(57)【要約】      （修正有）【課題】新規メタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチド、並びに使用するための組成物及び方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含み、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解を含むプロテアーゼ活性を有する組み換えポリペプチド、及びクリーニング組成物又は洗剤組成物、並びにプロテーゼ活性を有するポリペプチドの産生方法。【選択図】図１．６
2018153183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３、８、１３、１８、２３、２８、３３、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、８０％、又は９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、バチルス（Bacillales）目のメンバーに由来するもの、又はプラノコッカス（Planococcus）種に由来するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記バチルス（Bacillales）目のメンバーが、パエニバチルス（Paenibacillaceae）科のメンバーである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記バチルス（Bacillales）目のメンバーがパエニバチルス種（Paenibacillus spp.）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドがプロテアーゼ活性を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記プロテアーゼ活性が、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解を含むものである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ｐＨ４．５〜１０及び／又は３０℃〜７０℃下で、前記ポリペプチドの最大活性の少なくとも５０％を保持するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、洗剤組成物中でクリーニング活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、組み換えポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、クリーニング組成物又は洗剤組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、布地柔軟化洗剤、食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング洗剤からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、界面活性剤；少なくとも１種のカルシウムイオン及び／又は亜鉛イオン；少なくとも１種の安定剤；約０．００１〜約０．１重量％の前記ポリペプチド；少なくとも１種の漂白剤；少なくとも１種の補助成分；及び／又はアシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ，カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、その他のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含むものである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記クリーニング組成物がリン酸塩を含むもの、又はリン酸塩を含まないものである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ゲル、又はペースト組成物である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
表面又は物品を、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むクリーニング組成物と接触させることを含む、クリーニング方法。
【請求項１７】
前記物品が食器又は布地である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ．請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を安定的に形質転換させることと；
ｂ．前記宿主細胞に前記プロテアーゼを産生させるのに好適な条件下で、前記形質転換させた宿主細胞を培養することと；
ｃ．前記プロテアーゼを回収することと、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、
ａ．配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％配列同一性であるもの；又は
ｂ．中程度〜高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズさせることができるもの；又は
ｃ．配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列に対し相補的なポリヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸配列であって、
（ｉ）配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９からなる群から選択される配列に対し少なくとも７０％同一性を有する、又は
（ｉｉ）中程度〜高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズさせることができる、又は
（ｉｉｉ）配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と相補的である、
核酸配列を含むものである、核酸配列。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸配列を含むものである、ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターで形質転換させたものである、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、布地加工、動物飼料、皮革加工、羽毛加工、又はトウモロコシ大豆タンパク質加工の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、すべて２０１３年５月２９日に出願された、国際公開第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４１９号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６３８７号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４０１号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４０６号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４１４号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６３８４号；同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６３９８号；及び同第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７６４１５号に対する優先権を主張するものであり、これらの特許文献の全容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、プロテアーゼ及びそれらの変異体に関する。プロテアーゼを含有している組成物は、クリーニング、食品及び飼料、並びにその他の様々な工業用途に好適である。
【背景技術】
【０００３】
メタロプロテアーゼ（ＭＰ）は、活性部位に配位する水分子を利用し、ペプチド結合に対する求核攻撃を介在する、加水分解酵素の一種である。メタロプロテアーゼでは、亜鉛などの二価イオンが水分子を活性化する。この金属イオンは、通常は数にして３つのアミノ酸リガンドにより適切に保持される。ＭＡ族は、亜鉛リガンドのモチーフ：ＨｉｓＧｌｕＸＸＨｉｓ（配列番号４１）中にヒスチジンが２つ存在する亜鉛依存性ＭＰから構成される。このＧｌｕが触媒残基である。これらはドメイン間に活性部位を有する２ドメインプロテアーゼである。Ｇｌｕ−ｚｉｎｃｉｎｓとしても既知であるＭＡ（Ｅ）亜属では、３番目のリガンドは、ＨＤＸＸＨモチーフ（配列番号４２）のＣ末端に位置するＧｌｕである。ファミリーのメンバー：Ｍ１、３、４、１３、２７、及び３４は、すべて分泌プロテアーゼであり、もっぱら細菌由来のものである（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｓｅｎ（２０１３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ）。それらは、一般に高温下で活性であり、それらの安定性にはカルシウムの結合が関与している。サーモリシン様プロテアーゼは、ＭＥＲＯＰＳにより定義されるＭ４ファミリーに見られるＲａｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０：Ｄ３４３−Ｄ３５０。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロテアーゼは工業用酵素の分野で古くから知られているものの、特定の条件及び用途に好適な新規プロテアーゼが尚も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、新規メタロプロテアーゼ酵素、これをコードしている核酸、並びにそれらの製造及び使用に関係する組成物及び方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、アリシクロバチルス科（Alicyclobacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、イグジオバクテリウム（Exiguobacterium）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、又はパエニバチルス（Paenibacillus）、例えば、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、前記ポリペプチドは、コナカイガラムシ（Pseudococcidae）、又はプラノコッカス（Planococcus spp.）、例えば、プラノコッカス・ドンガエンシス（Planococcus donghaensis）などのメンバーに由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜９．５で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３０℃〜７０℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、又はブレビバチルス科（Brevibacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、又はパエニバチルス（Paenibacillus spp.）、例えばパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、ブレビバチルス種（Brevibacillus sp.）に由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜１０で最大活性の少なくとも５０％を保持する。
本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３５℃〜７０℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、又はブレビバチルス科（Brevibacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、又はパエニバチルス（Paenibacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）に由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜９．５で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３５℃〜７０℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、又はブレビバチルス科（Brevibacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、又はパエニバチルス（Paenibacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、ブレビバチルス種（Brevibacillus sp.）に由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜１０．５で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、４５℃〜７５℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、アリシクロバチルス科（Alicyclobacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、又はラクトバチルス（Lactobacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、コナカイガラムシ（Pseudococcidae）、又はプラノコッカス（Planococcus spp.）、例えばプラノコッカス・ドンガエンシス（Planococcus donghaensis）科のメンバーに由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜１０で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３５℃〜６５℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２８のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、又はラクトバチルス（Lactobacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、コナカイガラムシ（Pseudococcidae）、又はプラノコッカス（Planococcus spp.）、例えばプラノコッカス・ドンガエンシス（Planococcus donghaensis）科のメンバーに由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。
本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５〜９．５で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３０℃〜６５℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３３のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、又はパエニバチルス（Paenibacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）科のメンバーに由来するものである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）に由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ４．５〜９．０で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３５℃〜７０℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３８のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかのものであり、上記ポリペプチドは、バチルス目（Bacillales）；バチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、又はバチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、又はゲオバチルス（Geobacillus spp.）、例えば、パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus amylolyticus）科のメンバーに由来するものである。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、アゾカゼイン加水分解などのプロテアーゼ活性を有する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ｐＨ  ５．５〜１０で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、３５℃〜６５℃で最大活性の少なくとも５０％を保持する。本発明の様々な実施形態では、上記のポリペプチドのうちいずれかのものは、ＡＤＷ洗剤、洗濯洗剤、液体洗濯洗剤、又は粉末洗濯洗剤組成物などの洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記のいずれかを含む組成物、例えば、クリーニング又は洗剤組成物などである。いくつかの実施形態では、組成物は、界面活性剤、少なくとも１つのカルシウムイオン及び／又は亜鉛イオン、少なくとも１種の安定剤、少なくとも１種の漂白剤を更に含み、かつリン酸塩を含有するものであってよく、あるいはリン酸塩を含まないものであってよい。いくつかの実施形態では、組成物には、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される１つ以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含ませることができる。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約５．５〜約８．５のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のポリペプチド又は組成物のうちいずれかを使用するクリーニング方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、布地加工組成物、動物飼料組成物、皮革加工組成物、又は羽毛加工組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１．１】実施例１．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ０８５（ａｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）を提供する。
【図１．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｓｐＰｒｏ３の用量応答曲線を提供する。
【図１．３】ＰｓｐＰｒｏ３のｐＨプロファイルを提供する。
【図１．４】ＰｓｐＰｒｏ３の温度特性を提供する。
【図１．５Ａ】ｐＨ  ６及び８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図１．５Ｂ】ｐＨ  ６及び８、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図１．６】液体洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図１．７】（配列番号３、４４、及び４５は、それぞれ）ＰｓｐＰｒｏ３と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図１．８】ＰｓｐＰｒｏ３及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図２．１】実施例２．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ０８４（ａｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）を提供する。
【図２．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｓｐＰｒｏ２の用量応答曲線を提供する。
【図２．３】精製したＰｓｐＰｒｏ２のｐＨプロファイルを提供する。
【図２．４】精製したＰｓｐＰｒｏ２の温度特性を提供する。
【図２．５Ａ】ｐＨ  ６下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図２．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、精製したＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図２．６Ａ】液体洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図２．６Ｂ】粉末洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図２．７】（配列番号８、４６、及び４５は、それぞれ）ＰｓｐＰｒｏ２と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図２．８】ＰｓｐＰｒｏ２及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図３．１】実施例３．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１５０（ａｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２）を提供する。
【図３．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｈｕＰｒｏ２の用量応答曲線を提供する。
【図３．３】精製したＰｈｕＰｒｏ２のｐＨプロファイルを提供する。
【図３．４】精製したＰｈｕＰｒｏ２の温度特性を提供する。
【図３．５Ａ】ｐＨ  ６下、ＡＴ食器洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図３．５Ｂ】ｐＨ  ８下、ＡＴ食器洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図３．６】（配列番号１３、４７、及び４５は、それぞれ）ＰｈｕＰｒｏ２と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図３．７】ＰｈｕＰｒｏ２及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図４．１】実施例４．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４８（ａｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１）を提供する。
【図４．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｅｈＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図４．３】精製したＰｅｈＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図４．４】精製したＰｅｈＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図４．５Ａ】ｐＨ  ６下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、ＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図４．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、精製したＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図４．６】（配列番号１８、４８、及び４５は、それぞれ）ＰｅｈＰｒｏ１と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図４．７】ＰｅｈＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図５．１】実施例５．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４７（ａｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）を提供する。
【図５．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｂａＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図５．３】精製したＰｂａＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図５．４】精製したＰｂａＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図５．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｂａＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図５．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｂａＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図５．６】（配列番号２３、４９、及び４５は、それぞれ）ＰｂａＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図５．７】ＰｂａＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図６．１】実施例６．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１３８（ａｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）を提供する。
【図６．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｐｏＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図６．３】精製したＰｐｏＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図６．４】精製したＰｐｏＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図６．５Ａ】ｐＨ  ６、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図６．５Ｂ】ｐＨ  ８、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図６．６】（配列番号２８、５０、及び４５は、それぞれ）ＰｐｏＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図６．７】ＰｐｏＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図７．１】実施例７．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４９（ａｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１）を提供する。
【図７．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｈｕＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図７．３】精製したＰｈｕＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図７．４】精製したＰｈｕＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図７．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図７．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図７．６】（配列番号３３、５１、及び４５は、それぞれ）ＰｈｕＰｒｏ１と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図７．７】ＰｈｕＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図７．８Ａ】ＰｈｕＰｒｏ１及びＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡプロテアーゼのクリーニング性能を示す。
【図７．８Ｂ】ＰｈｕＰｒｏ１及びＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡプロテアーゼのクリーニング性能を示す。
【図８．１】実施例８．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４６（ａｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）を提供する。
【図８．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰａｍＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図８．３】精製したＰａｍＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図８．４】精製したＰａｍＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図８．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰａｍＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図８．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰａｍＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図８．６】（配列番号３８、５２、及び４５は、それぞれ）ＰａｍＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図８．７】ＰａｍＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図９．１Ａ−９．１Ｄ】（配列番号５３−６２、３８、２３、１３、６３、８、２８、６４、３、１８、３３、６５−６８は、それぞれ）様々なパエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼとその他の細菌メタロプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、新規メタロプロテアーゼ酵素、特に様々なパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）からクローン化された、洗剤組成物に有用な酵素を提供する。組成物及び方法は、本発明の新規メタロプロテアーゼが、洗剤組成物の存在下でタンパク質分解活性を有するという観察に部分的に基づくものである。この特徴により、本発明のメタロプロテアーゼは、様々なクリーニング用途に特に良好に適しかつ有用であり、本酵素は、洗剤組成物に見られる界面活性剤及びその他の成分の存在下でポリペプチドを加水分解することができる。発明は、本明細書に記載の新規メタロプロテアーゼ群の少なくとも１種を含む組成物を包含する。このような組成物のうち一部のものは、洗剤組成物を含む。本発明のメタロプロテアーゼ酵素は、洗剤組成物に有用な他の酵素と組み合わせることが可能である。
本発明はまた、本発明のメタロプロテアーゼ酵素を用いたクリーニング方法も提供する。
【００１７】
定義及び略記
特に記載のない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術において通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。多くの専門用語辞典が当業者に既知である。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施に使用されるが、本明細書には一部の好適な方法及び材料を記載する。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。同様に、本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で明示されない限り、対象物が複数個ある場合も含まれる。特に断りのない限り、核酸（の塩基配列）は５’側から３’側へ向かって左から右に表示され、そしてアミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基へ向かって左から右に表示される。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ると理解されるべきである。
【００１９】
更に、本明細書に提供されている見出しは、本発明の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。
【００２０】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数値の制限には、それよりも小さいあらゆるより小さい数値の制限が、あたかもこうしたより小さい数値の制限が本明細書に明確に記載されているかのように包含されるものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて記載されているあらゆる最小数値の制限には、それよりも大きいあらゆる数値制限が、あたかもこうしたより大きい数値制限が本明細書に明確に記載されているかのように包含される。本明細書の全体を通じて記載されているあらゆる数値的範囲には、このような広い数値的範囲に含まれるより狭いあらゆる数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように包含される。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、タンパク質及びペプチドを分解する能力を有する酵素を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成するペプチド鎖又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解することによる、「タンパク質分解」の実施能を有する。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には、多くの周知の手順が存在する（例えば、Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８）を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが適合性の基質を加水分解する能力を解析する比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を利用する比色アッセイは当業界では周知である（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、国際公開第ＷＯ  ９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。ｐＮＡペプチジルアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６〜３２０［１９７９］を参照されたい）も、活性酵素濃度の決定における使用が見出されている。このアッセイは、酵素が、可溶性の合成基質、例えばスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）（配列番号４３）を加水分解する際に放出される、ｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度を分光光度計で４１０ｎｍにて測定するが、この速度は活性酵素濃度に比例する。更に、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を利用して、精製したタンパク質サンプル中の全タンパク質濃度を求めることができる。「基質に対する活性」を、「タンパク質濃度」により除算することで、酵素の特異的な活性が得られる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド変異体」は、親又は参照ポリペプチド（限定するものではないが野生型ポリペプチドが挙げられる）のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（巨大菌、B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サークランス（B. circulans）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類学上の再編成を絶えず受けているものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されているバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの生物を包含するものと意図される。ストレスの多い環境条件下での耐性内生胞子の産生は、バチルス（Bacillus）属を定義する特徴であるとみなされているものの、この特徴は、近年、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アンフィバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラチリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレビバチルス（Ureibacillus）、及びバージバチルス（Virgibacillus）と命名された複数の属にも該当する。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用され、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、及びリボヌクレオチドポリマーであるＲＮＡ（リボ核酸）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。以下のものがポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、１つ以上の発現配列タグ（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、参照アミノ酸配列又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語には、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語、「ベクター」は、核酸を標的細胞又は組織の中に導入する又は移入するために使用される核酸構築物を指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを細胞又は組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクターなどが挙げられる。典型的には、ベクターは複製開始点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを備えている。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、典型的に形質転換と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明は、メタロプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体又は成熟メタロプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含するものであり、当該ＤＮＡ配列は、好適な宿主内でのＤＮＡ配列の発現、並びに組み換えポリペプチド鎖のフォールディング及び転座を行うことができる好適なプロ配列（例えば、分泌性のシグナルペプチド配列など）に機能的に連結される。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」、「発現プラスミド」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸を標的細胞で発現させるための組み換え又は合成により生成される核酸構築物又はベクターを指す。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又はカセットは、標的細胞で特定の核酸の転写を可能にする任意の他の指定された核酸エレメントを包含する。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。多くの原核及び真核細胞発現ベクターが市販されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、配列の両末端は、ＤＮＡ構築物が閉環を形成するように閉じている。当業者に周知である技術を用いてＤＮＡ構築物に組み込まれる、対象とする核酸配列は、野生型、変異型、又は修飾型核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体と相同である核酸配列を１種以上含む。他の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、非相同的なヌクレオチド配列を１種以上含む。ＤＮＡ構築物がインビトロで構築されたならば、例えば、１）異種配列の、宿主細胞の望ましい標的配列への挿入；及び／又は２）宿主細胞の染色体領域に対する変異誘発（すなわち、内在性配列を異種配列により置き換える）；３）標的遺伝子の欠失；及び／又は４）複製プラスミドの宿主への導入、に使用できる。「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において「発現カセット」とほぼ同じ意味で使用される。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
【００３０】
本明細書で、核酸配列を細胞に導入する文脈において使用するとき、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入するのに好適な任意の方法を指す。導入の際のこのような方法としては、プロトプラスト融合、遺伝子導入、形質転換、電気穿孔、複合、及び形質導入（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐｐ．５７〜７２［１９８９］を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意でゲノムへの組み込み、及び発現により生じる、細胞の遺伝的変化を指す。
【００３２】
本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された場合に、別の核酸配列と「機能的に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に機能的に連結される。コード配列の翻訳を促進するように配置される場合、リボソーム結合部位は、コード配列に機能的に連結され得る。通常、「機能的に連結された」ＤＮＡ配列は隣接している。ただし、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが用いられ得る。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びに個々のコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、細胞を参照して使用する場合の「組み換え」は、典型的には、その細胞が外来核酸配列の導入により改変されていること、あるいは、その細胞がそのように改変された細胞から誘導されることを指す。例えば、組み換え細胞は、未改変（非組み換え型）型の細胞において同一の形で見られない遺伝子を含み得るものであり、又は組み換え細胞は、改変されて細胞に再導入されている未改変の遺伝子（未改変型の細胞で見られる遺伝子）を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含み得るが、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、及び当業者に既知の関連技術によって生じる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロで組み換えＤＮＡを産生する技術、及び組み換えＤＮＡが発現され得る又は増加し得る細胞に組み換えＤＮＡを移入して、それによって組み換えポリペプチドが産生される技術が挙げられる。ポリヌクレオチド又は核酸の「組み換え（Recombination）」、「組換する（recombining）」及び「組み換えられた（recombined）」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片をアセンブル又は結合させて新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。組み換えポリヌクレオチド又は核酸は、時にキメラと呼ばれる。核酸又はポリペプチドは、人工的であるか又は操作されている場合、「組み換え型」である。
