(57)【要約】      （修正有）【課題】ジカウイルス（ＺＩＫＶ）を迅速かつ高精度に検出する手段の提供。【解決手段】ＺＩＫＶを特異的に検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセット、アッセイキット、および検出のための増幅方法。プライマーセットは、アジア型検出用プライマー群、即ち、アジア型のＺＩＫＶを検出するためのプライマー群、およびアフリカ型検出用プライマー群、即ち、アフリカ型のＺＩＫＶを検出するためのプライマー群の少なくともどちらか一方を含む、プライマーセット。【選択図】図１Ａ
2018121607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルスを特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の少なくとも一方を含み、
前記アジア型検出用プライマー群により増幅されるべき鋳型配列は、それぞれ、３’側から５’側に向けてＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列をこの順番で含み、
前記アジア型検出用プライマー群は、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを含み、Ｆ３プライマーはＦ３配列を含み、Ｂ３プライマーはＢ３配列を含み、ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とをこの順番で含み、ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とをこの順番で含み、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ３配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号９若しくは配列番号１９に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２配列は、配列番号５８、配列番号６５若しくは配列番号５１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ１配列は、配列番号３６、配列番号６０若しくは配列番号６８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号５４、配列番号６２若しくは配列番号７０に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６４若しくは配列番号７２に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０若しくは配列番号２０に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記アフリカ型検出用プライマー群により増幅されるべき鋳型配列は、それぞれ、３’側から５’側に向けてＦ３ｃ−２配列、Ｆ２ｃ−２配列、Ｆ１ｃ−２配列、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列およびＢ３−２配列をこの順番で含み、
前記アフリカ型検出用プライマー群は、Ｆ３−２プライマー、Ｂ３−２プライマー、ＦＩＰ−２プライマーおよびＢＩＰ−２プライマーを含み、Ｆ３−２プライマーはＦ３−２配列を含み、Ｂ３−２プライマーはＢ３−２配列を含み、ＦＩＰ−２プライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ−２配列とＦ２−２配列とをこの順番で含み、ＢＩＰ−２プライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ−２配列とＢ２−２配列とをこの順番で含み、
ここで、Ｆ１−２配列とＦ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列とＦ２ｃ−２配列、Ｆ３−２配列とＦ３ｃ−２配列、Ｂ１−２配列とＢ１ｃ−２配列、Ｂ２−２配列とＢ２ｃ−２配列、Ｂ３−２配列とＢ３ｃ−２配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ３−２配列は、配列番号１、配列番号２４若しくは配列番号３７に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２−２配列は、配列番号５７、配列番号６５若しくは配列番号４８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ１−２配列は、配列番号３５、配列番号５９若しくは配列番号６７に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ−２配列は、配列番号５４、配列番号６１若しくは配列番号６９に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ−２配列は、配列番号５６、配列番号６３若しくは配列番号７１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ−２配列は、配列番号１０、配列番号２０若しくは配列番号３８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記Ｆ３プライマーが、配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１９の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号２、配列番号６、配列番号１０または配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号７、配列番号１１または配列番号２８の配列またはその相補配列であり、
前記ＢＩＰプライマーが、配列番号４、配列番号８、配列番号１２または配列番号２２の配列またはその相補配列であり、
前記Ｆ３−２プライマーが、配列番号１９または配列番号２４の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３−２プライマーが、配列番号１０または配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰ−２プライマーが、配列番号２１、配列番号２５、配列番号３１または配列番号３２の配列またはその相補配列であり、
前記ＢＩＰ−２プライマーが、配列番号２２または配列番号２６の配列またはその相補配列である
請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記Ｆ３プライマーが、配列番号１または配列番号１９の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号２または配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号２８または配列番号２９の配列またはその相補配列であり、
前記ＢＩＰプライマーが、配列番号４または配列番号２２の配列またはその相補配列であり、
前記Ｆ３−２プライマーが、配列番号１９の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３−２プライマーが、配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰ−２プライマーが、配列番号２１、配列番号３１または配列番号３２の配列またはその相補配列を含み、
前記ＢＩＰ−２プライマーが、配列番号２２の配列またはその相補配列を含む
請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
前記Ｆ３プライマー、前記Ｂ３プライマー、前記ＦＩＰプライマーおよび前記ＢＩＰプライマー、のためのそれぞれの当該認識配列が、
（Ａｓ１）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の組み合わせ；
（Ａｓ２）配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の組み合わせ；
（Ａｓ３）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の組み合わせ；
（Ａｓ４）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２８および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｓ５）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｓ１’）前記（Ａｓ１）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｓ２’）前記（Ａｓ２）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｓ３’）前記（Ａｓ３）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｓ４’）前記（Ａｓ４）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｓ５’）前記（Ａｓ５）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
からなる群より選択され、
前記Ｆ３−２プライマー、前記Ｂ３−２プライマー、前記ＦＩＰ−２プライマーおよび前記ＢＩＰ−２プライマー、のためのそれぞれの当該認識配列が、
（Ａｆ１）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ２）配列番号２４、配列番号１０、配列番号２５および配列番号２６の組み合わせ；
（Ａｆ３）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３１および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ４）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３２および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ５）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０の組み合わせ；
（Ａｆ１’）前記（Ａｆ１）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｆ２’）前記（Ａｆ２）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｆ３’）前記（Ａｆ３）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｆ４’）前記（Ａｆ４）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
（Ａｆ５’）前記（Ａｆ５）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
