(57)【要約】      （修正有）【課題】パターン認識受容体のリガンドに対する免疫担当細胞の免疫応答を亢進させる方法の提供。【解決手段】カルシウムフラックスアゴニストと免疫担当細胞を接触させる工程を含むパターン認識受容体のリガンドに対する免疫担当細胞の免疫応答を亢進させる方法。カルシウムフラックスアゴニストがＣａ２＋イオノフォア又はＳＥＲＣＡ阻害剤である前記方法。Ｃａ２＋イオノフォアがイオノマイシン、カルシマイシン、Ｃａ２＋イオノフォアＩＩ、Ｃａ２＋イオノフォアＩＶ、Ｃａ２＋イオノフォアＶ又はＣａ２＋イオノフォアＶＩである前記方法。【選択図】図２
2018080199.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パターン認識受容体のリガンドに対する免疫担当細胞の免疫応答を亢進させる方法であって、前記方法は、
前記免疫応答を亢進させるのに有効な濃度でカルシウムフラックスアゴニストと前記免疫担当細胞を接触させる工程を包含する、
方法。
【請求項２】
前記カルシウムフラックスアゴニストがカルシウムイオノフォアであることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
前記カルシウムイオノフォアがイオノマイシン、カルシマイシン、カルシウムイオノフォアＩＩ、カルシウムイオノフォアＩＶ、カルシウムイオノフォアＶ、またはカルシウムイオノフォアＶＩであることを特徴とする、
請求項２の方法。
【請求項４】
前記カルシウムフラックスアゴニストがＳＥＲＣＡ阻害剤であることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＳＥＲＣＡ阻害剤が２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、タプシガルギン、ルテニウムレッド、ジンゲロール、パキシリン、またはシクロピアゾン酸であることを特徴とする、
請求項４の方法。
【請求項６】
前記亢進された免疫応答が増加したＩＬ−８分泌または増強されたＮＦ−κＢシグナル伝達活性化であることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項７】
前記免疫担当細胞が表皮または真皮に存在する細胞であることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項８】
前記表皮または真皮が損傷を受けていることを特徴とする、
請求項７の方法。
【請求項９】
前記表皮または真皮が細菌性病原体に感染していることを特徴とする、
請求項８の方法。
【請求項１０】
前記細菌性病原体がＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体に対するリガンドを含有する、
請求項９の方法。
【請求項１１】
前記カルシウムフラックスアゴニストが前記表皮または真皮に局所的に適用されることを特徴とする、
請求項７の方法。
【請求項１２】
前記免疫担当細胞がＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体の少なくとも一つを発現することを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項１３】
前記パターン認識受容体がＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体であることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項１４】
前記パターン認識受容体のリガンドがＰＡＭＰであることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項１５】
前記免疫応答が、前記リガンド存在下で相乗的に亢進され、かつ前記カルシウムフラックスアゴニストが、前記リガンド非存在下での前記カルシウムフラックスアゴニストの最大効果に関する準最適濃度にて前記リガンド存在下で使用されることを特徴とする、
請求項１の方法。
【請求項１６】
パターン認識受容体のリガンドに対する免疫担当細胞の免疫応答を亢進する方法であって、前記方法は、
前記免疫応答を亢進するのに有効な濃度でカルシウムフラックスアゴニストと前記免疫担当細胞を接触させる工程を包含する、方法であって、
前記免疫応答が増加したＩＬ−８分泌またはＮＦ−κＢシグナル伝達の増強された活性化であることを特徴とし、かつ
前記パターン認識受容体がＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体であることを特徴とする、
方法。
【請求項１７】
前記カルシウムフラックスアゴニストがカルシウムイオノフォアである、
請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記カルシウムフラックスアゴニストがＳＥＲＣＡ阻害剤である、
請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記免疫担当細胞が表皮または真皮に存在する細胞である、
請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記表皮または真皮が、損傷または感染している、
請求項１９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月１３日に出願されたわれわれの係属中の出願番号６１／７２５８８１の仮出願の優先権を主張する。そして、当仮出願は、ここで参照することにより取り込まれる。
【０００２】
本発明は、組成物ならびに医薬化合物の方法に関するものであり、特に、局所適用されるカルシウムフラックスアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
さまざまなカルシウムフラックスアゴニストが、当該技術分野において知られており、またこれらは非常に異なった由来を有する。例えば、ある化合物はイオノフォアとして作用して、カルシウムイオンを細胞の内部に取り込むことによって細胞内カルシウムレベルを一般的に上昇させるが、他の化合物は、小胞体やミトコンドリアのような細胞内ストアからのカルシウム分泌を増加させることによって細胞内カルシウムレベルを上昇させる。
【０００４】
その他の既知のさまざまなイオノフォアの中で、カルシマイシン（Ａ２３１８７）およびイオノマイシンは天然産物（それぞれ、グラム陽性菌ストレプトマイセス  チャートリュウセンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈａｒｔｒｅｕｓｅｎｓｉｓ）およびストレプトマイセス  コングロバツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）由来）であり、これらはもともと、数十年前には抗生物質とされていた。より具体的には、Ａ２３１８７およびイオノマイシンの両者は、ＵＳ３９６０６６７およびＵＳ３８７３６９３に報告されているように、さまざまな潜在的な微生物病原体に対して直接的な抗生物質活性を示す。細胞壁の合成や細菌のリボソーム機能などの微生物の増殖に特有な生化学的経路を阻害する古典的な抗生物質（例えば、ペニシリンやテトラサイクリン）とは異なり、Ａ２３１８７およびイオノマイシンは抗生物質化合物の別個のクラスに分類され、該抗生物質化合物は基質として二価カチオンを比較的高い特異性で結合する。例えば、Ａ２３１８７の結合親和性はＭｎ２＋＞Ｃａ２＋＝Ｍｇ２＋＞Ｓｒ２＋＞Ｂａ２＋で特徴付けられ、イオノマイシンはＣａ２＋＞Ｍｇ２＋＞Ｂａ２＋＞Ｓｒ２＋で特徴付けられる。
【０００５】
一方、タプシガルギンは典型的なＥＲ分泌促進剤であり、セスキテルペンラクトンとして特徴付けることができる。タプシガルギンは植物（タプシア  ガルガニカ）から単離され、さまざまな筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ｓａｒｃｏ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋  ＡＴＰａｓｅｓ  、ＳＥＲＣＡ）の非競合阻害剤として作用する。タプシガルギン：ＳＥＲＣＡ結合は、低いピコモル濃度の範囲の親和定数を示し、分裂細胞および非分裂細胞のいずれに対しても毒性を持つ。動物においては、タプシガルギとのわずかな皮膚接触が炎症をもたらす可能性があり、また、強力なＤＮＡ損傷剤と併用した場合、慢性的、反復的な局所暴露は非悪性の乳頭腫の形成をもたらし得る。タプシガルギン（およびタプシガルギシンなどのような構造類似体）に加えて、他のＳＥＲＣＡ阻害剤はシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）および２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロ−キノン（ＤＢＨＱ）を包含する。
【０００６】
増加の一途をたどる慢性皮膚潰瘍を患う糖尿病患者の数、抗生物質耐性の微生物叢（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌あるいはＭＲＳＡ）の存在、ならびに増加する壊死性筋膜炎（あるいは「人食いバクテリア感染症」）の発生頻度、を含むいくつかの理由から、治療困難な皮膚感染症は、新たな公衆衛生上の懸念を象徴している。細菌に加えて、多くの真菌類およびウイルス類もまた、重大な皮膚の感染症を引き起こし得る。抗生物質は依然として、これらの多くの疾患に対する最善の治療選択肢ではあるが、患者自身の細胞およびそれらに関連した機能を刺激して進行中の感染症からの患者の回復をさらに向上させることが望ましいと考えられ、また、可能ならば有害な有機体に対する長期免疫を刺激してその後の遭遇時の発症を抑制することも望ましいであろう。
【０００７】
高等生物においては、皮膚を含む上皮組織は、病原体に起因する損傷、化学的損傷、および物理的損傷に対する重要なバリアとして機能する。皮膚の表皮層は、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞などの免疫細胞、メルケル細胞ならびにメラニン細胞から成る。疾病監視を担う樹状細胞（ＤＣ）の亜型であるランゲルハンス細胞に加えて、ケラチノサイト（表皮を形成する細胞全体の〜９５％を占める）もまた、トール様受容体（ＴＬＲ）タンパク質のメンバー、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、インフラマソームなどの、さまざまなパターン認識受容体を発現させることを通して、免疫番兵として機能する。
【０００８】
ケラチノサイトにおける、同種リガンドによるこれらの受容体の活性化は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ２０などの他の免疫細胞を招集するためのケモカイン、ならびにＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０などの免疫調節サイトカインの両者の放出をもたらす。表皮の下の真皮は、ＣＤ４＋（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７など）および非古典的（例えば、γδ、ＮＫ−、など）Ｔ細胞のさまざまなサブセット、さまざまな抗原提示細胞（例えば、マクロファージならびに真皮樹状細胞および形質細胞様樹状細胞）、マスト細胞ならびに線維芽細胞を含む、多種多様の細胞型から成り、これらの細胞型の多くは、上述したさまざまなパターン認識タンパク質を発現する。したがって、表皮細胞および真皮細胞は協働して、微生物の侵入あるいは深刻な疾患を引き起こす他の物理的な損傷を阻止する。
【０００９】
ＴＬＲタンパク質（ヒトにおけるＴＬＲ１−１０）は、疾患ならびに組織の恒常性に関連するリガンドの特定クラスに対するパターン認識受容体（ＰＲＲ）として機能する、Ｉ型膜タンパク質であり、そのようなものとして、さまざまな免疫細胞および非免疫細胞において同様に発現する。全ての受容体と同様に、ＴＬＲシグナル伝達はリガンド結合によって引き起こされ、リガンド類は病原体関連分子パターン（あるいはＰＡＭＰ）および疾患関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に分類できる。
