(57)【要約】【課題】不均一な組織幹細胞を増殖能や分化状態に応じて分離することのできるマーカーを開発し、提供する。また、ダイレクトリプログラミングにより、線維芽細胞等の非骨格筋細胞から骨格筋前駆細胞を誘導する転写因子の組み合わせを同定し、それらを用いて骨格筋前駆細胞を製造する方法を提供する。【解決手段】細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤からなる組織幹細胞の分化別分類剤を前記マーカーとして提供する。また、MyoD遺伝子、Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及びMef2b遺伝子からなる骨格筋前駆細胞誘導剤、及び当該剤を用いて非骨格筋細胞から骨格筋前駆細胞を製造する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）MyoD遺伝子、
（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及び
（ｃ）Mef2b遺伝子
からなる骨格筋前駆細胞誘導剤。
【請求項２】
（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の骨格筋前駆細胞誘導剤。
【請求項３】
前記各遺伝子が発現ベクターに発現可能な状態で包含されている、請求項１又は２に記載の骨格筋前駆細胞誘導剤。
【請求項４】
外因性の
（ａ）MyoD遺伝子、
（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及び
（ｃ）Mef2b遺伝子
を含む細胞。
【請求項５】
外因性の
（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子をさらに含む、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記各遺伝子が発現ベクターに発現可能な状態で包含されている、請求項４又は５に記載の細胞。
【請求項７】
骨格筋前駆細胞である、請求項５又は６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含む、筋原性疾患治療剤。
【請求項９】
請求項７に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含む、骨格筋再生促進剤。
【請求項１０】
MyoD遺伝子、Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及びMef2b遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを宿主細胞に導入する導入工程、及び
前記宿主細胞を培養し、発現ベクターに含まれた遺伝子の発現を誘導する誘導工程
を含む骨格筋前駆細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記誘導工程後の細胞からエステラーゼ活性又はM-カドヘリンの発現に基づいて骨格筋前駆細胞を分離する分離工程をさらに含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記導入工程において、Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターをさらに導入する、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が分化済み細胞である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤からなり、不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する組織幹細胞の分化別分類剤。
【請求項１５】
前記エステラーゼ活性を検出可能な剤が生細胞染色用色素のアセトキシメチルエステル体である、請求項１４に記載の分化別分類剤。
【請求項１６】
前記生細胞染色用物質がCalcein又はBDECFである、請求項１５に記載の分化別分類剤。
【請求項１７】
前記組織幹細胞が筋衛星細胞である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の分化別分類剤。
【請求項１８】
不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する方法であって、
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組織幹細胞の分化別分類剤を対象細胞群に投与する投与工程、及び
前記分化別分類剤による細胞内エステラーゼ活性の強度に基づいて前記対象細胞群を分化状態の近似する細胞集団に分離する分離工程
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記分離工程において、
前記対象細胞群を細胞内エステラーゼ活性の、
強度が高い細胞集団からなる非増殖性分化済み細胞、
強度が中位の細胞集団からなる高増殖性未分化細胞、そして
強度が低い細胞集団からなる高移植性未分化細胞
に分離する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記強度が高い細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の上位15％であり、
前記強度が中位の細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の中央値から前後7.5％であり、そして
前記強度が低い細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の下位15％である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分化の不均一性を示す組織幹細胞群が筋衛星細胞又は骨格筋前駆細胞である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋前駆細胞誘導剤、骨格筋前駆細胞の製造方法、及び不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋衛星細胞（Satellite Cells：本明細書では、しばしば「SCs」と表記する）は、骨格筋中に存在する、骨格筋の成長や再生に不可欠な内在性の幹細胞である。通常は休止期（G0期）の状態で存在しているが、成長時、筋肉肥大時、又は傷害等により骨格筋に損傷を生じた場合には、直ちに活性化されて増殖し、その後、筋芽細胞へと分化することによって新たな骨格筋を形成する。
【０００３】
SCsや筋芽細胞は、上記性質からデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）等の筋変性疾患の治療用細胞ソースとしての利用が期待されている。例えば、DMD患者から採取した筋芽細胞に遺伝子治療を施した後、その治療済み筋芽細胞をもとの患者に移植する治療法等が挙げられる。しかし、SCsや筋芽細胞の採取は、高侵襲性であるため、採取回数には制限がある。また、採取したそれらの細胞をインビトロで増殖させた場合、細胞増殖に伴い、移植効率が低下するという問題がある。
【０００４】
近年、疾患治療用の移植細胞ソースの作製技術としてダイレクトリプログラミングが注目されている。「ダイレクトリプログラミング」とは、iPS細胞等の多能性幹細胞を介さずに、皮膚線維芽細胞や末梢血幹細胞のような低侵襲性で採取の容易な分化細胞から各種幹細胞を直接作製する方法である（非特許文献１）。ダイレクトリプログラミング法は、ES細胞やiPS細胞を用いる方法と比較して、迅速で、細胞の安全性が高いという利点がある。この方法によれば、線維芽細胞等に目的とする組織特異的な転写因子をいくつか組み合わせて強制発現させることで、その組織を直接誘導することができる。実際、これまで線維芽細胞等から神経幹細胞、肝細胞、内皮細胞等を誘導できたことが報告されている（非特許文献１）。同様に線維芽細胞等に筋肉特異的な転写因子を強制発現させれば直接筋組織を誘導することも理論的には可能である。事実、線維芽細胞にMyoD遺伝子を過剰発現させると骨格筋細胞に分化することが報告されている（非特許文献２）。しかし、この細胞は分化が完了し、成熟した筋細胞であるため増殖せず、それ故に、移植細胞ソースとして利用することはできなかった。移植細胞ソースとしては、分化が完了する前の前駆細胞である必要がある。しかしながら、骨格筋では、ダイレクトリプログラミングによって線維芽細胞等から筋衛星細胞のような前駆細胞を誘導できる転写因子の組み合わせはこれまで明らかにされていなかった。
【０００５】
ところで、全ての組織幹細胞は、不均一性（heterogeneity）を示す。この「不均一性」とは、組織幹細胞を構成する細胞集団が質的に均一ではないことをいう。通常、細胞は分裂に伴う増殖によりダメージを受ける。そこで組織幹細胞は、最も未分化な細胞（最上位幹細胞）が自己複製（Self-renewal）によって娘細胞を生み出し、その娘細胞が膨大な分裂及び増殖を担う。それによって最上位幹細胞は、必要最小限の分裂のみを行い、分裂に伴うダメージの蓄積を回避している。増殖した娘細胞は、やがて分化して非増殖性の細胞となる。このように組織幹細胞内には、個々の細胞の増殖能や分化状態に応じた階層性が存在する。このような不均一性は、SCsにおいても認められる。
【０００６】
ダイレクトリプログラミングにより、線維芽細胞等から骨格筋の前駆細胞を誘導する転写因子の組み合わせを解明するには、分化した非増殖性の筋衛星細胞で発現している転写因子群ではなく、最も未分化な最上位幹細胞で発現している転写因子群を同定する必要がある。しかし、不均一性を示す筋衛星細胞群を増殖能や分化状態に応じて分離できるマーカーは存在せず、それ故、目的とする転写因子の組み合わせを同定することも従来困難とされてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sadahiro, T., et al., 2015, Circ. Res. 116: 1378-1391.
【非特許文献２】Davis, R. L., et al., 1987, Cell 51: 987-1000.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、筋衛星細胞をはじめとする不均一な組織幹細胞を増殖能や分化状態に応じて分離することのできるマーカーを開発し、提供することである。
また、ダイレクトリプログラミングにより、線維芽細胞等の非骨格筋細胞から骨格筋前駆細胞を誘導する転写因子の組み合わせを同定し、それらを用いて骨格筋前駆細胞を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、組織幹細胞の分化に伴い細胞内のエステラーゼ活性が上昇するという新規知見を得た。この知見に基づいて、細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な物質が、組織幹細胞群を分化状態に応じて分離可能な検出マーカーとなることを明らかにした。また、開発した検出マーカーを用いて、筋衛星細胞を増殖能や分化状態に基づいて分類し、最も未分化な幹細胞で発現している各種転写因子を同定した。また、その結果からダイレクトリプログラミングにより、骨格筋前駆細胞を誘導可能な遺伝子の組み合わせを明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものであり、以下を提供する。
【００１０】
（１）（ａ）MyoD遺伝子、（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及び（ｃ）Mef2b遺伝子からなる骨格筋前駆細胞誘導剤。
（２）（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子をさらに含む、（１）に記載の骨格筋前駆細胞誘導剤。
（３）前記各遺伝子が発現ベクターに発現可能な状態で包含されている、（１）又は（２）に記載の骨格筋前駆細胞誘導剤。
【００１１】
（４）外因性の（ａ）MyoD遺伝子、（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及び（ｃ）Mef2b遺伝子を含む細胞。
（５）外因性の（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子をさらに含む、（４）に記載の細胞。
（６）前記各遺伝子が発現ベクターに発現可能な状態で包含されている、（４）又は（５）に記載の細胞。
（７）骨格筋前駆細胞である、（５）又は（６）に記載の細胞。
（８）（７）に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含む、筋原性疾患治療剤。
（９）（７）に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含む、骨格筋再生促進剤。
【００１２】
（１０）MyoD遺伝子、Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及びMef2b遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを宿主細胞に導入する導入工程、及び前記宿主細胞を培養し、発現ベクターに含まれた遺伝子の発現を誘導する誘導工程を含む骨格筋前駆細胞の製造方法。
（１１）前記誘導工程後の細胞からエステラーゼ活性又はM-カドヘリンの発現に基づいて骨格筋前駆細胞を分離する分離工程をさらに含む、（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記導入工程において、Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターをさらに導入する、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）前記宿主細胞が分化済み細胞である、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
（１４）細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤からなり、不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する組織幹細胞の分化別分類剤。
（１５）前記エステラーゼ活性を検出可能な剤が生細胞染色用色素のアセトキシメチルエステル体である、（１４）に記載の分化別分類剤。
（１６）前記生細胞染色用物質がCalcein又はBDECFである、（１５）に記載の分化別分類剤。
