(57)【要約】【課題】本発明の課題は、脳梗塞の処置方法を提供することである。【解決手段】式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩を含む脳梗塞処置剤を提供する。式（Ｉ）において、ｍは１または２の整数であり、ｎは２または３の整数であり、Ａは、ジアルキルアミノであるか、または、窒素原子を含有する特定の環構造である。式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩は、脳出血のリスクのある血栓溶解剤とは異なるメカニズムで、また、適用時間の制限なく、脳梗塞を処置し得る。2018080113.tif 000021【選択図】図１
2018080113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2018080113.tif 000014
［式中、
ｍは１または２の整数であり、
ｎは２または３の整数であり、
Ａは、
【化２】
2018080113.tif 000015
（式中、ＲおよびＲ’はＣ１−Ｃ６アルキルである）
からなる群から選択される］、
の化合物またはその医薬上許容され得る塩を含む、脳梗塞処置剤。
【請求項２】
Ａが、
【化３】
2018080113.tif 000016
である、請求項１に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項３】
Ａが、
【化４】
2018080113.tif 000017
である、請求項１または請求項２に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項４】
Ｒがメチルである、請求項３に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項５】
急性期の脳梗塞を処置するための、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の脳梗塞処置剤。
【請求項６】
１種またはそれ以上のさらなる薬剤と、同時に、連続的に、または異なる時点で対象に投与するための、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の脳梗塞処置剤。
【請求項７】
さらなる薬剤が他の脳梗塞処置剤である、請求項６に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項８】
さらなる薬剤が血栓溶解剤である、請求項６または請求項７に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項９】
血栓溶解剤がｔＰＡである、請求項８に記載の脳梗塞処置剤。
【請求項１０】
式（Ｉ）
【化５】
2018080113.tif 000018
［式中、
ｍは１または２の整数であり、
ｎは２または３の整数であり、
Ａは、
【化６】
2018080113.tif 000019
（式中、ＲおよびＲ’はＣ１−Ｃ６アルキルである）
からなる群から選択される］、
の化合物またはその医薬上許容され得る塩。
【請求項１１】
【化７】
2018080113.tif 000020
からなる群から選択される化合物またはその医薬上許容され得る塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の構造を有するベンゼン誘導体であるＶＡＰ−１阻害剤を含む脳梗塞処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中の患者数は２０２０年頃には日本国内で３００万人に達すると推定され、また、一旦発症すると後遺症を残す可能性が高く、福祉および医療経済面でも大きな課題となっている。脳卒中にはいくつかの種類があり、脳の血管がつまる脳梗塞と、脳の血管が破れて出血する「脳出血」や「くも膜下出血」に大別される。脳梗塞は、一般に、脳動脈の閉塞または狭窄により脳虚血が生じ、脳組織が酸素または栄養の不足のため壊死または壊死に近い状態になることを特徴とする疾患である。脳梗塞には、脳内小動脈病変が原因の「ラクナ梗塞」、頸部ないし頭蓋内の比較的大きな動脈のアテローム硬化が原因の「アテローム血栓性脳梗塞」、心疾患による「心原性脳塞栓症」等の病型が含まれる。
【０００３】
急性期の脳梗塞に対しては、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue plasminogen activator：ｔＰＡまたはｔ−ＰＡ）による血栓溶解治療が第一選択である。プラスミノーゲンは、血管内に出来た血栓を強力に溶解する酵素である。脳の動脈に生じた血栓により脳梗塞が起こった後にｔＰＡを投与することにより、血栓を溶解し、血液の流れを回復させる治療が行われている（血栓溶解療法）。ｔＰＡ治療により自立して生活できるまで回復する患者は４０−５０％と報告されている。しかしながら、発症からｔＰＡ投与までの時間が長く経過した場合には、脳出血を引き起こすことがあり、現状は発症後４.５時間以内の患者にしか使用できない。また、最近、発症から6時間以内の治療可能な患者に機械的血栓回収療法により血栓を除去する血管内治療を行うことも実施されつつある。いずれにしても更なる治療改善率および適応時間の拡大が臨床現場から強く望まれており、脳内出血のリスクを軽減し、かつ治療対象を広げる新たな治療法を開発することは極めて重要である。
【０００４】
ＶＡＰ−１（Vascular adhesion protein-1）は、ＳＳＡＯ（セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ）とも呼ばれるタンパク質である。膜結合型のＶＡＰ−１は血管内皮表面に存在し、遊離型のＳＳＡＯは血清中に存在する。前者は白血球（炎症に関連する顆粒球、炎症や免疫に関連するリンパ球や単球）との接着分子の機能を持ち、主に炎症に関連し、後者はアミンオキシダーゼ活性により生体内のアミンの解毒を担う。糖尿病、アトピー性皮膚炎、乾癬、肥満、動脈硬化、心疾患等の患者の血清および種々の組織においてＶＡＰ−１／ＳＳＡＯ活性の増加が見られる。そのため、過剰になったＶＡＰ−１／ＳＳＡＯの機能をＶＡＰ−１／ＳＳＡＯ阻害剤により抑制し、正常化することにより、これらの疾患を処置することが期待されている。
【０００５】
