(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis, H. meleagridis）の原虫（protozoa）培養物の製造及び用途の提供。【解決手段】ヒストモナス・メレアグリジスの単一細菌株培養物を産生する方法であって、Ｈ．メレアグリジスのゼニック培養物に野生型細菌叢を供給する工程、前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、前記Ｈ．メレアグリジスを洗浄し、前記洗浄されたＨ．メレアグリジス細胞を再懸濁する工程、前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス細胞に一又は二以上の単一細菌株を加えると共に培養することにより、Ｈ．メレアグリジスの単一細菌株培養物を得る工程を特徴とする方法である。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis, H. meleagridis）の単一細菌株培養物を産生する方法であって、
（ａ）Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を含むＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物（xenic culture）に野生型細菌叢を供給する工程、
（ｂ）前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
（ｃ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離及び洗浄し、
（ｄ）工程（ｂ）の有効性を制御する工程、
（ｅ）前記洗浄されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を再懸濁する工程、
（ｆ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
（ｇ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養することにより、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物が、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の顕微操作（micro-manipulation）により確立されたクローン培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の抗生物質の混合物が、少なくとも３種の異なる抗生物質、好ましくはドリペネム、ネオマイシン及びリファンピシンの混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）が工程（ｂ）又は（ｃ）の後にコロニー形成単位を決定することにより実施され、好ましくは、前記野生型細菌叢がＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞から完全に除去されていなかった場合に、工程（ｄ）が繰り返される、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｆ）において、大腸菌（Eschericia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）、ゲルトネル菌（Salmonella Typhimurium）、黄色ブドウ球菌（Staphlyococcus aureus）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）及び／又は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ）において、クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、大腸菌（Escherichia coli）DH5α、又はベクター pGFPuvで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞が、ウシ胎児血清を含む培地、好ましくは更に緩衝剤、アミノ酸及び炭化水素源、とりわけ澱粉を含む培地内に維持される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物が、弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化クローン培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922-C6/04の弱毒化クローン培養物である、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｆ）で添加される前記一又は二以上の単一細菌株が、
（ｈ）工程（ｇ）で得られた前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を、工程（ｆ）で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程（ｆ）で添加された前記細菌株を死滅させる工程、
（ｉ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程、
（ｊ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程、及び、
（ｋ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養し、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程
により、一又は二以上の他の単一細菌株に置換される、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｊ）において、クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis）の弱毒化培養物からなるヒストモナス（Histomonas）成分、
一又は二以上の単一細菌株からなる細菌成分、及び、
医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物
からなるワクチン製剤。
【請求項１２】
前記ヒストモナス（Histomonas）成分及び前記細菌成分が、請求項１〜１０の何れか一項に従って得られ得るＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物として提供される、請求項１１に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
前記細菌成分が、単一細菌株の一培養物、好ましくはクロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一培養物を含む、請求項１１又は１２に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
前記弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）が、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化クローン培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922-C6/04のの弱毒化クローン培養物である、請求項１１〜１３の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
前記製剤が、好ましくは家禽、とりわけシチメンチョウ及びニワトリにおける、並びに狩猟鳥、とりわけキジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ及びウズラにおける、ヒストモナス症（histomonosis）の予防に用いられる、請求項１１〜１４の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis, H. meleagridis）の原虫（protozoa）培養物の製造及び用途。
【背景技術】
【０００２】
有鞭毛原虫（flagellated protozoan）ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis）は、家禽におけるヒストモナス症（histomonosis）（別名；黒頭病）の原因となる。本疾患は主にシチメンチョウやニワトリに生じる。本疾患の特徴としては、肝臓の壊死性病変、盲腸壁の肥厚・潰瘍形成、硫黄色糞（sulphur-coloured droppings）等が挙げられる。ヒストモナス症（histomonosis）は、とりわけシチメンチョウの群において高い死亡率を示す。ニワトリはヒストモナス症（histomonosis）に対してより高い耐性を有し、病変は通常盲腸に限られる（McDougald, Avian Dis. 49 (2005), 462-476; Springer, Exp. Parasitol. 28 (1970), 383-392）。
【０００３】
欧州及び北米の多くの国で抗鞭毛虫剤として認可されていた有効な医薬や食品添加物が禁止された後、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）に対する科学的な興味がこの１０年ほどで高まってきた。その原因としては、家禽の群れに対する脅威に加えて、当該疾患の大発生に伴う膨大な金銭的損失がある。
【０００４】
寄生生物であるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）は、トリコモナス（Trichomonadida）目二核アメーバ（Dientamoebidae）科に属する。斯かる原虫の一般的な特徴としては、単一の鞭毛を有する副基器（parabasal apparatus）、ヒドロゲノソーム（hydrogenosomes）、及び、澱粉粒又は細菌を有する食胞（feed vacuoles）が挙げられる。斯かる特徴から明らかなように、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）の何れにおいても、細菌と原虫寄生生物との相互作用が極めて重要である（Delappe et al., Exp. Parasitol. 2 (1953), 79-86）。
【０００５】
Goedbloed等（Avian Dis. 6 (1962), 302-315）は、ヒストモナス（Histomonas）培養物への細菌添加を開示する。彼等はシチメンチョウ由来の肝臓抽出物に大腸菌（E. coli）を補充し、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のモノゼニック培養物を作製している（「モノゼニック」（monoxenic）とは、肝臓材料中に天然で存在する細菌（例えば大腸菌（E. coli）や球菌（cocci）等）の全てを含む生検材料に対し、単一の外因性細菌培養物を加えることを意味する）。斯かるモノゼニック培養物は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物の確立に使用されている。しかし、斯かる培養物の確立には、細菌ビオトープの存在が常に必要とされていた（欧州特許出願公開第１７２１９６５号明細書）。それゆえ、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の確立には、細菌成分の存在が必須である。
【０００６】
Goedbloed等の報告とは対照的に、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のインビトロ（in vitro）培養に関する、シチメンチョウ盲腸細菌叢と大腸菌（E. coli）又はエシェリヒア腸菌（Escherichia freundii）の生存及び死滅細胞の混合物を含む既存の培養物を用いた研究によれば、単一細菌株は原虫の連続インビトロ（in vitro）増殖には適していない旨が示されている（Lesser, Helminthol. Soc. Wash. 31 (1964), 265-266）。その結果、単一細菌培養物が寄生生物のインビトロ（in vitro）での生育を補助する能力を有するという見解は、最近では疑問視されている（Hauck et al., J. Parasitol. 96 (2010), 1-7）。この点は、現在研究されているインビトロ（in vitro）培養物には非常に重要である。斯かる培養物は何れも、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）が単離された鳥類の野生型盲腸細菌叢を含むからである（例えばvan der Heijden et al., Avian Pathol. 34 (2005), 505-508）。死亡したシチメンチョウの糞からクローン化した原虫培養物を確立することにより、原虫と細菌との相互作用を連続的且つ長期間に亘って調べることが可能となる（欧州特許出願公開第１７２１９６５号明細書）。斯かるクローン培養物は、単一細菌株のみを有する明確に規定された培養物を確立し、更には特定の細菌の交換を可能とする上で、好ましい出発点となろう。
【０００７】
一方で、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）感染に対するワクチンには、安全な抗原が必要である（Lund et al., Exp. Parasitol. 18 (1966), 403-407）。安全な抗原を提供する方法として、ワクチン化のための弱毒化培養物を提供することが挙げられる。近年ではＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化培養物が利用可能となっている（Liebhart et al., Avian Pathol. 39 (2010), 399-403; Liebhart et al., Poultry Sci. 90 (2011), 996-1003; Hess et al., Vaccine 26 (2008), 4187-4193）。しかし、斯かる培養物は依然として天然源から、例えば顕微操作（micro-manipulation）を用いた個別化等により得られている（Hess et al., Parasitol. 133 (2006), 547-554; (より一般的には) Clark et al., Clin. Microb. Rev. 15 (2002), 329-341）ため、依然として天然の細菌叢を含んでいる。近年ではＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物の提供も可能となっている（欧州特許出願公開第１７２１９６５号明細書）が、これらの培養物はヒストモナス（Histomonas）についてはクローン化されているものの、斯かるクローン培養物は依然として、その性質が大まかにしか特定されていない細菌群の混合培養物を含んでいる。
【０００８】
