(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ７０陽性悪性腫瘍の免疫療法のためにＴ細胞をＣＤ７０に仕向けるための方法および組成物の提供。【解決手段】ＣＤ７０抗原を認識し、かつ、細胞内シグナル伝達ドメインを含むＴ細胞キメラ抗原受容体。Ｔ細胞キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ3−ゼータ鎖シグナル伝達ドメインであるＣＤ７０Ｔ細胞キメラ受容体（ＣＤ２７）。ＣＤ７０陽性腫瘍細胞をＣＤ７０Ｔ細胞キメラ抗原受容体を含む腫瘍細胞特異的Ｔ細胞により処置する方法。【選択図】図１ＡＢ
2018121642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ７０抗原を認識し、かつ、細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラな抗原受容体。
【請求項２】
Ｔ細胞表面に存在する、請求項１に記載の受容体。
【請求項３】
ＣＤ７０受容体を含むとしてさらに定義される、請求項１に記載の受容体。
【請求項４】
前記ＣＤ７０受容体がＣＤ２７である、請求項１に記載の受容体。
【請求項５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体のＣＤ３−ζ鎖である、請求項１に記載の受容体。
【請求項６】
ＣＤ７０抗原を有する細胞を標的化する方法であって、前記ＣＤ７０抗原を有する前記細胞に、請求項１に記載される受容体を含む細胞を与える工程を含む方法。
【請求項７】
前記ＣＤ７０抗原を有する前記細胞が、ガン細胞、または、自己免疫疾患に関連する細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ガン細胞が血液学的悪性腫瘍細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ガン細胞が、リンパ腫細胞、白血病細胞、腎細胞ガン細胞、骨髄腫細胞または神経膠芽細胞腫細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガン細胞がＨＴＬＶ−１関連悪性腫瘍細胞またはＥＢＶ関連悪性腫瘍細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガン細胞が固形腫瘍細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記固形腫瘍細胞が、腎臓（ｒｅｎａｌ）ガン細胞、膵臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、肺ガン細胞、鼻咽頭ガン細胞、胸腺ガン細胞、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）ガン細胞、膵臓ガン細胞、咽頭（ｌａｒｙｎｘ）ガン細胞、咽頭（ｐｈａｒｙｎｘ）ガン細胞、皮膚ガン細胞、卵巣ガン細胞、肺ガン細胞、結腸ガン細胞、乳ガン細胞または脳ガン細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、関節炎、炎症、自己免疫性脳炎、炎症性腸疾患、大腸炎または狼瘡である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載される受容体を含む前記細胞がＴ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞がその個体から得られ、かつ、前記キメラな抗原受容体を含むために遺伝子操作される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞がその個体から得られず、かつ、前記キメラな抗原受容体を含むために遺伝子操作される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
個体におけるＣＤ７０陽性悪性腫瘍細胞を処置する方法であって、前記ＣＤ７０陽性悪性腫瘍細胞を、請求項１に記載されるキメラな抗原受容体を含む腫瘍特異的Ｔ細胞により標的化する工程を含む方法。
【請求項１８】
請求項１に記載されるキメラな抗原受容体を保有するようにＴ細胞を改変する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体がさらなる抗ガン治療を受けたことがあるか、または、さらなる抗ガン治療を受けているか、または、さらなる抗ガン治療を受ける予定である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記さらなる抗ガン治療が、手術、放射線、化学療法、免疫療法またはホルモン療法を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
個体をガンについて処置するためのキットであって、請求項１に記載されるキメラな受容体をコードする発現構築物を含むポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが好適な容器に収容される、キット。
【請求項２２】
Ｔ細胞をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に対する相互参照】
【０００１】
本出願は米国仮特許出願第６１／４０７，１８９号（２０１０年１０月２７日出願）（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【連邦政府援助による研究開発に関する言及】
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ／ＮＣＩによって与えられるＰＯ１  ＣＡ０９４２３７、および、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫによって与えられるＴ３２  ＤＫ６４７１７、および、ＮＩＨによって与えられる５Ｔ３２ＨＬ０９２３３２−０７のもとでの政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明の実施形態は、細胞生物学、分子生物学、免疫学および医学の分野に関連する。
【背景技術】
【０００４】
抗原特異的なＴ細胞を用いた免疫療法が、血液学的悪性腫瘍の処置において有望であることが前臨床モデルにおいて、同様にまた、第Ｉ／ＩＩ相臨床研究において示されている（Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｂｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｊｕｎｅ，  ２００７；  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。腫瘍特異的なＴ細胞を作製するための１つの注目される戦略が、細胞外の抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子の内部ドメインに連結されることが多い、Ｔ細胞受容体のＣＤ３−δ（デルタ）鎖に由来する細胞内シグナル伝達ドメインとからなるキメラな抗原受容体（ＣＡＲ）による遺伝子改変によるものである（Ｒｏｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  ２００４；  Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。血液学的悪性腫瘍を処置するためにＣＤ１９抗原およびＣＤ２０抗原を標的とする様々なＣＡＲが広範囲に探求されており、しかし、この取り組みはＢ細胞由来の悪性腫瘍に限定されており、また、Ｔ細胞の潜在的に長い寿命のために体液性免疫の長期にわたる障害をもたらすことがある（Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。したがって、潜在的に処置可能な腫瘍の範囲を拡大すること、および／または、正常な細胞に対する損傷を低下させることを可能にすると考えられる代わりの抗原に向けられるＣＡＲを調製することが望ましい。
【０００５】
ＣＤ７０は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属するＣＤ２７受容体の膜結合リガンドである（Ｈｉｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。ＣＤ７０がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および濾胞性リンパ腫によって発現され、同様に、ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症および多発性骨髄腫の悪性腫瘍細胞によって、また、ＨＴＬＶ−１関連悪性腫瘍およびＥＢＶ関連悪性腫瘍によっても発現される（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ，．  １９９５；  Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。加えて、ＣＤ７０が非血液学的悪性腫瘍（例えば、腎細胞ガンおよび神経膠芽細胞腫など）によって発現される（Ｊｕｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｃｈａｈｌａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。生理学的には、ＣＤ７０の発現は一時的であり、非常に活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞のサブセットに限定される。ＣＤ７０／ＣＤ２７の共刺激はＴ細胞の活性化において役割を果たす一方で、ＣＤ７０／ＣＤ２７のシグナル伝達は機能的な免疫系の発達および維持のために必須ではない。これは、ＣＤ２７ノックアウトマウスが明白な免疫不全を全く有しておらず、インフルエンザウイルス感染から野生型マウスと同じ時間枠の範囲内で回復するからである（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ，，  ２００９）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ガンの処置および／または防止のための免疫療法に関する方法および／または組成物に関する。具体的な局面において、本発明の実施形態は、ＣＤ７０陽性細胞（これには、例えば、悪性腫瘍が含まれる）の免疫療法のためにＣＤ７０に対して仕向けられるＴ細胞に関する。本発明は、ヒト、イヌ、ネコおよびウマなどを含めて、雄性または雌性にかかわらず、どのような哺乳動物であれ、それらのために用いることができる。
【０００７】
ＣＤ７０（腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバー）の発現が、活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球ならびに成熟した樹状細胞に限定される。ＣＤ７０がその受容体のＣＤ２７に結合することが、Ｔ細胞の初回抗原刺激、エフェクター機能、分化およびメモリー形成、ならびに、形質細胞およびメモリーＢ細胞の生成において重要である。特に、ＣＤ７０が、ａ）血液学的悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫およびホジキン病など）、ｂ）固形腫瘍（例えば、腎細胞ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、肺ガンおよび鼻咽頭ガンなど）、および、ｃ）脳腫瘍（例えば、多形性神経膠芽細胞腫など）の広範囲の腫瘍で発現される。モノクローナル抗体を使用する動物モデルにおける前臨床研究では、免疫療法剤としてのＣＤ７０の有効性が検証されている。本発明者らは今回、Ｔ細胞を遺伝子的取り組みによりＣＤ７０陽性悪性腫瘍に仕向けている。この目的のために、本発明者らは、Ｔ細胞受容体複合体のゼータ・シグナル伝達ドメインに融合される全長のＣＤ７０受容体（ＣＤ２７）からなる新規な分子（ＣＤ２７ゼータ）を構築している。ＣＤ２７ゼータを発現するＴ細胞がレトロウイルス形質導入によって作製され、そして、ＣＤ２７ゼータを発現するＴ細胞は、ＣＤ７０陽性腫瘍細胞との共培養の後では非形質導入のＴ細胞とは対照的に、増殖することができ、また、ＩＦＮ−γならびにＩＬ−２を産生することができることによって判断されるように、ＣＤ７０陽性腫瘍細胞を認識した。加えて、ＣＤ２７ゼータを発現するＴ細胞は細胞溶解活性を有し、ＣＤ７０陽性腫瘍細胞を殺しており、これに対して、ＣＤ７０陰性腫瘍細胞は殺されなかった。
【０００８】
本発明の１つの実施形態において、腫瘍を縮小させるか、または防止するための方法であって、本発明のキメラな受容体をコードする核酸構築物を、腫瘍を有するか、または、腫瘍を有することが疑われる個体の単離されたＴ細胞に導入すること、および、前記Ｔ細胞を前記個体に（例えば、注入などによって）送達し、その結果、キメラな受容体が、抗腫瘍免疫性を前記個体において活性化するために前記Ｔ細胞の表面で発現させられ、それにより、前記腫瘍を縮小させるか、または防止することを含む方法が提供される。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤ７０抗原を認識し、かつ、細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラな抗原受容体が提供される。具体的な実施形態において、前記受容体は、Ｔ細胞のような細胞上に存在する。特定の実施形態において、前記受容体は、例えばＣＤ２７のようなＣＤ７０受容体としてさらに定義される。特定の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体のＣＤ３−ζ鎖である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ７０抗原を有する細胞を標的化する方法であって、前記細胞に、本発明のキメラな受容体を含む別の細胞を与える工程を含む方法が提供される。具体的な実施形態において、標的化されている細胞は、ガン細胞を含めて、ＣＤ７０抗原を含むいずれの種類の細胞であってもよく、具体的な実施形態において、標的化されている細胞は、例えば、血液学的悪性腫瘍細胞である。ある種の局面では、標的化されている細胞は、例えば、リンパ腫細胞、腎細胞ガン細胞または神経膠芽細胞腫である。いくつかの局面では、ガン細胞は、例えば、ＨＴＬＶ−１関連悪性腫瘍細胞またはＥＢＶ関連悪性腫瘍細胞である。具体的な実施形態において、ガン細胞はＣＤ７０陽性である。具体的な実施形態において、処置されているガンは、腎細胞ガン、胸腺ガン、鼻咽頭ガン、脳腫瘍、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、ＥＢＶ関連悪性腫瘍およびＨＴＬＶ−１関連悪性腫瘍、腎臓、膵臓、咽頭（ｌａｒｙｎｘ、ｐｈａｒｙｎｘ）、メラノーマ、卵巣、肺（肺腺ガンを含む）、結腸、乳房または脳である。
【００１１】
本発明の具体的な実施形態において、キメラな受容体を含むＴ細胞は、どのような細胞であれ、ＣＤ７０抗原を含む細胞を標的とし、ただし、この場合、その標的化された細胞はガン性であるか否かによらない。例えば、いくつかの実施形態において、本発明に関連するある種の局面では、自己免疫に寄与するＣＤ７０−ＣＤ２７共刺激の調節異常が存在するので、ＣＤ７０が、自己免疫障害に関連づけられる細胞の表面に発現される。具体的な実施形態において、ＣＤ７０細胞が、自己免疫障害の個体において、例えば、関節リウマチ(RA)、関節炎（乾癬性関節炎を含む）、炎症、自己免疫性脳炎、炎症性腸疾患、大腸炎および狼瘡などを有する個体において存在する。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、個体におけるＣＤ７０陽性悪性腫瘍細胞を処置する方法であって、前記ＣＤ７０陽性悪性腫瘍細胞を、本発明のキメラな抗原受容体を含む腫瘍特異的Ｔ細胞により標的化する工程を含む方法に関する。具体的な実施形態において、前記個体は、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法またはホルモン療法のような、さらなる抗ガン治療を受けたことがあるか、または、さらなる抗ガン治療を受けているか、または、さらなる抗ガン治療を受ける予定である。
【００１３】
上記は、下記の本発明の詳細な説明がより良く理解され得るために本発明の特徴および技術的利点をかなり広範囲に概略している。本発明の請求項の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点が本明細書中下記に記載される。開示される概念および具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を行うために他の構造体を改変または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者によって理解されるはずである。そのような同等な構築は、添付された請求項に示されるような本発明の精神および範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されるはずである。その操作構成および作用方法の両方に関して本発明に特徴的であると考えられる新規な特徴、ならびに、さらなる目的および利点が、添付されている図との関連で検討されるとき、下記の説明からより良く理解されるであろう。しかしながら、図のそれぞれが例示および説明のために提供されるだけであり、本発明の範囲限界の定義として意図されないことが特に理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明のより完全な理解のために、添付されている図面と併せて理解される下記の説明が次に参照される。
