(57)【要約】      （修正有）【課題】安価で、効率良く、安定にファルネシル酸を産生することができるファルネシル酸の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物、新規酵母、ファルネシル酸産生用酵母の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物を用いた酒粕の製造方法、並びに、ファルネシル酸を含有する酒粕及び酵母培養物の提供。【解決手段】スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換されたサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を用いるファルネシル酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を用いることを特徴とするファルネシル酸の製造方法。
【請求項２】
ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である請求項１に記載のファルネシル酸の製造方法。
【請求項３】
スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を含有することを特徴とするファルネシル酸産生用組成物。
【請求項４】
ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である請求項３に記載のファルネシル酸産生用組成物。
【請求項５】
サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）    ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）であり、ファルネシル酸を産生する能力を有することを特徴とする酵母。
【請求項６】
サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列７１４位のグアニンをアデニンに置換し、配列番号１で表される遺伝子に変異させることを特徴とするファルネシル酸産生用酵母の製造方法。
【請求項７】
ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である請求項６に記載のファルネシル酸産生用酵母の製造方法。
【請求項８】
請求項３から４のいずれかに記載のファルネシル酸産生用組成物を用いることを特徴とする酒粕の製造方法。
【請求項９】
ファルネシル酸を含有することを特徴とする酒粕。
【請求項１０】
ファルネシル酸を含有することを特徴とする酵母培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファルネシル酸の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物、ファルネシル酸を産生する能力を有する新規酵母、ファルネシル酸産生用酵母の製造方法、前記ファルネシル酸産生用組成物を用いた酒粕の製造方法、並びに、ファルネシル酸を含有する酒粕及び酵母培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、テルペノイド合成の第一段階は、イソプレン単位の生成であり、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡとなって活性化され、他の２分子のアセチルＣｏＡと反応し、還元されてメバロン酸が生成する。更にこれが脱炭酸してイソペンテニル二リン酸（Ｃ５）及びジメチルアリル二リン酸（Ｃ５）となる。ジメチルアリル二リン酸にイソペンテニル二リン酸が順次結合することにより炭素数が５つずつ増えていき、ゲラニル二リン酸（Ｃ１０）やファルネシル二リン酸（Ｃ１５）などが合成される。
【０００３】
このうち、ファルネシル二リン酸は重要な生合成中間体であり、エルゴステロール等のステロイド類、キノンの側鎖、セスキテルペン類、スクアレン、ファルネシル化タンパク質のアンカー分子、ドリコール、バクトプレノール、天然ゴムなどの合成前駆体であり、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００４】
ファルネシル二リン酸が脱リン酸化されて生成するファルネソール（Ｆａｒｎｅｓｏｌ：ＦＯＨ）は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲｓ）の標的遺伝子の転写活性化に機能していることが報告されている（非特許文献１参照）。このようなファルネソールは、ＰＰＡＲｓのリガンドとなり、ＰＰＡＲｓ活性を上昇させることから、抗肥満及び抗高脂血症効果が期待されるものである（非特許文献２参照）。
しかしながら、ファルネソールは、高温安定性が低く、食品などへの応用が難しいという問題がある（特許文献１参照）。
【０００５】
一方、ファルネソールの代謝物であるファルネシル酸（Ｆａｒｎｅｓｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＦＡ）は、ファルネソールより優れたＰＰＡＲα（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α）の活性化作用を有することが知られており（非特許文献３参照）、更に、ファルネシル酸は、ファルネソールと比較して高温安定性が高いという利点がある。
【０００６】
しかしながら、ファルネシル酸の前駆体であるファルネソールは、植物の精油から抽出されるため、その利用性や価格は、植物の入手性や原産国の安定性などに関連して変動し、安定に供給することが困難であるという問題がある（特許文献２及び３参照）。また、標準品等として市販されているファルネシル酸は、少量で非常に高価であるという問題がある。
したがって、安価かつ安定に供給することができるファルネシル酸の新たな製造方法の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２２９０５１号公報
【特許文献２】特表２００６−５００９４２号公報
【特許文献３】特表２００８−５４６３８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５１４，  Ｉｓｓｕｅ  ２−３，  Ｍａｒｃｈ  １３，  ２００２，  ｐｐ．３１５−３２２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５６，  Ｉｓｓｕｅ  ２,   Ｆｅｂ,  ２０１５，  ｐｐ．２５４−２６５
