(57)【要約】      （修正有）【課題】非天然アルブミン結合ドメイン、それをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらのドメイン及びポリヌクレオチドの作製方法及び使用方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。特定のアミノ酸配列において、１、２、３、４、５、又は６の残基における置換を有する配列を含み、前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、特定のアミノ酸位置Ｙ２１、Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、Ｉ４２、及びＡ４５の１つ以上で生じる単離されたアルブミン結合ドメイン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又
は１００％同一のアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
【請求項２】
１、２、３、４、５、又は６の残基における置換を有する配列番号２１のアミノ酸を含
む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
【請求項３】
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置
Ｙ２１、Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、
Ｉ４２、及びＡ４５の１つ以上で生じる、請求項２に記載の単離されたアルブミン結合ド
メイン。
【請求項４】
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置
Ｙ２１、Ｙ２２、Ｋ３０、Ｔ３１、Ａ３７、及びＥ４１の１つ以上で生じる、請求項２に
記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項５】
Ｎ端末に５つのアミノ酸の伸長部分を更に含む、請求項１に記載の単離されたアルブミ
ン結合ドメイン。
【請求項６】
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４２、４３、及び４５〜５５からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン
。
【請求項７】
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記
載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項８】
配列番号２１〜３４又は４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離され
た非天然アルブミン結合。
【請求項９】
Ｎ端末に５つのアミノ酸の伸長部分を更に含む、請求項８に記載の単離されたアルブミ
ン結合ドメイン。
【請求項１０】
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４２、４３、又は４５〜５５のアミノ酸配
列を含む、請求項９に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項１１】
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記
載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項１２】
前記アルブミン結合ドメインが、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００
５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、ＧＬＣセンサーチップを用い
たＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ−３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）を使用して、約５０ｐＭ〜１μＭの間のヒトアルブミンへの結合の解離定数（ＫD
）を有する、請求項１に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項１３】
前記アルブミン結合ドメインが、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００
５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、ＧＬＣセンサーチップを用い
たＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ−３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）を使用して、３．６×１０-5〜１．１×１０-1のヒトアルブミンへの結合のオフレ
ート定数（Ｋｏｆｆ）を有する、請求項１に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離されたアルブミン結合ドメインの作製方法であって、
ａ）前記単離されたアルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する
工程と、
ｂ）宿主で又はインビトロで前記ポリヌクレオチドを発現する工程と、
ｃ）前記単離されたアルブミン結合ドメインを回収する工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のアルブミン結合ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド
。
【請求項１６】
配列番号２１〜３４又は４４からなる群から選択されるアルブミン結合ドメインをコー
ドするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３５のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１５、１６又は１７に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、単離されたベ
クター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１、５又は８のいずれか一項に記載のアルブミン結合ドメインと、生物活性剤と
を含む、融合タンパク質。
【請求項２１】
前記生物活性剤が、標的分子に特異的に結合するタンパク質スカフォールドである、請
求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質スカフォールドが、配列番号３９のアミノ酸残基１〜９０又はその変異
体を含むＴｅｎｃｏｎ２５に基づくものである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記アルブミン結合タンパク質及び前記生物活性剤が、リンカーを使用して、操作可能
に連結される、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記リンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、請求項２３に記載の融合タンパク質
。
【請求項２５】
前記リンカーが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の融合タンパ
ク質。
【請求項２６】
請求項２０に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体又は
希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン結合ドメイン並びにそれらの作製方法及び使用方法に関する。よ
り具体的には、本発明は、本明細書に記載する非天然アルブミン結合ドメインのコンセン
サス配列、及びその変異体を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
腎クリアランスを介した生物学的治療分子の急速な排除は、患者のための臨床的有効性
の制限又はより頻繁な投与の一因となる。５０，０００ダルトンを超える分子量を有する
分子については腎臓濾過率が大幅に減少されるため、糸球体濾過による腎クリアランスに
は、ほとんどの場合、より小さい生物学的治療薬が伴う（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒ
ｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：８６８〜７６、２０１１）。いくつかの承
認された生物学的治療薬は活性部分を含み、それらは自ら濾過限界より低くなるため、迅
速にクリアされる。この制限を克服するために、腎臓濾過を減らすために治療薬分子の大
きさを有効に増し、結果として半減期を増加させるための数々の技術が導入されてきた。
【０００３】
治療薬のＰＥＧ化（ＰＥＧ）は、タンパク質の流体力学的半径を増大させ、糸球体濾過
を減少させる有効な方法である。１つ又は複数のＰＥＧ鎖は、最も一般的には、タンパク
質の表面上の遊離チオール基又はアミン基とのコンジュゲーションを介して、タンパク質
に結合することができる。アデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフ
ェロンα−２ｂ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、ウリカーゼ、及び
抗ＴＮＦα抗体フラグメントのＰＥＧ化バージョンは全て、ヒトの治療のために承認され
ている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：８
６８〜７６，２０１１）。ＰＥＧ化の制限としては、異種生成物の生産、及び特定のタン
パク質に結合したＰＥＧ分子の数を制御することの難しさが挙げられる。ＰＥＧ化により
治療薬タンパク質の生産のための追加的なコンジュゲーション工程及び精製工程が導入さ
れるので、結果的に収率が下がり、製品コストが上がる。ＰＥＧ化はまた、ＰＥＧ鎖が腎
臓において非分解性であるために、動物及び患者の尿細管の空胞形成につながる場合があ
る（Ｇａｂｅｒｃ−Ｐｏｒｅｋａｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  
Ｄｅｖｅｌ  １１：２４２〜２５０、２００８）。
【０００４】
治療用分子の血清半減期を増加させるために、抗体のＦｃ領域に治療薬を結合してＦｃ
融合タンパク質を生成することを、用いることができる。免疫グロブリンは、それらの大
きなサイズ及びＦｃＲｎを介したリサイクルによって約数週間という長い半減期を示す場
合がある（Ｋｕｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：７７７〜７８９、２０１０
）。ＴＮＦ受容体２、ＬＦＡ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１Ｒ、及びＴＰＯ模倣ペプチド
分子は全て、Ｆｃの融合としてもたらされる承認された治療法である（Ｋｏｎｔｅｒｍａ
ｎｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：８６８〜７６、２０１１）。
Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの理由から、全ての治療薬クラスのために理想的ではな
い。Ｆｃ領域のホモ二量体型の性質は、二量体型治療薬タンパク質の産生をもたらし、受
容体のクラスター化による細胞活性化をもたらす可能性がある。また、Ｆｃ融合は、哺乳
類発現系で行う必要もあり、これは原核生物系より費用がかかる場合がある。
【０００５】
Ｆｃの他では、アルブミンが、ＦｃＲｎのリサイクルに起因する長い半減期をインビボ
で示す。約４０ｇ／Ｌの濃度で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血液中に見られる最
も豊富なタンパク質である。ＦｃＲｎのリサイクルは、ヒトで約１９日間の長い半減期を
もたらす。加えて、生体内分布の研究は、炎症関節又は腫瘍などの疾患を標的化するため
の体内の重要な区域にアルブミンを分配し得ることを示唆している（Ｗｕｎｄｅｒら、Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４７９３〜４８０１、２００３）。したがって、多くのタン
パク質の血清半減期の増加は、ＨＳＡへのＣ末端又はＮ末端融合のいずれかとしてそれら
を生産することによって行われてきた。融合物の成功例としては、インターフェロンα（
Ｆｌｉｓｉａｋ  ａｎｄ  Ｆｌｉｓｉａｋ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅ
ｒ  １０：１５０９〜１５１５、２０１０）、ヒト成長ホルモン（Ｏｓｂｏｒｎら、Ｅｕ
ｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４５６：１４９〜１５８、２００２）、腫瘍壊死因子（Ｍ
ｕｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９６：７９
３〜７９９、２０１０）、凝固因子ＩＸ（Ｍｅｔｚｎｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏ
ｓｔ  １０２：６３４〜６４４、２００９）、凝固因子ＶＩＩａ（Ｓｃｈｕｌｔｅ、Ｔｈ
ｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １２２  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ１４〜１９、２００８）、インスリン（
Ｄｕｔｔａｒｏｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：２５１〜２５８、２００５）、ウロキナ
ーゼ（Ｂｒｅｔｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３１：５６３〜５６９、１９９
５）、ヒルジン（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｓｉｓ  １２：４３３〜４４３、２００１）、及び二重特異性抗体フラグメント（Ｍｕ
ｌｌｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：１２６５０〜１２６６０、２００７）が
挙げられる。ＨＳＡ融合タンパク質は、長い血清半減期を有することができるが、これら
の融合タンパク質の大規模生産は、酵母発現系に主に限定されている。更に、ＨＳＡの大
きいサイズは、立体障害による治療活性の損失につながり得る。
【０００６】
治療用タンパク質はまた、それらの半減期を増加させるために血流中の血清アルブミン
に結合するペプチド又はタンパク質との融合タンパク質としても生産することができる。
そのようなアルブミン結合ペプチドとしては、システイン拘束性ペプチド又はアルブミン
抗体フラグメントが挙げられる。システイン拘束性ペプチドへの融合としてのＦａｂ抗体
フラグメントの発現は、Ｆａｂの血清半減期を有意に増加させた（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ  
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３５０３５〜３５０４３、２００２；米国特許第２００４
／０２５３２４７Ａ１号）。抗体フラグメントにシステイン拘束性ペプチドを結合するこ
とは、同じ抗原を標的化するＦａｂ及びｍＡｂ分子と比較して、より良好なピーク腫瘍蓄
積及びより均一な腫瘍分布を導いた（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：２
５４〜２６１、２００７；ＵＳ２００５／０２８７１５３Ａ１）。更に、アルブミンに特
異的に結合する多くの抗体フラグメントは、治療薬構成部分に結合されて、治療薬の半減
期を増加した。ＨＳＡに結合するラクダのＶHH抗体フラグメント（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ
（登録商標））を、ＴＮＦ−αに結合する別のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（Ｃｏｐｐ
ｉｅｔｅｒｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：１８５６〜１８６６、２００
６）又は抗ＥＧＦＲ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｔｉｊｉｎｋら、Ｍｏｌ  Ｃ
ａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２２８８〜２２９７、２００８）に融合した。アルブミンに
結合する抗アルブミンドメイン抗体（ｄＡｂｓ）が生成され、それらの半減期を改善する
ために、例えば、インターロイキン−１受容体（Ｈｏｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  
Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２１：２８３〜２８８、２００８）及びインターロイキンα  ２ｂ（Ｗ
ａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３：２７１〜２７８、２０
１０）に融合された。
【０００７】
周知のように、細菌由来の天然に生じる数々のタンパク質ドメインは、アルブミンと相
互作用して、そのような細菌が宿主生物全体に分散するのを助けると推定されている。そ
れらは、サイズが約６ｋＤａの３へリックスバンドルのタンパク質ドメインであり、３へ
リックスバンドルの一面を利用して、血清アルブミンと相互作用する（Ｃｒａｍｅｒら、
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８１：３１７８〜３１８２、２００７；Ｌｅｊｏｎら、Ａｃｔａ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｓｅｃｔ  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔ  Ｃｏ
ｍｍｕｎ  ６４：６４〜６９、２００８；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  
３７４：２５７〜２６１、１９９５；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２
６６：８５９〜８６５、１９９７；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２
７７：８１１４〜８１２０、２００２）。そのようなアルブミン結合ドメインの１つは、
連鎖球菌タンパク質Ｇ由来であり（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ
Ｓｅｌ  ２１：５１５〜５２７、２００８）、タンパク質の血清半減期を延ばすために
最も広く使用されてきた。このドメインとの融合は、１型可溶性補完受容体（Ｍａｋｒｉ
ｄｅｓら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２７７：５３４〜５４２、１９
９６）、二重特異性抗体（Ｓｔｏｒｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２
０：５６９〜５７６、２００７）、ＣＤ４（Ｎｙｇｒｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９１：
３６３〜３６８、１９９１；米国特許第６２６７，９６４Ｂ１号）、Ｐｆ１５５／ＲＥＳ
Ａ（Ｓｔａｈｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２４：４３〜５２、１９８
９）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｆｒｅｊｄ、Ｆ．ＰＥＧＳ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ５，２
０１０）、及び多くの標的に結合するアフィボディ分子（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉ
ｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：５２３４〜５２４１、２０１１）（Ｆｒｅｊｄ、Ｆ．ＰＥＧＳ
Ｅｕｒｏｐｅ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ５，２０１０）の半減期を増加させることが示されて
いる。しかし、このドメインに対する抗体産生が患者において報告されており、したがっ
て、治療用途としてのこの分子の使用は困難であり得る（Ｇｏｅｔｓｃｈら、Ｃｌｉｎ  
Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１２５〜１３２、２００３；Ｌｉｂｏｎら
，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：４０６〜４１４、１９９９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルブミンに結合する数々のタンパク質ドメイン又はペプチドは、血清半減期を延長す
ること、及び治療タンパク質のより有益な生体内分布パターンを生成することができる。
治療用途でこれらのアルブミン結合ドメインを使用するためには、宿主における高い発現
レベル、溶解性及び安定性、並びに最小限の免疫原性など、多くの生物物理学的要件を満
たす必要がある。アルブミンに結合しているときと結合していないときの治療薬構成部分
の活性を用いて、血清半減期と生体内分布とを効果的に均衡する親和性によって、アルブ
ミン結合部分が血清アルブミンに結合する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する単離された非天然アルブミン
結合ドメインを含むタンパク質である。本発明の別の態様は、配列番号２１と少なくとも
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む単離さ
れた非天然アルブミン結合ドメインである。
【００１０】
本発明のまた別の態様は、１、２、３、４、５及び／又は６の残基での置換を有し、好
ましくは、１、２、３、４、５及び／又は６の残基での置換が、配列番号２１のＹ２１、
Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、Ｉ４２及
び／若しくはＡ４５、又は配列番号２１のＹ２１、Ｙ２２、Ｋ３０、Ｔ３１、Ａ３７、及
び／若しくはＥ４１のアミノ酸の位置で生じ得る、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単
離された非天然アルブミン結合ドメインである。
【００１１】
本発明の更なる態様は、アミノ酸配列：ＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＸ
1Ｘ2ＦＤＬＩＮＫＡＸ3Ｘ4ＶＥＧＶＮＸ5ＬＫＤＸ6ＩＬＫＡ（配列番号２２）を含む単離
された非天然アルブミン結合ドメインであり、そのＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、及びＸ6は
、任意のアミノ酸又は特定のアミノ酸のサブセットであり得る。
【００１２】
本発明の更なる態様において、単離された非天然アルブミン結合ドメインは、そのＮ末
端に５つのアミノ酸の伸長部分（extension）を含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明の非天然アルブミン結合ドメインの作製方法であり、この
方法は、非天然アルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と
、宿主又はインビトロでポリヌクレオチドを発現させる工程と、非天然アルブミン結合ド
メインを回収する工程と、を含む。本発明の別の態様は、本発明のアルブミン結合ドメイ
ンをコードする単離されたポリヌクレオチドである。本発明の別の態様は、配列番号３５
のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む単離されたベクター
と、本発明の単離されたベクターを含む宿主細胞である。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明のアルブミン結合タンパク質と生物活性剤とを含む融合タ
ンパク質である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の融合タンパク質と、少なくとも１つの医薬的に許容され
る担体又は希釈剤とを含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】精製されたＡＢＤＣｏｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。試料は、横列１）がＳｅｅＢｌｕｅプラス２メーカー、２）が全細胞溶解物、３）が可溶性細胞溶解物、４）がカラムフロースルー、５〜１２）が溶出画分である。いくつかのマーカーバンドの分子量を左側に示す。
【図２】精製されたＡＢＤＣｏｎ試料のエレクトロスプレーイオン化質量分析を示す。
【図３】ＰＢＳ中で実行される、精製されたＡＢＤｃｏｎのサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図４】ＰＢＳ中でＤＳＣによって測定されたＡ）溶融温度及びＢ）ＡＢＤＣｏｎのアンフォールディングの可逆性を示す。最初のスキャンの正規化されたベースライン減算データはＡに示されている。最初のスキャンの後、試料を２０℃に冷却し、スキャンを繰り返して、フォールディングの可逆性を決定した。パートＢでは、１回目及び２回目のスキャンについての生データトレースを重ねた。
【図５】２ｍｇ／ｋｇを静脈注射したマウスでのＴｅｎｃｏｎ２５−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質の薬物動態を示す。
【図６】ＡＢＤＣｏｎ（配列番号２１）、ＡＢＤＣｏｎ３（配列番号２６）、ＡＢＤｃｏｎ５（配列番号２８）、ＡＢＤＣｏｎ７（配列番号３０）、及びＡＢＤＣｏｎ９（配列番号３２）に融合したＴｅｎｃｏｎ２５（配列番号３９の残基１〜９０）分子を２ｍｇ／ｋｇ静脈注射したマウスでの薬物動態を示す。
【図７】ＰＢＳ中で０日又は２８日間、３７℃でインキュベートしたときに、ＡＢＤＣｏｎにＮ末端へリックス伸長を有する、Ａ）特定のＦＮ３ドメインＡＢＤＣｏｎ（配列番号１）融合タンパク質、及びＢ）ＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ１２（配列番号４６）融合タンパク質の安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用される用語「アルブミン結合ドメイン」又は「ドメイン」は、インビボ
