(57)【要約】【課題】  その構築を培養時間の短い、エシェリキア属微生物で行うことができ、且つ、ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させることができるベクターを提供すること。【解決手段】  以下の（ａ）〜（ｃ）の領域を含むベクター。  （ａ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域  （ｂ）エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域  （ｃ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域【選択図】図１
2018011518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の領域を含むシャトルベクター。
（ａ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
（ｂ）エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
（ｃ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域
【請求項２】
請求項１に記載のベクターにより、宿主を形質転換した形質転換体。
【請求項３】
請求項２に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを含む、目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトマイセス属微生物用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、ニトリル代謝酵素遺伝子プロモーターを用いた、ストレプトマイセス属微生物用誘導型発現ベクターpSH19（以下、「pSH19」という）を構築している（特許文献１）。このベクターは、ニトリル分解性放線菌Rhodococcus rhodochrous J1株由来の強力な誘導型ニトリラーゼプロモーター (PnitA) (Komeda et al. 1996) を有しており、誘導物質を添加することにより、ポジティブレギュレーターであるNitRがニトリラーゼプロモーターPnitAに作用することで正のフィードバックがかかり、ニトリラーゼ構造遺伝子であるnitAのプロモーターからの転写を顕著に促進する。
そして、このストレプトマイセス属微生物用誘導型発現ベクター（pSH19）にレポーター遺伝子を組み込み、ε−カプロラクタムもしくはイソバレロニトリルを誘導剤として添加することにより、目的タンパク質の著量の生産が確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−０９７０３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ベクターpSH19は異種発現の実験ツールとして有用であるが、ストレプトマイセス属放線菌でしか複製できず、プラスミドの構築に時間がかかるとの課題があった。
そこで、本発明は、ベクターpSH19をエシェリキア属微生物とストレプトマイセス属微生物の両方で複製可能なシャトルベクターへと改変することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、
（ａ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
（ｂ）エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
（ｃ）ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域
を含むベクターである。
【０００６】
また、本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）の領域を含むベクターにより、ストレプトマイセス属微生物を形質転換した形質転換体をも提供する。
【０００７】
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを含む、目的タンパク質の製造方法をも提供する。
【０００８】
すなわち、目的タンパク質をコードするＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を鋳型にして、前記ＤＮＡ断片を増幅する工程、
前記増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素処理したストレプトマイセス属微生物用誘導型発現ベクターに連結する工程、
前記連結したＤＮＡ断片を含むストレプトマイセス属微生物用誘導型発現ベクターを、大腸菌を宿主として用いて形質転換を行う工程、及び
前記形質転換した大腸菌を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取する工程
を含む、目的タンパク質の製造方法が提供できる。
ここで、目的タンパク質とは、例えば、ニトリラーゼである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、その構築を培養時間の短い、エシェリキア属微生物で行うことができ、且つ、ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させることができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】pSH19由来のシャトルベクターpESH19cFの構築例を示す図である。
【図２】本発明に係るpSH19由来のシャトルベクターを示す図である。
【図３】pSH19由来のシャトルベクターのエシェリキア属微生物宿主における安定性結果に関する電気泳動の結果を示す図である。
