(57)【要約】【課題】本発明は、加齢黄斑変性の発症リスクを評価するための方法を提供する。【解決手段】ヒトＰＡＮＫ４遺伝子上の遺伝子多型のうち、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０の遺伝子型に基づいてヒト被験者の加齢黄斑変性の発症リスクを評価する評価工程を有し、前記評価工程において、前記ヒト被検者が、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルを２本有する場合、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルと、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルとを有する場合、又はｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧであるアレルを少なくとも１本有する場合に、当該ヒト被検者の加齢黄斑変性の発症リスクは高いと評価する、加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＡＮＫ４遺伝子上の遺伝子多型のうち、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０の遺伝子型に基づいてヒト被験者の加齢黄斑変性の発症リスクを評価する評価工程を有し、
前記評価工程において、前記ヒト被検者が、
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルを２本有する場合、
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルと、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルとを有する場合、又は
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧであるアレルを少なくとも１本有する場合に、
当該ヒト被検者の加齢黄斑変性の発症リスクは高いと評価することを特徴とする、加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。
【請求項２】
前記加齢黄斑変性が、典型加齢黄斑変性又はポリープ状脈絡膜血管症である、請求項１に記載の加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。
【請求項３】
前記ヒト被検者が女性であり、前記加齢黄斑変性がポリープ状脈絡膜血管症である、請求項１に記載の加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。
【請求項４】
前記ヒト被検者が男性であり、前記加齢黄斑変性が典型加齢黄斑変性である、請求項１に記載の加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。
【請求項５】
前記ヒト被検者が日本人である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の加齢黄斑変性の発症リスクの評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の発症リスクを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＤは、中途失明疾患の原因の一つで、社会の高齢化とともに世界的に増加している網膜変性疾患である。ＡＭＤは多因子疾患であり、遺伝要因と環境要因の両方が関与するが、その発症機序の多くは不明である。
【０００３】
ＡＭＤの遺伝要因は、これまでに５０種近いＡＭＤ発症関連遺伝子が報告されているが、その機能は、神経変性、血管新生、免疫、炎症、視物質代謝などと多様であり（非特許文献１参照。）、それらを繋ぎ合わせてＡＭＤ発症の分子機構の全貌を理解するのは困難である。また、多因子遺伝の性格上、責任遺伝子多型は多く持つほど易罹患性が高まる。そのため、他にも未知の重要な遺伝子が発症に関連している可能性は充分にあると考えられる。ただし、これまでに、欧米を中心とした世界各地で人を対象とした大規模なゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）が進められているが、本発明者らの同定した責任遺伝子についての報告はない。
【０００４】
ＡＭＤの環境要因については様々な報告がある（年齢（５５歳以上）、性別（発症率：女性＞男性）、太陽光曝露（屋外労働者等）、肌の色（発症率：白人＞黄色人種＞黒人）、全身疾患（高血圧、動脈硬化）、他）。環境要因については、発症までの期間が長期（５５年以上）に亘るため、様々な危険因子がＡＭＤ発症に大きく影響すると考えられ、ＡＭＤの易罹患性遺伝子の責任多型を同定することの障害となっている。
【０００５】