【００３５】
核酸又はポリヌクレオチドは、未改変の状態にせよ又は当業者に既知の手法により工学的に操作された場合にせよ、転写及び／又は翻訳されてポリペプチド又はそれらの断片を産生できるのであれば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に、配列をコードすると言われる。
【００３６】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。
【００３７】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列からなる。「タンパク質」及び「ポリペプチド」なる用語は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用される。
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、本開示全体を通して使用する。一文字のＸは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の１文字表記、続いて位置番号、次に変異アミノ酸を表す１文字表記により記載される。例えば、８７位でのグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。変異は、また、アミノ酸の３文字表記に続いて、ポリペプチド鎖のＮ末端から数えた位置により記載されることがあり、例えば、１０位のアラニンはＡｌａ１０で記載される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。８７位及び９０位での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」若しくは「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」若しくは「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のいずれかとして表される。欠失については、一文字コード「Ｚ」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の左側に記載する。欠失については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の右側に記載する。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号にアミノ酸毎に０．０１を加えた番号である。例えば、位置８７と８８の間に三つのアミノ酸、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）を挿入することは、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ」と表される。したがって、上記のすべての変異に加え第１００番目の位置に欠失が存在する場合には、「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」となる。改変について記載するとき、位置の後に続く括弧内に記載のアミノ酸は置換一覧を意味し、すなわち、その位置において、掲載の任意のアミノ酸により置換がなされる。例えば、６（Ｌ，Ｉ）とは、６位がロイシン又はイソロイシンで置換され得ることを意味する。
【００３８】
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」とは、適切なフォールディング及びプロテアーゼの分泌にとって必要な、シグナルペプチド配列と成熟型プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指す。これらは、分子内シャペロン分子と称されることもある。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、成熟型活性プロテアーゼを生じる。細菌メタロプロテアーゼは、プロ酵素と表現されることが多い。
【００３９】
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆体型タンパク質の分泌又は直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的に、前駆体型又は成熟型タンパク質配列のＮ端末に位置する。シグナル配列は内因性又は外来性であり得る。シグナル配列は通常、成熟型タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
【００４０】
用語「成熟型」タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとは、シグナルペプチド配列及びプロぺプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形態を指す。
【００４１】
用語「前駆体」型タンパク質又はペプチドとは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に機能的に連結されたプロ配列を有する成熟型タンパク質を指す。前駆体型タンパク質又はペプチドは、プロ配列のアミノ末端に、機能的に連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆型タンパク質又はペプチドは、翻訳後活性に関係する追加のポリペプチド（例えば、前駆体から開裂されて、成熟型のタンパク質又はペプチドを後に残すポリペプチド）を有する場合もある。
【００４２】
アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列が未改変又は天然由来の配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語「天然に生じる」とは、自然界で見出される任意のもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「非天然に生じる」とは、野生型配列の改変として、自然界で見出されない任意のもの（例えば、研究室で産生された組み換え型核酸及びタンパク質配列）を指す。
【００４４】
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」とは、タンパク質若しくはペプチド中の列挙された位置にあるアミノ酸残基、又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙された残基と類似、相同、若しくは等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、「対応する領域」とは、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を指す。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「に由来する」及び「から得られる」とは、当該生物株により産生されるあるいは産生され得るタンパク質だけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、このようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるタンパク質も指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされかつ当該タンパク質の識別特徴を有するタンパク質を指す。例示すると、「バチルス属に由来するプロテアーゼ」は、バチルス属により自然に生産されたタンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス属供給源により生産される酵素と類似であるが、遺伝子工学技術を使用することにより、セリンプロテアーゼをコードする核酸によって形質転換された非バチルス生物によって生産されるセリンプロテアーゼを指す。
【００４６】
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて測定する際に、最大限一致するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「相同な遺伝子」は、互いに対応し、かつ互いに同一であるか又は非常に類似している、異なるが通常は近縁である種からの一対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「同一性（％）又は同一性パーセント」とは、配列類似性を指す。同一性（％）は当業界で既知の標準法を利用して求めることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ソフトウェアパッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメント法を用いて、関連する配列群から複数の配列のアラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するのに使用されるクラスタリング関連性を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０頁［１９８７年］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されたものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３頁［１９８９年］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重み（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ長重み（default gap length weight）及び重み付きエンドギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。その他の有用なアルゴリズムには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，により記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムがある（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０［１９９０］；及びＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴプログラムは、そのほとんどがデフォルト値に設定される複数の検索パラメーターを使用する。
【００４９】
ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、生物学的類似性の点で最も相関する配列が特定されるものの、２０残基未満のクエリー配列には推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２９９４〜３００５を参照されたい）。核酸配列の検索におけるデフォルトのＢＬＡＳＴパラメーター例は次の通りである。
・近隣ｗｏｒｄｓの閾値：１１
・Ｅ値カットオフ：１０
・スコア行列：ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１，ミスマッチ＝−３）
・ギャップ開始：５
・ギャップ伸長：２
また、アミノ酸配列検索におけるパラメーターは次の通りである。
・Ｗｏｒｄ長：３
・Ｅ値カットオフ：１０
・スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ６２
・ギャップ開始：１１
・ギャップ伸長：１
【００５０】
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最適／最大のアラインメントが得られるようにプログラムによって作成された任意のギャップを含む「参照」配列の残基総数で、マッチする同一残基数を除することによって決定される。配列が、配列番号Ａと９０％同一性である場合、配列番号Ａは、「参照」配列である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、「参照」配列を「問い合わせ」配列と呼ぶ。
【００５１】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムは、別の配列アラインメントアルゴリズム例である。
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターは、次の通りである。
【００５２】
【表１】
2018153183.tif 000003
【００５３】
ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、どちらか一方の末端に存在する欠失を含める。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドのどちらか一方の末端で（又はポリペプチド内に）アミノ酸５個の欠失を有する変異体は、「参照」ポリペプチドに対して９９％の配列同一性パーセントを有する（同一残基４９５個／５００個×１００）。このような変異体は、ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
【００５４】
対象とするポリペプチドが参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合、対象とするポリペプチドは参照ポリペプチドと「実質的に同一」であると言われ得る。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適に整列させた２つのポリペプチド配列を目視確認することで手作業により、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標の１つは、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応するというものである。典型的に、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的アミノ酸置換のみが異なる、又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみが異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。
【００５５】
対象とする核酸が参照核酸のヌクレオチド配列に対し少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合、対象とする核酸は参照核酸と「実質的に同一」であると言われ得る。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することで手作業により、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの指標の１つは、ストリンジェント（例えば、中程度〜高ストリンジェンシーの範囲）な条件下で、２つの核酸分子が互いにハイブリダイズするというものである。
【００５６】
核酸又はポリヌクレオチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、核酸又はポリヌクレオチドは「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは「単離され」ている。単離された種は、モルベースで、組成物中に他の種よりも豊富に含まれている。例えば、単離された種は、含まれているすべての高分子種の（モルベースで）少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％を構成し得る。好ましくは、対象とする分子種は、本質的に均質になるよう精製される（すなわち、従来の検出法では、組成に夾雑物が検出されない）。純度及び均一性は、当該技術分野で周知の多数の技術、例えば核酸又はタンパク質試料のそれぞれアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後の染色による可視化を用いて決定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
【００５７】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一つの鎖が、相補鎖と二本鎖、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。中等度〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であるものと見なされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば一般的に、「最高限度のストリンジェンシー」はおよそＴｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い温度）で生じ、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃低い温度で生じ、「中等度のストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃低い温度で生じ、そして「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で生じる。機能上、最高限度のストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いられ、一方、中等度又は低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列同族体を同定又は検出するために用いられ得る。
【００５８】
中等度及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、以下の条件下でのハイブリダイゼーションである。６５℃及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸酸三ナトリウム、ｐＨ  ７．０）。ハイブリダイゼーションさせた二本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションさせた核酸鎖のうち半分が相補鎖と対をなさなくなる融解温度（Ｔｍ）により特性評価される。二本鎖にミスマッチの核酸が含まれると、Ｔｍが低くなる。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃及び０．１×ＳＳＣを要する。メタロプロテアーゼ変異体をコードしている核酸は、核酸及びその相補的な核酸間に形成される二本鎖と比較して、Ｔｍが１℃〜３℃低くなる。
【００５９】
高ストリンジェンシー条件の別の例としては、約４２℃にて、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ中でハイブリダイゼーションを行った後、室温で２×ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳにより２回洗浄し、更に４２℃で０．１×ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳで２回洗浄するというものが挙げられる。中等度ストリンジェンシーな条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸及び２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精液ＤＮＡを含む溶液により３７℃で一晩インキュベート後、約３７〜５０℃で、１×ＳＳＣによりろ過洗浄というものが挙げられる。当業者であれば、温度、イオン強度などを調整して、プローブ長などの因子を適切なものにする方法を御存知であろう。
【００６０】
核酸又はポリペプチドに使用するとき、用語「精製された」は、概して、当業者に周知の解析技術により測定したときに、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製されているポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた培養液中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１本のバンドのみが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製されている核酸又はポリペプチドは、少なくとも純度約５０％のものであり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、又は約９９．８％以上（例えば、モル重量による純度）のものである。
これに関連し、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドのような本発明の分子１つ以上について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。本発明の実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、それぞれ本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている実質的に純粋なメタロプロテアーゼポリペプチド又はポリヌクレオチド）は、特定の組成物中で、典型的には、全高分子種の少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９．５％以上（モルベース）を構成する。
【００６１】
用語「濃縮された」とは、化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分が開始組成物よりも高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在することを指す。
【００６２】
これに関連して、本発明は、１種以上の本発明の分子、例えば１種以上の本発明のポリペプチド（例えば、１種以上の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド）又は１種以上の本発明の核酸（例えば、１種以上の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸）について組成物を富化させる方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の（モルベースで）少なくとも約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９１重量％、約９２重量％、約９３重量％、約９４重量％、約９５重量％、約９６重量％、約９７重量％、約９８重量％、約９９重量％、約９９．５重量％又はそれ以上を構成する。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「機能性アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質を、通常の性能で機能し得るかに関して解析するアッセイ系を指す。例えば、プロテアーゼの場合、機能性アッセイは、プロテアーゼがタンパク質基質を加水分解する実効性を評価することを包含する。
【００６４】
用語「改変核酸配列」及び「改変遺伝子」は、本明細書において天然に生じる（すなわち、野生型の）核酸配列に欠失、挿入又は中断を含む核酸配列を指す際に互換的に使用される。いくつかの実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断である場合）。いくつかの実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。代替的な実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、伸長型タンパク質である（例えば、改変が核酸配列への挿入を含む場合）。
いくつかの実施形態では、核酸配列にヌクレオチドを挿入することで切断型タンパク質が得られる（例えば、挿入により終止コドンが形成される場合）。したがって、挿入によって、切断型タンパク質又は伸長型タンパク質のいずれかが発現産物として生じ得る。
【００６５】
「変異体」核酸配列は、典型的には、変異体核酸配列の発現産物が、野生型タンパク質と比較してアミノ酸配列が変化しているタンパク質になるよう、宿主細胞の野生型配列に存在する少なくとも１つのコドンに変更を有する核酸配列を指す。発現産物は、変化した機能的能力（例えば、酵素活性の増強）を有し得る。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「基質特異性の変化」は、酵素の基質特異性に生じる変化を指す。いくつかの実施形態では、基質特異性の変化は、酵素の変異、又は反応条件の変化により生じる、特定の基質に関するｋｃａｔ及び／又はＫｍの変化として定義される。酵素の基質特異性は、その酵素が示す触媒効率を異なる基質と比較することで決定される。概して、対象とする基質のｋｃａｔ／Ｋｍ比がより大きい変異体酵素を生産することが所望されることから、これらの決定は、変異体酵素の効率を評価する際に特に有用である。しかしながら、本発明は、いかなる特定の基質組成物又は基質特異性にも制限されないと意図される。
【００６７】
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面が示す疎水性及び親水性などの特性に関して使用される。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「実効電荷」は、分子中に存在するすべての電荷の合計として定義される。親タンパク質分子の「実効電荷を変化」させることで、親分子とは異なる実効電荷を有する変異体が得られる（すなわち、変異体は親分子と同じではない実効電荷を有する）。例えば、中性アミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は正電荷を持つアミノ酸を中性アミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−１になる。正電荷を持つアミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−２になる。中性アミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は負電荷を持つアミノ酸を中性アミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋１になる。負電荷を持つアミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋２になる。親タンパク質の実効電荷は、電荷を持つアミノ酸の欠失及び／又は挿入によっても変化し得る。同じｐＨ条件下で測定した場合の親分子のものと、変異体の電荷を変化させるべく、実効電荷を変更（net change）させる。
【００６９】
用語「熱的に安定な」及び「熱安定性の」及び「熱安定性」は、変化した温度に曝露されているがタンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、所定の時間にわたって特定の温度に曝露された後でも、明記された量の酵素活性を保持するプロテアーゼを意味する。「温度の変更」は、温度の上昇又は低下を包含する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、変更した温度に、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露した後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質分解活性を保持する。
【００７０】
酸化安定性、キレート安定性、熱安定性、化学安定性、自己分解安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼの文脈において、用語「安定性の増強された」は、その他のプロテアーゼ（例えば、サーモリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較して、長期間にわたってタンパク質分解活性が高度に保持されていることを指す。
【００７１】
酸化安定性、キレート安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の低下」は、他のプロテアーゼ（例えば、サーモリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、時間が経過するにつれて保持されるタンパク質分解活性が低下することを意味する。
【００７２】
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、メタロプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の１種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食物、草類、血液、インク、牛乳、油及び／又は卵タンパク質による染み）をクリーニングするための様々なアッセイを用いることで決定され得る。プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的な洗浄条件に晒す工程、及び染みが除去される程度を様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用いて評価する工程によって決定され得る。代表的なクリーニングアッセイ及び方法は、当該技術分野で既知であり、限定するものではないが、国際公開第ＷＯ  ９９／３４０１１号、及び米国特許第６，６０５，４５８号に記載のもの（これらの特許文献の両方共が参照により本明細書に援用される）、並びに以下に提供される実施例に包含されるクリーニングアッセイ及び方法が挙げられる。
【００７３】
メタロプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼに関し、用語「クリーニング有効量」は、特定のクリーニング組成物中で、所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。このような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用される特定のプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、粒状、錠剤、棒状）のいずれであるのか、などの多くの要因に基づくものである。
【００７４】
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に包含される、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド以外の任意の液体、固体、又はガス状の材料を指す。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上のクリーニング助剤を包含する。
各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の特定のタイプ及び形態（例えば、液体、粒状、粉末、棒状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又はその他の組成）に応じて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性である。
【００７５】
クリーニング活性の文脈において、用語「性能が増強されている」は、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数回洗浄サイクル後に、卵、牛乳、草類、インク、油、及び／又は血液などの特定の酵素反応性の染みに対し測定し、通常の評価法により評価したときに、酵素によるクリーニング活性が親又は参照タンパク質と比較して向上若しくは増大されていることを指す。
【００７６】
クリーニング活性の文脈において、用語「性能が低下している」は、標準洗浄サイクル及び／又は複数回洗浄サイクル後に、卵、牛乳、草類又は血液などのある種の酵素反応性の染みに対し測定し、通常の評価法により評価したときに、酵素によるクリーニング活性が低減若しくは劣っていることを指す。
【００７７】
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象物、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成物を含む。このような組成物及び配合物としては、限定するものではないが、液体及び／又は固体組成物、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、棒状、粒状、及び／又は固体洗濯クリーニング又は洗剤組成物、並びにおしゃれ着用洗剤組成物など）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木材、セラミック及び金属製のカウンターの天板及び窓用のもの）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び繊維製品、洗濯洗浄性能増進用クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物のシミ抜き前処理用クリーニング組成物；食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器「手洗い」用又は食器「手動」洗浄用の洗剤）及び自動食器洗浄機用組成物（例えば、「自動食器洗浄機用の洗剤」）を包含する食器洗浄用組成物などが挙げられる。
【００７８】
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、特に断りのない限り、粒状又は粉末状万能又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液状、粒状、ゲル状、固形、錠剤型又はペースト状万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力粉末洗剤（ＨＤＤ）型；おしゃれ着用液体洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手動洗浄剤；食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、或いは家事用及び業務用の様々な錠剤、粉末、固形、粒状、液状、ゲル状及びすすぎ助剤型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌性手洗い用液体クリーニング及び殺菌剤、固形石鹸、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、車洗浄剤、カーペット洗浄剤、風呂場クリーナーなどの液体クリーニング及び殺菌剤；人間及び他の動物の毛髪用シャンプー及び／又は毛髪用リンス；シャワージェル及びバブルバス、並びに金属製品クリーナー；加えて、漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型などのクリーニング補助剤が挙げられる。
いくつかの実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」形態であり；いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００７９】
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用添加組成物などの手洗い用及び洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、リネン類、及び他の繊維材料）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「非布地用クリーニング組成物」としては、限定するものではないが、例えば、食器手洗い用若しくは手動食器洗浄用又は自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物、及びパーソナルクレンジング組成物などの、非繊維製品（すなわち、非布地）表面用のクリーニング組成物が挙げられる。
【００８１】
本明細書で使用するとき、用語「布地及び／又は硬質表面用のクリーニング及び／又は処理組成物」は、特に断りのない限り、粒状又は粉末状の万能又は「強力」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト状の万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体洗浄剤、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗浄剤又はライトデューティ食器洗浄剤（特に高起泡型のもの）、家庭用及び業務用の各種の錠剤型、粒状、液体、及びすすぎ補助型を含む食器洗浄機用洗剤、液体洗浄剤及び殺菌剤、車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む浴室クリーナー、液体、固体、及び／又は乾燥機用シート形態であり得る柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む布地コンディショニング製品、並びに漂白剤添加型及び「染み抜きスティック」又は前処理型そして乾燥機用シート（dryer added sheet）などの基材添加製品（substrate-laden product）のようなクリーニング補助剤を包含する、クリーニング及び処理組成物に属する組成物である。適用可能であるこのような製品のすべては、標準形態又は濃縮形態であってよく、又は特定の態様では、このような製品は、更には非水性となり得る程度まで高濃縮された形態であってもよい。
【００８２】
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布地製の物体又は物品などの、汚れた又は泥のついた物体を洗浄するために洗浄媒質中で使用することが意図される組成物に関して使用される。本発明のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は配合物に限定されない。実際に、いくつかの実施形態では、本発明の洗剤は、少なくとも１種の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドに加え、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩など）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光染料、ケーキング防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化物質、及び／又は可溶化剤を１種以上含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物などの、本発明のいくつかの組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含まない。
【００８３】
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、物質の増白（すなわち、ホワイトニング）及び／若しくはクリーニングを行うために充分な時間及び／又は適切なｐＨ及び／又は温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド）の「洗浄性能」は、洗浄に対するメタロプロテアーゼポリペプチドの貢献度を指し、この貢献度により、洗剤には、組成物にメタロプロテアーゼポリペプチドを添加していない洗剤と比較して追加のクリーニング性能がもたらされる。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。いくつかの試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連する要因を、特定のマーケットセグメントにおける家事用途に典型的な条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、自動食器洗浄、食器クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニングなど）を模倣するように調節することができる。
【００８５】
本明細書において、用語「関連する洗浄条件」は、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤のマーケットセグメントに含まれる家事で実際に使用される条件であって、具体的には、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度（sud concentration）、洗剤のタイプ及び水硬度などの条件を意味する。
【００８６】
用語「改良された洗浄性能」の使用により、関連する洗浄条件下での染み除去において、良好な最終結果が得られること、あるいは対応する野生型又は初期親プロテアーゼと比較して、同じ最終結果を得るのに必要とされるメタロプロテアーゼポリペプチドが、重量ベースで少なくなることを意味する。
【００８７】
本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並びに、物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。本発明は、任意の特定の表面、物品、又は除去される汚染物若しくは微生物に限定されないと意図される。
【００８８】
本明細書では、「コンパクト」形態のクリーニング組成物は、密度によって最善に表され、組成の点で言えば無機塩充填剤の量によって最善に表される。無機塩充填剤は、粉末形態の洗剤組成物の通常の成分である。通常の洗剤組成物では、塩充填剤は、相当量で、典型的には組成物全体の約１７〜約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、塩充填剤は、組成物全体の約１５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、塩充填剤は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機塩充填剤は、硫酸アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩、並びアルカリ塩化物及びアルカリ土類金属塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、塩充填剤は硫酸ナトリウムである。
【００８９】
数値に関連して本明細書で使用するとき、用語「約」は、この用語が文脈において具体的に定義されない限り、数値の＋／−０．５の範囲を指す。例えば、「ｐＨ約６」は、ｐＨが具体的に定義されない限り、ｐＨが５．５〜６．５であることを指す。
【００９０】
所定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置は、本明細書において、典型的には、配列番号３、８、１３、１８、２３、２８、３３又は３８に示す野生型パエニバチルス（Paeniacillus）メタロプロテアーゼのアミノ酸配列の、対応するアミノ酸残基の位置に対する付番を利用して付番される。したがって、パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）メタロプロテアーゼアミノ酸配列は、参照親配列として提供される。本明細書に記載のアラインメントアルゴリズムを利用して、本明細書に記載のメタロプロテアーゼ酵素のアミノ酸配列及びそれらの変異体などといった所定のアミノ酸配列を、野生型メタロプロテアーゼ配列（例えば、配列番号３）とアラインメントさせることができ、所定のアミノ酸配列中の、野生型配列中のアミノ酸残基とアラインメント（好ましくは、至適アラインメント）するアミノ酸残基については、メタロプロテアーゼ配列中の対応するアミノ酸残基を参照することにより保存的に付番することができる。
【００９１】
オリゴヌクレオチドの合成工程及び精製工程は、典型的には本明細書に従って実施される。概して技術及び手順は、当業者に周知の従来法、並びに本明細書を通して提供される様々な一般参考文献に従って実施される。それらの手順は当業者に周知のものであると考えられ、読み手には便宜のため提供される。
【００９２】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド
本発明は、「本発明の酵素」又は「本発明のポリペプチド」として総称することのできる新規メタロプロテアーゼ酵素ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチド、組換えポリペプチド、実質的に純粋なポリペプチド、又は非天然に生じたポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドはクリーニング用途で有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面をクリーニングする方法において有用なクリーニング組成物に組み込むことができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の酵素は、配列番号３、８、１３、１８、２３、２８、３３、又は３８に対し５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有する。様々な実施形態では、本発明の酵素は、表１．２、２．２、３．２、４．２、５．２、６．２、７．２、又は８．２中の任意の属由来のメタロプロテアーゼ酵素に対し、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、上掲のすべての実施形態を包含する本発明の酵素は、バチルス目（Bacillales）又はバチルス科（Bacillaceae）、パエニバチルス科（Paenibacillaceae）、アリシクロバチルス科（Alicyclobacillaceae）、又はラクトバチルス科（Lactobacillaceae）科のメンバーに由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、上掲のすべての実施形態を包含する本発明の酵素は、バチルス（Bacillus）、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、イグジオバクテリウム（Exiguobacterium）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、又はパエニバチルス種（Paenibacillus species）に由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、上掲のすべての実施形態を包含する本発明の酵素は、コナカイガラムシ（Pseudococcidae）科のメンバーに由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、上掲のすべての実施形態を包含する本発明の酵素は、プラノコッカス種（Planococcus）に由来するものであってよい。
