(57)【要約】      （修正有）【課題】生物試料の組織膨張を軽減し、かつ、有効な透明化を達成し得る透明化方法を提供する。さらに、本発明は、骨を含む生物試料の透明化方法を提供する。【解決手段】グアニジンもしくはグアニジン誘導体もしくはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む透明化試薬で生物試料を処理することを特徴とする生物試料の透明化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含む透明化試薬で生物試料を処理することを特徴とする生物試料の透明化方法。
【請求項２】
グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程を、さらに、含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬がソルビトールを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記透明化試薬が、グルコースを含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬が、界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む溶液であることを特徴とする生物試料の透明化試薬。
【請求項７】
ソルビトールおよび／またはグルコースを含むことを特徴とする請求項６に記載の生物試料の透明化試薬。
【請求項８】
界面活性剤を含むことを特徴とする請求項６または７に記載の生物試料の透明化試薬。
【請求項９】
グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む溶液であることを特徴とする生物試料の屈折率調整試薬。
【請求項１０】
ソルビトールを含むことを特徴とする請求項９に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
【請求項１１】
界面活性剤を含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、骨を含む生物試料の透明化方法。
（ａ）カルシウムキレート剤を含む溶液で生物試料を処理する工程、
（ｂ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む透明化試薬で生物試料を処理する工程、
（ｃ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程。
【請求項１３】
前記透明化試薬が、さらにグルコースを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬が、さらに、界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｂ）および／または（ｃ）のカオトロープが尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩であることを特徴とする請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｂ）および／または（ｃ）のカオトロープがグアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩であることを特徴とする請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープ、ソルビトールおよびグルコースを含む溶液であることを特徴とする生物試料の透明化試薬。
【請求項１８】
界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１７に記載の生物試料の透明化試薬。
【請求項１９】
尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む溶液であることを特徴とする生物試料の屈折率調整試薬。
【請求項２０】
界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１９に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料の透明化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、生物学の分野において、生体由来の組織の構造や形態を観察および解析する上で必要な情報を得る際、本来の構造にできるだけ近い状態で行うことが重要である。とりわけ、１つの細胞における変化が細胞間相互作用等を通じたネットワークにより、生体全体に重大な影響を及ぼすような疾患（例えば、がん、免疫疾患など）の原因や症状の進行を解明する場合、組織や器官の３次元構造を詳細に解析することで有益な情報が得られることも多い。
生物組織の観察において、特定の分子を標識し、生体内における存在状態を観察する手法は、生物試料の形態や分子組成を明らかにする上で有効な方法の１つである。生物組織や器官は立体的で複雑な構造をしているため、組織全体、あるいは個体全体を、３次元イメージングにより観察する方がより多くの有益な情報を得ることができる。しかし、これまでの免疫的な手法による観察は、切片などの２次元の試料を用いて行うことが多く、３次元的な深い構造を明瞭に観察することは困難な場合が多かった。
【０００３】
近年、生物試料の３次元イメージングを行う試みが多くの研究者によって行われており、生物試料内の各領域の屈折率の相違を少なくし、試料をできる限り透明化して深い３次元構造を可視化するための手法がいくつか開発されてきている。このような手法として、例えば、Scale（非特許文献１、特許文献１）、iDISCO（非特許文献２）、CUBIC（非特許文献３）などを挙げることができる。
これらの方法は、主として脳サンプルに導入された蛍光タンパク質や蛍光標識した抗体からの蛍光シグナルをある程度保持しながら、組織を透明化することが可能で、３次元イメージングを行う上で有効な方法である。
【０００４】
しかし、従来法による処理においては、組織や器官が膨張し本来の構造を再現できない、あるいは、イメージングに使用する蛍光分子の消退が生じる、などの改善すべき点が存在している。
また、骨などの硬組織を含む生体試料の透明化においては、骨と他の組織との屈折率の違いを調整することが難しく、さらには、骨の内側に存在する重要な組織や構造体を保存したまま（損傷することなく）、骨を透明化することも非常に困難であった。例えば、内耳に存在する聴覚器官である蝸牛は、側頭骨内の骨迷路と膜迷路から構成される複雑な構造をしており、骨の内側に重要な構造（例えば、有毛細胞など）が多く存在している。また、骨格を構成する硬骨の内部には、骨髄が存在している。有毛細胞は音を脳に伝える際に重要な役割をしており、また、骨髄は赤血球や顆粒白血球をつくりだす重要な場としての役割を果たしている。これらの骨の内側に存在する組織や構造体を、無傷な状態でイメージングすることができれば、疾患の診断や治療に有用な多くの情報を取得することができる。しかしながら、現在のところ、上記問題を解決し得るような透明化方法は確立されていない。
【０００５】
以上のように、生物試料の透明化技術は、医学、生物学の分野における基礎的および臨床的研究の発展に寄与する有用なツールであるが、解決すべき課題も多く残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願2013-522590
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hamaら, Nat. Neurosci., 18:1518-1529 2015
【非特許文献２】Renierら, Cell 159:896-910 2014
【非特許文献３】Susakiら, Cell 157:726-739 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の通り、これまでにも様々な生物試料の透明化方法が報告されている。
しかしながら、生物試料の組織膨張を軽減し、かつ、研究等に利用可能な程度に生物試料を透明化する方法はまだ報告されていない。
