(57)【要約】【課題】本発明は、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを高い精度で、簡便かつ容易に判定することを可能とする新たな手法を提供することを目的とする。【解決手段】患者より採取された試料における、ＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐの量を測定し、得られた測定値を用いて、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法であって、
患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定すること、
得られた測定値と参照値とを用いて、患者がＮＡＳＨであるか否かを判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することを含む、方法。
【請求項２】
ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定値が、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＫ−１８及び／又はその断片の量を、Ｍ５抗体及びＭ６抗体ならびに／あるいはＭ３０抗体及びＭ５抗体もしくはＭ６抗体を用いて測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の活性を測定し測定値を得ることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＳＨの診断方法において使用するためのキットであって、患者より採取された試料におけるＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐのそれぞれに対する抗体を含む、キット。
【請求項６】
ＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐをそれぞれ標識するための抗体及び／又は化合物をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者試料中のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定値を利用したＮＡＳＨの検出／診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）はアルコールを発生原因としない脂肪肝の総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌へと進行する可能性がある非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（以下、「ＮＡＳＨ」と記載する）と、進行せず良性の経過をたどる非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ）（以下、「ＮＡＦＬ」と記載する）とに区別される。日本国内においては、約１００万〜２００万人がＮＡＳＨに罹患していると考えられている。
【０００３】
現在、ＮＡＳＨの確定診断は、肝生検により行われることが一般的である。しかしながら、肝生検は部位による肝組織像の差異（サンプリングエラー）が生じ得、例えば、５１例のＮＡＦＬＤ患者の２つの肝生検サンプルについて、各々のグレーディング（ｇｒａｄｉｎｇ）及びステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）を行ったところ、肝脂肪化について４１例（７８％）、線維化について２１例（４１％）の一致率が示され、２つのサンプル間で差が生じたことが報告されている（非特許文献１）。また、左葉と右葉からの肝生検サンプルにおいて、線維化のステージで１段階以上の違いが約３０％認められたとの報告もある。さらに、肝生検は肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取する工程を含むものであることから、患者、臨床現場、及び医療経済に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを生ずるものとなっている。このように様々な問題を生じ得ることから、肝生検に代わる新たなＮＡＳＨ診断法の開発が切望されている。
【０００４】
近年、患者血清におけるバイオマーカーの発現量を指標にして、ＮＡＳＨを検出・判定する方法が開発されている。このようなバイオマーカーには、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、血小板、血糖、空腹時インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、レプチン、アディポネクチン、レチノール結合タンパク質４、脂質過酸化物、酸化ＬＤＬ、チオレドキシン、ＴＮＦ−α、高感度ＣＲＰ，フェリチン、ペントラキシン３、ＩＬ−６、オステオプロテグリン、ＣＣ−ケモカインリガンド−２、ＩＣＡＭ−１、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）の断片、ヒアルロン酸、４型コラーゲン７Ｓ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ１、ＤＨＥＡ−Ｓ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、エンドセリン−１、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）等が含まれる。例えば、ＣＫ−１８の断片は、健常者やＮＡＦＬＤ患者と比べてＮＡＳＨ患者において高値を示すことが報告されている（非特許文献２−４）。また、Ｆｕｃ−ＨｐｔとＭａｃ−２ｂｐの２つのバイオマーカーを組み合わせて利用することによってＮＡＳＨを良好に検出・判定できることが報告されている（非特許文献５）。
【０００５】
しかしながら、バイオマーカーを利用したＮＡＳＨの検出・判定方法は、いずれも研究段階であり、実用化に至ってはおらず、一般臨床レベルで利用可能な高い精度を有する手法の確立が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｔｚｉｕ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１０，５３，３７２−３８４
【非特許文献２】Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００６，４４，２７−３３
【非特許文献３】Ｙｉｌｍａｚ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００７，１３，８３７−８４４
【非特許文献４】Ｄｉａｂ  ＤＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ，２００８，６，１２４９−１２５４
【非特許文献５】Ｋａｍａｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１５，Ｊｕｌ．２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的に、病気の検出・判定方法の「精度」は、「感度」及び「特異度」によって評価することができる。「感度」及び「特異度」は、病気の検出・判定の結果と病気の有無に基づいて表すことができ、「感度」は、（真陽性）／（真陽性＋偽陰性）の割合で、「特異度」は、（真陰性）／（真陰性＋偽陽性）の割合で示される。感度を高めることにより、病気の検出能を高めることができ、病気の見落としが生じる可能性を低下させることができる。一方、特異度を高めることによって、病気でないものを病気と誤判定する可能性を低下させることができる。「感度」及び「特異度」はトレードオフの関係にあり、いずれを重要視するかは、病気の種類や検出・判定方法の目的に応じて異なる。