（１７）前記組織幹細胞が筋衛星細胞である、（１４）〜（１６）のいずれかに記載の分化別分類剤。
（１８）不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する方法であって、（１４）〜（１７）のいずれかに記載の組織幹細胞の分化別分類剤を対象細胞群に投与する投与工程、及び前記分化別分類剤による細胞内エステラーゼ活性の強度に基づいて前記対象細胞群を分化状態の近似する細胞集団に分離する分離工程を含む、前記方法。
（１９）前記分離工程において、前記対象細胞群を細胞内エステラーゼ活性の、強度が高い細胞集団からなる非増殖性分化済み細胞、強度が中位の細胞集団からなる高増殖性未分化細胞、そして強度が低い細胞集団からなる高移植性未分化細胞に分離する、（１８）に記載の方法。
（２０）前記強度が高い細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の上位15％であり、前記強度が中位の細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の中央値から前後7.5％であり、そして前記強度が低い細胞集団が細胞内エステラーゼ活性に基づく前記対象細胞群の下位15％である、（１９）に記載の方法。
（２１）前記分化の不均一性を示す組織幹細胞群が筋衛星細胞又は骨格筋前駆細胞である、（１８）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤によれば、分化した細胞からダイレクトリプログラミングにより骨格筋前駆細胞を誘導することができる。
本発明の骨格筋前駆細胞の製造方法によれば、分化した細胞からダイレクトリプログラミングにより骨格筋前駆細胞を製造することができる。
本発明の分離方法によれば、不均一性を示す組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離し、その性質に応じて分類することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】筋衛星細胞群におけるエステラーゼ活性を示した図である。A〜Cは同視野であり、Aは微分干渉像（DIC）を、Bは蛍光像を、CはAとBの統合図を示す。
【図２】Calcein-AMで染色した筋衛星細胞をFACSで解析した図である。AはC2C12マウスの筋芽細胞株を、またBは筋衛星細胞を示す。以降の実施例では、筋衛星細胞を図中のCalceinlow SCs、CalceinmiddleSCs、及びCalceinhigh SCsの3つの細胞集団に分けて検証した。
【図３】筋衛星細胞の各細胞集団における分化状態の検証結果を示す図である。AはPax7遺伝子の、またBはMyogenin遺伝子の発現量を示す。
【図４】筋衛星細胞の各細胞集団における増殖性を示す図である。
【図５】筋衛星細胞の各細胞集団における増殖性を、BrdUを用いて検証した結果を示す図である。
【図６】筋衛星細胞の各細胞集団における移植能の検証結果を示す図である。
【図７】Calceinlow SCsで高発現する7種の転写因子を示す図である。
【図８】骨格筋前駆細胞誘導剤候補遺伝子を組み合わせてマウスの線維芽細胞内で過剰発現させた時の骨格筋前駆細胞誘導性を検証した図である。A-aはマウスのembryonic fibroblast（MEF）を、A-bは候補遺伝子10個を強制発現したMEFを、そしてA-cは培養した筋衛星細胞を示す。Bは候補遺伝子5個の様々な組み合わせによるMEFからの骨格筋前駆細胞の誘導結果を示す。
【図９】骨格筋前駆細胞検出用マーカーとしてのM-カドヘリンの検証結果を示す図である。Aは抗M-カドヘリン抗体で染色したMEFを、BはMEF誘導型骨格筋前駆細胞の精製前、そしてCはその精製後を、FACSで解析した結果を示す。Dは骨格筋前駆細胞誘導剤による抗M-カドヘリン抗体陽性細胞の出現数を示す。
【図１０】骨格筋前駆細胞の候補細胞が骨格筋前駆細胞としての性質を有することを確認した図である。A及びBはそれぞれ外因性遺伝子であるpax3遺伝子及びpax7遺伝子の、またCは筋肉決定遺伝子である内因性myf5遺伝子の、各細胞における発現量を示している。
【図１１】骨格筋前駆細胞における筋細胞分化能の検証結果を示す図である。Aは骨格筋前駆細胞を分化誘導した後の細胞を示す。myogenin陽性細胞を赤紫で、ミオシンへビーチェーン陽性細胞を緑で示す。Bは内在性の筋衛星細胞との融合状態を示す。GFPマウス由来の筋衛星細胞を緑で、骨格筋前駆細胞を赤で示す。
【図１２】成体マウス尾部線維芽細胞（TTF）からの骨格筋前駆細胞の誘導性を示す図である。Aは、候補遺伝子4個の様々な組み合わせによるTTFからの骨格筋前駆細胞の誘導結果を示す。Bは抗M-カドヘリン抗体で染色したTTF及びTTF誘導型骨格筋前駆細胞の精製前の、そしてCはその精製後の細胞をFACSで解析した結果を示す。
【図１３】TTFs由来の骨格筋前駆細胞が骨格筋細胞としての性質を有することを確認した図である。A及びBはそれぞれ外因性遺伝子であるpax7遺伝子及びMyoD遺伝子の、またC及びDはそれぞれ内因性のmyf5遺伝子及びMyogeninの、各細胞における発現量を示している。
【図１４】TTFs由来の骨格筋前駆細胞における筋細胞分化能の検証結果を示す図である。Aは骨格筋前駆細胞を分化誘導した後の細胞を示す。myogenin陽性細胞を赤紫で、ミオシンへビーチェーン陽性細胞を緑で示す。Bは骨格筋前駆細胞をmdxマウスに移植したときのdystrophin陽性の筋線維を示す。Cは移植後のセクションあたりのdystrophin陽性筋線維の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．骨格筋前駆細胞誘導剤
１−１．概要
本発明の第１の態様は、骨格筋前駆細胞誘導剤である。本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤は、複数の遺伝子の組み合わせで構成され、それらの遺伝子群をダイレクトリプログラミングに基づき、宿主細胞内で強制発現させることで、その細胞が非骨格筋細胞であっても未分化の骨格筋前駆細胞に誘導することができる。
【００１７】
１−２．定義
本明細書において頻用する以下の用語について定義する。
本明細書において「骨格筋前駆細胞（skeletal muscle progenitor cell）」とは、骨格筋への分化運命が決定づけられた幹細胞をいう。実質的には筋衛星細胞（SCs）と同義であるが、本明細書ではSCsが骨格筋中に内在する細胞であるのに対して、骨格筋前駆細胞は、ダイレクトリプログラミングによって特定の転写因子群を細胞内で強制発現させることで、分化済みの細胞から人工的に誘導された筋衛星細胞様細胞を意味するものとする。
【００１８】
本明細書において「骨格筋前駆細胞（への）誘導」とは、ダイレクトリプログラミングによって非骨格筋細胞から骨格筋前駆細胞を誘導することをいう。
【００１９】
本明細書において「非骨格筋細胞」とは、発生過程において運命付けが決定した骨格筋細胞以外の細胞で、その決定した細胞に特有の構造的及び機能的な変化を生じている。本明細書における非骨格筋細胞は、原則として分化的に不可逆であるが、ダイレクトリプログラミングにより各組織特異的な細胞、又は前駆細胞への誘導が可能な可塑性を有する。
【００２０】
本明細書において「未分化細胞」とは、発生過程において運命付けが未決定であり、複数種の細胞への分化能を保持する細胞である。未分化細胞の例として、例えば、幹細胞が挙げられる。「幹細胞」とは、分裂よって自分と同じ細胞を生み出す自己複製能(Self-renewal)と、様々な細胞系列に分化可能な分化多能能、及び際限ない増殖能を有する細胞である。幹細胞の例として組織幹細胞（成体幹細胞、又は体性幹細胞とも呼ばれる）や多能性幹細胞が知られている。組織幹細胞は、分化状態がある程度進み、分化可能な細胞系列が限定されている幹細胞をいう。組織幹細胞には、例えば、筋衛星細胞、造血幹細胞、腸管幹細胞、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、乳腺幹細胞等が挙げられる。多能性幹細胞は、ほぼ全ての細胞に分化可能な幹細胞をいう。例えば、胚性幹細胞（Embryonic stem cell:ES細胞）やiPS細胞（induced pluripotent stem cell：人工多能性幹細胞）が該当する。
【００２１】
１−３．構成
１−３−１．遺伝子の組み合わせ
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤は、宿主細胞内で発現可能なように構成された複数の遺伝子の組み合わせ物で構成される。具体的な遺伝子の組み合わせは、
（ａ）MyoD遺伝子、
（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、
（ｃ）Mef2b遺伝子、及び
（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子
からなる。このうち、（ａ）〜（ｃ）の3群は、本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する必須遺伝子である。2つの遺伝子を含む（ｂ）群では、少なくとも1つが構成遺伝子として選択される。一方、（ｄ）群は選択遺伝子である。したがって、必要に応じてこの群から選択された1以上の遺伝子を構成遺伝子として本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤に追加すればよい。以下、各遺伝子について説明をする。
【００２２】
（１）MyoD遺伝子
「MyoD（Myoblast determination protein 1）遺伝子」は、転写因子MyoDをコードする遺伝子である。MyoDは、筋特異的な遺伝子プロモーターに結合して、下位の遺伝子の転写を制御し、筋細胞系負の決定と分化、及び筋特異的形質の発現に関与している。MyoD遺伝子を線維芽細胞、脂肪芽細胞、骨芽細胞等で強制発現させることで、それらの細胞を筋細胞へと転換させることが可能であり、それ故、MyoD遺伝子は、筋細胞分化を決定する上位遺伝子の一つと考えられている。
【００２３】
MyoD遺伝子には、例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型MyoDをコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるヒト野生型MyoD遺伝子である。また、ヒト野生型MyoDと同様の活性を有する他生物種由来の野生型MyoDオルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型MyoDオルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型MyoDオルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型MyoDオルソログ遺伝子として、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型MyoDをコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号４で示す塩基配列からなるマウス野生型MyoD遺伝子である。
【００２４】
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、MyoD遺伝子は、骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する必須遺伝子の一つ（ａ）群を構成する。なお、使用する宿主細胞が胚性由来の非骨格筋細胞の場合には、（ｄ）群に属するPitx1遺伝子がMyoD遺伝子と同等の機能を奏し得ることから、MyoD遺伝子の代替遺伝子となり得る。
【００２５】
（２）Pax7遺伝子
「Pax7遺伝子」は、転写因子Pax7をコードする遺伝子である。Pax7は、胚期や周産期の骨格筋形成に必須の分子で、生後は筋衛星細胞の生存に必須であることが知られている（Yin H., et al., 2013, Physiol. Rev. 93, 23-67）。
【００２６】
Pax7遺伝子には、例えば、配列番号９で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型Pax7をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１０で示す塩基配列からなるヒト野生型Pax7遺伝子である。また、ヒト野生型Pax7と同様の活性を有する他生物種由来の野生型Pax7オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Pax7オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Pax7オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Pax7オルソログ遺伝子として、配列番号１１で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型Pax7をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１２で示す塩基配列からなるマウス野生型Pax7遺伝子である。
【００２７】
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、Pax7遺伝子は、骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する必須遺伝子の一つ（ｂ）群を次述のPax3遺伝子と共に構成する。（ｂ）群から選択される遺伝子は、Pax7遺伝子、及びPax3遺伝子のいずれか一方又は両方であればよいが、いずれか一方の場合にはPax7遺伝子が好適である。
【００２８】
（３）Pax3遺伝子
「Pax3遺伝子」は、転写因子Pax3をコードする遺伝子である。Pax3は、Pax7と同様に胚期や周産期の骨格筋形成に必須の分子で、Pax3欠損型マウスは胎生致死となる（Yin H., et al., 2013, Physiol. Rev. 93, 23-67）。
【００２９】