からなる群より選択される、
請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
前記ＦＩＰプライマーが、前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ２配列との間にリンカーを含み、
前記ＢＩＰプライマーが、前記Ｂ１配列と前記Ｂ２ｃ配列との間リンカーを含み、
前記ＦＩＰ−２プライマーが、前記Ｆ１ｃ−２配列と前記Ｆ２−２配列との間にリンカーを含み、および／または
前記ＢＩＰ−２プライマーが、前記Ｂ１−２配列と前記Ｂ２ｃ−２配列との間にリンカーを含む
請求項１〜４の何れか１項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
前記リンカーが、１〜５０塩基長を有する任意の塩基配列からなることを特徴とする請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
前記アジア型検出用プライマー群が、更に、配列番号１５、１７または３４の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列であるＬＦプライマー、および／または、配列番号１４、１６または１８の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含むＬＢプライマーを含む請求項１〜６の何れか１項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
前記アフリカ型検出用プライマー群が、更に、配列番号１５、１７または６６の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含むＬＦ−２プライマー、および／または、配列番号１４、２７または４１の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列含むＬＢ−２プライマーを含む請求項１〜６の何れか１項に記載のプライマーセット。
【請求項９】
前記Ｆ３プライマーが、配列番号１または配列番号１９の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号２または配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号２８または配列番号２９の配列またはその相補配列であり、
前記ＢＩＰプライマーが、配列番号４または配列番号２２の配列またはその相補配列であり、
前記ＬＦプライマーが、配列番号１３または配列番号３０配列またはその相補配列であり、
前記ＬＢプライマーが、配列番号１４の配列またはその相補配列である
請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
前記Ｆ３−２プライマーが、配列番号１９の配列またはその相補配列であり、
前記Ｂ３−２プライマーが、配列番号２０の配列またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰ−２プライマーが、配列番号２１、配列番号３１または配列番号３２の配列またはその相補配列であり、
前記ＢＩＰ−２プライマーが、配列番号２２の配列またはその相補配列であり、
前記ＬＦ−２プライマーが、配列番号２３または配列番号３３配列またはその相補配列であり、
前記ＬＢ−２プライマーが、配列番号１４の配列またはその相補配列である
請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の何れかのプライマーセットと、前記プライマーセットを収容する容器とを含むジカウイルスを検出するためのアッセイキット。
【請求項１２】
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第３のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第４のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のダンベル構造体、および／または
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のダンベル構造体
を含む核酸構造体であって、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ３配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号９若しくは配列番号１９に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２配列は、配列番号５８、配列番号６５若しくは配列番号５１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ１配列は、配列番号３６、配列番号６０若しくは配列番号６８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号５４、配列番号６２若しくは配列番号７０に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６４若しくは配列番号７２に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０若しくは配列番号２０に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
ことを特徴とする核酸構造体。
【請求項１３】
３’側から５’側に向けて、Ｆ１−２配列、Ｆ２ｃ−２配列およびＦ１ｃ−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１−２配列と前記Ｆ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第５のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列およびＢ１ｃ−２配列をこの順番で含み、前記Ｂ１−２配列と前記Ｂ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第６のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列およびＦ１−２配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ−２配列と前記Ｆ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第７のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ−２配列、Ｂ２ｃ−２配列およびＢ１−２配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ−２配列と前記Ｂ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第８のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｆ１−２配列、Ｆ２ｃ−２配列、Ｆ１ｃ−２配列、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列およびＢ１ｃ−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１−２配列と前記Ｆ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１−２配列と前記Ｂ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第５のダンベル構造体、および／または
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列、Ｆ１−２配列、Ｂ１ｃ−２配列、Ｂ２ｃ−２配列およびＢ１−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ−２配列と前記Ｆ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ−２配列と前記Ｂ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第６のダンベル構造体
を含む核酸構造体であって、
ここで、Ｆ１−２配列とＦ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列とＦ２ｃ−２配列、Ｆ３−２配列とＦ３ｃ−２配列、Ｂ１−２配列とＢ１ｃ−２配列、Ｂ２−２配列とＢ２ｃ−２配列、Ｂ３−２配列とＢ３ｃ−２配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ３−２配列は、配列番号１、配列番号２４若しくは配列番号３７に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２−２配列は、配列番号５７、配列番号６５若しくは配列番号４８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ１−２配列は、配列番号３５、配列番号５９若しくは配列番号６７に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ−２配列は、配列番号５４、配列番号６１若しくは配列番号６９に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ−２配列は、配列番号５６、配列番号６３若しくは配列番号７１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ−２配列は、配列番号１０、配列番号２０若しくは配列番号３８に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
ことを特徴とする核酸構造体。
【請求項１４】
請求項１〜１０に記載の何れかのプライマーセットを用いて試料に含まれる核酸を増幅し、蛍光を指標に前記試料にジカウイルスが含まれているか否かを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカウイルス（Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ：ＺＩＫＶ）は、主に蚊によって媒介されるフラビウイルス科フラビウイルス属のウイルスである。ヒトに感染すると、発熱、発疹、関節痛、筋肉痛、頭痛などを引き起こすが、特に、妊娠中の女性に感染することで、胎児が小頭症となる症例が多く報告されている。ＺＩＫＶは、２０１５年〜２０１６年にかけて南アメリカ大陸を中心に流行している。流行の中心地であるブラジルでは、小頭症の胎児の報告件数が数千にも上っている。
【０００３】
このような状況におい、ＺＩＫＶを更に精度よく検出できる手段の開発が望まれている。ＺＩＫＶの検出は、病理学的方法、モノクローナル抗体を使用する抗原抗体反応による方法、特異的なプライマーセットを利用するＰＣＲ法などにより行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