【図４】S. lividans TK24内における、pSH19由来シャトルベクターに組み込んだ複数のレポータータンパク質のSDS-PAGE上での発現解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のベクターは、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物（以下、「ストレプトマイセス属微生物」ともいう）を宿主として複製可能なＤＮＡ領域、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物（以下、「エシェリキア属微生物」ともいう）を宿主として複製可能なＤＮＡ領域およびストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域を有する。すなわち、本発明のベクターは、ストレプトマイセス属微生物内およびエシェリキア属微生物内のいずれにおいても複製可能なシャトルベクタープラスミドであり、目的タンパク質をストレプトマイセス属微生物内で発現させるのに有効なベクターである。
【００１２】
１．ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
本発明のベクターは、ストレプトマイセス属微生物内において複製可能なＤＮＡ領域を含むため、ストレプトマイセス属に属する微生物内で複製することができる。プラスミドがストレプトマイセス属微生物内において複製可能であるためには、ストレプトマイセス属微生物のプラスミド由来の複製領域（ori、rep）を含有してればよい。
【００１３】
また、本発明のベクターにおいて、ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域は、複製領域のほか、さらにストレプトマイセス属微生物用抗生物質耐性遺伝子などを含有してもよい。このストレプトマイセス属微生物用抗生物質耐性遺伝子としては、チオストレプトン耐性遺伝子などを選択することができる。
【００１４】
２．エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域
本発明のベクターは、エシェリキア属微生物内において複製可能なＤＮＡ領域を含むため、エシェリキア属に属する微生物内で複製することができる。プラスミドがエシェリキア属微生物内において複製可能であるためには、エシェリキア属微生物のプラスミド由来の複製領域（ColE1）を含有すればよい。エシェリキア属微生物内において複製可能なＤＮＡ領域としては、pHSG398、pHSG298（Takara Bio Inc.）などのプラスミドを用いることが可能であり、複製領域を有する限り、プラスミド全体であってもよく、あるいは一部分であってもよい。
【００１５】
また、本発明のベクターにおいて、エシェリキア属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域は、複製領域のほか、さらにエシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子などを含有してもよい。このエシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などを選択することができる。
【００１６】
ここで、本発明において、エシェリキア属微生物としては、大腸菌（Escherichia coli）が好ましく、中でも、TOP10、DH10B、Stbl2、Stbl3およびStbl4（いずれも、Invitrogen）がより好ましい。
【００１７】
３．ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域
本発明のベクターは、ストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域を備え、これによりε−カプロラクタムもしくはイソバレロニトリルを誘導剤として添加することにより、目的タンパク質を生産することができる。
このストレプトマイセス属微生物を宿主として目的タンパク質を誘導的に発現させ得るＤＮＡ領域としては、例えば、ストレプトマイセス属微生物用誘導型発現ベクターpSH19の全部または一部をもとにして作製することができる。前記pSH19の配列及び作製方法に関しては、特開２００４−０９７０３６号公報に記載されている。
【００１８】
ストレプトマイセス属微生物を宿主として複製可能なＤＮＡ領域としては、例えば、前記pSH19の全部または一部を利用することができ、例えば、5'末端から順にfd-ter、nitAプロモーター（PnitA）、マルチクローニングサイト（MCS）、fd-ter、nitAプロモーター、転写調節タンパク質NitRなどの全部または一部を含むものである。
そして、NitRは誘導剤と複合体を形成し、nitAプロモーターに結合し、nitAプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を活性化する。MCSは発現目的のタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための制限酵素サイトが多重化した部位である。MCSのすぐ上流にnitAプロモーターを位置することにより、標的遺伝子の発現を強力に誘導する。NitRもその直前に位置するnitAプロモーターにより誘導されるが、ε−カプロラクタム、イソバレロニトリルといった誘導剤が存在しなくても、極微量の発現が起こる。また、nitAプロモーターの上流からの読み過ごし（read through）転写を最小限に抑えるために、ターミネーターとしてfd-ターミネーター（fd-ter）が、各nitAプロモーターのすぐ上流に配置されている。
【００１９】
尚、本発明のベクターにおいて、ニトリラーゼ系誘導型発現プロモーター領域は、誘導剤によって標的遺伝子の発現が誘導されるものであればよく、ベクターpSH19由来の塩基配列からなるＤＮＡに限定されず、変異ＤＮＡであってもよい。また、本発明の当該プロモーター領域は、上記の要素のほか、スペーサー、オペレーター、スプライシング領域、ポリA付加部位などを含有することもできる。
