(57)【要約】【課題】リグノセルロースを基に多元ポリ乳酸を製造する多元ポリ乳酸製造方法を提供する。【解決手段】  リグノセルロースの熱水抽出物を含む培地で微生物を培養し多元ポリ乳酸を製造する方法である。また、熱水抽出物の水溶液の糖の糖濃度が１質量％のときの熱水抽出物の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下である。また、多元ポリ乳酸が、乳酸とヒドロキシ酪酸のコポリマーである。多元ポリ乳酸の乳酸分率が５％以上５０％未満である。また、熱水抽出物は、該熱水抽出物を酸で加水分解処理して得られる処理物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスの熱水抽出物を含む培地で微生物を培養し多元ポリ乳酸を製造する多元ポリ乳酸製造方法であって、
前記熱水抽出物の水溶液に含まれる糖の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下である
ことを特徴とする多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項２】
前記多元ポリ乳酸は、乳酸とヒドロキシ酪酸のコポリマーである
ことを特徴とする請求項１に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項３】
前記多元ポリ乳酸の乳酸分率が５〜５０％である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項４】
前記熱水抽出物は、前記バイオマスを熱水抽出して得られたろ液を酸加水分解処理して得られる
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項５】
前記熱水抽出物は、前記酸加水分解処理された粗単糖液を活性炭カラムに透過させた際の初期透過液、又は、前記粗単糖液を前記活性炭カラムに透過させた後に混床カラムに透過させた精製糖液である
ことを特徴とする請求項４に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項６】
前記微生物は、遺伝子組換え菌である
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項７】
前記微生物は、遺伝子組換え大腸菌である
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多元ポリ乳酸製造方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多元ポリ乳酸製造方法で製造された多元ポリ乳酸を含有する
ことを特徴とするバイオプラスチック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、バイオマスの熱水抽出物を含む培地で微生物を培養し多元ポリ乳酸を製造する多元ポリ乳酸製造方法及びバイオプラスチックに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生物由来のプラスチック（バイオプラスチック）として、生分解性のポリ乳酸（ＰＬＡ）等が実用化され、注目を集めている。
【０００３】
特許文献１を参照すると、セルロース及び/又はヘミセルロース由来のセロビオース、セロオリゴ糖類、キシロース、アラビノース、グルコースからなる群より選択されるいずれかを基質として含む環境で、Ｌ−乳酸を生産可能な乳酸菌、好ましくはエンテロコッカス・ムンヅティ、を培養し、Ｌ−乳酸を得る工程を含む、Ｌ−乳酸の生産方法の技術が開示されている。
特許文献１の技術は、乳酸菌を用いて、ペントースやセロオリゴ糖存在下で、高純度のＬ−乳酸を効率よく生産することができる。
【０００４】
一方、典型的なポリ乳酸は、ポリマーの結晶度が高く、不透明で脆いという特性があるため、用途が限られるという問題があった。
このため、ポリ乳酸を共重合したコポリマー（ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ）によって特性を改善する技術が開発されている。
非特許文献１を参照すると、乳酸とヒドロキシ酪酸のコポリマーである多元ポリ乳酸（Ｐ［（Ｒ）−ｌａｃｔａｔｅ−ｃｏ−（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ］［Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）］）を製造することが可能な微生物の一種として、遺伝子組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−１６５７１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｉａｎ  Ｓｕｎ、他６名、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ−ｃｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄ  Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｇａｒｓ」、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、日本、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ、２０１６年、ｖｏｌ８０、４号、ｐ．８１８−８２０