ワクチンの販売承認には、獣医薬分野でも、有効成分が特定された組成が必要である。従って、未特定の細菌組成物の培養物を登録及び使用することは、（Goedbloed et al., 1962にて報告されている通り）モノゼニック培養物であっても、工業用途では通常は認められない。従って、弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を含有するのみならず、細菌成分が均一となるように設計された医薬組成物を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
即ち、本発明の目的の一つは、「野生型」の細菌環境を含まず、細菌成分が特定されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の特定培養物を確立することである。より具体的には、本発明の目的の一つは、１つのみ（単一）の細菌株が存在するＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物を提供することが可能か否か、また、斯かる細菌株を一又は二以上の更なる細菌株で置換又は補足することにより、明確に特定されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物、即ち、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）成分が特定されている（例えばクローン化及び／又は弱毒化培養物として）のみならず、細菌成分も特定された培養物を提供し、惹いてはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化株を用いた産業利用可能な抗Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）ワクチンの適切な審査及び登録を可能とすることができるか否か、これらを検討することである。これによって産業上利用可能な抗Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）ワクチンの提供を実現するのが、本発明の中心となる目的である。斯かる十分に特定されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）／細菌培養物は、特定の細菌の存在下におけるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の生育挙動を検討し、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）での寄生生物と細菌との相互作用を分析する上でも有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明は、ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis, H. meleagridis）の単一細菌株培養物を産生する方法であって、
（ａ）Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を含むＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物（xenic culture）に野生型細菌叢を供給する工程、
（ｂ）前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
（ｃ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離及び洗浄し、
（ｄ）工程（ｂ）の有効性を制御する工程、
（ｅ）前記洗浄されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を再懸濁する工程、
（ｆ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
（ｇ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養することにより、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程
を特徴とする方法を提供する。
【００１１】
本発明によれば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物が、液体培地中において、「野生型」細菌叢が完全に除去され、一又は二以上の単一細菌株に置換された、十分に特定された（well-defined）細菌成分として、初めて提供される。斯かるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物は、当初の細菌を種々の抗生物質で死滅させると共に、鞭毛虫を生存したまま維持する選択的破壊（selective destruction）により、糞便叢が特定（defined）細菌株と交換されている。本発明の過程において、原虫細胞を実質的に損なうことなく、斯かる細菌を破壊できることも判明した。原虫寄生生物の増殖は細菌に、とりわけそのエネルギー代謝に依存することが明らかになった。大腸菌（Escherichia coli）は寄生生物の生育を強力に補助する一方で、ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は効率こそ劣るものの、それでもなお本発明の範囲内で良好に機能することが分かった。共焦点レーザー顕微鏡法（Confocal laser microscopy）により、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）が緑色蛍光タンパク質タグ化大腸菌（E. coli）DH5αを補助すること、細菌が原虫の食料供給原として機能し得ることが示された。連続的なインビトロ（in vitro）での継代を経たＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物において、細菌叢を大腸菌（E. coli）DH5αと交換することにより、弱毒化過程が細菌とは独立であることを示すことができ、インビボ（in vivo）で立証された。更に、本発明の過程において、大腸菌（E. coli）DH5αを一又は二以上の細菌株で置換することにより、産業上利用可能な細菌ワクチン成分を含む、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）感染に対する十分に特定された（well-defined）ワクチンの提供が可能となった。更に、感染したシチメンチョウの腸内叢が、原虫の毒性に対して負の作用を及ぼさないことも示された。結論として、弱毒化が培養物内の細菌に依存するのではなく、インビトロ（in vitro）での継代に依存することが明らかになった。本発明によれば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）感染に対する、十分に特定された（well-defined）産業上利用可能なワクチンが提供される。これにより、効率的に動物を保護することが可能になると共に、獣医薬の登録及び使用の法令上及び方式上の要請も充足される（Ganas et al., Int. J. Parasitol. 42 (2012), 893-901）。
【００１２】
以下に本発明を具体例及び図を用いて更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、細菌単一株培養物を得るプロセスの各工程において、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の存在及び細菌の低減を示すＰＣＲである。ＤＮＡは（１）ゼニック培養物、（２）抗生物質処置前の細胞懸濁液、（３）抗生物質処置後の細胞懸濁液、及び（４）洗浄工程後の細胞懸濁液から単離。プライマーはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）（Ａ）及び細菌（Ｂ）に特異的。Ｍ：分子サイズマーカー（１００ｂｐラダー）。
【図２Ａ】図２は、種々の細菌株と共に増殖させたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の異なる継代（Ｐ１〜Ｐ３）における増殖挙動を、細菌富化あり（Ｂ＋）及びなし（Ｂ）の場合について示す。（Ａ）Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）を含む細菌単一株培養物のパーセンテージ。（Ｂ）種々の細菌株の細菌単一株培養物中におけるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の細胞数（平均±ＳＤ）。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】図３は、細菌単一株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物において試験された細菌株の増殖曲線を、細菌富化なし（Ａ）及びあり（Ｂ）の場合について示す。共培養実験開始時及び３日間培養後に、コロニー形成単位（colony forming unit：cfu）を計数することにより、細胞数を決定した。
【図３Ｂ】同上。
【図４】図４は、大腸菌（E. coli）DH5α pGFPuvと共に増殖させた細菌単一株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の共焦点レーザー顕微鏡法（Confocal laser micrographs）を示す。ポリクローナル抗ヒストモナド（histomonad）血清標識化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞（Alexa Fluor 568により可視化、赤色）及び大腸菌（E. coli）DH5α pGFPuv（緑色）の８連続断面群（ｚスタック、ｚ軸増分０．３１８μｍ）。寄生生物及び細菌ＤＮＡの核をＤＡＰＩで染色（青色）。ＧＦＰ陽性細菌はＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の表面に付着し（Ａ-Ｂ、Ｇ-Ｈ；矢印）、原虫に包囲されていた（Ｃ-Ｆ、矢印先端）。スケールバーは２μｍ。
【図５】図５は、細菌単一株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物インビトロ（in vitro）継代295（HM+DH5α P295）、細菌単一株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物インビトロ（in vitro）継代20（HM+DH5α P20）、ゼニックＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物インビトロ（in vitro）継代20（HMゼニックP20）、及び大腸菌（E. coli）DH5α培養物（DH5α）に感染したシチメンチョウのヒストモナス症（histomonosis）による累積死亡率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の過程において、用語（Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の）「単一細菌株」（single bacterial strain）又は「単一細菌株培養物」（single bacterial strain culture）とは、細菌成分が純粋培養下での単一の単離の子孫から構成され、そして通常、最初の単一コロニーに由来することを意味する（Dijkshoorn et al., J. Med. Microbiol. 49 (2000), 397-401）。これは通常、細菌学における基本的操作単位であり、「分類学的意味での菌株」（the strain in the taxonomic sense）と呼ばれる場合も多い。「天然」の最初の単一コロニーの子孫は人工培養下で維持されている以上、「単一細菌株」は天然を意味する概念ではないが、この定義は菌株を特定する上では疑念を残す余地はない。分類学的意味において菌株に対する対応物が天然に存在するかも知れないが、本発明の「単一細菌株」は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の任意の野生型細菌叢とは、例えばその純度（主にＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の天然環境下での種々の細菌種の組成により）や、その遺伝子同一性（例えば突然変異、プラスミドの欠失又は獲得等に関して）等により、明確に区別することができる。従って、本発明の培養物中に複数の単一細菌株が存在していても、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の野生型細菌叢とは明確に区別できることも明白である。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に添加され得る単一細菌株の数は可変であるが、産業的利用可能なワクチン製品を提供するためには、５つを超える単一細菌株を追加することは好ましくない。むしろこれとは対照的に、単一細菌株のみを有する本発明のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物を提供することが特に好ましい。しかし、いくつかの理由により（例えば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）にとってより好ましい環境を提供するために）、４以下、好ましくは３以下、特に２以下の単一細菌株を有する態様が望まれる。
【００１５】
（１又は２以上の）「単一細菌株」を有するＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物とは対照的に、本発明における（Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の）「ゼニック」（xenic）培養物という用語は、未知の細菌、特にＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）が採取された天然環境に由来する細菌叢と共に増殖され、或いはこれらと共存するＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物を意味する。また、（Goedbloed et al., 1962により使用された）用語「モノゼニック」（monoxenic）とは、天然環境（例えば肝臓組織）から採取され、天然界に存在する細菌の全部又は一部を依然として含むＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物に対して、単一の外因性細菌培養物を添加することのみを意味する。Hess et al., 2006に開示されるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物でさえ、当初環境の細菌混合物の少なくとも一部を依然として含んでいる。
【００１６】
