(57)【要約】【課題】本発明は、多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造する際に、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導し得る従来の培地（特にＨＤＩ培地又はＬ１５培地）と比較して、より長期間、肝前駆細胞を培養することができ、あるいは、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができる、「肝前駆細胞の製造方法」や、「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加する培地添加剤」や、「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地」を提供することを目的とする。【解決手段】解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養することを特徴とする。かかる解糖系抑制剤としては、解糖系を構成する物質のアナログ物質や、解糖系を構成する酵素の抑制物質が挙げられ、中でも、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ブロモピルビン酸が好ましく挙げられる。前述の解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地としては、解糖系抑制剤を含むウィリアムＥ培地が好ましく挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程を有することを特徴とする肝前駆細胞の製造方法。
【請求項２】
解糖系抑制剤が、解糖系を構成する物質のアナログ物質、又は、解糖系を構成する酵素の抑制物質であることを特徴とする請求項１に記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項３】
解糖系抑制剤が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ブロモピルビン酸のいずれか又はその両方を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項４】
肝前駆細胞誘導培地中の２−デオキシ−Ｄ−グルコースの濃度が、０．０５〜３０μＭであることを特徴とする請求項３に記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項５】
肝前駆細胞誘導培地中の３−ブロモピルビン酸の濃度が、０．０５〜３０μＭであることを特徴とする請求項３又は４に記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項６】
肝前駆細胞誘導培地が、解糖系抑制剤を含むウィリアムＥ培地であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項７】
少なくとも７日間以上培養することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項８】
多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加するための培地添加剤であって、解糖系抑制剤を含む培地添加剤。
【請求項９】
解糖系抑制剤が、解糖系を構成する物質のアナログ物質、又は、解糖系を構成する酵素の抑制物質であることを特徴とする請求項８に記載の培地添加剤。
【請求項１０】
さらに、グルコースを含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の培地添加剤。
【請求項１１】
解糖系抑制剤とグルコースとを含むことを特徴とする、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝前駆細胞の製造方法や、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加する培地添加剤や、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、自分自身を複製する自己複製能と多分化能を共に有する細胞である。近年、多能性幹細胞から分化させた細胞を使用する移植療法が、機能不全や機能障害を起こした細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的とした再生医療において注目されている。また、多能性幹細胞から分化させた細胞を、薬剤の毒性試験などに応用することが期待されている。このように、多能性幹細胞から目的とする細胞を分化誘導し、増幅することは、医薬分野において大きな課題である。
【０００３】
多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：以下、ｉＰＳ細胞と略称することがある）や、胚性幹細胞（embryonic stem cells：以下、ＥＳ細胞と略称することがある）などが知られている。これら多能性幹細胞は、目的とする細胞に分化誘導させて使用する移植療法などの再生医学や、薬剤の毒性試験などへの応用が期待されている。特にｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞のような倫理的な問題がない他、患者自身の細胞から作製したｉＰＳ細胞は免疫拒絶の問題がないことから、移植療法には理想的な細胞源である。
【０００４】
例えば、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞を分化誘導することができれば、肝不全症例に対する移植療法への発展が期待される。肝臓は、主に肝実質細胞である肝細胞と、胆管上皮細胞などの肝非実質細胞などにより構成される。肝臓は、胆汁の分泌、吸収栄養分の濾過と解毒、薬物代謝、糖分の貯蔵と血糖の調節を行う他に、フィブリノーゲン、ヘパリンおよび貧血阻止物質などの生成器官であり生命必須のものである。そのため、機能する肝細胞が極度に減少する肝不全は致命的な病態であり、肝不全の症例では極度の凝固因子の不足による出血傾向、肝性昏睡などの大変重篤な状態となる。肝細胞の移植はこのような病態の根本的な治療法になり得る。
【０００５】
ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞を分化誘導する技術は、肝細胞への分化を促進する増殖因子および／または転写因子をそれぞれヒトｉＰＳ細胞の培養に添加し、導入する方法などが報告されている（非特許文献１〜３）。また、ヒトｉＰＳ細胞から肝臓を形成する方法が報告されている（非特許文献４）。この方法は、まずインビトロ（in vitro）でｉＰＳ細胞から肝細胞への分化を促進し、次いで血管内皮細胞および間葉系幹細胞と混合してマウスの脳に移植することにより肝臓を作成するものである。ヒトに応用するときには異種タンパクへの曝露のないことが条件となる。また、肝細胞への分化を促進したｉＰＳ細胞は、マウスの脳に移植しないでインビトロで維持すると死滅してしまう。さらに、かかる方法によるインビトロでの肝細胞への分化誘導には数週間を要し、しかも成熟した肝細胞は得られない（非特許文献５）。したがってヒトに応用するためには、異種タンパクに曝露しないｉＰＳ細胞から肝細胞を短期間に製造する方法の開発が必須である。
【０００６】
このように、ｉＰＳ細胞は再生医学への応用が期待されているが、ｉＰＳ細胞から目的の細胞をインビトロで分化誘導する場合、得られる細胞群には目的の細胞の他に未分化のｉＰＳ細胞が含まれるため、移植すると残存する未分化ｉＰＳ細胞が腫瘍を形成する可能性がある。したがって、ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞を移植などの再生医療に利用するためには、分化誘導された細胞と未分化ｉＰＳ細胞とを含む細胞群から、分化誘導された細胞を分離する必要がある。
【０００７】
本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞とヒト初代培養肝細胞との共培養より、ヒトｉＰＳ細胞を死滅させヒト初代培養肝細胞のみを回収する方法、及び、該方法で使用する肝細胞選択培地（hepatocyte selection medium； ＨＳＭ）を開発し、報告している（特許文献１及び非特許文献６）。このＨＳＭ培地は、細胞の生存に必須であるグルコース及びアルギニンを除き、ガラクトース及びオルニチンを添加して作製する。肝細胞は糖新生経路や尿素サイクルに関する一連の酵素群を有し、糖新生経路によりガラクトースからグルコースを、及び、尿素サイクルによりオルニチンからアルギニンを合成することができるため、ＨＳＭ培地で培養しても生存することができる。しかし、ヒトｉＰＳ細胞は糖新生経路や尿素サイクルを有していないので、ＨＳＭ培地で培養すると３日で死滅する。そのため、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞を製造する方法が確立された場合、製造された細胞群をＨＳＭ培地で３日間培養することにより、残存する未分化なヒトｉＰＳ細胞を細胞群から除去することができ、実質的に肝細胞からなる細胞培養物を得ることができる。ＨＳＭ培地では通常の培地に含有される成分のみで構成されるので、得られた肝細胞に障害が生じる可能性は極めて低い。
【０００８】
本発明者は、ヒトｉＰＳ細胞をＨＳＭ培地で２日間培養すると、胎生期肝細胞（肝芽細胞）等の肝前駆細胞や肝実質細胞などの肝細胞系細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン（α-feto protein：ＡＦＰ）の発現が顕著に亢進することを見いだした（特許文献２）。本発明者はさらに、ＨＳＭ培地に、「オンコスタチンＭ（oncostatin M）」、「肝細胞機能性増殖誘導物質１（hepatocyte functional proliferation inducer 1； ＦＰＨ１）」、「アポトーシス阻害剤であるＭ５００５４」、「マウスＥＳ細胞の生存に効果のある非必須アミノ酸（non-essential amino acid； ＮＥＡＡ）」、「ピルビン酸ナトリウム」、「ニコチンアミド」、及び「Ｌ−グルタミン」を添加して作製した肝細胞分化誘導物質（hepatocyte differentiation inducer； ＨＤＩ）培地を開発し、報告している（特許文献２）。本発明者は、ヒトｉＰＳ細胞をＨＤＩ培地で２日間培養すると、肝細胞マーカーであるＡＦＰと、胆管上皮細胞マーカーであるγ−グルタミル トランスペプチダーゼ（γ-glutamyl trans peptidase； Ｇ−ＧＴＰ）の両方の発現の亢進が認められ、また、肝芽細胞等の肝前駆細胞のマーカーであるデルタ様１ホモログ（Delta like-1 homolog； ＤＬＫ−１）等の発現の亢進が認められたことを見いだしている（特許文献２）。このように、ヒトｉＰＳ細胞をＨＳＭ培地やＨＤＩ培地で培養すると、肝芽細胞等の肝前駆細胞（未分化な肝細胞であって、肝細胞及び胆管上皮細胞に分化する能力を有する細胞）が得られることは知られていた。
【０００９】
しかし、ヒトｉＰＳ細胞をＨＳＭ培地で培養しても、肝前駆細胞は３日間でほぼ死滅してしまい、また、ヒトｉＰＳ細胞をＨＤＩ培地で培養しても、肝前駆細胞は７日間でほぼ死滅してしまった。したがって、ヒトｉＰＳ細胞から肝前駆細胞を製造する場合に、かかる細胞が７日間を超えて生存できる肝前駆細胞誘導培地や、肝前駆細胞の製造方法が求められていた。
【００１０】
解糖系とは生物の体内にある糖の代謝経路であり、真核生物や嫌気性真正細菌における解糖系は特にエムデン−マイヤーホフ経路（Embden-Meyerhof pathway；ＥＭ経路）と呼ばれる。また、このＥＭ経路は酸素を必要としないので、嫌気的解糖とも呼ばれる。ＥＭ経路は、グルコースがピルビン酸又は乳酸まで嫌気的に分解される代謝経路であり、かかる経路全体で、グルコース１ｍｏｌ当たりＡＴＰ２ｍｏｌを生成し、及び、２ｍｏｌのＮＡＤ＋を還元してＮＡＤＨを生成する。解糖系の最終産物であるピルビン酸は、その後、クエン酸回路に入り、細胞の生存に必要なエネルギーをさらに生成する。
【００１１】
様々な物質には、その物質のアナログが知られている。解糖系の出発物質であるグルコースのアナログとして、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（2-Deoxy-d-glucose；２ＤＧ）が知られている。かかる２ＤＧは、グルコースと同様に細胞に取り込まれるが、ＥＭ経路等では代謝されずに細胞内に蓄積する性質を有している。フッ素１９で標識した２ＤＧは、ポジトロン断層法（Positron emission tomography；ＰＥＴ）に応用されている（非特許文献７）。また、解糖系の最終産物であるピルビン酸のアナログとして、３−ブロモピルビン酸（3-Bromopyruvate； ３ＢＰ）は、解糖系を抑制することが知られている（非特許文献８）。
【００１２】
しかし、解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養すると、かかる肝前駆細胞が７日間を超えて生存できること等は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２０１４−１２８２１０号公報
【特許文献２】特開２０１６−０２６４９０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Tomizawa Mら、「肝臓」、2011年、第52巻、（増刊2）：A 680。
【非特許文献２】Inamuraら、「Efficient Generation of Hepatoblasts fr om Human ES Cells and iPS Cells by Transient Overexpression of Homeobox Gene HEX」、Molecular Therapy、2011年、第19巻、第2号、p.400-407。
【非特許文献３】Tomizawa Mら、「Single-step protocol for the differe ntiation of human-induced pluripotent stem cells into hepatic progenitor-like cells」、Biomedical Reports、2013年、第1巻、p.18-22 （Published online on Monday, August 13, 2012 as Doi: 10.3892/br.2012.2）。
【非特許文献４】Takebe Tら、「Vascularized and functional human liver from a iPSC-derived organ bud transplantation」、Nature、2013年、第499巻、p.481-489。
【非特許文献５】Si-Tayeb Kら、「Highly efficient generation of human hepaotcyte-like cells from induced pluripotent stem cells」、Hepatology、2010年、第51巻、p.297-305。
【非特許文献６】Tomizawa et al. Survival of primary human hepatocytes and death of induced pluripotent stem cells in media lacking glucose and arginine. PLoS One 8, e71897, 2013）
【非特許文献７】Zhang D, Li J, Wang F, Hu J, Wang S and Sun Y: 2-Deoxy-D-glucose targeting of glucose metabolism in cancer cells as a potential therapy. Cancer Lett 355, 176-183, 2014.