【００１０】
ＴＬＲに認識されるＰＡＭＰは細菌性リポタンパク質／リポペプチド、リポサッカリド、フラジェリン、および非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、真菌細胞壁成分（例えば、ザイモサン）、およびウイルス核酸（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、およびＣｐＧ  ＤＮＡ）を含み、一方ＤＡＭＰｓは宿主に直接由来し、感染なしで発生し得るものであり、かつ主にわずか２種類のＴＬＲファミリータンパク質（ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４）によって認識される。
【００１１】
適切なリガンドによって活性化されるとすぐに、ＴＬＲはシグナル伝達カスケードを開始するが、該カスケードは感染／疾患の程度を抑制し、かつ組織修復を誘発するという両方の役割を果たす。後者に関し、ＴＬＲのリガンド認識は、抗菌活性のアップレギュレーションをもたらし、かつさまざまな免疫学的プレーヤーの活性化／成熟をもたらして、侵入病原体の殲滅を完了させる。例えば、ＴＬＲの活性化は、活性酸素種（ＲＯＳ）、抗菌ペプチドの放出、ならびに、マクロファージ、好中球、ケラチノサイトなどの固有の細胞（ｉｎｎａｔｅ  ｃｅｌｌｓ）中の食細胞機能のアップレギュレーションをもたらし得る。疾患に対抗する役割に加えて、ＴＬＲはまた、さまざまな組織損傷モデル（化学的損傷、放射線損傷、外科的損傷、および感染性損傷によって誘導されるものを含む）において実証されているように、組織修復および再生にも関与している。
【００１２】
パターン認識受容体のさらに別のクラスは、ＮＯＤ様受容体タンパク質ファミリーによって形成され、もっとも重要なメンバーとしてＮＯＤ１およびＮＯＤ２を包含する。ＮＯＤ１およびＮＯＤ２は細胞内パターン認識受容体であり、構造面で植物の抵抗タンパク質に似ており、かつＤ−グルタミル−メソ−ジアミノピメリン酸およびムラミールジペプチドをそれぞれ含む細菌分子を認識することによって、自然免疫および獲得免疫を媒介する。それぞれのリガンドによる刺激に続いて、両ＮＯＤタンパク質はそれぞれの認識ドメインを通してＲＩＰＫ２と相互作用し、これにより最終的に転写因子ＮＦ−κＢの活性化がもたらされる。
【００１３】
シグナル伝達の小分子アゴニスト（プロテインキナーゼＣアゴニストＴＰＡ／ＰＭＡ、あるいはＡ２３１８７、イオノマイシンまたはタプシガルギンのような持続的カルシウムフラックスアゴニスト）の局所適用に対する無損傷皮膚の応答の特性を明らかにしようとするこれまでの試みは、さまざまな下流の結果を示した。例えば、ホルボールエステルＴＰＡの局所適用は、血管の拡張、毛細血管透過性の変化、炎症細胞の動員、およびさまざまな細胞型からの炎症誘発因子の放出を引き起こした。ＰＫＣアゴニストとは対照的に、持続的カルシウムフラックスアゴニスト（ＳＣＦＡ）による局所処理は、皮膚の炎症および過剰増殖を引き起こした。一方、比較的高い量のカルシウムイオノフォア（イオノマイシン）存在下におけるＴＬＲリガンド（ＬＰＳ）への細胞の暴露は、測定可能ないかなる免疫活性化作用をももたらさなかった（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１２  Ｊｕｌ  １０；１０９（２８）：  １１２８２−７）。ＵＳ２０１２／０２７２７００Ａ１およびＵＳ２０１３／０１８３３４３Ａ１で議論されているように、カルシウムイオノフォアおよびＴＬＲリガンドは比較的高い用量で個別に適用した場合、分化を刺激し、あるいは樹状細胞を活性化することが知られている。
【００１４】
したがって、多数の組成物ならびにＴＬＲ／ＮＯＤに関するカルシウムフラックスアゴニストおよび／またはリガンドの使用は当該技術分野において既知であるが、改善された免疫調節活性を提供する組成物および方法を提供する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の主題は、カルシウムフラックスアゴニストのさまざまな組成物および方法に関しており、該組成物および方法においては、これらの化合物は、ＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介イベントに対する免疫応答を調節するために用いられ、特にＴＬＲおよび／またはＮＯＤリガンド結合に対する相乗的に増加する応答を調節するために用いられる。とりわけ、免疫刺激に関する相乗効果は、準最適濃度のカルシウムフラックスアゴニスト存在下で観察される。
【００１６】
異なる観点から見ると、本発明者らは、細胞内Ｃａ２＋依存性のＴＬＲ／ＮＯＤシグナル伝達を増強させるためのカルシウムフラックスアゴニストの使用を企図する。したがって、またその他の適切な使用の中で、特に企図される使用は、ＴＬＲ／ＮＯＤ依存性刺激（例えば、感染または損傷）に対する亢進された応答を可能にするための組織の前条件付け、および／または細胞内Ｃａ２＋依存性ＴＬＲ／ＮＯＤシグナル伝達を増強するための、表皮の局所的感染またはそれ以外の感染のカルシウムフラックスアゴニストによる処理を包含する。したがって、本発明者らはまた、創傷の治癒を促し、および／または瘢痕を縮小させるための、皮膚感染症およびその他の状態（例えば、糖尿病性の潰瘍）の予防および／または治療用の局所医薬組成物および化粧品組成物も企図する。
【００１７】
本発明の主題のひとつの態様において、本発明者らは、パターン認識受容体のリガンドに対する免疫担当細胞の免疫応答を亢進させるための、カルシウムフラックスアゴニストの使用を企図する。例えば、カルシウムフラックスアゴニストがカルシウムイオノフォアである場合、好ましいアゴニストはイノマイシン、カルシマイシン、ボーベリシン（ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）、カルシウムイオノフォアＩＩ、カルシウムイオノフォアＩＶ、カルシウムイオノフォアＶ、およびカルシウムイオノフォアＶＩを包含し、アゴニストがＳＥＲＣＡ阻害剤である場合、好ましいＳＥＲＣＡ阻害剤はＤＢＨＱ（２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン）、タプシガルギン、ルテニウムレッド、ジンゲロール（ｇｉｎｇｅｒｏｌ）、パキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎｅ）、およびシクロピアゾン酸を包含する。その他の観察可能な現象のうち、亢進された免疫応答は、増加したＩＬ−８分泌および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達の増強された活性化によって一般的に裏づけられ、かつ免疫応答がリガンドの存在下で、特にカルシウムフラックスアゴニストが準最適濃度（リガンドの非存在下におけるカルシウムフラックスアゴニストの最大効果に関して）で用いられる場合、カルシウムフラックスアゴニストによって相乗的に亢進されることが好ましい。
【００１８】
好適な細胞に関しては、細胞が免疫担当細胞であることが一般的に企図され、該免疫担当細胞は、好ましくは皮膚の表皮層または真皮層に存在する。さらに、免疫担当細胞は一般的に、ＴＬＲ受容体および／またはＮＯＤ受容体をパターン認識受容体として発現する。ゆえに、リガンドは通常、ＰＡＭＰリガンドおよびＤＡＭＰリガンドを包含する。
【００１９】
それゆえに、本発明者らは、皮膚における免疫応答を亢進させるための局所適用薬の製造におけるカルシウムフラックスアゴニストの使用もまた企図する。このような使用において、免疫応答は一般的に、免疫担当細胞における（ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰ）リガンドのパターン認識受容体への結合と関連しており、かつパターン認識受容体は、もっとも一般的にはＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体である。上述したように、好ましいカルシウムフラックスアゴニストは、カルシウムイオノフォア（例えば、イオノマイシン、カルシマイシン、カルシウムイオノフォアＩＩ、カルシウムイオノフォアＩＶ、カルシウムイオノフォアＶ、またはカルシウムイオノフォアＶＩ）、およびＳＥＲＣＡ阻害剤（例えば、２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、タプシガルギン、ルテニウムレッド、ジンゲロール、パキシリン、またはシクロピアゾン酸など）を包含し、および／またはカルシウムフラックスアゴニストは、アゴニストがリガンドの存在下で準最適濃度で細胞中に存在するような濃度で、医薬品中に存在する。
【００２０】
したがって、また異なる観点から見ると、本発明者らは、皮膚の創傷治癒を促進するための局所適用薬の製造におけるカルシウムフラックスアゴニストの使用もまた企図する。このような使用において、カルシウムフラックスアゴニストは一般的に、創傷中の細胞のＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化するのに効果的な量で存在する。このような使用は、創傷が細菌性病原体（一般的にＴＬＲ受容体および／またはＮＯＤ受容体に対するリガンドを発現または産出している）に感染している場合に特に効果的である。
【００２１】
さらに別の本発明の主題の態様において、本発明者らは、カルシウムフラックスアゴニスト（例えば、カルシウムイオノフォアまたはＳＥＲＣＡ阻害剤）を薬学的に許容される担体中に含有する医薬組成物もまた企図する。ここで、該医薬組成物は損傷したまたは感染した皮膚への局所適用のために製剤化され、かつカルシウムフラックスアゴニストは、損傷皮膚または感染皮膚への製剤の適用時に、パターン認識受容体（例えば、ＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体）のリガンドに対する損傷皮膚または感染皮膚中の免疫担当細胞の免疫応答を亢進させる量で存在する。このような医薬組成物は、例えば、液剤、スプレー剤、またはゲル剤として製剤化されてよいが、医薬組成物が、損傷皮膚または感染皮膚へ適用される固形担体を通した損傷皮膚または感染皮膚への局所適用のために製剤化されること（例えば、医薬組成物を含浸させた創傷包帯またはバンドエイド）もまた企図される。例えば、皮膚は、ＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体に対するリガンドを含有する病原体（例えば、細菌性病原体）に感染していてよい。
【００２２】
特に好ましい医薬組成物において、カルシウムフラックスアゴニスト（例えば、イオノマイシン、カルシマイシン、またはタプシガルギン）の量は、リガンドの非存在下における免疫応答と比較して、リガンドの存在下において相乗的に免疫応答を亢進させる。
【００２３】
したがって、本発明者らは、パターン認識受容体（例えば、ＴＬＲ受容体またはＮＯＤ受容体）を発現している細胞の、パターン認識受容体のリガンド（例えば、ＰＡＭＰ）に対する免疫応答を亢進する方法もまた企図する。ここで該方法は、細胞をリガンドの存在下で、免疫応答を亢進させる量のカルシウムフラックスアゴニスト（例えば、ＳＥＲＣＡ阻害剤またはカルシウムイオノフォア）に暴露する工程を含む。
【００２４】
もっとも一般的には、免疫応答は増加したＩＬ−８の分泌および／または増強されたＮＦ−κＢシグナル伝達活性化よって裏づけられ、かつリガンドとカルシウムフラックスアゴニストが相乗作用を示す量で存在することが特に好ましい。発明の主題に限定しないが、細胞が皮膚（例えば、損傷皮膚または感染皮膚）の真皮層または表皮層に存在していることがさらに好ましい。
【００２５】
異なる観点から見ると、本発明者らは、したがって、損傷皮膚または感染皮膚の治療方法もまた企図する。該方法においては、ひとつの工程において損傷皮膚または感染皮膚は、免疫応答（例えば、増加したＩＬ−８分泌または増強されたＮＦ−κＢシグナル伝達活性化）を亢進させかつ創傷治癒を向上させる量のカルシウムフラックスアゴニスト（例えば、カルシウムイオノフォアまたはＳＥＲＣＡ阻害剤）と接触させられる。
【００２６】
