(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍反応性Ｔ細胞を用いる養子細胞療法のための濃縮された腫瘍反応性Ｔ細胞集団を腫瘍から作製する方法の提供。【解決手段】a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；（b）混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ、−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得る方法であって、前記方法は、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれ
か１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び
（c）（b）において選択された前記細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、
を含む、方法。
【請求項２】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法であって、前記方法は、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれ
か１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること； 
（c）（b）において選択された前記細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び
（d）腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団を医薬上許容される担体と組
み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ること、
を含む、方法。
【請求項３】
（b）が、前記混合集団からＴＩＭ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（b）が、前記混合集団からＬＡＧ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（b）が、前記混合集団から４−１ＢＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（b）が、前記混合集団からＰＤ−１を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、（ii）４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、及び／または（iii）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
（b）が、前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+、及び／または（iii）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。 
【請求項１３】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団が、自己腫瘍認識についてスクリーニングすることなく得られる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞の前記混合集団が、（b）より前に非特異的に刺激されない、請求項１〜１３の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（c）において得られた前記濃縮された細胞集団においてＴ細胞の数を増加させること
を更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
TWS１１９、インターロイキン（ＩＬ−２１）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、
形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴインヒビター（AKTi）のいずれか１以上の
存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞
を用いて刺激することを更に含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（c）において得られた前記濃縮された集団の細胞にＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１
５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ−１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌクレオチド配列を形質導入またはトランスフェクトすることを更に含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって、単離され、または精製された細胞集団。
【請求項２０】
（a）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（b）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（c）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（d）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（e）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（f）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（g）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（h）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（i）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（j）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（k）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（l）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、
（m）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（n）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（o）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、
（p）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、
（q）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、及び
（r）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−Ｔ細胞、
のいずれか１以上を含む、単離され、または精製された細胞集団であって、
前記細胞集団が、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮される、細胞集団。
【請求項２１】
（a）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（b）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（c）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（d）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（e）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（f）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（g）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（h）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、
（i）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、
（j）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（k）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（l）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、
（m）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（n）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、
（o）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、
（p）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、
（q）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、または
（r）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−Ｔ細胞、
を含む、請求項２０に記載の単離され、または精製された細胞集団。
【請求項２２】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって、該細胞集団が、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれ
か１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び
（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、
を含む方法によって得られ、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団の哺乳動物への投与に使用するための、細胞集団。
【請求項２３】
（b）が、前記混合集団からＴＩＭ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
（b）が、前記混合集団からＬＡＧ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２または２３に記載の細胞集団。
【請求項２５】
（b）が、前記混合集団から４−１ＢＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項２６】
（b）が、前記混合集団からＰＤ−１を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項２７】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、（ii）４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、及び／または（iii）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２８】
（b）が、前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＬＡＧ−３−／ＰＤ
−１+、及び／または（iii）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２９】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項３０】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項３１】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項３２】
