(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＰＶ１６に対する治療ワクチンとして使用可能なデザイナー核酸構築物およびポリペプチドの提供。【解決手段】ＨＰＶ１６腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７の本質的にすべての可能なＴ細胞エピトープを含むにもかかわらず、再整理されているＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む一方で、同時に望ましくないネオエピトープは最少数有することにより、野生型Ｅ６およびＥ７と比べてより著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有するポリペプチド。該ポリペプチドをコードする核酸分子。コードポリペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質、例えばＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２】
前記ポリペプチドがリーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリペプチドがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープをさらに含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または突然変異を有するＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号３または配列番号５を含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
コドン最適化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号２を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号４または配列番号６を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
組換えアデノウイルスである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが、リプレッサー・オペレーター配列に作動可能に結合され、リプレッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在下での前記プロモーターの発現を抑制するため、それに結合することができる、請求項９または１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物。
【請求項１３】
被験者におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記被験者に２回以上投与される、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
被験者における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんを治療するための、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
配列番号１を含むポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号３または配列番号５を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬の分野、またより特別にはヒトパピローマウイルス１６型に対する治療ワクチン中で使用可能な核酸構築物およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のファミリーは、皮膚または粘膜のケラチノサイトに感染することが可能な１００を超える型（サブタイプとも称される）からなる。ＨＰＶの４０を超える型が典型的には性交渉を介して感染し、男女双方において肛門性器領域のＨＰＶ感染は極めて一般的である。一部の性感染性ＨＰＶ型は、性器疣贅を引き起こし得る。「高リスク」ＨＰＶ型（例えば、１６、１８、３１、４５型）（皮膚疣贅を引き起こすものと異なる）を伴う持続性感染は、例えば、頸部、外陰部、腟、陰茎、中咽頭および肛門の前癌性病変および浸潤性がんに進行し得る。ＨＰＶ感染の大半は、感染後１〜２年以内に自発的に除去される。健常者では、ＨＰＶ−１６のウイルス初期タンパク質Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に特異的な循環性Ｔｈ１型およびＴｈ２型ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＥ６に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が抗原負荷時に皮膚に遊走し、これはＨＰＶ−１６感染に対する奏効的防御が一般にこれらのウイルス初期抗原に対する全身性エフェクターＴ細胞応答に関連することを示す。感染個体の少数派（約１％）では、ＨＰＶ感染は持続し、最終的に性器腫瘍性病変をもたらす。高リスクＨＰＶの中のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頸がんの主因であり、共に症例の約７０％を引き起こし、またこれら２つの型はまた、肛門がんおよび中咽頭がんなどの他のＨＰＶ誘発がんにおいて主要な役割を果たす。世界的に、ＨＰＶはがんを引き起こす最も重要な感染病原体の１つである。
【０００３】
ＨＰＶに対するワクチン接種は、ＨＰＶによる感染の発生率または効果を低下させることが可能な方法であると思われる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｅｌｉｅｆ，２０１１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２５２−２５７）。
【０００４】
ＨＰＶ１６型および１８型の（エンベロープ）タンパク質Ｌ１によって形成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく予防用ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８による持続性感染および関連疾患の予防において極めて効率的である。これらのワクチンは、Ｌ１タンパク質に対する中和抗体の誘導を介して無菌免疫をもたらすと考えられる。追加的な高リスクＨＰＶ型由来のＬ１に基づくＶＬＰの添加は、かかるワクチンによって与えられる幅広い保護をさらに増強する場合がある。
【０００５】
しかし、かかるワクチンが初期感染を予防し得る（すなわちそれらが予防をもたらす）一方、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８によって引き起こされる確立された性器病変に対する有益な効果の証拠が存在しないことから、それらはＨＰＶに対する治療ワクチンと考えられない（Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＪＡＭＡ  ２９８：７４３−５３）。
【０００６】
これらの予防ワクチンの導入にもかかわらず、多数の人々が、持続性の高リスクＨＰＶ感染を既に受けているかまたは受けるリスクがさらにあり、それ故、がんを患うリスクがある。確立されたＨＰＶ感染および関連疾患の根絶のための治療ワクチンは、未だ対処されていない緊急の医学的需要である。
【０００７】
この需要に対処するための幾つかの試みについては記載がなされている。例えば、種々の異なるワクチン接種方法、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）由来の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）およびＨＰＶ−１６  Ｅ７からなる融合タンパク質またはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８に由来するＥ６、Ｅ７およびＬ２からなる融合タンパク質、キメラＬ１−Ｅ７  ＶＬＰ、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７またはウシパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）Ｅ２のいずれかを発現する組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７のＣＴＬエピトープを発現するＤＮＡワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７抗原を分泌する弱毒化生リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）、ならびにＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７ペプチドを含む合成ロングペプチド（ＳＬＰ）を用いた臨床試験が実施されている。これらの手法の一部が限定はされないが幾つかの臨床有効性を示す一方、大部分が奏功しておらず、これは現行の方法の改善が必要であることを示している。
【０００８】
初期ＨＰＶタンパク質Ｅ６およびＥ７の組込みは、感染からがんに至る過程における必要なステップであり、子宮頸がん細胞の腫瘍性表現型の維持にとって、Ｅ６およびＥ７の持続的発現が必要とされる。したがって、Ｅ６およびＥ７は、治療ワクチン接種にとっての良好な標的と考えられる。前述のように、一部の試験によると、高リスクＨＰＶに感染した女性への治療ワクチン接種が既存の病変の退縮を誘導し得ることが示されている。Ｋｅｎｔｅｒらは、治療ワクチンとしてＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質に由来するＳＬＰおよびアジュバントを用いることで、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を有する患者の４７％における持続的かつ完全な退縮を示した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７）。同様に、タンパク質に基づくワクチン（ＴＡ−ＣＩＮ、ＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７およびＬ２の融合タンパク質からなる）をＶＩＮの２／３の患者における局所免疫調節と組み合わせた試験によると、患者の６３％において完全な退縮が示された（Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６）。ワクチンとしての合成ロングペプチドの考えられる欠点として、大規模での製造可能性およびそれに伴うコスト、潜在的に反応源性を示すアジュバントに対する需要およびそれに伴う免疫に関連した有害作用（特に疼痛および腫脹）が挙げられる。高レベルの不快感に起因し、自発的クリアランス速度が依然として高い場合、ＳＬＰが初期ステージの疾患において用いられる可能性は高くない。同様に、ＴＡ−ＣＩＮ治療の場合での局所的なイミキモド治療に対する需要に起因し、女性の大半がイミキモド治療の持続時間にかけて持続する局所性および全身性副作用を経験し、それが日々の活動に影響し得ることから、耐容性は重要な課題である。
【０００９】
考えられる代替案は、ワクチン接種用にＨＰＶ  Ｅ６および／またはＥ７タンパク質をコードするＤＮＡワクチンまたはウイルスワクチンなどの核酸に基づくワクチン接種を用いることである。
【００１０】
しかし、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、発がん可能性を有し、それ故にこれらのタンパク質をコードする核酸を含むワクチンを用いるワクチン接種は、抗原の持続的発現の可能性に起因して細胞形質転換を誘導するリスクを提起する。
【００１１】
したがって、遺伝子ワクチン接種の場合、ワクチン接種に起因する細胞形質転換の任意のリスクを排除するため、Ｅ６および／またはＥ７の非発がん性／解毒化バージョンを用いることができる。野生型Ｅ６およびＥ７の発がん可能性の低下は一般に、これらのタンパク質の機能にとって重要であることが知られている残基の欠失および／または置換によって達成可能である（例えば、Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４０；Ｗｉｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９：６６７−７４；国際公開第２００９／１０６３６２号パンフレット）。しかし、これらの手法の不利な点は、それらがタンパク質から重要なＴ細胞エピトープを除去し、かつ／または新規の望ましくないＴ細胞エピトープをタンパク質に導入するというリスクを有し、それ故、所望される免疫応答をもたらさない可能性があることである。
【００１２】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の発がん可能性を排除するための他の方法では、Ｅ６およびＥ７タンパク質の混合バージョン（すなわち、野生型タンパク質の断片が再整理された（ｒｅ−ｏｒｄｅｒｅｄ）ポリペプチド）が構築されている（例えば、Ｏｅｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ２３：１３０１−１２）。しかし、これらの手法の場合、Ｅ６およびＥ７タンパク質の双方の考えられるあらゆるエピトープの包含を確保するための複数分子の作製、配合および投与がさらに必要になり、最適以下のロジスティックスおよび比較的高いコストをもたらし、さらに記載された方法はＥ６およびＥ７中に存在しない潜在的に強力な非天然エピトープを導入し、また免疫応答が関連のあるＥ６／Ｅ７エピトープからかかる非天然エピトープの方へ転用され得ることから、記載された構築物は最適な免疫学的特性を有しない可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、当該技術分野では、ＨＰＶに対する治療ワクチン、好ましくは前述の手法が有する欠点がより少ないことへの需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ＨＰＶ１６腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７の本質的にすべての可能なＴ細胞エピトープを含むにもかかわらず、再整理されているＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む一方で、同時に望ましくないネオエピトープは最少数有することにより、（野生型Ｅ６およびＥ７と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。これは、他者によって先行的に提示された分子と対照をなす。
【００１５】
本発明は、配列番号１で示されるような配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１６】
コードポリペプチドは、リーダー配列をさらに含んでもよい。
【００１７】
特定の実施形態では、コードポリペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質、例えばＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。Ｅ２タンパク質は、ＤＮＡ結合性を低下させるため、例えばそのＤＮＡ結合ドメイン内での欠失または突然変異によって変異導入してもよい。特定の実施形態では、コードポリペプチドは、配列番号３または配列番号５で示されるような配列を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、本核酸配列は、例えばヒト細胞内での発現のため、コドン最適化される。
【００１９】
特定の実施形態では、本核酸配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で示されるような配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、本発明に従う核酸分子を含むベクターを提供し、ここでポリペプチドをコードする配列はプロモーターに作動可能に連結される。
【００２１】
特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどのＤＮＡベクターである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばＭＶＡベクターまたは組換えアデノウイルスベクターである。特定の好ましい実施形態では、ベクターは組換えアデノウイルスである。
【００２２】
特定の実施形態では、ベクター中のプロモーターは、リプレッサー・オペレーター配列に作動可能に結合され、リプレッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在下でのプロモーターの発現を抑制するため、それに結合することができる。特定の実施形態では、リプレッサー・オペレーター配列は、ＴｅｔＯ配列またはＣｕＯ配列である。
【００２３】
本発明はまた、本発明に従うベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、被験者におけるＨＰＶ、特にＨＰＶ１６に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に従うワクチン組成物を被験者に投与するステップを含む、方法を提供する。本発明はまた、ＨＰＶ、特にＨＰＶ１６に対する免疫応答を誘導する中での使用を意図した本発明に従うワクチンを提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、ワクチンは、被験者に２回以上投与される。
【００２６】
本発明はまた、被験者における持続性ＨＰＶ感染（特に持続性ＨＰＶ１６感染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんのいずれかを治療するための方法であって、本発明に従うワクチンを被験者に投与するステップを含む、方法を提供する。本発明はまた、被験者における持続性ＨＰＶ感染（特に持続性ＨＰＶ１６感染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんのいずれかの治療における使用を意図した本発明に従うワクチンを提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号５で示されるような配列を含むポリペプチドを提供する。
本発明はまた以下を提供する。
［１］  配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
［２］  前記コードポリペプチドがリーダー配列をさらに含む、［１］に記載の核酸分子。
［３］  前記コードポリペプチドがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープをさらに含む、［１］または［２］に記載の核酸分子。
［４］  前記コードポリペプチドが、ＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または突然変異を有するＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質を含む、［３］に記載の核酸分子。
［５］  前記コードポリペプチドが配列番号３または配列番号５を含む、［４］に記載の核酸分子。
［６］  コドン最適化される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［７］  配列番号２を含む、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［８］  配列番号４または配列番号６を含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の核酸分子。
［９］  前記ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
［１０］  組換えアデノウイルスである、［９］に記載のベクター。
［１１］  前記プロモーターが、リプレッサー・オペレーター配列に作動可能に結合され、リプレッサータンパク質は、前記リプレッサータンパク質の存在下での前記プロモーターの発現を抑制するため、それに結合することができる、［９］または［１０］に記載のベクター。
［１２］  ［９］〜［１１］のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物。
［１３］  被験者におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、［１２］に記載のワクチン組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
［１４］  ［１２］に記載のワクチンを前記被験者に２回以上投与するステップを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］  被験者における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）など）、中咽頭がん、陰茎がん、膣がんまたは肛門がんを治療するための方法であって、［１２］に記載のワクチンを前記被験者に投与するステップを含む、方法。
［１６］  配列番号１を含むポリペプチド。
［１７］  配列番号３または配列番号５を含む、［１６］に記載のポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質の発現。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、図の上部に示される導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターが一過性に遺伝子導入された。遺伝子導入の２４時間後、細胞は収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１６  Ｅ７に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された（上パネル）。ＮＦ−ｋＢを示すローディングコントロール（下パネル）により、全レーンにおいて細胞可溶化物の類似した負荷が確認される。分子量マーカーは左側に示される。融合タンパク質の予想サイズは、Ｅ６Ｅ７ＳＨが約３８ｋＤａ；Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ６Ｅ７Ｅ２ＳＨが約７５ｋＤａ、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨが約７８ｋＤａである。
【図２】軟寒天中のコロニー形成。Ａ）軟寒天アッセイの仕組みの略図。Ｂ）播種の６週後、寒天中の細胞の倍率４０倍での代表的な顕微鏡画像。白色矢印はＥ７ｗｔ遺伝子導入細胞内で認められるコロニーを強調する。Ｃ）Ｇｅｌｃｏｕｎｔ（商標）および関連ソフトウェアを用いた、寒天中、播種の６週後でのコロニーの定量化。＊：ｐ＜０．０５（ポアソン回帰モデル）；＊＊：非劣性（５％の非劣性マージンを伴う一般化線形モデル）。