それゆえ、本発明者らは、組織（例えば、上皮組織）または細胞におけるＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介刺激に対する免疫応答を調節する方法もまた企図する。該方法においては、ひとつの工程において組織または細胞は、カルシウムフラックスアゴニスト非存在下における細胞内カルシウム濃度と比較して細胞内カルシウム濃度を増加させるのに効果的な濃度のカルシウムフラックスアゴニストと、接触（例えば、局所適用）させられる。もっとも一般的には、カルシウムフラックスアゴニスト（例えば、カルシウムイオノフォアまたはＳＥＲＣＡ阻害剤）の濃度は、ＴＬＲ−媒介刺激に対する免疫応答を調節するのに効果的である。発明の主題のいくつかの態様において、ＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介刺激は細菌性、ウイルス性、または真菌性の感染であり、他の態様においては、ＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介刺激は組織損傷である。
【００２７】
本発明の主題のさまざまな対象、特徴、態様および利点は、後述する好ましい実施態様の詳細な説明、ならびに、同様の数字が同様の成分を表している付随の図面よって、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＮＦ−κＢシグナル伝達およびＩＬ−８産生の強さに関する、さまざまなカルシウムフラックスアゴニスト（１ＡはＡ２３１８７；  １Ｂはイオノマイシン；１Ｃはタプシガルギン）の用量反応曲線を表す図である。
【図２】図２は、さまざまなカルシウムフラックスアゴニストと代表的なＴＬＲリガンド（Ｐａｍ２ＣＹＳ）との相乗効果を表す例示的なグラフである。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅは、代表的なカルシウムフラックスアゴニスト（図３ＡはＡ２３１８７；図３Ｂはイオノマイシン；図３Ｃはシクロピアゾン酸；図３ＤはＤＢＨＱ；図３Ｅはタプシガルギン）と、それぞれのＴＬＲおよびＮＯＤ受容体に対する代表的なＴＬＲおよびＮＯＤリガンドとの、ＩＬ−８産生の強さに関する相乗効果を説明するさまざまなグラフを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｅは、代表的なカルシウムフラックスアゴニスト（図３ＡはＡ２３１８７；図３Ｂはイオノマイシン；図３Ｃはシクロピアゾン酸；図３ＤはＤＢＨＱ；図３Ｅはタプシガルギン）と、それぞれのＴＬＲおよびＮＯＤ受容体に対する代表的なＴＬＲおよびＮＯＤリガンドとの、ＩＬ−８産生の強さに関する相乗効果を説明するさまざまなグラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｅは、代表的なカルシウムフラックスアゴニスト（図３ＡはＡ２３１８７；図３Ｂはイオノマイシン；図３Ｃはシクロピアゾン酸；図３ＤはＤＢＨＱ；図３Ｅはタプシガルギン）と、それぞれのＴＬＲおよびＮＯＤ受容体に対する代表的なＴＬＲおよびＮＯＤリガンドとの、ＩＬ−８産生の強さに関する相乗効果を説明するさまざまなグラフを示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｅは、代表的なカルシウムフラックスアゴニスト（図３ＡはＡ２３１８７；図３Ｂはイオノマイシン；図３Ｃはシクロピアゾン酸；図３ＤはＤＢＨＱ；図３Ｅはタプシガルギン）と、それぞれのＴＬＲおよびＮＯＤ受容体に対する代表的なＴＬＲおよびＮＯＤリガンドとの、ＩＬ−８産生の強さに関する相乗効果を説明するさまざまなグラフを示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｅは、代表的なカルシウムフラックスアゴニスト（図３ＡはＡ２３１８７；図３Ｂはイオノマイシン；図３Ｃはシクロピアゾン酸；図３ＤはＤＢＨＱ；図３Ｅはタプシガルギン）と、それぞれのＴＬＲおよびＮＯＤ受容体に対する代表的なＴＬＲおよびＮＯＤリガンドとの、ＩＬ−８産生の強さに関する相乗効果を説明するさまざまなグラフを示す。
【図４】図４は、ＮＦ−κＢの活性化に関する相乗作用における、異なるＣａ２＋調節化合物の影響を説明するグラフを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、生菌増殖の、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞（図５Ａ）、タプシガルギンによるＮＦ−κＢ応答の増強（図５Ｂ）に及ぼす影響、およびカルシウムフラックスアゴニストシグナル増幅のためのＣａ２＋の細胞外必要性（図５Ｃ〜５Ｅ）を表すグラフを示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、生菌増殖の、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞（図５Ａ）、タプシガルギンによるＮＦ−κＢ応答の増強（図５Ｂ）に及ぼす影響、およびカルシウムフラックスアゴニストシグナル増幅のためのＣａ２＋の細胞外必要性（図５Ｃ〜５Ｅ）を表すグラフを示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは、生菌増殖の、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞（図５Ａ）、タプシガルギンによるＮＦ−κＢ応答の増強（図５Ｂ）に及ぼす影響、およびカルシウムフラックスアゴニストシグナル増幅のためのＣａ２＋の細胞外必要性（図５Ｃ〜５Ｅ）を表すグラフを示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、生菌増殖の、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞（図５Ａ）、タプシガルギンによるＮＦ−κＢ応答の増強（図５Ｂ）に及ぼす影響、およびカルシウムフラックスアゴニストシグナル増幅のためのＣａ２＋の細胞外必要性（図５Ｃ〜５Ｅ）を表すグラフを示す。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、生菌増殖の、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞（図５Ａ）、タプシガルギンによるＮＦ−κＢ応答の増強（図５Ｂ）に及ぼす影響、およびカルシウムフラックスアゴニストシグナル増幅のためのＣａ２＋の細胞外必要性（図５Ｃ〜５Ｅ）を表すグラフを示す。
【図６】図６は、貪食された黄色ブドウ球菌の至適殺菌のための、ヒト初代単球および顆粒球の細胞外Ｃａ２＋の必要性を説明するグラフを示す。
【図７】図７は、選択されたカルシウムフラックスアゴニストを用いた創傷治癒の写真を示す。
【図８】図８は、コントロールおよび選択されたカルシウムフラックスアゴニストによる創傷治療後の、創傷の大きさおよび細菌負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）を表すグラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａ２３１８７、イオノマイシン、およびＣＰＡそれぞれに対する、黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性を表すグラフを示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａ２３１８７、イオノマイシン、およびＣＰＡそれぞれに対する、黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性を表すグラフを示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、Ａ２３１８７、イオノマイシン、およびＣＰＡそれぞれに対する、黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性を表すグラフを示す。
【図１０】図１０は、タプシガルギンの、黄色ブドウ球菌に対する直接的な抗生物質効果の欠如を表すグラフである。
【図１１】図１１は、タプシガルギン処理細胞による、改善された細胞内黄色ブドウ球菌殺傷を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らは、細胞内フリーＣａ２＋濃度を増加させるカルシウムフラックスアゴニスト（特に、カルシウムイオノフォアおよびＳＥＲＣＡ阻害剤）が、ＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介イベントに対する宿主の免疫応答を、調節および／または亢進するために効果的に使用され得ることを見出した。特に注目すべき態様において、カルシウムフラックスアゴニストは、カルシウムフラックスアゴニストが実質的な準最適濃度で存在する場合、ＴＬＲおよび／またはＮＯＤリガンド結合に対する宿主応答を相乗的に増加させた。
【００３０】
以下でさらに詳述されるように、本発明者らは実際に、自然免疫細胞が、Ｃａ２＋依存的に黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）またはそれらが放出した産出物（および、他の病原体および病原体のフラグメント）を認識して活性化されることによって感染制御を補助し、その後それが、影響を受けた細胞（罹患細胞）の準最適用量のＣａ２＋フラックスアゴニストへの暴露によって効果的に増強されることを見出した。多くの一般的な病原体（例えば、黄色ブドウ球菌）の産出物はほとんどがＴＬＲおよびＮＯＤ受容体によって認識されるため、本発明者らは、病原体産出物が確かに活性化させていること、ならびに、そのような活性化がさらに顕著に向上され得ることを、多数のＣａ２＋フラックスアゴニスト（それらはカルシウムキレート剤によって無効化または著しく減少させられ得る）を用いて調査し、立証した。さらに、本発明者らはまた、Ｃａ２＋が、貪食された細菌の効果的な殺傷のためにヒト単球および顆粒球（特に好中球）において重要な因子であることも実証した。このような知見は、皮膚感染ならびに生菌感染後の創傷治癒の哺乳類（マウス）モデルにも直接転換された。
【００３１】
本発明の主題のひとつの態様において、本発明者らは、それゆえ、（主に局所的な）治療および／または予防ためのさまざまな組成物および方法を企図する。該組成物および方法は、宿主細胞の病原体に対する免疫応答能の刺激に効果的であり、ならびに瘢痕形成の減少および局所的創傷の閉鎖までの期間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｃｌｏｓｕｒｅ）の減少に効果的であり、特に、創傷が、ＴＬＲおよび／またはＮＯＤに対するリガンドを発現するまたは発現しなくとも含有している１種以上の病原体に感染している場合に効果的である。例えば、本発明者らは、表在性皮膚感染（例えば、細菌感染）を防止または治療するための、ＳＥＲＣＡ阻害剤（例えば、タプシガルギン）および／またはイオノフォア（例えば、イオノマイシンおよび／またはＡ２３１８７（カルシマイシン））の局所適用を企図する。
【００３２】
そのような中で、本発明者らは、ＳＥＲＣＡ阻害剤および／またはイオノフォアの局所適用が、感染症生動物モデルにおける創傷治癒動態を同時に向上させながら、表在性皮膚感染（例えば、黄色ブドウ球菌）における細菌負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）を顕著に減少させたことを見出した。驚くべきことに、カルシウムフラックスアゴニストが病原体に対するバイオサイドとして作用した場合、抗菌作用は直接的な抗菌作用に起因していたわけではなく（ＳＥＲＣＡ阻害剤のタプシガルギンの場合）、あるいは完全に起因していたわけではく（イオノフォアの場合）、むしろカルシウムフラックスアゴニストの免疫学的アジュバンドとしての役割に起因していた。いかなる理論や仮説によって制限されるものではないが、本発明者らは、該抗菌作用は、ＴＬＲまたはＮＯＤリガンドの存在下でカルシウムフラックスアゴニストを添加したときの、相乗的なサイトカイン放出の活性化および核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）シグナル伝達経路の活性化に起因し得ると考える。
