(57)【要約】【課題】水耕栽培において格段に生育が良好なコプティス・ジャポニカを選抜する方法や、その栽培方法を提供する。【解決手段】コプティス・ジャポニカから、配列番号１で示されるType I遺伝子を検出することを特徴とする水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法および配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカを、水耕栽培することを特徴とするコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカ（Coptis japonica）を、水耕栽培することを特徴とするコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法。
【請求項２】
コプティス・ジャポニカが、セリバオウレンである請求項１に記載のコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法。
【請求項３】
コプティス・ジャポニカから、配列番号１で示されるType I遺伝子を検出することを特徴とする水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法。
【請求項４】
配列番号１で示されるType I遺伝子の検出にあたり、配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅プライマーを用いるものである、請求項３に記載のコプティス・ジャポニカの選抜方法。
【請求項５】
コプティス・ジャポニカが、セリバオウレンである請求項３または４に記載の水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法。
【請求項６】
配列番号１で示されることを特徴とするType I遺伝子。
【請求項７】
配列番号２または３に記載のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするType I遺伝子増幅用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカを用いた水耕栽培方法及び水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄連は、苦味健胃、整腸、止瀉等の作用を有し、胃炎、二日酔い、高血圧、神経症等に用いられる黄連解毒湯のほか、漢方処方の約１割に配合される重要生薬である。その主成分であるベルベリンは、抗菌、抗炎症に加え、最近、血中ＬＤＬコレステロール濃度低下や血糖値低下作用等が報告され、特に欧米ではメタボリックシンドロームに対する効果から注目されており、今後、需要の高まりが予想される。
【０００３】
日本産黄連の品質は高く、かつては海外にも輸出されていた。しかし、日局規格（非特許文献１）を満たす生薬の生産には、畑栽培で５年、林床栽培では１５年以上の長い栽培期間を必要とする。黄連は、栽培農家の高齢化に加え、薬価の低下や安価な中国産黄連に押され、国内栽培は衰退した。
【０００４】
近年、高品質かつ安心・安全な黄連の効率的な生産技術の確立を目指し、黄連の原料の一つであるセリバオウレンの植物工場での水耕栽培が試みられ、１年間の水耕栽培によりベルベリン含量等の点で問題がなかったことが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、セリバオウレンは水耕栽培であまり生育が良くない株が多く、どのよう株を選択すれば水耕栽培で生育が良いのかも不明であった。また、従来は水耕栽培の期間も長期であり、それが栽培コストを大きく引き上げ、実用化に至らない要因となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】第十七改正日本薬局方、ｐ１７５０〜１７５２、２０１６年３月７日
【非特許文献２】吉松嘉代，河野徳昭，乾貴幸：薬用植物資源研究センターの取り組み（その2）-薬用植物の水耕栽培について-医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス、PMDRS、47(10)、712-723（2016）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、実用化に耐えうる、水耕栽培において格段に生育が良好なコプティス・ジャポニカを選抜する方法、その栽培方法を見出すことを、その課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、特定の遺伝子の特定の型を有するコプティス・ジャポニカが水耕栽培での生育が格段に良好で、質量の増加も多いことを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカを、水耕栽培することを特徴とするコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法である。
【００１０】
また、本発明は、コプティス・ジャポニカから、配列番号１で示されるType I遺伝子を検出することを特徴とする水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法である。
【００１１】
更に、本発明は、配列番号１で示されることを特徴とするType I遺伝子である。
【００１２】