【非特許文献３】Ｊｏｏ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８７，  Ｉｓｓｕｅ  ２,  Ｊａｎ  ２８,  ２０１０，  ｐｐ．１２３−１３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安価で、効率良く、安定にファルネシル酸を産生することができるファルネシル酸の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物、新規酵母、ファルネシル酸産生用酵母の製造方法、前記ファルネシル酸産生用組成物を用いた酒粕の製造方法、並びに、ファルネシル酸を含有する酒粕及び酵母培養物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を用いることを特徴とするファルネシル酸の製造方法である。
＜２＞  スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を含有することを特徴とするファルネシル酸産生用組成物である。
＜３＞  サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）    ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）であり、ファルネシル酸を産生する能力を有することを特徴とする酵母である。
＜４＞  サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列７１４位のグアニンをアデニンに置換し、配列番号１で表される遺伝子に変異させることを特徴とするファルネシル酸産生用酵母の製造方法である。
＜５＞  前記＜２＞に記載のファルネシル酸産生用組成物を用いることを特徴とする酒粕の製造方法である。
＜６＞  ファルネシル酸を含有することを特徴とする酒粕である。
＜７＞  ファルネシル酸を含有することを特徴とする酵母培養物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安価で、効率良く、安定にファルネシル酸を産生することができるファルネシル酸の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物、新規酵母、ファルネシル酸産生用酵母の製造方法、前記ファルネシル酸産生用組成物を用いた酒粕の製造方法、並びに、ファルネシル酸を含有する酒粕及び酵母培養物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、試験例１におけるＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを示す図である。
【図２】図２は、試験例１における清酒酵母の抽出エキスの液体クロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は、試験例１におけるファルネシル酸標準品の液体クロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、試験例３における高温貯蔵前のＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを示す図である。ピーク２がファルネシル酸のピーク、ピーク３がファルネソールのピークを示す。
【図５】図５は、試験例３における高温貯蔵後のＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを示す図である。ピーク２がファルネシル酸のピーク、ピーク３がファルネソールのピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（酵母）
本発明の酵母は、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）（以下、「ＨＬ３０５株」と称することがある）であり、ファルネシル酸を産生する能力を有する酵母である。
前記ＨＬ３０５株は、本発明者らが分離した菌株である。
なお、前記ＨＬ３０５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に寄託申請し、２０１７年１月１７日にＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６として寄託されている。
【００１４】
前記酵母は、ファルネシル酸を産生する能力を有するため、後述する本発明のファルネシル酸の製造方法、ファルネシル酸産生用組成物、酒粕の製造方法に好適に利用可能である。
【００１５】
（ファルネシル酸産生用組成物）
本発明のファルネシル酸産生用組成物は、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子（以下、「ｅｒｇ９−２遺伝子」と称することがある）に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１６】
＜ファルネシル酸産生用酵母＞
前記ファルネシル酸産生用酵母は、ファルネシル酸を産生する能力を有する酵母である。前記ファルネシル酸産生用酵母は、ファルネシル酸を産生する能力を有する限り、一倍体であってもよく、二倍体であってもよい。
前記ファルネシル酸産生用酵母は、前記スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表されるｅｒｇ９−２遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のような菌学的性質を有するものであることが好ましく、前記ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６の菌株番号が付されたサッカロミセス・セルビシエであることが特に好ましい。
【００１７】
＜＜菌学的性質＞＞
（１）ＹＰＤ液体培地で育成させた時の菌の形態
１．栄養細胞の大きさ：４μｍ〜８μｍ、幅：４μｍ〜６μｍ
２．栄養細胞の形状：卵型
３．増殖の形態：出芽
（２）生理学的性質
ａ．糖の資化性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
ｂ．糖の発酵性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
ラフィノース：＋
（３）接合性
一倍体には接合性があるが、二倍体には接合性がない。
（４）胞子形成
一倍体は、胞子形成しない。二倍体は、胞子形成用培地にて３０℃で４日間培養すると胞子形成する。
【００１８】