【図３】Ｅ６Ｅ７ＳＨはＥ６およびＥ７活性を失っている。Ａ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ６野生型、Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて同時遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディングコントロール）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ７野生型、Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはｅｍｐｔｙベクターを発現するプラスミドと組み合わせて遺伝子導入された。非ＴＦは非遺伝子導入細胞を示す。遺伝子導入から２４時間後、細胞可溶化物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上に負荷された。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディングコントロール）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（分散分析モデル）；＊＊：非劣性（試験は分散分析モデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図４】Ｅ６Ｅ７ＳＨは一次ヒト上皮ケラチノサイトを不死化しない。一次ヒト上皮ケラチノサイトに、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７をコードするオープンリーディングフレーム（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、Ｅ６Ｅ７ＳＨ配列またはｅＧＦＰのいずれかをコードするレンチウイルスが形質導入された。非形質導入ドナー細胞は対照として用いられた。約２００日目、Ｅ６Ｅ７ｗｔの発現のみが、寿命延長およびｈＴＥＲＴ活性化によって示される通り、一次ケラチノサイトの不死化を誘導する（記載せず）。十字記号は、細胞が老化で死滅し、さらなる培養ができなかったことを示す。詳細については、実施例２を参照のこと。２つの追加的なドナーにおいて同様の結果が得られた（記載せず）。
【図５】ＤＮＡ免疫後、Ｅ６Ｅ７ＳＨによって誘導される免疫応答−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。Ａ．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤＮＡプラスミドまたは導入遺伝子を発現しないプラスミド（対照）で免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞がＥ７に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。Ｂ．個別のマウスにおけるＥ７に特異的な免疫応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定として、１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として与えられる。
【図６】Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）免疫スキーム。マウスが、指定通りの挿入物を有するアデノベクターで免疫された。２週後（Ｂ）および８週後（Ｃ）でのＥ７に特異的な応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析された（１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として表される）。黒丸は、１×１０１０個のｖｐの用量で免疫されたマウスを表し、白丸は５×１０９個のｖｐで免疫されたマウスを表す。黒棒は、応答の幾何平均を表す。点線は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける検出下限を示す。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析（ＡＮＯＶＡ  Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が対数変換データに対して実施された（＊：ｐ＜０．０５）。詳細については実施例３を参照のこと。
【図７】Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−Ｅ７四量体染色。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、指定通りの導入遺伝子を発現する１×１０１０ｖｐのアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞が、Ｅ７４９−５７−Ｈ２−Ｄｂ四量体と相互作用可能なＣＤ８＋細胞の存在について分析された。（Ｂ）Ｅ７四量体陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率がｙ軸上に示される。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施され、異なるＥ６Ｅ７ＳＨ変異体間の差異は統計学的に有意でなかった。
【図８】Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルＢおよびＣの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫の２週後、マウスは屠殺され、単離された脾細胞が、Ｅ２（Ｂ）、Ｅ６（記載せず）またはＥ７（Ｃ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞あたりのＳＦＵとして与えられる。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。Ｅ２単独をコードするアデノベクターによって誘導されるＥ２応答は、Ｅ６およびＥ７断片を含む本発明のポリペプチドによって誘導される応答よりも高い。Ｅ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨにおける差異は有意である（＊：ｐ＜０．０５）。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。
【図９】免疫マウスにおける持続的応答。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、変異体ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現する１×１０１０ｖｐのＡｄ３５ベクター、または導入遺伝子を発現しないアデノベクター（Ｅｍｔｐｙ）で免疫された。四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を測定するため、血液試料が２週毎に採取された。（Ｂ）免疫の２週後の免疫応答。リーダー配列を含むベクターは、リーダー配列を伴わないベクターよりも高い応答を誘導した。ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（＊：ｐ＜０．０５）。（Ｃ）応答の動態。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が２週目のデータセットの対数変換データに対して実施された。Ｅ２を含む分子によって誘導されるＥ７応答は、Ｅ２を含まない分子と比べてより高い傾向があるが、結果は統計学的に有意でなかった。
【図１０】免疫応答をブーストするための異なるアデノウイルスベクターの使用。（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクター（ＨＰＶ１６−Ｔｘ）または導入遺伝子を発現しないＡｄ２６ベクター（ｅｍｐｔｙ）で免疫された。２週後、免疫は、同図の下部に示されるようなＡｄ３５に基づくベクターを用いて反復された。２回目の免疫の４週後、マウスは屠殺され、四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を測定するため、血液試料が用いられた。（Ｂ）＊はＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｔｘ対Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．Ｅｍｐｔｙの比較を示す（ｐ＜０．０５）（多重比較におけるα＝０．０１を伴う対数変換データに対するスチューデントｔ検定）。
【図１１】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの細胞免疫原性。（Ａ）免疫スキーム。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）が０日目に免疫された、すなわち、筋肉内免疫（ｉ．ｍ）により、動物８匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを受け、対照動物２匹がＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙを受けた。ブースト免疫（Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ）が８週後に与えられた。１６週後、動物は同じＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５ベクターにより２回目のブースト免疫を受けた一方、対照動物はＡｄ３５．Ｅｍｐｔｙを受けた。アデノベクターの用量は１×１０１１ｖｐ／免疫であった。採血は数回の時点で実施された。（Ｂ）ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）の数が図示される。ｅｍｐｔｙ対照動物（ｎ＝２）は、検出可能な応答を全く示さなかった。詳細については、実施例４を参照のこと。
【図１２】ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターの治療効果。（Ａ）ＴＣ−１注射および免疫スキーム。０日目、ＣＢ６Ｆ１マウスに１×１０５個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知できた時、マウスが、５ｎｍｏｌのＯＤＮ１８２６−ＣｐＧ（Ｂ）またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（Ｃ）を添加した最終容量が２００μｌの０．９％生理食塩水中、１５０μｇでのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７免疫優勢エピトープ（すなわちＨＰＶ１６  Ｅ６、ａａ４１〜６５（ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ；配列番号１８）およびＨＰＶ１６  Ｅ７、ａａ４３〜７７（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ；配列番号１９））を網羅する２つのＳＬＰで免疫された。対照マウスは、ＣｐＧ単独（Ｄ）またはＡｄ２６．Ｅｍｐｔｙ（Ｅ）のいずれかを受けた。すべてのマウスが、２０日目にブースト免疫を受けた。プライム免疫においてＡｄ２６ベクターを受けたマウスが、その後、対応するＡｄ３５ベクターで免疫された。その他のマウスが、プライム免疫などの場合、ＣｐＧまたはＣｐＧ単独で免疫賦活されたＳＬＰを受けた。（Ｂ〜Ｅ）ＴＣ−１注射マウスにおける腫瘍測定。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスは屠殺された。マウス２匹は、（アスターリスクで表示される）２０％を超える体重減少が原因で屠殺されなければならなかった。（Ｆ〜Ｇ）最初の３５日間のパネルＢおよびＣのクローズアップ。（Ｈ）ＴＣ−１注射後の生存。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで治療されたマウスの生存は、ＳＬＰおよびＣｐＧで免疫されたマウスと比べて有意に増加した（ログランク検定ｐ＜０．０５）。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった（９２日目）。
【図１３】ＨＰＶ  ＡｇまたはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨのいずれかをコードする導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターは、導入遺伝子発現を抑制可能な細胞でウイルス収量の増加を示す。Ａ）Ａｄ３５ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−ＬｕｃまたはＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を保有するＡｄ３５ベクターによる感染を受けた。これらの導入遺伝子は、ＣｕＯまたはＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターのいずれかにより駆動された。ウイルス収量は、感染の４日後にＡｄ３５ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。Ｂ）Ａｄ２６ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする導入遺伝子を保有するＡｄ２６ベクターによる感染を受け、すべてがＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターにより駆動された。ウイルス収量は、感染の３日後にＡｄ２６ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。詳細については、実施例６を参照のこと。
【図１４】ベクター産生中での導入遺伝子発現を抑制するためのリプレッサー系の使用により、ＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子カセットの不安定性が阻止される。ＣＭＶＣｕＯの制御下でＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株のいずれかでのＤＮＡ遺伝子導入により救出された。得られたウイルスプラークは、５個／細胞株で採取され、各々の細胞株での継続的感染にわたって用いられた。Ａ）１０回のウイルス継代後のベクター・導入遺伝子カセット領域の完全性のＰＣＲによる分析。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代されたウイルス単離物から得られたＰＣＲ産物が各々、中間および右パネルに示される。ＰＥＲ．Ｃ６で継代されたウイルス単離物１、２、４、および５において得られた完全長と見られるＰＣＲ産物、ならびにＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代された単離物１〜５において認められたものが、サンガーＤＮＡ配列決定により分析された。クロマトグラムトレースの分析（記載せず）によると、ＰＥＲ．Ｃ６で増殖したすべての単離物（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖したものでない）が、ＨＰＶＡｇにおけるコード配列内に少しのフレームシフト欠失または中途での停止突然変異のいずれかを有することが示された。Ｂ）７回のウイルス継代後でのベクターがＨＰＶＡｇを発現する能力の分析。Ａ５４９細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖されたウイルス単離物により形質導入され、ＨＰＶＡｇの発現がＨＰＶ１６  Ｅ７特異抗体を用いるウエスタンブロットにより分析された。ＨＰＶＡｇにおいて予測されたサイズは８３ｋＤａである。詳細については、実施例６を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。ポリペプチドは、融合ポリペプチドであり、時として、本明細書中で本発明のポリペプチド、または本発明の融合ポリペプチドと称される。このポリペプチドは、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパク質に対する免疫応答をもたらすのに有用であり、故に核酸分子は、持続性ＨＰＶ１６感染、およびそれに伴う疾患を予防するための治療ワクチンとして用いることができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、再整理されて、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の（本質的に）すべてのＴ細胞エピトープが存在するように部分的に重複している断片の形態で、仮想的にはＨＰＶ１６の完全なＥ６およびＥ７アミノ酸配列を含む入念に設計された分子（それは天然ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質のＣ末端から１つのアミノ酸のみ欠如している）である。ＨＰＶワクチンとしての幾らかの可能性を有するより初期の分子は、他者によって記述されている（例えば、Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６；Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４０；Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６；欧州特許第１１８３３６８号明細書、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレット）が、これらの分子の各々は１つ以上の欠点を有する。本発明のデザイナーポリペプチド分子は、前述の手法に対して、少なくとも１つ、典型的には幾つかの態様において有利である。特に、本発明の分子および／またはベクターの利点として、（ｉ）それらが、核酸が（天然Ｅ６およびＥ７タンパク質と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有することから、所望される安全性特性を有すること；（ｉｉ）それらが、経済的に採算が合うように産業的規模で作製することが容易な単一の核酸分子であり、複数分子手法と異なりロジスティックな課題を提起しないこと；（ｉｉｉ）コードポリペプチドが天然ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の本質的にすべてのＴ細胞エピトープを含むこと；（ｉｖ）コードポリペプチドの設計により、望ましくない潜在的な強力なネオエピトープ（すなわち、天然Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープ）の導入が最少化されていること；および（ｖ）特定の実施形態では、それらが、所望される免疫応答をもたらすのに高度に反応源性のあるアジュバントに依存しないこと、が挙げられる。したがって、本発明の分子は、単一の設計で様々な有利な特性を組み合わせることからの主要なステップフォワードを表し、また主にＨＰＶ１６に対する治療ワクチン接種にとっての優れた候補である。これらの分子であれば、おそらくはＨＰＶ１６に対する予防ワクチンとしても作用することができ、これはそれらがワクチン接種した被験者でのＨＰＶ１６による持続性感染を予防する可能性が高いことを意味する。
【００３１】
特定の実施形態では、入念な設計により、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対する予測される結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長のネオエピトープの数はわずか１つに最少化された。単一のシャッフルされたＥ６タンパク質が３０を超えるかかるネオエピトープを既に有し、また構築物が、エピトープの欠如を阻止するためにこれらの構築物に付加された配列中にさらに幾つかのより多くのネオエピトープを含む可能性が高くなることから、これは他者によって記述された構築物をしのぐ有意な改善である（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３）。それ故、本発明の分子において改変される免疫応答の機会が天然Ｅ６およびＥ７と比べて最少化されていることから、本発明の構築物は、他者によって記述された手法と比べて有意に改善された免疫学的特性を有する。
【００３２】
当業者は、通常の技術を用いて、ポリペプチドが発現される予定である任意の特定の宿主生物でのコドン使用を反映するように記述されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないようにヌクレオチド置換を行うことができる。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化の方法は公知であり、先行的に記載がなされている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合、配列がコドン最適化されると考えられる。本明細書中で、好ましくないコドンは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも低頻度で用いられるコドンであり、より好ましいコドンは、生物において好ましくないコドンよりも高頻度で用いられるコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにて見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、例えば、１０％、４０％、６０％、８０％を超える好ましくないコドン、好ましくは、最大（例えば少なくとも９０％）もしくはすべての好ましくないコドンは、より好ましいコドンで置換される。好ましくは、生物において最も頻用されるコドンは、コドン最適化配列で用いられる。好ましいコドンによる置換は一般に、より高い発現をもたらす。
【００３４】
核酸配列は、通常の分子生物学技術を用いてクローン化され得るか、またはＤＮＡ合成により新規に作製され得、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野で事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による通常の方法を用いて実施され得る。
【００３５】
