(57)【要約】      （修正有）【課題】インビトロでの科学的および医療的な調査のための、生きている、三次元の組織構成物、そのアレイ、および前記組織およびアレイを提供する。【解決手段】生きている、三次元の組織構成物であって、前記組織構成物は、少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、前記組織構成物は血管チューブでない多層構造を有し、前記組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織の成分がバイオプリントされたことを条件とする、ことを特徴とする組織構成物。【選択図】図１３
2018171065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている、三次元の組織構成物であって、前記組織構成物は、少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、前記組織構成物は血管チューブでない多層構造を有し、前記組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織の成分がバイオプリントされたことを条件とする、ことを特徴とする組織構成物。
【請求項２】
組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ないことを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項３】
組織構成物は、平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置される、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項４】
組織構成物は、複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる、複数の層を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項５】
非接着細胞型をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項６】
組織構成物は、生体適合性の表面に固定されることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項７】
生体適合性の表面は、多孔質膜であることを特徴とする、請求項６に記載の組織構成物。
【請求項８】
生体適合性の表面は、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子、の１つ以上でコーティングされることを特徴とする、請求項６に記載の組織構成物。
【請求項９】
組織構成物は、１つ以上の側面で、流体流によって引き起こされる、せん断力にさらされることを特徴とする、請求項６に記載の組織構成物。
【請求項１０】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最小の寸法が少なくとも約２５μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１１】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最大の寸法が約３ｃｍを超えないことを特徴とする、請求項１０に記載の組織構成物。
【請求項１２】
インビトロでのアッセイに使用するための、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１３】
薬物検査に使用するための、請求項１２に記載の組織構成物。
【請求項１４】
接着細胞は、分化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１５】
接着細胞は、非分化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１６】
接着細胞は、肝臓、胃腸、膵臓、腎臓、肺、気管、血管、骨格筋、心臓、皮膚、平滑筋、結合組織、角膜、尿生殖器、乳房、生殖器、内皮、上皮、線維芽細胞、神経、シュワン、脂肪、骨、骨髄、軟骨、周細胞、中皮、内分泌、間質、リンパ、血液、内胚葉、外胚葉、および中胚葉、から成る群から選択される組織から生じたことを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１７】
組織構成物は、血管壁セグメントであることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
【請求項１８】
生きている、三次元の組織構成物のアレイであって、各組織構成物は、少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、各組織構成物は多層構造を有し、各組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織の成分がバイオプリントされたことを条件とする、ことを特徴とするアレイ。
【請求項１９】
各組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ないことを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】
接着細胞は、肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周細胞、中皮細胞、内分泌組織由来の細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせ、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２１】
アレイ内の各組織構成物は、略類似していることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２２】
アレイ内の組織構成物の１つ以上は、独特であることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２３】
アレイ内の１つ以上の個々の組織は、血管またはリンパ管、筋肉、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、乳房、膵臓、ひ臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、前立腺、内分泌組織、内胚葉、中胚葉、また外胚葉、から成る群から選択されるヒト組織を表わすことを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２４】
各組織構成物は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル中に存在することを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２５】
ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子、の１つ以上でコーティングされることを特徴とする、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２６】
各組織構成物は、マルチウェル容器のウェル内の、多孔性の、生体適合性の膜上へと置かれたことを特徴とする、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２７】
マルチウェル容器は、自動化または半自動化の薬物スクリーニングのプロセスと適合性があることを特徴とする、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２８】
各組織構成物は、生体適合性の表面に固定されることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項２９】
生体適合性の表面は、多孔質膜であることを特徴とする、請求項２８に記載のアレイ。
【請求項３０】
生体適合性の表面は、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子、の１つ以上でコーティングされることを特徴とする、請求項２８に記載のアレイ。
【請求項３１】
各組織構成物は、１つ以上の側面で、流体流によって引き起こされる、せん断力にさらされることを特徴とする、請求項２８に記載のアレイ。
【請求項３２】
アレイ内の各組織構成物は、培養下で独立して維持されることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項３３】
アレイ内の２つ以上の個々の組織構成物は、可溶性因子を交換することを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項３４】
インビトロでのアッセイに使用するための、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項３５】
薬物検査で使用するための、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３６】
アレイ内の少なくとも１つの組織は、血管壁セグメントであることを特徴とする、請求項１８に記載のアレイ。
【請求項３７】
生きている、三次元の組織構成物であって、前記組織構成物は、１つ以上の層を含み、ここで、各層は、１つ以上の細胞型を含有し、１つ以上の層は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集され、前記組織構成物は、
ａ．平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および
ｂ．複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる複数の層、の少なくとも１つを有することを特徴とする組織構成物。
【請求項３８】
組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされたことを特徴とする、請求項３７に記載の組織構成物。
【請求項３９】
組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ないことを特徴とする、請求項３８に記載の組織構成物。
【請求項４０】
インビトロでのアッセイに使用するための、請求項３７に記載の組織構成物。
【請求項４１】
薬物検査に使用するための、請求項４０に記載の組織構成物。
【請求項４２】
生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法であって、前記方法は、
ａ．少なくとも１つの接着細胞型を含むバイオインクを、形態内へとまたは形態上へとバイオプリントする工程；および
ｂ．バイオインクを、生きている、三次元の組織構成物へと融合する工程を含み；
但し、組織構成物は、インビトロでの使用のためのものであり、血管チューブではない、ことを特徴とする方法。
【請求項４３】
組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドがないことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記形態は、バイオプリントされることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記形態は、バイオインクで略同時にバイオプリントされることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記形態を溶解する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法であって、前記方法は、
ａ．哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；
ｂ．ｉ．平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および
ｉｉ．複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる複数の層、の少なくとも１つを形成するために、前記１つ以上の凝集した多細胞集合体を、支持体上へと置く工程；
ｃ．前記１つ以上の多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項４８】
組織構成物の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされたことを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドがないことを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生きている、三次元の組織構成物のアレイを構成する方法であって、前記方法は、
ａ．哺乳動物細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；
ｂ．前記凝集した多細胞集合体を支持体上へと置く工程であって、ここで、前記多細胞集合体は、組織アレイに適した形態で空間的に配置される工程；および
ｃ．前記多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記多細胞集合体をインキュベートする工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
各組織構成物の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされたことを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
各組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ないことを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１１年９月１２日に出願の米国特許出願第６１／５３３，７５７号、２０１１年９月１２日出願の米国特許出願第６１／５３３，７５３号、および２０１１年９月１２日出願の米国特許出願第６１／５３３，７６１号の利益を主張し、これらすべては、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
新しい医薬品化合物の研究開発費は、およそ１８億ドルである。Ｐａｕｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｈｏｗ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ Ｒ＆Ｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ： ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ'ｓ ｇｒａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９（３）：２０３−２１４を参照。創薬は、薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。創薬のプロセスは、一般に少なくとも次の工程を含んでいる：治療上の有効性に関する、候補の識別、合成、特徴づけ、スクリーニング、およびアッセイ。技術の進歩および生物系の理解にもかかわらず、創薬はまだ、新しい治療上の発見の率が低い、長い、高価な、非能率的なプロセスである。
【発明の概要】
【０００３】
持続不可能な研究開発費を課すことなく、革新的でコスト効率の良い新薬の数および品質を実質的に増加させる、材料、ツールおよび技術も必要とされている。したがって、発明者は、操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）哺乳動物組織および血管壁セグメント、そのアレイ、および組織および臓器の培養、インビトロでのアッセイ、創薬、および他の領域において有用性を有するその製造方法を本明細書で記載する。
【０００４】
１つの態様では、本明細書には、生きている、三次元の組織構成物が開示され、前記組織構成物は、少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、前記組織構成物は血管チューブでない多層構造を有し、前記組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織構成物の成分がバイオプリントされた（ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ）ことを条件とする。幾つかの実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、組織構成物は、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層を含み、前記複数の層は、平面の幾何学的形状（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を作り出すために、互いに対して空間的に配置される。幾つかの実施形態では、組織構成物は、複数の層を含み、少なくとも１つの層は、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる。幾つかの実施形態では、組織構成物は、非接着細胞型をさらに含む。幾つかの実施形態では、組織構成物は、生体適合性の表面に固定される。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、多孔質膜である。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、以下の：生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子の１つ以上でコーティングされる。またさらなる実施形態では、組織構成物は、１つ以上の側面で、流体流によって引き起こされる、せん断力にさらされる。幾つかの実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最小の寸法が少なくとも約２５μｍである。幾つかの実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最大の寸法が約３ｃｍを超えない。幾つかの実施形態では、組織構成物は、インビトロでのアッセイに使用するためのものである。さらなる実施形態では、組織構成物は、薬物検査に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、接着細胞は、分化細胞である。他の実施形態では、接着細胞は、非分化細胞である。幾つかの実施形態では、接着細胞は、肝臓、胃腸、膵臓、腎臓、肺、気管、血管、骨格筋、心臓、皮膚、平滑筋、結合組織、角膜、尿生殖器、乳房、生殖器、内皮、上皮、線維芽細胞、神経、シュワン、脂肪、骨、骨髄、軟骨、周細胞、中皮、内分泌、間質、リンパ、血液、内胚葉、外胚葉、および中胚葉、から成る群から選択される組織から生じた。幾つかの実施形態では、組織構成物は、血管壁セグメントである。
【０００５】
別の態様では、本明細書には、生きている、三次元の組織構成物のアレイが開示され、各組織構成物は：少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、各組織構成物は多層構造を有し、各組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、各組織構成物の少なくとも１つの成分がバイオプリントされたことを条件とする。幾つかの実施形態では、各組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、接着細胞は：肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周細胞、中皮細胞、内分泌組織由来の細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせ、から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、アレイ内の組織構成物は、略類似している。他の実施形態では、アレイ内の組織構成物の１つ以上は、独特である。幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の個々の組織は：血管またはリンパ管、筋、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、乳房、膵臓、ひ臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、前立腺、内分泌組織、内胚葉、中胚葉、および外胚葉、から成る群から選択されるヒト組織を表わす。幾つかの実施形態では、各組織構成物は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル中に存在する。さらなる実施形態では、ウェルは：生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子、の１つ以上でコーティングされる。さらなる実施形態では、各組織構成物は、容器のウェル内の多孔性の、生体適合性の膜上へと置かれた。さらなる実施形態では、容器は、自動化または半自動化の薬物スクリーニングのプロセスと適合性がある。幾つかの実施形態では、各組織構成物は、生体適合性の表面に固定される。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、多孔質膜である。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、以下の：生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、または増殖因子、の１つ以上でコーティングされる。またさらなる実施形態では、各組織構成物は、１つ以上の側面で、流体流によって引き起こされる、せん断力にさらされる。幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織構成物は、培養下で独立して維持される。他の実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織構成物は、可溶性因子を交換する。幾つかの実施形態では、アレイは、インビトロでのアッセイで使用するためのものである。さらなる実施形態では、アレイは、薬物検査に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、アレイ内の少なくとも１つの組織は、血管壁セグメントである。
【０００６】
別の態様では、本明細書には、生きている、三次元の組織構成物が開示され、前記組織構成物は：１つ以上の層を含み、ここで、各層は、１つ以上の細胞型を含有し、１つ以上の層は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集され、前記組織構成物は：平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる、複数の層、の少なくとも１つを有することを特徴とする。幾つかの実施形態では、組織構成物の少なくとも１つの成分がバイオプリントされた。さらなる実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、組織構成物は、インビトロでのアッセイに使用するためのものである。さらなる実施形態では、組織構成物は、薬物検査に使用するためのものである。
【０００７】
別の態様では、本明細書には、生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法が開示され、前記方法は：少なくとも１つの接着細胞型を含むバイオインクを、形態内へとまたは形態上へとバイオプリントする工程；およびバイオインクを生きている、三次元の組織構成物へと融合する工程を含み；但し、組織構成物は、インビトロでの使用のためのものであり、血管チューブではない。幾つかの実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドがない。幾つかの実施形態では、形態は、バイオプリントされる。さらなる実施形態では、形態は、バイオインクで略同時にバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、方法は、形態を溶解する工程をさらに含む。
【０００８】
別の態様では、本明細書には、生きている、三次元の組織構成物を構成する方法が開示され、前記方法は：哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる、複数の層、の少なくとも１つを形成するために、前記１つ以上の凝集した多細胞集合体を、支持体上へと置く工程；および前記１つ以上の多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程を含む。幾つかの実施形態では、組織構成物の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドがない。
【０００９】
本明細書には、生きている、三次元の組織構成物のアレイを構成する方法が開示され、前記方法は：哺乳動物細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；組織アレイに適した形態で空間的に配置される、前記凝集した多細胞集合体を、生体適合性の支持体上へと置く工程；および前記多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記多細胞集合体をインキュベートする工程を含む。幾つかの実施形態では、各組織構成物の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、各組織構成物は、バイオプリンティング時または使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を引用することによって、および以下の添付図面によって得られるであろう。
【００１１】
【図１】図１は、円柱状のフォーマットで多型の（ｐｏｌｙｔｙｐｉｃ）ＳＭＣ：ＥＣのバイオインクで構成された、バイオプリントされた血管壁セグメントの限定しない例を描写する。細胞型の分布および位置を示すために、様々な染色条件が示される。
【図２ａ】図２ａは、８５：１５の比率でＨＡＳＭＣ：ＨＡＥＣの多型のバイオインクのシリンダー（ｂｉｏ−ｉｎｋ ｃｙｌｉｎｄｅｒｓ）によって構成された、バイオプリントされた血管壁セグメントの限定しない例を描写するマクロ画像である。
【図２ｂ】図２ｂは、８５：１５の比率でＨＡＳＭＣ：ＨＡＥＣを含むバイオインクによって構成された、バイオプリントされた血管壁セグメントの限定しない例を描写する。ＨＡＥＣは、ＣＤ３１に対して染色される。
【図３】図３は、ＳＭＣのみのバイオインクのシリンダーによって構成され、その後、ＥＣ濃度を含む第２層のバイオプリンティングが続き、層状の構造を作り出す、バイオプリントされた血管壁セグメントの限定しない例を描写する。細胞型の分布および位置を示すために、様々な染色条件が示される。
【図４ａ】図４ａは、ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）の第１層上にバイオプリントされたＨＡＳＭＣによって構成され、続いて、ＨＡＥＣによって層状にされ、三層の層状の構造を作り出す、バイオプリントされた血管壁セグメントの限定しない例を描写する。ＨＡＳＭＣは、アルファＳＭＡに対して染色される。
【図４ｂ】図４ｂは、同時印刷したＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の格納窓内にバイオプリントされ、ＨＡＥＣによって層状にされるが、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）格子（ｌａｔｔｉｃｅ）（例えば、メッシュ）の第３の層が上にない、ＨＡＳＭＣのバイオインクの限定しない例を描写するマクロ画像である。
【図５】図５は、バイオプリントされた細胞シートおよび一時的なまたは除去可能なバイオプリントされた格納格子の構造の限定しない例であり；また、それを作り上げるための典型的な工程が描写される。
【図６】図６は、操作した肝臓組織、この場合、水溶性の押出化合物（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（例えばＰＦ−１２７）中でカプセル化された、複数の肝細胞型で構成されたバイオインクを使用する連続的な堆積機構を使用してバイオプリントされた、多層の肝臓組織の限定しない例を描写するマクロ画像である。（Ａ）は、バイオインクおよびネガティブスペースのパターン化によって作り出された平面の幾何学的形状を強調する単一の機能ユニットの概略図を示し；（Ｂ）は、碁盤目状の、バイオプリントされた機能ユニットを示し；（Ｃ）および（Ｄ）は、培地の適用および押出化合物の溶解の後の構成物を示し；経時的な平面の幾何学的形状の保持に言及する（ｎｏｔｅ）。
【図７】図７は、図６のＨ＆Ｅの染色された碁盤目状の構成物の顕微鏡写真であり、碁盤目状の構成物における典型的な「スポーク（ｓｐｏｋｅ）」を描写する。
【図８】図８は、層状の幾何学的形状を有するバイオプリントされた新生組織（ｎｅｏｔｉｓｓｕｅ）の、限定しない概略図（Ａ）、マクロ写真（Ｂ）、および一連の顕微鏡写真（Ｃ−Ｅ）である。
【図９】図９は、バイオプリントされた組織中の細胞のパターン化および層状化を描写する、一連の顕微鏡写真（Ａ−Ｄ）である。
【図１０】図１０は、層状の幾何学的形状を有するバイオプリントされたヒト肺組織の構成物の限定しない概略図であり、成形（ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）のための工程を描写する（Ａ−Ｄ）。
【図１１】図１１は、バイオプリントされたヒト肺組織の特徴を描写する、一連の顕微鏡写真（Ａ−Ｈ）である。
【図１２】図１２は、（Ａ）バイオプリンティング直後の、（Ｂ）培地中の２４時間のインキュベーション後の、バイオプリントされた血管壁セグメントを描写する、１対のマクロ写真である。
【図１３】図１３は、静的および流動的条件下でマルチウェルの細胞培養の挿入物上にバイオプリントされた層状の幾何学的形状を有する多層の血管壁セグメントの分析を描写する、一連の顕微鏡写真（Ａ−Ｆ）である。
【図１４】図１４は、（Ａ）マルチウェルのプレートに、または（Ｂ）マルチウェルの細胞培養の挿入物内にバイオプリントされた組織を描写する、１対の限定しないマクロ写真である。
【図１５】図１５は、ＴＧＦ−β１を有するバイオプリントされた多層の血管壁セグメントの刺激を描写する、１対の限定しない顕微鏡写真である。
【図１６】図１６は、ＴＧＦ−β１を有する肝臓の星細胞を含有している、バイオプリントされた肝臓組織の刺激を描写する、一連の顕微鏡写真（Ａ−Ｈ）である。
【図１７】図１７は、（Ａ）各三角形への細胞ペーストのバイオプリンティングによるＰＦ−１２７のパターン化した６層の六角形の連続的な堆積のバイオプリンティングによって、続いて、（Ｂ）ＰＦ−１２７の縁（ｂｏｒｄｅｒ）の溶解によって形成された、同時成形された機能的な肝臓組織のミクロ構造を描写する１対のマクロ写真である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、平面の幾何学的形状の一連の限定しない例である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、平面の幾何学的形状の一連の限定しない例である。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、平面の幾何学的形状の一連の限定しない例である。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、層状の幾何学的形状の一連の限定しない例である。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、層状の幾何学的形状の一連の限定しない例である。
【図１８Ｆ】図１８Ｆは、本明細書に記載される構成の方法と適合性があり、天然組織の構造および生態の構造的または空間的な要素を再生する、平面の幾何学的形状と層状の幾何学的形状の組み合わせの一連の限定しない例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、再生医療と組織及び／又は臓器の工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、操作された哺乳動物組織のアレイ、操作された血管壁セグメント、そのアレイ、および成形の方法に関する。
【００１３】
本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物が開示され、前記組織構成物は：少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、前記組織構成物は血管チューブでない多層構造を有し、前記組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織の成分がバイオプリントされたことを条件とする。
【００１４】
また本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物のアレイが開示され、各組織構成物は：少なくとも１つの接着細胞型を含み、前記少なくとも１つの接着細胞型は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集且つ融合され、各組織構成物は多層構造を有し、各組織構成物はインビトロでの使用のためのものであり、但し、少なくとも１つの組織の成分がバイオプリントされたことを条件とする。
【００１５】
また本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物が開示され、前記組織構成物は：１つ以上の層を含み、ここで、各層は、１つ以上の細胞型を含有し、１つ以上の層は、生きている、三次元の組織構成物を形成するために凝集され、前記組織構成物は：平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる、複数の層、の少なくとも１つを有することを特徴とする。
【００１６】
また本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法が開示され、前記方法は：少なくとも１つの接着細胞型を含むバイオインクを、形態内へとまたは形態上へとバイオプリントする工程；およびバイオインクを生きている、三次元の組織構成物へと融合する工程を含み；但し、組織構成物は、インビトロでの使用のためのものであり、血管チューブではない。
【００１７】
また本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法が開示され、前記方法は：哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる、複数の層、の少なくとも１つを形成するために、前記１つ以上の凝集した多細胞集合体を、支持体上へと置く工程；および前記１つ以上の多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程を含む。
【００１８】
また本明細書には、特定の実施形態において、生きている、三次元の組織構成物のアレイを構成するための方法が開示され、前記組織構成物は：哺乳動物細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；組織アレイに適した形態で空間的に配置される、前記凝集した多細胞集合体を、生体適合性の支持体上へと置く工程；および前記多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記多細胞集合体をインキュベートする工程を含む。