また、骨を含む生物試料を透明化する場合には、できるだけ骨の内側の組織や器官の構造を保存した状態（生体内で存在する状態に保存）で透明化することが好ましく、既知の手法のみでは、この目的を達成することは困難である。
上記事情に鑑み、本発明は、生物試料の組織膨張を軽減し、かつ、有効な透明化を達成し得る透明化方法の提供を目的とする。
さらに、本発明は、骨を含む生物試料の透明化方法の提供を目的とする。より具体的には、本発明は、骨の内側の組織や器官（あるいは、細胞のネットワーク）の構造を保存した状態（生体内で存在する状態に保存）で、骨を含む生物試料の透明化方法の開発を解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、生物試料の透明化処理の過程における組織膨張を軽減すべく、従来の尿素ベースの試薬による透明化方法に変えて、グアニジンベースの試薬による透明化を行ったところ、組織膨張を引き起こさない透明化方法の開発に成功した。
【００１０】
さらに、本発明者らは、骨を含む生物試料の透明化のために、骨の主成分であるカルシウムをキレート剤で除去し（以下、「脱灰」とも記載する）、脱灰後の骨組織と骨の内側に存在する組織の屈折率を一致させるための試薬の開発を試みた。
これまでに報告されている生物試料の透明化方法のうち、例えば、CUBICは組織浮腫並びに蛍光減退を生じることが報告されており、iDISCOは有機溶媒であることから、生組織に用いるのは困難であるだけでなく、試薬特性から自然環境への配慮が必要となり、臨床研究への応用が不可能である。CUIBCならびにiDISCOでは骨自体の透明化は一定のレベルで達成されている。しかし、骨の奥に存在する組織の観察は実現できていない。
発明者らは、生物試料を主として透明化するための透明化試薬と異なる組織間の屈折率を一致させるための手法および屈折率調整試薬の組成について鋭意検討を行った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２０）である。
（１）グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む透明化試薬で生物試料を処理することを特徴とする生物試料の透明化方法。
（２）グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程を、さらに、含むことを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬がソルビトールを含むことを特徴とする上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記透明化試薬が、グルコースを含むことを特徴とする上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬が、界面活性剤を含むことを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。
（６）グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む溶液であることを特徴とする生物試料の透明化試薬。
（７）ソルビトールおよび／またはグルコースを含むことを特徴とする上記（６）に記載の生物試料の透明化試薬。
（８）界面活性剤を含むことを特徴とする上記（６）または（７）に記載の生物試料の透明化試薬。
（９）グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープを含む溶液であることを特徴とする生物試料の屈折率調整試薬。
（１０）ソルビトールを含むことを特徴とする上記（９）に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
（１１）界面活性剤を含むことを特徴とする上記（９）または（１０）に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
【００１２】
（１２）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、骨を含む生物試料の透明化方法。
（ａ）カルシウムキレート剤を含む溶液で生物試料を処理する工程、
（ｂ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む透明化試薬で生物試料を処理する工程、
（ｃ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程。
（１３）前記透明化試薬が、さらにグルコースを含むことを特徴とする上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記透明化試薬および／または屈折率調整試薬が、さらに、界面活性剤を含むことを特徴とする上記（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）前記工程（ｂ）および／または（ｃ）のカオトロープが尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩であることを特徴とする上記（１２）ないし（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記工程（ｂ）および／または（ｃ）のカオトロープがグアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩であることを特徴とする上記（１２）ないし（１４）のいずれかに記載の方法。
（１７）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープ、ソルビトールおよびグルコースを含む溶液であることを特徴とする生物試料の透明化試薬。
（１８）界面活性剤を含むことを特徴とする上記（１７）に記載の生物試料の透明化試薬。
（１９）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される、少なくとも１種のカオトロープおよびソルビトールを含む溶液であることを特徴とする生物試料の屈折率調整試薬。
（２０）界面活性剤を含むことを特徴とする上記（１９）に記載の生物試料の屈折率調整試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の生物試料の透明化方法（グアニジンベースの試薬を使用する方法）によれば、生物試料の膨張を引き起こさずに、試料を透明化することが可能である。
【００１４】
本発明の生物試料の透明化方法によれば、骨を含む生物試料を透明化することができる。より具体的には、骨の内側に存在する組織や器官の構造を保存した状態での透明化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】グアニジン塩酸塩を含む試薬でThy1-YFPマウスの大脳スライス標本を透明化した結果。  4 M尿素、1 M グアニジン塩酸塩、2 M グアニジン塩酸塩、3 M グアニジン塩酸塩、4 M グアニジン塩酸塩、5 M グアニジン塩酸塩、6 M グアニジン塩酸塩を含む試薬で透明化処理を行った結果を示す。上図は蛍光顕微鏡写真である。下図は、コントロールの蛍光強度を１として相対値で表した。なお、コントロールとは透明化処理を行っていない試料のことである。
【図２】グアニジン塩酸塩を含む試薬の生物試料への影響の検討（１）。  グアニジン塩酸塩を含む試薬で透明化処理することで消退した蛍光を、PBS（NaCl:137mM, (PO4)3-:9.57mM））、または、既知の尿素ベースの透明化試薬（25 (W/V) % 尿素、50 (W/V) % スクロース、10  (W/V) % 2, 2’, 2’’-ニトリロトリエタノール、0.1 % Triton X-100；図中「従来の透明化試薬2」と記載した）で試料を処理することで蛍光が回復する様子を示した蛍光写真（上の蛍光写真）と、当該既知の尿素ベースの透明化試薬（従来の透明化試薬2）により回復した蛍光強度をグラフ化した結果（下のグラフ）である。グラフは、コントロール（透明化処理を行っていない試料）の蛍光強度を１として相対値で表した。  なお、「従来の透明化試薬1」と示される蛍光写真は、従来の透明化試薬1（25 (W/V) % 尿素、10 (W/V) % テトラキスエチレンジアミン、15 % Triton X-100）を用いて透明化処理を行った結果である。