本発明によれば、天然（「野生型」）細菌環境の完全な除去は、種々の工程、すなわち複数の抗生物質や制御工程を組み合わせて適用することにより達成される。斯かる抗生物質は、斯かる野生型細菌叢から精製されるべきＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物中の細菌叢を予め検討することにより、選択することが好ましい。従って、工程（ａ）はゼニック培養物中の細菌叢の分析を伴うことが好ましい。斯かる検討は、任意の適切な手法により、例えば従来の細菌増殖試験、例えば耐性試験により、又は分子生物学的方法、例えばＰＣＲを適用することにより実施することができる。斯かる検討の後、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に存在することが見出された細胞のタイプに応じて、抗生物質混合物を最適化することができる。通常、本方法の工程（ｂ）に適用される混合物には、抗菌作用の異なる抗生物質を組み合わせて用いることが好ましい。本発明の方法の工程（ｂ）に使用される抗生物質混合物は、少なくとも２種の異なる抗生物質を含む。斯かる混合物は、常に細菌叢の分析結果又は予測を考慮して選択し、また、野生型細菌の破壊に最も強力な効果を達成するべく、好ましくは異なる化合物分類に属する抗生物質から構成する。本発明の過程で検討したＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物によれば、本発明の好ましい実施形態においては、少なくとも３種の異なる抗生物質を含む抗生物質混合物を使用する。ドリペネム、ネオマイシン及びリファンピシンの組合せは、野生型細菌叢を有効に死滅させる上で格別有益な効果を示した。
【００１７】
本発明によれば事実上、任意のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単離物を、単一細菌培養物に転換することができる。また、得られる培養物中のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）成分は、通常は均一であることが好ましいので、本発明の好ましい実施形態によれば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の顕微操作（micro-manipulation）により確立されたクローン培養物を用いて開始する。例えば欧州特許第１７２１９６５号等に開示されている斯かるクローン培養物は、単一細胞に由来するＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のみを含む。従って、斯かる培養物は培養物中の寄生成分が均一であり、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）感染に対する特定された（defined）ワクチンを製造する上で好ましい。
【００１８】
本発明の方法における重要な工程は、抗生物質処理の効果を制御する制御工程（ｄ）である。細菌叢の予備分析に基づき最適化された抗生物質混合物の場合には、通常は存在する細菌の全てが有効に死滅するが、他の場合や、当初試料や培養物に耐性細菌株が含まれる場合には、必ずしもそうとは限らない。従って、制御工程の結果において細菌が検出された場合には、抗生物質処理及びその後の遠心分離及び洗浄工程を反復すべきである。例えば、別の抗生物質混合物（もちろん添加される単一細菌株が耐性を示す混合物）を添加して工程（ｆ）を実施してもよく、その場合には工程（ｆ）と同時又はその後に、工程（ｂ）を再度実施する。この「反復される」工程（ｂ）の抗生物質処理には、別の抗生物質混合物を用いることが好ましく、斯かる抗生物質混合物は、生存細菌の性質に応じて調整することが好ましい。抗生物質混合物の組成の修正に先立ち、生存細菌の性質を分析してもよい。
【００１９】
初期細菌叢（上記参照）の検討においては、また、制御工程（ｄ）には、任意の適切な原核生物分析法（例えば、従来の細菌増殖試験又は応用分子生物学的方法、例えばＰＣＲ）を適用することができる。好ましい方法を用いて、工程（ｂ）又は（ｃ）の後、コロニー形成単位を決定する。特に工程（ｂ）及び（ｃ）を反復する必要がある場合、即ち初回の抗生物質混合物の適用により野生型細菌叢をＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞から完全に除去できない場合には、工程（ｄ）を反復することが好ましい。
【００２０】
工程（ａ）〜（ｇ）、特に工程（ｂ）〜（ｇ）は、必ずしもアルファベット順に実施する必要はない（但し、もちろん工程（ａ）は通常は最初の工程であり、工程（ｇ）は培養物を得るための最終工程ではある）。例えば、単一細菌株の添加（工程（ｆ））を、工程（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前に実施してもよい。斯かる添加を、これらの工程の実施中に、例えば工程（ｂ）（例えば終了近く）、工程（ｃ）（例えば遠心分離後、洗浄前）、又は工程（ｅ）の実施中に実施することも可能である。もちろん、工程（ｂ）の実施中に単一細菌株を添加する場合には、添加される細菌の生存を確保するよう、単一細菌株の抗生物質耐性と適用される抗生物質混合物とを比較考量すべきである。また、制御工程（ｄ）を、工程（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）の後（或いはこれらの工程の実施中、例えば工程（ｂ）（例えば終了近く）、工程（ｃ）（例えば遠心分離後、洗浄前）、又は工程（ｅ）の実施中）に実施してもよい。或いは、例えば工程（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）及び／又は（ｇ）の後（又は実施中）に、制御工程（ｄ）を複数回繰り返してもよい。
【００２１】
制御工程（ｄ）の結果、野生型細菌叢がＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞から完全には除去されていないことが明らかになった場合、工程（ｂ）及び（ｃ）を反復してもよい。しかし、斯かる工程を反復する場合は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞及び（既存の又は添加された）細菌を含む混合物の適切な生存を可能にするよう注意すべきである。これは、本発明の方法を通じて、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞及び細菌細胞の生存率を連続的に監視し、所与の出発材料を最適化することにより達成できる。例えば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の生存細胞と死亡細胞との識別には、トリパンブルー染色を使用することができる。細菌細胞の試験は、従来の試験方法、例えば寒天プレート試験（及びコロニー計数）等により行うことができる。本発明の方法を通じて、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞及び細菌細胞を監視することにより、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞の生存を危険にさらす細菌と原虫との間の非生理学的不均衡を防止することが好ましい。
【００２２】
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞の適切な生存及び増殖を可能にする上で、本発明の過程において使用される単一細菌株の性質は非常に重要である。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を培養する上で、細菌成分が必須であることが知られている。本発明の過程において、通性嫌気性である細菌株のみが良好な性能を示すことが観察され得た。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に関してそのような満足のゆく生存／増殖性能を示すためには、通性嫌気性又は好気性種（すなわち好気呼吸を行う細菌）の単一細菌株を提供することが必要である。本発明の過程で実施された検討によれば、工程（ｆ）において、大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）、黄色ブドウ球菌（Staphlyococcus aureus）及び／又は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）から選択される１又は２以上の細菌株の単一細菌株を添加した場合に、特に良好な結果が得られることが明らかになった。
【００２３】
細菌株の特に好ましい単一細菌株培養物は、クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、大腸菌（Escherichia coli）DH5α、又はベクター pGFPuvで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択することができる。
【００２４】
更に、本発明の単一細菌株培養物は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞の増殖／生存に必要な全ての培養成分を含む。従って、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞は、ウシ胎児血清を含む培地、好ましくは緩衝剤、アミノ酸及び炭水化物源、とりわけ澱粉を更に含む培地に維持することが好ましい。斯かる培地は本発明の方法にとりわけ適していることが分かった。
【００２５】
本発明の方法は任意のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に適用可能であるが、ワクチン接種用の培養物を提供することが好ましい。ワクチン接種用途には、病原体（Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis））の弱毒化形、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922 -C6/04の弱毒化クローン培養物を用いることが好ましい。斯かる弱毒化形は近年では入手可能となっており（Liebhart et al., Avian Pathol. 39 (2010), 399-403; Liebhart et al., Poultry Sci. 90 (2011), 996-1003; Hess et al., Vaccine 26 (2008), 4187-4193）、斯かる培養物に本発明の方法を適用することにより、単一細菌株培養物に転換することができる。
【００２６】
本発明の方法では、野生型細菌叢を単一細菌株と置換する。工程（ｆ）では遺伝子操作を施した菌株を用いることが好適である。斯かる細菌細胞の存否は、遺伝子工学的特徴、例えば耐抗生物質性遺伝子やマーカー遺伝子の使用により、容易に制御できるからである。このため、実施例の欄では、大腸菌（E. Coli）DH5αを用いて工程（ｆ）を実施した。しかし、遺伝子操作された細菌がワクチンに存在することは、大半の場合は所望されない。従って、遺伝子操作を施していない細菌のみ、即ち天然源由来の菌株のみを含む、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を提供することが所望される。斯かる培養物を提供するために、工程（ｆ）を、遺伝子操作されていない単一細菌株を用いて行ってもよい。他方では、本発明の過程において、培養物における単一細菌株を、別の細菌株と交換可能であることも明らかになった。例えば、遺伝子操作を施した菌株を、遺伝子操作を施していない菌株と置換することができる。実際に、遺伝子操作を施した単一細菌株を用いて工程（ｆ）を実施した後、この遺伝子操作を施した菌株を、遺伝子操作を施していない１又は２以上の単一細菌株と置換する方が、容易性、制御性、及び安全性の何れの面でも有利であることが分かった。即ち、本発明の方法の好ましい形態によれば、工程（ｆ）で添加される前記一又は二以上の単一細菌株を、以下の工程により、一又は二以上の他の単一細菌株に置換する。
（ｈ）工程（ｇ）で得られた前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を、工程（ｆ）で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程（ｆ）で添加された前記細菌株を死滅させる工程。
（ｉ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程。
（ｊ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程。
（ｋ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養し、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程。
【００２７】
工程（ｊ）において添加する菌株は、遺伝子操作を施していない菌株とすることが好ましい（主に規制上の理由による。但し、時期や国に応じて変更可能である）。工程（ｊ）での使用には、特に以下の単一細菌株が好ましい（遺伝子操作を施した菌株のみを使用するという条件の場合）。クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853。
【００２８】
本方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｂ）における抗生物質の混合物は、５〜５００、好ましくは１０〜１００、特に３０〜７０μｇ／ｍＬの濃度のドリペネル、５０〜５０００、好ましくは１００〜１０００、特に３００〜７００μｇ／ｍＬの濃度のネオマイシン、及び３０〜３０００、好ましくは５０〜１５００、特に１００〜５００μｇ／ｍＬの濃度のリファンピシンの混合物である。
【００２９】
工程（ｂ）における抗生物質の混合物は、クロラムフェニコール、コトリモキサゾール（cotrimoxazol）、ジフロキサシン、ドリペネム、エンロフロキサシン、カナマイシン、リンコマイシン、マルボフロキサシン、メロペネム、ネオマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンから選択された、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の抗生物質を含むことが好ましい。
【００３０】
工程（ｂ）、及び任意により工程（ｋ）は、通常は、細菌細胞を完全に死滅させるのに十分であり、且つ、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の生存を有意に脅かすことのない程度の温度及び時間で実施される（例えばGoeldbloed et al., 1962の実施例４参照。ここでは１２時間後、全ての原虫が死滅したとの記載がある）。
【００３１】
本方法の好ましい実施形態によれば、少なくとも工程（ｇ）、及び任意により工程（ｋ）は、３５〜４５℃、好ましくは３８〜４２℃の温度で行われる。
【００３２】
本方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｂ）、及び任意により工程（ｈ）は、３５〜４５℃、好ましくは３８〜４２℃の温度で行われる。
【００３３】