【００１５】
【図１Ａ】ＣＤ７０−ＣＡＲの作製、細胞表面発現およびヒトＴ細胞の形質導入。（Ａ）ＣＤ７０−ＣＡＲが、全長のＣＤ２７をＣＤ３−ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合することによって作製され、ＩＲＥＳ配列およびｔＣＤ１９が、遺伝子改変されたＴ細胞の検出のために含まれた。
【図１Ｂ】ＣＤ７０−ＣＡＲの作製、細胞表面発現およびヒトＴ細胞の形質導入。（Ｂ）ＣＤ７０−ＣＡＲ構築物によりトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞はＣＤ２７およびマーカー遺伝子ｔＣＤ１９の両方を発現する。
【図１Ｃ】ＣＤ７０−ＣＡＲの作製、細胞表面発現およびヒトＴ細胞の形質導入。（Ｃ）形質導入されたヒトＴ細胞におけるＣＤ７０−ＣＡＲ発現が、ｔＣＤ１９を染色することによって明らかにされるように４５％（＋／−６）であった。
【図１Ｄ】ＣＤ７０−ＣＡＲの作製、細胞表面発現およびヒトＴ細胞の形質導入。（Ｄ）ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方が遺伝子改変された。
【００１６】
【図２】ＣＤ７０が、正常なリンパ球ではなく、いくつかの腫瘍細胞株の表面に過剰発現される。健康なドナーの末梢血から得られるＢリンパ球およびＴリンパ球の５％未満がＣＤ７０を発現する。Ｋ５６２およびＫ５６２．７０が陰性コントロールおよび陽性コントロールとして役立った。ＣＤ７０の過剰発現が、非ホジキン細胞（Ｄａｕｄｉ、ＳＮＫ６、ＳＮＴ１６）、ホジキン細胞（Ｌ１２３６）、ＡＬＬ細胞（ＣＣＬ−１２０）および多発性骨髄腫細胞（Ｕ２６６）において認められた。
【００１７】
【図３Ａ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、ＣＤ７０陽性の標的細胞に応答して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を放出し、増殖する。（Ａ）３名のドナーに由来するＴ細胞をＣＤ７０−ＣＡＲにより形質導入し（黒色）、または形質導入せず（灰色）、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡを行う前の４８時間、Ｋ５６２．７０およびＫ５６２と、同様にまた、様々なＣＤ７０発現腫瘍細胞株と共培養した。黒四角および灰色四角はＣＤ７０−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞の平均ＩＦＮ−γ放出をそれぞれ表す。有意に（ｐ＜０．０３）より多くのＩＦＮ−γが、Ｋ５６２細胞と比較して、Ｋ５６２．７０細胞の存在下で放出されたので、ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ７０について特異的であった。ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、ＣＤ７０発現の腫瘍細胞株と共培養されたとき、非形質導入Ｔ細胞よりも有意に（ｐ＜０．０００１）より多くのＩＦＮ−γを放出した。
【図３Ｂ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、ＣＤ７０陽性の標的細胞に応答して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を放出し、増殖する。（Ｂ）ＩＬ−２の存在についてアッセイされたことを除いて同じ共培養実験。ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ７０発現腫瘍の存在下では非形質導入Ｔ細胞よりも有意に（ｐ＜０．０００１）より多くのＩＬ−２を放出する。
【図３Ｃ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、ＣＤ７０陽性の標的細胞に応答して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２を放出し、増殖する。（Ｃ）Ｔ細胞をＣＦＳＥにより標識し、外因性ＩＬ−２の非存在下、Ｋ５６２、Ｋ５６２．７０、ＳＮＴ１６またはＤａｕｄｉと５日間にわたって共培養し、ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ７０を過剰発現する標的のＫ５６２．７０およびＳＮＴ１６と共培養されたときには増殖したが、ＣＤ７０微弱（ｄｉｍ）のＤａｕｄｉ細胞またはＣＤ７０陰性のＫ５６２細胞と共培養されたときには増殖しなかった。
【００１８】
【図４Ａ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の腫瘍細胞株を殺す。（Ａ）ＣＤ７０−ＣＡＴ  Ｔ細胞（実線）により、Ｋ５６２．７０細胞が殺されたが、元のＫ５６２細胞は殺されなかった。非形質導入のコントロールＴ細胞（点線）はどちらの標的も殺さなかった。
【図４Ｂ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の腫瘍細胞株を殺す。（Ｂ）ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞（実線）により、ＣＤ７０陽性のＤａｕｄｉ、Ｕ２６６、ＳＮＫ６およびＳＮＴ１６の腫瘍細胞株が殺され、一方で、コントロールＴ細胞（点線）はこれらを殺さなかった。
【図４Ｃ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の腫瘍細胞株を殺す。（Ｃ）ＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＣＦＳＥにより標識し、２：１の比率でＳＮＴ１６細胞と共培養した。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較した場合、ＣＤ３＋細胞のＣＦＳＥ希釈および培養物におけるＣＤ３／ＣＦＳＥ陰性細胞の欠如によって示されるように増殖し、ＳＮＴ１６を殺した。
【図４Ｄ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の腫瘍細胞株を殺す。（Ｄ）すべての共培養実験において、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞のみがＣＤ３／ＣＦＳＥ陰性ＣＤ７０＋腫瘍細胞のＤａｕｄｉ、Ｕ２６６、ＳＮＫ６およびＳＮＴ１６を排除した。
【００１９】
【図５Ａ】ＣＤ２７共刺激はＴ細胞の生存性を高める。（Ａ）Ｃｏ−ＩＰ実験において、全長ＣＤ２７−ζのみがＴＲＡＦ２と会合した。
【図５Ｂ】ＣＤ２７共刺激はＴ細胞の生存性を高める。（Ｂ）ＣＤ７０−ＣＡＲまたはΔＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞が、５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ７０＋のＬＣＬ細胞およびＵ２６６細胞の同等の殺傷を示し、ＣＤ７０−のＫ５６２細胞を殺さなかった。
【図５Ｃ】ＣＤ２７共刺激はＴ細胞の生存性を高める。（Ｃ）ＣＤ７０を発現するように遺伝子改変された自己由来の線維芽細胞により活性化された、ＣＤ７０−ＣＡＲまたはΔＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞の顕微鏡法評価（１０倍）では、ＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞のより大きい「Ｔ細胞凝集塊」が明らかにされ、しかしながら、ＣＦＳＥ希釈分析では、増殖における有意差が群間において全く示されなかった。
【図５Ｄ】ＣＤ２７共刺激はＴ細胞の生存性を高める。（Ｄ）ΔＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存性が、ＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞の生存性の３５％（＋／−１６％）であった（ｎ＝５）。
【図５Ｅ】ＣＤ２７共刺激はＴ細胞の生存性を高める。（Ｅ）Ｂｃｌ−ｘｌについての細胞内染色をＣＤ７０遺伝子組換えの自己由来の線維芽細胞による刺激の３日後にＴ細胞に対して行った。Ｂｃｌ−ｘｌの発現が、ΔＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合、ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞では一貫して増大した（ｎ＝３）。１つの代表的なＦＡＣＳ分析が示される。
【００２０】
【図６Ａ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は原発性ＣＤ７０陽性リンパ腫の認識および殺傷を生じさせる。（Ａ）３名のＢ細胞リンパ腫患者および１名のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病患者に由来するＣＤ７０過剰発現の腫瘍細胞を、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡを行う前の４８時間、健康なドナーに由来するＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞と共培養した。すべての場合において、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は患者の腫瘍細胞の存在下でＩＦＮ−γを放出し、これに対して、非形質導入Ｔ細胞はＩＦＮ−γの放出が皆無かそれに近かった。
【図６Ｂ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は原発性ＣＤ７０陽性リンパ腫の認識および殺傷を生じさせる。（Ｂ、Ｃ）共培養アッセイを、エフェクター細胞および標的細胞をＦＡＣＳ分析によって区別するために原発性腫瘍細胞およびＣＦＳＥ標識のＴ細胞を用いて行った。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞（ＣＤ３／ＣＦＳＥ陽性細胞）のみが患者の腫瘍細胞を根絶することができた（ｐ＝０．０３６）。
【図６Ｃ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は原発性ＣＤ７０陽性リンパ腫の認識および殺傷を生じさせる。（Ｂ、Ｃ）共培養アッセイを、エフェクター細胞および標的細胞をＦＡＣＳ分析によって区別するために原発性腫瘍細胞およびＣＦＳＥ標識のＴ細胞を用いて行った。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞（ＣＤ３／ＣＦＳＥ陽性細胞）のみが患者の腫瘍細胞を根絶することができた（ｐ＝０．０３６）。
【００２１】
【図７Ａ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はインビボ抗腫瘍活性をリンパ腫のマウス異種移植片モデルにおいて示す。（Ａ〜Ｂ）ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子を発現するＤａｕｄｉ細胞（５×１０５個）をＳＣＩＤマウスに腹腔内注入した。腫瘍の成長を、増大する光シグナル（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として測定した。１０日目、１１日目および１７日目に、マウスには、１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞が注入された。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞により処置された腫瘍は処置後７日に退行し、これに対して、非形質導入Ｔ細胞により処置された腫瘍は退行しなかった（Ｐ＝０．００２）。パネルＡは代表的な動物の画像を示す。パネルＢは定量的生物発光画像化を示す。パネルＣおよびパネルＤでは、Ｒａｊｉ細胞（２×１０５個）がＳＣＩＤマウスに静脈内注入された。４日目、５日目および１１日目に、マウスには、１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞が注入された。
【図７Ｂ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はインビボ抗腫瘍活性をリンパ腫のマウス異種移植片モデルにおいて示す。（Ａ〜Ｂ）ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子を発現するＤａｕｄｉ細胞（５×１０５個）をＳＣＩＤマウスに腹腔内注入した。腫瘍の成長を、増大する光シグナル（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として測定した。１０日目、１１日目および１７日目に、マウスには、１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞が注入された。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞により処置された腫瘍は処置後７日に退行し、これに対して、非形質導入Ｔ細胞により処置された腫瘍は退行しなかった（Ｐ＝０．００２）。パネルＡは代表的な動物の画像を示す。パネルＢは定量的生物発光画像化を示す。パネルＣおよびパネルＤでは、Ｒａｊｉ細胞（２×１０５個）がＳＣＩＤマウスに静脈内注入された。４日目、５日目および１１日目に、マウスには、１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞が注入された。
【図７Ｃ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はインビボ抗腫瘍活性をリンパ腫のマウス異種移植片モデルにおいて示す。（Ｃ）全身の腫瘍数を、生物発光画像化を使用して求めた。腫瘍細胞注入後の第３週および第４週において、非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスでは、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞を受けたマウスの場合よりも有意に大きい腫瘍負荷量が認められた（第３週、Ｐ＝０．０１２；第４週［ｎ＝１２］、Ｐ＝０．０１０）。
【図７Ｄ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はインビボ抗腫瘍活性をリンパ腫のマウス異種移植片モデルにおいて示す。（Ｄ）ＣＤ７０特異的Ｔ細胞により処置されたマウスは、非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスを上回る有意な生存上の利点を示した（Ｐ＜０．０５）。
【００２２】
【図８Ａ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は自己由来のＢ細胞およびＴ細胞に対する最小限の反応性を示す。（Ａ）３名の健康なドナーに由来するＣＤ７０特異的Ｔ細胞（１×１０５個）を、５×１０４個の自己由来のＴ細胞、Ｂ細胞またはＲａｊｉ細胞の存在下、単独で置床したか、あるいは、ＰＭＡ／イオノマイシンにより刺激した。強い反応性が、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるように、Ｒａｊｉ細胞に対して、また、ＰＭＡ／イオノマイシンによる処置の後で見られ、しかし、自己由来のＴ細胞またはＢ細胞に対しては見られない。
【図８Ｂ】ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は自己由来のＢ細胞およびＴ細胞に対する最小限の反応性を示す。（Ｂ）ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、４時間の５１−クロム放出アッセイにおいて、Ｒａｊｉ細胞およびＢ細胞芽細胞を殺すが、ＯＫＴ３芽細胞を殺さない。非形質導入細胞はいずれの標的の殺傷も示さない（実線：ＣＤ７０特異的Ｔ細胞、点線：非形質導入Ｔ細胞）。
【００２３】
【図９】ＣＤ７０−ＣＡＲ  ＤｓＲｅｄ発現のＴ細胞およびΔＣＤ７０−ＣＡＲ  ＤｓＲｅｄ発現のＴ細胞の作製。（Ａ）ＣＤ７０−ＣＡＲ発現カセットを、形質導入されたＴ細胞の検出および選抜のためにＤｓＲｅｄを含むように改変した。ΔＣＤ７０−ＣＡＲをＣＤ２７内部ドメインにおける２３アミノ酸のＰＣＲ欠失によって作製し、ＤｓＲｅｄ発現カセットにクローン化した。（Ｂ）形質導入効率が、ＣＤ７０−ＣＡＲ−Ｉ−ＤｓＲｅｄまたはΔＣＤ７０−ＣＡＲ−ＩＤｓＲｅｄを発現するＴ細胞の間で同程度であった。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本明細書中で使用される場合、語“ａ”または語“ａｎ”の使用は、請求項および／または明細書において用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）と併せて使用されるときには“ｏｎｅ”（１つ）を意味する場合があり、しかし、語“ａ”または語“ａｎ”の使用はまた、“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ”（１つまたは複数）、“ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ”（少なくとも１つ）、および、“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ”（１つまたは１つを超える）の意味と矛盾しない。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法からなる場合があり、あるいは、本発明の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法から本質的になる場合がある。本明細書中に記載される方法または組成物はどれも、本明細書中に記載されるいずれかの他の方法または組成物に関して実行され得ることが意図される。