【非特許文献８】Tomizawa et al. Suppressive effects of 3-bromopyruvate on the proliferation and the motiligy of hepatocellular carcinoma cells. Oncol Rep 35, 59-63, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造する際に、多能性幹細胞から肝芽細胞等の肝前駆細胞を誘導し得る従来の培地（特にＨＤＩ培地又はＬ１５培地）と比較して、より長期間、肝前駆細胞を培養することができ、あるいは、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができる、「肝前駆細胞の製造方法」や、「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加する培地添加剤」や、「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地」を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行ったところ、グルコースを含む肝前駆細胞誘導培地（例えばウィリアムＥ培地）に、「解糖系抑制剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）及び／又は３−ブロモピルビン酸（３ＢＰ）」を添加した培地で多能性幹細胞を培養した場合、解糖系抑制剤及びグルコースを含んでいない肝前駆細胞誘導培地（特にＨＤＩ培地又はＬ１５培地）で培養した場合と比較して、肝前駆細胞をより長期間培養することができ、及び、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は
（１）解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程を有することを特徴とする肝前駆細胞の製造方法や、
（２）解糖系抑制剤が、解糖系を構成する物質のアナログ物質、又は、解糖系を構成する酵素の抑制物質であることを特徴とする上記（１）に記載の肝前駆細胞の製造方法や、
（３）解糖系抑制剤が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ブロモピルビン酸のいずれか又はその両方を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の肝前駆細胞の製造方法や、
（４）肝前駆細胞誘導培地中の２−デオキシ−Ｄ−グルコースの濃度が、０．０５〜３０μＭであることを特徴とする上記（３）に記載の肝前駆細胞の製造方法や、
（５）肝前駆細胞誘導培地中の３−ブロモピルビン酸の濃度が、０．０５〜３０μＭであることを特徴とする上記（３）又は（４）に記載の肝前駆細胞の製造方法や、
（６）肝前駆細胞誘導培地が、解糖系抑制剤を含むウィリアムＥ培地であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の肝前駆細胞の製造方法や、
（７）少なくとも７日間以上培養することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の肝前駆細胞の製造方法に関する。
【００１８】
また、本発明は、
（８）多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加するための培地添加剤であって、解糖系抑制剤を含む培地添加剤や、
（９）解糖系抑制剤が、解糖系を構成する物質のアナログ物質、又は、解糖系を構成する酵素の抑制物質であることを特徴とする上記（８）に記載の培地添加剤や、
（１０）さらに、グルコースを含むことを特徴とする上記（８）又は（９）に記載の培地添加剤に関する。
【００１９】
さらに、本発明は、
（１１）解糖系抑制剤とグルコースとを含むことを特徴とする、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造する際に、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導し得る従来の培地（特にＨＤＩ培地又はＬ１５培地）と比較して、肝前駆細胞をより長期間培養することができ、及び／又は、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｉＰＳ細胞を培養する培地の種類が、肝臓特異的遺伝子の発現に与える影響を示す図である。縦軸は、各遺伝子の発現レベルを表す。Ａ：細胞質型アスパラギン酸アミノ基転移酵素（cytosolic aspartate aminotransferase； Ｃｙｔｏ ＡＳＴ）遺伝子についての結果を示す。Ｂ；ミトコンドリア型アスパラギン酸アミノ基転移酵素（mitochondrial aspartate aminotransferase； Ｍｉｔｏ ＡＳＴ）遺伝子についての結果を示す。Ｃ；アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase；ＡＬＴ）遺伝子についての結果を示す。Ｄ；グリコーゲン合成酵素（glycogen synthase； ＧＳ）遺伝子についての結果を示す。  なお、「Fetal」は胎児肝臓の結果を表し、「adult」は成人肝臓の結果を表す。また、エラーバーは標準偏差を表し、「＊」は、ＦＦの場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示す。ｎ＝３
【図２】培地におけるガラクトースの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響を示す図である。縦軸は、α−フェトプロテイン遺伝子の発現レベルを表す。「Medium」は、培地の種類を表し、「Galactose」の（−）は、ガラクトース無添加の培地を表し、（＋）は、ガラクトース添加の培地を表す。エラーバーは標準偏差を表し、「＊」は、ＦＦの場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示す。ｎ＝３
【図３】培地においてグルコースを含まず、ガラクトースを含むことの、ＧＡＬＫ１プロモーター活性及びＧＡＬＫ２プロモーター活性への影響を示す図である。図の縦軸は、pMetLuc2-controlを用いた場合のMetridiaルシフェラーゼの発光量（ＣＭＶ）に対する相対発光量（％）を表す。黒い棒グラフは、ReproFF培地を用いた場合の結果（ＦＦ）を表し、白い棒グラフは、ＷＥ培地を用いた場合の結果（ＷＥ）を表し、灰色の棒グラフは、ＨＳＭ培地を用いた場合の結果（ＨＳＭ）を表す。エラーバーは標準偏差を表し、「＊」は、ＦＦの場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示す。ｎ＝４
【図４】培地における２ＤＧの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響を表す図である。図の縦軸は、ＡＦＰ遺伝子の発現レベルを×１０の表示で表す。エラーバーは標準偏差を表し、「＊」は、ＦＦで２ＤＧ無添加及びガラクトース無添加の場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示し、「＊＊＊」は、ＦＦで、０．１μＭ ２ＤＧ添加及びガラクトース無添加の場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示す。ｎ＝３
【図５】培地における２ＤＧの有無、３ＢＰの有無の、細胞の形態学的特徴への影響を表す図である。各培地で７日間培養した細胞を顕微鏡で観察した結果を表す。顕微鏡観察した際の倍率は４００倍であり、スケールバーは１００μｍを表す。
【図６】培地における２ＤＧの有無、３ＢＰの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響を表す図である。図の縦軸は、ＡＦＰ遺伝子の発現レベルを表す。エラーバーは標準偏差を表し、「＊」は、ＦＦの場合と比較してＰ値＜０．０５であることを示す。ｎ＝３
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、「解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程を有することを特徴とする肝前駆細胞の製造方法」（以下、「本発明の肝前駆細胞の製造方法」とも表示する。）や、「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加する培地添加剤であって、解糖系抑制剤とグルコースとを含む培地添加剤」（以下、「本発明の培地添加剤」とも表示する。）や、「解糖系抑制剤とグルコースとを含む、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地」（以下、「本発明の分化誘導培地」とも表示する。）等からなる。
【００２３】
本発明における「多能性幹細胞」としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、腸骨骨髄、顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞や、脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞や、皮膚、骨髄等の間葉系組織から選択して得られた多能性を有する細胞（Ｍｕｓｅ細胞［Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell］）や、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ；induced pluripotent stemcell）を挙げることができ、これらの中でもｉＰＳ細胞が好ましい。また、本発明の肝前駆細胞の製造方法により製造した肝前駆細胞を、哺乳動物細胞に移植して肝疾患の治療に用いる場合、移植による拒絶反応のリスクを考慮すると、肝疾患に罹患した患者由来の体細胞から得られたｉＰＳ細胞や、肝疾患に罹患した患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ；Human leukocyte antigen）遺伝子型が同一又は実質的に同一である対象（ヒト）由来の体細胞から得られたｉＰＳ細胞を好適に例示することができる。ここで「ＨＬＡ遺伝子型が実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることを意味する。したがって、上記ＨＬＡ遺伝子型が実質的に同一である対象（ヒト）由来の体細胞としては、具体的には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲのＨＬＡ遺伝子型３種、或いはかかるＨＬＡ遺伝子型３種にＨＬＡ−Ｃを加えたＨＬＡ遺伝子型４種が一致するＨＬＡ遺伝子型が同一である対象（ヒト）由来の体細胞を挙げることができる。
【００２４】
