(57)【要約】【課題】糞便中の核酸を高感度で、簡単、簡便、迅速に検出できる核酸クロマトグラフィーによる遺伝子検査方法を提供する。【解決手段】糞便中の標的核酸を検出する方法であって、糞便試料と陰イオン性界面活性剤とを混合して懸濁液を調製する前処理工程、該懸濁液中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅させる増幅工程、および、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて、増幅された該標的核酸を検出する検出工程を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便中の標的核酸を検出する方法であって、
糞便試料と陰イオン性界面活性剤とを混合して懸濁液を調製する前処理工程、
該懸濁液中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅させる増幅工程、および、
核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて、増幅された該標的核酸を検出する検出工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前処理工程の後かつ増幅工程の前に、該懸濁液を加熱処理し、加熱処理後の懸濁液を遠心分離に供し、標的核酸を含む上清液を得る工程を更に含み、
増幅工程において、該上清液が核酸増幅反応に用いられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
陰イオン性界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
核酸増幅反応が、該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤が、Tween20、Tween60、Tween80、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸が、サルモネラ菌、赤痢菌、大腸菌、またはカンピロバクター属菌に由来する核酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸を精製する工程が行われない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン性界面活性剤と、核酸増幅用試薬と、核酸クロマトグラフィー用ストリップとを含む、糞便中の標的核酸の検出用キット。
【請求項１０】
陰イオン性界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤を更に含む、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤が、Tween20、Tween60、Tween80、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
標的核酸が、サルモネラ菌、赤痢菌、大腸菌、またはカンピロバクター属菌に由来する核酸である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトや動物の糞便中の核酸の検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物の糞便から細菌を検出することによる感染症の検査が行われている。検査方法としては、細菌を培養する培養法や、ＤＮＡを含む核酸を増幅する遺伝子検査が検査の現場や試験センターなどにおいて一般に用いられている。培養法では、特定の細菌のみが増殖可能である選択培地を用いて培養を行い、形成されるコロニーを確認する。遺伝子検査では、増幅した断片を電気泳動やマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲなどにより確認する。
【０００３】
しかしながら、これらの方法にはいくつかの問題点がある。培養法では、必ず細菌の増殖が必要となり、数日の時間を要することになる。更に、糞便より採取した後に細菌が死滅した場合にはコロニーが形成されず、誤判定となる。また、リアルタイムＰＣＲでは、高感度の検出ができる一方で、初期導入費用が高く、更には検出するための高度な技術が要求される。そのため、費用が安く、簡単、簡便、迅速な検査方法が求められている。
【０００４】
一方、ＰＣＲ反応前に陰イオン性界面活性剤を用いて阻害物質を除去し、更に非イオン性界面活性剤を用いて陰イオン性界面活性剤のＰＣＲ阻害を抑制する方法が報告されている（非特許文献１）。また、当該方法をリアルタイムＰＣＲを用いた糞便由来の食中毒菌検出方法に適用したことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】水環境学会誌, Vol.31, No.9, pp.565-568 (2008)
【非特許文献２】第36回 日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集, pp.122  (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
