(57)【要約】【課題】高速化を図ることできる核酸増幅反応試薬を提供する。【解決手段】第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にハイブリダイゼーションするプローブと、前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングするプライマーと、を含み、前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する、核酸増幅反応試薬。【選択図】図１
2018014930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にハイブリダイゼーションするプローブと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングするプライマーと、
を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する、核酸増幅反応試薬。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１塩基配列の前記重なる部分にハイブリダイゼーションするのは、前記プローブの３´末端側であり、
前記第２塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記プライマーの３´末端側である、核酸増幅反応試薬。
【請求項３】
第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にアニーリングするフォワードプライマーと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングするリバースプライマーと、
を含み、
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する、核酸増幅反応試薬。
【請求項４】
請求項３において、
前記第１塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記フォワードプライマーの３´末端側であり、
前記第２塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記リバースプライマーの３´末端側である、核酸増幅反応試薬。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記重なる部分の塩基数は、１以上１０以下である、核酸増幅反応試薬。
【請求項６】
プローブおよびプライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記プローブは、第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にハイブリダイゼーションし、
前記プライマーは、前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングし、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記フォワードプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にアニーリングし、
前記リバースプライマーは、前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングし、
前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応試薬および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応溶液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
例えば特許文献１には、第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、鋳型核酸上の約ゼロ〜約５個の塩基のギャップが、ＰＣＲプライマーの３´末端間に存在するように設計されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−５８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の技術のように、フォワードプライマーとリバースプライマーとの間や、プライマーとプローブとの間にギャップが存在するような設計では、ＰＣＲの高速化の妨げになることを、発明者は見出した。
【０００７】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、高速化を図ることができる核酸増幅反応試薬を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、高速化を図ることできる核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にハイブリダイゼーションするプローブと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングするプライマーと、
を含み、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する。
【０００９】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図ることができる（詳細は後述する「４．  実験例」参照）。
【００１０】
本発明に係る核酸増幅反応試薬において、
前記第１塩基配列の前記重なる部分にハイブリダイゼーションするのは、前記プローブの３´末端側であり、
前記第２塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記プライマーの３´末端側であってもよい。
【００１１】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図ることができる。
【００１２】
本発明に係る核酸増幅反応試薬は、
第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にアニーリングするフォワードプライマーと、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングするリバースプライマーと、
を含み、
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する。
【００１３】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図ることができる。
【００１４】
本発明に係る核酸増幅反応試薬において、