なお、他の酵母にも見られるように、前記ファルネシル酸産生用酵母は、性状が変化することもあるが、例えば、前記ファルネシル酸産生用酵母に由来する突然変異株（例えば、自然変異株や、紫外線、エックス線、放射線、薬品等の変異処理により取得できる人工変異株）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、ファルネシル酸を生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。
【００１９】
前記ファルネシル酸産生用酵母は、ファルネシル酸を産生させるために特別な培地を必要とせず、エルゴステロールを添加する必要がない。即ち、酵母の培養に一般的に使用される培地、例えば、ＹＰＤ培地で好気的に培養するだけでファルネシル酸を産生することができる点で有利である。
【００２０】
前記ファルネシル酸産生用酵母は、後述する本発明のファルネシル酸産生用酵母の製造方法により好適に製造することができる。
【００２１】
前記ファルネシル酸産生用組成物における、前記ファルネシル酸産生用酵母の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ファルネシル酸産生用組成物は、前記ファルネシル酸産生用酵母そのものであってもよい。
【００２２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体や、飲食品に利用される補助的原料又は添加物などの中から目的に応じて適宜選択することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２３】
ここで、前記飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品；健康食品；保健機能食品（栄養機能食品及び特定保健用食品）や病者用食品等の特別用途食品；医薬部外品；医薬品などを幅広く含むものを意味する。
【００２４】
−薬理学的に許容され得る担体−
前記薬理学的に許容され得る担体としては、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２５】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００２６】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００２７】
前記粘結剤、増粘剤、又は固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２８】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００２９】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００３０】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００３１】
前記ｐＨ調整剤又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３２】
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００３３】
−補助的原料又は添加物−
前記補助的原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００３４】
前記ファルネシル酸産生用組成物における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
前記ファルネシル酸産生用組成物は、そのまま使用されてもよく、該ファルネシル酸産生用組成物の乾燥物であってもよく、該ファルネシル酸産生用組成物を溶媒等で抽出した抽出物の形態であってもよい。
【００３６】
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
前記ファルネシル酸産生用組成物は、後述する本発明の酒粕の製造方法に好適に利用可能である。
【００３８】
（ファルネシル酸の製造方法）
本発明のファルネシル酸の製造方法は、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表されるｅｒｇ９−２遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を用いてファルネシル酸を製造する方法である。
前記ファルネシル酸産生用酵母は、前記「ファルネシル酸産生用組成物」における＜ファルネシル酸産生用酵母＞の項目に記載したものが好ましく用いられる。
前記ファルネシル酸の製造方法は、前記ファルネシル酸産生用酵母を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養工程を含むことが好ましく、採取工程を更に含むことがより好ましく、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。
【００３９】
＜培養工程＞
前記培養工程は、前記ファルネシル酸産生用酵母を培養する工程である。前記培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ファルネシル酸産生用酵母を栄養培地（以下、単に「培地」と称することがある）中に接種し、前記ファルネシル酸の産生に良好な温度で培養する方法などが挙げられる。
【００４０】
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来酵母の培養に利用されている公知のものを使用することができ、液体培地であってもよく、固体（寒天）培地であってもよい。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、小麦胚芽、押し麦、ペプトン、綿実粕、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等の窒素源；トマトペースト、グリセリン、デンプン、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪等の炭素源；などが挙げられる。
更に、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、前記ファルネシル酸産生用酵母が利用し、前記ファルネシル酸の生産に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００４１】
前記ファルネシル酸の生産のための種培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、液体培地、平板培地、斜面培地、半斜面培地等の培地上で前記ファルネシル酸産生用酵母を培養した生育物などを使用することができる。