互いに、及び配列番号３、８、１３、１８、２３、２８、３３、又は３８に示すパエニバチルス（Paenibacillus）酵素に対し高い同一性を有する様々な酵素メタロプロテアーゼが発見されている。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明は、パエニバチルス（Paenibacillus）属由来の酵素である。特定の実施形態では、本発明は、パエニバチルス属（Paenibacillus）及びパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）、パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）、パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）、パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）、パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus amylolyticus）、パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）及びパエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）に由来する酵素である。
【００９６】
パエニバチルス（Paenibacillus）からクローン化された酵素に関係する組成物及び方法について記載する。組成物及び方法は、本発明のクローン化され及び発現された酵素が、洗剤組成物の存在下でタンパク質分解活性を有するという観察に部分的に基づくものである。本発明の酵素は、洗剤組成物中で優れた安定性も示す。これらの特徴により、本発明の酵素は、界面活性剤及び洗剤組成物中に見られるその他の成分の存在下で、酵素がタンパク質を加水分解する、様々なクリーニング用途への使用に良好に適したものになる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼ活性を有する、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然に生じる酵素を包含し、ポリペプチドは、本明細書に提供される親酵素に対し少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、代表的なポリペプチドに対し特定の程度のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドであり、例えば、配列番号３、８、１３、１８、２３、２８、３３、又は３８のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％配列相同性であるポリペプチドである。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
【００９９】
プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチド酵素も提供され、この酵素は、前述のアラインメント法のいずれかを利用してアラインメントしたときに、配列番号：３、８、１３、１８、２３、２８、３３、又は３８のアミノ酸配列とは、５０以下、４０以下、３０以下、３５以下、２５以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は１以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
上記の通り、本発明の変異体酵素ポリペプチドは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有し、したがって、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、テーブルの天板、壁、家具、床、天井などの硬質表面）をクリーニングするための方法が挙げられるがこれらに限定されないクリーニング用途に有用である。本発明のメタロプロテアーゼ酵素変異体ポリペプチドを１つ以上含むクリーニング組成物の例を以下に記載する。本発明の酵素ポリペプチドの酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性）は、当業者に周知の手順を利用して容易に求めることができる。酵素活性及びクリーニング性能を評価する方法について、以下に例を示す。本発明のポリペプチド酵素の、染み（例えば、血液／牛乳／インク又は卵黄などのタンパク質性の染み）の除去、硬質表面のクリーニング、又は衣類、食器類、若しくは食卓用食器類のクリーニングについての性能は、当業者に周知の手順を利用して、及び／又は実施例に記載の手順を利用して容易に決定することができる。
【０１０１】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解に有用なプロテアーゼ活性を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、食品、飼料、又はタンパク質分解のための前処理などといったその他の用途における利用も見いだされる。
【０１０２】
本発明のポリペプチドは、大豆タンパク質、コーンミール、及びその他の富タンパク質製品などの、動物飼料製品の前処理にも有用である。これらの動物飼料製品を本発明のポリペプチドにより前処理することは、複雑なタンパク質を、動物により消化しやすい加水分解物へと分解するのに役立ち得る。
【０１０３】
更に他の実施形態では、本開示のメタロプロテアーゼポリペプチドは、トウモロコシ大豆タンパク質の加水分解への利用が見いだされる。本開示のメタロプロテアーゼポリペプチドを、単独で、又はその他のプロテアーゼ、アミラーゼ、又はリパーゼと組み合わせて使用して、トウモロコシ又は大豆タンパク質からペプチド及び遊離アミノ酸を生成することもできる。いくつかの実施形態では、回収されたタンパク質、ペプチド、又はアミノ酸を、続いて動物飼料又はヒト食品製品に使用することができる。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、深刻な創傷、特に、創傷郭清にも有用である。創傷郭清とは、壊死組織、損壊組織、又は感染組織を除去して残存している健常組織の治癒性を向上させることである。創傷郭清はやけど及びその他の重度の創傷の治癒プロセスに重要な処置である。創傷又はやけどは、本発明のポリペプチドを含む組成物により処理することができ、これにより、望ましくない損壊組織が除去され、健常組織が改善される。
【０１０５】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、広範なｐＨ条件でプロテアーゼ活性を有し得る。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、実施例３．１〜３．８に記載の通り、アゾ−カゼインを基質としてプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約３．０〜約１２．０でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約４．０〜約１０．５でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約５．５〜約９．０で最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約６．０〜約８．５で最大プロテアーゼ活性の少なくとも８０％を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約７．５で最大プロテアーゼ活性を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、約１０℃〜約１００℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、約２０℃〜約９０℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、約４５℃〜約６０℃の温度で最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を有する。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、５０℃の温度で最大プロテアーゼ活性を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、クリーニング組成物中でクリーニング性能を示す。クリーニング組成物は、多くの場合、酵素の安定性及び性能に有害であり、クリーニング組成物を、酵素、例えばメタロプロテアーゼが機能を保持するには過酷な環境にする。したがって、酵素をクリーニング組成物に加えて、酵素機能（例えば、クリーニング性能により示されるものなどのメタロプロテアーゼ活性）を期待することは簡単ではない。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物中でクリーニング性能を示す。いくつかの実施形態では、自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物におけるクリーニング性能は、卵黄の染みのクリーニングを包含する。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、洗濯洗剤組成物中でクリーニング性能を示す。いくつかの実施形態では、洗濯洗剤組成物のクリーニング性能は、血液／牛乳／インクの染みのクリーニングを包含する。本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの各クリーニング組成物では、漂白成分を添加又は非添加でクリーニング性能を示す。
【０１０８】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解で有用なプロテアーゼ活性を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、食品、飼料、又はタンパク質分解についての前処理などのその他の用途での利用が見いだされる。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は保存的若しくは非保存的のいずれかの置換などといった様々な変化を受けることができ、このような変化としては、この変化によってポリペプチドの酵素活性が実質的に変更されないものが包含される。同様にして、本発明の核酸には様々な変更を施すこともでき、例えば、同じ又は異なるアミノ酸をコードしている特定のコドンなどの１つ以上のコドン中の１つ以上のヌクレオチドの１つ以上を置換することによるサイレント変異（例えば、コードされているアミノ酸はヌクレオチドの変異により変更を受けない場合）又は非サイレント変異、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の付加又は挿入、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上のの開裂又は切断を施すこともできる。核酸配列における多くのこのような変更は、得られるコードされているポリペプチド酵素の酵素活性を、もとの核酸配列によりコードされているポリペプチド酵素と比較して実質的に変更し得るものではない。本発明の核酸配列を改変し、１つ以上のコドンを含有させて、発現系（例えば、細菌発現系）において最適な発現を提供させることもでき、一方、所望される場合、前述の１つ以上のコドンには尚も同じアミノ酸（複数可）をコードさせることもできる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、所望の酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性又はクリーニング性能活性）を有する酵素ポリペプチド族を提供し、このポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸置換を有する配列を含み、かつ１つ以上の追加のアミノ酸置換、例えば、保存的及び非保存的置換も含み、このポリペプチドは、所望の酵素活性（例えば、配列番号３、８、１３、１８、２３、２８、３３、及び３８のポリペプチドのクリーニング活性又は性能に反映されるものなどのタンパク質分解活性）を示し、維持し、又はおよそ維持する。本発明に従うアミノ酸置換には、限定するものではないが、１つ以上の非保存的置換及び／又は１つ以上の保存的アミノ酸置換が包含され得る。保存的なアミノ酸残基置換は、典型的には、１つの機能クラスのアミノ酸残基に含まれるメンバーの、同じ機能クラスに属する残基による置き換えを包含する（保存的なアミノ酸残基は機能的相同性（％）の算出において相同又は保存的に機能するものとみなされる）。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸配列中のアミノ酸を機能的に類似するアミノ酸により置換することを含む。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、このため互いに保存的アミノ酸置換を提供し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的置換を提供し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的置換を提供し得る。アルギニン、リシン、及びヒスチジンは、互いに保存的置換を提供し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的置換を提供し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的置換を提供し得る。
【０１１１】
他の保存的アミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似する機能又は化学的構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄の含有）をもとにグループ化することができる。例えば、脂肪族のグループには、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）が含まれ得る。互いに保存的な置換であるものと考えられるその他のアミノ酸を包含するグループには、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性電荷残基、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）；親水性非荷電残基：セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）が挙げられる。アミノ酸のその他の分類も当業者に周知であり、様々な一般的な文献に記載されている。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換されたすべてのポリペプチド配列の明白な一覧を提供する。
【０１１２】
上記のアミノ酸残基分類には、より保存的な置換が存在し、これらも同様に又は別法として好適であり得る。より保存的である保存的置換基としては：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【０１１３】
本発明のポリペプチド配列の保存的置換変異体（例えば、本発明のメタロプロテアーゼ変異体）は、ポリペプチド配列中のアミノ酸のうち僅かな割合の、場合により２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、若しくは６％未満のアミノ酸、又はポリペプチド配列中のアミノ酸の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、若しくは１％未満、又は１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、又は１個未満のアミノ酸と、同じ保存的置換基の保存的に選択されたアミノ酸との置換を包含する。
【０１１４】
本明細書内の他の箇所で更に詳細に記載されるように、及び本明細書で提供される実施例に記載されるように、本発明のポリペプチドは、既知のメタロプロテアーゼを包含する既知のプロテアーゼに匹敵し得るクリーニング能力を有し得る。
【０１１５】
本発明の核酸
本発明は、「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と総称され、本発明のポリペプチドをコードする、単離された、非天然に生じる、又は組み換え核酸を提供する。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生（例えば発現）に有用である。上記の通り、ポリペプチドは、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有するメタロプロテアーゼポリペプチドを包含し、クリーニング用途、並びにクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の他の場所に記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などが包含される）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然に生じる核酸を提供する。本発明は、上記及び本明細書の他の箇所に記載の、本発明の任意のポリペプチドの２つ以上の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非天然に生じる核酸も提供する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、配列番号：４、９、１４、１９、２４、２９、３４、及び３９に対し５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一性を有する。
【０１１７】
本発明は、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を提供し、ここで、メタロプロテアーゼポリペプチドは、タンパク質分解活性を有する成熟型であり、変異体のアミノ酸位置は、配列番号：３、８、１３、１８、２３、２８、３３、又は３８に示すパエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて付番する。
【０１１８】
本発明の核酸は、任意の好適な合成技術、操作技術、及び／又は単離技術、又はこれらの組み合わせを用いて作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法などの標準的な核酸合成技術を用いて製造することもできる。このような技術では、典型的には最大５０ヌクレオチド塩基以上の断片が合成された後、連結（例えば、酵素的又は化学的ライゲーション法により）され、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が生成される。本発明の核酸の合成は、古典的なホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜６９［１９８１］を参照されたい）を利用する化学的合成法；又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．により記載の、典型的に自動化合成法において実施されるものなどの方法（Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜８０５［１９８４］を参照されたい）などが挙げられるがこれらに限定されない、当業界で既知の任意の好適な方法によっても促進できる。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を使用しても作製できる。カスタマイズされた核酸を、各種供給業者（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＤＮＡ２．０）に発注することができる。核酸合成に関係するその他の技術及び関連する原理は、当業界で既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３［１９８４］；及びＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６［１９８４］を参照されたい）。
【０１１９】
上記のように、核酸の改変に有用な、ＤＮＡの組み換え技術は、当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡの生産、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）などの技法が知られており、当業者により容易に使用される。本発明のヌクレオチドは、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドポリペプチド（複数可）をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、又はこれをＰＣＲ増幅させることができる１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを利用して、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより得ることもできる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、並びにＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、当業者に既知の標準的な参考文献に記載されている。本発明の核酸のいくつかは、天然由来のポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド主鎖）を、例えば既知の変異導入法（例えば、部位特異的変異導入法、部位飽和変異導入法、及びインビトロ組み換え）によって変化させることによって得ることができる。
【０１２０】
本発明の改変されたメタロプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法
本発明のメタロプロテアーゼポリヌクレオペプチドをコードしている本発明の改変されたポリヌクレオチドを生成するのに好適であるものとして様々な方法が既知であり、例えば、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）、系統的変異導入、挿入変異導入、欠失変異導入、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びにその他の各種リコンビナトリアルなアプローチが挙げられるがこれらに限定されない。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質（例えば、メタロプロテアーゼポリペプチド）の作製方法としては、ＤＮＡシャッフリング法、ＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，７：２１３９〜４４［１９９９］）、ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．９８：１１２４８〜５３［２００１］を参照されたい）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９：４５６〜６０［２００１］を参照されたい）、及びＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０：１０２４〜９［２００１］；Ｂｉｔｔｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１０１：７０１１〜６［２００４］を参照されたい）などの遺伝子の非相同組換えによる方法、並びにオリゴヌクレオチドを利用してランダムな及び標的とする変異、欠失及び／又は挿入を挿入する方法（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０：１２５１〜５［２００２］；Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０：１２４６〜５０［２００２］；Ｚｈａ  ｅｔ  ａｌ．，４：３４〜９［２００３］；Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１４９：３９０３〜１３［１９９２］を参照されたい）が挙げられる。
【０１２１】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを産生するためのベクター、細胞、及び方法  本発明は、本明細書に記載の本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド）を含むベクター、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は発現カセット、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えＤＮＡ構築物、本発明の少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む単離された又は組み換え細胞、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡ構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を含む組成物を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡ構築物）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。このような組み換え細胞の一部のものは、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞の一部のものは、細菌の細胞、例えば、限定するものではないが、バチルス・スブチリス細胞などのバチルス種の細胞を含む。
本発明は、本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む、組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド配列が、効率的な遺伝子発現に必要とされる１つの又は追加の核酸断片（例えば、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結されているプロモーター）に操作可能に連結されている、発現ベクター又は発現カセットである。ベクターには、転写ターミネーター及び／又は選択遺伝子を含有させることができ、選択遺伝子は、例えば、抗生物質を含有させた培地で増殖させることによりプラスミド感染させた宿主細胞の持続的な培養を維持することのできる、抗生物質耐性遺伝子などである。
【０１２４】
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され得るか、又は代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。ベクターの例としては、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照されたい；バチルス・スブチリス（B. subtilis）に好適な複製プラスミドとしては、第９２頁に掲載のものが挙げられる）。同様にして、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５〜６２４も参照されたい）、及びｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
細胞において、対象とするタンパク質（例えば、メタロプロテアーゼポリペプチド）を発現及び産生させるため、メタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含み、及びいくつかの例では複数のコピーを含む、少なくとも１種の発現ベクターを、メタロプロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞に形質転換させる。本発明のいくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチド（並びにベクターに含有させるその他の配列）をコードしているポリヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込むのに対し、他の実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは、細胞内に自律性の染色体外エレメントとしてとどまる。本発明は、染色体外の核酸エレメント、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる移入ヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを産生させるのに有用である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド構築物は、メタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを宿主染色体に組み込みかつ任意選択的に増幅させることのできる、組み込みベクター上に存在する。組み込み部位の例は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターにより実施される。他のいくつかの実施形態では、プロモーターは、前駆体プロテアーゼとは異種であるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、限定するものではないが、例えば、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；並びにバチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース生成型アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウシイのアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルスのキシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシスのｃｒｙＩＩＩＡ、及びバチルス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
【０１２６】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、細菌及び糸状菌などの任意の好適な微生物宿主細胞において産生させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、グラム陽性細菌において産生させることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス（Bacillus spp.）、ストレプトミセス（Streptomyces spp.）、エシェリキア（Escherichia spp.）、アスペルギルス（Aspergillus spp.）、トリコデルマ（Trichoderma spp.）、シュードモナス（Pseudomonas spp.）、コリネバクテリウム（Corynebacterium spp.）、サッカロミセス（Saccharomyces spp.）、又はピキア（Pichia spp.）である。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、バチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞により産生される。本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの産生への使用が見いだされるバチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞の例としては、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（B. alkalophilus）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・プミリス（B. pumilis）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、及びバチルス・メガテリウム（B. megaterium）、並びにバチルス（Bacillus）属に含まれるその他の生物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドの産生にはバチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主細胞が使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行３４，６０６）には、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの産生に使用することのできる様々なバチルス（Bacillus）宿主株が記載されているものの、その他の好適な株を使用することもできる。
【０１２７】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの産生に使用することのできる幾種類かの細菌株としては、非組み換え型（すなわち、野生型）バチルス種（Bacillus sp.）株、並びに天然に生じる株及び／又は組み換え株が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている。いくつかの実施形態では、宿主株はバチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主株であり、特に組み換え型バチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主株である。数多くのバチルス・スブチリス（B. subtilis）株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０、及びＰＥＰ  ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７３：２１５〜２２８頁［１９７３年］、また同様に、米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、並びに欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい。
これら各公報は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としてのバチルス・スブチリス（B. subtilis）の使用は当業者に周知である（例えば、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１〜８７頁［１９８２年］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４頁［１９８６年］；並びにＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９〜４７頁［１９８８年］を参照されたい）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主細胞は、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、及びｄｅｇＱのうちの少なくとも１つに変異又は欠失を含むバチルス種（Bacillus sp.）である。いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ遺伝子中のものであり、いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２中のものである（例えば、Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４［１９９０］；及びＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７［１９９７］を参照されたい）。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０［２００１］を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５［１９９９］を参照されたい）；及び／又はｏｐｐＡ又はｏｐｐオペロンのその他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５［１９９１］を参照されたい）中に変異又は欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡの遺伝子の変異と同じ表現型を生じるｏｐｐオペロンにおけるいかなる変異も、本発明の変化したバチルス株に関する一部の実施形態において有用であろうと想到される。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で生じるが、他の実施形態では複数の変異が組み合わさって存在する。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの産生に使用することのできる、変更を加えたバチルス（Bacillus）宿主細胞株は、上記遺伝子の１種以上に予め変異を含有しているバチルス（Bacillus）宿主株である。加えて、内因性のプロテアーゼ遺伝子に関する変異及び／又は欠失を含むバチルス種の宿主細胞も有用である。いくつかの実施形態では、バチルス属の宿主細胞は、ａｐｒＥ遺伝子及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞は、５つのプロテアーゼ遺伝子に欠失を含むのに対し、他の実施形態では、バチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞は９つのプロテアーゼ遺伝子に欠失を含む（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号を参照されたい）。
【０１２９】
宿主細胞は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法の利用により、本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている少なくとも１種の核酸で形質転換される。プラスミドＤＮＡ構築物又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属の細胞又は大腸菌細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡ構築物又はベクターをそのような細胞に形質転換する方法は周知である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、次に大腸菌細胞から単離され、バチルス属の細胞に形質転換される。しかしながら、大腸菌などの介在微生物を用いることは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは直接バチルス属の宿主に導入される。
【０１３０】
当業者であれば、本発明の核酸配列をバチルス（Bacillus）細胞に導入するのに好適な方法を認識されるであろう（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐｐ．５７〜７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５［１９８６］；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７［１９８１］；及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］を参照されたい）。更に、プロトプラスト形質転換及び遺伝子導入、形質導入、及びプロトプラスト融合を含むこのような形質転換方法が周知であり、本発明で使用するのに好適である。バチルス（Bacillus）細胞を形質転換させるのに当該技術分野で既知の方法としては、部分的に相同性の常在性プラスミドを保有しているコンピテントセルにドナープラスミドを取り込ませることを包含するプラスミドマーカーレスキュー形質転換法（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５〜５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７［１９８３］；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１［１９８７］を参照されたい）などの方法が挙げられる。この方法では、組み込まれるドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣するプロセスにおいて、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組み換えられる。
【０１３１】
共通して使用される方法に加え、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＮＡ構築物、又は本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含むベクターにより、直接形質転換される（すなわち、ＤＮＡ構築物又はベクターを宿主細胞に導入する前の増幅、あるいは別のプロセスに中間体細胞は使用されない）。本発明のＤＮＡ構築物又はベクターの宿主細胞への導入には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、宿主ゲノムには挿入せずに宿主細胞に導入する、当該技術分野で既知の物理的及び化学的方法が包含される。このような方法としては、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔、ネイキッドＤＮＡ、及びリポソームなどが挙げられる。更なる実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは、プラスミドに挿入されることなく、プラスミドと共に同時形質転換される。更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野で既知の方法により、変更を加えたバチルス（Bacillus）株から除去される（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８［１９８４］；及びＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５〜２６４［２０００］を参照されたい）。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本発明の形質転換細胞は、一般的な栄養培地で培養される。
温度及びｐＨなどの好適な具体的な培養条件は当業者に既知であり、科学文献に詳しく記載されている。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチド又は本発明の少なくとも１種の核酸を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチド配列により形質転換させた宿主細胞を、好適な栄養培地で、本発明のプロテアーゼを発現させる条件下で培養した後、得られるプロテアーゼを培地から回収する。いくつかの実施形態では、細胞により産生されたプロテアーゼは、限定するものではないが、例えば、遠心沈降又は濾過による培養液からの宿主細胞の分離、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清又は濾液中のタンパク質様成分の沈殿、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーなど）などの従来法により培地から回収される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞により産生されたメタロプロテアーゼポリペプチドは、培養培地に分泌される。精製促進ドメインをコードしている核酸配列を使用して、タンパク質の精製を促進することができる。メタロプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡ構築物は、メタロプロテアーゼポリペプチドの精製を促進する精製促進ドメインをコードしている核酸配列を更に含む（例えば、Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜５３［１９９３］を参照されたい）。このような精製促進ドメインとしては、例えば、固定した金属による精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１［１９９２］を参照されたい）、固定した免疫グロブリンによる精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系に利用されるドメインが挙げられるがこれらに限定されない。精製ドメインと非相同的なタンパク質との間に、凝固因子ＸＡ又はエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な配列）を含めることも、精製を促進するために有用である。
【０１３５】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドなどの酵素の酵素活性を検出及び測定するためのアッセイは周知である。プロテアーゼ（例えば、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド）の活性を検出及び測定するための様々なアッセイも当業者に既知である。特に、それらのアッセイは、２８０ｎｍでの吸光度又はフォリン法を利用する比色測定により測定される、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出をベースとして、プロテアーゼ活性を測定する際に利用可能である。他の代表的なアッセイは、発色性基質の可溶化を伴うものである（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３年］，２５１〜３１７頁を参照されたい）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当該技術分野で既知の数多くのその他の参照文献により好適な方法が提供される（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９［１９９４］；及びＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７［１９９９］を参照されたい）。
