(57)【要約】      （修正有）【課題】グラム陰性菌、特に多剤耐性化したグラム陰性菌に対して、他の薬剤と併用せずに単独で使用しても殺菌作用を発揮する低分子化合物の提供。【解決手段】図２−１に代表される化合物を含有する抗グラム陰性菌剤。【選択図】図２−１
2018080110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有することを特徴とする、抗グラム陰性菌剤。
【化１】
2018080110.tif 000008
式（Ｉ）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25およびＲ31はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数が１〜４個のアルキル基（−Ｒ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、炭素原子数が１〜４個のアルコキシ基（−ＯＲ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、炭素原子数が２〜５個のカルボン酸エステル基（−ＣＯＯ−Ｒ）、カルボン酸アミド基（−ＣＯＯ−ＮＨ2）、炭素原子数が２〜５個のアシル基（−ＣＯ−Ｒ）、カルバモイル基（−ＣＯ−ＮＨ2）、アミノ基（−ＮＨ2）、ウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ2）、ニトロ基（−ＮＯ2）またはシアノ基（−ＣＮ）を表す。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、式（ＩＩ−Ａ）〜（ＩＩ−Ｄ）のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載の抗グラム陰性菌剤。
【化２】
2018080110.tif 000009
【請求項３】
前記グラム陰性菌が薬剤耐性グラム陰性菌である、請求項１または２に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項４】
前記薬剤耐性グラム陰性菌が多剤耐性緑膿菌または多剤耐性アシネトバクター属菌である、請求項３に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗グラム陰性菌剤を有効成分として含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症に対する治療薬または予防薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗グラム陰性菌剤を有効成分として含有することを特徴とする、グラム陰性菌に対する消毒薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌感染症の治療、予防、グラム陰性菌の消毒等に有効な薬剤に関する。より詳細には、本発明は、グラム陰性菌の外膜に存在するＢＡＭ複合体の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、および／または薬剤排出阻害作用を発揮することのできる薬剤、特にペプチドではなく低分子化合物からなる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界初の抗生剤であるペニシリンが発明されて以降、数多くの抗生剤が発見され、また天然の抗生剤を改良した各種の合成抗菌剤が開発され、細菌感染症に対する治療は飛躍的に進歩した（以下、本明細書において抗生剤および合成抗菌剤をまとめて抗菌剤と表記する）。しかしながら、抗菌剤が多用された結果、抗菌剤に対する抵抗性を獲得した細菌、薬剤耐性菌が現れ、その後複数の抗菌剤に対する抵抗性を有する多剤耐性菌（multi-drug resistant）が出現して大きな問題となっていたが、近年ではさらに、ほとんどの抗菌剤に耐性を示す汎多剤耐性菌（pan-drug resistant）まで出現してきている。多剤耐性菌としては、多剤耐性緑膿菌（multiple‐drug-resistant Pseudomonas aeruginosa: MDRP）、多剤耐性アシネトバクター（multiple drug-resistant Acinetobacter: MDRA）などが、院内感染の主要起因菌として臨床上の大きな問題となっている。例えば緑膿菌は、抵抗力の低下している入院患者等に感染すると、肺炎、尿路感染症、術創部感染症、菌血症などを起こすことがあり、特に多剤耐性緑膿菌に感染した場合には治療が困難である。そのような多剤耐性菌への対策のため、従来の抗菌剤とは異なる新たな標的分子に作用することで多剤耐性菌にも有効性を示す、新規薬剤の開発が必要とされている。
【０００３】
グラム陰性菌は、外膜の透過性の低下、酵素による薬剤修飾、薬剤の標的分子の構造変化、薬剤排出ポンプによる細胞外への排出などによって抗菌剤の作用を弱め、多剤耐性を獲得するものと考えられている。特に、緑膿菌等の多剤耐性の獲得に大きく貢献しているのが、様々な薬剤を排出することのできる多剤排出ポンプである、ＲＮＤ（resistance nodulation division）ファミリーのポンプである。したがって、新規薬剤の開発の一つの方向性として、ＲＮＤファミリーのポンプの機能を阻害する薬剤を開発することが考えられていた。
【０００４】