【００４２】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養、静置培養、タンク培養などが挙げられる。
前記培養の温度としては、前記ファルネシル酸産生用酵母の発育が実質的に阻害されずに、前記ファルネシル酸を生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜４０℃が好ましく、３５℃〜４０℃がファルネシル酸の産生効率が良い点で特に好ましい。
前記培養のｐＨとしては、前記ファルネシル酸産生用酵母の発育が実質的に阻害されずに、前記ファルネシル酸を生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用するファルネシル酸産生用酵母に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４．０〜７．５などが挙げられる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記ファルネシル酸の蓄積に合わせて適宜選択することができる。
【００４３】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からファルネシル酸を採取する工程である。
【００４４】
前記培養物としては、前記培養工程で得られ、前記ファルネシル酸を含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、菌体、液体培養後の培養上清、固体培養後の固体培地、及びこれらの混合物などが挙げられる。
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ファルネシル酸を菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。
【００４５】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフ法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離及び／又は精製された前記ファルネシル酸を採取することができる。
【００４６】
前記溶媒抽出法に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４７】
前記吸着剤としては、特に制限はなく、公知の吸着剤の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン系吸着樹脂などが挙げられる。
【００４８】
前記クロマトグラフ法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガスクロマトグラム法、薄層クロマトグラフ法、順相あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
前記クロマトグラフ法に用いる担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換樹脂、ゲル濾過、シリカゲル、アルミナ、活性炭などが挙げられる。
【００４９】
前記吸着剤や前記クロマトグラフ法における担体から前記ファルネシル酸を溶出させる方法としては、特に制限はなく、該吸着剤や該担体の種類や性質等に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
以上のようにして前記ファルネシル酸を製造することができる。
なお、前記採取工程における前記ファルネシル酸の精製の程度としては、特に制限はなく、粗精製物であってもよいし、粗精製物を精製したものであってもよい。
【００５１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、洗浄工程、精製工程などが挙げられる。
前記洗浄工程は、前記培養工程で得られた培養物、又は前記採取工程で得られた前記ファルネシル酸を洗浄する工程である。前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
前記精製工程は、前記採取工程で得られた前記ファルネシル酸を精製する工程である。前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができ、例えば、前記採取工程に記載した方法と同様の方法が挙げられる。
【００５２】
前記ファルネシル酸の製造方法は、安価かつ簡便な方法で効率良く安定にファルネシル酸を産生することができる点で有利である。
【００５３】
（ファルネシル酸産生用酵母の製造方法）
本発明のファルネシル酸産生用酵母の製造方法は、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列７１４位のグアニンをアデニンに置換し、配列番号１で表されるｅｒｇ９−２遺伝子に変異させることによりファルネシル酸産生用酵母を製造する方法である。
前記サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換されることにより、スクアレン合成酵素のアミノ酸配列２３８位のトリプトファンが終始コドンに置換され、その結果として酵母にファルネシル酸産生性を付与することができる。
【００５４】
前記サッカロミセス・セルビシエとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、清酒酵母が好ましい。
【００５５】
前記サッカロミセス・セルビシエにおけるＥＲＧ９遺伝子を、前記ｅｒｇ９−２遺伝子に変異させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、突然変異、形質接合、遺伝子組み換えなどが挙げられる。
前記突然変異としては、自然変異であってもよく、人工的に変異処理を施す方法であってもよい。人工的に変異処理を施す方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紫外線照射、エックス線照射、放射線照射、薬品による処理などが挙げられる。
これらの中でも、人工的に変異処理を施す方法が、変異を誘導し易い点で好ましく、紫外線照射が特に好ましい。
【００５６】
前記サッカロミセス・セルビシエにおけるＥＲＧ９遺伝子が、前記ｅｒｇ９−２遺伝子に変異した菌株を選抜する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファルネシル酸の産生性を指標として選抜する方法などが挙げられる。
【００５７】
