含んだ発現ベクターおよび軽鎖遺伝子を含んだ発現ベクター（ｐＡＰ−ＣＨ、ｐＡＰ−ＣＬ）各１μｇと８μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）との複合体を含んだＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を各ウェルに２５０μＬ加え３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養し抗体Ａ、抗体Ｂおよび抗体Ｃのタンパク質を得た。
【００６７】
（４）（２）で得られた抗体のヒトｇｐ１３０受容体に対する結合性を、実施例２（３）に記載のＥＬＩＳＡ法で評価した。
【００６８】
結果を図１に示す。黒棒はヒト可溶性ｇｐ１３０受容体を固定化したとき（ｇｐ１３０（＋））の、白棒は前記ｇｐ１３０受容体を固定化していないとき（ｇｐ１３０（−）、ネガティブコントロール）の、それぞれ結果である。抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、いずれも可溶性ヒトｇｐ１３０受容体に結合することが確認された。このことから抗体Ａ（配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有した抗体）、抗体Ｂ（配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有した抗体）および抗体Ｃ（配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有した抗体）は、いずれもヒトｇｐ１３０受容体と結合することがわかる。
【００６９】
実施例５  抗体精製
（１）実施例２で得た３種類のハイブリドーマを、３０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が入った５枚の１５０ｍｍφディッシュ（住友ベークライト社製）で、それぞれ培養した。培養後、遠心分離により培養上清を取得した。
【００７０】
（２）（１）で得られた上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）に流速１ｍＬ／分でアプライした。
【００７１】
（３）前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。なお得られた溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【００７２】
この精製により、高純度の抗体Ａを約５ｍｇ、抗体Ｂを約２０ｍｇ、抗体Ｃを約２ｍｇ、それぞれ得た。
【００７３】
実施例６  エピトープマッピング
（１）配列番号１に記載のヒトｇｐ１３０受容体のアミノ酸配列のうち、１２４番目のロイシン（Ｌｅｕ）から３２４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（全２０１アミノ酸残基）に対して、２アミノ酸残基のギャップで当該領域をカバーするよう、１５アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを計９４本合成した（表５、配列番号４６から配列番号１３９に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド）。
【００７４】
【表５】
2018153172.tif 000007
【００７５】
（２）（１）で合成した９４本のペプチドをマイクロアレイスライドにリンカーを付加して固定化した。
【００７６】
（３）実施例５で精製した抗体Ａ、抗体Ｂおよび抗体Ｃを１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬまたは０．１μｇ／ｍＬとなるようＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で希釈し、前記マイクロアレイスライドに添加した。
【００７７】
（４）３０℃で１時間静置した後、洗浄緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含んだＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））で洗浄し、２次抗体としてＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０を結合したａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈した上で添加した。
【００７８】
（５）３０℃で１時間静置し、洗浄緩衝液で洗浄し乾燥後、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４２００ＡＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて蛍光をスキャンした。
【００７９】
各抗体１０μｇ／ｍＬの時の結果を表６に示す。今回検討した抗体（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ）はいずれも配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１２７および配列番号１２８に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドに対して高い結合性（高い蛍光強度）を有していた。配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの共通領域は配列番号１に記載のヒトｇｐ１３０受容体アミノ酸配列のうち２５２番目から２６２番目までの領域（具体的にはＶＩＩＬＫＹＮＩＱＹＲ）であり、配列番号１２７および配列番号１２８に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドの共通領域は配列番号１に記載のヒトｇｐ１３０受容体アミノ酸配列のうち２８８番目から３００番目までの領域（具体的にはＤＬＫＰＦＴＥＹＶＦＲＩＲ）である。以上の結果から、今回検討した抗体（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ）はいずれもヒトｇｐ１３０受容体（配列番号１）のＶＩＩＬＫＹＮＩＱＹＲ領域（配列番号１の２５２番目から２６２番目までの領域）およびＤＬＫＰＦＴＥＹＶＦＲＩＲ領域（配列番号１の２８８番目から３００番目までの領域）を少なくとも認識していることがわかる。
【００８０】
【表６】
2018153172.tif 000008
【００８１】
実施例７  抗体によるＩＬ−６シグナル抑制
（１）ヒトＩＬ−６に感受性があり、かつヒトＩＬ−６の添加により細胞増殖が促進される細胞株である７−ＴＤ−１（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣから提供されたＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  Ｎｏ．ＲＣＢ１１９０）を１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で培養した。
【００８２】
（２）培養後、セルカウントを行ない、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（培地１ｍＬ）となるよう、２４ウェルプレートへ加えた。
【００８３】
（３）ヒトＩＬ−６（和光純薬社製）を終濃度で５０ｎｇ／ｍＬとなるようウェルに加え、さらに実施例５で精製した抗体Ａまたは抗体Ｂを終濃度で５００ｎｇ／ウェルまたは１０００ｎｇ／ウェルとなるよう加えた後、当該２４ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間静置培養した。
【００８４】
（４）（３）の培養後、ヒトＩＬ−６未添加、ヒトＩＬ−６のみ添加、ヒトＩＬ−６および抗体（抗体Ａまたは抗体Ｂ）を添加したウェルの細胞数を自動細胞測定装置Ｃｏｕｎｔｎｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて測定した。
【００８５】
