(57)【要約】      （修正有）【課題】培養する細胞の品質を向上させ、煩雑な継代操作を軽減する細胞培養容器、装置、及び分離回収方法の提供。【解決手段】温度応答部位とｐH応答部位を持ち、温度とｐHにより親水性２ｃ、疎水性２ａが変わるｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜２を、支持体１に固定した分離回収膜１０を使った細胞培養容器を用いて細胞培養を行い、分離回収膜１０のｐHと温度とを変化させるｐH・温度変化ステップと、前記ｐH・温度変化ステップにおいて、ｐHと温度が変化させられた分離回収膜１０の表面に膜処理液を供給し、供給した前記膜処理液を前記細胞回収装置により回収して、細胞結合部位２ｂに吸着した細胞２０を回収する細胞回収ステップと、を含む細胞を効率的に分離回収する方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答部位とｐH応答部位を持ち、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜を支持体に被覆した分離回収膜を有する、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記ｐH・温度応答性ポリマは、少なくとも一部に螺旋構造を有する、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記薄膜は、前記ｐH・温度応答性ポリマに結合している親水性部位を有する、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記ｐH・温度応答性ポリマは、ポリアミノ酸を含んでいる、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記親水性部位は、ポリエチレングリコールを含んでいる、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記ｐH・温度応答性ポリマは、細胞結合部位を含んでいる、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んでいる、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞培養容器であって、
前記細胞結合部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項９】
請求項６に記載の細胞培養容器であって、
前記細胞結合部位が細胞接着因子もしくは細胞接着因子の一部である、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１０】
支持体と、前記支持体に固定され、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、
細胞を含む被処理液に、前記細胞容器の前記分離回収膜を含浸させる含浸装置と、
前記分離回収膜を加熱或いは冷却する加熱冷却装置と、
培養液に酸性溶液を送液する送液装置と、
前記分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、
前記加熱冷却装置及び前記送液装置により、前記分離回収膜の温度とｐHを変化させることにより、前記細胞回収装置が前記細胞を回収する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞培養装置であって、
前記ｐH・温度応答性ポリマは、細胞を含む被処理液に接触させたときに前記細胞を吸着可能な細胞結合部位を含み、
前記薄膜は、前記ｐH・温度応答性ポリマに結合している親水性部位を有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞培養装置であって、
前記細胞結合部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１３】
細胞培養装置で培養された細胞の分離回収方法であって、
前記細胞培養装置は、
支持体と、前記支持体に固定され、細胞結合部位を有し、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、細胞を含む被処理液に、前記分離回収膜を含浸させる含浸装置と、前記分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、
前記分離回収膜を、前記含浸装置によって前記細胞を含む被処理液に接触させて、前記細胞を前記細胞結合部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、
前記分離回収膜接触ステップ後において、前記分離回収膜のｐHと温度とを変化させるｐH・温度変化ステップと、
前記ｐH・温度変化ステップにおいて、ｐHと温度が変化させられた前記分離回収膜の表面に膜処理液を供給し、供給した前記膜処理液を前記細胞回収装置により回収して、前記細胞結合部位に吸着した前記細胞を回収する細胞回収ステップと、を含む、
ことを特徴とする分離回収方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の分離回収方法であって、
前記薄膜は、前記ｐH・温度応答性ポリマに結合している親水性部位を有し、
前記細胞結合部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている、
ことを特徴とする分離回収方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の分離回収方法であって、
前記細胞培養装置は、前記分離回収膜を加熱或いは冷却する加熱冷却装置と、培養液に酸性溶液を送液する送液装置と、を更に含み、
前記ｐH・温度変化ステップにおいて、前記前記送液装置と前記加熱冷却装置により、前記分離回収膜のｐHと温度とを変化させる、
ことを特徴とする分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器に係り、特に、付着系細胞等を簡単に回収するための培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、生体組織から細胞を分離し、体外で増殖・維持することであり、生物の基礎研究やバイオ医薬品の製造、再生医療などの用途に使用される。生体から分離し、最初の植え替えを行うまでを初代培養、既存の培養細胞を新たな培養容器へと移し替えて増殖、維持することを継代培養と呼ぶ。培養細胞は、大きく２つの形態に分類することができ、培養容器に付着し増殖する細胞を接着系細胞、或いは付着系細胞と呼び、培地内で浮遊した状態で増殖する培養細胞を浮遊系細胞と呼ぶ。
【０００３】