一方で、グラム陰性菌の外膜に、多剤排出ポンプの外膜チャネルタンパク質（例えば緑膿菌におけるＯｐｒＭ）のようなβ−バレルプロテインを輸送して挿入するために、ＢＡＭ（β-barrel assembly machinery）複合体が必須の機能を担っていることが知られており、その立体構造も解明されてきている。ＢＡＭ複合体はグラム陰性菌だけに存在することから、その機能を阻害する薬剤を開発できれば、緑膿菌等のグラム陰性菌だけを選択的に殺菌することができる。ＢＡＭ複合体は５つのサブユニット、ＢａｍＡ、ＢａｍＢ、ＢａｍＣ、ＢａｍＤおよびＢａｍＥで構成されているので、それらのタンパク質間の相互作用を阻害すれば正常な複合体を形成することができず、機能不全に陥ると考えられる。したがって、新薬開発のさらなる方向性の一つとして、ＢＡＭ複合体のサブユニットのタンパク質間相互作用を阻害する薬剤を開発することが考えられている。
【０００５】
新薬開発の方向性には上に挙げた２つ以外にも様々なものが考えられるかもしれないが、本発明者らはこれまでに、上に挙げた２つの方向性に基づき、下記のような抗グラム陰性菌剤を提案している。
【０００６】
特許文献１（国際公開ＷＯ２００７／０９１３９５号パンフレット）には、ＲＮＤファミリーのポンプの一つである、ＭｅｘＡ、ＭｅｘＢおよびＯｐｒＭの３つのサブユニットで構成されているＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭポンプを標的とし、そのＯｐｒＭタンパク質の特定の部位に特異的に作用することで上記ポンプの機能を阻害する薬剤、例えばその特定の部位に特異的に結合する抗体、ならびに当該薬剤（抗体）と抗菌剤とを含有する緑膿菌の感染症の治療薬などが開示されている。実施例では、上記所定の作用を有するモノクローナル抗体を作製し、抗菌剤であるアズトレオナム（ＡＺＴ）と併用したときに、緑膿菌の殺菌作用が発揮されることが例証されている。
【０００７】
特許文献２（国際公開ＷＯ２０１０／１４７１４５号パンフレット）には、ＹａｅＴ複合体（ＢＡＭ複合体に相当）の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用等を発揮する抗グラム陰性菌剤が提案されている。そのような抗グラム陰性菌剤の第１実施形態としては、少なくともＬＴＬＲで表されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＣ末端がアミド化されている、ＹａｅＴ（ＢａｍＡに相当）とＹｆｇＬ（ＢａｍＢに相当）との結合を阻害するペプチド分子が記載されている。ＬＴＬＲは、ＹｆｇＬのアミノ酸配列に含まれる、ＹａｅＴと相互作用を起こし結合する領域のアミノ酸配列である。また、第２実施形態としては、ＦＩＲＬまたはＩＲＬＨで表されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＣ末端がアミド化されている、ＹａｅＴ（ＢａｍＡに相当）とＹｆｉＯ（ＢａｍＤに相当）との結合を阻害するペプチド分子が記載されている。実施例では、抗菌剤であるポリミキシンＢ、オフロキサシン（ＯＦＬＸ）またはアズトレオナム（ＡＺＴ）をこれ自体では緑膿菌の生存に影響がない低濃度で併存させたときに、緑膿菌（標準株および高度多剤耐性株）および大腸菌に対して殺菌作用を示すことが例証されている。実施例ではさらに、多剤耐性緑膿菌感染によるウサギ角膜潰瘍モデルに上記所定のペプチド分子およびＯＦＬＸを投与したとき、また緑膿菌感染によるマウス肺炎モデルに対して上記所定のペプチド分子投与および硫酸コリスチンを投与したときに、それぞれの感染症に対する優れた治療効果が認められることも例証されている。
【０００８】
特許文献３（特開２０１１−１７８６７４号公報）には、ＬＸＬＲ（ＸはＴまたはＳ）で表されるアミノ酸配列を含む少なくとも４アミノ酸からなるペプチド分子であって、そのＣ末端に疎水性基（例えばβ−ナフチルアミン）が結合している修飾ペプチド分子、ならびに当該修飾ペプチド分子を含有する抗菌剤、および当該ペプチド分子と抗菌剤を含有する菌感染症の治療薬が開示されている。この修飾ペプチドについて、上記のようにＣ末端を疎水性基で修飾して膜透過性を改善したことにより、グラム陰性菌のみならずグラム陽性菌に対しても殺菌作用を示すこと、特に多剤耐性緑膿菌やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの薬剤耐性株に対しても有効であること、また従来の抗生物質等の薬剤と併用せずとも修飾ペプチド単独で殺菌作用を示すが、例えばグラム陰性菌の外膜の透過性を向上させる抗菌剤と併用すればさらにその殺菌作用が向上することなどが記載されている。実施例では、細胞膜変質作用を有する抗菌剤（ポリミキシンＢ）をこれ自体では緑膿菌の生存に影響がない低濃度で併存させたときに、β−ナフチルアミン（疎水性基）でＣ末端を修飾した上記所定のペプチド分子が、緑膿菌（標準株および高度多剤耐性株）、大腸菌、および黄色ブドウ球菌（メチシリン感受性株およびメチシリン耐性株）に対して殺菌作用を示すことが例証されている。
【０００９】
特許文献４（特開２０１２−１８０３０２号公報）には、ＸＸＬＲ（ＸＸはＬＴ、ＦＳまたはＬＳ）で表されるアミノ酸配列の繰り返し単位を少なくとも２個含み、そのＣ末端がアミド化されたペプチド分子を含有する抗グラム陰性菌剤が開示されている。この抗グラム陰性菌剤は、他の抗菌剤と併用せずに単独で用いた場合でも十分な殺菌作用を示すことが記載されている。実施例では、抗菌剤（ＯＦＬＸ）を添加しないときまたは添加したときに、上記所定のペプチドが緑膿菌（標準株）およびアシネトバクターに対して殺菌作用を示すことが例証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０９１３９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／１４７１４５号パンフレット