簡単、簡便、迅速な検査としては、核酸クロマトグラフィーを用いる技術が存在する。この技術は、抽出した遺伝子を、タグを持つプライマーによってＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を用いてクロマトグラフィーによる検出を行う技術である。簡単かつ簡便な方法であるため、高度な取得技術を必要とせず、高額な装置を導入する必要もない。迅速に反応を行うことができるため、現場にも導入しやすいメリットがある。
【０００７】
しかしながら、核酸クロマトグラフィーによる検出は、簡単、簡便、迅速な反応を可能にする一方、高精度や高感度の反応ができないといった欠点がある。更に、糞便系由来のサンプルは汚染されており、ＰＣＲ反応を行う上で抽出、精製の工程を必須とするという問題点がある。
【０００８】
よって、本発明は、糞便中の核酸を高感度で、簡単、簡便、迅速に検出できる核酸クロマトグラフィーによる遺伝子検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従来、糞便の遺伝子検査では、糞便乳剤を作製した後、細菌の破壊、溶出の処理を行い、核酸増幅を行っている。その際に、核酸の精製を行い、不純物を除き核酸濃度を高める工程が存在している。これに対し、本発明によれば、細菌の破壊、溶出の効率性を高めるために、増幅反応前の前処理の工程で界面活性剤を使用することで、細菌の膜を破壊すると同時に不要なタンパク質を変性させることができる。この処理により、核酸の精製を行わず、工程の短縮化および高感度の検出を実現し、従来技術の問題点や欠点を解決することができる。
【００１０】
本発明は即ち、以下を提供する。
［１］糞便中の標的核酸を検出する方法であって、
糞便試料と陰イオン性界面活性剤とを混合して懸濁液を調製する前処理工程、
該懸濁液中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅させる増幅工程、および、
核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて、増幅された該標的核酸を検出する検出工程
を含む、前記方法。
［２］前処理工程の後かつ増幅工程の前に、該懸濁液を加熱処理し、加熱処理後の懸濁液を遠心分離に供し、標的核酸を含む上清液を得る工程を更に含み、
増幅工程において、該上清液が核酸増幅反応に用いられる、
［１］に記載の方法。
［３］陰イオン性界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］核酸増幅反応が、該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤の存在下で行われる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤が、Tween20、Tween60、Tween80、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドからなる群から選択される少なくとも１つである、［４］に記載の方法。
［６］標的核酸が、サルモネラ菌、赤痢菌、大腸菌、またはカンピロバクター属菌に由来する核酸である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］該核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］核酸を精製する工程が行われない、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］陰イオン性界面活性剤と、核酸増幅用試薬と、核酸クロマトグラフィー用ストリップとを含む、糞便中の標的核酸の検出用キット。
［１０］陰イオン性界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムである、［９］に記載のキット。
［１１］該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤を更に含む、［９］または［１０］に記載のキット。
［１２］該陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤が、Tween20、Tween60、Tween80、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、オクチルグルコシド、およびオクチルチオグルコシドからなる群から選択される少なくとも１つである、［１１］に記載のキット。
［１３］標的核酸が、サルモネラ菌、赤痢菌、大腸菌、またはカンピロバクター属菌に由来する核酸である、［９］〜［１２］のいずれか１項に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、糞便中の核酸を高感度で、簡単、簡便、迅速に検出できる核酸クロマトグラフィーによる遺伝子検査方法、および当該方法に用いるためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】Salmonella Enteritidisの検出試験の結果を示す。
