(57)【要約】【課題】齲蝕の原因細菌の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・手法の開発を目的とする。【解決手段】本発明は、下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ等に係るものである。（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ  （ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列  （ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列  （ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列（ｂ）総量指標プローブ（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【請求項２】
ＤＮＡチップの形態が繊維型ＤＮＡチップである、請求項１に記載のＤＮＡチップ。
【請求項３】
下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを含む、齲蝕細菌検出用プローブセット。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、齲蝕細菌を検出するためのＤＮＡチップ、及び当該チップに搭載するプローブ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔内の２大疾患である歯周病及び齲蝕は、複数の細菌が関与する細菌感染症である。
齲蝕は、原因細菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ、及び、乳酸桿菌が知られており、これら原因細菌が糖類を代謝することにより乳酸を産生し、この結果、口内環境が酸性になり、エナメル質の脱灰が起こることが知られている。
原因細菌の存在量に加え、口腔内に存在する総連鎖球菌の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの比率が、指標となることが報告されている。すなわち、総連鎖球菌の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの比率が高いと、齲蝕になり易い（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【０００３】
齲蝕の細菌検査としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓと乳酸桿菌を培養して検査するキットが市販されており、診断の一つの材料として利用されている。培養した結果から、目視で、およそのコロニー数が測定され、検査結果が判定されている。
しかしながら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓと乳酸桿菌とは培養条件が異なるため、別々に実施する必要があり、作業効率よく同時に測定できる手法はなかった。また、それらの培養法では、測定までに数日が必要であり、判定結果が得られるまでの時間が長いという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  Ｊａｎｕａｒｙ、２００７年、第１巻、Ｐ．３１−３９
【非特許文献２】Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６年、第４１巻、ｐ．１６７−７３
【非特許文献３】「日本細菌学会誌」２００１年、第５６巻、ｐ．３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下において、齲蝕の細菌検査として、齲蝕の原因細菌（複数種の細菌群）の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・手法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示すＤＮＡチップ等を提供するものである。
【０００７】
［１］下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップ。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【０００８】
［２］ＤＮＡチップの形態が繊維型ＤＮＡチップである、上記［１］に記載のＤＮＡチップ。
【０００９】
［３］下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを含む、齲蝕細菌検出用プローブセット。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、齲蝕の細菌検査として、齲蝕の原因細菌（複数種の細菌群）の検出及び齲蝕の判定を、効率的かつ迅速に行うことができる手段・方法を提供することができる。
具体的には、本発明によれば、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓと、総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の各細菌の細菌数を、当該各細菌に特異的なＤＮＡ配列に対応するプローブを搭載したＤＮＡチップを用いることにより、同時に且つ短時間で算出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本発明は、前述のとおり、下記プローブ（ａ）と、下記プローブ（ｂ）及び（ｃ）のうち少なくとも一方のプローブとを搭載したＤＮＡチップに係るものである。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の口腔内細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブであって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの配列である、プローブ
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
【００１３】
１．プローブ（プローブセット）  前述したプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び／又はプローブ（ｃ）とは、齲蝕細菌検出用のプローブセットとして用いることができる。
以下、これら各プローブについて説明する。
【００１４】
（１）プローブ（ａ）
検出の対象となる口腔内細菌は、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓと、総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の内の少なくとも１種、好ましくは２種以上である。
プローブ（ａ）は、口腔内細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡであることが好ましい。
【００１５】
本発明に用い得るプローブは、検出目的となる各種の前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子において、特異的な塩基配列となるような領域から設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
【００１６】
一方で、プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、細菌検出の目的に応じて適宜選択・判断が可能である。プローブの長さとしては、例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、１００塩基以下、好ましくは８０塩基以下の配列を採用できる。
【００１７】
プローブ（ａ）の例を、表１に示す（配列番号２〜７）。
【００１８】
【表１】
2018148855.tif 000002
【００１９】
本発明に用いるプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成することにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。設計の際には、ハイブリダイゼーション時の条件を考慮し、ストリンジェントな条件を設定する必要がある。
【００２０】
なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件として、バッファーの塩濃度が４８〜７８０ｍＭ、温度が３７〜８０℃が好ましく、さらにストリンジェントな条件として、表１に示したプローブ配列がハイブリダイズし、それ以外の類似配列がハイブリダイズしない条件として、塩濃度が９７．５〜３９０ｍＭ、温度が４５〜６０℃がより好ましい。具体的には、例えば２４０ｍＭで５０℃の条件を挙げることができる。
【００２１】
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、プローブのＤＮＡの塩基配列に対して、６０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が好ましく挙げられ、より好ましくは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が挙げられる。
本発明の検出目的となる前記口腔内細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものでなくてもよく、例えば、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。
【００２２】
