(57)【要約】【課題】試料中の脂肪酸の検出を正確に行い、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能な病原菌の検出法および検出装置を提供する。【解決手段】試料から抽出した総脂肪酸画分を調製する第１の工程と、総脂肪酸画分を質量分析装置によりマススペクトルデータを取得し、マススペクトルデータからピークを検出してピークリストを作成する第２の工程と、ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度比の情報を取得する第３の工程と、第３の工程で取得したモノアイソトープピークの観測質量に基づいて、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を取得する第４の工程と、取得したＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各モノアイソトープピークをプロットすることにより、総脂肪酸画分に含まれる脂肪酸のプロットを作成する第５の工程と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から抽出した総脂肪酸画分を調製する、第１の工程と、
前記総脂肪酸画分を質量分析装置によりマススペクトルデータを取得し、前記マススペクトルデータからピークを検出してピークリストを作成する、第２の工程と、
前記ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度の情報を取得する、第３の工程と、
前記第３の工程で取得したモノアイソトープピークの観測質量に基づいて、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を取得する、第４の工程と、
取得したＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各モノアイソトープピークをプロットすることにより、前記総脂肪酸画分に含まれる脂肪酸のプロットを作成する、第５の工程と、を備え、
前記ＫＭ値、前記ＮＫＭ値、前記ＫＭＤ値及び前記ＲＮＫＭ値は、以下の式（１）〜（４）により求める、病原菌の検出法。
ＫＭ値＝モノアイソトープピークの観測質量×０．９９９８８・・・式（１）
ＮＫＭ値＝ＫＭ値の整数値・・・式（２）
ＫＭＤ値＝ＮＫＭ値−ＫＭ値・・・式（３）
ＲＮＫＭ値＝ＮＫＭ値を１４で割った剰余の値・・・式（４）
【請求項２】
作成したプロットの位置から菌を同定する、請求項１に記載の病原菌の検出法。
【請求項３】
前記ピーク強度に基づいて前記プロットの大きさが決定され、
前記プロットの位置と大きさとに基づいて菌を同定する、請求項１に記載の病原菌の検出法。
【請求項４】
前記脂肪酸は、酸素原子を４個または５個含む酸化型ミコール酸である、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項５】
前記脂肪酸の酸素原子数と水素不足指数とから病原菌を同定する、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項６】
前記第１の工程は、脂肪酸のメチルエステル化工程を含む、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項７】
前記第２の工程の前に、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを用いて前記総脂肪酸画分を分離する工程を備える、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項８】
前記質量分析装置はイオン源を備え、
前記イオン源によるイオン化法が、電子イオン化法、エレクトロスプレーイオン化法、またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法である、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項９】
前記質量分析装置は、飛行時間型またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ型の質量分析部を備える、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項１０】
前記質量分析装置が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置である、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の病原菌の検出法。
【請求項１１】
試料から抽出した総脂肪酸画分を質量分析する質量分析装置と、前記総脂肪酸画分を質量分析して取得されたマススペクトルデータから病原菌の検出を行うマススペクトル解析装置とを含み、
前記マススペクトル解析装置は、
取得されたマススペクトルデータからピークを検出し、ピークリストを作成するピークリスト作成部と、
前記ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度比の情報を取得する、ピークデータ作成部と、
前記デアイソトープ処理により抽出されたミコール酸のモノアイソトープピークの観測質量から、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を求める、ＫＭＤデータ取得部と、
得られたＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各ピークをプロットして表示する、表示部と、
を備え、
前記ＫＭ値、前記ＮＫＭ値、前記ＫＭＤ値及び前記ＲＮＫＭ値は、以下の式（１）〜（４）により求める、病原菌の検出装置。
ＫＭ値＝モノアイソトープピークの観測質量×０．９９９８８・・・式（１）
ＮＫＭ値＝ＫＭ値の整数値・・・式（２）
ＫＭＤ値＝ＮＫＭ値−ＫＭ値・・・式（３）
