(57)【要約】【課題】Ｓ．ポンベの形質転換体を用いて、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で３−ＨＰを産生する方法、および該方法に好適なＳ．ポンベの形質転換体の提供。【解決手段】シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を有している形質転換体を、酢酸または酢酸塩を含みそれらの合計の濃度が１０〜５０ｍＭである液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を有している形質転換体を、酢酸または酢酸塩を含みそれらの合計の濃度が１０〜５０ｍＭである液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項２】
前記形質転換体が、少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項３】
前記形質転換体が、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子群）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１または２に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項４】
前記形質転換体が、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除または不活性化されている、請求項２または３に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項５】
前記マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項６】
前記マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子がプラスミドに組み込まれている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項７】
前記液体培地が、グルコースまたはスクロースを含み、それらの合計の濃度が１〜５０質量％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項８】
培養により前記液体培地のｐＨが３．５以下になった後にもさらに培養を継続する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項９】
前記液体培地中の３−ヒドロキシプロピオン酸を中和することなく培養を継続する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項１０】
シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、外来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子および外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を有し、かつ前記宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主が本来有するメタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子群）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除または不活性化されている、請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１３】
前記マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子がプラスミドに組み込まれている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、以下、「Ｓ．ポンベ」ということがある。）を宿主とし、外来遺伝子を組込んだ形質転換体を用いて、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ＨＰは、アクリル酸エステルなど様々な化学製品の原料として非常に有用な化合物である。３−ＨＰは、微生物による発酵工程を経て製造できる。たとえば、マロニルＣｏＡレダクターゼ（ＭＣＲ）遺伝子を導入した微生物では、マロニルＣｏＡから３−ＨＰが産生される。また、グリセロールデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ等をコードする遺伝子を導入した微生物では、グリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）を介して３−ＨＰが産生される。
【０００３】
微生物に３−ＨＰを産生させた場合、産生された３−ＨＰにより、培養培地が酸性となる。該微生物の耐酸性が低い場合には、培養培地のｐＨ低下に伴い微生物自体の生育が抑制される結果、３−ＨＰの産生量も低下してしまうため、一般的には、培養培地のｐＨを中和しながら培養する必要がある。しかし、中和した場合には、３−ＨＰは塩として回収されるため、３−ＨＰに変換するための工程が必要になる。そこで、中和を必要とせずに３−ＨＰ生産が可能になることから、３−ＨＰを産生させる微生物としては、耐酸性の高いものが好ましい。たとえば、特許文献１には、耐酸性の高いＳ．ポンベに、外来のＭＣＲ遺伝子と外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）遺伝子を導入した形質転換体を、中和をせずに培養することにより、３−ＨＰが産生されたことが記載されている。
【０００４】
一方で、酵母などの真核細胞微生物を用いた異種タンパク質生産系においては、目的の異種蛋白質の生産効率を向上させるべく、異種タンパク質生産に不要または有害な宿主のゲノム部分の一部または全部を削除または不活性化した改良宿主を用いることが知られている。たとえば、特許文献２には、Ｓ．ポンベにおいて、特定のプロテアーゼをコードする遺伝子（プロテアーゼ遺伝子群）から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を削除または不活性化した改良宿主を用いることにより、異種タンパク質の生産効率を向上させられることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１３７２７７号
【特許文献２】国際公開第２００７／０１５４７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いて、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で３−ＨＰを産生する方法、および該方法に好適なＳ．ポンベの形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法は、Ｓ．ポンベを宿主とし、外来のＭＣＲ遺伝子および外来のＡＣＣ遺伝子を有している形質転換体を、酢酸または酢酸塩を含みそれらの合計の濃度が１０〜５０ｍＭである液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする。
本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、前記形質転換体が、少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されていることが好ましく、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子群）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されていることがより好ましく、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除または不活性化されていることがさらに好ましい。
また、本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、前記ＭＣＲ遺伝子および前記ＡＣＣ遺伝子が染色体に組み込まれていることが好ましく、前記ＭＣＲ遺伝子および前記ＡＣＣ遺伝子がプラスミドに組み込まれていることも好ましい。
