(57)【要約】【課題】効率的に幹細胞等の細胞を培養する技術を提供する。【解決手段】糖鎖を除去したラミニンE8や微生物を宿主として発現させたラミニンE8がコーティングされた細胞培養容器を利用して幹細胞等の細胞を培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）の性質を有するラミニンE8：
（Ａ）Ｎ型糖鎖の付加率が２０％以下である；
（Ｂ）微生物型の糖鎖構造を有する。
【請求項２】
糖鎖を有さないマウスのラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミ
ニン221E8を除く、請求項１に記載のラミニンE8。
【請求項３】
Ｎ型糖鎖を有さない、請求項１または２に記載のラミニンE8。
【請求項４】
酵母型の糖鎖構造を有する、請求項１または２に記載のラミニンE8。
【請求項５】
ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラ
ミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、またはラミニン521E8である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のラミニンE8。
【請求項６】
ラミニン511E8である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のラミニンE8。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のラミニンE8であって、
前記ラミニンE8を構成するα鎖E8が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
（１ａ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（１ｃ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記ラミニンE8を構成するβ鎖E8が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
（２ａ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（２ｃ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記ラミニンE8を構成するγ鎖E8が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、ラミニンE8：
（３ａ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（３ｃ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質。
【請求項８】
微生物を宿主としてラミニンのα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8を発現することを含む、ラミニンE8の製造方法。
【請求項９】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を宿主としてマウスのラミニン111E8、ラミ
ニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8を発現する場合を除く、請求項８に記
載の方法。
【請求項１０】
前記ラミニンE8が、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、またはラミニン521E8
である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラミニンE8が、ラミニン511E8である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記α鎖E8が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：（１ａ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（１ｃ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記β鎖E8が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：（２ａ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（２ｃ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記γ鎖E8が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
（３ａ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（３ｃ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質。
【請求項１３】
少なくとも前記β鎖E8およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現される、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8が複数の微生物によりそれぞれ別個に発現される、
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細菌または酵母である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌またはコリネ型細菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピヒア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項２０】
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からラミニンE8を構成することを含む、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記β鎖E8およびγ鎖E8がヘテロ二量体として得られ、前記α鎖E8と該ヘテロ二量体からラミニンE8を構成することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラミニンE8を含有する、組成物。
【請求項２３】
請求項８〜２１のいずれか１項に記載の方法で製造されたラミニンE8を含有する、組成物。
【請求項２４】
細胞足場材料である、請求項２２または請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞足場材料が、幹細胞の培養用である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
細胞培養容器のコーティング剤である、請求項２２または請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞培養容器が、幹細胞の培養用である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のラミニンE8を備える、器具。
【請求項３１】
請求項８〜２１のいずれか１項に記載の方法で製造されたラミニンE8を備える、器具。
【請求項３２】
医療用または研究用の器具である、請求項３０または請求項３１に記載の器具。
【請求項３３】
細胞培養容器である、請求項３０または３１または３２に記載の器具。
【請求項３４】
細胞足場材料である、請求項３０または３１または３２に記載の器具。
【請求項３５】
細胞培養面が前記ラミニンE8でコーティングされている、請求項３３に記載の器具。
【請求項３６】
幹細胞の培養用である、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の器具。
【請求項３７】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３６に記載の器具。
【請求項３８】
請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
【請求項３９】
前記培養される細胞が幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニンE8の製造方法およびラミニンE8を利用した細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞、特に胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の多能性幹細胞
は、再生医療への応用が期待されている。幹細胞の培養には、通常、フィーダー細胞が用いられている。しなしながら、臨床応用における制約等から、フィーダー細胞を代替する技術の開発が進められている。
【０００３】
例えば、ラミニンやそのE8断片であるラミニンE8等の細胞接着性タンパク質を細胞培養用の足場材として用いて幹細胞を培養することが知られている。ラミニンE8は、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有する。ラミニンE8としては、例えば、ヒトラミニン511のE8断片である
ヒトラミニン511E8が細胞培養用の足場材として有用である。ヒトラミニン511E8としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来のCHO-S細胞を宿主として異種発現したもの
やカイコを宿主として異種発現したものが市販されている。
【０００４】
また、Escherichia coliを宿主としてマウスラミニンの各サブユニットのE8断片を発現させ、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8等のヘテロ三量体構造を再構成したことが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、糖鎖を除去したラミニンE8や微生物を宿主として発現させたラミニンE8を細胞培養用の足場材として用いることにより、幹細胞を効率的に培養できることは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】A Utani, et al., Laminin chain assembly. J. Biol. Chem. 1994 269: 19167-19175.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率的に幹細胞等の細胞を培養する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は、鋭意検討の結果、糖鎖を除去したラミニンE8や微生物を宿主として発現させたラミニンE8を細胞培養用の足場材として用いることにより、幹細胞を効率的に培養できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
以下の（Ａ）または（Ｂ）の性質を有するラミニンE8：
（Ａ）Ｎ型糖鎖の付加率が２０％以下である；
（Ｂ）微生物型の糖鎖構造を有する。
［２］
糖鎖を有さないマウスのラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミ
ニン221E8を除く、前記ラミニンE8。
［３］
Ｎ型糖鎖を有さない、前記ラミニンE8。
［４］
酵母型の糖鎖構造を有する、前記ラミニンE8。
［５］
ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラ
ミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、またはラミニン521E8である、前記ラミニンE8。
［６］
ラミニン511E8である、前記ラミニンE8。
［７］
前記ラミニンE8であって、
前記ラミニンE8を構成するα鎖E8が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
（１ａ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（１ｃ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記ラミニンE8を構成するβ鎖E8が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
（２ａ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（２ｃ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記ラミニンE8を構成するγ鎖E8が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、ラミニンE8：
（３ａ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（３ｃ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質。
［８］
微生物を宿主としてラミニンのα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8を発現することを含む、ラミニンE8の製造方法。
［９］
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を宿主としてマウスのラミニン111E8、ラミ
ニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8を発現する場合を除く、前記方法。
［１０］
前記ラミニンE8が、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、
ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、またはラミニン521E8
である、前記方法。
［１１］
前記ラミニンE8が、ラミニン511E8である、前記方法。
［１２］
前記方法であって、
前記α鎖E8が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：（１ａ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（１ｃ）配列番号２、１３、１９、２０、２１、または２２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、β鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記β鎖E8が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：（２ａ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（２ｃ）配列番号３、７、２３、または２４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびγ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
前記γ鎖E8が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
