(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる細胞を、当該細胞が有する物質に基づき、高感度かつ高精度に検出／解析可能な方法を提供すること。【解決手段】  試料中に含まれる目的細胞を検出する際、当該目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を（好ましくは夾雑細胞も）検出した後、試料中に含まれる細胞群から前記検出した目的細胞（好ましくは目的細胞および／もしくは夾雑細胞）を検出対象から除外した細胞群に対し、前記特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出することにより、前記課題を解決する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（５）に示す工程を少なくとも含む、目的細胞および夾雑細胞を含む試料から目的細胞を検出する方法。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を検出する工程、
（３）夾雑細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、試料中に含まれる夾雑細胞を検出する工程、
（４）試料中に含まれる細胞群から（３）の工程で検出した夾雑細胞を検出対象として除外する工程、
（５）（４）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出する工程
【請求項２】
以下の（１）から（４）に示す工程を少なくとも含む、試料中に含まれる目的細胞を検出する方法。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を検出する工程、
（３）試料中に含まれる細胞群から（２）の工程で検出した目的細胞を検出対象として除外する工程、
（４）（３）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出する工程
【請求項３】
以下の（１）から（５）に示す工程を少なくとも含む、目的細胞および夾雑細胞を含む
試料から目的細胞を検出する方法。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれ
る目的細胞を検出する工程、
（３）夾雑細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、試料中に含まれる夾雑細胞を検出
する工程、
（４）試料中に含まれる細胞群から（２）の工程で検出した目的細胞および（３）の工程
で検出した夾雑細胞を検出対象として除外する工程、
（５）（４）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以
外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞
を検出する工程
【請求項４】
試料が血液試料であり、目的細胞が血中循環腫瘍細胞であり、前記（２）の工程で目的細胞の検出に用いる物質が上皮系細胞が発現するタンパク質である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる細胞を検出する方法に関する。特に本発明は、血液や尿などの生体試料中に含まれる特定の細胞を、当該細胞が特異的に有する物質に基づき検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織懸濁液や、細胞培養液といった試料から細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、癌患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣと表記）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
しかしながら、ＣＴＣは存在確率が非常に少なく（試料が癌患者由来の全血の場合、全血１ｍＬあたり数個程度）、高感度な検出を必要とする。またＣＴＣは通常、ＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）などの核染色試薬で染色され、サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）など上皮系細胞が発現するタンパク質に対する標識抗体で染色され、かつＣＤ４５など白血球マーカーに対する標識抗体では染色されない細胞をＣＴＣとして判定しているが、ＣＴＣの中には前記上皮系細胞が発現するタンパク質に対する標識抗体では染色されないＣＴＣもあり（特許文献１）、当該ＣＴＣを検出するには、腫瘍細胞で発現し、かつ前記上皮系細胞が発現するタンパク質とは異なる物質に対する標識抗体で再染色する必要がある。
【０００４】
試料中に含まれる細胞を検出および解析する方法として、従来よりフローサイトメトリー法による検出が用いられている。フローサイトメトリー法は、あらかじめ蛍光物質や発光基質などで標識した細胞を、１列に整列させた状態で流路に流し、当該流路に流れる標識した細胞をレーザー光および光学検出器を用いて検出および解析する方法であり、試料中に含まれる前記細胞を精度高く定量できる。しかしながら、本方法は、流路を流れる細胞を連続的に検出する方法であり、一度検出した同一の細胞に対し、別の標識を行ない、再度検出または解析することは困難である。そのため、フローサイトメトリー法による高感度かつ高精度なＣＴＣの検出／解析は困難といえる。
【０００５】
また試料中に含まれる細胞が保有していると推測される複数の抗原候補にそれぞれ結合可能な標識抗体を一度に添加し検出する方法や、蛍光標識抗体により標識した細胞を検出後、細胞と結合した蛍光標識抗体を一旦解離させ、別の蛍光標識抗体で再標識する方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら、前者の方法は標的細胞以外の細胞に標的細胞を標識するための物質が結合する非特異標識が発生するおそれがあり、後者の方法も抗原抗体の結合および解離反応の繰り返し操作は煩雑であるため実用的とは言えない。さらに特許文献２に開示の方法では、蛍光観察時には、各々の蛍光波長の重複を最小限に抑えるように励起光光源やフィルターを最適化する必要もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１１２９５５号
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０９３１１６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、試料中に含まれる目的細胞を、当該細胞が特異的に有するタンパク質に基づき、高感度かつ高精度に検出／解析可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
