(57)【要約】【課題】動脈硬化の進行を直接的に把握可能なマーカーを見出して、動脈硬化自体の予防又は治療動機を提供すること、さらに的確な動脈硬化症を含む動脈硬化関連疾患の病状把握を行う手段を提供することを目的とする。【解決手段】体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することにより、動脈硬化の進行に関する直接的なデータを取得できることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、動脈硬化の進行に関するデータ取得方法。
【請求項２】
抗体レベルは、配列番号２のアミノ酸配列の蛋白質又はその一部、に結合する抗体のレベルであることを特徴とする、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７−４５５個であることを特徴とする、請求項２に記載のデータ取得方法。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列の一部は、配列番号５に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３に記載のデータ取得方法。
【請求項５】
配列番号２の全部又は一部のアミノ酸配列は、１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、又は、追加されていることを特徴とする、請求項２−５のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項６】
体液検体は、血液検体であることを特徴とする、請求項１−６のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項７】
血液検体は、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項７に記載のデータ取得方法。
【請求項８】
動脈硬化の進行に関するデータは、動脈硬化関連疾患の検出データであることを特徴とする、請求項１−７のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項９】
動脈硬化関連疾患の検出データは、動脈硬化症の検出データであることを特徴とする、請求項８に記載のデータ取得方法。
【請求項１０】
抗体レベル測定法は、ＥＬＩＳＡ法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、又は、ＣＬＥＩＡ法であることを特徴とする、請求項１−９のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患の検出手段に関する発明であり、より具体的にはＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する血液等の体液における抗体を検出することによる、動脈硬化の進行についての把握手段に関する発明である。本発明により、動脈硬化が関連する疾患の検出を行うことも可能である。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、「動脈の壁が厚くなったり、硬くなったりして本来の構造が壊れ、働きが悪くなる病変」の病理学的な総称であり、無症状で進行する。動脈硬化のうち最も典型的な粥状動脈硬化（アテローム性動脈硬化）は、心臓を養う冠状動脈、大動脈、さらに脳、頸部、腎臓、内臓、手足の動脈に起こりやすく、動脈壁の内膜の中にコレステロールが蓄積し、次第に脂肪分が沈着して、血管が狭くなり、血栓や潰瘍が形成され易くなる。これらが原因となって、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症、手足の壊死等の動脈硬化症が引き起こされる。
【０００３】
脳梗塞や心筋梗塞等の動脈硬化症は、直接死に至る場合も多く、たとえ死に至らなくともその後の長いリハビリを余儀なくされる。患者本人やその家族にとって負担が重いものであり、社会的にも国民医療費の増大につながり、その発症の予防は重要な課題である。もし、動脈硬化の進行状況を把握し、その後の脳梗塞や心筋梗塞の発症を予測できるなら、発症前の治療や生活習慣の改善により、動脈硬化症全般を予防できる可能性が極めて高い。
【０００４】
そこで、動脈硬化症の病状把握のために、ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  （ＬＤＬ）−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  （ＨＤＬ）−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  （ＴＣ），  ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  （ＨｂＡ１ｃ）（非特許文献１）、ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（非特許文献２）等の血液検査が一般的に用いられている。
【０００５】
さらに血液抗体マーカーとしては、心血管障害に関しｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（非特許文献３）、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１（非特許文献４）、ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（非特許文献５）、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｓｐｓ）（非特許文献６）、脳卒中のＨｓｐ６０（非特許文献７）、糖尿病のｉｎｓｕｌｉｎ（非特許文献８）、ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）（非特許文献９）、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＩＡ−２（非特許文献１０、１１）等が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rollins KE, Varadhan KK, Dhatariya K, Lobo DN (2015) Systematic review of the impact of HbA1c on outcomes following surgery in patients with diabetes mellitus. Clin Nutr S0261-5614: 00082-5.
【非特許文献２】Nakanishi N, Okamoto M, Yoshida H, Matsuo Y, Suzuki K, et al. (2003) Serum uric acid and risk for development of hypertension and impaired fasting glucose or type II diabetes in Japanese male office workers. Eur J Epidemiol 18: 523-530.
【非特許文献３】Liang, K. P., Kremers, H. M., Crowson, C. S., Snyder, M. R., Therneau, T. M., Roger, V. L. and Gabriel, S. E. Autoantibodies and the risk of cardiovascular events. J. Rheumatol., 2009, 36, 2462-2469.
【非特許文献４】Montecucco, F., Vuilleumier, N., Pagano, S., Lenglet, S., Bertolotto, M., Braunersreuther, V., Pelli, G., Kovari, E., Pane, B., Spinella, G., Pende, A., Palombo, D., Dallegri, F., Mach, F. and Roux-Lombard, P. Anti-apolipoprotein A-1 auto-antibodies are active mediators of atherosclerotic plaque vulnerability. Eur. Heart J., 2011, 32, 412-421.
【非特許文献５】Fesmire, J., Wolfson-Reichlin, M. and Reichlin, M. Effects of autoimmune antibodies anti-lipoprotein lipase, anti-low density lipoprotein, and anti-oxidized low density lipoprotein on lipid metabolism and atherosclerosis in systemic lupus erythematosus. Rev. Bras. Reumatol., 2010, 50, 539-551.