【非特許文献２】Ｎｄｕｋｏ  Ｊ．  Ｍ．他、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１４年、ｖｏｌ９８、ｐ．２４５３−２４６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の多元ポリ乳酸を製造する微生物は、リグノセルロース等のバイオマスの熱水抽出物を炭素源として用いた場合、ほとんど増殖せず、培養できなかった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の問題を解消することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、バイオマスの熱水抽出物を含む培地で微生物を培養し多元ポリ乳酸を製造する多元ポリ乳酸製造方法であって、前記熱水抽出物の水溶液に含まれる糖の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下であることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記多元ポリ乳酸は、乳酸とヒドロキシ酪酸のコポリマーであることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記多元ポリ乳酸の乳酸分率が５〜５０％であることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記熱水抽出物は、前記バイオマスを熱水抽出して得られたろ液を酸加水分解処理して得られることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記熱水抽出物は、前記酸加水分解処理された粗単糖液を活性炭カラムに透過させた際の初期透過液、又は、前記粗単糖液を前記活性炭カラムに透過させた後に混床カラムに透過させた精製糖液であることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記微生物は、遺伝子組換え菌であることを特徴とする。
本発明の多元ポリ乳酸製造方法は、前記微生物は、遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする。
本発明のバイオプラスチックは、前記多元ポリ乳酸製造方法で製造された多元ポリ乳酸を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、バイオマスの熱水抽出物の水溶液に含まれる糖の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下であるように構成することで、多元ポリ乳酸を合成する微生物を増殖させ、多元ポリ乳酸を高収率で取得可能となる多元ポリ乳酸製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜実施の形態＞
本発明者らは、非特許文献１に記載されたものと同様の多元ポリ乳酸を合成する遺伝子組換え大腸菌について、バイオマスとして利用が期待されるリグノセルロースの熱水抽出物を炭素源及び栄養源として培養できるか否かについて調べたところ、そのままでは殆ど増殖させることが不可能であった。このため、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、当該熱水抽出物を活性炭カラムで処理した特定の画分のもの、又は精製糖液を単一の栄養源として与えることで、この遺伝子組換え大腸菌を増殖させ、多元ポリ乳酸を製造可能となることを見いだした。そして、この熱水抽出物をカラム処理した特定の画分、又は精製糖液について、「糖の糖濃度が１質量％のときの熱水抽出物の水溶液の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下」であることにより、当業者に区別可能に特徴づけることを確定し、本発明を完成させるに至った。
以下で、本実施形態の多元ポリ乳酸製造方法の詳細について記載する。
【００１２】
（原料）
ここで、本実施形態で原料として用いるバイオマスとしては、五炭糖、六炭糖を構成糖として含むものであれば、木本類、草本類由来のいずれであっても、特に制限なく使用することができる。
より具体的に説明すると、本実施形態の木本類由来のバイオマスとしては、広葉樹、針葉樹の木部、樹皮、枝、葉等、林地残材、間伐材、廃材等のチップ又は樹皮、製材工場等から発生するおが屑、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられる。また、草本類由来のバイオマス原料としては、ケナフ、麻、バガス、イネ、稲藁、麦わら、コーンコブ等（農産廃棄物も含む）、油用作物やゴム用作物等の工芸作物の残渣及び廃棄物、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等のバイオマスを用いることも可能である。また、工芸作物の残渣及び廃棄物として、例えば、ＥＦＢ（Ｅｍｐｔｙ  Ｆｒｕｉｔ  Ｂｕｎｃｈ）等を用いることもできる。
本実施形態においては、これらのバイオマスの中で木本類由来のバイオマスを用いるのが好ましく、広葉樹、針葉樹の木部等のリグノセルロース系バイオマスを用いるのが特に好ましい。
【００１３】
本実施形態のバイオマスとして用いる木本類としては、広葉樹であっても、針葉樹であってもよい。