実施形態は、ジカウイルスを精度よくかつ迅速に検出できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態によれば、ジカウイルスを特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。当該プライマーセットは、アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の少なくとも一方を含む。アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマー群に関し、Ｆ３配列は、配列番号１、５、９若しくは１９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号５８、６５若しくは５１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、配列番号３６、６０若しくは６８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号５４、６若しくは７０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号５５、５６、６４若しくは７２に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号２、６、１０若しくは２０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【０００６】
前記アフリカ型検出用プライマー群に含まれるプライマー群に関し、Ｆ３−２配列は、配列番号１、２４若しくは３７に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２−２配列は、配列番号５７、６５若しくは４８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【０００７】
前記Ｆ１−２配列は、配列番号３５、５９若しくは６７に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ−２配列は、配列番号５４、６１若しくは６９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ−２配列は、配列番号５６、６３若しくは７１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ−２配列は、配列番号１０、２０若しくは３８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。
【図１Ｂ】鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。
【図２−１】ジカウイルスゲノムのｃＤＮＡと対応する認識配列の例とを示す図である。
【図２−２】ジカウイルスゲノムのｃＤＮＡと対応する認識配列の例とを示す図である。
【図２−３】ジカウイルスゲノムのｃＤＮＡと対応する認識配列の例とを示す図である。
【図２−４】ジカウイルスゲノムのｃＤＮＡと対応する認識配列の例とを示す図である。
【図２−５】ジカウイルスゲノムのｃＤＮＡと対応する認識配列の例とを示す図である。
【図３】核酸構造物を示す模式図である。
【図４】実験結果を示すグラフである。
【図５】実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＺＩＫＶの流行拡大を防止または鎮静化するためには、ＺＩＫＶを精度よく、迅速に検出することが必須である。実施形態は、ＺＩＫＶのＲＮＡのタンパク質コード領域に含まれる特定の配列を利用して設計した、ＺＩＫＶをより精度よく、迅速に検出することができる新規のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを発見したことに基づく。
【００１０】
ＺＩＫＶは、非分節型プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＺＩＫＶの遺伝子型は、大きく分けてアジア型とアフリカ型とに分類される。実施形態のプライマーセットによれば、アジア型および／またはアフリカ型のＺＩＫＶを精度よく、かつ迅速に検出することができる。
【００１１】
実施形態のプライマーセットは、アジア型検出用プライマー群、即ち、アジア型のＺＩＫＶを検出するためのプライマー群、およびアフリカ型検出用プライマー群、即ち、アフリカ型のＺＩＫＶを検出するためのプライマー群の少なくともどちらか一方を含む。言い換えれば、実施形態のプライマーセットは、アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群のどちらか一方を含んでいてもよいし、両方を含んでいてもよい。
【００１２】
アジア型検出用プライマー群は、アジア型のＺＩＫＶの遺伝子を増幅するための１セットのＬＡＭＰプライマーを含む。アフリカ型検出用プライマー群は、アフリカ型のＺＩＫＶの遺伝子を増幅するための１セットのＬＡＭＰプライマーを含む。従って、アジア型検出用プライマー群を含む実施形態のプライマーセットによれば、試料中のアジア型のＺＩＫＶを検出することができ、アフリカ型検出用プライマー群を含む実施形態のプライマーセットによれば、試料中のアフリカ型のＺＩＫＶを検出することができる。アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の両方を含むプライマーセットによれば、試料中のＺＩＫＶを、遺伝子型の違いに関わらず検出することができる。
【００１３】
上記各プライマー群に含まれるプライマーは、対応する型のＺＩＫＶの遺伝子を増幅するために、対応する型のＺＩＫＶのＲＮＡおよびそのｃＤＮＡの特定の領域に結合することができるように設計されている。各プライマーが結合すべき領域について、図１Ａおよび図１Ｂを用いて説明する。図１Ａおよび図１Ｂには、アジア型ＺＩＫＶのＲＮＡおよびそのｃＤＮＡと、アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマーとの対応について示す。図１Ａおよび図１Ｂは、鋳型としての検出されるべきアジア型ＺＩＫＶのＲＮＡ（以下、「ｖＲＮＡ」と記す）、そのｃＤＮＡおよびプライマーを、互いに対応付けて示した図である。
【００１４】
図１Ａに示すアジア型ＺＩＫＶのＲＮＡは、各プライマーが結合すべき領域（即ち、認識領域）としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でＺＩＫＶのＲＮＡに含まれる。各認識領域は、認識配列、即ち、Ｆ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列、Ｂ３配列をそれぞれ含む。
【００１５】
ｃＤＮＡは、ｖＲＮＡを鋳型として逆転写反応により作られるｖＲＮＡの相補鎖である。
【００１６】
ｃＤＮＡは、認識領域として、５’側から３’側に向けて、Ｆ３領域、Ｆ２領域、Ｆ１領域、Ｂ１ｃ領域、Ｂ２ｃ領域およびＢ３ｃ領域を含む。これらの各領域は、認識配列としてＦ３配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ３ｃ配列をそれぞれ含む。
【００１７】
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は、互いに相補配列である。
【００１８】
このようなｖＲＮＡおよびｃＤＮＡを鋳型配列として、実施形態のプライマーセットによる増幅反応が行われる。
【００１９】
アジア型検出用プライマー群は、鋳型配列の上記６つの認識配列に対応する配列を含む２つの内部プライマーと２つの外部プライマーとを含む。２つの内部プライマーは、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーである。ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とを含む。ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とを含む。２つの外部プライマーは、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーである。Ｆ３プライマーは、Ｆ３配列を含む。Ｂ３プライマーは、Ｂ３配列を含む。これらのプライマーの各配列に対応する鋳型配列の認識配列を矢印で示した。矢印の向きは、対応するプライマー配列上での方向性を示しており、矢印の始点が５’端、矢印の終点が３’端を表す。
【００２０】
アジア型検出用プライマー群は、更に、ループプライマーとしてＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。図１Ｂは、図１Ａのプライマーに加えてＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを含むプライマーセットのプライマーが結合すべき領域の対応の１例を示す。
【００２１】
この場合、ｖＲＮＡは、認識領域としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、ＬＦｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、ＬＢ領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でｖＲＮＡに含まれる。ＬＦｃ領域およびＬＢ領域は、それぞれＬＦｃ配列およびＬＢｃ配列を含む。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、それぞれＬＦｃ領域およびＬＢ領域に結合すべきＬＦｃ配列およびＬＢｃ配列を含む。
【００２２】
或いは、ループプライマーは、例えば、増幅産物のループ部分に結合するように設計されてもよい。ループ部分は、例えば、図１Ｂ中に「一本鎖部分」と示される領域である。即ち、ループ部分は、例えば、ｖＲＮＡのＦ２ｃ領域の５’端からＦ１ｃ領域の３’端よりも３’側の塩基までの範囲、またはｖＲＮＡのＢ２領域の３’端からＢ１領域の５’端よりも５’側の塩基までの範囲であり得る。
【００２３】
以上の説明は、認識配列がＺＩＫＶアフリカ型検出用の配列である点を除いて、アフリカ型検出用プライマー群にも共通して適応することができる。即ち、アフリカ型ＺＩＫＶのＲＮＡは、認識配列として、Ｆ３ｃ−２配列、Ｆ２ｃ−２配列、Ｆ１ｃ−２配列、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列、Ｂ３−２配列をそれぞれ含み、そのｃＤＮＡは、認識配列として、Ｆ３−２配列、Ｆ２−２列、Ｆ１−２配列、Ｂ１ｃ−２配列、Ｂ２ｃ−２配列およびＢ３ｃ−２配列をそれぞれ含む。Ｆ１−２列とＦ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列とＦ２ｃ−２配列、Ｆ３−２配列とＦ３ｃ−２配列、Ｂ１−２配列とＢ１ｃ−２配列、Ｂ２−２配列とＢ２ｃ−２配列、Ｂ３−２配列とＢ３ｃ−２配列は、互いに相補配列である。
【００２４】
