(57)【要約】      （修正有）【課題】ネイキッド核酸を始めとする核酸の導入に適した核酸導入用組成物及びその利用法の提供。【解決手段】固体物質としての核酸と、アニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分と、を含有する核酸導入用組成物。核酸はネイキッド核酸であり、アニオン性成分はヒアルロン酸又はその塩であり、核酸とアニオン性成分を含む多孔質粒子を含む組成物。更にロイシン、フェニルアラニン、又はイソロイシンから選択される１以上の疎水性アミノ酸を含有する組成物。本組成物は、核酸を細胞に導入して当該核酸による種々の効果、例えば、遺伝子発現（タンパク質の合成）、遺伝子の発現抑制を意図するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体物質としての核酸と、アニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分と、を含有する核酸導入用組成物。
【請求項２】
前記核酸は、ネイキッド核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性キャリアを含有しない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記核酸と前記アニオン性成分を含む多孔質粒子を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
さらに、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
実質的に水を利用しないで細胞に供給するための組成物である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
固相である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳類細胞に対する遺伝子導入用である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
核酸導入用組成物の製造方法であって、
核酸と、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分と、を含有する溶液を、凍結乾燥する乾燥工程、
を備える、製造方法。
【請求項１２】
前記乾燥工程は、噴霧凍結乾燥による工程である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
生体外の細胞に対して、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸導入用組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、
を備える、核酸導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、核酸導入用組成物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の導入による細胞の形質転換は、種々の分野において利用されている。遺伝子の導入方法は、対象とする細胞の種類等によっても異なるが、いわゆるベクターと称されるウイルス等に由来する人工的なＤＮＡコンストラクトをキャリアとして用いて行われることが多い。一方、こうしたウイルス由来ベクターに対して安全性の観点から、カチオン性ポリマーやカチオン性脂質等の非ウイルス性キャリアも検討されている。導入されるＤＮＡなどの核酸は、アニオン性を示し、細胞膜も同様にアニオン性を示すためである。こうしたカチオン性キャリアがＤＮＡと複合体を形成し、細胞膜を通過することが意図されている。
【０００３】
こうしたカチオン性キャリアの利用に際しては、アニオン性ポリマーであるヒアルロン酸の併用の有用性が開示されている（特許文献１）。アニオン性ポリマーとしてのヒアルロン酸を併存させることで、ヒアルロン酸受容体を有する細胞に対して高い特異性と効率で遺伝子を導入できることが開示されている。
【０００４】
一方、こうしたウイルス性キャリアや非ウイルス性キャリアを使用しないで、naked ＤＮＡなどの（以下、ネイキッドＤＮＡともいう。）を遺伝子導入に用いる手法も検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１７６８３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非ウイルス性であっても、カチオン性キャリアを用いることによる細胞障害性、発現効率の低下が問題となる場合がある。また、キャリアを全く使用しないネイキッドＤＮＡの直接導入は、キャリアに由来する細胞障害性を低下させることができるものの、安定性や導入効率の低さが危惧される。さらに、こうした核酸の細胞への導入は、核酸を予め水系媒体に溶解した状態で行うことが一般的である。
【０００７】
本明細書は、ネイキッドＤＮＡを始めとするネイキッド核酸など核酸の導入に適した核酸導入用組成物及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、最も安定性や発現効率が問題となると考えられるネイキッド核酸を対象として細胞に導入して発現させることについて種々の検討を行ったところ、意外にも核酸を固体物質としてある種の賦形剤とともに含有する組成物が、高い遺伝子導入効率を実現するという知見を得た。本明細書は、こうした知見に基づき、以下の手段を提供する。
【０００９】
［１］固体物質としての核酸と、アニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分と、を含有する核酸導入用組成物。
［２］前記核酸は、ネイキッド核酸である、［１］に記載の組成物。
［３］カチオン性キャリアを含有しない、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記核酸と前記アニオン性成分を含む多孔質粒子を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］さらに、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される、［６］に記載の組成物。
［８］実質的に水を利用しないで細胞に供給するための組成物である、［１］〜［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］固相である、［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］哺乳類細胞に対する遺伝子導入用である、［１］〜［９］のいずれかに記載の組成物。
［１１］核酸導入用組成物の製造方法であって、
核酸と、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分と、を含有する溶液を、凍結乾燥する乾燥工程、
を備える、製造方法。
［１２］前記乾燥工程は、噴霧凍結乾燥による工程である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］生体外の細胞に対して、［１］〜［１０］のいずれかに記載の核酸導入用組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、
を備える、核酸導入方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】各種の組成物における粒子形態を示す図である。
【図１Ｂ】各種の組成物における粒子形態を示す図である。
【図１Ｃ】各種の組成物における粒子形態を示す図である。
【図２】各種アニオン性成分を含む組成物による遺伝子発現量を示す図である。
【図３】各種アニオン性成分を含む組成物による遺伝子発現量を示す図である。