脳梗塞に関連して、血漿ＶＡＰ−１活性が高い脳卒中の患者は、神経症状の予後が悪いことが報告されている（非特許文献１）。また、自己血栓または栓子により脳虚血を生じさせた脳梗塞モデルラットにおいて、ＶＡＰ−１阻害剤が神経保護効果を示すことが報告されている（非特許文献１および２）。
【０００６】
ＶＡＰ−１阻害活性を有するベンゼン、チオフェンまたはチアゾール誘導体が知られており、ＶＡＰ−１関連疾患の予防または治療に使用し得ることが示唆されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９６６０９号
【特許文献２】国際公開第２００９／１４５３６０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Stroke. 2010;41:1528-1535
【非特許文献２】Journal of Neurochemistry (2012) 123 (Suppl. 2), 116-124
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の末、特定の構造を有するベンゼン誘導体であるＶＡＰ−１阻害剤が脳梗塞の処置に特に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は、以下の通りである。
［１］式（Ｉ）
【化１】
2018080113.tif 000003
［式中、
ｍは１または２の整数であり、
ｎは２または３の整数であり、
Ａは、
【化２】
2018080113.tif 000004
（式中、ＲおよびＲ’はＣ１−Ｃ６アルキルである）
からなる群から選択される］、
の化合物またはその医薬上許容され得る塩を含む、脳梗塞処置剤（本明細書において、本発明の脳梗塞処置剤と称する）。
［２］Ａが、
【化３】
2018080113.tif 000005
である、［１］に記載の脳梗塞処置剤。
［３］Ａが、
【化４】
2018080113.tif 000006
である、［１］または［２］に記載の脳梗塞処置剤。
［４］Ｒがメチルである、［３］に記載の脳梗塞処置剤。
［５］急性期の脳梗塞を処置するための、［１］ないし［４］のいずれかに記載の脳梗塞処置剤。
［６］１種またはそれ以上のさらなる薬剤と、同時に、連続的に、または異なる時点で対象に投与するための、［１］ないし［５］のいずれかに記載の脳梗塞処置剤。
［７］さらなる薬剤が他の脳梗塞処置剤である、［６］に記載の脳梗塞処置剤。
［８］さらなる薬剤が血栓溶解剤である、［６］または［７］に記載の脳梗塞処置剤。
［９］血栓溶解剤がｔＰＡである、［８］に記載の脳梗塞処置剤。
［１０］式（Ｉ）
【化５】
2018080113.tif 000007
［式中、
ｍは１または２の整数であり、
ｎは２または３の整数であり、
Ａは、
【化６】
2018080113.tif 000008
（式中、ＲおよびＲ’はＣ１−Ｃ６アルキルである）
からなる群から選択される］、
の化合物またはその医薬上許容され得る塩。
［１１］
【化７】
2018080113.tif 000009
からなる群から選択される化合物またはその医薬上許容され得る塩。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脳梗塞処置剤は、特定の構造を有するベンゼン誘導体である化合物またはその医薬上許容され得る塩を含む。これらの化合物または塩は、ＶＡＰ−１阻害剤であり、脳出血のリスクのある血栓溶解剤とは異なるメカニズムで、また、適用時間の制限なく、脳梗塞を処置し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ラットにおける一過性局所脳虚血後の脳梗塞巣体積に対する化合物１および製造例１の効果を示す。各値は、１０匹のラットの平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１：媒体群と化合物１群、化合物２群および製造例１群との間での比較で認められた有意差（Dunnett の多重比較検定）。＃＃Ｐ＜０.０１：媒体群と陽性対照群の比較で認められた有意差（Student のt検定）。陽性対照群と化合物１群、化合物２群および製造例１群との間での比較で有意差は認められなかった（Dunnett の多重比較検定）。
【図２】図２は、ラットにおける一過性局所脳虚血後の脳梗塞巣体積に対する化合物１の効果を示す。各値は、１０匹のラットの平均値±標準偏差を示す。＊＊Ｐ＜０.０１：媒体群と各化合物１群との間での比較で認められた有意差（Dunnett の多重比較検定）。＃＃Ｐ＜０.０１：媒体群と陽性対照群の比較で認められた有意差（Student のt検定）。陽性対照群と、化合物１（高用量）および陽性対照の併用投与群の比較で有意差は認められなかった（Student のt検定）。
【図３】図３は、ラットにおける一過性局所脳虚血後の神経症状スコアに対する化合物１の効果を示す。各値は、１０匹または１１匹のラットの平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０.０５：媒体群と化合物１群の比較で認められた有意差（Steel-Dwass 検定）。＃Ｐ＜０.０５：媒体群と陽性対照群の比較で認められた有意差（Steel-Dwass 検定）。化合物１群と陽性対照群の比較で有意差は認められなかった（Steel-Dwass 検定）。
【図４】図４は、ラットにおける一過性局所脳虚血後の回転棒上の滞在時間に対する化合物１の効果を示す。各値は、１０匹または１１匹のラットの平均値±標準偏差を示す。＊Ｐ＜０.０５：媒体群と化合物１群の比較で認められた有意差（Tukey-Kramer 検定）。＃Ｐ＜０.０５：媒体群と陽性対照群の比較で認められた有意差（Tukey-Kramer 検定）。化合物１群と陽性対照群の比較で有意差は認められなかった（Tukey-Kramer 検定）。
【図５】図５は、ラット自己血栓モデルにおける神経症状スコアに対する化合物１の効果およびｒｔＰＡと化合物１の併用効果を示す。＊Ｐ＜０.０５：媒体群と化合物１群またはｒｔＰＡと化合物１の併用群との比較で認められた有意差（Wilcoxon 検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の上記および下記の記載において、本発明の範囲に含まれるべき種々の定義の適切な例および説明を、以下に詳細に説明する。
【００１４】
式（Ｉ）において、ピリジン環上の置換基Ａの位置は、その任意の適切な位置であり、特に限定されない。
