(57)【要約】      （修正有）【課題】昆虫系統を凍結保存する技術を提供する。【解決手段】ショウジョウバエ又はミバエなどの昆虫の始原生殖細胞を流動パラフィン又はシリコンオイルの疎水性液体中で昆虫の胚からキャピラリーで始原生殖細胞を採取し、得られた始原生殖細胞をエチレングリコール及びスクロースを含有する氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程と、前記懸濁液を液体窒素を用いて−１００℃以下まで急速冷却する工程と、を備える、昆虫系統の凍結保存方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程と、
前記懸濁液を−１００℃以下まで急速冷却する工程と、
を備える、昆虫系統の凍結保存方法。
【請求項２】
前記懸濁液を得る工程の前に、疎水性液体中で昆虫の胚からキャピラリーで始原生殖細胞を採取する工程を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記懸濁液を得る工程が、採取した前記始原生殖細胞を前記キャピラリーから排出して前記胚の外面に付着させ、前記胚の外面において前記始原生殖細胞を前記氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記急速冷却する工程が、前記懸濁液を前記キャピラリーに収容して液体窒素で急速冷却する工程である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性液体が流動パラフィン又はシリコンオイルである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記昆虫が、ショウジョウバエ又はミバエである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記氷晶防止剤がエチレングリコールを含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記氷晶防止剤がスクロースを更に含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エチレングリコールの含有量が１０〜３０ｖ／ｖ％であり、前記スクロースの含有量が０．５〜２ｍｏｌ／Ｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１０〜３０ｖ／ｖ％のエチレングリコール及び０．５〜２ｍｏｌ／Ｌのスクロースを含有する、昆虫系統の凍結保存用氷晶防止剤。
【請求項１１】
エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞。
【請求項１２】
エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞を解凍し、昆虫の胚に移植する工程と、
前記胚を飼育して生殖系列キメラ個体を得る工程と、
前記生殖系列キメラ個体を交配させ、前記始原生殖細胞に由来する遺伝型を有する個体を得る工程と、
を備える、凍結保存した昆虫系統の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫系統の凍結保存方法に関する。より詳細には、昆虫系統の凍結保存方法、昆虫系統の凍結保存用氷晶防止剤、昆虫の始原生殖細胞、昆虫の始原生殖細胞からの昆虫系統の再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ショウジョウバエは、ライフサイエンス分野の研究で欠かすことのできないモデル生物であり、全世界のストックセンターや大学の研究室に約１０万系統が存在する。これらの系統は継代飼育により維持されている。
【０００３】
しかしながら、継代飼育による系統の維持は、継代中における突然変異の蓄積により遺伝的変化がおこる危険性がある。また、継代飼育に必要な労力や飼育施設・機材等のために莫大な経費を必要とする。
【０００４】
このため、ショウジョウバエを含む昆虫系統を凍結保存する技術の確立が試みられている。例えば、非特許文献１、２には、ショウジョウバエの凍結保存技術が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Steponkus P. L., et al., Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos., Nature, 345 (6271), 170-172, 1990.
