(57)【要約】      （修正有）【課題】植物、特に、タバコ植物、好ましくは、ニコチアナ・ベンタミアーナにおける組み換えタンパク質の生産方法の提供。【解決手段】以下の工程：ａ）植物を、好ましくは、移動性フロート上、ＬＥＤ照射下で気耕栽培又は水耕栽培を行う、ｂ）工程ａ）で得られた植物を、真空下、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、アグロインフィルトレーションする、ｃ）植物を、工程ｂ）の後、工程ａ）のものと同一条件下での培養に戻す、ｄ）組み換えタンパク質を、工程ｃ）で生産された植物の地上部から抽出及び精製する、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、特に、タバコ植物、好ましくは、ニコチアナ・ベンタミアーナにおける組み換えタンパク質の生産方法であって、以下の工程：
ａ）植物を、好ましくは、移動性フロート上、ＬＥＤ照射下で気耕栽培又は水耕栽培し、次に、
ｂ）工程ａ）で得られた植物を、真空下、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、アグロインフィルトレーションし、次に、
ｃ）植物を、工程ｂ）の後、工程ａ）についてのものと同一条件下での培養に戻し、次に、
ｄ）組み換えタンパク質を、工程ｃ）で生産された植物の地上部から抽出及び精製する、
を含む方法。
【請求項２】
組み換えタンパク質が、組み換えアレルゲン、好ましくは、組み換えダニアレルゲンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
組み換えタンパク質が、デルマトファゴイデス・ファリナエのアレルゲン、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスのアレルゲン、オイログリフス・マネイのアレルゲン、アカルス・シロのアレルゲン、ブロミア・トロピカリスのアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、木又は草の花粉アレルゲン、動物のアレルゲン、カビのアレルゲン、ヘベアラテックスのアレルゲン、及び食物アレルギーに関与するアレルゲンから選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
組み換えタンパク質が、Der f 10、Der f 11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 2、Der f 2.0101、Der f 2.0102、Der f 2.0103、Der f 2.0104、Der f 2.0105、Der f 2.0106、Der f 2.0107、Der f 2.0108、Der f 2.0109、Der f 2.0110、Der f 2.0111、Der f 2.0112、Der f 2.0113、Der f 2.0114、Der f 2.0115、Der f 2.0116、Der f 2.0117、Der f 20、Der f 3、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 7、Der f 8、Der f 9、及びDer f HSP70から選択される、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項５】
組み換えタンパク質が、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 2、Der p 2.0101、Der p 2.0102、Der p 2.0103、Der p 2.0104、Der p 2.0105、Der p 2.0106、Der p 2.0107、Der p 2.0108、Der p 2.0109、Der p 2.0110、Der p 2.0111、Der p 2.0112、Der p 2.0113、Der p 20、Der p 21、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、及びDer p 9から選択される、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項６】
組み換えタンパク質が、Blo t 1、Blo t 5、Blo t 9、Blo t 10、Blo t 12、及びBlo t 21から選択されることを特徴とする、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項７】
アグロインフィルトレーションが、ベンチュリー効果により真空下で行われることを特徴とする、請求項１〜６の１項記載の方法。
【請求項８】
アグロインフィルトレーションが、植物を真空下に２分間置く工程、又は真空、好ましくは、−０．８barで２分間置き、次に、真空を解除し、大気圧に、好ましくは、３０秒間戻し、次に、真空下、好ましくは、−０．８barで２分間置き、最後に大気圧に戻すことにより、行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８の１項記載の方法により得られ得る、組み換えタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２１及びインサートを含む発現ベクターであって、インサートが配列番号１〜２０から選択されるペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、核酸配列が対象のタンパク質をコードする第２の核酸配列と直接融合される、発現ベクター。
