(57)【要約】      （修正有）【課題】植物病原体又は植物病原性疾患の発生を予防、阻害、或いは処理するための植物の成長及び／又は収量を増強するための微生物株、組成物、およびそれらの使用方法の提供。【解決手段】植物がトウモロコシ植物またはコムギ植物であり、微生物株に人工的に感染させた非天然の植物及びその派生物。下記代表的な微生物が、細菌属バチルス、バークホルデリア、ヘルバスピリルム、パントエア、及びペドバクターから選別されたパントエア・アグロメランス、バチルス・チューリンゲンシス、パークホルデリア・メタリカ、パークホルデリア・ベトナミエンシス等の細胞株であり、それらの富栄養培養物、単離培養物、純粋な培養物、単離微生物株、及び前記微生物株又は培養物を含む組成物、前記組成物で処理等を含む、植物病原体の発生を予防、阻害若しくは処理する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８３として寄託されたＳＧＩ−００３−Ｈ１１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８４として寄託されたＳＧＩ−０２０−Ａ０１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８５として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０６株、およびＮＲＲＬ Ｂ−５０４８６として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０７株からなる群から選択される微生物株の富栄養培養物。
【請求項２】
ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８３として寄託されたＳＧＩ−００３−Ｈ１１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８４として寄託されたＳＧＩ−０２０−Ａ０１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８５として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０６株、およびＮＲＲＬ Ｂ−５０４８６として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０７株からなる群から選択される微生物株の単離培養物。
【請求項３】
ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８３として寄託されたＳＧＩ−００３−Ｈ１１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８４として寄託されたＳＧＩ−０２０−Ａ０１株、ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８５として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０６株、およびＮＲＲＬ Ｂ−５０４８６として寄託されたＳＧＩ−０２６−Ｇ０７株からなる群から選択される微生物株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項４】
ａ）ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８３として寄託された微生物株またはそれに由来する株、
ｂ）ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８４として寄託された微生物株またはそれに由来する株、
ｃ）ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８５として寄託された微生物株またはそれに由来する株、および
ｄ）ＮＲＲＬ Ｂ−５０４８６として寄託された微生物株またはそれに由来する株からなる群から選択される、単離微生物株。
【請求項５】
配列表中のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対し少なくとも８５％の配列同一性を示すＤＮＡ配列を含む単離微生物株であって、さらに植物成長促進活性を有する、単離微生物株。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物と、肥料、殺ダニ剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤および殺虫剤からなる群から選択される農業上有効な量の化合物または組成物とを含む組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物と、担体とを含む組成物。
【請求項８】
前記担体が植物種子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
種子コーティング製剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
乳剤、コロイド、粉剤、粒剤、ペレット、粉末、噴霧剤、乳剤および溶液からなる群から選択される製剤として調製される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の組成物を含むコーティングを有する植物種子。
【請求項１２】
植物種子を処理する方法であって、前記植物種子を、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物に曝露するかまたは接触させる工程を含む、方法。
【請求項１３】
植物の成長および／または収量を増強するための方法であって、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の有効な量の微生物株または培養物を前記植物または前記植物の周囲に適用することを含む、方法。
【請求項１４】
前記微生物株または培養物が、宿主植物の成長培地または土壌中で、前記成長培地または土壌中における宿主植物の成長に先行して、またはそれと同時に、成長させられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、トウモロコシ植物またはコムギ植物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物株または培養物が、前記植物上の内生菌として確立される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
植物病原体の発生を予防、阻害または処理するための方法であって、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物を、宿主植物の成長培地または土壌中で、前記成長培地または土壌中における宿主植物の成長に先行するか、またはそれと同時に、成長させることを含む、方法。
【請求項１８】
前記植物病原体が、コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、モノグラフェラ属（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびスタグノスポラ属（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ）の生物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物病原体が、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）またはスタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
植物の病原性疾患の発生を予防、阻害または処理するための方法であって、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の有効な量の微生物株または培養物を前記植物または前記植物の周囲に適用することを含む、方法。
【請求項２１】
前記微生物株または培養物が、土壌、種子、根、花、葉、前記植物の部分、または前記植物全体に適用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物に人工的に感染させた植物である、非天然の植物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の非天然の植物の種子、生殖組織、栄養組織、再生組織、植物部分、または子孫。
【請求項２４】
農業用組成物を調製するための方法であって、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の微生物株または培養物を基層の中または上に接種すること、および前記微生物株または培養物を、１〜３７℃の温度で、１ミリリットル当たりまたは１グラム当たり少なくとも１０２〜１０３の細胞数または胞子数を得るまで成長させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月１３日に出願された米国仮出願第６１／５７０，２３７号の利益を主張し、参照により全ての表、図面、および請求項を含むその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、持続可能な農業の分野に関する。具体的に、本開示は、作物植物の生産に有用な微生物組成物および方法を提供する。特に、本明細書に開示される組成物および方法は、植物成長を増進する、ならびに／または植物病原体および病原性疾患の発生を抑制するために有用である。
【０００３】
配列表の組み込み
付随の配列表中の材料は、参照により本出願に組み込まれる。「ＳＧＩ１５４０＿１ＷＯ＿ＣＲＦ＿ＯＦ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の付随ファイルは、２０１２年１２月１３日に作成され、２０ＫＢである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＯＳを使用するコンピューター上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
植物を取り囲む微生物相は、非常に多様であり、細菌、真菌、酵母、藻類を含む。これらの微生物のいくつかは、植物に対して有害であり得、病原体と称される場合が多いが、植物成長および作物生産性を促進することにより植物に有益であり得るものもある。土壌微生物学および植物バイオテクノロジーにおける近年の進歩は、農業、園芸、林業、および環境管理における微生物剤の使用に対する関心を高めた。特に、一般に根圏および根面として既知の土壌生態的地位に存在することが知られている多数の微生物は、植物成長を促進する能力に関して相当な注目を集めている。実際に、根圏土壌は、有益な微生物の潜在的単離のための良好な微生物の貯留層を表す。植物根圏は、１グラムの土壌に１０億の微生物を含み得る。理論的に、微生物の接種は、ヒトの介入なしに、土壌１グラム当たりのコロニー形成単位が不十分であるため、それらの自然な土壌環境における生存率および有用性が低い。したがって、１９６０年代以降、高いコロニー接種潜在的濃度を有する多数のバイオ肥料が、化学肥料の必要性を低減する試みにおいて開発され、商品化されている。
【０００５】
さらに、近年行われている研究は、農業生産性および効率性を高めるために、微生物を生物防除剤として使用できることを示した。これらの研究は、様々な微生物が、植物病原体を抑制する、および／または植物成長を補うことができることを示し、従って、ヒトの健康および環境品質に対するそれらの潜在的な悪影響に起因してあまり好まれていない化学殺虫剤に対する魅力的な代替物を提供する。
【０００６】
植物根をコロニー形成し、植物成長を刺激することができる微生物は、植物成長促進微生物（ＰＧＰＭ）として一般に知られている。過去２０年間に、多様な作物植物の成長に対して好ましい影響を有する多くのＰＧＰＭ種が報告された。ＰＧＰＭは、多くの場合、高等植物の普遍的共生体であり、分子状窒素の固定、不応性(recalcitrant)土壌養分（例えば、鉄、亜リン酸、硫黄等）の移動、植物ホルモンおよびビタミンの合成、ならびに多くの場合土壌有機物質を増加させる土壌中の植物物質の分解等の多数の機序を介してそれらの宿主の適合能力を高めることができる。また、ある微生物は、植物に対して病原性の微生物種（すなわち、植物病原体）を防除することにより、植物成長を促進することができる。例えば、いくつかの有益な微生物は、植物根の表面上の空間について菌類と競合することにより、植物の根腐れを防除することができる。他の例では、植物の自生の微生物相における様々な微生物株間の競合は、根の成長を刺激し、無機養分および水の取り込みを増加させて植物収量を高めることができる。したがって、生物肥料は、土壌中に天然に生存する微生物に基づく製品として開発することができる。人工接種を介して土壌中の有益な微生物群を増加させることにより、これらの土壌微生物は、それらの生物活性を高めることができるため、それらの成長を増進させる重要な養分および有益な要素を植物に供給することができる。
【０００７】
栽培植物にＰＧＰＭを接種することは、殺虫剤を大量に使用することなく、害虫を防除することを可能にするため、一般に有望な農業的手法として見られている。食物における過剰な肥料および殺虫剤曝露による地下水品質に関する環境懸念が増すにつれて、生物学的代替物が必要になっている。したがって、肥料および殺虫剤と適合する生物処理を開発すること、またはこれらの化学化合物の量をさらに低減させることは、農業における重大な進歩となり得る。ＰＧＰＭによる植物成長の刺激は、多くの場合、ＰＧＰＭが植物根をコロニー形成する能力に密接に関連する。しかしながら、高い根コロニー形成能力を持つ微生物株を得るための効率的な選択手順の開発に対する注目は比較的低い。かかる選択手順の欠失は、植物−細菌共生の研究、および農業におけるＰＧＰＭの展開を遅らせている。
【０００８】
したがって、新たなＰＧＰＭの特定、および／または既存の市販の作物管理製品とのそれらの適合性の試験が引き続き必要とされている。さらに、純粋な培養株を、相乗共同体を形成する微生物の相補的混合株と比較するために追加の調査も必要とされている。かかる混合共同体は、異なる環境および成長条件下で、より良好な競合能力と共に、一貫した性能の優れた可能性を有し得る。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において、微生物株および培養物が提供される。植物の成長および／または収量を増強するための微生物組成物およびそれらの使用方法も提供される。本明細書に開示される微生物組成物を使用することにより、植物種子を処理するための方法も提供される。植物病原体の発生または植物病病原性疾患の発生を予防、阻害、または処理するための方法がさらに提供される。この開示は、本発明の微生物内生菌に人工的に感染させた品種である、非天然の(non-naturally occurring)植物品種も提供する。非天然の植物品種の種子、生殖組織、栄養組織、再生組織、植物部分、または子孫も提供される。この開示は、農業組成物を調製するための方法をさらに提供する。
【００１０】
一態様では、本開示は、単離した微生物株、単離したその培養物、その生物学的に純粋な培養物、およびその富化培養物を提供する。この態様のある好適な実施形態では、微生物株は、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４８３として寄託された）、ＳＧＩ−０２０−Ａ０１（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４８４として寄託された）、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４８５として寄託された）、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０４８６として寄託された）、または該株のうちのいずれか１つに由来する株であり得る。いくつかの他の好適な実施形態では、微生物株は、配列表中の１６Ｓリボソームおよび／またはｒｅｃＡのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列のうちのいずれか１つに少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を呈する、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、微生物株は、本明細書に記載される植物成長促進活性も有する。
【００１１】
本発明の微生物株またはその培養物を含む微生物組成物も提供される。いくつかの好適な実施形態によるかかる微生物組成物は、農業上有効な量の化合物または組成物を含んでよく、追加の化合物または組成物は、肥料、殺ダニ剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、または殺虫剤であり得る。いくつかの他の好適な実施形態では、微生物組成物は、担体をさらに含み得る。さらに他の好適な実施形態では、担体は、植物種子であり得る。この態様のある実施形態では、微生物組成物は、乳剤(emulsion)、コロイド、粉剤(dust)、粒剤(granule)、ペレット、粉末、噴霧剤、乳剤、または溶液であり得る製剤として調製される。いくつかの他の好適な実施形態では、微生物組成物は、種子コーティング製剤であり得る。さらに別の態様では、本発明により微生物組成物でコーティングされる植物種子も提供される。
【００１２】
別の態様では、植物種子を処理するための方法が提供される。かかる方法は、植物種子を本発明による微生物株またはその培養物に曝露すること、または接触させることを含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、植物の成長および／または収量を増強するための方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、かかる方法は、有効な量の本発明による微生物株またはその培養物を、植物または植物の周囲に適用することを含む。いくつかの他の実施形態では、この方法は、本発明による微生物株またはその培養物を、宿主植物の成長培地または土壌中で、該成長培地または土壌中の宿主植物の成長に先行するか、またはそれと同時に成長させることを含む。好適な実施形態では、植物は、トウモロコシ植物またはコムギ植物である。いくつかの他の実施形態では、微生物株またはその培養物は、植物上の内生菌として確立され得る。
【００１４】
本発明の別の態様では、植物病原体の発生を予防、阻害、または処理するための方法が提供される。かかる方法は、本発明による微生物株またはその培養物を、宿主植物の成長培地または土壌中で、該成長培地または土壌中の宿主植物に先行するか、またはそれと同時に成長させることを含む。いくつかの好適な実施形態では、植物病原体は、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、モノグラフェラ（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、またはスタグノスポラ（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ）属の微生物であり得る。いくつかの特定の好適な実施形態では、植物病原体は、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、またはスタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ）であり得る。
【００１５】
本発明の別のさらなる態様は、植物の植物病原性疾患の発生を予防、阻害、または処理するための方法を提供する。かかる方法は、植物または植物の周囲に、有効な量の本発明による微生物株またはその培養物を適用することを含む。いくつかの好適な実施形態では、微生物株またはその培養物は、土壌、種子、根、花、葉、植物の部分、または植物全体に適用され得る。
【００１６】
本発明の別のさらなる態様は、非天然の植物を提供する。この非天然の植物を、本発明の微生物株またはその培養物に人工的に感染させる。この態様のいくつかの実施形態では、非天然の植物の種子、生殖組織、栄養組織、再生組織、植物部分、および子孫がさらに提供される。
【００１７】
本発明の別の態様は、農業用組成物を調製するための方法を提供する。かかる方法は、本発明による微生物株またはその培養物を基層(substratum)中または基層の上に接種することと、それを成長させることを含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の微生物の単離した微生物株、単離したその培養物、その生物学的に純粋な培養物、およびその富化培養物(enriched culture)を提供する。一実施形態では、微生物は、配列表に開示される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはｒｅｃＡタンパク質をコードする配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはｒｅｃＡタンパク質をコードするＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明は、上記のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列のうちのいずれかを含み、本明細書に記載される、植物の成長および／または収量を増強する微生物の属を提供する。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明および特許請求の範囲からより完全に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語、表記、および科学用語または専門用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって広く理解される意味を有する。場合によっては、広く理解される意味を持つ用語は、明確にするため、および／または容易に参照するために本明細書に定義され、本明細書におけるかかる定義の包含は、必ずしも当該技術分野において一般に理解されるものの実質的な差異を表すものと見なされるべきではない。本明細書に記載されるか、または参照される技術および手順の多くは、当業者によって十分に理解され、従来の方法を使用して広く用いられる。
【００２１】
単数形「ある(a)」「ひとつの(an)」および「該(the)」は、文脈が別に明らかに指示しない限り複数の言及を含む。例えば、「細胞(a cell)」という用語は、１つ以上の細胞を含み、その混合物を含む。
【００２２】
殺細菌性：「殺細菌性」という用語は、本明細書で使用されるとき、組成物または物質が死亡率を増加させるか、または細菌の成長速度を阻害する能力を指す。
【００２３】