また更に、本発明は、配列番号２または３に記載のオリゴヌクレオチドからなることを特徴とするType I遺伝子増幅用プライマーである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法は、水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカを栽培するため、短期間で効率良く栽培することができる。
【００１４】
また、本発明の水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法は、水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカを高い精度で選抜できる。
【００１５】
更に、上記選抜方法で選抜されたコプティス・ジャポニカは、水耕栽培に適したものであり、これを水耕栽培することにより、従来のものに比べて有害元素含量が低い、より安全性が高いものであると共に、ベルベリン含量も安定し、品質が安定する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例２の遺伝子増幅確認試験の結果を示す図である（レーン１、２：セリバオウレン、レーン３：コセリバオウレン、レーン４：キクバオウレン、レーン５：C.chinensis、レーンＰ：セリバオウレンの不定胚培養物（Type I）、レーンＮ：水、レーンＭ：マーカー）。
【図２】土耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を示す図である。
【図３】水耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のコプティス・ジャポニカの水耕栽培方法（以下、「本発明栽培方法」という）は、配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカを、水耕栽培するものである。なお、配列番号１で示されるType I遺伝子は、ベルベリンの生合成経路鍵酵素の一つと考えられているS-adenosyl-L-methionine : 3’-hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltrans ferase （Cj4'OMT）をコードする遺伝子のゲノムＤＮＡの多型の一つである。
【００１８】
本発明栽培方法に用いられるコプティス・ジャポニカは、配列番号１で示されるType I遺伝子を有するものである。コプティス・ジャポニカとしては、キクバオウレン（Coptis japonica Makino var. japonica Satake）、セリバオウレン（Coptis japonica Makino var. dissecta Nakai）、コセリバオウレン（Coptis japonica Makino var. major Satake）が挙げられる。これらの中でもセリバオウレンが好ましい。また、これらの由来は特に限定されないが、不定胚培養由来のものが好ましい。
【００１９】
コプティス・ジャポニカが、配列番号１で示されるType I遺伝子を有しているかどうかを判断する方法は、特に限定されず、公知の遺伝子の検出方法を用いることができる。具体的には、コプティス・ジャポニカのゲノムDNA、コプティス・ジャポニカのCj4'OMTをコードする遺伝子のゲノムDNA等の塩基配列を公知の方法で解析して配列番号１で示されるType I遺伝子があるかどうかを判断する方法、配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅用プライマーを用い、公知の方法でType I遺伝子が増幅されるかどうかで判断する方法等が挙げられる。これらの方法の中でも配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅用プライマーを用いてType I遺伝子が増幅されるかどうかで判断する方法が好ましい。
【００２０】
配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅用プライマーを用いてType I遺伝子を増幅する方法は特に限定されないが、例えば、PCR、LAMP等が挙げられる。これらの方法の中でもPCRが好ましい。PCRの条件は特に限定されないが、例えば、公知の方法で調製したコプティス・ジャポニカの遺伝子サンプル（ゲノムDNA）に対し、配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅用プライマーを使用し、94℃〜98℃で、DNAを一本鎖に解離させ、好ましくは、50℃〜65℃、特に好ましくは54℃〜56℃でプライマーを結合させ、68℃〜72℃でDNAを増幅させることが好ましい。 また、遺伝子増幅用プライマーの濃度は、0.4μＭ〜0.5μＭ、更に0.42μＭが好ましい。
【００２１】
また、このType I遺伝子の増幅の際には別途、PCRの鋳型として用いるゲノムDNAの品質そのものに問題がないことを示すために、ITS領域（約0.7kbp）の増幅も確認することが好ましい。
【００２２】
上記した配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカを水耕栽培する方法は特に限定されないが、例えば、配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカを、栽培ベッド部、養液タンク部、養液供給部、酸素（空気）供給ユニット（エアポンプ、ドリップ装置等）、光照射部及びそれらのコントロールユニット等を備えた水耕栽培装置で水耕栽培を行えばよい。水耕栽培の栽培ベッド部に設置する培地は、保水性と通気性を有する素材であれば特に限定されない。水耕栽培に用いる養液は、特に限定されないが、例えば、マツザキ１号及び２号（マツザキアグリビジネス製）、ウオーターファーム（清和肥料製）、ＯＡＴハウス肥料（ＯＡＴアグリオ製）等の水耕栽培用の肥料を、地下水、井戸水、水道水等の常水に溶解させたもの等を用いればよい。栽培条件は、特に限定されず、例えば、温度１０℃〜２５℃、湿度３０％〜７０％等のあまり高温多湿にならない環境下で直射日光に当てない様な条件で６か月以上である。