例えばアミノ酸の置換、欠失、付加などによって、例えば通常の分子生物学的方法を用いてタンパク質を改変することができることは当業者によって理解されるであろう。一般に、保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの機能または免疫原性の欠損を伴わない限り、適用してもよい。これは、当業者に周知の通常の方法に従って検討することができる。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明に従うコードポリペプチドは、シグナル配列またはシグナルペプチドとも称されるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かうことが運命づけられた新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（典型的には５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。かかる配列の存在は、発現および免疫原性の増強をもたらし得る。使用可能な非限定例として、ＩｇＥリーダーペプチド（例えば米国特許第６，７３３，９９４号明細書を参照；例えば配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号７）を有する）またはＨＡＶＴ２０リーダーペプチド（例えば配列ＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ（配列番号９）を有する）が挙げられる。これらの１つは、任意選択的に本発明のポリペプチドのＮ末端に付加することができる。他の実施形態では、本発明に従うポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００３７】
種々のＨＰＶ型が存在し（１２０を超える型が同定されており、番号により参照される）、一般にワクチンにより包含される必要がある各型に対しては型特異的抗原がワクチン中に組み込まれる必要があり得るが、特定の抗原に対しては幾つかの交差反応性が存在し得る。１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および８２型は、発がん性のある「高リスク」の性感染性ＨＰＶであり、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、および／または肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）の発症を引き起こし得る。本発明に従うＨＰＶ（すなわち、コードポリペプチド中のＥ６およびＥ７断片の由来元であるＨＰＶ）はＨＰＶ１６である。それはＨＰＶ１６に感染している被験者に対して用いることができる。それはまた、特定の実施形態では、他のＨＰＶ型に対するワクチンと好適に組み合わせてもよい。特定の実施形態では、この組み合わせは、同定された上記の高リスク型のＨＰＶに対するワクチン、例えばＨＰＶ１８に対するワクチンを伴う。他の実施形態では、本発明のワクチンは、ＨＰＶ−１８、−３１、−３３、−３５、−３９、−４５、−５１、−５２、−５６、−５８、−５９、−６８、−７３、または−８２の１つ以上に対するワクチンと組み合わされる。かかる組み合わせは、例えば、ＨＰＶ感染の正確な型がいまだ確定されない場合、または予防効果を伴う免疫応答が２つ以上のＨＰＶ型に対して所望される場合、用いることができる。本発明のワクチンと性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型、例えばＨＰＶ６および／またはＨＰＶ１１に対するワクチンとの組み合わせもまた想定される。これらのＨＰＶ型およびそれらによりコードされるタンパク質（例えば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ２）の配列は、公的データベース、例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されるジェンバンク配列データベースにて当業者が利用可能である。
【００３８】
本発明に従うポリペプチドは配列番号１を含み、また一実施形態では、本発明に従う核酸分子は配列番号２を含む。
【００３９】
本明細書中の配列は、当該技術分野における慣例として、５’から３’方向へ、またはＮからＣ末端へ提示される。
【００４０】
本発明に従うポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質のエピトープを含む。特定の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、かかるさらなる抗原の少なくとも１つのさらなる抗原またはエピトープをさらに含む（ひいては、ポリペプチドをコードする核酸はそれらをさらにコードする）。かかるさらなる抗原は、好ましくは、ＨＰＶ抗原、好ましくはポリペプチド中のＥ６およびＥ７タンパク質と同じＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６に属するものである。したがって、かかるさらなる抗原は、ＨＰＶタンパク質またはその免疫原性断片であり得、また特定の実施形態では、ＨＰＶの、好ましくはＨＰＶ１６由来のＥ２の少なくとも１つのエピトープを含むＥ２タンパク質またはその断片を含む。かかるさらなる抗原またはエピトープは、配列番号１を含むポリペプチド中のＥ６および／もしくはＥ７の２つの断片の間に内部的に配置され得るが、好ましくは配列番号１を含むＥ６／Ｅ７ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。その代わりまたはそれに加えて、免疫応答を刺激するアミノ酸配列が存在し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、配列番号１を含むポリペプチドをコードする本発明に従う核酸分子を提供し、ここでポリペプチドは、少なくとも１つの他の抗原、例えばＨＰＶ  Ｅ２タンパク質またはその少なくとも１つのエピトープ（好ましくはより多くのエピトープ）をさらに含む。本発明におけるＥ２抗原の付加の１つの利点は、Ｅ２が、感染の間／Ｅ６およびＥ７の発現がまだ極めて低い低グレードの病変において早期に発現されることが知られていることである。子宮頸がんの発生過程の間、Ｅ２の発現は低下し、その結果、Ｅ６およびＥ７レベルは上昇する（Ｙｕｇａｗａ  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，２００９，Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  １９：９７−１１３）。１つのワクチン中でＥ２、Ｅ６およびＥ７由来のエピトープを組み合わせることにより、持続性感染から浸潤性子宮頸がん（または他のＨＰＶ１６誘発性がん）に至る範囲を有する患者の広範な標的群における治療が可能になる。特定の実施形態では、Ｅ２タンパク質は野生型Ｅ２タンパク質である。特定の他の実施形態では、Ｅ２タンパク質は、（野生型Ｅ２タンパク質と比べて）そのＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または１つ以上の突然変異を有する。ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質（ＮＰ＿０４１３２８．１）の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）中に番号ＮＰ＿０４１３２８．１の下で見出すことができる。このタンパク質のＣ末端部分におけるＧ２９３Ｖ、Ｋ２９９Ｍ、またはＣ３００ＲなどのＥ２中の幾つかの単一のアミノ酸変化は、ＤＮＡ結合性を抑制することが知られている。ＤＮＡ結合能が欠如したＥ２の変異体または断片を用いる利点は、それが、予測不能な転写変化を、それが発現される細胞内での宿主細胞ＤＮＡへの直接的結合を介して阻止し得る点である。Ｅ２タンパク質またはその一部もしくは変異体は、内部的に付加され得るが、好ましくは配列番号１を有する本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号３を含むポリペプチドをコード��る。その一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号４を含む。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号５を含むポリペプチドをコードする。その一実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号６を含む。
【００４１】
本発明のデザイナーポリペプチドとさらなるタンパク質、例えばいわゆる担体タンパク質、例えば、カルレティキュリン、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）熱ショックタンパク質７０、ＩＰ１０、またはテタヌス毒素フラグメントＣとのさらなる融合を行うことも可能であり（さらなる例として、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１２（上記）を参照）、その場合、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７（および任意選択的にはＥ２）エピトープに対する免疫応答をさらに増強することができる。したがって、本発明はまた、かかるさらなる融合タンパク質、およびそれをコードする核酸を提供する。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明に従う核酸分子は、ベクター中に組み込まれる。「ベクター」は、本明細書で用いられるとき、典型的には、外来遺伝子材料を、それが複製および／または発現可能な別の細胞へ人工的に運ぶための媒体であり、本発明によると、本発明に従う核酸分子を組み込む任意の核酸分子であり得る。これらは、クローニングなどの通常の分子生物学技術に従って調製され得る。典型的には、かかるベクターは、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの好適な宿主の少なくとも１つのタイプにおいて増殖され得る。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。ベクター自体は一般に、挿入物（導入遺伝子；本発明では本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸）およびベクターの「骨格」として寄与する配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に移すベクターの目的は、典型的には、挿入物を標的細胞内で単離する、増殖させる、または発現させることである。好ましくは、ポリペプチドをコードする配列は、ベクター中のプロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、ベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内で）プロモーターに連結されることを意味するように意図されている。発現制御配列は、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、ベクターは、標的細胞内での導入遺伝子の発現を意図して設計され、一般に導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。特定の実施形態では、転写ターミネーター配列、ポリアデニル化テイル配列、コザック配列、ＵＴＲ、複製起点、複数のクローニング部位、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、およびさらなる配列などの通常用いられるベクター要素の１つ以上が存在してもよく、当業者は、ベクターを、例えば、ベクターの伝播および増殖用の特定の細胞内での複製のため、またベクターが導入される標的細胞内でのベクターの導入遺伝子の発現のため、所望される特性を有するように設計することができる。好ましくは哺乳動物細胞内での発現を意図して設計された、本発明に従う融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、本発明に従うワクチンとして好適である。特定の実施形態では、本発明に従うベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルスベクターなどである。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。真核生物細胞内での発現用の、幾つかの周知であり、多用されるプロモーターは、ウイルス、例えばアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）由来のプロモーター、例えばＥ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えばＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター（本明細書中でＣＭＶプロモーターと称される）（例えばｐｃＤＮＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０）由来のプロモーター（例えば、ｐＩＲＥＳ、カタログ番号６３１６０５、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）などを含む。好適なプロモーターはまた、真核生物細胞由来であり、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ユビキチンＣもしくはＵＢ６プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる（例えば国際公開第２００６／０４８４５９号パンフレットを参照）。真核生物細胞内での発現を得るのに適したプロモーターの非限定例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むもの、例えば配列番号１３で示されるような配列を有する、本明細書に提供されるようなＣＭＶプロモーター、が挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）が導入遺伝子の後に存在し得る。
【００４３】
さらに、制御配列もまた付加してもよい。用語「制御配列」は、本明細書中で「調節エレメント」と交換可能に用いられ、典型的にはＤＮＡに限定されないが、それが作動可能に連結される対象の核酸配列の転写を調節する核酸のセグメントを指し、それ故、転写修飾因子として作用する。制御配列は、転写結合ドメインであり、転写タンパク質および／または転写因子の核酸結合ドメイン、エンハンサーまたはリプレッサーなどによって認識される核酸配列を含むことが多い。例えば、リプレッサー配列をプロモーターに対して作動可能に結合させることは可能であり、そこでリプレッサー配列は、リプレッサータンパク質（このリプレッサータンパク質を発現する産生細胞株中での導入遺伝子の発現を低下または阻止し得る）によって結合され得る。これは、核酸分子の、継代時および／またはこれが産生細胞株中で大量に生成される時の遺伝的安定性および／または発現レベルを改善し得る。かかる系は、当該技術分野で記載がなされている。例えば、制御配列は、１つ以上のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得ることから、発現がテトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で阻害される。テトラサイクリンの不在下で、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合し、ｔｅｔＯ部位に作動可能に連結される遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テトラサイクリンの存在下で、ｔｅｔＲタンパク質における立体構造変化は、それがオペレーター配列に結合し、作動可能に連結された遺伝子の転写が生じることを阻止する。特定の実施形態では、本発明の、例えば組換えアデノウイルスベクター中に存在する場合の核酸分子は、任意選択的にプロモーターに作動可能に連結されたｔｅｔＯを含み得ることから、１つ以上の導入遺伝子の発現が、ｔｅｔＲタンパク質が発現されるプロデューサー細胞株中で産生される組換えアデノウイルス中で阻害される。その後、組換えアデノウイルスが被験者またはｔｅｔＲタンパク質を発現しない細胞に導入される場合、発現は阻害されないことになる（例えば、国際特許出願の国際公開第０７／０７３５１３号パンフレット）。特定の他の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば組換えアデノウイルス中に存在する場合、任意選択的にｃｕｍａｔｅ遺伝子スイッチ系を含み得、そこで発現の調節は、リプレッサー（ＣｙｍＲ）の、プロモーターの下流に配置されるオペレーター部位（ＣｕＯ）への結合によって媒介される（例えば、Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  ６：４３）。本明細書で用いられるとき、用語「リプレッサー」は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、遅延させ、および／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分子）を指す。例えば、例えば発現カセット内の発現ベクターに沿う適切な位置での結合部位との干渉によるものである。リプレッサーの例として、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、λリプレッサー、および当該技術分野で公知の他の適切なリプレッサーが挙げられる。ｔｅｔＯ／ｔｅｔＲオペレーター／リプレッサー系��よびＣｕＯ／ＣｙｍＲオペレーター／リプレッサー系の使用例が本明細書に提供される。ベクター伝播中のベクター・導入遺伝子発現の抑制により、導入遺伝子の不安定性が阻止され得、また本発明の導入遺伝子を有するベクターの生成中の収量が増加し得る。それ故、一部の実施形態では、本発明のベクターは、リプレッサータンパク質の結合によって、例えばリプレッサー・オペレーター配列（例えば非限定的な実施形態ではＴｅｔＯ含有配列、例えば配列番号１１で示されるもの、またはＣｕＯ含有配列、例えば配列番号１２で示されるもの）と作動可能に結合されるプロモーターを有することによって抑制可能なプロモーターを有し、リプレッサータンパク質（例えば、ＴｅｔＲタンパク質、例えば配列番号１５で示されるようなアミノ酸配列を有するもの、またはＣｙｍＲタンパク質、例えば配列番号１７で示されるようなアミノ酸配列を有するもの）がそれに結合し得る。
【００４４】
特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドＤＮＡ分子、またはその断片である。これらは、ＤＮＡワクチン接種用に用いることができる。他のプラットフォーム、例えば弱毒生二重欠失化リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株もまた、ベクターとしての使用が可能である。
【００４５】
他の実施形態では、ベクターは、組換えウイルスベクターであり、それは複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＤＮＡゲノムを含む。特定の実施形態では、本発明に従うベクターは、例えば、組換えアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、組換えレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、組換えポックスウイルス（ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、例えばワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（例えば、修飾ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ））、組換えアルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、例えばセムリキ森林ウイルス（ｓｅｍｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、組換えパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、例えば組換え麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、または別の組換えウイルスである。特定の実施形態では、本発明に従うベクターはＭＶＡベクターである。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明に従うベクターは、組換えアデノウイルスである。ワクチンとしての使用のためのアデノウイルスの利点は、報告されている極めて多数のアデノウイルスベクターを用いた研究、開発、製造および臨床試験における長年の経験に基づく、操作の容易性、大規模での良好な製造可能性、および優れた安全性の記録を含む。ワクチンとして用いられるアデノウイルスベクターは一般に、導入遺伝子にコードされたタンパク質に対する良好な免疫応答、例えば細胞免疫応答をもたらす。本発明に従うアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の型に基づく可能性があり、特定の実施形態ではヒトアデノウイルスであり、それは任意の血清型に属し得る。他の実施形態では、それはサルアデノウイルス、例えばチンパンジーまたはゴリラアデノウイルスであり、それらは任意の血清型に属し得る。特定の実施形態では、本発明に従うベクターは、ヒトアデノウイルス血清型５、２６または３５に属する。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、本発明に従うアデノウイルスベクターは、ウイルス複製にとって必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明に従うアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能および非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。
【００４７】
アデノウイルスベクター、その構築方法およびその伝播のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、および米国特許第６，１１３，９１３号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８（各々），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、ならびに本明細書中に記載の他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築は、標準の分子生物学技術、例として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、および本明細書中に記載の他の参考文献に記載のものの使用を含む。
【００４８】