【０１３６】
様々な方法を使用して、宿主細胞における成熟型プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟型メタロプロテアーゼポリペプチド）の産生レベルを評価することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらの及びその他のアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。
【０１３７】
いくつかのその他の実施形態では、本発明は、本発明の成熟型メタロプロテアーゼポリペプチドを作製又は産生するための方法を提供する。成熟型メタロプロテアーゼポリペプチドは、シグナルペプチド又はプロペプチド配列を含有しない。いくつかの方法は、例えば、バチルス種（Bacillus sp.）細胞（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞）などの組み換え細菌宿主細胞において本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを作製又は産生することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを産生する方法を提供し、方法は、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含む組み換え発現べクターを含む組み換え宿主細胞を、メタロプロテアーゼポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養することを含む。いくつかのこのような方法は、培養物からメタロプロテアーゼポリペプチドを回収することを更に含む。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを産生する方法を提供し、方法は、（ａ）本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含む組み換え発現べクターを細胞群（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞などの細菌の細胞）に導入することと；（ｂ）この細胞を、発現ベクターによりコードされているメタロプロテアーゼポリペプチドの産生を実施する条件下で、培養培地で培養することと、を含む。いくつかのこのような方法は、（ｃ）細胞又は培養培地からメタロプロテアーゼポリペプチドを単離することを更に含む。
【０１３９】
布地ケア及びホームケア製品
いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、助剤及びメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物に使用でき、組成物は、布地ケア及びホームケア製品である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む布地ケア及びホームケア製品組成物は、以下の原料のうちの１種以上を含む（組成物の合計重量に基づく）：約０．０００５重量％〜約０．１重量％、約０．００１重量％〜約０．０５重量％、又は更には約０．００２重量％〜約０．０３重量％の前述のメタロプロテアーゼポリペプチド；並びに以下の１種以上：約０．００００３重量％〜約０．１重量％の布地色相剤；約０．００１重量％〜約５重量％の香料カプセル；約０．００１重量％〜約１重量％冷水溶解性増白剤；約０．００００３重量％〜約０．１重量％漂白触媒；約０．００００３重量％〜約０．１重量％第１の洗浄リパーゼ；約０．００００３重量％〜約０．１重量％の細菌性クリーニングセルラーゼ；及び／又は約０．０５重量％〜約２０重量％  Ｇｕｅｒｂｅｔ非イオン性界面活性剤。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、布地ケア及びホームケア製品組成物は、液体洗濯洗剤又は食器洗浄洗剤、例えば、自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤又は食器手洗い洗剤などである。
【０１４２】
布地ケア及びホームケア製品が、液体若しくは固体、又は顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ゲル、又はペースト形態などの任意の好適な形態で提供されることも意図される。布地ケア及びホームケア製品は、特に、液体形態の場合には１回用量パウチの形態であってよく、典型的には、布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも一部が又は更には完全に水溶性パウチ中に封入される。更に、少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む布地ケア及びホームケア製品のいくつかの実施形態では、布地ケア及びホームケア製品は、上記のパラメーター及び／又は特徴の任意の組み合わせを有し得る。
【０１４３】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを有する組成物
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率（％）及び比率はすべて、特に断りのない限り、重量で計算している。
すべての百分率（％）及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。
本発明の組成物は、クリーニング組成物、例えば、洗剤組成物などを包含する。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
【０１４４】
本明細書で示されるように、いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、更に、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ度供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤などの補助材料を含む（例えば、参照によりその全容が本明細書に援用される、米国特許第６，６１０，６４２号、米国特許第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない補助剤を更に含む。具体的なクリーニング組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドと適合するものでない実施形態では、これら２種の構成成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼ（複数可）を別々に保管する（すなわち、互いに接触させない）好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
【０１４５】
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面のクリーニング、自動食器洗い及び食器の手洗いを含む食器洗浄用途、並びに義歯、歯、毛髪及び肌などの美容用途において、有利に利用される。加えて、低温の溶液中で有効性が増大するという独特の利点により、本発明の酵素は洗濯用途に理想的なものである。更に本発明の酵素は、粒状及び液体組成物での使用が見出される。
【０１４６】
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、クリーニング添加剤への使用も見出されている。いくつかの実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング用途での使用が見出される。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の酵素を少なくとも１種含むクリーニング添加剤を提供し、当該クリーニング添加剤は、更に漂白効果が所望される場合に、洗浄プロセスに含めるために理想的に適している。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング用途が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加剤は最も単純な形態の１種以上のプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、添加剤は、クリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加剤は、過酸化物供給源が用いられかつ漂白効果の増加が所望されるクリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位が、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料を含める。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイなどが挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、このような材料を約５％〜約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを低下させるために有用である。あるいは、いくつかの実施形態では、クリーニング添加剤として、以下により詳細に記載されるような補助成分が挙げられる。
【０１４７】
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング添加剤は、単独で又はその他のプロテアーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせて本明細書で提供される、有効量の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを必要とする。必要とされる酵素レベルは、１種以上の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを添加することにより達成される。典型的には、本発明のクリーニング組成物は、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドのうち少なくとも１種を、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は約０．０１〜約０．１重量％含む。
【０１４８】
本明細書に記載のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作において使用している間、洗浄水が約４．０〜約１１．５、又は更には約５．０〜約１１．５、又は更には約５．０〜約８．０、又は更には約７．５〜約１０．５のｐＨを有するよう配合される。液体製品の処方は、典型的には、ｐＨが約３．０〜約９．０、又は更には約３〜約５になるよう配合される。粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。推奨される使用レベルでｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
【０１４９】
好適な「低ｐＨクリーニング組成物」は、典型的には、約３〜約５のｐＨを有し、典型的には、このようなｐＨ環境で加水分解する界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシド約１〜約１６モルを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このようなクリーニング組成物は、典型的には、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などのｐＨ調整剤を十分量含み、このようなクリーニング組成物のｐＨは約３〜約５になる。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。いくつかの実施形態では、組成物は液体であるが、他の実施形態では、組成物は固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には原液のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の１０％固体溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、特に断りのない限り、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチド（複数可）が顆粒状組成物又は液体に利用するとき、保管中にメタロプロテアーゼポリペプチドを顆粒状組成物以外の成分から保護するため、メタロプロテアーゼポリペプチドがカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。更に、カプセル化は、クリーニングプロセス中のメタロプロテアーゼポリペプチドの利用能を調節する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化は、メタロプロテアーゼポリペプチド（複数可）及び／又は追加の酵素の性能を増強する。これに関し、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、当業界で既知の任意の好適なカプセル材でカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル材は、典型的には、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド（複数可）の少なくとも部分をカプセル化する。典型的には、カプセル材は、水溶性及び／又は水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル材は、０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度は、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ９７／１１１５１号により詳細に記載されている。
カプセル材は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル材が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、カプセル材はデンプンである（例えば、欧州特許第０９２２４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル材は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物などのプラスチックから製造されるマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、限定するものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにＰＭ  ６５４５、ＰＭ  ６５５０、ＰＭ  ７２２０、ＰＭ  ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）として供給されるものが挙げられる。
【０１５１】
本明細書で記載するとき、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、クリーニング及び食器洗剤が挙げられるがこれらに限定されないクリーニング工業での使用が特に見いだされる。これらの用途では、酵素は様々な環境ストレス下に置かれる。様々な条件下で安定であることから、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、現在使用されている多くの酵素を上回る利点を提供する。
【０１５２】
実際に、多様な洗剤の配合、多様な洗浄水の容量、多様な洗浄水の温度、及び多様な洗浄時間の長さを含む各種洗浄条件が存在し、洗浄に関与するプロテアーゼはこれらの条件に晒される。加えて、異なる地域で使用される洗剤配合物では、洗浄水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有するが、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有する。
【０１５３】
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤が包含される。日本の洗剤は、洗浄水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に低濃度洗剤系とみなされる。
【０１５４】
中間濃度の洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤が包含される。北アメリカの洗剤は、洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、典型的に洗浄水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
【０１５５】
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在している洗剤が包含される。欧州の洗剤は、洗浄水中におよそ４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に高濃度洗剤系であるとみなされる。
【０１５６】
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸塩ビルダー洗剤であり、洗浄水中に１５００〜６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記のように、ブラジルでは、洗浄水中に典型的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、例えば、その他のラテンアメリカの国々に限定するものではないが、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、洗浄水中に洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
【０１５７】
前述の点を踏まえると、世界中の典型的な洗浄溶液中の洗剤組成物の濃度は、約８００ｐｐｍ未満から高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている地域で約６０００ｐｐｍと異なることが明らかである。
【０１５８】
典型的な洗浄液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国では、典型的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、洗浄溶液中に約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗浄液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者が、洗剤に付属された計量カップを用いて洗浄水に量り入れる典型的な量である。
【０１５９】
更なる例として、異なる地域では異なる洗浄温度が使用される。日本で使用されている洗浄水の温度は、一般的に、欧州で使用される温度よりも低い。例えば、北アメリカ及び日本の洗浄水の温度は、典型的には約１０〜約３０℃（例えば、約２０℃）であるが、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約４０〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水洗浄の使用に切り替えている。加えて、いくつかの更なる地域では、典型的に洗濯だけでなく食器洗浄用途にも冷水が使用されている。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」では、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべてのその他の組み合わせ、並びに１０℃〜４０℃のすべての範囲の洗浄温度に好適な「冷水用洗剤」を用いる。
【０１６０】
更なる例として、異なる地域では、典型的には異なる硬度の水が用いられている。水硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を合わせて１ガロンあたりのグレーンを単位とする。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）量の測定値である。
米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍ（ｐｐｍをグレーン／ＵＳガロン単位に変換する場合、ｐｐｍ数を１７．１で除したものがグレーン／ガロンに相当する）の鉱物を含有する。
【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
欧州の水硬度は、典型的には、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋合わせて約１８０（例えば、約１８０〜約３４０）ｐｐｍ［約１０．５（例えば、約１０．５〜約２０．０）グレーン／ガロン］である［例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋合わせて約２５５ｐｐｍ（１５グレーン／ガロン）］。北アメリカの水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度より低い。例えば、北アメリカの水硬度は、約５１〜約１７０ｐｐｍ、約５１〜約１３６ｐｐｍ、約５１〜１０２ｐｐｍ（約３〜約１０グレーン、約３〜約８グレーン又は約６グレーン）とすることができる。日本の水硬度は、典型的には、北アメリカの水硬度よりも低く、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋合わせて約５１ｐｐｍ未満であル（約４、例えば、約３グレーン／ガロン）である。
【０１６３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すメタロプロテアーゼポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、その他のメタロプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼに対し、洗浄性能において適合する。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書において提供するメタロプロテアーゼポリペプチドは、増強された酸化安定性、増強された熱安定性、様々な条件下で増強されたクリーニング能力、及び／又は増強されたキレート安定性を示す。更に、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、洗剤を含有しないクリーニング組成物への、単独使用、又はビルダー及び安定剤と組み合わせての使用が見いだされる。
【０１６４】
本発明のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルで本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドと、組成物の重量をもとに、クリーニング助剤を含む残部（例えば、約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）と、を含む。本発明のいくつかのその他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルの少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドと、クリーニング助剤を含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器洗浄効果を提供する追加の洗剤用酵素を１種以上含む。好適な酵素の例としては、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ，リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼなどの一般的に適用可能な酵素をアミラーゼと共に含む酵素混合物（すなわち、「カクテル」）が使用される。
【０１６６】
本発明の組成物には、本明細書で提供されるメタロプロテアーゼポリペプチドに加え、任意のその他の好適なプロテアーゼの使用が見いだされる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、微生物由来のプロテアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバチルス属由来のサブチリシンが挙げられる（例えば、サブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８）。追加の例としては、参照によりその全容が本明細書に援用される、米国再発行特許第３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号が挙げられる。追加のプロテアーゼ例としては、例えば、限定するものではないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及びＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ８９／０６２７０号に記載のフサリウムプロテアーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明に使用できる市販のプロテアーゼ酵素としては、限定するものではないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ａｕｆ  Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、並びにＫＡＰ（バチルス・アルカロフィルスサブチリシン；花王株式会社、日本国東京）が挙げられる。様々なプロテアーゼが、国際公開第ＷＯ９５／２３２２１号、同第ＷＯ９２／２１７６０号、同第ＷＯ０９／１４９２００号、同第ＷＯ０９／１４９１４４号、同第ＷＯ０９／１４９１４５号、同第ＷＯ１１／０７２０９９号、同第ＷＯ１０／０５６６４０号、同第ＷＯ１０／０５６６５３号、同第ＷＯ１１／１４０３６４号、同第ＷＯ１２／１５１５３４号、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号、及び米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号���同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６，、及び同第６，４８２，６２８号、並びに様々なその他の特許文献に記載されている。いくつかの更なる実施形態では、本発明において有用であるメタロプロテアーゼとしては、限定するものではないが、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ０７／０４４９９３号に記載の中性のメタロプロテアーゼが挙げられる。
【０１６７】
加えて、任意の好適なリパーゼが本発明において有用である。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体は本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８  ０６８号、及び同第３０５  ２１６号を参照されたい）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８  ０２３号を参照されたい）、カンジダ（Candida）リパーゼ、例えば、カンジダ・アンタークティカ（C. antarctica）リパーゼ［例えば、カンジダ・アンタークティカ（C. antarctica）リパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４  ７６１号を参照されたい］、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリジェネス（P. alcaligenes）及びシュードモナス・シュードアルカリジェネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８  ２７２号を参照されたい）、シュードモナス・セパキア（P. cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１  ３７６号を参照されたい）、シュードモナス・ストゥッチェリ（P. stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい），シュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：２５３〜２６０［１９９３］）；バチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）リパーゼ［例えば、日本国特許第６４／７４４９９２号を参照されたい］；並びにバチルス・プミルス（B. pumilus）リパーゼ［例えば、国際公開第ＷＯ  ９１／１６４２２号を参照されたい］）が挙げられる。
【０１６８】
更に、本発明のいくつかの実施形態には、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０３：６１〜６７［１９９１］を参照されたい）、ゲオトリクム・カンジドウム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８［１９８９］を参照されたい）、及び様々なリゾプス（Rhizopus）リパーゼ、例えば、リゾプス・デレマー（R. delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０９：１１７〜１１３［１９９１］を参照されたい）、リゾプス・ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９［１９９２］）、及びリゾプス・オリゼ（R. oryzae）リパーゼが挙げられるがこれらに限定されない数多くのクローン化されたリパーゼの使用が見いだされる。
【０１６９】
本発明のいくつかの実施形態では、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来するクチナーゼ（国際公開第ＷＯ  ８８／０９３６７号を参照されたい）、及びフザリウム・ソラニィ（Fusarium solani pisi）に由来するクチナーゼ（国際公開第ＷＯ  ９０／０９４４６号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されないクチナーゼなどの、他の種類のリパーゼポリペプチド酵素も使用が見いだされる。
【０１７０】
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１  ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ  ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ  Ｐ（商標）「アマノ」（天野エンザイム，日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のリパーゼのレベルのリパーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にリパーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％リパーゼのレベルで含む。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態では、任意の好適なアミラーゼが、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、細菌由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において有用なアミラーゼとしては、限定するものではないが、バチルス・リケニフォルミスから得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照されたい）。追加の好適なアミラーゼとしては、国際公開第Ｗ０９５１０６０３号、同第ＷＯ９５２６３９７号、同第ＷＯ９６２３８７４号、同第ＷＯ９６２３８７３号、同第ＷＯ９７４１２１３号、同第ＷＯ９９１９４６７号、同第ＷＯ００６００６０号、同第ＷＯ００２９５６０号、同第ＷＯ９９２３２１１号、同第ＷＯ９９４６３９９号、同第ＷＯ００６００５８号、同第ＷＯ００６００５９号、同第ＷＯ９９４２５６７号、同第ＷＯ０１１４５３２号、同第ＷＯ０２０９２７９７号、同第ＷＯ０１６６７１２号、同第ＷＯ０１８８１０７号、同第ＷＯ０１９６５３７号、同第ＷＯ０２１０３５５号、同第ＷＯ９４０２５９７号、同第ＷＯ０２３１１２４号、同第ＷＯ９９４３７９３号、同第ＷＯ９９４３７９４号、同第ＷＯ２００４１１３５５１号、同第ＷＯ２００５００１０６４号、同第ＷＯ２００５００３３１１号、同第ＷＯ０１６４８５２号、同第ＷＯ２００６０６３５９４号、同第ＷＯ２００６０６６５９４号、同第ＷＯ２００６０６６５９６号、同第ＷＯ２００６０１２８９９号、同第ＷＯ２００８０９２９１９号、同第ＷＯ２００８０００８２５号、同第ＷＯ２００５０１８３３６号、同第ＷＯ２００５０６６３３８号、同第ＷＯ２００９１４０５０４号、同第ＷＯ２００５０１９４４３号、同第ＷＯ２０１００９１２２１号、同第ＷＯ２０１００８８４４７号、同第ＷＯ０１３４７８４号、同第ＷＯ２００６０１２９０２号、同第ＷＯ２００６０３１５５４号、同第ＷＯ２００６１３６１６１号、同第ＷＯ２００８１０１８９４号、同第ＷＯ２０１００５９４１３号、同第ＷＯ２０１１０９８５３１号、同第ＷＯ２０１１０８０３５２号、同第ＷＯ２０１１０８０３５３号、同第ＷＯ２０１１０８０３５４号、同第ＷＯ２０１１０８２４２５号、同第ＷＯ２０１１０８２４２９号、同第ＷＯ２０１１０７６１２３号、同第ＷＯ２０１１０８７８３６号、同第ＷＯ２０１１０７６８９７号、同第ＷＯ９４１８３３１４号、同第ＷＯ９５３５３８２号、同第ＷＯ９９０９１８３号、同第ＷＯ９８２６０７８号、同第ＷＯ９９０２７０２号、同第ＷＯ９７４３４２４号、同第ＷＯ９９２９８７６号、同第ＷＯ９１００３５３号、同第ＷＯ９６０５２９５号、同第ＷＯ９６３０４８１号、同第ＷＯ９７１０３４２号、同第ＷＯ２００８０８８４９３号、同第ＷＯ２００９１４９４１９号、同第ＷＯ２００９０６１３８１号、同第ＷＯ２００９１００１０２号、同第ＷＯ２０１０１０４６７５号、同第ＷＯ２０１０１１７５１１号、及び同第ＷＯ２０１０１１５０２１号に見られるものが挙げられる。本発明において有用な市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のアミラーゼのレベルのアミラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。同様に、本発明の一部の他の実施例では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にアミラーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％アミラーゼのレベルで含む。
【０１７４】
いくつかの更なる実施形態では、任意の好適なセルラーゼが、本発明のクリーニング組成物において有用である。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。好適なセルラーゼには、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼがある（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）。特に好適なセルラーゼは、色ケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０  ４９５  ２５７号を参照されたい）。本発明において有用である市販のセルラーゼとしては、限定するものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＰＵＲＡＤＥＸ  ＡＮＤ  ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ−末端部分が欠失している成熟野生型又は変異体セルラーゼの部分又は断片として組み込まれる（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。更なる好適なセルラーゼとしては、国際公開第ＷＯ２００５０５４４７５号、同第ＷＯ２００５０５６７８７号、米国特許第７，４４９，３１８号、及び同第７，８３３，７７３号に見いだされるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のセルラーゼのレベルのセルラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にセルラーゼを、組成物の重量に基づいて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％セルラーゼのレベルで含む。
【０１７５】
洗剤組成物で使用するのに好適な任意のマンナナーゼも同様に本発明において有用である。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において使用が見いだされる様々なマンナナーゼが既知である（例えば、参照によりその全容が本明細書に援用される米国特許第６，５６６，１１４号；同第６，６０２，８４２号；同第５，４７６，７７５号、及び同第６，４４０，９９１号、及び米国仮出願特許第６１／７３９２６７号を参照されたい）。本発明において使用が見いだされる市販のマンナナーゼの例としては、ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＰＵＲＡＢＲＩＴＥ（商標）、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のマンナナーゼのレベルのマンナナーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にマンナナーゼを、組成物の重量に基いて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％マンナナーゼのレベルで含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼは過酸化水素又は過酸化水素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用される。
いくつかの代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。いずれのタイプの酵素も「溶液を漂白する」（すなわち、布地を一緒に洗浄液で洗浄する場合に、繊維製品の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ９４／１２６２１号及び同第ＷＯ  ９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルのペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルで含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、有用である追加の酵素としては、限定するものではないがペルヒドロラーゼが挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ０５／０５６７８２号を参照されたい）。加えて、いくつかの実施形態では、上述の酵素の混合物、特に、１種以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼなどの酵素の混合物が、本明細書に包含される。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明において有用であることは想到される。様々なレベルのメタロプロテアーゼポリペプチド（複数可）と、１種以上の追加の酵素を、いずれも独立して、約１０％の範囲までとし、クリーニング組成物の残部をクリーニング助剤としてもよいことも想到される。具体的なクリーニング助剤の選別は、クリーニングされる表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗剤を用いた洗浄中）のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
【０１７８】
好適なクリーニング助剤の例としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒材料、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、ポリマー型分散剤、泥汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、フィラー塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、色素、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、参照により本明細書にその全容が援用される、米国特許第６，６１０，６４２号；同第６，６０５，４５８号；同第５，７０５，４６４号；同第５，７１０，１１５号；同第５，６９８，５０４号；同第５，６９５，６７９号；同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい）。具体的なクリーニング組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドと適合するものでない実施形態では、これら２種の構成成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼ（複数可）を別々に保管する（すなわち、互いに接触させない）好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される有効量の１種以上のメタロプロテアーゼポリペプチド（複数可）を、タンパク質性の染みを除去する必要のある様々な表面をクリーニングするのに有用な組成物に含有させる。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、布地、及び皿のクリーニングなどの用途向けのクリーニング組成物が挙げられる。実際に、いくつかの実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、口腔ケア組成物（歯磨剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに義歯洗浄用組成物を包含する）、皮膚クリーニング組成物及び毛髪クリーニング組成物などのパーソナルケアに好適なクリーニング組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、粒状、棒状、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含することを意図する。
【０１８０】
例えば、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドの使用が見いだされる複数種のクリーニング組成物を以下に詳細に記載する。本発明のクリーニング組成物が、洗濯機を用いる洗浄方法で使用するのに好適な組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のビルダー化合物と、並びに好ましくは、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸カス分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、及び防食剤から選択される１種以上のクリーニング助剤と、を含有する。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明の組成物は、固体又は液体形態の洗剤添加剤への使用も見いだされる。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。いくつかの実施形態では、２０℃で測定した場合、本発明の洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方で他の実施形態では約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
【０１８１】
食器手洗い方式で使用する組成物として配合される実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、好ましくは有機高分子化合物、起泡剤、第２族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される少なくとも１種の追加のクリーニング助剤と、を含有する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるものなどの様々なクリーニング組成物と、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドとを組み合わせての使用が見いだされる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、コンパクト顆粒布地クリーニング組成物であるのに対し、他の実施形態では、組成物は、着色の施された布地の洗濯に有用な顆粒布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、洗浄キャパシティ（wash capacity）により柔軟化を提供する顆粒布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は重質液体布地クリーニング組成物である。いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの布地クリーニング組成物である。更に、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、欧州又は日本の洗浄条件（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）下で特に有用である顆粒状洗濯洗剤組成物への使用が見いだされる。
【０１８３】
