(57)【要約】【課題】双極性障害等の各種疾患の解析に寄与するＤＧＫηノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供する。【解決手段】本発明の一観点に係るノックアウトマウスは、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたものである。また、本発明の他の一観点に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。本観点において、限定されるわけではないが、対照マウスにも被験物質を接触させることが好ましく、更には、ノックアウトマウス及び対照マウスに複数の被験物質を接触させ、双極性障害指標、単極性鬱病指標、統合失調症指標、及び、注意欠陥多動性障害指標の少なくともいずれかが対照マウスよりもノックアウトマウスにおいて改善された前記被験物質を選択することが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたノックアウトマウス。
【請求項２】
ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法。
【請求項３】
対照マウスにも前記被験物質を接触させる請求項２記載の方法。  
【請求項４】
前記ノックアウトマウス及び前記対照マウスに複数の前記被験物質を接触させ、双極性障害指標、単極性鬱病指標、統合失調症指標、及び、注意欠陥多動性障害指標の少なくともいずれかが前記対照マウスよりも前記ノックアウトマウスにおいて改善された前記被験物質を選択する請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＧＫηノックアウトマウス及びこれを用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
双極性障害（ＢＰＤ）とは、気分が高揚した躁状態の極と、気分が沈み込む鬱状態の極の間の異常な変化によって特徴づけられる精神障害をいう。現在、ＢＰＤの生涯有病率は約５％近くあるといった報告もなされており、ＢＰＤは重大な健康問題として認識されつつある。
【０００３】
ＢＰＤに関する最近の研究として、例えば下記非特許文献１乃至３がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂａｕｍ，Ａ．Ｅ．，Ａｋｕｌａ，Ｎ．，Ｃａｂａｎｅｒｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、２００８、“Ａ  ｇｅｎｏｍｅ-ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｅｔａ  （ＤＧＫＨ）  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｔｈｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．”、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１３、１９７−２０７
【非特許文献２】Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｋｉｔｔｅｌ−Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｓ．，Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、２０１１、“Ｃｒｏｓｓ−ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｇｅｎｅｓ：  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ＤＧＫＨ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，  ｂｕｔ  ａｌｓｏ  ｕｎｉｐｏｌａｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ＡＤＨＤ．”、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３６、２０７６−２０８５．
【非特許文献３】Ｚｅｎｇ，Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、２０１１、“Ｃｏｍｍｏｎ  ＳＮＰｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ＤＧＫＨ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎｄ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．”、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１６、４７３−４７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