（b）が、前記混合集団から（i）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項３３】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団が、自己腫瘍認識についてスクリーニングをすることなく得られる、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３４】
Ｔ細胞の前記混合集団が、（b）より前に非特異的に刺激されない、請求項２２〜３３
のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３５】
（c）において得られた前記濃縮された細胞集団においてＴ細胞の数を増加させること
を更に含む、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３６】
TWS１１９、インターロイキン（ＩＬ−２１）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、
形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴインヒビター（AKTi）のいずれか１以上の
存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、
請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３７】
腫瘍抗原及び／または自己腫瘍Ｔ細胞を用いて、（c）において得られた前記濃縮され
た細胞集団を刺激することを更に含む、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３８】
ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ−１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌクレオチド配列を用いて、（c）にお
いて得られた前記濃縮された集団の前記細胞を形質導入またはトランスフェクトすることを更に含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３９】
癌の治療または予防に使用するための、請求項１及び３〜１８のいずれか１項において記載された方法によって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団、請求項２〜１８のいずれか１項に記載された方法によって得られた前記医薬組成物、または請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の前記細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１３年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７７１,２４
７号の利益を主張し、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の背景
腫瘍反応性Ｔ細胞を用いる養子細胞療法（Adoptive cell therapy，ACT）は、ある種の癌患者において明確な臨床反応を引き起こし得る。それにもかかわらず、癌及び他の病気の治療のためのＡＣＴの成功的な利用には、いくつかの障害が残っている。例えば、腫瘍から単離されたＴ細胞は、十分な腫瘍特異的反応性を示し得ない。従って、腫瘍から腫瘍反応性Ｔ細胞の集団を得る方法を改善する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の概要
本発明の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮（enriched）された細胞集団を得る方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団（bulk population）を得ること；（b）混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ及びＰＤ−１の
いずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び（c）（b）にお
いて選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性T細胞について
濃縮された細胞集団を得ること、を含む。
【０００４】
本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を、哺乳動物へ投与する方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得るこ
と；（b）ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現
するＣＤ８+Ｔ細胞を、混合集団から特異的に選択すること；（c）（b）において選択さ
れた細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動
物へ投与すること、を含む。
【０００５】
本発明のもう１つの実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を
得ること；（b）混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のい
ずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；（c）（b）において選
択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反応性T細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性T細胞について濃縮された細胞集団を含む
医薬組成物を得ることを含む。
【０００６】
本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって（a
）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；（b）混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡ
Ｇ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的
に選択すること；及び（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、を含む方法によって得られ、腫瘍反応性T細胞について濃縮された細胞集団の哺乳動物への投与に使用する
ための、細胞集団を提供する。
【０００７】
本発明の追加的な実施態様は、関連する細胞集団、及び癌を治療または予防する方法を
提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の見方の簡単な説明
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＣＤ７０を発現する、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルから単離されたＣＤ３+／ＣＤ８+細胞の百分率を示すグラフである。各ドットは、１の腫瘍を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３）から単離され、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３もしくは４−１ＢＢの発現、またはＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３もしくは４−１ＢＢの発現欠損によってソートされ、１４日間のインビトロ増加（in vitro expansion）（ＲＥＰ）後の、ＣＤ８+細胞数の倍増加（fold-expansion）を示すグラフである。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、５つの異なるメラノーマ腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３（Ａ）、ＦｒＴｕ♯３５５０（Ｂ）、ＦｒＴｕ♯３２８９（Ｃ）、ＦｒＴｕ♯２４４８（Ｄ）、またはＦｒＴｕ♯３７１３（Ｅ））の１つから単離されたＣＤ８+細胞による、インターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマ分泌（ｐｇ／ｍｌ）（黒棒）、またはＣＤ３、ＣＤ８、及び４−１ＢＢを発現するエフェクターＴ細胞（Teff）の百分率（灰色棒）を示す。細胞を、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、もしくは４−１ＢＢ発現、またはＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、もしくは４−１ＢＢ発現の欠損によってソートし、１４日間、インビトロで増加させた。インターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマ分泌及び４−１ＢＢ発現を、自己腫瘍細胞株との共培養時に分析した。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、メラノーマ腫瘍サンプルＦｒＴｕ♯１９１３から単離され、ＣＤ８発現（白円）、ＰＤ−１発現（黒円）、ＴＩＭ−３発現（黒ひし形）、ＬＡＧ−３発現（黒三角）または４−１ＢＢ発現（黒四角）、あるいはＰＤ−１発現の欠損（灰色円）、ＴＩＭ−３発現の欠損（灰色ひし形）、ＬＡＧ−３発現の欠損（灰色三角）、または４−１ＢＢ発現の欠損（灰色四角）でソートされたエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞による標的腫瘍細胞株ＴＣ１９１３（自己）（Ａ）、ＴＣ３２８９（同種異系）（Ｂ）、またはＴＣ２４４８（ＨＬＡ−Ａ０２０１適合）（Ｃ）の、示されたエフェクター：ターゲット比での特異的溶解の百分率を示す。図３Ｄ〜３Ｆは、メラノーマ腫瘍サンプルＦｒＴｕ♯３７１３（Ｄ−Ｆ）から単離され、ＣＤ８発現（白円）、ＰＤ−１発現（黒円）、ＴＩＭ−３発現（黒ひし形）、または４−１ＢＢ発現（黒四角）、あるいはＰＤ−１発現の欠損（灰色円）、ＴＩＭ−３発現の欠損（灰色ひし形）、または４−１ＢＢ発現の欠損（灰色四角）によってソートされたエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞による標的腫瘍細胞株ＴＣ３７１３（自己）（Ｄ）、ＴＣ３５５０（同種異系）（Ｅ）またはＴＣ１３７９（同種異系）（Ｆ）の示されたエフェクター：ターゲット比での特異的溶解の百分率を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、メラノーマ腫瘍（ＦｒＴｕ♯３７１３）から単離され、ＣＤ８+、ＰＤ−１+、ＰＤ−１−、４−１ＢＢ+、４−１ＢＢ−、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、または４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−によってソートされ、インビトロで１４日間増加させた細胞の自己腫瘍認識を示す。自己腫瘍細胞株との共培養時に４−１ＢＢを発現するＣＤ３+ＣＤ８+細胞の百分率を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、メラノーマ腫瘍（ＦｒＴｕ♯３６１２）から単離された後に、４−１ＢＢ（灰色棒）を発現し、またはＩＦＮ−ガンマ（黒棒）を分泌するＣＤ３+ＣＤ８+細胞の百分率を示すグラフである。細胞は、ＣＤ８+、ＰＤ−１+、ＰＤ−１−、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、または４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−集団についてソートされ、インビトロで１４日間増加させ、自己腫瘍細胞株との共培養時のＩＦＮ−ガンマ分泌及び４−１ＢＢ上方制御が示される。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、５１Ｃｒ放出分析（release assay）によって測定されるように、メラノーマ腫瘍（ＦｒＴｕ♯３７１３）から単離され、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−（円））、４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+（四角）、４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+（ひし形）、または４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−（U）集団についてソートされたエフェクターＣＤ８+細胞による標的腫瘍細胞株ＴＣ３７１３（自己）（Ａ）、ＴＣ３５５０（同種異系）（Ｂ）及びＴＣ１３７９（同種異系）（Ｃ）の、示された標的に対するエフェクターの比率での特異的溶解の百分率を示す。
