(57)【要約】【課題】本発明は、容器外部から内容物を容易に観察できる凍結保存容器の提供を課題とする。【解決手段】上記課題は、細胞を凍結保存するための容器であって、容器が内表面を有し、内表面を構成する材料の屈折率が１．３０以上１．４０以下であり、内表面を通って容器を通過する光の透過率が５５％以上である容器によって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を凍結保存するための容器であって、
容器が内表面を有し、
内表面を構成する材料の屈折率が１．３０以上１．４０以下であり、
内表面を通って容器を通過する光の透過率が５５％以上である、容器。
【請求項２】
屈折率が１．３３以上１．３６以下である、請求項１に記載の容器。
【請求項３】
光の透過率が８０％以上である、請求項１又は２に記載の容器。
【請求項４】
内表面が平滑面を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の容器。
【請求項５】
内表面が非平滑面を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の容器。
【請求項６】
内表面が平滑面及び非平滑面を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の容器。
【請求項７】
細胞と保存液とが充填されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞を凍結保存するための容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療、細胞含有医薬品、不妊治療等の医療分野において目覚ましい発展が遂げられている。これらの医療分野では細胞が使用されるため、細胞を長期的に安定して保存する技術が必要とされている。このような技術として凍結保存が知られている。
【０００３】
細胞を凍結保存するための容器については種々の報告がされている。例えば、特許文献１は、安定して製造可能な凍結保存容器、特に低温ヒートシール性に優れた凍結保存容器を開発することを目的として、接着性フッ素高分子フィルムを含む凍結保存容器を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２３６０３５号公報（特許第５５４８７３２号）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Elisabetta Ada Cavalcanti-Adam, et al., "Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands", Biophysical Journal, Volume 92, Issue 8, April 2007, p.2964-2974
【非特許文献２】北森武彦、「ナノ構造を利用した細胞パターン制御」、[online]、［平成２７年７月２８日検索］、インターネット(URL:http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/kitamori/research/nanopattern/nanopattern.html)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の上記目的の他、容器の破損を防止すること、容器の耐寒性能を向上させること、液体窒素、雑菌又はウイルスの容器への侵入を防止すること、細胞の生存率を向上させること等を目的として、種々の凍結保存容器が開発されている。
【０００７】
しかしながら、凍結保存容器の内容物を容器外部から容易に観察可能とする、即ち、容器外部からの内容物の視認性を高めるという見地から凍結保存容器を開発する試みはなされていない。細胞製品を検査するためには、凍結保存容器に保存された細胞の状態、凍結保存容器に混入した異物の有無等を容器外部から観察する必要がある。そのため、容器外部から内容物を容易に観察できることが重要である。従って、本発明は、容器外部から内容物を容易に観察できる凍結保存容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的に鑑み、本発明者等が鋭意検討した結果、凍結保存容器の屈折率及び光透過率に着目することにより本発明を完成するに至った。具体的には、細胞を凍結保存するための保存液の屈折率と凍結保存容器の屈折率とを一致又は近似させることにより、保存液と凍結保存容器との界面で生じる光散乱を抑制し、容器外部からの内容物の視認性を高めることが可能となる。また、凍結保存容器を通過する光の透過率を高めることにより、容器外部からの内容物の視認性を高めることが可能となる。
【０００９】