また、本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、前記液体培地が、グルコースまたはスクロースを含み、それらの合計の濃度が１〜５０質量％であることが好ましい。
また、本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、培養により前記液体培地のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましく、前記液体培地中の３−ヒドロキシプロピオン酸を中和することなく培養を継続することも好ましい。
【０００８】
本発明に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、外来のＭＣＲ遺伝子および外来のＡＣＣ遺伝子を有し、かつ前記宿主が本来有する少なくとも１種のプロテアーゼをコードする遺伝子が削除または不活性化されていることを特徴とする。
本発明に係る形質転換体としては、前記宿主が本来有するメタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子群）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されていることが好ましく、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除または不活性化されていることがより好ましい。
また、本発明に係る形質転換体としては、前記ＭＣＲ遺伝子および前記ＡＣＣ遺伝子が染色体に組み込まれていることが好ましく、前記ＭＣＲ遺伝子および前記ＡＣＣ遺伝子がプラスミドに組み込まれていることも好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法により、中和処理を要することなく、形質転換体を培養することにより、効率よく３−ＨＰを製造できる。
また、本発明に係る形質転換体を培養することにより、効率よく３−ＨＰを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧベクターの構造の模式図である。
【図２】ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧベクターの構造の模式図である。
【図３】参考例１において、ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧベクターを導入した形質転換体の抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットの結果を示した図である。
【図４】参考例１において、ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧベクターを導入した形質転換体の抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットの結果を示した図である。
【図５】１−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ＬＰＩｔベクターの構造の模式図である。
【図６】２−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔベクターの構造の模式図である。
【図７】ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲベクターの構造の模式図である。
【図８】ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６ベクターの構造の模式図である。
【図９】ｐＲＥＰＡｄｅ−ＡＣＳ２ベクターの構造の模式図である。
【図１０】ｐＲＥＰＡｄｅ−ａｃｓ１ベクターの構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法は、Ｓ．ポンベを宿主とし、外来のＭＣＲ遺伝子および外来のＡＣＣ遺伝子を有している形質転換体を、酢酸または酢酸塩を含有する液体培地中で培養し、該液体培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を取得することを特徴とする。ＭＣＲ遺伝子およびＡＣＣ遺伝子を有している形質転換体では、アセチルＣｏＡからＡＣＣによりマロニルＣｏＡが産生され、このマロニルＣｏＡからＭＣＲにより３−ＨＰが産生される。また、該形質転換体を酢酸存在下で培養することにより、該形質転換体に取り込まれた酢酸により、アセチルＣｏＡの産生量が増大する結果、３−ＨＰの産生量も多くなる。ただし、酢酸量が多すぎる場合には、かえって３−ＨＰの産生が抑制されてしまう。本発明に係る３−ＨＰの製造方法においては、該形質転換体を、酢酸または酢酸塩の合計の濃度が１０〜５０ｍＭである液体培地中で培養することにより、効率よく３−ＨＰを製造できる。
【００１２】
［形質転換体］
本発明に係る３−ＨＰの製造方法において培養する形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、外来のＭＣＲ遺伝子および外来のＡＣＣ遺伝子を有している形質転換体である。これらの外来遺伝子により、該形質転換体内ではアセチルＣｏＡから３−ＨＰが産生される。
【００１３】
なお、本発明および本願明細書において、外来遺伝子とは、宿主が本来有している構造遺伝子（形質転換前の天然型の宿主の染色体に含まれている構造遺伝子）ではなく、形質転換操作等により導入された構造遺伝子を意味する。宿主が本来有している遺伝子であっても、形質転換操作等により導入された遺伝子は、本発明における外来遺伝子である。
【００１４】
＜Ｓ．ポンベ＞
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における３−ＨＰの生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で３−ＨＰを製造できる。
【００１５】
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB （http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名や前記系統名で検索して、入手できる。
【００１６】
＜ＭＣＲ遺伝子＞
本発明において用いられる形質転換体は、ＭＣＲ遺伝子を有する。Ｓ．ポンベは本来ＭＣＲ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物由来のＭＣＲ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。該形質転換体に導入されるＭＣＲ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＭＣＲ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＭＣＲ遺伝子であってもよい。また、該形質転換体が有する外来のＭＣＲ遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００１７】
外来遺伝子として導入されるＭＣＲ遺伝子がコードするＭＣＲとしては、たとえば、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）、クロロフレクサス・アグレガンス（Chloroflexus aggregans）、ロセイフレクサス・カステンホルジイ（Roseiflexus castenholzii）、ロセイフレクサス・エスピー（Roseiflexus sp.）、ロセイフレクサスエスピー・ストレインＲＳ−１（Roseiflexussp. Strain RS-1）、エリスロバクター・エスピー（Erythrobacter sp.）、エリスロバクターエスピー・ストレインＮＡＰ１（Erythrobactersp. Strain NAP1）、ガンマ・プロテオバクテリウム（gamma proteobacterium）、メタロスファエラ・セデュラ（Metallosphaera sedula）、スルフォロバス・トコダイ（Sulfolobus tokodaii）、スルフォロバス・メタリカス（Sulfolobus metallicus）、スルフォロバス・エスピー（Sulfolobus sp.）、アシディアヌス・ブリーエリイ（Acidianus brierleyi）、アシディアヌス・インフェルノス（Acidianus infernos）、アシディアヌス・アンビバレンス（Acidianus ambivalens）、スティギオロバス・アソリカス（Stygiolobus azoricus）、およびピロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）に由来のＭＣＲ等が挙げられる。また、これらのＭＣＲの改変体であってもよい。ＭＣＲの改変体としては、たとえば、これらのＭＣＲのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＭＣＲ活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのＭＣＲのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＣＲ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明において用いられる形質転換体が有するＭＣＲとしては、クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＭＣＲ（ＣａＭＣＲ、配列番号１）が好ましい。