【図６】図６は、胃腸腫瘍（ＦｒＴｕ♯３４４６ｂ）から単離され、ＣＤ８+、ＰＤ−１+、ＰＤ−１−、ＴＩＭ−３+、ＴＩＭ−３−、４−１ＢＢ+、または４−１ＢＢ−集団についてソートされ、培地において２１日間増加させた、４−１ＢＢ（灰色棒）を発現し、またはＩＦＮ−ガンマ（黒棒）を分泌するＣＤ８+細胞の百分率を示すグラフである。自己腫瘍細胞株との共培養時のＩＦＮ−ガンマ及び４−１ＢＢ上方制御を示す。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ソートされたＰＤ−１−細胞（２９８５ＴＣＲクロノタイプ）（Ａ）またはソートされたＰＤ−１+細胞（８０５ＴＣＲクロノタイプ）（Ｂ）の１４日間のインビトロ増加後の固有ＴＣＲベータ鎖ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の頻度（％）を示すグラフである。図７Ｃは、ソートされたＰＤ−１−細胞（黒円）またはソートされたＰＤ−１+細胞（灰色円）の固有ＴＣＲベータ鎖ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の頻度（％）を示すグラフである。
【図８】図８は、自己腫瘍細胞株によって特異的に発現される変異エピトープｐ１４ＡＲＦ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ（黒円）またはＨＬＡ−Ａ１１ｍｕｔ（灰色円）を認識する、ＰＤ−１−集団またはＰＤ−１+集団におけるＴＣＲβ鎖クロノタイプ、並びに未知の反応性を有するクロノタイプ（白円）の頻度（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の詳細な説明
ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有分子−３（T Cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-3））、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３；
ＣＤ２２３）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＰＤ−１（ＣＤ２７９）バイオマーカのいずれか１以上も発現するＣＤ８+細胞を選択することにより、新鮮な腫瘍サンプルから
単離された腫瘍反応性Ｔ細胞が濃縮されることが判明した。ＰＤ−１、４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３のいずれか１以上も発現するＣＤ８+細胞を選択することにより
、これらのマーカを発現しないＣＤ８+細胞と比べて、より多数の腫瘍反応性Ｔ細胞が有
利に濃縮される。
【００１１】
この点において、本発明の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得る方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以
上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び（c）（b）において選択され
た細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、を含む。本発明の方法は、有利には、患者へ細胞を投与する前に、細胞のインビトロでの培養時間を短くすることを可能にする。更に、本発明の方法は、有利には、自己腫瘍認識についてスクリーニングする必要なく患者へ投与されてよい、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を提供し得る。
【００１２】
本方法は、当分野で知られた任意の適切な方法によって腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ることを含み得る。例えば、腫瘍サンプルを解離して、特異的な細胞集団が選択され得る細胞懸濁液とすることによって、Ｔ細胞の混合集団を腫瘍サンプルから得ることができる。Ｔ細胞の混合集団を得るのに適切な方法としては、機械的に腫瘍を解離すること（例えば、細かに切ること）、酵素的に腫瘍を解離すること（例えば、消化すること）、及び吸引すること（例えば、針を用いるのと同様）のいずれか１以上が挙げられるが、これに限定されない。
【００１３】
腫瘍サンプルから得られたＴ細胞の混合集団は、Ｔ細胞の任意の適切なタイプを含み得る。好ましくは、腫瘍サンプルから得られたＴ細胞の混合集団は、腫瘍浸潤リンパ球（TILs）を含む。
【００１４】
腫瘍サンプルは、任意の哺乳動物から入手され得る。特に指定のない限り、本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語は、ウサギ等のウサギ目；ネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含む食肉目；ウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（豚）を含む偶蹄目；またはウマ科動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物のことをいう。哺乳動物は、例えば、サル目、セボイド（Ceboids）目、またはシモイド（Simoids）目（サル）あるいはアンスロポイド目（ヒト及び類人猿）の非ヒト霊長類であることが好ましい。いくつかの実施態様では、哺乳動物は、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は、非ヒト霊長類またはヒトである。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。
【００１５】
本方法は、混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含み得る。好ましい実施態
様では、本方法は、ＣＤ３も発現する細胞を選択することを含む。本方法は、任意の適切な方法において細胞を特異的に選択することを含み得る。好ましくは、当該選択は、フローサイトメトリーを用いて実施される。フローサイトメトリーは、当分野で知られた任意の適切な方法を用いて実施され得る。フローサイトメトリーは、任意の適切な抗体及び染色剤を使用し得る。例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、またはＰＤ−１の特異的な選択は、それぞれ抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＴＩＭ−３、抗ＬＡＧ−３、抗４−１ＢＢ、または抗ＰＤ−１抗体を用いてなされ得る。好ましくは、抗体は、選択されている特定のバイオマーカを特異的に認識し、結合するように選択される。抗体または複数の抗体は、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）または蛍光色素に結合し得る。好ましくは、フローサイトメトリーは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。
【００１６】
本発明の実施態様では、特異的に選択することは、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、もしくはＰＤ−１のいずれか１つ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ及びＰＤ−１の２つもしくは３つの任意の組み合わせ、またはＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１の４つ全ての発現に対して陽性であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択する
ことを含み得る。この点において、特異的に選択することは、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１つの発現に関し、シングルポジティブであるＴ細胞を特異的に選択すること、またはＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか２つ、３つまたは４つの同時共発現に対し、二重、三重、または四重陽性であるＴ細胞を特異的に選択することを含み得る。本発明の実施態様において、本方法は、混合集団からＴＩＭ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む。別の実
施態様では、本方法は、混合集団からＬＡＧ−３を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選
択することを含む。もう１つの実施態様では、本方法は、混合集団から４−１ＢＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含む。本発明のもう１つの実施態様では、
本方法は、混合集団からＰＤ−１を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを含
む。本発明の追加的な実施態様は、（i）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、（ii）４−１ＢＢ−
／ＰＤ−１+、及び／または（iii）４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む方法を提供する。本発明の別の実施態様は、（i）
ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+、及び／または（iii）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む方法を提供する。本発明のもう１つの実施態様は、（i）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+、（ii）Ｔ
ＩＭ−３−／ＰＤ−１+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む方法を提供する。本発明のもう１つの実施態様は、（i）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+、または（iii
）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む方法を提供する。本発明の別の実施態様は、（i）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択することを含む方法を提供する。本発明のもう一つ
の実施態様は、（i）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+、（ii）４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+、または（iii）４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選
択することを含む方法を提供する。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載された方法のいずれかは、ＣＤ３+も発現する細胞を選択することを更に含んでよい。
【００１７】
本発明の実施態様では、特異的に選択することは、本明細書中に記載されたマーカのいずれかを発現するＣＤ８+細胞の組み合わせを特異的に選択することを含み得る。この点