具体的に、本実施形態の広葉樹としては、例えば、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｇｒａｎｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐｅｌｌｉｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂｒａｓｓｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｔｅｎｓ等）、Ａｃａｃｉａ属（Ａｃａｃｉａ  ｍｅｌａｎｏｘｙｌｏｎ、Ａｃａｃｉａ  ｍａｎｇｉｕｍ、Ａｃａｃｉａ  ｍｅａｒｎｓｉｉ等）、Ａｃｅа属（Ａｃｅа  ｒｕｂｒｕｍ、Ａｃｅа  ｓａｃｃｈａｒｕｍ等）、Ｆａｇｕｓ属（Ｆａｇｕｓ  ｓｙｌｖаｔｉｃａ等）、Ｂｅｔｕｌａ属（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ、Ｂｅｔｕｌａ  ｐａｐｙｒｉｆｅｒａ等）、Ａｌｎｕｓ属（Ａｌｎｕｓ  ｉｎｃａｎａ等）が挙げられるものの、これらに限定されない。
【００１４】
また、具体的に、本実施形態の針葉樹としては、例えば、Ｌａｒｉｘ属（Ｌａｒｉｘ  ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｌａｒｉｘ  ｄｅｃｉｄｕａ、等）、Ｐｉｎｕｓ属（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｔｒｉｓ等）、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ等）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ等）、Ａｂｉｅｓ属（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅа等）、Ｔｓｕｇａ属（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ等）、Ｐｉｃｅа属（Ｐｉｃｅа  ａｂｉｓ、Ｐｉｃｅа  ｇｌａｕｃａ等）が挙げられるものの、これらに限定されない。
【００１５】
また、本実施形態においては、これらのバイオマスは、単独、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。
ここで、本実施形態におけるバイオマスが乾燥固形物又は水分を含んだ固形物であれば、水と混合させスラリー状態にした後に、後述する加熱加圧に用いる装置に供給することが好適である
【００１６】
また、本実施形態においては、木本類の木部や樹皮の部位、あるいは草本性植物の茎、枝葉等の部位を微細化処理した微細化物を用いることができる。微細化の方式は、リファイナー、ウィレーミル、ボールミル等による粉末化、破砕、爆砕等の手法を用いることができる。
【００１７】
〔熱水抽出物の構成〕
次に、以下において、本発明の実施の形態に係る多元ポリ乳酸製造方法の構成について説明する。
【００１８】
（液比）
本実施形態の加熱加圧装置による熱水抽出処理におけるバイオマスの乾燥重量に対する水の量（液比）は、１．０〜１０．０、好ましくは１．５〜５．０であることが好適である。液比が１．０より少ない場合には、水が不足して加水分解が十分に進まない上に、反応が不均一となるので適さない。また、液比が１０．０より高い場合には、所望の温度まで加熱するのに要する熱量が多くなるので適さない。
また、熱水処理における水の添加方法は、特に限定されない。たとえば、外部から水を添加してもよく、バイオマスに元々含まれる水を利用してもよい。また、加熱時に蒸気を使用する場合には、蒸気に含まれる水を利用してもよい。
【００１９】
（処理温度及び処理時間）
本実施形態の熱水抽出処理の処理温度は、加圧状態で１４０〜２００℃、好ましくは１６０〜１７０℃であることが好適である。ここで、１４０℃未満であると、十分な糖質濃度が得られない。また、２００℃を超えると、セルロースの加水分解やヘミセルロースの過分解等が起きるため、好ましくない。
また、本実施形態の熱水抽出処理の処理時間は、上述の温度での加圧状態で３０〜１２０分であることが好適である。ここで、３０分未満であると、十分な糖質濃度が得られない。また、１２０分以上を超えても、生成される糖質の濃度は殆ど変化しない。
【００２０】
（熱水抽出物の加工）
本実施形態の熱水抽出物を得るために、まず、加熱加圧処理により取得した熱水抽出物の原液を減圧濃縮する。この減圧濃縮は、下記で説明する酸加水分解に適した濃度、例えば、原液が１．５〜３０倍になる程度に濃縮することが好適である。
なお、この濃縮は、減圧濃縮以外の濃縮方式、例えば、膜による濃縮等の方式を用いてもよい。
【００２１】
次に、本実施形態の熱水抽出物を得るために、上述の濃縮液を酸の存在下で加水分解処理して、粗単糖液を得る。この酸加水分解処理は、当業者が用いる硫酸や塩酸等の一般的な酸を用いることが可能である。また、酸加水分解処理の酸としては、硝酸やリン酸等の無機酸や、トリフルオロ酢酸やギ酸等の有機酸を用いてもよい。また、この酸加水分解処理の反応時間、温度、圧力等は、セルロースやヘミセルロースが加水分解される当業者に知られている一般的な条件を用いることが可能である。たとえば、本実施形態の酸加水分解処理として、濃縮液に希硫酸を添加し、ｐＨを１．０程度に調整し、１２０℃程度で６０分間以上反応させ、中和後に沈殿を除去するといった処理であってもよい。
なお、本実施形態の粗単糖液は、セルラーゼやヘミセルラーゼ等の酵素による糖化された糖化液、亜臨界水による水熱糖化された水熱糖化液等であってもよい。
【００２２】