【００１９】
＜特定の定義＞
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
本明細書及び添付の請求項に使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりと特に指示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「核酸」への言及は、１つ以上の核酸、及び／又は本開示などを読むことで当業者に明らかになるであろう本明細書に記載されるタイプの組成物などを含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールを意味する。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「アッセイ」は、有機サンプルまたは生体サンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「生体適合性の」は、細胞に対する損傷または毒性の危険性が限られていることを意味する。明細書と請求項で示されるように、「生体適合性のマルチウェル容器」および「生体適合性の膜」は、哺乳動物細胞に対する損傷または毒性の危険性を限定するが、定義は、生体適合性の要素が哺乳動物へとインビボで注入され得ると示唆するまでには至らない。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「バイオプリンティング」は、自動化または半自動化した、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピング装置（例えば、バイオプリンター）と適合性のある方法を介して、細胞（例えば、細胞溶液、細胞を含むゲル剤、細胞懸濁液、細胞濃縮液（ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）、多細胞集合体、多細胞体など）の三次元の正確な堆積を利用することを意味する。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「血管」は、平滑筋細胞を包含する壁および内腔を覆う（ｌｉｎｉｎｇ）内皮細胞を有し、１００μｍより長い内径を有するが、非血管組織を含む三次元の組織構成物の成分として存在しない、単一の簡素な又は分枝した管状構造を意味する。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、および「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、細胞集合体、多細胞集合体、及び／又はそれらの層に結合する細胞間接着の特性を指す。前記用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、および「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と交換可能に使用される。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「層状の」は、ｚ平面で組織の全体厚を増加させるために２つ以上の平面層が組み合わせられる、多層のバイオプリントされた組織を意味する。幾つかの実施形態では、各平面層は、構造及び／又は組成において略類似している。他の実施形態では、各平面層は、構造及び／又は組成において大幅に異なる。例えば、図１８Ａ−１８Ｆを参照。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「多層の」は、組織の２つ以上の層で構成されていることを意味し、各組織層は、厚さで１つ以上の層である。幾つかの実施形態では、組織の層は、一つずつ堆積される。他の幾つかの実施形態では、複数の層は、同時に堆積される。随意に、各層は、複数の細胞型で構成される。さらに、各層内の複数の細胞型は、随意に、ｘ−ｙ平面（すなわち、横平面）での空間的に定義された構造において互いに相対的に配置される。さらに、ｚ平面（すなわち、縦平面）における層の付加は、幾つかの場合において、空間的に定義された構造がｚ平面で継続されるように、互いに相対的な層内の細胞の制御された空間の位置決めを結果的にもたらす。
【００２９】
本明細書で使用されるように「平面（ｐｌａｎａｒ）」は、へ複数のバイインクの組成物及び／又は空所が、組織層のｘ−ｙ平面内で互いに相対的に、定義されたパターンへと配置される、多細胞のバイオプリントされた組織の層を意味する。例えば、図１８Ａ−１８Ｆを参照。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「スキャフォールド,」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層、死細胞の層、および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠である、および前記組織及び／又は臓器の損傷／破壊なしで前記組織及び／又は臓器から取り除かれることができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる実施形態では、脱細胞化組織のスキャフォールドは、例えば、生きている間に生成したＥＣＭを残して、死滅される又は脱細胞化される細胞層などの、任意の方法における培養細胞によって生じた、脱細胞化した天然組織または脱細胞化した細胞物質を含む。それ故、用語「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」は、スキャフォールドが、使用時に操作した組織の不可欠な部分ではない、つまり、取り除かれたか、または操作した組織の不活性の成分として残っているかを示唆するように意図される。「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」は、「スキャフォールドのない（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」および「予め形成されたスキャフォールドのない（ｆｒｅｅ ｏｆ ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と交換可能に使用される。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「被験体」は、ヒト、ヒト以外の動物、任意の哺乳動物、または任意の脊椎動物である、任意の個体を意味する。前記用語は、「患者」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網様結合組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、尿生殖器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、内胚葉由来組織、中胚葉由来組織、および外胚葉由来組織を含む。
【００３３】
＜組織工学＞
組織工学は、臓器または組織の増大、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用し、組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性であり、最終的に生物分解性である環境（例えば、スキャフォールド）へと生細胞を播種し、その後、前駆細胞の集団が、移植後に標的組織を生成するように、さらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養することである。生物学的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドによって、発達中の組織は、幾つかの場合において、インビトロおよびインビボの成熟後に所望の臓器の形態と機能の両方を取り入れる。しかしながら、天然組織のような構造を有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたる細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、しばしば結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされる。さらなる困難は、スキャフォールドの生物分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける：
・  １つ以上の層が、他の層とは組成的に又は構造的に異なる、または１つ以上の層が、互いに対して空間的に定義された位置で複数の細胞型を含む、多層構造などの、複雑な平面及び／又は層状の幾何学的形状は、しばしば、天然組織のような結果を再生可能な方法で達成するために、具体的な構造内に細胞型の明確で高分解性の配置を必要とする。
・  尺度および幾何学的形状は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
・  組織の生存能力は、幾つかの場合において、拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれる。
【００３４】
本明細書には、特定の実施形態において、操作した哺乳動物組織、操作した血管壁セグメント、そのアレイ、および成形の方法が開示される。本明細書に開示される組織工学の方法は、以下の利点を有する：
・  細胞を含む組織及び／又は臓器を生成することができる。
・  再形成する天然組織のような細胞間の相互作用によって、天然組織の、発達、恒常性機能、及び／又は病因内で見られる環境条件を模倣する。
・  随意に、広範囲の複雑なトポロジーおよび幾何学的形状（例えば、多層構造、セグメント、シート、チューブ、嚢など）を有する、生きている、三次元の組織および化合物組織を達成する。
・  製造の自動化または半自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
【００３５】
バイオプリンティングは、インビトロでのアッセイに有用なものを含むマイクロスケールの組織アナログを生成する方法を向上させることができる（以下を参照）。
【００３６】
＜バイオプリンティング＞
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む、操作した組織の少なくとも１つの成分およびそのアレイが、バイオプリントされる。さらなる実施形態では、バイオプリントされた構成物は、三次元の送達装置（例えば、バイオプリンター）によって、（例えば、ヒドロゲル及び／又は多孔質膜で作られた）生体適合性のある表面上に、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃縮液、多細胞体（例えば、円柱、楕円体、リボンなど）、および随意に制限物質を含む、細胞の三次元の、自動化した、コンピューター支援の堆積に基づいて、急速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、組織及び／又は臓器に言及するために使用されるときの、用語「操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲル剤またはペースト剤、細胞濃縮液、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピュータースクリプトに従うコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって、三次元構造を形成するために位置付けられる。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態では、三次元の組織構造は、幾つかの場合において、初期の形態形成で自己集合現象に類似した細胞または多細胞体のプリンティング後の融合を介して形成される。
【００３７】
手動での配置を含む三次元構造をもたらすために、生体適合性のある表面上に、細胞、多細胞集合体、及び／又はそれらの層を配置する多くの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機械による位置決めが利点となっている。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、多細胞集合体及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の、計画された又は予め決められた配向またはパターンを示す構成物をもたらすために、細胞または多細胞体の、急速で、正確で、再生可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むことである。
【００３８】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続的及び／又は略連続的である。連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ｔｉｐ）（例えば、注射器、注射針、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインクを分注することである。さらに限定しない実施形態では、連続的なバイオプリンティング方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンでバイオインクを分注することである。様々な実施形態では、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円形、四角形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的形状を有し、その結果、異なるバイオインク及び／又は空所の空間的なパターン化によって達成された平面の幾何学的形状を有する１つ以上の組織層をもたらす。さらなる実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットの繰り返しのパターンは、層を含み、複数の層は、幾何学的形状を有する操作した組織または臓器を形成するために、隣接してバイオプリントされる（例えば、積み重ねられる）。様々な実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、操作した組織または臓器を形成するために、隣接してバイオプリントされる（例えば、積み重ねられる）。さらなる実施形態では、層状の幾何学的形状を有する組織の１つ以上の層はまた、平面の幾何学的形状を有している。
【００３９】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、碁盤目状のパターンで繰り返す。「碁盤目状のパターン」は、重なりや隙間で平面を満たさない図の平面である。図６のＡは、図６のＢ−Ｄおよび図７で描写される碁盤目状のパターンをもたらすための、随意に繰り返される機能ユニットの例を示す。連続的な及び／又は碁盤目状のバイオプリンティングの利点は、限定しない例として、バイオプリントされた組織の増加した生産性を含む。別の限定しない、典型的な利点は、以前に堆積したバイオインクの要素を有するバイオプリンターを並べる必要性を排除することである。幾つかの実施形態では、連続的なバイオプリンティングは、随意に注射器の機構を使用して、バイオインクの大きな貯蔵器からのより大きな組織のプリンティングを促進する。連続的なバイオプリンティングはまた、押出化合物、ヒドロゲル、ポリマー、バイオインク、またはプリンティング後にその形状を保持することができる任意のプリント可能な物質を使用して、空間的に定義された境界線（ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）を同時印刷するための好適な方法であり；ここで、作り出される境界線は、１つ以上のバイオインクのバイオプリンティングによって随意に充填され、それによって、空間的に定義された平面の幾何学的形状を有するモザイク組織を作り出す（例えば、図１７で例証される実施形態を参照）。
【００４０】
幾つかの実施形態では、連続的なバイオプリンティングでの方法は、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに相対的に、最適化及び／又は平衡化する工程を含む。一例では、堆積のためのバイオプリンターヘッドの速度は、３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に関しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に関しては、０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態では、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径と略等しい。限定されることなく、適切及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に物質が分注針にぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態では、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおいてインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態では、バイオプリンターのバイオインク貯蔵器は、約０．０５．０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。ポンプ速度は、幾つかの場合において、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適である。好都合なポンプ速度は、幾つかの場合において、貯蔵器と分注針の断面積間の割合に依存し、分注針の割合が大きいと、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態では、適切な及び／又は最適な印刷速度によって、物質の機械的結着性に影響を与えることなく、一様な線の堆積が可能となる。
【００４１】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティは、移植のための操作した組織及び／又は臓器の作成、またはインビトロでのアッセイなどの、調査および開発のための細胞ベースのツールの作成における使用のための産業施設及び／又は商業施設を設計、建築、かつ経営するために利用される。さらなる実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそのアレイは、例えば、バイオアッセイおよび高スループットの薬物スクリーニングのための細胞アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、組織アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）およびキットとして作成、保存、分配され、市場に出され、広告、および販売される。他の実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそのアレイは、サービスとしてバイオアッセイ及び／又は薬物スクリーニングを行うために生成される且つ利用される。
【００４２】
＜操作した組織＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、少なくとも１つの接着細胞型を含む、生きている、三次元の組織構成物が開示され、ここで、少なくとも１つの接着細胞型は、多層の構造を有する組織構成物を形成するために凝集される且つ融合される。さらなる実施形態では、組織構成物の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、組織は、血管壁セグメントである（例えば、実施例１６および図１２および１３を参照）。それ故、本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、操作された血管壁セグメントが開示され、前記操作された血管壁セグメントは：平滑筋細胞；および随意に、線維芽細胞及び／又は内皮細胞を含み；ここで、細胞は、互いに凝集され；ここで、血管壁セグメントは、バイオプリントされ、非管状である。他の実施形態では、組織は、気道のアナログである（例えば、実施例１５および図１０および１１を参照）。幾つかの実施形態では、気道のアナログは：肺線維芽細胞、および随意に、平滑筋細胞及び／又は内皮細胞を含み、ここで、組織の少なくとも１つの表面は、小さな気管上皮細胞によって層状にされる。他の実施形態では、組織は、肝臓のアナログである（例えば、実施例１３および１９および図６のＡ−Ｄ、図７、図１７のＡ−Ｂを参照）。さらなる実施形態では、肝臓組織のアナログは：肝細胞または肝細胞様の細胞、および随意に、胆管上皮細胞、および随意に、限定されないが、星細胞、内皮細胞、クッパー細胞、免疫細胞、または筋線維芽細胞を含む、非実質細胞型を含む。
【００４３】
また本明細書には、特定の実施形態において、凝集した、哺乳動物細胞を含み、さらに哺乳動物細胞の１つ以上の層を含む、操作した組織が開示され、ここで、組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、組織層の１つ以上は、平面の幾何学的形状を特徴とし、ここで、複数の細胞型またはバイオインクの型及び／又は空所は、ｘ−ｙ平面で空間的に定義された位置にある。幾つかの実施形態では、組織は、多層であり、ここで、層の少なくとも１つは、他の層とは構造的または組成的に異なることで、組織は、幾何学的形状を特徴とする。さらなる実施形態では、層は、ｚ平面で類似した厚さを有する。またさらなる実施形態では、層は、ｚ平面で可変的な厚さを有する。さらなる実施形態では、任意の単層は、１つの細胞層の厚さである。幾つかの実施形態では、組織は、血管壁セグメントである。それ故、本明細書にはまた、特定の実施形態において、凝集した平滑筋細胞、および１つ以上の表面上に内皮細胞の層、１つ以上の表面上に線維芽細胞の層、またはその両方を含む、操作した血管壁セグメントが開示され、ここで、前記血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；および前記血管壁セグメントは、非管状である。他の実施形態では、組織は、気道のアナログである。幾つかの実施形態では、気道のアナログは：肺線維芽細胞、および随意に、平滑筋細胞及び／又は内皮細胞を含み、ここで、組織の少なくとも１つの表面は、小さな気管上皮細胞によって層状にされる。他の実施形態では、組織は、肝臓のアナログである。さらなる実施形態では、肝臓組織のアナログは：肝細胞または肝細胞様の細胞、および随意に、胆管上皮細胞、および随意に、限定されないが、星細胞、内皮細胞、クッパー細胞、免疫細胞、または筋線維芽細胞を含む、非実質細胞型を含む。
【００４４】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、バイオプリントされ、本明細書に方法論が記載される。さらなる実施形態では、操作した組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされる。さらなる実施形態では、バイオプリントされた成分は、凝集した平滑筋細胞を含む。またさらなる実施形態では、組織の追加の成分は、バイオプリントされる。さらなる実施形態では、追加のバイオプリントされた層は、線維芽細胞及び／又は内皮細胞を含む。さらなる実施形態では、組織は、製造時または使用時に本明細書にさらに記載されるような任意の予め形成されたスキャフォールドがない。幾つかの実施形態では、バイオプリンティングを含む、組織工学技術によって作り上げられた結果として、本発明の組織は、有機体の一部として、インビボで発達した組織とはさらに区別される。幾つかの実施形態では、操作した組織の１つの層は、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋線維芽細胞、周細胞、および内皮細胞などの様々な細胞型を含む、間質組織から成る。さらなる実施形態では、間質組織は、ジェネリックの（ｇｅｎｅｒｉｃ）、組織に特異的な内皮または上皮の細胞を含む第２組織型とともに１つ以上の表面上で層状にされる。またさらなる実施形態では、第２組織層は、近接し、基礎的な間質組織の層への分子の継代に対する関門（ｂａｒｒｉｅｒ））として機能する。
【００４５】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、任意の型の哺乳動物細胞を含む。様々なさらなる実施形態では、血管壁セグメントを含む組織は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、組織は、平滑筋細胞のみを含む。幾つかの実施形態では、組織は、平滑筋細胞および内皮細胞を含む。実施例３は、ヒト大動脈平滑筋細胞およびヒト大動脈内皮細胞から成る、多型の円柱状のバイオインクの成形を実証し、一方で実施例４は、血管壁セグメントを形成するためのそのような円柱のバイオプリンティングおよび融合を実証する（例えば、図１、２ａ、および２ｂを参照）。実施例７は、ヒトの吸引脂肪組織の間質血管細胞群から培養された平滑筋細胞および内皮細胞から成る、多型の円柱状のバイオインクの成形を実証し、一方で実施例８は、血管壁セグメントを形成するためのそのような円柱のバイオプリンティングおよび融合を実証する。他の実施形態では、組織は、平滑筋細胞および線維芽細胞を含む。また別の実施形態では、組織は、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞を含む。実施例５は、実施例６がバイオ印刷を実証する間に、ヒト大動脈平滑筋細胞、ヒト真皮線維芽細胞、およびヒト大動脈内皮細胞から成る、多型の円柱状のバイオインクの成形を実証し、一方で実施例６は、血管壁セグメントを形成するためのそのような円柱のバイオプリンティングおよび融合を実証する。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織の細胞は、互いに「凝集」または「接着」している。さらなる実施形態では、凝集または接着は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。
【００４６】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の表面上に細胞の１つ以上の層を含む。さらなる実施形態では、細胞の１つ以上の層は、凝集した平滑筋細胞の１つ以上の表面上にある。さらなる様々な実施形態では、凝集した平滑筋細胞の１つ以上の表面上に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の層がある。またさらなる様々な実施形態では、凝集した平滑筋細胞の１、２、３、４つまたはそれ以上の表面上に、細胞の少なくとも１つの層があり、これは、操作した組織において層状の幾何学的形状を作り出している。さらなる実施形態では、層の１つ以上は、平面の幾何学的形状を有することを特徴としている。またさらなる実施形態では、操作した組織の複数の層は、平面の幾何学的形状を有し；ここで、平面の幾何学的形状は、層間で可変的であるか、または同じである。またさらなる実施形態では、個々の層における平面の幾何学的形状（ｘ−ｙ平面）は、成形中にｚ平面に並び、その結果、さらなる幾何学的形状が、複合組織中のｚ平面に作られる（例えば、図１８Ｄ−Ｆに示される実施形態を参照）。
【００４７】
幾つかの実施形態では、組織の層は、細胞の単層を含む。さらなる実施形態では、単層は、集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）である。他の実施形態では、単層は、集密的ではない。幾つかの実施形態では、細胞の層は、バイオプリンターは、１つ以上の細胞のシート（ｓｈｅｅｔ）を含む。様々な実施形態では、細胞のシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の細胞の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、細胞のシートは、約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さであり、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、組織の層は、細胞の融合した集合体を含む。さらなる実施形態では、融合前に、細胞の集合体は、限定しない例として、略球状の、細長い、略円柱状の、およびリボン状の形状である、定義された形状及び／又は構造を有する。様々な実施形態では、細胞の融合した集合体は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍまたはそれ以上の厚さの層を形成し、それらにおいてインクリメントを含む。
【００４８】
幾つかの実施形態では、１つ以上の層は、任意の型の哺乳動物細胞を含む。様々なさらなる実施形態では、各層は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の、１８、１９、２０またはそれ以上の細胞型を含む．幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の表面上に内皮細胞の１つ以上の層を含む。実施例９は、円柱状の平滑筋細胞のバイオインクを含む血管の培地組織の層をバイオプリントすることによる、血管壁セグメントの構成、その後の、血管壁の培地および内膜を再現する層状の幾何学的形状を生成するために細胞濃縮液をＳＭＣの構成物上に直接バイオプリントすることによって達成された、内皮細胞の第２層の上面への適用を実証する。実施例１０は、ヒト大動脈平滑筋細胞を含む円柱状のバイオインクのバイオプリンティングによる血管壁セグメントの構成、その後の、内皮細胞の特別に位置決めされた液滴をＳＭＣ構成物上に堆積させることによって達成された、内皮細胞の層の上面への適用を実証する。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む、操作した組織は、１つ以上の表面上に線維芽細胞の１つ以上の層を含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の表面上に内皮細胞の１つ以上の層、および１つ以上の表面上に線維芽細胞の１つ以上の層を含む。さらなる実施形態では、内皮細胞の１つ以上の層は、線維芽細胞の１つ以上の単層と同じ表面上にある。他の実施形態では、内皮細胞の１つ以上の層は、線維芽細胞の１つ以上の単層の表面とは異なる表面上にある。さらなる実施形態では、多層の構造内の層の１つ以上は、さら平面の幾何学的形状を有することを特徴とする。
【００５０】
実施例１１は、ヒト大動脈平滑筋細胞を含む円柱状のバイオインクを線維芽細胞の第１層上へと直接バイオプリントすることによる血管壁セグメントの構成、その後の、内皮細胞を含む第３層の上面への適用を実証し、それによって、三層の層状の構造を作り出し、ここで、各層は、組成的に異なり、可変的な厚さおよび構造を有する（例えば、図１２を参照）。内皮細胞の層は、内皮細胞懸濁液の特別に位置決めされた液滴を構成物上に堆積させることによって適用される。実施例１１の手順は、凝集した平滑筋細胞、平滑筋細胞の１つの表面上に線維芽細胞の層、および平滑筋細胞の対向した表面上に線維芽細胞の層を含む、三層の組織を結果的にもたらす。各層内の細胞は、互いに凝集され、および層間の界面に位置した細胞も凝集され、その結果、細胞間相互作用（参照、例えば図４ａ、４ｂ）によって個々の層を一緒に結合する。血管壁セグメントを含む操作した組織は、様々な実施形態では、任意の適切なサイズである。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む、バイオプリントされた組織のサイズは、時間とともに変化する。さらなる実施形態では、バイオプリントされた組織は、縮めるまたは例えば、細胞移動、細胞死、細胞間の相互作用、収縮または減少の他の形態が原因で、バイオプリントした後に収縮または縮小する。他の実施形態では、バイオプリントされた組織は、例えば、細胞移動、細胞の成長および増殖、細胞外マトリックスの生成、または天然組織の他の細胞を生成した成分、細胞／組織の成熟または拡張の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に成長または拡張する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織の物理的な寸法は、構成物を内部に拡散するために、酸素を含む栄養素に対する能力によって限定される。様々な実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｍである。様々な実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、または５．０ｍｍである。さらなる実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、約２５μｍと約５００μｍの間である。他の実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、成形時に最大寸法で３ｃｍ未満である。
【００５２】
血管壁セグメントを含む操作した組織は、様々な実施形態において任意の適切な形状である。幾つかの実施形態では、形状は、特定の天然の組織または臓器を模倣するために選択される。さらなる実施形態では、形状は、特定の病理、疾病、または疾患の状態を模倣するために選択される。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、略平面の形状を有する。さらなる実施形態では、平面の組織は、限定しない例として、四角形、長方形、多角形、円形、卵形、または不規則な形を含む、任意の適切な平面の幾何学的形状を有する。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、特定の細胞またはバイオインクの成分及び／又は空所を、互いに相対的にｘ−ｙ平面に位置決めすることによって、操作した組織中で生み出される。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、実質的にシートまたはディスクである形状を有する。幾つかの実施形態では、操作した血管壁セグメントは、非管状の形状を有し、血管チューブよりもむしろ、血管壁セグメント、パッチ、またはシートである。
【００５３】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、格納容器に対する空間に組織の位置を固定するのに適切な手段によって格納容器に固定される。さらなる実施形態では、操作した組織は表面に付けられる。さらなる実施形態では、組織は、生体適合性の表面に付けられる。またさらなる実施形態では、複数の組織は、本明細書に記載されるように、表面に付けられることによって関連付けられ、アレイを形成するように空間的に配置される。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の側面で、流体流によって引き起こされる、せん断力にさらされる（例えば、図１３を参照）。さらなる実施形態では、せん断力の適用は、組織の成熟および発達を促進する、及び／又は細胞外マトリックスの移動、分化、増殖、または堆積、または組織内の細胞への又は細胞からのタンパク質または分子の輸送を促進する役割を果たす。
【００５４】
＜組織の幾何学的形状＞