【請求項１１】
対象のタンパク質がアレルゲンである、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
対象のタンパク質が、デルマトファゴイデス・ファリナエのアレルゲン、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスのアレルゲン、ブロミア・トロピカリスのアレルゲン、オイログリフス・マネイのアレルゲン、アカルス・シロのアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、木又は草の花粉アレルゲン、動物のアレルゲン、カビのアレルゲン、ヘベアラテックスのアレルゲン、及び食物アレルギーに関与するアレルゲンから選択される、請求項１０又は１１記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高品質の組み換えアレルゲンの製造方法に関する。
【０００２】
組み換えアレルゲンの使用により、より高い特異性及びより良好な有効性のアレルギーの診断検査及び処置が可能になる。
【０００３】
多数のアレルゲンは、かねてより組み換え形態で生産されている。今日、それらは、アレルギーのインビトロ診断のために用いられる。しかしながら、用いられる発現系（一般的には、エシェリキア・コリ（E. coli））は、最も頻繁には、真核生物のタンパク質の正しいフォールディングに必要な翻訳後修飾を行うことができないために、天然のアレルゲンに非常に近似したコピーを得ることのみを可能にしている。患者の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）との反応を可能にするある種のエピトープは、エシェリキア・コリにおいて生産される組み換えアレルゲン上に存在しないので、このことは、しばしば、これらの分子を用いて実施される診断検査の信頼性及び感度に悪影響を与える。
【０００４】
真核生物の発現系はまた、組み換えアレルゲンを生産するために用いられている。これらは、最も頻繁には酵母であり、この場合、これらの生物に特異的なハイパーグリコシル化は、依然として、天然の相同体と一致する組み換えアレルゲンの生産を可能にしない。
【０００５】
植物は、診断検査と治療を統合したアレルギーの個別処置のためのその使用と生産コスト及び品質とを両立させ、組み換え形態における複合アレルゲンの生産を可能にする唯一の真核生物宿主である。
【０００６】
しかしながら、組み換えアレルゲンを産生するために用いられる植物発現系は、一般的には、よく知られた根本的な制限、すなわち：
−  遺伝子からタンパク質への移行のために長い時間を要すること（開発の仕事が数年かかることを意味する）、及び
−  可溶性タンパク質の０．１％〜１％オーダーである、低い収量（ラージスケールでの生産用の植物材料のバイオマスの大容量の処理を意味する）
を伴う植物遺伝子組み換えを採用している。
【０００７】
一過性発現を用いて達成された最近の進歩は、ひとつには、遺伝子からタンパク質への通過における遅延を大いに低減し、これによりずっと迅速な開発を可能にすることにより、もうひとつには、少なくとも１０個の因子により生産収量を増大させ、対象のタンパク質の抽出及び精製のコストを最小にすることにより、これらの制限を超えることを可能にした。
【０００８】
植物における一過性発現のこの種の技術は、今日、米国における大規模な生産設備を現在開発している、ある会社によってワクチンを生産するためのラージスケールにおいて用いられる。
【０００９】
しかしながら、これらの努力にも関わらず、天然の相同体のものと類似する組成及び構成を有する、組み換えアレルゲンを得ることを可能にする、組み換えアレルゲンの有効かつ再現可能な生産方法が依然として必要である。更に、良好な生産収量を有する方法が必要である。
【００１０】
本発明は、これまでに組み換え形態では決して得られなかった、複合組み換えタンパク質、特に、複合組み換えアレルゲンを得ることを可能にする。更に、これらのアレルゲンは、天然の相同体と同一のコピーである。
【００１１】
従って、本発明は、植物、好ましくは、タバコ植物、好ましくは、ニコチアナ・ベンタミアーナ（Nicotiana benthamiana）における組み換えタンパク質の生産方法であって、以下の工程：
ａ）植物を、好ましくは、移動性フロート上、ＬＥＤ照射下で気耕栽培又は水耕栽培し、
ｂ）工程ａ）で得られた植物を、真空下、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、アグロインフィルトレーションし、次に、
ｃ）植物を、工程ｂ）の後、工程ａ）についてのものと同一条件下での培養に戻し、次に、
ｄ）組み換えタンパク質を、工程ｃ）で生産された植物の地上部から抽出及び精製する、
