(57)【要約】【課題】肝機能不全の未病の検出を補助する方法を提供すること【解決手段】生体から採取した体液の、下記(1)及び(2)に示す少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する。(1)  BAG6、FAM104A、GMPR、PIM1、RAD23A、RPIA、STOM、TESC及びTSPAN5、 (2)  ARHGAP30、CAST、CALM2、CIRBP、CORO1A、DNAJB1、RSRP1、VIM、CCNDBP1、CD164、CD48、EIF2S1、IFIT2、IFIT3、IGSF6、ISCA1、RAB8B及びSUPT4H1。(1)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが増加していること、及び／又は上記(2)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが減少していることが肝機能不全の未病であることを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した体液中の、下記(1)及び(2)に示す少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む、肝機能不全の未病の検出を補助する方法であって、
(1)  BAG6、FAM104A、GMPR、PIM1、RAD23A、RPIA、STOM、TESC及びTSPAN5
(2)  ARHGAP30、CAST、CALM2、CIRBP、CORO1A、DNAJB1、RSRP1、VIM、CCNDBP1、CD164、CD48、EIF2S1、IFIT2、IFIT3、IGSF6、ISCA1、RAB8B及びSUPT4H1
上記(1)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが増加していること、及び／又は上記(2)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが減少していることが肝機能不全の未病であることを示す、方法。
【請求項２】
BAG6、FAM104A、GMPR、PIM1、RPIA、TESC、TSPAN5、ARHGAP30、CAST、CALM2、CIRBP、CORO1A、DNAJB1、RSRP1、VIM、CD164、CD48、IGSF6、ISCA1、RAB8B及びSUPT4H1から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
CAST、CIRBP、CORO1A、VIM、CD164、EIF2S1、ISCA1及びSUPT4H1から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記体液が血液である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の発現レベルは、mRNA量を測定することにより測定される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記体液がヒト由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝機能不全の未病の検出を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「未病」は、まだ病気になってはいないが、健康でもない、病気と健康の中間状態である。未病を検出することができれば、未病の段階で対策が可能となり、病気を予防することが可能となる。したがって、未病を検出できることは、予防医学において非常に重要である。
【０００３】
しかしながら、これまで、未病を検出する方法は全く知られていない。
【０００４】
一方、クワの葉（以下、「桑葉」と呼ぶ）は、デオキシノジリマイシン、ケルセチン、ケンフェロール等を含み、古くは鎌倉時代から健康茶として飲み継がれてきた。桑葉には、脂質代謝異常改善効果、糖質代謝異常改善効果、血圧抑制効果、線溶系活性化効果、変異原性抑制効果、抗酸化能があることが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。また、桑葉を摂取することにより、AST、ALT及びγ-GTPのような各種肝機能マーカーの数値が改善されることが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kobayashi Y. et al., Biosci Biotechnol Biochem. 74, 2385-2395 (2010)
【非特許文献２】Kobayashi Y. et al., Journal of Pharmacognosy & Natural Products (2016)
【非特許文献３】小笹  牧子他、NMCC共同利用研究成果報文集12 (2004) pp.193-196
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、肝機能不全の未病の検出を補助する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
桑葉は、上記のような効果を発揮することが確認されており、桑葉を摂取することにより、各種肝機能マーカーの数値が改善されることも知られている。本願発明者らは、ラットに桑葉又は桑葉を含まないプラセボを摂取させ、桑葉摂取群でのみ発現変動する遺伝子及びプラセボ摂取群でのみ発現変動する遺伝子を抽出し、さらにヒト介入試験を行い、桑葉摂取によって、遺伝子発現が顕著に変動している２７種類の遺伝子を同定した。さらに、肝機能マーカーの数値がほとんど変化しないヒトの血液中の、上記遺伝子の発現量を調べ、桑葉摂取により発現が増加する遺伝子と減少する遺伝子を、２０種類、特には８種類見出した。そして、これらの２７種類、２０種類又は８種類の遺伝子のいずれかの発現レベルを測定することにより肝機能不全の未病を検出可能であることに想到し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、生体から採取した体液の、下記(1)及び(2)に示す少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む、肝機能不全の未病の検出を補助する方法であって、
