(57)【要約】      （修正有）【課題】アポトーシスにおいてエフェクターとして働く、カスパーゼ-３の阻害剤及び細胞死予防剤の提供。【解決手段】下式又は式（ＩＩ）のカスパーゼ-３阻害剤を含有する細胞死予防剤。2018131410.tif 000008（Ｒ１〜Ｒ４はＨ又はＣ１〜６のアルキル基；Ｒ５はＨ又は独立に水酸基がエステル化されていてもよいＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨ；ｎ＝１〜６の整数）2018131410.tif 000009（Ｒ１〜Ｒ４はＨ又はＣ１〜６のアルキル基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するカスパーゼ-３阻害剤。
【化１】
2018131410.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基、
Ｒ５は水素、または独立に水酸基がエステル化されていてもよいＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨである（ｎ＝１〜６の整数）。）
2018131410.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基である。）
【請求項２】
前記ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨの少なくとも一つの水酸基が、エステル化されている、請求項１に記載のカスパーゼ-３阻害剤。
【請求項３】
酪酸またはリン酸でエステル化されている、請求項２に記載のカスパーゼ-３阻害剤。
【請求項４】
前記化合物が、アロキサジン、ルミクローム、ルミフラビン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはリボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のカスパーゼ-３阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、細胞死予防剤。
【請求項６】
ALS、敗血症、脳虚血からなるグループから選択される疾患の治療薬である、請求項５に記載の細胞死予防剤。
【請求項７】
脳虚血発症後、４．５時間以内に投与される、請求項６に記載の細胞死予防剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤と併用される、請求項５に記載の細胞死予防剤。
【請求項９】
前記抗腫瘍剤が、フルオロウラシル系薬剤である、請求項８に記載の細胞死予防剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗ウイルス剤を有効成分として含有するウイルス性疾患の予防・治療薬。
【請求項１２】
前記ウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１１に記載の予防・治療薬。
【請求項１３】
前記マイナス鎖ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス(Orthomyxovirus)、アレナウイルス（Arenavirus）、ブニヤウイルス（Bunyavirus）、ラブドウイルス(Rhabdovirus)、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)、フィロウイルス(filovirus)からなる群から選択される、請求項１１に記載の予防・治療薬。
【請求項１４】
前記ウイルス性疾患が、インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、腎症候性出血熱、ハンタウイルス肺症候群、腎出血熱、リフトバレー熱、狂犬病、水胞性口内炎、麻疹、流行性耳下腺炎、ウイルス性脳炎、エボラ出血熱、およびマールブルグ出血熱からなる群から選択される、請求項１１に記載の予防・治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、カスパーゼ-３活性阻害用食品組成物。
【請求項１６】
請求項５に記載の細胞死予防剤を有効成分として含有する、細胞死予防用食品組成物。
【請求項１７】
請求項１０に記載の抗ウイルス剤を有効成分として含有する、ウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物。
【請求項１８】
前記ウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１７に記載のウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物。
【請求項１９】
前記マイナス鎖ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス(Orthomyxovirus)、アレナウイルス（Arenavirus）、ブニヤウイルス（Bunyavirus）、ラブドウイルス(Rhabdovirus)、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)、フィロウイルス(filovirus)からなる群から選択される、請求項１８に記載のウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物。
【請求項２０】
インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、腎症候性出血熱、ハンタウイルス肺症候群、腎出血熱、リフトバレー熱、狂犬病、水胞性口内炎、麻疹、流行性耳下腺炎、ウイルス性脳炎、エボラ出血熱、およびマールブルグ出血熱からなる群から選択されるウイルス性疾患に対して用いられる、請求項１７に記載のウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の食品組成物を含有する食品。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、カスパーゼ-３活性阻害用化粧品組成物。