一般的に、疾患の発症機序の解明や有効な治療薬の開発には、当該疾患の動物モデルが有効なツールとされている。しかし、残念ながら、ＡＭＤを忠実に再現する動物モデルは未だ報告されていない。そこで、ＡＭＤの疾患動物モデルの代替として、過剰な光照射にて網膜変性を生じるラットの網膜光障害実験モデル（非特許文献２参照。）が歴史的に多用されてきた。ラットには黄斑がないが、この網膜光障害実験モデルは、病理・生化学的知見にはＡＭＤと多くの共通点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Katta，et al.，Journal of Genetics、２００９年、第８８巻、第４号、第４２５〜４４９ページ。
【非特許文献２】Noell，et al.，Investigative Ophthalmology、１９６６年、第５巻、第５号、第４５０〜４７３ページ。
【非特許文献３】Zhang, et al.，Chemistry & Biology、２００７年、第１４巻、第３号、第２９１〜３０２ページ。
【非特許文献４】Huang, et al.，NATURE CHEMICAL BIOLOGY、２０１６年、第１２巻、第８号、第６２１〜６２７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＭＤの発症前にその発症リスクが評価できれば、環境の改善や早期発見等により、ＡＭＤの予防や治療をより効率よく行うことが可能になる。
そこで、本発明は、ＡＭＤの発症リスクを評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラットの網膜光障害実験モデルを解析して、ラットのＰａｎｋ４（パントテン酸キナーゼ−４）遺伝子（ｒＰａｎｋ４遺伝子）が網膜光障害感受性の系統差に関わる遺伝子であることを見出した。そして、ヒトの相同遺伝子ＰＡＮＫ４（ｈＰＡＮＫ４）の遺伝子多型について、ＡＭＤ患者群とＡＭＤを発症していない白内障患者群を比較したところ、特定のハプロタイプがＡＭＤ患者群において高頻度に認められることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、以下のＡＭＤの発症リスクの評価方法を提供するものである。
［１］  ｈＰＡＮＫ４遺伝子上の遺伝子多型のうち、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０の遺伝子型に基づいてヒト被験者のＡＭＤの発症リスクを評価する評価工程を有し、
前記評価工程において、前記ヒト被検者が、
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルを２本有する場合、
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルと、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルとを有する場合、又は
ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧであるアレルを少なくとも１本有する場合に、
当該ヒト被検者のＡＭＤの発症リスクは高いと評価することを特徴とする、ＡＭＤの発症リスクの評価方法。
［２］  前記加齢黄斑変性が、典型ＡＭＤ又はポリープ状脈絡膜血管症である、前記［１］のＡＭＤの発症リスクの評価方法。
［３］  前記ヒト被検者が女性であり、前記ＡＭＤがポリープ状脈絡膜血管症である、前記［１］のＡＭＤの発症リスクの評価方法。
［４］  前記ヒト被検者が男性であり、前記ＡＭＤが典型ＡＭＤである、前記［１］のＡＭＤの発症リスクの評価方法。
［５］  前記ヒト被検者が日本人である、前記［１］〜［４］のいずれかのＡＭＤの発症リスクの評価方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るＡＭＤの発症リスクの評価方法により、発症前にその発症リスクを評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るＡＭＤの発症リスクの評価方法（以下、「本発明に係るリスク評価方法」ということがある。）は、ｈＰＡＮＫ４遺伝子上の遺伝子多型のうち、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０の遺伝子型に基づいてヒト被験者のＡＭＤの発症リスクを評価する評価工程を有する。より詳細には、本発明に係るリスク評価方法は、ｈＰＡＮＫ４遺伝子上のｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰ  ＢＵＩＬＤ１２４）のリファレンス番号）のハプロタイプをバイオマーカーとする。
【００１２】
