(57)【要約】      （修正有）【課題】観察する一定範囲内に細胞を留めながら、細胞を自由に鉛直方向沿いに回転させることができる、細胞回転方法及び装置と細胞観察方法及び装置の提供。【解決手段】開放された上面１ａと、凹部３を有する下面１ｂとを備える容器１内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、凹部は、側面３ｃ，３ｄと、側面で囲まれるとともに容器の下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口２を有する下面３ｂとを有する容器を準備し、容器に、細胞を含む第１の液体を導入するとき、容器内に保持された第１の液体の液面までの距離と凹部の側面の高さとが所定の関係を満たすように第１の液体を容器に導入し、凹部内に、液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、容器内の第１の液体中で細胞を鉛直方向沿いに回転させる、細胞回転方法。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ａ）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有し、かつ、前記凹部を前記容器の前記上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下である前記容器を準備し、
（ｂ）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）前記凹部内に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
細胞回転方法。
【請求項２】
前記（ｃ）の工程において、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入するとき、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置された前記液体吹出し口から前記第２の液体を導入することにより、前記凹部内の前記第１の液体中に鉛直方向沿いの旋回流を発生させて、前記容器内で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
請求項１に記載の細胞回転方法。
【請求項３】
前記（ｃ）の工程において、前記凹部の前記長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の前記長さの方向沿いの一方の側面ら（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲で他方の側面側に離れて配置された状態で、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入する、
請求項２に記載の細胞回転方法。
【請求項４】
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項５】
前記（ｃ）の工程において、前記第２の液体を前記凹部内に導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が、前記容器の側面の外側に接するように配置されたオーバーフロー部に導入されて、前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記距離Ｈで維持される、
請求項１〜４のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項６】
前記（ｂ）の工程と前記（ｃ）の工程との間に、
（ｄ）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置する工程をさらに備える、
請求項１〜５のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項７】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ｂ１）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有し、かつ、前記凹部を前記容器の前記上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下である前記容器を準備し、
（ｂ２）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｂ３）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置し、
（ｂ４）前記凹部内に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させ、
（ｂ５）前記液体吹出し口からの前記第２の液体の導入を停止することにより、前記細胞を前記凹部の前記下面の上に移動させ、
（ｂ６）前記カバーの上方に配置された光源により前記細胞を照明し、前記凹部の前記下面に配置されたイメージセンサにより前記凹部の前記下面に位置する前記細胞を観察する、
細胞観察方法。
【請求項８】
側面と、液体が導入される液体吹出し口を有する下面とを有する凹部を備えて、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入して、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプとを備え、
前記容器は、
前記凹部を上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下であって、
前記凹部の前記下面から前記容器に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たす、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞回転装置。
【請求項９】
前記容器の前記液体吹出し口は、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置される、
請求項８に記載の細胞回転装置。
【請求項１０】
前記凹部の長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の前記側面の端から（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲に配置される、
請求項８又は９に記載の細胞回転装置。
【請求項１１】
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
請求項８〜１０のいずれか１つに記載の細胞回転装置。
【請求項１２】
前記容器の前記側面の外側に接するように配置されて、前記第２の液体を導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の内部の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が排出されるオーバーフロー部をさらに備えて、
前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記Ｈで維持される、
請求項８〜１０のいずれか１つに記載の細胞回転装置。
【請求項１３】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備えるとともに、前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに容器下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有して、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプと、
液面であり、かつ、前記上面から見たとき前記凹部と重なる位置に配置されて、透光性を有するカバーと、
前記容器の、前記凹部の下面に接するように配置されて前記細胞を観察するイメージセンサと、を備え、
前記容器は、
前記凹部を上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下であって、
前記凹部の前記下面から前記容器における前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に保持可能である、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を容器の培養液内で動かすのに必要な培養液又は培養液と同等の浸透圧濃度を有する生理食塩水などの溶液を微小穴から吹出す微小水流操作法を用いた、細胞回転方法、細胞観察方法、細胞回転装置、及び細胞観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞観察は、容器内にある細胞のうちから特定の細胞を抽出し、その細胞を一方向から観察するが、殆どの場合は細胞の向きを故意に変えることはない。しかし、細胞の任意の場所を観察しようとすると、細胞の向きを変える必要がある。細胞は生きた状態で観察する必要があるので、細胞は容器内に培養液と一緒に入れられている。
【０００３】
細胞を培養液内で動かす従来の操作法は、ニードルを用いる方法であり、ニードルが細胞に直接触れるため、細胞に刺激を与えることになる。この方法は、細胞に対して侵襲性があり、細胞が本来の働き又は動作をしない可能性が生じる。そこで、細胞に直接触れないで細胞を操作する方法が望まれている。細胞に非接触で力を及ぼす方法としては、光又は電気又は超音波を利用する方法もあるが、これらは自然状態との違いが大きいので、細胞に与える悪影響が不確かである（例えば、非特許文献１〜３）。その他の方法では、一般の細胞の周囲にも体液又は培養液などの液体があることから、流体力を利用する方法が、自然との違いが少ないので、最も侵襲性が小さいと著者らは推察した（例えば、非特許文献４）。
【０００４】
細胞を取り扱う容器としては、深さが浅い領域と深さが深い領域とを有して培養液を流し、深い領域に細胞を留めることが開示されている。また、細胞が褥瘡を起こさないように培養液で転がして移動させることが開示されている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５３３２２１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】K. C. Neuman and S. M. Block, "Optical trapping," Review of Scientific Instruments, Vol.75,pp.2787-2809,2004.
【非特許文献２】P. Y. Chiou, A. T. Ohta, and M. C. Wu, "Massively Parallel Manipulation of Single Cells and Micro particles Using Optical Images," Nature, Vol.436, pp370-372, 2005.
【非特許文献３】H. M. Hertz, "Standingwave acoustic trap for nonintrusive positioning of micro particles," J. of Applied Physics, Vol.78, pp.4845-4849, 1995.