【図１−２】核酸クロマトを用いたSalmonella Enteritidisの検出結果を示す。
【図２−１】S. sonneiの検出試験の結果を示す。
【図２−２】核酸クロマトを用いたS. sonneiの検出結果を示す。
【図３−１】O157-sakaiの検出試験の結果を示す。
【図３−２】核酸クロマトを用いたO157-sakaiの検出結果を示す。
【図４−１】S.typhimuriumの検出試験の結果を示す。
【図４−２】核酸クロマトを用いたS.typhimuriumの検出結果を示す。
【図５−１】S.stanleyの検出試験の結果を示す。
【図５−２】核酸クロマトを用いたS.stanleyの検出結果を示す。
【図６−１】S.dysenteriaeの検出試験の結果を示す。
【図６−２】核酸クロマトを用いたS.dysenteriaeの検出結果を示す。
【図７−１】S.flexineriの検出試験の結果を示す。
【図７−２】核酸クロマトを用いたS.flexineriの検出結果を示す。
【図８−１】S.boydiiの検出試験の結果を示す。
【図８−２】核酸クロマトを用いたS.boydiiの検出結果を示す。
【図９−１】O111の検出試験の結果を示す。
【図９−２】核酸クロマトを用いたO111の検出結果を示す。
【図１０−１】O26の検出試験の結果を示す。
【図１０−２】核酸クロマトを用いたO26の検出結果を示す。
【図１１】SDBSおよびTween20の有無での核酸クロマトおよびリアルタイムPCRによるO157-sakai株の検出の比較実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、糞便中の標的核酸を検出する方法（以下、本発明の方法ともいう。）を提供する。本発明の方法は、
糞便試料と陰イオン性界面活性剤とを混合して懸濁液を調製する前処理工程、
該懸濁液中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅させる増幅工程、および、
核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて、増幅された該標的核酸を検出する検出工程
を含む。本発明の方法は、好ましくは、核酸を精製する工程を含まない。
【００１４】
本発明において、糞便試料の由来となる動物種は限定されず、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類（例えば、鶏など）、哺乳動物などであってよい。該動物は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の種類は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができ、好ましくはヒトである。
【００１５】
標的核酸は、検出の対象とするものであって、その種類は特に限定されない。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。好ましい実施形態において、標的核酸は、感染症を生じる病原体に由来する核酸である。該病原体は、糞便中に存在する可能性があるものであれば限定されず、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫などであってよい。
病原性ウイルスとしては、ノロウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、コロナウイルスなどが挙げられる。
病原性真菌としては、クリプトコッカス属菌、カンジダ属菌、アスペルギルス属菌などが挙げられる。
寄生虫としては、回虫、蟯虫、鉤虫、アニサキス、肝吸虫などが挙げられる。
【００１６】
また、標的核酸は、１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。本発明の一つの実施形態によれば、複数の標的核酸をマルチプレックスの核酸増幅反応により増幅させ、増幅された該複数の標的核酸を一括に検出してもよい。
【００１７】
（前処理工程）
前処理工程では、糞便試料と陰イオン性界面活性剤とを混合して懸濁液を調製する。好ましい実施形態において、懸濁液は、後述の増幅工程に用いられる反応容器（例えば、ＰＣＲ用のチューブ）中に調製される。
糞便試料は、検査の対象とする糞便を含むものであれば特に限定されない。糞便試料は、固形の糞便であってもよいし、糞便を含む懸濁液であってもよい。
陰イオン性界面活性剤は、その溶液の形態で提供されてもよいし、または固体（乾燥形態）として提供されてもよい。溶液の形態の場合、該溶液は、本発明の方法による標的核酸の検出を有意に阻害しない限り任意の溶液であってよく、好ましくは、緩衝作用を有する液体（緩衝液）である。陰イオン性界面活性剤は、本発明の方法による標的核酸の検出に用いることができる限り特に限定されない。陰イオン性界面活性剤は、好ましくは、検出の対象とする細菌、ウイルス、真菌、寄生虫などの膜を破壊すると共に、タンパク質を変性させる作用を有する。陰イオン性界面活性剤の具体例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（SDBS）、ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）などが挙げられる。陰イオン性界面活性剤の量は、用いる陰イオン性界面活性剤の種類などによっても異なるが、上記混合後の懸濁液中の当該濃度が例えば０．０１〜５％、好ましくは０．１〜３％となるものであってよい。