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、本発明による方法により取得し得る組み換えタンパク質に関する。
【００１３】
本発明による方法で利用可能な植物は、特に、ニコチアナ・ベンタミアーナ、及びニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）から選択されるタバコ植物、又は一過性発現に利用可能な任意の他の植物、例えば、レタス（ラクツカ（Lactuca属））、又はホウレンソウ植物（スピナシア・オレラセア（Spinacia oleracea））である。レタスのうちでは、レタス・アッピア（lettuce Appia）、グロッス・ブロンド・パレッソイス（Grosse Blonde Paresseuse）、ロロ・ロッソ（Lollo Rosso）、メルベイル・デ・クアトル・サイソンス（Merveille de quatre saisons）［「フォーシーズンワンダー（four−seasons Wonder）」］、フュ・ド・シェーヌ（feuille de chene）［オーク葉レタス］、又はレッドサイルスに言及し得る。植物はまた、アラビドプシス（Arabidopsis）属、又はその変異体、特に、アラビドプシスのグリコシル化変異体であってもよく；最終的に、ノックアウトタバコ植物（特に、グリコシル化変異体のもの）を使用することが可能である。
【００１４】
好ましくは、本発明による方法により生産される組み換えタンパク質は、組み換えアレルゲン、好ましくは、組み換えダニアレルゲンである。
【００１５】
「アレルゲン」は、それと接触したとき、最も頻繁には、皮膚との接触、吸引、又は摂取により、既に感作されている対象におけるアレルギー反応の引き金をひくことが可能な任意のタンパク質又は任意のペプチドを意味する。アレルギーは、精製された抗原が、検査される患者の５０％以上でアレルギーの引き金をひくとき、及び非常に低濃度での即時陽性皮膚検査で、このアレルゲンに対するアレルギーを有する対象の少なくとも７０％において、特異的なＩｇＥを提示するとき、「主要」であると言われる。
【００１６】
「タンパク質」は、少なくとも５０個のアミノ酸を含む配列を意味する。
【００１７】
「ペプチド」は、１〜４９個のアミノ酸、好ましくは、２〜４０個のアミノ酸を含む配列を意味する。
【００１８】
好ましくは、本発明による方法により生産される組み換えタンパク質は、アレルゲン、アレルゲンフラグメント、又はアレルゲン若しくはアレルゲンフラグメントを含む融合タンパク質である。
【００１９】
好ましくは、組み換えタンパク質は、ハウスダストダニ、例えば、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Dermatophagoides farinae）、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス（Dermatophagoides pteronyssinus）、又はオイログリフス・マネイ（Euroglyphus manei）に起因する呼吸アレルギーに関与するアレルゲン、強力なダニのアレルゲン、例えば、ブロミア・トロピカリス（Blomia tropicalis）、アカルス・シロ（Acarus siro）種（チログリフス・ファリナ（Tyroglyphus farinae）と正式には呼ばれる）のダニのアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、木又は草の花粉アレルゲン、動物（ネコ、イヌ、ウマ）由来のアレルゲン、カビのアレルゲン、接触性アレルギーに関与するアレルゲン、例えば、ヘベアラテックスのもの、又は食物アレルギー（牛乳、卵、魚、果物）に関与するアレルゲンから選択される。
【００２０】
デルマトファゴイデス・ファリナエのアレルゲンのうち、Der f 10、Der f 11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 2、Der f 2.0101、Der f 2.0102、Der f 2.0103、Der f 2.0104、Der f 2.0105、Der f 2.0106、Der f 2.0107、Der f 2.0108、Der f 2.0109、Der f 2.0110、Der f 2.0111、Der f 2.0112、Der f 2.0113、Der f 2.0114、Der f 2.0115、Der f 2.0116、Der f 2.0117、Der f 20、Der f 3、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 7、Der f 8、Der f 9、及びDer f HSP70に言及し得る。
【００２１】
デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスのアレルゲンのうち、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 2、Der p 2.0101、Der p 2.0102、Der p 2.0103、Der p 2.0104、Der p 2.0105、Der p 2.0106、Der p 2.0107、Der p 2.0108、Der p 2.0109、Der p 2.0110、Der p 2.0111、Der p 2.0112、Der p 2.0113、Der p 20、Der p 21、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、Der p 9に言及し得る。
