(57)【要約】      （修正有）【課題】高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法を提供する。【解決手段】幹細胞の分化能を、幹細胞上の抗原ＣＤ１４６およびＮＧ２の分化発現を測定することによって評価する方法であって、ＣＤ１４６およびＮＧ２の発現と分化能および三血球系統分化能との間の相関性を調査し、所望の分化能を有する幹細胞を特異的に増幅または強化し、不均一な幹細胞集団の分化能を監視し、幹細胞培養物の分化能における不均一性を定量化し、不均一な細胞培養物から特定の分化能を有する細胞を除去する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０％を超えるコロニー形成効率及び２０時間の平均細胞倍増時間に相当する、高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、
収集された間葉系幹細胞におけるＮＧ２の発現を測定するステップと、
ＮＧ２を高発現する間葉系幹細胞を選択するステップであって、前記ＮＧ２の高発現は間葉系幹細胞の表面上のＮＧ２量に相当し、且つ、前記ＮＧ２量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも１００，０００個の抗体分子に相当する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
以下の追加のステップ：
老化細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項１において選択される前記間葉系幹細胞中の老化細胞を最小限に抑えるステップと、
老化細胞を示す前記マーカーを測定するステップと、
ＮＧ２の高い発現と老化細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する細胞を選択するステップと、
を含む、請求項１に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。
【請求項３】
以下の追加のステップ：
系統拘束された細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項１において選択される前記間葉系幹細胞中の系統拘束された細胞を最小限に抑えるステップと、
系統拘束された細胞を示す前記マーカーを測定するステップと、
ＮＧ２の高い発現と系統拘束された細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択するステップと、
を含む、請求項１に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。
【請求項４】
４０％を超えるコロニー形成効率及び２０時間の平均細胞倍増時間に相当する、高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、
ＮＧ２と結合する基質で膜をコーティングするステップと、
前記膜の片側に収集された間葉系幹細胞を配置するステップと、
前記膜の反対側に、細胞移動を促進する走化剤を配置するステップと、
前記間葉系幹細胞を、前記膜を通って移動することを可能にするステップと、
前記膜を通ってより迅速に移動する前記間葉系幹細胞を収集するステップと、
を含む方法。
【請求項５】
４０％を超えるコロニー形成効率及び２０時間の平均細胞倍増時間に相当する、高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、
収集された間葉系幹細胞におけるＣＤ１４６およびＮＧ２の発現を測定するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２を高発現する前記間葉系幹細胞を選択するステップであって、前記ＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現は間葉系幹細胞の表面上のＣＤ１４６量およびＮＧ２量に相当し、前記ＣＤ１４６量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも２００，０００個の抗体分子に相当し、且つ、前記ＮＧ２量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも１００，０００個の抗体分子に相当する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項６】
以下の追加のステップ：
老化細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項５において選択される前記間葉系幹細胞中の老化細胞を最小限に抑えるステップと、
老化細胞を示す前記マーカーを測定するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２の高い発現と老化細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する細胞を選択するステップと、
を含む、請求項５に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。
【請求項７】
以下の追加のステップ：
系統拘束された細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項５において選択される前記間葉系幹細胞中の系統拘束された細胞を最小限に抑えるステップと、
系統拘束された細胞を示す前記マーカーを測定するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２の高い発現と系統拘束された細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択するステップと、
を含む、請求項５に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。
【請求項８】
４０％を超えるコロニー形成効率及び２０時間の平均細胞倍増時間に相当する、高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、
ＮＧ２の高い発現について、収集された間葉系幹細胞を免疫表現型検査するステップと、
ＮＧ２を高発現する細胞を選択するステップであって、前記ＮＧ２の高発現は間葉系幹細胞の表面上のＮＧ２量に相当し、且つ、前記ＮＧ２量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも１００，０００個の抗体分子に相当する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項９】
以下の追加のステップ：
請求項８において選択される前記細胞を培養するステップ、
を含む、請求項８に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１０】
以下の追加のステップ：
培養した細胞を凍結保存するステップ、
を含む、請求項９に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１１】
以下の追加のステップ：
請求項８において選択される前記細胞を培養するステップと、
ＮＧ２の存在を監視するステップと、
を含む、請求項８に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１２】