本方法の好ましい実施形態によれば、工程（ｂ）、及び任意により工程（ｈ）は、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも５時間、特に少なくとも１０時間に亘って行われる。約２０時間の持続時間が、最適な持続時間であることが判明した。
【００３４】
既述のように、単一細菌株は、通性嫌気性又は好気性細菌株であることが好ましい。
【００３５】
既述のように、工程（ｆ）において添加する単一細菌株は、遺伝子操作を施した細菌株であることが好ましい。また、工程（ｊ）において添加する単一細菌株は、遺伝子操作を施していない細菌株であることが好ましい。
【００３６】
工程（ｃ）、及び任意により工程（i）において適用される洗浄溶液としては、本発明の方法の過程において、特に工程（ｇ）及び任意により工程（ｋ）において、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を培養するのに通常使用される培養用溶液と同一であるか、少なくともこれに由来するものを使用することが好ましい。斯かる培養用溶液は当業者には周知であり、例えば本明細書において引用する文献等から特定することができる。従って、洗浄工程は、培養用溶液を用いて実施することが好ましい。
【００３７】
本発明の方法は、単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物を供給する上で極めて信頼性が高い方法である。しかし、工程（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のうち１又は２以上の工程を省略し、及び／又は、工程（ｂ）において複数の抗生物質の混合物の代わりに単一の抗生物質のみを用いて、斯かる培養物を得ることも可能である。但し、斯かる方法では、初期培養物由来の残存細菌が生じるおそれがある。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物内の野生型細菌叢のうち一部の細菌種が、そのような単一の抗生物質に対して耐性を有する可能性があるからである。
【００３８】
別の側面によれば、本発明は、下記成分からなるワクチン製剤にも関する。
−ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis）の弱毒化培養物からなるヒストモナス（Histomonas）成分、
−一又は二以上の単一細菌株からなる細菌成分、及び、
−医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物。
【００３９】
本ワクチン製剤は（欧州特許第１７２１９６５号により近年実現された）十分に特定された（well-defined）Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）成分を含むのみならず、十分に特定された（well-defined）細菌成分をも含む。斯かる細菌成分は、単一細菌株の培養物からなる（場合によっては、複数の（少数の）単一細菌株を細菌成分として供してもよい）。これにより、両成分について十分に特定され（well-defined）、十分に特徴付けられた（well-characterized）ワクチン製剤が使用可能となる。また、この細菌成分は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の天然細菌叢からも明白に区別することが可能である。本発明において定義するような細菌成分を有するワクチンは、天然原から誘導することはできないからである。こうした細菌成分は、従来技術のワクチンに存在する細菌叢の性質及び組成を検討することにより、細菌を含む任意のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）ワクチンの細菌成分の性質及び組成から容易に検出可能である。既存のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物から、初期細菌叢を予め破壊することなく、本発明の単一細菌株成分を含むワクチンを誘導することは不可能である。
【００４０】
本発明の方法によれば、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物として、ヒストモナス（Histomonas）成分及び細菌成分を同時に供給することが可能となる。従って、本ワクチンは特に、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を、本発明の方法に従って得られるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物として含むことが好ましい。
【００４１】
本ワクチン製剤の好ましい実施形態によれば、細菌成分は、単一細菌株の一培養物を含む。斯かる細菌株として、好ましくは、クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株；好ましくは、それらから選択された、遺伝子操作を施していない菌株が挙げられる。
【００４２】
本ワクチン製剤の好ましい実施形態によれば、弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化クローン培養物、特にＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922-C6/04の弱毒化クローン培養物である。斯かる弱毒化培養物は、安定性を有すること、すなわち少なくとも５継代にわたって増殖させた場合でも安定であることが必須である。「安定増殖」（Stable growth）とは、増殖性質が継代を通じて有意に変化しないこと、例えば増殖速度の偏差が２０％以上とならないことを意味する。
【００４３】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは家禽、とりわけシチメンチョウ及びニワトリにおける、並びに狩猟鳥、とりわけキジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ及びウズラにおける、ヒストモナス症（histomonosis）の予防のために、特に好都合であることが判明した。
【００４４】
本発明のワクチン製剤中の医薬的に許容される非生成物学的製剤化合物としては、ワクチン（特に家禽ワクチン）に通常含まれる任意の化合物が挙げられる（もちろん、本明細書において定義されるようなヒストモナス（Histomonas）成分及び細菌成分以外であるが）。即ち、医薬的に許容される非生物学的製剤化合物としては、緩衝剤、アジュバント、特に水酸化アルミニウム、保存剤、充填剤、安定剤、栄養剤が挙げられる。通常は、２種以上の斯かる化合物の組合せからなる。
【００４５】
ワクチン製剤は、ワクチンに適した任意の形で、例えば錠剤、特に被覆錠剤、カプセル、油中水型エマルジョン、食品、スプレー製剤、液体製剤、特に飲料水への添加物、注射用製剤、特に既に注射器にパッケージされた製剤として、ゲル、ゲルパッド又はそれらの組合せとして製剤化することができる。
【００４６】
本発明のワクチン製剤は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体又は希釈剤、例えば水、生理食塩水、培養液、安定剤、炭水化物、タンパク質、タンパク質含有剤、例えばウシ血清又は脱脂粉乳及び緩衝剤、又は医薬的に許容される非生物学的製剤化合物としてのそれらの任意の組合せを含む。安定剤としては、ＳＰＧＡが挙げられる。ＳＰＧＡは、０．２１８ Ｍのスクロース（７４．６２グラム）、０．００３７６ Ｍ のＫＨ ２ ＰＯ ４（０．５２ ｇ）、０．００７１ ＭのＫ ２ ＨＰＯ４（１．２５ ｇ）、０．００４９ Ｍのグルタミン酸カリウム（０．９１２ｇ）、及び１％血清アルブミン（１０ｇ）を含む。これらＳＰＧＡ中の各成分量に対して、種々の変更を加えてもよいことが当業者には知られており、特にグルタミン酸ナトリウムはしばしばグルタミン酸カリウムと置換される。しかし、斯かる変更を加えた組成物も依然としてＳＰＧＡと呼ばれる。例えば、あるＳＰＧＡ安定剤は、グルタミン酸一カリウムの代わりにグルタミン酸一ナトリウムを含む。別のＳＰＧＡ安定剤は、１Ｌの滅菌蒸留水当たり、７４．６２ｇのスクロース、０．４５ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．３５ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．９５６ｇのＬ−グルタミン酸一ナトリウム、及びアルブミノソール（albuminosol）（ヒトアルブミン）の２５％溶液４０ｍＬを含む。一般的に、ＳＰＧＡ安定剤は、約２〜約１０％の糖、例えばスクロース；約０．０５〜約０．３％の一又は二塩基性アルカリ金属リン酸塩又はその混合物、例えばＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４又はＮａ２ＨＰＯ４、約０．０５〜約０．２％のグルタミン酸アルカリ金属塩、例えばグルタミン酸ナトリウム又はカリウム；及び約０．５〜約２％の血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミン又はヒトアルブミンを含む。ＳＰＧＡ安定剤の製剤中の成分の代わりに、種々の代替成分を用いてもよい。例えば、澱粉加水分解物、例えばグルコースやデキストランの全部または一部に代えて、スクロースを用いてもよい。また、カゼイン又はＰＶＰの全部または一部に代えて、アルブミンを用いてもよい。炭水化物は、例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン又はそれらの組合せを包含する。更に、タンパク質、例えばアルブミン又はカゼイン、又はタンパク質含有剤、例えばウシ血清又は脱脂粉乳は、医薬的に許容される担体又は希釈剤として有用である。医薬的に許容される担体又は希釈剤として使用可能な緩衝剤としては、マレイン酸塩、リン酸塩、ＣＡＢＳ、ピペリジン、グリシン、クエン酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、琥珀酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピペラジン、ピリジン、カコジル酸塩、コハク酸塩、ＭＥＳ、ヒスチジン、ビス − トリス、ホスフェート、エタノールアミン、ＡＤＡ、炭酸塩、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ビス − トリスプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ピロリン酸塩、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、トリシン、ヒドラジン、グリシルグリシン、ＴＲＩＳ、ＥＰＰＳ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン、ホウ酸塩、ＣＨＥＳ、グリシン、水酸化アンモニウム、ＣＡＰＳＯ、炭酸塩、メチルアミン、ピペラジン、ＣＡＰＳ、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。ワクチン製剤は、凍結乾燥された（lyophirized or freeze-dried）ものでもよい。ある実施形態によれば、本発明のワクチン製剤は更に、少なくとも１つのアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油、カルボポール、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油エマルジョン（例えばBayol F（登録商標）又はマルコール（Marcol）の52（登録商標））、サポニン又はビタミンＥの可溶化物、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。ある実施形態によれば、ワクチン製剤は、粘膜投与に特に有用なアジュバント、例えば大腸菌（E. coli）熱不安定性毒素やコレラ毒素等を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明のワクチン製剤は、眼科的、卵内、皮内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、エアロゾル（噴霧予防接種）、排泄腔経由、又は筋肉内等の各経路で投与され得る。対象が家禽類である場合には、点眼、卵内及びエアロゾル投与が好ましい。ワクチン製剤を多数の対象に投与する場合には、エアロゾル投与が特に好ましい。本発明のワクチンは、カプセル又は被覆形で提供することが特に好ましい。これにより細菌／原虫混合物の適切な保存が可能となる。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明のワクチン製剤は、病原性細菌株の弱毒化単一株、好ましくは弱毒腸炎菌（Salmonella Enteritidis）及び／又はネズミチフス菌（Salmonella Enteritidis）及び／又はネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）株を、単一細菌株の１又は２以上の培養物として含む。
【００４９】
本発明のワクチン製剤は、１×１０２〜１×１０６、好ましくは１×１０３ 〜５×１０５、特に５×１０３〜１×１０５のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）、及び／又は、１×１０５〜１×１０１１、好ましくは１×１０７〜５×１０１０、特に５×１０７ 〜１×１０１０の細菌細胞を含むことが好ましい。
【００５０】
好ましい実施形態によれば、本発明のワクチン製剤は投与形として処方される。即ち、更なる分画／製剤化／分離工程を追加することなく投与できるよう、予め製剤化される。
【実施例】
【００５１】
材料及び方法
１．Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養
インビトロで増殖され、割り当てられたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis Turkey/Austria/2922-C6/04の同一の単一真核生物培養物について、２種の異なる継代（１０及び９０回）を用いた。まず、ヒストモナス症で死亡した七面鳥の盲腸壁から掻爬された約１ｇの盲腸内容物及び材料から、培養物を確立した。前記材料を、アール塩、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのHEPES及びＬ−アミノ酸を含む、９ｍＬのMedium 199（Gibco（登録商標）、Invitrogen）に添加した。更に、１５％の熱不活性化ウシ胎児血清ＦＢＳ（Gibco（登録商標）、Invitrogen）及び１１ｍｇの米澱粉（Sigma-Aldrich）を添加した。近年報告された手法に従い（Hess et al., 2006）、クローン化寄生生物の顕微操作及びインビトロ増殖を行い、単一真核生物培養物を確立した。液体窒素下での貯蔵後、クローン培養物を融解し、本実験に使用した。同じMedium 199に対して１５％ＦＢＳ、及び最大２０ｍｇまでの米澱粉を加え、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のインビトロ培養のための標準として使用した。細胞の継代は２〜３日毎に、１ｍＬの培養物を、９ｍＬの新鮮な培地を含む、新しい５０ｍＬの無菌管（Sarstedt）に移送することにより行った。