抗体Ａを用いたときの細胞数測定結果を図２に、抗体Ｂを用いたときの細胞数測定結果を図３に、それぞれ示す。ヒトＩＬ−６を添加することでウェル中の７−ＴＤ−１細胞数がヒトＩＬ−６未添加時と比較して増加していることから、７−ＴＤ−１はヒトＩＬ−６により細胞数が増殖することが確認できた。一方、ヒトＩＬ−６を添加したウェルに抗体Ａまたは抗体Ｂを添加した場合、いずれも抗体未添加時と比較しウェル中の７−ＴＤ−１の増殖は抑制され、かつ当該抑制度合いは抗体の添加量に依存した結果となった（図２および図３）。以上の結果から、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち、２５２番目のバリン（Ｖａｌ）から２６２番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸残基（具体的にはＶＩＩＬＫＹＮＩＱＹＲ）および／または２８８番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から３００番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸残基（具体的にはＤＬＫＰＦＴＥＹＶＦＲＩＲ）と少なくとも結合する抗体である、抗体Ａおよび抗体Ｂはヒトｇｐ１３０受容体に結合することでＩＬ−６のシグナル伝達を抑制できることがわかる。
【００８６】
実施例８  抗体Ａの親和性測定
（１）実施例５で調製した抗体Ａ溶液を、限外ろ過にて濃縮しながらＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）に置換後、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）にて１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬおよび０．１２５μｇ／ｍＬに希釈した。
【００８７】
（２）実施例１で調製したヒトｇｐ１３０受容体を１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）へアミンカップリング法を用いて固定化した（固定化量１０８ＲＵ相当）。
【００８８】
（３）ヒトｇｐ１３０を固定化したチップへ（１）で調製した抗体Ａ希釈溶液を接触時間２００秒、解離時間８００秒、流速３０μＬ／分の条件で流し、固定化したヒトｇｐ１３０受容体との相互作用をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した。解析ソフトにて親和性の解析を行なった結果、抗体Ａの親和性はｋａ＝１．７４×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝１．１６×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝６．６７×１０−１０［Ｍ］となり、高い親和性を有していることが確認できた。
【００８９】
実施例９  ヒト化抗体遺伝子の作製
（１）配列番号１６に記載のアミノ酸配列のうち２０番目のグルタミン酸から１３９番目のセリンまでのアミノ酸残基からなる、抗体Ａの重鎖可変（ＶＨ）領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち２３番目のグルタミンから１２９番目のアルギニンまでのアミノ酸残基からなる、抗体Ａの軽鎖可変（ＶＬ）領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）を、マウス抗体のアミノ酸残基からヒト抗体のアミノ酸残基に変更したもの（以下、ヒト化抗体Ａともいう）を、統合計算化学システム「ＭＯＥ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて設計した。
【００９０】
設計した９種類のヒト化抗体ＡのＶＨ領域（ＡＨ１からＡＨ９）および８種のヒト化抗体ＡのＶＬ領域（ＡＬ１からＡＬ８）のうち、ＡＨ１のアミノ酸配列を配列番号１４０に、ＡＨ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４１に、ＡＨ２のアミノ酸配列を配列番号１４２に、ＡＨ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４３に、ＡＨ３のアミノ酸配列を配列番号１４４に、ＡＨ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４５に、ＡＨ４のアミノ酸配列を配列番号１４６に、ＡＨ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４７に、ＡＨ５のアミノ酸配列を配列番号１４８に、ＡＨ５をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４９に、ＡＨ６のアミノ酸配列を配列番号１５０に、ＡＨ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５１に、ＡＨ７のアミノ酸配列を配列番号１５２に、ＡＨ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５３に、ＡＨ８のアミノ酸配列を配列番号１５４に、ＡＨ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５５に、ＡＨ９のアミノ酸配列を配列番号１５６に、ＡＨ９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５７に、ＡＬ１のアミノ酸配列を配列番号１５８に、ＡＬ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５９に、ＡＬ２のアミノ酸配列を配列番号１６０に、ＡＬ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６１に、ＡＬ３のアミノ酸配列を配列番号１６２に、ＡＬ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６３に、ＡＬ４のアミノ酸配列を配列番号１６４に、ＡＬ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６５に、ＡＬ５のアミノ酸配列を配列番号１６６に、ＡＬ５をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６７に、ＡＬ６のアミノ酸配列を配列番号１６８に、ＡＬ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６９に、ＡＬ７のアミノ酸配列を配列番号１７０に、ＡＬ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７１に、ＡＬ８のアミノ酸配列を配列番号１７２に、ＡＬ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７３に、それぞれ示す。
【００９１】
（２）（１）で設計した、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７に記載の配列からなるポリヌクレオチド）に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加したポリヌクレオチド、またはＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１および配列番号１７３に記載の配列からなるポリヌクレオチド）に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加し、クローニング後にフレームシフトをしないように調整したポリヌクレオチドをそれぞれ全合成（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）し、それぞれプラスミドにクローニングした。
【００９２】