アフリカ型検出用プライマー群は、Ｆ３−２プライマー、Ｂ３−２プライマー、ＦＩＰ−２プライマーおよびＢＩＰ−２プライマーを含む。Ｆ３−２プライマーは、Ｆ３−２配列を含む。Ｂ３−２プライマーは、Ｂ３−２配列を含む。ＦＩＰ−２プライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ−２配列とＦ２−２配列とを含む。ＢＩＰ−２プライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ−２配列とＢ２−２配列とを含む。
【００２５】
アフリカ型検出用プライマー群は、更に、ループプライマーとしてＬＦ−２プライマーおよび／またはＬＢ−２プライマーを含んでもよい。この場合、アフリカ型ＺＩＫＶのＲＮＡは、３’側から５’側に向けて、認識配列としてＦ３ｃ−２配列、Ｆ２ｃ−２配列、ＬＦｃ−２配列、Ｆ１ｃ−２配列、Ｂ１−２配列、ＬＢ−２配列、Ｂ２−２配列、Ｂ３−２配列を含む。ＬＦ−２プライマーはＬＦｃ−２配列を含み、ＬＢ−２プライマーはＬＢｃ−２配列を含む。ループプライマーは、アジア型検出用の場合と同様に、増幅産物のループ部分に結合するように設計されてもよい。
【００２６】
実施形態のプライマーセットが、アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の両方を含む場合、アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の一方が上記の何れかのループプライマーを含み、他方がループプライマーを含んでいなくてもよいし、両方が同じ種類のループプライマーを含んでいてもよいし、両方が互いに異なる種類のループプライマーを含んでいてもよいし、両方がループプライマーを含んでいなくてもよい。
【００２７】
アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群において、Ｆ３配列およびＦ３−２配列、Ｂ３配列およびＢ３−２配列、ＦＩＰ配列およびＦＩＰ−２配列、ＢＩＰ配列およびＢＩＰ−２配列、ＬＦｃ配列およびＬＦｃ−２配列、並びにＬＢｃ配列およびＬＢｃ−２配列はそれぞれ互いに同じ塩基配列を有していてもよい。従って、Ｆ３プライマーおよびＦ３−２プライマー、Ｂ３プライマーおよびＢ３−２プライマー、ＦＩＰプライマーおよびＦＩＰ−２プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢＩＰ−２プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＦ−２プライマー、並びにＬＢプライマーおよびＬＢ−２プライマーはそれぞれ互いに同じ塩基配列を有していてもよい。例えば、アジア型検出用プライマー群およびアフリカ型検出用プライマー群の両方を含む実施形態のプライマーセットにおいて、Ｆ３プライマーおよびＦ３−２プライマー、Ｂ３プライマーおよびＢ３−２プライマー、ＦＩＰプライマーおよびＦＩＰ−２プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢＩＰ−２プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＦ−２プライマー、並びにＬＢプライマーおよびＬＢ−２プライマーとして、それぞれ、両者を兼ねる１種類のプライマーを用いてもよい。
【００２８】
実施形態のプライマーセットに含まれる各プライマーの配列は、ＬＡＭＰ ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社、オンラインソフトウェア、http://www.optigene.co.uk/lamp-designer/）を用いて設計した。まず基礎となる認識領域を設計し、その後、アラインメントからの情報や実験結果などを考慮しながら、手動および目視などによって、各認識配列のｃＤＮＡ上での位置や塩基の種類について改変および調整を行った。
【００２９】
具体的な認識配列の例を図２−１〜図２−５に示す。図２−１〜図２−５には、５’から３’の方向で、コンセンサス配列としてのアフリカ型ＺＩＫＶのｃＤＮＡ（図中「Ａｆｒｉｃａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ」）と、アフリカ型ＺＩＫＶであるＺＩＫＶ９７６Ｕｇａｎｄａ（図中「９７６Ｕｇａｎｄａ」）、コンセンサス配列としてのアジア型ＺＩＫＶ（図中「Ａｓｉａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ」）およびアフリカ型ＺＩＫＶであるＺＩＫＶＰＲＶＡＢＣ５９（図中「ＰＲＶＡＢＣ５９」）のｃＤＮＡとのアラインメント、およびプライマー配列の認識配列の設計例を示した。括弧内に認識配列の配列番号を示す。図２−１〜図２−５においては、ＺＩＫＶのＥタンパク質Ｎ末端側コード領域内のｃＤＮＡの領域の１番目から４８０番目までの配列を１位〜４８０位として示している。
【００３０】
図２−３中の下線を付した塩基は、図２−４に示される配列番号２７および１８の続きの配列である。
【００３１】
アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列の例は、例えば、好ましくは次の通りである。Ｆ３配列は、７７位〜９５位の配列、即ち、配列番号１または１９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、１３８位〜１６１位の配列、即ち、配列番号５１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、１９８位〜２１７位の配列、即ち、配列番号３６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、２２３位〜２４４位の配列、即ち、配列番号５４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、２８６位〜３０３位の配列、即ち、配列番号５５または５６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、３３９位〜３５６位の配列、即ち、配列番号２または２０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００３２】
または、アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列は、例えば、次の通りであってもよい。Ｆ３配列は、８位〜２７位の配列、即ち、配列番号９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、３５位〜５３位の配列、即ち、配列番号５８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、９０位〜１０９位の配列、即ち、配列番号６０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、１４７位〜１６５位の配列、即ち、配列番号６２に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、１９０位〜２１０位の配列、即ち、配列番号６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、２４０位〜２６０位の配列、即ち、配列番号１０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００３３】
または、アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列は、例えば、次の通りであってもよい。Ｆ３配列は、１６０位〜１７８位の配列、即ち、配列番号５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、２２４位〜２４１位の配列、即ち、配列番号６５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、２８４位〜３０３位の配列、即ち、配列番号６８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、３２７位〜３４６位の配列、即ち、配列番号７０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、３８６位〜４０３位の配列、即ち、配列番号７２に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、４１２位〜４３０位の配列、即ち、配列番号６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００３４】
或いは、これらの認識配列は何れも、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基〜３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
【００３５】
アジア型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する各認識配列の好ましい例は、次の通りである。Ｆ３配列は、配列番号１、５、９若しくは１９の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号１または１９の配列またはその相補配列を含む。Ｆ２配列は、配列番号４５、４６、４７、５８若しくは６５の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号４５、４６若しくは４７の配列またはその相補配列を含む。Ｆ１配列は、配列番号５２、５３、６０若しくは６８の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号５２若しくは５３の配列またはその相補配列を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号５４、６２若しくは７０の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号５４の配列またはその相補配列を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号５５、５６、６４若しくは７２の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号５５または５６の配列またはその相補配列を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号２、６、１０若しくは２０の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号２または２０の配列またはその相補配列を含む。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００３６】