以下の（１）から（５）に示す工程を少なくとも含む、目的細胞および夾雑細胞を含む試料から目的細胞を検出する方法である。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を検出する工程、
（３）夾雑細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、試料中に含まれる夾雑細胞を検出する工程、
（４）試料中に含まれる細胞群から（３）の工程で検出した夾雑細胞を検出対象として除外する工程、
（５）（４）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出する工程
さらに本発明の第二の態様は、
以下の（１）から（４）に示す工程を少なくとも含む、試料中に含まれる目的細胞を検出する方法である。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を検出する工程、
（３）試料中に含まれる細胞群から（２）の工程で検出した目的細胞を検出対象として除外する工程、
（４）（３）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出する工程
さらに本発明の第三の態様は、
以下の（１）から（５）に示す工程を少なくとも含む、目的細胞および夾雑細胞を含む
試料から目的細胞を検出する方法である。
（１）核染色試薬により目的細胞を染色する工程、
（２）目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれ
る目的細胞を検出する工程、
（３）夾雑細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、試料中に含まれる夾雑細胞を検出
する工程、
（４）試料中に含まれる細胞群から（２）の工程で検出した目的細胞および（３）の工程
で検出した夾雑細胞を検出対象として除外する工程、
（５）（４）の工程を行なった細胞群に対し、（２）の工程で検出に用いた特定の物質以
外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞
を検出する工程
さらに本発明の第四の態様は、
試料が血液試料であり、目的細胞が血中循環腫瘍細胞であり、前記（２）の工程で目的細胞の検出に用いる物質が上皮系細胞が発現するタンパク質である、前記第一から第三のいずれかの態様に記載の方法である。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明における、目的細胞（および夾雑細胞）を含む試料の一例として、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、腹水、羊水といった生体から取得した試料や、細胞の凝集物、腫瘍、リンパ節、動脈といった器官または組織由来の試料や、細胞や組織の培養物およびそれらの培養液といった培養試料があげられる。
【００１２】
本発明では、試料中に含まれる目的細胞（および夾雑細胞）が特異的に有する物質の有無に基づき、当該細胞を検出する。本発明において、目的（夾雑）細胞が特異的に有する物質とは、目的（夾雑）細胞の表面または内部に特異的に存在する物質であって、目的（夾雑）細胞の識別を可能にする物質のことをいう。ここで目的（夾雑）細胞に特異的に存在するとは、
目的（夾雑）細胞には存在し、かつ夾雑細胞など目的細胞以外の細胞（目的細胞など夾雑細胞以外の細胞）には存在しないこと、または、
目的（夾雑）細胞における存在量が前記目的細胞以外の細胞（前記夾雑細胞以外の細胞）よりも多いこと、を意味する。
【００１３】
試料が血液試料であり、目的細胞が血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）であり、夾雑細胞が白血球である場合、目的細胞が特異的に有する物質の一例としては、サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）といった上皮系細胞が発現するタンパク質や、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１４６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ−Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  １）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、Ｍｕｃｉｎ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＣＤ２６６（腫瘍壊死因子受容体）があげられ、夾雑細胞が特異的に有する物質の一例としては、ＣＤ４５があげられる。なお本明細書において血液試料とは、全血、希釈血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液由来成分に限らず、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腫瘍、リンパ節といった血液由来成分を含む組織の一片を適切な緩衝液で懸濁させた懸濁液や、尿、羊水、腹水といった血液由来成分を含み得る試料も含まれる。また本明細書におけるＣＴＣの一例として、胃癌、大腸癌、食道癌、肝臓癌、肺癌、すい臓癌、膀胱癌、子宮癌（上皮性腫瘍）といった腫瘍組織（原発巣）から血管中に侵入した腫瘍細胞、および血液に含まれるリンパ球や白血球の腫瘍細胞（リンパ腫、白血病）があげられる。
【００１４】
目的（夾雑）細胞が特異的に有する物質の有無に基づく目的（夾雑）細胞の検出は、具体的には、当該物質と特異的に結合可能な認識物質に光学的に検出可能なシグナルを発することが可能な標識を結合して得られる標識物質を用いて、前記目的（夾雑）細胞を標識化した後、前記標識を検出することで、目的（夾雑）細胞を検出すればよい。前記認識物質の一例として、当該物質に対する抗体や、当該物質と特異的に結合可能なリガンド／レクチンがあげられる。前記標識は、光学的に検出可能なシグナル（蛍光、化学発光、燐光など）を発することが可能な物質であれば特に限定はなく、一例として、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ローダミンといった蛍光色素や、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼといった化学発光基質との反応を触媒する酵素があげられる。前記認識物質への前記標識の結合は、公知の方法により両者を直接結合させてもよいし、前記認識物質にビオチン（アビジンまたはストレプトアビジン）を、前記標識にアビジンまたはストレプトアビジン（ビオチン）を、それぞれ結合させた後、ビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）結合を介して間接的に両者を結合させてもよい。
【００１５】