【請求項２３】
請求項５に記載の細胞死予防剤を有効成分として含有する、細胞死予防用化粧品組成物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の化粧品組成物を含有する化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ-３阻害剤とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、神経変性疾患、虚血障害、炎症性疾患、ウイルス性疾患など、様々な疾病と深く関わっている。中でも、細胞死が主な病理学的現象である脳梗塞や心筋梗塞は、重篤な疾病であり、世界でも主な死因の一つである（非特許文献１）。脳組織や心臓組織の細胞は一度死滅すると再生しないため、患者はたとえ死に至らなくても、重い後遺症を患うことが多い。例えば、脳梗塞の場合には運動障害、記憶障害、感情障害等、心筋梗塞の場合には心臓ポンプ機能低下、不整脈等の後遺症が残ることがある。
【０００３】
脳梗塞や心筋梗塞は、その症状の発生から短時間（この期間は急性期と呼ばれている）に、血管障害が原因で生じる細胞死の予防策を講じることができれば、病状の進行を抑制することができ、結果として患者の生存率上昇や梗塞の後遺症の軽減が可能となることが知られている。
【０００４】
現在、脳梗塞や心筋梗塞の原因である血管障害の外科的治療として、血管内にカテーテルを挿入して膨らませることによって詰まった血管を拡張し、再開通する方法（風船療法）が用いられている。この風船療法を実施するためには心臓カテーテル室などの特別な施設が必要である。また、内科的治療としては、血栓溶解薬（組織型プラスミノゲン・アクティベータ（アルテプラーゼ）等）を投与することによって、血管に詰まった血栓を溶かす方法（血栓溶解療法）（例えば、特許文献１、非特許文献２）も一般に用いられているが、副作用として、脳出血を起こす危険性が指摘されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８―２３０９６８公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Suwanwela N, Koroshets WJ. Acute ischemic stroke: overview of recent therapeutic developments. Annual Review of Medicine 58: 89-106 (2007)
【非特許文献２】Fisher M, Bastan B. Treating acute ischemic stroke.  Current Opinion in Drug Discovery and Development 11: 626-625 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なカスパーゼ-３阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施態様は、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するカスパーゼ-３阻害剤である。
【０００９】
【化１】
2018131410.tif 000002
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基、
Ｒ５は水素、または独立に水酸基がエステル化されていてもよいＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨである（ｎ＝１〜６の整数）。）
2018131410.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基である。）
前記ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨの少なくとも一つの水酸基が、エステル化されていてもよく、酪酸またはリン酸でエステル化されていてもよい。前記化合物が、アロキサジン、ルミクローム、ルミフラビン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはリボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）であってもよい。
【００１０】
本発明の他の実施態様は、上記いずれかのカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、細胞死予防剤である。この細胞死予防剤は、ALS、敗血症、脳虚血からなるグループから選択される疾患の治療薬であってもよい。脳虚血発症後、４．５時間以内に投与されてもよい。また、抗腫瘍剤と併用されてもよく、前記抗腫瘍剤が、フルオロウラシル系薬剤であってもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有する、抗ウイルス剤である。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、上記抗ウイルス剤を有効成分として含有するウイルス性疾患の予防・治療薬である。前記ウイルスが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであってもよい。前記マイナス鎖ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルス(Orthomyxovirus)、アレナウイルス（Arenavirus）、ブニヤウイルス（Bunyavirus）、ラブドウイルス(Rhabdovirus)、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)、フィロウイルス(filovirus)からなる群から選択されてもよい。