(57)【要約】【課題】サイトカイン組成物の提供。【解決手段】ＩＬ‐４サイトカインレセプターについての増加した選択性を有している増強された生物活性を有するＩＬ‐４サイトカイン組成物、およびそれらの使用の方法が、本明細書に開示される。これらの組成物は、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）変異タンパク質を包含する。開示される方法は、新生物疾患、自己免疫疾患、伝染病を治療するために、または造血細胞群を増大させるために、ＩＬ‐４を投与することを包含する。【選択図】図１
2018161143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドにより認識されるリガンドに対して、標的細胞における細胞応答を選択的に操作するための方法であって、変異タンパク質リガンドを提供することを含み、前記変異タンパク質リガンドが、前記リガンドよりも高い親和性で前記２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドの１つと結合することにより、前記細胞応答を選択的に操作する方法。
【請求項２】
前記変異タンパク質リガンドが、前記リガンドよりも高い親和性で前記２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドのうちの２つと結合することにより、前記細胞応答を選択的に操作する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記変異タンパク質リガンドが、前記リガンドよりも高い親和性で前記２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドのうちの１つと結合し、前記リガンドよりも低い親和性で前記２つまたはそれ以上のうちの共有レセプターポリペプチドの別の１つと結合することにより、前記細胞応答を選択的に操作する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドが、前記標的細胞の表面に等しく存在しない、請求項１の方法。
【請求項５】
前記変異タンパク質リガンドにより結合される前記共有レセプターが、前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターよりも、前記標的細胞の表面に、より低いレベルで存在する、請求項４の方法。
【請求項６】
前記変異タンパク質リガンドにより結合される前記共有レセプターが、前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターよりも、前記標的細胞の表面に、より高いレベルで存在する、請求項４の方法。
【請求項７】
前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターが、前記変異タンパク質リガンドへの低減された到達性を有する、請求項１の方法。
【請求項８】
前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターへの到達性が、前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターの前記到達性に干渉する反応剤を提供することにより低減される、請求項７の方法。
【請求項９】
前記反応剤は、前記変異タンパク質リガンドにより結合されていない前記共有レセプターを認識する抗体である、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記変異タンパク質は、ＩＬ‐４変異タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記共有レセプターは、共通γ鎖（γｃ）、またはインターロイキン‐１３レセプターアルファ１（ＩＬ‐１３Ｒα１）である、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記より高い親和性は少なくとも１０倍である、上記請求項のいずれかの方法。
【請求項１３】
前記より低い親和性は少なくとも５倍である、請求項３の方法。
【請求項１４】
前記リガンドは、増殖因子またはサイトカインである、上記請求項のいずれかの方法。
【請求項１５】
サイトカイン変異タンパク質を含み、前記サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、共有サイトカインレセプターに結合する、より高い親和性をもたらす、組成物。
【請求項１６】
前記サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、第１の共有サイトカインレセプターに結合するより高い親和性、および野生型サイトカインと比較して、第２の共有サイトカインレセプターへの低減された親和性をもたらす請求項１５の組成物。
【請求項１７】
前記第１の共有サイトカインレセプターは、前記第２の共有サイトカインレセプターよりも低いレベルで発現される、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
前記第１の共有サイトカインレセプターは、前記第２の共有サイトカインレセプターよりも高いレベルで発現される、請求項１６の組成物。
【請求項１９】
前記サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、第１および第２の共有サイトカインレセプターに結合するより高い親和性をもたらす、請求項１５の組成物。
【請求項２０】
前記親和性における増加は少なくとも１０倍である、請求項１５から１９の組成物。
【請求項２１】
前記親和性における低減は少なくとも５倍である、請求項１６の組成物。
【請求項２２】
前記共有サイトカインレセプターは、共通γ鎖（γｃ）またはインターロイキン‐１３レセプターアルファ１（ＩＬ‐１３Ｒα１）である、請求項１５の組成物。
【請求項２３】
前記第１の共有サイトカインレセプターはγｃであり、前記第２の共有サイトカインレセプターはＩＬ‐１３Ｒα１である、請求項１６の組成物。
【請求項２４】
前記第１の共有サイトカインレセプターはＩＬ‐１３Ｒα１であり、前記第２の共有サイトカインレセプターはγｃである、請求項１６の組成物。
【請求項２５】
前記第１および第２の共有サイトカインレセプターはγｃおよびＩＬ‐１３Ｒα１である、請求項１６の組成物。
【請求項２６】
前記変異タンパク質はＩＬ‐４変異タンパク質である、請求項１５の組成物。
【請求項２７】
位置１１７、１１８、１２１、１２２、１２４、１２５、１２８、および／または１２９で、前記ＩＬ‐４変異タンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸の番号付けは野生型ヒトＩＬ‐４に従っている、請求項２６の組成物。
【請求項２８】
前記ＩＬ‐４変異タンパク質は、１つまたはそれ以上の、以下のアミノ酸置換：１１７Ｒ、１１８Ｖ、１２１Ｑ、１２２Ｓ、１２４Ｗ、１２４Ｆ、１２５Ｆ、１２５Ｒ、１２８Ｇ、および／または１２９Ａを含み、前記アミノ酸の番号付けは野生型ヒトＩＬ‐４に従っている、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
対象に、請求項１５の前記組成物を投与することを含み、これにより、それを必要とする前記対象を治療する、それを必要とする対象を治療する方法。
【請求項３０】
前記対象が炎症性疾患に罹っている、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月２１日に出願された米国仮出願第６１／８２５，９８０号、２０１２年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／７２５，７９１号、および２０１２年８月９日に出願された米国仮出願第６１／６８１，４９０号に対して優先権を主張し、これらのそれぞれの開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、多数の細胞により分泌され、細胞間情報伝達において広範囲にわたって使用されるシグナル伝達分子の一種である、細胞シグナル伝達小分子である。サイトカインは、分化、増殖、およびアポトーシス／抗アポトーシスを含む、鍵となる細胞機能を調節する。
【０００３】
多くのサイトカインは、通常「α」で示される、比較的高い親和性のサイトカインレセプター鎖とまず相互作用することと、その後に続く、異なるサイトカインの間で共有されるレセプター鎖、すなわち共有レセプター鎖との比較的低い親和性の相互作用により、刺激を媒介する。第１の高い親和性のレセプターに対するサイトカインの結合は、共有レセプター鎖がその後に結合し得る、複合表面を作成する。
【０００４】
インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）は、そのようなサイトカインを典型的に表す。ＩＬ‐４の主要な結合鎖は、ＩＬ‐４レセプターα（ＩＬ‐４Ｒα）である。ＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα複合体は、ＩＬ‐４レセプターの第二の構成要素であるγｃに対するリガンドとしての役目を果たす。さらに、ＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα複合体は、インターロイキン‐１３（ＩＬ‐１３）レセプターα１（ＩＬ‐１３Ｒα１）に対するリガンドとしての役目を果たす。ＩＬ‐４とは異なり、ＩＬ‐１３は、ＩＬ‐４Ｒαに結合しないが、ＩＬ‐１３／ＩＬ‐１３Ｒα１複合体結合は、ＩＬ‐４Ｒαに結合する。
【０００５】
ＩＬ‐４およびＩＬ‐１３は、別個のレセプターによりシグナル伝達し得るので、それらが異なるシグナル伝達経路を活性化することができることが推論され得る。実際に、ＩＬ‐１３Ｒα１がＴｙｋ２およびＪＡＫ２を活性化するのに対して、γｃはチロシンキナーゼヤヌスキナーゼ３（ＪＡＫ３）を活性化する。活性化されたＪＡＫは、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含むタンパク質についてのドッキング部位としての役目を果たす、保護されたチロシン残基で、ＩＬ‐４Ｒの細胞質尾部のリン酸化を媒介する。３つの接近して集合するチロシン残基は、ＩＬ‐４Ｒα鎖に選択的に結合される転写因子であるトランスクリプションシグナル伝達物質および活性化因子６（ＳＴＡＴ６）に対するドッキング部位としての役目を果たす。ＩＬ‐１３Ｒα１へのＩＬ‐１３の結合は、また、ＩＬ‐１３／ＩＬ‐１３Ｒα１複合体によるＩＬ‐４Ｒαの結合によりＳＴＡＴ６を活性化する。
【０００６】
ＳＴＡＴ６に加えて、ＩＬ‐４は、ＩＲＳ‐２を動員し、活性化する。構造関数解析が、ＩＬ‐４ＲαがＩＬ‐４により活性化された後に、ＩＬ‐４Ｒαの膜貫通ドメインでチロシン残基［Ｔｙｒ４９７、インスリン／ＩＬ‐４Ｒモチーフ（Ｉ４Ｒ）の一部］がＩＬ‐４ＲαへのＩＲＳ‐２のドッキングのために必要であることを明らかにした。ＪＡＫ１およびＪＡＫ３は、その後、ＩＬ‐４Ｒα結合ＩＲＳ‐２をリン酸化する。ＩＲＳ‐２の活性化は、多くの細胞型における増殖および生存シグナルを媒介すると考えられている経路である、ホスホイノシチド３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）および下流のタンパク質セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔの活性化を導く。実際に、この経路は、Ｉ型のＩＬ‐４Ｒを発現している細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞）でのＩＬ‐４媒介の増殖において重要である。
【０００７】
ＩＬ‐４Ｒαは、広範に存在するが、ＩＬ‐１３Ｒα１ではないγＣは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、マスト細胞、およびほとんどのマウスＢ細胞（ほとんどのヒトＢ細胞がγＣおよびＩＬ‐１３Ｒα１の両方を発現する）でみられる。その結果、ＩＬ‐１３ではなくＩＬ‐４が、ナイーブなＴ細胞のＴＨ２細胞への分化を促進し、ＩＬ‐４は、マウスＩｇＥ応答の誘導のためにＩＬ‐１３よりもはるかに重要であると思われる。
【０００８】
マクロファージおよび樹状細胞を含むいくつかの骨髄由来細胞は、γＣおよびＩＬ‐１３Ｒα１の両方を発現し、その結果、ＩＬ‐４およびＩＬ‐１３の両方に応答する。これらの細胞の異なる副集団での、これらの２つのレセプターサブユニットの相対的存在量における差異が、ＩＬ‐４対ＩＬ‐１３へのそれらの相対的応答性について、部分的に、説明し得る。平滑筋および上皮細胞を含む、ほとんどの非骨髄由来細胞では、ＩＬ‐１３Ｒα１が見出されるが、γＣサブユニットがほとんどまたは全くなく、その結果、ＩＬ‐４は、これらの細胞を刺激することにおいて、ＩＬ‐１３を上回る本来の利点を有しない。
【０００９】
１９９０年代前半には、癌を治療するために、ＩＬ‐４を利用する臨床試験が行われた。ＩＬ‐４が、インビトロで白血病リンパ芽球における増殖停止およびアポトーシス誘導することが観察された。これらの観察は、免疫不全のマウスに移植されたヒト白血病細胞による実験で確認された。残念ながら、ＩＬ‐４の臨床有用性は、腎臓、肝臓、神経性、および胃腸の毒性、並びに、非造血細胞に対するＩＬ‐４の結合に関連する、血管漏出症候群（vascular leak syndrome）を含む、サイトカインの多面発現性の活性により制限される。よって、治療法としての「野生型」ＩＬ‐４の使用は、望ましくない応答を引き起こす細胞型に結合するその能力により制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
その結果、１つのレセプターについて、別のものと比較して選択的に増加された分子に対する、当該分野での必要性が存在し、例としてＩＬ‐４を用いれば、ＩＬ‐１３Ｒα１と比較してγｃについて増加された選択性が有利となり得、または逆の場合も同じである。
【００１１】
さらに、野生型サイトカインの使用と関連するいくつかの毒性は、高用量の投与に起因し得る。よって、低投与量で所望の共有レセプターの活性化を達成し得る分子もまた有利であろう。
【００１２】
従って、本発明は、当該分野におけるこれらのおよび他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
多くのサイトカインが、可能性のある臨床応用のために、薬学的部門において開発されている。これらの事例の大多数では、用量制限の毒性または不十分な効能と関連することが多い、内因性の野生型サイトカインが試みられている。
【００１４】
サイトカインを向上させるための１つの可能性は、ある所望の細胞型での好ましい活性についてそれらにバイアスをかけることである。ヘテロ二量体のレセプター複合体を通じて作用するサイトカインは、このアプローチに対して特に適している。タンパク質操作が、共有レセプターについての相対的な親和性を変更した新規なサイトカイン変異タンパク質を提供するために利用され得る。
【００１５】
従って、いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドにより認識されるリガンドに対して標的細胞における細胞応答を選択的に操作するための方法が提供される。当該方法は、変異タンパク質リガンドを提供することを包含し、変異タンパク質リガンドは、リガンドよりも高い親和性で２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドの１つと結合する。他の実施形態では、変異タンパク質リガンドは、リガンドよりも高い親和性で２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドのうちの２つと結合することにより、細胞応答を選択的に操作する。さらに他の実施形態において、変異タンパク質リガンドは、リガンドよりも高い親和性で２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドのうちの１つと結合し、リガンドよりも低い親和性で２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドのうちの別の１つと結合することにより、細胞応答を選択的に操作する。他の実施形態では、２つまたはそれ以上の共有レセプターポリペプチドは、標的細胞の表面に等しく存在しない。他の実施形態では、変異タンパク質リガンドにより結合される共有レセプターが、変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターよりも、標的細胞の表面に、より低いレベルで存在する。他の実施形態では、変異タンパク質リガンドにより結合される共有レセプターが、変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターよりも、標的細胞の表面に、より高いレベルで存在する。変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターが、変異タンパク質リガンドへの低減された到達性を有する、請求項１の方法。他の実施形態では、変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターへの到達性が、変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターの到達性に干渉する反応剤を提供することにより低減される。他の実施形態では、反応剤は、変異タンパク質リガンドにより結合されていない共有レセプターを認識する抗体である。他の実施形態では、変異タンパク質は、ＩＬ‐４変異タンパク質である。他の実施形態では、共有レセプターは、共通γ鎖（γｃ）、またはインターロイキン１３レセプターアルファ１（ＩＬ‐１３Ｒα１）である。他の実施形態では、より高い親和性は少なくとも１０倍である。他の実施形態では、より低い親和性は少なくとも５倍である。他の実施形態では、リガンドは、増殖因子またはサイトカインである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、サイトカイン変異タンパク質を包含する組成物が提供され、サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、共有サイトカインレセプターに結合するより高い親和性をもたらす。いくつかの実施形態では、サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、第１の共有サイトカインレセプターとの結合親和性における相対的な増加、および第２の共有サイトカインレセプターへの低減された結合親和性をもたらす。他の実施形態では、サイトカイン変異タンパク質は、野生型サイトカインと比較して、２つの共有サイトカインレセプターへの結合親和性における相対的な増加をもたらす。いくつかの実施形態では、第１の共有サイトカインレセプターは、第２の共有サイトカインレセプターよりも低いレベルで発現され、いくつかの実施形態では、第１の共有サイトカインレセプターは、第２の共有サイトカインレセプターよりも高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、サイトカイン変異タンパク質が、野生型サイトカインと比較して、第１および第２の共有サイトカインレセプターに結合するより高い親和性をもたらす。いくつかの実施形態では、親和性における増加は少なくとも１０倍である。いくつかの実施形態では、親和性における低減は少なくとも５倍である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、共有サイトカインレセプターは、共通γ鎖（γｃ）である。他の実施形態では、共有サイトカインレセプターは、ＩＬ‐１３レセプターα１である。いくつかの実施形態では、第１の共有サイトカインレセプターはγｃであり、第２の共有サイトカインレセプターはＩＬ‐１３Ｒα１である。いくつかの実施形態では、第１の共有サイトカインレセプターはＩＬ‐１３Ｒα１であり、第２の共有サイトカインレセプターはγｃである。いくつかの実施形態では、第１および第２の共有サイトカインレセプターはγｃおよびＩＬ‐１３Ｒα１である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、サイトカイン変異タンパク質はＩＬ‐４変異タンパク質である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、変化したシグナル伝達特性を有するＩＬ‐４変異タンパク質が提供され、ＳＴＡＴリン酸化は、同じ濃度のＩＬ‐４と接触させたラモス細胞と比較して、ＩＬ‐４変異タンパク質と接触させたラモス細胞（Ramos cell）においてより高く、これにより、変化したシグナル伝達特性を有するＩＬ‐４変異タンパク質を示す。いくつかの実施形態では、変化したシグナル伝達特性を有するＩＬ‐４変異タンパク質が提供され、ＳＴＡＴリン酸化は、同じ濃度のＩＬ‐４と接触させたＡ５４９細胞と比較して、ＩＬ‐４変異タンパク質と接触させたＡ５４９細胞においてより高く、これにより、変化したシグナル伝達特性を有するＩＬ‐４変異タンパク質を示す。