天然組織は、組織の細胞および細胞外（すなわち、空所、細胞外マトリックス、タンパク性物質など）の成分によってもたらされた空間的および構成的なパターンの存在を特徴とする。三次元性を達成するために合成のスキャフォールドを展開させる（ｄｅｐｌｏｙ）組織工学の方策に対する固有の課題は、天然組織の幾何学的および生物学的な特質の両方を再生することができないことである。現在まで、天然組織を模倣する密度で細胞の取り込みも可能にしながら、スキャフォールドの構造内に天然組織のような層状または平面の幾何学的形状を作り出す試みは、技術的な制限によって妨げられている。バイオプリンティングは、図１８Ａ−Ｆで例証される例に従って、細胞で構成されたバイオインクの空間的に定義された堆積を介して両方の固有の課題（平面／層状の幾何学的形状および細胞密度）を克服する。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、複数のバイオインク製剤から作り出され、それによって、２つ以上の組織成分（すなわち、間質、上皮、血管、骨、軟骨、柔組織、皮質、骨髄、乳頭、小葉など）が、図１８Ａ−Ｃで述べられる例によって、ｘ、ｙ、及び／又はｚ平面において互いに相対的な定義された位置に各組織成分／細胞集団／バイオインク製剤を位置決めする方法で成形される。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、バイオプリンティングによって生成される。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、腺組織、癌組織、組織界面（例えば、骨：軟骨）、血管化した組織、ピラミッド形の組織、帯状の組織、または分葉状の組織の少なくとも１つの空間的要素を再現する。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、空所を組み込む。さらなる実施形態では、平面の幾何学的形状内の空所は、血液、リンパ液、胆液、尿、分泌液などの、体液の少なくとも１つの要素を模倣する流体に適応している。さらなる実施形態では、空所は、随意に、非接着細胞型または体液由来成分（例えば、血液細胞、骨髄細胞、リンパ細胞、免疫細胞、癌細胞、血小板、タンパク質など）を包含する。またさらなる実施形態では、体液由来成分の非接着細胞型は、随意に、成形の前、間、または後に、平面の幾何学的形状の細胞を含む成分へと導入された非空所の成分として存在する。またさらなる実施形態では、非接着細胞型または体液由来成分は、細胞間の相互作用または分泌された因子に対する反応の結果として、空所から平面の幾何学的形状内の細胞を含む空間へと動員される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、流体流または灌流は、随意に、幾何学的形状内の空所を通って開始される。幾つかの実施形態では、平面の幾何学的形状は、図１８Ｂで強調されるように、組織間または組織−液体間の界面の生成を可能にする。さらなる実施形態では、組織は、幾何学的形状によって作り出された界面で細胞の実時間の観察を可能にするために光学的に透明な容器へと成形される。
【００５６】
幾つかの実施形態では、組織は、複数の層を含み、ここで、層の少なくとも１つは、構成物内で他の層とは構造的または組成的に異なり、それによって、ｚ平面で層状の構造を作り出す。層状の構造の例は、図１８Ｄ−Ｆで示される例によって描写されるように、基礎的な間質組織に対する内皮または上皮の関門を有する関門組織を含む。幾つかの実施形態では、層状の組織は、管腔または管状の構造（例えば、腸、血管、リンパ管、尿細管、尿管、膀胱、気管、食道、気道、卵管、尿道、細管構造など）の壁の一部分を表わす。他の実施形態では、層状の組織は、組織（例えば、粘膜組織、被包組織、腎臓組織、心臓組織など）の領域または層を表わす（例えば、図８−１１を参照）。さらなる実施形態では、組織の１つ以上の層は、血管または微小血管の成分を組み込む。またさらなる実施形態では、血管または微小血管の成分の組み込みは、操作した組織の１つ以上の成分内での微小血管または偽血管網の形成につながる。幾つかの実施形態では、層状の幾何学的形状を有する組織の１つ以上の成分は、バイオプリントされる。幾つかの実施形態では、層状の幾何学的形状を有する１つ以上の組織は、互いに隣接して成形され、それによって、図１８Ｅで描かれるように、粘膜皮膚移行部などの組織界面を作り出す。
【００５７】
幾つかの実施形態では、層状の幾何学的形状を有する多層の操作した組織の１つ以上の層はまた、図１８Ｆ述べられる限定しない例に従って、平面の幾何学的形状を含む。幾つかの実施形態では、同じ平面の幾何学的形状は、各層において連続しており、結果的に、ｘ、ｙ、およびｚ平面内で連続的な構造を有する三次元の組織をもたらす。幾つかの実施形態では、１つ以上の層状の層の組成物または平面の幾何学的形状は、異なり、その結果、結果として生じる三次元の組織は、図１８Ｆで例証される尿細管の限定しない例によって、ｘ、ｙおよびｚ平面内で複雑な構造を有する。
【００５８】
＜細胞＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、１つ以上の型の哺乳動物細胞を含む操作した組織が開示される。本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、平滑筋細胞を含む操作した血管壁セグメント；および随意に、線維芽細胞及び／又は内皮細胞が開示される。他の実施形態では、組織は、気道のアナログである。幾つかの実施形態では、気道のアナログは：肺線維芽細胞、および随意に、平滑筋細胞及び／又は内皮細胞を含み、ここで、組織の少なくとも１つの表面は、小さな気管上皮細胞によって層状にされる。他の実施形態では、組織は、肝臓のアナログである。さらなる実施形態では、肝臓のアナログは：肝細胞または肝細胞様の細胞、および随意に、胆管上皮細胞、および随意に、限定されないが、星細胞、内皮細胞、クッパー細胞、免疫細胞、または筋線維芽細胞を含む、非実質細胞型を含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、任意の哺乳動物細胞は、操作した組織およびそのアレイに含まれることに適している。さらなる実施形態では、操作した組織の少なくとも１つの成分は、接着細胞型である。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、限定しない例として、収縮細胞または筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および造骨細胞へと分化する細胞、軟骨細胞、またはリンパ組織）、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳房細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、胃腸細胞、肝細胞、膵細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば、胚細胞、幹細胞、および前駆細胞）、内胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、癌由来の細胞およびそれらの組み合わせである。
【００６０】
１つの実施形態では、細胞は、平滑筋細胞である。別の実施形態では、細胞は、平滑筋細胞および線維芽細胞である。また別の実施形態では、細胞は、平滑筋細胞および内皮細胞である。また別の実施形態では、細胞は、平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞である。１つを超える細胞型を含む実施形態では、細胞型は、多くの適切な割合で存在し、それらの例は本明細書に記載される。
【００６１】
幾つかの実施形態では、成体の、分化細胞である。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、分離に、例えば、時平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞とともに、組織特異的な表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的な表現型（あるいは表現型を示す可能性）は、分離時から使用時まで維持される。他の実施形態では、細胞は、成体の、非分化細胞である。さらなる実施形態では、「非分化細胞」は、例えば、平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の明確な組織特異的な特性を有さない又は失くした細胞である。幾つかの実施形態では、非分化細胞は、幹細胞を含む。
【００６２】
さらなる実施形態では、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞である。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、多能性細胞、分化多能細胞、少能性細胞、分化単能細胞、および前駆細胞を含む。様々な実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、成体の、分化細胞、および成体の、非分化細胞の混合物である。
【００６３】
幾つかの実施形態では、平滑筋細胞は、ヒト平滑筋細胞である。幾つかの実施形態では、適切な平滑筋細胞は、限定しない例として、血液、血管、リンパ管を含む組織、消化管の組織、尿生殖路の組織、脂肪組織、気道の組織、生殖器系の組織、骨髄、および臍帯の組織を含む組織から生じた。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。幾つかの実施形態では、適切な内皮細胞は、限定しない例として、血液、血管、リンパ管を含む組織、消化管の組織、尿生殖路の組織、脂肪組織、気道の組織、生殖器系の組織、骨髄、および臍帯の組織を含む組織から生じた。幾つかの実施形態では、線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞である。幾つかの実施形態では、適切な線維芽細胞は、非血管性の線維芽細胞である。他の実施形態では、適切な線維芽細胞は、血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態では、細胞の幾つかまたはすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織に由来する。さらなる実施形態では、細胞の幾つかまたはすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織の間質血管細胞群から培養される。実施例１を参照。
【００６４】
様々な実施形態では、細胞型及び／又は細胞のソース（ｓｏｕｒｃｅ）は、具体的な研究目的または対象に基づいて、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の疾患または疾病の検査を促進するために、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の被験体の疾患または疾病の検査を促進するために、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、２つ以上の異なるヒトのドナーに由来する。幾つかの実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の脊椎動物被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定の哺乳動物被験体に由来する。またさらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、特定のヒト被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特異的な細胞型は、疾患または組織の機能性に関係する特異的な表現型を有する特定の被験体に由来する。またさらなる実施形態では、被験体に特異的な細胞は、生検または組織のサンプリングによって対象の標的組織から分離される。さらなる実施形態では、被験体に特異的な細胞は、分離直後に組織を成形するために利用される。他の実施形態では、被験体に特異的な細胞は、三次元の組織の成形での使用前にインビトロで操作され；ここで、操作は：拡張、分化、一定方向への分化、増殖、タンパク質または核酸への曝露、遺伝子ベクターの取り込み、遺伝的または非遺伝的な細胞を追跡する部分の取り込み、脱分化（すなわち、人工多能性幹細胞または同等物の生成）、低温保存、の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、被験体に特異的な細胞は、標的組織以外の組織から分離される。さらなる実施形態では、被験体に特異的な細胞は、標的組織内の対象の細胞型への分化を必要とする。またさらなる実施形態では、分化を必要とする被験体に特異的な細胞は、三次元構造への成形の前、間、または後に分化される。
【００６５】
＜細胞を培養する方法＞
本発明の操作した組織で使用される細胞型は、当該技術分野に既知の任意の方法で適切に培養される。細胞および組織の培養の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｗｉｌｅｙ （１９８７）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。本発明と併用して適切に使用される、一般的な哺乳動物細胞の培養技術、細胞株、および細胞培養システムも、Ｄｏｙｌｅ， Ａ．， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． Ｂ．， Ｎｅｗｅｌｌ， Ｄ． Ｇ．， （ｅｄｓ．） Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｗｉｌｅｙ （１９９８）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。
【００６６】
培養下の哺乳動物細胞のための適切な増殖条件は、当該技術分野に周知である。例えば、実施例１を参照。細胞培養培地は、一般に、必須栄養素を含み、および随意に、培養されている細胞型に従って随意に選択される、塩、ミネラル、ビタミン、多血小板血漿などの、追加の要素を含む。幾つかの実施形態では、特定の成分は、細胞の増殖、分化、特異タンパク質の分泌などを高めるために選択される。一般に、標準的な増殖培地は、１１０ｍｇ／Ｌのピルベートおよびグルタミンとともに、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）または低グルコースを含み、それらは、当業者に周知の様々な他の標準的な培地のように適切である、１−２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、またはヒト血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補われる。好ましくは、細胞は、細胞の起源の動物の体温で、またはその体温に近い温度で、１−２１％のＯ２および好ましくは３−５％のＣＯ２の大気中で無菌条件下で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは、およそ３７℃で培養される。
【００６７】
細胞は、随意に、所望の株にわたって細胞の分化を誘発するために細胞の分化剤によって培養される。例えば、細胞は、随意に、増殖因子、サイトカインなどで培養される。幾つかの実施形態では、用語「増殖因子」は、細胞によって生成され、それ自体に及び／又は様々な他の隣接する又は離れた細胞に影響を与える、タンパク質、ポリペプチド、またはサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。典型的に、増殖因子は、特異的な型の細胞の増殖及び／又は分化に、発達上で、または多くの生理学的または環境上の刺激に反応してのいずれかで影響を与える。すべてではないが、幾つかの増殖因子は、ホルモンである。典型的な増殖因子は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などである。増殖因子は、とりわけ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８６； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｄ ｅｄ．， Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２０００で議論される。当業者は、本明細書に記載される調整培地中の任意の及び全ての培養由来の増殖因子が本発明の範囲内にあると理解するであろう。
【００６８】
＜バイオインクおよび多細胞集合体＞
本明細書には、特定の実施形態において、血管壁セグメントを含む、操作した三次元の生体組織、そのアレイ、およびバイオプリントされた細胞を含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、細胞は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させる又は押し出すことによってバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体の組成物を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。さらなる実施形態では、細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液は、液体または半固体（例えば、粘着性）の担体、および複数の細胞を含む。またさらなる実施形態では、担体は、本明細書に記載されるような、適切な細胞栄養培地である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティング前に多細胞の集合体へと随意に凝集する複数の細胞を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、複数の細胞を含み、特定の平面及び／又は層状の幾何学的形状を生成するためにバイオプリントされ；ここで、バイオインク内の個々の細胞の凝集は、バイオプリンティングの前、間、及び／又は後に起こる。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１）固定量で複数の細胞を集めることによって作り出され；ここで、細胞成分は、全容積の少なくとも約３０％および高々１００％を占める。幾つかの実施形態では、バイオインクは、半固体または固体の多細胞の集合体または多細胞体を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、１）結果的にバイオインクをもたらすために、予め決められた割合で複数の細胞または細胞集合体を生体適合性の液体またはゲル剤と混合することによって、および２）所望の細胞密度および粘性を有するバイオインクを生成するために、バイオインクを圧縮する（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）ことによって生成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）、またはその組み合わせによって達成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、結果的に、押し出し成形できる組成物をもたらし、多細胞の集合体または多細胞体の形成を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し成形できる」は、ノズルまたはオリフィス（例えば、１つ以上の穴またはチューブ）を通して押し進める（ｆｏｒｃｉｎｇ）（例えば、圧力下で）ことにより形作られることができることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、適切な密度まで細胞を育てることから起因する。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞および生成されている組織または臓器に応じて異なる。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞は、凝集及び／又は接着される。幾つかの実施形態では、「凝集する」、「凝集した」、および「凝集」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。さらなる実施形態では、前記用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持材、細胞培養培地（あるいはその補足物）、細胞外マトリックス（あるいはその成分）、細胞接着剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス性薬剤、抗酸化剤、押出化合物、およびそれらの組み合わせを含む。
【００６９】
様々な実施形態では、細胞は、任意の適切な細胞である。さらなる様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に使用される細胞の型は、生成されている構成物または組織の型に依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つの型の細胞を含む（「均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」または「単型の（ｍｏｎｏｔｙｐｉｃ）」バイオインクとも呼ばれる）。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つを超える型の細胞を含む（不均質な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）」または「多型の（ｐｏｌｙｔｙｐｉｃ）」バイオインクとも呼ばれる）。
【００７０】
＜細胞培養培地＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、限定しない例として、ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、Ｅａｒｌｅ'ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ'ｓ Ｓａｌｔｓ、オルシーバー液、Ｇｅｙ'ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ'ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ'ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ'ｓ Ｓａｌｉｎｅ、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素Ｆ−１２Ｈａｍ、栄養素混合物Ｆ−１０Ｈａｍ（Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０）、培地１９９、最少必須培地イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ａｍｅｓ' Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ'ｓ培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ変法培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ'ｓ Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、変更されるか又は補足される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地はさらに、アルブミン、セレン、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、多血小板血漿、またはそれらの組み合わせを含む。
【００７１】
＜細胞外マトリックス＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、細胞外マトリックスまたはその誘導体の１つ以上の成分を含む。幾つかの実施形態では、「細胞外マトリックス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外空間へと輸送されるタンパク質を含み、ここで、タンパク質は、組織を一緒に保持するための支持として機能し、引っ張り強度を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。細胞外マトリックス成分の例は、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンを含む。例えば、幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含有する。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、随意に、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられる。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、随意に、ヒトまたは動物のソースから精製されるか、または当該技術分野に既知の組換え方法によって生成される。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌されるか、または細長い細胞体を作るために使用される細胞は、随意に、当該技術分野に公知の任意の適切な方法によって遺伝子操作されることで、１以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドヘリン（ａｄｈｅｒｉｎｓ））の発現レベルを変化させることができる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体中の細胞の凝集を促進する。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細胞ペーストに適切に加えられ、多細胞集合体を形成するために使用される。フィブリノゲンは、トロンビンの付加によってフィブリンに転換される。
【００７２】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【００７３】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば、壊死、アポトーシス、または自己貪食）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態において、バイオインクは、抗アポトーシス性薬剤をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は、抗ＴＮＦ薬剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症蛋白の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（形質転換増殖因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤（例えば、図１５および１６を参照）、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤヌス・キナーゼ）の活性を阻害する薬剤、あるいはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態において、バイオインクは、抗酸化剤を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、酸素担体または他の細胞特異的な栄養素を含む。
【００７４】
＜押出化合物＞
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、押出化合物（すなわちバイオインクの押出特性を変更する化合物）を含む。押出化合物の例は、限定されないが、ゲル剤、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル剤、界面活性剤ポリオール（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリックス成分（およびその誘導体）、コラーゲン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己集合性ナノファイバーを含む。幾つかの実施形態では、押出化合物は、物理的、化学的、または酵素的な手段によってバイオプリントした後に取り除かれる。（ときにゼリー剤とも呼ばれる）ゲル剤は、様々な方法で定義されてきた。例えば、米国薬局方は、ゲル剤を、液体がしみこんだ小さな無機粒子または大きな有機分子のいずれかで構成されている懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲル剤は、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分散した高分子と液体との間に明らかな境界が存在しない方法で、液体全体に均一に分布する有機高分子からなる。幾つかの単相ゲルは、合成高分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態では、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作成されるであろう。二相ゲルは、小さな別個の粒子のネットワークからなる。
【００７５】
ゲル剤は、幾つかの場合において、疎水性または親水性であると分類される。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基剤は、ポリエチレンを有する液体パラフィン、またはコロイド状シリカでゲル化した脂肪油、またはアルミニウム石鹸または亜鉛石鹸からなる。対称的に、疎水性ゲルの基剤は、通常は、水、グリセロール、または適切なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロース誘導体、カルボキシビニルポリマー、マグネシウム−アルミニウムシリケート）でゲル化したプロピレングリコールからなる。特定の実施形態では、本明細書で開示される組成物またはデバイスのレオロジーは、偽プラスチック、プラスチック、チキソトロピー、またはダイラタントである。
【００７６】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、あるいはそれらの組み合わせから選択される。
【００７７】
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押出化合物は、（熱応答性のゲル剤または温熱ゲル（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｓ）としても知られる）熱可逆性のゲル剤である。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約４０℃である。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約３０℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞型、他の添加剤などを含む）は、室温で液体ではない。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、哺乳動物の体温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４１℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２２℃乃至約５２℃である。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約３２℃乃至約４２℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞型、他の添加剤などを含む）は、哺乳動物の体温で液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃に、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約１５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１５℃乃至約２０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約２５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約２５℃乃至約３０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約３０℃乃至約３５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約３５℃乃至約４０℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約４０℃乃至約４５℃である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約４５℃乃至約５０℃である。
【００７８】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンで構成されるポリマーは、水溶液に組み込まれると、熱可逆性のゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器において維持可能な温度で、液態からゲル状態まで変化する能力を有している。液態からゲル状態の相転移は、ポリマー濃度および溶液中の成分に依存する。ポロクサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７またはＰＦ‐１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから成る非イオン性界面活性剤である。他のポロクサマーは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマーの水溶液は、酸、アルカリ、および金属イオンの存在下で安定している。ＰＦ−１２７は、市販で入手可能な、１３，０００の平均分子量を有する、一般式Ｅ１０６ Ｐ７０ Ｅ１０６のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーである。前記ポリマーは、随意に、ポリマーのゲル化特性を増強する適切な方法によってさらに精製される。前記ポリマーは、親水性を構成する、約７０％のエチレンオキシドを含有している。前記ポリマーは、ポロクサマーＡＢＡ型ブロックコポリマーのシリーズの１つである。ＰＦ−１２７は、良好な可溶化能力を有し、毒性が低く、したがって、適切な押出化合物と考えられる。幾つかの実施形態では、本明細書で示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段で測定される。例えば、幾つかの実施形態では、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ Ｃｏｎｅ ＰｌａｔｅＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒおよびＣｏｎｅ Ｓｐｉｎｄｌｅ ＣＰＥ‐４０が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。他の実施形態では、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドルおよびカップ）の粘度計が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書に言及される粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書に言及される粘度範囲は、体温（例えば、健康なヒトの平均体温）で測定される。