【特許文献３】特開２０１１−１７８６７４号公報
【特許文献４】特開２０１２−１８０３０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
引用文献１〜４に開示されている抗グラム陰性菌剤のいずれも、比較的アミノ酸数の少ない、必要に応じて修飾されたペプチド分子が利用される。このようなペプチド分子は、固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）、液相ペプチド合成法（ＬＰＰＳ）などの有機合成法で製造することができ、ペプチド合成機を用いれば自動的かつ比較的容易な製造が可能である。しかしながら、ＳＰＰＳは縮合剤や保護アミノ酸などの試薬を過剰に使用することから高コストであり、また反応容器でバッチサイズが決定してしまうことから、大量生産に向いている訳ではない。また、ＬＰＰＳは大量生産に適しているが、一般的に残基数5個（５ｍｅｒ）以上のペプチドの製造においては生成物（保護ペプチド、脱保護ペプチド）が結晶化しにくく、工程毎の固液分離、精製が困難である。
【００１２】
一方、多くの薬剤に利用されている低分子化合物は、ペプチド分子に比べると低コストで大量に製造することができる。したがって、引用文献１〜４に開示されているようなペプチド分子を利用した抗グラム陰性菌剤と同等以上の殺菌作用を有する低分子化合物が製造できれば、その有用性は極めて高い。特に、引用文献１〜４では、多剤耐性化したグラム陰性菌に対して、抗菌剤を併用せずに単独で用いたときに、殺菌効果を示すようなペプチドミメティクスが実際に得られたことは開示されていない。ペプチドは体内でプロテアーゼによる分解を受ける可能性があり、その結果、ペプチドの抗菌性は弱まるため、それらの文献に記載されているペプチド分子を超える効果を有する低分子化合物が得られることが望ましい。
【００１３】
したがって、本発明は、グラム陰性菌、特に多剤耐性化したグラム陰性菌に対して、他の薬剤と併用せずに単独で使用しても殺菌作用を発揮する低分子化合物を提供することを課題とする。
【００１４】
なお、特許文献１には、ＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭポンプの三次元構造が明らかにされているので、その構造における標的部位を特定し、当該部位を覆うような立体構造を有する化学物質をコンピュータプログラム等を用いて予測し、その結果に基づいて化学物質を合成、機能スクリーニングすることにより、上記抗体と同様の機能を発揮する薬剤を調製することが可能であることが示唆されている。しかしながら、そのような化学物質を実際に得ることに成功したことは、特許文献１には開示されていない。
【００１５】
また、特許文献２には、上記のような特定のペプチド分子以外の物質、たとえば低分子化合物であって、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用等を発揮するという作用を実際に発揮するものは、具体的に開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、特許文献２〜４に開示されているＬＸＬＲ（ＸはＴまたはＳ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに注目し、当該ペプチドの測鎖（元来はＢａｍＢ分子の表面の一部）とＢａｍＡの所定の領域との分子間相互作用と同様の状態を生み出すことのできる低分子化合物をin silicoにて探索した。すなわち、そのような分子間相互作用に関与する原子団である“薬理活性団”（ファーマコフォア、pharmacophore）の立体配置をコンピュータプログラムによりシミュレートし、膨大な候補化合物の中から適切な立体配置をとる可能性のあるものを選抜した。そして、その選抜された候補化合物の中からついに、上記所定のペプチドの作用を超える低分子化合物、つまり多剤耐性化したグラム陰性菌に対して、他の抗菌剤と併用せずとも、優れた殺菌作用を発揮する低分子化合物を見出し、本発明に至った。
【００１７】
すなわち、本発明には下記の各発明が包含される。
［１］
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有することを特徴とする、抗グラム陰性菌剤。
【００１８】
【化１】
2018080110.tif 000003
式（Ｉ）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25およびＲ31はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数が１〜４個のアルキル基（−Ｒ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、炭素原子数が１〜４個のアルコキシ基（−ＯＲ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、炭素原子数が２〜５個のカルボン酸エステル基（−ＣＯＯ−Ｒ）、カルボン酸アミド基（−ＣＯＯ−ＮＨ2）、炭素原子数が２〜５個のアシル基（−ＣＯ−Ｒ）、カルバモイル基（−ＣＯ−ＮＨ2）、アミノ基（−ＮＨ2）、ウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ2）、ニトロ基（−ＮＯ2）またはシアノ基（−ＣＮ）を表す。