【００２５】
ＣＤ７０陽性悪性腫瘍をＣＤ７０特異的モノクローナル抗体により標的化することが、前臨床動物モデルにおいて有望であることが示されており（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、本発明者らは今回、Ｔ細胞が、適切なＣＡＲの強制された発現によってＣＤ７０に仕向けられ得るかどうかを評価した。ＣＡＲは、マウスのモノクローナル抗体に由来する細胞外の抗原認識ドメインからなるので、ＣＡＲは、完全にヒト化される場合を除き、融合されたときにはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を誘導するかもしれない（Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。この制限を克服するための１つの潜在的な戦略が、抗原認識ドメインを、モノクローナル抗体ではなく、むしろ、内因性のタンパク質リガンドまたは受容体を使用して操作することである（Ｋａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＣＤ７０をＴ細胞により標的化するために、本発明者らは生理学的なＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用を利用し、ＣＤ３−ζ鎖の細胞内ドメインに融合される抗原認識ドメインとしての全長ＣＤ２７からなるＣＤ７０特異的ＣＡＲを作製した。ＣＤ７０リガンドを発現する腫瘍標的によるキメラなＣＤ２７−ζの会合はＴ細胞の活性化およびＣＤ２７の共刺激をもたらし、この場合、このことはＣＤ２７の細胞質テール内のＴＲＡＦ２結合部位の存在に依存していた。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の腫瘍細胞株を原発性腫瘍と同様に殺し、また、抗腫瘍活性をマウスＳＣＩＤ異種移植片モデルにおいて有した。
【００２６】
Ｉ．本発明のキメラな受容体およびその使用の実施形態
本発明の実施形態において、ＣＤ７０の受容体と、細胞内シグナル伝達ドメインとをコードするキメラな受容体が提供される。具体的な局面において、ＣＤ７０受容体は、ＣＤ７０抗原を認識するポリペプチドである。具体的な局面において、ＣＤ７０の受容体はＣＤ２７である。
【００２７】
特定の実施形態では、好適な細胞内ドメインはどれも、本発明のキメラな受容体において用いられるが、具体的な実施形態において、好適な細胞内ドメインはＣＤ３のゼータ鎖の一部またはすべてである。具体的な実施形態において、細胞内の受容体シグナル伝達ドメインはＴ細胞抗原受容体複合体の細胞内受容体シグナル伝達ドメインであり、例えば、ＣＤ３のゼータ鎖などであり、同様に、単独またはＣＤ３ゼータとの直列で、例えば、Ｆｃγ  ＲＩＩＩ共刺激性シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ２である。具体的な実施形態において、細胞内ドメイン（これは細胞質ドメインとして示される場合がある）は、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２およびＣＤ４０のうちの１つまたは複数の一部またはすべてを含む。１つまたは多数の細胞質ドメインを用いることができ、これは、いわゆる第三世代のＣＡＲが、例えば、少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを相加的または相乗的な効果のために一緒に融合されて有するからである。
【００２８】
本発明による免疫受容体は、この技術分野で知られているいずれかの手段によって製造することができ、だが、好ましくは、本発明による免疫受容体は、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。キメラな受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列を、分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援連結、部位特異的変異誘発など）によって調製し、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域が好ましくは、免疫受容体の発現のために、発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞株（好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己由来のＴリンパ球細胞株、第三者由来のＴ細胞株／Ｔ細胞クローン、形質転換された液性または異種の免疫学的エフェクター細胞株）を形質転換するために使用される。ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、ＬＡＫ細胞、ＬＩＫ細胞、および、これらの細胞に分化する幹細胞もまた使用することができる。１つの好ましい実施形態において、抗ガン治療を達成するために、リンパ球が白血球フェレーシスによって患者から得られ、この自己由来のＴ細胞が、ゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）を発現させるために形質導入され、いずれかの臨床的に許容され得る手段によって当該個体に投与されて戻される。
【００２９】
治療効果の好適な用量が、好ましくは一連の服用サイクルにおいて、服用あたり約１０６個の細胞〜約１０９個の細胞の間であると考えられる。好ましい服用法は、０日目に約１０７個の細胞から開始して、５日目までに約１０８個の細胞の目標用量にまで徐々に増大させる増大用量の１週間に４回の服用サイクルからなる。好適な投与様式には、静脈内、皮下、腔内（例えば、リザーバー・アクセス・デバイスによる）、腹腔内、および、腫瘍塊内への直接注入が含まれる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、核酸構築物または核酸配列は、Ｔ細胞に形質転換または導入され、生成物（例えば、キメラな受容体）を産生するために転写および翻訳されることが可能であるＤＮＡ分子を意味することが意図される。例としてだけであるが、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセション番号ＮＭ＿００１２４２はＣＤ２７についてのヌクレオチド配列を提供し、これは参照によって本明細書中に組み込まれる。ＣＤ２７のほかに、ＣＤ２７−ζ分子はＣＤ３−ζ鎖のシグナル伝達ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ(R)  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＰ＿０００７２５．１  ａｎｄ  ＮＰ＿９３２１７０．１）を含有する。
【００３１】
本発明で用いられる核酸構築物において、プロモーターが、本発明のキメラな受容体をコードする核酸配列に機能的に連結される。すなわち、それらは、キメラな受容体をコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進させるように配置される。プロモーターはゲノム起源のものが可能であり、または、合成により作製することができる。Ｔ細胞における使用のための様々なプロモーターがこの技術分野では広く知られている（Ｍａｒｏｄｏｎらにより開示されるｔｈｅ  ＣＤ４  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１（９）：３４１６−２３）。プロモーターは、誘導が、例えば、特定の細胞タイプまたは特定の成熟化レベルに伴う場合、構成的または誘導可能であることが可能である。代替において、数多くの広く知られているウイルスプロモーターもまた好適である。目的とするプロモーターには、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、ならびに、フレンド脾フォーカス形成ウイルスプロモーターが含まれる。プロモーターには、エンハンサーが伴ってもよく、または伴わなくてもよく、ただし、この場合、エンハンサーには当然ながら、特定のプロモーターが伴ってもよく、または、異なるプロモーターが伴ってもよい。
【００３２】
キメラな受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列を、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得ることができ、あるいは、（例えば、ＰＣＲにより）合成することができ、あるいは、それらの組合せが可能である。ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に依存して、ｃＤＮＡまたはその組合せを使用することが望ましい場合がある。これは、イントロンがｍＲＮＡを安定化するか、または、Ｔ細胞特異的な発現をもたらすことが見出されるからである（Ｂａｒｔｈｅｌ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｆｅｌｄ  （２００３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１（７）：３６１２−９）。また、内因性または外因性の非コード領域を、ｍＲＮＡを安定化させるために使用することがさらに好都合である場合がある。
【００３３】
本発明のキメラな受容体の発現のために、キメラな受容体のＮ端成分をコードする核酸配列の天然に存在する転写開始領域または内因性の転写開始領域を、キメラな受容体を標的宿主において生じさせるために使用することができる。代替において、構成的または誘導可能な発現について可能にする外因性の転写開始領域を使用することができ、ただし、この場合、発現が、標的宿主、所望される発現レベル、および、標的宿主の性質などに依存して制御され得る。
【００３４】
同様に、キメラな受容体を表面膜に導くシグナル配列として、キメラな受容体のＮ端成分の内因性シグナル配列を挙げることができる。場合により、いくつかの場合には、この配列を異なるシグナル配列に交換することが望ましい場合がある。しかしながら、選択されたシグナル配列はＴ細胞の分泌経路との適合性を有し、その結果、キメラな受容体がＴ細胞の表面に提示されるようにしなければならない。
【００３５】
類似して、終結領域が、キメラな受容体のＣ端成分をコードする核酸配列の天然に存在する転写終結領域または内因性の転写終結領域によって提供される場合がある。代替において、終結領域は、異なる起源に由来する場合がある。大抵の場合、終結領域の起源は一般に、組換えタンパク質の発現に対して重要であるとは見なされず、広範囲の様々な終結領域を、発現に悪影響を及ぼすことなく用いることができる。
【００３６】
当業者によって理解されるであろうが、いくつかの場合には、ＣＤ２７の両末端における数アミノ酸を欠失させることができる（例えば、通常的には１０残基以下、より通常的には５残基以下を欠失させることができる）。また、少数のアミノ酸を両端において導入することが望ましい場合がある（通常的には１０残基以下、より通常的には５残基以下が導入される）。アミノ酸の欠失または挿入は構築の必要性の結果としてであるかもしれず、これにより、好都合な制限部位、操作の容易さ、または、発現レベルにおける改善などがもたらされる。加えて、１つまたは複数のアミノ酸の、異なるアミノ酸による置換を、同じような理由から行うことができ、だが、通常の場合、約５個を超えるアミノ酸をいずれか１つのドメインにおいて置換することは行われない。
【００３７】
本発明によるキメラな受容体をコードするキメラな構築物は好都合な方法で調製することができる。大抵の場合には天然の配列が用いられ得るので、天然の遺伝子が、様々な成分の適切な結合を可能にするように、適するように単離および操作され得る。したがって、キメラな受容体のＮ端タンパク質およびＣ端タンパク質をコードする核酸配列を、遺伝子の望まれない部分の欠失をもたらす適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって単離することができる。代替において、クローン化された遺伝子の制限消化を、キメラな構築物を作製するために使用することができる。いずれの場合でも、配列は、平滑末端である制限部位、または、相補的な重複を有する制限部位を提供するために選択することができる。
【００３８】
キメラな構築物を調製するための様々な操作をインビトロで行うことができ、特定の実施形態では、キメラな構築物が、標準的な形質転換方法またはトランスフェクション方法を使用して、クローニングおよび適切な宿主における発現のためにベクターに導入される。したがって、それぞれの操作の後で、ＤＮＡ配列の結合からの得られた構築物がクローン化され、ベクターが単離され、配列が、当該配列が所望のキメラな受容体をコードすることを保証するためにスクリーニングされる。配列は制限分析または配列決定などによってスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明のキメラな構築物は、ガンを有する対象、または、ガンを有することが疑われる対象における適用が、これらの対象において腫瘍のサイズを縮小させるか、あるいは、腫瘍の成長または再成長を防止することによって見出される。したがって、本発明はさらに、本発明のキメラな構築物を対象の単離されたＴ細胞に導入し、形質転換されたＴ細胞を対象に再導入し、それにより、対象において腫瘍を縮小させるか、または排除するための抗腫瘍応答を達成することによって対象において、成長を低下させるか、または、腫瘍形成を防止するための方法に関連する。使用することができる好適なＴ細胞には、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、または、活性化されたときに標的細胞を殺すことができる他の細胞が含まれる。当業者には広く知られているように、様々な方法が、これらの細胞を対象から単離するために容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカーの発現を使用して、または、市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から得られるＩＳＯＣＥＬＬ（商標））を使用して。
【００４０】
キメラな構築物は、ネイクドＤＮＡとして、または、好適なベクターにおいて対象自身のＴ細胞に導入され得ることが意図される。Ｔ細胞を、ネイクドＤＮＡを使用してエレクトロポレーションによって安定的に形質転換するための様々な方法がこの技術分野では知られている。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。ネイクドＤＮＡは一般には、プラスミド発現ベクターに発現のための適切な配向で含有される本発明のキメラな受容体をコードするＤＮＡを示す。好都合なことに、ネイクドＤＮＡの使用により、本発明のキメラな受容体を発現するＴ細胞を製造するために要求される時間が短縮される。
【００４１】
代替において、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を、キメラな構築物をＴ細胞に導入するために使用することができる。本発明の方法に従って使用される好適なベクターは対象のＴ細胞において非複製性である。ウイルスに基づく非常に多数のベクターが知られており、この場合、細胞に維持されるウイルスのコピー数が、細胞の生存性を維持するために十分に少ない。例示的なベクターには、本明細書中に開示されるｐＦＢ−ｎｅｏ系ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、同様にまた、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターが含まれる。
【００４２】
トランスフェクションまたは形質導入されたＴ細胞が、キメラな受容体を、所望される調節により、かつ、所望されるレベルで表面膜タンパク質として発現する能力を有することが立証されると、キメラな受容体は、所望されるシグナル誘導を提供するために宿主細胞において機能的であるかどうかを明らかにすることができる。その後、形質導入されたＴ細胞は、抗腫瘍応答を対象において活性化するために対象に再導入または投与される。投与を容易にするために、本発明による形質導入されたＴ細胞は、さらに医薬的に許容され得る適切なキャリアまたは希釈剤とともに、医薬組成物にすることができ、または、インビボでの投与のために適切なインプラントにすることができる。そのような組成物またはインプラントを作製する様々な手段がこの技術分野では記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ編（１９８０）を参照のこと）。適切である場合、形質導入されたＴ細胞は、半固体形態または液体形態での調製物（例えば、カプセル剤、溶液剤、注射剤、吸入剤またはエアロゾルなど）にそれらのそれぞれの投与経路のための通常の方法で配合することができる。この技術分野で知られている様々な手段を、組成物が標的組織または標的器官に到達するまでは組成物の放出および吸収を防止するか、または最小限にするために、あるいは、組成物の徐放性を保証するために利用することができる。しかしながら、望ましくは、キメラな受容体を発現する細胞を無力化しない医薬的に許容される形態が用いられる。したがって、望ましくは、形質導入されたＴ細胞は、平衡化塩溶液（好ましくはハンクス平衡塩溶液）または規定生理的食塩水を含有する医薬組成物にすることができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は単独で使用することができ、または、ガンを処置するために有用である他の十分に確立された薬剤との併用で使用することができる。単独で送達されるか、または、他の薬剤との併用で送達されるかによらず、本発明の医薬組成物は、特定の効果を達成するために、様々な経路を介して、かつ、哺乳動物（好ましくはヒト）の身体における様々な部位に送達することができる。当業者は、２つ以上の経路が投与のために使用され得るとはいえ、ある特定の経路が別の経路よりも即時的かつ効果的な反応をもたらし得ることを認めるであろう。例えば、皮内送達が、メラノーマの処置のために吸入に優先して都合良く使用される場合がある。局所的または全身的な送達を、体腔内への配合物の適用または点滴注入、エアロゾルの吸入または吹送を含む投与によって、あるいは、筋肉内投与、静脈内投与、門脈内投与、肝臓内投与、腹膜投与、皮下投与または皮内投与を含む非経口導入によって達成することができる。