【００５２】
２．ゼニッククローン培養物の細菌叢の特性決定及び死滅化
細菌学的調査のために、ゼニック培養物のアリコートを、５％の羊血液を有するSchaedler寒天（ＳＣＳ）、５％羊血液を補充したColumbia寒天（ＣＯＳ）（BioMerieux）、MaCConkey寒天（McC）（ＬＡＢＭ）、及びColiform寒天（ＣＦ）に移送した。全ての寒天プレートを、３７℃で２４時間、好気条件下でインキュベートした。但し、ＳＣＳプレートは嫌気条件下でインキュベートした。単離された全ての細菌株について、Bauer et al. Am. J. Clin. Pathol. 45 (1966), 493-496に従って抗生物質感受性試験を行った。次の抗生物質ディスクを使用した：クロラムフェニコール３０μg、コトリモキサゾール（cotrimoxazol）２５μｇ、ジフロキサシン１０μｇ、エンロフロキサシン５μｇ、カナマイシン３０μｇ、リンコマイシン１５μｇ、マルボフロキサシン５μｇ、メロペネム１０μｇ、ネオマイシン３０μｇ、リファンピシン３０μｇ、スペクチノマイシン１００μｇ及びストレプトマイシン２５μｇ。感受性試験の結果を用いて、ゼニック培養物における細菌を死滅させるための抗生物質を選択した。
【００５３】
単一細菌株を有する培養物を確立するための鞭毛虫細胞を調製するために、１０ｍＬのゼニック培養物を、室温（ＲＴ）で５分間、３００×ｇで遠心分離し、上清液を除去し、そしてペレットを、１５％ＦＢＳを含む、９ｍＬの新鮮なMedium 199に再懸濁した。細菌を死滅させるべく、ドリペネム５０μｇ／ｍＬ、ネオマイシン５００μｇ／ｍＬ、及びリファンピシン３００μｇ／ｍＬを含む抗生物質混合物により、細胞懸濁液を４０℃で２０時間に亘って処理した。インキュベーションの後、細胞懸濁液をＲＴで５分間、３００×ｇで遠心分離した。細胞ペレットを、１５％ＦＢＳを補充した５ｍＬの新鮮Medium 199を用いて３度洗浄し、９ｍＬの新鮮培地に再懸濁した。
【００５４】
３．細菌の破壊
寒天プレート上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）のＰＣＲ及び計数を用いて、ゼニック培養物内の細菌叢を死滅させる上での抗生物質処理の有効性を評価した。元のゼニック培養物の細胞材料、抗生物質処理の前後に再懸濁された細胞ペレット、又は３回の洗浄工程後に再懸濁された細胞ペレットを、ＤＮＡ抽出に供した。試料を５００×ｇで５分間遠心分離し、上清液を除去した後、ペレットを−２０℃で凍結した。これをＲＴで融解し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した上で、動物血液又は細胞由来の総ＤＮＡ精製プロトコル（スピンカラムプロトコル）に従って、DNeasy（登録商標）Blood及びTissue Kit（Qiagen）を用いてＤＮＡ抽出を行った。
【００５５】
ＰＣ用小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子の一部増幅には、以下のプライマー対を用いた。即ち、
Ｈｍｆ 5'−ＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡ−3'    （配列番号１）
及び
Ｈｍｒ 5'−ＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＡＡＡ−3'（配列番号２）
（Grabensteiner et al., Parasitology 142 （2006）, 223-230）を、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）18S rRNA遺伝子用として用い、ユニバーサル対である：
16S F 5'−ＧＧＣＧＧＣＲＫＧＣＣＴＡＡＹＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴ−3'（配列番号３）
及び
16S R 5'−ＧＡＣＧＡＣＡＲＣＣＡＴＧＣＡＳＣＡＣＣＴＧＴ−3'    （配列番号４）
（Carroll et al., J. Clin. Microbiol. 38 （2000）, 1753-1757）を、細菌16S rRNA遺伝子に用いた。増幅は、２５μｌの反応混合物を用い、HotStarTaq Master Mix Kit（Qiagen）により行った。反応混合物の組成は、１２．５μｌのHotStarTaq Master Mix、８μｌの蒸留水、１μｌの前方向プライマー、１μｌの逆方向プライマー（何れのプライマーも１０ｐモル／μｌ濃度で使用した）、及び２．５μｌのＤＮＡ鋳型とした。９５℃で１５分間の初期変性工程後、反応混合物を、Biometra T3サーモサイクラーを用いて、４０サイクルの９４℃での３０秒の熱変性、Ｈｍｆ／Ｈｍｒについて、５５℃での、及び16S F/16S Rについて６０℃での１分間のプライマーアニーリング、及び７２℃での１．５分のＤＮＡ伸長、続く７２℃で１０分間の最終伸長工程に供した。得られたＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【００５６】
ＰＣＲ結果を評価するために、元のゼニック培養物から単離されたＤＮＡの１：１０段階希釈溶液を鋳型として用いると共に、プライマー対16S F／16S R、及び適切な増幅のためのプログラムを用い、半定量的ＰＣＲを実施した。
【００５７】
コロニー形成単位を決定するべく、抗生物質処理及び３回の洗浄工程の後、１００μｌの培養材料を、ＣＯＳ（BioMerieux） 及びＣＦ寒天（Merck）上に画線培養した。ＣＯＳ寒天プレートを微小好気条件下で、また、ＣＦ寒天プレートを好気条件下で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００５８】
４．大腸菌（E. Coli）DH5α及びDH5α pGFPuvを有する単一細菌株培養物の確立
細胞懸濁における鞭毛虫の数に依存して、２０〜３０μｌの体積のMedium 199における合計１００個のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を用いて、無菌の１．５ｍＬのエッペンドルフ管における単一細菌株培養物を接種した。生存原虫を、血球計数器を用いて計数した。試料を、等量のトリパンブルー株０．４％（Invitrogen）と共に混合し、生存細胞と死亡細胞とを区別した。
【００５９】
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）との共培養実験用に、細菌株大腸菌（E. coli）DH5α（Invitrogen）及びpGFPuvベクター（Clontech；緑色蛍光タンパク質発現及びAmp-耐性を提供する）を、１５％のＦＢＳ及び２０ｍｇの米澱粉を補充した９ｍＬのMedium 199中で３７℃で２０時間、２２５ｒｐｍで振盪しながら定常期に達するまで増殖させた。新鮮な１５％ＦＢＳ、並びに、DH5αには抗生物質ナリジクス酸１００μｇ／ｍＬ及びペニシリンＧ １００μｇ／ｍＬ、DH5α pGFPuvにはナリジクス酸１００μｇ／ｍＬ及びアンピシリン１００μｇ／ｍＬを添加した後、細菌培養物を１．５ｍＬのエッペンドルフ管に５００μｌのアリコートずつ分注した。抗生物質を用いて、DH5α及びDH5α pGFPuvの増殖に影響を及ぼすことなく、野生型盲腸細菌叢由来の残存する細菌を死滅させた。培養物を４０℃で３日間インキュベートした。顕微鏡試験で原虫の存在を監視することにより、単一細菌株培養物の確立の成否を確認した。ＣＯＳ （BioMerieux）及びＣＦ寒天（Merck）上に培養材料を画線培養することにより、細菌の存在を検出した。ＣＯＳ寒天プレートを微小好気条件下で、また、ＣＦ寒天プレートを好気条件下で、３７℃で２４時間に亘ってインキュベートした。２〜３日毎に、古い培養物１００μｌを、１５％ＦＢＳ、２ｍｇの米澱粉、並びに、抗生物質ナリジクス酸１００μｇ／ｍＬ及びペニシリンＧ １００μｇ／ｍＬ、或いは、ナリジクス酸１００μｇ／ｍＬ及びアンピシリン１００μｇ／ｍＬを有する９００μｌの新鮮Medium 199を含む、新しい滅菌２．０ｍＬエッペンドルフ管（Sarstedt）に移すことにより、継代培養を３度行った。その後の継代培養は、１ｍＬの古い培養物を９ｍＬの新鮮な培地を含む新しい無菌５０ｍＬ管（Sarstedt）に移すことにより、２〜３日ごとに行った。
【００６０】
５．異なる細菌株を有する単一細菌株培養物の確立
異なる細菌株を有する単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物を生成するべく、大腸菌（E. Coli）DH5αを含む単一細菌株培養物１０ｍＬを、ドリペネム５０μｇ／ｍＬ、ネオマイシン５００μｇ／ｍＬ及びリファンピシン３００μｇ／ｍＬの抗生物質により、４０℃で２０時間に亘って処理した。細胞ペレットの洗浄、細胞懸濁液の調製後、各々異なる細菌株を有する複数の単一細菌株培養物を１．５ｍＬエッペンドルフ管に入れ、これに上記のように１００個のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を接種した。
【００６１】
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010（内部診断番号、Clinic for Avian, Reptile and Fish Medicine, University of Veterinary Medicine Vienna）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853を、１５％ＦＢＳ及び２０ｍｇの米澱粉を補充した９ｍＬのMedium 199中で、４０℃で２０時間、振盪せずに増殖させた。６００ｎｍでの光学密度を測定し、必要に応じて、１５％ＦＢＳを補充したMedium 199により細菌懸濁液を希釈し、５×１０８〜９×１０８細胞／ｍＬの範囲内の細菌数を得た。新鮮な１５％ＦＢＳの添加後、細菌培養物を無菌の１．５ｍＬのエッペンドルフ管に５００μｌずつアリコートに分割した後、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を添加した。その培養物を４０℃で３日間インキュベートした。
【００６２】
共培養実験の開始時に、細菌の正確な数を、コロニー形成単位の計数により決定した。ウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）についての細菌学的調査は、ＳＣＳ寒天（BioMerieux）上で、大便連鎖球菌（Ｅ．faecalis）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．aureus）及び緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）についてはＣＯＳ寒天（BioMerieux）で、ネズムチフス菌（Ｓ．Typhimurium）及び腸炎菌（S. Enteritidis）についてはＣＦ寒天（Merck）上で、大腸菌（Ｅ．coli）についてはＭｃＣ寒天（LABM）上で実施した。ＳＣＳ寒天プレートを除き、何れのプレートも３７℃で２４時間、好気条件下でインキュベートした。新しい無菌の２．０ｍＬのエッペンドルフ管（Sarstedt）に入れた、１５％ＦＢＳ及び２ｍｇの米澱粉を含む９００μｌの新鮮Medium １９９に、１００μｌの古い培養物を移すことにより、培養物を２〜３日毎に２度継代した。
【００６３】
３継代全てにおいて、単一細菌株性質を確かめるために、培養物由来の生存Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を、血球計数器及びトリパンブルー染色０．４％（Invitrogen）を用いて計数した。細菌学的調査のために、コロニー形成単位を、上記転換プレートを用いて計数した。各増殖検査は５つずつ並行で四回実施した。２０種の試料の計数値の平均を用いて、原虫及び細菌の両者の増殖挙動性を評価した。統計学的分析にはＳＰＳＳプログラムを使用した。
【００６４】
同一の増殖実験を、ウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）、大便連鎖球菌（Ｅ．faecalis）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．aureus）、ネズムチフス菌（Ｓ．Typhimurium）及び腸炎菌（S. Enteritidis）を用いて、培養物中の細菌細胞を富化した条件下で実施した。最大３日間継続した第一の増殖期間中は、細菌細胞（２００μｌのMedium 199中に２×１０８〜５×１０８個の範囲の細胞）を、２４時間毎に単一細菌株培養物に添加した。第２の増殖期間中は、新鮮なMedium 199の代わりに３００μｌの適切な細菌培養物を含む新しい無菌の２．０ｍＬエッペンドルフ管（Sarstedt）中に、１００μｌの古い培養物を移した。第３の増殖期間中は、１００μｌの培養物を、１５％ＦＢＳ及び２ｍｇの米澱粉を補充した９００μｌの新鮮なMedium 199に継代した。
【００６５】
６．共焦点レーザー顕微鏡検査
共焦点レーザー顕微鏡検査のための試料を、大腸菌（E. Coli）DH5α pGFPuvを含むＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の培養物１０ｍＬから得た。２日間の培養物に対して、アンピミリン１００μｇ／ｍＬを有するＬＢ寒天プレートから追加の大腸菌（E. Coli）DH5α pGFPuvを接種し、４０℃で２０時間インキュベートした。培養物を２６６５×ｇで１０分間遠心分離し、培地中の米澱粉により結合されたペレットを生成した。斯かるペレットを生検包埋カセットに配置し、３．５％ホルマリンでＲＴで３時間固定化し、パラフィンに包埋し、１０μｍ厚切片化した。その切片をSuperfrost Ultra Plus slides（Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany）上に配置し、Neoclear（Merck）で脱蝋し、段階的濃度の複数のエタノール（１００％、９６％及び７０％）及び蒸留水で再水和化した。このスライドを、１．５％過酸化水素を補充したメタノール中で３０分間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４により２０分間洗浄し、保湿チャンバー内でＲＴで１時間に亘り、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清によるブロックを行った。血清を除き、切片を１：１０，０００希釈の精製ポリクローナルウサギ抗ヒストモナス血清で被覆し、保湿チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、切片を１：５００希釈Alexa Fluor 568（Invitrogen）結合抗ウサギＩｇＧと共に、保湿チャンバー内でＲＴで１時間インキュベートし、続いてＰＢＳにより洗浄し、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI、Roche）により５分間染色した。切片を再びＰＢＳで洗浄した後、スライドをAquatex（Merck）によりカバースリップ下にマウントした。共Zeiss 510 METAレーザー走査モデル（Carl Zeiss, Germany）を備えたZeiss Axiovert 200Mを用いて焦点顕微鏡写真を撮影した。画像スタックの走査は、６３倍／１．４油浸対物レンズを用い、１０２４×１０２４ピクセル及び０．３１８μｍのＺ軸増分で行った。最終画像の明るさ及びコントラストを、Adobe Photoshop CS2 （Adobe Systems, San Jose, CA）を用いて調節した。
