(57)【要約】【課題】インビトロで、簡便、短時間かつ安定に大量のがん細胞の初代培養物を得る。【解決手段】（ａ）生体由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供することを含む、がん細胞の初代培養物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）生体由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む、がん細胞の初代培養物の製造方法。
【請求項２】
挟雑物の除去が篩い分けにより行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が２０μｍ〜１００μｍ、上限が２００μｍ〜５００μｍである請求項１記載の方法。
【請求項３】
浮遊培養が２４〜４８時間行われる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
下記工程：
（ｄ）工程（ｃ）で得られた培養物をさらに継代培養する
を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られたがん細胞の初代培養物を用いることを特徴とする、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られたがん細胞の初代培養物を含む、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニングのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初代細胞の培養方法に関する。詳細には、本発明は、がん細胞の初代培養物の製造方法、ならびに該方法で得られたがん細胞の初代培養物を用いる医薬品のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは根治の難しい疾患である。特に消化器癌は悪性度が高く、根治は非常に難しい。抗がん剤などの化学療法の基礎的研究には、一般的には、確立されたがん細胞株が用いられているが、臨床におけるがんとはその形態、遺伝子発現など多くの点で性質が異なる。このような理由から、抗がん剤のスクリーニングやがんの化学療法の基礎研究などには、臨床におけるがんの性質と類似の性質を有するがん組織由来の初代培養物を用いることが望ましい。
【０００３】
がん組織由来細胞を初代培養する方法が報告されているが（特許文献１参照）、この方法は、臨床におけるがんの性質と類似の性質を有する初代細胞を得ることはできるが、簡便、短時間かつ安定に多くの初代細胞を得ることは難しい。
【０００４】
また、浮遊培養後に接着培養する工程を含む、がん組織の階層構造を再現するがん幹細胞集団の作製方法が報告されているが（特許文献２参照）、この方法は、本発明とは目的が異なるうえ、動物に移植して細胞塊を作製する工程を必須とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０８８号公報
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１２／０４６７９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、患者由来がん細胞の性質を保持したがん細胞集団を提供することを課題とする。詳細には、本発明は、患者由来がん細胞を、インビトロで、簡便、短時間かつ安定に大量培養できる初代培養法を提供することを課題とする。当該がん細胞集団は、インビトロ条件下での培養系において、あるいは当該がん細胞集団が移植された非ヒト動物モデルにおいて、がんの分子メカニズム解明、薬剤感受性試験などに用いることができるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、がん組織由来の細胞塊を浮遊培養し、次いで接着培養することにより、インビトロで、簡便、短時間かつ安定に大量のがん細胞の初代培養物が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）下記工程：
（ａ）生体由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む、がん細胞の初代培養物の製造方法；
（２）挟雑物の除去が篩い分けを含む方法により行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が２０μｍ〜１００μｍ、上限が２００μｍ〜５００μｍである（１）記載の方法；
（３）浮遊培養が２４〜４８時間行われる（１）または（２）記載の方法；
（４）下記工程：
（ｄ）工程（ｃ）で得られた培養物をさらに継代培養する
を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られたがん細胞の初代培養物を用いることを特徴とする、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニング方法；
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られたがん細胞の初代培養物を含む、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニングのためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、インビトロで、簡便、短時間かつ安定に大量のがん細胞の初代培養物を得ることができる。本発明のがん細胞初代培養方法は、様々な種類のがん細胞に適用することができる。本発明により得られるがん細胞の初代培養物は、臨床におけるがん組織と類似の性質を有しているので、体内のがん組織の状態をインビトロで再現することができる。したがって、本発明により得られる初代培養物を用いて、医薬品のスクリーニング、薬剤感受性試験、がんの分子メカニズムの解明などの研究を、正確かつ効率的に行うことができる。さらに、本発明によれば、患者のがん組織と同じ性質を有する類似の初代培養物が得られるので、患者に対する個別治療にも役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、臨床試料由来の大腸癌細胞塊の浮遊培養０日目の顕微鏡像（左）、浮遊培養１日目の顕微鏡像（中）、接着培養３０日目の顕微鏡像（右）を示す。