【００１９】
［２］
前記式（Ｉ）で表される化合物が、式（ＩＩ−Ａ）〜（ＩＩ−Ｄ）のいずれかで表される化合物である、項［１］に記載の抗グラム陰性菌剤。
【００２０】
【化２】
2018080110.tif 000004
【００２１】
［３］
前記グラム陰性菌が薬剤耐性グラム陰性菌である、項［１］または［２］に記載の抗グラム陰性菌剤。
【００２２】
［４］
前記薬剤耐性グラム陰性菌が多剤耐性緑膿菌または多剤耐性アシネトバクター属菌である、項［３］に記載の抗グラム陰性菌剤。
【００２３】
［５］
項［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗グラム陰性菌剤を有効成分として含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症に対する治療薬または予防薬。
【００２４】
［６］
項［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗グラム陰性菌剤を有効成分として含有することを特徴とする、グラム陰性菌に対する消毒薬。
【００２５】
なお、項［１］〜［４］に記載の抗グラム陰性菌剤に係る発明は、例えば「式（Ｉ）で表される化合物またはその塩をグラム陰性菌に接触させることを含むことを特徴とする、グラム陰性菌の殺菌方法」のような、殺菌方法に係る発明に転換することが可能である。
【００２６】
また、項［５］に記載のグラム陰性菌感染症に対する治療薬および予防薬に係る発明は、例えば「式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、グラム陰性菌感染症に罹患しているまたは罹患するおそれのある、ヒトまたはその他の動物に投与することを含むことを特徴とする、グラム陰性菌感染症の治療または予防方法」のような、治療・予防方法に係る発明に転換することが可能である。
【００２７】
同様に、項［６］に記載のグラム陰性菌に対する消毒薬に係る発明は、例えば「式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、グラム陰性菌と接触させることを含むことを特徴とする、グラム陰性菌の消毒方法」のような、消毒方法に係る発明に転換することが可能である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の低分子化合物は、多剤耐性化したグラム陰性菌に対しても、他の薬剤と併用せずに単独での使用により、殺菌作用を発揮することができる。従来の抗菌剤のほとんどは多剤耐性緑膿菌や多剤耐性アシネトバクターに効かなくなっているので、本発明の低分子化合物は深刻な問題となっているそれらの多剤耐性菌による感染症の治療等にとって有望な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はＢＡＭ複合体による外膜タンパク質の輸送機構を表す模式図である。
【図２−１】図２−１は、実施例で用いられた２４種類の低分子化合物のうち、グラム陰性菌に対する抗菌活性が認められた低分子化合物A-1〜A-4の構造式である。
【図２−２】図２−２は、実施例で用いられた２４種類の低分子化合物のうち、グラム陰性菌に対する抗菌活性が認められなかった低分子化合物B-1〜B-8の構造式である。
【図２−３】図２−３は、実施例で用いられた２４種類の低分子化合物のうち、グラム陰性菌に対する抗菌活性が認められなかった低分子化合物B-9〜B-16の構造式である。
【図２−４】図２−４は、実施例で用いられた２４種類の低分子化合物のうち、グラム陰性菌に対する抗菌活性が認められなかった低分子化合物B-17〜B-20の構造式である。
【図３】図３は低分子化合物A-3の緑膿菌（PAO4290株）に対する抗菌活性を示すグラフ［Ａ］および多剤耐性緑膿菌（Yok1株）に対する抗菌活性を示すグラフ［Ｂ］である。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌の生存率を表す。
【図４】図４は低分子化合物A-2の緑膿菌（PAO4290株）に対する抗菌活性を示すグラフ［Ａ］および多剤耐性緑膿菌（Yok1株）に対する抗菌活性を示すグラフ［Ｂ］である。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌の生存率を表す。
【図５】図５は低分子化合物A-1の多剤耐性緑膿菌（Yok1株）に対する抗菌活性を示すグラフである。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌の生存率を表す。
【図６】図６は低分子化合物A-4の多剤耐性緑膿菌に対する抗菌活性を示すグラフである。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌（Yok1株）の生存率を表す。
【図７】図７は低分子化合物A-3の多剤耐性アシネトバクターに対する抗菌活性を示すグラフである。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌の生存率を表す。
【図８】図８はコリスチンの多剤耐性緑膿菌（Yok1株）に対する抗菌活性を示すグラフである。横軸が当該薬剤の培地中の濃度、縦軸が当該多剤耐性菌の生存率を表す。