【図４Ａ】粉末状組成物と溶液組成物（いずれも低分子量ヒアルロン酸含有）とによる遺伝子発現レベルの比較結果を示す図である。
【図４Ｂ】粉末状組成物と溶液組成物（いずれも高分子量ヒアルロン酸含有）とによる遺伝子発現レベルの比較結果を示す図である。
【図５】低分子量ヒアルロン酸と疎水性アミノ酸との組合せと遺伝子発現量との関係を示す図である。上段及び下段は、それぞれＡＵＣ及びＬｕｃに基づく結果を示す。
【図６】高分子量ヒアルロン酸と疎水性アミノ酸との組合せと遺伝子発現レベルとの関係を示す図である。上段及び下段は、それぞれＡＵＣ及びＬｕｃに基づく結果を示す。
【図７】粉末組成物と溶液組成物とによる遺伝子発現量の比較結果を示す図である。
【図８】疎水性アミノ酸の吸入特性に及ぼす影響を示す図である。
【図９】各種態様のネイキッド核酸導入用組成物のＳＥＭ観察結果を示す図である。
【図１０】各種態様のネイキッド核酸導入用組成物によるin vivoにおける遺伝子発現効果を示す図である。
【図１１】ｓｉＲＮＡを含むネイキッド核酸導入用組成物によるin vitroにおける遺伝子発現抑制効果を示す図である。
【図１２】ｓｉＲＮＡを含むネイキッド核酸導入用組成物によるin vivoにおける遺伝子発現抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書の開示は、核酸導入用組成物及びその利用に関する。本明細書に開示する核酸導入用組成物（以下、本組成物ともいう。）によれば、細胞に対して、高い効率で、所望の核酸を導入し、当該核酸に基づく機能、例えば、遺伝子の発現等を生じさせることができる。本組成物は、また、カチオン性ポリマーなど、核酸の有する負電荷と相互作用する非ウイルス性キャリアを用いないため、かかるカチオン性キャリアによる細胞障害性を抑制又は回避することができる。
【００１２】
本組成物、すなわち、粉末状の本組成物を、細胞に供給するとき、非ウイルス性カチオン性キャリアや、本組成物を溶解した状態した細胞に供給するときよりも、高い効率で核酸を導入することができる。このような本組成物の効果は、必ずしも明らかではなく、推論であって本明細書における開示を拘束するものではないが、細胞に供給された本組成物が細胞上の少量の水分に溶解することで核酸の高濃度曝露条件を生じて能動的な細胞内取り込みが向上し、粘膜付着性の付与によって、細胞との接触時間の延長及び核酸取り込みの持続等、により、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸と細胞膜の負電荷との反発が抑制又は回避されて効率的に取り込まれたと推論することができる。
【００１３】
以下、本明細書の開示に関する各種実施形態を詳細に説明する。
【００１４】
（本組成物）
本組成物は、固体物質としての核酸と、アニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分と、を含有することができる。以下、本組成物の成分について説明し、その後、本組成物の各種態様について説明する。
【００１５】
（核酸）
核酸は、天然に存在するデオキシリボクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの重合体である天然核酸及び少なくとも一部に非天然構造を有するデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含む重合体である非天然核酸を含むことができる。天然のデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは天然塩基を備えている。天然塩基は、天然のＤＮＡ及びＲＮＡにおける塩基であって、アデ二ン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルが挙げられる。また、天然のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドは、その２−デオキシリボース及び／又はリボースの５位のリン酸と隣接するデオキシリボース及び／又はリボースの３’の水酸基とがリン酸ジ工ステル結合で連結した骨格を有している。本明細書において、天然核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとのキメラ（以下、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラともいう。）であってもよい。また、ＤＮＡ、ＲＮＡはそれぞれ一本鎖であってもよいし、同種の二本鎖であってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとがハイブリダイズしたハイブリッドであってもよい。さらには、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラが、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラとハイブリダイズしたハイブリッドであってもよい。
【００１６】
非天然の核酸は、塩基、骨格（糖部分及びリン酸部分）のいずれかにおいて、少なくとも一部に非天然構造を有する核酸をいう。非天然塩基としては、種々の非天然塩基が知られている。また、天然のリボースーリン酸骨格を代替する各種の骨格も提供されている。例えば、糖−リボース骨格に替えて炭素数が３個程度の炭素を有するグリコール核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。また、天然の核酸はＬ−ＤＮＡ又はＬ−ＲＮＡであるが、Ｄ−ＤＮＡ及びＤ−ＲＮＡの構造を少なくとも一部に備える核酸は非天然核酸に含まれる。非天然の核酸においても、一本鎖、二本鎖、ハイブリッド及びキメラ等の各種態様が含まれる。
【００１７】
この種の非天然核酸は、概して、タンパク質をコードするコード鎖や鋳型鎖でなく、例えば、他の機能、例えば、細胞内である種の核酸と相互作用させて、その核酸の機能を変化させるなどに用いられる。典型的には、標的タンパク質の発現阻害や機能阻害という機能発現のために用いられる。例えば、遺伝子発現を介することなく、生体内核酸に直接作用する核酸が挙げられ、具体的には、アンチセンス核酸、センス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。この種の非天然核酸は、ヌクレオチドが十数個から数十個程度が重合したオリゴヌクレオチドである場合が多い。
【００１８】
本組成物は、核酸として、ネイキッド核酸の状態であることが好ましい。ネイキッド核酸（naked 核酸）とは、すなわち、裸の核酸をいう。より具体的には、例えば、遺伝子発現を意図する場合には、プラスミドを用いた核酸コンストラクト（非ウイルス性ベクター）が挙げられる。また、例えば、遺伝子発現の抑制を意図する場合には、プラスミドＤＮＡなどの非ウイルス性ベクターほか、アンチセンス核酸（アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、マイクロＲＮＡ等が挙げられる。ネイキッド核酸としては、治療目的のための核酸要素を主体とし、あるいは当該核酸のみからなり、細胞への核酸の導入のためだけのビヒクルとしての核酸要素を含まない核酸であってもよい。
【００１９】
ネイキッド核酸の形態は、特に限定するものではなく、リニアであってもよいし、サーキュラー（閉環又は開環）であってもよい、また、スーパーコイル状であってもよい。目的に応じた形態を適宜備えることができる。ネイキッド核酸としては、ウイルス由来の要素を有するウイルス性キャリア、リポソームやカチオン性ポリマーなどのカチオン性の非ウイルス性キャリアを有していないことが好ましい。ウイルス性キャリアの危険性のほか、かかる非ウイルス性キャリアについても細胞障害、標的性能、発現効率に関して必ずしも十分でないからである。
【００２０】
本組成物は、粉末など固体物質としての核酸を有している。固体物質としての核酸とは、核酸が結晶又は非結晶の状態であって固相を形成している状態をいう。