【００１８】
好ましい実施形態において、前処理工程の後かつ後述の増幅工程の前に、上記懸濁液を加熱処理し、加熱処理後の懸濁液を遠心分離に供する処理が行われる。加熱処理の前に、上記懸濁液中の糞便を竹串などでピックして破砕する処理を行ってもよい。加熱処理の条件は、用いる陰イオン性界面活性剤などによっても異なるが、例えば８０〜１００℃で３〜１０分間程度、好ましくは９０〜１００℃で５〜１０分間程度行う。加熱処理により、核酸増幅反応の阻害要因となる酵素や、タンパク質が失活され得る。加熱処理後、例えば１００００〜１５０００Ｇで３〜１０分間程度遠心分離を行うことにより、核酸を含む上清液を得る。この上清液を後述の核酸増幅反応のサンプルとして用いることができる。該上清液を得た同じ反応容器を後述の核酸増幅反応に用いることができる。
【００１９】
（増幅工程）
増幅工程では、懸濁液中の標的核酸を核酸増幅反応により増幅させる。核酸増幅反応の方法としては、標的核酸を増幅できるものである限り制限されない。本明細書において、標的核酸の増幅とは、必ずしも標的核酸（例えば標的遺伝子）の全体を増幅するものでなくてもよく、少なくとも該核酸の検出対象領域を増幅できればよい。核酸増幅反応のための方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法のみならず、それを基にした各種改良法を含む。）、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＣＬＲ（Cycling Ligation Reaction；特開2016-140287、特開2016-140288に記載の技術）法などを用いることができる。ＰＣＲ法は最も広く用いられている核酸増幅法であることから当該方法に最適化された様々な試薬や機器が容易に入手できるだけでなく、上記の通り様々なバリエーションの方法があり、汎用性が極めて高いため、本発明のために好適な手法として挙げられる。
【００２０】
核酸増幅用の試薬混合液の組成は、使用する核酸増幅法によって多少異なるが、通常は核酸増幅反応用プライマーセットと、基質としてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、をバッファー中に含むことを基本とする。また、核酸増幅反応において偽陽性や偽陰性を防ぐために、該混合液は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）などの試薬を含んでもよい。各ｄＮＴＰの濃度は、終濃度が２０〜４００μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。ＤＮＡポリメラーゼは、用いる核酸増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＰＣＲ法であれば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、その他バイオサイエンス関連の各社により開発されたもの等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１〜６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００２１】
核酸増幅反応用プライマーセットに含まれる増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸や修飾核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が１０ｎＭから２μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。増幅プライマーの数は、標的核酸を増幅可能であれば特に問わない。増幅プライマーの塩基数は、好ましくは１５〜６０塩基であり、より好ましくは２５〜４０塩基である。ただし、増幅プライマーの増幅に関係しないタグ領域の配列は塩基数として含まない。増幅プライマー間の距離、即ち検出領域は通常５０〜５０００塩基の範囲であり、好ましくは１００〜２０００塩基である。増幅プライマーの配列は、検出領域を前記核酸増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が通常５０℃から７５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６８℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu）等を用いてもよい。
【００２２】
上記のバッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する核酸増幅法によっては、更にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、各核酸増幅法に用いるための様々なタイプのキットが市販されており、本工程における核酸増幅反応はそのような市販のキットを用いて行ってもよい。