確かに、上記非特許文献１乃至３では、ＤＧＫηとＢＰＤの病因に関し検討がなされている。しかしながら、遺伝子欠損動物はまだ確立されておらず、ＤＧＫηが実際にＢＰＤに関連しているかどうかは確認されていない。
【０００６】
そこで、本発明は、上記課題に鑑み、双極性障害等の各種疾患の解析に寄与するＤＧＫηノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明の一観点に係るノックアウトマウスは、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたものである。
【０００８】
また、本発明の他の一観点に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。
【発明の効果】
【０００９】
以上、本発明により、双極性障害等の各種疾患の解析に寄与するＤＧＫηノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＣＲの概略を示す図である。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲの概略を示す図である。
【図３】ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】オープンフィールド試験の結果を示す図である。
【図５】高架式十字迷路試験の結果を示す図である。
【図６】尾懸垂試験の結果を示す図である。
【図７】ＤＧＫηノックアウトマウスのオープンフィールド試験及びオープンフィールド試験におけるリチウムの効果を示す図である。
【図８】ＧＳＫ３βに関するウエスタンブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例における具体的な例示にのみ限定されるわけではない。
【００１２】
本実施形態に係るノックアウトマウス（以下「本マウス」という。）は、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）遺伝子をノックアウトしたものである。
【００１３】
本マウスは、後述の実施例の記載からも明らかであるが、双極性障害、単極性鬱病、統合失調症、及び、注意欠陥多動性障害の少なくともいずれかを発症している。ここで、双極性障害（ＢＰＯ）とは、上記の通り気分が高揚した躁状態の極と、気分が沈み込む鬱状態の極の間の異常な変化によって特徴づけられる精神障害をいい、単極性鬱病とは、気分が沈み込む鬱状態の極が継続して現れる精神障害をいい、統合失調症とは、妄想や幻想を生じさせる陽性症状や活動低下や自傷行為などを生じさせる陰性症状により特徴づけられる精神障害をいい、注意欠陥多動性障害とは、不注意、多動性、衝動性を特徴とする行動の障害をいう。
【００１４】
また本マウスは、上記の通りＤＧＫηをノックアウトしたものであれば限定されず公知の種々の方法を応用することによって作製することができる。例えば（１）ターゲティングベクターを作製するステップ、（２）ターゲティングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入するステップ、（３）ＥＳ細胞を胚盤胞にインジェクションすることでキメラマウスを作製するステップ、（４）作製したキメラマウスと野生型のマウスを交配させるステップ、を経ることで作製することができる。
【００１５】
（ＤＧＫηノックアウトマウスを用いる方法）
上記の通り、本実施形態において得られるノックアウトマウスを用いることで、様々な疾患に関するスクリーニングを行うことができる。より具体的に本実施形態に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼη（ＤＧＫη）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。
【００１６】
また本方法においては、対照マウスにも被験物質を接触させることが好ましい。具体的には、ノックアウトマウス及び対照マウスに複数の被験物質を接触させ、双極性障害指標、単極性鬱病指標、統合失調症指標、及び、注意欠陥多動性障害指標の少なくともいずれかが対照マウスよりもノックアウトマウスにおいて改善された被験物質を選択する。これにより、上記障害等を効果的に抑制する候補物質をスクリーニングすることができる。
【００１７】
以上、本実施形態により、双極性障害等の各種疾患の解析に寄与するＤＧＫηノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することができる。この詳細については、以下詳細に示す実施例により明らかとなる。  
【実施例】
【００１８】
ここで、上記実施形態に従い、実際にノックアウトマウスを作製しその効果を確認した。なお本実施例における動物実験については、必要な許可及び必要なガイドラインに準拠して行われたものである。なお、下記で示す全ての試験において、ＤＧＫηノックアウトマウスのコントロール群として、野生型（ＷＴ）の同腹子（野生型マウス）を用いた。
【００１９】
（実験）
（１）抗ＤＧＫη抗体
抗ヒトＤＧＫη抗体の調製のため、抗原として、ヒトＤＧＫη（ＩＧＫＰＳＳＱＫＡＶＫＰＲＥＩＭＬＲＡＮＳ）のアミノ酸６００〜６２０に相当するオリゴペプチドを用いた。