このような細胞を増殖させるには、細胞を低密度で播種し、細胞分裂により増殖させ、培養液中の栄養成分が枯渇するか、細胞の分泌物の蓄積により細胞の増殖が停止する前に、継代により新しい培養容器に細胞を希釈して播きなおす必要がある。この継代作業では、目的としている生物因子以外の生物因子の混入、すなわち、コンタミネーションのリスクがあり、それを防ぐために無菌操作が行えるクリーンベンチや滅菌された試薬・器具、さらには熟練した作業員による操作が必要とされる。
【０００４】
付着系細胞における継代作業工程にあっては、例えば古い培地を抜き、PBS(−)等の溶液で培養容器に付着した細胞表面を洗い、溶液を捨てる。この操作を数回繰り返し、次に0.25％トリプシンで細胞表面を洗い直ちに抜き、一滴落とし、数分静置し、ディッシュを水平にたたき細胞を剥がす。そして、顕微鏡で剥がれたのを確認した後、血清入り培地を入れ、トリプシンの活性を止めピペッティングをし、細胞をディッシュからはがすと同時に単離細胞にする。新しいディッシュに培地を入れ、細胞を目的の密度となるように培地で希釈し、新しい培養容器に播種する。
【０００５】
このような培養細胞の剥離に関する技術として、例えば、特許文献１、特許文献２などがある。特許文献１には、細胞培養支持体の製造において、刺激応答性高分子を形成し得るモノマーと、モノマーが重合してなるプレポリマと、有機溶媒とを含む塗布用組成物中のモノマーの配合量を基材の種類に応じて選択することにより、細胞接着性、細胞シートや単一細胞の剥離性を最適化することが開示されている。また、特許文献２には、支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに標的細胞を特異的に吸着可能な細胞結合部位と、外表面に露出し、被処理液に接触される親水性部位とを備える細胞の分離回収膜が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１６２７９６号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０３３４５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、培養細胞を新しい培養容器に植え替える（継代）場合、細胞を酵素処理により培養容器底面から剥がし、酵素を遠心処理により取り除く工程は作業者に負担を与えるだけでなく、雑菌混入のリスクが更に高くなるため、色々の検討がなされているが、未だ迅速な細胞の剥離技術は十分に確立されていない。
【０００８】
本発明の目的は、上記の課題を達成し、製造できる細胞の品質を向上させ、且つ煩雑な継代操作を軽減することを可能とする細胞培養容器、装置、及び分離回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するため、本発明においては、温度応答部位とｐH応答部位を持ち、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜を支持体に被覆した分離回収膜を有する細胞培養容器を構成する。
【００１０】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、支持体と、支持体に固定され、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、細胞を含む被処理液に、細胞容器の分離回収膜を含浸させる含浸装置と、分離回収膜を加熱或いは冷却する加熱冷却装置と、培養液に酸性溶液を送液する送液装置と、分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、加熱冷却装置及び送液装置により、分離回収膜の温度とｐHを変化させることにより、細胞回収装置が細胞を速やかに回収することを可能とする細胞培養装置を構成する。
【００１１】
更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞培養装置で培養された細胞の分離回収方法であって、細胞培養装置は、支持体と、支持体に固定され、細胞結合部位を有し、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、細胞を含む被処理液に分離回収膜を含浸させる含浸装置と、分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、分離回収膜を、含浸装置によって細胞を含む被処理液に接触させて、細胞を細胞結合部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、分離回収膜接触ステップ後において、分離回収膜のｐHと温度とを変化させるｐH・温度変化ステップと、ｐH・温度変化ステップにおいて、ｐHと温度が変化させられた分離回収膜の表面に膜処理液を供給し、供給した膜処理液を細胞回収装置により回収して、細胞結合部位に吸着した細胞を回収する標的細胞回収ステップと、を含む分離回収方法を構成する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、迅速な細胞の剥離を行うことが可能となり、培養細胞の品質向上とコンタミネーションのリスク低減、および作業者の負荷低減を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明、実施例１に係る分離回収膜の基本構成を示す図である。
【図２】本発明のｐH・温度応答性ポリマを説明するための図である。
【図３】本発明の細胞培養容器の作用を説明するための図である。
【図４】本発明、実施例１の分離回収膜の作用を説明するための図である。
【図５】実施例１に係る、分離回収膜の変形例を示す図である。
【図６】実施例１に係る、培養シートの上面図である。
【図７】実施例１に係る、培養シートの断面図である。
【図８】実施例２に係る、細胞培養装置の一構成を示すブロック図である。
【図９】MEF細胞をｐH、温度を変えて培養した際の細胞の付着状態を示す図である。
【図１０】温度を変えてiPS細胞を培養した際の細胞の付着状態を示す図である。
【図１１】iPS細胞をｐH、温度を変えて培養した際の細胞の付着状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を実施するための形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。本発明の分離回収膜を用いた細胞培養容器は、特に接着系細胞の培養に有効であるが、接着系培養としては、主に臓器由来実質細胞（代表的な細胞HeLa・Vero）などの上皮細胞様、主に間質系の細胞（代表的な細胞WI38・C３H/10 1/2 clone８）などの線維芽細胞様、その他、神経細胞のように細胞質突起を伸展するものやマクロファージのようにアメーバ様形態を示すものなどがある。なお、接着系細胞以外の細胞としては、浮遊系細胞があり、例えば、主に血液臓器由来で培養容器壁に接着しない細胞（代表的な細胞HL60）などの血球系細胞、その他、腫瘍組織由来の接着能をもたない細胞（代表的な細胞FM3A）がある。
【００１５】
