(57)【要約】【課題】新たなＩＬ−１ＲＡ産生促作用を有する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】酵母抽出液とビタミンＢ２を含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。【選択図】図２
2018080128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母抽出物とビタミンＢ２を含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
【請求項２】
酵母抽出物が、Saccharomycesに属する酵母あるいはCandidaに属する酵母を自己消化または酸加水分解することによって得られた液の濃縮又は乾燥物であるか、或いは該濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む溶液で抽出して得られた組成物の蒸発残留物である請求項１に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
【請求項３】
ビタミンＢ２を、酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含有する請求項１又は２に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
【請求項４】
酵母抽出物とイノシトールを含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
【請求項５】
酵母抽出物１に対しイノシトールを６２以上含有する請求項４に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物を含む皮膚老化防止用化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１（以下、「ＩＬ−１」と略す）は、単球・マクロファージを中心とした種々の免疫担当細胞から生産され、生体が受ける障害に対して急性期の反応を引き起こす多彩な作用を持ったサイトカインである。その多彩な生物学的作用から種々の疾患あるいは病態の形成に直接または間接的に関わっていることが近年知られるようになってきた。特にＩＬ−１は種々の炎症において、その慢性化と組織破壊に関係しているため、ＩＬ−１の作用を抑制することが疾患あるいは病態の治療、さらには老化進行の抑制に役立つという観点から、その抑制物質、すなわちＩＬ−１阻害剤が注目されている。
【０００３】
その中でも、生体内に存在するＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（以下、「ＩＬ−１ＲＡ」）が注目されている。ヒトＩＬ−１ＲＡは、ＩＬ−１阻害物質として単球性白血病の患者や発熱患者の尿中に存在することが知られている。
【０００４】
近年、皮膚におけるＩＬ−１ＲＡの挙動と皮膚症状の関係が注目されている。非特許文献１には、ＩＬ−１ＲＡの欠損マウスと正常マウスでは皮膚の創傷治癒過程に相違があり、欠損マウスは、創傷治癒過程における血管新生が遅延し、皮膚の創傷回復が遅くなることが記載されている。そして非特許文献１では、皮膚の外傷の回復にはＩＬ−１ＲＡの存在が重要であると結論付けている。
【０００５】
本発明者らも、ヒト皮膚の角層におけるＩＬ−１ＲＡの挙動を研究し、皮膚角層中のＩＬ−１ＲＡの発現量を指標として皮膚の血流量を間接的に測定する方法（特許文献１）の発明をなした。さらに、皮膚の肌理の状態と皮膚角層中のＩＬ−１ＲＡの発現量とが極めて高い相関を有していることを見いだし、新たな皮膚の肌理の状態を評価する方法の発明をなした（特許文献２）。
このように皮膚の健康状態を理解する上で、ＩＬ−１ＲＡの発現量が密接に関係していることが明らかになってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７３１６７８号公報
【特許文献２】特許第５９７７２６８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Immunol 2006; 176:5598-5606;
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、皮膚の老化研究を行う過程で、皮膚の老化現象が、様々な要因（例えば紫外線や活性酸素）による皮膚や皮膚細胞の微小な傷害の蓄積・進行のためにシワの発生につながり、これにＩＬ−１ＲＡが関与していることを見出した。そしてこのような微小な傷害の回復を早めるためには、皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡを増加させることで解決すると考え、皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡを産生する物質の探索を行ってきた。その過程で、酵母抽出物には、皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡの産生を促進するものと、産生を促進しないものとが存在することに注目し、さらに研究を進め、その効果の本質を見出した。本発明は、このような探索によって見出されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は新たなＩＬ−１ＲＡ産生促進作用を有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、次の構成からなる。
（１）酵母抽出物とビタミンＢ２を含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