アジア型検出用プライマー群に含まれる各プライマーの好ましい例は、例えば次の通りである。Ｆ３プライマーは、配列番号１、５、９または１９の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。Ｂ３プライマーは、配列番号２、６、１０または２０の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ＦＩＰプライマーは、配列番号３、７、１１、２８または２９の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号３の配列は、配列番号４８の相補配列と配列番号４５の配列を含み、配列番号７の配列は、配列番号６８の相補配列と配列番号６５の配列を含み、配列番号１１の配列は、配列番号６０の相補配列と配列番号５８の配列を含み、配列番号２８の配列は、配列番号５２の相補配列と配列番号４６の配列を含み、配列番号２９の配列は、配列番号５３の相補配列と配列番号４７の配列を含む。ＢＩＰプライマーは、配列番号４、８、１２または２２の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号４の配列は、配列番号５４の配列と配列番号５５の相補配列を含み、配列番号８の配列は、配列番号７０の配列と配列番号７２の相補配列を含み、配列番号１２の配列は、配列番号６２の配列と配列番号６４の相補配列を含み、配列番号２２の配列は、配列番号５４の配列と配列番号５６の相補配列を含む。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００３７】
より好ましいアジア型検出用プライマー群の各プライマーの例は、例えば次の通りである。Ｆ３プライマーは、より好ましくは配列番号１または１９の配列またはその相補配列を含む。Ｂ３プライマーは、より好ましくは配列番号２または２０の配列またはその相補配列を含む。ＦＩＰプライマーは、より好ましくは配列番号３、２８または２９の配列またはその相補配列を含む。ＢＩＰプライマーは、より好ましくは配列番号４または２２の配列またはその相補配列を含む。上記のより好ましい例では検出の特異性がより向上し、更に好ましい例では検出の特異性が更に向上する。
【００３８】
また、アジア型検出用プライマー群にループプライマーが含まれる場合、増幅効率を更に増大することが可能である。好ましいＬＦプライマーのための配列の例は、配列番号１５、１７または３４の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含む。ＬＦプライマーは、好ましくは、配列番号１３、１５、１７または３０の配列またはその相補配列を含み、より好ましくは配列番号１３または３０の配列またはその相補配列を含む。好ましいＬＢプライマーのための配列の例は、配列番号１４、１６または１８の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含む。ＬＢプライマーは、好ましくは、配列番号１４、１６または１８の配列またはその相補配列を含み、より好ましくは配列番号１４の配列またはその相補配列を含む。
【００３９】
好ましいループプライマーにおいて、例えば、ＬＦプライマーは配列番号１３または３０を含み、ＬＢプライマーは配列番号１４を含む。或いはこれらのループプライマーは、これらの相補配列を含む。
【００４０】
アフリカ型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列の例は、例えば、好ましくは次の通りである。Ｆ３配列は、７７位〜９５位の配列、即ち、配列番号１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、１３８位〜１６１位の配列、即ち、配列番号４８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、１９８位〜２１７位の配列、即ち、配列番号３５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、２２３位〜２４４位の配列、即ち、配列番号５４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、２８６位〜３０３位の配列、即ち、配列番号５６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、３３９位〜３５６位の配列、即ち、配列番号２０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００４１】
または、アフリカ型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列は、例えば、次の通りであってもよい。Ｆ３配列は、８位〜２７位の配列、即ち、配列番号２４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、３５位〜５３位の配列、即ち、配列番号５７に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、９０位〜１０９位の配列、即ち、配列番号５９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、１４７位〜１６５位の配列、即ち、配列番号６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、１９０位〜２１０位の配列、即ち、配列番号６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、２４０位〜２６０位の配列、即ち、配列番号１０に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００４２】
または、アフリカ型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列は、例えば、次の通りであってもよい。Ｆ３配列は、１６０位〜１７８位の配列、即ち、配列番号３７に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、２２４位〜２４１位の配列、即ち、配列番号６５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、２８４位〜３０３位の配列、即ち、配列番号６７に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、３２７位〜３４６位の配列、即ち、配列番号６９に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、３８６位〜４０３位の配列、即ち、配列番号７１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、４１２位〜４３０位の配列、即ち、配列番号３８に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【００４３】
或いは、これらの認識配列は何れも、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基〜３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
【００４４】
アフリカ型検出用プライマー群に含まれるプライマーに対応する認識配列の好ましい例は、例えば次の通りである。Ｆ３配列は、配列番号１、２４若しくは３７の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号１の配列またはその相補配列を含む。Ｆ２配列は、配列番号４２、４３、４４、５７若しくは６５の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号４２、４３若しくは４４の配列またはその相補配列を含む。Ｆ１配列は、配列番号４９、５０、５９若しくは６７の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号４９若しくは５０の配列またはその相補配列を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号５４、６１若しくは６９の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号５４の配列またはその相補配列を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号５６、６３若しくは７１の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号５６の配列またはその相補配列を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号２０、１０若しくは３８の配列またはその相補配列を含み、好ましくは、配列番号２０の配列またはその相補配列を含む。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００４５】
アフリカ型検出用プライマー群の各プライマーの好ましい例は、例えば次の通りである。Ｆ３−２プライマーは、配列番号１９または２４の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。Ｂ３−２プライマーは、配列番号１０または２０の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ＦＩＰ−２プライマーは、配列番号２１、２５、３１または３２の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号２１の配列は、配列番号５０の相補配列と配列番号４４の配列を含み、配列番号２５の配列は、配列番号５９の相補配列と配列番号５７の配列を含み、配列番号３１の配列は、配列番号４９の相補配列と配列番号４３の相補配列を含み、配列番号３２の配列は、配列番号４９の相補配列と配列番号４２の相補配列を含む。ＢＩＰ−２プライマーは、配列番号２２または２６の配列またはその相補配列を含むことが好ましい。ここで、配列番号２２の配列は、配列番号５４の配列と配列番号５６の相補配列を含み、配列番号２６の配列は、配列番号６１の配列と配列番号６３の相補配列を含む。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００４６】
より好ましいアフリカ型検出用プライマー群の各プライマーの例は、例えば次の通りである。Ｆ３−２プライマーは、より好ましくは配列番号１９の配列またはその相補配列を含む。Ｂ３−２プライマーは、より好ましくは配列番号２０の配列またはその相補配列を含む。ＦＩＰ−２プライマーは、より好ましくは配列番号２１、３１または３２の配列またはその相補配列を含む。ＢＩＰ−２プライマーは、より好ましくは配列番号２２の配列またはその相補配列を含む。上記のより好ましい例では検出の特異性がより向上し、更に好ましい例では検出の特異性が更に向上する。
【００４７】
また、アフリカ型検出用プライマー群にループプライマーが含まれる場合、増幅効率を更に増大することが可能である。好ましいＬＦ−２プライマーのための配列の例は、配列番号１５、１７または６６の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含む。ＬＦ−２プライマーは、好ましくは、配列番号１７、２３または３３の配列またはその相補配列を含み、より好ましくは配列番号２３または３３の配列またはその相補配列を含む。好ましいＬＢ−２プライマーのための配列の例は、配列番号１４、２７または４１の配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列またはその相補配列を含む。ＬＢ−２プライマーは、好ましくは、配列番号１４または２７の配列またはその相補配列を含み、より好ましくは配列番号１４の配列またはその相補配列を含む。