【００２３】
なお、水耕栽培に用いる配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカの形態は特に限定されないが、上記したような方法でType I遺伝子を有することが確認されたコプティス・ジャポニカから誘導された培養クローンを用いることが好ましい。
【００２４】
上記した水耕栽培装置としては、例えば、フィールド水耕栽培装置（エスペックミック製）等の市販の装置を利用することもできる。このフィールド水耕栽培装置を利用する場合、栽培ベッド部に設置する培地としては、ココピート、パミス、ハイドロボール、ピートモス、パーライト、バーミキュライト、ゼオライト等が好ましい。養液としては、ＯＡＴハウス１号とＯＡＴハウス２号（いずれも、ＯＡＴアグリオ製）を組合せたものを常水に溶解させたものを用いることが好ましい。栽培条件は温度１８℃〜２２℃、湿度４５％〜６０％、太陽光＋補助光源で１２時間〜１６時間明期で６か月以上である。
【００２５】
以上のようにして水耕栽培された配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカは、同じ期間、土耕栽培された場合と比較して、根の生育が早く且つ大きくなる。また、Type I遺伝子を有していないコプティス・ジャポニカと比較して、水耕栽培を行った際の生存率が高い。そのため、配列番号１で示されるType I遺伝子を有するコプティス・ジャポニカは、水耕栽培に適していると判断できる。
【００２６】
本発明の水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカの選抜方法（以下、「本発明選抜方法」という）は、コプティス・ジャポニカから、配列番号１で示されるType I遺伝子を検出するものである。
【００２７】
コプティス・ジャポニカから、配列番号１で示されるType I遺伝子を検出する方法は、上記した公知の遺伝子の検出方法を用いることができるが、好ましくは配列番号１で示されるType I遺伝子の検出にあたり、配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅用プライマーを用いる方法である。配列番号１で示されるType I遺伝子の検出にあたり、配列番号２および３に記載のオリゴヌクレオチドからなるType I遺伝子増幅プライマーを用いれば、他のType IIa、Type IIb、Type IIIa、Type IIIb、Type IIIc、Type IIId等の遺伝子を有するコプティス・ジャポニカと鑑別できる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２９】
参  考  例  １
セリバオウレンの不定胚培養物の塩基配列解析：
セリバオウレンのベルベリンの生合成経路における鍵酵素の一つであるCj4'OMTをコードする遺伝子のゲノムＤＮＡ（Cj4'OMTg）の種間多型を、以下のようにして調べた。
【００３０】
＜サンプル＞
セリバオウレンの由来の全て異なる不定胚培養物４クローン（クローン１、２、３、４）をサンプルとした。
【００３１】
＜方法＞
セリバオウレンの4’OMT遺伝子間で保存されている領域について設計したプライマー、Cj4’OMT-668S（センスプライマー、sense primer）及びCj4’OMT-801A（アンチセンスプライマー、antisense primer）のセット（配列番号４および５）を用い、ゲノムDNAを鋳型に、Cj4’OMTg遺伝子の増幅を行った。PCR条件は表１に示す。各プライマーの最終濃度は、1 μMとした。
【００３２】
（PCR条件）
【表１】
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【００３３】
得られた増幅産物は末端A付加ののち、アガロースゲル電気泳動及びWizard（登録商標）SV Gel and PCR Cleanup System (Promega)を用いたゲル精製により未反応のプライマー等を除去し、T-vectorにクローニングした。大腸菌DH5aを形質転換し、アンピシリン耐性の各植物由来8クローンについてコロニーダイレクトPCRを行い、解析領域を増幅し、得られた増幅産物を鋳型としてF-primer（フォワードプライマー、forward primer）またはR-primer（リバースプライマー、reverse primer）を用いたダイレクトシーケンシングに供した。
塩基配列の解析にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI)を用いたサイクルシーケンシング法を適用し、 ABI PRISM 3130-Avant DNA sequencer、80 cm キャピラリー、POP-7ポリマー(ABI)により解析を行った。得られた塩基配列データは、DNASIS V3.7 (Hitachi software)、FinchTV (Geospiza Inc.)、BioEdit ver. 7.1.11を用い解析し、分子系統樹解析にはTreeView (1.6.6)を使用した。
【００３４】
＜結果＞