本発明の第一の態様では、前述した方法で、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を検出（以下、先の検出とも表記）した後、細胞群の中から、当該目的細胞の検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が有する物質の有無に基づき、前記夾雑細胞を除去および／または検出対象として除外した細胞群中に含まれる目的細胞を検出（以下、後の検出とも表記）する。また本発明の第二の態様では、前述した方法で、試料中に含まれる目的細胞を検出（以下、先の検出とも表記）した後、細胞群の中から、当該目的細胞の検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が有する物質の有無に基づき、前記目的細胞を除去および／または検出対象として除外した細胞群中に含まれる目的細胞を検出（以下、後の検出とも表記）する。また本発明の第三の態様では、前述した方法で、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を検出（以下、先の検出とも表記）した後、細胞群の中から、当該目的細胞の検出に用いた特定の物質以外の、目的細胞が有する物質の有無に基づき、前記目的細胞および前記夾雑細胞を除去ならびに／または検出対象として除外した細胞群中に含まれる目的細胞を検出（以下、後の検出とも表記）する。中でも前記第二の態様は、目的細胞に対する標識物質の詳細な結合能を評価することができ、目的細胞の性状をより詳しく評価できる点で、好ましい態様といえる。
【００１６】
なお、先の検出で検出した目的細胞および／または夾雑細胞を回収することで検出対象として除去し、検出対象として除外しても良い。この場合、吸引手段などにより直接回収してもよく、後の検出の際、先の検出で検出した目的細胞および／または夾雑細胞が保持された位置での検出をスキップすることで検出の対象として除外してもよい。なお目的細胞が特異的に有する物質が多数存在する場合は、後の検出は複数回行なってもよい。
【００１７】
さらに、目的細胞に対して先の検出で用いる特異的に結合可能な認識物質Ａに結合した標識物質Ａと、後の検出で用いる認識物質Ｂに結合した標識物質Ｂにおいて、標識物質Ａと標識物質Ｂを光学的に異なるシグナルで検出する場合、目的細胞に対して認識物質Ａと認識物質Ｂのそれぞれが結合した割合および、認識物質Ａおよび認識物質Ｂがどちらも結合した割合に基づき評価してもよい。
【００１８】
なお本発明では、先の検出および後の検出で行なう、目的細胞（夾雑細胞）が特異的に有する物質の有無に基づく検出の他に、ＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）、ヘマトキシリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（商品名）などの核染色試薬を用いた有核細胞の検出も行なう。なおこれら検出に加え、追加の検出を行なってもよい。追加検出の一例として、オレンジＧ、ライトグリーン、エオシンなどの細胞質染色試薬を用いた細胞検出や、明視野像に基づく細胞の大きさ／形状／模様の違いによる検出があげられる。
【００１９】
本発明を、血液試料中に含まれるＣＴＣの検出に適用する場合、例えば、前述した核染色試薬を用いた有核細胞の検出を行ないつつ、先の検出を、上皮系細胞が発現するタンパク質（ＣＫやＥｐＣＡＭなど）の有無に基づき行ない、後の検出を、上皮系細胞が発現するタンパク質以外の、腫瘍細胞が特異的に発現するタンパク質（ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１４６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、Ｍｕｃｉｎ、ＰＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＣＤ２６６など）の有無に基づき行なえばよい。さらに前述した、明視野像に基づく検出を追加してもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、試料中に含まれる目的細胞を検出する際、当該目的細胞が特異的に有する物質のうち特定の物質の有無に基づき、試料中に含まれる目的細胞を（好ましくは夾雑細胞も）検出した後、先の検出で検出した目的細胞（好ましくは目的細胞および／もしくは夾雑細胞）を検出対象として除去ならびに／または検出対象として除外した残りの細胞群に対し、前記特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質の有無に基づき、前記細胞群中に含まれる目的細胞を検出することを特徴としている。
【００２１】
本発明は、試料中に含まれる目的細胞の中に、前記特定の物質を有さない細胞が存在したとしても、前記特定の物質以外の、目的細胞が特異的に有する物質を用いて検出することができる。従って、試料中に含まれる目的細胞の取りこぼしを抑えることができ、試料中に含まれる目的細胞を高感度かつ高精度に検出／解析できる。更に、試料が培養細胞の様な同一の細胞株であっても、細胞によって保有する特定の物質量、例えば、特異的に有するタンパク質の発現にばらつきがある場合、同様にして複数の特異的に有するタンパク質に基づいて検出／解析を行なうことによって、目的細胞を取りこぼすことを抑えることができる。例えば、目的細胞のサイトケラチンの発現が弱い場合であっても、試料中の細胞が細胞保持装置に設けた保持部に保持されているため、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１４６、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＥＡ、Ｍｕｃｉｎ、ＰＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＣＤ２６６等を使用して再度検出することができる。その結果、同じ細胞の発現状態を何度も検出することができるため、目的細胞を取りこぼすことを防止することができる。さらに、本発明によれば、目的細胞に結合した標識物質が２つ以上であっても、目的細胞に結合した標識物質の割合をそれぞれ評価できるため、目的細胞の性状をより詳細に解析できる。
【００２２】
特に、全血、希釈血、血清、血漿といった血液試料からの血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出においては、血液試料中に含まれるＣＴＣ数が少なく（全血１ｍＬあたり数個程度）、かつ当該ＣＴＣの中には腫瘍細胞が特異的に有する物質（サイトケラチン、ＥｐＣＡＭなど）を有しないＣＴＣも存在するため、従来の方法では高感度かつ高精度なＣＴＣの検出／解析が困難だったが、本発明を適用することで高感度かつ高精度なＣＴＣの検出／解析が可能となる。
【００２３】
更に本発明において、ＣＴＣに代表される希少な目的細胞を検出するには、目的細胞を含む試料を、保持部を有した基板に展開し、保持部に保持された細胞を検出することで、高感度かつ高精度に１細胞ごとを観察／解析が可能であり、かつ、後の検出で細胞の再標識を行なう際、保持された細胞の剥離を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の検出方法で利用可能な、目的細胞を濃縮可能な構造体を示す図であ  る。