【００１８】
＜ＡＣＣ遺伝子＞
本発明において用いられる形質転換体は、外来のＡＣＣ遺伝子を有する。該形質転換体に導入されるＡＣＣ遺伝子としては、Ｓ．ポンベに導入した場合にＡＣＣ活性を発揮するタンパク質を発現させ得る構造遺伝子であればよく、いずれの生物種由来のＡＣＣ遺伝子であってもよい。また、該形質転換体が有する外来のＡＣＣ遺伝子は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００１９】
外来遺伝子として導入されるＡＣＣ遺伝子がコードするＡＣＣとしては、たとえば、Ｓ．ポンベ、サッカロミセス・セレビシエ、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）、バチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ボス・タウラス（Bos taurus）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）、ラクトバチラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、キャンディダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・カテヌラタ（Candida catenulata）、キャンディダ・グロペンギエセリ（Candida gropengiesseri）、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、キャンディダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、キャンディダ・メタノソルボサ（Candida methanosorbosa）、キャンディダ・カルバタ（Candida curvata）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、イタッツェンキア・オリエンタリス（Ittatchenkia orientalis）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、アスペルギルス・クレバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・オケラセウス（Aspergillus ochraceus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クリプトスポリディウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、エシュケリキア・コリ（Escherichia coli）、エシュケリキア・ブラッタエ（Escherichia blattae）、ホルデウム・バルガレ（Hordeum vulgare）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）、セタリア・ビリヂス（Setaria  viridis）、ソラナム・ツベロサム（Solanum tuberosum）、スピナシア・オレラセア（Spinacia oleracea）、スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、スルフォロバス・メタリカス、タキフグ・エスピー（Takifugu sp.）、プロピオニバクテリウム・シェラマニ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレスセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）、クロロフレクサス・オーランティアカス、クロロフレクサス・アグレガンス、メタロスファエラ・セデュラ、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、トリコスポラン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、リポマイセス・スタルケイ（Lipomyces starkeyi）、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来のＡＣＣ等が挙げられる。また、これらのＡＣＣの改変体であってもよい。ＡＣＣの改変体としては、たとえば、これらのＡＣＣのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡＣＣ活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのＡＣＣのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するア���ノ酸配列からなり、かつＡＣＣ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明において用いられる形質転換体が有するＡＣＣとしては、Ｓ．ポンベ由来のＡＣＣ（配列番号２）が好ましい。なお、Ｓ．ポンベのＡＣＣをコードする遺伝子は、ｃｕｔ６遺伝子である。
【００２０】
＜ＡＣＳ（アセチルＣｏＡシンセターゼ）遺伝子＞
本発明において用いられる形質転換体は、ＭＣＲ遺伝子とＡＣＣ遺伝子に加えて、外来のＡＣＳ遺伝子を有することが好ましい。形質転換体内で充分量のＡＣＳが発現していることにより、酢酸から変換されるアセチルＣｏＡ量が多くなり、結果として３−ＨＰの生産量も多くなる。
【００２１】
外来遺伝子として導入されるＡＣＳ遺伝子がコードするＡＣＳとしては、たとえば、Ｓ．ポンベ、サッカロミセス・セレビシエに由来のＡＣＳ等が挙げられる。また、これらのＡＣＳの改変体であってもよい。ＡＣＳの改変体としては、たとえば、これらのＡＣＳのアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、または欠失したアミノ酸配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのＡＣＳのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明において用いられる形質転換体が有するＡＣＣとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来のＡＣＳ（ＡＣＳ２、配列番号３）またはＳ．ポンベ由来のＡＣＳ（ａｃｓ１、配列番号４）が好ましい。
【００２２】
＜プロテアーゼ遺伝子＞
本発明において用いられる形質転換体としては、プロテアーゼをコードする遺伝子（プロテアーゼ遺伝子）のうちの少なくとも１種が削除または不活性化されているものが好ましい。形質転換体内においてＳ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子のプロテアーゼ活性が阻害されていることにより、ＭＣＲおよびＡＣＣの生産効率が向上し、３−ＨＰの生産量がより高まる。本発明において用いられる形質転換体としては、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子（セリンプロテアーゼ遺伝子群）、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子（アミノペプチダーゼ遺伝子群）、カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子（カルボキシペプチダーゼ遺伝子群）およびジペプチダーゼをコードする遺伝子（ジペプチダーゼ遺伝子群）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子が削除または不活性化されているものが好ましい。