ＲＮＫＭ値＝ＮＫＭ値を１４で割った剰余の値・・・式（４）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析装置を用いた病原菌の検出法および検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の原因となる菌（以下、「病原菌」とも呼ぶ。）を検出し、同定することは、効果的な治療、多剤耐性菌発生の抑制、および感染拡大抑制などに重要である。病原菌の検出法としては、例えば、胸部レントゲン（Ｘ線検査）、ＣＴ（コンピューター断層撮影）スキャン、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）などのイメージングによる検査、痰の中の結核菌を蛍光染色して検出する喀痰塗抹検査、痰の中の結核菌の遺伝子を増幅して解析して結核菌を検出する検査、結核菌専用の培地を用いて培養して結核菌を検出する検査、選択培地を用いて、増殖した菌体や培地の色などで試料菌株を鑑別する培養法による検査などが知られている（例えば、非特許文献１−３参照。）。その他、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）で細菌を測定して検出されるリボソームタンパク質のマススペクトルパターンから、試料菌株の属や種を同定する手法がある。
【０００３】
感染症の一つである結核は、マイコバクテリウム属の細菌、主に結核菌（Mycobacterium tuberculosis）により引き起こされ、胸部イメージングなどにより診断される。しかし、結核は世界において、ＨＩＶの次に死者の多い感染症であるにもかかわらず、病状が進行していないと結核であることが判断できない。また、喀痰中の結核菌の顕微鏡観察は、結核菌以外の菌が染まる場合や擬陽性があり、正確な判断ができない。さらに、結核菌は増殖速度が遅いため、培養法による方法には数日という長い時間が必要であり、結核菌以外では、日和見感染の原因となるNocardia属などの菌群は、培養法による同定はしばしば困難であるだけでなく、臨床現場において見逃されている症例も多数存在すると考えられている。その他、遺伝子を用いる方法では、コンタミネーションの可能性が排除できず、他の手法での検査が必須である。
【０００４】
また、結核菌の場合、細胞当たりのリボソームタンパク質量が極度に少ないうえ、細胞壁が強固であるため、細胞からのリボソームタンパク質抽出が極めて困難である。このため、リボソームタンパク質のマススペクトルを得るのは容易ではなく、信頼性の高い結果を得るのは非常に困難である。
【０００５】
そこで、結核菌に特徴的に存在する脂肪酸の一種である「ミコール酸」を、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳなどを用いて検出することにより、結核菌を検出する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１８７５４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】International Standards for Tuberculosis Care (2006) Tuberculosis Coalition for Technical Assistance.
【非特許文献２】F. Laval et al., Anal. Chem., 73, 4537-4544, 2001.
【非特許文献３】渋谷理恵ら、日本臨床微生物学会誌、16、81-88、2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記検出法は前処理や測定が煩雑であり、得られたスペクトルの解析には熟練が要求される。また、検出感度が低く、大量の菌体試料が必要であるため、分析までに時間がかかったり、ＭＳの質量分解能が低く、ミコール酸を正確に分析できない。さらに、日和見感染原因菌のミコール酸は、結核菌やその類縁菌ほど詳細に分析されていないため、ミコール酸を指標とした病原菌の同定は困難である。
【０００９】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、試料中の脂肪酸の検出を正確に行い、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能な、病原菌の検出法および検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る病原菌の検出法は、
試料から抽出した総脂肪酸画分を調製する、第１の工程と、
前記総脂肪酸画分を質量分析装置によりマススペクトルデータを取得し、前記マススペクトルデータからピークを検出してピークリストを作成する、第２の工程と、
前記ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度比の情報を取得する、第３の工程と、
前記第３の工程で取得したモノアイソトープピークの観測質量に基づいて、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を取得する、第４の工程と、
取得したＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各モノアイソトープピークをプロットすることにより、前記総脂肪酸画分に含まれる脂肪酸のプロットを作成する、第５の工程と、を備え、
前記ＫＭ値、前記ＮＫＭ値、前記ＫＭＤ値及び前記ＲＮＫＭ値は、以下の式（１）〜（４）により求める。
ＫＭ値＝モノアイソトープピークの観測質量×０．９９９８８・・・式（１）
ＮＫＭ値＝ＫＭ値の整数値・・・式（２）
ＫＭＤ値＝ＮＫＭ値−ＫＭ値・・・式（３）
ＲＮＫＭ値＝ＮＫＭ値を１４で割った剰余の値・・・式（４）
【００１１】