【図３】グアニジン塩酸塩を含む試薬の生物試料への影響の検討（２）。  尿素ベースの試薬で透明化処理した場合と、本発明にかかるグアニジンベースの試薬で透明化処理した場合において、組織浮腫の程度および透明度について比較を行った。  4 M尿素、1 M グアニジン塩酸塩、2 M グアニジン塩酸塩、3 M グアニジン塩酸塩、を含む試薬で透明化処理を行った後、光学顕微鏡観察を行い（上の図）、各処理後の試料の透明度および各試料の処理前と処理後の同一領域の膨張度をグラフ化した（下のグラフ）。なお、透明度については、試料全周に興味領域（ROI）を設定の後、透明化処理を行い、ROI内の平均輝度を算出した。コントロールとなる脳試料に関しては、PBSに浸透させた状態で測定を行い、透明化処理を行った試料に関しては透明化処理後に測定を行った。
【図４】従来の透明化方法と本発明の透明化方法（尿素ベース）を、骨を含む生物試料に適用した場合の効果の比較。  リン酸緩衝液（PBS)、有機溶媒ベースである3DISCO（Erturkら, Nat Protoc., 11:1983-95 2012）、iDISCO（Renierら, Cell 159:896-910 2014）、水溶性試薬であるCLARITY（Chungら, Nature 497(7449):332-7 2013）、CUBIC（Susakiら, Cell 157:726-739 2014）を用いた方法、および本発明にかかる方法を用いて内耳サンプルの透明化処理および免疫染色を行った。透明化処理後、内耳サンプルを光学顕微鏡（上段、中段）および共焦点レーザー顕微鏡（下段）で観察した結果を示す。スケールバーは500 μmである。
【図５】本発明にかかる骨を含む生物試料の透明化方法の概略図。  上段の矢印は従来の方法を、下段の矢印は本発明にかかる透明化方法を、各々、時系列的に概略的に示した図である。その下の概念図は、本発明にかかる透明化方法の概要を説明した図である。
【図６】本発明にかかる透明化方法（尿素ベース）を用いて、大腿骨（ａ）、膝関節（ｂ）、手骨（ｃ）、内耳（ｄ）、頭蓋骨軸位（ｅ）および頭蓋骨矢状位（ｆ）を処理した結果を示す。各々、上図が透明化前、下図が透明化後の状態を示す。
【図７】蛍光分子に対する影響の検討（１）。  上図は、中枢神経細胞、線維に黄色蛍光蛋白（YFP）が発現しているThy1-YFPマウスの大脳スライス標本を透明化処理（尿素ベース）し、その翌日に蛍光観察をした結果である。左図：透明化前、中央図：透明化後、右図：蛍光顕微鏡下で観察した試料（左図および中央図の四角部分の拡大図））。  下図は、ATPを感受するプローブであるAteamを発現しているマウスの内耳を透明化処理し、その翌日に蛍光観察をした結果である。内耳サンプルについては、聴毛のマーカーであるF-アクチンをRhodamine- phalloidinで標識した。「YFP」はAteamからの蛍光、「Rhodamine- phalloidin」は聴毛マーカーであるF-アクチンを標識したRhodamineからの蛍光を検出したイメージである。
【図８】蛍光分子に対する影響の検討（２）。  従来の透明化手法では免疫染色における抗原性の維持も課題の一つである。今回、内耳透明化標本を用いて、抗MyosinVIIa抗体（有毛細胞マーカー）、抗Neurofilament200抗体（神経線維マーカー）、抗VGLUT3抗体（小胞型グルタミン酸トランスポーター）を用いて免疫染色を行った。また、Rhodamine-Phalloidin（聴毛マーカー）によりF-アクチンの染色が可能であった。
【図９】本発明の透明化方法（尿素ベース）を使用し、内耳のマクロレベルとミクロレベルでの３次元再構築を行った結果。ａ−ｆは、頂回転から基底回転までの有毛細胞（図９ａ；抗Myosin7a抗体染色）、聴毛（図９ｂ；Rhodamine-phalloidin染色）、神経線維（図９ｃ；抗Neurofilament200抗体染色）を免疫染色した図である。ｄはａ、ｂおよびｃを重ね合わせた（merge）図である。ｅおよびｆは、有毛細胞のみ抽出した内耳３次元再構築画像である。ｇおよびｈは、透明化試料の蛍光深度を検討するため、蝸牛頂回転から基底回転まで２回転半のラセン状に配置された聴毛のみ抽出した２次元再構築画像である。ｇは、表層0-180μm、ｈは、深層180-580μmの構築画像である。ｉ−ｋは、ミクロ試料での３次元再構築画像である。ｉは表、ｊは横、ｋは裏からの画像である。
【図１０】３次元構築における、本発明の透明化方法と従来法との比較。  左図は、内耳サンプルをEDTA処理（脱灰）後、従来の透明化方法の１つ（CUBIC法；Susakiら, Cell 157:726-739 2014）を用いて処理を行い、抗Myosin7a抗体で有毛細胞を染色した結果である。右図は、内耳サンプルを本発明の透明化処理方法（尿素ベースの方法）で処理し、抗Myosin7a抗体で有毛細胞を染色した結果である。
【図１１】本発明にかかる透明化方法（グアニジンベース）を用いて、膝関節、手関節および大腿骨を処理した結果を示す。矢印：骨髄残存部、矢尻：関節温存部、＊：骨髄透明化部
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第１の実施形態は、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含み、好ましくはソルビトールを含み、さらに好ましくはグルコース含む透明化試薬で生物試料を処理することを特徴とする生物試料の透明化方法である。
さらに、本発明の第１の実施形態には、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含み、好ましくはソルビトールを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程が含まれていてもよい。
また、本発明の第１の実施形態には、抗体等を用いて、免疫組織学的な方法（免疫染色など）により生物試料を染色する工程が含まれていてもよい。
【００１７】
第１の実施形態において、透明化の対象となる生物試料は、特に限定されるものではなく、例えば、多細胞生物の個体に由来する組織、器官、細胞などである。また、多細胞生物についても、特に限定されるものではなく、例えば、魚類、両生類、は虫類、鳥類、哺乳類などであってもよく、特に好ましくは、哺乳類である。好ましい哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類（ヒトを除く）およびヒトである。
また、生物試料は、あらかじめ、蛍光タンパク質などを発現させたもの、蛍光化学物質を導入したもの、蛍光標識を使用して染色を行ったものであってもよい。また、生物試料は顕微鏡観察用に固定化処理（例えば、PFA(paraformaldehyde) -PBSで処理）されたものであってもよい。
【００１８】
第１の実施形態において、透明化試薬で生物試料を処理する工程は、主として、脂質やコラーゲンなどからなる細胞外基質を除去する工程である（脱脂および脱コラーゲン）。第１の実施形態で用いられる透明化試薬は、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープと、好ましくは、ソルビトールを含み、さらに、グルコースを含んでいてもよい。そして、当該透明化試薬は、水を溶媒とする溶液、または、pHの維持が可能な緩衝液が好ましく、生物試料を浸した際に、生物試料が変形しないように、浸透圧が調整されたものであってもよい。
ここで、カオトロープ（chaotrope）とは、任意の物質に接触させた場合、当該物質内に存在する水分子間の相互作用を減少させ、その結果、当該物質の構造を不安定化させる（変性させる）もののことである。第１の実施形態で使用される好ましいカオトロープは、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩などである。
また、「試薬で生物試料を処理する」とは、生物試料を試薬である溶液中に浸し、当該溶液を生物試料全体に浸透させることである（以下、本明細書において、溶液の試薬による処理において同義）。
【００１９】
