(57)【要約】【課題】クロマトカラムの洗浄回数を低減し、更に、クロマトカラム装置の分解と組み立て作業を容易とすることができるクロマトカラムの洗浄方法を提供する。【解決手段】カラム軸心方向を上下方向としたカラム２と、該カラム２の下端側に設けられた固定栓３と、該カラム２の上部側に設けられた可動栓４と、該固定栓３と可動栓４との間のカラム２内に形成された充填剤層８と、該栓３，４にそれぞれ設けられた通液口３ａ，４ａとを有するクロマトカラム１を洗浄する方法において、分離操作時の通液方向と逆方向に洗浄液を通液することを特徴とするクロマトカラムの洗浄方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、
該カラムの一端側に設けられた第１の栓と、
該カラムの他端側に設けられた第２の栓と、
該第１の栓と第２の栓との間のカラム内に形成された充填剤層と、
該第１及び第２の栓にそれぞれ設けられた通液口と、
を有するクロマトカラムを洗浄する方法において、
分離操作時の通液方向と逆方向に洗浄液を通液することを特徴とするクロマトカラムの洗浄方法。
【請求項２】
請求項１において、洗浄薬液を前記充填剤層の容積の３〜３０％通液することを特徴とするクロマトカラムの洗浄方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、精製処理５〜１０バッチに１回の頻度で洗浄を行うことを特徴とするクロマトカラムの洗浄方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、洗浄液の通液速度（ＬＶ）を０．０１〜１ｍ／ｈｒとすることを特徴とするクロマトカラムの洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程で用いられるクロマトカラムを洗浄する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野での近年の進歩に伴って、タンパク質のような生体物質及び生化学物質を回収、精製及び分離するための迅速で一段と精密な技術が必要とされている。医薬品やファインケミカル、機能性成分などの分離・精製工程ではクロマトグラフィーが広く用いられている。
【０００３】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは、タンパク質や多糖類、核酸などの生体分子を精製する際に用いられる代表的な方法の一つである。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーでは、カラムに充填されたゲル粒子状の充填剤に原液サンプルを通すことにより、様々な大きさの分子を分子量（ここでは溶液中での分子の大きさの意味）に従って分離することができる。担体には小さな孔が開いてあり、小さい分子はその孔に入り込むため、長い間カラム内にとどまることになる。そのため、高分子ほど早く溶出され、低分子ほど溶出されるまで時間がかかる。
【０００４】
医薬品やファインケミカルや機能性成分などの分離精製に用いられるクロマトグラフィーカラムへ供給される（即ち、導入される）液には、精製回収を目的とする成分の他に、微生物培養や化学合成反応に伴う有機物や無機物などの精製回収を目的としない溶存成分（即ち、溶解性不純物）が含まれている。
【０００５】
これらの不純物の中には、クロマトグラフィーカラム導入前に不溶化して微細な懸濁質となって多孔質板を徐々に閉塞させたり、充填層の液導入側近傍で不溶化して充填層を閉塞し、クロマトグラフィーカラムを汚染するものがある。
【０００６】
一般に、一連のクロマト構成操作、分離精製操作と、メンテナンス作業は、例えば以下のように行われる。なお、以下の説明は、２０％エタノールに浸漬され保存された湿潤型のゲル状の充填剤を用いる場合を例にとったものである。
（１）  カラム準備
カラムを組み立て、水やエタノールなどで満たし、気泡を除去する。
（２）  充填剤準備
ゲル粒子状の充填剤を純水あるいは平衡化バッファーで洗浄してエタノールから置換した後に、純水あるいは平衡化バッファーを所定量加えて充填剤スラリーを調製する。
（３）  充填剤のカラム充填
スラリーを気泡が入らないようにカラムに注入し、その後、スラリー注入口をシールする。