【００２２】
ブロミア・トロピカリスのアレルゲンのうち、Blo t 1、Blo t 5（Der p 5と４０％の配列相同性を有する）、Blo t 9、Blo t 10、Blo t 12、又はBlo t 21に言及し得る。
【００２３】
これらのアレルゲンの全ては周知であり、それらの配列は、特に、データベース、例えば、Allergome（allergome.org）、又は極めて簡単に言えばUniProtにおいて見つけることができる。
【００２４】
特に、ニコチアナ・ベンタミアーナでの、本発明による一過性発現による組み換えアレルゲンの生産方法は、非常に効果的かつ再現可能であり、良好な収量を有する。
【００２５】
本発明による組み換えタンパク質の生産方法は、組み換えタンパク質を生産するために、植物を、好ましくは、自由な移動性フロート上、ＬＥＤ照射下で植物を気耕栽培又は水耕栽培する第１の工程（工程ａ）を含む。
【００２６】
気耕栽培とは、一般的には、鉱物塩ベースの栄養素溶液との一定噴霧と組み合わせて、プラスチックから作られた支持体上での植物の栽培に対応する。
【００２７】
水耕栽培とは、土なしでの植物の栽培に対応する。植物は、中性の不活性基質、例えば、砂、粘土ビーズ、ポリスチレンプレート、又はロックウール上で栽培される。基材は、鉱物塩、及び必須栄養素を植物に供給する溶液流で定期的に水を与えられる。本発明により用いられる方法において、タバコ植物、特に、ニコチアナ・ベンタミアーナが、好ましくは、自由なフロート、例えば、穿孔ポリスチレンのプレート上で水耕栽培される。これらのフロートは、エアーディフューザーにより定期的に通気される栽培培地を含むタンクに配置される。この技術により、工程ｂ）において、（通常の栽培の場合）ポットに含まれる基材由来の不純物又は破片によるアグロインフィルトレーション媒体の汚染のリスクを完全になくし、組み換えタンパク質の産生の条件の標準化が可能となる。更に、この栽培系の使用は、実施例に示される通り、より高い収量に達することを可能にする。
【００２８】
最終的に、スケールアップの際、アグロインフィルトレーションの操作、又はポリスチレンプレート上に固定された植物バッチの回収は、当然、ポット及び基材栽培植物のものより容易である。
【００２９】
本発明による組み換えタンパク質の生産方法は、工程ａ）後、植物、特に、タバコ植物を、真空下、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、アグロインフィルトレーションする工程ｂ）を含む。
【００３０】
特に、５週間の栽培の後、好ましくは、自由な移動性フロート上での水耕栽培後、タバコ植物のアグロインフィルトレーションは、真空下、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、行われる。
【００３１】
この工程ｂ）のアグロインフィルトレーションは、真空の作成を可能にする任意の手段により行われ得る。好ましくは、本発明により用いられる方法において、それは、ベンチュリー効果による真空下で行われる。
【００３２】
工程ａ）において用いられ、アグロバクテリアに挿入された組み換えタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントは、クローニングにより調製され得る。このＤＮＡフラグメントは、組み換えタンパク質、例えば、異種アレルゲンをコードする配列を含み、当該配列は、精製を促進するペプチドをコードする配列、例えば、「ヒスチジンタグ」配列、又は細胞内アドレッシングのためのペプチド又はポリペプチドをコードする配列と融合される。細胞内アドレッシングのためのかかるペプチド又はポリペプチドは、特に、表１に提示される配列のペプチド、すなわち、ペプチド配列番号１〜２０から選択され得る。
【００３３】
次に、ＤＮＡフラグメントは、本発明との関連で開発されたｐＡＧ０１発現ベクターに組み込まれ（図１、及び配列番号２１）、次に、アグロバクテリアは、この発現ベクターを用いて形質転換される。好ましくは、本発明はまた、配列番号２１、及び特に、トランスファーＤＮＡ（ＴＤＮＡ）の右及び左境界に位置したインサートを含む発現ベクターに関し（これは図１に説明され、左境界が「ＬＢ」であり、右境界は「ＲＢ」である）、当該インサートは、配列番号１〜２０から選択されるペプチドをコードする少なくとも１個の核酸配列を含み、当該核酸配列は、対象のタンパク質をコードする第２の核酸配列と直接融合される。このベクターは、インサートを含むｐＡＧ０１ベクターに対応し、当該インサートは、対象のアレルゲンの核酸配列と直接融合した核酸ペプチド配列（配列番号１〜２０から選択される）を含む。好ましくは、対象のタンパク質は、上述のアレルゲンである。
【００３４】
