(57)【要約】【課題】in situ PCR による非特異的増幅を抑制し、HTLV‐Ｉ感染細胞をフローサイトメトリーによって検出することができるHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法を提供すること。【解決手段】HTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法は、（１）固定・透過処理工程、（２）タンパク質分解工程、（３）in situ PCR工程、（４）検出工程を含み、二本鎖標的配列を含むPCR産物の両端には、UniPrimerに由来する蛍光領域が形成される。【選択図】図３
2018148884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法であって、
以下の工程：
（１）ヒト血液から分離されたCD4陽性T細胞とBD Cytofix/Cytoperm bufferとを混合する第１固定・透過処理工程；
（２）前記細胞と、25〜150μg/mLのプロテイナーゼKとを混合して、30〜60℃で10〜45分間反応させるタンパク質分解工程；
（３）UniPrimer、第１プライマー、第２プライマー、dNTPsおよびDNAポリメラーゼを含むPCR反応液と、前記細胞とを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応によってHTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖標的配列を増幅させるin situ PCR工程；および
（４）前記in situ PCR工程で得られたPCR産物の蛍光をフローサイトメトリーによって検出する検出工程
を含み、
前記in situ PCR工程において、前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列と、前記一本鎖標的配列と相補的な相補的一本鎖標的配列とからなり、
前記第１プライマーは、前記一本鎖標的配列の５’末端配列と、この配列の５’末端側に付加された前記UniPrimerの３’末端配列とを含み、
前記第２プライマーは、前記一本鎖標的配列の３’末端側と相補的な相補配列と、この相補配列の５’末端側に付加された前記UniPrimerの３’末端配列とを含み、
前記二本鎖標的配列を含むPCR産物の両端には、前記UniPrimerに由来する蛍光領域が形成されることを特徴とするHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法。
【請求項２】
前記第１固定・透過処理工程および前記タンパク質分解工程では、前記細胞に洗浄液を供給する洗浄処理を含み、
前記固定・透過処理工程および前記タンパク質分解工程における前記洗浄液は、BD Perm/Wash bufferであることを特徴とする請求項１のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法。
【請求項３】
前記in situ PCR工程における前記DNAポリメラーゼは、Takara EX Taq Hot Start Versionであることを特徴とする請求項１または２のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法。
【請求項４】
前記in situ PCR工程におけるPCR反応液中の細胞濃度は、0.1〜0.2×10６cells/30μlであることを特徴とする請求項１から３のいずれかのHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトT細胞白血病ウイルス１型（HTLV -Ｉ）は、ヒトで初めて発見されたレトロウイルスであり、CD４陽性Tリンパ球に感染すると、細胞内に侵入したHTLV-ＩのゲノムRNAが逆転写されてゲノムDNAになった後、ヒトゲノムに組み込まれて長期間潜伏し、成人T細胞白血病、HTLV-Ｉ関連脊髄症、HTLV -Ｉぶどう膜炎などを引き起こすことが知られている。
【０００３】
また、HTLV-Ｉは主に母乳によって感染することが知られている。したがって、被験者がHTLV-Ｉキャリアであることが確認できれば、母乳哺育を行わずに人工乳を用いるなどして感染を回避することができるため、HTLV‐Ｉ感染細胞を高感度で検出することができる技術の確立が望まれている。
【０００４】
しかしながら、HTLV-Ｉ感染細胞は、生体内でウイルスタンパク質をほとんど発現していないため、抗体によってHTLV-Ｉ感染細胞を検出することはできない。このため、HTLV-Ｉ感染細胞を検出するためには、HTLV-Ｉ感染細胞内のウイルス核酸を検出することが考えられる。
【０００５】