組換えアデノウイルス用に特に好ましい血清型は、ヒト血清型３５またはヒト血清型２６である。ｒＡｄ２６ベクターの調製については、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製については、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、およびＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入番号ＡＣ＿００００１９および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６の中に見出される。
【００４９】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域内に欠失を有することから複製欠損である。当業者に公知であるように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域によってコードされる機能は、好ましくはプロデューサー細胞によりトランスで提供される必要がある、すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失される場合、これらはプロデューサー細胞内に、例えばそれらのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスはまた、複製にとって不要であるＥ３領域内に欠失を有してもよく、それ故、かかる欠失は補完される必要がない。
【００５０】
使用可能なプロデューサー細胞（時として当該技術分野や本明細書中で「パッケージング細胞」または「補完細胞」とも称される）は、所望されるアデノウイルスが伝播され得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの伝播は、アデノウイルス中での欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。かかるプロデューサー細胞は、好ましくはそのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有し、それにより、Ｅ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完する能力がある。任意のＥ１を補完するプロデューサー細胞、例えばＥ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：２１３−１９）、２９３などは用いることができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサー細胞内でのアデノウイルスベクターの作製は（Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：１６８１−７０３）中にレビューされている。
【００５１】
特定の実施形態では、Ｅ１欠損アデノウイルスは、Ａｄ５などのサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、かかるアデノウイルスのＡｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株、例えば２９３細胞もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞などにおける伝播を可能にする（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照、その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【００５２】
本発明のベクター中の「異種核酸」（本明細書中で「導入遺伝子」とも称される）は、ベクター中に天然に存在しない核酸であり、本発明によると、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター中に存在する場合、異種核酸と考えられる。それは、例えば標準の分子生物学技術によりベクター中に導入される。それは例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域内、またはＥ４領域とｒＩＴＲとの間の領域内にクローン化され得る。導入遺伝子は一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、アデノウイルスベクターのＥ１領域内にクローン化される。
【００５３】
ＤＮＡベクターなどのベクター、または組換えアデノウイルスベクターの生成は、当業者に周知の様々な方法に従って実施され得る。一般に、生成は、実質量のベクター材料を作製するための培養細胞内での増殖、その後の細胞培養液からのベクターの収集、また典型的にはその後の、他の物質を除去し、医薬組成物に配合され得る精製ベクターを得るためのベクターのさらなる精製を必要とする（例えば、Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２４５８−７５）。例えば、アデノウイルスをプロデューサー細胞の培養液から収集するための方法は、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに幅広く記載されている。例えば、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレット、および国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレット（双方とも参照により本明細書中に援用される）は、大量の組換えアデノウイルスを得て精製するのに適した方法を記載している。
【００５４】
特定の態様では、本発明はまた、本発明に従う核酸分子によってコードされるポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは配列番号１を含む。特定の実施形態では、かかるポリペプチドは、配列番号３または配列番号５を含んでもよい。かかるポリペプチドの特性は、上記の通りである。かかるポリペプチドは、例えばＨＰＶに対するワクチンとして直接的に用いることができる。
【００５５】
本発明はまた、本発明に従う核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを含むワクチンを提供し、これらの態様の各々における実施形態は、上記のものを含み得る。好ましい実施形態では、本発明に従うワクチンは、本発明に従う核酸分子を含む。さらなる好ましい実施形態では、ワクチンは、本発明に従うベクター、好ましくはＤＮＡベクター、ＭＶＡベクター、または組換えアデノウイルスベクターを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明に従うワクチンは、さらなる活性成分、例えば、ＨＰＶ１６と異なる少なくとも１つのＨＰＶ型、例えば高リスクＨＰＶ型、例えばＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、もしくはＨＰＶ８２のＥ６および／またはＥ７タンパク質の少なくとも１つのエピトープをコードする核酸を含む。
【００５７】
用語「ワクチン」は、特定の病原体または疾患に対して被験者における予防および／または治療度合いの免疫（この場合、ＨＰＶに対して治療的）を誘導するのに有効な活性成分を含有する薬剤または組成物を指す。ワクチンは、典型的には、本発明に従う核酸分子、またはベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含む。被験者への投与時、本発明に従う核酸分子によってコードされるポリペプチドは、被験者において発現されることになり、それによりポリペプチド中に存在するＥ６および／またはＥ７抗原断片に対する免疫応答をもたらすことになる。本分子の利点は、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の本質的にすべてのＴ細胞エピトープが存在することから、野生型Ｅ６またはＥ７中に存在する任意のエピトープに対するＴ細胞応答がワクチン中で開始され得ることである。さらに、本ワクチンは、本発明に従う核酸分子における、上で概説されるようなあらゆる安全性および有効性の利点を有する。
【００５８】
ヒトへの投与については、本発明では、ベクター、および薬学的に許容できる担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物を用いてもよい。この場合、用語「薬学的に許容できる」は、担体もしくは賦形剤が、用いられる用量および濃度で、任意の望ましくないかまたは有害な効果をそれが投与される被験者においてもたらさないことを意味する。かかる薬学的に許容できる賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。賦形剤は一般に、薬物の活性成分と配合される薬理学的に不活性な物質である。賦形剤は一般に、強力な活性成分を含有する製剤を増量するために用いられ（それ故、「増量剤」、「充填剤」または「希釈剤」と称されることが多い）、それにより剤形を生産する際での原薬の便宜的かつ正確な調剤を可能にする。賦形剤はまた、様々な治療増強の目的、例えば薬剤の吸収または溶解性を促進すること、または他の薬物動態学的考慮に寄与し得る。賦形剤はまた、製造過程において、想定される有効期間にわたる変性の阻止などのインビトロ安定性に寄与することに加えて、粉末流動性または非粘着性を促進することなどの関係する活性物質の取扱いに寄与する上で有用であり得る。適切な賦形剤の選択はまた、投与経路および剤形、ならびに活性成分および他の要素に依存する。
【００５９】
精製された核酸分子、ベクターまたはポリペプチドは、好ましくは、滅菌溶液として配合され、投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌濾過により、または本質的に当該技術分野で公知の他の方法により調製される。次に、溶液は、凍結乾燥されるかまたは医薬品の投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲内である。核酸分子またはベクターまたはポリペプチドは、典型的には、好適な緩衝液を有する溶液中に存在し、ベクターの溶液はまた、塩を含有してもよい。任意選択的には、安定化剤、例えばアルブミンが存在してもよい。特定の実施形態では、洗剤が添加される。特定の実施形態では、ワクチンは、注射用製剤に配合してもよい。これらの製剤は、核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを有効量含有し、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選択的には安定剤または賦形剤を含有する。
【００６０】
例えば、組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８）においても用いられる緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）中に貯蔵してもよい。ヒトへの投与に適した別の有用な調製用緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、スクロース１０％ｗ／ｖ、ポリソルベート８０  ０．０２％ｗ／ｖである。組換えアデノウイルスに適した別の調製用緩衝液は、１０〜２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．９〜６．２）、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０、および任意選択的には０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかに、多くの他の緩衝液を用いることができ、貯蔵や精製ベクターの医薬投与に適した製剤の数例が公知である。
【００６１】
特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含む。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増強することが当該技術分野で公知である。用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書中で交換可能に用いられ、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のベクター中の核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する免疫応答を増強するために用いられる。好適なアジュバントの例として、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムおよび／またはアルミニウムカリウムホスフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などのアルミニウム塩；油エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えばスクアレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物誘導体が挙げられ、その例として、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフを有するオリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌性毒素またはその突然変異体、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどが挙げられる。ベクターにコードされるアジュバントを、例えばＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー形成ドメインの目的の抗原への融合体をコードする異種核酸を用いることにより（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）、または目的の導入遺伝子およびＴＬＲ−３作動薬、例えば異種ｄｓＲＮＡ（例えば国際公開第２００７／１００９０８号パンフレット）の双方をコードするベクターなどを用いることにより、用いることも可能である。
【００６２】
他の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントを含まない。
【００６３】
医薬組成物は、被験者、例えばヒト被験者に投与してもよい。１回の投与中に被験者に提供されるワクチン活性成分の全用量は、熟練した施術者に公知であるように変動し得、アデノウイルスについては、一般に１×１０７個のウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐの間、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐの間、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐの間、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐの間である。ＤＮＡワクチンについては、１投与あたりのＤＮＡの総量は、例えば１μｇ〜１０ｍｇの間であってもよい。遺伝子銃が投与に用いられる場合、典型的には少量、例えば１０μｇが用いられる。筋肉内注射においては、典型的にはより多量、例えば最大５ｍｇが用いられる。
【００６４】
医薬組成物の投与は、標準の投与経路を用いて実施され得る。非限定的な実施形態として、例えば注射による非経口投与、例えば、皮内、筋肉内など、または皮下もしくは経皮、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口、腟内、直腸などが挙げられる。一実施形態では、組成物は、筋肉内注射により、例えば、腕の三角筋、または大腿の外側広筋に投与される。特定の実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンであり、例えばこれは、例えばＤＮＡタトゥーイング（例えば、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−５０を参照）により皮内投与され得る。この経路はまた、アデノウイルスベクターに使用可能である。特定の実施形態では、本発明に従う組成物は、アデノウイルスベクターを含み、筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対して免疫応答を誘導するため、組成物、例えばワクチンを投与するための様々な可能性を理解している。
【００６５】
本明細書で用いられる被験者は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、被験者はヒト被験者である。
【００６６】
本発明のワクチンは、例えば、（前）がん性病変、ならびに子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ；子宮頸部異形成および子宮頸部間質性腫瘍としても公知であり、潜在的には子宮頸部の表面上の扁平上皮細胞の前癌性形質転換および異常成長（異形成）である）から子宮頸がん（子宮頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）などまで（を含む）が形成される前のような（例えば、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験により検出されるような）偶発性および持続性ＨＰＶ感染からのＨＰＶ（特に１６型）によって引き起こされる疾患の様々なステージの１つを有する患者を治療するため、用いることができる。さらに、他のＨＰＶ誘発腫瘍、例えば外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、ならびに中咽頭がん（頭頚部がんとしても公知）、陰茎がん、膣がん、外陰部がんおよび肛門がんのより進行したステージは、標的化され得る。したがって、本発明のワクチンは、広範囲のＨＰＶ誘発性病変を標的にし得、またＨＰＶ誘発性疾患の前癌ステージ、例えば（持続性）感染および／または腫瘍ステージ（Ｅ２、Ｅ６および／もしくはＥ７の発現が最高である場合）では最も有効である可能性が高い。本発明のワクチンを用いる治療を、進行したがん細胞における免疫回避機構に対して相互作用するかまたは克服し得る化合物、例えば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体、イピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ２５抗体、ＩＤＯ阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＤ１３７アゴニスト抗体などと組み合わせることも可能である（例えば、Ｈａｍｉｄ  ａｎｄ  Ｃａｒｖａｊａｌ，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：８４７−８６１；Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  ４８０：４８０−８９）。治療ワクチン接種方法はまた、ワクチンが外部性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型のＥ６および／またはＥ７（をコードする配列）をさらに含み、かかるＨＰＶ型による感染を受けた被験者に投与される場合、原則として、外部性器疣贅またはその前駆病変を治療するため、用いることができる。
【００６７】
本明細書で用いられるとき、「治療する」は、患者におけるＨＰＶ１６  Ｅ６および／またはＥ７（のエピトープ）を発現する細胞に対する治療的免疫応答を誘導するためのワクチンの投与を意味し、それによりＨＰＶ１６感染のレベルの少なくとも低下および好ましくは完全な除去がもたらされ、その結果、腫瘍などのＨＰＶ１６誘発性疾患および／またはその症状の進行が少なくとも緩徐化し、好ましくは停止する。好ましくは、ワクチンによる治療もまた、より進行したステージのＨＰＶ誘発がんの寛解をもたらす。ワクチンを、分類されている確立されたＨＰＶ感染を有する患者に投与することが好ましいことから、対応するＨＰＶ型のポリペプチドをコードするワクチンが投与され得る。スクリーニングの不在下で、ワクチンはまた、ＨＰＶ感染の可能性が高い集団、すなわち性交好きな人々の一部において投与され得る。本発明のワクチンは、ＨＰＶ１６による感染を受けていない被験者に、例えば予防用途で、おそらくは患者が感染を受けていない、またはその他として非感染被験者において別のＨＰＶ型に対するワクチンと組み合わせて投与することも可能である。本発明のワクチンはまた、他の手段によるさらなる治療、例えば手術（ＨＰＶ１６感染によって引き起こされる病変の除去）、またはイミキモドによる治療（ＴＬＲ−７／８作動薬を含む、例えば、Ｄａｙａａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６を参照）に対する被験者である被験者に投与され得る。治療の効果は、細胞診またはＨＰＶ試験のいずれかにより測定され得る。
【００６８】
ワクチン接種は、本発明のワクチンを被験者または患者に少なくとも１回投与するステップを含む。１回以上のさらなるワクチンの１回以上のブースター投与を提供することも可能である。追加免疫ワクチン接種が実施される場合、典型的にはかかる追加免疫ワクチン接種は、同じ抗原を有する免疫原性組成物を初めて被験者に投与（「プライミングワクチン接種」と称されるような場合に相当）後、１週〜１年の間、好ましくは２週〜４か月の間の期間に同じ被験者に投与されることになる。他の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質をプライミングまたは追加免疫ワクチン接種として被験者に投与することも可能である。特定の実施形態では、本発明の同じ形態のワクチンは、例えば本発明に従う同じ組換えアデノウイルス（Ａｄ２６など）を用いたプライム−ブーストレジメンで同じ患者に少なくとも２回投与される。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、プライム−ブーストレジメンで少なくとも２回投与されるが、ワクチンのベクターは異なり、例えばアデノウイルスベクターの２つの異なる血清型が用いられ、例として、組換えＡｄ２６によるプライミングおよび組換えＡｄ３５による追加免疫、またはその逆；あるいはＤＮＡによるプライミングおよびアデノウイルスベクターによる追加免疫、またはその逆；あるいはアデノウイルスベクターによるプライミングおよびＭＶＡベクターによる追加免疫、またはその逆、が挙げられる。特定の実施形態では、本発明に従うワクチンは、プライム−ブースト−ブーストレジメンで少なくとも３回投与される。場合によって、さらなるブースター投与をレジメンに加えてもよい。
【００６９】
被験者においてＨＰＶ１６に対するＣＴＬ応答を誘導することも本発明の態様であり、本発明に従うワクチンを被験者に投与するステップを含む。
【００７０】
本発明はまた、以下の非限定的な実施形態、すなわち
１）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸；