【００４８】
好ましいループプライマーにおいて、例えば、ＬＦ−２プライマーは配列番号２３または３３を含み、ＬＢ−２プライマーは配列番号１４を含む。或いはこれらのループプライマーは、これらの相補配列を含む。
【００４９】
以上に記載した各プライマーの長さは、１３〜４０塩基、例えば、１５〜３０塩基であってもよい。認識配列に加えて鋳型へのアニーリングを阻害せず、且つプライマーの伸長を妨げない限り、何れのプライマーにおいても、認識配列に加えて更なる配列または成分を含んでもよい。
【００５０】
例えば、上記ＦＩＰプライマーおよびＦＩＰ−２プライマーは、それぞれＦ１ｃ配列とＦ２配列の間、またはＦ１ｃ−２配列とＦ２−２配列の間にリンカーを含んでいてもよい。また、上記ＢＩＰプライマーおよびＢＩＰ−２プライマーは、それぞれ、Ｂ１配列とＢ２ｃ配列の間、またはＢ１−２配列とＢ２ｃ−２配列の間にリンカーを含んでいてもよい。リンカー配列は、任意の塩基配列であればよく、好ましくは鋳型配列に特異的に結合しない配列であり得る。リンカー配列の長さは、例えば、１〜６塩基であればよい。好ましいリンカー配列の例は、ＴＴＴＴである。
【００５１】
アジア型検出用プライマー群に含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのための配列の組み合わせは、表１に示す以下の群より選択されてもよい：
【表１】
2018121607.tif 000003
【００５２】
（Ａｓ１）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の組み合わせ；
（Ａｓ２）配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の組み合わせ；
（Ａｓ３）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の組み合わせ；
（Ａｓ４）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２８および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｓ５）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｓ１’）〜（Ａｓ５’）前記（Ａｓ１）〜（Ａｓ５）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。これらの組み合わせのアジア型検出用プライマー群を用いた場合、検出の特異性が更に向上する。
【００５３】
また、更にループプライマーを含むアジア型検出用プライマー群に含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーの組み合わせは、表２および表３に示す以下の群より選択されてもよい：
【表２】
2018121607.tif 000004
【００５４】
【表３】
2018121607.tif 000005
【００５５】
（Ａｓ６）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｓ７）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１５および配列番号１６の組み合わせ；
（Ａｓ８）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１７および配列番号１８の組み合わせ；
（Ａｓ９）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２８、配列番号２２、配列番号３０および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｓ１０）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２９、配列番号２２、配列番号３０および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｓ６’）〜（Ａｓ１０’）前記（Ａｓ６）〜（Ａｓ１０）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
【００５６】
これらの組み合わせのアフリカ型検出用プライマー群を用いた場合、検出の特異性が更に向上する。
【００５７】
より好ましいアジア型検出用プライマー群の組み合わせは、上記（Ａｓ１）、（Ａｓ４）、（Ａｓ５）、（Ａｓ６）、（Ａｓ９）および（Ａｓ１０）である。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００５８】
アフリカ型検出用プライマー群に含まれるＦ３−２プライマー、Ｂ３−２プライマー、ＦＩＰ−２プライマーおよびＢＩＰ−２プライマーのための配列の組み合わせは、表４に示す以下の群より選択されてもよい：
【表４】
2018121607.tif 000006
【００５９】
（Ａｆ１）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ２）配列番号２４、配列番号１０、配列番号２５および配列番号２６の組み合わせ；
（Ａｆ３）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３１および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ４）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３２および配列番号２２の組み合わせ；
（Ａｆ５）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９および配列番号４０の組み合わせ；
（Ａｆ１’）〜（Ａｆ５’）前記（Ａｆ１）〜（Ａｆ５）に含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。これらの組み合わせのアフリカ型検出用プライマー群を用いた場合、検出の特異性が更に向上する。
【００６０】
また、更にループプライマーを含むアフリカ型検出用プライマー群に含まれるＦ３−２プライマー、Ｂ３−２プライマー、ＦＩＰ−２プライマー、ＢＩＰ−２プライマー、ＬＦｃ−２ループプライマーおよびＬＢｃ−２ループプライマーの組み合わせは、表５および表６に示す以下からなる群より選択されてもよい：
【表５】
2018121607.tif 000007
【００６１】
【表６】
2018121607.tif 000008
【００６２】
（Ａｆ６）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｆ７）配列番号２４、配列番号１０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号１７および配列番号２７の組み合わせ；
（Ａｆ８）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３１、配列番号２２、配列番号３３および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｆ９）配列番号１９、配列番号２０、配列番号３２、配列番号２２、配列番号３３および配列番号１４の組み合わせ；
（Ａｆ１０）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号１５および配列番号４１の組み合わせ；
（Ａｆ６’）〜（Ａｆ１０’）前記（Ａｆ６）〜（Ａｆ１０）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
【００６３】
これらの組み合わせのアフリカ型検出用プライマー群を用いた場合、検出の特異性が更に向上する。
【００６４】
より好ましいループプライマーを含むアジア型検出用プライマー群の組み合わせは、上記（Ａｆ１）、（Ａｆ３）、（Ａｆ４）、（Ａｆ６）、（Ａｆ８）および（Ａｆ９）である。この場合、検出の特異性が更に向上する。
【００６５】
実施形態のプライマーセットによれば、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶを従来に比べてより精度よく検出することが可能となる。
【００６６】
また、上述のプライマーセットによれば、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶの遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。即ち、従来では、ＺＩＫＶの遺伝子の増幅には２時間以上かかっていた。しかしながら、実施形態のプライマーセットによれば、迅速に、例えば、１５分〜３０分以内にＺＩＫＶの遺伝子を検出できるまでに増幅することが可能である。その結果、ＺＩＫＶの検出をより迅速に行うことが可能である。
【００６７】
更に、従来のプライマーセットでは、例えば、同じフラビウイルス属ウイルスであるデングウイルスなどに感染しており、ジカウイルスに感染していない場合に得られる結果は偽陽性となってしまう可能性が高い。しかしながら、実施形態のプライマーセットによれば、後述するように約６５℃以上でＬＡＭＰ増幅反応を行った場合、例えば、同じフラビウイルス属ウイルスであるデングウイルスなどと区別して、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶを特異的に増幅することができる。その結果、ＺＩＫＶを更に精度よく検出することが可能となる。
【００６８】
更なる実施形態によれば、試料にＺＩＫＶが含まれているか否かを判定する方法が提供される。当該方法は、上述の何れかのプライマーセットを用いて試料に含まれる核酸を増幅し、増幅産物を検出することにより前記試料にＺＩＫＶが含まれているか否かを判定する。
【００６９】
当該方法に供される試料は、分析されるべき対象であり、核酸を含む可能性のあるものであればよい。例えば、試料は、血液、血清、白血球、リンパ液、髄液、尿、便、精液、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、涙液、母乳、羊水、組織、バイオプシー、または培養細胞などの生体物質、環境から採取された環境物質、或いはそれらの混合物などの材料そのものであってもよい。或いは、それらを材料として調製された調製物であってもよい。試料は、増幅反応を妨害しない状態にあることが好ましく、採取された後にそれ自身公知の何れかの手段により前処理が行われてもよい。前処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出および／または分離などである。
【００７０】
核酸の増幅は、等温増幅法で行われる。等温増幅法は、例えば、ＬＡＭＰ法またはＬＡＭＰ法と同様の原理により核酸を増幅するそれ自身公知の何れの方法であればよい。
【００７１】