植物、特に、タバコ植物、特に、ニコチアナ・ベンタミアーナの地上部分のアグロインフィルトレーションは、真空下で行われる。好ましくは、気密チャンバーが用いられ、それは、ベンチュリー効果により真空にするシステムを有する。典型的には、チャンバーは、アグロバクテリアの培養物を含み、そして植物が水耕栽培される浮遊プラットフォームを逆にした後で、後者は、バクテリアの懸濁液に逆さに浸される。この方法は、図２に説明される。これにより、１つの同一浮遊プラットフォーム上で栽培された全ての植物の同時侵入が可能になる。
【００３５】
第１の実施態様によると、アグロインフィルトレーションは、植物を真空下に２分間置く工程により行われる。
【００３６】
好ましくは、第２の実施態様によると、アグロインフィルトレーションは、３工程（順次のプロセス）：
１）真空下、好ましくは、−０．８barで２分間置き、
２）真空を解除し、大気圧に、好ましくは、３０秒間戻し、次に、
３）真空下、好ましくは、−０．８barで２分間置き、その後、大気圧に戻す
で行われる。
【００３７】
このアグロインフィルトレーション技術は、迅速（全持続時間５分未満）、かつ効果的であり、オートメーション化が容易である。
【００３８】
本発明により利用可能なアグロバクテリアのうち、好ましくは、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１／１０５、又はＣ５８株に言及し得る。
【００３９】
好ましくは、アグロバクテリアは、１０mM  Ｍｅｓ（２−モルホリノ−エタンスルホン酸）を含む溶液中、ＯＤ６００、０．７〜１．０で規定される濃度でインフィルトレーションのため用いられ、溶液は、場合により、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸）、１０mM  ＭｇＣｌ２、及び１００μMアセトシリンゴンで代替されてもよい。
【００４０】
工程ｂ）のアグロインフィルトレーションの最後に、方法は、植物を工程ａ）と同一条件下での栽培に戻す工程ｃ）を含む。
【００４１】
植物は、典型的には、１５分間上下逆さにして排水され、次に、工程ａ）について記載された条件での栽培に戻され、理想的には、アグロインフィルトレーション後の栽培の最初の６時間、後者の頻繁な噴霧を確実にする。或は、植物は、工程ａ）について記載される条件下での栽培に直接戻される。
【００４２】
最終的に、本発明による方法は、工程ｃ）におけるアグロインフィルトレーション後に生産された組み換えタンパク質の抽出及び精製の工程ｄ）を含む。
【００４３】
植物バイオマスは、アグロインフィルトレーション後に植物を栽培した４〜５日後、回収される。
【００４４】
植物の空中部分からタンパク質を粉砕及び抽出した後、組み換えタンパク質が精製される。先行技術から知られている抽出及び精製技術が、この工程で用いられてもよい。好ましくは、組み換えタンパク質が、「ヒスチジンタグ」配列を含む場合、固定ニッケルカラムクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いて分子ふるいの工程により精製される。次に、精製に用いられるタグ配列は、最終産物から切断され得る。
【００４５】
本発明は、ここで、以下の実施例で説明されるが、これらは制限するものではない。
【００４６】
図の凡例は、以下の通りである：
【００４７】
表１（図８）：これらのアドレッシングペプチドと融合して産生されるときの、組み換えアレルゲンの標的化発現に用いられるＲｅｏｚｙｍｅ（登録商標）配列、及びアレルゲンの細胞内貯蔵コンパートメント。ＥＲ：小胞体；ＧＡ：ゴルジ体。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ｐＡＧ０１ベクターのＴ−ＤＮＡは、アグロバクテリアのＴ−ＤＮＡの２つの隣接する配列（ＲＢ及びＬＢ）、及びサイレンシングインヒビター発現を可能にする３つの発現カセット（カセット１）、組み換えタンパク質、好ましくは、アレルゲン（カセット２）、及びセレクション抗生物質に対する耐性を与える酵素、若しくはタンパク質成熟化酵素からなる（カセット３）。
【図２】本発明により開発されたプラットフォームは、無類に高品質の組み換えアレルゲンの低コストのマス生産を可能にするオリジナルの工程及びツールを組み合わせたものである。４〜５日間が、遺伝子からタンパク質への移行に十分なので、生産の適合性及び速度はまた、この生産プラットフォームの特徴である。
【図３】ダニデルマトファゴイデス・プテロニッシヌスの複合主要アレルゲン：Der p 4（トラック１）；Der p 7（トラック２）；Der p 21（トラック４）；Der p 5（トラック６）、及びDer p 2（トラック７）；ラテックスの主要アレルゲンの１つ：Hev b １３（トラック３）、及びカビアレルゲン：CP120（トラック５）の生産。
【図４Ａ】用いられた発現カセットの模式的説明（パネルＡ）。
【図４Ｂ】パネルＢにおいて、ウエスタンブロット分析は、異なるＲｅｏｚｙｍｅ（登録商標）シグナルとの融合により生産されたアレルゲンDer p 2の品質の差を説明する。Ｒｅｏｚｙｍｅ（登録商標）シグナルＲ１、Ｒ２、及びＲ３が用いられるとき、アレルゲンは、異種形態で生産され、不適合な分子量を有する。しかしながら、シグナルＲ４が用いられるとき、組み換えアレルゲンは、同種であり、天然のアレルゲンのものと同一の分子量を有する。