（４）  クロマト分離精製
カラムをクロマト送液システムに接続し、精製目的性分の分離精製を繰り返す。
（５）  充填剤洗浄
所定回数の精製を行った後、またはゲル状の充填剤が汚れた際に、カラムをクロマト送液システムから外し、充填剤をカラムから抜き出してＮａＯＨなどの洗浄液で洗浄する（薬品洗浄）。
（６）  前記工程（１）〜（５）を繰り返す。
【０００７】
クロマトグラフィーカラム及びカラムへの通液システム（送液ポンプや配管やバルブや圧力計や流量計やフィルターや気液分離ユニットなど）を洗浄して組み立て、カラムに吸着剤を充填し、充填具合の適否を評価して、洗浄殺菌して、目的成分を実際に分離精製するに至るまでの工程は、煩雑で多大な労力と時間を要する。そのため、通常は、クロマトグラフィーカラムに吸着剤を充填すると、洗浄殺菌することなく複数回のスパイク・分離精製操作を繰り返し行う。
【０００８】
複数回のスパイク・分離精製操作を繰り返し行っている間に、先に述べた多孔質板や充填層などの閉塞やカラムの汚染などの問題が発生する事がある。
【０００９】
このような現象の発生が懸念された場合、従来は、クロマトグラフィーカラム内の充填剤を抜き出し、更に、クロマトグラフィーカラムを分解して、充填剤と全てのカラム部品と配管部品、ポンプなどを洗浄、殺菌して対処する事が慣例であったが、あまりにも煩雑で、多大な労力と時間を要する。
【００１０】
精製分離の繰り返し数が少なく、汚染物や汚染程度が想定できるような場合、簡便な対処法として、クロマトグラフィーカラムに洗浄薬品を通液して汚染物を洗い出す対応操作が考えられる。例えば、液導入口からＮａＯＨなどアルカリ性の洗浄液を供給し、多孔質板や充填層に付着した有機性汚染物を溶かし出し、次いで、無菌水を同様に通液してアルカリ性洗浄液を洗い出し、次いで、酸性洗浄液を同様に通液して無機性汚染物を溶かし出し、再び無菌水を同様に通液して酸性洗浄液を洗い出した後、目的成分を含む液を通液して、医薬品やファインケミカルや機能性成分などを分離精製する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１０−５２５３７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来技術が抱えていた煩雑で多大な労力と時間を要するクロマトグラフィーカラムの洗浄回数を低減することができるクロマトカラムの洗浄方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のクロマトカラムの洗浄方法は、カラム軸心方向を上下方向としたカラムと、該カラムの一端側に設けられた第１の栓と、該カラムの他端側に設けられた第２の栓と、該第１の栓と第２の栓との間のカラム内に形成された充填剤層と、該第１及び第２の栓にそれぞれ設けられた通液口と、を有するクロマトカラムを洗浄する方法において、分離操作時の通液方向と逆方向に洗浄液を通液することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の一態様では、洗浄薬液を前記充填剤層の容積の３〜３０％通液する。
【００１５】
本発明の一態様では、精製処理５〜１０バッチに１回の頻度で洗浄を行う。
【００１６】
本発明の一態様では、洗浄液の通液速度（ＬＶ）を０．０１〜１ｍ／ｈｒとする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、分離操作時の通液方向（医薬品やファインケミカルや機能性成分などの目的成分を含む液をクロマトグラフィーカラムに通液する方向）と逆方向に洗浄液を通液して、カラムを洗浄するクロマトグラフィーカラム洗浄方法である。
【００１８】
本発明では、可動栓を緩めず充填剤層が固定された状態のまま押出洗浄することで、カラム内の充填剤層の汚染エリアから剥離された汚染物が、充填剤層の広範囲に拡散することなく、直近の栓のフリットを通過して排出される。
【００１９】
本発明の洗浄方法は、押出洗浄であるので、洗浄液は充填剤層の全容積の３％〜３０％の容量だけ注入すれば十分に充填剤層を洗浄できる。
【００２０】
