(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、濃度範囲が非常に広い検量線作成用の標準試料を分析した際の、ピーク形状変化に対応できるピーク同定方法を提供するものである。【解決手段】  ２以上の定量対象成分を含有する標準試料のクロマトグラムについて、ピーク面積を全ピーク面積の総和で除したピーク面積比率を、前記定量対象成分ごとに標準ピーク面積比率として算出し、前記標準試料を一定割合で希釈した試料のクロマトグラムについて、前記標準ピーク面積比率を基に前記定量対象成分を同定することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の定量対象成分を含有する標準試料のクロマトグラムについて、ピーク面積を全ピーク面積の総和で除したピーク面積比率を、前記定量対象成分ごとに標準ピーク面積比率として算出し、前記標準試料を一定割合で希釈した試料のクロマトグラムについて、前記標準ピーク面積比率を基に前記定量対象成分を同定することを特徴とする方法。
【請求項２】
テーブル化された前記標準ピーク面積比率を、希釈した試料のクロマトグラムの各ピーク面積比率と比較し、最も値が近しい成分を特定の前記定量対象成分と同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標準試料の基準溶出時間と希釈した試料のクロマトグラムの溶出時間とを比較することを更に行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
複数濃度となるように前記標準試料を希釈した試料群を、請求項１〜３のいずれかに記載の方法で定量対象成分を同定し、検量線を作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィでの定量計算に使用される検量線を、簡便かつ確実に作成するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
検量線を作成する場合、一般的には定量目的の複数成分を含む混合標準試料原液を希釈液にて多段階で希釈を行い、複数濃度の標準試料溶液を調整する。次に、これらの濃度の異なる複数の標準試料をクロマトグラフに供して、各成分に相当するピークを同定し、出力値（面積、高さ、吸光度等）を算出する。最後に、成分毎に、濃度に対する出力値（面積、高さ、吸光度等）つまり検量線を作成するのが一般的な手順となる。このような一連の検量線作成の操作は、手動で行うことも可能であるが、近年はデータ処理装置により自動で作成されることが多くなっている。
【０００３】
この一連の流れが、正確に実行される前提は、濃度の異なる標準試料であっても、各成分の溶出時間がほぼ一定であることである。図１は濃度による時間変動の影響を模式的に示した図である。図１ａは、濃度により溶出時間が変動しない場合、図１ｂは、濃度により溶出時間が遅れる場合、図１ｃは、濃度により溶出時間が早まる場合を示している。理想的なクロマトグラフィでは、図１ａのように溶出時間は濃度の影響を受けないで一定となる。しかしながら、現実的には図１ｂ、ｃのように、濃度が高くなるにつれて、程度の差はあれ、ピークがテーリングまたはリーディング現象を起こすことが多々ある。
【０００４】
このようは場合、同じ成分であれ、同定条件で指定した同定時間許容範囲に収まらず、同定ができなくなり、検量線用の出力値（面積、高さ、吸光度）に値を受け渡すことができなくなる。また、目的成分の近傍に不純物由来のピークが存在した場合などは、不純物由来のピークを目的の成分として誤同定し、検量線用の出力値（面積、高さ、吸光度）に誤った値を受け渡してしまうことにもなる。解決策として同定の許容幅を広げることも考えられるが、一定程度正確に同定できる確率が高くなるが、不純物由来のピークを目的の成分として誤同定してしまうリスクも同時に高まることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、濃度範囲が非常に広い検量線作成用の標準試料を分析した際の、ピーク形状変化に対応できるピーク同定方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した通り、一般的な液体クロマトグラフィの検量線作成時には、複数成分を混合した標準試料を順次希釈し、異なる濃度の標準試料を複数調整し、これらをクロマトグラフィに供して行うため、クロマトグラムはほぼ相似形をとることになる。濃度が異なる標準試料でも、それに含まれる複数成分の混合比率は、理論上は一定の値となる。ピーク形状が変化しても、検出器の定量範囲内であれば、ピーク面積比率はほぼ一定の値となる。標準試料中に予期せぬ不純物が含まれていた場合であっても、全体に対する混合比率は、微小であり、目的の標準試料成分の存在比率（面積比率）には大きな影響を与えるものではない。
