(57)【要約】【課題】熱サイクルの高速化を図ることできる核酸増幅反応方法を提供する。【解決手段】プライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させる熱サイクルを付与する熱サイクル付与工程と、前記熱サイクル付与工程の後に、前記反応溶液の温度を、増幅された核酸が変性する温度に上げる温度上昇工程と、前記温度上昇工程の後に、前記反応溶液の温度を、前記プローブがハイブリダイゼーションする温度に下げる温度下降工程と、前記反応溶液にプローブを添加するプローブ添加工程と、を含み、前記熱サイクル付与工程において、前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、前記プローブ添加工程は、前記熱サイクル付与工程の後であって前記温度上昇工程の前、前記温度上昇工程の後であって前記温度下降工程の前、または前記温度下降工程の後である、核酸増幅反応方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させる熱サイクルを付与する熱サイクル付与工程と、
前記熱サイクル付与工程の後に、前記反応溶液の温度を、増幅された核酸が変性する温度に上げる温度上昇工程と、
前記温度上昇工程の後に、前記反応溶液の温度を、前記プローブがハイブリダイゼーションする温度に下げる温度下降工程と、
前記反応溶液にプローブを添加するプローブ添加工程と、
を含み、
前記熱サイクル付与工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記プローブ添加工程は、前記熱サイクル付与工程の後であって前記温度上昇工程の前、前記温度上昇工程の後であって前記温度下降工程の前、または前記温度下降工程の後である、核酸増幅反応方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、２．５秒以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記プローブは、マイナーグループバインダー分子を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記プローブが添加された前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記プローブが添加された前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項６】
請求項４において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記プローブが添加された前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記プローブは、非加水分解プローブである、核酸増幅反応方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記核酸におけるプローブがハイブリダイゼーションする鎖にアニーリングするプライマーの量に対する前記核酸における前記鎖の相補鎖にアニーリングするプライマーの量の比は、１より大きく４より小さい、核酸増幅反応方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記温度下降工程において、前記反応溶液の温度を下げる速度は、２．５℃／ｓ以上である、核酸増幅反応方法。
【請求項１０】
核酸を増幅させるための試薬であって、プライマーおよびＭｇＣｌ２を含む第１試薬と、
核酸の増幅量を定量するための試薬であって、プローブを含む第２試薬と、
を含み、
前記第１試薬および前記第２試薬は、互いに離間し、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、前記反応溶液に前記第２試薬が添加された場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である、試薬セット。
【請求項１１】
核酸を増幅させるための試薬であって、プライマーおよびＭｇＳＯ４を含む第１試薬と、
核酸の増幅量を定量するための試薬であって、プローブを含む第２試薬と、
を含み、
前記第１試薬および前記第２試薬は、互いに離間し、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、前記反応溶液に前記第２試薬が添加された場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、試薬セット。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の試薬セットの使用方法であって、
前記第１試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液において核酸を増幅させた後に、前記反応溶液に前記第２試薬を添加する、試薬セットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応方法、試薬セット、および試薬セットの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応溶液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。核酸の増幅は、例えば、プローブを用いることにより定量することができる。
【０００４】
ＰＣＲの高速化は、遺伝子検査の検査時間短縮化のために必要な技術であり、遺伝子検査の業界において非常に期待されている。
【０００５】
例えば特許文献１には、ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭ、プライマーが少なくとも２μＭの濃度で提供され、１サイクルあたり２０秒未満のサイクル時間で完了する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５２０６１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明者らは、鋭意研究の結果、ＰＣＲの高速化を図るために熱サイクルを高速化させると（熱サイクルの時間を短縮化させると）、プローブによって核酸増幅反応が阻害されることを見出した。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、熱サイクルの高速化を図ることができる核酸増幅反応方法を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、高速化を図ることができる試薬セットおよびその使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
プライマーを含む反応溶液に、核酸を増幅させる熱サイクルを付与する熱サイクル付与工程と、
前記熱サイクル付与工程の後に、前記反応溶液の温度を、増幅された核酸が変性する温度に上げる温度上昇工程と、
前記温度上昇工程の後に、前記反応溶液の温度を、前記プローブがハイブリダイゼーションする温度に下げる温度下降工程と、
前記反応溶液にプローブを添加するプローブ添加工程と、
を含み、
前記熱サイクル付与工程において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記プローブ添加工程は、前記熱サイクル付与工程の後であって前記温度上昇工程の前、前記温度上昇工程の後であって前記温度下降工程の前、または前記温度下降工程の後である。
【００１０】
このような核酸増幅反応方法では、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液にプローブを添加するので、プローブによって核酸の増幅が阻害されることを抑制することができる。したがって、このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、２．５秒以下であってもよい。
【００１２】
このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、マイナーグループバインダー分子を含んでもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応方法では、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、２価の陽イオンを含み、