【図５】パネルＡは、各植物から抽出された総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。植物が、標準的条件（ポット栽培＋白熱ランプによる照射）（トラック１〜６、異なるトラックは、異なる形質転換現象に対応する）で栽培されるか、又は気耕栽培＋ＬＥＤ照射（トラック７〜９）で栽培されるときの、ウエスタンブロットによるこれらの抽出物の分析（パネルＢ及びＣ）は、対象の１つの同一タンパク質についての生産収量を説明する。パネルＢ：発色性検出；パネルＣ：化学発光による検出。
【図６】１）アグロインフィルトレーションが、本発明に記載されるプロトコールにより行われたとき（パネルＢ）、又は２）インフィルトレーションが、通常の方法のインフィルトレーションにより行われるときの（パネルＡ）、ＧＦＰの発現の比較。
【図７】アレルゲンDer p 4の精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる分析。トラック１：総タンパク質抽出物。トラック２：固定ニッケルカラム（ＩＭＡＣ）上で精製され、５０mMイミダゾールの存在下で溶出されたDer p 4。トラック３：ＩＭＡＣ工程後、分子粉砕により精製されたDer p 4。トラック４：タグがインビトロで切断され、精製されたDer p 4。上部のパネル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルにおいてクーマシーブルーでタンパク質を染色することによるDer p 4の分析。下部のパネル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロット、及び精製タグの特異的な免疫血清でのプリント上での免疫検出によるDer p 4の分析。
【図８】これらのアドレッシングペプチドと融合して産生されるときの、組み換えアレルゲンの標的化発現に用いられるＲｅｏｚｙｍｅ（登録商標）配列、及びアレルゲンの細胞内貯蔵コンパートメント。ＥＲ：小胞体；ＧＡ：ゴルジ体。
【００４９】
実施例１：複合抗原の標準化生産
本明細書に記載の方法を検証するため、ダニ、木、又はカビの複合アレルゲンをコードするｃＤＮＡを、ｐＡＧ０１ベクターにクローニングした。次に、これらのベクターを、ニコチアナ・ベンタミアーナにおける一過性発現のために、アグロバクテリア（ＬＢＡ４４０４株）に挿入した。
【００５０】
ニコチアナ・ベンタミアーナ植物を、以下に記載の方法により栽培した：種を土壌にまき、この基材上で最大４５日間栽培した。好ましくは、これらの種からの実生は、この基質中（ＬＥＤ照射下）、１５日間で展開し、その後、移動自由なフロート上での水性栽培のためのタンクに移される。次に、植物を、これらの条件下、栄養素及び微量元素の存在下、ＬＥＤ照射下で２５日間栽培した。このプロトコールに代わり、コートされた種の使用により、浮遊するプラットフォーム上でのニコチアナ・ベンタミアーナの直接の種まきを可能にする。これらの条件下、植物の発芽及び栽培は、水性条件下で起こった。
【００５１】
４０日間栽培後、フロート上で維持した植物を、トランスフェクションのため気密チャンバーに移した。バイナリーベクターを有するアグロバクテリアの挿入のため、植物の地上部を、アグロバクテリア溶液（その濃度はＯＤ６００：０．７に対応する）に浸した（フロートを逆にした）。トランスフェクションを、真空下で、気密チャンバーで、次のプロトコールによるベンチュリー効果により行った：真空下（−０．８bar）で２分、通常に戻し、再度、真空下（−０．８bar）で２分。次に、フロートを、支持体上に１０〜１５分間置き（植物を上下逆さにした）、植物を排出した。次に、植物を、それらを栽培している浮遊プラットフォーム上に置き、栽培タンクに４日間戻し、理想的には、アグロインフィルトレーション後の栽培の最初の６時間、後者の頻繁な噴霧を確実にした。
【００５２】
４日後、種々のアレルゲンを発現する植物の地上部を回収した。タンパク質を、変性バッファー中で抽出し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＦＬＡＧエピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。
【００５３】
図３は、得られた結果を説明する。本発明による方法により、複合主要アレルゲンの生産が可能になる。
【００５４】
実施例２：本発明による方法により、アレルゲンの品質コントロールが可能になる
組み換えアレルゲンの成熟化及び均一性をモニターするために、異なるシグナル（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４）を、対象のアレルゲンと融合させ、次に融合タンパク質を、ｐＡＧ０１ベクターにクローニングした。次に、これらのベクターを、ニコチアナ・ベンタミアーナでの一過性発現のために、アグロバクテリア（ＬＢＡ４４０４株）に挿入した。
【００５５】
ニコチアナ・ベンタミアーナ植物を、以下に記載の方法により栽培した：種を土壌にまき、これらの種からの実生を、この基質中（ＬＥＤ照射下）、１５日間で展開させ、その後、移動自由なフロートに移した。次に、植物を、移動自由なフロート上で２５日間水耕栽培した。
【００５６】