このような病原菌の検出法では、質量分析装置を用いることにより試料中の脂肪酸の検出を迅速に正確に行うことができ、さらに、測定結果に基づいて脂肪酸のプロットを作成することにより、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能となる。
【００１２】
本発明に係る病原菌の検出装置は、
試料から抽出した総脂肪酸画分を質量分析する質量分析装置と、前記総脂肪酸画分を質量分析して取得されたマススペクトルデータから病原菌の検出を行うマススペクトル解析装置とを含み、
前記マススペクトル解析装置は、
取得されたマススペクトルデータからピークを検出し、ピークリストを作成するピークリスト作成部と、
前記ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度比の情報を取得する、ピークデータ作成部と、
前記デアイソトープ処理により抽出されたミコール酸のモノアイソトープピークの観測質量から、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を求める、ＫＭＤデータ取得部と、
得られたＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各ピークをプロットして表示する、表示部と、
を備え、
前記ＫＭ値、前記ＮＫＭ値、前記ＫＭＤ値及び前記ＲＮＫＭ値は、以下の式（１）〜（４）により求める。
ＫＭ値＝モノアイソトープピークの観測質量×０．９９９８８・・・式（１）
ＮＫＭ値＝ＫＭ値の整数値・・・式（２）
ＫＭＤ値＝ＮＫＭ値−ＫＭ値・・・式（３）
ＲＮＫＭ値＝ＮＫＭ値を１４で割った剰余の値・・・式（４）
【００１３】
このような病原菌の検出装置では、試料中の脂肪酸の検出を正確に行い、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係る病原菌の検出装置の構成の一例を示す図。
【図２】本実施形態に係る病原菌の検出法の一例を示すフローチャート。
【図３】ミコール酸理論プロットを示す図。
【図４】実施例１で得られたマススペクトルを示す図。
【図５】実施例１で得られたプロットを示す図。
【図６】実施例２で得られたマススペクトルを示す図。
【図７】実施例２で得られたプロットを示す図。
【図８】実施例２において、相対ピーク強度が５０％以下のものを削除して作成したプロットを示す図。
【図９】実施例３で得られたマススペクトルを示す図。
【図１０】実施例３で得られたプロットを示す図。
【図１１】実施例４で得られたマススペクトルを示す図。
【図１２】実施例４で得られたプロットを示す図。
【図１３】実施例５で得られたマススペクトルを示す図。
【図１４】実施例５で得られたプロットを示す図。
【図１５】実施例６で得られたマススペクトルを示す図。
【図１６】実施例６で得られたプロットを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００１６】
１．  病原菌の検出装置
まず、本実施形態に係る病原菌の検出装置について図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る検出装置１００を模式的に示す図である。
【００１７】
本実施形態に係る検出装置１００は、試料から抽出した総脂肪酸画分を質量分析する質量分析装置１０と、総脂肪酸画分を質量分析して取得されたマススペクトルデータから病原菌の検出を行うマススペクトル解析装置２０とを含む。
【００１８】
１．１．  質量分析装置
質量分析装置１０は、質量分析を行うための装置であり、試料をイオン源１１０でイオン化し、生成されたイオンを、イオン源１１０に接続された質量分析部１２０で質量電荷比に応じて分離し検出する。質量分析部で質量分離されたイオンの検出結果（マススペクトルデータ）は、マススペクトル解析装置２０に送られ、マススペクトル解析装置２０においてマススペクトルデータに基づいて、イオン化された試料成分の質量電荷比（ｍ／ｚ）を横軸、検出されたイオン強度を縦軸としたマススペクトルと、Kendrick mass defect
法（以下、「ＫＭＤ法」とも呼ぶ。）により作成されたプロットが得られる。
【００１９】
質量分析装置１０のイオン源によるイオン化法は、電子イオン化（ＥＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法などの各種方式のイオン化法を用いることができるが、測定前に前処理が不要で、試料から抽出した総脂肪酸画分をそのまま測定が可能であるか、または前処理の工程が少なくて済む点により、ＭＡＬＤＩ法を用いることが好ましい。
【００２０】
また、質量分析装置１０の質量分析部１２０としては、磁場型、飛行時間型（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴ−ＩＣＲ）などの各種方式の質量分析部を用いることができるが、イオン化法として上記のＭＡＬＤＩ法を用いる場合には、質量分析部はＴＯＦであることが好ましい。
【００２１】
本実施形態では、質量分析装置１０として、イオン源によるイオン化法がマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）であり、飛行時間型（ＴＯＦ）の質量分析部を備えるマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）である場合について説明する。
【００２２】
なお、後述するＫＭＤ法では精密質量情報が必要であるため、質量差０．０３６Ｄａ（ダルトン）のピークを明りょうに識別できる高い質量分解能、例えば、半値全幅(full width at half maximum, FWHM)で質量分解能が２００００以上、より好ましくは５００００以上を有する質量分析部を有する装置が好ましく用いられる。
【００２３】
１．２．  マススペクトル解析装置