【０００８】
ＮＡＳＨの検出・判定方法においては、ＮＡＦＬＤ患者の中からＮＡＳＨ患者を見落とすことなく拾い上げることができる高い感度と、ＮＡＳＨ患者とＮＡＦＬ患者とを区別して検出・判定することができる高い特異度が要求される。
【０００９】
本発明は、一般臨床レベルで利用可能な高い感度と高い特異度を有すると共に、簡便・容易に実施することを可能とする、新たなＮＡＳＨの検出・判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定し、得られた測定値を利用して、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを高い精度で判定／診断し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法であって、
患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）の量を測定すること、
得られた測定値と参照値とを用いて、患者がＮＡＳＨであるか否かを判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することを含む、方法。
［２］  ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定値が、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法により得られる、［１］の方法。
［３］  ＣＫ−１８及び／又はその断片の量を、Ｍ５抗体及びＭ６抗体ならびに／あるいはＭ３０抗体及びＭ５抗体もしくはＭ６抗体を用いて測定することを含む、［２］の方法。
［４］  さらに、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の活性を測定し測定値を得ることを含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  ＮＡＳＨの診断方法において使用するためのキットであって、患者より採取された試料におけるＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐのそれぞれに対する抗体を含む、キット。
［６］  ＣＫ−１８もしくはその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐをそれぞれ標識するための抗体及び／又は化合物をさらに含む、［５］のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを高い精度で、簡便かつ容易に診断／判定することができ、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出することができる。
【００１３】
また、本発明によれば、肝生検を用いることなく、低侵襲性な手法により、ＮＡＦＬＤ患者より、ＮＡＳＨ患者を高い精度で選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料中におけるＣＫ−１８の断片の測定値（Ｍ３０抗体による検出）を示すプロット図である。
【図２】図２は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料中におけるＦｕｃ−Ｈｐｔの測定値を示すプロット図である。
【図３】図３は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料中におけるＭａｃ−２ｂｐの測定値を示すプロット図である。
【図４】図４は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料中におけるＣＫ−１８及びその断片の測定値（Ｍ５抗体による検出）を示すプロット図である。
【図５】図５は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）に基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ）曲線である。
【図６】図６は、患者血清試料中におけるＦｕｃ−Ｈｐｔ量に基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図７】図７は、患者血清試料中におけるＭａｃ−２ｂｐ量に基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図８】図８は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８及びその断片量（Ｍ５抗体による検出）に基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図９】図９は、患者血清試料中におけるＦｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１０】図１０は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）及びＦｕｃ−Ｈｐｔ量の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１１】図１１は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１２】図１２は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１３】図１３は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（Ｍ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１４】図１４は、患者血清試料中におけるＣＫ−１８の断片量（Ｍ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（Ｍ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性ならびにＡＬＴ活性の組み合せに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１５】図１５は、ＮＡＦＬＤ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｓｃｏｒｅ（ＮＦＳ）に基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１６】図１６は、ＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【図１７】図１７は、ＢＡＲＤ  ｓｃｏｒｅに基づくＮＡＳＨ診断能を示すＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．ＮＡＳＨの診断／検出方法
本発明は、患者より採取された試料における、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）及び／又はその断片、フコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）、ならびにＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ−２ｂｐ）等のタンパク質マーカーの量を測定し、当該測定値を利用して、該患者がＮＡＳＨに罹患しているか否か診断／判定し、患者におけるＮＡＳＨの有無を検出する方法に関する。
【００１６】
（タンパク質マーカーの定量）
本発明において「患者」とは、明らかな飲酒歴のない（エタノール換算で１日２０ｇ未満の飲酒量）脂肪肝患者（いわゆるＮＡＦＬＤ患者）が挙げられる。ＮＡＦＬＤ患者には、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者が含まれ得るが、本発明によればＮＡＳＨ患者を、ＮＡＦＬＤ患者の集団より高い精度で選別することができる。