【００２０】
４．シャトルベクターの構築
本発明のベクターpESH19cFの構築例を以下に述べる（図１）。
【００２１】
まず、大腸菌のプラスミド複製開始起点(ColE1)と、エシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子である、クロラムフェニコール耐性遺伝子と、を含むＤＮＡ断片を、ベクターpHSG398を鋳型にして、PCRにより増幅する。
次に、制限酵素SpeIで処理したベクターpSH19に対して、増幅した断片をIn-Fusion HD Cloning kit (Takara Bio Inc.)を用いて連結し、五種類の大腸菌（TOP10、DH10B、Stbl2、Stbl3およびStbl4：いずれも、Invitrogen）を宿主として用いて形質転換を行う（図１参照）。
尚、遺伝子組み換えの手法は特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。
【００２２】
ＰＣＲにて用いたプライマーは、以下のとおり（配列番号１及び２）である。
【００２３】
pSH19Cm-F1（配列番号１）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【００２４】
pSH19Cm-R1（配列番号２）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTTCGATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAG
【００２５】
５．プラスミドの安定性試験
このようにして構築されたベクターpESH19cFにおいて、プラスミド安定性試験は、例えば以下のように行うことができる。
（１）大腸菌における安定性試験
先ず、ベクターpESH19cFを保持した大腸菌の形質転換体を適当な抗生物質を含む2 × YT 培地で24時間培養する。この培養液の1%を適当な抗生物質を含む2 × YT 培地に新たに植菌し、さらに24時間培養する。この操作を2回繰り返す。
そして3回の継代培養の後に、集菌した菌体からMagExtractor-plasmid- (Toyobo Co., Ltd.)を用いてプラスミドを抽出し、制限酵素SpeIで処理してアガロース電気泳動によりサイズの確認を行う。
（２）ストレプトマイセス属微生物における安定性試験
次に、大腸菌から抽出したプラスミドを用いて、ストレプトマイセス属微生物におけるベクターpESH19cFの安定性を、大腸菌と同様の方法で試験する。かかる場合、例えば、培地としてはYEME培地を用い、プラスミドの抽出はGeneElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich Co. LLC) を用いて行うことができる。
【００２６】
以上の条件で得たコロニーを培養し、プラスミドの抽出を行うことによって目的とするシャトルベクターの構築を確認することができる。例えば、pESH19cFは、ストレプトマイセス属微生物内においても、エシェリキア属微生物内においても複製することが可能であるといえる。
【００２７】
６．形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主を本発明のベクターで形質転換することで作製できる。形質転換を行うには、常法を用いればよく、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法を用いることができる。本発明において用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物、エシェリキア属微生物である。目的タンパク質を発現させるために用いる宿主は、好ましくはストレプトマイセス属微生物である。ベクタープラスミドの増殖、回収に用いる宿主は、ストレプトマイセス属微生物またはエシェリキア属微生物を用いることができるが、好ましくはエシェリキア属微生物である。
【００２８】
７．タンパク質の製造方法
本発明は、目的タンパク質の製造方法も提供することができる。すなわち、上記６の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することにより、目的タンパク質を製造することができる。形質転換体の培養方法は、宿主に用いるストレプトマイセス属微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
【００２９】
また、本発明のベクターは誘導剤によって目的遺伝子の発現を誘導することができるため、培養時にε−カプロラクタム、イソバレロニトリルなどの誘導剤を添加することができる。宿主にストレプトマイセス属微生物を用いるときは、ε−カプロラクタムを0.01〜1％、好ましくは0.05〜0.2％、より好ましくは0.1%添加して、またはイソバレロニトリルを0.01〜1％、好ましくは0.05〜0.2％、より好ましくは0.1%添加して、24〜120時間培養することができる。
【００３０】
更に、本発明に係るタンパク質の製造方法において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（例えば１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることができる。
【００３１】
目的タンパク質は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、電気泳動、あるいはゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を単独又は適宜組み合わせることによって、濃縮、精製したものを用いてもよい。
【実施例１】
【００３２】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３３】
＜ベクターpESH19cFの構築＞