本発明を実施するための形態として、培養した目的細胞を分離するのを容易にするため、その培養表面を温度応答部位とｐH応答部位を併せ持つｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜で覆った細胞培養容器がある。図１に本発明の細胞培養容器、並びにその表面に被覆する分離回収膜の基本構造を示す。本発明に係る分離回収膜１０は、支持体１と、支持体１上に被覆された、ｐH応答部位と温度応答部位、更には細胞結合部位で構成されるｐH・温度応答性ポリマなどを含む薄膜２で構成される。なお、本発明の分離回収膜を細胞培養容器に用いる場合、細胞培養容器自身が支持体１であっても良い。その場合は、図１は、その表面がｐH・温度応答性ポリマなどを含む薄膜２で覆われた細胞培養容器の一部分を示している。
【００１６】
図２の（a）は、本発明に用いるｐH・温度応答性ポリマの合成法を模式的に示した図である。同図に示すうように、ｐH・温度応答性ポリマは、細胞結合部位を含んでいる。温度応答部位の原料は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマであり、ｐH応答部位の原料は所定ｐHより高いｐHで疎水性を示し、該所定ｐHより低いｐHで親水性を示すポリマである。これら温度応答部位と、ｐH応答部位と、目的の細胞と結合するゼラチンなどの接着因子である細胞結合部位を合成することにより、ｐH・温度応答性ポリマ３を得ることができる。
【００１７】
ここで疎水性とは、水に対する親和性が低い、すなわち水に溶解しにくい、あるいは水と混ざりにくい物質または分子またはそれらの一部分の性質のことであり、逆に、親水性とは、水に対する親和性が高い性質のことである。親水性と疎水性の判断として、水に対する溶解度を求めるものや、電離度の指標である酸解離定数を求めるもの、また、分配係数、つまりその物質を水と相分離する有機溶媒（一般にn-オクタノール）に溶解して水と混ぜ合わせ、平衡に達したときの双方での濃度の比（有機溶媒中の濃度÷水中の濃度）を求めるものがある。その他、ポリマを材料表面にコーティングし、その上から水滴を落として、その接触角を測ることで疎水性か親水性を定量的に測ることができる。
【００１８】
本発明に係る分離回収膜では、温度およびｐHにより構造変化を起こせばよいので、上記の何れかの測定方法により、測定値が測定誤差以上に変化すればよい。本発明に係る分離回収膜では、温度応答部位に加え、ｐH応答部位を合わせ持つ構造を有するため、短時間で構造変化が起こり、細胞を迅速に剥離することを可能とする。
【００１９】
ｐH・温度応答性ポリマの温度応答部位としては、ポリプロピレングリコール，ε−ポリリジン吉草酸アミド、ε−ポリリジン酪酸アミド、Ｎ−ヒドロキシペンチルε−ポリリジン、Ｎ−ヒドロキシブチルε−ポリリジン、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、ポリメタクリル酸エステルが挙げられる。また、ｐH・温度応答性ポリマのｐH応答部位としては、アミン、イミン、ホスファゼン、グアニジン、含窒素ヘテロ芳香族化合物、カルボン酸、フェノール性ヒドロキシル基、ホウ酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸が挙げられる。図２の（ｂ）に、ｐH応答部位と温度応答部位を併せ持つ材料の一例を模式的に示した。
【００２０】
続いて、図３を用いて、本発明に係る分離回収膜２を備えた細胞培養容器の作用を、iPS細胞培養を例として説明する。図３の(a)の左側に示すように、細胞培養容器などの支持体１上にｐH・温度応答性ポリマ３を含む薄膜２が形成され、その細胞結合部位にフィーダー細胞４、iPS細胞５が結合している。細胞の細胞膜には、様々な種類の膜タンパクが発現している。この膜タンパクを介して細胞は細胞培養容器の培養面に接着することができる。細胞を増殖させる条件（例えば37℃）では膜タンパクと薄膜２の細胞結合部位が結合することで、細胞は支持体１である不織布などの細胞培養容器面上に結合し、その上で増殖できる。
【００２１】
継代などで細胞を培養面から剥離する際は、培養温度を下げることで、図３の(a)の右側に示すように、細胞の膜タンパクとｐH・温度応答性ポリマ３を含む薄膜２の細胞結合部位の結合は解消され、iPS細胞５、フィーダー細胞４が培養液中に浮遊する。なお、図３の(a)では、ｐH応答部位と温度応答部位、細胞結合部位が全て結合したｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜２の構造を示しているが、図３の(b)に示すように、ｐH応答部位並びに温度応答部位からなるｐH・温度応答性ポリマと、細胞結合部位が独立している構成のｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜６であっても同様な効果を得ることができる。
【００２２】
以上説明したように、本発明の分離回収膜を用いた培養容器では、その表面に温度応答部位に加え、ｐH応答部位を合わせ持つ構造とすることにより、短時間で構造変化が起こり、培養した細胞を迅速に剥離できる。続いて、本発明における細胞培養容器の分離回収膜の構成要素である支持体と、ｐH・温度応答性ポリマなどの疎水性高分子部位等を含む薄膜の各要素について説明する。
【００２３】
＜支持体＞
分離回収膜に備えられる支持体１は、ｐH・温度応答性ポリマ３などの疎水性高分子部位等を固定するものである。このような支持体１はどのようなものであってもよいが、特に、ｐH・温度応答性ポリマ３などの疎水性高分子部位等を化学的に固定できるものであることが好ましい。具体的には、支持体は、不繊布、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んで構成されていることが好ましい。このような材料を用いることで、ｐH・温度応答性ポリマなどのｐH・温度応答性高分子部位等を固定するための表面処理が特に容易であり、また、表面処理のために加圧したときの耐久性に優れるという利点がある。
【００２４】
高分子材料としては、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、表面修飾アガロースゲル等が挙げられる。ただし、支持体１は、ｐH・温度応答性高分子部位等を固定可能であればこれらの材料により構成されている必要は無く、例えば金属の単体、金属酸化物等の金属材料を用いることができる。支持体表面の形状は、ｐH・温度応答性高分子部位等を固定可能であればどのようになっていてもよいが、例えば平坦形状にすることができ、他にも、支持体表面の形状は、ピラー構造や球状構造、多孔形状等とすることもできる。
【００２５】
＜薄膜＞
薄膜２は、ｐH・温度応答性高分子部位からなる疎水性高分子部位と細胞結合部位、更に好適には親水性部位からなり、上述した支持体１に固定される。この薄膜は、ｐH・温度応答性細胞吸脱着ポリマと呼ぶことができる。
【００２６】
（疎水性高分子部位）