ｈＰＡＮＫ４遺伝子は１番染色体短腕テロメア近傍に位置し、ｒＰａｎｋ４遺伝子と同様に１９個のエキソンで構成されており、眼を含め様々な臓器・組織で発現している。ＰＡＮＫ４は、ＰＡＮＫ１α、ＰＡＮＫ１β、ＰＡＮＫ２、ＰＡＮＫ３とともにＰＡＮＫファミリーを形成している。ＰＡＮＫ１〜３はＰＡＮＫドメインをもち、パントテン酸（ビタミンＢ５）のリン酸化を触媒してパントテン酸−４’−リン酸を生成する酵素として、補酵素Ａ（ＣｏＡ）生合成経路の第１段階を担う。一方、ＰＡＮＫ４は、Ｎ末側にＰＡＮＫドメインと配列同一性の高いドメインを持ち、その下流にＤＵＦ８９（Domain of Unknown Function-89）ドメインを持つが、パントテン酸に対するリン酸化活性はなく（非特許文献３参照。）、ＤＵＦ８９ドメインにより、パンテテイン酸−４’−リン酸などに対する脱リン酸化活性を有する（非特許文献４参照。）。
【００１３】
ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０は、どちらもｈＰＡＮＫ４遺伝子上のアミノ酸置換を伴うコモンＳＮＰ（一般集団に高頻度（通常、マイナーアレル頻度が１％以上）で見られる一塩基多型）である。ｒｓ７５３５５２８は、ｈＰＡＮＫ４遺伝子の第１３エキソンにあるＣ（シトシン）／Ｔ（チミン）多型である。ｈＰＡＮＫ４の５５５位のアミノ酸は、ｒｓ７５３５５２８がＣの場合にアラニン（Ａ）であり、Ｔの場合にバリン（Ｖ）である。ｒｓ２４９４６２０は、ｈＰＡＮＫ４遺伝子の第１８エキソンにあるＡ（アデニン）／Ｇ（グアニン）多型である。ｈＰＡＮＫ４の６９２位のアミノ酸は、ｒｓ２４９４６２０がＡの場合にグルタミン（Ｑ）であり、Ｇの場合にアルギニン（Ｒ）である。
【００１４】
ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０は、いずれも単独ではＡＭＤ発症と有意な関連はない。しかし、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルを保有しているヒトは、当該アレルを保有していないヒトよりも、ＡＭＤの発症リスクが統計学的に有意に高い。具体的には、ヒト被検者が、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルを２本有する場合、又は、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルと、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルとを有する場合、又は、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧであるアレルを少なくとも１本有する場合に、当該ヒト被検者のＡＭＤの発症リスクは高いと評価する。２本のアレルのうちの１本がｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡであるアレルであっても、残る１本のアレルがｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＣであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧである遺伝子型は、ＡＭＤ発症リスクとの相関はない。
【００１５】
なお、以降において、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ（以下、「ｒｓ７５３５５２８［Ｃ］」）であり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ（以下、「ｒｓ２４９４６２０［Ａ］」）であるアレルを「Ｃ−Ａハプロタイプ」ということがある。また、ｒｓ７５３５５２８［Ｃ］であり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧ（以下、「ｒｓ２４９４６２０［Ｇ］」）であるアレルを「Ｃ−Ｇハプロタイプ」と、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ（以下、「ｒｓ７５３５５２８［Ｔ］」）であり、かつｒｓ２４９４６２０［Ａ］であるアレルを「Ｔ−Ａハプロタイプ」と、ｒｓ７５３５５２８［Ｔ］であり、かつｒｓ２４９４６２０［Ｇ］であるアレルを「Ｔ−Ｇハプロタイプ」と、それぞれいうことがある。
【００１６】
ハプロタイプ情報のあるデータベースである１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＮＣＢＩ）のデーターによれば、Ｔ−Ｇハプロタイプは、全世界で２５３５人中１人と極めて低頻度（０．０００２）であったことから、残る３種類のハプロタイプ（Ｃ−Ａハプロタイプ、Ｔ−Ａハプロタイプ、Ｃ−Ｇハプロタイプ）でほぼ全ての人類が構成されている。しかし、本発明者らの研究では、４６４人の被験者の内、Ｔ−ＧハプロタイプとＣ−Ｇハプロタイプの組み合わせを有する披検者が４人存在したが、その全員がＡＭＤ患者であり、またＣ−Ｇハプロタイプのホモ接合体を有する被験者はＡＭＤ発症と関連が認められなかった（表６）ため、Ｔ−Ｇハプロタイプの検出は重要であると考えられる。また、人種ごとのＣ−Ａハプロタイプを保有するヒトの割合は、日本人は１４．４％、南亜人は２６．３％７、中南米人は３４．１％、白人は４７．７％である。つまり、本発明に係るリスク評価方法は、日本人をはじめ様々な人種の被験者に対して実施できる。