本発明に関して、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、１から６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル、例えば１から４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルおよびヘキシルが含まれる。
【００１５】
本発明のある実施態様では、本発明の脳梗塞処置剤は、
【化８】
2018080113.tif 000010
または
【化９】
2018080113.tif 000011
で示される化合物またはその医薬上許容され得る塩を含む。
【００１６】
本発明に関して、「医薬上許容され得る塩」は、医薬上許容され得る通常の塩であり、非毒性であれば特に限定されず、無機または有機塩基との塩、酸付加塩などが挙げられる。無機または有機塩基との塩には、アルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、およびアミン塩（例、トリエチルアミン塩、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミン塩など）などが挙げられ、酸付加塩には、鉱酸（例、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸）から誘導される塩、および有機酸（例、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリールスルホン酸（例、ｐ−トルエンスルホン酸））から誘導される塩などが挙げられる。
【００１７】
本発明の式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容され得る塩は、公知の参考文献、例えば国際公開第２００９／０９６６０９号または国際公開第２００９／１４５３６０号に基づいて、あるいは、本明細書に記載の製造例に準じて、製造することができる。
【００１８】
本発明に関して、「脳梗塞」は、脳虚血に起因する脳の損傷およびそれに関連する症状を意味し、ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞および心原性脳塞栓症を含むが、これらに限定されず、神経障害、高次機能障害、感情障害等の脳梗塞の後遺症を包含する。脳虚血の原因としては、脳血栓、脳栓塞、血管攣縮、低血圧、低酸素血症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明に関して、「脳梗塞処置剤」は、脳梗塞を処置するために対象に投与される医薬を意味する。「脳梗塞を処置する」は、脳梗塞を軽減、減退および／または治癒すること、あるいは、その進行を遅延または停止することを意味する。
【００２０】
本発明の脳梗塞処置剤の投与対象は、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの哺乳動物、特にヒト）である。
【００２１】
本発明の脳梗塞処置剤は、任意の経路により投与することができ、例えば、経口、皮下、経皮、経粘膜、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、硬膜下、直腸、胃腸経由、吸入などの投与経路で、全身的または局所的に投与し得る。脊髄投与および硬膜外投与、または脳室への投与も可能である。本発明の脳梗塞処置剤が投与される様式は、処置に当たる医師が適宜決定すればよい。本発明の脳梗塞処置剤を投与するのに１つ以上の経路を用いることができ、ある経路が、別の経路よりも迅速でより効果的な反応を提供してもよい。記載された投与の経路は単なる例示であり、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の脳梗塞治療剤は、急性期の脳梗塞を処置するために投与され得る。「急性期」とは、脳梗塞の発症から１４日以内の期間を意味する。本発明の脳梗塞処置剤は、哺乳動物、特にヒトの対象が脳梗塞を発症した後、例えば、対象が脳梗塞を発症した後に速やかに、例えば、３時間以内、４.５時間以内、６時間以内、１２時間以内または２４時間以内に投与される。
【００２３】
本発明によれば、哺乳動物、特にヒトの対象に投与される本発明の脳梗塞処置剤の用量は、合理的な期間にわたって対象に所望の反応を及ぼすのに十分であるべきである。当業者は、用量は、用いられる個々の化合物の活性、対象の種、年齢、性別、体重、並びに、脳梗塞の状態および重篤度を含む種々の要因に依存することを理解するであろう。用量はまた、投与の経路、タイミングおよび回数、並びに、個々の化合物および所望の生理学的効果に伴い得る有害な副作用の存在、性質および程度にも依存するであろう。当業者は、脳梗塞の状態および重篤度によっては、複数回の投与を必要とする長期の治療が必要であり得ることを理解するであろう。適切な用量および投与計画は、当業者に公知の通常の範囲で見出される技術により決定することができる。
【００２４】
本発明の脳梗塞処置剤は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩の重量で、例えば、約０.００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量、約０.００５ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量、または、約０.０１ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量約０.１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で、１日当たり単回投与または２回、３回、４回もしくはそれ以上の回数で投与し得、あるいは、持続的に投与することもできる。
【００２５】
本明細書で用いる用語「約」は、数値の±３０％、好ましくは±２０％、より好ましくは±１０％までの誤差を意味し得る。
【００２６】
本発明の脳梗塞処置剤は、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、活性成分として、脳梗塞を処置するのに十分な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩、および、医薬上許容され得る担体を含む。医薬上許容され得る担体は、医薬として通常用いられる任意のものであってよく、これは物理化学的な検討事項（例えば、溶解度、および当該化合物に対する反応性の欠如）および投与の経路によって限定される場合を除き、特に限定されない。