【００４４】
本発明の組成物は、それぞれの投薬形態物（例えば、注射剤）が所定量の組成物を単独で、または、他の活性成分との適切な組合せで含有する単位投薬形態物において提供することができる。本明細書中で使用されるような単位投薬形態物の用語は、ヒト対象および動物対象のための単位投薬として好適である物理的に個別的な単位物（ただし、それぞれの単位物が、所定量の本発明の組成物を、単独または他の活性成分との適切な組合せであっても、適する場合には、医薬的に許容される希釈剤、キャリアまたはビヒクルとの連係で、所望される効果を生じさせるために十分な量で計算されて含有する）を示す。本発明の新規な単位投薬形態物のための仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に依存する。
【００４５】
望ましくは、単離された形質導入Ｔ細胞の効果的な量および十分な数が組成物において存在し、対象に導入され、その結果、長期間の特異的な抗腫瘍応答が確立されて、腫瘍のサイズを縮小するか、あるいは、そうでなければ、そのような処置の非存在下で生じるであろう腫瘍の成長または再成長を排除するようにされる。望ましくは、対象に再導入される形質導入されたＴ細胞の量は、形質導入されたＴ細胞が存在しないそれ以外では同じ条件と比較されたとき、腫瘍サイズにおける１０％の低下、２０％の低下、３０％の低下、４０％の低下、５０％の低下、６０％の低下、７０％の低下、８０％の低下、９０％の低下、９５％の低下、９８％の低下または１００％の低下を生じさせる。
【００４６】
したがって、投与される形質導入されたＴ細胞の量は投与経路を考慮に入れなければならず、また、十分な数の形質導入されたＴ細胞が導入されることになり、その結果、所望される治療応答を達成するようにしなければならない。そのうえ、本明細書中に記載される組成物に含まれるそれぞれの活性薬剤の量（例えば、接触させられることになる各細胞あたりの量、または、ある特定の体重あたりの量）が種々の適用において変化し得る。一般に、形質導入されたＴ細胞の濃度は望ましくは、処置されている対象において少なくとも、約１×１０６個〜約１×１０９個の形質導入されたＴ細胞を提供するために十分でなければならず、一層より望ましくは、約１×１０７個〜約５×１０８個の形質導入されたＴ細胞を提供するために十分でなければならず、だが、より多い量（例えば、５×１０８個を超える量）またはより少ない量（例えば、１×１０７個よりも少ない量）のいずれであっても、好適な量はどれも利用することができる。服用スケジュールは、十分に確立された、細胞に基づく治療法に基づくことができ（例えば、ＴｏｐａｌｉａｎおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８７）、Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．７８（Ｓｕｐｐｌ  １）、７５〜６；米国特許第４，６９０，９１５号を参照のこと）、または、代替となる連続注入戦略を用いることができる。
【００４７】
これらの値は、本発明の方法を本発明の実施のために最適化するときの実施者によって利用されるための形質導入されたＴ細胞の範囲の一般的な指針を提供する。そのような範囲の本明細書中での列挙は、特定の適用では認められるかもしれないように、より多い量またはより少ない量の成分の使用を決して排除しない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の医薬組成物との併用で投与されるかどうかに依存して、または、薬物動態学、薬物体内分布および代謝における個体間の差に依存して変化し得る。当業者は、どのような調節であれ、特定の状況の要求に従う必要な調節を容易に行うことができる。
【００４８】
ＩＩ．本発明のキットの実施形態
本明細書中に記載される組成物のどれもがキットに含まれ得る。限定されない一例において、キメラな受容体の発現構築物、キメラな受容体の発現構築物を作製するための１つまたは複数の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、および／あるいは、発現構築物のトランスフェクションのために自己由来の細胞を得るための１つまたは複数の器具（そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、および／または、いずれかのそのような医療承認された装置であるかもしれない）。
【００４９】
キットは、本発明の組成物を作製するために、１つまたは複数の好適に等分された本発明の組成物または試薬を含む場合がある。キットの構成成分は、水性媒体において、または、凍結乾燥形態においてそのいずれかで包装される場合がある。キットの容器手段には、構成成分を入れることができ、好ましくは好適に等分して入れることができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、びん、シリンジまたは他の容器手段が含まれる場合がある。２つ以上の構成成分がキットに存在する場合、キットはまた、さらなる構成成分を別々に入れることができる第２、第３または他のさらなる容器を一般に含有するであろう。しかしながら、構成成分の様々な組合せがバイアルに含まれる場合がある。本発明のキットはまた典型的には、キメラな受容体構築物を含有するための手段、および、商業用販売のために厳重に閉じ込められている何らかの他の試薬容器を含むであろう。そのような容器には、例えば、所望されるバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれる場合がある。
【実施例】
【００５０】
下記の実施例が、本発明のいくつかの実施形態を実証するために含められる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表しており、したがって、その実施のためのいくつかの態様を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化が、開示される具体的な実施形態において行われ得ること、そして、多くの変化により、同様な結果または類似する結果が依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく得られ得ることを理解しなければならない。
【００５１】
ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的化する遺伝子改変されたＴ細胞によるＴ細胞治療は、血液学的悪性腫瘍の免疫療法のために有望である。しかしながら、これらの標的はＢ細胞由来の悪性腫瘍の表面に存在するだけであり、また、これらの標的は造血系では広範囲に発現されるので、それらの標的化は望まれない結果を有するかもしれない。Ｔ細胞治療をＢ細胞由来でない血液学的悪性腫瘍に拡大するために、本発明者らは、Ｔ細胞が、ＣＤ７０に、すなわち、限定されたサブセットの正常なリンパ球および樹状細胞によって発現されるが、広範囲の様々な血液学的悪性腫瘍および一部の固形腫瘍によって異常に発現される抗原に仕向けられ得るかどうかを明らかにした。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞を作製するために、本発明者らは、ＣＤ３−ζ鎖に融合されるＣＤ７０受容体（ＣＤ２７）を含むキメラな抗原受容体（ＣＡＲ）を構築した。ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞の刺激は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌ならびに腫瘍細胞の殺傷によって示されるように、ＣＤ２７共刺激、ならびに、ＣＤ７０陽性腫瘍細胞株および原発性腫瘍細胞の認識がもたらされた。養子移入されたＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、定着したマウス異種移植片の持続した退行を誘導した。したがって、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性悪性腫瘍のための有用な免疫療法取り組みである。
【００５２】
実施例１
例示的な材料および方法
細胞株および腫瘍細胞
【００５３】
血液サンプルおよび原発性腫瘍細胞を得るためのプロトコルが、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって承認された。Ｄａｕｄｉ、ＣＣＬ−１２０、Ｕ２６６およびＫ５６２の細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）から得た。ＣＤ７０を発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２．７０）が、Ｋ５６２細胞を、ヒトＣＤ７０およびＧＦＰをコードする自己不活性化レンチウイルスベクターにより形質導入することによって作製された。Ｌ１２３６をＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）から得た。ＳＮＫ６およびＳＮＴ１６が清水則夫博士（東京医科歯科大学、日本）から譲渡された（Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。原発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（インビトロ培養されることなく凍結保存されていたもの）が、Ｓｔｅｐｈａｎ  Ａｎｓｅｌｌ博士（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、米国）によって提供された。
【００５４】
ＣＤ７０特異的ＣＡＲ構築物の作製
【００５５】
全長のヒトＣＤ２７（ＣＤ７０受容体）を、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＴ細胞受容体のζ鎖（ＴＣＲ−ζ）のシグナル伝達ドメイン（アミノ酸５２〜１６４）に読み枠を合わせて融合した；ｐＯＲＦ．ＣＤ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびｐＳＦＧ．ＦＲＰ５．ζ（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）がＰＣＲテンプレートとして役立った。プライマーを、５’−ＮｃｏＩ制限部位および３’−ＳｐｈＩ制限部位を作製するために改変し、ＣＤ２７  ＴＣＲ−ζ融合遺伝子（ＣＤ７０−ＣＡＲ）をＳＦＧレトロウイルスベクターにサブクローニングした。形質導入されたＴ細胞の明確な検出を容易にするために、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）により短縮化されたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）（Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）発現カセット（ＩＲＥＳ−ｔＣＤ１９）をオーバーラップＰＣＲによって作製し、ＣＤ２７  ＴＣＲ−ζ融合遺伝子の３’において、ＳＦＧレトロウイルスベクターの５’−ＳｐｈＩ制限部位および３’−ＡｃｃＩＩＩ制限部位にサブクローニングした（ｐＳＦＧ．ＣＤ７０−ＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ｔＣＤ１９；図１Ａ）。加えて、ＣＤ７０−ＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ発現カセット、または、ＣＤ２７の２３アミノ酸のＴＲＡＦ２結合部位（残基２３８〜２６０）が欠失されたΔＣＤ７０−ＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ発現カセット（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）を含有するレトロウイルスベクターを作製した（図８）。
【００５６】
レトロウイルスの産生およびＴリンパ球の形質導入
【００５７】
ＲＤ１１４偽型レトロウイルス粒子を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＣＤ７０−ＣＡＲ  ＳＦＧレトロウイルスベクター、ＭｏＭＬＶ  ｇａｇ−ｐｏｌのための配列を含有するＰｅｇ−Ｐａｍ−ｅプラスミド、および、ＲＤ１１４エンベロープを含有するＲＤＦプラスミド（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）を用いた２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生じさせた（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。レトロウイルスを含有する上清を４８時間〜７２時間の後で集めた。レトロウイルス形質導入のために、組織培養非処理の２４ウエルプレートをＯＫＴ３抗体（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）およびＣＤ２８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により一晩処理した。翌日、０．５×１０６個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をそれぞれのウエルに加え、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１％のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０完全培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で培養した。組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；２００Ｕ／ｍＬ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を３日目に培養物に加えた。ウイルス上清を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（宝酒造、大津、日本）により前処理された２４ウエルプレートに加え、培養されたＯＫＴ３／ＣＤ２８刺激の細胞をそれぞれのウエルに加えた（５×１０５細胞／ウエル）。細胞を遠心分離し、５％ＣＯ２において３７℃でインキュベーションした。Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を７２時間後に測定し、細胞を、ｒｈＩＬ−２（５０〜１００Ｕ／ｍＬ）が３日毎に加えられる完全培地における培養で維持した。非形質導入のＴ細胞（これはコントロールとして使用された）をＯＫＴ３／ＣＤ２８により活性化し、使用前の１０日間〜１５日間、５０ユニット／ｍＬ〜１００ユニット／ｍＬのＩＬ−２の存在下で拡大培養した。
【００５８】
フローサイトメトリー
【００５９】
ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、免疫蛍光データを取得し、免疫蛍光データをＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（バージョン３）（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）により分析した。表面染色のためのすべての抗体をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。イソ型コントロールが、免疫グロブリンＧ１−フルオレセインイソチオシアナート（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ）、ＩｇＧ１−フィコエリトリン（ＩｇＧ１−ＰＥ）、ＩｇＧ１−ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＩｇＧ１−ＰｅｒＣＰ）およびＩｇＧ１−アロフィコシアニン（ＩｇＧ１−ＡＰＣ）であった。前方散乱ゲーティングおよび側方散乱ゲーティングを使用して、生細胞を死細胞から識別した。ＣＤ７０−ＣＡＲの発現を、ＣＤ２７−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥを使用して２９３Ｔ細胞に対して、また、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ８−ＡＰＣを使用してヒトＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞に対して分析した。腫瘍細胞におけるＣＤ７０の発現を、ＣＤ７０−ＰＥを使用して求めた。細胞内染色のために、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＢＤ）により固定処理し、１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）により透過処理した。Ｂｃｌ−ｘｌに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を一次染色のために使用し、ヤギ抗マウスＡＰＣ（ＧＡＭ−ＡＰＣ；ＢＤ）を二次染色のために使用した。イソ型コントロールは、ＧＡＭＡＰＣ単独とインキュベーションされた細胞であった。