核酸の増幅に先駆けて逆転写反応を行ってもよい。或いは、逆転写反応と増幅反応とを１つの反応において行うＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いてもよい。当該方法におけるより好ましい増幅方法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法である。逆転写反応を行う場合、逆転写酵素は、例えば、ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＲＴｘであることが好ましい。その場合、ＺＩＫＶをより高感度かつ迅速に検出することが可能である。
【００７２】
等温増幅の温度条件は、例えば、６０℃〜６７℃であればよい。この温度で等温増幅を行うことによって、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶを、精度よくかつ迅速に増幅することができ、その結果、精度よくかつ迅速にＺＩＫＶを検出することができる。温度条件は、６５℃以上であることが好ましい。その場合、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶを、他のウイルス、例えば、同じフラビウイルス属ウイルスであるデングウイルスなどと区別してより精度よく増幅することが可能である。その結果、アジア型およびアフリカ型のＺＩＫＶをより精度よく検出することができる。
【００７３】
増幅産物の検出は、例えば、蛍光を指標に行うことができる。その場合、増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインタカレータなど、増幅産物または増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬を用い、生じた蛍光を検出することにより行われればよい。増幅産物の検出は、例えば、経時的に、または増幅反応を開始した後の特定の時点で行われる。
【００７４】
例えば、核酸の増幅および増幅産物の検出は、それぞれ公知の装置によって行われてもよい。例えば、核酸の増幅および増幅産物の検出は、一つの装置によって行われてもよい。このような装置は、例えば、Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）ＦＩＩＩ（東芝メディカルシステムズ社）、またはＧｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社製）等であれば、より迅速に検出できるため好ましい。
【００７５】
試料に、ＺＩＫＶが含まれているか否かの判定は、例えば、特定の時点で増幅産物が予め定められた閾値以上であるか否かを基準として行われる。例えば、予め定めた値以上の強度の蛍光が測定されたときに、試料中にＺＩＫＶが含まれていると判定すればよい。或いは、予め定められた値以上の強度の蛍光が測定されるまでにかかった時間が、予め定められた時間よりも短い場合に、試料中にＺＩＫＶが含まれていると判定すればよい。例えば、増幅開始から３０分までの間に予め定められた閾値以上の蛍光が測定されたときに試料にＺＩＫＶが含まれていると判定してもよい。
【００７６】
このような方法によれば、従来よりも精度よくかつ迅速にＺＩＫＶを検出することが可能となる。
【００７７】
当該方法では、増幅産物またはその一部分として核酸構造体が得られる。このような核酸構造体も実施形態として提供される。これらの核酸構造体の存在を検出することにより、アジア型および／またはアフリカ型のＺＩＫＶが検出できる。
【００７８】
アジア型検出用プライマー群を含む実施形態のプライマーセットを用いた当該方法において形成される核酸構造体について、図３を参照しながら説明する。図３（ａ）、図３（ｂ）、図３（ｃ）および図３（ｄ）は、互いに相補的な配列からなる二本鎖領域であるステム部分と、この二本鎖領域により形成された一本鎖領域であるループ部分とを含むステム・ループ構造体を示す。
【００７９】
図３（ａ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｆ１配列およびＦ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８０】
図３（ｂ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｂ１配列および前記Ｂ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８１】
図３（ｃ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列および前記Ｆ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８２】
図３（ｄ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｂ１ｃ配列および前記Ｂ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８３】
図３（ｅ）および（ｆ）は、３’側と５’側にそれぞれステム・ループ構造を有するダンベル構造体を示す。
【００８４】
図３（ｅ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１配列とＦ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８５】
図３（ｆ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列とＦ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１ｃ配列とＢ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
【００８６】
核酸構造体は、アフリカ型検出用プライマー群を用いた方法によっても形成される。即ち、実施形態によれば、以下の核酸構造体も提供される（図示せず）。
【００８７】
（ｇ）３’側から５’側に向けて、Ｆ１−２配列、Ｆ２ｃ−２配列およびＦ１ｃ−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１−２配列と前記Ｆ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第５のステム・ループ構造体、
（ｈ）３’側から５’側に向けて、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列およびＢ１ｃ−２配列をこの順番で含み、前記Ｂ１−２配列と前記Ｂ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第６のステム・ループ構造体、
（ｉ）５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列およびＦ１−２配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ−２配列と前記Ｆ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第７のステム・ループ構造体、
（ｊ）５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ−２配列、Ｂ２ｃ−２配列およびＢ１−２配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ−２配列と前記Ｂ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第８のステム・ループ構造体、
（ｋ）３’側から５’側に向けて、Ｆ１−２配列、Ｆ２ｃ−２配列、Ｆ１ｃ−２配列、Ｂ１−２配列、Ｂ２−２配列およびＢ１ｃ−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１−２配列と前記Ｆ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１−２配列と前記Ｂ１ｃ−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第５のダンベル構造体、および／または
（ｌ）５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ−２配列、Ｆ２−２配列、Ｆ１−２配列、Ｂ１ｃ−２配列、Ｂ２ｃ−２配列およびＢ１−２配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ−２配列と前記Ｆ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ−２配列と前記Ｂ１−２配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第６のダンベル構造体。
【００８８】
これらの核酸構造体に含まれる配列は、増幅反応に使用されるプライマーセットの配列により決定される。即ち、当該核酸構造体は、上述したプライマーセットが提供されることにより初めて得られるものである。そして、このような核酸構造体を検出すれば、ＺＩＫＶを従来に比べて精度よく検出することが可能となる。例えば、図３（ａ）〜（ｆ）の核酸構造体を検出することにより、アジア型のＺＩＫＶを検出することができ、上記（ｇ）〜（ｌ）の核酸構造体を検出することにより、アフリカ型のＺＩＫＶを検出することができる。また、このような核酸構造体は、上述のプライマーセットを用いることによって迅速に形成される。従って、当該核酸構造体は、アジア型および／またはアフリカ型のＺＩＫＶを迅速に検出するために使用することができる。
【００８９】
また実施形態によれば、試料にＺＩＫＶが含まれているか否かを判定する方法において使用するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述した何れかのプライマーセットを含めばよい。更に、当該アッセイキットは、プライマーセットを収容する容器、増幅反応を行うための酵素、基質、洗浄液、緩衝液および／または緩衝液を調製するための塩類などを含んでもよい。
【００９０】
このようなアッセイキットによれば、ＺＩＫＶを従来に比べて精度よく検出することが可能である。また、このようなアッセイキットによって、ＺＩＫＶの遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。そのため、ＺＩＫＶの検出を迅速に行うことが可能である。
【００９１】
［例］
例１：実施形態のプライマーセットを用いたアフリカ型ジカウイルスの検出
（１）鋳型ＲＮＡの準備
Ｖｅｒｏ細胞(アフリカミドリザル由来)にジカウイルス（ＺＩＫＶ９７６Ｕｇａｎｄａ：アフリカ型）を接種した。感染上清（１４０μＬ）から、Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、キット付属のプロトコールに従いウイルスＲＮＡを抽出および精製した。最終的にＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（６０μＬ）に溶出したものを鋳型ＲＮＡとして使用した。
【００９２】