第１の実施形態の透明化試薬に含まれるグアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩の至適濃度は、生物試料よって異なり、特に限定されるものはなく、当業者であれば予備的な実験により、その至適濃度を容易に決定することができる。例えば、グアニジン塩酸塩を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜3 Mである。
第１の実施形態の透明化試薬にソルビトールおよび／またはグルコースが含まれる場合、ソルビトールおよびグルコースの濃度は、特に限定されるものではないが、ソルビトールについては、例えば、10 (w/v) %〜50 (w/v) %、好ましくは20 (w/v) %〜45 (w/v) %、より好ましくは30 (w/v) %〜40 (w/v) %であり、グルコースについては、例えば、5 (w/v) %〜30 (w/v) %、好ましくは10 (w/v) %〜25 (w/v) %、特に好ましくは10 (w/v) %〜20 (w/v) %である。
第１の実施形態の透明化試薬には、さらに、界面活性剤が（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００２０】
また、第１の実施形態の透明化試薬による処理時間、処理温度の条件は、生物試料によって異なり、当業者であれば、予備的な実験により条件を設定することができ、例えば、処理温度は20℃〜37℃程度で、処理時間は数分〜48時間程度である。
【００２１】
本発明の第１の実施形態には、生物試料中に含まれる異なる組織間の屈折率の違いを調整するために、さらに、屈折率調整試薬で処理する工程が含まれていてもよい。
第１の実施形態で用いられる屈折率調整試薬は、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含み、好ましくは、ソルビトールを含んでいてもよい。そして、当該屈折率調整試薬は、水を溶媒とする溶液、または、pHの維持が可能な緩衝液が好ましく、生物試料を浸した際に、生物試料が変形しないように、浸透圧が調整されたものであってもよい。
【００２２】
第１の実施形態の屈折率調整試薬に含まれるグアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩の至適濃度は、生物試料よって異なり、特に限定されるものはなく、当業者であれば予備的な実験により、その至適濃度を容易に決定することができる。例えば、グアニジン塩酸塩を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜3 Mである。
第１の実施形態の屈折率調整試薬にソルビトールが含まれる場合、ソルビトールの濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、15 (w/v) %〜65 (w/v) %、好ましくは20 (w/v) %〜60 (w/v) %、より好ましくは50 (w/v) %〜60 (w/v) %である。
なお、第１の実施形態において、屈折率調整試薬で処理する工程が含まれる場合であって、透明化試薬および屈折率調整試薬にソルビトールが含まれる場合、屈折率調整試薬に含まれるソルビトール濃度が透明化試薬に含まれるソルビトール濃度より高い方が好ましい。
第１の実施形態の屈折率調整試薬には、さらに、界面活性剤が（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００２３】
第１の実施形態の屈折率調整試薬よる処理時間、処理温度の条件は、生物試料によって異なり、当業者であれば、予備的な実験により条件を設定することができ、例えば、処理温度は25〜37℃程度で、処理時間は数分〜数時間程度である。
【００２４】
第１の実施形態にかかる透明化処理（カオトロープとして、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩を選択する処理）後、蛍光分子からの蛍光が消退する場合には、透明化後の生物試料を、例えば、PBS（例えば、NaCl:137mM, (PO4)3-:9.57mM））、あるいは、既知の尿素ベースの透明化試薬（例えば、25 (W/V) % 尿素、50 (W/V) % スクロース、10  (W/V) % 2, 2’, 2’’-ニトリロトリエタノール、0.1 % Triton X-100）などで処理することにより、蛍光を回復させることができる。
【００２５】
本発明の第２の実施形態は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、骨を含む生物試料の透明化方法である。
（ａ）カルシウムキレート剤を含む溶液で生物試料を処理する工程、
（ｂ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれら塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含み、好ましくは、ソルビトール、さらに好ましくはグルコースを含む透明化試薬で生物試料を処理する工程、
（ｃ）尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれら塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープを含み、好ましくは、ソルビトールを含む屈折率調整試薬で生物試料を処理する工程
【００２６】
第２の実施形態は、主として、骨の主成分であるカルシウムを生物試料から除去する工程、生物試料を透明化する工程、生物試料に含まれる組織間の屈折率を調整する工程から構成される、骨を含む生物試料の透明化方法である。また、生物試料を免疫組織学的な方法（免疫染色など）により染色し、観察する場合には、これらの工程の他、さらに、抗体等で生物試料を免疫染色する工程が含まれていてもよい。
【００２７】
第２の実施形態において、透明化の対象となる生物試料は、骨（または骨組織）を生体内に含む、例えば、脊椎動物（例えば、硬骨魚類、両生類、は虫類、鳥類、哺乳類が好ましく、特に哺乳類が好ましい。好ましい哺乳類としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、霊長類（ヒトを除く）およびヒトである。）であればいかなる生物由来のものであってもよい。また、本明細書において「骨」は、当業者において理解される一般的な意味として捉えればよく、脊椎動物において骨格を構成するリン酸カルシウムを多分に含んだ硬い組織（硬組織）のことである。また、「骨を含む生物試料」とは、「骨」が含まれる組織や器官であればいかなるものであってもよく、例えば、骨髄および骨を含む硬組織由来の試料、頭部またはその一部のように頭蓋骨と脳を含む試料、内耳を含む試料、骨軟骨の連結部、骨と靭帯などの結合組織の連結部、骨同士が軟骨により連結する部分である関節を含む試料、骨化、石灰化をおこした病理組織などである。
さらに、「骨を含む生物試料」は、あらかじめ、蛍光タンパク質などを発現させたもの、蛍光化学物質を導入したもの、蛍光標識を使用して免疫染色を行ったものであってもよい。また、生物試料は顕微鏡観察用に固定化処理（例えば、PFA(paraformaldehyde) -PBSで処理）されたものであってもよい。
【００２８】
第２の実施形態の工程（ａ）は、骨の脱灰を行う工程で、カルシウムキレート剤を含む溶液で生物試料を処理する工程である。カルシウムキレート剤は、カルシウムをキレートする剤であれば、特に限定されるものではなく、例えば、EDAT（エチレンジアミン四酢酸）、EGTA（グリコールエーテルジアミン四酢酸）、NTA（ニトリロ三酢酸）、DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸）、HEDTA（エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸）、TTHA（トリエチレンテトラミン六酢酸）およびこれらの誘導体を例示することができる。カルシウムキレート剤を含む溶液の溶媒は水が好ましく、また、pHの維持が可能な緩衝液であってもよい。また、キレート剤の濃度は、用いるキレート剤の種類および透明化する試料の種類にもよるが、例えば、数mMから数百mMであってもよい。