疎水性高分子部位は、上述したｐH・温度応答性ポリマからなる。支持体１に固定される疎水性高分子部位は、上述の通りｐH並びに温度により構造が変化するものである。このような構造変化により、疎水性高分子部位に結合された細胞結合部位を後記する親水性部位の中に埋没させることができ、分離回収膜から標的細胞を脱離させ易くなる。疎水性高分子部位の具体的な構造は、先にその一例を示した通りであり、ｐHと温度により構造が変化すれば、特に制限されない。ただし、疎水性高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることが好ましい。このような構造を有する疎水性高分子部位とすることにより、ｐH並びに温度によって当該螺旋構造を掌る水素結合を切断させることができ、構造変化を生じ易くすることができる。
【００２７】
また、疎水性高分子部位は、どのような方法で支持体１に固定されていてもよい。例えば、化学的な結合（共有結合等）や物理的な吸着（抗原抗体反応を用いた吸着等）等の方法が挙げられる。
【００２８】
疎水性高分子部位の好適な具体例としては、ポリアミノ酸を含むものである。ポリアミノ酸はアミノ酸が二つ以上重合してなるものである。このとき、アミノ酸は、通常は直鎖状に重合することになる。ポリアミノ酸は、分子内で水素結合が生じることにより、螺旋構造を有している。従って、ポリアミノ酸を用いることにより、前記の構造変化を生じさせ易くなるという利点がある。また、ポリアミノ酸は通常直鎖状であるため、高分子部位の配向を制御し易くなる。そのため、支持体上での所望の位置への疎水性部位の固定が容易になる。さらには、後記する細胞結合部位を高分子部位に結合させ易くなるという利点もある。
【００２９】
ポリアミノ酸は、一種のみのアミノ酸により構成されてもよく（単独重合）、二種以上のアミノ酸が任意の比率及び組み合わせにより構成されてもよい（共重合）。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、特に制限されないが、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、グルタミン、システイン、アラニン、ロイシン等が挙げられる。なお、ポリアミノ酸の数平均分子量は特に制限されないが、通常は５ｋＤ ａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上、より好ましくは５０ｋＤａ以上である。この範囲とすることで、ポリアミノ酸を支持体により固定し易くなる。
【００３０】
（細胞結合部位） 
細胞結合部位は、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに標的細胞に吸着可能なものである。従って、細胞結合部位は、分離回収の対象となる標的細胞に応じて適宜決定して用いればよい。例えば、ゼラチンはフィーダー細胞を培養容器に固定するための細胞結合物質として一般に使われている。
【００３１】
また、細胞結合部位は、好適には疎水性高分子部位に結合している。細胞結合部位と疎水性高分子部位とは直接結合していてもよいが、リンカーを介して結合していることが好ましい。リンカーを介して細胞結合部位を疎水性高分子部位に結合させることにより、より確実に、細胞結合部位が分離回収膜表面から外側に向かって突出した形態、即ち外表面に露出した形とすることができる。これにより、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜を接触させたときに、細胞結合部位を標的細胞にいっそう特異的に吸着させ易くすることができる。
【００３２】
リンカーとしては、ビオチン−アビジンであることが好ましい。ビオチン−アビジンを用いることにより、細胞結合部位と疎水性高分子部位とをより容易に結合することができる。具体的には、細胞結合部位をビオチン化するとともに高分子部位をビオチン化することで、アビジンを介して、細胞結合部位と高分子とを容易に結合することができる。
【００３３】
疎水性高分子部位における細胞結合部位の具体的な結合位置は特に制限されない。ただし、詳細は後記するが、細胞結合部位をより確実に分離回収膜の外表面に露出させる観点から、高分子部位を構成する高分子の末端に結合されることが好ましい。具体的には、例えば、高分子部位を構成する高分子が直鎖状である場合には直鎖の末端であり、高分子が網目状である場合には網目の末端となる。これらの位置に細胞結合部位を結合させることで、細胞結合部位をより確実に分離回収膜の外表面に露出させることができる。
【００３４】
前記のように、細胞結合部位は、分離回収膜の外表面に露出している。そのため、被処理液を分離回収膜に接触させたときに、細胞結合部位に対して特異的に標的細胞を結合させて、回収することができる。細胞結合部位を外表面に露出させる方法は特に制限されず、例えば、前記のように、前記のリンカーを介して細胞結合部位を疎水性高分子部位に吸着させることで、細胞結合部位を外表面に露出させることができる。また、細胞結合部位以外の部分の位置（高さ）が、細胞結合部位の部分の位置（高さ）よりも相対的に低くすることで、リンカーを介さなくても、外表面に露出させることができる。なお、外表面に露出させるためのこれらの方法は一例であり、細胞結合部位が分離回収膜の外表面に露出していれば、どのような方法を用いてもよく、どのような形態になっていてもよい。
【００３５】
これらの説明のように、細胞結合部位が外表面に露出しつつ、細胞結合部位を高分子部位に結合させることで、分離回収膜表面の非特異的な吸着部分を低減することができる。即ち、細胞結合部位が、高分子部位を覆うように配置されることになるので、高分子部位に由来する非特異的な吸着部分の面積を減少させることができるようになる。
【００３６】
一般に 細胞は疎水性の部分に非特異的な吸着を生じやすいため、分離回収膜表面に疎水性の部分が存在すると、当該疎水性の部分に標的細胞以外の細胞が非特異的に吸着し易い。しかし、本実施形態においては、細胞結合部位が外表面に露出しつつ、高分子部位に結合させているため、細胞結合部位により標的細胞を特異的に吸着させることができる。しかも、前記のように、疎水性の部分の面積が低減されているため、標的細胞以外の細胞の分離回収膜への非特異的な吸着を抑制することもできる。
【００３７】
（親水性部位） 
親水性部位は、分離回収膜の外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触（例えば含浸）させたときに、前記被処理液が接触する部位である。疎水性高分子部位及び細胞結合部位以外の部位に、外表面に露出するように親水性部位が設けられることで、疎水性である細胞の非特異的な吸着をよりいっそう抑制することができる。
【００３８】
このような親水性部位としては、例えば親水性官能基、具体的には、ヒドロキシル基やカルボキシル基等を有しているものが挙げられる。親水性部位のより具体的な例としては、エチレングリコールやその重合体（ポリエチレングリコール）、リン脂質構造を有する分子、リン酸やその重合体（ポリリン酸）等が挙げられる。中でも、良好な親水性、及び疎水性高分子部位への結合のし易さ等の観点から、親水性部位は、エチレングリコールが２つ以上重合したポリエチレングリコールを含むことが好ましい。