Pax3遺伝子には、例えば、配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型Pax3をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１４で示す塩基配列からなるヒト野生型Pax3遺伝子である。また、ヒト野生型Pax3と同様の活性を有する他生物種由来の野生型Pax3オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Pax3オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Pax3オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Pax3オルソログ遺伝子として、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型Pax3をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１６で示す塩基配列からなるマウス野生型Pax3遺伝子である。
【００３０】
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、Pax3遺伝子は、骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する必須遺伝子の一つ（ｂ）群を前述のPax7遺伝子と共に構成する。
【００３１】
（４）Mef2b遺伝子
「Mef2b（Myocyte enhancer binding factor 2B）遺伝子」は、Mef2a遺伝子、Mef2c遺伝子、及びMef2d遺伝子と共にMEF2遺伝子ファミリーを構成し、転写因子MEF2Bをコードする遺伝子である。MEF2Bは、筋肉の発生に関与することが知られている（Molkentin, J.D. et al., 1996, Mol. Cell. Biol., 16: 3814-3824）。
【００３２】
Mef2b遺伝子には、例えば、配列番号１７で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型MEF2Bをコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号１８で示す塩基配列からなるヒト野生型Mef2b遺伝子である。また、ヒト野生型MEF2Bと同様の活性を有する他生物種由来の野生型MEF2Bオルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Mef2bオルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Mef2bオルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Mef2bオルソログ遺伝子として、配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型Mef2bをコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２０で示す塩基配列からなるマウス野生型Mef2b遺伝子である。
【００３３】
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、Mef2b遺伝子は、骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する必須遺伝子の一つ（ｃ）群を単独で構成する。
【００３４】
（５）Pitx1遺伝子
「Pitx1（Pituitary homeobox 1）遺伝子」は、転写因子PITX1をコードする遺伝子である。PITX1は、四肢、特に後肢の発生に関与することが知られている（Logan, M. & Tabin, C.J., 1999, Science 283: 1736-1739）。
【００３５】
Pitx1遺伝子には、例えば、配列番号５で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型PITX1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号６で示す塩基配列からなるヒト野生型Pitx1遺伝子である。また、ヒト野生型PITX1と同様の活性を有する他生物種由来の野生型PITX1オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Pitx1オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Pitx1オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Pitx1オルソログ遺伝子として、配列番号７で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型PITX1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号８で示す塩基配列からなるマウス野生型Pitx1遺伝子である。
【００３６】
（５）及び後述する（６）〜（１０）の遺伝子は、本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する選択遺伝子の一つ（ｄ）群を構成する。（ｄ）群に属する遺伝子は、必要に応じて、いずれか一以上を本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤の構成遺伝子として加えることができる。なお、本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、Pitx1遺伝子は、使用する宿主細胞が胚性由来の非骨格筋細胞の場合にのみ、上述のようにMyoD遺伝子の代替遺伝子となり得る。
【００３７】
（６）Meox1遺伝子
「Meox1（Mesenchyme Homeobox 1）遺伝子」は、ホメオボックス遺伝子ファミリーに属する遺伝子で、転写因子MOX-1をコードする。MOX-1は、発生期の骨格筋細胞の形成に関与することが知られている（Mankoo, B.S. et al., 2003, Development 130: 4655-4664）。
【００３８】
Meox1遺伝子には、例えば、配列番号２１で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型MOX-1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２２で示す塩基配列からなるヒト野生型Meox1遺伝子である。また、ヒト野生型MOX-1と同様の活性を有する他生物種由来の野生型MOX-1オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Meox1オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Meox1オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Meox1オルソログ遺伝子として、配列番号２３で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型MOX-1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２４で示す塩基配列からなるマウス野生型Meox1遺伝子である。
【００３９】
（７）Meox2遺伝子
「Meox2（Mesenchyme Homeobox 2）遺伝子」は、ホメオボックス遺伝子ファミリーに属する遺伝子で、転写因子MOX-2をコードする。MOX-2は、MOX-1と同様、発生期の骨格筋細胞の形成に関与することが知られている（Mankoo, B.S. et al., 2003, Development 130: 4655-4664）。
【００４０】
Meox2遺伝子には、例えば、配列番号２５で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型MOX-2をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２６で示す塩基配列からなるヒト野生型Meox2遺伝子である。また、ヒト野生型MOX-2と同様の活性を有する他生物種由来の野生型MOX-2オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Meox2オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Meox2オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Meox2オルソログ遺伝子として、配列番号２７で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型MOX-2をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号２８で示す塩基配列からなるマウス野生型Meox2遺伝子である。
【００４１】
（８）Twist1遺伝子
「Twist1（Twist-related protein 1）遺伝子」は、転写因子TWIST1をコードする進化的に保存された遺伝子である。TWIST1は、胚発生時において骨格筋細胞の形成に関与することが知られている（Bernard, F., et al., 2010, Development 137: 2633-2642）。
【００４２】
TWIST1遺伝子には、例えば、配列番号２９で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型TWIST1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号３０で示す塩基配列からなるヒト野生型Twist1遺伝子である。また、ヒト野生型TWIST1と同様の活性を有する他生物種由来の野生型TWIST1オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Twist1オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Twist1オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Twist1オルソログ遺伝子として、配列番号３１で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型TWIST1をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号３２で示す塩基配列からなるマウス野生型Twist1遺伝子である。
【００４３】
（９）Twist2遺伝子
「Twist2（Twist-related protein 2）遺伝子」は、転写因子TWIST2をコードする進化的に保存された遺伝子である。TWIST2は、TWIST1と同様、胚発生時において骨格筋細胞の形成に関与することが知られている（Bernard, F., et al., 2010, Development 137: 2633-2642）。
【００４４】
TWIST2遺伝子には、例えば、配列番号３３で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型TWIST2をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号３４で示す塩基配列からなるヒト野生型Twist2遺伝子である。また、ヒト野生型TWIST2と同様の活性を有する他生物種由来の野生型TWIST2オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Twist2オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Twist2オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Twist2オルソログ遺伝子として、配列番号３５で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型TWIST2をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号３６で示す塩基配列からなるマウス野生型Twist2遺伝子である。
【００４５】
（１０）Hoxc12遺伝子
「Hoxc12（Homeobox C12）遺伝子」は、ホメオボックス遺伝子ファミリーに属する遺伝子で、転写因子HOXC12をコードする。
【００４６】
Hoxc12遺伝子には、例えば、配列番号３７で示すアミノ酸配列からなるヒト野生型HOXC12をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号３８で示す塩基配列からなるヒト野生型Hoxc12遺伝子である。また、ヒト野生型HOXC12と同様の活性を有する他生物種由来の野生型HOXC12オルソログをコードするオルソログ遺伝子も含まれる。例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の野生型Hoxc12オルソログ遺伝子、及び鳥類、爬虫類、又は両生類由来の野生型Hoxc12オルソログ遺伝子が該当する。そのような他生物種由来の野生型Hoxc12オルソログ遺伝子として、配列番号３９で示すアミノ酸配列からなるマウス野生型HOXC12をコードする遺伝子が挙げられる。具体的には、例えば、配列番号４０で示す塩基配列からなるマウス野生型Hoxc12遺伝子である。
【００４７】
（１１）変異遺伝子
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する上記各遺伝子は、野生型タンパク質をコードする野生型遺伝子の他に、野生型タンパク質と同等以上の活性を有する変異タンパク質をコードする変異遺伝子を包含する。
【００４８】
前記変異遺伝子には、例えば、野生型タンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドや、野生型タンパク質のアミノ酸配列に対して90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。つまり、前述の各野生型遺伝子の塩基酸配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドや、野生型遺伝子の塩基配列に対して80％以上、82％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の塩基同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４９】
