(57)【要約】【課題】本発明は、非特異吸着量が抑制された分離材を提供することを目的とする。【解決手段】多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層、並びに、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備え、上記多孔質ポリマ粒子が、二重結合を２つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を９０質量％以上含有する架橋ポリマであり、上記水酸基を有する高分子が糖鎖を有する、分離材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層、並びに、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、二重結合を２つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を９０質量％以上含有する架橋ポリマであり、
前記水酸基を有する高分子が糖鎖を有する、分離材。
【請求項２】
前記膜が、ジヒドロキシインドール及びポリドーパミンの少なくとも一方を含む、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
前記水酸基を有する高分子が架橋している、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記二重結合を２つ以上有するモノマが、芳香族基と該芳香族基に結合した２以上のビニル基とを有する架橋性モノマである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
前記水酸基を有する高分子が、アガロース、デキストラン、プルラン、アミロース、キチン及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種の多糖類又はその変性体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
前記多孔質ポリマ粒子の平均細孔径が０．０５〜０．５μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記被覆層が、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を更に有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
前記被覆層が、アフィニティリガンドを更に有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填しクロマトグラフィーで用いる場合、通液時の耐圧性に優れる傾向がある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点があった。
【０００３】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１）。特許文献１には、このような複合体を用いることにより反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成ができること、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないことが記載されている。
【０００５】
セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。このゲルには収着性能を付加するために、ジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、当該ゲルはヘモグロビンの除去に用いられる。その効果として、上記文献には、カラムでの通液性の良さが挙げられている。
【０００６】
マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体ゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。
【０００７】
有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化分離材が提案されている（例えば、特許文献５、特許文献６参照）。
【０００８】
メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子が合成されている（例えば、特許文献７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【特許文献８】特開昭６０−１６９４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の分離材では、非特異吸着が多いという問題がある。
【００１１】
本発明は、非特異吸着量が抑制された分離材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記［１］〜［１０］に記載の分離材又はカラムを提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層、並びに、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備え、上記多孔質ポリマ粒子が、二重結合を２つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を９０質量％以上含有する架橋ポリマであり、上記水酸基を有する高分子が糖鎖を有する、分離材。
［２］上記膜が、ジヒドロキシインドール及びポリドーパミンの少なくとも一方を含む、［１］に記載の分離材。
［３］上記水酸基を有する高分子が架橋している、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］上記二重結合を２つ以上有するモノマが、芳香族基と該芳香族基に結合した２以上のビニル基とを有する架橋性モノマである、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］上記水酸基を有する高分子が、アガロース、デキストラン、プルラン、アミロース、キチン及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種の多糖類又はその変性体を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］上記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに、水の通液速度８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の分離材。
［７］上記多孔質ポリマ粒子の平均細孔径が０．０５〜０．５μｍである、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］上記被覆層が、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を更に有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］上記被覆層が、アフィニティリガンドを更に有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、非特異吸着量が抑制された分離材が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１５】
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層、及び、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された膜を備える。なお、本明細中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。
【００１６】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態における多孔質ポリマ粒子は、１種以上のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質粒子であり、二重結合を２つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を９０質量％以上含有する架橋ポリマである。多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られる粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。