【００２０】
いくつかの実施形態では、位置１１７、１１８、１２１、１２２、１２４、１２５、１２８、および１２９で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸置換を包含するＩＬ‐４変異タンパク質が提供され、アミノ酸の番号付けは野生型ヒトＩＬ‐４（配列番号１）に従う。いくつかの実施形態では、置換は、ＩＬ‐４の位置１２１でなされる。いくつかの実施形態では、置換は、ＩＬ‐４の位置１２１および１２４でなされる。他の実施形態では、置換は、位置１２１、１２４、および１２５でなされる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、置換は、ＩＬ‐４の位置１１７、１１８、１２１、１２２、１２４、１２５、１２８、および１２９でなされる。他の実施形態では、開示されたＩＬ‐４変異タンパク質は、配列１１７Ｒ、１１８Ｖ、１２１Ｑ、１２２Ｓ、１２４Ｗ、１２５Ｆ、１２８Ｇ、および１２９Ａを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、サイトカイン変異タンパク質を包含する薬学的組成物が提供され、変異タンパク質の投与は、野生型変異タンパク質と比較して、低減された副作用をもたらす。いくつかの実施形態では、副作用は血管漏出症候群である。他の実施形態では、サイトカイン変異タンパク質を包含する薬学的組成物が提供され、同じ治療法の効能が、野生型変異タンパク質と比較して、より少ないサイトカイン変異タンパク質で達成される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、あらゆる１つまたはそれ以上の記載されたサイトカイン変異タンパク質を包含すること薬学的組成物が提供される。他の実施形態では、対象を治療する方法が提供され、方法は、あらゆる１つまたはそれ以上の記載されたサイトカイン変異タンパク質の組成物を包含する。いくつかの実施形態では、対象は、炎症性疾患を罹っている。
【００２４】
さらなる特徴および利点が、以下の詳細な説明および請求の範囲において、ここにより具体的に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＩＬ−４スーパーカインの構造ベースの操作を示す。（ａ）ＩＬ−４およびＩＬ−１３のＩ型およびＩＩ型外部ドメイン三元複合体６の結晶構造である。（ｂ）および（ｃ）ＩＬ−４およびＩＬ−１３のＤ−へリックス上にある、それぞれの主要なγｃおよびＩＬ−１３Ｒα１結合部位である。（ｂ）では、ＩＬ−４部位２ライブラリーにおけるランダム化された位置が示され、（ｃ）では、レセプター複合体のＩＬ−４およびＩＬ−１３の構造上の重なりは、ＩＬ−４の位置１２１、１２４および１２５がＩＬ−１３の類似した位置上で密接に重なり合うことを示し、これらの位置をＩＬ−１３のものと置換することにつながった。（ｃ）では、ＩＬ−１３は紫色、ＩＬ−４は薄緑色、置換される残基は赤色である。（ｄ）酵母ディスプレイのＩＬ−４上のＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα／γｃ外部ドメイン三元複合体の協同的集合。（ｅ）パネル（ｂ）で示されるＩＬ−４部位２ライブラリーの、γｃ四量体上の選択による段階的濃縮。ライブラリーは、第１の選択ステップでＩＬ−４Ｒαと複合し、それに続くラウンドにはＩＬ−４Ｒαは含まれなかった。最後の６回目の選択のラウンドは、１μｍのγｃ単量体上だった（示されていない）。
【図２】Ｃ末端ビオチン標識を介した、表面に固定されたγｃに結合するＩＬ−４およびシンセカイン（ｓｙｎｔｈｅｋｉｎｅ）の表面プラズモン共鳴分析を示す。
【図３】γｃに対するＩＬ−４親和性増強のための構造基盤を示す。（ａ）３．２５Åにおけるスーパー４／γｃ二元複合体の結晶構造である。（ｂ）スーパー４／γｃ二元複合体のＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒa／γｃ三元複合体との構造上の重なりである。スーパー４のγｃとのドッキング形態はＩＬ−４のものと本質的に同一である。（ｄ）野生型（左）およびγｃとのスーパー４（右）複合体における部位２の界面を単離した図である。図は、サイトカインのＡおよびＤへリックスをリボンで表したものであり、γｃの半透明な分子表面上に突入する、γｃと相互作用する側鎖が示されている。表面下のγｃの相互作用残基は、表面上で濃い色の輪郭として見られる。γｃ上でそれぞれのサイトカインに接触される領域は、表面で黄色で表され、エネルギー的に重要なγｃのＹ１０３が赤色で示される。破線の楕円は、パネル（ｄ）で側部から示される界面の領域を囲む。（ｄ）では、スーパー４におけるS１２５ＦおよびＹ１２４Ｗ置換に起因する、スーパー４（右）対ＩＬ−４（左）における界面のパッキングおよび形状相補性の改善のクローズアップが示される。半透明分子表面が、サイトカインおよびレセプターに関して示される。
【図４】スーパー４へリックスＤの電子密度を表す。
【図５】スーパー４／γｃ界面での再構築した水素結合相互作用を表す。
【図６】細胞系統でのＩＬ−４レセプター成分の発現を示す。（ａ）一晩飢餓状態にした細胞上で、ＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１のｍＲＮＡの発現を、材料および方法で説明される通り、定量ＰＣＲで測定した。結果は、３つの独立した実験からの平均値および標準誤差を表す。（ｂ）指示された細胞系統の細胞表面上の、ＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１の発現をフローサイトメトリーで決定した。特定の抗体で測定したＭＦＩを、同一アイソタイプの対照抗体に対して正規化した。
【図７】細胞内シグナル伝達に対するＩＬ−４スーパーカインの効果を示す。（ａ）一晩飢餓状態にしたラモス細胞を、指示した時間の間、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４、スーパー４、またはＫＦＲで、刺激しなかった、または、刺激した。細胞を次いで固定化、透過処理し、リン酸化ＳＴＡＴ６に対する抗体で染色した。３つの独立した実験を実施し、平均値および標準誤差が示される。（ｂ）ラモス細胞を１５分間、量を増やしながらＩＬ−４またはスーパー４で刺激し、分析を次いで図７（ａ）の通り実施した。実験を３回繰り返した；平均値および標準誤差が示される。（ｃ）ラモス細胞を一晩飢餓状態にし、次いで、量を増やしながらＩＬ−４または指示されるスーパーカインで１５分間刺激した。３つの独立した実験の平均値および±標準誤差が示される。（ｄ）Ａ５４９細胞を一晩飢餓状態にし、指示された濃度のＩＬ−４またはスーパーカインで１５分間刺激した。７（ａ）の通りに細胞を固定化し、調製した；３つの独立した実験を実施し、平均値および標準誤差が示される。（ｅ）Ｕ９３７細胞を一晩飢餓状態にし、次いでＩＬ−４またはスーパーカインで１５分間刺激した；ｐＳＴＡＴ６を７（ａ）の通りに測定した。実験を３回繰り返した；平均値および標準誤差が示される。（ｆ）ラモス細胞を指示されるＩＬ−４またはスーパー４のいずれかで８時間刺激し、次いで、ＣＤ２３の表面染色を行った。実験を３回繰り返し；ＣＤ２３の上方制御の平均値および標準誤差が示される。
【図８】１つの実験からの、ＩＬ−４およびスーパーカインに応答したＳＴＡＴ６リン酸化染色を示す。
【図９】第２の鎖動員の増強および異なる数の第２の鎖に応答するレセプター集合のモデリングを表す。Ｍａｔｌａｂスクリプトを用いて、Ｉ型ＩＬ−４レセプターのみを発現する細胞表面上のＩＬ−４レセプターの集合を計算した。（ａ）上部３つのパネルでは、ＩＬ−４Ｒαの数を１５００に設定した。第２の鎖の数を５００から４５００に増やし、第２の鎖のＩＬ−４Ｒα複合体の２次元平衡定数は、指示されるように０．０１μｍ２から１μｍ２の範囲にわたった。最も高い第２の鎖Ｋ値（１．０μｍ２）対最も低い第２の鎖Ｋ値（０．０１μｍ２）の構築した鎖の比を、細胞１個あたり、５００、１５００および４５００のγｃ分子において１００および１０００ｐｇ／ｍｌに関して計算した。（ｂ）真ん中の３つのパネルでは、ＩＬ−４Ｒαの数を１５００に設定した。細胞１個あたり、２Ｄの平衡定数は１μｍ２から０．０１μｍ２に変化し、および、第２の鎖の数は１６７から４５００に変化した。１．０μｍ２、０．１μｍ２または０．０１μｍ２の２Ｄの平衡定数における、１００および１０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４または変異タンパク質での、細胞１個あたり１６７のγｃ鎖と集合した複合体が示される。下部のパネルでは、集合した複合体の数が、ＩＬ−４またはスーパー４の濃度に対してプロットされており、１０，０００から３０，０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＩＬ−４に関して集合したレセプターの最大数に線が引かれている。
【図１０】ＩＬ−４またはスーパーカインに誘導されたＳＴＡＴ６活性化に対する、γｃ有用性を変えることの効果を示す。（ａ）ＨＨ細胞を示した濃度のＩＬ−４または変異タンパク質で刺激し、図７の通りに、細胞内染色および分析を実施した。同一の結果を伴う２つの独立した実験の、代表的な実験が示される。（ｂ）飢餓状態のラモス細胞を、未処理のまま放置するか、または、５または５０μｇ／ｍｌの抗γｃ阻止抗体で１時間インキュベートするかのいずれかを行った。細胞を次いで、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４または示したスーパーカインで刺激した。次いで、図７ａの通りに分析を実施した。３つの独立した実験を実施し、平均値および標準誤差が示される。（ｃ）飢餓状態にしたＵ９３７細胞を、１０ｂのラモス細胞のように処理および分析した。
【図１１】ヒトの初代細胞上のスーパーカインの挙動を示す。（ａ）指示された濃度のＩＬ−４、スーパー４またはＫＦＲで１５分間刺激したＰＢＬまたは刺激しないままにしたＰＢＬである。ｐＳＴＡＴ６の誘導は、図７の通りに計算された；５人のドナーからのデータの平均値および標準誤差が示される。（Ｌ＝リンパ球、Ｍ＝単球、Ｎｅ＝好中球）（ｂ）１人のドナーのヒトＰＢＬ上のＩＬ−４レセプター鎖の発現を、図６ｂの通り測定した。ＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１の発現の測定に関しては、Ｂ細胞およびＴ細胞を細胞表面マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ３）でゲート化し、一方で、単球および好中球をＣＤ１９およびＣＤ３陰性細胞として識別し、これは、これらの特有の前方および後方散乱に基づいた。適切なアイソタイプ対照を陰性対照として用いた。（ｃ）６人のドナー由来のＰＢＬ上のＩＬ−４Ｒレセプター鎖発現を図１１ｂの通りに測定した；平均値および標準誤差が表される（Ｔ＝Ｔ細胞、Ｂ＝Ｂ細胞、Ｍ＝単球、Ｎｅ＝好中球）。（ｄ）ヒトＰＢＬ上のＩＬ−４のＩ型およびＩＩ型レセプター鎖の発現である。ＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１の発現の測定のために、ＢおよびＴ細胞を細胞表面マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８）でゲート化し、一方で、単球をＣＤ１４＋細胞として識別した。適切なアイソタイプ対照を陰性対照として用い、平均値および標準偏差が示される。（ｈ）ＩＬ−４およびスーパーカインのＳ字状の用量応答曲線（図１９）をもとに得た、正規化ｐＳＴＡＴ６  ＥＣ５０値である。ＩＬ−４野生型由来のｐＳＴＡＴ６  ＥＣ５０値を１に正規化し、スーパー４およびＫＦＲのＥＣ５０値をそれに従って計算した。対応のあるｔ検定を用いて有意な変化を決定した。
【図１２】リン酸化をスーパー４が、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞における、ＩＬ−４およびＫＦＲよりも強力なＳＴＡＴ６の誘導したことを示す。ＩＬ−４およびスーパーカインのＳ字状の用量応答曲線をもとに得た、正規化Ｐ−ＳＴＡＴ６  ＥＣ５０値である。ＩＬ−４野生型由来のＰ−ＳＴＡＴ６  ＥＣ５０値を１に正規化し、スーパー４およびＫＦＲのＥＣ５０値をそれに従って計算した（Ｌ＝リンパ球、Ｍ＝単球、Ｎｅ＝好中球）。
【図１３】図１３は、ＩＬ−４およびスーパーカインが示す機能活性を表す。（ａ）ヒト未処理ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２５−Ｔ細胞を、ＴＧＦおよび示された濃度のＩＬ−４、スーパー４またはＫＦＲの存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズと共に培養した。４日後、ブレフェルジンＡの存在下で、さらに４時間、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで再度刺激した。続いて細胞のＩＬ−９およびＦｏｘｐ３の細胞内発現を分析した。データ（平均値および標準誤差）は、４人を超えるドナーでの３つの独立した実験からである。（ｂ）健康な血液ドナーから取得した末梢血液単核細胞から、ＣＤ１４＋単球を単離（９７％超の純度）し、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦのみと共に培養、または、示された濃度のＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４と共に培養した。
【図１４】樹状細胞成熟がＩＩ型ＩＬ−４レセプター複合体の活性化に依存するということをスーパーカインが表すことを示す。ＣＤ１４、ＣＤ８６およびＣＤ２０９表面マーカー発現を用いて、スーパーカインのＤＣ成熟に対する影響を示した。この実験のために、ＣＤ１４＋単球を単離し（９７％超純度）、示された抗体の存在下で５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび２μｇ／ｍｌのＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４と共に培養した。細胞を６日目に処理し、続いてＤＡＰＩ、蛍光標識化アイソタイプ制御ｍ抗体、またはｍ抗体で、ＣＤ１４、ＣＤ８６およびＣＤ２０９に対して染色した。データ（平均値および標準誤差）は３人のドナーからである。
【図１５】単球中のＩＬ−４および２つのスーパーカインのシグナル伝達および内部移行動態を示す。末梢血液単核細胞からＣＤ１４＋単球を単離し（９７％超純度）、示される時間の間、３０ｐＭのＩＬ−４、スーパー４またはＫＦＲで刺激した。細胞を次いで回収し、レセプターの下方制御実験のために、４℃で維持してＩＬ−１３Ｒα１およびγｃレセプター鎖に特異的である抗体で染色するか、シグナル伝達動態実験のために、４％のＰＦＡで固定、１００％メタノールで透過処理、およびリン酸化型特異的抗体でＳＴＡＴ６およびＩＲＳ１に対して染色するかのいずれかを行った。双方の場合で、細胞をフローサイトメトリーで分析した。データ（平均値および標準誤差）は４人の健康なドナーからである。
【図１６】単球のＩＬ−４および２つのスーパーカインに誘導される遺伝子発現プロファイルを示す。５人の健康なドナー由来の高度に精製された単球を、ＧＭ−ＣＳＦ単独で、または、ＩＬ−４もしくは２つのスーパーカインと組み合わせて６時間刺激し、それらのＲＮＡを抽出し、２色アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）マイクロアレイ（６０，０００個の特徴）によって分析した。（ａ）３つのサイトカインによる遺伝子誘導を比較した散布図の相関関係が示される。（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ対照条件と比較した場合、３つのサイトカインによって遺伝子が顕著に下方／上方制御されるベン図が示される。（ｃ）ＩＬ−４／スーパー４対ＫＦＲ、ＩＬ−４／ＫＦＲ対スーパー４またはＩＬ−４対スーパー４／ＫＦＲによって顕著に制御される、遺伝子の選択された一覧（表４）を示すヒートマップである（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。青色はより高い発現を意味し、青色はより低い発現を示す。
【図１７】未熟およびＬＰＳで成熟したＤＣの、ＩＬ−４および２つのスーパーカインに誘導されるサイトカイン分泌の別個のパターンを示す。３人の健康なドナー由来の精製単球を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）単独で、または、ＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４（２０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて７日間培養し、次いで、さらに２４時間ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）で刺激した（またはしなかった）。相対量の５１のサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子に関して、培養の上澄みをＬｕｍｉｎｅｘで評価した（ヒートマップによって列挙される）。ヒートマップの右のパネルは、その分泌が変化しなかったか（ｎ＝１９）、ＬＰＳ刺激によってのみ増加したか（ｎ＝２０）、または、ＬＰＳの存在下または不在下でスーパーカインによって調節されたか（ｎ＝１２）のいずれかであった生成物の代表例である。データは、３人の健康なドナーからの平均値およびＳＤを示す（ＧＭ−ＣＳＦ単独群に基準化される）。対応のあるｔ検定を用いて有意な変化を決定した、＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】抗γｃ（０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）の存在下でＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲに応答したラモスおよびＵ９３７細胞におけるＳＴＡＴ６のリン酸化を示す。抗γｃの不在下での応答を１００％に正規化し、抗γｃの存在下での応答を正規化した値に関して表す。データ（平均値±標準誤差）は３つの独立した実験からである。
【図１９】ＩＬ−４および２つのスーパーカインに誘導されるＳＴＡＴ６リン酸化を示す。細胞を示される用量のＩＬ−４および２つのスーパーカインで刺激し、ＳＴＡＴ６リン酸化の量を、蛍光で標識したリン酸−ＳＴＡＴ６特異的抗体およびフローサイトメトリーを用いて、（ａ）ＣＤ４  Ｔ細胞、（ｂ）ＣＤ８  Ｔ細胞、（ｃ）単球、（ｄ）Ｂ細胞および（ｅ）ＨＨ細胞で検出した。平均値および標準誤差を３つの異なる実験から取得した。
【図２０】単球のＩＬ−４および２つのスーパーカインに誘導される、レセプターの下方制御およびＳＴＡＴ６およびＩＲＳ１リン酸化動態を示す。示される時間の間、５０ｎＭのＩＬ−４または２つのスーパーカインで単球を刺激し、細胞を、（ａ〜ｂ）固定化および１００％メタノールで３０分間透過処理し、リン酸−ＳＴＡＴ６およびリン酸−ＩＲＳ１抗体で染色するか；または、（ｃ〜ｄ）抗ＩＬ−１３Ｒα１またはγｃ特異的抗体で染色し、４℃にて３０分、レセプターの内部移行を阻止するために、４％ＰＦＡで固定し、フローサイトメトリーで分析した。データ（平均値および標準誤差）は４人の健康なドナーからである。
【図２１】ＩＬ−４、ＫＲＦおよびスーパー４によるサイトカイン分泌の差次的な誘導を示す。５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと共に、ＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４（２０ｎｇ／ｍｌ）有りまたは無しで、単球を７日間培養し、次いで、ＬＰＳ（２ｍｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、データは、３人の健康なドナーからの平均値±標準偏差を表す（刺激しなかったＧＭ−ＣＳＦ単独群に対して正規化）。＊ｐ＜０．０５（対応のあるｔ検定）。
【図２２】ＩＬ−４スーパーカインによって示される樹状細胞分化能を示す。ＣＤ１４＋単球を単離し（９７％超純度）、続いで５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦのみと共に培養、または、指された濃度のＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４と共に培養した。６〜７日目で細胞を処理し、蛍光標識化したＣＤ８６、ＣＤ２０９に対する抗体で染色した。樹状細胞分化を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで、フローサイトメトリーでによって評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター社（Ｔｒｅｅｓｔａｒ））上で決定した。データは、３人の健康なドナーからの平均値±標準誤差を意味する。