本発明における「多能性幹細胞」の由来となる生物種としては、哺乳動物である限り特に制限されず、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトを特に好ましく挙げることができる。
【００２５】
本発明における「解糖系抑制剤」としては、哺乳動物細胞の解糖系（以下、特に言及がない限り、解糖系とはエムデン−マイヤーホフ経路を表す）のいずれか１つ又は２つ以上の反応を抑制する性質を有する剤である限り特に制限されず、例えば、解糖系を構成する物質（以下、「解糖系構成物質」とも表示する。）のアナログ物質や、解糖系を構成する酵素（以下、「解糖系構成酵素」とも表示する。）の抑制物質などが好ましく挙げられ、中でも、解糖系構成物質のアナログ物質がより好ましく挙げられる。解糖系構成物質、及びそのアナログ物質の例を表１に記載し、解糖系構成酵素を表２に記載する。なお、解糖系構成物質としては、表１に記載のもの以外にも、例えば、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸が挙げられる。
【００２６】
【表１】
2018011538.tif 000002
【００２７】
【表２】
2018011538.tif 000003
【００２８】
本発明において「解糖系構成物質Ａのアナログ物質」とは、解糖系構成物質Ａに類似した構造を有する物質であって、哺乳動物細胞に取り込ませた場合にその哺乳動物細胞の解糖系の反応を抑制する作用を有する物質を意味する。前述の解糖系構成物質Ａに類似した構造を有する物質としては、物質Ａの官能基を、水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数１〜５のハロゲン化していてもよい炭化水素基に置換等した物質が挙げられる。
【００２９】
解糖系構成物質Ａに類似した構造を有する試験物質が、解糖系構成物質Ａのアナログ物質であるか否かは、例えば、当業者に公知である一般的な評価方法により確認することが可能である。例えば、哺乳動物細胞における解糖系の反応量を、試験物質の存在下および不存在下において比較する。試験物質の存在下における解糖系の反応量が、試験物質の不存在下における解糖系の反応量と比べて低減または欠失している場合には、当該試験物質を解糖系構成物質Ａのアナログ物質として同定することができる。また、解糖系構成物質Ａのアナログ物質は、例えば、当業者に公知である一般的なスクリーニング方法により取得することが可能である。例えば、哺乳動物細胞における解糖系の反応量を、試験物質の存在下および不存在下において比較する。試験物質の存在下における解糖系の反応量が、試験物質の不存在下における解糖系の反応量と比べて低減または欠失している場合には、当該試験物質を解糖系構成物質Ａのアナログ物質として取得することができる。
【００３０】
本発明において「解糖系構成酵素の抑制物質」とは、解糖系における上記表２の解糖系構成酵素による酵素反応を抑制し得る物質を意味する。かかる物質として例えば、エノラーゼによる酵素反応を抑制するフッ化ナトリウム（ＮａＦ）や、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼによる酵素反応を抑制するヨード酢酸、セスキテルペンラクトン、ＢＺＬ１０１（半枝蓮（Scutellaria barbata）の水抽出物）、コニンギン酸などが挙げられる。
【００３１】
ある試験物質が解糖系構成酵素の抑制物質であるか否かは、例えば、当業者に公知である一般的な評価方法により確認することが可能である。例えば、解糖系構成酵素の活性を、試験物質の存在下および不存在下において比較する。試験物質の存在下における酵素活性が、試験物質の不存在下における酵素活性と比べて低減または欠失している場合には、当該試験物質を解糖系構成酵素の抑制物質として同定することができる。また、解糖系構成酵素の抑制物質は、例えば、当業者に公知である一般的なスクリーニング方法により取得することが可能である。例えば、解糖系構成酵素の活性を、試験物質の存在下および不存在下において比較する。試験物質の存在下における酵素活性が、試験物質の不存在下における酵素活性と比べて低減または欠失している場合には、当該試験物質を解糖系構成酵素の抑制物質として取得することができる。
【００３２】
本発明における好適な「解糖系抑制剤」としては、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）、３−ブロモピルビン酸（３ＢＰ）、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、フッ化ナトリウム、ヨード酢酸、セスキテルペンラクトン、ＢＺＬ１０１及びコニンギン酸からなる群から選択される１種又は２種以上を挙げることができ、中でも、２ＤＧ、３ＢＰのいずれか又はその両方を好ましく挙げることができる。
【００３３】
本発明における「グルコース」とは、多能性幹細胞が資化し得るグルコースである限り特に制限されず、例えばＤ−グルコースが好ましい。
【００３４】
本発明における「肝前駆細胞」とは、「肝前駆細胞のマーカーであるデルタ様１ホモログ（Delta like-1 homolog； ＤＬＫ−１）の発現の亢進が認められる細胞」、あるいは、「肝細胞系細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン（α-feto protein：ＡＦＰ）と、胆管上皮細胞マーカーであるγ−グルタミル トランスペプチダーゼ（γ-glutamyl trans peptidase； Ｇ−ＧＴＰ）の両方の発現の亢進が認められる細胞」を意味し、好ましくは、ＤＬＫ−１、ＡＦＰ及びＧ−ＧＴＰのすべての発現の亢進が認められる細胞が含まれる。遺伝子の発現が亢進しているとは、ReproFF（品番：RCHEMD004、リプロセル社製）を培地として用いること以外は同様の条件で培養した細胞における遺伝子の発現レベルと比較して、その遺伝子の発現レベルが亢進していることを意味する。これらの遺伝子の発現の亢進は、リアルタイム定量ＰＣＲ等の公知の手法により測定することができる。かかるリアルタイム定量ＰＣＲの方法としては、例えば後述の実施例の５．に記載の方法を好適に挙げることができる。
【００３５】
肝芽細胞は、前腸内胚葉由来の組織幹細胞であり、肝組織発生に必須の細胞である。肝芽細胞は、胎児肝における組織幹細胞として位置づけられている。成熟肝における組織肝細胞の存在量は極少なく、肝前駆細胞と呼ばれている。本明細書における「肝前駆細胞」の定義は前述したとおりであり、肝芽細胞を包含する概念である。成熟肝に存在する肝前駆細胞は、肝傷害に伴い活性化され、肝修復に重要な役割を果たすと考えられる。肝芽細胞等の肝前駆細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や非実質細胞が産生する種々の細胞外基質、例えば肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；ＨＧＦ）やトランスフォーミング増殖因子β（Transforming growth factor β；ＴＧＦβ）などの関与が報告されている。肝芽細胞等の肝前駆細胞はin vitroで培養が可能であり、適当な培養条件下で培養することにより肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化することができる。
【００３６】
肝細胞は、本明細書において、肝前駆細胞（hepatic progenitor cell）や成熟肝細胞など、肝細胞への分化が決定された全ての分化段階の細胞を含む意味として使用される。成熟肝細胞は、成熟肝実質細胞ともいい、多種多様な肝特異的機能、例えばコレステロール合成能、アミノ酸輸送活性、グルコース−６−ホスファターゼ（glucose-6-phosphatase）活性などの機能を発現する最終分化細胞であるが、一方、肝再生現象でよく知られるように活発な増殖能力を有する。肝前駆細胞は成熟した肝細胞よりも増殖能が高く、胆管上皮も形成するので肝臓に移植した場合、速やかに既存の肝構築を形成し、肝細胞のみを移植するよりも効果的に失われた肝臓を再現することが期待できる（Sangan C B et. al.、「Hepatic progenitor cells」、Cell and Tissue Research、2010年、第342巻、第2号、p.131-137）。
【００３７】
本願明細書において、多能性幹細胞から肝細胞への分化が決定された細胞を、肝細胞系細胞と称することがある。肝細胞系細胞には、多能性幹細胞から肝細胞への分化過程の初期の段階にある細胞から成熟肝細胞までの様々な分化過程の細胞が包含され、肝芽細胞等の肝前駆細胞、肝実質細胞が好適に含まれる。
【００３８】
本発明における「肝前駆細胞誘導培地」とは、上記解糖系抑制剤とグルコースを含んでいる培地であって、その培地で多能性幹細胞を培養した場合に、肝前駆細胞に誘導し得る培地を意味する。本発明における「肝前駆細胞誘導培地」に含まれる解糖系抑制剤やグルコースの濃度としては、ＨＤＩ培地又はＬ１５培地と比較して、肝前駆細胞をより長期間培養することができ、及び／又は、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができる限り特に制限されない。解糖系抑制剤の合計濃度としては例えば、０．０５〜６０μＭの範囲内が挙げられ、０．１２〜５０μＭの範囲内が好ましく挙げられる。これらの濃度範囲は、解糖系抑制剤が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ブロモピルビン酸のいずれか又はその両方である場合に特に好ましく用いることができる。
【００３９】
解糖系抑制剤として２ＤＧを用いる場合の肝前駆細胞誘導培地中の２ＤＧの濃度としては、０．０５〜３０μＭの範囲内が挙げられ、０．０６〜２５μＭの範囲内が好ましく挙げられる。また、解糖系抑制剤として３ＢＰを用いる場合の肝前駆細胞誘導培地中の３ＢＰの濃度としては、０．０５〜３０μＭの範囲内が挙げられ、０．０６〜２５μＭの範囲内が好ましく挙げられる。
【００４０】
本発明の「肝前駆細胞誘導培地」における、解糖系抑制剤とグルコース以外の成分としては、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上のその他成分が挙げられる。該肝前駆細胞誘導培地は、グルコース以外に、１又は２種類以上の糖（類）をさらに含んでいてもよいが、含んでいなくてもよい。
【００４１】
グルコース以外の上記糖類としては、具体的には、ガラクトース、マンノース、フルクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができ、中でもガラクトースを挙げることができる。これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。
【００４２】