マススペクトル解析装置２０は、質量分析装置１０において試料に対する質量分析を行うことで取得されたマススペクトルデータから、病原菌の検出および同定を行う。つまり、質量校正されたマススペクトルデータに基づいて、イオン化された試料成分の質量電荷比（ｍ／ｚ）を横軸、検出されたイオン強度を縦軸としたマススペクトルと、ＫＭＤ法により作成されたプロットを作成することにより、ピークの帰属を行わずに試料中の脂肪酸を検出して同定する。
【００２４】
マススペクトル解析装置２０は、処理部２１０と、操作部２２０と、表示部２３０と、記憶部２４０と、情報記憶媒体２５０と、を含んで構成されている。マススペクトル解析装置２０は、例えば、パーソナルコンピューター（ＰＣ）などで実現することができる。
【００２５】
操作部２２０は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、処理部４１０に送る処理を行う。操作部２２０は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイクなどである。操作部２２０は、例えば、マススペクトルの解析条件の入力を行うために用いられる。
【００２６】
表示部２３０は、処理部２１０によって生成された画像を表示するものであり、その機能は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどにより実現できる。本実施形態では、後述するＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて各ピークをプロットして表示部２３０に表示する。また、必要に応じて、イオン化された試料成分の質量電荷比（ｍ／ｚ）を横軸、検出されたイオン強度（相対強度）を縦軸としたマススペクトルを表示することもできる。
【００２７】
記憶部２４０は、処理部２１０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部２４０は、処理部２１０の作業領域として用いられ、処理部２１０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。
【００２８】
情報記憶媒体２５０は、コンピューターにより読み取り可能な媒体である。情報記憶媒体２５０は、プログラムやデータなどを格納するものである。情報記憶媒体２５０の機能は、光ディスク（ＤＶＤ、ＣＤ等）、ＨＤＤ（ハードディスクドライブ）、或いはメモリ（ＲＯＭ等）などにより実現できる。処理部２１０は、情報記憶媒体２５０に格納されるプログラム（データ）に基づいて本実施形態の種々の処理を行う。すなわち、情報記憶媒体２５０には、処理部２１０の各部としてコンピューターを機能させるためのプログラム（各部の処理をコンピューターに実行させるためのプログラム）が記憶される。
【００２９】
処理部２１０は、マススペクトルデータを取得する処理や、マススペクトルデータからＫＭＤ法によりピークを処理してプロットを作成する処理、マススペクトルの解析結果等を表示部２３０に表示させる処理などの処理を行う。処理部２１０の機能は、各種プロセッサ（ＣＰＵ、ＤＳＰ等）でプログラムを実行することにより実現することができる。なお、処理部２１０の機能の少なくとも一部を、ＡＳＩＣ（ゲートアレイ等）などの専用回路により実現してもよい。処理部２１０は、ピークリスト作成部２１２と、ピークデータ作成部２１４と、ＫＭＤデータ取得部２１６と、表示制御部２１８と、を含む。
【００３０】
ピークリスト作成部２１２は、記憶部２４０に記憶されているマススペクトルデータを読み出して、当該マススペクトルデータから解析対象となる全てのピーク（以下、「解析対象ピーク」ともいう）を抽出してピークリストを作成する。
【００３１】
ピークデータ作成部２１４は、解析対象ピーク（ピーク群）をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度（相対強度）の情報を取得する。ここで、デアイソトープ処理とは、マススペクトルからモノアイソトープピークを抽出するための処理であり、例えば、マススペクトル上で１つの同位体ピーク群に属すると推定される複数の同位体ピークの強度から各元素の天然同位体比などに基づき理論的に計算される同位体ピークの強度を減算することにより行う。
【００３２】
ＫＭＤデータ取得部２１６は、デアイソトープ処理により抽出された脂肪酸のモノアイソトープピークの観測質量から、ＫＭＤ法によりKendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を求める。ここで、ＫＭ値、ＮＫＭ値、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値は、以下の式（１）〜（４）により求める。
ＫＭ値＝モノアイソトープピークの観測質量×０．９９９８８・・・式（１）
ＮＫＭ値＝ＫＭ値の整数値・・・式（２）
ＫＭＤ値＝ＮＫＭ値−ＫＭ値・・・式（３）
ＲＮＫＭ値＝ＮＫＭ値を１４で割った剰余の値・・・式（４）
【００３３】
２．  病原菌の検出法
次に、本実施形態に係る病原菌の検出法について説明する。ここでは、試料として結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を用い、結核菌の総脂肪酸画分を質量分析する例を挙げて説明する。
【００３４】
図２は、病原菌の検出法の一例を示すフローチャートである。まず、第１の工程において、結核菌から抽出した総脂肪酸画分を調製する（ステップＳ１００）。ここで、試料から総脂肪酸画分を抽出する方法は特に限定はされず、公知の方法を用いることができ、例えば、湿菌体を１０％のＫＯＨメタノール溶液で抽出後、６ＮのＨＣｌを加えてｐＨを下げ、ｎ−ヘキサンを加えることにより行う。
【００３５】
得られた総脂肪酸画分は、その後にメチルエステル化工程を経ることによりメチルエステル化して脂肪酸メチルとすることが好ましい。脂肪酸を脂肪酸メチルとするにより、イ
オン化効率が向上し、質量分析装置による測定において高感度化が可能となるだけでなく、ミコール酸を優勢に検出することが可能となる。メチルエステル化の方法は、特に限定はされず、公知の方法を用いることができ、例えば、得られた総脂肪酸画分にトルエン−メタノール−硫酸（１０：２０：１）を加えて加熱保持することにより脂肪酸メチルを得ることができる。
