(57)【要約】【課題】高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供すること。【解決手段】本発明は、化学式５’−Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ−３’および化学式５’−Ｆｃ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｒ−３’からなる群から選択される少なくとも１種により表されるコカインアプタマーである。ここで、Ｒは、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択される。ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなる。Ｌは、なし、または、任意のリンカーである。Ｆｃはフェロセン基を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（ＣＩ）および化学式（ＣＩＩ）からなる群から選択される少なくとも１種により表されるコカインアプタマー。
５’−Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ−３’      （ＣＩ）
５’−Ｆｃ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｒ−３’      （ＣＩＩ）
ここで、
Ｒは、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す、
コカインアプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
コカインアプタマー。
【請求項３】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）n1−であり、
ここで、
ｎ１は、自然数を表す
コカインアプタマー。
【請求項４】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩ）から選択され、かつ
Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ１−であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す。
コカインアプタマー。
【請求項５】
請求項４に記載のコカインアプタマーであって、
Ｌ１は、アミド結合である。
コカインアプタマー。
【請求項６】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩＩ）から選択され、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す
コカインアプタマー。
【請求項７】
請求項６に記載のコカインアプタマーであって、
Ｌ１は、アミド結合を表す
コカインアプタマー。
【請求項８】
試料溶液に含有されるコカインを検出する方法であって、
（ａ）  請求項１に記載のコカインアプタマーを前記試料溶液と混合して混合液を調製する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において調製された混合液に、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加する工程、および
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記混合液を電気化学的に測定することによって、コカインを検出する工程、
を具備する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれる前記フェロセン基Ｆｃの濃度が測定される、
方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）n1−を表し、
ここで、
ｎ１は、自然数を表す、
方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩ）から選択され、
Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ１−であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す、
方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
Ｌ１は、アミド結合を表す、
方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法であって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩＩ）から選択され、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｌ１は、アミド結合を表す、
方法。
【請求項１７】
試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  請求項１に記載のコカインアプタマーおよび前記試料溶液を混合して混合液を調製する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において調製された混合液に、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、サイクリックボルタンメトリー法により所定の酸化電位に対する前記フェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１を測定する工程、および
（ｄ）  以下の数式（Ｍ１）が充足された場合には、前記試料溶液がコカインを含有すると判定する工程、
ＲＣ１／ＲＣ２  ＞  １．０      （Ｍ１）
を具備し、
ここで、
ＲＣ２は、コカインを含有しない試料溶液の前記所定の酸化電位に対する予め測定された前記フェロセン基Ｆｃの還元電流を表す、
方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）n1−であり、
ここで、
ｎ１は、自然数を表す、
方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩ）から選択され、
Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ１−であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す、
方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
Ｌ１は、アミド結合を表す、
方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法であって、
前記コカインアプタマーは、前記化学式（ＣＩＩ）から選択され、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−であり、
ここで、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
ｎ２は、自然数を表す、
方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
Ｌ１は、アミド結合を表す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コカインアプタマーおよびそれを用いてコカインを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１は、５’−ＨＳ−（ＣＨ2）11−ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ−（ＣＨ2）7−ＭＢ−３’（配列番号：０１、ＭＢはメチレンブルーを表す）により表されるコカインアプタマーを開示している。図１０は、非特許文献１に含まれる図３の写しである。図１０に示されるように、０μＭの濃度を有するコカイン水溶液（すなわち、コカインを含有しない水溶液）に対するＭＢの還元電流は約３８０ナノアンペアである。２５０μＭの濃度を有するコカイン水溶液に対するＭＢの還元電流は約４００ナノアンペアである。従って、非特許文献１において開示されたコカインアプタマーのＳ／Ｎ比は、およそ１．０５（＝４００／３８０）である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】James S. Swensen et al, "Continuous, Real-Time Monitoring of cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor" Journal of American Chemical Society, 2009, 131, 4262-4266