【００２７】
本発明の脳梗塞処置剤が医薬組成物である場合、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩の量は、組成物の処方によって変化し得、例えば、０.００００１〜１０.０重量％、０.００１〜５重量％または０.００１〜１重量％である。
【００２８】
本発明の脳梗塞処置剤の投与形態は特に限定されず、脳梗塞の処置を達成するために種々の形態で投与することができる。式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩を単独でまたは医薬上許容され得る担体または希釈剤などの添加剤と組み合わせて製剤化し、本発明の脳梗塞処置剤として経口または非経口投与することができる。製剤の特性および性質は、活性成分として用いる化合物の溶解度および化学的特性、選択された投与経路および標準的な薬学的プラクティスによって決定される。経口投与に用いる製剤としては、固体剤形（例、カプセル、錠剤、散剤）または液体形態（例、溶液または懸濁液）などが挙げられる。非経口投与に用いる製剤としては、無菌溶液または懸濁液の形態である注射、点滴などが挙げられる。固体経口製剤は、通常の賦形剤などを含み得る。液体経口製剤は、種々の芳香剤、着色剤、保存剤、安定化剤、可溶化剤または懸濁剤などを含み得る。非経口製剤は、例えば、無菌の水性または非水性の溶液または懸濁液であり、特定の種々の保存剤、安定化剤、緩衝化剤、可溶化剤または懸濁化剤などを含み得る。必要に応じて、種々の等張化剤を添加してもよい。
【００２９】
本発明の脳梗塞処置剤は、本発明の効果を阻害しない限り、他の薬剤を含んでいてもよい。本発明の脳梗塞処置剤および他の薬剤を含む製剤、および、本発明の脳梗塞処置剤を含む製剤と他の薬剤を含む製剤を含むキットまたはパックは、本発明に含まれる。キットまたはパックは、投与のための指示書を含み得る。
【００３０】
本発明の脳梗塞処置剤は、本発明の効果を阻害しない限り、他の薬剤と組み合わせて、同時に、連続的に、または異なる時点で対象に投与することができる。本発明の脳梗塞処置剤と他の薬剤を、同一の製剤中または分離した別の製剤中で投与し得る。投与経路は、同一であっても異なっていてもよい。
【００３１】
他の薬剤または薬学的に活性な化合物としては、例えば、血栓溶解剤（例、ｔＰＡ、ｒｔＰＡ（アルテプラーゼ）、デスモテプラーゼ（desmoteplase）、ウロキナーゼ、オザグレルナトリウム、アスピリン）、選択的トロンビン阻害薬（例、アルガトロバン）、ヘパリン、低分子ヘパリン、ヘパリノイド、脳保護薬（例、エダラボン）、高張グリセロール、高張マンニトールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明の脳梗塞処置剤の投与を、機械的血栓回収療法、開頭外減圧療法、緊急頸動脈内膜剥離術、急性期再開通療法、急性期頸部頸動脈血行再建術（血管形成術／ステント留置術）などの外科的療法と組み合わせてもよい。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、脳梗塞の処置用医薬を製造するための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩の使用を提供する。式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容され得る塩はＶＡＰ−１阻害剤であり、ＶＡＰ−１関連疾患の予防または処置用医薬の製造に、特に脳梗塞の処置用医薬の製造に有用である。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、脳梗塞の処置方法であって、それを必要とする対象に治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容され得る塩を投与することを含む方法を提供する。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例（製造例および試験例）により、さらに詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
【００３５】
製造例１：２−｛４−［２−（３,４'−ビピリジン−６−イル）エチル］フェニル｝アセトヒドラジド
第１工程
５−ブロモピリジン−２−カルボアルデヒド（４.９７ｇ、２６.９ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液にエチレングリコール（８.３４ｇ、１３４ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（５１.２ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ）を加えた。発生する水を検水管で分離しながら、１３時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて攪拌、静置した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（５０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア BW-300SP １２０ｇ、酢酸エチル：ヘキサン＝２：３）で精製し、黄色粉末として、５−ブロモ−２−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン（５.２４ｇ、２２.８ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
【００３６】
第２工程