(1)  BAG6、FAM104A、GMPR、PIM1、RAD23A、RPIA、STOM、TESC及びTSPAN5
(2)  ARHGAP30、CAST、CALM2、CIRBP、CORO1A、DNAJB1、RSRP1、VIM、CCNDBP1、CD164、CD48、EIF2S1、IFIT2、IFIT3、IGSF6、ISCA1、RAB8B及びSUPT4H1
上記(1)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが増加していること、及び／又は上記(2)に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが減少していることが肝機能不全の未病であることを示す、方法、を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、肝機能不全の未病の検出を補助する方法が初めて提供された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記のとおり、本発明の方法では、生体から分離された体液中の、上記(1)及び(2)に示す少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む。好ましい体液としては、血液（全血、血清、血漿を包含する）を挙げることができる。また、これらの遺伝子は、少なくともほとんどの哺乳動物に共通に存在する遺伝子であり、「生体」も、これらの遺伝子を持つ動物であれば特に限定されないが、ヒトが好ましい。
【００１１】
上記(1)及び(2)に示す遺伝子は全て公知の遺伝子であり、その塩基配列も公知である。ヒトの各遺伝子のデータベースのEntrez Gene IDとGeneBank Accession No.を下記表１及び表２に示す。また、ヒトの各遺伝子のcDNAの塩基配列を配列表に記載し、その配列番号を下記表１及び表２に併せて示す。
【００１２】
【表１】
2018153160.tif 000002
【００１３】
【表２】
2018153160.tif 000003
【００１４】
各遺伝子の発現レベルは、体液中のmRNA量を測定することにより測定することができる。各mRNAの塩基配列は公知である（配列表にも記載）ので、mRNAの定量は、市販のDNAアレイを用いた周知の方法により容易に行うことができる（下記実施例参照）。
【００１５】
上記(1)（表１）に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが増加していること、及び／又は上記(2)（表２）に示される遺伝子から成る群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが減少していることが肝機能不全の未病である可能性が高いことを示す。なお、ここで、「増加」及び「減少」は、同一の被験者について経時的に測定した測定値を比較することにより得られる。経時的な測定は、例えば、ある時点と、その時点から２週間〜２４週間後、特に、４週間〜１２週間後、特に６週間〜１０週間後に再度の測定を行うことができる。この間に遺伝子の発現レベルが増加又は減少しているか否かを調べることにより、未病を検出することが可能である。「増加」や「減少」は、例えば、下記実施例と同様に、マイクロアレイを用いた測定値を、「DFW（the Distribution Free Weighted method」（文献： Bioinformatics. 23(3):321-327 (2007)）により正規化を行い、WAD weighted SAM法（文献：Proc Natl Acad Sci U S A. 98(9):5116-5121 (2001), Algorithms Mol Biol. 3:8 (2008)）にて、摂取前後（0 w対8 w）について対応のある検定を行い、上位1000プローブセットを抽出した上で、それらプローブセットの配列を含む遺伝子について対応のあるt検定にて統計処理を行い、統計学的有意差があれば、「増加」又は「減少」していると判断することができる。なお、対応のあるt検定において、統計学的有意差があるか否かは、p-valueが0.05未満であることにより判定することができる。
【００１６】
下記実施例に具体的に記載されるように、桑葉摂取群では、血液中の肝機能マーカーの１つである乳酸脱水素酵素(LD)が有意に低下する。プラセボ群におけるLD変化量の平均±2SDに収まる選抜者では、27遺伝子のうち２１遺伝子（BAG6、FAM104A、GMPR、PIM1、RPIA、TESC、TSPAN5、ARHGAP30、CAST、CALM2、CIRBP、CORO1A、DNAJB1、RSRP1、VIM、CD164、CD48、IGSF6、ISCA1、RAB8B及びSUPT4H1）、平均±SDに収まる選抜者では、27遺伝子のうち８遺伝子（CAST、CIRBP、CORO1A、VIM、CD164、EIF2S1、ISCA1及びSUPT4H1）が抽出された。したがって、上記２１遺伝子、特に上記８遺伝子は、本発明の方法において、特に感度の高いマーカーとして利用可能なものである。
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
材料及び方法
＜ヒト試験＞
試験食
桑葉食については、桑葉パウダー（相模原商工会議所）、玄米パウダー（マルサン中野園）、ホウレンソウパウダー（三笠産業）を80:15:5の比率で混合した。プラセボ食については、dextrin (Pinedex #2 AG,松谷化学工業)、玄米パウダー（マルサン中野園）、ホウレンソウパウダー（三笠産業）80:15:5の比率で混合した。いずれも、マルサン中野園にて2 gずつ個包装した。
【００１９】
ヒト介入試験
ヒト介入試験は、北海道情報大学にて実施した。36名のボランティア被験者を対象に、プラセボ対照ランダム化二重盲検並行群間比較試験を実施した。2群に分け、桑葉食、あるいはプラセボ食を8週間摂取するものとした。摂取量は、１日２ｇを３回、合計６ｇであった。摂取開始前(0w)、8週間後の摂取後(8 w)に採血を行い、血中成分および血液遺伝子発現解析用サンプルとした。
【００２０】
血清生化学パラメータ測定
血清生化学パラメータは札幌臨床検査センターにて測定した。