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の化学式（ＣＩ）および化学式（ＣＩＩ）からなる群から選択される少なくとも１種により表されるコカインアプタマーである。
５’−Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ−３’      （ＣＩ）
５’−Ｆｃ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｒ−３’      （ＣＩＩ）
ここで、
Ｒは、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態によるコカインアプタマーの第１合成スキームを示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに続き、実施形態によるコカインアプタマーの合成スキームを示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施形態によるコカインアプタマーの第２合成スキームを示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃに続き、実施形態によるコカインアプタマーの合成スキームを示す図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、実施形態によるコカインアプタマーの第３合成スキームを示す図である。
【図１Ｆ】図１Ｆは、図１Ｅに続き、実施形態によるコカインアプタマーの合成スキームを示す図である。
【図１Ｇ】図１Ｇは、実施形態によるコカインアプタマーの第４合成スキームを示す図である。
【図１Ｈ】図１Ｈは、実施形態によるコカインアプタマーの第５合成スキームを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例３Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例３Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例４Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例４Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例５Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例５Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例６Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例６Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、比較例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａに含まれる破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。
【図９Ａ】図９Ａは、比較例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。
【図１０】図１０は、非特許文献１に含まれる図３の写しである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態が説明される。
【０００９】
（コカインアプタマー）
本実施形態によるコカインアプタマーは、以下の化学式（ＣＩ）および化学式（ＣＩＩ）からなる群から選択される少なくとも１種により表される。
５’−Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ−３’      （ＣＩ）
５’−Ｆｃ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｒ−３’      （ＣＩＩ）
ここで、
Ｒは、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、なし、または、任意のリンカーであり、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す。
【００１０】
非特許文献１にも開示されているように、コカインに結合可能な遺伝子配列の例は、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）である。
【００１１】
Ｒは、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択される限り、Ｒは限定されない。なぜなら、後述されるように、Ｒはコカインの検出には影響を与えないからである。Ｒの例は、ＨＳ−（ＣＨ2）n1−またはＲ１−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−である。Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択される。ｎ１は、自然数を表す。
【００１２】
本実施形態によるコカインアプタマーは、後述される実施例および比較例から明らかなように、フェロセン基Ｆｃにより特徴づけられる。フェロセン基Ｆｃのこの特徴により、本実施形態によるコカインアプタマーは、高いコカイン検出感度を有する。
【００１３】
Ｌは、なし、または任意のリンカーである。
化学式（ＣＩ）においては、Ｌは、
−（ＣＨ2）n2−Ｌ１−、
−（（ＣＨ2）2−Ｏ−）n21−ＰＯ4−（ＣＨ2）n22−Ｌ１−、または
−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−であり得る。
ｎ２は、自然数を表す。Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーである。ｎ２１は、自然数を表す。ｎ２２は、自然数を表す。Ｌ２は、なし、または、任意のリンカーである。
【００１４】
１つの実施態様において、Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ１−である。この場合、Ｌ１はアミド結合であることが望ましい。
【００１５】
化学式（ＣＩＩ）においては、Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−であり得る。ここで、Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーを表す。ｎ２は、自然数を表す。望ましくは、Ｌ１はアミド結合である。
【００１６】
望ましくは、ｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１以上２０以下の自然数である。より望ましくは、ｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して３以上９以下の自然数である。
【００１７】
（コカインアプタマーの製法）
次に、本実施形態によるコカインアプタマーの製法が説明される。図１Ａおよび図１Ｂは、本実施形態によるコカインアプタマーの第１の合成スキームを示す。
【００１８】
まず、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される遺伝子配列が、一般的な人工遺伝子合成法により合成される。上述したように、配列番号：０１により表される遺伝子配列は、非特許文献１に開示されている。
【００１９】
次に、ビス（ヒドロキシアルキル）ジスルフィド（図１Ａでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）6−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）6−ＯＨにより表されるビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド）が添加される。このようにして、脱水縮合により遺伝子配列の５’末端にジスルフィド基を含む置換基が連結される。
