(57)【要約】【課題】光検出器の定量的な受光感度を正確に推定する。【解決手段】標本からの光を集光する対物レンズと、対物レンズにより集光された光を検出する光検出器２３と、光検出器２３により検出される光のフォトンを計数するフォトンカウンティング検出部３１と、光検出器２３の出力信号を積分するシグナル積算検出部３５と、シグナル積算検出部３５の積分値とフォトンカウンティング検出部３１の計数値とに基づいて、光検出器２３の受光感度を算出する受光感度算出部３７とを備える顕微鏡装置を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本からの光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記光を検出する光検出器と、
該光検出器により検出される前記光のフォトンを計数するフォトン計数部と、
前記光検出器の出力信号を積分する出力信号積分部と、
該出力信号積分部の積分値と前記フォトン計数部の計数値とに基づいて、前記光検出器の受光感度を算出する受光感度算出部とを備える顕微鏡装置。
【請求項２】
前記フォトン計数部により前記フォトンが計数される前記光の量を調節する光量調節部と、
前記フォトン計数部の計数値および前記出力信号積分部の積分値の少なくとも一方に、前記光量調節部による前記光の量の調節量を相殺する演算を施す光量調節相殺演算部とを備える請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記受光感度算出部により複数回算出される前記受光感度に基づき、該受光感度の変化量を測定する受光感度変化測定部を備える請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
所定の基準感度に対する前記受光感度算出部により算出された前記受光感度の感度比を算出する対基準感度比算出部と、
該対基準感度比算出部により算出される前記感度比に基づく補正係数により、前記出力信号積分部の積分値を補正して出力する感度補正出力部とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記光検出器により検出する前記光の波長を変更する検出波長変更部を備え、
前記感度補正出力部が、前記検出波長変更部により変更される前記光の波長に関わらず、前記受光感度算出部によりいずれかの波長の前記光に基づいて算出される前記光検出器の前記受光感度と前記所定の基準感度との前記感度比に基づく前記補正係数により、前記出力信号積分部の積分値を補正する請求項４に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
同一の前記標本からの前記光を検出する２以上の前記光検出器を備え、
前記フォトン計数部がいずれか一の前記光検出器の出力信号に基づいて前記フォトンを計数し、
前記出力信号積分部が他の前記光検出器の出力信号に基づいて前記積分値を算出する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記フォトン計数部が、前記標本からの前記光を検出して、そのフォトンを計数するマルチピクセルフォトンカウンタであり、
前記受光感度算出部が、前記出力信号積分部により得られる前記光検出器の出力信号の積分値と前記マルチピクセルフォトンカウンタの計数値とに基づいて、前記光検出器の前記受光感度を算出する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、検出器としてＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）を採用した顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載の顕微鏡装置は、ＰＭＴは受光感度の個体差が大きく、また、ＰＭＴは使用を重ねることにより受光感度が劣化していくという問題に対して、使用開始前と使用開始後の２つの時期でのＰＭＴに入射する光を遮断したときの暗電流を比較することで、劣化の度合いを算出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−０９２７７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置によれば、使用開始前のＰＭＴの受光感度を基準として、使用開始後の現状のＰＭＴの受光感度の相対的な比率を推定することはできるが、ＰＭＴに入射する光量に対するＰＭＴから出力される光の強度の特性こそがＰＭＴの定量的な受光感度であり、特許文献１に記載の顕微鏡装置ではこれを測定することができないという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光検出器の定量的な受光感度を正確に推定することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記光を検出する光検出器と、該光検出器により検出される前記光のフォトンを計数するフォトン計数部と、前記光検出器の出力信号を積分する出力信号積分部と、該出力信号積分部の積分値と前記フォトン計数部の計数値とに基づいて、前記光検出器の受光感度を算出する受光感度算出部とを備える顕微鏡装置である。
【０００７】
本態様によれば、フォトン計数部によって得られるフォトンの計数値により、その計数時間内に光検出器に入射する光量が分かり、出力信号積分部によって得られる積分値により、その積分時間内に光検出器に入射した光の強度が分かる。光検出器に入射した光の強度は、光検出器の受光感度と光検出器に入射する光量との積に相当するので、受光感度算出部により、フォトンの計数値と出力信号の積分値とに基づいて、光検出器の定量的な受光感度を正確に推定することができる。