HTLV-Ｉ感染細胞内のウイルス核酸を検出する方法としては、in situ ハイブリダイゼーションを利用した検出方法（非特許文献１、２）や、in situ PCR を利用した検出方法（非特許文献３）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Annals of Neurology Volume 37, Issue 2, 167-175, February 1995 “Detection of human T-lymphotropic virus type I (HTLV-I) tax RNA in the central nervous system of HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis patients by in situ hybridization”
【非特許文献２】International Journal of Cancer Volume 57, Issue 5, 760-764, June 1994 “HTLV-I messenger RNA is expressed in vivo in adult T-cell leukemia/lymphoma patients: An in situ hybridization study”
【非特許文献３】Journal of the Neurological Sciences 159 (1998) 67-72 “Quantitative in situ PCR assay of HTLV-1 infected cells in peripheral blood lymphocytes of patients with ATL, HAM/TSP and asymptomatic carriers”
【非特許文献４】The Journal of Histochemistry & cytochemistry Volume 47, Issue 3, 273-280, March 1999 “In Situ Amplification Using Universal Energy Transfer-labeled Primers”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、in situ ハイブリダイゼーションを利用した検出方法の場合、標的核酸の検出感度が十分でないという問題がある。
【０００８】
一方、in situ PCR を利用した検出方法の場合、HTLV-Ｉ感染細胞のゲノムに組み込まれたウイルスDNA（プロウイルス）を標的核酸として増幅することができるため、in situ ハイブリダイゼーションを利用した検出方法よりも感度が向上することが期待される。しかしながら、in situ PCR を利用した従来の検出方法の場合、非特異的増幅が顕著であり、これを抑えることが極めて難しいことから、実用的な方法とはなっていないのが現状である。
【０００９】
また、このような従来の検出方法では顕微鏡による検出が限界であり、フローサイトメトリーによってHTLV‐Ｉ感染細胞の検出を可能とする技術は存在しない。フローサイトメトリーによってHTLV‐Ｉ感染細胞の検出をすることができれば、生体内でのHTLV‐Ｉ感染細胞の病態解析をより定量的に行うことが可能になる。
【００１０】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、in situ PCR による非特異的増幅を抑制し、フローサイトメトリーによるHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、HTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法であって、
以下の工程：
（１）ヒト血液から分離されたCD4陽性T細胞とBD Cytofix/Cytoperm bufferとを混合する第１固定・透過処理工程；
（２）前記細胞と、25〜150μg/mLのプロテイナーゼKとを混合して、30〜60℃で10〜45分間反応させるタンパク質分解工程；
（３）UniPrimer、第１プライマー、第２プライマー、dNTPsおよびDNAポリメラーゼを含むPCR反応液と、前記細胞とを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応によってHTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖標的配列を増幅させるin situ PCR工程；および
（４）前記in situ PCR工程で得られたPCR産物の蛍光をフローサイトメトリーによって検出する検出工程
を含み、
前記in situ PCR工程において、前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列と、前記一本鎖標的配列と相補的な相補的一本鎖標的配列とからなり、
前記第１プライマーは、前記一本鎖標的配列の５’末端配列と、この配列の５’末端側に付加された前記UniPrimerの３’末端配列とを含み、
前記第２プライマーは、前記一本鎖標的配列の３’末端側と相補的な相補配列と、この相補配列の５’末端側に付加された前記UniPrimerの３’末端配列とを含み、
