(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を無毒化する抗体、およびその使用方法の提供。【解決手段】ヒト免疫不全ウイルスのエピトープまたはヒト免疫不全ウイルスを対象とした中和抗体。抗ＨＩＶ抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、またはヒト抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３８７の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および配列番号５５８の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含み、
前記配列番号３８７の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列がそれぞれＤＹＦＩＨ、ＷＩＮＰＫＴＧＱＰＮＮＰＲＱＦＱＧ、およびＱＲＳＤＹＷＤＦＤＶであり；
前記配列番号５５８の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の配列がそれぞれＱＡＮＧＹＬＮ、ＤＧＳＫＬＥＲ、およびＱＶＹＥＦである、
単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号３８７のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５５８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＺＭ５３Ｍ．ＰＢ１２を中和し、または１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＲ１１６６．ｃ１を中和し、または３０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＤＵ１７２．１７を中和する、請求項１または２に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ＣＤＲ領域以外の少なくとも１つのアミノ酸残基が保存的置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗ＨＩＶ抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＨＩＶ抗体が組み換え抗体である、請求項５に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つ、および薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染またはＨＩＶに関連する疾患の予防または治療に用いられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
第２の治療剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記第２の治療剤が抗ウイルス薬である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片が組み換え抗体またはその抗原結合断片である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片の製造方法であって、
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターを含む細胞を、前記核酸が発現する状況下で培養すること、および、
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片を単離すること、
を含む、方法。
【請求項１７】
患者における請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片を検出する方法であって、
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片に結合する、または前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡとハイブリダイズする剤と、前記患者から採取した生物学的試料とを接触させること、および
前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片または前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの少なくとも１つを含む細胞の存在について、前記生物学的試料を分析すること、
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つの薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニットと、非核酸系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤または融合阻害剤およびインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ＨＩＶ剤の薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニットと、を含み、２つの薬理学的に許容される投薬ユニットは１つの薬理学的に許容される投薬ユニットの形状をとってもよい、ＨＩＶ感染またはＨＩＶに関連する疾患を予防または治療するためのキット。
【請求項１９】
被験者由来の生物学的試料において請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する１以上の検出試薬を含む、患者におけるＨＩＶの診断、予後、または治療のモニタリングのためのキット。
【請求項２０】
ＰＣＲを実施するための試薬をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
質量分析を実施するための試薬を含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年5月17日に出願された米国仮特許出願第61／486,960号の関連出願であり、米国特許法第119条の下でこの仮出願に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府による出資研究に関する声明）
本発明に至る研究は、一部、国立衛生研究所認可番号Ｐ０１  ＡＩ０８６７７−０１によって支援された。したがって、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。
【０００３】
発明の分野
この発明はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエピトープに結合する抗体に関する。この発明は、さらに、その製法とＨＩＶ感染の予防と治療のために、ＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープタンパク質へ結合する抗体を広く無毒化する使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＨＩＶは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす。長期非進行者におけるＨＩＶ感染に対する免疫反応は、特異的なウイルス性免疫が感染および病気の兆候を制限し得ることを示唆している。ＨＩＶに感染した個体の中には、血清中に中和ＩｇＧ抗体を広く示す者もいる。そして、効果的なワクチンの設計におけるそれらの潜在的重要性にも関わらず、これらの抗体の特異性と活性に関してはほとんど知られておらず、また保護免疫と相関するは１つたりとも発見されていない。動物モデルにおいて、中和抗体の受身移入がウイルスの攻撃に対する保護に貢献し得る。中和抗体はＨＩＶに感染した個体において、発達し得るが、血清学的反応の詳細な構成は、まだ完全には解明されていない。
【０００５】
いくつかの免疫学的異常は、エイズで描写される。これらは、以下のものに限られるわけではないが、Ｂ細胞の機能における異常、異常な抗体反応、欠陥のある単球細胞機能、障害のあるサイトカイン生産、抑圧されたナチュラルキラー細胞および細胞障害性細胞の機能、可溶性抗原を認識し反応するためのリンパ球の能力欠陥、およびＴ４ヘルパー／誘因リンパ球数の減少などを含む。
【０００６】
いくつかのＨＩＶ株から、ＨＩＶのエンベロープをコードしたのアミノ酸とＲＮＡの配列が知られている(Modrow, S. et al., J. Virology 61(2): 570 (1987))。ＨＩＶウイルス粒子（ビオリン）は、宿主細胞の表面膜に由来する膜またはエンベロープで覆われている。この膜は、それらのＣ末端領域の膜二重層に定着しているエンベロープ糖たんぱく質（ｇｐ１６０）の群を含む。それぞれの糖たんぱく質は、Ｎ末端の部分、およびＣ末端の部分という２つの部分を含む。約１２０ｋＤの相対的な分子量を持つことからｇｐ１２０と呼ばれる、Ｎ末部分は、ビリオン周辺の水溶液環境へ突き出している。ｇｐ４１と呼ばれる、Ｃ末端領域は膜にまたがる。Ｎ末端のｇｐ１２０とＣ末端のｇｐ４１は、特に蛋白質分解切断に影響されやすいペプチド結合によって共有結合的に結合している。European Patent Application Publication No. 0 335 635, McCune et al、およびそこに掲載された引用例はそれぞれ完全に参照によってここに取り入れられる。
【０００７】
ＡＩＤＳワクチンへの様々なアプローチ、以下のものに制限されないが、例えば、不活性されたおよび弱毒化されたウイルスワクチン、ウイルス感染した細胞からのサブユニットワクチン、リコンビナント的に生産されたウイルス抗原、合成ペプチドに基づくワクチン、抗イディオタイプワクチンおよびウイルスキャリアーに基づくワクチンが提案されている。ＨＩＶの治療的および予防的処置へのさらなるアプローチは、高い能力のある、広いモノクローナル中和抗体を作製することを含む。複数の研究は、ビリオンスパイクの他の部分だけでなくＣＤ４結合部位を標的とするため、およびＨＩＶを無毒化するための様々な技術によって、モノクローナル抗体のクローニングおよび作製を報告している。通常これらの技術は、自己融合またはファージディスプレイ技術を含む。典型的に、ファージディスプレイ技術を使用したＨＩＶ中和抗体の作製において、重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせは結合され、およびランダムなペアは選択される。研究は、ＨＩＶに対して、広く高い能力を持ち、および広く無毒化する（血清中でＨＩＶの複数の株を無毒化する抗体を意味する）限られた数のモノクローナル抗体（例えば、ファージディスプレイ抗体ｂ１２）を報告している。モノクローナル抗体ｂ１２は、マカクにおいて、ＨＩＶ感染を防ぐことが報告された広範囲の中和抗体である。他の広範囲の中和抗体は、非定型的に、３つの結合部位をもつ他の抗体において見られない構造を有している２Ｇ１２を含む。
【０００８】
ＶＲＣ０１は最近発見された、ＨＩＶのスパイク上のＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）をターゲットにした広範囲の中和抗体である。ＶＲＣＯ１は、可溶性の、ビオチンラベルされ、安定化され、さらに再表面化された、ＨＩＶ  ｇｐ１２０のコアフラグメントに結合している単一のＢ細胞を精製することによって単離された(X. Wu et al., Science 329, 856 (Aug 13, 2010))。成功にも関わらず、単離は非効率的で、１個体からの2500万の末梢血単核細胞から、たった３つの近縁のＨＩＶ結合抗体しか産生されなかった。単細胞抗原の捕獲方法によって得られた他の抗ＨＩＶ抗体と同様に、ＶＲＣＯ１−３は効果と広がりに不可欠である体細胞突然変異を非常に高いレベルで示した。突然変異した配列は、クローニングに使用されるプライマーとの相補性でない場合があるので、突然変異が高頻度であることは抗体のクローニングにとって潜在的な障害である。
【０００９】
いくつかの研究は、一定の患者らは、広範囲に中和するＨＩＶに対する抗体を発達させていると報告している。研究は、抗体はヒト以外の霊長類の受動伝達実験において抗体が最初のＨＩＶ感染に対して保護し得ること、および感染の間、ウイルスの量を調整し得ることを報告している。例えば、Mascola, 2000; Shibata, 1999; Veazey, 2003; Parren, 2001; Mascola, 1999; Trkola, 2005; Wei, 2003; Frost, 2005; Burton, 2004; Mascola, 2007; Karlsson Hedestam, 2008; McMichael, 2006; Zolla-Pazner, 2004を参照。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
この発明は、一つの形態において、ＨＩＶに対する広範囲の中和抗体を提供する。一形態において、この発明は以下のコンセンサスアミノ酸配列を含む重鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。ＱＸＸＬＸＱＳＧＧＸＶＫＫＰＧＸＳＶＸＶＳＣＸＡＳＧＹＸＸＦＸＸＹＸＩＨＷＸＲＱＡＰＧＸＧＸＸＷＶＧＸＩＸＰＲＸＧＸＸＸＸＡＸＸＦＱＧＲＬＳＬＴＲＤＸＸＸＸＸＸＴＸＸＸＦＭＤＬＸＧＬＲＸＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＸ（配列番号１）。式中、Ｘは任意のアミノ酸を示すか、アミノ酸が存在しないことを示す。
【００１１】
他の一形態では、この発明は、以下のコンセンサスアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。ＥＩＸＬＴＱＳＰＸＳＬＳＸＳＸＧＥＸＸＴＩＳＣＸＸＸＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＷＹＱＱＲＸＧＸＡＲＰＬＬＩＸＸＸＳＸＸＸＸＧＶＰＸＲＦＳＧＸＸＸＧＸＸＹＸＬＸＩＳＸＬＸＸＤＤＸＡＸＹＦＣＸＸＹＥＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号２）。式中、Ｘは任意のアミノ酸を示すか、アミノ酸が存在しないことを示す。
【００１２】
他の一形態において、この発明は、高度に保存されたコンセンサス配列を含む重鎖、および高度に保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖を含む単離されたＨＩＶ抗体を提供する。この発明は、さらに、高度に保存されたコンセンサス配列を含む重鎖、および高度に保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖を含む単離されたＨＩＶ抗体を産生する方法を提供する。
【００１３】
他の一形態において、この発明は、配列番号１のコンセンサス配列を含む重鎖、および配列番号２のコンセンサス配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。さらなる形態において、この発明は、抗体がＶＲＣ０１のアミノ酸配列を持っていないという条件で、配列番号１のコンセンサス配列を含む重鎖、および配列番号２の配列を含む軽鎖の一方または双方を含むか、または、それに対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を持つ配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００１４】
他の一形態において、この発明は、配列番号１のコンセンサス配列を含む重鎖、および配列番号２のコンセンサス配列を含む軽鎖の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで抗体は１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＺＭ５３Ｍ．ＰＢ１２を中和し、または１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＲ１１６６．ｃ１を中和し、または３０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＤＵ１７２．１７を中和する。他の一形態においては、この発明は、配列番号１のコンセンサス配列を含む重鎖、および配列番号２のコンセンサス酸配列を含む軽鎖の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで抗体は、３０μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０濃度でＶＲＣ０１耐性ＨＩＶウイルスを中和する。
【００１５】
発明の他の一形態においては、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ６０、１２Ａ１２、１２Ａ２１、ＮＩＨ４５−４６、８ＡＮＣ１３１、８ＡＮＣ１３４、ＩＢ２５３０、ＩＮＣ９および８ＡＮＣ１９６からなる群から選択される、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００１６】
他の一形態において、この発明は、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ６０、１２Ａ１２、１２Ａ２１、ＮＩＨ４５−４６、ｂＡＮＣ１３１、８ＡＮＣ１３４、ＩＢ２５３０、ＩＮＣ９および８ＡＮＣ１９６からなる群から選択される、ＨＩＶ抗体の一致する領域のアミノ酸配列を含む、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００１７】
他の一形態において、この発明は、配列番号５〜４３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００１８】
他の一形態において、この発明は、配列番号４３９〜５８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する
他の一形態において、この発明は、表Ａまたは表Ｂに示されているアミノ酸配列を含む重鎖と軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００１９】
他の一形態において、この発明は、アミノ酸配列：ＡＳＷＤＦＤＦ（配列番号３）を含む挿入配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００２０】
他の一形態において、この発明は、アミノ酸配列：ＴＡＲＤＹ（配列番号４）を含む挿入配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００２１】
他の一形態において、この発明は、配列番号３および配列番号４の挿入配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００２２】
他の一形態において、この発明は配列番号３および配列番号４の挿入配列の少なくとも１つを挿入することを含む、単離されたＨＩＶ抗体のＨＩＶの中和の能力および広さを改善する方法を提供する方法を提供する。
【００２３】
他の一形態によれば、この発明は、発明に係る単離されたＨＩＶを含む、組成物を提供する。
【００２４】
他の一形態によると、この発明は、発明に係る抗体および薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００２５】
他の一形態によると、この発明は、この発明に係る単離されたＨＩＶ抗体をコードする核酸分子を提供する。
【００２６】
他の一形態によると、この発明に係る単離されたＨＩＶ抗体をコードする核酸分子を含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞を提供する。
【００２７】
他の一形態によると、この発明は、そのような予防または治療を必要とする哺乳類の被験体を特定する工程、および発明に係るＨＩＶ抗体の少なくとも１つの治療上有効量を前記被験体に投与する工程を含む、ＨＩＶ感染またはＨＩＶに関連する疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００２８】
他の一形態によると、前記方法は、第２の治療剤の投与をさらに含む。他の一形態によると、第２の治療剤は抗ウイルス薬である。
【００２９】
この発明の他の一形態は、この発明に係る抗体の少なくとも１つと哺乳動物細胞を接触することを含む、ウイルスの複製、または付加的な宿主細胞または組織への感染の拡大を減少する方法を提供する。他の一側面によると、この発明は、ＨＩＶに感染した哺乳類被験体を治療するための方法を提供し、前記方法は、この発明に係る抗体の少なくとも一つを含む医薬組成物を前記被験体に投与することを含む。
【００３０】
他の一形態によると、この発明は、哺乳類被験体におけるＨＩＶに対する保護免疫反応またはＨＩＶウイルスの減少を誘導するために十分な量で、かつ十分なスケジュールに従って、ＨＩＶに感染している、またはリスクを持っている哺乳類被験体へ投与するのに適したＨＩＶ抗体製剤の作製と投与のための方法を提供する。
他の一形態において、この発明は高く保存されたコンセンサス配列を含む重鎖、および高く保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖を含むＨＩＶ抗体を検出する方法を提供する。
【００３１】
他の一形態において、この発明は、ＨＩＶの処置に使用するための、この発明に係る単離された抗体を提供する。
【００３２】
他の一形態において、この発明は、この発明に係る単離されたＨＩＶ抗体の少なくとも１つの薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニット、並びに非核酸系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤または融合阻害剤およびインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択されるＨＩＶ剤の薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニットを含み、２つの薬理学的に許容される投薬ユニットは１つの薬理学的に許容される投薬ユニットの形状をとってもよい、キットを提供する。
【００３３】
他の一形態において、この発明は、被験者由来の生物学的試料において抗ＨＩＶ中和抗体に特異的に結合する１以上の検出試薬を含む、患者におけるＨＩＶの診断、予後、または治療のモニタリングのためのキットを提供する。発明の他の一側面において、ＰＣＲまたは質量分析を実施するための試薬をさらに含む、前記キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜ＤはＨＩＶ抗体の中和活性ＩＣ５０を示している。（Ａ）限定的パネル。トップラインはドナー番号、クローンまたは抗体を示している（表４）。ウイルスは、左に示している。色はＩＣ５０での濃度を示している。赤は０．１μｇ／ｍｌ以下、オレンジは０．１〜１μｇ／ｍｌ、オレンジは０．１〜１μｇ／ｍｌ、黄色は１〜１０μｇ／ｍｌ、緑は１０μｇ／ｍｌ以上を示し、白はどんな濃度テストでも中和を示さなかったものを示す。（Ｂ）拡張パネル。（Ｃ）ＶＲＣＯ１、ＮＩＨ４５−４６、３ＢＮＣ１１７を比較した中和サマリグラフ。ＩＣ５０に反比例した線の長さおよび円のサイズ。カラーはそれぞれウイルスクレード（系統）を示す。赤はＡ、青はＢ、緑はＣ、赤紫色はＤ、黒はＡＥ、金はＡＧを表す。（Ｄ）質量スペクトルによって発見されたペプチドによる、カバレッジを有する３ＢＮＣ６０、１Ｂ２５３０および８ＡＮＣ１３４の重鎖の配列を淡い灰色で表す。赤いドットはそれぞれの生殖細胞系配列との違いを表す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜ＤはＨＩＶ抗体の中和活性ＩＣ５０を示している。（Ａ）限定的パネル。トップラインはドナー番号、クローンまたは抗体を示している（表４）。ウイルスは、左に示している。色はＩＣ５０での濃度を示している。赤は０．１μｇ／ｍｌ以下、オレンジは０．１〜１μｇ／ｍｌ、オレンジは０．１〜１μｇ／ｍｌ、黄色は１〜１０μｇ／ｍｌ、緑は１０μｇ／ｍｌ以上を示し、白はどんな濃度テストでも中和を示さなかったものを示す。（Ｂ）拡張パネル。（Ｃ）ＶＲＣＯ１、ＮＩＨ４５−４６、３ＢＮＣ１１７を比較した中和サマリグラフ。ＩＣ５０に反比例した線の長さおよび円のサイズ。カラーはそれぞれウイルスクレード（系統）を示す。赤はＡ、青はＢ、緑はＣ、赤紫色はＤ、黒はＡＥ、金はＡＧを表す。（Ｄ）質量スペクトルによって発見されたペプチドによる、カバレッジを有する３ＢＮＣ６０、１Ｂ２５３０および８ＡＮＣ１３４の重鎖の配列を淡い灰色で表す。赤いドットはそれぞれの生殖細胞系配列との違いを表す。