【非特許文献６】Carbone, F., Nencioni, A., Mach, F., Vuilleumier, N. and Montecucco, F. Evidence on the pathogenic role of auto-antibodies in acute cardiovascular diseases. Thromb. Haemost., 2013, 109, 854-868.
【非特許文献７】Kramer, J., Harcos, P., Prohaszka, Z., Horvath, L., Karadi, I., Singh, M., Csaszar, A., Romics, L. and Fust, G. Frequencies of certain complement protein alleles and serum levels of anti-heat-shock protein antibodies in cerebrovascular diseases. Stroke, 2000, 31, 2648-2652.
【非特許文献８】Palmer, J. P., Asplin, C. M., Clemons, P., Lyen, K., Tatpati, O., Raghu, P. K. and Paquette, T. L. Insulin antibodies in insulin-dependent diabetics before insulin treatment. Science, 1983, 222, 1337-1339.
【非特許文献９】Baekkeskov, S., Aanstoot, H., Christgau, S., Reetz, A., Solimena, M. S., Cascalho, M., Folli, F., Richter-Olsen, H. and DeCamilli, P. Identification of the 64K autoantigen in insulin dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature, 1990, 347, 151-156.
【非特許文献１０】Payton, M. A., Hawkes, C. J. and Christie, M. R. Relationship of the 37,000- and 40,000-M(r) tryptic fragments of islet antigens in insulin-dependent diabetes to the protein tyrosine phosphatase-like molecule IA-2 (ICA512). J. Clin. Invest., 1995, 96, 1506-1511.
【非特許文献１１】Taplin, C. E. and Barker, J.M. Autoantibodies in type 1 diabetes. Autoimmunity, 2008, 41, 11-18.
【非特許文献１２】Matsushita, M., Yamadori, T., Kato, S., Takemoto, Y., Inazawa, J., Baba, Y., Hashimoto, S., Sekine, S., Arai, S., Kunikata, T., Kurimoto, M., Kishimoto, T., Tsukada, S. Identification and characterization of a novel SH3-domain binding protein, Sab, which preferentially associates with Bruton's tyrosine kinase (Btk). Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 245, 337-343.
【非特許文献１３】Yamadori, T., Baba, Y., Matsushita, M., Hashimoto, S., Kurosaki, M., Kurosaki, T., Kishimoto, T. and Tsukada, S. Bruton's tyrosine kinase activity is negatively regulated by Sab, the Btk-SH3 domain-binding protein. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 6341-6346.
【非特許文献１４】Win, S., Than, T. A., Le, B. H., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. and Kaplowitz, N. Sab (Sh3bp5) dependence of JNK mediated inhibition of mitochondrial respiration in palmitic acid induced hepatocyte lipotoxicity. J. Hepatol., 2015, 62(6), 1367-1374.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、動脈硬化症の病状把握を行う試みが種々のマーカーにより行われているが、これらのマーカーによる病状把握の試みは、動脈硬化症のリスクファクター側からの試みであり、いわば間接的な病状把握方式である。このような病状把握方式でおいては、特定のリスクファクターに基づいた動脈硬化症の病状把握が可能である一方で、全ての動脈硬化症のリスクファクターに対応している訳では無いので、動脈硬化症自体の進行を見落としてしまう可能性が認められる。
【０００８】
本発明は、動脈硬化の進行を直接的に把握可能なマーカーを見出して、動脈硬化自体の予防又は治療動機を提供すること、さらに的確な動脈硬化症を含む動脈硬化関連疾患の病状把握を行う手段を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、体液中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する抗体レベルを測定することにより、動脈硬化の進行を的確に把握することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明において「動脈硬化」とは、「動脈の壁が厚くなったり、硬くなったりして本来の構造が壊れ、働きが悪くなる病変」であり、「動脈硬化関連疾患」とは、「動脈硬化に関係する疾患」であり、「動脈硬化が原因となって発症する疾患」と「動脈硬化の原因となる疾患」の双方を含むものである。「動脈硬化症」とは、前記の「動脈硬化が原因となって発症する疾患」であり、動脈硬化関連疾患の下位概念である。
【００１１】
本発明は、第一に、体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、動脈硬化の進行に関するデータ取得方法（本発明のデータ取得方法）を提供する。
【００１２】
本発明のデータ取得方法における測定対象である体液抗体を捕捉する基礎である、抗原としてのＳＨ３ＢＰ５蛋白質は、別名ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５、又はＳａｂと称され、アクセッションナンバー「ＮＭ＿００４８４４」としてＮＣＢＩに登録されている。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質はＢｒｕｔｏｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  （ＢＴＫ）に結合し、その活性を阻害する蛋白質として発見された（非特許文献１２、１３）。また、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）とともに脂質毒性や非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）を誘導することが知られている（非特許文献１４）。
【００１３】