【００１７】
二重結合を２つ以上有する多官能性モノマは、芳香族基と該芳香族基に結合した２以上のビニル基とを有する架橋性モノマを含むことが好ましい。二重結合を２つ以上有するモノマは、例えば、スチレン系モノマ等であってよい。モノマは、単官能性モノマを含んでいてもよい。
【００１８】
二重結合を２つ以上有する多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、単独で使用しても２種以上を併用してもよい。上記のなかでも耐久性、耐酸及びアルカリ性の観点より、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。
【００１９】
単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等の、スチレン及びその誘導体が挙げられる。これらは単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。上記の中でも耐酸性及び耐アルカリ性の観点より、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００２０】
モノマは、多官能性アクリルモノマを含んでいてもよい。多官能性アクリルモノマとしては、例えば、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート、エトキシ化ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。商業的に入手可能な多官能性モノマとしては、新中村化学工業社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ）等が挙げられる。これらのモノマは、単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
以上のモノマと共重合可能な単官能モノマとしては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等のフッ化アルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらは単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。
【００２２】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である、脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類が挙げられる。具体的には、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらは単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。
【００２３】
上記多孔質剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２４】
重合反応の溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、モノマの液滴が水を吸収することによって、粒子を多孔質化させることが可能である。
【００２５】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、例えば、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル等のジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
これらの油溶性界面活性剤のうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは純度約５０％、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。
【００２７】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で使用することが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。
【００２８】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２９】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。
【００３０】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３１】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤などが挙げられる。
【００３２】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤などが挙げられる。
【００３３】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３４】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３５】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３６】
多孔質ポリマ粒子の剛性において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。
【００３７】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部であることが好ましい。
【００３８】
モノマが単独に重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３９】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。平均粒径が小さくなると、カラム充填後のカラム圧が増加する可能性がある。
【００４０】
多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性を向上させるために、５〜１５％であることが好ましく、は５〜１０％であることがより好ましい。粒径のＣ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（日立製作所社製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００４１】
分離材及び多孔質ポリマ粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。
【００４２】
多孔質ポリマ粒子及び分離材の細孔容積（空隙率）は、それぞれ多孔質ポリマ粒子又は分離材の全体積（細孔容積を含む）基準で３０体積％以上７０％体積以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔直径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアーを有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の平均細孔径は、０．０５〜０．５μmであることが好ましく、０．１〜０．５μｍであることがより好ましく、０．２μｍ以上０．５μｍ未満であることが更に好ましい。平均細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向があり、平均細孔径が０．５μｍ以下であると、比表面積がより充分なものとなる傾向がある。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００４３】
多孔質ポリマ粒子は比表面積が約３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向がある。
【００４４】
（カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜）
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層との間に、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備える。当該膜は、多孔質ポリマ粒子の表面の、水酸基を有する高分子を含む被覆層で被覆されていない部分を被覆していてもよい。