【図２３】ＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４の存在下での表面マーカーの差次的な発現を示す。５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと共に、ＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４（２０ｎｇ／ｍｌ）有りまたは無しで、単球を７日間培養した。データは、３人の健康なドナーからの平均値±標準偏差を表す(ＧＭ−ＣＳＦ単独群に基準化)。＊ｐ＜０．０５（対応のあるｔ検定）。ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）およびＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）は、バックグラウンド量を超えて検知されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
序
サイトカインは、１つの細胞により作られて、他に作用する分子として広く定義される。他の命名の中でも、インターロイキン、インターフェロン、増殖因子、およびＴＮＦとよばれるこれらの分子は、また、細胞の増殖から炎症、免疫、遊走、線維症、修復、および血管新生まで、あらゆる本質的に重要な生物学的過程に関わる。これらの特性に起因して、治療法としてのサイトカインの使用が探究されてきた。残念ながら、実例の大多数において、治療法としての野生型サイトカインの使用は、用量制限の毒性または不十分な効能を伴うことが多い。
【００２７】
サイトカインは、三次元構造に基づいて、２つのカテゴリー、すなわちＩ型およびＩＩ型に分けることができる。
【００２８】
Ｉ型サイトカインは、「アップ‐アップ‐ダウン‐ダウン（up-up-down-down）」構造による、４つのα‐ヘリックスバンドル構造を有する。これらのサイトカインは、α‐ヘリックスの長さ並びにいくつかの他の構造的／形態的考慮に基づいて、短鎖および長鎖の４つのα‐ヘリックスバンドルサイトカインにさらに分けることができる。短鎖サイトカインでは、ヘリックスは、長鎖サイトカインについての２５アミノ酸に対して、典型的には、約１５のアミノ酸の長さである。
【００２９】
ＡＢループは、長鎖サイトカインではＣＤループより「上」であるのに対して、短鎖サイトカインではＣＤループより「下」である。別の特有の特徴は、短鎖サイトカインのみが、ＡＢおよびＣＤループ内にβ‐シート構造を有することである。
【００３０】
短鎖サイトカインの例は、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐７、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、およびＩＬ‐２１であり、一方、長鎖サイトカインの例は、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１１、およびＩＬ‐１２である。
【００３１】
ＩＩ型サイトカインは、異なる構造を有する。例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）‐βは、ＣＤ鎖の代わりにエクストラへリックスを有し、２つの絡み合ったペプチド鎖から構築される６つのα‐ヘリックスからなる各ＩＬ‐１０ドメインで、１つの鎖由来のヘリックスＡからＤ、並びに２重の関連する鎖由来のヘリックスＥおよびＦで、ＩＦＮ‐γは６つのヘリックス／ダイマーのα‐ダイマーとして結合し、およびＩＬ‐１０は、２つのセットのダイマーとしてそのレセプターに対して結合する。
【００３２】
他のＩＩ型サイトカインは、ＩＬ‐２０およびＩＬ‐２２である。
【００３３】
サイトカインは、標的細胞で発現される特異的なレセプターとの相互作用を介して、それらの機能を発揮する。サイトカインのように、サイトカインレセプターは、構造的類似性に基づいて、関連するタンパク質の別個のファミリーにグループ化することができる。これらのレセプターは、関連するタンパク質の別個のファミリーに入り、４つの広いグループに分類される場合もある。Ｉ型サイトカインレセプターは、ヘマトポイエチン（haematopoietin）レセプターファミリーに属する。
【００３４】
Ｉ型サイトカインレセプターは、αレセプターおよび共有され得る１つまたは２つの二次成分を有する多量体である。Ｉ型サイトカインレセプターは、共通のレセプター成分の共有に基づく３つのサブファミリーに分けることができる。Ｉ型サイトカインレセプターは、共通β鎖（βｃ）、ｇｐ１３０、または共通γ鎖（γｃ）のいずれかを共有し得る。
【００３５】
βｃを共有するサイトカインの例は、ＩＬ‐３、ＩＬ‐５、およびＧＭ‐ＣＳＦであり、ｇｐ１３０を共有するサイトカインは、例えば、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１１であり、並びにγｃを共有するサイトカインは、例えば、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐７、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１５、およびＩＬ‐２１である。
【００３６】
サイトカインを向上させるための１つの可能性は、ある所望の細胞型での好ましい活性のためにそれらにバイアスをかけることである。αレセプターは、異なる細胞型の表面での選択的な発現に基づくサイトカイン特異性および細胞特異性の動因である。共有レセプタは、また、差次的に発現される。よって、ある一定の細胞型でのサイトカインの好ましい活性は、リガンドの操作により改良され得る。例えば、共有レセプターの補充についての結合パラメーターの操作は、ある細胞型に対して、サイトカインの活性をゆがめ得る。これは、共有および／またはヘテロ二量体のレセプターを通じてシグナル伝達する広い範囲のサイトカインに適用され得る。
【００３７】
本発明がより容易に理解されるために、ある一定の用語および表現が、以下に並びに明細書の全体にわたって定義される。
【００３８】
定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、概して、本発明が属する技術分野の当業者により共通に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法および細胞培養、分子遺伝学、有機化学における実験手順は、当該技術分野でよく知られたものであり、共通に採用される。標準的な技術が、核酸およびペプチド合成のために使用される。技術および手順は、概して、当該技術分野における従来の方法および種々の一般的な参照文献に従って行われ（概して、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）、それはこの文献の全体にわたって提供される。本明細書で使用される命名法および以下に記載される分析および有機合成化学の実験手順は、よく知られるものであり、当該技術分野で共通に採用される。標準的な技術またはその改変形態が、化学合成および化学分析のために使用される。
【００３９】
「野生型」または「ＷＴ」または「ナイーブ」は、本明細書では、対立遺伝子変異を含む、天然でみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。「野生型ＩＬ‐４」は、天然または組換え型かどうかに関わらず、２４のアミノ酸のＩＬ‐４シグナルペプチドを含まない配列番号１、天然ヒトＩＬ‐４の１２９の通常生じるアミノ酸配列を有する、ＩＬ‐４を意味する。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「変異タンパク質」は、野生型のポリペプチドと比較して、１つまたはそれ以上の部位でアミノ酸挿入、欠失、置換、および変更のあるポリペプチドを意味する。例示的な変異タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸の置換を含み得る。
【００４１】
変異タンパク質は、また、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全体にわたって保存的変更および置換を含む（例えば、変異タンパク質の二次または三次構造に最小の影響を有するもの）。このような保存的置換は、The Atlas of Protein Sequence and Structure5 (1978)においてDayhoffにより記載され、およびEMBO J., 8:779-785 (1989)においてArgosにより記載されたものを含む。例えば、以下のグループの１つに属するアミノ酸は保守的な変更を表す。グループＩ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；グループＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；グループＶ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；およびグループＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕ。
【００４２】
本明細書で使用される、「共有レセプターポリペプチド」は、１つより多いリガンド間で共有されるポリペプチドレセプターを指す。代表的な共有レセプターは、ＩＬ‐４により結合されるものであり、γｃ、ｇｐ１３０、βｃ、またはＩＬ‐１３Ｒα１を含み得るが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される、「リガンド」は、レセプターのような別の分子と特異的に結合することが可能であるあらゆる分子を指す。「リガンド」という用語は、アゴニストおよびアンタゴニスト（antogonist）の両方を含み、例えば、小分子、抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、変異タンパク質のようなポリペプチド、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。
【００４４】
本明細書で使用される、「標的細胞」は、共有レセプターのポリペプチドを発現する細胞、または本発明の変異タンパク質に結合することができるレセプターのポリペプチドを発現している細胞を指す。標的細胞の例は、Ｂ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、マクロファージ、モノサイト、および上皮細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【００４５】
「野生型に従った番号付け」は、野生型ポリペプチドの成熟した配列でアミノ酸が通常生じる位置と関連して、選択されたアミノ酸を識別することを意味し、例えば、１１８は、配列番号１で生じる１１８番目のアミノ酸を指す。
【００４６】
ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関連して本明細書で使用される、「同一性」という用語は、２つの分子間のサブユニット配列の同一性を指す。分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体のサブユニット（例えば、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）により占められる場合、そのとき分子はその位置で同一である。２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一である位置の数の直接の関数となる。一般的に、配列は、最も高い順序の一致が得られるように整列される。必要に応じて、同一性は、ＧＣＳプログラムパッケージ（Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12:387, 1984)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al., J. Molecular Biol. 215:403, 1990）のような公開された技術および広く利用可能なコンピュータープログラムを用いて算出され得る。配列同一性は、そのデフォルトのパラメーターを用いて、ウイスコンシン・バイオテクノロジー・センター大学（University of Wisconsin Biotechnology Center）（1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）でのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒグループの配列分析ソフトウェアパッケージのような配列分析ソフトウェアを用いて測定され得る。
【００４７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、その長さまたは翻訳後の変更（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸残基のあらゆる鎖を指す。
【００４８】
本開示の変異タンパク質ポリペプチドが「実質的に純粋」である場合には、それらは、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）関心ポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％の関心ポリペプチドであり得る。純度は、あらゆる適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定され得る。
【００４９】
本明細書で使用される、「有効量」という用語は、所望の生物応答を誘発するために必要な量を指す。薬物の有効な量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬物、あらゆる追加の活性または不活性成分の組成物等のような因子に応じて変化し得る。
【００５０】
「発現」という用語は、ポリペプチドがＤＮＡから産生されるプロセスを意味するために本明細書で使用される。プロセスは、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写およびポリペプチドへのこのｍＲＮＡの翻訳を伴う。それが使用される文脈に応じて、「発現」は、ＲＮＡ、タンパク質、または両方の産生を指すこととしてもよい。
【００５１】
本明細書で使用される、「遺伝子産物」という用語は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））または遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。
【００５２】
本明細書で使用される、「単離された」という用語は、実質的に純粋な分子を指す。単離されたタンパク質は、実質的に純粋であり得、例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％他の、異なるタンパク質分子を含まない。
【００５３】
本明細書で使用されるように、「調節する」および「調節」または「操作する」および「操作」という用語は、概して、具体的な標的遺伝子（それらのＲＮＡおよび／またはタンパク質産物を含む）の下方制御（例えば、阻害または抑制）、シグナル伝達経路、細胞、および／もしくは標的表現型、または標的遺伝子の上方制御（例えば、誘導または増加）を指す。
【００５４】
「患者」または「対象」は、哺乳類、例えば、炎症性疾患のような疾患または症状になるリスクがあるもしくは有する、または炎症性疾患を有すると診断されたもしくは診断される、または本明細書に記載される組成物および方法から別様の利益を受け得るヒトを意味する。
【００５５】
本明細書で使用される、「低減させる」という用語および文法上同等のものは、発現もしくは遺伝子産物活性の、あらゆる阻害、減少、低減、抑制、下方制御、または防止を指す。例えば、発現または活性のレベルは、例えば、無抑制の発現または活性の１００％または１００％未満、例えば、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％以下、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満であり得る。
【００５６】
用語「治療する」または「治療」または「軽減」または「寛解」は、治療処置および予防的または防止的手段の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態または障害の防止または鈍化（和らげる）ことである。
【００５７】
ＩＬ‐４
ＩＬ‐４は、古典的な４つのα‐ヘリックスバンドルサイトカインである。その一次結合鎖は、ＩＬ‐４Ｒαであり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および長い細胞内テイル（intracellular tail）からなり、Ｂｏｘ１ドメイン、ＰＴＢドメインタンパク質および３つのＳＴＡＴ６ドッキングについての結合部位、並びに活性化部位を含む、ＩＩ型サイトカインレセプター鎖である。
【００５８】
野生型ヒトＩＬ‐４は、２４アミノ酸シグナルペプチドおよび１２９アミノ酸鎖ペプチドを含む。配列番号１は、成熟した１２９のアミノ酸ヒトＩＬ‐４配列である。
【００５９】
ＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰＬＦＦＬＬＡＣＡＧＮＦＶＨＧＨＫＣＤＩＴＬＱＥＩＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣＴＥＬＴＶＴＤＩＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥＫＤＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧＬＮＳＣＰＶＫＥＡＮＱＳＴＬＥＮＦＬＥＲＬＫＴＩＭＲＥＫＹＳＫＣＳＳ（配列番号１）。
【００６０】
ＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα複合体は、ＩＬ‐４レセプターの二次成分に対するリガンドとしての役目を果たし、Ｉ型レセプターはγｃに対してであり、ＩＩ型レセプターはＩＬ‐１３Ｒα１に対してである。細胞表面でのＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα／γｃまたはＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα／ＩＬ‐１３Ｒα１複合体の形成は、Ｊａｋ‐ＳＴＡＴ経路およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を含む、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、後者は、ＰＴＢドメインタンパク質、特にＩＲＳ２の動員により動員される。ＩＬ‐４結合のＩ型およびＩＩ型のＩＬ‐４レセプター（図１ａ）の細胞外ドメインの結晶構造の最近の解析は、ＩＬ‐４がＩＬ‐４Ｒαおよび第２のレセプター鎖により形成される「Ｙフォーク（Ｙ‐ｆｏｒｋ）」に位置し、サイトカインのＤへリックスの表面と結合することにより第２のレセプター鎖と直接接触することを示した。
【００６１】
ＩＬ‐４ＲαへのＩＬ‐４の結合は、非常に高い親和性があり、約１０−１０ＭのＫＤである。γｃまたはＩＬ‐１３Ｒα１のいずれかへのＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒα複合体の後続の結合は、比較的低い親和性がある。ＩＬ‐４ＲαへのＩＬ‐４の結合の非常に高い親和性に起因して、ほとんどの状況下で、シグナル伝達複合体の形成は、第２の鎖（複数を含む）の発現の相対的なレベルにより測定される。さらに、代替的な第２の鎖は、造血細胞で主に発現されるγｃおよび非造血細胞で主に発現されるＩＬ‐１３Ｒα１による細胞の発現の異なるパターンを有するが、いくつかの造血細胞は、可変量のＩＬ‐１３Ｒα１を発現する。ＩＬ‐４の制御性の活性の多くはＩ型レセプターを主に発現するＢ細胞およびＴ細胞により媒介されるが、ＩＬ‐１３を擬態する、そのエフェクター機能の多くは、ＩＩ型レセプターを独自に発現し、また、ＩＬ‐１３に応答する細胞により媒介される。
【００６２】