【００１７】
本発明において「患者より採取された試料」としては、患者由来の体液を挙げることができ、患者より比較的低侵襲的に採取可能な試料を用いることができる。体液としては例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、患者より採取された試料は、血液、血清、又は血漿であり、より好ましくは血清である。
【００１８】
本発明において、患者より採取された試料は、そのまま利用してもよいし、あるいは採取された試料より目的のタンパク質マーカーが精製又は粗精製された形態のものを利用してもよい。
【００１９】
目的のタンパク質マーカーの精製又は粗精製は、タンパク質の精製もしくは粗精製に一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過カラム、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）、フィルター法、ポリマーによる沈殿法、抗体やレクチンによる吸着法等の一又は複数を組み合わせた手法により行うことができる。
【００２０】
本発明の「タンパク質マーカー」としては、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐが挙げられる。
【００２１】
ヒトのＣＫ−１８は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０５７８３．２；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿９５４６５７．１；ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００２１５．１等）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。
【００２２】
本発明において利用可能なＣＫ−１８の断片は、検出・定量可能なＣＫ−１８の断片であればよく、特に限定されるものではないが、ＣＫ−１８がカスパーゼにより切断されて生じる断片等が挙げられる。ＣＫ−１８がカスパーゼにより切断されて生じる断片は公知であり、ＣＫ−１８のＡｓｐ・Ａｌａ・Ｌｅｕ・Ａｓｐ−Ｓｅｒ部位をカスパーゼが認識・切断し生じた断片のうち、Ｃ末端にＡｓｐ・Ａｌａ・Ｌｅｕ・Ａｓｐのアミノ酸配列を有する断片を利用することができる（Ｔｈｏｍａｓ  Ｌｕｆｔら、ＢＬＯＯＤ，ＶＯＬ．１１０，Ｎｏ．１３，ｐｐ．４５３５−４５４２，２００７）。本明細書において、ＣＫ−１８の断片を「ＣＫ−１８Ｆ」と記載する場合がある。
【００２３】
「Ｆｕｃ−Ｈｐｔ」は、ヒトのハプトグロビンにおけるＮ末端（メチオニン末端）より１８４番目、２０７番目、２１１番目、及び２４１番目より選択される一以上の位置におけるアスパラギンに結合した糖鎖にフコースが結合して修飾（フコシル化）されてなるハプトグロビンである（特開２００９−１６８４７０号公報）。ヒトのハプトグロビンは公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８０８０．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨ００３３４４．２等）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。
【００２４】
「Ｍａｃ−２ｂｐ」は公知であり、ヒトのＭａｃ−２ｂｐはＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３６１９３．１；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ１３２１０．１）にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。本発明において、Ｍａｃ−２ｂｐはレクチンと結合していても、していなくてもよいが、好ましくは、Ｍａｃ−２ｂｐに関し、下記「捕捉手段」及び「標識手段」としてレクチンは利用しない。
【００２５】
本発明の「タンパク質マーカー」には、上記ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐに加えて、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＶＣＡＭ−１、ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ、ヒアルロン酸等から選択される一又は複数を含めることができる。これらはＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースにそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。例えば、ＡＳＴはＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ３７４００．１やＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５５６３．１にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、また、ＡＬＴはＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００５３００．１やＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１０３５５．１にそのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等が開示されており、本発明においてはこれらの情報を利用することができる。ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐに加えて、さらにこれらのタンパク質マーカーを利用することによってＮＡＳＨの診断／検出の精度をより高めることができる。
【００２６】
試料中の各タンパク質マーカーの定量は、タンパク質の定量解析において一般的に用いられる手法により行うことができ、例えば、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法（サンドイッチ法、競合法）、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロット法、ナノトラッキング法（ナノサイト（登録商標））等を利用することができるが、これらに限定はされない。好ましくはＥＬＩＳＡ法である。
【００２７】
例えば、本発明の一例においては、固相担体に結合された各タンパク質マーカーに対する抗体（捕捉手段）と、試料とを接触させ、さらに、各タンパク質マーカーに結合可能な標識手段を接触させ、これにより捕捉抗体−タンパク質マーカー−標識手段からなるサンドイッチ複合体を形成する。次いで、当該複合体における標識手段を検出・定量することによって、試料中の各タンパク質マーカーを検出・定量することができる。
【００２８】
「捕捉手段」として利用可能な抗体は、標的となるタンパク質マーカーと結合可能なものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、標的となるタンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。
【００２９】