【図９】図９は低分子化合物A-1、A-2、A-3、A-4およびコリスチンの線維芽細胞（WI-38株）に対する細胞毒性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
−抗グラム陰性菌剤−
＜化合物＞
本発明に係る抗グラム陰性菌剤は、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を含有する。
【００３１】
【化３】
2018080110.tif 000005
式（Ｉ）中、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25およびＲ31はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数が１〜４個のアルキル基（−Ｒ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、炭素原子数が１〜４個のアルコキシ基（−ＯＲ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、炭素原子数が２〜５個のカルボン酸エステル基（−ＣＯＯ−Ｒ）、カルボン酸アミド基（−ＣＯＯ−ＮＨ2）、炭素原子数が２〜５個のアシル基（−ＣＯ−Ｒ）、カルバモイル基（−ＣＯ−ＮＨ2）、アミノ基（−ＮＨ2）、ウレイド基（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ2）、ニトロ基（−ＮＯ2）またはシアノ基（−ＣＮ）を表す。なお、炭素原子数が１〜４個のアルキル基、ならびに炭素原子数が２〜５個のカルボン酸エステル基、炭素原子数が１〜４個のアルコキシ基および炭素原子数が２〜５個のアシル基のそれぞれに含まれている炭素原子数が１〜４個のアルキル基の部位は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。
【００３２】
式（Ｉ）で表される化合物の塩は、典型的には、当該化合物をグラム陰性菌感染症に対する医薬品の有効成分として利用する場合の、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等である。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩；およびギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を挙げることができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩；およびアルミニウム、亜鉛等の各金属塩を挙げることができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を挙げることができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を挙げることができる。
【００３３】
式（Ｉ）で表される化合物は、水またはその他の各種溶媒との付加物の形で存在することもあり、また一部の置換基が電離（荷電）した形で存在することもあるが、そのような状態の化合物も、本発明の抗グラム陰性菌剤に利用される式（Ｉ）で表される化合物の一形態といえる。
【００３４】
本発明における式（Ｉ）で表される化合物の好ましい実施形態の一種として、次の条件の１つまたは２つ以上を満たすものが挙げられる：（i）Ｒ23がヒドロキシル基である、（ii）Ｒ31が水素原子である、（iii）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15のうち、水素原子以外の置換基であるものの数が１以下である、（iv）Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24およびＲ25のうち、水素原子以外の置換基であるものの数が２以下である。例えば、式（ＩＩ−Ａ）〜（ＩＩ−Ｄ）で表される４種類の化合物は、本発明の抗グラム陰性菌剤として好適な化合物である。
【００３５】
【化４】
2018080110.tif 000006
上記の各種の式（Ｉ）で表される化合物は、公知の手法によって合成することが可能であり、またその精製物は商品として一般的に市販されているので、容易に入手することができる。
【００３６】
＜他の成分＞
本発明の抗グラム陰性菌剤は、式（Ｉ）で表される化合物のみを含有する（のみからなる）ものであってもよいが、抗グラム陰性菌剤としての用途を考慮したときに必要に応じて、式（Ｉ）で表される化合物またはその塩以外の物質を含有していてもよい。例えば、本発明の抗グラム陰性菌剤は単独でもグラム陰性菌に対する優れた殺菌作用を有するが、グラム陰性菌に対する殺菌作用等を増強するために、および／または適用対象とするグラム陰性菌を拡張するために、他の薬剤を含有していてもよい。
【００３７】
他の薬剤の例としては、膜変質作用を有する（つまりグラム陰性菌の外膜の透過性を向上させる）抗菌剤、例えば、ポリミキシンＢ、コリスチンや、膜変質作用を有さない抗菌剤、例えば、セファロスポリン系抗菌剤（セファレキシン、セフォタキシム等）、フルオロキノロン系抗菌剤（オフロキサシン、シプロフロキサシン等）、アミノグリコシド系抗菌剤（アミカミン等）、カルバペネム系抗菌剤（メロペネム等）が挙げられる。
【００３８】
＜適用対象＞
本発明の抗グラム陰性菌剤の適用の対象とすることのできるグラム陰性菌は特に限定されるものではなく、各種のグラム陰性菌に対して、しかも薬剤（単剤もしくは多剤）耐性化しているグラム陰性菌に対しても、本発明の抗グラム陰性菌剤による殺菌効果を及ぼすことができる。