【００２１】
（アニオン性成分）
本組成物は、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分を有している。ア二オン性成分は、必ずしも明らかではないが、固体物質としての核酸と併存させることで、核酸の細胞への導入効率を高めることができると推論される。また、核酸を噴霧凍結乾燥などで乾燥するときにおいて併存させることで、核酸の生物活性の維持に寄与することが推論される。
【００２２】
アニオン性ポリマーとしては、特に限定するものではないが、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００〜４００万程度の天然由来又は合成ポリマーが挙げられる。アニオン性基は、特に限定しないが、１分子中に複数、好ましくは５個以上有するポリマーを使用することができ、このような官能基としては、例えばカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基が挙げられる。なお、このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
【００２３】
アニオン性ポリマーとしては、より具体的には、アニオン性基を有する多糖類又はその誘導体；アニオン性基を側鎖に有するアミノ酸残基を含むポリペプチド；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；アニオン性基を有する合成ポリマー等が挙げられる。
【００２４】
アニオン性基を有する多糖類又はその誘導体としては、グルコサミノグリカンが挙げられる。かかるグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００〜４００万、より好ましくは４０００〜３００万である。グルコサミノグリカンは、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸等が挙げられる。なかでも、ヒアルロン酸は、核酸導入や保護に優れた寄与が推測される。ヒアルロン酸を始めとする各種グルコサミノグリカンの誘導体としては、ポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体又はその一部などを導入することによって得られるものが挙げられるほか、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体等が挙げられる。
【００２５】
ヒアルロン酸又はその塩は、特にその由来を問わないで、広い範囲の分子量のヒアルロン酸又はその塩を用いることができる。例えば、ヒアルロン酸の平均分子量（典型的には、重量平均分子量）が５，０００以下（未満）であっても好適であり、平均分子量が１０，０００以上であってもよく、２０，０００以上であってもよく、さらには、３０，０００以上であってもよい。また、平均分子量は、４０，０００以上であってもよい。また、上限も特に限定するものではないが、例えば、平均分子量は、２００，０００以下であってもよく、１５０，０００以下であってもよい。また、例えば、平均分子量が５０，０００以上１１０，０００以下であっても好適に用いることができる。こうしたヒアルロン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩）としては、例えば、ＦＣＨ−ＳＵ（分子量５万から１１万）やマイクロヒアルロン酸ＦＣＨ（分子量５０００以下（又は未満）（いずれも、キッコーマンバイオケミファ社製）等を適宜用いることができる。
【００２６】
ヒアルロン酸の重量平均分子量が、１５，０００以上４０，０００以下であることが好適である。こうしたヒアルロン酸又はその塩を用いることで、ｓｉＲＮＡなどのネイキッド核酸の導入効率を高めることができる場合がある。
【００２７】
ヒアルロン酸の平均分子量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱検出器を組み合わせる方法（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ、例えば、「国立医薬品食品衛生研究所報告」，２００３年，１２１巻，ｐ．３０−３３）やＭｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法とＣａｒｂａｚｏｌ硫酸法の組み合わせ等により求めることができる（特許文献  特開２００９−１５５４８６号公報参照）。好ましくは、ＳＥＣ／ＭＡＬＳを用いる。
【００２８】
アニオン性基を側鎖に有するアミノ酸残基を含むポリペプチドとしては、好ましくは５００〜１００万の分子量を有するペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。
【００２９】
カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体が挙げられる。
【００３０】
アニオン性基を有する合成ポリマーとしては、１分子当たり複数、好ましくは５個以上のアニオン性基を有するポリマー又はコポリマーであって、好ましくは５００〜４００万の分子量を有するポリマー又はコポリマーである。このようなポリマー又はコポリマーとしては、具体的には分子量１０００〜３００万のアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマー、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジン等が挙げられる。
【００３１】
アニオン性ポリマーの塩としては、例えば、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属の塩のほか、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、アンモニウム塩等が挙げられる。用いるアニオン性ポリマーに応じて適宜その塩が選択される。
【００３２】
本組成物においては、各種態様（すなわち、ポリマーの種類、分子量、塩の種類等）のアニオン性成分を１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。本組成物に用いるアニオン性成分は、後述するように、固体物質としての核酸の安定化、細胞への導入、細胞における遺伝子発現又は抑制などの核酸固有の機能発現等を向上させることができるものであれば適宜商業的に入手し、あるいは必要に応じて人工的に合成し、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【００３３】
本組成物における、核酸とアニオン性成分との配合比率は、特に限定するものではなく、アニオン性成分の種類や後述する分散補助剤の存否等にもよるが、例えば、核酸１質量部に対して、５質量部以上１００質量部以下とすることができる。より好ましくは同５質量部以上５０質量部以下である。
【００３４】
（カチオン性キャリア）
本組成物は、アニオン性ポリマー等であるアニオン性成分を含有するが、カチオン性ポリマーなどの非ウイルス性であっても、細胞障害性等を発現する可能性があるため、カチオン性キャリアを含有しないことが好ましい。かかるカチオン性キャリアとしては、特に限定するものではないが、カチオン性基を有するカチオン性ポリマーやカチオン性脂質が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性基を有する多糖類、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチド、カチオン性基を有する人工ポリマー若しくはこれらの塩等が挙げられる。
【００３５】
こうしたカチオン性キャリアとしては、例えば、カチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、又はＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３６】