【０００７】
そこで、本発明者は、前記の特性を同定方法の少なくとも一部に取り入れることにより、各成分の同定精度を向上させられることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、２以上の定量対象成分を含有する標準試料のクロマトグラムについて、ピーク面積を全ピーク面積の総和で除したピーク面積比率を、前記定量対象成分ごとに標準ピーク面積比率として算出し、前記標準試料を一定割合で希釈した試料のクロマトグラムについて、前記標準ピーク面積比率を基に前記定量対象成分を同定することを特徴とする。以下に、その詳細について説明する。
【０００９】
まず、基準となる２以上の定量対象成分を含有する標準試料のクロマトグラムを取得し、ピーク面積を全ピーク面積の総和で除したピーク面積比率を算出する。前記クロマトグラムは本目的のためだけに取得しても良いが、事前にピーク面積比率が既知の場合、その値を使用しても良い。このピーク面積比率を標準ピーク面積比率とする。
【００１０】
次に、前記標準試料を一定割合で希釈した試料のクロマトグラムについて、前記標準ピーク面積比率を基に前記定量対象成分を同定する。同定の可否を判断する基準としては、閾値を設けて単純に判定する方法や、全ての成分に対する面積差比率を比較して判断する方法や、あるいは、両者を組み合わせて判断する方法があるが、特に限定するものではない。例えば、面積差比率の計算方法としては
面積差比率＝絶対値（１−ピーク面積比率／標準ピーク面積比率）
が挙げられるが、面積の差の大小が判別できる式であれば良い。前記式を用いた場合、面積差比率がゼロに近いほど、比較対象の項目が似ていることを意味する。
【００１１】
本発明の効果を分かりやすく説明するために、濃度の異なる複数の正規関数による疑似クロマトグラムを基にして行う。図２ｂは同定の基準となるクロマトグラム、図２ａは濃度の異なる検証クロマトグラムである。図中の破線は同定の対象となる３つのピーク（ＡＡＡＡ、ＢＢＢＢ、ＣＣＣＣ）の溶出時間に対する±５％の範囲を示している。
【００１２】
図３は図２ａの濃度の異なる検証クロマトを拡大した図である。各検証用のクロマトグラムには、同定対象の３つのピーク（＃２、＃４、＃６）以外に不純物成分４つ（＃１、＃３、＃５、＃７）を故意に加えている。
【００１３】
同定の流れは以下の通りである。
（ステップ１）
基準となるクロマトグラムから、同定の目的成分のピーク面積を取得し、全ピーク面積の総和に対するピーク面積比率を算出する。
（ステップ２）
一定割合で希釈した試料についてクロマトグラフィで一般的に用いられる手法により、ピーク検出を行い、最低限、ピーク面積を取得し、全ピーク面積の総和に対するピーク面積比率を計算する。以降の説明を分かりやすくするため、ここでは、各ピークの溶出時間も併せて表記する。
（ステップ３）
検出されたピークに対して、得られた面積比率に対する同定条件のすべてのピーク面積比率との面積差比率（上述の方法で算出）を計算し、最も近いピーク面積比率を有する成分を特定する。すなわち、テーブル化された標準ピーク面積比率を、各ピーク面積比率と比較し、最も値が近しい成分を特定の定量対象成分と同定する。
【００１４】
上述した方法で、検証クロマトグラム１、４を同定した。同定条件を表１、検証クロマトグラム１、４の同定結果をそれぞれ表２、３に示す。
【００１５】
【表１】
2018080981.tif 000002
【００１６】
【表２】
2018080981.tif 000003
【００１７】
【表３】
2018080981.tif 000004
一方、従来の溶出時間の許容幅により同定した。同定条件を表４、検証クロマトグラム１、４の同定結果をそれぞれ表５、６に示す。なお、溶出時間の許容幅は基準となる溶出時間の±２．０％とした。
【００１８】
【表４】
2018080981.tif 000005
【００１９】
【表５】
2018080981.tif 000006
【００２０】
【表６】
2018080981.tif 000007
このように、従来の溶出時間を基にした同定法では、溶出時間が大きく変化する場合は正確に同定することができない。これを回避するため、同定条件の溶出時間許容幅を広げる方策もあるが、許容幅を広げた場合、ピーク＃１、３、５、７のような目的外のピークを同定対象のピークと誤判定するリスクが高くなり、最善の方策ではない。
【００２１】
上述した通り、本発明の面積比率を基にした同定法であれば、溶出時間が濃度等により変動する場合であっても、正確に同定することが可能であり、本発明の優位性が明らかである。
【００２２】
また、本発明では、上述したピーク面積比率の比較による同定以外に、前記標準試料の基準溶出時間と希釈した試料のクロマトグラムの溶出時間とを比較することを更に行っても良い。上述した検証クロマトの場合、同定対象の成分の面積比率がそれぞれ大きく乖離しているため、面積比率だけでの同定が精度良く行えているが、同定対象の成分の面積比率が近しい場合は、面積比率だけでは同定を精度良く行うことが困難となる。そこで、従来の同定方法である溶出時間の許容幅と、本発明の面積比率による同定法を組み合わせることで、簡便に同定を行うことが可能となる。