【図２】図２は、大腸癌の臨床試料（左）と本発明により得られた大腸癌の臨床試料由来の初代培養物のマウスへの移植片（移植４２日目）（右）の組織切片の顕微鏡像（ＨＥ染色）を示す。
【図３】図３は、本発明の方法により得られた胃癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（上段左）、膵癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（上段右）、肝臓癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（下段左）を示す。
【図４】図４は、本発明の方法により得られた肺癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（上段左）、腎癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（上段右）、乳癌の臨床試料由来の初代培養物の顕微鏡像（下段左）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、第１の態様において、
下記工程：
（ａ）生体由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む、がん細胞の初代培養物の製造方法を提供する。
【００１２】
上記方法の工程（ａ）について説明する。生体は、生きた動物を意味し、好ましくは哺乳動物であり、典型的にはがんを有するヒトである。生体からのがん組織の取得はいずれの手段・方法によって行ってもよく、例えば、外科手術時に採取または摘出することによって、あるいは生検を行うことによって得てもよい。
【００１３】
がんの種類はいずれの種類であってもよく、例えば、大腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、肛門癌、膵癌、肝癌、胆管癌、消化器内分泌腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、乳癌、肺癌、中皮腫、胸腺癌、腎癌、尿路上皮癌、精巣腫瘍、前立腺癌、子宮体癌、子宮頚癌、子宮肉腫、卵巣悪性腫瘍、舌癌、歯肉癌、口腔底癌、咽頭癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲状腺癌、骨肉種、Ewing肉腫、軟部肉腫、骨髄異形成症候群、皮膚癌、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫（グリオブラストーマ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが例示されるが、これらに限定されない。
【００１４】
生体から得られたがん組織をそのまま細分化してもよく、細分化前に動物細胞培養用培地にて維持してもよい。動物細胞培養用培地としてはＤ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などが例示されるが、これらに限定されない。この段階での培地中での維持は適当時間行うことができ、例えば数時間〜４８時間維持してもよい。
【００１５】
細分化の前に、がん組織を洗浄してもよい。洗浄は、生理食塩水中、あるいはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液中で行うことができる。
【００１６】
細分化はいずれの手段・方法によって行ってもよく、ナイフ、はさみ、カッターなどを用いて行うことができる。例えば、剪刀を用いてがん組織を細断してもよい。あるいは、適切なサイズの注射針を備えたシリンジにがん組織の懸濁液を繰り返し出し入れすることにより、細分化を行ってもよい。好ましくは、組織塊が肉眼で見えなくなる程度（直径約１ｍｍ以下）まで細断する。
【００１７】
細分化されたがん組織を酵素処理して、結合組織等を除去してもよい。酵素としてはコラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼなどを単独または組み合わせて用いることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
細分化したがん組織からの挟雑物の除去は、いずれの手段／方法にて行ってもよい。挟雑物は雑菌類やがん組織以外の組織片などであるがこれら以外のものであってもよい。挟雑物の除去方法には上述のような洗浄や酵素処理も含まれるが、好ましくは、挟雑物の除去が篩い分けを含む方法により行われることが好ましい。
【００１９】
篩い分けはいずれの手段・方法を用いて行ってもよく、好ましくは、滅菌されたフィルターを用いて行う。がんの種類や組織型によって篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限および上限を選択することができる。下限が約２０μｍ〜約１００μｍ、上限が約２００μｍ〜約５００μｍであることが好ましい。このようなサイズの細胞塊を得るために、２種類の適切なポアサイズのフィルターを選択して、逐次用いることができる。様々なポアサイズのフィルターが市販されている。例えば、ポアサイズ２００μｍのフィルターを通過し、ポアサイズ２０μｍのフィルターを通過しないで残った細胞塊を生理食塩水または動物細胞培養用培地に懸濁し、その後例えば遠心分離を行って、所望サイズの細胞塊を回収することができる。