以下の追加のステップ：
請求項８において選択される前記細胞を培養するステップと、
ＮＧ２の存在を監視するステップと、
ＮＧ２を高発現する前記細胞を選択するステップと、
前記先行ステップで選択された前記細胞をさらに培養するステップと、
を含む、請求項８に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１３】
４０％を超えるコロニー形成効率及び２０時間の平均細胞倍増時間に相当する、高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、
ＣＤ１４６およびＮＧ２について、収集された間葉系幹細胞を免疫表現型検査するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２を高発現する細胞を選択するステップであって、前記ＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現は間葉系幹細胞の表面上のＣＤ１４６量およびＮＧ２量に相当し、前記ＣＤ１４６量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも２００，０００個の抗体分子に相当し、且つ、前記ＮＧ２量は、ＡＢＣ値として細胞１個あたり少なくとも１００，０００個の抗体分子に相当する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
以下の追加のステップ：
請求項１３において選択される前記細胞を培養するステップ、
を含む、請求項１３に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の高い増殖能を有する、多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、以下の追加のステップ：
前記培養した細胞を凍結保存するステップ、
を含む、方法。
【請求項１６】
以下の追加のステップ：
請求項１３において選択される前記細胞を培養するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２の存在を監視するステップと、
を含む、請求項１３に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【請求項１７】
以下の追加のステップ：
請求項１３において選択される前記細胞を培養するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２の存在を監視するステップと、
ＣＤ１４６およびＮＧ２を高発現する前記細胞を選択するステップと、
前記先行ステップで選択された前記細胞をさらに培養するステップと、
を含む、請求項１３に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとに、米国特許仮出願第６１／４５９，９８７号の優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより付与された認可番号ＮＩＨ−Ｒ０３ＥＢ００７２８１号、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより付与された認可番号ＮＳＦ−ＢＥＳ０５１４２４２号および同第ＮＳＦ−ＣＢＥＴ１０６６１６７号のもとに、政府の支援により成された。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、免疫表現型検査を使用して、多能性であり、コロニー形成の高く効率的な間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を識別および単離することに関する。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、再生療法に有望な種類の成熟幹細胞である。ＭＳＣの治療的可能性の実現に対する主な課題は、種々の分化能力（または分化能）を有する、分化細胞と未分化前駆体の不均一な混合物である、ＭＳＣ培養物中のそれらの前駆体含量における変動性である。多能性ＭＳＣは、間葉系統への分化、急速な細胞増殖、および栄養因子の分泌を含む、広範な再生特性を示す。ＭＳＣ療法は、間葉および非間葉組織への損傷を修復するように開発されている。これらの治療の有効性は、異なるドナーからの、および生体外増殖時の前駆体含量における変動性に強く影響される。前駆体含量の制御は、不均一な培養物中の多能性ＭＳＣを識別する免疫表現型の非存在によって妨げられる。ＭＳＣの多分化能および高効率なコロニー形成能の、特異的な細胞表面マーカーの使用は、治療的可能性を有するＭＳＣの単離および識別に有用である。多能性および高効率のコロニー形成ＭＳＣを容易に識別および単離するための、免疫表現型に対する必要性が存在する。
【０００４】
骨髄は、再生医療のための有望なＭＳＣ源として認識されている。それらは、培養物中で容易に増殖し、種々の細胞系統に分化し、免疫反応を調節し、宿主細胞の成長を促進する。脂質生成、軟骨形成、および骨形成を呈する三血球系統分化能は、治療的使用に望ましい多能性ＭＳＣを定義するための基本的基準である。したがって、ＭＳＣ療法は、心筋梗塞、腎不全、および骨関節炎を含む、広範な疾患の治療のために開発中である。これらの治療用途の有効性は、ＭＳＣ調製物の本質的な不均一性に高く依存する。単細胞分析は、ＭＳＣが、それらの系統拘束(lineage  commitment)段階および分化範囲に差がある、細胞の不均一な混合物であることを明らかにした。分化能を定義することにおけるその重要性にも関わらず、ＭＳＣの三血球系統分化能における不均一性および根本的な階層関係について、限られた調査しか行われてこなかった。ＭＳＣ系統拘束の階層は、脂質生成を保持するが軟骨形成は保持しない骨形成前駆体またはＭＳＣをもたらす、脂質生成能および続く軟骨形成能の段階的な損失として、様々に記載されてきた。この階層における不明確性は、部分的に、不均一な培養物からの多能性ＭＳＣの単離に関する現在の問題点に起因する。
【０００５】
分化能を示す特定の免疫表現型を用いて、ＭＳＣを単離するための標準的な手順は存在しない。ＭＳＣのトランスクリプトームおよびプロテオーム発現プロファイルは、それらの培養条件に高く依存し、フローサイトメトリーの際に光散乱特性に従ってＭＳＣを分類することは、多能性細胞の部分的な識別のみを提供する。個々のＭＳＣ細胞は、単離され、その分化を評価されているが、しかしながら、多能性ＭＳＣを識別するための統計的に有意な結果を得るには、高容量のフォーマットが必要である。さらに、高容量アッセイは、軟骨細胞等、特定の系統に対する増殖および分化を評価するために開発されてきたが、それらは、多分化能を評価するわけではなく、機能を判定した後、さらなる分析のために多数の単細胞由来培養物を保持する方法を提供するわけでもない。これらの制限は、ＭＳＣの治療的使用に対する深刻な障害を代表する。
【０００６】