前記第１塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記フォワードプライマーの３´末端側であり、
前記第２塩基配列の前記重なる部分にアニーリングするのは、前記リバースプライマーの３´末端側であってもよい。
【００１５】
このような核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図ることができる。
【００１６】
本発明に係る核酸増幅反応試薬において、
前記重なる部分の塩基数は、１以上１０以下であってもよい。
【００１７】
このような核酸増幅反応試薬では、例えば、プローブの重なる部分にハイブリダイゼーションする部分と、プライマーの重なる部分にアニーリングする部分とが、結合して解離しなくなる可能性を小さくすることができる。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
プローブおよびプライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記プローブは、第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にハイブリダイゼーションし、
前記プライマーは、前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングし、
前記プライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する。
【００１９】
このような核酸増幅反応方法では、高速化を図ることができる。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させるための熱サイクルを付与する工程を含み、
前記熱サイクルを付与する工程において、
前記フォワードプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡに含まれる第１塩基配列にアニーリングし、
前記リバースプライマーは、前記第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡに含まれる第２塩基配列にアニーリングし、
前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、
前記第１の一本鎖ＤＮＡと前記第２の一本鎖ＤＮＡとがアニーリングした場合に、前記第１塩基配列および前記第２塩基配列は、重なる部分を有する。
【００２１】
このような核酸増幅反応方法では、高速化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態に係る核酸増幅反応試薬に含まれるプライマーとプローブとの関係を説明するための図。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応試薬に含まれるプライマーとプローブとの関係を説明するための図。
【図３】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図４】本実施形態に係る反応溶液に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置を模式的に示す断面図。
【図５】本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応試薬に含まれるフォワードプライマーとリバースプライマーとの関係を説明するための図。
【図６】ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２４】
１．  核酸増幅反応試薬
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬について説明する。核酸増幅反応試薬は、ＰＣＲにおいて、核酸を増幅させるための試薬である。核酸増幅反応試薬は、例えば、液状であってもよいし、凍結乾燥された状態であってもよい。例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応試薬は、容器（図示せず）内に固定されており、該容器に、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）やＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含む鋳型核酸溶液を導入して、鋳型核酸溶液と核酸増幅反応用試薬とを接触させる。核酸増幅反応用試薬は、鋳型核酸溶液の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液に取り込まれ、反応溶液となる。したがって、反応溶液は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００２５】
核酸増幅反応試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、プローブと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００２６】
１．１．  プライマー
プライマーは、鋳型核酸（テンプレート）にアニールするよう設計されている。アニール（アニーリング）とは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。核酸増幅反応用試薬は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応溶液に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上６．４μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応溶液に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、例えば、同じである。
【００２７】
プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、好ましくは７２℃以上７８℃以下であり、より好ましくは７４℃以上７６℃以下である。これにより、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬は、高速化を図ることができる（詳細は後述する「４．  実験例」参照）。Ｔｍ値は、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする温度の指標であり、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値以上の温度であれば、半数以上のプライマーが鋳型核酸にアニーリングする。フォワードプライマーのＴｍ値と、リバースプライマーのＴｍ値とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００２８】