ブロモ−２−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン（２.０８ｇ、９.００ｍｍｏｌ）、ピリジン−４−イルボロン酸（１.２８ｇ、１０.４ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１０１ｍｇ、１.３μｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（７０８ｍｇ、２.７０ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１.９１ｇ、１８.０ｍｍｏｌ）、ジオキサン（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）の混合物を２５時間加熱還流した。室温まで冷却後、水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア BW-300SP １２０ｇ、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１→１０：１）で精製し、淡黄色固体として６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−３,４'−ビピリジン（１.９７ｇ、８.６０ｍｍｏｌ、収率９６％）を得た。
【００３７】
第３工程
６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−３,４'−ビピリジン（９６１ｇ、４.２１ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（６４０ｇ、３.３７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（２５ｍＬ）、水（５ｍＬ）の混合物を８０℃で８時間攪拌した。室温まで冷却後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）を加え、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア BW-300SP １００ｇ、アセトン）で精製し、黄色固体として３,４'−ビピリジン−６−カルボアルデヒド（５２５ｍｇ、２.８５ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。
【００３８】
第４工程
［４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンジル］（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（９０６ｍｇ、１.７９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７ｍＬ）懸濁液に０℃でｔ−ブトキシカリウム（２１６ｍｇ、１.７９ｍｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌した。３,４'−ビピリジン−６−カルボアルデヒド（３００ｍｇ、１.６３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。反応液に水（１０ｍＬ）を加えて酢酸エチルで３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、メチル｛４−［２−（３,４'−ビピリジン−６−イル）エテニル］フェニル｝アセテートとトリフェニルホスフィンオキシドとの混合物（５８０ｍｇ）を得た。
【００３９】
第５工程
前工程で得られたメチル｛４−［２−（３,４'−ビピリジン−６−イル）エテニル］フェニル｝アセテートとトリフェニルホスフィンオキシドとの混合物を酢酸エチル−エタノール混合溶媒（１：１、３０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（５０％含水、４００ｍｇ）を加え、室温、常圧水素添加した。反応液をセライト濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア BW-300SP ６０ｇ、酢酸エチル）で精製し、メチル｛４−［２−（３,４'−ビピリジン−６−イル）エチル］フェニル｝アセテート（２１８ｍｇ、０.６６ｍｍｏｌ、２工程通算収率４０％）を得た。
【００４０】
第６工程
メチル｛４−［２−（３,４'−ビピリジン−６−イル）エチル］フェニル｝アセテート（２１８ｍｇ、０.６６ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液にヒドラジン一水和物（３３４ｍｇ、６.６７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１９時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（富士シリシア BW-300SP ５０ｇ、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１）で精製した。目的物を含む分画を濃縮して得られた結晶を酢酸エチル−ジイソプロプルエーテル混合液（１：１、５ｍＬ）にて懸濁洗浄した。濾過、減圧乾燥し、白色固体として表題化合物（１５０ｍｇ、０.４５ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。
1H-NMR(CDCl3): 8.83 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.69 (dd, J = 4.4 Hz, 1.8 Hz, 2H), 7.82 (dd, J = 8.4 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 4.4 Hz, 1.8 Hz, 2H), 7.29 - 7.13 (m, 5H), 6.58 (brs, 1H), 3.83 (brs, 2H), 3.53 (s, 2H), 3.19 - 3.05 (m, 4H)
高分解能MS（ESI）：実測値 355.1515 [M+Na]+  理論値 355.1529 [M+Na]+
【００４１】
製造例２：２−｛４−［２−（３,３'−ビピリジン−６−イル）エチル］フェニル｝アセトヒドラジド
第１工程
製造例１の第２工程と類似の方法により、５−ブロモ−２−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン（２.０３ｍｇ、８.８２ｍｍｏｌ）とピリジン−３−イルボロン酸（１.２５ｇ、１０.２ｍｍｏｌ）から、淡黄色固体として６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−３,３'−ビピリジン（１.７８ｇ、７.８１ｍｍｏｌ、収率８９％）を得た。
【００４２】
第２工程