本明細書において「複数個」とは2〜10個、2〜8個、2〜6個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのポリペプチドのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じて、いずれかのアミノ酸配列にギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、一方のポリペプチドの全アミノ酸数に対する他方のポリペプチドの同一アミノ酸の割合（％）をいう。同様に本明細書において「塩基同一性」とは、二つのポリヌクレオチドの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じて、いずれかの塩基配列にギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、一方のポリヌクレオチドの全塩基数に対する他方のポリヌクレオチドの同一塩基の割合（％）をいう。％同一性は、相同性検索プログラムBLAST（Basic local alignment search tool；Altschul, S. F. et al，J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索等の公知のプログラムを用いて容易に決定できる。また、前記アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、野生型タンパク質と実質的に同等な構造又は性質を有し得るからである。保存的アミノ酸とは、同じアミノ酸群に分類されるアミノ酸どうしの関係をいう。前記アミノ酸群には、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）、極性アミノ酸群（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸群（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸））及び塩基性アミノ酸群（アルギニン、ヒスチジン、リジン）、非荷電アミノ酸群（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐鎖アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等が知られている。
【００５０】
また、各野生型遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸断片と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子も変異遺伝子に包含される。本明細書において「高ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない、高温かつ低塩濃度の条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、60℃〜68℃で1×SSC以下、好ましくは65℃〜70℃で0.1×SSC以下の条件をいう。
【００５１】
上記のような変異遺伝子の具体的な例として、例えば、天然型変異遺伝子が挙げられる。「天然型変異遺伝子」とは、自然界に存在する変異遺伝子であって、例えば、SNPｓ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体（スプライスバリアント）等が挙げられる。
【００５２】
１−３−２．発現ベクター
本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤において、前記各遺伝子は、発現ベクターに発現可能な状態で包含されていることが好ましい。
【００５３】
「発現ベクター」とは、内部に含まれる目的の遺伝子やその遺伝子断片の発現を制御できる発現単位をいう。「発現可能な状態」とは、所定条件下で目的の遺伝子等が宿主細胞内で転写され得る状態をいう。具体的には、プロモーターの制御下に目的の遺伝子を配置した状態が該当する。プロモーターが活性することで、その制御下に配置された目的の遺伝子等は、発現が誘導される。発現ベクターは、宿主細胞内で複製かつ発現が可能な様々な発現ベクターを利用することができる。例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。ウイルスベクターには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等に由来する種々のベクターが含まれる。これらの発現ベクターは、各メーカーからの市販品を利用することもできる。発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよい。
【００５４】
なお、（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）の各群内に含まれる遺伝子は、それぞれ別個の発現ベクターに包含されていてもよいし、（ａ）群及び（ｂ）群であれば1つの発現ベクターに、また（ｄ）群であれば1以上の発現ベクターに包含されていてもよい。さらに各群間の遺伝子も、別個の発現ベクターに包含されていてもよいし、いくつかがまとめて包含されていてもよい。例えば、（ａ）群に含まれるMyoD遺伝子と（ｂ）群に含まれるPax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子が1つの発現ベクターに包含されていてもよい。
【００５５】
発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主細胞内で転写制御機能を有するプロモーターであれば、その種類は特に限定はしない。当該分野で公知のプロモーターを用いればよい。プロモーターには、例えば、目的の遺伝子を、宿主細胞内で恒常的に発現可能な構成的活性型プロモーター、宿主細胞内で発現時期を制御できる発現誘導型プロモーター、そして宿主の特定組織や特定部位で選択的に発現することができる部位特異的プロモーター等が知られているが、いずれのプロモーターを用いてもよく、本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤の用途を勘案して適宜定めればよい。構成的活性型プロモーターの例として、CMVプロモーター（CMV-IEプロモーター）、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、EF1αプロモーター、Ubプロモーター等が挙げられる。発現誘導型プロモーターの例として、E. coliテトラサイクリン耐性オペロンから得られたTetオペレーターDNA配列（tetO）の反復配列をもつテトラサイクリン応答因子（TRE）を含むプロモーター等が挙げられる。各メーカーから宿主細胞や誘導目的に応じて改変された好適なプロモーターを含む発現ベクターが市販されているので、それらを利用してもよい。なお、前記いずれのプロモーターも宿主細胞内では目的の遺伝子を過剰発現できる過剰発現型プロモーターに分類される。
【００５６】
２．骨格筋前駆細胞
２−１．概要
本発明の第２の態様は、骨格筋前駆細胞に誘導可能な複数の外因性遺伝子群を発現可能な状態で含む細胞である。本発明の細胞は、分化済み状態であっても包含する外因性遺伝子群を強制発現させることで骨格筋前駆細胞に誘導され得る。本発明の細胞、特に骨格筋前駆細胞は、第３態様の筋原性疾患治療剤又は骨格筋再生促進剤の有効成分として利用することができる。
【００５７】
２−２．構成
本発明の細胞は、細胞内で発現可能なように構成された複数の外因性遺伝子を包含する。本明細書において「外因性遺伝子」とは、外部から導入された外来性遺伝子をいう。
【００５８】
本態様の細胞が包含する外因性遺伝子は、第１態様で記載した各遺伝子群である。具体的には、必須遺伝子の組み合わせとして、
（ａ）MyoD遺伝子、
（ｂ）Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及び
（ｃ）Mef2b遺伝子
を発現可能な状態で包含し、また選択遺伝子として
（ｄ）Pitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子
を包含する。各遺伝子の構成は、第１態様と同じであることからここではその説明を省略する。
【００５９】
本態様の細胞は、内因性遺伝子（内在性遺伝子）として前記外因性遺伝子と同一遺伝子又は同一オルソログ遺伝子を原則、細胞内に包含する。導入される外因性遺伝子の由来生物種は、限定はしないが宿主細胞の由来種と同種でよい。例えば、細胞がヒト由来であるとき、外因性遺伝子の一つであるMyoD遺伝子は、ヒトMyoD遺伝子でよい。
【００６０】
上記各外因性遺伝子は、宿主細胞内に発現可能な状態で包含されている。宿主細胞内での包含状態は特に限定はしないが、通常は前記各遺伝子を含む発現ベクターの状態で包含される。すなわち、第１態様に記載の骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する遺伝子又はそれを含む発現ベクターを導入した宿主細胞が本態様の細胞となり得る。
【００６１】
本態様の宿主細胞は限定しない。例えば、胎児由来の胚性細胞であっても、また成体由来の細胞であってもよい。具体的には、胚性線維芽細胞であっても、また成体由来の線維芽細胞であってもよい。未分化細胞又は分化済み細胞のいずれであってもよいが、本発明の趣旨から分化済み細胞であることが好ましい。宿主細胞の由来腫も限定はしないが、脊椎動物細胞由来、好ましくは哺乳動物細胞由来、より好ましくはヒト由来である。
【００６２】
本態様の細胞は、上記必須の外因性遺伝子群が発現している場合には、骨格筋前駆細胞へと誘導される。発現は一過性であっても恒常的であってもよいが、骨格筋前駆細胞状態を安定的に維持するためには恒常的発現が好ましい。一方、本態様の細胞は、上記必須の外因性遺伝子群が発現誘導されない状態含み得る。この場合、本態様の細胞は、骨格筋前駆細胞に誘導には誘導されないが、骨格筋前駆細胞への誘導潜在性を有する細胞と解することができる。
【００６３】
２−３．骨格筋前駆細胞の製造方法
本態様の細胞は、前記外因性遺伝子群を発現可能な状態で宿主細胞内に導入して、その発現を誘導することで、線維芽細胞等の非骨格筋細胞から骨格筋前駆細胞を製造できる。
本発明の骨格筋前駆細胞の製造方法は、導入工程及び誘導工程を必須の工程として含み、選択工程として分離工程を含む。以下、各工程について説明をする。
【００６４】
（１）導入工程
「導入工程」とは、骨格筋前駆細胞へ誘導する遺伝子群を発現可能な状態で含む発現ベクターを、宿主細胞に導入する工程である。本工程で導入する遺伝子群は、第１態様に記載の必須遺伝子群、すなわちMyoD遺伝子、Pax7遺伝子及び／又はPax3遺伝子、及びMef2b遺伝子である。また選択遺伝子としてPitx1遺伝子、Meox1遺伝子、Meox2遺伝子、Twist1遺伝子、Twist2遺伝子、及びHoxc12遺伝子からなる群から選択される1以上の遺伝子を導入することもできる。これらの遺伝子の組み合わせ及び発現ベクターについては第１態様の記載に準ずるので、ここではその説明を省略する。
前記発現ベクターを導入する宿主細胞は、第２態様に記載の宿主細胞に準ずる。
【００６５】
各発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、その発現ベクターにおける当該分野で公知の形質転換法又はトランスフェクション法に従えばよい。例えば、ウイルスベクターであれば、宿主細胞に感染させることで導入することができる。形質転換法又はトランスフェクション法については、Green ＆ Sambrook、2012、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York等に記載された遺伝子導入方法を参考にすればよい。
【００６６】
（２）誘導工程
「誘導工程」は、導入工程後の宿主細胞を培養し、宿主細胞が包含する各発現ベクターに含まれた遺伝子の発現を誘導する工程である。本工程によって、宿主細胞は、骨格筋前駆細胞へと誘導される。
【００６７】
本工程で宿主細胞を培養する方法は、宿主細胞の種類及び由来に応じた当該分野で公知の培養方法で行えばよい。通常は、宿主細胞を細胞培養用培地に播種した後、5％CO2下、37℃で培養すれば足りる。
【００６８】
また、培地は、宿主細胞を増殖及び／又は維持可能な培地であれば、その種類は、特に限定はしない。当該分野で公知の培地であればよい。通常は、標準細胞培養用培地で足りる。ここでいう「標準細胞培養用培地」とは、主として哺乳動物由来の様々な種類の細胞の培養に用いられる汎用性の高い基本培地をいう。具体的には、例えば、イーグルMEM（Eagle Minimum Essential Medium）、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ハムF10（Ham's Nutrient Mixture F10）培地、ハムF12（Ham's Nutrient Mixture F12）培地、M199培地、高性能改良199培地（High Performance Medium 199）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培地、DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Ham's Nutrient Mixture F12）培地が挙げられる。DMEM/F12培地の場合、その混合比率は、特に制限しない。好ましくは、構成成分の重量濃度比でDMEMとF12を6：4〜4：6の範囲で混合すればよい。
【００６９】
標準細胞培養用培地の具体的な組成については、当該分野で公知であり、それ故、適当な文献（例えば、Kaech S. and Banker G., 2006, Nat. Protoc., 1(5): 2406-2415）に記載の組成に基づいて調製すればよい。又は、Thermo Fisher Scientifics社, Wako Pure Chemical Industries社等の各メーカーで市販の培地を用いてもよい。
【００７０】
培養期間は、宿主細胞の種類及び由来に応じて多少異なるが、本工程の上記目的を達成するためには、通常12時間〜72時間、好ましくは24時間〜48時間でよい。
【００７１】
また遺伝子の誘導は、宿主細胞内に導入した発現ベクターのプロモーターに基づく。すなわち、発現ベクターにおいて、骨格筋前駆細胞へ誘導する遺伝子群の発現を誘導するプロモーターが宿主細胞内で恒常的に発現可能な構成的活性型プロモーターであれば、本工程で特段の誘導処理を行うことなく培養するのみで本工程は達成される。一方、宿主細胞内で発現時期を制御できる発現誘導型プロモーターであれば、本工程での培養期間中も宿主細胞内で不活状態にあることから、培養と共にそのプロモーター特有の誘導処理を行う必要がある。例えば、前記TREを含むプロモーターであれば、発現誘導剤であるテトラサイクリン（Tet）又はその誘導体であるドキシサイクリン（Dox)を培地に添加して細胞内の発現ベクターに含まれるプロモーターを活性化させる。それによって、そのプロモーター制御下の遺伝子群の発現を誘導しなければならない。