生物防除：「生物防除（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」という用語およびその省略形「ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ」は、本明細書で使用されるとき、ヒト以外の少なくとも第２の生物の使用による病原体もしくは昆虫、または任意の他の望ましくない生物の防除として定義される。生物防除の既知の機序の一例は、根の表面上の空間について菌類に勝ることによって根腐れを防除する微生物、あるいは病原体の成長を阻害するかまたは病原体を死滅させる微生物の使用である。生物防除の文脈における「宿主植物」は、病原体によって引き起こされる疾患に感受性の植物である。細菌種または真菌種等の生物のその自然環境からの単離の文脈では、「宿主植物」は、細菌または真菌の成長を支持する植物、例えば、細菌または真菌がその内生菌である種の植物である。
【００２４】
「有効な量」は、本明細書で使用されるとき、有益な結果または所望の結果をもたらすために十分な量である。有効な量は、１回以上の投与で投与されることができる。処理、阻害、または保護に関して、有効な量は、標的感染または疾患状態の進行を軽減、安定化、逆行、減速、または遅延させるために十分な量である。微生物を参照して本明細書で使用される「有効な微生物」という表現は、対象の株が植物の成長および／または収量の促進の程度、または統計的に有意なレベルで未処理の対照のそれを超える病原性疾患の阻害の程度を呈することを意味するよう意図される。場合によっては、「有効な量」という表現は、本明細書に記載される処理の適切な条件下で、未処理の対照において発生するものと比較して有益な結果または所望の結果を得るために必要な微生物処理の量に関して本明細書において使用される。本開示の目的で、液体製剤の実際の適用量(rate of application)は、通常、最小約１×１０３〜約１×１０１０生細胞／ｍＬおよび好ましくは約１×１０６〜約５×１０９生細胞／ｍＬまで異なる。大部分の条件下で、以下の例に記載される本発明の株は、植物組織の少なくとも約５０％の実質的に均一な接触を達成する適用形態を想定すると、約１×１０６〜１×１０９生細胞／ｍＬの範囲の適用量(application rate)で最適に有効である。微生物が固体製剤として適用される場合、適用量は、前述の液体処理量によって得られるのと同等の数の植物組織表面の単位面積当たりの生細胞をもたらすように制御されるべきである。典型的に、本発明の微生物組成物は１０６ＣＦＵ／ｇ（１グラム当たりのコロニー形成単位）、好ましくは１０７ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１０８ＣＦＵ／ｇ、および最も好ましくは１０９ＣＦＵ／ｇを超える濃度で送達されるとき、生物学的に有効である。
【００２５】
組成物：「組成物」は、活性物質と、肥料等の不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識もしくは液体担体）または活性であり得る少なくとも別の化合物、担体または組成物との組み合わせを意味するよう意図される。
【００２６】
「対照植物」は、本開示で使用されるとき、対象植物の表現型における変化を測定するための参照点を提供し、任意の適切な植物細胞、種子、植物構成要素、植物組織、植物器官、または全植物であり得る。対照植物は、例えば、（ａ）野生型、すなわち、対象植物もしくは細胞をもたらした遺伝的変化の出発材料と同じ遺伝子型の植物もしくは細胞；（ｂ）出発材料と同じであるが、ヌル(null)コンストラクト（すなわち、関心のある形質に対する既知の影響を有しないコンストラクト、例えばレポーター遺伝子を含むコンストラクト）で形質転換された遺伝子型の植物もしくは細胞；（ｃ）対象植物もしくは細胞の子孫の中の非形質転換分離個体である植物もしくは細胞；（ｄ）対象植物もしく細胞と遺伝的に同一であるが、対象植物もしく細胞と同じ処理（例えば、肥料処理）に曝露されない植物もしくは細胞；（ｅ）関心のある遺伝子が発現しない条件下における対象植物もしくは細胞；または（ｆ）特定の処理、例えば肥料または肥料および／もしくは他の化学物質の組み合わせ等に曝露されない条件下における対象植物もしくは細胞を含み得る。
【００２７】
培養物、単離した培養物、生物学的に純粋な培養物、および富化培養物：本明細書で使用されるとき、微生物の単離した株は、その自然環境から除去された株である。したがって、「単離（された）」という用語は、必ずしも微生物が精製された程度を反映するものではない。しかし、異なる実施形態では、「単離（された）」培養物は、それが単離された原材料から少なくとも２倍または５倍または１０倍または５０倍または１００倍精製されている。非限定的な例として、培養物が、原材料として土壌から単離される場合、生物は、所定量の精製または部分的に精製された材料（例えば、土壌）中のその濃度が、元の原材料中の少なくとも２倍または５倍または１０倍または５０倍または１００倍である程度に単離されることができる。微生物株の「実質的に純粋な培養物」は、所望の微生物株（複数可）以外の微生物を実質的に含まない培養物を指す。換言すれば、微生物株の実質的に純粋な培養物は、微生物夾雑物(contaminant)ならびに望ましくない化学的夾雑物を含み得る他の夾雑物を実質的に含まないものである。さらに、本明細書で使用されるとき、「生物学的に純粋な」株は、自然界において通常付随している材料から分離された株を意味するよう意図される。他の株と、または自然界において通常は付随して見出されない化合物もしくは材料と付随している株も「生物学的に純粋」として定義されることに留意されたい。特定の株の単一培養物(monoculture)は、当然のことながら「生物学的に純粋」である。異なる実施形態では、「生物学的に純粋な」培養物は、自然界で通常付随している材料から少なくとも２倍または５倍または１０倍または５０倍または１００倍精製されたものである。非限定的な例として、培養物が、自然界で通常土壌と付随している場合、生物は、自然界で通常それに付随している、所定量の精製または部分的に精製された材料（例えば、土壌）中におけるその濃度が、元の非精製材料中の少なくとも２倍または５倍または１０倍または５０倍または１００倍である程度に生物学的に精製されることができる。本明細書で使用されるとき、単離した微生物株の「富化培養物」という用語は、培養物の総微生物群が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える単離した株を含む、微生物培養物を指す。
【００２８】
培養：「培養」という用語は、本明細書で使用されるとき、様々な種類の培地上または培地中の生物の増殖を指す。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「内生菌」は、明らかな疾患を引き起こすことなく、その寿命の少なくとも一部の間、植物内で生存する内部共生体である。内生菌は、縦方向（親から子孫に直接）または横方向（個体から関連のない個体）のいずれかに伝播され得る。縦方向に伝播される真菌性内生菌は、典型的に無性であり、宿主の種子を貫通する真菌性菌糸を介して材料植物から子孫に伝播する。細菌性内生菌は、種子から実生苗に縦方向に移行されることもできる（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８７：８−１４，２００８）。反対に、横方向に伝播される内生菌は、典型的に有性であり、風および／または昆虫ベクターによって拡散されることができる胞子を介して伝播する。作物植物の微生物内生菌は、それらが疾患および昆虫の寄生を防除する能力、ならびに植物成長を促進する能力に関して相当の注目を集めている。
【００３０】
真菌性病原体：この発明の目的で、真菌性病原体または真菌という用語の使用は、この生物の有性（テレオモルフィック）ステージおよび無性（アナモルフィック）ステージの両方を含むよう意図され、それぞれ完全および不完全真菌ステージとも称される。例えば、フザリウム・グラミネアラムの不完全ステージは、ジベレラ・ゼアエである。
【００３１】
殺真菌性：本明細書で使用されるとき、「殺真菌性」は、組成物または物質が、真菌の成長速度を減少させるか、または真菌の死亡率を増加させる能力を指す。
【００３２】
突然変異体：本明細書で使用されるとき、「突然変異体」または「変異体」という用語は、微生物を参照して、所望の生物活性が、親株によって発現されるものに類似する親株の修飾を指す。例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の場合、「親株」は、突然変異誘発前の元のバークホルデリア株として本明細書において定義される。突然変異体または変異体は、ヒトの介入なしに自然界に発生し得る。それらは、当業者に既知の多様な方法および組成物を用いる処理によって、または該方法および組成物によっても得ることが可能である。例えば、親株は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン等の化学物質を用いて、またはγ線、ｘ線、もしくはＵＶ照射を使用する照射によって、または当業者に周知の他の手段によって処理され得る。
【００３３】
殺線虫性：「殺線虫性」という用語は、本明細書で使用されるとき、物質または組成物が、線虫の死亡率を増加させるか、または成長速度を阻害する能力を指す。
【００３４】
病原体：「病原体」という用語は、本明細書で使用されるとき、植物または動物において疾患を生じさせることができる藻、クモ、細菌、真菌、昆虫、線虫、寄生植物、原生動物、酵母、またはウイルス等の生物を指す。「植物病原体」という用語は、本明細書で使用されるとき、植物に感染する病原性生物を指す。
【００３５】
配列同一性のパーセンテージ：「配列同一性のパーセンテージ」は、本明細書で使用されるとき、２つの配列間の局所アラインメントの長さによって定義される比較ウィンドウ上の２つの最適に局所アラインメントされた配列を比較することによって決定される。比較ウィンドウ内のアミノ酸配列は、２つの配列の最適アラインメントの参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含み得る。２つの配列間の局所アラインメントは、アラインメントを行うために使用されるアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）に依存する基準に従って十分に類似すると見なされる各配列のセグメントのみを含む。配列同一性のパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を出し、この一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって算出される。比較のための最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のグローバル相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）の類似法の検索によって、これらのアルゴリズムの発見的実行(heuristic implementation)（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、ＳＩＭ、ＢＬＡＳＴＺ）によって、または目視検査(inspection)によって行われ得る。比較のための２つの配列が特定されると、好ましくはＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴを用いて、それらの最適アラインメントを決定する。典型的に、ギャップ重量(gap weight)にはデフォルト値５．００、ギャップ重量長(gap weight length)にはデフォルト値０．３０を使用する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「実質的な配列同一性」という用語は、プログラムを使用する参照配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。さらに、対配列相同性または配列類似性は、使用されるとき、アラインメントされた２つの配列間で類似する残基のパーセンテージを指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において十分に定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。
【００３６】
クエリ核酸およびアミノ酸配列は、公共または独自のデータベースに存在する対象核酸またはアミノ酸配列に対して検索することができる。かかる検索は、全米バイオテクノロジー情報センターのベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  ｖ２．１８）プログラムを使用して行うことができる。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センターからインターネット上で入手可能である（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。典型的に、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴの以下のパラメータを使用することができる：「デフォルト」に設定されたフィルターオプション、「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定された比較マトリクス、「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定されたギャップコスト、３に設定されたワードサイズ、１ｅ−３に設定されたＥｘｐｅｃｔ（Ｅ閾値）、およびクエリ配列長の５０％に設定されたローカルアラインメントの最小長。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を使用して決定されてもよい。
【００３７】
「害虫」という用語は、本明細書で使用されるとき、細菌、真菌、植物（例えば、雑草）、線虫、昆虫、および他の病原性動物が挙げられ得るが、これらに限定されない望ましくない生物を指す。「殺虫性」は、本明細書で使用されるとき、物質または組成物が害虫、すなわち、望ましくない生物の成長速度を減少させるか、または害虫の死亡率を増加させる能力を指す。
【００３８】
子孫：本明細書で使用されるとき、「子孫」は、特定の植物または植物系統の子孫を含む。現在の植物の子孫として、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、および後次世代の植物上に形成される種子、またはＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３および後次世代の植物上に形成される種子、またはＦ１ＢＣ１、Ｆ１ＢＣ２、Ｆ１ＢＣ３、および後次世代の植物上に形成される種子が挙げられる。記号Ｆ１は、遺伝学的に異なる２つの親間の交配の子孫を指す。記号Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６は、Ｆ１植物の自家受粉または兄妹受粉された後次世代を指す。
【００３９】
変異体：核酸およびポリペプチドを参照して本明細書で使用されるとき、「変異体」という用語は、本明細書において、それぞれ参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、それらのアミノ酸または核酸配列中に合成によりまたは自然に生成されるいくつかの差異を持つポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド分子を示すように使用される。例えば、これらの差異は、置換、挿入、欠失、または参照ポリペプチドもしくはポリペプチドにおけるかかる変化の所望の組み合わせが挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質変異体は、電荷における変化および／または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、メチル化、ホスホリル化等）によりさらに構成され得る。
【００４０】
微生物を参照して本明細書で使用されるとき、「変異体」という用語は、それが属する種の特徴を特定する一方で、親株に対して少なくとも１つのヌクレオチド配列変異または特定可能に異なる遺伝に基づく（遺伝性の）形質を有する微生物株である。例えば、植物成長促進活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）０２０＿Ａ０１株の場合、特定可能な形質として、１）真菌性植物病原体（フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、スタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ）、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）を含む）の発生を抑制する能力； ２）コムギの種子産生を増進させる能力；および ３）バチルス・チューリンゲンシス０２０＿Ａ０１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対して９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列を持つ１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有することが挙げられ、該形質を使用して、変異体をバチルス・チューリンゲンシス０２０＿Ａ０１として確認することができる。
【００４１】
収量：本明細書で使用されるとき、「収量」という用語は、収穫可能な植物材料または植物由来の生成物の量を指し、通常、作物の経済価値の測定可能な生産量(produce)として定義される。作物植物の場合、「収量」は、１エーカーまたは生産単位当たりの収穫された材料の量も意味する。収量は、量または質に関して定義され得る。収穫される材料は、作物毎に異なり得、例えば、種子、地上バイオマス、根、果実、綿繊維、植物の任意の他の部分、または経済価値がある任意の植物由来の生成物であり得る。「収量」という用語は、得ることができる最大収量である生産力も包含する。収量は、多数の収量構成要素に依存し得、特定のパラメータによってモニターし得る。これらのパラメータは、当業者に周知であり、作物毎に異なる。「収量」という用語は、収穫されたバイオマスとバイオマスの総量との比率である収穫指数も包含する。
【００４２】
この明細書に記載の全ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
任意の参照が先行技術を構成することは承認されない。参照文献に関する論考は、それらの著者が主張することを述べるものであり、出願人は、引用される文献の正確性および妥当性に異議を唱える権利を有する。多数の先行技術出版物が本明細書において参照されるが、この参照文献は、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという承認を構成しないことが明らかに理解されるであろう。
【００４４】
本明細書において提供される一般的な方法に関する論考は、例証目的のみが意図される。他の代替方法および実施形態は、この開示をレビューすれば当業者に明らかとなるであろう。
【００４５】
植物成長促進微生物
多種多様の植物関連微生物は、多様な方法で植物の健康および生理学に好ましい影響を及ぼすことができる。これらの有益な微生物は、一般に植物成長促進微生物（ＰＧＰＭ）と称される。「植物成長促進活性」という用語は、本明細書で使用されるとき、広範の向上した植物特性を包含し、例えば、限定されることなく、向上した窒素固定、向上した根の発生、増加した葉面積、増加した植物収量、増加した種子発芽、増加した光合成、または植物の蓄積バイオマスの増加を含む。様々な実施形態では、この向上は、測定される特性の少なくとも１０％の増加、または少なくとも２５％の増加、または少なくとも５０％の増加、または少なくとも７５％の増加、または少なくとも１００％の増加である。したがって、非限定的な例として、微生物は、窒素固定の上記パーセンテージの増加、または総根重量もしくは葉面積もしくは植物生成物収量の上記増加（例えば、植物生成物重量の上記パーセンテージの増加）、または１０日もしくは１４日もしくは３０日以内に発芽する種子のパーセンテージの増加、または光合成速度（例えば、ＣＯ２消費によって決定される）、または植物の蓄積バイオマス（例えば、植物の重量によって決定される）を生じ得る。植物生成物は、品目、通常、必ずしもそうではないが、植物によって生成される食品である。収量は、任意の便宜的な方法、例えば、植栽の１エーカー当たりで生成された植物生成物のブッシェルまたはポンドを使用して決定することができる。今日まで、２４を超える微生物属の単離株が、植物成長促進活性および／または生物防除活性を有することが報告されており、同様の活性を持つ新たな属および種が依然として発見されている。加えて、いくつかの細菌属内においては、生物防除物質の複数の種および亜種が同定されており、地球レベルから農場レベルまでの複数の空間規模に渡って、また、単一植物においてもこれらを見出すことができる。さらに、いくつかの個別の微生物単離株(microbial isolate)が、それらが得られた植物または作物上のみならず、他の作物上でも生物防除および／または植物成長促進活性を呈し得ることが報告された。これは、いくつかの遺伝子型、特に広い地理的分布を持つ遺伝子型の万能型の(generalist)性質を示す。上述のとおり、十分な数で導入され、十分な期間の間活性である場合、単一微生物群は、植物の健康に著しい影響を及ぼすことができる。
【００４６】
いくつかの機序は、植物成長の促進に対するＰＧＰＭの好ましい影響についての説明を提供すると想定される。植物成長に対する微生物の有益作用は、直接または間接的であり得る。
【００４７】
「直接的植物成長促進微生物」という用語は、この開示の目的で、病原体の不在下で植物の成長を増進することができる微生物を指す。以下でより詳細に論じられるとおり、直接的植物成長促進の例として、（ａ）生物肥料作用、（ｂ）根成長の刺激、（ｃ）ライゾレメディエーション(rhizoremediation)、および（ｄ）植物ストレス制御が挙げられる。さらに、いくつかのＰＧＰＭは、生物防除の機序を介して間接的に、すなわち、疾患のレベルを低減すること、例えば、抗生作用、全身抵抗性の導入、および養分およびニッチの病原体との競合によって植物の成長を促進することが報告された。
【００４８】
生物肥料：微生物肥料は、植物に養分を供給し、病原体圧力の不在下で、植物成長を促進することができる。植物の成長および／または収量を直接促進することができる微生物単離株の非限定的な例として、共生的窒素固定を介して、マメ科植物の根上に小瘤を形成することができるＮ２固定細菌リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種が挙げられ、それらは、大気のＮ２を、大気のＮ２とは対照的に植物によって窒素源として使用され得るアンモニアに変換する。他の例として、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）種が挙げられ、コムギ、モロコシ、およびトウモロコシ等の穀物を肥沃にし、その収量を増加させることができる自由生活型Ｎ２固定剤である。アゾスピリルムのＮ２固定能力に関わらず、アゾスピリルムによる接種によって引き起こされる収量の増加は、多くの場合、根の発生の増加、したがって水およびミネラルの取り込み率の増加に寄与される。この点において、窒素固定菌種（Azotobacter spp.）のようないくつかの根細菌は、多岐にわたる植物ホルモン（例えば、オーキシン、サイトカイニン）および酵素（例えば、ペクチナーゼ）を生成することができると報告されている。これらの植物ホルモンおよび酵素の多くは、リゾビウムによる根粒形成に対する制御的影響(regulatory influence)を有する、共生細菌−植物連合（symbiotic bacteria-plant association）の感染プロセスに密接に関与することが示された。