前記二本鎖標的配列を含むPCR産物の両端には、前記UniPrimerに由来する蛍光領域が形成されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法によれば、in situ PCR による非特異的増幅が抑制され、HTLV‐Ｉ感染細胞をフローサイトメトリーによって検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程の一実施形態の概要を例示した概要図である。
【図２】本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程後の細胞をフローサイトメトリーで分析し、FSC及びSSCで展開した図である。黒はin situ PCR反応液中にDNAポリメラーゼを含まない場合、赤は含む場合をそれぞれ示している。
【図３】本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程後の細胞をフローサイトメトリーで分析し、図2でゲートした細胞集団について蛍光強度をヒストグラムで示した図である。黒はin situ PCR反応液中にDNAポリメラーゼを含まない場合、赤は含む場合をそれぞれ示している。
【図４】本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程後の細胞を完全に分解した後、アガロースゲル電気泳動し、蛍光を検出した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法は、HTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法であって、
以下の工程：
（１）ヒト血液から分離されたCD4陽性T細胞とBD Cytofix/Cytoperm bufferとを混合する第１固定・透過処理工程；
（２）前記細胞と、25〜150μg/mLのプロテイナーゼKとを混合して、30〜60℃で10〜45分間反応させるタンパク質分解工程；
（３）UniPrimer、第１プライマー、第２プライマー、dNTPsおよびDNAポリメラーゼを含むPCR反応液と、前記細胞とを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応によってHTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖標的配列を増幅させるin situ PCR工程；および
（４）前記in situ PCR工程で得られたPCR産物の蛍光をフローサイトメトリーによって検出する検出工程
を含んでいる。
【００１５】
以下、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法の一実施形態について説明する。
【００１６】
（第１固定・透過処理工程）
第１固定・透過処理工程では、ヒト血液から分離されたCD4陽性T細胞とBD Cytofix/Cytoperm bufferとを混合する。
【００１７】
被験者から採取した全血からCD4陽性T細胞を分離する。CD4陽性T細胞を分離する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜採用することができる。具体的には、CD4陽性T細胞を分離するための市販のキットとしては、例えば、STEM CELL TECHNOLOGIES社の「EasySepTM Direct Human CD4+ T Cell Isolation Kit」などを例示することができる。
【００１８】
そして、分離されたCD4陽性T細胞と、細胞の固定・透過処理用バッファーとを混合して懸濁液を得る。細胞の固定・透過処理用バッファーは、フローサイトメトリーによってHTLV‐Ｉ感染細胞を検出するための試薬であり、本発明では、BD biosciences社の「BD Cytofix/Cytoperm buffer」を使用する。バッファーの組成などは、フローサイトメトリーによるHTLV‐Ｉ感染細胞の検出結果に大きく影響するが、本発明では、BD biosciences社の「BD Cytofix/Cytoperm buffer」を使用することで、フローサイトメトリーによるHTLV‐Ｉ感染細胞の検出を向上させることができる。「BD Cytofix/Cytoperm buffer」以外のバッファーの場合、各工程における条件の設定が容易でなく、フローサイトメトリーによるHTLV‐Ｉ感染細胞の検出を行うことは難しい。
【００１９】
第１固定・透過処理工程での具体的な固定・透過処理方法は、プロトコルに従って行うことができる。
【００２０】
また、第１固定・透過処理工程を経た細胞に洗浄液を供給した後、4〜25℃で、48時間以内に次の工程に進むことが好ましい。洗浄液は、BD biosciences社の「BD Perm/Wash buffer」であることが好ましい。例えば、細胞を洗浄液に入れて4〜25℃、好ましくは4℃で、16〜19時間放置することができる。放置する温度と放置時間は検出結果に影響する。
【００２１】
（追加透過処理工程）
このHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法の実施形態においては、追加透過処理工程を含むことできる。追加透過処理工程では、細胞と、BD biosciences社の「BD permeabilization buffer plus」と混合することで透過処理を行うことができる。具体的な透過処理の方法は、プロトコルに従って行うことができる。
【００２２】
また、追加透過処理工程では、細胞に洗浄液を供給して洗浄する処理を含むことができ、この場合、洗浄液としてBD Perm/Wash bufferを使用することが好ましい。
【００２３】
（第２固定・透過処理工程）
このHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法の実施形態においては、第２固定・透過処理工程を含むことができる。第２固定・透過処理工程では、追加透過処理工程での透過処理を行った細胞とBD Cytofix/Cytoperm bufferとを混合して懸濁液を得る。この第２固定・透過処理工程においても、細胞の固定・透過処理用バッファーとして、BD biosciences社の「BD Cytofix/Cytoperm buffer」を使用する。具体的な固定・透過処理方法は、プロトコルに従って行うことができる。
【００２４】
また、第２固定・透過処理工程では、細胞に洗浄液を供給して洗浄する処理を含むことができ、この場合、洗浄液としてBD Perm/Wash bufferを使用することが好ましい。
【００２５】
（タンパク質分解工程）
タンパク質分解工程では、上述した工程を経た細胞と25〜150μg/mLのプロテイナーゼKとを混合して、30〜60℃で10〜45分間反応させる。この条件でタンパク質を適度に分解することで、in situ PCR工程での検出感度を高めることができる。
【００２６】
プロテイナーゼKの濃度は、例えば、BD biosciences社の「BD Perm/Wash buffer」で希釈して調整することができる。プロテイナーゼKの濃度は、25〜150μg/mLの範囲が好ましく、50μg/mL程度であることがより好ましい。
【００２７】
また、プロテイナーゼKとの反応時間は、プロテイナーゼKの濃度にもよるが、10〜45分の範囲を好ましく例示することができる。
【００２８】
また、タンパク質分解工程では、細胞に洗浄液を供給して洗浄する処理を含むことができ、この場合、洗浄液としてBD Perm/Wash bufferを使用することが好ましい。
【００２９】
（in situ PCR工程）
in situ PCR工程では、PCR反応液と細胞とを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応によってHTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖標的配列を増幅させる。
【００３０】
二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列と、一本鎖標的配列と相補的な相補的一本鎖標的配列とからなる。二本鎖標的配列は、既知のHTLV‐Ｉプロウィルスの配列に基づいて適宜設計することができる。
【００３１】
PCR反応液は、UniPrimer（Universal energy transfer-labeled primer）、第１プライマー、第２プライマー、dNTPsおよびDNAポリメラーゼを含む。
【００３２】
UniPrimerを利用したin situ PCRに関する技術は、例えば非特許文献４に報告されている。
【００３３】
具体的には、UniPrimerは、蛍光レポーター（例えばフルオレセイン）が向かい合うクエンチャーによって消光するヘアピン構造を有しており、PCRによる伸長によって蛍光レポーター／クエンチャーを含む配列がPCR産物に一旦組み込まれると、ヘアピン構造が解除されることで、クエンチャーは蛍光レポーターから離れて、蛍光レポーターが蛍光を発する。
【００３４】
UniPrimerを使用することで、PCRにおける非特異的増殖を抑制することができる。
【００３５】
in situ PCR工程では、従来知られているUniPrimerを使用することができる。具体的には、UniPrimerは、例えば、Millipore社の「Amplifluor UniPrimer II」などを使用することができる。
【００３６】
PCR反応液中のUniPrimerの濃度は、0.25〜0.5μMの範囲を一応の目安として例示することができる。
【００３７】
第１プライマーは、35〜45塩基を有する核酸であり、一本鎖標的配列の５’末端配列と、この一本鎖標的配列の５’末端側に付加されたUniPrimerの３’末端配列とを含んでいる。
【００３８】
第１プライマーの配列は具体的に限定されないが、例えば、以下の配列番号１の配列を例示することができる。
【００３９】
配列番号１：actgaacctgaccgtacaggcagatgacaatgaccatgagc
【００４０】
また、PCR反応液中の第１プライマーの濃度は、所望の増幅の量（サイクル数）などに応じて適宜設定することができるが、0.05〜0.1μMの範囲を一応の目安として例示することができる。