【非特許文献２】Mazur P., et al., Cryobiological preservation of Drosophila embryos., Science, 258 (5090), 1932-1935, 1992.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１、２に記載された方法は、追試に成功したという報告例がなく、実用化されていない。そこで、本発明は、昆虫系統を凍結保存する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］昆虫の始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程と、前記懸濁液を−１００℃以下まで急速冷却する工程と、を備える、昆虫系統の凍結保存方法。
［２］前記懸濁液を得る工程の前に、疎水性液体中で昆虫の胚からキャピラリーで始原生殖細胞を採取する工程を更に備える、［１］に記載の方法。
［３］前記懸濁液を得る工程が、採取した前記始原生殖細胞を前記キャピラリーから排出して前記胚の外面に付着させ、前記胚の外面において前記始原生殖細胞を前記氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程である、［２］に記載の方法。
［４］前記急速冷却する工程が、前記懸濁液を前記キャピラリーに収容して液体窒素で急速冷却する工程である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］前記疎水性液体が流動パラフィン又はシリコンオイルである、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記昆虫が、ショウジョウバエ又はミバエである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記氷晶防止剤がエチレングリコールを含有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記氷晶防止剤がスクロースを更に含有する、［７］に記載の方法。
［９］前記エチレングリコールの含有量が１０〜３０ｖ／ｖ％であり、前記スクロースの含有量が０．５〜２ｍｏｌ／Ｌである、［８］に記載の方法。
［１０］１０〜３０ｖ／ｖ％のエチレングリコール及び０．５〜２ｍｏｌ／Ｌのスクロースを含有する、昆虫系統の凍結保存用氷晶防止剤。
［１１］エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞。
［１２］エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞を解凍し、昆虫の胚に移植する工程と、前記胚を飼育して生殖系列キメラ個体を得る工程と、前記生殖系列キメラ個体を交配させ、前記始原生殖細胞に由来する遺伝型を有する個体を得る工程と、を備える、凍結保存した昆虫系統の再生方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、昆虫系統を凍結保存する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例１において、始原生殖細胞（極細胞）を採取している状態を示す写真である。
【図２】実験例１において、始原生殖細胞（極細胞）を排出した状態を示す写真である。
【図３】実験例２において、ホストの胚にドナーの始原生殖細胞（極細胞）を移植している状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［昆虫系統の凍結保存方法］
１実施形態において、本発明は、昆虫の始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る工程と、前記懸濁液を−１００℃以下まで急速冷却する工程と、を備える、昆虫系統の凍結保存方法を提供する。
【００１１】
従来、例えばショウジョウバエ胚の凍結保存が試みられてきたが、内部氷晶形成を防止して適切に凍結保存することが困難であった。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、実用的な効率で昆虫系統を凍結保存することができる。本実施形態の方法は、昆虫の遺伝資源の凍結保存方法であるということもできる。本実施形態の方法により、現在継代飼育により系統維持されている昆虫系統を凍結保存することが可能となり、継代中の突然変異の蓄積による遺伝的変化を抑制することができる。また、継代飼育に必要な労力やコストを抑制することができる。
【００１２】
本実施形態の方法は、実施例において後述するように、上記の懸濁液を得る工程の前に、疎水性液体中で昆虫の胚からキャピラリーで始原生殖細胞を採取する工程を更に備えていてもよい。キャピラリーとしては、例えば内径１０〜１２μｍのガラスキャピラリーを好適に用いることができる。また、上記の疎水性液体としては、氷晶防止剤が溶解せず、始原生殖細胞に対して毒性を有しない液体であれば特に制限されず、例えば流動パラフィン、シリコンオイル等を好適に用いることができるがこれらに限定されない。