抗体の種類は、特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれの種類も利用することができる。また、抗体には、標的となるタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。本発明において利用可能な「抗体断片」には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｃｂ、Ｆｄ等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００３０】
捕捉手段を固相化するための固相担体には、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等（これらに限定はされない）の材質、ならびにこれらの組み合わせからなるものを利用することができる。固相担体の形状は特に限定されることなく、プレート、ディッシュ、ビーズ、球、スティック等の形状とすることができる。固相担体への捕捉手段となる抗体の結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等によって行うことができる。一つの固相担体に対して、標的となるタンパク質マーカーが異なる複数種の捕捉手段が固相化されていてもよいし、あるいは、異なる捕捉手段はそれぞれ別々の固相担体に固相化されていてもよい。
【００３１】
「標識手段」としては、標的となるタンパク質マーカーと結合可能な抗体や化合物を利用することができる。
【００３２】
標識手段となる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、標的となるタンパク質マーカーの特異的な検出を可能とするモノクローナル抗体である。また、抗体には、標的となるタンパク質マーカーと結合することが可能な抗体断片も含まれる。本発明において利用可能な「抗体断片」には、上述したものが挙げられる。
【００３３】
標識手段として利用される抗体と、捕捉手段として利用される抗体とは、互いの結合が干渉しないように両者の結合部位（エピトープ）は異なるものであることが好ましい。また、標識手段として利用される抗体と、捕捉手段として利用される抗体とは、両者を区別して検出できるように、異なる動物種から産生されたものを利用することができる。
【００３４】
本発明において捕捉手段、及び標識手段として利用可能な抗体は、抗体製造において一般的に用いられる手法（Ｋｅｎｎｅｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）によって製造されたものを用いても良いし、あるいは市販のものを用いても良い。
【００３５】
例えば、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段又は標識手段として利用可能な抗体としては、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）を認識・結合できる抗体を利用することができ、またＣＫ−１８の断片の捕捉手段又は標識手段として利用可能な抗体としては、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体を利用することができる。
【００３６】
例えば、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段として、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用し、標識手段として、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体を使用してもよいし、あるいは、標識手段として、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用してもよい。標識手段として、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体、及び、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体を使用する場合には、それぞれ別個の解析系において用いることが好ましい。
【００３７】
本発明においては、ＣＫ−１８及び／又はその断片の捕捉手段又は標識手段として、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができる。好ましくは、捕捉手段として抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、又は抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができ、標識手段として、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、又は抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用することができる。なお、本明細書中、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）」を単に「Ｍ５抗体」、抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を単に「Ｍ６抗体」、抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を単に「Ｍ３０抗体」と呼ぶ場合がある。上述のＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体には「Ｍ３０抗体」が含まれ、ＣＫ−１８及びその断片に含まれるサイトケラチン１８の中間部（サイトケラチン１８の２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体には、「Ｍ５抗体」及び「Ｍ６抗体」が含まれる。なお、本明細書中、「ＣＫ−１８及びその断片」を、単に「ＣＫ−１８」と記載する場合がある。
【００３８】
Ｆｕｃ−Ｈｐｔの捕捉手段として利用される抗体は、標識手段として利用するレクチンの非特異的な結合を回避すべく、Ｆｃ部分の糖鎖よりフコースを除去する（脱フコシル化）か、Ｆｃ部分を除去した抗体断片を用いることが好ましい。
【００３９】
標識手段となる化合物としては、アプタマーやレクチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。例えば、Ｆｕｃ−Ｈｐｔのフコシル化糖鎖に結合可能なレクチン（ヒイロチャワンタケレクチン、スギタケレクチン等）を利用することができる。
【００４０】
「標識手段」である抗体や化合物は、検出可能な標識化合物により標識することができる。このような標識化合物としては、例えば蛍光色素（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリオジニンクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）、酵素（ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性物質、アビジン、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４１】
標識手段の検出は、標識手段に付された標識化合物を当該化合物の検出に適した方法で検出することによって行うことができる。
【００４２】