自己ＭＳＣ療法については、ドナーのＭＳＣ調製物は、各患者によって異なることになる。ＭＳＣの治療的可能性を実現することに対する障害は、異なるドナーからのＭＳＣの再生能力における変動性である。ＭＳＣ調製物におけるドナー変動性は、異なる患者間で一定した有効性を有する自己ＭＳＣ療法の生成を妨害する。また、同種異系ＭＳＣ選択は、高い増殖能力のある多能性細胞のスクリーニングプロセスの欠如により妨げられる。目下のところ、ＭＳＣは、間質性抗原の発現および造血性抗原の不在によって識別され、免疫表現型検査される。しかしながら、これらのマーカーは、治療的可能性を有するＭＳＣに望ましい多分化能または高く効率的なコロニー形成とは相関しない。したがって、多分化能および高い増殖能力を有する任意の哺乳動物の幹細胞源から、ＭＳＣをスクリーニングし、単離するための方法は、治療および研究使用に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高い増殖能力のある多能性ＭＳＣを識別する方法を提供する。多能性細胞は、骨形成細胞、脂質生成細胞、または軟骨形成細胞に分化することができる。ＭＳＣは、治療的使用のためにドナーもしくは患者、または研究的使用のために他のドナーのいずれかから、採取することができ、本発明は、自己用途および同種異系用途の両方を有する。細胞バンクからのＭＳＣもまた、使用可能である。指示薬と抱合されたＣＤ１４６およびＮＧ２抗原を標的とする抗体を、不均一な幹細胞の収集物に暴露する。幹細胞表面へのこれらの抗体の付着は、ＣＤ１４６および／またはＮＧ２抗原の存在を示す。ＣＤ１４６、ＮＧ２、または両方の組み合わせを高発現するＭＳＣを、フローサイトメトリーまたは他の選択技術を使用して選択することができる。本発明の方法を使用した細胞の識別は、細胞への最小限の損傷を与える。
【０００９】
高い増殖能を有する多能性ＭＳＣを即座に必要とする患者については、選択した細胞を即座に使用することができる。本発明の免疫表現型検査によるＭＳＣ選択はまた、老化細胞を最小限に抑え、単一または二重組織系統に拘束されるのではなく、多能性の細胞に選択的である。ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する細胞はまた、４０％を超えるコロニー形成効率を有することができ、治療的使用のためのそれらの可能性を強化する。
【００１０】
高い増殖能力のある多能性ＭＳＣ、より迅速な選択および単離を必要としない患者または他の用途については、ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する細胞を選択し、培養することができる。培養した細胞を監視し、所望されるＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する細胞をさらに選択し、単離することができる。ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する細胞を識別し、単離し、さらに培養して、強化された細胞集団を生成することができる。このプロセスは、所望であれば反復することができる。培養プロセス中の任意の時点で、細胞は、後の使用のために凍結保存することができる。本発明は、獣医学的療法および研究、ならびに自己および同種異系療法を含む、全ての哺乳動物に対して使用可能である。
【００１１】
図面中の用語：ＣＣＭＡは、抗生物質を伴う細胞培養培地を指し、ＧＡＧは、グリコサミノグリカンを指し、ＯＡＣは、三分能性細胞を指し、ＯＡは、骨−脂質生成細胞を指し、ＯＣは、骨−軟骨形成細胞を指し、Ｏは、骨形成を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】親集団（薄い灰色）およびアイソタイプ対照（黒）に対する、プールした多能性ＭＳＣ細胞（濃い灰色）における、ＮＧ２（Ａ）およびＣＤ１４６（Ｂ）の発現についての代表的なヒストグラム。多能性集団（Ｃ）および親集団（Ｄ）に対する、ＣＤ１４６発現と対比したＮＧ２発現を表す代表的な二変量ヒストグラム。平均±平均の標準誤差として報告された、ＮＧ２発現（白）とＣＤ１４６発現（黒）との平均蛍光強度比（Ｅ）（ｎ＝４個の試料）。＊親に対してＰ＜０．０５。
【図２】多能性ＭＳＣの継代効果。ＮＧ２（Ａ）およびＣＤ１４６（Ｂ）の発現を、プールした多能性ＭＳＣに対する継代数に関して判定した。加えて、各継代における、累積倍増（Ｃ）、倍増時間（Ｄ）、およびβ−ガラクトシダーゼの発現（Ｅ）を監視することによって、成長特性を評価した。骨形成（Ｆ）、脂質生成（Ｇ）、および軟骨形成（Ｈ）を観察し、継代中の三血球系統分化能の損失を検証した。
【図３】増幅ＭＳＣ単細胞由来培養物の代表的な分化能。ＭＳＣの三血球系統分化能を、実験培養物の接種時に検証した。単細胞由来の３つの一致する培養物を、２１日間分化培地に入れた後、骨形成（Ａ）についてはＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ、脂質生成（Ｂ）についてはＡｄｉｐｏＲｅｄ、脂質、軟骨形成（Ｃ）については１，９−ジメチルメチレンブルー、硫酸化ＧＡＧで染色し、細胞外マトリックスの鉱化を検出した。陰性対照：ＣＣＭＡ中のＭＳＣ。無次元分化スコアを、０．１９±０．０４吸収ユニット（Ａ）、２２００±４００相対的蛍光ユニット（Ｂ）、および０．２６±０．０７μｇＧＡＧ／μｇＤＮＡ（Ｃ）の陰性対照に対し、平均±標準偏差に対して標準化した。陽性分化に対する閾値（点線）は、陰性対照に対する確率密度の９５パーセンタイルに相当する。中央値(Median)（−、ｎ＝５ＭＳＣ）。＊ＯＡＣ  ＭＳＣに対してＰ＜０．０５。
【図４】三血球系統分化能の機能としてのＭＳＣ細胞のコロニー形成効率。細胞を、９６ウェルマイクロプレート内において原位置で凍結させ、解凍し、増幅させて、約２×１０３細胞を得た（３継代）。増殖した細胞の分化能を確認した。コロニー形成効率を、ＣＣＭＡを含有する１０ｃｍの培養皿に、１００±１０細胞で接種した際に、コロニーを形成するＰ３  ＭＳＣ細胞のパーセンテージとして計算した。２週間の培養後、クリスタルバイオレット染色によってコロニーを検出した。中央値（−、ｎ＝５個の細胞）。＊ＯＡＣ細胞に対してＰ＜０．０１。
【図５】ＭＳＣ細胞の生体外増殖。Ｐ３  ＭＳＣ細胞を、１００±１０細胞／ｃｍ２で、２４ウェルプレートに接種し、ＣＣＭＡで１０日間培養した。ＯＡＣ（Ａ）、ＯＡ（Ｂ）、ＯＣ（Ｃ）、およびＯ（Ｄ）細胞を接種した個別のＭＳＣ培養物の成長プロファイル（ｎ＝５個の細胞）。培養表面の画像分析によって判定した１０日目のコンフルエンスパーセント（Ｅ）（ｎ＝３０画像／培養物）。Ａ〜Ｄの成長プロファイルに対応する比成長速度（Ｆ）。中央値（−、ｎ＝５個の細胞）。ＯＡＣ細胞に対して、＊Ｐ＜０．０１および†Ｐ＜０．００１。
【図６】三血球系統分化能の機能としてのＭＳＣ細胞における細胞老化の表現型検査。図５に描写されるＭＳＣ培養物の老化は、培養４日目に細胞がサブコンフルエントになった際に、評価した。細胞寸法（Ａ）を、画像分析で、培養表面上のＭＳＣの平均投影２Ｄ面積として評価した（ｎ＝３０個の画像／培養物）。ＯＡＣ（Ｂ）、およびＯ細胞（Ｃ）を接種したＭＳＣ培養物において、ｐＨ６．０で、細胞寸法および老化関連β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性の染色を示す、代表的な位相差画像。画像分析によって判定したβ−Ｇａｌ陽性ＭＳＣのパーセンテージ（Ｄ）。中央値（−、ｎ＝５個の細胞）。ＯＡＣ細胞に対して、＊Ｐ＜０．０１および†Ｐ＜０．００１。スケールバー：１００μｍ。