【０００８】
上記態様においては、前記フォトン計数部により前記フォトンが計数される前記光の量を調節する光量調節部と、前記フォトン計数部の計数値および前記出力信号積分部の積分値の少なくとも一方に、前記光量調節部による前記光の量の調節量を相殺する演算を施す光量調節相殺演算部とを備えることとしてもよい。
【０００９】
このように構成することで、光量調節部により、フォトンを計数する光の量を調節することによって、フォトン計数部の計数値が飽和するのを防ぐことができる。この場合において、光量調節相殺演算部により、フォトン計数部の計数値および出力信号積分部の積分値の少なくとも一方に、光量調節部による光の量の調節量を相殺する演算を施すことによって、受光感度算出部により、光量調節部によって光の量を調節していない状態と同じ割合のフォトンの計数値と出力信号の積分値とに基づいて、光検出器の受光感度を算出することができる。
【００１０】
上記態様においては、前記受光感度算出部により複数回算出される前記受光感度に基づき、該受光感度の変化量を測定する受光感度変化測定部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、受光感度変化測定部により測定される光検出器の受光感度の変化量によって、光検出器の異常や交換時期が分かる。
【００１１】
上記態様においては、所定の基準感度に対する前記受光感度算出部により算出された前記受光感度の感度比を算出する対基準感度比算出部と、該対基準感度比算出部により算出される前記感度比に基づく補正係数により、前記出力信号積分部の積分値を補正して出力する感度補正出力部とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、光検出器の受光感度が経時的に劣化してきた場合でも、その劣化の影響を補正して、得られる光の強度に定量性を持たせることができる。
【００１２】
上記態様においては、前記光検出器により検出する前記光の波長を変更する検出波長変更部を備え、前記感度補正出力部が、前記検出波長変更部により変更される前記光の波長に関わらず、前記受光感度算出部によりいずれかの波長の前記光に基づいて算出される前記光検出器の前記受光感度と前記所定の基準感度との前記感度比に基づく前記補正係数により、前記出力信号積分部の積分値を補正することとしてもよい。
【００１３】
光検出器の感度は、入射したフォトンを電子に変換する効率に関する光電面感度と、光子から変換された電子を増幅する効率に関する増倍感度との積により求められる。そして、光検出器の感度において波長特性が存在するのは光電面感度だけであり、また、光電面感度には使用に応じた劣化がほとんど生じない。したがって、感度劣化の度合いと補正係数はどの波長でも等しくなるので、上記のように構成することで、いずれの波長でも出力信号積分部の積分値を精度よく補正することができる。
【００１４】
上記態様においては、同一の前記標本からの前記光を検出する２以上の前記光検出器を備え、前記フォトン計数部がいずれか一の前記光検出器の出力信号に基づいて前記フォトンを計数し、前記出力信号積分部が他の前記光検出器の出力信号に基づいて前記積分値を算出することとしてもよい。
【００１５】
このように構成することで、いずれか一の光検出器の出力信号から得られるフォトンの計数値により他の光検出器のフォトンの計数値を推定すれば、他の光検出器におけるフォトンの計数と積分値の算出とを同時に行うことができる。したがって、１つの光検出器によりフォトンの計数と積分値の算出とを切り替えながら行う場合と比較して、受光感度の推定を短時間で実施することができる。また、通常の観察を行っている最中も、いずれか一の光検出器の出力信号から得られるフォトンの計数値により、観察に使用している他の光検出器のフォトンの計数値を推定して、その光検出器の受光感度を推定することができる。
【００１６】
上記態様においては、前記フォトン計数部が、前記標本からの前記光を検出して、そのフォトンを計数するマルチピクセルフォトンカウンタであり、前記受光感度算出部が、前記出力信号積分部により得られる前記光検出器の出力信号の積分値と前記マルチピクセルフォトンカウンタの計数値とに基づいて、前記光検出器の前記受光感度を算出することとしてもよい。
【００１７】
マルチピクセルフォトンカウンタは、入射光量に対して出力が飽和せずに応答できるダイナミックレンジが広いので、このように構成することで、フォトンを計数する光の量を低減するための構成を用いなくて済む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る顕微鏡装置によれば、光検出器の定量的な受光感度を正確に推定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図２】図１の光検出制御ユニットを示すブロック図である。
【図３】フォトンカウント検出特性と時間積算特性との関係の一例を示したグラフである。
【図４】図１の顕微鏡装置による光検出器の受光感度を推定する工程を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の第１実施形態の第１変形例に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図６】図５の光検出制御ユニットを示すブロック図である。