前記反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応方法では、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＣｌ２を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２由来であり、
前記プローブが添加された前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。
【００１８】
このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記反応溶液は、ＭｇＳＯ４を含み、
前記２価の陽イオンは、ＭｇＳＯ４由来であり、
前記プローブが添加された前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であってもよい。
【００２０】
このような核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００２１】
このような核酸増幅方法では、２価の陽イオンの種類によって伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制するのに最適な濃度範囲が異なってくる。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記プローブは、非加水分解プローブであってもよい。
【００２３】
このような核酸増幅反応方法では、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールする増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記核酸におけるプローブがハイブリダイゼーションする鎖にアニーリングするプライマーの量に対する前記核酸における前記鎖の相補鎖にアニーリングするプライマーの量の比は、１より大きく４より小さくてもよい。
【００２５】
このような核酸増幅反応方法では、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００２６】
本発明に係る核酸増幅反応において、
前記温度下降工程において、前記反応溶液の温度を下げる速度は、２．５℃／ｓ以上であってもよい。
【００２７】
このような核酸増幅反応方法では、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００２８】
本発明に係る試薬セットは、
核酸を増幅させるための試薬であって、プライマーおよびＭｇＣｌ２を含む第１試薬と、
核酸の増幅量を定量するための試薬であって、プローブを含む第２試薬と、
を含み、
前記第１試薬および前記第２試薬は、互いに離間し、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、前記反応溶液に前記第２試薬が添加された場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００２９】
このような試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００３０】
本発明に係る試薬セットは、
核酸を増幅させるための試薬であって、プライマーおよびＭｇＳＯ４を含む第１試薬と、
核酸の増幅量を定量するための試薬であって、プローブを含む第２試薬と、
を含み、
前記第１試薬および前記第２試薬は、互いに離間し、
前記プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、
前記第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、前記反応溶液に前記第２試
薬が添加された場合に、前記反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下である、試薬セット。
【００３１】
このような試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００３２】
本発明に係る試薬セットの使用方法は、
本発明に係る試薬セットの使用方法であって、
前記第１試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて前記反応溶液を調整し、前記反応溶液において核酸を増幅させた後に、前記反応溶液に前記第２試薬を添加する。
【００３３】
このような試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図２】本実施形態に係る反応溶液に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置を模式的に示す断面図。
【図３】蛍光強度を示すグラフ。
【図４】蛍光強度を示すグラフ。
【図５】電気泳動の結果。
【図６】蛍光強度を示すグラフ。
【図７】蛍光強度を示すグラフ。
【図８】蛍光強度を示すグラフ。
【図９】蛍光強度を示すグラフ。
【図１０】蛍光強度を示すグラフ。
【図１１】ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフ。
【図１２】ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３６】
１．  試薬セット
まず、本実施形態に係る試薬セットについて説明する。本実施形態に係る試薬セットは、第１試薬と、第２試薬と、を含む。第１試薬および第２試薬は、互いに離間している。第１試薬および第２試薬は、液状であってもよいし、凍結乾燥された状態であってもよい。第１試薬および第２試薬は、互いに離間した状態で、１つの筐体内に収容されていてもよい。
【００３７】
１．１．  第１試薬
第１試薬は、核酸を増幅させるための試薬である。第１試薬は、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００３８】
１．１．１．  プライマー
プライマーは、鋳型核酸（テンプレート）にアニールするよう設計されている。アニール（アニーリング）とは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。第１試薬は、プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。第２試薬が添加された反応溶液に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。
【００３９】
なお、反応溶液とは、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）やＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を含む鋳型核酸溶液と、第１試薬とが接触して形成される、核酸増幅反応を行うための溶液のことである。
【００４０】
核酸におけるプローブがハイブリダイゼーションする鎖にアニーリングするプライマーの量に対する核酸における前記鎖の相補鎖にアニーリングするプライマーの量の比は、１より大きく４より小さくてもよい。例えば、第１の一本鎖ＤＮＡにプローブがハイブリダイゼーションし、該第１の一本鎖ＤＮＡにフォワードプライマーがアニーリングし、第１の一本鎖ＤＮＡと相補的な第２の一本鎖ＤＮＡにリバースプライマーがアニーリングする場合、フォワードプライマーの量に対するリバースプライマーの量の比は、１より大きく４より小さくてもよい。上記範囲とすることにより、反応容器にプローブを含む第２試薬を添加した場合に、プローブによる発光強度（蛍光強度）を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００４１】
プライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）のＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下であり、好ましくは７０℃以上７５℃以下である。これにより、本実施形態に係る試薬セットは、高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。Ｔｍ値は、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする温度の指標であり、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度、すなわち、融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。Ｔｍ値以上の温度であれば、半数以上のプライマーが鋳型核酸にアニーリングする。フォワードプライマーのＴｍ値と、リバースプライマーのＴｍ値とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４２】