【００７２】
（３）分離工程
「分離工程」は、発現誘導工程後の細胞からエステラーゼ活性又はM-カドヘリンの発現に基づいて骨格筋前駆細胞を分離する工程である。本工程は選択工程であり、必要に応じて行えばよい。誘導工程後の細胞群は、骨格筋前駆細胞に誘導された細胞と誘導の掛らなかった非骨格筋前駆細胞が混在している。本工程により、骨格筋前駆細胞のみを分離精製することができる。
【００７３】
エステラーゼ活性に基づく分離方法については、後述の第５態様で詳述することから、ここでの説明は省略する。
【００７４】
M-カドヘリンの発現に基づく分離方法は、骨格筋特異的膜タンパク質であるM-カドヘリンが骨格筋前駆細胞の特異的マーカーとなり得るという後述の実施例１０の結果に基づく。本工程では、細胞群からM-カドヘリンを発現する細胞を検出、及び分離可能な方法であれば特に限定はしない。例えば、蛍光標識した、抗M-カドヘリン抗体又は抗M-カドヘリン核酸アプタマーと、誘導工程後の細胞とを混合して結合させた後に、FACS（fluorescence activated cell sorting）を用いて、蛍光陽性細胞、すなわちM-カドヘリン陽性細胞を分離することで本工程を達成し得る。
【００７５】
本発明の骨格筋前駆細胞の製造方法によれば、分離済み細胞から骨格筋前駆細胞を誘導し、製造することができる。
【００７６】
３．筋原性疾患治療剤
３−１．概要
本発明の第３の態様は、筋原性疾患治療剤である。本発明の筋原性疾患治療剤は、第２態様に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として、筋原性疾患に罹患した被験体の疾患部位に移植することで筋原性疾患の治療剤又は予防剤として利用することができる。
【００７７】
本明細書において「治療」とは、疾患の治癒、それに伴う症状の緩和又は除去、及び／又は進行の阻止又は抑制をいう。また本明細書において「予防」とは、疾患の罹患を未然に防ぐことをいう。治療剤又は予防剤は、疾患の治療又は予防を目的とした薬剤又は医薬組成物をいう。
【００７８】
３−２．構成
本発明の筋原性疾患治療剤は、前記第２態様に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含み、培地、溶媒、及び担体等を選択構成成分として包含する。以下それぞれの構成成分について説明をする。
【００７９】
３−２−１．有効成分
本発明の筋原性疾患治療剤は、前記第２態様に記載の骨格筋前駆細胞を有効成分として含む。骨格筋前駆細胞の由来は問わない。本発明の製造方法で誘導された、いかなる細胞であってもよいし、本発明の筋原性疾患治療剤を投与する被験体以外の個体に由来する細胞であってもよい。ただし、投与後の拒絶反応や生着性点を鑑みれば、本発明の筋原性疾患治療剤を適用する被験体由来の細胞が好適である。この場合、筋原性疾患に罹患した被験体から採取された細胞であれば、筋原性疾患の原因遺伝子を包含し得る。それ故に、前記第２態様に記載の骨格筋前駆細胞の製造前後で、遺伝子治療により治療し、正常化させた細胞を用いることが望ましい。また、骨格筋前駆細胞は、必要に応じて筋芽細胞に分化させてもよい。骨格筋前駆細胞を筋芽細胞に分化させる方法は、例えば、2%ウマ血清/DMEM等の分化培地での培養が挙げられる。
【００８０】
筋原性疾患治療剤に含まれる骨格筋前駆細胞の量（含有量）は、本発明の筋原性疾患治療剤の構成、疾患の種類、骨格筋前駆細胞の分化の度合い、並びに後述する培地の種類によって異なる。したがって、筋原性疾患治療剤中の骨格筋前駆細胞の含有量、及びそれに基づいて算出される投与量は、前記条件や被験体の情報等に応じて、最終的には医師又は獣医師等の判断により、それぞれの条件を勘案し決定される。
【００８１】
本明細書において「被験体」とは、筋原性疾患治療剤の投与対象となる生体（生きた個体）をいう。例えば、ヒト、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、競走馬、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル等）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）等が該当する。好ましくはヒトである。また、「被験体の情報」とは、筋原性疾患治療剤を投与する生体の様々な個体情報であって、例えば、ヒトの場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。
【００８２】
３−２−２．培地
本発明の筋原性疾患治療剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な培地を含むことができる。「薬学的に許容可能な」とは、製剤技術分野において使用が認められていることをいう。
【００８３】
培地は、前記有効成分である骨格筋前駆細胞を増殖及び／又は維持するために使用される。培地の種類は、特に限定はしない。前記第２態様の製造方法における誘導工程に記載の当該分野で公知の培地であればよい。培地については、Green ＆ Sambrook（前述）の記載を参考にすればよい。
【００８４】
３−２−３．溶媒
本発明の筋原性疾患治療剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な溶媒を含んでいてもよい。溶媒には、例えば、バッファ（緩衝液）、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助剤を含む等張液が挙げられる。バッファは、前記有効成分である骨格筋前駆細胞を含む溶液中のpHを維持するために使用される。具体的にはPBS、HEPES、MOPS、Tricine等が挙げられる。バッファ等の溶媒については、Green ＆ Sambrook（前述）の記載を参考にすればよい。
【００８５】
３−２−４．担体
本発明の組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。担体とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤で、例えば、賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等が挙げられる。担体は、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
【００８６】
３−３．剤形
本実施形態の筋原性疾患治療剤の剤形は、通常は、有効成分の骨格筋前駆細胞を生細胞状態で含んだ液体状態で構成される。骨格筋前駆細胞が不活化せず、投与後に生体内で生着し、筋細胞へと分化できるようにできる剤形であることが好ましい。なお、適用時には、液体成分を除去した細胞のみとすることもできる。
【００８７】
３−４．適用方法
本形態の筋原性疾患治療剤は、筋原性疾患の治療又は予防用として適用される。したがって、主な適用対象部位は骨格筋又は心筋である。投与形態は、原則として全身投与及び局所投与である。投与方法は、限定はしないが、骨格筋又は心筋への直接投与が好ましい。具体的には、例えば、筋肉内注射による局所投与や、培養した骨格筋前駆細胞を筋管細胞に分化させて細胞シート状にした後、患部に直接移植する方法が挙げられる。注射剤には、前述の賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよい。
【００８８】
３−５．対象疾患
本発明の筋原性疾患治療剤の治療又は予防の対象となる疾患は、筋原性疾患である。筋原性疾患は、前述の通り筋萎縮と筋力低下を伴う疾患である。具体的には、例えば、筋ジストロフィー（デュシャン型、ベッカー型、エメリ・ドレフュス型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、先天性の各種筋ジストロフィーを含む）、ミオパチー（先天性、遠位型、甲状腺機能低下性、ステロイドミオパチー等を含む）、炎症性筋疾患（多発性節炎、皮膚節炎を含む）、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病、周期性四肢麻痺等が含まれる。本発明において、好ましい筋原性疾患は、筋ジストロフィーである。
【００８９】
４．骨格筋再生促進剤
４−１．概要
本発明の第４の態様は、骨格筋再生促進剤である。本発明の骨格筋再生促進剤は、第３態様に記載の筋原性疾患治療剤と同様に骨格筋前駆細胞を有効成分として、骨格筋の再生促進用に利用することができる。
【００９０】
４−２．構成、剤形、適用方法
本発明の骨格筋再生促進剤の基本構成は、第３態様に記載の筋原性疾患治療剤に準ずる。すなわち、第３態様に記載の筋原性疾患治療剤が、筋原性疾患に罹患した被験体を適用対象とするのに対して、本発明の骨格筋再生促進剤は、物理的に骨格筋を欠損した被験体やや老化や衰弱等で骨格筋が減少した被験体が適用対象となる。つまり、第３態様の筋原性疾患治療剤とは、その用途のみが異なる。したがって、構成、剤形、適用方法等の第３態様に準ずるものに関しては、具体的な説明を省略する。
【００９１】
４−３．適用対象
本発明の骨格筋再生促進剤は、筋原性疾患には罹患していないが、何らかの理由で骨格筋や心筋の一部が欠損又は減少した場合に、その骨格筋や心筋を補填又は充填すると共に、筋肉量を元の水準に回復させるための補助剤として利用される。したがって、適用対象は、事故や手術等により骨格筋や心筋の一部を欠損した被験体、老化又は骨折治療後のような運動負荷の抑制後に見られる骨格筋が減少した被験体が適用対象となる。
【００９２】
５．組織幹細胞の分化別分類剤
５−１．概要
本発明の第５の態様は、組織幹細胞の分化別分類剤である。
本明細書において「分化別分類」とは、組織幹細胞を構成する細胞群を増殖能や分化状態が近似する細胞集団に分類することをいう。
【００９３】
本発明の組織幹細胞の分化別分類剤は、細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤で構成され、組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離することにより、その組織幹細胞群を分化状態に応じて分類することができる。それによって、ダイレクトリプログラミングに適した未分化細胞を容易に分離同定することが可能となる。
【００９４】
５−２．構成
本発明の組織幹細胞の分化別分類剤は、細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤からなり、細胞内のエステラーゼ活性に基づき組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離可能なように構成されている。
「エステラーゼ」は、エステルを酸とアルコールに加水分解する一群の酵素をいう。
【００９５】
本明細書において「細胞内のエステラーゼ活性を検出可能な剤」とは、細胞内のエステラーゼ活性を検出可能であり、かつその活性に応じて細胞を標識化できる物質をいう。細胞毒性の低い物質がより好ましい。エステラーゼ活性を検出できる物質には、例えば、エステラーゼの標的部位、すなわちエステル基（R-CO-O-R’）のような、エステラーゼ感受性の構造を有する物質が該当する。エステラーゼ活性に応じて細胞を標識化できる物質には、例えばエステラーゼの標的部位を有する蛍光物質（蛍光タンパク質、及び蛍光色素を含む）や発光物質（発光タンパク質、及び発光色素を含む）等で、標的部位がエステラーゼによって加水分解されることで活性化し、蛍光や発光を示す物質等が挙げられる。例えば、Calcein又はBDECFのような生細胞染色用物質のアセトキシメチルエステル体（本明細書では、しばしば「AM体」と略称する）である、Calcein-AMやBDECF-AM等は好適である。Calcein-AMは、Calceinの4つのカルボキシル基をアセトキシメチルエステル化（AM化）することにより細胞膜透過性とした物質で、Calcein-AMは蛍光をほとんど示さないが、細胞内のエステラ−ゼによる加水分解でCalceinとなり、強い黄緑色の蛍光を示すようになる。またBCECF-AMも細胞膜透過性のBCECFをAM化することにより細胞膜透過性とした物質である。BCECF-AMの蛍光は微弱であるが、細胞内のエステラ−ゼによる加水分解でBCECFに戻り、強い蛍光を示すようになる。Calcein及びBCECFは膜不透過性で、細胞内で生じたこれらの物質は細胞外に漏出し難い点でも優れている。
【００９６】
本発明の組織幹細胞の分化別分類剤で用いる組織幹細胞は、特に限定はしない。前述した筋衛星細胞、造血幹細胞、腸管幹細胞、間葉系幹細胞、毛包幹細胞、乳腺幹細胞等のあらゆる組織幹細胞が対象となり得る。また、本発明の第２態様で得られる骨格筋前駆細胞を対象とすることもできる。好ましくは筋衛星細胞である。
【００９７】
５−３．分離方法
本発明の組織幹細胞の分化別分類剤を用いて組織幹細胞群から分化状態の近似する細胞集団を分離する方法を説明する。本発明の分離方法で対象となる細胞群は不均一性を示す組織幹細胞群である。前述のように通常の組織幹細胞群は、増殖能や分化状態に階層性のある異なる細胞集団で構成されており不均一性を示す。
本発明の分離方法は、必須の工程として、投与工程及び分離工程を含む。以下、それぞれの工程について具体的に説明をする。
【００９８】
（１）投与工程
「投与工程」は、本発明の組織幹細胞の分化別分類剤を対象細胞群に投与する工程である。
本明細書において「対象細胞群」とは、本発明の組織幹細胞の分化別分類剤の投与対象となる不均一性を示す組織幹細胞群である。
【００９９】
対象細胞群に分化別分類剤を投与する方法は、分化別分類剤の種類に応じて、当該分野で公知の方法に従って行えばよい。例えば、分化別分類剤がCalcein-AMやBCECF-AMであれば、分化別分類剤が細胞膜透過性を有することから、標的細胞群をPBSやHEPES等のバッファで懸濁後、分化別分類剤を添加し、37℃で適当な時間インキュベートすることで達成できる。本工程により、細胞内に投与された分化別分類剤は、細胞内のエステラーゼ活性に応じて細胞を標識化する。例えば、分化別分類剤がCalcein-AMやBCECF-AMであれば、対象細胞群を構成する各細胞内のエステラーゼ活性に応じた強度で蛍光を発するようになる。
【０１００】
（２）分離工程
「分離工程」は、分化別分類剤による細胞内エステラーゼ活性の強度に基づいて対象細胞群を分化状態の近似する細胞集団に分離する工程である。対象集団を増殖能や分化状態に基づいて分類することができる。分類数は限定しない。また分類境界の基準も特に限定はしない。エステラーゼ活性の強度と細胞の増殖能や分化状態を勘案して、適宜分類境界を設ければよい。