【図７】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の組織学的染色と標準化した骨形成（Ａ〜Ｅ）、脂質生成（Ｆ〜Ｊ）、および軟骨形成（Ｋ〜Ｏ）の測定値との間の相関。Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ（Ａ〜Ｄ）、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（Ｆ〜Ｉ）、およびＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ（Ｋ〜Ｎ）で染色した代表的な組織学的試料：陰性対照（Ａ、Ｆ、Ｋ）、骨形成ＭＳＣ細胞の平均標準化吸光度は４．３（Ｂ）、３０（Ｃ）、および４４（Ｄ）、脂質生成細胞の平均標準化蛍光は７３（Ｇ）、１９０（Ｈ）、および５１０（Ｉ）、ならびに軟骨形成細胞の平均標準化したμｇＧＡＧ／μｇＤＮＡは４．４（Ｌ）、１０（Ｍ）、および３７（Ｎ）。スケールバー：１００μｍ。相関グラフ：細胞は、標準化スコアが骨形成（Ｅ）については１．９±０．２、脂質生成（Ｊ）については２．１±０．１、軟骨形成（Ｏ）については１．６±０．３である９５％の信頼性レベルに基づいて、分化に対する陽性（▲）または陰性（○）を示す。挿入したグラフは、拡大した縮尺でプロットする。陰性対照：完全培養培地中のＭＳＣ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１つ以上の好ましい実施形態または方法の詳細な説明を本明細書に提供する。しかしながら、本発明は、種々の方法または形態をとり得ることを理解されたい。したがって、本明細書に開示される特定の詳細は、制限するものではなく、特許請求の範囲の基礎として、および本発明を任意の適切な方法で採用する当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。
【００１４】
幹細胞またはＭＳＣという用語は、長期の自己再生能力を有し、少なくとも一種類の分化した子孫細胞を生成することができる細胞を指す。本明細書に使用される、分化能とは、種々の表現型を有する子孫細胞に分化する、幹細胞の能力を指す。幹細胞およびＭＳＣは、内容に応じて互換的に使用され得る。多分化能とは、複数の種類の子孫細胞、特に骨形成細胞、脂質生成細胞、および軟骨形成細胞に分化する、細胞の能力を指す。単分能性幹細胞とは、１種類の子孫細胞にのみ分化する能力のある幹細胞を指し、二分能性幹細胞とは、２種類の子孫細胞にのみ分化する能力のある幹細胞を指す。老化細胞とは、もはや有糸分裂が起こり得ない細胞を指す。ＣＤ１４６とは、いくつかの幹細胞の表面上に発現される細胞接着分子を指す。ＣＤ１４６抗体とは、ＣＤ１４６抗原に結合する任意の抗体を指す。本発明は、ＣＤ１４６および／またはＣＤ１４６の発現と、幹細胞の分化能およびコロニー形成効率との関連性を開示する。ＮＧ２とは、神経／神経膠抗原２を指し、幹細胞の表面上に発現される抗原である。ＮＧ２抗体とは、ＮＧ２抗原に結合する任意の抗体を指す。本発明は、ＮＧ２の発現と幹細胞の分化能との間の関連性を開示する。免疫表現型検査とは、細胞上の抗原結合を監視することによって、細胞上の抗原またはマーカーを判定するプロセスを指す。このプロセスは、不均一または任意の他の種類の細胞培養物の構成成分および特徴を分析するために使用されてもよい。指示薬または指標化合物という用語は、抗体の存在およびその抗体に結合する細胞を識別または標識化する目的で使用される、任意の化合物を指し得る。指示薬の例には、染料、蛍光剤、または検出および／または定量化可能な他の化合物が挙げられる。
【００１５】
三分能性のＭＳＣは、単離細胞が由来する不均一な細胞集団よりも、高いレベルのＣＤ１４６およびＮＧ２を発現する。ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ、Ｍｅｌ−ＣＡＭ、Ｓ−Ｅｎｄｏ−１、Ａ３２抗原、およびＭＵＣ１８としても既知）は、複数の細胞型（例えば、ＭＳＣ、内皮細胞、および黒色腫細胞）に発現し、異型細胞間接着に関与する。ＮＧ２は、外側の細胞膜に及ぶコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。三分能性ＭＳＣにおけるＣＤ１４６および／またはＮＧ２のより高い発現は、ＭＳＣの分化能に非依存的なＣＤ４４およびＣＤ７３等の他の細胞表面タンパク質の発現とは対照的である。ＣＤ１４６および／またはＮＧ２の分化発現を利用して、幹細胞の所望の分化能を、特異的に増幅および／または強化し、不均一な幹細胞集団の分化能を監視し、幹細胞培養物の分化能における不均一性を定量化し、不均一な細胞培養物から特定の分化能を有する幹細胞を除去することができる。
【００１６】
記載される本発明は、不均一な幹細胞集団の分化能を判定するための定量的および高容量アッセイを開発することによって、幹細胞技術における基礎的な欠点に取り組む。この技術は、ＭＳＣの治療的および研究的可能性に対する不均一性の重要性を考慮した多数の用途を有する。この技術により達成可能なＭＳＣ集団に関する洞察は、最終的に、組成物に対する制御、したがって、ＭＳＣ療法の有効性を可能にするであろう。
【００１７】
本方法で使用される幹細胞は、ドナーまたは患者から抽出される。あるいは、幹細胞は、培養細胞コロニーまたは不均一な培養物から得られてもよい。幹細胞上の非特異的な抗原は、アルブミンでブロッキングされる。細胞を、続いて、ＣＤ１４６抗体、ＮＧ２抗体、または両方とともにインキュベートする。ＣＤ１４６および／またはＮＧ２抗体を、指標化合物と抱合する。存在する全てのＣＤ１４６またはＮＧ２抗原にＣＤ１４６およびＮＧ２抗体が結合することを可能にするのに十分な時間が経過した後、未結合の抗体を除去する。未結合の抗体を除去した後、ＣＤ１４６、ＣＤ１４６抱合指標化合物、および／またはＮＧ２、ＮＧ２抱合指標化合物のいずれかの存在は、高い増殖能を有する多能性ＭＳＣの分化能を示すことになる。単独または組み合わせでのＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現は、高い増殖および多分化能を有するＭＳＣの選択に使用される。
【００１８】
ＭＳＣの多能性分化能を、ＣＤ１４６およびＮＧ２抗原発現の観察により監視する。指標化合物と抱合したＣＤ１４６およびＮＧ２抗体を、幹細胞とともにインキュベートする。ＣＤ１４６およびＮＧ２抗体は、ＣＤ１４６およびＮＧ２抗原を発現する幹細胞に選択的に結合することになる。ＭＳＣにおける多系統分化能の損失は、さらに、ＣＤ１４６およびＮＧ２の発現における変化、ならびにＣＤ１４６およびＮＧ２の抗体結合の対応する変化と関連する。未結合抗体は、連続的、または離散的時間間隔で除去することができる。抱合された指標化合物によって示され得るＣＤ１４６および／またはＮＧ２抗体の結合は、ＭＳＣの培養中に、ＭＳＣの分化能を連続的または離散的時間で監視するために使用することができる。
【００１９】
細胞間通信は、細胞培養物に対する望ましくない変化を促進する幹細胞を選択的に除去することによって、制御される場合がある。単分能性細胞および老化細胞は、特に、細胞間通信を介した細胞培養の変化を促進することに関連し、それらの存在は、多能性細胞の培養に悪影響を及ぼし得る。これらの幹細胞は、それらのＣＤ１４６および／またはＮＧ２抗体結合特性の欠如によって識別され、幹細胞培養物から除去することができる。
【００２０】