Ｔｍ値の算出方法としては、例えば、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法が挙げられ、下記式（１）によって算出することができる。本発明においては、下記式（１）で算出した場合に、プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下となる。
【００４３】
Ｔｍ＝１０００ΔＨ／（−１０．８＋ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃｔ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］  ・・・  （１）
【００４４】
なお、式（１）において、ΔＨは、ハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり、ΔＳは、ハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｒは、気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ／ｍｏｌ）であり、Ｃｔは、プライマーのモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、Ｎａ＋は、バッファーに含まれる一価の陽イオンの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）である。
【００４５】
プライマーは、人工核酸を含んでもよい。これにより、プライマーの塩基数を多くすることなく、プライマーのＴｍ値を上記の範囲にすることができる。プライマーの塩基数が多くなると、非特異的吸着や、プライマー同士がプライマーダイマー（二本鎖）を形成してしまい、目的の核酸を増幅することができない場合がある。プライマーダイマーには、１つのプライマーにおいて二本鎖を形成するセルフダイマーと、フォワードプライマーとリバースプライマーとにおいて二本鎖を形成するクロスダイマーとがある。
【００４６】
人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子以外の核酸分子をいう。人工核酸としては、例えば、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とをメチレン架橋した、２’，４’− ＢＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ
−ｍｅｔｈａｎｏ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）が挙げられる。
【００４７】
１．１．２．  ポリメラーゼ
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ポリメラーゼには、Ｔａｑポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させる加水分解型と、ＫＯＤポリメラーゼのように、加水分解によってプローブを分解させない非加水分解型とが、存在する。ＫＯＤは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１であり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のＤＮＡポリメラーゼである。第２試薬が添加された反応溶液に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００４８】
１．１．３．  ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。第２試薬が添加された反応溶液に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００４９】
１．１．４．  バッファー
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、バッファーのＰＨを調整することができる。
【００５０】
バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれる２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。２価の陽イオンの濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる（具体的には熱サイクルの１サイクル当たりの時間を９秒以下にすることができる）。２価の陽イオンの濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００５１】
具体的には、バッファーは、２価の陽イオン化合物と、ＫＣＬと、Ｔｒｉｓと、を含む。より具体的には、バッファーは、ＭｇＣｌ２を含み、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２に由来する。すなわち、２価の陽イオンは、ＭｇＣｌ２が電離して生成される。２価の陽イオンがＭｇＣｌ２に由来する場合は、Ｍｇ２＋の濃度は、ポリメラーゼの活性に起因する。核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であり、好ましくは５ｍＭ以上７ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭである。ＭｇＣｌ２の濃度を４ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。Ｍ
ｇＣｌ２の濃度を７．５ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。なお、核酸増幅反応試薬が凍結乾燥されている状態では、核酸増幅反応試薬は、固形の状態で、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ、賦形剤、例えばトレハロースを含む。
【００５２】
２価の陽イオン化合物は、ＭｇＳＯ４に由来していてもよい。この場合は、バッファーは、ＭｇＣｌ２の代わりにＭｇＳＯ４を含み、核酸増幅反応試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液になった場合、該反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４の濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭである。ＭｇＳＯ４の濃度を２ｍＭ以上とすることにより、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図ることができる。ＭｇＳＯ４の濃度を３ｍＭ以下とすることにより、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００５３】
１．１．５．  その他の成分
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、第１試薬は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００５４】
第１試薬が凍結乾燥されている場合、第１試薬（凍結乾燥試薬）は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、凍結保護剤としての機能が高いため、特にトレハロースを用いることが好ましい。トレハロースは、その強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、核酸増幅反応試薬の各成分と、糖と、を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００５５】
１．２．  第２試薬
第２試薬は、核酸の増幅量を定量するための試薬である。第２試薬は、プローブを含む。第２試薬は、プローブ以外の成分を含んでいてもよいし、プローブのみから構成されていてもよい。
【００５６】
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。反応溶液に第２試薬が添加された場合、反応溶液に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上７．２μＭ以下であり、好ましくは０．９μＭ以上３．６μＭ以下である。