（２）酵母抽出物が、Saccharomycesに属する酵母あるいはCandidaに属する酵母を自己消化または酸加水分解することによって得られた液の濃縮又は乾燥物であるか、或いは該濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む溶液で抽出して得られた組成物の蒸発残留物である（１）に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
（３）ビタミンＢ２を、酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含有する（１）又は（２）に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
（４）酵母抽出物とイノシトールを含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
（５）酵母抽出物１に対しイノシトールを６２以上含有する（４）に記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物を含む皮膚老化防止用化粧料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新たなＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物が提供される。
本発明の組成物を皮膚外用剤として用いることで、皮膚のＩＬ−１ＲＡが増加し、皮膚に生じた微細な障害の回復を促進して、シワなどの発生や回復を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】酵母抽出物のロットの相違によるＩＬ−１ＲＡ産生促進効果の相違を試験した結果を示すグラフである。
【図２】ビタミンB2と酵母抽出物の併用によるＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図３】イノシトールと酵母抽出物の併用によるＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を試験した結果を示すグラフである。
【図４】イノシトールと酵母抽出物の併用によるＩＬ−１ＲＡ産生促進効果をヒトで試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、酵母抽出物とビタミンＢ２を有効成分として含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物に係る発明である。また本発明は、酵母抽出物とイノシトールを有効成分として含有する皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物に係る発明である。本発明の組成物は、皮膚細胞に発現するＩＬ−１ＲＡの遺伝子発現を活性化させて、細胞のＩＬ−１ＲＡ量を増加させ、その結果、皮膚細胞を活性化させて、皮膚老化を予防し、さらに回復させる。
【００１４】
本発明の組成物の構成成分である酵母抽出物とは、自己消化または酸加水分解することによって得られた液の濃縮又は乾燥物、或いは該濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む溶液で抽出して得られた組成物の、蒸発残留物である。つまり、本発明の酵母抽出物は、酵母の細胞を集めて破砕し、酵母自身に含まれる消化酵素の作用によって自己消化させたもの、あるいは酸やアルカリ、さらにはタンパク質分解酵素、核酸分解酵素により分解したものをろ過し、或いはろ過せずに、濃縮又は乾燥したものでもよいし、前記濃縮又は乾燥物をさらに水及び／又はアルコール類を含む溶液にて抽出した組成物の蒸発残留物でもよい。したがって、酵母抽出物には、アミノ酸類、糖類などの酵母の培養によって得られる成分が豊富に含まれる。
【００１５】
本発明の酵母抽出物は市販品を用いることができる。酵母抽出物が乾燥物である市販品としてはSpectrum Chemical Mfg.Corp.のYeast Extract Powder(YE105)を例示することができる。酵母抽出物を水及び／又はアルコール類で抽出・分散した市販品としては、丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」、一丸ファルコス株式会社製の「イーストリキッド１０００４０」、ＢＩＯＤＥＬＬ製の「チトカタライザー」を例示することができる。
酵母抽出物を得るための原料である酵母は、特に制限はなく、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に代表される醸造用酵母、パン酵母は勿論のこと、トルラ属酵母（例えばCandida utilis）等のどのような酵母も利用することができる。
さらに、本発明に使用する酵母は、培養された酵母のみならず、ビール、清酒等の醸造後の酵母であっても差し支えない。なお、ビール醸造に利用された酵母（ビール酵母）の場合、ホップ由来の苦味、渋味等を有しているので、水洗その他の脱苦味等の処理をした後、酵母抽出物の製造に用いることが望ましい。
また、生の酵母ばかりでなく、ドラム乾燥、噴霧乾燥等により製造された乾燥酵母も原料として用いることができる。酵母を原料として、酵母抽出物とするためには次のような工程を一般的には採用する。
原料酵母を常法により、自己消化させ、あるいは酸分解、アルカリ分解、プロテアーゼによって分解処理を行う。ついで、不溶物をろ過により除去した後、加熱濃縮あるいは減圧濃縮を行うが、場合によっては噴霧乾燥処理を行う。かくして得られた濃縮物又は乾燥物は本発明の酵母抽出物であるが、厚生省薬務局審査課編「医薬部外品原料規格2006」以下「外原規」）において酵母エキス（１）又は酵母エキス（２）として規格化されているものを用いてもよい。