【００６０】
サイトカイン産生の分析
【００６１】
健康なドナーに由来するＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、ＣＤ７０陽性細胞株または原発性ＣＤ７０陽性リンパ腫と、２：１のエフェクター対標的の比率で４８ウエルプレートにおいて共培養した。２４時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、本発明者らはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を製造者の説明書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に従ってＥＬＩＳＡによって測定した。
【００６２】
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
【００６３】
本発明者らは以前の記載（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）のようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の頻度を求めた。ＣＤ７０−ＣＡＲまたは非形質導入のＴ細胞を１×１０５個で播種し、適切な刺激とともに１８時間インキュベーションした。その後、プレートを発色させ、一晩乾燥し、定量化のためにＺｅｌｌＮｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）に送付した。
【００６４】
共免疫沈殿
【００６５】
ＣＤ７０−ＣＡＲまたはΔＣＤ７０−ＣＡＲを安定的に発現する２９３Ｔ細胞をレトロウイルス形質導入によって作製した。ＣＡＲを発現する細胞を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して２μｇのＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２（これはＪｉｎｈｕａ  Ｙａｎｇ博士（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって譲渡された）によりトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を１：１の比率でＫ５６２．７０細胞と共培養して、受容体を架橋した。１２時間後、細胞を氷冷ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により洗浄し、非接着性のＫ５６２．７０細胞を培養物から吸引した。残留する２９３Ｔ細胞を溶解し、タンパク質を、μＭＡＣＳ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびμＣｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）により沈殿させた。免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＣＤ３−ζ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるブロッティングに供した。
【００６６】
クロム放出アッセイ
【００６７】
標準的なクロム放出アッセイを以前の記載（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）のように三連で行った。簡単に記載すると、１×１０６個の標的細胞を０．１ｍＣｉ（３．７ＭＢｑ）の５１Ｃｒにより標識し、減少する数のエフェクター細胞と混合して、４０：１、２０：１、１０：１および５：１のエフェクター対標的の比率を得た。完全培地単独、または、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００においてインキュベーションされた標的細胞を、自発的５１Ｃｒ放出および最大５１Ｃｒ放出を求めるためにそれぞれ使用した。４時間後、上清を集め、放射能をガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  Ｑｕａｎｔｕｍ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ；ＭＡ）で測定した。三連ウエルの特異的溶解の平均百分率を下記の式に従って計算した：［試験放出−自発的放出］／［最大放出−自発的放出］×１００。
【００６８】
ＣＦＳＥ増殖アッセイおよび長期殺傷アッセイ
【００６９】
Ｔ細胞の増殖および長期殺傷を測定するために、本発明者らは１×１０７個のＴ細胞を１．５μＭのカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と室温で１０分間インキュベーションした。本発明者らは、ＣＦＳＥ標識されたＴ細胞を、外因性ＩＬ−２の非存在下、適切なＣＤ７０陽性腫瘍細胞またはＣＤ７０陰性腫瘍細胞と２：１のエフェクター：標的の比率で培養した。５日〜７日の共培養の後、細胞を集め、ＣＤ３に関して染色し、ＦＡＣＳ分析によってＣＦＳＥ希釈について分析した。増殖実験のための陽性コントロールおよび陰性コントロールがそれぞれ、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の存在下で培養されたＴ細胞、および、サイトカインを全く伴わないＴ細胞単独であった。長期殺傷実験のために、ＦＡＣＳ分析を、生細胞を求めるために前方散乱ゲーティングおよび側方散乱ゲーティングを使用して行い、一方で、ＣＦＳＥ染色およびＣＤ３陽性を、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＣＤ３陰性の非標識腫瘍細胞から区別するために使用した。
【００７０】
異種移植片モデルおよび生物発光画像化
【００７１】
すべての動物実験が、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルのもとで行われた。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞の抗腫瘍効果をインビボで評価するために、本発明者らは２つのＳＣＩＤマウスモデルおよびＩＶＩＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）インビボ画像化システムを使用した（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。８週齢〜１０週齢のＳＣＩＤマウス（ＩｃｒＴａｃ：ＩＣＲ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ；Ｔａｃｏｎｉｃ）を亜致死的放射線照射（２．５Ｇｙ）に供し、２日後、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）−ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）融合遺伝子を発現する５×１０５個のＤａｕｄｉ細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に懸濁させてＩＰ注入した。腫瘍の成長をモニターするために、イソフルラン麻酔のマウスにＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射し、生物発光画像を１０分後に得て、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（バージョン４．０）（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。目的とする一定領域を腫瘍領域の上に描き、総光子数／秒／平方センチメートル／ステラジアン（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として測定されるシグナルの強度を得た。１０日後、腫瘍のシグナルが一貫して増大し続けているときであるが、マウスをＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞により処置した。１×１０７個のＴ細胞の３回のＩＰ注入を、１０日目、１１日目および１７日目に与え、その後、１５００ＵのｒｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）もまたＩＰ注射により与えた。マウスをそれぞれのＴ細胞注入の前に画像化し、その後は週に３回、画像化した。本発明者らは、Ｒａｊｉ  ＳＣＩＤ異種移植片を使用して、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞の抗腫瘍活性を全身的非ホジキンリンパ腫モデルにおいて評価した（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｔａｍｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。簡単に記載すると、２×１０５個のＲａｊｉ．ＦＦｌｕｃ細胞を亜致死的放射線照射（２．５Ｇｙ）のＳＣＩＤマウスにＩＶ注入し、４日後、マウスを１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞のＩＶ投与によって処置した。本発明者らは３回のＴ細胞（４日目、５日目および１１日目）を１５００ＵのｒｈＩＬ−２とともに与えた。本発明者らは、生物発光画像化を使用して転移腫瘍を定量化した。生存分析のために、マウスを、歩行時の片足または両足の引きずりとして特定される後肢麻痺の最初の徴候のときに安楽死させた。
【００７２】
統計学的分析
【００７３】
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞と、非形質導入Ｔ細胞との間におけるＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌の比較を、ウィルコクスン符号付順位検定を使用して行った。腫瘍体積データをｌｏｇ変換し、最初のＴ細胞注入から処置後の測定までの変化を計算した。ペア毎の比較を、２つのＴ細胞群の間での光強度における何らかの統計学的有意差を特定するために用いた。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると見なした。生存曲線を、カプラン・マイヤー法を使用して作製し、重みつきロングレンジ検定を使用して比較した。
【００７４】
実施例２
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞の作製
本発明者らは、Ｔ細胞受容体のζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合されるＣＤ７０受容体（ＣＤ２７）（ＣＤ７０−ＣＡＲ）をコードするＳＦＧレトロウイルスベクターを構築した。ほとんどのナイーブなメモリーＴ細胞は低レベルのＣＤ２７を内因的に発現するので、ＩＲＥＳ−ｔＣＤ１９発現カセットもまた、形質導入された細胞の明確な検出について可能にするためにレトロウイルスベクターに含まれた（図１Ａ）。ＣＤ２７およびｔＣＤ１９は直線的な共発現パターンを示した。このことは、ｔＣＤ１９がＣＤ７０−ＣＡＲ発現のための好適なマーカーであることを示している（図１Ｂ）。ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞を、ＣＤ７０−ＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ｔＣＤ１９をコードするＲＤ１１４偽型レトロウイルス粒子により形質導入し、形質導入後１０日〜１４日で、ｔＣＤ１９の発現をＦＡＣＳ分析によって求めた。平均して４５％（＋／−６；ｎ＝５）のＴ細胞がｔＣＤ１９を発現し、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞の両方を形質導入した（図１Ｃ〜図１Ｄ）。
【００７５】
実施例３
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性腫瘍細胞への暴露の後で免疫刺激サイトカインを分泌し、増殖する
遺伝子組換えＴ細胞によるＣＤ７０の認識を検出するために、本発明者らは最初、ＣＤ７０陰性Ｋ５６２細胞およびＣＤ７０遺伝子組換えＫ５６２細胞を使用した（図２）。３名のドナーのＣＤ７０特異的Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞をＫ５６２またはＫ５６２．ＣＤ７０により刺激し、４８時間後、本発明者らはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の放出を測定した（図３Ａ、図３Ｂ）。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較した場合、Ｋ５６２．ＣＤ７０にさらされた後、著量のＩＦＮ−γ（ｐ＝０．０３）およびＩＬ−２（ｐ＝０．０２）を産生した。加えて、ＣＤ７０陰性Ｋ５６２細胞はＣＤ７０特異的Ｔ細胞を活性化しなかった。このことは、サイトカインの産生には、標的細胞表面におけるＣＤ７０の発現と、Ｔ細胞表面におけるＣＤ７０−ＣＡＲの存在との両方が要求されることを示している。本発明者らがこれらの培養組合せのそれぞれにおけるＴ細胞の増殖を比較したとき、類似した結果が認められた（図３Ｃ）。
【００７６】
本発明者らは、上記の知見を、ＣＤ７０の発現が様々なレベルではあるが、生来的に存在する腫瘍細胞を使用することによって確認した。本発明者らは、非ホジキンリンパ腫を表すＣＤ７０陽性腫瘍細胞株（Ｄａｕｄｉ、ＳＮＫ６、ＳＮＴ１６）、ホジキンリンパ腫を表すＣＤ７０陽性腫瘍細胞株（Ｌ１２３６）、白血病を表すＣＤ７０陽性腫瘍細胞株（ＣＣＬ−１２０）、および、多発性骨髄腫を表すＣＤ７０陽性腫瘍細胞株（Ｕ２６６）のパネルを使用した（図２）。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は非形質導入Ｔ細胞よりも有意に多いＩＦＮ−γ（ｐ＜０．０００１）およびＩＬ−２（ｐ＜０．０００１）を分泌した（図３Ａ、図３Ｂ）。Ｔ細胞の増殖は標的細胞におけるＣＤ７０の発現に依存し、ＣＤ７０微弱の腫瘍細胞（Ｄａｕｄｉ）はＣＤ７０明瞭の腫瘍細胞よりも少ないＴ細胞増殖を誘導した。加えて、本発明者らは、非形質導入Ｔ細胞の増殖をＳＮＴ１６細胞による刺激の後で認めた。本発明者らは、それらはＣＤ７０特異的Ｔ細胞のＩＬ−２産生を誘導することができることによって判断されるように（図１Ｂ）、このことが、ＳＮＴ１６細胞による低レベルのＩＬ−２分泌（１０〜５０ｐｇ／ｍＬ）、および、それらの共刺激能が堅固であることに起因すると考えた。ＣＤ７０の発現が、健康なドナーに由来する末梢血のＢ細胞およびＴ細胞では低かったか、存在しなかった（図２）。したがって、本発明者らはＣＤ７０特異的Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生またはＩＬ−２産生を初代Ｂ細胞または初代Ｔ細胞との共培養の後で検出することができなかった。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞がＢ細胞またはＴ細胞によって刺激されないことを確認するために、本発明者らはＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、初代Ｂ細胞または初代Ｔ細胞との共培養の後におけるＣＤ７０特異的Ｔ細胞の活性化が全く示されなかった（図８Ａ）。
【００７７】
実施例４
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性腫瘍細胞を殺すが、ＣＤ７０陰性細胞を殺さない
本発明者らは次に、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイと、５日〜７日の共培養アッセイとの両方で、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞によるＣＤ７０陽性標的の殺傷を測定した。４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の標的細胞（Ｋ５６２．７０、Ｄａｕｄｉ、Ｕ２６６、ＳＮＫ６、ＳＮＫ１６）を殺したが、ＣＤ７０陰性の細胞（Ｋ５６２）を殺さなかった。非形質導入Ｔ細胞は殺傷を全く示さず、このことから、ＣＤ７０特異性が確認された（図４Ａ、図４Ｂ）。共培養アッセイのために、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＣＦＳＥにより標識し、非標識の腫瘍細胞に２：１の比率で加えた。５日〜７日の後、腫瘍細胞の数をＣＤ３陰性／ＣＦＳＥ陰性画分のＦＡＣＳ分析によって求めた（図４Ｃ）。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、試験された４つすべてのＣＤ７０陽性株（Ｄａｕｄｉ、Ｕ２６６、ＳＮＫ６、ＳＮＫ１６）を排除し、一方で、コントロールＴ細胞はこれらを排除することができなかった（図４Ｄ）。ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激されたＴ細胞はＣＤ７０特異的Ｔ細胞によって殺されなかったが、ＭＲＣ５細胞上のＣＤ４０リガンドにより「超生理学的に」活性化されたＢ細胞芽細胞はＣＤ７０特異的Ｔ細胞による殺傷に対して感受性であった（図８Ｂ）。