次に、本実施形態の熱水抽出物を得るために、上述の酸加水分解処理された粗単糖液をカラム等に通過させ、熱水抽出物の水溶液に含まれる糖の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下になるような状態に精製した溶液（以下、「透過液」という。）、又は精製糖液を取得する。
具体的には、本実施形態の透過液として、液層用の活性炭カラム等に上述の粗単糖液を通過させて得られた、糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下になるような溶液（糖化液）を取得する。たとえば、粗単糖液を活性炭カラムに通過させた際に初期にカラムから溶出される溶液の画分（以下、「初期透過液」という。）が糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度は、０．０４以下になる。この初期透過液では、フルフラール類等の有色成分が活性炭カラムに吸着されるため、初期透過液中（溶液中）には、フルフラール類等の有色成分が少ない量しか存在しない。また、この初期透過液は、例えば、後述する実施例の製造例１で製造した透過液１と同様の溶液であってもよい。
また、本実施形態の精製糖液として、上述の粗単糖液を活性炭カラムに透過させた後に、更にイオン交換膜等を混床カラムに透過させた糖液を取得してもよい。この混床カラムは、例えば、Ｈ型強酸性カチオン交換樹脂とＯＨ型強塩基性アニオン交換樹脂とを充填した一般的なイオン交換樹脂のカラムであってもよい。
なお、透過液又は精製糖液の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４よりも大きいと、透過液又は精製糖液に、本実施形態の多元ポリ乳酸の生産効率を低下させる成分が含まれているため好ましくない。
【００２３】
（ポリ乳酸の製造方法）
本実施形態の多元ポリ乳酸製造方法は、上述の熱水抽出物を含む培地で微生物を培養し多元ポリ乳酸を製造することを特徴とする。
また、本実施形態の多元ポリ乳酸製造方法は、この培養する微生物としては、遺伝子組換え菌であることを特徴とする。
この遺伝子組換え菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む各種乳酸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、その他の多元ポリ乳酸の製造に好適な真正細菌等を用いることが可能である。
また、本実施形態の多元ポリ乳酸製造方法においては、この微生物として、遺伝子組換え大腸菌を好適に用いることが可能である。この遺伝子組換え大腸菌としては、非特許文献１に記載された方式と同様に、メガスフェラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のプロピオニルＣｏＡ転移酵素遺伝子、ＳＴＱＫ変異のあるポリヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来β−ケトチオラーゼ遺伝子、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子を含むプラスミド（ファージミド）等により形質転換されたものであることが好適である。なお、ＳＴＱＫ変異のあるポリヒドロキシ酸合成酵素遺伝子については、人為的にランダムな変異を起こして特性の優れた酵素を選ぶ「酵素進化工学」手法等により、更に収率等が改良されたものを用いてもよい。また、形質転換する菌種等に合わせて、コドン等を最適化した遺伝子を合成したもので形質転換してもよい。
【００２４】
また、本実施形態の遺伝子組換え大腸菌は、当業者に一般的な方法で培養することが可能である。
具体的には、本実施形態の遺伝子組換え大腸菌は、例えば、上述の熱水抽出物を唯一の炭素源として、一般的な大腸菌培養用の培地を用いて、３７℃で好気的に１２〜９０時間培養することにより本実施形態の多元ポリ乳酸を菌体内に蓄積させ、回収することが可能である。なお、この培養時には、ＬＢ培地等の一般的な培地を用いることも可能である。また、培養時に、例えばアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等を窒素源として加えてもよい。また、培養時に、無機物として、例えばリン酸塩、硫酸塩、塩化ナトリウム等を加えてもよい。また、培養時に、プラスミド保持用に、培地中に、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加して培養してもよい。
また、本実施形態の遺伝子組換え大腸菌は、培養菌中に多元ポリ乳酸を蓄積させるため、回収した菌体から容易に多元ポリ乳酸を採取して製造することが可能である。この培養菌の菌体は、遠心分離して粉砕し、クロロホルム、メタノール等の一般的な溶媒で多元ポリマーを溶出させて取得してもよい。また、この溶出させた際に、ＰＴＦＥ膜等のフィルダーで残渣等を濾過させてもよい。このように、本実施形態のバイオマスの熱水抽出物を単一炭素源として、従来のポリ乳酸よりも特性を向上させた多元ポリ乳酸を製造することができる。
【００２５】
また、本実施形態のバイオプラスチックは、上述の多元ポリ乳酸製造方法で製造された多元ポリ乳酸を含有することを特徴とする。
また、この多元ポリ乳酸は、乳酸とヒドロキシ酪酸のコポリマーであることが好適である。