Ｔｍ値の算出方法としては、例えば、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法が挙げられ、下記式（１）によって算出することができる。
【００２９】
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
【００３０】
なお、式（１）において、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００３１】
プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、プライマーの塩基数を多くすることなく、プライマーのＴｍ値を上記の範囲にすることができる。プライマーの塩基数が多くなると、非特異的吸着や、プライマー同士がプライマーダイマー（二本鎖）を形成してしまい、目的の核酸を増幅することができない場合がある。プライマーダイマーには、１つのプライマーにおいて二本鎖を形成するセルフダイマーと、フォワードプライマーとリバースプライマーとにおいて二本鎖を形成するクロスダイマーとがある。
【００３２】
人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が挙げられる。ＬＮＡの化学式を下記式（２）に示す。
【００３３】
【化１】
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【００３４】
なお、式（２）において、Ｂａｓｅ（塩基）は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデニン）等が挙げられるが、特に限定されない。また、塩基は、メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。
【００３５】
人工核酸は、ＬＮＡを修飾したＬＮＡアナログであってもよく、具合的には、３’アミノ− ２’，４’− ＢＮＡ、２’，４’− ＢＮＡＣＯＣ、または２’，４’− ＢＮＡＮＣであってもよい。また、プライマーに含まれる人工核酸は、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、またはこれらを修飾したアナログであってもよい。プライマーに含まれる人工核酸の数は、特に限定されず、１つのプライマーは、複数の人工核酸を含んでいてもよい。
【００３６】
プライマーのＴｍ値は、プライマーの塩基数を多くすることで高くなる。プライマーの塩基数を多くする場合は、プライマーを増幅領域の内側（プライマーを鋳型核酸の５´末端側）に伸ばすように設計することで、伸長反応による核酸の増幅領域を増やすことなく、Ｔｍ値を高くすることができる。これにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００３７】
１．２．  ポリメラーゼ
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させる加水分解型と、ＫＯＤポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させない非加水分解型とが、存在する。反応溶液に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００３８】
１．３．  ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。反応溶液に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００３９】
１．４．  プローブ
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。反応溶液に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上２．４μＭ以下であり、好ましくは０．５μＭ以上１．８μＭ以下である。
【００４０】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。より具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。
【００４１】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブ、Ｅプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎなどであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＫＯＤポリメラーゼを用いる。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００４２】
プローブは、人工核酸およびマイナーグループバインダー分子の少なくとも一方を含んでもよい。これにより、プローブの塩基数を多くすることなく、プローブのＴｍ値を高くすることができる。プローブの塩基数が多くなると、プローブを分解するために伸長反応の時間が長くなり（伸長反応において増幅される核酸の領域が増えてしまい）、ＰＣＲの高速化が困難になる場合がある。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））が挙げられる。
【００４３】
１．５．  バッファー
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。
【００４４】
さらに、ポリメラーゼとして加水分解型を用いる場合、バッファーは、ＭｇＣｌ２と、ＫＣｌと、を含む。ＭｇＣｌ２に起因するＭｇ２＋の濃度は、ポリメラーゼの活性に起因する。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、好ましくは５ｍＭ以上７ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭである。ＭｇＣｌ２の濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる（具体的にはプライマーのアニーリング反応のための加熱時間を４秒以下にすることができる）。ＭｇＣｌ２の濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。なお、核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている状態では、核酸増幅反応試薬は、固形の状態で、上記の塩、ＭｇＣｌ２に、およびＫＣｌを含む。
【００４５】