【００６６】
７．単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物によるインビボ実験
この実験では、生後１日齢の七面鳥（Converter, Hybrid Europe, Malguenac, France）３０羽を、藁を深く敷いた囲い内に収容し、圧力下で飼育した。個々の鳥を番号付けタグ（Swiftack（登録商標）; Heartland Animal Health Inc., Fair Play, MO）によりマークした。飼料（市販の七面鳥用スタータ飼料）及び水は自由に提供したが、感染直後に５時間の食餌制限を行った。
【００６７】
本動物実験は制度理論委員会により議論・承認され、オーストリア法律により認可された（ライセンス番号BMWF- 68.205/0256-BrGT/2005）。
【００６８】
野生型細菌叢を有するゼニック培養物Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）／Turkey/Austria/2922-C6/04 （Hess et al., 2006）をインビトロで１０及び２９０代に亘って継代培養したあと、大腸菌（E. Coli）DH5αを有する単一細菌株培養物の生成に供した。更に１０及び５代のインビトロ継代培養（合計インビトロ継代培養数は２０及び２９５代）の後、単一細菌株培養物を感染用接種物として使用した。更に、ゼニックＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物インビトロ継代培養物２０及び大腸菌（E. Coli）DH5αの一晩の培養物を、対照として使用した。感染は、１５％ＦＢＳ及び０．６６ｍｇの米澱粉を補充したMedium 199中に１０４個の原虫細胞を含む培養物３００μｌ、又は同じ培地で増殖された細菌培養物３００μｌを、従来のエッペンドルフピペットを用いて、排泄腔から鳥に投与した。
【００６９】
実験には異なる４つのグループを設定した。グループＡ及びＢに含まれる鳥各１０羽は、それぞれ２９５代及び２０代のインビトロ継代培養を行った単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に感染させた。対照として、グループＣ及びＤの鳥各５羽は、それぞれ２０代インビトロ継代培養ゼニック培養物及び大腸菌（E. Coli）DH5培養物に感染させた。何れの鳥も生後１４日齢に接種を受けた。
【００７０】
臨床徴候を毎日記録した。寄生虫のインビトロでの再単離用の排泄腔スワブを、感染後０、２、５、９、１２、１６及び１９日目に、標準のプロトコル（Hess et al., Avian Pathol. 35 (2006), 280-235；“Hess et al., (2006b)”）に従って採取した。ＣＦ寒天（Merck）での細菌学的調査用の追加の排泄腔スワブを、感染後０、２及び５日目に採取した。何れの寒天プレートも３７℃で２４時間、好気条件下でインキュベートした。死亡した鳥、病気の重症化ゆえに安楽死された鳥、及び実験終了時に屠殺された鳥は、何れも剖検に供した。鳥の盲腸及び肝臓について、ヒストモナス症（histomonosis）を示す病理学的変化の有無を調べた。器官に見出される病変の重症度は、既に確立されている病変評点に従って分類した（Windisch et al., Paras. Immunol. 32 (2010), 29-35; Zahoor et al., Avian Dis. 55 (2011), 29-34）。単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に感染した七面鳥（グループＡの５羽の鳥及びグループＢの全ての鳥）、又は細菌培養物大腸菌（E.coli）DH5αのみに感染した七面鳥（グループＤの３羽の鳥）について、盲腸及び肝臓の細菌学的調査を実施した。器官からの組織材料を、異なる寒天プレート上に画線培養した。ＣＦ（Merck）及びＭｃＣ寒天プレート（LABM）は、好気条件下で３７℃で２４時間インキュベートし、ＳＣＳ寒天プレート（BioMerieux）は、嫌気条件下で３７℃で２４時間インキュベートした。
【００７１】
結果
１．野生型細菌叢の交換、及び大腸菌（E.coli）DH5αを有する単一細菌株培養物の提供
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を生成するには、ゼニック培養物中の細菌叢の特性決定をする必要がある。元のゼニック培養物は１０９の細胞／ｍＬの細胞数を有し、大腸菌（E.coli）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）及びプロテウス属（Proteus sp.）を寒天プレート上で単離した。感受性試験により、細菌株がメロペネム、ネオマイシン及びリファンピシンを除く殆どの抗生物質に耐性であることが分かった。その結果、これらの抗生物質を単一細菌株培養物の供給のために使用した。また、ドリペネムはカルバペネムの分類に属し、メロペネムに非常に類似した作用を示すことから、調製に使用した。種々の濃度のドリペネム（２０〜５０μｇ／ｍＬ）、ネオマイシン（５０〜５００μｇ／ｍＬ）及びリファンピシン（２００〜３００μｇ／ｍＬ）を用いて、細菌叢を死滅させる試験を行った。細菌の殆どを死滅させるが、原虫細胞は生存したまま維持し得る最良の結果は、ドリペネム５０μｇ／ｍＬ、ネオマイシン５００μｇ／ｍＬ及びリファンピシン３００μｇ／ｍＬの混合物により得られた。抗生物質処理及び洗浄後のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の計数値によれば、寒天プレート上で増殖された大腸菌（E. coli）及びプロテウス属（Proteus sp.）の単一コロニー数は少数（１２０個の細菌／ｍＬ）であった。プライマー対Ｈｍｆ／ＨｍｒによるＰＣＲにより、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）が細菌懸濁液にまだ存在することを確認した（図１）。プライマー対１６Ｓ Ｆ／１６Ｓ ＲによるＰＣＲにより、細菌ＤＮＡが低下したことが示された。この知見は、半定量的ＰＣＲの結果により支持された。単一細菌株培養物の生成時に、抗生物質ナリジクス酸及びペニシリンＧを添加することにより、残留細菌叢が完全に除去されたことが、寒天プレート上で示された。大腸菌（E. coli）DH5αが単一細菌株培養物にまだ存在していることを、lacz遺伝子の特異的な部分欠失に基づく増殖挙動により同定した。単一細菌株培養物の確立に成功し、２．０ｍＬのエッパンドルフ管からの５０ｍＬの管へ変更した後、連続した継代培養における大腸菌（E. coli）DH5αと共に増殖された原虫細胞の数は、継代培養レベルに関係なく、ゼニック培養物における数と同等であった（約５０×１０４細胞／ｍＬ）。
【００７２】
２．異なる細菌株との共存下での単一細菌株培養物におけるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖
種々の細菌株と共にＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物の供給に続いて、生存原虫の細胞の存在を、血球計数器を用いて顕微鏡的に調べた。
【００７３】
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）を含む最高数の試料が見出されたのは、大腸菌（E. coli）（３０％〜４５％）と、続いてゲルトネル菌（Ｓ．Typhimurium）（５％〜２０％）及び緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）（１０％）と共に同時インキュベートされた培養物であった（図２Ａ）。腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）を有する単一細菌株培養物では、原虫細胞は第１継代培養後でのみ検出され（５％）、ウェルシュ菌（Ｃ. perfringens）は第３継代培養後でのみ検出された（１０％）。大便連鎖球菌（Ｅ．faecalis）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ. aureus）を含む培養物の何れにも、原虫細胞は見出されなかった。最高６１×１０４細胞／ｍＬの細胞数の鞭毛虫が、緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）を有する単一細胞菌株培養物において計数された（図２Ｂ）。原虫の細胞数は、大腸菌（E. coli）及びゲルトネル菌（Ｓ．Typhimurium）を有する培養物では殆ど同一であり、それぞれ１９．４×１０４細胞／ｍＬ及び１６．６×１０４細胞／ｍＬであった。
【００７４】
第２組の実験では、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖を、ウェルシュ菌（Ｃ．Perfringens）、大便連鎖球菌（E. faecalis）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．aureus）、ゲルトネル菌（S. Typhimurium）及び腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）を含む単一細菌株培養物で、細菌細胞の富化に続いて分析した。黄色ブドウ球菌（Ｓ. aureus）を有する殆ど全て培養物（８０％〜８６．７％）が、原虫細胞を含んでいた（図２Ａ）。継代培養の数に応じて、ゲルトネル菌（Ｓ．Typimurium）又は腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）と共に同時インキュベートした試料の２６．７％〜６６．７％及び６．７〜５３．３％が陽性であることを見出した。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞は、ウェルシュ菌（Ｃ. perfringens）及び大便連鎖球菌（E. faecalis）を含む培養物の何れにおいても検出されなかった。ゲルトネル菌（Ｓ．Typhimurium）を有する単一細菌株培養物では、最高２０×１０４個の原虫細胞／ｍＬが計数され、腸炎菌（Ｓ. Enteritidis）を有する培養物では、最高１２．６×１０４個の原虫細胞／ｍＬが計数された（図２Ｂ）。黄色ブドウ球菌を含む培養物における鞭毛虫細胞の最大数は９．８×１０４細胞／ｍＬであった。
【００７５】
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）との共培養実験の開始時、及び、３日間のインキュベーション期間後に、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を計数することにより、単一細菌株培養物における細菌数を決定した。細菌数が最も上昇したのは、ゲルトネル菌（Ｓ．Typhimuriumu）、続く緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）及び大腸菌（E. coli）であった（図３Ａ）。腸炎菌（Ｃ．Enteritidis）、大便連鎖球菌（E. faecalis）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．aureus）及びウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）の細菌数は、インキュベーションの間ほぼ安定して推移した。開始以降、単一細胞菌株培養物における黄色ブドウ球菌（Ｓ．aureus）及びウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）細胞数は、他の細菌株の細胞数よりも低かったが、その理由は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のインビトロ増殖に最適化した条件下では、これらの細菌は十分に増殖しなかったからである。何れの菌株でも、共培養実験は利用可能な最大数の細胞を用いて開始した。単一細菌株培養物における細菌の富化の後、経時的に数が上昇した唯一の細菌は、ゲルトネル菌（Ｓ．Typhimurium）であった（図３Ｂ）。腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）、大便連鎖球菌（Ｅ．faecalis）及びウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）の数は、多少の差はあれど大幅に減少した。
【００７６】
３．共焦点蛍光顕微鏡
共焦点蛍光顕微鏡を用いて、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞における大腸菌（E. coli）DH５α pGFPuvの存在を調査し、原虫内での分布を研究した。ＧＦＰ発現細菌は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の表面に付着され、鞭毛中により包囲されることが分かった（図４）。ＤＡＰＩはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の核を染色し、原虫内及び培養培地中で、細菌ＤＮＡに対応する多くの細長いプロフィールを示した。ＤＡＰＩ陽性細菌の一部は、緑色蛍光タンパク質の安定性が限定ていたために、ＧＦＰシグナルを欠いていた。
【００７７】
４．単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物によるインビボ実験
ヒストモナス症により死亡し、或いは安楽死された七面鳥の累積死亡率を、図５に示す。感染後２及び３日目に共食いにより死亡したグループＢの２羽の鳥は、分析から排除した。単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の２０代のインビトロ継代培養物に感染させたグループＢの他の全ての鳥、及び、ゼニックＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の２０代のインビトロ継代培養物に感染させたグループＣの全ての鳥は、ヒストモナス症の臨床学的症状、例えば波状の羽、傾眠及び硫黄色の下痢を示した。グループＢとＣとの間には、臨床学的症状の出現及び死亡率に、約１週間の遅延が存在した。ヒストモナス症から死亡した両グループ由来の全ての鳥を倍検したところ、盲腸及び肝臓に重度の破壊が見受けられ、病変評点は最高の４であった。グループＡ及びＤの七面鳥は何れも、研究期間中、何の臨床的症状も示さなかった。それらは、感染後５週間の実験の終了時に屠殺された。剖検により、盲腸壁の散発的肥厚化（病変評価１）が、単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の２９５代インビトロ継代培養物に感染したグループＡの鳥１０羽中４羽に検出され、１羽は両盲腸壁の強い肥厚化を有した（病変評点３）。他の５羽の鳥は何れも、盲腸の炎症の症状を何ら示さなかった（病変評点０）。更に、何れの鳥も肝臓は正常であった（病変評価０）。大腸菌（E. coli）DH5α培養物に感染したグループＤの鳥の盲腸及び肝臓は、臨床学的異常性を示さなかった（病変評点０）。