上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、塩化マンガン四水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、亜セレン酸ナトリウム五水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができるが、多能性幹細胞からの肝前駆細胞の製造に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類又はその組合せも用いることができる。上記無機塩類として、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、塩化マンガン四水和物、硫酸亜鉛七水和物からなる群から選ばれる１種又は２種以上を無機塩類として少なくとも含むことが好ましく、かかる群のすべての無機塩類を含むことがより好ましい。これらの群の無機塩類は、好適な培地であるＷＥ培地に比較的特徴的な無機塩類だからである。なお、これらの無機塩類は水和の程度は特に制限されず、無水物を用いてもよい。
【００４３】
上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ−体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を挙げることができ、上記システインとしては、Ｌ−システイン二塩酸塩、Ｌ-システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を挙げることができ、上記チロシンとしては、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を挙げることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を挙げることができ、上記リジンとしては、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができる。また、ＮＥＡＡ（マウスＥＳ細胞の生存に効果のある非必須アミノ酸）を好適に挙げることができる。上記アミノ酸類として、アラニン、アスパラギン及びグルタミン酸からなる群から選ばれる１種又は２種以上をアミノ酸類として少なくとも含むことが好ましく、かかる群のすべてのアミノ酸類を含むことがより好ましい。これらの群のアミノ酸類は、好適な培地であるＷＥ培地に比較的特徴的なアミノ酸類だからである。
【００４４】
上記ビタミン類としては、具体的には、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、ビタミンＡ、α−トコフェロールから選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を挙げることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド（ニコチンアミド）、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を挙げることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を挙げることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を挙げることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を挙げることができ、アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ascorbic acid 2-phosphate）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を挙げることができ、α−トコフェロールとしては、α−トコフェリルリン酸ナトリウム等のα−トコフェロールの派生物を挙げることができる。上記ビタミン類として、アスコルビン酸、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ビタミンＫ３）、ビタミンＡ（好ましくはビタミンＡの酢酸塩）及びα−トコフェロール（好ましくはα−トコフェリルリン酸ナトリウム）からなる群から選ばれる１種又は２種以上をビタミン類として少なくとも含むことが好ましく、かかる群のすべてのビタミン類を含むことがより好ましい。これらの群のビタミン類は、好適な培地であるＷＥ培地に比較的特徴的なビタミン類だからである。
【００４５】
上記その他成分としては、血清又は血清代替物、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、ヌクレオチド等の核酸、ピルビン酸、グルタチオン、リノール酸及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物、フェノールレッドなどを挙げることができる。
【００４６】
上記の血清としては、多能性幹細胞、肝芽細胞等の肝前駆細胞や、肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用できる。血清を使用する場合、培養する細胞の種と同種の生物由来の血清を使用することが好ましい。例えば、培養する細胞がヒト細胞である場合 、ヒト由来の血清を使用することが好ましい。上記の血清代替物質としては、血清の代わりに細胞の維持や生育に使用される物質であり、化学的組成が明らかな組成物を意味する。血清代替物質は、多能性幹細胞、肝芽細胞等の肝前駆細胞や、肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用でき、例えばKnockout（登録商標）Serum Replacement（Life Tec hnologies社製）、CDM-HD血清代替物（FiberCell Systems社製）、StemSure血清代替品（和光純薬工業株式会社製）、Nu-Serum商標（Becton Dickinson社製）を例示できる。血清または血清代替物質の用量は簡単な繰り返し実験によって決定することができる。
【００４７】
上記ヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、好ましくはこれら４種の等モル混合物）を好ましく挙げることができ、ピルビン酸の派生物としてはピルビン酸ナトリウムを好ましく挙げることができる。
【００４８】
また、それ以外のその他成分として、オンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、ＦＰＨ１（肝細胞機能性増殖誘導物質１）、Ｍ５００５４等の増殖促進剤；ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰα等の転写因子；などが挙げられる。
【００４９】
本発明における「肝前駆細胞誘導培地」の好適な具体例として、以下の「グルコースを含む哺乳動物細胞培養用基本培地」に解糖系抑制剤を含有させた培地を挙げることができる。「グルコースを含む哺乳動物細胞培養用基本培地」としては、ウィリアムＥ培地（William's E medium、Life Technologies社製）、ReproFF（品番：RCHEMD004、リプロセル社製）、イーグル最小必須培地（Minimum Essential Medium、品番：11090-081、Life Techn ologies社製）、改良最小必須培地（Improved Minimum Essential Medium、品番：10373-017、Life Technologies社製）、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium、品番：12440-053、Life Technologies社製）、コンノート医学研究所1066培地（Connaught Medical Research Laboratories Medi um 1066、品番：11530-037、Life Technologies社製）、イーグル基礎培地（Basal Medium Eagle、品番：21010-046、Life Technologies社製）、マッコイ5A培地（McCoy's 5A Medium、品番：16600-082、Life Technologies社製）等の、グルコースを含む哺乳動物細胞培養用基本培地を挙げることができ、中でも、ウィリアムＥ培地、ReproFFを好ましく挙げることができ、中でも、ウィリアムＥ培地をより好ましく挙げることができる。なお、これらの哺乳動物細胞培養用基本培地は、グルコースを含んでいるものの、解糖系抑制剤を含んでいないため、本発明に用いる際には、解糖系抑制剤を添加して用いる。また、先に列挙した哺乳動物細胞培養用基本培地の組成は公知であるが、参考のために、ウィリアムＥ培地の組成を表３に示す。表３におけるそれぞれの成分の「固形分の重量部」の数値をｍｇ／Ｌ単位とすると、その成分の「濃度（ｍＭ）」と等しくなる。例えば、グリシンを５０ｍｇ／Ｌとすると、０．６６７ｍＭの濃度となる。なお、本発明における「グルコースを含む肝前駆細胞誘導培地」には、先に列挙した哺乳動物細胞培養用基本培地（好ましくはウィリアムＥ培地）における各成分の濃度に対して、各成分ごとに独立に７０％〜１３０％の範囲内の割合の濃度の各成分を含む培地も挙げることができる。
【００５０】
【表３】
2018011538.tif 000004
【００５１】
本発明の肝前駆細胞の製造方法としては、前述したように、解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程を有している限り特に制限されない。かかる培養の培養条件としては、多能性幹細胞を上記肝前駆細胞誘導培地で培養することにより、肝前駆細胞を製造し得る限り特に制限されない。培養温度としては、通常約３０〜４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。培養時のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲内であり、好ましくは約９５〜１００％の範囲内である。また、培養時のＯ２濃度は、正常酸素濃度（１８〜２２％Ｏ２）であっても、低酸素濃度（０〜１０％Ｏ２）であってもよい。培養期間としては、通常２〜１５日間の範囲内、好ましくは３〜１５日間の範囲内、より好ましくは７〜１５日間の範囲内、さらに好ましくは７〜１４日間の範囲内、より好ましくは７〜１２日間の範囲内を挙げることができる。培養期間は、目的に応じて適宜調整することができ、より長期間培養すると、得られる細胞数は減少するものの、肝細胞への分化がより進んだ肝前駆細胞を得ることができる。なお、培地交換は必要に応じて行うことができ、好ましくは１〜２日に一度、より好ましくは２日に一度行うことが挙げられる。
【００５２】