具体的には、本実施形態の多元ポリ乳酸は、重合反応でポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）のコポリマーであり、ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ−ｃｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）（以下、「Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）」と記載する。）である。
【００２６】
また、本実施形態の多元ポリ乳酸の乳酸分率は、５〜５０％であることが好適である。このような構成の多元ポリ乳酸を含有するバイオプラスチック（成形体）は柔らかく、伸びやすく、高強度となるため好適である。ここで、乳酸分率が５％未満であると製造されたバイオプラスチックが柔らかすぎるため、好ましくない。また、乳酸分率が５０％以上であると、ポリ乳酸の結晶化率が高すぎて弾性が低くなり、好ましくない。
また、本実施形態のバイオプラスチックは、各種プラスチック製品として、通常の生分解性のポリ乳酸で製造可能な用途に加え、一般的なプラスチック製品のようなフィルムや成形品を含む様々な用途に使用可能である。
また、本実施形態のバイオプラスチックは、医薬用途として、患者の体内に埋め込まれる徐放製剤や担体等（生分解と共に薬剤を放出する徐放製剤や担体等）として用いることも可能である。
【００２７】
〔本実施形態の主な効果〕
以上まとめると、上述のように構成することで以下のような効果を得ることができる。
従来、特許文献１に記載のポリ乳酸は「不透明で脆い」という特性があった。
しかしながら、これを改善した非特許文献１に記載の多元ポリ乳酸を産生する微生物は、リグノセルロース等のバイオマスを単一炭素源として培養することができなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る多元ポリ乳酸製造方法は、リグノセルロース等のバイオマスの熱水抽出物を、糖の糖濃度を１質量％とした際の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．０４以下であるように精製することで、この熱水抽出物を単一炭素源として、多元ポリ乳酸を産生する微生物を増殖させることが可能となる。これにより、特性が改善された多元ポリ乳酸を容易に製造することが可能となる。この製造された多元ポリ乳酸は、従来のポリ乳酸よりも様々な用途で使用することが可能となる。
また、本実施形態の多元ポリ乳酸は、木質バイオマスで製造可能なので、原料の入手も容易であり、安価に製造することも可能である。
【００２８】
なお、上述の実施の形態においては、多元ポリ乳酸を製造する多元ポリ乳酸製造方法における微生物の培養の炭素源として上述の熱水抽出物を用いる例について説明したものの、これに限られない。本実施形態の熱水抽出物は、バイオマス由来の良質な糖を多く含み、重金属等の有害物質を含まないため、各種医薬品原料、化粧品、香料、甘味料等の食品原料、菌や酵母等の発酵用の培地添加物、バイオエタノールや多元ポリ乳酸以外のバイオプラスチックの原料等として幅広く用いることが可能である。
【実施例】
【００２９】
次に、本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
【００３０】
＜製造例１＞
〔木材パルプ抽出液の調製〕
ユーカリ属のチップ（厚さ２ｍｍ）を絶乾質量で３００ｇ採取し、水道水１０リットルに一晩浸漬した。その後、チップを取り出して４００メッシュの篩に空け、濾別した後、この脱水後のチップを２．５リットル容量のオートクレーブに入れ、液比が３になるように水道水を加えた後、１６５℃で６０分間、熱水処理した。熱水処理後、オートクレーブの脱気コックから廃ガスを抜き出し、オートクレーブ内の圧力が０になったことを確認した後、処理後のチップを４００メッシュの篩に空け、チップとろ液に分離した。
【００３１】
ろ液には、キシロオリゴ糖０．６４質量％、キシロース０．１２質量％、ガラクトース０．１２質量％、Ｌ−アラビノース０．０５質量％、グルコース０．０２質量％、マンノース０．０１質量％が含まれていた。
このろ液を減圧下でエバポレーターにより２７倍に濃縮し、得られた濃縮液に硫酸を添加し酸性下で１２０℃加圧条件下において、６０分間、加水分解処理を行った。この加水分解処理した処理物に水酸化カルシウムを添加して中和した。処理物を含む液中に発生した沈澱をろ紙で除去して、粗単糖液を得た。粗単糖液に含まれる糖の組成を分析した。
また、着色の指標として粗単糖液に含まれる糖の糖濃度が１質量％のときの粗単糖液の水溶液の波長４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００３２】
〔糖液の精製〕
粗単糖液１００ｍｌを活性炭カラム（クラレケミカル製活性炭、吸着剤量１８０ｍｌ）に通過させて５つのフラクション（透過液１〜５）に分画した。透過液１〜５に含まれる糖の組成を分析した。また、透過液１〜５に含まれる糖の糖濃度が１質量％のときの透過液１〜５の波長４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００３３】
粗単糖液の組成及び吸光度、透過液１〜５の組成及び吸光度を、下記の表１に示す。
【００３４】
【表１】
2018074927.tif 000002
【００３５】
〔精製糖液の製造〕