【００４９】
多くの例では、ＰＧＰＭは、養分の取り込みを修正することによって植物の成長および発生に影響を及ぼすこともできる。それらは、例えば、根に対する直接作用によって、根の挙動を修正する環境に対する作用によって、および養分について直接競合することによって、養分取り込み率を変化させ得る（Ｇａｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔ．Ｅｃｏｓｙｓｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．１２：９９−１１６，１９８５）。ＰＧＰＭが土壌中の養分使用効率を修正することにおいて役割を果たし得るいくつかの要因として、例えば、根の形状、養分の可溶性、植物に適した(plant congenial)イオン形態を生成することによる養分の利用可能性、植物における養分の分割および利用効率が挙げられる。例えば、低レベルの可溶性リン酸塩は、植物の成長を制限し得る。いくつかの植物成長促進微生物は、有機または無機結合リン酸塩のいずれかからリン酸塩を溶解することができ、それによって植物成長を促進する。微生物起源のいくつかの酵素、例えば、非特異的ホスファターゼ、フィターゼ、ホスホナターゼ、およびＣ−Ｐリアーゼは、土壌中の有機化合物から可溶性リンを放出する。例えば、土壌中の無機リンの可溶性の増加は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）を使用するキャノーラ実生のリン取り込みを高めると同時に、硫黄酸化および硫黄取り込みを増加させることが分かった（Ｇｒａｙｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｍｉｄａ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：５２１−５２９，１９９１；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，ｖｏｌ．１５，Ｍａｙ  １８，１９９５）。
【００５０】
植物刺激物質：いくつかの微生物は、病原体の不在下で、植物の成長を刺激する物質を生成することができる。例えば、植物ホルモンの生成は、多くの植物関連微生物の特徴である。５つの従来の植物ホルモン、すなわち、オーキシン、エチレン、アブシジン酸、サイトカイニン、およびジベレリンの全てについて、二次代謝産物としての合成は、少なくとも１つの細菌および／または真菌種について実証された（概説として、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．７７，５：１５４８−１５５５，２０１１を参照されたい）。いくつかの微生物は、植物における植物ホルモン生成に影響を及ぼす二次代謝産物を生成することもできる。恐らく、最も知られている例は、根成長を促進することができる、ホルモンオーキシンである。他の例として、インドール酢酸（ＩＡＡ）を生成し、ＩＡＡの量を増加させ、植物バイオマス生成に対して重大な影響を及ぼすことが報告されているシュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）が挙げられる（Ｂｒｏｗｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，６８：１８１−１９７，１９７４）。例えば、Ｔｉｅｎらは（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：１０１６−１０２４，１９７９）、トウジンビエの根の周囲の養分溶液にアゾスピリルム・ブラシリエンス（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）を接種することは、新芽および根重量の増加、側根数の増加をもたらし、全ての側根は、根毛で密に被覆されていたことを報告した。ＩＡＡ、ジベレリン、およびキネチンの組み合わせを補充した植物は、アゾスピリラによって引き起こされるものと同様の側根の生成の増加を示した。これらの植物ホルモンおよび植物ホルモン様物質の生物学的重要性は完全に理解されないが、これらの微生物の成長刺激活性は、一般に、該微生物によるこれらの物質の生成に起因している。
【００５１】
加えて、他のホルモンならびに特定の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）および共因子ピロルキノリンキノン（ＰＱＱ）もまた植物成長を刺激する。例えば、いくつかの根圏細菌、例えば、細菌種バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびエンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）の株等は、ＶＯＣを放出することによって植物成長を促進する。最高レベルの成長促進は、２，３−ブタンジオール、および３−ヒドロキシ−２−ブタノン（アセトインとも称される）を、誘導型全身抵抗性の誘導因子として用いて観測された。共因子ＰＱＱは、植物において抗酸化剤として作用する、植物成長促進因子として説明されている。いくつかの報告は、ＰＱＱがいくつかの酵素の共因子である、例えば、抗真菌性活性および全身抵抗性の誘導に関与するため、効果が間接的であり得ることを示唆する。
【００５２】
ストレス制御因子：酵素１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）デアミナーゼを含む植物成長促進微生物は、植物エチレンレベルを減少させることによって植物の成長および発生を促進する。かかる微生物は、エチレン前駆体ＡＣＣを取り込み、それを２−オキソブタノエートおよびＮＨ３に変換する。例えば、植物病原性細菌の効果からのストレス、ポリ芳香族炭化水素からのストレス、Ｃａ２＋およびＮｉ２＋等の重金属からのストレス、ならびに塩および干ばつからのストレス等のいくつかの種類のストレスが、ＡＣＣデアミナーゼ生成因子によって軽減されることが報告された。
【００５３】
加えて、ジャガイモの収量増加を誘導したいくつかのＰＧＰＭ株は、Ｆｅ３＋に結合する細胞外シデロホアを生成し、天然の微生物相の特定のメンバーに対する利用可能性を低下させることが報告された（Ｋｌｏｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：８８５−８８６，１９８０）。これらの根圏細菌は、膜結合したシデロホア受容体に結合することにより、それらの鉄の獲得を特異的に高める低分子量かつ高親和性の鉄キレート化微生物共因子を分泌する。いくつかのシュードモナスＰＧＰＭによって生成されるシデロホアのうちの１つは、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｔｏｖｏｒａ）（ジャガイモの軟根の原因生物）の成長を阻害するシュードバクチンとして知られている（例えば、Ｋｌｏｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：３１７−３２０，１９８０参照）。成長培地へのシュードバクチンの付加は、軟根感染を阻害し、ジャガイモ収量の著しい増加と共に、ジャガイモ植物の病原性真菌の数も低減した。ＰＧＰＭによる生物防除のシデロホア理論を支持する最も有力な証拠は、蛍光シュードモナスの蛍光色素を含むシデロホアの一類である、ピオベルジンを用いた研究から生じる［Ｄｅｍａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｉｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｗｉｎｋｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ１６７−１８７，１９８７］。シデロホア理論によると、ピオベルジンは、外膜シデロホア受容体の選択的認識に起因する、特定の機能的株特異性を実証する（Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：４４３−４５０，１９８９）。
【００５４】
本発明の単離した培養物
本開示の実施例部分でより詳細に説明されるとおり、出願人は、植物成長および植物収量の有効な促進因子である、いくつかの新規の微生物を発見した。多くの場合、単離した微生物は、いくつかの植物病原性疾患の発生を抑制することにおいても有効である。微生物単離株は、米国全体のいくつかの場所から採取された環境試料から得られる約５，０００微生物株のプールから選択された。微生物の最初の選択は、微生物が植物根をコロニー形成し、植物との相互作用に重要であると考えられる化学化合物および酵素を生成する能力に基づいた。微生物は、インビトロ拮抗作用アッセイにおいて、様々な真菌性植物病原体の発生を抑制する能力について、バイオアッセイも行った。次に選択された細菌性微生物を、市販のコムギおよびトウモロコシ品種に対して、微生物株が植物成長を促進する能力、および種子生産力を保つ能力について、温室研究においてバイオアッセイした。
【００５５】
分類学的分析は、本開示に記載される代表的な微生物が、細菌属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、およびペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）と密接に関連することをさらに決定した。
【００５６】
生物材料の寄託
本開示に記載される微生物株の精製培養物は、特許手続きの目的で、ブタペスト条約およびそれに基づく規則（ブタペスト条約）に従って、１８１５Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ  ６１６０４，ＵＳＡにある農業研究サービス系統保存機関（Agricultural Research Service Culture Collection）（ＮＲＲＬ）に寄託した。これらの寄託物の受入番号は以下のとおりである。
【００５７】
【表１】
2018011600.tif 000002
【００５８】
微生物株は、培養物へのアクセスが、この特許出願の係属中に、特許庁長官によって、連邦規則第３７条１．１４章および合衆国法典第３５条１２２章の下、その資格があると決定された者に利用可能であることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を表す。寄託物は、対象の出願の対応出願またはその子孫が提出される国における外国特許法による要求に応じて入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性は、行政措置によって付与される特許権を制限して(in derogation of)対象発明を実施するライセンスを構成しないことを理解されたい。
【００５９】
本発明の好適な微生物は、寄託された株の特定特徴(identifying characteristics)、特に本明細書に記載される植物の成長および／または収量を促進することができる特定特徴、ならびに本明細書に記載される真菌性植物病原体の発生を抑制することができる特定特徴の全てを有する。特に、本発明の特定の微生物は、上記の寄託された微生物、およびそれに由来する株を指す。
【００６０】
微生物学的組成物
単離した微生物株またはその培養物を含む本発明の微生物組成物は、多様な形態を取ることができ、静置培養物、全培養物、細胞の保存ストック、菌糸体および／または菌糸（特にグリセロールストック）、寒天ストリップ、グリセロール／水中の保存寒天プラグ、凍結乾燥ストック、および濾紙または穀物種子の上に乾燥させた凍結乾燥物または菌糸体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の別の場所で定義されるとおり、「単離した培養物」または文法的相当語句は、この開示および当該技術分野において使用されるとき、培養物に関する言及が、培養液、ペレット、剥離物(scraping)、乾燥試料、凍結乾燥物、または切片（例えば、菌糸もしくは菌糸体）；または単一の型の生物を含むプレート、紙、フィルター、マトリックス、ストロー、ピペットもしくはピペット先端、繊維、針、ゲル、綿棒、管、バイアル、粒子等の支持体、容器、もしくは培地を意味すると理解される。本発明では、微生物拮抗薬の単離した培養物は、培養液、もしくは剥離物、ペレット、乾燥調製物、凍結乾燥物、もしくは微生物の切片、または他の生物の不在下で、微生物を含む支持体、容器、もしくは培地である。
【００６１】
本開示は、本発明の少なくとも１つの単離した微生物株またはその培養物、および担体を含む組成物をさらに提供する。担体は、増加した安定性、湿潤性、分散性等の多様な特性を付与する多数の担体のうちの任意の１つ以上であり得る。非イオン性またはイオン性界面活性剤であり得る天然もしくは合成界面活性剤等の湿潤剤、またはそれらの組み合わせは、本発明の組成物に含まれ得る。油中水乳剤を使用して、本発明の少なくとも１つの単離した微生物を含む組成物を製剤することもできる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４８５，４５１号参照）。調製され得る適切な製剤として、湿潤性粉末、顆粒、ゲル、寒天ストリップもしくはペレット、増粘剤および同様物、マイクロカプセル化粒子および同様物、水性流動体(aqueous flowables)、水性懸濁液、油中水乳剤等の液体が挙げられる。この製剤は、穀物またはマメ製品（例えば、穀粒もしくは豆、穀物もしくは豆に由来するブロスもしくは粉）、デンプン、糖、または油を含み得る。担体は、農業用担体であり得る。ある好適な実施形態では、担体は種子であり、組成物は、種子の上に適用もしくはコーティングされ得るか、または種子を飽和させ得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、農業用担体は、土壌または植物成長培地であり得る。使用され得る他の農業用担体として、水、肥料、植物系油、湿潤剤、またはそれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、農業用担体は、珪藻土、ローム(loam)、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種嚢(seed case)、他の植物および動物生成物等の固体、または組み合わせであり得、顆粒、ペレット、または懸濁液を含む。前述の成分のいずれかの混合物は、限定されないが、ペスタ（粉およびカオリン粘土）、ローム、砂、または粘土中の寒天もしくは粉系ペレット等の担体としても企図される。製剤は、培養した生物の食物源、例えばオオムギ、コメ、または他の生物学的材料、例えば種子、植物部分、サトウキビバガス、穀物処理からの外殻もしくは茎、粉末植物材料（「庭ごみ」）または建設現場廃棄物からの木材、のこぎり塵、または紙、布地、もしくは木材のリサイクルからの小繊維を含み得る。他の適切な製剤は、当業者に知られるであろう。
【００６３】
液体、例えば、溶液または懸濁液の形態において、本発明の微生物は、水または水溶液に混合または懸濁され得る。適切な液体希釈剤または担体として、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が挙げられる。
【００６４】
固体組成物は、泥炭、コムギ、ブラン、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、低温殺菌した土壌等の適切に分割された固体担体中および該担体上に本発明の微生物を分散させることにより調製され得る。かかる製剤が湿潤性粉末として使用されるとき、非イオン性、アニオン性、両性、またはカチオン性分散剤および乳化剤等の生体適合性分散剤を使用することができる。
【００６５】
好適な実施形態では、本明細書に企図される組成物は、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシ等の作物植物の成長および収量を高め、十分な量で使用されると、微生物肥料として作用する。これらの組成物は通常、他の生物肥料薬と同様、植物に肥料焼けを起こすことや植物を損傷することがないため、高い安全性を有することができる。
【００６６】
本開示全体で詳細に記載されるとおり、植物成長および植物収量の増強は、本発明の微生物組成物のうちの１つ以上を、宿主植物または宿主植物の部分に適用することにより生じ得る。これらの組成物は、未処理の対照におけるものと比較して、植物の成長または収量を増強するために有効な量で適用され得る。活性成分は、植物に適用されるとき、標的植物の成長を増強するために十分な濃度で使用される。当業者に明らかとなるように、有効な濃度は、例えば、（ａ）植物または農産物の種類、（ｂ）植物または農産物の生理学的状態、（ｃ）植物または農産物に影響する病原体の濃度、（ｄ）植物または農産物上の病害の種類、（ｅ）気候条件（例えば、温度、湿度）、および（ｆ）植物の病気等の様々な要因に応じて異なり得る。本発明によると、典型的な濃度は、１×１０２ＣＦＵ／ｍＬ担体より高い濃度である。好適な濃度は、約１×１０４〜約１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの範囲、例えば、１×１０６〜１×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲の濃度である。より好適な濃度は、担体（液体組成物）１ミリリットル当たり、または担体（乾燥製剤）１グラム当たり約３７．５〜約１５０ｍｇの乾燥細菌質量の濃度である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物中の微生物のうちの１つ以上の量は、最終製剤ならびに利用される植物または種子のサイズまたは種類に応じて異なり得る。好ましくは、組成物中の１つ以上の微生物は、製剤全体の約２％ｗ／ｗ〜約８０％ｗ／ｗで存在する。より好ましくは、この組成物に用いられる１つ以上の微生物は、製剤全体の重量で約５％ｗ／ｗ〜約６５％ｗ／ｗ、および最も好ましくは約１０％ｗ／ｗ〜約６０％ｗ／ｗである。
【００６８】
当業者に理解されるように、本発明の微生物組成物は、散布、コーティング、注入、塗擦、ローリング、浸漬、噴霧、もしくはブラッシング等の多様な従来の方法、または処理される標的植物を著しく傷害しない任意の他の適切な技術を使用して標的植物に適用され得る。特定の好適な方法は、成長培地または土壌への微生物細胞の懸濁液の接種、および微生物細胞および／または胞子での植物種子のコーティングを含む。
【００６９】
典型的に、本発明の組成物は、化学的に不活性であり、したがって、適用計画の任意の他の構成要素と実質的に適合性である。かかる化合物または物質は、それらが生体適合性である限り、植物成長に作用する物質、例えば、肥料、植物成長調整物質等と組み合わせて用いてもよい。それらは、例えば、除草剤、殺線虫剤、殺真菌剤、殺昆虫剤等の生体適合性殺虫活性剤と組み合わせて使用することもできる。
【００７０】
市販の製剤中およびそれらの製剤から調製される使用形態で生物肥料として使用されるとき、本発明による活性微生物株および組成物は、共力剤(synergist)との混合物の形態でさらに存在することができる。共力剤は、付加される該共力剤がそれ自体で活性であることを必要とせずに、活性組成物の活性を増加させる化合物である。
【００７１】
市販の製剤中およびそれらの製剤から調製される使用形態で生物肥料として使用されるとき、本発明による活性微生物株および組成物は、植物の生息地内、植物の部分の表面上、または植物組織への適用後に、活性組成物の分解を低減する、阻害剤との混合物の形態でさらに存在することができる。
【００７２】
本発明による活性微生物株および組成物は、それ自体で、またはそれらの製剤において、例えば作用のスペクトルを広げるため、またはこのように殺虫剤への抵抗性の発生を予防するために、既知の肥料、殺ダニ剤、殺菌剤、殺真菌剤、殺昆虫剤、殺微生物剤、殺線虫剤、殺虫剤、または任意のそれらの組み合わせとの混合物として使用することもできる。多くの場合、相乗効果は、すなわち、混合物の活性が個別の成分の活性を超え得るという結果になる。他の既知の活性化合物、例えば、成長調節剤、毒性緩和剤(safener)、および／または情報物質(semiochemical)等との混合物も企図される。
【００７３】
本発明の好適な実施形態では、組成物は、少なくとも１つの化学肥料または生物学的肥料をさらに含み得る。組成物中に用いられる少なくとも１つの化学肥料または生物学的肥料の量は、最終製剤ならびに処理される植物および種子のサイズに応じて異なり得る。好ましくは、この用いられる少なくとも１つの化学肥料または生物学的肥料は、製剤全体に基づいて約０．１％ｗ／ｗ〜約８０％ｗ／ｗである。より好ましくは、少なくとも１つの化学肥料または生物学的肥料は、約１％ｗ／ｗ〜約６０％ｗ／ｗ、および最も好ましくは約１０％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗの量で存在する。
【００７４】
本発明の微生物組成物は、好ましくは、少なくとも１つの生物学的肥料を含む。本明細書での使用に適切であり、植物の成長および／収量を促進するための本発明の微生物組成物に含まれ得る例示の生物学的肥料として、微生物、動物、細菌、真菌、遺伝物質、植物、および生きている生物の天然産物(natural product)が挙げられる。これらの組成物中で、本発明の微生物は、追加の生物との製剤化に先行して単離される。例えば、限定されないが、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アンペロマイセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、コルディセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオマイセス（Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エクソフィリア（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、ヘルバスピリルム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マリアンナエ（Ｍａｒｉａｎｎａｅａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃｕｓ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種等の微生物は、本発明の微生物と共に組成物中に提供され得る。米国特許出願第２００３０１７２５８８Ａ１号、第２００３０２１１１１９Ａ１号、米国特許第７，０８４，３３１号、第７，０９７，８３０号、第７，８４２，４９４号、ＰＣＴ出願第２０１０１０９４３６Ａ１号に開示される細菌微生物と組み合わせた、本発明による微生物組成物の使用も特に好ましい。
【００７５】