（３）実施例１で作製したｐＣＡＧ−ｄｈｆｒを鋳型として配列番号１７４（５’−ＴＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧ−３’）および配列番号１７５（５’―ＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＣＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡまでの領域を）をｄｈｆｒ−Ｐ１と命名した。
【００９３】
【表７】
2018153172.tif 000009
【００９４】
（４）ヒト抗体の重鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）、ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（３）で作製したｄｈｆｒ−Ｐ１をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化・精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋを得た。ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１にＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒと命名し、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋにＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒと命名した。
【００９５】
（５）（２）で作製した、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化することで、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５および配列番号１５７に記載の配列からなるポリヌクレオチド）を調製した。
【００９６】
（６）（４）で作製したｐＦＵ−ＣＨＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化・精製後、（５）で調製したポリヌクレオチドとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ヒト化抗体Ａの重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドを作製した。
【００９７】
作製したプラスミドのうち、ＡＨ１（配列番号１４０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ１と命名し、ＡＨ２（配列番号１４２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４３）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ２と命名し、ＡＨ３（配列番号１４４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４５）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ３と命名し、ＡＨ４（配列番号１４６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４７）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ４と命名し、ＡＨ５（配列番号１４８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４９）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ５と命名し、ＡＨ６（配列番号１５０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５１）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ６と命名し、ＡＨ７（配列番号１５２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５３）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ７と命名し、ＡＨ８（配列番号１５４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５５）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ８と命名し、ＡＨ９（配列番号１５６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５７）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＨ９と命名した。
【００９８】
（７）（２）で作製した、ヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化することで、ヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１および配列番号１７３に記載の配列からなるポリヌクレオチド）を調製した。
【００９９】
（８）（４）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化・精製後、（７）で調製したポリヌクレオチドとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでヒト化抗体Ａの軽鎖（Ｌ鎖）を発現するプラスミドを作製した。
【０１００】
作製したプラスミドのうち、ＡＬ１（配列番号１５８）をコードするポリヌクレオチド
（配列番号１５９）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ１と命名し、ＡＬ２（配列番号１６０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６１）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ２と命名し、ＡＬ３（配列番号１６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６３）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ３と命名し、ＡＬ４（配列番号１６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６５）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ４と命名し、ＡＬ５（配列番号１６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６７）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ５と命名し、ＡＬ６（配列番号１６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６９）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ６と命名し、ＡＬ７（配列番号１７０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７１）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ７と命名し、ＡＬ８（配列番号１７２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７３）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ８と命名した。
【０１０１】
実施例１０  ヒト化抗体Ａのヒトｇｐ１３０受容体への結合性評価