【非特許文献４】Y. Yalikun, Y. Akiyama and K. Morishima, "Multiple Microfluidic Stream based Manipulation for Single Cell Handling," International Conference on Intelligent Robots and Systems, pp.508-513, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の流体力を用いる細胞の操作方法では、細胞を水平方向で平行又は回転などの移動をさせることはできる。しかしながら、細胞の任意の場所を観察するためには、現状観察している面と反対側の面も観察できる必要がある。観察は、鉛直方向に沿った上下方向の一方からなされるため、細胞を鉛直方向沿いに回転させる必要がある。
従来方法では、細胞を自由に鉛直方向沿いに安定に回転させることが難しいという課題があった。
【０００８】
また、一つの細胞を観察し続けるには、一定の範囲内に細胞が留まっている必要がある。しかしながら、特に細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合には、細胞が軽いので、少しの力で細胞が移動してしまう。そこで、細胞を動かして、かつ、一定の範囲内に留めるという課題があった。
【０００９】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、観察する一定範囲内に細胞を留めながら、細胞を自由に鉛直方向沿いに回転させることができる、細胞回転方法、細胞観察方法、細胞回転装置、及び細胞観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本開示の細胞回転方法は、
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ａ）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有し、かつ、前記凹部を前記容器の前記上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下である前記容器を準備し、
（ｂ）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）前記凹部内に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、例えば細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器の側面と下面とで囲まれた凹部内に細胞を留めながら、下面の液体吹出し口から第２液体を導入することにより、細胞を容器の第１の液体内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明の実施形態１を示す細胞回転装置の容器の立体斜視図
【図１Ｂ】図１Ａに示したＸ面における細胞回転装置の容器の断面図
【図１Ｃ】図１Ａに示したＹ面における細胞回転装置の容器の断面図
【図２】直径１６ｍｍの容器の真ん中下面にある直径０．１ｍｍの穴から１５０ｍｍ／ｓの速度で溶液が吹出す場合の溶液深さ２ｍｍで上面が開放された系で数値解析した容器中心軸を通る中央断面での流線分布図
【図３Ａ】観察領域に透明カバーを設けた細胞回転装置の容器の断面図
【図３Ｂ】細胞回転装置の容器の凹部の下面を示す平面図
【図４】数値解析領域を示した細胞回転装置の容器の断面図
【図５】本発明の実施形態１の細胞回転装置の容器内の中心を通るＹ面で数値解析した流線分布図
【図６】細胞の直径が１００μｍの場合の細胞が鉛直方向沿いに回転する２段構造の範囲を示した図
【図７】細胞の直径が２００μｍの場合の細胞が鉛直方向沿いに回転する２段構造の範囲を示した図
【図８】細胞の直径が３００μｍの場合の細胞が鉛直方向沿いに回転する２段構造の範囲を示した図
【図９】細胞の直径が４００μｍの場合の細胞が鉛直方向沿いに回転する２段構造の範囲を示した図
【図１０】吹出し口からの流速と吹出し口中心から細胞が回転する中心位置まで距離との関係を示した図
【図１１】イメージセンサ搭載とオーバーフロー部を示した、本発明の実施形態１の変形例にかかる細胞回転装置の容器の断面図
【図１２】本発明の実施形態２の細胞回転装置の容器の立体斜視図
【図１３】オーバーフロー部が両側にある場合の本発明の実施形態２の細胞回転装置の容器の立体図
【図１４Ａ】吹出し口が１箇所の場合の細胞導入導出口も示した本発明の実施形態１，２の変形例の細胞回転装置の容器の平面図
【図１４Ｂ】吹出し口が４箇所の場合の細胞導入導出口も示した本発明の実施形態１，２の変形例の細胞回転装置の容器の平面図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明にかかる実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
【００１４】
以下、図面を参照して本発明における実施形態を詳細に説明する前に、本発明の種々の態様について説明する。
【００１５】
本開示の第１の態様によれば、
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ａ）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有し、かつ、前記凹部を前記容器の前記上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下である前記容器を準備し、
（ｂ）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）前記凹部内に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
細胞回転方法を提供する。
【００１６】
前記態様によれば、例えば細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器の側面と下面とで囲まれた凹部内に細胞を留めながら、下面の液体吹出し口から第２液体を導入することにより、細胞を容器の第１の液体内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができる。
【００１７】
本開示の第２の態様によれば、
前記（ｃ）の工程において、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入するとき、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置された前記液体吹出し口から前記第２の液体を導入することにより、前記凹部内の前記第１の液体中に鉛直方向沿いの旋回流を発生させて、前記容器内で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
第１の態様に記載の細胞回転方法を提供する。
【００１８】
前記態様によれば、前記液体吹出し口に近い前記凹部の側面側の旋回流は抑制され、前記凹部の中央側を中心とする旋回流が形成される。そこで、旋回流が安定する。また、細胞回転時に、細胞に対して侵襲性がなく、細胞が本来の働き又は動作をすることができる。
【００１９】
本開示の第３の態様によれば、
前記（ｃ）の工程において、前記凹部の前記長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の前記長さの方向沿いの一方の側面ら（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲で他方の側面側に離れて配置された状態で、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入する、
第２の態様に記載の細胞回転方法を提供する。
【００２０】
前記態様によれば、前記凹部を上面から見た場合に前記細胞が前記凹部の中央近傍で回転することになり、前記細胞が限定された位置に保持されることになる。このため、前記細胞の特定がしやすい。また、イメージセンサを使用して観察する場合には、前記イメージセンサが前記凹部の底面の中央近傍にあれば、前記液体吹出し口と干渉せずに観察ができる。
【００２１】
本開示の第４の態様によれば、
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
第１〜３の態様のいずれか１つに記載の細胞回転方法を提供する。
【００２２】