本発明の好適な実施形態では、組成物は、少なくとも１つの化学殺虫剤または生物殺虫剤をさらに含み得る。組成物中に用いられる少なくとも１つの化学殺虫剤または生物殺虫剤の量は、最終製剤ならびに処理される植物および種子のサイズに応じて異なり得る。好ましくは、この用いられる少なくとも１つの化学殺虫剤または生物殺虫剤は、製剤全体に基づいて約０．１％ｗ／ｗ〜約８０％ｗ／ｗである。より好ましくは、少なくとも１つの化学殺虫剤または生物殺虫剤は、約１％ｗ／ｗ〜約６０％ｗ／ｗ、および最も好ましくは約１０％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗの量で存在する。
【００７６】
多様な化学殺虫剤は、当業者に明らかであり、使用されてもよい。例示の化学殺虫剤として、カルバミン酸塩、有機リン酸塩、有機塩素化合物、およびピレスロイドのクラスのものが挙げられる。限定されないが、ベノミル、ボラックス、カプタホール、カプタン、クロロタロニル、銅を含む製剤等の化学防除剤；ジクロン、ジクロラン、ヨード、亜鉛を含む製剤；限定されないが、ブラスチジン、シモキサニル、フェナリモール、フルシラゾール、ホルペット、イマザリル、イポルジオン、マネブ、マノコゼブ、メタラキシル、オキシカルボキシン、マイクロブタニル、オキシテトラサイクリン、ＰＣＮＢ、ペンタクロロフェノール、プロクロラズ、プロピコナゾール、クノメチオナート、亜ヒ酸塩ナトリウム、ＤＮＯＣナトリウム、次亜塩素酸塩ナトリウム、フェニルフェネートナトリウム、ストレプトマイシン、硫黄、テブコナゾール、テルブトラゾール、チアベンダゾレル、チオフェネート−メチル、トリアジメホン、トリシクラゾール、トリホリン、バリジマイシン、ビンクロゾリン、ジネブ、およびジラム等のエルゴステロール生合成を阻害する殺真菌剤も含まれる。
【００７７】
本発明の微生物組成物は、好ましくは、少なくとも１つの生物殺虫剤を含む。本明細書での使用に適切であり、植物病原性疾患を予防するための本発明の微生物組成物に含まれ得る例示の生物殺虫剤として、微生物、動物、細菌、真菌、遺伝物質、植物、および生きている生物の天然産物が挙げられる。これらの組成物中で、本発明の微生物は、追加の生物との製剤化に先行して単離される。例えば、限定されないが、アンペロマイセス（Ａｍｐｅｌｏｍｙｃｅｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、コルディセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオマイセス（Ｄａｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エクソフィリア（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）、マリアンナエ（Ｍａｒｉａｎｎａｅａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)の種等の微生物は、本発明の微生物と共に組成物中に提供され得、ムスコドール（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ）属の株が特に好ましい。米国特許第７，５１８，０４０号、米国特許第７，６０１，３４６号、米国特許第６，３１２，９４０号に開示される微生物拮抗薬と組み合わせた、本発明による微生物組成物の使用も特に好ましい。
【００７８】
組成物中で本発明の微生物株および組成物と組み合わせることができる真菌の例としては、限定なく、ムスコドール（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ）種、アスシェルソニア・アレロディス（Ａｓｃｈｅｒｓｏｎｉａ  ａｌｅｙｒｏｄｉｓ）、ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）（「白色ムスカリン」）、ボーベリア・ブロングニアルチ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、クラドスポリウム・ハーバルム（Ｃｈｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、コルディセプス・クラブラタ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｌａｖｕｌａｔａ）、コルディセプス・エントモリザ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｅｎｔｏｍｏｒｒｈｉｚａ）、コルディセプス・ファシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｆａｃｉｓ）、コルディセプス・グラシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、コルディセプス・メロランテ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｅｌｏｌａｎｔｈａｅ）、コルディセプス・ミルメコフィラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｙｒｍｅｃｏｐｈｉｌａ）、コルディセプス・ラヴェネリ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｒａｖｅｎｅｌｉｉ）、コルディセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、コルディセプス・スフェコセファラ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｐｈｅｃｏｃｅｐｈａｌａ）、コルディセプス・サブセッシリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｕｂｓｅｓｓｉｌｉｓ）、コルディセプス・ウニラテラリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）、コルディセプス・バリアビリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、コルディセプス・ワシントネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）、クリシノマイセス・クラボスポラス（Ｃｕｌｉｓｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｏｓｐｏｒｕｓ）、エントモファガ・グリリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｇｒｙｌｌｉ）、エントモファガ・マイマイガ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｍａｉｍａｉｇａ）、エントモファガ・ムスカ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｍｕｓｃａｅ）、エントモファガ・プラキシブリ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ  ｐｒａｘｉｂｕｌｌｉ）、エントモフトラ・プルテラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐｌｕｔｅｌｌａｅ）、フザリウム・ラテリチウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）、ヒルステラ・シトリホルミス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、ヒルステラ・トムプソニ（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｔｈｏｍｐｓｏｎｉ）、メタリジウム・アニソプリア（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）（「緑色ムスカリン」）、メタリジウム・フラビリド（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｆｌａｖｉｒｉｄｅ）、ムスコドール・アルブス（Ｍｕｓｃｏｄｏｒ  ａｌｂｕｓ）、ネオジギテス・フロリダナ（Ｎｅｏｚｙｇｉｔｅｓ ｆｌｏｒｉｄａｎａ）、ノムラエア・リレイ（Ｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｉｌｅｙｉ）、パエシロマイセス・ファリノサス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）、パエシロマイセス・フモソロセウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ）、パンドラ・ネオアフィジス（Ｐａｎｄｏｒａ  ｎｅｏａｐｈｉｄｉｓ）、トリポクラジウム・シリンドロスポラム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｉｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ）、バーティシリウム・レカニ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）、ゾオフトラ・ラジカンス（Ｚｏｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｄｉｃａｎｓ）、およびラッカリア・ビコロル（Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ）等の菌根種が挙げられる。他の真菌殺虫性種は、当業者に明らかとなるであろう。
【００７９】
本発明は、有効な量の多様な慣習的製剤を、土壌（すなわち、畝内）、植物の部分（すなわち、潅注）のいずれか、または植栽前の種子上（すなわち、種子コーティングまたは粉衣）に適用することによって、植物を処理する方法も提供する。慣習的製剤として、溶液、濃縮乳剤、湿潤性粉末、濃縮懸濁剤、可溶性粉末、顆粒、濃縮懸濁剤−乳剤、活性化合物を含浸させた天然および合成材料、およびポリマー物質中の極微細制御放出カプセルが挙げられる。本発明のある実施形態では、微生物組成物は、調製済みの(ready-to-use)製剤で入手可能であるか、または使用時に一緒に混合されるかのいずれかである粉末中で製剤される。いずれかの実施形態では、粉末は、植栽に先行するか、または植栽時に土壌と混合され得る。代替実施形態では、植物成長促進剤または生物防除剤のいずれか一方または両方は、処理時に一緒に混合される液体製剤である。当業者は、有効な量の本発明の組成物が、組成物の最終製剤ならびに植物のサイズまたは処理される種子のサイズに依存することを理解する。
【００８０】
出願の最終製剤および方法に応じて、１つ以上の適切な添加剤を、本発明の組成物に導入することもできる。カルボキシメチルセルロース等の接着剤、粉末、顆粒、またはラテックスの形態の天然および合成ポリマー、例えば、アラビアガム、チチン、ポリビニルアルコール、およびポリビニル酢酸塩、ならびにセファリンおよびレシチン等の天然リン脂質、および合成リン脂質は、本組成物に添加され得る。
【００８１】
好適な実施形態では、微生物組成物は、単一の安定した溶液、または乳剤、または懸濁剤中で製剤される。溶液の場合、活性化学化合物は、典型的に、生物学的薬剤が添加される前に溶媒中に溶解される。適切な液体溶媒として、キシレン、トルエン、またはアルキルナフタレン等の石油系芳香油、シクロヘキサンまたはパラフィン等の脂肪族炭化水素、例えば、石油留分、鉱物および植物油、ブタノールまたはグリコール等のアルコール、ならびにそれらのエーテルおよびエステル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、またはシクロヘキサノン等のケトン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の強い極性溶媒が挙げられる。乳剤または懸濁剤の場合、液体培地は水である。一実施形態では、化学薬剤および生物学的薬剤は、別個の液体中に懸濁され、適用時に混合される。懸濁剤の好適な実施形態では、化学薬剤および生物学的薬剤は、適度に長い貯蔵寿命を呈する、調製済みの製剤中で組み合わされる。使用時に、液体は、噴霧され得るか、または霧化スプレーとして葉に適用され得るか、または作物の植栽時に畝内に適用され得る。液体組成物は、有効な量で、種子の発芽前に種子上（すなわち、種子コーティングまたは粉衣）または土壌（すなわち、畝内）に導入され得るか、または限定されないが、点滴灌漑、スプリンクラー、土壌注入、または土壌潅注を含む、当該技術分野において既知の多様な技術を用いることによって、根と接触している土壌に直接導入され得る。
【００８２】
任意選択により、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ならびにクエン酸およびアスコルビン酸等の有機酸、塩酸または硫酸等の無機酸を含む、安定剤および緩衝剤を添加することができる。殺生物剤を添加することもでき、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤および安息香酸の誘導体、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸を含み得る。
【００８３】
病原体
当該技術分野における熟練者は、本発明による方法および組成物が、原則として任意の植物病原体または任意の植物病原性疾患の発生を抑制するために適用され得ることを認識するであろう。本発明が特定の培養物の種類または細胞の種類に限定されることは意図されない。例えば、複雑な形態の分化、フィラメント形成、胞子形成等を受ける微生物細胞を、本発明の方法および組成物に使用することもできる。
【００８４】
本発明の方法および材料の適用に適切な植物病原性疾患の例として、広範な病原性真菌により引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、好ましくは、農業、園芸、生物燃料分子および他の化学物質の生成のための植物バイオマス、ならびに／または林業に重要であるか、または関心のある病原性真菌に対して適用される。病原性シュードモナス種（例えば、シュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｊｉｏｓａ）；ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、カンキツカイヨウ病菌（ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種（例えば、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｈａｅｒｉａ）種、うどんこ病（子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、およびサビ菌（担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）等が特に興味深い。
【００８５】
関心のある植物病原体の非限定的な例として、例えば、アクレモニウム・ストリクトゥム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｔｕｍ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、アファノマイセス・エウテイチェス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アテリア・ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、アウレオバシジウム・プルラン（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、バイポラリス・ゼイコラ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｚｅｉｃｏｌａ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、カロネクトリア・キオテンシス（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｋｙｏｔｅｎｓｉｓ）、セファロスポリウム・マイディス（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍａｙｄｉｓ）、セルコスポラ・メジカギニス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、セルコスポラ・ソジナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ）、コレトトリクム・ココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｄｅｓ）、コレトトリクム・フラガリエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コニエラ・ジプロジエラ（Ｃｏｎｉｅｌｌａ  ｄｉｐｌｏｄｉｅｌｌａ）、コプリノプシス・サイクロモルビダ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｒｂｉｄａ）、コリネスポラ・カシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、クルブラリア・パレセンス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ）、シリンドロクラジウム・クロタラリアエ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｒｏｔａｌａｒｉａｅ）、ディプロカルポン・イアリアナム（Ｄｉｐｌｏｃａｒｐｏｎ  ｅａｒｌｉａｎｕｍ）、ディプロディア・ゴッシイナ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｇｏｓｓｙｉｎａ）、ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）種、エピコッカム・ニグラム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ）、エリシフェ・チコラセアルム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラムｆ種ツベロシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｔｕｂｅｒｏｓｉ）、フザリウム・プロリフェラタム種プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ  ｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・バーティシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ガノデルマ・ボニネンス（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、ゲオチルカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、グロメレラ・ツクマネンシス（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｔｕｃｕｍａｎｅｎｓｉｓ）、グギグナ���ジア・ビドウェリイ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｂｉｄｗｅｌｌｉｉ）、カバチエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、レプトスファエルリナ・ブリオシアナ（Ｌｅｐｔｏｓｈａｅｒｕｌｉｎａ  ｂｒｉｏｓｉａｎａ）、レプトトロキア・メヂカギニス（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｃｈｉａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、マクロフォミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、マグナポルテ・オリザエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、ミクロスファエラ・マンシュリカ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ）、モニリニア・フルクチコラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、マイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、マイコスファエレラ・フラガリアエ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）、ニグロスポラ・オリザエ（Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ  ｏｒｙｚａｅ）、オフィオストマ・ウルミ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉ）、ペクトバクテリウム・カロトヴォラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、ペリキュラリア・ササキイ（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ  ｓａｓａｋｉｉ）（担子菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ペロノスポラ・マンシュリカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ）、ファコスポラ・パチリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、フォマ・フォヴェアタ（Ｐｈｏｍａ  ｆｏｖｅａｔａ）、フォマ・メディカギニス（Ｐｈｏｍａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、フォモプシス腐敗病菌（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｌｏｎｇｉｃｏｌｌａ）、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）、フィトフトラ・エリスロセプティカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、フィトフトラ・フラガリエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、フィトフトラ・メディカギニス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・パルミボラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｌｍｉｖｏｒａ）、ポドスファエラ・ロイコトリカ（Ｐｏｄｏｓｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、シュードペジザ・メディカギニス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、プッチニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）亜種Ｔｒｉｔｉｃｉ（ＵＧ９９）、プッチニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ）、ピリキュラリア・グリセア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｇｒｉｓｅａ）、ピリキュラリア・オリーゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、ピチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、リゾクトニア・ゼアエ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｚｅａｅ）、ロゼリニア（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ）種、スクレロチニア・スク��ロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチニナ・トリフォリオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉｎａ  ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ）、スクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、セプトリア・グリシン（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、セプトリア・リコペルシシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、セトメラノッマ・ツルシカ（Ｓｅｔｏｍｅｌａｎｏｍｍａ  ｔｕｒｃｉｃａ）、スファエロテカ・マクラリス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｍａｃｕｌａｒｉｓ）、スポンゴスポラ・スブテラネア（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）種、シンチトリウム・エンドビオチカム（Ｓｙｎｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｕｍ）、テカフォラ（Ｔｈｅｃａｐｈｏｒａ）（アンジオソラス（Ａｎｇｉｏｓｏｒｕｓ））、チエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）、チレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、バーティシリウム・アルボアトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、ザントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、ザントモナス・オリーゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）が挙げられる。