カルシウムキレート剤で処理する時間は、生物試料によって異なるが、骨を含む資料を切離する際に抵抗が無くなる程度にキレート剤処理を行えばよく、例えば、数分〜数日である（例えば、10％EDTA・2Na（269 mM）をキレート剤とした場合、内耳（3〜5日）、頭蓋骨（7〜21日）、四肢骨（2〜7日））。
【００２９】
本発明の第２の実施形態の工程（ｂ）は、生物試料を透明化する工程で、主として、脂質やコラーゲンなどからなる細胞外基質を除去する工程である（脱脂および脱コラーゲン）。
第２の実施形態の透明化試薬は、少なくとも１種類のカオトロープを含み、好ましくはソルビトールを含み、さらに、グルコースを含んでいてもよい。そして、当該透明化試薬は、水を溶媒とする溶液、または、pHの維持が可能な緩衝液が好ましく、生物試料を浸した際に、生物試料が変形しないように、浸透圧が調整されたものであってもよい。第２の実施形態の透明化試薬に含まれるカオトロープとしては、例えば、尿素、尿素誘導体、尿素もしくは尿素誘導体の塩、グアニジン、グアニジン誘導体、グアニジンもしくはグアニジン誘導体の塩などが好ましい。
【００３０】
第２の実施形態の透明化試薬には、カオトロープの他、好ましくはソルビトール（sorbitol）、さらに好ましくはグルコース（glucose）が含まれていてもよい。ソルビトールは、これまでに報告されている生物試料の透明化試薬にも含まれているが（例えば、非特許文献１を参照のこと）、従来の方法においてソルビトールは主として蛍光物質の消光を防ぐ目的で使用されていたのに対し、本発明においては骨の内側の組織等の保存性の向上（たとえば、蝸牛の透明化の場合には、外有毛細胞の聴毛などの保存性の向上など）、および骨コラーゲンを溶解させ骨の屈折率を調整するという点において効果を発揮していると考えられる。さらに、透明化試薬にグルコースを加えることで、透明化処理時間が短くなり、また、透明化後の試料に含まれる組織や細胞のコントラストが際立つ傾向にあることを見いだした。
【００３１】
第２の実施形態の透明化試薬に含まれるカオトロープの至適濃度は、透明化する生物試料または用いるカオトロープの種類によって異なり、特に限定されるものではなく、当業者であれば予備的な実験により、その至適濃度を容易に決定することができる。例えば、カオトロープとして、尿素を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜4 Mであり、グアニジン塩酸塩を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜3 Mである。
第２の実施形態の透明化試薬にソルビトールおよび／またはグルコースが含まれる場合、ソルビトールおよびグルコースの濃度は、特に限定されるものではないが、ソルビトールについては、例えば、10 (w/v) %〜50 (w/v) %、好ましくは20 (w/v) %〜45 (w/v) %、より好ましくは30 (w/v) %〜40 (w/v) %であり、グルコースについては、例えば、5 (w/v) %〜30 (w/v) %、好ましくは10 (w/v) %〜25 (w/v) %、特に好ましくは10 (w/v) %〜20 (w/v) %である。
第２の実施形態の透明化試薬には、さらに、界面活性剤が（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００３２】
第２の実施形態の透明化試薬による処理時間、処理温度の条件は、生物試料によって異なり、当業者であれば、予備的な実験により条件を設定することができ、例えば、処理温度は20℃〜37℃程度で、処理時間は数分〜48時間程度である。例えば、内耳のように骨組織が少ない試料の場合は、室温（10〜30℃）で2〜4時間程度、または30〜40℃で0.5〜1.5時間程度、より骨組織を多く含む試料の場合は、室温（10〜30℃）で15〜30時間程度、または30〜40℃で2〜4時間程度処理してもよい。
【００３３】
本発明の第２の実施形態の工程（ｃ）は、生物試料を構成する骨とその他の組織もしくは器官との間の屈折率の違いを調整する工程である。
第２の実施形態で用いられる屈折率調整試薬は、少なくとも１種類のカオトロープと、好ましくは、ソルビトールを含んでいてもよい。そして、該屈折率調整試薬は、水を溶媒とする溶液、または、pHの維持が可能な緩衝液が好ましく、生物試料を浸した際に、生物試料が変形しないように、浸透圧が調整されたものであってもよい。第２の実施形態の屈折率調整試薬に含まれるカオトロープとしては、例えば、尿素、尿素誘導体、尿素もしくは尿素誘導体の塩、グアニジン、グアニジン誘導体、グアニジンもしくはグアニジン誘導体の塩などが好ましい。
【００３４】
第２の実施形態の屈折率調整試薬に含まれるカオトロープの至適濃度は、透明化する生物試料または用いるカオトロープの種類によって異なり、特に限定されるものはなく、当業者であれば予備的な実験により、その至適濃度を容易に決定することができる。例えば、カオトロープとして、尿素を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜4 Mであり、グアニジン塩酸塩を用いる場合は、1 M〜6 M、より好ましくは1 M〜3 Mである。
第２の実施形態の屈折率調整試薬にソルビトールが含まれる場合、ソルビトールの濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、15 (w/v) %〜65 (w/v) %、好ましくは20 (w/v) %〜60 (w/v) %、より好ましくは50 (w/v) %〜60 (w/v) %である。
なお、第２の実施形態において、透明化試薬および屈折率調整試薬にソルビトールが含まれる場合、屈折率調整試薬に含まれるソルビトール濃度が透明化試薬に含まれるソルビトール濃度より高い方が好ましい。
また、カオトロープとして尿素もしくは尿素誘導体またはこれらの塩を選択する場合、ソルビトールの濃度は、好ましくは40 (w/v) %よりも高濃度で、60 (w/v) %以下であることが好ましい。
また、第２の実施形態の屈折率調整試薬には、さらに、界面活性剤が（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００３５】
第２の実施形態の屈折率調整試薬による処理時間、処理温度の条件は、生物試料によって異なり、当業者であれば、予備的な実験により条件を設定することができ、例えば、処理温度は25〜37℃程度で、処理時間は数分〜48時間程度である。例えば、内耳のように骨組織が少ない試料の場合は、室温（10〜30℃）で5分〜20分程度、または30〜40℃で数分、より骨組織を多く含む試料の場合は、室温（10〜30℃）で2〜4時間程度または30〜40℃で0.5〜2時間程度処理してもよい。
【００３６】
第２の実施形態にかかる透明化処理（カオトロープとして、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩を選択する処理）を、蛍光タンパク質（例えば、GFPなど）を含む生物試料に対して行った後、蛍光分子からの蛍光が消退する場合には、透明化後の生物試料を、例えば、PBS（例えば、NaCl:137mM, (PO4)3-:9.57mM））、あるいは、既知の尿素ベースの透明化試薬（例えば、25 (W/V) % 尿素、50 (W/V) % スクロース、10  (W/V) % 2, 2’, 2’’-ニトリロトリエタノール、0.1 % Triton X-100）などで処理することにより、蛍光を回復させることができる。
【００３７】
本発明の第１および第２の実施形態において、カオトロープとして、尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩が使用される場合、尿素誘導体は、特に限定はされず、例えば、下記の一般式（１）で示される化合物である。
【化１】
2018044800.tif 000002
一般式（１）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して水素、炭化水素基、ハロゲン原子である。