多能性幹細胞の培養は、培養容器内にコーティングした細胞外マトリックス（例えば、ラミニン−１〜１２、コラーゲン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、マトリゲル（ベクトンディッキンソン社製）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（インヴィトロジェン社製）など）上で行うことが好ましい。また、多能性幹細胞は、フィーダー細胞と共培養してもよいし、しなくてもよい。フィーダー細胞としては、多能性幹細胞の増殖、維持に寄与する細胞であればいずれも使用可能であり、例えば、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＴ２細胞、ＰＡ６細胞、好ましくは、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、ＳＬ１０細胞などを用いることができる。フィーダー細胞を用いるときには、例えば、マイトマイシンＣ処理或いは放射線照射などにより、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。
【００５３】
本発明の肝前駆細胞の製造方法は、解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程（以下、「工程Ａ」とも表示する。）以外に、任意の工程を有していてもよい。かかる任意の工程としては、工程Ａの後、前記肝前駆細胞誘導培地から肝前駆細胞を分取する工程が挙げられる。
【００５４】
本発明の肝前駆細胞の製造方法は、工程Ａを行う前に、多能性幹細胞を、グルコースを含まない培地（例えばＨＳＭ培地やＨＤＩ培地）で培養する工程Ｐを含んでいてもよいが、含んでいないことが好ましい。工程Ａを行う前に、該工程Ｐを含んでいない方が、肝前駆細胞の減少をより多く抑制することができ、より多くの肝前駆細胞を得ることができるからである。
【００５５】
また、本発明の肝前駆細胞の製造方法は、工程Ａの後に、肝前駆細胞をＨＤＩ培地で培養する工程Ｑを含んでいてもよいが、含んでいないことが好ましい。また、本発明の肝前駆細胞の製造方法は、工程Ａの後に、肝前駆細胞をＨＳＭ培地で培養する工程Ｒを含んでいなくてもよい。本発明の肝前駆細胞誘導培地は、多能性幹細胞から肝前駆細胞へ分化誘導する培地であるが、肝前駆細胞へ分化誘導すると共に、肝前駆細胞を緩やかに選択する性質も併せ持っている。本発明の肝前駆細胞誘導培地は解糖系抑制剤を有しており、グルコースの代謝が阻害されているため、肝細胞系細胞以外の細胞は生存し難い傾向があるからである。しかし、肝前駆細胞等の肝細胞系細胞（好ましくは肝前駆細胞）を、より選択的かつより高精度に分取又は単離する観点から、本発明の肝前駆細胞の製造方法は、工程Ａの後に、肝前駆細胞をＨＳＭ培地で培養する工程Ｒを含んでいることが好ましい。背景技術に記載したように、ＨＳＭ培地は、肝前駆細胞等の肝細胞系細胞は数日間生存することができるが、肝細胞系細胞以外の細胞はすみやかに死滅するため、肝細胞系細胞の選択培地としては優れている。ＨＳＭ培地の組成を以下の表４、表５に示し、ＨＤＩ培地の組成を以下の表６に示し、Ｌ１５培地の組成を以下の表７に示す。なお、表５のＨＳＭ培地の組成は、インスリン、デキサメタゾン、アプロチニンを含んでいないこと以外は、表４のＨＳＭ培地の組成と同じである。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
2018011538.tif 000006
【００５８】
【表６】
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【００５９】
【表７】
2018011538.tif 000008
【００６０】
本発明の肝前駆細胞の製造方法により、多能性幹細胞から肝前駆細胞や肝細胞が分化誘導されたことは、肝前駆細胞や肝細胞の公知マーカーの発現を検出することにより確認することができる。肝芽細胞等の肝前駆細胞のマーカーとしてはＡＦＰやＤＬＫ−１が挙げられ、肝細胞のマーカーとしては、薬物代謝に関連するＣＹＰ３Ａ４や、アルコール代謝に関連するＡＬＤＨ２の他、アルブミンが挙げられる
【００６１】
肝前駆細胞や肝細胞のマーカーの検出は、細胞内の対象タンパク質のｍＲＮＡを逆転写後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応などの公知の遺伝子工学的手法によって測定するか、さらに、被検タンパク質に対する抗体を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）や免疫染色法によっても確認できるが、これら方法に限定されず、公知の方法をいずれも使用することができる。
【００６２】
本発明の肝前駆細胞の製造方法により得られる細胞培養物は、肝前駆細胞を含む細胞培養物である。「細胞培養物」とは、細胞を培養した後に得られる細胞群をいう。本発明における細胞培養物には、未分化能を有する細胞は実質的に含有されていない。「実質的に含有されていない」とは、肝前駆細胞と未分化能を有する細胞との比（肝前駆細胞：未分化能を有する細胞）が１０００：１以下、好ましくは１００００：１以下、さらに好ましくは１０００００：１以下であることをいう。また、本細胞培養物には、肝前駆細胞の他、肝前駆細胞からさらに分化した細胞が含まれていることがある。
【００６３】
本発明の肝前駆細胞の製造方法により得られる培養細胞物は、例えば、劇症肝炎、部分肝切除術後、または肝硬変の自然経過中に生じる肝不全などの肝疾患の移植治療を含む再生医療に医薬として用いることができる。本発明の肝前駆細胞の製造方法により得られる細胞培養物を有効成分として含有する医薬は、薬理学的に許容される生理食塩水、添加剤、または培地などを含んでもよいが、異種血清やウィルスなどの不純物の混入のないものが好ましい。
【００６４】
本発明の肝前駆細胞の製造方法により得られる細胞培養物はまた、in vitroで、適当な培養条件下で培養することにより、肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化させることができる。例えば、肝前駆細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や、非実質細胞が産生するＨＧＦおよびＴＧＦβなどの種々の細胞外基質の関与が報告されており、これら物質を利用して肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導をin vitroで実施できる。このように、本発明の肝前駆細胞の製造方法により得られた細胞培養物は、さらに公知の方法で分化誘導させることにより、肝実質細胞や胆管上皮細胞を得るために使用することができる。
【００６５】
さらに、肝細胞を含む細胞培養物は、肝細胞の有する薬物代謝機能やアルコール代謝機能に関するin vitroでの試験や、肝細胞に対する薬剤の毒性試験などに、利用することができる。
【００６６】
本発明の培地添加剤としては、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地に添加するための培地添加剤であって、解糖系抑制剤を含んでいる限り特に制限されない。本発明の培地添加剤は解糖系抑制剤を有効成分として含有している。本発明の培地添加剤は、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導する際に、肝前駆細胞をより長期間培養し、及び／又は、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得るための培地添加剤である。
【００６７】
本発明の培地添加剤は、粉末状、粒状、顆粒状等の固体状であってもよいし、液体状であってもよい。固体状の培地添加剤は、固体状の解糖系抑制剤を用いて作製することができる。また、液体状の培地添加剤は、解糖系抑制剤を、水等の溶媒に溶解又は懸濁することにより作製することができる。
【００６８】
本発明の培地添加剤の使用態様は、培地に添加する際に希釈して用いる態様を含む場合があるため、該培地添加剤における解糖系抑制剤の含有量としては特に制限されず、培地添加剤全量に対する割合として例えば０．０１〜９９．９９重量％の範囲内、好ましくは０．１〜９９．９重量％の範囲内、より好ましくは１〜９９重量％の範囲内、さらに好ましくは３〜８０重量％の範囲内、より好ましくは１０〜６０重量％の範囲内が挙げられる。
【００６９】
本発明の培地添加剤は、解糖系抑制剤のみを含有していてもよいし、他の任意成分を含有していてもよい。任意成分としては、グルコース、担体、溶媒などが挙げられる。
【００７０】
本発明の培地添加剤がグルコースを含んでいる場合、そのグルコース濃度としては特に制限されないが、解糖系抑制剤の合計モル濃度：グルコースのモル濃度の比率が例えば１：１８５〜１：２２２０００の範囲内、好ましくは１：２２２〜１：９２５００の範囲内が挙げられる。
【００７１】
本発明の培地添加剤は、上記の肝前駆細胞誘導培地に添加すること等により使用することができる。本発明の培地添加剤を添加した肝前駆細胞誘導培地には、解糖系抑制剤とグルコースが含まれているようにすることが好ましい。そのようにして調製した肝前駆細胞誘導培地は、多能性幹細胞から肝前駆細胞への培養に好適に用いることができる。
【００７２】
本発明の培地添加剤を添加した肝前駆細胞誘導培地における、解糖系抑制剤（好ましくは２ＤＧ、３ＢＰ）、グルコース、その他の培地成分の態様や濃度は、本発明における「肝前駆細胞誘導培地」について前述したのと同様である。
【００７３】
また、本発明の培地添加剤と、ＨＳＭ培地とを組み合わせて、培養キットとすることもできる。かかる培養キットは、本発明の培地添加剤と、ＨＳＭ培地とを少なくとも含んでいる。かかる培養キットは、
解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程Ａ、及び、
工程Ａの後に、肝前駆細胞をＨＳＭ培地で培養する工程Ｒ
を含む本発明の肝前駆細胞の製造方法に好適に用いることができる。すなわち、かかる培養キットは、多能性幹細胞から肝前駆細胞へ分化誘導し、及び、肝細胞系細胞（好ましくは肝前駆細胞）を選択するための培養キットである。なお、ＨＳＭ培地の組成は、上記表４に示されている。
【００７４】
本発明の分化誘導培地としては、多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地であって、解糖系抑制剤とグルコースとを含んでいる限り特に制限されない。なお、本発明の分化誘導培地は、解糖系抑制剤とグルコースを有効成分として含有している。本発明の分化誘導培地は、多能性幹細胞から肝前駆細胞へ分化誘導するための培地であり、より詳しくは、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導する際に、肝前駆細胞をより長期間培養し、及び／又は、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得るための「多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導培地」である。
【００７５】
本発明の分化誘導培地は、粉末状、粒状、顆粒状等の固体状であってもよいし、液体状であってもよい。本発明の分化誘導培地の使用態様は、水等の溶媒で希釈して用いる態様を含む場合があるため、該分化誘導培地における解糖系抑制剤の含有量としては特に制限されず、該解糖系抑制剤（乾燥重量）の、分化誘導培地の固形分全量（乾燥重量）に対する割合として例えば１．０×１０−７〜１．０重量％の範囲内、好ましくは１．０×１０−６〜０．１重量％の範囲内、より好ましくは１．０×１０−５〜０．１重量％の範囲内が挙げられる。