【図２】図２Ａ−ＣはＨＩＶ抗体の結合特性を示す。（Ａ）１２Ａ１２、１２Ａ２１および１２Ａ−生殖細胞系統（ＧＬ）復帰抗体（ｒｅｖｅｒｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）によるＹＵ２−ｇｐｌ４０および２ＣＣ−コアへの結合のための代表的な表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。（Ｂ）代表的抗体のためのＫＡを示す。（Ｃ）グラフは指示抗体とのインキュベーションのノリ、２９３Ｔ細胞に発現したＢａｌ．２６に結合した抗ＣＤ４ｉ抗体の平均蛍光強度を示す。表は、抗体がＣＤ４ｉ部位のアクセスしやすさを誘発するかどうか、を示す。
【図３Ａ−１】図３ＡおよびＢはＨＩＶ抗体のコンセンサス配列、およびＨＩＶ抗体のアミノ酸配列を示す。（Ａ）コンセンサス、生殖細胞遺伝子、１０の選択された抗体、および８ＡＮＣ１９５のための枠組み（フレームワーク、ＦＲ）およびＣＤＲ領域に関連するアミノ酸のアライメント。３ＢＮＣ６０の構造にしたがって残基は番号を付けた。（Ｂ）軽鎖について（Ａ）ように表した。（Ｃ、Ｄ、およびＥ）３ＢＮＣ６０の抗原結合フラグメントの結晶構造。
【図３Ａ−２】図３ＡおよびＢはＨＩＶ抗体のコンセンサス配列、およびＨＩＶ抗体のアミノ酸配列を示す。（Ａ）コンセンサス、生殖細胞遺伝子、１０の選択された抗体、および８ＡＮＣ１９５のための枠組み（フレームワーク、ＦＲ）およびＣＤＲ領域に関連するアミノ酸のアライメント。３ＢＮＣ６０の構造にしたがって残基は番号を付けた。（Ｂ）軽鎖について（Ａ）ように表した。（Ｃ、Ｄ、およびＥ）３ＢＮＣ６０の抗原結合フラグメントの結晶構造。
【図３Ｂ】図３ＡおよびＢはＨＩＶ抗体のコンセンサス配列、およびＨＩＶ抗体のアミノ酸配列を示す。（Ａ）コンセンサス、生殖細胞遺伝子、１０の選択された抗体、および８ＡＮＣ１９５のための枠組み（フレームワーク、ＦＲ）およびＣＤＲ領域に関連するアミノ酸のアライメント。３ＢＮＣ６０の構造にしたがって残基は番号を付けた。（Ｂ）軽鎖について（Ａ）ように表した。（Ｃ、Ｄ、およびＥ）３ＢＮＣ６０の抗原結合フラグメントの結晶構造。
【図４Ａ−１】４ＡおよびＢは特異的なプライマーを用いた高度の変異がある免疫グロブリンの重鎖の修復を示す。（Ａ）新しい、および古いプライマーのセットを左右に並べた比較。赤いボックスはＩｇＶＨ遺伝子の増幅に成功したことを示している。（Ｂ）Ｐｔ  ８からの２ＣＣ−コアへ結合するＨＩＶ抗体。クローンファミリーは、異なって拡張されたスライスによって示す。古いプライマーセットで増幅されなかった２つの高度の変異を受けたクローンはストライプのパイのスライスで示す。
【図４Ａ−２】４ＡおよびＢは特異的なプライマーを用いた高度の変異がある免疫グロブリンの重鎖の修復を示す。（Ａ）新しい、および古いプライマーのセットを左右に並べた比較。赤いボックスはＩｇＶＨ遺伝子の増幅に成功したことを示している。（Ｂ）Ｐｔ  ８からの２ＣＣ−コアへ結合するＨＩＶ抗体。クローンファミリーは、異なって拡張されたスライスによって示す。古いプライマーセットで増幅されなかった２つの高度の変異を受けたクローンはストライプのパイのスライスで示す。
【図４Ｂ】４ＡおよびＢは特異的なプライマーを用いた高度の変異がある免疫グロブリンの重鎖の修復を示す。（Ａ）新しい、および古いプライマーのセットを左右に並べた比較。赤いボックスはＩｇＶＨ遺伝子の増幅に成功したことを示している。（Ｂ）Ｐｔ  ８からの２ＣＣ−コアへ結合するＨＩＶ抗体。クローンファミリーは、異なって拡張されたスライスによって示す。古いプライマーセットで増幅されなかった２つの高度の変異を受けたクローンはストライプのパイのスライスで示す。
【図５Ａ】図５は、新しいＶＲＣ０１のクローンメンバーのＩｇＶの重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の配列を示している。
【図５Ｂ】図５は、新しいＶＲＣ０１のクローンメンバーのＩｇＶの重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の配列を示している。
【図６Ａ】図６は患者の血清中和活性を示している。（Ａ）表は、Ｔｚｍ−ｂｌ分析における、Ｔｉｅｒ２ウイルスのパネルに対して、精製した血清ＩｇＧの中和活性の概要を表している。暗い赤色のボックスは１０μｇ／ｍｌよりも低いＩＣ５０値を、オレンジは１０〜１００μｇ／ｍｌ、黄色は１００μｇ／ｍｌよりも高い値を示している。（Ｂ）ドットプロットは、Ａにおいて４よりも高い被験患者ＩＣ５０の概要を示している。
【図６Ｂ】図６は患者の血清中和活性を示している。（Ａ）表は、Ｔｚｍ−ｂｌ分析における、Ｔｉｅｒ２ウイルスのパネルに対して、精製した血清ＩｇＧの中和活性の概要を表している。暗い赤色のボックスは１０μｇ／ｍｌよりも低いＩＣ５０値を、オレンジは１０〜１００μｇ／ｍｌ、黄色は１００μｇ／ｍｌよりも高い値を示している。（Ｂ）ドットプロットは、Ａにおいて４よりも高い被験患者ＩＣ５０の概要を示している。
【図７Ａ−Ｂ】図７は、質量分析による抗体の検出を示している。衝突は二重にチャージされたペプチド、３ＢＮＣ１５３ＨＣからのＨＳＤＹＣＤＦＤＶＷＧＳＧＳＱＶＩＶＳＳＡＳＴＫ（Ａ）および、８ＡＮＣ１３４ＨＣからのＤＧＬＧＥＶＡＰＡＹＬＹＧＩＤＡＷＧＱＧＴＴＶＩＶＴＳＡＳＴＫ（Ｂ）上に記録された分離ＭＳ／ＭＳスペクトルを活性化した。観察されたｂ−タイプ断片イオン（Ｎ末端を含む）およびｙ−タイプ断片イオン（Ｃ末端を含む）は、スペクトルにおいてラベルした。断片イオンからの水の損失は＊によって示した。元のイオンからの水の損失に対応するイオンはスペクトルでラベルした。観察された主鎖の切断はｂ−タイプイオンについては、（「を左右反転させた記号）を用い、ｙ−タイプイオンについては（」を左右反転させた記号）を用いて配列中に示した。
【図８Ａ】図８ＡおよびＢはＨＩＶ抗体の親和性を示している。（Ａ）表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、ｇｐ１４０および２ＣＣ−コアに結合した抗体を測定した。オーバータイムで、選択された３ＢＮＣ抗体クローンの結合した抗体のためのＳＰＲセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を示した。（Ｂ）棒グラフは、Ａ中に示された、選択されたＩｇＧ抗体のためのｇｐ１４０および２ＣＣ−コアの抗原のための結合親和性（ＫＡ）を示す。
【図８Ｂ】図８ＡおよびＢはＨＩＶ抗体の親和性を示している。（Ａ）表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、ｇｐ１４０および２ＣＣ−コアに結合した抗体を測定した。オーバータイムで、選択された３ＢＮＣ抗体クローンの結合した抗体のためのＳＰＲセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を示した。（Ｂ）棒グラフは、Ａ中に示された、選択されたＩｇＧ抗体のためのｇｐ１４０および２ＣＣ−コアの抗原のための結合親和性（ＫＡ）を示す。
【図９Ａ−１】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ａ−２】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ａ−３】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ｂ−１】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ｂ−２】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ｂ−３】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図９Ｃ】図９Ａ−Ｃは、（Ａ）免疫グロブリンの重鎖遺伝子、（Ｂ）軽鎖カッパ、および（Ｃ）軽鎖ラムダの遺伝子配列のための選択されたＨＩＶ抗体の体細胞超変異分析を説明する。配列は、それぞれの生殖細胞系ヌクレオチド配列とのアライメントである。体細胞変異は、赤色で表し、加えてグレイのボックスは置換変異を示す。生殖細胞系アミノ酸配列は、コンセンサス残基を示す＊を用いて、ヌクレオチドのアライメントの上に示した。
【図１０Ａ−１】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【図１０Ｂ−１】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【図１０Ｂ−２】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【図１０Ｃ−１】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【図１０Ｃ−２】図１０Ａ−Ｃは、それぞれ（Ａ）患者（Ｐｔ）１、（Ｂ）Ｐｔ３、および（Ｃ）Ｐｔ８における、１つの拡大した中和クローンからの抗体の配列を示す。質量分析によって特定されたペプチドは色で示した。アスタリスクによって印を付けられた変異体は、１つ以上の質量分析により観察されたペプチド（淡い灰色で示した）によって独自に特定される。残りの質量分析は、ダークグレイで示された複数の変異体へ、非独自的に、ペプチドマップを観察した。アンダーラインで示されたアミノ酸は、示された変異体における非トリプシン切断部位を示す。開裂は、これらの部位において、リジン残基またはアルギニン残基を置く、キモトリプシンの開裂または付加的な変異（クローンされた変異体の間では観察されない）を通して起こることが推定される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
１．ＨＩＶ中和抗体
この発明の一形態においては、ＨＩＶに対する広範囲の中和抗体を提供する。一形態において、この発明は、以下のコンセンサスアミノ酸配列を含む重鎖を含む単離されたＨＩＶ抗体を提供する。ＱＸＸＬＸＱＳＧＧＸＶＫＫＰＧＸＳＶＸＶＳＣＸＡＳＧＹＸＸＦＸＸＹＸＩＨＷＸＲＱＡＰＧＸＧＸＸＷＶＧＸＩＸＰＲＸＧＸＸＸＸＡＸＸＦＱＧＲＬＳＬＴＲＤＸＸＸＸＸＸＴＸＸＸＦＭＤＬＸＧＬＲＸＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＸ（配列番号１）。式中、Ｘは任意のアミノ酸を示すか、アミノ酸が存在しないことを示す。
【００３６】
他の一形態では、この発明は、以下のコンセンサスアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。ＥＩＸＬＴＱＳＰＸＳＬＳＸＳＸＧＥＸＸＴＩＳＣＸＸＸＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＷＹＱＱＲＸＧＸＡＲＰＬＬＩＸＸＸＳＸＸＸＸＧＶＰＸＲＦＳＧＸＸＸＧＸＸＹＸＬＸＩＳＸＬＸＸＤＤＸＡＸＹＦＣＸＸＹＥＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号２）Ｘは任意のアミノ酸を示すか、アミノ酸が存在しないことを示す。
【００３７】
他の一形態において、この発明は、配列番号１のコンセンサス配列を含む重鎖、および配列番号２のコンセンサス配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。さらなる形態において、この発明は、配列番号１の重鎖の配列、および配列番号２の軽鎖の配列、または抗体がＶＲＣ０１のアミノ酸配列を持っていないという条件で、それに対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を持つ配列の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。パーセンテージの特定は以下に示されているように決定した。
【００３８】
この発明は、他の形態において、単離された抗体を提供する。高く保存された重鎖のアミノ酸配列を含む重鎖、および高く保存された軽鎖のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む単離された絵ＨＩＶ抗体を提供する。高く保存された重鎖のアミノ酸配列は、ここでは配列番号１の配列と少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸として特定する。高く保存された軽鎖のアミノ酸配列は、ここでは配列番号２の配列と少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸として特定する。パーセンテージの特定は以下に示されているように決定した。
【００３９】
他の一形態において、この発明は、抗体がＶＲＣ０１のアミノ酸配列を持っていないという条件で、高く保存された重鎖のアミノ酸配列を含んだ重鎖および、高く保存された軽鎖のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４０】
他の一形態において、この発明は、配列番号１の重鎖の配列、および配列番号２の軽鎖の配列の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで抗体は１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＺＭ５３Ｍ．ＰＢ１２を中和し、または１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＲ１１６６．ｃ１を中和し、または３０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＤＵ１７２．１７を中和する。他の一形態においては、この発明は、配列番号１の重鎖の配列、および配列番号２の軽鎖の配列の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで抗体は、３０μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０濃度でＶＲＣ０１耐性ＨＩＶウイルスを中和する。ＶＲＣ０１耐性ＨＩＶウイルスはここでは、５０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で、ＶＲＣ０１による中和に耐性を示す、ＨＩＶウイルスをして定義される。
【００４１】
他の一形態において、この発明は、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ６０、１２Ａ１２、１２Ａ２１、ＮＩＨ４５−４６、ｂＡＮＣ１３１、（８ＡＮＣ１３１）、８ＡＮＣ１３４、ＩＢ２５３０、ＩＮＣ９および８ＡＮＣ１９６からなる群から選択される、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４２】
他の一形態において、この発明は、３ＢＮＣ１１７、３ＢＮＣ６０、１２Ａ１２、１２Ａ２１、ＮＩＨ４５−４６、ｂＡＮＣ１３１、（８ＡＮＣ１３１）、８ＡＮＣ１３４、ＩＢ２５３０、ＩＮＣ９および８ＡＮＣ１９６からなる群から選択される、ＨＩＶ抗体の一致する領域のアミノ酸配列を含む、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４３】
他の一形態において、この発明は、配列番号５〜４３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４４】
他の一形態において、この発明は、配列番号４３９〜５８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４５】
他の一形態において、この発明は、表Ａまたは表Ｂに示されているアミノ酸配列を含む重鎖と軽鎖を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。
【００４６】
他の一形態において、この発明は、アミノ酸配列：ＡＳＷＤＦＤＦ（配列番号３）を含む挿入配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。さらなる形態においては、この発明は単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで、図５Ａに示した通り、３ＢＮＣ１１７および３ＢＮＣ６０の７４番目のアミノ酸で開始する重鎖のＦＲ３と一致する挿入配列、配列番号３は、発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられる。例えば配列番号３は、重鎖のＦＲ３の７番目のアミノ酸の後に挿入し得る。
【００４７】
他の一形態において、この発明は、アミノ酸配列：ＴＡＲＤＹ（配列番号４）を含む挿入配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を提供する。さらなる形態においては、この発明は単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで、図５Ａに示した通り、ＮＩＨ４５−４６の１０３番目のアミノ酸で開始する重鎖のＣＤＲ３と一致する挿入配列、配列番号４は、発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられる。例えば配列番号４は、重鎖のＣＤＲ３の４番目のアミノ酸の後に挿入し得る。
【００４８】
他の一形態において、この発明は単離されたＨＩＶ抗体を提供し、図５Ａに示した通り、３ＢＮＣ１１７および３ＢＮＣ６０の７４番目のアミノ酸で開始する重鎖のＦＲ３と一致する挿入配列、配列番号３は、発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられ、および図５Ａに示した通り、ＮＩＨ４５−４６の１０３番目のアミノ酸で開始する重鎖のＣＤＲ３と一致する挿入配列、配列番号４は、発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられる。例えば、配列番号３は、重鎖のＦＲ３の７番目のアミノ酸の後に挿入され、および配列番号４は、重鎖のＣＤＲ３の４番目のアミノ酸の後に挿入されうる。
【００４９】
さらなる形態において、この発明は、単離されたＨＩＶ抗体の作製を含む、単離されたＨＩＶ抗体の中和の能力および広さを改善する方法を提供する。ここで、図５Ａに示した通り、３ＢＮＣ１１７および３ＢＮＣ６０の７４番目のアミノ酸で開始する重鎖のＦＲ３と一致する挿入配列、配列番号３は発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられ、および／または図５Ａに示した通り、ＮＩＨ４５−４６の１０３番目のアミノ酸で開始する重鎖のＣＤＲ３と一致する挿入配列、配列番号４は発明のＨＩＶ抗体の対応する領域（配列アライメントによって決定されたように）の代わりに用いられる。例えば、配列番号３は、重鎖のＦＲ３の７番目のアミノ酸の後に挿入され、および／または配列番号４は、重鎖のＣＤＲ３の４番目のアミノ酸の後に挿入されうる。当業者は、ペプチドまたは抗体の産生のための組換え技術および／または合成化学技術を利用する抗体のアミノ酸配列を修正することができる。また、当業者は、以下に示した通り、ＨＩＶ中和分析を用いて、より良い中和の能力および広さをもった改善されたＨＩＶ抗体を特定し得る。
【００５０】
他の一形態において、この発明は配列番号３および配列番号４の挿入配列の少なくとも１つを含む、改善された単離されたＨＩＶ抗体を提供し、ここで改善された単離されたＨＩＶ抗体は、配列番号３および配列番号４の挿入配列を持たない単離されたＨＩＶ抗体よりも、優れたＨＩＶの中和の能力および広さを持つ。当業者は、以下に示した通り、ＨＩＶ中和分析を用いて、より良いＨＩＶの中和の能力および広さをもった改善されたＨＩＶ抗体を特定し得る。
【００５１】
当業者は、ペプチドまたは抗体の産生のための組換え技術および／または合成化学技術を利用する抗体のアミノ酸配列を修正することができる。
【００５２】
他の一形態において、この発明は、配列番号１の重鎖のコンセンサス配列、および配列番号２の軽鎖の配列を含む、単離されたＨＩＶ抗体を作製するための方法を提供する。
【００５３】
さらなる形態において、この発明は、配列番号１の重鎖のコンセンサス配列、および配列番号２の軽鎖の配列、または抗体がＶＲＣ０１のアミノ酸配列を持っていないという条件で、それに対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を持つ配列の一方、または双方を含む、単離されたＨＩＶ抗体を製造する方法を提供する。パーセンテージの特定は以下に示した通りに決定した。
【００５４】
他の一形態において、この発明は単離されたＨＩＶ抗体を検出するための方法を提供し、前記方法は哺乳類被験体からの免疫グロブリンを含んだ生物学試料、前記試料からのＨＩＶ抗体の単離、ＨＩＶ抗体のアミノ配列の決定、および配列番号１の重鎖の配列および配列番号２の軽鎖の配列の存在を特定することを含む。さらなる形態において、この発明は単離されたＨＩＶ抗体の選択する方法を提供し、前記方法は、配列番号１の重鎖のコンセンサス配列、および配列番号２の軽鎖の配列、または抗体がＶＲＣ０１のアミノ酸配列を持っていないという条件で、それに対して少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を持つ配列の一方、または双方の存在を決定することを含む。パーセンテージの特定は以下に示した通りに決定した。生物学試料生体試料は、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ（ｓｗａｂ）試料または組織バイオプシーであり得る。たとえば、ＰＣＲと質量分析を含んでいる公知の方法で、アミノ酸配列は決定し得る。
【００５５】
「抗体」（Ａｂ）の単語は、ここでは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体とポリ反応性抗体）および抗体断片を含む。この様に、「抗体」（Ａｂ）の単語は、この明細書の範囲内では、以下に制限される物ではないが、任意の特異的結合のメンバー、免疫グロブリンのクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）をも含む。そして、生物学的に関連した断片、またはそれらの特異的結合をするメンバーは、以下に制限されるわけでないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（単鎖または関連した存在）を含む。この分野では周知のとおり、抗体はジスルフィド結合によって相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれのタンパク質に結合する抗体を含む、糖たんぱく質である。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ１，ＣＨ２およびＣＨ３）から成る。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から成る。両方の重鎖および軽鎖の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。４つのＦＷＲ領域は相対的に保存されており、一方でＣＤＲ領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、高度可変領域を表し、および以下のようにＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端までに配置されている；ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗体と総合作用をする結合ドメインを含む一方、アイソタイプの場合によると、定常領域は宿主の組織またはファクターと免疫グロブリンの結合を仲介し得る。