について、本方法は、腫瘍反応性細胞について濃縮された細胞集団であって、本明細書中に記載されたバイオマーカのいずれか２つ、３つ、４つまたはそれ以上を発現する細胞の混合物を含むものを作製し得る。本発明の実施態様では、特異的に選択することは、細胞の以下の組み合わせのいずれかを特異的に選択することを含む：（a）ＰＤ−１+細胞及び４−１ＢＢ+細胞、（b）ＰＤ−１+細胞及びＬＡＧ−３+細胞、（c）ＰＤ−１+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（d）４−１ＢＢ+細胞及びＬＡＧ−３+細胞、（e）４−１ＢＢ+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（f）ＬＡＧ−３+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（g）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、及びＬＡＧ−３+細胞、（h）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、及びＴ
ＩＭ−３+細胞、（i）ＰＤ−１+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞、（j）４−１ＢＢ+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞、並びに／あるいは（k）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記載された方法のいずれかは、ＣＤ８+及び／またはＣＤ３+も発現する細胞を選択することを更に含み得る。
【００１８】
本方法は、選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることを含み得る。この点において、選択された細胞は、選択されていない細胞から物理的に分離され得る。選択された細胞は、例えば、ソーティング等の任意の適切な方法によって、選択されていない細胞から分離され得る。選択されていない細胞から選択された細胞を分離することにより、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団が好ましくは作製される。
【００１９】
本発明の方法によって得られた細胞集団は、腫瘍反応性Ｔ細胞について有利に濃縮される。この点において、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上の発現によってソートすることにより得られなかった細胞集団に比べて、本発明の方法によって得られた細胞集団は、より高い割合の腫瘍反応性Ｔ細胞を含み得る。
【００２０】
本発明の実施態様では、本方法は、自己腫瘍認識についてスクリーニングすることなく、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ることを含む。この点において、本発明の方法は、自己腫瘍認識について細胞をスクリーニングする必要なく、腫瘍反応性を有する細胞について濃縮された細胞集団を有利に提供する。
【００２１】
本発明の実施態様では、本方法は、細胞を特異的に選択するより前に、Ｔ細胞の混合集団を非特異的に刺激することを含まない。この点において、本発明の方法は、Ｔ細胞の混合集団を非特異的に刺激（例えば、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いて）することなく、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を有利に提供する。
【００２２】
本発明の実施態様では、本方法は、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団においてインビトロでＴ細胞数を増大させることを更に含む。Ｔ細胞の数は、少なくとも
約３倍（または４、５、６、７、８、もしくは９倍）、より好ましくは少なくとも約１０倍（または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０倍）、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１,０００倍、または最も好ま
しくは少なくとも約１００，０００倍に増加され得る。Ｔ細胞の数は、その分野において知られた任意の適切な方法を用いて増加され得る。細胞数を増大させる典型的な方法は、米国特許第８,０３４,３３４号及び米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号において記述され、そのそれぞれは、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【００２３】
本発明の実施態様では、本方法は、ＴＷＳ１１９、インターロイキン（ＩＬ）−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴイン
ヒビター（AKTi）のいずれか１以上の存在下、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団を培養することを更に含む。特定の理論に拘束されることなく、ＴＷＳ１１９、ＩＬ−２１、及び／またはＩＬ−１２の存在下において、濃縮された細胞集団を培養することにより、濃縮された細胞集団の分化を抑制または遅らせることによって、濃縮された細胞集団の抗腫瘍反応性が有利に促進され得ると考えられている。
【００２４】
本発明の実施態様では、本方法は、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ−１ ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌ
クレオチド配列を用いて、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られた濃縮された集団の細胞を形質導入すること、またはトランスフェクトすることを更に含む。
【００２５】
本発明の実施態様では、本方法は、本発明の方法によって得られた濃縮された細胞集団を、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で刺激することを更に含む。癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で濃縮された細胞集団を刺激することは、任意の適切な方法によってなされ得る。例えば、濃縮された細胞集団を刺激することは、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞を濃縮された細胞集団に物理的に接触させることによってなされ得る。特定の理論に拘束されることなく、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞で濃縮された細胞集団を刺激することにより、濃縮された細胞集団の抗腫瘍反応性が有利に促進され得ると考えられる。
【００２６】
本明細書中において使用される「癌抗原」という用語は、抗原が腫瘍または癌に関連付けられるように、腫瘍細胞または癌細胞によってもっぱらまたは大部分が発現され、または過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物等）のことをいう。癌抗原は、正常、非腫瘍、または非癌性細胞によって追加的に発現され得る。しかしながら、このような場合には、正常、非腫瘍、または非癌性細胞による癌抗原の発現は、腫瘍または癌細胞による発現程に強く（robust）ない。この点において、腫瘍または癌細胞は、抗原を過剰発現し得、または正常、非腫瘍、もしくは非癌性細胞による抗原の発現に比べて、より有意に高いレベルにおいて抗原を発現し得る。また、癌抗原は、発生または成熟（maturation）の異なる状態の細胞によって追加的に発現され得る。例えば、癌抗原は、胚形成期または胎児期の細胞によって追加的に発現され得、該細胞は、成体宿主（adult host）において通常みられない。あるいは、癌抗原は、幹細胞または前駆細胞によって追加的に発現され得、該細胞は、成体宿主には通常みられない。
【００２７】
癌抗原は、本明細書中に記述された癌及び腫瘍を含む、任意の癌または腫瘍のいずれかの細胞によって発現される抗原であり得る。癌抗原は、１種類のみの癌または腫瘍に関連づけられ、またはこれらに特徴的であるように、１種類のみの癌または腫瘍の癌抗原であり得る。代わりに、癌抗原は、２種類以上の癌または腫瘍の癌抗原（例えば、特徴的であり得る）であり得る。例えば、癌抗原は、乳癌及び前立腺癌細胞の両方によって発現され、正常、非腫瘍、または非癌性細胞によって全く発現されなくてもよい。典型的な癌抗原としては、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ
３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、血管内皮増殖因子受容体２（VEGFR−２）、ＨＥＲ−２、メソテリン（mesothelin）、及び上皮細胞増殖因子受容体変異体III（epidermal growth factor receptor variant III, EGFR III）のいずれか１以上が挙げられ得る。
【００２８】
本発明の方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を有利に作製する。Ｔ細胞は、腫瘍細胞を特異的に認識し、溶解し、及び／または殺すように腫瘍反応性であり得る。この点において、本発明の実施態様は、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって、単離され、または精製された細胞集団を提供する。実施態様では、単離され、または精製された細胞集団は、（a）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（b）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（c）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（d）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（e）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（f）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（g）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（h）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（i）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（j）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（k）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（l）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、（m）
ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（n）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（o）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、（p）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、（q）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、及び（r）Ｃ