【００２３】
核酸増幅反応のテンプレートを含むサンプルとして、上記懸濁液、好ましくは上記懸濁液の加熱遠心後の上清液が核酸増幅用の試薬混合液と混合される。容量比として、試薬混合液に対して５〜５０％程度、より好ましくは１０〜３０％の上記懸濁液もしくは上清液を混合することが好ましい。
【００２４】
ＰＣＲを含む核酸増幅反応の条件、操作等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。また、核酸増幅反応は、市販の機器や試薬を用い、その説明書に従って行うことができる。
【００２５】
好ましい実施形態において、核酸増幅用の試薬混合液は、前処理工程に用いた陰イオン性界面活性剤を失活させるための界面活性剤を含む。これにより、陰イオン性界面活性剤が有し得る増幅反応阻害作用を抑制することができる。このための界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤を用いることが用いることができる。非イオン性界面活性剤としては、Tween系界面活性剤（例えば、Tween20、Tween60、Tween80など）、Triton系界面活性剤（例えば、Triton X-100、Triton X-114など）、NP-40、Brij-35、Brij-58、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシドなどが好ましく用いられる。上記懸濁液もしくは上清液との混合後の反応液中の該界面活性剤の濃度は、例えば０．１〜１０％、好ましくは１〜５％であってよい。
【００２６】
（検出工程）
検出工程では、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いて、増幅された標的核酸を検出する。本発明の方法では、核酸クロマトグラフィー用ストリップを用いることにより、ＰＣＲ法などに用いた反応液をそのまま利用し、核酸増幅の有無を迅速かつ簡便に確認できる。
【００２７】
本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、クロマトグラフィーを用いて標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸を含むクロマトグラフィー溶液を、特定の領域に検出用プローブを固定した固相担体の内部または表面上を展開させて、標的核酸と検出用プローブとのハイブリダイズ産物を形成させ、ハイブリダイズ産物を検出することを含む。ハイブリダイズ産物の検出は、展開に先立って（例えば、核酸増幅時に）または展開の際に、標的核酸に対して付与したシグナル要素を利用して行う。核酸クロマトグラフィーとして、例えば、特開2014-018150、特開2013-059319、特開2013-059320、特開2013-059321、特開2014-057565、特開2014-079260、特許第5503021号などに記載の技術を用いることができる。核酸クロマトグラフィーの実施形態は特に限定されず、ほぼ水平状態での展開を意図したいわゆるラテラルフロー型であってもよいし、ほぼ鉛直方向での展開を意図したいわゆるディップスティック型であってもよい。
【００２８】
本明細書において、検出用プローブを固定した上記の固相担体をストリップと呼称する。ストリップは従来公知のものを用いることができる。例えば、ストリップの基材はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、ストリップに固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。また、代表的なストリップとしては、ＴＢＡ社製の商品Ｃ-ＰＡＳがあげられる。このストリップは、幅２ｍｍ×長さ１０ｃｍ程度の検査試験紙であり、表面のニトロセルロース膜上に核酸をプローブとしてプリントしたものである。このプローブと相補的にハイブリダイゼーションするタグを持つプライマーをセットで用いることで核酸の検出が可能となる。
【００２９】
（キット）
本発明はまた、本発明の方法に用いるためのキット（以下、本発明のキットともいう。）を提供する。本発明のキットは、少なくとも、陰イオン性界面活性剤、核酸増幅用試薬、および核酸クロマトグラフィー用ストリップを含む。好ましい実施形態において、本発明のキットは、該陰イオン性界面活性剤を更に含む。本発明のキットに含まれる各構成要素の実施形態は、好ましい態様も含めて本発明の方法に関して上述した通りである。
例えば、陰イオン性界面活性剤は、その溶液の形態で提供されてもよいし、または固体（乾燥形態）として提供されてもよい。本発明のキットは、陰イオン性界面活性剤のための溶媒を更に含んでもよい。
核酸増幅用試薬は、上述した核酸増幅反応に用いるための少なくとも１の試薬を含んでいればよいが、好ましくは、上述したような、プライマーセット、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、マグネシウムイオン、およびバッファーを含む。また、核酸増幅用試薬は、上述したＵＮＧを含んでいてもよい。使用時に、上記の陰イオン性界面活性剤も核酸増幅用の試薬混合物中に添加され得る。