不均一なＭＳＣ培養物から多能性ＭＳＣを強化する代替の方法は、多孔質膜を通じた細胞移動を利用することができる。膜は、ＣＤ１４６、ＮＧ２、または２つのマーカーの組み合わせのための基質でコーティングされてもよい。基質の例は、ＮＧ２のためのコラーゲンＶＩであるが、当該技術分野で既知の任意の基質を使用してもよい。不均一なＭＳＣ培養物を、膜の片側(one  side)に配置し、細胞移動を促進する走化剤(chemotactic  agent)を、膜の反対側(the  other  side)に配置する。走化剤の例は、無血清ＭＳＣ培養と組み合わせて使用する場合、血清である。基質に結合する抗原（すなわち、ＣＤ１４６、ＮＧ２、またはそれらの組み合わせ）を高発現する多能性ＭＳＣは、抗原の発現が低い系統拘束された(lineage-committed)ＭＳＣよりも、迅速に多孔質膜を通って移動する。移動した細胞は、多能性ＭＳＣの強化された培養物である。より迅速に移動するＭＳＣを収集し、所望であれば治療法または研究に使用することができる。
【００２１】
ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する選択された細胞は、後で使用するために凍結保存することができる。一実施形態において、幹細胞コロニーを、寒剤を含有するマイクロプレートに添加する。寒剤の一例には、６５％ＣＣＭＡ、２７％ＦＢＳ、および８％ＤＭＳＯが含まれる。パラフィン油を、各ウェルの上部に添加して、ＣＯ２の脱気および培地の蒸発を防止してもよい。幹細胞コロニーを含有するマイクロプレートを凍結させる。一実施形態では、マイクロプレートの温度を、−８０℃に維持する。使用のために幹細胞を回復させるには、プレートを解凍し、３日間回復させる。回復した幹細胞を、マイクロプレートに播種し、増幅させてもよい。
【００２２】
本発明は、系統拘束(lineage-committed)（非多能性）および／または老化ＭＳＣを検出するために、任意の他の指示薬と組み合わせて使用してもよい。指示薬は、系統拘束ＭＳＣに対して強く、多能性ＭＳＣに対して弱いことになる。指示薬の例には、系統拘束および／または老化ＭＳＣ上で上方制御される、蛍光増殖染料および細胞表面抗原が挙げられる。増殖染料は、細胞内での長期の保持能力によって特徴付けられる。各細胞分裂の際に、染料の量は、２つの娘細胞間で分割される。各後続世代は、親細胞の蛍光の半分を受容する。成長の遅い系統拘束および老化ＭＳＣは、これらの増殖染料に強く染色し、一方で、急速に分裂する多能性ＭＳＣは、弱く染色されることになる。これらの指示薬は、本発明のマーカーと組み合わせて使用することができる。多能性ＭＳＣは、ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現し、系統拘束および／または老化ＭＳＣ細胞の指示薬に対しては弱いことになる。この組み合わせは、不均一なＭＳＣ培養物からの系統拘束および／または老化ＭＳＣの除去、ならびにさらには不均一なＭＳＣ培養物からの多能性ＭＳＣの強化に有用であり得る。
【００２３】
以下は、使用される免疫表現型検査プロセスであるが、このプロセスは、当業者に利用可能な任意の方法によって達成されてもよい。トリプシン処理したＭＳＣを、ＰＢＳ中で、遠心分離によって洗浄した。非特異的な抗原は、３７℃で２０分間、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で、細胞を１０６細胞／ｍｌでインキュベートすることによってブロッキングした。細胞懸濁液の１００μｌアリコートを、４℃で２０分間、蛍光色素抱合した抗ヒトモノクローナル抗体とともにインキュベートした。標識化した試料を、３つの量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、遠心分離によって洗浄した。アイソタイプ対照は、各抗体に使用したものと同じ濃度で平行して行った。ＭＳＣの免疫表現型を、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ．ｃｏｍ）を用いて評価した。この方法のための細胞は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙによって示されるＭＳＣに対する基準を満たす。具体的には、細胞は、接着依存性であり、三血球系統分化能を示し、ＭＳＣの特徴である免疫表現型（例えば、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、およびＣＤ１０５＋）を発現し、造血性細胞の細胞表面エピトープ指標が陰性であった（例えば、ＣＤ１９−、ＣＤ３４−、およびＣＤ４５−）。
【００２４】
ＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現のスクリーニングに使用されるＭＳＣは、ドナー、細胞コロニー、または異種源からのものとすることができる。ＣＤ１４６およびＮＧ２についてスクリーニングされるＭＳＣは、ＮＧ２：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ＮＧ２−アロフィコシアニン、カタログ＃ＦＡＢ２５８５Ａ、クローン＃ＬＨＭ−２、およびＣＤ１４６：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの抗ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ、カタログ＃１１−１４６９、クローン＃Ｐ１Ｈ１２とともに、上述のようにインキュベートされる。これらの抗体の抗体結合能力（antibody  binding  capacity,ＡＢＣ）は、ＭＳＣのコロニー形成効率ならびに多能性と相関する。ＡＢＣ値は、本発明ではＣＤ１４６および／またはＮＧ２である、細胞表面上の抗原分子の量であり、使用される抗体に特異的である。
【００２５】
効率的に倍増する幹細胞を提供し、幹細胞療法を必要とする患者に最良の転帰をもたらすか、または研究のための集団をもたらすのに所望されるコロニー形成効率は、４０％を超える。さらに、ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現する幹細胞は、前述のように、他の細胞型への所望の分化能力を有する。ＡＢＣは、ドナー、患者、または細胞バンクからの、高いコロニー形成効率を有する多能性ＭＳＣについてのスクリーニングに使用することができる。４０％を超えるコロニー形成効率に関して、ＡＢＣ値は、ＮＧ２については細胞１個あたり少なくとも約１００，０００個の抗体分子とすることができる。ＣＤ１４６については、この値は、細胞１個あたり少なくとも２００，０００個の抗体分子とすることができる。所望のＭＳＣのスクリーニングに使用される別の尺度は、等価可溶性蛍光色素分子（ＭＥＳＦ）の値である。多能性ＭＳＣに関して、ＭＥＳＦ値は、ＣＤ１４６については細胞１個あたり少なくとも約１００，０００個の蛍光色素分子であり、ＮＧ２については細胞１個あたり少なくとも約２００，０００個の蛍光色素分子である。
【００２６】
図１は、親ＭＳＣ集団（薄い灰色）およびアイソタイプ対照（黒色）に対して、プールした多能性細胞（濃い灰色）における、ＮＧ２（図１Ａ）およびＣＤ１４６（図１Ｂ）の発現についての代表的なヒストグラムである。代表的な二変量ヒストグラムは、多能性集団（図１Ｃ）および親集団（図１Ｄ）について、ＣＤ１４６の発現に対比したＮＧ２の発現を描写する。多能性細胞（ＯＡＣ）におけるＮＧ２発現（白色）とＣＤ１４６発現（黒色）との平均蛍光強度比（図１Ｅ）を、多能性細胞が由来する不均一な親培養物に対して、平均±平均の標準誤差と比較して示す（ｎ＝４個の試料）。＊親に対してＰ＜０．０５。多能性ＭＳＣにおけるＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現を、図１に図示する。
【００２７】