Ｄ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−Ｔ細胞のいずれか１以上を含み、細胞集団は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮される。本発明の別の実施態様では、単離され、または精製された細胞集団が、（a）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（b）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（c）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（d）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（e）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（f）ＣＤ８+／ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（g）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（h）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+Ｔ細胞、（i）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−Ｔ細胞、（j）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（k）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（l）ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、（m
）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３+Ｔ細胞、（n）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＬＡＧ−
３+Ｔ細胞、（o）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＬＡＧ−３−Ｔ細胞、（p）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、（q）ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＴＩＭ−３+Ｔ細胞、または（r）ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＴＩＭ−３−Ｔ細胞を含む。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された細胞集団のいずれかは、ＣＤ３+でもあり得る。
【００２９】
本発明の実施態様では、単離され、または精製された細胞集団は、本明細書中に記述されたバイオマーカのいずれかを発現する細胞の混合物を含む。例えば、単離され、または精製された細胞集団は、（a）ＰＤ−１+細胞及び４−１ＢＢ+細胞、（b）ＰＤ−１+細胞
及びＬＡＧ−３+細胞、（c）ＰＤ−１+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（d）４−１ＢＢ+細胞及びＬＡＧ−３+細胞、（e）４−１ＢＢ+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（f）ＬＡＧ−３+細胞及びＴＩＭ−３+細胞、（g）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、及びＬＡＧ−３+細胞
、（h）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞、（i）ＰＤ−１+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞、（j）４−１ＢＢ+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及
びＴＩＭ−３+細胞、並びに／または（k）ＰＤ−１+細胞、４−１ＢＢ+細胞、ＬＡＧ−３+細胞、及びＴＩＭ−３+細胞の組み合わせを含み得る。本発明の別の実施態様では、本明細書中に記述された細胞集団のいずれかはまた、ＣＤ８+及び／またはＣＤ３+であり得る。
【００３０】
本明細書中において使用される「単離され（isolated）」という用語は、その天然の環
境から取り出されていることを意味する。本明細書中において使用される「精製され（purified）」という用語は、純度を増加させたことを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈されない。例えば、純度は、少なくとも約５０%であり得
、６０%、７０%もしくは８０%より大きく、９０%より大きく、あるいは１００%であり得
る。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物へ投与する方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること
；（b）ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現す
るＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択すること；（c）（b）において選択された
細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物へ
投与すること、を含む。腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること、混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現するＣＤ８+
Ｔ細胞を特異的に選択すること、並びに、選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、細胞集団を得ることは、本発明の他の態様について本明細書中に記述されたようになされ得る。
【００３２】
本方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物へ投与することを更に含み得る。腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団は、任意の適切な方法において投与され得る。好ましくは、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団は、例えば、静脈に注射することによって投与される。
【００３３】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団は、医薬組成物等の組成物中に含まれ得る。この点において、本発明は、本明細書中に記述された細胞集団のいずれか及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施態様は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法を提供し、該方法は：（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得るこ
と；（b）ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現
するＣＤ８+Ｔ細胞を混合集団から特異的に選択すること；（c）（b）において選択され
た細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び（d）腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許
容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ること、を含む。腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１のいずれか１以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を
混合集団から特異的に選択すること、並びに、選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、細胞集団を得ることは、本発明の他の態様について本明細書中に記述されたようになされ得る。
【００３５】
本方法は、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ることを含み得る。好ましくは、担体は、医薬上許容される担体である。医薬組成物に関し、担体は、細胞の投与のために従来使用されるもののいずれかであり得る。かかる医薬上許容される担体は、当業者に周知であり、公に容易に利用可能である。医薬上許容される担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性を全く有さないものであることが好ましい。注射用の細胞のための適切な医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水（水中における約０.９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中における約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、
または水１リットル当たり約９.０ｇＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Abbott、シカゴ，IL）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ Ａ （バクスター、ディアフィールド、IL）
、水中における約５％ブドウ糖、または乳酸リンゲル液等の任意の等張性担体が挙げられ得る。実施態様において、医薬上許容される担体には、ヒト血清アルブメン（albumen）
が追加される。
【００３６】
本発明の目的のため、投与される用量（dose）、例えば、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団における細胞の数は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物において、例えば治療応答または予防応答などをもたらすのに十分でなければならない。例えば、細胞の数は、投与時点から約２時間またはそれ以上、例えば、１２〜２４時間またはそれ以上の期間において、癌抗原と結合するため、または癌を検出、治療若しくは予防するために、十分でなければならない。ある実施態様では、時間は、更に長くなり得る。細胞の数は、例えば、特定の細胞の有効性及び哺乳動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療対象の哺乳動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるだろう。
【００３７】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団から、投与される細胞の数を決定するための多くの分析が、その分野において知られている。本発明の目的のため、分析は、それぞれ異なる数の細胞が与えられる１セットの哺乳動物間で、ある哺乳動物へ所与の数のかかる細胞が投与された時に、標的細胞が溶解される程度、またはＩＦＮ−g 及びＩＬ−２等の１以上のサイトカインが分泌される程度を比較することを含み、該分析が、哺乳動物に投与される開始数を決定するために使用され得る。ある数の細胞の投与時に、標的細胞が溶解される程度、または例えば、ＩＦＮ−g 及びＩＬ−２等のサイトカインが分泌される程度は、その分野において知られた方法によって分析され得る。例えば、ＩＬ−２等のサイトカインの分泌は、細胞調製物（cell preparation）の品質（例えば、表現型及び／または有効性）の指標も提供し得る。
【００３８】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された本発明の細胞集団からの細胞の数は、特定の細胞集団の投与に伴い得る有害な副作用の存在、類型及び程度によっても決定されるだろう。通常、主治医が、年齢、体重、全体的な健康、食生活、性別、投与ルート、及び治療されている疾患の重症度等の多様な要因を考慮して、それぞれ個々の患者を治療するための細胞の数を決定するだろう。例として、本発明を制限する意図なく、細胞の数は、注入１回当たり（per infusion）約１０ ｘ １０６から約１０ x １０１１細胞、注入１回当たり
約１０ ｘ １０９細胞から約１０ ｘ １０１１細胞、または注入１回当たり１０ ｘ １０７から約１０ ｘ １０９細胞であり得る。本発明の方法によって得られた細胞集団は、有利には、効果的に癌を治療または予防することを可能にし得る。
【００３９】