ＳＨ３ＢＰ５蛋白質をコードする遺伝子（ＳＨ３ＢＰ５遺伝子）の塩基配列と、当該蛋白質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１（塩基配列）、配列番号２（アミノ酸配列）に示す通りである。
【００１４】
本発明のデータ取得方法の別の表現として、例えば、「体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、動脈硬化の進行の把握方法」が挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明は、第二に、本発明のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。
【００１６】
本発明のデータ取得用キットの別の表現として、例えば、「体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする動脈硬化の進行の把握方法を行うためのキット」が挙げられる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、体液抗体マーカーによって、直接的に動脈硬化の進行を把握する手段が提供される。これにより動脈硬化自体の予防又は治療動機の提供、及び、的確な動脈硬化症を含む動脈硬化関連疾患の病状把握を行う手段が提供される。また、本発明を用いることにより、個々の動脈硬化関連疾患を積極的に検出することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＳＨ３ＢＰ５蛋白質由来のペプチドを搭載したアレイでの体液抗体捕捉アッセイの結果を示す図面である。
【図２】糖尿病（ＤＭ）患者と健常者（ＨＤ）血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により行った結果を示す図面である。本図２は、ａ−ｄの４図面で構成されている。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質抗原を用いた場合の結果をａに、ＳＨ３ＢＰ５ペプチド抗原を用いた時の結果をｃに、それぞれ箱髭図で示している。これらの箱髭図の縦軸はＡｌｐｈａ  Ｃｏｕｎｔであり、各箱髭に示された境界は、下から、１０番目（最下段の横バー）、２０番目（箱の底辺）、５０番目（箱の中心線）、８０番目（箱の上辺）、９０番目（最上段の横バー）のパーセンタイルを示す。ｂとｄはそれぞれａとｃの結果を反映するＲＯＣ曲線である。ｂとｄのＲＯＣ図中に示した４段の数値は、上から順番にカットオフ値（感度、特異度）、Ｐ値、ａｒｅａｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値、９５％  ＣＩを示す。
【図３−１】一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ａＣＩ）患者と健常者におけるＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの比較をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により行った結果を示す図面である。図３全体はａ−ｆの６図面で構成されており、本図３−１は、それらのうちａ−ｃの３図面を示している。ａは、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質を体液抗体捕捉抗原として用いた場合の結果を示す箱髭図であり、ｂは、当該ａのうちＴＩＡについての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｃは、当該ａのうちａＣＩについての結果を示すＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線図中に示された４段の数字の意味は、上記図２ｂ等と同様である。
【図３−２】上記図３のうち、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドを抗体捕捉抗原として用いたｄ−ｆの３図面を示している。ｄは、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドを用いた場合の結果を示す箱髭図であり、ｅは、当該ｄのうちＴＩＡについての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｆは、当該ｄのうちａＣＩについての結果を示すＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線図中に示された４段の数字の意味は、上記図２ｂ等と同様である。
【図４】健常者と心血管障害患者におけるＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの比較検討を行った結果を示す図面である。本図４は、ａ−ｄの４図面で構成されている。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質抗原を用いた場合の結果をａに、ＳＨ３ＢＰ５ペプチド抗原を用いた時の結果をｃに、それぞれ箱髭図で示している。ｂとｄはそれぞれａとｃの結果を反映するＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線図中に示された４段の数字の意味は、上記図２ｂ等と同様である。
【図５−１】健常者と慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者におけるＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの比較をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により行った結果を示す図面である。図５全体はａ−ｈの８図面で構成されており、本図５−１は、それらのうちａ−ｄの４図面を示している。ａは、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質を体液抗体捕捉抗原として用いた場合の結果を示す箱髭図であり、ｂは、当該ａのうちタイプ１についての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｃは、同タイプ２についての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｄは、同タイプ３についての結果を示すＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線図中に示された４段の数字の意味は、上記図２ｂ等と同様である。
【図５−２】健常者と慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者におけるＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの比較をＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により行った結果を示す図面である。図５全体はａ−ｈの８図面で構成されており、本図５−２は、それらのうちｅ−ｈの４図面を示している。ｅは、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドを体液抗体捕捉抗原として用いた場合の結果を示す箱髭図であり、ｆは、当該ｅのうちタイプ１についての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｇは、同タイプ２についての結果を示すＲＯＣ曲線であり、ｈは、同タイプ３についての結果を示すＲＯＣ曲線である。ＲＯＣ曲線図中に示された４段の数字の意味は、上記図２ｂ等と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）本発明のデータ取得方法
（ａ）体液検体