前記ファルネシル酸の産生性を確認する方法としては、例えば、以下の方法などが挙げられる。
前記選抜の対象となる菌株を、ＹＰＤ培地液体培地にて３５℃で３日間培養した後、培養した菌体を凍結乾燥し、前記凍結乾燥した菌体中のファルネシル酸を、溶媒を用いて常法により抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてファルネシル酸を分析することにより、ファルネシル酸が検出された菌株を、ファルネシル酸の産生性を有する酵母として選抜することができる。
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５８】
前記ファルネシル酸産生用酵母は、前記ファルネシル酸の産生性を有する酵母を、更に酵母一倍体と戻し交雑し、胞子形成させた後、子嚢解剖し、その後、ファルネシル酸を高生産する一倍体株同士で交雑し、二倍体のファルネシル酸産生用酵母とすることが、更に高濃度のファルネシル酸を産生するファルネシル酸産生用酵母を得ることができる点で好ましい。
【００５９】
前記酵母一倍体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒酵母などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６０】
前記ファルネシル酸の産生性を有する酵母において、ＥＲＧ９遺伝子が、前記ｅｒｇ９−２遺伝子に変異していることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡシーケンス解析法などが挙げられる。
【００６１】
前記ファルネシル酸産生用酵母の製造方法により製造されたファルネシル酸産生用酵母は、前記「ファルネシル酸産生用組成物」の＜ファルネシル酸産生用酵母＞の項目で記載した菌学的性質を有する酵母であることが好ましく、前記ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６の菌株番号が付されたサッカロミセス・セルビシエであることが特に好ましい。
【００６２】
（酒粕及びその製造方法）
本発明の酒粕の製造方法は、前記ファルネシル酸産生用組成物を用いて酒粕を製造する方法である。
また、本発明の酒粕は、ファルネシル酸を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有する。前記酒粕は、前記酒粕の製造方法により好適に製造することができる。
以下、前記酒粕の製造方法の説明と併せて、前記酒粕について詳細に説明する。
【００６３】
＜酒粕の製造方法＞
前記酒粕の製造方法は、前記ファルネシル酸産生用組成物を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、初添処理と、仲添処理と、留添処理とを含む醪造り工程、及び上槽工程を含むことが好ましく、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。
【００６４】
＜＜醪造り工程＞＞
日本酒の醸造において、基本的に、醪造り工程は、初添処理、仲添処理、及び留添処理の三段仕込みで行われている。前記三段仕込みでは、各段で麹、蒸米（以下、「掛米」と称することがある）、及び水（以下、「汲水」と称することがある）が添加される。
【００６５】
−初添処理−
前記初添処理は、酒母が仕込まれた容器に、掛米と、麹と、汲水と、前記ファルネシル酸産生用組成物とを添加する処理である。前記初添処理では、乳酸を更に添加してもよいし、前記容器に予め酒母を仕込んでおいてもよい。
【００６６】
前記酒母の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
【００６７】
前記ファルネシル酸産生用組成物及び乳酸の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６８】
前記初添処理における掛米としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製歩合７５％に精米した米などが挙げられる。
【００６９】
前記初添処理における麹としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製歩合７５％の精米を蒸したものに麹菌を育成させたものなどが挙げられる。前記麹菌としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の麹菌を適宜選択することができる。
前記初添処理における麹の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７０】
また、前記初添処理における掛米及び麹（以下、「総米」と称することがある）の添加量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７１】
−仲添処理−
前記初添処理は、前記初添処理されたものに、掛米と、麹と、汲水とを添加する処理である。
【００７２】
前記仲添処理を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記初添処理後２日目などが挙げられる。
【００７３】
前記仲添処理における掛米及び麹としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記初添処理と同様のものが挙げられる。
【００７４】
前記仲添処理における掛米、麹、及び総米の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７５】
−留添処理−
前記留添処理は、前記仲添処理されたものに、掛米と、麹と、汲水とを添加する処理である。前記留添処理では、必要に応じて酵素剤を添加してもよい。
【００７６】
前記留添処理を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記仲添処理後１日目などが挙げられる。
【００７７】
前記留添処理における掛米及び麹としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記初添処理と同様のものが挙げられる。
【００７８】
前記留添処理における掛米、麹、及び総米の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７９】
前記酵素剤としては、特に制限はなく、公知の酵素剤を適宜選択することができる。前記酵素剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記酵素剤の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８０】