【００５６】
また、ここで用いられる抗体の定義には、当業者が利用可能な濃縮技術を使用したライブラリーから選択された抗体と同様に、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から作製されるヒト抗体を含む。
【００５７】
「可変」という単語は、可変（Ｖ）ドメインのあるセグメントは、抗体の間の配列と異なるという事実について言及している。Ｖドメインは、抗原の結合を仲介し、特定の抗原のための特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、変異は、可変領域の１１０−アミノ酸スパン全体で、均一に分配されない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２のアミノ酸の高頻度可変領域と呼ばれる極端な変異性のより短い領域によって分離される、１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲｓ）と呼ばれる比較的不変の範囲を含む。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は４つのＦＲｓからそれぞれ成り、ベータシート構成を採用し、そして、３つの高頻度可変領域に結合される。そして、ベータシート構造に結合する、場合によってはそれの一部をなしている、ループを形成する。それぞれの差における高頻度可変領域は、ＦＲｓによって隣接した状態で一緒に保持され、他の鎖から高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照）。
【００５８】
ここで用いられる高頻度可変領域は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般的に相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。
【００５９】
ここで用いられるモノクローナル抗体の単語は、実質上、同種の抗体の個体群から得られた抗体を意味する。例えば、少量存在し得る自然に生じる突然変異を除いて、個体群を含む個々の抗体は、同一である。ポリクローナル抗体は、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む調製物を意味する。
【００６０】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である一方で、上記鎖の残りが他の種に由来するか、他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体を含み、望ましい生物活性を示す限り、かような抗体の断片をも含む（例えば、U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)参照）。記述された発明は、可変領域にヒト抗体に由来する抗原結合性配列を提供する。したがって、ここでの主要な関心のキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲｓ）を持ち、および非ヒト抗体（例えばＦＲまたはＣ領域配列）に由来する１以上を含む抗体を含む。これに加えて、ここに含まれるキメラ抗体は、１つの抗体のクラスおよびサブクラス、および他の抗体のクラスまたはサブクラス由来の他の配列（例えば、ＦＲまたはＣ領域配列）を含むヒト可変領域の抗原結合配列を含むこれらである。
【００６１】
「ヒト化抗体」は、一般的に、非ヒトであるソースからそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基としばしば呼ばれ、「輸入」残基は一般的に「輸入」可変領域からとられる。ヒト抗体の対応する配列を輸入輸入高可変領域配列と置換するによって、ヒト化はＷｉｎｔｅｒらの方法（例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))参照）に従って実行し得える。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり(U.S. Pat. No. 4,816,567)、ここで、実質上、より少なく無傷のヒト可変領域は非ヒトの種から対応する配列によって置換された。
【００６２】
抗体断片は、抗原結合または無傷の抗体の可変領域のような無傷の抗体の一部を含む。抗体断片の例は、以下に制限されないが、Ｆａｂ，  Ｆａｂ’，  Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、二重特異性抗体、線形抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、U.S. Pat. No. 5,641,870; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]参照）、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多選択制抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含む。
【００６３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原−認知部位および抗原−結合部位を含む最小限の抗体断片である。この断片は、タイトな、非共有結合的な関係で、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域の二量体を含む。これらのフォールディングから、２つのドメインは抗原の結合のためのアミノ酸残基に貢献し、および抗体に対して特異的に結合する抗原を差し出す、６つの高頻度可変性ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれからの３つのループ）を発する。しかし、全体的な結合部位よりも低い親和性にもかかわら、単体の可変領域（または、抗原のための特有の３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００６４】
「単鎖Ｆｖ」（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ）は単体のペプチド鎖につながるＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にするＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドペプチドリンカーを含む。ｓＦｖのレビューのために、例えば、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995下記参照。
【００６５】
二重特異性抗体の単語は、鎖内ではなく鎖の間でのＶドメインの結合を達成し、これによって二価断片（すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片）を生じるようなＶＨドメインおよびＶＬドメイン間の短いリンカー（５−１０残基）を有するｓＦｖ断片を構築することで調製される小さい抗体断片を意味する。二重の特異性を持つ、二重特異性抗体は、異なるペプチド鎖に存在する２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインにおける２つのクロスオーバーｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。例えば、二重特異性抗体は以下により完全に記載されている。例えば、EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)。
【００６６】
ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、完全にヒトの形で生み出すことができる、は最も小さい知られた抗体の抗原結合断片であり、約１１〜１５ｋＤａである。ｄＡｂｓは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の頑丈な可変領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）である。それらは微生物細胞培養において高く発現し、好ましい生物物理学的な特性（例えば、以下に制限されないが、可溶性と温度安定性）を示し、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択システム（例えば、ファージディスプレイ）による選択や親和性成熟に好都合である。ｄＡｂｓはモノマーとして生理活性をもち、それらの小さいサイズおよび固有の安定性によって、長い血清半減期または他の薬理活性を持った薬を作製するためのより大きな分子にフォーマットされうる。この技術の例は、例えば、ラクダ科の重鎖Ｉｇに由来する抗体についてのWO9425591、同様にファージライブラリーからの単一のドメインの全長ヒト抗体の単離についてのUS20030130496に記載されている。
【００６７】
ＦｖおよびｓＦｖは定常領域がかけている、無傷の組み合わせ部分を持つ唯一の種類である。このように、それらは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用において、非特異的な結合を減少させることに適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端において、エフェクタータンパク質の融合を産する為に構成されることができる。例えば、Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra参照。抗体断片は、線形抗体でもあり、例えば、U.S. Pat. No. 5,641,870に記載されている。そのような線形抗体断片のような、単一特異性または二重特異性であり得る。
【００６８】
ある形態において、発明に係る抗体は二重特異性であるか多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープのための結合特異性を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、１つの抗原の２つの異なるエピトープと結合することができる。その他のそのような抗体は、第２の抗原のために最初の抗原結合部位を結合部位と結合することができる。あるいは、感染細胞に細胞防御機構を集中させ、および局所化させるように、抗ＨＩＶの腕は、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）のような白血球上のターゲット分子、または、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧのためのＦｃ受容体（ＦｃガンマＲ）に結合する腕と結合することが出来る。二重特異性抗体は感染した細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として作製することが出来る（たとえば、Ｆ（ａｂ‘）２二重特異性抗体）。
【００６９】
例えば、WO 96/16673は、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩＩＩ抗体を開示し、U.S. Pat. No. 5,837,234は、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃガンマＲＩ抗体を開示している。例えば、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃアルファ抗体は、WO98/02463で報告されている。U.S. Pat. No. 5,821,337は、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を開示している。また、例えばMouquet et al., Polyreactivity Increases The Apparent Affinity Of Anti-HIV Antibodies By Heteroligation. NATURE. 467, 591-5 (2010)を参照。二重特異性抗体の作成方法は公知の方法を用いることが出来る。全長二重特異性抗体の従前の作成方法は、２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖のペアを共発現することに基づいている。ここで、その２つの鎖は違う特異性を持つ（例えば、  Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）参照。同様の生産が、例えば、  WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)および  Mouquet et al., Polyreactivity Increases The Apparent Affinity Of Anti-HIV Antibodies By Heteroligation. NATURE. 467, 591-5 (2010)に開示されている）。
【００７０】
あるいは、望ましい結合特異性（抗体−抗原結合部）を持つ抗体可変領域は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。融合はＩｇ重鎖の定常ドメイン、少なくともヒンジの部分、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、である。いくつかの具体例によると、軽鎖の結合のために必要な部位を含む、第一の重鎖の定常領域（ＣＨ１）は、融合の少なくとも１つにおいて存在する。免疫グロブリンの重鎖融合および、必要に応じて、免疫グロブリンの軽鎖をコードしたＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞へ共トランスフェクションされる。コンストラクションに使用される３つのポリペプチド鎖の不均衡な割合が望ましい二重特異性抗体の最適の収率を提供する際、これは、実施形態における、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調整において、より大きな柔軟性を与える。しかしながら、均衡な比率における少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率であるとき、または割合が望まれた鎖の組み合わせの収率に大きな影響を与えないとき、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖をコードした配列を１つのベクターに挿入することが可能である。
【００７１】
抗体断片から二重特異性抗体を製造するための技術は、文献にも記述されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を利用して製造し得る。例えば、Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)では、Ｆ（ａｂ‘）２断片を生み出すために、無傷の抗体をタンパク質分解性に開裂する。近隣のジチオールを安定させて、分子間ジスルフィド形成を妨げるために、これらの断片は、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で減少させる。
製造されたＦａｂ’断片は、その後、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変わる。Ｆａｂ‘−ＴＮＢ誘導体の一つは、その後、メルカプトエチルアミンとの還元によって、Ｆａｂ‘−チオールに再変換され、そして二重特異性抗体を形成するために、等モル量の他のＦａｂ‘−ＴＮＢ誘導体と混合される。製造された二重特異性抗、酵素の選択的な固定化のための薬品として使用することが出来る。
【００７２】
タンパク質の他の修飾は、ここに考慮される。例えば、抗体はいろいろな非タンパク・ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコールとポリプロピレン・グリコールのポリエチレングリコール、ポリプロピレン・グリコール、ポリオキシアルキレンまたは共重合体）の１つに結合されることができる。抗体は、また、例えば、コロイド薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン類、ナノ粒子とナノカプセル）または、マクロエマルジョン類において、コアセルベーション技術によって、または、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル、それぞれ））によって製造されたマイクロカプセルに封入することが出来る。そのような技術は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【００７３】
典型的に、この発明に係る抗体は、公知の技術として利用できるベクターと方法を使用して、リコンビナント的に生産される。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化Ｂ細胞によって産生される（例えば、U.S. Pat. Nos. 5,567,610および5,229,275参照）。分子遺伝学における一般的な方法およびこの発明に役立つ遺伝子工学は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇの現行版に記述されている。ラボラトリーマニュアル（Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、遺伝子発現技術（Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA）、酵素学の方法における“タンパク質精製のガイド” （M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.）；  ＰＣＲプロトコール  ：方法およびアプリケーションのガイド（Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA）、動物細胞の培養：  基本技術のマニュアル、第二版、  （(R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY）、および遺伝子トランスファーおよび発現のプロトコール pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.）を参照。遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、商業的なベンダー（例えばバイオラド社、ストラタジーン社、インビトロゲン社、クローンテック社とシグマアルドリッチ社）から入手可能である。
【００７４】
ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリン産生が欠如している状態で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニックアニマル（例えば、マウス）において産生することも出来る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体の重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体の産生の完全な抑制させることが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子のアレイをそのような生殖細胞系変異マウスへトランスファーすることで、抗原のチャレンジに際し、ヒト抗体が生産される。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (all of GenPharm); U.S. Pat. No. 5,545,807;およびWO 97/17852参照。そのような動物は、記載された発明のポリペプチドを含むヒト抗体の産生のために遺伝子的に設計することが出来る。
【００７５】
さまざまな技術は、抗体断片の生産のために開発された。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化を経由して得られた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)参照）。しかしながら、これらの断片は、現在、組み換え宿主細胞によって直接的に賛成することが可能である。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、大腸菌から分泌される。このように、大量のこれらの断片を容易く生産をすることが可能である。Ｆａｂ‘−ＳＨ断片は、大腸菌から直接的に取り戻すことができ、および化学的にＦ（ａｂ’）２断片を形成するために結合することが出来る（例えば、Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)参照）。他のアプローチによると、Ｆ（ａｂ‘）２断片は、組み換え宿主細胞の培養から直接的に単利することが出来る。エピトープ残基に結合するサルベージレセプターを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで、半減期が増加されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、U.S. Pat. No. 5,869,046に記載されている。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者にとって明らかである。
【００７６】
濃縮技術を使用したライブラリーからの抗体断片の選択のための、当業者に知られた他の技術は、以下に制限されないが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ(Hanes and Pluckthun, 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 4937-4942）、バクテリアディスプレイ（Georgiou, et al., 1997, Nature Biotechnology 15: 29-34）および／または酵母ディスプレイ（Kieke, et al., 1997, Protein Engineering 10: 1303-1310）が含まれ、単鎖抗体を選択するための以前に述べた技術にとって代わり得る。単鎖抗体は、繊維状のファージ技術を直接利用し、産生した単鎖抗体のライブラリーから選択される。ファージディスプレイ技術は、当該分野で知られている（例えば、U.S. Patent Nos. 5,565,332; 5,733,743; 5,871,907; 5,872,215; 5,885,793; 5,962,255; 6,140,471; 6,225,447; 6,291650; 6,492,160; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593, 081および他のUSファミリーメンバー並びに１９９２年５月２４日に出願されたGB9206318の優先権出願に依拠した出願に開示されているような、Cambridge Antibody Technology (CAT)による技術を参照；さらにVaughn, et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309-314を参照）。単鎖抗体は、ＤＮＡ増幅技術（例えば、ＰＣＲ）のような利用可能な遺伝子組み換え技術の使用、またはテンプレートとしてそれぞれのハイブリドーマｃＤＮＡの使用によって、設計され、組み立てられ得る。