（疎水性アミノ酸）
本組成物は、さらに、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有していてもよい。かかるアミノ酸を含有していると、本組成物を細胞に供給する際の、分散性、吸入投与に際しての吸入特性などを向上させることができると考えられる。疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン等が挙げられる。なかでも、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンを用いることが好ましい。好適な疎水性で固相として存在する核酸及びアニオン性成分の分散性等を向上させることができると考えられる。例えば、フェニルアラニンは、好適な細胞導入効率に寄与しているものと考えられる。
【００３７】
疎水性アミノ酸の、核酸又はアニオン性成分に対する配合比率は特に限定するものではないが、核酸の分散性等を向上させることができる範囲で適宜設定される。例えば、核酸１質量部に対して、５質量部以上１００質量部以下とすることができる。より好ましくは同５質量部以上５０質量部以下である。
【００３８】
以上説明したように、本組成物は、固体物質としての核酸及びアニオン性成分のほか、必要に応じて、疎水性アミノ酸を含むことができる。さらに、本組成物は、遺伝子発現やその抑制を意図したＤＮＡやＲＮＡ等を含む組成物に一般的に使用される添加剤を含むことを排除するものではない。
【００３９】
本組成物は、固体物質としての核酸と、アニオン性成分とを含んでいればよいが、本組成物は、固体物質としての核酸を含むため、アニオン性成分も固体物質であって固相を形成して、本組成物として全体が固相を形成している組成物という態様を採ることができる。すなわち、本組成物は、固相として、粉末（散剤）、粒剤、細粒剤、顆粒剤等、適宜許容される形態を採ることができる。
【００４０】
固体物質の核酸と固体物質のアニオン性成分とを含む固相の本組成物は、さらに各種態様を採ることができる。例えば、核酸の結晶性又は非結晶性粉末等と、アニオン性成分の結晶性又は非結晶性粉末と、を混合した混合物であってもよい。また、核酸とアニオン性成分とを溶質として含む溶液（水溶液）（液層）を、固相に変換した組成物であってもよい。例えば、こうした溶液を凍結乾燥や噴霧凍結乾燥して得られた組成物であってもよい。
【００４１】
なかでも、凍結乾燥又は噴霧凍結乾燥は、核酸とアニオン性成分とを均一に複合できる点において好適である。なかでも、噴霧凍結乾燥は、例えば、動物に対する吸入投与に適した形態である。概して、噴霧凍結乾燥によれば、核酸とアニオン性成分とを含む多孔性粒子を得ることができる。当該粒子は、概して平均粒径が、１００μｍ以下、より好ましくは５μｍ以上５０μｍ以下、さらに好ましくは５μｍ以上２０μｍ以下、なお好ましくは５μｍ以上１０μｍ以下の球状粒子又は不定形、好ましくは球状粒子であり、分散性や取り扱い性に優れるものとなる傾向がある。
【００４２】
なお、本組成物が、疎水性アミノ酸やその他の添加剤を含む場合には、これを独立して付与して混合してもよいし、核酸、アニオン性成分及び疎水性アミノ酸を含む溶液から凍結乾燥や噴霧凍結乾燥から一挙に本組成物を調製してもよい。
【００４３】
また、本組成物は、固体物質の核酸を含むように、核酸が不溶の媒体（例えば、非水系溶媒など）中に当該媒体に不溶のアニオン性成分又は当該媒体に溶解したアニオン性成分を含んで、本組成物として固相と液相を含む不均一な相を形成している組成物という態様も採ることができる。
【００４４】
（本組成物の用途）
本組成物は、核酸の細胞への導入用である。さらには、本組成物は、核酸を細胞に導入して当該核酸による種々の効果、例えば、遺伝子発現（タンパク質の合成）、遺伝子の発現抑制を意図するものである。
【００４５】
本組成物の核酸は、本組成物の目的に応じて種々の態様を採ることができる。例えば、核酸が、タンパク質などをコードするコード領域を含む場合には、核酸には、当該タンパク質を発現可能に、プロモーター、ターミネーター等の発現制御領域を同時に含むことができる。例えば、こうした核酸としては、発現カセット、あるいは発現カセットを含むプラスミドベクターや人工染色体が挙げられる。プロモーターやターミネーターを始めとする制御領域やその他の要素は、当業者であれば適宜必要に応じて選択して用いることができる。また、プラスミドベクターや人工染色体は、導入する細胞の種類や導入しようとする核酸のサイズ等を考慮して適宜選択される。
【００４６】
また、例えば、遺伝子の発現を抑制する場合には、既述のように、核酸として、センス核酸、アンチセンス核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ等）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー等の態様が挙げられる。また、核酸は、こうしたＲＮＡ等を転写によって形成するＤＮＡであってもよい。
【００４７】
本組成物を適用する細胞は、特に限定するものではないが、動物細胞や微生物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、ヒトを含む哺乳類のほか、各種非哺乳類細胞が挙げられる。微生物としては、酵母、細菌、真菌等が挙げられるが、特に限定するものではない。
【００４８】
本組成物は、ヒトや動物に対する遺伝子治療、核酸医薬、免疫治療、胚作製等及び各種の遺伝子関連研究に好適に用いることができる。すなわち、いわゆるin vivo遺伝子治療のほか、ex vivo遺伝子治療に用いることができる。
【００４９】
本組成物は、実質的に水系媒体を利用しないで細胞に供給するための組成物とすることができる。「実質的に水系媒体を利用しない」とは、細胞への適用に際して、本組成物を緩衝液などの水を主体とする媒体（本明細書において、水系媒体という。）で溶解又は分散等することなく、という意味である。本組成物を適用した先の水（水分）によって、核酸等が溶解することは、「実質的に水系媒体を利用しない」に反しない。
【００５０】
固体物質としての核酸を含む本組成物は、そのままの状態で、固体物質の核酸を維持して、より好ましくは固相の組成物を、インビトロ及びインビボの細胞に適用することが好適である。固体物質としての核酸を含む本組成物又は固相の本組成物を細胞に適用することにより、細胞表面において、核酸の導入に有利な環境が形成されるものと考えられる。例えば、こうした態様の本組成物は、気液界面等において培養した培養細胞に対して、粉末とした本組成物を供給するようにすることができる。本組成物の核酸及びアニオン性成分は、細胞表面の水分を媒介して作用し、核酸が細胞内に取り込まれるものと考えられる。このようにして導入処理した細胞は、その後、目的に応じた培養状態で培養し、核酸導入効果の確認等、さらなる利用に供することができる。
【００５１】
また、ヒトを含む動物等において、外部から非侵襲的又はおおよそ非侵襲的にカテーテル等を用いて到達可能な臓器、例えば、鼻腔、眼、口腔、気道、肺、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、膀胱、膣、子宮、心臓、血管等の内表面（粘膜）に対しては、本組成物を、適当なガスを介したインジェクションにより、固体物質としての核酸を標的箇所に到達させることができる。例えば、肺粘膜や鼻腔粘膜に対する粉末製剤等の供給は、吸入法等として周知である。また、開腹や切開等によって動物の内部、例えば、皮下、筋肉、腹腔、腫瘍等の病変部に、直接本組成物を供給してもよい。なお、本組成物の適用にあたっては、標的組織内部、その表面又はその近傍に移殖するなどの手段を採ることもできる。また、ゲル状物、スポンジなどの多孔体、不織布などの表面に本組成物を担持させて留置することもできる。
【００５２】