ポリメラーゼとして非加水分解型を用いる場合、バッファーは、上記ＭｇＣｌ２の代わりにＭｇＳＯ４を用いる。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、１ｍＭ以上３ｍＭ以下である。これにより、ポリメラーゼとして非加水分解型を用いる場合において、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００４６】
１．６．  その他の成分
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、核酸増幅反応試薬は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００４７】
核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている場合、核酸増幅反応試薬（凍結乾燥試薬）は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応試薬の各成分と、糖と、を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００４８】
１．７．  プライマーとプローブとの関係
図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬に含まれるプライマーとプローブとの関係を説明するための図である。
【００４９】
一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とは、相補的な塩基配列を有している。図示の例では、二本鎖ＤＮＡが変性反応して、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とに解離した状態を示している。
【００５０】
プローブ２０は、図１に示すように、一本鎖ＤＮＡ１０にハイブリダイゼーションしている。フォワードプライマー３０は、一本鎖ＤＮＡ１０にアニーリングしている。リバースプライマー３２は、一本鎖ＤＮＡ１２にアニーリングしている。図示の例では、ポリメラーゼによる伸長反応が起こる前の状態を示している。
【００５１】
具体的には、プローブ２０は、一本鎖ＤＮＡ１０の塩基配列１０ａにハイブリダイゼーションしている。すなわち、塩基配列１０ａは、一本鎖ＤＮＡ１０が含む塩基配列であって、プローブ２０がハイブリダイゼーションする塩基配列である。プローブ２０の塩基数と、塩基配列１０ａの塩基数とは、同じである。
【００５２】
リバースプライマー３２は、一本鎖ＤＮＡ１０と相補的な一本鎖ＤＮＡ１２の塩基配列１２ａにアニーリングしている。すなわち、塩基配列１２ａは、一本鎖ＤＮＡ１２が含む塩基配列であって、リバースプライマー３２がアニーリングする塩基配列である。リバースプライマー３２の塩基数と、塩基配列１２ａの塩基数とは、同じである。
【００５３】
一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合（仮に二本鎖ＤＮＡになった場合）に、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａは、重なる部分（重なり部）１１を有する。塩基配列１０ａの重なり部１１の塩基配列と、塩基配列１２ａの重なり部１１の塩基配列とは、相補的な配列である。
【００５４】
ここで、本実施形態に係る核酸増幅試薬では、ＰＣＲを高速化するためにＴｍ値が高いプライマーを使用している。しかし、従来技術のようにプローブがハイブリダイゼーションする領域と、リバースプライマーがアニールする領域とが重ならないように設計すると、核酸の増幅領域（図１または図２で、左端から右端までの領域）が長くならざるを得ない。増幅領域が長くなると、必然的に伸長反応に時間を要することになる。本実施形態に係る核酸増幅試薬では、プローブがハイブリダイゼーションする領域と、リバースプライマーがアニールする領域とを重なることにより、増幅領域が長くなることを抑え、その結果、伸長反応に要する時間が長くなることも抑制している。すなわち、本実施形態に係る核酸増幅試薬では、プライマーのＴｍ値を高くした弊害を、重なり部１１を設けることによって解消（緩和）している。
【００５５】
第１塩基配列１０ａの重なり部１１にハイブリダイゼーションするのは、プローブ２０の３´末端側である。第２塩基配列２０ａの重なり部１１にアニーリングするのは、リバースプライマー３２の３´末端側である。
【００５６】
重なり部１１の塩基数は、例えば、１以上１０以下である。重なり部１１の塩基数を１以上であれば重なり部１１が存在し、プライマー３０，３２の塩基数を多くしてＴｍ値を高くすることができる。重なり部１１の塩基数を１０以下とすることにより、プローブ２０の重なり部１１にハイブリダイゼーションする部分と、リバースプライマー３２の重なり部１１にアニーリングする部分とが、結合して解離しなくなる可能性を小さくすることができる。
【００５７】
なお、図２に示すように、プローブ２０は、一本鎖ＤＮＡ１２の塩基配列１２ａにハイブリダイゼーションし、フォワードプライマー３０は、一本鎖ＤＮＡ１０の塩基配列１０ａにアニーリングし、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合に、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａは、重なり部１１を有してもよい。図２に示す例では、塩基配列１０ａは、一本鎖ＤＮＡ１０が含む塩基配列であって、フォワードプライマー３０がアニーリングする塩基配列である。塩基配列１２ａは、一本鎖ＤＮＡ１２が含む塩基配列であって、プローブ２０がハイブリダイゼーションする塩基配列である。
【００５８】
核酸増幅反応試薬は、例えば、以下の特徴を有する。
【００５９】
核酸増幅反応試薬では、プライマー３０，３２のＴｍ値は、６５℃以上８０℃以下であり、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合に、第１塩基配列１０ａおよび第２塩基配列１０ｂは、重なり部１１を有する。そのため、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、高速化を図ることができる（詳細は後述する「４．  実験例」参照）。
【００６０】
例えば、核酸増幅反応試薬では、リバースプライマー３２を、一本鎖ＤＮＡ１２の５´末端側に伸ばして重なり部１１を有するように設計して、リバースプライマー３２のＴｍ値を高くしている。そのため、リバースプライマー３２を、一本鎖ＤＮＡ１２の３´末端側に伸ばしてリバースプライマー３２のＴｍ値を高くする場合に比べて、核酸の増幅領域を短くすることができ（伸長反応を短縮化することができ）、高速化を図ることができる。また、例えば、リバースプライマー３２を、一本鎖ＤＮＡ１２の５´末端側に伸ばして重なり部１１を有するように設計すると、Ｇ（グアニン）とＣ（シトシン）とによる結合が多く、Ｔｍ値をより高くすることができる。ＧとＣとによる結合は、Ａ（アデニン）とＴ（チミン）とによる結合に比べて、結合力が高く、Ｔｍ値を高くすることができる。