前記ウイルス性疾患が、インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、腎症候性出血熱、ハンタウイルス肺症候群、腎出血熱、リフトバレー熱、狂犬病、水胞性口内炎アラゴウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、ウイルス性脳炎、エボラ出血熱、およびマールブルグ出血熱からなる群から選択されてもよい。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有するカスパーゼ-３活性阻害用食品組成物、上記いずれかの細胞死予防剤を有効成分として含有する細胞死予防用食品組成物、あるいは上記抗ウイルス剤を有効成分として含有するウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物である。これらの食品組成物を含有する食品も、本発明のさらなる実施態様である。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのカスパーゼ-３阻害剤を有効成分として含有するカスパーゼ-３活性阻害用化粧品組成物、あるいは上記いずれかの細胞死予防剤を有効成分として含有する細胞死予防用化粧品組成物である。これらの化粧品組成物を含有する化粧品も、本発明のさらなる実施態様である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、新規なカスパーゼ-３阻害剤を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る一実施例で用いた化合物の構造式を表した図である。
【図２】本発明に係る一実施例において、リボフラビン及びその類縁体である、アロキサジン、ルミクローム、ルミフラビン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびリボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）がカスパーゼ-３をin vitroで阻害することを示す図である。
【図３】本発明に係る一実施例において、ＲＴＢが、濃度依存的にカスパーゼ-３の活性を阻害することを示す図である。
【図４】本発明に係る一実施例において、（Ａ）神経細胞の酸化ストレスによる細胞数の減少を、ＲＴＢが抑制すること（Ｂ）カスパーゼ-３の標的であるＰＡＲＰの切断を、ＲＴＢが抑制することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、標準的なプロトコール集に記載の公知の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１８】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝カスパーゼ活性阻害剤＝＝
下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する薬剤は、カスパーゼ-３の活性を阻害することができる。
【００２０】
【化１】
2018131410.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基、
Ｒ５は水素、または独立に水酸基がエステル化されていてもよいＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨである（ｎ＝１〜６の整数）。）
2018131410.tif 000005
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は水素またはＣ１〜６のアルキル基である。）
ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨのエステル化の種類は特に限定されないが、酪酸エステルまたはリン酸エステル化であることが好ましい。
【００２１】
具体的には、上記化合物は、アロキサジン、ルミクローム、ルミフラビン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはリボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）などが例示できる（図１）。
【００２２】
＝＝細胞死予防剤＝＝
カスパーゼ-３は、アポトーシスにおいてエフェクターとして機能するため、カスパーゼ-３を阻害することにより、細胞死を予防することができる。したがって、有効量の上記カスパーゼ活性阻害剤を、細胞死予防剤として用いることができる。
【００２３】
細胞死予防剤の投与対象となる動物に制限はないが、投与対象は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００２４】
細胞死予防剤は、投与対象の動物内で、予防対象の細胞死が起こる前に投与することが好ましい。ここで、「投与する」とは、予防に対する有効量を投与し終えることを言う。また、「予防対象の細胞死が起こる前」とは、組織に細胞死が全く生じていない状態に加え、組織の一部が既に細胞死を起こしているが、細胞死を予防できる細胞が残存している状態も含む。後者の場合、既に死した細胞周辺の健康な細胞に、細胞死が広がることを予防することによって、組織単位で細胞死の進行を抑制することができる。
【００２５】
細胞死予防剤は、アポトーシス関連疾患に対する細胞死予防剤などの医薬品（医薬及び試薬を含む）、細胞死予防用食品、細胞死予防用化粧品として用いることができる。それぞれの実施態様について詳細に後述するが、その記載は実施の一例であって、当業者がその効果を得る範囲で、自由に修正、改良できることは言うまでもない。
【００２６】
＝＝抗ウイルス剤＝＝
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは増殖に際し、カスパーゼ−３を必要とし、カスパーゼ−３なしの細胞では増殖することができない（特表２００６−５２４６４０）。従って、有効量の上記カスパーゼ活性阻害剤を、ウイルス増殖を抑制する抗ウイルス剤として用いることができる。