いくつかの代替的な実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む硬質表面クリーニング組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号；同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載の硬質表面クリーニング組成物である。
【０１８４】
尚更なる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む食器洗浄組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの硬質表面クリーニング組成物である。いくつかの尚更なる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む食器洗浄組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、少なくとも１種の本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの口腔ケア組成物を含む。前述の米国特許第６，３７６，４５０号；同第６，６０５，４５８号；同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に包含される化合物及びクリーニング助剤の処方及び説明に、本明細書で提供されるメタロプロテアーゼポリペプチドの使用が見いだされる。
【０１８５】
本発明のクリーニング組成物は、製造者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形態に処方され、かつ調製され、非限定的な例は、参照によりその全容が本明細書に援用される米国特許第５，８７９，５８４号；同第５，６９１，２９７号；同第５，５７４，００５号；同第５，５６９，６４５号；同第５，５６５，４２２号；同第５，５１６，４４８号；同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載されている。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、かかる組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）などの追加の材料により調整される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、ｐＨ約８．０〜約１２．０、又は約８．５〜約１１．０、又は約９．０〜約１１．０などの洗浄条件下でアルカリｐＨを有するよう処方できる。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、ｐＨ約５．０〜約８．０、又は約５．５〜約８．０、又は約６．０〜約８．０、又は約６．０〜約７．５などの洗浄条件下で、中性のｐＨを有するよう処方できる。いくつかの実施形態では、中性のｐＨ条件は、２０℃にてクリーニング組成物を脱イオン水に１：１００（重量：重量）で溶解させて、標準的なｐＨメーターを利用して測定することで測定できる。
【０１８７】
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的な一覧は、本発明のクリーニング組成物での使用に好適である。いくつかの実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料などの場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドにはこのような助剤が加えられることは理解されたい。このような追加的成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用される洗浄操作の性質によって決まる。好適な補助剤としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、高分子分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の補助剤の好適な例及び使用レベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これら公報は参照により組み込まれる。上述の補助成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明によるクリーニング組成物は、酸性化粒子又はアミノカルボン酸ビルダーを含む。アミノカルボン酸ビルダーの例としては、アミノカルボン酸、それらの塩及び誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、アミノポリカルボン酸ビルダー、例えば、グリシン−Ｎ，Ｎ−二酢酸又は一般式ＭＯＯＣ−ＣＨＲ−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＭ）２の誘導体であり、式中、ＲはＣ１〜１２アルキルであり、Ｍはアルカリ金属である。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）、イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシメチルイヌリンイヌリン及びそれらの塩及び誘導体、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノ二コハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、ＩＤＳ（イミノ二酢酸）及びそれらの塩及び誘導体、例えば、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）及びスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）及びこれらのアルカリ金属塩及び誘導体とすることができる。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、約４００μ〜約１２００μの加重幾何平均粒径と、少なくとも５５０ｇ／Ｌのかさ密度を有する。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、少なくとも約５％のビルダーを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、有機酸及び鉱酸などの任意の酸を含み得る。
有機酸は、１種又は２種のカルボキシル部分を有し得るものであり、いくつかの例では、最大１５個、特に最大１０個の炭素を有することができ、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、カプリン酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、セバシン酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸、及びグリオキシル酸などである。いくつかの実施形態では、酸はクエン酸である。鉱酸としては、塩酸及び硫酸が挙げられる。いくつかの例では、本発明の酸性化粒子は、アミノカルボン酸ビルダーを高レベルで含む高活性の粒子である。硫酸は、最終的な粒子の安定性に更に貢献することも判明している。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明に従うクリーニング組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低ｐＨクリーニング組成物の実施形態（例えば、原液ｐＨが約３〜約５の組成物の場合）では、界面活性剤がこのような組成物の酸性成分により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には当該組成物はエトキシル化アルキル硫酸塩を含まない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、クリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約６０重量％のレベルで存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％〜約５０重量％のレベルで、あるいは更に他の実施形態では約５重量％〜約４０重量％のレベルで存在する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本発明の洗剤組成物は、１種以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含む。少なくとも１種のビルダーを組み込むいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、クリーニング組成物の重量に基づいて、少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸）、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩などのポリカルボン酸類が挙げられる。実際に、本発明の様々な実施形態では任意の好適なビルダーが有用であることが想到される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ビルダーは水溶性の硬度イオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩など（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物など）を形成する。当該技術分野において既知のものが挙げられる（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号参照）、任意の好適なビルダーが、本発明において有用であることが想到される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるビルダーは、リン酸塩ビルダー及び非リン酸塩ビルダーを包含する。いくつかの実施形態では、ビルダーはリン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは非リン酸塩ビルダーである。存在させる場合、ビルダーは、組成物の０．１重量％〜８０重量％、又は５〜６０重量％、又は１０〜５０重量％のレベルで使用する。いくつかの実施形態では、製品は、リン酸塩及び非リン酸塩ビルダーの混合物を含む。好適なリン酸塩ビルダーとしては、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩又はオリゴマー程度のポリリン酸塩が挙げられ、これらの化合物のアルカリ金属塩が包含され、ナトリウム塩が包含される。いくつかの実施形態では、ビルダーは、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）とすることができる。更に、組成物には、カルボン酸塩及び／又はクエン酸塩を含ませることができる。好ましくは、クエン酸は本発明の中性ｐＨ組成物を達成するよう機能する。その他の好適な非リン酸塩ビルダーとしては、ポリカルボン酸及びそれらの部分的に又は完全に中和された塩、ポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩のホモポリマー及びコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記の化合物の塩としては、アンモニウム及び／又はアルカリ金属塩、すなわち、リチウム、ナトリウム、及びカリウム塩、ナトリウム塩が挙げられる。好適なポリカルボン酸としては、非環式、脂環式、複素環式及び芳香族カルボン酸が挙げられ、いくつかの実施形態では、それらのポリカルボン酸は、いずれの場合にも互いに別々のものであり、炭素原子２個以下の少なくとも２つのカルボキシル基を含有する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は少なくとも１種のキレート剤を含有する。好適なキレート剤としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１種のキレート剤を使用する実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、対象とするクリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約１５重量％又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
【０１９５】
いくつかの更なる実施形態では、本明細書で提供されるクリーニング組成物は、少なくとも１種の付着助剤を含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸などの汚れ剥離ポリマー、カオリナイトなどのクレイ、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１９６】
本明細書に記載されるように、再付着防止剤は、本発明の一部の実施形態において有用である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は有用である。例えば、自動食器洗浄機の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、表面改質の目的で、特にシート形成に関し、フィルム形成とスポッティングを防止するため、及び光沢を改善するために有用である。これらの非イオンの界面活性剤は、また、汚れの再付着の防止にも有用である。
いくつかの実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野において既知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、エトキシル化非イオン性界面活性剤、エポキシ保護ポリ（オキシアルキル化）アルコール及びアミンオキシド系界面活性剤とすることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の移染防止剤を包含する。好適なポリマー移染防止剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１種の移染防止剤が使用される実施形態では、本発明のクリーニング組成物において、クリーニング組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を構成する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ケイ酸塩が本発明の組成物に含まれる。このようないくつかの実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）は有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％のレベルで存在する。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は組成物の約５重量％〜約１５重量％のレベルで存在する。
【０１９９】
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は分散剤も含有する。好適な水溶性有機材料には、ホモポリマー型若しくはコポリマー型の酸又はそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されず、このうち、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以内の程度で互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０２００】
いくつかの更なる実施形態では、クリーニング組成物に使用される酵素は任意の好適な技術により安定化されている。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を存在させて、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給することで安定化する。いくつかの実施形態では、酵素安定剤としては、オリゴ糖、多糖、及びアルカリ土類金属塩などの無機二価金属塩、例えば、ギ酸カルシウムなどのカルシウム塩が挙げられる。酵素安定化に関する様々な技術が本発明において有用であると想到される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ）イオン）の水溶性供給源を存在させて当該イオンを酵素に供給することで安定化される。塩化物及び硫酸塩もまた、本発明の一部の実施形態において有用である。好適なオリゴ糖類及び多糖類（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ０７／１４５９６４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた、所望により更に安定性を改善させるために有用である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤及び／又は漂白触媒が、本発明の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定するものではないが、ペルハイドレート塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において既知な任意の好適な塩が、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤を本発明の組成物に使用する。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度にてクリーニング過程で漂白作用を増強させる有機過酸前駆体である。本明細書に用いるのに好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で好ましくは約１〜約１０個の炭素原子、特に約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意に置換された過安息香酸を生じる化合物が挙げられる。
更なる漂白活性化剤も当該技術分野において既知であり、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号を参照されたい）。
【０２０３】
加えて、一部の実施形態において及び本明細書に更に記載されるように、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト錯体、銅錯体、マンガン錯体、及び鉄錯体も有用である。その他の漂白触媒も本発明において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、及び同第４，８１０，４１０号；ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ９９／０６５２１号；及び欧州特許第２１００９４９号を参照されたい）。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は１種以上の触媒型金属錯体を含有する。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒は有用である。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒には、所定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかしか有さない又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒型及び補助金属カチオンに関して所定の安定性定数を有する金属イオン封鎖剤、具体的には、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩を含む触媒系が含まれる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はマンガン化合物により触媒される。このような化合物及び使用レベルは当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照されたい）。
追加の実施形態では、コバルト漂白触媒は、本発明のクリーニング組成物において有用である。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において既知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照されたい）、既知の手順により容易に調製される。
【０２０５】
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、マクロ多環式剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含有する。実際問題として、制限を目的とするものではないが、いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物及びクリーニング方法は、水性洗浄媒質中に少なくとも１ｐｐｈｍの次数で活性ＭＲＬ種を供給するように調整され、及びいくつかの実施形態では約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬが洗浄液中に供給される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒の遷移金属としては、限定するものではないが、例えば、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。同様に、ＭＲＬとしては、限定するものではないが、例えば、特定の架橋型超剛性配位子（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順により容易に調製される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照されたい）。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、金属製品ケア剤を含有する。金属製品ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食、及び／又は酸化の予防及び／又は軽減に有用である。好適な金属製品ケア剤としては、欧州特許第２  １００  ９４９号、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ  ９４／２６８６０号、及び同第ＷＯ  ９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属製品ケア剤は亜鉛塩である。いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の金属製品ケア剤を約０．１重量％〜約５重量％含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、メタロプロテアーゼ変異体ポリペプチドプロテアーゼを有する高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ液体洗濯洗剤には、アニオン性洗剤界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、スルホン酸アルキル、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）；及び任意選択的に非イオン性界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシル化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）を含む、洗剤界面活性剤を含ませることができ（１０％〜４０％）、任意選択的に、アニオン性洗剤界面活性剤（親水性指数（ＨＩｃ）が６．０〜９のもの）の非イオン性洗剤界面活性剤に対する重量比は１：１である。
【０２０９】
組成物には、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーからなる界面活性増強ポリマー（surfactancy boosting polymer）（分岐親水性及び疎水性を備える分岐部分を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から選択され、例えば、アルコキシル化ポリアルキレンイミンを０．０５重量％〜１０重量％）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、飽和ポリアルコール、例えば、グリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（複数可）とを含む）を含ませることができる。
【０２１０】
組成物には、追加ポリマー、例えば汚れ剥離ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、ランダム又はブロック構成で、単糖類、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種のモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマーであって、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ  ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ  ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ  ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、並びに／又はポリエチレングリコールなどのカルボキシレートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースであって、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物などから選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシレート（マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマー又はポリアクリル酸ホモポリマーなど）などを含めることもできる。
【０２１１】
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）、及び付着補助剤を含んでもよく、付着補助剤の例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びＤＡＤ  ＭＡＣと、ビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物との、ランダム又はブロック構成のコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（例えば、カチオン性ヒドロキシエチル（hydoxyethyl）セルロースなど）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、並びにそれらの混合物が挙げられる。
【０２１２】
組成物には、更に、移染防止剤を含ませることもでき、移染防止剤としては、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、並びに／又はこれらの混合物、キレート剤（例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びその任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【０２１３】
組成物には、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される酵素（０．０１重量％活性酵素〜０．０３重量％活性酵素）を更に含ませることができる。組成物は、酵素安定剤（例としては、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール類、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、若しくは芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体、ペプチド又はギ酸塩が挙げられる）を含んでもよい。
【０２１４】
組成物には、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色相染料、カルシウム及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微小結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択される）を更に含ませることもできる。
【０２１５】
好適な洗浄界面活性剤には、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
【０２１６】
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体又はジェル形態、あるいはこれらの組み合わせであってよい。組成物は、任意の単回用量形態であってよく、例えば、パウチであってもよい。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、メタロプロテアーゼ変異体ポリペプチドプロテアーゼを有する高密度粉体（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯洗剤は、洗浄用界面活性剤、例えば、アニオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はそれらの混合物からなる群から選択される）、非イオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のＣ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）、カチオン性洗浄用界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及びそれらの混合物からなる群から選択される）、双性イオン性及び／又は両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びそれらの混合物など；ビルダー、例えば、リン酸塩を含まないビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰなどのゼオライトビルダー）、リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、トリポリリン酸ナトリウムを包含する）、１５重量％未満の範囲のクエン酸、クエン酸塩、及びニトリロ三酢酸又はその塩、ケイ酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム又はメタケイ酸ナトリウム、あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））、炭酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲の、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）；並びに漂白剤（すなわち、フォトブリーチであって、例としては、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びそれらの混合物が含まれる）、疎水性若しくは親水性の漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸若しくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、及びノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）、ニトリル四級アンモニウム塩、並びにこれらの混合物を含む）、過酸化水素、過酸化水素供給源（無機ペルハイドレート塩、例えば、過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸又は過ケイ酸のナトリウム塩一水和物又は四水和物を含む）、予形成された親水性及び／又は疎水性の過酸（過カルボン酸及びその塩、過炭酸及びその塩、ペルイミド酸及びその塩、ペルオキシ一硫酸及びその塩からなる群から選択される）、並びにこれらの混合物及び／又は漂白触媒（例えば、イミニウムカチオン及びポリイオンを含むイミン漂白増進剤など、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン及びこれらの混合物、並びに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオンと、亜鉛又はアルミニウムなどの補助金属カチオン）が挙げられる）、並びにエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びそれらの水溶性塩などの金属イオン封鎖剤を含ませることができる。
【０２１８】
組成物には、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ（rhamnogalacturonases）、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される酵素を更に含ませることができる。
【０２１９】
組成物には、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤（hueing agent）、追加のポリマー（布地保全剤（fabric integrity）及びカチオン性ポリマー）、染料固定剤、布地柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着助剤（fabric deposition aid）、及び／又はシクロデキストリンなどの追加の洗剤原料を更に含ませることができる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、本発明のメタロプロテアーゼを有する自動食器洗い（ＡＤＷ）洗剤組成物である。ＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する、エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシ保護ポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤からなる群から選択される２種以上の非イオン性界面活性剤；５〜６０％の範囲の、リン酸塩（一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩又はオリゴマーポリリン酸塩（oligomeric-poylphosphates）のいずれかのビルダー、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ又はリン酸塩を含有しないビルダー［アミノ酸ベースの化合物、例えば、ＭＧＤＡ（メチル−グリシン−二酢酸など）、及びそれらの塩及び誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン−Ｎ，Ｎ二酢酸）及びそれらの塩及びそれらの誘導体、ＩＤＳ（イミノジコハク酸）及びそれらの塩及びそれらの誘導体、カルボキシメチルイヌリン、及びそれらの塩及び誘導体、並びにそれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニンニ酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びそれらの塩］、０．５重量％〜５０重量％の範囲のポリカルボン酸及びそれらの部分的に又は完全に中和された塩のホモポリマー及びコポリマー、ポリカルボン酸単量体及びヒドロキシカルボン酸単量体及びそれらの塩；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を提供する）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥助剤（ポリエステルから選択され、特にアニオン性ポリエステルと、場合により、特に、酸、アルコール、又はエステル官能基の重縮合をもたらす３〜６個の官能基を有するモノマー、ポリカーボネート、ポリウレタン−、及び／又はポリウレア−ポリオルガノシロキサン化合物又はそれらの活性環状カーボネート及び尿素タイプの前駆体化合物との組み合わせ）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のシリケート（ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロ珪酸）；無機漂白剤（例えば、過酸化水素化物塩、例えば、過ほう酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過珪酸塩）及び有機（例えば、ジアシル及びテトラアシルペルオキシド、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸、及びジペルオキシヘキサデカン二酸などの有機過酸）；約０．１重量％〜約１０重量％の漂白活性剤−有機過酸前駆体；漂白触媒（マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体から選択）；約０．１重量％〜５重量％の金属ケア剤（ベンザトリアゾール（benzatriazoles）、金属塩及び錯体、及び／又は珪酸塩から選択）；自動食器洗浄洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇ活性酵素の範囲の酵素（アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチ���ーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノロキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、及びこれらの任意の混合物）；並びに酵素安定成分（オリゴ糖、多糖及び無機二価金属塩から選択）を含んでよい。
【０２２１】
メタロプロテアーゼは、通常、酵素タンパク質が組成物の０．０００００１重量％〜５重量％のレベルになるよう、又は酵素タンパク質が組成物の０．００００１重量％〜２重量％、又は０．０００１重量％〜１重量％、又は０．００１重量％〜０．７５重量％のレベルになるよう洗剤組成物に組み込まれる。
【０２２２】
動物飼料に使用するための本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド
本発明の更なる態様では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドは、メタロプロテアーゼ及びそれらの変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、及び／又はペットフードの成分として使用することができる。更に、本発明は、１種類以上の動物飼料材料、及び／又は動物飼料添加物成分、及び／又はペットフード材料に、メタロプロテアーゼポリペプチドを混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び／又は動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製における、メタロプロテアーゼポリペプチドの使用に関する。
【０２２３】
用語「動物」は、すべての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚など）、鶏（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏など）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉など）、及び甲殻類（海老及び車海老など）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２４】
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウムなど）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビなど）、並びに飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙など）であるがこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
【０２２５】
用語「動物飼料組成物」、「飼料原料」及び「飼葉」は、互換的に使用され、かつａ）シリアル類、例えば、小粒（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、及びこれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガムなどの大粒；ｂ）シリアル、例えば、トウモロコシグルテンミール、醸造乾燥粒可溶化物（Distillers Dried Grain Solubles）（ＤＤＧＳ）（特にコーンベースの醸造乾燥粒可溶化物（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、ホイートミドリングス、小麦ショート、米ふすま、もみ殻、オーツ殻、パーム核、及びシトラスパルプからの生成物；ｃ）大豆、ひまわり、落花生、ハウチワマメ、えんどう、そら豆、綿、キャノーラ、魚肉、乾燥結晶タンパク質、肉骨粉、じゃがいもタンパク質、乳清、コプラ，胡麻などの資源から得られたタンパク質；ｄ）植物及び動物資源から得られる油脂；ｅ）ミネラル及びビタミンからなる群から選択される１種以上の試料成分を含ませることができる。
【０２２６】
布地の湯通しに使用するための本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド
本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを用いて布地を処理する（例えば、布地を湯通しする）組成物及び方法も想到される。布地の処理方法は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のメタロプロテアーゼと接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
【０２２７】
本発明のメタロプロテアーゼは、織物の製織の間に若しくはその後に、又は糊抜き段階、若しくは１つ以上の追加の布地加工工程の間に、適用することができる。織物の製織の間、織り糸は相当な機械的な歪に曝される。機械式織機での製織前、縦糸は、引張り強度を向上させ、かつ断裂を防止するために、しばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体により被覆される。本発明のメタロプロテアーゼは、これらの糊付け用デンプン又はデンプン誘導体を取り除くために、製織の間又はその後に適用することができる。製織後にメタロプロテアーゼを使用して、均一かつ耐洗浄的な効果を確保するために布地を更に加工する前に、糊付け用コーティングを取り除くことができる。
【０２２８】
本発明のメタロプロテアーゼは、単体で使用して、又は他の糊抜き用化学試薬、及び／若しくは糊抜き用酵素と共に、（例えば、水性組成物中の）洗剤添加剤として使用して、綿含有布地などの布地の糊抜きを行ってよい。また、アミラーゼは、インディゴ染色デニム布地及び衣類のストーンウォッシュ加工したような見た目を作り出すための組成物及び方法において使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による湯通し工程により開始され、この間、衣類はタンパク質分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程による作用を受けやすくなる。メタロプロテアーゼは、デニム衣類の仕上げ方法（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き方法及び、布地への柔らかさの付与方法、並びに／又は仕上げ加工にて使用することができる。
【０２２９】
製紙用パルプの漂白に使用するための本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のメタロプロテアーゼポリペプチドは、酵素により補助される製紙パルプの漂白、例えば、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ又は亜硫酸塩法によリ調製されたパルプなどの漂白への更なる使用が見出されている。おおまかに言えば、製紙パルプの漂白に好適な条件下で製紙パルプを本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドとインキュベートする。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、パルプは無塩素漂白パルプのうち酸素、オゾン、ペルオキシド又はペルオキシ酸漂白されたものである。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、改変又はパルプ連続製造法により製造され、低リグニン含量を示すパルプの、酵素による漂白補助に使用される。その他のいくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは単独で利用され、又は好ましくはキシラナーゼ及び／又はエンドグルカナーゼ及び／又はα−ガラクトシダーゼ及び／又はセロビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて利用される。
【０２３１】
タンパク質分解に使用するための本発明のメタロプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のメタロプロテアーゼポリペプチドは、羽毛、皮膚、毛髪、皮革、及び等価物などの動物由来のタンパク質の酵素による除去及びそれらの分解又は廃棄への使用が更に見いだされる。いくつかの例では、本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを含む溶液中に動物の死骸を浸漬することで、従来の熱湯消毒水への浸漬又は抜羽プロセスと比較して皮膚を損傷から保護するよう機能させることができる。一実施形態では、羽毛には、羽毛の消化又は分解の開始に好適な条件下で、本発明の単離したメタロプロテアーゼポリペプチドを噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本発明のメタロプロテアーゼは、上記のとおりに酸化剤と組み合わせて使用することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、原羽毛の油脂の除去は本発明のメタロプロテアーゼポリペプチドを使用することにより補助される。いくつかの実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、羽毛のクリーニング並びに繊維の消毒及び部分的脱水のために組成物に使用される。いくつかの他の実施形態では、メタロプロテアーゼポリペプチドは、約０．５％（体積／体積）の界面活性剤を添加して又は添加せずに、９５％エタノール又はその他の極性有機溶媒と組み合わせて利用される。