機能的に、ＩＬ‐４は、ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ２分化、ＩｇＥへの免疫グロブリンクラスのスイッチ、およびナイーブなＣＤ４  Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージで活性化することによる代替的なマクロファージ活性化をそれぞれ調節する。ＩＬ‐４は、Ｉ型レセプターに結合するのと同じくらい効率的に、非造血細胞で主に発現されるＩＩ型レセプターに結合するので、エフェクター機能並びに調節機能を誘導することができる。エフェクター機能の中には、気道過敏症および杯細胞の化生がある。しかしながら、これらの後者の活性は、ＩＬ‐４よりもはるかに多い量で生成されるので、ＩＬ‐１３を利用してＩＩ型レセプターにより、生理学的に主に誘導される。さらに、ＩＬ‐１３は、造血細胞で優性に発現されるＩ型レセプターに結合できないので、「調節」活性がほとんどまたは全くない。全体として、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ‐４レセプターを用いることにより、ＩＬ‐４は、アレルゲンまたは侵入する細胞外寄生生物により始動されるかどうかに関わらず、Ｔｈ２タイプの炎症における中心的役割を果たす。
【００６３】
ＩＬ‐４は、現在は治療薬として使用されていないが、過去にそのような使用が考慮されており、毒性がない場合には、ワクチン接種中のＣＤ４  Ｔ細胞の分化に方向づけるような、または、分化されたＣＤ４  Ｔ細胞の可塑性の最近の認識を考慮して、確立されたパターンの分化を変化させるような目的のために考慮されるかもしれない。１９９０年代前半には、Ｔ細胞応答の刺激の期待または自然免疫系の関与の期待を有する癌患者にＩＬ‐４が投与された臨床治験が行われた。
【００６４】
しかしながら、高投与量（６００μｇ／ｍ２／日）のＩＬ‐４の静脈内投与は、研究グループにおける３人の患者のうち２人に血管漏出症候群をもたらした。これらの研究および前臨床の分析で、他の毒性に遭遇した。これらの毒性の多くは、ＩＬ‐４が非造血細胞に作用することが関与するが、ＩＬ‐４は、マウスにおいて、実質的なマクロファージ媒介の毒性を有する。マウスへのＩＬ‐４の投与は、代替的に活性化されたマクロファージにより媒介される血球貪食症候群をもたらした。
【００６５】
リンパ球の分化を薬理学的に調節するためにＩＬ‐４の利用は、ＩＩ型レセプターへの結合および結果として生じるエフェクター機能による非造血細胞でのその活性により困難となる。よって、ＩＩ型レセプターを活性化できない、または、Ｉ型レセプターの活性化がＩＩ型レセプターの活性化より大幅に低い濃度で達成され得る、ＩＬ‐４変異タンパク質の産生は、有利であろう。
【００６６】
従って、いくつかの実施形態では、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの第２の鎖についての野生型ＩＬ‐４と比較して、相対的に結合活性が変化した、操作されたＩＬ‐４変異タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ‐４変異タンパク質は、それをブロックするよりもむしろ、シグナル伝達を調節し、または増強する。
【００６７】
本明細書では、ヒトＩＬ‐４変異タンパク質の産生が記載され、それは「スーパーカイン」と呼ばれ、γｃに対して非常に高い親和性、およびＩＬ‐１３Ｒα１に対して減少された親和性を有し、並びに、逆に、γｃに対するそれらの親和性における変化がほとんどまたは全くなく、ＩＬ‐１３Ｒα１に対して、ＩＬ‐４よりもかなり高い親和性で結合するものである。
【００６８】
よって、いくつかの実施形態では、ＩＬ‐４変異タンパク質は、γｃに対して比較的高い親和性、およびＩＬ‐１３Ｒα１に対して減少された親和性を有する。他の実施形態では、ＩＬ‐４変異タンパク質は、γｃに対するそれらの親和性における変化がほとんどまたは全くなく、ＩＬ‐１３Ｒα１に対して、ＩＬ‐４よりも相対的にかなり高い親和性を有する。
【００６９】
ＩＬ‐４スーパーカイン（変異タンパク質）
種々の実施形態では、本開示は、必ずではないが、実質的に精製され、野生型ＩＬ‐４のアゴニストとして機能し得るＩＬ‐４変異体ポリペプチドを提供し、それらは１つまたはそれ以上のＩＬ‐４の生物活性を保持する（例えば、細胞増殖の刺激）。
【００７０】
代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、配列番号１により表されるポリペプチドがγｃと結合する親和性よりも高い親和性かつ減少されたＩＬ‐１３Ｒα１に対する親和性でγｃと結合し、配列番号１と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、野生型ＩＬ‐４と比較して、少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、追加、または置換）を有し得、配列番号１のＩＬ‐４より高い親和性で、配列番号１のそれと比較して減少されたＩＬ‐１３Ｒα１に対する親和性でγｃと結合する。
【００７１】
代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドと比較して、γｃに対する相対的な親和性における変化がほとんどまたは全くなく、ＩＬ‐１３Ｒα１に対するＩＬ‐４（配列番号１）よりも高い親和性で結合する、配列番号１と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、野生型ＩＬ‐４と比較して、少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、追加、または置換）を有し得、配列番号１のポリペプチドと比較して、γｃに対する相対的な親和性における変化がほとんどまたは全くなく、ＩＬ‐１３Ｒα１に対して、ＩＬ‐４（配列番号１）よりも高い親和性で結合する。
【００７２】
代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、野生型ＩＬ‐４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり得る。突然変異は、アミノ酸残基の数または内容における変化からなり得る。例えば、変異体ＩＬ‐４は、野生型ＩＬ‐４よりもより多いまたはより少ない数のアミノ酸残基を有し得る。代替的に、または追加して、代表的な変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ‐４に存在する１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含み得る。種々の実施形態において、変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、単一のアミノ酸残基の追加、欠失、または置換、例えば、位置１２１での残基の置換により野生型ＩＬ‐４と異なり得る。同様に、代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のアミノ酸残基、例えば、配列番号１の位置１１７、１１８、２１、１２２、１２４、１２５、１２８、および１２９での残基の置換により、ＩＬ‐４と異なり得る。
【００７３】
例示として、配列番号１の参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号１の参照アミノ酸の１３までの変更の包含以外の参照配列と同一である配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列における１０％までのアミノ酸残基が、欠失または別のアミノ酸で置換されることとしてもよく、または参照配列における総アミノ酸残基の１０％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入されることとしてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ‐‐）もしくはカルボキシ（Ｃ‐‐）末端位置、または参照配列においてもしくは参照配列内の１つもしくはそれ以上の連続的な群において残基間で個々に分散される、これらの末端位置間のどこにでも生じ得る。
【００７４】
置換されたアミノ酸残基（複数を含む）は、必ずではないが、典型的には、以下のグループ内：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；および、フェニルアラニン、チロシンでの置換を含む、保存的置換であり得る。
【００７５】
例えば、置換Ｒ１２１Ｑは、変異形ポリペプチドを指し、本実例では、位置１２１でのアルギニンがグルタミンにより置換される。また、置換は、親ポリペプチド内の位置７４で単純になされ得、例えば、１２１Ｑは、親ポリペプチドの位置１２１で生じるアミノ酸に関わらず、グルタミンによる位置１２１でのアミノ酸の置換を指す。
【００７６】
本明細書で、「タンパク質変異形」または「変異形タンパク質」または「変異形ポリペプチド」は、少なくとも１つのアミノ酸変更により野生型ンパク質と異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然起源もしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであることとしてもよく、またはＷＴポリペプチドの変更されたバージョンであることとしてもよい。変異形ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体、そのポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指すこととしてもよい。好ましくは、変異形ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸変更、例えば、親と比較して約１から約１０のアミノ酸変更、および好ましくは約１から約５のアミノ酸変更を有する。
【００７７】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」は、変異形を生成するためにその後に変更される非変更ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、または野生型ポリペプチドの変異形もしくは操作されたバージョンであることとしてもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指すこととしてもよい。
【００７８】
親和性に関し、本明細書では、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％だけ、より高い親和性またはそれ以上、野生型ＩＬ‐４ポリペプチドより高い親和性でγｃと結合する代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドが開示される。野生型ＩＬ‐４ポリペプチドは、約３３００ｎＭのＫｄでγｃと結合する。代表的な開示される変異体ＩＬ‐４ポリペプチドの結合親和性は、また、γｃについて、野生型ＩＬ‐４よりも、１．２、１．４、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、またはそれ以上の倍数のより高い親和性で発現され得る。
【００７９】
代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、γｃレセプターサブユニットによる増加された会合速度を示す性能を有し得る。
【００８０】
また、本開示は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％だけ、より低い親和性またはそれ以上、野生型ＩＬ‐４ポリペプチドより低い親和性でγｃと結合する変異体ＩＬ‐４ポリペプチドを提供する。代表的な開示される変異体ＩＬ‐４ポリペプチドの結合親和性は、また、γｃについて、野生型ＩＬ‐４よりも、１．２、１．４、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０倍、またはそれ以上のより低い親和性として発現され得る。
【００８１】
親和性に関し、本明細書では、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％だけ、より高い親和性またはそれ以上、野生型ＩＬ‐４ポリペプチドより高い親和性でＩＬ‐１３Ｒα１と結合する代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドが開示される。野生型ＩＬ‐４ポリペプチドは、約４２００ｎＭのＫｄでＩＬ‐１３Ｒα１と結合する。代表的な開示される変異体ＩＬ‐４ポリペプチドの結合親和性は、また、ＩＬ‐１３Ｒα１について、野生型ＩＬ‐４よりも、１．２、１．４、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、４００、４５０、５００、１０００、１５００、２０００、またはそれ以上の倍数のより高い親和性で発現され得る。
【００８２】
代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドは、ＩＬ‐１３Ｒα１レセプターサブユニットによる増加された会合速度を示す性能を有し得る。
【００８３】
また、本開示は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％だけ、より低い親和性またはそれ以上、野生型ＩＬ‐４ポリペプチドより低い親和性でＩＬ‐１３Ｒα１と結合する変異体ＩＬ‐４ポリペプチドを提供する。代表的な開示される変異体ＩＬ‐４ポリペプチドの結合親和性は、また、ＩＬ‐１３Ｒα１について、野生型ＩＬ‐４よりも、１．２、１．４、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０倍、またはそれ以上のより低い親和性として発現され得る。
【００８４】
野生型ＩＬ４と比較して、γｃについての増加した親和性およびＩＬ‐１３Ｒα１についての低減した親和性の両方の特性を有する代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドもまた開示される。
【００８５】
野生型ＩＬ４と比較して、γｃおよびＩＬ‐１３Ｒα１についての増加した親和性の両方の特性を有する代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドもまた開示される。
【００８６】
野生型ＩＬ４と比較して、γｃについての低減した親和性およびＩＬ‐１３Ｒα１についての増加した親和性の両方の特性を有する代表的な変異体ＩＬ‐４ポリペプチドもまた開示される。
【００８７】
サイトカインと関連する疾患
増殖および分化の障害
いくつかの実施形態では、変異体サイトカインポリペプチドおよび／またはそれらを発現する核酸が、異常なアポトーシスまたは分化のプロセスに関連する障害（例えば、細胞増殖性障害または細胞分化性障害、例えば癌）を治療するために対象に投与され得る。
【００８８】
本明細書で使用されるように、「癌」（または「癌性の」）、「過剰増殖」、および「新生物」という用語は、自律増殖についての能力（例えば、細胞成長の急速な増殖により特徴づけられる異常な状態または症状）を有する細胞を指す。過剰増殖および新生物疾病状態は、病態（例えば、疾病の状態を特徴づけるまたは構成する）として分類されることとしてもよく、またはそれらは非病態（例えば、正常から逸脱するが、疾病状態を伴わない）として分類されることとしてもよい。この用語は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階に関わらず、全てのタイプの癌の増殖または発癌性のプロセス、転移性の組織または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことが意味される。
【００８９】
癌の例は、限定されることなく、癌腫、肉腫、および造血性の新生物障害（例えば、白血病）を含む。
【００９０】
変異体サイトカインポリペプチドが、腎臓癌もしくは黒色腫、またはあらゆるウイルス性疾患を含む、あらゆるタイプの癌を発症する高いリスクを有する、有することが疑われる、またはリスクがあり得る患者を治療するために使用され得る。代表的な癌腫は、頸部、肺、前立腺、胸、頭頸部、結腸と卵巣の組織から形成するものを含む。この用語は、また、癌性のおよび肉腫性の組織からなる悪性腫瘍を含む、癌肉腫を含む。
【００９１】
本明細書で使用される、「造血性の新生物障害」という用語は、例えば、骨髄性、リンパ性、もしくは赤血球系の系統、またはこれらの前駆細胞から生じる、造血性の起源の過形成性／新生物細胞を伴う疾患を含む。好ましくは、疾病は、低分化の急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。追加の代表的な骨髄性の障害は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含むが、これらに限定されず（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97でレビューされた）、リンパ性腫瘍は、Ｂ系列のＡＬＬおよびＴ系列のＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＬＬ）、並びにワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
悪性のリンパ腫の追加の形態は、非ホジキンリンパ腫およびその変異形、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、並びにリード・シュテンベルグ病を含むがこれらに限定されない。
【００９３】
増殖性および／または分化性の障害の他の例は、皮膚の障害を含む。皮膚の障害は、１つの細胞もしくは細胞の群または真皮、表皮、もしくは皮下組織層における層の異常な活性、または真皮表皮接合部における異常を伴うこととしてもよい。
【００９４】
例えば、皮膚障害は、ケラチノサイト（例えば、基底のおよびすぐ近くの基底上のケラチノサイト過剰増殖）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、および１つまたはそれ以上の表皮層、例えば、基底細胞層（胚芽層）、有棘層、果粒層、透明層、または角質層でみられる他の細胞の異常な活性が関与し得る。
【００９５】
他の実施形態では、障害は、真皮層、例えば、乳頭層または網状層でみられる、真皮細胞、例えば、真皮の内皮、繊維芽細胞、免疫細胞（例えば、マスト細胞またはマクロファージ）の異常な活性が関与し得る。
【００９６】
皮膚障害の例は、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、粃糠疹酒さ（pityriasis rosacea）、類乾癬、苔癬状粃糠疹（pityriasis lichenoider）、扁平紅色苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様の皮膚疾患、魚鱗癬、皮膚疾患、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡（例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症（prokeratosis）、関節包に沿って並ぶ上皮関連細胞（epithelial-related cell）の炎症および過増殖を伴うリウマチ性関節炎；皮膚炎、例えば、脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎；角化症、例えば、脂漏性角化症、老人性角化症、紫外線角化症、光誘導角化症（photo-induced keratosis）、および毛包性角化症；尋常性座瘡；ケロイドおよびケロイド形成に対する予防；母斑；たこ、コンジローマまたは尖圭コンジローマ（condyloma acuminatum）、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、例えば、尖圭コンジローマ（venereal warts）を含む、疣贅；白板症；扁平紅色苔癬；並びに角膜炎を含む。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎もしくはアレルギー性皮膚炎、または乾癬であり得る。
【００９７】
患者への直接投与の方法に加えて、または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体サイトカインポリペプチドは、エクスビボの方法で使用され得る。例えば、細胞（例えば、患者から単離されおよび培養で維持されまたは配置される末梢血リンパ球または精製された個体群のリンパ球（lymhocyte））は、培養培地にてインビトロで培養され得、接触ステップは、培養培地にサイトカイン変異体を添加することにより影響を受け得る。培養ステップは、他の薬剤により細胞が刺激されまたは処理される、例えば、関心抗原（例えば、癌抗原またはウイルス抗原）に応答性がある細胞の個体群を増大させるためのまたは増殖を刺激するためのステップをさらに含み得る。細胞は、それらが処理された後に、患者にその後投与される。