前記醪造り工程の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１５℃一定とするなどが挙げられる。
また、前記醪造り工程で得られた醪を上槽する時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８１】
＜＜上槽工程＞＞
前記上槽工程は、前記醪造り工程で得られた醪を、清酒と酒粕とに分離する工程である。
前記醪を、清酒と酒粕とに分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧搾機に入れて濾過する方法などが挙げられる。
【００８２】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、公知の酒粕の製造方法で行われる工程を適宜行うことができる。
【００８３】
＜酒粕＞
前記酒粕の形態としては、用途などに応じて適宜選択することができ、酒粕そのものであってもよく、前記酒粕の乾燥物の形態、固形物の形態（前記酒粕から水分を除去したものなど）、液状物の形態（前記酒粕から固形分を除去したものなど）、前記酒粕を溶媒等で抽出した酒粕抽出物の形態などであってもよい。
【００８４】
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８５】
前記酒粕は、ファルネシル酸を含有するため、抗肥満や抗高脂血症効果を奏する点で有利である。
【００８６】
（酵母培養物）
本発明の酵母培養物は、ファルネシル酸を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有する。
【００８７】
前記酵母培養物は、ファルネシル酸を含む酵母の培養物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記「ファルネシル酸産生用組成物」におけるファルネシル酸産生用酵母の培養物であることが好ましい。
【００８８】
前記培養物としては、ファルネシル酸を含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、酵母菌体、酵母菌体の破砕物、酵母の液体培養後の培養上清、酵母の固体培養後の固体培地、及びこれらの混合物などが挙げられる。
なお、前記酵母菌体の破砕物とは、顕微鏡観察下で未破砕菌体がなくなった状態をいう。
【００８９】
＜ファルネシル酸＞
前記酵母培養物中の前記ファルネシル酸の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記酵母を培養する際の培地成分などが挙げられる。
【００９１】
前記培地成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記「ファルネシル酸の製造方法」の＜培養工程＞の項目に記載の栄養培地の成分などが挙げられる。
【００９２】
前記酵母培養物中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９３】
前記酵母培養物の形態としては、用途などに応じて適宜選択することができ、培養物そのものであってもよく、前記培養物の乾燥物の形態、固形物の形態（培養物から培養液等を除去したものなど）、液状物の形態（培養物から固形分を除去したものなど）、前記培養物を溶媒等で抽出した抽出物の形態などであってもよい。
【００９４】
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエチルエーテル、エタノール、メタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００９５】
前記酵母培養物は、ファルネシル酸を含有するため、抗肥満や抗高脂血症効果を奏する点で有利である。
【００９６】
＜酵母培養物の製造方法＞
本発明は、前記酵母培養物の製造方法にも関する。
前記酵母培養物の製造方法としては、前記ファルネシル酸を少なくとも含有する酵母培養物を製造することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養工程を含むことが好ましく、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。
【００９７】
＜＜培養工程＞＞
前記培養工程は、ファルネシル酸を産生する能力を有する酵母を培養する工程である。
前記ファルネシル酸を産生する能力を有する酵母としては、前記「ファルネシル酸産生用組成物」におけるファルネシル酸産生用酵母を用いることが好ましい。
前記培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記「ファルネシル酸の製造方法」の＜培養工程＞に記載の方法が好ましく用いられる。
【００９８】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、破砕工程、洗浄工程などが挙げられる。
【００９９】
前記破砕工程は、前記培養工程で得られた菌体を破砕する工程である。前記菌体を破砕する方法としては、顕微鏡観察下で未破砕菌体がなくなる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理的破砕処理法、化学的破砕処理法などが挙げられる。これらの処理法は、公知の装置などを用い、公知の方法に従って行うことができる。
【０１００】
前記洗浄工程は、前記培養工程で得られた酵母培養物を洗浄する工程である。前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
【０１０１】
前記酵母培養物は、医薬品及び医薬部外品を含む医薬組成物；化粧品；一般食品、一般食品、健康食品、保健機能食品（栄養機能食品及び特定保健用食品）や病者用食品等の特別用途食品などの食品；などにも好適に利用可能である。
【０１０２】
前記酵母培養物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物、化粧品、又は食品と併せて使用されてもよい。また、前記組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物中、化粧品中、又は食品中に、配合された状態で使用されてもよい。
【実施例】
【０１０３】
以下に製造例、試験例などを挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例、試験例などに何ら限定されるものではない。
【０１０４】
（製造例１）
＜ファルネシル酸産生用酵母の製造＞