本組成物が、このように固体物質としての核酸を含む形態で標的箇所又は細胞に供給されることにより、従来のように水系媒体で希釈されることもなく高濃度に標的部位に供給され、当該部位に継続して留まることができる。すなわち、本組成物は、本質的に、高濃度に標的細胞に到達させることが可能となっている。その結果、高い取り込み能と核酸による機能発現が可能となっていると考えられる。
【００５３】
本組成物は、用時に溶解して用いても十分な効果を発揮する。例えば、用時に、本組成物を、水、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、培地液などの水系媒体に懸濁又は溶解することにより再溶解物を調製して適用することも可能である。再溶解については、本組成物を、例えば、例えば、核酸の１００〜１００００倍（重量比）の溶媒を用いて懸濁又は稀釈する。凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった比較的高濃度の懸濁液や溶液（たとえば１ｍｌ中にＤＮＡを１ｍｇ含む液）も容易に調製することができる。
【００５４】
本組成物は、用時に非水系媒体に核酸を固体物質として含有させた状態であってもよい。例えば、用時に、本組成物を、非水系媒体に懸濁してもよい。例えば、凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった非水系媒体をベースとして核酸を適用することができるようになる。
【００５５】
このように、適当な液性媒体で溶解又は懸濁した本組成物は、生体細胞への核酸、又はその誘導体の導入に通常用いられる任意の方法を用いることができる。
【００５６】
本組成物の細胞への適用量は、上述した導入方法、疾患の種類、目的などによって異なるが、例えば核酸の量にして、投与部位によって大きく異なるが、腫瘍内への局所投与では例えば５〜１０００μｇ／ｃｍ3・腫瘍、膀胱などの臓器への投与では例えば０．１μｇ〜１００ｍｇ／臓器、全身投与では例えば０．１ｎｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ・体重とすることができる。また、対細胞の場合には、直径１〜２ｃｍのウェル当たりで０．２〜１０μｇ／１０４〜７個・細胞等とすることができる。
【００５７】
（本組成物の製造方法）
本組成物の製造方法は、核酸と、アニオン性成分と、を含有する溶液を、凍結乾燥する乾燥工程、を備えることができる。本製造方法によれば、核酸とアニオン性成分とを均一に混合された組成物を得ることができる。核酸とアニオン性成分とを含み、必要に応じて疎水性アミノ酸を含んだ溶液（水溶液等）を凍結乾燥用溶液として準備する。凍結乾燥用溶液を調製する際の、核酸、アニオン性成分の混合順序は特に限定しない。また、疎水性アミノ酸の混合も特に限定するものではなく、核酸及びアニオン成分溶解後であってもよいし、これらの成分の溶解前及び同時であってもよい。凍結乾燥用溶液に用いる媒体は、特に限定するものではないが、蒸留水や純水等を用いることができる。
【００５８】
乾燥工程は、通常の凍結乾燥条件下で行うことができ、例えば減圧下（好ましくは、５．０Ｐａ以下、より好ましくは２．０Ｐａ以下）、−６０℃〜−３０℃（棚温度１０℃〜３０℃）で乾燥することによって行うことができる。また、噴霧凍結乾燥する場合には、噴霧圧を例えば、１５０ｋＰａ程度とし、凍結乾燥用溶液の送液速度を５ｍｌ／分程度として行うことができる。乾燥に要する時間は、減圧度、溶媒の量によって異なり、通常は１時間〜２日間で完了する。
【００５９】
（核酸の導入方法）
本明細書に開示される核酸の導入方法は、生体外の細胞に対して、本組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、を備えることができる。本導入方法によれば、既に説明したように、固体物質としての核酸をアニオン性成分とともに用いるため、高い導入効率を得ることができる。本組成物の細胞の対する適用方法は、既に説明した各種態様を採ることができる。
【実施例】
【００６０】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明するが、以下の実施例は、本明細書の開示を限定するものではない。なお、以下の実施例において、特に言及しない限り％は質量％を示す。
【実施例１】
【００６１】
（各種のアニオン性成分を含むネイキッド核酸の導入用組成物の調製）
本実施例では、固体物質としての核酸に対して賦形剤として用いる各種のアニオン成分について検討するために、各種組成物を調製した。
（１）核酸
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡ (pCpG-△Luc)を用いた。
【００６２】
（２）賦形剤
賦形剤として高分子量ヒアルロン酸(M.W.; 50〜110 kDa、ヒアルロン酸FCH-SU: 以下、ＨＨＡともいう。)及び低分子量ヒアルロン酸 (M.W.; < 5 kDa、マイクロヒアルロン酸FCH: 以下、ＬＨＡともいう。)の各ナトリウム塩(ともにキッコーマンバイオケミファ株式会社)、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（ＣＭＣ、シグマアルドリッチ）、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩（ＣＳ、シグマアルドリッチ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ、シグマアルドリッチ)、β−シクロデキストリン(β-CyD、和光純薬工業株式会社)、イヌリン（Ｉｎｕ、（from chicory;Inu、シグマアルドリッチ）、メチルセルロース（ＭＣ、シグマアルドリッチ）、D(-)-マンニトール(Man、和光純薬工業株式会社)を使用した。
【００６３】
（３）試料溶液の調製
ｐＤＮＡ水溶液と各種アニオン性成分水溶液を混合して試料溶液とした。溶媒には全て超純水 (UltraPureTMDNase/ＲＮＡse-Free Distilled Water、invitrogenTM)を用いた。試料溶液の最終濃度はｐＤＮＡ濃度として200 μg/mLとした。各試料溶液の組成を以下に示す。
【００６４】
【表１】
2018011588.tif 000002
【００６５】
（４）噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）法による組成物の調製
導入用組成物は、ＳＦＤ法により調製した。噴霧乾燥機 (SD-1000、東京理化器械株式会社)に付属の2流体噴霧ノズルを用いて、試料溶液をノズル先端から15 cm下の液体窒素 (500 mL)中に150 kPaで噴霧することにより急速凍結した。詳細な条件を以下に示す。試料溶液は5 mL/minで送液し、1.5 min噴霧を続けた。得られた氷滴を凍結乾燥機 (FDU-210東京理化器械株式会社)を接続した角形ドライチャンバー (DRC-1000東京理化器械株式会社)に入れ、真空条件下で24 h乾燥することにより目的の組成物を得た。
【００６６】
【表２】
2018011588.tif 000003
【００６７】
調製した組成物をマイクロスパーテルで少量充填した100 μL用ディスポーザブルチップに三方活性を介して接続した1 mLシリンジ (TERUMO)内の空気0.25 mLを圧縮・開放することで、黒色両面テープを貼った試料台上に噴霧した。その後、30 mA、90 secプラチナコーティング処理 (JFC-1600、日本電子データム株式会社)を行い、粒子形状を走査型電子顕微鏡 (SEM; JSM-6060、日本電子株式会社)を用いて観察した。結果を図１Ａ〜１Ｃに示す。
【００６８】