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「体液検体」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「検体」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。体液検体の中でも血液検体が好適である。血液検体としては、全血、血清、血漿等が挙げられるが、血清又は血漿が好ましく、血清が特に好ましい。血液検体は、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。本発明における体液検体中の標的検出物質は、ＳＨ３ＢＰ５に対する抗体（体液抗体、自己抗体又は体液自己抗体として明細書中に記載されている）である。
【００２０】
（ｂ）体液抗体捕捉抗原
本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎であるＳＨ３ＢＰ５蛋白質は、そのアミノ酸配列である配列番号２の全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。配列番号２のアミノ酸配列の一部を体液抗体捕捉抗原として用いる場合は、配列番号２のアミノ酸配列から７−４５５個の連続したアミノ酸配列を選んで体液抗体捕捉抗原とすることが可能である。より効率的な検出系の確立のために、比較的短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７−３０個程度が好適であり、さらに好適には１０−２０個程度である。
【００２１】
また、配列番号２のアミノ酸配列の全部又は一部のうち、１０％以下の個数のアミノ酸残基（小数点以下は切り捨て）が、改変（欠失、置換、又は、追加）されていてもよい。この場合、目的の体液抗体の捕捉が可能な限りのアミノ酸配列の改変であることが好ましい。
【００２２】
「欠失」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、対象となるアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。Ｎ末端とＣ末端における新たな１個以上のアミノ酸残基の付加も、この「付加」の概念に含まれる。これらの「付加」されたアミノ酸残基の個数が「アミノ酸付加の個数」として数えられる。
【００２３】
また、上記の「目的の体液抗体の捕捉が可能」とは、アミノ酸残基を改変した体液抗体捕捉抗原候補が、本願明細書の実施例の手法と同様の手法で体液抗体の捕捉を行った場合に、その捕捉抗体レベルに基づいて、目的とする動脈硬化症の病状把握が可能な程度を意味するものである。
【００２４】
体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号３（SH3BP5-43: FRSVLVEATVKLDE）、配列番号４（SH3BP5-149: VHKETAARYNAAMG）、配列番号５（SH3BP5-161: MGRMRQLEKKLKRA）、配列番号６（SH3BP5-185: KAKYYVQLEQLKKT）、及び、配列番号７（SH3BP5-327:EFGMMFPVLGPRSE）を挙げることができる。これらの体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチドの中でも、配列番号５に示すアミノ酸配列のペプチドが好適である。これらの捕捉ペプチドのアミノ酸配列の改変可能な個数は、上記の基準より１個である。
【００２５】
所定のアミノ酸配列の体液抗体捕捉抗原は、常法に従って確保することが可能である。具体的には、例えば上記の配列番号１に示す塩基配列等に基づいて、ＳＨ３ＢＰ５遺伝子の塩基配列の全部又は一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物を、ＳＨ３ＢＰ５遺伝子の全部又は一部として得て、これを用いてｐＧＥＸ−４Ｔ等の原核細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択し、さらにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の薬物を添加することにより所定のＳＨ３ＢＰ５遺伝子の全部又は一部の発現を誘導し、発現されたＳＨ３ＢＰ５蛋白質の全部又は一部を、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。また、サイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)）等の常法を用いることにより、ＳＨ３ＢＰ５遺伝子の塩基配列の欠失、置換、又は、追加を行うことにより、対応する改変がなされたＳＨ３ＢＰ５蛋白質を得ることができる。
【００２６】
特に、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質の一部の配列を持つペプチド（典型的には、上記のアミノ酸残基数７−３０個の体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチド）は、公知のペプチドの化学合成法に従い容易に製造することが可能である。ペプチド合成に関しては、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法として、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能である。
【００２７】
ＳＨ３ＢＰ５蛋白質は、市販品を用いることも可能である。市販品には、既製品はもとより、注文に応じて製造される外注品も含まれる。
【００２８】
また、これらの体液抗体捕捉抗原として用いられる蛋白質又はペプチド（体液抗体捕捉のための本質部分）には、必要に応じて適宜修飾構造を付加することができる。例えば、後述するように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法において用いられる、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）−融合化蛋白質又はペプチドや、ビオチン融合化蛋白質又はペプチドとすること等も可能である。
【００２９】
（ｃ）動脈硬化の進行に関するデータ取得方法について
本発明のデータ取得方法は、血液検体等の体液検体中のＳＨ３ＢＰ５蛋白質又はペプチドに対する体液抗体を定量し、その定量値が標準値よりも大きい場合に、体液検体提供者におけるＳＨ３ＢＰ５蛋白質の存在の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈硬化の進行に関するデータとすることが可能である。
【００３０】
動脈硬化には、粥状動脈硬化（アテローム性動脈硬化）の他に、細動脈硬化、中膜硬化が含まれる。
【００３１】
本発明では、動脈硬化の進行に関する直接的なデータを取得することが可能である。すなわち、動脈硬化の進行による具体的な症状が認められない状態においても、動脈硬化の存在を把握することが可能である。この無症状の段階における動脈硬化に対して、リスクファクターを減ずる措置、例えば、食事指導、運動指導、禁煙指導等の生活習慣改善指導を行うことにより、動脈硬化の進行を抑制することが可能である。また、別個の手段により、高脂血症や高血圧が認められる場合には、抗コレステロール薬、降圧剤、血栓治療剤等の適切な薬剤の処方により、これらの動脈硬化のリスクファクターの進展を抑制することが可能である。
【００３２】
また、本発明における動脈硬化の進行に関するデータは、動脈硬化関連疾患の検出データであり得る。すなわち、動脈硬化関連疾患の直接的な指標データとして、体液検体提供者におけるＳＨ３ＢＰ５蛋白質の存在の亢進データを用いることが可能である。
【００３３】
上述したように動脈硬化関連疾患は、「動脈硬化に関係する疾患」であり、「動脈硬化が原因となって発症する疾患（動脈硬化症）」と「動脈硬化の原因となる疾患」の双方を含むものである。動脈硬化の原因となる疾患としては、糖尿病、慢性腎臓病、脂質異常症、家族性高コレステロール血症、高血圧症、非心原性脳梗塞・末梢動脈疾患、睡眠時無呼吸症候群等が挙げられる。動脈硬化症としては、狭心症、心筋梗塞等の心血管障害の他、脳梗塞、一過性脳虚血発作、脳出血、くも膜下出血、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症、手足の壊死等が挙げられる。
【００３４】