野生型実験室酵母Ｘ２１８０−１Ａ株（ＡＴＣＣ（登録商標）２０４５０４，ＭＡＴａ）を紫外線照射して変異を誘導した後、以下に示す方法で確認したファルネシル酸の生産性を指標にして選抜し、シーケンスによってＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換され、ｅｒｇ９−２遺伝子に変異したことを確認した。
次に、前記ｅｒｇ９−２遺伝子に変異した株と、清酒酵母の一倍体とを交雑させ、胞子形成させた後、子嚢解剖し、その後、前記同様の方法でファルネシル酸の生産性を指標にして選抜したファルネシル酸を高生産する一倍体株同士を交雑し、二倍体のファルネシル酸生産性酵母を得た。このファルネシル酸生産性酵母を「ＨＬ３０５株」とした。
【０１０５】
＜＜ファルネシル酸の生産性の確認＞＞
前記選抜の対象となる菌株を、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス  １０ｇ、ペプトン  ２０ｇ、及びグルコース  ２０ｇ／水  １，０００ｍＬ、以下同様）にて３５℃で３日間培養した後、培養した菌体を凍結乾燥した。前記凍結乾燥した菌体６０ｍｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４００μＬを添加し、ボルテックスにより十分懸濁した後、１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清をフィルター（製品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＲＣ４、孔径：０．４５μｍ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過した。この上清中のファルネシル酸を、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
−ＨＰＬＣ条件−
・  装置：ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓ  ｓｅｒｉｅｓ（日本分光株式会社製）
（インテリジェントＨＰＬＣポンプ  ＰＵ−２０８０型、デガッサＤＧ−２０８０−５３（３連）型、ダイナミックミキサＭＸ−２８０−３２型、インテリジェントオートサンプラＡＳ−２０５７型、インテリジェントカラムオーブンＣＯ−２０６７型、ＵＶ／ＶＩＳ多波長検出器ＭＤ−２０１０型）
・  カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム、１３０Å、粒径：３．５μｍ、内径：２．１ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
・  移動相：［Ａ］蒸留水／［Ｂ］アセトニトリル（グラジエント条件は、下記表１に示す）
・  カラム温度：５０℃
・  注入量：１０μＬ
・  流速：０．３ｍＬ／分間
【０１０６】
【表１】
2018121532.tif 000002
【０１０７】
ＨＬ３０５株の菌学的性質を以下に示す。
（１）ＹＰＤ液体培地で育成させた時の菌の形態
１．栄養細胞の大きさ：４μｍ〜８μｍ、幅：４μｍ〜６μｍ
２．栄養細胞の形状：卵型
３．増殖の形態：出芽
（２）生理学的性質
ａ．糖の資化性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
ｂ．糖の発酵性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
ラフィノース：＋
（３）接合性
二倍体であるため、接合性なし。
（４）胞子形成
ＨＬ３０５株を、胞子形成用培地にて３０℃で４日間培養した結果、胞子形成した。
【０１０８】
以上の菌学的性質より、ＨＬ３０５株は、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母菌であることを示している。
【０１０９】
（試験例１）
ＨＬ３０５株及び清酒酵母を、それぞれＹＰＤ液体培地にて３５℃で３日間培養した後、培養した菌体を凍結乾燥した。前記凍結乾燥した菌体６０ｍｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４００μＬを添加し、ボルテックスにより十分懸濁した後、１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清をフィルター（製品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＲＣ４、孔径：０．４５μｍ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過することにより、各培養液の抽出エキスを得た。得られた各抽出エキス、及びファルネシル酸の標準品（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を前記製造例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
【０１１０】
図１にＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを、図２に清酒酵母の抽出エキスの液体クロマトグラムを、図３にファルネシル酸標準品の液体クロマトグラムを示す。また、ファルネシル酸の産生量を定量した結果を下記表２に示す。
【０１１１】
【表２】
2018121532.tif 000003
【０１１２】
標準品の結果（図３）より、ファルネシル酸のリテンションタイムは３６．５分であり、ＨＬ３０５株の抽出エキスにおいてファルネシル酸が検出された（図１及び表２）。一方、清酒酵母の抽出エキスでは、ファルネシル酸が検出されなかった（図２及び表２）。
【０１１３】
（試験例２）
＜小仕込試験＞
ＨＬ３０５株及び清酒酵母を用いて、以下の方法で小仕込試験を行った。
ＨＬ３０５株及び清酒酵母をそれぞれＹＰＤ液体培地２０ｍＬにて３０℃で一晩培養した。培養後、４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離してＨＬ３０５株及び清酒酵母をそれぞれ集菌し、蒸留水で洗浄後、蒸留水５ｍＬに懸濁し、全量を小仕込試験に使用した。小仕込試験は、下記表３に示す仕込配合により三段仕込で行った。また、醪は１５℃一定で発酵させた。１日に１回、醪のＣＯ２重量減少量を測定することで発酵経過を観察し、発酵１２日目で上槽し、酒粕と清酒とに分離した。
【０１１４】
【表３】
2018121532.tif 000004
【０１１５】
＜酒粕中のファルネシル酸含有量＞