より具体的には、以下の実施形態が本発明に包含される。
［１］細胞を凍結保存するための容器であって、
容器が内表面を有し、
内表面を構成する材料の屈折率が１．３０以上１．４０以下であり、
内表面を通って容器を通過する光の透過率が５５％以上である、容器。
［２］屈折率が１．３３以上１．３６以下である、［１］に記載の容器。
［３］光の透過率が８０％以上である、［１］又は［２］に記載の容器。
［４］内表面が平滑面を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の容器。
［５］内表面が非平滑面を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の容器。
［６］内表面が平滑面及び非平滑面を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の容器。
［７］細胞と保存液とが充填されている、［１］〜［６］のいずれかに記載の容器。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の凍結保存容器を使用することにより、容器外部から内容物を容易に観察することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】自己支持型の容器の正面視断面図である。
【図２】非自己支持型の容器の正面図である。
【図３】容器の内表面に形成された微細突起を示す側面視断面図である。
【図４】図１の微細突起の平面図である。
【図５】図１の微細突起の頂面を示す平面図である。
【図６】図１の微細突起上に細胞が配置された状態を示す模式図である。
【図７】比較例による微細突起上に細胞が配置された状態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、細胞を凍結保存するための容器（以下、単に「容器」とも称する）に関する。また、本発明は、細胞及び保存液が充填されている容器に関する。容器に充填されている細胞及び保存液は凍結保存されている状態であってもよいし、凍結保存されていない状態であってもよい。
【００１３】
＜容器形状＞
容器は、細胞及び保存液（以下、細胞及び保存液を併せて「細胞含有保存液」とも称する）を保持できるものであれば特に限定されない。
【００１４】
一実施形態では、容器は自己支持型の容器である。本明細書において「自己支持型の容器」とは、形状が容易に変化しない容器、具体的には、容器へ細胞含有保存液を充填する際に容器の形状が変化しない容器、より具体的には、容器の最大充填容量の８０％の純水を容器に充填した際の容器の容積の変化率が１％未満である容器を意味する。本明細書において「最大充填容量」とは、過剰量の純水の充填によって、容器が破損して純水が漏れ出ること、容器から純水が溢れ出ること等がなく、容器に充填可能な純水の最大の容量を意味する。本明細書において「容器の容積」とは、３次元測定機による容器の３次元立体形状の測定により算出される容器の充填部位の容積を意味する。自己支持型の容器としては、例えば、チューブ形状、バイアル形状、シャーレ形状等の容器が挙げられる。一般的な自己支持型の容器としては、例えば図１に示すような、底部１１と、底部の周縁から立設して開口部１２を形成する側壁部１３とを有する容器１０が挙げられるが、これに限定されるものではない。図示しないが、容器は開口部を液密に封鎖する蓋部を更に有していてもよい。蓋部は、容器本体と一体化されていてもよいし、容器本体と分離されていてもよい。
【００１５】
一実施形態では、容器は非自己支持型の容器である。本明細書において「非自己支持型の容器」とは、形状が容易に変化する容器、具体的には、容器へ細胞含有保存液を充填する際に容器の形状が変化する容器、より具体的には、容器の最大充填容量の８０％の純水を容器に充填した際の容器の容積の変化率が１％以上である容器を意味する。非自己支持型の容器としては、例えば、袋形状、バッグ形状等の容器が挙げられる。一般的な非自己支持型の容器としては、例えば図２に示すような、対向する一対のフィルム部（第１フィルム部２１及び第２フィルム部２２）と、一対のフィルム部の外縁に沿った底辺封止部２３及び開口部２４を形成する一対の側辺封止部（第１側辺封止部２５及び第２側辺封止部２６）とを有する容器２０が挙げられるが、これに限定されるものではない。図示しないが、容器は、細胞含有保存液の充填口及び／又は放出口を備える、一対のフィルム部の外縁に沿った上辺封止部を更に有していてもよい。
【００１６】
容器は内表面を有する。本明細書において「内表面」とは、細胞含有保存液を容器に充填した際に、細胞含有保存液と接触する側の容器の表面を意味する。
容器は外表面を有する。本明細書において「外表面」とは、細胞含有保存液を容器に充填した際に、細胞含有保存液と接触しない側の容器の表面を意味する。