【００１７】
ＡＭＤには、日本人に多い「滲出型」と欧米人に多い「萎縮型」に分類される。滲出型ＡＭＤは更に、従来より知られている典型ＡＭＤ（ｔＡＭＤ）と新しい病型であるポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）などに分けられ、日本人のＡＭＤの大半はｔＡＭＤとＰＣＶである。すなわち、本発明に係るリスク評価方法により、評価対象であるヒト被検者が、ｔＡＭＤ又はＰＣＶの発症リスクを評価することができる。ヒト被検者が、Ｃ−Ａハプロタイプのホモ接合体である場合、Ｃ−ＡハプロタイプとＴ−Ａハプロタイプのヘテロ接合体である場合、又は、Ｔ−Ｇハプロタイプのアレルを少なくとも１本有する接合体である場合に、当該ヒト被検者は、ｔＡＭＤ又はＰＣＶの発症リスクが高いと評価する。
【００１８】
ヒト被検者が女性の場合には、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプは特にＰＣＶと非常に高い相関を有する。すなわち、本発明に係るリスク評価方法により、ヒト女性被検者が、Ｃ−Ａハプロタイプのホモ接合体である場合、Ｃ−ＡハプロタイプとＴ−Ａハプロタイプのヘテロ接合体である場合、又はＴ−Ｇハプロタイプのアレルを少なくとも１本有する接合体である場合に、当該ヒト女性被検者はＰＣＶの発症リスクが高いと評価できる。
【００１９】
ヒト被検者が男性の場合には、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプは特にｔＡＭＤと相関を有する。すなわち、本発明に係るリスク評価方法により、ヒト男性被検者が、Ｃ−Ａハプロタイプのホモ接合体である場合、Ｃ−ＡハプロタイプとＴ−Ａハプロタイプのヘテロ接合体である場合、又はＴ−Ｇハプロタイプのアレルを少なくとも１本有する接合体である場合に、当該ヒト男性被検者はｔＡＭＤの発症リスクが高いと評価できる。
【００２０】
本発明に係るリスク評価方法を行うために、ヒト被検者のゲノムＤＮＡのうち、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの遺伝子型を特定しておく必要がある。ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの遺伝子型を特定する方法は特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の方法の中から適宜選択することができる。ハプロタイプの遺伝子型を特定する方法としては、例えば、サンガー法を基礎とするダイレクト・シーケンス解析法、特定のアレルと特異的にハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーション法、特定のアレルと特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物を解析する方法等が挙げられる。なお、各ＳＮＰの遺伝子型の特定に用いられるプローブやプライマー等の核酸分子は、例えば、ヒトゲノム上のｈＰＡＮＫ４遺伝子領域中の各ＳＮＰが存在する部分の塩基配列情報や、ｈＰＡＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、常法により設計し、合成することができる。
【００２１】
ハプロタイプ解析は、ダイレクト・シーケンス解析法で実施可能である。具体的には、まず、ダイレクト・シーケンス解析法を用いてｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０の遺伝子型を調べる。ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの遺伝子型は、ｒｓ７５３５５２８の３種類の遺伝子型（Ｃ｜Ｃ、Ｃ｜Ｔ、Ｔ｜Ｔ）及びｒｓ２４９４６２０の３種類の遺伝子型（Ａ｜Ａ、Ａ｜Ｇ、Ｇ｜Ｇ）の組み合わせにより、９種類の組み合わせの可能性が存在する。この組み合わせから、下記（１）〜（３）の３種類の方法で、ハプロタイプの組み合わせを検討する。
【００２２】