【図２】図１に示す構造体を用いた、目的細胞の濃縮を説明する図である。
【図３】図１に示す構造体を用いた、目的細胞の濃縮を説明する図である。
【図４】本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の一例を示す図である。
【図５】本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の別の態様を示す図である。
【図６】図４に示す細胞保持装置を用いた、細胞の保持および検出を示した図である。
【図７】実施例１および２の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２６】
本発明を、例えば血液試料中に含まれるＣＴＣの検出のような、試料中に含まれる目的細胞数が少ない、および／または夾雑細胞数が極めて多い場合、あらかじめ試料中に含まれる目的細胞を濃縮する、および／または夾雑細胞を低減させる工程（以下、目的細胞濃縮工程という）を行なうと、目的細胞（または夾雑細胞）を検出する工程を効率的に行なえる点で好ましい。目的細胞濃縮工程は、試料中に含まれる目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を低減することで目的細胞をより選択的に回収できれば特に制限はない。例えば、目的細胞と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）との大きさの違いを利用して分離濃縮するフィルター法、細胞表面の抗体発現プロファイルの違いを利用し、前記抗体を結合した磁性粒子を用いて目的細胞を分離濃縮する磁気ビーズ法、細胞間の比重差を利用した比重差分離法が例示できる。なかでも比重差分離法は、短時間で選択的に目的細胞を濃縮できることから、目的細胞濃縮工程として特に好ましい。
【００２７】
以下、比重差分離法による目的細胞濃縮工程について詳細を示す。
【００２８】
比重差分離法による目的細胞の濃縮（夾雑細胞の低減）は、目的細胞と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）が比重差によって分離できれば特に制限はない。例えば、密度勾配溶液が入った遠沈管に目的細胞を含む試料を重層後、遠心分離操作を行なうことで、目的細胞を含む画分と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を含む画分とに分離させ、前記目的細胞を含む画分を回収することで、目的細胞を濃縮（夾雑細胞の低減）させればよい。ここで用いる密度勾配溶液は、それ自身でまたは遠心分離によって密度勾配を形成する液体状の物質であり、目的細胞の密度（比重）を特定し、その分離に適当なものを選択して使用すればよい。選択の指標としては、例えば栄養成分、ｐＨ、等張性等を例示できる。密度勾配溶液の具体例としては、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソールがあげられ、市販品として、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ（以上、ＧＥヘルスケア製）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（以上、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ製）などが知られている。
【００２９】
比重差分離法による目的細胞濃縮工程を行なう際、図１に示す構造体１００を用いて行なうと好ましい。図１に示す構造体１００は、連通開口端１３０を介して上下に分割可能な筒状部材である。下部筒状部材１１０は、連通開口端１３０を介して上部筒状部材１２０と接続する側（上面）には開口部を設ける一方、他端（下面）は閉じられた（開口部を設けない）構造となっている。上部筒状部材１２０は両端とも開口部を設けており、かつ下部筒状部材１１０と連通開口端１３０を介して接続する側の開口部（下面側開口部）は、他端（上面側開口部）と比較し、内径が絞られた構造となっている。
【００３０】
図１に示す構造体１００に密度勾配溶液を注入する際は、下部筒状部材１１０および上部筒状部材１２０のうち連通開口端１３０付近の領域を満たすよう、密度勾配溶液を注入するとよい。すなわち、下部筒状部材１１０と上部筒状部材１２０とを分離した際に、遠心分離操作により密度勾配溶液を通過して下部筒状部材１１０側に移動した目的細胞以外の成分を密度勾配溶液の大半とともに下部筒状部材１１０に、密度勾配溶液上に維持される目的細胞を上部筒状部材１２０に、それぞれ維持された状態で分離できる程度、好ましくは１ｍｍ程度、高くなるよう注入すればよい。その後、目的細胞を含む試料１５０を密度勾配溶液の上に重層後、上部筒状部材１２０上面側開口部を蓋１４０で密閉し、遠心分離操作を行なう（図２）。
【００３１】
遠心分離操作は、一般には１０００×ｇから２０００×ｇ程度の低速で実施すればよいが、目的細胞の密度や使用する密度勾配溶液の密度を勘案し、当該目的細胞が密度勾配溶液の上に維持される条件を選択すればよい。例えば目的細胞が腫瘍細胞であり、上記条件で遠心分離操作を行なう場合、濃縮対象である腫瘍細胞の種類に応じて密度勾配溶液の密度を１．０６０から１．０９５ｇ／ｍＬまでの範囲に設定することができる。中でも、腫瘍細胞の濃縮率を高める観点から、密度勾配溶液の密度は１．０７５ｇ／ｍＬ以上が好ましく、１．０８０ｇ／ｍＬ以上とするとより好ましい。一方、同じ理由から、密度勾配溶液の密度は１．１００ｇ／ｍＬ以下が好ましく、１．０９６ｇ／ｍＬ以下とするとより好ましく、１．０９３ｇ／ｍＬ以下とするとさらにより好ましい。腫瘍細胞の濃縮に最も好ましい密度勾配溶液の密度は、１．０８２から１．０９１ｇ／ｍＬまでの範囲である。
【００３２】
密度勾配溶液の浸透圧は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲で適宜設定すればよいが、３００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲とするとより好ましい。密度勾配溶液のｐＨは、目的細胞が損傷を受けない範囲で任意に選択することができ、通常の細胞の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．８までの範囲に設定すればよい。
【００３３】
前述した遠心分離操作により、密度勾配溶液の密度より大きな密度を有する目的細胞以外の成分は密度勾配溶液の勾配層を通過して下部筒状部材１１０側に移動する。一方、密度勾配溶液より小さな密度を有した目的細胞を含む画分１６０は、上部筒状部材１２０内の密度勾配溶液の上に維持される（図３）。そこで蓋１４０による密閉を維持したまま、下部筒状部材１１０を上部筒状部材１２０から分離すると、上部筒状部材１２０中に目的細胞を含む画分１６０を回収することができる（図３）。前記画分は、例えば蓋１４０を取り外し、上部筒状部材１２０の密閉状態を開放することで下方へ滴下させる等行なうことで、特別の熟練を要することなく容易に目的細胞を含む画分１６０を回収できる（図３）。一方、下部筒状部材１１０側に移動した目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を含む画分については、例えば当該筒状部材とともに廃棄すればよい。