【００９８】
肺障害
開示されるサイトカイン変異タンパク質の組成物およびそれらの使用の方法による寛解ができる病的症状は、例えば、喘息およびアレルギー性炎症応答のような肺障害を含む。
【００９９】
喘息の特徴は、例えば、呼吸器症状の再発する発症、自発的にまたは治療によるいずれかの可逆的であることが多い、多様な気道障害（variable airflow obstruction）、気道過応答性の存在、および例えば、マスト細胞、好酸球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好中球、および上皮細胞を含む、多くの細胞および細胞要素が伴われる、慢性気道炎症を含む（National Heart, Lung, and Blood Institute: National Asthma Education and Prevention Program. Expert Panel Report Guidelines for the diagnosis and management of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 88:425-534, 1991; National Heart, Lung, and Blood Institute National Asthma Education Program Expert Panel Report II: Guidelines for the diagnosis and management of asthma; 1997. NIH Publication No. 97-4051A参照）これらの特徴の全てが、あらゆる所与の喘息の患者に存在する必要はないが、喘息の診断を確立する絶対的な「最小限の基準」がなく、または広く同意されておらず、気道の過応答性の存在は、現在の徴候およびアクティブな喘息を有する患者における共通の所見である。
【０１００】
気道過敏性は、喘息の特徴であり、吸入された収縮アゴニストに対する増加された気道の感受性、用量応答曲線の急な勾配、およびアゴニストに対するより大きい最大限の応答からなる（Byrne and Inman, Chest, 2003）。気道応答性の測定は、特に、喘息と矛盾しない徴候を有し、および気道障害の証拠がない患者において、喘息の診断をする際に有用である。例えば、環境アレルゲンを含む、ある特定の吸入された刺激が、気道の炎症を増加させ、気道過敏性を増強する。健康な対象における気道過敏性における変化は、持続する気道過敏性を有する喘息患者である場合にみられるものよりも、かなり小さな規模である。喘息の発病、および当該方法に従った治療による寛解は、気管支鏡法、気管支肺胞洗浄、気道生検、気道ガスの測定、および熟練された臨床医に知られる他のこのような方法により把握し得る。
【０１０１】
処方
１つもしくはそれ以上の治療薬が単独で、または１つもしくはそれ以上の化学療法と組み合わせて、対象への投与のために薬学的に許容可能な担体とともに処方され得る。活性成分は、逐次投与のために単独で（個々に）処方され得、または同時投与のために一緒に処方されることとしてもよい。
【０１０２】
本明細書で使用される、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、対象への投与に適している、１つまたはそれ以上の適合性のある固体もしくは液体充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。薬学的組成物の成分は、また、所望の薬学的効率性を実質的に損なうであろう、相互作用のない態様で、互いに混合することができる。このような調製物は、通常、薬学的に許容可能な濃度の、塩、緩衝剤、保存剤、適合性のある担体、アジュバント、および任意に他の治療成分を含む。
【０１０３】
本明細書に記載される組成物は、遊離塩基としてまたは薬学的に許容可能な塩として投与されることとしてもよい。このような薬理学的および薬学的に許容可能な塩は、以下の酸、塩化水素、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ‐トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレンスルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない。また、薬学的に許容可能な塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
【０１０４】
薬学的組成物は、また、適切な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含むこととしてもよい。このような担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
適切な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；並びにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を含む。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を含む。
【０１０６】
適切な液体または個体の薬学的調製形態は、例えば、吸入のための水溶性のまたは生理食塩水、マイクロカプセル化、エンコクリート化（encochleated）、リポソーム（ｐＨに依存する放出の処方を含む）に含まれる顕微鏡レベルのゴールドの粒子での被覆、リピドイド（lipidoid）、噴霧、エアロゾル、皮膚への移植のためのペレット、または皮膚内で引っ掻くために鋭い物体上で乾燥されたものである。また、薬学的組成物は、果粒、粉末、タブレット、被覆されたタブレット、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、または組成物の遅延性放出による調製物を含み、その調製において、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香料、甘味料、もしくは可溶化剤が上記のように慣習上使用される。薬学的組成物が種々の薬物送達系における使用に適している。薬物送達の方法の簡潔なレビューについては、Langer, Science 249:1527-1533, 1990 および Langer and Tirrell, Nature, 2004 Apr 1; 428(6982): 487-92を参照。
【０１０７】
組成物は、単位用量形態において便利に存在することとしてもよく、薬学の分野でよく知られるあらゆる方法により調製されることとしてもよい。ある一定の実施形態では、投与される組成物は、溶液としてよりもむしろ粉末または粒子形態である。本発明の一部として考慮される粒子形態の例は、米国出願公開第２００２／０１２８２２５号で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、エアロゾル形態で投与される。他の実施形態では、組成物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水による組成のために、粉末形態であることとしてもよい。
【０１０８】
さらに、本明細書に記載される組成物は、デポー製剤、徐放、遅延放出、または持続性放出送達システムとして処方されることとしてもよい。このようなシステムは、本明細書に記載される組成物の繰り返しの投与を避けることができ、対象および医師に対する簡便性を増加させることができる。このように長く作用する処方は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば、許容できるオイルでのエマルジョン）またはイオン交換樹脂、または難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩で処方されることとしてもよい。
【０１０９】
多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に知られる。それらは、ポリマーベースのシステム、例えば、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ベータグルカン粒子、ポリ無水物およびポリカプロラクトン；ステロールを含む脂質である非ポリマーシステム、例えば、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸、中性脂肪、例えば、モノ‐、ジ‐、およびトリグリセリドまたはリピドイド；ハイドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング、従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的に融合されたインプラント等を含む。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムが使用され得、そのいくつかは埋め込みに適用される。
【０１１０】
また、制御された放出は、生体適合性および生体分解性のある適切な賦形剤物質により達成され得る。遅延放出に影響を及ぼすこれらのポリマー物質は、非生体分解性／非生体分解性および生体分解性／生体分解性のポリマーを含むがこれらに限定されない、粒子を生成するために適切なあらゆるポリマー物質であることとしてもよい。このようなポリマーは、先行技術文献にかなり詳細に記載されており、ベータグルカン粒子、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート（polyalkylene terepthalate）、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニールハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、アセチルセルロース、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン  ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテート、ポリ塩化ビニルポリスチレン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpryrrolidone）、ヒアルロン酸、並びにコンドロイチン硫酸を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、緩効性ポリマーは、ブロックコポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）／ポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ブロックコポリマーである。
【０１１１】
非生体分解性ポリマーの例は、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、コポリマー、およびこれらの混合物を含む。
【０１１２】
生体分解性ポリマーの例は、合成ポリマー、例えば、ベータグルカン粒子、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（ブチック酸（butic acid））、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチラート）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）およびポリ（ラクチド‐コ‐カプロラクトン）、および天然高分子例えば、アルギン酸並びにデキストランおよびセルロースを含む他のポリサッカライド、コラーゲン、その化学的誘導体（化学基の置換、追加、例えば、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により通常なされる他の変更）、アルブミン、および他の親水性タンパク質、ゼイン、および他のプロラミン、疎水性タンパク質、コポリマー、並びにこれらの混合を含む。概して、これらの物質は、表面もしくは内部分解により、インビボにおける水への露出または酵素的加水分解のいずれかにより分解する。前述の物質が、物理的混合（ブレンド）として、またはコポリマーとして、単体で使用されることとしてもよい。好ましいポリマーは、ポリエステル、ポリ無水物、ポリスチレン、およびこれらのブレンドである。
【０１１３】
本明細書に記載される組成物の有効な量が、このような治療を必要とする対象に投与される。有効な量は、症状、症状の疾病または障害または徴候、疾病または障害における所望の改善もたらすような量である。
【０１１４】
有効量は、投与の形態に応じて、１ｎｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重までの、または１００ｎｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重までの、または１μｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。代替的に、有効量は、細胞の４平方センチメートル面積あたり３マイクログラムから１４ミリグラムの範囲であり得る。絶対量は、種々の因子（投与を他の治療と合わせるかどうか、投与の数、並びに年齢、健康状態、サイズ、および体重を含む個々の患者のパラメーターを含む）に依存し、通常の実験で測定され得る。なされ得る１つの有用な投与量は、堅実な医学的診断に従った最も安全な投与量である。
【０１１５】
種々の活性剤の送達間の時間は、動態学的、送達、放出、薬物の薬力学的、薬物の薬物動態、またはこれらのあらゆる組み合わせの原則により通常定義され得る。代替的に、種々の薬剤の送達間の時間は、最大の効果が達成される場合を定義するための実験により経験的に定義され得る。
【０１１６】
投与の様式
投与の様式は、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、気管内投与、吸入、点眼、局所投与、経皮投与、皮内投与、直腸投与、腟内投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、胸骨内の、投与、経粘膜的投与を介するもの、を含む、あらゆる医学的に許容可能な様式であることとしてもよい。また、投与の様式は、体外装置および／または組織貫通電磁気装置を介することとしてもよい。
【０１１７】
選択される具体的な様式は、選択される具体的な活性剤、所望の結果、治療される具体的な症状、および治療の効能に必要とされる投与量によるであろう。本明細書に記載される方法は、概して言えば、医学的に許容可能な投与のあらゆる様式、例えば、臨床的に許容できない副作用を引き起こさずに、有効なレベルの炎症応答の変化を生じるあらゆる様式を用いて実行されることとしてもよい。
【０１１８】
組成物は、障害および投与の様式に応じて、異なる容器、ビヒクル、または処方で提供され得る。例えば、組成物は、口腔への適用のために、舌下錠、ガム、マウスウォッシュ、練り歯みがき、キャンディ、ゲル類、フィルム等として、眼への適用のために、点眼器での点眼、眼軟膏、アイゲル、アイパックとして、コンタクトレンズまたはクリーニング液における、コンタクトレンズまたは眼内レンズへのコーティングとして等、局所への適用のために、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、ティッシュ、スワブ、ワイプ等として、膣または直腸への適用のために、軟膏、タンポン、坐薬、粘液接着剤処方等として投与され得る。
【０１１９】
組成物は、例えば、静脈、皮下、筋肉内、腹膜内、胸骨内の経路を介して、ボーラス注入または連続注入によるような注入により投与されることとしてもよい。注入の処方は、追加の保存剤とともに、例えば、アンプルまたは複数投与容器において、単位用量形態で存在することとしてもよい。組成物は、油性または水性のビヒクルで、懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような形態をとることとしてもよく、懸濁、安定、および／または分散剤のような調合剤を含むこととしてもよい。経口投与のために、組成物は当該技術分野で知られる薬学的に許容可能な担体、例えば、舌下錠、液体処方、または経口ゲルと組成物を組み合わせることにより容易に処方され得る。
【０１２０】
吸入による投与のために、組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用により、加圧されたパックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー組成の形態で簡便に送達されることとしてもよい。圧縮されたエアロゾルの場合では、単位用量は、計量された量を送達するためのバルブに供給することにより測定されることとしてもよい。吸入器または注入器での使用のための例えばゼラチンのようなカートリッジおよびカプセルは、組成物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤を含んで処方されることとしてもよい。治療薬の吸入のための医療装置は当該技術分野で知られる。いくつかの実施形態では、医療装置は、吸入器である。他の実施形態では、医療装置は、計量された用量の吸入器、ディスクヘラー、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ、ディスカス（ｄｉｓｋｕｓ）またはスペーサーである。ある一定のこれらの実施形態において、吸入器は、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（Rhone-Poulenc Rorer, West Malling, Kent）である。他の医療装置は、当該技術分野で知られ、Ｉｎｈａｌｅ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｍａｎｎｋｉｎｄ／Ｇｌａｘｏ、およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ａｌｋｅｒｍｅｓを含む。
【０１２１】
組成物は、また、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような、従来の坐剤基剤を含む、坐薬または保持浣腸のような直腸または膣組成物で処方されることとしてもよい。
【０１２２】
追加の使用
本明細書に記載される変異タンパク質は、例えば、酵素、放射標識、エピトープ、または蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）のような、シグナルを産生するまたは標識である部分で直接または間接的に標識され得る。本明細書に記載される変異タンパク質は、例えば、標準的なイムノブロッティング、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光エネルギー転移、ウエスタンブロット、並びに他の診断および検出技術を用いて、レセプターがサンプルにまたは細胞上に存在するかどうかを測定するために、サンプルにまたは細胞に接触され得る。
【０１２３】
また、本明細書に記載される変異タンパク質は、インビトロ検出のために標識され、対象に投与され得る。対象は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段により、撮像され得る。例えば、結合剤は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈのような放射標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャナにより検出可能な陽電子放出同位体、ルシフェリンのようなケミルミネッサ（chemiluminescer）、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素マーカーにより標識され得る。本明細書に記載される変異タンパク質は、常磁性剤および強磁性または超常磁性剤のような造影剤で標識され得る。
【０１２４】