まず、大腸菌のプラスミド複製開始起点(ColE1)と、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Cmr）と、を含むＤＮＡ断片を、ベクターpHSG398を鋳型にして、PCRにより増幅した。かかる際、クロラムフェニコール耐性遺伝子はnitRと同一方向に導入した。また、プライマーとしては、前記pSH19Cm-F1（配列番号１）及びpSH19Cm-R1（配列番号２）を用いた。
次に、制限酵素SpeIで処理したベクターpSH19に対して、増幅した断片をIn-Fusion HD Cloning kit (Takara Bio Inc.)を用いて連結し、五種類の大腸菌（TOP10、DH10B、Stbl2、Stbl3およびStbl4：いずれも、Invitrogen）を宿主として用いて形質転換を行った（図２参照）。
【実施例２】
【００３４】
＜ベクターpESH19cRの構築＞
プライマーとして下記pSH19Cm-F2（配列番号３）及びpSH19Cm-R2（配列番号４）を用い、且つ、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Cmr）をnitRと逆向きに導入した以外は、実施例１と同様の方法で、ベクターpESH19cRを構築した（図２参照）。
【００３５】
pSH19Cm-F2（配列番号３）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTTCGATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAG
【００３６】
pSH19Cm-R2（配列番号４）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【実施例３】
【００３７】
＜ベクターpESH19kFの構築＞
プライマーとして下記pSH19Km-F1（配列番号５）及びpSH19Km-R1（配列番号６）を用い、且つ、エシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子（Kmr）とした以外は、実施例１と同様の方法で、ベクターpESH19kFを構築した（図２参照）。
【００３８】
pSH19Km-F1（配列番号５）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【００３９】
pSH19Km-R1（配列番号６）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCG
【実施例４】
【００４０】
＜ベクターpESH19kRの構築＞
プライマーとして下記pSH19Km-F2（配列番号７）及びpSH19Km-R2（配列番号８）を用い、且つ、カナマイシン耐性遺伝子（Kmr）をnitRと逆向きに導入した以外は、実施例３と同様の方法で、ベクターpESH19kRを構築した（図２参照）。
【００４１】
pSH19Km-F2（配列番号７）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCG
【００４２】
pSH19Km-R2（配列番号８）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【実施例５】
【００４３】
＜ベクターpESH19aFの構築＞
プライマーとして下記pSH19Ap-F1（配列番号９）及びpSH19Ap-R1（配列番号１０）を用い、且つ、エシェリキア属微生物用抗生物質耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子（Apr）とした以外は、実施例１と同様の方法で、ベクターpESH19aFを構築した（図２参照）。
【００４４】
pSH19Ap-F1（配列番号９）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG
【００４５】
pSH19Ap-R1（配列番号１０）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【実施例６】
【００４６】
＜ベクターpESH19aRの構築＞
プライマーとして下記pSH19Ap-F2（配列番号１１）及びpSH19Ap-R2（配列番号１２）を用い、且つ、アンピシリン耐性遺伝子（Apr）をnitRと逆向きに導入した以外は、実施例５と同様の方法で、ベクターpESH19aRを構築した（図２参照）。
【００４７】
pSH19Ap-F2（配列番号１１）
CCGGCGCACCTGCATACTAGTGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG
【００４８】
pSH19Ap-R2（配列番号１２）
GTAGGAAGAGCCCGGACTAGTACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
【００４９】
尚、実施例１のベクターpESH19cF、実施例２のベクターpESH19cR、実施例５のベクターpESH19aF、および実施例６のベクターpESH19aRのプラスミド内のマルチクローニングサイト(MCS)はpSH19と同じであり、HindIII、SphI、Sse8387I、PstI、XbaI、BamHI、KpnI、SacI、およびEcoRIがユニークサイトとして利用可能である。
一方、実施例３のベクターpESH19kFおよび実施例４のベクターpESH19kRのMCSでは、HindIIIがユニークサイトにならず利用できないが、その他の制限酵素サイトは他の四つのpSH19由来シャトルベクターと同様、ユニークサイトとして利用できる。
【実施例７】
【００５０】
＜pSH19由来のシャトルベクターの大腸菌宿主における安定性＞
実施例１〜６に示すpSH19由来のシャトルベクターについて、大腸菌を宿主とした際の安定性について、以下のように評価した。大腸菌としては、TOP10、DH10B、Stbl2、Stbl3およびStbl4（いずれも、Invitrogen）を用いた。