【００３４】
比重差分離法による目的細胞濃縮工程を行なう際、目的細胞に特異的に結合する物質または目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）に特異的に結合する物質を添加することにより、目的細胞を更に効率的に分離することができる。なお、前記特異的に結合する物質と多孔質シリカ粒子等比較的密度が小さい物質とを結合させれば、見かけ上の密度を小さくすることができる。前記特異的に結合する物質としては、目的細胞（または夾雑細胞など目的細胞以外の成分）と特異的に結合可能な抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチンといった生体高分子を例示できる。また前述した密度を調整する目的で使用可能な物質としては、前述した多孔質シリカ粒子の他に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカルボネート等のポリビニル化合物に代表される有機ポリマー、ポリスチレンラテックス、ナイロン、ポリテレフタレート等の共重合体、ガラス、シリカ、ジルコニア等の無機材料、セルロース、デキストラン、アガロース、セルロース、セファロース等の生体ポリマー、赤血球などの生体試料が例示できる。
【００３５】
比重差分離法による目的細胞濃縮工程を行なう際、夾雑細胞を積極的に除去する操作を追加してもよい。例えば、血液試料から比重差分離法によりＣＴＣの濃縮操作を行なう際、赤血球を積極的に除去する溶血操作を追加してもよい。前記夾雑細胞を積極的に除去する操作は、遠心分離操作前に行なってもよいし、遠心分離操作後に行なってもよい。なお夾雑細胞を積極的に除去する操作を遠心分離操作前に行なう場合は、その後遠心分離操作を追加すると好ましい。
【００３６】
本発明において目的細胞（または夾雑細胞）を検出するには、例えば、目的細胞を含む試料（または当該試料をあらかじめ前述した目的細胞濃縮工程により濃縮した試料）を希釈、懸濁などの処理をした後、スライドに塗布または保持部を有した基板に展開し、塗布された、または保持部に保持された細胞を顕微鏡などの光学的手段を用いて検出すればよい。前述した検出方法のうち、保持部を有した基板に試料を展開し、保持部に保持された細胞を検出する方法は、高感度かつ高精度に１細胞ごとを観察／解析できる点、および後の検出で細胞の再標識を行なう際、保持された細胞が剥離されるおそれが軽減される点で好ましい。
【００３７】
本発明において、目的細胞を含む試料を展開し検出するのに好ましい装置の一例として、図４から６に示す細胞保持装置があげられる。
図４および６に示す細胞保持装置２００は、
貫通孔２１１を有した平板状の絶縁膜２１０と、
貫通孔２２１を有した平板状の遮光膜２２０と、
導入口２３１および排出口２３２を有した平板状のスペーサ２３０と、
遮光部材２２０の下面およびスペーサー２３０の上面と密着するよう設けた電極２４１・２４２と、
電極２４１・２４２同士を接続する導線２５０と、
電極２４１・２４２に信号を印加する交流電源２６０と、
を備えている。絶縁膜２１０が有する貫通口２１１と遮光膜２２０が有する貫通孔２２１とは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう絶縁膜２１０および遮光膜２２０を備えている。貫通孔２１１、貫通孔２２１および遮光部材１１の下部に密着して設けた電極２４１により、細胞保持装置２００内に細胞を保持可能な保持部２７０が構成され、導入口２３１から細胞を含む液体を導入すると保持部２７０へ細胞が導入される。遮光膜２２０は、絶縁膜２１０自体の自家蛍光に起因するバックグラウンドノイズや隣接する保持部２７０からの漏れ光に起因するクロストークノイズなどの光ノイズを低減することができ、各保持部２７０に保持された細胞由来の光のみを高感度かつ高精度に検出することができる。電極２４２はスペーサ２３０上面に密着して備えており、導入口２３１から導入した、目的細胞を含む試料の飛散や蒸発を防止している。なお保持部２７０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極２４２はスペーサ２３０から取り外し可能な構造となっている。また電極２４１・２４２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部２７０に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器を用いて検出可能となるため、好ましい。
【００３８】
前述した細胞保持装置２００のうち、電極基板については、図４に示す装置のように絶縁膜２１０、遮光膜２２０およびスペーサ２３０を上下方向に挟むよう備えてもよいし、図５に示す装置のように遮光膜２２０の下面のみに＋極２４１ａおよび−極２４１ｂを設けた櫛形電極の態様で電極２４１を備えてもよい。
【００３９】
保持部２７０の大きさは、１個の目的細胞のみを保持可能な大きさとすると、検出工程にて標的細胞の検出が容易になる点で好ましい。なお細胞保持装置２００へ展開させる試料中に含まれる細胞数（目的細胞と夾雑細胞との和）が、細胞保持装置２００に設けた保持部２７０の数よりも多いことが予想される場合は、適切な細胞数が展開されるように希釈したり、展開に供する試料をあらかじめ計量するとよい。
【００４０】
目的細胞を含む試料（または当該試料をあらかじめ前述した目的細胞濃縮工程により濃縮した試料）の細胞保持装置２００への展開は、細胞検出に適した間隔で基板上に分布させることができれば任意の手法を用いることができ、単に前記試料を細胞保持装置２００へ展開させるのみでもよいが、その後、振動や誘電泳動力を与えるなどして細胞を細胞保持装置２００に設けた保持部２７０へ積極的に保持させる操作を追加してもよい。特に、前記保持させる操作を誘電泳動力を与えることで行なうと、生きた細胞を数秒程度の極めて短い時間で保持部２７０に保持できる点で好ましい。誘電泳動力５００を細胞４００に作用させるには、保持部２７０を含めた細胞保持蔵置２００内の空間を液体で満たした状態で、保持部２７０の部分に電気力線が集中するよう、交流電源２６０を用いて電極２４１・２４２へ所定の波形を有する交流電圧を印加すればよい（図６）。なお保持部２７０をアレイ状に均等に設けると、電極間に印加した電圧によって生じる電界が各保持部２７０にほぼ均等に生じ、各保持部２７０に対して同じように細胞４００を誘導し捕捉できるため好ましい。
【００４１】