図２は、多能性ＭＳＣの培養中の継代効果についての研究である。ＮＧ２（図２Ａ）およびＣＤ１４６（図２Ｂ）の発現は、多能性ＭＳＣの継代数に関して判定した。図形の各線は、下記のように調製したＭＳＣの単細胞由来培養物のプール（ｎ＝５）を表す。さらに、成長特性を、各継代時の累積倍増（図２Ｃ）、倍増時間（図２Ｄ）、および細胞老化を判定するためのβ−ガラクトシダーゼの発現（図２Ｅ）を監視することによって評価した。骨形成（図２Ｆ）、脂質生成（図２Ｇ）、および軟骨形成（図２Ｈ）を観察した。ＣＤ１４６およびＮＧ２の発現における減少は、培養ＭＳＣの継代中の三血球系統分化能の損失と相関する。
【００２８】
ＣＤ１４６および／またはＮＧ２を高発現するＭＳＣを、即時使用のために単離することができる。別の方法では、高発現する細胞は、下記のように培養し、ＣＤ１４６および／またはＮＧ２の発現について監視することができる。単離して培養した、所望のレベルのＣＤ１４６および／またはＮＧ２を有するＭＳＣを、単離し、さらに培養して、所望の多分化能特性および高いコロニー形成効率を有する強化されたＭＳＣを生成することができる。選択基準、培養、および保存を本明細書に記載する。図２は、最良の多能性分化能を提供するための培養中のＣＤ１４６およびＮＧ２の存在を図示する。高レベルの発現を有するＭＳＣを、使用のためにさらに選択する、および／または強化されたＭＳＣ集団のために培養を続けることができる。さらに、強化されたＭＳＣは、単離時に凍結保存するか、または後で使用するために培養して凍結保存することができる。
【００２９】
ＣＤ１４６およびＮＧ２のためのマーカーを用いて細胞の分化能およびコロニー形成を確認するために使用される本発明の別の方法は、ドナー、細胞コロニー、または不均一な培養物から単離可能な個々の細胞を利用する。次の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｏｆ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２８  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ７８８−７９８（２０１０）、Ｃｌｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｃｙ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１０８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２７１６−２７２６（２０１１）。
【００３０】
本方法は、培養用の単細胞を単離するために使用することができる。使用または研究のために、少数のＭＳＣが望ましい場合、この代替方法を使用してもよい。多能性ＭＳＣの源は、約２〜１５回（１０〜５０倍増）継代されることになる単細胞であるため、使用可能な細胞の数は、上述の方法よりも少ない。この方法はまた、ＣＤ１４６およびＮＧ２に加えて、高い増殖能を有する多能性細胞を示し得る他のマーカーを識別するために使用することもできる。ＭＳＣは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの使用説明書に従って、５μΜのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、５−クロロメチルフルオロセイン二酢酸（λｅｘ／λｅｍ＝４９２／５１７ｎｍ）を用いて、原位置で１０分間、３７℃に余熱した無血清ＣＣＭＡ内で、滅菌標識化した。トリプシン処理した後、ＭＳＣ単細胞を、４８時間ＭＳＣで馴化した５０μｌ／ウェルの新鮮ＣＣＭＡおよび７５μｌ／ウェルのＣＣＭＡを含有する９６ウェルマイクロプレートへの限界希釈によって生成し、滅菌濾過（０．２μｍの細孔寸法）して全ての懸濁細胞を除去した。各ウェルを、蛍光Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｌｙｍｐｕｓａｍｅｒｉｃａ．ｃｏｍ）で検査して、単細胞を接種したウェルのパーセンテージとして、平板効率を判定した。接種の３日後に５０μｌの新鮮ＣＣＭＡを各ウェルに添加し、さらに３日後に、５０μｌの培地を新鮮ＣＣＭＡと置き換えた。培養７日目に、コロニー形成効率を、単細胞を起源とするＭＳＣコロニーのパーセンテージとして計算し、接種材料中の生存細胞の割合で除した。少なくとも３００細胞／ウェルを含有する単細胞由来のコロニーを、１：４の比率で継代培養し、三血球系統分化多能性分化能を評価した。
【００３１】
単細胞由来のＭＳＣコロニー、またはドナーもしくは培養物由来の他の単離ＭＳＣは、５０μｌのトリプシン処理した細胞懸濁液を、５０μｌ／ウェルの２倍寒剤（６５％ＣＣＭＡ、２７％ＦＢＳ、および８％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を含有する新鮮９６ウェルマイクロプレートに添加することにより凍結保存することができる。ＣＯ２の脱気および培地の蒸発を阻害するために、１００μｌの濾過滅菌した軽質パラフィン油を各ウェルの表面に添加してもよく、蓋をパラフィルムで固定した。プレート（複数を含む）を、Ｓｔｙｒｏｆｏａｍの箱に移し、−８０℃で８時間凍結させ、続いて長期保管のために、−８０℃の冷凍庫に直接入れることができる。７５細胞／ウェル程の少量を、この方法で凍結させた。プレートは、３７℃のインキュベーターで解凍し、解凍した細胞懸濁液を、１ｍｌの新鮮ＣＣＭＡ／ウェルを含有する２４ウェルプレートに移すことができる。接種翌日に、定期的な細胞増幅のために、培地を新鮮ＣＣＭＡと交換した。
【００３２】
単細胞から培養した凍結ＭＳＣ細胞を解凍し、３日間増幅させ（約２×１０３細胞／単細胞コロニー）、それらの分化能を検証した。１０ｃｍの組織培養皿中に、１００±１０個の細胞で接種した際のＰ３増幅ＭＳＣ細胞のコロニー形成効率を、細胞コロニーを検出するクリスタルバイオレット染料を使用して評価した。成長動態については、単細胞から培養したＰ３  ＭＳＣ細胞を、０．５ｍｌのＣＣＭＡ／ウェルを含有する２４ウェルプレートに、１００±１０個の細胞／ｃｍ２で接種し、１日おきに培地を完全に交換した。細胞濃度を、血球計計数によって測定し、比成長速度を、Ｂｌａｎｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ｐ．７０２．（１９９７）にあるように評価した。
【００３３】
継代培養後、ＭＳＣ単細胞由来コロニーを、７日間、１５０μｌ／ウェルのＣＣＭＡを含有する９６ウェルマイクロプレートで、約７５％コンフルエントになるまで増殖させた。アッセイにより、分化能の尺度として、脂質生成、軟骨形成、および骨形成を示す、ＭＳＣ単細胞の三血球系統分化能を定量化した。骨形成は、１０％ＦＢＳ、１００ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および５０μΜのＬ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した低グルコースのダルベッコＭＥＭでの培養によって誘発した。２１日間の分化後、コンフルエントな単分子層を、４％パラホルムアルデヒド中に２０分間固定し、１％Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ（ｐＨ４．２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０分間染色し、鉱化した細胞外マトリックスを検出した。染料を、１５分間、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、１００μｌ／ウェルの１０％塩化セチルピリジニウムで抽出し、スペクトル吸収率を５６２ｎｍで測定した。