これらの条件下で４０日間栽培後、浮遊栽培プラットフォーム上で維持した植物を、トランスフェクションのために気密チャンバーに移した。バイナリーベクターを有するアグロバクテリアの挿入のため、植物の地上部を、アグロバクテリア溶液に浸した（フロートを逆にした）。トランスフェクションを、真空下で、気密チャンバー中、次のプロトコールによるベンチュリー効果により行った：真空下（−０．８bar）で２分、通常に戻し、再度、真空下（−０．８bar）で２分。次に、フロートを、支持体上に１０〜１５分間置き（植物を上下逆さにした）、植物を排出した。次に、植物を、それらを栽培している浮遊プラットフォーム上に置き、栽培タンクに４日間戻した。
【００５７】
４日後、種々のアレルゲンを発現する植物を回収した。タンパク質を、空中部分を変性バッファー中で粉砕することにより抽出し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＦＬＡＧエピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。
【００５８】
図４は、用いた発現カセットの模式的説明を示す（パネルＡ）。それはまた、ダニアレルゲンDer p 2の実施例で、Ｒｅｏｚｙｍｅ（登録商標）シグナルを用いたことに関連する質的利点を示す。事実、パネルＢにおいて、ウエスタンブロット分析は、異なるＲｅｏｚｙｍｅ（登録商標）シグナルと融合させることにより生産したアレルゲンDer p 2の質の差を説明する。アレルゲンは、異種形態で生産され、Ｒｅｏｚｙｍｅ（登録商標）シグナルＲ１、Ｒ２、及びＲ３が用いられると、不適合な分子量を有する。しかしながら、シグナルＲ４を用いたとき、組み換えアレルゲンは、同種であり、天然のアレルゲンのものと同一の分子量を有する。
【００５９】
実施例３：本発明による方法により、より多い収量が可能になる
この実施例のため、本発明者等は、本発明に記載の方法を用いて結合したｐＡＧ０１ベクターの使用を、例えば、Medrano et al. (2009)に記載の通常のトランスフェクション方法で結合したバイナリーベクター（−／＋サイレンシングインヒビター）の使用と比較した。
【００６０】
デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスのアレルゲンDer p 7をコードするｃＤＮＡを、ｐＡＧ０１ベクター、又はｐＢＩ１２１ベクターにクローニングした。次に、これらのベクターを、ニコチアナ・ベンタミアーナでの一過性発現のために、アグロバクテリア（ＬＢＡ４４０４株）に挿入した。
【００６１】
次に、アグロバクテリア株を、実施例１及び２に記載の浮遊プラットフォーム上での水耕栽培、又は土壌中での栽培のいずれかで栽培した植物をトランスフェクションするために用い、次に、Pogue et al. (2010)に公開される通常のプロトコールにより、真空下でインフィルトレーションした。
【００６２】
図５に説明する通り、方法に記載の植物培養条件、並びにｐＡＧ０１ベクターの使用により、一過性発現の一般的に用いられる条件で観察されるものより、組み換えアレルゲンのより多い収量を可能にする。
【００６３】
本発明による方法の収量は、通常の方法で得られるものより多いことは、図５から明白である。更に、トラック７〜９をトラック４〜６と比較することにより説明する通り、種々の形質転換現象のより良好な均一性を示した。
【００６４】
Der p 7について観察したより高い発現レベルを、本発明の方法によるアグロインフィルトレーションの条件により、一部説明した。事実、図６に説明する通り、葉組織のインフィルトレーションは、方法に記載する通り、より効果的である。この図において、本発明者等は、１）アグロインフィルトレーションを、本発明に記載のプロトコールにより行うとき（パネルＢ）、又は２）インフィルトレーションを、例えば、Medrano et al. (2009)に記載の通常の方法のインフィルトレーションにより行われるときの（パネルＡ）、ＧＦＰの発現を比較した。
【００６５】
実施例４：本発明による方法により、容易な精製が可能になる
ニコチアナ・ベンタミアーナ植物の葉を回収し、タンパク質を、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）を添加したリン酸塩バッファー中、pH７．５でこの植物材料を粉砕することにより、抽出した。迅速な濾過後、抽出物を、固定ニッケルカラム上に置いた。クロマトグラフィー基質に対する親和性を有しない抽出物のタンパク質は、カラム上に保持されない。しかしながら、方法により生産された組み換えアレルゲンは、ヘキサ−ヒスチジンタグを有し、この種の基質上に保持される。カラムを洗浄して、混入したタンパク質を除去した後、アレルゲンを、リン酸塩バッファー中の５０mMイミダゾールの存在下で特異的に溶出した。
【００６６】
本発明による生産方法は、柔軟であり、対象の任意のアレルゲンの生産に容易に適合可能である。これは、栽培、クローニング、アグロインフィルトレーション、及び抽出技術だけでなく、精製技術についても真実である。
【００６７】
事実、タグの融合により、組み換えアレルゲンの精製を標準化した。これを図７に説明し、それは、本発明に記載の通り生産したアレルゲンDer p 4の精製工程であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる分析を示す。この分析は、２つのクロマトグラフィー工程でのこのアレルゲンの精製方法を説明する：