【００３６】
また、得られた脂肪酸または脂肪酸メチルを、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを用いて分離する工程を有していてもよい。液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを用いて分離することにより、質量分析装置を用いた分析において、感度が向上する。
【００３７】
次に、第２の工程において、得られた総脂肪酸画分を質量分析装置により分析してマススペクトルデータを取得し、取得したマススペクトルデータからピークを検出してピークリストを作成する（ステップＳ１０２）。本実施形態では、試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定してマススペクトルを得る。
【００３８】
測定の際、イオン化法としてＭＡＬＤＩ法を用いる場合、測定対象である試料と、内部標準法による質量校正に用いる質量校正用内部試薬と、マトリックス剤と、必要に応じてカチオン化剤を混合し、例えば、ステンレス製の試料プレート上に滴下して乾燥させることにより結晶化し、その結晶に窒素レーザーのパルスを照射することにより試料をイオン化する。
【００３９】
その際、使用するマトリックス剤としては、特に限定されないが、例えば、シナピン酸（ＳＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、２，（４−ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、トランス−３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、レチイノン酸（ＡＴＲＡ）、２‘，４’，６‘−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、１，１，４，４−テトラフェニル−１，３−ブタジエン（ＴＰＤ）、trans−２−[３-(４−tert−ブチルフェニル)−２−メチル−２−プロペニリデン]マロノニトリル（ＤＣＴＢ）、ジスラノール（ＤＩＴ）、フェルラ酸が挙げられる。
【００４０】
質量校正用内部標準試薬としては、特に限定されないが、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、Triton-X-100などが挙げられる。
【００４１】
カチオン化剤としては、特に限定されないが、例えば、ヨウ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４２】
混合結晶を形成する際の手法としては、特に限定されないが、例えば、Thin layer法、Dried droplet法、Crash crystal法、Pre-mix法などが挙げられる。
【００４３】
次に、得られたマススペクトルデータに対して、スペクトル中に出現する質量校正用内部標準試薬の質量既知ピークを用いて、内部標準法により未知ピークの質量校正を行い、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを得て記憶部２４０に記憶する。そして、記憶部２４０に記憶されているマススペクトルデータを読み出して、当該マススペクトルデータから解析対象となる全てのピークを抽出してピークリストを作成する。
【００４４】
その後、第３の工程において、ピークリストのピーク群をデアイソトープ処理し、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度（相対強度）の情報を取得し、テキストファ
イル形式に変換して記憶部２４０に記憶する（ステップＳ１０４）。
【００４５】
次に、記憶部２４０に記憶されているモノアイソトープピークの観測質量のデータを読み出して、当該モノアイソトープピークの観測質量に基づいて、Kendrick質量値（ＫＭ値）、整数ＫＭ値（ＮＫＭ値）、ＫＭＤ値及びＲＮＫＭ値を取得する（ステップＳ１０６）。より詳細には、モノアイソトープピークの観測質量に０．９９９８８を掛けてＫＭ値を得て、ＫＭ値を四捨五入することによりＮＫＭ値を得る。次に、ＫＭ値とＮＫＭ値の差を求めて、ＫＭＤ値を得て、ＮＫＭ値を１４で割った余りの値を計算して、Remainder of NKM by 14（ＲＮＫＭ）値を得る。
【００４６】
そして、第５の工程において、取得したＫＭＤ値とＲＮＫＭ値とに基づいて、ＲＮＫＭ値をｘ軸に、ＫＭＤ値をｙ軸にとって各モノアイソトープピークをプロットすることにより散布図を作成し（ステップＳ１０８）、総脂肪酸画分に含まれる脂肪酸のプロットを作成し、画像として表示部２３０に表示する（ステップＳ１１０）。
【００４７】
以上の処理により、試料中の脂肪酸に由来する各ピークのプロットが表示部２３０に表示され、そのプロットの位置や表示されたパターンから、試料中に含まれる脂肪酸を同定することができる。そして、同定された脂肪酸の組成により、測定対象となった試料（菌）を容易に同定することができる。
【００４８】
また、プロットの大きさがピーク強度に基づいて決定されるように設定した場合には、プロットの大きさから試料中の脂肪酸の含有率が推定できる。このため、プロットの位置と大きさとに基づいて、試料中に含まれる脂肪酸の組成と含有率を得ることができ、それにより、より正確に、測定対象となった試料（菌）を同定することができる。
【００４９】
さらに、脂肪酸の酸素原子数と水素不足指数とにより、より詳細に病原菌を同定することもできる。
【００５０】
ここで、本実施形態では、試料として結核菌を用いているため、結核菌および結核菌の類縁菌や日和見感染菌が特徴的に含有するミコール酸を検出するためには、予め、代表的なミコール酸含有菌に存在することが想定されるミコール酸の構造から、ミコール酸の観測質量の理論的なＫＭＤ値とＲＮＫＭ値を計算して「ミコール酸理論プロット」を作成することが好ましい。