製造例１の第２工程と類似の方法により、６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）−３,３'−ビピリジン（１.７７ｇ、７.７５ｍｍｏｌ）から黄色固体として、３,４'−ビピリジン−６−カルボアルデヒド（７９７ｍｇ、４.３２ｍｍｏｌ、収率５６％）を得た。
【００４３】
第３工程〜第５工程
製造例１の第４〜第６工程と類似の方法により、［４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンジル］（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（７７８ｍｇ、１.５４ｍｍｏｌ）と３,４'−ビピリジン−６−カルボアルデヒド（２５８ｍｇ、１.５４ｍｍｏｌ）から白色固体として表題化合物（３３５ｍｇ、０.９４ｍｍｏｌ、収率６１％）を得た。
1H-NMR(CDCl3): 8.85 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.79 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.64 (dd, J = 4.7 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.88 (ddd, J = 7.7 Hz, 2.0 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.41(dd, J = 7.7 Hz, 4.7 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 6.60 (brs, 1H), 3.84 (brs, 2H), 3.55 (s, 2H), 3.20 - 3.06 (m, 4H)
高分解能MS（ESI）：実測値 355.1522 [M+Na]+  理論値 355.1529 [M+Na]+
【００４４】
製造例３：２−｛４−［２−（５−ピリミジン−５−イルピリジン−２−イル）エチル］フェニル｝アセトヒドラジド
第１工程
製造例１の第２工程と類似の方法により、５−ブロモ−２−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン（２.０６ｇ、８.９５ｍｍｏｌ）、ピリミジン−５−イルボロン酸（１.２８ｇ、１０.３ｍｍｏｌ）から、淡黄色固体として５−［６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン−３−イル］ピリミジン（１.２４ｇ、５.４１ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。
【００４５】
第２工程
製造例１の第２工程と類似の方法により、５−［６−（１,３−ジオキソラン−２−イル）ピリジン−３−イル］ピリミジン（１.２４ｇ、５.４１ｍｍｏｌ）から、黄色固体として５−ピリミジン−５−イルピリジン−２−カルボアルデヒド（４５３ｍｇ、２.４５ｍｍｏｌ、４５％）を得た。
【００４６】
第３工程〜第５工程
製造例１の第４〜第６工程と類似の方法により、［４−（２−メトキシ−２−オキソエチル）ベンジル］（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（９００ｍｇ、１.７８ｍｍｏｌ）と５−ピリミジン−５−イルピリジン−２−カルボアルデヒド（３００ｍｇ、１.６２ｍｍｏｌ）から、白色固体として表題化合物（１６２ｍｇ、０.４９ｍｍｏｌ、収率５２％）を得た。
1H-NMR(CDCl3): 9.25 (s, 1H), 8.95 (s, 2H), 8.79 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.0 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.34 - 7.10 (m, 5H), 6.58 (brs, 1H), 3.83 (brs, 2H), 3.53 (s, 2H),3.20 - 3.06 (m, 4H)
高分解能MS（ESI）：実測値 356.1461 [M+Na]+  理論値 356.1482 [M+Na]+
【００４７】
試験例１：ＳＳＡＯ阻害活性評価、ＭＡＯ−Ａ／Ｂ阻害活性評価
国際公開第２００９／１４５３６０号（特許文献２）に記載の方法により、製造例１〜３の化合物、試験例２の被験物質についてＳＳＡＯ（ＶＡＰ−１）阻害活性およびヒトモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ａ／Ｂ阻害活性を測定した。測定結果を下表に示す。
【表１】
2018080113.tif 000012
− 未試験
【００４８】
試験例２：ラット一過性局所脳虚血モデルを用いた薬効スクリーニング試験
試験物質
媒体として生理食塩液（ｐＨ４.０）を、被験物質として化合物１、化合物２、製造例１溶液（各０.２ｍｇ／ｍＬ）を、陽性対照物質としてエダラボン（田辺三菱製薬株式会社、販売名：ラジカット（登録商標）注３０ｍｇ）を使用した。
【表２】
2018080113.tif 000013
【００４９】
ラット一過性局所脳虚血モデルの作製
一過性局所脳虚血モデルの作製には、８週齢、体重２６０〜３５０ｇの雄性ラット（系統：Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）、供給源：日本チャールス・リバー株式会社）を使用した。ラットをイソフルラン（マイラン製薬株式会社）の２％吸入による麻酔下にて、仰臥位に固定した。右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を露出し、中大脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞するために総頸動脈および外頸動脈を縫合糸で結紮した。予めシリコン（ヘレウスクルツァージャパン株式会社）コーティングし、１９ｍｍの長さに切断した４号のナイロン糸（栓子）を外頸動脈と内頸動脈の分岐部より挿入し、ＭＣＡを閉塞した。ＭＣＡ閉塞後２時間に栓子を抜き、ＭＣＡの血流を再開させた。ＭＣＡ閉塞手術後、ベンジルペニシリンカリウム（Meiji Seika ファルマ株式会社）を２００００ｕｎｉｔｓ／ｋｇの用量で筋肉内投与した。ＭＣＡ閉塞後３０分に閉塞側の対側前肢の屈曲を確認した。
【００５０】
試験物質の投与