粗単糖液１００ｍｌを活性炭カラム（クラレケミカル製活性炭、吸着剤量１８０ｍｌ）に通過させた。次に、活性炭を通過させた後の液体をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０Ｂカラム（同１８０ｍｌ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＥ５８３カラム（３６０ｍｌ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ２００ＣＴ  Ｎａ  とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ４１１を１：１で混合した混床カラム（１８０ｍｌ）に順次通過させた。混床カラムを通過した後の液（溶出液）の波長４２０ｎｍにおける吸光度が０．５になるまでの溶出液を回収し８００ｍｌの精製糖液を得た。
【００３６】
下記の表２に、精製糖液の組成を示す。
【００３７】
【表２】
2018074927.tif 000003
【００３８】
＜糖の定量分析＞
単糖の定量は、アジレント社製１１００シリーズＨＰＬＣを使用した。Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて定量分析した。溶離液として超純水を用い、ＩＲ検出器により検出した。
【００３９】
＜不純物の定量分析＞
ギ酸、酢酸、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラールは、アジレント社製１１００シリーズＨＰＬＣにより定量分析した。ＨＰＬＣはＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用し、溶離液として５ｍＭ硫酸を用い、２８０ｎｍの紫外吸収およびＩＲにより検出した。
【００４０】
〔多元ポリ乳酸生産菌の作成〕
非特許文献１に記載された方式と同様に、メガスフェラ・エルスデニＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、ＡＴＣＣ１７７５３）からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出後、非特許文献（Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０５巻、１７３２３−１７３２７（２００８））記載の方法に従ってプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（アクセッションＮｏ．Ｊ０４９８７）をコードする核酸をＰＣＲで増幅し、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）に挿入して、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含む、約４．７ｋｂｐの組み換えプラスミドＰＴＶ１１８Ｎ  Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴを調製した。
【００４１】
Ｔａｋａｓｅら（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第１３３巻、第１３９−１４５頁）に記載されている方法に従い、ポリヒドロキシ酸合成酵素のＳＴＱＫ変異（Ｓｅｒ３２５Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８１Ｌｙｓ二重変異）をコードするＤＮＡを全て含むプラスミドｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを調製した。
【００４２】
ｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢをＢａｍＨＩで消化して、約６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰを含む３ｍＭ  トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを３７℃で５分間作用させて、ＳＴＱＫをコードするＤＮＡ断片を得た。
【００４３】
ｐＴＶ１１８Ｎ  Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴをＰｓｔＩで消化し、上述のものと同条件でＴ４ポリメラーゼを作用させた後、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、ｐｈａＣｍをコードするＤＮＡ断片をライゲーションして、ｐＴＶ１１８Ｎ  Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴのＳａｌＩサイトにＳＴＱＫをコードするＤＮＡを導入した、約９．６ｋｂｐのプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを得た。大腸菌ＢＷ２５１１３株のコンピテントセルをｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを用いて形質転換し、Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）を生産する遺伝子をコードするプラスミド（ｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢ）を保持する遺伝子組換え大腸菌ＢＷ２５１１３株（以下、「遺伝子組換え大腸菌」という。）を作成した。使用したプラスミドｐＴＶ１１８ＮｐｃｔｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢは以下の遺伝子を含む。
【００４４】