（３ａ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質；
（３ｃ）配列番号４、８、２５、または２６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α鎖E8およびβ鎖E8とヘテロ三量体を形成し細胞に対する足場機能を示すタンパク質。
［１３］
少なくとも前記β鎖E8およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現される、前記方法。
［１４］
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現される、前記方法。
［１５］
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8が複数の微生物によりそれぞれ別個に発現される、前記方法。
［１６］
前記微生物が、細菌または酵母である、前記方法。
［１７］
前記微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌またはコリネ型細菌である、前記方法。
［１８］
前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記方法。
［１９］
前記微生物が、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピヒア・パストリス（Pichia pastoris）である、前記方法。
［２０］
前記α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からラミニンE8を構成することを含む、前記方法。［２１］
前記β鎖E8およびγ鎖E8がヘテロ二量体として得られ、前記α鎖E8と該ヘテロ二量体からラミニンE8を構成することを含む、前記方法。
［２２］
前記ラミニンE8を含有する、組成物。
［２３］
前記方法で製造されたラミニンE8を含有する、組成物。
［２４］
細胞足場材料である、前記組成物。
［２５］
前記細胞足場材料が、幹細胞の培養用である、前記組成物。
［２６］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記組成物。
［２７］
細胞培養容器のコーティング剤である、前記組成物。
［２８］
前記細胞培養容器が、幹細胞の培養用である、前記組成物。
［２９］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記組成物。
［３０］
前記ラミニンE8を備える、器具。
［３１］
前記方法で製造されたラミニンE8を備える、器具。
［３２］
医療用または研究用の器具である、前記器具。
［３３］
細胞培養容器である、前記器具。
［３４］
細胞足場材料である、前記器具。
［３５］
細胞培養面が前記ラミニンE8でコーティングされている、前記器具。
［３６］
幹細胞の培養用である、前記器具。
［３７］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記器具。
［３８］
前記器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
［３９］
前記培養される細胞が幹細胞である、前記方法。
［４０］
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、効率的に幹細胞等の細胞を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラミニン511E8の糖鎖切断前後のSDS-PAGEの結果を示す図（写真）である。
【図２】糖鎖切断ラミニン511E8を細胞培養プレートにコーティングし、ｉＰＳ細胞足場機能を3週間にわたって評価した結果を示す図である。横軸は「週」を示す。
【図３】E. coliヒトラミニンα5鎖E8発現株の菌体破砕液のSDS-PAGEの結果を示す図（写真）である。各レーンに対してロードしたサンプルは以下の通り。1：BSA 0.25μg、2：BSA 0.5μg、3：BSA 1.0μg、4：菌体破砕液（培養液に対して5倍希釈）10μL。黒矢印頭はヒトラミニンα5鎖E8のバンドを示す。
【図４】YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8γ株、及び、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γ株の培養上清を非還元SDS-PAGEに供した結果を示す図（写真）である。
【図５】ヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現株の培養上清から生成したタンパク質のデコンボリューション処理したESI-TOF-MSスペクトルを示す図である。
【図６】変性ラミニン511E8のアフィニティークロマトグラフィーにおけるフロースルー、洗浄画分、および溶出画分をSDS-PAGEに供した結果を示す図（写真）である。
【図７】非変性ラミニン511E8のアフィニティークロマトグラフィーにおけるフロースルー、洗浄画分、および溶出画分をSDS-PAGEに供した結果を示す図（写真）である。
【図８】希釈サンプルのアフィニティークロマトグラフィーにおけるフロースルー、洗浄  画分、溶出画分をSDS-PAGEに供した結果を示す図（写真）である。
【図９】尿素変性したラミニン511E8から再構成されたαβγ三量体を細胞培養プレートにコーティングし、ｉＰＳ細胞足場機能を評価した結果を示す図である。
【図１０】希釈サンプルのアフィニティークロマトグラフィーにおけるフロースルー、洗浄画分、溶出画分をSDS-PAGEに供した結果を示す図（写真）である。
【図１１】還元変性したラミニン511E8から再構成されたαβγ三量体を細胞培養プレートにコーティングし、ｉＰＳ細胞足場機能を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明のタンパク質およびその製造
＜１−１＞本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、ラミニンE8である。
【００１４】
ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンとしては、哺乳類のラミニンが挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等のその他の各種哺乳類が挙げられる。ラミニンのサブユニット鎖（すなわち、α鎖、β鎖、およびγ鎖）としては、５種のα鎖（α１〜α５）、３種のβ鎖（β１〜β３）、３種のγ鎖（γ１〜γ３）が挙げられる。各種生物由来のラミニンサブユニット鎖のアミノ酸配列およびそれらをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、NCBI等の公開データベースから取得できる。ヒトおよびマウスのラミニンサブユニット鎖のNCBIアクセッション番号を表１に示す。
【００１５】
【表１】
2018131426.tif 000002
【００１６】
ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンとして、具体的には、表２に示すヘテロ三量体構造を有するものが挙げられる。
【００１７】
【表２】
2018131426.tif 000003
【００１８】
「ラミニンE8」とは、ラミニンのE8断片をいう。ラミニンE8は、具体的には、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンE8のサブユニット鎖（すなわち、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を総称して、「E8サブユニット鎖」ともいう。E8サブユニット鎖としては、上記例示したラミニンサブユニット鎖のE8断片が挙げられる。ラミニンE8は、これらE8サブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンE8として、具体的には、表２に示すヘテロ三量体構造を有するラミニンのE8断片が挙げられる。ラミニンE8として、特に、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8
、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、ラ
ミニン521E8が挙げられる。ラミニンE8も、そのヘテロ三量体構造に応じて、ラミニンと
同様に称呼するものとする。すなわち、例えば、「ラミニン511E8」とは、ラミニン511のE8断片をいい、具体的には、α５鎖のE8断片（α５鎖E8）、β１鎖のE8断片（β１鎖E8）、およびγ１鎖のE8断片（γ１鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質をいう。
【００１９】
「α鎖E8」とは、α鎖のＣ末端付近の領域であってよく、具体的には、α鎖の球状ドメイン４および５を除くＣ末端断片であってもよく、より具体的には、α鎖の球状ドメイン４および５を除くＣ末端の７８０〜８３０（例えば７９０〜８００）アミノ酸残基の断片であってもよい。「β鎖E8」とは、β鎖のＣ末端断片であってよく、具体的には、β鎖のＣ末端の２２０〜２３０アミノ酸残基の断片であってもよい。「γ鎖E8」とは、γ鎖のＣ末端断片であってよく、具体的には、γ鎖のＣ末端の２４０〜２５０アミノ酸残基の断片であってもよい。
【００２０】
ヒトのラミニンサブユニット鎖におけるE8断片の位置、およびそれらE8断片のアミノ酸配列（Ｎ末に開始メチオニンを付加したもの）の配列番号を表１に示す。すなわち、例えば、ヒトのα５鎖E8は、NP_005551のアミノ酸番号２５３４〜３３２７の部位に相当する
。また、ヒトのβ１鎖E8は、NP_002282のアミノ酸番号１５６１〜１７８６の部位に相当
する。また、ヒトのγ１鎖E8は、NP_002284のアミノ酸番号１３６４〜１６０９の部位に
相当する。
【００２１】
すなわち、E8サブユニット鎖は、例えば、上記データベースに開示されたラミニンサブユニット鎖のアミノ酸配列中のE8断片に相当する部位のアミノ酸配列（例えば配列番号３、４、１３、１９〜２６に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。同様に、E8サブユニット鎖をコードする遺伝子（「E8サブユニット鎖遺伝子」ともいう）は、例えば、上記データベースに開示されたラミニンサブユニット鎖遺伝子の塩基配列中のE8断片に相当する部位をコードする部位の塩基配列を有する遺伝子であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００２２】
E8サブユニット鎖は、元の機能が維持されている限り、上記例示したE8サブユニット鎖のバリアントであってもよい。同様に、E8サブユニット鎖遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したE8サブユニット鎖遺伝子のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したE8サブユニット鎖やE8サブユニット鎖遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００２３】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、E8サブユニット鎖にあっては、タンパク質のバリアントが、他のE8サブユニット鎖とヘテロ三量体を形成し幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すことをいう。「他のE8サブユニット鎖」とは、α鎖E8に対してβ鎖E8およびγ鎖E8、β鎖E8に対してα鎖E8およびγ鎖E8、γ鎖E8に対してα鎖E8およびβ鎖E8をいう。他のE8サブユニット鎖としては、本発明のタンパク質のサブユニット鎖として使用を希望するものを特に制限されず用いることができる。他のE8サブユニット鎖としては、特に、α５鎖E8、β１鎖E8、およびγ１鎖E8を用いることができる。他のE8サブユニット鎖として、さらに特には、ヒトのα５鎖E8、β１鎖E8、およびγ１鎖E8を用いることができる。また、「元の機能が維持されている」とは、E8サブユニット鎖遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわち他のE8サブユニット鎖とヘテロ三量体を形成し幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すタンパク質）をコードすることをいう。タンパク質が幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すか否かは、例えば、当該タンパク質で細胞培養面をコーティングした培養容器を用いて幹細胞等の細胞を培養することにより、確認できる。すなわち、当該タンパク質で細胞培養面をコーティングすることにより幹細胞等の細胞の増殖が向上した場合に、当該タンパク質が幹細胞等の細胞に対する足場機能を示すと判断できる。
【００２４】
E8サブユニット鎖のホモログは、例えば、ラミニンサブユニット鎖のホモログのE8断片として得られる。また、E8サブユニット鎖遺伝子のホモログは、例えば、ラミニンサブユニット鎖遺伝子のホモログのE8断片に相当する部位をコードする断片として得られる。ラミニンサブユニット鎖またはラミニンサブユニット鎖遺伝子のホモログは、例えば、上記データベースに開示されたラミニンサブユニット鎖のアミノ酸配列またはラミニンサブユニット鎖遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、ラミニンサブユニット鎖遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、上記データベースに開示されたラミニンサブユニット鎖遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００２５】
以下、E8サブユニット鎖およびE8サブユニット鎖遺伝子の保存的バリアントについて例示する。
【００２６】
E8サブユニット鎖は、元の機能が維持されている限り、上記E8サブユニット鎖のアミノ酸配列（例えば配列番号３、４、１３、１９〜２６に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００２７】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２８】
また、E8サブユニット鎖は、元の機能が維持されている限り、上記E8サブユニット鎖のアミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指す。
【００２９】
また、E8サブユニット鎖は、元の機能が維持されている限り、上記E8サブユニット鎖遺伝子の塩基配列から調製され得るプローブ、例えば同塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパ
ク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さ
らに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常の
サザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましく
は60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダ
イゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
【００３０】
また、E8サブユニット鎖遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、E8サブユニット鎖遺伝子は、コドンの縮重による上記例示したE8サブユニット鎖遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、E8サブユニット鎖遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００３１】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３２】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００３３】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア
＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸
配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、
スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパ
ク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的
としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用
できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００３４】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００３５】
E8サブユニット鎖は、その機能を損なわない限り、他のアミノ酸配列を含んでいてよい。他のアミノ酸配列としては、例えば、シグナルペプチド（シグナル配列ともいう）、ペプチドタグ、プロテアーゼの認識配列、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が挙げられる。
これら他のアミノ酸配列を含むE8サブユニット鎖としては、配列番号２、７、および８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。すなわち、E8サブユニット鎖は、例
えば、これらのアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、それらのバリアントであってもよい。
【００３６】
シグナルペプチドは、E8サブユニット鎖を発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。コリネ型細菌等の細菌で機能するシグナルペプチドとしては、Sec系分
泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが
挙げられる（WO2016/171224）。Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとしては、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナル配列が挙げられる。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質として、具体的には、C. glutamicumのPS1やPS2（CspB）（特表平6-502548
）、C. stationisのSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる。E8サブユニッ
ト鎖において、シグナルペプチドはＮ末端に存在していてよい。シグナルペプチドは、例えば、E8サブユニット鎖の分泌生産に利用できる。シグナルペプチドを利用してE8サブユニット鎖を分泌生産する場合、典型的には、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有さないE8サブユニット鎖が菌体外に分泌され得る。すなわち、「E8サブユニット鎖がシグナルペプチドを有する」とは、E8サブユニット鎖がシグナルペプチドを有する形態で発現することを意味し、E8サブユニット鎖の成熟タンパク質がシグナルペプチドを有するかは問わないものとする。
【００３７】
ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペ
プチドタグは、例えば、発現したE8サブユニット鎖の検出や精製に利用できる。
【００３８】
プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現し
たE8サブユニット鎖の切断に利用できる。
【００３９】
Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列としては、WO2013/062029に記載されたものが挙げられる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列は、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質CspBの成熟
タンパク質（以下、「成熟CspB」ともいう）のN末端からの３アミノ酸残基またはそれ以
上からなる配列であってよい。コリネ型細菌としては、後述するものが挙げられる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列は、例えば、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３〜５０
位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であってもよい。Gln-Glu-Thrを含むア
ミノ酸配列は、特に、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３〜８、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であってもよい。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配
列は、さらに特には、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、４、６、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であってもよい。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配
列として、具体的には、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr（配列番号１４）、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr（配列番号１５）、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr（配列番号１６）、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr（配列番号１７）、Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr（配列番号１８）が挙げられる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列は、特に、Sec系依存シグナルペプチドと組み合わせて好
適に用いることができる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列は、例えば、シグナル配列と
それ以外の部位との間に配置することができる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列は、特
に、シグナル配列の直後に配置することができる。Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列の利
用により、例えば、E8サブユニット鎖の分泌生産量の向上が期待される。
【００４０】
E8サブユニット鎖は、同一の生物に由来するものであってもよく、そうでなくてもよい。E8サブユニット鎖は、例えば、３つ全てがヒトのサブユニットおよびそのバリアントから選択されてもよく、３つ全てがマウスのサブユニットおよびそのバリアントから選択されてもよく、ヒトのサブユニットまたはそのバリアントおよびマウスのサブユニットまたはそのバリアントを含む組み合わせであってもよい。
【００４１】
本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖（各E8サブユニット鎖）は、糖鎖を有していてもよく、有していなくてもよい。糖鎖としては、Ｎ型糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖；アスパラギン残基に付加されるもの）やＯ型糖鎖（Ｏ−結合型糖鎖；セリン残基またはスレオニン残基に付加されるもの）が挙げられる。糖鎖としては、特に、Ｎ型糖鎖が挙げられる。
【００４２】
本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖（各E8サブユニット鎖）は、例えば、微生物型の糖鎖構造を有していてもよい。「微生物型の糖鎖構造」とは、微生物を宿主としてタンパク質を発現させた際に付加され得る糖鎖の構造（微生物を宿主としてタンパク質を発現させた際に付加され得る糖鎖修飾のパターン）をいう。微生物型の糖鎖構造は、天然の哺乳類型の糖鎖構造、すなわち、哺乳類細胞が本来的に有する糖鎖修飾系により付加される糖鎖構造、とは異なるものであってよい。また、微生物型の糖鎖構造は、天然の昆虫型の糖鎖構造、すなわち、昆虫細胞が本来的に有する糖鎖修飾系により付加される糖鎖構造、とは異なるものであってよい。微生物型の糖鎖（微生物型の糖鎖構造を構成する糖鎖）は、例えば、フコース残基およびシアル酸残基のいずれも含まないものであってよい。微生物としては、細菌や酵母等の後述するものが挙げられる。微生物としては、特に、酵母が挙げられる。酵母型の糖鎖（酵母型の糖鎖構造を構成する糖鎖）としては、Ｎ型糖鎖としてマンナン型糖鎖やガラクトマンナン型糖鎖が、Ｏ型糖鎖としてＯ−マンノース型糖鎖が挙げられる。
【００４３】
本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖（各E8サブユニット鎖）は、例えば、糖鎖を実質的に有していなくてもよい（すなわち、糖鎖の種類を問わず全体として糖鎖を実質的に有していなくてもよい）。「本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖が糖鎖を実質的に有さない」とは、本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖における糖鎖の付加率が、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下、または０（ゼロ）であることをいう。「糖鎖の付加率」とは、糖鎖が付加され得るアミノ酸残基の総数（具体的には、アスパラギン残基、セリン残基、およびスレオニン残基の総数）に対する糖鎖が付加されているアミノ酸残基の数（具体的には、糖鎖が付加されているアスパラギン残基、セリン残基、およびスレオニン残基の総数）の比率をいう。
【００４４】
また、本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖（各E8サブユニット鎖）は、例えば、特定の糖鎖（例えば、Ｎ型糖鎖およびＯ型糖鎖の一方または両方）を実質的に有していなくてもよい。具体的には、例えば、本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖は、少なくともＮ型糖鎖を実質的に有していなくてもよく、さらにＯ型糖鎖を実質的に有していなくてもよい。「本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖が特定の糖鎖を実質的に有さない」とは、本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖における当該特定の糖鎖の付加率が、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下、または０（ゼロ）であることをいう。「特定の糖鎖の付加率」とは、当該特定の糖鎖が付加され得るアミノ酸残基の総数（具体的には、Ｎ型糖鎖についてはアスパラギン残基の数、Ｏ型糖鎖についてはセリン残基およびスレオニン残基の総数）に対する当該特定の糖鎖が付加されているアミノ酸残基の数（具体的には、Ｎ型糖鎖については糖鎖が付加されているアスパラギン残基の数、Ｏ型糖鎖については糖鎖が付加されているセリン残基およびスレオニン残基の総数）の比率をいう。
【００４５】
なお、一態様において、本発明のタンパク質からは、マウスのラミニンE8が除かれてもよい。また、一態様において、本発明のタンパク質からは、マウスのラミニン111E8、ラ
ミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8が除かれてもよい。また、一態様に
おいて、本発明のタンパク質からは、糖鎖を実質的に有さない（例えば糖鎖を有さない）マウスのラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8が除かれてもよい。また、一態様において、本発明のタンパク質からは、特定の糖鎖を実質的に有さない（例えば特定の糖鎖を有さない）マウスのラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8が除かれてもよい。本発明のタンパク質またはその各サブユニット鎖が糖鎖または特定の糖鎖を実質的に有さない場合についての記載は、マウスのラミニンE8が糖鎖または特定の糖鎖を実質的に有さない場合にも準用できる。
【００４６】
＜１−２＞本発明のタンパク質の製造
本発明のタンパク質を製造する手段は特に制限されない。
【００４７】
本発明のタンパク質は、例えば、微生物を宿主として本発明のタンパク質を発現することにより製造することができる。すなわち、本発明は、微生物を宿主として本発明のタンパク質を発現することを含む、本発明のタンパク質の製造方法を提供する。同方法を「本発明の製造方法」ともいう。「本発明のタンパク質の発現」とは、具体的には、E8サブユニット鎖（α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）の発現をいう。すなわち、本発明の製造方法は、具体的には、微生物を宿主としてE8サブユニット鎖（α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を発現することを含む、本発明のタンパク質の製造方法である。
【００４８】