【００７９】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００乃至１，０００，０００センチポアズ、約７５０乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至４００，０００センチポアズ；約２０００乃至１００，０００センチポアズ；約３０００乃至５０，０００センチポアズ；約４０００乃至２５，０００センチポアズ；約５０００乃至２０，０００センチポアズ；あるいは約６０００乃至１５，０００センチポアズの間の粘度を有していることを特徴とする。
【００８０】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオプリンティングに適した細胞および押出化合物を含む。具体的な実施形態では、バイオインクは、約１５００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７および細胞物質の混合物は、連続的なバイオプリンティングに適している。そのようなバイオインクは、４８時間にわたる冷たい（４℃）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の連続混合によるＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の粉末剤を、３０％（ｗ／ｖ）まで溶解することによって適切に調製される。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７はまた、水中で適切に溶解される。幾つかの実施形態では、細胞は、標準の無菌の細胞培養技術を使用して、培養される且つ拡張される。さらなる実施形態では、細胞は、例えば２００ｇでペレットにされ、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７で再懸濁され、および幾つかの実施形態において、約１０乃至約２５℃のゲル化温度で凝固することを可能にするバイオプリンターに付けられたリザーバへと吸引される。バイオプリンティング前のバイオインクのゲル化は随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７を包含するバイオインクを含む、バイオインクは、液体として随意に分注される。
【００８１】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘度及び／又は細胞毒性の特性を有する任意の値である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の適切な濃度は、バイオプリントされたときにその形状を保持しながら、重さを支える。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、あるいは約５０％である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、約３０％と約４０％の間、または約３０％と約３５％の間である。
【００８２】
幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞構造がない成分（例えば、押出化合物など）は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、例えば、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル剤、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーである。またさらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、一部の細胞構造がない成分は、使用時に細胞成分に関連付けられたままである。
【００８３】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるために予め処理される。例えば、細胞は、バイオインクを形作る前に、細胞間相互作用を増強するために遠心分離後に遠心管の内部で適切にインキュベートされる。
【００８４】
＜典型的な細胞の割合＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、平滑筋細胞および内皮細胞を含む。さらなる実施形態では、平滑筋細胞と内皮細胞の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、平滑筋細胞と内皮細胞の割合は、約９０：１０から約６０：４０までである。特定の実施形態では、多細胞体は、平滑筋細胞と内皮細胞を含み、平滑筋細胞と内皮細胞の比率は、約８５：１５である。別の特定の実施形態では、多細胞体は、平滑筋細胞と内皮細胞を含み、平滑筋細胞と内皮細胞の割合は、約７０：３０である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、平滑筋細胞および線維芽細胞を含む。さらなる実施形態では、平滑筋細胞と線維芽細胞の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、平滑筋細胞と線維芽細胞の割合は、約９０：１０から約６０：４０までである。
【００８６】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を含む。さらなる実施形態では、平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞の割合は、任意の適切な割合である。またさらなる実施形態では、平滑筋細胞と内皮細胞と線維芽細胞の割合は、約７０：２５：５である。
【００８７】
＜細胞の自己選別（Ｓｅｌｆ−ｓｏｒｔｉｎｇ）＞
幾つかの実施形態では、構成物または組織を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞型（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞など）を含み；このような例では、各細胞型は、血管壁セグメントなどの操作した組織を形成するために、（例えば、成熟の間に）適切な位置へと遊走する。他の実施形態では、構造を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞型より少ない細胞型を含む。幾つかの実施形態では、各型の細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内に均一に分散される。他の実施形態では、各型の細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内の特定の領域に局在化する。
【００８８】
例えば、適切な割合（例えば、８５：１５、７０：３０など）で平滑筋細胞と内皮細胞を含む、操作された血管壁セグメント（例えば、維管束組織シート）の場合には、隣接する、バイオプリントされた、凝集した多型の円柱状のバイオインクユニットは、融合する。成熟中に、内皮細胞は、構成物の周辺にある程度まで局在化し、コラーゲンが形成される。例えば、図１、３、および４ａを参照。さらなる例として、適切な割合（例えば、７０：２５：５など）で平滑筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を含む、バイオプリントされた血管壁セグメントの場合には、バイオプリントされた多型の円柱状のバイオインクは、融合し、内皮細胞は、構成物の周辺にある程度まで局在化する。幾つかの実施形態では、構成物内の細胞型の局在化は、インビボまたはエキソビボの哺乳動物組織の層構造体を模倣する。さらなる実施形態では、例えば、操作された血管壁セグメントにおいて、構成物内の細胞型の局在化は、推定上の内膜、中膜、および外膜を形成する。
【００８９】
幾つかの実施形態では、細胞の選別または自己選別は、細胞の１つ以上の層の適用によって加速されるか、増強されるか、または増大される。例えば、幾つかの実施形態では、平滑筋細胞および内皮細胞を含む多細胞集合体によってバイオプリントされた構成物はさらに、構成物の１つ以上の表面上で内皮細胞の層の適用にさらされる。さらなる実施形態では、結果的に、構成物の周辺への内皮細胞の局在化によってもたらされた層状化が増大する。
【００９０】
＜予め形成されたスキャフォールド＞
幾つかの実施形態において、本明細書には、任意の予め形成されたスキャフォールドが略ない、操作された、移植可能な組織および臓器が開示される。さらなる実施形態では、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層、死細胞の層、および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠である、および組織及び／又は臓器から取り除かれることができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。またさらなる実施形態では、脱細胞化組織のスキャフォールドは、例えば、生きている間に生成したＥＣＭを残して、死滅される又は脱細胞化される細胞層などの、任意の方法における培養細胞によって生じた、脱細胞化した天然組織または脱細胞化した細胞物質を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織、およびそのアレイは、例えば、組織の形成、組織の任意の層、または組織の形状の形成のために、予め形成されたスキャフォールドを利用しない。限定しない例として、本発明の操作した組織は、製造時または使用時に、ポリマースキャフォールドなどの、予め形成された、合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックス層、または任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを利用しない。幾つかの実施形態では、操作した組織は、予め形成されたスキャフォールドが略ない。幾つかの実施形態では、組織の細胞成分は、例えば、全組成物の２．０％未満、１．０％未満、または０．５％未満の、検知可能な量であるが、微量または取るに足らない量のスキャフォールドを含む。さらなる実施形態では、微量または取るに足らない量のスキャフォールドは、組織、またはそのアレイの長期的な作用に影響を与える、またはその主要な生体機能を妨害するには不十分である。追加の実施形態では、スキャフォールド成分は、物理的、化学的、あるいは酵素的な方法によって、印刷後に取り除かれ、スキャフォールド成分がない又は略ない操作した組織をもたらす。
【００９２】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される予め形成されたスキャフォールドのない又は略ない操作した組織は、スキャフォールド材が最初に形成される組織工学の特定の他の方法によって発達された操作した組織とは対照的であり、その後、細胞は、スキャフォールド上で播種され、続いて、細胞は、例えば、スキャフォールドの形状を満たす且つとるために増殖する。１つの態様では、本明細書に記載されるバイオプリンティングの方法は、予め形成されたスキャフォールドのない又は略ない、実行可能で有用な組織の生成を可能にする。別の態様では、本発明の細胞は、幾つかの実施形態において、制限物質を使用して、所望の三次元形状で保持される。制限物質は、少なくとも、制限物質が細胞及び／又は組織からの一時的なものであり及び／又は除去可能であるという事実から、スキャフォールドとは異なる。
【００９３】
＜アレイ＞
幾つかの実施形態では、本明細書には、血管壁セグメントを含む操作した組織のアレイが開示される。幾つかの実施形態では、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールである。幾つかの実施形態では、アレイは、中スループットまたは高スループットのスクリーニングに関連付けられるものを含む、スクリーニング方法およびデバイスに適応しているか又は適合性がある。さらなる実施形態では、アレイによって、複数の試験が同時に行われる。さらなる実施形態では、アレイによって、複数のサンプルが同時に試験される。幾つかの実施形態では、アレイは、細胞のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、細胞のマイクロアレイは、固体担体の表面上で生細胞の多重の照合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にする研究器具である。他の実施形態では、アレイは、組織のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、組織のマイクロアレイは、アレイで集められた複数の個別の組織または組織サンプルを含み、これによって、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的な解析の実施が可能となる。
【００９４】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、各々、生体適合性のマルチウェル容器のウェル中に存在する（例えば、図１４を参照）。幾つかの実施形態では、各組織は、ウェルに入れられる。他の実施形態では、各組織は、ウェルへとバイオプリントされる。さらなる実施形態では、ウェルは、コーティングされる。様々なさらなる実施形態では、ウェルは、以下の組み合わせを含む、生物学的適合のヒドロゲル、１つ以上のタンパク質、１つ以上の化学薬品、１つ以上のペプチド、１つ以上の抗体、および１つ以上の増殖因子の１つ以上でコーティングされる。幾つかの実施形態では、ウェルは、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。他の実施形態では、ウェルは、アガロースでコーティングされる。幾つかの実施形態では、各組織は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内の、多孔性の、生体適合性の膜上に存在する。幾つかの実施形態では、マルチウェル容器の各ウェルは、２つ以上の組織を含有する。
【００９５】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の側面上で生体適合性の表面に固定される。多くの方法が、生体適合性の表面に組織を固定するのに適切である。様々な実施形態では、組織は、例えば、１つ以上の全体の側面に沿って、１つ以上の側面の縁のみで、または１つ以上の側面の中心のみで、生体適合性の表面に適切に固定される。様々なさらなる実施形態では、組織は、生体適合性の表面に適切に固定され、保持体（ｈｏｌｄｅｒ）または担体は、表面へと統合されるか、または表面に関連付けられる。様々なさらなる実施形態では、組織は、生体適合性の表面に適切に固定され、１つ以上のピンチクランプまたはプラスチックのナブは、表面へと統合されるか、または表面に関連付けられる。幾つかの実施形態では、組織は、多孔質膜への細胞付着によって生体適合性の表面に適切に固定される。幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、１つ以上の側面上で生体適合性の表面に付けられることによって、アレイ形状で保持される。さらなる実施形態では、組織は、１、２、３、４またはそれ以上の側面上で生体適合性の表面に付けられる。幾つかの実施形態では、生体適合性の表面は、組織または組織に接触する有機体に対する損傷または毒性の著しい危険をもたらさない任意の表面である。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、従来の組織培養法に適した任意の表面である。適切な生体適合性の表面は、限定しない例として、処理されたプラスチック、膜、多孔質膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、処理されたガラス、およびコーティングされたガラスを含み、ここで、適切なコーティングは、ヒドロゲル、ＥＣＭ成分、化学薬品、タンパク質などを含み、コーティングまたは処理は、生体適合性の表面に対する細胞および組織の接着を刺激するか又は妨げる手段を提供する。
【００９６】
幾つかの実施形態では、１つ以上の側面上で生体適合性の表面に操作した組織を固定することによって、流体流によって引き起こされた、せん断力に組織をさらすことが促進される。さらなる実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織は、流体流によって引き起こされた、せん断力にさらされる。様々な実施形態では、操作した組織は、１、２、３、４またはそれ以上の側面上でせん断力にさらされる（例えば、図１３を参照）。
【００９７】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織のアレイは、２つ以上の要素の関連付けを含む。様々な実施形態では、アレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の関連付けを含み、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる実施形態では、各要素は、１つ以上の細胞、多細胞集合体、組織、臓器、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９８】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織のアレイは、予め決められたパターンで空間的に配置された複数の要素を含む。さらなる実施形態では、パターンは、要素の任意の適切な空間的配置である。様々な実施形態では、配置のパターンは、限定しない例として、二次元のグリッド、三次元のグリッド、１本以上の線、アーク、または円、一連の列またはカラムなどを含む。さらなる実施形態では、パターンは、高スループットのバイオアッセイまたはスクリーニング方法またはデバイスとの適合性のために選ばれる。
【００９９】
様々な実施形態では、アレイにおいて１つ以上の組織を成形するために使用される細胞型及び／又は細胞のソースは、具体的な研究目的または対象に基づいて選択される。さらなる様々な実施形態では、アレイにおける具体的な組織は、具体的な研究目的または対象に基づいて選択される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した組織は、特定の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した組織は、特定の被験体の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の具体的な操作した組織は、２つ以上の異なるヒトのドナーに由来する１つ以上の細胞型とともに生成される。幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、細胞型、細胞のソース、細胞の層、細胞の割合、構成の方法、サイズ、形状などに関して略類似している。他の実施形態では、アレイ内の組織の１つ以上は、細胞型、細胞のソース、細胞の層、細胞の割合、構成の方法、サイズ、形状などに関して独特である。様々な実施形態では、アレイ内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上の組織は、独特であり、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、アレイ内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の組織は、独特であり、それらにおいてインクリメントを含む。
【０１００】
幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の組織は、人体における１つ以上の具体的な組織を表わす。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の個々の組織は、血管またはリンパ管、筋、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、乳房、膵臓、ひ臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、前立腺、腫瘍、内胚葉、外胚葉、および中胚葉を含む、ヒト組織を表わす。１つの実施形態では、アレイ内の組織は、被験体におけるすべての主要な組織のタイプを表わすために選択される。幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。さらなる実施形態では、アレイ内の各組織の培養状態は、それらが他の組織から分離され、培地または培地において可溶性である因子を交換することができないような状態である。他の実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織は、可溶性因子を交換する。さらなる実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織の培養状態は、それらが培地および培地において可溶性である因子を他の組織と交換するような状態である。様々な実施形態では、アレイ内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上の組織は、培地及び／又は可溶性の因子を交換し、それらにおいてインクリメントを含む。他の様々な実施形態では、アレイ内の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の組織は、培地及び／又は可溶性の因子を交換し、それらにおいてインクリメントを含む。
【０１０１】
＜インビボでのアッセイ＞
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織、および本明細書に開示されるアレイは、インビボでのアッセイに使用するためのものである。幾つかの実施形態では、「アッセイ」は、有機サンプルまたは生体サンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物、薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる実施形態では、アッセイは、定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。またさらなる実施形態では、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
【０１０２】
様々な実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織およびアレイは、限定しない例として、画像ベースのアッセイ、分泌されたタンパク質の測定、マーカーの発現、およびタンパク質の生成に使用するためのものである。様々なさらなる実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織およびアレイは、分子結合（放射リガンド結合を含む）、分子摂取、活性（例えば、酵素活性および受容体活性など）、遺伝子発現、タンパク質発現、受容体のアゴニズム、受容体拮抗、細胞シグナル伝達、アポトーシス、抗癌剤感受性、トランスフェクション、細胞移動、走化性、細胞の生存率、細胞増殖、安全性、有効性、代謝、毒性、および乱用傾向、の１つ以上を検出または測定するためのアッセイに使用するためのものである。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織、およびアレイは、免疫学的アッセイに使用するためのものである。さらなる実施形態では、免疫学的アッセイでは、競合的な免疫学的アッセイまたは非競合的な免疫学的アッセイである。競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体と結合するために標識抗原と競合し、その後、抗体の部位に結合した標識抗原の量が測定される。（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）非競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体の部位に結合され；続いて、標識抗体は、抗原に結合され、その後、部位上の標識抗体の量が測定される。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、血管壁セグメントを含む操作した組織、およびアレイは、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用するためのものである。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的な技術である。ＥＬＩＳＡでは、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有するサンプルは、非特異的に（表面への吸収を介して）または特異的に（「サンドイッチ」のＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して）のいずれかで、固体担体（例えば、ポリスチレン・マイクロタイタープレート）上で不動化される。またさらなる例として、抗原が不動化された後、検出抗体が加えられ、抗原との複合物を形成する。検出抗体は、例えば、酵素に共有結合されるか、またはバイオ結合を介して酵素に結合される第２抗体によって、それ自体が検出される。
【０１０５】
例えば、幾つかの実施形態では、細胞の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップ、多細胞集合体、または組織は、薬物スクリーニングまたは創薬に使用される。さらなる実施形態では、一連の、細胞の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップは、キットの一部として薬物スクリーニングまたは創薬に使用される。幾つかの実施形態では、各血管壁セグメントは、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内に存在し、ここで、容器は、１つ以上の自動化した薬物スクリーニング法及び／又はデバイスと適合性がある。さらなる実施形態では、自動化した薬物スクリーニング法及び／又はデバイスは、コンピューターまたはロボット支援である任意の適切な手順またはデバイスを含む。
【０１０６】
さらなる実施形態では、薬物スクリーニングのアッセイまたは創薬のアッセイのためのアレイは、研究するかまたは任意の治療分野に潜在的に有用な薬物を検査または開発するために使用される。またさらなる実施形態では、適切な治療分野は、限定しない例として、伝染病、血液学、腫瘍学、小児科学、心臓学、中枢神経系疾患、神経病学、消化器病学、肝臓学、泌尿器学、不妊症、眼科学、腎臓病学、整形外科、疼痛管理、精神医学、肺臓学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒性学、および免疫学を含む。
【０１０７】
＜方法＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、生きている、三次元の組織構成物を構成するための方法が開示され、前記方法は、少なくとも１つの接着細胞型を含むバイオインクを、形態内へとまたは形態上へとバイオプリントする工程、およびバイオインクを生きている、三次元の組織構成物へと融合する工程を含む。さらなる実施形態では、組織構成物は、インビトロでの使用のためのものである。またさらなる実施形態では、組織構成物は、血管チューブではない。
【０１０８】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、血管壁セグメントを含む組織を構成するための方法が開示され、前記方法は、平滑筋細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；前記凝集した多細胞集合体を支持体上へと置く工程；および前記多細胞集合体を凝集させ、血管壁セグメントなどの組織を形成することを可能にするために、前記多細胞集合体をインキュベートする工程、を含み、ここで、インキュベーションの持続期間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態では、方法は、バイオプリンティングを利用する。さらなる実施形態では、方法は、任意の予め形成されたスキャフォールドがない又は略ない、血管壁セグメントを含む操作した組織を生成する。
【０１０９】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、血管壁セグメントを含む、生きている、三次元の組織を構成するための方法が開示され、前記方法は：哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；前記１つ以上の凝集した多細胞集合体を、支持体上へと置く工程；前記１つ以上の凝集した多細胞集合体に、１つ以上の外部表面上の哺乳動物細胞の第１型の層、１つ以上の外部表面上の哺乳動物細胞の第２型の層の１つ以上を適用する工程；および前記１つ以上の多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程、を含み；ここで、インキュベーションの持続期間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態では、方法は、バイオプリンティングを利用する。さらなる実施形態では、方法は、任意の予め形成されたスキャフォールドがない又は略ない、血管壁セグメントを含む操作した組織を生成する。
【０１１０】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、生きている、三次元の組織構成物を構成する方法が開示され、前記方法は、哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；平面の幾何学的形状を作り出すために、互いに対して空間的に配置された、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層；および複数の層であって、少なくとも１つの層が、層状の幾何学的形状を作り出すために、少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる複数の層、の少なくとも１つを形成するために、前記１つ以上の凝集した多細胞集合体を、支持体上へと置く工程；および前記１つ以上の多細胞集合体を凝集させ、生きている、三次元の組織構成物を形成するために、前記１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程を含む。
【０１１１】
＜凝集した多細胞の集合体の調製＞
幾つかの実施形態において、方法は、１つ以上の型の哺乳動物細胞を含む、凝集した多細胞の集合体を調製する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、平滑筋細胞を含む、凝集した多細胞の集合体を調製する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、内皮細胞を更に含む、凝集した多細胞の集合体を調製する工程を含む。例えば、実施例３、４、及び７を参照する。幾つかの実施形態において、方法は、繊維芽細胞を更に含む、凝集した多細胞の集合体を調製する工程を含む。例えば、実施例５及び６を参照する。
【０１１２】
本明細書に記載されるような特徴を有する、多細胞の集合体を作る様々な方法が存在する。幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、複数の生細胞を含むか、又は所望の細胞の密度及び粘性を備える細胞ペースト剤から作り上げられる。更なる実施形態において、細胞ペースト剤は、所望の形状、及び成熟（例えばインキュベーション）を経て形成される多細胞体へと形成される。幾つかの実施形態において、多細胞集合体は、ほぼ円柱状である。幾つかの実施形態において、多細胞集合体は、ほぼリボン形状である。幾つかの実施形態において、多細胞集合体は、ほぼ球状である。他の実施形態において、操作した組織は、様々な形状を持つ多細胞の集合体から構築される。特定の実施形態において、細長い多細胞体は、複数の生細胞を含む細胞ペースト剤を細長い形状（例えば、円柱状、リボン形状等）に形成することによりもたらされる。更なる実施形態において、細胞ペースト剤は、細長い多細胞体を形成するため、細胞が互いに付着及び／又は凝集することを可能にするための制御環境においてインキュベートされる。また別の特定の実施形態において、多細胞体は、細胞ペースト剤を三次元形状に保持するデバイスにおいて、複数の生細胞を含む細胞ペースト剤を形成することによりもたらされる。更なる実施形態において、細胞ペースト剤は制御環境においてインキュベートされる一方で、平面上で自身を支えるのに十分な凝集力を有する身体をもたらすのに十分な時間、三次元形状で保持される。
【０１１３】
様々な実施形態において、細胞ペースト剤は、次の工程によって提供される：１）細胞懸濁液をもたらすため、細胞又は（１つ以上の細胞型の）細胞集合体、及び（例えば、予め定義した比率における）細胞培養培地などの生体適合性のゲル又は液体を収集する工程、並びに２）所望の細胞の密度及び粘性を持つ細胞ペースト剤をもたらすため細胞懸濁液を圧縮する工程。様々な実施形態において、圧縮工程は、細胞ペースト剤に必要な所望の細胞の濃度（密度）、粘性、及び硬度を達成するため細胞培養から結果として生じる、特定の細胞懸濁液の濃縮など、多くの方法によって達成される。特定の実施形態において、細胞培養からの比較的薄い細胞懸濁液は、鋳型（ｍｏｌｄ）での形成を可能にするペレット中で細胞濃度を達成するため、定められた時間、遠心分離される。タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮又は圧縮する、別の適切な方法である。幾つかの実施形態において、化合物は、必要とされる押し出し特性を加えるために細胞懸濁液と結合する。適切な化合物は、制限のない例として、界面活性剤ポリオール、コラーゲン、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ナノファイバー、自己集合ナノファイバー、ゼラチン、フィブリノゲン等を含む。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、細胞ペースト剤は、複数の生細胞を組織培養培地と混合して、（例えば遠心分離により）生細胞を圧縮することにより、もたらされる。１つ以上のＥＣＭ成分（又はＥＣＭ成分の誘導体）は、細胞ペースト剤を形成するため再び遠心分離される、ＥＣＭ成分（複数）（又はＥＣＭ成分（複数）の誘導体）及び結果として生じる細胞懸濁液を含む、１以上の生理学的に許容可能なバッファー中で細胞ペレットを再懸濁することにより、随意に含まれる。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、更なる処理に所望される細胞ペースト剤の細胞密度は、細胞の型に応じて変わる。更なる実施形態において、細胞間の相互作用は、細胞ペースト剤の特性を決定し、異なる細胞型は、細胞密度と細胞間相互作用の間に異なる関係を有する。また更なる実施形態において、細胞は、細胞ペースト剤を形成する前に細胞間相互作用を増加させるため予め処理される。例えば、幾つかの場合、細胞は、細胞ペースト剤を形成する前に細胞間相互作用を増強するために、遠心分離後に遠心分離管の内部でインキュベートされる。幾つかの実施形態において、細胞ペースト剤は、バイオプリンティングにより付随的に形成され；ここで、バイオインクを形成するため個別細胞の互いの凝集が、バイオプリンティングの間、又はその後に生じる。