【００７７】
変形抗体も、発明の範囲内に含まれる。この出願において詳述された配列の変形は、発明の範囲内に含まれる。さらに、改善された親和性を持つ抗体配列の変形は、当該分野で知られた方法を用いて得ることができ、さらに、発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸の置換はさらに改善された親和性を持つ抗体を得る為に用いられることができる。あるいは、核酸配列のコドンの最適化は、抗体の産生のための発現システムにおいて翻訳の効率の改善に用いることができる。
【００７８】
そのような変形抗体の配列は、７０％以上（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性をこの出願において詳述された配列と共有する。そのような参照される配列（すなわち、出願において詳述された配列）の全長に関して、そのような配列同一性は計算される。ここに言及されるように、同一性のパーセンテージは、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定される［Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1］。例えば、本発明によれば、ペプチド配列は、ここに開示された１以上の配列の少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０以上の隣接するペプチドを含むもの、並びにこれらのすべての中間の長さを含むものとして提供される。本明細書で用いる場合、「中間の長さ」という語は、引用された値（例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、その他；２１，２２，２３，その他；３０、３１、３２、その他；５０、５１、５２、５３、その他；１００、１０１、１０２、１０３、その他；１５０、１５１、１５２、１５３、その他）の間の任意の長さを表すことを意味する。
【００７９】
この発明は、単体で、または以下に制限しないが、ＶＲＣ０１とＰＧ９のような、他の抗体との組み合わせによる、血清中で幅広い無毒化活性を有する抗体を提供する。
【００８０】
もう一つの実施形態によると、この発明は、ヒトにおけるＨＩＶに対する保護免疫反応またはＨＩＶウイルスの減少を誘発するのに十分な量で、かつ十分なスケジュールに従って、ＨＩＶに感染した、またはＨＩＶ感染のリスクを有するヒトまたは非ヒトの霊長類の患者へ投与するのに適したＨＩＶ抗体組成物の製造および投与のための方法を提供する。
【００８１】
他の一形態によると、この発明は、少なくとも１つの発明に係る抗体および薬理学的に許容されるキャリヤーを含むワクチンを提供する。一形態によると、ワクチンは、ここに記述される少なくとも１つの抗体と薬理学的に許容されるキャリヤーを含むワクチンである。ワクチンはどんな組み合わせにおいてもここに記述されている特徴を持つ抗体の多数を含むことができ、さらに当該分野で知られたＨＩＶを無毒化する抗体を含むことができる。
【００８２】
組成物は、予防的に、または治療的にワクチン接種の後のＨＩＶ感染の多様なサブタイプの進行を処置するために、同じまたは異なる、ここに開示された単体または抗体の組み合わせであり得ることが理解されるべきである。そのような組み合わせは、望ましい免疫によって選ばれることができる。抗体を動物またはヒトに投与する場合、当業者に知られた１つ以上の薬理学的に許容されたキャリアー、賦形剤またはアジュバントを組み合わせることが可能である。組成物はさらに、以下に制限されないが、ＶＲＣ０１、ＰＧ９およびｂ１２を含む当該分野で知られた広く中和する抗体を含むことができる。
【００８３】
さらに、ＨＩＶの処置のために患者において効果的なレベルを測定することに関して、特に、適当な動物モデルは利用でき、および、様々な遺伝子治療のプロトコル（Ｓａｒｖｅｒら（１９９３ｂ）、ｓｕｐｒａ）のＨＩＶに対してｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を評価するために広く実施される。これらのモデルは、マウス、猿と猫を含む。たとえこれらの動物がＨＩＶ疾患に自然にかかりやすくないとしても、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）、リンパ節、胎児の肝臓／胸腺または他の組織で再構成されるキメラマウスモデル（たとえば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫適格ＳＣＩＤ−ｈｕ、骨髄切除ＢＡＬＢ／ｃ）はレンチウイルスのベクターまたはＨＩＶで感染していることができ、およびＨＩＶ病因モデルとして使用することができる。同様に、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）／猫モデルがそうすることができるように、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／猿モデルは使用することができる。治療的にエイズの処置に用いるとき、医薬品組成物は、発明に係るベクターとともに、他の医薬を含むことができます。それらの従来のやり方（すなわち、HIV感染を治療する抗ウイルス薬として）で、これらの他の医薬品を使用することができる。ＨＩＶ剤の例は、非核酸系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤または融合阻害剤およびインテグラーゼ阻害剤を含む。
【００８４】
他の一形態によると、この発明は、有効量の単離されたＨＩＶ抗体を含む抗体またはその親和性が改善されたバージョンに基づく医薬組成物を提供し、これによりＨＩＶウイルスの感染を減らすための予防的または治療的な処置選択が提供される。この発明の抗体に基づく医薬組成物は、当該分野で知られている多くの方法によって調製され得る（例えば、McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158; Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127参照)。許容できる温度範囲内での保管の間、最大限の安定性を促進するが、生物活性を両方とも保持する製剤中に、患者への投与に適した薬理学的に許容される組成物は、有効量の抗体を含む。医薬組成物は、要求される製剤に従い、薬理学的に許容される希釈剤、薬理学的に許容されるキャリヤーや薬理学的に許容される賦形剤を含むこともできる。または、そのような賦形薬は動物や人間への投与のために医薬組成物を一般に調製したものである。希釈剤は、組合せにより生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝塩類溶液、リンガー溶液、ブドウ糖溶液とハンクの水溶液である。医薬組成物に役立つ賦形薬の量またはこの発明の処方は、それが必要に応じて被験体に届けられることになっているとき、それが一様に分散することができるように、組成物を通して一様に抗体を配布するのに役立つ量である。それは、あまりに高い濃度から起こるかもしれないどんな有害な副作用をも最小にすると同時に、望ましい有益な緩和剤または治癒的な結果を提供する濃度に対する抗体を希釈するのに役立ち得る。それは、保存の影響も有し得る。このように、高い生理的活性を有する抗体のために、賦形薬のより多くは、使用される。他方、低い生理的活性を示すどんな活性成分のために、より小量の賦形薬は、使用される。
【００８５】
上記の抗体、抗体組成物、またはワクチン組成物は、ここに記載の抗体の１つまたは組み合わせを含み、HIVウイルス感染の予防的および治療的な処置のために投与することができる。
【００８６】
この発明は、以下に示された軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関するものである。表Ａ、表Ｂおよび図１０Ａ−Ｃ；配列番号１および２の重鎖と軽鎖のコンセンサス配列；および挿入配列、配列番号３および４。
【００８７】
他の関連した実施形態において、発明は、表Ａ、Ｂおよび図１０Ａ−ＣにリストされるＨＩＶ抗体のアミノ酸配列をコードするポリペプチド変異体を提供する；配列番号１および２の重鎖および軽鎖のためのコンセンサス配列；および挿入配列、配列番号３および４。これらのポリペプチド変異体は、この発明のポリペプチド配列と比べて、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、または、より大きい配列同一性を有する。ここで配列同一性はここに記載の方法（例えば、スタンダードパラメーターを使用したＢＬＡＳＴ分析）によって決定される。当業者はアミノ酸の類似性などを考慮することによってコードされたタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値が適切に調整されうることを理解可能であろう。
【００８８】
「ポリペプチド」という単語は、その従来の意味で使われる。すなわち、アミノ酸の配列としての意味である。ポリペプチドは、産物の特定の長さに限られない。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義の中で含まれ、そして、特に別途示されない限り、そのような単語が互換的にここで使用することができる。この単語も、自然に生じる、および非自然に生じる、当該分野で知られている他の修飾と同様にポリペプチドの発現後修飾（たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。ポリペプチドは、全てのタンパク質またはそのサブシーケンスであり得る。この発明の背景における関心の特定のポリペプチドは、ＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬを含むアミノ酸サブシーケンスであり、抗原またはＨＩＶ感染細胞を結合することができる。
【００８９】
単語がここに使われるように、ポリペプチド「変異体」は特に一つ以上の置換、欠落、追加や挿入によって、ここに明らかにされるポリペプチドと、一般的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は自然に生じるか、合成的に産生することができる。例えば、ここに記載される、および／または周知であるいくつかの技術を用いて、発明に係る上記のポリペプチド配列の１以上を修飾することによって、およびポリペプチドの１以上の生理活性を評価することによって可能である。
【００９０】
たとえば、特定のアミノ酸は、他のポリペプチド（たとえば、抗原）または細胞に結合するための能力を明らかに喪失することなく、タンパク質構造において他のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の生物学的機能的活性を定めるのはタンパク質の結合能と性質であることから、あるアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列において、および、それに応じてその基礎をなしているＤＮＡのコーディング配列においてなされることができ、それによって好ましい特性を有するタンパク質が得られる。様々な変化が、開示された組成物のペプチド配列、または、それらの生物学的有用性または活性を明らかに喪失しない前記ペプチドをコードした対応するＤＮＡ配列によってなされることは。このように考えられる。
【００９１】
多くの例において、ポリペプチド変異体は、一つ以上の保存的置換を含む。ペプチド化学の当業者が二次構造とポリペプチドの疎水性親水性指標の性質が大体において不変であると考えるように、「保存的置換」は類似した特性がある他のアミノ酸によって、アミノ酸が置換されるものである。
【００９２】
アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（たとえば、彼らの疎水性、親水性、電荷、サイズ、など）に基づく。前述の特性による多様性を考慮に入れた典型的な置換は当業者によく知られており、以下のものを含む；アルギニンとリジン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；そして、バリン、ロイシンとイソロイシン。
【００９３】
「相同性」または「配列同一性」は、必要に応じて、最大のパーセントの相同性を達成するために、配列をアライメントし、ギャップを出した後の非変異体配列と一致するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体における残基のパーセンテージについて言及する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドとポリペプチド変異体は、ここに記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ７５％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％、少なくともおよそ９８％または少なくともおよそ９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。
【００９４】
そのような変異体ポリペプチド配列は、７０％（すなわち８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）以上の配列同一性を、この出願で詳述される配列と共有します。さらなる実施形態において、記述された発明は、ここに開示したアミノ酸配列の隣接する範囲の様々な長さから成るポリペプチド断片を提供する。例えば、本発明において、ペプチド配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０またはそれ以上、並びにこれらのすべての中間の長さのの、ここに開示された配列の１つ以上の隣接するペプチドを含むものとして提供される。
【００９５】
発明も、記載された発明の抗体の軽鎖と重鎖の一部、または全体、およびそれらの断片をコードしたヌクレオチド配列を含む。遺伝情報の冗長性のために、これらの配列の変異体は、同じアミノ酸配列をコードして存在する。
【００９６】
この発明は、表Ａ、Ｂおよび図１０Ａ−Ｃに表示されるＨＩＶ抗体の重鎖および軽鎖のためのポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含む；配列番号１および２の重鎖および軽鎖のためのコンセンサス配列；および挿入配列、配列番号３および４。
【００９７】
他の関連する実施形態において、記載された発明は、表Ａ、Ｂおよび図１０Ａ−Ｃに表示されるＨＩＶ抗体の重鎖および軽鎖のペプチド配列をコードするポリヌクレオチド変異体提供する；配列番号１および２の重鎖および軽鎖のためのコンセンサス配列；および挿入配列、配列番号３および４。これらのポリペプチド変異体は、この発明のポリヌクレオチド配列と比べて、ここに記載された方法（例えばスタンダードパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ分析）を用いて決定される、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を持つ。当業者は、これらの値がコドンの縮退、アミノ酸の類似性、読み枠の位置決め等を考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整されうることを理解可能であろう。
【００９８】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」の単語は、ここでは、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーに言及するために、相互に用いられる。ポリヌクレオチドは、発現するゲノム配列、エクストラゲノムの（ｅｘｔｒａーｇｅｎｏｍｉｃ）およびプラスミドの配列、およびより小さな操作された遺伝子区分を含み得る。または、ポリペプチドを発現するのに適していることがあり得る。
【００９９】
「単離された核酸」は、リボソームおよびポリメラーゼのようなタンパク質または複合体と同様に、他のゲノムＤＮＡ配列から分離される核酸であり、必然的に天然の配列を有する。この単語は自然に生じる環境から除去された核酸配列を含み、組換えまたはクローンＤＮＡの単離、および化学的に合成されたアナログまたは非相同システムによって生物学的に合成されたアナログを含む。十分に精製された核酸は核酸の単離された形を含む。したがって、これは、核酸について言及し、もともと単離された核酸、そして、人工的に後に単離された核酸に加えられる遺伝子、または配列を除外しない。
【０１００】
ここで用いられるポリヌクレオチド「変異体」の単語は、特に一つ以上の置換、欠落、追加および／または挿入によって、ここに明らかにされるポリヌクレオチドと、一般的に異なるポリヌクレオチドである。そのような変異体は自然に生じるか、合成的に産生することができる。例えば、ここに記載されるように、発明に係るポリヌクレオチド配列の１以上を修飾することによって、およびポリペプチドの１以上の生理活性を評価することによっておよび／または周知であるいくつかの技術を用いて、可能である。
【０１０１】
修飾は、記載された発明に係るポリヌクレオチドの構造でなされることができ、および、望ましい特徴を持つ変異体または派生的なポリペプチドをコードする機能的な分子を得ることができる。この発明に係るポリペプチドの等価物または、さらに改善された変異体または、部分をつくるためにポリペプチドのアミノ酸配列を変えることが好ましい場合、当業者は一般的コードされたＤＮＡ配列のコドンの一つ以上を変更する。
【０１０２】
変異体ポリヌクレオチドによってコードれらたポリペプチドの免疫原性の結合特性は、特にここに述べられるポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと関連して、実質的に減らされることはないように、一般的に、ポリヌクレオチドの変異体は、一つ以上の置換、欠落、追加および／または挿入を含む。
【０１０３】
さらなる実施形態において、記載された発明は、ここに開示されている配列の一つ以上と同一であるか相補的な配列の隣接する範囲のいろいろな長さを含む、ポリヌクレオチド断片を提供する。たとえば、そこの間の、すべての中間の長さと同様に、ここに開示される配列の一つ以上の少なくともおよそ１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００以上の隣接するヌクレオチドを含み、さらに以下のような引用された値の間のどんな長さも含み得る。１６、１７、１８、１９その他；２１、２２、２３その他；３０、３１、３２、その他；５０、５１、５２、５３、その他；１００、１０１、１０２、１０３、その他；１５０、１５１、１５２、１５３、その他；および２００−５００；５００−１０００のすべての整数を含む。
【０１０４】
発明の他の一つ実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、ここに提供されるポリヌクレオチド配列、またはそれの断片、またはそれの相補配列へ、適度に高いストリンジェンシーな状況下で、ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学で周知の技術である。説明の便宜上、この発明のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを他のポリヌクレオチドでテストするために適した適度にストリンジェンシーな状況は以下を含む。予洗を５ｘＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の溶液で行い；一晩中５０−６０℃、５ｘ  ＳＳＣでハイブリダイゼーションし；その後、６５℃、２０分間、それぞれ０．１％のＳＤＳを含む２ｘ、０．５ｘ、および０．２ｘ  ＳＳＣで２回洗浄する。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩の内容および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を変更することによって、すぐに操作可能であることを理解する。例えば、他の実施形態において、適した高いストリンジェンシーな状況は、ハイブリダイゼーションの温度を、例えば６０−６５℃または６５−７０℃へ増加させることを除外した、上述のものを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、天然ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、ポリヌクレオチド変異体または断片によってコードされるポリペプチドは、ポリペプチドと同じ結合特異性（すなわち、特異的に、または、優先的に、同じエピトープまたはHIV株と結合する）を有する。いくつかの実施形態において、記載されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド変異体、断片およびハイブリダイズしている配列は、ここに示された特異的なポリペプチド配列のために、それの少なくともおよそ５０％、少なくともおよそ７０％、および少なくともおよそ90%の結合活性のレベルを有するポリペプチドをコードする。
【０１０６】
コード配列自体の長さに関係なく、発明に記載されたポリヌクレオチド、またはその断片は、それらの全長がかなり変化することができるように、他のＤＮＡ配列（例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素サイト、複数のクローニングサイト、他のコーディング区分、など）と組み合わせることができる。ほとんどどんな長さの核酸断片でも、使用される。たとえば、およそ１００００、およそ５０００、およそ３０００、およそ２０００、およそ１０００、およそ５００、およそ２００、およそ１００、およそ５０の塩基対の長さ等（すべての中間の長さを含む）の全長をもつ、実例となるポリヌクレオチド区分は、この発明の多くの実施に含まれる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ここに提供されているポリヌクレオチド配列が、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして使用される（たとえば、ＰＣＲプライマーとして）。それらの核酸プローブの対象配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補的な配列の存在を検出するためにそれらを使用することができる。しかし、記載された発明によって、例えば変異体プライマーの作製のための配列情報の使用、または他の遺伝子構造を作製するのに用いられるプライマーなど、他の用途も含まれている。そういうことで、ここに開示されている１５ヌクレオチドの長い連続する配列と同様の配列、または相補的である、少なくともおよそ１５ヌクレオチドの長い連続する配列の配列領域を含む、記載された発明の核酸区分は特に有用である。より長い連続する同一または、相補的な配列、たとえば、全長配列、および間のすべての長さを含む、およそ２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００のそれら（すべての中間の長さを含む）もいくつかの実施形態に用いられる。