交流電源２６０を用いて電極２４１・２４２へ印加する交流電圧の大きさは、保持部２７０に細胞４００を移動／保持可能な誘電泳動力５００を発生させるのに十分な電圧であればよい。具体的には、ピーク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１０ｋＨｚから１０ＭＨｚ程度の正弦波、矩形波、三角波、台形波等の波形の交流電圧が例示できる。特に１つの保持部に対し１個の細胞のみを保持させたい場合は、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚの矩形波を用いると好ましい。矩形波は、正弦波、三角波、台形波などの他の波形と比較し、瞬時に設定したピーク電圧に到達するため、細胞を保持部へ速やかに移動させることでき、２個以上の細胞が重なる態様で保持部に保持される確率を低くできる（１つの保持部に１個の細胞のみを保持する確率が高くなる）。細胞は電気的にコンデンサーと見なすことができるが、矩形波のピーク電圧が変化しない間は、保持部に保持された細胞には電流が流れ難くなって電気力線が生じ難くなり、この結果、細胞を保持した保持部には誘電泳動力が発生し難くなる。従って、一度保持部に細胞が保持されると、別の細胞が同一の保持部に保持される確率は低くなり、代わりに電気力線が生じ誘電泳動力が発生している他の保持部（細胞を保持していない、空の保持部）に、順次、細胞が保持される。
【００４２】
なお図４から６に示す細胞保持装置２００に備える交流電源２６０は、直流成分を有しない交流電圧を発生する電源が好ましい。直流成分を有する交流電圧を電極へ印加すると、直流成分により発生した静電気力（電気泳動力）により細胞が特定の方向に偏った力を受けて移動し、誘電泳動力による細胞保持が困難になるからである。また直流成分を有する交流電圧を印加すると、細胞を含有する懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じて発熱し、細胞が熱運動を起こすため誘電泳動力による動きを制御できなくなり、保持部への移動／保持が困難になる。本明細書において、直流成分を有する交流電圧とは、周波数デューティ比が５０％でない電圧、オフセットを有する電圧、周期が極端に長い（例えば１秒以上）電圧などをいう。
【００４３】
細胞保持装置２００に備える保持部２７０に保持された目的細胞および夾雑細胞は、目的細胞（または夾雑細胞）が特異的に有する物質と特異的に結合可能な認識物質に光学的に検出可能なシグナルを発することが可能な標識を結合して得られる標識物質を用いて、前記目的細胞および夾雑細胞を標識化した後、前記標識を別途設けた検出部３００を用いて光学的に検出する。検出部３００の一例としては蛍光顕微鏡が例示できる。
【００４４】
蛍光顕微鏡を用いて目的細胞および夾雑細胞を検出する場合は、前記標識としてＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ローダミンといった蛍光色素を用い、当該蛍光色素に対応した励起光を標識化した細胞に照射し、当該照射により得られる前記標識化した細胞由来の蛍光の強度に基づき検出すればよい。標識化した細胞への照射に用いる光源としては、ハロゲンランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプ、レーザー、ＬＥＤ等を用いることができ、前記光源からの光は、必要に応じて光学フィルターやミラー、レンズ等によって構成される光学手段により観察領域（標識化された細胞が保持された保持部）に照射されればよい。前記照射により観察領域から得られる蛍光シグナル情報として、蛍光物質が発する蛍光から検出した蛍光強度、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の最小値、蛍光強度の平均値、蛍光強度の積分値などの蛍光強度から算出された数値が例示できる。また前記照射により観察領域から得られるシグナル情報は、前記蛍光に関する情報の他に、広い波長域での透過光、反射光による光強度分布から構成される像（明視野）なども得られる。このうち明視野情報からは、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、細胞の周囲長、真円度など細胞形態に関する情報が取得できる。そのため、前述した蛍光強度による検出の他に、明視野像に基づく目的細胞の大きさ／形状／模様などの外観の情報をあわせることで、より精度高く目的細胞の検出を行なうこともできる。
【００４５】
本発明の検出方法の流れを、血液試料中に含まれるＣＴＣの検出を例として説明する。患者から採取した血液試料を、図１に示す構造体１００を用いて比重差分離法により、試料中に含まれるＣＴＣを濃縮し、夾雑細胞（赤血球、白血球など）を減少させた後、図４および６に示す細胞回収装置２００に導入し、ＣＴＣを含む細胞を保持部２７０に保持させる。前記保持させた細胞に対し、核染色試薬であるＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識した抗サイトケラチン（腫瘍細胞など上皮系細胞が発現するマーカー）抗体（以下、ＣＫ−ＦＩＴＣと表記）、およびＰＥ（フィコエリスリン）で標識した抗ＣＤ４５（白血球が特異的に有するタンパク質）抗体（以下、ＣＤ４５−ＰＥと表記）を用いて標識操作を行なった後、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣおよびＰＥ由来の蛍光を蛍光顕微鏡を用いて検出する。
【００４６】
表１に示す結果が得られた場合、ＤＡＰＩ陽性、ＣＫ−ＦＩＴＣ陽性かつＣＤ４５−ＰＥ陰性の細胞（細胞ａ）は目的細胞であるＣＴＣと判定できる。またＤＡＰＩ陽性、ＣＫ−ＦＩＴＣ陰性かつＣＤ４５−ＰＥ陽性の細胞（細胞ｂ）は夾雑細胞である白血球と判定できる。しかしながら、ＤＡＰＩ陽性、ＣＫ−ＦＩＴＣ陰性かつＣＤ４５−ＰＥ陰性の細胞（細胞ｃおよび細胞ｄ）は目的細胞であるＣＴＣなのか、白血球などの夾雑細胞なのか不明である。そこで不明な細胞である、細胞ｃおよび細胞ｄに対して、２回目の検出を行なう。
【００４７】
２回目の検出は、サイトケラチン以外の腫瘍細胞が特異的に有するタンパク質であるＡおよびＢの有無に基づき検出する。具体的には、細胞ｃおよび細胞ｄに対し、ＦＩＴＣで標識した抗Ａ抗体（以下、抗Ａ抗体−ＦＩＴＣと表記）、およびＰＥで標識した抗Ｂ抗体（以下、抗Ｂ抗体−ＰＥと表記）を用いて標識操作を行なった後、ＤＡＰＩ（１回目の検出の際、標識済）、ＦＩＴＣおよびＰＥ由来の蛍光を蛍光顕微鏡を用いて検出する。２回目の検出結果が表１に示す結果となった場合、ＤＡＰＩ陽性、抗Ａ抗体−ＦＩＴＣ陽性、抗Ｂ抗体−ＰＥ陰性の細胞（細胞ｃ）はＡ抗原を有する細胞すなわちＣＴＣと判定できる。一方、ＤＡＰＩ陽性、抗Ａ抗体−ＦＩＴＣ陰性かつ抗Ｂ抗体−ＰＥ陰性の細胞（細胞ｄ）はＣＴＣか夾雑細胞か不明のままである。そこで不明な細胞である、細胞ｄに対して、３回目の検出を行なう。
【００４８】
３回目の検出は、サイトケラチン、ＡおよびＢ以外の腫瘍細胞が特異的に有するタンパク質であるＣおよびＤの有無に基づき検出する。具体的には、細胞ｄに対し、ＦＩＴＣで標識した抗Ｃ抗体（以下、抗Ｃ抗体−ＦＩＴＣと表記）、およびＰＥで標識した抗Ｂ抗体（以下、抗Ｄ抗体−ＰＥと表記）を用いて標識操作を行なった後、ＤＡＰＩ（１回目の検出の際、標識済）、ＦＩＴＣおよびＰＥ由来の蛍光を蛍光顕微鏡を用いて検出する。細胞ｄの３回目の検出結果が表１に示す結果となった場合、細胞ｄはＤ抗原を有する細胞すなわちＣＴＣと判定できる。
【００４９】