【００１３】
また、上記の懸濁液を得る工程は、採取した始原生殖細胞をキャピラリーから排出して胚の外面に付着させ、胚の外面において始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合し、始原生殖細胞の懸濁液を得る工程であってもよい。このような方法により、短時間に効率よく始原生殖細胞と氷晶防止剤を混合することができる。
【００１４】
また、本明細書において、急速冷却するとは、氷晶を形成させることなく室温（約２５℃）から−１００℃以下まで瞬時に冷却することを意味する。室温から−１００℃以下までの冷却に要する時間は、１０秒以内であることが好ましく、５秒以内であることがより好ましく、１秒以内であることが更に好ましい。急速冷却は、例えば、上記の懸濁液をキャピラリーに収容して、キャピラリーごと液体窒素で冷却することにより実施することができる。
【００１５】
本実施形態の方法において、昆虫としては特に制限されず、例えば、ショウジョウバエ、ミバエ等が挙げられる。
【００１６】
始原生殖細胞とは、発生の初期に出現し、将来、生殖細胞になる細胞のことである。例えばショウジョウバエの場合、卵の後端に極細胞質（生殖質）と呼ばれる特別な細胞質があり、この細胞質を取り込む極細胞（始原生殖細胞）が、生殖巣へと移動し、生殖細胞に分化することが知られている。したがって、ショウジョウバエの場合には、極細胞を氷晶防止剤と混合して急速冷却すればよい。ショウジョウバエ以外の昆虫の場合においても、始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合して急速冷却すればよい。
【００１７】
氷晶防止剤は、エチレングリコールを含有することが好ましい。実施例において後述するように、発明者らは、エチレングリコールを含有する氷晶防止剤を用いることにより、凍結保存した始原生殖細胞から昆虫系統の再生が可能となることを明らかにした。本明細書において、「再生」とは、凍結保存した始原生殖細胞に由来する遺伝情報を有する昆虫系統生体を得ることをいう。
【００１８】
氷晶防止剤はエチレングリコール及びスクロースを含有することが好ましい。氷晶防止剤は、エチレングリコールを１０〜３０ｖ／ｖ％、より好ましくは約２０ｖ／ｖ％含有する。また、氷晶防止剤は、スクロースを０．５〜２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約１．０ｍｏｌ／Ｌ含有する。氷晶防止剤の成分は、凍結保存する昆虫に応じて適宜調整することができる。
【００１９】
本実施形態の方法では、まず、昆虫の始原生殖細胞を氷晶防止剤と混合し、前記始原生殖細胞の懸濁液を得る。昆虫の始原生殖細胞は、昆虫の胚から摘出されていることが好ましい。始原生殖細胞の摘出は、マイクロマニュピレーター等を用いて行うことができる。始原生殖細胞と氷晶防止剤は等容量ずつ混合することが好ましい。
【００２０】
続いて、始原生殖細胞と氷晶防止剤とを混合して得られた懸濁液を−１００℃以下まで急速冷却する。急速冷却は、上記の懸濁液を、例えばガラスキャピラリー等に収容して、キャピラリーごと液体窒素に浸漬することにより実施することができる。急速冷却した始原生殖細胞は、液体窒素中で保存することが好ましい。液体窒素中で保存することにより、半永久的に始原生殖細胞を凍結保存することができる。
【００２１】
［昆虫系統の凍結保存用氷晶防止剤］
１実施形態において、本発明は、１０〜３０ｖ／ｖ％のエチレングリコール及び０．５〜２ｍｏｌ／Ｌのスクロースを含有する、昆虫系統の凍結保存用氷晶防止剤を提供する。
【００２２】
氷晶防止剤におけるエチレングリコールの含有量は、約２０ｖ／ｖ％であることがより好ましい。また、氷晶防止剤におけるスクロースの含有量は、約１．０ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００２３】
実施形態の氷晶防止剤は、特にショウジョウバエの凍結保存に適している。氷晶防止剤の成分は、凍結保存する昆虫に応じて適宜調整することができる。
【００２４】
［始原生殖細胞］
１実施形態において、本発明は、エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞を提供する。本実施形態の始原生殖細胞は、エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存状態にある始原生殖細胞であるといいかえることもできる。本実施形態の始原生殖細胞は、室温から−１００℃以下まで急速冷却されたものであることが好ましい。また、始原生殖細胞の形質をより安定に維持するためには、液体窒素中で保存されていることが好ましい。
【００２５】