【００５１】
作成した「ミコール酸理論プロット」は、記憶部２４０に記憶する。そして、実際に未知の試料を測定する際には、予め作成した「ミコール酸理論プロット」を読み出し、その「ミコール酸理論プロット」上に、試料を測定して得た結果を重ねてプロットして表示部２３０に表示する。このように、予め作成した「ミコール酸理論プロット」上に実際に測定した試料の測定結果をプロットすることにより、より容易に病原菌由来のミコール酸の有無を判別することができる。このように、「ミコール酸理論プロット」を作成した場合には、より迅速容易に病原菌を検出し、さらには同定することが可能となる。
【００５２】
以上のように、本実施形態によれば、質量分析装置で得た結果をＫＭＤ法で処理して表示することにより、試料中の脂肪酸を質量分析して得たマススペクトルデータのピークの帰属を行うことなく、試料中の脂肪酸の判別を迅速簡便に行うことができ、その結果に基づいて、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能となる。また、プロットする際に、ピーク強度比の設定を変えてプロットを作成することで、脂肪酸の含有率が異なる菌を識別することも可能となる。
【００５３】
３．実施例
以下、本発明を実験例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに何ら限定されるものではない。
【００５４】
３．１．  実施例１
実施例１では、試料としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の総脂肪酸画分を使用した。
【００５５】
３．１．１．  ミコール酸理論プロットの作成
まず、図３に示す「ミコール酸理論プロット」を作成し、得られたデータを記憶部２４０に記憶した。ミコール酸理論プロットは、代表的なミコール酸含有菌に存在することが想定されるミコール酸の構造式から、各ミコール酸の観測質量の理論値を計算し、その理論値に基づいて各ミコール酸のＲＮＫＭ値、ＫＭＤ値を求めて作成したものであり、ＲＮＫＭ値をｘ軸に、ＫＭＤ値をｙ軸に散布図を作成することにより、元素組成が異なる１６種の各ミコール酸がｘ−ｙ座標のどの位置にプロットされるのか、その分布を表現したものである。１６個のサークルの各中心が理論値に基づくプロットであり、各サークルは、測定値に基づいてプロットを行った際に、測定誤差に起因して発生するプロット位置の理論値からのずれの範囲を表している。「ミコール酸理論プロット」は、例えば、次のようなデータに基づいて作成される。
【表１】
2018044810.tif 000002
【００５６】
図３において、各サークルの上部に記載されたアルファベットＡ、Ｂ、Ｃは、ミコール酸のサブタイプを表している。つまり、サブタイプＡは酸素原子を３個含むαミコール酸を表し、サブタイプＢは酸素原子を４個含み、一般に酸化型ミコール酸と呼ばれ、サブタイプＣは酸素原子を５個含む酸化型ミコール酸を表す。括弧内の数値は、ミコール酸の分子中のアルキル鎖の二重結合および／またはシクロプロパン環の数を表している。ミコール酸の３つのサブタイプのうち、サブタイプＢとしては、結核菌やその類縁菌に存在することが知られるメトキシミコール酸やケトミコール酸が挙げられる。サブタイプＣとしては、結核菌やその類縁菌に存在することが知られるワックスミコール酸やカルボキシミコ
ール酸が挙げられる。
【００５７】
例えば、図３のＡ（１）は、酸素原子を３個含む一般的なミコール酸であり、アルキル鎖の二重結合および／またはシクロプロパン環の数が０個、すなわち、水素不足指数（ＩＨＤ）が１ということになる。もし、結核菌およびその類縁菌由来の試料を測定し、測定値に基づくプロットを行えば、最低でも図３の矢印で示したサークル、つまり、Ａ（３）、Ｂ（２）、Ｂ（３）のいずれかを含むサークル内にプロットされることになる。なお、図３において、サブタイプごとの分布を視覚的に把握しやすくするために、例えば、サブタイプＡを表すサークルは緑色、サブタイプＢを表すサークルは赤色、サブタイプＣを表すサークルは橙色と色分けする。
【００５８】
３．１．２．  試料の調製
試料として使用するヒト型結核菌の総脂肪酸は、一般的な方法で得ることができるが、ここでは、より高感度の測定を可能とするために、得られた総脂肪酸をメチルエステル化して用いた。
【００５９】
まず、湿菌体１００ｍｇを硝子製のバイアルに入れ、１０％のＫＯＨメタノール溶液１００μｌを加えて蓋をし、１００度で５分間保持した。その後冷却し、６ＮのＨＣｌを加えてｐＨを２以下に下げた。次に、ｎ−ヘキサンを１００μｌ加えて、総脂肪酸画分を抽出した。得られた総脂肪酸画分にトルエン−メタノール−硫酸（１０：２０：１）を３００μｌ加え、１００℃で２時間保持し、脂肪酸メチルを得た。
【００６０】
次に、得られた脂肪酸メチルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定しマススペクトルを得た。測定の際、質量校正用内部標準試薬としてＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を、マトリックス剤として２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いた。ここで、ＰＭＭＡは、１ｍｇ／ｍｌとなるようにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で溶解した。試料は、１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＨＦに溶解した。カチオン化剤として、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＨＦで溶解した。マトリックス剤として、ＤＨＢを１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＨＦで溶解した。このように溶解したものを、試料：ＰＭＭＡ：カチオン化剤：マトリックス剤＝１：１：１：１となるようにガラス製のバイアル中で混合した後、ステンレス製の試料プレートに１滴滴下して、風乾させた。