【００４５】
分離材が、多孔質ポリマ粒子と、水酸基を有する高分子を含む被覆層との間に、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む薄膜を備えることにより、該被覆層と多孔質ポリマ粒子との接着性を高めることができ、吸着性能をより向上させ、非特異吸着をより抑制することができる。
【００４６】
カテコール誘導体は、例えば、下記一般式（１）で表される部分構造を有する化合物であってよい。式（１）中の水酸基は、水素原子が解離してイオンを形成していてもよい。
【００４７】
【化１】
2018171556.tif 000002
【００４８】
カテコール誘導体としては、例えば、ジヒドロキシインドール、ジヒドロキシインドールのダイマー又はトリマー、ポリドーパミン、ウルシオール、タンニン酸、没食子酸エピカテキン等が挙げられる。カテコール又はカテコール誘導体は、会合体を形成していてもよい。上記膜は、ジヒドロキシインドール及びポリドーパミンの少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００４９】
カテコール誘導体としてポリドーパミンを用いる場合、ポリドーパミンを含む膜（ポリドーパミン膜）は、例えば、多孔質ポリマ粒子の表面でドーパミンを重合することにより形成することができる。具体的には例えば、多孔質ポリマ粒子存在下でドーパミンを酸化重合する方法を用いることができる。多孔質ポリマ粒子等の表面へのポリドーパミン膜の形成は、ドーパミンの優れた接着性及び自発的薄膜形成能力を活用して行うことができる。具体的には、例えば、ドーパミン水溶液（ｐＨ＝８程度）に、基材としての多孔質ポリマ粒子を浸漬させると、速やかにドーパミンの自己酸化重合が始まり、基材表面に高分子化したドーパミンが堆積して薄膜を形成する。
【００５０】
ドーパミン水溶液の濃度は、一般的には０．０００１モル／Ｌ以上であれば特に限定はされないが、好ましくは、０．００１モル／Ｌ以上である。ｐＨは、一般的には６．４〜１０．８程度であり、好ましくは８．０〜８．５である。また、基材浸漬時のドーパミン水溶液の温度は、１０〜５０℃程度であることが好ましい。浸漬時間は、目的とするポリドーパミン膜の厚みにより様々であり、一般的には６〜４８時間程度が好適である。
【００５１】
（水酸基を有する高分子を含む被覆層）
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層を備える。多孔質ポリマ粒子と、被覆層との間には、上述のカテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜が少なくとも一部形成されているが、被覆層が当該膜を介さずに多孔質ポリマ粒子の表面に直接被覆されている部分があってもよい。被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。分離材が、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備えることにより、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、官能基を導入した際のタンパク質吸着量を充分高いものとすることが可能となる。
【００５２】
本実施形態の分離材は、被覆層中の水酸基を有する高分子として、糖鎖を有する高分子を含む。糖鎖を有する高分子は、多糖類又はその変性体であることが好ましい。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、プルラン、アミロース等が挙げられる。糖鎖を有する高分子は、アガロース、デキストラン、プルラン、アミロース、キチン及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種の多糖類又はその変性体であることが好ましい。被覆層は、水酸基を有する高分子として、糖鎖を有する高分子以外のものを含んでいてよい。水酸基を有する高分子は水酸基を有するポリマであってよい。水酸基を有する高分子は、親水性であることが好ましい。糖鎖を有する高分子以外の水酸基を有する高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、親水性アクリルポリマ等が挙げられる。水酸基を有する高分子の分子量としては、粒子吸着時における高分子同士の立体的反発を避けることができる点から、重量平均分子量が１万〜１０万であることが好ましい。
【００５３】
また、界面吸着能を向上させるために、水酸基を有する高分子として、疎水基を導入した変性体も用いることができる。
【００５４】
（被覆層の形成方法）
糖鎖を有する高分子等の水酸基を有する高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を形成した後の多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍｌ）が好ましい。この溶液を、多孔質ポリマ粒子の細孔内に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に、多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００５５】
水酸基を有する高分子は、固定化されていることが好ましい。固定化は、例えば、水酸基を有する高分子を架橋することにより行うことができる。例えば、粒子の細孔内に溶液状で保持されている水酸基を有する高分子に、架橋剤を加えて架橋反応させることにより、高分子の架橋ゲルを形成させ、高分子を細孔内に担持させることができる。この時、水酸基を有する高分子は３次元架橋網目構造を有するようになる。
【００５６】
架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような、水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロルオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。
【００５７】
上記架橋反応には通常、触媒が用いられる。該触媒の種類は架橋剤の種類に合わせて適宜選択される。例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００５８】
架橋剤による架橋反応は、通常、水酸基を有する高分子の溶液を吸着させた粒子を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加して行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合には、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定される。架橋剤の添加量が上記下限値以上であると、被覆層が多孔質ポリマ粒子上に良好に保持される傾向にある。また、架橋剤の添加量が上記上限値以下であれば、架橋剤と水酸基を有する高分子との反応率が高い場合でも、水酸基を有する高分子の特性が損なわれにくい。
【００５９】
触媒の使用量は、架橋剤の種類により異なる。通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、好ましくは０．１〜５モル倍の範囲で使用される。
【００６０】
温度等の架橋反応条件を変化させることにより、架橋反応を生起させてもよい。例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度上達すれば架橋反応が生起する。
【００６１】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。具体的には例えば、水、アルコール等が挙げられる。
【００６２】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００６３】
架橋反応終了後、粒子をろ別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部に、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備え、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜が形成された分離材が得られる。水酸基を有する高分子を含む被覆層の量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００６４】