【０１１６】
様々な実施形態において、多くの方法が細胞ペースト剤を形成するために使用される。例えば、特定の実施形態において、細胞ペースト剤は、所望の形状を達成するため、（例えば濃縮／圧縮の後に）手作業で成型される、又はプレスされる。更なる例として、細胞ペースト剤は、細胞ペースト剤を器具の内面に順応するように形成するマイクロピペット（例えば毛管ピペット）などの器具へ取り上げられる（例えば、吸引される）。マイクロピペット（例えば毛管ピペット）の断面形状は代替的に、円形、正方形、長方形、三角形、又は他の非円形の断面形状である。幾つかの実施形態において、細胞ペースト剤は、プラスチック型、金型、又はゲル鋳型などの予め形成された鋳型に置くことにより、形成される。幾つかの実施形態において、細胞ペースト剤を形成するために遠心鋳造又は連続鋳造が使用される。幾つかの実施形態において、バイオインクの形成は、付随的に、又はバイオプリンティングの後に生じる。更なる実施形態において、バイオインクの形成は、共同プリントされた鋳型の結果として生じ；ここで、鋳型はバイオプリンティングを介して随意に堆積され；ここで、鋳型は、ゲル、ヒドロゲル、合成ポリマー、炭水化物、タンパク質、又は哺乳動物細胞の１つ以上を含む。また更なる実施形態において、共同プリントした鋳型の１つ以上の成分は、バイオプリンティングの後に取り除かれ；ここで、除去方法は、物理的手段（水性溶媒による可溶化）；化学処理；酵素処理；温度調節の１つから選択される。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、定義された形状の多細胞の集合体はまた、本明細書に記載される、血管壁セグメントを含む組織を構築するのに適切である。球状の多細胞の集合体は、限定されないが、細胞の自己集合、鋳型の使用、及び水滴法を含む様々な方法によって随意に作り出される。更なる実施形態において、ほぼ球状の多細胞の集合体をもたらす方法は、１）所望の細胞の密度及び粘性を備える、複数の予め選択された細胞又は細胞集合体を含む細胞ペースト剤を提供する工程、２）細胞ペースト剤を円柱形状へ操作する工程、３）シリンダーを等しいフラグメントに切断する工程、４）旋回振盪機上で一晩、フラグメントを随意に丸くする工程、及び５）成熟によりほぼ球状の多細胞の集合体を形成する工程を含む。更なる実施形態において、細胞の集合体は、音響学の注目する方法論（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ）を介して作り出される。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、部分的に付着した及び／又は凝集した細胞ペースト剤はバイオプリンティングに使用され；ここで、凝集及びバイオインク形成は、主にプリント後に生じる。他の実施形態において、細胞ペースト剤は、バイオプリンティング前の第一工程で形成される。更なる実施形態において、細胞ペースト剤は、第１整形装置（例えば毛管ピペット）から第２整形装置（例えば鋳型）へと移され、第２整形装置は、栄養素及び／又は酸素を細胞に供給することを可能にし、一方でそれらを更なる成熟期の間に第２整形装置中で保持する。細胞に栄養素と酸素を供給することを可能にするのに適切な整形装置の１つの例は、複数の多細胞の集合体（例えば、ほぼ同一の多細胞の集合体）をもたらすための鋳型である。更なる例として、そのような鋳型は、細胞の基質への移動及び内殖に耐性があり、及び細胞の基質への接着に耐性がある物質で作られる、生体適合性の基質を含む。様々な実施形態において、基質は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、ポリエチレングリコール、グラス、金属、プラスチック、又はゲル材料（例えばアガロース又は他のヒドロゲル）、及び類似の物質から適切に作られる。幾つかの実施形態において、鋳型はまた、（例えば、鋳型の頂部上に組織培養培地を分注することにより）細胞ペースト剤に組織培養培地を供給することを可能にするよう適切に構成される。
【０１１９】
故に、第２整形装置が使用される実施形態において、部分的に付着した及び／又は凝集した細胞ペースト剤は、第１整形装置（例えば毛管ピペット）から第２整形装置（例えば鋳型）へと移される。更なる実施形態において、部分的に付着した及び／又は凝集した細胞ペースト剤は、第１整形装置（例えば毛管ピペット）によって鋳型の溝へと移される。また更なる実施形態において、多細胞の集合体を形成するため細胞ペースト剤中の細胞が互いに更に接着及び／又は凝集するのを可能にする制御環境において保持される細胞ペースト剤と共に鋳型がインキュベーションされる、成熟期の後、細胞の凝集は、結果として生じる多細胞の集合体が器具（例えば毛管ピペット）により拾い上げられることを可能にするほど十分に強くなる。また更なる実施形態において、毛管ピペットは適切に、多細胞の集合体を三次元構成物へ自動的に入れるのに操作可能なバイオプリンター又は類似の機器のプリンティングヘッドの一部である。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、多細胞の集合体の断面形状及び大きさは、第１整形装置の、及び随意に、多細胞の集合体を作るために使用される第２の整形装置の断面形状及び大きさに十分に相当し、当業者は、上述の断面形状、横断面積、直径、及び長さを有する多細胞の集合体を作り出すのに適切な断面形状、横断面積、直径、及び長さを有する適切な整形装置を選択することができる。
【０１２１】
＜凝集した多細胞の集合体の支持体上への配置＞
多くの方法は、所望の三次元構造をもたらすため、多細胞の集合体を支持体上に置くのに適切である。例えば、幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、互いに接触して手作業で配置され、ピペット、ノズル、又は針からの押し出しにより適所に堆積され、又は、バイオプリンターなどの自動のコンピューター支援されたデバイスによって位置付けられる。
【０１２２】
本明細書に記載されるように、様々な実施形態において、多細胞の集合体は多くの適切な形状及び大きさを有する。幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、限定されないが、円形、卵形、正方形、三角形、多角形、及び不規則な形状を含む、様々な適切な断面形状の何れかで伸長される。更なる実施形態において、多細胞の集合体は伸長され、円柱の形態にある。幾つかの実施形態において、細長い多細胞の集合体は、同様の長さ及び／又は直径である。他の実施形態において、細長い多細胞の集合体は、異なる長さ及び／又は直径である。幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、ほぼ球状である。幾つかの実施形態において、操作した組織（例えば血管壁セグメントなど）は、大きさがほぼ同様の、ほぼ球状の多細胞の集合体を含む。他の実施形態において、操作した組織（例えば血管壁セグメントなど）は、大きさが異なる、ほぼ球状の多細胞の集合体を含む。幾つかの実施形態において、異なる形状及び大きさの操作した組織（例えば血管壁セグメントなど）は、様々な形状及び大きさの多細胞の集合体を並べることにより形成される。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、支持体上に置かれる。様々な実施形態において、支持体は、任意の適切な生体適合性表面である。また更なる実施形態において、適切な生体適合性表面は、限定されないが、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、グラス、金属、ヒドロゲル、及びそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、支持体は、限定されないが、ヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、成長因子、又はそれらの組み合わせを含む、生体適合性物質でコーティングされる。１つの実施形態において、支持体はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。別の実施形態において、支持体はアガロースによりコーティングされる。１つの実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに入れられる。
【０１２４】
凝集した多細胞の集合体の配置が一旦完了すると、幾つかの実施形態において、組織培養培地は構成物の頂部にわたって注がれる。更なる実施形態において、組織培養培地は、多細胞体中の細胞を支持するため、多細胞体間の空間に入る。
【０１２５】
＜第１型の細胞の層及び／又は第２型の細胞の層の適用＞
多くの方法は、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部表面上に、細胞の１つ以上の層を適用するのに適切である。例えば、幾つかの実施形態において、細胞の層の適用は、細胞の懸濁液、シート、単層、又は融合した集合体により、前述の凝集した多細胞の集合体の１つ以上の表面をコーティングする工程を含む。様々な実施形態において、凝集した哺乳動物細胞構成物の１、２、３、４、又はそれ以上の表面が、コーティングされる。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、細胞の層の適用は、融合した多細胞の集合体の追加の層をバイオプリントする工程を含む。他の実施形態において、細胞の層の適用は、細胞の溶液、懸濁液、又は液体濃縮物を、バイオプリント、スプレー、又はインクジェットする工程を含む。更なる実施形態において、適切な細胞懸濁液は、約１×１０４乃至約１×１０６細胞／μｌを含む。更なる実施形態において、適切な細胞懸濁液は、約１×１０５乃至約１．５×１０５細胞／μｌを含む。更なる実施形態において、細胞の層の適用は、空間的に分配される液滴のような凝集した哺乳動物細胞構成物の１以上の表面に直接、細胞の懸濁液を分注する工程を含む。また更なる実施形態において、細胞の層の適用は、スプレーとして、凝集した哺乳動物細胞の１つ以上の表面上に直接、細胞の懸濁液を分注する工程を含む。細胞の層は、様々な実施形態において、構築プロセスにおける任意の適切な時間に適用される。幾つかの実施形態において、細胞の１つ以上の層は、バイオプリンティング直後（例えば１０分まで）に凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部表面上に適用される。他の実施形態において、１つ以上の層は、バイオプリンティングの後（例えば１０分後）に適用される。更に他の実施形態において、１つ以上の層は、構成物の成熟中に適用される。
【０１２７】
任意の型の細胞は、バイオインクとしてバイオプリントすることにより、層としての適用に適している。更に、任意の型の細胞は、懸濁液、溶液、又は濃縮物としての堆積の液滴、又は、懸濁液、溶液、又は濃縮物としてのスプレーにより、層としての適用に適している。幾つかの実施形態において、線維芽細胞は、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部表面上に、細胞の１つ以上の層として適用される。他の実施形態において、内皮細胞は、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部表面上に、細胞の１つ以上の層として適用される。更なる実施形態において、内皮細胞の層は、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部表面に適用され、繊維芽細胞の層は、構成物の１つ以上の異なる表面に適用される。
【０１２８】
実施例９は、血管壁構成物が、内皮細胞濃縮物（例えば１−１．５×１０５細胞／μｌ）でさらにコーティングされた、凝集した平滑筋細胞集合体によりバイオプリントされることを実証する。実施例９の技術は、ＳＭＣで構成された血管壁構成物、及びＥＣの被覆（例えば推定上の中膜及び内膜）をもたらした。例えば、図３、４Ｂを参照。
【０１２９】
実施例１０は、血管壁構成物が、凝集したヒト大動脈の平滑筋細胞集合体によりバイオプリントされることを実証する。更に、懸濁液中のヒト大動脈内皮細胞は、２．５μＬの液滴として平滑筋の円柱状のバイオインクの上にバイオプリンターから分注される。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、方法は、支持体上で細胞の層を培養する工程を更に含む。そのような実施形態において、細胞の層の適用は、幾つかの場合、細胞の確立した培養に直接接触して、凝集した平滑筋細胞構成物の１つ以上の表面を置く工程を含む。更なる実施形態において、構成物は、細胞の培養された層又は細胞の単層の上に直接バイオプリントされる。生体適合性の支持体上の培養細胞層の任意の型が適切である。幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、内皮細胞の層上にバイオプリントされる。他の実施形態において、多細胞の集合体は、繊維芽細胞の層上でバイオプリントされる。更なる実施形態において、細胞の層は、バイオプリントされた構成物の多細胞の集合体に付着する、及び／又はそれと共に凝集する。幾つかの実施形態において、多層構造の各層が、バイオプリントされる。更なる実施形態において、個々の層は、限定されないが、凝集した細胞集合体、細胞ペースト剤、押し出し化合物（複数）又は他の添加剤と組み合わせた細胞ペースト剤、細胞単層、及び細胞シートを含む、バイオインクの可変性の形態を含む。
【０１３１】
実施例１１は、実施例１０の同じ構成物の構築を実証する；しかし、構成物は、ヒト真皮線維芽細胞の集密的な単層が予め培養された支持体上にバイオプリントされた。実施例１１の技術は、ＳＭＣ、及びＥＣ並びにＦｂの被覆（例えば推定上の中膜、内膜、及び外膜）で構成された血管壁構成物をもたらした。例えば、図４ａ及び４ｂを参照。
【０１３２】
＜多細胞の集合体のインキュベート＞
幾つかの実施形態において、多細胞の集合体がインキュベートされる。更なる実施形態において、インキュベーションは、多細胞の集合体が血管壁セグメントなどの組織に付着及び／又は凝集することを可能にする。幾つかの実施形態において、多細胞の集合体は、細胞培養環境（例えばペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクター等）で組織を形成するために凝集する。更なる実施形態において、多細胞の集合体は、多細胞の集合体に含まれる細胞型の増殖を促進するのに適切な条件を備える環境で組織を形成するために凝集する。１つの実施形態において、多細胞の集合体は、付着及び／又は凝集を促進するための要因及び／又はイオンを含む細胞培養培地の存在下で、約５％のＣＯ２を含む湿った大気中で、約３７℃でインキュベートされる。他の実施形態において、多細胞の集合体は、０．１％乃至２１％のＯ２を含む環境において維持される。
【０１３３】
インキュベーションは、様々な実施形態において、任意の適切な持続時間を有する。更に様々な実施形態において、インキュベーションは、約２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、又はそれ以上の持続時間を有する。更に様々な実施形態において、インキュベーションは、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、４８時間、又はそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。更に様々な実施形態において、インキュベーションは、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、又はそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。様々な因子が、限定されないが、細胞型、細胞型比率、培養条件、及び成長因子など添加物の存在を含む組織を形成するため、多細胞の集合体が凝集するのに必要な時間に影響を及ぼす。
【０１３４】
＜操作した組織の生存度を増加させるための追加の工程＞
幾つかの実施形態において、方法は、操作した組織の生存度を増加させるための工程を更に含む。更なる実施形態において、これらの工程は、制限物質の一時的又は半恒久的な格子を介して、組織と培養液の間の直接的な接触を提供する工程を含む。幾つかの実施形態において、組織は、多孔性又は間隙のある物質において抑制される。少なくとも幾つかの操作した組織の細胞の栄養素への直接アクセスは、操作した組織の生存度を増加させる。
【０１３５】
更なる実施形態において、操作した組織の生存度を増加させるための追加及び随意の工程は、１）凝集した多細胞の集合体を置く前に制限物質の基層を随意に分注する工程；２）制限物質の周囲を随意に分注する工程；３）定義された幾何学的形状内の組織の細胞をバイオプリントする工程；及び４）格子、メッシュ、又はグリッドなどの制限物質に間隙を導入するパターンで初期の組織を覆う、制限物質の細長い体（例えば円柱、リボン等）を分注する工程を含む。例えば、実施例１２及び図５を参照。
【０１３６】
多くの制限物質は、本明細書に記載される方法における使用に適している。幾つかの実施形態において、ヒドロゲルは、次のものを含む１つ以上の有利な特性を持つ典型的な制限物質である；非接着性、生体適合性、押出可能、バイオプリンティング可能、細胞構造がない、適切な強度、及び水性条件で可溶性でない。幾つかの実施形態において、適切なヒドロゲルは天然ポリマーである。１つの実施形態において、制限物質はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成される。更なる実施形態において、適切なヒドロゲルは、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、フィブリン、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、及びそれらの誘導体又は組み合わせなどの界面活性剤ポリオールに由来するものを含む。他の実施形態において、適切なヒドロゲルは合成ポリマーである。更なる実施形態において、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、及びそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態において、制限物質は、次の：ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、絹、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、パターンを覆う間隙は、組織の表面の周囲で均一に又はほぼ均一に分配される。他の実施形態において、間隙は、非均一に分配され、それにより、組織の細胞は、非均一に栄養素に暴露される。非均一の実施形態において、栄養素への異なるアクセスは、組織の１つ以上の特性に影響を及ぼすように随意に活用される。例えば、幾つかの場合、バイオプリントされた組織の別の表面上よりも、バイオプリントされた組織の１つの表面上で速く増殖する細胞を有することが望ましい。幾つかの実施形態において、組織の様々な部位の栄養素への曝露は、所望のエンドポイントへの組織の進行に影響を及ぼす様々な時間で変化させられる。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、制限物質は、限定されないが、バイオプリンティングの直後（例えば１０分以内）、バイオプリンティングの後（例えば１０分後）、細胞が互いにほぼ凝集する前、細胞が互いにほぼ凝集した後、細胞が細胞外マトリックスをもたらす前、細胞が細胞外マトリックスをもたらした後、使用の直前などを含む、任意の適切な時間に取り除かれる。様々な実施形態において、制限物質は、任意の適切な方法によって取り除かれる。例えば、幾つかの実施形態において、制限物質は、切除され、細胞から引き抜かれ、消化され、又は溶解される。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、方法は、１つ以上の側部上で、操作した組織（例えば血管壁セグメント等）を、流体流によって引き起こされる剪断力に晒す工程を更に含む。
【０１４０】
＜特定の典型的な実施形態＞
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の組織が開示され、ここで、前記組織の少なくとも１つの成分がバイオプリントされ；ここで、前記組織は血管チューブではない。幾つかの実施形態において、組織は、予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、使用時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織の少なくとも１つの成分は、層状又は平面の幾何学的形状を含む。幾つかの実施形態において、組織は、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。更なる実施形態において、組織は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５μｍである。更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１００μｍである。また更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。また更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最大の寸法で３．０ｃｍ未満である。幾つかの実施形態において、組織は平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は、約９０：１０乃至約６０：４０である。幾つかの実施形態において、組織は平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は約８５：１５である。幾つかの実施形態において、組織は平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は約７０：３０である。幾つかの実施形態において、組織は平滑筋細胞と繊維芽細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対繊維芽細胞の比率は、約９０：１０乃至約６０：４０である。幾つかの実施形態において、組織は、平滑筋細胞、繊維芽細胞及び内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対繊維芽細胞対内皮細胞の比率は、約７０：２５：５である。幾つかの実施形態において、組織はインビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、組織は薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、組織は心血管系作用薬試験で使用するためのものである。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の非分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞はヒト平滑筋細胞である。更なる実施形態において、平滑筋細胞は、次の：血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じた。幾つかの実施形態において、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。更なる実施形態において、内皮細胞は、次の：血液、血管、リンパ管、���化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じる。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞は、非血管性繊維芽細胞である。他の実施形態において、繊維芽細胞は血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態において、前記細胞型の１つ以上は、特定の脊椎動物被験体に由来する。更なる実施形態において、細胞は、心血管系に影響を及ぼす疾患又は疾病を有する、脊椎動物被験体に由来する。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が選択される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が構成される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣する方法で細胞が処理又は調節される。
【０１４１】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の組織のアレイが開示され、ここで、前記組織の各々は、１つ以上の型の哺乳動物細胞を含み；ここで、前記細胞は互いに凝集し；ここで、前記組織の各々の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；前記組織の各々は、培養下で維持される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、使用時に予め形成したスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞は、次の：肝細胞、胃腸細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、神経系細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周細胞、間葉細胞、中皮細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、腫瘍由来の細胞、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、ほぼ類似する。他の実施形態において、アレイ内の組織の１つ以上は独特である。幾つかの実施形態において、アレイ内の個々の組織は、人体における１つ以上の特異的な組織を表わす。更なる実施形態において、アレイ内の１つ以上の個々の組織は、次の：血液又はリンパ管、筋肉、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、乳房、膵臓、脾臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、及び前立腺から成る群から選択されたヒト組織を表わし；ここで、組織の各々は、特異的な疾患状態（例えば、繊維症、癌、炎症等）の粗製的又は構造的な特徴を随意に組み込む。幾つかの実施形態において、各組織は、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに存在する。更なる実施形態において、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、又は成長因子の１つ以上によりコーティングされる。また更なる実施形態において、ウェルはアガロースによりコーティングされる。幾つかの実施形態において、各組織は、前記容器の前記ウェル内の多孔性の生体適合膜上に置かれた。幾つかの実施形態において、容器は、自動化した薬物スクリーニングに適合する。幾つかの実施形態において、各組織は、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、各組織は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、アレイ内の組織は、２つ以上の異なるヒトドナー由来の１つ以上の細胞型と共に作り出される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。他の実施形態において、アレイ内の組織の２つ以上は、可溶性因子を交換する。幾つかの実施形態において、アレイは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、アレイは、薬物検査で使用するためのものである。
【０１４２】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の哺乳動物組織のアレイを構築する方法が開示され、該方法は：哺乳動物細胞を含む凝集した多細胞の集合体を調製する工程；生体適合性の支持体上に、前記凝集した多細胞の集合体を置く工程であって、ここで、前記集合体は、組織アレイに適した形態で空間的に配置される、工程；及び、前記多細胞の集合体が凝集して三次元組織のアレイを形成することを可能にするため、それらをインキュベートする工程を含み；ここで、前記インキュベーションの存続時間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。更なる実施形態において、アレイ内の各組織は、使用時に任意の予め形成したスキャフォールドがほぼない。様々な実施形態において、アレイは２乃至５００の異なる組織を含む。更なる実施形態において、組織は、定義されたパターンで空間的に配置される。また更なる実施形態において、組織は、列と柱のグリッドにおいて配置される。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞集合体は、１つの細胞型を含む。他の実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、１より多くの細胞型を含む。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞集合体は、ほぼ球状及び／又はほぼ円柱状である。幾つかの実施形態において、生体適合性の支持体は、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、グラス、金属、又はヒドロゲルから成る。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５μｍである。更なる実施形態において、各組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、各組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。また更なる実施形態において、各組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、培養下で維持される。更なる実施形態において、方法は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力に前記各組織を晒す工程を含む。
【０１４３】
特定の実施形態において、本明細書には生きている三次元の血管壁セグメントが開示され、該セグメントは：平滑筋細胞；及び、随意に、繊維芽細胞及び内皮細胞から成る群から選択される１つ以上の細胞型を含み；ここで、前記細胞は互いに凝集し；ここで、前記血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；及びここで、前記血管壁セグメントは非管状である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、予め形成したスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、ほぼ平面である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５μｍである。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は、約９０：１０乃至約６０：４０である。更なる実施形態において、血管壁セグメントは平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は約８５：１５である。他の実施形態において、血管壁セグメントは平滑筋細胞と内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対内皮細胞の比率は約７０：３０である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは平滑筋細胞と繊維芽細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対繊維芽細胞の比率は、約９０：１０乃至約６０：４０である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、平滑筋細胞、繊維芽細胞及び内皮細胞を含み、ここで、平滑筋細胞対繊維芽細胞対内皮細胞の比率は、約７０：２５：５である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは心血管系作用薬試験で使用するためのものである。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の分化細胞である。他の実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の非分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞はヒト平滑筋細胞である。更なる実施形態において、平滑筋細胞は、次の：血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じた。幾つかの実施形態において、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。更なる実施形態において、内皮細胞は、���の：血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じる。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞は、非血管性繊維芽細胞を含む。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞は血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態において、細胞は、特定の脊椎動物被験体に由来する。更なる実施形態において、１以上の細胞型は、心血管系に影響を及ぼす疾患又は疾病を有する、脊椎動物被験体に由来する。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が選択される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が構成される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣する方法で細胞が処理又は調節される。