【００２３】
本発明において用いられる形質転換体としては、１種類のプロテアーゼ遺伝子のみが削除等されたものであってもよく、２種類以上のプロテアーゼ遺伝子が削除等されたものであってもよい。なかでも、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子（メタロプロテアーゼ遺伝子群）、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼをコードする遺伝子（システインプロテアーゼ遺伝子群）、およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群）からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が削除等された形質転換体が好ましく、メタロプロテアーゼ遺伝子群およびセリンプロテアーゼ遺伝子群からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とシステインプロテアーゼ遺伝子群およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群内からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子とが削除等された形質転換体も好ましい。
【００２４】
Ｓ．ポンベの該４種のプロテアーゼ遺伝子群としては、たとえば以下のものが挙げられる。
メタロプロテアーゼ遺伝子群：ｃｄｂ４（SPAC23H4.09）、ｍａｓ２（SPBC18E5.12c）、ｐｇｐ１（SPCC1259.10）、ｐｐｐ２０（SPAC4F10.02）、ｐｐｐ２２（SPBC14C8.03）、ｐｐｐ５１（SPAC22G7.01c）、ｐｐｐ５２（SPBC18A7.01）、ｐｐｐ５３（SPAP14E8.04）。
セリンプロテアーゼ遺伝子群：ｉｓｐ６（SPAC4A8.04）、ｐｐｐ１６（SPBC1711.12）、ｐｓｐ３（SPAC1006.01）、ｓｘａ２（SPAC1296.03c）。
システインプロテアーゼ遺伝子群：ｐｐｐ８０（SPAC19B12.08）、ｐｃａ１（SPCC1840.04）、ｃｕｔ１（SPCC5E4.04）、ｇｐｉ８（SPCC11E10.02c）。
アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群：ｓｘａ１（SPAC26A3.01）、ｙｐｓ１（SPCC1795.09）、ｐｐｐ８１（SPAC25B8.17）。
【００２５】
本発明において用いられる形質転換体において削除等されているメタロプロテアーゼ遺伝子としては、ｃｄｂ４遺伝子、ｐｇｐ１遺伝子、ｐｐｐ２０遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｐｐｐ５２遺伝子、またはｐｐｐ５３遺伝子の少なくとも１種が好ましく、ｃｄｂ４遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、またはｐｐｐ５３遺伝子の少なくとも１種がより好ましい。
本発明において用いられる形質転換体において削除等されているセリンプロテアーゼ遺伝子としては、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｓｐ３遺伝子、またはｓｘａ２遺伝子の少なくとも１種が好ましい。
本発明において用いられる形質転換体において削除等されているシステインプロテアーゼ遺伝子としては、ｐｐｐ８０遺伝子が好ましい。
【００２６】
本発明において用いられる形質転換体としては、ｃｄｂ４遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、およびｐｐｐ５３遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子と、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｓｐ３遺伝子、およびｓｘａ２遺伝子からなる群から選ばれる２種以上の遺伝子の合計３種以上の遺伝子が削除等されているものが好ましく、ｐｐｐ５３遺伝子およびｃｄｂ４遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子とｉｓｐ６遺伝子とｐｓｐ３遺伝子とを含む合計３種以上の遺伝子が削除等されているものがより好ましい。たとえば、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子の少なくとも３種の遺伝子が削除等されているものがさらに好ましい。
【００２７】
本発明において用いられる形質転換体としては、さらに、ｐｐｐ５３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｓｐ３遺伝子、およびｐｐｐ１６遺伝子を含む４種以上の遺伝子が削除等されているものが好ましく、ｐｐｐ５３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｓｐ３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、およびｐｐｐ２２遺伝子を含む５種以上の遺伝子が削除等されているものがより好ましく、ｐｐｐ５３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｓｐ３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、およびｓｘａ２遺伝子を含む６種以上の遺伝子が削除等されているものがさらに好ましく、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除等されているものがよりさらに好ましい。
【００２８】
＜形質転換体の製造＞
本発明に係る形質転換体は、宿主となるＳ．ポンベに、ＭＣＲ遺伝子とＡＣＣ遺伝子（必要に応じて、ＡＣＳ遺伝子）を遺伝子工学的方法で導入することにより製造できる。複数の外来遺伝子を導入する場合、全てを同時に宿主に導入してもよく、順次（順不同）導入してもよい。酵母を宿主として用いた遺伝子組換え法に関しては、異種タンパク質をより安定に効率よく発現させるために種々の発現システム、特に発現ベクター、分泌シグナル遺伝子導入発現ベクター等が開発されており、本発明に係る形質転換体の製造においては、
これらを広く応用可能である。例えば、Ｓ．ポンベを宿主とした発現システムとしては、特許２７７６０８５号公報、特開平０７−１６３３７３号公報、特開平１０−２１５８６７号公報、特開平１０−２１５８６７号公報、特開平１１−１９２０９４号公報、特開１１−１９２０９４号公報、特開２０００−２６２２８４号公報、国際公開第９６／０２３８９０号等が知られており、本発明に係る形質転換体を製造する方法には広くこれら発現システムが利用できる。
【００２９】
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲを利用したランダム変異法（PCR  Methods  Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
【００３０】
特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号、国際公開第２０１３／１３７２７７号等に記載されている。本発明において用いられる宿主としては、Ｓ．ポンベが本来有する少なくとも１種のプロテアーゼ遺伝子が削除または不活性化されているものが好ましく、セリンプロテアーゼ遺伝子群、アミノペプチダーゼ遺伝子群、カルボキシペプチダーゼ遺伝子群およびジペプチダーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されているものがより好ましく、メタロプロテアーゼ遺伝子群、セリンプロテアーゼ遺伝子群、システインプロテアーゼ遺伝子群、およびアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が削除または不活性化されているものがさらに好ましく、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除または不活性化されているものがよりさらに好ましい。