【００３９】
グラム陰性菌としては、以下のようなものが挙げられる：
アシネトバクター（Acinetobacter）属菌、例えばアシネトバクター・バウマニ（A.baumannii）、A.calcoaceticus；
エロモナス（Aeromonas）属菌、例えばA.hydrophilia；
バクテロイデス（Bacteroides）属菌、例えばB.fragilis、B.melaninogenicus；
ボルデテラ（Bordetella）属菌、例えば百日咳菌（B.pertussis）、パラ百日咳菌（B.parapertussis）、気管支敗血症菌（B.bronchiseptica）；
ブランハメラ（Branhamella）属菌、例えばカタル球菌（B.catarrhalis）；
ブルセラ（Brucella）属菌；
バークホルデリア（Burkholderia）属菌、例えばセパシア菌（B.cepacia、旧名Pseudomonas cepacia）；
キャンピロバクター（Campylobacter）属菌、例えばC.coli、C.jejuni、C.fetus；
クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属菌；
シトロバクター（Citrobacter）属菌、例えばC.freundii；
エンテロバクター（Enterobacter）属菌、例えばE.cloacae、E.aerogenes；
大腸菌（Escherichia）、例えば大腸菌（E.coli）；
フラボバクテリウム（Flavobacterium）属菌、例えばF.memingosepticum；
フゾバクテリウム（Fusobacterium）属菌；
ヘモフィルス（Haemophilus）属菌、例えばインフルエンザ菌（H.parainfluenzae）、パラインフルエンザ菌（H.parainfluenzae）、軟性下疳菌（H.ducreyi）；
ハフニア（Hafnia）属菌、例えばH.alvei；
ヘリコバクター（Helicobacter）属菌、例えばヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）；
クレブシエラ菌（Klebsiella）属菌、例えば肺炎桿菌（K.pneumoniae）、K.oxytoca；
レジオネラ（Legionella）属菌、例えばL.pneumophilia；
モルガネラ（Morganella）属菌、例えばM.morganii；
ナイセリア（Neisseria）属菌、例えば淋菌（N.gonorrhoeae）、髄膜炎菌（N.meningitidis）；
プロテウス（Proteus）属菌、例えばミラビリス変形菌（P.mirabilis）、P.vulgaris；
プロビデンシア（Providencia）属菌、例えばP.rettgeri、P.alcalifaciens、P.stuartii；
シュードモナス（Pseudomonas）属菌、例えば緑膿菌（P.aeruginosa）、プチダ菌（P.putida）；
サルモネラ（Salmonella）属菌、例えばチフス菌（S.typhi）、パラチフスA菌（S.paratyphi-A）、パラチフスB菌（S.schottmuelleri）、ネズミチフス菌（S.typhimurium）、腸炎菌（S.enteritidis）、ゲルトネル菌（S.enforitidis）；
セラチア（Serratia）属菌、例えばS.marcescens；
赤痢菌（Shigella）、例えば志賀赤痢菌（S.dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（S.frexneri）、ソンネ赤痢菌（S.sonnei）；
ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属菌、例えばS.maltophilia
ベイロネラ（Veillonella）属菌；
ビブリオ（Vibrio）属菌、例えばコレラ菌（V.cholera）、腸炎ビブリオ（V.parahaemolyticus）；
キサントモナス（Xanthomonas）属菌、例えばマルトフィリア菌（X.maltophilia）；
エルシニア（Yersinia）属菌、例えばペスト菌（Y.pestis）、Y.enterocolitica。
【００４０】
これらのうち、多剤耐性能を獲得した緑膿菌、アシネトバクター属菌、セラチア属菌など、また特定の薬剤耐性能を獲得した大腸菌、肺炎桿菌、エンテロバクター属菌、黄色ブドウ球菌などが、院内感染において問題となることが多い。本発明の抗グラム陰性菌剤は、薬剤感受性（野生型）のグラム陰性菌のみならず、薬剤耐性、特に多剤耐性、汎多剤耐性のグラム陰性菌に対して、殺菌作用、増殖阻害作用、および／または薬剤排出阻害作用（これらを抗菌活性と総称する。）を発揮することができる。
【００４１】
＜使用形態＞
本発明の抗グラム陰性菌剤の使用形態は、グラム陰性菌に対する抗菌活性を発揮できる限り、特に限定されるものではない。本発明の抗グラム陰性菌剤は、典型的には、後述するようなグラム陰性菌感染症に対する治療用または予防用の薬剤、すなわち治療薬または予防薬といった医薬品の好適な有効成分として利用することができるが、それ以外の実施形態で利用することもできる。
【００４２】