また、酵母エキス（１）又は酵母エキス（２）を、さらに水及び／又はアルコールの混合溶液にて抽出した組成物も本発明の酵母抽出物であるが、こちらは「外原規」において酵母エキス（３）、酵母エキス（４）として規格化されているものを用いてもよい。
前記抽出に用いるアルコールとしては、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、例えばエタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコールが例示できる。また、これらのアルコールは混合物であっても良い。
【００１６】
溶解又は分散操作にあたっては、用いる溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、溶解操作時間について、原料及び使用する溶媒によってそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、酵母中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。操作は、例えば溶媒と酵母抽出物の混合物を１〜１０時間連続的に振盪あるいは撹拌混合することで行われる。そして所定の操作が終了後、１０００〜１５０００Ｇで遠心分離を行い、不溶解性あるいは非分散性沈殿物を除去すれば本発明に使用する酵母抽出物を得ることができる。
【００１７】
酵母抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことも可能であり、活性炭処理やクロマト分離などを行っても良い。また１，３ブチレングリコールを用いた抽出の場合、抽出液から減圧濃縮などの方法で濃縮した濃縮物を本発明の酵母抽出物とすることができる。
【００１８】
本発明では、酵母エキス（３）として規格化されているものを用いることが好ましい。
酵母エキス（３）は、酵母を自己消化又は酸加水分解によって得られた液を乾燥したものを、さらに水、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混液にて抽出して得られた組成物である。酵母エキス（３）を含む市販品としては、前述した丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」があげられるが、これは酵母の自己消化によって得られた消化液を噴霧乾燥し、得られたものを水で抽出し、１，３−ブチレングリコールを加えたものである。丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」を例にとると、本発明の酵母抽出物に該当する蒸発残留物は、１０ｍＬを１０５℃で６時間乾燥させたときに０．８〜２．４ｗ／ｖ％を示す。後述する試験例で用いた、丸善製薬株式会社製の「酵母抽出液ＢＧ」は、酵母抽出物１．６質量％、水４９．２質量％、１，３−ブチレングリコール４９．２質量％から成る。
【００１９】
本発明の組成物の構成成分であるビタミンＢ２は、リボフラビン (Riboflavin)、ラクトフラビン（Lactoflavine）とも呼ばれ、ビタミンの中で水溶性ビタミンに分類される生理活性物質で、ヘテロ環状イソアロキサジン環に糖アルコールのリビトールが結合したものである。生体内においては脂肪、炭水化物および蛋白質の代謝や呼吸、赤血球の形成、抗体の生産、正常な発育に必要とされる。甲状腺の正常な活性の維持や、皮膚、爪あるいは頭髪をはじめ体全体の正常な健康状態の維持に不可欠であり、不足すると口内炎や舌炎、皮膚炎、てんかん発作などの症状を生じるといわれている。
ビタミンＢ２は、酵母に本来含有されており、上記の酵母抽出物にも微量含有されているが、その含有量は、原料の酵母、あるいは極性溶媒への溶解分散操作工程に影響され、一定ではなく、本発明において必要とする含有量に到達しない場合がしばしば発生する。
本発明者らは皮膚細胞のＩＬ−１ＲＡ産生促進物質の探索を行うなか、酵母抽出物の種類によりＩＬ−１ＲＡ産生促進効果の高いものと低いものがあることに注目した。分析を行ったところ、ＩＬ−１ＲＡ産生促進効果の高い酵母抽出物は、「ビタミンＢ２を、酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含有する」ことが判明した。従って本発明のＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を確実に得るためには、ＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物に、ビタミンＢ２を、酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含有するように添加する。なお、ビタミンＢ２の添加上限は特に制限されないが、コストを考慮すると酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたときにビタミンＢ２が０．００１９となることを上限としておくことが好ましい。
【００２０】
本発明は、又、酵母抽出物に、さらにイノシトールを配合することでＩＬ−１ＲＡ産生促進効果が増強されることを見出してなしたものである。
イノシトールは、シクロヘキサンの各炭素上の水素原子が１つずつヒドロキシ基に置き換わった構造（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）を持つ、シクリトールの１種である。ビタミンＢ群の１種とも言われており、ヒトの場合、糖尿病などが原因で、体内でイノシトールが不足すると、神経症状が起こるなどの悪影響が知られている。イノシトールと酵母抽出物を併用すると、相乗的にＩＬ−１ＲＡ産生能が高まる。