E8サブユニット鎖は、例えば、単一の微生物によりまとめて発現されてもよいし、複数の微生物により別個に発現されてもよい。すなわち、例えば、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8が３種の微生物によりそれぞれ発現されてもよい。また、例えば、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8のいずれか１つがある微生物により発現され、残りの２つが別の単一の微生物によりまとめて発現されてもよい。具体的には、例えば、少なくともβ鎖E8およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現されてもよい。すなわち、具体的には、例えば、α鎖E8がある微生物により発現され、β鎖E8およびγ鎖E8が別の単一の微生物によりまとめて発現されてもよい。すなわち、宿主として用いられる微生物は、単一の微生物であってもよく、複数の微生物の組み合わせであってもよい。本発明において、単数形の「微生物」という用語（例えば「a microorganism」や「the microorganism」）は、文脈に従って、少なくとも１種の微生物として、すなわち、単一の微生物または複数の微生物の組み合わせとして、読み替えてよい。
【００４９】
宿主として用いられる微生物は、E8サブユニット鎖遺伝子（α鎖E8遺伝子、β鎖E8遺伝子、およびγ鎖E8遺伝子）を有する。宿主として用いられる微生物が単一の微生物である場合は、該単一の微生物が単独でE8サブユニット鎖遺伝子３つ全てを有する。宿主として用いられる微生物が複数の微生物の組み合わせである場合、該複数の微生物が全体としてE8サブユニット鎖遺伝子３つ全てを有する。複数の微生物は、該複数の微生物が有するE8サブユニット鎖遺伝子の種類以外は、互いに同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、複数の微生物は、同一の属、種、または株に由来する微生物であってもよく、そうでなくてもよい。E8サブユニット鎖遺伝子を有する微生物は、適当な微生物にE8サブユニット鎖遺伝子を導入することにより得られる。
【００５０】
宿主として用いられる微生物は、E8サブユニット鎖を発現できるものであれば特に制限されない。微生物としては、細菌や酵母が挙げられる。
【００５１】
細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、
パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙
げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリ
ヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株やそのrecA-株であるBLR(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。コ
リネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）等のコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌が挙げられる。コリネバクテリウム・グルタミカムとして、
具体的には、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036株（FERM BP-734）やその細胞表層タンパク質PS2（CspB）の欠損株であるコリネバクテリウム・グルタミカムYDK010株（WO2002/081694）が挙げられる。
【００５２】
酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属酵母、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属酵母、ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属酵母が挙げられる。酵母と
しては、特に、サッカロマイセス属酵母やピヒア属酵母が挙げられる。酵母として、さらに特には、サッカロマイセス・セレビシエやピヒア・パストリスが挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエY006株（FERM BP-11299）、サッカロマイセス・セレビシエBY4743株（ATCC 201390）、サッカロマイセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）が挙げられる。
【００５３】
微生物と発現するE8サブユニット鎖の組み合わせは特に制限されない。例えば、α鎖E8遺伝子、β鎖E8遺伝子、およびγ鎖E8遺伝子の全てが、上記のいずれか１種の微生物により発現されてもよい。また、例えば、α鎖E8がエシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌またはサッカロマイセス・セレビシエやピヒア・パストリス等の酵母により発現され、β鎖E8およびγ鎖E8がコリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌により発現されてもよい。
【００５４】
宿主として用いられる微生物は、E8サブユニット鎖を発現できる限り、所望の性質を有していてよい。例えば、コリネ型細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下していてよい（WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2016/171224、WO2013/062029）。
また、コリネ型細菌は、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい（WO2013/065869）。また、コリネ型細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺
伝子の発現が上昇するように改変されていてよい（WO2013/065772）。また、コリネ型細
菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子（変異型rpsA遺伝子）を有するように改変されていてよい（WO2013/118544）。また、コリネ型細菌は、変異型phoS遺伝子を有するよ
うに改変されていてよい（WO2016/171224）。変異型phoS遺伝子としては、野生型PhoSタ
ンパク質の３０２位のトリプトファン残基（Ｗ３０２）が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換された変異型PhoSタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、より具体的には、K（Lys）、A（Ala）、V（Val）、S（Ser）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、N（Asn）が挙げられる。野生型phoS遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoS遺伝子が挙げ
られる。「野生型PhoSタンパク質の３０２位のトリプトファン残基（Ｗ３０２）」とは、任意の野生型PhoSタンパク質における、C. glutamicum YDK010株のPhoSタンパク質の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基を意味する。当該アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。またコリネ型細菌は、Tat系分泌装置が増強されていてよい（WO2016/171224）。これらの性質または改変により、例えば、E8サブユニット鎖の分泌生産量の向上が期待される。これらの性質または改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。
【００５５】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテ
クノロジーズ社より入手可能である（製品番号C6000-03）。また、BLR(DE3)株は、例えば、メルクミリポア社より入手可能である（製品番号 69053）。
【００５６】
微生物の種類等の諸条件に応じて、E8サブユニット鎖における糖鎖の有無や糖鎖構造が決定され得る。例えば、酵母を宿主としてE8サブユニット鎖を発現することにより、典型的には、酵母型の糖鎖構造を有するE8サブユニット鎖が生成し得る。また、例えば、細菌を宿主としてE8サブユニット鎖を発現することにより、典型的には、糖鎖を有さないE8サブユニット鎖が生成し得る。
【００５７】
なお、一態様において、本発明の製造方法からは、エシェリヒア・コリを宿主としてマウスのラミニンE8を発現する場合が除かれてもよい。また、一態様において、本発明の製造方法からは、エシェリヒア・コリを宿主としてマウスのラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、およびラミニン221E8を発現する場合が除かれてもよい。
【００５８】
E8サブユニット鎖遺伝子は、例えば、ヒトやマウス等のラミニンサブユニット鎖遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改
変して利用できる。遺伝子の改変は、公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。すなわち
、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J.,
Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、E8サブユニット鎖遺伝子は、例えば、化学合成に
よっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【００５９】
E8サブユニット鎖遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、E8サブユニット鎖遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、E8サブユニット鎖遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、各E8サブユニット鎖遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、各E8サブユニット鎖遺伝子について、１種類の遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の遺伝子を有していてもよい。ま
た、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
【００６０】
E8サブユニット鎖遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、E8サブユニット鎖遺伝子が由来するラミニンサブユニット鎖遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、E8サブユニット鎖遺伝子が由来するラミニンサブユニット鎖遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型
細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細
菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモー
ターが挙げられる。また、酵母で利用できる強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターである、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００６１】
また、E8サブユニット鎖遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、E8サブユニット鎖遺伝子が由来するラミニンサブユニット鎖遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネー
ターが挙げられる。
【００６２】
E8サブユニット鎖遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。E8サブユニット鎖遺伝子を含むベクターを、E8サブユニット鎖遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。E8サブユニット鎖遺伝子の発現ベクターは、例えば、E8サブユニット鎖遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。E8サブユニット鎖遺伝子の発現ベクターで宿主を
形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（
クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（TaKaRa）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には
、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミ
ド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げら
れる。酵母細胞内で機能するベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つマルチコピー型プラスミドが挙げられる。酵母細胞内で機能するベクターとして、具体的には、例えば、pAUR123（タカラバイオ社製）やpYES2（インビトロジェン社）が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、E8サブユニット鎖のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にE8サブユニット鎖のコード領域を組み込んでもよい。
【００６３】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００６４】
また、E8サブユニット鎖遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーシ
ョン（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、ト
ランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入するこ
ともできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の
導入の際には、例えば、E8サブユニット鎖のコード領域を上記のようなプロモーターの下
流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にE8サブユニット鎖のコード領域を組み込んでもよい。
【００６５】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００６６】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリ
ネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
【００６７】