【００５７】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＴａｑポリメラーゼを用いる。
【００５８】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてＫＯＤポリメラーゼを用いる。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５９】
プローブが非加水分解プローブの場合は、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールする増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００６０】
プローブは、マイナーグループバインダー（ＭＧＢ）分子を含んでいることが好ましい。これにより、本実施形態に係る試薬セットは、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００６１】
プローブは、人工核酸を含んでもよい。人工核酸としては、上述したものを用いることができる。
【００６２】
１．３．  使用方法
次に、本実施形態に係る試薬セットの使用方法について説明する。本実施形態に係る試薬セットの使用方法では、第１試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて反応溶液を調整し、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液に第２試薬を添加する。
【００６３】
本実施形態に係る試薬セットは、例えば、以下の特徴を有する。
【００６４】
試薬セットでは、プライマーおよびＭｇＣｌ２を含む第１試薬と、プローブを含む第２試薬と、を含み、前記第１試薬および前記第２試薬は、互いに離間している。そのため、試薬セットでは、第１試薬と鋳型核酸を含む鋳型核酸溶液とを接触させて反応溶液を調整し、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液に第２試薬を添加することができる。したがって、試薬セットでは、ＰＣＲにおいて、プローブによって核酸の増幅が阻害されることを抑制することができる。よって、試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００６５】
さらに、プローブを、核酸を増幅させる前に反応溶液に添加する場合は、高速化のためにプライマーのＴｍ値を上げると、プローブのＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも約１０℃高くする必要がある。これは、プローブのハイブリダイゼーションを、プライマーのアニーリングより先に行うことにより、ポリメラーゼによってプローブをより確実に分解させるためである。プローブのＴｍ値が高くなると、プローブによって核酸の増幅が阻害される度合いが大きくなる。しかしながら、本実施形態に係る試薬セットでは、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液にプローブを添加するので、上記のような問題を回避することができ、原理的には、プローブのＴｍ値や濃度を向上させればさせるほど検出感度を向上させることができる。
【００６６】
さらに、試薬セットでは、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液にプローブを添加するので、プローブのハイブリダイゼーションを考慮することなく、プライマーの濃度やＴｍ値を高くすることができる。プライマーの濃度が高いほど、熱サイクルの高
速化を図ることができる。
【００６７】
試薬セットでは、プライマーのＴｍ値は、７０℃以上８０℃以下である。そのため、試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００６８】
試薬セットでは、第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、反応溶液に第２試薬が添加された場合に、反応溶液に２価の陽イオンの濃度は、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。そのため、試薬セットでは、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００６９】
試薬セットでは、第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、反応溶液に第２試薬が添加された場合に、反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２濃度は、４ｍＭ以上７．５ｍＭ以下であってもよい。そのため、試薬セットでは、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００７０】
試薬セットでは、第１試薬が核酸増幅反応を行うための反応溶液となり、反応溶液に第２試薬が添加された場合に、反応溶液に含まれるＭｇＳＯ４濃度は、２ｍＭ以上３ｍＭ以下であってもよい。そのため、試薬セットでは、ポリメラーゼによる伸長反応を速め、ＰＣＲの高速化を図りつつ、非特異増幅を抑制し、特異的な増幅産物の収量が低下することを抑制することができる。
【００７１】
試薬セットでは、プローブは、ＭＧＢ分子を含んでいてもよい。これにより、試薬セットは、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００７２】
試薬セットでは、プローブは、加水分解プローブであってもよい。そのため、試薬セットでは、ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼによってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消してレポーター色素が発光することにより、核酸の増幅量を定量することができる。
【００７３】
試薬セットでは、プローブは、非加水分解プローブであってもよい。そのため、試薬セットでは、ポリラーゼとして、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きいＫＯＤポリメラーゼを用いることができる。したがって、試薬セットでは、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００７４】
プローブが非加水分解プローブの場合は、プローブを伸長反応で分解する必要がないために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーより内側にプローブがアニールする増幅領域を設ける必要がなくなる。これにより、加水分解型の系よりも増幅領域を狭く設計することが可能となる。増幅領域が狭くなることでアニール時間を短くでき、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００７５】
試薬セットでは、核酸におけるプローブがハイブリダイゼーションする鎖にアニーリングするプライマーの量に対する核酸における前記鎖の相補鎖にアニーリングするプライマーの量の比は、１より大きく４より小さくてもよい。そのため、試薬セットでは、反応溶液にプローブを含む第２試薬を添加した場合に、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００７６】
２．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。以下では、本実施形態に係る試薬セットを用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【００７７】
まず、本実施形態に係る試薬セットの第１試薬と、鋳型核酸溶液と、を接触させて、反応溶液を調整する（反応溶液調整工程（ステップＳ１））。具体的には、第１試薬および第２試薬が収容されている筐体から、第１試薬を取り出して容器に導入する。そして、第１試薬が導入された容器に、ピペット等を用いて鋳型核酸溶液を導入し、第１試薬と鋳型核酸溶液とを接触させて、反応溶液を調整する。反応溶液は、第１試薬に含まれる成分を含む。
【００７８】
鋳型核酸溶液は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００７９】
次に、反応溶液に、核酸を増幅させる熱サイクルを付与する（熱サイクル付与工程（ステップＳ２））。ここで、図２は、本実施形態に係る反応溶液６に熱サイクルを付与するための熱サイクル装置１００を模式的に示す断面図である。
【００８０】