また、ウサギを用い、このウサギに対し、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で乳化したペプチド１００μｇを、複数回の皮下注射により免疫化した。注射は４週間間隔で繰り返し行い、５回目の注射後に血清を得た。そしてＩｇＧを抗原ペプチドコンジュゲートＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００２０】
（２）ウエスタンブロット
脳のウエスタンブロットは、上述の抗ＤＧＫη抗体、抗グリコーゲン合成キナーゼ（ＧＳＫ）３β（Ｈ−７６、サンタクルズバイオテクノロジ）、及び、抗リン酸化ＧＳＫ３β（Ｓｅｒ９、セルシグナリングテクノロジ）を用い、”Ｕｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｓａｋａｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｏｎｏｙａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓａｋａｎｅ，Ｆ．、（２０１５）、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｄ  ｅｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，６３，５７−６８．”（以下「Ｕｓｕｋｉ」という。）に記載に従い行った（図３参照）。
【００２１】
（３）ＤＧＫ遺伝子のＰＣＲ及びＤＧＫｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
図１で示すように、ゲノムＤＮＡに対し、以下のプライマー（Ａ）５’−ＴＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＴＴＧＣ−３’、（Ｂ）５’−ＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣ−３’、および（Ｃ）５’−ＧＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＣ−３’、を用いてＰＣＲを行った。なおＰＣＲ条件は、９４℃を３分間とした後、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃６０秒のサイクルを３２回、７２℃を５分とした。
【００２２】
また、脳のＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ＤＧＫηプライマー配列は、フォワードプライマーＤ（ヌクレオチド配列部位６５−８８）：５’−ＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣ−３’、及び、リバースプライマーＥ（ヌクレオチド部位４７３−４９６）：５’−ＧＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＧＧＡＴＧＧ−３であった（図２参照）。また、ＰＣＲ条件は、９４℃を５分とした後、９４℃３０秒、６５℃３０秒及び７２℃６０秒のサイクルを４５回、７２℃を５分とした。
【００２３】
（４）オープンフィールド試験
各マウスは、オープンフィールド装置（長さ６０ｃｍ×幅６０ｃｍ×高さ４０ｃｍ）に入れられ、中央領域（長さ３０ｃｍ×幅３０ｃｍ）に居た時間、中心領域に侵入した回数、行動スイッチの数を、各テストを単一の観測者の盲検法によって解析した。なお、合計距離の定量は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を用いて行った。
【００２４】
（５）高架式十字迷路試験
高架式十字迷路試験は、２つのオープンアーム（長さ３０ｃｍ×幅５ｃｍ）と、壁の高さ１５ｃｍの２つのクローズアーム（長さ３０ｃｍ×幅５ｃｍ）、及び、セントラルプラットフォーム（長さ５ｃｍ×幅５ｃｍ）を備えた高架式十字迷路試験装置を用いることで行った。また試験は、上記アーム及びプラットフォームを床上５０ｃｍの高さに持ち上げて行った。また、試験において、各マウスはセントラルプラットフォーム上に配置され、その後オープンアームに入った回数及びオープンアームに居た時間を計測することにより行った。
【００２５】
（６）尾懸垂試験
尾懸垂試験として、フロアから５０ｃｍの高さとなるよう尾を粘着テープで固定し、その動作を７分間記録することにより行った。
【００２６】
（７）薬物処置
ＬｉＣｌを６００ｍｇ／Ｌとなるよう混合し、１０日間投与した（Ｄｅｈｐｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，Ｓａｄｒ，Ｓ．Ｓ．，Ａｚｉｚｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｎａｍｉｒａｎｉａｎ，Ｋ．，Ｆａｒａｈａｎｉ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｊａｖｉｄａｎ，Ａ．Ｎ．、（２００２）、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，９０，８９−９３．、及び、Ｒｏｙｂａｌ，Ｋ．，Ｔｈｅｏｂｏｌｄ，Ｄ．，Ｇｒａｈａｍ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、（２００７）、Ｍａｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＬＯＣＫ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０４，６４０６−６４１１．参照）。