【図７】同じ入射光量でフォトンカウンティング検出とシグナル時間積算の両方を正確に実施できる場合のフォトンカウント検出特性と時間積算特性との関係の一例を示すグラフである。
【図８】同じ入射光量ではフォトンカウンティング検出とシグナル時間積算の両方を正確に実施できない場合のフォトンカウント検出特性と時間積算特性との関係の一例を示すグラフである。
【図９】図５の顕微鏡装置による光検出器の受光感度を推定する工程を説明するフローチャートである。
【図１０】本発明の第１実施形態の第２変形例に係る顕微鏡装置の光検出制御ユニットを示すブロック図である。
【図１１】本発明の第１実施形態の第３変形例に係る顕微鏡装置の光検出制御ユニットを示すブロック図である。
【図１２】所定の基準感度として光検出器の初期時の受光感度を用いた場合の感度補正特性の一例を示すグラフである。
【図１３】所定の基準感度としてフォトンカウンティング検出の感度を用いた場合の感度補正特性の一例を示すグラフである。
【図１４】本発明の第１実施形態の第４変形例に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図１５】ＰＭＴの入射する光の波長と検出感度との関係の一例を示すグラフである。
【図１６】ＰＭＴが高感度の場合と低感度の場合の入射する光の波長と検出感度との関係の一例を示すグラフである。
【図１７】図１４の顕微鏡装置による光検出器の受光感度を推定する工程を説明するフローチャートである。
【図１８】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図１９】図１８の光検出制御ユニットを示すブロック図である。
【図２０】マルチピクセルフォトンカウンタ（ＭＰＰＣ）によるフォトンカウンティング検出のイメージの一例を示す図である。
【図２１】ＰＭＴとＭＰＰＣの入射する光の波長と検出感度との関係の一例を示すグラフである。
【図２２】ＭＰＰＣの感度波長特性と仮想的な基準ＰＭＴの感度波長特性との相対的な感度比の対応関係の一例を示すルックアップテーブルである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態においては、顕微鏡装置１として、例えば図１に示されるような多光子励起レーザ顕微鏡を例示して説明する。この顕微鏡装置１は、標本Ｓを載置するステージ３と、レーザ光を発生するレーザ光源５と、レーザ光源５から発せられたレーザ光を反射する反射ミラー７と、反射ミラー７により反射されたレーザ光を走査させるスキャナ９と、スキャナ９により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１１と、瞳投影レンズ１１により集光されたレーザ光を平行光に変換する結像レンズ１３と、結像レンズ１３により平行光に変換されたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１５とを備えている。
【００２１】
また、顕微鏡装置１は、対物レンズ１５により集光されてレーザ光の光路を戻る標本Ｓからの蛍光をレーザ光の光路から分岐させる励起ダイクロイックミラー１７と、励起ダイクロイックミラー１７によりレーザ光の光路から分岐された蛍光を他の光から分離させる蛍光分離ダイクロイックミラー１９と、蛍光分離ダイクロイックミラー１９により分離された蛍光を集光する集光レンズ２１と、集光レンズ２１により集光された蛍光を検出するＰＭＴ等の光検出器２３とを備えている。
【００２２】
また、顕微鏡装置１には、光検出器２３を制御する光検出制御ユニット２５と、標本Ｓの画像を生成したりその画像情報を記録したりするコンピュータ２７と、レーザ光源５、スキャナ９、光検出制御ユニット２５およびコンピュータ２７を制御するシステム制御ユニット２９とが備えられている。
【００２３】
システム制御ユニット２９は、スキャナ９を駆動する駆動波形を生成する駆動波形生成回路と、駆動波形を駆動信号としてスキャナ９に送信するためのドライブ回路と、スキャナ９が走査する領域のうち、画像取得する部位を走査しているタイミングを知らせる画像有効期間信号を生成する画像有効期間信号生成部と、画像有効期間信号をレーザ光源５に出力するレーザ光源インタフェース回路と、同様に画像有効期間信号を光検出制御ユニット２５に出力する光検出ユニットインタフェース回路と、コンピュータ２７とのデータやコマンドの送受信を行うコンピュータインタフェース回路（いずれも図示略）とを備えている。
【００２４】
レーザ光源５は、システム制御ユニット２９から入力される画像有効期間信号が有効な期間においてレーザ光を照射するように制御されるようになっている。
スキャナ９は、例えば、近接ガルバノミラーであり、互いに直交する揺動軸回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を備えている。このスキャナ９は、２枚のガルバノミラーの各揺動軸回りの揺動角度をそれぞれ制御することで、レーザ光を２次元的に走査させることができるようになっている。
【００２５】
光検出制御ユニット２５は、図２に示すように、光検出器２３により検出される蛍光のフォトンを計数するフォトンカウンティング検出部（フォトン計数部）３１と、フォトンカウンティング検出部３１により計数されたフォトンの数に基づき光検出器２３の入射光量を推定する入射光量推定部（フォトン計数部）３３と、光検出器２３から出力される出力信号を積分するシグナル積算検出部（出力信号積分部）３５と、光検出器２３の受光感度を算出する受光感度算出部３７と、シグナル積算検出部３５から出力される出力信号をスキャナ９による走査と同期した画像輝度データに変換する輝度データ変換部３９とを備えている。