（１）ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０の遺伝子型の両方がホモ接合体の場合は、ハプロタイプもホモ接合体となる。ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｃであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ａであるハプロタイプの組み合わせはＣ−Ａ｜Ｃ−Ａディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｃであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせはＣ−Ｇ｜Ｃ−Ｇディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ａであるハプロタイプの組み合わせはＴ−Ａ｜Ｔ−Ａディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせはＴ−Ｇ｜Ｔ−Ｇディプロタイプとなる。
【００２３】
（２）ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０の遺伝子型の何れかがホモ接合体であり、かつ残りがヘテロ接合体である場合は、ハプロタイプもヘテロ接合体となる。ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｃであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせはＣ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＴ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせはＴ−Ａ｜Ｔ−Ｇディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ａであるハプロタイプの組み合わせはＣ−Ａ｜Ｔ−Ａディプロタイプとなり、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＧ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせはＣ−Ｇ｜Ｔ−Ｇディプロタイプとなる。
【００２４】
（３）ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０の遺伝子型の双方がヘテロ接合体の場合は、ハプロタイプの決定が困難となる。ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせは、Ｃ−Ａ｜Ｔ−ＧディプロタイプとＴ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプの２種類の可能性が発生する。通常は、それぞれのハプロタイプの組み合わせが５０％の確率で発生する。しかし、ｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの場合には、Ｃ−Ａハプロタイプ、Ｔ−Ａハプロタイプ、及びＣ−Ｇハプロタイプの３種類でほぼ全ての人類が構成されているという特徴から、ほぼ全員がＴ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプと判断できることになる。実際に、ハプロタイプ情報のある１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓのデーターにおいては、全世界の２５３５人中３９２人がｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせを有するが、３９２人全員がＴ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプであった。しかし、個人での遺伝子検査のためには、Ｃ−Ａ｜Ｔ−Ｇディプロタイプである可能性について精査する必要がある。
【００２５】
ｈＰＡＮＫ４遺伝子の第１３エキソンと第１４エキソンの間のイントロンにあるｒｓ７４４１１２は、ｒｓ７５３５５２８の１８８ｂｐ下流にあり、かつｒｓ２４９４６２０の２８６８ｂｐ上流にあるＳＮＰである。また、ｒｓ７４４１１２はｒｓ２４９４６２０と連鎖するＳＮＰである。ｒｓ２４９４６２０がＡであるアレルではｒｓ７４４１１２はＧであり、ｒｓ２４９４６２０がＧであるアレルではｒｓ７４４１１２はＡである。ヒト被験者のｒｓ７５３５５２８、ｒｓ７４４１１２、及びｒｓ２４９４６２０の３つの遺伝子型を調べることにより、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであるハプロタイプの組み合わせが、（１）Ｔ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプである、（２）Ｔ−Ａ｜Ｃ−ＧディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−Ｇディプロタイプの両方の可能性を残す、のいずれの可能性が高いかについて決定することが可能となる。
【００２６】