試料中の各タンパク質マーカーの定量は、その活性値を検出・定量することによって行っても良い。例えば、ＡＳＴの活性は、確立されたＭＤＨ−ＵＶ法に準拠して行うことができる。すなわち、ＡＳＴは、α−ケトグルタール酸のαケト基とＬ−アスパラギン酸のアミノ基の転移反応を触媒して、オキザロ酢酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）は生成したオキザロ酢酸の存在下で、βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤＨ）をβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）に変える。この時のＮＡＤＨの減少速度を波長３３０〜３５０ｎｍで測定することにより、ＡＳＴの活性を求めることができる。また、ＡＬＴの活性は、確立されたＬＤＨ−ＵＶ法に準拠して行うことができる。すなわちＡＬＴは、α−ケトグルタール酸のαケト基とＬ−アラニンのアミノ基の転移反応を触媒して、ピルビン酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は生成したピルビン酸の存在下で、βニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）をβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）に変える。この時のＮＡＤＨの減少速度を波長３３０〜３５０ｎｍで測定することにより、ＡＬＴの活性を求めることができる。
【００４３】
（判定方法）
患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値を、各タンパク質マーカーの「参照値」と比較することによって、当該患者がＮＡＳＨに罹患しているか否か診断／判定することができる。なお、本明細書において、ＮＡＳＨを「判定」、「診断」、「検出」するとは、医師によるものではなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検査による結果に基づいた、「判定」、「診断」、「検出」の補助であってもよい。
【００４４】
本発明においては、ＮＡＳＨ患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値と、ＮＡＦＬ患者より採取された試料におけるタンパク質マーカー量の測定値を利用して、ＮＡＳＨ患者群とＮＡＦＬ患者群とを分ける判別式（判別関数）を作成し、当該判別式を利用して、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを判定することができる。
【００４５】
すなわち、本発明においては、ＮＡＳＨに罹患していることが既知である患者及びＮＡＦＬに罹患していることが既知である患者（すなわち、非ＮＡＳＨ患者）より採取された試料における上述の各タンパク質マーカー量を測定し、これらの測定値を利用して、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者（非ＮＡＳＨ患者）を分類する判別式を作成し、当該判別式に基づいてＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者を判別するカットオフ値（参照値）を求める。次いで、被験者（患者）より採取された試料における各タンパク質マーカー量を同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果を参照値と比較することによって、患者がＮＡＳＨに罹患しているか否かを判定する。
【００４６】
判別式は、線形判別法（ロジスティック回帰分析、フィッシャーの判別分析、ナイーブベイズ分類器、単純パーセプトロン、線形サポートベクターマシン等）や、非線形判別法（カーネル法、ニューラルネットワーク、ｋ近傍法、判別木、アンサンブル法等）等、公知の手法に利用して作成することができる。
【００４７】
カットオフ値（参照値）は、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１−特異度）」に関し、「真陽性（感度）」−「偽陽性（１−特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。
【００４８】
判別式の性能（判定の精度）は、ＲＯＣ曲線下の面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ，ＡＵＣ）より確認することができる。ＡＵＣは０．５〜１の範囲の数値であらわされ、１に近づくほど高い精度を有することを示す。本発明において好ましくは、ＡＵＣは０．９以上である。
【００４９】
本発明において、判別式、ＲＯＣ曲線、及び／又は、カットオフ値（参照値）は、公知の統計解析ソフトを使用して得てもよい。
【００５０】
本発明の一実施形態においては、ＮＡＳＨに罹患していることが既知である患者及びＮＡＦＬに罹患していることが既知である患者より採取された試料における上述の各タンパク質マーカー量を測定し、これらの測定値よりロジスティック回帰分析に基づいて、ＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者（非ＮＡＳＨ患者）を分類するロジスティックモデル式（判別式）を作成し、また、当該判別式に基づいてＲＯＣ曲線を作成し、ＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）」−「偽陽性（１−特異度）」が最大となる値をＮＡＳＨ患者及びＮＡＦＬ患者を判別するカットオフ値（参照値）とする。次いで、被験者（患者）より採取された試料における各タンパク質マーカー量を同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式から得られた結果（スコア）を参照値と比較し、当該判別式から得られた結果（スコア）が参照値以上である場合に、当該被験者（患者）がＮＡＳＨに罹患していると判定する。
【００５１】
２．ＮＡＳＨの診断／検出方法において使用するためのキット
本発明はまた、上述の方法において使用するためのキットに関する。
【００５２】
本キットには、上述のタンパク質マーカーを捕捉するための各捕捉手段を含めることができる。捕捉手段には、上述のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐと結合することが可能な抗体を含めることができる。例えば、ＣＫ−１８の中間部（２８４位〜３９６位のアミノ酸位置）に対応する領域を認識・結合できる抗体（Ｍ５抗体やＭ６抗体）等を含めることができる。好ましくは捕捉手段である抗体は固相担体に結合されている。
【００５３】
加えて／あるいは、本キットには、上述のタンパク質マーカーを標識するための各標識手段を含めることができる。標識手段には、上述のＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、及びＭａｃ−２ｂｐと結合することが可能な抗体や化合物を含めることができる。例えば、ＣＫ−１８の断片のＣ末のＡｓｐを特異的に認識・結合できる抗体（Ｍ３０抗体等）やＦｕｃ−Ｈｐｔのフコシル化糖鎖に結合可能なレクチン（ヒイロチャワンタケレクチン、スギタケレクチン等）等を含めることができる。
【００５４】
本キットにはさらに、タンパク質マーカーと捕捉手段／標識手段と結合反応に適当な緩衝液、当該結合反応の非特異的な結合を阻害するためのブロッキング試薬、標識手段を検出するための検出試薬等を含めることができる。
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
実施例１：ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、ならびにＭａｃ−２ｂｐの測定
１．測定系及び測定条件
（１−１）Ｍ３０抗体を用いたＣＫ−１８の断片のＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
【００５７】
次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ＰＢ）（ブロッキング液）を各ウェル充填し、４℃一晩インキュベートしてブロッキングを行った。
【００５８】
次いで、ブロッキング液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、以下の実験に利用した。
【００５９】
（１−２）検体におけるＣＫ−１８の断片の検出・測定