輝度データ変換部３９は、システム制御ユニット２９から入力される画像有効期間信号が有効な期間において有効な画像輝度データをシステム制御ユニット２９に出力するようになっている。
【００２６】
ここで、フォトンカウンティング検出部３１としては、例えば、コンパレータと、エッジ検出回路と、カウンタ回路（いずれも図示略）とを備えている。光検出器２３の出力信号が所定の閾値よりも高いか低いかをコンパレータにて２値化し、２値化したコンパレータ出力を閾値を超えるパルスが到来したタイミングとしてエッジ検出回路でエッジ検出し、エッジ検出した回数をカウンタ回路でカウントすることで、光検出器２３に入射するフォトンを計数することができる。
【００２７】
また、シグナル積算検出部３５としては、例えば、時間カウンタ回路と、積分回路と、ＡＤコンバータ（いずれも図示略）とを備えている。時間カウンタ回路が所定の時間に達するまでの期間、光検出器２３の出力信号を積分回路で積分し、時間カウンタ回路が所定の時間に到達した時刻において積分回路の出力信号をＡＤコンバータにてデータ化することで、出力信号の積分値を得ることができる。
【００２８】
また、受光感度算出部３７としては、例えば、複数のレジスタと、ＬＵＴデータ配列と、演算器（いずれも図示略）とを備えている。ＬＵＴデータ配列には、フォトンカウンティング検出部３１で計数される入射フォトン数に対する光検出器２３が基準感度である場合のシグナル積算値との相関関係が参照されるようデータ構築されている。
【００２９】
ここで、フォトンカウンティング検出部３１により計数されたフォトン数Ｐｎ＿ｉｎと、シグナル積算検出部３５で算出したシグナル積算値Ｓｉ＿ｉｎとをそれぞれレジスタに保持し、フォトン数Ｐｎ＿ｉｎが入射した場合の光検出器２３が基準感度の場合のシグナル積算値Ｓｉ＿ｒｅｆをＬＵＴデータ配列を参照して抽出して同様にレジスタに保持し、Ｓｉ＿ｒｅｆに対する実際のＳｉ＿ｉｎの比率を演算器で算出することで、検出器２３の基準となる受光感度に対する現在の受光感度を推定することができる。
【００３０】
フォトンカウンティング検出部３１は、光検出器２３から出力される出力信号をフォトンカウンティング検出し、一定時間内に計数したフォトンの数をその一定時間内に光検出器２３に入射したフォトンの数（以下、フォトン数Ｐｎとする。）とするようになっている。光検出器２３の自発的なノイズよりもフォトンパルスの振幅の方が統計的には大きいため、フォトンカウンティング検出部３１は、所定の閾値以上のパルスをフォトンとして検出するようになっている。
【００３１】
入射光量推定部３３は、フォトンカウンティング検出部３１により計数されたフォトン数Ｐｎに基づき、一定時間内の光検出器２３の入射光量を定量的に推定するようになっている。入射光量推定部３３により推定された光検出器２３の入射光量（ここでは、フォトン数Ｐｎとする。）は受光感度算出部３７に送られるようになっている。
【００３２】
シグナル積算検出部３５は、フォトンカウンティング検出部３１によるフォトンカウンティング検出と同じ条件下で、光検出器２３から出力される出力信号を一定時間積分し（シグナル時間積算）、その積分値（以下、シグナル積算値Ｓｉという。）をその一定時間内に光検出器２３に入射した光量強度として算出するようになっている。シグナル積算検出部３５により算出されたシグナル積算値Ｓｉは受光感度算出部３７および輝度データ変換部３９に送られるようになっている。
【００３３】
受光感度算出部３７は、入射光量推定部３３から送られてくるフォトン数Ｐｎとシグナル積算検出部３５から送られてくるシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度を算出するようになっている。
【００３４】
具体的には、一定時間内に光検出器２３に入射するフォトン数Ｐｎとその一定時間内に光検出器２３から出力される出力信号のシグナル積算値Ｓｉとの関係が以下の式を満たすこととする。
Ｓｉ＝α×（Ｐｎ＋γ）＋β
上記式において、αは光検出器２３の感度係数、βはオフセット量、γは暗電流である。本実施形態においては、説明の便宜上、オフセット量βと暗電流γをいずれも０とする。オフセット量βは、回路オフセットの調整によっては値を有するので、装置状況に応じて設定することとしてもよい。
【００３５】
ここで、光検出器２３の感度推定は、例えば、図３のグラフにより表される。
図３において、フォトン数Ｐｎがグラフ上の○印点に対応し、フォトンカウンティング検出と同条件下でのシグナル積算値Ｓｉがグラフ上の●印点に対応する。光検出器２３の感度が異なると、同じ入射光量（フォトン数Ｐｎ）であっても、シグナル積算値Ｓｉが異なる。
【００３６】
図３において、実線はフォトンカウンティング検出部３１により検出されるフォトン数Ｐｎの特性（フォトンカウント検出特性）を示し、破線は光検出器２３が高感度の場合にシグナル積算検出部３５により算出されるシグナル積算値Ｓｉの特性（時間積算特性）を示し、二点鎖線は光検出器２３が低感度の場合にシグナル積算検出部３５により算出されるシグナル積算値Ｓｉの特性（時間積算特性）を示している。
【００３７】
受光感度算出部３７は、例えば、光検出器２３の感度係数αを基準となる所定の基準感度係数αｓと比較し、その＋側と−側の乖離度から光検出器２３の受光感度を定量的に推定するようになっている。
【００３８】
輝度データ変換部３９は、シグナル積算検出部３５により算出されたシグナル積算値Ｓｉの出力信号を輝度データに変換するようになっている。