【００３１】
さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得られる。
【００３２】
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得られる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００３３】
＜外来遺伝子導入方法＞
各外来遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体に外来遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、外来遺伝子は染色体に複数導入することもできる。
【００３４】
遺伝子工学的方法で宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。外来遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、外来遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
【００３５】
＜発現カセット＞
発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明において用いられる形質転換体の製造において用いられる発現カセットは、外来遺伝子と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。１の発現カセットには複数の外来遺伝子が存在していてもよい。１の発現カセット中の外来遺伝子の数は１〜８が好ましく、１〜５がより好ましい。また、１の発現カセット中に複数の外来遺伝子が含まれている場合、２種類以上の外来遺伝子を含んでいてもよい。具体的には、該形質転換体の製造において、ＭＣＲ遺伝子およびＡＣＣ遺伝子は、それぞれ別個の発現カセットにより宿主に導入してもよく、両遺伝子を１の発現カセットにより宿主に導入してもよい。
【００３６】
発現カセットに含めるＭＣＲ遺伝子とＡＣＣ遺伝子（必要に応じて、ＡＣＳ遺伝子）の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
【００３７】
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明に係る形質転換体により３−ＨＰが蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能して外来遺伝子がコードするタンパク質の発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
【００３８】
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照、国際公開第２０１４／０３０６４４号）などが挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００３９】
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００４０】
＜ベクター＞
本発明において用いられる形質転換体は、外来遺伝子を含む発現カセットを、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。各発現カセットを含む形質転換体は、各発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
【００４１】
該ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence:ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００４２】
該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００４３】
該ベクターをＳ．ポンベの染色体に導入する場合、該ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００４４】
ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
【００４５】
染色体に外来遺伝子を組み込む場合、ベクターは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
【００４６】
ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いられる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させられる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得られる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
【００４７】
＜標的部位＞
ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中の外来遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数の外来遺伝子を組み込める。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数の外来遺伝子を組み込むことができ、これにより外来遺伝子がコードするＭＲＣまたはＡＣＣの発現量を増大させ、３−ＨＰの生産性を向上できる。たとえば、ＭＲＣ遺伝子を含む発現カセットを第１の標的部位を有するベクターに組み込み、ＡＣＣ遺伝子を含む発現カセットを第２の標的部位を有するベクターに組み込み、該ベクターをＳ．ポンベを宿主として形質転換することにより、本発明に係る形質転換体が得られる。
【００４８】
１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込める。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、該方法は煩雑である。
【００４９】
染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込められれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込める。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数の外来遺伝子が組み込まれている場合に比較して、外来遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位に外来遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際に外来遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
【００５０】
染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
【００５１】
染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込められる。この場合、２個以上の外来遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上の外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上の外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。この場合、２個以上の外来遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くの外来遺伝子を有する形質転換体を得られる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。好ましくは、１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。
【００５２】
＜形質転換方法＞
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００５３】