先ず、実施例１〜６のpSH19由来のシャトルベクターを用いて、それぞれの大腸菌を形質転換し、プラスミドを抽出した。更に、各pSH19由来のシャトルベクターを制限酵素SpeIで切断し、アガロース電気泳動に供した。ここで、ベクターpSH19のサイズは5.7kb、ColE1+クロラムフェニコール耐性遺伝子のサイズは1.6kb、ColE1+カナマイシン耐性遺伝子のサイズは1.8kb、ColE1+アンピシリン耐性遺伝子のサイズは1.7kbである。
【００５１】
アガロース電気泳動の結果を図３に示す。図３中、（ａ）は実施例１のベクターpESH19cFの結果を、（ｂ）実施例２のベクターpESH19cRの結果を、（ｃ）実施例３のベクターpESH19kFの結果を、（ｄ）実施例４のベクターpESH19kRの結果を、（ｅ）実施例５のベクターpESH19aFの結果を、（ｆ）実施例６のベクターpESH19aRの結果を示す。また、各結果において、lane 1は TOP10、lane 2は DH10B、lane 3はStbl2、lane 4はStbl3、lane 5はStbl4、lane MはλＤＮＡ/StyI マーカーを示す。
更に、各pSH19由来のシャトルベクターにおける欠損の有無（安定性）の結果を表１に示す。表１中、記号○は安定であることを示し、記号×は不安定であることを示す。
【００５２】
【表１】
2018011518.tif 000003
【００５３】
図３及び表１に示されるように、実施例１のベクターpESH19cF及び実施例５のベクターpESH19aFに関しては、大腸菌Stbl4を宿主とした場合には欠損したが、大腸菌TOP10、DH10B、Stbl2、Stbl3を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
また、実施例２のベクターpESH19cRに関しては、大腸菌TOP10、DH10B、Stbl2を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
更に、実施例３のベクターpESH19kFに関しては、大腸菌TOP10及びStbl2を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
また、実施例４のベクターpESH19kRに関しては、大腸菌Stbl2を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
更に、実施例６のベクターpESH19aRに関しては、大腸菌TOP10、DH10B、Stbl2及びStbl4を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
以上のことから、実施例１〜６のベクターは、実験に供した大腸菌５種類のうち、少なくとも１つの大腸菌で安定的に保持されることが確認できた。また、実施例１〜６のベクターはいずれも、ストレプトマイセス属菌で安定的に保持されることが確認できた。よって、実施例１〜６のベクターは、大腸菌とストレプトマイセス属菌の両方で有効に保持され、シャトルベクターとして機能すると判断できる。
【実施例８】
【００５４】
＜pSH19由来のシャトルベクターのStreptomyces lividans TK24宿主における安定性＞
実施例７と同様に、実施例１〜６の各pSH19由来のシャトルベクターを制限酵素SpeIで切断し、アガロース電気泳動に供し、Streptomyces lividans TK24宿主における安定性を評価した。結果を上記表１に示す。
表１に示すように、実施例１〜６の各pSH19由来のシャトルベクターは、Streptomyces lividans TK24を宿主にした場合に欠損すること無く安定的に保持されていることが確認された。
【実施例９】
【００５５】
＜pSH19由来のシャトルベクターを利用したタンパク質発現＞
（１）実施例１〜６の各pSH19由来のシャトルベクターの機能解析
構築した実施例１〜６の各pSH19由来のシャトルベクターに、Rhodococcus rhodocrous J1菌由来のニトリラーゼ遺伝子（nitA）、Pseudomonas putida由来のカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ遺伝子（xylE）、並びにArthrobacter pascens F164株由来Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ遺伝子（nfdA）をレポーター遺伝子として組込み、Streptomyces lividans TK24における発現をSDS-PAGEで確認することでその機能性の検討を行った（図４参照）。
【００５６】
（２）xylEを含むpSH19シャトルベクターの構築
先ず、Pseudomonas putida(Nakai et al. 1983, Worsey and Williams. 1975)を鋳型にして、xylEをPCRにより増幅した。
次に、PCRによって得られたＤＮＡ断片を、XbaI及びSacI（Takara Bio Inc.）で制限酵素処理したベクターpHSG298にIn-Fusion HD Cloning Kit （Takara Bio Inc.）を用いて連結し、pHSG298-xylEを得た。
そして、pHSG298-xylEプラスミドからXbaIとSacIで制限酵素処理することでxylE 遺伝子を切り出し、T4 DNA ligase（Takara Bio Inc.）を用いて、XbaI及びSacIで処理したpESH19cF、pESH19kFおよび pESH19aF に連結し、大腸菌TOP10を宿主に用いてpESH19cF-xylE、pESH19kF-xylEおよびpESH19aF-xylEを構築した。それぞれのプラスミドにおいて、Streptomyces属での発現に適したシャイン・ダルガーノ配列をxylEの上流に配置した。
【００５７】
（３）nitAを含むpSH19シャトルベクターの構築