【００３４】
脂質生成を誘発するために、単細胞由来コロニーを、上述のように増殖させ、０．５μΜデキサメタゾン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および５０μΜインドメタシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＣＣＭＡ中で２１日間培養した。脂質は、２００μｌのＰＢＳ／ウェルにおいて、細胞の単分子層に５μｌのＡｄｉｐｏＲｅｄ試薬（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を添加することにより検出した。蛍光を、４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの放出で１０分後に測定した。
【００３５】
軟骨形成については、単細胞由来コロニーを、２ｍｌのＣＣＭＡ／ウェルを含有する６ウェルプレートで、２週間近く増幅させた。２００μｌ／ウェルのＣＣＭＡを含有する、９６ウェルのＶ字底ポリプロピレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に、２±０．２×１０５細胞／ウェルを接種することによって、ペレット培養物を形成した。翌日に、１００ｎｇ／ｍｌの骨形成タンパク質−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、１０ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子−β３、１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸２−リン酸、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４０μｇ／ｍｌのプロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１０μｌ／ｍｌのＩＴＳ＋（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を補充した高グルコースのダルベッコＭＥＭから構成される分化培地で、ＣＣＭＡを置き換えた。２１日間の分化後、消化した細胞ペレット中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を、１，９−ジメチルメチレンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、較正にコンドロイチン硫酸Ａを使用して定量化した。ＧＡＧ含量は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて消化したペレット試料中のＤＮＡの定量化による質量あたりのＤＮＡ単位で報告し、較正基準として仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を採用する。
【００３６】
細胞型を確認するための分化したＭＳＣの染色組織学的試料の画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５０顕微鏡に載置した、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ  ＤＥＩ−７５０デジタルカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ．ｃｏｍ）で取得した。染色を、染色面積パーセントおよびその光学密度の積に関して評価した。培養中のＭＳＣの、４つの陽性染色面積および投影２Ｄ面積を、Ｇｒａｐｈｉｒｅ  ４  ＣＴＥ−６４０タブレット（Ｗａｃｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｃｏｍ．ｃｏｍ）を使用してトレースし、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアバージョン６．１（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃｒｏｆｔｏｎ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉａｃｙ．ｃｏｍ）のＣｏｕｎｔ／ＳｉｚｅおよびＤｒａｗツールのＡｒｅａ、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ａｒｅａ、およびＯｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙオプションで分析した。光学密度を、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎオプションを使用して、対応する陰性対照に対し、０（白色）から２．５（黒色）の段階で計算した。画像化の結果を、培養試料あたり平均して２０〜５０個の無作為に選択した画像からの平均値として報告する。
【００３７】
図３は、上述の分化培地での２１日間の誘発後の、骨形成（図３Ａ）、脂質生成（図３Ｂ）、および軟骨形成（図３Ｃ）について、培養ＭＳＣの多分化能を要約する。陽性分化に対する閾値（破線）は、陰性対照に対する確率密度の９５パーセンタイルに相当する。
【００３８】
コロニー形成効率を、これらの条件下で容易にコロニーを形成した蛍光標識化ＭＳＣの限界希釈によって評価した。追跡用染料ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎは、９６ウェルマイクロプレートでウェルにおける細胞検出を容易化した。染料は、無視できる程度の細胞毒性を有し、接種材料の生存率は９０±４％であった。４０％を超えるコロニー形成能を有する細胞を、識別することができる。図４は、多能性ＭＳＣのより高いコロニー形成を示す。図４に示されるように、多能性ＭＳＣにより、しばしば、所望される４０％のコロニー形成効率を上回る。
【００３９】
ＭＳＣ培養物中のＤＮＡ含量を定量化するために、１００μｌのパパイン消化細胞試料を、２００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム中の２００μｌの０．１Ｍ  ＨＣｌの添加によって、中和した。９６ウェルマイクロプレートにおいて、１００μｌの試料を、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含有する１０ｍＭトリス緩衝液中の１００μｌの０．７μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。蛍光を、３４０ｎｍの励起および４６５ｎｍの放出で測定した。標準曲線を、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて作製した。
【００４０】
ＭＳＣの単細胞由来培養物の三血球系統分化能を、上に示した分化条件を使用して評価した。単細胞コロニーを、１：４の比率で、複製マイクロプレートに継代培養し、３つのプレートは、三血球系統分化能の評価に採用し、４つ目は、後で使用するために凍結させてＭＳＣ細胞の鋳型を保存した。ＭＳＣ細胞は、それらの標準化した測定値が、陰性対照に対する推定確率密度の９５パーセンタイルを超えた場合、分化が陽性であると指定された。値は、骨形成、脂質生成、および軟骨形成について、それぞれ、１．９±０．２、２．１±０．１、および１．６±０．３標準偏差であった。