【００８６】
本発明の好適な実施形態では、発明の方法および材料は、病原体アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、セルポスポラ・ベタ（Ｃｅｒｐｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔａｅ）、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）種、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ガノデルマ・ボニネンス（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）種、モノグラフェラ（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ）種、マイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、フィトフトラ・パルミボラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｌｍｉｖｏｒａ）、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、ピチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、担子菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）種、スクレロチニア・スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スタグノスポラ（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ）種、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、またはザントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）の発生を抑制することにおいて有用である。特定の好適な実施形態では、発明の方法および材料を使用して、商業上重要ないくつかの植物病原体の発生を抑制してもよく、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ） ＮＲＲＬ−５８８３、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ） ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−３９６８、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ） ＡＴＣＣ−１６１０６、スタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ） ＡＴＣＣ−２６３６９、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ） ＡＴＣＣ−３４１６７、およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種病原体が挙げられる。
【００８７】
種子コーティング製剤
特に好適な実施形態では、本発明の微生物組成物は、種子処理剤(seed treatment)として製剤される。種子は、混合、噴霧、またはそれらの組み合わせの従来の方法を使用し、正確、安全、かつ効率的に種子処理製品を種子に適用するように特異的に設計および製造される、処理アプリケーション装置の使用を介して、本明細書に開示される微生物組成物の１つ以上の層で実質的に均一にコーティングされ得ることが企図される。かかる装置は、回転コーター(coater)、ドラムコーター、流動床技術、噴流層、回転ミスト、またはそれらの組み合わせ等の様々な種類のコーティング技術を使用する。液体種子処理剤、例えば本発明の液体種子処理剤は、噴霧パターンを通って移動するにつれて、種子処理剤を種子の上に均等に分配することができる回転「噴霧器」ディスクまたは噴霧ノズルのいずれかを介して適用され得る。好ましくは、次に種子を混合し、追加の期間の間回転させて、追加の処理剤の分配および乾燥を達成する。種子を本発明の組成物でコーティングする前にプライム(prime)またはアンプライム(unprime)して、発芽および出現の均一性を増加させることができる。代替実施形態では、乾燥粉末製剤を移動する種子の上に計量し、完全に分配されるまで混合させることができる。
【００８８】
本発明の別の態様は、対象の微生物組成物で処理された種子を提供する。一実施形態は、本発明による微生物組成物でコーティングされた表面積の少なくとも一部分を有する種子を提供する。特定の実施形態では、微生物処理した種子は、１種子当たり約１０６〜約１０９の微生物胞子濃度または微生物細胞濃度を有する。種子は、１種子当たりより多くの胞子または微生物、例えば、１種子当たり１０１０、１０１１、または１０１２個の胞子を有してもよい。微生物胞子および／または細胞は、種子の上に自由にコーティングされ得るか、好ましくは、それらは種子の上にコーティングされる前に、液体または固体組成物中に製剤され得る。例えば、微生物を含む固体組成物は、固体担体が胞子または細胞懸濁液に含浸されるまで、固体担体を胞子の懸濁液と混合することによって調製することができる。次にこの混合物を乾燥させて、所望の粒子を得ることができる。
【００８９】
いくつかの他の実施形態では、本発明の固体または液体微生物組成物が、選択的除草剤の有害作用から種子を保護することができる機能性薬剤、例えば活性炭素、養分（肥料）、および生成物の発芽および品質を改善することができる他の薬剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むことが企図される。
【００９０】
当該技術分野において既知の種子をコーティングする方法および組成物は、それらが本発明の実施形態のうちの１つを付加することによって修正されるときに特に有用であり得る。それらの適用のためのかかるコーティング法および装置は、例えば、米国特許第５，９１８，４１３号、第５，５５４，４４５号、第５，３８９，３９９号、第４，７５９，９４５号、および第４，４６５，０１７号に開示されている。種子コーティング組成物は、例えば、特に米国特許出願第２０１００１５４２９９号、米国特許第５，９３９，３５６号、第５，８７６，７３９号、第５，８４９，３２０号、第５，７９１，０８４号、第５，６６１，１０３号、５，５８０，５４４号、第５，３２８，９４２号、第４，７３５，０１５号、第４，６３４，５８７号、第４，３７２，０８０号、第４，３３９，４５６号、および第４，２４５，４３２号に開示されている。
【００９１】
多様な添加物を、本発明の組成物を含む種子処理製剤に添加することができる。結合剤を添加することができ、好ましくは、コーティングされる種子に対する植物毒性作用なしに、天然または合成であり得る接着ポリマーで構成されるものを含む。結合剤は、酢酸ポリビニル；酢酸ポリビニルコポリマー；エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールコポリマー；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、加工デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサンを含む、ポリサッカリド；脂肪；油；ゼラチンおよびゼインを含むタンパク質；アラビアガム；シェラックス；塩化ビニリデンおよび塩化ビニリデンコポリマー；リグノスルホン酸カルシウム；アクリルコポリマー；ポリビニルアクリレート；ポリエチレンオキシド；アクリルアミドポリマーおよびコポリマー；ポリヒドロキシエチルアクリレート；メチルアクリルアミドモノマー；およびポリクロロプレンから選択され得る。
【００９２】
ニトロソとして分類される有機クロモフォア；ニトロ；モノアゾ、ビサゾ、およびポリアゾを含むアゾ；アクリジン、アントラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアン、チアジン、チアゾール、トリアリルメタン、キサンテンを含む、多様な着色剤のいずれかを用いてもよい。添加され得る他の添加剤は、鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン、および亜鉛の塩等の微量栄養素が挙げられる。ポリマーまたは他の防塵剤を適用して、種子表面に処理剤を維持することができる。
【００９３】
いくつかの特定の実施形態では、微生物細胞または胞子に加えて、コーティングは、接着剤の層をさらに含むことができる。接着剤は、非毒性、生分解性、および接着性であるべきである。かかる材料の例として、酢酸ポリビニル；酢酸ポリビニルコポリマー；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールコポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、およびヒドロキシメチルプロピルセルロース等のセルロース；デキストリン；アルギン酸塩、糖；糖蜜；ポリビニルピロリドン；ポリサッカリド；タンパク質；脂肪；油；アラビアガム；ゼラチン；シロップ；およびデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例は、例えば、米国特許第７，２１３，３６７号、および米国特許出願第２０１００１８９６９３号において見出すことができる。
【００９４】
様々な添加剤、例えば、接着剤、分散剤、界面活性剤、ならびに栄養素および緩衝材料を、種子処理製剤に含めることもできる。他の従来の種子処理添加剤は、コーティング剤、湿潤剤、緩衝剤、および多糖を含むが、これらに限定されない。少なくとも１つの農業的に許容される担体を、水、固体、または乾燥粉末等の種子処理製剤に添加することができる。この乾燥粉末は、炭酸カルシウム、ジプサム、バーミキュライト、タルク、腐植土、活性炭、および様々なリン化合物等の多様な材料に由来し得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、種子コーティング組成物は、活性構成成分と組み合わされて、種子へのその適用を促進する、有機または無機、天然または合成構成成分である、少なくとも１つの充填剤を含み得る。好ましくは、充填剤は、粘土、天然または合成ケイ酸、シリカ、樹脂、ワックス、固体肥料（例えば、アンモニウム塩）、カオリン、粘土、タルク、石灰、石英、アタパルジャイト、モントモリロナイト、ベントナイトもしくは珪藻土、または特定のアルミニウムもしくはケイ酸マグネシウム中のシリカ、アルミナ、またはケイ酸塩等の合成鉱物である。
【００９６】
種子処理製剤は、以下の成分のうちの１つ以上をさらに含んでよい：地下のみで作用する化合物を含む他の殺虫剤、カプタン、チラム、メタラキシル、フルジオキソニル、オキサジキシル、およびそれらの材料のそれぞれの異性体等を含む殺真菌剤；グリフォセート、カルバメート、チオカルバメート、アセトアミド、トリアジン、ジニトロアニリン、グリセロールエーテル、ピリダジノン、ウラシル、フェノキシ、尿素、および安息香酸から選択される化合物を含む除草剤；ベンゾキサジン、ベンジドリル誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアリルジクロロアセトアミド、様々なジハロアシル、オキサゾリジニル、およびチアゾリジニル化合物、エタノン、無水ナフタル化合物、およびオキシム誘導体等の除草剤毒性緩和剤；化学肥料；生物学的肥料；および他の天然に存在するか、または組み換え細菌およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、グロムス（Ｇｌｏｍｕｓ）、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）属および菌根菌からの真菌等の生物防除剤。これらの成分は、分離層として種子上に添加され得るか、あるいは本発明の種子コーティング組成物の一部として添加されてもよい。
【００９７】
好ましくは、種子処理に使用される新規の組成物または他の成分の量は、種子の発芽を阻害しないか、または種子への植物毒性損傷を引き起こしてはならない。
【００９８】
本発明において種子を処理するために使用される製剤は、懸濁液；乳剤；水性培地（例えば、水）中の粒子のスラリー；湿潤性粉末；湿潤性顆粒（乾燥流動性）；および顆粒の形態を取り得る。懸濁液またはスラリーとして製剤される場合、製剤中の活性成分の濃度は、好ましくは、約０．５重量％〜約９９重量％（ｗ／ｗ）、好ましくは５〜４０％であるか、または他の方法で当業者によって製剤される。
【００９９】
上述のとおり、他の従来の非活性または不活性成分を製剤に組み込むことができる。かかる不活性成分としては、従来の粘着剤；例えば、種子処理において使用するための複合分散剤／粘着剤メチルセルロース；ポリビニルアルコール；レシチン、ポリマー分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル）、増粘剤（例えば、粘度を向上させ、粒子懸濁液の定着を低減する粘土増粘剤）；乳化安定剤；界面活性剤；抗凍結化合物（例えば、尿素）、染料、着色剤等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらなる不活性成分は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ`ｓ，ｖｏｌ．１，″Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，″ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６において見出すことができる。本発明において有用なさらなる不活性成分は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ′ｓ，ｖｏｌ．２，″Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，″ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６において見出すことができる。
【０１００】
本発明のコーティング製剤は、容器（例えば、ボトルまたはバッグ）、機械的適用、回転、噴霧、および浸漬を含むが、これらに限定されない多様な方法によって種子に適用され得る。多様な活性または不活性材料は、本発明による微生物組成物と種子を接触させるために使用することができ、例えば、従来のフィルムコーティング材料は、水系フィルムコーティング材料、例えば、ＳＥＰＩＲＥＴ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｊ．）およびＯＰＡＣＯＡＴ（商標）（Ｂｅｒｗｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐ．Ａ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
種子の処理に使用される本発明による組成物の量は、種子の種類、活性成分の種類に応じて異なるが、処理は、農業的に有効な量の本発明の組成物と種子を接触させることを含む。上述のとおり、有効な量とは、有益または所望の結果に作用するために十分な不活性組成物の量を意味する。有効な量は、１回以上の投与で投与されることができる。
【０１０２】
コーティング層に加えて、種子は、以下の成分のうちの１つ以上で処理されてよい：殺真菌剤および除草剤を含む他の殺虫剤；除草剤毒性緩和剤；肥料および／または生物防除剤。これらの成分は、分離層として添加され得るか、あるいはコーティング層に添加されてもよい。
【０１０３】
本発明の種子コーティング製剤は、流動床技術、ローラーミル法、回転式静的種子処理器、およびドラムコーター等の多様な技術および機械を使用して、種子に適用され得る。噴流層等の他の方法も有用であり得る。種子は、コーティング前に事前に定寸され得る。コーティング後、通常は種子を乾燥させ、次に定寸機に移す。かかる手順は、当該技術分野において既知である。
【０１０４】
微生物処理した種子を、フィルムオーバーコーティングで被包し、コーティングを保護してもよい。かかるオーバーコーティングは、当該技術分野において既知であり、流動床およびドラムフィルムコーティング技術を使用して適用され得る。
【０１０５】
本発明の別の実施形態では、本発明による組成物は、固体マトリックスプライミングの使用によって種子の上に導入され得る。例えば、発明の組成物の量は、固体マトリックス材料と混合することができ、次に種子を、固体マトリックス材料と一定期間接触するように置いて、組成物を種子に導入することができる。次に種子は、任意選択により個体マトリックス材料から分離され、保存または使用され得るか、または固体マトリックス材料および種子の混合物を、保存するか、または直接植栽することができる。本発明に有用な個体マトリックス材料として、ポリアクリルアミド、デンプン、粘土、シリカ、アルミナ、土壌、砂、ポリ尿素、ポリアクリレート、または発明の組成物を一定期間吸収または吸着し、その組成物を種子中またはその上に放出することができる任意の他の材料が挙げられる。発明の組成物および固体マトリックス材料は、互いに適合性であることを保証することが有用である。例えば、固体マトリックス材料は、適切な速度で、例えば、数分、数時間、または数日の期間に渡って放出することができるように選択されるべきである。
【０１０６】
原則として、植物を形成するように発芽することができる任意の植物種子は、本発明により処理され得る。適切な種子として、穀物、コーヒー、アブラナ属の(cole)作物、繊維作物、花、果物、豆、油作物、木、塊茎作物、野菜、ならびに単子葉植物および双子葉植物種の種子が挙げられる。好ましくは、作物種子として、マメ、ニンジン、トウモロコシ、綿、草、レタス、ピーナッツ、コショウ、ジャガイモ、菜種、コメ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、およびトマト種子が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、オオムギまたはコムギ（春小麦または冬小麦）種子を、本組成物でコーティングする。
【０１０７】
本発明による微生物組成物の調製
微生物の培養物は、当該技術分野において既知の標準的静的乾燥および液体発酵技術を使用して、発明の微生物組成物中で使用するために調製され得る。成長は、一般にバイオリアクター内で生じる。
【０１０８】
バイオリアクターは、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイスまたはシステムを指す。本明細書に記載されるとおり、バイオリアクターは、発明の微生物を含む微生物が成長させられ得る容器である。バイオリアクターは、微生物を成長させるための任意の適切な形状または寸法であってよい。バイオリアクターは、１０ｍＬ〜リットル〜立方メートルの寸法および規模の範囲であってよく、ステンレス鋼または当該技術分野において既知であり使用される任意の他の適切な材料で作製され得る。バイオリアクターは、バッチ(batch)型バイオリアクター、フェドバッチ(fed batch)型、または連続型バイオリアクターであってよい（例えば、連続攪拌反応器）。例えば、バイオリアクターは、微生物を成長および収穫するための微生物学の分野において既知であり使用される、ケモスタットであってよい。バイオリアクターは、任意の商業サプライヤーから得られてよい（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｓｅｎｊｏ＆Ｍｅｒｃｈｕｋ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５も参照）。
【０１０９】
少規模操作の場合、バッチバイオリアクターを使用して、例えば、新たなプロセスを試験および開発してよく、連続操作に変換することができないプロセスに使用されてもよい。