本発明の方法によって得られた細胞集団は、癌を治療または予防する方法において使用され得ると考えられる。この点において、本発明は、哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量で、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られた医薬組成物または細胞集団を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。本発明の別の実施態様は、哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、哺乳動物において癌を治療または予防するのに有効な量で、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかにより、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
「治療する，」及び「予防する」という用語、並びにその派生語は、本明細書中で使用される場合、１００%または完全な治療または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業
者が、潜在的な利益または治療的効果を有すると認識する治療または予防の様々な度合いがある。この点では、本発明の方法は、哺乳動物において任意の量または任意のレベルの癌の治療または予防をもたらし得る。更に、本発明の方法によってもたらされる治療または予防としては、治療または予防される疾患、例えば、癌の１以上の状態または症状の治療または予防が挙げられる。また、本明細書中の目的のために、「予防」は、疾患、また
はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
【００４１】
本発明の方法の目的のために、細胞集団が投与される場合において、細胞は、哺乳動物に対して同種または自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自家性である。
【００４２】
本発明の実施態様には、本明細書中に記述された本発明の方法のいずれかによって得られる濃縮された細胞集団のいずれかを投与する前に、哺乳動物のリンパ球を枯渇させること（lymphodepleting）が更に含まれる。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リン
パ球枯渇化学療法（nonmyeloablative lymphodepliting chemotherapy）、骨髄破壊的リ
ンパ球枯渇化学療法（myeloablative lymphodepleting chemotherapy）、全身照射（total body irradiation）等が挙げられるが、これらに限定され得ない。
【００４３】
本発明の方法に関し、癌は、肉腫（例えば、滑膜肉腫、骨肉種、子宮平滑筋肉腫（leiomyosarcoma uteri）、及び胞巣状横紋筋肉腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、肝細胞癌、神経膠腫、頭頸部癌、急性リンパ腫（acute lymphocytic cancer）、急性骨髄性白血病、骨肉種、脳腫瘍、乳癌、肛門癌、肛門管癌、または肛門直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌（cancer of the joints）、頸部癌、胆嚢癌、または胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、または中耳癌（middle ear）、口腔癌、外陰癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄癌（chronic myeloid cancer）、結腸癌（colon cancer）（例えば、結腸上皮性悪性腫瘍（colon carcinoma））、食道癌、子宮頚癌、消化管癌（例えば、
消化管カルチノイド腫瘍）、下咽頭癌、咽頭癌、肝癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵癌、腹膜癌（peritoneum cancer）、網癌（omentum cancer）、及び腸間膜癌（mesentery cancer）、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、小腸癌
、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌のいずれかを含む任意の癌であり得る。
【００４４】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、言うまでもなく、その範囲を多少なりとも限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１
本実施例は、新鮮なメラノーマ腫瘍消化物サンプルにおいてＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３または４−１ＢＢを発現するＣＤ３+／ＣＤ８+細胞の頻度を示す。本実施例は、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルから単離されたＣＤ８+Ｔ細胞による１）ＴＩＭ−３及び
ＰＤ−１、２）ＬＡＧ−３及びＰＤ−１、並びに３）ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の共発現も示す。本実施例は、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性細胞によるＰＤ−１、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３発現も示す。
【００４６】
新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルの機械的及び酵素的消化物から得られる単細胞懸濁液を、解凍し、サイトカイン非存在下において１ ｘ １０６細胞／ｍｌで一晩静置した。細胞を染色し、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＣＤ７０を発現するＣＤ３+ＣＤ８+細胞の百分率を、フローサイトメトリーによって測定した。結果を図１Ａに示す。図１Ａに示すように、新鮮な腫瘍消化物サンプルからのＣＤ３+／ＣＤ８+細胞は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３または４−１ＢＢを発現し得る。
【００４７】
別個の実験では、細胞を、２つの異なるメラノーマ腫瘍の新鮮なサンプルから得て、ＴＩＭ−３及びＰＤ−１の共発現、ＬＡＧ−３及びＰＤ−１の共発現、並びにＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の共発現を、生きている細胞及びＣＤ３+ＣＤ８+細胞についてゲーティング
されたフローサイトメトリーを用いて測定した。その結果、メラノーマ腫瘍に浸潤するＣＤ８+Ｔ細胞のサブセットが、１）ＴＩＭ−３及びＰＤ−１、２）ＬＡＧ−３及びＰＤ−
１、並びに３）ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３を共発現することが示された。
【００４８】
別個の実験では、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性Ｔ細胞におけるＰＤ−１、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３発現を、生きている細胞及びＣＤ３+ＣＤ８+細胞についてゲーティングされたフローサイトメトリーを用いて測定し、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性がないＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞のものと比較した。その結果、メラノーマ腫瘍に浸潤するＭＡＲＴ−１２７−３５反応性細胞が、ＭＡＲＴ−１２７−３５反応性がないＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞と比べて、高レベルのＰＤ−１、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３を発現することが示された。
【００４９】
実施例２
本実施例は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３及び４−１ＢＢの１つを発現するＣＤ３+ＣＤ８+細胞を特異的に選択し、選択された細胞の数を増加させる方法を示す。
【００５０】
新鮮なメラノーマ腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３）から得られた単細胞懸濁液を解凍し、サイトカイン非存在下で一晩静置し、その後、染色した。抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３及び４−１ＢＢ抗体を用いて、細胞を、以下のＣＤ３+集団にソートした：蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によるＣＤ８+、ＣＤ８+
／ＰＤ−１+、ＣＤ８+／ＬＡＧ３+、ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+、Ｃ
Ｄ８+／ＰＤ−１−、ＣＤ８+／ＬＡＧ３−、ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−、またはＣＤ８+／４−１ＢＢ−。細胞数を、その後、急速拡張プロトコル（rapid expansion protocol）を用いて増加させ（２００倍過剰照射されたフィーダー（200-fold excess irradiated feeder）、３０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３及び５００ＣＵ／ｍｌ ＩＬ−２）、単離された集団の増加倍率を測定した。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３及び４−１ＢＢの１つも発現するＣＤ８+細胞数が増加した。
【００５１】
実施例３
本実施例は、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルから単離され、ＣＤ８と、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及び４−１ＢＢの１つとの発現によってソートされたＴ細胞のインビトロでの反応性を示す。
【００５２】
４−１ＢＢ上方制御は、ＴＣＲ刺激の指標である。Ｔ細胞数を増加させた後、ＴＣＲ刺激の非存在下において、４−１ＢＢ発現が失われることが認められた。細胞数を増加させ、細胞を自己腫瘍細胞株とともに共培養した後、４−１ＢＢ発現を先に失って、腫瘍細胞株で刺激されたＴ細胞は、４−１ＢＢを再び発現するだろうということも認められた。従って、４−１ＢＢ発現を、自己腫瘍細胞株に対するＴＣＲ刺激マーカとして、自己腫瘍とともに共培養した２４時間後に測定する。
【００５３】
新鮮なメラノーマ腫瘍消化物サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３）からの単細胞懸濁液を、サイトカインを用いずに一晩静置し、以下の集団についてソートした：実施例３において記述された通り、ＦＡＣＳによるＣＤ８+、ＣＤ８+／ＰＤ−１+、ＣＤ８+／ＬＡＧ３+、
ＣＤ８+／ＴＩＭ−３+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+、ＣＤ８+／ＰＤ−１−、ＣＤ８+／ＬＡＧ３−、ＣＤ８+／ＴＩＭ−３−、またはＣＤ８+／４−１ＢＢ−集団。ソートされた細胞の数を、インビトロで１４日間増加させた。１４日目に、細胞を洗浄し、自己腫瘍細胞株（１ ｘ １０５エフェクター：１ ｘ １０５標的細胞）と共培養した。自己腫瘍細胞株（ＴＣ１９１３）及び同種異系（Allo.）腫瘍細胞株との共培養の２４時間後に、ＩＦＮ−ガ
ンマ放出、及び４−１ＢＢを発現するＣＤ８+細胞の百分率を定量することによって反応
性を評価した。Ｔ細胞によって標的とされる特異的変異エピトープ（ＣＤＫｎ２Ａ）を認
識するＣＤ８+細胞の百分率も、この特定のエピトープに対する四量体を用いて定量した
。結果を表１及び２ならびに図２Ａ〜２Ｅにおいて示す。
【００５４】
【表１】
2018148898.tif 000002
【００５５】
【表２】