【０１０１】
後述する実施例で、細胞内エステラーゼ活性が低いほど未分化状態であり、また高いほど細胞の分化状態が進行していることが明らかとなった。未分化状態の細胞であっても、最上位の組織幹細胞に近い未分化細胞では移植効率は高いものの細胞増殖性が低いのに対して、嬢細胞由来の細胞のように分化状態がやや進行した細胞では細胞増殖性が非常に高かった。また分化の進んだ組織幹細胞では、細胞増殖はほとんど見られなかった。したがって、対象細胞群を増殖能や分化状態の近似する細胞集団に分離する一例として、前記性質に基づいて、（ａ）細胞内エステラーゼ活性の強度が高い細胞集団を非増殖性分化済み細胞、（ｂ）細胞内エステラーゼ活性の強度が中位の細胞集団を高増殖性未分化細胞、そして（ｃ）細胞内エステラーゼ活性の強度が低い細胞集団を高移植性未分化細胞の３つの集団に分類することができる。分類境界は限定しないが、例えば、対象細胞群において、細胞内エステラーゼ活性の強度が上位15％、14％、13％、12％、11％、又は10％に属する細胞を強度が高い細胞集団、細胞内エステラーゼ活性の強度が中央値から前後7.5％、前後7.0％、前後6.5％、前後6.0％、前後5.5％、又は前後5.0％に属する細胞を強度が中位の細胞集団、そして細胞内エステラーゼ活性の強度が下位15％、14％、13％、12％、11％、又は10％に属する細胞を強度が低い細胞集団とすることができる。
【実施例】
【０１０２】
＜材料及び方法＞
以下に記載する各実施例で使用した実験材料及び実験方法を説明する。
【０１０３】
１．実験用動物
実験動物としてマウスを使用した。マウスは、12〜16週目の雄のC57BL/6匹のマウスで、日本クレアから購入した。C57BL/6-GFPトランスジェニックマウスは、岡部勝博士（大阪大学：日本）からご恵与いただいた。また、C57BL/6-mdxマウスは、笹岡俊邦博士（基礎生物学研究所：日本）からご恵与いただいた。全てのマウスは動物施設内で飼育した。
【０１０４】
２．単一筋繊維の調製
初代筋衛星細胞（SCs）の調製は、長指伸筋（EDL）の筋肉を12〜16週目のC57BL/6マウスオス個体とC57BL/6-GFPマウス雄個体から採取し、単離したEDLの筋肉を0.2% 1型コラゲナーゼ/DMEMで、80分間〜90分間インキュベートした。解離した筋肉をピペッティングによって穏やかにほぐした。単一筋繊維をマトリゲル（MatrigelTM-Growth Factor Reduced、BD Biosciences社）でコーティングしたディッシュ上にプレーティングした。
【０１０５】
３．細胞培養
初代SCsから単離した単一筋繊維を20%のウシ胎児血清（FBS）、1%のニワトリ胚エクストラクト（CEE）（US Biological社）及び1% ペニシリン・ストレプトマイシン（PS）（Thermo Fisher Scientific社）を添加したDMEM（高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAXサプリメント；Thermo Fisher Scientific社）で5% CO2下にて37℃で培養した。10% FBS、1% CEE、及び5ng/mL basic fibroblast growth factor（Cell Signaling社）、5ng/mLのLIF（PROSPEC社）、100ng/mLのdox（LCK Laboratories社）及び1% PSを添加したDMEM（高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAXサプリメント）で、確立した骨格筋前駆細胞を培養した。SCと骨格筋前駆細胞に使用した全てのプラスチック・ディッシュは、マトリゲルでコーティングしたものを用いた。C2C12細胞、3T3-L1細胞、MEFs細胞、TTFs細胞、Plat-E、及びHEK293T細胞は、10% FBと1% PSを添加したDMEM（高グルコース；和光）で5% CO2下にて37℃でインキュベートした。培地は2日毎に交換した。
【０１０６】
４．アセトキシメチル・エステル化合物処理
単離後4〜7日目の初代SCsを20% FBS、1% CEE、及び1% PSを添加したDMEM（高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAXサプリメント）中において、50nM Calcein-AM（Dojindo）を用いて5% CO2下にて37℃で30分間処理した。C2C12筋芽細胞は、10% FBと1% PSを添加したDMEM（高グルコース）中において、50nM Calcein-AM（Dojindo）を用いて5% CO2下にて37℃で30分間処理した。また、分化誘導4日目のC2C12筋芽細胞を1μM BCECF-AM（DOJINDO）、1μM CFSE（DOJINDO）、1μM FDA（DOJINDO）又は1μM Calcein-AMを用いて2％ ウマ血清及び1% PSを添加したDMEM（高グルコース）中において、5% CO2下にて37℃で30分間処理した。
【０１０７】
５．FACS解析
単離後4〜7日目のCalcein-AM処理したSCsを0.05% トリプシン/EDTA（Thermo Fisher Scientific社）で5% CO2下にて37℃で5分間処理して解離した。細胞のソーティングは、FACS ARIA（BD Biosciences社）を用いて行った。蛍光強度に基づいて、Calcein-AM処理したSCs集団を下位、中位、及び上位10〜15％で分離して、それぞれをCalceinlowSCs、CalceinmiddleSCs、及びCalceinhighSCsと定義した。抗M-カドヘリン抗体による細胞表面マーカー解析と精製のために、細胞をCell Dissociation Buffer（Thermo Fisher Scientific社）中で、5% CO2下にて37℃で30分間解離した後、勢いよくピペッティングを行った。FACS解析に用いた抗体は、以下の通りである：FITC-抗CD31抗体（1:200希釈、クローン名：390、BD Biosciences社）、FITC-抗CD34抗体（1:200希釈、クローン名：RAM34、BD Biosciences社）、FITC-抗CD45抗体（1:200希釈、クローン名：30-F11、BD Biosciences社）、Alexa488-抗CD36抗体（1:200希釈、クローン名：HM36、BioLegend社）、FITC-抗CD93抗体（1:200希釈、クローン名：AA4.1、BD Biosciences社）、FITC-抗CD68抗体（1:200希釈、クローン名：FA-11、BD Biosciences社）、APC-抗CD140抗体（1:200希釈、クローン名：APA5、BD Biosciences社）、biotin-抗Ly-6G/Ly-6C抗体（1:200希釈、クローン名：RB6-8C5、BioLegend社）、ビオチン-抗CD3e抗体（1:200希釈、クローン名：145-2C11、BioLegend社）、ビオチン-抗CD11b抗体（1:200、クローン名：M1/70、BioLegend社）、ビオチン-抗CD45R/B220抗体（1:200希釈、クローン名：RA3-6B2、BioLegend社）、ビオチン-抗TER-119/erythroid細胞抗体（1:200希釈、クローン名：TER-119、BioLegend社）、APC-抗VCAM1抗体（1:200希釈、クローン名：429（MVCAM。A）、BioLegend社）、APC-抗FLK-1抗体（1:200希釈、クローン名：Avas 12alpha1、BD Biosciences社）、APC-抗CD135抗体（1:200希釈、クローン名：A2F10、BioLegend社）、抗M-カドヘリン抗体（1:400希釈、クローン名：5/M-Cadherin、BD Biosciences社）、及びAPC-抗マウスIgG抗体（1:200希釈、クローン名：Poly4053、BioLegend社）。
【０１０８】
６．増殖解析
単離後4日目のSCsをFACSソーティング後、CalceinlowSCs、CalceinmiddleSCs、及びCalceinhighSCsをそれぞれ1.0×104細胞で24ウェルプレート上に播種し、フィールドあたりの細胞数を毎日カウントした。BrdUアッセイのために、単離後4日目のSCsを20% FBS、1% CEE、及び1% PSを添加したDMEM（高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAXサプリメント）中において、10μM BrdU（Sigma Aldrich社）を用いて、5% CO2下にて37℃で2時間処理した。続いて、細胞を50nM Calcein-AM（Dojindo）で処理した後、FACSソーティングを行った。ソートされたCalceinlowSCs、CalceinmiddleSCs、及びCalceinhighSCsをそれぞれ4%パラホルムアルデヒド/PBSで固定した。洗浄後、固定された細胞を透過化処理のために0.1% TritonX-100/PBSで10分間、続いて2N HClで室温にて30分間、処理をした。2% BSA/PBS中で5% ヤギ血清（Cedarlane社）を用いて15分間ブロッキングした後、抗BrdU抗体（1:400希釈、クローン名：BU1/75（ICR1）、AbD Serotec社）と共に2% BSA/PBS中で4℃にて一晩インキュベーションした。洗浄後、細胞を1% BSA/PBS中でAlexa Fluor 488で標識した二次抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific社）と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、核をDAPI（Dojindo社）で染色した。免疫蛍光染色画像を蛍光顕微鏡（Olympus IX71、オリンパス社）で評価し、BrdU陽性細胞のパーセンテージを算出した。
【０１０９】
７．RNAの分離とRT-PCR分析
TRIzol（Thermo Fisher Scientific社）を使って総RNAを分離した後、QuantiTect Reverse Transcriptionキット（Qiagen社）を用いて、分離したRNAを鋳型に一本鎖cDNAを合成した。従来型PCRは、ExTaq（Takara社）を用いて行った。量的RT（qRT）-PCRのために、各遺伝子の発現レベルをMyiQ single-color system（Bio-Rad社）でSYBR Premix Ex Taq II（Takara社）を使って評価した。RT-PCR用プライマー配列は、以下の通りである：
・内因性Pax7-F：5′-gcccacagaacctgtcactc-3′（配列番号４１）、
・内因性Pax7-R：5′-ggacttgaaagcttggtgctct-3′（配列番号４２）、
・MyoD-F：5′-tgagccttgcacacctaagcc-3′（配列番号４３）、
・MyoD-R：5′-ctccgcaagctgtggggaaa-3′（配列番号４４）、
・Myf5-F：5′-tctctcccgatgatcactcct-3′（配列番号４５）、
・Myf5-R：5′-tctgcccagcttgtctttcc-3′（配列番号４６）、
・Myogenin-F：5′-tgtgcacatctgttctagtctc-3′（配列番号４７）、
・Myogenin-R：5′-gctttggaaccggatagctc-3′（配列番号４８）、
・Mef2c-F：5′-cggtgtcgtcagttgtatgg-3′（配列番号４９）、
・Mef2c-R：5′-tgcagtagatatgcggcttg-3′（配列番号５０）、
・Mrf4-F：5′-aagtgtttcggatcattccag-3′（配列番号５１）、
・Mrf4-R：5′-aaatactgtccacgatggaag-3′（配列番号５２）、
・Desmin-F：5′-tggaataccgacaccagatcca-3′（配列番号５３）、
・Desmin-R：5′-ctgcctcatcagggagtcgtt-3′（配列番号５４）、
・Mef2b-F：5′-ctccacagagttcccgaagt-3′（配列番号５５）、
・Mef2b-R：5′-tccttgggctttattgatgcag-3′（配列番号５６）、
・Pitx1-F：5′-tacgaggacgtgtacgct-3′（配列番号５７）、
・Pitx1-R：5′-tgaagaaggtaaagctcttggt-3′（配列番号５８）、
・Twist1-F：5′-gcggccaggtacatcgactt-3′（配列番号５９）、
・Twist1-R：5′-acatagctgcagcttgccatct-3′（配列番号６０）、
・Twist2-F：5′-aagatccagacgctcaag-3′（配列番号６１）、
・Twist2-R：5′-ctggtcatcttattgtccatc-3′（配列番号６２）、
・Meox1-F：5′-cataccccgacttctctgcttc-3′（配列番号６３）、
・Meox1-R：5′-gctgctcgttgaagattcgct-3′（配列番号６４）、
・Meox2-F：5′-cagacaggggactcactagca-3′（配列番号６５）、
・Meox2-R：5′-tcctgagaatggagctggtctt-3′（配列番号６６）、
・Hoxc12-F：5′-agccgtattcgaagttgcag-3′（配列番号６７）、
・Hoxc12-R：5′-ttcaagcggtccgagagt-3′（配列番号６８）、
・外因性ユニバーサルプライマー：5′-cahhctttaaaggaacca-3′（配列番号６９）、
・外因性Pax3：5′-tgtcacctgcttgggttt-3′（配列番号７０）、
・外因性Pax7：5′-ccatggtgggccatttccact-3′（配列番号７１）、
・外因性Mef2b：5′-ctcttcagtgtctgaagg-3′（配列番号７２）、
・外因性Pitx1：5′-tggcttgtgaagtgagtg-3′（配列番号７３）、及び
・TATA-結合タンパク質（Tbp）-F：5′-cagcctcagtacagcaatcaac-3′（配列番号７４）、
・Tbp-R：5′-taggggtcataggagtcattgg-3′（配列番号７５）。
なお、qRT-PCRのために、各々の遺伝子の表現濃度をTbpの値に標準化した。
【０１１０】
８．マイクロアレイ分析
単離後７日目のCalceinlow SCs、Calceinmiddle SCs、及びCalceinhigh SCs、各1.0×105細胞からTRIzolを用いて総RNAを分離した。RNAサンプルは、Agilent SurePrint G3マウスGE8×60Kのマイクロアレイ・プラットホームを用いてMBL社で分析された。得られたデータは、GeneSpring GXによって分析した。全ての発現データを75回のパーセンタイル正規化に適用した。前記3集団で「not detected」とされた遺伝子は、分析から除外した。