熱サイクル装置１００は、図２に示すように、第１ホットプレート１０と、第２ホットプレート１２と、第１ビーカー２０と、第２ビーカー２２と、アーム３０と、固定部３２と、を含む。
【００８１】
第１ホットプレート１０は、第１ビーカー２０に収容されている液体２を第１温度に加熱する。第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。液体２の種類は、第１ホットプレート１０により第１温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８２】
第２ホットプレート１２は、第２ビーカー２２に収容されている液体４を第２温度に加熱する。第２温度は、第１温度よりも低い温度である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。すなわち、本工程では、プライマーのアニーリング反応のための加熱において、伸長反応を行う。つまり、アニーリング反応と伸長反応とを同じ温度で行う。液体４の種類は、第２ホットプレート１２により第２温度に加熱されることができれば、特に限定されず、例えば、食塩水、オイルが挙げられる。
【００８３】
アーム３０は、一端３０ａが固定部３２によって固定されており、他端３０ｂが自由端となっている。アーム３０の他端３０ｂは、反応溶液６が収容されている容器８を支持している。アーム３０は、図示せぬモーターにより、一端３０ａが固定された状態で、他端３０ｂが円弧状に往復運動する。
【００８４】
アーム３０の往復運動により、反応溶液６は、第１温度に加熱された液体２中と、第２温度に加熱された液体４中とに、交互に配置される。これにより、反応溶液６に、ＰＣＲのための熱サイクルを付与することができる。本工程における熱サイクル数は、モーターの駆動および停止により適宜設定することができ、例えば、２０サイクル以上６０サイク
ル以下である。反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間は、例えば、０．５秒程度である。
【００８５】
熱サイクル付与工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりの変性反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体２中に配置されている時間）は、例えば、０．３秒以上であって２秒未満であり、好ましくは０．５秒以上０．７秒以下である。変性反応のための加熱時間を０．３秒以上とすることにより、変性反応の時間が短すぎて変性が十分に行われないことを抑制することができる。変性反応のための加熱時間を２秒未満とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００８６】
熱サイクル付与工程（ステップＳ２）において、１サイクル当たりのアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（図示の例では、反応溶液６が液体４中に配置されている時間）は、例えば、６秒以下であり、０．３秒以上であって１秒未満であり、好ましくは０．５秒以上０．７秒以下である。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を０．３秒以上とすることにより、アニーリング反応および伸長反応の時間が短すぎてアニーリング反応および伸長反応が十分に行われないことを抑制することができる。アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間を６秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００８７】
熱サイクル付与工程（ステップＳ２）において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、９秒以下であり、好ましくは２．５秒以下であり、より好ましくは１秒以上２．５秒以下であり、さらにより好ましくは２秒以上２．４秒以下である。１サイクル当たりの時間を９秒以下とすることにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。なお、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、変性反応、アニーリング反応、および伸長反応にかかる時間と、これらの反応を行うための反応溶液の移動時間（例えば、反応溶液６の液体２から液体４への移動時間、および液体４から液体２への移動時間）と、を含む。
【００８８】
熱サイクル付与工程（ステップＳ２）において、増幅される核酸の塩基数は、２００以下であってもよい。これにより、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００８９】
次に、反応溶液に、プローブを含む第２試薬を添加する（プローブ添加工程（ステップＳ３））。例えば、熱サイクルを付与した反応溶液を別の容器に移し、該容器にプローブを導入して、反応溶液にプローブを添加してもよい。または、反応溶液が収容される容器８にプローブを導入して、反応溶液にプローブを添加してもよい。
【００９０】
次に、反応溶液の温度を、増幅された核酸が変性する温度（第３温度）に上げる（温度上昇工程（ステップＳ４））。本工程における第３温度は、例えば、８５℃以上１０５℃以下であり、熱サイクル付与工程（ステップＳ２）の第１温度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００９１】
次に、反応溶液の温度を、プローブが一本鎖ＤＮＡ（変性された核酸）にハイブリダイゼーションする温度（第４温度）に下げる（温度下降工程（ステップＳ５））。本工程における第４温度は、熱サイクル付与工程（ステップＳ２）の第２温度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００９２】
温度下降工程（ステップＳ５）において、反応溶液の温度を下げる速度は、例えば、２．５℃／ｓ以上であり、好ましくは１２℃／ｓ以上２００℃／ｓ以下である。反応溶液の温度を下げる速度を２．５℃／ｓ以上とすることにより、プローブによる発光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。反応溶液の温度を下げる速度を２００℃／ｓ以下とすることにより、熱サイ
クル装置のコストを抑えることができる。
【００９３】
温度上昇工程（ステップＳ４）および温度下降工程（ステップＳ５）は、図２で示した熱サイクル装置１００で行われてもよいし、熱サイクル装置１００とは別の熱サイクル装置で行われてもよい。別の熱サイクル装置としては、反応溶液が移動する流路を備えた容器を装着可能な装置であって、流路の第１領域を第３温度に加熱し、流路の第２領域を第４温度に加熱し、容器を上下逆さまにする（第１領域が第２領域よりも重力方向において下の状態から、第２領域が第１領域よりも重力方向において下の状態にする）ことにより、反応溶液を第１領域から第２領域に移動可能な装置が挙げられる。
【００９４】
次に、反応溶液の蛍光強度を測定する（蛍光強度測定工程（ステップＳ６））。反応溶液の蛍光強度を測定する装置としては、特に限定されない。
【００９５】
本実施形態に係る核酸増幅反応方法は、例えば、以下の特徴を有する。
【００９６】
核酸増幅反応方法では、熱サイクル付与工程（ステップＳ２）と、プローブ添加工程（ステップＳ３）と、温度上昇工程（ステップＳ４）と、温度下降工程（ステップＳ５）と、を含む。核酸増幅反応方法では、反応溶液において核酸を増幅させた後に、反応溶液にプローブを添加するので、ＰＣＲにおいて、プローブによって核酸の増幅が阻害されることを抑制することができる。したがって、核酸増幅反応方法では、熱サイクルの高速化を図ることができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００９７】
核酸増幅反応方法では、温度下降工程（ステップＳ５）において、反応溶液の温度を下げる速度は、２．５℃／ｓ以上であってもよい。そのため、核酸増幅反応方法では、プローブによる蛍光強度を高くすることができ、高感度に増幅量を定量することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【００９８】
なお、上記では、プローブ添加工程（ステップＳ３）は、熱サイクル付与工程（ステップＳ２）の後であって温度上昇工程（ステップＳ４）の前に行われる例について説明したが、プローブ添加工程（ステップＳ３）は、温度上昇工程（ステップＳ４）の後であって温度下降工程（ステップＳ５）の前でもよいし、温度下降工程（ステップＳ５）の後であって蛍光強度測定工程（ステップＳ６）の前であってもよい。