本発明では特に、上記動脈硬化関連疾患の検出データが、上記動脈硬化症の検出データである態様が挙げられる。
【００３５】
被験試料におけるＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する体液抗体レベルの標準値は、一般的な検査により動脈硬化が認められないと推定される者の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する当該体液抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
【００３６】
当該体液抗体レベルの測定は、例えば、上述した体液抗体捕捉抗原（蛋白質、及びペプチドを含む）の固定化物に体液検体を接触させ、当該体液検体内のＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する抗体（体液抗体）の当該体液抗体捕捉抗原との抗原抗体反応に基づく結合をシグナルとして検出することにより、行うことができる。具体的には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量測定を行うことができる。ここに例示したいずれの定量測定手段も、定量標的物質を体液検体中の抗体とした場合の、確立した定量測定手段である。例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法では、ＧＳＴ−融合ＳＨ３ＢＰ５抗原（蛋白質又はペプチド）を体液抗体捕捉抗原とする場合は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−結合ドナービーズを用い、ｂｉｏｔｉｎ化ＳＨ３ＢＰ５体液抗体捕捉抗原とする場合はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−結合ドナービーズを用い、体液抗体捕捉抗原、血液検体、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させたアクセプタービーズを混合し、数時間から数日、室温でインキュベートし、形成された抗原抗体複合体に６８０ｎｍの光を照射し、発生した５２０−６２０ｎｍの光を検出することにより、所望の体液抗体の定量を行うことができる。間接蛍光抗体法では、所定の体液抗体捕捉抗原を固定化したプロテインアレイに体液検体を接触させて、形成された体液抗体捕捉抗原−抗ＳＨ３ＢＰ５体液抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＳＨ３ＢＰ５に対する体液抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、体液抗体捕捉抗原をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、体液検体を接触させて、生じた体液抗体捕捉抗原−抗ＳＨ３ＢＰ５体液抗体複合体を、二次抗体を用いて検出することにより定量測定を行うことができる。比濁法や比朧法では、体液検体と体液抗体捕捉抗原を接触させることにより形成された体液抗体捕捉抗原−抗ＳＨ３ＢＰ５体液抗体複合体を、濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子と体液検体とを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体をラテックス粒子に結合した体液抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、体液抗体捕捉抗原の結合磁性粒子と体液検体を接触させて、磁性粒子上に体液抗体捕捉抗原−抗ＳＨ３ＢＰ５抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量測定を行うことができる。
【００３７】
（２）本発明のキットについて
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ−融合ＳＨ３ＢＰ５抗原（蛋白質又はペプチド）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−結合ドナービーズ、及びアクセプタービーズの組、あるいは、ｂｉｏｔｉｎ化ＳＨ３ＢＰ５抗原（蛋白質又はペプチド）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−結合ドナービーズ及びアクセプタービーズの組を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うためのキットの構成として挙げることができる。
【００３８】
また、体液抗体捕捉抗原を固定化したプレート、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＥＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うためのキットの構成として挙げることができる。
【００３９】
また、体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。
【００４０】
また、体液抗体捕捉抗原を結合させた磁性粒子と、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。
【００４１】
ここに挙げたこれらのキットの構成はあくまでも例示であり、他の定量測定手段を行うためのキットも本発明キットの範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、本発明のキットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査に応じた他の要素を加味することも可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明の実施例を開示する。
【００４３】
１．ＳＨ３ＢＰ５蛋白質の発現と精製
ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  III  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。それを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲ法により、ＳＨ３ＢＰ５の全長ｃＤＮＡを増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＳＨ３ＢＰ５を作製し、ＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認した。さらに、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−ＳＨ３ＢＰ５を大腸菌ＢＬ−２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、ＳＨ３ＢＰ５ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これをＳＨ３ＢＰ５タンパク質抗原とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
【００４４】
２．ペプチドアレイの作製
ＳＨ３ＢＰ５蛋白質の公開されているアミノ酸配列（配列番号２）からウェブ公開のエピトープ検索サイトプログラムＰｒｏＰｒｅｄ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて抗体認識部位を検索した。その結果、以下の５ヶ所の配列を得た。コントロールとしてＣ９ｏｒｆ１５６のエピトープ部位（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  ＮＭ＿００１０８０５０７）を検索し、当該エピトープの配列（下記配列番号８）を得た。
【００４５】
それぞれのアミノ酸配列を持つペプチド、合計６種類をＫａｔｏらの方法（Kato R, Kaga C, Kunimatsu M, Kobayashi T, Honda H (2006) Peptide array-based interaction assay of solid-bound peptides and anchorage-dependent cells and its effectiveness in cell adhesive peptide design. J Biosci Bioeng 101: 485-495.）によりＦｍｏｃ法を用いてメンブレン上で合成したペプチドアレイを作製した。