（１）実施例９（６）で作製したヒト化抗体ＡのＨ鎖を発現するプラスミド１００ｎｇおよび実施例９（８）で作製したヒト化抗体ＡのＬ鎖を発現するプラスミド１００ｎｇを加えた２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製社製）と、１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製社製）を含んだ２５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地とを混合し室温で２０分間静置した。
【０１０２】
（２）９６穴培養プレートを用いて１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ１細胞（アフリカミドリザルの腎線維芽細胞）の培地を、９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、（１）に記載の抗体発現プラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を含んだＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を加えることでトランスフェクションを行ない、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２日間静置することでヒト化抗体Ａを発現させた。
【０１０３】
（３）発現させたヒト化抗体Ａのヒトｇｐ１３０受容体に対する結合性を実施例２（３）に記載のＥＬＩＳＡ法と同様の方法を用いて確認した。ＥＬＩＳＡ法はヒト化抗体を検出するためにぺルオキシターゼ標識された抗ヒト抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を使用した以外は実施例２（３）に記載と同様の方法を用いた。
【０１０４】
結果を表８に示す。表８において、数値はＥＬＩＳＡの吸光度であり、その数値が大きいほどｇｐ１３０に対する結合性が強いことを表している。表８より、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域とＶＬ領域との組み合わせが、ＡＨ１（配列番号１４０）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ１（配列番号１５８）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ２（配列番号１６０）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ３（配列番号１６２）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ４（配列番号１６４）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ５（配列番号１６６）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ６（配列番号１６８）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ８（配列番号１７２）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ１（配列番号１５８）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ２（配列番号１６０）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ３（配列番号１６２）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ４（配列番号１６４）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ５（配列番号１６６）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ６（配列番号１６８）、ＡＨ３（配列番号１４４）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ４（配列番号１４６）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ５（配列番号１４８）−ＡＬ１（配列番号１５８）、ＡＨ５（配列番号１４８）−ＡＬ３（配列番号１６２）、ＡＨ５（配列番号１４８）−ＡＬ４（配列番号１６４）、ＡＨ５（配列番号１４８）−ＡＬ５（配列番号１６６）、ＡＨ５（配列番号１４８）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ６（配列番号１５０）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ１（配列番号１５８）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ２（配列番号１６０）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ３（配列番号１６２）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ４（配列番号１６４）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ５（配列番号１６６）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ６（配列番号１６８）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ７（配列番号１７０）、ＡＨ７（配列番号１５２）−ＡＬ８（配列番号１７２）、ＡＨ８（配列番号１５４）−ＡＬ１（配列番号１５８）、ＡＨ８（配列番号１５４）−ＡＬ４（配列番号１６４）、ＡＨ８（配列番号１５４）−ＡＬ７（配列番号１７０）およびＡＨ９（配列番号１５６）−ＡＬ７（配列番号１７０）においてヒトｇｐ１３０受容体との結合性を確認できた。このことから抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）をマウス抗体のアミノ酸残基からヒト抗体のアミノ酸残基へ変更しても、抗原との結合性を示すヒト化抗ｇｐ１３０受容体抗体が得られることがわかる。
【０１０５】
表８の結果から、今回検討したヒト化抗体ＡのＶＬ領域のうち、ＡＬ７（配列番号１７０）は、今回検討したすべてのヒト化抗体ＡのＶＨ領域との組合せで高いヒトｇｐ１３０受容体との結合性を示していた。そこでＡＬ７（配列番号１７０）と今回設計した他のヒト化抗体ＡのＶＬ領域（ＡＬ１からＡＬ６およびＡＬ８）とでＦＲのアミノ酸配列を比較したところ、配列番号１７０の３４番目から４８番目までのアミノ酸配列の領域で特徴的な配列を見出した（表９）。このことから、配列番号１７０の３４番目から４８番目のアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲを有した抗体は、ヒトｇｐ１３０受容体に対する抗体として好ましい態様であることが示唆される。
【０１０６】
【表８】
2018153172.tif 000010
【０１０７】
【表９】
2018153172.tif 000011
【０１０８】
実施例１１  ヒト化抗体Ａの親和性評価
実施例１０でヒトｇｐ１３０受容体への結合性を示したヒト化抗体ＡのＶＨ領域とＶＬ領域との組み合わせのうち、ＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ３（配列番号１６２）およびＡＨ２（配列番号１４２）−ＡＬ４（配列番号１６４）の組み合わせについて親和性を測定した。
【０１０９】
（１）実施例９で作製したｐＦＵ−ＡＨ２、ｐＦＵ−ＡＬ３およびｐＦＵ−ＡＬ４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ培養し、プラスミドを抽出することでｐＦＵ−ＡＨ２、ｐＦＵ−ＡＬ３およびｐＦＵ−ＡＬ４を得た。
【０１１０】
（２）１２μｇのｐＦＵ−ＡＨ２および１２μｇのｐＦＵ−ＡＬ３、または１２μｇのｐＦＵ−ＡＨ２および１２μｇのｐＦＵ−ＡＬ４を加えた、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、６０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製社製）を含んだ１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を混合し、室温で２０分間静置した。