【０２３３】
尚更なる実施形態では、本開示のメタロプロテアーゼポリペプチドは、羽毛由来のタンパク質の回収への使用が見いだされる。本開示のメタロプロテアーゼポリペプチドは、単独で、又は参照により本明細書に援用される国際公開第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６２号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６３号、及び同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６４号に記載のものなどの好適な羽毛加工及びタンパク質分解法と組み合わせて使用できる。いくつかの実施形態では、回収したタンパク質を、続いて動物又は魚用の飼料に使用することができる。
【０２３４】
実験
請求される本発明は、以降の実施例により、更に詳細に記載されるが、この記載により本発明の範囲が請求されたものとして、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０２３５】
（実施例１．１）
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）の株を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｓｐＰｒｏ３と命名した。配列番号１に提供する。ＰｓｐＰｒｏ３遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号２に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２６個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｓｐＰｒｏ３は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質に予想される成熟領域を配列番号３に示す。
【０２３６】
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）から単離されたＰｓｐＰｒｏ３遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000005
【０２３７】
ＰｓｐＰｒｏ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２として記載する。予想されるシグナルペプチドをイタリック体で示し、予想されるプロペプチドには下線を付して示す：
2018153183.tif 000006
【０２３８】
予想されるＰｓｐＰｒｏ３の成熟型のアミノ酸配列を配列番号３として示す。
2018153183.tif 000007
【０２３９】
（実施例１．２）
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３の発現
プロペプチド−成熟型のＰｓｐＰｒｏ３のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ０８５（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）を得た（図１．１）。消化したベクターに、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｓｐＰｒｏ３の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図１．１に示す通り、ｐＧＸ０８５（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、及びＰｓｐＰｒｏ３の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号４）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３遺伝子の翻訳産物を配列番号５に示す。
【０２４０】
ｐＧＸ０８５（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣ）を形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発酵させた。
【０２４１】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した１５０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、次に、０〜０．７Ｍの直線勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｓｐＰｒｏ３を溶出した。対応する未改変の活性精製タンパク質画分を更にプールし、以降の解析のため１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０２４２】
プラスミドｐＧＸ０８５（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）中の合成ＰｓｐＰｒｏ３遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号４に記載する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示し、追加の３残基（ＡＧＫ）をコードしている領域をボールド体で示す：
2018153183.tif 000008
【０２４３】
プラスミドｐＧＸ０８５（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）により発現されたＰｓｐＰｒｏ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000009
【０２４４】
バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）培養物から単離されたＰｓｐＰｒｏ３組み換えタンパク質のアミノ酸配列をタンデム質量分析により決定した。以下に示す。配列番号３に示す予想配列と同じである。
2018153183.tif 000010
【０２４５】
（実施例１．３）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したＰｓｐＰｒｏ３のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に５０μＬの希釈酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏのみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼインを添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は２連アッセイの平均値とした。この値は５％超変動しない。タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図１．２）により、ＰｓｐＰｒｏ３が活性プロテアーゼであることが示される。
【０２４６】
（実施例１．４）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でＰｓｐＰｒｏ３のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μＬの希釈した酵素（２５０ｐｐｍ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）と混合し、続いて８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水溶液を添加した。実施例１．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。最適ｐＨでの活性を１００％に設定した。ｐＨ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図１．３に示す通り、ＰｓｐＰｒｏ３の最適ｐＨは７．５であり、ｐＨ  ５．５〜９で最大活性の７０％超を保有する。
【０２４７】
（実施例１．５）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）でＰｓｐＰｒｏ３の温度プロファイルを解析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈したＰｓｐＰｒｏ３（１００ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例１．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、及び９０℃で試験した。各値は３連アッセイの平均値とした。図１．４のデータは、ＰｓｐＰｒｏ３が５０℃を最適温度とし、４５℃〜６０℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０２４８】
（実施例１．６）
自動食器洗浄（ＡＤＷ）条件下でのメタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６又は８で利用して、自動食器洗浄（ＡＤＷ）条件下でのＰｓｐＰｒｏ３のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｓｐＰｒｏ３を、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、漂白成分（過酸Ｎ，Ｎ−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−ＰＡＰ）の非存在下又は存在下でＡＴ洗剤（表１．１に示す組成）により反応を実施した。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ６又は８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで２０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍ（Ａ４０５）で測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する。ＡＴ洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下、漂白剤の存在又は非存在下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｓｐＰｒｏ３の用量応答について、それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。
【０２４９】
【表３】
2018153183.tif 000011
＊ＡＴ洗剤のｐＨは、０．９Ｍクエン酸を添加することにより規定値（ｐＨ  ６又は８）に調整される。
【０２５０】
（実施例１．７）
洗濯条件のメタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ３のクリーニング性能
ＥＭＰＡ−１１６（血液／牛乳／インクで汚した綿）布帛細片（ＣＦＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）を使用し、ｐＨ  ８．２下で市販の洗剤を利用して、液体洗濯洗剤中のＰｓｐＰｒｏ３タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｓｐＰｒｏ３タンパク質サンプルを希釈溶液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコール）で既定の濃度に希釈した；市販の洗剤（Ｔｉｄｅ（登録商標）、Ｃｌｅａｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ、ＵＳＡ、２０１１年９月に購入）を９５℃で１時間インキュベートして、洗剤中に存在する酵素を失活させた。続いて、タンパク質分解アッセイを実施して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。熱処理した洗剤を、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．２）で最終濃度０．７８８ｇ／Ｌに更に希釈した。一方、緩衝化した液体洗剤の水硬度は１０３ｐｐｍに調整した（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）。緩衝化した洗剤中のＮａＣｌ濃度を調節することにより、緩衝化した洗剤の比導電率を０．６２ｍＳ／ｃｍ（低導電率）又は３．５ｍＳ／ｃｍ（高導電率）に調整した。反応を開始するに当たり、ＥＭＰＡ−１１６布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに１９０μＬの高伝導率又は低伝導率の緩衝化した洗剤を添加し、次に１０μＬの希釈酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、３２℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで２０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１５０μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を使用して６００ｎｍで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す；続いて、酵素のＡ６００からブランク対照のＡ６００を減算することにより実際のＡ６００を計算した。高伝導率又は低伝導率の液体洗濯洗剤中でのＥＭＰＡ−１１６布帛細片のクリーニングについての用量応答を図１．６に示す。
【０２５１】
（実施例１．８）
ＰｓｐＰｒｏ３とその他のメタロプロテアーゼとの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｓｐＰｒｏ３の成熟タンパク質アミノ酸配列（配列番号３）をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表１．２Ａ及び１．２Ｂは、ＰｓｐＰｒｏ３に対する各配列の同一率についての一覧である。表１．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０２５２】
【表４】
2018153183.tif 000012
【０２５３】
【表５】
2018153183.tif 000013
【０２５４】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、成熟ＰｓｐＰｒｏ３（配列番号：３）のアミノ酸配列をサーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテオリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）Ａｌｏｅ−１１由来のプロテアーゼ（ＺＰ＿０９７７５３６４）とアラインメントした。図１．７は、ＰｓｐＰｒｏ３配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０２５５】
Ｃ．系統発生樹
表２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｓｐＰｒｏ３（配列番号：２）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図１．８に示す。
【０２５６】
（実施例１．９）
Ｔｅｒｇ−ｏ−ＴｏｍｅｔｅｒによるＰｓｐＰｒｏ３の性能評価
Ｔｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を利用して、洗濯洗剤用途についてＰｓｐＰｒｏ３の洗浄性能を試験した。３２℃及び１６℃で性能評価を実施した。負荷布は、１Ｌの脱イオン水を入れたＴｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒの各ビーカーに、合計重量が４０ｇになるよう、次のうちの２種の染み付き布帛細片：ＥＭＰＡ１１６：木綿に対し血液、牛乳、インク（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＭＰＡ１１７：ポリコットンに対し血液、牛乳、インク（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＭＰＡ１１２：木綿に対しココア（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びＣＦＴ  Ｃ−１０：木綿に対し顔料、油、及び牛乳成分（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、に加え、エクストラ・ホワイト・インターロック・ニット生地を入れたものとした。水硬度は１０２ｐｐｍ（６グレーン／ガロン）に調製し、ビーカー中で５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．２）によりｐＨを緩衝させた。近所の米国スーパーマーケットで購入し、熱により失活させた、市販の液体洗剤であるＴｉｄｅ  Ｒｅｇｕｌａｒ  ＨＤＬ（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）を０．８ｇ／Ｌで使用した。使用前に、水浴中で９２℃の温度で２〜３時間、洗剤を不活性化させた後、室温に冷却した。市販の洗剤を熱により失活させることで、酵素成分の活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性を保持させる。熱により失活させた洗剤の酵素活性は、プロテアーゼ活性を測定するためのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを利用して測定した。Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡ、（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ’ｌ）及びＰｓｐＰｒｏ３プロテアーゼをそれぞれ最終濃度が０、０．２、０．５、１、及び１．５ｐｐｍになるよう添加した。洗浄時間は１２分とした。洗浄処理後、すべての布帛細片を３分間すすぎ洗いし、低温で機械乾燥させた。
【０２５７】
Ｔｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ  Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｍｅｔｅｒ  ＣＲ−４００を利用し、処理の前後に各４枚ずつの布帛細片の光反射率を測定した。Ｌ、ａ、ｂ値の差を、ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間により定義される通りの総合色差（ｄＥ）に変換した。染みのクリーニングは、洗浄前後の色差間の比をとり、この比と、汚していない布地と洗浄していない汚れ（洗浄前）との差を比較して、各洗浄済み細片の２つの別個の領域を読取った８つの値を平均することで、染み除去指数（％ＳＲＩ）として表される。表１．９Ａ及び１．９Ｂに％  ＳＲＩ（ｄＥ）±９５ＣＩとして報告する。表１．９Ａには、３２℃下でのＰｓｐＰｒｏ３のクリーニング性能を要約し、表１．９Ｂには、１６℃下でのＰｓｐＰｒｏ３のクリーニング性能を要約する。
【０２５８】
【表６】
2018153183.tif 000014
【０２５９】
【表７】
2018153183.tif 000015
【０２６０】
（実施例２．１）
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）からのメタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２のクローニング
様々な工業用途に有用となり得る可能性のある酵素供給源としてパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）株を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。
プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）株の完全なゲノムを配列を決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｓｐＰｒｏ２と命名した。配列番号６に提供する。ＰｓｐＰｒｏ２遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号７に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２４個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｓｐＰｒｏ２は分泌酵素であることが示唆される。ＰｓｐＰｒｏ２のプロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｓｐＰｒｏ２に予想される成熟領域を配列番号８に示す。
【０２６１】
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）から単離されたＰｓｐＰｒｏ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号６として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000016
【０２６２】
ＰｓｐＰｒｏ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７として記載する。予想されるシグナルペプチドをイタリック体で示し、予想されるプロペプチドには下線を付して示す：
2018153183.tif 000017
【０２６３】
予想されるＰｓｐＰｒｏ２の成熟型のアミノ酸配列を配列番号８として示す。
2018153183.tif 000018
【０２６４】
（実施例２．２）
パエニバチルス種（Paenibacillus sp.）メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２の発現
プロペプチド−成熟型のＰｓｐＰｒｏ２のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ０８４（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）を得た（図２．１）。消化したベクターに、ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｓｐＰｒｏ２の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図２．１に示す通り、ｐＧＸ０８４（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｓｐＰｒｏ２の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列を含有する（配列番号９）。合成ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２遺伝子の翻訳産物を配列番号１０に示す。
【０２６５】
ｐＧＸ０８４（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣ）を形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発酵させた。
【０２６６】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した１５０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、次に、０〜０．５Ｍの直線塩勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｓｐＰｒｏ２を溶出した。対応する活性画分を回収し、濃縮し、緩衝液を再度上記のローディングバッファと交換した。サンプルを、同じローディングバッファで平衡化した２０ｍｌ  ＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎに通した。０〜０．３Ｍの直線塩勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｓｐＰｒｏ２を溶出した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。プラスミドｐＧＸ０８４（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）中の合成ＰｓｐＰｒｏ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号９に記載する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示し、追加の３残基（ＡＧＫ）をコードしているオリゴ−ヌクレオチドをボールド体で示す：
2018153183.tif 000019
【０２６７】
プラスミドｐＧＸ０８４（ＡｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）により発現されたＰｓｐＰｒｏ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000020
【０２６８】
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）培養物から単離された組み換えＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のアミノ酸配列を、タンデム質量分析により決定した。以下に示す。配列番号８に示す予想配列と同じである。
2018153183.tif 000021
【０２６９】
（実施例２．３）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したＰｓｐＰｒｏ２のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼインを添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は２連アッセイの平均値とした。この値は５％超変動しない。タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質とするタンパク質分解アッセイにより、ＰｓｐＰｒｏ２は活性なプロテアーゼであることが示された。
【０２７０】
（実施例２．４）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でＰｓｐＰｒｏ２のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μＬの希釈した酵素（５００ｐｐｍ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水溶液を添加した。実施例２．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ  ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨ値とした。各値は３連アッセイの平均値である。図２．３に示す通り、ＰｓｐＰｒｏ２の最適ｐＨは７．５であり、ｐＨ  ５．５〜９．５で最大活性の７０％超を保有する。
【０２７１】
（実施例２．５）
メタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、ＰｓｐＰｒｏ２の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例２．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈したＰｓｐＰｒｏ２（２００ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値である。図２．４のデータは、ＰｓｐＰｒｏ２が５０℃を最適温度とし、４０℃〜６５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０２７２】
（実施例２．６）
自動食器洗浄（ＡＤＷ）条件下でのメタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６又は８で利用して、自動食器洗浄（ＡＤＷ）条件下でのＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｓｐＰｒｏ２タンパク質サンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、漂白成分（過酸Ｎ，Ｎ−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−ＰＡＰ）の存在下でＡＴ洗剤により反応を実施した（表１に示すＡＴ洗剤組成物）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ６又はｐＨ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで５０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する。ＡＴ洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下、漂白剤の存在又は非存在下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｓｐＰｒｏ２の用量応答について、それぞれ図２．５Ａ及び２．５Ｂに示す。
【０２７３】
【表８】
2018153183.tif 000022
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０２７４】
（実施例２．７）
洗濯条件下でのメタロプロテアーゼＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能
Ａ．液体洗濯洗剤中でのクリーニング性能
ＥＭＰＡ−１１６（血液／牛乳／インクで汚した綿）布帛細片（ＣＦＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手）を使用し、ｐＨ８．２下で市販の洗剤を利用して、液体洗濯洗剤中のＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｓｐＰｒｏ２タンパク質サンプルを希釈液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコール）により所望の濃度に希釈した；市販の洗剤（Ｔｉｄｅ（登録商標）、Ｃｌｅａｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ、ＵＳＡ、２０１１年９月に購入）を９５℃で１時間インキュベートして、洗剤中に存在する酵素を失活させた。続いて、タンパク質分解アッセイを実施して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。熱処理した洗剤を、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．２）で最終濃度０．７８８ｇ／Ｌに更に希釈した。一方、緩衝化した液体洗剤の水硬度は１０３ｐｐｍに調整した（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）。緩衝化した洗剤中のＮａＣｌ濃度を調節することにより、緩衝化した洗剤の比導電率を０．６２ｍＳ／ｃｍ（低導電率）又は３．５ｍＳ／ｃｍ（高導電率）に調整した。反応を開始するに当たり、ＥＭＰＡ−１１６布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに１９０μＬの高伝導率又は低伝導率の緩衝化した洗剤を添加し、次に１０μＬの希釈酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、３２℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで２０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１５０μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を使用して６００ｎｍで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す；続いて、酵素の「合計性能」のＡ６００からブランク対照の「合計性能」のＡ６００を減算することにより実際のＡ６００を計算した。高伝導率又は低伝導率の液体洗濯洗剤中でのＥＭＰＡ−１１６布帛細片のクリーニングについての用量応答を図２．６Ａに示す。
【０２７５】
Ｂ．粉末洗濯洗剤におけるクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、市販の洗剤を利用して、粉末洗濯洗剤におけるＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｓｐＰｒｏ２タンパク質サンプルを、希釈液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコール）により所望の濃度に希釈した。粉末洗濯洗剤（Ｔｉｄｅ（登録商標）、漂白剤不含有、Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ、中国、２０１１年１２月購入）を硬度１０３ｐｐｍの水に溶解させて（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）、最終濃度２ｇ／Ｌ（伝導率２．３ｍＳ／ｃｍ−低伝導率）又は５ｇ／Ｌ（伝導率５．５ｍＳ／ｃｍ−高伝導率）とした。続いて、伝導率の異なる洗剤をマイクロ波で沸騰寸前まで加熱して、洗剤中に存在する酵素を失活させた。処理後にタンパク質分解活性を測定して、市販の洗剤中のプロテアーゼが失活していることを確認した。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、加熱処理済みの高又は低電導率の洗剤１９０μＬを添加し、次に１０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、３２℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１５０μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を使用して４０５ｎｍで吸光度を測定した。この吸光度が染みモデルに対するプロテアーゼ活性を示す；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。
高又は低伝導率の粉末洗濯洗剤によるＰＡ−Ｓ−３８布帛細片クリーニングの用量応答性を図２．６Ｂに示す。
【０２７６】
（実施例２．８）
ＰｓｐＰｒｏ２とその他のメタロプロテアーゼとの比較
相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｓｐＰｒｏ２（配列番号８）の成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表２．２Ａ及び２．２Ｂは、ＰｓｐＰｒｏ２に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表２．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０２７７】
【表９】
2018153183.tif 000023
【０２７８】
【表１０】
2018153183.tif 000024
【０２７９】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、成熟ＰｓｐＰｒｏ２のアミノ酸配列（配列番号：８）サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））の配列及びパエニバチルス種（Paenibacillus sp.）、Ａｌｏｅ−１１由来のプロテアーゼ（ＺＰ＿０９７７５３６５．１）配列とアラインメントした。図２．７は、ＰｓｐＰｒｏ２配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０２８０】
Ｃ．系統発生樹
前駆体ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質配列（配列番号：７）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図２．８に示す。
【０２８１】
（実施例３．１）
パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）の株（ＤＳＭ１８７８４）を選択した。
３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｈｕＰｒｏ２と命名した。配列番号１１に提供する。ＰｈｕＰｒｏ２遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号１２に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２３個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｈｕＰｒｏ２は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｈｕＰｒｏ２タンパク質に予想される成熟領域を配列番号１３に示す。パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）から単離されたＰｈｕＰｒｏ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１１として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000025
【０２８２】
ＰｈｕＰｒｏ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000026
【０２８３】
予想されるＰｈｕＰｒｏ２の成熟型のアミノ酸配列を配列番号１３として示す。
2018153183.tif 000027
【０２８４】
（実施例３．２）
パエニバチルス・ヒュミカス（Paenibacillus humicus）メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２の発現
プロペプチド−成熟型のＰｈｕＰｒｏ２のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２）を得た（図１）。消化したベクターに、ＰｈｕＰｒｏ２タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｈｕＰｒｏ２の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図１に示す、得られたプラスミドは、標識されたｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２）であった。図３．１に示す通り、ｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｈｕＰｒｏ２の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号１４）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２遺伝子の翻訳産物を配列番号１５に示す。
【０２８５】
ｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞（ｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣ）を形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０２８６】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００  ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有している緩衝液と緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、活性な通過画分を回収し、濃縮した。サンプルを、上記の０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有させたローディングバッファにより平衡化した３２０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲルろ過カラムに通した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０２８７】
プラスミドｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−  ＰｈｕＰｒｏ２）中の合成ＰｈｕＰｒｏ２遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１４に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000028
【０２８８】
プラスミドｐＧＸ１５０（ＡｐｒＥ−  ＰｈｕＰｒｏ２）により発現されたＰｈｕＰｒｏ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000029
【０２８９】
（実施例３．３）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したメタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μｌの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μｌの１．５％アゾ−カゼインを添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は３連アッセイの平均値とした。
【０２９０】
タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図３．２）により、ＰｈｕＰｒｏ２が活性プロテアーゼであることが示される。
【０２９１】
（実施例３．４）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でメタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（１２５ｐｐｍ）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例３．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図３．３に示す通り、ＰｈｕＰｒｏ２の最適ｐＨは６であり、ｐＨ  ５．５〜８．５で最大活性の７０％超を保有する。
【０２９２】
（実施例３．５）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）中で、メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例３．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈した酵素（５０ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例３．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値とした（この値は５％超変動しない）。図３．４のデータは、ＰｈｕＰｒｏ２が５０℃を最適温度とし、４５℃〜６５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０２９３】
（実施例３．６）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６及び８で利用して、ＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、ＡＴ洗剤により反応を実施した（表３．１に示す洗剤組成物）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ  ６又はｐＨ  ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ食器洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｈｕＰｒｏ２の用量応答について、それぞれ図３．５Ａ及び３．５Ｂに示す。
【０２９４】
【表１１】
2018153183.tif 000030
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０２９５】
（実施例３．７）
ＰｈｕＰｒｏ２とその他のプロテアーゼの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｈｕＰｒｏ２（配列番号：１３）に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表３．２Ａ及び３．２Ｂは、ＰｈｕＰｒｏ２に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表３．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０２９６】
【表１２】
2018153183.tif 000031
【０２９７】
【表１３】
2018153183.tif 000032
【０２９８】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰｈｕＰｒｏ２（配列番号：１３）タンパク質のアミノ酸配列を、サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））の配列及びパエニバチルス・テッラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３（ＹＰ＿００５０７３２２３．１）由来のプロテアーゼ配列とアラインメントした。図３．６は、ＰｈｕＰｒｏ２配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０２９９】