本発明のキットは、核酸クロマトグラフィーに用いるための展開液を更に含んでもよい。
その他に、本発明のキットは本発明の方法を行うために用い得る任意の構成要素を含むことができる。
【００３０】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
試験例1
本発明の方法による簡易クロマト試験を用いた糞便由来の核酸の検出を以下の手順で行った。比較のためにリアルタイムＰＣＲ試験および培養法試験も行った。以下、これらの順序に従って説明する。
【００３２】
1. 前処理
1-1. 糞便乳剤の調整 (5%糞便乳剤)
1-2. 細菌の混合
1-3. 糞便乳剤の採取
2. 試験
2a. 簡易クロマト試験
2b. リアルタイムPCR試験
2c. 培養法試験
【００３３】
1. 前処理
1-1. 採取した便を、滅菌水を用いて調整し、5%糞便乳剤を作製した。
1-2. 5%糞便乳剤を1 g採取し、各接種用菌液を0.1 mlずつ接種して良く混合した。
(糞便検体中の各対象菌濃度は、0, 10, 102, 103, 104, 105, 106 CFU/gにした。)
1-3. 菌液を接種した糞便乳剤0.2 gをエッペンドルフチューブに採取し、これをサンプルとした。
(核酸クロマト用(x3)、リアルタイムPCR用(x3)、培養法用(x1)に分注した。)
なお、実際の患者の糞便由来の細菌を用いることは個人情報保護の観点からできないので、健常人の糞便に菌を混ぜ込み、細菌に汚染された便とみなして実験を行った。
【００３４】
2. 試験
2a. 簡易クロマト試験
2a-1. 1-3のサンプルの便液に終濃度が0.5%となるように5% SDBSを添加した (200 μlの便液に22 μlの5% SDBS液を添加した)。
2a-2. 100℃で10分間インキュベートした。
2a-3. 12,000 rpmで3分間遠心した。
2a-4. PCR反応を行った。反応条件を下記表１に示す。表１においてMultiplex PCR kitとしては核酸クロマト GeneFields-Meat (Cat# GF-1)を用いた。
【００３５】
【表１】
2018121584.tif 000002
【００３６】
2a-5. 核酸クロマト解析
表２の混合物を1.5 mlチューブに添加した。混合液に50℃のヒートブロックで1分間インキュベートした。1分後に核酸クロマトをチューブに入れ、クロマト反応を40分間行った。
【００３７】
【表２】
2018121584.tif 000003
【００３８】
2b. リアルタイムPCR試験
2b-1. 95℃で5分間インキュベートした。
2b-2. 12,000 rpmで5分間遠心した。
2b-3. PCR反応を行った。反応条件を下記表３−５に示す。PCR反応には、各表中に示す市販のキットを添付の説明書に従って用いた。
【００３９】
【表３】
2018121584.tif 000004
【００４０】
【表４】
2018121584.tif 000005
【００４１】
【表５】
2018121584.tif 000006
【００４２】
2c. 培養法試験
2c-1. 0.2 g (およそ200 μl)の便液に1800 μlの生理食塩水を加えた。
2c-2. 選択培地を用いて培養を行った。
【００４３】
比較評価のために、下記の10菌株を用いた。
サルモネラ3株 (1. S. Enteritidis、2. S. Typhimurium、3. S. stanley)
赤痢菌4株 (1. S. sonnei、2. S. dysenteriae、3. S. flexineri、4. S. boydii)
腸管出血性大腸菌 (EHEC) 3株 (1. O157、2. O111、3. O26)
上記菌株のうち、リアルタイムPCRを用いた試験にはS. Enteritidis、S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexineri、O157の5株のみを用いた。
【００４４】
結果を図1-10に示す。
【００４５】
試験例2
核酸クロマトおよびリアルタイムPCRによる検出をSDBSおよびTween20の有無の4通りで実施した。菌株としてO157-sakai株を用い、リアルタイムPCRについて上記タカラバイオ社製のキットを用いた。実験の手順は試験例1に準じた。
【００４６】
結果を図11に示す。
【００４７】
以上の結果が示すように、本発明の技術によって、従来の界面活性剤を用いない方法と比較した場合、菌の種類によって異なるが、総じて10-1000倍の感度の向上が見られた。本方法を用いることで、培養法と同等以上の検出感度が得られることが分かった。
また、本方法を用いることで、リアルタイムPCR法と同等の検出感度が得られることが分かった。試験例２の結果が示すように、核酸クロマトのデータは、界面活性剤の有無で102の検出感度の差異が見られたのに対し、リアルタイムPCRのデータは、界面活性剤の有無で効果の差異が見られなかった。リアルタイムPCRについては、そもそもの精度が上限にまで達していた可能性がある。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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