E8サブユニット鎖遺伝子を有する宿主を培養することにより、E8サブユニット鎖を発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行う。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、E8サブユニット鎖を発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【００６８】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【００６９】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【００７０】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。
【００７１】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【００７２】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【００７３】
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、より好ましくは27℃〜37℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50%に、好ましくは20〜40％に調節してよい。培養中のpHは、5〜9が好ましい。
尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養時間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。
【００７４】
特に、エシェリヒア・コリを宿主として用いる場合、E8サブユニット鎖の発現誘導時の有機酸蓄積を低減させること（WO2015/178465）やE8サブユニット鎖の発現誘導後の菌体
増殖を低減すること（WO2015/178466）により、E8サブユニット鎖を効率的に製造するこ
とができると期待される。
【００７５】
上記のようにしてE8サブユニット鎖遺伝子を有する宿主を培養することにより、培地中および／または菌体内にE8サブユニット鎖が蓄積する。E8サブユニット鎖は、例えば、菌体内に封入体として蓄積し得る。
【００７６】
E8サブユニット鎖の回収および定量は、例えば、異種発現させたタンパク質を回収および定量する既知の方法（例えば、「新生化学実験講座  タンパク質VI  合成及び発現」日本生化学会編、東京化学同人(1992) pp183-184を参照）により行うことができる。
【００７７】
以下、E8サブユニット鎖が菌体内に封入体として蓄積する場合の回収および定量の手順について例示する。まず、培養液から菌体を遠心操作にて集菌後、緩衝液で懸濁する。菌体懸濁液を、超音波処理やフレンチプレス等の処理に供し、菌体を破砕する。菌体破砕の前に、菌体懸濁液にリゾチームを終濃度0-200mg/lで添加し、氷中に30分から20時間放置
してもよい。次いで、破砕物から、低速遠心分離（6000-15000 rpm, 5-10分、4℃）によ
り、不溶性画分を沈殿として得る。不溶性画分は、必要により、適宜緩衝液で洗浄する。洗浄回数は特に制限されず、例えば、１回、２回、または３回以上であってもよい。不溶性画分を緩衝液で懸濁することにより、E8サブユニット鎖の懸濁液が得られる。菌体やE8サブユニット鎖の懸濁用の緩衝液としては、E8サブユニット鎖の溶解性が低いものを好ましく用いることができる。そのような緩衝液としては、例えば、NaClを含むTris-HCl緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、例えば、通常4〜12、好ましくは6〜9であってよい。
また、不溶性画分をSDS溶液や尿素溶液で溶解することにより、E8サブユニット鎖の溶液
が得られる。回収されるE8サブユニット鎖は、E8サブユニット鎖以外に、細菌菌体、培地成分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。E8サブユニット鎖は、所望の程度に精製されていてよい。E8サブユニット鎖の精製は、例えば、タンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿、透析が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。E8サブユニット鎖の量は、例えば、懸濁液や溶液等のE8サブユニット鎖を含むサンプルをSDS-PAGEに供して染色し、目的のE8サブユニット鎖の分子量に相当する位置のバンドの強度に基づいて決定することができる。染色は、CBB染色、蛍光染色、銀染色等により行
うことができる。定量の際には、濃度既知のタンパク質を標準として利用することができる。そのようなタンパク質としては、例えば、アルブミンや、別途濃度を決定したE8サブユニット鎖が挙げられる。
【００７８】
発現したE8サブユニット鎖（α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）は、直接、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体として（すなわち本発明のタンパク質として）得られてもよく、そうでなくてもよい。すなわち、E8サブユニット鎖は、その発現態様等の諸条件に応じて、単量体あるいは多量体として得られ得る。E8サブユニット鎖は、例えば、それぞれの単量体として、ホモ二量体等のそれぞれのホモ多量体として、あるいはヘテロ二量体やヘテロ三量体等の２つ以上のE8サブユニット鎖のヘテロ多量体として得られ得る。例えば、E8サブユニット鎖がそれぞれ別個の微生物により発現する場合等のE8サブユ
ニット鎖が互いに共存していない状態で発現する場合に、それらE8サブユニット鎖は、それぞれの単量体として、あるいはそれぞれのホモ二量体として得られ得る。また、例えば、２つ以上のE8サブユニット鎖が単一の微生物によりまとめて発現する場合等の２つ以上のE8サブユニット鎖が共存した状態で発現する場合に、それらE8サブユニット鎖は、ヘテロ多量体として得られ得る。具体的には、例えば、β鎖E8およびγ鎖E8が単一の微生物によりまとめて発現する場合等のβ鎖E8およびγ鎖E8が共存した状態で発現する場合、それらE8サブユニット鎖は、β鎖E8およびγ鎖E8からなるヘテロ二量体として得られ得る。また、具体的には、例えば、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8の全てが単一の微生物によりまとめて発現する場合等のα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8の全てが共存した状態で発現する場合、それらE8サブユニット鎖は、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体として（すなわち本発明のタンパク質として）得られ得る。
【００７９】
発現したE8サブユニット鎖（α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）からは、適宜、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体（すなわち本発明のタンパク質）を構成することができる。すなわち、本発明の製造方法は、E8サブユニット鎖からヘテロ三量体を構成することを含んでいてもよい。ヘテロ三量体を構成する手段は特に制限されない。ヘテロ三量体の構成は、例えば、タンパク質の多量体の構成に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、A Utani, et al., Laminin chain assembly. J. Biol. Chem. 1994 269: 19167-19175.に記載の方法が挙げられる。ヘテロ三量体の構成は、例えば、E8サブユニット鎖を適当な溶媒中で共存させる（混合する）ことにより行うことができる。溶媒としては、水や水性緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。E8サブユニット鎖は、全てまとめて混合してもよいし、逐次混合してもよい。例えば、E8サブユニット鎖を全てまとめて混合することによりα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体を構成することができる。また、例えば、β鎖E8およびγ鎖E8を混合することによりβ鎖E8およびγ鎖E8からなるヘテロ二量体を構成し、さらにα鎖E8を混合することによりα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体を構成することができる。同様に、例えば、発現したE8サブユニット鎖がβ鎖E8およびγ鎖E8からなるヘテロ二量体として得られる場合は、さらにα鎖E8を混合することによりα鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体を構成することができる。なお、発現したE8サブユニット鎖がホモ多量体として得られる場合は、例えば、適宜、単量体へ解離させた後、ヘテロ三量体の構成に用いてよい。ホモ多量体を単量体に解離する手段は特に制限されない。単量体への解離は、例えば、タンパク質の変性に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、尿素変性や還元変性が挙げられる。なお、「E8サブユニット鎖からヘテロ三量体を構成すること」には、それぞれ単量体として得られた（発現した）E8サブユニット鎖からヘテロ三量体を構成することに限られず、α鎖E8とヘテロ二量体として得られた（発現した）β鎖E8およびγ鎖E8からヘテロ三量体を構成することや、ホモ多量体として得られた（発現した）E8サブユニット鎖からヘテロ三量体を構成することも包含される。ヘテロ三量体の構成に用いるE8サブユニット鎖の量比は特に制限されないが、通常、E8サブユニット鎖を等モルずつ用いればよい。
【００８０】
また、本発明のタンパク質は、例えば、無細胞タンパク質合成系で本発明のタンパク質を発現させることにより製造することができる。無細胞タンパク質合成系でE8サブユニット鎖を発現することにより、典型的には、糖鎖を有さないE8サブユニット鎖が生成し得る。この場合も、得られるE8サブユニット鎖の態様に応じて、適宜、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8からなるヘテロ三量体（すなわち本発明のタンパク質）を構成することができる。
【００８１】
また、本発明のタンパク質の内、糖鎖を実質的に有さないラミニンE8は、例えば、糖鎖を有するラミニンE8の糖鎖を除去することにより製造することができる。糖鎖を除去する手段は、特に制限されない。糖鎖を除去する手段としては、グリコシダーゼ等の酵素を用
いる方法や無水ヒドラジンや無水ＴＦＭＳ（Anhydrous trifluoromethanesulfonic acid
）等の化学物質を用いる方法が挙げられる。
【００８２】
本発明のタンパク質の用途は、特に制限されない。本発明のタンパク質は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。本発明のタンパク質は、幹細胞等の細胞に対する足場機能を示す。よって、本発明のタンパク質は、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。本発明のタンパク質は、具体的には、例えば、細胞培養用の足場タンパク質として利用してもよい。また、本発明のタンパク質は、例えば、細胞培養用器具等の器具の構成要素として利用してよい。本発明のタンパク質は、具体的には、例えば、細胞培養容器等の器具の表面にコーティングして利用してもよい。器具や細胞培養については、後述する本発明の器具や本発明の方法についての説明を準用できる。
【００８３】
＜２＞本発明の組成物
本発明の組成物は、本発明のタンパク質を含有する組成物である。本発明の組成物の用途は、特に制限されない。本発明の組成物は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。すなわち、本発明の組成物は、例えば、医療用または研究用の組成物であってよい。本発明の組成物は、具体的には、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。すなわち、本発明の組成物は、具体的には、例えば、細胞培養用の組成物であってよい。本発明の組成物は、より具体的には、例えば、細胞足場材料であってもよい。「細胞足場材料」とは、細胞の足場として機能する構造物をいい、具体的には、細胞培養時に細胞の足場として機能する構造物をいう。細胞足場材料は、例えば、細胞培養に利用できる。すなわち、細胞足場材料を足場として細胞を培養することができる。細胞足場材料を利用して得られた細胞培養の結果物（培養細胞、細胞シート、組織、臓器、等）は、例えば、細胞足場材料から回収して、あるいは細胞足場材料ごと、治療等の所望の用途に利用することができる。また、細胞足場材料は、生体内にインプラントされ、生体内での細胞の培養（細胞の接着および増殖を介した組織形成、等）に利用されてもよい。また、本発明の組成物は、より具体的には、例えば、細胞培養容器等の器具のコーティング剤であってもよい。器具や細胞培養については、後述する本発明の器具や本発明の方法についての説明を準用できる。
【００８４】
本発明の組成物は、本発明のタンパク質からなるものであってもよく、そうでなくてもよい。本発明の組成物は、本発明のタンパク質と他の成分との組み合わせからなるものであってもよい。すなわち、本発明のタンパク質は、単独で、あるいは他の成分を組み合わせて、本発明の組成物として利用できる。他の成分は、本発明の組成物の利用態様に応じた許容可能な性質を有するものであれば特に制限されない。他の成分としては、例えば、医薬品や試薬に配合して利用されるものが挙げられる。そのような成分として、具体的には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の添加剤が挙げられる。
【００８５】
本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度（含有量）は、特に制限されない。本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物における本発明のタンパク質の濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｗ）以上、０．１％（ｗ／ｗ）以上、１％（ｗ／ｗ）以上、５％（ｗ／ｗ）以上、または１０％（ｗ／ｗ）以上であってもよく、１００％（ｗ／ｗ）以下、９９．９％（ｗ／ｗ）以下、７０％（ｗ／ｗ）以下、５０％（ｗ／ｗ）以下、３０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下、または５％（ｗ／ｗ）以下、または１％（ｗ／ｗ）以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。
【００８６】
本発明の組成物の形状は、特に制限されない。本発明の組成物の形状は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物は、所望の形状で製剤
化されていてもよい。本発明の組成物の形状として、具体的には、例えば、液体（溶液や懸濁液、等）、ペースト、粉末、顆粒、球体、タブレット、泡沫、スポンジ、繊維、フィルム、シート、メンブレン、メッシュ、チューブが挙げられる。
【００８７】
本発明の組成物は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水や水性緩衝液等の媒体を用いて希釈、分散、又は溶解等し、所望の用途（例えば器具のコーティング）に用いてよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の組成物の範囲に含まれることは言うまでもない。