【００１７】
一実施形態では、容器は単層から構成される。即ち、容器は同一の材料から構成される。
一実施形態では、容器は多層から構成される。即ち、容器は異なる複数の材料から構成される。容器が多層から構成される場合、容器は内表面を有する内層と外表面を有する外層とを有する。容器は内層及び外層に加えて、内層及び外層の中間に位置する中間層を更に有していてもよい。中間層は一層のみであってもよいし、複数の層であってもよい。容器を多層から構成することにより、容器に複数の機能を持たせることが可能となる。機能としては、例えば、強度、バリア性、ヒートシール性等が挙げられる。
【００１８】
＜屈折率＞
容器に充填された保存液の屈折率と容器の内表面を構成する材料の屈折率とが大きく異なると、保存液と容器の内表面との界面で光散乱が生じる。その結果、充填された細胞含有保存液を容器外部から観察することが困難となる。従って、容器外部からの細胞含有保存液の視認性を高めるためには、保存液の屈折率と容器の内表面を構成する材料の屈折率とを一致又は近似させることが重要である。
【００１９】
細胞を凍結保存するための保存液としては、一般的に、水、又は水とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との混合液が使用される。水の屈折率は約１．３３である。ＤＭＳＯの屈折率は約１．４８である。水とＤＭＳＯとの混合液が使用される場合、ＤＭＳＯは通常５〜１０％の濃度で使用され、最大で２０％の濃度で使用される。ＤＭＳＯが２０％の濃度で使用された場合の混合液の屈折率は約１．３６である。従って、一般的に使用される保存液の屈折率は約１．３３〜約１．３６の範囲に含まれる。なお、保存液は一般的に緩衝剤、無機塩類、栄養成分等の追加成分を含有するが、追加成分の含有量は微量であるため、保存液の屈折率に大きな影響を与えるものではない。それ故、容器の内表面を構成する材料の屈折率は、上記範囲と一致又は近似した値であることが重要であり、具体的には１．３０以上１．４０以下であり、好ましくは１．３０以上１．３９以下であり、より好ましくは１．３１以上１．３８以下であり、更に好ましくは１．３２以上１．３７以下であり、特に好ましくは１．３３以上１．３６以下である。
【００２０】
容器が単層から構成される場合には、容器の内表面を構成する材料は容器全体を構成する材料と同一である。
【００２１】
容器が多層から構成される場合には、容器の内表面を構成する材料は容器の内層を構成する材料と同一である。容器が多層から構成される場合において、容器外部からの細胞含有保存液の視認性を高めるためには、更に、内層を構成する材料の屈折率と外層を構成する材料の屈折率とが一致又は近似していることが好ましい。また、中間層が存在する場合には、更に、内層を構成する材料の屈折率と中間層を構成する材料の屈折率とが一致又は近似していることが好ましい。
【００２２】
内層を構成する材料の屈折率（ｎ内層）と外層を構成する材料の屈折率（ｎ外層）との比率（ｎ外層／ｎ内層）は、好ましくは１．２０以上０．８０以下であり、より好ましくは１．１５以上０．８５以下であり、更に好ましくは１．１０以上０．９０以下であり、特に好ましくは１．０５以上０．９５以下である。
【００２３】
内層を構成する材料の屈折率（ｎ内層）と中間層を構成する材料の屈折率（ｎ中間層）との比率（ｎ中間層／ｎ内層）は、好ましくは１．２０以上０．８０以下であり、より好ましくは１．１５以上０．８５以下であり、更に好ましくは１．１０以上０．９０以下であり、特に好ましくは１．０５以上０．９５以下である。
【００２４】
屈折率は、容器を構成する材料の種類に依存して一義的に決定される。そのため、材料の種類を適宜選択することによって、所望の屈折率を得ることができる。また、複数種の材料を適宜混合することによって、屈折率を調節し、所望の屈折率を得ることもできる。
【００２５】
本明細書における「屈折率」の測定法は、第十六改正日本薬局方の屈折率測定法に従うものとする。簡潔には、アッベ屈折計を使用し、２０℃の条件下でナトリウムスペクトルのＤ線を用いて空気に対する屈折率を測定する。容器が多層から構成される場合には、容器から内層を剥離し、剥離物に対して測定を行う。
【００２６】
＜光透過率＞
容器の光透過率が高いほど、充填された細胞含有保存液を容器外部から容易に観察することが可能となる。そのため、光透過率は高いほど好ましい。従って、容器の内表面を通って容器を通過する光の透過率は、少なくとも５５％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、更に好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは９５％以上である。光の透過率が８０％以上であると、顕微鏡を用いた細胞含有保存液の観察が容易となる。
