(57)【要約】【課題】龍涎香を呈する香料素材の探索。【解決手段】龍涎香様の匂いを呈する香料素材の選択方法であって：試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれと同様の応答選択性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
龍涎香様の匂いを呈する香料素材の選択方法であって：
試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＯＲ７Ａ１７が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＲ７Ａ１７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（−）−アンブロキシドに応答性を有するポリペプチドである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試験物質非存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答の１２０％以上に増加させる試験物質を選択する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を選択する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによって行われる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記選択された試験物質の匂いを評価することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は龍涎香様の匂いを呈する香料素材を探索する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
龍涎香（又はアンバーグリス）は、マッコウクジラの腸内に生じた未消化物を原料とする香料である。龍涎香は、通常、マッコウクジラから排泄された未消化物を採取することでしか入手することができないうえ、その生成の機序も未解明であることから、極めて希少価値の高い香料である。龍涎香の香りの主成分としては、アンブロキシド（[3aR-(3aα,5aβ,9aα,9bβ)]-Dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphto[2,1-b]furan、合成化合物はアンブロキサン（登録商標）などとして販売されている）が知られている。また、龍涎香と類似した香りを有する合成香料が販売されており、それらは一般に、アンバー系香料と総称される。
【０００３】
従来、香料物質の開発においては、候補物質の匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題があった。そこで近年では、候補物質に対する嗅覚受容体の応答を指標にした香料物質の探索方法が開発されている（例えば特許文献１）。しかしながら、嗅覚受容体の応答は匂い物質に選択的であるため、最初に標的とする匂いに選択性を有する嗅覚受容体を見つけ出すことが肝要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報第２０１５／０２０１５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、龍涎香の匂いに選択的に応答する嗅覚受容体は見出されていなかった。本発明は、龍涎香様の匂いに選択的に応答する嗅覚受容体の応答を指標として、龍涎香様の匂いを呈する香料素材を探索する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、龍涎香様の匂いに選択的に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。また本発明者は、当該嗅覚受容体又はそれと同様の応答選択性を有するポリペプチドの応答を指標とすることにより、龍涎香様の匂いを呈する香料素材を効率よく探索することができることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、龍涎香様の匂いを呈する香料素材の選択方法であって：
試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、龍涎香様の匂いを呈する香料素材を効率よく探索又は選択することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】嗅覚受容体の（−）−アンブロキシドに対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は受容体応答強度を示す（ｎ＝２）。
【図２】種々の濃度の（−）−アンブロキシドに対する嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７の応答。ｎ＝３〜５、エラーバー＝±ＳＥ。
【図３】各種匂い物質に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７の応答。ｎ＝３、エラーバー＝±ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。
【００１１】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
図１に示すとおり、本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から、（−）−アンブロキシド（[3aR-(3aα,5aβ,9aα,9bβ)]-Dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphto[2,1-b]furan）に対して特異的に応答する嗅覚受容体として、ＯＲ７Ａ１７を同定した。（−）−アンブロキシドは、龍涎香の匂いの主成分であり、また龍涎香様の匂いを有するアンバー系香料の１種である。さらに、図２〜３に示すとおり、嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７は、（−）−アンブロキシドに対して濃度依存的に応答する一方、アンバー系香料以外の香料物質に応答しなかった。したがって、ＯＲ７Ａ１７は、龍涎香様の匂い、とりわけ（−）−アンブロキシドの匂いに対して選択的に応答する嗅覚受容体であることが見出された。言い換えれば、ＯＲ７Ａ１７及びこれと同様の応答選択性を有する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を増加させる物質は、龍涎香様の匂い、とりわけ（−）−アンブロキシド様の匂いを呈することができる香料素材である。
【００１３】
したがって、本発明は、龍涎香様の匂いを呈する香料素材の選択方法を提供する。当該方法は、試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれと同様の応答選択性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、（−）−アンブロキシド様の匂いを呈する香料素材の選択方法である。当該方法は、試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれと同様の応答選択性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、を含む。
【００１５】
上記本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われ得る。
【００１６】
本発明の方法に使用される試験物質としては、龍涎香様の匂いを呈するかどうか評価したい物質、又は龍涎香様の匂いを呈する香料素材として使用することを所望する物質であればよく、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的もしくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。
【００１７】
本発明の方法に使用される嗅覚受容体ポリペプチドは、ＯＲ７Ａ１７及びこれと同様の応答選択性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドである。ＯＲ７Ａ１７は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体である。ＯＲ７Ａ１７は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１３７７５１６１として登録されている。ＯＲ７Ａ１７は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１８】