本発明に用いるプローブとしては、具体的には、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）の塩基配列ＤＮＡからなるものが好ましく挙げられる。
（ｉ）配列番号２〜７に示される塩基配列から選ばれる少なくとも1つの配列
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列の相補配列
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）の配列と実質的に同一の配列
【００２３】
ここで、上記（ｉｉｉ）の配列における「実質的に同一の配列」とは、配列番号２〜７に記載の配列又は相補配列に対して、前述したようなストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし得る塩基配列であり、より具体的には、配列番号２〜７に記載の配列又は相補配列に対して、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列が挙げられる。
【００２４】
（２）プローブ（ｂ）について
総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた検体の中のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を検出することもきわめて重要となる。
【００２５】
非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。
細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップによる測定とは別に、独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作・測定の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。
【００２６】
総量指標プローブの例を、表１（配列番号１）に示す。
【００２７】
（３）プローブ（ｃ）について
絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。
本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。
【００２８】
従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を１種類設定した場合、複数のＤＮＡチップから得られる絶対量指標の蛍光強度は一定になるはずであり、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標の蛍光強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップにおいて、補正した蛍光強度は比較することができる。
【００２９】
絶対量指標プローブの例を、表１（配列番号９〜２３）に示す。また、絶対量指標となる塩基配列（絶対量指標プローブによる検出対象となる塩基配列）の例を、表２（配列番号２４〜３８）に示す。
【００３０】
【表２】
2018148855.tif 000003
【００３１】
絶対量指標は、例えば、産業技術総合研究所が開発した定量解析用核酸標準物質を利用しても良いし、新たに設計しても良い。設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
【００３２】
これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
【００３３】
増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
【００３４】
絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を、表３に示す。絶対量指標用プライマー対（配列番号３９、４０）や、細菌増幅用プライマー対（配列番号４１、４２）を利用することが可能である。
【００３５】
【表３】
2018148855.tif 000004
【００３６】
２．ＤＮＡチップ
本発明のＤＮＡチップは、前記１.項で説明した各種プローブが支持体となる基盤に複数配置（搭載）されたものである。
【００３７】
支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，  ４６７−４７０  （１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  ７６７−７７３  （１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下、「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このＤＮＡチップは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。
【００３８】
プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。
【００３９】
以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。繊維型ＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
【００４０】
（ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
（ｉｉ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
（ｉｉｉ）プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
（ｉｖ）中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
【００４１】
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４−１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。
【００４２】
製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
【００４３】
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
【００４４】
中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる。
前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ  ＴＭ）等が好ましく挙げられる。
【００４５】
繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
【００４６】
３．口腔内細菌数を測定する方法
口腔内細菌数を測定する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
（I）採取した口腔内試料を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する工程
（II）抽出した核酸を、前述した本発明のＤＮＡチップ（又は本発明のプローブ）に接触させる工程
（III）上記接触後のＤＮＡチップ（又はプローブ）から得られた蛍光強度に基づいて細菌数を算出する工程
【００４７】
以下に、当該測定方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（I）について
本工程では、採取した口腔内試料（口腔内の細菌（細菌群））を検体とし、検体中に含まれる細菌の核酸を抽出する。検体の採取は、例えば、所望の被験者又は被験生物から行うことができる。採取する口腔内試料の種類は、特には限定されないが、例えば、唾液、プラーク（歯肉縁下プラーク、歯肉縁上プラーク）、舌苔、口腔洗浄液等を使用することができる。
【００４８】
口腔内試料として唾液を使用する場合、唾液を採取する方法は特には限定されず、例えば、容器に直接唾液を流し込む方法、あるいは綿棒やその他紙状のものに唾液をしみこませる方法等が挙げられる。唾液採取を容易にするために、採取前にガムをかんでも良い。
採取した試料を輸送する場合は、採取した試料を密閉容器に入れて凍結させ輸送する方法や、ケース付き綿棒を用いて綿棒で試料を採取しケースに収納して輸送する方法が好ましい。
【００４９】
採取する唾液の量は特には限定されず、口腔内試料に存在する細菌のＤＮＡを検出する方法に応じて適宜選択することができる。例えば、ＤＮＡチップを用いて試料中の遺伝子ＤＮＡを検出する場合は、被験者の唾液であれば０．１ｍＬ以上が好ましく、０．５ｍＬ以上がより好ましい。
検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。増幅する所望の部位としては、具体的には、例えば、前記口腔内細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ  （１６Ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、表３の配列番号４１、４２が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
【００５０】
本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。
【００５１】
（２）工程（II）について
本工程では、工程（I）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。
ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。