【００２７】
（８）統計分析
データは、平均±標準誤差として示した。また、統計的比較はテューキーの検定に従い、ｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。
【００２８】
（結果）
（１）相同組換えによるＤＧＫη欠損マウスの作製
ＤＧＫηとＢＰＤ間の相関を考慮し、ＤＧＫη遺伝子に変異を導入したマウスが気分関連の行動異常を示すか確認した。具体的には、相同組換えによって、マウスのエクソン５及び６によりコードされる触媒領域の一部を欠失させた。ノックアウト対立遺伝子はメンデル分布に従っていた。ＤＧＫηが欠失したマウス（ｄｇｋｈ−／−）（ｎｏ．ＣＤＢ０６０６Ｋ：ｈｔｔｐ：ｗｗｗ２．ｃｌｓｔ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ａｒｇ／ｍｕｔａｎｔ％２０ｍｉｃｅ％２０ｌｉｓｔ．ｈｔｍｌ）は、通常の男女比を有し、肉眼的には正常であった。しかしながらこのＤＧＫηが欠失したマウスでは省略された又は全長のＤＧＫηｍＲＮＡは発現していなかった。また、ＤＧＫηノックアウトマウスでは、ＤＧＫタンパク質は検出されなかった。
【００２９】
（２）ＤＧＫηノックアウトマウスの多動表出
躁状態にあるＢＰＤ患者はしばしば多動、低レベル不安、鬱低減を示す。したがって、上記三つの状態を示すか否かについて確認を行った。まず、ＤＧＫηノックアウトマウスと野生型マウスに対し、オープンフィールド試験を行い、その活動及び定型行動について比較を行った。この結果、ＤＧＫηノックアウトマウスの移動距離は野生型マウスに比べて大きく異なることはなかった。しかしながら、行動転換の頻度、すなわち、歩行、立ち上がり、グルーミング、ひっかき、ジャンプへの移行に着目したところ、ＤＧＫηノックアウトマウスは野生型マウスに比べて頻繁に行動転換が多かった（約１．４倍）ことを確認した（図４Ａ参照）。このことは、ＤＧＫηノックアウトマウスが躁状態にあり頻繁に行動を変えているということを示している。
【００３０】
（３）ＤＧＫηノッキングマウスの低レベル不安表出
次に、オープンフィールド試験では、オープンフィールド試験装置の中心領域（マウスの不安誘起領域）に入った頻度を測定することにより、ＤＧＫηノッキングマウスの不安レベルを評価した。この結果、ＤＧＫηノックアウトマウスは野生型マウスよりも約１．４倍頻繁に中心エリアに入ったことが確認できた（図４Ｂ参照）。また、その領域に居た時間も上記と同様に野生型マウスよりも長かった（約１．３倍）（図４Ｃ参照）。
【００３１】
さらに、ＤＧＫηノックアウトマウスの低レベル不安を評価するため、他の不安測定テストとして高架式十字迷路試験を行った。この試験の結果、ＤＧＫηノックアウトマウスがオープンアームに入った回数は野生型マウスに比べて約１．７倍と著しく増加していたことを確認した（図５Ａ）。また、ＤＧＫηノックアウトマウスがオープンアームに居た時間も、野生型マウスに比べ約３倍と著しく長かったことを確認した（図５Ｂ）。この結果、ＤＧＫηノックアウトマウスが低レベル不安であることを確認した。
【００３２】
（４）尾懸垂試験におけるＤＧＫηノックアウトマウスの無動減少
気分障害のマウスモデルは、一般に、抑うつ状態からの変化、すなわち、躁病のマウスモデルは低い抑うつ状態を示す。そこで、尾懸垂試験を行い、ＤＫＧηノックアウトマウスの変化を無動時間によって評価した。この結果、ＤＧＫηノックアウトマウスは、絶望状態から還元された状態（約０．７倍）を示した（図６参照）。
【００３３】
（５）ＤＧＫηノックアウトマウスの躁的な挙動に対するＬｉＣｌ処置
ＤＧＫηノックアウトマウスの躁的な挙動は、ＬｉＣｌの処置により治療させることができる。リチウムは、躁病の治療に特に有効である気分安定剤として一般的に処方されるものである。したがって、ＤＧＫηノックアウトマウスの異常行動が低用量のリチウム処理によって低減するかを確認するため、“Ｄｅｈｐｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，Ｓａｄｒ，Ｓ．Ｓ．，Ａｚｉｚｉ，Ｍ．Ｒ．，  Ｎａｍｉｒａｎｉａｎ，Ｋ．，Ｆａｒａｈａｎｉ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｊａｖｉｄａｎ，Ａ．Ｎ．、（２００２）、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，９０，８９−９３．”、および、“Ｒｏｙｂａｌ，Ｋ．，Ｔｈｅｏｂｏｌｄ，Ｄ．，Ｇｒａｈａｍ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、（２００７）、Ｍａｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＬＯＣＫ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０４，６４０６−６４１１．”に記載の方法を準用し、ＬｉＣｌを６００ｍｇ／リットルで投与した。