【００３９】
また、親水性部位は、前記の疎水性高分子部位と独立して設けられていてもよいが、疎水性部位の構造変化をいっそう促す観点から、親水性部位は、疎水性高分子部位に結合していることが好ましい。即ち、親水性部位は、前記の疎水性高分子部位と一体になっていることが好ましい。親水性部位が疎水性高分子部位に結合していることで、温度変化及びｐH変化に伴う疎水性高分子部位の構造変化をいっそう促すことができる。ただし、分離回収膜に備えられる全ての親水性部位が疎水性高分子部位に結合している必要は無く、適宜アルキル基等を結合することで、疎水性高分子部位の温度応答性を制御することができる。
【００４０】
親水性部位の疎水性高分子部位への結合位置は特に制限されない。ただし、疎水性高分子部位が直鎖状である場合には、疎水性高分子部位の側鎖に親水性部位が結合していることが好ましい。これにより、分離回収膜において、疎水性高分子部位以外の部位に、親水性部位を容易に配置することができる。そのため、分離回収膜の外表面に、より確実に親水性部位を露出させることができる。
【００４１】
前記のように、疎水性高分子部位としてはポリアミノ酸が好ましく、親水性部位としてはポリエチレングリコールを含むことが好ましい。また、親水性部位は、疎水性高分子部位に結合していることが好ましい。これらを満たす疎水性高分子及び親水性部位として好適な材料としては、例えば、以下の式（１）で表される化合物である。
【００４２】
【化１】
2018153097.tif 000003
【００４３】
式（１）中、ｎ及びｘは、それぞれ独立した、２以上の整数である。
【実施例１】
【００４４】
次に、実施例１として分離回収膜、及び細胞培養容器の実施例の構成、作用を説明する。すなわち、本実施例は、温度応答部位とｐH応答部位を持ち、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜を支持体に被覆した分離回収膜、並びにそれを用いた細胞培養容器の実施例である。
【００４５】
図１は、実施例１の分離回収膜の斜視図である。分離回収膜１０は、マクロの視点で観察すると、支持体１の表面にｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜２が形成されている。上述した通り、細胞培養容器自身が支持体１であって良い。薄膜２には、先の原理で説明したｐH・温度応答性高分子部位からなる疎水性高分子部位や細胞結合部位、及び親水性部位が含まれている。
【００４６】
図４は、実施例１の分離回収膜１０の作用を説明するための図であり、同図の（ａ）は加熱前で、且つ高ｐHの状態、同図の（ｂ）は加熱後で低ｐHの状態の分離回収膜１０を示す図である。本実施例では、分離回収膜１０を加熱及び低ｐHとすることで、疎水性高分子部位の構造が変化、破壊されるようになっている。図４の（ａ）に示すように、本実施形態においては、薄膜２には、温度とｐHで構造が変化する螺旋状の疎水性高分子部位２ａと、疎水性高分子部位２ａに結合した細胞結合部位２ｂと、疎水性高分子部位２ａに結合した親水性部位２ｃとが含まれている。同図に示した３つの疎水性高分子部位２ａ各々には、それぞれ、細胞結合部位２ｂが結合されている。また、支持体１の表面において、疎水性高分子部位２ａと親水性部位２ｃとが交互に配置されている。即ち、支持体１の表面は、細胞結合部位２ｂで覆われた疎水性高分子部位２ａの部分以外は、親水性部位２ｃにより覆われていることになる。そして、細胞結合部位２ｂの位置が、支持体１に対して、親水性部位２ｃの位置よりも相対的に高い位置になっている。
【００４７】
そして、本実施例の分離回収膜１０においては、同図の（ａ）に示すように、細胞結合部位２ｂに標的細胞２０が吸着した後、分離回収膜１０を加熱及び低ｐHとすることにより疎水性高分子部位２ａの構造が変化し、同図の（ｂ）に示すように、細胞結合部位２ｂに吸着した標的細胞２０が脱離するようになっている。なお、図示の例では、便宜上、一つの細胞結合部位２ｂに一つの標的細胞２０を吸着させているが、二つ以上の標的細胞部位２ｂに一つの標的細胞２０が吸着されるようにしてもよい。
【００４８】
本実施例の構成において、 図４の（ａ）の状態から（ｂ）の状態に変化するときの作用について説明する。高ｐHで加熱前の疎水性高分子部位２ａにおいては、螺旋構造が維持されている。また、細胞結合部位２ｂには、標的細胞２０が吸着している。そして、この状態で分離回収膜１０を加熱且つ低ｐHにすると、熱エネルギにより疎水性高分子部位２ａの螺旋構造が破壊されランダム構造に変化し、外表面に露出していた細胞結合部位２ｂが、親水性部位２ｃの中に埋没する。これにより、細胞結合部位２ｂと標的細胞２０の吸着が、同図の（ｂ）に示すように、ランダム構造に変化した疎水性高分子部位２ａの立体障害により、遮断されることになる。さらに、細胞結合部位２ｂが親水性部位２ｃの中に埋没すると、親水性部位２ｃで覆われた支持体１上に、標的細胞２０が載置されている状態になる。そうすると、疎水性である標的細胞２０は、親水性部位２ｃから容易に回収可能な状態になる。
【００４９】
図４の（ａ）の状態から（ｂ）の状態に変化する温度としては、例えば疎水性高分子部位２ａの構造により制御が可能である。例えば、疎水性高分子部位２ａが長い螺旋構造を有している場合、水素結合の数も多くなるため、それらを切断して構造を変化させるために必要な熱エネルギも大きくなる。そのため、構造変化をさせるための温度も高くなる傾向となる。一方で、含まれる螺旋構造が短い場合には、水素結合の数も少ない。そのため、構造変化をさせるための温度は低くなる傾向となる。さらには、疎水性高分子部位２ａに親水性部位２ｃが結合している場合には、親水性部位２ｃの構造によっても制御が可能である。
【００５０】
なお、上記のｐH・温度応答性ポリマを用いた分離回収膜の実施例１の説明では、所定の温度以上、且つｐH以下で螺旋構造がランダム構造に変化する構造したが、所定の温度以下または所定のｐH以上ではランダム構造であるが、所定の温度以上では螺旋構造になるようにしてもよい。この場合には冷却且つ高ｐH、もしくは冷却且つ低ｐHにより構造変化が生じ、標的細胞２０が回収可能な状態になる。また、所定の温度以上且つｐH以上で螺旋構造がランダム構造に変化する構造になるようにしてもよい。
【００５１】
なお、本実施例の分離回収膜は、図示の内容や前記の説明の内容に限定されるものではない。例えば、図５の（ａ）に示すように、全ての疎水性高分子部位２ａに細胞結合部位２ｂが結合している必要はなく、一部の疎水性高分子部位２ａにのみ細胞結合部位２ｂを結合される分離回収膜１０Ａとしてもよい。このようにすることで、被処理液に含まれる標的細胞の数が少ないときでも、効率よく標的細胞を回収することができる。
【００５２】
また、図５の（ｂ）に示すように、疎水性高分子部位２ａに結合している親水性部位２ｃに加えて、隣接する親水性部位２ｃ間であって支持体１が露出している部位に、別の親水性部位２ｄを設けた分離回収膜１０Ｂとしてもよい。このようにすることで、非特異的な吸着をより確実に防止することができる。