前記態様によれば、前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液であるため、前記細胞は生存し続けて成長できるとともに、侵襲性がない。
【００２３】
本開示の第５の態様によれば、
前記（ｃ）の工程において、前記第２の液体を前記凹部内に導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が、前記容器の側面の外側に接するように配置されたオーバーフロー部に導入されて、前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記距離Ｈで維持される、
第１〜４の態様のいずれか１つに記載の細胞回転方法を提供する。
【００２４】
前記態様によれば、オーバーフロー部により液面は前記距離Ｈで維持されるので、液体の液面の高さが一定となり、前記容器内の液体の圧力が変わらず、前記細胞が回転する状態を常に再現することができる。
【００２５】
本開示の第６の態様によれば、
前記（ｂ）の工程と前記（ｃ）の工程との間に、
（ｄ）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置する工程をさらに備える、
第１〜５の態様のいずれか１つに記載の細胞回転方法を提供する。
【００２６】
前記態様によれば、前記液面表面にできる波による前記照射光の反射又は散乱の影響をカバーにより除去できる。
【００２７】
本開示の第７の態様によれば、
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ｂ１）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有し、かつ、前記凹部を前記容器の前記上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下である前記容器を準備し、
（ｂ２）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｂ３）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置し、
（ｂ４）前記凹部内に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させ、
（ｂ５）前記液体吹出し口からの前記第２の液体の導入を停止することにより、前記細胞を前記凹部の前記下面の上に移動させ、
（ｂ６）前記カバーの上方に配置された光源により前記細胞を照明し、前記凹部の前記下面に配置されたイメージセンサにより前記凹部の前記下面に位置する前記細胞を観察する、
細胞観察方法を提供する。
【００２８】
前記態様によれば、例えば細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器の側面と下面とで囲まれた凹部内に細胞を留めながら、下面の液体吹出し口から第２液体を導入することにより、細胞を容器の第１の液体内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができるので、細胞の任意の面を観察できる。また、前記イメージセンサで直接に前記細胞を観察するので、顕微鏡の場合のようにレンズ等の光学系が不要である。
【００２９】
本開示の第８の態様によれば、
側面と、液体が導入される液体吹出し口を有する下面とを有する凹部を備えて、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入して、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプとを備え、
前記容器は、
前記凹部を上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下であって、
前記凹部の前記下面から前記容器に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たす、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞回転装置を提供する。
【００３０】
前記態様によれば、例えば細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器の側面と下面とで囲まれた凹部内に細胞を留めながら、下面の液体吹出し口から第２液体を導入することにより、細胞を容器の第１の液体内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができる。
【００３１】
本開示の第９の態様によれば、
前記容器の前記液体吹出し口は、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置される、
第８の態様に記載の細胞回転装置を提供する。
【００３２】
前記態様によれば、前記液体吹出し口に近い前記凹部の側面側の旋回流は抑制され、前記凹部の中央側を中心とする旋回流が形成される。そこで、安定した旋回流が得られる。
【００３３】
本開示の第１０の態様によれば、
前記凹部の長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の側面の端から（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲に配置される、
第８又は９の態様に記載の細胞回転装置を提供する。
【００３４】
前記態様によれば、前記凹部を上面から見た場合に前記細胞が前記凹部の中央近傍で回転することになり、前記細胞が限定された位置に保持されることになる。このため、前記細胞の特定がしやすい。
【００３５】
本開示の第１１の態様によれば、
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
第８〜１０の態様のいずれか１つに記載の細胞回転装置を提供する。
【００３６】
前記態様によれば、前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液であるため、前記細胞は生存し続けて成長できるとともに、侵襲性がない。
【００３７】
本開示の第１２の態様によれば、
前記容器の前記側面の外側に接するように配置されて、前記第２の液体を導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の内部の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が排出されるオーバーフロー部をさらに備えて、
前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記Ｈで維持される、
第８〜１０の態様のいずれか１つに記載の細胞回転装置を提供する。
【００３８】
前記態様によれば、オーバーフロー部により液面は前記距離Ｈで維持されるので、液体の液面の高さが一定となり、前記容器内の液体の圧力が変わらず、前記細胞が回転する状態を常に再現することができる。
【００３９】
本開示の第１３の態様によれば、
開放された上面と、凹部を有する下面とを備えるとともに、前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに容器下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有して、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に、前記液体吹出し口から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の液体を導入することにより、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプと、
液面であり、かつ、前記上面から見たとき前記凹部と重なる位置に配置されて、透光性を有するカバーと、
前記容器の、前記凹部の下面に接するように配置されて前記細胞を観察するイメージセンサと、を備え、
前記容器は、
前記凹部を上面から見たとき、前記凹部の長さは２ｍｍ以上６ｍｍ以下であって、
前記凹部の前記下面から前記容器における前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に保持可能である、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞観察装置を提供する。
【００４０】