図１Ａ〜１Ｃに示すように、各組成物のほとんどは、粒子径5〜10μｍでＳＦＤ製剤特有の中空多孔性構造が観察され、吸入剤に適した微粒子であることがわかった。ＨＰＣを含有する製剤は中空多孔ではなく、賦形剤の種類が粒子の形状に影響を及ぼす可能性が示唆された。このような違いが生じた原因としては、試料溶液の粘度が影響していると考えられる。ＨＰＣは他の賦形剤と比較し、粘度が高い。そのため、ある一定の粘度を境にＨＰＣはＳＦＤ法による噴霧の過程で球形の微粒子を形成できず、非中空多孔な製剤ができたと考えられた。
【実施例２】
【００６９】
（ネイキッド核酸導入用組成物のin vivoにおける遺伝子発現効果の評価）
本実施例では、実施例１で調製した各組成物をマウス肺内に投与して、遺伝子発現効果を評価した。マウスへの投与及び評価は以下のようにして行った。
【００７０】
（１）マウス肺内への投与
前処置としてペントバルビタール (50 mg/kg、i.p.)麻酔下、雌性ＩＣＲマウス (5 週齢)の前歯を自作の固定板に設置し、胸部を垂直にした。ライト (MegaLight100（商標）、ショット日本株式会社)を用いて、胸部に局所的に光を当てながら、マウスの口を開放してピンセットで舌を引き出した。口内で白色の穴として見える気管を確認し、挿管補助器具 (Liquid MicroSprayer (商品名、PennCentury, Inc))のスプレーチップ部分を使用)に装着したマウス肺内投与用カニューレ（総長４．０ｃｍのＰＥ−６０ポリエチレンチューブ）を３．０ｃｍ気管に挿入した。
【００７１】
カニューレを気管に残しつつ挿管補助器具だけを引き抜いた後、カニューレから呼気が通ることを確認し、その後、肺内投与用デバイスのチップ先端をカニューレに挿入して、マウスの吸気に合わせて0.25 mLの圧縮空気を開放することで予めチップに充填しておいた各組成物0.5 mg (ｐＤＮＡとして10 μg)を肺内投与した。
【００７２】
（２）肺内遺伝子発現効果の評価
ルシフェラーゼ活性に基づく発光をIVIS（商標）を用いて検出・解析することにより評価した。測定時に用いたluciferin はＰＢＳを用いて30 mg/mLに調整し、-80°Cで保存したものを使用した。Isoflurane (イソフル、商標、アボットラボラトリーズ)により麻酔し、マウス肺内投与6、12、24、48 h後に、発光基質であるluciferin (30 mg/mL、0.05 mL/ mouse; 300 mg/kg)を経鼻投与した。luciferin投与10 min後にisoflurane麻酔下、exposure time 1 minで発光を検出した。肺に相当するregion of interest (ＲＯＩ; 縦１ cm、横３ cm)を作成して、その発光強度 (Total Flux (photon/sec))を遺伝子発現量として求め、遺伝子発現量−時間パターンを解析した。得られた遺伝子発現量−時間パターンより、遺伝子発現量−時間曲線下面積 (ＡＵＣ)及び最大遺伝子発現量 (Ｌｕｃ（ｍａｘ）)をそれぞれ求めた。これらの結果を、それぞれ図２〜３に示す。
【００７３】
図２及び３に示すように、ＬＨＡ、ＨＨＡのほか、ＣＭＣやＣＳを含む組成物によっても遺伝子発現が確認された。特にＬＨＡを含む組成物を投与した群において、ＡＵＣ、Ｌｕｃ（ｍａｘ）ともに他の賦形剤を含む遺伝子吸入粉末剤を投与した群よりも優れた遺伝子発現効果を示した。
【００７４】
ＨＡ、ＣＭＣ及びＣＳは、カニューレに詰まることなく投与ができた。また、これらは、いずれも、アニオン性ポリマーであり、体内の特異的な受容体を介して細胞内への取り込み、転写活性の促進を期待できる。これらの要因からＨＡやＣＭＣ、ＣＳは他の賦形剤よりも細胞への取り込みが有利であり、比較的高い遺伝子発現効果がみられたと考えた。
【実施例３】
【００７５】
（粉末組成物と溶液組成物との比較）
本実施例では、実施例１で調製したＬＨＡ含有組成物及びＨＨＡ含有組成物、これらの各組成物のＳＦＤ用に用いられた各試料溶液及び各組成物を再溶解した再溶解液を、それぞれマウスに投与して、遺伝子発現量−時間パターン、ＡＵＣ、Ｌｕｃ（ｍａｘ）を比較した。
【００７６】
各組成物のマウス肺内投与は実施例２と同様に行った。また、試料溶液及び再溶解液については、液体噴霧器Liquid MicroSprayer Microspray (商標、PennCentury, Inc)のスプレーチップをカニューレに挿入して、各液剤１００μｌ（ｐＤＮＡとして１０μｇ）をマウス肺内投与した。遺伝子発現レベルは、実施例２と同様に行った。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
【００７７】
図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＬＨＡ、ＨＨＡともに、試料溶液及び再溶解液でも遺伝子発現を確認することができたが、これらの溶液よりも、粉末状の本組成物が最も高い遺伝子発現効果を示した。このことから、naked ｐＤＮＡ製剤が肺内で高い遺伝子発現を示すのは剤形が粉末剤であることがわかった。
【００７８】
このような結果になった原因として、（１）吸入粉末剤は呼吸器上皮細胞上の少量の水分に溶解することで高濃度曝露条件を生じ、能動的な細胞内取り込みを介した細胞内取り込みが向上したため、（２）吸入粉末剤による粘膜付着性の付与により、気管支内の粘膜繊毛クリアランスを回避して呼吸器系上皮細胞との接触時間を延長したためという二つの可能性が考えられた。すなわち、粉末状の本組成物が肺内の少量の水分に溶解されるのに対し、溶液製剤を投与する場合、超純水で希釈後投与されるため、比較的溶媒量が多く、 （１）や（２）のような環境を作ることが出来ないことから、肺上皮細胞膜上の負電荷とｐＤＮＡの持つ負電荷による静電的な反発で、効率的な取り込みがされなかったことが考えられた。また、遺伝子発現の時間を比較すると、溶液、粉末再溶解液ともに投与後48 h後においてほぼ遺伝子発現がみられなかったのに対し、粉末剤投与群においては48 h後でも遺伝子発現が確認された。このことから、粉末剤投与による遺伝子発現の持続性も示唆された。この結果も粉末剤投与による高濃度曝露条件によるｐＤＮＡ製剤の長期滞留が原因と考えられた。
【実施例４】
【００７９】
（ネイキッド核酸を含む導入用組成物におけるネイキッド核酸の安定性の検討）
核酸の粉末化における最重要課題の１つとして、その工程で生じる熱、凍結、せん断などの種々のストレスに対して遺伝子の構造・機能を十分に保持することが挙げられる。ｐＤＮＡは通常Supercoiled (S.C.)型の状態で存在しているが、外部からのストレスによりＤＮＡ鎖の切断等が生じてOpen-circular (O.C.)型、Linear型へと構造が段階的に変化し、特にLinear型では遺伝子発現効果が著しく低下する。一般的に、S.C.およびO.C.の位置にバンドが検出されれば、ｐＤＮＡの構造安定性が維持されたと考えられる。
【００８０】
実施例１で調製した組成物はベクターを用いていないため、カチオン性ベクターを用いることで生じる、静電的相互作用による複合体は形成しないと考えられる。そのため、複合体の安定性 (結合親和性)による、遺伝子発現効果の影響は考慮する必要がない。本実施例では、賦形剤や分散補助剤の添加、さらには、ＳＦＤが、組成物に含まれる核酸の構造に対する影響を検討することとした。
【００８１】
本実施例では、ＬＨＡ（ナトリウム塩）を核酸の賦形剤として用いるとともに、分散補助剤との組合せについて各種組成物を調製し、賦形剤及び分散補助剤の核酸の構造安定性に与える影響を検討した。
【００８２】
（１）核酸
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡ (pCpG-△Luc)を用いた。
（２）賦形剤
賦形剤としては、実施例１で用いたＨＨＡ及びＬＨＡの各ナトリウム塩を用いた。
（３）分散補助剤
分散補助剤としては、Ｌ-フェニルアラニン (SIGMA-ALDRICH: Phe)、Ｌ-ロイシン (SIGMA-ALDRICH: Leu)及びＬ−イソロイシン(SIGMA-ALDRICH: Ile)を用いた。
（４）試料溶液の調製