ｐｃｔ：  Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ由来プロピオニルＣｏＡ転移酵素遺伝子
ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）  ：  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６１−３由来乳酸重合酵素遺伝子
ｐｈａＡ：  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来β−ケトチオラーゼ遺伝子
ｐｈａＢ：  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ
【００４５】
＜実施例１＞
〔ポリマーの生産〕
製造例１で製造した透過液１を用いて、糖の濃度が２質量％になるようにＬＢ培地を調製した。このＬＢ培地には、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍｌ、１０ｍＭパントテン酸カルシウムを添加し、培地の最終容量を１００ｍｌに調製後、オートクレーブで滅菌した。この培地に、上述の〔多元ポリ乳酸生産菌の作成〕で作成した遺伝子組換え大腸菌を、前培養液（３０℃、一晩培養）１ｍＬを加えて、３０℃で７２時間振盪培養した。
【００４６】
得られた培養液を遠心分離（１２０００×ｇ、５ｍｉｎ）により集菌後、得られた菌体を凍結乾燥した。また培養上清中の糖の濃度を測定し、加えた糖と残存した糖の差を加えた糖で除して、糖資化率を求めた。
【００４７】
乾燥菌体に５ｍｌのクロロホルムを添加し、１００℃で３時間撹拌した。このクロロホルム溶液を０．２２μｍ  ＰＴＦＥフィルターでろ過し、クロロホルム溶液に含まれる菌体を除去した。次に、クロロホルム溶液に１００ｍｌのメタノールを加え、ポリマーを沈澱させた。沈澱はＰＴＦＥ膜で濾別し、真空乾燥し、固形分（ポリマー）を得た。真空乾燥した固形分の成分を下記の方法で分析した。得られたポリマーを秤量し、ポリマーの生産量を求めた。結果を表３に示した
【００４８】
〔ポリマーの分析〕
得られたポリマー１２．５ｍｇを０．２５ｍｌのクロロホルムに溶解し、非特許文献２に記載の方法に従って、メチル化し、ＧＣ／ＭＳおよび1Ｈ−ＮＭＲ分析により、ポリマー中の乳酸と３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の構成比を算出した。1Ｈ−ＮＭＲはポリマーを重水素化クロロホルムに溶解してサンプルとし、３００ＭＨｚで1Ｈ−ＮＭＲを測定した。結果を表３に示した。
【００４９】
＜実施例２＞
実施例１において、透過液１の代わりに製造例１で製造した精製糖液を用いた以外は実施例１と同様の方法で試験した。
【００５０】
＜比較例１＞
実施例１で透過液１の代わりに、製造例１で製造した粗単糖液を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５１】
＜比較例２＞
実施例１で透過液１の代わりに、製造例１で製造した透過液２を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５２】
＜比較例３＞
実施例１で透過液１の代わりに、製造例１で製造した透過液３を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５３】
＜比較例４＞
実施例１で透過液１の代わりに、製造例１で製造した透過液４を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５４】
＜比較例５＞
実施例１で透過液１の代わりに、製造例１で製造した透過液５を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５５】
実施例１〜実施例２、比較例１〜比較例５のポリマーの生産、分析の結果を下記の表３に示す。
【００５６】
【表３】
2018074927.tif 000004
【００５７】
表３に示すように透過液１、精製糖液を含む培地で遺伝子組換え菌を培養した場合、乳酸と３−ヒドロキシ酪酸を含むポリマー（多元ポリマー）を効率的に製造できることが確認できた。
【００５８】
＜実施例３＞
〔ポリマーの特性試験〕
実施例１で得られたポリマーをクロロホルムに溶解し、流延法により成膜し、乾燥機で乾燥させてフィルムを得た。得られたフィルム１０ｍｇをパーキンエルマー社製  Ｐｙｒｉｓ１  ＤＳＣ  示差走査熱量計でガラス転位点、融点を測定した。
また、実施例１で得られたポリマーをクロロホルムに溶解し、ガラス製ペトリ皿に拡げて、室温で３週間エイジングを行った。引張強度試験は１０ｍｍ×５ｍｍのフィルムを用いて、テンシロン試験機（エー・アンド・デイ社製）により測定した。フィルムの引張強度、ヤング率、引張伸びをテンシロン試験機（エー・アンド・デイ社製）で測定した。
【００５９】
＜実施例４＞
実施例３において、実施例２で得られたポリマーを用いた以外は、実施例３と同様の方法で試験した。
【００６０】
上述の実施例３、実施例４の結果を下記の表４に示す。
【００６１】
【表４】
2018074927.tif 000005
【００６２】
表４に示すように、実施例３、４のフィルムは、柔らかく、延びやすく、高強度であった。
【００６３】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、リグノセルロースから、多元ポリ乳酸の原料となる熱水抽出物の提供が可能となることで、産業上利用することができる。