【００９９】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【０１００】
３．１．  第１実験例
３．１．１．  反応溶液の調整および実験方法
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。
【０１０１】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）    ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）      ０．３２μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ４．８１μＬ
【０１０２】
上記のような反応溶液を、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域（９０℃）と低温領域（６６℃）とを３９回往復運動させて、ＰＣＲを行った（図２参照）。
【０１０３】
その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、プローブを添加した。該容器をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで高温（９５℃）処理後、低温（５５℃）で蛍光輝度を測定した。プローブとしては、マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標））１０μＭを０．９μＬ用いた。
【０１０４】
なお、バッファー（緩衝液）は、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。プローブが添加された反応溶液に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を、５ｍＭとした。このことは、以下に示す実験例において同様である。
【０１０５】
第１実験例に用いたプライマーおよびプローブのＴｍ値および配列は、下記表１のとおりである。
【０１０６】
【表１】
2018014950.tif 000003
【０１０７】
なお、表１に示すフォワードプライマーおよびリバースプライマーのＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。
【０１０８】
表１に示すプローブのＴｍ値は、実測にて求めた。実測でＴｍ値を求める場合は、プライマーと相補鎖が形成する二本鎖ＤＮＡに所定の蛍光物質を結合させ、熱変性による該蛍光物質の発光強度の低下を温度に対してプロットする。このグラフの一次微分の負の値がピークになった温度を、Ｔｍ値として測定することができる。
【０１０９】
比較例として、上記の蛍光標識プローブを予め反応溶液に添加し、該反応溶液を、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域（９０℃）と低温領域（６６℃）とを４０回往復運動させて、ＰＣＲを行った（図２参照）。その後、Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍにより、蛍光強度を測定した。
【０１１０】
往復運動（熱サイクル）の１サイクル当たりの時間を、２秒（高温領域０．５秒／低温領域０．５秒）、２．４秒（高温領域０．７秒／低温領域０．７秒）、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）と振った。
【０１１１】
３．１．２．  蛍光強度測定の結果
図３は、プローブを核酸増幅前に添加した場合（「プローブ前添加」ともいう）の蛍光強度を示すグラフである。図４は、プローブを核酸増幅後に添加した場合（「プローブ後
添加」ともいう）の蛍光強度を示すグラフである。
【０１１２】
図３に示すように、「プローブ前添加」では、熱サイクルの１サイクル当たりの時間が２．４秒以下では、プローブによる蛍光が確認されなかった。一方、図４に示すように、「プローブ後添加」では、熱サイクルの１サイクル当たりの時間が２．４秒では、プローブによる蛍光が確認され、１サイクル当たりの時間が２秒であっても、２万というかなり大きな蛍光強度が確認された。図３および図４より、「プローブ後添加」は、「プローブ前添加」に比べて、熱サイクルの高速化に非常に有効であることがわかった。
【０１１３】
なお、図３では、明らかに核酸が増幅されていない状態（例えば１サイクル終了後）の蛍光輝度を、４０サイクル終了後の蛍光輝度から引いた値をプロットしている。蛍光輝度がマイナスを示しているプロットは、測定誤差であると考えられる。このことは、後述する図１１においても同様である。
【０１１４】
３．１．３．  電気泳動の結果
上記の「プローブ前添加」の反応溶液を、アガロースゲル電気泳動法によって解析を行った。また、プローブを全く添加せずに、「プローブ前添加」の反応溶液と同様に、熱サイクルを付与した反応溶液についても、アガロースゲル電気泳動法によって解析を行った。
【０１１５】
なお、上記に示した実験条件の他、プローブとしては、表１に示した蛍光標識プローブにおいてＭＧＢ分子を含んでいない蛍光標識プローブ（Ｔｍ値＝６０℃）を用いた。また、熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、５秒（高温領域２秒／低温領域２秒）とした場合についても解析した。
【０１１６】
図５は、プローブ前添加の電気泳動の結果である。図５において、「なし」は、プローブを全く添加していない例である。「Ｐｒｏｂｅ」は、ＭＧＢ分子を含んでいない蛍光標識プローブを添加した例である。「Ｐｒｏｂｅ−ＭＧＢ」は、ＭＧＢ分子を含む蛍光標識プローブを添加した例である。
【０１１７】
図５に示すように、１サイクル当たりの時間が３秒以上では、目的バンド（増幅の対象となる塩基配列を有する核酸のバンド）がはっきりと確認された。一方、１サイクル当たりの時間が２．４秒では、「Ｐｒｏｂｅ−ＭＧＢ」では、目的バンドがぼやけ、１サイクル当たりの時間が２秒では、「Ｐｒｏｂｅ」および「Ｐｒｏｂｅ−ＭＧＢ」において、目的バンドがぼやける、ないし消滅した。図５より、プローブによって核酸増幅反応が阻害されることがわかった。
【０１１８】
３．２．  第２実験例
第１実験例で用いた「プローブ後添加」において、プローブの種類を振って、第１実験例と同様の方法で核酸を増幅させて蛍光強度を測定した。熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、２．４秒（高温領域０．７秒／低温領域０．７秒）、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）と振った。第２実験例に用いたプローブのＴｍ値および配列は、下記表２のとおりである。
【０１１９】
【表２】
2018014950.tif 000004
【０１２０】
表２に示すプローブのＴｍ値は、実測にて求めた。実測でＴｍ値を求める場合は、プライマーと相補鎖が形成する二本鎖ＤＮＡに所定の蛍光物質を結合させ、熱変性による該蛍光物質の発光強度の低下を温度に対してプロットする。このグラフの一次微分の負の値がピークになった温度を、Ｔｍ値として測定することができる。
【０１２１】
表２で示したＮｏ．３〜Ｎｏ．１１のプローブは、人工核酸を含んでいる。表２の配列において、人工核酸は、下線を引いて示している。
【０１２２】
なお、第２実験例および以下示す実験例において、特に記載がない場合は、第１実験例の反応溶液と同様の組成および濃度を有する反応用液を用いている。
【０１２３】
図６は、蛍光強度を示すグラフである。図６において、各プローブの、斜線の棒グラフ（左側の棒グラフ）は、熱サイクルの１サイクル当たりの時間を３秒とした場合を示しており、黒塗りの棒グラフ（右側の棒グラフ）は、熱サイクルの１サイクル当たりの時間を２．４秒とした場合を示している。
【０１２４】
図６に示すように、Ｔｍ値に関わらず、ＭＧＢ分子を含むプローブは、最も蛍光強度が高かった。したがって、ＭＧＢ分子を含むプローブは、「プローブ後添加」の場合に、最も適したプローブであることがわかった。
【０１２５】
図６に示すように、Ｎｏ．６のプローブは、蛍光強度が低かった。これは、５´末端がＬＮＡであるため、ポリメラーゼによるプローブの分解が起こる確率が低かったためであると考えられる。したがって、ＬＮＡは、５´末端を避けて配置されていることが好ましいといえる。
【０１２６】
３．３．  第３実験例