【００２１】
酵母抽出物１に対しイノシトールを６２以上含有させたＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物は、ＩＬ−１ＲＡ産生促進効果が高まるので好ましい。このとき、ビタミンＢ２が酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含まれているとより好ましい。
【００２２】
本発明のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物を含む皮膚老化防止用化粧料には、ＩＬ−１ＲＡ発現量を増強させることが確認できる範囲であれば、配合する量に制限はない。製剤として、一般的には製剤重量当たりＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物を０．１〜２０質量％配合する。
本発明のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物を含む皮膚老化防止用化粧料の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良い。
これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の皮膚老化防止用化粧料用の無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【実施例】
【００２３】
以下に、試験例、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（市販の酵母抽出物分散体のビタミンＢ群含有量の測定）
市販の化粧品原料である、酵母抽出液BG（Lot.Ａ 丸善製薬株式会社）、酵母抽出液BG （Lot.Ｂ 丸善製薬株式会社）、チトカタライザーBG30（BIODELL BIOCHEMICAL S.A.）のビタミンＢ群の含有量を測定した。
【００２４】
（1）ビタミンB1(塩酸チアミン）分析
＜HPLC法＞
各試料（原料）0.5gを精密に量り、25%塩化カリウム含有0.1mol/L塩酸溶液を加えて正確に5mLとする。この液を孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を試験試料溶液とする。
別に、塩酸チアミン標準品10mgを精密に量り、25%塩化カリウム含有0.1mol/L塩酸溶液を加えて正確に50mLとする。この液を0.001、0.005、0.01、0.1ppmとなるよう25%塩化カリウム含有0.1mol/L塩酸溶液にて適宜希釈し、孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を標準溶液とする。
試料溶液および標準溶液それぞれ20μLを、次の条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、本品中の塩酸チアミン含量(%)を求める。
【００２５】
《HPLC分析条件》
検出器：蛍光検出器
カラム：L-カラムODS  4.6mm ID×250mm (財) 化学物質評価研究機構
カラム温度：40℃付近の一定温度
移動相：0.01mol/L リン酸二水素ナトリウム溶液-0.15mol/L 過塩素酸ナトリウム
溶液 (pH2.2)：メタノール＝95：5(v/v)
流速：1.0mL/min
注入量：20μL
蛍光励起波長：375nm
蛍光測定波長：440nm
ポストカラム：反応コイル；ステンレス管φ0.25mm×50cm
反応試液：0.01mol/L フェリシアン化カリウム含有15%水酸化ナトリウム溶液
反応液流速：0.5mL/min
反応温度：40℃
【００２６】
（2）ビタミンB2（リボフラビン）分析
＜HPLC法＞
各試料（原料）0.5gを精密に量り、0.1mol/L塩酸溶液を加えて正確に5mLとする。この液を孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を試験試料溶液とする。
別に、リボフラビン標準品約5mgを精密に量り、0.1mol/L塩酸溶液を加えて正確に50mLとする。
この液を0.005、0.01、0.02、0.05ppmとなるよう0.1mol/L塩酸溶液にて適宜希釈し、孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を標準溶液とする。試料溶液および標準溶液それぞれ20μLを、次の条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、本品中のリボフラビン含量(%)を求める。
【００２７】
《HPLC分析条件》
検出器：蛍光検出器
カラム：TSK-GEL ODS-80Ts  4.6mm ID×250mm (株) 東ソー
カラム温度：40℃付近の一定温度
移動相：酢酸緩衝液 (pH4.5)：メタノール＝65：35(v/v)
流速：1.0mL/min
注入量：20μL
蛍光励起波長：445nm
蛍光測定波長：530nm
【００２８】
（3）ビタミンB3(ナイアシン）分析
＜HPLC法＞
各試料（原料）を0.5gを精密に量り、水を加えて正確に5mLとする。この液を孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を試料溶液とする。