【００４１】
組織培養プラスチック上での生体外増殖の際のＭＳＣ細胞の成長動態を、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄに提示する。１００細胞／ｃｍ２の接種密度を選択した。接種の２４時間後に培養物中に生存していたＭＳＣの割合、および遅滞期の期間に関して、それぞれ、中央値(median  values)は、４つ全ての群について６０％および１日（ｎ＝２０）であり、４つの分化能群の間に有意な差異は存在しなかった（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄ）。１０日間の増殖後、三分能性ＭＳＣを接種した培養物は、２００倍（ｎ＝５）、２−１０×１０４細胞／ｃｍ２（図５Ａ）に増殖し、８５％〜１００％コンフルエント(confluent)であった（図５Ｅ）。系統拘束は、培養ＭＳＣの生体外増殖を制限した。Ｏ細胞を接種した場合、同じ期間にわたり、培養物は、蓄積が＜１０３細胞／ｃｍ２であり（図５Ａ）、≦１５％コンフルエント(confluent)であった（図５Ｅ）（Ｐ＜０．００１）。ＭＳＣ分化能の機能としての比成長速度における傾向（図５Ｆ）は、コロニー形成効率に対するもの（図４）と類似である。４つの分化能群の中でも、ＯＡＣ細胞の三分能性接種材料が、メジアン(median)比成長速度が０．８５日−１（ｎ＝５）であり、２０時間の倍増時間に相当する、最も高い増殖能を呈した（図５Ｆ）。メジアン比成長速度は、Ｏ細胞を接種した培養物については５倍低かった（Ｐ＜０．０１）。二分能性接種材料は、ＯＡおよびＯＣＭＳＣと平均比成長速度が同程度であり（０．５０〜０．６０日−１）、これらの２つの両極端の間の中等度の増殖能を呈した。
【００４２】
Ｏ細胞は、細胞老化の表現型表示を発現した。細胞寸法を、サブコンフルエントな培養物の表面上の、ＭＳＣの投射面積の画像分析によって推定した（ｎ＝３０個の画像／培養物）。Ｏ  ＭＳＣを接種したＭＳＣ培養物は、４日目に、細胞半径＞３４μｍ（図６Ｃ）に相当する、＞３．６×１０３μｍ２／細胞（ｎ＝５個の培養物）の平均投影面積で細胞を含有した（図６Ａ）。７５％を超えるこれらの系統拘束されたＭＳＣが、ｐＨ６．０で、老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ活性に対して陽性に染色した（図６Ｄ）。サブコンフルエントなＭＳＣにおける陽性β−ガラクトシダーゼ染色は、コンフルエント細胞における可逆の休眠状態ではなく、老化からの不可逆の成長停止を示唆する。三分能性接種材料は、良好な形態学（図６Ａおよび６Ｂ）ならびに無視できる程度のβ−ガラクトシダーゼ染色（図６Ｄ）を有する培養物をもたらしたが、一方で、二分能性接種材料は、増殖能について観察されたパターン（図４および５Ｆ）と一致する老化の中間表現型（図６Ａおよび６Ｄ）を呈した。
【００４３】
ＣＤ１４６およびＮＧ２を高発現する多能性細胞はまた、細胞の老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ活性の欠如も示す（図６Ｄ）。この特徴は、本発明のさらなる態様である。細胞を、ｐＨ６．０で試験し、成長動態について接種の４日後に、サブコンフルエントな培養物中で老化β−ガラクトシダー染色キット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて組織化学的に検出した。
【００４４】
標準化した分化測定値を分化ＭＳＣの組織学的染色と関連付けるための相関を確立した（図７）。組織学的試料は、骨形成および脂質生成（図７Ａ〜Ｅおよび図７Ｆ〜Ｊ）については単分子層であり、軟骨形成（図７Ｋ〜Ｏ）については分割したペレットであった。染色を、染色面積パーセントおよびその光学密度の積に関して評価した。この面積かける強度スコアは、骨形成については≦３０（図７Ａ〜Ｅ）、脂質生成については≦１０（図７Ｆ〜Ｊ）、および軟骨形成については≦２５（図７Ｋ〜Ｏ）であった。骨形成および軟骨形成の高いパーセンテージは、細胞内マーカーと対比した細胞外染色、および／またはより高い分化度に起因し得る。線形回帰モデルは、全ての事例におけるデータに適合するのに十分であった。これらの等式から、陽性分化に対する９５パーセンタイルの閾値は、それを越えると単細胞由来の培養物が骨形成に陽性であることが示された、１．０±０．１の面積かける強度スコアに対応する。脂質および軟骨形成に対するカットオフ値は、それぞれ、０．２０±０．０１および２．９±０．２のスコアに相当した。３つ全ての場合において、閾値の面積かける強度スコアは、陽性細胞に対して観察された最大値よりも、少なくとも８倍低かった。多分化能が陽性である単細胞培養物は、本明細書に記載のように、ＣＤ１４６およびＮＧ２の両方を高発現する。
【００４５】
多能性ＭＳＣの識別における現在の制限を克服するために、不均一なＭＳＣを任意の試料で使用するための、新しい効率的な高容量アッセイを開発した。本方法を使用して、単純に、ＣＤ１４６およびＮＧ２に対するマーカーを使用することにより、ＭＳＣをスクリーニングすることができる。既知の分化能の細胞を単離し、ＭＳＣの不均一性を定量化するこのアッセイの能力は、ＭＳＣ療法の有効性を改善するであろう。
【００４６】
フローサイトメトリーにより、平均蛍光強度に約３倍の差異（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）がある、親ＭＳＣと対比した多能性ＭＳＣでの細胞表面抗原ＮＧ２の高発現を確認する。ＣＤ１４６については、平均蛍光強度は、多能性ＭＳＣに対して、親培養物よりも約２倍大きかった（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。単細胞由来ＭＳＣコロニーの使用、および４０％を超えるコロニー形成効率と相関する多能性細胞の単離は、所望のＭＳＣにおけるＣＤ１４６およびＮＧ２の高発現を明らかにした。
【００４７】
本発明は、例えば、臨床で、多能性細胞の一定した含量についてＭＳＣ調製物を監視するため、および年齢および異なる培養条件で、異なるドナー間の不均一性における変動性を判定するために、採用することができる。本発明の方法を使用して、ＭＳＣの多分化能と関連する他の因子を識別することができる。
【００４８】
本発明の使用は、マーカーＮＧ２およびＣＤ１４６を使用することによって、臨床で使用するための生体外増幅の際に、不均一なＭＳＣ調製物中の多能性細胞を強化する、分化成長動態を有効利用することを可能にする。多分化能および効率的なコロニー形成を有するＭＳＣの識別、ならびにＣＤ１４６およびＮＧ２を高発現する単離ＭＳＣのさらなる培養の容易さは、治療法および研究のためのＭＳＣ源の提供を可能にする。
【符号の説明】
【００４９】
ＣＣＭＡは、抗生物質を伴う細胞培養培地を指し、ＧＡＧは、グリコサミノグリカンを指し、ＯＡＣは、三分能性細胞を指し、ＯＡは、骨−脂質生成細胞を指し、ＯＣは、骨−軟骨形成細胞を指し、Ｏは、骨形成を指す。
【図１】
2018148889.tif 000002
【図２】
2018148889.tif 000003
【図３】
2018148889.tif 000004
【図４】
2018148889.tif 000005
【図５】
2018148889.tif 000006
【図６】
2018148889.tif 000007
【図７】
2018148889.tif 000008
【外国語明細書】
2018148889000001.pdf