【００５３】
＜分離回収膜の製造方法＞ 
次に、本実施例の分離回収膜の製造方法について説明する。以下に説明する製造方法は、下限臨界溶液温度（LCST）型抗体を１種類用いる場合を記載しているが、LCST型抗体が複数種類を分離回収膜上に固定する場合も同様にして行なうことができる。本実施例の分離回収膜の製造方法は特に制限されないものの、例えば以下の方法により製造することができる。なお、以下の説明では、分離回収膜の製造方法の一例として、ｐH・温度応答性高分子部位からなる疎水性高分子部位に更に親水性部位が結合した分離回収膜を製造する場合を挙げて、図４の（ａ）を参照しながら説明する。
【００５４】
まず、親水性部位２ｃを結合させた疎水性高分子部位２ａを任意の方法で調製し、例えば、スピンコート、ディップ法、気相蒸着法等により、支持体１の表面に固定する。固定の方法としては、可逆反応により疎水性高分子部位２ａそのものが脱離しない化学結合が好ましい。具体的には例えば、アミド結合、エステル結合、シラノール結合、マレイミド、チオエステル結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応による化学結合、クリック反応による化学結合、あるいは、用途によっては金−チオール結合、イミン結合等が挙げられる。
【００５５】
ここで、疎水性高分子部位２ａの固定に際して、親水性部位２ｃは支持体１に固定されてもよく、固定されなくてもよい。ただし、疎水性高分子部位２ａを支持体１に固定すれば、側鎖に結合した親水性部位２ｃは、固定せずとも支持体１の表面に十分に配置することができる。その後、固定されなかった疎水性高分子部位２ａは、良溶媒により除去される。
【００５６】
次いで、固定した疎水性高分子部位２ａの末端に、化学結合により、細胞結合部位２ｂが結合される。このとき、細胞結合部位２ｂは、必ずしも疎水性高分子部位２ａの末端に結合している必要は無い。従って、細胞結合部位２ｂが、細胞分離膜１０の外表面に露出していれば、疎水性高分子部位２ａ のどの部分に結合していてもよい。このようにすることで、親水性部位２ｃを表面に露出させた、分離回収膜を製造することができる。
【００５７】
なお、疎水性高分子部位２ａの支持体１への結合は、疎水性高分子部位２ ａを必要に応じて溶媒に分散させ、例えばスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の各種方法により、支持体１の表面に塗布してもよい。このような方法によっても、支持体１に疎水性高分子部位２ａを配置することができる。
【００５８】
＜分離回収膜の用途＞ 
次に、本実施例の分離回収膜の具体的な用途について、図面を参照しながら説明する。本実施例の分離回収膜は、培養容器の他、種々の用途に適用可能であるが、例えば、細胞の培養シート等のバイオデバイスや、細胞の培養装置等に好適である。以下、本実施例の分離回収膜の好適な用途として、これら二つを例に挙げて説明する。
【００５９】
図６は、本実施例の分離回収膜を用いて構成される培養シート５０の上面図である。本実施例の細胞の培養シート５０は、分離回収膜１０と同様の構成を有するものである。細胞培養シート５０は、厚さ０．５μｍのポリスチレンを主成分とする支持体１と、この薄膜に立設され、ポリスチレンを主成分とする複数の柱状微細突起２Ａとを備えている。突起２Ａは円柱状であり、その直径は５００ｎｍ、高さは１μｍである。それぞれの突起２Ａは１μｍの周期（ピッチ）で配列している。また、本実施例の培養シート５０においては、はじめに円柱状に突起２Ａが形成されたあと十字形状に突起２Ａが除去され、十字形状の隙間５１が形成されている。
【００６０】
突起２Ａは、以下の方法により形成可能である。即ち、まず、ポリスチレンからなる、前記の形状を有する土台部分の突起が、インプリント方法により、支持体１上に形成される。そして、この土台表面が、紫外光／オゾン発生装置を用いて表面酸化処理される。最後に、この表面酸化処理された土台に対して、疎水性高分子部材等を図４の（ａ）などに示したように結合させることにより、標的細胞を吸着可能な突起２Ａを備える培養シート５０が得られる。培養シート５０は、培養液が入れられたガラスシャーレ等の容器内で培養液に含浸され、培養シート５０上で標的細胞２０の培養が行われる。
【００６１】
図７を参照しながら、培養シート５０の使用方法、すなわち、具体的な細胞の培養方法について説明する。図７は、本実施例の培養シート５０の断面図である。細胞２０は、各突起２Ａ表面の細胞結合部位に吸着、固定される。なお、図示の例では、複数の突起２Ａ表面の細胞結合部位に対して、一つの細胞２０が吸着している様子を示している。そして、このように細胞２０が吸着した状態で培地や栄養素等の培養液を供給することで、細胞２０ が培養される。なお、培養可能な細胞２０としては特に制限されるものではないが、例えば、皮膚、骨、血液等の細胞（組織）である。
【００６２】
図７に示すように、支持体１と細胞２０とは隙間５１により離間した状態になっている。そのため、細胞２０を培養するための培養液や酸素が、細胞２０の上側と下側との双方から供給される。これにより、細胞２０は効率よく培養可能である。また、細胞２０の培養に伴って排出される老廃物である、例えば二酸化炭素が、細胞２０の上側と下側とから効率よく排出される。
【００６３】
このような培養シート５０を使用することにより、細胞２０は、突起２Ａ の上面によってのみ支持されることになる。そのため、従来、ガラスシャーレの底面において培養されていた細胞２０の接触面積を低減することができる。従って、細胞２０を剥離する際の細胞２０への細胞の損傷を大幅に軽減することができる。これにより、細胞２０を移植する際の移植部位への定着率を高めることができる。また、図７に示すように、突起２Ａにより形成される、細胞２０下方の隙間を通して、細胞２０全体に培養液が流れやすくなる。その結果、細胞２０ への栄養素の供給や細胞２０の老廃物の排出を効率よく行うことができ、従来生じていた培養中の細胞２０の死滅を抑制することができる。
【００６４】
なお、突起２Ａは、高分子材料にプラズマ処理等により親水化処理が施されたものであってもよい。また、高分子材料は、培養する細胞（組織）に対して影響の少ない材料を選択することが好ましく、具体的にはポリスチレンを用いているが、これに限られるものではない。例えば、高分子材料としては、ポリメタクリル酸メチル、ポリ乳酸等も好ましい。
【００６５】
さらに、バイオデバイスとしては、前記のものの他にも、例えば医療・診断ツールとして特にμＴＡＳと総称されるものが挙げられる。具体的には、表面に微細加工を施したものや、医療・化学分野向けの検出・合成等の手段に用いられるものも挙げられる。
【実施例２】
【００６６】