【００４１】
第２プライマーは、35〜45塩基を有する核酸であり、一本鎖標的配列の３’末端側と相補的な配列と、この相補配列の５’末端側に付加されたUniPrimerの３‘末端配列を含んでいる。第２プライマーの配列は具体的に限定されないが、例えば、以下の配列番号２の配列を例示することができる。
【００４２】
配列番号２：actgaacctgaccgtacaggggagacgtcagagccttatt
【００４３】
また、PCR反応液中の第２プライマーの濃度は、所望の増幅の量（サイクル数）などに応じて適宜設定することができるが、0.05〜0.1μMの範囲を一応の目安として例示することができる。
【００４４】
dNTPsは、ｄＡＴＰ（デオキシ−アデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシ−グアニン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシ−シトシン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシ−チミン三リン酸）の混合物である。  PCR反応液中のdNTPsの濃度は、所望の増幅の量（サイクル数）などに応じて適宜設定することができるが、0.2ｍMを一応の目安として例示することができる。
【００４５】
DNAポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼを使用することができるが、ホットスタートを行なうことができるものであることが好ましい。ホットスタートは、PCR反応を行なう前に、ＰＣＲ混合物を９５℃程度の高温で一定の時間加熱することを意味する。
【００４６】
具体的には、DNAポリメラーゼは、タカラバイオ社の「Takara EX Taq Hot Start Version」であることが好ましい。このDNAポリメラーゼであると、非特異的増幅をより確実に抑制することができる。
【００４７】
PCR反応液中のDNAポリメラーゼの濃度は、所望の増幅の量（サイクル数）などに応じて適宜設定することができるが、0.025〜0.05U/μlの範囲を一応の目安として例示することができる。
【００４８】
PCR反応液中の細胞濃度は、0.1〜0.2×10６cells/30μlの範囲であることが好ましい。PCR反応液中の細胞濃度がこの範囲であると、検出感度を向上させることができる。
【００４９】
次に、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程の一実施形態について、図１とともに詳しく説明する。図１は、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法におけるin situ PCR工程の一実施形態の概要を例示した概要図である。
【００５０】
図１に例示したように、１サイクル目では、HTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖DNAから得た一本鎖DNA１に含まれる一本鎖標的配列の３’末端側に、第２プライマーＰ２の相補配列Ｃ２が結合し、第２プライマーＰ２からDNA２が伸長する。
【００５１】
２サイクル目では、第２プライマーＰ２から伸長した新たな一本鎖DNA２に含まれる相補的一本鎖標的配列の３’末端側に第１プライマーＰ１が結合し、第１プライマーＰ１からDNA４が伸長する。このとき、第２プライマーＰ２には、相補配列Ｃ２の５’末端側にUniPrimer３の３’末端配列Ｂが付加されているため、第１プライマーから伸長したDNA４は、３’末端にUniPrimer３との結合配列Ｄ（UniPrimer３の３’末端配列Ｂと相補的な配列）が形成されている。
【００５２】
３サイクル目では、第１プライマーＰ１から伸長した一本鎖DNA４の３’末端にUniPrimer３が結合して、DNAが伸長する。そして、UniPrimer３の一部と相補的な配列Ｅが形成されると、UniPrimer３のへアピン構造が解除され、クエンチャーが蛍光レポーターから離れるため、蛍光レポーターが蛍光を発する。また、第１プライマーＰ１には、配列Ｃ１の５’末端側にUniPrimer３の３’末端配列Ｂが付加されているため、UniPrimer３から伸長したDNA５は、３’末端にUniPrimer３との結合配列Ｄ（UniPrimer３の３’末端配列Ｂと相補的な配列）が形成されている。
【００５３】
４サイクル目では、３サイクル目で得た二本鎖DNAから得た一本鎖DNA５の３’末端の結合配列ＤにUniPrimer３が結合して、DNAが伸長する。３サイクル目で得た二本鎖DNAから得た一本鎖DNA５の５’末端には、UniPrimer３のヘアピン構造が形成されているが、UniPrimer３からDNA６が伸長して、UniPrimer３の一部と相補的な配列Ｅが形成されると、UniPrimer３のへアピン構造が解除されるため蛍光レポーターが蛍光を発する。
【００５４】
また、DNA５の伸長に伴って、UniPrimer３の一部と相補的な配列Ｅが形成されると、UniPrimer３のへアピン構造が解除されるため蛍光レポーターが蛍光を発する。