【００３３】
さらにより驚くべきことに、ＴＬＲおよび／またはＮＯＤ活性とカルシウムフラックスアゴニスト（イオノフォア／ＳＥＲＣＡ阻害剤）との間に、ＩＬ−８産生およびＮＦ−κＢシグナル伝達の活性化に関して、非常に強い相乗効果が観察された。例えば、準最適用量のＴＬＲ２リガンドＰａｍ２ＣＳＫ４の存在下または非存在下でヒト前単球ＴＨＰ−１細胞をインキュベートし、同様に処理をして準最適用量のイオノフォア（ここでは、Ａ２３１８７およびイオノマイシン）も添加した細胞と比較した。興味深いことに、また詳細を後述するように、本発明者らは、両アゴニストが、個別の応答を累積した場合に産生されると考えられる水準を超えて、ＩＬ−８産生量を顕著に増加させたことを見出し、したがってこれが真の相乗効果であると示唆される。別の実施例では、準最適用量のＴＬＲ２リガンドＰａｍ２ＣＳＫ４の存在下または非存在下でκＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１細胞（ＮＦ−κＢ駆動ルシフェラーゼ発現カセットを有するＴＨＰ−１由来の形質転換株）を培養し、同様に処理をして準最適用量のさまざまなＳＥＲＣＡ阻害剤も添加した細胞と比較した。注目すべきことに、また詳細を後述するように、本発明者らは、試験された全てのアゴニスト（ここでは、タプシガルギン、シクロピアゾン酸）が、個別の反応を累積した場合産生されると考えられる水準を超えてルシフェラーゼ産生量を顕著に増加させたことを見出し、ゆえにまた相乗効果を示唆する。
【００３４】
これに関連して、ＮＦ−κＢは細胞活性化の媒介、炎症性サイトカインの分泌、増殖、および生存への関与を通して獲得免疫に強い影響を与え、一方でＩＬ−８は、抗菌および抗真菌において重要な自然免疫細胞型である、好中球のような免疫細胞に対する、強力な化学誘引物質である、ということに注目されたい。興味深いことに、Ｃａ２＋フラックス誘導剤イオノマイシンの存在下でのＴＬＲ４のリガンド活性化は、マウス貪食細胞株におけるアラキドン酸由来エイコサノイド脂質の相乗的な産生をもたらし、防止的および治療的作用を示すためにＣａ２＋フラックス誘導剤がＴＬＲリガンドと結合している可能性を示唆している。
【００３５】
本発明者らは、したがって、本発明の主題のひとつの態様において、イオノフォア（例えば、Ａ２３１８７および／またはイオノマイシン）が、感染／疾患関連ＴＬＲおよび／またはＮＯＤリガンドと共に、イン・ビボにおいて相乗効果をもたらして、イン・サイチュでの免疫細胞応答および修復プロセスを変化させるであろうと考える。このような効果は、本発明者らが以下に詳細を示したように、細菌負荷および創傷サイズを予防および／または治療奏功の指標として用い、さまざまなイオノフォアを含有する局所適用製剤を使用して表在性皮膚感染、例えば黄色ブドウ球菌によって誘発される感染をモデル系として、の経路を変化させることによって、容易に確かめられる。
【００３６】
同様に、本発明者らはまた、本発明の主題の別の態様において、タプシガルギン（およびさまざまな他のＳＥＲＣＡ阻害剤）が、感染／疾患関連ＴＬＲおよび／またはＮＯＤリガンドと共に、イン・ビボにおける相乗効果をもたらして、イン・サイチュでの免疫細胞およびイン・ビボでの修復プロセスを変化させると考える。上述したように、このような効果は、本発明者らが以下に詳細を示したように、細菌負荷および創傷サイズを予防および／または治療奏功の指標として用い、さまざまなＳＥＲＣＡ阻害剤（特に、タプシガルギン）を含有する局所適用製剤を使用して表在性皮膚感染、例えば黄色ブドウ球菌によって誘導される感染をモデル系として、の経路を変化させることによって容易に確認できる。
【００３７】
したがって、本発明者らが、パターン認識受容体リガンドに対する１種以上の免疫担当細胞の免疫応答を亢進させるために、カルシウムフラックスアゴニストの使用を特に企図する、ということが理解されるべきであろう。もっとも一般的には、好適な免疫担当細胞は、細胞免疫系の一部である細胞であり（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、抗原提示細胞または自然番兵細胞、および特に樹状細胞、マクロファージ、マスト細胞、単球など）、一般的には、このような免疫担当細胞は皮膚の真皮層または表皮層に存在していることが好ましい。ゆえに、本発明者らはまた、皮膚における免疫応答および／または創傷治癒を亢進させる（例えば、閉鎖までの期間の短縮）ための局所適用薬を製造するための、カルシウムフラックスアゴニストの使用も企図する。このような使用において、免疫応答は、免疫担当細胞でのパターン認識受容体へのリガンドの結合と関連していることが、一般的に企図される。その他のパターン認識受容体のうち、特に好適なパターン認識受容体はＴＬＲおよびＮＯＤファミリーの受容体を包含し、特にＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３、ならびにＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＯＤ３、ＮＯＤ４、ＮＯＤ５、およびＣＩＩＴＡを包含する。それゆえに、リガンドが大きく異なり得ること、ならびに企図されるリガンドが、ＴＬＲおよびＮＯＤ受容体と結合することが知られている全てのリガンドを包含し、かつもっとも好ましくは病原体関連分子パターンリガンド（ＰＡＭＰ）および損傷／疾患関連分子パターンリガンド（ＤＡＭＰ）を包含する、ということが理解されるべきであろう。したがって、好適なＰＡＭＰリガンドは、さまざまなリポペプチド、糖脂質、リポタイコ酸、熱ショックタンパク質、ベータグルカン、フィブリノゲン、ヘパリン硫酸フラグメント、ヒアルロン酸フラグメント、ＲＮＡ（特に、ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ（特に、ＣｐＧ配列）、プロファイリングなどを包含するであろう。同様に、好適なＤＡＭＰは、さまざまな核タンパク質および／またはサイトゾルタンパク質を包含し、かつ特に熱ショックタンパク質、ＨＭＧＢ１、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞外マトリックス由来タンパク質のフラグメントを包含するだろう。
【００３８】
本願発明の主題のさらに別の主題において、本発明者らはまた、パターン認識受容体のリガンドに対する、細胞（１種以上の上記パターン認識受容体を発現する）の免疫応答の亢進方法も企図する。上述したように、リガンドの性質は主に受容体のタイプに依存し、また全ての受容体およびリガンドは上で議論したように、企図する方法に好適である。特に好ましい方法において、細胞はリガンドの存在下で、免疫応答を亢進させる量のカルシウムフラックスアゴニストに暴露される。当然ながら、リガンドは治療計画の一環として送達されてもよい（例えば、カルシウムフラックスアゴニストと共に）ということに注意すべきである。しかしながら、もっとも一般的には、リガンドは、細胞の中または周辺に存在する病原体によって提供されるか、またはＤＡＭＰとして宿主によって提供されるであろう。発明の主題に限定されるものではないが、亢進された免疫応答は、増加したＩＬ−８産生および増強されたＮＦ−κＢシグナル伝達の少なくともひとつによって一般的に特徴付けられる（例えば、カルシウムフラックスアゴニストの非存在下での同じ遺伝子の発現と比較した場合の、カルシウムフラックスアゴニスト存在下におけるＮＦ−κＢの制御下での増加した遺伝子発現）。後述する実験の詳細から容易に明らかであるように、亢進された免疫応答は、一般的に相乗的増大である。
【００３９】
したがって、本発明者らはまた、詳細をさらに後述するように、損傷皮膚または感染皮膚を、免疫応答を亢進および損傷治癒を向上させる量のカルシウムフラックスアゴニストと接触させることによる、損傷皮膚または感染皮膚の（予防的）治療方法も企図する。異なる観点から見ると、細胞または組織におけるＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介刺激への免疫応答を調節するために、１種以上のカルシウムフラックスアゴニストを採用できることが、理解されるべきであろう。
【００４０】
企図されるカルシウムフラックスアゴニスト
【００４１】
ここでの使用のための、好適であると企図される化合物は、さまざまな感染症および外傷、特に皮膚または他の表皮の感染症を伴うもの、の予防または治療において一般的に有用であると考えられ、とりわけ宿主の疾患および／または外傷に対する応答がＴＬＲまたはＮＯＤ反応経路に関連する場合に有用であると考えられる。したがって、発明の主題に従った化合物が、カルシウムフラックス媒介物質（特に、アゴニスト）であり、細胞内カルシウムの少なくとも一時的な、より典型的には持続的な増加をもたらすことが、一般的に好ましい。
【００４２】
したがって、特に好ましい化合物は、当技術分野においてよく知られているイオノフォアおよびＳＥＲＣＡ阻害剤を包含する。もっとも好ましくは、好適なイオノフォアはカルシウムイオノフォアであり、特にイオノマイシン、カルシマイシン、カルシウムイオノフォアＩＩ、カルシウムイオノフォアＩＶ、カルシウムイオノフォアＶ、またはカルシウムイオノフォアＶＩであり、一方、特に好ましいＳＥＲＣＡ阻害剤は２，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＤＢＨＱ）、タプシガルギン、ルテニウムレッド、ジンゲロール、パキシリン、またはシクロピアゾン酸を包含する。上記は好ましい化合物のリストであるが、該リストは完全なものではなく、各化合物は２種以上のカルシウムフラックスアゴニストと混合物を形成するように組み合わされてよく（例えば、細胞外および細胞内アゴニストを提供するため）、および／またはさらに化合物が加えられてもよい、ということもまた留意されたい。
【００４３】
当然ながら、企図される化合物は（必要に応じて）、異性体、互変異性、またはその他立体的アイソフォーム（例えば、Ｒ−および／またはＳ−配置、Ｅ／Ｚ配置、互変異性アイソフォーム、エナンチオマー、ジアステレオマーなど）を生じさせ得る、１種以上の不斉中心あるいは不斉基を有していてよく、かつそのような型およびそれらの混合物のそれぞれが、明確にここで企図されるということも理解されたい。加えて、企図されるカルシウムフラックスアゴニストは、所望の物理化学的パラメーター（例えば、水性溶媒への溶解度、膜透過性、Ｃａ２＋への選択性など）を実現するために化学修飾されてもよいことも理解されたい。したがって、好適なカルシウムフラックスアゴニストは、完全な合成物、半合成物であってよく、またこのようなイオノフォアを産生する宿主株から単離されてもよい。
【００４４】
さらに、企図される化合物はまた、送達を増加させるためおよび／または影響を受けた組織や器官に対する標的特異性を向上させるために、プロドラッグに変換されてもよい。ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、企図される化合物を修飾したものをいう。ここで、修飾された化合物はより低い薬理活性を示し（修飾されていない化合物と比較して）、かつ修飾された化合物は標的細胞または標的器官中で修飾されていない形態へと再変換される。例えば、企図される化合物のプロドラッグへの変換は、安全な全身投与に供するには薬理活性物質の毒性が強すぎる場合、あるいは企図される化合物が消化管から吸収されにくい場合、もしくは身体が企図される化合物をその標的に到達する前に分解してしまう場合に、有用であり得る。数多くのプロドラッグ調製方法が当技術分野で知られており、これらすべてがここで企図される。例えば、好適なプロドラッグへのアプローチは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．Ｓｌｏａｎによる「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：  ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ）」（ＩＳＢＮコード：０８２４７８６２９７）、またはＢｅｒｎａｒｄ  Ｔｅｓｔａによる「Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（ＩＳＢＮコード：３９０６３９０２５Ｘ）に記載されており、これらの２文献は、ここで参照することにより適切な範囲において組み込まれる。