【０１０８】
ここに開示されたポリヌクレオチド配列と同一または相補的である、１０−１４、１５−２０、３０、５０、あるいは１００−２００ヌクレオチド等（同様に中間の長さを含む）の連続したヌクレオチドの範囲を含む配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えばサウザンおよびノーザンブロッティングのためのハイブリダイゼーションのプローブとして、および／または例えばＰＣＲのためのプライマーとして特に設計される。補完的な範囲のサイズと同様に、断片の総サイズは、特定の核酸区分の用途またはアプリケーションに最終的に依存する。ハイブリダイゼーションの実施形態において一般的に使用されるフラグメント使用される。ここで、連続する補完的な領域の長さは、約１５〜約１００ヌクレオチドの間のように、変化することがあるが、より長い連続する補完的な範囲は、所望の配列を検出するための相補的配列の長さによって使用される。
【０１０９】
長さがおよそ１５−２５ヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定であり、選択的である二重鎖分子の形成を可能にする。長さ１２塩基以上の範囲である連続する相補的な配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させるために、およびそれによって得られる特定の複合型分子の品質と特異性の程度を改善するために利用することができる。要求された場所では、１５から２５の連続したヌクレオチドの、またはより長いヌクレオチドの遺伝子の相補的な範囲を持つ核酸分子を利用することができる。
【０１１０】
ここに開示にされる任意の配列の任意の部分から、ハイブリダイゼーションのプローブは選択される。必要なことは、プローブまたはプライマーとして利用することを望む、ここに記載の配列、または、配列のどんな連続部分、約１５−２５ヌクレオチドから全長配列まで、および全長配列を含む約１５−２５ヌクレオチド、を確認することである。たとえば、全長配列の末端の方からのプライマーの使用を望むかもしれない。
【０１１１】
さらに、発明による核酸配列を含む、発現ベクターのようなベクターは、発明の範囲内に含まれる。そのようなベクターで形質転換した細胞も、発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
この発明も、発明のポリペプチドの生産の組み換え型技術と同様に、発明にかかる核酸を含むベクターと宿主細胞を提供する。発明に係るベクターはどんな種類の細胞または有機体ででも複製ができるもの（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミドとミニ染色体）を含む。いくつかの実施形態では、記載された発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの増殖または複製にふさわしいベクター、または記載された発明に係るポリペプチドを発現することにふさわしいベクターである。そのようなベクターは当該分野で知られていて、市販されている。
【０１１３】
「ベクトル」は、シャトルベクターと発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドのコンストラクトも、それぞれ細菌中のプラスミドの複製と選択のために、複製起点（たとえば、ColE1複製起点）および、選択マーカー（たとえば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）を含む。「発現ベクター」は、細菌または真核生物細胞において、発明にかかる抗体断片を含む抗体の発現のために、必要な制御配列または調整要素を含むベクターについて言及する。
【０１１４】
ここに用いられているように、「細胞」はどんな細胞でもありえる。以下に制限されないが、哺乳動物細胞またはヒト細胞のような、真核生物、多細胞種（たとえば、単細胞のイースト細胞とは対照的に）の細胞を含む。細胞は単体として存在し得、またはより大きな細胞の集合体の一部であり得る。そのような「より大きな細胞の集合体」は、例えば、細胞培養（混合または純粋）、組織（例えば、内皮、上皮の、粘膜または他組織）、器官（例えば、たとえば、肺、肝臓、筋肉と他の器官）、器官システム（例えば、循環系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮のシステムまたは他の器官システム）、または生物（例えば、鳥、哺乳類、またはその種の他のもの）を含むことができる。
【０１１５】
発明に係るポリヌクレオチドは全体または結合される一部が合成され、そして、ルーチン分子および細胞生物学技術（たとえば、適切な制限部位および制限酵素を用いて、線形化ベクターへポリヌクレオチドをサブクローニングすることを含む）を使用して、ベクターに挿入される。記載された発明に係るポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのそれぞれのストランドと相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される。これらのプライマーも、ベクターへのサブクローニングを容易にするために、制限酵素切断部位を含む。複製可能なベクターの構成要素は、一般的に以下のものを含むが、これに限定されない：シグナル配列、複製起源、および一つ以上のマーカーまたは選択可能な遺伝子。
【０１１６】
発明に係るのポリペプチドを発現するために、ポリペプチドまたは機能的な等価物をコードしているヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写と翻訳のために必要な要素を含むベクター）に、挿入され得る。当業者によく知られた方法は、対象ポリペプチドおよび、適切な転写のおよび翻訳の制御因子をコードした配列を含む発現ベクターを作製するために用いることができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組み換えＤＮＡ技術、合成技術とｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝組換え技術を含む。そのような技術は、たとえば、Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Yに記載されている。
【０１１７】
この発明は、この発明に係る抗体、ポリペプチドおよび核酸を使用した使っている診断または予後の分析を実行することに役立つキットを提供する。この発明に係るキットは、ラベル化または非ラベル化された形で、発明に係るＨＩＶ抗体、ポリペプチドまたは核酸を含む適当な容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を含む。これに加えて、抗体、ポリペプチドまたは核酸が間接的な結合実験にふさわしいラベル化された形で供給されるとき、キットは適切な間接的な分析を実行するために試薬を更に含む。たとえば、ラベルの性質に従い、キットは酵素基質または誘導体化剤を含む一つ以上の適当な容器を含み得る。制御サンプルおよび／または説明書も、含み得る。この発明は、ＰＣＲまたは質量分析によって、生物学試料中の、この発明に係るＨＩＶ抗体またはＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列の存在を見つけるためのキットをも提供する。
【０１１８】
ここで使用される「ラベル」は、「ラベル化された」抗体を産生するために、抗体と直接的または間接的に複合化される検出可能な化合物または組成物を指す。ここに開示されるポリペプチドおよび／または核酸配列とラベルは複合化されることもできる。ラベルは単独で検出することが可能であり（たとえば、放射性同位元素ラベルまたは蛍光ラベル）、また酵素のラベルの場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変成を引き起こすことが可能である。記載された発明に係る抗体およびポリペプチドは、例えば、精製または診断用のアプリケーションで使用するためにエピトープタグまたはラベルを含むために修飾され得る。適当な発見手段は、ラジオヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、酵素、補酵素、蛍光剤、化学ルミネセンサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、クロモゲン、酵素基質またはコファクター、酵素阻害物質、補欠分子族複合体、遊離基、粒子、染料、などのようなラベルの使用を含む。
【０１１９】
もう一つの他の実施形態によると、この発明は、診断方法を提供する。診断方法は一般的に、患者（例えば血、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ（ｓｗａｂ）試料または組織生検）から得られる生物学試料をＨＩＶ抗体と接触させ、抗体がコントロールサンプルまたは予期されたカットオフ値と比較してサンプルに優先的に結合するかどうかを決定し、それによって、HIVウイルスの存在を示すことを含む。
【０１２０】
もう一つの他の実施形態によると、この発明は、患者からの生物学試料においてこの発明のＨＩＶ抗体の存在を検出するための方法を提供する。検出方法は、一般的に患者（例えば血、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ（ｓｗａｂ）試料または組織生検）から生物学試料を得ること、およびＨＩＶ抗体またはその断片、ＨＩＶ抗体をコードする核酸を単離すること、および生物学試料中のＨＩＶ抗体の存在を分析することを含む。また、この発明は細胞中でＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。ＨＩＶ抗体のヌクレオチド配列は、ここに開示されるプライマーを使用して検出し得る。患者からの生物学試料中のＨＩＶ抗体の存在は、既知の組換え技術の利用および／または質量分析計の使用によって決定され得る。
【０１２１】
もう一つの他の実施形態において、この発明は、生物学試料中に高く保存されたコンセンサス配列を含む重鎖および高く保存されたコンセンサス配列を含む軽鎖を含むＨＩＶ抗体を検出するための方法を提供する。この方法は、哺乳類被験体から免疫グロブリンを含む生物学試料を得ること、前記試料からＨＩＶ抗体を単離すること、およびに重鎖および軽鎖の高く保存されたコンセンサス配列を特定することを含む。生物学試料は血、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ（ｓｗａｂ）試料または組織生検であることがある。アミノ酸配列は例えばＰＣＲおよび質量分析を含む、当該分野で周知の方法によって決定し得る。
【０１２２】
「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」という単語は、測定のどんな形も含み、要素が存在するかどうかについて決定することを含む。「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」「計測する」、「査定する」、「評価する」および「分析する」の単語は、相互に使用され、定量的および定性的な決定を含む。評価することは、相関的または絶対的である場合がある。「〜の存在を評価する」は、何かの存在の量を決定すること、および／または存在の有無を決定することを含む。ここに用いられているように、「決定する」「計測する」、「評価する」、「分析する」の単語は相互に用いられ、および定量的決定と定性的決定の両方を含む。
【０１２３】
ＩＩ．ウイルス複製を減らす方法
さらに、被験体においてＨＩＶウイルス価（ＨＩＶ  ｖｉｒｕｓ  ｔｉｔｅｒ）、ウイルス複製、ウイルス増殖またはＨＩＶウイルスタンパク質の量の増加を減らす方法は提供される。もう一つの面によると、方法は、被験体においてＨＩＶウイルス価、ウイルス複製、または１つ以上のＨＩＶ株または分離株のＨＩＶタンパク質の量の増加を減少させるために効果的なＨＩＶ抗体の量を被験体に投与することを含む。
【０１２４】
他の一つの実施形態によると、この発明は、ｇｐ１２０上の抗原エピトープに結合する哺乳類動物細胞と抗体、その部分を接触することを含む、ウイルス複製またはさらなる宿主細胞または組織へのＨＩＶ感染の核酸を減少する方法を提供する。
【０１２５】
ＩＩＩ．処置方法
他の一つの実施形態によると、この発明はウイルス（例えば、ＨＩＶのような）に感染した哺乳類を処置する方法を提供し、この方法は、ここの開示されるＨＩＶ抗体を含む医薬組成物を前記哺乳類に投与することを含む。１つの実施形態によると、ＨＩＶに感染した哺乳類を処置する方法は、この発明に係る抗体、またはその断片を含む医薬組成物を前記哺乳類に投与することを含む。発明に係る組成物は開示された特徴（例えば、抗体の多数またはプール）を持つ１つ以上の抗体を含むことができる。例えば、以下に制限されないが、ＶＲＣ０１、ＰＧ９およびｂ１２などの、当該分野において周知の、他のＨＩＶ中和抗体を含むこともできる。
【０１２６】
受動免疫は、ウイルス性疾患の予防と治療に対する効果的かつ安全な戦略であることが証明された（例えば、Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000); Casadevall, Nat. Biotechnol. 20:114 (2002); Shibata et al., Nat. Med. 5:204-10 (1999); and Igarashi et al., Nat. Med. 5:211-16 (1999)を参照。それぞれ参照によってここに取り入れられる）。ヒト・モノクローナル抗体を使用した受動免疫は、ＨＩＶの緊急時の予防および処置のための応急処置方法を提供する。
【０１２７】
ＨＩＶ関連の病気または障害の危険がある被験者は、感染者と接触した、または、何かしらＨＩＶにさらされた患者を含む。予防薬剤の投与は、病気または障害が防止されるか、代わりに、その進行で遅れるように、ＨＩＶ関連の病気または障害に特有の徴候の前に起こることがありえる。
【０１２８】
ヒトとヒト以外の患者のｉｎ  ｖｉｖｏの治療のために、患者は発明に関するＨＩＶ抗体を含む製薬処方を投与され、または提供される。ｉｎ  ｖｉｖｏの治療に使用される場合、治療的に効果的な量（すなわち、患者のウイルス負担を除くか、減らす量）で、発明に係る抗体は患者に投与される。当該抗体は、既知の手法に従い、ボーラス投与としての静脈注射により、又は一定時間の連続的な点滴により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄こう内、経口の、局所の、吸入経路により患者に投与される。抗体は、可能な場合、標的細胞サイトに、または、静脈内に、非経口的に投与されることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈または皮下へ投与される。発明に係る治療組成物は、組織的に、非経口的に、または、局所的に、患者または被験体に投与されうる。病気における治療の成功と改善を評価するための上記のパラメータは、医者に知られているルーチンな処置によってすぐに測定可能である。
【０１２９】
非経口投与のために、抗体は、薬理学的に許容される、非経口の賦形薬に関連して、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で処方され得る。そのような賦形薬の例は、以下に制限されないが、水、食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含む。非水系の賦形薬は、不揮発性油とエチルオレイン酸塩を含むが、これに限定されるものではない。リポソームをキャリヤーとして使用することができる。賦形薬は、例えばバッファと防腐剤のような等張性と化学安定性を強化する物質のような添加物を少量含み得る。抗体は、そのような賦形薬中でおよそ１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、処方され得る。
【０１３０】
服用量と投与計画は、医者によって決定される様々な要因（例えば、その治療指数のような感染症の性質、患者、および患者の病歴）に依存する。一般的に、治療に効果的な量の抗体が、患者に投与される。いくつかの実施形態においては、投与される抗体の量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜およそ５０ｍｇ／ｋｇの患者の体重の範囲にある。感染症の種類と重症度に応じて、体重に対する抗体の量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（たとえば、およそ０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／服用）であり、この範囲は、たとえば、一つ以上の分割された投与、または持続性の点滴のいずれかによる、患者への投与のための最初の投薬量の候補である。この治療の進歩は、すぐに従来の方法と分析によってモニターされ、医師または当業者に周知の基準に基づく。病気における治療の成功と改善を評価するための上記のパラメータは、医者に知られているルーチンな処置によってすぐに測定可能である。
【０１３１】
他の最適治療計画は、この発明に係るＨＩＶ抗体の投与と組み合わせられ得る。組み合わされた投与は、どちらの順序でもよいが、分割処方または、単体の医薬処方を利用した同時投与、および連続投与を含む。ここで、両方の（またはすべての）活性剤がそれらの生体活性を発揮する間に時間周期があることが好ましい。そのような組み合わされた治療は、治療的において相乗効果をもたらすことがある。病気における治療の成功と改善を評価するための上記のパラメータは、医者に知られているルーチンな処置によってすぐに測定可能である。
【０１３２】
「処置すること」または「処置」または「緩和」の単語は相互に使用され、治療的な処置と予防または防止の方法を指す；ここで、目的は目標とされた病的状態または障害を防止することまたは、進行を遅くする（減少する）ことである。処置が必要な群には、障害を持ちやすい群、または障害が防止される予定の群と同様にすでに障害を有している群も含まれる。被験体または哺乳類は、この発明に係る方法による治療的な量の抗体を受けた後、患者が以下に示した１つ以上の観察可能な、および／または測定可能な減少または欠如を見せた場合、感染に対し、うまく治療される：感染細胞の数の減少または感染細胞の欠如；感染した総細胞数のパーセンテージの減少；および／または、いくらかの範囲、感染に特異的に関連した１つ以上の兆候の除去；病的状態および死亡率の減少、および生活の質（クオリティオブライフ）に関する問題の改善。病気における治療の成功と改善を評価するための上記のパラメータは、医者に知られているルーチンな処置によってすぐに測定可能である。
【０１３３】
「治療的に効果的な量」という単語は、被験体または哺乳類において病気または障害を処理するために、効果的な抗体または薬の量を指す。
【０１３４】
一つ以上の更なる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（同時の）および連続的な投与を含み、どんな順番でもよい。
【０１３５】
ここで用いられる「キャリヤー」は、薬理学的に許容されるキャリヤー、賦形薬、またはスタビライザーを含み、使用される投薬量と濃度においてそれにさらされる細胞または哺乳類に、無毒である。しばしば、生理学的に許容できるキャリヤーは、水性のｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容できるキャリヤーの例は、これらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩と他の有機酸のような緩衝液を含む；アスコルビン酸を含むがこれに限らない酸化防止剤；低分子量（およそ１０未満の残基）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含むが、これに限らない単糖類、二糖類と他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；糖アルコール類（例えばマンニトールまたはソルビトール）；ナトリウムのような塩形成対イオン（ｓａｌｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ）；および／またはＴＷＥＥＮのようなノニオン界面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）。
【０１３６】
ある範囲の値が与えられている場合、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値（文脈においてそうではないと明確に謳われていない限り当該下限値の単位の十分の一の位で四捨五入されたもの）、および、その明示された範囲におけるいかなる他の明示された値または介在値も本発明に含まれる。これらのより小さい範囲（より小さい範囲に独立して含まれうる）の上限値および下限値もまた、明示された範囲において特に除外された末端値次第では本発明に含まれる。明示された範囲が末端値の一方または双方を含む場合、これらの含まれる末端値の双方のいずれかが除外された範囲もまた本発明に含まれる。
【０１３７】
特に定められない限り、ここに用いられるすべての技術的および化学的な単語はこの発明の属する分野の通常の知識を有する者によって、共通の意味として理解される意味を持つ。ここに記載されたものと類似するまたは等しいどんな方法および材料でもこの発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法と材料はここに記載される。ここに記載のすべての出版物は、全体として参照によってここに取り入れられる。
【０１３８】
ここで、および添付の請求項に用いられるように、単数形「１つの」、「および」および「その」は、特に述べない限り、複数についても言及している。
【０１３９】
ここに開示された出版物は、この発明の出願日の前に、それらの開示のために、単独で提供されている。この発明が、先の発明の効力によって、そのような出版に先だつ権利がないと認めるような、解釈がされることはない。さらに、独立的に確認する必要があり得る実際の出版日付と、提供された出版日は、異なる場合がある。
【０１４０】
本明細書に引用されたそれぞれの出願と特許は、それぞれの文書または参照、または特許文献または非特許文献（患者（ｐａｔｉｅｎｔ）または非患者（ｎｏｎ−ｐａｔｉｅｎｔ）文献）と同様に、それぞれの出願または特許に引用され（出願手続中のそれぞれの発行済み特許を含む；出願引用文献を含む）、および、ＰＣＴおよび海外の出願または特許のそれぞれに対応する、および／またはこれらの出願または特許から優先権を主張している、および引用された文書またはそれぞれの出願引用文献における参照は、参照によってここに明確に取り入れられる。より一般的に、本明細書おいて、文書または参照は引用されており、請求項の前の参照リスト；またはテキスト自体；および、これらの文書または参照（「ここに引用された参照」）の各々は、ここに引用された参照のそれぞれの文書または参照（どんなメーカーの仕様、指示などでも含む）はここに、参照によって明確に取り入れられる。
【０１４１】
以下の非限定的な実施例は、さらにこの発明を例示するのに役立つ。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
材料、方法および器機使用