【００２３】
具体的には、まず溶出時間により対象成分の絞り込みを行う。この際、試料濃度による溶出時間の変動を考慮し、一般的な許容幅より大きくしておくことが好ましい。一般的な溶出時間のみによる同定の場合、許容幅は±２〜５％程度であるが、本発明では±５〜２０％の値を設定しておくことが好ましい。これにより、条件を満たす成分を複数に絞り込む。次に、溶出時間により絞り込まれた複数の成分に対して、上述した面積比率による同定法を施し、最終同定を行う。
【００２４】
上述した通り、本発明は標準試料を一定割合で希釈した試料のクロマトグラムについて、前記標準ピーク面積比率を基に前記定量対象成分を同定することが可能であるため、複数濃度となるように前記標準試料を希釈した試料群に本発明を適用することで、検量線を好適に作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】濃度変化によるピーク形状の変化を模式的に示した図である。図１ａは理想的な場合、図１ｂは濃度によりリーディングを生じる場合、図１ｃは濃度によりテーリングを生じる場合を示している。
【図２】疑似クロマトグラムである。図２ａは濃度の異なる検量線作成用の検証クロマトグラム２種、図２ｂは同定の基準となるクロマトグラムを示している。
【図３】図２の検証クロマトグラムをぞれぞれ拡大した図である。
【図４】実施例で使用したシステム構成を示した図である。
【図５】実施例１を説明するためのクロマトグラムである。
【図６】実施例１での検量線作成用の検証クロマトグラムである。図中の＃はデータ処理によりピーク検出を実行し、検出されたピークの番号を示している。
【図７】実施例２を説明するためのクロマトグラムである。
【図８】実施例２での検量線作成用の検証クロマトグラムの一例である。図中の＃はデータ処理によりピーク検出を実行し、検出されたピークの番号を示している。図中の←→範囲は同定目的成分の溶出時間の許容範囲を示している。
【実施例】
【００２６】
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。
【００２７】
図４に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０）７、およびデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｚ（５μｍ、４．６  ｍｍＩ．Ｄ．×１５  ｃｍ）を使用し、ｐ−ヒドロキシ安息香酸類の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０ｕＬ、カラム温度：４０℃、流速：１．０  ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ  混合液
サンプル：Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（２．５０ｕｇ／１ｍＬ）Ｅｔｈｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（１．６７ｕｇ／１ｍＬ）Ｐｒｏｐｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．３３ｕｇ／１ｍＬ）Ｂｕｔｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（０．８３ｕｇ／１ｍＬ）Ｈｅｘｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（１．３３ｕｇ／１ｍＬ）Ｈｅｐｔｙｌ  ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ（３．３３ｕｇ／１ｍＬ）  混合物
上記混合物を標準試料１とし、１／２希釈した試料を標準試料２、更に１／２希釈した試料を標準試料３、更に１／２希釈した試料を標準試料４、更に１／２希釈した試料を標準試料５とした。溶離液組成は、溶出時間を故意に変動させるため、ＣＨ３ＣＮ：６５．０％、６４．５％、６４．０％、６３．５％、６３．０％と変化させて測定を行った。
【００２８】
（実施例１）
本発明の効果を明確にするため、下記のように、標準試料の濃度ごとに溶離液のアセトニトリルの濃度をわずかに変化させて取得したクロマトグラムを元に本発明の効果を検証した。
【００２９】
基準クロマトグラム、検量線作成用の標準試料１〜５のクロマトグラムを図５に示す。
【００３０】