ここで、炭化水素基は、置換基を有してもよく、また、鎖状であっても環状であってもよく、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基などが好ましい。より好ましい炭化水素基としては、炭素数1〜6であり、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロプロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基などを挙げることができる。
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。
本発明の実施形態で使用される尿素および尿素誘導体の好ましい例は、一般式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４の全てが水素である尿素の他、Ｒ１〜Ｒ４のうち３つが水素で残り１つの基がハロゲン原子である尿素誘導体であってカオトロープとして作用する化合物およびＲ１〜Ｒ４のうちＲ１またはＲ２のいずれか１つおよびＲ３またはＲ４のいずれか１つが水素で、残りの２つの基がアルキル基である尿素誘導体であってカオトロープとして作用する化合物である。
また、一般式（１）で表される尿素および尿素誘導体の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩などを挙げることができる。
【００３８】
また、本発明の第１および第２の実施形態において、カオトロープとして、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩が使用される場合、グアニジン誘導体は、特に限定はされず、例えば、下記の一般式（２）で示される化合物である。
【化２】
2018044800.tif 000003
一般式（２）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して水素、炭化水素基、ハロゲン原子である。
ここで、炭化水素基は、置換基を有してもよく、また、鎖状であっても環状であってもよく、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基などが好ましい。より好ましい炭化水素基としては、炭素数1〜6であり、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロプロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基などを挙げることができる。
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。
本発明の実施形態で使用されるグアニジンおよびグアニジン誘導体の好ましい例は、一般式（２）において、Ｒ１〜Ｒ４の全てが水素であるグアニジンの他、Ｒ１〜Ｒ４のうち３つが水素で残り１つの基がハロゲン原子であるグアニジン誘導体であってカオトロープとして作用する化合物およびＲ１〜Ｒ４のうちＲ１またはＲ２のいずれか１つおよびＲ３またはＲ４のいずれか１つが水素で、残りの２つの基がアルキル基であるグアニジン誘導体であってカオトロープとして作用する化合物である。
また、一般式（２）で表されるグアニジンおよびグアニジン誘導体の塩としては、例えば、塩酸塩、チオシアン酸塩などを挙げることができる。
【００３９】
本発明の透明化試薬および屈折率調整試薬に含まれるカオトロープとして、尿素およびその誘導体、または、グアニジンおよびその誘導体のいずれを用いても、生物試料を効果的に透明化することができる。グアニジンは、一般には、尿素よりも強いカオトロープとして知られているため、当業者においては、尿素と比較して生物試料に対するダメージが大きいと考えるのが通常である。しかしながら、発明者らが、透明化試薬および屈折率調整試薬のカオトロープとしてグアニジン塩酸塩を使用したところ、生物試料の膨張が尿素を使用した場合よりも少ないことを見いだした。また、発明者らは、生物試料の透明化の程度も、グアニジンベースの試薬は、尿素ベースの試薬と同程度かそれ以上の透明化を実現し得ることを確認している。
以上のような特徴を理解した上で、当業者は、カオトロープとして、尿素ベースの試薬またはグアニジンベースの試薬のいずれも選択することが可能である。
【００４０】
本発明の第３の実施形態は、第１および第２の実施形態において使用される、生物試料の透明化試薬（「本発明の透明化試薬」とも記載する）および生物試料の屈折率調整試薬（「本発明の屈折率調整試薬」とも記載する）である。
本発明の透明化試薬としては、例えば、尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体もしくはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープ含む溶液を挙げることができる。本発明の透明化試薬には、カオトロープの他に、好ましくはソルビトール、より好ましくはグルコースが含まれていてもよく、さらに、界面活性剤（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。好ましいカオトロープは、尿素またはグアニジン塩（例えば、グアニジン塩酸塩）である。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００４１】
本発明の屈折率調整試薬としては、例えば、尿素もしくは尿素誘導体またはそれらの塩、グアニジンもしくはグアニジン誘導体またはそれらの塩からなるグループから選択される少なくとも１種のカオトロープ含む溶液を挙げることができる。カオトロープの他に、好ましくはソルビトールが含まれていてもよく、さらに、界面活性剤（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどのエステル型非イオン界面活性剤、脂肪アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのエーテル型非イオン界面活性剤などを挙げることができる。より具体的には、Triton X（登録商標）シリーズ、Nonidet P（登録商標）シリーズ、Tween（登録商標）シリーズなどを挙げることができる）が含まれていてもよい。好ましいカオトロープは、尿素またはグアニジン塩（例えば、グアニジン塩酸塩）である。界面活性剤の好ましい濃度は、特に限定はしないが、0.1 %〜4.0 %程度である。
【００４２】
さらに、本発明の第４の実施形態は、生物材料または骨を含む生物材料透明化処理キット（「本発明の透明化処理キット」とも記載する）である。
本発明の透明化処理キットには、上記の本発明の透明化試薬、屈折率調整試薬が含まれる他、生物試料の透明化に必要な試薬、例えば、生物試料の固定液（例えば、PFA-PBSなど）、カルシウムキレート剤の溶液、免疫染色に用いる種々の抗体（標識されていても、されていないなくてもよい）などが含まれていてもよい。
【００４３】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。
以下に、いくつかの実施例を示すが、本発明の範囲はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実験方法
１．試料の固定
１−１．生後５日より前のマウス
マウスを頸部脱臼して安楽死させた後、断頭および腕関節並びに股関節離断を行った。後頸筋を、用手的可及的に剥離を行い、背側頸髄正中を覆う骨に剪刀を挿入し、硬膜下腔に空気が入るように頭頂骨を垂直上方へ把持した後、脳組織を損傷しないよう剪刀を前進させるとともに両眼窩間正中にかけて頭頂骨の正中切開を行った。正中切開部より内耳上方の側頭骨まで鑷子を用いて鈍的剥離を行った。脳上方の全貌を明視化におくことができるまで頭頂骨を可及的鈍的剥離を行った。延髄、中脳、続いて両側側頭葉下に剥離子を挿入し頭蓋底より用手剥離を行った。両側眼窩間に切離を行って生じた後頭頂骨を、鑷子を用いて丁寧に摘出を行い、嗅球下へ剥離子をすすめ全脳を摘出した。脳摘出後上顎骨に正中切開を行い、側頭骨を切離した。肩関節、股関節に剪刀を挿入し上前腕、上下腿を摘出した。