なお、充填剤層の汚染が進んだ段階で洗浄すると剥離した汚染物がフリットの目開きと比較して大きくフリットを部分的に閉塞させ洗浄が完了しない恐れがあるので、少なくとも精製処理１０バッチに１回、好ましくは５バッチに１回くらいの頻度で洗浄を行い、充填剤層の汚染が進まないうちに洗浄を行うことが好ましい。
【００２１】
医薬向けクロマトカラムでは目開きの小さいフリットを使用するので逆洗によるフリットの閉塞リスクの課題があり本発明がより好適に適用される。
【００２２】
本発明の洗浄は押出洗浄なので洗浄液の流速はＬＶで０．０１〜１ｍ／ｈｒ程度でじっくり洗浄するのが好ましい。
【００２３】
本発明方法によると、充填剤を抜き出すことなく、充填剤およびカラムを定置洗浄することができる。これにより、大幅な省力化、時間短縮、汚染低減（充填剤のこぼれや噴き出しなし）、安全性向上（重量物取扱なし）等の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】クロマトカラムの洗浄方法を示す断面図である。
【図２】クロマトカラムの洗浄方法を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を参照して実施の形態について説明する。図１は、本発明方法で洗浄されるクロマトカラム１の概略的な縦断面図である。
【００２６】
このクロマトカラム１は、筒軸心方向を上下方向（この実施の形態では鉛直方向）とした円筒状のカラム２と、該カラム２の下端に装着された固定栓３と、該カラム２内に上下動移動可能かつ固定部材（図示略）によって任意位置に固定可能とされた可動栓４とを有する。固定栓３及び可動栓４には通液口（流入・流出口）３ａ，４ａが設けられている。なお、固定栓３は、カラム２の下端外周に外向き鍔状に設けられたフランジ部（図示略）に対しボルトやクランプによって固定されている。
【００２７】
固定栓３と可動栓４との間に充填剤層８が形成されている。
【００２８】
図示は省略するが、固定栓３及び可動栓４の充填剤層８側には多孔板やメッシュ等よりなるフリットが設けられており、充填剤の流出が阻止されるよう構成されている。
【００２９】
医薬品やファインケミカル、機能性成分などの目的成分を含む液を、クロマトグラフィーカラムの可動栓通液口４ａからスパイク導入して下向流で通液して分離精製する操作を繰り返している間に、カラムへの通液圧力が上昇したり、吸着剤充填層の上部が着色して変色し始めた場合（目視などで確認）、主に、充填剤層８の上部、即ち、可動栓４の近傍が汚染している。そこで目的成分を含む原液のスパイクを一旦停止した後、無菌水あるいは純水を下部フランジ通液口から導入し、上向流で通液し、可動栓通液口４ａから導出させて内部に残存する目的成分を含む液をカラム外へ洗い出す。
【００３０】
次いで、アルカリ性の薬品、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを無菌水あるいは純水で希釈した洗浄薬液を、固定栓通液口３ａから導入し、上向流で通液し、可動栓通液口４ａから導出させて洗浄する。なお、アルカリ性薬品の一例として、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを挙げたが、これらに限定されるものではない。このときのアルカリ性薬品の通液速度は、汚れをアルカリ溶解する時間を考慮して０．０１〜１ｍ／ｈｒ程度でじっくり洗浄するのが好ましい。
【００３１】
このように、分離操作時の通液方向と逆方向に洗浄液を流す事で、汚れ程度が進んでいる領域から汚れを速やかにカラム外へ排出でき、洗浄に要する洗浄液量や洗浄時間を低減できる。
【００３２】
具体的には、ゲル充填全容積の３％〜３０％程度の洗浄薬液を通液すれば十分に洗浄可能である。目的成分を含む液に含まれる成分を検出できる検出器、例えばＵＶ検出器に洗浄液を流し、汚れ成分の溶出程度をモニタリングする事も可能である。洗浄薬液を連続通液せず、一旦通液を止めて、充填剤層やフリット（多孔質板）に付着した汚れをアルカリ溶解させ、再度、洗浄薬液を通液すれば、より良好に洗浄することができる。
【００３３】
なお、仮に、分離操作時の通液方向と同方向に洗浄液を流すと、溶け出した汚れが、まだ汚れていないカラム内部の充填層へ展開拡散し、汚れが広がるばかりでなく、洗浄にかかる洗浄液量が増え、洗浄時間も長く必要になる。
【００３４】