前記態様によれば、例えば細胞の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器の側面と下面とで囲まれた凹部内に細胞を留めながら、下面の液体吹出し口から第２液体を導入することにより、細胞を容器の第１の液体内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができるので、細胞の任意の面を観察できる。
【００４１】
以下、図面を参照して本発明における第１実施形態を詳細に説明する。
【００４２】
（発明を創作するに至った知見）
流体力を用いる細胞の操作方法のうち、非特許文献４に記載されている微小水流操作法は、微小穴から溶液、例えば、水を吹出したり吸引したりして、吹出し穴から吸込み穴へ流れる微小水流を発生させて、この水流を主に細胞に当てて細胞を移動させるものである。細胞の重心に水流が当たれば、細胞はそのままの向きで移動するし、細胞の重心から外れて水流が細胞に当たれば、細胞は少し向きを変えながら移動する。しかし、細胞を移動させるには、細胞の重心近くに力が作用する必要があるため、細胞の向きを制御することは困難である。
【００４３】
一方、細胞の任意の位置を観察するためには、細胞を上から下へ又は下から上への一方向から観察するので、鉛直方向沿いに細胞を回転させなければならない。先の微小水流を細胞の重心から大きくずらして細胞に当てれば、細胞は回転するが、細胞はその下面を容器の下面に接触させた状態であるため、細胞は、細胞の上下面は変わらないままの水平方向沿いの回転に留まる。
【００４４】
したがって、鉛直方向沿いに細胞を安定に回転させるには、溶液を微小穴から細胞に直接当てるだけでは不十分で、溶液を微小穴から鉛直方向の上方から下方若しくは下方から上方に吹出して旋回流を発生させ、その旋回流に細胞を巻き込んで、細胞に回転する力を継続して与える必要がある。
【００４５】
特許文献１に記載されているように、細胞を転がせば、細胞の上下面は変えられる。しかし、細胞の観察面を変える度に細胞を転がす必要があり、細胞に与える刺激が強く、侵襲性を低くすることができない。
【００４６】
微小穴から溶液の吹出しが無い状態では、細胞は自重によって容器の下面と接しているので、細胞を鉛直方向沿いに回転させるためには、まず、細胞を容器の下面から浮上させる必要がある。
【００４７】
そこで、まず、微小穴が容器の上面に配置されて容器内で溶液を下方へ吹出す場合と、微小穴が容器の下面に配置されて容器内で溶液を上方へ吹出す場合とについて、どちらの方が細胞が容器の下面から浮上しやすいかを調べる検討を行った。一例として、容器の高さは３ｍｍで、微小穴の穴径は０．１ｍｍ、微小穴からの吹出し速度は１００ｍｍ／ｓ、２００ｍｍ／ｓ、３００ｍｍ／ｓとした。細胞の大きさは、一例として、直径４００μｍで行った。
【００４８】
旋回流の発生の様子を調べると、微小穴が容器の上面に配置されて溶液を上方から下方へ吹出す場合は、容器の底に位置している細胞に水流が当たる前に、水流が減速されて弱くなり、細胞は横回転しかしなかった。一方、微小穴が容器の下面に配置されて溶液を下方から上方へ吹出す場合は、細胞に当たる水流が強く、細胞は鉛直方向沿いに回転することが確認できた。したがって、微小穴は容器の下面に配置されて溶液の吹出し方向は下方から上方の方が良いことがわかった。そこで、以後の検討での溶液の吹出し方向は、下方から上方で行うことにした。
【００４９】
また、細胞の観察には照明光が必要である。微小穴があっても、細胞が透明物体であれば光は細胞を透過するが、細胞を透過するうちに細胞の物体内で光が干渉し、細胞を観察した像が不鮮明になる可能性がある。そこで、照明光は、微小穴が無い側、すなわち、上方から下方に照射することにする。
【００５０】
次に、容器の上面全体が開放された系で、容器内で溶液を鉛直方向の下方から上方に吹出す場合の旋回流の状態を調べた。一例として、溶液吹出しの微小穴は直径０．１ｍｍで直径φ１６ｍｍの容器の真ん中にあり、水深は１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍとした。吹出し速度の例は１５０ｍｍ／ｓとした。
【００５１】
一例として、水深が２ｍｍの場合のシミュレーション結果を図２に示す。高さ方向は拡大している。ここで、図２の中央断面にある線は、流線を示していて、中央旋回流２１０と周囲旋回流２１１との存在がわかる。
【００５２】
この場合に、旋回流は吹出し口２０２近傍の中央旋回流２１０だけでなく、この中央旋回流２１０の外側に先の中央旋回流２１０とは反対側の向きで容器２０１の外周壁２０１ａまで達する、ゆったりした流れの周囲旋回流２１１が生じることがわかった。吹出し口側の中央旋回流２１０は、検討した範囲では、吹出し口２０２の中心から半径１．５〜３．０ｍｍの範囲で発生することがわかった。
【００５３】
吹出し口２０２が容器２０１の真ん中にある場合には、中央旋回流２１０が吹出し口２０２の周りに軸対称に生じて、向きが軸周りの３６０ｄｅｇの全方向にあることがわかった。しかし、細胞を観察するには、細胞の回転する向きが一定であることが望ましい。また、内側の中央旋回流２１０が生じることで、付随的に生じる外側の周囲旋回流２１１があると、その外側の周囲旋回流２１１内に細胞が入ると中央旋回流２１０の外側に放り出されたままで、一定の場所では回転しなくなる。そこで、細胞を鉛直方向沿いに回転させるのは、内側の中央旋回流２１０だけに制限する必要がある。
【００５４】
（実施形態１）
本発明者は、前記知見に基づき、旋回流の生じる方向を制御するため、細胞を入れる容器の形状及び構造を工夫して、工夫した形状及び構造で、内側の中央旋回流８だけを発生させるように制限して、細胞を鉛直方向沿いに回転させることを創作するに至った。
【００５５】
実施形態１にかかる細胞回転方法を実施可能な細胞回転装置は、容器１と、ポンプ３２とを備えている。
【００５６】
容器１の構造を図１Ａ〜図１Ｃに示す。図１Ａは斜視図であり、図１Ｂ及び図１Ｃは後述するように容器１の幅方向と長手方向とのそれぞれの縦断面の端面図である。
【００５７】
容器１は、少なくとも、開放された上面１ａと、例えば直方体形状の凹部３を長手方向の中間部（例えば中央）に有する下面１ｂとを備えており、液体の一例である溶液が容器１内に保持されて満たされている。ここで溶液とは、一例として、細胞を容器１中の培養液内で動かすために必要な培養液、又は、培養液と同等の浸透圧濃度を有する生理食塩水などを指す。凹部３を含む容器１内に予め保持して満たしておく溶液を、第１の液体又は溶液と称し、後述するように凹部３の下面３ｂの溶液吹出し口２から導入する溶液を、第２の液体又は溶液と称する。細胞は、容器１の凹部３内の第１の溶液中に予め配置されている。細胞は、容器１の上方から凹部３内に配置されたり、溶液吹出し口２から第２の溶液とともに凹部３内に配置されたりすることができる。凹部３は、正方形などの矩形の直方体に限らず、円柱形でもよい。
【００５８】
より具体的には、一例として、容器１は、鉛直方向沿いに立設された一対の長方形板状の側壁１ｄが長手方向沿いに互いに平行にかつ対向して配置された長方形の箱体形状である。箱体形状の長方形の上面１ａは開放されており、長方形の下面１ｂの長手方向の中央に、鉛直方向の下方にくぼんだ四角形の凹部３を有する。凹部３は、四角形（例えば正方形）の下面３ｂと、一対の長方形板状の側壁１ｄの一部である一対の第１側面３ｄと、第１側面３ｄと直交して幅方向沿いにかつ鉛直方向沿いに立設された一対の第２側面３ｃとで構成された直方体形状の凹部である。凹部３は、一対の側壁１ｄ間の幅寸法Ｗと同じ幅寸法Ｗを有している。
【００５９】
図１Ａに示すＸ面とＹ面とは、容器１の中心軸３３を通り、かつ、直交する２方向で構成され、かつ、容器１の一対の壁１ｄに対して、一方のＹ面は平行で、他方のＸ面は直交している。Ｘ面は、一対の壁１ｄ間での擬似２次元流れの幅方向を示しており、このＸ面上の容器１の断面の端面図を、図１Ｂに示している。両側の壁１ｄは下面３ｂから上面１ａまである。一方、Ｙ面は、容器１の長手方向沿いの面であって、擬似２次元流れの流れる方向を示しており、このＹ面上の容器１の断面の端面図を、凹部付近のみ図１Ｃに示している。
【００６０】
溶液吹出し口２は、下面１ｂの幅Ｗ方向の中央でかつ凹部３の下面３ｂの長手方向の真ん中から一方の第２側面３ｃ側にずれた非対称な位置に設けられて、第２の溶液を凹部３内に吹き出す。溶液吹出し口２は、例えばポンプ３２に接続されて、ポンプ３２の駆動により、第２の溶液を溶液吹出し口２を通して凹部３内に吹き出す。なお、必要に応じて、ポンプ３２に、第２の溶液を供給するタンク３４（図１Ｂ参照）を接続していてもよい。
【００６１】