別に、ニコチン酸及びニコチン酸アミド標準品それぞれ約5mgを精密に量り、水を加えて正確に50mLとする。この液を0.05、0.1、0.5、1、5ppmとなるよう水にて適宜希釈し、孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を標準溶液とする。
試料溶液および標準溶液それぞれ20μLを、次の条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、本品中のニコチン酸及びニコチン酸アミド含量(%)を求め、両者を合算しナイアシンとする。
【００２９】
《HPLC分析条件》
検出器：紫外線分光検出器 (検出波長：254nm)
カラム：Capcell pak  AQ 4.6mm ID×250mm (株) 資生堂
カラム温度：45℃付近の一定温度
移動相：5mmol/L ヘキサンスルホン酸ナトリウム、20mmol/L Lリン酸(pH2.3)：
アセトニトリル＝93：7(v/v)
流速：1.0mL/min
【００３０】
（4）ビタミンB6（塩酸ピリドキシン）分析
＜HPLC法＞
各試料（原料）0.5gを精密に量り、50mmol/L過塩素酸溶液を加えて正確に5mLとする。この液を孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を試験試料溶液とする。
別に、塩酸ピリドキシン標準品約10mgを精密に量り、50mmol/L過塩素酸溶液を加えて正確に50mLとする。この液を0.01、0.05、0.1、1ppmとなるよう50mmol/L過塩素酸溶液にて適宜希釈し、孔径0.45μmのメンブランフィルターで濾過した液を標準溶液とする。
試料溶液および標準溶液それぞれ20μLを、次の条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行い、本品中の塩酸ピリドキシン含量(%)を求める。
【００３１】
《HPLC分析条件》
検出器：紫外線分光検出器（検出波長：290nm)
カラム：TSK-GEL ODS-80Ts  4.6mm ID×250mm (株) 東ソー
カラム温度：45℃付近の一定温度
移動相：50mmol/L 過塩素酸
流速：1.2mL/min
注入量：20μL
【００３２】
（5）結果
・各原料（酵母抽出物分散体）中のビタミンB1、B2、B3、B6濃度
ビタミンＢ群の測定結果を下記の表１に示す。また、酵母抽出物分散体中の酵母抽出物の含有量（蒸発残留物）と、酵母抽出物（ビタミンＢ２を含む総量）に対するビタミンＢ２の割合を計算して記載した。
【００３３】
【表１】
2018080128.tif 000003
【００３４】
酵母抽出液BGの異なる２ロットとチトカタライザーBG30のビタミンB1、B2、B3、B6濃度を測定した結果、チトカタライザーはビタミンB6が高含有であり、ビタミンB2が検出限界以下であった。一方、酵母抽出物BGは、ビタミンB6は検出限界以下であったが、ビタミンB2、B3の含有量が高く、Lot. Ｂにおいては特にビタミンB2の含有量が高かった。
【００３５】
２．試験例２（酵母抽出物のＩＬ−１ＲＡ発現促進試験）
（１）試験方法
ヒトケラチノサイト（Human Epidermal Keratinocytes, neonatal (HEKn)(Thermo Fischer Sientific社製)）を25000cells/cm2で24well plateに播種し、EpiLife（登録商標）Medium with 60μM Calcium（Thermo Fisher Scientific社製）にHumedia-KG2増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地で2日間培養後、サンプル（原料）を添加し（n=3)、2日後に細胞をT-PER Buffer（Thermo Fisher Scientific社製）で溶解した。溶解液中のＩＬ−１ＲＡ濃度はHuman ＩＬ−１ＲＡ/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D systems製）で、蛋白質濃度をBCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific社製)で定法に従って測定した。
単位蛋白質あたりのＩＬ−１ＲＡ産生量を以下の計算式で算出した。
[ＩＬ−１ＲＡ発現量（pg/μg protein)]＝[細胞溶解液のＩＬ−１ＲＡ濃度（pg/ml)]/[細胞溶解液の蛋白量濃度 (μg/ml)]
【００３６】
＜検定＞
各サンプルによるＩＬ−１ＲＡ発現量についてOne-way ANOVAで多重比較検定をdunnett法で解析した。相乗効果については、Two-way ANOVAで多重比較検定をdunnett法で解析した。
【００３７】
（２）結果
試験試料のＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を図１に示した。
チトカタライザー、酵母抽出液BG (Lot.Ａ)にはＩＬ−１ＲＡ産生促進が確認されなかったが、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)において、濃度依存的であって有意なＩＬ−１ＲＡ産生促進効果が認められた。
【００３８】
３．試験例３（ビタミンＢ２添加濃度によるＩＬ−１ＲＡ発現促進への影響確認試験）
試験例２において酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)と酵母抽出液BG (Lot.Ａ)には有意なＩＬ−１ＲＡ発現促進作用の相違が認められた。この相違はビタミンB2含有量に由来するものと考えられた。市販の酵母抽出液（酵母抽出物分散体）にビタミンB2を添加した効果を試験した。
（１）試験方法