【００７８】
生存原虫細胞を、特定のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に感染した各グループからの異なる七面鳥から再単離した。予測されるように、対照グループＤの鳥からの全ての試料は、陰性のままであった。
【００７９】
ＣＦ寒天上での感染の後、０、２及び５日目に採取された総排泄腔スワブの細菌学的調査は、野生型大腸菌（E. coli）及びシトロバクター属（Citrobacto sp.）の存在を示したが、大腸菌（E. coli）DH5αは見出されなかった。更に、単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物又は細菌培養物大腸菌（E. coli）DH5αに感染した七面鳥の盲腸及び肝臓から採取された材料の何れにおいても、大腸菌（E. coli）DH5αは単離されなかった。しかし、試験された何れの鳥の盲腸でも、野生型大腸菌（E. coli）に加えて球菌細菌株が観察された。緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）が、単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物インビトロ継代培養物２０に感染した２羽の鳥の盲腸に見出され（グループＢ）、別の鳥の盲腸にはウェルシュ菌（Ｃ．perfringens）が検出された。肝臓の細菌学的調査によれば、試験された全ての鳥に球菌細胞株の存在が示された。更に、野生型大腸菌（E. coli）が、グループＢの鳥の肝臓試料の６２．５％で単離された。
【００８０】
議論
Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）は、前世紀の初めからインビトロで培養されてきた。広範囲の種類の培養培地及び条件が使用されてきたが、良好且つ急速な増殖が補助されたのは、盲腸から単離された便材料由来の一定の生存細菌が培養物に存在する場合のみであった（例えば、Hauck et al., 2010）。これらの細菌は液胞にも観察されたことから、鞭毛虫の食料として機能すると推測される。また、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞の電子顕微鏡試験により、細菌がファゴサイトーシスを介して原虫に摂取されることが示された（Mazet et al., Int. J. Parasitol. 38 (2008), 177-190）。本出願に報告される、大腸菌（E. coli）DH5α pGFPuvと共に増殖されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の共焦点レーザー顕微鏡分析により、原虫細胞内に細菌が存在することが明確に確認され、また、組込まれる細菌株の１つが大腸菌（Ｅ．coli）であることが示された。
【００８１】
本調査によれば、原虫の増殖を最も強く促進するのは大腸菌（E. coli）であり、次いでゲルトネル菌（S. Typhimurium）で有ることが判明した。大腸菌（E. coli）が有する係る陽性の効果は、以前の研究と一致する。Goedbloed et al. (1962)は、ヒストモナス症により死亡した七面鳥の新鮮な肝臓材料由来のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）を、予め生存大腸菌（Ｅ．coli）を接種した培養培地に首尾よく移送した旨を報告する（Boeck-Drbohlav及びDobell-Laidlaw）。大腸菌（Escherichia）及びサルモネラ菌（Salmonella）は腸内細菌科に属し、エネルギーを得るために好気性又は嫌気性呼吸を用いるグラム陰性の通気嫌気性桿菌である。嫌気性条件下且つ最終電子受容体の不在下では、これらの増殖は発酵により駆動される。従って、これらが実験条件下でＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖に対して正の影響を有する理由の一つは、高い分裂速度を有する細菌が、原虫により消化される細胞物質を生成することによる。更に、細菌は培養管中で酸素を効果的に消費し、これによりＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の嫌気性代謝のための条件が向上する。これは極めて重要である。嫌気性鞭毛虫であるＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖は、酸素により阻害されるからである。
【００８２】
興味あることには、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖を促進する能力において、腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）はネズミチフス菌（Ｓ．Typhimurium）よりも劣っている。斯かる知見の説明の一つは、使用された条件下での腸炎菌（Ｓ．Enteritidis）の増殖速度が低いというものである。既存の知見によれば、ネグレリア（Naegleria）、アカントアメーバ（Acanthamoeba）及びハルトマネラ（Hartmanella）属の腸内原虫は、種々のチフス菌（Salmonella enterica serovars）を抗原的に区別することにより、捕食対象の識別及び選択を行っている。
【００８３】
緑膿菌（P. aeruginosa）は、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）のグラム陰性の通気嫌気性桿菌である。通常は好気性増殖条件を好むとされているが、酸素制限条件下では、エネルギーを得るために嫌気性呼吸又は発酵を用いることができる。大腸菌（Ｅ．coli）と同様のエネルギー代謝及び高増殖速度にもかかわらず、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）との共培養実験下では、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）陽性の試料はわずか１０％であった。その説明の一つは、緑膿菌（Ｐ．aeruginosa）がバイオフィルムを形成する能力を有し、斯かるバイオフィルムによって補助効果が阻止されるというものである。鞭毛虫リンコモナス・ナスタ（Rhynchomonas nasuta）による実験によれば、鞭毛虫により誘発される細菌性バイオフィルム内でのマイクロコロニーの形成が、原核細胞を原虫接触（grozing）に対して抵抗性にすることが示された。
【００８４】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）を共培養実験に使用したところ、細菌細胞の富化後に単一細菌株培養物を確立することしかできなかった。黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、スタフィロコカセアエ（Staphylococcaceae）科に属する。球菌グラム陽性細菌は通気嫌気性であり、そのエネルギー代謝は好気性又は嫌気性呼吸に基づく。従ってそれは、培養管内の酸素レベルを低下させるための必要条件を満たす。インキュベーションの間、試料に新鮮な細菌を添加することにより、実験条件下での細菌の低い増殖速度が補償され、単一細菌株培養物における原虫の増殖が補助される。ここでさらに留意すべき点は、単一の大腸菌（E. coli）細胞は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞の最大１０倍の大きさであり、原虫の栄養必要性を満たすには、結果的により多くの数の黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞が必要になるという点である。
【００８５】
２種の細菌、ウェルシュ菌（C. perfringens）及び大便連鎖球菌（E. faecalis）は、それぞれグラム陽性、嫌気性又は通気嫌気性であり、クロストリジウム（Clostridaceae）及びエンテロコッカセアエ（Enterococcaceae）科の原核生物であり、それらのエネルギー代謝は発酵に依存する。よってこれらは培養管内の酸素を消費するため、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖を補助することはできない。第３継代の後、ウェルシュ菌（C. perfringens）との共培養に見られた小数の単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）は、この細菌株が使用する発酵の形態により説明することができる。酪酸発酵の間に生成された二酸化炭素が培養物中の酸素の一部を置換し、好気性状態を低下させる。しかし、斯かる置換は低レベルでしか作動せず、ウェルシュ菌（C. perfringens）は絶対嫌気性であるので、共培養ではあまりよく増殖しない。対照的に、酸素耐性嫌気性菌である大便連鎖球菌（E. faecalis）は、より良好に増殖した。この細菌はエネルギー生成にホモ乳酸発酵を用いるが、これは二酸化炭素の形成を伴わず、グルコースを乳酸に転換するものである。従って、培養物中の酸素レベルは変化しない。このことが、斯かる単一細菌株培養物においてＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の増殖が見られなかった理由の説明となる。
【００８６】
単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物と複数の異なる細菌株との共培養物の確立に成功した後、鞭毛虫の病原性に対する大腸菌（E. coli）DH5αの影響を調べるために、動物試験を実施した。インビトロで２０回継代培養されたゼニック又は単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物を摂取した鳥は、何れもヒストモナス症により死亡するか、或いは安楽死された。剖検により、盲腸及び肝臓における壊死を伴う重度の炎症が示され、その病変評点は最大となった。インビトロでの僅か数度の継代を経た寄生生物に感染した鳥において、臨床学的徴候が縮小した事実は、以前の実験と一致している（Hess et al., (2006b); Hess et al., 2008）。また、Goedbloed et al. (1962)は、大腸菌（E. coli）と一緒に増殖されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物に感染した七面鳥が、ヒストモナス症を縮小したことも示している。更に、腸における１つの定義された細菌株、例えば大腸菌（E. coli）又はエシェリヒア・インターメディア（Escherichia intermedia）の存在は、原虫がその感染性及び病原性を表すために十分である。対照的に、ノトバイオート七面鳥及び無菌盲腸の七面鳥による実験は、腸管における及び特に、盲腸における細菌の存在がヒストモナス症を生成するのに必要であることを示した。
【００８７】
臨床学的徴候の出現及び死亡における約１週間の遅延は、細菌単一株又はＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物（両者とも短時間継代されている）の何れかに感染したグループにおける鳥の比較であると認められた。ゼニック培養物に存在する細菌は、この実験に使用される七面鳥の腸内細菌叢に類似することが想定される。更に、ゼニックＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物は、大腸菌（E. coli）DH5αはそれらの条件下で低い効率で増殖するが、単一細菌株培養物よりも多数の細菌細胞を含んでいた。結果として、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）は、ゼニック培養物に感染した鳥の腸管において幾分良好な増殖条件を有した。接種物におけるより多くの数の細菌細胞、及びそれらの野生型細菌への原虫の適応が、それらのより早い増殖を可能にし、予想される結果をもたらした。
【００８８】
大腸菌（E. coli）DH5αは、宿主内で複製せず、感染後に全く再単離されなかった。更に、細菌培養物のみに感染した七面鳥では、臨床学的効果は観察されなかった。
【００８９】
インビトロで２９５回継代された単一細菌株Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物に感染した七面鳥は、何れも感染後５週まで維持されたが、何ら臨床学的徴候を示さなかった。死後の調査の間、盲腸の一部で幾分の僅かな変化が見出されたが、肝臓には病変は全く見られなかった。かかる知見は過去の研究と一致する（例えば、Liebhart et al., 2011）。
【００９０】
単一細菌株培養物に感染した七面鳥の盲腸及び肝臓の細菌学的調査は、原虫感染が、おそらくは腸粘膜の高い透過性ゆえに、大腸菌（E. coli）による肝臓の感染を促進できたことを示唆する。近年の報告によれば、天然感染の鳥におけるヒストモナス症と大腸菌（E. coli）感染との間には一定の相互作用が存在し、大腸菌症を誘発する大腸菌（E. coli）株に対する幾分の選好性が見受けられる。驚くべきことに、Goedbloed. et al. (1962)によれば、斯かる単一細菌株培養物に直腸、肝臓内又は静脈内感染した鳥の肝臓には、大腸菌（E. coli）は検出されなかった。
【００９１】
結論として、本実施例では、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）含有便相のクローンゼニック培養物の２種の異なる継代培養物から、細菌単一株培養物が確立された。Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の病原性は、大腸菌（E. coli）DH5αへの細菌の交換に影響されないので、本培養物は、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の生物学的特性及びインビトロ弱毒化の基本的作用機序の特定の側面を調査するのに非常に適しているのみならず、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）感染により引き起こされる疾患を予防するためのワクチン製剤を提供する上でも卓越した材料であると思われる。
【００９２】
好ましい態様
本発明の好ましい態様を以下に定義する。
【００９３】
１．ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis, H. meleagridis）の単一細菌株培養物を産生する方法であって、