（イオン交換基の導入）
分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を、粒子表面の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基（イオン交換用官能基）は、陰イオン交換基又は陽イオン交換基であってよい。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００６５】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン及びその塩酸塩、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。モノハロゲノカルボン酸としては、例えば、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する３級アミンとしては、例えば、ジエチルアミノエチルクロライド等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６６】
イオン交換基の導入には、反応を促進するために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００６７】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基を有する高分子に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０、還流下で、０．５〜１２時間行うのが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。
【００６８】
イオン交換基として弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６９】
イオン交換基として、強塩基性基の四級アンモニウム基を導入する方法としては、まず３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。
【００７０】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応する方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００７１】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基を導入する方法としては、分離材に対してエビクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、さらに亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００７２】
一方、イオン交換基の他の導入方法としては、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００７３】
本実施形態の分離材は、更にアフィニティリガンドを備えていてよい。アフィニティリガンドは、例えばプロテインＡ等であってよい。
【００７４】
本実施形態の分離材の平均細孔径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：島津製作所社製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７５】
本実施形態の分離材は、タンパク質の静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に、イオン交換基を導入した分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて使用することも可能である。カラムクロマトグラフィーにおいて、本実施形態の分離材を備えるカラムを用いることができる。
【００７６】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質、生体中に存在する酵素などのタンパク質、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下のものである。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、イオン交換体の性質及び条件等を選ぶ必要がある。例えば、特許文献８等に記載の方法が挙げられる。
【００７７】
本実施形態の分離材は、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子及びポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。本実施形態の分離材は、耐久性及び耐アルカリ性に優れる。また、分離材が、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備えることにより、非特異吸着が起こりにくく、タンパク質等の生体高分子に対する優れた分離能を有する。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着容量（動的吸着容量）が大きい傾向にある。本実施形態の分離材は、高い弾性率を有し、カラム充填時及び粒子取り扱い時の破壊を抑制することができる。
【００７８】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレス又はガラス製のカラムに分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム内の圧力が０．３ＭＰａとなるように水を通液させたときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用のイオン交換体よりも速い、通液速度８００ｃｍ／ｈ以上でも高吸着容量で使用できる。高い通液速度を有することにより、より高速での精製が可能となる。
【００７９】
分離材の粒径は、通常、好ましくは１０〜３００μｍである。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、分離材の粒径は、５０〜１００μｍであることが好ましい。本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーで使用した場合、使用する溶出液の性質によらず、カラム内での体積変化がほとんどないという、操作性における優れた効果を発揮することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
（多孔質ポリマ粒子の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０、新日鉄住金社製）１６ｇ、油溶性界面活性剤としてＳＰＡＮ８０を６ｇ、重合開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを加えたものをモノマ相として用意し、ポリビニルアルコール（０．５質量％）水溶液を連続相として用意した。上記モノマ相及び連続相を使用してマイクロプロセスサーバーにより乳化した後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間攪拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子を得た。
【００８２】
（カテコール誘導体を含む膜の形成）
多孔質ポリマ粒子の０．２ｇを、リン酸緩衝液でｐＨを８．５に調整したドーパミン塩酸塩水溶液１０ｇ（ドーパミン塩酸塩０．０２ｇ）に浸漬し、２４時間室温にて攪拌した。その後、粒子をろ過し、水洗した後、過ヨウ素酸ナトリウム液（５ｍｍｏｌ／ｌ）中に浸漬し、２４時間室温で攪拌し、架橋させた。架橋後、粒子をろ過し、水洗して、カテコール誘導体を含む膜が形成された粒子を得た。
【００８３】
（水酸基を有する高分子層の形成）
アガロース水溶液（２質量％）５００ｍＬに、水酸化ナトリウム０．９８ｇ、グリシジルフェニルエーテル４．９０３ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで３回沈殿させ、洗浄した。
【００８４】