【００５２】
洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４２８  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱レイヨン社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。
【００５３】
（３）工程（III）について
本工程では、前記工程（I）及び（II）の手順を経て、ＤＮＡチップ（又はプローブ）から得られた蛍光強度に基づいて、検出対象菌種の細菌の細菌数を算出する。例えば、検出対象細菌を検出するためのプローブの蛍光強度とバックグラウンドの蛍光強度からＳＮ比として示す方法がある。または、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られる蛍光強度を元に、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られた蛍光強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法などが好ましい。
【００５４】
いずれの場合でも、複数のＤＮＡチップの検出から得られる絶対量指標プローブの蛍光強度が一定となるようにＤＮＡチップごとに補正係数を算出し、各ＤＮＡチップの検出対象細菌の蛍光強度に補正係数を考慮することで、ＤＮＡチップ間の比較をしてもよい。
【００５５】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
細菌検出用ＤＮＡプローブの設計  細菌検出用ＤＮＡプローブを設計するために、１６ＳｒＲＮＡの可変領域として、Ｖ３及びＶ４に着目した。Ｖ３及びＶ４領域のうち、各細菌が特異的に有する配列を選抜し配列番号２〜７に示される塩基配列を設計・作製した。
【実施例２】
【００５７】
細菌検出用ＤＮＡプローブの評価
＜測定対象＞
ＡＴＣＣより購入した、各種細菌由来ゲノムＤＮＡ１００ｐｇを測定する検体とし、実施例１で設計・作製した細菌特異的プローブの性能を評価した。
【００５８】
＜ＰＣＲ＞
細菌由来ゲノムＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑTM  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＰｒｏＦｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、増幅反応を実施した。プライマーは、以下に示すプライマー条件とした。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いて、増幅産物の末端を標識した。
【００５９】
＜プライマー配列＞
フォワードプライマー
５’Ｃｙ５−ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号４１）
リバースプライマー
５’−ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ−３’ （配列番号４２）
【００６０】
＜反応液組成＞    
２×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）
Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ                        １０μＬ    
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）（配列番号４１）        １μＬ    
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）（配列番号４２）          １μＬ    
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用）（配列番号３９）  １μＬ    
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用）（配列番号４０）    １μＬ    
２０ｐｇ検体由来ＤＮＡ                                          ５μＬ    
１ｐｇ絶対量指標                                                １μＬ      
合計                                                        ２０μＬ    
【００６１】
＜反応条件＞    
９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５０℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。
【００６２】
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例１に記載の方法と同様の方法で製造した。
ただし、搭載させたプローブは、表１の配列番号１〜７、２３に示す配列情報をもつプローブを用いた。
【００６３】
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００６４】
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物  ２０μＬ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ        ４８μＬ
１Ｍ  ＮａＣｌ                ４８μＬ
０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０      ２０μＬ
水                            ６４μＬ    
合計                      ２００μＬ
【００６５】
自動ハイブリ洗浄装置（型式：AHF-200、三菱レイヨン社製）を用い、２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。
ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ混合溶液に移した。
【００６６】
＜検出＞
前記洗浄後、ジェノパールリーダー（型式：GR-S1、三菱レイヨン社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。
【００６７】
＜検出条件＞
中心励起波長  ：６３３ｎｍ    
露光時間  ：０．１、１、４、４０秒
【００６８】
＜結果＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度を算出した。その結果、表４に示すとおり、いずれの細菌由来ゲノムＤＮＡにおいても陽性コントロールの役割でもある総量指標のプローブの蛍光強度が認められ、反応の妥当性が確認できた。さらに、本発明の各細菌プローブにおいて、目的の細菌のみ蛍光強度が得られた。以上の結果より、本発明のプローブはいずれも特異性の高いプローブであることが示された。
【００６９】
【表４】
2018148855.tif 000005
【実施例３】
【００７０】
唾液検体中の細菌数測定
＜ＤＮＡの調製＞
成人健常者５名の協力により、唾液評価試験を実施した。この５名の被験者をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅとし、唾液を評価した。
唾液採取は、γコレクトスワブＲＩ（栄研化学）を１分間口に含み唾液を採取する方法とした。γコレクトスワブＲＩをチューブ中の水に浸漬し室温で５分静置し、細菌成分を溶出させた。その後、γコレクトスワブＲＩを取り出し、チューブを遠心分離機にかけた。得られたペレットに対し、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００７１】
＜ＤＮＡの解析＞
ＤＮＡ解析のためのＰＣＲ、検出条件は実施例２と同様の条件にて実施した。ただし、ＤＮＡチップに搭載させたプローブは、表１の配列番号１、４、６、７、８、２３に示す配列情報をもつプローブを用いた。
【００７２】
＜結果＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度から、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）を減算し、ハイブリダイゼーションに由来す蛍光強度を算出した。
さらに、実施例２のように、濃度既知の細菌ＤＮＡを複数評価することにより、検量線を作成し、蛍光強度を唾液１ｍｌ中の細菌数へ換算した。その結果、表５に示すとおり、目的の細菌５種類の存在量及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの比率を算出することが出来た。
【００７３】
【表５】
2018148855.tif 000006
【００７４】
以上の結果より、口腔内における、齲蝕関連細菌のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の存在量、及び総連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の菌数に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの比率という多項目を同時に短時間で算出することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１〜４２：合成ＤＮＡ
【配列表】
2018148855000001.app