ＣＫ−１８の断片の検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。
組換えヒトＣＫ１８の断片を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
【００６０】
試験検体２５μＬ及び検量標準品２５μＬをそれぞれ、（１−１）で作製した測定系のウェルに添加し、続いてＨＲＰ標識した抗ＣＫ１８フラグメント抗体（Ｍ３０）７５μＬを添加して、２５℃で１時間インキュベートした。
【００６１】
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、テトラメチルベンジジン（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａ／Ｓ，Ｔａａｓｔｒｕｐ，デンマーク）の溶液１００μＬを基質として各ウェルに添加した。暗所にて、室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を終了させた。
【００６２】
各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｅ−Ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ＣＫ−１８の断片量を測定した。
【００６３】
（２−１）Ｆｕｃ−ＨｐｔのＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ヒトハプトグロビン抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）をパパイン消化してＦａｂ断片とし、これを１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
【００６４】
次に、上記（１−１）に記載したのと同様の手法にてブロッキングを行い、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、以下の実験に利用した。
【００６５】
（２−２）検体におけるＦｕｃ−Ｈｐｔの検出・測定
Ｆｕｃ−Ｈｐｔの検出は、ビオチンで標識したヒイロチャワンタケレクチン（Ｊ−オイルミルズ）、及びＨＲＰで標識したアビジン（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＬＬＣ）を使用した。
組換えＦｕｃ−Ｈｐｔを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
【００６６】
試験検体５０μＬ及び検量標準品５０μＬをそれぞれ、（２−１）で作製した測定系のウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。
【００６７】
続いて、１／１０００希釈したビオチン化ヒイロチャワンタケレクチン５０μＬを添加して、室温にて１時間インキュベートした。
【００６８】
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識アビジン５０μＬを添加して、室温にて１時間インキュベートした。
【００６９】
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて測定した。
【００７０】
（３−１）Ｍａｃ−２ｂｐのＥＬＩＳＡ測定系の作製
Ｃ末端にＦＬＡＧタグを含む完全及び部分長組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓを、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＲ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製した。得られた組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓタンパク質を免疫抗原としてマウスに投与し、常法に従って、抗ヒトＭａｃ−２ｂｐｓマウスモノクローナル抗体を作製し、ヒトＭａｃ−２ｂｐｓに対して特に強い反応性を示した二つのクローン、８Ａ２及び６７Ａ１を得、これらの抗体を以下の実験に利用した。
【００７１】
８Ａ２をペプシン消化してのＦ（ａｂ’）２断片とし、これを１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に０．５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
【００７２】
次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ＰＢ）（ブロッキング液）２００μＬを各ウェル充填し、４℃一晩インキュベートしてブロッキングを行った。
【００７３】
次いで、ブロッキング液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、以下の実験に利用した。
【００７４】
（３−２）検体におけるＭａｃ−２ｂｐの検出・測定
Ｍａｃ−２ｂｐの検出は、ＨＲＰで標識した６７Ａ１を使用した。
組換えヒトＭａｃ−２ｂｐｓを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈して検量標準品とした。
【００７５】
試験検体１００μＬ及び検量標準品１００μＬをそれぞれ、（３−１）で作製した測定系のウェルに添加し、４℃にて１時間インキュベートした。
【００７６】
インキュベート終了後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰ標識６７Ａ１を添加して、４℃にて３０分間インキュベートした。
【００７７】
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて測定した。
【００７８】
（４−１）Ｍ５抗体を用いたＣＫ−１８及びその断片のＥＬＩＳＡ測定系の作製
抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ６；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に５μｇ／ｍＬの濃度にて調製した抗体液を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェル充填し、４℃で一晩インキュベートして固相化した。
【００７９】
次に、上記（１−１）に記載したのと同様の手法にてブロッキングを行い、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、以下の実験に利用した。
【００８０】
（４−２）検体におけるＣＫ−１８及びその断片の検出・測定
ＣＫ−１８及びその断片の検出は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５；ＶＬＶｂｉｏ  ＡＢ  Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。
【００８１】
上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、試験検体２５μＬ及び検量標準品２５μＬをそれぞれ、（４−１）で作製した測定系のウェルに添加し、続いてＨＲＰ標識した抗ＣＫ１８マウスモノクローナル抗体（Ｍ５）７５μＬを添加して、２５℃で１時間インキュベートした。
【００８２】
インキュベート終了後、上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、反応を終了させた後、各ウェルの吸光度（波長４５０ｎｍ）を上記（１−２）に記載したのと同様の手法にて、ＣＫ−１８及びその断片の量を測定した。
【００８３】
（５−１）検体におけるＡＳＴ活性の検出・測定