受光感度算出部３７により算出された光検出器２３の受光感度および輝度データ変換部３９により変換された画像輝度データは、それぞれシステム制御ユニット２９に送られるようになっている。
【００３９】
基準感度係数αｓの決定方法の一例としては、装置提供者が多数の光検出器の感度係数を試験評価測定した統計平均を基準感度係数αｓとして標準的にすべての装置に適用することとしてもよい。その結果、特定の装置で得た受光感度算出部３７が算出する感度係数αからは、その標準的な基準感度係数αｓに対する乖離度を推定できるということになる。
【００４０】
システム制御ユニット２９は、受光感度算出部３７から送られてくる光検出器２３の受光感度をコンピュータ２７上で表示させたり、コンピュータ２７に記録させたりするようになっている。また、システム制御ユニット２９は、輝度データ変換部３９から送られてくる画像輝度データに基づいてコンピュータ２７により標本Ｓの画像を構築させ、構築した画像をコンピュータ２７上で表示させたりコンピュータ２７に記録させたりするようになっている。
【００４１】
受光感度の表現方法としては、例えば、標準的な基準感度係数αｓに対する光検出器２３の感度係数αの感度比率（％）で表示する、あるいは、装置初期出荷時の光検出器２３の感度係数αをαｉとしてαｉ／αｓを１００％と規格化し、現在α／αｓとの変化率（減衰率）を％で表示するなどが考えられる。
【００４２】
また、システム制御ユニット２９は、光検出制御ユニット２５により光検出器２３の感度推定が行われる場合には、スキャナ９による走査を停止して、標本Ｓ上の１点にレーザ光が照射される状態を維持させるようになっている。このようにすることで、光検出器２３に入射する蛍光の量を一定にして、光検出器２３の受光感度を精度よく推定することができる。
【００４３】
また、システム制御ユニット２９は、光検出制御ユニット２５により光検出器２３の感度推定を行う場合に、フォトンカウンティング検出部３１によりフォトン数Ｐｎを計数するフォトンカウントモードと、シグナル積算検出部３５によりシグナル積算値Ｓｉを算出するシグナル積算モードとに切り替えるようになっている。
【００４４】
このように構成された顕微鏡装置１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１により標本Ｓを観察する場合は、まず、ステージ３上に標本Ｓを載置し、レーザ光源５からレーザ光を発生させる。
【００４５】
レーザ光源５から発せられたレーザ光は、反射ミラー７により反射されてスキャナ９により２次元的に走査された後、瞳投影レンズ１１により集光されて結像レンズ１３により平行光に変換され、励起ダイクロイックミラー１７を介して対物レンズ１５により標本Ｓに照射される。
【００４６】
レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ１５により集光されてレーザ光の光路を戻り、励起ダイクロイックミラー１７を透過することによりレーザ光の光路から分岐される。励起ダイクロイックミラー１７を透過した蛍光は、蛍光分離ダイクロイックミラー１９により他の光から分離され、集光レンズ２１により集光されて光検出器２３に入射する。
【００４７】
光検出器２３により蛍光が検出されると、検出された蛍光の量に応じた大きさの出力信号が光検出器２３から出力され、光検出制御ユニット２５のシグナル積算検出部３５により積分された後、輝度データ変換部３９により、スキャナ９の走査と同期した画像輝度データに変換されてシステム制御ユニット２９に送られる。システム制御ユニット２９により、光検出制御ユニット２５から送られてきた画像輝度データに基づいてコンピュータ２７において画像が構築され、コンピュータ２７上に表示されたりコンピュータ２７に記録されたりする。
【００４８】
次に、光検出器２３の感度推定について、図４のフローチャートを参照して説明する。
まず、システム制御ユニット２９によりスキャナ９の走査を停止し、レーザ光の照射位置を標本Ｓ上の１点に固定する（ステップＳＡ１）。次いで、レーザ光源５から発生させるレーザ光の強度を最小にし、標本Ｓにおける蛍光の発生量を最少にする（ステップＳＡ２）。
【００４９】
次に、システム制御ユニット２９により、光検出制御ユニット２５をフォトンカウントモードに設定し（ステップＳＡ３）、レーザ光源５から発生させるレーザ光の強度を徐々に強くしていきながら、フォトンカウンティング検出部３１により、一定時間内に光検出器２３に入射するフォトン数Ｐｎを計数して、フォトンカウント検出特性をコンピュータ２７に記録していく（ステップＳＡ４）。
【００５０】
次いで、システム制御ユニット２９により、図３に示すように、フォトンカウント検出特性が直線応答となる光検出器２３の入射光量範囲を特定する（ステップＳＡ５）。そして、フォトンカウント検出特性が直線応答となる入射光量範囲の内、最大の入射光量となる条件を、光検出器２３の受光感度を推定する入射光量条件として設定する（ステップＳＡ６）。
【００５１】
次に、システム制御ユニット２９により、光検出制御ユニット２５をシグナル積算モードに設定し（ステップＳＡ７）、シグナル積算検出部３５により、ステップＳＡ６で設定された入射光量条件下で、一定時間内に光検出器２３から出力される出力信号をシグナル時間積算し、シグナル積算値Ｓｉを算出する（ステップＳＡ８）。
【００５２】
次に、受光感度算出部３７により、入射光量推定部３３から送られてくる光検出器２３の入射光量（ここではフォトン数Ｐｎ。）とシグナル積算検出部３５から送られてくるシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度を推定する（ステップＳＡ９）。