以上に示す本発明の検出方法により、血液試料中に含まれるＣＴＣを、１回目の検出しか行なわない従来の検出方法と比較し、高感度かつ高精度に検出できる。
【００５０】
さらに具体的には、ＣＴＣに代表される希少な目的細胞を検出するには、目的細胞を含む試料を、保持部を有した基板に展開し、保持部に保持された細胞を検出することで、同じ細胞の発現状態を何度も検出することができるため、目的細胞を取りこぼすことを防止することができる。また、後の検出で細胞の再標識を行なう際、保持された細胞の剥離を軽減することができる。
【００５１】
【表１】
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【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
（１）インフォームドコンセントを得て取得した健常者血液３ｍＬに約５００個のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を添加し、懸濁させることで本実施例で用いる血液試料を調製した。
（２）以下に示す方法で、図１に示す構造体１００を使用して、（１）で調製した血液試料から癌細胞を濃縮した。なお図１に示す構造体１００のうち、下部筒状部材１１０は内径φ１０ｍｍ、縦５４ｍｍ、容量３ｍＬの底を有したポリプロピレン製部材である。また上部筒状部材１２０は縦７０ｍｍ、容量１５ｍＬのポリプロピレン製部材であり、内径は上面側（蓋１４０側）φ１８ｍｍ、下面側（連通開口端１３０側）φ２ｍｍであり、下面側先細り形状の部分の傾斜角度は３０°である。
（２−１）下部筒状部材１１０に、密度が１．０８４ｇ／ｍＬの密度勾配溶液を３ｍＬ注入した。なお密度勾配溶液の液面高さは、上部筒状部材１２０の下面側（連通開口端１３０側）から約１ｍｍの位置（従って液面は、上側筒状部材１２０の内部に位置する）である。
（２−２）密度勾配溶液の上に、３ｍＬの血液試料と３ｍＬの生理食塩水と７５μＬの結合剤（商品名ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）の混合液１５０を重層した（図２中、黒塗部分が重層した混合液１５０の部分である）。ここで添加する結合剤は、癌細胞以外の夾雑細胞（赤血球、白血球）を互いに結合させるための試薬であり、前記夾雑細胞の密度を高くし、癌細胞との密度差を大きくすることで、構造体１００を用いた比重差分離により、高い回収率と選択性をもって癌細胞を分離できる。
（２−３）試料重層後、上部筒状部材１２０の上面を蓋１４０（ポリプロピレン製）で密閉し、２０００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離した。当該遠心分離操作により、密度勾配溶液と試料の界面１６０に癌細胞は維持された（図３）。
（２−４）蓋１４０を取り外すことなく構造体１００を構成する筒状部材１１０・１２０を分離した後、蓋１４０をはずして密閉を開放することで、上部筒状部材１２０の連通開口端１３０側より密度勾配溶液の一部とその上に維持された細胞１６０を流出させ、下方に設置した５０ｍＬチューブで回収するとともに、上部筒状部材１２０の内壁を洗浄することで、上部筒状部材１２０の壁に付着した細胞も同時に回収した。
（３）回収した細胞の懸濁液に塩化アンモニウムを主成分とする赤血球破砕液を添加して３０ｍＬまでメスアップし、３００×ｇで１０分間室温にて遠心分離した。遠心分離後、ペレットの頂部の液体をピペットで取り出し、ペレット中の細胞を３００ｍＭのマンニトール溶液３０ｍＬに再懸濁し、３００×ｇで５分間室温にて遠心分離した。この遠心分離操作は、細胞破片及び血小板を除去し、癌細胞を濃縮するためのものである。
（４）以下に示す方法で、（３）で回収した細胞を、図４および６に示す細胞保持装置２００に保持した後、癌細胞を検出した。なお細胞保持装置１００には、直径φ３０μｍ、深さ４０μｍの保持部２７０を約３０万個設けている。
（４−１）導入部２３１から、（３）で回収した細胞の懸濁液を導入した後、交流電源２６０から各電極２４１・２４２に交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚ、矩形波）を印加し、誘電泳動力により前記細胞を保持部２７０に保持させた。
（４−２）導入部２３１から、０．０１％ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を、前記交流電圧を印加しながら導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、排出部２３２から前記水溶液を吸引除去した。
（４−３）導入部２３１から、細胞膜透過試薬を導入し、１０分間静置することで細胞膜を透過させた後、排出部２３２から前記試薬を吸引除去した。その後、導入部２３１から、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した前記試薬を洗浄した。
（４−４）導入部２３１から、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗サイトケラチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製）（以下、ＣＫ−ＦＩＴＣと表記）、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ製）（以下、ＣＤ４５−ＰＥと表記）およびＤＡＰＩ（４’，６−ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ−２−ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）（０．５μｇ／ｍＬ）（同仁化学研究所製）を混合した細胞染色液８００μＬを導入し、細胞標識を行なった（２５℃、３０分）後、導入部２３１から、３００ｍＭマンニトール水溶液を導入することで洗浄した。
（４−５）保持部２７０に保持された全ての細胞を観察するために、コンピューター制御式電動ステージおよび電子増倍型冷却ＣＣＤカメラ（ＦＬＯＶＥＬ製ＡＤＴ−１００）を備えた蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製ＩＸ７１）を用いて全ての保持部の明視野像および蛍光画像を撮影した。
（４−６）（４−５）で撮影した画像を解析ソフトウェアＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて解析し、以下に示す条件に基づき、細胞を判別した。なおＤＡＰＩで染色されない（細胞核を有さない）細胞は、赤血球や死細胞片などの細胞核を有さない夾雑細胞のため解析ソフトウェア上で排除した。また保持部２７０には夾雑細胞である白血球が１０万から５０万個保持されていたが、目的細胞であるヒト乳癌細胞の検出に際しては妨げにならない量であった。
癌細胞（目的細胞）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＣＫ−ＦＩＴＣで染色され（サイトケラチンを発現し）、かつＣＤ４５−ＰＥでは染色されない（ＣＤ４５を発現しない）細胞