【０１１１】
（３）９０ｍｍφの培養ディッシュ（住友ベークライト社製）を用いて１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地で培養したＣＯＳ１細胞（アフリカミドリザルの腎線維芽細胞）の培地を、９ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、上記のｐＦＵ−ＡＨ２およびｐＦＵ−ＡＬ３の組み合わせ、またはｐＦＵ−ＡＨ２およびｐＦＵ−ＡＬ４の組み合わせと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を含んだＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地とを加えることでトランスフェクションを行ない、３７℃、５％ＣＯ２環境下で３日間静置することで、ＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４を発現させた。
【０１１２】
（４）（３）で発現させたＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４を含む培養液から遠心分離することで細胞を除去した培養上清を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−６５０Ｆ（東ソー社製）にアプライした。１０ｍＬの１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸（ｐＨ３．０）で溶出し精製した。精製後直ちに溶出量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）を加えることでｐＨを中性に戻した。
【０１１３】
（５）精製したＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４を、限外ろ過にて濃縮しながらＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）に置換し、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）にて１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬおよび０．１２５μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１１４】
（６）実施例１で調製したヒトｇｐ１３０受容体を１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）へ１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）へアミンカップリング法を用いて固定化した（固定化量２６６ＲＵ相当）。
【０１１５】
（７）ヒトｇｐ１３０受容体固定化センサーチップへ（５）で調製した各濃度のＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４希釈溶液を接触時間２３０秒、解離時間８００秒、流速３０μＬ／分の条件で流し、固定化したヒトｇｐ１３０受容体との相互作用をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて測定した。
【０１１６】
解析ソフトにて親和性の解析を行なった結果、ＡＨ２−ＡＬ３の親和性はｋａ＝７．０
６×１０４［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝２．６８×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝３．８０×１０
−９［Ｍ］であり、ＡＨ２−ＡＬ４の親和性はｋａ＝６．２７×１０４［１／Ｍｓ］、ｋ
ｄ＝２．８９×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝４．６１×１０−９［Ｍ］であった。このこ
とから、ヒト化抗体ＡＨ２−ＡＬ３およびヒト化抗体ＡＨ２−ＡＬ４の親和性は、実施例
８に記載のヒト化前の抗体Ａ（マウス抗体）の親和性（ＫＤ＝６．６７×１０−１０［Ｍ
］）とほぼ同等の親和性を有していることが確認された。
【０１１７】
実施例１２  Ｌ鎖フレームライブラリーの作製
（１）配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１２９番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸残基からなる、抗体Ａの軽鎖可変（ＶＬ）領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）をヒト化した抗体のアミノ酸残基を、統合計算化学システム「ＭＯＥ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて５種設計した。
設計したヒト化抗体ＡのＶＬ領域（ＡＬ９からＡＬ１３）のうち、ＡＬ９のアミノ酸配列を配列番号１７６に、ＡＬ９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７７に、ＡＬ１０のアミノ酸配列を配列番号１７８に、ＡＬ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７９に、ＡＬ１１のアミノ酸配列を配列番号１８０に、ＡＬ１１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８１に、ＡＬ１２のアミノ酸配列を配列番号１８２に、ＡＬ１２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８３に、ＡＬ１３のアミノ酸配列を配列番号１８４に、ＡＬ１３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８５に示した。
【０１１８】
（２）配列番号１７７、１７９、１８１、１８３および１８５に記載のポリヌクレオチドに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を付加し、クローニング後にフレームシフトをしないように調整したポリヌクレオチドをそれぞれ全合成（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）し、それぞれプラスミドにクローニングした。
【０１１９】
（３）（２）で作製した、ヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードする５種類のポリヌクレオチドをそれぞれ含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化することで、５種類のヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７７、１７９、１８１、１８３および１８５に記載の配列からなるポリヌクレオチド）を調製した。
【０１２０】
（４）実施例９（４）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化・精製後、調製した５種類のヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドとそれぞれライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでヒト化抗体ＡのＬ鎖を発現するプラスミドを作製した。