【０１４４】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の血管壁セグメントのアレイが開示され、ここで、前記各血管壁セグメントは、平滑筋細胞、及び随意に、繊維芽細胞及び内皮細胞から成る群から選択される１以上の細胞型を含み；ここで、前記細胞は互いに凝集し；ここで、前記各血管壁セグメントが操作される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。更なる実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、使用時に任意の予め形成したスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、各血管壁セグメントは、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに存在する。更なる実施形態において、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、又は成長因子の１つ以上によりコーティングされる。また更なる実施形態において、ウェルはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）によりコーティングされる。他の実施形態おいて、ウェルはアガロースによりコーティングされる。幾つかの実施形態において、各血管壁セグメントは、前記容器の前記ウェル内の多孔性の生体適合膜上に置かれた。更なる実施形態において、容器は、自動化した薬物スクリーニングに適合する。幾つかの実施形態において、各血管壁セグメントは、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、各血管壁セグメントは、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、ほぼ類似する。他の実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントの１つ以上は独特である。幾つかの実施形態において、アレイ内の個々のセグメントは、人体における１つ以上の異なる血管組織を表わす。幾つかの実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントは、２つ以上の異なるヒトドナー由来の１つ以上の細胞型と共に作り出される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、培養下で独立して維持される。他の実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントの２つ以上は、可溶性因子を交換する。幾つかの実施形態において、アレイは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、アレイは、薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、アレイは心血管系作用薬試験で使用するためのものである。
【０１４５】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の血管壁セグメントを構築する方法が開示され、該方法は：平滑筋細胞を含む凝集した多細胞の集合体を調製する工程；支持体上に、前記凝集した多細胞の集合体を置く工程；及び、前記多細胞の集合体が凝集して血管壁セグメントを形成することを可能にするため、それらをインキュベートする工程を含み；ここで、前記インキュベーションの存続時間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、インビトロでのアッセイに使用され、使用時に任意の予め形成したスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、内皮細胞を更に含む。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、繊維芽細胞を更に含む。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞集合体は、ほぼ球状又はほぼ円柱状である。幾つかの実施形態において、凝集した多細胞の集合体は、生体適合性表面上に置かれる。更なる実施形態において、生体適合性の表面は、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、グラス、金属、又はヒドロゲルから成る。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５０μｍである。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２６６μｍである。他の実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、方法は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力に前記血管壁セグメントを晒す工程を更に含む。
【０１４６】
特定の実施形態において、本明細書には生きている三次元の組織が開示され、該組織は：互いに凝集する平滑筋細胞；及び：１つ以上の表面上の内皮細胞の層；１つ以上の表面上の繊維芽細胞の層の１つ以上を含み；ここで、前記組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；及びここで、前記組織は非管状である。幾つかの実施形態において、組織は、予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、使用時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、ほぼ平面である。幾つかの実施形態において、内皮細胞の層は、単層、１以上のシート、又は内皮細胞の融合した集合体を含む。幾つかの実施形態において、組織は、前記組織の１つ以上の表面上に内皮細胞の層を含む。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞の層は、単層、１以上のシート、又は繊維芽細胞の融合した集合体を含む。幾つかの実施形態において、組織は、前記組織の１つ以上の表面上の繊維芽細胞の層を含む。幾つかの実施形態において、組織は、内皮細胞の層及び繊維芽細胞の層を含み；ここで、内皮細胞の前記層は、前記組織の１つ以上の外部表面上にあり、繊維芽細胞の前記層は、前記組織の１つ以上の異なる表面上にある。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５０μｍである。更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。また更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、組織は、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。更なる実施形態において、組織は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、組織はインビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、組織は薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、組織は心血管系作用薬試験で使用するためのものである。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の非分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞はヒト平滑筋細胞である。更なる実施形態において、平滑筋細胞は、次の：血液、血管組織、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、筋組織、結合組織、中胚葉由来の組織、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じた。幾つかの実施形態において、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。更なる実施形態において、内皮細胞は、次の：血管組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖���系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じる。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞は、非血管性繊維芽細胞である。他の実施形態において、繊維芽細胞は血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態において、細胞は、特定の脊椎動物被験体に由来する。更なる実施形態において、細胞は、心血管系に影響を及ぼす疾患又は疾病を有する、脊椎動物被験体に由来する。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が選択される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣するために細胞が構成される。幾つかの実施形態において、特定の病状を模倣する方法で細胞が処理又は調節される。
【０１４７】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の組織の列が開示され、ここで、前記組織の各々は、互いに凝集する哺乳動物細胞；及び：１つ以上の表面上の哺乳動物細胞の第１型の層；１つ以上の表面上の哺乳動物細胞の第２型の層の１つ以上を含み；ここで、前記組織の各々の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；前記組織の各々は、培養下で維持される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、使用時に予め形成したスキャフォールドがない。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞は、次の：血管組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、筋組織、間充組織、結合組織、中胚葉由来の組織、及び臍の組織から成る群から選択される組織に由来する平滑筋細胞を含む。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞は、次の：血管組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織に由来する内皮細胞を含む。幾つかの実施形態において、前記哺乳動物細胞は、非血管性繊維芽細胞を含む。他の実施形態において、哺乳動物細胞は血管の繊維芽細胞を含む。更なる実施形態において、血管の繊維芽細胞は血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、ほぼ類似する。他の実施形態において、アレイ内の組織の１つ以上は独特である。幾つかの実施形態において、アレイ内の個々の組織は、人体における１つ以上の特異的な組織を表わす。更なる実施形態において、アレイ内の１つ以上の個々の組織は、次の：血液又はリンパ管、筋肉、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、乳房、膵臓、脾臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、及び前立腺から成る群から選択されたヒト組織を表わす。幾つかの実施形態において、各組織は、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに存在する。更なる実施形態において、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、又は成長因子の１つ以上によりコーティングされる。幾つかの実施形態において、ウェルはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）によりコーティングされる。また更なる実施形態において、ウェルはアガロースによりコーティングされる。幾つかの実施形態において、各組織は、容器のウェル内の多孔性の生体適合膜上に置かれた。幾つかの実施形態において、容器は、自動化した薬物スクリーニングに適合する。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、各組織は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、アレイ内の組織は、２つ以上の異なるヒトドナー由来の１つ以上の細胞型と共に作り出される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。他の実施形態において、アレイ内の組織の２つ以上は、可溶性因子を交換する。幾つかの実施形態において、アレイは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、アレイは、薬物検査で使用するためのものである。
【０１４８】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の組織を構築する方法が開示され、該方法は：哺乳動物細胞を含む１以上の凝集した多細胞の集合体を調製する工程；支持体上に、前記１以上の凝集した多細胞の集合体を置く工程；１つ以上の外部表面上の哺乳動物細胞の第１型の層；１つ以上の外部表面上の哺乳動物細胞の第２型の層の１以上を、前記１以上の凝集した多細胞の集合体に適用する工程；及び、前記１多細胞の集合体が凝集して三次元の組織を形成することを可能にするため、それらをインキュベートする工程を含み；ここで、前記インキュベーションの存続時間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態において、前記組織の少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態において、組織は、製造時に任意の予め形成したスキャフォールドがない。更なる実施形態において、組織は、製造時に任意の予め形成したスキャフォールドがほぼない。他の実施形態において、組織は、使用時に任意の予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５０μｍである。更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。他の実施形態において、組織は、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。更なる実施形態において、組織は、最も小さな寸法で約５０μｍ乃至約６００μｍの長さ、幅、又は高さ、或いは厚みを有する。また更なる実施形態において、組織は、１ｍｍより大きな長さ、幅、高さ、又は厚みを有する。幾つかの実施形態において、第１細胞型の凝集した多細胞の集合体は、間質細胞、結合組織由来の細胞、中胚葉由来の細胞を含む。更なる実施形態において、凝集した多細胞集合体は、第２細胞型を更に含む。追加の実施形態において、第２細胞型は、上皮組織、内皮組織、間充組織、又は外胚葉性組織に由来する。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞の層の適用は、細胞の懸濁液、単層、１以上のシート、多層、又は融合集合体により、凝集した多細胞の集合体の少なくとも１つの表面をコーティングする工程を含む。更なる実施形態において、懸濁液は、約１×１０４乃至約１×１０６細胞／μｌを含む。更なる実施形態において、懸濁液は、約１×１０４乃至約１．５×１０６細胞／μｌを含む。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞の層の適用は、空間的に分配される液滴として、前記凝集した多細胞の集合体の１つの表面に直接、細胞の懸濁液を分注する工程を含む。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞の層の適用は、スプレーとして、凝集した哺乳動物細胞の１つの表面上に直接、細胞の懸濁液を分注する工程を含む。幾つかの実施形態において、哺乳動物細胞の層の適用は、細胞の確立した層に直接接触して、前記凝集した多細胞の集合体の１つ以上の表面を置く工程を含む。更なる実施形態において、細胞の確立した層は、単層、多層、１以上のシート、又は細胞の融合集合体を含む。幾つかの実施形態において、細胞の第１型の層は、前記凝集した多細胞の集合体の１つ以上の表面上に適用され、細胞の第２型の層は、前記凝集した多細胞の集合体の１つ以上の異なる表面に適用される。幾つかの実施形態において、インキュベーションの持続時間は、約２時間乃至約１０日である。幾つかの実施形態において、１つ以上の表面上の細胞の第１型の層；１つ以上の表面上の細胞の第２型の層の１以上を適用する工程は、１つ以上の凝集された多細胞の集合体が置かれる時間に行なわれる。他の実施形態において、１つ以上の外部表面上の細胞の第１型の層；１つ以上の外部表面上の細胞の第２型の層の１以上を適用する工程は、前記インキュベーション中に行われる。更なる実施形態において、方法は、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力に組織を晒す工程を含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、本明細書には生きている三次元の血管壁セグメントが開示され、該セグメントは：互いに凝集する平滑筋細胞；及び：１つ以上の表面上の内皮細胞の層；１つ以上の表面上の繊維芽細胞の層の１つ以上を含み；ここで、前記血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされ；及びここで、前記血管壁セグメントは非管状である。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、製造時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。他の実施形態において、血管壁セグメントは、使用時に予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントはほぼ平面である。幾つかの実施形態において、内皮細胞の層は、内皮細胞の単層、１以上の層、１以上のシート、又は融合集合体を含む。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、１つ以上の表面上に内皮細胞の層を含む。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞の層は、繊維芽細胞の単層、１以上の層、１以上のシート、又は融合集合体を含む。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、前記血管壁セグメントの１つ以上の表面上に繊維芽細胞の層を含む。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、内皮細胞の層及び繊維芽細胞の前記層を含み；ここで、内皮細胞の前記層は、前記血管壁セグメントの１つ以上の外部表面上にあり、繊維芽細胞の前記層は、前記血管壁セグメントの１つ以上の異なる表面上にある。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５０μｍである。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約１５０μｍである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約２５０μｍである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、バイオプリンティング時にその最も小さな寸法で少なくとも約５００μｍである。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、血管壁セグメントは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、血管壁セグメントは、薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、血管壁セグメントは心血管系作用薬試験で使用するためのものである。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の分化細胞である。他の実施形態において、平滑筋細胞、繊維芽細胞、及び内皮細胞は、成体の非分化細胞である。幾つかの実施形態において、平滑筋細胞はヒト平滑筋細胞である。更なる実施形態において、平滑筋細胞は、次の：血管組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、筋組織、結合組織、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じた。幾つかの実施形態において、内皮細胞は���ヒト内皮細胞である。更なる実施形態において、内皮細胞は、次の：血管組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、骨髄、及び臍の組織から成る群から選択される組織から生じる。幾つかの実施形態において、繊維芽細胞は、非血管性繊維芽細胞である。他の実施形態において、繊維芽細胞は、血管性繊維芽細胞である。更なる実施形態において、繊維芽細胞は血管の外膜に由来する。幾つかの実施形態において、１以上の細胞成分は、特定の脊椎動物被験体に由来する。更なる実施形態において、１以上の細胞成分は、心血管系に影響を及ぼす疾患又は疾病を有する、脊椎動物被験体に由来する。幾つかの実施形態において、１以上の細胞成分は、特定の病状を模倣するように選択及び／又は構成される。幾つかの実施形態において、１以上の細胞成分は、特定の病状を模倣する方法で処理及び／又は調節される。
【０１５０】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の血管壁セグメントのアレイが開示され、ここで、前記血管壁セグメントの各々は、互いに凝集する平滑筋細胞；及び：１つ以上の表面上の内皮細胞の層；１つ以上の表面上の繊維芽細胞の層の１つ以上を含み；ここで、前記各血管壁セグメントが操作され；前記血管壁セグメントの各々は、培養下で維持される。幾つかの実施形態において、配列内の各血管壁セグメントの少なくとも１つの成分は、バイオプリントされた。更なる実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、製造時に任意の予め形成したスキャフォールドがほぼない。他の実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、使用時に任意の予め形成したスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態において、各血管壁セグメントは、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに存在する。更なる実施形態において、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、タンパク質、化学物質、ペプチド、抗体、又は成長因子以下の１つ以上によりコーティングされる。幾つかの実施形態において、ウェルはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）によりコーティングされる。他の実施形態おいて、ウェルはアガロースによりコーティングされる。幾つかの実施形態において、各血管壁セグメントは、前記容器の前記ウェル内の多孔性の生体適合膜上に置かれた。幾つかの実施形態において、容器は、自動化した薬物スクリーニングに適合する。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、１以上の側部上の生体適合性表面に固定される。更なる実施形態において、生体適合性表面は多孔質膜である。また更なる実施形態において、各血管壁セグメントは、１以上の側部上で、流体流によって引き起こされる剪断力にさらされる。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、ほぼ類似する。他の実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントの１つ以上は独特である。幾つかの実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントは、人体における１つ以上の異なる血管組織を表わす。幾つかの実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントは、２つ以上の異なるヒトドナー由来の１つ以上の細胞型と共に作り出される。幾つかの実施形態において、アレイ内の各血管壁セグメントは、培養下で独立して維持される。他の実施形態において、アレイ内の血管壁セグメントの２つ以上は、可溶性因子を交換する。幾つかの実施形態において、アレイは、インビトロのアッセイでの使用のためのものである。更なる実施形態において、アレイは、薬物検査で使用するためのものである。また更なる実施形態において、アレイは心血管系作用薬試験で使用するためのものである。
【０１５１】
特定の実施形態において、本明細書には、生きている三次元の血管壁セグメントを構築する方法が開示され、該方法は：生体適合性の支持体上で繊維芽細胞の層を培養する工程；平滑筋細胞を含む１以上の凝集した多細胞の集合体を調製する工程であって、ここで、前記集合体は、ほぼ球状又はほぼ円柱状である、工程；前記支持体上に１以上の凝集した多細胞の集合体を置く工程；１以上の表面上の内皮細胞の層を、前記１以上の凝集した多細胞の集合体に適用する工程：及び、前記多細胞の集合体が凝集して三次元の組織を形成するのを可能にするため、それらをインキュベートする工程を含む。
【０１５２】
特定の実施形態において、本明細書には、三次元細胞ベースの要素、及び一時的又は除去可能な制限を含む操作した組織の培養系が開示され、ここで、制限物質は、細胞と培養液の間の直接的な接触を可能にする。幾つかの実施形態において、操作した三次元細胞ベースの要素は、バイオプリントされた。更なる実施形態において、操作した三次元細胞ベースの要素は、任意の予め形成されたスキャフォールドが無い。幾つかの実施形態において、制限物質は、次の特徴の少なくとも１つを有する：細胞にほとんど付着しない；生体適合性である；押出可能である；細胞構造がない；細胞に支持体を提供するのに十分な強度がある；及び、水性の状態において可溶性ではない。更なる実施形態において、制限物質はプラスチックではなく、グラスではなく、陶器ではない。幾つかの実施形態において、制限物質はヒドロゲルである。１つの実施形態において、制限物質はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）である。幾つかの実施形態において、制限物質は、アガロース、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒアルロナン、ゼラチン、ポロクサマー、ヒドロキシエチルメタクリレート、ペプチドヒドロゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ポリジメチルシロキサン、シリコン、絹、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、界面活性剤ポリオール、及びアルギン酸塩の１以上を含む。幾つかの実施形態において、細胞及び／又は制限物質の少なくとも１つは、バイオプリンターから押し出された。更なる実施形態において、制限物質中に間隙が存在し、ここで、培養液は、間隙を経て細胞に接触することができる。また更なる実施形態において、間隙は、幅が約１００μｍと約３０ｍｍの間である。他の実施形態において、間隙は、構造の周囲に非均一に分配され、それにより、組織の細胞は非均一に栄養素に暴露される。幾つかの実施形態において、ここで、組織の表面積の少なくとも約１０％は、培養液との接触に適した間隙に暴露された。幾つかの実施形態において、制限物質は、少なくとも１つの細長い要素として細胞に上塗りされた。更なる実施形態において、制限物質の細長い要素は、約１００μｍと約１ｍｍの間の横断面の厚さを有する。幾つかの実施形態において、制限物質の細長い要素間に間隙が存在する。幾つかの実施形態において、バイオプリンターから制限物質を押し出す時、間隙は細長い要素の間に残された。他の実施形態において、制限物質の少なくとも幾つかは、間隙を提供するためシステムから取り除かれた。幾つかの実施形態において、制限物質の細長い要素はほぼ平面であり、間隙が伸長された。幾つかの実施形態において、制限物質の細長い要素が格子中で並べられた。幾つかの実施形態において、制限物質の細長い要素は、支持面に構造を付ける。幾つかの実施形態において、システムは輸送に適していた。幾つかの実施形態において、バイオプリントした細胞は、平滑筋細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、及び上皮細胞の少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態において、培養液物質は、酸素（Ｏ２）、炭素源、窒素源、成長因子、塩、無機質、ビタミン、血清、抗生物質、化学物質、タンパク質、核酸、医薬品、及び抗体の少なくとも１つを含んだ。
【０１５３】
特定の実施形態において、本明細書には、ヒドロゲルによって適所に保持された、三次元細胞を含む要素を含む、操作した、生きている組織が開示され、ここで、ヒドロゲルは、細胞が栄養素にアクセスする円柱状又はリボン状の間の間隙を有する、円柱状又はリボン状として前記細胞を含む要素上で分配され、ヒドロゲルは組織から除去可能である。
【０１５４】
特定の実施形態において、本明細書には、操作した組織の生存度を増加させるための方法が開示され、該方法は、一時的又は半恒久的な格子を経て組織と培養液の間の直接的な接触を提供する工程を含み、ここで、組織は任意の予め形成されたスキャフォールドが無い。幾つかの実施形態において、一時的又は半恒久的な格子を経て組織と培養液の間の直接的な接触を提供する工程は、多孔性又は間隙のある物質において前記組織を制限する工程を含む。更なる実施形態において、孔又は間隙は、幅が約１００μｍと約３０ｍｍの間であった。更なる実施形態において、多孔性又は間隙のある物質はヒドロゲルであった。また更なる実施形態において、多孔性又は間隙のある物質はアガロースであった。幾つかの実施形態において、操作した組織の生存度は、エキソビボで増加される。幾つかの実施形態において、操作した組織を含む細胞の少なくとも一部の生存度が拡張される。更なる実施形態において、細胞の生存度は、１日以上まで拡張される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの栄養素は、次の：炭素源、窒素源、成長因子、塩、無機質、ビタミン、血清、抗生物質、タンパク質、核酸、医薬品化合物、及び抗体から成る群から選択される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの栄養素は酸素（Ｏ２）である。更なる実施形態において、多孔性又は間隙のあるヒドロゲル制限は、バイオプリントされた細胞に、１つ以上の表面上の栄養素への異なる暴露を提供するために設計される。
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書には、組織培養システムを作る方法が開示され、該方法は：生体適合性の基質上に三次元の細胞を含む要素を確立する工程；及び、三次元の細胞を含む要素を覆う制限物質を分配する工程を含み、ここで、覆われた制限物質は、細胞の少なくとも幾つかが増殖培地を接触させることを可能にする。
【０１５６】
特定の実施形態において、本明細書には、組織培養系を作る方法が開示され、該方法は：表面上に制限物質の周辺を分配する工程；周辺内に細胞を分配する工程；及び、細胞を覆う制限物質を分配する工程を含み、ここで、覆われた制限物質は、細胞の少なくとも幾つかが増殖培地を接触させることを可能にする。幾つかの実施形態において、制限物質を分配する工程は、バイオプリンティングにより達成される。幾つかの実施形態において、方法は、バイオプリントした細胞の構成を成熟するのに適切な培地において、システムを培養する工程を含む、又は更に含む。
【実施例】
【０１５７】
以下の具体的な実施例は、単に実例となり、あらゆる任意の方法における開示の残りに制限されないものとして、解釈されるべきである。
【０１５８】
＜実施例１−細胞培養＞
＜平滑筋細胞＞
初期のヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、３７℃で５％のＣＯ２にて１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ由来）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（全てＳｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯに由来）で補われた、低いグルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の中で維持し、拡張した。継代４と８の間のＨＡＳＭＣの集密的培養を、全ての研究において使用した。
【０１５９】
＜内皮細胞＞
初期のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡに由来）で補われた、培地１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の中で維持し、拡張した。細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、ゼラチン（ブタ血清から；Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）をコーティングした、組織培養により処理したフラスコ上で成長させた。継代４と８の間のＨＡＥＣの集密的培養を、全ての研究において使用した。
【０１６０】
＜繊維芽細胞＞
初期のヒト真皮線維芽細胞（ＨＡＥＣ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、２％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡに由来）で補われた、培地１０６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の中で維持し、拡張した。継代４と８の間のＨＤＦの集密的培養を、全ての研究において使用した。
【０１６１】
＜ヒト吸引脂肪組織のＳＶＦからのＳＭＣ様細胞＞
ＳＭＣ様細胞を、吸引脂肪組織のコラゲナーゼ消化の後に隔離された細胞の接着性画分から生じさせた。この消化は、間質の血管の画分（ＳＶＦ）として知られる細胞の集団をもたらす。ＳＶＦの細胞を、標準組織培養プラスチック上に蒔き、付着細胞を適切な培養条件と共に更に選択した。脂肪組織の吸引脂肪組織のＳＶＦからのＳＭＣ様細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ由来）、５０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０ｍｇ／Ｌのグリシン、２０ｍｇ／Ｌのアラニン、５０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、及び３μｇ／ＬのＣｕＳＯ４（全てＳｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯに由来）で補われた、高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の中で維持し、拡張した。継代３と８の間のＳＶＦＳＭＣの融合性の副次培養を、全ての研究において使用した。
【０１６２】
＜ヒト吸引脂肪組織のＳＶＦからのＥＣ＞