本発明者らの研究では、４６４人の被験者の内の１人（ＡＭＤ患者）で、ｒｓ７５３５５２８の遺伝子型がＣ｜Ｔであり、ｒｓ７４４１１２の遺伝子型がＧ｜Ｇであり、かつｒｓ２４９４６２０の遺伝子型がＡ｜Ｇであって、ｒｓ７４４１１２とｒｓ２４９４６２０の遺伝子型が対応しなかった。このことから、当該ＡＭＤ患者では、ｒｓ７４４１１２とｒｓ２４９４６２０間において片側のアレルにおいて組換えが起きていたことが示された。このタイプの被験者だけはダイレクト・シーケンス解析法ではディプロタイプ（ハプロタイプの組み合わせ）を決定できないため、更に別の方法により解析するか、Ｔ−Ａ｜Ｃ−ＧディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−Ｇディプロタイプの２つの可能性を提示しなければならない。
【００２７】
このように、ｒｓ７４４１１２を解析対象に追加することにより、ハプロタイプ解析のために、ダイレクト・シーケンス解析法とは別の方法を必要とする症例数を、４６４分の1に減らすことができている。
【００２８】
ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの特定に供される被験者由来の核酸は、被験者のゲノムＤＮＡのうち、ｈＰＡＮＫ４遺伝子領域の塩基配列、又はｈＰＡＮＫ４遺伝子領域の部分領域であってｒｓ７５３５５２８及びｒｓ２４９４６２０の遺伝子型が反映されている領域の塩基配列が反映されている核酸が含まれていればよい。このような核酸としては、例えば、被験者のゲノムＤＮＡや、ゲノムＤＮＡを鋳型としてその部分領域をＰＣＲ等により増幅させた増幅産物が挙げられる。被験者のゲノムＤＮＡは、被験者から採取された生体試料から抽出・精製された核酸であってもよく、精製前の核酸であってもよい。
【００２９】
なお、ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの特定に用いられるプローブやプライマー等の核酸分子をキット化することにより、本発明に係るリスク評価方法をより簡便に行うことができる。なお、これらの核酸分子は、発症リスクの評価キットに、乾燥粉末として含まれていてもよく、水やＴｒｉｓバッファー等の適当な溶媒に溶解させた溶液として含まれていてもよく、基板に固定された状態で含まれていてもよい。また、発症リスクの評価キットには、被験者から採取された生体試料から核酸を抽出・精製するための試薬や器具等を含ませることも好ましい。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［参考例１］
本発明者らは、過剰な光照射にて網膜変性を生じるラットの網膜光障害実験モデル（非特許文献２）を解析し、網膜光障害の感受性を支配する原因遺伝子及び多型を同定した。網膜光障害の表現型解析は、モリス水迷路試験（プール内を標的まで泳ぐ所要時間を測定する行動学的視機能査定法）と眼病理観察により行い、遺伝子型解析は系統特異的多型のタイピングにより行った。
【００３２】
具体的には、まず、網膜光障害感受性であるＷＫＹ／Ｉｚｍ（以下、ＷＫＹ）系統と、網膜光障害耐性であるＬＥＷ／ＳｓＮＳｌｃ（以下、ＬＥＷ）系統とを交配したところ、得られたＦ−１個体は雌雄ともに網膜光障害感受性であり、網膜光障害感受性は網膜光障害耐性に対して優性であった。そこで、このＦ−１個体に対してＬＥＷ系統の個体を交配する戻し交配（ＢＣ）を行い、感受性個体を選択した。このＢＣを９世代繰り返し、得られた感受性個体の遺伝子型解析を行ったところ、ＷＫＹ系統が保有する網膜光障害感受性の原因遺伝子が存在する領域が、ラット５番染色体ｑ３６内の２８４ｋｂ領域内に絞り込まれた。網膜光障害感受性であるＦ３４４／ＮＳｌｃ系統を加えた３系統間で、当該領域を含む約４Ｍｂの遺伝子領域（Ｄ５Ｕｗｍ５０から５番染色体長腕テロメア（５ｑｔｅｒ）まで）について領域限定エキソーム解析を行い、各系統の表現型−遺伝子型の比較解析を行ったところ、３系統の持つ遺伝子型と表現型の関係に整合性を示す遺伝子としてｒＰａｎｋ４遺伝子が同定された。
【００３３】
ＬＥＷ系統では、ｒＰａｎｋ４遺伝子の第１９エキソン上のフレームシフト挿入欠失変異［c.2160_2163delTGGTinsACCAG（p.Val721GlyfsX20）］が生じており、当該変異により、ｒＰａｎｋ４タンパク質のＣ末端の５４アミノ酸部分が、アミノ酸配列の異なる２１アミノ酸からなる部分に置換される。
【００３４】
［実施例１］
ｒＰａｎｋ４遺伝子の相同遺伝子であるｈＰＡＮＫ４遺伝子の遺伝子多型と、ＡＭＤの発症との関係を調べた。
【００３５】
まず、日本人健常者のゲノム配列を解析したデータベースであるＨＧＶＤ（Human genetic variation database、京都大学）及び１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓのデーターを調べたところ、日本人のｈＰＡＮＫ４遺伝子には、アミノ酸が置換するコモンＳＮＰとして、ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０があることがわかった。そこで、ヒトのＡＭＤ患者（３３３検体、ＡＭＤ群）とＡＭＤを発症していない対照者（１３１検体、対照群）の血液検体から抽出したゲノムＤＮＡに対してダイレクト・シーケンス解析を行い、両ＳＮＰの遺伝子型を特定した。対照者は主に白内障患者とした。