本実施形態の始原生殖細胞を解凍して昆虫の胚に移植することにより、生殖系列キメラ個体を得ることができる。生殖系列キメラ個体を所望の遺伝型の昆虫と交配することにより、本実施形態の始原生殖細胞に由来する遺伝型を有する昆虫生体を得ることができる。
【００２６】
［昆虫系統の再生方法］
１実施形態において、本発明は、エチレングリコール及びスクロースの存在下で凍結保存された、昆虫の始原生殖細胞を解凍し、昆虫の胚に移植する工程と、前記胚を飼育して生殖系列キメラ個体を得る工程と、前記生殖系列キメラ個体を交配させ、前記始原生殖細胞に由来する遺伝型を有する個体を得る工程と、を備える、凍結保存した昆虫系統の再生方法を提供する。
【００２７】
上述したように、本明細書において、「再生」とは、凍結保存した始原生殖細胞に由来する遺伝情報を有する昆虫系統生体を得ることをいう。本実施形態の方法により、凍結保存した始原生殖細胞から昆虫生体を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２９】
［実験例１］
（ショウジョウバエの始原生殖細胞の凍結保存及び氷晶防止剤の検討）
赤眼であるｗ系統のショウジョウバエ（ドナー）の始原生殖細胞を凍結保存した。
【００３０】
まず、産卵後２５±２５分の胚を定法により採卵した。続いて、２５℃で１００分間インキュベートし、始原生殖細胞を形成させた。この結果、産卵後１２５±２５分の胚が得られた。なお、ショウジョウバエの場合、産卵後９０分で始原生殖細胞が形成される。また、産卵後１３０分で細胞化が開始され、産卵後１８０分で陥入が開始する。
【００３１】
続いて、卵をメッシュ上に集め、卵殻を取り除いた。続いて、ピンセットを用いて卵をスライドグラス上の両面テープ上に並べ、シリカゲルを用いて乾燥させた。続いて卵の上にシリコンオイルを滴下した。以上の操作を約２０分で行った。
【００３２】
続いて、以下の始原生殖細胞の採取から凍結保存までの操作を約３０分で行った。まず、内径１０〜１２μｍのガラスキャピラリーを用いて始原生殖細胞を吸い取った。図１は、始原生殖細胞を採取している状態を示す写真である。図１中、矢印はガラスキャピラリーを示す。スライドグラス上の両面テープ上に並べた約１０個の胚から始原生殖細胞を連続して吸い取った。
【００３３】
続いて、胚の外側に始原生殖細胞を排出した。図２は、始原生殖細胞を排出した状態を示す写真である。続いて、始原生殖細胞に等容量の氷晶防止剤を混合し、余分な氷晶防止剤を吸い取った。続いて、始原生殖細胞と氷晶防止剤との懸濁液をガラスキャピラリーに吸い取り、液体窒素中で急速冷却した。
【００３４】
氷晶防止剤としては、下記表１に記載の組成のものをそれぞれ使用した。氷晶防止剤は表１に記載の凍結防止剤と糖を含有しており、残余は水であった。表１中、「Ｄ・Ｅ」はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とエチレングリコールを等容量混合したものを表し、「ＰＣ状態」は液体窒素中で始原生殖細胞（極細胞、ＰＣ）を凍結保存後解凍し、正常な形態を保っていたか否かの指標を表す。具体的には、「±」は正常なＰＣの割合が０％以上５％未満であったことを表し、「＋」は正常なＰＣの割合が５％以上５０％未満であったことを表し、「＋＋」は正常なＰＣの割合が５０％以上であったことを表す。
【００３５】
続いて、急速冷却したドナーの始原生殖細胞を解凍し、白眼であるｙｗ系統のショウジョウバエ（ホスト）の胚に移植した。
【００３６】
解凍は、凍結保存してある始原生殖細胞を含むガラスキャピラリーを３０℃のシリコンオイル中に１０秒間浸して保温する条件で行った。続いて、ガラスキャピラリー１本分の始原生殖細胞を約１０個のホストの胚に連続して移植した。図３は、ホストの胚にドナーの始原生殖細胞を移植している状態を示す写真である。
【００３７】
続いて、始原生殖細胞を移植した胚を定法により飼育し成虫（生殖系列キメラ個体）を得た。更に、得られた成虫に、白眼であるｙｗ系統のショウジョウバエを交配させて、雑種第１代（Ｆ１）のショウジョウバエの表現型（赤眼又は白眼）を観察した。Ｆ１個体が赤眼であることは、その個体がドナーの始原生殖細胞に由来する遺伝型を有すること、すなわち、ドナー系統を凍結保存し、再生することができたことを示す。
【００３８】
下記表１に、移植したホスト胚数、孵化数、羽化数、ドナー由来のＦ１の数を示す。
【００３９】
【表１】
2018074946.tif 000002
【００４０】
その結果、エチレングリコールを２０ｖ／ｖ％含有し、スクロースを１ｍｏｌ／Ｌ含有する氷晶防止剤が、特に移植の効率がよく、ドナー由来のＦ１を産生する割合も高いことが明らかとなった。この結果は、実験例の凍結保存方法が十分に実用的であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、昆虫系統を凍結保存する技術を提供することができる。
【図１】
2018074946.tif 000003
【図２】
2018074946.tif 000004
【図３】
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