【００５３】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、フォトンカウンティング検出部３１により計数されるフォトン数Ｐｎにより、一定時間内に光検出器２３に入射する蛍光の量が分かり、シグナル積算検出部３５によって算出されるシグナル積算値Ｓｉにより、その一定時間内に光検出器２３に入射した蛍光の強度が分かる。光検出器２３に入射した蛍光の強度は、光検出器２３の受光感度と光検出器２３に入射する蛍光の量との積に相当するので、受光感度算出部３７により、フォトン数Ｐｎとシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の定量的な受光感度を正確に推定することができる。
【００５４】
本実施形態においては、例えば、フォトン数Ｐｎをそのまま輝度とするとともに、シグナル積算値Ｓｉも所定の演算アルゴリズムで輝度に置き換えて、双方の輝度を直接比較することで、光検出器２３の受光感度を推定することとしてもよい。
【００５５】
また、光検出器２３の受光感度に相当するのが感度係数αであり、感度係数αは図３のグラフ上で時間積算特性の傾きに相当する。光検出器２３の受光感度が高ければ時間積算特性の傾きが大きくなり、受光感度が低ければ時間積算特性の傾きが小さくなるので、例えば、光検出器２３に入射する蛍光の量を変化させたときの時間積算特性の傾きを測定することにより、光検出器２３の受光感度を推定することとしてもよい。
【００５６】
この場合、光検出器２３のある入射光量のときのシグナル積算値Ｓｉを点で測定して、式により推測することで、時間積算特性の傾きを直接測定する方が、より精度よく受光感度を推定することができる。ただし、図３のグラフの横軸の入射光量はフォトンカウンティング検出により計数されるフォトン数Ｐｎで定量測定しなければならず、また、フォトンカウンティング検出により定量測定できる光検出器２３に入射する蛍光の強度は微弱領域に限定される。図３のグラフでは、フォトンカウント検出特性の線形領域でのみフォトンカウンティング検出を正常に実施することができるので、線形領域でのみ時間積算特性の傾きを測定することが望ましい。
【００５７】
本発明は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、例えば、図５に示すように、フォトンカウンティング検出部３１によりフォトンが計数される蛍光の量、すなわち、光検出器２３に入射する蛍光の量を調節する可変ＮＤフィルタ（光量調節部）４１と、可変ＮＤフィルタ４１による蛍光の減光率を調節する入射蛍光光量調節部４３とを備えることとしてもよい。可変ＮＤフィルタ４１は、例えば、蛍光分離ダイクロイックミラー１９と集光レンズ２１との間の光路上に配置することとすればよい。
【００５８】
また、図６に示すように、光検出制御ユニット２５が、フォトン数Ｐｎに可変ＮＤフィルタ４１による蛍光の量の調節量を相殺する演算を施す光量調節相殺演算部４５を備えることとしてもよい。光量調節相殺演算部４５としては、例えば、複数のレジスタと、演算器（いずれも図示略）とを備えている。この光量調節相殺演算部４５は、フォトンカウンティング検出により計数されるフォトン数Ｐｎと可変ＮＤフィルタ４１の減光率情報とをそれぞれレジスタに保持し、演算器がフォトン数Ｐｎに対して減光率の逆数を乗算することで、可変ＮＤフィルタ４１による減光影響を相殺したフォトン数を得られるようになっている。
【００５９】
ここで、光検出器２３の入射光量が多くなると、フォトンパルスを分離できずフォトン数Ｐｎを正確に計数することができない。可変ＮＤフィルタ４１により、フォトンパルスを分離できる強度に蛍光を減光して光検出器２３に入射させることとすれば、フォトンカウンティング検出部３１の計数値が飽和するのを防ぐことができる。一方、シグナル積算値Ｓｉの算出は、ノイズ成分の積分がＳ／Ｎに影響しないよう、光検出器２３の入射光量が多い状況で行うことが望ましい。
【００６０】
そこで、可変ＮＤフィルタ４１により蛍光量を減光して、フォトンカウンティング検出部３１によりフォトン数Ｐｎを正確に計数できる光検出器２３の入射光量で、シグナル積算検出部３５によりシグナル積算値ＳｉもＳ／Ｎよく算出できる場合は、例えば図７に示すように、その入射光量で算出されるフォトン数Ｐｎとシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度を推定することとすればよい。
【００６１】
一方、フォトン数Ｐｎを正確に計数できる入射光量ではシグナル積算検出部３５によるシグナル積算値ＳｉをＳ／Ｎよく算出できない場合は、シグナル積算値Ｓｉを算出する際に、蛍光を減光しない状態にして光検出器２３により蛍光を検出する必要がある。
【００６２】
この場合、フォトンカウンティング検出とシグナル時間積算時の入射光量比を可変ＮＤフィルタ４１の減光率設定により定量化できるので、例えば図８に示すように、光量調節相殺演算部４５により、可変ＮＤフィルタ４１によって蛍光が減光された状態でフォトンカウンティング検出により計数されるフォトン数Ｐｎに可変ＮＤフィルタ４１による減光率の逆数を乗じることで、減光していない状態でのシグナル時間積算時に光検出器２３に入射するフォトン数Ｐｎを推測することとしてもよい。そして、受光感度算出部３７により、推測したフォトン数Ｐｎに対するシグナル積算値Ｓｉを比較することで、光検出器２３の受光感度を推定することとしてもよい。
【００６３】