【００２７】
一実施形態では、光がいずれの位置の内表面を通っても上記の光透過率が達成される。
一実施形態では、光が特定の位置の内表面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成される。本実施形態では、特定の位置は、細胞含有保存液を観察しやすい位置であることが好ましい。細胞含有保存液を観察しやすい位置は容器の種類によって異なる。
【００２８】
光透過率は、容器を構成する材料の種類、結晶性等によって変化する。そのため、材料の種類、容器の製造方法等を適宜選択することによって、所望の光透過度を得ることができる。
【００２９】
本明細書における「光透過率」の測定法は、第十六改正日本薬局方のプラスチック製医薬品容器試験法における透明性試験の第１法に従うものとする。簡潔には、水中において紫外可視吸光度測定法により波長４５０ｎｍの光の透過率を測定する。
【００３０】
＜内表面構造＞
一実施形態では、容器の内表面が平滑面を有する。好ましくは、内表面の全面が平滑面である。本実施形態では、光がいずれの位置の平滑面を通っても上記の光透過率が達成されてもよいし、光が特定の位置の平滑面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成されてもよい。
【００３１】
一実施形態では、容器の内表面が非平滑面を有する。好ましくは、内表面の全面が非平滑面である。本実施形態では、光がいずれの位置の非平滑面を通っても上記の光透過率が達成されてもよいし、光が特定の位置の非平滑面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成されてもよい。
【００３２】
一実施形態では、内表面が平滑面及び非平滑面を有する。本実施形態では、光が平滑面及び非平滑面のいずれを通っても上記の光透過率が達成されてもよいし、光が平滑面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成されてもよい。また、本実施形態では、光がいずれの位置の平滑面を通っても上記の光透過率が達成されてもよいし、光が特定の位置の平滑面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成されてもよい。また、本実施形態では、光がいずれの位置の非平滑面を通っても上記の光透過率が達成されてもよいし、光が特定の位置の非平滑面を通る場合にのみ上記の光透過率が達成されてもよい。
【００３３】
本明細書において「平滑面」とは、実質的に凹凸が無い面を意味する。「実質的に凹凸が無い」とは、凹部が存在していたとしても、凹部の深さが、例えば１μｍ以下であり、好ましくは０．５μｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ以下であること、及び凸部が存在していたとしても、凸部の高さが、例えば１μｍ以下であり、好ましくは０．５μｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ以下であることを指す。凹部の深さ及び凸部の高さは、以下で説明する微細突起の測定法を用いて測定することができる。簡潔には、原子間力顕微鏡又は走査型電子顕微鏡を用いて測定することができる。
【００３４】
平滑面では、非平滑面と比較して、光散乱が抑制され、光透過率が高くなる。そのため、充填された細胞含有保存液を平滑面を介して容器外部から容易に観察することが可能となる。
【００３５】
非平滑面では、一般的に、平滑面と比較して、光散乱が生じやすく、光透過率が低くなる。しかしながら、本発明に係る容器は、保存液の屈折率と一致又は近似した屈折率を有する材料から構成された内表面を有するため、内表面が非平滑面であっても光散乱を抑制することができる。そのため、充填された細胞含有保存液を非平滑面を介して容器外部から観察することも可能である。
容器の内表面は種々の目的のために非平滑面とすることができる。
【００３６】
非自己支持型の容器では、一対のフィルム部が互いに付着して、容器に細胞含有保存液を充填する妨げになることがある。この問題を解決するためには、一方又は両方のフィルム部の内表面の全面又は一部に非平滑面（例えば、容器の内部空間に向かって突出した凸部）を形成することが好ましい。凸部の存在により、一対のフィルム部が互いに付着することが防止され、細胞含有保存液の充填性が向上する。内表面の一部に凸部を形成する場合、一方のフィルム部の内表面に凸部を形成させ、他方のフィルム部の内表面を平滑面とすることが好ましい。これにより、凸部により細胞含有保存液の充填性を向上させると共に、平滑面により充填した細胞含有保存液の視認性を高めることができる。
【００３７】