ＯＲ７Ａ１７と同様の応答選択性を有するポリペプチドの例としては、ＯＲ７Ａ１７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドであって、かつ（−）−アンブロキシド（[3aR-(3aα,5aβ,9aα,9bβ)]-Dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphto[2,1-b]furan）に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。より詳細には、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（−）−アンブロキシドに対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。ＯＲ７Ａ１７と同様の応答選択性を有するポリペプチドの他の例としては、げっ歯類各種よりそれぞれ選択される、ＯＲ７Ａ１７と最も相同性が高いアミノ酸配列をもつポリペプチドであり、かつ（−）−アンブロキシドに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。本明細書において、あるポリペプチドが「（−）−アンブロキシドに対する応答性を有する」とは、該ポリペプチドの（−）−アンブロキシドに対する応答強度が、（−）−アンブロキシド非存在下の１２０％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上であるか、又は、該ポリペプチドの（−）−アンブロキシドに対する応答強度が、ＯＲ７Ａ１７（配列番号２）の応答強度の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上であることをいう。（−）−アンブロキシドは、アンブロキサン（花王株式会社による登録商標）などの名称で販売されている。
【００１９】
本発明の方法において、上述した嗅覚受容体ポリペプチドは、いずれか１種を使用すればよいが、いずれか２種以上を組み合わせて使用してもよい。好ましくは、本発明の方法において使用される嗅覚受容体ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２０】
本発明の方法において、上記嗅覚受容体ポリペプチドは、（−）−アンブロキシドに対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、当該嗅覚受容体ポリペプチドは、生体から単離された嗅覚受容器もしくは嗅細胞等の、当該嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する当該組換え細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体ポリペプチドの範囲に含まれる。
【００２１】
好ましい態様においては、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、嗅細胞等の上記嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する細胞、又は嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。該組換え細胞は、例えば、嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２２】
好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓを含むＲＴＰは、嗅覚受容体タンパク質を細胞膜表面へ移行する機能を有する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されているタンパク質である。
【００２３】
本発明の方法においては、上記嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質が適用される。嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を適用する手段としては、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現する細胞を培養する培地に試験物質を添加する方法、該嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を直接滴下、散布もしくは噴霧する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２４】
本発明の方法においては、嗅覚受容体ポリペプチドへの試験物質の添加に続いて、該試験物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定等によって行えばよい。嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。したがって、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ等が挙げられる。上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する他の方法の例としては、カルシウムイメージング法が挙げられる。
【００２５】
次いで、測定された嗅覚受容体ポリペプチドの応答に基づいて、試験物質を評価する。該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を引き起こす試験物質は、龍涎香様の匂いを呈する香料素材として使用することができる。したがって、本発明の方法においては、該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質が目的物質として選択される。
【００２６】
好適には、試験物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答は、試験物質を添加した嗅覚受容体ポリペプチド（試験群）の応答を、対照群における該嗅覚受容体ポリペプチドの応答と比較することによって評価することができる。対照群としては、試験物質を添加していない該嗅覚受容体ポリペプチド、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、より低濃度の試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチド、などを挙げることができる。試験群における応答が対照群と比べてより高い場合、該嗅覚受容体ポリペプチドは該試験物質に応答したと評価され、該試験物質は目的物質として選択される。
【００２７】
したがって、本発明の方法の一実施形態においては、試験物質の存在下及び非存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定され、次いで、試験物質の存在での応答が、試験物質非存在下での応答に比べて高いか否かが判定される。試験物質の存在下での応答がより高い場合、該試験物質は目的物質として選択される。好ましい実施形態においては、試験物質の存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該試験物質は目的物質として選択される。別の好ましい実施形態においては、試験物質の存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して統計学的に有意に増加していれば、該試験物質は目的物質として選択される。
【００２８】
あるいは、試験物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答は、該嗅覚受容体ポリペプチドの（−）−アンブロキシドに対する応答と比較することによって評価することができる。したがって、本発明の方法の別の一実施形態においては、試験物質の存在下及び（−）−アンブロキシド存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。試験物質の存在下での応答と（−）−アンブロキシド存在下での応答との比較に基づいて、該嗅覚受容体ポリペプチドが該試験物質に応答したと評価された場合、該試験物質は目的物質として選択される。好ましい実施形態においては、試験物質の存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答強度が、（−）−アンブロキシド存在下と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上であれば、該試験物質は目的物質として選択される。別の好ましい実施形態においては、試験物質の存在下での嗅覚受容体ポリペプチドの応答強度が、（−）−アンブロキシド存在下と比較して統計学的に有意に低くなければ、該試験物質は目的物質として選択される。
【００２９】
必要に応じて、当該選択された試験物質の匂いをさらに評価してもよい。すなわち、本発明の方法の一実施形態においては、上記手順で選択された試験物質を、龍涎香様の匂いを呈する香料素材の候補物質として取得する。次いで、該候補物質の匂いを評価する。候補物質の匂いの評価は、当該分野で通常使用される匂い評価手順、例えば、専門家による官能評価、匂いセンサー等の手段によって行うことができる。この匂い評価でより良い結果が得られた候補物質は、龍涎香様の匂いを呈する香料素材として選択される。