一過性局所脳虚血モデル作製手術の当日、ＭＣＡ再開通前３分およびＭＣＡ再開通後２時間に、媒体群（１０匹）には生理食塩液（ｐＨ４.０）を５ｍＬ／ｋｇの容量で尾静脈内に投与し、化合物１群、化合物２群および製造例１群（各１０匹）には、それぞれ化合物１、化合物２および製造例１を１回あたり１ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇの投与量で尾静脈内に２回投与した。また、陽性対照群はＭＣＡ再開通前３分およびＭＣＡ再開通後３０分に、陽性対照物質（エダラボン、田辺三菱製薬株式会社、販売名：ラジカット（登録商標）注３０ｍｇ）を１回あたり３ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇの用量で尾静脈内に２回投与した。
【００５１】
脳梗塞巣体積の算出
ＭＣＡ閉塞後２４時間に動物を断頭し、全脳を摘出して厚さ２ｍｍの脳切片を作製した。脳切片を１ｗ／ｖ％２,３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ナカライテスク株式会社）により染色し、写真撮影を行った。得られた写真を画像解析し、脳梗塞巣面積を実測値で求め、その値より脳梗塞巣体積を算出した。
【００５２】
統計学的解析
脳梗塞巣体積について、媒体群と化合物１群および陽性対照群と被験物質群の比較は Dunnett の多重比較検定にて、媒体群と陽性対照群の比較は Student のt検定にて行った。各検定では、解析ソフトSAS 9.1.3［EXSUS Version 7.7.1、SAS Institute Japan株式会社（株式会社CACエクシケア）］を用いた。有意水準は５％（両側）とし、１％および５％に分けて表示した。
【００５３】
結果
本試験の結果を図１に示す。媒体群、化合物１群、化合物２群、製造例１群および陽性対照群の脳梗塞巣体積は、それぞれ３４４.０±３６.３ｍｍ３（平均値±標準偏差、以下同じ）、２８７.７±４２.９ｍｍ３、３０５.２±４１.２ｍｍ３、２７３.２±５７.９ｍｍ３および２７３.７±５６.６ｍｍ３であった。化合物１および製造例１群の脳梗塞巣体積は、媒体群と比較して統計学的に有意な縮小が認められた。化合物１群、化合物２群および製造例１群の脳梗塞巣体積は、陽性対照群と比較して統計学的に有意な縮小は認められなかった。陽性対照群の脳梗塞巣体積は、媒体群と比較して低い値を示し、統計学的に有意な差が認められた。以上の結果より、化合物１および製造例１は脳梗塞巣体積縮小作用を有することが示唆される。
【００５４】
試験例３：ラット一過性局所脳虚血モデルを用いた用量反応性検討試験
試験物質
媒体として生理食塩液（ｐＨ６.０）を、被験物質として化合物１の３濃度（０.００５、０.０５、０.５ｍｇ／ｍＬ）を、陽性対照物質としてエダラボン（田辺三菱製薬株式会社、販売名：ラジカット（登録商標）注３０ｍｇ）を使用した。
ラット一過性局所脳虚血モデルの作製
試験例２と同様の試験方法でラット一過性局所脳虚血モデルを作製した。
【００５５】
試験物質の投与
一過性局所脳虚血モデル作製手術の当日、ＭＣＡ再開通前３分およびＭＣＡ再開通後２時間に、媒体群（１０匹）には生理食塩液（ｐＨ６.０）を、低用量群、中用量群および高用量群（各１０匹）には化合物１をそれぞれ０.０１、０.１および１ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇの投与量で尾静脈内に投与した。また、化合物１［投与量：１ｍｇ／ｋｇ／回（高用量）］およびエダラボン（田辺三菱製薬株式会社、販売名：ラジカット（登録商標）注３０ｍｇ、３ｍｇ／ｋｇ／回、再開通直前、再開通後３０分の２回投与）の併用投与並びにエダラボン投与（３ｍｇ／ｋｇ／回、再開通直前、再開通後３０分の２回投与）も尾静脈内に行った。
【００５６】
脳梗塞巣体積の算出
試験例２と同様の試験方法で脳梗塞巣体積を算出した。
統計学的解析
脳梗塞巣体積について、媒体群と低用量群、中用量群および高用量群との間ではDunnett の多重比較検定にて、媒体群と陽性対照群の間並びに化合物１（高用量）およびエダラボンの併用（以下、併用）群と陽性対照群の間では Student のt検定にて比較した。比較には、解析ソフトSAS 9.1.3［EXSUS Version 7.7.1、SAS Institute Japan 株式会社（株式会社CACエクシケア）］を用いた。有意水準は５％（両側）とし、１％および５％に分けて表示した。
【００５７】
結果
本試験の結果を図２に示す。媒体群、低用量群、中用量群、高用量群、陽性対照群および併用群の脳梗塞巣体積は、それぞれ３５８.０±４０.７ｍｍ３（平均値±標準偏差、以下同じ）、３２２.１±１９.６ｍｍ３、２９３.６±２９.７ｍｍ３、２５９.７±８０.０ｍｍ３、２６３.０±５０.７ｍｍ３および２６２.０±５２.２ｍｍ３であった。化合物１は用量依存的かつ中用量群および高用量群で媒体群と比較して有意な脳梗塞巣体積縮小を示した。高用量群と併用群の間および併用群と陽性対照群の間で脳梗塞巣体積に有意差は認められなかった。
【００５８】
試験例４：ラット一過性局所脳虚血モデルを用いた行動薬理学的評価試験
試験物質
被験物質として、化合物１（０.５ｍｇ／ｍＬ）を使用した。媒体および陽性対照物質は試験例３と同様の物質を使用した。
ラット一過性局所脳虚血モデルの作製
試験例２と同様の試験方法でラット一過性局所脳虚血モデルを作製した。
【００５９】
試験物質の投与
化合物１（投与量：１ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇ）は、モデル作製日に３回（再開通直前、再開通後２時間および８時間）、ＭＣＡ閉塞・再開通後１〜６日に２回（９時および２１時）尾静脈内に投与した。陽性対照物質（エダラボン、田辺三菱製薬株式会社、販売名：ラジカット（登録商標）注３０ｍｇ）は、モデル作製日に２回（再開通直前、再開通後３０分）、ＭＣＡ閉塞・再開通後１〜６日には化合物１同様に尾静脈内に投与した。
【００６０】
神経症状スコアの評価
神経症状の評価はBedersonらの方法（Bederson J.B., Pitts L.H., Tsuji M. Nishimura M.C., Davis R.L., Bartkowski H. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986; 17: 472-476）を参考にＭＣＡ閉塞・再開通後３、７および１４日（以下、それぞれ３、７、１４日後）に実施した。観察は午前中に実施した。