（２）プライマーセットの準備
上記ウイルスＲＮＡの検出を行うためのプライマーセットを作製した。作製したプライマーセットを表７に示す。プライマーセットは、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３および配列番号１４であるアジア型検出用プライマー群、並びにＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号１４であるアフリカ型検出用プライマー群を含む。
【表７】
2018121607.tif 000009
【００９３】
（３）増幅反応液の調整
上記プライマーセットを含むプライマー混合液（４μＬ）を調製した。プライマー混合液の組成を表８に示す。
【表８】
2018121607.tif 000010
【００９４】
次に、プライマー混合液（４μＬ）を含む反応マスターミックス（２０μＬ）を調製した。反応マスターミックスの組成を表９に示す。
【表９】
2018121607.tif 000011
【００９５】
８セットの反応マスターミックス（２０μＬ）に（１）で準備した鋳型ＲＮＡ（５μＬ）を添加し、表１０に示す８セットの増幅反応液（２５μＬ）を得た。
【表１０】
2018121607.tif 000012
【００９６】
増幅反応液は、それぞれ鋳型ＲＮＡを１．０×１０６コピー（ｗｅｌｌ１）、１．０×１０５コピー（ｗｅｌｌ２）、１．０×１０４コピー（ｗｅｌｌ３）、１．０×１０３コピー（ｗｅｌｌ４）、１．０×１０２コピー（ｗｅｌｌ５）、１．０×１０コピー（ｗｅｌｌ６）、１．０コピー（ｗｅｌｌ７）および０コピー（ネガティブコントロール、ｗｅｌｌ８）含む。ネガティブコントロールは、反応マスターミックス（２０μＬ）に水（５μＬ）を添加して作製した。
【００９７】
（４）増幅反応
各増幅反応液に対して、等温遺伝子増幅検出装置Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社製）を用いて増幅反応および検出を行った。温度制御は以下のように行った。
【００９８】
Ｐｒｅｈｅａｔ：４０℃
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６５℃、３０分
Ｍｅｌｔ：９５℃〜７５℃、０．１℃／秒
結果を図４に示す。
【００９９】
ネガティブコントロールおよび鋳型ＲＮＡを１．０コピー含む試料においては、測定時間０分〜６０分までの何れの時点においても蛍光値は０であった。鋳型ＲＮＡを鋳型ＲＮＡを１．０×１０６コピー、１．０×１０５コピー、１．０×１０４コピー、１．０×１０３コピー、１．０×１０２コピー、１．０×１０コピー含む試料においては、何れも３０分以内に蛍光値の立ち上がり（鋳型ＲＮＡの増幅）が得られた。特に、１．０×１０６コピーまたは１．０×１０５コピーでは、約１５分で蛍光値の立ち上がり（鋳型ＲＮＡの増幅）が得られ、１．０×１０３コピー、１．０×１０２コピーまたは１．０×１０コピーでは、２０分〜２５分の間に蛍光値の立ち上がり（鋳型ＲＮＡの増幅）が得られた。
【０１００】
この結果から、実施形態のプライマーセットによればアフリカ型のＺＩＫＶを短時間で、精度よく検出できることが明らかとなった。
【０１０１】
例２：実施形態のプライマーセットを用いたアジア型およびアフリカ型ジカウイルスの検出、並びに増幅温度の違いによる検出精度の評価
（１）鋳型ＲＮＡの準備
アフリカ型ジカウイルス（ＺＩＫＶ ９７６Ｕｇａｎｄａ）、アジア型ジカウイルス（ＺＩＫＶ ＰＲＶＡＢＣ５９）、並びに２種類のデングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ１およびＤｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ３）をそれぞれ接種したＶｅｒｏ細胞を用意した。各細胞の感染上清（１４０μＬ）からＶｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、キット付属のプロトコールに従い、それぞれのウイルスＲＮＡを抽出および精製した。最終的にＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水（６０μＬ）に溶出したものを鋳型ＲＮＡとして使用した。
【０１０２】
（２）プライマーセットおよび増幅反応液の準備
例１と同じプライマーセットを用いて、例１と同様の反応マスターミックスを調製した。
【０１０３】
８セットの反応マスターミックス（２０μＬ）に、（１）で準備した鋳型ＲＮＡ（５μＬ）を添加し、表１１に示す８セットの増幅反応液（２５μＬ）を得た。
【表１１】
2018121607.tif 000013
【０１０４】
増幅反応液は、それぞれＤｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ１の鋳型ＲＮＡを２．０×１０４コピー（ｗｅｌｌ１、ｗｅｌｌ２（２反復））、Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ３の鋳型ＲＮＡを２．０×１０４コピー（ｗｅｌｌ３、ｗｅｌｌ４（２反復））、ＺＩＫＶ ９７６Ｕｇａｎｄａの鋳型ＲＮＡを１．０×１０２コピー（ｗｅｌｌ５）、ＺＩＫＶ ＰＲＶＡＢＣ５９の鋳型ＲＮＡを１．０×１０２（ｗｅｌｌ６）、および０コピー（ネガティブコントロール、ｗｅｌｌ７、８）含む。ネガティブコントロールは、反応マスターミックス（２０μＬ）に水（５μＬ）を添加して作製した。
【０１０５】
（３）増幅反応
各増幅反応液に対して、等温遺伝子増幅検出装置Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社製）を用いて、以下の３つの異なる温度条件で増幅反応および検出を行った。
【０１０６】
条件１
Ｐｒｅｈｅａｔ：４０℃
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６３℃、３０分
Ｍｅｌｔ：９５℃〜７５℃、０．１℃／秒
条件２
Ｐｒｅｈｅａｔ：４０℃
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６５℃、３０分
Ｍｅｌｔ：９５℃〜７５℃、０．１℃／秒
条件３
Ｐｒｅｈｅａｔ：４０℃
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６７℃、３０分
Ｍｅｌｔ：９５℃〜７５℃、０．１℃／秒
結果を図５に示す。
【０１０７】
図５の（ａ）は、条件１での結果を示す。アフリカ型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ５）およびアジア型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ６）のＲＮＡをそれぞれ１４分３０秒、１８分４５秒で増幅することができた。しかしながら、デングウイルスＲＮＡを含むサンプルのうち、２サンプル（ｗｅｌｌ１、３）でもＲＮＡが増幅された。
【０１０８】
図５の（ｂ）は、条件２での結果を示す。デングウイルスＲＮＡは増幅されず、アフリカ型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ５）およびアジア型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ６）のＲＮＡのみを増幅することができた。
【０１０９】
図５の（ｃ）は、条件３での結果を示す。デングウイルスＲＮＡおよびアジア型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ５）が増幅されず、アフリカ型ＺＩＫＶ（ｗｅｌｌ６）のＲＮＡのみが増幅された。
【０１１０】
以上の結果から、実施形態のプライマーセットによれば、ＺＩＫＶのＲＮＡが１．０×１０２コピー存在する増幅反応液においては、６３℃〜６７℃の増幅条件でアフリカ型ＺＩＫＶを検出することができ、６３℃〜６５℃でアジア型ＺＩＫＶを検出することができ、６５℃以上であれば、デングウイルスと区別してＺＩＫＶを特異的に増幅および検出できることが明らかとなった。
【０１１１】
例３：逆転写酵素の添加条件による検出感度の評価
実施形態のプライマーセットを用いたＺＩＫＶのＲＮＡの検出を、逆転写酵素の種類または逆転写酵素の濃度の異なる条件で行い、各条件における検出感度を評価した。
【０１１２】
（１）試料の調整
各１ｍＬのＰＢＳ並びに健常人から採取した血清および尿に、ＺＩＫＶ（９７６Ｕｇａｎｄａ）懸濁液（１０μＬ）を添加し、最終ウイルス力価１４．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの疑似感染試料を得た。疑似感染試料（１４０μＬ）をＲＮＡ抽出キット（キアゲン社）で抽出し、ウイルスＲＮＡ液を得た。
【０１１３】
（２）ＬＡＭＰ増幅
以下の３つの逆転写酵素の添加条件の増幅反応液を調製した。
【０１１４】
１．ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社）  ０．１５Ｕ／反応
２．ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社）        １Ｕ／反応
３．ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＲＴｘ（ＮＥＢ社）          １Ｕ／反応
各増幅反応液は、他に、それぞれ、例１のプライマーセット（各Ｆ３およびＢ３を０．２μＭ、ＦＩＰおよびＢＩＰを０．８μＭ、ＬＦおよびＬＢを０．４μＭ）を含む。各増幅反応液に対して、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ社製）を用いて増幅反応および検出を行った。結果を表１２に示す。
【表１２】
2018121607.tif 000014
【０１１５】
表中の「陽性（数）」は、測定時間（３０分）以内に明らかな蛍光値の増加を示したサンプル数を示し、「陽性（率）」は、全サンプル数（４サンプル）に対する、明らかな蛍光値の増加を示したサンプル数の割合を示す。ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＲＴｘ（表中ではＷＳ  ＲＴｘと表記）を用いた場合、何れの試料においても、他の２条件と比べて蛍光値が得られたサンプル数が多く、検出時間が短かった。従って、ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＲＴｘによれば、検出の感度が向上し、かつ検出時間が短縮できることが明らかとなった。
【図１Ａ】
2018121607.tif 000015
【図１Ｂ】
2018121607.tif 000016
【図２−１】
2018121607.tif 000017
【図２−２】
2018121607.tif 000018
【図２−３】
2018121607.tif 000019
【図２−４】
2018121607.tif 000020
【図２−５】
2018121607.tif 000021
【図３】
2018121607.tif 000022
【図４】
2018121607.tif 000023
【図５】
2018121607.tif 000024
【配列表】
2018121607000001.app