凸部の高さは、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、０．５μｍ以上２０μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以上１０μｍ以下であることが特に好ましい。また、第１の凸部の頂点と、第１の凸部と最も近接する第２の凸部の頂点との間の距離は、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、０．５μｍ以上２０μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以上１０μｍ以下であることが特に好ましい。
【００３８】
自己支持型の容器では、容器に充填された細胞が重力によって沈降し、容器の内表面に接着することがある。この問題を解決するためには、内表面の全面又は一部に非平滑面（例えば、微細突起）を形成することが好ましい。内表面の一部に微細突起を形成する場合には、細胞が沈降する位置に対応する内表面（即ち、底部の内表面）に微細突起を形成し、側壁部の内表面を平滑面とすることが好ましい。これにより、微細突起により細胞の接着を抑制すると共に、平滑面により充填した細胞含有保存液の視認性を高めることができる。
【００３９】
非自己支持型の容器でも、容器に充填された細胞が重力によって沈降し、容器の内表面に接着することがある。この問題を解決するためには、内表面の全面又は一部に非平滑面（例えば、微細突起）を形成することが好ましい。内表面の一部に微細突起を形成する場合、微細突起の位置は容器の使用方法又は保存方法によって異なる。簡潔には、重力によって沈降した細胞と接触する内表面に微細突起を形成する。
【００４０】
一例として、容器を横たえて使用又は保存する場合（即ち、一方のフィルム部上に細胞が重力によって沈降するように使用又は保存する場合）、細胞が沈降する側のフィルム部の内表面に微細突起を形成し、他方のフィルム部の内表面を平滑面とすることが好ましい。これにより、微細突起により細胞の接着を抑制すると共に、平滑面により充填した細胞含有保存液の視認性を高めることができる。
【００４１】
一方、容器を吊り下げて使用又は保存する場合（即ち、底辺封止部（又はこれと同等の部分。以下同じ。）上に細胞が重力によって沈降するように使用又は保存する場合）、両方のフィルム部の内表面の下部領域に微細突起を形成し、両方のフィルム部の内表面の中部領域及び上部領域を平滑面とすることが好ましい。これにより、微細突起により細胞の接着を抑制すると共に、平滑面により充填した細胞含有保存液の視認性を高めることができる。なお、微細突起は下部領域の全面又は一部（下方）に形成することができる。
【００４２】
当業者であれば、非自己支持型の容器の形状、説明書等を総合考慮して、容器がどのように使用又は保存されるのかを容易に理解することができるはずである。
【００４３】
本明細書における「フィルム部の内表面の下部領域」とは、フィルム部を底辺封止部から長手方向（即ち、底辺封止部と直交する方向）に向かって順に３０％：４０％：３０％の面積比でフィルム部を分画した場合における、底辺封止部側の３０％の面積を意味する。
【００４４】
本明細書における「フィルム部の内表面の中部領域」とは、フィルム部を底辺封止部から長手方向（即ち、底辺封止部と直交する方向）に向かって順に３０％：４０％：３０％の面積比でフィルム部を分画した場合における、４０％の面積を意味する。
【００４５】
本明細書における「フィルム部の内表面の上部領域」とは、フィルム部を底辺封止部から長手方向（即ち、底辺封止部と直交する方向）に向かって順に３０％：４０％：３０％の面積比でフィルム部を分画した場合における、底辺封止部側と反対側の３０％の面積を意味する。
【００４６】
＜細胞非接着性微細突起＞
以下、細胞の接着を抑制するための微細突起について図面を参照して説明する。図３は微細突起１の側面視断面図である。図４は微細突起１の平面図である。
【００４７】
微細突起は、細胞非接着性の突起である。本明細書において「細胞非接着性の突起」とは、平滑面に対する細胞の接着と比較して、細胞の接着を抑制する突起を意味する。細胞非接着性の突起は、細胞の接着を完全に抑制することが好ましい。微細突起が細胞非接着性の機能を示すためには、好ましくは、微細突起の配置ピッチが、６０ｎｍ以上且つ充填する細胞の平均径以下であり、微細突起の高さが、充填する細胞の平均径×１／２以上であり、微細突起の頂部の短辺の長さが、充填する細胞の平均径×１／４０以下である。
【００４８】