【００２０】
ポリグリコール（図１Ａでは、化学式ＨＯ−（（ＣＨ2）2−Ｏ−）3−Ｈにより表されるトリグリコール）が添加される。このようにして、脱水縮合により遺伝子配列の３’末端にＬの一部が連結される。
【００２１】
アミノアルキルリン酸誘導体（図１Ａでは、化学式Ｈ2ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ2により表される）が添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端を伸ばすように、脱水縮合によりポリグリコールの末端にＬの一部がさらに連結される。アミノアルキルリン酸誘導体は、リン酸およびアルカノールアミンの脱水縮合により得られる。化学式Ｈ2ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ2により表されるアミノアルキルリン酸誘導体は、リン酸および６−アミノ−１−ヘキサノールの脱水縮合により得られる。
【００２２】
フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ａでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）が添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりリン酸誘導体の末端にフェロセン基Ｆｃが連結される。
【００２３】
図１Ｂに示されるように、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。還元剤の例は、Tris-(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (以下、「TCEP」という)である。
【００２４】
図１Ｂでは、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−により表され、かつ
Ｌは、（（ＣＨ2）2−Ｏ−）n1−ＰＯ4−（ＣＨ2）n2−Ｌ1により表されるリンカーである（すなわち、ｎ１は３に等しく、ｎ２は６に等しく、かつＬ１はＮＨＣＯにより表されるアミド結合である）。
【００２５】
図１Ｃおよび図１Ｄは、本実施形態によるコカインアプタマーの第２の合成スキームを示す。
【００２６】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n1−ＯＨにより表されるジヒドロキシアルカン（図１Ｃでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）12−ＯＨにより表される１，１２−ジヒドロキシドデカン、すなわち、ｎ１＝１２）が遺伝子配列に混合される。このようにして、脱水縮合により、遺伝子配列の５’末端にヒドロキシアルキル基が連結される。以下、ヒドロキシアルキル基が連結された５’末端を有する遺伝子配列は「遺伝子配列（Ａ）」と呼ばれる。
【００２７】
これとは別に、リン酸が、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＯＨにより表されるビス（ヒドロキシアルキル）ジスルフィド（ｎ５は自然数を表す。図１Ｃでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）6−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）6−ＯＨにより表されるビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド、すなわち、ｎ５＝ｎ３＝６）と混合され、脱水縮合により一方のヒドロキシル基がリン酸基に置換される。このようにして、図１Ｃでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4Ｈ2により表される化合物が得られる。以下、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4Ｈ2により表される化合物は、「化合物（Ｂ）」と呼ばれる。
【００２８】
遺伝子配列（Ａ）は、化合物（Ｂ）と混合される。このようにして、遺伝子配列の５’末端を伸ばすように、脱水縮合により、Ｒ１’−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡが得られる。Ｒ１’は、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−を表す。上述の通り、図１Ｃでは、ｎ１＝１２、ｎ３＝６、かつｎ５＝６である。
【００２９】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルカノール（図１Ｃでは、ＨＯ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2、すなわち、ｎ２＝６）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端を伸ばすように、脱水縮合によりＲ１’−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−ＤＮＡ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2が得られる。
【００３０】
フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ｃでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。
【００３１】
図１Ｄに示されるように、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。図１Ｄでは、Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−を表す。Ｌは、−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯ−を表す。還元剤の例は、TCEPである。
【００３２】
図１Ｄでは、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−を表し、かつ
Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーである。
ここで、ｎ１は１２に等しく、ｎ２は６に等しく、ｎ３は６に等しく、かつＬ２はＮＨＣＯにより表されるアミド結合である。
【００３３】
図１Ｅおよび図１Ｆは、本実施形態によるコカインアプタマーの第３の合成スキームを示す。
【００３４】
図１Ｃの場合と同様に、遺伝子配列（Ａ）は、化合物（Ｂ）と混合される。このようにして、遺伝子配列の５’末端を伸ばすように、脱水縮合により、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡが得られる。図１Ｅでは、ｎ１＝１２、ｎ３＝６、かつｎ５＝６である。
【００３５】
次に、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n4−ＯＨにより表されるジヒドロキシアルカン（図１Ｅでは、ＨＯ-（ＣＨ2）12-ＯＨ。すなわち、ｎ４＝１２）が添加される。ジヒドロキシアルカンは、脱水縮合により遺伝子配列の３’末端に連結され、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡ-（ＣＨ2）n4-ＯＨが得られる。
【００３６】
次に、化学式Ｈ2ＰＯ4-（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルキルリン酸誘導体（図１Ｅでは、Ｈ2ＰＯ4-（ＣＨ2）6−ＮＨ2。すなわち、ｎ２＝６）が添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミノアルキルリン酸誘導体の脱水縮合を介してＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−ＤＮＡ−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2が得られる。