続いて、実施例２として、実施例１の分離回収膜を利用する細胞培養装置、及び細胞の分離回収方法の実施例を説明する。この細胞培養装置により、被処理液に含まれる標的細胞の分離回収が行われる。すなわち、本実施例は、支持体と、支持体に固定され、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、細胞を含む被処理液に、細胞容器の分離回収膜を含浸させる含浸装置と、分離回収膜を加熱或いは冷却する加熱冷却装置と、培養液に酸性溶液を送液する送液装置と、分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、加熱冷却装置及び送液装置により、分離回収膜の温度とｐHを変化させることにより、細胞回収装置が細胞を速やかに回収することを可能とする細胞培養装置の実施例である。
【００６７】
また、本実施例は、細胞培養装置で培養された細胞の分離回収方法であって、細胞培養装置は、支持体と、支持体に固定され、細胞結合部位を有し、温度とｐHにより親水性、疎水性が変化するｐH・温度応答性ポリマを含む薄膜と、からなる分離回収膜を備えた細胞培養容器と、細胞を含む被処理液に分離回収膜を含浸させる含浸装置と、分離回収膜に吸着した細胞を回収する細胞回収装置と、を備え、分離回収膜を含浸装置によって細胞を含む被処理液に接触させて、細胞を細胞結合部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、分離回収膜接触ステップ後において、分離回収膜のｐHと温度とを変化させるｐH・温度変化ステップと、ｐH・温度変化ステップにおいて、ｐHと温度が変化させられた分離回収膜の表面に膜処理液を供給し、供給した膜処理液を細胞回収装置により回収して、細胞結合部位に吸着した細胞を回収する細胞回収ステップと、を含む分離回収方法の実施例である。以下、本実施例の細胞培養装置の具体的な装置構成と、細胞培養装置を用いた細胞の分離回収方法について説明する。
【００６８】
図８は、上述した分離回収膜を用いて構成される細胞培養装置の一構成例のブロック図である。細胞培養装置１００は、前記の分離回収膜１０を備える培養容器１０２ａと、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜１０を含浸、接触させる含浸装置１０２ｂと、分離回収膜１０を加熱或いは冷却する加熱冷却装置１０４と、分離回収膜１０に吸着した標的細胞を回収する細胞回収装置１０５と、酸性溶液を送液する送液装置１０６を備えるものである。
【００６９】
また、培養装置１００は、これらのほかにも、分離回収膜に非特異的に吸着した細胞を洗浄する洗浄液１００ｂと、標的細胞を培養するための培地試薬１００ｃと、培地試薬１００ａを保管する保冷庫１００ａと、洗浄液１００ｂや培地試薬１００ｃを恒温室１０２に供給する送液システム１０１とを備えている。さらに、培養装置１００には恒温室１０２が備えられ、恒温室１０２内の培養容器１０２ａ内の標的細胞を含む培養液に、分離回収膜１０ が含浸されるようになっている。また、培養容器１０２ａ内の雰囲気は、ガス交換装置１０３により、制御されるようになっている。
【００７０】
以上の構成の細胞培養装置１００を用いた、細胞の分離回収方法について説明する。なお、以下の説明においては、細胞を分離回収膜に吸着させて培養した後に回収しているが、培養せず、吸着後にすぐに回収するようにしてもよい。
【００７１】
まず、培養容器１０２ａに、標的細胞を含む被処理液が供給される。その後、含浸装置１０２ｂは、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜１０を含浸、接触させて、被処理液中の標的細胞を分離回収膜に吸着させる分離回収膜接触ステップを実行する。その後、分離回収膜１０は洗浄液１００ｂにより洗浄されることで非特異的に吸着した細胞を洗い流し、特異的に吸着した標的細胞が培養される。このようにすることで、恒温室１０２内で標的細胞を効率よく培養することができる。
【００７２】
次いで、含浸装置１０２ｂは、含浸させた分離回収膜１０を被処理液から取り出し、酸性溶液を送液する送液装置１０６により炭酸溶液を培養液に添加して、分離回収膜１０が接触する培養液のｐHを所定のｐHまで低下させた後、加熱冷却装置１０４により、分離回収膜１０が冷却される加熱冷却ステップを実行する。これにより、分離回収膜１０の疎水性高分子部位２ａ の構造が変化し、培養面に吸着した標的細胞、すなわち、培養された標的細胞が容易に剥離可能となる。そして、細胞回収装置１０５は、この状態の分離回収膜１０の表面に対して細胞回収液１０５ａを供給する。これにより、分離回収膜１０の表面から、培養された標的細胞が剥離される。剥離された標的細胞は、細胞回収装置１０５により回収される。
【００７３】
以上詳述した実施例２の分離回収膜を利用した培養装置の方法によれば、従来、通常の培地や従来の培養シートを使用するときに生じてきた剥離による細胞への損傷や、回収時に化学薬品の使用を抑えることが可能となる。これにより、標的細胞の回収率の低下を抑制することができる。
【００７４】
なお、前記の例では、冷却により標的細胞が剥離するようにしたが、ｐH・温度応答性ポリマなどの疎水性高分子部位２ａ 等の構造を変化させることで、加熱により標的細胞が脱離するようにしてもよい。この場合、加熱冷却装置１０４による冷却に代えて、分離回収膜１ ０を加熱するよう制御すればよい。同様に、前記の例では、ｐHを低いｐHに変えることにより標的細胞が剥離するようにしたが、疎水性高分子部位２ａ 等の構造を変化させ、酸性溶液を送液する装置１０６をアルカリ性溶液に変えることにより、高いｐHにより標的細胞が脱離するようにしてもよい。
【００７５】
なお、先に説明した通り、本実施例の説明においては、LCST型抗体を１種類用いる場合を説明したが、相転移の異なるLCST型抗体が複数ある場合は、上記の工程を培養温度を変えて行なえばよい。
【００７６】
次に、以上説明した各実施例における分離回収膜を作成、細胞剥離の評価について具体例を挙げて説明する。
【００７７】
＜ＰＥＧ修飾ポリリジンの調製＞
まず、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びカルボン酸末端のポリエチレングリコールを純水に溶解させ、この溶液を４℃に冷却、撹拌しながら、ポリリジン（種々の分子量が混在）を加えた。そして、常温で２時間撹拌し、ポリリジン（疎水性高分子部位）の側鎖にポリエチレングリコール（親水性部位）が結合したＰＥＧ修飾ポリリジンを得た。
【００７８】
＜支持体に対するポリリジンの固定化）＞
得られたポリリジンを、それぞれ、表面にアミノ基処理を施した樹脂プレート（ポリスチレン製の支持体）上に以下の手順に従って共有結合させた。１ ｍｏｌ％のポリリジン水溶液に、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加え、各プレートを浸漬した。その後、室温で２時間反応させた。これにより、ポリリジンを結合させた支持体を得た。その後、純水で各プレートを３回洗浄した。
【００７９】
＜ポリリジンに対するゼラチンの結合＞ 