【００３０】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３１】
〔１〕ＯＲ７Ａ１７及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を指標とする、龍涎香様の匂いを呈する香料素材の探索方法。
【００３２】
〔２〕龍涎香様の匂いを呈する香料素材の選択方法であって：
試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
を含む、方法。
【００３３】
〔３〕（−）−アンブロキシド様の匂いを呈する香料素材の選択方法であって：
試験物質存在下で、ＯＲ７Ａ１７及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
該嗅覚受容体ポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
を含む、方法。
【００３４】
〔４〕好ましくは、前記ＯＲ７Ａ１７が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
【００３５】
〔５〕好ましくは、前記ＯＲ７Ａ１７とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（−）−アンブロキシドに対する応答性を有するポリペプチドである、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
【００３６】
〔６〕好ましくは、試験物質非存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、〔２〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【００３７】
〔７〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答の１２０％以上に増加させる試験物質を選択する、〔６〕記載の方法。
【００３８】
〔８〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を選択する、〔６〕記載の方法。
【００３９】
〔９〕好ましくは、（−）−アンブロキシド存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、〔２〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【００４０】
〔１０〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記（−）−アンブロキシド存在下での応答の１０％以上に増加させる試験物質を選択する、〔９〕記載の方法。
【００４１】
〔１１〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、前記（−）−アンブロキシド存在下での応答と比べて統計学的に有意に低下させない試験物質を選択する、〔９〕記載の方法。
【００４２】
〔１２〕好ましくは、前記嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
【００４３】
〔１３〕前記組換え細胞が、
好ましくは、前記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞である、〔１２〕記載の方法。
【００４４】
〔１４〕好ましくは、前記嗅覚受容体ポリペプチドとして、〔１２〕又は〔１３〕記載の組換え細胞又はその培養物が使用される、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
方法。
【００４５】
〔１５〕好ましくは、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによって行われる、〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４６】
〔１６〕好ましくは、前記選択された試験物質の匂いを評価することをさらに含む、〔２〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
【００４７】
〔１７〕好ましくは、前記匂い評価が官能評価によって行われる、〔１６〕記載の方法。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００４９】
本実施例で用いた試験物質を下記表１に示す。
【００５０】
【表１】
2018074944.tif 000002
【００５１】
実施例１  （−）−アンブロキシド受容体の同定
１）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
培養細胞内で作られた嗅覚受容体タンパク質を細胞膜表面へ移行するヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、別のｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込み、ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ１Ｓベクターを作製した。
表２に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で２０分静置した後、３８４ウェルプレート又は９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ）で懸濁させたＨＥＫ２９３細胞を３０μＬ又は１００μＬずつ各ウェルに２×１０5細胞／ｃｍ2で播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、嗅覚受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
【００５２】
【表２】
2018074944.tif 000003
【００５３】
２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記１）で作製した培養物から、培地を取り除き、新しい培地で調製した所定の濃度の試験物質溶液を４０μＬ又は７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製品の操作マニュアルに従って測定した。匂い刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を匂い刺激を行わない細胞での発光値で割った値を、ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００５４】
３）結果
４７５種類の嗅覚受容体それぞれを発現させた細胞について試験物質に対する応答を測定した結果、（−）−アンブロキシドに対して活性化する受容体としてＯＲ７Ａ１７が見出された（図１）。ＯＲ７Ａ１７発現細胞の（−）−アンブロキシドに対する応答は濃度依存的であった（図２）。これらの結果から、ＯＲ７Ａ１７を（−）−アンブロキシドを認識する（−）−アンブロキシド受容体として同定した。
【００５５】
実施例２  各種匂い物質のＯＲ７Ａ１７応答性評価
１）匂い物質
下記表３に示すアンバー系香料を含まない１１種の匂い物質を調製した。その各々は、特徴的な官能基を有する４〜７種類の香料からなる混合物である。これに（−）−アンブロキシドを加えた１２種類の匂い物質を以下のルシフェラーゼアッセイに用いた。各匂い物質の濃度は３０μＭ及び１００μＭとした。
【００５６】
【表３】
2018074944.tif 000004
【００５７】
２）ルシフェラーゼアッセイ
実施例１と同様の手順で、ＯＲ７Ａ１７発現細胞を用いたルシフェラーゼアッセイにより、ＯＲ７Ａ１７発現細胞の各種匂い物質に対する応答強度を測定した。嗅覚受容体発現細胞の応答強度は以下のとおり算出した：各種刺激条件について、ホタルルシフェラーゼ由来の発光値をウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値で除した値ｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃを算出した。匂い刺激により誘導されたｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｘ）を、匂い刺激を行わなかった細胞でのｆＬｕｃ／ｈＲｌｕｃ値（Ｙ）で除し、匂い刺激による受容体活性Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｘ／Ｙ）を求めた。
【００５８】
３）結果
ルシフェラーゼアッセイにおいて、（−）−アンブロキシド以外の匂い物質に対してＯＲ７Ａ１７は応答しなかった（図３）。したがって、ＯＲ７Ａ１７が、龍涎香様香料素材である（−）−アンブロキシドに特異的に応答すること、及び龍涎香様の匂いを呈する香料素材の探索にＯＲ７Ａ１７が有用であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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