ヒトのサンプルは、すべての参加している機関（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって治験審査委員会（ＩＲＢ）にチェックされたプロトコールに従って、署名された告知に基づく同意の後に集められた。患者１は、アーロンダイアモッドエイズサーチセンター（Ａａｒｏｎ  Ｄｉａｍｏｄ  Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ニューヨーク）で追従される長期未発症者の群から選択した。患者３および８は、ボストンのラゴン研究所（Ｒａｇｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で追従された一群の長期非進行者から選択した。患者１、３および８は、ＨＩＶ分離株の標準的なパネルに対して、彼らの幅広い中和血清活性に基づいて選択した。幅広い中和血清活性に基づく「インターナショナルエイズワクチンイニシアチブ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｉｄｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）」のプロトコールＧの群から、患者１２を選んだ。
【０１４３】
染色、単細胞ソーティング、および抗体のクローニング
２ＣＣ−Ｃｏｒｅおよびｇｐ１４０特異的Ｉｇ＋メモリーＢ細胞の染色と単細胞ソーティングを実施した(J. F. Scheid et al., Nature 458, 636 (Apr 2, 2009))。手短に言うと、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、抗ヒトＣＤ１９マグネティックＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、末梢血単核細胞から濃縮し、そして、続いて、ビオチン化２ＣＣ−Ｃｏｒｅ(B. Dey et al., PLoS Pathog 5, e1000445 (May, 2009))、またはＹＵ２−ｇｐ１４０三量体(R. Diskin, P. M. Marcovecchio, P. J. Bjorkman, Nat Struct Mol Biol 17, 608 (May, 2010))と同様に、抗ヒトＣＤ２０および抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色し、その後、ストレプトアビジン結合フィコエリトリンによって検出した（ＰＥ, Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。単細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してソーティングし、細胞ダブレットを除き、１ウェルあたり４μｌの１０ ｍＭ ＤＴＴ、 ８ Ｕ ＲＮＡｓｉｎ（商標登録）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、 ０．４ Ｕ ５’−３’ Ｐｒｉｍｅ ＲＮＡｓｅ ＩｎｈｉｂｉｔｏｒTM  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を含む、冷たい０．５×リン酸緩衝塩類溶液を入れた９６ウェルＰＣＲプレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ）へ入れた。プレートは、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（商標登録） ’Ｆ‘フィルム（ＢｉｏＲａｄ）によってシールし、ドライアイス上で素早く凍結し、−８０℃で保存した。
【０１４４】
ｃＤＮＡ合成とＩｇ増幅は、以下の修正で実行した(H. Wardemann et al., Science 301, 1374 (Sep 5, 2003))：
オリジナルのプライマーセットを使用する代わりに、セミネストアプローチにおける表１に記載のプライマーを用いて、１回目と２回目の免疫グロブリン特異的ＰＣＲは、実行した。それらのそれぞれの発現ベクターへの重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物のクローニングは実行し、そしてオリジナルのＰＣＲ産物とクローン化発現プラスミドの１００の同一性を、ＨＥＫ２９３細胞中の抗体の発現の前にシークエンシングによって、確認した。
【０１４５】
ELISA。高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｈｉｇｈ−結合 ９６−ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｓｔａｒ））は、ＰＢＳ中の１ウェルあたり１００ｎｇの生成した抗体（ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１２０ｃｏｒｅおよび２ＣＣ−ｃｏｒｅ）(B. Dey et al., PLoS Pathog 5, e1000445 (May, 2009))、および変異タンパク質（ｇｐ１２０  Ｄ３６８Ｒ、ｇｐ１２０  Ｉ４２０Ｒ）で一晩、コートした。  洗浄後、プレートを２％のＢＳＡ、１μＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（ブロッキング・バッファ）で、２時間ブロックした。その後、４μｇ／ｍｌに希釈したＩｇＧ抗体および、ＰＢＳ中のいくつかの連続的な１：４の希釈でインキュベーションした。その後、プレートはゴートＨＲＰ−複合化抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）（ブロッキング・バッファ中 ０．８μｇ／ｍｌ）で１時間インキュベーションすることによって、および１００μｌのＨＲＰ色素原基質（ＡＢＴＳ ｓｏｌｕｔｉｏｎ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって、発展させた。光学濃度は、ELISAマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して、４０５ｎｍ（ＯＤ４０５ｎｍ）で測定した。コート化したウェル中にＰＢＳのみでインキュベーションすることによって測定した背景値を引いた。ＩｇＧ抗体は、ポリ反応性(H. Mouquet et al., Nature 467, 591 (Sep 30, 2010))であることを検証し、それらが４つから少なくとも２つの構造的に異なった抗原を認めたときポリ反応性であると考えた；ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、インスリン、およびＬＰＳ。反応性のための閾値は、コントロール抗体ｍＧＯ５３（ネガティブ）、ｅｉＪＢ４０（低ポジティブ）、およびＥＤ３８（高ポジティブ）を使用することによって決定した。
【０１４６】
中和分析：中和化スクリーンは実行した(D. C. Montefiori, Curr Protoc Immunol Chapter 12, Unit 12 11 (Jan, 2005))。手短に言うと、中和化は、Ｔｚｍ−ｂｌにおいてｓｉｎｇｌｅ−ｒｏｕｎｄ 感染の後、ルシフェラーゼレポーター遺伝子表現の減少として検出した。抗体サンプルにおける非特異的抗ウイルス活性を除外するために、ＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス）がネガティブコントロールとして使用した。
【０１４７】
骨髄形質細胞のクローンの特異的同定（Clone specific identification of bone marrow plasma cells）。骨髄形質細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ）は、フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、骨髄液から、単核細胞のフィコール精製の後、抗ヒトＣＤ１３８および抗ＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。ＣＤ１３８＋、ＣＤ１９＋ヒト形質細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でバルクソーティングし、そして、ＲＮＡの単離を、メーカーの説明に従って、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１０００００の細胞に対して行った。ＲＮＡは、メーカーの説明に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン）を用いて逆転写した。その後、ｃＤＮＡは以下の修飾を施した免疫グロブリン特異的ＰＣＲを行った：１μｌのｃＤＮＡは、表１に示された第１のフォワードリーダー配列プライマーおよびリバース定常領域プライマーを用い、続いて単細胞分析の結果の配列に基づいて設計された、クローン特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたネスト免疫グロブリン重鎖クローン特異的ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｌｏｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）２回によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ゲル精製後、メーカーの説明に従って、ＴＯＰＯ  ＴＡベクターへ組み込んだ。コロニーはクローン特異的プライマーおよび配列を用いたＰＣＲによって選別した。
【０１４８】
表面プラズモン共鳴。全ての実験は、前に解説される（Ｍｏｕｑｕｅｔ２０１０）ように、２５℃でＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）中で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて実施した。１００ＲＵｓの固定化レベルの結果になるｐＨ  ４．５でカップリングするアミンによって、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）上で、１２．５ 、μｇ／ｍＬのＹＵ−２ ｇｐ１４０および２ＣＣ−ｃｏｒｅタンパク質は固定化した。ｇｐ１４０および２ＣＣ−ｃｏｒｅを誘導化したチップの速度論的解析のために、ＩｇＧは、フローセルを通して、３分間の結合と５分間の解離で、流速４０μｌ／ｍｉｎでＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）中、７００ｎＭおよび４つの連続的１：２希釈で注入した。センサー表面は、５０μＬ／ｍｉｎの流速で、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ  ２．５の３０秒の注入で、各々の実験の間に再生した。オフ率（（ｋｄ（ｓ−１）））、オン率（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）と結合定数（ＫＤ  （Ｍ）またはＫＡ  （Ｍ−１））は速度分析および１：１結合モデルを使用したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価用ソフトウェアを使用して背景値（コントロールフローセルへの結合およびＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファのシグナル）を引いたのちに計算した。図２および図８に示したセンサーグラムはＳｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ, Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）を用いたＢｉａｃｏｒｅのデータ処理に由来している。
【０１４９】
ＣＤ４ｉサイトインダクション。２９３Ｔ細胞はプラスミド：Ｆｕｇｅｎｅが１：２の割合でＦｕｇｅｎｅＴＭ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｐＭＸ−ＩＲＥ−ＧＦＰコンストラクト（Ｐｉｅｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ. ２０１０）中のｇｐ１６０ＢＡＬ.２６Δｃまたはｇｐ１６０ＹＵ.２Δｃでトランスフェクションした。４６時間後、２９３Ｔ細胞はＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシンフリーの細胞解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ）で剥離し、ＦＡＣＳバッファ（１ｘＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１０７ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で再懸濁した。ｓＣＤ４（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.）およびｍＡｂｓは、４０ μｇ／ｍｌの最終濃度で始まる１：４の希釈系列において、ｇｐ１６０−発現２９３Ｔ細胞へ加えた。ｍＧＯはｇｐ１６０Δｃへ結合しないネガティブコントロール抗体である(H. Mouquet et al., Nature 467, 591 (Sep 30, 2010))。氷上での１５分間のインキュベーションの後、細胞を分離し、Ａｌｅｘａ６４７ラベル化ＣＤ４−誘導化サイトｍＡｂ(3-67; (J. F. Scheid et al., Nature 458, 636 (Apr 2, 2009))、またはＡｌｅｘａ６４７ラベル化コントロールｍＡｂ(すなわち、ＰＧ１６； L. M. Walker et al., Science 326, 285 (Oct 9, 2009)またはｇｐ１６０ＹＵ．２ のための２Ｇ１２およびｇｐ１６０ＢＡＬ.２６のための２Ｇ１２)を用いて、氷上で２５分間染色した。抗体ラべリングは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標登録）６４７マイクロスケールタンパク質ラべリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することで実施した。細胞はＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で分析した。
【０１５０】
結晶化。３ＢＮＣ６０  ＩｇＧは、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において一過性発現によって発現し、パパイン開裂によって作製した(R. Diskin, P. M. Marcovecchio, P. J. Bjorkman, Nat Struct Mol Biol 17, 608 (May, 2010)。結晶化スクリーンは、ＭＲＣ結晶化プレート（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で、ＭｏｓｑｕｉｔｏＴＭ（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ）結晶化ロボットを使用して、ｎＬシッティングドロップ（ｎＬ ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐｓ）中で、蒸気拡散によって２０℃で実施した。私たちは、４００ｎＬの液滴を作製するために、９．５ｍｇ／ｍｌの濃度の３ＢＮＣ６０  Ｆａｂとリザーバー溶液を１：１の割合で組み合わせた。最初の結晶化のヒットはＰＥＧＲｘ  ＨＴＴＭ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）結晶化スクリーンを用いて得た。さらに手動で最適化した。データ収集に適した結晶は、非対称ユニットにおける２つのＦａｂと単斜晶空間群において、１１．７％  ポリエチレングリコール２００００、０．１Ｍ  酢酸ナトリウムｐＨ５．０、１００ｍＭ  酒石酸カリウム／ナトリウム、２０ｍＭ  硫酸リチウム、１０ｍＭ  Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）ｐＨ９．５中で、数週間後、成長した。結晶は、２時間の間、１５％グリセロ−ルで補充されたレシーバー溶液中に浸し、その後、３０％グリセロ−ルで補充されたレシーバー溶液に浸し、および液化窒素中で瞬間的に冷やした。回析データは、Ｐｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ検出器を使用して、１００Ｋで、Ｓｔａｎｆｏｒｄシンクロトロン放射光源（ＳＳＲＬ）ビーム−ライン１２−２によって収集した。データは、ＸＤＳ（W. Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125 (Feb, 2010)）を用いて、指標付し、集積し、およびスケール化（ｓｃａｌｅｄ）した（表８）。分子置換は、検索モデルのように、抗腫瘍抗体ＣＴＭ０１（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  １ＡＤ９）からのＶＨおよびＣＨ１ドメイン、および抗ｇｐ１２０  ｂ１３抗体（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  ３ＩＤＸ）のＶＬおよびＣＬドメインを用いたフェザーを使用して実施した。２．６５Aの分析へのモデル結合および精製は、Phenix P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486 (Apr, 2010) and Coot (P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486 (Apr, 2010)を使用して繰り返し実施した。構造は、最大公算標的機能（ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｔａｒｇｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）および、非結晶学的な対称制限（ｎｏｎ−ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）を使用してリファイン（ｒｅｆｉｎｅｄ）した。最終モデルは（Ｒｗｏｒｋ＝２０．７％；Ｒｆｒｅｅ＝２５．７％）は、６４７８のタンパク質原子、１４６の水分子、２８の糖原子を含む（表８）。残基の９１．９％、７．６％および０．５％は、それぞれ、好ましい、許されるおよび許されないラマチャンドランプロットの領域である。構造解析または可視化は、ＰｙＭｏｌ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３，  Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ）を使用して実施した。３ＢＮＣ６０構造は、軽鎖のための３−２０５の残基（Ａｓｎ７２へ結合したＮ−結合型炭水化物内の最初のＮ−アセチルグ��コサミンを含む）および、重鎖のための２−２１７の残基から成る。末端残基およびＣＨ１ドメイン中の１３３−１４０残基に障害があった。
【０１５１】
質量分析。メーカーの説明に従って、ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、血清から、ＩｇＧは精製した。その後、ＩｇＧは、固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）で消化し、Ｆａｂ−Ｆｃ断片混合物はビオチン化２ＣＣ−Ｃｏｒｅタンパク質の飽和量とインキュベートした。ストレプトアビジン結合ダイナビーズ（インビトロゲン）は、室温で１５分間インキュベーション後に加え、リン酸緩衝塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）で、１０回洗浄した。結合したＦａｂフラグメントは９５℃のドデシル硫酸リチウムバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶出し、およびサンプル純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色またはクーマシー染色することよって確認し、その後、質量分析を行った。
【０１５２】
単離されたＦａｂ断片は、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドを使用してアルキル化し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で１Ｄゲル電気泳動によって分離し、クーマシーブルー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。Ｆａｂ断片は、ゲルから削り出され、２００ｎｇのトリプシンを使用して消化した。結果として生じたペプチドは、逆相樹脂を使用して単離し（ＰＯＲＳ  ２０  Ｒ２,  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、０．５％酢酸中４０％アセトニトリルのアリコートおよび０．５％酢酸中８０％アセトニトリルの第二のアリコートを使用して抽出した。アセトニトリルは、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除き、そして集積エミッターチップ（３６０μｍ Ｏ.Ｄ., ５０μｍ Ｉ.Ｄ., １０μｍチップ）を用いてセルフパックするＰｉｃｏＦｒｉｔ（商標登録）カラムへ残った溶液の圧力のアリコートをロードし、６ｃｍの逆相Ｃ１８マテリアル（Ｄｒ. Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨからのＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ,  ３μｍ  ビーズ）をパックし、自家製のミクロエレクトロスプレー源を使用したＬＴＱ  ＯｒｂｉｔｒａｐＴＭ  ＸＬ質量分析器またはＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＶｅｌｏｓＴＭ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかと、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）にインターフェースした。ペプチドは、以下の勾配で質量分析計に抽出した：０〜５％Ｂを５分間、４０％Ｂを１２５分間、６０％Ｂを１５０分間、１００％Ｂを１６５分間（Ａ=０．１Ｍ酢酸、Ｂ＝０．１Ｍ酢酸中の７０％のアセトニトリル、流速９０ｎＬ／ｍｉｎ）。両方の機器は、データ依存的モードで操作し、そして、両方の質量分析計のために、目標値は５ｅ５イオンおよび６０，０００（４００ ｍ／ｚで）の解像度にセットした。ＬＴＱ  ＯｒｂｉｔｒａｐＴＭＸＬ上の分析のために、完全なスキャンの後に、その完全なスキャンから８つの最大存在イオン上で、８つのＭＳ／ＭＳスキャンを行った。ペプチド（電荷状態＞１のみ）は２Ｄａウインドウで単離し、１ｅ４のイオンの目標ウインドウ、ＣＡＤを介して解離し（規格化衝突エネルギー（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）＝３５、Ｑ値（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｑ）＝０．２５、活性時間（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）＝３０ミリ秒）、そしてＬＴＱで質量は分析された。ＬＴＱ ＯｒｂｉｔｒａｐＴＭＶｅｌｏｓ上の分析のために。完全なスキャンの後に、即時の前述の完全なスキャンから１０の最も存在するイオン上で、７５０００の解能で１０ＭＳ／ＭＳスキャンを行った。ペプチド（電荷状態＞２のみ）は３Ｄａウインドウ、２ｅ５のイオンの目標ウインドウ、で単離し、ＨＣＤを介して解離し（規格化衝突エネルギー（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ）＝４０、活性時間（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）＝０．１００ミリ秒）、そしてＯｒｂｉｔｒａｐで質量は分析された。両方の機器のために、ＭＳ／ＭＳから選択されたイオンは３０秒間、除外リスト（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｌｉ���ｔ）にセットした。結果として生じたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｘｔａｎｄｅｍを用いて、ヒトＩＰＩ（Ｈｕｍａｎ  ＩＰＩ）または院内患者特異的ＩｇＧデータベース（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ｄａｔａｂａｓｅ）に対して検索し、ペプチドを自動的にヒトＩＰＩおよび我々の院内患者特異的ＩｇＧデータベース中のトリプシンペプチドと比較した。患者の特異的ＩｇＧを一致したペプチドは手動で確認した。