白血球（夾雑細胞）：ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＣＫ−ＦＩＴＣでは染色されず（サイトケラチンを発現しない）、かつＣＤ４５−ＰＥでは染色される（ＣＤ４５を発現する）細胞
本実施例で目的細胞として用いた癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）はサイトケラチンの発現量が少ないまたは中程度の細胞株である。そのため前記判定条件では添加した癌細胞数の１１．１％しか検出されなかった。一方、ＤＡＰＩで染色され（細胞核を有し）、ＣＫ−ＦＩＴＣでは染色されず（サイトケラチンを発現しない）、かつＣＤ４５−ＰＥでも染色されない（ＣＤ４５を発現しない）細胞が多数検出された（例えば、図７（ａ）の左下に示す保持部に保持された細胞）。
【００５４】
実施例２
（１）実施例１（４−６）に記載の方法による細胞判別を行なった後、導入部２３１から、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製）（以下、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ）およびＰＥ標識抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）（以下、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ−ＰＥ）を混合した細胞染色液８００μＬを導入し、細胞標識を行なった（２５℃、３０分）後、導入部２３１から、３００ｍＭマンニトール水溶液を導入することで洗浄した。
（２）実施例１で検出した細胞のうち、ＤＡＰＩで染色され、ＣＫ−ＦＩＴＣでは染色されず、かつＣＤ４５−ＰＥでも染色されない細胞（すなわち、実施例１の時点では目的細胞である癌細胞か夾雑細胞か判定できなかった細胞）が保持された保持部に対して、実施例１（４−５）に記載の方法で明視野像および蛍光画像を撮影した。
（３）（２）で撮影した画像を解析ソフトウェアＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて解析し、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣまたはＶｉｍｅｎｔｉｎ−ＰＥで染色された（ＣＤ１４６またはＶｉｍｅｎｔｉｎを発現する）細胞を目的細胞である癌細胞と判定した。
【００５５】
結果、実施例１の検出で、目的細胞か夾雑細胞か判定できなかった細胞（例えば、図７（ａ）の左下に示す保持部に保持された細胞）のうち、７０％の細胞がＶｉｍｅｎｔｉｎ−ＰＥで染色されており、これらの細胞は癌細胞として判定することができた（一例として、図７（ｂ）の左下に示す保持部に保持された細胞）。なお本実施例では、ＣＤ１４６−ＦＩＴＣで染色された細胞はなかった。
【００５６】
また図７（ｂ）の左下に示す保持部に保持された細胞（すなわち、ＤＡＰＩおよびＶｉｍｅｎｔｉｎ−ＰＥでは染色され、ＣＫ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥおよびＣＤ１４６−ＦＩＴＣでは染色されない細胞）について、ヘマトキシリン染色を行なった結果、細胞核が肥大している癌細胞の特徴が観察できた（図７（ｃ））。
【００５７】
実施例３
（１）実施例１（１）から（３）に記載の方法で血液試料中の癌細胞を濃縮後、実施例１（４）に記載の方法で前記濃縮試料中の細胞を検出した。
（２）実施例１（４−６）に記載の方法による細胞判別を行なった後、導入部２３１から、ＰＥ標識抗ＣＤ２６６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）（以下、ＣＤ２６６−ＰＥ）を含む細胞染色液８００μＬを導入し、細胞標識を行なった（２５℃、３０分）後、導入部２３１から３００ｍＭマンニトール水溶液を導入することで洗浄した。
（３）（１）で検出した細胞のうち、ＤＡＰＩで染色され、かつＣＤ４５−ＰＥでは染色されない細胞（ＣＫ−ＦＩＴＣの染色結果は不問）が保持された保持部に対して、実施例１（４−５）に記載の方法で蛍光画像を撮影した。
（４）（３）で撮影した画像を解析ソフトウェアＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて解析し、ＣＤ２６６−ＰＥで染色された細胞を検出した。
【００５８】
検出した目的細胞（癌細胞）に結合したそれぞれの標識物質（ＣＫおよびＣＤ２６６）における目的細胞の検出率の結果を表２に示す。目的細胞において、ＣＫ陽性の検出率（ＣＤ２６６の検出結果は不問）は２２．０％、ＣＤ２６６陽性（ＣＫの検出結果は不問）の検出率は１３．４％、ＣＫ陽性かつＣＤ２６６陽性の検出率は３．６％、ＣＫ陽性かつＣＤ２６６陰性の検出率は１８．４％、ＣＫ陰性かつＣＤ２６６陽性の検出率は９．８％、ＣＫ陽性もしくはＣＤ２６６陽性の検出率は３１．８％となった。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
実施例２による目的細胞の検出法では、１回目の検出でＤＡＰＩで染色され、目的細胞を染色する試薬であるＣＫ−ＦＩＴＣでは染色されず、かつ夾雑細胞を染色する試薬であるＣＤ４５−ＰＥでも染色されない細胞に対してのみ、追加で標識した標識物質（ＶｉｍｅｎｔｉｎおよびＣＤ１４６）での染色の有無に基づき目的細胞か否かを判定（２回目の検出）している。したがって、得られる目的細胞の検出率は、１回目の検出で用いた標識物質（ＣＫ）陽性の検出率、ＣＫ陰性かつ２回目の検出で用いた標識物質（ＶｉｍｅｎｔｉｎまたはＣＤ１４６）陽性の検出率、ＣＫ陽性またはＶｉｍｅｎｔｉｎもしくはＣＤ１４６の検出率のみであり、これら検出率に基づく評価しかできない。
【００６１】
一方、本実施例による目的細胞の検出法は、２回目の検出における対象細胞を、ＤＡＰＩで染色され、かつ夾雑細胞を染色する試薬であるＣＤ４５−ＰＥでは染色されない細胞（すなわち目的細胞を染色する試薬であるＣＫ−ＦＩＴＣでの染色は不問）としているため、より詳細な目的細胞に対する標識物質の結合能を評価することができ、目的細胞の性状をより詳しく評価できる。                                                                          
【符号の説明】
【００６２】
１００：構造体
１１０・１２０：筒状部材
１３０：連通開口端
１４０：蓋
１５０：目的細胞を含む試料
１６０：目的細胞を含む画分
２００：細胞保持装置
２１０：絶縁膜
２２０：遮光膜
２２１：貫通孔
２３０：スペーサ
２３１：導入口
２３２：排出口
２４１・２４２：電極
２４１ａ：＋極
２４１ｂ：−極
２５０：導線
２６０：交流電源
２７０：保持部
３００：検出部
４００：細胞
５００：誘電泳動力
６００：光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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