間質の血管の画分（ＳＶＦ）の内皮細胞を、本物の内皮細胞（ＥＣ）の初期の分離を発達させるために共通して使用される成長媒体において維持し、拡張した。特に、ＳＶＦ−ＥＣを、１０％のＦＢＳ、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト表皮増殖因子、３ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ／ｍＬのヘパリン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンにより補われるＭ１９９において維持した。細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、組織培養により処置したフラスコ上で成長させた。継代３と８の間のＳＶＦ−ＥＣの集密的培養を、全ての研究において使用した。
【０１６３】
肺由来の細胞
【０１６４】
正常ヒト肺線維芽細胞を、ＬｉｆｅＬｉｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＬｏｎｚａから獲得し、それぞれの売り手からの培地を使用し、メーカーの説明書に従って繁殖させた。小さな気管上皮細胞（Ｓｍａｌｌ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）を、Ｌｏｎｚａから購入し、メーカーの説明書に従って売り手が提供する培地において成長させた。肺気道及び肺の血管平滑筋細胞を、ＬｉｆｅＬｉｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得て、売り手が提供する培地において製造業者の指示に従って培養した。
【０１６５】
＜実施例２−ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の溶液及び鋳型＞
＜２％及び４％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の溶液の調製＞
（それぞれ２％又は４％に関して）１ｇ又は２ｇのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を、５０ｍＬのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の中に溶解した。簡潔に、ＤＰＢＳ及びＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶けるまで持続的に撹拌すると共に、ホットプレート上で８５℃に加熱する。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を２５分間、１２５℃で蒸気殺菌によって殺菌する。温度が６５．５℃より上に維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は液相で残る。この温度以下で相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘性が増加し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）は固体のゲルを形成する。
【０１６６】
＜ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型の調製＞
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型を、１０ｃｍのペトリ皿に適合したＴｅｆｌｏｎ（登録商標）鋳型を使用して、円柱状のバイオインクのインキュベーションのために作り上げた。簡潔に、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）鋳型を、７０％のエタノール溶液を使用し、４５分間、鋳型をＵＶ光にさらして、予め殺菌した。殺菌した鋳型を、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）の上に置き、しっかりと付けた。このアセンブリ（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）鋳型＋ペトリ皿）を垂直に維持し、４５ｍＬの予め暖めた無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）鋳型とペトリ皿の間の空間に注いだ。その後、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の完全なゲル化を可能にするため、アセンブリを１時間、室温で平面に置いた。ゲル化後、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プリントを除去し、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型を、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地を、多型の円柱状のバイオインクをインキュベートするためのＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型に加えた。
【０１６７】
＜実施例３−ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの多型の円柱状のバイオインクの生成＞
多型の円柱状のバイオインクを調製するため、ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣを別々に集め、その後、予め決定した比率で混合した。簡潔に、培養培地を集密的培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（成長地域の１ｍｌ／５ｃｍ２）により洗浄した。１０分間、トリプシン（成長地域の１ｍｌ／１５ｃｍ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の存在下でのインキュベーションによって、培養フラスコの表面から細胞を分離した。０．１５％のトリプシンを使用してＨＡＳＭＣを分離し、一方で０．１％のトリプシンを使用してＨＡＥＣを分離した。インキュベーション後、適切な培養培地をフラスコ（トリプシン容積に関して２Ｘの容積）に加えた。細胞懸濁液を６分間２００ｇで遠心分離し、その後、上清の溶液の除去を達成した。細胞ペレットをそれぞれの培養培地において再懸濁し、血球計算器を使用して数えた。ＨＡＳＭＣとＨＡＥＣの適切な容積を、１５％のＨＡＥＣ及び残り８５％のＨＡＳＭＣ（全体の細胞集団の％として）を含む多型の細胞懸濁液を得るために組み合わせた。多型の細胞懸濁液を５分間２００ｇで遠心分離し、その後、上清の除去を達成した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地において再懸濁し、２０ｍＬのグラスバイアル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）に移し、その後、６０分間、及び３７℃並びに５％のＣＯ２で、１５０ｒｐｍで軌道のシェーカー上でインキュベーションを行った。これは、細胞が互いに集合し、細胞間接着を起こすことを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を１５ｍＬ遠心分離管に移し、５分間２００ｇで遠心分離した。上清培地の除去後、細胞ペレットを４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地において再懸濁し、全ての細胞集団が確実に崩壊する様々な時間で、ピペットアップ及びピペットダウンした（ｐｉｐｅｔｔｅｄ  ｕｐ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ）。細胞懸濁液を、１５ｍＬ遠心分離管の内部に置かれた０．５ｍＬ微量遠心管（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）へ移し、その後、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成するため、４分間２０００ｇで遠心分離した。上清培地を吸引し、細胞を、長さ５０ｍｍの円柱状のバイオインクを得るように吸入によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．５ｍｍ、ＩＤ  ０．５ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｂｒｏｏｍａｌｌ，  ＰＡ）へ移した。キャピラリー内部の細胞ペースト剤を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、２０分間ＨＡＳＭＣ培地でインキュベートした。その後、円柱状のバイオインクを、キャピラリーを供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（例えば、実施例２を参照）（ＨＡＳＭＣ培地により覆われる）の溝へと押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１６８】
＜実施例４−ＨＡＳＭＣ及びＨＡＥＣの多型の円柱状のバイオインクを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁を模倣するセグメントを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングしたウェルの内部で、又はマルチウェルプレート（例えば、６のウェルプレート）におけるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上に直接、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベースプレート（１００ｍｍのペトリ皿の大きさ）上で、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用してバイオプリントした。このプロセスは、以下の３段階を含む：
【０１６９】
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣの多型のバイオインクの調製
【０１７０】
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）及びヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の培養をトリプシン処理し、数え、適正量で混合して、８５：１５又は７０：３０の比率の何れかでＨＡＳＭＣ：ＨＡＥＣを含んだバイオインクを得た。多型の細胞懸濁液を回転振盪機上で６０分間振り混ぜ、集めて、遠心分離した。２６６又は５００μｍ（ＩＤ）のグラスマイクロキャピラリーへと細胞を引き抜き、その後、培地で覆われたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレートへと押し出し、最小で６時間インキュベートした。
【０１７１】
パッチ／三次元細胞シートのバイオプリンティング
【０１７２】
マルチウェルプレートのウェルの内部又はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベースプレート（１００ｍｍのペトリ皿の大きさ）上のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上にプリントする場合、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第１層をバイオプリントした。その後、内部の空間が長さ８ｍｍ×幅１．２５ｍｍとなるよう、その上に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドを使用して箱をバイオプリントした。成熟した円柱状のバイオインクを、箱の内部でのプリンティングのためバイオプリンターに乗せた。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第３の層を、細胞の全長を覆う、又は頂部に格子／メッシュを作る第２の頂部の上にプリントした。プレートのウェルの内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合、以前に述べたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドの第１層を除去した。バイオプリントした構成物をその後、適切な細胞培養培地で覆い、バイオインクの近接のセグメントが細胞の三次元のパッチを形成するために融合される間にインキュベートした。
【０１７３】
バイオプリントした構成物の成熟
【０１７４】
ＨＡＳＭＣ−ＨＡＥＣバイオインクを含むバイオプリントした構成物を、１−７日間インキュベートして、構成物の成熟を可能にし、構成物の周囲へ選別するのに十分なＨＡＥＣの時間を提供し、それにより、血管壁のセクションを模倣する。幾つかの試験において、三次元細胞のパッチを剪断力（即ち、拍動流）にさらし、ＨＡＥＣ選別のプロセスを支援した。
【０１７５】
＜実施例５−ＨＡＳＭＣ−ＨＤＦ−ＨＡＥＣの多型の円柱状のバイオインクの生成＞
多型の円柱状のバイオインクを調製するため、ＨＡＳＭＣ、ＨＤＦ、及びＨＡＥＣを別々に集め、その後、予め決定した比率（例えば、７０：２５：５のＨＡＳＭＣ：ＨＤＦ：ＨＡＥＣの比率）で混合した。簡潔に、培養培地を集密的培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（成長地域の１ｍｌ／１０ｃｍ２）により洗浄した。１０分間、トリプシン（成長地域の１ｍｌ／１５ｃｍ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の存在下でのインキュベーションによって、培養フラスコの表面から細胞を分離した。０．１５％のトリプシンを使用してＨＡＳＭＣとＨＤＦを分離し、一方で０．１％のトリプシンを使用してＨＡＥＣを分離した。インキュベーション後、適切な培養培地をフラスコ（トリプシン容積に関して２Ｘの容積）に加えた。細胞懸濁液を６分間２００ｇで遠心分離し、その後、上清の溶液の除去を達成した。細胞ペレットをそれぞれの培養培地において再懸濁し、血球計算器を使用して数えた。ＨＡＳＭＣ、ＨＤＦ、及びＨＡＥＣの適切な容量を組み合わせ、多型の細胞懸濁液を得た。多型の細胞懸濁液を５分間、２００ｇで遠心分離し、その後、上清溶液の吸収を達成した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＨＡＳＭＣ培養培地において再懸濁し、２０ｍＬのグラスバイアル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）に移し、その後、６０分間、及び３７℃並びに５％のＣＯ２で、１５０ｒｐｍで軌道のシェーカー上でインキュベーションを行った。これは、細胞が互いに集合し、細胞間接着を起こすことを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を１５ｍＬ遠心分離管に移し、５分間２００ｇで遠心分離した。上清培地の除去後、細胞ペレットを４００μｌのＨＡＳＭＣ培養培地において再懸濁し、全ての細胞集団が確実に崩壊する様々な時間で、ピペットアップ及びピペットダウンした。細胞懸濁液を、１５ｍＬ遠心分離管の内部に置かれた０．５ｍＬ微量遠心管（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）へ移し、その後、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成するため、４分間２０００ｇで遠心分離した。上清培地を吸引し、細胞を、長さ５０ｍｍの円柱状のバイオインク集合体を得るように吸入によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．２５ｍｍ、ＩＤ  ０．２６６ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｂｒｏｏｍａｌｌ，  ＰＡ）へ移した。キャピラリー内部の細胞ペースト剤を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、２０分間ＨＡＳＭＣ培地でインキュベートした。その後、円柱状のバイオインクを、キャピラリーを供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（例えば、実施例２を参照）（ＨＡＳＭＣ培地により覆われる）の溝へと押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃及び５％のＣＯ２で、６乃至２４時間インキュベートした。
【０１７６】
＜実施例６−多型のＨＡＳＭＣ、ＨＡＥＣ、及びＨＤＦａのバイオインクを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁を模倣するセグメントを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングしたウェルの内部で、又はマルチウェルプレート（例えば、６のウェルプレート）におけるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上に直接、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベースプレート（１００ｍｍのペトリ皿の大きさ）上で、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用してバイオプリントした。このプロセスは、以下の３段階を含む：
【０１７７】
＜多型のＨＡＳＭＣ−ＨＤＦａ−ＨＡＥＣのバイオインクの調製＞
ＨＡＳＭＣ、ＨＡＥＣ、及びＨＤＦａの培養をトリプシン処理し、数え、適正量で混合して、７０：１５：１５の比率でＨＡＳＭＣ：ＨＤＦａ：ＨＡＥＣを含んだバイオインクを得た。多型の細胞懸濁液を回転振盪機上で６０分間振り混ぜ、集めて、遠心分離した。２６６又は５００μｍ（ＩＤ）のグラスマイクロキャピラリーへと細胞を引き抜き、その後、培地で覆われたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレートへと押し出し、最小で６時間インキュベートした。
【０１７８】
＜パッチ／三次元細胞シートのバイオプリンティング＞
マルチウェルプレートのウェルの内部又はＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベースプレート（１００ｍｍのペトリ皿の大きさ）上のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上にプリントする場合、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第１層をバイオプリントした。その後、内部の空間が長さ８ｍｍ×幅１．２５ｍｍとなるよう、その上に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドを使用して箱をバイオプリントした。成熟した円柱状のバイオインク集合体を、箱の内部でのプリンティングのためバイオプリンターに乗せた。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第３層を、細胞の全長を覆う、又は頂部に格子／メッシュを作る第２の頂部の上にプリントした。プレートのウェルの内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合、以前に述べたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドの第１層を除去した。バイオプリントした構成物をその後、適切な細胞培養培地で覆い、バイオインクの近接のセグメントが細胞の三次元のパッチを形成するために融合される間にインキュベートした。
【０１７９】
＜バイオプリントした構成物の成熟＞
多型のＨＡＳＭＣ−ＨＤＦａ−ＨＡＥＣバイオインクを含むバイオプリントした構成物を、１−７日間インキュベートして、構成物の成熟を可能にし、構成物の周囲へ選別するのに十分なＨＡＥＣの時間を提供し、それにより、血管壁のセクションを模倣する。幾つかの試験において、三次元細胞のパッチを剪断力（即ち、拍動流）にさらし、ＨＡＥＣ選別のプロセスを支援した。
【０１８０】
＜実施例７−ＳＶＦ−ＳＭＣ−ＳＶＦ−ＥＣの多型の円柱状のバイオインクの生成＞
多型の円柱状のバイオインクを調製するため、ＳＶＦ−ＳＭＣ及びＳＶＦ−ＥＣを別々に集め、その後、予め決定した比率で混合した。簡潔に、培養培地を集密的培養フラスコから取り除き、細胞をＤＰＢＳ（成長地域の１ｍｌ／５ｃｍ２）により洗浄した。５乃至１０分間、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の存在下でのインキュベーションによって、培養フラスコの表面から細胞を分離した。インキュベーション後、適切な培養培地をフラスコに加えた、酵素活性をクエンチした。細胞懸濁液を６分間２００ｇで遠心分離し、その後、上清の溶液の除去を達成した。細胞ペレットをそれぞれの培養培地において再懸濁し、血球計算器を使用して数えた。ＳＶＦ−ＳＭＣとＳＶＦ−ＥＣの適切な容積を、１５％のＳＶＦ−ＥＣ及び残り８５％のＳＶＦ−ＳＭＣ（全体の細胞集団の％として）を含む多型の細胞懸濁液を得るために組み合わせた。多型の細胞懸濁液を５分間２００ｇで遠心分離し、その後、上清の除去を達成した。多型の細胞ペレットを、６ｍＬのＳＶＦ−ＳＭＣ培養培地において再懸濁し、２０ｍＬのグラスバイアル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）に移し、その後、６０分間、及び３７℃並びに５％のＣＯ２で、１５０ｒｐｍで軌道のシェーカー上でインキュベーションを行った。これは、細胞が互いに集合し、細胞間接着を起こすことを可能にする。インキュベーション後、細胞懸濁液を１５ｍＬ遠心分離管に移し、５分間２００ｇで遠心分離した。上清培地の除去後、細胞ペレットを４００μｌのＳＶＦ−ＳＭＣ培養培地において再懸濁し、全ての細胞集団が確実に崩壊する様々な時間で、ピペットアップ及びピペットダウンした。細胞懸濁液を、１５ｍＬ遠心分離管の内部に置かれた０．５ｍＬ微量遠心管（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ，  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）へ移し、その後、非常に密でコンパクトな細胞ペレットを形成するため、４分間２０００ｇで遠心分離した。上清培地を吸引し、細胞を、長さ５０ｍｍの円柱状のバイオインク集合体を得るように吸入によってキャピラリーチューブ（ＯＤ  １．２５ｍｍ、ＩＤ  ０．２６６ｍｍ、Ｌ  ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｂｒｏｏｍａｌｌ，  ＰＡ）へ移した。キャピラリー内部の細胞ペースト剤を、３７℃及び５％のＣＯ２にて、２０分間ＳＶＦ−ＳＭＣ培地でインキュベートした。その後、円柱状のバイオインクを、キャピラリーを供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型（例えば、実施例２を参照）（ＳＶＦ−ＳＭＣ培地により覆われる）の溝へと押し出した。円柱状のバイオインクを、３７℃及び５％のＣＯ２で、６乃至１２時間インキュベートした。
【０１８１】
＜実施例８−血管のＳＭＣ及びＥＣの混合物を含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁構成物を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用し、１．５ｍＬの２％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で既に覆われていた６つのウェルの培養皿のウェルへとバイオプリントした。円柱状のバイオインクを、８５：１５又は７０：３０のＳＭＣ：ＥＣ比率で、ヒト血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）及びヒト内皮細胞（ＥＣ）の混合物と共に調製した。バイオインクを、５００μｍ又は２６６μｍの内径（ＩＤ）のいずれかを備えたグラスマイクロキャピラリーチューブへの細胞ペレット（ＳＭＣ：ＥＣ）の吸入によって生じさせた。その後、バイオインクシリンダーを、適切な培地で覆われたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型へ押し出した。バイオプリンティング前に、バイオインクを６〜１８時間保持した。ＳＭＣとＥＣの混合物を含む多型のバイオインクを使用した。これらの実験において、バイオインク内のＥＣをバイオインク凝集物の周囲へと選別し、結果として、ＥＣで覆われ、且つＳＭＣの豊富な構成物の壁を含む構成物をもたらした。このプロセスは、ＳＭＣ及びＥＣの被覆（例えば、推定上の中膜及び内膜）で構成された壁を含む血管壁構成物の発達をもたらした。構成物を、バイオプリンティングプロトコルを使用して培養ウェルの中心にバイオプリントし、培養ウェルを、適切な培地で満たし、成熟と評価のために構成物をインキュベーターに戻した。バイオプリンティング後、構成物を、培養培地の適正量（例えば、６つのウェルプレートの１つのウェルにつき４ｍＬ）で覆った。要するに、この実施例は、血管壁セグメント又は標準の大きさのマルチウェル培養プレート内の模倣物をバイオプリントするための、血管のＳＭＣ及びＥＣの使用を記載する。結果として生じる血管壁セグメント又は模倣物は、外層、又は大部分又は単独でＳＭＣで構成されるＥＣと内部壁の層を特徴とする。
【０１８２】
＜実施例９−ＥＣの被覆による、ヒト血管のＳＭＣを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁構成物を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用し、１．５ｍＬの２％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で既に覆われていた６つのウェルの培養皿のウェルへとバイオプリントした。細胞のバイオインクを、ヒト血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）と共に調製した。バイオインクシリンダーを、５００μｍ又は２６６μｍの内径（ＩＤ）のいずれかを備えたグラスマイクロキャピラリーチューブへの細胞ペレット（ＳＭＣ：ＥＣ）の吸入によって生じさせた。その後、円柱状のバイオインク集合体を、適切な培地で覆われたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）鋳型へ押し出した。バイオプリンティング前に、バイオインクを６〜１８時間保持した。ＥＣ−濃縮物（１−１．５×１０５細胞／μｌ）を、前にバイオプリントしたＳＭＣ構造の頂部に直接バイオプリントし、構成物の第２層を形成した。このプロセスは、ＳＭＣ及びＥＣの被覆（例えば、推定上の中膜及び内膜）で構成された壁を含む血管壁構成物の発達をもたらした。バイオプリンティングプロトコルを使用し、構成物を培養ウェルの中心にバイオプリントした。バイオプリンティング後、構成物を、培養培地の適正量（例えば、６つのウェルプレートの１つのウェルにつき４ｍＬ）で覆い、成熟と評価のためにインキュベーターに戻した。要するに、この実施例は、血管壁セグメント又は標準の大きさのマルチウェル培養プレート内の模倣物をバイオプリントするための、血管のＳＭＣ及びＥＣの使用を記載する。結果として生じる血管壁セグメント又は模倣物は、ＥＣの外層、及び大部分又は単独でＳＭＣで構成される内部壁を特徴とする。
【０１８３】
＜実施例１０−ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）制限を利用する、ＨＡＥＣと共に層になったＨＡＳＭＣを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁を模倣するセグメントを、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングしたウェルの内部で、又はマルチウェルプレート（例えば、６のウェルプレート）におけるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上に直接、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用してバイオプリントした。このプロセスは、以下の３段階を含む：
【０１８４】
＜ＨＡＳＭＣバイオインクの調製＞
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の培養をトリプシン処理し、その後、回転振盪機上で６０分間振り混ぜた。振り混ぜた後、細胞を集め、遠心分離し、２６６又は５００μｍ（ＩＤ）のグラスマイクロキャピラリーへと吸引した。最後に、細胞を、培地で覆ったＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレートへ押し出し、最小で６時間インキュベートした。
【０１８５】
＜ＨＡＥＣにより層になったＨＡＳＭＣパッチのバイオプリンティング＞
パッチ（例えばセグメント）のバイオプリンティングの直前、ヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）培養を、培地の１×１０６細胞／１０μＬの作動濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）でＨＡＥＣ培地においてトリプシン処理し、数え、その後、再懸濁した。ＨＡＥＣ懸濁液を、バイオプリントしたパッチを層にするために利用されるバイオプリンターに置く。マルチウェルプレートのウェルの内部のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ベッド上にプリントする場合、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第１層をバイオプリントした。その後、内部の空間が長さ８ｍｍ×幅１．２５ｍｍとなるよう、その上に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドを使用して箱をバイオプリントした。成熟した円柱状のＨＡＳＭＣバイオインクを、箱の内部でのプリンティングのためバイオプリンターに乗せた。その後、懸濁液中のＨＡＥＣをバイオプリンターによって清潔なマイクロキャピラリーに引き抜き、プリントしたパッチの４つの角の近くでプリントしたＨＡＳＭＣ層の上に４回分配した。各ドロップは２．５μＬの容積であった。第３層をプリントし始める前に、構成物を１５−３０分間インキュベートした。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの第３層を、第２層の頂部にプリントし、頂部に格子／メッシュを作った。プレートのウェルの内部のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上にプリントする場合、以前に述べたＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッドの第１層を除去した。その後、バイオプリントした構成物を、適切な細胞培養培地で覆い、インキュベートした。
【０１８６】
＜バイオプリントした構成物の成熟＞
バイオプリントした構成物を、１−７日間インキュベートし、構成物が成熟して、ＨＡＳＭＣパッチの上に均一に薄い単層を形成するのに十分な時間ＨＡＥＣを提供することを可能にした。幾つかの試験において、三次元細胞のパッチを剪断力（即ち、拍動流）にさらした。
【０１８７】
＜実施例１１−ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）制限を利用する、ＨＤＦａ単層上のＨＡＥＣと共に層になったＨＡＳＭＣを含む血管壁セグメントのバイオプリンティング＞
血管壁を模倣するセグメントを、マルチウェルプレート（例えば、６のウェルプレート）におけるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）挿入物上に直接、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用してバイオプリンティングした。このプロセスは、以下の４段階を含む：
【０１８８】
＜Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上でのＨＤＦａの培養＞
ヒト成体の真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）を、２０，０００細胞／ｃｍ２の密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞膜上に蒔き、最低６日間培養した。これは、細胞が付着し、増殖し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞膜上で集密的な層になることを可能にした。
【０１８９】
＜ＨＡＳＭＣバイオインクの調製＞
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の培養をトリプシン処理し、回転振盪機上で６０分間振り混ぜた。振り混ぜた後、細胞を集め、遠心分離し、２６６又は５００μｍ（ＩＤ）のグラスマイクロキャピラリーへと吸引した。その後、細胞を、培地で覆ったＮｏｖｏＧｅｌ（商標）プレートへ押し出し、最小で６時間インキュベートした。
【０１９０】
＜ＨＡＥＣにより層になったＨＡＳＭＣパッチのバイオプリンティング＞
パッチ（例えばセグメント）のバイオプリンティングの直前、ヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）培養をトリプシン処理し、数え、その後、培地の１×１０６細胞／１０μＬの作動濃度でＨＡＥＣ培地において再懸濁した。ＨＡＥＣ懸濁液を、バイオプリントしたパッチを層にするために利用されるバイオプリンターに置く。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で成長したＨＤＦａを有するマルチウェルプレートにおける培養培地を、完全に吸引し、プレートをバイオプリンターに移した。定義された空間が、膜上のＨＤＦａの頂部で直接、長さ８ｍｍ×幅１．２５ｍｍとなるように、ＮｏｖｏＧｅｌ（登録商標）ロッドを使用し、箱をバイオプリントした。成熟したＨＡＳＭＣバイオインクシリンダーを、箱の内部でのプリンティングのためバイオプリンターに乗せた。その後、懸濁液中のＨＡＥＣをバイオプリンターによって清潔なマイクロキャピラリーチューブに引き抜き、プリントしたパッチの４つの角の近くでプリントしたＨＡＳＭＣ層の上に４回分配した。各ドロップは２．５μＬの容積であった。頂部のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ロッド層をプリントし始める前に、構成物を１５−３０分間インキュベートした。最後に、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）シリンダーの頂部の層をプリントし、頂部に格子／メッシュを作った。その後、バイオプリントした構成物を、適切な細胞培養培地で覆い、インキュベートした。
【０１９１】
＜バイオプリントした構成物の成熟＞
バイオプリントした構成物を、１−７日間インキュベートし、構成物が成熟して、ＨＡＳＭＣパッチの上に薄い単層を均一に形成するのに十分な時間ＨＡＥＣを提供することを可能にした。
【０１９２】
＜実施例１２−構成物を空間的に制限するために使用され、一方で媒体に直接接触するのを可能にするヒドロゲル格子＞