【００２７】
抗ウイルス剤の対象となるウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであることが好ましく、例えば、インフルエンザウイルス(Orthomyxovirus)；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV；lymphocyte choriomeningitis virus）、ラッサ熱ウイルス（Lassa fever virus）などのアレナウイルス（Arenavirus）；腎症候性出血熱を引き起こすハンタウイルス（Hantavirus）、ハンタウイルス肺症候群を引き起こすシンノンブレウイルス（Sin Nombre Hantavirus）、腎出血熱を引き起こすハンターンウイルス（Hantaanvirus）；リフトバレー熱ウイルス（Rift Valley fever virus）などのブニヤウイルス（Bunyavirus）；狂犬病ウイルス（Rabies virus）、水胞性口内炎アラゴウイルス（vesicular stomatitis Alagoas virus）などのラブドウイルス(Rhabdovirus)；麻疹ウイルス（measles virus）、流行性耳下腺炎ウイルス（mumps virus）などのパラミクソウイルス(Paramyxovirus)；エボラ出血熱を引き起こすエボラウイルス（Ebolavirus）、マールブルグ出血熱を引き起こすマールブルグウイルス（Marburgvirus）などのフィロウイルス(filovirus)が挙げられる。
【００２８】
抗ウイルス剤は、in vitroで用いるための試薬やウイルス性疾患に対する予防・治療薬などの医薬品、ウイルス性疾患に対する予防・治療用食品として用いることができる。それぞれの実施態様について詳細に後述するが、その記載は実施の一例であって、当業者がその効果を得る範囲で、自由に修正、改良できることは言うまでもない。
【００２９】
＝＝医薬＝＝
＜アポトーシス関連疾患＞
有効量の上記カスパーゼ活性阻害剤を、アポトーシス関連疾患に対する細胞死予防剤として用いることができる。
【００３０】
アポトーシス関連疾患としては、脳疾患(例えば、脳血管障害性痴呆、多発性微小脳梗塞、脳血栓症、脳梗塞、脳出血など)、神経変性疾患(アルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症など)、心血管疾患（心筋梗塞、心筋炎など）、免疫性疾患（慢性関節リウマチ・膠原病・バセドウ氏病・全身性エリテマトーデスなどの全身性または局所的な自己免疫疾患、ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)免疫不全症候群、移植片拒絶など）、肝臓病（ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変など）、全身性汎発性紅斑、インスリン依存性糖尿病、虚血性腸炎、肺疾患、皮膚筋炎、癌および他の増殖性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
＜ウイルス性疾患＞
有効量の上記抗ウイルス剤を、ウイルス性疾患の予防・治療薬として用いることができる。
【００３２】
対象とするウイルス性疾患は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスが引き起こすものが好ましく、インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、腎症候性出血熱、ハンタウイルス肺症候群、腎出血熱、リフトバレー熱、狂犬病、水胞性口内炎、麻疹、流行性耳下腺炎、ウイルス性脳炎、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱などが例示できるが、これらに限定されない。
【００３３】
＜剤形化及び投薬＞
これらの医薬の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を患者体内の患部に送達するために適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよい。
【００３４】
これらの医薬は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対し、必要量を、適した方法で投与することができる。本発明の薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。投与方法は、その剤形の医薬剤を患部に送達するために適した方法を用いればよいが、非経口投与が好ましく、例えば、患部組織に局部的に注射または塗付したり、あるいは、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射等により全身投与したりすることができるが、血管を介した投与が好ましい。
【００３５】
細胞死予防剤の場合、例えば、細胞死が血管障害（例えば、脳梗塞や心筋梗塞）により引き起こされると、その血管障害の急性期に投与されることが好ましく、例えば、血管障害発生から４．５時間以内に投与が開始されることが好ましく、３時間以内に投与が開始されることがさらに好ましい。
【００３６】
細胞死予防剤は、異なる薬剤と併用してもよい。併用する薬剤は、必ずしも時間的に同時に投与する必要はなく、同時に作用するように投与されるのであれば、時間を前後して投与しても構わず、投与方法も異なっていても構わない。また、併用する複数の薬剤は、単剤であってもよく、複合剤であってもよい。
【００３７】