２）ポリペプチドがＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形態１に記載の核酸；
３）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１６のＥ２タンパク質に由来する、実施形態２に記載の核酸；
４）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態２に記載の核酸；
５）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態２に記載の核酸；
６）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合されたＥ２タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態３に記載の核酸；
７）ポリペプチドが配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合されたＥ２タンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態３に記載の核酸；
８）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態２に記載の核酸；
９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態３に記載の核酸；
１０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態４に記載の核酸；
１１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態５に記載の核酸；
１２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態６に記載の核酸；
１３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態７に記載の核酸；
１４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１に記載の核酸を含むベクター；
１５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態２に記載の核酸を含むベクター；
１６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態３に記載の核酸を含むベクター；
１７）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態４に記載の核酸を含むベクター；
１８）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態５に記載の核酸を含むベクター；
１９）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態６に記載の核酸を含むベクター；
２０）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態７に記載の核酸を含むベクター；
２１）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態８に記載の核酸を含むベクター；
２２）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態９に記載の核酸を含むベクター；
２３）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１０に記載の核酸を含むベクター；
２４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１１に記載の核酸を含むベクター；
２５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１２に記載の核酸を含むベクター；
２６）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１３に記載の核酸を含むベクター；
２７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４に記載のベクター；
２８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１５に記載のベクター；
２９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１６に記載のベクター；
３０）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１７に記載のベクター；
３１）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１８に記載のベクター；
３２）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１９に記載のベクター；
３３）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２０に記載のベクター；
３４）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２１に記載のベクター；
３５）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２２に記載のベクター；
３６）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２３に記載のベクター；
３７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２４に記載のベクター；
３８）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２５に記載のベクター；
３９）ベクターがアデノウイルスである、実施形態２６に記載のベクター；
４０）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２７に記載のベクター；
４１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２８に記載のベクター；
４２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態２９に記載のベクター；
４３）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３０に記載のベクター；
４４）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３１に記載のベクター；
４５）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３２に記載のベクター；
４６）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３３に記載のベクター；
４７）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３４に記載のベクター；
４８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３５に記載のベクター；
４９）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３６に記載のベクター；
５０）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３７に記載のベクター；
５１）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３８に記載のベクター；
５２）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態３９に記載のベクター；
５３）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２８に記載のベクター；
５４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態２９に記載のベクター；
５５）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３０に記載のベクター；
５６）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３１に記載のベクター；
５７）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３２に記載のベクター；
５８）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３３に記載のベクター；
５９）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３４に記載のベクター；
６０）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３５に記載のベクター；
６１）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３６に記載のベクター；
６２）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３７に記載のベクター；
６３）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３８に記載のベクター；
６４）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態３９に記載のベクター；
６５）実施形態１４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
６６）実施形態１５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
６７）実施形態１６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
６８）実施形態１７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
６９）実施形態１８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７０）実施形態１９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７１）実施形態２０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７２）実施形態２１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７３）実施形態２２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７４）実施形態２３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７５）実施形態２４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７６）実施形態２５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７７）実施形態２６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７８）実施形態２７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
７９）実施形態２８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８０）実施形態２９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８１）実施形態３０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８２）実施形態３１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８３）実施形態３２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８４）実施形態３３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８５）実施形態３４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８６）実施形態３５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８７）実施形態３６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８８）実施形態３７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
８９）実施形態３８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９０）実施形態３９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９１）実施形態４０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９２）実施形態４１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９３）実施形態４２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９４）実施形態４３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９５）実施形態４４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９６）実施形態４５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９７）実施形態４６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９８）実施形態４７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
９９）実施形態４８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１００）実施形態４９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０１）実施形態５０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０２）実施形態５１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０３）実施形態５２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０４）実施形態５３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０５）実施形態５４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０６）実施形態５５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０７）実施形態５６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０８）実施形態５７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１０９）実施形態５８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１０）実施形態５９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１１）実施形態６０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１２）実施形態６１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１３）実施形態６２に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１４）実施形態６３に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１５）実施形態６４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１１６）被験者におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチン組成物を被験者に投与するステップを含む、方法；
１１７）持続性ＨＰＶ（１６型）感染を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、持続性ＨＰＶ感染を患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１１８）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＶＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１１９）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）外陰部がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２０）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＣＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２１）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）子宮頸がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２２）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）中咽頭がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２３）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＰＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２４）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）陰茎がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２５）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＶａＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２６）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）膣がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、膣がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２７）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、ＡＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２８）（根底にあるＨＰＶ１６型感染を伴う）肛門がんを治療するための方法であって、実施形態６５〜１１５のいずれか一つに記載のワクチンを、肛門がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１２９）配列番号１を含むポリペプチド；
１３０）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部をさらに含む、実施形態１２９に記載のポリペプチド；
１３１）ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＨＰＶ１６のＥ２タンパク質に由来する、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３２）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合される、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３３）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合される、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３４）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＮ末端側に融合される、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３５）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部が配列番号１を有するポリペプチドのＣ末端側に融合される、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３６）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３０に記載のポリペプチド；
１３７）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３１に記載のポリペプチド；
１３８）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３２に記載のポリペプチド；
１３９）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３３に記載のポリペプチド；
１４０）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３４に記載のポリペプチド；
１４１）Ｅ２タンパク質の少なくとも一部がＥ２のＤＮＡ結合性を抑制する突然変異を有するＥ２タンパク質の変異体を含む、実施形態１３５に記載のポリペプチド；
１４２）配列番号３に記載のポリペプチドをコードする、実施形態３に記載の核酸；
１４３）配列番号５に記載のポリペプチドをコードする、実施形態３に記載の核酸；
１４４）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１４２に記載の核酸をコードするベクター；