第１実験例で用いた「プローブ後添加」において、プローブのＴｍ値を、６７℃、７２℃、７９℃と振って、第１実験例と同様の方法で核酸を増幅させて蛍光強度を測定した。熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）とした。プローブとしては、ＭＧＢ分子や人工核酸を含んでいない加水分解プローブを用いた。
【０１２７】
図７は、蛍光強度を示すグラフである。図７により、ＭＧＢ分子や人工核酸を含んでいないプローブでは、Ｔｍ値が高いほど、蛍光強度が高いことがわかった。
【０１２８】
また、第１実験例で用いた「プローブ後添加」において、プローブの濃度を、０．９μＭ、１．８μＭ、３．６μＭ、７．２μＭと振って、第１実験例と同様の方法で核酸を増幅させて蛍光強度を測定した。熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）とした。プローブとしては、ＭＧＢ分子や人工核酸を含んでいない加水分解プローブを用いた。
【０１２９】
図８は、蛍光強度を示すグラフである。図８に示すように、蛍光強度は、プローブの濃度が７．２μＭで飽和した。したがって、コストを考慮すると、プローブの濃度は、３．６μＭ以下が好ましいことがわかった。
【０１３０】
３．４．  第４実験例
第１実験例で用いた「プローブ後添加」において、プライマーの濃度を振って、第１実験例と同様の方法で核酸を増幅させて蛍光強度を測定した。具体的には、フォワードプライマー（２０μＭ）を１．６μＬとし、リバースプライマー（１００μＭ）を、０．３２μＬ、０．６４μＬ、０．９６μＬ、１．２８μＬと振った。すなわち、フォワードプライマーの量に対するリバースプライマーの量の比ＲＲ／Ｆを、１、２、３、４と振った。熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）とした。プローブとしては、ＭＧＢ分子を含んだ加水分解プローブを用いた。
【０１３１】
図９は、蛍光強度を示すグラフである。図９に示すように、比ＲＲ／Ｆを、１より大きく４より小さくすると、蛍光強度が高くなることがわかった。さらに、比ＲＲ／Ｆを、２以上３以下とすることにより、より確実に蛍光強度が高くなることがわかった。これは、フォワードプライマーの量とリバースプライマーの量とを変化させることにより、核酸増幅物（増幅された核酸、アンプリコン）のセンス、アンチセンスの量が変わった影響だと考えられる。
【０１３２】
なお、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのどちらのプライマー量を増やすかは、プローブの結合する（ハイブリダイゼーションする）のが、核酸配列のセンス鎖なのかアンチセンス鎖なのかによって異なる。プローブが結合する側の塩基配列にアニーリングするプライマー量を４倍未満で増やすと、蛍光強度を高くすることができる。
【０１３３】
３．５．  第５実験例
第１実験例で用いた「プローブ後添加」において、プローブを添加した後に反応溶液の温度を高温から低温に下げる工程（図１の温度下降工程（ステップＳ５）に相当する工程）において、反応溶液の温度を下げる速度（降温速度）を、２．３℃／ｓ、１２℃／ｓと振って、蛍光強度を測定した。
【０１３４】
降温速度２．３℃／ｓの場合は、プローブを添加した後に反応溶液の温度を高温にする工程（図１の温度下降工程（ステップＳ４）に相当する工程）、および高温から低温に下げる工程を、第１実験例のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで行った。降温速度１２℃／ｓの場合は、プローブを添加した後に反応溶液の温度を高温する工程、および高温から低温に下げる工程を、核酸の増幅を行った装置（図２参照）で行った。
【０１３５】
なお、フォワードプライマー（２０μＭ）を１．６μＬとし、リバースプライマー（２０μＭ）を３．２μＬとした。また、熱サイクルの１サイクル当たりの時間を、３秒（高温領域１秒／低温領域１秒）とした。プローブとしては、ＭＧＢ分子を含んだ加水分解プローブを用いた。
【０１３６】
図１０は、蛍光強度を示すグラフである。図１０に示すように、降温速度１２℃／ｓの
場合は、降温速度２．３℃／ｓの場合に比べて、蛍光強度が高かった。したがって、降温速度を２．５℃／ｓとすることにより、蛍光強度を高くできることがわかった。
【０１３７】
降温速度の大きい方が蛍光強度を高くできる理由としては、次のように考えられる。核酸増幅物（増幅された核酸、アンプリコン）のＴｍ値は、プライマーやプローブのＴｍ値より高い。そのため、降温速度が小さいと、核酸増幅物同士のみがアニーリングする時間が長くなり、プライマーのアニーリングやプローブのハイブリダイゼーションが阻害される。一方、降温速度が大きいと、核酸増幅物同士のみがアニーリングする時間が短くなるので、プライマーのアニーリングやプローブのハイブリダイゼーションが阻害される確率が小さくなる。したがって、降温速度が大きい方が、蛍光強度が高くなると考えられる。
【０１３８】
３．６．  第６実験例
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、マイコプラズマ菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。第６実験例は、「プローブ前添加」である。核酸増幅反応試薬とは、プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、プローブと、を含む試薬のことである。
【０１３９】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
マイコプラズマ菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）      １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）        １．２μＬ
マイコプラズマ菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）          ０．９μＬ
マイコプラズマ菌ＤＮＡ（１００コピー／μＬ）                １．０μＬ
蒸留水                                                      ３．０５μＬ
【０１４０】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１４１】
第６実験では、Ｔｍ値が異なるプライマーを用いた。具体的には、Ｔｍ値が約６０℃（Ｔｍ６０）、約７０℃（Ｔｍ７０）、約７５℃（Ｔｍ７５）、約８０℃（Ｔｍ８０）、および約８５℃（Ｔｍ８５）のプライマーを用いた。プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表３のとおりである。
【０１４２】
【表３】
2018014950.tif 000005
【０１４３】
なお、表３に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において
、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。
【０１４４】
上記のような反応溶液１０μＬを、容器（ロシュ社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（２０μＬ））に入れて、高温領域と低温領域とを往復運動させて、ＰＣＲを行った（図２参照）。熱サイクルの回数を、４０サイクルとした。その後、反応溶液を、別の容器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ）に移し変えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで蛍光輝度を測定した。
【０１４５】