併用する薬剤は特に限定されないが、抗がん剤であることが好ましく、フルオロウラシル系薬剤であることがより好ましい。フルオロウラシル系薬剤としては、５-フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びそのプロドラッグが例示でき、プロドラッグとしては、オテラシルカリウム・ギメラシル・テガフール配合剤（商品名：ティーエスワン（ＴＳ-１））、ウラシル・テガフール配合剤（商品名：ユーエフティ（ＵＦＴ））、ドキシフルリジン（商品名：フルツロン）、テガフール（商品名：フトラフール、サンフラール、ルナシン、テフシールなど）、カペシタビン（商品名：ゼローダ）などが挙げられる。これは、腫瘍組織が薬剤耐性の高い細胞と低い細胞の混合状態である場合、５−ＦＵなどの抗がん剤が薬剤耐性の低い細胞にアポトーシスを誘導すると、その細胞から周囲の細胞に増殖シグナルが出されて、周囲にある薬剤耐性の高い細胞の増殖を促すことがあり、このとき、カスパーゼ-３阻害剤を加えておくと、アポトーシスを抑制することができ、５−ＦＵが効率よく作用するからである（Flanagan, L. et al. 2016 Cell Death Dis. vol.7 e2087）。
【００３８】
ウイルス性疾患に対する抗ウイルス剤は、予防にも治療にも使用できる。予防の目的である場合、ウイルスに感染する前から服用する。また、治療の目的である場合、ウイルス感染の症状があらわれてから４８時間以内に服用を始めることが好ましい。
【００３９】
＝＝食品＝＝
有効量の上記カスパーゼ活性阻害剤を、カスパーゼ-３活性阻害用食品組成物として用いることができる。また、有効量の上記細胞死予防剤を、アポトーシス関連疾患に対する細胞死予防用食品組成物として用いることができるし、有効量の上記抗ウイルス剤を、ウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物として用いることができる。そして、カスパーゼ活性阻害用食品組成物、細胞死予防用食品組成物、あるいはウイルス性疾患の予防・治療用食品組成物を食品に含有させることにより、それぞれの効果を有する食品を製造することができる。
【００４０】
本明細書で言及される食品は、健康食品や機能性食品を含み、特定保健用食品や栄養機能食品などの保険機能食品であっても一般食品であってもよい。また、補助食品、特に栄養補給を主な目的とする補助食品であるサプリメントであってもよく、栄養補助食品や健康補助食品や機能性補助食品であってもよい。これらは、ヒト用であっても、ヒト以外の哺乳動物用であっても、ヒト以外の脊椎動物用であっても、ヒト以外の動物用であってもかまわない。
【００４１】
これらの食品の摂取方法は特に限定されない。例えば、日常的に細胞死予防用食品組成物をサプリメントとして摂取することにより、突発的に生じる脳梗塞などの際の神経細胞における細胞死の広がりを予防することができる。また、日常的に抗ウイルス用食品組成物をサプリメントとして摂取することにより、インフルエンザなどの上記ウイルス性疾患を予防することができ、感染した場合でも、悪化を防止することができる。
【００４２】
＝＝化粧品＝＝
有効量の上記カスパーゼ活性阻害剤を、カスパーゼ-３活性阻害用化粧品組成物として用いることができる。また、有効量の上記細胞死予防剤を、アポトーシス関連疾患に対する細胞死予防用化粧品組成物として用いることができる。そして、カスパーゼ活性阻害用化粧品組成物または細胞死予防用化粧品組成物を化粧品に含有させることにより、それぞれの効果を有する化粧品を製造することができる。
【００４３】
例えば、紫外線、活性酸素、物理的刺激、高齢化などによって、皮膚細胞や筋肉細胞にアポトーシスが誘導されることが知られている。この化粧品は、皮膚組織や筋肉組織におけるアポトーシスの予防によって、皮膚や筋肉の損傷や衰えの予防に用いることができる。
【００４４】
細胞死予防用化粧品の製造には、当業者に周知の生理学的に許容される担体が用いられる。その形態は本医薬剤を患者体内の患部に送達するために適切な剤形であれば特に特定されず、化粧品の形態としては、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム、シャンプー、リンス、整髪料等のスキンケア用品またはメイクアップ用品とすることができるが、これらに限定されない。これらの化粧品は、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］
本実施例では、リボフラビン及びその類縁体である、アロキサジン、ルミクローム、ルミフラビン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびリボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）がカスパーゼ-３をin vitroで阻害することを示す。
【００４６】
まず、ヒト・リコンビナント・カスパーゼ-３（メルクミリポア社）を、添付のバッファーに１００Ｕ／μＬになるように溶解した。そして、カスパーゼ-３によって切断されることにより化学発光を生じる基質であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１００ｍＭになるように溶解した。被検化合物はそれぞれＤＭＳＯに１００ｍＭになるように溶解した。
【００４７】
アッセイフォーマットは黒色の平底の９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング社）上に構成した。ヒト・リコンビナント・カスパーゼ-３を終濃度１Ｕ／μＬで添加し、２μＬの阻害剤を終濃度１０μＭとなるように添付バッファー中に溶解し、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡは終濃度５０μＭとなるように加えて全量が１００μＬとなるようにした。
【００４８】
混合後、３７℃で５分ごとに経時的に励起光３９０ｎｍに対する４６０ｎｍの蛍光を測定し、グラフをプロットし、そのグラフの傾きを求めた。一方、コントロールとして、被検化合物を含まないＤＭＳＯを用いたときのグラフの傾きを同様に求め、被検化合物の阻害活性（％）＝（目的化合物のウエルに対するグラフの傾き）／（コントロールウエルに対するグラフの傾き）×１００として算出し、グラフ化した。
【００４９】
その結果、図２に示すように、リボフラビン及び全てのリボフラビン類縁体がカスパーゼ-３阻害活性を示した。特にリボフラビンとリボフラビン４酪酸エステルは高い阻害活性を示した。