形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの液体培地における異種蛋白質の発現量を調べ、該異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
【００５４】
［３−ＨＰの製造］
本発明に係る３−ＨＰの製造方法において、該形質転換体を植菌する液体培地の酢酸または酢酸塩の濃度は、酢酸等が無添加の液体培地で培養した場合よりも３−ＨＰの生産量が高くなるような濃度であればよく、培養する形質転換体の遺伝子型および該液体培地のその他の組成、特にグルコースまたはスクロースの濃度等を考慮して適宜決定できる。該液体培地の酢酸または酢酸塩の濃度としては、１０〜５０ｍＭであることが好ましく、１０〜４０ｍＭであることがより好ましく、２０〜３０ｍＭであることがさらに好ましい。
【００５５】
３−ＨＰの製造に用いる液体培地としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を酢酸または酢酸塩の濃度が所定の範囲内になるように調整したものを用いられる。該液体培地としては、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものが好ましい。該液体培地としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００５６】
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピド等の発酵促進因子などを含ませられる。
【００５７】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法では、糖として特にグルコースまたはスクロースを含有する液体培地を用いることが好ましい。培養初期の液体培地（１００質量％）中のグルコースまたはスクロースの濃度は１質量％以上が好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、３−ＨＰを分離しながら液体培地を循環させて連続的に培養を行う場合には、前記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、３−ＨＰの生産性がより向上する。また、液体培地中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、３−ＨＰの生産効率がより向上する。
【００５８】
また、３−ＨＰ製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、液体培地中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５ｇ／Ｌとすることが好ましい。液体培地中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．２〜２ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集および精製効率の低下等の問題が生じるおそれがある。
【００５９】
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６００ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６００）値である。
【００６０】
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行える。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を液体培地から分離して、３−ＨＰを含む液体培地を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から液体培地の一部を抜き出し、抜き出した液体培地から３−ＨＰを分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースおよび新たな液体培地等を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、３−ＨＰの生産性がより向上する。
【００６１】
本発明に係る３−ＨＰの製造方法では、耐酸性に特に優れたＳ．ポンベの形質転換体を用いているため、３−ＨＰの蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２〜４程度）となっても中和を行わずに３−ＨＰを生産できる。そのため、液体培地のｐＨが３．５以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養により３−ＨＰを製造できる。培養終期のｐＨおよび連続培養におけるｐＨは、３．５以下が好ましく、特に２．３〜３．５が好ましい。３−ＨＰの生産性を高くするために、液体培地のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。本発明において用いられる形質転換体は耐酸性が優れているため、該形質転換体により産生された液体培地中の３−ＨＰを中和することなく培養を継続できる。
【００６２】
液体培地からの３−ＨＰの取得は、公知の方法を用いられる。特に、液体培地中の３−ＨＰを中和することなく、液体培地と３−ＨＰを分離して、３−ＨＰを取得することが好ましい。たとえば、培養終了後の液体培地から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては液体培地中の３−ＨＰを中和した後液体培地と３−ＨＰ塩を分離して、３−ＨＰを取得することもできる。たとえば、液体培地中の３−ＨＰをカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、該中和塩を晶析する方法で３−ＨＰを取得することもできる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
【００６４】
［参考例１］
野生型のＳ．ポンベＡＲＣ０３９株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｃ１９０Ｔ）と、Ｓ．ポンベのうち、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子が削除されているＭＧＦ４３３株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｓｐ３：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｉｓｐ６：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ５３：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ１６：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ２２：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｓｘａ２：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ８０：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ２０：：ｕｒａ４）（特許文献２参照）をＦＯＡ処理してウラシル要求性にしたＭＧＦ４３８株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｓｐ３：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｉｓｐ６：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ５３：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ１６：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ２２：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｓｘａ２：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ８０：：ｕｒａ４（ＦＯＡ）  ｐｐｐ２０：：ｕｒａ４（ＦＯＡ））に、ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧ（ＣａＭＣＲのＣ末端にＦＬＡＧタグを付加したもの）の発現カセットまたはｃｕｔ６−ＦＬＡＧ（Ｓ．ポンベ由来のＡＣＣ（ｃｕｔ６）のＣ末端にＦＬＡＧタグを付加したもの）の発現カセットを導入し、発現を比較した。