細胞の平均径とは、ＪＩＳ  Ｚ８８２５の規定に準じる測定装置を用いてレーザー回折・散乱法により球相当径として測定された、細胞含有保存液に含まれる細胞の平均粒子径を意味する。細胞の平均径は、細胞の種類により異なるが、通常、１０μｍ以上１００μｍ以下の範囲にある。従って、より具体的には、微細突起の配置ピッチは６０ｎｍ以上且つ細胞の平均径（１０μｍ以上１００μｍ以下）以下であり、微細突起の高さは細胞の平均径（１０μｍ以上１００μｍ以下）×１／２以上であり、微細突起の頂部の短辺の長さは細胞の平均径（１０μｍ以上１００μｍ以下）×１／４０以下である。
【００４９】
微細突起の配置ピッチとは、図４における隣り合う２つの微細突起１の中心間の距離Ｌをいう。ここで「中心」とは、図４における微細突起１の形状が点対称である場合、当該形状の対称点を意味し、この場合、当該形状の重心と一致する。一方、図４における微細突起１の形状が点対称では無い場合、当該形状の重心を意味する。
【００５０】
微細突起の高さとは、図３における微細突起１の形状における、微細突起１の底部２と頂部３との間の距離Ｈをいう。
【００５１】
微細突起の頂部の短辺の長さとは、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ａ）に示すように正方形状を有する場合、その一辺の長さをいい、長方形状を有する場合、その短辺の長さをいう。また、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ｂ）に示すように円形状を有する場合、その直径の長さをいい、楕円形状を有する場合、その短径の長さをいう。また、微細突起１を図４のように平面視した際に、微細突起１の頂部が、図５（ｃ）に示すように全体的且つ大局的に見た場合に長手方向（即ち、図５（ｃ）における上下方向）と、短手方向（即ち、図５（ｃ）における左右方向）とを有する場合、その短手方向の長さをそのばらつきの全体的な傾向を反映し得ると期待される複数の箇所にて測定し、測定された短手方向の長さの平均値として特定される。具体的には、例えば、長手方向に沿った仮想線分上に位置する４つの中間点Ｐであって、当該仮想線分を５等分する中間点を特定し、特定された４つの中間点のそれぞれについて、各中間点での短手方向の長さを測定する。そして、合計４つの短手方向の長さを平均した値を、微細突起の頂部の短辺の長さとする。また、微細突起１を図３のように側面視した際に、微細突起１の頂部が鋭く尖っている場合、頂部の短辺の長さをゼロとする。
【００５２】
微細突起に関する各種寸法及び形状は、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）又は走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて特定することができる。但し、微細突起の各寸法は、対象となる内表面の全領域を調べてその平均値を算出して特定する必要はなく、実際的には、調査すべき対象（即ち、微細突起の配置ピッチ、高さ、頂面の短辺の長さ等）の全体的な傾向を反映し得ると期待される面積を持つ一区画内において、調査すべき対象のばらつきの程度を考慮して適当と考えられる数を調べてその平均値を算出することによって特定することができる。例えば、３０ｍｍ×３０ｍｍの領域内に含まれる３０箇所を電子顕微鏡により測定して平均を算出することにより、微細突起に関する各寸法（例えば、微細突起の配置ピッチ、高さ、頂面の短辺の長さ等）を特定することができる。
【００５３】
図示された例では、微細突起は規則的なパターンで形成されているが、不規則に形成されていてもよい。
【００５４】
微細突起を非自己支持型の容器のフィルム部の内表面に規則的なパターンで形成する方法の一例を説明する。まず、銅、アルミニウム、ステンレス鋼等の金属シートの表面に微細突起のネガ形に対応する凹凸形状をエッチング又は切削加工により形成し、当該金属シートを加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルム部を搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたフィルム部の表面に金属シート表面の凹凸形状を転写させる。これにより、フィルム部の内表面に微細突起が規則的なパターンで形成される。
【００５５】
微細突起を非自己支持型の容器のフィルム部の内表面に不規則に形成する方法の一例を説明する。まず、フィルム部の内表面を構成する材料からなるシートの表面に不規則な凹凸形状（梨地形状）をサンドブラストにより形成し、当該シートを回転可能な加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルム部を搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたシートの表面の凹凸形状をフィルム部の内表面に熱転写させる。即ち、適度に溶かされたシートの表面の凹凸形状の頂部の材料をフィルム部の内表面に付着させる。これにより、フィルム部の内表面に微細突起が不規則に形成される。