又はインビトロでアルブミンに結合するポリペプチドを指す。アルブミンは、例えばヒト
、サル、又はげっ歯類など、任意の動物種に由来することができる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「ＫD」は、アルブミンとアルブミン結合ドメインとの間の
解離定数を指す。
【００２０】
本明細書で使用される用語「Ｋon」は、アルブミン結合ドメイン／アルブミン複合体を
形成するアルブミンへのアルブミン結合ドメインの会合に関するオンレート定数（on rat
e constant）を指す。
【００２１】
本明細書で使用される用語「Ｋoff」は、アルブミン結合ドメイン／アルブミン複合体
からのアルブミン結合ドメインの解離に関するオフレート定数（off rate constant）を
指す。
【００２２】
本明細書で使用される用語「非天然」は、合成のドメインすなわち、天然のポリペプチ
ドに存在しないアミノ酸配列を有するドメインを指す。
【００２３】
本明細書で使用される用語「置換する」又は「置換」は、ポリペプチド又はポリヌクレ
オチド配列の変異体を生成するために、その配列中の１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチ
ドを改変すること、欠失すること若しくは挿入すること、又はそれらの改変、欠失若しく
は挿入を指す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「変異体」は、例えば、置換、挿入、又は欠失等の１つ以上
の修飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポリペ
プチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００２５】
本明細書で使用される用語「生物活性剤」は、動物患者に投与されたときに、患者に利
益を提供する、タンパク質、抗体、ペプチド、ヌクレオチド、小分子医薬品等を指す。合
成的に生成される、天然に由来する、又は組換えにより生成される部分も、この用語に含
まれる。生物活性剤は、生物活性剤の類似体、誘導体、アゴニスト、アンタゴニスト、鏡
像異性体、又は医薬的に許容される塩であり得る。
【００２６】
本明細書で使用される用語「安定性」は、例えば半減期など、その正常な機能活性のう
ちの少なくとも１つを維持するように、生理学的条件下で折りたたみ状態を維持する分子
の能力を指す。
【００２７】
用語「ベクター」は、生体系内で複製されることができる、又はこうした系の間で移動
可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体
系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点
、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの配列を含有する。このような生体系の
例としては、細胞、細菌、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することのできる
生物学的成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを構成する
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であって
もよい。
【００２８】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示する
ために使用することができるベクターを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される用語「操作可能に連結された」は、構成要素がそれらの意図され
る様式で機能するように位置づけられていることを指す。
【００３０】
本明細書では、アミノ酸は、それらの標準の３つ又は１つの文字コードを用いて言及さ
れる。
【００３１】
アルブミン結合ドメイン組成物
本発明は、合成アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）（配列番号２１）及びその変
異体を提供する。ＡＢＤＣｏｎは、治療剤の血清半減期及び生体内分布の改善のために生
物活性剤と操作可能に連結され得る。ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は、大腸菌内で高レベ
ルに発現され得、可溶性であり、高い熱安定性を有する。本発明は、ＡＤＢＣｏｎ及びそ
の変異体をコードするポリヌクレオチド、相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれ
らを作製及び使用する方法を提供する。
【００３２】
本発明は、更に、Ｎ末端に５つのアミノ酸伸長部分を有する合成アルブミン結合ドメイ
ン（ＡＢＤＣｏｎ）を提供する。その伸長は、ＡＢＤＣｏｎの安定性を改善する。
【００３３】
このＡＢＤＣｏｎ結合ドメインは、連鎖球菌種のＧ１４８タンパク質Ｇ（配列番号１）
由来のＡＢＤをテンプレートとして用いて、非冗長タンパク質データベースに寄託された
特定の３へリックスバンドルアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）配列のコンセンサスアミ
ノ酸配列を計算し、各配列位置で最も優勢なアミノ酸を選択することにより、設計された
（表６）。本明細書に定めた条件を用いて試験したとき、ＡＢＤＣｏｎは、７５ｐＭのＫ
D及び３．０２×１０-5  １／ｓのＫoffを有し、ヒトアルブミンとの高親和性を有するも
のであり、したがって、ＡＢＤＣｏｎに操作可能に連結された生物活性剤は、動物患者に
投与されると、ほとんどがアルブミンに結合することができる。ヒト患者において、血清
アルブミンとの結合が弱すぎる分子は、腎臓濾過のために短い血清半減期を有することに
なり（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３：８２７〜８３４、
２０１０）、一方、血清アルブミンとの結合が強すぎる分子は、好ましい作用部位でアル
ブミンから解放されず、そのために、場合によっては、所望の標的の活性を調節する能力
及び治療の利益を提供する能力がより低いことがある。したがって、本発明の一態様は、
アルブミンとの親和性のスペクトルを有することにより、ＡＢＤＣｏｎ変異体及び結合ド
メインと操作可能に連結された生物活性剤の半減期を調節する能力を提供するＡＢＤＣｏ
ｎ変異体及び結合ドメインを有すること、並びにそれらを生成する能力を有することであ
る。
【００３４】
本発明の一実施形態は、配列番号２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、
８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイ
ン（ＡＢＤＣｏｎ）：ＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫ
ＴＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡである。
【００３５】
本発明の別の実施形態は、１、２、３、４、５、又は６の残基に置換を有する配列番号
２１のアミノ酸配列を含む、単離されたアルブミン結合ドメインである。
【００３６】
ＡＢＤＣｏｎ変異体は、アルブミンとの複合体中の代表的な３ヘリックスバンドルアル
ブミン結合タンパク質の結晶構造を調べ、代表的なタンパク質と同様のやり方でＡＢＤＣ
ｏｎがアルブミンに結合し得ると仮定することによって、設計することができる。利用し
得る例示的な結晶構造は、ヒトアルブミンとの複合体における嫌気性細菌フィネゴルディ
アマグナ（旧称、ペプトストレプトコッカスマグナス）のタンパク質ＰＡＢのＧＡモジュ
ール（タンパク質Ｇ関連アルブミン結合モジュール）の結晶構造である（タンパク質デー
タベース（ＰＤＢ）コード１ＴＦ０（Ｌｅｉｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：
４２９２４〜４２９２８、２００４））。
【００３７】
例えば、予測される疎水性接触の破壊、芳香族残基間の予測されるπスタッキングの破
壊、より大きいアミノ酸との置換による立体衝突の導入、帯電した残基の除去による塩橋
の破壊、及びＡＢＤＣｏｎとアルブミンとの間に生じることが予測される水素結合の破壊
など、多様な戦略によって、アルブミンとの親和性が減少されたＡＢＤＣｏｎを設計する
ことができる。導入される変更は、結合を無効にするようなやり方で結合表面を変更せず
に結合親和性を減少するように設計される。例えば、残基Ｙ２１を、荷電アミノ酸（Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）又はより小さいアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｙ）と置換して、
この残基とアルブミン残基Ｖ３２５及びＦ３２６との間の疎水性相互作用を減少すること
ができる。更に、ＡＢＤＣｏｎのＹ２１は、Ｐｈｅの変異のような小さい変化が相互作用
をわずかに弱めることができるように、アルブミン残基Ｎ３１８及びＤ３２４の骨格鎖と
の水素結合を形成する。ＡＢＤＣｏｎの残基Ｙ２２は、アルブミン残基Ｆ３０９及びＦ３
２６との疎水性相互作用及びπスタッキング相互作用を形成すると予測される。したがっ
て、より小さい中性のアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又は荷電アミノ酸Ｌｙｓ、Ａｒｇ
、Ａｓｐ又はＧｌｕをＹ２２と置換することは、疎水性接触を減少させ、アルブミンに対
するＡＢＤＣｏｎ変異体の親和性を低減することができる。ＡＢＤＣｏｎ中の残基Ｋ３０
がアルブミン残基Ｅ２２７と塩橋を形成することが予測されるので、反発電荷を導入し、
アルブミンに対するＡＢＤＣｏｎの親和性を潜在的に減少させるように、Ｋ３０をＡｓｐ
又はＧｌｕと置換することができる。任意の帯電されていないアミノ酸への変異もまた、
塩橋を排除することにより、親和性を減少させることができる。ＡＢＤＣｏｎの残基Ｔ３
１はアルブミン残基Ｎ２６７との分子間水素結合を形成すると予測され、相互作用を有意
に不安定にする可能性のある大きい立体衝突を導入せずに分子間水素結合を破壊するため
に、Ａｌａ又はＧｌｙの置換を用いることができる。立体衝突を導入するために、ＡＢＤ
Ｃｏｎ残基Ａ３７をＶａｌ、Ｔｙｒ、又は他の、より大きいアミノ酸と置換することがで
きる。残基Ｅ４１をＧｌｎ又はＡｓｎと置換して、電荷を取り除くことができる。Ｌｙｓ
又はＡｒｇなどの正に帯電した残基の導入は、結合親和性を更に減少させると期待され得
る。ＡＢＤＣｏｎ残基Ｌ２５、Ｅ３３、Ｇ３４、Ｌ３８、Ｉ４２、及びＡ４５は、アルブ
ミンとの直接接触を形成すると予測され、これらの残基での置換は、アルブミンとのＡＢ
ＤＣｏｎの親和性を調節する可能性がある。残基の位置は、配列番号２１のＡＢＤＣｏｎ
及び配列番号３６のヒトアルブミンを指す。
【００３８】
あるいは、特定の位置での置換のために例えばＮＮＫコドンなどを用いて、アミノ酸の
ランダムなカクテルを使用してもよく、得られた変異体のアルブミンとの結合を標準的方
法及び本明細書に記載の方法を用いて測定する。
【００３９】
代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、配列番号２１のＹ２１、Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ
３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、Ｉ４２及びＡ４５から選択される少な
くとも１つの残基に置換を有する変異体である。
【００４０】
代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、配列番号２１のＹ２１、Ｙ２２、Ｋ３０、Ｔ３１、Ａ
３７及びＥ４１から選択される少なくとも１つの残基に置換を有する変異体である。
【００４１】
代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、アミノ酸配列ＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴ
ＳＤＸ1Ｘ2ＦＤＬＩＮＫＡＸ3Ｘ4ＶＥＧＶＮＸ5ＬＫＤＸ6ＩＬＫＡ（配列番号２２）を含
み、そのＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、及びＸ6は任意のアミノ酸であり得る。
【００４２】
他の実施形態では、代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、アミノ酸配列ＬＫＥＡＫＥＫＡＩ
ＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＸ1Ｘ2ＦＤＬＩＮＫＡＸ3Ｘ4ＶＥＧＶＮＸ5ＬＫＤＸ6ＩＬＫＡ（
配列番号２３）を含み、
ｉ）Ｘ1は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸
（Ｅ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、フェニルアラニン（Ｆ）又はチロシン（Ｙ）
であり、
ｉｉ）Ｘ2は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）、アルギ
ニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はチロシン（Ｙ）であり、
ｉｉｉ）Ｘ3は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）又はリジン（Ｋ）であり
、
ｉｖ）Ｘ4は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はスレオニン（Ｔ）であり、
ｖ）Ｘ5は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）又はアラニン（Ａ）であり、
ｖｉ）Ｘ6は、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（
Ｒ）又はグルタミン酸（Ｅ）である。
【００４３】
他の実施形態では、代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、アミノ酸配列ＬＫＥＡＫＥＫＡＩ
ＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＸ1Ｘ2ＦＤＬＩＮＫＡＸ3Ｘ4ＶＥＧＶＮＸ5ＬＫＤＸ6ＩＬＫＡ（
配列番号２４）を含み、
ｉ）Ｘ1は、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）又はチロシン（Ｙ）であり、
ｉｉ）Ｘ2は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）又はチロシン（Ｙ）であ
り、
ｉｉｉ）Ｘ3は、アスパラギン酸（Ｄ）又はリジン（Ｋ）であり、
ｉｖ）Ｘ4は、アラニン（Ａ）又はスレオニン（Ｔ）であり、
ｖ）Ｘ5は、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）又はアラニン（Ａ）であり、
ｖｉ）Ｘ6は、グルタミン（Ｑ）又はグルタミン酸（Ｅ）である。
【００４４】
追加の代表的なＡＢＤＣｏｎ変異体は、配列番号２５〜３４に示されるアミノ酸配列を
含む。例えば、プラズモン共鳴を用いたインビトロアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ（スウェーデン））などの周知の方法を用いて、Ａ
ＢＤＣｏｎ変異体のアルブミン結合の試験を行う。特定のＡＢＤＣｏｎ変異体／アルブミ
ン相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測
定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原結合パラメータ（
例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、ＡＢＤＣｏｎ変異体とアルブミンの
標準化溶液、及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。Ａ
ＢＤＣｏｎ変異体のアルブミンへの親和性は、少なくとも約１×１０-5Ｍ、少なくとも約
１×１０-6Ｍ、少なくとも約１×１０-7Ｍ、少なくとも約１×１０-8Ｍ、少なくとも約１
×１０-9Ｍ、少なくとも約１×１０-10Ｍ、少なくとも約１×１０-11Ｍ、少なくとも約１
×１０-12Ｍ、又は少なくとも約１×１０-13Ｍの範囲であり得る。例えば、ＡＢＤＣｏｎ
変異体（配列番号２１）のＹ２２での様々な置換は、アルブミンとの変異体の親和性を、
置換に依存して、約３００〜１，０００倍減少させた（表４）。当業者は、定義された位
置又は位置の組み合わせにおける置換を有するその他の変異体を設計及び生成し、通常の
方法を用いて所望のアルブミン結合親和性を試験することができる。
【００４５】
ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は、更に、ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体のＮ末端への５つ
のアミノ酸の伸長部分の追加により修飾することができる。５つのアミノ酸の伸長部分は
、アミノ酸配列ＴＩＤＥＷＬ（配列番号４３）、又は配列番号４２又は４５〜５５に示さ
れる任意のアミノ酸配列からなる場合がある。Ｎ末端の５つのアミノ酸の伸長部分をＡＢ
ＤＣｏｎ及びその変異体に組み込むことは、分子の安定性を増加することができる。Ｎ末
端の５つのアミノ酸の伸長部分は、ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体の第１のαへリックスの
一部として構造上順番付けられてもよい。したがって、Ｎ末端の伸長分子の改善された安
定性は、へリックスの構造全体の安定化によるものであり得る。Ｎ末端のＡＢＤＣｏｎ変
異体は、標準的方法を用いて作ることができ、例えば熱安定性などそれらの安定性は、本
明細書に記載のように評価することができる。任意のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）
を５つのＮ末端アミノ酸の追加により修飾して、ＡＢＤ構造を安定化し、得られる分子の
熱安定性のような安定性を改善することができる。
【００４６】
安定性の改善、免疫原性の減少、溶解性又は任意の他の適切な特性の向上などの目的の
ために、アルブミンとの結合に影響しない残基でＡＢＤＣｏｎ及びその変異体を更に修飾
することができる。この目的を達成する一方法において、ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は
、任意に、親配列及び改変配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的改変
産物の分析プロセスによって調製され得る。三次元モデルが一般的に利用可能であり、当
業者によく知られている。選択された候補配列の考えられる三次元立体構造を図示し表示
するコンピュータプログラムが使用可能であり、潜在的な免疫原性を計測することができ
る（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）のＩｍｍｕｎｏｆｉｌ
ｔｅｒプログラム）。これらの表示の検査は、例えばＡＢＤＣｏｎドメインの安定性に影
響する残基など、候補配列の機能における残基の可能な役割の分析を可能にする。このよ
うに、残基は、改善された安定性などの所望の特徴が達成されるように、親配列及び基準
配列から選択及び組み合わされ得る。あるいは、又は上記の手順に加えて、他の好適な改
変方法が当該技術分野において既知であるように使用され得る。
【００４７】
本発明のアルブミン結合ドメインの望ましい物理特性は、高い熱安定性並びに熱フォー
ルディング及びアンフォールディングの可逆性を含む。タンパク質及び酵素の見かけの熱
安定性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジ
スルフィド架橋の安定化設計、α−ヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タン
パク質の表面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物を含む、いくつかの方法が
適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ，１２：３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパク質の収率を
増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェー
ンの必要性を最小化することができる。
【００４８】
本発明のアルブミン結合ドメインの任意の特徴を改善するように置換され得る残基は、
置換を行い、アルブミン結合ドメインの所望の特徴をアッセイすることによって決定され
得る。例えば、アルブミン結合ドメインの安定性に影響し得るＡＢＤＣｏｎ及びその変異
体における位置を特定するために、アラニンスキャニングを採用することができる。
【００４９】
安定性の消失に関しては、即ち、タンパク質が「変性する」又はタンパク質の「変性」
とは、タンパク質の機能特性を付与する三次元立体配座のうちのいくつか又は全てが、活
性及び／又は溶解度の付随損失と共に消失するプロセスを意味する。変性中に破壊される
力としては、分子内結合、例えば、静電力、疎水性力、ファン・デル・ワールス力、水素
結合、及びジスルフィドが挙げられる。タンパク質の変性は、タンパク質、又はタンパク
質を含む溶液に加えられる力、例えば、機械力（例えば、圧縮力又は剪断力）、熱応力、
浸透ストレス、ｐＨ、電界、又は磁界の変化、電離放射線照射、紫外線放射及び脱水など
、並びに化学的変性剤によって引き起こされ得る。
【００５０】
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性と同じ又は異な
る態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場
合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過、紫外線放射、γ線
照射によるなどの電離放射線、化学的又は熱脱水、あるいはタンパク質構造の破壊を引き
起こす可能性のあるその他の任意の作用又は力によって引き起こされる変性に対して感受
性がある、つまり「不安定」である。分子の安定性は、標準方法を用いて決定することが
できる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用いて、分子の半分がアンフォールディン
グされるセ氏（℃）での温度である、熱融解（「Ｔm」）温度を測定することによって決
定され得る。典型的には、Ｔmが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学
環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。
【００５１】
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤としては
、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ
、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム
、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン（dinitrothiobenzene）、及び
水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸類（例え
ば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば
、リン脂質）、並びに標的変性剤が挙げられる。変性の範囲の定量化は、標的分子に結合
する能力などの機能特性の消失、あるいは凝集する、これまで溶媒が到達しにくかった残
基が露出する、又はジスルフィド結合が破壊若しくは形成する傾向などの物理化学的性質
による消失に依存し得る。
【００５２】
ＡＢＤＣｏｎ結合ドメイン及びその変異体は、生物活性剤に操作可能に連結され得る。
代表的な生物活性剤は、周知のリンカーを使用してＡＢＤＣｏｎ及びその変異体に操作可
能に連結され得るペプチド及びタンパク質であり、例えば、ポリ−グリシン、グリシンと
セリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー）、又はアラニンとプロリンなどである。天然発生的及
び人工的なペプチドリンカーの使用は文献で周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ  Ｂ
ｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１０９〜１１６、１９９６；米国特許第５，８５６
，４５６号）。生物活性剤は、ＡＢＤＣｏｎ又はその変異体にそのＣ末端又はＮ末端から
連結され得る。多重特異性生物活性剤もまた、ＡＢＤＣｏｎに連結され得る。そのような
場合、ＡＢＤＣｏｎは分子のＮ末端又はＣ末端に連結され得る。ＡＢＤＣｏｎはまた、そ
れが１つの薬剤のＣ末端及び別の薬剤のＮ末端に連結されるように、そのような多重特異
性薬剤の内部に位置づけられてもよい。生物活性剤はまた、当該技術分野において周知の
化学的架橋を用いて、例えば、ヒドラゾン又はセミカルバゾン結合により、本発明のアル
ブミン結合ドメインに結合されてもよい。代表的な生物活性剤は、例えば、国際公開第２
０１１／１３７３１９Ａ２号及び同第２０１０／０９３６２７Ａ２号に記載されているＴ
ｅｎｃｏｎ２５系のライブラリーなど、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタ
ンパク質ライブラリーから同定されたタンパク質などの標的抗原に特異的に結合するタン
パク質である。
【００５３】
毒素複合体、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）分子、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウレート、ミリステ
ート、ステアレート、アラキダート、ベヘネート、オレエート、アラキドナート、オクタ
ン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸等、ポリリシン、オクタン
、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ又はポリサッカライド）など、追加の部
分が、所望の特性のために本発明のＡＢＤＣｏｎ又はその変異体に組み込まれ得る。これ
らの部分は、ＡＢＤＣｏｎコード配列との直接融合であってもよく、標準的なクローニン