【００２１】
RNA抽出およびDNAマイクロアレイ実験
PAXgene（商品名） Blood RNA tube (Nippon Becton Dickinson Company, Tokyo, Japan)にて採取した血液から定法に従いRNAを抽出し、GeneChip 3’ IVT PLUS Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)にて調製したcRNAをGeneChip（商品名）Human Genome U133 PLUS 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)に供した。
【００２２】
DNAマイクロアレイ解析
全サンプルに対し、the Distribution Free Weighted method (DFW)法にて正規化を行い、WAD weighted SAM法にて、摂取前後（0 w対8 w）について対応のある検定を行った。上位1000のプローブセットを顕著な発現変動ありと定義し、抽出した。ここから、摂取前後において桑葉摂取群でのみ発現変動する遺伝子およびプラセボ摂取群でのみ発現変動する遺伝子を抽出した。前者は桑摂取により発現変動した遺伝子、後者は、本来であれば発現変動するが、桑葉摂取により発現変動なかった遺伝子であり、変動の方向性は桑葉による作用の反対を示すものである。両者を桑葉摂取マーカー遺伝子と定義した。
【００２３】
＜動物試験＞
材料
試験に使用する桑葉は相模原商工会議所より贈呈頂いた。
【００２４】
試験食摂取
7週齢Wistar系雄性ラットを日本SLC社より購入し、21 ± 1℃、相対湿度50 ± 10%、明期 08:00-20:00; 暗期20:00-08:00にて飼育した。通常食CE-2（日本クレア）にて馴化の後、10匹ずつ3群に分け8週間飼育した。通常食（CE-2）摂取群、高脂肪食（Quick fat, 日本クレア）摂取群、高脂肪食1%桑葉パウダー添加食群である。いずれも24時間の自由摂取とした。解剖前夜絶食の後、血液を採取した。試験は神奈川県衛生研究所の動物実験ガイドラインに則って実施した。
【００２５】
血漿生化学パラメータ
血漿alanine aminotransferase (ALT)をFuji DRI-CHEM 7000 system (Fujifilm, Tokyo, Japan)にて測定した。統計処理はTukey’s testにて実施した。
【００２６】
RNA抽出およびDNAマイクロアレイ実験
血液RNAはTRIzol LS reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)の定法に従い実施し、RNeasy Mini Kit (Qiagen K.K., Tokyo, Japan)にて精製を行った。GeneChip 3’ IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)により調製したaRNAをGeneChip(登録商標) Rat genome 230 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)に供した。
【００２７】
DNAマイクロアレイ解析
ランダムに各群4個体を選抜し、the Distribution Free Weighted method (DFW)法にて正規化を行い、rank products法にて2群間比較を行った。false discovery rate (FDR) < 0.05と判定されたプローブセットを顕著な変動ありと定義して抽出し、桑葉食によって、高脂肪食によって起こる変動を通常食に近づける変動の見られる遺伝子、および通常食と高脂肪食間では変化はないが、高脂肪食と桑葉食間で変化のある遺伝子を桑葉摂取マーカー遺伝子と定義した。
【００２８】
＜マーカー遺伝子の選抜＞
ヒト試験、動物試験で抽出した桑葉摂取マーカー遺伝子を遺伝子名により比較し、共通の変動を示す遺伝子を抽出した。ヒト試験では、桑葉摂取群でのみ発現変動する遺伝子およびプラセボ群でのみ発現変動する遺伝子により構成されているが、前者と動物試験は変動の方向性が同一であること、後者は逆であることを抽出条件とした。
【００２９】
＜遺伝子マーカーの有効性評価＞
桑葉摂取により抽出されたマーカーについて、桑葉摂取に対する応答が強いものがあり、それらの中には肝機能マーカーよりも顕著に変化するものが存在すると考え、次の検討を行った。プラセボ群におけるLD変化量の平均±SD、平均±2SDを算出し、この範囲内に収まる桑葉群、プラセボ群の被験者をそれぞれ選抜し、選抜者についてのみ、同様にそれぞれDFW法にて正規化を行い、WAD weighted SAM法にて摂取前後（0 w対8 w）について対応のある検定を行い、27遺伝子が上位1000のプローブセットに含まれるかを比較した。
【００３０】
結果
＜ヒト試験＞
血清生化学パラメータ測定
0 wと8 wのパラメーターを比較した結果、血液中の肝機能マーカーのひとつである乳酸脱水素酵素（LD）が桑葉摂取群において、有意に低下していることが明らかになった。
【００３１】
DNAマイクロアレイ解析
桑葉摂取群でのみ発現変動する遺伝子数は527、プラセボ摂取群でのみ発現変動する遺伝子数は564であった。
【００３２】
＜動物試験＞
血漿生化学パラメータ測定
血漿ALTが高脂肪食群において通常群よりも有意に上昇し、桑葉群において高脂肪食群よりも有意に低下した。
【００３３】
DNAマイクロアレイ解析
桑葉摂取マーカー遺伝子は256であった。
【００３４】
＜遺伝子マーカー＞
ヒト試験、動物試験を比較して共通の方向性をもって抽出された遺伝子マーカーは上記表１及び表２に示す27遺伝子であった。なお、これらの２７遺伝子は全て、上記のDFWとSAM法にて抽出し、DFW正規化数値を用いた対応のあるt検定において統計学的有意差が認められたものである。
【００３５】
＜遺伝子マーカーの有効性評価＞
プラセボ群におけるLD変化量の平均±SDに収まる選抜者では、27遺伝子のうち8遺伝子、平均±2SDに収まる選抜者では、27遺伝子のうち21遺伝子が抽出された。ここから、抽出された27の遺伝子マーカーは、既存の肝機能マーカーよりも顕著に応答するものであり、未病のマーカーであると定義した。
【配列表】
2018153160000001.app