Ｃ．系統発生樹
表２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｈｕＰｒｏ２（配列番号：１２）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６−４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図３．７に示す。
【０３００】
（実施例４．１）
パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）の株（ＤＳＭ１１０２９）を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｅｈＰｒｏ１と命名した。配列番号１６に提供する。ＰｅｈＰｒｏ１遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号１７に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２３個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｅｈＰｒｏ１は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｅｈＰｒｏ１タンパク質に予想される成熟領域を配列番号１８に示す。
【０３０１】
パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）から単離されたＰｅｈＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１６として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000033
【０３０２】
ＰｅｈＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000034
【０３０３】
予想されるＰｅｈＰｒｏ１の成熟型のアミノ酸配列を配列番号１８として示す。
2018153183.tif 000035
【０３０４】
（実施例４．２）
パエニバチルス・エヒメンシス（Paenibacillus ehimensis）メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１の発現
プロペプチド−成熟型のＰｅｈＰｒｏ１のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１）を得た（図４．１）。消化したベクターに、ＰｅｈＰｒｏ１タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｅｈＰｒｏ１の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図１に示す、得られたプラスミドは、標識されたｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１）であった。図１に示す通り、ｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｅｈＰｒｏ１の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号１９）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１遺伝子の翻訳産物を配列番号２０に示す。
【０３０５】
ｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１プラスミドによりバチルス・スブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣ）を形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０３０６】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、次に、０〜０．３Ｍの直線塩勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｅｈＰｒｏ１を溶出した。対応する活性画分を回収し、濃縮し、緩衝液を上記のローディングバッファに再度交換した。同じローディングバッファで平衡化した４０ｍｌ  ＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎにサンプルを通した。０〜０．１５Ｍの直線塩勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｅｈＰｒｏ１を溶出した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０３０７】
プラスミドｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−  ＰｅｈＰｒｏ１）中の合成ＰｅｈＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１９に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000036
【０３０８】
プラスミドｐＧＸ１４８（ＡｐｒＥ−  ＰｅｈＰｒｏ１）により発現されたＰｅｈＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000037
【０３０９】
（実施例４．３）
メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したメタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μｌの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μｌの１．５％アゾ−カゼイン水を添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は３連アッセイの平均値とした。
【０３１０】
タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図４．２）により、ＰｅｈＰｒｏ１が活性プロテアーゼであることが示される。
【０３１１】
（実施例４．４）
メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でメタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（２５０ｐｐｍ）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例４．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ  ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図４．３に示す通り、ＰｅｈＰｒｏ１の最適ｐＨは７であり、ｐＨ  ５．５〜９．５で最大活性の７０％超を保有する。
【０３１２】
（実施例４．５）
メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例４．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈した酵素（１００ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例４．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値である（この値は５％超変動しない）。図４．４のデータは、ＰｅｈＰｒｏ１が７０℃を最適温度とし、６０℃〜７５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０３１３】
（実施例４．６）
メタロプロテアーゼＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６及び８で利用して、ＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、ＡＴ洗剤により反応を実施した（表４．１に示す洗剤組成物）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ  ６又はｐＨ  ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｅｈＰｒｏ１の用量応答について、それぞれ図４．５Ａ及び４．５Ｂに示す。
【０３１４】
【表１４】
2018153183.tif 000038
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０３１５】
（実施例４．７）
ＰｅｈＰｒｏ１とその他のプロテアーゼの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｅｈＰｒｏ１（配列番号１８）の成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表４．２Ａ及び４．２Ｂは、ＰｅｈＰｒｏ１に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表４．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０３１６】
【表１５】
2018153183.tif 000039
【０３１７】
【表１６】
2018153183.tif 000040
【０３１８】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰｅｈＰｒｏ１（配列番号：１８）のアミノ酸配列を、サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス・エルギィ（Paenibacillus elgii）Ｂ６９（ＺＰ＿０９０７７６３４．１）由来のプロテアーゼとアラインメントした。図４．６は、ＰｅｈＰｒｏ１配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０３１９】
Ｃ．系統発生樹
表２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｅｈＰｒｏ１（配列番号：１７）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図４．７に示す。
【０３２０】
（実施例５．１）
パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）の株（ＤＳＭ１５４７８）を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｂａＰｒｏ１と命名した。配列番号２１に提供する。ＰｂａＰｒｏ１遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号２２に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２５個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｂａＰｒｏ１は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｂａＰｒｏ１タンパク質に予想される成熟領域を配列番号２３に示す。
【０３２１】
パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）から単離されたＰｂａＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２１として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000041
【０３２２】
ＰｂａＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000042
【０３２３】
予想されるＰｂａＰｒｏ１の成熟型のアミノ酸配列を配列番号２３として示す。
2018153183.tif 000043
【０３２４】
（実施例５．２）
パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis）メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１の発現
プロペプチド−成熟型のＰｂａＰｒｏ１のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）を得た（図５．１）。消化したベクターに、ＰｂａＰｒｏ１タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｂａＰｒｏ１の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図１に示す、得られたプラスミドは、標識しされたｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）であった。図５．１に示す通り、ｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｂａＰｒｏ１の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号２４）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１遺伝子の翻訳産物を配列番号２５に示す。
【０３２５】
ｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣを形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０３２６】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、活性な通過画分を回収し、濃縮した。このサンプルを、上記の０．１５ＭのＮａＣｌを添加したローディングバッファにより平衡化した３２０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲルろ過カラムに通した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０３２７】
プラスミドｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）中の合成ＰｂａＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２４に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000044
【０３２８】
プラスミドｐＧＸ１４７（ＡｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）により発現されたＰｂａＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２５に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000045
【０３２９】
（実施例５．３）
メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したメタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン水を添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は３連アッセイの平均値とした。
【０３３０】
タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図５．２）により、ＰｂａＰｒｏ１が活性プロテアーゼであることが示される。
【０３３１】
（実施例５．４）
メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ５〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でメタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（１２５ｐｐｍ）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例５．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ  ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図５．３に示す通り、ＰｂａＰｒｏ１の最適ｐＨは８であり、ｐＨ  ７〜９で最大活性の７０％超を保有する。
【０３３２】
（実施例５．５）
メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１の温度プロファイルを分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例５．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈した酵素（５０ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例５．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。
各値は２連アッセイの平均値である（この値は５％超変動しない）。図５．４のデータは、ＰｂａＰｒｏ１が５０℃を最適温度とし、４５℃〜５５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０３３３】
（実施例５．６）
メタロプロテアーゼＰｂａＰｒｏ１のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６及び８で利用して、ＰｂａＰｒｏ１のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、ＡＴ洗剤により反応を実施した（表５．１に示す洗剤組成物）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ  ６又はｐＨ  ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回めのインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｂａＰｒｏ１の用量応答について、それぞれ図５．５Ａ及び５．５Ｂに示す。
【０３３４】
【表１７】
2018153183.tif 000046
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０３３５】
（実施例５．７）
ＰｂａＰｒｏ１とその他のプロテアーゼの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｂａＰｒｏ１（配列番号：２３）に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表５．２Ａ及び５．２Ｂは、ＰｂａＰｒｏ１に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表５．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０３３６】
【表１８】
2018153183.tif 000047
【０３３７】
【表１９】
2018153183.tif 000048
【０３３８】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰｂａＰｒｏ１（配列番号：２３）のアミノ酸配列を、サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２（ＹＰ＿００３９４８５１１．１）由来のプロテアーゼとアラインメントした。図５．６は、ＰｂａＰｒｏ１配列とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０３３９】
Ｃ．系統発生樹
表２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｂａＰｒｏ１（配列番号：２２）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図５．７に示す。
【０３４０】
（実施例６．１）
パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１のクローニング
ＰｐｏＰｒｏ１遺伝子の核酸配列はＮＣＢＩデータベースで同定され（ＮＣＢＩ参照配列：４５３６３９７−４５３８１７５のＮＣ＿０１４６２２．１）、配列番号：２６に提供される。ＰｐｏＰｒｏ１遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号２７に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２４個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｐｏＰｒｏ１は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０−６８２５）。ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質に予想される成熟領域を配列番号２８に示す。
【０３４１】
ＮＣＢＩデータベースで同定したＰｐｏＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２６として示す。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000049
【０３４２】
ＰｐｏＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000050
【０３４３】
予想されるＰｐｏＰｒｏ１の成熟型のアミノ酸配列を配列番号２８として示す。
2018153183.tif 000051
【０３４４】
（実施例６．２）
パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１の発現
プロペプチド−成熟型のＰｐｏＰｒｏ１のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１３８（ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）を得た（図１）。消化したベクターに、ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｐｏＰｒｏ１の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図６．１に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したｐＧＸ１３８（ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｐｏＰｒｏ１の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号２９）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１遺伝子の翻訳産物を配列番号３０に示す。
【０３４５】
ｐＧＸ１３８（ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣを形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０３４６】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、次に、０〜０．２５Ｍの直線塩勾配でＮａＣｌを添加したローディングバッファによりカラムからＰｐｏＰｒｏ１を溶出した。対応する活性な画分を回収し、濃縮した。このサンプルを、上記の０．１５ＭのＮａＣｌを添加したローディングバッファにより平衡化した３２０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲルろ過カラムに通した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０３４７】
プラスミドｐＧＸ１３８（ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）中の合成ＰｐｏＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２８に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000052
【０３４８】
プラスミドｐＧＸ１３８（ＡｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）により発現されたＰｐｏＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３０に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000053
【０３４９】
（実施例６．３）
メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したＰｐｏＰｒｏ１のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン水を添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は２連アッセイの平均値でとした。この値は５％超変動しない。タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図６．２）によりＰｐｏＰｒｏ１が活性プロテアーゼであることが示される。
【０３５０】
（実施例４）
メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でＰｐｏＰｒｏ１のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６−ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（２５０ｐｐｍ）と混合し、続いて８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例６．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。最適ｐＨでの活性を１００％に設定した。ｐＨ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図６．３に示す通り、ＰｐｏＰｒｏ１の最適ｐＨは約７であり、ｐＨ５．５〜８で最大活性の７０％超を保有する。
【０３５１】
（実施例６．５）
メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、ＰｐｏＰｒｏ１の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例６．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈したＰｐｏＰｒｏ１（１００ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例６．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。活性は相対活性として記録し、最適温度下での活性を１００％に設定した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値でとした（この値は５％超変動しない）。図６．４のデータは、ＰｐｏＰｒｏ１が５０℃を最適温度とし、４０℃〜５５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０３５２】
（実施例６．６）
メタロプロテアーゼＰｐｏＰｒｏ１のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤（ＡＴ洗剤）をｐＨ６及び８で利用して、ＰｐｏＰｒｏ１のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したＰｐｏＰｒｏ１を、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、漂白成分（過酸Ｎ，Ｎ−フタロイルアミノペルオキシカプロン酸−ＰＡＰ）の存在下で、ＡＴ洗剤（表６．１に示す組成）により反応を実施した。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ  ６又は８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ洗剤中、ｐＨ  ６及びｐＨ  ８下、漂白剤の存在下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｐｏＰｒｏ１の用量応答について、それぞれ図６．５Ａ及び６．５Ｂに示す。
【０３５３】
【表２０】
2018153183.tif 000054
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０３５４】
（実施例６．７）
ＰｐｏＰｒｏ１とその他のメタロプロテアーゼとの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｐｏＰｒｏ１（配列番号：２８）に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表６．２Ａ及び６．２Ｂは、ＰｐｏＰｒｏ１に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表６．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０３５５】
【表２１】
2018153183.tif 000055
【０３５６】
【表２２】
2018153183.tif 000056
【０３５７】
相同体プロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰｐｏＰｒｏ１（配列番号：２８）のアミノ酸配列を、サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２（ＹＰ＿００３９４８５１１．１）由来のプロテアーゼとアラインメントした。図６．６は、ＰｐｏＰｒｏ１とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０３５８】
系統発生樹
表６．２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｐｏＰｒｏ１（配列番号：２７）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図６．７に示す。
【０３５９】
（実施例７．１）
パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）の株（ＤＳＭ２２１７０）を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）株の完全なゲノムを配列決定した。
データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰｈｕＰｒｏ１と命名した。配列番号３１に提供する。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＴＴＧ）を有する。ＰｈｕＰｒｏ１遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号３２に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２３個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰｈｕＰｒｏ１は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質に予想される成熟領域を配列番号３３に示す。
【０３６０】
パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）から単離されたＰｈｕＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３１として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000057
【０３６１】
ＰｈｕＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３２として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000058
【０３６２】
予想されるＰｈｕＰｒｏ１の成熟型のアミノ酸配列を配列番号３３として示す。
2018153183.tif 000059
【０３６３】
（実施例７．２）
パエニバチルス・ヒュナネンシス（Paenibacillus hunanensis）メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１の発現
プロペプチド−成熟型のＰｈｕＰｒｏ１のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１４９（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１）を得た（図７．１）。消化したベクターに、ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰｈｕＰｒｏ１の未改変プロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図１に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したｐＧＸ１４９（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰｈｕＰｒｏ１の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号３４）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１遺伝子の翻訳産物を配列番号３５に示す。
【０３６４】
ｐＧＸ１４９（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣを形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０３６５】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、活性な通過画分を回収し、更なる解析のため１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０３６６】
プラスミドｐＧＸ１４９（ＡｐｒＥ−  ＰｈｕＰｒｏ１）中の合成ＰｈｕＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３４に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000060
【０３６７】
プラスミドｐＧＸ１４９（ＡｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１）により発現されたＰｈｕＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３５に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000061
【０３６８】
（実施例７．３）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したメタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン水を添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は３連アッセイの平均値とした。タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図７．２）により、ＰｈｕＰｒｏ１が活性プロテアーゼであることが示される。
【０３６９】
（実施例７．４）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でメタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６−ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（１２５ｐｐｍ）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ  ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図７．３に示す通り、ＰｈｕＰｒｏ１の最適ｐＨは約６であり、ｐＨ  ５〜８で最大活性の７０％超を保有する。
【０３７０】
（実施例７．５）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、ＰｈｕＰｒｏ１の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例７．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈した酵素（５０ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例７．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値である（この値は５％超変動しない）。図７．４のデータは、ＰｈｕＰｒｏ１が６０℃を最適温度とし、４５℃〜６５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０３７１】
（実施例７．６）
メタロプロテアーゼＰｈｕＰｒｏ１のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６及び８で利用して、ＰｈｕＰｒｏ１のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、ＡＴ洗剤により反応を実施した（表７．１に示す洗剤組成物）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ  ６又はｐＨ  ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回目のインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ洗剤中、ｐＨ及びｐＨ  ８下、漂白剤の存在下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰｈｕＰｒｏ１の用量応答について、それぞれ図７．５Ａ及び７．５Ｂに示す。
【０３７２】
【表２３】
2018153183.tif 000062
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０３７３】
（実施例７．７）
ＰｈｕＰｒｏ１とその他のプロテアーゼの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰｈｕＰｒｏ１（配列番号：３３）に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表７．２Ａ及び７．２Ｂは、ＰｈｕＰｒｏ１に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表７．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０３７４】
【表２４】
2018153183.tif 000063
【０３７５】
【表２５】
2018153183.tif 000064
【０３７６】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰｈｕＰｒｏ１（配列番号：３３）タンパク質のアミノ酸配列を、プロテイナーゼＴ（Ｐ００８００，チルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス・テッラエ（Paenibacillus terrae）ＨＰＬ−００３（ＹＰ＿００５０７３２２３．１）由来のプロテアーゼとアラインメントした。図７．６は、ＰｈｕＰｒｏ１とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０３７７】
Ｃ．系統発生樹
表２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰｈｕＰｒｏ１（配列番号：２）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図７．７に示す。
【０３７８】
（実施例７．８）
Ｔｅｒｇ−ｏ−ＴｏｍｅｔｅｒによるＰｈｕＰｒｏ１の性能評価
Ｔｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を利用して、洗濯洗剤用途についてＰｈｕＰｒｏ１の洗浄性能を試験した。３２℃及び１６℃で性能評価を実施した。負荷布は、１Ｌの脱イオン水を入れたＴｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒの各ビーカーに、合計重量が４０ｇになるよう、次のうちの２種の染み付き布帛細片：ＥＭＰＡ１１６：木綿に対し血液、牛乳、インク（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＭＰＡ１１７：ポリコットンに対し血液、牛乳、インク（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＭＰＡ１１２：木綿に対しココア（Ｔｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及びＣＦＴ  Ｃ−１０：木綿に対し顔料、油、及び牛乳成分（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、に加え、エクストラ・ホワイト・インターロック・ニット生地を入れたものとした。水硬度は１０２ｐｐｍ（６グレーン／ガロン）に調製し、ビーカー中で５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ８．２）によりｐＨを緩衝させた。近所の米国スーパーマーケットで購入し、熱により失活させた、市販の液体洗剤であるＴｉｄｅ  Ｒｅｇｕｌａｒ  ＨＤＬ（Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）を０．８ｇ／Ｌで使用した。使用前に、水浴中で９２℃の温度で２〜３時間、洗剤を不活性化させた後、室温に冷却した。市販の洗剤を熱により失活させることで、酵素成分の活性を破壊しつつ、非酵素成分の特性を保持させる。熱により失活させた洗剤の酵素活性は、プロテアーゼ活性を測定するためのＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを利用して測定した。Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡ、（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ’ｌ）及びＰｈｕＰｒｏ１プロテアーゼをそれぞれ最終濃度が１ｐｐｍになるよう添加した。酵素を含有しない対照サンプルを包含させた。洗浄時間は１２分とした。洗浄処理後、すべての布帛細片を３分間すすぎ洗いし、低温で機械乾燥させた。
【０３７９】
Ｔｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ  Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｍｅｔｅｒ  ＣＲ−４００を利用し、処理の前後に各４枚ずつの布帛細片の光反射率を測定した。Ｌ、ａ、ｂ値の差を、ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間により定義される通りの総合色差（ｄＥ）に変換する。染みのクリーニングは、洗浄前後の色差間の比をとり、この比と、汚していない布地と洗浄していない汚れ（洗浄前）との差を比較して、各洗浄済み細片の２つの別個の領域を読取った８つの値を平均することで、染み除去指数（％ＳＲＩ）として表される。ＰｈｕＰｒｏ１及びＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡプロテアーゼの３２℃下でのクリーニング性能を表７．８Ａ及び図７．８Ａに示し、１６℃下でのクリーニング性能を表７．８Ｂ及び図７．８Ｂに示す。
【０３８０】
【表２６】
2018153183.tif 000065
【０３８１】
【表２７】
2018153183.tif 000066
【０３８２】
（実施例８．１）
パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus terrae）メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のクローニング