得られたポリリジンを結合させた３種のプレートを、炭酸緩衝液で希釈した２％グルタルアルデヒドに浸漬し、３７℃で２時間静置した。反応後の各プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そして、濃度０．１ｗｔ％のゼラチン溶液(ｐH７．４のＰＢＳ緩衝液を使用)を調整し、このゼラチン溶液に各プレートを浸漬し、のようにして、ゼラチンをポリリジンに結合させた。
【００８０】
＜MEF細胞の剥離試験１＞
ｐH-温度応答性ポリマを被覆した培養容器にマウス胎仔線維芽細胞の初代培養細胞（MEF細胞）を播種した。MEF細胞の準備は以下の手順で行った。
【００８１】
バイアル中に凍結されているMEF細胞を液体窒素タンクから取り出し、37℃のウォーターバス中で90秒間加温後、半解の状態でウォーターバスから取り出して安全キャビネット内に移動させ、バイアル内の細胞全量を遠心管にデカントで移し、37℃に加温したMEF 培地（DMEM培地にウシ血清を最終濃度10％となるように添加）を添加後、170 × g で5 分間（室温）遠心した。安全キャビネット内で細胞ペレットを吸引しないように培地上清をアスピレーターで取り除き、1 mL のMEF 培地を遠心管に加えて数回ピペ
ッティングし、ペレットを崩し、9ml の培地を足して10mlとした。細胞数をカウントし、５×10^3 cells/cm2でMEF細胞を本発明の培養容器に播種した。播種した培養容器は37℃、5%CO2 インキュベーターに入れ、３日間培養の後、温度・ｐH条件を変えて、細胞の剥離試験を行った。
【００８２】
図９に温度・ｐH条件を変えたときのMEF細胞の付着状況を示す。対照実験として、細胞接着因子であるゼラチンを被覆した培養容器でMEF細胞を培養した結果も示してある。ｐH7.2、37℃では、ｐH-温度応答性ポリマ被覆とゼラチン被覆ともにMEF細胞は培養容器に付着し、培養細胞に影響はなかった。ｐH7.2のままで、培養容器を４℃に下げたところ、ｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器の細胞は３時間経ってようやく剥離した。コラーゲン被覆培養容器の細胞は、MEF細胞の付着に変化はなかった。培養液に炭酸を添加し、ｐHを6.5に、更に培養容器の温度を４℃に下げた場合、ｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器の細胞は５分以内に剥離した。コラーゲン被覆培養容器の細胞は、MEF細胞の付着に変化はなかった。このようにｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器では、温度を下げることで、細胞を剥離することができ、更にｐHを細胞培養に影響のない範囲であるｐH(上記ではｐH6.5)にすることで、迅速に細胞の剥離を行えることを確認した。
【００８３】
＜iPS細胞コロニーの剥離試験＞
iPS細胞の培養は以下の手順で行った。まずiPS細胞を培養するにあたり、試薬の調製を行った。各試薬の組成は以下の通りである。
・PBS(-)溶液：80g NaCl、2g KCl、29g  Na2HPO4・12H2O、2g KH2PO4
・遠心分離用培地：400mL KO-DMEM/F12培地、0.925mL 2-メルカプトエタノール、4ｍL NEAA、4ｍL L-グルタミン(200mM)、5mL PSA、100mL KSR
・培養用培地：上記遠心分離用培地にFGF-2 を添加
iPS細胞はフィーダー細胞上で培養するため、実施例１で播種したMEF細胞にiPS細胞を播種した。播種方法は次の通りである。通常の培養方法（コラーゲン被覆培養容器）で培養したiPS細胞の培地を吸引除去し、2mL 0.1%(w/v) ディスパーゼ溶液を加えて、37℃で3 - 10 min 反応させた。ディスパーゼ溶液を吸引除去し、iPS(-)培地を5 mL加え、セルスクレーパーで剥がした。この細胞懸濁液を遠心用の15 mLチューブに移し、新たに5 mLのiPS(-)培地を加え、遠心分離（300 rpm, 2 min, 室温）で細胞を沈降させ、上清液を取り除き、iPS(-)培地を添加し、軽く細胞を懸濁した。一方、前日にｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器にMEF細胞を播種し、37℃、5%CO2 インキュベータで培養されているMEF細胞をインキュベータから取り出し、先ほどのiPS細胞の懸濁液を本発明のｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器に細胞を播種し、37℃、5%CO2 インキュベータで５日間培養を行い、その後、温度・ｐH条件を変えて、iPS細胞の剥離試験を行った。
【００８４】
図１０、図１１に温度・ｐH条件を変えたときのiPS細胞コロニーの付着状況を示す写真を図示した。対照実験として、細胞接着因子であるゼラチンを被覆した培養容器でiPS細胞を培養した結果も示してある。ｐH7.2、37℃では、ｐH-温度応答性ポリマ被覆とゼラチン被覆ともにiPS細胞は培養容器に付着し、培養細胞に影響はなかった。ｐH7.2のままで、培養容器を４℃に下げたところ、ｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器の細胞はMEF細胞の際と同様に３時間経ってようやく剥離した。図１０に示すように、コラーゲン被覆培養容器の細胞は、iPS細胞の付着に変化はなかった。培養液に炭酸を添加し、ｐHを6.5に、更に培養容器の温度を４℃に下げた場合、図１１に示すように、ｐH-温度応答性ポリマ被覆培養容器のiPS細胞は５分以内に剥離した。コラーゲン被覆培養容器の細胞は、iPS細胞の付着に変化はなかった。このようにｐH・温度応答性ポリマ被覆培養容器では、温度を下げることで、細胞を剥離することができ、更にｐHを細胞培養に影響のない範囲であるｐH(上記ではｐH6.5)にすることで、迅速に細胞の剥離を行えることを確認した。
【００８５】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８６】
１  支持体
２、６  薄膜
２ａ  疎水性高分子部位
２ｂ  細胞結合部位
２ｃ  親水性部位
３  ｐH・温度応答性ポリマ
４  フィーダー細胞
５  iPS細胞
１０  分離回収膜
５０  培養シート
５１  隙間
１００  細胞培養装置
１００a  保冷庫
１００b  洗浄液
１００c  培地試薬
１０１  送液システム
１０２  恒温室
１０２a  培養容器
１０２b  含浸装置
１０３  ガス交換装置
１０４  加熱冷却装置
１０５  細胞回収装置
１０５ａ  細胞回収液
１０６  送液装置
【図１】
2018153097.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018153097.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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