【００７６】
本発明の分化誘導培地におけるグルコースの濃度としては特に制限されず、グルコース（乾燥重量）の、分化誘導培地の固形分全量（乾燥重量）に対する割合として例えば０．２〜１０重量％の範囲内、好ましくは０．５〜５重量％の範囲内、より好ましくは０．８〜３．２重量％の範囲内、さらに好ましくは１〜２．２重量％の範囲内、より好ましくは１．３〜２重量％の範囲内が挙げられる。
【００７７】
本発明の分化誘導培地中の解糖系抑制剤の合計モル濃度：グルコースのモル濃度の比率としては、例えば１：１８５〜１：２２２０００の範囲内、好ましくは１：２２２〜１：９２５００の範囲内が挙げられる。
【００７８】
本発明の分化誘導培地における、解糖系抑制剤とグルコース以外の成分としては、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び１又は２種類以上のその他成分が挙げられる。該肝前駆細胞誘導培地は、グルコース以外に、１又は２種類以上の糖（類）をさらに含んでいてもよいが、含んでいなくてもよい。解糖系抑制剤（好ましくは２ＤＧ、３ＢＰ）、グルコース、その他の培地成分の態様や濃度は、本発明における「肝前駆細胞誘導培地」について前述したのと同様である。
【００７９】
本発明の分化誘導培地の好適な態様として、該分化誘導培地の固形分の各成分の組成（重量部）が、ＷＥ培地の固形分の各成分の重量部（表３）に対して、各成分ごとに独立に７０〜１３０％の範囲内の割合の重量部の各成分を含む培地が挙げられる。
【００８０】
本発明の分化誘導培地はその態様に応じて、そのまま、あるいは、適宜希釈して、肝前駆細胞誘導培地として使用することができる。肝前駆細胞誘導培地として使用する際の、解糖系抑制剤やグルコースの態様や濃度は、本発明における「肝前駆細胞誘導培地」について前述したのと同様である。
【００８１】
また、本発明の分化誘導培地と、ＨＳＭ培地とを組み合わせて、培養キットとすることもできる。かかる培養キットは、本発明の分化誘導培地と、ＨＳＭ培地とを少なくとも含んでいる。かかる培養キットは、
解糖系抑制剤とグルコースとを含む肝前駆細胞誘導培地で、多能性幹細胞を培養する工程Ａ、及び、
工程Ａの後に、肝前駆細胞をＨＳＭ培地で培養する工程Ｒ
を含む本発明の肝前駆細胞の製造方法に好適に用いることができる。すなわち、かかる培養キットは、多能性幹細胞から肝前駆細胞へ分化誘導し、及び、肝細胞系細胞（好ましくは肝前駆細胞）を選択するための培養キットである。なお、ＨＳＭ培地の組成は、上記表４に示されている。
【００８２】
［参考例１］
［培地におけるグルコース等の有無の、肝臓特異的遺伝子の発現への影響］
グルコースを含まず、ガラクトースを含む培地（グルコース不含及びガラクトース含有培地）での培養が、ヒトｉＰＳ細胞における肝臓特異的遺伝子の発現にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。実験の方法は、後述の実施例の（方法）の３．〜６．の方法にしたがった。
【００８３】
ＨＳＭ培地やＨＤＩ培地は、グルコースを含まず、ガラクトースを含んでおり、アルギニンを含んでおらず、オルニチンを含んでいる。ReproFF（リプロセル社製）は、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を、未分化を維持して培養するための培地である。ReproFFの組成は公表されておらず、不明であるが、少なくともグルコースを含有していると考えられる。
【００８４】
肝臓特異的遺伝子の発現レベルを分析するために、２０１Ｂ７細胞（理研細胞バンクのヒトｉＰＳ細胞）をReproFF培地、ＨＳＭ培地、又はＨＤＩ培地にて２日間培養した。培養した細胞からＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＰＣＲに供し、細胞質型アスパラギン酸アミノ基転移酵素（cytosolic aspartate aminotransferase； Ｃｙｔｏ ＡＳＴ）（図１Ａ）、ミトコンドリア型アスパラギン酸アミノ基転移酵素（mitochondrial aspartate aminotransferase； Ｍｉｔｏ ＡＳＴ）（図１Ｂ）、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase；ＡＬＴ）（図１Ｃ）、及びグリコーゲン合成酵素（glycogen synthase； ＧＳ）（図１Ｄ）の発現レベルを分析した。それらの結果を、図１Ａ〜Ｄに示す。
【００８５】
図１の結果から分かるように、ＨＳＭ培地やＨＤＩ培地で培養した場合は、ReproFFで培養した場合と比較して、ミトコンドリアＡＳＴ、ＡＬＴ及びグリコーゲン合成酵素の発現レベルが著しく（Ｐ＜０．０５）増加した（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。また、ＨＳＭ培地やＨＤＩ培地で培養した場合は、ReproFFで培養した場合と比較して、細胞質ＡＳＴの発現レベルが著しく（Ｐ＜０．０５）増加した（図１Ａ）。これらの結果から、培地においてグルコースを含まないこと、又は、アルギニンを含まないこと、並びに、ガラクトース及びオルニチンを含むことにより、肝臓特異的遺伝子及びグリコーゲン合成酵素が増加することが示された。
【００８６】
［参考例２］
［培地におけるガラクトースの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響］
参考例１の試験の結果（図１）において、ガラクトースがヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７細胞）の肝細胞分化に影響した可能性を検討するために、以下の実験を行った。実験の方法は、後述の実施例の（方法）の３．〜６．の方法にしたがった。なお、ＤＦ１２培地（ダルベッコ改変イーグル培地／Nutrient F-12 Ham培地）を用いた場合は、後述の実施例の（方法）において、ＷＥ培地に代えて、ＤＦ１２培地を用いた。
【００８７】
ガラクトースを添加又は無添加のＬ１５培地、ＷＥ培地及びＤＦ１２培地で２０１Ｂ７細胞を培養した。培養した細胞からＲＮＡを単離して、リアルタイム定量ＰＣＲに供し、肝前駆細胞等のマーカーであるα−フェトプロテイン（α-feto protein：ＡＦＰ）の発現レベルを分析した。それらの結果を図２に示す。
【００８８】
図２の結果から分かるように、Ｌ１５培地（リーボビッツ１５培地）、ＷＥ培地（ウィリアムＥ培地）、ＤＦ１２培地（ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２混合培地）のいずれの場合においても、ガラクトースの添加の有無によってＡＦＰの発現レベルにほとんど差がなかった。これらの結果から、ガラクトースが２０１Ｂ７細胞の肝細胞系統への分化には何ら影響しないことが示された。
【００８９】
［参考例３］
［培地においてグルコースを含まず、ガラクトースを含むことの、ＧＡＬＫ１プロモーター活性及びＧＡＬＫ２プロモーター活性への影響］
本発明者らは、ＧＡＬＫ１（ガラクトキナーゼ１）遺伝子及びＧＡＬＫ２（ガラクトキナーゼ２）遺伝子の発現レベルが、グルコース無添加で、ガラクトースを補充したＨＤＩ培地にて培養した２０１Ｂ７細胞で増加することを既に見いだしている（Tomizawa M, Shinozaki F, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S and Ishige N: AnOptimal Medium Supplementation Regimen for Initiation of Hepatocyte Differentiation in Human Induced Pluripotent Stem Cells. J Cell Biochem 116: 1479-1489, 2015）。ＨＤＩ培地は、オンコスタチンＭ及び低分子化合物で補充されている。したがって、オンコスタチンＭ及び低分子化合物がＧＡＬＫ１及びＧＡＬＫ２の発現に影響する可能性がある。そこで、グルコース無添加で、ガラクトースを補充した培地における、ＧＡＬＫ１及びＧＬＡＫ２のプロモーター活性の変化を明らかにするために、２０１Ｂ７細胞をＨＳＭ培地で培養した後、Metridiaルシフェラーゼ活性アッセイを行うこととした。なお、比較対照として、ＨＳＭ培地に代えて、ReproFF培地や、ＷＥ培地にて培養を行った２０１Ｂ７細胞について、Metridiaルシフェラーゼ活性アッセイを行うこととした。ReproFF培地は、前述したように、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を、未分化を維持して培養するための培地である。また、ＷＥ培地は、元々、初代肝細胞培養のために構築された培地である（Wu D, Ramin SA and Cederbaum AI: Effect of pyridine on the expression of cytochrome P450 isozymes in primary rat hepatocyte culture. Mol Cell Biochem 173： 103-111, 1997 ; Takeba Y, Matsumoto N, Takenoshita-Nakaya S, et al.: Comparative study of culture conditions for maintaining CYP3A4 and ATP-binding cassette transporters activity in primary cultured human hepacytes. J Pharmacol Sci 115: 516-524, 2011）。Metridiaルシフェラーゼ活性アッセイは以下のような方法で行った。
【００９０】
（Metridiaルシフェラーゼ活性アッセイに用いるプラスミド構築）
pLightSwitch Prom（SwitchGear Genomics社製）のＧＡＬＫ１プロモーターから、ＧＡＬＫ１プロモーターのSac1-Hind3断片を、pMetLuc2-reporter(Promega Corporation社製）へとサブクローニングし、pMetLuc2/GALK1を作製した。pLightSwitch Prom(SwitchGear Genomics社製）のＧＡＬＫ２プロモーターから、ＧＡＬＫ２プロモーターのSac1-Hind3断片を、pMetLuc2-reporter(Promega Corporation社製)へとサブクローニングし、pMetLuc2/GALK2を作製した。なお、コントロール用のプラスミドとして、ＣＭＶプロモーターをpMetLuc2-reporter(Promega Corporation社製) へとサブクローニングし、pMetLuc2-controlを作製した。
【００９１】
（トランスフェクション及びMetridiaルシフェラーゼ活性アッセイ）