また、凹部３の長手方向（すなわち、Ｙ面沿いの方向）の寸法Ｌ１を、容器１の長手方向の寸法すなわちＹ面沿いの凹部３の上方の容器１の擬似２次元流れの空間１１である上面側の長手方向の寸法Ｌ２より狭めるようにして、容器１の下面側に凹部３を有している。この凹部３は、観察対象の細胞が移動する範囲を制限して、細胞が観察できる範囲内に細胞を留める働きをするためのものである。言い換えれば、凹部３は、細胞が観察できる範囲内に配置されているので、細胞が凹部３内に位置すれば、細胞を確実に観察することができる。
【００６２】
このような凹部３を有する容器１の構造により、旋回流８は、平面的には凹部３内でかつ凹部３を構成する鉛直方向沿いの４つの側面３ｃ，３ｄと下面３ｂとで形成される凹部３の内部空間及び凹部３の上面より容器上面１ａまでの間の空間で形成され、吹出し口２を通る鉛直方向の軸を中心にかつＹ面に沿った方向で非対称に生じると考えた。
【００６３】
一例として、吹出し口２を直径０．１ｍｍとし、吹出し流速を１５０ｍｍ／ｓ、容器１の下面１ｂからの凹部３の高さ（深さ）ｈを、下面３ｂから液面（例えば、容器１の上面１ａ）までの高さＨの半分とする。さらに、凹部３の狭まった正方形の一辺の長さＬ１（＝幅Ｗ）に対して、吹出し口２に近い第２側面３ｃから吹出し口２の中心までの距離を長さ（Ｌ１）／４とする。このような条件下で、高さＨが１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍの３種類の容器に対して、安定な一方向の向きの旋回流８が発生するかを、長さＬ１との関係で調べた。その結果、長さＬ１が２〜６ｍｍの場合に、一方向の向きの旋回流８が安定に生じることが見出せた。
【００６４】
ここで、長さＬ１が２ｍｍより狭い場合には、吹出し口２から出た流れは、そのまま上に上がって容器内の第１の溶液の上面１ｂまで上昇して横に広がるか、さらに凹部３を出た後の広がった下面１ｂに当たるかして、旋回流が生じない。
【００６５】
一方、長さＬ１が６ｍｍより広い場合には、下面１ｂの凹部３がない場合の外側の付随的な旋回流が生じようとするので、安定な旋回流でなくなった。
【００６６】
以上の結果から、凹部３を長さＬ１を２〜６ｍｍに制限すると、思惑通りに、微小穴である吹出し口２からの第２の溶液の吹出しによって生じた旋回流８によって、まず、凹部３の下面３ｂに載置された細胞が旋回流８に巻き込まれて下面３ｂから浮上し、次に、凹部３内又は凹部３の上方付近で細胞が安定に回転し、細胞が凹部３の領域内に収まることを確認できた。
【００６７】
次に、図１Ｃに対して、図３Ａに示すように観察領域となる容器１の上面１ａのうち凹部３に相当する部分のみを覆う透明カバー４を設けるようにしてもよい。容器１の上面１ａの液面表面をすべて開放にすると、第１の液体の一例である溶液４１の液面４１ａに波が立って、観察のため光源３０から照射される照射光３１が反射又は散乱されて、細胞７が見にくくなる。そこで、波防止の観点から、液面である容器１の上面１ａを透明カバー４で覆うことにしたが、液面全体すなわち容器１の上面１ａ全体を覆った閉空間にすると、容器１内が溶液４１で満たされて溶液４１が動けなくなるので、第１の溶液４１が流れなくなり、旋回流も円滑に発生させることができない。そこで、図３Ｂに示す吹出し口２から容器１内に流入する第２の液体の一例である溶液４２の量だけ、容器１から排出する排出口を設けてみたが、吹出し口２と排出口の近傍以外は溶液の流れが著しく制限されてしまって旋回流が発生しないことがわかった。そこで、旋回流ができる流れの観点からは、容器１の上面１ａにカバーがないことが理想であるため、観察に必要な領域（言い換えれば、凹部３に相当する部分）以外の箇所はカバーで覆わないことにした。透明カバー４のある場合と透明カバー４のない場合とで旋回流の様子を直径１０μｍのガラスビーズを流して観察すると、差が見られないことがわかった。この結果、限られた狭い範囲の観察に必要な領域のみを、閉じた半閉空間とすることで、観察上の波の影響を取り除き、かつ、液面表面全体を開放したのと同等の旋回流が得られることがわかった。このように、容器１とポンプ３２とで構成する細胞回転装置に、少なくとも透明カバー４を備えれば、細胞観察装置を構成することができる。
【００６８】
なお、光源３０は、一例して、透明カバー４の上方に配置されて、透明カバー４を透過して凹部３の溶液内の細胞７を照射光３１で照明できるように配置されている。細胞観察装置としては、光源３０を備えることもできる。
【００６９】
このように容器下面１ｂに凹部３を有する２段構造の細胞観察容器１で細胞７が鉛直方向沿いに回転する条件を具体的に求めることにした。
【００７０】
実際の細胞の鉛直方向の回転の有無は、実際の細胞の回転確認とシミュレーション及び可視化から旋回流の回転中心周囲の細胞表面相当位置での流速測定によって導出した。
【００７１】
容器内で旋回流が生じても、必ずしも細胞が回転するわけではない。細胞が回転するためには、まず、細胞が凹部下面３ｂから浮遊する必要があるため、旋回流の回転中心周囲の細胞表面相当位置での流速を、シミュレーション実験と直径１０μｍのガラスビーズの可視化実験とを比較することで、シミュレーションの確からしさの検証を行った。
【００７２】
次に、細胞の回転の有無の境界で、シミュレーション実験による流速の結果を調べることで、細胞が回転する旋回流周囲の流速条件が導出される。しかし、細胞が実際に回転するかどうかは、境界位置では微妙である。そこで、この細胞が回転する流速条件を基に、まず、シミュレーションから細胞が回転する領域を求め、その境界に相当する場所から、細胞が実際に回転するかを調べ、細胞が回転する領域を特定した。
【００７３】
シミュレーションは、アンシス・ジャパン株式会社の「アンシス（ＡＮＳＹＳ）」の流体解析ソフトを使用して、非定常状態を時間ステップ０．００５ｓｅｃで１０００ステップで、メッシュは最小５μｍで行った。
【００７４】
容器１内にある細胞７には、主に、抗力、浮力、重力、及び、揚力が作用する。抗力は、細胞が流れの抵抗になっているために作用する力で、細胞の大きさ又は流速に依る。浮力は、細胞が細胞自体で排除している体積分を周りの溶液から受ける、上に持ち上げる力である。重力は、細胞の自重である。揚力は、細胞の周囲の流れの速度差によって生じる力で、流速に依る。抗力と揚力とは、細胞に作用する力で、ベクトルであり、共に流速に依る。浮力と重力とは、細胞と溶液とが決まれば、一定である。そこで、細胞が回転するかは、容器の形状による拘束があるので、どの形状が良いかは、実験で確認する必要があるが、容器１内の流速を調べると、細胞が回転するかしないかのおおよその範囲がわかるわけである。
【００７５】
シミュレーションでは、計算時間の短縮のため、容器１の凹部３近傍の観察領域は詳細に計算したが、観察領域から離れた凹部３の外側の部分は省略した計算を行った。
【００７６】
吹出し口２を凹部３の片側（図４の左側の第２側面３ｃ）に偏らせたのがわかる、Ｙ面断面図を、図４に示す。実際の構造は、図１Ｃのように透明カバー４の外側で上面開放であるが、シミュレーションでは、図４の破線部に開放面の境界５０があるとして計算を行った。すなわち、境界面（開放面）５０では静水圧がかかり、吹出し口２から流入した溶液４２の液量が、開放面５０からの流出した液量に等しいとした。
【００７７】
シミュレーション結果の一例を図５に示す。これは、凹部３の下面３ｂから液面（容器１の上面１ｂ）までの高さＨが２ｍｍ、凹部３の高さｈが１ｍｍの場合のＹ面での流線分布図である。容器１の中央側の渦周りの流線密度が高く、容器１内の流れはこの旋回流８が支配的であることがわかる。
【００７８】
図３Ａに示す、凹部３の高さをｈとし、凹部下面３ｂから液面（容器１の上面１ｂ）までの高さをＨとして、細胞７の直径が１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍの場合において、細胞７が鉛直方向沿いに回転するかを調べた。吹出し口２の穴径は０．１ｍｍ、吹出し流速は１５０ｍｍ／ｓ、凹部３の直交する２面の一辺の長さＷ，Ｌ１は共にＷ＝Ｌ１＝３ｍｍ、吹出し口２が偏った方向の第２側面３ｃからの距離は（Ｌ１）／４である。細胞７の比重は１．１である。これは人の胚細胞を想定している。
【００７９】
高さ比（ｈ／Ｈ）と高さＨとの関係に対して、細胞７の安定回転の有無の領域を調べた結果を、図６から図９に示す。「○」印が安定回転することを表し、「×」印が回転しないか回転しても不安定な回転の場合を表している。
【００８０】
図６が細胞径１００μｍの場合、図７が細胞径２００μｍの場合、図８が細胞径３００μｍの場合、図９が細胞径４００μｍの場合をそれぞれ示している。図中の線で囲まれた左側の領域は、細胞径が１００μｍの細胞が安定回転する領域を示している。
【００８１】