【００５０】
［実施例２］
本実施例では、リボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）が、濃度依存的にカスパーゼ-３の活性を阻害することを示す。
【００５１】
ＲＴＢの濃度を各濃度（０．１、０．３、１，３、１０、３０、１００μＭ）に代えた以外は、他は実施例１と同様の方法でＲＴＢのカスパーゼ-３阻害活性を測定した。
【００５２】
その結果、図３に示すように、ＲＴＢは濃度依存的にカスパーゼ-３の活性を阻害した。このことは、カスパーゼ-３の活性阻害がＲＴＢ特異的に生じていることを示す。
【００５３】
［実施例３］
本実施例では、リボフラビン酪酸エステル（ＲＴＢ）が、細胞のアポトーシス阻害効果を有することを示す。
【００５４】
＜細胞死の抑制＞
まず、神経細胞の酸化ストレスによる細胞数の減少を、ＲＴＢが抑制することを示す。
【００５５】
３５ｍｍ径の細胞培養シャーレ（住友ベークライト株式会社）または６ウエル細胞培養プレート（ＩＷＡＫＩ）を用いてヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ）を５×１０５細胞、２ｍＬのＨｕｍ’ｓ  Ｆ−１２／ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）１：１混合培地（それぞれ和光純薬工業株式会社）に終濃度１０％のＦＢＳ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と規定量のペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬工業株式会社）を加えた培地で培養した。３２時間培養後、３μＭまたは１０μＭのＲＴＢを培地に添加し、１６時間培養した。なお、コントロールとして、ＲＴＢ無添加の培地を使用した。その後、培地を２００μＭの過酸化水素を含む培地に交換して６時間培養し、細胞死を誘導した。その後、以下のように細胞を回収した。まず、培地上清を回収し、１ｍＬのリン酸緩衝液で細胞を洗浄して洗浄液を回収し、培地上清と合わせた。回収液をＨＩＴＡＣＨＩｈｉ−ｍａｃ  ＣＲ２１（株式会社日立製作所）で遠心分離し、沈澱した細胞Ａを回収した。一方、プレートにはアキュターゼ（ナカライテスク株式会社）１ｍＬを加えて３分間処理し、細胞をプレートから剥離させて、細胞懸濁液Ｂを回収した。この細胞懸濁液Ｂを沈殿した細胞Ａに加え、ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉ−ｍａｃＣＦ１５Ｒで４℃、５０００回転（２３８６×ｇ）で５分間遠心した。上清を除き、沈澱した細胞を１×ＰＢＳ１ｍＬにて再懸濁した。得られた細胞懸濁液Ｃのうち１０μＬに１０μＬのトリパンブルー溶液（和光純薬工業株式会社）を添加して混合し、ＴＣ−２０セルカウンター（ＢｉｏＲａｄ社）により死細胞数（ブルーに染まっているもの）及び生細胞数（ブルーに染まっていないもの）をそれぞれ計測した。
【００５６】
その結果、図４Ａに示すようにＲＴＢが無添加であるコントロールは４０％程度の細胞死が引き起こされたが、ＲＴＢを３、１０μＭと加えることによって、それぞれ１０％、２０％の細胞死の抑制が見られた。
【００５７】
＜ＰＡＲＰ切断の抑制＞
次に、ウエスタン・ブロッティングでＰＡＲＰ（Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を検出することにより、カスパーゼ-３の標的であるＰＡＲＰの切断を、ＲＴＢが抑制することを示す。
【００５８】
細胞懸濁液ＣをＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉ−ｍａｃＣＦ１５Ｒで遠心し、沈澱した細胞に５×１０３細胞／μＬとなるようにＲＩＰＡバッファー（ＳＩＧＭＡ社）を添加して、細胞を溶解させた（細胞抽出液Ｄ）。得られた細胞抽出液Ｄの１５μＬに対し、ＲＩＰＡバッファーを２５μＬ、ローディングダイ（Ｔｒｉｓ９８．３ｍＭ、ＳＤＳ３．１１９％、ｇｌｙｃｅｒｏｌ１０％、ブロモフェノールブルー２５ｍｇ／ｍＬ、いずれも終濃度）を２０μＬ加え、１００℃のヒートブロック（ニッポンジーン）上で１０分間インキュベートし、ローディングサンプルとした。そのうち２０μＬ（２．５×１０４細胞／レーン）を１２．５％のプレキャストゲル（ナカライテスク）にロードし、定電流２０ｍＡで８０分間電気泳動した。ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社）に、定電圧１００Ｖで６０分間トランスファーした。そして、ブロッキング剤（ナカライテスク社）でブロッキングを行った後、抗ＰＡＲＰ抗体（セルシグナリング社、１／１０００希釈）を１次抗体とし、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社、１／１００００希釈）を２次抗体として、抗原抗体反応を行った。抗体が結合したＰＶＤＦ膜に対してウエスタンブロット検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、およびＢｉｏＲａｄ社のＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰを用いて、ケミルミネッセンスを検出した。シグナルは同機材付属のソフトウェアＩｍａｇｅＬａｂを用いて数値化を行った。
【００５９】
その結果、図４Ｂに示すように、３または１０μＭのＲＴＢを添加した群では、ＰＡＲＰの切断がそれぞれ２０％または５０％抑制されていた（図４Ｂ）。このように、ＲＴＢは細胞内でＰＡＲＰの切断を抑制する。
【００６０】
以上２つの結果で示されたように、ＲＴＢは神経細胞の酸化ストレスによる細胞死を、カスパーゼ-３阻害作用によって抑制することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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