【００７８】
実施例５
ＣＤ２７共刺激はＣＤ７０特異的刺激の後におけるＴ細胞の生存のために重要である
ＣＤ７０−ＣＡＲ（図１Ａ）の内部ドメイン内に位置するＣＤ２７の２３アミノ酸の共刺激ドメインの役割を求めるために、本発明者らは、ＣＤ２７の共刺激ドメインが欠失されたＣＤ７０−ＣＡＲ（ΔＣＤ７０−ＣＡＲ）を作製した。共刺激ドメインの機能的非存在を、ΔＣＤ７０−ＣＡＲがＴＲＡＦ２（ＣＤ２７のシグナル伝達を媒介する重要なアダプタータンパク質）に結合することができないことによって確認した（図５Ａ）。Ｔ細胞を、ＣＤ７０−ＣＡＲ−Ｉ−ｄｓＲｅｄまたはΔＣＤ７０−ＣＡＲ−Ｉ−ｄｓＲｅｄ（図９Ａ）をコードするレトロウイルスベクターにより形質導入した。両方の構築物の形質導入効率は、ｄｓＲｅｄ発現によって判断されるように類似しており（６５％〜９０％；図９Ｂ）、細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ７０−ＣＡＲ発現Ｔ細胞およびΔＣＤ７０−ＣＡＲ発現Ｔ細胞はＣＤ７０陽性の標的を同じ効率により殺した（図５Ｂ）。Ｔ細胞の活性化に対するＣＤ２７共刺激の寄与を評価するために、本発明者らは、共刺激分子を欠いているが、ＣＤ７０を発現させるために遺伝子改変された自己由来の線維芽細胞（Ｆｉｂ．ＣＤ７０）を利用した。Ｆｉｂ．ＣＤ７０によるＴ細胞刺激の３日後から始まったが、活性化されたＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞の有意により大きい「凝集塊」が、ΔＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞との比較において認められた（図５Ｃ）。Ｔ細胞の増殖における差（図５Ｄ）およびＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の産生における差が何ら認められなかったが、ΔＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存性が、ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞との比較において有意に低下した（図５Ｄ；Ｐ＜０．０５）。他の研究者によって報告されるように、Ｂｃｌ−ｘｌ（重要な抗アポトーシスタンパク質）がＣＤ２７のシグナル伝達によって誘導される（ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。この知見と一致して、ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ΔＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞との比較においてより高レベルのＢｃｌ−ｘｌを一貫して発現した（図５Ｅ）。これらの結果は、ＣＤ７０−ＣＡＲ内に位置するＣＤ２７の共刺激ドメインが共刺激シグナルを提供し、高まったＴ細胞生存をもたらすことを示している。したがって、すべてのその後の実験のために、本発明者らはＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ７０特異的Ｔ細胞）を使用した。
【００７９】
実施例６
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は原発性のＢ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の認識および殺傷を生じさせる
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞がＣＤ７０陽性のリンパ腫細胞株の認識および殺傷を生じさせることを示したので、本発明者らは次に、ＣＤ７０抗原を原発性のＢ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の表面における標的としての妥当性について検証した。本発明者らは、原発性のＣＤ７０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞（ＭＦ１７９２、ＭＦ１７３１、ＭＦ８８８）およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞（Ｔ００７）を、健康なドナーに由来するＣＤ７０特異的Ｔ細胞と２４時間にわたって共培養し、上清におけるＩＦＮ−γを測定した。コントロールのＴ細胞ではなく、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞が、ＣＤ７０＋の悪性腫瘍にさらされたとき、ＩＦＮ−γの分泌をもたらした（図６Ａ）。５日の共培養アッセイにおいて、コントロールのＴ細胞ではなく、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞により、原発性ＣＤ７０陽性細胞が排除された（図６Ｂ、図６Ｃ）、したがって、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は原発性ＣＤ７０陽性悪性腫瘍細胞のＣＤ７０特異的様式での認識および殺傷を生じさせる。
【００８０】
実施例７
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞を投与した後における定着リンパ腫のインビボ退行
本発明者らはＣＤ７０特異的Ｔ細胞の抗腫瘍活性を異種ＳＣＩＤマウスモデルにおいて測定した。本発明者らは、亜致死的放射線照射を受けたＳＣＩＤマウスに５×１０５個のＤａｕｄｉ．ＦＦｌｕｃ細胞をｉ．ｐ．注入し、腫瘍の成長をマウスの連続生物発光画像化によってモニターした。１０日後、マウスは、１日離して、その後は１週間離して３回（注入０日目、注入１日目および注入７日目に）与えられる１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞の３回の注入を受けた（ｎ＝１０）。腫瘍を有するマウスの第２の群には、非形質導入Ｔ細胞が注入された。非形質導入Ｔ細胞により処置されたマウスでは、腫瘍が、生物発光画像化によって判断されるように指数関数的に成長した（図７Ａ）。対照的に、腫瘍負荷量における有意差が、Ｔ細胞注入後７日目に、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞と、非形質導入Ｔ細胞との間で認められた（ｐ＝０．００２）（図７Ｂ）。成長する腫瘍を有する９匹のマウスのうちの８匹において、光子放射がＣＤ７０特異的Ｔ細胞の注入の後でベースラインに戻った。このことは、Ｔ細胞移入後の２週間超にわたって７匹のマウスにおいて持続した腫瘍退行を示している。
【００８１】
第２のインビボ研究において、本発明者らは、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、全身リンパ腫モデルを使用して測定した。本発明者らは、亜致死的放射線照射を受けたＳＣＩＤマウスに２×１０５個のＲａｊｉ．ＦＦｌｕｃ細胞をＩＶ注入した。４日後、本発明者らは、マウスに、前記段落に記載される同じ処置スキームを使用して、１×１０７個のＣＤ７０特異的Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞の３回のＩＶ注入を与えた。全身の腫瘍の数を、生物発光画像化を使用して求めた。腫瘍細胞注入後の第３週および第４週で、非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスにおいてＣＤ７０特異的Ｔ細胞の場合よりも有意に大きい腫瘍負荷量（それぞれ、Ｐ＝０．０１２およびＰ＝０．１０）が認められた（図７Ｃ）。このことは、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞により処置されたマウスでの全生存における有意な増大（Ｐ＜０．０５）につながった（図７Ｄ）。
【００８２】
実施例８
重症慢性活動性ＥＢＶ感染を伴う原発性ＣＤ７０陽性Ｔ細胞リンパ腫細胞がＣＤ７０特異的Ｔ細胞によって殺される
重症慢性活動性エプスタイン・バールウイルス感染（ＣＡＥＢＶ）は潜在性ＥＢＶ感染の希な合併症である。これは主として日本で発生するが、数例が西半球で報告されている（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ＣＡＥＢＶにおいて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、または、希にはＢ細胞が感染し、患者を、命を脅かす合併症（例えば、血球貪食症候群、および、ＮＫ細胞またはＴ細胞のリンパ球増殖性疾患（ＬＰＤ）など）に罹りやすくしている（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，．  ２００１；  Ｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＣＡＥＢＶ関連ＬＰＤのための唯一の治癒選択肢が現在、幹細胞移植である。本実施例において、本発明者らは、攻撃的Ｔ細胞リンパ腫をＣＡＥＢＶの状況で発症した患者を報告する。
【００８３】
本発明者らは今回、ＣＤ７０が原発性ＣＡＥＢＶ関連Ｔ細胞リンパ腫細胞において発現されること、および、これらの細胞がＣＤ７０特異的Ｔ細胞による殺傷に対して感受性であることを明らかにし、これにより、ＣＤ７０をＣＡＥＢＶ関連Ｔ細胞リンパ腫のための可能性のある免疫療法標的として特定する。
【００８４】
実施例９
本発明のある種の実施形態の重要性
本発明者らは、ＣＤ７０がいくつかの血液学的悪性腫瘍およびガン腫において異常に発現されるので、ＣＤ７０が、ＣＤ２７をＣＡＲの一部として発現するように操作されたＴ細胞によって標的化され得ることを示す。ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞はＣＤ７０陽性腫瘍細胞株および原発性腫瘍サンプルのインビトロでの認識および殺傷を生じさせ、また、ヒトＣＤ７０腫瘍をマウス異種移植において排除した。
【００８５】
多くの白血病およびリンパ腫の表面に存在するが、ＣＤ７０は系譜特異的なマーカーではなく、生理学的には、ＣＤ７０は、非常に活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞のサブセットにおいて一時的に発現されるだけである。ＣＤ７０プロモーターは、ＡＰ−１、ＡＰ−２、Ｓｐ１およびＮＦ−κＢについての転写因子結合部位を含有し、メチル化に対して感受である；しかしながら、ＣＤ７０の発現を調節する正確なシグナル伝達経路は十分には理解されていない（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ＣＤ７０が、構成的なＮＦ−κＢ活性化（ＣＤ７０の発現を調節することに寄与しているかもしれない経路）に伴っているかもしれないが、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型関連悪性腫瘍およびＥＢＶ関連悪性腫瘍ならびにホジキンリンパ腫においてアップレギュレーションされる（Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｊｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。悪性腫瘍細胞での異常なＣＤ７０発現の役割はその生理学的寄与ほどには十分に理解されておらず、しかし、非ホジキンリンパ腫による免疫回避には寄与しているかもしれない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。他の研究者は、ＣＤ７０／ＣＤ２７の共刺激経路が、白血病特異的なＴ細胞応答を誘導するために非常に重要であることを示している（Ｇｌｏｕｃｈｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【００８６】
ほとんどのＣＡＲの細胞外ドメインが、腫瘍細胞のＭＨＣ非拘束様式での認識および殺傷を生じさせる抗原特異的なＴ細胞を調製するために使用することができる改変されたモノクローナル抗体結合部位からなる。これらのモノクローナル抗体フラグメントはヒト化されない限り、ヒト抗マウス抗体、および／または、注入細胞のエフェクター機能を省略する内因性のＴ細胞応答を誘導するかもしれない（Ｍｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｋａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。したがって、生理学的に存在する受容体−リガンド相互作用（Ｋａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）を利用することにより、この障害が回避され、したがって、ヒト対象におけるインビボでのエフェクター機能が、導入遺伝子に対する望まれない免疫応答によって中断されないことが保証されるにちがいない。したがって、本発明者らは、ＣＤ３−ζ鎖を天然に存在するＣＤ７０受容体（ＣＤ２７）に融合することによってＣＤ７０特異的ＣＡＲを構築した。
【００８７】
ＣＤ７０特異的Ｔ細胞をＣＤ７０陽性腫瘍細胞により刺激することにより、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の両方の分泌がもたらされた。ζ−シグナル伝達ドメインのみを含有するＣＡＲを誘発することにより、ＩＦＮ−γの産生がもたらされるが、ＩＬ−２は一般に、抗原依存的様式で分泌されるだけである（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。ＣＤ７０特異的Ｔ細胞のＣＤ７０陽性腫瘍細胞との共培養は、他のＣＡＲ発現Ｔ細胞について報告される範囲に含まれる、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞による４０００ｐｇ／ｍＬ〜１４０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γの産生をもたらした（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、標的細胞上の抗原密度（Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、同様にまた、共刺激分子の存在（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に依存するので、ＩＦＮ−γの産生が個々のＣＤ７０陽性腫瘍細胞株の間で変化したことは驚くべきことではない。Ｄａｕｄｉ細胞は、最も低いレベルのＩＦＮ−γ分泌を誘導した一方で、ＦＡＣＳ分析によって判断されるように、ＣＤ７０の最も低い発現を有した。ＩＦＮ−γの産生に加えて、本発明者らは、腫瘍細胞にさらされた後で、一定しないが、ＩＬ−２の有意な分泌を認めた。これらの違いは、腫瘍のＣＤ７０発現レベルとは無関係であったが、従来の共刺激分子の発現に依存しているようではなかった。これは、本発明者らが、古典的な共刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６など）を発現しないＫ５６２．７０細胞によるＴ細胞刺激の後でＩＬ−２の分泌を認めたからである。しかしながら、これらの細胞は、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞の表面に発現されるＮＫＧ２Ｄと相互作用することによって共刺激シグナルをもたらすことができるＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する（Ｍａａｓｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。そのうえ、ＳＮＴ１６およびＳＮＫ６の非ホジキンリンパ腫細胞はＣＤ７０特異的Ｔ細胞から高レベルのＩＬ−２産生を誘導し、これは、ＥＢＶ陽性のＮＫ／Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫細胞における接着分子の知られている高い発現と一致する影響であった（Ｋａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【００８８】
ＣＤ２７共刺激により、Ｔ細胞における活性化誘導された細胞死が、部分的にはＢｃｌ−ｘｌ（抗アポトーシスタンパク質）のアップレギュレーションによって妨げられる（ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。この知見と一致して、本発明者らは、ＣＤ２７の共刺激ドメインが欠失されたΔＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞が、低下した生存性、および、全長ＣＤ２７を有するＣＤ７０−ＣＡＲを発現するＴ細胞よりも低いレベルのＢｃｌ−ｘｌ発現を有したことを認めた。これらのデータは、ＣＤ７０−ＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、長期間に及ぶ永続性をインビボで示すかもしれないことを示している。興味深いことに、エクスビボ拡大された腫瘍浸潤リンパ球のインビボ効力データは、ＣＤ２７の発現が抗腫瘍活性と相関することを示唆する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＣＤ２７共刺激がＣＡＲ発現Ｔ細胞の永続性を高めるかどうかを明らかにすることができる。
【００８９】
