(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘテロサイクリックアミン（ＨＣＡ）類の簡易検出方法を提供する。【解決手段】被検体と、貴金属ナノ粒子のコロイド液と、コロイドを凝集させる無機塩類の水溶液と、を接触させて、被検体を含む貴金属ナノ粒子の自己集合体を形成させて、測定試料液を調製し、当該測定試料液をラマン分光器にかけて、表面増強ラマン散乱スペクトルを測定し、被検体中ヘテロサイクリックアミン類を検出する。【選択図】図１
2018132350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体と、貴金属ナノ粒子のコロイド液と、コロイドを凝集させる無機塩類の水溶液と、を接触させて、被検体を含む貴金属ナノ粒子の自己集合体を形成させて、測定試料液を調製し、
当該測定試料液をラマン分光器にかけて、表面増強ラマン散乱スペクトルを測定し、ヘテロサイクリックアミン類の特定ラマンシフトの発現により、被検体中ヘテロサイクリックアミン類を検出するヘテロサイクリックアミン類の簡易検出方法。
【請求項２】
前記貴金属ナノ粒子は、金ナノ粒子又は銀ナノ粒子である、請求項１に記載の簡易検出方法。
【請求項３】
前記ヘテロサイクリックアミン類は、PhIP（2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine：2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン）、Trp-P-1（3-Amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1,4-ジメチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、MeIQx（2-Amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline：2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノクサリン）、MeIQ（2-Amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3,4-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）、A-α-C（2-Amino-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Glu-P-1（2-Amino-6-methyldipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノ-6-メチルジピリド[1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、Glu-P-2（2-Aminodipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノジピリド [1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、MeA-α-C（2-Amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-3-メチル-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Trp-P-2（3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1-メチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、IQ（2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）から選択される、請求項１又は２に記載の簡易検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の有害物質の簡易検出技術、特にがん誘発性が疑われるヘテロサイクリックアミン（HCA）類の簡易検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食肉を加熱すると、たとえばPhIP（2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine：2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン）、Trp-P-1（3-Amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1,4-ジメチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、MeIQx（2-Amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline：2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノクサリン）、MeIQ（2-Amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3,4-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）、A-α-C（2-Amino-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Glu-P-1（2-Amino-6-methyldipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノ-6-メチルジピリド[1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、Glu-P-2（2-Aminodipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノジピリド [1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、MeA-α-C（2-Amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-3-メチル-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Trp-P-2（3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1-メチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、IQ（2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）などのヘテロサイクリックアミン（HCA）が生成することが知られている。
【０００３】
これらHCAには変異原性やがん誘発性が疑われている。HCAのがん誘発作用には、HCA濃度の閾値があると考えられている。食品中に含まれるHCAが、閾値未満であるか又は閾値以上であるかを簡便に検出する方法が必要である。非特許文献１に説明のあるように、HCAの高感度迅速検出には主として質量分析が利用されている。一方、試料にレーザーを照射してHCAに特有のラマン散乱スペクトルを測定するラマン分光法は、HCAを含めた複素環化合物の優れた簡易検出法である。しかしラマン分光法で検出できる濃度は、通常パーセント（％）レベルであるため、高感度化が求められている。
【０００４】
ラマン分光法を高感度化する手法には、適切な局在プラズモン共鳴を有する貴金属ナノ構造体の増強電場を利用する表面増強ラマン散乱（SERS）がよく知られている（特許文献１、非特許文献２）。実際に、広義のHCA類似物質であるピリジンなどの複素環化合物が、ナノレベルの粗さを有する銀ナノ薄膜を用いて増感されたSERSの例が報告されている（非特許文献３）。SERSで物質を測定する方法は、特許文献１、特許文献２、非特許文献３、非特許文献４が提案されているが、発明者の知る限り、MeIQxを含むHCAのSERSはこれまでまだ実証されてはいなかった。少なくとも、HCAのSERSを簡易に取得しうる手法はまだ開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許４７７２２７３号公報
【特許文献２】米国特許８，６９９，０１９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品の加熱によるヘテロサイクリックアミン付加体の生成と調理法によるその制御、片岡洋行、浦上財団研究報告書、16、130(2006)
【非特許文献２】表面プラズモンの分光学II、表面増強ラマン散乱、伊藤民武、分光研究、64(2)、1-16(2015)
【非特許文献３】D. L. Jeanmaire and R. P. Van Duyne, J. Electroanal. Chem., 84, 1-20(1977)
【非特許文献４】金ナノ粒子自己集合体の表面増強ラマン散乱による超高感度分析、福岡隆夫、森康維、オレオサイエンス、14(1)、5-10(2014)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヘテロサイクリックアミン（ＨＣＡ）類の簡易検出方法及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering：ＳＥＲＳ）とは、貴金属ナノ構造体中の電子が集団振動して生じる局在プラズモンによって、ナノ構造体近傍のラマン活性分子のラマン散乱が著しく増強される現象である。本発明者らは、貴金属ナノ粒子自己集合体と表面増強ラマン散乱を利用して、微量のヘテロサイクリックアミン類（HCA）を簡易迅速に検出できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下のヘテロサイクリックアミン類の簡易検出方法を提供する。
［１］被検体と、貴金属ナノ粒子のコロイド液と、コロイドを凝集させる無機塩類の水溶液と、を接触させて、被検体を含む貴金属ナノ粒子の自己集合体を形成させて、測定試料液を調製し、
当該測定試料液をラマン分光器にかけて、表面増強ラマン散乱スペクトルを測定し、ヘテロサイクリックアミン類の特定ラマンシフトの発現により、被検体中ヘテロサイクリックアミン類を検出するヘテロサイクリックアミン類の簡易検出方法。
［２］前記貴金属ナノ粒子は、金ナノ粒子又は銀ナノ粒子である、［１］に記載の簡易検出方法。
［３］前記ヘテロサイクリックアミン類は、PhIP（2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine：2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-b]ピリジン）、Trp-P-1（3-Amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1,4-ジメチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、MeIQx（2-Amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline：2-アミノ-3,8-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノクサリン）、MeIQ（2-Amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3,4-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）、A-α-C（2-Amino-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Glu-P-1（2-Amino-6-methyldipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノ-6-メチルジピリド[1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、Glu-P-2（2-Aminodipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole：2-アミノジピリド [1,2-a:3',2'-d]イミダゾール）、MeA-α-C（2-Amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole：2-アミノ-3-メチル-9H-ピリド[2,3-b]インドール）、Trp-P-2（3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole：3-アミノ-1-メチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール）、IQ（2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline：2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]キノリン）から選択される、［１］又は［２］に記載の簡易検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の簡易検出方法によれば、試料HCAの濃度に係わらず、ラマン分光器のレーザー波長およびHCAのラマン散乱の波長におけるそれぞれの吸光度が十分に大きくなる適切な凝集体の分散液（測定試料液）を得ることができるので、該分散液に適した波長のレーザーを照射することにより、被検体中HCAのSERSを簡易に取得することができ、簡易且つ迅速に定量分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例における、金ナノ粒子のコロイドと顕微ラマン分光器を用い、７８５ｎｍ（８ｍＷ）のレーザーを２０倍の対物レンズで１秒間照射して取得したＭｅＩＱｘのＳＥＲＳスペクトル（実線）とバックグラウンドのスペクトル（点線）である。
【図２】実施例における、試料ＨＣＡを含む溶液と金ナノ粒子のコロイド溶液を混合させ、塩を加えて凝集させて得た金ナノ粒子凝集体の分散液の吸収スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明は、貴金属ナノ粒子自己集合体に被検体を分散させた測定試料液を表面増強ラマン散乱（SERS）法により測定してHCAを簡易分析するHCA検出方法である。
【００１３】
本発明は、被検体と、金ナノ粒子または銀ナノ粒子などの貴金属ナノ粒子のコロイド溶液と、金ナノ粒子または銀ナノ粒子を凝集させるための塩の溶液と、をこの順に混合して、被検体中HCA分子を吸着した金ナノ粒子または銀ナノ粒子の凝集体の分散液を調製し、そのままラマン分光器で測定し、HCAの特定ピークによって同定することを特徴とする。本発明の検出方法は、簡易かつ迅速に、SERSによるHCAの高感度検出を実現する。
【００１４】
被検体は、通常の手法にて調製することができる。例えば、食肉からクロロホルム抽出によりHCAを含む可能性のある溶液を調製することができる。
金ナノ粒子あるいは銀ナノ粒子などの貴金属ナノ粒子のコロイドは、既知の方法で合成することができる。該コロイドを凝集せしめる条件はコロイドの濃度やナノ粒子の表面電荷によって異なるが、急速凝集が起きるに十分なイオン強度を与える濃度の塩を加えればよく、これはSchulze-Hardyの法則から自明である。塩の種類は塩析作用を有する物質であれば特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウムなどの無機塩類の水溶液を好適に用いることができる。
【００１５】
貴金属ナノ粒子としては、特に金ナノ粒子及び銀ナノ粒子を好ましく用いることができる。
貴金属ナノ粒子のコロイドを凝集させる条件は、コロイドの濃度やナノ粒子の表面電荷によって異なるが、急速凝集が起きるに十分なイオン強度を与える濃度の塩を加えればよい。塩の種類は特に限定されず、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウムなどの無機塩類の水溶液を好適に用いることができる。０．２ｍＭ〜１．５ｍＭの塩化金酸を還元して得られる金ナノ粒子の多くの場合、塩化ナトリウムを３０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度となるように加えればよいが、これに限定されるものではない。
【００１６】
該コロイドを凝集させるとき、混合操作あるいは凝集時間のいずれか又はその両方を調整することにより、試料HCA分子を吸着させた金ナノ粒子または銀ナノ粒子の凝集の進行を調整することができる。混合操作の調整は撹拌の有無又は撹拌速度の調整によって行うことができる。撹拌方法としては、（１）凝集体を入れた容器に蓋をして容器を転倒させ、凝集体を含む溶液を流動させる方法、（２）凝集体を入れた容器を振盪させ、凝集体を含む溶液を流動させる方法、（３）凝集体を入れた容器に撹拌子を入れ、マグネティックスターラーで撹拌子を回転させる方法、（４）凝集体を入れた容器に遠心力を作用させ、凝集体を含む溶液を流動させる方法、（５）凝集体を含む溶液に圧力を加え、凝集体を含む溶液を流動させる方法、（６）凝集体を含む溶液をピペット等で吸い上げ、ただちに吐出させるピペッティング操作により、凝集体を含む溶液を流動させる方法、（７）凝集体を入れた容器に圧力を加え、容器を変形させて凝集体を含む溶液を流動させる方法、から好ましく選択することができるが、これらに限定されない。撹拌は断続的又は連続的に行うことができるが、短時間の撹拌を断続的に行うことにより、SERS測定に好適な凝集状態とすることができるので好ましい。また、凝集時間の調整は、試料HCAを含む上記コロイド溶液に塩を加えてからラマン分光器で測定するまでの所要時間の長短で行うことができる。凝集させて測定試料液を調製した後、ラマン分光器で測定するまでの時間は短時間であるほど好ましい。あるいは混合操作及び凝集時間の両者を調整してもよい。混合操作あるいは凝集時間のいずれか、またはその両方を調整することにより凝集の進行を調整することができる。凝集体の分散液が得られたならば、ラマン分光器で測定する。ラマン分光器による測定は、凝集体の分散液に沈殿が生じるまでに測定を終えることが望ましい。