【００６１】
核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする前に、プローブを鋳型核酸にハイブリダイゼーションさせることができる。これにより、核酸増幅反応試薬では、ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼによってプローブを分解させて発光させることができる。
【００６２】
核酸増幅反応試薬では、重なり部１１の塩基数は、１以上１０以下である。そのため、核酸増幅反応試薬では、プローブ２０の重なり部１１にハイブリダイゼーションする部分と、リバースプライマー３２の重なり部１１にアニーリングする部分とが、結合して解離しなくなる可能性を小さくすることができる。
【００６３】
２．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図３は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。
【００６４】
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する（ステップＳ１）。具体的には、核酸増幅反応試薬が収容されている容器に、ピペット等を用いて鋳型核酸溶液を導入し、核酸増幅反応試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する。
【００６５】
鋳型核酸溶液は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００６６】
次に、反応溶液に、核酸を増幅させるための（ＰＣＲのための）熱サイクルを付与する（ステップＳ２）。熱サイクルを付与するにおいて、二本鎖ＤＮＡの解離し、プライマーは、一本鎖ＤＮＡにアニーリングし、プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションする。ここで、図４は、本実施形態に係る反応溶液６に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置１００を模式的に示す断面図である。
【００６７】
熱サイクル装置１００は、図４に示すように、第１ホットプレート４０と、第２ホットプレート４２と、第１ビーカー５０と、第２ビーカー５２と、アーム６０と、固定部６２と、を含む。
【００６８】
第１ホットプレート４０は、第１ビーカー５０に収容されている液体２を第１温度に加熱する。第１温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。液体２の種類は、第１ホットプレート４０により第１温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００６９】
第２ホットプレート４２は、第２ビーカー５２に収容されている液体４を第２温度に加熱する。第２温度は、第１温度よりも低い温度である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。すなわち、本工程では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。つまり、アニーリング反応と伸長反応とを同じ温度で行う。液体４の種類は、第２ホットプレート４２により第２温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００７０】
アーム６０は、一端６０ａが固定部６２によって固定されており、他端６０ｂが自由端となっている。アーム６０の他端６０ｂは、反応溶液６が収容されている容器８を支持している。アーム６０は、図示せぬモーターにより、一端６０ａが固定された状態で、他端６０ｂが円弧状に往復運動する。
【００７１】
アーム６０の往復運動により、反応溶液６は、第１温度に加熱された液体中と、第２温度に加熱された液体４中とに、交互に配置される。これにより、反応溶液６に、ＰＣＲのための熱サイクルを付与することができる。本工程における熱サイクル数は、モーターの駆動および停止により適宜設定することができ、例えば、２０サイクル以上６０サイクル以下である。反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間は、例えば、０．５秒程度である。
【００７２】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりの変性反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体２中に配置されている時間）は、例えば、０．５秒以上５秒以下であり、好ましくは１秒以上３秒以下である。変性反応のための加熱時間を０．５秒以上とすることにより、変性反応の時間が短すぎて変性が十分に行われないことを抑制することができる。変性反応のための加熱時間を５秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００７３】
熱サイクルを付与する工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりのアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体４中に配置されている時間）は、例えば、４秒以下であり、好ましくは１秒以上４秒以下であり、により好ましくは２秒以上４秒以下である。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を４秒以下とすることにより、ＰＣＲの高速化を図ることができる。
【００７４】
次に、反応溶液の蛍光強度を測定する（ステップＳ３）。例えば、熱サイクルを付与した反応溶液を、透光性の容器に移し、該透光性の容器に光を照射して蛍光強度を測定する。これにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００７５】
３．  核酸増幅反応試薬の変形例
次に、本実施形態の変形例に係る核酸増幅試薬について説明する。以下、本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応試薬において、上述した本実施形態に係る核酸増幅反応試薬の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【００７６】
上述した本実施形態に係る核酸増幅反応試薬では、図１に示すように、プローブ２０は、一本鎖ＤＮＡ１０の塩基配列１０ａにハイブリダイゼーションし、リバースプライマー３２は、一本鎖ＤＮＡ１２の塩基配列１２ａにアニーリングし、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合に、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａは、重なり部１１を有していた。