グ及び発現技術によって生成できる。あるいは、組み換え技術によって産生された本発明
のＡＢＤＣｏｎにその部分を付着させるために、よく知られている化学的結合方法を使用
することができる。
【００５４】
ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体、並びに生物活性剤とＡＢＤＣｏｎの融合タンパク質の半
減期は、インビボモデルにおいて、周知の薬物動態特性を用いて評価され得る。代表的な
ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は、約１ｐＭ〜１μＭの間、約７５ｐＭ〜８６０ｎＭの間、
１００ｐＭ〜５００ｎＭの間、又は１ｎＭ〜１００ｎＭの間のＫDでアルブミンと結合す
る。
【００５５】
ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体の生成及び生産
本発明のアルブミン結合ドメインの生成は、典型的には、標準方法を用いて核酸レベル
で達成される。置換されたコドンを１つ以上の特定の残基に有するＡＢＤＣｏｎ変異体は
、標準ＰＣＲクローニング法、又は、米国特許第６，５２１，４２７号及び同第６，６７
０，１２７号に記載の方法による化学遺伝子合成、又はＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕ
ｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７〜３８２、１９８７）を
用いることにより、合成され得る。ランダム化されたコドンを任意の残基の位置に使用す
る場合、ランダム化は、例えば、設計多様性に一致する縮重オリゴヌクレオチドなど周知
の方法を用いて、又は、２０の全ての天然発生アミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用い
て、ランダム化を達成し得る。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、
Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、
及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。あるいは、２０
全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコド
ンを使用することができる。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
【００５６】
特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合
成は当該分野でよく知られており、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅ
ｋら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７〜８６，１９９９；Ｇａｒｒａｒｄ  ＆  Ｈ
ｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  １２８：１０３〜１０９，１９９３）。特定のコドンセットを有
するヌクレオチドのそのようなセットは、市販されているヌクレオチド又はヌクレオシド
試薬、及び装置を使用して合成することができる。
【００５７】
標準のクローニング及び発現の技術は、ＡＢＤＣｏｎ若しくはその変異体をベクターに
するか又はＡＢＤＣｏｎの合成二本鎖ｃＤＮＡにすることにより、そのタンパク質をイン
ビトロで発現又は翻訳するために使用される。生物活性剤は、周知の方法を用いてＡＢＤ
Ｃｏｎ又はその変異体に操作可能に連結することができる。
【００５８】
核酸分子及びベクター
本発明は、インビトロ転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列、原核、真核、若しくは
糸状ファージ発現、組成物の分泌及び／若しくは提示に適合するベクターを含む、単離ポ
リヌクレオチドとして、又は発現ベクターの部分として、又は線状ＤＮＡ配列の部分とし
て、本発明のＡＢＤＣｏｎ又はその変異体をコードする核酸を提供する。特定の代表的な
ポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝暗号の縮重又は所与の発現系におけるコ
ドンの選択性を考慮して、本発明のＡＢＤＣｏｎ又はその変異体をコードする他のポリヌ
クレオチドも本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオ
チド合成などの化学合成により製造され、完全一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。別
の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを
行うなどの他の手法により製造され得る。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを製造す
る又は得るための手法は、当該技術分野において周知である。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリ
アデニル化シグナル等、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチ
ド配列はまた、シグナル配列、生物活性剤をコードするｃＤＮＡなど融合タンパク質パー
トナーなど、タンパク質の精製又は検出を容易にするために、例えば、ヘキサヒスチジン
又はＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列などをコードする追加のアミノ酸をコードする
追加の配列も含むことができる。
【００６１】
代表的なポリヌクレオチドは、ＡＢＤＣｏｎをコードする配列、リボソーム結合部位の
ための配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、抗生物質耐性遺伝子、及び複製開
始点（ｏｒｉ）の細菌起源を含む。本発明のアルブミン結合ドメインをコードする代表的
なポリヌクレオチドは、配列番号３５に示される。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクター
である。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイル
ス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生
物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の
任意のベクターであってよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされる
ポリペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列因子を含む
発現ベクターであってもよい。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポ
リメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリ
ペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野に
おいて周知の、細胞を用いる、又は無細胞の系であってよい。
【００６３】
宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本発明のＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は、所望により、当該技術分野において周知の細
胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって産生することがで
きる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ
Ｙ，ＮＹ（１９８７〜２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
，ＮＹ（１９９４〜２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，
ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照のこと。
【００６４】
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯ
Ｓ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、６５３、ＳＰ
２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘
導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプ
チドをグリコシル化することが不可能な種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ
３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然若しくは改変大腸菌種、クレブシエラ種、又はシュー
ドモナス種の菌株などの原核細胞又は生物、から選択され得る。
【００６５】
本発明のアルブミン結合ドメインの用途
本発明の非天然アルブミン結合ドメインＡＢＤＣｏｎ及びその変異体の組成物を使用し
て、ＡＢＤＣｏｎと生物活性剤とを操作可能に連結することにより、動物の組織内での生
物活性剤の半減期及び／又は生体内分布を調節することが可能であり、動物へのこの組成
物の投与は、その生物活性剤の半減期及び／又は生体内分布を、生物活性剤のみの投与に
より得られる組織分布と異なるものにする。
【００６６】
ＡＢＤＣｏｎ又はその変異体を含む医薬組成物
生物活性剤に操作可能に連結されたアルブミンを結合するＡＢＤＣｏｎ又はその変異体
は、捕獲、固定化、分割、又は沈殿のための当該技術分野で周知の分離手順を用いて単離
し、商用適応性のために必要とされる範囲で精製することができる。
【００６７】
治療用としての生物活性分子−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質は、医薬的に許容される担
体中の有効成分としての生物活性分子−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質の有効量を含有する
医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される
希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。かかる溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物
油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む、水及び油等の液体で
あってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる
。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来の公
知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物には、生理学的条
件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着
色剤などの薬理学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こうした医薬製
剤に含まれる生物活性剤−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質の濃度は、重量にして約０．５％
未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異な
ってよく、選択される特定の投与方法に従って、主として、必要とされる用量、液体の体
積、粘度などに基づいて選択される。好適な媒体及び製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２
１st  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．編、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ
ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５
，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９
２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【００６８】
生物活性剤−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質の治療的使用のための投与方法は、非経口投
与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺；経粘膜的（経口、鼻腔
内、膣内、直腸）；タブレット、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、ゲル、粒子の製剤を使
用する；及びシリンジ、埋め込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポン
プに収容される；又は当該技術分野でよく知られているような、当業者によって理解され
る他の手段など、宿主に薬剤を送達する任意の好適な投与法であってもよい。部位特異的
投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳
室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、
前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内
、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され
得る。
【００６９】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００７０】
実施例１．非天然アルブミン結合ドメインの生成
非天然アルブミン結合ドメインコンセンサス（ＡＢＤＣｏｎ）の設計
非天然アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、非冗長タンパク質データベースに寄託さ
れた３へリックスバンドルＡＢＤ配列のコンセンサスアミノ酸配列を計算することにより
設計された。コンセンサス配列を決定するために、連鎖球菌ｓｐ．Ｇ１４８タンパク質Ｇ
（配列番号１）を、非冗長ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｂｌａｓ
ｔ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ＿ｎｉｈ＿ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ＿ｃｇｉ）に対するＢＬＡＳＴ検索
のためのテンプレート配列として使用した。ＢＬＡＳＴ検索では、全て初期設定を使用し
た（期待しきい値＝１０、ワード長＝３、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコ
スト＝存在１１、伸長１、組成調整＝条件付き組成スコアマトリックス調整）。この検索
から、表１（配列番号１〜２０）に記載した最も密に関係する２０のタンパク質ドメイン
を選択して多重配列アラインメントに含め、コンセンサスを決定した。非冗長配列のみを
選択した。いくつかのタンパク質アクセッション番号が表１に複数回記載されており、い
くつかのタンパク質がいくつかの密に関係するＡＢＤドメインを含んでいることを示して
いる。配列番号４は、ファージディスプレイ及び遺伝子シャッフリングにより得られた非
天然ＡＢＤである（Ｈｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １６：１４９０〜１４９４、２０
０７）。
【００７１】
【表１】
2018171063.tif 000002
【００７２】
ＡｌｉｇｎＸソフトウェアを（全て初期設定で）使用し、記載されている配列から、多
重配列アラインメントを生成した。表６に示す配列アラインメントは、アルブミン結合ド
メインコンセンサス配列ＡＢＤＣｏｎ（配列番号２１、表６）を誘導するために、各配列
位置で最も優勢なアミノ酸を選択するために使用した。位置２１については明確なコンセ
ンサスがなく、芳香族残基Ｔｙｒ及びＰｈｅがよく表現されていたので、Ｉｌｅではなく
Ｔｙｒをこの位置に選択した。ＡＢＤＣｏｎ間のペアワイズ配列同一性は、４５％（配列
番号３）から８２％（配列番号８、１３、１４及び１６）の範囲である。
【００７３】
遺伝子合成
アルブミン結合ドメインコンセンサス（ＡＢＤＣｏｎ）のアミノ酸配列を、以下のよう
に大腸菌発現についての好ましいコドンを用いて（配列番号３５）、ＡＢＤＣｏｎをコー
ドする核酸配列に逆翻訳し、合成遺伝子を産出した（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。サブクローニングのためのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位、並びにタ
ンパク質精製のためのＮ末端の８−ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列を加えるために、
配列番号３４の合成遺伝子配列に５’及び３’ＤＮＡ配列を追加した。Ｔ７プロモーター
配列によって駆動される発現のためにこの遺伝子をｐＥＴ２６ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ
）にクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。
【００７４】
発現及び精製
ＡＢＤｃｏｎの発現のために、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した５０ｍＬのＬ
Ｂ培地に１コロニーを接種し、２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩増殖させた。
翌日、その一晩置いた培養物１０ｍＬを、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０
０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈに添加し、２２０ｒｐｍで２．５時間、３７℃で
増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭの最終濃度にし、タンパク質の発現を誘導するた
めに温度を３０℃に下げた。１４時間後に、４０００Ｘｇで２０分間の遠心分離により細
胞を回収し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。凍結した細胞ペレットを、湿潤ペレッ
ト１グラムにつき５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で再懸濁し、室
温で３０分間やさしく混合した。ポリ−ヒスチジンタグ付きのＡＢＤＣｏｎ分子を、ｐＨ
７．４の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で１０〜２５０ｍＭのイミダゾールの勾
配で５００ｍＭの塩化ナトリウムを溶出するＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＡＢＤＣｏｎを含む画分をプールし、ＰＢＳの移
動相とともにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ解析（図１）により評価した。質量分析は、６３８２  Ｄａ（図２）の理論質量と一致
する６３８３  Ｄａの質量であることを決定した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０
カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー分析は、
ＡＢＤＣｏｎ製剤に凝集体がなく、単量体タンパク質と一致するときに溶出することを示
している（図３）。
【００７５】
実施例２．ＡＢＤＣｏｎの特性評価
ＡＢＤＣｏｎの熱安定性
ＡＢＤＣｏｎをｐＨ  ７．４のＰＢＳ中に２．１７５ｍｇ／ｍＬの濃度にし、示差走査
熱量計（ＤＳＣ）により熱安定性を評価した。安定性データは、ＶＰ−ＤＳＣ計器（Ｍｉ
ｃｒｏＣａｌ）で毎分１℃の走査速度で、ＡＢＤＣｏｎ溶液４００μＬを２５℃から１０
０℃まで加熱することによって生成した。その試料で、熱によるフォールディング／アン
フォールディングの可逆性を評価するために、第２の同一の走査を行った。融解温度を計
算するために、データを２ステートのアンフォールディングモデルに適合させた。図４は
、ＡＢＤＣｏｎがＰＢＳ中で８１．５℃の高い熱安定性を有し、そのフォールディングが
完全に可逆的であることを示している。
【００７６】
アルブミンへのＡＢＤＣｏｎの結合
ＧＬＣセンサーチップを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ−３６  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、ヒト血清
アルブミン及びマウス血清アルブミンへのＡＢＤＣｏｎの結合の動態を測定した。ヒト（
配列番号３６）、アカゲザル（配列番号３７）、及びマウス（配列番号３８）の血清アル
ブミンは、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ａ４３２７（ヒト）、番号Ａ３５５９（マウス）、
番号Ａ４２９７（アカゲザル））から購入し、異なる濃度でＰＢＳに再懸濁した。５００
〜１０００共鳴単位のリガンド密度を有する表面を得るために、ｐＨ  ５．０、２．１μ
ｇ／ｍＬで標準のアミンカップリングを介して、ＧＬＣチップの垂直方向において、各血
清アルブミンをリガンドチャネル上に直接固定化した。組換えＡＢＤＣｏｎの結合は、固
定化された血清アルブミンの表面の上に水平方向に同時に分析物として５つの異なる濃度
（例えば、１μＭを３倍濃度系列で希釈）を流すことによって試験した。ＰＢＳＴ（ＰＢ
Ｓ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として用いて、１００μＬ／分
の流量で、全ての濃度に関して解離相を２時間モニターした。６つ目の試料（緩衝液のみ
）を注入して、ベースライン安定性をモニターした。１短パルス幅（１８μＬ）の０．８
％リン酸を用いて表面を再生した。
【００７７】
【表２】
2018171063.tif 000003
【００７８】
緩衝液のみの応答、及び分析物とチップとの間の非特異的結合を減算することにより、
未処理の応答データを最初に処理した。各リガンド表面について、５つの濃度全ての処理
されたデータを、１：１の単純ラングミュア結合モデルにグローバルに適合させた。表２
は、アルブミンの各種について決定された結合動態を記述している。
【００７９】
マウスにおけるＡＢＤＣｏｎ融合の血清半減期
ＡＢＤＣｏｎが融合タンパク質の血清半減期を延長する能力を、Ｔｅｎｃｏｎ２５のｃ
末端へのＡＢＤＣｏｎの融合をコードする合成遺伝子を産生することにより、評価した。
Ｔｅｎｃｏｎ２５は、配列番号３９の残基１−９０に示される配列を有するフィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質のコンセンサス配列に基づくタンパク質スカ
フォールドであり、米国特許第２０１１／０２７４６２３Ａ１号に記載されている。Ｔｅ
ｎｃｏｎ２５とＡＢＤＣｏｎのタンパク質ドメインは、（Ｇ4Ｓ）2ペプチドリンカー（配
列番号４０）により融合した。得られる融合タンパク質は、配列番号３９に示されるポリ
ペプチド配列を有する。ポリ−ヒスチジンタグは、精製目的のためにＣ末端に組み込んだ
。６９匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを３群に分けた（Ｎ＝３の無処置対照群１群、Ｎ＝３３
の２群〜３群）。１回の静脈注射で用量２ｍｇ／ｋｇのＴｅｎｃｏｎ２５−ＡＢＤＣｏｎ
融合タンパク質をマウスに投与した。この用量は、投与の日の動物の体重に基づく。注射
後、１０分後、３０分後、１、４、６時間後、１、２、３、７、１０、１４日後の時点で
マウスを安楽死させた。各動物から心穿刺により血液検体を得た。血液検体は、３０分間
（ただし１時間以下）、室温で凝固させた。次いで、血液検体を約３，５００ｒｐｍで１
５分間、遠心分離した。Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットホームで、均
質なサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて血液検体を分析した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−
Ｇｏｌｄプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ
（ＴＢＳ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔｈｅｒｍｏ）で１時間ブロックした。捕獲（ビオチン化
）及び検出（ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）
の標識付き）の両方に、０．６２５μｇ／ｍＬでポリクローナル抗Ｔｅｎｃｏｎ２５抗体
を用いた。抗原及び抗体をプレートに添加し、ＲＴで激しく振盪しながら２時間インキュ
ベートした。ＴＢＳ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ）でプレートを洗浄し、界面活性剤を有するＭＳＤ
Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加した。Ｍ
ＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を使用してプレートの読み取りを行った。
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを解析した。以前の研究は、類似した未融
合のＴｅｎｃｏｎ分子が、マウスで約２０分間の血清半減期で急速に血流からクリアされ
るのを示している。ＡＢＤＣｏｎへのＴｅｎｃｏｎ２５の融合は、血清半減期を６０時間
以上延長した（図５）。
【００８０】
実施例３：血清アルブミン親和性を変更するためのＡＢＤＣｏｎの操作
血清アルブミンへの結合親和性は、治療タンパク質の血清半減期だけでなく、分子が結
合しその標的を中和させる能力もまた、支配することができる。例えば、血清アルブミン
との結合が弱すぎる分子は、アルブミンに結合されない間の腎臓濾過のために、短い血清