（ａ）Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を含むＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物（xenic culture）に野生型細菌叢を供給する工程、
（ｂ）前記ゼニック培養物を複数の抗生物質の混合物で処理することにより野生型細菌叢を死滅させる工程、
（ｃ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離及び洗浄し、
（ｄ）工程（ｂ）の有効性を制御する工程、
（ｅ）前記洗浄されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を再懸濁する工程、
（ｆ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に一又は二以上の単一細菌株を加える工程、及び、
（ｇ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養することにより、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程
を特徴とする方法。
【００９４】
２．前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物が、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のクローン培養物、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）培養物の顕微操作（micro-manipulation）により確立されたクローン培養物である、態様１に記載の方法。
【００９５】
３．前記複数の抗生物質の混合物が、少なくとも３種の異なる抗生物質、好ましくはドリペネム、ネオマイシン及びリファンピシンの混合物である、態様１又は２に記載の方法。
【００９６】
４．工程（ｄ）が工程（ｂ）又は（ｃ）の後にコロニー形成単位を決定することにより実施され、好ましくは、前記野生型細菌叢がＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞から完全に除去されていなかった場合に、工程（ｄ）が繰り返される、態様１〜３の何れか一項に記載の方法。
【００９７】
５．工程（ｆ）において、大腸菌（Eschericia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）、ゲルトネル菌（Salmonella Typhimurium）、黄色ブドウ球菌（Staphlyococcus aureus）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）及び／又は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、態様１〜４の何れか一項に記載の
【００９８】
６．工程（ｆ）において、クロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、大腸菌（Escherichia coli）DH5α、又はベクター pGFPuvで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、態様１〜５の何れか一項に記載の方法。
【００９９】
７．前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞が、ウシ胎児血清を含む培地、好ましくは更に緩衝剤、アミノ酸及び炭化水素源、とりわけ澱粉を含む培地内に維持される、態様１〜６の何れか一項に記載の方法。
【０１００】
８．前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）のゼニック培養物が、弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）、好ましくはＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化クローン培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922-C6/04の弱毒化クローン培養物である、態様１〜７の何れか一項に記載の方法。
【０１０１】
９．工程（ｆ）で添加される前記一又は二以上の単一細菌株が、
（ｈ）工程（ｇ）で得られた前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を、工程（ｆ）で添加された前記一又は二以上の単一細菌株を特異的に死滅させる一の抗生物質又は複数の抗生物質の混合物で処理することにより、工程（ｆ）で添加された前記細菌株を死滅させる工程、
（ｉ）前記Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞を遠心分離、洗浄及び再懸濁する工程、
（ｊ）前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞に、一又は二以上の単一細菌株を添加する工程、及び、
（ｋ）前記一又は二以上の単一細菌株を前記再懸濁されたＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞と共に培養し、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物を得る工程
により、一又は二以上の他の単一細菌株に置換される、態様１〜８の何れか一項に記載の方法。
【０１０２】
１０．工程（ｊ）において、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種ATCC29212、チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一又は二以上の単一細菌株培養物が添加される、態様１〜９の何れか一項に記載の方法。
【０１０３】
１１．工程（ａ）で供されるゼニック培養物が、その細菌組成について分析され、好ましくは細菌増殖試験、とりわけコロニー形成単位の決定により、或いは分子生物学的方法、とりわけポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分析される、態様１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【０１０４】
１２．工程（ｂ）における複数の抗生物質の混合物が、５〜５００、好ましくは１０〜１００、とりわけ３０〜７０μｇ／ｍＬのドリペネム、５０〜５０００、好ましくは１００〜１０００、とりわけ３００〜７００μｇ／ｍＬのネオマイシン、及び、３０〜３０００、好ましくは５０〜１５００、とりわけ１００〜５００μｇ／ｍＬのリファンピシンの濃度で使用される、態様１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【０１０５】
１３．工程（ｂ）における複数の抗生物質の混合物が、クロラムフェニコール、コトリモキサゾール、ジフロキサシン、ドリペネム、エンロフロキサシン（enrofloxacin）、カナマイシン、リンコマイシン、マルボフロキサシン（marbofloxacin）、メロペネム、ネオマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンから選択される少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の抗生物質を含む、態様１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【０１０６】
１４．少なくとも工程（ｇ）が、及び任意により工程（ｋ）が、３５〜４５℃、好ましくは３８〜４２℃の温度で実施される、態様１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【０１０７】
１５．工程（ｂ）が、及び任意により工程（ｈ）が、３５〜４５℃、好ましくは３８〜４２℃の温度で実施される、態様１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【０１０８】
１６．工程（ｂ）が、及び任意により工程（ｈ）が、少なくとも１ｈ、好ましくは少なくとも５ｈ、とりわけ少なくとも１０ｈに亘って実施される、態様１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【０１０９】
１７．前記単一細菌株が通性嫌気性又は好気性細菌株である、態様１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【０１１０】
１８．工程（ｆ）で添加される前記単一細菌株が遺伝子操作された細菌株である、態様１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【０１１１】
１９．工程（ｆ）で添加される前記単一細菌株が遺伝子操作されていない細菌株である、態様９〜１８の何れか一項に記載の方法。
【０１１２】
２０．前記洗浄工程を洗浄用溶液を用いて行う態様１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【０１１３】
２１．ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis）の弱毒化培養物からなるヒストモナス（Histomonas）成分、
一又は二以上の単一細菌株からなる細菌成分、及び、
医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物
からなるワクチン製剤。
【０１１４】
２２．前記ヒストモナス（Histomonas）成分及び前記細菌成分が、態様１〜２０の何れか一項に従って得られ得るＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）の単一細菌株培養物として提供される、態様２１に記載のワクチン製剤。
【０１１５】
２３．前記細菌成分が、単一細菌株の一培養物、好ましくはクロストリジウム（Clostridium）属、好ましくはウェルシュ菌（Clostridium perfringens）種、とりわけウェルシュ菌（Clostridium perfringens）野外株PA10/2010、腸球菌（Enterococcus）属、好ましくは大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）種、とりわけ大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくはチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）種、とりわけチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ATCC14028、サルモネラ（Salmonella）属、好ましくは腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）種、とりわけ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）ATCC13076、大腸菌（Escherichia coli）種、とりわけ大腸菌（Escherichia coli）ATCC25922、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、好ましくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、とりわけ黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）野外株PA10/10643、及び／又はシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、とりわけ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853から選択される細菌株の一培養物を含む、態様２１又は２２に記載のワクチン製剤。
【０１１６】
２４．前記弱毒化Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）が、Ｈ．メレアグリジス（H. meleagridis）の弱毒化クローン培養物、とりわけＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）Turkey/Austria/2922-C6/04のの弱毒化クローン培養物である、態様２１〜２３の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１１７】
２５．前記製剤が、好ましくは家禽、とりわけシチメンチョウ及びニワトリにおける、並びに狩猟鳥、とりわけキジ、ヤマウズラ、ホロホロチョウ及びウズラにおける、ヒストモナス症（histomonosis）の予防に用いられる、態様１１〜１４の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１１８】
２６．前記医薬的に許容可能な非生物学的製剤化合物が、緩衝剤、アジュバント、とりわけ水酸化アルミニウム、保存料、フィラー（filler）、安定化剤、栄養剤、又はこれらの組み合わせを含む、態様２１〜２５の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１１９】
２７．前記製剤が、錠剤、とりわけ被覆錠剤、カプセル、油中水型（water-in-oil）エマルション、食品、噴霧製剤、液体製剤、とりわけ飲料水用添加物、注射用製剤、とりわけシリンジ予充填品、ゲル、ゲルパッド、又はこれらの組わせである、態様２１〜２４の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１２０】
２８．前記単一細菌株の一又は二以上の培養物が、病原性細菌株の弱毒化単一株、好ましくは弱毒化単一ゲルトネル菌（Salmonella Typhimurium）及び／又はネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）株である態様２１〜２７の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１２１】
２９．前記製剤が、１×１０２〜１×１０６、好ましくは１×１０３〜５×１０５、とりわけ５×１０３〜１×１０５のＨ．メレアグリジス（H. meleagridis）細胞、及び／又は、１×１０５〜１×１０１１、好ましくは１×１０７〜５×１０１０、とりわけ５×１０７〜１×１０１０の細菌細胞を含む、態様２１〜２８の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【０１２２】
３０．前記ワクチン製剤が投与形態として処方されてなる、態様２１〜２９の何れか一項に記載のワクチン製剤。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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