2018148898.tif 000003
【００５６】
表１及び２に示すように、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルから単離され、かつＣＤ８発現、及びＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及び４−１ＢＢの１つの発現によってソートされたＴ細胞は、ＩＦＮ−ガンマ分泌、４−１ＢＢ発現、及びＣＤＫｎ２Ａを認識する細胞の百分率によって測定された通り、自己腫瘍細胞株に対して反応性を有する。図２Ａ−２Ｅに示すように、５つの異なる新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルのそれぞれから単離さ
れ、かつ、ＣＤ８発現、及びＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及び４−１ＢＢの１つの発現によってソートされたＴ細胞は、ＩＦＮ−ガンマ分泌及び４−１ＢＢ発現によって測定された通り、自己腫瘍細胞株に対する反応性を有する。
【００５７】
別個の実験では、実施例３に記述された通りに、細胞を、２つの独立の新鮮なメラノーマ腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３及びＦｒＴｕ♯３７１３）から単離し、ＣＤ８発現、並びにＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３または４−１ＢＢ発現によってソートした。ソートされた細胞数を、インビトロにおいて１４日間、増加させた。１５日目に、標的腫瘍細胞株（自己及び同種異系）を５１Ｃｒで標識し、図３Ａ〜３Ｆに示された比率においてエフェクター細胞とともに４時間、共培養した。５１Ｃｒ放出を、ガンマ計測によって３重に決定し、特異的溶解の百分率を、以下の式を用いて算出した：［（１分当たりの実験的カウント（ｃｐｍ）−自発的ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）］ × １００。結果を、図３Ａ〜３Ｆに示す。図３Ａ〜３Ｆに示すように、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３または４−１ＢＢの発現によってソートされた細胞は、自己腫瘍細胞株において溶解を行うことができた。
【００５８】
実施例４
本実施例は、メラノーマ腫瘍サンプルから単離され、かつ４−１ＢＢ及び／またはＰＤ−１の発現によってソートされたＣＤ８+細胞の反応性を示す。
【００５９】
細胞を、３人の患者からの新鮮なメラノーマ腫瘍サンプルから単離し、ＦＡＣＳによりＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−、ＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、ＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、ＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−、ＣＤ３+／ＣＤ８+／ＰＤ−１+、ＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ+、ＣＤ３+
／ＣＤ８+／ＰＤ−１−、またはＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ−集団についてソートし
た。ソートされた細胞を、自己腫瘍細胞とともに共培養し、４−１ＢＢ発現の上方制御を、フローサイトメトリーによって測定した。結果は、自己腫瘍を認識するＴ細胞（４−１ＢＢ発現の上方制御によって測定された通り）は、単独陽性ＰＤ−１+または４−１ＢＢ+発現細胞にみられ得るが、最も高頻度の腫瘍反応性細胞（４−１ＢＢ上方制御によって測定された通り）は、新鮮なメラノーマ腫瘍消化物サンプルにおいて４−１ＢＢ及びＰＤ−１の両方を共発現する集団においてみられたことを、３つの腫瘍サンプル全てに対して示した。
【００６０】
別個の実験では、細胞を、新鮮なメラノーマ腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３）から単離し、ＦＡＣＳによりＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、ＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、及びＣＤ３+／ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−集団に
ついてソートし、ソートされた細胞からクローンを樹立した。クローンを、自己腫瘍細胞株とともに共培養し、４−１ＢＢ発現の上方制御をフローサイトメトリーによって測定し、ＩＦＮ−ガンマ分泌を測定した。結果は、最も高頻度の腫瘍反応性クローン（４−１ＢＢ上方制御及びＩＦＮ−ガンマ分泌によって測定された通り）が、ＰＤ−１及び４−１ＢＢの両方を共発現する集団においてみられることを示した。
【００６１】
別個の実験では、メラノーマ腫瘍ＦｒＴｕ♯３７１３からの単細胞懸濁液を、サイトカインを用いずに一晩静置し、細胞を、ＦＡＣＳによりＣＤ８+、ＣＤ８+／ＰＤ−１+、Ｃ
Ｄ８+ＰＤ−１−、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ−、ＣＤ８+／４−１Ｂ
Ｂ+／ＰＤ−１−、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−
１+、及びＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−集団についてソートした。メラノーマ腫瘍ＦｒＴｕ♯３６１２からの単細胞懸濁液を、サイトカインを用いずに一晩静置し、細胞を、ＦＡＣＳによりＣＤ８+、ＣＤ８+／ＰＤ−１+、ＣＤ８+ＰＤ−１−、ＣＤ８+／４−１
ＢＢ+／ＰＤ−１−、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ
−１+、及びＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−集団についてソートした。ソートされた細胞数を、１４日間、インビトロで増加させた。１４日目に、細胞を洗浄し、自己腫瘍細胞株（１ x １０５エフェクター：１ x １０５標的細胞）と共培養し、共培養から２４時間後に４−１ＢＢを発現するＣＤ８+細胞の百分率（ＦｒＴｕ♯３６１２及びＦｒＴｕ♯
３７１３）及び／またはＩＦＮ−ガンマ分泌の量（ＦｒＴｕ♯３６１２）を定量することによって、反応性を評価した。結果を、図４Ａ及び４Ｂに示す。図４Ａに示すように、二重陽性ＰＤ−１及び４−１ＢＢ共発現によってソートされた細胞は、単独陽性ＰＤ−１または４−１ＢＢ発現に基づいてソートされた細胞によって示された４−１ＢＢ上方制御と、同様のレベルの４−１ＢＢ上方制御を示した。図４Ｂに示すように、二重陽性ＰＤ−１及び４−１ＢＢ共発現によってソートされた細胞は、単独陽性ＰＤ−１発現に基づいてソートされた細胞によって示された４−１ＢＢ上方制御及びＩＦＮ−ガンマ分泌と、同様のレベルの４−１ＢＢ上方制御及びＩＦＮ−ガンマ分泌を示した。
【００６２】
別個の実験では、メラノーマ腫瘍ＦｒＴｕ♯３７１３から単離された細胞は、ＦＡＣＳによりＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１−、ＣＤ８+／４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+、ＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１+、及びＣＤ８+／４−１ＢＢ−／ＰＤ−１−集団についてソートされた。ソートされた細胞数を、１４日間インビトロで増加させた。１５日目に、標的腫瘍細胞株（自己及び同種異系）を、５１Ｃｒで標識し、図５Ａ〜５Ｃに示す比率においてエフェクター細胞とともに４時間、共培養した。５１Ｃｒ放出を、γ−カウントによって３重に決定し、特異的溶解の百分率を、以下の式を用いて算出した：［（実験的ｃｐｍ
− 自発的ｃｐｍ）／（最大 ｃｐｍ − 自発的ｃｐｍ）］ × １００。結果を、図５Ａ
〜５Ｃに示す。図５Ａ〜５Ｃに示すように、４−１ＢＢ+単独陽性発現、ＰＤ−１+単独陽性発現、または二重陽性４−１ＢＢ+／ＰＤ−１+発現によってソートされた細胞は、インビトロで自己腫瘍細胞を溶解することができる。
【００６３】
実施例５
本実施例は、胃腸（GI）管腫瘍サンプルから単離され、かつＰＤ−１、ＴＩＭ−３、または４−１ＢＢ発現によってソートされたＣＤ８+細胞の反応性を示す。
【００６４】
新鮮な胃腸（GI）管腫瘍サンプル（ＦｒＴｕ♯３４４６b）からの単細胞懸濁液をサイ
トカインを用いることなく一晩静置し、ＦＡＣＳによりＰＤ−１、ＴＩＭ−３、または４−１ＢＢの発現に従ってソートした。ソートされた細胞数を、１４日間、インビトロで増加させた。１４日目に細胞を洗浄し、自己腫瘍細胞株（１ ｘ １０５ エフェクター： １
ｘ １０５標的細胞）と共培養し、共培養の２４時間後に、ＩＦＮ−ガンマ放出と、４−１ＢＢを発現するＣＤ８+細胞の百分率とを定量することによって反応性を評価した。結
果を図６に示す。図６に示すように、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、または４−１ＢＢ発現に従ってソートされた細胞は、４−１ＢＢ発現によって測定された通り、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、または４−１ＢＢ発現をそれぞれ欠損する細胞集団の腫瘍反応性に比べて、より大きな腫瘍反応性を示した。ＩＦＮ−ガンマ分泌は全く検出されなかったが、４−１ＢＢの特異的上方制御により、細胞が腫瘍反応性であったことが示される。
【００６５】
実施例６
本実施例では、細胞数をインビトロで増加させた後に、ＰＤ−１+でソートされた細胞
がＰＤ−１−細胞よりもオリゴクローナルであることを示す。本実施例では、ＰＤ−１+
でソートされた細胞は、細胞数をインビトロで増加させた後に、自己腫瘍によって発現された変異エピトープを標的とするクローンを含むことも示す。
【００６６】
新鮮なメラノーマ腫瘍消化物サンプル（ＦｒＴｕ♯１９１３）からの単細胞懸濁液を、サイトカインを用いずに一晩静置し、ＦＡＣＳによりＰＤ−１発現に従ってソートした。ソートされた細胞数を、インビトロで１４日間、増加させた。ＴＣＲベータ鎖ＲＮＡを、
μＭＡＣＳ ＲＮＡ単離キット（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて抽出した。ｃＤＮＡ合成及び５’ＲＡＣＥを行った。サンプルの同定のために、ＰＣＲによって、ＰＣＲ産物の末端にバーコード配列を導入した。ＰＣＲ産物を洗浄し、ライブラリーのサイズを定量した。ディープシーケンス（Deep sequencing）を行った（Illumina, Inc., San Diego, CA）。集団における各固有ＴＣＲベータ鎖ＣＤＲ３領域アミノ酸配列の頻度を決定した。結果を図７Ａ〜７Ｃに示す。図７Ａ〜７Ｃに示すように、細胞数をインビトロで増加させた後、ＰＤ−１+でソートされた細胞は、ＰＤ−１−細胞よりもオリゴクローナルで
ある。
【００６７】
ＰＤ−１+集団における２０個の最も高頻度のクロノタイプを図８に示す。図８に示す
ように、細胞数を増加させた後にＰＤ−１+でソートされた細胞における最も高頻度のＴ
ＣＲベータ鎖クロノタイプは、ＰＤ−１−画分（fraction）において低頻度にみられた。図８に示すように、自己腫瘍細胞株によって発現される変異エピトープを認識するクローンは、ＰＤ−１+集団における２０個の最も高頻度のクローン内にみられ、ＰＤ−１−集
団において非常に低頻度にみられた。これらの結果は、変異エピトープを標的とする腫瘍反応性クローンが、新鮮な腫瘍サンプルにおいてＰＤ−１を初期に発現したことを示した。
【００６８】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本発明を説明する文脈における“a”及び“an”及び「前記（the）」及び「少なくとも１つ（at least one）」という用語及び同様の指示対象の使用（特に、以下のクレームの文脈において）は、異なるように明細書中に示され、または文脈によって明確に否定されなければ、単数形及び複数形の両方をカバーするように解釈されるべきである。異なるように明細書中に示され、または文脈によって明確に否定されなければ、１以上の項目のリストが次に来る「少なくとも１つ（at least one）」という用語の使用（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、リストされた項目（ＡまたはＢ）から選択された１の項目、または２以上のリストされた項目の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するべく解釈される。「含む（comprising）」「有する（having）」「含む（including）」及び「含