まず、図５の基準クロマトグラムを一般的なピーク検出法により、同定の対象となる６成分に対して、ピーク面積を取得し、総面積に対する面積比率を算出し、表７のように、同定の基本となる同定条件を決定した。簡易的に、溶出時間の早い順に、Ｐｅａｋ＿１からＰｅａｋ＿６とした。
【００３１】
【表７】
2018080981.tif 000008
表８〜１２に検量線作成用の標準試料１から５の計算結果および同定結果を示す。面積差比率は、基準クロマトグラムでの各成分の面積比率（標準ピーク面積比率）と、それぞれのピークの面積比率の差の割合を示している。
面積差比率＝絶対値（１−ピーク面積比率／標準ピーク面積比率）
つまり面積差比率が小さい成分が、基準のクロマトグラムの成分と類似性が高いと判断できる。ここでは、面積差比率が最も小さい成分を合致する成分と判定する。また、面積差比率が１．０に近いピークは、面積値が極端に小さいことを意味するため、面積差比率が０．５を超えるピークは同定対象でないと判断した（ｕｎｋｎｏｗｎ  表記）。
【００３２】
【表８】
2018080981.tif 000009
【００３３】
【表９】
2018080981.tif 000010
【００３４】
【表１０】
2018080981.tif 000011
【００３５】
【表１１】
2018080981.tif 000012
【００３６】
【表１２】
2018080981.tif 000013
以上のように、本発明の同定方法では、クロマトグラムで溶出時間が大きく変動する場合であっても、何の障害もなく確実に同定することができる。
【００３７】
（実施例２）
同定の基準となるクロマトグラムおよび標準試料１から５のクロマトグラムは、実施例１で使用したものを使用し、溶出時間と面積比率を組み合わせた同定法を行った。
【００３８】
図７に、基準クロマトグラム、標準試料１〜５のクロマトグラムおよび同定対象のピークの溶出時間許容幅を示す。図中の破線は各ピークの基準溶出時間、←→は溶出時間許容幅を示している。
【００３９】
まず、表１３のように、同定の基本となる同定条件を作成する。第一の判断基準となる溶出時間の許容幅を設定し、更に、第二の判断基準となる総面積に対する面積比率を算出する。同定の許容幅は、基準となるクロマトグラムの各ピークの溶出時間に対して±１４％と規定した。例としてＰｅａｋ＿１では、基準となる溶出時間２．３２７ｍｉｎ±２．３２７＊１４／１００の範囲に入るピークが「Ｐｅａｋ＿１」の候補として仮同定される。
【００４０】
【表１３】
2018080981.tif 000014
表１４〜１８に標準試料１から５の計算結果および同定結果を示す。なお、同定結果は溶出時間による第一の同定法で絞り込まれた成分から、面積比率による第二の同定法により決定した成分（最終同定結果）を記している。
【００４１】
【表１４】
2018080981.tif 000015
【００４２】
【表１５】
2018080981.tif 000016
【００４３】
【表１６】
2018080981.tif 000017
【００４４】
【表１７】
2018080981.tif 000018
【００４５】
【表１８】
2018080981.tif 000019
以上のように、実施例１と同様の結果が得られた。
【００４６】
（比較例）
従来の方法である溶出時間を基にした同定法を行った。  同定の許容幅は、基準となるクロマトグラムの各ピークの溶出時間に対して±２％と規定した。例としてＰｅａｋ＿１では、基準となる溶出時間２．３２７ｍｉｎ±２．３２７＊２／１００の範囲に入るピークが「Ｐｅａｋ＿１」として同定される。詳細は表１９に示すとおりである。
【００４７】
【表１９】
2018080981.tif 000020
表２０〜２４に標準試料１から５の同定結果を示す。
【００４８】
【表２０】
2018080981.tif 000021
【００４９】
【表２１】
2018080981.tif 000022
【００５０】
【表２２】
2018080981.tif 000023
【００５１】
【表２３】
2018080981.tif 000024
【００５２】
【表２４】
2018080981.tif 000025
このように、検量線作成時において、溶出時間に大きな変動がある場合、溶出時間を基にした従来の同定方法では確実な同定ができないことが分かる。
【符号の説明】
【００５３】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．紫外可視検出器
８．廃液
９．システム制御およびデータ処理装置
【図１】
2018080981.tif 000026
【図２】
2018080981.tif 000027
【図３】
2018080981.tif 000028
【図４】
2018080981.tif 000029
【図５】
2018080981.tif 000030
【図６】
2018080981.tif 000031
【図７】
2018080981.tif 000032
【図８】
2018080981.tif 000033