【００３７】
図１Ｆに示されるように、フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ｆでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。このようにして、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡ-（ＣＨ2）n4-ＰＯ4-（ＣＨ2）n2-ＮＨＣＯ-Ｆｃが得られる。
【００３８】
最後に、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。図１Ｆでは、Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−を表す。Ｌは、−（ＣＨ2）12−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯ−を表す。還元剤の例は、TCEPである。
【００３９】
図１Ｇは、本実施形態によるコカインアプタマーの第４の合成スキームを示す。
【００４０】
ビス（ヒドロキシアルキル）ジスルフィド（図１Ｇでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）6−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）6−ＯＨにより表されるビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド）が遺伝子配列に添加される。このようにして、脱水縮合により遺伝子配列の５’末端にジスルフィド基を含む置換基が連結される。
【００４１】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルカノール（図１Ｇでは、ＨＯ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2、すなわち、ｎ２＝６）がさらに添加される。このようにして、脱水縮合により、遺伝子配列の３’末端にアミノアルキル基が連結される。
【００４２】
フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ｇでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）が添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。
【００４３】
最後に、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。還元剤の例は、TCEPである。
【００４４】
図１Ｇでは、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−であり、かつ
Ｌは、−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯ−である。
【００４５】
次に、本実施形態によるコカインアプタマーの製法が説明される。図１Ｈは、本実施形態によるコカインアプタマーの第５の合成スキームを示す。
【００４６】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルカノール（図１Ｈでは、ＨＯ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2、すなわち、ｎ２＝６）が遺伝子配列に添加される。このようにして、脱水縮合により、遺伝子配列の５’末端にアミノアルキル基が連結される。
【００４７】
ビス（ヒドロキシアルキル）ジスルフィド（図１Ｈでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）6−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）6−ＯＨにより表されるビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド）が添加される。このようにして、脱水縮合により遺伝子配列の３’末端にジスルフィド基を含む置換基が連結される。
【００４８】
フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ｈでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）が添加される。このようにして、遺伝子配列の５’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。
【００４９】
最後に、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式フェロセン基Ｆｃ−Ｌ−ＤＮＡ−Ｒ（ＣＩＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。還元剤の例は、TCEPである。
【００５０】
図１Ｈでは、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−であり、かつ
Ｌは、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）6−である。
【００５１】
本実施形態によるこれらのコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成され得る。
【００５２】
（コカインアプタマーの使用方法）
以下、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液に含有されるコカインを検出する方法が説明される。すなわち、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法が説明される。
【００５３】
（工程（ａ））
まず、本実施形態によるコカインアプタマーが、試料溶液と混合される。このようにして、混合液が調製される。試料溶液は、水溶液であることが望ましい。本実施形態によるコカインアプタマーは、１本鎖であることが望ましい。そのため、本実施形態によるコカインアプタマーが試料溶液と混合される前に、本実施形態によるコカインアプタマーは熱処理に供されることが望ましい。熱処理の一例として、本実施形態によるコカインアプタマーは、摂氏８０度で５分間加熱され、次いで３０分間で摂氏２５度に冷却される。このようにして、１本鎖のコカインアプタマーが得られる。
【００５４】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが、工程（ａ）において調製された混合液に添加される。制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩは、２本鎖デオキシリボ核酸に特異的な３’→５’エキソヌクレアーゼであり、二本鎖デオキシリボ核酸の３’−ＯＨ末端から５’−モノヌクレオチドを遊離させる。試料溶液がコカインを含有する場合、コカインアプタマーは２本鎖を形成するようにコカインに結合する。従って、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの働きにより、コカインに結合したＤＮＡは分解される。ＤＮＡの分解により、フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する。ＤＮＡの分解により、Ｒも混合液中で遊離するが、フェロセン基Ｆｃに影響を与えない。従って、Ｒは限定されない。同様に、フェロセン基Ｆｃに影響を与えない限り、Ｌも限定されない。
【００５５】
一方、試料溶液がコカインを含有しない場合、コカインアプタマーはほとんど２本鎖を形成しない。従って、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが添加された後であっても、本実施形態によるコカインアプタマーは変化せず、かつフェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部は遊離しない。
【００５６】
工程（ｂ）の最後には、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させることが望ましい。具体的には、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）が混合液に添加される。