【００７７】
これに対し、本実施形態の変形例に係る核酸増幅反応試薬では、図５に示すように、フォワードプライマー３０は、一本鎖ＤＮＡ１０の塩基配列１０ａにアニーリングし、リバースプライマー３２は、一本鎖ＤＮＡ１２の塩基配列１２ａにアニーリングし、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合に、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａは、重なり部１１を有している。図５に示す例では、塩基配列１０ａは、一本鎖ＤＮＡ１０が含む塩基配列であって、フォワードプライマー３３０がアニーリングする塩基配列である。塩基配列１２ａは、一本鎖ＤＮＡ１２が含む塩基配列であって、リバースプライマー３２がアニーリングする塩基配列である。
【００７８】
第１塩基配列１０ａの重なり部１１にアニーリングするのは、フォワードプライマー３０の３´末端側である。第２塩基配列２０ａの重なり部１１にアニーリングするのは、リバースプライマー３２の３´末端側である。
【００７９】
本実施形態の変形例に係る核酸増幅試薬では、本実施形態に係る核酸増幅試薬で用いたプローブ（蛍光標識プローブ）の代わりに、サイバーグリーンを用いることにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００８０】
本実施形態の変形例に係る核酸増幅試薬では、上述のように、フォワードプライマー３０は、一本鎖ＤＮＡ１０の塩基配列１０ａにアニーリングし、リバースプライマー３２は、一本鎖ＤＮＡ１２の塩基配列１２ａにアニーリングし、一本鎖ＤＮＡ１０と一本鎖ＤＮＡ１２とがアニーリングした場合に、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａは、重なり部１１を有している。そのため、本実施形態の変形例に係る核酸増幅試薬では、塩基配列１０ａおよび塩基配列１２ａが重なり部１１を有さない場合に比べて、プライマー３０，３２のＴｍ値を高くしつつ、核酸の増幅領域を短くすることができる。したがって、本実施形態の変形例に係る核酸増幅試薬では、高速化を図ることができる。
【００８１】
４．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【００８２】
４．１．  反応溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【００８３】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー）                      １．０μＬ
蒸留水                                                      ３．０５μＬ
【００８４】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【００８５】
バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。
【００８６】
本実験では、Ｔｍ値が異なるプライマーを用いた。具体的には、Ｔｍ値が約６０℃（Ｔｍ６０）および約７５℃（Ｔｍ７５）のプライマーを用いた。Ｔｍ値が約６０℃および約７５℃プライマーのＴｍ値および配列、並びに、蛍光標識プローブの配列は、下記表１のとおりである。
【００８７】
【表１】
2018014930.tif 000004
【００８８】
なお、表１に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。
【００８９】
また、Ｔｍ７５のリバースプライマーの３´末端の配列「ＧＧ」と、蛍光標識プローブの３´末端の配列「ＣＣ」は、上述した重なり部１１に相当する。
【００９０】
４．２．  実験結果
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った（図４参照）。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光輝度を測定した。
【００９１】
各プライマー（Ｔｍ６０およびＴｍ７５）を用いたＰＣＲにおいて、変性反応のための加熱温度（高温温度）は、８７℃とした。Ｔｍ６０およびＴｍ７５を用いたＰＣＲにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱温度（低温温度）は、それぞれ、６０℃、６６℃とした。ＰＣＲにおける、１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表２に示す。反応時間は、高温時間および低温時間にサイクル数４０を掛け、さらに、反応溶液の移動時間を足したものである。
【００９２】
【表２】
2018014930.tif 000005
【００９３】
図６は、ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフである。図６に示すように、低温時間が６秒の場合は、Ｔｍ６０およびＴｍ７５で増幅が確認されたが、低温時間が４秒以下の場合は、Ｔｍ６０では核酸の増幅が確認されず、Ｔｍ７５で増幅が確認された。したがって、プライマーのＴｍ値を、６５℃以上であって８０℃未満とし、上述した重なり部１１に相当する部分を有すると、低温時間が４秒以下という高速ＰＣＲでも、核酸を増幅できることがわかった。
【００９４】
なお、図６では、明らかに核酸が増幅されていない状態（例えば１サイクル終了後）の蛍光輝度を、４０サイクル終了後の蛍光輝度から引いた値をプロットしている。蛍光輝度がマイナスを示しているプロットは、測定誤差であると考えられる。
【００９５】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００９６】
２，４…液体、６…反応溶液、８…容器、１０…一本鎖ＤＮＡ、１０ａ…第１塩基配列、１１…重なり部、１２…一本鎖ＤＮＡ、１２ａ…第１塩基配列、２０…プローブ、３０…フォワードプライマー、３２…リバースプライマー、４０…第１ホットプレート、４２…第２ホットプレート、５０…第１ビーカー、５２…第２ビーカー、６０…アーム、６０ａ…一端、６０ｂ…他端、６２…固定部、１００…熱サイクル装置
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
【図１】
2018014930.tif 000006
【図２】
2018014930.tif 000007
【図３】
2018014930.tif 000008
【図４】
2018014930.tif 000009
【図５】
2018014930.tif 000010
【図６】
2018014930.tif 000011
【配列表】
2018014930000001.app