具体的には、図９のフローチャートに示すように、ステップＳＡ１においてスキャナ９の走査を停止した後、ステップＳＡ２によりレーザ光源５から発生させるレーザ光の強度を最小にする前に、可変ＮＤフィルタ４１により、光検出器２３に入射する蛍光の量を減光することとすればよい（ステップＳＢ１）。
【００６４】
また、ステップＳＡ７において光検出制御ユニット２５をシグナル積算モードにした後、可変ＮＤフィルタ４１による蛍光の減光を解除し（ステップＳＢ７−１）、フォトンカウンティングモードで蛍光を減光した際の可変ＮＤフィルタ４１の減光率から、蛍光を減光していない状態でのシグナル時間積算時に光検出器２３に入射するフォトン数Ｐｎを推測することとすればよい（ステップＳＢ７−２）。
【００６５】
そして、ステップＳＡ８においてシグナル積算値Ｓｉが算出された後、受光感度算出部３７により、ステップＳＢ７−２において推測されたフォトン数Ｐｎに対するステップＳＡ８において算出されたシグナル積算値Ｓｉに基づいて、光検出器２３の受光感度を推定することとすればよい（ステップＳＡ９´）。
【００６６】
このようにすることで、受光感度算出部３７により、可変ＮＤフィルタ４１によって蛍光の量を調節していない状態と同じ割合のフォトン数Ｐｎとシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度を算出することができる。
【００６７】
本変形例においては、例えば、可変ＮＤフィルタ４１を採用せず、レーザ光源５によりレーザ光の強度を弱めることで、標本Ｓにおいて発生する蛍光の量そのものを低減させることとしてもよい。蛍光現象は、線形光学効果のため、理論上は、レーザ光の強度に比例した蛍光の強度となることを利用することができる。
【００６８】
また、本変形例においては、フォトン数Ｐｎおよびシグナル積算値Ｓｉの少なくとも一方に、可変ＮＤフィルタ４１による蛍光の量の調節量を相殺する演算を施すこととすればよく、例えば、光量調節相殺演算部４５が、シグナル積算値Ｓｉに可変ＮＤフィルタ４１による蛍光の量の調節量を相殺する演算を施すこととしてもよい。
【００６９】
第２変形例としては、例えば図１０に示すように、受光感度算出部３７により複数回算出される受光感度に基づき、光検出器２３の受光感度の変化量を測定する受光感度変化測定部４７を備えることとしてもよい。受光感度変化測定部４７としては、例えば、レジスタと、メモリ（いずれも図示略）とを備えている。この場合、メモリには光検出器２３の初期状態における受光感度を保存しておく一方で、そのデータとは別アドレスに受光感度算出部３７により算出される光検出器２３の受光感度を定期的に保存するようにすればよい。システム制御ユニット２９は、必要に応じて初期感度と直近の感度をそれぞれメモリから読み出してこれらの比率を算出することで、初期状態に対する受光感度の変化量を測定することができる。
【００７０】
光検出器２３の受光感度の変化経歴は、例えば、光検出制御ユニット２５内に不揮発メモリ（図示略）を設けて、その不揮発メモリに光検出器２３の受光感度の変化を記録して、それをユーザが参照できるようにしてもよい。また、システム制御ユニット２９を介して顕微鏡装置１の全体を制御するコンピュータ（図示略）上で、光検出器２３の受光感度の変化をデータとして保存し、それをユーザが参照できるようにしてもよい。
【００７１】
第３変形例としては、例えば図１１に示すように、光検出制御ユニット２５が、所定の基準感度に対する受光感度算出部３７により算出された光検出器２３の受光感度の感度比を算出する対基準感度比算出部４９と、対基準感度比算出部４９により算出される光検出器２３の受光感度の感度比に基づく補正係数により、シグナル積算検出部３５の積分値を補正して出力する感度補正出力部５１とを備えることとしてもよい。
【００７２】
対基準感度比算出部４９としては、例えば、レジスタと、メモリと、演算部（いずれも図示略）とを備えている。この対基準感度比算出部４９は、光検出器２３の初期状態の感度を所定の基準感度としてメモリに保存し、一方で現在の受光感度算出部３７により算出される光検出器２３の現在の受光感度を同様にレジスタに保持し、それらの比率を演算器で算出することで、基準感度に対する現状の感度を知るようになっている。
【００７３】
感度補正出力部５１としては、例えば、演算器（図示略）を備え、シグナル積算検出部３５により算出される現在のシグナル積算値Ｓｉに対して、対基準感度比算出部４９により算出された感度比の逆数を補正係数として乗じて感度補正を行うようになっている。
輝度データ変換部３９は、感度補正出力部５１から出力される感度補正された出力信号に基づいて輝度データを生成するようになっている。
【００７４】
このようにすることで、光検出器２３の受光感度が経時的に劣化してきた場合でも、その劣化の影響を補正して、得られる蛍光の強度に定量性を持たせることができる。
【００７５】
例えば、所定の基準感度として光検出器２３の初期時の受光感度（例えば、初期時の受光感度をαｎとする。）を用いた場合は、初期時の受光感度に対する現在の感度係数（例えば、現在の感度係数をαｏとする。）の逆数であるαｎ／αｏを補正係数として、現在のシグナル積算値Ｓｉに乗じることとすればよい。このようにすることで、図１２に示すように、光検出器２３の初期時の受光感度で得られた値に相当する出力信号を得ることができる。
【００７６】
また、所定の基準感度としてフォトンカウンティング検出の感度を用いた場合は、単に光検出器２３の劣化を補正するというだけではなく、図１３に示すように、光検出器２３の現状の受光感度をフォトンカウンティングの感度に一致させるので、測定値に定量性をもたらすことができる。
【００７７】