【００８８】
＜３＞本発明の器具
本発明の器具は、本発明のタンパク質を備える器具である。本発明の器具の用途は、特に制限されない。本発明の器具は、例えば、医療用途や研究用途に利用してよい。すなわち、本発明の器具は、例えば、医療用または研究用の器具であってよい。本発明の器具は、具体的には、例えば、幹細胞等の細胞の培養に利用してよい。すなわち、本発明の器具は、具体的には、例えば、細胞培養用器具であってよい。細胞培養用器具としては、細胞培養容器や細胞足場材料が挙げられる。細胞培養容器である本発明の器具を、特に「本発明の培養容器」ともいう。また、細胞足場材料である本発明の器具を、特に「本発明の細胞足場材料」ともいう。本発明の器具は、本発明のタンパク質を、本発明のタンパク質の機能が発揮される態様で備えていればよい。本発明の器具は、例えば、本発明のタンパク質を表面に備えていてよい。すなわち、本発明の器具は、具体的には、例えば、本発明のタンパク質で表面がコーティングされた器具であってよい。また、本発明のタンパク質や本発明の組成物がそのまま器具として使用可能な態様に構成されている場合は、本発明のタンパク質や本発明の組成物をそのまま本発明の器具として利用してもよい。具体的には、例えば、本発明の組成物が細胞足場材料として構成されている場合は、本発明の組成物をそのまま本発明の細胞足場材料として利用してもよい。細胞培養については、後述する本発明の方法についての説明を準用できる。
【００８９】
以下、主に培養容器を参照して本発明の器具について説明するが、当該説明は他の器具にも準用できる。すなわち、以下の説明は、そのまま、あるいは器具の態様や用途等の諸条件に応じて適宜変更して、他の器具にも適用できる。
【００９０】
培養容器は、細胞を培養できる材質と形状を有する限り、特に制限されない。培養容器は、例えば、細胞と培地を保持できる材質と形状を有していてよい。培養容器の形状として、具体的には、例えば、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、セルインサート、メンブレンが挙げられる。培養容器の材質として、具体的には、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のプラスチック類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、それらの共重合体等の生分解性ポリマー類、ガラス、改質ガラス等のガラス類、セラミックス類、金属類、セルロース、その他各種高分子化合物が挙げられる。
【００９１】
本発明の培養容器は、少なくともその細胞培養面に本発明のタンパク質を備える。すなわち、本発明の培養容器は、例えば、その細胞培養面が本発明のタンパク質でコーティングされていてよい。「細胞培養面」とは、細胞の培養が実施される面をいい、具体的には、細胞培養時に細胞と接触し得る部位をいう。本発明のタンパク質は、本発明の培養容器を利用して幹細胞等の細胞を培養できる限り、培養容器の細胞培養面の全体をコーティングしていてもよく、そうでなくてもよい。培養容器の細胞培養面の総面積に対する本発明
のタンパク質にコーティングされている部分の面積の比率は、例えば、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であってよい。本発明のタンパク質は、通常は、培養容器の細胞培養面全体をコーティングしているのが好ましい。例えば、培養容器がディッシュ形状であれば、底面全体を本発明のタンパク質でコーティングするのが好ましい。
【００９２】
培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングする手法は、特に制限されない。培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることは、例えば、培養容器表面を機能性材料でコーティングする公知の手法を利用して実施できる。例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライすることにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。具体的には、例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライして乾燥（溶媒を揮発）させることにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。また、具体的には、例えば、本発明のタンパク質を含有する溶液を培養容器の細胞培養面にアプライして時間（以下、「コーティング時間」ともいう）が経過することにより、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングすることができる。コーティング時間は、所望の程度に培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングできる限り、特に制限されない。コーティング時間は、例えば、３０分以上、１時間以上、６時間以上、１２時間以上、または１８時間以上であってもよく、７２時間以下、４８時間以下、または３０時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。コーティング時間の経過後は、適宜、残存する溶液を除去することができ、また、乾燥させることができる。培養容器は、適宜滅菌することができる。培養容器は、例えば、培養容器の細胞培養面を本発明のタンパク質でコーティングした後に滅菌することができる。滅菌には、例えば、エタノールや２−プロパノール等のアルコールを用いることができる。アルコールは、例えば、７０％エタノール等の含水アルコールとして利用してもよい。滅菌は、例えば、細胞培養面にアルコールをアプライすることや、培養容器をアルコールに浸漬することにより、実施できる。このように細胞培養前の滅菌はアルコールを用いて実施できるが、より万全を期すために、本発明のタンパク質を含有する溶液をフィルター滅菌等により滅菌してから培養容器の細胞培養面にアプライし、以降の操作を無菌条件下で行ってもよい。フィルター滅菌には、例えば、メルクミリポア社製マイレクス等のフィルターを用いることができる。適宜無菌操作を行うことができる。本発明の培養容器は、製造後（本発明のタンパク質のコーティング後）すぐに利用してもよいし、適宜保存してから利用してもよい。本発明の培養容器は、製造後すぐに利用しない場合にも、幹細胞等の細胞の培養に有効である。保存温度は、例えば、０℃〜５０℃、０℃〜４０℃、０℃〜２５℃、または０℃〜１０℃であってよい。保存期間は、例えば、１年以下、６月以下、または１月以下であってよい。本発明の培養容器は、乾燥状態で保存してもよいし、湿潤状態で保存してもよい。例えば、細胞培養面をＰＢＳ等の緩衝液で湿潤させた状態で保存してもよい。
【００９３】
培養容器表面への本発明のタンパク質のコーティング量は、本発明の培養容器を利用して幹細胞等の細胞を培養できる限り、特に制限されない。培養容器表面への本発明のタンパク質のコーティング量は、例えば、０．１μｇ／ｃｍ２以上、０．２μｇ／ｃｍ２以上、０．４μｇ／ｃｍ２以上、１μｇ／ｃｍ２以上、または５μｇ／ｃｍ２以上であってもよく、５００μｇ／ｃｍ２以下、２５０μｇ／ｃｍ２以下、１００μｇ／ｃｍ２以下、または５０μｇ／ｃｍ２以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。培養容器表面への本発明のタンパク質のコーティング量は、具体的には、例えば、０．１μｇ／ｃｍ２〜５００μｇ／ｃｍ２、好ましくは０．２μｇ／ｃｍ２〜２５０μｇ／ｃｍ２、より好ましくは０．４μｇ／ｃｍ２〜１００μｇ／ｃｍ２であってもよい。
【００９４】
同様に、本発明の細胞足場材料も適宜取得できる。細胞足場材料は、細胞を培養できる
材質と形状を有する限り、特に制限されない。細胞足場材料は、例えば、目的とする細胞培養の結果物（細胞シート、組織、臓器、等）の形状に応じた形状を有していてよい。細胞足場材料は、例えば、細胞足場材料の内部に細胞が充填されるよう、多孔質等の空隙を有する形態に構成されていてよい。細胞足場材料の材質としては、例えば、生体内にインプラントするのに適している等の観点から、生体吸収性高分子が好ましく挙げられる。生体吸収性高分子として、具体的には、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリカプロラクトン、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリペプチドが挙げられる。本発明の細胞足場材料は、例えば、細胞足場材料の表面（具体的には、細胞培養面）を本発明のタンパク質でコーティングすることにより得られる。なお、「細胞足場材料の表面」には、細胞足場材料が空隙を有する形態に構成されている場合は、空隙内部の表面も含まれる。また、例えば、上述の通り、細胞足場材料として構成された本発明の組成物をそのまま本発明の細胞足場材料として用いてもよい。
【００９５】
＜４＞本発明の方法
本発明のタンパク質を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。具体的には、本発明のタンパク質を備える器具（本発明の器具）を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。より具体的には、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の、本発明のタンパク質を備える培養器具を利用して、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。すなわち、本発明は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具で細胞を培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。同方法を、「本発明の方法」ともいう。本発明のタンパク質は、特に、iPS細胞等の幹細胞
の増殖に高い効果を示す。すなわち、本発明のタンパク質およびそれを備える細胞培養容器や細胞足場材料等の細胞培養用器具は、例えば、iPS細胞等の幹細胞を増殖させるため
に使用することが可能である。また、本発明のタンパク質およびそれを備える細胞培養容器や細胞足場材料等の細胞培養用器具は、iPS細胞等の幹細胞の増殖に限られず、例えば
、その前段階であるiPS細胞等の幹細胞の樹立、ならびに、その後段階であるiPS細胞等の幹細胞の分化にも使用することが可能である。すなわち、本発明において、「細胞の培養」には、細胞の増殖に限られず、例えば、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞の樹立、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞から他の細胞への分化も包含される。具体的には、「幹細胞の培養」には、幹細胞の増殖に限られず、例えば、幹細胞の樹立（例えば、iPS細胞やES細胞等の万能性幹細胞または多能性幹細胞の樹立）や幹細胞の分化（例
えば、iPS細胞やES細胞等の幹細胞からのその他の幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞へ
の分化）も包含される。本発明の方法により、培養された細胞（培養細胞）が得られる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法である。本発明の方法により得られる培養細胞は、分化していてもよく、していなくてもよい。すなわち、本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、未分化状態が維持されていてもよく、未分化状態を獲得していてもよい。本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、幹細胞や前駆細胞等の分化能を有する細胞であってもよいし、前駆細胞や成熟細胞等の分化した細胞であってもよい。本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、遊離の細胞（個々の独立した細胞）であってもよいし、細胞シート、組織、臓器、等の組織化した細胞であってもよい。
【００９６】
培養される細胞の種類は特に制限されない。本発明の方法は、特に、幹細胞の培養に好適に利用できる。幹細胞として、具体的には、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、多能性生殖幹細胞（mGS細胞）、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞が挙げられる。幹細胞として、より具体的には、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）が挙げられる。細胞は、いずれの生体組織に由来するもの
であってもよい。生体組織としては、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根
、気管、口腔粘膜が挙げられる。細胞が由来する生物は特に制限されず、使用目的等に応じて適宜選択することができる。細胞が由来する生物として、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類として、具体的には、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーが挙げられる。哺乳類は、免疫不全動物であってもよい。培養した細胞をヒトの治療に用いる場合、細胞が由来する生物としては、例えば、ヒト、ブタ、チンパンジーから選択される哺乳類が好ましい。本発明の方法においては、１種の細胞のみを培養してもよく、２種またはそれ以上の細胞を共培養してもよい。
【００９７】
培養条件は、所望の培養結果（細胞の増殖、幹細胞の樹立、細胞の分化、等）が得られる条件であれば特に制限されない。培養条件は、本発明の培養容器や本発明の細胞足場材料等の本発明の器具を用いること以外は、例えば、ES細胞やiPS細胞等の細胞の培養に用
いられる通常の条件と同じであってよい。培養条件は、本発明の器具の態様、細胞の種類、細胞が由来する生物種等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００９８】
培地の組成は、培養する細胞の性質等の諸条件に応じて適宜設定できる。培地成分としては、例えば、グルコース等の炭素源、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩、緩衝剤、成長因子、血清、血清アルブミンが挙げられる。細胞の培養に用いられる通常の培地として、具体的には、例えば、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＫＣＭが挙げられる。また、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）の培養に用いられる通常の培地として、具体的に
は、例えば、Essential 8培地（インビトロジェン社製）、StemFit(R)培地（味の素社製
）、その他実施例で用いた培地が挙げられる。
【００９９】