【００６５】
まず、ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧ発現カセットを保持する組換えベクターｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧ（１２４７１ｂｐ、図１）を作製した。ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
同様にして、ｃｕｔ６−ＦＬＡＧ発現カセットを保持する組換えベクターｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧ（１５１６６ｂｐ、図２）を作製した。ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧベクターは、ＭＧＦ４３８株から抽出したＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
【００６６】
次いで、ＡＲＣ０３９株およびＭＧＦ４３８株を、それぞれ、ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧベクターで形質転換した。形質転換物をＭＭ−ｌｅｕプレート（ＭＭ（最小培地）プレートからロイシンを除いたプレート）にストリークして３０℃にて培養し、得られたコロニーから５個を選択し、それぞれＭＭ−ｌｅｕ培地（ＭＭ培地からロイシンを除いた培地）に植え継ぎ、３０℃にて培養した。
また、ＡＲＣ０３９株およびＭＧＦ４３８株を、それぞれ、ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧベクターで形質転換した。形質転換物をＭＭ−ｕｒａプレート（ＭＭプレートからウラシルを除いたプレート）にストリークして３０℃にて培養し、得られたコロニーから１個を選択し、それぞれＭＭ−ｕｒａ培地（ＭＭ培地からウラシルを除いた培地）に植え継ぎ、３０℃にて培養した。得られた培養物から回収された菌体にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９９℃で３分間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。該ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルをポリアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜へ転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜に対して、ＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ抗体（(株)医薬生物学研究所製、Ａｎｔｉ−ＤＤＤＤＫ−ｔａｇ  ｍＡｂ−ＨＲＰ−ＤｉｒｅｃＴ）を用い、イムノブロットを行った。
【００６７】
ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧベクターを導入した形質転換体のイムノブロットの結果を図３に、ｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６−ＦＬＡＧベクターを導入した形質転換体のイムノブロットの結果を図４に、それぞれ示す。この結果、ＡＲＣ０３９株を宿主とした形質転換体では、ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧとｃｕｔ６−ＦＬＡＧのいずれもプロテアーゼにより著しく分解され、多数の分解物が検出されたが、ＭＧＦ４３８株を宿主とした形質転換体では、ＣａＭＣＲ−ＦＬＡＧとｃｕｔ６−ＦＬＡＧのいずれも分解が抑制されていた。
【００６８】
［実施例１］
Ｓ．ポンベのうち、ｐｓｐ３遺伝子、ｉｓｐ６遺伝子、ｐｐｐ５３遺伝子、ｐｐｐ１６遺伝子、ｐｐｐ２２遺伝子、ｓｘａ２遺伝子、ｐｐｐ８０遺伝子、およびｐｐｐ２０遺伝子がＬａｔｏｕｒ法で削除されているＭＳＰ００８０株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｓｐ３−Ｄ１３  ｉｓｐ６−Ｄ１４  ｏｍａ１−Ｄ１０  ｐｐｐ１６−Ｄ２０  ｆｍａ２−Ｄ１３  ｓｘａ２−Ｄ１５  ａａｐ１−Ｄ１７  ｐｐｐ８０−Ｄ１１）にＣａＭＣＲをコードする遺伝子とＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６遺伝子とを組込んだ形質転換体を用いて３−ＨＰを産生するに当たり、培養に用いる液体培地のグルコース濃度および酢酸濃度の３−ＨＰ産生に対する影響を調べた。
【００６９】
＜ＭＣＲ／ＡＣＣ−１発現株の作製＞
まず、ｈｓｐ９プロモーターとＬＰＩターミネーターの間にＣａＭＣＲをコードする遺伝子が組み込まれている組換えベクター１−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ＬＰＩｔ（１１０５２ｂｐ、図５、配列番号７）と、ｈｓｐ９プロモーターとＬＰＩターミネーターの間にＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６遺伝子が組み込まれている組換えベクター２−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔ（１３７４９ｂｐ、図６、配列番号８）とを、ＤＮＡ合成により作製した。
次いで、ＭＳＰ００８０株を、１−ｈｓｐ９ｐ−ＣａＭＣＲ−ＬＰＩｔベクターおよび２−ｈｓｐ９ｐ−ｃｕｔ６−ＬＰＩｔベクターで形質転換し、両ベクターを導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体を、ＭＣＲ／ＡＣＣ−１発現株とした。
【００７０】
＜ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株およびＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株の作製＞
まず、ｎｍｔ１プロモーターとｎｍｔ１ターミネーターの間にＣａＭＣＲをコードする遺伝子が組み込まれている組換えベクターｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲ（１２４３１ｂｐ、図７、配列番号９）と、ｎｍｔ１プロモーターとｎｍｔ１ターミネーターの間にｃｕｔ６遺伝子が組み込まれている組換えベクターｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６（１５１１４ｂｐ、図８、配列番号１０）と、ｎｍｔ１プロモーターとｎｍｔ１ターミネーターの間にサッカロミセス・セレビシエ由来のＡＣＳ２をコードする遺伝子が組み込まれている組換えベクターｐＲＥＰＡｄｅ−ＡＣＳ２（１０９７０ｂｐ、図９、配列番号１１）と、ｎｍｔ１プロモーターとｎｍｔ１ターミネーターの間にＳ・ポンべ由来のａｃｓ１をコードする遺伝子が組み込まれている組換えベクターｐＲＥＰＡｄｅ−ａｃｓ１（１０９０７ｂｐ、図１０、配列番号１２）とをＤＮＡ合成により作製した。
次いで、ＭＳＰ００８０株のａｄｅ７遺伝子を破壊してアデニン要求性を付与した株を、ｐＲＥＰ１−ＣａＭＣＲベクターおよびｐＲＥＰ２−ｃｕｔ６ベクターで形質転換し、２種のベクターが全て導入された形質転換体を選抜した。該形質転換体を、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株とした。
次いで、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株を、ｐＲＥＰＡｄｅ−ＡＣＳ２ベクターで形質転換し、該ベクターを導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体を、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株とした。また、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株を、ｐＲＥＰＡｄｅ−ａｃｓ１ベクターで形質転換し、該ベクターを導入した形質転換体を選抜した。該形質転換体を、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ａｃｓ１発現株とした。