【００５７】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いたサイクリックボルタンメトリー法により測定される。フェロセン基Ｆｃは還元体であるため、本実施形態によるサイクリックボルタンメトリーにおいては、酸化電位が連続的に変化されながら、フェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１が測定される。具体的には、酸化電位は、まず、０ボルトから０．６ボルトに増加される。次いで、酸化電位は０．６ボルトから０ボルトに低下される。この期間の還元電位は、０ボルトに設定される。言い換えれば、この期間では、酸化電位の変化に拘わらず、還元電位は０ボルトに設定される。
【００５８】
所定の酸化電位（例えば、０．５ボルト）に対して測定されたフェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１に基づいて、コカインが検出される。以下、試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法がより詳細に説明される。
【００５９】
（工程（ｄ））
以下の数式（Ｍ１）が充足された場合には、試料溶液がコカインを含有すると判定される。
ＲＣ１／ＲＣ２  ＞  １．０      （Ｍ１）
ここで、
ＲＣ２は、コカインを含有しない試料溶液の所定の酸化電位（例えば、０．５ボルト）に対する予め測定されたフェロセン基Ｆｃの還元電流を表す。
【００６０】
ＲＣ２の値は、以下のように測定される。コカインを含有しない混合液に含有されるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いたサイクリックボルタンメトリー法により、バックグラウンドノイズの値として測定される。ＲＣ２の値は、本実施形態による方法が実施される前に予め測定される。
【００６１】
言うまでもないが、工程（ｂ）においてコカインアプタマーに含まれるフェロセン基Ｆｃが混合液中で遊離しない場合（すなわち、試料溶液がコカインを含有しない場合）、等式ＲＣ１＝ＲＣ２（すなわち、ＲＣ１／ＲＣ２＝１）が成立する。言い換えれば、遺伝子配列（代表的には、配列番号：０１により表される）が分解されていないコカインアプタマーに含まれるフェロセン基Ｆｃは、還元電流ＲＣ１の値の増加には寄与しない。
【００６２】
後述される実施例および比較例から明らかなように、ＭＢ（ＭＢはメチレンブルーを表す）が用いられた場合よりもフェロセン基Ｆｃが用いられた場合の方が、より高い感度でコカインが検出される。
【００６３】
（実施例）
以下、実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。以下の実施例においては、ＤＮＡは、配列番号：０１により表される遺伝子配列からなる。
【００６４】
（実施例１）
実施例１は、実施例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）および実施例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）から構成される。
【００６５】
株式会社  日本遺伝子研究所により、以下の化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーが合成された。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＤＮＡ−（（ＣＨ2）2−Ｏ）3−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩａ）
【００６６】
まず、混合溶媒が調製された。混合溶媒は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、および５ｍＭのＭｇＣｌ2を含有していた。
【００６７】
（実施例１Ａ）
コカインが混合溶媒に添加され、混合液を得た。コカインの濃度は、２５０μＭであった。次いで、上記のコカインアプタマー（濃度：１０μＭ）が、混合液に添加された。
【００６８】
次いで、混合液は、熱処理に供された。具体的には、コカインアプタマーを含有する水溶液は、摂氏８０度で５分間、加熱された。次いで、水溶液は、３０分間かけて摂氏２５度に冷却された。熱処理により、混合液中でコカインアプタマーは、１本鎖のコカインアプタマーとして遊離し、次いでコカインと２本鎖を形成するようにコカインに結合した。
【００６９】
混合液に、２ユニット／１００μＬの濃度を有する制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが添加された。混合液は、１０秒間、撹拌された。制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの作用により、２本鎖を形成するようにコカインに結合していたコカインアプタマーは分解された。その結果、フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が遊離した。
【００７０】
次いで、５０ｍＭの濃度を有するＥＤＴＡが混合液に添加され、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させた。
【００７１】
遊離したコカインアプタマーの一部に含まれるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いてサイクリックボルタンメトリー法により測定された。板状の測定電極（ビー・エー・エス株式会社より入手、商品名：くし型電極Ａｕ）がポテンシオスタットに接続された。板状の測定電極は、互いに係合した２つのくし形電極を表面に有していた。各くし型電極は、１本の長い電極および多数の針電極から構成されていた。各針電極は、１本の長い電極と直交するように１本の長い電極から伸び出ていた。一方のくし形電極が酸化電極として用いられる一方、他方のくし形電極が還元電極として用いられた。２つのくし形電極に含まれる針電極の総数は１３０本（＝６５×２本）であった。１本の針電極の幅は２マイクロメートルであった。隣接する２本の針電極の間の距離もまた、２マイクロメートルであった。Ａｇ／ＡｇＣｌの参照電極がポテンシオスタットに接続された。
【００７２】
サイクリックボルタンメトリー法においては、酸化電位が、１０ｍＶ／秒の速度で、０ボルトから０．６ボルトに増加された。次いで、同じ速度で、酸化電位が０．６ボルトから０ボルトに低下された。このように酸化電位を変化させることにより、混合液はサイクリックボルタンメトリー法により掃引された。還元電位は、０ボルトに固定された。
【００７３】
図２Ａは、実施例１Ａによるサイクリックボルタモグラムを示す。図２Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．０９ナノアンペアであった。
【００７４】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ｂにおいては、コカインが混合溶媒に添加されなかったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。言い換えれば、実施例１Ｂにおいては、コカインの濃度は０μＭであった。図２Ｂは、実施例１Ｂによるサイクリックボルタモグラムを示す。図２Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ５．９３ナノアンペアであった。従って、実施例１において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．５３であった。
【００７５】
（実施例２）
実施例２においては、化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｂ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＤＮＡ−（（ＣＨ2）2−Ｏ）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｂ）
化学式（ＣＩｂ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００７６】