これらの図６〜図９から、細胞の大きさによらず、直径が１００μｍ〜４００μｍの細胞の全てで
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈの形状の容器１ならば、細胞７が鉛直方向沿いに安定に回転することがわかる。
【００８２】
これは、細胞７が容器１内で成長しても、同条件で継続して観察するが可能であることを示している。
【００８３】
細胞７が安定に回転した範囲を示す図を、詳細に見ることにする。高さ比（ｈ／Ｈ）が大きい領域では、細胞は安定に回転しない。この領域は、容器の周囲が囲まれる割合が多いところで、流れが拘束されるので、細胞の方向によって流速差が小さいことにより、揚力を得ることが難しいため、と考えられる。ここで、「容器の周囲が囲まれる」とは、凹部３の周辺の２方向は下から上まで壁１ｄ，３ｄであるため、凹部周辺の直交するもう２方向の壁３ｃの高さｈの、全体の溶液の凹部底面から液面までの高さＨに対する割合が高くなると、容器の周囲が壁で囲まれた状態になる、という意味である。また、「細胞の方向によって流速差が小さいことにより、揚力を得ることが難しい」とは、以下の意味である。まず、揚力を得るには、全体的に概して、細胞の下方で流速が遅くなり、細胞の上方で流速が速くなることで、細胞の上下で圧力差を生じさせる必要がある。この圧力差を生じさせて揚力を生じさせるのに必要な、細胞の上下での流速の差が、細胞の周りで生じることが難しいということを意味している。
【００８４】
高さ比（ｈ／Ｈ）が極端に小さい領域でも、細胞は安定に回転しない。ここでは、細胞径が小さい場合の方が、細胞径が大きい場合の方より、回転しない領域が広い。この領域は、容器の周囲が囲まれる割合が少ないところで、細胞が旋回せずに凹部３の周囲に放り出されやすくなり、安定な回転が難しくなる領域である。この傾向は、細胞径が小さく軽い細胞に顕著であるため、と考えられる。
【００８５】
凹部３の下面３ｂから液面４１ａまでの高さＨが高くなると、細胞７は安定に回転しない。高さＨが高くなるにつれて、吹出し口２からの溶液４２の液流の流速は容器１内の溶液４１に当たって減速する。液流は液面４１ａに当たって旋回して容器１の底に流れるが、高さＨが高過ぎると、細胞の方向によって流速が異なることにより生じる揚力が不足して、細胞浮遊ができなくなるためと考えられる。
【００８６】
吹出し口２からの流速と吹出し口２の中心から細胞が回転する中心位置までの距離との関係を、図１０に示す。吹出し口２の直径は０．１ｍｍで、高さ比（ｈ／Ｈ）＝１ｍｍ／２ｍｍである。凹部３の長さＬ１は３ｍｍで、吹出し口２は第２側面３ｃから（Ｌ１）／４だけ離れた位置である。吹出し口中心から細胞が回転する中心位置までの距離が４００μｍ以上になるのは、吹出し流速が１００ｍｍ／ｓ以上の場合である。一方、局所的な周内の流速変動を伴う旋回流において、φ１００μｍの細胞が安定な回転から外に放り出されないためには、実験の結果、吹出し流速は２００ｍｍ／ｓ以下の場合であった。したがって、直径φ１００μｍの細胞が安定して鉛直方向沿いに回転するには、吹出し流速は１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓ以下にする必要がある。
【００８７】
細胞観察が、イメージセンサ５を用いた直接撮影の場合は、顕微鏡によるレンズが不要というメリットがある。すなわち、細胞観察装置としては、細胞回転装置に透明カバー４及びイメージセンサ５を備えて構成するようにしてもよい。そのような細胞観察装置に光源３０をさらに備えてもよい。
【００８８】
図１１に一例を示す。擬似２次元流のＹ面断面図を示す。イメージセンサ５による撮影は、イメージセンサ５が鉛直方向の凹部３の下面３ｂに配置されて細胞７が接触して行うとともに、鉛直下面にある吹出し口２とイメージセンサ５とは離れた位置にあるので、吹出し口２中心から細胞７が回転する中心位置までの距離を大きくすることが望ましい。そこで、吹出し流速としては２００ｍｍ／ｓ近傍で、使用することになる。
【００８９】
吹出し口２の穴径は１００μｍが好ましい。吹出し口２の径は吹出す液流の量と流速に関係する。容器１は、例えばポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）などのプラスチックで形成するので、吹出し口２は後加工で形成する。少ない量で大きな流れを生じさせるには、吹出し口２の穴径は小さい方が良いが、加工性から穴径は１００μｍ以上が好ましい。吹出しによる流量は、吹き出し口２の面積に比例するため、穴径の２乗に比例する。また、吹出しによるエネルギーは、吹出しの流量と流速とに関係し、吹き出し口２の穴径の２乗と流速の２乗とに比例する。
【００９０】
そこで、穴径が小さいと、流速が同じでも吹出した溶液全体のエネルギーが小さいため、吹出した後に、周囲の溶液４１によって流れの勢いが減少される割合が増加する。
【００９１】
一方、穴径が大きいと、液量が同じでも流速が遅くなり、吹出す溶液全体のエネルギーが小さいので、同様に、吹出した後に、周囲の溶液４１によって流れの勢いが減少される割合が増加する。
【００９２】
流速が同じで穴径を大きくすると、吹出す溶液全体のエネルギーは大きくなる。しかし、取り扱う細胞が小さいので、穴径が大きいと、小さい細胞が旋回流の中で安定に回転せず、回転中心から外に放り出されることになる。
【００９３】
実施形態１で扱う細胞の大きさは例えば１００μｍ以上である。したがって、吹出し口２の穴径は１００μｍ近傍が好ましい。
【００９４】
吹出し口２の位置は、容器１の正方形の凹部３の一辺の長さをＬ１とすると、直交する壁に対して幅方向には真ん中の位置であり、長手方向には真ん中の位置から一方の第２側面３ｃ側にずれて設ける。これは、旋回流８が、容器１の凹部３の真ん中近傍で生じるようにして、観察する細胞７が観察領域である凹部３の中央近傍で安定に鉛直方向沿いに回転するようにして、細胞７の任意の場所を観察可能にするためである。
【００９５】
一方の第２側面３ｃ側にずらす方向の吹出し口２の中央と、吹出し口２に近い側（例えば図３Ａ及び図３Ｂの左側）の第２側面３ｃとの距離は、（Ｌ１）／５〜（Ｌ１）／３が好ましい（図３Ｂ参照）。
【００９６】
凹部３が正方形であることで、旋回流８は、一対の第１側面３ｄと一対の第２側面３ｃとで制限された状態で生じる。
【００９７】
具体的には、図１１に示すように、容器１の幅方向の一対の第１側面３ｄ間の中央に位置する側の壁面と直交する横方向（図１１の紙面貫通方向）を旋回流８の回転軸とし、一方の（図１１の左側の）第２側面３ｃにずらした方向の中央近傍で細胞７が旋回流８により回転するようにしている。旋回流は、吹出し口２の両側に発生するが、一方の（図１１の左側の）第２側面３ｃに近い側の旋回流は、一方の（図１１の左側の）第２側面３ｃの影響で反対側のように大きくは発達しない。そこで、細胞７は、中央側の大きい旋回流８の方に巻き込まれる。
【００９８】
凹部３の長さＬ１が２〜６ｍｍで、上面側では側面が近くにない開放に近い状態において、細胞７が凹部３の観察領域の中央近傍で安定して回転するのは、一方の（図１１の左側の）第２側面３ｃにずらした方向の吹出し口２の中央と、吹出し口２に近い側の一方の（図１１の左側の）第２側面３ｃとの距離が（Ｌ１）／５〜（Ｌ１）／３の場合であった。
【００９９】
このような構成にかかる実施形態１の細胞回転方法は、以下のような工程で実施することができる。
【０１００】
（ａ）まず、凹部３を有し、かつ、凹部３を容器１の上面から見たとき、凹部３の長さＬ１は２ｍｍ以上６ｍｍ以下である容器１を準備する。
【０１０１】
（ｂ）容器１に、細胞７を含む第１の溶液４１を導入するとき、凹部３の下面３ｂから容器１内に保持された第１の溶液４１の液面４１ａまでの距離をＨとし、凹部３の側面３ｃの高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように第１の溶液４１を容器１に導入する。
【０１０２】
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）細胞回転させるとき、凹部３内に、溶液吹出し口２から１００ｍｍ／ｓ以上２００ｍｍ／ｓの流速で、第２の溶液４２を導入することにより、凹部３内の第１の溶液４１中に鉛直方向沿いの旋回流８を発生させて、容器１内の第１の溶液４１中で細胞７を鉛直方向沿いに回転させる。
【０１０３】
なお、必要に応じて、（ｂ）の工程と（ｃ）の工程との間に、（ｄ）液面４１ａに接触し、かつ、上面１ａから見たとき凹部３を覆うように、透光性を有する透明カバー４を配置するようにしてもよい。
【０１０４】