【０１１１】
９．免疫細胞化学
細胞は、4% パラホルムアルデヒド/PBSで室温にて10分間固定した。洗浄後、固定された細胞を、透過化処理のために0.1% TritonX-100/PBSで10分間処理し、抗Myf5抗体には6% スキムミルク（メグミルク雪印）/PBSで、また他の抗体には2% BSA/PBS中の5% ヤギ血清で15分間ブロッキングを行った。その後、細胞を抗Pax3抗体（1:80希釈、Developmental Studies Hybridoma Bank社）、抗Pax7抗体（1:80希釈、sc-81648、Santa Cruz社）、抗MyoD抗体（1:400希釈、クローン名：sc-32758、Santa Cruz社）、抗myogenin抗体（1:1000希釈、sc-12732、Santa Cruz社）、又は抗MyHC抗体（1:500希釈、MAB4470、クローン名：MF20; R&D Systems社）と共に2% BSA/PBS中で、又は抗Myf5抗体（1:200希釈、クローン名：sc-302、Santa Cruz社）と共に6%スキムミルク/PBS中で、4℃にて一晩インキュベートした。続いて、細胞を2% BSA/PBS中でAlexa Fluor 488、又はAlexa Fluor 647で標識した二次抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific社）と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、核をDAPI（Dojindo社）で染色した。免疫蛍光染色画像を蛍光顕微鏡（オリンパス社）で評価した。
【０１１２】
１０．免疫組織化学
移植された前脛骨筋（TA）と長指伸筋（EDL）をクライオスタットにより8-μmのクロスセクションで切断し、冷却したアセトンで10分間固定した。空気乾燥の後、セクションをM.O.M. Mouse Ig Blocking reagent（Vector M.O.M. Immunodetection Kit、Vector社）で1時間、続いて1% BSA/PBS中の5%ヤギ血清で15分間ブロッキングした後、抗Dys2抗体（1:100希釈、Clone名：Dy8/6C5、ライカ社）と共にM.O.M.希釈液中で4℃にて一晩中インキュベートした。セクションを、その後、M.O.M.希釈液中で、Alexa Fluor 488標識した二次抗体（1:1000希釈、Thermo Fisher Scientific社）と共にインキュベートした。数回の洗浄の後、核をDAPI（Vector社）で染色した。免疫蛍光染色画像を蛍光顕微鏡（BZ-9000;キーエンス社）で評価し、ジストロフィン陽性繊維をカウントした。
【０１１３】
１１．プラスミド構築
pMXs-puro-Pax3、pMXs-puro-Pax7、pMXs-Ig-MyoD、pMXs-Ig-Mef2b、pMXs-Ig-Pitx1、pMXs-Ig-Twist1、pMXs-Ig-Twist2、pMXs-Ig-Hoxc12、pMXs-Ig-Meox1、及びpMXs-Ig-Meox2を作製するために、標的遺伝子のコード領域を単離後７日目に、初代SCsのcDNAからRT-PCRによって増幅した。pENTR1Aベクターに標的遺伝子のコード領域をクローニングして、CSIV-TRE-Pax3-CMV-KT、CSIV-TRE-Pax7-CMV-KT、CSIV-TRE-Mef2b-CMV-KT、CSIV-TRE-Pitx1-CMV-KTとCSIV-TRE-MyoD-CMV-KTを作製した。これらのプラスミドを、LR反応（Thermo Fisher Scientific社）によって、CSIV-TRE-RfA-CMV-KTベクターと組み替えた。
【０１１４】
１２．レトロウイルス及びレンチウイルスの調製
レトロウイルスとレンチウイルスはTakahashi K. & Yamanaka S.（2006, Cel, 126: 663-676）に記載の方法を若干変更して調製した。すなわち、細胞を包装しているPlat-Eパッケージング細胞をレトロウイルス調製用に使用した。pMXsをベースとしたレトロウイルスベクターは、20〜30%のコンフルエントに達したPlat-E細胞にFugene 6（ロシュ社）を用いて、添付の使用説明書に若干の変更を加えてトランスフェクトした。9μgのプラスミドベクターを300μLのopti-MEM（Thermo Fisher Scientific社）で希釈し、その後、27μLのFugene 6を加えて混合した。室温で15分間インキュベートした後、5％ CO2下で、37℃にて一晩経過したDMED中のPlat-E細胞に混合液を加えた。培地を10% FBS及び1% PSを添加したDMEMに変更した後、上清を4日間回収した。その上清をSteriflip-HV, 0.45μMフィルター（ミリポア社）に通して濾過し、夾雑物を除去した。濾過上清を、ポリエチレングリコール沈降法によって濃縮した。レンチウイルスの調製には、HEK293T細胞を使用した。調製方法は、若干の変更以外は、前記レトロウイルスの方法に準じた。すなわち、4.2μgのCSIV-TRE-標的遺伝子-CMV-KT、2.4μgのpCMV-VSV-G-RSV-Rev、及び2.4μgのpCAG-HIVgpを300μLのopti-MEMで希釈し、続いて27μLのFugene 6を追加した。室温で15分間インキュベートした後、前記混合液を、5% CO2下で37℃にて一晩培養したDMEM中の50〜70%コンフルエントのHEK293T細胞に加えた。培地を10% FBS及び10μM フォルスコリン（Wako社）及び1% PSを添加したDMEMに変更した後、Steriflip-HV（0.45のμMフィルタ）に通してろ過し、ポリエチレングリコール沈降法で濃縮した。
【０１１５】
１３．MEFs（マウス胎児線維芽細胞）の調製
初代MEFs（マウス胎児線維芽細胞：Murine Embryonic Fibroblasts）は、13.5日目の妊娠したメス6匹のC57BL（C57BL/6匹）マウスから分離した。具体的には、頭、手肢、尾、及び内臓をE13.5胚から摘出した、残りの部分はPBSで洗浄した後、細かく切り刻み、0.25% トリプシン/EDTA（Thermo Fisher Scientific社）中で37℃にて15分間〜20分間インキュベートした。トリプシン処理後、10% FBS及び1% PSを添加した等量のDMEMを加えて、穏やかにピペッティングを行った。組織/媒体の混合物を100μmのnylon Cell Strainer（BD Falcon社）に通して濾過した。ろ過した細胞は遠心分離によって回収した後、10% FBS及び1% PSを添加した新たなDMEM中に再懸濁して、プラスチック・ディッシュに播種した。ディッシュに付着したMEFsを使用した。
【０１１６】
１４．TTFs（成体マウス尾部線維芽細胞）の調製
初代TTFs（成体マウス尾部線維芽細胞：Tail Tip Fibroblasts）は、12〜16週間目のオス6匹C57BLのマウスから分離した。尾部をPBSで洗浄したのち、細かく切り刻み、1000U/mLディスパーゼI（Wako社）及び2mg/mLの2型コラゲナーゼ（Worthington社）を含むDMEM
中で37℃にて30分間インキュベートした。消化後に、10% FBS及び1% PSを添加した等量のDMEMを加えて、穏やかにピペッティングを行った。組織/媒体の混合物を100μmのnylon Cell Strainer（BD Falcon社）に通して濾過した。ろ過した細胞は遠心分離によって回収した後、10% FBS及び1% PSを添加した新たなDMEM中に再懸濁して、プラスチック・ディッシュに播種した。インキュベーション後4〜5日目のディッシュに付着したTTFsを使用した。
【０１１７】
１５．骨格筋前駆細胞の生成
調製したMEFsとTTFsをそれぞれ2.0×105細胞/6ウェルプレートと1.0×105細胞/6ウェルプレートに播種した。MEFsに関しては、24時間後に、10% FBS、8μg/mLポリブレン（Sigma Aldrich社）、及び1% PSを添加したレトロウイルス含むDMEMを加えて、一晩培養した。又は、レンチウイルスを含むDMEMを加えて48時間培養した。TTFsに関しては、播種して10〜12時間後にウイルス感染を開始した。感染後、細胞を10cmディッシュに移し、数日間培養した。GFP陽性、又はKusabira-orange陽性の細胞をFACSによって精製し、その後、約2.5×105細胞を10cmディッシュに移した。骨格筋前駆細胞の形成は感染日から2週以内に観察した。
【０１１８】
１６．ウエスタンブロット法
全タンパク質を0.1% TritonX-100、50mM HEPES（pH 7.4）、4mM EGTA、10mM EDTA、15mM Na4P2O7、100mMグリセロリン酸、25mM NaF、5mM Na2VO4及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ社）を含むサンプルバッファで抽出した。タンパク質濃度は、Coomassie Brilliant Blue G-250（Bio-Rad社）を用いて決定した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）の直前に、抽出したタンパク質溶液を30% グリセロール、5% 2-メルカプトエタノール、2.3% SDS、62.5mM Tris-HCl（pH 6.8）及び0.05% ブロモフェノールブルーを含んだ等量のサンプル・ローディング・バッファと混合し、その混合液を60℃で10分間加熱した。8μgのタンパク質をSED-PAGEによって分離した後、PVDF（ポリビニリデンジフルオリド）メンブレン（ミリポア社）に電気的に転写した。ブロッティングメンブレンは、6% スキムミルク/TBSにより1時間未満でブロックした。続いて、6% スキムミルク/TBS中で抗Pax3抗体（1:100希釈）、抗Pax7抗体（1:500希釈）、抗Mef2b抗体（1:50希釈、クローン名：sc-98595、Santa Cruz社）、抗Pitx1抗体（1:500希釈、クローン名：sc-18922、Santa Cruz社）、抗MyoD抗体（1:100希釈、クローン名：sc-760、Santa Cruz社）、又は抗α-チューブリン抗体（1:4000希釈、クローン名：sc-12462、Santa Cruz社）と共に4℃にて一晩インキュベートした。その後、ブロッティングメンブレンを西洋わさびペルオキシダーゼ共役型二次抗体（1:2000希釈）（抗ウサギIgG抗体、クローン名：NA9340V、GE Healthcare社；抗ヤギIgG抗体、クローン名：611620、Thermo Fisher Scientific社；抗マウスIgG抗体、クローン名：115-036-062、Jackson Immuno Research社）と共にインキュベート。シグナルは、ECLTM Western Blotting Detection system（GE Healthcare社）を用いて検出した。
【０１１９】
１７．白色及び茶色脂肪細胞の分化解析
白色及び茶色脂肪細胞の分化誘導は、Seale, P. et al.（2008,  Nature, 454: 961-967）に記載の方法に若干の変更を加えて行った。
白い脂肪細胞分化については、10% FBS、10μg/mLインシュリン（Wako社）、2.5μMデキサメタゾン（Sigma Aldrich社）及び500μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（Sigma Aldrich社）を含むDMEMで細胞を処理した。3日後に、培地を10% FBS及び10μg/mL インシュリンを含むDMEMに変更した後、さらに5日間処理した。
茶色脂肪細胞分化については、細胞が10% FBS、5μg/mL インシュリン、1μM デキサメタゾン、500μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、125nM インドメタシン（和光）、1nMトリヨードサイロニン（メルク社）及び1μM ロシグリタゾン（Wako社）を含むDMEMで処理した。3日後に、培地を10% FBS、5μg/mLインシュリン、及び1nMトリヨードサイロニンを含むDMEMに変更した後、さらに5日間処理した。培地は毎日交換した。4% パラホルムアルデヒド/PBSで固定後、細胞をOil Red Oで染色し、画像は顕微鏡（BZ-9000、キーエンス社）で評価した。
【０１２０】
１８．バイサルファイトシーケンシング解析
NucleoSpin Tissue kit (Macherey-Nagel社)を用いて、ゲノムDNAを精製した。シトシンからウラシルへの重亜硫酸塩媒介転換には、MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit (Human Genetic Signatures社)を用いて行った。Myf5転写開始点を起点とした−927位〜−529位の配列、−373位〜+75位の配列、及び+24位〜+426位の配列をTakara EpiTaq HS（Takara社）で増幅した。増幅したDNA断片をpMD20-Tベクターにクローニングした。重亜硫酸塩配列決定のためのプライマー配列は、以下の通りである：
・Myf5重亜硫酸塩1-F：5′-gttggtagttgggatttatttgtaa-3′（配列番号７６）、
・Myf5重亜硫酸塩1-R：5′-caataactaaacttcctttctaaaatctaa-3′（配列番号７７）、
・Myf5重亜硫酸塩2-F：5′-aaagtttatgaaaatgagaagtaagtat-3′（配列番号７８）、
・Myf5重亜硫酸塩2-R：5′-aaacaaatacctattaaccaaaatc-3′（配列番号７９）、
・Myf5重亜硫酸塩3-F：5′-aaagagttttaattttagttattgat-3′（配列番号８０）、
・Myf5重亜硫酸塩3-R：5′-aaactttacaaacccacataaaaca-3′（配列番号８１）。
プライマーは、MethPrimer（Li, L. & Dahiya, 2002, Bioinformatics 18: 1427-1431）を用いて設計した。得られた配列は、メチル化分析（QUMA）のための定量化ツール（Kumaki, Y.et al., 2008, Nucleic Acids Res. 36: 170-175）を使用して分析した。
【０１２１】
１９．GFP-SCsと骨格筋前駆細胞の共培養