半減期を有することになる（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２
３：８２７〜８３４、２０１０）。逆に、アルブミンとの結合が強すぎる分子は、好まし
い作用部位でアルブミンから解放されないために、場合によっては、所望の標的を中和す
ることができないことがある。したがって、所望の血清半減期を与えるためにちょうどよ
い強さでアルブミンと相互作用するようにアルブミン結合を介して半減期の延長を達成す
ることが好ましい。本明細書に記載のＡＢＤＣｏｎ配列は、７５ｐＭの親和性及び３．０
２×１０-5  １／ｓのオフレートでヒト血清アルブミンに結合するので（本明細書に記載
の実験条件下で）、ＡＢＤＣｏｎに融合された分子は、いったん動物又は患者に投与され
た後に、ほとんどがアルブミンに結合する。いくつかの標的及び融合に関しては、血清ア
ルブミンにより弱く結合することが望ましい場合がある。アルブミンへのＡＢＤＣｏｎの
結合親和性を下げるために、１０種類のＡＢＤＣｏｎの突然変異バージョンを設計した。
表３は、それらの突然変異体をまとめたものである。
【００８１】
【表３】
2018171063.tif 000004
*配列番号２１に従ったアミノ酸番号
【００８２】
ＡＢＤＣｏｎ突然変異体の選択は、ヒト血清アルブミン（ＰＤＢコード１ＴＦ０）に結
合したＧＡモジュール（タンパク質Ｇ関連アルブミン結合モジュール）の結晶構造を調査
し（Ｌｅｊｏｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｓｅｃｔ  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ  
Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６４：６４〜６９、２００８）、ＡＢＤＣｏｎが
ＧＡと非常に類似したやり方でアルブミンに結合すると仮定することにより行った。突然
変異体は、疎水性接触の破壊、立体衝突の導入、塩橋の破壊、水素結合の破壊により、ア
ルブミンに対するＡＢＤＣｏｎの親和性を減少するように設計した（表３）。導入した変
更は、結合を無効にするほど劇的に結合表面を変更せずに結合親和性を減少するように設
計した。各突然変異体は、ＡＢＤＣｏｎについて説明したように大腸菌から発現し、精製
した。突然変異体ＡＢＤＣｏｎ１１は不溶性であることがわかったので、その後の分析に
は含めなかった。ヒト、マウス、及びアカゲザルの血清アルブミンに対する各変異体の親
和性は、表面プラズモン共鳴により決定し、表４に示した。表３に記載した位置の他に、
アルブミンとの直接接触を形成すると予測される残基Ｌ２５、Ｅ３３、Ｇ３４、Ｌ３８、
Ｉ４２、及びＡ４５を変異させて、アルブミンに対するＡＢＤＣｏｎの親和性を加減して
もよい。
【００８３】
【表４】
2018171063.tif 000005
【００８４】
実施例４：ＡＢＤＣｏｎ変異体融合タンパク質の血清半減期
アルブミンに対するＡＢＤＣｏｎ親和性と半減期の延長との相関を評価するために、Ｔ
ｅｎｃｏｎ２５（配列番号３９のアミノ酸１〜９０）をＡＢＤＣｏｎ変異体３、５、７、
及び９（表３）に融合した。これらの分子は、先の研究において上述したように２ｍｇ／
ｋｇの用量でマウスに投与し、Ｔｅｎｃｏｎ２５−ＡＢＤＣｏｎ融合について説明したの
と同一の方法を用いて分析した。これらの分子について得られたＰＫパラメータの要約を
表５及び図６に示す。ＰＫパラメータにおける大きな差が得られなくなる１０３ｎＭの親
和性に達するまでは、アルブミンに対する親和性が増加するにつれてクリアランス速度が
減少することが、ここで実証されている。表５のデータは、アルブミンに対するＡＢＤＣ
ｏｎ分子の親和性の変更により、半減期、クリアランス速度、合計暴露（ＡＵＣ）などの
特性を調製する能力を実証している。
【００８５】
【表５】
2018171063.tif 000006
【００８６】
【表６】
2018171063.tif 000007
【００８７】
実施例５：アルブミン結合ドメインの安定化
様々なフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインとの融合タンパク質として産生さ
れたとき、ＡＢＤＣｏｎ（配列番号２１）の安定性を決定するための研究を完了した（例
えば、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号を参照）。標準のクローニング技術を
用い、ＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質を生成した。融合タンパク質の１つ
であるＴｅｎｃｏｎ−ＡＢＤＣｏｎのアミノ酸配列は配列番号４１に示されている。産生
したその他のＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ融合タンパク質は、Ｔｅｎｃｏｎ２５−ＡＢ
ＤＣｏｎ、８３−ＡＢＤＣｏｎ及び７１−ＡＢＤＣｏｎであった。これらのタンパク質は
、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを用いて産生し、ニッケル親和性とサイズ排除クロマトグラ
フィーとの組み合わせにより、標準的な方法を用いて精製した。それぞれの精製された分
子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法による分析の前に２８日間、３７℃においてＰＢ
Ｓ（ｐＨ  ７．４）中でインキュベートした。図７Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での低
分子量のバンドの出現によって証明されているように、各ＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ
融合タンパク質が、このインキュベーションの間に分解することが見出されたことを示し
ている。質量分析解析は、主要な分解パターンが、ＡＢＤＣｏｎ配列（配列番号２１）の
残基Ｌ１、Ｋ２、及びＥ３でのこれらの分子のクリッピングであることを確認した。更に
、ＦＮ３ドメインに融合された天然の連鎖球菌タンパク質Ｇ  ＡＢＤ（配列番号１）が、
６〜８ヶ月間、４℃でインキュベートした場合に（図示していない）、残基Ｌ１でのクリ
ッピングを有する同様の分解パターンを示したことが観察された。最後に、天然ＡＢＤ（
配列番号１）及びＡＢＤＣｏｎ（配列番号２１）のいくつかの精製ロットが４℃で数ヶ月
保存された後、溶液中で不活性かつ検出不能であることがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察さ
れたことは、深刻な劣化を示している。
【００８８】
上記の観察は、血清半減期の延長のために使用されるＡＢＤＣｏｎ及び天然ＡＢＤ構造
のＮ末端のαヘリックスが不安定であることを示唆している。そのような融合タンパク質
のこの安定性の欠如は、研究及びに治療用のためのそのような分子の貯蔵寿命を制限する
可能性があるため、望ましくない。したがって、これらの分子の安定性を改善するための
戦略が開発された。タンパク質データバンクに寄託されたアルブミン結合ドメインの三次
元構造の分析は、天然ＡＢＤ（配列番号１）の始まりのＮ末端に見出されるアミノ酸配列
ＴＩＤＱＷＬ（配列番号４２）が、いくつかの結晶構造（例えば、ＰＤＢ  ２ＶＤＢ、Ａ
ｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  ２００８  Ｆ６４、６４〜６９）において、この分子の第１のαへ
リックスの一部として構造的に順序づけられていることを示している。これは、ＡＢＤの
元のＮＭＲ構造とは対照的であり、この領域が溶液中で無秩序になったことを示している
（ＰＤＢ  １ＧＡＢ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６６：８５９〜
８６５、１９９７）。このように、αへリックスの伸長はそのようなへリックスの安定性
を高めることができるので、ＡＢＤ及びＡＢＤＣｏｎ配列のこの最初のαヘリックスを伸
長することは、この領域に高い安定性を付与することができると仮定した（Ｓｕら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５５０１〜１５５１０、１９９４）。
【００８９】
表１に示す天然アルブミン結合ドメインの多重配列アラインメントは、これらのＮ末端
残基に関しての明確なコンセンサス配列がないことを明らかにした。しかし、１つのペプ
チド配列、ＴＩＤＥＷＬ（配列番号４３）は、これらのタンパク質ドメインのうち５つの
Ｎ末端に存在する。したがって、新しいＡＢＤＣｏｎコンストラクトであるＡＢＤＣｏｎ
１２（配列番号４４）は、ＡＢＤＣｏｎのＮ末端にＴＩＤＥＷＬ配列を付加することによ
って生成した。このタンパク質は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグを用いて発現させ、ニッケ
ル親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーのための標準的な方法を
用いて均質に精製した。精製されたＡＢＤＣｏｎ１２は、２８日間、ＰＢＳ中で３７℃に
おいてインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって安定性を評価した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥは、１４日目の後に、分解を示すわずかにより速い移動パターンを示した
。しかしながら、総質量分析は、この分解が専らポリヒスチジンタグで生じ、ＡＢＤＣｏ
ｎ１２配列では生じないことを実証しており、ＴＩＤＥＷＬ配列がＡＢＤＣｏｎの安定性
を改善したことを示している。安定性の更なる証拠は、ＰＢＳ中で２８日間３７℃におい
てインキュベートしたとき、元のＦＮ３ドメインＡＢＤＣｏｎ分子（図７Ａ）と比較して
有意に少ない分解産物を示した、生成されたＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ１２融合タン
パク質（図７Ｂ）の安定性において実証された。
【００９０】
この分子の安定化のメカニズムを調べるために、ＡＢＤＣｏｎ１２の融解温度を、上記
の実施例２で概説した手順を使用して示差走査熱量測定法によって測定した。ＰＢＳ中で
、元のＡＢＤｃｏｎ分子と比べて９．４℃高い、９０．９℃の融解温度が得られたことは
、ＡＢＤＣｏｎ１２及びＡＢＤＣｏｎ１２融合タンパク質について観察されたタンパク質
分解／分解がＮ末端のαへリックスの伸長によりもたらされた立体配座の安定性の増加に
よるものであることを示唆している。
【００９１】
配列番号４１：Ｔｅｎｃｏｎ−ＡＢＤＣｏｎ
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳ
ＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨ
ＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳ
ＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＴＶＥＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡＧＧＨＨＨＨＨＨ
【００９２】
配列番号４２：Ｓｔｒｅｐ  ＧのＮ末端配列ＡＢＤ
ＴＩＤＱＷＬ
【００９３】
配列番号４３：ＡＢＤＣｏｎ付属のＮ末端配列
ＴＩＤＥＷＬ
【００９４】
配列番号４４：ＡＢＤＣｏｎ１２
ＴＩＤＥＷＬＬＫＥＡＫＥＫＡＩＥＥＬＫＫＡＧＩＴＳＤＹＹＦＤＬＩＮＫＡＫＴＶＥ
ＧＶＮＡＬＫＤＥＩＬＫＡ
【００９５】
実施例６：ＡＢＤＣｏｎ１２の特性評価
ヒト及びマウスのアルブミンに結合する精製されたＡＢＤＣｏｎ１２の親和性は、実施
例２において上述したのと同じ方法を用いて表面プラズモン共鳴により決定した。ヒト及
びマウスのアルブミンに対するＡＢＤＣｏｎ１２の結合に関して、それぞれ、０．７ｎＭ
及び８．２ｎＭの解離定数が得られた。融合分子の血清半減期を延長するＡＢＤＣｏｎ１
２の能力は、抗原に特異的に結合するＦＮ３ドメインのＣ末端にＡＢＤＣｏｎ１２を融合
することによって実証された。この分子を２ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射によってマウスに投
与し、実施例４において上述したように分析した。ＦＮ３ドメイン−ＡＢＤＣｏｎ１２融
合タンパク質については、５５時間の末端半減期が測定された。
【００９６】
実施形態７：アルブミン結合ドメインの安定
天然に生じるアルブミン結合ドメインの配列分析に基づいて、アルブミン結合ドメイン
のＮ末端に付加された他の配列は、それらをより安定にできる可能性があることが予想さ
れる。例えば、これらの天然アルブミン結合ドメインへのＮ末端に、例えばＡＰＡＶＤＶ
（配列番号４５）、ＩＡＫＥＫＡ（配列番号４６）、ＴＩＤＱＷＬ（配列番号４２）、Ｖ
ＰＡＡＤＶ（配列番号４７）、ＴＶＫＳＩＥ（配列番号４８）、ＴＰＡＶＤＡ（配列番号
４９）、ＴＬＫＳＩＫ（配列番号５０）、ＷＥＫＡＡＡ（配列番号５１）、ＡＶＤＡＮＳ
（配列番号５２）、ＱＬＡＡＥＡ（配列番号５３）、ＡＬＫＡＡＡ（配列番号５４）、Ｅ
ＫＬＡＡＡ（配列番号５５）など、多くの異なる配列が見られる。これらの配列がより長
いαへリックスを産生する場合、これらの配列をアルブミン結合ドメインに添加すること
は、安定性を増す可能性がある。更に、αへリックスの長さ又は安定性を増す非天然ペプ
チドもまた、アルブミン結合ドメインを安定させると予測される。
【００９７】
追加のＮ末端配列を有する変異体は、標準的な手法により生成することができ、それら
の特性は上述したように試験することができる。