たとえば、グラム陰性菌に起因する院内感染において、接触感染により患者にグラム陰性菌が伝播、拡散することを防ぐために、感染経路となる可能性のある医療用具等の物品や手指を消毒することが行われる。そのための消毒薬（医薬品、医薬部外品）として、７０％エタノールや５０％以上の濃度のイソプロピルアルコール等のアルコール系消毒薬や、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、トリクロサンなどの各種の消毒薬（剤）が用いられているが、必要に応じて本発明のグラム陰性菌剤をそのような消毒薬に添加して用いることができる。また、消毒薬の剤形は特に限定されるものではなく、上記のようなアルコール系消毒薬の他、薬用石鹸のような剤形にすることもできる。さらに、実験的な場面において、グラム陰性菌の培地に本発明の抗グラム陰性菌剤を添加して用いることもできる。実施形態を問わず様々な場面において、必要に応じて消毒薬（剤）やその他の組成物を調製した上で、本発明の抗グラム陰性菌剤をグラム陰性菌と接触させることにより、グラム陰性菌を消毒することができる。
【００４３】
−治療薬・予防薬−
本発明に係るグラム陰性菌感染症に対する治療用または予防用の薬剤（治療薬、予防薬といった医薬品）は、上述したような本発明の抗グラム陰性菌剤を有効成分として含有するものである。このような医薬品は、グラム陰性菌感染症を治療または予防するために、ヒトまたはその他の動物に投与して使用される。
【００４４】
本発明の治療薬等は、従来のグラム陰性菌感染症に対する治療薬等と同様の形態で製剤化すればよく、注射薬、経口薬（錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ、溶液剤、懸濁剤等）などの医薬用組成物として調製することができる。
【００４５】
経口薬は一般的に、有効成分（本発明の抗グラム陰性菌剤）と、経口薬の剤型に応じた添加剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、等張化剤、乳化剤などとを混合し、成形することにより製造される。
【００４６】
注射薬は一般的に、有効成分（本発明の抗グラム陰性菌剤）を、生理食塩水等の希釈剤に溶解させた後、濾過・滅菌処理を施し、アンプル等の密封容器に充填することにより製造される。
【００４７】
治療薬等の投与形態は、目的とする治療または予防の効果が得られるようであれば特に限定されるものではない。すなわち、１回あたりの有効成分の投与量、投与回数、投与時期および投与期間（頻度）等の諸条件は、治療または予防（事前投与）の目的、用いる有効成分の種類、作用および体内での動態、剤型および投与経路、投与対象の年齢、体重および症状などを考慮しながら、適切に調整することができる。
【００４８】
特に、ヒトに対して使用される治療薬等の実施形態は、生体外（in vitro）での試験、好ましくはモデル動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルなど、ヒト以外の哺乳動物）を対象とした生体内（in vivo）での試験、最終的にはヒトを対象とした治験などを通じて、適切に調整することが可能である。この場合、製品化されている公知の治療薬等の実施形態の参考にして、それに用いられている有効成分の効果と本発明の治療薬等に用いられる有効成分の効果を対比しながら、本発明の治療薬等の実施形態を設計することも可能である。
【実施例】
【００４９】
in silico法を用いてペプチドＬＴＬＲの構造に類似した低分子化合物を探索し、類似度の高いと考えられた２４種類の低分子化合物をリストアップした。各低分子化合物の構造式を図２−１〜２−４に示す（以下の試験により抗グラム陰性菌活性が認められたNo. A-1〜A-4および認められなかったNo. B-1〜B-20）。次にこれらの化合物をナミキ商事株式会社から購入した。これら化合物に抗菌活性があるかを検討するために以下の方法を用いた。
【００５０】
［方法］
（１）３７度で一晩培養した細菌（緑膿菌PAO4290株、多剤耐性緑膿菌Yok１株など）の一部をＬＢ培地（Bacto tryptoneとYeast extractは日本ベクトン・ディッキンソン社より購入）に希釈して培養し、６００ｎｍでの吸光度が０．６〜０．８に達するまで培養を続けた。
（２）このように調製した細菌培養液に一定濃度の各種低分子化合物を加えた。低分子化合物を加えていない細菌培養液をコントロールとした。
（３）細菌培養液を３７度で３〜４時間培養したのち、菌液を生理的食塩水で希釈してＬＢ寒天培地（寒天は和光純薬工業株式会社より購入）に播いた。
（４）寒天培地シャーレをインキュベーターＥＹＥＬＡＳＬＩ−４００（東京理化機械株式会社）内に置き、３７度で一晩培養した。
（５）次の日に寒天上のコロニー数を計測して生菌数を求めた。コントロールの生菌数を１００％として低分子化合物を添加した時の生菌数とを比較することで生存率（％）を求めた。
【００５１】
［結果］
（i）緑膿菌PAO4290株に対する低分子化合物A-3の抗菌活性
候補物質となる各種低分子化合物の中の一つであるA-3（図２−１）を緑膿菌PAO4290株に作用させたところ、菌の生存率が減少するという結果が得られた。そこで低分子化合物A-3の濃度によって抗菌活性がどのように変化するかを検討した。その結果を図３［Ａ］に示す。この結果から低分子化合物A-3は緑膿菌に抗菌活性を示し、その活性は化合物の濃度に依存して高まることが明らかとなった。この実験において他の抗菌剤は併用していない。すなわち低分子化合物A-3はそれ自身で抗菌活性を発現する物質（抗菌剤A-3）であるということが示された。
【００５２】
（ii）多剤耐性緑膿菌株に対する抗菌剤A-3の抗菌活性