【００４５】
同様に、企図される化合物はまた、ここに記載するような形態においてより低活性であり、かつイン・ビボにおいて形成される１種以上の代謝産物としてより高活性であってよい、ということに留意されたい。例えば、企図される化合物は、フェーズＩおよび／またはフェーズＩＩの肝酵素系により、あるいは胃液酸度、腸内微生物環境、またはその他の生化学的プロセスによって変換されてよい。ゆえに、好適な化合物は、酸化、ヒドロキシル化、糖質に連結、などされてよい。
【００４６】
企図される組成物
【００４７】
企図されるカルシウムフラックスアゴニストが、細胞または組織への送達に好適な組成物の形態で提供されることが、一般的に企図される。したがって、好適な組成物は液体組成物、ゲル、固形組成物を包含し、これらのすべては担体に付随または結合していてよく、あるいは細胞や組織に直接適用されてよい。もっとも一般的には、このような組成物は、水性溶媒あるいはそうでない場合は薬学的に許容される担体を、１種以上のカルシウムフラックスアゴニストと共に包含するであろう。本発明の主題の特に好ましい態様において、医薬組成物は損傷組織または感染組織への局所適用のために製剤化され、より好ましくは上皮組織、もっとも好ましくは皮膚への局所適用のために製剤化される。さらに、カルシウムフラックスアゴニストは、細胞または組織への製剤の適用時に、１種以上のパターン認識受容体（典型的にはＴＬＲおよび／またはＮＯＤ受容体）リガンドに対する損傷または感染した細胞または組織の免疫担当細胞の免疫応答を亢進させる量で存在することが、一般的に好ましい。カルシウムフラックスアゴニストは、リガンドの非存在下における免疫応答と比べてリガンド存在下において免疫応答を相乗的に亢進させる量で存在することがさらにより好ましい。
【００４８】
したがって、本発明の主題に従う組成物は、局所的経路、経鼻的経路、吸入による経路、経口的経路、非経口的経路などを含むさまざまな経路を利用して投与されてよいことが理解されるべきである。なお、ここで使用される「非経口的」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、髄腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内投与（一般的には、注射または点滴）を包含する。しかしながら、もっとも好ましくは、組成物は、液、ゲル、または固形の形態で局所的に投与される。
【００４９】
例えば、本発明の医薬組成物は、局所適用によって容易に到達できる領域または器官へ局所的に投与されてよく、このような領域または器官は、目、皮膚、下部消化管、または外科的処置の間に露出される領域を包含する。多数の局所製剤が当技術分野で知られており、そのような製剤のすべてがここでの使用に好適であると考えられる。
【００５０】
例えば、企図される組成物は、１種以上の担体に懸濁または溶解された活性成分を含有している好適な軟膏に、製剤化されてよい。本発明組成物の局所投与のための担体は、鉱油、流動パラフィン（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水を包含する。あるいは、医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される担体に懸濁または溶解された活性成分を含有している好適なローション剤またはクリーム剤に製剤化することもできる。好適な担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を包含する。少なくともいくつかの活性化合物が高疎水性であることから、製剤は比較的低い溶解性を考慮し、したがってエマルジョンとして、ナノベシクル粒子として調製されるか、あるいは遮閉下で疎水性基材の形態で投与されることが、企図される。
【００５１】
もしくは、企図される製剤は、皮膚または他の投与部位に注入されてよい。もっとも好ましくは、企図される化合物の無菌注射剤の形態は、エマルジョン、水溶液、または油性懸濁液を包含するであろう。これらの懸濁液は、当技術分野で知られている技術に従って、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化されてよい。無菌注射剤の調製はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中で無菌の注射溶液または注射懸濁液として調製してよく、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として調製してよい。その他の許容されるビヒクルおよび溶媒、特に企図される液体は、水、リンゲル溶液、および生理食塩水を包含する。さらに、無菌の、不揮発性油を共溶媒または懸濁剤として採用してよい（例えば、天然または合成のモノ−またはジグリセライド）。脂肪酸もまた使用されてよく、好適な脂肪酸は、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体、オリーブ油、ひまし油、特にこれらのポリオキシエチレン化体を包含する。そのような油性溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤をさらに含んでもよい。
【００５２】
その他の例においては、企図される化合物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または溶液剤を含む、経口的に許容される任意の剤形によって経口投与されてもよい。経口用の錠剤の場合、すべての薬学的に許容される担体（例えば、ラクトース、コーンスターチなど）が好適であると考えられる。同様に、さまざまな潤滑剤を加えてもよい（例えば、ステアリン酸マグネシウム）。カプセル剤の形態での経口投与において、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを包含する。
【００５３】
組成物における企図される化合物の量に関して、特定の量は、具体的な製剤、有効成分、および望ましい目的に一般的に依拠すると認識されるべきである。したがって、企図される化合物の量は、著しく異なるであろうことが認識されるべきである。しかしながら、化合物がイン・ビトロおよび／またはイン・ビボにおいて予防的および／または治療的効果を奏するのに有効な最小限の量で存在することが、一般的に好ましい。別の観点から見ると、カルシウムフラックスアゴニストは、一般的に、ＮＦ−κＢシグナル伝達を活性化させるのに効果的な量、および／またはイン・ビトロにおける、あるいは創傷または罹患した（例えば、感染した）組織における細胞のＩＬ−８産生を増加させるのに効果的な量で存在する。
【００５４】
さらに、アゴニストがリガンド非存在下でのカルシウムフラックスアゴニストの最大効果に関する準最適濃度で細胞中に存在する（ＴＬＲまたはＮＯＤリガンドの存在下で）ように、カルシウムフラックスアゴニストが細胞または組織に提供されることが、一般的に好ましい。これに関連して、カルシウムフラックスアゴニストの準最適濃度は、該カルシウムフラックスアゴニストによって得られる最大の応答（ＮＦ−κＢおよび／またはＩＬ−８産生に関して）を十分に下回る濃度であることに、注意するべきである。したがって、カルシウムフラックスアゴニストの準最適濃度は、最大効果（ＮＦ−κＢおよび／またはＩＬ−８産生に関しての）を提供するカルシウムフラックスアゴニストの用量の８０％以下、７０％以下、６０％以下、２０〜６０％、または１０〜５０％を提供する濃度であろう。例えば、後記する実施例のデータから分かるように、タプシガルギンの代表的な準最適濃度は１０〜５０ｎＭ（例えば、約２０ｎＭ）であり、この数値範囲は、図１Ｃから分かるように、タプシガルギンの最大効果が得られる値を十分に下回る。同様に、Ａ２３１８７の代表的な準最適濃度は１００ｎＭ〜５００ｎＭ（例えば、約３１６ｎＭ）であり、この数値範囲は、図１Ａから分かるように、Ａ２３１８７の最大効果が得られる値を十分に下回る。また、イオノマイシンの代表的な準最適濃度は３００ｎＭ〜５μＭ（例えば、約１μＭ）であり、この数値範囲は、図１Ｂから分かるように、イオノマイシンの最大効果が得られる値を十分に下回る。別の視点から見ると、準最適濃度は、したがって、カルシウムフラックスアゴニストに暴露された細胞または組織において急性毒作用が観察され得る濃度よりも低い濃度として特徴付けられるであろう。
【００５５】
さらなる詳細を以下に示すように、最大応答および準最適濃度は、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ試験および／または発光試験を使って容易に決定できる。本発明の主題の好ましい態様において、準最適濃度は、最大応答の７０％以下の応答となる濃度、より一般的には最大応答の５０％以下、およびもっとも一般的には最大応答の３０％以下の応答となる濃度であるだろう。したがって、準最適濃度は、最大応答の１〜２０％、最大応答の２０〜４０％、最大応答の４０〜６０％、最大応答の６０〜８０％、または最大応答の８０〜９５％の範囲であるだろう。同様に、リガンドもまた準最適濃度で存在していてよく、該準最適濃度は、リガンドに対する応答が、リガンドのみに対する応答における最大応答の７０％以下となる濃度、より一般的には最大応答の５０％以下、およびもっとも一般的には最大応答の３０％以下となる濃度となるであろうことに留意されたい。したがって、準最適濃度は、リガンドのみに対する応答における最大応答の１〜２０％から１〜４０％、最大応答の２０〜４０％から２０〜８０％、最大応答の３０〜７０％、最大応答の４０〜８０％、または最大応答の５０〜９５％の範囲であるだろう。
【００５６】
それゆえに、少なくともいくつかの実施態様において、企図される化合物は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの間の量で、より一般的には約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の量で、およびもっとも一般的には約１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの間の量で存在する。製剤が固形またはゲルであるとき、企図される化合物は、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇの間の量で、より一般的には約１０ｎｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇの間の量で、およびもっとも一般的には約１μｇ／ｇ〜約１００μｇの間の量で、存在するであろう。別の観点から見ると、カルシウムフラックスアゴニストは一般的には、０．１μＭ〜１０μＭの間、１０μＭ〜１００μＭの間、１００μＭ〜１ｍＭの間、１ｍＭ〜１０ｍＭの間、または１０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度で、製剤中に存在するであろう。さらに、細胞または組織におけるカルシウムフラックスアゴニストの濃度（「有効暴露濃度」）に関して、有効暴露濃度が１ｐＭ〜１ｍＭの間であることが一般的に好ましく、もっとも好ましくは各カルシウムフラックスアゴニストの準最適濃度にあることである。したがって、タプシガルギンは、一般的に１ｎＭ〜１μＭの間、より一般的には１ｎＭ〜５００ｎＭの間、およびもっとも一般的には１ｎＭ〜５０ｎＭの間に、有効暴露濃度を有するであろう。一方、ＤＢＨＱおよびＣＰＡは、一般的に１００ｎＭ〜５００μＭの間、より一般的には５００ｎＭ〜１００μＭの間、およびもっとも一般的には１μＭ〜５０μＭの間に、有効暴露濃度を有するであろう。他方、イオノマイシンおよびＡ２３１８７は、一般的には１０ｎＭ〜１００μＭの間、より一般的には１００ｎＭ〜５０μＭの間、およびもっとも一般的には２００ｎＭ〜１０μＭの間に、有効暴露濃度を有するであろう。
【００５７】