【００５６】
微細突起を非自己支持型の容器のフィルム部の内表面に不規則に形成する方法の別例を説明する。まず、表面に不規則な凹凸形状を有する紙（例えば上質紙）を回転可能な加熱ロールの表面に巻き付ける。そして、互いに逆向きに回転する加熱ロールと圧ロールとの間を通るようにフィルム部を搬送させながら、加熱ロールと圧ロールとを所定の圧力で接近させ、適度に溶かされたフィルム部の内表面に紙の表面の凹凸形状を転写（賦形）させる。これにより、フィルム部の内表面に微細突起が不規則に形成される。ここで、紙の代わりに、分散メッキ若しくはサンドブラストにより表面に不規則な凹凸形状が形成された金属シート、又はサンドブラストにより表面に不規則な凹凸形状が形成された合成樹脂シートを用いてもよい。
【００５７】
微細突起を自己支持型の容器の内表面に形成する方法の一例を説明する。微細突起は、例えば、切削加工、サンドブラスト、又は分散メッキにより表面に凹凸形状が形成された金型を用いて射出成形により形成することができる。また、容器の内表面を切削加工又はエッチングすることにより微細突起を直接形成することもできる。
【００５８】
図６に示すように、微細突起１の配置ピッチが６０ｎｍ以上且つ細胞４の平均径以下であることで、細胞４が微細突起１の頂部にのみ接触し、微細突起１の側面には接触しにくくなる。これにより、細胞４の足場が小さくなり、細胞４の接着が抑制される。
【００５９】
一方、図７（ａ）に示す比較例のように、微細突起５の配置ピッチが細胞４の平均径より大きい場合、細胞４が微細突起５の側面に接触し、側面を足場として細胞４の接着が生じる可能性がある。
【００６０】
また、図７（ｂ）に示す比較例のように、微細突起５の配置ピッチが６０ｎｍ以下である場合、微細突起５が細胞にとって平面として認識され、細胞の非接着性が得られないことが報告されている（非特許文献１）。但し、非特許文献１は、微細突起により細胞の非接着性が得られることを確認するに留まっており、細胞含有保存液が充填された容器に応用することまでは記載も示唆もされていない。
【００６１】
また、図７（ｃ）に示す比較例のように、微細突起５の高さが、細胞４の平均径×１／２未満の場合、たとえ微細突起５の配置ピッチが細胞４の平均径以下であっても、細胞４が微細突起５の側面に接触し、側面を足場として細胞４の接着が生じる可能性がある。従って、微細突起の高さを細胞の平均径×１／２以上とすることで、細胞に対する非接着性を一層確実に保証している。
【００６２】
また、経験則上、図７（ｄ）に示す比較例のように、微細突起５の頂部の短辺の長さが細胞４の平均径×１／４０より大きい場合、細胞４が微細突起５の頂部を足場として利用して接着する可能性がある。非特許文献２には、２５０ｎｍより大きい幅の微細突起には細胞が吸着できるが、２５０ｎｍ以下の幅の微細突起には細胞が吸着できないことが記載されている。２５０ｎｍという値を、最も小さい平均径１０μｍの細胞に換算すると、細胞の平均径×１／４０という値になる。
【００６３】
従って、微細突起の頂部の短辺の長さを細胞の平均径×１／４０以下とすることで、細胞に対する非接着性を一層確実に保証している。ここで、微細突起の頂部の短辺の長さが細胞の平均径×１／４０以下であれば、頂部の平面形状は特に限定されない。例えば、図５（ａ）に示すように正方形であって、その１辺が細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。また、図５（ｂ）に示すように円形であって、その直径が細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。また、図５（ｃ）に示すように円形部分の上端及び下端にそれぞれ四角形部分が接続された形状であって、短手方向（左右方向）の長さが細胞の平均径×１／４０以下となっていてもよい。
【００６４】
微細突起間の隙間には、空気が存在することが好ましい。この場合、微細突起間の隙間に細胞が入り込むことが空気により妨げられ、細胞に対する非接着性が一層向上する。
【００６５】
＜容器材料＞
容器の材料（容器が多層から構成される場合には内層の材料）は、容器の内表面を構成する材料の屈折率として上記した範囲（例えば１．３０以上１．４０以下）、及び容器の内表面を通って容器を通過する光の透過率として上記した範囲（例えば５５％以上）を満たすものであれば特に限定されない。一般的に知られている樹脂材料は１．３以上１．８以下の屈折率を有するが、フッ素系樹脂はその中でも低い屈折率を有する傾向にある。また、フッ素系樹脂は高い光透過率を有する傾向にある。従って、フッ素系樹脂を容器の材料として使用することが好ましい。
【００６６】