作製したプラスミドのうち、ＡＬ９（配列番号１７６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７７）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ９と命名し、ＡＬ１０（配列番号１７８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７９）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ１０と命名し、ＡＬ１１（配列番号１８０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８１）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ１１と命名し、ＡＬ１２（配列番号１８２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８３）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ１２と命名し、ＡＬ１３（配列番号１８４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８５）を含むプラスミドをｐＦＵ−ＡＬ１３と命名した。
【０１２１】
（５）ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだプラスミドｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を鋳型として配列番号１８６（５’−ＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧ−３’）および配列番号１８７（５’−ＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてとしてＰＣＲを行なった。具体的には表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【０１２２】
（６）（５）で得られたプロモーター、ＩＬ−２分泌シグナル、ヒトＩｇκ鎖をコードする遺伝子を含んだＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、同制限酵素で消化した実施例１（４）で作製したｐＣＡＧ−ｄｈｆｒとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでヒト抗体の軽鎖定常領域を発現可能なｐＥＦ-ｈＬを得た。
【０１２３】
（７）実施例９で作製した８種類のヒト化Ｌ鎖（ｐＦＵ−ＡＬ１、ｐＦＵ−ＡＬ２、ｐＦＵ−ＡＬ３、ｐＦＵ−ＡＬ４、ｐＦＵ−ＡＬ５、ｐＦＵ−ＡＬ６、ｐＦＵ−ＡＬ７、およびｐＦＵ−ＡＬ８）ならびに（２）で作製した５種類のヒト化Ｌ鎖（ｐＦＵ−ＡＬ９、ｐＦＵ−ＡＬ１０、ｐＦＵ−ＡＬ１１、ｐＦＵ−ＡＬ１２およびｐＦＵ−ＡＬ１３）を各５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号１８８（５’−ＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣ−３’）、１８９（５’−ＡＡＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＡＡＣＣＴＣ−３’）、１９１（５’−ＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴ−３’）および１９３（５’−ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣ−３’）のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９０（５’−ＧＡＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴＴ−３’）、１９２（５’−ＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧ−３’）、１９４（５’−ＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧ−３’）および１９５（５’−ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧ−３’）のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてＰＣＲを行なった。具体的には表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
配列番号１８８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ１をコードしておりＡＬ−ＦＲ１と命名した。また配列番号１８９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ２をコードしておりＡＬ−ＦＲ２と命名した。また配列番号１９１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ３をコードしておりＡＬ−ＦＲ３と命名した。また配列番号１９３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ４をコードしておりＡＬ−ＦＲ４と命名した。
【０１２４】
（８）（７）で得られたＰＣＲ産物を精製した後、これら各１μＬの混合物を鋳型とし、配列番号１８８に記載のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号１９５に記載のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてＰＣＲを行なった。具体的には表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【０１２５】
（９）（８）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化し精製した（６）で作製したｐＥＦ−ｈＬとライゲーションした。
【０１２６】
（１０）（９）で得られたライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含んだＬＢプレート培地に散布することで、抗体ＡのＬ鎖フレーム領域がヒト化されライブラリーとなったヒト化Ｌ鎖フレームライブラリーのコロニーを得た。
【０１２７】
実施例１３  ヒト化Ｌ鎖フレームライブラリースクリーニング
（１）実施例３で作製したｐＡＰ−ＡＨ（抗体Ａ重鎖、ヒト化前のマウス抗体）を鋳型とし配列番号１９６（５’−ＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣ−３’）および配列番号１９７（５’−ＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（配列番号１６に記載の抗体Ａ重鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）をＡＨ−Ｐと命名した。
【０１２８】
（２）実施例３で作成したｐＡＰ−ＡＬ（抗体Ａ軽鎖、ヒト化前のマウス抗体）を鋳型とし配列番号１９８（５’−ＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣ−３’）および配列番号１９９（５’−ＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（配列番号２１に記載の抗体Ａ軽鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）をＡＬ−Ｐと命名した。
【０１２９】
（３）（１）で作製したＡＨ−Ｐおよび（２）で作製したＡＬ−Ｐを精製後、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同様に制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し精製した実施例１で作製したｐＣＡＧ−ｄｈｆｒとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含んだＬＢ培地で培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで抗体ＡのＨ鎖を発現するプラスミドｐＣＡＧ−ＡＨおよび抗体ＡのＬ鎖を発現するプラスミドｐＣＡＧ−ＡＬを作製した。