本発明者らは、ＣＤ７０陽性腫瘍細胞の完全な殺傷を５日〜７日の共培養アッセイにおいて認めた（図４Ｃ〜図４Ｄ）一方で、より様々なレベルの腫瘍細胞殺傷を標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて認めた（図４Ｂ）。これらの違いは、Ｔ細胞に依存していない可能性が最も高かった。これは、腫瘍細胞崩壊（クロム放出）の速度論は、Ｔ細胞自体のエフェクター機能における差ではなく、むしろ、Ｔ細胞由来の細胞毒性分子（例えば、パーフォリンまたはグランザイムＢなど）に対するそれらの固有的な感受性に依存するからである（Ｐｅｒｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４）。
【００９０】
本発明の実施形態において、ＣＤ２７−ζ  ＣＡＲを発現するＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、有意なインビボ抗腫瘍活性をリンパ腫のＩＰ  ＤａｕｄｉモデルおよびＩＶ  Ｒａｊｉモデルの両方において示した。ＩＰ  ＤａｕｄｉモデルにおけるＣＤ７０特異的Ｔ細胞の認められた抗腫瘍活性は、以前の報告（Ｔａｍｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｋｏｗｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｏｙｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）において示されるように、ＣＤ１９−ＣＡＲを発現するＴ細胞と類似していた。興味深いことに、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞に関して認められるような持続した抗腫瘍応答が、共刺激ドメインを含有するＣＡＲを発現するＣＤ１９特異的Ｔ細胞に関して認められただけであった。このことは、本発明者らがそのインビトロ実験で示しているように（図５）、ＣＤ２７−ζ  ＣＡＲが具体的な実施形態では、共刺激シグナルをインビボでもたらすことを示している。ＣＤ１９−ＣＡＲがＩＶ  Ｒａｊｉモデルにおいて腫瘍細胞を殺すために共刺激ドメインを必要とすることは、議論の余地があり、また、矛盾している（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｔａｍｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。これらの相反する結果は、ある種の局面では、遺伝子改変されたＴ細胞のエクスビボ調製、免疫不全マウスの系統、および／または、インビボ実験のために使用される特定のＲａｊｉ細胞株誘導体における違いによって説明されるかもしれない。
【００９１】
ＣＤ７０が生理学的には免疫細胞のあるサブセットによって活性化期間中に発現されるので、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるこの受容体の標的化は潜在的には、細胞免疫応答を損なうかもしれない。しかしながら、ＣＤ７０は、活性化されたリンパ球および樹状細胞の小さい割合で一時的に発現されるだけであるので、本発明者らは、これは可能性がないと考えている。加えて、ＣＤ２７ノックアウトマウス（これはＣＤ２７／ＣＤ７０共刺激を全く欠いている）はその免疫系におけるほんのかすかな変化を有するだけであり、保護的な一次の抗原特異的Ｔ細胞応答を、病原体暴露後の正常なマウスと比較して、より小さいメモリーＴ細胞区画を除いて有する（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。これらのかすかな変化は、前から存在するメモリー集団の再活性化が感染に対する優勢な応答である成人対象では大きな関連がない可能性がある。本研究において、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は末梢血のＢ細胞およびＴ細胞に対する反応性を全く示さなかった。本発明者らはまた、活性化されたＴ細胞が細胞毒性アッセイにおいてＣＤ７０特異的Ｔ細胞によって殺されないことを示した（図８Ｂ）。対照的に、Ｂ細胞芽細胞がＣＤ７０特異的Ｔ細胞による殺傷に対して感受性であった。しかし、これは、ＣＤ４０リガンドによる活性化の後、および、同種フィーダー細胞がＣＤ７０の発現を誘導した後においてのみであった（図８Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞が、活性化されたＢ細胞を殺す潜在的能力を有することを示している一方で、この知見の生理学的関連性は依然として不明のままである。これは、長期に及ぶＣＤ７０発現をもたらすこのタイプの「超生理学的な」Ｂ細胞活性化がインビボでは生じていないからである。実際、ＣＤ７０が、ＣＤ４０モノクローナル抗体およびリポ多糖によりインビトロで刺激されたマウスＢ細胞の表面に容易に発現されることが明らかにされている；しかしながら、インフルエンザウイルスによる攻撃を受けたマウスは、肺および流入領域リンパ節に浸潤するＢ細胞におけるＣＤ７０の表面発現を事実上示さない（Ｔｅｓｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。同様に、ＣＤ７０発現Ｂ細胞はヒトでは希にしか認められず、試験された扁桃の１０％未満における限られた数の胚中心Ｂ細胞において、また、二次的リンパ系器官および末梢血における散在したリンパ球において見出される（Ｈｉｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。副作用が、ＣＤ７０モノクローナル抗体の安全性および耐容性を評価する２件の第１相臨床研究（ＭＤＸ−１２０３、ＮＣＴ００９４４９０５；ＳＧＮ−７５、ＮＣＴ０１０１５９１１）において今までのところ何ら報告されていない。
【００９２】
まとめると、ＣＤ７０特異的Ｔ細胞は、ＣＤ２７−ζをコードするＣＡＲによる遺伝子移入によって容易に作製することができ、これらの細胞はヒト腫瘍をインビトロおよびインビボで殺すことができる。ＣＤ７０に仕向けられたＴ細胞の養子移入は、Ｂ細胞またはＴ細胞に由来する血液学的悪性腫瘍および他のＣＤ７０陽性の固形腫瘍のための魅力的な免疫療法取り組みであるかもしれない。
【００９３】
参考文献
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が関連する技術分野における当業者のレベルを示すものである。すべての特許および刊行物が、それぞれの個々の刊行物が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのように同じ程度に参照によって本明細書中に組み込まれる。
特許文献
【００９４】
Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，６９０，９１５
【００９５】
Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，４１０，３１９  
刊行物
【００９６】
Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ  Ａ，  Ｎｉｅｄｏｂｉｔｅｋ  Ｇ，  Ｃｈｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｔｒｏｍａ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １９９５；１４７：  １１５２−１１６０．
【００９７】
Ａｈｍｅｄ  Ｎ，  Ｒａｔｎａｙａｋｅ  Ｍ，  Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＨＥＲ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：５９５７−５９６４．
【００９８】
Ｂａｂａ  Ｍ，  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈａｍａｓａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ７０  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  −ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００８；８２：３８４３−３８５２．
【００９９】
Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭ，  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｓ，  Ｌｅｅｎ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１１０：２８３８−２８４５．
【０１００】
Ｂｏｗｍａｎ  ＭＲ，  Ｃｒｉｍｍｉｎｓ  ＭＡ，  Ｙｅｔｚ−Ａｌｄａｐｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ７０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＣＤ２７．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４；１５２：  １７５６−１７６１．
【０１０１】
Ｃｈａｈｌａｖｉ  Ａ，  Ｒａｙｍａｎ  Ｐ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ＣＤ７０．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：５４２８−５４３８．
【０１０２】
Ｃｏｈｅｎ  ＪＩ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｈｏｓｔｓ：  ａ  ｓｔａｔｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ，  ８−９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２０：  １４７２−１４８２．
【０１０３】
Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ，  Ａｌ  Ｋａｄｈｉｍｉ  Ｚ，  Ｓｅｒｒａｎｏ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｌｙｍｐｈｏｍａ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＣＤ１９−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＭＰ  １−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＴＬｓ  ｂｙ  ｃｏｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＭＰ  １．  Ｂｌｏｏｄ  ２００５  ；  １０５  ：  １６２２−  １６３１．
【０１０４】
Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａ，  Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓ  Ｂ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＣＲ４  ａｎｄ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＤ３０  ｈａｖｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｏｍｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；  １１３：６３９２−６４０２．  
【０１０５】
Ｇｌｏｕｃｈｋｏｖａ  Ｌ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｂ，  Ｚｉｂｅｒｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＣＤ７０／ＣＤ２７  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９；１８２：７１８−７２５．
【０１０６】
Ｇｏｔｏｈ  Ｋ，  Ｉｔｏ  Ｙ，  Ｓｈｉｂａｔａ−Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  １５  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００８；４６：  １５２５−１５３４．
【０１０７】
Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｓ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  ＯＬ，  Ｓｉｌｉ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ＣＴＬ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ＬＭＰ１  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ２９  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＥＢＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０１：  １９０５−１９１２．
【０１０８】
Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  Ｊ，  Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎ  ＬＡ，  Ｔｅｓｓｅｌａａｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  ＣＤ２７  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；１：４３３−４４０．
【０１０９】
Ｈｉｎｔｚｅｎ  ＲＱ，  Ｌｅｎｓ  ＳＭ，  Ｂｅｃｋｍａｎｎ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ２７  ｌｉｇａｎｄ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４；１５２：  １７６２−１７７３．
【０１１０】
Ｈｕｎｔｅｒ  ＺＲ，  Ｂｒａｎａｇａｎ  ＡＲ，  Ｓａｎｔｏｓ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；  １０４：４８８１．  ２６
【０１１１】
Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｓ，  Ｏｋａｄａ  Ｓ，  Ｗａｋｉｇｕｃｈｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｏｎａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｂｉｔｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７；５４：２７６−２８１．
【０１１２】
Ｉｓｒａｅｌ  ＢＦ，  Ｇｕｌｌｅｙ  Ｍ，  Ｅｌｍｏｒｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−ＣＤ７０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＥＢＶ＋  ＣＤ７０−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００５；４：２０３７−２０４４．
【０１１３】
Ｊｅｎｓｅｎ  ＭＣ，  Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  Ｌ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ＣＤ２０／ＣＤ１９−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ．  Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１０  ３０
【０１１４】
Ｊｏｓｔ  ＰＪ，  Ｒｕｌａｎｄ  Ｊ．  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：２７００−２７０７．  
【０１１５】
Ｊｕｎｅ  ＣＨ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７；１１７：  １４６６−１４７６．
【０１１６】
Ｊｕｎｋｅｒ  Ｋ，  Ｈｉｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｗ，  ｖｏｎ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  ＣＤ７０：  ａ  ｎｅｗ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊ  Ｕｒｏｌ．  ２００５；１７３：２１５０−２１５３．
【０１１７】
Ｋａｈｌｏｎ  ＫＳ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｃ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １３−ｚｅｔａｋｉｎｅ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：９１６０−９１６６．