試験例２に記載の方法によりＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を試験した。
試験は、対照群（添加区１）、ビタミンB2（添加区２、３）、酵母抽出液BG (Lot.Ａ)（添加区４、５）、酵母抽出液BG (Lot.Ａ)にビタミンB2添加（添加区６、７）、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)（添加区８、９）の５群とした。組成を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2018080128.tif 000004
【００４０】
ヒトケラチノサイト（Human Epidermal Keratinocytes, neonatal (HEKn)(Thermo Fischer Sientific社製)を25000cells/cm2で24well plateに播種し、EpiLife（登録商標） Medium with 60μM Calcium（Thermo Fisher Scientific社製）にHumedia-KG2増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地で2日間培養後、サンプル（５群）を添加し（n=3)、2日後に細胞をT-PER Buffer（Thermo Fisher Scientific社製）で溶解した。溶解液中のＩＬ−１ＲＡ濃度はHuman ＩＬ−１ＲＡ/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D systems製）で、蛋白質濃度をBCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific社製)で定法に従って測定した。
単位蛋白質あたりのＩＬ−１ＲＡ産生量を以下の計算式で算出した。
[ＩＬ−１ＲＡ発現量（pg/μg protein)]＝[細胞溶解液のＩＬ−１ＲＡ濃度（pg/ml)]/[細胞溶解液の蛋白量濃度 (μg/ml)]
【００４１】
＜検定＞
各サンプルによるＩＬ−１ＲＡ発現量についてOne-way ANOVAで多重比較検定をdunnett法で解析した。相乗効果については、Two-way ANOVAで多重比較検定をdunnett法で解析した。
【００４２】
（２）結果
試験試料のＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を図２に示した。
酵母抽出液BG（Lot.Ａ)にビタミンB2を添加するとＩＬ−１ＲＡ産生が明らかに促進された。しかしビタミンB2単独では、ＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を示さなかった。また、酵母抽出液BG（Lot.Ａ)にビタミンB2を加えたことにより、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)と同程度のＩＬ−１ＲＡ発現促進効果が観察された。このことからビタミンB2と酵母抽出物による有意な相乗効果が確認された(p=0.0068)（図２参照)。ビタミンＢ２を、酵母抽出物とビタミンＢ２の総量を１としたとき０．０００１８以上含有させるとＩＬ−１ＲＡ産生促進作用が高まることがわかった。
【００４３】
４．試験例４（イノシトール添加によるＩＬ−１ＲＡ発現促進効果確認試験）
ＩＬ−１ＲＡ産生に影響を及ぼす物質を探索したところイノシトールに強いＩＬ−１ＲＡ産生促進増強効果が認められた。この確認試験を次に示す。
（１）試験方法
試験例２に記載の方法によりＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を試験した。
酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)を用い、これにイノシトール添加し、試験を行った。イノシトール添加濃度は、１質量％とした。対照、イノシトール、酵母抽出液BG、酵母抽出液＋イノシトールの４群とした。その内訳は図３に示したとおりである。
ヒトケラチノサイト（Human Epidermal Keratinocytes, neonatal (HEKn) (Thermo Fischer Sientific社製)）を25000cells/cm2で24well plateに播種し、EpiLife（登録商標）Medium with 60μM Calcium（Thermo Fisher Scientific社製）にHumedia-KG2増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地で2日間培養後、サンプル（４群）を添加し（n=3)、2日後に細胞をT-PER Buffer（Thermo Fisher Scientific社製）で溶解した。溶解液中のＩＬ−１ＲＡ濃度はHuman ＩＬ−１ＲＡ/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D systems製）で、蛋白質濃度をBCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific社製)で定法に従って測定した。
単位蛋白質あたりのＩＬ−１ＲＡ産生量を以下の計算式で算出した。
[ＩＬ−１ＲＡ発現量（pg/μg protein)]＝[細胞溶解液のＩＬ−１ＲＡ濃度（pg/ml)]/[細胞溶解液の蛋白量濃度 (μg/ml)]
【００４４】
＜検定＞
各サンプルによるＩＬ−１ＲＡ発現量についてTwo-way ANOVAで多重比較検定をdunnett法で解析した。
【００４５】
（２）結果
試験試料のＩＬ−１ＲＡ産生促進効果試験結果を図３に示した。