各プライマー（Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５）を用いたＰＣＲにおいて、変性反応のための加熱温度（高温温度）は、８７℃とした。Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５、Ｔｍ８０、およびＴｍ８５を用いたＰＣＲにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱温度（低温温度）は、それぞれ、６０℃、６３℃、６６℃、６９℃、７２℃とした。ＰＣＲにおける、１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表４に示す。なお、ポリメラーゼを活性化させるため、初めに１０秒間高温温度で加熱した（ホットスタート）。反応時間は、ポリメラーゼ活性時間に加え、高温時間および低温時間にサイクル数４０を掛け、さらに、反応溶液の移動時間を足したものである。また、表４において、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間と低温時間との和に、高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）および低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）を足したものである。例えば、反応時間３７０秒の場合、熱サイクルの１サイクル当たりの時間は、高温時間（２秒）＋高温時間（６秒）＋高温領域から低温領域への移動時間（０．５秒）＋低温領域から高温領域への移動時間（０．５秒）＝９秒となる。
【０１４６】
【表４】
2018014950.tif 000006
【０１４７】
図１１は、ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフである。図１１に示すように、低温時間が６秒の場合（１サイクル当たりの時間が９秒の場合）は、Ｔｍ６０、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認されたが、低温時間が４秒以下の場合（１サイクル当たりの時間が７秒の場合）は、Ｔｍ６０では核酸の増幅が確認されず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５で増幅が確認された。したがって、プライマーのＴｍ値を、６５℃以上であって８０℃未満とすることにより、低温時間が４秒以下でも、核酸を増幅できることがわかった。これは、Ｔｍ値が高いプライマーの方が鋳型核酸に速くアニーリングするので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。また、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方が、Ｔｍ６０よりも、ポリメラーゼの活性効率が高く、伸長反応を速めることができるので、Ｔｍ７０およびＴｍ７５の方がＴｍ６０よりも高速化に適しているためと考えられる。なお、本実験例で用いた装置のばらつきを考慮すると、蛍光強度が３万５千以上であると、確実に核酸が増幅されているといえる。そのため、１サイクル当たりの時間が９秒の場合に、Ｔｍ６０は確実に核酸が増幅されているとはいえず、Ｔｍ７０、Ｔｍ７５は確実に核酸が増幅されているといえる。
【０１４８】
以上、第６実験例は、「プローブ前添加」であるが、「プライマーのＴｍ値を、７０℃以上であって８０℃未満とすると高速化に適している」という傾向は、「プローブ後添加
」でも同様であると考えられる。したがって、「プローブ後添加」において、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上であって８０℃未満とすると、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【０１４９】
さらに、図１１より、プライマーのＴｍ値を、７０℃以上７５℃以下とすることにより、低温時間が４秒以下でも、より確実に、核酸を増幅できることがわかった。また、図１１より、Ｔｍ８０およびＴｍ８５では、核酸の増幅が確認されなかった。これは、Ｔｍ値が高すぎて、プライマーダイマーなどが生じたためであると考えられる。
【０１５０】
３．７．  第７実験例
鋳型核酸（テンプレートＤＮＡ）として、百日咳菌ＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応試薬に添加して下記の反応溶液を調製した。第７実験例は、「プローブ前添加」である。
【０１５１】
＜反応溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）    ０．４μＬ
バッファー                                                  ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                        ０．２５μＬ
百日咳菌検出用フォワードプライマー（１００μＭ）            ０．３２μＬ
百日咳菌検出用リバースプライマー（１００μＭ）              ０．３２μＬ
百日咳菌蛍光標識プローブ（１０μＭ）                        ０．９μＬ
百日咳菌ＤＮＡ（２０コピーまたは１００コピー／μＬ）        １．０μＬ
蒸留水                                                      ４．８１μＬ
【０１５２】
なお、蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。
【０１５３】
プライマーのＴｍ値および配列、ならびにプローブの配列は、下記表５のとおりである。
【０１５４】
【表５】
2018014950.tif 000007
【０１５５】
なお、表５に示すＴｍ値は、上記式（１）より算出したものであり、式（１）において、Ｃｔを５００ｎＭとし、Ｎａ＋を５０ｍＭとして計算した。
【０１５６】
上記のような反応溶液１０μＬに対して、第６実験例と同様に、ホットスタートを１０秒間行ってＰＣＲを行った。高温温度を９０℃とし、低温温度を６０℃とした。１サイクル当たりの、変性反応のための加熱時間（高温時間）、およびアニーリング反応および伸長反応のための加熱時間（低温時間）、および反応時間を下記表６に示す。
【０１５７】
【表６】
2018014950.tif 000008
【０１５８】
図１２は、ＰＣＲの反応時間と蛍光輝度との関係を示すグラフである。図１２に示すように、プライマーのＴｍ値が約８０℃であっても、核酸の増幅を確認することができた。
【０１５９】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１６０】
２，４…液体、６…反応溶液、８…容器、１０…第１ホットプレート、１２…第２ホットプレート、２０…第１ビーカー、２２…第２ビーカー、３０…アーム、３０ａ…一端、３０ｂ…他端、３２…固定部、１００…熱サイクル装置
【配列表フリーテキスト】
【０１６１】
配列番号１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号４は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号６は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号７は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号８は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号９は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１０は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１１は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂａｃｔｅｒｉａのリバースプライマーの配列である。
配列番号１２は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１３は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号１４は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの蛍光標識プローブの配
列である。
【図１】
2018014950.tif 000009
【図２】
2018014950.tif 000010
【図３】
2018014950.tif 000011
【図４】
2018014950.tif 000012
【図５】
2018014950.tif 000013
【図６】
2018014950.tif 000014
【図７】
2018014950.tif 000015
【図８】
2018014950.tif 000016
【図９】
2018014950.tif 000017
【図１０】
2018014950.tif 000018
【図１１】
2018014950.tif 000019
【図１２】
2018014950.tif 000020
【配列表】
2018014950000001.app