SH3BP5-43: FRSVLVEATVKLDE（配列番号３）
SH3BP5-149: VHKETAARYNAAMG（配列番号４）
SH3BP5-161: MGRMRQLEKKLKRA（配列番号５）
SH3BP5-185: KAKYYVQLEQLKKT（配列番号６）
SH3BP5-327: EFGMMFPVLGPRSE（配列番号７）
C9orf156-428: HMTGPVGSLVSLGS（配列番号８）
【００４６】
このメンブレンをＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ［ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ．  １％（ｗ／ｖ）ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０５％  ＮａＮ3］で５回洗浄し、頸動脈のエコー検査で狭窄が認められなかった健常者血清（検体番号ＨＤ＃１）、及び、頸動脈のエコー検査で狭窄が認められた動脈硬化患者血清（検体番号Ｐ＃７）を２００倍希釈して１８時間反応させ、次いでこのメンブレンをＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで５回洗浄し、さらに、１００００倍希釈したＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と１時間反応させ、再度の洗浄後、４８８ｎｍ／５２０ｎｍフィルターを用いて検出される蛍光を、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
【００４７】
図１に、上記ペプチドアレイでのアッセイの結果を示す。具体的には、上記６種類のペプチドを搭載したメンブレンを、上記健常者血清（検体番号ＨＤ＃１）、及び動脈硬化患者血清（検体番号Ｐ＃７）と反応させ、６種類各々のペプチドに結合した血清ＩｇＧを、蛍光標識二次抗体を用いて検出し、これらの検出結果を蛍光レーザースキャナーによるイメージとして示す。矢印は患者血清ＩｇＧと反応した陽性スポットを示す。
【００４８】
図１に示す通り、動脈硬化患者の血清に対してペプチド「SH3BP5-161」（配列番号５）が特に強く反応し、動脈硬化患者の血清において当該ペプチドに対する抗体、すなわち、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する抗体が存在することが明らかになった。
【００４９】
３．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析
（１）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）を、上記の試験で血清中のＳＨ３ＢＰ５抗体に最も鋭敏に反応したペプチドタイプの体液抗体捕捉抗原であるＳＨ３ＢＰ５−１６１（配列番号５：以下の実施例で「ＳＨ３ＢＰ５ペプチド」と記載されているものは、特に断らない限りは、この配列番号５のアミノ酸配列のペプチドである）と、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質（配列番号２：以下の実施例で「ＳＨ３ＢＰ５蛋白質」と記載されているものは、特に断らない限りは、この配列番号２の全アミノ酸配列の蛋白質である）を主な検出対象として行った。具体的には、３８４穴マイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ  ｏｐａｑｕｅ  ＯｐｔｉＰｌａｔｅTM，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行った。各ウェルに、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１％ｃａｓｅｉｎ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍｇ／ｍＬｄｅｘｔｒａｎ−５００，０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ−３００）で１００倍希釈した血清を、２．５μＬ、及び、抗原となるＧＳＴ、またはＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質（１０μｇ／ｍＬ）、又はビオチン化ペプチド（ｂＳＨ３ＢＰ５−１６１）（４００ｎｇ／ｍｌ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。６−８時間室温でインキュベートした後、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｂｅａｄｓ（２．５μＬ  ａｔ４０μｇ／ｍＬ）、及び、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−、またはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｂｅａｄｓ  （２．５μＬ  ａｔ４０μｇ／ｍＬ）をＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。１−１４日間、室温で放置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐｈａ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生じた光子の数を測定して、「Ａｌｐｈａ  Ｃｏｕｎｔ」とした。ＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５タンパク質の場合はコントロールのＧＳＴを、ｂＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチドの場合は緩衝液コントロールの値を差し引いてＳＨ３ＢＰ５抗原に特異的な抗体レベルを算出した。
【００５０】
（２）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた糖尿病患者における検討
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により、糖尿病（ＤＭ）患者と健常者におけるＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びｂＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチド、に対する血清抗体レベルを測定した。ＤＭ患者血清、及び、健常者血清は千葉大学医学部附属病院において、各被験者のインフォームドコンセントを得て採取した。ＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びｂＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチドに対する血清抗体レベルはどちらも健常者血清に比べ、ＤＭ患者血清において有意に高かった（図２、表１）。
【００５１】
表１は、ＤＭ患者血清と健常者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較解析結果、すなわち、図２に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による結果のデータ解析結果を示している。表１の上から、健常者検体の平均値、ＳＤ、カットオフ値（平均値＋２ＳＤ）、全検体数、カットオフ値以上を示す陽性検体数、陽性率、及び、ＤＭ患者検体の平均値、ＳＤ、全検体数、カットオフ値以上を示す陽性検体数、陽性率、及び、健常者検体と患者検体を比較した時のＰ値を示す。Ｐ値が０．０５以下、または陽性率が１０％以上の値を太字で示した。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