１４５）ポリペプチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結される、実施形態１４３に記載の核酸をコードするベクター；
１４６）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４４に記載のベクター；
１４７）ベクターがアデノウイルスである、実施形態１４５に記載のベクター；
１４８）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１４６に記載のベクター；
１４９）アデノウイルスが血清型２６のヒトアデノウイルスである、実施形態１４７に記載のベクター；
１５０）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１４６に記載のベクター；
１５１）アデノウイルスが血清型３５のヒトアデノウイルスである、実施形態１４７に記載のベクター；
１５２）実施形態１４４に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５３）実施形態１４５に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５４）実施形態１４６に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５５）実施形態１４７に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５６）実施形態１４８に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５７）実施形態１４９に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５８）実施形態１５０に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１５９）実施形態１５１に記載のベクター、および薬学的に許容できる賦形剤を含むワクチン組成物；
１６０）被験者におけるＨＰＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチン組成物を被験者に投与するステップを含む、方法；
１６１）外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６２）外陰部がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、外陰部がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６３）子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＣＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６４）子宮頸がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、子宮頸がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６５）中咽頭がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、中咽頭がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６６）陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＰＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６７）陰茎がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、陰茎がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６８）腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＶａＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１６９）膣がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、膣がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１７０）肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、ＡＩＮを患う被験者に投与するステップを含む、方法；
１７１）肛門がんを治療するための方法であって、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載のワクチンを、肛門がんを患う被験者に投与するステップを含む、方法
を提供する。
【００７１】
本発明の実施では、別段の指示がない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術が当該技術の範囲内で用いられることになる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ，１９８８を参照のこと。
【００７２】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例は、決して本発明を限定するものではない。実施例はあくまで本発明を明らかにするのに役立つ。
【実施例】
【００７３】
実施例１：本質的にすべてのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ＣＴＬエピトープを含むデザイナーポリペプチドの構築
発明者は、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の本質的にすべてのＣＴＬエピトープを有し、期待／予測される強力なネオエピトープ（ネオエピトープは野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープを意味する）を最少数有する新規な非腫瘍化ポリペプチド（およびそれをコードする核酸）を設計した。本発明のポリペプチド（本明細書中で「Ｅ６Ｅ７ＳＨ」とも称されるときがある）は、配列番号１で提供される配列を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸は、配列番号２で提供される。
【００７４】
本発明の分子は、複数分子が用いられる方法よりも作製上の利点を提供する単一分子である。さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７中に存在する本質的にすべての推定上のＣＴＬエピトープを含み、それと同時に、潜在的には免疫優勢であり得る期待／予測される強力なネオエピトープを最少数有し、それ故に免疫応答を関連のある野生型ＣＴＬエピトープから転用する。それ故、本発明の構築物は、あり得るＣＴＬエピトープがいずれか欠如し、かつ／またはより多いまたはより強力なネオエピトープを有する、他者によって記載された分子よりも免疫学的に好都合である。
【００７５】
例えば、配列番号１の構築物は、ＩＥＤＢウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００９−０９−０１Ｂ）での「ＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチド結合（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」における予測ツールの、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対するＡＮＮ（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ５０９−１２）およびＳＭＭ法（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９：１７６５−７２）ならびにＨＬＡ−Ｃに対するＮｅｔＭＨＣｐａｎ法（Ｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６１：１−１３）を用いた判定として、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ−Ａ＊３４：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３、ＨＬ−Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊１７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０３）に対する予測される結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長の１つのネオエピトープのみを有する。
【００７６】
ＩＥＤＢウェブサイトでのＳＭＭ予測ツールを用いての非限定例として、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６およびＯｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３により記載されるようなシャッフルされたＥ６およびＥ７配列は各々、コア部分において、２０の大部分のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対する９つの潜在的な強力な固有のネオエピトープ（ＡＮＮまたはＳＭＭ  ＩＣ５０＜５０ｎＭ）を有する。これはさらに、その手法で用いられる付録（ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ）を除外する（ここで付録は、付加的なネオエピトープにさらに寄与することになり、また「重複」の長さが制限されていることに起因してより多くの天然ＭＨＣＩＩエピトープに対する機会を逃す可能性がある）。当然ながら、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレットに記載された、報告としてシャッフルされたＥ６およびＥ７タンパク質を伴う変異体を有する改善された分子は、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対して予測されたＩＣ５０＜５０ｎＭ（ＡＮＮ、ＳＭＭもしくはＮｅｔＭＨＣＰａｎ）を伴う、９つのアミノ酸長を有する２２の固有のネオエピトープを有する。
【００７７】
したがって、本発明のデザイナー分子は、Ｅ６およびＥ７が機能性を除去するためにシャッフルされる場合の他の公表された手法と比べて極めて数が少なめの予測されるネオエピトープを有することにおいて明らかに好都合である。
【００７８】
発明者がこのように設計したＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子（すなわち、配列番号１で提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする核酸、すなわち配列番号２を含む核酸配列を合成し、５’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコザック配列ならびに３’部位上のＸｂａＩ部位によって隣接させた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙでのカスタム合成および標準分子クローニング）。
【００７９】
合成された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、細菌耐性マーカー（アンピシリン）および哺乳動物耐性マーカー（ネオマイシン）の双方を有する標準の発現ベクターｐＣＤＮＡ２００４．Ｎｅｏにクローン化し、例えば（一過性）遺伝子導入に基づく実験用に本発明の分子をコードするプラスミドベクターを得た。
【００８０】
これらの分子は、かかる以外にも、追加的な特徴を有するさらなる分子のための基盤としても用いることができた。非限定例として、幾つかのさらなる変異体を下記のように調製した。
【００８１】
ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質配列は他のＨＰＶ１６初期タンパク質の配列と組み合わせることで、持続性感染を有する個体を標的にし、免疫される個体における免疫レパートリーを広げることができる。Ｅ２に対する免疫応答は、ＨＰＶ１６感染のクリアランスにおいて重要な役割を果たすことが示唆されている（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：４７２−４７９）。Ｅ２のＥ６Ｅ７ＳＨへの融合は、持続性感染からＬＥＥＰ手術後の浸潤性がんまたは再発性／難治性疾患といったＨＰＶ関連がんの諸ステージに対する抗原を有するワクチン成分を供することになる。したがって、かかる実施形態の非限定例として、発明者は、Ｅ６Ｅ７ＳＨとそのＮ末端でのＥ２との融合タンパク質をコードする配列を調製した。Ｅ２配列内で、融合タンパク質を発現する細胞内での遺伝子発現に影響を与え得るＤＮＡ結合活性を抑制するための修飾を行うことができる。発明者は、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質の、位置２９３のグリシンを、位置２９９のリジンを、また位置３００のシステインを各々、バリン、メチオニンおよびアルギニンに突然変異させた。これらの自発的に生じる突然変異の各々は既に、Ｅ２のＥ２結合ドメインを有するＤＮＡ配列への結合を完全に抑制する（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１６）。
【００８２】
得られたポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称し、配列番号３を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化配列を調製し、それを配列番号４にて提供する。
【００８３】
発明者はまた、同じＥ２変異タンパク質が、配列番号５を含む、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨと称されるポリペプチドを生じさせる、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合ポリペプチドのＣ末端に融合した変異体を構築した。この構築物をコードする配列は、配列番号６として提供する。
【００８４】
対照を目的として、発明者はまた、融合タンパク質としての完全長ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７における野生型配列を有するポリペプチド（ａａ１〜１５８のＥ６がａａ１〜９８のＥ７に直接融合されたものであり、本明細書中でＥ６Ｅ７ｗｔと称される）をコードする配列を構築した。
【００８５】
発明者はまた、リーダー配列をポリペプチドに付加する効果について試験した。非限定例として、ＩｇＥリーダー配列（例えば、米国特許第６，７３３，９９４号明細書を参照）［リーダーペプチドの配列は配列番号７で提供される］をコードする配列を、構築物、例えばＬＳＥ６Ｅ７ｗｔを与えるＥ６Ｅ７ｗｔ構築物内、またＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを与えるＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ構築物内の一部のＮ末端に融合した。その効果は、免疫マウスにおけるＥ７四量体分析による測定によると、ＬＳ配列を有しない同じ抗原と比べて有意に（ｐ＜０．０５）増強された免疫原性であった（例えば図９中に見られる通りである）。
【００８６】
本発明のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドをコードする配列は、Ｅ２の有無にかかわらず、例えば、ＤＮＡ構築物から、ＲＮＡから、またはウイルスベクターから発現され得る。図１は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での上記のような導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターの一過性遺伝子導入時の発現を示す。遺伝子導入後、細胞を収集し、細胞抽出物を、ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する抗体を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。この実験は、発現ベクターの遺伝子導入時での適切なサイズの想定される融合タンパク質の発現を示す。
【００８７】
Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされた融合タンパク質の免疫原性を増強するための追加的配列の有無にかかわらず、いずれにしてもＥ６Ｅ７を発現させるには、アデノウイルスベクターを用いることができる。
【００８８】
上記のＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ｗｔ対照またはＨＰＶデザイナー配列をコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔにより、ヒト発現のために最適化され、合成された遺伝子であった。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）はＡＴＧ開始コドンの直前に含め、また２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）は各々のコード配列の終端に付加した。遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド中およびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミド中に挿入した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，２１３５−４３）。
【００８９】
すべてのアデノウイルスは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞内で単一の相同組換えにより作製し、前述のように生成した（ｒＡｄ３５について：Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；ｒＡｄ２６について：Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：４６５４−６３）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１７）は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９０】
簡潔に述べると、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供される使用説明書に従い、リポフェクタミンを用いて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にＡｄベクタープラスミドを遺伝子導入した。細胞は、十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した１日後に収集し、凍結解凍させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。ウイルスは、マルチウェル２４組織培養プレートの単一のウェル内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でプラーク精製し、増幅した。Ｔ２５組織培養フラスコ内と、その後のＴ１７５組織培養フラスコ内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でさらなる増幅を実施した。Ｔ１７５フラスコの後に得られた細胞から調製したクルードライセートからの３〜５ｍｌをＰＥＲ．Ｃ６細胞の７０％のコンフルエント層を有する２４×Ｔ１０００の５層の組織培養フラスコに接種するのに用いた。２ステップのＣｓＣｌ精製法を用いてウイルスを精製した。最後に、ウイルスを−８５℃でアリコート中に貯蔵した。
【００９１】
Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の融合タンパク質（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、ならびに上記のようなデザイナー融合タンパク質変異体（Ｅ６Ｅ７ＳＨ、配列番号１で提供されるアミノ酸配列を有する）の各々の発現のための、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。組み合わされたＥ６およびＥ７配列は、Ｅ１、Ｅ３が欠失したアデノウイルスゲノムのＥ１領域内のＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、組換えアデノウイルス血清型２６に基づく等価なベクターである。
【００９２】
同様に、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号３）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５に基づく組換えアデノウイルスベクターを生成した。同様に、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ（配列番号５）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５を生成した。また、Ｎ末端にＩｇＥリーダー配列を有するＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質をコードするＡｄ３５ベクターを生成し、Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称した。また、Ｎ末端でのＩｇＥリーダー配列に融合されたＥ６Ｅ７ｗｔを有する対照アデノウイルスを生成した。
【００９３】
組換えアデノウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で生成し、塩化セシウム勾配での遠心分離により精製した。
【００９４】
リプレッサー系に結合させた本発明の構築物のさらなる例を、下の後述する実施例で提供する。
【００９５】
実施例２．デザイナー構築物の形質転換活性の欠損
野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、特定のアッセイにおける形質転換活性（例えば軟寒天アッセイにおけるコロニー形成）として明白な腫瘍化の可能性を有する（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。実施例１に記載のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドは、再整理された様式でのＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む。これは、例えばかかるアッセイにおける野生型Ｅ６およびＥ７タンパク質のいずれかと比べて有意に低下した形質転換活性により測定可能である通り、腫瘍化の可能性を排除することが期待される。