【０１５３】
マルチプルシーケンスアライメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）。すべてのマルチシーケンスアライメントは、デフォルトパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ２を使用して実施した（重み行列（ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ）：タンパク質のためのゴネット（ＧＯＮＮＥＴ）およびＤＮＡのためのＵＩＢ、ギャップオープン＝ １０、ギャップエクステンション（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）０．１）。アライメントの影付けはＴｅＸｓｈａｄｅ  ｐａｃｋａｇｅを使用して行った。
【０１５４】
アライメントのコンセンサス。マルチプルアライメントのためのコンセンサス配列は残基間の同一性および類似性（＞＝７０％）に基づいて作成した。アミノ酸は以下のように類似性に沿って分けた：ＦＹＷ、ＩＬＶＭ、ＲＫ、ＤＥ、ＧＡ、ＳＴおよびＮＱ。
生殖細胞系の系統樹。配列間の関係はＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法を使用して作成した。１０００の複製から推論されるブートストラップ方式のコンセンサス系統樹を、関連性を示すためにとった。５０％のブートストラップ方式の複製において再生した分割と一致する枝は崩壊する。ブートストラップ方式のテスト（１０００の複製）において集まった関連した配列のうち、複製の系統樹のパーセンテージは次の枝に示した。系統樹を推論するのに用いられる進化の距離のそれらのように同じ単位の枝の長さを持って、系統樹を描いた。進化距離は、相違方法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｍｅｔｈｏｄ）の数を利用して計算し、配列ごとのアミノ酸の違いの数の単位である。すべての曖昧な位置（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、配列対ごとに取り除いた。進化分析は、ＭＥＧＡ５で行った。
【０１５５】
Ｒ／Ｓ比率計算。ＤＮＡ配列は、置換／代用（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ／ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）計算のために、タンパク質配列と重ねた。すべてのギャップポジションは分析から取り除いた。Ｒ／Ｓ比率分析は、Ｐｅｒｌスクリプトを使用して実施した。
【０１５６】
実施例２
ＨＩＶ抗体クローニングが体細胞突然変異のため、制限されるかどうか決定するため、新たな一連のプライマーを潜在的な問題を避けるように設計した（表１）。新しいプライマーのセットは、Ｖ１−３ループが欠如し、安定したジスルフィド結合（２ＣＣ−ｃｏｒｅ）を含む、ＨＩＶ−ｇｐ１２０へ結合したＢ細胞をソーティングすることによって検証した。ＶＲＣ０１のクローンをつくるのに用いられる再表面化されたベイト（ｂａｉｔ）と対照的に、２ＣＣ−ｃｏｒｅベイトも、 ＣＤ４誘導化補助受容体結合部位（ＣＤ４ｉ）に対する抗体の捕獲を許諾する。
【０１５７】
並んでいる比較において、最初のプライマーセットと比較したとき（図４（ａ））とき、新しいプライマーセットはＩｇＨ鎖の回復を増加した。新しいプライマーセットで得られた抗体はより変異しており（平均３５．６ｖｓ．１９．８  ｐ＝＜０．０００１および最大８５ｖｓ．５０、ＩｇＨのため）、そして、オリジナルプライマーセットで見つからないクローンを含んだ。新しいプライマーがＹＵ２  ｇｐ１４０でソーティングされた細胞からＶＲＣ０１様抗体を奪還するかどうか決定するために、どんなＶＲＣ０１関連のクローンも産生することのないオリジナルプライマーセットで、徹底的にすでに検査されている個々からｃＤＮＡサンプルを検証した。８０ウェルにおいて、ＩｇＨとＩｇＬの配列によって決定したように、ＶＲＣ０１変異体と一致する３つの抗体を発見した（図５ＡおよびＢ）。ＶＲＣ０１様抗体がｇｐ１４０三量体によって捕獲され、高変異抗体をクローン化するために特異的に設計されたプライマーは広い中和抗体の高力価（ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ）をもつ患者のメモリーＢ細胞から抗ＨＩＶ抗体の大きな断片を捕獲することが分かった。
【０１５８】
白人２人、ヒスパニック１人、アフリカ人１人を含み、２ＣＣ−ｃｏｒｅベイトを使用して調べたところ広い中和抗体の高力価を示した４人の無関係なＨＩＶ感染した個体のうち、２人については、それらの前述のクローン化抗体では血清学的活性を説明することができなかった（表２及び図６ＡおよびＢ）。２０１つの異なる独特な多様化されたクローンを代表する５７６つの抗体が、１．５×１０５のＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の開始時の群から得られた。
【０１５９】
実施例３
ＨＩＶ抗体の結合特異性
２ＣＣ−ｃｏｒｅベイトによって捕獲された抗体クローンのサイズは２−７６の多様化されたメンバーから広い範囲で異なった（表３）。２ＣＣ−ｃｏｒｅによって捕獲された抗体がＨＩＶスパイクに結合するかどうか決定するために、それぞれの拡張されたクローンの代表的なメンバーで、ＹＵ２  ｇｐ１２０を使用して、ＥＬＩＳＡを実施した。検証したすべての抗体はｇｐ１２０へ結合した（表３）。
【０１６０】
ＨＩＶスパイク上に結合する抗体の部位はＣＤ４ｂｓ（ｇｐ１２０（Ｄ３６８Ｒ））またはＣＤ４誘導化補助受容体結合部位（ＣＤ４ｉ、ｇｐ１２０（Ｉ４２０Ｒ））に干渉する変異体タンパク質を使用してマップした。X. Wu et al., Science 329, 856 (Aug 13, 2010)で報告されているように、ＶＲＣ０１は、Ｄ３６８Ｒ変異体に対してセンシティブであるため、ＣＤ４ｂｓ抗体として分類される。しかし、ＣＤ４ｉ部位に近接するため、Ｉ４２０Ｒ変異体へのいくらかのセンシティビティも示した。ＶＲＣ０１変異体であるＮＩＨ４５−４６、および抗体３ＢＮＣ６０、８ＡＮＣ１３１、および１２Ａ１２はＶＲＣ０１と類似したＥＬＩＳＡパターンを示した（これらのクローンメンバーは中和活性に基づいて選択した、表３）。１Ｂ２５３０および８ＡＮＣ１９５を含む他のクローンは、両方の変異体に等しくセンシティブで、ELISAだけに基づいて、正確に分類することができなかった。
【０１６１】
抗体がポリ反応性かどうか決定するために、精製されたｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、インシュリンとＬＰＳにおいてＥＬＩＳＡを実施した。検証された抗２ＣＣ−ｃｏｒｅ抗体の６３％はポリ反応性であった。２ＣＣ−ベイトによって捕獲された抗体の大部分は、ｇｐ１２０上のＣＤ４ｂｓまたはＣＤ４ｉ部位のいずれか を認識し、そして多くがポリ反応性でもあった。
【０１６２】
実施例４
体細胞超変
体細胞超変は、高親和性抗原結合の発達のために必要で、いくつかのケースにおいて、抗ＨＩＶ抗体のポリ反応性に貢献する。高変異２ＣＣ−ｃｏｒｅ特異的抗体を検証するために、４つの代表的な抗体を対応する生殖細胞系へ復帰変異させた。復帰変異は検証された４つのクローンすべてにおいて抗原結合の完全な欠損、およびポリ反応性の欠如という結果になった。
【０１６３】
実施例５
ＨＩＶ中和
ＨＩＶ中和活性は、３つのｔｉｅｒ１のクレードＡ、ＢおよびＣ、および５つのｔｉｅｒ２のクレードＢ  Ｅｎｖ偽ウイルス変異体(M. S. Seaman et al., J Virol 84, 1439 (Feb, 2010))を含む、８ウイルスの最初のパネルを使用した標準化ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によって計測した。抗体の中和活性はＶＲＣ０１およびドナーからの精製した血清ＩｇＧと比較した（図１Ａ、表４または図６）。高レベルの中和活性を示した抗体は、ＶＲＣ０１に耐性を持つ５つのウイルスを含む（図１Ｂ、表５）、１５個の付加的ｔｉｅｒ２のクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＡＧおよびＡＥのＥｎｖ偽ウイルス変異体（図１Ｂ、表５）のパネル上でさらに検証した。
【０１６４】
検証された抗体のすべての９０はいくらかの中和抗体を示し、６つのクローンは有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）と幅（ｂｒｅａｄｔｈ）の高いレベルを示した抗体変異体を含んでいた（図１Ａ、ＢおよびＣ、および表４および５）。これらのクローンは、４つの患者の研究のそれぞれにおいて、２ＣＣ−ベイトによって捕獲されたものの間で最も豊富であった（表３）。もっとも効果を生む新しい抗体、７６メンバーのクローンに属する３ＢＮＣ１１７、は、ＶＲＣ０１での１．８μｇ／ｍｌと比較して、０．５μｇ／ｍｌの１４のｔｉｅｒ２のウイルスのグループとの組み合わせにおいて平均ＩＣ８０を示した。
【０１６５】
検証された２０個のウイルスのうちわずか４個は３ＢＮＣ１１７よりもＶＲＣ０１にセンシティブであった。ところが、１４個は完全にＶＲＣ０１耐性であり、３ＢＮＣ１１７感受性であるＤＵ１７２．１７を含み、３ＢＮＣ１１７によりセンシティブである（図１ＢおよびＣ）。ＮＩＨ４５−４６、新たなＶＲＣ０１の変異体、検証された２０のウイルスのうち１５のウイルスにおいてはＶＲＣ０１よりも能力があるが、しかし、３ＢＮＣ１１７よりも能力がない（図１ＢおよびＣ、および図４および５）。
【０１６６】
５つのもっともの能力のある中和抗体クローンのメンバーの間の中和の有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）と幅（ｂｒｅａｄｔｈ）において多くのバリエーションがある。例えば、最初のパネルにおいて、３ＢＮＣ１１７の変異体である３ＢＮＣ１５６は、たった２つのウイルスを中和したのみで、しかも３ＢＮＣ１１７よりもずっと高い濃度であった（図１Ａおよび表４）が、他の変異体である３ＢＮＣ５５は、４μｇ／ｍｌの平均ＩＣ５０で６つのウイルスに対して活性を示し、上記２つの中間であった。最終的に、最も高い活性を持つ抗体は、高頻度の変異を受けていた。トップ１０の抗体のための変異の平均数はＶＨで７２、およびＶＬで４５であり、これは有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）と幅（ｂｒｅａｄｔｈ）に関連していた。変異を受けた残基の生殖細胞系への復帰変異は、残基検証されたすべての抗体のために、中和活性を完全に欠損する結果となった。
【０１６７】
実施例６
診断ペプチドの同定
前述のクローニング方法は、メモリーＢ細胞に結合する抗原によって産生される抗体を捕獲したが、しかし、循環する抗体はこれらの細胞によって産生されず、その代わりとして骨髄において形質細胞に由来する。しかしながら、同族の抗原は、表面ＩｇＡを発現していないので、形質細胞を捕獲するためのベイトとして用いることができない(Radbruch et al., Nat Rev Immunol 6, 741 (Oct, 2006))。さらに、骨髄中の形質細胞と循環メモリーＢ細胞の姶良の関係は正確に定められていないメモリーＢ細胞からクローン化された抗体が骨髄形質細胞コンパートメントにおいても発見されるどうかを決定するために、ＣＤ１３８発現形質細胞は、研究対象の４個体のうちの２個体から組み合わせた骨髄サンプルから精製し、そして、これらの個体におけるメモリーＢ細胞からクローン化されるより強力な抗体のためのＩｇＶＨ遺伝子を増幅するためのＰＣＲに使用した。ＲＵ０１のためのクローン特異的プライマーは以下のとおりである。：ＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣ  （ＦＷＲＤ）（配列番号５８４)、ＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧ  （ＦＷＲＤ）、（配列番号５８５）ＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣ（ＲＥＶ）（配列番号５８６）、ＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＴＧ（ＲＥＶ）（配列番号５８７）、ＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＴ（ＲＥＶ）（配列番号５８８)および、ＲＵ１０のための：ＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧ（ＦＷＲＤ）（配列番号５８９）、ＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＴＧ（ＲＥＶ）（配列番号５９０）。選択されたクローンのメンバーと多数の付加的な変異体は、両方の患者ですぐに特定された。
【０１６８】
これらの抗体が血清中でも見られることを確かめるために、同じ２個体および追加の血清から精製されるＩｇＧは２ＣＣ−ｃｏｒｅベイト上に吸着され、そして、質量分析は溶出したＩｇＧの上で実施した（図１Ｄ、図７および図１０Ａ−Ｃ）。診断ペプチドは、すべてのケースにおいて、非常に活性の高い抗体変異体のために見つけた（図７、図１０Ａ−Ｃ）。骨髄形質細胞コンパートメントにおいて、および、広い中和抗体の高い血清の力価をもつ患者の循環ＩｇＧにおいて、メモリーＢ細胞からクローン化される幅広くて強力な抗ＨＩＶ抗体も発見されることが分かった。
【０１６９】
実施例７
ＨＩＶ抗体結合特性
ｇｐ１２０への抗体の親和性が中和活性に関連があるかどうか決定するために、鏡面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、高い活性を持つ抗体の結合、選択されたクローンの類縁体および生殖細胞系復帰変異前駆体を比較した（図２ＡおよびＢ、図８および表６）。
【０１７０】
トップの中和抗体は、２ＣＣ−ｃｏｒｅの上で、親和性（ＫＡ）はＹＵ２  ｇｐ１４０三量体上で１０７−１０１２および２ＣＣ−ｃｏｒｅ上で１０７−１０１１（Ｍ−１）の範囲を示した（表２ＡおよびＢ、および表６）。それらの中和の有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）と幅（ｂｒｅａｄｔｈ）に調和して、３ＢＮＣ６６、３ＢＮＣ１５６および３ＢＮＣ５５は、３ＢＮＣ１１７よりもＹＵ２  ｇｐ１４０三量体上での低い親和性を示したが、しかし、驚くべくことに、２ＣＣ−ｃｏｒｅへの親和性は中和活性と関連していなかった（図１、図８、表４および表６）。ＳＰＲによる結合は、検証されたどんな生殖細胞系復帰変異抗体でも検出されなかった（図２Ｂ、表６）。ＹＵ２  ２ＣＣ−ｃｏｒｅによって捕獲された抗ＨＩＶ抗体は、２ＣＣ−ｃｏｒｅよりも、ｇｐ１４０三量体へのより高い親和性を示す傾向があるということが分かった。
【０１７１】
ＶＲＣ０１がＨＩＶスパイクと結合する場合、ＣＤ４結合を模倣し、およびＣＤ４ｉ部位を露出させる大きな構造的な変化をもたらす。対照的に、Ｂ１２および大部分の他の既知の抗ＣＤ４ｂｓ抗体は、そうしない。
【０１７２】
これが高い活性を持つ抗体の共有された特徴であるかどうかを決定するために、ＨＩＶ−ＢＡＬ.２６Δｃまたは−ＹＵ２  ｇｐ１６０Δｃを、ＨＥＫ２９３細胞の表面上に発現させ、およびＣＤ４ｉ抗体結合は、ＣＤ４または抗−ＣＤ４ｂｓ抗体の存在の有り無しで計測した（図２Ｃ）。１つの例外は、検証された高い活性を持つ抗体のすべては、ＨＩＶ−ＢＡＬ.２６Δｃまたは−ＹＵ２  ｇｐ１６０Δｃまたは両方と結合する抗ＣＤ４ｉ抗体を促進するという点で、ＣＤ４とＶＲＣ０１と類似していた。
【０１７３】
この特徴を共有することがない高い活性を持つ抗体、８ＡＮＣ１９５のみは、それがＤ３６８Ｒおよび Ｉ４２０Ｒ変異体に等しくセンシティブであるという点で、典型的な抗ＣＤ４ｂｓ抗体と異なる（表３）。これに加えて、その中和パターンにおいて、他の高い活性を持った抗体を異なった：それはどんなｔｉｅｒウイルスも中和せず、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１およびｂ１２を含む検証された他のすべての抗体に対して耐性を示すクレードＢウイルス、Ｈ０８６．８に対して、強い活性を示した。
【０１７４】
実施例８
ＨＩＶ抗体の配列同一性
高い活性を持った抗ＣＤ４ｂｓ抗体が共通配列の特徴を共通するかどうかを決定するための、１０の最も良い抗体：５人の異なる患者に由来する５つの独立した抗体からの２つの変異体は、アライメントした（図３）。ＩｇＶＨ領域の比較は、６８のＩｇＶＨ残基をカバーする高く保存されたコンセンサス配列と関連した（図３Ａ）。ＩｇＶＨコンセンサスは、６のＶＲＣ０１−ｇｐ１２０の接触残基（ｃｏｎｔａｃｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を含み、Ａｒｇ５９ＣＤ４およびＡｓｐ３６８ｇｐ１２０のキーインタラクションを模倣するＶＲＣ０１−Ａｒｇ  ７１を含む（図３Ａ）。さらに、６の接触残基を含む、コンセンサスは、このクラスにおける抗体のすべてをもたらす密接に関連した生殖細胞系ＩｇＶＨ遺伝子（ＶＨ１−２とＶＨ１−４６）の両方で保存されていた。
【０１７５】
コンセンサス残基をコードしているコドンは、１０の選択した抗体で高度に体細胞性に変異したが、それでも、アミノ酸配列は保存されていた（図９）。コンセンサス残基のサイレント変異の置換率は０．７−１．７の範囲であるが、それはコンセンサスの保存が強く選択されることを示している非コンセンサス残基においては３．５−２２であった。（表７）。重鎖と対照的に、ＶＲＣ０１の軽鎖は、ｇｐ１２０と接触する３２つのうちわずか８つになった。より限られた役割と一致して、同じ抗体の軽鎖配列の比較により、３ＶＲＣ０１−ｇｐ１２０接触残基を含む５３のＩｇＶＬ残基をカバーしている、より広範囲でないコンセンサスが明らかとなった（図３Ｂ）。最終的に、重鎖のように、軽鎖は生殖細胞系遺伝子の限られたセットに起因した：２つはＩｇＫ１Ｄ−３３、２つはＩｇＫ３−１１、および１つはＩｇＬ１−４７に由来した（図３）。抗体８ＡＮＣ１９５は、いくつかの重要な側面において他のものとは異なった、コンセンサスに完全に従うわけではなく、および関連した重鎖および軽鎖に起因しなかった（図３ＡおよびＢ）。高い活性をもったアゴニスト抗ＣＤ４ｂｓ抗体（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４ｂｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ＨＡＡＤｓ））の間に、重要な配列のコンバージェンス（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）があることを確認した。
【０１７６】
実施例９
３ＢＮＣ６０  Ｆａｂの結晶構造
異なる患者における抗体の構造も保存されるかどうか決定するために、３ＢＮＣ６０ Ｆａｂの結晶構造は、２．６５Aリソリューション（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で解析し、ＶＲＣ０１と比較した。構造は、抗原結合部位を形成するＶＨとＶＬ内の標準的なＦａｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）の４つのドメイン、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬとＣＬを明らかにした。３ＢＮＣ６０の非対称ユニットにおける２つのＦａｂは、ほぼ同一であった；しかし、結晶格子の接触によって形成する異なる化学的な環境のために、鎖のＤとＥをつなぐループの残基７４−７８の形態は、わずかに異なった。
【０１７７】
ＶＲＣ０１− ｇｐ１２０共結晶構造(T. Zhou et al., Science 329, 811 (Aug 13, 2010))における３ＢＮＣ６０およびＶＲＣ０１からのＶＨドメインの重複画像はＣＤＲ２の残基５８−６５（３ＢＮＣ６０のナンバリング）に限定された大きな違いと１．３A  （１１１  Ｃα原子のために計算された）の平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）を与えた。構造を重畳することは、ｇｐ１２０で認知インターフェース（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）の保存を示しました。たとえば、Ａｒｇ７２３ＢＮＣ６０は、Ａｒｇ７１ＶＲＣ０１として類似した形態を採用し、それは通常Ａｒｇ５９ＣＤ４とＡｓｐ３６８ｇｐ１２０の間で形成される重要な塩橋に擬態する。これに加えて、Ｔｒｐ４７３ＢＮＣ６０は、Ｔｒｐ４７ＶＲＣ０１、ｇｐ１２０に接触する残基と同様の形態を採用し、およびＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の形態を安定化する芳香族および脂肪族の残基の相互作用の複雑なネットワークを含む。Ｇｌｎ６４ＶＲＣ０１と一致するＧｌｎ６５３ＢＮＣ６０は、ＶＲＣ０１からの構造とは異なる残基セグメント（残基５８−６５）中にある。結晶において格子の接触において含まれる３ＢＮＣ６０のこの領域の形態は、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合ループと衝突することで、ｇｐ１２０に結合することに変化するようだ。
【０１７８】
３ＢＮＣ６０とＶＲＣ０１  ＶＬドメインを重畳することは、０．９A（９５  Ｃα原子のために計算された）のｒｍｓｄを与えて、およびｇｐ１２０−接触残基のいくつかは構造的に保存されることを示した；Ｔｙｒ９１３ＢＮＣ６０およびＧｌｕ９１ａ３ＢＮＣ６０は、Ｔｙｒ９１ＶＲＣ０１およびＧｌｕ９６ＶＲＣ０１に類似した形態を採用した。
そして、それは正反対（ｐｏｌａｒ）の相互作用を介してｇｐ１２０のループＤに関与する。全体として、これらの構造比較は、３ＢＮＣ６０が、ＶＲＣ０１の結合で観察されるのと同じ構成をもつｇｐ１２０と結合することを示唆した。
【０１７９】
実施例１０
ＨＩＶ抗体コンセンサス配列
前述の実験は、ＶＲＣ０１とＨＩＶスパイクの間で、接触残基の８つを含む、ＩｇＶＨおよびＩｇＶＬコンセンサス配列を共有する、アゴニスト抗ＣＤ４ｂｓ抗体（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ４ｂｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＨＡＡＤｓのクラスを決定した（図３ＡおよびＢ）。５人の異なる提供者において、これらの高いレベルの血清学的の抗ＨＩＶ活性のために選択され、これらの抗体は、ＨＡＡＤコンセンサスにかなう２つの密接に関連したＩｇＶＨおよび３つのＩｇＶＬ生殖細胞系遺伝子だけに由来する；ＶＨ１−２およびＶＨ１−４６は７つのアミノ酸だけによって異なり、コンセンサスの一部ではない（図３Ａ）。広範囲な体細胞超変にもかかわらず、コンセンサス残基は、彼らの生殖細胞系フォームで保持された。