したがって、企図される化合物の好適な量は  単位用量あたり０．１μｇ〜単位用量あたり約０．５グラムの範囲、より一般的には単位用量あたり１０μｇ〜単位用量あたり約０．０５グラムの間、およびもっとも一般的には単位用量あたり５０μｇ〜単位用量あたり約１００ｍｇの間となるであろう。ゆえに、好適な用量は  約０．０１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、およびもっとも一般的には１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間となるであろう。
【００５８】
単位用量に関し、単位用量は、単位用量が所望の治療的および／または予防的効果を奏するのに有効であるようになることが一般的に企図される。異なる観点から見ると、単位用量は、ＩＬ−８産生および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達を（好ましくは相乗的に）増強させるために十分な量のカルシウムフラックスアゴニストを好ましくは含有するであろう。
【００５９】
企図される化合物および組成物は局所的に適用されてよく、あるいは医薬組成物（例えば、クリーム、軟膏など）中に適用されてもよいが、罹患組織への適用のための多数の代替法もまた好適であると考えられることを、さらに理解されたい。例えば、企図される化合物は、担体に結合されるかまたは組み込まれてよく、該担体は直接および可逆的に治療部位へ適用され、あるいは移植され、もしくはそうでなければ治療部位に近接または接触して設置される。例えば、企図される化合物および組成物は、局所的に適用されおよび取り外し可能な担体（例えば、包帯、ガーゼなど）の１部分以上の部分に取り込まれてよく、あるいは分解または摩滅してもしなくてもよい保護フィルムに取り込まれてもよい（例えば、生分解性薬剤溶出ポリマーを通して）。代替の担体は移植されるビーズまたは生分解性薬剤溶出ポリマーを包含し、ここで、企図される化合物および組成物は、移植されたデバイスの表面の一部であってよく、またはそのようなデバイスを被覆していてよい。
【００６０】
カルシウムフラックスアゴニストの用量応答
【００６１】
本発明者らは、免疫応答のさまざまな構成要素に対するカルシウムフラックスアゴニストの影響を特定するためにいくつかの研究を行い、特にＩＬ−８産生およびＮＦ−κＢシグナル伝達の活性化に対するカルシウムフラックスアゴニストの影響について研究を実施した。図１Ａ〜１Ｃから容易に読み取れるように、イオノフォアとＳＥＲＣＡ阻害剤の両者は、ＩＬ−８産生およびＮＦ−κＢシグナル伝達活性化の顕著な増強をもたらした。用量応答は、イオノフォア（例えば、Ａ２３１８７およびイオノマイシン）に関しては比較的広範囲の用量にわたって観察され、ＳＥＲＣＡ阻害剤（例えば、タプシガルギン）に関しては少なくとも２桁の範囲にわたって観察される。
【００６２】
より具体的には、外添ＴＬＲまたはＮＯＤリガンドの非存在下で処理に供される単球由来細胞株ならびにＡ２３１８７およびイオノマイシンを用いた、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−８に対するイオノフォアの用量応答を、図１Ａ〜１Ｂに示す。安定的にインテグレートされたＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポーターカセットを有するヒト単球細胞株（ＴＨＰ−１）トランスフェクタントを、濃度の増加するＡ２３１８７およびイオノマイシンで処理した。ＮＦ−κＢレポーターに基づく応答は発光測定法を用いて観察し（ＲＵＬ＝発光量、黒丸）、一方、ヒトＩＬ−８（ｈＩＬ−８）放出はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて定量した（白丸）。図１Ｃは、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−８に関するタプシガルギンに対する用量応答を表している。ここでは、安定的にインテグレートされたＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼ受容体カセットを有するヒト単球細胞株（ＴＨＰ−１）トランスフェクタントを、濃度の増加するタプシガルギンで処理した。ＮＦ−κＢレポーターに基づく応答は発光測定法を用いて観察し（ＲＬＵ＝発光量、黒丸）、一方、ヒトＩＬ−８（ｈＩＬ−８）放出はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて定量した（白丸）。フラックスアゴニストの両グループから読み取れるように、用量応答はＮＦ−κＢおよびＩＬ−８応答を顕著に増加させながら、数桁の大きさにわたって増加している。
【００６３】
ヒトＩＬ−８活性：タプシガルギン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サンディエゴ、カルフォルニア）、イオノマイシン（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ）、およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（シグマ−アルドリッチ社）のタイトレーションを、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社、ウォルサム  マサチューセッツ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ社、ハーダン  バージニア）中で培養された１５０，０００個のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−２０２）を播種した９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｔｒｉｘ、ウォルサム  マサチューセッツ）に添加した。添加の２４時間後、上澄み液２５μＬを採取し、メソスケールディスカバリーヒトＩＬ−８組織培養キット（ＭＳＤ社、ロックビル、メリーランド）を用いて生産者のプロトコルに従い、ヒトＩＬ−８を定量した。結果はメソスケールディスカバリーＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ２４００を用いて解析し、ならびに、ＭＳＤキットによって供給されるヒトＩＬ−８のタイトレーションに正規化した。
【００６４】
ＮＦ−κＢ活性：タプシガルギン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、イオノマイシン、およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７のタイトレーションを、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ社、ハーダン  バージニア）中で培養された１５０，０００個のＴＨＰ−１  κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１’ｓ（ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターの安定的インテグレーションを含有するＴＨＰ−１細胞）を播種した９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｔｒｉｘ）に添加した。添加の２４時間後、２５μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社、マディソン  ウィスコンシン）を各ウェルに添加し、ルシフェラーゼ活性をパーキンエルマーＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（パーキンエルマー社、ウォルサム  マサチューセッツ）を用いて解析した。
【００６５】
パターン認識受容体との相乗作用剤としてのカルシウムフラックスアゴニスト
【００６６】
初期の一連の実験において、ＴＬＲ２受容体リガンドＰａｍ２ＣＹＳをさまざまな濃度のカルシウムフラックスアゴニストの存在下で試験し、本発明者らは、予想外にも、準最適でかつ比較的低い濃度の多様なカルシウムフラックスアゴニストが、ＴＬＲリガンドの存在下において顕著な相乗的応答をもたらしたことを見出した。
【００６７】
例えば、図２は、選択されたカルシウムフラックスアゴニストと代表的なＴＬＲリガンドとの典型的な相乗効果を表しているグラフである。ここで、イオノフォアＡ２３１８７およびイオノマイシン、ならびにＳＥＲＣＡ阻害剤タプシガルギンは、ヒトＴＨＰ−１前単球性白血病細胞株から放出されたサイトカインの活性化において、ＴＬＲ２リガンド（Ｐａｍ２ＣＹＳ）との相乗作用を示した。ＴＬＲ２リガンド単独では約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−８応答を提供したのに対して、準最適用量のカルシウムフラックスアゴニストの添加（例えば、タプシガルギンの場合は２０ｎＭ、Ａ２３１８７の場合は３１６ｎＭ、およびイオノマイシンの場合は１μＭ）は、細胞において１０倍を超える量のＩＬ−８産生をもたらしたことは、特に注目すべきである。
【００６８】
この試験結果が他のパターン認識受容体、特に、ＴＬＲおよびＮＯＤ受容体ならびにその他のリガンドにも当てはまるか否かを調べるために、本発明者らは、多数のＴＬＲおよびＮＯＤ受容体ならびにさまざまなリガンド類を試験した。とりわけ、図３Ａ〜３Ｅからも明らかなように、顕著な相乗効果が幅広いタイプおよびクラスのカルシウムフラックスアゴニスト、ならびにさまざまなＴＬＲおよびＮＯＤ受容体とリガンド類にわたって確認された。これによって、ＴＬＲ−およびＮＯＤ−媒介シグナルは、準最適用量のカルシウムフラックスアゴニストで（一般には相乗的に）亢進され得ることが立証される。
【００６９】
より具体的には、図３Ａは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーメンバー（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）、およびＮＯＤファミリーメンバー（ＮＯＤ１、ＮＯＤ２）に関する細胞応答を上昇させる、準最適用量のＡ２３１８７の相乗効果を表すグラフを示す。図３Ｂは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーメンバー（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）、およびＮＯＤファミリーメンバー（ＮＯＤ１、ＮＯＤ２）に関する細胞応答を上昇させる、準最適用量のイオノマイシンの相乗効果を表すグラフを示す。図３Ｃは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーメンバー（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５）、およびＮＯＤファミリーメンバー（ＮＯＤ１、ＮＯ２）に関する細胞応答を上昇させる、準最適用量のシクロピアゾン酸の相乗効果を表すグラフを示す。図３Ｄは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーメンバー（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５）、およびＮＯＤファミリーメンバー（ＮＯＤ１、ＮＯＤ２）に関する細胞応答を上昇させる、準最適用量の２，５−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）ヒドロキノン（ＤＢＨＱ）の相乗効果を表すグラフを示す。図３Ｅは、トール様受容体（ＴＬＲ）ファミリーメンバー（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）、およびＮＯＤファミリーメンバー（ＮＯＤ１、ＮＯＤ２）に関する細胞応答を上昇させる、準最適用量のタプシガルギンの相乗効果を表すグラフを示す。この実験で使用した用量は、タプシガルギンが２０ｎＭ、Ａ２３１８７が３１６ｎＭ、イオノマイシンが１μＭ、シクロピアゾン酸が１０μＭ、およびＤＢＨＱが３１．６μＭであった。
【００７０】
容易に理解できるように、試験した全てのＴＬＲおよびＮＯＤファミリーメンバーならびに好適なリガンド類においてＩＬ−８産生に関する相乗効果が観察され、一方、試験した全てのカルシウムフラックスアゴニストは準最適濃度で用いられた。ゆえに、免疫応答がＴＬＲ−またはＮＯＤ−媒介イベントと関連している場合には、免疫応答における、特にＩＬ−８産生およびＮＦ−κＢシグナル伝達におけるカルシウムフラックスアゴニストの明確なアジュバンド活性様式は、明らかである。