【００９６】
他者がＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の遺伝子シャッフルされた変異体が当然ながらその発がん可能性を失っていることを報告したが（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−６６）、これは遺伝子シャフリングによりＥ６およびＥ７タンパク質の野生型機能が破壊されることを示している。
【００９７】
腫瘍化特性の欠如を評価するため、発明者は、我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物が（例えば、Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５で記載の通り）ＮＩＨ３Ｔ３細胞上の軟寒天中での増殖能を与える能力を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への野生型ＨＰＶ１６  Ｅ７を発現するプラスミドの遺伝子導入の結果、一貫してコロニー形成が生じた。これらのアッセイでは、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６単独の発現により、バックグラウンドを超えたコロニー形成が生じなかった。これは、このアッセイではＥ７ｗｔがＥ６ｗｔよりもはるかに効率的であるという公表された観察結果と一致している（Ｓｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４８６０−６６）。我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物の遺伝子導入は、４つの独立実験では軟寒天中での細胞のコロニーの増殖をもたらさず（図２）、これは本発明のポリペプチドＥ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸がＥ７に関連した形質転換能力を失っていることを示した。
【００９８】
Ｅ６およびＥ７の腫瘍化の可能性は、細胞タンパク質ｐ５３およびｐＲｂのレベルを各々低下させるそれらの能力に関連している。本発明のポリペプチドＥ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸の構築物が分子レベルで野生型Ｅ６およびＥ７に関連した生物学的活性を有しないことを示すため、ｐ５３およびｐＲｂ分解アッセイを実施した。つまり、ＨＰＶ１６  Ｅ６ｗｔおよび我々のＥ６Ｅ７ＳＨ構築物を、ｐ５３分解アッセイにおいて、内因性ｐ５３が欠如したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞内で発現させた。ｐＲｂ分解アッセイにおいては、ＨＰＶ１６  Ｅ７ｗｔおよびＥ６Ｅ７ＳＨ構築物をｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞内で発現させた。図３で分かるように、ｐ５３と（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ６ｗｔとの同時発現は、ｐ５３レベルの低下をもたらす（パネルＡおよびＢ）。同様に、パネル３Ｃおよび３Ｄは、ｐＲｂと（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ７ｗｔとの同時発現がｐＲＢレベルの低下をもたらすことを示す。これらのデータは、本発明のポリペプチドをコードする核酸が軟寒天中でコロニー形成能を全く有することなく、また野生型Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの主な生物学的活性、すなわちｐ５３およびｐＲｂの各々の不活化を有しないことを示している。
【００９９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸構築物の安全性をさらに実証するため、発明者は、ＨＰＶ媒介性形質転換に対する天然標的細胞である一次ヒト包皮ケラチノサイトを用いた。一次ヒトケラチノサイトの不死化は、Ｅ６およびＥ７野生型双方の作用を必要とする（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−２１）。このアッセイは、おそらくは我々の構築物の安全性を実証するための生理学的に最も関連性のあるインビトロアッセイである（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。ＨＰＶ１６由来の野生型Ｅ６およびＥ７（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）を発現するレンチウイルスを形質導入した細胞は、それらの寿命の非形質導入対照細胞と比べての延長（図４）およびテロメラーゼの触媒サブユニットであるｈＴＥＲＴの活性化（データは示さず）によって示されるように、一次ケラチノサイトにおける不死化を誘導する。本発明のポリペプチド（Ｅ６Ｅ７ＳＨ）の発現では、ＧＦＰが形質導入されたケラチノサイトまたは形質導入されないケラチノサイトと比べて寿命を延ばすことができない。同様の結果が、２つの追加的な独立ドナーにおいて得られた（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、我々の構築物が、高度に生理学的なモデルと考えられる、一次ヒトケラチノサイトにおける不死化を誘導する能力を失っていることを示す。
【０１００】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の断片が別の順序で組み換えられた別の構築物もまた、一次ヒト包皮ケラチノサイトを不死化することができなかった。しかし、最大で約１２０〜１５０日の寿命の延長がその構築物において認められた。これは、この分野では一部予測不能であることを示し、この安全性に関連した態様における本発明に従うデザイナー分子の優位性を示している。
【０１０１】
本実施例における実験は、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸の形質転換活性の欠如と、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ｗｔ構築物よりも著しく改善された安全性に関する強力な証拠を同時に提供する。
【０１０２】
実施例３．Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナー構築物に対する免疫応答
発明者は、実施例１に記載のようなＤＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを調製している。
【０１０３】
発明者は、マウスが野生型Ｅ２、またはＥ６もしくはＥ７をコードするＤＮＡプラスミドで免疫され、またＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７抗原による免疫により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスよりも広範な細胞免疫応答がＣＢ６Ｆ１で誘導される場合の初期実験に基づき、免疫応答を測定するのにＣＢ６Ｆ１マウス株を用いた。別々の実験において、マウスを本発明の分子をコードするＤＮＡベクターで免疫し、細胞免疫応答を測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的な免疫応答は、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤＮＡプラスミドで免疫したマウスにおいて測定することができた（図５）。
【０１０４】
本実施例中に示す以下のデータは、アデノウイルスベクターを用いて実施したマウス実験から得られる。
【０１０５】
ワクチンに誘導される免疫原性を評価するため、ＣＢ６Ｆ１マウスを、Ｅ６Ｅ７ｗｔ、ＬＳＥ６Ｅ７ｗｔ、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５）または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）で免疫した。マウスへの投与について、５×１０９個のウイルス粒子（ｖｐ）および１×１０１０個のｖｐの２つの用量を試験した。免疫の２週後および８週後、マウスを屠殺し、単離した脾細胞をＨＰＶ１６  Ｅ７の１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激した。２週後および８週後のＥ７に特異的な応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。データは図６に示す。
【０１０６】
これは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析による測定によると、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨによる免疫がＥ７に特異的な免疫応答を誘導することを示す。さらに、図６での結果は、Ｎ末端リーダー配列を導入遺伝子に付加することにより、アデノウイルスの発現される導入遺伝子に対する免疫応答を増強する可能性を示す。
【０１０７】
次に、免疫原性に関してＥ２をＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドに付加する効果を試験した。Ａｄ３５ベクターは、Ｎ末端（Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ）またはＣ末端（Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ）のいずれかに融合されたＥ２を有するポリペプチドをコードした。ＣＢ６Ｆ１マウスを、１×１０１０個のｖｐの用量で免疫した。図７（Ｅ７四量体染色）および図８（パネルＣ、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ）は、Ｅ７に対する免疫応答を示し、免疫応答はＥ２を含むデザイナー構築物については、Ｅ２を含まない構築物と比べてより高い傾向があるが、差異は統計学的に有意でなかった。Ｅ２に対する応答は、Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナーポリペプチドに融合されたＥ２を有するアデノウイルスベクターに対する応答と比べて、Ｅ２のみをコードするアデノウイルスベクターの場合がより高く（図８Ｂ）、差異はＥ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨの双方において有意であった（Ｐ値：＜０．０５）。
【０１０８】
Ｅ２をさらに含むデザイナー構築物がＥ７に対する免疫応答をさらにもたらし、加えてＥ２に対する免疫応答ももたらし得ることで、Ｅ２を含まない構築物よりも免疫応答の幅が増加すると結論づけられる。
【０１０９】
リーダー配列の付加は、野生型Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質のＮ末端に融合されるとき、より高いＥ７に特異的な応答をもたらすことが示された（図６Ｃ）。同様に、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質の免疫原性に対するリーダー配列の効果を判定した。したがって、Ｎ末端Ｅ２の有無にかかわらないデザイナーポリペプチドをコードするＡｄ３５ベクターおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＡｄ３５ベクターをマウスの免疫のために用い、Ｅ７に特異的な免疫応答を測定するため、血液試料を２週間隔で採取した（図９）。図７および８に示されるように、Ｅ６Ｅ７ＳＨに融合されたＮ末端もしくはＣ末端のいずれかでのＥ２の存在は、免疫応答を増強する傾向が高かった。ＩｇＥリーダー配列の付加により、Ｅ７に特異的な応答がさらに増強された（図９Ｂ）。本発明に従うデザイナー分子をコードする３つすべてのアデノウイルスベクターにおいて、経時的に持続的な免疫応答が認められ、また免疫後の最高の応答が実験の持続時間にわたっての最高の応答に対応した。
【０１１０】
Ｎ末端Ｅ２をさらに含むデザイナー構築物によって誘導される応答が、コード化タンパク質を特定の細胞区画に標的化する特定の配列、例えばＩｇＥリーダー配列の付加により増強され得ると結論づけられる。
【０１１１】
本発明のペプチドに対する細胞免疫応答は、異なるタイプのアデノウイルスベクターを用いて誘導され得る。先行実験では、発明者は、Ａｄ３５ベクターを用いた一方、図１０の実験では、マウスを、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６アデノウイルスベクターで免疫した。データは、Ａｄ２６に基づくワクチンによる免疫がまた、Ｅ７に特異的なＴ細胞を誘導したことを示す。さらに、その結果によると、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５アデノウイルスベクターでの２回目の免疫が細胞免疫応答をさらにブーストしたことが示される（図１０）。
【０１１２】
実施例４．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるデザイナー構築物の免疫原性
本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターが非ヒト霊長類における免疫応答を誘導する能力を評価するため、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ２６）または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（Ｅｍｐｔｙ）を１×１０１１ｖｐの用量で筋肉内注射することにより、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。免疫の８週後、同じ抗原を発現するＡｄ２６ベクターによる免疫により免疫応答をブーストした。１６週後、動物は、同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターのもう１回の注射を受けた。血液試料は数回の時点で採取し、単離した白血球をＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６もしくはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激した。特異的応答をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図１１に示す。さらにプライム免疫の１０週後および１８週後、本発明における新規な接合に及ぶペプチドに特異的な細胞免疫応答を評価した。ＩＦＮγ応答の誘導は、すべての動物において＜５０ＳＦＵ／１×１０６ＰＢＭＣの検出限界未満であった（データは示さず）。
【０１１３】
データは、Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでの非ヒト霊長類の免疫により、新規な接合に対してではない、コードされた導入遺伝子中に存在する３つすべてのＨＰＶ１６タンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨによる追加的免疫により応答がブーストされ得、また対応するＡｄ３５ベクターによる１６週後の追加的ブーストにより、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に特異的な免疫応答がさらに増強された。
【０１１４】
Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの７２週後の遅いブースター投与により、ＨＰＶ１６細胞免疫応答の増強が再び生じ、数週間後に低下した（記載せず）。
【０１１５】
別の実験（記載せず）では、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を、２つのアデノウイルスベクター（一方がＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現し、他方がＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を発現する）の組み合わせの腟内投与により免疫した。Ｅ６およびＥ７の双方に対する低いものの測定可能な細胞応答を、末梢単核血液細胞内で測定した。これらの実験では、Ｌ１に対する強力な細胞免疫応答を検出した。
【０１１６】
実施例５．マウス腫瘍モデルにおける治療効果
本発明のポリペプチドは、動物においてＨＰＶ１６に特異的な細胞免疫応答を誘導することができ、ＨＰＶ１６  Ｅ６および／またはＥ７を発現する細胞に対して治療効果を発揮し得る。治療的免疫、すなわち腫瘍増殖が開始してからの免疫は、治療用ＨＰＶワクチン候補の有効性を実証するのに用いることができる。Ａｄ２６およびＡｄ３５ベクターの治療効果を、ＴＣ−１細胞が注射されたマウス（ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を発現するマウス細胞）において試験した（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：２１−６）。ＴＣ−１細胞は、マウスにおける皮下注射後、数日から数週以内に固形腫瘍を形成することになる。ワクチンの不在下では、腫瘍は急速に増殖し、３０日以内に１０００ｍｍ３の所定のサイズに達した（パネルＤおよびＥ）。このサイズに達したら、倫理的理由でマウスを屠殺する。
【０１１７】
ＳＬＰ（正の対照として用いられる；Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：３５０−８）またはＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノウイルスベクターを用いるプライムブースト免疫スキームの場合、ＴＣ−１誘発腫瘍の増殖の著しい低下が認められた（図１２、パネルＢおよびＣ）。プライム免疫後の最初の３０日でのより詳細な検査（パネルＦおよびＧ）によると、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターによる免疫が、腫瘍増殖に対してＳＬＰによる免疫よりも実質的に大きな影響を有することが示される。初期増殖速度ははるかに低下し、ほとんどの場合、腫瘍は収縮した。アデノウイルスベクターによって免疫したマウスの１１匹中３匹において、腫瘍は完全に根絶されたが、それは生存プロットに反映されている（パネルＨ）。
【０１１８】
結論として、本発明のポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターによる免疫により、ＨＰＶ１６誘発がんに対する十分に確立された負荷モデルにおいて、腫瘍増殖が有意に低下するかまたは定着腫瘍が完全に根絶された。
【０１１９】
実施例６：ＨＰＶ由来の抗原を発現するアデノウイルスベクターの生産性および遺伝的安定性を改善するためのリプレッサー系の利用
強力で構成的に活性なプロモーターの制御下でアデノウイルスベクターに挿入される導入遺伝子が、導入遺伝子産物の特性に応じてベクター産生に負の影響を与え得ることは先行的に報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ＆  Ｙａｍａｄａ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３０：４２６−３０；Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：８７５−８５；Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３）。導入遺伝子依存性ベクターの生産性での課題の例として、非効率的なベクターの救出および増殖、低い最終ベクターの収量、また深刻な場合では欠陥のある導入遺伝子カセットを有するウイルス突然変異体の迅速な増殖が挙げられる。これらの課題を解決するため、複数の試験において、ベクター・導入遺伝子の発現をプロデューサー細胞内でのベクター複製中に抑制するための可能性が探索された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。これに関して、異なる抑制系がＡｄベクターとの関連で先行的に装備されており、当然ながら、異なるタイプの（阻害性）導入遺伝子をコードするベクターにおいてベクターの生産性および遺伝的安定性を改善することを示している。
【０１２０】
本明細書に記載のアデノウイルスベクターの一部、ならびに特定のＨＰＶ抗原変異体をコードする一部の他のアデノウイルスベクターが、上記の導入遺伝子依存性ベクターの生産性の課題の一部を提示し、それ故、おそらくはその観点でさらに改善され得ることが認められた。したがって、発明者は、ベクター・導入遺伝子の発現を抑制するための系の使用により、本明細書に記載されるようなＨＰＶ由来の抗原を発現するＡｄベクターの生成特性が改善され得るか否かを検討しようと努力した。この目的のため、発明者は、２つの既存のリプレッサー−オペレーター系、すなわちＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，１９９９，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２、欧州特許第０９９００４１Ｂ１号明細書）およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３）を我々のアデノウイルスベクタープラットフォームに装備した。ＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ系およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ系の双方が、アデノウイルスベクターの生産性をベクター複製中でのベクター・導入遺伝子のサイレンシングを介して改善するため、他者により先行的に用いられている（Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。これら２つの系の装備は、ＴｅｔＯまたはＣｕＯ配列のいずれかを有するＣＭＶプロモーターの制御下での目的の遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製を含んだ。さらに、その装備は、各々の同族のリプレッサータンパク質（すなわちＴｅｔＲまたはＣｙｍＲ）を安定的に発現する細胞株の作製を必要とした。
【０１２１】