カットオフ値を健常者検体の平均値＋２ＳＤに設定したときの陽性率は、健常者で３．７％、ＤＭで２２．２％であった（表１）。ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）解析で得られたＡＵＣ値（ａｒｅａｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）はＳＨ３ＢＰ５蛋白質で０．７２２、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドで０．７０２であった。同様にＲＯＣ解析で得られたＳＨ３ＢＰ５蛋白質における感度は５３．５％、特異度は８３．５％、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドにおける感度は５３．１％、特異度は８１．２％であった（図２ｂ、ｄ）。このことはＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチドのエピトープ領域が、タンパク質全体の血清抗体との反応を反映していることを示している。
【００５４】
（３）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ａＣＩ）患者における検討
次にＴＩＡ患者とａＣＩ患者におけるＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びｂＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により検討した。健常者検体はポートスクエア柏戸クリニックにおいて頭部ＭＲＩ検査で異常の認められない被験者から得た。ＴＩＡとａＣＩの患者血清は千葉県立佐原病院、千葉労災病院、千葉市立青葉病院、及び千葉メディカルセンターにおいて入手した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による結果は、ＧＳＴ−ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びｂＳＨ３ＢＰ５−１６１ペプチドの抗体レベルはＴＩＡ、ａＣＩのどちらの患者血清においても有意に高かった（図３ａ、３ｂ）。カットオフ値を健常者検体の平均値＋２ＳＤに設定した時のＳＨ３ＢＰ５蛋白質の抗体レベルの陽性率は、健常者で０．８％、ＴＩＡ患者で１５．６％、ａＣＩ患者で１５．２％であった（表２）。表２は、ＴＩＡ患者とａＣＩ患者と健常者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較解析結果、すなわち、図３に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果、を示している。表２に表示されている数値の種類は表１と同様である。
【００５５】
【表２】
2018080976.tif 000003
【００５６】
ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルの陽性率はそれぞれ４．９％、１８．２％、１５．８％であった。ＲＯＣ解析により得られたＴＩＡのＡＵＣ値はＳＨ３ＢＰ５タンパク質抗原で０．６７０、ＳＨ３ＢＰ５ペプチド抗原で０．６５５であった。ａＣＩのＡＵＣ値はそれぞれ０．６１４と０．６２０であった（図３ｃ、３ｆ）。従って、ＳＨ３ＢＰ５の抗体マーカーはＴＩＡとａＣＩの診断に有用である。
【００５７】
（４）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた心血管障害（ＣＶＤ）患者と睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡ）患者における検討
次に急性心筋梗塞や不安定狭心症等を含むＣＶＤの患者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により検討した。ＣＶＤ患者血清は千葉大学医学部附属病院、及び、京都大学医学部附属病院において採取した。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルは、どちらの体液抗体捕捉抗原においても、健常者血清に比べてＣＶＤ患者血清において有意に高かった（図４ａ、４ｃ）。
【００５８】
さらに睡眠時無呼吸症候群ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｓｌｅｅｐ  ａｐｎｅａ（ＯＳＡ）は動脈硬化に関係し、ＣＩやＣＶＤの高リスク因子であるので、これに関してもＳＨ３ＢＰ５抗体レベルを検討した。ＯＳＡ患者血清は千葉大学医学部附属病院において採取した。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルは、どちらも健常者血清に比べて、ＯＳＡ患者血清において有意に高かった（表３）。
表３は、上述のようにＣＶＤとＯＳＡの患者血清と健常者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較解析結果を示している。表３中に表示されている数値の種類は表１と同様である。
【００５９】
【表３】
2018080976.tif 000004
【００６０】
表３において、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する抗体レベルの陽性率は健常者で６．４％、ＣＶＤ患者で８．０％、ＯＳＡ患者で１１．６％であった。ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルの陽性率は健常者で６．４％、ＯＳＡ患者で１２．８％であった。また、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルの陽性率は健常者で６．４％、ＣＶＤ患者で１３．０％、ＯＳＡ患者で１２．８％であった。
【００６１】
一方、ＲＯＣ解析により得られたＡＵＣ値は、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質で０．６５３、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドで０．６８７であった（図４ｂ、４ｄ）。
【００６２】
これらの結果は、ＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルは、健常者に対してＣＶＤとＯＳＡの患者を識別できることを示している。
【００６３】
（５）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における検討
次に動脈硬化に関連するＣＫＤの患者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いて調べた。ＣＫＤ患者血清は熊本コホートにより収集した。ＣＫＤはタイプ１：糖尿病性腎症、タイプ２：腎硬化症、タイプ３：糸球体腎症、に分類した。健常者検体は千葉大学医学部附属病院おいて採取したものを用いた。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質、及びＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルは共に、健常者血清に比べて全てのタイプのＣＫＤ患者血清において有意に高かった（図５ａ、４ｅ）。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質を用いた時の陽性率は、健常者で２．４％、タイプ１で１５．２％、タイプ２で１２．５％、タイプ３で４．１％であり、ペプチド抗原を用いた時の陽性率は、健常者で２．４％、タイプ１で２５．５％、タイプ２で２８．１％、タイプ３で１３．０％であった（表４）。ＲＯＣ解析により得られたタイプ２ＣＫＤのＡＵＣ値は、ＳＨ３ＢＰ５タンパク質抗原で０．７８９、ペプチド抗原で０．８３９と非常に高かった（図５ｃ、５ｇ）。
【００６４】
表４は、ＣＫＤタイプ１、タイプ２、タイプ３の患者血清と健常者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較解析結果を示している。表４に表示されている数値の種類は表１と同様である。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