【０１１８】
Ｋａｗａ  Ｋ，  Ｓａｗａｄａ  Ａ，  Ｓａｔｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ＳＣＴ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ＥＢＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１１；４６：７７−７８３．
【０１１９】
Ｋｅｌｌｙ  ＰＦ，  Ｖａｎｄｅｒｇｒｉｆｆ  Ｊ，  Ｎａｔｈｗａｎｉ  Ａ，  Ｎｉｅｎｈｕｉｓ  ＡＷ，  Ｖａｎｉｎ  ＥＦ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｅｌｉｎｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  （ＲＤ１１４）  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：  １２０６−１２１４．
【０１２０】
Ｋｅｒｓｈａｗ  ＭＨ，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ＪＡ，  Ｐａｒｋｅｒ  ＬＬ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；１２：６１０６−６１１５．
【０１２１】
Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｋａｎｅｇａｎｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００３；１８７：５２７−５３３．
【０１２２】
Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｙ，  Ｋａｎｅｇａｎｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９８：２８０−２８６．
【０１２３】
Ｌｅｅｎ  ＡＭ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，  Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＥ．  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；２５：２４３−２６５．
【０１２４】
Ｌｅｎｓ  ＳＭ，  Ｄｒｉｌｌｅｎｂｕｒｇ  Ｐ，  ｄｅｎ  Ｄｒｉｊｖｅｒ  ＢＦ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ７０  ｏｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９９９；１０６：４９１−５０３．  
【０１２５】
Ｌｕ  Ｑ，  Ｗｕ  Ａ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＢＣ．  Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ＣＤ７０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｐｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｕｐｕｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５；１７４：６２１２−６２１９．
【０１２６】
Ｍａａｓｈｏ  Ｋ，  Ｏｐｏｋｕ−Ａｎａｎｅ  Ｊ，  Ｍａｒｕｓｉｎａ  ＡＩ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥ，  Ｂｏｒｒｅｇｏ  Ｆ．  ＮＫＧ２Ｄ  ｉｓ  ａ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５；１７４：４４８０−４４８４．
【０１２７】
ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ＪＡ，  Ｏｆｌａｚｏｇｌｕ  Ｅ，  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ７０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：  １１８５−１１９２．
【０１２８】
ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ＪＡ，  Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ，  ＭｃＤｏｎａｇｈ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＧＮ−７０，  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ７０．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００８；１４：７７６３−７７７２．
【０１２９】
Ｍｉｏｔｔｉ  Ｓ，  Ｎｅｇｒｉ  ＤＲ，  Ｖａｌｏｔａ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｉ−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＯＣ／ＴＲ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９；８４：６２−６８．
【０１３０】
Ｎａｇａｔａ  Ｈ，  Ｋｏｎｎｏ  Ａ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｇａｍｍａｄｅｌｔａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ２８  ｎａｓａｌ  Ｔ／ＮＫ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：７０８−７１３．
【０１３１】
Ｎｏｌｔｅ  ＭＡ，  ｖａｎ  Ｏｌｆｆｅｎ  ＲＷ，  ｖａｎ  Ｇｉｓｂｅｒｇｅｎ  ＫＰ，  ｖａｎ  Ｌｉｅｒ  ＲＡ．  Ｔｉｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ２７−ＣＤ７０  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ｓｅｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２００９；２２９：２１６−２３１．  ２７
【０１３２】
Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  ＥＢＶａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔ／ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  （ＬＰＤ）  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔｓ：  Ｏｖｅｒｌａｐ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ＥＢＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ＥＢＶ  Ｔ−ＬＰＤ．  Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ  ２００８；  ５８：２０９−２１７．
【０１３３】
Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｓｕｚｕｍｉｙａ  Ｊ，  Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎｄ／ｏｒ  ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ  １９９８；４８：９３４−９４３．  
【０１３４】
Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｌ，  Ｋｉｍｕｒａ  Ｈ，  Ｊａｆｆｅ  ＥＳ．  ＥＢＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．  Ｉｎ．  ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｌｙｏｎ：  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ；  ２００８；  ｐ  ２７８−２８０．
【０１３５】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｒｅｓｔｉｆｏ  ＮＰ，  Ｙａｎｇ  ＪＣ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，  Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；８：２９９−３０８．
【０１３６】
Ｒｏｓｓｉｇ  Ｃ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．  ２００４；１０：５−１８．  ２５
【０１３７】
Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ，  Ｒｉｖｉｅｒｅ  Ｉ，  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  Ｒ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００３；３：３５−４５．
【０１３８】
Ｓｈａｆｆｅｒ  ＤＲ，  Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，  Ｙｉ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ７０  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＣＤ７０−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１７：４３０４−４３１４．
【０１３９】
Ｔｅｙ  ＳＫ，  Ｄｏｔｔｉ  Ｇ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，  Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ．  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２００７；１３：９１３−９２４．
【０１４０】
Ｔｉｌｌ  ＢＧ，  Ｊｅｎｓｅｎ  ＭＣ，  Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｄｏｌｅｎｔ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ２０−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：２２６１−２２７１．
【０１４１】
ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ＭＦ，  Ｊｕｗａｎａ  Ｈ，  Ａｒｅｎｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＣＤ２７−ＣＤ７０  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｓｅ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ＩＬ−１２−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔｈｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；１９：７１３−７１８．
【０１４２】
Ｖｅｒａ  Ｊ，  Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，  Ｖｉｇｏｕｒｏｕｘ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｋｉｌｌ  ｍａｔｕｒｅ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：３８９０−３８９７．  
【０１４３】
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｍｉｎａｍｏｔｏ  Ｓ．  ＮＦ−｛  ｋａｐｐａ  ｝Ｂ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ２７  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＮＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｉｔｓ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２７．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８；１６１：４７５３−４７５９．
【０１４４】
Ｙａｎｇ  ＺＺ，  Ｎｏｖａｋ  ＡＪ，  Ｚｉｅｓｍｅｒ  ＳＣ，  Ｗｉｔｚｉｇ  ＴＥ，  Ａｎｓｅｌｌ  ＳＭ．  ＣＤ７０＋  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｆｏｘｐ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１１０：２５３７−２５４４．
【０１４５】
Ｚｈａｎｇ  Ｔ，  Ｂａｒｂｅｒ  Ａ，  Ｓｅｎｔｍａｎ  ＣＬ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＮＫＧ２Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６：５９２７−５９３３．
【０１４６】
本発明およびその利点が詳しく記載されているが、様々な変化、置換および変更が、添付された請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中で行われ得ることを理解しなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることが意図されない。当業者が本発明の開示から容易に理解するであろうように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、または、後に開発されることになる様々なプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程を本発明に従って利用することができる。したがって、添付された請求項は、それらの範囲内において、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程を包含することが意図される。
【図１ＡＢ】
2018121642.tif 000003
【図１Ｃ】
2018121642.tif 000004
【図１Ｄ】
2018121642.tif 000005
【図２】
2018121642.tif 000006
【図３Ａ】
2018121642.tif 000007
【図３Ｂ】
2018121642.tif 000008
【図３Ｃ】
2018121642.tif 000009
【図４Ａ】
2018121642.tif 000010
【図４Ｂ】
2018121642.tif 000011
【図４Ｃ】
2018121642.tif 000012
【図４Ｄ】
2018121642.tif 000013
【図５Ａ】
2018121642.tif 000014
【図５Ｂ】
2018121642.tif 000015
【図５Ｃ】
2018121642.tif 000016
【図５Ｄ】
2018121642.tif 000017
【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月23日(2018.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ７０抗原を認識し、且つ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラな抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、
該キメラな受容体をコードする構築物を調製するために組換えＤＮＡ技術を使用する工程、及び、
該キメラな受容体をベクターに導入する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、前記キメラな抗原受容体をコードする配列に機能的に連結されたプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが、構成的または誘導可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、細胞内で構成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項７に記載の方法。