本発明の方法によれば、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質（本発明のタンパク質以外の細胞接着タンパク質）を使用することなく、幹細胞等の細胞を効率よく培養することができる。しかしながら、このことは、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質を使用することを妨げるものではない。すなわち、本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質（本発明のタンパク質以外の細胞接着タンパク質）を使用してもよいし、しなくてもよい。本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質の使用量を、細胞の培養に使用される通常の量と比較して低減するのが好ましい。本発明の方法においては、フィーダー細胞や他の細胞接着タンパク質を使用しないのがより好ましい。
【０１００】
培養開始時に播種する細胞数は、例えば、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、または２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上であってもよく、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、または５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。培養温度は、例えば、３６℃〜３８℃であってよく、好ましくは約３７℃であってよい。培養ｐＨは、例えば、ｐＨ６．８〜７．２であってよい。培養時の気相は、例えば、空気と炭酸ガスの混合ガスであってよい。具体的には、例えば、５％炭酸ガスと９５％空気の雰囲気下で培養を行ってよい。培養期間は、例えば、５〜３０日、好ましくは７〜１６日であってよい。培養中、培地交換を実施してもよい。
【０１０１】
このようにして細胞培養を実施することにより、培養細胞が得られる。
【実施例】
【０１０２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
【０１０３】
実施例１：糖鎖切断ラミニン511E8の調製と細胞足場機能の評価
＜１＞糖鎖切断ラミニン511E8の調製
市販ラミニン511E8（iMatrix-511、ニッピ社）に対し、N型糖鎖切断酵素Glycopeptidase F（タカラバイオ社）を、付属のプロトコールに従い、変性条件下および非変性条件下
にて、37℃、15時間反応させた。iMatrix-511は、チャイニーズハムスター卵巣由来のCHO-S細胞を宿主として異種発現して製造されたヒトのラミニン511E8である。その後、糖鎖
切断によるバンドシフトを確認するために、SDS-PAGE分析を実施した。その結果を図１に示す。その結果、予測された糖鎖の分子量に相当する分だけ、バンドが移動していることを確認した。本結果より、糖鎖切断ラミニン511E8（糖鎖が除去されたラミニン511E8）を調製することができた。
【０１０４】
＜２＞糖鎖切断ラミニン511E8の細胞足場機能の評価
＜２−１＞細胞培養プレートへのコーティング
上記実施例１＜１＞で得た糖鎖切断ラミニン511E8の水溶液をリン酸緩衝生理食塩水（
ナカライテスク社）で希釈し、6ウェル細胞培養プレート（コーニング社Falcon培養プレ
ート）にタンパク質量が4.8μg/ウェルとなるように投入した。4℃で一昼夜静置した後、水溶液を除いた。
【０１０５】
＜２−２＞ｉＰＳ細胞増殖系での評価
糖鎖切断ラミニン511E8をコーティングした表面での人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）
の接着増殖効果を評価した。ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳポータル社より購入した201B7株を用
いた。細胞培養は、StemFit(R)培地（味の素社製）を用いて、5%CO2/37℃の条件で行った。糖鎖切断ラミニン511E8を細胞培養プレート上にコーティングして直ちに培養に用いる
ことにより、その効果を検討した。1ウェルあたり13,000個の生細胞をシングルセル播種
した。播種時に使用する培地にはY-27632を添加（最終濃度10μM、ナカライテスク社製）し、翌日以降はY-27632を添加していない培地で培養した。1〜3日毎に培地交換を行い、6〜7日間の培養後、細胞解離酵素（ライフテクノロジーズ社TrypLE Select）処理により剥離した細胞の個数を、細胞数測定装置（ベックマン・コールター社ViCell）を用いて測定した。尚、比較対照として、糖鎖切断していない市販ラミニン511E8（iMatrix-511、ニッピ社製）を製品プロトコルの方法に従い細胞培養プレート上にコーティングして、同様の培養方法で評価した。
【０１０６】
結果を図２に示す。図２に示すように、糖鎖切断ラミニン511E8は、上記＜２−１＞の
方法でコーティングし、13,000個の生細胞を播種する条件において、途中2回の継代によ
り3週間にわたって培養を行うことができた。この間、生細胞増加率が変動することはな
く、安定した培養が可能であることも示された。3週間の培養を行った後、アルカリフォ
スファターゼ染色キット（シグマアルドリッチ社：86-R）を用いて染色を行った結果、細胞の未分化状態が維持されていることを確認した。これは、ラミニン511E8が糖鎖を有さ
ずとも、長期培養において、ｉＰＳ細胞の未分化状態を維持した状態で増殖することが可能であることを示すものである。
【０１０７】
実施例２：ヒトラミニンα5鎖E8のE. coliでの発現
＜１＞E. coliヒトラミニンα5鎖E8発現株の構築
ヒトラミニンα5鎖E8の遺伝子を発現するプラスミドpET22b-LNaは、pET22b(+)ベクター（Novagen）を制限酵素NdeIとEcoRIによって切断した後、全合成したヒトラミニンα5鎖E8の遺伝子をDNA Ligation Kit（TaKaRa）を用いて挿入して構築した。同遺伝子の塩基配
列を配列番号１に、同遺伝子がコードするヒトラミニンα5鎖E8のアミノ酸配列を配列番
号２に示す。配列番号２のヒトラミニンα5鎖E8はＮ末に6xHisタグが付加されている。上記pET22b-LNaでエシェリヒア・コリBL21(DE3)ΔrecA株(F- ompT hsdSB  (rB- mB-) gal dcm (DE3) Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR))を形質転換することにより、ヒトラミニンα5
鎖E8生産菌BL21(DE3)ΔrecA/pET22b-LNa株を得た。BL21(DE3)ΔrecA株は、BL21(DE3)株からλRed法によりrecA遺伝子を欠損することで得られる。
【０１０８】
＜２＞ヒトラミニンα5鎖E8のE. coliでの発現
上記で得られたBL21(DE3)ΔrecA/pET22b-LNa株を、（１）に示す培地を張り込んだ500 mL坂口フラスコに播種し、37℃で8時間、震盪培養し、種培養液Ａを得た。種培養液Ａを
（２）に示す培地を張り込んだ500 mL坂口フラスコに播種し、37℃でグルコースを全て消費するまで震盪培養して種培養液Ｂを得た。種培養液Ｂ 6 mLを（３）に示す培地294 mL
に添加し、1 vvm、37℃、DO >24% （播種前のDOを100%とする）、pH6.9の条件下で本培養を実施した。培養開始後、グルコースが枯渇した時点より（４）に示すフィード液を添加し、培養液中OD（620 nmの波長で測定）値が40になった時点で、培養温度を30℃に下げ、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを1 mM添加してヒトラミニンα5鎖E8の発現
を誘導した。IPTG添加後12時間で培養を終了し、菌体を遠心分離して回収した。超音波にて菌体を破砕し、菌体破砕液をSDS-PAGEに供したところ、目的サイズのバンドが観察され（図３）、ヒトラミニンα5鎖E8が発現していることを確認した。
【０１０９】
（１）プレシード培地
Yeast extract 5 g/L、Selecto soytone 10 g/L、NaCl 10 g/L、アンピシリンナトリウム
100 mg/L。
【０１１０】
（２）プレシード培地
グルコース 5 g/L、Yeast extract 5 g/L、Selecto soytone 10 g/L、NaCl 10 g/L、アンピシリンナトリウム 100 mg/L。
【０１１１】
（３）生産培地
グルコース20 g/L、硫酸マグネシウム七水和物2.5 g/L、硫酸アンモニウム 5 g/L、Select soytone 1.0 g/L（窒素重量換算）、リン酸二水素カリウム5 g/L、クエン酸ナトリウム
3 g/L、硫酸鉄七水和物40 mg/L、硫酸マンガン七水和物40 mg/L、塩化カルシウム二水和物40 mg/L、GD-113（消泡剤）0.1 ml/L、アンピシリンナトリウム100mg/L
【０１１２】
（４）フィード培地
グルコース600 g/L
【０１１３】
実施例３：C. glutamicumにおけるヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の各
分泌発現、並びにヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現
＜１＞ヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の各分泌発現プラスミド、並びにヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現プラスミドの構築
ヒトラミニン511を酵素処理して得られたヒトラミニン511E8に関しては既にアミノ酸配列が決定されている。ヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8のアミノ酸配列を<配列番号３>および<配列番号４>に示す。これらのアミノ酸配列を元にヒトラミニンβ1
鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8をコードする塩基配列をC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮してデザインした。さらに、C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのシグナルペ
プチド30アミノ酸残基、同株由来のCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、FactorXaプロテアーゼの認識配列IEGR、ヒトラミニンβ1鎖E8またはヒトラミニンγ1鎖E8、および6xHisタグの融合タンパク質（以下、「CspB6Xa-LE8β」または「CspB6Xa-LE8γ」と表記
する）と、その融合タンパク質をコードする塩基配列をデザインした。デザインしたCspB6Xa-LE8βおよびCspB6Xa-LE8γをコードする塩基配列を<配列番号５>および<配列番号６>に、CspB6Xa-LE8βおよびCspB6Xa-LE8γのアミノ酸配列を<配列番号７>および<配列番号
８>に示す。
【０１１４】
次に、<配列番号５>に記載の塩基配列の上流にC. glutamicum ATCC13869株由来のCspB
遺伝子のプロモーターを繋げ、さらに5’-側にKpnIサイト、3’-側にBamHIサイトを付加
した、CspB6Xa-LE8βの発現カセットをデザインし、全合成した。全合成したDNA断片（CspB6Xa-LE8βの発現カセット）を制限酵素KpnIとBamHI処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpnI-BamHI部位に挿入することによって、CspB6Xa-LE8βの分泌発現プラスミドで
あるpPK4_CspB6Xa-LE8βを構築した。同様に<配列番号６>に記載の塩基配列の上流にC. glutamicum ATCC13869株由来のCspB遺伝子のプロモーターを繋げ、さらに5’-側にKpnIサ
イト、3’-側にBamHIサイトを付加した、CspB6Xa-LE8γの発現カセットをデザインし、全合成した。全合成したDNA断片（CspB6Xa-LE8γの発現カセット）を制限酵素KpnIとBamHI
処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpnI-BamHI部位に挿入することによって、CspB6Xa-LE8γの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6Xa-LE8γを構築した。
【０１１５】
pPK4_CspB6Xa-LE8βを鋳型として、<配列番号９>と<配列番号１０>のプライマーを用いてCspB6Xa-LE8βを含む約1.5 kbpのDNA断片を、<配列番号１１>と<配列番号１２>のプラ
イマーを用いてCspB6Xa-LE8γを含む約1.5 kbpのDNA断片を、それぞれPCR法によって増幅した。PCRにはPrimeSTAR GXL(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。増幅したそれぞれ約1.5 kbpのDNA断片はWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製した。精製した2つのDNA断片を鋳
型として、<配列番号９>と<配列番号１２>のプライマーを用いて、連結されたCspB6Xa-LE8βおよびCspB6Xa-LE8γを含む約3.0kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。PCRにはKOD-FX(R) DNA polymerase（TOYOBO）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従っ
た。増幅した約3.0kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し
、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。
回収したDNA断片をインフュージョン反応により特開平9-322774に記載のpPK4のKpnI-SalI部位に挿入することによって、CspB6Xa-LE8βおよびCspB6Xa-LE8γの同時分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γを得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに
従った。
【０１１６】
＜２＞C. glutamicumにおけるヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の各分泌
発現、並びにヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現
上記で構築したpPK4_CspB6Xa-LE8β、pPK4_CspB6Xa-LE8γ、およびpPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γを用いて、WO2016/171224に記載のC. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8γ株、およびYDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γ株を得た。YDK010::phoS(W302C)株は、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010の野生型phoS遺伝子を変異型phoS(W302C)遺伝子に置換して得られた株である。変異型phoS(W302C)遺伝子は、302位のトリプトファン残基がシステイン残基に置換されたPhoSタンパク質(W302C)をコードする。YDK010株は、C. glutamicum AJ12036株（FERM BP-734）の細胞表層タンパク質PS2（CspB）の欠損株である。AJ12036株は、1984年3月26日に工業技術院  微生