上記のアルカリ洗浄ではＬＶをごく低く設定したが、その後ＬＶを３〜５倍に上げて汚れの溶解したアルカリ洗浄液を排出するようにしてもよい。なお、このとき、アルカリ性薬品でなく無菌水あるいは純水を用いてもよい。この場合はアルカリ洗浄液の押し出しも兼ねる。
【００３５】
アルカリ性薬品による洗浄後、無菌水あるいは純水を上向流で通水して、カラム内のアルカリ性洗浄液を流し出す。
【００３６】
次いで、酸性薬品、例えば、塩酸や硫酸などを無菌水あるいは純水で希釈した酸性洗浄液を、固定栓通液口３ａから導入し、上向流で通液し、可動栓通液口４ａから導出させて洗浄する。分離操作時の通液方向と逆方向に通液することで洗浄に要する洗浄液量や洗浄時間を低減できることは先と同様である。さらに一旦通液を止めて、充填剤層８やフリットに付着した汚れを酸溶解させ、再度、洗浄液を通液すれば、より良好な洗浄を行うことができる。なお、酸性薬品の一例として、塩酸や硫酸を挙げたが、これらに限定されるものではない。このときの酸性薬品の通液速度は汚れを酸溶解する時間を考慮して０．０１〜１ｍ／ｈｒ程度でじっくり洗浄するのが好ましい。
【００３７】
上記の酸洗浄ではＬＶをごく低く設定したが、その後ＬＶを３〜５倍に上げて汚れの溶解した酸性洗浄液を排出するようにしてもよい。なお、このとき、酸性薬品でなく無菌水あるいは純水を用いてもよい。この場合は酸性洗浄液の押し出しも兼ねる。
【００３８】
酸性薬品による洗浄後、無菌水あるいは純水を上向流で通水して、カラム内の酸性洗浄液を流し出す。アルカリ性洗浄液を無菌水や純水で洗い出す場合も同様であるが、例えば、可動栓通液口４ａから導出した液のｐＨが無菌水あるいは純水のｐＨと同等になった時点で、洗浄薬品の押し出しを終了とするのが好ましい。
【００３９】
汚れ成分によっては、洗浄薬品としてアルカリ性薬品や酸性薬品の他に、キレート剤や界面活性剤を併用あるいは、逐次通液して、同様に薬品洗浄することができる。一方、アルカリ性薬品による洗浄が不要、あるいは、酸性薬品による洗浄が不溶な場合、これらの薬液の通液は実施しないのが好ましい。
【００４０】
充填剤層８の着色が改善／あるいは無くなっていること、あるいは、通液圧力の上昇分が低減されている／あるいは無くなっている事を確認して、洗浄を終了する。その後、目的成分を含む液をスパイクして分離精製する操作を再開する。
【００４１】
洗浄後の洗浄液の押出し（リンス）においては、純水で押出洗浄後にリン酸バッファで押出洗浄を行う２段処理かリン酸バッファ単独による押出洗浄の１段処理のいずれかを行うのが好ましい。
【００４２】
図１では、分離操作時の通液方向を下降流とし、洗浄液を上向流としているが、分離操作時の通液方向を上向流とし洗浄液を下降流としてもよい。
【００４３】
上記説明は本発明の一例であり、本発明は上記以外の態様とされてもよい。例えば、上記実施の形態では、固定栓３をカラム２の下端側としているが、上下逆とし、固定栓３をカラム２の上端側としてもよい。また、上記実施の形態では、可動栓４を用いているが、図２のクロマトカラム１Ａのように、カラム２の両端に固定栓３，３を設けた場合にも本発明を適用することができる。この場合の分離精製操作手順及び洗浄手順は上記と同じである。
【実施例】
【００４４】
本発明の「分離精製時は液を下降流で流し、洗浄時は洗浄薬液や無菌水や純水を上向流で流す」、および従来技術の「分離精製時、洗浄液や無菌水や純水による洗浄時共に液を上向流で流す」操作で、分離精製目的成分を含む液をカラムへスパイクした直後に流れを止めて、洗浄液を流して汚染物を押し出す操作を数値流体力学シミュレーションした。シミュレーションソフトとしてはＡＮＳＹＳ社製ＣＦＸを用いた。その結果、汚染物がカラムの外へ流れ出されるのに要する時間は、本発明の場合５秒程度であるのに対して、従来技術では１２０秒近くかかった。本発明による洗浄方法が格段に優れており、洗浄時間、洗浄液量、洗浄作業を大幅に低減できると考えられる。
【符号の説明】
【００４５】
１、１Ａ  クロマトカラム
２  カラム
３  固定栓
４  可動栓
３ａ，４ａ  通液口
８  充填剤層
【図１】
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【図２】
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