【０１１０】
バイオリアクター内で成長させられる微生物は、懸濁または固定され得る。バイオリアクター内の成長は、概して、好気条件下、成長に適切な温度およびｐＨにおいてである。発明の生物の場合、細胞成長は、５〜３７℃の温度で達成することができ、好適な温度は、１５〜３０℃、１５〜２８℃、２０〜３０℃、または１５〜２５℃の範囲である。栄養培地のｐＨは、４．０〜９．０の間で変化し得るが、好適な操作範囲は、通常、ｐＨ４．０〜７．０、または４．５〜６．５、またはｐＨ５．０〜６．０でわずかに酸性〜中性である。通常、最大細胞収量は、接種後２０〜７２時間で得られる。
【０１１１】
本発明の微生物の培養に最適な条件は、当然のことながら、特定の株に依存する。しかしながら、選択プロセスにおいて適用される条件および大部分の微生物の一般要件によって、当業者は、必須の栄養素および条件を決定することができるであろう。微生物は、典型的に、炭素、窒素、および微生物によって同化され、効率的な細胞成長を支援することができる無機塩を含む、培地上の好気性液体培養物中で成長させられる。好適な炭素源は、グルコース等のヘキソースであるが、アミノ酸等の容易に同化される他の源が代用されてもよい。多くの無機およびタンパク質性材料は、成長プロセスにおける窒素源として使用されてもよい。好適な窒素源は、アミノ酸および尿素であるが、その他として、気体アンモニア、硝酸およびアンモニウムの無機塩、ビタミン、プリン、ピリミジン、酵母抽出物、牛肉抽出物、プロテオースペプトン、大豆粉(soybean meal)、カゼインの加水分解物、蒸留器の溶解物等である。栄養培地に組み込まれ得る無機ミネラルは、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、銅、コバルト、カリウム、ナトリウム、モリブデン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、ホウ酸塩、および同様のイオンである。それに限定されないが、真菌株にはジャガイモデキストロース液体培地、細菌株にはＲ２Ａブロスプレミックスの使用が好適である。
【０１１２】
新規の植物品種
本発明の別の態様では、本発明の微生物内生菌を、内生微生物を含まない植物に人工的に導入することによって形成される、新規の植物である。本態様のいくつかの実施形態では、植物に導入される微生物内生菌は、植物成長促進活性、生物防除活性、または両活性の組み合わせを有する内生微生物であってよい。微生物内生菌を穀物草種に導入するために有効であることが以前に判明した多様な方法が、当該技術分野において既知である。かかる方法の例として、特に、米国特許出願第２００３０１９５１１７Ａ１号、米国特許出願第２００１００３２３４３Ａ１号、および米国特許第７，０８４，３３１号に記載されるものが挙げられる。前述の方法の多くが、本発明の新規植物の作成に有用であり得ることは、当業者に明らかとなるであろう。
【０１１３】
人工感染後、単離した内生微生物のＤＮＡ配列が、ＰＣＲによって増幅されることが好ましく、内生菌は、増幅されたＤＮＡ配列について相同性検索を行うことによって確認される。さらに、特定可能な手段を発現する外来遺伝子を、上述の内生微生物に導入することが好ましく、植物に感染する上述の内生微生物のコロニー形成は、外来遺伝子を使用する上記特定可能な手段によって確認される。
【０１１４】
本発明の方法に適切な植物
原則として、本発明による方法および組成物は、任意の植物種について展開され得る。単子葉植物ならびに双子葉植物種は、特に適切である。方法および組成物は、好ましくは、農業、園芸、液体燃料分子および他の化学物質を生成する際に使用されるバイオマスの生成、ならびに／または林業に重要であるか、または関心がある植物と共に使用される。
【０１１５】
したがって、本発明は、広範囲の植物、好ましくは、被子植物類および裸子植物類の群に関する高等植物に対する用途を有する。双子葉類および単子葉類の亜群の植物は、特に適切である。双子葉植物は、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、キク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）、バテス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、シキミ目（Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｉｄａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、モクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、アワ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、ナス目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎｔａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、サラセニア目（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、およびスミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）に属する。単子葉植物は、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ヤシ（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ラン目（Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、およびショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）に属する。裸子植物類の群に属する植物は、ソテツ類（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、イチョウ類（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、グネツム綱（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）、および針葉樹（Ｐｉｎａｌｅｓ）である。
【０１１６】
適切な種として、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、アナナス属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、メリケンカルカヤ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、オオカミナスビ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、カタランタス属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、キトルルス属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒー属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ダチュラ属（Ｄａｔｕｒａ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、コカ属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、フェスク属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、イチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランツス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、バラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ジャトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、ハッカ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、パニクム属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、パルセニウム（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、フレウム属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、トウダイグサ属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、スコポリア属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、エゾヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ユニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、ベラトラム属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ツルニチニチソウ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）のメンバーが挙げられる。
【０１１７】
本発明の方法および組成物は、好ましくは、農業、園芸、生物燃料分子および他の化学物質の生成のためのバイオマス、ならびに／または林業に重要であるか、または関心のある植物において使用される。非限定的な例として、例えば、パニカム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ミスカンサス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ミスカンサス）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、（エナジーケーン）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（コーン）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（大豆）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（綿）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）（パールミレット）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、エリアンサス（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、ウシクサ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ネピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バーミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（トールフェスク）スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（草原コードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ジャイアントリード）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギＸライ）、バンブー（Ｂａｍｂｏｏ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（サフラワー）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ジャトロファ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ひまし油）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（パーム油）、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）（デーツヤシ）、ユスラヤシモドキ（Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ  ｃｕｎｎｉｇｈａｍｉａｎａ）（キングパーム）、ジョオウヤシ（Ｓｙａｇｒｕｓ  ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ）（クイーンパーム）、イチネンアマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマニ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（ｃａｓｓａｙａ）、��マト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（レタス）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（茶）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（ストロベリー）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、バイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ）（トウガラシおよびピーマン）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）（タマネギ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）（メロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、トウナス（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（オピウムポピー）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ）、タキサン（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、オウカコウ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）、キナ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、カリフォルニアバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｌａｎａｔａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、ハイイヌガヤ（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、マオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ）、マオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ  ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｅｒｒａｔｕｍ）（トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）���、アカネグサ（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ  ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ）種（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ（Ｒｏｓａ）種（バラ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア種（ペチュニア）、ポインセチア（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）（ルピン）、海オートムギ（Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（オート）、ベントグラス（ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（コヌカグサ種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（アスペン）、マツ（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ（Ａｃｅｒ）種（カエデ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（バーリー）、ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクミギ（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー）、および球果植物が挙げられる。関心対象は、エネルギー作物と呼ばれるエネルギー生成のために成長させられる植物であり、例えば、パニカム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ミスカンサス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ミスカンサス）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（エナジーケーン）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ウシクサ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ネピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バーミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（トールフェスク）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（草原コードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）（ジャイアントリード）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（ライ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギＸライ）およ��タケ（Ｂａｍｂｏｏ）等のセルロース系エネルギー作物、ならびにトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（コーン）およびキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）等のデンプン系エネルギー作物、ならびにサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、デンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、およびモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（Ｌ．）サトウモロコシ（Ｍｏｅｎｃｈ）（スイートソルガム）等の糖系エネルギー作物、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（大豆）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（サフラワー）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ）（ジャトロファ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ひまし油）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（アフリカパーム油）、ヤシ（Ｅｌａｅｉｓ  ｏｌｅｉｆｅｒａ）（アメリカパーム油）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）（ココナッツ）、ナガミノアマナズナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）（野生アマ）、ナツフジ（Ｐｏｎｇａｍｉａ  ｐｉｎｎａｔａ）（ポンガム）、オレアエウロパエア（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）（オリーブ）、リナムウシタティッシマム（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）（アビシニアンケール）、およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）等の生物燃料生成エネルギー作物である。
【０１１８】
本明細書において付与される一般的な方法に関する論考は、例証目的のみが意図される。他の代替方法および実施形態は、この開示の検討時に当業者に明らかとなり、この出願の趣旨および範囲内に含まれるものとする。
【０１１９】
以下の実施例は、例証のために提供されるが、本発明を限定しないことも理解されたい。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：環境試料からの微生物の単離
超音波処理した根および連続希釈法を使用する胞子形成根圏細菌の特定。
以下の微生物は、以下に記載される「超音波処理した根、連続希釈」法を使用して単離した：ＳＧＩ−０２６−Ｇ０６およびＳＧＩ−０２６−Ｇ０７単離株（針様草試料から単離した）；ＳＧＩ−０４１−Ｂ０３単離株（野生ライムギ試料から単離した）；およびＳＧＩ−０２０−Ａ０１単離株（混合土試料中で成長したコムギ根組織から単離した）。
【０１２１】