【００７１】
カルシウムフラックスの性質
【００７２】
本発明者らは、増加した細胞内カルシウムの由来が異なる場合に、カルシウムフラックスの性質が重要であるかどうかをさらに調べた。その趣旨で、本発明者らはさまざまなカルシウムシグナル伝達モジュレータを用いてカルシウムフラックスアゴニストの性質および寄与を調べた。示されたデータから容易に読み取れるように、細胞外カルシウムの細胞内へのフラックスは、カルシウムシグナル伝達の相乗的な増強に関して重大な意味を持っていた。より具体的には、図４は、異なるＣａ２＋調節化合物がＮＦ−κＢ活性化に関する相乗効果に与える影響を表す。ＥＧＴＡは細胞外キレート剤であること、また、ＫＮ−６２はキレート効果のないＣａＭキナーゼＩＩ（Ｔ細胞の活性化に重要である）の阻害剤であることに留意されたい。図４から容易に理解されるように、細胞外Ｃａ２＋スカベンジャーＥＧＴＡは、相乗的なシグナルを、ＴＬＲリガンド単独で達成される程度のレベルまで減少させるが、一方でＣａＭキナーゼＩＩ阻害剤ＫＮ−６２による処理は、レポーター遺伝子の発現レベルを変化させない。
【００７３】
以前に、哺乳動物細胞による黄色ブドウ球菌感染の感知および制御において、ＴＬＲ２およびＮＯＤ２が重要な役割を果たすということが実証された。ＴＨＰ−１由来κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１細胞が、一般的なＴＬＲ２およびＮＯＤ２リガンドであるＰａｍ２ＣｙｓおよびＭＤＰによってそれぞれ活性化され、および、この活性化がカルシウムフラックスアゴニストの添加によってさらに増強され得た（図３Ａ〜３Ｅ）ことから、これらの細胞が真正の黄色ブドウ球菌由来産出物を認識する能力を、以下のようにして測定した。手短に述べると、対数的に分裂する黄色ブドウ球菌の培養物をＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）で３回洗浄した。同時に、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社、ウォルサム  マサチューセッツ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＨｙＣｌｏｎｅ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）で培養されたＴＨＰ−１  κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１’ｓ（ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定的インテグレーションを含有するＴＨＰ−１細胞）を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）で３回洗浄し、２４ウェル０．４μｍカットオフトランスウェルプレート（コーニング社）の底のコンパートメントに１２０万／ｍＬの濃度で移した。洗浄した黄色ブドウ球菌培養物の希釈液を、その後、所定の初期感染多重度（ＭＯＩ）でトランスウェルシステムのトップチャンバーに添加した。該細胞を３７℃で１８時間インキュベートし、その時点で６０，０００細胞を含有する所定分量を３８４−ウェル白色ボトムプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社）のウェルに移した。ルシフェラーゼ遺伝子発現を評価するために、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）を各ウェルに添加し、パーキンエルマーＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴシステム（パーキンエルマー社）を用いて、ルシフェラーゼ活性についてプレートを解析した。先の結果と一致して、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞は、細菌産物の受動拡散は可能であるが黄色ブドウ球菌全体とκＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞との間の直接的な接触を妨げる培養システムで生菌と共培養した場合、レポーター活性においてＭＯＩ−依存的増加を示す（図５Ａ）。
【００７４】
黄色ブドウ球菌産出物の認識がカルシウムフラックスの調節を通してさらに増強され得るかを決定するため、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞を、細菌フィルターでろ過した黄色ブドウ球菌条件（すなわち使用済み）培地の１：１００（Ｖ／Ｖ）希釈液または未使用の滅菌培地の存在下でインキュベートし、上述したように準最適用量（２０ｎＭ）のタプシガルギンまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ビヒクルコントロールで処理した。簡単に説明すると、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地で黄色ブドウ球菌を振とうインキュベータにて一晩３７℃で培養し、その後遠心分離によって細菌を沈殿させて上澄み液を０．２μｍフィルター（ＶＷＲ社、ラドナー  ペンシルバニア）でフィルター滅菌することにより、条件培地を作製した。κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１細胞を、上述したルシフェラーゼアッセイに先立ち、条件／使用済み培地の存在下で１８時間インキュベートした。興味深いことに、κＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１レポーター細胞の条件／ならし細菌培養液への応答は、タプシガルギンの存在下で顕著に増強された（図５Ｂ）。
【００７５】
観察された、細菌産出物によるκＢ−ＬＵＣ  ＴＨＰ−１細胞の活性化における、準最適なタプシガルギン処理がもたらした亢進が、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７およびイオノマイシンにも当てはまるか否かを決定するため、これらのイオノフォアを準最適用量３１６ｎＭおよび１μＭでそれぞれ使用して、実験を繰り返した。三つの例すべてにおいて、黄色ブドウ球菌条件／使用済み培地の認識は、いずれのカルシウムフラックスアゴニストの存在下でも顕著に亢進した（図５Ｃ〜５Ｅ）。おそらく同じくらい興味深いことに、図から容易に理解できるように、カルシウムフラックスが誘導した相乗効果は、細胞外キレート剤ＥＧＴＡ（１ｍＭ）添加によって抑制され得るだろう。
【００７６】
ヒト細胞における細胞外カルシウムの役割
【００７７】
ヒト細胞における応答がカルシウムフラックスの性質に影響を受けるか否かを調べるために、本発明者らは、黄色ブドウ球菌に感染させた初代ヒト単球および顆粒球を試験した。図６中のデータから分かるように、ヒト初代単球および顆粒球は、貪食された黄色ブドウ球菌の至適殺菌のために細胞外Ｃａ２＋を必要とすることは明確である。簡単に述べると、初代ヒト単球を、市販の末梢血単核細胞製剤（ヒトバフィーコート白血球（Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ノバイ  ミシガン）から、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  ヒト単球キット（ライフ・テクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク）を用いて製造者の示唆に基づいて精製した。初代ヒト顆粒球を、製造者の指示に従ったＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心法（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）により、健常ドナー血液を二つの画分に分離することによって精製した。その後、末梢血単核細胞画分を廃棄し、赤血球／顆粒球画分を製造者のプロトコルに従った赤血球溶解バッファー処理（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ  カリフォルニア）に供し、続いて、ハンクス緩衝塩類溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で２回洗浄して溶解剤および細胞片を除去した。次に、黄色ブドウ球菌の培養を、トリプチックソイブロス（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で一晩行った。得られた培養物を新しい培地の植菌に用いて、実験の開始に先立って対数増殖期を確保した。培養菌を沈殿させ（２０００×ｇで１０分間）、ハンクス緩衝塩類溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）で３回洗浄した。上記のようにして調製した初代単球／顆粒球に、その後、１０％ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ノバイ  ミシガン）および該当する場合は１ｍＭ  ＥＤＴＡ（シグマアルドリッチ社、セントルイス  ミズーリ）を補充し、氷上で３０分間冷却した。３０分後、黄色ブドウ球菌（ＭＯＩは３．３３）を添加し、結合を同期させるため、該混合物を氷上でさらに２０分間インキュベートした。その後、チューブを３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、非内在化黄色ブドウ球菌を除去するために１０Ｕ／ｍＬのリゾスタフィン（シグマアルドリッチ社）を各チューブに加えた。所望の時点（２０、３０、６０分間）で、２０μＬずつ試料を採取し、１０ｍＬの水で希釈した。該希釈液のチューブをボルテックスにかけ、初代細胞の適切な溶解を確保するために室温にて１０分間静置した。１０分後、希釈液チューブを１０分間２０００×ｇで遠心分離し、残存黄色ブドウ球菌を２０倍に濃縮した。黄色ブドウ球菌含有試料は、その後、３連でトリプチック寒天培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）に播種し、翌日にコロニーを計数できるように、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７８】
感染および損傷治癒のイン・ビボモデル
【００７９】
すでに上記で述べたように、カルシウムフラックスアゴニストはＴＬＲおよびＮＯＤリガンドと、免疫活性化に関連する経路の活性化において相乗効果を示す。感染および損傷におけるＴＬＲおよびＮＯＤリガンドの分布を考えれば、本発明者はゆえに、そのような状況におけるカルシウムフラックスアゴニストの導入によって、疾患期間が大幅に短縮され、および／または修復機能が亢進されるだろうと予期する。そのようなモデルを実証するために、さまざまなカルシウムフラックスアゴニストを、損傷治癒動態を変化させる能力および細菌排除に影響を与える能力について、感染前処置実験で試験した。
【００８０】
Ａ２３１８７およびイオノマイシンあるいはＳＥＲＣＡポンプ阻害剤タプシガルギンのようなカルシウムフラックスアゴニストが細菌感染の前処置として使用可能か否かを決定するために、本発明者らは、６〜８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスの剃毛背面皮膚を、ビヒクルのみ、もしくはＡ２３１８７、イオノマイシンまたはタプシガルギンを２ｍＭ含有する製剤で処理した。１日後、本発明者らは、５匹のマウスからなる各グループの背面皮膚に、２×１０６ＣＦＵの黄色ブドウ球菌を表面的に感染させ、細菌負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）および損傷サイズを翌週にわたって評価した。このモデルを用いて、本発明者らは図７に示したように、カルシウムフラックスアゴニストが創傷治癒（サイズで評価）において有益な効果を有するか否かを調査した。興味深いことに、イオノフォアもしくはタプシガルギンのいずれかで処置された動物は、コントロール処置の動物と比較し、感染３、５および７日後において有意に小さい損傷サイズを示した（ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定により評価）。さらに、イオノフォアまたはタプシガルギンのいずれかを含有する製剤による前処置を受けた動物は、ビヒクルコントロールと比較し、第７日の感染部位における保持細菌が有意に少なかった（図８）。