細胞観察時には、さらに、工程（ａ）〜（ｄ）に相当する工程（ｂ１）〜（ｂ４）に加えて、（ｂ５）溶液吹出し口２からの第２の溶液４２の導入を停止することにより、細胞７を凹部３の下面３ｂの上に移動させる。
【０１０５】
次いで、（ｂ６）透明カバー４の上方に配置された光源３０により細胞７を照明し、凹部３の下面３ｂに配置されたイメージセンサ５により凹部３の下面３ｂに位置する細胞７を観察する。
【０１０６】
さらに、必要に応じて、例えば細胞７の異なる面を観察したいときなどには、前記工程（ｂ４），（ｂ５），（ｂ６）を繰り返せばよい。
【０１０７】
前記実施形態１によれば、容器１の側面３ｃ，３ｄと下面３ｂとで囲まれた凹部３内に細胞７を配置して観察する一定範囲内に細胞７を留めながら、下面３ｂの溶液吹出し口２から第２溶液４２を導入することにより、細胞７を容器１の第１の溶液４１内で自由に鉛直方向沿いに回転させることができる。よって、例えば細胞７の大きさが１００μｍ又は２００μｍと小さい場合であっても、容器１の凹部３の範囲内に細胞７を留めながら、細胞７を鉛直方向沿いに自由に回転させることができる。
【０１０８】
（実施形態１の変形例）
実施形態１では、容器１内に吹出し口２より第２の溶液４２を吹出すために導入する。そこで、容器１内から溶液４１又は４２を外に排出せずそのままにしていると、導入開始当初は、側壁１ｄの高さより十分に低い液位であっても、第２の溶液４２を導入するにつれて液位が徐々に上昇し、側壁１ｄの高さである最大高さまで容器１内の液位が上昇することになる。この場合、液位に応じて静水圧によって圧力が増すため、溶液４１中の細胞７の状態が変化する可能性がある。
【０１０９】
そこで、図１１に示すように、実施形態１の変形例では、一定の液位を保つため、一定の液位を超えると溶液４１，４２が溢れ出るオーバーフロー部６を設けるようにしてもよい。すなわち、容器１の長手方向の一端又は両端に又は周囲、例えば側壁１ｄよりも低いオーバーフロー壁１ｅを設けるとともに、オーバーフロー壁１ｅの外側に、オーバーフロー壁１ｅから外側にオーバーフローした溶液を回収する回収凹部６ａを設けている。言い換えれば、第２の溶液４２を容器１に導入することにより、第１の溶液４１及び第２の溶液４２の量が容器１の内部の容量を超えたとき、第１の溶液４１及び第２の溶液４２の少なくとも一方が回収凹部６ａ内に排出されて、容器１に貯留される第１の溶液４１及び第２の溶液４２の液面は一定に維持されることを意味している。この結果、第２の溶液４２を導入する前から液位をオーバーフロー壁１ｅの高さに保つようにすれば、第２の溶液４２を導入しても液位を常にオーバーフロー壁１ｅの高さに保つことができ、細胞７に対して静水圧による圧力は常に同じとなり、細胞７は同じ状態を保つことが可能になり、繰り返し、細胞７を安定に鉛直方向沿いに回転させることができる。
【０１１０】
（実施形態２）
今までに説明した実施形態１の細胞観察容器の立体斜視図は、図１Ａに示す形をしている。
【０１１１】
これに対して、実施形態２にかかる細胞観察容器の立体斜視図が図１２である。図１２では、凹部３の上面開放側を凹部３から外へ離れていくほど広げている。すなわち、容器１の一対の側壁１ｄを鉛直方向沿いの長方形板状の壁ではなく、凹部３の長手方向の両側それぞれにおいて、一対の端部側の側壁１ｆが端に向かうに従い、擬似２次元流れの空間１１が広がるように傾斜して配置されている。よって、平面的に見れば、凹部３を挟む側壁１ｄと、両端部の側の側壁１ｆとが台形を形成するように配置されている。
【０１１２】
容器１の主な流れとなる凹部３の下面３ｂから液面４１ａまでの流れは、図１Ａの場合と変わらない。しかし、図１２のような形状の方が、凹部３を越えて上面が開放されている領域に流れてくる溶液４１の通り道の断面積、言い換えれば、擬似２次元流れの空間１１が、凹部３から離れるほど広くなるので、容器１の外周端部での流れが緩やかになり、流れが安定する。
【０１１３】
（実施形態２の変形例）
また、実施形態２の変形例として、オーバーフロー部６が図１１では片側であったが、さらに、周囲に配置する場合を、図１３に示す。
【０１１４】
溶液が流れる方向で溶液かさが増した分だけ、オーバーフロー部６のオーバーフロー壁１ｅを越えて溶液が回収凹部６ａに流れ出るので、より流れが安定する。
【０１１５】
（実施形態１，２の変形例）
次に、実施形態１，２の変形例として、容器１内に対する細胞７の導入導出方法について説明する。
【０１１６】
細胞回転装置の容器１には、少なくとも、細胞７が直径１００μｍ〜４００μｍまでは培養し存在する。スポイド等を使用して細胞７を溶液とともに吸い込んで、容器１内に対する細胞７の導入又は導出を行っても良いが、本容器１を創作するに至った経緯の侵襲性の低減の観点からすると、例えば、細胞７の容器１内への導入及び導出は、容器１内の通路を第２の溶液４２と共に流れることとする。例えば直径４００μｍ以上の細胞７が容器１に対して導入及び導出できるためには、例えば、少なくとも直径６００μｍ以上の円形断面の通路を有する細胞導入導出口９を、図１４Ａに示すように、凹部３の下面３ｂに設ける。また、細胞導入導出口９へ導く通路において、流れの向きが変わる位置では、緩やかに徐々に曲がる必要があり、例えば、その曲率が穴の直径と同じくらいの曲がりとする。
【０１１７】
細胞導入導出口９の配置位置は、例えば、第１側面３ｄと第２側面３ｃとの接続部分である凹部３の端近傍とする。旋回流が無い状態では、細胞７は凹部３の下面３ｂに接して静止しているので、細胞７の導入又は導出では、細胞７のいる高さを変える必要がなく、細胞７を転がすだけで良い。また、細胞７を鉛直方向沿いに回転させる場合には、細胞７が凹部３の中央近傍に位置しているため、細胞７を導入又は導出する細胞導入導出口９が中央近傍に配置されていると、細胞７を回転させるために発生させる旋回流に悪影響を与えるが、端の方に配置されている場合では、悪影響はほとんどないためである。
【０１１８】
具体的に、図１４Ａ及び図１４Ｂに、容器１の凹部３の下面部分のみに対して、細胞の導入導出口９と吹出し口２との位置関係を示す。
【０１１９】
図１４Ａは、吹出し口２が１箇所に配置した場合であり、図１４Ｂは吹出し口２が対称な４箇所に配置した場合である。図１４Ｂのように、ポンプ３２を駆動して、複数の吹出し口２から第２溶液４２を、同時に、溶液吹出しと溶液吸引とを行うことによって、細胞７を水平方向で移動させることが可能になる。これは、例えば、１つの吹出し口２で溶液吹出しを行うと同時に、他の吹出し口２で溶液吸引を行うことにより、凹部３の下面３ｂ付近の溶液を強制的に移動させることを意味する。もちろん、吹出し口２の数は、１個から４個の間の任意の数でも構わない。
【０１２０】
細胞が生存するためには、容器１内に供給する第２の溶液は、培養液又は生理食塩水等の浸透圧が細胞の通常環境と同等であれば、常に同じものである必要は無い。そこで、第２の溶液としては、初期に容器１内に細胞を導入する際の溶液と、観察時に容器１内に導入する溶液とが異なっても構わない。
【０１２１】
なお、上記様々な実施形態又は変形例のうちの任意の実施形態又は変形例を適宜組み合わせることにより、それぞれの有する効果を奏するようにすることができる。また、実施形態同士の組み合わせ又は実施例同士の組み合わせ又は実施形態と実施例との組み合わせが可能であると共に、異なる実施形態又は実施例の中の特徴同士の組み合わせも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本開示にかかる細胞回転方法、細胞観察方法、細胞回転装置、及び細胞観察装置は、観察する一定範囲内に細胞を留めながら、細胞を自由に鉛直方向沿いに回転させることができて、例えば細胞が分裂成長しても継続して観察が可能である。そこで、本開示は、例えば不妊治療としての人の健康な卵子の選別だけでなく、家畜又は魚の養殖用の卵子の選別等の用途にも有効である。
【符号の説明】
【０１２３】
１  細胞観察容器
１ａ  上面（開放）
１ｂ  下面
１ｄ  側壁
１ｅ  オーバーフロー壁
１ｆ  端部側の側壁
２  吹出し口
３  凹部
３ｂ  下面
３ｃ  第２側面
３ｄ  第１側面
４  透明カバー
５  イメージセンサ
６  オーバーフロー部
６ａ  回収凹部
７  細胞
８  旋回流
９  細胞導入導出口
１１  擬似２次元流れの空間
３０  光源
３１  照射光
３２  ポンプ
３３  容器１の中心軸
４１  第１の液体
４２  第２の液体
５０  境界面（開放面）
２０１  容器
２０１ａ  外周壁
２０２  吹出し口
２１０，２１１  旋回流
Ｌ１  凹部である下面側の長手方向の寸法
Ｌ２  凹部の上方の容器１の擬似２次元流れの空間である上面側の長手方向の寸法
Ｗ  一対の側壁間の幅寸法（凹部の幅寸法）
【図１Ａ】
2018074966.tif 000003