本明細書に記載される変異タンパク質は、α、β、またはγ放射体のような放射性同位体に結合され得る。放射性同位体の例は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジム、またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）を含む。結合タンパク質は、生物学的タンパク質、植物または細菌起源の分子（または、その誘導体）、例えば、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノール、その類似体、またはＤＭ１）、並びに、タキサン（例えば、タキソールまたはタキソテレ）、またはカリケアマイシンに結合され得る。マイタンシノール類似体の例は、修飾芳香環（例えば、Ｃ‐１９‐デクロロ、Ｃ‐２０‐デメトキシ、Ｃ‐２０‐アシルオキシ）を有するもの、および他の位置に修飾を有するもの（例えば、Ｃ‐９‐ＣＨ、Ｃ‐１４‐アルコキシメチル、Ｃ‐１４‐ヒドロキシメチルまたはアセロキシメチル、Ｃ‐１５‐ヒドロキシ／アシルオキシ、Ｃ‐１５‐メトキシ、Ｃ‐１８‐Ｎ‐デメチル、４，５‐デオキシ）を含む。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が、例えば、米国特許第６，３３３，４１０号に記載される。マイタンシノールは、例えば、Ｎ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオナート（Ｎ‐スクシンイミジル４‐（２‐ピリジルジチオ）ペンタノアートまたはＳＰＰとしても知られる）、４‐スクシンイミジル‐オキシカルボニル‐ａ‐（２‐ピリジルジチオ）‐トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ‐スクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＤＰＢ）、２‐イミノチオラン、またはＳ‐無水アセチルコハク酸（acetylsuccinic anhydride）を用いて結合され得る。
【０１２５】
以下の例は、例示のためのみに提供され、本発明の範囲を限定することを意味しない。当業者は、本質的に類似の結果をもたらすために変更または修正し得る種々の決定的ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：変化した結合親和性を有するＩＬ−４変異タンパク質の開発
ＩＬ−４／ＩＬ−１３系を用いて、共有サイトカインレセプターの相対親和性の操作が特徴的な応答性のパターンを有するサイトカインをもたらし得るという考えを試験した。２つのアプローチをとって、γｃ（図１ｂ）またはＩＬ−１３Ｒα１（図１ｃ）に結合するより高い親和性のためにＩＬ−４を操作した。
【０１２７】
完全にリガンドと結合したＩ型およびＩＩ型レセプター三元複合体の三次元構造が、最近解析された。ＩＬ−１３は、ＩＬ−４よりもＩＬ−１３Ｒα１により高い親和性で結合する（ＫＤ３０ｎＭ対ＫＤ１μＭ超）。このように、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の構造を、それらの構造から、２つのＩＩ型三元複合体（ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα／ＩＬ−１３Ｒα１）に並べた。
【０１２８】
ＩＬ−１３Ｒα１と広範囲な接触を形成するＩＬ−４およびＩＬ−１３のＤへリックスは、それぞれの複合体で大変密接に整列する。ＩＬ−４のＩＩ型レセプター三元複合体でγｃと接触する、３つのＩＬ−４のＤへリックス残基、Ｒ１２１、Ｙ１２４およびＳ１２５は、ＩＬ−１３のものとは異なる。従って、これらの残基を、それらのＩＬ−１３位置上同等物（図１ｃ）と入れ替え、２つのＩＬ−４変異形、ＫＦと称されるＲ１２１Ｋ、Ｙ１２４Ｆの保存的二重変異体、ならびに、３つの全ての残基が入れ替わったＲ１２１Ｋ、Ｙ１２４ＦおよびＳ１２５Ｒである三重変異体ＫＦＲ、を作製した。
【０１２９】
ＩＬ−４のγｃに対する親和性と高めるために、親和性成熟のための酵母表面ディスプレイを用いてコンビナトリアルライブラリーのアプローチを適用した。ＩＬ−４を酵母表面タンパク質Ａｇａ２ｐに融合し、そこで、ＩＬ−４はＩＬ−４レセプター外部ドメイン（ＥＣＤ）により認識された（図１ｄ）。これを達成するために、ヒトＩＬ−４  ＤＮＡを酵母ディスプレイベクターｐＣＴ３０２内にクローニングし、ｐＣＴ３０２＿ＩＬ−４ベクターを形成した。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＥＢＹ１００をｐＣＴ３０２＿ＩＬ−４ベクターで形質転換し、ＳＤＣＡＡプレート上で、３０℃にて３日間成長させた。ＩＬ−４酵母の各コロニーをＳＤＣＡＡ液体培地（ｐＨ４．５）内で、３０℃にて一晩成長させ、続いてＳＧＣＡＡ液体培地（ｐＨ７．０）内で、２０℃にて２日間誘導した。
【０１３０】
ＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１の、Ｃ−末端をビオチン標識した外部ドメインを、ストレプトアビジンとの結合による四量体選択のための、染色および選別試薬としての使用のために作製した。酵母をビオチン標識したＩＬ−４Ｒα（ｂ−ＩＬ−４Ｒα）、四量体化したビオチン標識γｃ（ｂ−γｃ）、またはｂ−ＩＬ−４Ｒα存在下のｂ−γｃで染色した。２μＭのｂ−γｃを４７０ｎＭのＳＡＶ−ＰＥ（ストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で１５分間、氷上でインキュベートすることで、最も高い濃度のγｃ四量体を形成した。分析をＡｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターシステムで実施した。
【０１３１】
酵母上にディスプレイされたＩＬ−４は、高親和性でＩＬ−４Ｒαと結合した（図１ｄ、２番目のパネル）が、ＩＬ−４Ｒαの不在下ではγｃに結合しなかった（図１ｄ、３番目のパネル）。ＩＬ−４Ｒαの存在下では、酵母上のＩＬ−４はγｃ細胞外ドメイン四量体に結合し、このことは、ヘテロ二量体レセプター複合体の協同的集合を示唆する（図１ｄ、一番右のパネル）。これらの実験は、それぞれＩＬ−４Ｒαおよびγｃによる、酵母上での野生型ＩＬ−４部位１および部位２の連続的な結合を示す。
【０１３２】
サイトカインの主要なγｃ相互作用へリックス（図１ｂ）であるＩＬ−４のＤへリックスのライブラリーを作製するために、Ｉ型レセプター三元複合体の結晶構造におけるＩＬ−４／γｃ界面を分析した。原子間接触に基づいて、へリックスＤの表面上の８つの残基が、２０個のアミノ酸のいずれかの使用を可能にするコドンＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ）にランダム化された、焦点を絞ったライブラリーを作製した（図１ｂ）。アセンブリＰＣＲを用いて、２×１０８の変異形を有する酵母ライブラリーを作製し、これは、理論上の全多様性（２．６×１０１０）の約１％を示す。
【０１３３】
そのうちの１つがランダム化した配列を含む１１個の重複したプライマーを用いて、アセンブリＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物を、プライマー、５’ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣＴＴＡＣ３’（配列番号２）および５’ＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣ３’（配列番号３）を用いてさらに増幅し、該プライマーは、酵母内での相同組み換えに必要なベクター配列相同性も含んでいた。以前説明された通り、挿入ＤＮＡを直線化したベクター主鎖およびエレクトロコンピテントＥＢＹ１００と組み合わせ、電気穿孔し、レスキューした。電気穿孔によって、２×１０８の形質転換体のライブラリーを得た。
【０１３４】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、ミルテニー社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））を用いて選択を行った。選択の第１のラウンドは、酵母ライブラリー由来の、形質転換体の数のおよそ１０倍の適用範囲である２×１０９の細胞で実施した。続く選択のラウンドでは、１×１０７の酵母細胞を用いた。
【０１３５】
酵母ライブラリーをＩＬ−４Ｒαで装飾して酵母上にＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα部位２を作製することで、選択を実行し、次いで、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて、インビトロ選択の５回のラウンドを通して、γｃ結合酵母を濃縮した（図１ｅ）。最初のラウンドでは、ＩＬ−４Ｒαの存在下で四量体γｃに結合した酵母を選択した。四量体γｃの濃度を低下させることで連続した選択ラウンド（２〜５）を実施し、最後の選択、６回目のラウンドは、１μＭ濃度の単量体γｃを用いた。γｃの高結合活性四量体は、比較的弱いγｃ結合の検知および初期の選択ラウンドのために必要不可欠であった。続く選択ランドでは、１×１０７の酵母細胞を使用した。ＩＬ−４ライブラリーを、ＳＤＣＡＡ溶液培地（ｐＨ４．５）で一晩、３０℃で新たに成長させ、続いて、２０℃にて２日間、ＳＧＣＡＡ液体培地（ｐＨ７．０）で誘導させた。１×ＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡの緩衝溶液と一緒に、ビオチン標識ＩＬ−４Ｒα（ｂ−ＩＬ−４Ｒα）、四量体化したビオチン標識γｃ（ｂ−γｃ）、またはｂ−ＩＬ−４Ｒγ存在下でのｂ−γｃで酵母を４℃にて２時間染色した。２μＭのｂ−γｃを４７０ｎＭのＳＡＶ−ＰＥ（ストレプトアビジン−フィコエリトリン抱合体、インビトロイゲン社）で、氷上で１５分間インキュベートすることで、γｃの四量体を形成させた。γｃ、２μｇ／ｍＬのＳＡ−ＰＥおよび５０μｌのミルテニー社抗ＰＥミクロビーズ／１×１０８酵母細胞の連続的な結合を通して、γｃとの単量体選択を行った。分析をＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで実施した。
【０１３６】
ＩＬ−４で選択した変異体の配列決定によって、２つの独特な配列、「ＲＱ」および「ＲＧＡ」変異体が明らかになり、ここで、その１つ、ＲＧＡは高度に濃縮されていた（表１）。ＲＱは、野生型ＩＬ−４からの残基のずれをたった１つしか含んでおらず、それはＲ１２１Ｑであった。興味深いことに、この位置のＱは、大部分のγｃ結合サイトカインに存在する。選択された一方のサイトカイン、ＲＧＡは、へリックスＤに７つの他の変化を一緒に伴って、Ｒ１２１Ｑ突然変異を含んでいた（ＲＱおよびＲＧＡの配列に関しては表１を参照）。
【０１３７】
実施例２：ＩＬ−４変異タンパク質の第２のレセプター鎖結合の特徴
得られたＩＬ−４変異タンパク質の結合の特徴を、特徴づけした。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってそれらの部位２結合親和性および動態をＩＬ−１３Ｒα１およびγｃに関して測定するために、バキュロウイルスおよびＩＬ−４Ｒαと形成された複合体を用いた組み換えＩＬ−４および変異体ＫＦ、ＫＦＲ、ＲＱおよびＲＧＡである（表１および図２を参照）。
【０１３８】
ヒトＩＬ−４変異体（アミノ酸１〜１２９）、ＩＬ−４Ｒα外部ドメイン（アミノ酸１〜２０２）、ＩＬ−１３Ｒα１（アミノ酸１〜３１０）およびγｃ（アミノ酸３４〜２３２）を、Ｎ末端ｇｐ６７シグナル配列およびＣ末端ヘキサヒスチジンタグと一緒にｐＡｃＧＰ６７Ａベクター（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））内に、インフレームでクローニングし、バキュロウイルス発現系を用いて作製した。ＳＦ９００ＩＩ培地（インビトロゲン社）で成長したスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞での形質移入および増幅によってバキュロウイルスのストックを調製し、タンパク質発現を、Ｉｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ（商標）培地（ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））で成長した懸濁イラクサギンウワバ（ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（ハイファイブ社（ＨｉＦｉｖｅ））細胞で実行した。４８〜６０時間後、ニッケル寒天（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））によって、ハイファイブ上澄みからタンパク質を発現させ、捕獲し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって濃縮および精製し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化した。細胞ベース分析で使用されたＩＬ−４変異体は、完全にグリコシル化して発現された。ＳＰＲ測定で使用された高親和性二元複合体（ＩＬ−４変異体を有するＩＬ−４Ｒα）を同時発現させ、完全にグリコシル化した。ビオチン標識レセプター発現のために、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１およびγｃを、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥおよびヘキサヒスチジンタグと一緒にｐＡｃＧＰ６７−Ａベクター内にクローニングした。レセプタータンパク質を、余分なビオチン（１００μＭ）を有するＢｉｒＡリガーゼと同時発現させた。結晶化のために、下で考察されるが、ＩＬ−４  ＲＧＡを、Ｎ結合グリコシル化部位Ａｓｎ５３がＧｌｎに突然変異したγｃと同時発現させた。ニッケル精製の後、結晶化タンパク質をカルボキシペプチダーゼ−Ａで一晩処理し、次いでサイズ排除を行った。タンパク質を結晶化のために８〜２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０１３９】
表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器上で実行した。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光計（サーモ・サイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いた２８０ｎｍのＵＶ分光測定によって定量した。全てのデータを、１：１ラングミュア結合モデルで、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア、バージョン２．０を用いて、全てのデータを分析した。実験では、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ビオチン標識したレセプターを、低密度（１００〜２００ＲＵ）で捕獲し、動態試験を４０μＬ／分で実行した。無関係のビオチン標識したタンパク質を、適合するＲＵを伴うＳＡセンサーチップの参照表面として実験用の表面に固定化した。全ての測定を、ランニング緩衝液（１×ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥヘルスケア社）、０．０１％ＢＳＡ）中のＩＬ−４変異体の３倍連続希釈を用いて行った。γｃ表面を、サイトカインＩＬ−４ＲＱおよびＩＬ−４ＲＧＡのために、７ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）および２５０ｍＭのＮａＣｌで再生した。１２０ｓ〜１９０ｓのＩＬ−４変異体結合および２０ｓ〜９００ｓの分離を用いて、動態データを決定した。
【０１４０】
表１．γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１に関するスーパーカインの結合親和性
【表１】
2018161143.tif 000003
【０１４１】
ＩＬ−１３Ｒα１およびγｃに関する野生型ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαのＫＤは、それぞれ４２００ｎＭおよび３３００ｎＭであった。ＫＦ／ＩＬ−４Ｒαは、ＩＬ−１３Ｒα１（ＫＤ＝２５０ｎＭ）およびγｃ（ＫＤ＝３３０ｎＭ）の双方への結合に対してより高い親和性を有した。ＫＦＲのＳ１２５Ｒ突然変異の追加は、ＩＬ−１３Ｒα１への親和性において４４０倍の改善（ＫＤ＝９．６ｎＭ）につながったが、低下したγｃへの親和性（ＫＤ＝６４００ｎＭ）につながった。このように、ＫＦＲはＩＬ−４に、ＩＬ−１３Ｒα１結合親和性において１０２．６倍の改善、および、γｃへの親和性において対応する２倍の低下をもたらした。親和性増強は、主に、オフ速度における１０３倍の低下によるものであった。この点では、移植は大きな成功であり、γｃと比較してＩＬ−１３Ｒα１に対する１０３倍の選択性につながった。ちなみに、ＩＬ−４のＤへリックスライブラリーもＩＬ−１３Ｒα１に対して選択し、この選択は驚くことに、ＩＬ−４残基１２２、１２４および１２５がそれぞれＬｙｓ、ＰｈｅおよびＡｒｇで置換されたコンセンサス配列をもたらした。これは、構造上の重なり（図１ｂ）に基づいて野生型ＩＬ−４にＩＬ−１３残基を移植することで操作したＫＦＲとほぼ同一である。
【０１４２】
酵母ディスプレイから選択したＲＱおよびＲＧＡをＩＬ４Ｒαと複合した場合、γｃに結合する、大幅により高い親和性を示した（表１、図２）。ＲＱ／ＩＬ−４Ｒαは、３６倍高いγｃへの親和性（ＫＤ＝９１ｎＭ）を示し、ＲＧＡ／ＩＬ−４Ｒαは、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαよりも３７００倍高い親和性（ＫＤ＝０．８９ｎＭ）を示した。ＲＱおよびＲＧＡの親和性の増加は、主にオフ速度での低下によるものであるが、さらに、オン速度では７および６倍速かった。ＲＱおよびＲＧＡ双方のスーパーカインは、ＩＬ−１３Ｒα１に対して実質的に低下した結合（それぞれ、ＫＤ＝２９，０００ｎＭおよび２１，０００ｎＭ）を示した。生理的濃度では、これらの変異体は無視できる程度のＩＩ型レセプター結合を示すであろう。
【０１４３】
このように、ＲＧＡは結合親和性をおよそ１０４倍増大し、Ｉ型レセプター複合体への選択性が、ＩＩ型レセプターよりも約１０６倍高い。まとめると、構造ベースおよびインビトロ進化アプローチは、機能試験に関して、より高い親和性およびレセプター選択性ＩＬ−４変異体をもたらした。これらＩＬ−４変異タンパク質を、ＩＬ−４「スーパーカイン」と呼び、具体的には、ＲＧＡ変異体を「スーパー４」と呼ぶ。
【０１４４】
実施例３：γｃに対するＩＬ−４親和性増強の構造上の基盤
理想的には、スーパー４といったＩＬ−４変異タンパク質の増大した親和性は、野生型ＩＬ−４／γｃ結合の配向の最小限の妨害によって実現された。第２の鎖、γｃとのスーパー４ドッキング様式が野生型ＩＬ−４に比べて乱されたかどうかを決定するために、結晶解析を実施した。遊離（たとえば、ＩＬ−４Ｒαに結合していない）スーパー４の、γｃに対するより高い部位２親和性（ＫＤ約３００ｎＭ）を考慮すると、ＩＬ−４Ｒαの不在下で、スーパー４／γｃ二元複合体を３．２５Åの分解能まで結晶化させることが可能であった（図３ａおよび４、表２）
【０１４５】
表２．データ収集および精密化統計（分子置換）
【０１４６】
【表２】
2018161143.tif 000004
【０１４７】
これを達成するために、０．１μＬのタンパク質［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中２０ｍｇ／ｍＬ］を同体積の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌおよび３０％ＰＥＧ−４０００と混合することで、ＩＬ−４  ＲＧＡ／γｃ結晶を２５℃にて、シッティングドロップで成長させた。結晶は、５〜１０日後に最大サイズの２００×４０×４０μＭまで成長した。凍結保護物質として２５％エチレングリコールを含む母液を用いた液体窒素中で結晶を急速凍結させた。アドバンスト・ライト・ソース（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ）で、ビームライン８−２で３．３Åデータセットを収集した。回析データを、ＨＫＬ２０００を用いて処理した。
【０１４８】
ＩＬ−４  ＲＧＡ二元結晶構造を、ＩＬ−４およびγｃの座標を別々に用いて（ｐｂｄコード３ＢＰＬ）、プログラムＰＨＡＳＥＲでの分子置換によって解析した。全ドメインが配置された後、野生型配列をＩＬ−４  ＲＧＡに転化し、ＰＨＥＮＩＸでの精密化およびＣＯＯＴでのモデル調節のラウンドを反復して構造を精密化した。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）を用いてラマチャンドラン分析を行った。埋没表面積値（ｂｕｒｉｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，Ｓｕｒｆａｃｅｓ，ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ（ＰＩＳＡ）サーバー（ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ−ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ）を用いて計算した。ＩＬ−４  ＲＧＡは、２つの二元複合体を含んでいた。全ての構造上の図形および外面を、ＰｙＭＯＬを用いて準備した。