【００６１】
３．１．３．  試料の測定
３．１．２．で得られた試料プレートを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（日本電子株式会社製、ＪＭＳ−Ｓ３０００  ＳｐｉｒａｌＴＯＦ）のイオン源に導入して質量分析を行った。測定は、ｍ／ｚ  １２００における質量分解能が５００００となるようにチューニングして行われた。
【００６２】
次に、得られたマススペクトルデータに対して、スペクトル中に出現するＰＭＭＡの質量既知ピークを用いて、内部標準法により未知ピークの質量校正を行い、さらに、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図４に示す。図４に示すように、ヒト型結核菌の総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００６３】
３．１．４．  データの解析
図４のマススペクトルに基づくプロットを、図３に示す「ミコール酸理論プロット」に重ねてプロットした結果を図５に示す。すなわち、得られたマススペクトルのピーク検出を行い、各ピークをデアイソトープし、モノアイソトープピークの観測質量とピーク強度（相対強度）の情報をテキストファイル形式に変換し、モノアイソトープピークの観測質量に０．９９９８８を掛けて、各モノアイソトープピークについてＫＭ値を得た。次に、
ＫＭ値を四捨五入して、ＮＫＭ値を得て、ＫＭ値とＮＫＭ値の差を求めて、各モノアイソトープピークについてＫＭＤ値を得た。次に、ＮＫＭ値を１４で割った余りの値を計算して、各ピークについてＲＮＫＭ値を得た。そして、図３の「ミコール酸理論プロット」に重ねて各ピークをプロットすることにより、図５のプロットを作図した。
【００６４】
実施例１の脂肪酸メチル由来の欠くピークは、図５上において、サークルＡ（３）、Ｂ（２）、Ｂ（３）の３箇所にプロットされた。上記したように、サークルＡ（３）、Ｂ（２）、Ｂ（３）は、結核菌およびその類縁菌由来の試料に特徴的に存在する事が知られているミコール酸に該当するため、図５のプロットにより、実施例１で使用した試料は、確かに結核菌であると検出および同定された。
【００６５】
３．２．  実施例２
次に、試料として結核ワクチン株（Mycobacterium bovis)の総脂肪酸画分を使用した。
【００６６】
実施例１と同様の操作により試料プレートを調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで質量分析して得られたマススペクトルデータを内部標準法により質量校正し、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図６に示す。図６に示すように、結核ワクチン株の総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００６７】
図６のマススペクトルから、実施例１と同様の操作により作成したプロットを図７に示す。本菌株はワクチン生産株であるが、図７上において、サークルＡ（３）、Ｂ（２）、Ｂ（３）の３箇所にプロットされ、結核の原因菌として誤同定された。
【００６８】
そこで、図７のプロットのうち、相対ピーク強度が５０％以下のものを削除して、図８に示すプロットを作成した。この例では、菌体に含まれるミコール酸の種類は同じであるが、結核菌およびその類縁菌と、結核ワクチン株とでは含まれるミコール酸の含有率が異なるため、ピーク強度に閾値を設けて、閾値以下のピークはプロットしないようにしてプロットを作成した結果、ヒト型結核菌とワクチン株とを識別することができた。
【００６９】
３．３．  実施例３
次に、試料としてグルタミン生産菌として知られるCorynebacterineae glutamicumの総脂肪酸画分を使用した。
【００７０】
実施例１と同様の操作により試料プレートを調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで質量分析して得られたマススペクトルデータを内部標準法により質量校正し、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図９に示す。図９に示すように、Corynebacterineae glutamicumの総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００７１】
図９のマススペクトルから、実施例１と同様の操作により作成したプロットを図１０に示す。図１０上において、サークルＡ（１）、Ａ（２）、Ａ（３）の３箇所にプロットされ、αミコール酸の、ＩＨＤが１から３のミコール酸が検出され、結核の原因菌とは異なる菌であることがわかった。
【００７２】
３．４．  実施例４
次に、試料として病原性放線菌として知られているNocardia pneumoniaeの総脂肪酸画分を使用した。
【００７３】
実施例１と同様の操作により試料プレートを調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで質量分
析して得られたマススペクトルデータを内部標準法により質量校正し、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図１１に示す。図１１に示すように、Nocardia pneumoniaeの総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００７４】