１３．５６ｇ／Ｌの変性アガロース水溶液４４８ｍＬに多孔質ポリマ粒子を１０ｇの濃度で投入し、５５℃で６時間攪拌し、多孔質ポリマ粒子に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
【００８５】
多孔質ポリマ粒子の表面に吸着した水酸基を有する高分子は次のようにして架橋した。１０ｇの多孔質ポリマ粒子を水３５０ｇに分散させ、クロロメチルオキシラン（和光純薬工業株式会社）０．６４７５ｇ及びＮａＯＨ５．６ｇを加え、２５℃、８時間攪拌した。その後、２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液の熱水で洗浄後、純水で洗浄し、分離材を得た。得られた分離材は水中で保管した。
【００８６】
（被覆層量）
多孔質ポリマ粒子１ｇ当たりの被覆層量（ｍｇ）は、示差熱熱重量測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）を用いて測定される、粒子の５％重量減少温度におけるＴＧから算出した。測定は、４０℃で３０分保持した後、４０〜５００℃の温度範囲で行い、昇温速度は１０℃／ｍｉｎとした。被覆層量は下記式より算出した。結果を表１に示す。
被覆層量（ｍｇ／粒子ｇ）＝Ｒ／（１００−Ｒ）×１０００
Ｒ（％）＝９５％−Ｔ
Ｒ（％）：分離材に対する被覆量の割合
Ｔ（％）：多孔質ポリマ粒子の５％重量減少温度における分離材のＴＧ
【００８７】
（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．２ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、２４時間室温で攪拌した。その後、２４時間静置し、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計で上澄み液のＢＳＡ濃度を測定し、当該濃度に基づいて、分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。分離材１ｇ当たりのＢＳＡ吸着量（非特異吸着量）が５ｍｇ以下を「○」、５ｍｇ超１０ｍｇ未満を「△」、１０ｍｇ以上を「×」とした。結果を表１に示す。
【００８８】
（イオン交換基の導入）
分離材を含む分散液から遠心分離により水を除去した後、２０ｇのジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を溶解させた水溶液１００ｍＬに分離材を分散させ、７０℃で１０分攪拌した。そこに、７０℃に加温したＮａＯＨ水溶液５Ｍ１００ｍＬを添加し、１時間反応させた。反応終了後、ろ過し、水／エタノール（体積比８／２）で２回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。得られた粒子の平均細孔径を水銀圧入法にて測定した。
【００８９】
（カラム特性評価）
非特異吸着の評価が「○」であった分離材について、カラム特性を評価した。ＤＥＡＥ変性した分離材をメタノールと混合して、濃度３０質量％のスラリーを調製した。当該スラリーをφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。
【００９０】
（通液性評価）
上記カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム内圧力（カラム圧）との関係を調べた。カラム圧が０．３ＭＰａのときの線流速（通液速度）を測定した。結果を表１に示す。
【００９１】
（ＳＢＣ特性評価）
非特異吸着評価が「○」であった分離材について、静的吸着量（ＳＢＣ）を評価した。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール（以下「Ｔｒｉｓ」と略す）６．０６ｇをポリカップに秤量し、純水を９００ｍＬまで加えてスターラーで攪拌した。３０分攪拌後、１Ｎ塩酸を加えてｐＨ８．０に調整した。これをメスフラスコに移し、総量１Ｌとなるように純水を加えてメスアップし、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）とした。
【００９２】
予め、既知濃度（０〜１．４％）のＢＳＡ水溶液を用いて検量線を作成した。ＤＥＡＥ変性分離材０．２ｇを、Ｔｒｉｓ緩衝液１０ｍＬを入れたスクリュー管に加え、分離材溶液とした。ＢＳＡを秤量し、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解して、濃度２４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ水溶液を調製した。このＢＳＡ溶液１０ｍＬを、上記分離材溶液に添加して反応溶液とし、２５℃にて２４時間ミックスローターで攪拌した。攪拌後、溶液を静置し、上澄み１ｍＬを分取し、Ｔｒｉｓ緩衝液で１０倍に希釈した。希釈液の吸光度（２８０ｎｍ）を測定することによって上澄み液のＢＳＡ濃度を求め、分離材へのＢＳＡ吸着量を算出した。分離材へのＢＳＡ吸着量は、分離材の１ｇ当たり、及び分離材１ｍＬ当たりにおける量を算出した。
【００９３】
（イオン交換基の定量）
非特異吸着評価が「○」であった分離材について、逆滴定法によってイオン交換基を定量した。ＤＥＡＥ変性分離材０．２ｇを秤量し、純水中に分散させた。分離材を吸引ろ過し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬを用いて、ろ紙上の分離材をポリカップに移した後、シェーカーで３０分攪拌した。その後、吸引ろ過を行い、洗浄液のｐＨが８以下になるまで純水洗浄した。その後、０．１Ｎ硫酸水溶液１０ｍＬでろ紙上の分離材をポリカップに移した。シェーカーを用いて、室温で０．５時間液を攪拌した。再度吸引ろ過を行い、約８００ｍｌの純水で洗浄した。この洗浄液を、自動電位差滴定装置を使用し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定して、イオン交換基密度を求めた。
【００９４】
（実施例２）
カテコール誘導体を含む膜の形成において、ドーパミン塩酸塩の量を０．１ｇに変更し、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を２５ｍｍｏｌ／ｌに変更した以外は、実施例１と同様に処理を行って分離材を作製し、実施例２として評価を行った。
【００９５】
（実施例３）
カテコール誘導体の形成において、ドーパミン塩酸塩の量を０．１ｇに変更し、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を２５ｍｍｏｌ／ｌに変更し、水酸基を有する高分子として、変性アガロースの代わりに以下の方法で調製した変性デキストリンを用い、クロロメチルオキシランの量を６．４７５ｇに変更した以外は、実施例１と同様に処理を行って分離材を作製し、実施例３として評価を行った。
【００９６】
分子量（Ｍｗ）７，０００，０００のデキストラン水溶液（２質量％）５００ｍＬに、水酸化ナトリウム０．９８ｇ、グリシジルフェニルエーテル９．２６ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをメタノールで３回再沈殿させ、洗浄した。
【００９７】
（比較例１）
カテコール誘導体を含む膜の形成、水酸基を有する高分子を含む被覆層の形成、及び当該被覆層の架橋をいずれも行わなかった以外は実施例１と同様に処理を行って分離材を作製し、比較例１として評価した。
【００９８】
（比較例２）
水酸基を有する高分子を含む被覆層の形成、及び当該被覆層の架橋をいずれも行わなかった以外は実施例１と同様に処理を行って分離材を作製し、比較例２として評価した。
【００９９】
（比較例３）
カテコール誘導体を含む膜の形成を行わなかった以外は実施例１と同様に処理を行って分離材を作製し、比較例３として評価した。
【０１００】
（比較例４）
カテコール誘導体を含む膜の形成を行わなかった以外は実施例３と同様に処理を行って分離材を作製し、比較例４として評価した。
【０１０１】
（比較例５）
粒子としてＣａｐｔｏ  ＤＥＡＥ（ＧＥ社製）を用い、そのまま比較例５として評価した。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
表１に示されるように、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を多孔質ポリマ粒子の表面に設け、更にその表面に水酸基を有する高分子を被覆することで、高い通液性を付与しつつ、被覆する水酸基を有する高分子との接着性を向上させ、非特異吸着を抑制することができた。