【００６１】
ロータロッドテスト
ロータロッドテストはモデル作製前１日または２日並びに３、７および１４日後に実施した。なお、３、７および１４日後は、神経症状観察後にロータロッドテストを実施した。回転速度を８回／分に設定したロータロッドを用いて、回転棒上の滞在時間（秒）を測定した。最長測定時間は１２０秒間とした。なお、モデル作製前１〜３日のうち続けて２日、回転棒上に滞在できるように動物の訓練を行い、回転棒上に１２０秒間滞在できるラットをモデル作製に供した。
【００６２】
統計学的解析
各観察日の神経症状スコアについて、各群間の比較をSteel-Dwass検定にて行った。各測定日の回転棒上の滞在時間については、各群間の比較をTukey-Kramer検定にて行った。
【００６３】
結果
本試験の結果を図３〜４に示す。３、７、１４日後の神経症状スコアは、媒体群ではそれぞれ２.９±０.３（平均値±標準偏差、以下同じ）、２.９±０.３および２.８±０.４、化合物１群ではそれぞれ２.８±０.４、２.５±０.７および２.１±０.７、陽性対照群ではそれぞれ２.７±０.５、２.５±０.７および２.１±０.７であった。３、７、１４日後の回転棒上の滞在時間は、媒体群ではそれぞれ１１.５±９.１秒、１４.２±１０.１秒および１７.０±１０.９秒であり、化合物１群ではそれぞれ１７.９±１９.０秒、３２.３±２３.８秒および５５.０±４４.０秒であり、陽性対照群ではそれぞれ１７.７±２６.２秒、３１.６±３１.０秒および５４.５±３９.７秒であった。化合物１群はＭＣＡ閉塞・再開通後１４日に陽性対照群と同程度かつ媒体群と比較して有意な神経症状スコアの低下（図３）および回転棒上の滞在時間の延長（図４）を示した。
【００６４】
試験例５：ラット自己血栓モデルを用いた薬効薬理試験
試験物質
媒体として生理食塩液（ｐＨ６.０）を、被験物質として化合物１（０.５ｍｇ／ｍＬ）を、血栓溶解剤としてｒｔＰＡ（アルテプラーゼ、協和発酵キリン株式会社、販売名：アクチバシン（登録商標）注６００万）を使用した。
【００６５】
ラット自己血栓モデル作製
自己血栓モデルの作製には、８週齢、体重１８０〜２６０ｇの雄性ラット（系統：Ｓｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ、供給源：日本エスエルシー株式会社）を使用した。
血栓の作製において、１.５〜２.０％イソフルラン吸入麻酔下で採血用動物の鎖骨下静脈から約２ｍＬ採血し、採血直後の血液に日本薬局方トロンビン１５０単位およびヒトフィブリノゲン末４０ｍｇを血液と混和させた。混和後、直ちにポリエチレンチューブ（PE8040、外径：０.８０ｍｍ、内径：０.４０ｍｍ、株式会社夏目製作所）に充填し、３７℃に設定したインキュベータ内に２４時間静置した。使用直前に血栓の形状を実体顕微鏡下で確認し、２５ｍｍに切断して使用した。
【００６６】
ラットを小動物実験用簡易吸入麻酔装置［NARCOBIT-E（II型）、株式会社夏目製作所］を用いて１.５〜２.０％イソフルラン吸入麻酔下で仰臥位に固定し、頸部正中切開にて右総頸動脈、外頸動脈、内頸動脈を露出し、外頸動脈を糸で結紮した。血栓を充填したテフロンチューブ（SLW-AWG32、内径：０.２０３ｍｍ、外径：０.３５５ｍｍ、株式会社ハギテック）を右外頸動脈から右内頸動脈を介して中大脳動脈の起始部まで挿入し、血栓を注入した。血栓注入後、チューブを抜き、頸部を縫合し、麻酔から解放した。
【００６７】
試験物質の投与
ラットを１.５〜２.０％イソフルラン吸入麻酔下にて仰臥位に固定し、頸部の縫合を解き、テフロンチューブを内頸動脈内に挿入し、そのテフロンチューブを介して血栓注入後２時間にインフュージョンポンプ（テルフュージョンシリンジポンプ３５型TE-351、テルモ株式会社）を用いてｒｔＰＡ（投与量：２００,０００ＩＵ／０.５ｍＬ／ラット）または生理食塩液（投与容量：０.５ｍＬ／ラット）を２ｍＬ／ｈの投与速度で１５分かけて投与した。なお、投与中には体温低下を防ぐため、３７.０℃に設定した小動物体温保持装置（BWT-100、バイオリサーチセンター株式会社）の上に動物を載せた。
【００６８】
ｒｔＰＡ投与（血栓注入後２時間、動脈内投与）下あるいは非投与（血栓注入後２時間、生理食塩液動脈内投与）下において化合物１を尾静脈内に投与した。化合物１（投与量：１ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇ）は４回（ｒｔＰＡあるいは生理食塩液の投与直前、投与後２時間、８時間および１４時間）尾静脈内に投与した。
【００６９】
神経症状の評価
神経症状の評価はW. E. Hoffmanらの方法（William E. Hoffman, Eberhard Kochs, Christian Werner, Chinamma Thomas, and Ronald F. Albrecht, Dexmedetomidine improves neurologic outcome from incomplete ischemia in the rat. Anesthesiology 75: 328-332, 1991）を参考に血栓注入後２４時間に行った。
【００７０】
統計学的解析
神経症状スコアでは、媒体群とｒｔＰＡ群の間、媒体群と化合物１群の間並びに媒体群と化合物１およびｒｔＰＡの併用（以下、併用）群の間でWilcoxon検定を行った。併用群とｒｔＰＡ群および化合物１群との間でSteel検定を行った。各検定では、SAS 9.3（SAS Institute社）を用いた。なお、検定はいずれも片側で行った。有意水準は５％とし、１および５％に分けて表示した。
【００７１】
結果
本試験の結果（死亡例は除く）を図５に示す。媒体群、ｒｔＰＡ群、化合物１群および併用群の神経症状スコアは、それぞれ１０.０±２.７（平均値±標準偏差、以下同じ）、７.５±３.１、７.６±３.３および６.４±３.８であった。ｒｔＰＡ非投与下での化合物１投与およびｒｔＰＡ投与下での化合物１投与により、媒体と比較して有意な神経症状スコアの低下が認められた（図５）。
【図１】
2018080113.tif 000022
【図２】
2018080113.tif 000023
【図３】
2018080113.tif 000024
【図４】
2018080113.tif 000025
【図５】
2018080113.tif 000026