全てのセリバオウレン不定胚培養物でCj4'OMTgが増幅された。Cj4'OMTg塩基配列解析の結果、Cj4'OMTgの多型はType I、Type IIa、Type IIb、Type IIIa、Type IIIb、Type IIIc、Type IIIdの7種であった。これらの出現頻度はクローン１でType I : Type IIIb (5 : 2)、クローン２では、Type IIa : Type IIIa : Type IIIc : Type IIId (3 : 3 : 1 : 1)、クローン３では、Type IIIa : Type IIIc (6 : 1)、クローン４では、Type IIa : Type IIb : Type IIIb (3 : 2 : 3)であった。
【００３５】
実  施  例  １
セリバオウレンの水耕栽培：
由来の異なるセリバオウレン（Ａ株：１４株、Ｂ株：６株、Ｃ株：１６株）の苗（２〜５ｇ程度）を定植し、７か月間、水耕栽培した。水耕栽培の条件は以下の通りである。
【００３６】
＜水耕栽培条件＞
栽培条件：非閉鎖温室  設定温度20℃、16時間明期、湿度60％
栽培装置：底面潅水方式水耕栽培装置
栽培支持体：パミス  特小粒  粒度2.4〜5.0 mm（大江化学工業製）
養液：ＯＡＴハウス1号（ＯＡＴアグリオ製）0.1875g/l＋ＯＡＴハウス２号（ＯＡＴアグリオ製）0.125/l、pH5.7、EC 0.37mS/cm 
【００３７】
水耕栽培後、Ａ株、Ｂ株、Ｃ株の収穫時の地上部生存率（平均値）、栽培開始時に対する質量増加率（平均値）を表２に示した。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
以上の結果から、水耕栽培において、A株が特に生育が良好であることが判明した。A株のCj4'OMTgの遺伝子型を実施例2により調べたところ、Type I遺伝子が検出された。その他のB株、C株においてはType Iの遺伝子は検出されなかった。オウレン株のCj4'OMTgの遺伝子型を調べ、Type Iが検出されるものを選別すれば、水耕栽培に適した株を選抜できることが判明した。
【００４０】
実  施  例  ２
Type I遺伝子用プライマーの設計：
実施例１の結果から、Type I遺伝子を有するセリバオウレンが、水耕栽培に適していることが判明した。このType I遺伝子を有するセリバオウレンを鑑別できるように、Type I遺伝子に特有のプライマーを設計した（配列番号２および３）。これらのプライマーと、GoTaq  Green Master Mix（Promega製）を用い、各サンプルのType I遺伝子の増幅を行った。PCR条件は表３に示す。各プライマーの最終濃度は、0.42 μMとした。結果を図１に示した。
【００４１】
＜サンプル＞
Type I遺伝子を有さないセリバオウレン２種、Type I遺伝子を有さないセリバオウレン２種、Type I遺伝子を有さないコセリバオウレン、Type I遺伝子を有さないキクバオウレン、Type I遺伝子を有さないC.chinensis、Type I遺伝子を有するセリバオウレンを用いた。
【００４２】
（PCR条件）
【表３】
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【００４３】
Type I遺伝子用プライマーを用いることによりType I遺伝子の増幅産物以外の非特異的増幅産物の出現が抑制されていた。
【００４４】
なお、PCRの鋳型として用いるゲノムDNAの品質そのものに問題がないことを示すために、各サンプルのITS領域（約0.7kbp）が増幅されることも確認した。
【００４５】
実  施  例  ３
Type I遺伝子を有するセリバオウレンの栽培：
参考例１においてType I遺伝子を有するオウレン株の葉柄から誘導した不定胚培養由来のType I遺伝子を有するセリバオウレンの苗（平均生質量１．９３ｇ）を、以下の条件で土耕栽培または水耕栽培し、栽培189日後に生薬の原料となる根茎の質量を凍結乾燥機で乾燥後、測定した。その結果を表４に示した。また、土耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を図２に、水耕栽培189日後のセリバオウレンの外観を図３に示した。
【００４６】
＜土耕栽培条件＞
3寸鉢：赤玉土：培養土（クレハ製）：堆肥＝3：1：1
肥料：ハイポネックス6-10-5（ハイポネックスジャパン製）  500倍液を週１回散布
【００４７】
＜水耕栽培条件＞
栽培条件：閉鎖温室  20℃、16時間明、湿度60％
栽培装置：フィールド水耕栽培装置（エスペックミック製）
栽培ベッド：ココピート（エスペックミック製）
養液：111日まで：マツザキ1号（マツザキアグリビジネス製）0.38g/l+マツザキ2号（マツザキアグリビジネス製）0.25/l、pH6.0、EC 0.73mS/cm 
112日以降：マツザキ1号（マツザキアグリビジネス製）0.19g/l+マツザキ2号（マツザキアグリビジネス製）0.13/l、pH5.6、EC 0.32mS/cm
【００４８】
【表４】
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【００４９】
以上の結果から、Type I遺伝子を有するセリバオウレンは、水耕栽培に特に適していることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、水耕栽培に適したコプティス・ジャポニカを選抜することができ、そこで選抜されたコプティス・ジャポニカを水耕栽培することにより、生薬として有用なコプティス・ジャポニカを効率良く得ることができる。そのため、本発明は、漢方薬の黄連の製造に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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