ＡＳＴ活性は、確立されたＭＤＨ−ＵＶ法にしたがって、ＡＳＴ試薬・Ｌ「コクサイ」（シスメックス株式会社）を製造元の指示書に従って利用して行った。
【００８４】
（６−１）検体におけるＡＬＴ活性の検出・測定
ＡＬＴ活性は、確立されたＬＤＨ−ＵＶ法にしたがって、ＡＬＴ試薬・Ｌ「コクサイ」（シスメックス株式会社）を製造元の指示書に従って利用して行った。
【００８５】
２．試験検体
試験検体として、ＮＡＦＬ患者（５８名）、及びＮＡＳＨ患者（９５名）それぞれより採取された血清試料を用いた。
【００８６】
３．測定結果
上記各ＥＬＩＳＡ測定系を用いた、ＮＡＦＬ患者及びＮＡＳＨ患者の血清試料におけるＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ及びＭａｃ−２ｂｐの測定結果を図１〜４に示す。
【００８７】
図１は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）をそれぞれプロットした結果を示す。
【００８８】
図２は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＦｕｃ−Ｈｐｔ量をそれぞれプロットした結果を示す。
【００８９】
図３は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＭａｃ−２ｂｐ量をそれぞれプロットした結果を示す。
【００９０】
図４は、ＮＡＦＬ患者（左）及びＮＡＳＨ患者（右）の血清試料に基づいて測定されたＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）をそれぞれプロットした結果を示す。
【００９１】
また、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ又は、Ｍａｃ−２ｂｐの各測定値に基づくＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ）曲線を図５〜８に示す。ＲＯＣ曲線は、ロジスティック回帰分析による判別式に基づき、ＪＭＰ  Ｐｒｏ１１．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＶＣ）を用いて作成した。ＲＯＣ曲線の横軸は偽陽性（１−特異度）を、縦軸は真陽性（感度）を示す。得られたＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）−偽陽性（１−特異度）」の値が最大となる点をカットオフ値として示す。
【００９２】
図５は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）は０．７３３であり、カットオフ値（Ｕ／Ｌ）は３３１．０を示し、その時の感度（％）は７１．６、特異度（％）は６９．０を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３０程度であることが示された。
【００９３】
図６は、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７５９であり、カットオフ値（Ｕ／ｍＬ）は５４４．２を示し、その時の感度（％）は６９．５、特異度（％）は７２．４を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ４０程度であることが示された。
【００９４】
図７は、Ｍａｃ−２ｂｐ量に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８６８であり、カットオフ値（μｇ／ｍＬ）は１．２６を示し、その時の感度（％）は９２．６、特異度（％）は７０．７を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６０程度であることが示された。
【００９５】
図８は、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７８３であり、カットオフ値（Ｕ／Ｌ）は６２７．０を示し、その時の感度（％）は７３．１、特異度（％）は７５．９を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ２８程度であることが示された。
【００９６】
さらに、ＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＡＳＴ及びＡＬＴより選択される２以上のタンパク質マーカーの組み合せの測定値に基づくＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ曲線を図９〜１４に示す。各判別式において、得られたＲＯＣ曲線において「真陽性（感度）−偽陽性（１−特異度）」の値が最大となるｐの値をカットオフ値として示す。
【００９７】
図９は、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−３．７４４＋０．００１９×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋１．７１１×Ｍａｃ−２ｂｐ；（Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８９６であり、カットオフ値（ｐ）は０．４４２を示し、その時の感度（％）は８８．４、特異度（％）は７５．９を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。
【００９８】
図１０は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）及びＦｕｃ−Ｈｐｔ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−１．４０２＋０．００１７×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．００１８×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８００であり、カットオフ値（ｐ）は０．５０９であり、その時の感度（％）は７７．９、特異度（％）は６７．２を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ４０程度であることが示された。
【００９９】
図１１は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−３．３３９＋１．７０７×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１８×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．８８３であり、カットオフ値（ｐ）は０．４６６であり、その時の感度（％）は８９．５、特異度（％）は７２．４を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６５程度であることが示された。
【０１００】
図１２は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−４．３２＋１．７２０×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１７×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．００１５×ＣＫ−１８Ｆ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９０６であり、カットオフ値（ｐ）は０．５６３であり、その時の感度（％）は８６．３、特異度（％）は７９．３を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。カットオフ値（ｐ）が０．７４７である場合に、特異度（％）が９０を示す。
【０１０１】