胞子形成根圏細菌を特異的に特定するために、富化手順を開発した。つまり、超音波処理した根抽出物を熱処理して、栄養細胞を死滅させた後、富栄養培地の上に置いた。この加熱処理を生き延び、コロニーを形成した微生物を、胞子菌であると見なした。この方法は、グラム陽性細菌の選択に特に有効であることが分かった。新たに試料採取した根を、これらの富化の出発物質として使用した。根の先端で見出される微細断片は最も若く、高い根毛密度を有し得、典型的に高密度の根圏細菌を有する。滅菌した刃を使用して、根のこれらの領域を５〜１０ｃｍ区分に分割し、次に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水下で洗浄して、大きな土壌粒子を除去した。必要な場合、２５ｍＬの１×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（すなわち、ＰＢＳ緩衝液）を含む５０ｍＬファルコン管の中に根を入れ、１分間ボルテックス(vortex)することによって、より綿密な洗浄を行った。後次に、各根試料を２０ｍＬの滅菌ＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、氷上で１分間隔で２回、８ワットでＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを使用して超音波処理した。加熱処理の場合、典型的に１ｍＬの超音波処理した根細胞懸濁液を、滅菌エッペンドルフ管の中に移し、８０℃の水浴中で２０分間インキュベートした。１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、および１０−７の濃度に連続希釈する前に、加熱処理した細胞懸濁液を室温に冷ました。１００μＬの各１０倍希釈液を、寒天および１００ｍｇ／Ｌシクロヘキシイミドで固化した微生物培地を含む培養プレートの上に広げ、真菌の成長を阻害した。場合によって、コロニー採集の適切なＣＦＵ密度を得るために、プレートに置く前に、１／１０または１／１００希釈を行う必要があった。単離したコロニーを、滅菌したピペット先端を使用して採集し、それぞれ１ウェル当たり１５０μＬ２×ＹＴ液体媒質を含む、９６ウェルマイクロタイタープレートに配置した。このマイクロタイタープレートを、さらなる特性化および保存のための高細胞密度を得るために、１〜２日間３０℃でインキュベートした。
【０１２２】
生物膜形成細菌の単離。
以下の微生物単離株は、以下に記載される「生物膜形成」法を使用して単離した：ＳＧＩ−００３−Ｈ１１単離株（ユッカ植物根試料から単離した）；ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９単離株（草根試料から単離した）；およびＳＧＩ−０３４−Ｅ１０単離株（クイーンアンズレース植物試料に由来する）。
【０１２３】
生物膜形成法：この手順では、生物膜形成細菌を、Ｆａｌｌらによって記載される、超音波処理した根断片から単離した（Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７，３７２−３７９，２００４）。上記のとおり、根の表面に生物膜を形成する細菌は、典型的に非常に良好な根コロニー形成細菌である。一般に、かかる細菌が高密度で存在するとき、それらは、植物の健康に著しい影響を及ぼし得、侵入する病原体を競合的に除外することができる。つまり、超音波処理を使用して、根に緩く付着する細菌および真菌細胞を除去し、根表面に強力に付着したそれらの微生物のみを残した。グラム陽性およびグラム陰性生物膜形成細菌の両方を、この方法を使用して選択した。
【０１２４】
新たに試料採取した根を、これらの富化の出発物質として使用した。根の先端で見出される微細断片は最も若い組織であり、高い根毛密度を有し、典型的に高密度の根圏細菌を有していた。滅菌した刃を使用して、根のこれらの領域を５〜１０ｃｍ区分に分割し、次に滅菌２５ｍＬの１×ＰＢＳを含む５０ｍＬファルコン管にそれらを入れ、１分間ボルテックスすることによって洗浄した。洗浄からの残差(debris)を沈殿させ、次に滅菌した鉗子を使用して、洗浄した根断片を、２５ｍＬの１×ＰＢＳで満たした５０ｍＬファルコン管に移し、氷上でＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを使用して、バースト(burst)の間に３０秒の休止を伴って、２回の３０秒間隔で超音波処理した。超音波処理した根試料を、滅菌したプラスチックペトリ皿に移し、安全キャビネット内で蓋なしで完全に乾燥させた。次に各根断片を、１％寒天（１０ｇ／Ｌカゼイン分解物、１０ｇ／Ｌマンニトール、１０ｇ／Ｌ寒天）を含む別個のＣＭＡプレートの上に置いた。場合によっては、滅菌鉗子を使用して、根断片を寒天培地に押し入れた。後次に、プレートを３７℃でインキュベートし、微生物成長について監視した。典型的に、１〜２日後、複数の微生物成長が根からＣＭＡ培地上に出現した。滅菌したピペット先端を使用して、断片に沿って固有の形態を持つ成長物を選択し、これらの成長物のそれぞれを０．３％アガロースを含むＣＭＡプレートの中心に移した。後次に、このＣＭＡプレートを１〜２日間３７℃でインキュベートし、成長を監視した。典型的に、生物膜形成単離株は、この培地上で樹状成長を示した。
【０１２５】
滅菌ループを使用して、バイオマスを移し、ＣＭＡプレートからの各単離株をＣＭＫＡプレート（２％寒天、１．２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）の上に画線精製(streak-purify)した。ＣＭＫＡ培地は、生物膜成長を制限し、保存するための個別のコロニーの選択を可能にする。
【０１２６】
実施例２：微生物単離株の成長および保管
単離した細菌を純粋な培養物として保管した。細菌コロニーを、Ｒ２Ａブロス液体培地（Ｔｅｃｋｎｏｖａ）を含むバイアルに写し、３０℃で２日間２５０ｒｐｍで攪拌しながら成長させた。次に培養物を、１５％グリセロールを含むバイアルに移し、−８０℃で保管した。
【０１２７】
実施例３：ＤＮＡ抽出、配列決定、および分類
２０μＬアリコート(aliquot)の細菌細胞懸濁液を、２０μＬの２ｘ溶解緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、４００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）を含む９６ウェルＰＣＲプレートに移した。溶解条件は以下のとおりであった：５５℃で３０分間のインキュベーションに続いて、９４℃で４分間のインキュベーション。溶解生成物のアリコートを、ＰＣＲ増幅のＤＮＡ鋳型の源として使用した。
【０１２８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域の増幅の場合、各ＰＣＲ混合物を、４μＬの細菌溶解反応物、２μＭの各ＰＣＲプライマー、６％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０μＬの２ｘＩｍｍｏＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）を含む、２０μＬ最終容積反応において調製した。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、Ｍ１３−２７Ｆ（５′−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３′、配列番号８）および１４９２Ｒ  Ｍ１３末端（５′−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３′、配列番号９）。ＰＣＲを、以下のとおりＰＴＣ−２００パーソナルサーモサイクラー（ＭＪ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）において行った：９４℃で１０分間；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で７５秒間３０サイクル；７２℃で１０分間。２μＬアリコートの各ＰＣＲ生成物を、１．０％アガロースゲル上で移動(run)させ、予想したサイズの単一バンドを確認した。陽性バンドを単離し、精製して、ＰＣＲ配列決定に供した。配列決定は、Ｊ．Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）により、正(forward)および逆(reverse)プライミング方向で、４５４の技術を使用して行った。
【０１２９】
既定のヌクレオチド配列の相同性検索は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを使用して行った。後次に、１６  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列の系統発生関係を、ＣｌｕｓｔａｌＷ系統樹構築プログラムを使用して、本明細書に記載される単離した細菌株、単離した細菌株に高い配列相同性を呈する属および種の細菌、ならびに他の多種多様な細菌属の間で分析した。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ  Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）を使用して決定されてもよい。配列分析の結果から、細菌単離株ＳＧＩ−００３＿Ｈ１１、ＳＧＩ−０２０＿Ａ０１、ＳＧＩ−０２６＿Ｇ０６、ＳＧＩ−０２６＿Ｇ０７、ＳＧＩ−０３４＿Ｃ０９、ＳＧＩ−０３４＿Ｅ１０、ＳＧＩ−０４１＿Ｂ０３は、それぞれの微生物に対する１６  ｒＲＮＡ配列のそれぞれの９８％を超える配列相同性に基づいて、それぞれパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・メタリカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｃａ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バシラス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、ヘルバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）種、ペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）種に関連すると見なすことができることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例４：細菌単離株の生化学的特性
単離した細菌は、それらの植物との相互作用において重要な特性についてさらに研究した。研究した特性として、窒素固定、シデロホア分泌、無機リンの可溶化、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）デアミナーゼの生成、２，３ブタンジオールの生成、および植物成長ホルモンオーキシンの生成が挙げられる。インビトロ生化学アッセイの結果を表２に示す。
【０１３１】
窒素固定：
細菌細胞懸濁液を、窒素源を含まない以下の組成の固体培地上に画線した：ＫＯＨ  ４．０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．０２ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００５ｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．００２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、リンゴ酸  ５．０ｇ／Ｌ、ゲランガム０．１〜１．０ｇ／Ｌ、および任意選択により０．５％ｖ／ｖブロモチモールブルー、ｐＨ７．０。ゲランガムまたは寒天濃度は、所望の培地厚を達成するために必要に応じて異なり得、典型的に０．５ｇ／Ｌが使用される。画線を３０℃で２〜５日間インキュベートした。これらのプレートを毎日監視し、コロニーが出現するとそれらを選択した。場合によって、より長い成長期間（約２週間以上）が、よりゆっくり成長する単離株の捕捉を可能にした。これらの画線プレートを、典型的に、２０または２００μＬエアロゾルバリアピペット先端を使用してコロニー採取し、１５０μＬ／ウェルの２ＹＴ培質で満たした９６ウェル細胞培養プレートに置いた。あるいは、単離株をプレートからコロニー採取して無窒素培地に直接置き、それらの無窒素成長能力を確認した。結果は、表２に要約されるとおり、単離株ＳＧＩ−０２６−Ｇ０７のみが検出可能なレベルで窒素固定活性を示したことを示す。
【０１３２】
シデロホア分泌：
このアッセイを使用して、インビトロで高親和性Ｆｅ３＋キレート化合物である、シデロホアを生成する細菌単離株を特定した。典型的に、微生物単離株は、本質的に鉄を含まない最小培地上で培養した。このアッセイ全体で使用される全てのガラス製品は酸で洗浄し、ｍｉｌｌｉＱ水で３回濯いで、アッセイ結果を変化させ得る残渣鉄を除去した。ＭＭ９培地の組成は以下のとおりであった：Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＰＩＰＥＳ緩衝液７．５５ｇ／Ｌ、グルコース１０．０ｇ／Ｌ、グルコン酸２．５ｇ／Ｌ、リンゴ酸２．５ｇ／Ｌ、カザミノ酸０．５ｇ／Ｌ。この培地を５Ｎ  ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、０．２μＭフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して滅菌した。
【０１３３】
このアッセイは、典型的に、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸ液体処理ステーションおよび１ウェル当たり１５０μＬ  ＭＭ９成長培地を含む９６ウェル細胞培養プレートを使用して、高スループット形式で実行した。培養物および培地は、オートクレーブ可能なピンツールを使用して、層流フード(laminar flow hood)の下で無菌的に分配および移送した。移送後、培養物を３０℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、培養物の上清を、９６ウェル０．２２μＭフィルタープレートを使用して、遠心分離を介して採取した。１０マイクロリットルの濾過した上清を各ウェルからファルコンアッセイプレートに移送した。ＭＭ９培地中で希釈されたデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）を使用して、標準曲線を作成した。２００マイクロリットルのＣＡＳアッセイ溶液［１０ｍＭ  ＨＤＴＭＡ、Ｆｅ（ＩＩＩ）溶液：１ｍＭ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣＡＳ］を、上清および標準ウェルのそれぞれに添加し、続いて室温で２０〜３０分間インキュベートした。青色ＣＡＳアッセイ溶液の６３０ｎｍ（ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ２）での吸光度は、各ウェルのシデロホア濃度に反比例する（すなわち、アッセイ溶液は、より大量のシデロホアを用いると強いオレンジ色に変化するはずである）。
【０１３４】
無機リンの可溶化：
微生物単離株がリン酸塩鉱物(mineral phosphate)をインビトロで可溶化する能力を以下のとおり評価した。試験する細菌を、寒天リン酸成長培地［ヒドロキシアパタイト−Ｃａ１０（ＰＯ４）５（ＯＨ）２ ５．０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ／Ｌ、グルコース ５．０ｇ／Ｌ、グルコン酸 ２．５ｇ／Ｌ、リンゴ酸 ２．５ｇ／Ｌ、カザミノ酸 ０．５ｇ／Ｌ、ゲランガム ２０．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）］上に画線し、それらの成長を毎日監視した。培養培地は、リン酸カルシウムの存在に起因して不透明性を有した。細菌成長および培地の色の喪失は、細菌がリン酸カルシウムの溶解能力を有する場合に観測される。鉱物相リン酸塩を可溶化する能力を有する単離株は、コロニーを取り囲む不透明な培地上に透明なハロー(halo)を生成する。表２に要約されるとおり、リン酸塩鉱物を可溶化する能力は、本明細書に記載されるインビトロアッセイによって決定される通り、試験した微生物のうちのいずれにおいても検出できなかった。
【０１３５】
ＡＣＣデアミナーゼ生成：
植物の成長および発生を促進するために植物成長促進根圏細菌（ＰＧＰＭ）によって利用される主要な機序のうちの１つは、植物中のエチレンの直接前駆体である、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）の脱アミノ化によるエチレンレベルの低下である。ＡＣＣデアミナーゼは、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）のα−ケト酪酸およびアンモニアへの加水分解を触媒する。次に、α−ケト酪酸生成物の存在を、フェニルヒドラゾン誘導体を形成するＨＣｌ中の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応を介して直接決定することができる。ＮａＯＨの添加後、溶液中のフェニルヒドラゾンの量を、その５４０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定することができる（Ｐｅｎｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ．Ｍａｙ；１１８：１０−１，２００３）。このアッセイは、典型的に、９６ウェル細胞培養プレートを使用して、高スループット形式で実行した。各ウェルは、２．０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４を補充した１５０μＬ  ＤＦ塩成長培地を含んだ。培養物および培地は、オートクレーブ可能なピンツールを使用して、層流フード下で無菌的に分配および移送した。移送後、培養物を３０℃で２日間インキュベートした。混濁(turbidity)に達した後、層流フード下、滅菌したピンツールを使用して、単一窒素源として５ｍＭ  ＡＣＣを補充した１ウェル当たり１５０μＬのＤＦ塩成長培地を含む９６ウェルプレートに培養物を２回移送した後、３０℃で４日間インキュベートした。各培養物の６００ｎｍでの吸光度を、分光光度計を使用して測定した。これらの条件（ＯＤ＞０．２）下で堅調な成長を示した単離株を、上記Ｐｅｎｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ（２００３）に記載される、ＡＣＣデアミナーゼ活性についてのさらなるアッセイにかけた。
【０１３６】
試験結果は、表２に要約されるとおり、以下の単離株が相当量のＡＣＣデアミナーゼを生成したことを示した：ＳＧＩ−００３−Ｈ１１、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０６、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０７、およびＳＧＩ−０４１−Ｂ０３。
【０１３７】
２，３−ブタンジオール生成：
細菌単離株が２，３−ブタンジオールをインビトロで合成する能力を、Ｒｙｕらにより記載される毛管ガスクロマトグラフィー質量分光法を使用して、以下のとおり評価した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：４９２７−４９３２，２００３）。このアッセイは、典型的に、１ウェル当たり１５０μＬのＤＦ塩成長培地を含む９６ウェル細胞培養プレートを使用して、高スループット形式で実行した。大きな単離株コレクションの一次スクリーニングのために大量のプレートを調製するときは、Ｔｉｔｅｒｔｅｋを使用してもよい。培養物および培地は、オートクレーブ可能なピンツールを使用して、層流フード下で無菌的に分配および移送した。移送後、培養物を３０℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、培養物の上清を、９６ウェル０．２２μＭフィルタープレートを使用して、遠心分離を介して回収した。各ウェルからの５０マイクロリットルの濾過した上清を、Ｌ２００マルチチャネルピペットを使用して、１ウェル当たり４５０μＬの５０％メタノールを含む深い９６ウェルプレートの対応するウェルに移送し、接着プレートシールで密封した後、Ｒｙｕら（２００３、上記）により記載されるプロトコルを使用して、２，３−ブタンジオール定量アッセイを行った。試験結果は、表２に要約されるとおり、以下の単離株が相当量の２，３−ブタンジオールを生成したことを示した：ＳＧＩ−００３−Ｈ１１、ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９、およびＳＧＩ−０４１−Ｂ０３。
【０１３８】
オーキシンの生成：
オーキシンは、植物成長に直接影響し得るホルモンである。多くの根圏および内生細菌単離株は、オーキシンであるインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）およびその誘導体を合成する生物活性経路を有することが知られているため、このアッセイを行って細菌単離株がオーキシンを生成したか否かを決定した。トリプトファンは、多くの場合、この合成における前駆体であるため、このアッセイは、低濃度のアミノ酸トリプトファンを補充した培地上の細菌単離株からのＩＡＡ（オーキシン）生成を定量化した。
【０１３９】
このアッセイは、典型的に、１ウェル当たり１５０μＬのＹＴ塩成長培地を含む９６ウェル細胞培養プレートを使用して、高スループット形式で実行した。大きな単離株コレクションの一次スクリーニングのために大量のプレートを調製するときは、Ｔｉｔｅｒｔｅｋを使用した。培養物および培地は、オートクレーブ可能なピンツールを使用して、層流フード下で無菌的に分配および移送した。移送後、培養物を３０℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、培養物の上清を、９６ウェル０．２２μＭフィルタープレートを使用して、遠心分離を介して回収した。１０マイクロリットルの濾過した上清を各ウェルからファルコンアッセイプレートに移送した。２００マイクロリットルのサルコウスキーアッセイ溶液（Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６：１９２−１９５，１９５１）を、上清および標準ウェルのそれぞれに添加し、続いて室温で１５〜２０分間インキュベートした。サルコウスキーアッセイ溶液の黄色から紫／ピンク色への色変化は各ウェルのオーキシン（ＩＡＡ）濃度に比例するため、５３５ｎｍでのＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｍ２上のプレートの吸光度によって反応を監視した。試験結果は、表２に要約されるとおり、以下の単離株が相当量の植物ホルモンオーキシンを生成したことを示した：ＳＧＩ−００３−Ｈ１１、ＳＧＩ−０２０−Ａ０１、ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９、ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９、およびＳＧＩ−０４１−Ｂ０３。
【０１４０】
【表２】
2018011600.tif 000003
【０１４１】
実施例５：真菌性植物病原体に対する細菌単離株の生物防除活性