【０１４９】
Ｉ型シグナル伝達三元複合体とのスーパー４／γｃ二元複合体の重なりは、サイトカイン−レセプター配向において大きな乱れを一切示さなかった。
【０１５０】
スーパー４／γｃ界面では、側鎖密度がスーパー４のへリックスＤ残基１１７１２７に関して明確であった（図４）；これらは、ＩＬ−４と位相的に類似した方法で、γｃ結合部位を、中央位置を占めるγｃホットスポット残基Ｙ１２４に結合させる（図２ｃ）。スーパー４の増強した親和性の根底にある可能性のあるメカニズムは、Ｓ１２５のＦとの置換であり（図２ｄ、左パネル）、これは、以前は占められていなかったγｃの大きな疎水性ポケットの中に挿入し、埋没表面積（ＢＳＡ）の追加の５２．５Å２に寄与する（図２ｄ、右パネル）。ＩＬ−４  Ｙ１２４が占めるγｃの疎水性の溝は、スーパー４でＷに突然変異された場合、ＢＳＡにおいて変化しなかったが、接触界面のこの領域は、Ｔｒｐ−Ｎ７からγｃの主鎖カルボニルに水素結合を得た。Ｒ１２１Ｑスーパーカインは単独でＳＰＲによる実質的な親和性増大を示した（表２）。これは、ＩＬ−４  Ｒ１２１とγｃ  Ｓ２１１との間の以前の水素結合が失われ、γｃのＳ２１１へのＫ１１７Ｒの結合に置換される、再構築された極性相互作用（図５）のためであるようである。ＩＬ−４およびスーパー４のγｃとのアミノ酸相互作用の詳細な比較を表３で示し、これは、γｃとスーパー４の相互作用対γｃのＩＬ−４との相互作用を比較したリガンド−レセプター接触の表である（接触は、太文字で示されない限りはファンデルワールス相互作用を意味し、これらは、Ｈ結合距離内である）。
【０１５１】
表３．リガンド−レセプター接触の表
【０１５２】
【表３】
2018161143.tif 000005
【０１５３】
表３の太文字は可能性のあるＨ結合（３．５Åカットオフ）またはγｃからスーパー４の塩橋を意味する。表３のイタリック体は、可能性のあるＨ結合（３．５Åカットオフ）またはγｃからＩＬ−４の塩橋を意味する。
【０１５４】
実施例４：ＩＬ−４変異タンパク質は細胞活性化ができる
様々な細胞型に対する、開示されるＩＬ−４変異タンパク質の影響を試験した。スーパーカインの第２の鎖の動員の平衡定数がＩＬ−４のものよりも劇的に異なったため、主にＩ型もしくはＩＩ型ＩＬ−４レセプターまたは顕著な量の双方を発現する細胞型のスーパーカインの挙動を試験した。
【０１５５】
最初に、ラモスＢ細胞、ＨＨ  Ｔ細胞、Ｕ９３７単球およびＡ５４９上皮細胞を含む、複数の異なるヒト細胞系統でのＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１のＲＮＡおよびタンパク質発現を決定した。ラモス、Ｕ９３７、Ａ５４９およびＨＨ細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含むＲＰＭＩで成長させ、５％ＣＯ２と一緒に３７℃で維持した。細胞を一晩血清不足にし、回収した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社）で飢餓細胞からＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロゲン社）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。定量的ＰＣＲ応答を、７９００3ＨＴ配列検知システム（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて実行した。ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１およびγｃを検知するプライマー／プローブのセット（ＦＡＭ−ＭＧＢプローブ）ならびに１８Ｓを検知するためのＴａｑＭａｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＶＩＣ−ＭＧＢプローブ）は、アプライド・バイオシステム社のものである。ｍＲＮＡ量を１８ＳリボソームＲＮＡに正規化した。リアルタイムＰＣＲによる、各レセプター鎖のｍＲＮＡの相対発現を図３ａに示す。ラモス細胞は他の細胞系統よりも約３〜４倍多くＩＬ−４ＲαのｍＲＮＡを有した。ＨＨ  Ｔ細胞系統およびＵ９３７単球系統がγｃの発現を豊富に有した一方で、ラモスは低いが測定可能な量のγｃを発現した。Ａ５４９は、低い、または、検知不能な量のγｃを有した。ＩＬ−１３Ｒα１に関しては、Ａ５４９上皮細胞系統が最も高い発現を有し、Ｕ９３７細胞が明らかに検知可能な量のレセプターを有した一方で、ラモスおよびＨＨ細胞では、ＩＬ−１３Ｒα１のｍＲＮＡ発現は、ＰＣＲの感度の下限であった。
【０１５６】
このように、ｍＲＮＡ量に基づくと、ラモス細胞は比較的、ＩＩ型ＩＬ−４レセプターをほとんど有さない。ラモス細胞は大量のＩＬ−４Ｒαを有するものの、それらのＩ型レセプターの量は、γｃの比較的低い発現によって制限される。Ａ５４９細胞は、ＩＩ型レセプターを豊富に有し、Ｉ型レセプターをほとんどまたは一切有さない。最後に、Ｕ９３７はＩ型およびＩＩ型レセプター鎖ＲＮＡの双方を相当量で有する。
【０１５７】
ＦＡＣＳ染色により、ラモスはＩＬ−４Ｒαの高発現を示した。ＨＨおよびＵ９３７がγｃの最も高い発現を示した一方で、ラモスは比較的低い、この鎖の発現を示した。ＩＬ−１３Ｒα１発現はＡ５４９細胞で最も高かった（図６ｂ）。ＩＬ−４レセプター鎖の細胞表面発現を、ＦｃレセプターＩ、ＩＩおよびＩＩＩを遮断した後に実施した。ＣＤ２３に対する抗体、ＩＬ−４Ｒαおよびγｃ抗体をＢＤから購入し、ＩＬ−１３Ｒα１に関してはＲ＆Ｄから購入した。
【０１５８】
ＳＴＡＴ６  Ｙ６４１リン酸化の決定は、細胞内シグナルを伝達できるレセプター複合体の集合に直接的に依存した、ＩＬ−４シグナル伝達でのかなり初期の事象を測定する定量化ツールを提供した。ＳＴＡＴ６  Ｙ６４１リン酸化には、Ｊａｋキナーゼの活性化、および、ＩＬ−４Ｒαの細胞内チロシン、特にＹ５７５、Ｙ６０３およびＹ６３１のリン酸化が必要である。これらのリン酸化チロシンは、ＳＴＡＴ６のＳＨ２ドメインのためのドッキング部位として役に立ち、次いで、Ｙ６４１でリン酸化し、ＳＴＡＴ６の二量体化およびそれに続く核への流入につながる。
【０１５９】
ＩＬ−４およびそのスーパーカインへの応答を実験するために、上記の細胞型を用いた。ＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲの刺激活性を試験した。スーパー４は、ＩＬ−４Ｒαと複合した場合、γｃへの結合に関して最も高いＫＤを有し、ＫＦＲはＩＬ−１３Ｒα１への結合に関して最も高いＫＤを有する。
【０１６０】
ラモス細胞を用いて、Ｉ型レセプター複合体が大勢を占めるＩＬ−４応答を試験した（図７および８）。様々な時間の間、ラモス細胞をＩＬ−４またはスーパー４またはＫＦＲスーパーカインのいずれか１００ｐｇ／ｍｌ（約７ｐＭ）で刺激すると、刺激から２０分での最大誘導が、３０分で持続しており、６０分で少しずつ減少したことが分かった（図４ａ）。ＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲによるＳＴＡＴ６リン酸化の刺激の時間経過は類似しているが、スーパー４は、測定された時間点全てにおいてＩＬ−４またはＫＦＲよりも実質多くのリン酸化を誘導した；２０分の刺激後、スーパー４によって誘導されたＳＴＡＴ６リン酸化の平均ＭＦＩは１９．６であり、ＩＬ−４によって誘導されたＳＴＡＴ６リン酸化の平均ＭＦＩは７．７であり、ＫＦＲによって誘導されたＳＴＡＴ６リン酸化の平均ＭＦＩは５，４である。
【０１６１】
刺激する前に、２％ＦＢＳを含む成長培地で細胞を一晩培養した（「飢餓状態」）。氷冷メタノール（９０％）透過処理を行った後に細胞内ｐＳＴＡＴ６染色を実施した。抗ｐＳＴＡＴ６抗体はＢＤバイオサイエンス社から購入した。刺激していない試料から刺激した試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を引くことで、ＳＴＡＴ６リン酸化の誘導を計算した。
【０１６２】
ＩＬ−４、スーパー４、ＫＦＲならびにＲＱおよびＫＦの濃度／応答曲線も決定した。３０ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）から１００，０００ｐｇ／ｍｌ（７．４ｎＭ）の範囲に及ぶＩＬ−４またはスーパーカインの濃度で飢餓状態のラモス細胞を１５分間刺激したが、多くの実験では範囲は３０〜１，０００ｐｇ／ｍｌに制限された。ＩＬ−４およびスーパー４は双方とも類似した量のＳＴＡＴ６リン酸化をもたらしたが、スーパー４がプラトーレベルに到達するために１，０００ｐｇ／ｍｌを必要とした一方で、ＩＬ−４はプラトーレベルを達成するために１０，０００〜３０，０００ｐｇ／ｍｌを必要とした（図７ｂ）。
【０１６３】
３０〜１０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲のＩＬ−４および４つのスーパーカインに対するラモス細胞の応答の分析を実行した（図７ｃおよび８）。スーパー４は、試験された全濃度でＩＬ−４よりも優れていた；スーパー４で達成されたのと同じ度合いのＳＴＡＴ６リン酸化を達成するために、約３倍多くのＩＬ−４が必要である。ＫＦ、ＲＱおよびＩＬ４は概してお互い類似していた；ＫＦＲはＩＬ−４よりも少ない刺激をもたらし、３倍未満ほど活性が低かった。その結果、スーパー４はＫＦＲよりも約１０倍より活性が高い。このように、定性的には、γｃに対して最も親和性を有するＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体を形成するスーパーカインＩＬ−４は、ラモス細胞で最も活性が高く、最も低い親和性を有するスーパーカインは最も活性が低かった。しかし、ＩＬ４に勝るスーパー４の相対的な利点は、ＩＬ−４Ｒαと複合した場合のγｃに対するそれらの溶液平衡定数における約３７００倍の違いと比較すると、比較的控えめである。
【０１６４】
上記の通り、第２の鎖としてＩＬ−１３Ｒα１を主に用いるＡ５４９細胞で、同様の分析を実行した。これらの細胞に関して、ＫＦＲおよびＫＦはＩＬ−４よりも３〜１０倍刺激性が高かった；スーパー４およびＲＱはＩＬ−４と変わりなかった（図４ｄ）。ＩＬ−４Ｒαと複合したＫＦＲが、ＩＬ−１３Ｒα１のための溶液にてＩＬ−４よりも約４００倍大きい親和性を有した一方で、ＫＦはＩＬ−４よりも約１０倍の利点しか有さなかった。より高い親和性のスーパーカインはより良好な応答をもたらすが、それらの利点の度合いはそれらの溶液親和性の違いとは直接的には相関していないという性質上の同意は依然とあった。
【０１６５】
実施例５：レセプター集合のモデリング
スーパー４が約３〜１０倍より強力な、ＳＴＡＴ６リン酸化の活性剤であった一方で、γｃに関する三次元平衡はＩＬ−４のものよりも約３７００倍高かったという考えは、シグナル誘導レセプター形成が、どのように第２の鎖の発現によって決定されるかという分析を促した。マクロファージの約４０のレセプターは、ほとんど最大限のＳＴＡＴ６活性化をもたらすであろうと計算されていた。従って、細胞レベルでスーパー４が有した驚くほどに控えめな利点は、形成されたレセプター複合体の比較的低い数と何か関係があり得、および／または、第２の鎖の数が低い、たとえば、リガンドが利用可能な第２の鎖と競合する場合として観測され得る。
【０１６６】
この疑問を解決するため、計算的なアプローチを用いた。第２の鎖の数を変える、および、第２の鎖の平衡定数値を変える際に、リガンド濃縮の機能としてレセプター複合体の集合を予測するＭａｔｌａｂ（登録商標）スクリプトを適用した。
【０１６７】
ラモス細胞上のＩＬ−４Ｒα鎖の数は約１５００であるため、レセプターの集合をこの数に固定化した。γｃの数を４５００に設定した場合は第２の鎖Ｋを０．０１から１．０に増大することに対して比較的控えめな効果が計算されたが、γｃの数を５００に設定した場合、第２の鎖Ｋの増大は集合したレセプター鎖の数に強力な影響を有した（図９ａ、左および右のパネルを比較）。
【０１６８】
このように、１００ｐｇ／ｍｌのサイトカイン濃度では、第２の鎖の数が４５００であった時にＫ＝０．０１μｍ２と比較したＫ＝１μｍ２の集合した複合体の比が６．７であった一方で、γｃの数を５００に設定した場合はその比は３４．５であった。サイトカインの濃度が１０倍高い、１０００ｐｇ／ｍｌだったとき、４５００のγｃ分子に関するＫ＝１μｍ２／Ｋ＝０．０１μｍ２の比は６．８である一方で、γｃの数が５００だった時は２５．６であった。このように、第２の鎖の数が比較的低い場合、増大する第２の鎖Ｋはさらに有用になる。このことは、低い量のγｃまたはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞は、第２の鎖に対して増強された親和性から最も強力に利益を得るが、大きい数のγｃまたはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞は、高い親和性のスーパーカインとＩＬ−４との間でより不十分に区別するはずであるということを効果的に意味する。
【０１６９】
別の疑問は、細胞１個あたりかなり少数のγｃ分子を有する細胞の複合体の集合上でスーパーカイン／ＩＬ−４Ｒα複合体の親和性を増大することの効果であろう。２次元Ｋが一定に維持され、γｃ分子の数が４５００から１６７に変化した時の、レセプター複合体の集合を計算した。インビトロでのほとんどの刺激アッセイで使用されたサイトカインの濃度において、ＩＬ−４のために推奨される２次元Ｋである、０．０１μｍ２のγｃのための２次元Ｋを有したＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体は、たった１６７個のγｃ分子しか持たない細胞上でかなり少数のレセプターを集合させた（１００ｐｇ／ｍｌでは１未満、および１０００ｐｇ／ｍｌでは３．６）（図９ｂ、右パネル）。このように、そのような細胞は、これらのサイトカイン濃度でＩＬ−４に対して基本的に無応答であるはずである。対照的に、１μｍのγｃに関して２次元Ｋを有するであろうスーパーカインは、１００ｐｇ／ｍｌで３３個の複合体および１０００ｐｇ／ｍｌで１０９個の複合体を集合させるであろう（図９ｂ、左パネル）。
【０１７０】
いくつの集合した複合体が、ラモス細胞における最大刺激のために理論上十分であるのかを評価するために、ＩＬ−４およびＲＧＡがＳＴＡＴ６リン酸化に関して類似したプラート値を刺激するかどうかを決定した。ＩＬ−４およびＲＧＡは、ＳＴＡＴ６リン酸化に関して類似したプラート値を確実に刺激した；ラモス細胞では、１０，０００と３０，０００ｐｇ／ｍｌの間のＩＬ−４でプラートが達成される（図７ｂ）。第２の鎖（０．０１μｍ）に対して低い親和性を有したリガンドに関する集合した複合体の数を、１０，０００および３０，０００ｐｇ／ｍｌのγｃ鎖の中間数（１５００）を用いて計算した。集合した鎖の値は、６５と７１との間（図９ｃ）であり、より多くの鎖を集合させることはより大きなシグナル伝達にはつながり得ないことを示唆した。もし低いγｃ数（５００）を選択していたら、最大刺激に対して集合した鎖の数は、対応してより低くなっていたであろう。しかし、最大シグナルを与える約７０の集合したレセプターの値は控えめな推定である。
【０１７１】
このように、１００ｐｇ／ｍｌで使用される高親和性スーパーカインによって達成される３３個の集合した複合体は、１６７個のγｃ分子を発現する細胞による実質的な応答には十分であるはずであり、１０００ｐｇ／ｍｌで集合した１０９個の複合体は、最大応答をもたらすはずであった。このことは、これら低濃度ではＩＬ−４に応答していなかった細胞が高親和性スーパーカインには応答し、予期しない応答（および毒性）が、第２の鎖に対して非常に高い親和性を伴うＩＬ−４スーパーカインを操作することで達成され得る可能性を高めるであろう。
【０１７２】
実施例６：第２の鎖発現を変化させる
γｃ発現での増加はＩＬ−４に対してスーパー４が有した利点を低下させることが予測され得るため、ラモス細胞よりもはるかに高いγｃ発現を有したＨＨ細胞系統で、ＩＬ−４およびスーパー４に対する感受性を実験した（図６ａおよびｂ）。スーパー４は、１０ｐｇ／ｍｌから１０，０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲にわたって、ＨＨ細胞でのＳＴＡＴ６のリン酸化においてＩＬ−４よりも優れてはいなかった（図１０ａ）。
【０１７３】
第２の鎖の数の、ＩＬ−４およびスーパーカインへの相対的応答に対する寄与の別の試験は、γｃの到達性を低下させることである。この目的のために、異なる濃度の抗γｃ抗体を刺激培養に添加した。１００ｐｇ／ｍｌのスーパー４でラモス細胞を刺激すると、ＳＴＡＴ６活性化で判断して、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４を勝る実質的な利点をもたらした（図７ｃ）。これらの細胞を、抗γｃの存在下または不在下で、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４またはスーパー４／ＲＱ／ＫＦ／ＫＦＲスーパーカインで刺激し、フローサイトメトリーによってＳＴＡＴ６のリン酸化を測定し、抗γｃによってもたらされたＳＴＡＴ６リン酸化のパーセンテージ低下を計算した。ＩＬ−４によって誘導されたＳＴＡＴ６リン酸化が５０μｇ／ｍｌの抗γｃによって５８％減少した一方で、スーパー４に関しては、減少はたったの１２％だけであった（図１０ｂ；図１８）。ＲＱおよびＫＦスーパーカインに関しては、阻害は約４０％であり、ＫＦＲに関しては、阻害はＩＬ−４に関してのものと類似していた。これらの結果はγｃへの結合のためのＬ−４およびスーパーカインの相対溶液ＫＤの結果と一貫しており（スーパー４＞ＲＱ、ＫＦ＞ＩＬ−４＝ＫＦＲ、表１）、第２の鎖の発現が低下する場合、第２の鎖に対する親和性の増加は、より大きな刺激の区別をもたらすという考えを支持する。
【０１７４】
類似したγｃ遮断実験を、Ｕ９３７単球細胞系統上でも実施した。γｃ遮断実験に関しては、一晩飢餓状態にしたラモスまたはＵ９３７細胞を、阻止抗体と共に、３７℃にて１時間、インキュベートした。
【０１７５】
Ｕ９３７細胞系統は、Ｉ型およびＩＩ型ＩＬ−４レセプターの双方を発現し、γｃの遮断はＩＬ−４応答を低下させることが予測され得る一方で、ＩＩ型レセプターを原則的に使用するためＫＦＲスーパーカインの活性にはほとんど影響はないはずである。実際に、Ｕ９３７細胞でのγｃ遮断は、ＩＬ−４に応答するＳＴＡＴ６リン酸化において４４％の低下をもたらしたが、ＫＦＲスーパーカインに対する応答では７％の低下だけであった（図１０ｃ）。
【０１７６】
実施例７：ＩＬ−４およびスーパーカインに対する、ヒト細胞の一次応答
様々なスーパーカインに対する応答は、どの第２の鎖をそれらが第１に使用するか次第であったことを確認するために、ヒト末梢血液白血球（ＰＢＬ）のＳｔａｔ６リン酸化応答を試験した（図１１）。ＰＢＬは、刺激されなかったか、１５分間、ＩＬ−４または様々なスーパーカインで刺激されたかのいずれかであった。ＳＴＡＴ６  Ｙ６４１リン酸化をフローサイトメトリーで測定し、様々な末梢血液細胞型の応答性を試験した。スーパー４に対するリンパ球の応答は、低いリガンド濃度で著しくより良好であった。
【０１７７】
１００ｐｇ／ｍｌにおける、ＩＬ−４と比べたスーパー４によるＳＴＡＴ６リン酸化の利点の比較のためのＰ値は０．０００３であり、１ｎｇ／ｍｌでは、Ｐ値は０．０１０４であり、１０ｎｇ／ｍｌでは、Ｐ値は統計的に有意ではなかった（０．１４９３）。比較上、リンパ球ＳＴＡＴ６リン酸化における、ＫＦＲ−スーパーカインと比較したＩＬ−４の利点を比較するための対応するＰ値は、０．０００５、０．０００４および０．５３６４であった。これらの発見は、ヒトリンパ球における、第２のレセプター鎖としてのγｃの第１の使用に一致している（図１１ａ）。単球および好中球は、ＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲに対するそれらの応答で、ほとんど違いを示さなかった。
【０１７８】
初代細胞上のＩ型およびＩＩ型ＩＬ−４レセプターの発現の度合いを確認するために、６人の健康なドナー由来のＢ細胞、Ｔ細胞、単球および好中球におけるＩＬ−４Ｒα、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１をフローサイトメトリーで測定した。ＩＬ−４Ｒα発現がＢ細胞上で一番高い一方で、単球および好中球はＩＬ−４Ｒα発現ではほとんど違いを示さず、Ｔ細胞は一番少ないＩＬ−４Ｒαを有した（図１１ｂ、１１ｃおよび１１ｄ）。γｃに関しては、単球とＣＤ４  Ｔ細胞との間の発現には、違いは比較的ほとんどなかった。Ｂ細胞は少しだけより少ないγｃを有し、ＣＤ８  Ｔ細胞は一番低い量を有した。予測された通り、ＩＬ−１３Ｒα１発現が単球で一番高い一方で、ＢおよびＴ細胞は非常に低いこの鎖の発現を有した。ＰＢＬは、刺激されなかったか、１５分間、ＩＬ−４または様々なスーパーカインで刺激されたかのいずれかであった；ＳＴＡＴ６  Ｙ６４１リン酸化を、フローサイトメトリーで測定した。スーパー４は、ＩＬ−４よりも強力なＳＴＡＴ６のリン酸化を誘導し、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞におけるＫＦＲよりもはるかに強力なリン酸化を誘導した（図１１ｅ）。単球は、γｃおよびＩＬ−１３Ｒα１双方のそれらの発現に一致して、ＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲに対するそれらの応答においてほとんど違いを示さなかった。