以下の表に示す組成に基づき、実施例に準じて、核酸と賦形剤を含む溶液に分散補助剤の溶液を添加して、各試料溶液を調製した。なお、賦形剤を含まない場合には、核酸溶液に分散補助剤溶液を添加して、ＳＦＤに用いる各試料溶液を調製した。
【００８３】
【表３】
2018011588.tif 000004
【００８４】
（５）粉末状組成物及び再溶解液の調製
各試料溶液を、実施例１と同様の方法で噴霧凍結乾燥して各組成物を調製した。これらの組成物に、含有される各成分がＳＦＤ前と同じ濃度になるように超純水を添加し溶解して再溶解液を調製した。
【００８５】
（６）アガロースゲル電気泳動による構造安定性評価、
ＳＦＤ前の試料溶液及びＳＦＤ後の再溶解液について、アガロースゲル電気泳動に行って、構造安定性を評価した。すなわち、一検体あたり6 μL(ｐＤＮＡとして0.1 μg)を、0.6％アガロースゲルを用いて100 V、30 mAで120 min電気泳動 (泳動槽AE-6530、電源AE-8270及びAE-8155、アトー株式会社)を行った。泳動緩衝液にはtris-acetate-EDTA (TAE) bufferを用いた。
【００８６】
また、同時に、組成物に含まれる核酸を人工的にスーパーコイルにしたS.C型の核酸、同じくオ−プンサーキュラーとしたO.C型核酸及び線状化したリニア型核酸もそれぞれ電気泳動した。また、サイズマーカーにはλ/Hind III digest (Loading Quick(R) DNA Size Markers, TOYOBO Life Science)を用いた。
【００８７】
電気泳動後、0.5 μg/mL ethidium bromide (EtBr)/精製水で5 min染色し、TAE bufferで脱色した後、バリアブルイメージアナライザーTyphoon9000 (GE imagination at work)を用いてEtBr由来の蛍光 (Ex; 518 nm、Em; 603 nm)を検出した。検出したバンドの位置と濃さから、ｐＤＮＡの構造安定性を評価した。
【００８８】
電気泳動結果によれば、ＬＨＡまたはＨＨＡが含まれる溶液において、Supercoiled / Open-circular型を示すバンドが確認された。ＬＨＡ、ＨＨＡともに、組成比の違いによるバンドの明らかな違いは確認されなかった。しかし、ＬＨＡが含まれる製剤においてはSupercoiled / Open-circular型以外のバンドが確認された。一方、ＨＡを含まず疎水性アミノ酸のみを含む製剤においてはSupercoiled / Open-circular型を示す位置にバンドが確認されなかった。このことから疎水性アミノ酸のみの添加ではｐＤＮＡを物理的ストレスから保護できないことがわかった。
【実施例５】
【００８９】
（ネイキッド核酸を含む導入用組成物による遺伝子発現効果の評価）
実施例４で調製した各種賦形剤を含む粉末の導入用組成物を、実施例２の手順に準じてマウス肺内に投与し、得られた遺伝子発現量−時間パターンを測定し、ＡＵＣ、Ｌｕｃ（ｍａｘ）について比較した。結果を、図５及び図６に示す。
【００９０】
図５に示すように、ＬＨＡと疎水性アミノ酸が含まれる導入用組成物において、疎水性アミノ酸を加えることにより、ＬＨＡ単独と比較して有意な遺伝子発現増加効果はみられなかったものの、ＡＵＣ、Ｌｕｃ（ｍａｘ）の最大値はＬＨＡ７３％／Phe 25％の組成で上昇傾向がみられた。しかし、ＬＨＡの組成比が減少し、疎水性アミノ酸の組成比が増加するに従い、ＬＨＡ単独と比較して遺伝子発現効果は有意に低下した。
【００９１】
図６に示すように、ＨＨＡと疎水性アミノ酸が含まれる粉末製剤においては、疎水性アミノ酸を加えることにより、特にＨＨＡ４９％／Ｐｈｅ４９％の組成においてＨＨＡ単独と比較して有意に高い遺伝子発現効果を示した。ＨＨＡ４９％／Ｐｈｅ４９％のＡＵＣ、Ｌｕｃ（ｍａｘ）の最大値はＨＨＡを賦形剤とするこれまでの検討の中で最も高い遺伝子発現効果を示した。
【００９２】
以上の結果から、疎水性アミノの添加により吸入特性を向上させ、遺伝子発現が上昇する可能性が示唆されたものの、過剰な分散補助剤の添加は遺伝子発現効果を低下させることがわかった。
【００９３】
さらに、最も遺伝子発現効果が高かったＬＨＡ７３％／Ｐｈｅ２５％のネイキッド核酸導入用組成物を実施例１に準じて調製し、粉末状の当該導入用組成物、当該導入用組成物のための試料溶液及び当該導入用組成物を試料溶液と同等の濃度になるように水に再溶解した再溶解液について、実施例２に準じてマウス肺内に投与して、ＡＵＣ及びＬｕｃ（ｍａｘ）を測定した。結果を、図７に示す。
【００９４】
図７に示すように、粉末状のネイキッド核酸導入用組成物が、いずれも溶液組成物である試料溶液及び再溶解液に対して顕著に高い遺伝子発現効果を示した。この結果から、ネイキッド核酸の高い遺伝子発現効果は、固体物質としてネイキッド核酸が細胞に到達しているためと考えられた。
【実施例６】
【００９５】
（ネイキッド核酸導入用組成物の吸入特性評価）
本実施例では、ネイキッド核酸導入用組成物と吸入特性との関係について評価した。なお、評価の定量用ラベル剤としてfluorescein sodium (SIGMA-ALDRICH、FLNa)を使用した。吸入特性の評価は以下のようにして行った。
【００９６】
評価用のネイキッド核酸導入用組成物は、実施例４において高い遺伝子発現効果があったＬＨＡ７３％／Ｐｈｅ２５％の粉末状ネイキッド核酸導入用組成物を、実施例１に準じて調製した。また、ＬＨＡのみのネイキッド核酸導入用組成物を、同様に実施例２に準じて調製した。以下の表に示す具体的組成を示す。
【００９７】
【表４】
2018011588.tif 000005
【００９８】
評価には、アンダーセン型カスケードインパクター (ＡＣＩ; ローボリウムエアーサンプラー、AN-200型、柴田科学株式会社)を用いた。各粉末状の組成物を２号HPMCカプセル (クオリカプス株式会社)に1.0 mg (FLNa換算量; 20 μg)充填した後、カプセルをＤＰＩ用吸入器 (JetＨＡler（商標）; Reverse type: 日立オートモティブシステムズ)に装着して、吸引速度28.3 L/minで5 sec吸引した。各ステージの捕集板 (プレート)にはグリセリンを薄く塗布した。カプセル (Cap)、デバイス (Dev)、スロート (Thr)、各ステージ (S0〜7)、フィルター (Fil)に付着した粉末製剤をリン酸緩衝生理食塩水 (ＰＢＳ; pH 7.4)10 mLで溶解し、その溶液250 μLを遮光96-wellマイクロプレートに分取し、蛍光プレートリーダー (SPECTRA MAX GEMINI EM、日本モレキュラーデバイス株式会社)を用いてFLNaを定量することで粉末製剤の回収率を算出した。FLNaの定量には、各粉末状組成物の再溶解液により作成した検量線を用いた。
【００９９】
Capセクション及びDevセクションから放出された組成物の割合であるOE値 (Output Efficiency、％)、またS3 (空気力学的粒子径としてのカットオフ値; 4.7 μm)からFilまでの各セクションで回収された組成物量をCap及びDevから放出された粉末製剤量で除した割合であるFPF値 (Fine Particle Fraction、％)をそれぞれ算出した。FPF値は一般に、放出された粉末製剤のうち肺治療域に到達する割合の指標として用いられる。また、全回収量のうち肺治療域に到達した粉末製剤の割合であるOE×FPF値、空気中での粒子の運動性の指標である空気力学的粒子径 (MMAD; mass median aerodynamic diameter)も併せて算出した。MMADは、S0からFilまでの各部の粉末製剤の回収量を基にして解析ソフト (AEROSOL particle density analysis system、柴田科学株式会社)を用いて解析・算出した。結果を、図８に示す。
【０１００】