【００５５】
このように、二本鎖標的配列を含むPCR産物の両端には、UniPrimer３に由来する蛍光領域が形成される。以後のサイクルでは、蛍光領域が形成されたPCR産物が増幅する。
【００５６】
なお、PCRにおける加熱温度と加熱時間、および、冷却温度と冷却時間は、DNAポリメラーゼなどに応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、タカラバイオ社の「Takara EX Taq Hot Start Version」を使用する場合、95〜98℃で10秒の加熱（変性）、60〜65℃で20秒の冷却（アニーリング）、72℃で40秒の加熱（伸長）のサイクルを50サイクル繰り返すことで、非特異的増幅を抑制し、HTLV‐Ｉプロウィルスの二本鎖標的配列を含むPCR産物を効率的に増幅させることができる。
【００５７】
（検出工程）
この工程では、in situ PCR工程で得られたPCR産物の蛍光をフローサイトメトリーによって検出する。
【００５８】
フローサイトメトリーによる検出には、市販のフローサイトメーターを使用することができる。
【００５９】
以上のように、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法では、各工程において、検出感度を高め、非特異的増幅を抑制するための条件が設定されている。特に、in situ PCR工程で得られたPCR産物の両端には、UniPrimerに由来する蛍光領域が形成されている。したがって、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法では、in situ PCR工程において、HTLV‐Ｉプロウィルスを含む二本鎖標的配列が増幅されている場合は、HTLV‐Ｉ感染細胞の蛍光をフローサイトメトリーによって高感度で検出することができる。
【００６０】
本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法は、以上の実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法について実施例とともに説明するが、本発明のHTLV‐Ｉ感染細胞の検出方法は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６２】
＜１＞CD4陽性T細胞の分離
ヘパリンチューブに血液を採取し、STEM CELL TECHNOLOGIES社の「EasySepTM Direct Human CD4+ T Cell Isolation Kit」を用いて、全血からCD4陽性Tリンパ球を分離した。遠心分離機で300g、5分間遠心処理し、上澄みを取り除いた後、1mlのPBSで細胞ペレットを懸濁して細胞数を数え、適切な数の細胞を新しいチューブに入れ、遠心分離機で300g、5分間遠心処理し、上澄みを取り除いた。
【００６３】
＜２＞細胞の固定・透過処理
細胞ペレットをBD Cytofix/Cytoperm buffer 100μlの中に入れて再懸濁することによって、細胞を固定し、室温で30分間インキュベートした（第１固定・透過処理工程）。
【００６４】
その後、洗浄液としてBD Perm/Wash buffer 1mlを加え、冷蔵庫（4℃）に一晩（16時間）放置した。
【００６５】
＜３＞追加透過処理
300gで5分間、チューブを遠心分離して上澄みを取り除き、細胞ペレットをBD permeabilization buffer plus 100のμlの中に入れて再懸濁することによって、細胞を透過処理し、10分間、氷上でインキュベートした。1mlのBD Perm/Wash bufferを加え、300gで5分間、遠心分離機により遠心処理を行って、上澄みを取り除いた。
【００６６】
＜４＞再固定・透過処理
細胞ペレットをBD Cytofix/Cytoperm buffer 100μlの中に入れて再懸濁することによって、細胞を再固定し、室温で5分間インキュベートした（第２固定・透過処理工程）。
【００６７】
その後、1mlのBD Perm/Wash bufferを加え、300gで5分間、遠心分離機により遠心処理を行って、上澄みを取り除き、細胞ペレットを150μlのBD Perm/Wash bufferの中に入れて再懸濁し、エッペンドルフチューブに移した。さらに、300gで5分間、遠心分離機により遠心処理を行った後、完全に上澄みを取り除いた。
【００６８】
＜５＞プロテイナーゼKによるタンパク質の分解処理
細胞ペレットをプロテイナーゼK 100μl（50μg/ml をBD Perm/Wash bufferで希釈した）の中に入れ再懸濁し、40℃で15分間インキュベートした（タンパク質分解工程）。
【００６９】
1mlのBD Perm/Wash bufferを加えて、300gで5分間、遠心分離機により遠心処理を行って、上澄みを取り除き、適切な量のBD Perm/Wash bufferで細胞ペレットを再懸濁して、PCRチューブに移した。
【００７０】