図３Ａは、実施例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図３Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．０１ナノアンペアであった。
【００７７】
図３Ｂは、実施例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図３Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ６．２３ナノアンペアであった。
【００７８】
従って、実施例２において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．４５であった。
【００７９】
（実施例３）
実施例３においては、化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−ＤＮＡ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｃ）
化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００８０】
図４Ａは、実施例３Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図４Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．４７ナノアンペアであった。
【００８１】
図４Ｂは、実施例３Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図４Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ４．８２ナノアンペアであった。従って、実施例３において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．９６であった。
【００８２】
（実施例４）
実施例４においては、化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｄ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−ＤＮＡ−（ＣＨ2）12−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｄ）
化学式（ＣＩｄ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００８３】
図５Ａは、実施例４Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図５Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．２３ナノアンペアであった。
【００８４】
図５Ｂは、実施例４Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図５Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ６．９９ナノアンペアであった。
【００８５】
従って、実施例４において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．３２であった。
【００８６】
（実施例５）
実施例５においては、化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｅ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＤＮＡ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｅ）
化学式（ＣＩｅ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００８７】
図６Ａは、実施例５Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図６Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ１０．８０ナノアンペアであった。
【００８８】
図６Ｂは、実施例５Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図６Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ８．６７ナノアンペアであった。
【００８９】
従って、実施例５において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．２４であった。
【００９０】
（実施例６）
実施例６においては、化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｆ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−フェロセン基Ｆｃ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＤＮＡ−（ＣＨ2）6−ＳＨ−３’    （ＣＩｆ）
化学式（ＣＩｆ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００９１】
図７Ａは、実施例６Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図７Ａに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ１１．９０ナノアンペアであった。
【００９２】
図７Ｂは、実施例６Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図７Ｂに示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ１０．５０ナノアンペアであった。
【００９３】
従って、実施例６において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．１３であった。
【００９４】
（比較例１）
比較例１においては、以下の事項（Ｉ）〜（ＩＩ）を除き、実施例１と同様の実験が行われた。
（Ｉ）  化学式（ＣＩａ）により表されるコカインアプタマーに代えて、以下の化学式（ＣＩｇ）により表されるコカインアプタマーが用いられた。化学式（ＣＩｇ）により表されるコカインアプタマーは、非特許文献１に開示されたコカインアプタマーと同一であり、かつ非特許文献１の開示内容に従って合成された。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）11−ＤＮＡ−（ＣＨ2）7−ＮＨ−ＣＯ−ＭＢ−３’    （ＣＩｇ）
ここで、ＭＢはメチレンブルーを表す。
（ＩＩ）  メチレンブルーは、酸化体であるので、サイクリックボルタンメトリー法においては、還元電流に代えて酸化電流が測定された。
【００９５】
図８Ａは、比較例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図８Ｂは、図８Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。図８Ｂに示されるように、−０．５ボルトの還元電位に対する酸化電流は、およそ４．６２ナノアンペアであった。
【００９６】
図９Ａは、比較例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図９Ｂは、図９Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。図９Ｂに示されるように、−０．５ボルトの還元電位に対する酸化電流は、およそ４．２０ナノアンペアであった。
【００９７】
従って、比較例１において、−０．５ボルトの還元電位に対して測定された２つの酸化電流の比は、おおよそ１．１０（＝４．６２／４．２０）であった。
【００９８】
実施例を比較例１と比較すれば明らかなように、フェロセン基Ｆｃが、コカインの検出感度を向上させる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、コカインの検出に用いられ得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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