【００２０】
細胞塊のサイズを上記のようなサイズにすることにより、コンタミネーションを効率良く防止できるほか、細胞塊中の生細胞の割合も高くなる。したがって、次工程である浮遊培養工程、および次々工程である接着培養工程を経て得られる癌細胞の初代培養の効率が高まる。また、細胞塊のサイズを上記のようなサイズにすることにより、線維芽細胞等の割合を減らすことができ、接着培養後に得られる初代培養物は、実際の臨床組織に類似したものとなる。
【００２１】
上記方法の工程（ｂ）は、上記のようにして得られたがん細胞塊を浮遊培養に供する工程である。浮遊培養は、がん細胞塊が培養容器に接着しない条件下での培養である。浮遊培養は当業者に公知である。浮遊培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し難い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。浮遊培養の培地の組成、培養温度、静置か撹拌または振盪を行うかなどの浮遊培養に関するその他の条件も、がん細胞の種類その他の条件に応じて当業者が適宜定めうるものである。
【００２２】
本発明において、浮遊培養を適当時間行うことで接着培養に移行させ得る細胞をより選択的に選別することができる。浮遊培養を約２４時間ないし約４８時間行うことが好ましい。これらの時間浮遊培養されたがん細胞塊は、次の接着培養に供した場合に、得られる初代培養物は臨床組織に類似した形態、性質となり、遺伝子の変異も見られないか、あってもごくわずかである。
【００２３】
上記方法の工程（ｃ）は、上記のごとく浮遊培養されたがん細胞塊を接着培養に供する工程である。接着培養は、がん細胞塊が培養容器に接着する条件下での培養である。接着培養は当業者に公知である。接着培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し易い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。がんの種類や組織型によってはラミニン５１１、可溶性Ｅカドヘリン等を固層化したプレートに播種してもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。接着培養の培地も、がん細胞の種類その他の条件に応じて選択することができる。培地の種類、培養温度などの接着培養に関するその他の条件も、当業者が適宜定めうるものである。
【００２４】
接着培養を適当時間行うことにより細胞を増殖させて、多くのがん細胞の初代培養物を得ることができる。例えば、市販の接着培養用のプレートにて、３７℃、ＣＯ２ ５％下で１〜２日おきに培地交換しながら、細胞がプレートの約５割〜約８割程度まで増殖するまで接着培養を行ってもよい。本発明の方法によれば、臨床組織に類似したがん細胞の初代培養物を多く得ることができる。すなわち、本発明によれば、体内のがん組織の状態をインビトロで再現することができる。そのため、本発明により得られた初代培養物を用いて、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、医薬品のスクリーニング等を、正確に、しかも効率良く行うことができる。これらの研究のために、本発明により得られた初代培養物をインビトロで用いてもよく、動物に移植して用いてもよい。
【００２５】
上で説明した本発明の初代培養物の製造方法において、（ｂ）の浮遊培養を行う工程を省略してもよい。
【００２６】
上記のようにして得られた初代培養物を、さらに継代培養してもよい。具体的には、上記にようにして得られた初代培養物を培養容器から剥離させ、常法により継代培養することができる。継代培養を行うことにより、さらに多くの新鮮な初代培養物を得ることができる。継代は、初代培養物の性質（形態学的性質、遺伝学的性質、生理学的性質など）が変化しない回数行うことが好ましい。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法により得られた初代培養物を用いることを特徴とする、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニング方法を提供する。
【００２８】
本発明は、さらなる態様において、本発明の方法により得られた初代培養物を含む、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、または医薬品のスクリーニングのためのキットを提供する。本発明のキットは、上記初代培養物のほか、試験に必要な試薬および器具、ならびにキットの取扱説明書などを含んでいてもよい。
【００２９】
以上、本発明によるがん組織由来の初代細胞培養方法について説明したが、本発明の方法は、がん組織に限らずあらゆる組織の初代培養にも適用可能である。
【００３０】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３１】
実施例１  大腸癌由来の初代培養物の作製
手術時に癌組織を切除し、生理食塩水で３回洗浄し、１％ anti−anti PBSで３回洗浄した。洗浄した癌組織を、剪刀を用いて細断した。肉眼的に組織塊が見えなくなり、１０ｍＬピペットで吸引可能なサイズ（直径１ｍｍ以下）まで細断した。細切した組織片を５０ｍＬファルコンチューブへ回収し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）（C6885;Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO, USA）１０ｍＬを加え、シェーカー（Bio Shakor,BR−13FP）にて、３７℃、２００ｒｐｍで１５分間反応させた。
【００３２】