得られたＨＬ３０５株及び清酒酵母の酒粕を凍結乾燥した。前記凍結乾燥した酒粕６０ｍｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４００μＬを添加し、ボルテックスにより十分懸濁した後、１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清をフィルター（製品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＲＣ４、孔径：０．４５μｍ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過することにより、それぞれの酒粕抽出エキスを調製した。この酒粕抽出エキス中のファルネシル酸の含有量を、前記製造例１に記載のＨＰＬＣ条件と同様の条件で定量した。結果を下記表４に示す。
【０１１６】
【表４】
2018121532.tif 000005
【０１１７】
ＨＬ３０５株の酒粕抽出エキスにおいてファルネシル酸が検出された。一方、清酒酵母の酒粕抽出エキスでは、ファルネシル酸が検出されなかった。
【０１１８】
＜一般分析値＞
また、得られた清酒の一般分析値は、下記表５に示す。
【表５】
2018121532.tif 000006
【０１１９】
ＨＬ３０５株は、十分量のアルコール生産性を示した。
【０１２０】
（試験例３）
＜ファルネシル酸及びファルネソールの高温安定性＞
ＨＬ３０５株を、ＹＰＤ液体培地にて３５℃で３日間培養した後、培養した菌体を凍結乾燥した。この凍結乾燥した菌体をバイアルに入れ、５５℃の恒温室内にて１ヶ月間静置し、高温貯蔵サンプルとした。この高温貯蔵サンプル及び高温貯蔵前の凍結乾燥した菌体６０ｍｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４００μＬを添加し、ボルテックスにより十分懸濁した後、１０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清をフィルター（製品名：Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＲＣ４、孔径：０．４５μｍ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ社製）で濾過することにより、各菌体の抽出エキスを得た。得られた各抽出エキスを前記製造例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ファルネシル酸及びファルネソールを検出した。なお、ファルネソールのリテンションタイムは３８．０分である。
【０１２１】
図４に高温貯蔵前のＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを、図５に高温貯蔵サンプルのＨＬ３０５株の抽出エキスの液体クロマトグラムを示す。図４及び図５において、ピーク２がファルネシル酸のピーク、ピーク３がファルネソールのピークを示す。
図４及び図５のピーク面積に基づき、ファルネシル酸（ピーク２）及びファルネソール（ピーク３）のそれぞれについて、高温貯蔵前のピーク面積に対する、高温貯蔵後のピーク面積の割合から、高温貯蔵後の各化合物の残存率を算出した。
下記表６に、高温貯蔵前後のＨＬ３０５株の抽出エキスにおけるファルネシル酸及びファルネソールのピーク面積、並びに各化合物の高温貯蔵後の残存率を示す。
【表６】
2018121532.tif 000007
【０１２２】
表６の結果より、高温貯蔵後の残存率は、ファルネシル酸の方が高かった。これは、ファルネシル酸の方が、ファルネソールと比較して高温条件下においても安定性が高いことを示している。
【０１２３】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を用いることを特徴とするファルネシル酸の製造方法である。
＜２＞  ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である前記＜１＞に記載のファルネシル酸の製造方法である。
＜３＞  スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列の７１４位のグアニンがアデニンに置換された配列番号１で表される遺伝子に変異したサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるファルネシル酸産生用酵母を含有することを特徴とするファルネシル酸産生用組成物である。
＜４＞  ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である前記＜３＞記載のファルネシル酸産生用組成物である。
＜５＞  サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）    ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）であり、ファルネシル酸を産生する能力を有することを特徴とする酵母である。
＜６＞  サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、スクアレン合成酵素をコードするＥＲＧ９遺伝子の塩基配列７１４位のグアニンをアデニンに置換し、配列番号１で表される遺伝子に変異させることを特徴とするファルネシル酸産生用酵母の製造方法である。
＜７＞  ファルネシル酸産生用酵母が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＨＬ３０５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６）である前記＜６＞に記載のファルネシル酸産生用酵母の製造方法である。
＜８＞  前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載のファルネシル酸産生用組成物を用いることを特徴とする酒粕の製造方法である。
＜９＞  ファルネシル酸を含有することを特徴とする酒粕である。
＜１０＞  ファルネシル酸を含有することを特徴とする酵母培養物である。
【受託番号】
【０１２４】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４０６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2018121532.tif 000011
【図５】
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【配列表】
2018121532000001.app