インビトロ拮抗作用アッセイを使用して、単離した細菌株が、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）ＮＲＲＬ−５８８３、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−３９６８、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＡＴＣＣ−１６１０６、スタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ）ＡＴＣＣ−２６３６９、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ−３４１６７、およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種病原体を含む、いくつかの植物真菌性病原体の発生を抑制する能力を評価した。ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地上でアッセイを行った。単離した細菌株を、使用する前に、５分の１強度のトリプシン大豆ブロス寒天（ＴＳＢＡ／５）上で２４時間成長させた。
【０１４２】
各真菌性病原体について、分生子接種は、活発に成長している真菌コロニーを菌糸チッピング(hyphal tipping)すること、および菌糸の鎖(strand)をＰＤＡ寒天培地に移送することによって生成した。１２時間／日の明期(photoperiod)を使用して、２５℃で７日間プレートをインキュベートした後、弱リン酸緩衝液（０．００４％リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、０．０１９％  ＭｇＣｌ２を含む）を使用して真菌分生子をＰＤＡプレートから洗浄した。次に、弱リン酸緩衝液中の真菌分生子の懸濁液（約１×１０５分生子／ｍＬ）を、寒天表面上に即時噴霧し、次にこの噴霧したプレートを、拮抗性試験において使用する前に、２５℃で４８〜７２時間インキュベートした。
【０１４３】
拮抗性試験を開始するために、単離した微生物株の細胞を、プレートの周囲の内側に等距離で点接種した。５日後、菌糸成長を欠く目に見えてクリアな領域（すなわち、成長阻害区域）が、微生物コロニーの周囲に存在したとき、細菌株を抗生作用陽性として採点した。拮抗性アッセイの結果は、表３に要約されるとおり、本明細書に開示される微生物のそれぞれが、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、モノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、スタグノスポラ・ノドルム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｕｒｕｍ）、コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種を含む、いくつかの真菌性植物病原体の発生を阻害したことを実証した。
【０１４４】
【表３−１】
2018011600.tif 000004
【表３−２】
2018011600.tif 000005
【０１４５】
実施例６：コムギ収量能力の増進
植物の成長および収量に対する細菌接種の影響は、単離株ＳＧＩ−０２０−Ａ０１を用いて温室内で研究した。微生物細胞懸濁液は、以下のように調製した。２ＹＴ培地、または同様の成長培地、ブロス培養物を、単離株のグリセロールストックまたは線条プレートから接種した。典型的に、成長チャンバ、温室、または圃場内で使用する前に、細菌培養物を４８〜７２時間開始(initiate)し、培養物を後期指数増殖期に到達させた。より長い倍増期間を有する単離株は、さらに事前に開始した。培養物を、３０℃で２００ｒｐｍの回転攪拌器上でインキュベートした。成長後、細胞を１０，０００×ｇで１５分間、４℃でペレット化し、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞密度を、ＣＦＵ／ｍＬベースで各単離株について正規化した。典型的に、約１０９ＣＦＵ／ｍＬの懸濁液を、各単離株について調製し、氷上で接種部位に輸送した。接種は、これらの細胞懸濁液を灌漑用水中で１／２０に希釈して最終密度５×１０７ＣＦＵ／ｍＬとすることによって行った。１リットルポット試験の場合、２０ｍＬのこの希釈細胞懸濁液を、各複製ポットの表面に均等に分配した。
【０１４６】
温室試験は、栄養不足の畑土壌を用いて行った。大きな岩および残屑を除去した後、畑土壌を完全に混合して均質性を保証した。充填後、各ポットの土壌を約２ｃｍ押し下げ、硬い播種層にした。市販のコムギ品種の種子（硬質赤色春小麦、Ｈｏｗｅ  Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．）を、畑土壌培地を含む１リットルポットに播種した（１０．５ｃｍ×１２．５ｃｍ先細直径のプラスチックポット）。２グラムの春小麦種子（約７０個）を、各ポットに均等に分配し、５０ｍＬの畑土壌を適用して、種子層上に均等に広げた。コムギ子葉鞘の均一出現および第一葉の後次出現に続いて、植物集団に２０ｍＬの１０９ＣＦＵ／ｍＬのＳＧＩ−０２０−Ａ０１を接種した。負の対照植物は、２０ｍＬの接種緩衝液のみを受けた。各条件は８つの複製平面内で行い、それぞれ４つの１リットルポットを含む（１平面当たりｎ＝４）。この平面は、４つの実験ブロック上でランダムに分配した。次に、種子および植物を、温室内で６０日間、周囲温度（約８℃〜約２２℃）で、試験を通して約１１．５時間明所／１２時間暗所の日周光サイクルで維持した。植物は、温度および成長段階に応じて、適切な湿潤レベルに底部を均一に灌漑した。播種後約３０日目に、ポット当たり約７０個体を確保し、一緒に緩く結束して、相互汚染を予防し、他のポットに落ちる植物の変異型に起因する位置的影響を最小限にした。播種後約６０日目に、植物を収穫の準備において乾燥させた。コムギ頭部を播種後約８０日目に収穫した。各コムギ頭部を、頭部の真下で切断することによって除去した。各ポット内のコムギ頭部を貯蔵し、計量した後、収量能力の推定として使用した。集団内の全ての植物は、同日に収穫し、処理をランダム化した順序で収穫して、処理間の収穫における大きな時間差を排除した。結果として、単離株ＳＧＩ−０２０−Ａ０１で処理したコムギ植物は、対照の未処理植物と比較して、収量能力の４０％増を示した（２．９５グラム／ポット対２．１０グラム／ポット）。８つの複製全てについて平均および標準偏差を記録し、ＡＮＯＶＡ（分散分析）を行った。コムギ収量能力を増進させることにおける微生物単離株ＳＧＩ−０２０−Ａ０１の有効性は、各ポット複製のコムギ頭部収量の重量を分析することによって定量化した。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。
【０１４７】
実施例７：トウモロコシにおけるバイオマス生成の増進
植物の成長および収量に対する細菌接種の影響は、以下の単離株ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９、ＳＧＩ−０３４−Ｅ１０、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１、ＳＧＩ−０４１−Ｂ０３、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０６、およびＳＧＩ−０２６−Ｇ０７のそれぞれを用いて、温室実験において研究した。温室試験は、栄養不足の畑土壌を用いて行った。大きな岩および残屑を除去した後、畑土壌を鉢植え用の土と完全に混合して（７０：３０）均質性を保証した。充填後、各ポットの土壌を約２ｃｍ押し下げ、硬い播種層にした。市販のコムギ品種の種子（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を、畑土壌培地を含む１リットルポットに播種した（１０．５ｃｍ×１２．５ｃｍの先細ポット）。２つのトウモロコシ穀粒を各ポットの胚の上方向に均等に分配し、５０ｍＬの畑土壌を適用して、種子層上に均一に広げた。発芽後、各ポットが１つのみの植物を含むように、必要に応じて、ポット当たり１つの実生の選択除去を行った。
【０１４８】
トウモロコシ子葉鞘の均一出現および第一葉の後次出現に続いて、ＳＧＩ−０３４−Ｃ０９、ＳＧ−０３４−Ｅ１０、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１、ＳＧＩ−０４１−Ｂ０３、ＳＧＩ−０２６−Ｇ０６、およびＳＧＩ−０２６−Ｇ０７からなる群から選択される約２０ｍＬの１０９ＣＦＵ／ｍＬの微生物単離株を植物集団に接種した。微生物細胞懸濁液は、上記実施例６に記載のとおり調製した。負の対照植物は、２０ｍＬの接種緩衝液のみを受けた。
【０１４９】
各条件は８つの複製平面内で行い、それぞれ２つの１リットルポットを含む（１平面当たりｎ＝２）。この平面は、４つの実験ブロック上でランダムに分配した。次に、種子および植物を、温室内で６０日間、周囲温度（約８℃〜約２２℃）で、試験を通して約１１．５時間明所／１２時間暗所の日周光サイクルで維持した。植物は、温度および成長段階に応じて、適切な湿潤レベルに底部を均一に灌漑した。トウモロコシ地上バイオマスを、播種後約６０日目に収穫した。
【０１５０】
集団内の全ての植物は、同日に収穫し、処理をランダム化した順序で収穫して、処理間の収穫における大きな時間差を排除した。トウモロコシ植物を、総バイオマスの差について分析した。表４に記録されるとおり、微生物単離株のそれぞれで処理したトウモロコシ植物は、対照の未処理植物と比較して、総バイオマスの有意な増加を示した。８つの複製全てについて平均および標準偏差を記録し、ＡＮＯＶＡ（分散分析）を行った。
【０１５１】
【表４】
2018011600.tif 000006
【０１５２】
実施例８：コムギ種子およびトウモロコシ種子の種子コーティング処理
Ｓｕｄｉｓｈａら（Ｐｈｙｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃａ，３７：１６１−１６９，２００９）に記載される手順に従い、わずかな修正を加えて小規模の種子処理実験を行った。典型的に生体ポリマーストック溶液は、１グラムのアラビアガム粉末（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を９ｍＬの水に添加し、均質になるまで混合することによって作製した。活発に成長している微生物細胞または微生物胞子調製物の混濁培養物を、ＰＢＳで洗浄し、約５．０のＯＤ６００に調整した。３ｍＬの調整細胞懸濁液を、５０ｍＬのファルコン管内で遠心分離を介してペレット化した。得られる上清を移し(decant)、３ｍＬの生体ポリマーストック溶液で置き換え、得られる懸濁液を完全に混合した。典型的に、約２５ｇの種子をファルコン管に添加し、激しく攪拌およびボルテックスして、ガム／細胞懸濁液の均一な分散を保証した。コーティングした種子を、プラスチック計量ボートに広げ、定期的に混合しながら概して３時間、粘性がなくなるまで層流フード内で乾燥させた。次にコーティングした種子を、４℃で保管し、安定性について定期的に試験した。一般的な硬質赤色春小麦品種Ｂｒｉｇｇｓ、Ｆａｌｌｅｒ、Ｇｌｅｎｎ、Ｈａｎｋ、ＲＢ０７、Ｓａｍｓｏｎ；硬質赤色春小麦品種Ｊｅｒｒｙ、ＭｃＧｉｌｌ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ；およびトウモロコシ種子品種ＤＫＣ６２−６１、ならびに市販のトウモロコシ栽培品種（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を含む、多様なコムギ種子およびトウモロコシ種子をコーティングし、上記の方法で試験した。
【０１５３】
種子コーティング製剤中で使用される微生物上の生存性試験は、標準プレートカウント法を使用して行った。典型的に、適切な緩衝液のアリコート中の種子を洗浄し、等量の緩衝液を栄養寒天培地上に置くことによって、既定量のコーティングされた種子を、生きた微生物の存在について試験した。生きたコロニー形成単位を、１〜４日間の３０℃でのインキュベーション後に決定した。生存性試験は、種１個当たり１ｘ１０４〜４ｘ１０７の生きたコロニー形成単位が、４℃での約５週間の保存後に存在することを示した。種子を微生物胞子でコーティングした場合、試験した微生物の大半の生存性は、冷蔵容器から出し入れされる米国内の複数の州間輸送を含む、少なくとも４ヶ月の間安定して維持された。冷蔵下で保管される場合（４℃）、微生物は、試験期間に渡って生存性をほとんど喪失せずに種子コーティング上で生存した。結果は、本明細書に開示される組成物でコーティングした種子は、冷蔵下で長期間保管することができ、微生物が、分配のためのより高温期間中に生存することを示した。さらに、コーティングした種子の発芽率を試験したところ、アラビアガムのみでコーティングした種子またはコーティングしていない種子のいずれかである対照種子と本質的に同一であることが決定された。
【０１５４】
実施例９：微生物組成物の固体製剤
この節は、本発明による細菌がカプセル化され、肥料が固体形態である微生物肥料の例示の製剤について説明する。
アルギン酸塩ビーズは、以下のように調製した。
【０１５５】
１ミリリットルの３０％グリセロールを、アルギン酸塩の特性（Ｍ／Ｇ比）に応じて、１、１．５、または２％アルギン酸ナトリウム溶液に添加し、最終容積２５ｍＬを得た。本発明の細菌単離株のうちの１つ、または２つ以上の単離株の組み合わせから得られる２５０ｍＬ培養物からの細菌細胞は、遠心分離を介してペレット化し、次に生理食塩水溶液（０．８５％  ＮａＣｌ、ｗ／ｖ）で洗浄し、２５ｍＬのアルギン酸塩混合液中に懸濁して、完全に混合した。次にこの細胞懸濁液を、ＣａＣｌ２の事前冷却した滅菌１．５または２％（ｗ／ｖ）水溶液中に、軽度の攪拌下で滴下添加し、細菌−アルギン酸塩ビーズを得る。これらのビーズを室温で２〜４時間硬化させる。ふるい分けによってビーズを収集し、滅菌水で数回洗浄して、４℃で保管した。製剤を保存するために、新鮮な湿潤ビーズを、約−８０℃で凍結した後、約−４５℃で１５時間凍結乾燥させることができる。凍結乾燥した乾燥ビーズを、滅菌ガラス瓶等の適切な容器内に保管することができる。
【０１５６】
生菌数を推定するために、カプセル化した細菌を、３０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）中に１００ｍｇのビーズを再懸濁し、均質化することによって、ビーズから放出することができる。放出された細菌の総数は、３０℃で４８時間インキュベートした後、標準プレートカウント法によって決定する。１ヶ月間隔で、ビーズ内の細胞密度を、同様の方法を使用して列挙する。
【０１５７】
実施例１０：市販の殺真菌剤との微生物組成物の適合性
農業において殺虫剤を使用することに関する環境懸念が高まっているため、生物学的代替物がますます必須であると認識される。しかしながら、新たな生物学的製剤は、生物を生存させ、それらの特定の有益な影響を発現させなければならない。化学的殺真菌剤は、一般に、有害な微生物に対してだけでなく、有益な微生物に対しても毒性である。しかしながら、これらの微生物剤の生存可能性は、低い割合で適用されるときに増進され得る。
【０１５８】
本研究では、泥炭ベースの担体材料を、殺真菌剤処理された作物種子ならびに裸の作物種子の両方の接種に使用する。殺真菌剤の細菌耐性は、一般に以下の方法で評価する：ａ）細菌を接種した裸の種子をトリプチケース大豆寒天（ＴＳＡ、トリプトン１５ｇ／Ｌ、ソイトン５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、および寒天１５ｇ／Ｌ）プレート等の適切な細菌成長培地上で成長させる、ｂ）殺真菌剤処理し、細菌を接種した種子を一般的なＴＳＡプレート上で成長させる、およびｃ）殺真菌剤処理し、細菌を接種した種子を滅菌成長パウチ内で成長させる。典型的に、３つの濃度の殺真菌剤を、各実験において使用する：製造者の推奨する用量およびそれより低い２つの用量（推奨用量の７５％および５０％）。殺真菌剤処理し、細菌を接種した種子を、接種後保管し、異なる時間間隔（２時間、４時間、および６時間）で使用して、種子発芽に対する影響を調べた。種子発芽および細菌存在の両方をペトリ皿内で監視する。成長パウチ試験の場合、殺真菌剤処理した（推奨用量）種子を使用し、根および胚軸の長さを実生成長の７日目に測定した。
【０１５９】
本発明のいくつかの根圏細菌単離株は、殺真菌剤富化したＴＳＡプレート上の細菌成長によって決定される通り、いくつかの広く使用される殺真菌剤と適合する。一般に、接種した泥炭でコーティングされる、裸の種子および殺真菌剤処理した種子はいずれも、非接種対照と比較して、発芽の有意な変化を示さない。さらに、非接種対照と比較して、根および総実生長に対する成長促進作用が全ての根圏細菌処理において観察される。
【０１６０】
実施例１１：非天然の品種および育種プログラムの開発
本発明の内生細菌を、様々な遺伝子型および地理的起源の、かかる内生真菌を欠く穀物を含む、作物植物に導入して、特に米国特許出願第２００３０１９５１１７Ａ１号、米国特許出願第２００１００３２３４３Ａ１号、および米国特許第７，０８４，３３１号を含む、当該技術分野において既知のものに類似する手順を使用して、改善された農業特性を持つ植物−内生菌の組み合わせを形成する。したがって、合成の植物−内生菌の組み合わせは、それらが農業的利益をもたらす共生的組み合わせを形成および維持する能力に基づいて、育種／品種開発プログラムにおいて形成および選択され得る。組み合わせの農業特性の評価は、かかる育種プログラムにおいて使用されてもよい。これらの特性として、限定されることなく、特に干ばつ耐性、バイオマス蓄積、昆虫寄生に対する耐性、家畜に対する嗜好性（例えば、草食動物）、繁殖の容易さ、および種子収量が挙げられ得る。かかる組み合わせは、麦角アルカロイドレベル、ロリン(loline)レベル、ペラミン(peramine)レベル、またはロリトレム(lolitrem)レベルを含む、害虫および雑草に対して毒性である微生物代謝物の蓄積レベルが異なり得るが、特に昆虫の摂食または寄生に対する耐性、非生物的ストレス、家畜に対する嗜好性、バイオマス蓄積、繁殖の容易さ、および種子収量を含む、作物植物の所望の農業特性を示し得る。
【０１６１】
実施例１２：収量研究
トウモロコシ種子（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）を、異なる微生物処理剤でコーティングし、調製した畑に播種した。各処理剤を、ランダム完全ブロック設計で５回複製した。単一複製は４つの３０フィート長の苗床（列）からなり、６０個の種子を、各苗床に播種した（６インチ間隔）。観察目的で、中央の２列のみからデータを取った。
【０１６２】
以下の表５に示されるとおり、植物の発芽を、複製における発芽した植物のパーセンテージとして２回記録した。各プロットの中央２列における１０個の植物をプラスチックリボンでタグ付けし、植物の草高、クロロフィル測定値、植物重量等の生命(vital)統計を記録した。
【０１６３】
植栽後３１日および５６日に記録された草高（最高／最長の葉の先端を測定する）は、処理間で草高が著しく異ならないことを示した。植栽後１１０日までに植物の大部分は乾燥し、葉は収縮したため、場合によっては、植物は以前の測定時よりも短く見えた（測定された）が、全体的に、草高は処理間で異ならなかった。植栽の５週間目に、クロロフィル含有量を、各プロットの１０個のタグ付けされた植物の低位の葉（地上約６０ｃｍ）および上位の葉（上から二番目の完全に開いた葉）から測定した（ＳＰＡＤ単位）。クロロフィル含有量は、処理間で著しく異ならなかった。植栽の１１０日目および１１１日目に作物を収穫した。各プロットからの１０個のタグ付けされた植物を、土壌の高さで切断し、植物の地上部分を計量して（全体植物重量またはＷＰｔＷｔ）、トウモロコシの穂を除去して、穂軸の長さを測定し（粒付きの穂長）（売り物になる粒のみで満たされた領域）、次にトウモロコシ粒を穂軸から除去し、それらの重量を穂当たりの粒重量（粒／重量／穂）として測定した。
【０１６４】
１プロット当たり１０個の植物を手で収穫した直後に、機械収穫機Ｇｌｅａｎｅｒ（登録商標）Ｋ２（Ａｌｌｉｓ−Ｃｈａｌｍｅｒｓ  Ｍｆｒｇ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を導入した。この機械は、残りの植物を各プロットの中央２列から機械的に除去し、粒を穂軸から除去して、粒の水分および重量を測定した（１０穂＋機械収穫）。粒（機械収穫された穂＋手で収穫された穂）の重量（ポンド）に基づく１５．５％含水量における推定総収量（１エーカー当たりのトウモロコシ粒のポンド）は、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））の場合、１エーカー当たり１０３６８．１４ポンドまたは１エーカー当たり１８５．１５ブッシェルであった。これは、全ての生物処理の中で最高収量であり、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＳＧＩ−０１５＿Ｆ０３の処理とは著しく異なった。他に高い生産をもたらしたものは、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＳＧＩ−０２０＿Ａ０１による処理であった。
【０１６５】
結論として、異なる処理における全ての植物は、同量の肥料、発芽前除草剤（シーズン後期には雑草を手で抜く）、および成長中および温暖シーズン中週１回の灌漑、および特にアメリカタバコガ(corn earworm)の害虫防除を与える圃場条件において、同様に発芽および成長した。全ての条件が等しい場合、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））による処理は、非微生物対照処理を上回る最高収量をもたらした。したがって、００３＿Ｈ１１は、対照群より約１７％高い収量をもたらした。したがって、本発明の様々な実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかによる有効な量の生物の適用は、対照群より少なくとも１０％、または少なくとも１２．５％、または少なくとも１５％、または約１７％高い収量をもたらし、いくつかの実施形態では、１エーカー当たりの植物生産物（例えば、トウモロコシ穂）のポンド、または１エーカー当たりの植物生産物のブッシェルによって決定され得る。表５に列挙される生物は、ＳＧＩ−００３−Ｈ１１（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、ＳＧＩ−０１５−Ｆ０３（バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ））、およびＳＧＩ−０２０−Ａ０１（バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））である。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
本発明の多数の実施形態が説明された。しかしながら、本明細書に記載される実施形態の要素を組み合わせて、追加の実施形態を作製することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を行ってよいことが理解されるであろう。したがって、他の実施形態、代替物、および等価物は、本願明細書および特許請求の範囲に記載されるとおり、本発明の範囲内である。
【０１６８】
本出願内の見出しは、単に読者の便宜のためであり、本発明の範囲またはその実施形態をいかなる形でも限定しない。
【０１６９】
この明細書に記載の全ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月24日(2017.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。
【外国語明細書】
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