図１１のマススペクトルから、実施例１と同様の操作により作成したプロットを図１２に示す。図１２上において、サークルＡ（３）、Ａ（４）、Ｂ（２）、Ｂ（３）、Ｃ（２）の５箇所にプロットされ、αミコール酸のＩＨＤが３および４のミコール酸、酸素原子が４個でＩＨＤが２および３の酸化型ミコール酸、および酸素原子が５個でＩＨＤが２の酸化型ミコール酸が検出された。図１２より、サブタイプＢとＣの酸化型ミコール酸の存在が分かり、これにより、この試料菌株の病原性が示唆された。
【００７５】
３．５．  実施例５
次に、試料として病原性放線菌として知られているNocardia brasiliensisの総脂肪酸画分を使用した。
【００７６】
実施例１と同様の操作により試料プレートを調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで質量分析して得られたマススペクトルデータを内部標準法により質量校正し、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図１１に示す。図１３に示すように、Nocardia brasiliensisの総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００７７】
図１３のマススペクトルから、実施例１と同様の操作により作成したプロットを図１４に示す。図１４上において、サークルＡ（２）、Ａ（３）、Ａ（４）、Ｂ（２）、Ｂ（３）、Ｃ（２）の６箇所にプロットされ、αミコール酸のＩＨＤが２から４のミコール酸、酸素原子が４個でＩＨＤが２および３の酸化型ミコール酸、および酸素原子が５個でＩＨＤが２の酸化型ミコール酸が検出された。図１４より、サブタイプＢとＣの酸化型ミコール酸の存在が分かり、これにより、この試料菌株の病原性が示唆された。さらに、サークルＡ（２）にもプロットされたことから、実施例４のNocardia pneumoniaeと識別することもできた。
【００７８】
３．６．  実施例６
次に、試料として放線菌Tsukamurella pulmonisのクロロホルム‐メタノール（２：１）抽出物を使用した。なお、この手法ではミコール酸はほとんど抽出されないと考えられている。次に、得られた抽出物にトルエン−メタノール−硫酸（１０：２０：１）を３００μｌ加え、１００℃で２時間保持し、脂肪酸メチルを得た。
【００７９】
実施例１と同様の操作により試料プレートを調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで質量分析して得られたマススペクトルデータを内部標準法により質量校正し、ミコール酸メチルエステルとして帰属された主要ピークで自己キャリブレーションして得たマススペクトルを図１５に示す。図１５に示すように、Tsukamurella pulmonisの総脂肪酸メチルエステルのマススペクトルでは、多数のピークが観測された。
【００８０】
図１５のマススペクトルから、実施例１と同様の操作により作成したプロットを図１６に示す。表１および図３に示すように、ミコール酸のＫＭＤ値（理論値）は、０．１０から０．２５の範囲に確実に入るが、実施例６では、全てＫＭＤ値は０．２以上になった。さらに、ＫＭＤ値が０．２以上のミコール酸の場合、ＲＮＫＭ値は９もしくは１１にプロットされる。したがって、図１６上でプロットされている成分はミコール酸由来ではないことが分かり、この試料菌株の病原性がないことが示唆された。
【００８１】
以上の結果により、本実施形態によれば、試料中の脂肪酸を質量分析して得られたマススペクトルデータのピークの帰属を行うことなく、ミコール酸であるかどうかの判別を迅速簡便に行うことができ、迅速簡便に病原菌の検出および同定が可能であることがわかった。特に、酸化型ミコール酸が容易に検出できるようになった。ミコール酸生産菌のうち病原性をもつものには酸化型ミコール酸が存在する傾向があるため、本実施形態によれば、酸化型ミコール酸が病原菌のバイオマーカーの一つとして利用できることが分かった。このように、本実施形態では、ピークの帰属を行わずにミコール酸を検出できるため、誰でも簡単に病原菌のスクリーニングができることがわかった。
【００８２】
また、プロットする際に、ピーク強度に閾値を設け、閾値の設定を変えてプロットを作成することで、同じ種類のミコール酸を含んでいても、ミコール酸の含有率が異なるようなケースでは、菌を識別することも可能であることがわかった。以上により、本実施形態によれば、結核菌、結核菌の類縁菌、およびミコール酸をもつ日和見感染菌の鑑別やスクリーニングを迅速簡便にできるため、実用性の高い分析手法になり得ることが示唆された。
【００８３】
本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００８４】
１０…質量分析装置、２０…マススペクトル解析装置、１００…検出装置、１１０…イオン源、１２０…質量分析部、２１０…処理部、２１２…ピークリスト作成部、２１４…ピークデータ作成部、２１６…ＫＭＤデータ取得部、２１８…表示制御部、２２０…操作部、２３０…表示部、２４０…記憶部、２５０…情報記憶媒体
【図１】
2018044810.tif 000003
【図２】
2018044810.tif 000004
【図３】
2018044810.tif 000005
【図４】
2018044810.tif 000006
【図５】
2018044810.tif 000007
【図６】
2018044810.tif 000008
【図７】
2018044810.tif 000009
【図８】
2018044810.tif 000010
【図９】
2018044810.tif 000011
【図１０】
2018044810.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2018044810.tif 000014
【図１３】
2018044810.tif 000015
【図１４】
2018044810.tif 000016
【図１５】
2018044810.tif 000017
【図１６】
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