異種ポリペプチドをコードする配列がＴｅｔＯもしくはＣｕＯオペレーター配列のいずれかを有するＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された、幾つかのＥ１が欠失したＡｄ２６およびＡｄ３５に基づくベクターを作製した。第１に、特定のＴｅｔＯまたはＣｕＯ含有配列（各々、配列番号１１および配列番号１２）は、ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄａｐｔ３５．ＢｓｕプラスミドのＣＭＶプロモーター（配列番号１３）の転写開始部位（ＴＳＳ）の近傍に挿入した（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：４６５４−６３；Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３）。オペレーター含有配列は、ＣＭＶプロモーターの２つの系についての前述の場合と正確に同じ位置に挿入した（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，１９９９，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２；欧州特許第０９９００４１Ｂ１号明細書；Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３；欧州特許第１３８５９４６Ｂ１号明細書）。詳細には、ＴＳＳ（最初に割り当てられた通り；Ｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１９０−９）に関しては、ＴｅｔＯおよびＣｕＯ含有配列は各々、位置−２０および＋７の下流に直接挿入された。配列番号１３では、これら２つの位置は各々、位置７１６および７４２に対応する。得られたオペレーター含有ＣＭＶプロモーターは各々、ＣＭＶＴｅｔＯおよびＣＭＶＣｕＯと称する。次に、異なる導入遺伝子を、得られた構築物の（修飾）ＣＭＶプロモーターの下流にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて挿入した。これらの導入遺伝子は、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼの融合タンパク質（ＧＦＰ−Ｌｕｃ）をコードする遺伝子、本発明からのＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、およびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨに幾つかの類似性を有する別のポリペプチド（本実施例で「ＨＰＶＡｇ」と称する構築物）を含んだ。ＨＰＶＡｇは、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ中に存在するのと同じリーダー配列、ならびにＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６、およびＥ７配列を含む。本明細書に記載される通りの方法を用いて、得られた修飾ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕプラスミドを、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯプロモーターのいずれかの制御下で上記のレポーターおよびＨＰＶ導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製のために用いた。
【０１２２】
ＴｅｔＲまたはＣｙｍＲのいずれかを発現する細胞株を、各々、プラスミドｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖ１０２５−２０）およびｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲの誘導体を用いてのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の安定的遺伝子導入により作製し、ここでＴｅｔＲコード配列（ポリペプチド配列番号１５をコードする配列番号１４）はコドン最適化されたＣｙｍＲコード配列（ポリペプチド配列番号１７をコードする配列番号１６）によって置換される。安定的細胞株の作製は、主に、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯ駆動遺伝子の発現を抑制する能力がある細胞クローンについてスクリーニングするための一過性遺伝子導入に基づくアッセイを用いて、ｐｃＤＮＡ（商標）６／ＴＲの供給業者による説明に従って実施した。得られたＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株では、これらの細胞内でのベクター複製中に導入遺伝子発現を抑制するそれらの能力について分析した。オペレーター含有ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ−Ｌｕｃを発現するベクターを用いて実施された実験によると、各々のオペレーター配列に対応するリプレッサーを発現する細胞株中での完全なウイルス複製サイクル全体を通じて、ルシフェラーゼ遺伝子発現の少なくとも１０倍の低下が示された（データは示さず）。これにより、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株がアデノウイルスベクターの複製との関連でベクター・導入遺伝子の発現を抑制する能力があることが確認された。
【０１２３】
アデノベクター・導入遺伝子発現のＴｅｔＲおよびＣｙｍＲ媒介性抑制のベクター収量に対する効果を、ＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５に基づくベクターについて検討した（図１３Ａ）。このため、２４ウェルプレートウェル内に３×１０５細胞／ウェルで播種したＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株に対して、１０００ウイルス粒子／細胞で３時間の持続時間、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯプロモーターのいずれかからＨＰＶＡｇを発現するベクターにより、４通りの感染を施した。対照として、ＨＰＶＡｇの代わりにＧＦＰ−Ｌｕｃを発現する対応するベクターを用いて平行感染を実施した。感染後４日目、クルードウイルスライセートを、ウェルの内容物（すなわち感染細胞および培地）に対して２つの凍結−解凍サイクルを施すことにより調製した。その後、標準としての公知のウイルス粒子力価を有する精製Ａｄ３５ベクターを用いる、Ａｄ３５ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣＲに基づくプロトコルによって、アデノベクター力価を測定した。結果によると、ＴｅｔＯおよびＣｕＯの双方を含有するＨＰＶＡｇをコードするＡｄ３５ベクターが、ＧＦＰ−Ｌｕｃを発現するコントロールベクターと比べて、正常なＰＥＲ．Ｃ６細胞でのベクター収量の低下を示すことが示される。それに対して、これらの同じベクターでは、それらの同族のリプレッサー（すなわち各々、ＴｅｔＲおよびＣｙｍＲ）を発現する細胞で生成されるとき、コントロールベクターを用いて得られる収量と同程度に高い収量が得られた。これらのデータは、プロデューサー細胞内でのベクター産生中における導入遺伝子発現の抑制が、導入遺伝子としてＨＰＶＡｇを保有するＡｄ３５ベクターの生産性にとって有利であり得ることを示す。
【０１２４】
アデノベクター導入遺伝子発現の抑制がベクター収量に対して有し得る効果もまた、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）由来のベクターについて検討した（図１３Ｂ）。Ａｄ３５ベクターについて本質的に上記のように実施したアッセイでは、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨのいずれかをコードする、ＣＭＶＴｅｔＯプロモーターに制御される導入遺伝子を保有するＡｄ２６ベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞を１５００ウイルス粒子／細胞で感染させるために用いた。３日後、感染物を収集し、ウイルス粒子力価を、Ａｄ２６ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣＲに基づく方法により測定した。結果によると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞でのＨＰＶＡｇおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするベクターにおける収量がＧＦＰ−Ｌｕｃをコードするコントロールベクターを用いて得られる場合よりも低いことが示される。それに対し、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞では、これらのベクターの双方が、コントロールベクターにおいて得られる場合と同程度に高い力価を示した。（Ａｄ３５ベクターにおける）上記の結果をまとめると、これらのデータは、アデノベクター産生中での導入遺伝子発現の抑制により、ＨＰＶＡｇおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するベクターの収量が増加することを示す。
【０１２５】
発明者は、ＨＰＶＡｇに対するＣＭＶプロモーター駆動導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターの遺伝的安定性に関する主要な課題について認めている。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６上でこのベクターが数継代経た後、ベクター集団の大半がＨＰＶＡｇコード配列内に大規模な欠失を保有する突然変異体ベクターからなることが認められた（データは示さず）。
【０１２６】
発明者は、導入遺伝子発現抑制系、例えば上記の２つのうちの１つを利用すれば、導入遺伝子、例えばベクターの増殖に対して阻害性を示すＨＰＶＡｇに関連した遺伝的安定性の課題が防止され得ると判断した。このことを試験するため、ＣＭＶＣｕＯプロモーターに駆動されるＨＰＶＡｇの発現を伴うＡｄ３５に基づくベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞でのベクターの増殖時の導入遺伝子カセットの安定性について評価した（図１４）。つまり、ベクターＤＮＡを２つの異なる細胞株に遺伝子導入し、得られたウイルスプラークをアガロース層下で増殖させておいた。２つの遺伝子導入の各々から、５つのウイルスプラークを単離し、さらに同じ細胞株（すなわち遺伝子導入用に用いられるもの）で別々に１０回のウイルス連続継代にわたり継代した。導入遺伝子の完全性を、ウイルス継代数１０（ＶＰＮ１０）での導入遺伝子カセットのＰＣＲ増幅、その後の得られたＰＣＲ産物のゲル電気泳動およびサンガー配列決定による分析により評価した。さらに、ＶＰＮ７の継代したウイルスクローンを、そのＨＰＶＡｇを発現する能力について評価した。これは、Ａ５４９細胞を１０００個のウイルス粒子／細胞で感染させるための継代したウイルス単離物を用い、感染の４８時間後に細胞を溶解し、その後、ＨＰＶＡｇの発現をＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により分析することにより行った。ゲル電気泳動および配列決定分析の結果によると、各々がＰＥＲ．Ｃ６で継代されていた５つ全部のウイルス単離物が、導入遺伝子カセット内に少しのフレームシフト欠失または中途での停止突然変異のいずれかを保有することが示された。それに対し、かかる欠失または突然変異は、ＣｙｍＲを発現する細胞株（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ）で継代されていたベクター単離物のいずれの中でも検出することができなかった。これらのデータと一致して、すべてのＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ増殖ベクター単離物がＨＰＶＡｇを発現することができた一方、すべてのＰＥＲ．Ｃ６増殖ベクターがこの能力を完全に失い、そこでこれらのベクターにおける欠陥導入遺伝子カセットが示唆された。結論として、我々のデータは、ベクター増殖中でのベクター・導入遺伝子の発現を抑制するための、例えばＣｙｍＲ／ＣｕＯ系のようなリプレッサー系の使用は、例えばＨＰＶＡｇを発現する導入遺伝子を保有するベクターにおいて見られる、深刻な導入遺伝子カセットの不安定性を防止するための有効な手段である。
【０１２７】
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Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ｏｈｌｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｐ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＪＨ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｇｏｍｅｚ  Ｒ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１１）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ  １６  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＪＨ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１２ｂ）ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｔａｔｔｏｏｉｎｇ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−２５０
Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ，Ｔｏｎｇ  Ｗ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｗｅｎｇ  Ｚ（２００３）Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ＭＨＣ−Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：１７６５−１７７２
Ｐｒａｋａｓｈ  ＳＳ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＳＲ，Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ＲＢ，Ｌａｉｍｉｎｓ  ＬＡ，Ａｎｄｒｏｐｈｙ  ＥＪ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｌｙ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｅ２  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１１６
Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ  Ｓ，Ｄｉｎｇ  Ｒ，Ｑｉｕ  ＡＪ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｄｏｎｇ  Ｊ（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ＦａｓＬ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｅｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：８７５−８８５
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Ｓｅｄｍａｎ  ＳＡ，Ｂａｒｂｏｓａ  ＭＳ，Ｖａｓｓ  ＷＣ，Ｈｕｂｂｅｒｔ  ＮＬ，Ｈａａｓ  ＪＡ，Ｌｏｗｙ  ＤＲ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＴ（１９９１）Ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｅ６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｈａｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅ７  ｔｏ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４８６０−４８６６
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Ｓｍａｈｅｌ  Ｍ，Ｓｉｍａ  Ｐ，Ｌｕｄｖｉｋｏｖａ  Ｖ，Ｖｏｎｋａ  Ｖ（２００１）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＰＶ１６  Ｅ７  Ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅ７−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−２３８
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ（２０１１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２５２−２５７
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Ｗｉｅｋｉｎｇ  ＢＧ，Ｖｅｒｍｅｅｒ  ＤＷ，Ｓｐａｎｏｓ  ＷＣ，Ｌｅｅ  ＫＭ，Ｖｅｒｍｅｅｒ  Ｐ，Ｌｅｅ  ＷＴ，Ｘｕ  Ｙ，Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ  ＥＳ，Ｂａｌｃａｉｔｉｓ  Ｓ，Ｂａｌｉｎｔ  ＪＰ，Ｊｒ．，Ｊｏｎｅｓ  ＦＲ，Ｌｅｅ  ＪＨ（２０１２）Ａ  ｎｏｎ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＨＰＶ  １６  Ｅ６／Ｅ７  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＰＶ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９：６６７−６７４
Ｙａｎ  Ｊ，Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ  ＤＫ，Ｃｏｒｂｉｔｔ  Ｎ，Ｈｏｋｅｙ  ＤＡ，Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  ＭＰ，ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ＫＡ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ，Ｓｅｗｅｌｌ  Ｄ（２００９）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＨＰＶ−１６  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ｅ６／Ｅ７  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４４０
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Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  Ｓ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｍｏｔａ  ＳＣ，Ｎｏｕｔａ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ，Ｌｉｐｆｏｒｄ  ＧＢ，Ｏｆｆｒｉｎｇａ  Ｒ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ（２００２）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：３５０−３５８
【０１２８】
表Ｉ．配列
【化１】
2018148890.tif 000002
【化２】
2018148890.tif 000003
【化３】
2018148890.tif 000004
【化４】
2018148890.tif 000005
【化５】
2018148890.tif 000006
【化６】
2018148890.tif 000007
配列番号７（ＩｇＥリーダーペプチドアミノ酸配列）
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ
配列番号８（ＩｇＥリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣ
配列番号９（ａａ  ＨＡＶＴ２０リーダーペプチドアミノ酸配列）
ＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ
【化７】
2018148890.tif 000008
配列番号１１（２ｘＴｅｔＯ含有配列）
ＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣ
配列番号１２（ＣｕＯ含有配列）
ＡＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡ
【化８】
2018148890.tif 000009
【化９】
2018148890.tif 000010
【化１０】
2018148890.tif 000011
【化１１】
2018148890.tif 000012
【化１２】
2018148890.tif 000013
配列番号１８（ＨＰＶ１６  Ｅ６、ａａ４１〜６５）
ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ
配列番号１９（ＨＰＶ１６  Ｅ７  ａａ４３〜７７）
ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ
【図１】
2018148890.tif 000014
【図２】
2018148890.tif 000015
【図３】
2018148890.tif 000016
【図４】
2018148890.tif 000017
【図５】
2018148890.tif 000018
【図６】
2018148890.tif 000019
【図７】
2018148890.tif 000020
【図８】
2018148890.tif 000021
【図９】
2018148890.tif 000022
【図１０】
2018148890.tif 000023
【図１１】
2018148890.tif 000024
【図１２】
2018148890.tif 000025
【図１３】
2018148890.tif 000026
【図１４】
2018148890.tif 000027
【配列表】
2018148890000001.app