【００３６】
血液検体からのゲノムＤＮＡの抽出・精製は、市販の核酸抽出・精製キット（製品名：「Relia Prep Blood gDNA MiniPrep System」、プロメガ社製）を用いて行った。遺伝子型の特定は、以下の通りで行った。まず、調製されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ベタイン（１Ｍ）存在下、ＤＮＡポリメラーゼ（製品名：「KOD Plus ver. 2」、ToYoBo社製）を用いたＰＣＲ反応による増幅を行った。次いで、ＰＣＲ精製試薬（製品名：「Exo-SAP-IT」、affymetrics社製）を用いて、得られた増幅産物中のプライマーとｄＮＴＰを分解処理した後、蛍光色素（製品名：「BigDye（登録商標）」、ThermoFisher社製）を用いて蛍光標識したＤＮＡ鎖を合成した。得られたＤＮＡ鎖は、ゲルろ過クロマトグラフィー法（充填材：セファデックスＧ２５）により精製した後、９６℃でのホルムアミド処理及びその後の急冷処理によって変性させた後に、キャピラリー・シーケンサー（ABI社製）にて解析した。
【００３７】
得られたシーケンス・データーは、コンピューター上で波形表示ソフトウェア「FinchTV」により波形をディスプレイ上に表示させ、また、核酸配列自動結合ソフトウェア「ATSQ」によりマルチプル・アライメント表示させ、各ＳＮＰタイピング及び波形の形状を確認した。ＳＮＰデーターは、χ２検定などの統計手法を用いてデーター解析した。また、２種類のＳＮＰデーターは、それぞれのアレル頻度、遺伝子型頻度に加え、ハプロタイプ頻度、ハプロタイプの組み合わせ（ディプロタイプ）頻度についても解析した。
【００３８】
各ＳＮＰの遺伝子型とＡＭＤの発症との関連を解析した結果を表１に示す。表中、「ＯＲ」はオッズ比を、「９５％ＣＩ」は９５％信頼区間を、「ＨＷＥ」はHardy−Weinberg平衡を、それぞれ意味する。また、「ＡＭＤ群（３３３検体）」と「対照群（１３１検体）」と「ＨＷＥ（Ｐ値）」の欄における「Ｒｉｓｋアレル」は、「ｒｓ７５３５５２８」欄ではＴアレルを、「ｒｓ２４９４６２０」欄ではＧアレルを、それぞれ意味する。一方で、「ＡＭＤ群（検体数）」と「対照群（検体数）」と「ＨＷＥ（Ｐ値）」の欄における「正常アレル」は、「ｒｓ７５３５５２８」欄ではＣアレルを、「ｒｓ２４９４６２０」欄ではＡアレルを、それぞれ意味する。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１に示すように、いずれのＳＮＰも、単独ではＡＭＤ発症との有意な関連は認められなかった。さらに、ＡＭＤ群と対照群の検体に対して、性別や病型（ｔＡＭＤ、ＰＣＶ）の臨床情報を追加して統計解析を行ったが、男女のいずれにおいても、両ＳＮＰは単独では、ＡＭＤ発症との有意な関連は認められず、ｔＡＭＤ発症及びＰＣＶ発症との有意な関連も認められなかった。このように、両ＳＮＰが単独ではＡＭＤ発症と有意な関連がないことが、これまでのＧＷＡＳ（ゲノムワイド関連解析）などを用いた大規模研究では、ＡＭＤ発症の原因遺伝子としてＰＡＮＫ４遺伝子を同定できなかった理由と考えられた。
【００４１】
次いで、両ＳＮＰの遺伝子型をペアとして、すなわちハプロタイプに分離して集計し直した。結果を表２に示す。表の「ＡＭＤ群（３３３検体）」と「対照群（１３１検体）」の欄における「対象のハプロタイプ」の欄は、各列に示すハプロタイプが各群の全検体に存在する数を意味し、「その他のハプロタイプ」の欄は、各列に示すハプロタイプ以外の全ハプロタイプが各群の全検体に存在する数を意味する。表の「ＨＷＥ（Ｐ値）」の欄における「ＡＭＤ群」の欄は、ＡＭＤ群における各列に示すハプロタイプのＨＷＥのＰ値を示し、「対照群」の欄は、対照群における各列に示すハプロタイプのＨＷＥのＰ値を示す。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
４種のハプロタイプとＡＭＤ罹患感受性の関係を調べた結果、表２に示す通り、対照群のＨＷＥのＰ値が０．０５以上のもとで、Ｃ−ＡハプロタイプのＰ値が０．０５未満であり、統計学的な有意差を示した。そこで、Ｃ−Ａハプロタイプについて、さらに、性別や病型（ｔＡＭＤ、ＰＣＶ）の臨床情報を追加して統計解析を行った。結果を表３〜５に示す。この結果、Ｃ−Ａハプロタイプは、ＡＭＤ発症、特に女性のＰＣＶの発症と強い関連を示した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