【０１７９】
スーパー４は、ＩＬ−４よりも強力なＳＴＡＴ６のリン酸化を誘導し、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞におけるＫＦＲよりも実質的に強力なリン酸化を誘導した（図１２）。単球は、ＩＬ−４、スーパー４およびＫＦＲに対するそれらの応答においてほとんど違いを示さなかった。多少驚くことに、Ｂ細胞は、比較的低い量の感知可能なＩＬ−１３Ｒα１にも関わらず、ＫＦＲに良好に応答した。
【０１８０】
ＴＨ９分化アッセイ
ＩＬ−４およびスーパーカインの機能上の特異性および免疫調節性能力を試験するために、ＣＤ４  Ｔ細胞および単球を含む一連の実験を実施した。ＴＧＦ−βおよびＩＬ−４の組み合わせは、未処置のヒトＣＤ４  Ｔ細胞の、ＴＨ９細胞への分化を促進する。スーパー４が野生型ＩＬ−４よりも強力にＴＨ９分化を誘導するかどうかを試験するために、未処置のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２５−Ｔ細胞を単離した。
【０１８１】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア社）での密度勾配遠心分離の前にＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ステム・セル・テクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞を健康なドナーから得たバフィーコート（スタンフォード血液センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ））から調製した。未処置のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２５−Ｔ細胞をＮａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））で、磁力で分別した。
【０１８２】
次いで、１０％Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｙｐｅ  ＡＢ（ロンザ社）、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン（インビトロゲン社）および５０μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地（ロンザ社）中における、４８ウェル平底プレート（ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ））内で、３７℃にて、細胞を培養した。５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（イー・バイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））および指示された濃度のＩＬ−４、スーパー４またはＫＦＲの存在下で、１：１のビーズ対細胞比にて、抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズ（インビトロゲン社）と、２．５×１０５細胞／ｍＬにて細胞を培養した。
【０１８３】
培養４日後、ビーズを磁気で除き、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（イー・バイオサイエンス社）の存在下で、４時間、２５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよび７５０ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（インビトロゲン社）で細胞を再度刺激した。細胞を次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（インビトロゲン社）で染色し、次いで、製造業者のプロトコルに従って固定化および透過処理した（イー・バイオサイエンス社）。続いて細胞を、蛍光標識したＩＬ−９およびＦｏｘｐ３に対する抗体で、染色した（イー・バイオサイエンス社）。標識した細胞を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）上で分析し、ＦＡＣＳプロットをさらにＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社）によって分析した。示されるＦＡＣＳデータは全て、一重線および生細胞に対してゲート化されている。
【０１８４】
１０または１００μｇ／ｍｌのスーパー４で準備することは、同一濃度のＩＬ−４またはＫＦＲで準備した時よりも著しく高いパーセンテージである、それに続くＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激の際にＩＬ−９を生産した細胞をもたらした（図１３ａ）。
【０１８５】
樹状細胞の分化アッセイ
ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたＩＬ−４は、ヒト単球から、樹状細胞（ＤＣ）のインビトロ分化を誘導する。このプロセスに関するＩ型またはＩＩ型レセプターの相対的な役割はまだ明らかになっていない。スーパー４がγｃに優先的に結合し、ＫＦＲはＩＬ−１３Ｒα１ライゲーションに向かってそれることを考慮し、ヒトＤＣ分化の間のγｃおよびＩＬ−１３Ｒα１経路のために必要な要件を解明した。
【０１８６】
Ｒｏｓｅｔｔｅ（登録商標）Ｓｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ステム・セル・テクノロジーズ社）を用いた密度遠心分離、それに続く抗ＣＤ１４複合ミクロビーズ（ミルテニー・バイオテク社）での磁気分離によって、健康な血液ドナー（スタンフォード血液センター）から得た末梢血液単核細胞から、ＣＤ１４＋単球を単離した（９７％超純度）。次いで、１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および５０μＭの２−ＭＥを添加したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を含む１２ウェルプレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ））内で、５×１０５のＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ単独と培養、または、指示された濃度のＩＬ−４、ＫＦＲまたはスーパー４で培養した。新しいサイトカインを２日目および４日目に添加した。
【０１８７】
６日目に、細胞を５ｍＭのＥＤＴＡで処理し、続いて、ＤＡＰＩ（インビトロゲン社）、蛍光標識化アイソタイプ制御ｍ抗体またはｍ抗体で、ＣＤ１４、ＣＤ８６、ＣＤ２０９およびＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤバイオサイエンス社）に対して染色した。樹状細胞分化を、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを有するフローサイトメトリーによって評価し、細胞表面マーカー発現の平均蛍光強度をＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社）で検知および分析した。
【０１８８】
ＣＤ２０９、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの上方制御によって評価して、ＩＬ−４およびＫＦＲが単球のＤＣへの分化を引き出した一方で（図１３ｂおよび図２２）、スーパー４は同じことができず、このことは、ＤＣ分化が主に、ＩＩ型ＩＬ−４レセプター複合体経由のシグナル伝達によって推進されることを示唆し、該ＩＩ型ＩＬ−４レセプター複合体は、スーパー４に不十分に結合される。単球のＤＣへの成熟はまた、ＣＤ１４の下方制御と関連している；スーパー４は、下方制御ＣＤ１４において、ＫＦＲまたはＩＬ−４よりも効率性が低い（図１３ｂ）。さらに、異なる樹状細胞のサブセットを区別するためにさらに使用されたマーカーの分析は、スーパー４の有無にかかわらず、ＧＭ−ＣＳＦによって誘導された細胞は、表現型的に同一であり（図２３）、このことは、スーパー４によって誘導された細胞は、別個の樹状細胞サブセットに分化したというよりは、別個の樹状細胞サブセットに不完全に分化したということを示唆する。
【０１８９】
ＤＣ分化におけるＩ型およびＩＩ型ＩＬ−４レセプター複合体の相対的な役割を確認するために、抗−ＩＬ−４Ｒα（Ｉ型およびＩＩ型レセプター特異性）がＩＬ−４およびＫＦＲに応答してＣＤ８６およびＣＤ２０９の発現を低下させる一方で、抗−γｃ（Ｉ型レセプター特異性）は同じことができなかったことを、本明細書で示した（図１４）。前述の通り、スーパー４は、これらマーカーの非常に控えめな誘導を引き起こした。スーパー４によって誘導されたＣＤ１４下方制御は、抗ＩＬ−４Ｒαによって部分的に阻害されたが、抗γｃによっては阻害されなかった。興味深いことに、γｃに対する中和抗体を使用した場合、ＩＬ−４およびＫＦＲは依然として、対照条件下と同じ量のＤＣ成熟を誘導し（図１４）、ＤＣ分化は、ＩＩ型ＩＬ−４レセプター複合体を介して生じることを確認した。
【０１９０】
実施例８：単球のＩＬ−４およびスーパーカインによって誘導されるシグナル活性化プロファイル
ＩＬ−４および２つのスーパーカインが単球において同じ程度までＳＴＡＴ６を活性化したため、スーパー４のＤＣ分化を誘導する能力を決定した（図１１（ｅ）、図１２および図１９）。精製した単球を２つの用量のサイトカインで処理し、１つの用量は、Ｐ−ＳＴＡＴ６  ＥＣ５０値（３０ｐＭ）（図１５）に対応しており、もう一方の用量は、飽和状態（５０ｎＭ）（図２０）に対応していた。ＳＴＡＴ６およびＩＲＳ１リン酸化の量ならびにγｃおよびＩＬ−１３Ｒα１レセプターの下方制御を示した時間で分析した。低用量では、スーパー４およびＫＦＲはＩＬ−４と比較して遅れたＳＴＡＴ６およびＩＲＳ１の活性化を示した。γｃまたはＩＬ−１３Ｒα１のいずれの顕著な内部移行も一切観察されなかった（図１５）。高用量では、３つのサイトカインは、ＳＴＡＴ６およびＩＲＳ１活性化の同一の動態プロファイルを誘導した。ＫＦＲは、刺激の終わりに近い時間で、ＩＬ−１３Ｒα１のより強力な内部移行を示した（図２０）。概して、これらの結果によって、表面レセプター内部移行とシグナル伝達活性化との間の相関関係の欠如が示される。さらに、シグナル伝達活性化の遅れた動態だけでは、スーパー４のＤＣ分化を誘導する非効率性を説明できず、ＩＩ型レセプター特異性シグナル伝達がＤＣ分化に必要であることを示唆する。
【０１９１】
実施例９：単球のＩＬ−４およびスーパーカインによって誘導される遺伝子発現プロファイル
ＤＣの分化において、ＩＬ−４およびスーパーカインによって誘導される遺伝子プログラムの重複性の程度に対して定性的な見識を得るために、ＧＭ−ＣＳＦで同時に処理した単球の野生型ＩＬ−４および２つのスーパーカインに応答した遺伝子発現のゲノム全体の分析を実施した。ＣＤ１４＋単球を、５人の健康なドナーから単離し、６時間、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ単独で、または、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、スーパー４、またはＫＦＲで刺激した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（シグマ社）に溶解した。組み合わせたＴＲＩｚｏｌ／ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ（キアゲン社）プロトコルを用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの品質を２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社）で確認した。ｃＤＮＡを作製し、Ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（アジレント社）を用いて、Ｃｙ３で標識される単一処理試料（ＧＭ−ＣＳＦ単独）およびＣｙ５で標識される二重処理試料で標識した。各ドナーに関し、各Ｃｙ５標識化二重処理（ＩＬ−４、Ｓｕｐｅｒ−４またはＫＦＲのいずれかを伴うＧＭ−ＣＳＦ）の試料を、８×６０Ｋ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｇｅｎｅ発現マイクロアレイ（アジレント社）上にＧＭ−ＣＳＦを伴う対応するＣｙ３標識化単一処理と同時ハイブリダイズし、製造業者の説明書に従って処理した。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（アジレント社）を用いて生のデータを正規化した。二重処理と単一処理の間、および変異形の間の変化の統計的分析のために、対応のあるｔ検定分析を用いた。遺伝子発現分析をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１１．５およびＥｘｃｅｌ上で実施した。６個未満のアレイでしか検知されなかった実体、品質管理プローブおよび長い遺伝子間非コードＲＮＡのためのプローブは除外した。ＧＭ−ＣＳＦ単独と比較して（Ｃｙ５対Ｃｙ３）少なくとも１つの二重処理群で有意な変化（対応のあるｔ検定）があった実体を保持した。２つの所与のサイトカインの間の倍変化統計的分析を、対応のあるｔ検定によって決定した。ミクロアレイデータをＮＣＢＩ（ＧＥＯシリーズ受託番号：ＧＳＥ４０２００）のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）Ｄａｔａｂａｓｅに提出した。
【０１９２】
散布図の相関関係に示される通り、３つのサイトカインはかなり大部分の遺伝子を同程度まで誘導する（図１６）。しかし、興味深いことに、遺伝子発現特異性のマイナーなポケットはＩＬ−４と２つのスーパーカインとの間でも観察され得る。図１６ｂのベン図によって示される通り、相当な数の遺伝子がたった１つまたは２つの使用されたサイトカインによって顕著に誘導された。図１６ｃのヒートマップは、ＩＬ−４および２つのスーパーカインによって誘導された発現パターンにおける明確な違いが観察された、サイトカイン選択的遺伝子の代表的なセットを示す。単球のスーパーカインおよびＩＬ−４によって差次的に制御される遺伝子の一覧表を表４に示す。ＴＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＡおよびＣＩＳＨといったＤＣ特異性遺伝子は、ＩＬ−４およびＫＦＲによって、スーパー４によってよりも高い量まで明らかに誘導され、ＩＬ−４に誘導される樹状細胞分化プロセスを偏らせ得るＩＩ型ＩＬ−４レセプターから来る特定のシグナルに一貫している。
【０１９３】
表４．スーパーカイン選択的遺伝子の倍誘導（平均値、初めの３つのコラムのデータ）およびｐ値（対応のあるｔ検定、最後３つのカラム）。
【表４】
2018161143.tif 000006
【表５】
2018161143.tif 000007
【表６】
2018161143.tif 000008
【０１９４】
実施例１０：ＩＬ−４および２つのスーパーカインによって誘導されるサイトカイン分泌プロファイル
操作されたサイトカインによって誘導されるＤＣの機能性をさらに評価するため、８日間、最後の２４時間はＬＰＳ刺激を行う、または行わないで、培養した細胞の上澄み上でＬｕｍｉｎｅｘアッセイを実施することで、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の分泌パターンを比較した。
【０１９５】
Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインのプロファイリングに関しては、培養上澄みを８日目（２μｇ／ｍｌのＬＰＳでの２４時間刺激を伴う、または伴わない）に回収した。ヒト５１−プレックスキットをアフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）から購入し、下記の変更を伴って、製造業者の推奨に従って使用した。簡潔に、９６ウェルフィルター底プレート上で試料を抗体結合ポリスチレンビーズと混合し、２時間室温でインキュベートし、続いて、４℃で一晩インキュベートした。プレートを真空濾過し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで、ビオチン標識化検知抗体で、２時間室温でインキュベートした。試料を次いで上記の通り濾過および２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥに再懸濁した。室温での４０分間のインキュベーション後、真空洗浄をさらに２回行い、試料をＲｅａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。サイトカイン１つごとの試料につき１００ビーズである、より低い限度を有するＬｕｍｉｎｅｘ  ２００機器を用いて、プレートを読み取った。ＭＦＩを、ＧＭ−ＣＳＦだけで培養した非刺激細胞の値に正規化した。
【０１９６】
５１個の分析物のうち、２０個は処理間（スーパーカインおよびＬＰＳ）の発現において違いを一切示さず、１９個は、ＩＬ−４とスーパーカインとの間に違いを伴わないで、ＬＰＳ（最も注目すべきはＩＬ−６、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１）によって下方制御された（図１７）。残った１２個の生成物の発現は、ＧＭ−ＣＳＦのみに誘導された細胞、または、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４もしくはＫＦＲによって誘導された、ＤＣ由来のＧＭ−ＣＳＦ＋スーパー４を区別した（図１７および図２１）。前者の２つのサブセットは大変類似していて、後者２つのサブセットよりも多くのＧ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＬＩＦ、ＴＮＦα、およびより少ないＭＣＰ３、ＭＩＰ１β、ＰＤＧＦ、ＴＧＦαを生産し、後者２つのサブセットも大変類似していた。多くの違いはＬＰＳ刺激後に見られたが、非活性化細胞にもいくつか存在した。これらのデータは全体で、スーパー４は、ＧＭ−ＣＳＦ単独のものに比べ、単球に対して一切効果を有さないが、一方で、ＩＬ−４またはＫＦＲの添加は表現型的にも機能性的にも異なるＤＣをもたらすことを示す。このように、操作されたサイトカインは、新しいおよび別個の機能活性を所有するようである。
【図１】
2018161143.tif 000009
【図２】
2018161143.tif 000010
【図３】
2018161143.tif 000011
【図４】
2018161143.tif 000012
【図５】
2018161143.tif 000013
【図６】
2018161143.tif 000014
【図７】
2018161143.tif 000015
【図８】
2018161143.tif 000016
【図９】
2018161143.tif 000017
【図１０】
2018161143.tif 000018
【図１１】
2018161143.tif 000019
【図１２】
2018161143.tif 000020
【図１３】
2018161143.tif 000021
【図１４】
2018161143.tif 000022
【図１５】
2018161143.tif 000023
【図１６】
2018161143.tif 000024
【図１７】
2018161143.tif 000025
【図１８】
2018161143.tif 000026
【図１９】
2018161143.tif 000027
【図２０】
2018161143.tif 000028
【図２１】
2018161143.tif 000029
【図２２】
2018161143.tif 000030
【図２３】
2018161143.tif 000031
【配列表】
2018161143000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月20日(2018.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018161143000001.pdf