【００９８】
以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できることは明
白であろう。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形形態が可能であり、
したがってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
【図１】
2018171063.tif 000008
【図２】
2018171063.tif 000009
【図３】
2018171063.tif 000010
【図４】
2018171063.tif 000011
【図５】
2018171063.tif 000012
【図６】
2018171063.tif 000013
【図７】
2018171063.tif 000014
【配列表】
2018171063000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月18日(2018.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
【請求項２】
配列番号２１のアミノ酸配列において、１、２、３、４、５、又は６の残基における置換を有する配列を含む、請求項１に記載の単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
【請求項３】
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置Ｙ２１、Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、Ｉ４２、及びＡ４５の１つ以上で生じる、請求項２に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項４】
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置Ｙ２１、Ｙ２２、Ｋ３０、Ｔ３１、Ａ３７、及びＥ４１の１つ以上で生じる、請求項２に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項５】
配列番号２１〜３４及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
【請求項６】
Ｎ端末に６つのアミノ酸の伸長部分を更に含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項７】
前記６つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４２、４３、及び４５〜５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項８】
前記６つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項９】
前記アルブミン結合ドメインが、
ａ）ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、表面プラズモン共鳴を使用して、５０ｐＭ〜１μＭの間のヒトアルブミンへの結合の解離定数（ＫD）を有する、及び／または
ｂ）ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、表面プラズモン共鳴を使用して、３．６×１０-5〜１．１×１０-1のヒトアルブミンへの結合のオフレート定数（Ｋｏｆｆ）を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたアルブミン結合ドメインの作製方法であって、
ａ）前記単離されたアルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）宿主で又はインビトロで前記ポリヌクレオチドを発現する工程と、
ｃ）前記単離されたアルブミン結合ドメインを回収する工程と、を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載のアルブミン結合ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２１〜３４又は４４からなる群から選択されるアルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、又は
ｂ）配列番号３５のポリヌクレオチド
を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載のアルブミン結合ドメインと、生物活性剤とを含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
前記生物活性剤が、標的分子に特異的に結合するタンパク質スカフォールドである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質スカフォールドが、配列番号３９のアミノ酸残基１〜９０又はその変異体を含むＴｅｎｃｏｎ２５に基づくものである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記アルブミン結合タンパク質及び前記生物活性剤が、リンカーを使用して連結される、請求項１５又は１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記リンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記リンカーが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体は、更に、ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体のＮ末端への６つのアミノ酸の伸長部分の追加により修飾することができる。６つのアミノ酸の伸長部分は、アミノ酸配列ＴＩＤＥＷＬ（配列番号４３）、又は配列番号４２又は４５〜５５に示される任意のアミノ酸配列からなる場合がある。Ｎ末端の６つのアミノ酸の伸長部分をＡＢＤＣｏｎ及びその変異体に組み込むことは、分子の安定性を増加することができる。Ｎ末端の６つのアミノ酸の伸長部分は、ＡＢＤＣｏｎ及びその変異体の第１のαへリックスの一部として構造上順番付けられてもよい。したがって、Ｎ末端の伸長分子の改善された安定性は、へリックスの構造全体の安定化によるものであり得る。Ｎ末端のＡＢＤＣｏｎ変異体は、標準的方法を用いて作ることができ、例えば熱安定性などそれらの安定性は、本明細書に記載のように評価することができる。任意のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を６つのＮ末端アミノ酸の追加により修飾して、ＡＢＤ構造を安定化し、得られる分子の熱安定性のような安定性を改善することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できることは明白であろう。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形形態が可能であり、したがってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
［２］
１、２、３、４、５、又は６の残基における置換を有する配列番号２１のアミノ酸を含む、単離された非天然アルブミン結合ドメイン。
［３］
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置Ｙ２１、Ｙ２２、Ｌ２５、Ｋ３０、Ｔ３１、Ｅ３３、Ｇ３４、Ａ３７、Ｌ３８、Ｅ４１、Ｉ４２、及びＡ４５の１つ以上で生じる、上記［２］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［４］
前記１、２、３、４、５、又は６の残基における置換が、配列番号２１のアミノ酸位置Ｙ２１、Ｙ２２、Ｋ３０、Ｔ３１、Ａ３７、及びＥ４１の１つ以上で生じる、上記［２］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［５］
Ｎ端末に５つのアミノ酸の伸長部分を更に含む、上記［１］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［６］
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４２、４３、及び４５〜５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［５］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［７］
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、上記［５］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［８］
配列番号２１〜３４又は４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された非天然アルブミン結合。
［９］
Ｎ端末に５つのアミノ酸の伸長部分を更に含む、上記［８］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［１０］
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４２、４３、又は４５〜５５のアミノ酸配列を含む、上記［９］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［１１］
前記５つのアミノ酸の伸長部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、上記［９］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［１２］
前記アルブミン結合ドメインが、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、ＧＬＣセンサーチップを用いたＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ−３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、約５０ｐＭ〜１μＭの間のヒトアルブミンへの結合の解離定数（ＫD）を有する、上記［１］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［１３］
前記アルブミン結合ドメインが、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を用い、１００μＬ／分の流量で、ＧＬＣセンサーチップを用いたＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ−３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、３．６×１０-5〜１．１×１０-1のヒトアルブミンへの結合のオフレート定数（Ｋｏｆｆ）を有する、上記［１］に記載の単離されたアルブミン結合ドメイン。
［１４］
上記［１］に記載の単離されたアルブミン結合ドメインの作製方法であって、
ａ）前記単離されたアルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する工程と、
ｂ）宿主で又はインビトロで前記ポリヌクレオチドを発現する工程と、
ｃ）前記単離されたアルブミン結合ドメインを回収する工程と、を含む、方法。
［１５］
上記［１］に記載のアルブミン結合ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
［１６］
配列番号２１〜３４又は４４からなる群から選択されるアルブミン結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
［１７］
配列番号３５のポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
［１８］
上記［１５］、［１６］又は［１７］に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
［１９］
上記［１８］に記載の単離されたベクターを含む、宿主細胞。
［２０］
上記［１］、［５］又は［８］のいずれか一項に記載のアルブミン結合ドメインと、生物活性剤とを含む、融合タンパク質。
［２１］
前記生物活性剤が、標的分子に特異的に結合するタンパク質スカフォールドである、上記［２０］に記載の融合タンパク質。
［２２］
前記タンパク質スカフォールドが、配列番号３９のアミノ酸残基１〜９０又はその変異体を含むＴｅｎｃｏｎ２５に基づくものである、上記［２１］に記載の融合タンパク質。
［２３］
前記アルブミン結合タンパク質及び前記生物活性剤が、リンカーを使用して、操作可能に連結される、上記［２１］に記載の融合タンパク質。
［２４］
前記リンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、上記［２３］に記載の融合タンパク質。
［２５］
前記リンカーが、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、上記［２４］に記載の融合タンパク質。
［２６］
上記［２０］に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
［２７］
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【外国語明細書】
2018171063000001.pdf