図８（ａ）に示すように、ＬＨＡ98％単独組成物と比較し、Ｐｈｅを添加したＬＨＡ７３％／Ｐｈｅ２５％組成物はカットオフ径の小さいステージ(Filterを含む)で沈着量が多い結果となり、肺送達性に優れていることが明らかとなった。図８（ｂ）及び図８（ｃ）に示すように、具体的な数値として、OE値は約８０％から９０％、FPF3値は約４０％から５０％、OE×FPF3値は約３０％から４５％、MMADで約4.5 μmから3 μmの変化が得られ、ＬＨＡのみでも吸入粉末剤として適した吸入特性は示すものの、分散補助剤である疎水性アミノ酸の添加により吸入特性の有意な向上が認められた。
【実施例７】
【０１０１】
（各種賦形剤を用いたネイキッド核酸導入用組成物の調製及び評価）
本実施例では、重量平均分子量が異なるヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量５０００未満（ＬＨＡ）、重量平均分子量１５，０００〜４０，０００）（ＭＨＡ）、重量平均分子量５０，０００〜１１０，０００（ＨＨＡ））、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（ヒアルロン酸に類似するグルコサミノグリカンである。）を賦形剤として用いるとともに、分散助剤としてのＬ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を適宜用いて、ネイキッド核酸導入用組成物を調製し、ＩＣＲマウスを用いin vivoでの遺伝子発現効果を評価した。ネイキッド核酸導入用組成物は、以下に示す表の組成の溶液を用いて噴霧凍結乾燥する以外は、実施例１と同様にして行って調製した。
【０１０２】
【表５】
2018011588.tif 000006
【０１０３】
得られたネイキッド核酸導入用組成物における粒子形状をＳＥＭ観察した。結果を図９に示す。また、得られたネイキッド核酸導入用組成物を用いる以外は、実施例２と同様にして、雌性ＩＣＲマウスを用いて肺内投与して、マウス胚内での遺伝子発現効果を評価した。結果を、図１０に示す。
【０１０４】
図９に示すように、いずれも５μｍ〜１０μｍ程度の概して球状で多孔質な微粒子を観察された。また、フェニルアラニンを添加したネイキッド核酸導入用組成物の粒子形状は、安定して球状を呈し、また粒子の分散状態も良好であった。したがって、フェニルアラニン等は、分散補助剤として有用であることがわかった。
【０１０５】
また、図１０に示すように、いずれの賦形剤を用いた場合においても、遺伝子発現効果を確認できたが、用いる賦形剤によって分散助剤との好適な比率が存在しうることもわかった。また、概して、フェニルアラニンなどの分散補助剤が発現量の増大に有用であることがわかった。さらに、ヒアルロン酸のなかでは、例えば、重量平均分子量が１５，０００〜４０，０００の中程度の分子量のヒアルロン酸のナトリウム塩が、好適な発現量を呈しうる場合があることがわかった。
【実施例８】
【０１０６】
（各種賦形剤を用いたｓｉＲＮＡ導入用組成物の調製及び評価）
本実施例では、ネイキッド核酸として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ＋）をターゲットとするｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＬ３）を用いて、in vitroでｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果を評価した。なお、このｓｉＲＮＡは、実施例１で用いたプラスミドＤＮＡのおおよそ３００分の１程度の分子量である。
【０１０７】
本実施例では、ｓｉＲＮＡのほか、賦形剤として、重量平均分子量が５，０００以下のヒアルロン酸ナトリウム（ＬＨＡ）と蛍光プローブとしてのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを以下の表に示す配合で溶液を調製して、実施例１と同様に操作して本実施例のネイキッド核酸導入用組成物を調製した。なお、溶液自体も比較例組成物として用いた。
【０１０８】
また、ネガティブコントロールとして、ｓｉＲＮＡを含まないで、既述のヒアルロン酸ナトリウム及びＤ−（−）マンニトール（Ｍａｎ）をそれぞれとＩＣＧとをのみからなる溶液から同様にしてネガティブコントロール組成物を調製した。さらに、ポジティブコントロールとして、既述のヒアルロン酸ナトリウムに替えて分岐型ポリエチレンイミン（Ｂ−ＰＥＩ）を用いた溶液から同様にしてポジティブコントロール組成物を調製した。
【０１０９】
【表６】
2018011588.tif 000007
【０１１０】
遺伝子発現の抑制効果は、ルシフェラーゼを恒常的に発現するヒト由来肺がん細胞（Ａ５４９−Ｌｕｃ）２×１０5cells／ウェルでＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商品名）に播種後、Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて、コンフルエントになるまで培養後、細胞層の気相曝露側に各種組成物０．５ｍｇ又は溶液も粉末として０．５ｍｇ相当量を各ウェルに均一に充填した。組成物を充填後、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間経過後に、ルシフェラーゼの発光強度を測定した。なお、ヒアルロン酸ナトリウムを用いたネガティブコントロールの発光強度を１００％として各種組成物の遺伝子発現抑制効果を評価した。結果を図１１に示す。
【０１１１】
また、ルシフェラーゼを恒常的に発現するマウス大腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６−Ｌｕｃ）を用いて肺転移癌マウスを作製し、実施例２と同様に操作して本実施例のネイキッド核酸導入用組成物の遺伝子発現抑制効果を評価した。すなわち、肺転移癌マウスに、本実施例のネイキッド核酸導入用組成物を投与し、その後３６時間経過後に同量をさらに投与して、ルシフェラーゼの発光強度を調べた。なお、ネガティブコントロール組成物についても同様に投与してルシフェラーゼ発光強度を測定した。結果を図１２に示す。
【０１１２】
図１１に示すように、ｓｉＲＮＡを含むネイキッド核酸導入用組成物は、細胞に添加後６時間から高い遺伝子発現抑制効果を示した。これに対して、溶液形態の比較例組成物は、顕著な遺伝子発現抑制効果を呈することはなかった。また、ポジティブコントロール組成物は、遺伝子発現抑制効果を添加から１２時間経過後から発揮した。
【０１１３】
また、図１２に示すように、ｓｉＲＮＡを含むネイキッド核酸導入用組成物は、in vivoにおいても、有効な遺伝子発現の抑制効果を発揮した。
【０１１４】
以上のことから、ネイキッド核酸導入用組成物によれば、固体物質であることのほか、ヒアルロン酸ナトリウムなどのアニオン性成分を含むことから、細胞へ導入されて遺伝子の発現を速やかにかつ効果的に抑制できることがわかった。また、ネイキッド核酸導入用組成物によれば、発現カセットを有するプラスミドＤＮＡのような比較的大きな分子から、ｓｉＲＮＡのように小さい分子まで広い範囲のネイキッド核酸の導入及び作用発現に有用であることがわかった。
【図１Ａ】
2018011588.tif 000008
【図１Ｂ】
2018011588.tif 000009
【図１Ｃ】
2018011588.tif 000010
【図２】
2018011588.tif 000011
【図３】
2018011588.tif 000012
【図４Ａ】
2018011588.tif 000013
【図４Ｂ】
2018011588.tif 000014
【図５】
2018011588.tif 000015
【図６】
2018011588.tif 000016
【図７】
2018011588.tif 000017
【図８】
2018011588.tif 000018
【図９】
2018011588.tif 000019
【図１０】
2018011588.tif 000020
【図１１】
2018011588.tif 000021
【図１２】
2018011588.tif 000022