コラゲナーゼで分散した細胞集塊を含んだ溶液を２種類のフィルターで分離した。ポアサイズ２５０μｍのフィルターを通過し、ポアサイズ５０μｍのフィルターを通過せずに残る細胞塊を回収した。２つ目のフィルターに残った細胞集団を培地１で懸濁し、遠心機（KUBOTA, KN−70）で、１５００ｒｐｍにて５分遠心した。培地１の組成は以下のとおりであった。
【００３３】
DMEM/F12
Knockout serum replacement (Thermo Fisher Scientific, cat. 10828028) (20%)
炭酸水素ナトリウム (25mM)
L−アスコルビン酸 (0.1mg/mL)
Fibroblast growth factor 2 (4−100ng/mL)
Transforming growth factor−β (20−30pM)
β−メルカプトエタノール (0.1mM)
4−aminobutanoic acid (1mM)
塩化リチウム(0.5−1mM)           
ペニシリン・ストレプトマイシン(1%)
L−グルタミン(1−4 mM) 
【００３４】
浮遊培養
上清を吸引し、沈渣を培地１で再懸濁した。細胞集団を懸濁した培養液をプレート（CORNIG, Ultra−Low Attachment Surface Polystyrene）上に播種した。浮遊培養開始時の細胞塊の顕微鏡写真を図１の左パネルに示す。３７℃で２４〜４８時間培養後、浮遊している細胞集団を含んだ培養液を回収した。浮遊培養を１日（２４時間）行った細胞塊の顕微鏡写真を図１の中パネルに示す。
【００３５】
接着培養
上記にようにして回収した浮遊細胞集団を遠心し、再懸濁し、プレート（hESC−matrigel coated plate）上に播種した。培養器（温度３７℃、二酸化炭素濃度５％）にて培養（上記の培地１を使用）し、培地交換（上記の培地１を使用）を１日から２日おきに行った。接着培養を３０日間行って本発明の初代細胞培養物を得た。３０日間接着培養して得られた初代細胞培養物を図１の右パネルに示す。臨床組織に類似した癌細胞の初代培養物を多く得ることができた。なお、接着培養せずに浮遊培養を長期間（６０日間）続けた場合は、浮遊細胞集団の細胞密度が高くなるだけで、本発明の初代細胞培養物は得られなかった。
【００３６】
継代培養
細胞がプレートの５割から８割程度まで増殖した段階で、以下の方法で継代を行った。培養液を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄した。アクターゼ（Innovative Cell Technologies, Inc. San Diego, CA, USA）を加え、室温で５分から１０分間反応させた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて５倍希釈し、細胞を回収した。遠心機（KUBOTA,KN−70）で、１５００ｒｐｍにて５分遠心した。上清を吸引し、沈渣を培地１で再懸濁し、プレート（hESC−matrigel coated plate）上に播種した。継代培養して得られた細胞は上記接着培養にて得られたものと同様の特徴を有していた。
【００３７】
２６例の大腸癌の手術、および１５例の大腸癌生検から得た試料について上記と同様にして初代細胞培養物を得た。これらの初代細胞培養物は、臨床の癌組織と形態が類似しており、免疫組織化学的分析の結果も臨床の癌組織と同様であった。得られた初代細胞の免疫細胞学的分析の結果も臨床組織の癌細胞と同様であった。ＰＣＲにて遺伝子変異解析（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ）したところ、初代細胞は臨床組織中の癌細胞と同じ遺伝子発現パターンを示した。
【００３８】
２６例の手術で得られた初代細胞培養物はすべて増殖可能かつ継代可能であった。このうち１５例の手術で得られた初代培養物をマウスに移植したところ（実施例２参照）、全例について移植が成功した。生検から得られた初代細胞培養物は、９０％が増殖可能であり、８０％が継代可能であった。
【実施例２】
【００３９】
実施例２  初代培養物のマウスへの移植
実施例１と同様にして得られた大腸癌の初代細胞培養物（１×１０５細胞）をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。マウスにおいて移植片のサイズが増加し、本発明により得られた初代培養物が腫瘍形成能を有することが示された。４２日後に移植片について解析した。移植片は、臨床試料と類似の形態を示し（図２）、免疫組織化学的分析の結果も臨床の癌組織と同様であった。得られた初代細胞の免疫細胞学的分析の結果も臨床組織の癌細胞と同様であった。ＰＣＲにて解析したところ、初代細胞は臨床組織中の癌細胞と同じ遺伝子発現パターンを示した。
【実施例３】
【００４０】
実施例３  様々な癌組織からの初代細胞培養物の作製
手術時に採取または生検により胃癌、膵癌、肝臓癌、肺癌、腎癌、乳癌の組織から採取した試料を用いて、実施例１と同様にして初代培養物を得た。胃癌由来の初代培養物を図３の左上パネルに、膵癌由来の初代培養物を図３の右上パネルに、肝臓癌由来の初代培養物を図３の左下パネルにそれぞれ示す。肺癌由来の初代培養物を図４の左上パネルに、腎癌膵癌由来の初代培養物を図４の右上パネルに、乳癌由来の初代培養物を図４の左下パネルにそれぞれ示す。本発明の方法を用いて様々な種類の癌組織から初代細胞を得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により得られるがん細胞の初代培養物は、臨床におけるがんと同様の性質を有するので、本発明は、医薬品の分野、がんの研究の分野などにおいて利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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