【０１３０】
（４）１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含んだ２ｘＹＴが１．５ｍＬ／ウェル入った９６穴ディープウェルに実施例１２で得たＬ鎖フレームライブラリーのコロニーをピックアップし３７℃、１０００ｒｐｍで一晩振盪培養した。培養後、２０００ｒｐｍで２０分間遠心することで集菌し、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｒｅｐ９６Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを調製した。
【０１３１】
（５）実施例９で作製した重鎖可変（ＶＨ）領域がＡＨ２（配列番号１４２）であるヒト化抗体ＡのＨ鎖発現プラスミドｐＦＵ−ＡＨ２を１５０ｎｇ、（４）で調製したヒト化Ｌ鎖フレームライブラリー発現プラスミドを２μＬおよび０．２μＬのＰ３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだ２０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだ２０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭとを混合し１５分間室温で静置した。当該混合物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて９６ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養し、コンフルエントになったＣＯＳ１細胞の培養上清を９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに交換した後に加え３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間静置培養することで、ヒト化抗体Ａを発現させた。
【０１３２】
（６）発現させたヒト化抗体Ａのヒトｇｐ１３０受容体への結合性を、検出に用いる標識抗体を抗ヒト抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）にした以外は実施例２（３）に記載のＥＬＩＳＡと同様の方法で評価した。ヒト化Ｌ鎖フレームライブラリーから約１４００クローンを評価した結果、ヒトｇｐ１３０受容体と結合性を示した４９クローンを得た。
【０１３３】
（７）実施例９で作製したｐＦＵ−ＡＨ２を２５０ｎｇ、（６）で選択したヒト化Ａ抗体のＬ鎖発現クローンをプラスミドとして２５０ｎｇ、および１μＬのＰ３０００試薬を含んだ５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を含んだ５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭとを混合し、１５分室温で静置した後、当該混合物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地を用いて２４ウェルプレートで３７℃、５％ＣＯ２の条件でＣＯＳ１細胞を培養した。
【０１３４】
（８）コンフルエントになった細胞の培養上清を４００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに交換した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間静置培養することで、ヒト化抗体Ａを発現させた。
【０１３５】
（９）（５）および（６）に記載と同様な方法で、（３）で作製したｐＣＡＧ−ＡＨ、ｐＣＡＧ−ＡＬを用いてコントロールであるマウス抗体Ａも発現させた。
【０１３６】
（１０）アミンカップリングキットを用いて、実施例１に記載の方法で調製したヒトｇｐ１３０受容体を、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）へ固定化し（固定化量：４０２３ＲＵ相当）、（８）で発現させたヒト抗体Ａおよび（９）で発現させたマウス抗体Ａを接触時間２００秒、解離時間８００秒、流速３０μＬ／分の条件で前記固定化したセンサーチップＣＭ５へ流し、固定化したヒトｇｐ１３０受容体との相互作用をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥヘルスケア社製）にて測定した。前記測定結果に基づき、固定化したヒトｇｐ１３０受容体と結合したヒト化抗体Ａとの解離特性がマウス抗体Ａと比較し解離が遅い、ヒト化抗体ＡのＬ鎖をスクリーニングし、４種類のクローンを得た。
【０１３７】
前記方法で得られた、ヒト化抗体ＡのＬ鎖を発現するクローンをＡＬ−４Ｆ１、ＡＬ−６Ｅ６、ＡＬ−１３Ｈ１０およびＡＬ−１４Ａ１０と命名した。またＡＬ−４Ｆ１が有するヒト化抗体Ｌ鎖発現プラスミドをｐＦＵ−ＡＬ−４Ｆ１と命名し、ＡＬ−６Ｅ６が有するヒト化抗体Ｌ鎖発現プラスミドをｐＦＵ−ＡＬ−６Ｅ６と命名し、ＡＬ−１３Ｈ１０が有するヒト化抗体Ｌ鎖発現プラスミドをｐＦＵ−ＡＬ−１３Ｈ１０と命名し、ＡＬ−１４Ａ１０が有するヒト化抗体Ｌ鎖発現プラスミドをｐＦＵ−ＡＬ−１４Ａ１０と命名した。ｐＦＵ−ＡＬ−４Ｆ１で発現するヒト化抗体Ｌ鎖ＡＬ−Ｌ４Ｆ１のアミノ酸配列を配列番号２００に、ＡＬ−Ｌ４Ｆ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０１に、ｐＦＵ−ＡＬ−６Ｅ６で発現するヒト化抗体Ｌ鎖ＡＬ−Ｌ６Ｅ６のアミノ酸配列を配列番号２０２に、ＡＬ−Ｌ６Ｅ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０３に、ｐＦＵ−ＡＬ−１３Ｈ１０で発現するヒト化抗体Ｌ鎖ＡＬ−Ｌ１３Ｈ１０のアミノ酸配列を配列番号２０４に、ＡＬ−Ｌ１３Ｈ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０５に、ｐＦＵ−ＡＬ−１４Ａ１０で発現するヒト化抗体Ｌ鎖ＡＬ−Ｌ１４Ａ１０のアミノ酸配列を配列番号２０６に、ＡＬ−Ｌ１４Ａ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０７に、それぞれ示す。
【０１３８】
実施例１４  ヒト化抗体ＡＨ２−Ｌ１３Ｈ１０の親和性測定
（１）実施例１３で得られたヒト化抗体Ｌ鎖発現プラスミドのうちｐＦＵ−ＡＬ−１３Ｈ１０を選択し、当該プラスミド２μｇと実施例９で作製した重鎖可変（ＶＨ）領域がＡＨ２（配列番号１４２）であるヒト化抗体ＡのＨ鎖発現プラスミドｐＦＵ−ＡＨ２  １μｇとを混合し、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたエレクトロポレーション（１７００Ｖ、２０ｍｓ、１回）でＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）に遺伝子導入した。
【０１３９】
（２）遺伝子導入細胞をＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍにて三角フラスコで振盪培養（３７℃、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍ）し、ヒト化抗体ＡＨ２‐Ｌ１３Ｈ１０を分泌発現させた。
【０１４０】
（３）得られた培養液中に含まれる細胞および不純物を遠心分離により除去し、得られた上清を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したプロテインＡゲル（東ソー社製）１ｍＬを充填したオープンカラムにアプライした。
【０１４１】
（４）前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお前記溶出液は当該溶出液の１／４量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性にした。
【０１４２】
（５）中性にした溶出液を限外ろ過で濃縮し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換することでヒト化抗体ＡＨ２−Ｌ１３Ｈ１０タンパク質を得た。
【０１４３】