物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄
託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
【０１１７】
得られた各形質転換体を、試験管内の25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グ
ルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水
素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素
量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養し
た。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5μlを非還元SDS-PAGEに供してからOriole 蛍光ゲルステイン（Bio-Rad）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β株の培養上清中にヒトラミニンβ1鎖E8のホモ二量体と推
定されるタンパク質バンド、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8γ株の培養上清中にヒトラミニンγ1鎖E8のホモ二量体と推定されるタンパク質バンド、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γ株の培養上清中にヒトラミニンβ1鎖E8及びヒトラミニンγ1鎖E8のホモ二量体あるいはヘテロ二量体と推定されるタンパク質バンドがそれぞ
れ検出された（図４）。染色後、画像解析ソフトImageQuant TL（GE Healthcare）を用いて各サンプルのバンド強度の数値化を行い、同時に泳動および染色したBSA溶液（50, 100, 200 ng/lane）から検量線を作成し、この検量線から各サンプル中の二量体の濃度を算
出した。結果を表３に示す。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
＜３＞ヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現株の培養上清中のLC-MS分析によるヒトラミニンβ1γ1E8二量体の確認
上記＜２＞で得られたYDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LE8β-CspB6Xa-LE8γ株の培養上清よりアフィニティー精製によりヒトラミニンβ1鎖E8及びヒトラミニンγ1鎖E8のホモ二量体あるいはヘテロ二量体と推定されるタンパク質を精製した。cOmplate His-Tag Purification Resin（Roche）1 mlを50 mlプラスチックチューブに取り、結合バッファー
（50 mM NaH2PO4 (pH8.0), 300 mM NaCl）20 mlを添加してよく混合した後、遠心して上
清を取り除くことによりレジンを平衡化した。培養上清12〜15 mlを平衡化したレジンに
加えて1時間30分転倒混和した後、遠心して上清を取り除いた。洗浄バッファー（50 mM NaH2PO4 (pH8.0), 300 mM NaCl, 5 mM イミダゾール）1 mlを添加し、5分間転倒混和した
。これを5回繰り返した後上清を取り除き、溶出バッファー（50 mM NaH2PO4(pH8.0), 300
mM NaCl, 250 mM イミダゾール）を添加して10分間転倒混和し、遠心上清を回収した。
この遠心上清をフィルター（PVDF, 0.22μm）濾過した。
【０１２０】
次に、得られた濾液を、LC-ESI-Q-TOF-MS（アジレント・テクノロジー社）を用いて、
アフィニティークロマトグラフィーによる精製およびMS測定に供した。分析条件は、下記のとおり。
【０１２１】
カラム：TSKgel Protein C4-300（3 μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm、東ソー社）
注入量：20 μl
カラム温度：40℃
流速：1 ml/min
移動相A：0.1％ギ酸
移動相B：0.1％ギ酸/アセトニトリル
グラジエント：表４
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
得られた多価イオンのMSスペクトルをMassHunter BioConfirm ソフトウェア（アジレント・テクノロジー社）を用いてデコンボリューション処理をおこなった。その結果を図５に示す。ヒトラミニンβ1γ1E8二量体（ヒトラミニンβ1鎖E8及びヒトラミニンγ1鎖E8のヘテロ二量体）の分子量の計算値は57272 Daである。図５から、濾液中のタンパク質の分子量はヒトラミニンβ1γ1E8二量体の計算値と一致していることが確認できた。よって、ヒトラミニンβ1鎖E8およびヒトラミニンγ1鎖E8の同時分泌発現株の培養により、培地中にヒトラミニンβ1γ1E8二量体が生成したことが確認された。
【０１２４】
実施例４：尿素変性した市販ラミニン511E8からのαβγ三量体の再構成と細胞足場機能
の評価
＜１＞尿素変性した市販ラミニン511E8（α鎖(fold)とβγ二量体）からのαβγ三量体
の再構成
市販ラミニン511E8（iMatrix-511、ニッピ社）を5倍(v/v)に遠心濃縮した後、終濃度8 M Urea, 20 mM Tris-HCl, pH7.4の溶液を調製し、4℃で一晩静置した。ラミニン511E8は
、Ureaを加えて変性させることでα鎖とβγ二量体に解離する。変性させたラミニン511E8を20 mM Tris-HCl, pH7.4で10倍に希釈し、4℃で16時間以上静置した。次いで、希釈サ
ンプルを1/10容のcOmplete His-Tag Purification Resin（Roche）と混合し、1時間30分
間撹拌した。フロースルーを回収し、樹脂を6倍容の50 mM NaH2PO4, 5 mMイミダゾールを用いて洗浄し、3倍容の50 mM NaH2PO4, 250 mMイミダゾールを用いて樹脂に吸着しているタンパク質を溶出させた。同様に、対照サンプルとして、尿素変性していない市販ラミニン511E8および尿素変性後かつ希釈前の市販ラミニン511E8について、樹脂への吸着、洗浄、および溶出を実施した。希釈サンプルおよび対照サンプルについて、各画分をSDS-PAGEに供した。結果を図６〜８に示す。市販ラミニン511E8では、α鎖にHisタグが付加されているため、ラミニン511E8が変性しα鎖とβγ二量体に解離している場合には、図６に示
す対照サンプル（尿素変性後かつ希釈前の市販ラミニン511E8）の結果のように、フロー
スルーおよび洗浄画分にβγ二量体が検出され、溶出画分にα鎖が検出される。一方、ラミニン511E8が三量体を形成している場合には、図７に示す対照サンプル（尿素変性して
いない市販ラミニン511E8）の結果のように、溶出画分にα鎖およびβγ二量体が検出さ
れる。希釈サンプルでは、溶出画分にα鎖とβγ二量体が検出された（図８）。すなわち、希釈サンプルではラミニン511E8が三量体を形成しており、希釈によりαβγ三量体を
再構成できることが示された。希釈サンプルの溶出画分を回収し、0.22μmのフィルター
で滅菌し、再構成されたαβγ三量体の水溶液を得た。同水溶液中のタンパク質濃度をBradford法（バイオ・ラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬、#5000006、Bio-Rad社）に
よりBSAを標準として測定した。
【０１２５】
＜２＞尿素変性した市販ラミニン511E8（α鎖(fold)とβγ二量体）から再構成したαβ
γ三量体の細胞足場機能の評価
＜２−１＞細胞培養プレートへのコーティング
上記＜１＞で得た尿素変性したラミニン511E8から再構成されたαβγ三量体の水溶液
をリン酸緩衝生理食塩水（ナカライテスク社）で希釈し、6ウェル細胞培養プレート（コ
ーニング社Falcon培養プレート）にタンパク質量が4.8μg/ウェルもしくは9.6μg/ウェルとなるように投入した。4℃で一昼夜静置した後、水溶液を除いた。
【０１２６】
＜２−２＞ｉＰＳ細胞増殖系での評価
実施例１＜２−２＞と同様の方法で、尿素変性したラミニン511E8から再構成されたα
βγ三量体をコーティングした表面での人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の接着増殖効果を評価した。
【０１２７】
結果を図９に示す。図９に示すように、尿素変性したラミニン511E8から再構成された
αβγ三量体は、上記＜２−１＞の方法でコーティングし、13,000個の生細胞を播種する条件において、良好なｉＰＳ細胞足場機能を示した。これは、尿素変性したラミニン511E8が上記＜１＞の方法によりαβγ三量体として再構成され、ｉＰＳ細胞足場機能を回復
することを示すものである。
【０１２８】
実施例５：還元変性した市販ラミニン511E8からのαβγ三量体の再構成と細胞足場機能
の評価
＜１＞還元変性した市販ラミニン511E8（α鎖(unfold)、β鎖、及びγ鎖）からのαβγ
三量体の再構成
市販ラミニン511E8（iMatrix-511、ニッピ社）を10Kの限外濾過膜を用いて10倍(v/v)に濃縮した後、終濃度8 M Urea, 20 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, pH7.4の溶液を調製し、37℃で1時間加熱した後、4℃で一晩静置した。ラミニン511E8は、Urea 及びDTTを加えて還元
変性させることでα鎖とβ鎖とγ鎖に解離する。還元変性させたラミニン511E8を、終濃
度が0.8 M Urea, 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM 酸化型グルタチオン, 1 mM 還元型グルタチオン, pH7.4となるように20 mM Tris-HCl, pH7.4および酸化還元剤で10倍(v/v)に
希釈し、4℃で16時間以上静置した。次いで、希釈サンプルを1/10容のcOmplete His-Tag Purification Resin（Roche）と混合し、1時間30分間撹拌した。フロースルーを回収し、樹脂を5倍容の50 mM NaH2PO4, 5 mMイミダゾールを用いて洗浄し、5倍容の50 mM NaH2PO4, 250 mMイミダゾールを用いて樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。各画分をSDS-PAGEに供すると、溶出画分にα鎖およびβγ二量体が検出された（図１０）。すなわち、希釈サンプルではラミニン511E8が三量体を形成しており、希釈によりαβγ三量体を再構
成できることが示された。溶出画分を回収し、0.22μmのフィルターで滅菌し、再構成さ
れたαβγ三量体の水溶液を得た。同水溶液中のタンパク質濃度をBCA法（Micro BCA Pritein Asay Reagentキット、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によりBSAを標準として測定した。
【０１２９】
＜２＞還元変性した市販ラミニン511E8（α鎖(unfold)、β鎖、及びγ鎖）から再構成し
たαβγ三量体の細胞足場機能の評価
＜２−１＞細胞培養プレートへのコーティング
上記＜１＞で得た還元変性したラミニン511E8から再構成されたαβγ三量体の水溶液
をリン酸緩衝生理食塩水（ナカライテスク社）で希釈し、6ウェル細胞培養プレート（コ
ーニング社Falcon培養プレート）にタンパク質量が4.8μg/ウェルもしくは9.6μg/ウェルとなるように投入した。4℃で一昼夜静置した後、水溶液を除いた。
【０１３０】
＜２−２＞ｉＰＳ細胞増殖系での評価
実施例１＜２−２＞と同様の方法で、還元変性したラミニン511E8から再構成されたα
βγ三量体をコーティングした表面での人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の接着増殖効果を評価した。
【０１３１】
結果を図11に示す。
【０１３２】
図３に示すように、還元変性したラミニン511E8から再構成されたαβγ三量体は、上
記＜２−１＞の方法でコーティングし、13,000個の生細胞を播種する条件において、良好なｉＰＳ細胞足場機能を示した。これは、還元変性したラミニン511E8が上記＜１＞の方
法によりαβγ三量体として再構成され、ｉＰＳ細胞足場機能を回復することを示すものである。
【０１３３】
＜配列表の説明＞
配列番号１：Ｎ末に6xHisタグが付加されたヒトラミニンα５鎖E8をコードする遺伝子の
塩基配列
配列番号２：Ｎ末に6xHisタグが付加されたヒトラミニンα５鎖E8のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトラミニンβ１鎖E8のアミノ酸配列
配列番号４：ヒトラミニンγ１鎖E8のアミノ酸配列
配列番号５：CspB6Xa-LE8βをコードする塩基配列
配列番号６：CspB6Xa-LE8γをコードする塩基配列
配列番号７：CspB6Xa-LE8βのアミノ酸配列
配列番号８：CspB6Xa-LE8γのアミノ酸配列
配列番号９〜１２：プライマー
配列番号１３：ヒトラミニンα５鎖E8のアミノ酸配列
配列番号１４〜１８：Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列
配列番号１９：ヒトラミニンα１鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２０：ヒトラミニンα２鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２１：ヒトラミニンα３鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２２：ヒトラミニンα４鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２３：ヒトラミニンβ２鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒトラミニンβ３鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒトラミニンγ２鎖E8のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトラミニンγ３鎖E8のアミノ酸配列
【図１】
2018131426.tif 000006
【図２】
2018131426.tif 000007
【図３】
2018131426.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
2018131426.tif 000011
【図７】
2018131426.tif 000012
【図８】
2018131426.tif 000013
【図９】
2018131426.tif 000014
【図１０】
2018131426.tif 000015
【図１１】
2018131426.tif 000016
【配列表】
2018131426000001.app