１）固定ニッケル親和性カラム（ＩＭＡＣ）、及び２）分子粉砕。
トラック１：総タンパク質抽出物。
トラック２：固定ニッケルカラム（ＩＭＡＣ）上で精製し、５０mM  イミダゾールの存在下で溶出したDer p 4。
トラック３：ＩＭＡＣ工程後、分子粉砕により精製したDer p 4。
トラック４：タグをインビトロで切断し、精製したDer p 4。
上部のパネル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルにおいてクーマシーブルーでタンパク質を染色することによるDer p 4の分析。
下部のパネル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロット、及び精製タグの特異的な免疫血清でのプリント上での免疫検出によるDer p 4の分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月13日(2018.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ植物における組み換えアレルゲンの生産方法であって、以下の工程：
ａ）植物を、ＬＥＤ照射下で気耕栽培又は水耕栽培し、次に、
ｂ）工程ａ）で得られた植物を、真空下、組み換えアレルゲンをコードするＤＮＡフラグメントを含むアグロバクテリアにより、アグロインフィルトレーションし、次に、
ｃ）植物を、工程ｂ）の後、工程ａ）についてのものと同一条件下での培養に戻し、次に、
ｄ）組み換えアレルゲンを、工程ｃ）で生産された植物の地上部から抽出及び精製する、
を含む方法。
【請求項２】
組み換えアレルゲンが、組み換えダニアレルゲンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
組み換えアレルゲンが、デルマトファゴイデス・ファリナエのアレルゲン、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスのアレルゲン、オイログリフス・マネイのアレルゲン、アカルス・シロのアレルゲン、ブロミア・トロピカリスのアレルゲン、ゴキブリアレルゲン、木又は草の花粉アレルゲン、動物のアレルゲン、カビのアレルゲン、ヘベアラテックスのアレルゲン、及び食物アレルギーに関与するアレルゲンから選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
組み換えアレルゲンが、Der f 10、Der f 11、Der f 13、Der f 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 2、Der f 2.0101、Der f 2.0102、Der f 2.0103、Der f 2.0104、Der f 2.0105、Der f 2.0106、Der f 2.0107、Der f 2.0108、Der f 2.0109、Der f 2.0110、Der f 2.0111、Der f 2.0112、Der f 2.0113、Der f 2.0114、Der f 2.0115、Der f 2.0116、Der f 2.0117、Der f 20、Der f 3、Der f 4、Der f 5、Der f 6、Der f 7、Der f 8、Der f 9、及びDer f HSP70から選択される、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項５】
組み換えアレルゲンが、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 2、Der p 2.0101、Der p 2.0102、Der p 2.0103、Der p 2.0104、Der p 2.0105、Der p 2.0106、Der p 2.0107、Der p 2.0108、Der p 2.0109、Der p 2.0110、Der p 2.0111、Der p 2.0112、Der p 2.0113、Der p 20、Der p 21、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、及びDer p 9から選択される、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項６】
組み換えアレルゲンが、Blo t 1、Blo t 5、Blo t 9、Blo t 10、Blo t 12、及びBlo t 21から選択されることを特徴とする、請求項１〜３の１項記載の方法。
【請求項７】
アグロインフィルトレーションが、ベンチュリー効果により真空下で行われることを特徴とする、請求項１〜６の１項記載の方法。
【請求項８】
アグロインフィルトレーションが、植物を真空下に２分間置く工程、又は、真空に置き、次に真空を解除して大気圧に戻し、次に真空下置き、最後に大気圧に戻すことにより、行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【外国語明細書】
2018148907000001.pdf