次に同じ方法を用いて多剤耐性緑膿菌に対しても抗菌剤A-3が抗菌活性を示すかどうかを検討した。本研究ではBAM複合体を新たに標的としていることから、多剤耐性緑膿菌もPAO4290株と同様な効果が得られるもとと期待できる。抗菌剤A-3の濃度を変えて多剤耐性緑膿菌に対する抗菌活性を調べた結果を図３［Ｂ］に示す。この結果から抗菌剤A-3は予想通り多剤耐性緑膿菌に対しても同様に濃度依存的に抗菌活性を示すことが明らかとなった。
【００５３】
（iii）緑膿菌PAO4290株および多剤耐性緑膿菌Yok1株に対する低分子化合物A-2の抗菌活性
低分子化合物（抗菌剤）A-3と構造類似性が高い低分子化合物A-2（図２−１）も抗菌活性を示す可能性が高いと考え、緑膿菌PAO4290株および多剤耐性緑膿菌Yok1株に対する活性を同様の方法で検討した。その結果を図４［Ａ］および［Ｂ］に示す。予想通り低分子化合物A-2は緑膿菌PAO4290株および多剤耐性緑膿菌Yok1株のどちらに対しても抗菌活性を示し、その活性は化合物の濃度に依存して変化することがわかった。
【００５４】
（iv）多剤耐性緑膿菌Yok1株に対する低分子化合物A-1およびA-4の抗菌活性
低分子化合物（抗菌剤）A-3と構造類似性が高い低分子化合物A-1およびA-4（図２−１）が多剤耐性緑膿菌に対して抗菌活性を発現するかどうかを調べた。結果を図５および図６に示す。この結果から、低分子化合物A-1およびA-4も多剤耐性緑膿菌に有効な抗菌活性を示すことが明らかとなった。
【００５５】
（v）多剤耐性アシネトバクターに対する低分子化合物A-3の抗菌活性
多剤耐性アシネトバクターに対する低分子化合物（抗菌剤）A-3の抗菌活性を調べた。結果を図７に示す。この結果から、低分子化合物（抗菌剤）A-3は多剤耐性緑膿菌のみならず、多剤耐性アシネトバクターに対しても同様に高い活性を示すことが明らかとなった。他の３種類の低分子化合物（抗菌剤）A-1、A-2およびA-4についても同様に、多剤耐性アシネトバクターに対して高い活性を示すものと推測される。
【００５６】
（vi）多剤耐性緑膿菌に対するコリスチンの抗菌活性
今回用いた抗菌活性測定法は標準的なものであるが、その有効性を確認するために従来ある抗菌剤を用いて同じようにしてその抗菌活性を測定した。ここでは抗菌剤として多剤耐性緑膿菌に対して有効性を示すコリスチン（Sigma-Aldrich社から購入した）を用いた。測定結果を図８に示す。コリスチンが抗菌活性を有することが明瞭に示すことができており、今回用いた方法の妥当性が証明されたものと考えられる。
【００５７】
なお、コリスチンは環状ペプチド系抗生物質であり、塩基性の陽イオン性界面活性剤として細胞質膜を傷害することにより殺菌的に作用する。緑膿菌感染症や細菌性赤痢に対して有効であるが、腎毒性、神経毒性が強いため、注射薬としては用いられておらず、我が国では医薬品として承認されていない。しかしながら、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）などの多剤耐性グラム陰性菌に対して比較的有効な貴重な治療薬の一つであり、欧米等の諸外国で見直されている。我が国でも２０１０年１０月に厚生労働省の薬事・食品衛生審議会が多剤耐性菌への使用に限り許可する方針を固めるなど見直しが始まっている。ただ、コリスチン耐性菌も出現しているとの報告もある。
【００５８】
（vii）低分子化合物が及ぼす動物細胞に対する毒性作用
以上の結果から低分子化合物A-1、A-2、A-3およびA-4（図２−１）が多剤耐性緑膿菌に抗菌活性を発現することが示された。さらにこれらの低分子化合物が、細菌には作用するが動物細胞には作用しないという選択性を有しているかを検討する必要がある。そこでこれらの低分子化合物による動物細胞の生存に及ぼす影響を検討した。まず培養した線維芽細胞WI-38株に低分子化合物を加えて一定時間、37度で培養を継続した。その後細胞毒性測定用試薬 Cell counting kit-8（株式会社同仁化学研究所）を用いて生細胞数を測定した。低分子化合物無添加で細胞を培養した時の生細胞数を100%として、低分子化合物を加えた時に得られた生細胞数の割合を算出した。同様の試験をコリスチンについても行った。その結果を図９に示す。これらの結果から、低分子化合物が抗菌活性を発現する濃度範囲では、培養細胞に影響するものでないことが示された。
【００５９】
（viii）低分子化合物間での抗菌活性の比較
in silico法によって候補に挙げられた２４種類の低分子化合物の活性を検討したところ、上で述べた低分子化合物A-1〜A-4の４種類には緑膿菌および多剤耐性緑膿菌（さらに多剤耐性アシネトバクター）に対する抗菌活性が認められたが、低分子化合物B-1〜B-20の２０種類には緑膿菌に対する抗菌活性は認められなかった。比較のため、低分子化合物B-1〜B-20の２０種類の化合物を１５０μｇ（０．１５ｍｇ）／ｍｌで用いたときの緑膿菌および多剤耐性緑膿菌の生存率を下記表に示す（この濃度で低分子化合物A-1〜A-4の４種類を用いれば、緑膿菌および多剤耐性緑膿菌の生存率はほぼ０になると推定される）。
【００６０】
また、低分子化合物A-1〜A-4の４種類の間で緑膿菌に対する活性の濃度依存性を比較し、その抗菌力を検討したところ、抗菌力は大差なく、ほぼ同等の抗菌力を示した。
【００６１】
【表１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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