【図１Ｂ】
2018074966.tif 000004
【図１Ｃ】
2018074966.tif 000005
【図２】
2018074966.tif 000006
【図３Ａ】
2018074966.tif 000007
【図３Ｂ】
2018074966.tif 000008
【図４】
2018074966.tif 000009
【図５】
2018074966.tif 000010
【図６】
2018074966.tif 000011
【図７】
2018074966.tif 000012
【図８】
2018074966.tif 000013
【図９】
2018074966.tif 000014
【図１０】
2018074966.tif 000015
【図１１】
2018074966.tif 000016
【図１２】
2018074966.tif 000017
【図１３】
2018074966.tif 000018
【図１４Ａ】
2018074966.tif 000019
【図１４Ｂ】
2018074966.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月16日(2018.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ａ）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有する前記容器を準備し、
（ｂ）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）前記凹部内に、前記液体吹出し口から第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
細胞回転方法。
【請求項２】
前記（ｃ）の工程において、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入するとき、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置された前記液体吹出し口から前記第２の液体を導入することにより、前記凹部内の前記第１の液体中に鉛直方向沿いの旋回流を発生させて、前記容器内で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる、
請求項１に記載の細胞回転方法。
【請求項３】
前記（ｃ）の工程において、前記凹部の長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の前記長さの方向沿いの一方の側面ら（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲で他方の側面側に離れて配置された状態で、前記液体吹出し口から前記第２の液体を前記凹部内に導入する、
請求項２に記載の細胞回転方法。
【請求項４】
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項５】
前記（ｃ）の工程において、前記第２の液体を前記凹部内に導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が、前記容器の側面の外側に接するように配置されたオーバーフロー部に導入されて、前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記距離Ｈで維持される、
請求項１〜４のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項６】
前記（ｂ）の工程と前記（ｃ）の工程との間に、
（ｄ）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置する工程をさらに備える、
請求項１〜５のいずれか１つに記載の細胞回転方法。
【請求項７】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ｂ１）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有する前記容器を準備し、
（ｂ２）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｂ３）前記液面に接触し、かつ、前記上面から見たとき前記凹部を覆うように、透光性を有するカバーを配置し、
（ｂ４）前記凹部内に、前記液体吹出し口から第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させ、
（ｂ５）前記液体吹出し口からの前記第２の液体の導入を停止することにより、前記細胞を前記凹部の前記下面の上に移動させ、
（ｂ６）前記カバーの上方に配置された光源により前記細胞を照明し、前記凹部の前記下面に配置されたイメージセンサにより前記凹部の前記下面に位置する前記細胞を観察する、
細胞観察方法。
【請求項８】
側面と、液体が導入される液体吹出し口を有する下面とを有する凹部を備えて、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に第２の液体を導入して、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプとを備え、
前記容器は、
前記凹部の前記下面から前記容器に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たす、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞回転装置。
【請求項９】
前記容器の前記液体吹出し口は、前記凹部の前記下面の中心からずれて配置される、
請求項８に記載の細胞回転装置。
【請求項１０】
前記凹部の長さをＬ１としたき、前記液体吹出し口は、前記凹部の前記側面の端から（Ｌ１）／５以上（Ｌ１）／３以下の範囲に配置される、
請求項８又は９に記載の細胞回転装置。
【請求項１１】
前記第１の液体及び前記第２の液体は、培養液である、
請求項８〜１０のいずれか１つに記載の細胞回転装置。
【請求項１２】
前記容器の前記側面の外側に接するように配置されて、前記第２の液体を導入することにより、前記第１の液体及び前記第２の液体の量が前記容器の内部の容量を超えたとき、前記第１の液体及び前記第２の液体の少なくとも一方が排出されるオーバーフロー部をさらに備えて、
前記容器に貯留される前記第１の液体及び前記第２の液体の液面は前記Ｈで維持される、
請求項８〜１０のいずれか１つに記載の細胞回転装置。
【請求項１３】
開放された上面と、凹部を有する下面とを備えるとともに、前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに容器下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有して、細胞を含む第１の液体が貯留される容器と、
前記容器の内部に、前記液体吹出し口から第２の液体を導入することにより、前記細胞を鉛直方向沿いに回転させるポンプと、
液面であり、かつ、前記上面から見たとき前記凹部と重なる位置に配置されて、透光性を有するカバーと、
前記容器の、前記凹部の下面に接するように配置されて前記細胞を観察するイメージセンサと、を備え、
前記容器は、
前記凹部の前記下面から前記容器における前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に保持可能である、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
細胞観察装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
前記従来の課題を解決するために、本開示の細胞回転方法は、
開放された上面と、凹部を有する下面とを備える容器内の第１の液体中の細胞を回転させる細胞回転方法であって、
（ａ）前記凹部は、側面と、前記側面で囲まれるとともに前記容器の前記下面よりも下方に窪みかつ液体吹出し口を有する下面とを有する前記容器を準備し、
（ｂ）前記容器に、前記細胞を含む前記第１の液体を導入するとき、前記凹部の前記下面から前記容器内に保持された前記第１の液体の液面までの距離をＨとし、前記凹部の前記側面の高さをｈとしたとき、以下の式を満たすように前記第１の液体を前記容器に導入し、
０．４ｍｍ≦Ｈ≦３．５ｍｍ
０．１＋０．１Ｈ≦（ｈ／Ｈ）≦０．８２−０．０４Ｈ
（ｃ）前記凹部内に、前記液体吹出し口から第２の液体を導入することにより、前記容器内の前記第１の液体中で前記細胞を鉛直方向沿いに回転させる。