＜６＞in situ PCR
3分間、PCRチューブを遠心分離し、完全に上澄みを取り除いた。
【００７１】
PCR反応液は、以下の材料を添加して調整した。
【００７２】
・UniPrimer：Millipore社「Amplifluor UniPrimer II」0.5μM
・第１プライマー  0.1μM
配列番号１：actgaacctgaccgtacaggcagatgacaatgaccatgagc
・第２プライマー  0.1μM
配列番号２：actgaacctgaccgtacaggggagacgtcagagccttatt
・dNTPs：0.2ｍM
・  DNAポリメラーゼ：Takara EX Taq Hot Start Version 0.05U/μL
・  Takara EX Taq バッファー  1×
細胞ペレットをPCR反応液の中に入れて再懸濁し、以下の条件でPCRを行った。
（１）DNAポリメラーゼの活性化及びプロテイナーゼKの不活化 95℃ 10分間
（２）変性 95℃ 10秒間
（３）アニーリング 63℃ 20秒間
（４）伸長反応 72℃ 40秒間
（５）最終的な伸長反応72℃ 5分間
（６）4℃での維持
そして、上記（２）から（４）の反応を50サイクル行ってPCR産物を得た。
【００７３】
＜７＞フローサイトメトリー（FACS：fluorescence activated cell sorting)
（１）200-300μlのPBSを含むFACSチューブを準備し、直接、FACSチューブにPCR溶液を添加した。
【００７４】
フローサイトメーターとしてBD社「BD FACSCalibur」を使用してFACSを実行した。
【００７５】
（２）結果を図２、図３に示す。図２は、FSCとSSCで展開したドットプロットであり、図３は図２でゲートした細胞集団のフルオレセイン蛍光強度を示したヒストグラム図である。両図とも黒がPCR反応液中にDNAポリメラーゼを含まない場合、赤がDNAポリメラーゼが含む場合を示している。陰性コントロール細胞として健常人のCD4陽性細胞を用い、陽性コントロール細胞としてHTLV-Ｉに感染している成人T細胞白血病患者のCD4陽性細胞を用いた。
【００７６】
図２に示したように、健常人及び患者由来のCD4陽性細胞はいずれも単一の細胞集団として確認され、DNAポリメラーゼの有無で細胞の形態及び内部構造に大きな変化は認められなかった。
【００７７】
図３に示したように、標的特異的プライマーが存在しない場合、蛍光の変化はない。このことから、標的特異的プライマー非依存的な非特異的PCR増幅によるノイズはないことが確認された。
【００７８】
βグロビンに対するプライマーが存在する場合、健常者及び患者由来のCD4陽性細胞はいずれも全細胞で蛍光が認められた。このことは、健常者及び患者由来のCD4陽性細胞はいずれもβグロビンの標的配列を有しており、DNAポリメラーゼによってPCR産物が増幅し、UniPrimer由来の蛍光が生じたと考えられた。
【００７９】
HTLV-Ｉに対するプライマーが存在する場合、健常者由来のCD4陽性細胞では蛍光の変化は認められなかったが、患者由来のCD4陽性細胞ではほぼ全細胞で蛍光が認められた。このことは、健常者由来のCD4陽性細胞ではHTLV-Ｉの標的配列がないため、PCR産物が生じないのに対して、患者由来のCD4陽性細胞では、ほぼ全ての細胞がHTLV-Ｉ標的配列を有しているため、DNAポリメラーゼによってPCR産物が生じ、UniPrimer由来の蛍光が生じたと考えられた。健常者由来のCD4陽性細胞で蛍光の変化が認められないことは、HTLV-Ｉプライマー依存的な非特異的増幅が起こっていないことを示している。以上より、フローサイトメトリーによってHTLV‐Ｉ感染細胞は特異的に検出可能であることが確認された。
【００８０】
＜８＞電気泳動
（１）FACS分析と等量のPCR溶液をPCRチューブに移し、5分間チューブを遠心分離して、上澄みをごく少量を残し取り除いた。プロテイナーゼK 10μl（100μg/ml）を加えて再懸濁し、完全に細胞を溶解するために、55℃で2時間以上インキュベートした。
【００８１】
細胞の懸濁液10〜12μlをブロモフェノールブルー（BPB）2μlと混合し、2%のアガロースゲルに添加するとともに、DNAサイズマーカーとしてFluoroBand 100bp DNAラダー（-20℃で保存される）を4μl 添加し、35〜40分間、電気泳動を行って、富士フィルム社の「LAS-3000」でフルオレセイン蛍光を観察した。
【００８２】
（２）結果を図４に示す。
【００８３】
図４に示したように、HTLV-Ｉ及びβグロビンのプライマー使用時に認められたin situ PCR産物は期待される大きさに単一バンドとして認められた。このことから、in situ PCRで認められた蛍光は特異的PCR産物に由来することが確認された。また、非特異的in situ PCR産物がほとんどないことも確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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