摘出した試料を4%PFA(paraformaldehyde) /PBS（NaCl:137mM, (PO4)3-:9.57mM）（以後固定液と称す）へ浸透させた。脳試料は固定液を浸透した状態で、4℃にて翌日まで保存した。固定液を浸透した状態で側頭骨頭蓋底面より三半規管側頭骨裂に沿わせて鑷子を挿入させ内耳外形を掘り出した。蝸牛頂部は骨との接着が強固なため蝸牛損傷を起こしやすいため丁寧な剥離をこころがける必要がある。早い週令では蝸牛表側にゼリー様組織が付着しており、組織摘出不十分だと屈折率調整が不十分になり試料透明化を妨げる可能性がある。
摘出された内耳は、新鮮な固定液に浸透させ4℃で翌日まで保存した。固定液を浸透した状態で、頭蓋骨は頬筋、側頭筋を、鑷子を用いて用手的に、四肢骨は剪刃を骨体正中部にあて骨長軸面で回転させ骨に付着した軟部組織の切離を行い、剪刃背を用いて残存軟部組織の剥離を行った。関節包を温存した状態で固定液へ浸透させ4℃で翌日まで保存した。
【００４５】
１−２．生後５日以降のマウス
十分量の麻酔下で疼痛刺激への反応がないことを確認した後にPBS 15 mlでの脱血後、60 mlの固定液で灌流固定を行った。脳、側頭骨、頭蓋骨、四肢骨の摘出法は前述した（上記（１））と同様である。内耳は、生後５日以降より側頭骨との接着が強固になるため、前述方法とは異なる処理を行った。側頭骨摘出後、固定液へ浸透させた状態で外耳道軟骨を、剪刀を用いて側頭骨より切離した。鑷子先端にて鼓膜縁側頭骨間で鼓膜穿孔を作製し、鼓膜外周で側頭骨より鼓膜を切離した。鼓膜摘出後、蝸牛表側を明視化におき内耳損傷に細心の注意をはらい周囲組織の切離を行った。その際、内耳から数mm程度の安全領域をつけて一部側頭骨を残存した状態で摘出した。耳小骨の摘出の有無は問わない（無理矢理摘出し蝸牛損傷をきたす可能性があるため）。摘出された内耳を新鮮な固定液へ変えて4℃で翌日まで保存した。
【００４６】
１−３．大脳皮質スライス標本
全脳固定化試料を大脳と小脳の境界部分で冠状断を行う。シアノアクリレート系瞬間接着剤（商品名：アロンアルファ（登録商標））を用いて大脳側の試料の冠状面の垂直固定を行った後にビブラトームを用いて100 μm〜2 mmの厚さのスライス標本を作製する。
【００４７】
２．脱灰
0.1% Triton X-100/ PBS（以後洗浄液と称する。）3 mlで、内耳（10分×3）、頭蓋骨・四肢骨（1時間×3）の攪拌洗浄を（40 rpm）行った。洗浄終了後、試料を10％(269 mM) EDTA・2Na溶液へ浸透させ37℃で保存した。内耳（3-5日）、頭蓋骨（7日-21日）、四肢骨（2-7日）試料に付着している軟部組織を洗浄液下で除去した。内耳を側頭骨から摘出する際には頭蓋内の三半規管を目印に行った。三半規管と頭蓋骨間にピンセットを挿入して内耳を全周くりぬくようにして内耳迷路骨包を一塊に側頭骨から剥がした。蝸牛上方の骨裂で左右に剥がすことで内耳を温存しやすくなる。内耳摘出後に蝸牛前面に付着しているゼリー様組織を丁寧に剥離する。内耳（蝸牛、三半規管）を温存した状態（内耳に骨がついた状態）で内耳を側頭骨から摘出した。蝸牛軸側の内耳からフックポーションにOverhangした三半規管、前庭を切り離し、内耳試料を作製した。
【００４８】
３．透明化（脱脂・脱コラーゲン）
尿素（1-4M）またはグアニジン塩酸塩（1-3M）、D-ソルビトール（35％v/w）をD-グルコース（15％v/w）、Triton X-100（0.1％v/w）から構成される透明化試薬（pH6.0-8.0）を作製した。
透明化試薬を適切な大きさのペトリ皿（内耳の場合は1 mlエッベンチューブなど）に注入し、その中に試料を静置した。内耳は、室温3時間、37℃1時間、その他の硬組織は室温24時間程度、37℃3時間程度で完了する。また、大脳スライス標本（100 μm厚の場合）の場合は、室温または37℃にて、数秒の処理で完了する。
【００４９】
４．免疫染色（GFPシグナル観察の場合は不要）
内耳（10分×3）、頭蓋骨・四肢骨（1時間×3）を洗浄液で攪拌洗浄（40 rpm）を行った。
１次抗体を洗浄液に最適濃度に希釈を行った後に遠心（4℃ 140rpm 30分）を行い、上清に試料を浸透させ37℃で24-48時間保存した。内耳（10分×3）、頭蓋骨・四肢骨（1時間×3）を洗浄液で攪拌洗浄（40rpm）を行った。
２次抗体を洗浄液に最適濃度に希釈を行った後に遠心を行い（4℃ 140rpm 30分）上清に試料を浸透させ37℃で24-48時間保存した。
【００５０】
５．屈折率調整
尿素（1-4M）またはグアニジン塩酸塩（1-3M）、D-ソルビトール（60％v/w）、Triton X-100（0.1％v/w）から構成される屈折率調整薬（pH6.0-8.0）を作製した。屈折率調整試薬を適切な大きさのペトリ皿（内耳の場合は1 mlエッベンチューブなど）に注入し、その中に試料を静置した。内耳は室温で15分、37℃で数分、その他の硬組織は室温で3時間程度、37℃で1時間程度の処理で完了する。また、大脳スライス標本（100 μm厚の場合）の場合は、室温または37℃にて、数秒の処理で完了する。
イメージングを行う際は透明化の完了した試料をスライドグラスへ取り出し、カバーグラスをかけた後に試料とカバーグラスの間に新鮮な屈折率調整試薬を注入した。
【００５１】
結果
１．カオトロープとしてグアニジン塩酸塩を使用した大脳スライス標本の透明化処理
グアニジンは、尿素よりも強力なカオトロープであるが、グアニジン塩酸塩を用いて生物試料の透明化が可能かどうか検討を行った。
以下の試薬を用いて、Thy1-YFPマウスの大脳スライス切片（100 μm）の透明化を行った。
・透明化試薬；1 M、2 M、3 M、4 M、5 Mまたは6 M グアニジン塩酸塩
【００５２】
既存の水溶性透明化試薬において尿素は必須要素であり、一般的に4Mで使用されている。今回４M尿素とグアニジン塩酸塩での組織浮腫、透明度、蛍光（GFP）輝度についての比較検討を行った。
透明化試薬に含まれるグアニジン塩酸塩の濃度を変えて、室温で数秒処理を行った。その結果、3 M程度で透明化を実現することができた（図１）。グアニジン塩酸塩濃度が４M以上の場合、蛍光タンパク質からの蛍光の検出が困難であった（図１、4M、5M、6Mの蛍光図の下段を参照のこと）。従って、蛍光タンパク質を含む試料等を透明化する場合には、グアニジン塩酸塩濃度は3 M程度が適当であると考えられる。
【００５３】
しかし、グアニジン塩酸塩で透明化処理することにより消失退色したGFP蛍光は、PBS置換を行うと退色の度合いに関わらずほぼ元の蛍光GFP強度へと可逆的に回復することが分かった（図２「PBS」）。同様に、グアニジン塩酸塩で処理した試料を、従来の透明化試薬（25 (W/V) % 尿素、50 (W/V) % スクロース、10  (W/V) % 2, 2’, 2’’-ニトリロトリエタノール、0.1 % Triton X-100）（図２では、「従来の透明化試薬2」と記載）に浸透させると、蛍光強度を回復させることができた（図２）。
【００５４】
次に、グアニジン塩酸塩を含む試薬で処理をしたときの試料の膨張の程度について検討を行った。1-3 Mのグアニジン塩酸塩を含む透明化試薬および屈折率調整試薬を用いて透明化処理を行った。その結果、４M尿素では20％程度の組織膨張を認めたがグアニジンでは最大5％程度の組織膨張しか認めなかった。また透明度においても3 Mグアニジンが４M尿素を上回る結果となった。（図３）。
【００５５】
２．骨を含む生物材料の透明化
２−１．従来の透明化方法と本発明の透明化方法の効果の比較
従来の透明化方法として、有機溶媒ベースである3DISCOとiDISCO、ならびに、水溶性試薬であるCLARITYおよびCUBICの各溶液を用いて、内耳サンプルの透明化処理を行い、本発明の透明化方法による透明化処理の結果と比較した。
従来の透明化方法で内耳サンプルを処理すると、脳組織の脱脂を行うための電気泳動を要するCLARITYで報告されている条件での透明化過程で硬組織に一部亀裂が入るような現象を認めたが、いずれの既存透明化手法においても一定の骨透明化を実現することができた（図４、3DISCO、iDISCO、CLARITYおよびCUBIC）。しかし、蝸牛内、コルチ器に存在する音を感受する有毛細胞（MyosinVIIa）の同定には至らなかった。
これに対して、本発明にかかる透明化方法で内耳サンプルを処理すると、骨の内側の有毛細胞を明瞭に確認することができた（図４、下段、Our studyの白色ラセン状の構造）。
この結果から、本発明にかかる透明化方法は、骨の透明化だけでなく骨の内側に存在する細胞を観察できる新たな手法であることが示された。
【００５６】