（６）２８０ｎｍの吸光にて濃度測定を行ない、吸光係数＝１．４としてヒト化抗体タンパク質濃度を算出後、アミンカップリングキットを用いて、実施例１に記載の方法で調製したヒトｇｐ１３０受容体を、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）へ固定化し（固定化量：３８９ＲＵ相当）、（２）で調製したヒト化抗体（ＡＨ２−Ｌ１３Ｈ１０）を接触時間２００秒、解離時間８００秒、流速３０μＬ／分の条件で流し、固定化したヒトｇｐ１３０受容体との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社製）にて測定した。
【０１４４】
解析ソフトにて親和性の解析を行なった結果、ヒト化抗体ＡＨ２−１３Ｈ１０の親和性はｋａ＝８．９３×１０４［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝２．０３×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝２．２７×１０−９［Ｍ］となり、高い親和性を有していることが確認できた。ヒト化抗体ＡＨ２−１３Ｈ１０の親和性は、実施例１１で作製したヒト化抗体ＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４のＫＤ値（ＡＨ２−ＡＬ３：３．８０×１０−９［Ｍ］、ＡＨ２−ＡＬ４：４．６１×１０−９［Ｍ］よりも低く、より高い親和性を有していた。
【０１４５】
実施例１５  ＶＨ領域の改良と親和性測定
（１）実施例９で作製した重鎖可変（ＶＨ）領域がＡＨ２（配列番号１４２）であるヒト化抗体ＡのＨ鎖発現プラスミドｐＦＵ−ＡＨ２を鋳型とし、配列番号２０８（５’−ＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧ−３’）または配列番号２０９（５’−ＧＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２１０（５’−ＧＴＡＧＴＡＧＧＴＡＣＧＡＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＡＡＣＣＧＣ−３’）または配列番号２１１（５’−ＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてＰＣＲを行なった。具体的には表１０に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
配列番号２０８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物をＡＨ２−２Ｐ１と命名し、配列番号２０９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして得られたＰＣＲ産物をＡＨ２−２Ｐ２と命名した。
【０１４６】
【表１０】
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【０１４７】
（２）（１）で作製したＡＨ２−２Ｐ１とＡＨ２−２Ｐ２の精製産物を鋳型とし、配列番号２０８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号２１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてＰＣＲを行なった。具体的には表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡＨ２−２Ｐ３とした。
【０１４８】
（３）ＡＨ２−２Ｐ３および実施例９（４）で作製したｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化後、精製し、ＡＨ２−２Ｐ３とｐＦＵ−ＣＬＩｇ−ｄｈｆｒとをライゲーションした。
【０１４９】
（４）ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ゼオシンを含んだＬＢ培地で培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ヒト化抗体ＡＨ２−２を含んだｐＦＵ−ＡＨ２−２を得た。配列解析の結果、ｐＦＵ−ＡＨ２−２にクローニングしたヒト化抗体ＡのＨ鎖であるＡＨ２−２のアミノ酸配列を配列番号２１２に、ＡＨ２−２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２１３に示した。配列番号２１２に記載のＡＨ２−２のアミノ酸配列のうちＶＨ領域（１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１２０番目のアラニン（Ａｌａ）まで）のアミノ酸配列は、配列番号１４２に記載のＶＨ領域アミノ酸配列（ＡＨ２）のうち９７番目のトレオニン（Ｔｈｒ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したアミノ酸配列と同一である。
【０１５０】
（５）実施例１３で得られたｐＦＵ−ＡＬ−４Ｆ１、ｐＦＵ−ＡＬ−６Ｅ６およびｐＦＵ−ＡＬ−１４Ｈ１０を各２μｇと（２）で作製したｐＦＵ−ＡＨ２−２を１μｇとをそれぞれ混合し、実施例１４（１）と同様の方法でＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）へ遺伝子導入した。
【０１５１】
（６）遺伝子導入したＣＨＯ細胞から実施例１４（２）から（５）と同様の方法で、ヒト化抗体ＡＨ２−２ＡＬ４Ｆ１、ＡＨ２−２Ｌ６Ｅ６、ＡＨ２−２Ｌ１４Ｈ１０タンパク質を調製した。
【０１５２】
（７）実施例１４（６）と同様な方法でタンパク質濃度を算出後、ヒトｇｐ１３０受容体を固定化したセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、実施例１４（６）と同様の方法でヒト化抗体Ａの親和性を測定した。
【０１５３】
結果、ＡＨ２−２ＡＬ４Ｆ１の親和性はｋａ＝１．１１×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝２．２１×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝１．９８×１０−９［Ｍ］であり、ＡＨ２−２Ｌ６Ｅ６の親和性はｋａ＝２．１１×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝２．０９×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝９．９１×１０−１０［Ｍ］であり、ＡＨ２−２Ｌ１４Ａ１０の親和性はｋａ＝１．５５×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝２．０２×１０−４［１／ｓ］、ＫＤ＝１．３０×１０−９［Ｍ］であった。ヒト化抗体ＡＨ２−２Ｌ４Ｆ１、ＡＨ２−２Ｌ６Ｅ６、ＡＨ２−２Ｌ１４Ａ１０の親和性は、いずれも実施例１４で作製したヒト化抗体ＡＨ２−Ｌ１３Ｈ１０のＫＤ値（ＫＤ＝２．２７×１０−９［Ｍ］）とほぼ同様の親和性であり、実施例１１で作製したヒト化抗体ＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４のＫＤ値（ＡＨ２−ＡＬ３：３．８０×１０−９［Ｍ］、ＡＨ２−ＡＬ４：４．６１×１０−９［Ｍ］よりも低く、より高い親和性を有していた。
【０１５４】
実施例１１（ＡＨ２−ＡＬ３およびＡＨ２−ＡＬ４）、実施例１４（ＡＨ２−Ｌ１３Ｈ１０）ならびに本実施例（ＡＨ２−２Ｌ４Ｆ１、ＡＨ２−２Ｌ６Ｅ６、およびＡＨ２−２Ｌ１４Ａ１０）で作製したヒト化抗体Ａが有する親和性と、ヒト化前の抗体Ａ（マウス抗体）が有する親和性（実施例８）とを比較した表を表１１に示す。実施例１４および本実施例で作製したヒト化抗体はいずれも、実施例１１で作製したヒト化抗体と同様、ヒト化前の抗体Ａ（マウス抗体）の親和性とほぼ同等の親和性を有していることが確認された。
【０１５５】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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