容器の材料として、例えば、エチレン−パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＥＦＥＰ）、パーフルオロエチレンプロペンコポリマー（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、エチレン−テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）等が挙げられる。
【００６７】
＜細胞含有保存液＞
凍結保存する細胞の種類は特に限定されないが、例えば、癌細胞（例えば、肝癌細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞）、肝細胞、クッパー細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞、角膜内皮細胞）、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮細胞（例えば、表皮角化細胞）、上皮細胞（例えば、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞）、乳腺細胞、ペリサイト、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、心筋細胞）、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、神経細胞（例えば、末梢神経細胞、視神経細胞）、軟骨細胞、骨細胞、卵細胞、受精卵、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等が挙げられる。また、凍結保存する細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞、再生医療用細胞等であってもよい。凍結保存する細胞は、１種のみでもよいし、２種以上の組み合わせでもよい。
【００６８】
卵細胞は、未受精の卵細胞を指し、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えてゆき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。
【００６９】
受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚等の初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。
【００７０】
ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞を指す。
ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞を指す。
【００７１】
即ち、一実施形態では、細胞は、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含する。
【００７２】
凍結保存容器は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の凍結保存に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物を指し、例えば、ヒト及びサル等の霊長類、マウス、ラット及びウサギ等の齧歯類、イヌ及びネコ等の愛玩動物、並びにウシ、ウマ及びブタ等の家畜が挙げられる。
【００７３】
細胞を凍結保存するための保存液は、容器の内表面を構成する材料の屈折率と一致又は近似した屈折率を有することが好ましい。具体的には、保存液の屈折率は、好ましくは１．３０以上１．４０以下であり、より好ましくは１．３０以上１．３９以下であり、更に好ましくは１．３１以上１．３８以下であり、特に好ましくは１．３２以上１．３７以下であり、最も好ましくは１．３３以上１．３６以下である。保存液としては、例えば、水、水とＤＭＳＯとの混合液が挙げられる。水とＤＭＳＯとの混合液を使用する場合、ＤＭＳＯの濃度は、通常最大で２０％であり、好ましくは３％以上１５％以下であり、より好ましくは５％以上１０％以下である。上記範囲の屈折率を有する保存液であれば、水及び水とＤＭＳＯとの混合液以外の保存液を使用してもよい。
【符号の説明】
【００７４】
１・・微細突起
２・・微細突起底部
３・・微細突起頂部
４・・細胞
１０，２０・・容器
１１・・容器底部
１２・・開口部
１３・・側壁部
２１・・第１フィルム部
２２・・第２フィルム部
２３・・底辺封止部
２４・・開口部
２５・・第１側辺封止部
２６・・第２側辺封止部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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