（６）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた癌患者における検討
多くの体液自己抗体が、癌患者において検出されるので、食道扁平上皮癌（esophageal squamous cell carcinoma）、及び大腸癌（colon carcinoma）の患者検体について、上記と同様にＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いて、血清中のＳＨ３ＢＰ５抗体レベルを調べた。患者血清は東邦大学附属病院において採取した。ＳＨ３ＢＰ５蛋白質に対する抗体レベルは、健常者血清に比べて食道癌、及び大腸癌の患者血清において有意に高かったが、陽性率はともに１０％以下であった（表５）。ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルは食道癌で高値を示したが、Ｐ値は０．０１１程度であり、大腸癌では有意差を認めなかった。このことは、ＳＨ３ＢＰ５蛋白質抗原よりもＳＨ３ＢＰ５ペプチド抗原に対する抗体レベルの方が動脈硬化症により特異的に対応するマーカーであることを示す。
【００６７】
表５は、食道癌（Ｅｓｏ  ＳＣＣ）、及び大腸癌（Ｃｏｌｏｎ  Ｃａ）の患者血清と健常者血清におけるＳＨ３ＢＰ５抗体レベルの比較解析結果を示している。表示されている数値の種類は表１と同様である。
【００６８】
【表５】
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【００６９】
４．相関解析
次に、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する血清抗体レベルと被験者データについて、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析、及び多変量解析を行った。被験者データは以下のものを用いた。
【００７０】
年齢、性別、身長、体重、ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ  （ＢＭＩ）、血圧、現在の症状［ａＣＩ、ＴＩＡ、慢性脳梗塞（ｃＣＩ）、無症候性脳梗塞（ａｓｙｍｐｔ  ＣＩ）］、  最大頸動脈内膜中膜肥厚（ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｎｔｉｍａ−ｍｅｄｉａ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍａｘ  ＩＭＴ）、生活習慣（喫煙習慣、喫煙期間、飲酒習慣、飲酒頻度）、合併症（高血圧、ＣＶＤ、ＤＭ、高脂血漿）、及び、血液検査データ［ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＬＤＬ−Ｃ）、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）、ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ−ＣＨＯ）、ｃｈｌｏｒｉｎｅ（Ｃｌ）、ＨＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ−Ｃ）、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Ｋ）、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ）、ｇ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ｇ−ＧＴＰ）、ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＵＡ）、ｇｌｙｃａｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）、ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ）、ｓｏｄｉｕｍ  （Ｎａ）、ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｒａｔｉｏ（ｅＧＦＲ）、ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＣＨＥ）、ｂｌｏｏｄ  ｕｒｅａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）、ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ｔＢｉｌ）、ｂｌｏｏｄ  ｓｕｇａｒ  （ＢＳ）、ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）、ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ）］である。
【００７１】
上記の相関解析を、県立佐原病院において採取した７４１血清検体について行った。その内訳は、健常者：１３９例、白質軟化：７９例、ａｓｙｍｐｔ  ＣＩ：１５例、ＴＩＡ：２９例、ａＣＩ：２２７例、ｃＣＩ：５８例、及び疾患対照群：１９４例である。多変量解析の結果は、ＳＨ３ＢＰ５ペプチドに対する抗体レベルは、ｃＣＩやａｓｙｍｐｔ  ＣＩよりも、ａＣＩやＴＩＡにより相関していることを示していた（表６）。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析と多変量解析の両者とも、ｍａｘ  ＩＭＴ、喫煙期間、及び年齢と相関していることを示した。また、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析は血圧、及び、合併症の高血圧と相関関係を示した。これらの結果から、ＳＨ３ＢＰ５血清抗体マーカーは高血圧や喫煙習慣により引き起こされる動脈硬化症に起因するｃＣＩやＴＩＡを識別していると考えられた。
【００７２】
上記のように表６は、ＳＨ３ＢＰ５ペプチド抗原に対する血清抗体レベルと被験者データの相関解析の結果、すなわち、千葉県立佐原病院において採取された７４１血清検体についてＳｐｅａｒｍａｎの相関解析、及び多変量解析を行った結果を示している。表６（表６−１と表６−２に分割）には、各解析による相関係数とＰ値を示す。太字は有意な相関解析を示す。
【００７３】
【表６−１】
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【００７４】
【表６−２】
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【産業上の利用可能性】
【００７５】
ＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの上昇が、直接動脈硬化の存在と関わり合っていたことと併せて、ＤＭ、ＴＩＡ、ａＣＩ、ＣＶＤ、ＣＫＤ等の多様な動脈硬化関連疾患の患者血清において上昇していること、及び、ｍａｘ  ＩＭＴや高血圧と相関していることから、ＳＨ３ＢＰ５血清抗体レベルの上昇は、動脈硬化自体の進行度を反映するマーカーであると考えられる。このマーカーは高血圧や喫煙習慣に相関していることから、このマーカーが陽性の被験者は、血圧低下や禁煙に務めることにより、進行している動脈硬化を抑制することが可能であると考えられる。
【００７６】
ａＣＩやＣＶＤの患者検体は発症後２週間以内に採取したものであり、その間に新しく自己抗体が出現する可能性は低いことから、ＳＨ３ＢＰ５血清抗体は発症前から存在していたと考えられる。従って、このマーカーは動脈硬化症の発症予測にも適用可能である。特に、脳梗塞や心筋梗塞の発症を予測することにより発症予防が可能になれば、社会的に大きな意味を持つ。実際に、ａＣＩの前段階と言われるＴＩＡの患者血清においてもＳＨ３ＢＰ５自己抗体が高値であったことは、実施例に示した通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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