２０１Ｂ７細胞をMatrigel（登録商標）で被覆した９６−ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に播種した。製品の説明書にしたがって、各ウェル１００ｎｇのpMetLuc2-control、pMetLuc2/GALK1又はpMetLuc2/GALK2を、FuGENE HD（Clontech社製）で、２０１Ｂ７細胞にトランスフェクトした（Tomizawa M,  Shinozaki F, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S and Sueishi M: Dual gene expression in embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells using episomal vectors. Tissue Eng Part A 20: 3154-3162, 2014）。レポータープラスミドであるpMetLuc2-control、pMetLuc2/GALK1又はpMetLuc2/GALK2は、培地に分泌されるMetridiaルシフェラーゼを発現する。pMetLuc2-controlは、サイトメガロウィルスの前初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター)により駆動し、Metridiaルシフェラーゼを発現する。ルシフェラーゼアッセイは、ReproFF培地、ＷＥ培地又はＨＳＭ培地で２日間培養後、Ready-To-Glow分泌型ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Clontech社製）及びGene Light（GL-200A）ルミノメーター（マイクロテック・ニチオン社製）を使用して実施した。トランスフェクション効率をモニターするために、１０ｎｇのｐＳＥＡＰ２コントロールベクター（Clontech社製）を黒色９６ウェルＦＩＡプレートの各ウェルに使用し、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）化学発光キット（Clontech社製）及び、Gene Lightルミノメーターを製品の説明書にしたがって使用して、転写活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、Metridiaルシフェラーゼ活性をＳＥＡＰ活性（発光量）で除して算出した。Metridiaルシフェラーゼ活性は、pMetLuc2-controlを用いた場合の結果（ＣＭＶ）に対して正規化した。Metridiaルシフェラーゼ活性は、pMetLuc2-controlを用いた場合の発光量（ＣＭＶ）に対する相対発光量（％）として示した。なお、MetridiaルシフェラーゼのＡＦＰ発光量の相対発現レベルは、ＪＭＰ５．０Ｊソフトウェア（SAS Institute社製）を使用して、一元配置分散分析によって分析した。Ｐ値＜０．０５の差を統計的に有意とした。
【００９２】
このようなMetridiaルシフェラーゼ活性アッセイの結果を図３に示す。図３から分かるように、pMetLuc2/GALK1を用いた場合の結果（ＧＡＬＫ１）、及び、pMetLuc2/GALK2を用いた場合の結果（ＧＡＬＫ２）のいずれにおいても、ＨＳＭ培地で培養した場合は、ReproFF培地で培養した場合と比較して、Metridiaルシフェラーゼ活性が顕著に（Ｐ＜０．０５）高いことが示された。すなわち、グルコース無添加で、ガラクトースを補充した培地でヒトｉＰＳ細胞を培養した場合の、ＧＡＬＫ１遺伝子及びＧＡＬＫ２遺伝子の発現レベルの増加は、ＧＡＬＫ１プロモーター活性及びＧＡＬＫ２プロモーター活性の増加によるものであることが示された。
【００９３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００９４】
（方法）
１．［細胞培養］
ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７（理研細胞バンク）を、Matrigel（登録商標）(Becton Dickinson社製）で被覆した１０ｃｍの培養皿（旭テクノグラス社製）にて、フィーダーフリー条件下、ReproFF培地（リプロセル社製）で培養した。かかる培養は、湿式チャンバー内にて、３７℃、５％二酸化炭素条件下で行った。細胞がコンフルエントになった時に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、Accutase（登録商標）（Innovative Cell Technologies）で採取した。継代培養する場合は、４〜５日毎に、採取した細胞を新しい培養皿のMatrigelに広げて、培養を継続した。また、採取した細胞を観察する場合は、かかる細胞を顕微鏡(CKX41N-31PHP，オリンパス社製）で観察した。
【００９５】
２．［試薬］
１００×ＮＥＡＡ（Non-Essential Amino Acids Solution）及び１００×ピルビン酸ナトリウムをLife Technologies社から購入した。アポトーシス阻害剤（Ｍ５００５４）（２，２’−メチレンピス（１，３−シクロヘキサンジオン）)をMerck社から購入した。ＦＰＨ１（２−（Ｎ−（５−クロロ−２−メチルフェニル）メチルスルフォンアミド）−Ｎ−（２，６−ジフルオロフェニル）アセトアミド）をXcessBio社から購入した（Shan J, Schwartz RE, Ross NT, et al.: Identification of small molecules for human hepatocyte expansion and iPS differentiation. Nat Chem Biol 9: 514-520, 2013）。オンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ニコチンアミド（１．２ｍｇ／ｍＬ）、プロリン（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＬーグルタミン（０．３ｍｇ／ｍＬ）を和光純薬工業株式会社から購入した。２−デオキシ−Ｄ−グルコース（2-Deoxy-d-glucose；２ＤＧ）をSigma-Aldrichから購入した。
【００９６】
３．［肝細胞選択培地及び肝細胞分化開始培地］
ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７（理研細胞バンク）を、Matrigel（登録商標）で被覆した６−ウェルプレートで、ＨＳＭ培地又はＨＤＩ培地にて２日間培養し、リアルタイム定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供した。ＨＳＭ培地は、リーボビッツ−１５（Leibovits-15）培地（Life Technologies社製）の処方にしたがってアミノ酸から調製し、ただし、アルギニン、チロシン、グルコース及びピルビン酸ナトリウムを省略し、ガラクトース（９００ｍｇ／Ｌ）（和光純薬工業社製）、オルニチン（１ｍＭ）（和光純薬工業社製）、グリセロール（５ｍＭ）（和光純薬工業社製）及びプロリン（２６０ｍＭ）（和光純薬工業社製）を添加して調製した（Tomizawa M, Shinozaki F, Sugiyama T, Yamamoto S, Sueishi M and Yoshida T: Survival of primary human hepatocytes and death of induced pluripotent stem cells in media lacking glucose and arginine. PLoS One 8: e71897, 2013）。プロリン（３０ｍｇ／Ｌ）は、ＤＮＡ合成に必要なため、添加した（Nakamura T, Teramoto H, Tomita Y and Ichihara A: L-proline is an essential amino acid for hepatocyte growth in culture. Biochem Biophys Res Commun 122: 884-891, 1984）。アスパラギン酸は、オルニチン代謝産物の一つであり、アルギニン合成のための基質であるため、添加しなかった。ＦＣＳの代わりにKnockout（登録商標）Serum Replacement（Life Technologies社製）を１０％の最終濃度で添加し、ゼノフリー（xeno-free）限定条件を確立した。ＨＤＩ培地は、オンコスタチンＭ、ＦＰＨ１、Ｍ５００５４、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム、ニコチンアミド、プロリン及びグルタミンを添加して調製した。プロリン及びニコチンアミドは、初代肝細胞増殖（Nakamura T, Teramoto H, Tomita Y and Ichihara A: L-proline is an essential amino acid for hepatocyte growth in culture. Biochem Biophys Res Commun 122: 884-891, 1984、Mitaka T, Sattler CA, Sattler GL, Sargent LM and Pitot HC: Multiple cell cycles occur in rat hepatocytes cultured in the presence of nicotinamide and epidermal growth factor. Hepatology 13: 21-30, 1991）に必要である。各試薬の濃度は上記の通りである。
【００９７】
４．［３ＢＰ又は２ＤＧを添加又は無添加の従来培地での培養］
２０１Ｂ７細胞を採取し、６−ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に播種し、ReproFF培地、リーボビッツ−１５（Ｌ１５）培地又はウィリアムＥ培地(ＷＥ）にて培養した。ReproFF培地、Ｌ１５培地及びＷＥ培地にはいずれも、１．２ｍｇ／ｍＬのニコチンアミド、３０ｎｇ／ｍＬのプロリン及び１０％ Knockout（登録商標）Serum Replacement（Life Technologies社製）を補充した。ニコチンアミド及びプロリンは初代肝細胞増殖に必要なため、各培地に添加した（Nakamura T, Teramoto H, Tomita Y and Ichihara A: L-proline is an essential amino acid for hepatocyte growth in culture. Biochem Biophys Res Commun 122: 884-891, 1984; Mitaka T, Sattler CA, Sattler GL, Sargent LM and Pitot HC: Multiple cell cycles occur in rat hepatocytes cultured in the presence of nicotinamide and epidermal growth factor. Hepatology 13: 21-30, 1991）。いくつかの実験では、０．１、１．０若しくは１０μＭの２ＤＧ(Sigma-Aldrich）、及び／又は、１０μＭの３ＢＰ(Sigma-Aldrich）を培地に添加した。また、いくつかの実験では、９００ｍｇ／ｍＬのガラクトースを培地に添加した。７日間の培養後、細胞を顕微鏡（CKX41N-31PHP;オリンパス社製）で観察するか、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供した。