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【００４７】
さらに、ｒｓ７５３５５２８とｒｓ２４９４６２０のハプロタイプの組み合わせとＡＭＤ発症との関連を調べた。結果を表６〜７に示す。表中、「組み合わせ」はハプロタイプの組み合わせを意味する。表の「ＡＭＤ群（３３３検体）」と「対照群（１３１検体）」の欄における「対象の組み合わせ」の欄は、各列に示すハプロタイプの組み合わせが各群の全検体に存在する数を意味し、「その他の組み合わせ」の欄は、各列に示すハプロタイプの組み合わせ以外の全ハプロタイプの組み合わせが各群の全検体に存在する数を意味する。Ｃ−Ａ｜Ｔ−Ｇは、Ｃ−Ｇ｜Ｔ−Ａとの区別が未確定であるため、表７には含めなかった。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
この結果、Ｃ−ＡハプロタイプとＣ−Ａハプロタイプの組み合わせ（Ｃ−Ａハプロタイプのホモ接合体。以下、「Ｃ−Ａ｜Ｃ−Ａディプロタイプ」ということがある。）及びＣ−ＡハプロタイプとＴ−Ａハプロタイプの組み合わせ（Ｃ−ＡハプロタイプとＴ−Ａハプロタイプのヘテロ接合体。以下、「Ｃ−Ａ｜Ｔ−Ａディプロタイプ」ということがある。）は、ＡＭＤ発症と有意な関連を示した。Ｔ−Ｇハプロタイプを少なくとも１本有する接合体はＰ値が大きく、統計学的な有意差は確認できなかった。しかし、Ｔ−Ｇハプロタイプ自体が低頻度であり、Ｔ−Ｇハプロタイプを保有する検体はＡＭＤ群で４検体、対照群で０検体であったことから、Ｔ−Ｇハプロタイプを少なくとも１本有する接合体については、この結果のみからは関連の有無の判断には適さなかった。一方で、Ｃ−ＡハプロタイプとＣ−Ｇハプロタイプの組み合わせ（Ｃ−ＡハプロタイプとＣ−Ｇハプロタイプのヘテロ接合体。以下、「Ｃ−Ａ｜Ｃ−Ｇディプロタイプ」ということがある。）は、ＡＭＤ発症との関連が認められなかった（ＯＲ＝０．９０、Ｐ値＝０．７３７）。
【００５１】
次いで、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−Ａディプロタイプのいずれかを保有する被験者におけるＣ−ＡハプロタイプとＡＭＤ発症の関連と、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−ＡディプロタイプとＴ−Ｇ｜Ｃ−Ｇディプロタイプのいずれかを保有する被験者における、Ｃ−Ａハプロタイプ及びＴ−ＧハプロタイプとＡＭＤ発症の関連を調べた。さらに、性別や病型（ｔＡＭＤ、ＰＣＶ）の臨床情報を追加して統計解析を行った。Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−Ａディプロタイプのいずれかを保有する被験者における結果を表８〜１０に、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−ＡディプロタイプとＴ−Ｇ｜Ｃ−Ｇディプロタイプのいずれかを保有する被験者における結果を表１１〜１３に、それぞれ示す。
【００５２】
【表８】
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【００５３】
【表９】
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【００５４】
【表１０】
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【００５５】
【表１１】
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【００５６】
【表１２】
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【００５７】
【表１３】
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【００５８】
この結果、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−ＡディプロタイプにおけるＣ−Ａハプロタイプと、Ｔ−Ｇ｜Ｃ−ＧディプロタイプにおけるＴ−Ｇハプロタイプは、ＡＭＤ発症との関連が認められ（ＯＲ＝３．４４、Ｐ値＝６．２×１０−４）、特に、女性のＡＭＤ発症との関連を示した（ＯＲ＝４．６９、Ｐ値＝１．１×１０−３）。また、ＰＣＶ発症との関連を性別に分けて検討したところ、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−Ｇディプロタイプは、女性におけるＰＣＶ発症に対して更に強い関連を示した（ＯＲ＝６．２６、Ｐ値＝３．３×１０−４）。一方で、ｔＡＭＤ発症との関連を性別に分けて検討したところ、Ｃ−Ａ｜Ｃ−ＡディプロタイプとＣ−Ａ｜Ｔ−ＡディプロタイプとＴ−Ｇ｜Ｃ−Ｇディプロタイプは、男性におけるｔＡＭＤ発症に対して弱い関連を示した（ＯＲ＝３．１２、Ｐ値＝０．０５７２）。