２−２．透明化方法の確立
本発明の透明化方法の一例を概略的に以下に説明する（図５を参照のこと）。
まず、生物試料の固定を十分に行った後、EDTAによる脱灰を行い、透明化試薬（尿素、ソルビトール、グルコースおよびTritonX-100からなる試薬、または、グアニジン塩酸塩、ソルビトール、グルコースおよびTritonX-100からなる試薬）にてコラーゲンの分解、脱脂を行った。その後、生物試料を免疫染色した後、屈折率調整試薬（尿素、ソルビトールおよびTritonX-100からなる試薬、または、グアニジン塩酸塩、ソルビトールおよびTritonX-100からなる試薬）で生物試料を処理して屈折率の調整を行った。
【００５７】
２−３．カオトロープとして尿素を選択した場合の透明化（内耳、大腿骨、膝関節、手関節、頭蓋骨）
２−３−１．透明化処理の結果
以下の試薬を用いて、内耳、大腿骨、膝関節、手関節、頭蓋骨を含む生物試料の透明化を行った。
（a）カルシウムキレート剤； 10％EDTA・2Na（269mM）
（b）透明化試薬；4 M 尿素、35 (w/v) % ソルビトール、15 (w/v) % グルコース、4 (w/v) % Triton X-100
（c）屈折率調整試薬；4 M 尿素、60 (w/v) % ソルビトール、0.1 (w/v) % Triton X-100
【００５８】
カルシウムキレート剤（EDTA）にて、大腿骨、膝関節、手関節は2日、内耳は3日、頭蓋骨は7日浸透させて脱灰を行った。また、透明化試薬に、内耳は室温1時間または37℃1時間、その他の組織は、室温24時間または37℃3時間程度浸透させ、屈折率調整試薬に、内耳は室温15時間または37℃数分、その他の組織は、室温3時間または37℃1時間程度浸透させて処理を行った。
大腿骨は、骨が透明になり、大腿骨内に存在する骨髄を透視することができた（図６（ａ））。
膝関節において骨体で離断したサンプルでは、骨越しに骨髄の透明化を確認できた（骨髄が透明化試薬と交通する。すなわち、骨髄の透明化されていることを意味する。）また、無傷状態の関節の透明化にも成功していることが確認できた（図６（ｂ））。
手骨は複数骨と関節から構成されるが、すべての骨、関節で透明化できていた（図６（ｃ））。
内耳は骨迷路と膜迷路から構成される組織であり、膜迷路内に存在するヘムなどの色素タンパク質を多く含む血管条の色素が若干残るものの、骨、膜迷路ともに透明化できている（図６（ｄ））。
頭蓋骨は複数の厚い骨から構成されているが、軸位、矢状位ともに鼻腔内気泡（矢尻）を確認できた（図６（ｅ）および（ｆ））。また、鼻腔内に存在する鼻甲介、鼻中隔の構造も確認（矢印）することができた。
【００５９】
２−３−２．本発明の透明化方法の蛍光への影響
従来法を用いて組織の透明化を行うと蛍光分子の消退が生じることが報告されている。そこで、本発明の透明化方法により蛍光分子が影響を受けるかどうか検討を行った。
中枢神経細胞、線維に黄色蛍光蛋白（YFP）が発現しているThy1-YFPマウス（Fengら Neuron 1:41-51 2000）の大脳皮質スライス標本（100μm）と、ATeam（ATPの濃度変化に応じて色が変化する蛍光プローブ）が発現しているマウス（Imamuraら Proc Natl Acad Sci U S A 106(37):15651-15656）の内耳を、各々、本発明の透明化方法で処理し、その翌日に蛍光観察を行った。
図７の上図（大脳皮質スライス標本）において、四角部分は聴皮質、皮質内に点状に白く点在している神経細胞体（矢印）と線上の神経線維（矢尻）を確認することができた。また、図７の下図（生後５日のマウスの内耳サンプル）においては、3列に配置された外有毛細胞（矢尻）とその内側に存在する１列に並んだフラスコ型の内有毛細胞（矢印）を確認することができ、それぞれの有毛細胞頂部に「くの字」屈曲した聴毛マーカーであるRhodamine- phalloidin（F-アクチンを標識する）も確認することができた。なお、Rhodamine- phalloidin処理は、透明化試薬による処理後で屈折率調整試薬による処理前の試料に対し、２次抗体処理と同じタイミングで行った。
以上の結果から、本発明の透明化方法で処理した生物試料において、蛍光シグナル消退は認められなかった。
【００６０】
内耳を透明化したサンプルに対し、MyosinVIIa（有毛細胞マーカー）、Neurofilament200（神経線維マーカー）およびVGLUT3（内有毛細胞内、小胞グルタミン酸トランスポーター）に対する抗体を用いて免疫染色を行った（図７）。また、Rhodamine-Phalloidin（聴毛マーカー）による染色の結果も示す（図７）。
【００６１】
２−３−３．内耳３次元再構築
本発明の透明化方法を使用して、内耳マクロとミクロの３次元再構築を行った。従来法（薄切切片、surface preparation）では、内耳に操作を加えて試料を作製するためマクロ３次元再構築は不可能であったが、本発明の透明化方法を用いることで可能となった（図９）。
頂回転から基底回転までの有毛細胞（図９ａ）、聴毛（図９ｂ）、神経線維（図９ｃ）を確認することができた。図９のｄは、ａ〜ｃを重ね合わせた（merge）図である。ｅおよびｆは、有毛細胞のみ抽出した内耳３次元再構築画像である。また、図９のｇおよびｈは、聴毛のみ抽出した２次元再構築画像で、ｇは、表層0-180μmを、ｈは、深層180-580μmの構築画像である。
また、ミクロ試料での３次元再構築は従来法（切片、surface preparation）でも可能であるが本手法を用いて従来法と同等の解像度で観察することが可能であった（図９、ｉ〜ｋ）。３次元再構築画像では表、横からでは有毛細胞、聴毛の存在によって、神経線維の観察は不十分である（図９、ｉおよびｊ）が、裏から観察すると神経線維の走行を確認できた（図８ｋ）。
【００６２】
内耳サンプルに対し、EDTA処理（脱灰）後、従来の透明化方法の１つ（CUBIC法；Susakiら, Cell 157:726-739 2014）を用いて処理を行ったところ、２回転半ある有毛細胞は１回転しか確認できなかった（図１０左）。これに対し、本発明の透明化処理法によれば、２回転半確認することができた（図１０右）。
従って、従来法（今回の比較対象はCUBIC法）よりも、本発明の透明化処理法によれば、3次元的により深い部分の観察も可能であることがわかった。また、EDTA処理を施したのち、従来法（CUBIC）の処理を行った場合において、内耳の深い部分を確認することはできなかったことから、骨を含む組織の透明化において、EDTA処理（脱灰）の段階のみで透明化が実現できるわけではなく、本発明の処理方法を行うことで初めて、上述のような優れた結果を実現できることが明らかとなった。
【００６３】
２−４．カオトロープとしてグアニジン塩酸塩を選択した場合の透明化（大腿骨、膝関節、手関節）
以下の試薬を用いて、大腿骨、膝関節、手関節を含む生物試料の透明化を行った。
（a）カルシウムキレート剤； 10％EDTA・2Na（269mM）
（b）透明化試薬；3 M グアニジン塩酸塩、35 (w/v) % ソルビトール、15 (w/v) % グルコース、4 (w/v) % Triton X-100
（c）屈折率調整試薬；3 M グアニジン塩酸塩、60 (w/v) % ソルビトール、0.1 (w/v) % Triton X-100
【００６４】
カルシウムキレート剤（EDTA）にて、大腿骨、膝関節、手関節を2日浸透させて脱灰を行った。また、透明化試薬に、室温24時間または37℃3時間程度浸透させ、屈折率調整試薬に、室温3時間または37℃1時間程度浸透させて処理を行った。
透明化処理の結果、骨段端より遠方部は骨髄の温存を確認できた（図１１中の矢印）。また、関節包の温存も同時に確認できた（図１１中の矢尻）。大腿骨においては骨髄の透明化の透明化を認めた（図１１中「＊」）
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明にかかる透明化方法により、生物試料の３次元的構造を生体内に近い状態で再現することが可能となり、生物学および医学等の分野の発展に寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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