先ず、Rhodococcus rhodocrous J1菌のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、nitAをPCRにより増幅した。そして、増幅されたＤＮＡ断片は、PstI及びXbaI（Takara Bio Inc.）で制限酵素処理したpESH19cF、pESH19kFおよびpESH19aFに、In-Fusion HD Cloning Kit（Takara Bio Inc.）を用いて連結し、大腸菌TOP10を宿主に形質転換を行い、pESH19cF-nitA、pESH19kF-nitAおよびpESH19aF-nitAを構築した。
【００５８】
（４）nfdAを含むpSH19シャトルベクターの構築
先ず、Arthrobacter pascens F164株のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、PCRを行い、nfdAを増幅した。増幅されたＤＮＡ断片は、PstI及びXbaI（Takara Bio Inc.）で制限酵素処理したpESH19cF、pESH19kFおよびpESH19aFに、In-Fusion HD Cloning Kitを用いて連結し、大腸菌TOP10を宿主に用いてpESH19cF-nfdA、pESH19kF-nfdAおよびpESH19aF-nfdAを構築した。
【００５９】
ここで、レポーター遺伝子増幅に用いたプライマーは以下のとおり（配列番号１３〜１８）である。
【００６０】
SDxylE-F（配列番号１３）
TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGCAACGGAGGTACGGACATGAACAAAGGTGTAATGCGACCGGGCC
【００６１】
xylE-R（配列番号１４）
ACGGCCAGTGAATTCGAGCTCTCAGGTCAGCACGGTCATGAATCGTTCG
【００６２】
SDnitA-F（配列番号１５）
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGAGCAACGGAGGTACGGACATGGTCGAATACACAAACACATTCAAAGTTGCTGCG
【００６３】
nitA-R（配列番号１６）
GGTACCCGGGGATCCTCTAGATCAGATGGAGGCTGTCGCCCGG
【００６４】
SDnfdA-F（配列番号１７）
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGAGCAACGGAGGTACGGACATGACACAAATGCGTGACCTAATGATCATTAATGCAAATGTG
【００６５】
nfdA-R（配列番号１８）
GGTACCCGGGGATCCTCTAGACTACGATCCGGTGCGTTCGTAGCG
【００６６】
（５）カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ活性の測定方法
構築したプラスミドpESH19cF-xylE、pESH19kF-xylEおよび pESH19aF-xylEを大腸菌TOP10から抽出し、S. lividans TK24を形質転換した。得られた形質転換体は10 mlのYEME培地中で誘導剤として0.1%のε-カプロラクタム添加または誘導剤非添加で培養した。培養液から無細胞抽出液を調製し、SDS-PAGEに供した。
ここで、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ の活性は、1mMカテコールを含む、50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)1ml中で測定した。反応液を25℃でインキュベートし、無細胞抽出液を加えることで反応をスタートさせた。
2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド産生量を、同化合物に特異的な吸収波長である375nmの吸収を測定することで評価した。カテコール2,3-ジオキシゲナーゼの活性は、1分間に1μmolの2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド（375nmにおけるモル吸光係数=36,000M-1cm-1）（Huper-Kocurek et al. 2014）を生産する酵素量を1unitと定義した。
【００６７】
（６）ニトリラーゼ活性の測定方法
構築したプラスミドpESH19cF-nitA、pESH19kF-nitAおよびpESH19aF-nitAを大腸菌TOP10から抽出し、S. lividans TK24を形質転換した。得られた形質転換体は10mlのYEME培地中で誘導剤として0.1%のε-カプロラクタムを添加し培養した。比較のために、同じ形質転換体を、誘導剤非添加でも培養した。培養液から無細胞抽出液を調製し、SDS-PAGEに供した。
ここで、ニトリラーゼの活性は、6mMベンゾニトリルと、0.1mMジチオスレイトールと、を含む10mMリン酸カリウムバッファー (pH8.0)、1ml中で測定した。 反応液を25℃で10分間インキュベートし、0.1mlの１M HClを添加することで、反応を停止した。表２に示す条件下で、反応によって生産された安息香酸の量をHPLCを用いて測定(Kobayashi et al. 1989)し、ニトリラーゼ活性を評価した。ニトリラーゼ活性は１分間に1μmolの安息香酸を生産する酵素量を1unitと定義した。
【００６８】
【表２】
2018011518.tif 000004
【００６９】
（７）Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性の測定
構築したpESH19cF-nitA、pESH19kF-nitAおよびpESH19aF-nitAを大腸菌TOP10から抽出し、S. lividans TK24 を形質転換した。得られた形質転換体は10mlのYEME培地中で誘導剤として0.1%のε-カプロラクタムを添加し培養した。比較のために、同じ形質転換体を、誘導剤非添加でも培養した。培養液から無細胞抽出液を調製し、SDS-PAGEに供した。