有する（containing）」という用語は、異なるように言及されなければ、オープンエンド用語（すなわち、「を含むが、これに限定されない」ということを意味する）として解釈されるべきである。明細書中の数値範囲の記述は、本明細書中に異なるように示されなければ、範囲に入るそれぞれ別々の値に個別に言及する略記方法として役立つことを意図したに過ぎず、それぞれ別々の値が、本明細書中に個別に挙げられたように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中において異なるように指摘されなければ、あるいは文脈によって異なるように明確に否定されなければ、明細書中に記述された全ての方法が、任意の適切な順序で行うことができる。異なるようにクレームされていなければ、本明細書中で提供された任意の及び全ての実施例または例示的な言葉（例えば、「等（such as）」）の
使用は、単に本発明の理解をより容易にすることが意図されており、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中におけるいかなる言葉も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【００７０】
本発明の好ましい実施の態様は、本明細書中に記述されており、本発明を実施するために本発明者らが知っている最良の形態を含んでいる。これらの好ましい実施の態様の変形例は、先の記述を読んだ当業者にとって明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、必要に応じてかかる変形例を採用するものと思っており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記述されたものとは異なるように本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された要旨の、適用され得る法律
によって許容されるすべての修正形態及び均等物を含む。さらに、本明細書中に異なるように示され、あるいは文脈によって異なるように明確に否定されなければ、これらの全ての可能な変形例において上述された要素の任意の組み合わせは、本発明に包含される。
【図１Ａ】
2018148898.tif 000004
【図１Ｂ】
2018148898.tif 000005
【図２】
2018148898.tif 000006
【図３】
2018148898.tif 000007
【図４Ａ】
2018148898.tif 000008
【図４Ｂ】
2018148898.tif 000009
【図５】
2018148898.tif 000010
【図６】
2018148898.tif 000011
【図７】
2018148898.tif 000012
【図８】
2018148898.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月25日(2018.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得る方法であって、前記方法は、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３＋、または（ii）ＴＩＭ−３＋であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び
（c）（b）において選択された前記細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、
を含む、方法。
【請求項２】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得る方法であって、前記方法は、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３＋、または（ii）ＴＩＭ−３＋であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること； 
（c）（b）において選択された前記細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること；及び
（d）腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団を医薬上許容される担体と組み合わせて、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を含む医薬組成物を得ること、
を含む、方法。
【請求項３】
（b）が、前記混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、及びＰＤ−１の２以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（b）が、前記混合集団からＬＡＧ−３＋／ＰＤ−１＋、またはＴＩＭ−３＋／ＰＤ−１＋であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団が、自己腫瘍認識についてスクリーニングすることなく得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞の前記混合集団が、（b）より前に非特異的に刺激されない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（c）において得られた前記濃縮された細胞集団においてＴ細胞の数を増加させることを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
TWS１１９、インターロイキン（ＩＬ）−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴインヒビター（AKTi）のいずれか１以上の存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を、癌抗原及び／または自己腫瘍細胞を用いて刺激することを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（c）において得られた前記濃縮された集団の細胞にＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ−１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌクレオチド配列を形質導入またはトランスフェクトすることを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団であって、単離され、または精製された細胞集団。
【請求項１２】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を哺乳動物に投与するための組成物であって、該組成物が、
（a）腫瘍サンプルからＴ細胞の混合集団を得ること；
（b）前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３＋、または（ii）ＴＩＭ−３＋であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択すること；及び
（c）（b）において選択された細胞を、選択されていない細胞から分離して、腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された細胞集団を得ること、
を含む方法によって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団を含む、組成物。
【請求項１３】
（b）が、前記混合集団からＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、及びＰＤ−１の２以上を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項１４】
（b）が、前記混合集団からＬＡＧ−３＋／ＰＤ−１＋またはＴＩＭ−３＋／ＰＤ−１＋を発現するＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
（b）が、前記混合集団から（i）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＬＡＧ−３−／ＰＤ−１+、及び／または（iii）ＬＡＧ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＰＤ−１+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＰＤ−１−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
（b）が、前記混合集団から（i）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３+、（ii）ＴＩＭ−３−／ＬＡＧ−３+、または（iii）ＴＩＭ−３+／ＬＡＧ−３−であるＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に選択することを更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団が、自己腫瘍認識についてスクリーニングをすることなく得られる、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｔ細胞の前記混合集団が、（b）より前に非特異的に刺激されない、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記方法が、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団においてＴ細胞の数を増加させることを更に含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記方法が、TWS１１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、形質転換成長因子（TGF）ベータ、及びＡＫＴインヒビター（AKTi）のいずれか１以上の存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記方法が、腫瘍抗原及び／または自己腫瘍Ｔ細胞を用いて、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を刺激することを更に含む、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記方法が、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ｍｉｒ１５５、及び抗ＰＤ−１ｓｉＲＮＡのいずれか１以上をコードするヌクレオチド配列を用いて、（c）において得られた前記濃縮された集団の前記細胞を形質導入またはトランスフェクトすることを更に含む、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記方法が、ＯＫＴ３の存在下で、（c）において得られた前記濃縮された細胞集団を培養することを更に含む、請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
癌の治療または予防のための組成物であって、前記組成物が、請求項１〜１０のいずれか１項において記載された方法によって得られた腫瘍反応性Ｔ細胞について濃縮された前記細胞集団、または請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の前記組成物を含む、組成物。
【外国語明細書】
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2018148898000002.pdf
2018148898000003.pdf
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