様々な工業用途に有用であり、酵素の供給源として可能性のあるものとして、パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus terrae）の株（ＤＳＭ１１７４７）を選択した。３７℃下で、Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）で株を２４時間初代培養し、配列決定のため、ゲノムＤＮＡを得た。プレートから細胞をかき集め、これを使用して、ＺｙｍｏのＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキット（カタログ番号Ｄ６００５）によりゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムの配列決定にゲノムＤＮＡを使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定技術を利用して、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりパエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus terrae）株の完全なゲノムを配列決定した。データのアセンブリ後、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりコンティグにアノテーション付与を行った。メタロプロテアーゼをコードしているパエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus terrae）のアノテーション後に、遺伝子のうち１つを同定し、この遺伝子配列をＰａｍＰｒｏ１と命名した。配列番号３６に提供する。ＰａｍＰｒｏ１遺伝子によりコードされる、対応するタンパク質を配列番号３７に示す。このタンパク質は、ＳｉｇｎａｌＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５〜７８６）により予想されたとおり、Ｎ末端に長さにして２５個のアミノ酸をシグナルペプチドとして有する。シグナル配列が存在することから、ＰａｍＰｒｏ１は分泌酵素であることが示唆される。プロペプチド領域は、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｎｐｒタンパク質とのタンパク質の配列アラインメントにより予想した（Ｔａｋｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３（２１）：６８２０〜６８２５）。ＰａｍＰｒｏ１タンパク質に予想される成熟領域を配列番号３に示す。
【０３８３】
パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus amylolyticus）から単離されたＰａｍＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３６として設定する。予想される未改変のシグナルペプチドをコードしている配列をイタリック体で示す：
2018153183.tif 000067
【０３８４】
ＰａｍＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３７として記載する。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す：
2018153183.tif 000068
【０３８５】
予想されるＰａｍＰｒｏ１の成熟型のアミノ酸配列を配列番号３８として示す。
2018153183.tif 000069
【０３８６】
（実施例８．２）
パエニバチルス・アミロリティクス（Paenibacillus amylolyticus）メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１の発現
プロペプチド−成熟型のＰａｍＰｒｏ１のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のバチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）に挿入し、プラスミドｐＧＸ１４６（ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）を得た（図１）。消化したベクターに、ＰａｍＰｒｏ１タンパク質をコードしている遺伝子をライゲーションし、バチルス・スブチルス（Bacillus subtilis）ＡｐｒＥシグナル配列の３末端と、予想されるＰａｍＰｒｏ１の未改変のプロペプチド５’末端との間に３コドン（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を付加した。遺伝子は、代替的な開始コドン（ＧＴＧ）を有する。図８．１に示す、得られるプラスミド、すなわち標識したｐＧＸ１４６（ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）は、ＡｐｒＥプロモーター、バチルス・スブチルス（B. subtilis）においてタンパク質の分泌を直接標的とするため使用するＡｐｒＥシグナル配列、並びにＰａｍＰｒｏ１の予想されるプロペプチド及び成熟領域をコードしている合成ヌクレオチド配列（配列番号３９）を含有する。合成ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１遺伝子の翻訳産物を配列番号４０に示す。
【０３８７】
ｐＧＸ１４６（ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１プラスミドによりバチルス・スブチルス（B. subtilis）細胞ｄｅｇＵＨｙ３２，ΔｓｃｏＣを形質転換させ、この形質転換させた細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコール及び１．２％スキムミルク（カタログ番号２３２１００，Ｄｉｆｃｏ）を添加したルリア寒天プレートに播種した。プレート上で最も大きく透明なハローを伴ったコロニーを選択し、ＭＢＤ培地（ＭＯＰＳ系合成培地、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を更に添加）を入れた２５０ｍｌ振とうフラスコで発行させた。
【０３８８】
振とうフラスコから回収したブロスを濃縮し、ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外ろ過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を利用して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０％プロピレングリコールを含有しているローディングバッファに緩衝液を交換した。ろ過後、このサンプルを、上記のローディングバッファにより平衡化した８０ｍＬ  Ｑセファロース高性能カラムに通し、活性な通過画分を回収し、濃縮した。このサンプルを、上記の０．１５ＭのＮａＣｌを添加したローディングバッファにより平衡化した３２０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲルろ過カラムに通した。対応する活性な精製タンパク質画分を更に回収し、更なる分析のため、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａにより濃縮した。
【０３８９】
プラスミドｐＧＸ１４６（ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）中の合成ＰａｍＰｒｏ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号３９に記載する。付加する３残基（ＡＧＫ）をコードしている配列をボールド体で示す：
2018153183.tif 000070
【０３９０】
プラスミドｐＧＸ１４６（ＡｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）により発現されたＰａｍＰｒｏ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４０に示す。予想されるシグナル配列をイタリック体で示し、付加した３残基（ＡＧＫ）をボールド体で示し、予想されるプロペプチドを文字列に下線を付して示す。
2018153183.tif 000071
【０３９１】
（実施例８．３）
メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のタンパク質分解活性
基質としてアゾ−カゼイン（カタログ番号７４Ｈ７１６５，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）中で、精製したメタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のタンパク質分解活性を測定した。反応を開始する前に、酵素をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で特定濃度に希釈した。アゾ−カゼインを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）に溶解して最終濃度１．５％（重量／体積）にした。反応を開始するに当たり、氷上に配置した低吸着性９６ウェルマイクロタイタープレート（９６−ＭＴＰ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃３６４１）に、５０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水のみ）を添加し、次に５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン水を添加した。９６−ＭＴＰのシール後、４０℃下で、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により６５０ｒｐｍで１０分間反応を実施した。１００μＬの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し反応を停止させた。平衡化（室温にて５分）後、遠心分離し（４℃、２０００ｇで１０分間）、１２０μＬの上清を新しい９６−ＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０を使用して上清の吸光度を４４０ｎｍ（Ａ４４０）で測定した。酵素のＡ４４０からブランク対照のＡ４４０を減算することにより実際のＡ４４０を計算した後、異なるタンパク質濃度に対しプロットした（１．２５ｐｐｍ〜４０ｐｐｍ）。各値は３連アッセイの平均値とした。タンパク質分解活性を実際のＡ４４０として示す。アゾ−カゼインを基質として用いるタンパク質分解アッセイ（図８．２）によりＰａｍＰｒｏ１が活性プロテアーゼであることが示される。
【０３９２】
（実施例８．４）
メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のｐＨ特性
基質としてアゾ−カゼインを用い、様々なｐＨ値（ｐＨ  ４〜１１の範囲）を有する１２．５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液でメタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のｐＨ特性を試験した。アッセイを開始するに当たり、最初に、氷上に配置した９６−ＭＴＰで、特定のｐＨを有する５０μＬの２５ｍＭ酢酸塩／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液を、２μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈した酵素（１２５ｐｐｍ）と混合し、続いて４８μＬの１．５％（重量／体積）アゾ−カゼイン水を添加した。実施例８．３に記載のとおりに反応を実施し、解析した。最適ｐＨ下での活性を１００％と設定し、各ｐＨ下での酵素活性を相対活性として記録した。ｐＨ  ４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０及び１１を試験ｐＨとした。各値は３連アッセイの平均値とした。図８．３に示す通り、ＰａｍＰｒｏ１の最適ｐＨは約８であり、ｐＨ  ７〜９．５で最大活性の７０％超を保有する。
【０３９３】
（実施例８．５）
メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１の温度特性
アゾ−カゼインアッセイを利用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ７）中で、ＰａｍＰｒｏ１の温度特性を分析した。酵素サンプル及びアゾ−カゼイン基質を実施例８．３に記載のとおりに調製した。反応を開始する前に、２００μＬのＰＣＲチューブ中で、５０μＬの１．５％アゾ−カゼイン及び４５μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を混合し、これを次にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）で所望の温度（すなわち２０〜９０℃）で５分間インキュベートした。インキュベート後、５μＬの希釈した酵素（５０ｐｐｍ）又は水（ブランク対照）を基質混合物に添加し、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅで異なる温度で１０分間反応を実施した。反応を停止させるに当たり、各ウェルに１００μＬの５％  ＴＣＡを入れた９６−ＭＴＰに各アッセイ混合物を移した。続いて、実施例８．３に記載のとおりに遠心分離し、吸光度を測定した。最適温度下での活性を１００％と設定して、活性を相対活性として記録した。２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０及び９０℃を試験温度とした。各値は２連アッセイの平均値である（この値は５％超変動しない）。図８．４のデータは、ＰａｍＰｒｏ１が５０℃を最適温度とし、４５℃〜５５℃で最大活性の７０％超を保有していたことを示す。
【０３９４】
（実施例８．６）
メタロプロテアーゼＰａｍＰｒｏ１のクリーニング性能
ＰＡ−Ｓ−３８（色素を添加した卵黄、加熱エージング処理）布帛細片（ＣＦＴ−Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、自動食器洗浄（ＡＤＷ）のモデル洗剤をｐＨ  ６及び８で利用して、ＰａｍＰｒｏ１のクリーニング性能を試験した。反応を開始する前に、精製したプロテアーゼサンプルを、１０ｍＭ  ＮａＣ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び１０％プロピレングリコールを含有させた希釈液により所定の濃度に希釈した。水硬度１００ｐｐｍ（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝３：１）で、ＡＴ洗剤により反応を実施した（表８．１に示す洗剤組成）。反応を開始するに当たり、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片を入れた９６−ＭＴＰに、ｐＨ６又はｐＨ  ８で緩衝した１８０μＬのＡＴ洗剤を添加し、次に２０μＬの希釈した酵素（又はブランク対照として希釈液）を添加した。９６−ＭＴＰをシールし、５０℃の恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルから１００μＬの洗浄液を新しい９６−ＭＴＰに移し、分光光度計を利用して吸光度を４０５ｎｍで測定した（本明細書において「初期性能」として参照）。９６−ＭＴＰに残存する洗浄液を回収し、布帛細片を２００μＬ水ですすぎ洗いをした。１８０μＬの０．１Ｍ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ  １０）の添加後、５０℃に設定した恒温器／振とう器で１１５０ｒｐｍで１０分間２回めのインキュベートを実施した。得られた洗浄液のうち１００μＬを新しい９６−ＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した（本明細書において「洗浄後」として参照）。２回の吸光度測定値を合算（「初期性能」と「洗浄後」の値を合算）し、「合計性能」とした。これにより、染みモデルに対するプロテアーゼ活性を測定する；続いて、酵素の「合計性能」のＡ４０５からブランク対照の「合計性能」のＡ４０５を減算することにより実際のＡ４０５を計算した。ＡＴ洗剤中、ｐＨ及びｐＨ  ８下、漂白剤の存在下での、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングにおける、ＰａｍＰｒｏ１の用量応答について、それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。
【０３９５】
【表２８】
2018153183.tif 000072
＊０．９Ｍクエン酸を添加することにより所望のｐＨ（ｐＨ  ６又は８）にＡＴ処方洗剤のｐＨを調整した。
【０３９６】
（実施例８．７）
ＰａｍＰｒｏ１とその他のプロテアーゼの比較
Ａ．相同なプロテアーゼの同定
検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。ＰａｍＰｒｏ１（配列番号：３８）に予想される成熟タンパク質アミノ酸配列をクエリー配列として使用した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表８．２Ａ及び８．２Ｂは、ＰａｍＰｒｏ１に対する配列同一性（％）の一覧を提供する。表８．２中の「長さ」は、相同プロテアーゼ配列の完全長を示す。
【０３９７】
【表２９】
2018153183.tif 000073
【０３９８】
【表３０】
2018153183.tif 000074
【０３９９】
Ｂ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、予想される成熟ＰａｍＰｒｏ１（配列番号：３８）のアミノ酸配列を、サーモリシン（Ｐ００８００，バチルス・サーモプロテイリティクス（Bacillus thermoproteolyticus））及びパエニバチルス・ペオリアエ（Paenibacillus peoriae）ＫＣＴＣ  ３７６３（ＹＰ＿００５０７３２２３．１）由来のプロテアーゼとアラインメントした。図８．６は、ＰａｍＰｒｏ１とこれらのプロテアーゼ配列とのアラインメントを示す。
【０４００】
Ｃ．系統発生樹
表８．２Ａの代表的な相同体の配列及び近隣結合法（ＮＪ）を利用して、ＰａｍＰｒｏ１（配列番号：３７）の完全長の配列についての系統発生樹を作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図８．７に示す。
【０４０１】
（実施例９）
様々なパエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼとその他の細菌由来のメタロプロテアーゼ相同体との比較
Ａ．相同なプロテアーゼ配列のアラインメント
ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで利用して、実施例１．１〜８．７に記載の、パエニバチルス（Paenibacillus）プロテアーゼに予想される成熟配列のアミノ酸配列を、関連する細菌由来のメタロプロテアーゼとアラインメントした。図９．１は、様々なパエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼとその他の細菌由来のメタロプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【０４０２】
Ｂ．系統発生樹
図９．１の完全長のメタロプロテアーゼ配列についての系統発生樹は、近隣結合法（ＮＪ）を利用して作製した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｒｅｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６〜４２５）。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。ｐｈｙｌｏｄｅｎｄｒｏｎ−系統発生樹プリンターソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅａｐｐ／ｔｒｅｅｐｒｉｎｔ−ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を利用して系統発生樹を表示した。これを図９．２に示す。図９．２では、パエニバチルス（Paenibacillus）属の配列のクラスタ形成を観察することができる。
【０４０３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書において提示され、記載されているものの、このような実施形態は例示目的でのみ提供されていることは当業者には明白である。当業者であれば、本発明から逸脱せずとも数多くの変種、変更、及び置き換えをなすことができるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替を本発明の実施に当たって利用可能であることは理解されたい。本発明の添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、並びに請求項の範囲内の方法及び構造とそれらの相当物とが特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１．１】
2018153183.tif 000075
【図１．２】
2018153183.tif 000076
【図１．３】
2018153183.tif 000077
【図１．４】
2018153183.tif 000078
【図１．５Ａ】
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【図１．５Ｂ】
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【図１．６】
2018153183.tif 000081
【図１．７】
2018153183.tif 000082
【図１．８】
2018153183.tif 000083
【図２．１】
2018153183.tif 000084
【図２．２】
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【図２．３】
2018153183.tif 000086
【図２．４】
2018153183.tif 000087
【図２．５Ａ】
2018153183.tif 000088
【図２．５Ｂ】
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【図２．６Ａ】
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【図２．６Ｂ】
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【図２．７】
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【図２．８】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図３．４】
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【図３．５Ａ】
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【図３．５Ｂ】
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【図３．６】
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【図３．７】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【図４．４】
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【図４．５Ａ】
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【図４．５Ｂ】
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【図４．６】
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【図４．７】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図５．３】
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【図５．４】
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【図５．５Ａ】
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【図５．５Ｂ】
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【図５．６】
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【図５．７】
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【図６．１】
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【図６．２】
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【図６．３】
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【図６．４】
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【図６．５Ａ】
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【図６．５Ｂ】
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【図６．６】
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【図６．７】
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【図７．１】
2018153183.tif 000126
【図７．２】
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【図７．３】
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【図７．４】
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【図７．５Ａ】
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【図７．５Ｂ】
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【図７．６】
2018153183.tif 000132
【図７．７】
2018153183.tif 000133
【図７．８Ａ】
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【図７．８Ｂ】
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【図８．１】
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【図８．２】
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【図８．３】
2018153183.tif 000138
【図８．４】
2018153183.tif 000139
【図８．５Ａ】
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【図８．５Ｂ】
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【図８．６】
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【図８．７】
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【図９．１Ａ】
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【図９．１Ｂ】
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【図９．１Ｃ】
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【図９．１Ｄ】
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【図９．２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月3日(2018.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３３、１３、１８、２３、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであるとともにプロテアーゼ活性を有するものである、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、バチルス（Bacillales）目のメンバーに由来するもの、又はプラノコッカス（Planococcus）種に由来するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記バチルス（Bacillales）目のメンバーが、パエニバチルス（Paenibacillaceae）科のメンバーである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記バチルス（Bacillales）目のメンバーがパエニバチルス種（Paenibacillus spp.）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記プロテアーゼ活性が、カゼイン加水分解、コラーゲン加水分解、エラスチン加水分解、ケラチン加水分解、大豆タンパク質加水分解、又はコーンミールタンパク質加水分解を含むものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ｐＨ  ４．５〜１０及び／又は３０℃〜７０℃下で、前記ポリペプチドの最大活性の少なくとも５０％を保持するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、洗剤組成物中でクリーニング活性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、組み換えポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、クリーニング組成物又は洗剤組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、布地柔軟化洗剤、食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング洗剤からなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、界面活性剤；少なくとも１種のカルシウムイオン及び／又は亜鉛イオン；少なくとも１種の安定剤；０．００１〜０．１重量％の前記ポリペプチド；少なくとも１種の漂白剤；少なくとも１種の補助成分；及び／又はアシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ，カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、その他のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含むものである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記クリーニング組成物がリン酸塩を含むもの、又はリン酸塩を含まないものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ゲル、又はペースト組成物である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
表面又は物品を、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むクリーニング組成物と接触させることを含む、クリーニング方法。
【請求項１６】
前記物品が食器又は布地である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ．請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を安定的に形質転換させることと；
ｂ．前記宿主細胞に前記プロテアーゼを産生させるのに好適な条件下で、前記形質転換させた宿主細胞を培養することと；
ｃ．前記プロテアーゼを回収することと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、
ａ．配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％配列同一性であるもの；又は
ｂ．高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブとハイブリダイズさせることができるもの；又は
ｃ．配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列に対し相補的なポリヌクレオチド配列、
を含む、ポリヌクレオチド配列を含むとともに前記ポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドがプロテアーゼ活性を有するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
核酸配列であって、
（ｉ）配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択される配列に対し少なくとも９０％同一性を有する、又は
（ｉｉ）高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリダイズさせることができる、又は
（ｉｉｉ）配列番号：３４、１４、１９、２４、及び３９からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と相補的である、
核酸配列を含むものであるとともに前記ポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドがプロテアーゼ活性を有するものである、核酸配列。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸配列を含むものである、ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターで形質転換させたものである、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むものである、布地加工、動物飼料、皮革加工、羽毛加工、又はトウモロコシ大豆タンパク質加工の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１．１】実施例１．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ０８５（ａｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ３）を提供する。
【図１．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｓｐＰｒｏ３の用量応答曲線を提供する。
【図１．３】ＰｓｐＰｒｏ３のｐＨプロファイルを提供する。
【図１．４】ＰｓｐＰｒｏ３の温度特性を提供する。
【図１．５Ａ】ｐＨ  ６及び８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図１．５Ｂ】ｐＨ  ６及び８、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図１．６】液体洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ３タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図１．７】（配列番号３、４４、及び４５は、それぞれ）ＰｓｐＰｒｏ３と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図１．８】ＰｓｐＰｒｏ３及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図２．１】実施例２．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ０８４（ａｐｒＥ−ＰｓｐＰｒｏ２）を提供する。
【図２．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｓｐＰｒｏ２の用量応答曲線を提供する。
【図２．３】精製したＰｓｐＰｒｏ２のｐＨプロファイルを提供する。
【図２．４】精製したＰｓｐＰｒｏ２の温度特性を提供する。
【図２．５Ａ】ｐＨ  ６下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図２．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、精製したＰｓｐＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図２．６Ａ】液体洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図２．６Ｂ】粉末洗濯洗剤中の、ＰｓｐＰｒｏ２タンパク質のクリーニング性能を示す。
【図２．７】（配列番号８、４６、及び４５は、それぞれ）ＰｓｐＰｒｏ２と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図２．８】ＰｓｐＰｒｏ２及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図３．１】実施例３．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１５０（ａｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ２）を提供する。
【図３．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｈｕＰｒｏ２の用量応答曲線を提供する。
【図３．３】精製したＰｈｕＰｒｏ２のｐＨプロファイルを提供する。
【図３．４】精製したＰｈｕＰｒｏ２の温度特性を提供する。
【図３．５Ａ】ｐＨ  ６下、ＡＴ食器洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図３．５Ｂ】ｐＨ  ８下、ＡＴ食器洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ２のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図３．６】（配列番号１３、４７、及び４５は、それぞれ）ＰｈｕＰｒｏ２と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図３．７】ＰｈｕＰｒｏ２及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図４．１】実施例４．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４８（ａｐｒＥ−ＰｅｈＰｒｏ１）を提供する。
【図４．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｅｈＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図４．３】精製したＰｅｈＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図４．４】精製したＰｅｈＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図４．５Ａ】ｐＨ  ６下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、ＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図４．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、漂白剤を添加したＡＴ食器洗剤中の、精製したＰｅｈＰｒｏ１のクリーニング性能についての用量応答を示す。
【図４．６】（配列番号１８、４８、及び４５は、それぞれ）ＰｅｈＰｒｏ１と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図４．７】ＰｅｈＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図５．１】実施例５．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４７（ａｐｒＥ−ＰｂａＰｒｏ１）を提供する。
【図５．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｂａＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図５．３】精製したＰｂａＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図５．４】精製したＰｂａＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図５．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｂａＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図５．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｂａＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図５．６】（配列番号２３、４９、及び４５は、それぞれ）ＰｂａＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図５．７】ＰｂａＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図６．１】実施例６．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１３８（ａｐｒＥ−ＰｐｏＰｒｏ１）を提供する。
【図６．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｐｏＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図６．３】精製したＰｐｏＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図６．４】精製したＰｐｏＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図６．５Ａ】ｐＨ  ６、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図６．５Ｂ】ｐＨ  ８、漂白剤の存在下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｐｏＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図６．６】（配列番号２８、５０、及び４５は、それぞれ）ＰｐｏＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図６．７】ＰｐｏＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図７．１】実施例７．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４９（ａｐｒＥ−ＰｈｕＰｒｏ１）を提供する。
【図７．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰｈｕＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図７．３】精製したＰｈｕＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図７．４】精製したＰｈｕＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図７．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図７．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰｈｕＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図７．６】（配列番号３３、５１、及び４５は、それぞれ）ＰｈｕＰｒｏ１と、その他の相同体タンパク質とのアラインメントを示す。
【図７．７】ＰｈｕＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図７．８Ａ】ＰｈｕＰｒｏ１及びＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡプロテアーゼのクリーニング性能を示す。
【図７．８Ｂ】ＰｈｕＰｒｏ１及びＰｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡプロテアーゼのクリーニング性能を示す。
【図８．１】実施例８．２に記載のプラスミドマップｐＧＸ１４６（ａｐｒＥ−ＰａｍＰｒｏ１）を提供する。
【図８．２】アゾカゼインアッセイにおけるＰａｍＰｒｏ１の用量応答曲線を提供する。
【図８．３】精製したＰａｍＰｒｏ１のｐＨプロファイルを提供する。
【図８．４】精製したＰａｍＰｒｏ１の温度特性を提供する。
【図８．５Ａ】ｐＨ  ６下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰａｍＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図８．５Ｂ】ｐＨ  ８下での、ＡＤＷ洗剤中の、ＰａｍＰｒｏ１タンパク質による、ＰＡ−Ｓ−３８布帛細片のクリーニングの際の用量応答を示す。
【図８．６】（配列番号３８、５２、及び４５は、それぞれ）ＰａｍＰｒｏ１とプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図８．７】ＰａｍＰｒｏ１及びその相同体の系統発生樹を提供する。
【図９．１Ａ−９．１Ｄ】（配列番号５３−６２、３８、２３、１３、６３、８、２８、６４、３、１８、３３、６５−６８は、それぞれ）様々なパエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼとその他の細菌メタロプロテアーゼ相同体とのアラインメントを示す。
【図９．２】パエニバチルス（Paenibacillus）メタロプロテアーゼと、その他の細菌由来のメタロプロテアーゼ相同体の系統発生樹を示す。