【００３４】
このパラダイムは、ヒト患者の治療範囲の下限である約０．４ミリモル／リットルの血清のＬｉ＋濃度に基づき決定したものである。そして、リチウムの効果を調査するために、オープンフィールド試験における行動のスイッチングの周波数を測定した。
【００３５】
図７で示すように、オープンフィールド試験において、ＤＧＫηノックアウトマウスの行動のスイッチングの頻度は、ビヒクル処置ＤＧＫηノックアウトマウスと比較して、リチウムの低用量処置によって減少し、基底レベル（野生型マウスの値）になっていた。一方、野生型マウスの挙動はＬｉＣｌこの濃度によって影響を受けなかった。この結果は、ＤＧＫηノックアウトマウスの機能がリチウムに対し敏感であることを示している。
【００３６】
また、高架式十字迷路試験により、ＤＧＫηノックアウトマウス上のＬｉＣｌの影響を分析した。リチウムは、オープンアーム（図７Ｄ）およびオープンアームに居る時間（図７Ｅ）を減衰させたことを確認した。一方、野生型マウスの動作では、大幅にオープンフィールド試験および高架式十字迷路試験において、いずれもＬｉＣｌの影響を大きくは受けなかった。これらの結果からも、ＤＧＫηノックアウトマウスがリチウムに対して高い感受性を有していることを確認した。
【００３７】
そして、尾懸垂試験におけるＤＧＫηノックアウトマウスに対するＬｉＣｌの影響を求めた。図７Ｆで示すように、リチウムによる治療は、ＤＧＫηノックアウトマウスに対する尾懸垂試験において大きな効果をもたらしていた。一方で野生型マウスに対しては、リチウムを投与しても大きな影響はなかった。この結果は、ＤＧＫηノックアウトマウスがリチウムに敏感であることを示している。
【００３８】
（６）ＤＧＫηノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳におけるＧＳＫ３βのリン酸化レベルの低下
ＧＳＫ３βは、ジアシルグリセロール依存性プロテインキナーゼＣの下流にあり、リチウムの標的たんぱく質の一つである。そこで、ウエスタンブロットを使用して、ＧＳＫ３βのリン酸化レベルを評価した。図８で示すように、ＧＳＫ３β（Ｓｅｒ９）のリン酸化レベルは、ＧＳＫ３βタンパク質全体のレベルが正常であるにもかかわらずＤＧＫηノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳において顕著に減少していた。この結果、ＧＳＫ３βシグナルに機能障害を有するＤＧＫηノックアウトマウスはＢＰＤの発症に密接な関係を有していることを示している。
【００３９】
（検討）
最近、ＢＰＤの病因としてＤＧＫη遺伝子が関与する可能性について検討がなされている。また、ＤＧＫηのｍＲＮＡレベルは、ＢＰＤを有する患者において増加しているとの報告がなされている。しかしながら、ＤＧＫηとＢＰＤの間の結合をテストするには、ＤＧＫηノックアウトマウスが必要である。そして、ＤＧＫηノックアウトマウスの生成は、これまで達成されていない。すなわち、確認がなされたものではなかった。
【００４０】
本発明では、ＤＧＫηノックアウトマウスの生成に成功し、高次脳機能におけるＤＧＫηの役割を調べるために、マウスの包括的な行動分析を行い、ＤＧＫηとＢＰＤの関係について検討した。この結果、ＤＧＫηがＢＰＤの病因に関与する重要な酵素の１つであることを確認した。また、ＤＧＫηノックアウトマウスは、ヒトのＢＰＤのモデルとなることも示している。 したがって、このノックアウトマウスは、躁病の病態生理学を研究するために特に有用である。
【００４１】
またＤＧＫηｍＲＮＡは、海馬のＣＡ領域よりも歯状回においてより多く発現しており、歯状回の異常発生はＢＰＤの原因となることが知られている。よって、この歯状回におけるＤＧＫηの高発現がＢＰＤの発症を引き起こしている可能性がある。また、ＤＧＫηは小脳のプルキンエ細胞においても多く発現しており、プルキンエ細胞もまたＢＰＤに関連していると考えられている。したがって、プルキンエ細胞におけるＤＧＫη発現もＢＰＤの病因において役割を果たし得る。
【００４２】
以上、ＤＧＫηはＢＰＤの病因となる重要な酵素の１つであり、ＤＧＫηノックアウトマウスはヒトの躁病におけるモデルとなりうることが確認できた。この知見は、ＢＰＤに対する新しい治療方法を提供することを意味する。例えば、ＤＧＫηを特異的に阻害する物質はＢＰＤの新しい治療薬となりうる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、ノックアウトマウス及びこれを用いた方法として産業上の利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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