【００７１】
＜３−ＨＰ産生＞
ＭＣＲ／ＡＣＣ−１発現株およびＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株を、グルコースと酢酸の濃度が様々である液体培地を用いて培養し、産生された３−ＨＰ量を測定して比較した。
【００７２】
具体的には、ＭＣＲ／ＡＣＣ−１発現株を、ＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ培地（ＭＭ培地からロイシンとウラシルを除いた培地）に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体を表１に記載のグルコース濃度および酢酸濃度のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝０．０５）になるように接種し、１４４時間培養した。培養終了後の培養液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）を以下に示すＨＰＬＣ条件で測定した。
使用カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８  ５μｍ、４．６ Ｉ.Ｄ.×２５０ ｍｍ      （ＧＬサイエンス社製）
溶離液：１０ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  （ｐＨ２．６、リン酸で調製）
注入量：１０μｌ
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ（波長２１０ｎｍ）
【００７３】
同様に、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株を、ＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地（ＭＭ培地からロイシンとウラシルとアデニンを除いた培地）に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体を表２に記載のグルコース濃度および酢酸濃度のＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に、初発菌体濃度がＯＤ６００＝０．０５）になるように接種したものを発酵液として、１４４時間発酵させた。発酵終了後の発酵液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）をＨＰＬＣで測定した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
【表２】
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【００７６】
各発酵液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）の測定結果を表１および表２に示す。この結果、両株とも、いずれのグルコース濃度においても、菌体を接種する液体培地の酢酸濃度が０ｍＭの場合よりも２０ｍＭの場合のほうが、３−ＨＰ産生量が多かったが、酢酸濃度が高くなりすぎると、３−ＨＰ産生は阻害された。また、酢酸濃度が２０ｍＭの場合には、グルコース濃度依存的に３−ＨＰの産生量が多くなっており、特に、ＭＣＲ／ＡＣＣ−１発現株では、酢酸濃度２０ｍＭ、グルコース濃度１５％において、４３．０３３ｍＭもの３−ＨＰが産生された。また、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株では、酢酸濃度３０ｍＭ、グルコース濃度１２％の場合と、酢酸濃度４０ｍＭ、グルコース濃度６％の場合に、２６ｍＭ以上の３−ＨＰが産生された。
【００７７】
［実施例２］
ＭＳＰ００８０株に、ＣａＭＣＲをコードする遺伝子とＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６遺伝子とを導入した形質転換体と、ＣａＭＣＲをコードする遺伝子とＳ．ポンベ由来のｃｕｔ６遺伝子とサッカロミセス・セレビシエ由来のＡＣＳ２をコードする遺伝子とを導入した形質転換体の３−ＨＰ産生量を比較した。
【００７８】
具体的には、実施例１で製造したＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株を、ＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコースおよび酢酸を含有するＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ培地（グルコース濃度：９％、酢酸濃度：２０ｍＭ）に、初発菌体濃度が（ＯＤ６0０＝０．０５）になるように接種したものを発酵液として、１４４時間発酵させた。発酵終了後の発酵液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）をＨＰＬＣで測定した。
【００７９】
また、実施例１で製造したＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株を、ＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコースおよび酢酸を含有するＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地（グルコース濃度：９％、酢酸濃度：２０ｍＭ）に、初発菌体濃度が（ＯＤ６0０＝０．０５）になるように接種したものを発酵液として、１４４時間発酵させた。発酵終了後の発酵液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）をＨＰＬＣで測定した。
【００８０】
この結果、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株の３−ＨＰ生産量は１５．９ｍＭであり、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株の３−ＨＰ生産量は２７．９ｍＭであり、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株よりもＭＣＲ／ＡＣＣ／ＡＣＳ２発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が１．７５倍向上した。これらの結果から、ＡＣＳ２を過剰発現させることにより、酢酸存在下で発酵させた場合の３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。
【００８１】
また、実施例１で製造したＭＣＲ／ＡＣＣ／ａｃｓ１発現株を、ＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度２００ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。
次いで、培養終了後の液体培地から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体をグルコースおよび酢酸を含有するＭＭ−ｌｅｕ−ｕｒａ−ａｄｅｎｉｎｅ培地（グルコース濃度：９％、酢酸濃度：２０ｍＭ）に、初発菌体濃度が（ＯＤ６0０＝０．０５）になるように接種したものを発酵液として、１４４時間発酵させた。発酵終了後の発酵液の３−ＨＰ濃度（ｍＭ）をＨＰＬＣで測定した。
【００８２】
この結果、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株の３−ＨＰ生産量は１８．７ｍＭであり、ＭＣＲ／ＡＣＣ／ａｃｓ１発現株の３−ＨＰ生産量は２９．３ｍＭであり、ＭＣＲ／ＡＣＣ−２発現株よりもＭＣＲ／ＡＣＣ／ａｃｓ１発現株のほうが、３−ＨＰ生産量が１．５６倍向上した。これらの結果から、ａｃｓ１を過剰発現させることにより、酢酸存在下で発酵させた場合の３−ＨＰ生産量を増大させられることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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