図１３は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−４．２８＋１．６４１×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１８×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ−０．０００５５×ＣＫ−１８Ｆ＋０．００１２×ＣＫ−１８；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を、ＣＫ−１８はＣＫ−１８及び／又はその断片量の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９０８であり、カットオフ値は０．４８９であり、その時の感度（％）は８９．３、特異度（％）は７７．６を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ７０程度であることが示された。カットオフ値（ｐ）が０．７５５である場合に、特異度（％）が９０を示す。
【０１０２】
図１４は、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の組み合せについて以下の判別式：
Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−５．２４＋１．５８４×Ｍａｃ−２ｂｐ＋０．００１６×Ｆｕｃ−Ｈｐｔ＋０．０００３３×ＣＫ−１８Ｆ−０．０００１１×ＣＫ−１８＋０．０７６１×ＡＳＴ−０．０２４×ＡＬＴ；（Ｍａｃ−２ｂｐはＭａｃ−２ｂｐ量の値を、Ｆｕｃ−ＨｐｔはＦｕｃ−Ｈｐｔ量の値を、ＣＫ−１８ＦはＣＫ−１８の断片量の値を、ＣＫ−１８はＣＫ−１８及びその断片量の値を、ＡＳＴはＡＳＴ活性の値を、ＡＬＴはＡＬＴ活性の値を示す）
に基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．９２８であり、カットオフ値は０．６６７を示し、その時の感度（％）は７９．６、特異度（％）は９１．４を示した。カットオフ値（ｐ）が０．６４８である場合に、特異度（％）が９０を示す。
【０１０３】
以上の結果より、ＮＡＳＨ患者の血清中におけるＣＫ−１８及び／又はその断片、Ｆｕｃ−ＨｐｔならびにＭａｃ−２ｂｐの各測定値は、ＮＡＦＬ患者の血清中におけるそれらの値よりも有意に高いことが確認された（図１−図４）。
【０１０４】
また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の３つの組み合せ、また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の４つの組み合せ、さらに、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の６つの組み合せ、に基づくＲＯＣ曲線においては、いずれもＡＵＣが０．９を超え、このＡＵＣ値は、ＣＫ−１８及び／又はその断片を単独で、Ｆｕｃ−Ｈｐｔを単独で、Ｍａｃ−２ｂｐを単独で、Ｆｕｃ−ＨｐｔとＭａｃ−２ｂｐとの２つの組み合せで、ＣＫ−１８の断片とＦｕｃ−Ｈｐｔとの２つの組み合せで、又はＣＫ−１８の断片とＭａｃ−２ｂｐとの２つの組み合せで用いた場合に得られたＡＵＣ値と比べて高いものであり、より優れた診断能を有することが確認された。そして、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量及びＭａｃ−２ｂｐ量の３つの組み合せ、また、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量ならびにＭａｃ−２ｂｐ量の４つの組み合せ、さらに、ＣＫ−１８の断片量（ＨＲＰ標識したＭ３０抗体による検出）、ＣＫ−１８及びその断片量（ＨＲＰ標識したＭ５抗体による検出）、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ量、Ｍａｃ−２ｂｐ量、ＡＳＴ活性値ならびにＡＬＴ活性値の６つの組み合せを用いた場合には、特異度（％）が９０である場合においても、およそ７０程度の感度（％）を有し、これらタンパク質マーカーを用いた手法が特異度及び感度がいずれも優れた判定を実現できることが確認された。
【０１０５】
実施例２：その他スコアリングシステムによるＮＡＳＨの診断
近年、タンパク質マーカーに限定されることなく、一般臨床検査で測定可能な複数の因子を組み合わせたスコアリングシステムが、ＮＡＳＨの診断に利用することが報告されている。以下に、代表的なスコアリングシステムを示す。
【０１０６】
１）ＮＡＦＬＤ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｓｃｏｒｅ（ＮＦＳ）
計算式：−１．６７５＋０．０３７×Ａｇｅ（年）＋０．０９４×ＢＭＩ（ｋｇ／ｍ２）＋１．１３×ＩＦＧ／糖尿病（あり＝１、なし＝０）＋０．９９×ＡＳＴ／ＡＬＴ−０．０１３×血小板数（×１０９／Ｌ）−０．６６×アルブミン（ｇ／ｄｌ）
２）ＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘ
計算式：Ａｇｅ×ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）／血小板数（×１０９／Ｌ）／√ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）
３）ＢＡＲＤ  ｓｃｏｒｅ
計算式：スケール０〜４点；ＢＭＩ≧２８ｋｇ／ｍ２  １点；ＡＳＴ／ＡＬＴ≧０．８  ２点；糖尿病あり  １点
【０１０７】
上記各スコアリングシステムに基づき、ＪＭＰ  Ｐｒｏ１１．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｄｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＶＣ）を用いて、ＲＯＣ曲線を作成した（図１５〜１７）。ＮＡＳＨ診断能についてのＲＯＣ曲線を図１５〜１７に示す。ＲＯＣ曲線の横軸は偽陽性（１−特異度）を、縦軸は真陽性（感度）を示す。
【０１０８】
図１５は、患者１１０名を対象とした、ＮＦＳに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．６１４であり、カットオフ値は−０．６５８を示し、その時の感度（％）は３４．１、特異度（％）は９４．１を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３５程度であることが示された。
【０１０９】
図１６は、患者１５３名を対象とした、ＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．７３８であり、カットオフ値は１．３７を示し、その時の感度（％）は６１．１、特異度（％）は９３．１を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ６０程度であることが示された。
【０１１０】
図１７は、患者９４名を対象とした、ＢＡＲＤ  ｓｃｏｒｅに基づくＲＯＣ曲線を示し、ＡＵＣは０．６９２であり、カットオフ値は２を示し、その時の感度（％）は５２．６、特異度（％）は７７．８を示した。また、特異度（％）が９０であるとき、感度（％）はおよそ３５程度であることが示された。
【０１１１】
これらのＡＵＣは、上記実施例１のタンパク質マーカーの組み合せによる判別式に基づくＡＵＣと比べて顕著に低く、また特異度（％）が９０であるときの感度（％）も低いことが確認された。このことから実施例１に記載のタンパク質マーカーの組み合せに基づくＮＡＳＨ診断法の高い精度・有用性が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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