円柱状のヒドロゲル要素を、三次元細胞シートの頂部表面の一部にわたって、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用してバイオプリントした。格子はシートに空間の制限を提供し、シートと周囲媒質の間の直接的な接触を可能にした。最初に、ヒドロゲル基層をバイオプリントした。次に、ヒドロゲル窓をバイオプリントし、長さ８ｍｍ×幅１．２５ｍｍの空間を定義する。第３に、三次元細胞シートを形成するため、細胞のバイオインクを、ヒドロゲル窓の内部でバイオプリントした。そして、第４に、ヒドロゲル格子構造をバイオプリントした。様々な実験において、ヒドロゲル要素の大きさは、直径およそ１００μｍ乃至１ｍｍであり、要素間の間隔はおよそ１００μｍ乃至１０ｍｍであった。
【０１９３】
幾つかの実験において、細胞シートの上に長い開放チャンネルを作るために、ヒドロゲル要素を１つの方向に沿ってプリントした。他の実験において、シート上にグリッド様のパターンの空地を作るために、ヒドロゲル要素を複数の方向にプリントした。ヒドロゲルはＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成された。格子構造を、構造を通りすぎて、及び、プリンティング表面上に随意に拡張し、プリンティング表面に構造を付けるため追加材料の適用を可能にする。結果として生じる格子を、空間的に構成物を制限するが、幾つかの細胞の構成物が周囲の栄養培地と直接接触するのを可能にするために使用した。
【０１９４】
＜実施例１３−連続的な沈着及び碁盤目状の機能ユニット構造を使用してバイオプリントされる肝臓組織＞
培養した肝臓組織を、連続的な堆積機構を使用するＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用して、バイオプリントした。肝臓組織の三次元構造は、繰り返しの機能ユニット、この場合、六角形に基づいた。バイオインクは、押し出し化合物（界面活性剤ポリオール−ＰＦ−１２７）に閉じ込められた肝星細胞及び内皮細胞からなっていた。
【０１９５】
＜３０％のＰＦ−１２７の調製＞
ＰＢＳを使用して３０％のＰＦ−１２７溶液（ｗ／ｗ）を作った。４℃で維持された磁気撹拌プレートを使用して、ＰＦ−１２７粉末を、冷凍したＰＢＳと混合した。完全溶解はおよそ４８時間で生じた。
【０１９６】
＜細胞調製及びバイオプリンティング＞
遠心分離後に３つの細胞濃度：５０×１０６細胞／ｍｌ、１００×１０６細胞／ｍｌ、及び２００×１０６細胞／ｍＬを達成するため、８２％の星細胞（ＳＣ）及び１８％のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）並びにヒト成体の真皮線維芽細胞（ＨＤＦａ）で構成された細胞懸濁液を、１５ｍＬチューブへ分離した。各細胞ペレットを３０％のＰＦ−１２７中で再懸濁し、バイオプリンターを使用して３ｃｃのリザーバへ吸引した。５１０μｍのディスペンスチップと共に、カプセル化細胞を、単一の六角形（図６Ａを参照）又は六角形の碁盤目状の構成（図６Ｂを参照）へと、ＰＤＭＳベースプレート上でバイオプリントした。各構成物はおよそ２００μＬの培地を受け、室温で２０分間インキュベートし、構成物の完全性を評価した。
【０１９７】
＜多重層バイオプリンティング＞
六角形の碁盤目状の実験のために、（４）までの連続する層をバイオプリントし、より多くの細胞物質が存在する、より高い構造をもたらした。生成後、各構成物は最初におよそ２００μＬの完全培地を受け、構成物の完全性を評価した。構成物を室温で２０分間インキュベートし、その後、２０ｍＬの完全培地に沈めた。
【０１９８】
結果
【０１９９】
１０％のウシ胎仔血清（ＰＦ１２７を溶解する）を含む成長媒体における１８時間の培養後、バイオプリントした幾何学的形状内に含まれていた細胞は、元の設計（図６Ｄを参照）の幾何学的パターンを保持した、組織の無傷の近接するシートを作るのに十分に、互いに凝集した。図７には、１０％の中性緩衝ホルマリンにおける固定後の、碁盤目状の構成物の単一のセグメントのＨ＆Ｅ染色が示される。細胞は、生存可能で、無傷で、それらの元のプリントした幾何学的形状に制限されると見出された。
【０２００】
実施例１４−層化の強化
細胞集団（均質又は不均質）を、円柱状のバイオインク、又はＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７（Ｌｕｔｒｏｌ，ＢＡＳＦ）における細胞懸濁液の何れかとしてバイオプリントするために調製した。簡潔に、バイオインクの調製のため、組み換え型のヒトトリプシン（７５μｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）又は０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の何れかを使用して、細胞を標準組織培養プラスチックから遊離した。酵素遊離の後、細胞を洗浄し、収集し、数え、所望の比率（即ち、５０：５０、肝臓の星細胞（ｈＳＣ）：内皮細胞（ＥＣ））で組み合わせ、遠心分離によってペレット状にした。その後、上清を細胞ペレットから取り除き、細胞混合物を、所望の直径（典型的に５００μｍ又は２５０μｍ）、内径のグラスマイクロキャピラリーに吸引した。その後、この円柱状の細胞調製物を鋳型へ押し出し、バイオインク成熟のための経路を有する非細胞接着ヒドロゲル物質から生成した。その後、結果として生じるバイオインクシリンダーを、経験に基づいて測定された時間の間、典型的に２〜２４時間、完全な細胞培養培地において培養した。
【０２０１】
簡潔に、ヒドロゲル細胞懸濁液の調製のため、本明細書に記載される酵素媒介プロトコルの何れかを使用して、細胞を標準細胞培養容器から遊離した。その後、遊離した細胞を、培地を含む血清により洗浄し、収集し、数え、遠心分離して、密な細胞ペレットを形成した。上清を、結果として生じる細胞ペレットから取り除き、その後、５０乃至２００×１０６細胞／ｍＬ（１０乃至３００×１０６細胞／ｍＬの範囲）の濃度で、冷たいＰＦ−１２７（４℃）の中で細胞を再懸濁した。その後、この細胞懸濁液を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を利用して、シリンジへと吸引した。
【０２０２】
その後、強化した細胞パターン化、層化、又は方向付けによる組織構成物の構成を、バイオプリンターを使用して達成した。三次元組織構成物のバイオプリントを、円柱状バイオインク、水溶ゲル中の細胞懸濁液、又はそれらの組み合わせにより実行した。定義された細胞パターン化又は層化を達成するため、関連する細胞集団の組み合わせを、バイオインク又は細胞懸濁液調製物に含め、その後、細胞溶液を支持するゲル物質の溶解が、沈着したバイオインクの周囲で層化する定義された細胞をもたらす様式で、バイオプリントした（図８を参照）。細胞パターン化、組織、又は層化も、定義された別々の細胞集団（例えば、ｈＳＣとＥＣ）の利用及び組み込みを経て達成され、それらは、バイオプリントした組織内の細胞及び細胞構造の予測可能且つ反復可能な組織をもたらした（図９を参照）。
【０２０３】
幾つかの実験において、バイオプリントした新生組織内の最終的な細胞構成を、成熟又は培養の期間後に観察した。構成物を、標準の研究所のインキュベーター（３７℃、５％のＣＯ２で補われる、湿ったチャンバ）の中で維持し、経時的に評価した。
【０２０４】
＜結果＞
細胞パターン化、層化、又は配列を、バイオプリンティングを使用して達成した。バイオインクを含む不均質の（即ち、多型性の）細胞集団でバイオプリントすることにより、又はバイオインク（均質又は不均質の細胞集団）を高密度細胞ゲル或いは細胞懸濁液と組み合わせることにより、異なる細胞組織化を観察した。湿ったチャンバ（インキュベーター）中のこれら新生組織の構成物の成熟は、これらバイオプリントした新生組織において異なる細胞配列、構成、及び／又は分離の更なる確立をもたらした。
【０２０５】
例えば、バイオプリントしたバイオインクを含むＨｅｐＧ２細胞の上の、ＥＣ：ｈＳＣを含んだＰＦ−１２７（ＥＣ：ｈＳＣ−ｌａｄｅｎ  ＰＦ−１２７）のバイオプリンティングは、異なる細胞集団及び別個の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）組織形態を備える構成物の異なる層の確立をもたらす。ｈＳＣとＥＣを含むバイオインク構成物の場合、完全培地において３日より多くの間成熟した、バイオプリントした構成物は、周囲にてＥＣの異なる層を含むことが分かり、構成物の核内の微細血管網を組織した。ＥＣの高濃縮溶液をバイオプリントした血管平滑筋細胞の均質の（即ち、単型の）集団を含むバイオインクにより作り上げられた、バイオプリントした構成物は、構成物の周囲にてＥＣの異なる層を含むことが分かった。
【０２０６】
＜実施例１５−層を成した非血管構成物（気道アナログ）＞
円柱状のバイオインクを、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）、小さな気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、及びヒト大動脈内皮細胞（ＥＣ）により調製した。細胞を標準の研究所条件下で増殖し、細胞と同じ売り手から購入した培地において、又は、特定の細胞型に関して標準の細胞培養行為の助けになると、典型的に初期の文献において見出される成分を含む培地において、細胞を培養した。簡潔に、細胞を、陽イオン遊離リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することにより標準組織培養プラスチックから遊離し、その後、０．１−０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に暴露した。その後、遊離した細胞を血清を含む培地中で洗浄し、収集し、数え、適切な比率で組み合わせて、遠心分離によってペレット状にした。典型的に、ＮＨＬＦとＥＣを、９０：１０乃至５０：５０のＮＨＬＦ：ＥＣの比率で混合した。その後、上清を取り除き、細胞ペレットをグラスマイクロキャピラリーへ吸引し、その後、それらをおよそ１５〜２０分間、完全培地に沈めた。その後、この円柱状のバイオインク構造を、直線流路を含む非細胞接着ヒドロゲルの鋳型へ押し出し、２〜１８時間保持した。
【０２０７】
その後、ＳＡＥＣを高濃縮細胞懸濁液において調製した。簡潔に、ＳＡＥＣを本明細書に記載されるように遊離し、収集し、数を数え、遠心分離によってペレット状にした。上清を取り除き、細胞ペレットを完全培地の少容量において再懸濁して、１×１０５細胞／μＬの高濃縮細胞ペレットを得た。その後、この細胞懸濁液を、使用時まで４℃で保存した。
【０２０８】
その後、ヒトの肺構成物を、マルチウェルプレートのウェルへ、又は細胞培養ウェルの挿入物（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，ＢＤ）の膜上にバイオプリントした。多細胞のＮＨＬＦ又はＮＨＬＦ：ＥＣのバイオインクを使用し、小さな気管壁を表わす組織の層をバイオプリントした。ヒト気道組織セグメントを、１．２５ｍｍ×８ｍｍ×０．２５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）の最初の寸法で作り上げた。ＮＨＬＦ又はＮＨＬＦ：ＥＣのバイオインクによる壁層のバイオプリンティングの後、ＳＡＥＣの濃縮細胞懸濁液を、壁の上面にバイオプリントし、推定上の気道の間質の上に気道上皮を含む第２層を生成した（図１０を参照）。
【０２０９】
その後、ヒト気道組織セグメントを、血清を含む完全な細胞培養培地に沈め、成熟のため５％のＣＯ２で補われる、標準の湿ったチャンバに置いた。その後、バイオプリントしたヒト気道セグメントを、静止状態で培養し、又は、サイトカイン或いは生体力学の信号の付加により刺激した（例えば、流体流、剪断応力等）。その後、バイオプリントしたヒト肺組織構成物を、７日までの間培養し、細胞組織化、細胞外マトリックス産生、細胞の生存率、及び構成物の完全性について評価した（図１１を参照）。
【０２１０】
＜結果＞
ＥＣが並んだ（ＥＣ−ｌｉｎｅｄ）微細血管特性の組織されたネットワークを含むＮＨＬＦ壁、及び小さな気道上皮細胞を含む先端面を含む、層を成した細胞構造を備える、バイオプリントしたヒト肺組織構成物を上手く作り上げ、培養下で維持した。バイオプリントした構成物を、ＮＨＬＦ又はＮＨＬＦ：ＥＣのバイオインクシリンダー及びＳＡＥＣのバイオプリントした層を有する多層の方法を使用して、生成した。肺の疾患プロセスに重大であると考えられるサイトカインによる刺激後、組織肥厚及びＮＨＬＦ活性化を含む形態変化を観察した。
【０２１１】
＜実施例１６−層を成した血管壁構成物＞
円柱状のバイオインクを、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）、及び幾つかの実験において真皮線維芽細胞（Ｆｂ）により調製した。簡潔に、細胞を、陽イオン遊離リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することにより標準組織培養プラスチックから遊離し、その後、０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に暴露した。その後、遊離した細胞を血清を含む培地中で洗浄し、収集し、数え、Ｆｂが含まれる実験のため、適切な比率で組み合わせて、遠心分離によってペレット状にした。その後、上清を取り除き、細胞ペレットをグラスマイクロキャピラリーへ吸引し、その後、それらをおよそ１５〜２０分間、完全培地に沈めた。その後、この円柱状のバイオインク構造を、直線流路を含む非細胞接着ヒドロゲルの鋳型へ押し出し、２〜１８時間保持した。
【０２１２】
その後、内皮細胞（ＥＣ）を高濃縮細胞懸濁液において調製した。簡潔に、ＥＣを上述のように遊離し、収集し、数を数え、遠心分離によってペレット状にした。上清を取り除き、細胞ペレットを完全培地の少容量において再懸濁して、１×１０５細胞／μＬの高濃縮細胞ペレットを得た。その後、この細胞懸濁液を、使用時まで４℃で保存した。
【０２１３】
その後、血管壁構成物を、マルチウェルプレートのウェルへ、又は細胞培養ウェルの挿入物（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，ＢＤ）の膜上にバイオプリントした。円柱状のＳＭＣ又はＳＭＣ：Ｆｂのバイオインクを使用し、血管壁の中膜をバイオプリントした。血管壁セグメントを、１．２５ｍｍ×８ｍｍ×０．２５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）の最初の寸法で作り上げた。組織の第１層を形成するため、ＳＭＣ又はＳＭＣ：Ｆｂのバイオインクによる推定上の中膜のバイオプリンティングの後、ＥＣの濃縮細胞懸濁液を、第１層の上面にバイオプリントし、推定上の内膜として機能する血管内皮の第２層を生じさせた（図１２を参照）。
【０２１４】
その後、バイオプリントした血管壁セグメントを、血清を含む完全な細胞培養培地に沈め、成熟のため５％のＣＯ２で補われる、標準の湿ったチャンバに置いた。その後、バイオプリントした血管壁セグメントを、静止状態で培養し、又は、サイトカイン或いは生体力学の信号の付加により刺激した（例えば、流量、剪断応力等）。血管壁セグメントを、７日までの間培養し、細胞組織化、細胞外マトリックス産生、細胞の生存率、及び構成物の完全性について評価した（図１３を参照）。
【０２１５】
＜結果＞
ＳＭＣの豊富な培地及びＥＣが並んだ内膜を含む、層を成した細胞構造を備えるバイオプリントした血管壁セグメントを、上手く作り上げ、培養下で維持した。バイオプリントした構成物を、ＳＭＣ又はＳＣＭ：Ｆｂのバイオインクシリンダー及びＥＣのバイオプリントした層を有する多層の方法を使用して、生成した。
【０２１６】
＜実施例１７−マルチウェルプレート＞
細胞集団（均質又は不均質）を、任意に押し出し化合物を含んでいる円柱状のバイオインク集合体、細胞の集合体の懸濁液、又は細胞懸濁液／ペースト剤を含み、随意に押し出し化合物を含む、様々なバイオインクフォーマットを使用してバイオプリントするために調製した。簡潔に、円柱状バイオインクの調製のため、組み換え型のヒトトリプシン（７５μｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）又は０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の何れかを使用して、細胞を標準組織培養プラスチックから遊離した。酵素遊離の後、細胞を洗浄し、収集し、数え、所望の比率（即ち、５０：５０、肝臓の星細胞（ｈＳＣ）：内皮細胞（ＥＣ））で組み合わせ、遠心分離によってペレット状にした。その後、上清を細胞ペレットから取り除き、細胞混合物を、所望の直径（典型的に５００μｍ又は２５０μｍ）、内径のグラスマイクロキャピラリーに吸引した。その後、この円柱状の細胞調製物を鋳型へ押し出し、バイオインク成熟のための経路を有する非細胞接着ヒドロゲル物質から生成した。その後、結果として生じるバイオインクシリンダーを、経験に基づいて測定された時間の間、典型的に２〜２４時間、完全な細胞培養培地において培養した。
【０２１７】
細胞の集合体の細胞懸濁液または細胞ペースト剤の調製のため、本明細書に記載される細胞伝播及び遊離プロトコルを行った。細胞ペレット生成の時間に、上清をペレットから取り除き、ペレットを特注の堆積シリンジ（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ）に移した。その後、このシリンジを、細胞集合体溶液又はペースト剤のマルチウェルプレートへの直接のバイオプリンティングのため、バイオプリンター堆積ヘッドに乗せた。
【０２１８】
複製した組織構成物を、その後、マルチウェル組織培養プレート（例えば、６−ウェル又は２４−ウェル）又はマルチウェル細胞培養挿入物（即ち、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，ＢＤ）の何れかの中でバイオプリントし、その後、適切なマルチウェルプレートに置く。バイオプリンティングの後、三次元の構成物を、幾つかの期間、典型的に３〜１４日間、関連する培地により成熟させた／調節した（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。成熟後、構成物を採取し、固定して、定期的な組織学的検査及び免疫組織化学的検査のために処理した。
【０２１９】
＜結果＞
バイオプリントした組織を、マルチウェル培養プレート、又はその後マルチウェルプレートに挿入されるマルチウェル培養挿入物内で上手く作り上げた。この方法は、随意に培養され、同じ又は独特な培養条件をつくるために処理される、複製したバイオプリントした組織の生成を可能にする。この方法は、バイオプリンティングプロセスの処理量及びサンプル生成において、著しい増加をもたらす（図１４を参照）。
【０２２０】
＜実施例１８−バイオプリントした新生組織の刺激＞
関連する不均質な（即ち、多型性の）細胞集団を含む円柱状のバイオインクを調製した。細胞の生理学的に関連する集団（例えば、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）及び小さな気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、又は、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）及び血管内皮細胞（ＥＣ））を、特定の比率で組み合わせ、適切なバイオインクを生成した。追加の実験において、肝星細胞（ｈＳＣ）をＥＣと結合し、肝臓組織を生成した。追加の実験において、肝星細胞（ｈＳＣ）をＥＣと結合し、肝臓組織を生成した。細胞を標準の研究所条件下で維持及び増殖し、細胞と同じ売り手から購入した培地において、又は、特定の細胞型に関して標準の細胞培養行為の助けになると、典型的に初期の文献において見出される成分を含む培地において、細胞を培養した。バイオインク調製のための細胞の処理は、以下の通りであった：簡潔に、細胞を、陽イオン遊離リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することにより標準組織培養プラスチックから遊離し、その後、０．１−０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に暴露した。その後、遊離した細胞を血清を含む培地中で洗浄し、収集し、数え、実行される刺激のアッセイ又は実験のため適切な比率で組み合わせて、遠心分離によってペレット状にした。その後、上清を取り除き、細胞ペレットをグラスマイクロキャピラリーへ吸引し、その後、それらをおよそ１５〜２０分間、完全培地に沈めた。その後、この円柱状のバイオインク構造を、直線流路を含む非細胞接着ヒドロゲルの鋳型へ押し出し、２〜１８時間保持した。
【０２２１】
上面に制限される、均質の（即ち、単型の）細胞層を必要とする組織構成物のため、第２の細胞の調製を、関連する細胞型を含めて利用した。典型的に、血管内皮細胞又は小さな気道上皮細胞（それぞれ血管壁及びヒト肺組織モデルに関する）を、高濃縮細胞懸濁液中で調製した。簡潔に、細胞を上述のように遊離し、収集し、数を数え、遠心分離によってペレット状にした。上清を取り除き、細胞ペレットを完全培地の少容量において再懸濁して、１×１０５細胞／μＬの高濃縮細胞ペレットを得た。その後、この細胞懸濁液を、使用時まで４℃で保存した。
【０２２２】
その後、バイオプリントした組織構成物を、マルチウェルプレートのウェルへ、又は細胞培養ウェルの挿入物（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，ＢＤ）の膜上に作り出した。多数の組織型を生成した。多細胞のＮＨＬＦ又はＮＨＬＦ：ＥＣのバイオインクを使用し、厚い間質組織をバイオプリントして、小さな気道の壁を再現し、続いて、ＳＡＥＣにより層を成し、同族の上皮性関門層を提供した。多細胞のＳＭＣ又はＳＭＣ：繊維芽細胞のバイオインクを使用し、厚い間質組織をバイオプリントして、血管壁を再現し、続いて、ＥＣにより層を成し、同族の内皮の障壁を提供した。ｈＳＣバイオインクをＥＣと共に、散在した内皮網又は内皮層の何れかを含んだパッチにバイオプリントした。組織セグメントを、１．２５ｍｍ×８ｍｍ×０．２５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）の最初の寸法で作り上げた。肺構成物又は血管壁セグメントのバイオプリンティングの後、濃縮細胞懸濁液を、第１層の表面上に細胞の更に定義された層を生成する、既に分配したバイオインク層の頂部にバイオプリントした。
【０２２３】
その後、バイオプリントした新生組織を、血清を含む完全な細胞培養培地に沈め、成熟のため５％のＣＯ２で補われる、標準の湿ったチャンバに置いた。その後、バイオプリントした新生組織を予め定めた時間、関連するサイトカインにより培養及び刺激して、ホルマリン固定し、採取して、標準の組織学的検査及び免疫組織化学的検査のために処理した。バイオプリントした組織を、限定されないが、組織形態、細胞組織化、細胞外マトリックス産生、細胞増殖、細胞の生存率、及び構成物の完全性等の特徴について評価した。
【０２２４】
サイトカイン刺激を、培地にサイトカインを直接加え、加えたタンパク質によりバイオプリントした組織をインキュベートすることにより実行し、適切な刺激に対する、直接の及び伸長した細胞アクセスを提供した。用量反応の実験を、実験的なサイトカインのＥＤ５０に依存する、典型的に０．１乃至１００ｎｇ／ｍＬの範囲の容量で行った。サイトカイン刺激が４８時間より多く行なわれた実験のため、培地を変更し、新鮮なサイトカインを４８時間ごとに加えた。
【０２２５】
結果
【０２２６】
細胞の生理学的に関連する集団を含む、バイオプリントした組織を、二次元のインビトロのシステムにおける細胞の反応を誘発すると既に実証された、サイトカインにより上手く刺激した。バイオプリントした三次元組織構成物で観察した反応を、用量依存性であり、バイオプリントした構成物内の細胞に対して独特であると観察した（例えば、図１１、１５及び１６を参照）。
【０２２７】
実施例１９−連続的な堆積による、共同成型した機能的な肝臓組織微細構造のバイオプリンティング
【０２２８】
３０％のＰＦ−１２７の調製
【０２２９】
ＰＢＳを使用して３０％のＰＦ−１２７溶液（ｗ／ｗ）を作った。４℃で維持された磁気撹拌プレートを使用して、ＰＦ−１２７粉末を、冷凍したＰＢＳと混合した。完全溶解はおよそ４８時間で生じた。
【０２３０】
鋳型と充填剤（ｆｉｌｌ）の細胞調製及び共同プリンティング
【０２３１】
３ｍＬのＰＦ−１２７溶液を、バイオプリンターを使用して、及び５１０μｍのディスペンスチップにより３ｃｃのリザーバへ吸引し、３０％のＰＦ−１２７溶液を、６つのウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌ上で、単一の６角形状にバイオプリントし、連続して６回，層を作った。
【０２３２】
７．８×１０７の肝細胞（ＨｅｐＧ２）で構成された細胞懸濁液を、６分間１０００ｇで遠心分離し、細胞ペースト剤を生成した。５μＬの細胞ペースト剤を５１０μｍの針により押し出し、三角形の鋳型の各々を満たした（図１７Ａを参照）。六角鋳型を１５時間、室温でインキュベートした。３ｍＬの培地（１０％のＦＢＳ及び１Ｘペニシリンで補われたＤＭＥＭ、ストレプトマイシン、及びアムホテリシンＢ）を、上述の支持されるＴｒａｎｓｗｅｌｌを有するウェルに加え、その後、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベーションを行った。４５分以内に、ＰＦ−１２７鋳型は溶解して、成型した肝臓のバイオインクを無傷にしておく培地となり、細胞と空所の平面の幾何学的形状を形成した（図１７Ｂを参照）。培地から残りのＰＦ−１２７を取り除くため、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、３ｍＬの培地を含む新しいウェルに移し、２時間インキュベートした。６時間にわたる９ｍＬの合計の培地の交換のため、これを更に２回繰り返した。
【０２３３】
６時間後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを培地の無い新しいウェルに移し、２×１０６細胞の細胞懸濁液を、９０％のヒト大動脈内皮細胞と１０％の肝星細胞の比率で分配し、ＰＦ−１２７鋳型の溶解によって作られる空間を満たした。肝臓の構成物を室温で１５分間インキュベートした。１５分のインキュベーション後、４ｍＬの培地は８５％の培地の比率を含む（１０％のＦＢＳと１Ｘペニシリンで補われたＤＭＥＭ、ストレプトマイシンとアムホテリシンＢ、肝細胞及び星細胞を支持するため、及び、２％のＬＳＧＳ、１０％のＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、及び１Ｘペニシリンで補われた１５％のＭ１９９、ストレプトマイシンとアムホテリシンＢ、ヒト大動脈内皮細胞を支持するため）。構成物を４８時間、３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートし、近接する構成物を形成し、平面の幾何学的形状は、内皮細胞を含む組織に介入することで、肝臓の実質の小葉状の（三角形の）配列を含む。
【０２３４】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であるであろう。当業者は、ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換がなされることは、当業者によって理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に適切に利用され得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月25日(2018.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの使用のための、生きている、三次元の組織構成物を生成するための方法であって、前記方法は、
ａ．少なくとも１つの接着細胞型を含む少なくとも１つの半固体または固体のバイオインクの押し出しにより、複数の層をバイオプリントする工程であって、少なくとも１つの半固体または固体のバイオインクは内皮細胞を含み、各層は少なくとも１つの他の層と直接接触している、工程；および
ｂ．血管または疑血管網と、血管または疑血管網の一部ではない細胞とを含む、生きている、三次元の組織構成物を形成するために層を凝集させる工程;を含み、
組織構成物は、バイオプリンティング時および使用時に、予め形成されたスキャフォールドがない、方法。
【請求項２】
バイオインクは、哺乳動物細胞を含む多細胞集合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオプリントする工程は、少なくとも１つの層に平面の幾何学的形状を作り出すために、複数の細胞型を互いに対して配置する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの他の層とは組成的にまたは構造的に異なる少なくとも１つの層をバイオプリントして層状の構造を作り出す工程を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非接着細胞型をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最小の寸法が少なくとも約２５μｍである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最大の寸法が約３ｃｍを超えない、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの接着細胞型、内皮細胞またはこれらの両方は、分化細胞である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの接着細胞型、内皮細胞またはこれらの両方は、非分化細胞である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
肝臓、胃腸、膵臓、腎臓、肺、気管、血管、骨格筋、心臓、皮膚、平滑筋、結合組織、角膜、尿生殖器、乳房、生殖器、内皮、上皮、線維芽細胞、神経、シュワン、脂肪、骨、骨髄、軟骨、周細胞、中皮、内分泌、間質、リンパ、血液、内胚葉、外胚葉、および中胚葉、からなる群から選択される組織から、少なくとも１つの接着細胞型を分離する工程を含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織からなる群から選択される組織から、内皮細胞を分離する工程を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
組織構成物は、血管壁セグメントである、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
組織構成物は、インビトロでのアッセイに使用するためのものである、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
組織構成物は、薬物検査で使用するためのものである、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複数の組織構築物を生成し、複数の組織構築物からアレイを構築する工程を含む、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
アレイ内の各組織構成物は、培養下で独立して維持される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アレイ内の組織構成物の２つ以上は、可溶性因子を交換する、請求項１５または１６に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月8日(2018.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの使用のための、生きている、三次元の組織構成物を生成するための方法であって、前記方法は、
ａ．少なくとも１つの接着細胞型を含む少なくとも１つの半固体または固体のバイオインクの押し出しにより、複数の層をバイオプリントする工程であって、少なくとも１つの半固体または固体のバイオインクは内皮細胞を含み、各層は少なくとも１つの他の層と直接接触している、工程；および
ｂ．血管または偽血管網と、血管または偽血管網の一部ではない細胞とを含む、生きている、三次元の組織構成物を形成するために層を凝集させる工程;を含み、
組織構成物は、バイオプリンティング時および使用時に、予め形成されたスキャフォールドがない、方法。
【請求項２】
バイオインクは、哺乳動物細胞を含む多細胞集合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオプリントする工程は、少なくとも１つの層に平面の幾何学的形状を作り出すために、複数の細胞型を互いに対して配置する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの他の層とは組成的にまたは構造的に異なる少なくとも１つの層をバイオプリントして層状の構造を作り出す工程を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非接着細胞型をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最小の寸法が少なくとも約２５μｍである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織構成物は、バイオプリンティング時に、その最大の寸法が約３ｃｍを超えない、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの接着細胞型、内皮細胞またはこれらの両方は、分化細胞である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの接着細胞型、内皮細胞またはこれらの両方は、非分化細胞である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
肝臓、胃腸、膵臓、腎臓、肺、気管、血管、骨格筋、心臓、皮膚、平滑筋、結合組織、角膜、尿生殖器、乳房、生殖器、内皮、上皮、線維芽細胞、神経、シュワン、脂肪、骨、骨髄、軟骨、周細胞、中皮、内分泌、間質、リンパ、血液、内胚葉、外胚葉、および中胚葉、からなる群から選択される組織から、少なくとも１つの接着細胞型を分離する工程を含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖器管の組織、脂肪組織、呼吸器官の組織、生殖器系の組織、中胚葉由来の組織、骨髄、及び臍の組織からなる群から選択される組織から、内皮細胞を分離する工程を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
組織構成物は、血管壁セグメントである、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
組織構成物は、インビトロでのアッセイに使用するためのものである、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
組織構成物は、薬物検査で使用するためのものである、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複数の組織構築物を生成し、複数の組織構築物からアレイを構築する工程を含む、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
アレイ内の各組織構成物は、培養下で独立して維持される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アレイ内の組織構成物の２つ以上は、可溶性因子を交換する、請求項１５または１６に記載の方法。
【外国語明細書】
2018171065000001.pdf