ここで、Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性は、Fukatsu et al.(2004)の方法に従って測定した。反応溶液は10mM Ｎ−ベンジルホルムアミド（NBFA）、0.1Mリン酸カリウムバッファー (pH7.5)400μlである。400μlの氷冷アセトニトリルを添加することで反応を停止させ、12,000×ｇで10分間遠心分離することで上清を得た。表３に示す条件下で、反応液上清のNBFAの残量を、HPLCを用いて測定(Fukatsu et al. 2004)し、Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼの活性を評価した。Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼの活性は、1分間に1μmolのNBFAを消費する酵素量を1unitと定義した。
【００７０】
【表３】
2018011518.tif 000005
【００７１】
各酵素の活性の測定結果を図４に示す。ここで、図４中、（ａ）はカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ活性の結果を、（ｂ）はニトリラーゼ活性の結果を、（ｃ）はＮ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性の結果を示す。各結果において、左端が実施例１のpESH19cFを用いた結果であり、中央が実施例３のpESH19kFを用いた結果であり、右端が実施例５のpESH19aFを用いた結果である。
図４に示されるように、誘導剤を添加したS. lividans TK24形質転換体において、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼが高生産されていることを確認された。
また、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ活性を測定したところ、pESH19cF-xylEを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は4.8 units/mgの比活性を示し、pESH19kF-xylEを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は 5.0 units/mgの比活性を示し、pESH19aF-xylEを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は 3.4 units/mgの比活性を示した。さらに、pESH19cF-xylE またはpESH19kF-xylEの形質転換体におけるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼの比活性は、シャトル化前のベクターであるpSH19-xylEの形質転換体におけるカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ活性 (4.1 units/mg) よりも高かった。
その一方で、誘導剤を添加せずに培養した形質転換体では、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ活性は確認できなかった。
【００７２】
また、ニトリラーゼ活性に関しては、誘導剤を添加したS. lividans TK24形質転換体において、ニトリラーゼが高生産していることを確認された。また、ベンゾニトリルを基質に用いてニトリラーゼ活性を測定した結果、pESH19cF-nitAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は0.12 units/mg、pESH19kF-nitAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は0.08 units/mg、pESH19aF-nitAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は0.15 units/mgの活性を示した。その一方で、誘導剤を添加せずに培養した形質転換体ではニトリラーゼ活性は確認できなかった。
【００７３】
更に、Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性に関しては、誘導剤を添加したS. lividans TK24形質転換体において、Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ遺伝子が生産されていることが確認された。また、Ｎ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性を測定したところ、pESH19cF-nfdAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は5.9 units/mg、pESH19kF-nfdAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は4.1 units/mg、pESH19aF-nfdAを保有する形質転換体から調製した無細胞抽出液は3.8 units/mg のＮ−置換ホルムアミドデホルミラーゼ活性を示した。
【００７４】
以上から、本発明に係るベクターが、グラム陽性およびグラム陰性細菌由来のレポータータンパク質をS. lividans TK24内で異種生産させることができることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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