図３に示すように、イノシトール１質量％と、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)１質量％を併用すると、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)又はイノシトールの単独添加の効果以上の相乗効果を示した。イノシトールは、１質量%以上の添加で、酵母抽出液BG（Lot.Ｂ)のＩＬ−１ＲＡ産生促進効果を相乗的に増強することが明らかとなった。酵母抽出物BG（Lot.Ｂ)は酵母抽出物分散体であり酵母抽出物を１．６質量％含むので、計算すると酵母抽出物１に対しイノシトールを６２以上含有すると、ＩＬ−１ＲＡ産生促進効果が増強されることが分かった。
【００４６】
下記に示す処方で化粧料を、常法により調製した。
実施例１（クリーム）                                            （質量％）
１．  水                                                            残余
２．  グリセリン                                                    ７
３．  ジプロピレングリコール                                        ７
４．  １，２−ペンタンジオール                                      １
５．  スクワラン                                                  １０
６．  メドゥフォーム油                                              ５
７．  ステアリン酸ポリグリセリル−１０                              ２
８．  水添レシチン                                                  ０．５
９．  シマルゲルＮＳ（セピック社製）                                ０．５
１０．ベヘニルアルコール                                            １
１１．カルボキシビニルポリマー                                      ０．１
１２．キサンタンガム                                                ０．０５
１３．水酸化カリウム                                                ０．０３
１４．酵母抽出液ＢＧ（丸善製薬（Lot.Ｂ)）＊１                       ０．１
１５．イノシトール                                                  ０．５
＊１酵母抽出液ＢＧ０．１質量％中に、酵母抽出物は０．００１６質量％含まれる。
得られた化粧料（クリーム）は、後述する実使用試験の試験品とした。
【００４７】
５．実使用試験によるＩＬ−１ＲＡ産生促進効果の確認
試験方法
35歳以上の日本香粧品学会「抗シワ製品評価ガイドライン」の目尻シワグレード2〜3を有する健康な日本人女性（9名）を対象とした。朝晩洗顔後、全顔に化粧水を使用した後に半顔に試験品（実施例１のクリーム）を塗布し（半顔を無塗布）し、4週間連用した。使用前後に左右の頬からテープストリッピング法にて角層テープ（アサヒテクノラボ製）1枚で角層を採取し、T-PER Tissue Protein Extraction Reagent （Thermo Fisher Scientific社製）を入れ、約0.8gのガラスビーズを加えて25分間ボルテックスし、角層を破砕した。回収したタンパク質溶解液中のIL-1RA濃度はHuman IL-1ra/IL-1F3 DuoSet ELISA (R&D systems製）で、蛋白質濃度をBCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific社製)で定法に従って測定した。角層タンパク質中の単位蛋白質あたりのIL-1RA量を算出した。
[角層中IL-1RA量（pg/μg protein)]＝[溶解液のIL-1RA濃度（pg/ml)]/[溶解液の蛋白量濃度 (μg/ml)]
無塗布及び塗布部位の使用前後の角層中IL-1RA量の変動量（ΔIL-1RA）を算出し、塗布による有効性を評価した。尚、検定は、対応のあるt検定により塗布と無塗布処理部分のIL-1RA変動値を比較検討した。結果を表３と図４に示す。
【００４８】
【表３】
2018080128.tif 000005
【００４９】
結果のまとめ
角層中IL-1RA量は無塗布では減少が認められたが、本発明のクリーム塗布によりその減少の抑制が認められ、本発明のクリーム塗布によるIL-1RA発現誘導が確認できた (p=0.13)。無塗布と比較して、本発明のクリームを塗布した皮膚ではIL-1RA量が平均約16pg/μg protein増加した。
【００５０】
出願人は角層中のＩＬ−１ＲＡ発現量は年齢とともに減少し、皮膚の新陳代謝の指標である肌理や血流量と相関があることを確認し、特許登録している（特許第５９７７２６８号、特許第５７３１６７８号）。本発明のＩＬ−１ＲＡ産生促進組成物、それを含む外用剤は、皮膚老化を防止する発明として有用な技術である。
【図１】
2018080128.tif 000006
【図２】
2018080128.tif 000007
【図３】
2018080128.tif 000008
【図４】
2018080128.tif 000009