【００１７】
非特許文献２の知見から、金ナノ粒子または銀ナノ粒子の凝集体がSERSを発現するに好ましくなるように、測定試料液の吸収スペクトルにおいて、照射レーザーの波長およびそれによって生じるラマン散乱の波長における吸収が十分に強くなるように調整することが望ましい。このとき、複数試料の測定値を比較するときには、該吸収が同程度になるように混合操作あるいは凝集時間のいずれか、またはその両方を調整することがさらに望ましい。
【００１８】
ラマン散乱の波長Ｘ［ｎｍ］は、HCAのSERSスペクトルに現れるピークのラマンシフトＹ［１／ｃｍ］と、用いるレーザーの波長Ｌ［ｎｍ］から、次の式によって算出することができる。
【００１９】
Ｘ＝１／（１／Ｌ−Ｙ／１０００００００）
したがって、測定試料液の吸収スペクトルにおいて、レーザーの波長Ｌとラマン散乱の波長Ｘにおける吸収強度に注目することができ、SERSを発現するに好ましいかどうかの予測を行うことができる。
【００２０】
HCAはラマン分光分析において、特定ピークのラマンシフトを発現する。本発明においては、貴金属ナノ粒子（コロイド）を用いて、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分析を行うことにより、上記の特徴的なラマンシフトを増強させて、微量な化学剤の検知及び特定を行うことができる。特に、超小型携帯型の現場分析に適するラマン分析装置を用いて、被検体を貴金属ナノ粒子（コロイド）と混合させて塩化ナトリウムなどの無機塩類を加えて形成される自己集合体を分析することによって、簡易迅速で高感度の現場分析を可能とすることができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
使用する器具はすべて王水で洗浄したものを用い、操作はクリーンベンチを備えた実験室で行った。０．０１％の四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）水溶液５０ｍｌを加熱して沸騰させ、１％のクエン酸三ナトリウム（Ｎａ３（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３））水溶液０．５ｍｌを添加し、四塩化金酸を還元して、粒子径がおおよそ４０ｎｍの金ナノ粒子のコロイドを合成した。金ナノ粒子のコロイドは赤色であった。
【００２２】
この金ナノ粒子のコロイドの５４μＬに、ＭｅＩＱｘのメタノール溶液を所定濃度（６０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ）となるように加え、塩化ナトリウム水溶液を加えて、１ｍＬのマイクロピペットでピペッティング操作を繰り返して凝集させ、ＭｅＩＱｘを含む凝集体の分散液を調製した。このとき分散液の全量が６０μＬとなるようにして測定試料液を調製した。測定試料調製の操作には３０秒も要しなかった。このようにして、６０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭのＭｅＩＱｘを含む凝集体の分散液である測定試料液を調製した。金ナノ粒子の凝集体の分散液（測定試料液）は、ＭｅＩＱｘ濃度に係わらず赤紫色であった。またバックグラウンドの大きさを調べるために、ＭｅＩＱｘのメタノール溶液の代わりに超純水を加えてブランク液を調製した。
【００２３】
２０倍の対物レンズを備えたラムダビジョン製の顕微ラマン分光器ＲＡＭ３００／７８５を用い、測定試料液およびブランク液に７８５ｎｍ（８ｍＷ）のレーザーを１秒間照射し、それぞれラマンスペクトルを取得した。
【００２４】
その結果を図１に示す。図１を見ると、ＭｅＩＱｘを含む分散液から特徴かつ明瞭なＳＥＲＳが１秒の測定時間で取得でき、６０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭのＭｅＩＱｘ濃度に応じて強度の異なるＳＥＲＳスペクトルが得られていることがわかる。したがって、本発明の簡易検出方法により、ラマン分光の強度からＭｅＩＱｘ濃度を定量分析も可能であることがわかる。
【００２５】
また測定試料液の吸光スペクトルを測定し、図２にまとめた。図２中「before aggregation X1/2」は、凝集前の金ナノ粒子を２倍希釈した試料の吸光スペクトルである。試料ＨＣＡを含む溶液と金ナノ粒子のコロイド溶液を混合させ、塩を加えて凝集させて得た金ナノ粒子凝集体の分散液（測定試料液）では、７００ｎｍ〜８００ｎｍの間に強い吸収があることがわかった。そして１００ｎＭ、５００ｎＭのＭｅＩＱｘ濃度を含む分散液の吸収スペクトルはほとんど同じであることがわかった。
【００２６】
これらの結果から、本発明の方法で、ＭｅＩＱｘ濃度に係わらず、ＳＥＲＳを発現する金ナノ粒子凝集体の分散液が得られ、ＭｅＩＱｘ濃度に応じた強度のＳＥＲＳが短時間で得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
がん誘発性が疑われるヘテロサイクリックアミン類をSERSによって簡易かつ迅速に高感度検出することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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