【０１８０】
コンセンサスに対する唯一の例外、８ＡＮＣ１９５は、抗原認識の独自の方法があるかもしれないことを示唆するいくつかの方法において他と異なる：重要なＡｒｇ５９ＣＤ４とＡｓｐ３６８ｇｐ１２０の接触部位に類似する重鎖のＡｒｇの欠如；独特の中和パターン；および、抗ＣＤ４ｉ抗体結合を容易にすることができないこと。この抗体は１人の患者において生じている２つの異なった高い活性抗体のうちの１つである。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
【表２】
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【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
【表４】
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【０１８５】
【表５】
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【０１８６】
【表６】
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【０１８７】
【表７】
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【０１８８】
【表８】
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【０１８９】
【表９】
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【０１９０】
【表１０】
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【０１９１】
【表１１】
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【０１９２】
【表１２】
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【０１９３】
【表１３】
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【０１９４】
【表１４】
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【０１９５】
【表１５】
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【０１９６】
【表１６】
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【０１９７】
【表１７】
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【０１９８】
【表１８】
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【０１９９】
【表１９】
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【０２００】
【表２０】
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【０２０１】
【表２１】
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【０２０２】
【表２２】
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【０２０３】
【表２３】
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【０２０４】
【表２４】
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【０２０５】
【表２５】
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【０２０６】
【表２６】
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【０２０７】
【表２７】
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【０２０８】
【表２８】
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【０２０９】
【表２９】
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【０２１０】
【表３０】
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【０２１１】
【表３１】
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【０２１２】
【表３２】
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【０２１３】
【表３３】
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【０２１４】
【表３４】
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【０２１５】
【表３５】
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【０２１６】
【表３６】
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【０２１７】
【表３７】
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【０２１８】
【表３８】
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【０２１９】
【表３９】
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【０２２０】
【表４０】
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【０２２１】
【表４１】
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【０２２２】
【表４２】
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【０２２３】
【表４３】
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【０２２４】
【表４４】
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【０２２５】
【表４５】
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【０２２６】
【表４６】
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【０２２７】
【表４７】
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【０２２８】
【表４８】
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【０２２９】
【表４９】
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【０２３０】
【表５０】
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【０２３１】
【表５１】
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【０２３２】
【表５２】
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【０２３３】
【表５３】
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【０２３４】
【表５４】
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【０２３５】
【表５５】
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【０２３６】
【表５６】
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【０２３７】
【表５７】
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【０２３８】
【表５８】
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【０２３９】
【表５９】
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【０２４０】
【表６０】
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【０２４１】
【表６１】
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【０２４２】
【表６２】
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【０２４３】
【表６３】
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【０２４４】
【表６４】
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【０２４５】
【表６５】
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【０２４６】
【表６６】
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【０２４７】
【表６７】
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【０２４８】
【表６８】
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【０２４９】
【表６９】
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【０２５０】
【表７０】
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【０２５１】
【表７１】
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【０２５２】
【表７２】
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【０２５３】
【表７３】
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【０２５４】
【表７４】
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【０２５５】
【表７５】
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【０２５６】
【表７６】
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【０２５７】
【表７７】
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【０２５８】
【表７８】
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【０２５９】
【表７９】
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【０２６０】
【表８０】
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【０２６１】
【表８１】
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【０２６２】
【表８２】
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【０２６３】
【表８３】
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【０２６４】
【表８４】
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【０２６５】
【表８５】
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【０２６６】
【表８６】
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【０２６７】
【表８７】
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【０２６８】
【表８８】
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【０２６９】
【表８９】
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【０２７０】
【表９０】
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【０２７１】
【表９１】
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【０２７２】
【表９２】
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【０２７３】
【表９３】
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【０２７４】
【表９４】
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【０２７５】
【表９５】
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【０２７６】
【表９６】
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【０２７７】
【表９７】
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【０２７８】
【表９８】
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【０２７９】
【表９９】
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【０２８０】
【表１００】
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【０２８１】
【表１０１】
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【０２８２】
【表１０２】
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【０２８３】
【表１０３】
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【０２８４】
【表１０４】
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【０２８５】
【表１０５】
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【０２８６】
【表１０６】
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【０２８７】
【表１０７】
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【０２８８】
【表１０８】
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【０２８９】
【表１０９】
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【０２９０】
【表１１０】
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【０２９１】
【表１１１】
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【０２９２】
【表１１２】
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【０２９３】
【表１１３】
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【０２９４】
【表１１４】
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【０２９５】
【表１１５】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ａ−３】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｂ−３】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ｂ−１】
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【図１０Ｂ−２】
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【図１０Ｃ−１】
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【図１０Ｃ−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月25日(2018.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８９６の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、および配列番号９１０の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項２】
１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＺＭ５３Ｍ．ＰＢ１２を中和し、または１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＨＩＶウイルスＲ１１６６．ｃ１を中和する、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項３】
３０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０濃度でＤＵ１７２．１７を中和する、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項４】
ＣＤＲ領域以外の少なくとも１つのアミノ酸残基が保存的置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗ＨＩＶ抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＨＩＶ抗体が組み換え抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片をコードする、核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片の少なくとも１つ、および薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染またはＨＩＶに関連する疾患の予防または治療に用いられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
第２の治療剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記第２の治療剤が抗ウイルス薬である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片が組み換え抗体またはその抗原結合断片である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片の製造方法であって、
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターを含む細胞を、前記核酸が発現する状況下で培養すること、および、
前記抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片を単離すること、
を含む、方法。
【請求項１７】
患者における請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片を検出する方法であって、
前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片に結合する、または前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡとハイブリダイズする剤と、前記患者から採取した生物学的試料とを接触させること、および
前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片または前記抗ＨＩＶ抗体もしくはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの少なくとも１つを含む細胞の存在について、前記生物学的試料を分析すること、
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片の少なくとも１つの薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニットと、非核酸系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤または融合阻害剤およびインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択される抗ＨＩＶ剤の薬理学的有効量の薬理学的に許容される投薬ユニットと、を含み、２つの薬理学的に許容される投薬ユニットは１つの薬理学的に許容される投薬ユニットの形状をとってもよい、ＨＩＶ感染またはＨＩＶに関連する疾患を予防または治療するためのキット。
【請求項１９】
被験者由来の生物学的試料において請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合断片もしくはそのＨＩＶ  ｇｐ１２０由来抗原結合断片に特異的に結合する１以上の検出試薬を含む、患者におけるＨＩＶの診断、予後、または治療のモニタリングのためのキット。
【請求項２０】
ＰＣＲを実施するための試薬をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
質量分析を実施するための試薬をさらに含む、請求項１９に記載のキット。