【００９８】
５．［リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ)］
Isogen（ニッポンジーン社製）で単離した５μｇ（マイクログラム）の全ＲＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡの合成のために、SuperScript III逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（Life Technologies社製）と共に、製品の説明書に従って用いられた。ヒト胎児肝臓（human fetal liver）由来の全ＲＮＡは、Clontech社から購入した。リアルタイムｑＰＣＲをFast SYBR Green Master Mix(Life Technologies社製）で実施し、結果をMini Opticonシステム（Bio-Rad社製）を使用して分析した。リアルタイムｑＰＣＲは、変性５秒間及びアニーリング５秒間からなるサイクルを４０サイクル実施した。アニーリング温度は６０℃とした。各遺伝子に対応するプライマー配列を表８に示す。なお、本実施例では用いなかったが、胆管上皮細胞マーカーであるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｇ−ＧＴＰ）遺伝子に対応するプライマー配列も表８に示す。
【００９９】
【表８】
2018011538.tif 000009
【０１００】
ＲＰＬ１９遺伝子は構成的に発現するハウスキーピング遺伝子なので、ｍＲＮＡの量をモニターするための内在性コントロールとして使用した（Davies B and Fried M: The L19 ribosomal protein gene (RPL19): gene organization, chromosomal mapping, and novel promoter region. Genomics 25: 372-380, 1995）。遺伝子の発現レベルは、デルタ−デルタサイクル閾値（ｄｄＣｔ）法に基づいて、Mini Opticonシステムによって自動的に分析した（Tam S, Clavijo A, Engelhard EK and Thurmond MC: Fluorescence-based multiplex real-time RT-PCR arrays for the detection and serotype determination of foot-and-mouth disease virus. J Virol Methods 161: 183-191, 2009）。各肝臓特異的遺伝子の、ＲＰＬ１９遺伝子に対する相対的な発現レベルは、各肝臓特異的遺伝子の発現レベルをＲＰＬ１９の発現レベルで除することにより算出した。
【０１０１】
６．［統計分析］
遺伝子の相対発現レベルは、ＪＭＰ５．０Ｊソフトウェア（SAS Institute社製）を使用して、一元配置分散分析によって分析した。Ｐ値＜０．０５の差を統計的に有意とした。
【０１０２】
（結果１）［培地における２ＤＧの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響］
グルコースアナログである２ＤＧの、２０１Ｂ７細胞の肝細胞分化への影響を分析するために、２ＤＧ添加（０．１μＭ、１．０μＭ又は１０μＭ）又は無添加のReproFF培地で、２０１Ｂ７細胞を培養し、その細胞のＡＦＰ遺伝子の発現レベルを分析した。また、２ＤＧと、ガラクトース（９００ｍｇ／ｍｌ）を併用等した場合の、２０１Ｂ７細胞の肝細胞分化への影響も分析した。
【０１０３】
具体的には、上記４．の方法で２０１Ｂ７細胞を培養し、培養した細胞からＲＮＡを単離して、上記５．の方法でリアルタイム定量ＰＣＲを行い、ＡＦＰの発現レベルを分析した。なお、２ＤＧ無添加及びガラクトース無添加のReproFF培地で培養した２０１Ｂ７細胞のＡＦＰ遺伝子の発現レベルを、コントロールの発現レベルとした。
【０１０４】
かかる分析の結果を図４に示す。図４から分かるように、ガラクトース無添加の培地を用いた場合、ＡＦＰの発現レベルは、０．１μＭ又や１０μＭで顕著（Ｐ＜０．０５）に増加した。また、ガラクトース添加培地を用いた場合、ＡＦＰの発現レベルは、０．１μＭで顕著（Ｐ＜０．０５）に増加した。これらの結果から、２ＤＧは２０１Ｂ７細胞の肝細胞分化を促進することが示された。なお、０．１μＭ ２ＤＧ添加及びガラクトース無添加の場合と比較して、０．１μＭ ２ＤＧ添加及びガラクトース添加の場合は、ＡＦＰの発現レベルが有意に増加した。
【０１０５】
（結果２）［培地における２ＤＧの有無、３ＢＰの有無の、細胞の形態学的特徴や細胞数への影響］
３ＢＰは、ピルビン酸塩のアナログであり、２ＤＧはグルコースのアナログである。これらの試薬は、解糖系の阻害剤として知られている。培地における２ＤＧの有無や３ＢＰの有無が２０１Ｂ７細胞の形態学的特徴へどのような影響を与えるか、及び、培地における２ＤＧの有無や３ＢＰの有無が細胞数の推移にどのような影響を与えるかを分析するために、以下の培養実験を行った。
【０１０６】
具体的には、上記４．の方法にしたがって、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰ及び／若しくは２ＤＧを添加したＬ１５培地又はＷＥ培地にて培養した。コントロールとして、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰも２ＤＧも添加しないＬ１５培地又はＷＥ培地にて培養した。さらに、別のコントロールとして、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰも２ＤＧも添加しないReproFF培地又はＨＤＩ培地にて培養した。培養開始から７日目にそれぞれの群の細胞を顕微鏡で観察した結果を図５に示す。
【０１０７】
これらの結果から分かるように、３ＢＰ及び／若しくは２ＤＧを添加したＬ１５培地又はＷＥ培地で培養した細胞の形態学的特徴を、ReproFF培地で培養した細胞の形態学的特徴と比較したところ、特に差異は認められなかった。なお、グルコースを含有せず、ガラクトースを含有するＨＤＩ培地の場合、培養後の細胞数はきわめて少なくなってしまうことも明らかとなった。
【０１０８】
また、かかる培養実験を１０日間行った際に各群の細胞数（cells/cm2）を培養開始直前（Ｄ０）、培養開始後７日目（Ｄ７）、培養開始後１０日目（Ｄ１０）に計測した結果を以下の表９に示す。
【０１０９】
【表９】
2018011538.tif 000010
【０１１０】
表９の結果から分かるように、グルコースを含まず、ガラクトースを含むＬ１５培地では、Ｄ７、Ｄ１０へと細胞数が大幅に減少した。一方、ＷＥ培地を用いた場合は、Ｌ１５培地を用いた場合と比較して、Ｄ７やＤ１０における細胞数の減少が抑制された。これは、ＷＥ培地ではグルコースを含んでいるのに対し、Ｌ１５培地ではグルコースを含んでいないことが主な原因と考えられた。また、ＷＥ培地を用いた場合、Ｄ７では、ＷＥ ３ＢＰ、ＷＥ ２ＤＧ、ＷＥ ３ＢＰ ２ＤＧはＷＥ（−）よりも細胞数が少なかったが、Ｄ１０では、ＷＥ ３ＢＰ、ＷＥ ２ＤＧ、ＷＥ ３ＢＰ ２ＤＧはＷＥ（−）よりも細胞数が多かった。すなわち、ＷＥ培地において、３ＢＰ及び／又は２ＤＧを添加すると、細胞数の減少が抑制されることが示された。このことから、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導する際の培地として、グルコースを含み、かつ、解糖系抑制剤（３ＢＰ及び／又は２ＤＧ）を含む培地を用いると、細胞数の減少を抑制することができることが示された。
【０１１１】
（結果３）［培地における２ＤＧの有無、３ＢＰの有無の、α−フェトプロテイン遺伝子の発現への影響］
培地における２ＤＧの有無や３ＢＰの有無が、２０１Ｂ７細胞におけるα−フェトプロテイン遺伝子の発現へどのような影響を与えるかを分析するために、以下の培養実験を行った。
【０１１２】
具体的には、上記４．の方法にしたがって、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰ及び／若しくは２ＤＧを添加したＬ１５培地又はＷＥ培地にて培養した。コントロールとして、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰも２ＤＧも添加しないＬ１５培地又はＷＥ培地にて培養した。さらに、別のコントロールとして、２０１Ｂ７細胞を、３ＢＰも２ＤＧも添加しないReproFF培地にて培養した。７日間の培養後、各群の細胞からＲＮＡを単離して、上記５．の方法でリアルタイム定量ＰＣＲを行い、ＡＦＰの発現レベルを分析した。なお、３ＢＰも２ＤＧも添加しないReproFF培地で培養した２０１Ｂ７細胞のＡＦＰ遺伝子の発現レベルを、コントロールの発現レベルとした。
【０１１３】
かかる分析の結果を図６に示す。ＷＥ培地において、３ＢＰ、２ＤＧのいずれかを添加した場合は、いずれも無添加の場合よりも、ＡＦＰの発現レベルは若干低いものの、ReproFF培地の場合よりもＡＦＰの発現レベルは有意に高かった。また、ＷＥ培地において、３ＢＰ、２ＤＧを両方添加した場合は、いずれも無添加の場合よりも、ＡＦＰの発現レベルは高かった。このように、３ＢＰと２ＤＧを両方添加すると、より高いＡＦＰ発現レベルが得られるため、より好ましいことが分かった。
【０１１４】
一方、グルコースを含まず、ガラクトースを含むＬ１５培地を用いた場合も、３ＢＰや２ＤＧの添加や無添加にかかわらず、ReproFF培地の場合よりもＡＦＰの発現レベルは有意に高かった。しかし、上記（結果２）の結果に示されるように（表９）、Ｌ１５培地を用いた場合は、Ｄ７やＤ１０における２０１Ｂ７細胞の減少の程度が大きいため、多能性幹細胞から肝前駆細胞を培養する培地としては好ましくはない。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造する際に、多能性幹細胞から肝前駆細胞を誘導し得る従来の培地（特にＨＤＩ培地又はＬ１５培地）と比較して、肝前駆細胞をより長期間培養することができ、及び／又は、肝前駆細胞の減少を抑制してより多くの肝前駆細胞を得ることができる。
【図１】
2018011538.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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