【００８１】
局所送達：Ａ２３１８７およびイオノマイシンならびにタプシガルギンを、無水エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ガーデナ  カルフォルニア）中で、続いて実施する製剤に適切な濃度へ再構成した。イン・ビボ試験の前感染において、局所製剤は７５％が無水エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、２２％がシクロヘキサン（シグマアルドリッチ社）、および３％がジメチルスルホキシド（シグマアルドリッチ社）で構成されていた。各局所製剤は、直径１．０センチメートルのワットマン紙（ワットマン社、ＧＥヘルスケアの一部門）の円形小片に含浸させ、前記円形小片を各受容動物の皮膚に５分間適用することによって送達された。
【００８２】
皮膚への植菌のための黄色ブドウ球菌の調製：簡単に説明すると、対数期の最中の黄色ブドウ球菌を２回洗浄し、無菌食塩水（０．９％）中に記載の濃度で再懸濁した。マウス：６〜８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６を遺伝的背景とするオスのマウスを全ての実験で使用した（ジャクソン研究所、バー・ハーバー、メイン）。
【００８３】
黄色ブドウ球菌の皮膚損傷感染のマウスモデル：損傷感染用の動物を用意するため、マウスの後部上背および首の皮膚を、＃４０クリッパーを使用して剃毛した。次に、３つの並行する８ｍｍ長の全層性のメス切創（ｎｏ．１１ブレイド）を真皮に作成した。得られた損傷に、マイクロピペッターで１０μＬの黄色ブドウ球菌（２×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を植菌した。総外傷サイズ（ｃｍ２）の測定は、撮影した動物の写真から、ミリメートルルーラーを参考にして総画素数を計測することによって定量化した。
【００８４】
イン・ビボにおける黄色ブドウ球菌負荷の定量：イン・ビボにおける細菌負荷を測定するため、感染および外傷組織を外科的に採取した後、感染マウスを７日目に殺処分した。採取した組織をホモジナイズして、適切な固形増殖培地にプレーティングした後細菌数を計測した。
【００８５】
抗菌作用
【００８６】
それらが本来有している黄色ブドウ球菌に対する抗生物質活性に関するこれらのおよび先の結果と一致して、本発明者らは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）に対する直接的な抗生物質活性に関する両イオノフォアの直接的な抗生物質活性を確認した。予期していたように、両イオノフォアは液体培養試験においてＭＳＳＡに対して有効であり、Ａ２３１８７がより活性の高い化合物であった。興味深いことに、両化合物は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株に対する顕著な抗生物質活性を示した。
【００８７】
例えば、図９Ａおよび９Ｂは、Ａ２３１８７およびイオノマイシンに対する黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性をそれぞれ示すグラフであり、図９ＣはＣＰＡに対する黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性を示す。グラフから読み取れるように、両イオノフォアは直接的な抗生物質効果をいくらか有するが、その効果はカナマイシンを直接的な抗生物質として使用したコントロールよりも実質的に低かった。対照的に、図１０は、黄色ブドウ球菌に対するＳＥＲＣＡ阻害剤タプシガルギンの直接的な抗生物質効果は、高濃度においても欠如していることを表すグラフである。黄色ブドウ球菌の抗生物質感受性を決定するために、培養をトリプチックソイブロス（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で一晩行った。得られた培養物を新しい培地の植菌に用いて、実験の開始に先立って対数増殖期を確保した。細菌が対数期に達したら直ちに、細菌を適切なＯＤ６００〜０．０５へと希釈し、２４−ウェルプレートに移した。対象の化合物を添加し、プレートを振とうインキュベータ中３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で所定分量の試料を採取し、それぞれのＯＤ６００をＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社、ウィヌースキー、バーモント）を用いて測定した。対象化合物の添加によって濁度が影響を受けるウェルについては、所定分量の試料を採取してトリプチックソイ寒天培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）に播種し、３７℃で一晩インキュベートし、翌日菌数を計測した。ゆえに、カルシウムフラックスアゴニストは間接的効果を介して抗菌処理において有効であり、もっとも高い可能性としては亢進されたＩＬ−８の産生および増強されたＮＦ−κＢ駆動性転写によることが、理解されるべきである。
【００８８】
さらに、本発明者らはまた、間接的な抗生物質効果は、予防的な方法で利用し得ることも見出した。例えば、本発明者らは、タプシガルギンで処理した前単球ＴＨＰ−１細胞が、タプシガルギン未処理の同様に成熟させた細胞よりも高い抗菌活性を示すことを実証した（図１１）。簡単に述べると、対数的に分裂する黄色ブドウ球菌を沈殿させ（２０００×ｇで１０分間）、ハンクス緩衝塩類溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）で３回洗浄した。平行して、ＴＨＰ−１細胞を２日間分化させ（１μＭのレチノイン酸および１μＭコレカルシフェロール（シグマアルドリッチ社）を用いて）、続いて２０ｎＭのタプシガルギンまたはビヒクルで１日間処理して回収し、ハンクス緩衝塩類溶液中で洗浄した。分化させた細胞に１０％ヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を補充し、氷上で３０分間冷やした。３０分後、黄色ブドウ球菌（ＭＯＩは１０）を添加し、結合を同期させるため、氷上でさらに２０分間インキュベートした。その後、チューブを３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、非内在化細菌を除去するために１０Ｕ／ｍＬのリゾスタフィン（シグマアルドリッチ社）を添加した。所望の時点（２０、３０、６０分）で２０μＬの分量の試料を採取し、１０ｍＬの水中に希釈した。希釈液チューブをボルテックスにかけ、初代細胞の適切な溶解を確保するために室温で１０分間静置した。１０分後、希釈液チューブを２０００×ｇで１０分間遠心分離して残存黄色ブドウ球菌を２０倍に濃縮し、３連でトリプチックソイ寒天培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）に播種し、コロニー計測に先立って３７℃で一晩インキュベートした。
【００８９】
したがって、１種以上のイオノフォアを、皮膚感染の処置および／または損傷治癒の向上のための、局所的予防剤および／または治療剤として採用し得ることが理解されるべきである。特に重要なのは、直接的な抗生物質様式でよりもむしろ、免疫賦活的な様式でのそのような組成物および方法の使用であり、これらは、他の抗生物質治療によって確立される耐性に関連する問題を、有利に回避するだろう。当然ながら、多数の他の病原体もまたここで企図されること、および全ての現在知られている皮膚の病原体（細菌性、ウイルス性、寄生性、および真菌性）が実際に包含されることが、理解されるべきである。
【００９０】
さらにまた、企図される化合物での処置の間中、顕著な相乗効果が観察されたことも理解されるべきである。ここで、相乗効果は、免疫細胞の活性化におけるイオノフォアとＴＬＲリガンドとの間のものである。このような相乗効果は、免疫応答の調節をすでに対象としている治療法（例えば、アルダラを用いた薬物療法）あるいは疾患と闘うための他の免疫賦活療法に関して、特に興味深いものとなり得るだろう。したがって、本発明者らは、イオノフォアが、表皮感染に対抗するために発症前もしくは発症後に、治療目的で使用できると考える。さらに、二重の物理的バリアおよび皮膚の免疫学的機能、ならびに免疫細胞におけるイオノフォアの活性化／調節作用を示す膨大なイン・ビトロデータを考えれば、本発明者らはまた、イオノフォアを含有する局所製剤が、急性（例えば、損傷からの）または慢性の（例えば、糖尿病性潰瘍などに観察されるような）表在性創傷、やけど、ならびに他の炎症性／自己免疫皮膚疾患（例えば、乾癬、湿疹など）に関する治療を必要としている患者にとって、治療上有益であると予期する。
【００９１】
皮膚に加えて、上皮組織は消化管（消化腔を含む）、気道および尿生殖路を覆っている細胞を包含する。後者は別として、残りの組織は微生物ならびに花粉や人工環境汚染物質のようなその他の因子に常に晒されており、これらは局所炎症および／または損傷形成を引き起こしまたはそうでなければ悪化させ得る。ＴＬＲ受容体を活性化させる微生物の消化管（口を含む）全体にわたる分布のため、イオノフォアを口腔膿瘍および場合によっては炎症性腸疾患の治療において活用することもまた企図される。
【００９２】
したがって、局所的に適用されるタプシガルギンは、治療剤として使用されて免疫細胞の活性化においてＴＬＲリガンドと相乗効果をもたらし得ることが理解されるべきである。中でも注目すべきことに、本発明者らは、感染に先立ってタプシガルギンまたは他のカルシウムフラックスアゴニストで処置された皮膚が生菌を一掃し、かつコントロール処置の皮膚よりも速く治癒することを見出した。同様に重要なことに、本発明者らは、イン・ビボで観察される相違は、タプシガルギンが本来有する抗菌性に起因するものではなさそうだということを示した。結果として、本発明者らは、タプシガルギンまたは他のカルシウムフラックスアゴニストを治療的に使用して、ＴＬＲ／ＮＯＤリガンドを産生または含有する病原体（例えば、黄色ブドウ球菌）によって引き起こされる表皮感染にその発症後に対抗し得ると予期する。皮膚の二重の物理的バリアおよび免疫学的機能、ならびに免疫細胞におけるタプシガルギンまたは他のカルシウムフラックスアゴニストの活性化／調節作用を示す膨大なイン・ビトロデータを考えれば、本発明者らは、タプシガルギンを含有する局所製剤は、急性（例えば、損傷からの）または慢性の（例えば、糖尿病性潰瘍などで観察されるような）表在性損傷、やけど、ならびに他の炎症性／自己免疫皮膚疾患（例えば、乾癬、湿疹など）に関する治療を必要としている患者にとって、治療上有用であると予期する。
【００９３】
このように、カルシウムフラックスアゴニストの具体的な実施形態および適用が開示された。しかしながら、当業者にとって、すでに記載したものに加えてさらに多くの改変が、本発明の本明細書に示した構想から逸脱することなく可能であることが、明らかとなるべきであろう。本発明の主題は、ゆえに、添付した特許請求の範囲の趣旨以外に制限されるものではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と整合性が取れる可能な限り広い意味で解釈されるべきである。特に、「含有する」および「含む」という用語は、要素、成分、または工程を非排他的に指すと解釈されるべきであり、言及された要素、成分、または工程は、存在していてもよく、または利用されていてもよく、あるいは、言及されていない他の要素、成分または工程と組み合わされていてもよいことを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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