GFP-SCsとKusabira-オレンジ陽性の骨格筋前駆細胞を、48ウェルプレートで共培養した。分化誘導培地（5% ウマ血清を添加したDMEM高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びGlutaMAXサプリメント）に置換した後、蛍光イメージを蛍光顕微鏡（オリンパス社）で観察した。培地は毎日交換した。
【０１２２】
２０．移植分析
SCs及び骨格筋前駆細胞の移植は、Motohashi, N. et al. （2008, J. Pathol., 173: 781-791）に記載の方法を若干変更して行った。具体的には、10μMカルディオトキシン（Sigma Aldrich社）100μLを移植の24時間前に、mdxマウスのTAとEDLの筋肉に注射して筋肉再生を誘発した。SCs移植については、C57BL/6匹のマウスから単離後7日の3.0×104細胞のCalceinlowSCs、CalceinmiddleSCs、又はCalceinhighSCsを含む30μLの細胞懸濁液をFACSソーティング直後に、直接TA/EDLの筋肉に注射した。
骨格筋前駆細胞の移植については、1.0×105細胞を含む細胞懸濁液30μLを、TAとEDLの筋肉内に注射した。筋肉を2週後に解剖して、液体窒素で冷却したイソペンタンで凍結した。
【０１２３】
２１．統計分析
実施例中の全ての値は、平均±平均値の標準誤差（SEM）で示した。有意差は、Tukey-Kramer事後分析によって評価されたグループ間の差異を用いて、スチューデントｔ検定、又は一元配置分散分析法（ANOVA）によって評価した。5%（*、P＜0.05）、1%（**、P＜0.01）、又は0.1%（***、P＜0.001）未満のときに統計的に有意であるとした。
【０１２４】
＜実施例１：筋衛星細胞群（SCs群）におけるエステラーゼ活性の検証＞
（目的）
筋衛星細胞群におけるエステラーゼ活性について検証した。
（結果）
図１は、細胞内のエステラーゼ活性を検出可能なCalcein-AMと共に培養した筋衛星細胞を示す。A〜Cは同視野であり、Aは微分干渉像（DIC）を、Bは蛍光像を、CはAとBの統合図を示す。Bから明らかなように、同じ筋衛星細胞にもcalceinの蛍光を強く発する細胞と弱く発する細胞が存在することが示された。
【０１２５】
＜実施例２：筋衛星細胞群のエステラーゼ活性による分類＞
（目的）
筋衛星細胞群におけるエステラーゼ活性の不均一性をFACSで確認すると共に、筋衛星細胞群をエステラーゼ活性に基づいて分類した。
（結果）
図２にCalcein-AMで染色した筋衛星細胞をFACSで解析した結果を示す。AはC2C12マウスの筋芽細胞株、Bは筋衛星細胞を示す。筋衛星細胞では、calcein蛍光のダイナミックレンジが広く、不均一な集団で構成されていることが示唆された。そこで、筋衛星細胞群をエステラーゼ活性に基づき、下位10〜15%、中位10〜15%（中間値から前後5％〜7.5％）及び上位10〜15%の3つの細胞集団を分離し、それぞれの細胞集団をCalceinlow SCs、CalceinmiddleSCs、Calceinhigh SCsとして以降の実験に用いた。
【０１２６】
＜実施例３：筋衛星細胞の各細胞集団における分化状態の検証＞
（目的）
実施例２で分離した3つの細胞集団について、Pax7遺伝子及びMyogenin遺伝子を用いて、その発現量によってそれぞれの分化状態を検証した。
（結果）
図３に結果を示す。Aは未分化マーカーであるPax7遺伝子の発現量を、またBは分化マーカーであるMyogenin遺伝子の発現量を、それぞれCalceinlow SCsの発現量を1としたときの相対値として示している。AからCalceinlow SCsやCalceinmiddle SCsではPax7遺伝子の発現量がCalceinhigh SCsのそれよりも有意に高かったのに対して、Bでは逆にCalceinhigh SCsのMyogenin遺伝子の発現量がCalceinlow SCsやCalceinmiddle SCsのそれよりも10倍以上高かった。
この結果からエステラーゼ活性の高いCalceinhigh SCsは、CalceinlowSCsやCalceinmiddle SCsよりも分化状態の進んだ筋衛星細胞であり、筋衛星細胞の分化に伴いエステラーゼ活性が上昇することが明らかとなった。
【０１２７】
＜実施例４：筋衛星細胞の各細胞集団における増殖性の検証（１）＞
（目的）
実施例２で分離した3つの細胞集団について、それぞれの増殖能を検証した。
（結果）
図４に示すように、Calceinmiddle SCsが最も高い増殖能を示し、CalceinhighSCsはほとんど増殖しないことが判明した。またCalceinlow SCsはそれらの中間の性質を示すことが明らかとなった。この結果から、Calceinlow SCsは低増殖性の幹細胞に、CalceinmiddleSCsは高増殖性の娘細胞に、そしてCalceinhigh SCsは増殖が停止し、分化するのみの筋細胞に分類できることが示唆された。
【０１２８】
＜実施例５：筋衛星細胞の各細胞集団における増殖性の検証（２）＞
（目的）
実施例４で示唆された3つの細胞集団における増殖能について、BrdUを用いた細胞増殖アッセイにより再検証した。
（結果）
図５に結果を示す。CalceinmiddleSCsが最も高いBrdU陽性率を、またCalceinhighSCsが最も低いBrdU陽性率を示した。またCalceinlowSCsはその中間程度の陽性率であることが示された。この結果から、実施例４の結果と同様に、CalceinlowSCsは低増殖性であり、Calceinmiddle SCsは高増殖性を示し、そしてCalceinhigh SCsは増殖がほぼ停止していることが確認された。
【０１２９】
＜実施例６：筋衛星細胞の各細胞集団における移植能の検証＞
（目的）
実施例２で分離した3つの細胞集団について、各細胞をデュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルマウスであり、原因遺伝子のdystrophinに変異を有するmdxマウスに移植したときの生着率を検証した。
（結果）
図６に結果を示す。Calceinlow SCsが他の細胞集団と比べて、有意に高いdystrophin陽性筋線維を形成した。この結果からCalceinlow SCsが最も高い移植効率を示すことが明らかとなった。
【０１３０】
＜実施例７：各細胞集団における遺伝子発現解析＞
（目的）
Calceinlow SCs、Calceinmiddle SCs、及びCalceinhigh SCsのそれぞれの細胞集団において発現している遺伝子を遺伝子オントロジー解析により網羅的に解析した。
（結果）
Calceinhigh SCsにおいて、Calceinlow SCsと比較して2倍より大きな表現レベルを有する遺伝子からなるA遺伝子群（総計2653遺伝子）、及びCalceinmiddle SCsにおいて、Calceinlow SCsと比較して2倍より大きな表現レベルを有する遺伝子からなるB遺伝子群（総計812遺伝子）を、遺伝子オントロジー解析で同定した。その結果、70以上の重要な遺伝子オントロジーが同定された。A遺伝子群のトップ14のオントロジーを表１に、B遺伝子群のトップ14のオントロジーを表２に示す。
【０１３１】
【表１】
2018011546.tif 000002
【０１３２】
【表２】
2018011546.tif 000003
【０１３３】
Calceinlow SCsと比べてCalceinhigh SCsではmyofibril、contractile fiber、sarcomere等の筋分化に関連した遺伝子群が発現していた。注目すべき点としてCalceinlow SCsとCalceinmiddle SCsを比べた場合も、Calceinmiddle SCsでは筋分化に関連した遺伝子群がより強く発現していた。これらの結果からCalceinlow SCs分画に、より未分化な細胞が分離されることが示唆された。
【０１３４】
＜実施例８：Calceinlow SCsで高発現する転写因子の同定＞
（目的）
実施例７の結果から、Calceinlow SCsには、他の細胞集団では検出できない未分化性に関連する転写因子が高発現していることが推定される。そこで、Calceinhigh SCsやCalceinmiddle SCsと比較して、Calceinlow SCsで高発現している遺伝子を網羅的解析により同定した。
（結果）
その結果、図７に示す7種の転写因子（Meox1, Meox2, Mef2b, Twist1, Twist2, Pitx1, Hoxc12）をコードする遺伝子がCalceinlow SCsで高発現する遺伝子として同定された。この7種の遺伝子に加えて、従来の研究から筋発生学的に重要であることが判明しているPax3遺伝子、Pax7遺伝子、及びMyoD遺伝子の3つを加えた10遺伝子を本発明の骨格筋前駆細胞誘導剤を構成する候補遺伝子群とした。
【０１３５】
＜実施例９：骨格筋前駆細胞誘導剤候補遺伝子の過剰発現による検証＞
（目的）
実施例８で選択された10個の骨格筋前駆細胞誘導剤候補遺伝子をマウスの線維芽細胞内で過剰発現させた時の骨格筋前駆細胞誘導性について検証した。
（結果）
図８に結果を示す。A-aはマウスのembryonic fibroblast（MEF）を、A-bは候補遺伝子10個をレトロウイルス又はDox-inducibleなレンチウイルスを用いて強制発現したMEFを、そしてA-cは培養した筋衛星細胞を示す。培養約2週間後には、A-bで明らかにA-aの線維芽細胞とは異なり、筋衛星細胞とよく似た形態の骨格筋前駆細胞の候補細胞が出現することが判明した。
前記候補細胞の誘導上、必須の転写因子を同定するため、10遺伝子から一遺伝子ずつ除く実験を行った結果、図８のBで示すように、pax3、mef2b、及びpitx1、又はpax7、mef2b、pitx1の組み合わせで誘導可能なことが明らかとなった。
【０１３６】
＜実施例１０：骨格筋前駆細胞検出用マーカーの検証＞
（目的）
実施例９で誘導された骨格筋前駆細胞の候補細胞の検出マーカーとして、骨格筋細胞検出マーカーであるM-カドヘリンを利用できるか否かを検証した。
（結果）
図９に結果を示す。骨格筋前駆細胞の候補細胞でも骨格筋細胞特異的なマーカーであるM-カドヘリンが発現していることが明らかとなった。したがって、標識化した抗M-カドヘリン抗体を用いて、FACSによりソーティングすれば、MEFからこの骨格筋前駆細胞の候補細胞を容易に分離精製できることが明らかとなった。
【０１３７】
＜実施例１１：骨格筋前駆細胞の確認＞
（目的）
実施例９においてMEFから誘導された骨格筋前駆細胞の候補細胞が骨格筋細胞としての性質を有する骨格筋前駆細胞であるか否かを確認した。
（結果）
図１０で示すように、実施例９で得られた骨格筋前駆細胞の候補細胞は、外因性遺伝子であるpax3遺伝子、pax7遺伝子、mef2b遺伝子、pitx1遺伝子に加えて、筋肉決定遺伝子の一つであるmyf5遺伝子を内因的に発現していることが判明した。この結果から、実施例９で得られた骨格筋前駆細胞の候補細胞は、目的の骨格筋前駆細胞であることが示唆された。
【０１３８】
＜実施例１２：骨格筋前駆細胞のエピジェネティックレベルでの解析＞
（目的）
実施例９で誘導された骨格筋前駆細胞が、骨格筋前駆細胞としての性質をエピジェネティックレベルで有することを確認するために、この骨格筋前駆細胞ゲノムのmyf5遺伝子プロモーター領域のDNAメチレーションパターンを解析した。
（結果）
MEFではメチル化されていたmyf5遺伝子のプロモーター領域が、実施例９で誘導された骨格筋前駆細胞では、筋衛星細胞と同程度にまで脱メチル化されていることが明らかとなった（データは図示せず）。この結果から、本発明の方法で誘導された骨格筋前駆細胞はエピジェネティックレベルで細胞の性質がリプログラミングされたことが示唆された。
【０１３９】
＜実施例１３：骨格筋前駆細胞における筋細胞分化能の検証＞
（目的）
実施例９で誘導された骨格筋前駆細胞が分化誘導によって筋細胞に分化可能な筋分化能を有することを確認した。
（結果）
図１１に結果を示す。Aは骨格筋前駆細胞を5%馬血清/DMEMでの培養によって分化誘導した後の細胞を示す。myogenin陽性細胞を赤で、ミオシンへビーチェーン陽性細胞を緑で示す。この図が示すように、筋分化誘導した骨格筋前駆細胞は、myogenin陽性かつミオシンへビーチェーン陽性の細胞を包含し、多核の筋管を形成していた。Bは内在性の筋衛星細胞との融合を示す。GFPマウス由来の筋衛星細胞を緑で、骨格筋前駆細胞を赤で示す。この図が示すように、筋衛星細胞と骨格筋前駆細胞が融合し、緑と赤両方が陽性の筋管を形成していた。
以上の結果から、実施例９で誘導された本発明の骨格筋前駆細胞は、骨格筋前駆細胞自身でも分化可能であり、また内在性の細胞と融合することで分化できることも明らかになった。
【０１４０】
＜実施例１４：TTFｓからの骨格筋前駆細胞の誘導＞
（目的）
実施例９ではマウスのembryonic fibroblast（MEF）を用いて本発明の骨格筋前駆細胞を誘導したが、成体マウス尾部線維芽細胞(Tail Tip Fibroblasts:TTF）からも同様に誘導できることを確認した。
（結果）
図１２に結果を示す。Aの結果からPax7遺伝子、mef2b遺伝子、pitx1遺伝子にmyoD遺伝子を加えて過剰発現した場合、MEFと同様に筋衛星細胞に形態的に良く似た骨格筋前駆細胞が誘導された。またMyoD遺伝子を過剰発現した場合、pitx1遺伝子は必要ないことが明らかとなった。
またBで示すようにTTFｓ由来の骨格筋前駆細胞もM-カドヘリンをマーカーとすることで精製できることが明らかとなった。
【０１４１】
＜実施例１５：TTFs由来の骨格筋前駆細胞の確認＞
（目的）
実施例１４においてTTFsから誘導された骨格筋前駆細胞が骨格筋細胞としての性質を有することを確認した。
（結果）
図１３で示すように、実施例１４でTTFsから得られた骨格筋前駆細胞は、外因性のpax7, mef2b, myoD、内因性のmyf5に加えて、内因性のmyoDを発現していることが明らかとなった。ピジェネティックレベルで細胞の性質がリプログラミングされたことが示唆された。
【０１４２】
＜実施例１６：骨格筋前駆細胞における筋細胞分化能の検証＞
（目的）
実施例１４においてTTFsから誘導された骨格筋前駆細胞が分化誘導によって筋細胞に分化可能な筋分化能を有することを確認した。
（結果）
図１４に結果を示す。TTFsから誘導された骨格筋前駆細胞も分化誘導によりin vitroにおいて筋管を形成した。また、この骨格筋前駆細胞をmdxマウスに移植したところ、dystrophin陽性の筋線維を形成することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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