第４変形例としては、例えば図１４に示すように、第１変形例および第３変形例の構成に加えて、さらに、光検出器２３により検出する蛍光の波長を変更する検出波長変更部５３を備えることとしてもよい。また、感度補正出力部５１が、検出波長変更部５３により変更される蛍光の波長に関わらず、受光感度算出部３７によりいずれかの波長の蛍光に基づいて算出される光検出器２３の受光感度と所定の基準感度との感度比に基づく補正係数により、シグナル積算検出部３５のシグナル積算値Ｓｉを補正することとしてもよい。
【００７８】
この場合、検出波長変更部５３は、標本Ｓにおいて発生させる蛍光の波長を変更するためにレーザ光源５の波長を切り替えるとともに、光検出器２３に入射する蛍光の波長を変更するために励起ダイクロイックミラー１７と蛍光分離ダイクロイックミラー１９の波長特性を切り替えることとすればよい。なお、光検出器２３の感度推定は、毎回特定の蛍光波長で行うことが好ましい。
【００７９】
ここで、ＰＭＴ等の光検出器２３は、例えば図１５に示すように、入射する光の波長によって、入射光量に対する出力特性が異なるという波長特性を有するため、ある波長で光検出器２３の感度推定を実施しても別の波長では受光感度が異なることがある。
また、光検出器２３の受光感度は、入射したフォトンを電子に変換する効率に関する光電面感度と、光子から変換された電子を増幅する効率に関する増倍感度との積により求められる。
【００８０】
光電面感度は、光検出器２３全体で考えれば、光検出器２３に入射した光子の数に対して、出力信号としてフォトンパルスに変換される数の割合を示し、フォトンカウンティング検出にもシグナル時間積算にも同様の影響を及ぼす因子である。一方、増倍感度は、光検出器２３全体で考えれば、出力信号の波形の振幅の大きさが変化する、すなわち、フォトンカウンティング検出においてフォトンパルスの数は変化せずに振幅だけが変化するものなので、フォトンカウンティング検出ではその影響を排除できるが、シグナル時間積算では出力に直接的に影響を及ぼす因子である。
【００８１】
ＰＭＴ等の光検出器２３において、波長特性が存在するのは光電面感度だけであり、増倍感度には波長特性は存在しない。また、光検出器２３において、使用に応じた劣化が生じるのは増倍感度が主であり、光電面感度には使用に応じた劣化がほとんど生じない。
【００８２】
そこで、光検出器２３の受光感度の高低が増倍感度の高低だけによるものと考えると、例えば図１６に示すように、低感度の場合の波長特性曲線に一律に一定のゲインを乗じたものが高感度の波長特性曲線となる。すなわち、光検出器２３が使用時間が浅く高感度のときと使用を重ねて低感度に劣化したときの変化を高感度／低感度の比率で表すと、この比率はどの波長でも一定といえる。したがって、いずれかの波長で光検出器２３の受光感度の変化比を算出すれば、その変化比は別のいずれの波長においても同じということになる。
【００８３】
この場合、図１７のフローチャートに示すように、ステップＳＡ１においてスキャナ９の走査を停止した後、ステップＳＢ１により蛍光を減光する前に、検出波長変更部５３により、レーザ光源５の波長を切り替えるとともに、励起ダイクロイックミラー１７および蛍光分離ダイクロイックミラー１９の波長特性を切り替えて、光検出器２３により検出する蛍光波長を特定の波長に切り替えることとすればよい（ステップＳＣ１）。
【００８４】
また、ステップＳＡ８においてシグナル積算値Ｓｉが算出された後、検出波長変更部５３により、レーザ光源５の波長と励起ダイクロイックミラー１７および蛍光分離ダイクロイックミラー１９の波長特性を変更して、光検出器２３により検出する蛍光波長を蛍光観察用の波長に戻し、感度推定のフローを終了することとすればよい（ステップＳＣ７）。
【００８５】
さらに、システム制御ユニット２９によりスキャナ９の走査を再開し（ステップＳＣ８）、感度補正を実施する場合は（ステップＳＣ９「ＹＥＳ」）、感度補正出力部５１により、対基準感度比算出部４９によって算出される所定の基準感度に対する受光感度算出部３７により算出された光検出器２３の現状の受光感度の感度比に基づいて補正係数を算出し（ステップＳＣ１０）、ステップＳＢ７−２において算出される現在のシグナル積算値Ｓｉに補正係数を乗じて感度補正を実施することとすればよい（ステップＳＣ１１）。
【００８６】
この場合は、輝度データ変換部３９により、ステップＳＣ１１において感度補正された出力信号に基づいて輝度データが生成される（ステップＳＣ１２）。一方、感度補正を実施しない場合は（ステップＳＣ９「ＮＯ」）、光検出器２３からの出力信号を感度補正出力部５１により補正せずに、輝度データ変換部３９により輝度データを生成することとすればよい。
本変形例によれば、いずれの波長でもシグナル積算検出部３５の積分値を精度よく補正することができる。
【００８７】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態においても、顕微鏡装置６１として、例えば図１８に示されるような多光子励起レーザ顕微鏡を例示して説明する。この顕微鏡装置６１は、同一の標本Ｓからの蛍光を検出する２つの光検出器２３，６３を備え、例えば図１９に示すように、フォトンカウンティング検出部３１が光検出器２３，６３の一方の出力信号に基づいてフォトン数Ｐｎを計数し、シグナル積算検出部３５が光検出器２３，６３の他方の出力信号に基づいてシグナル積算値Ｓｉを算出する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８８】
顕微鏡装置６１は、蛍光分離ダイクロイックミラー１９に代えて、励起ダイクロイックミラー１７を透過した蛍光を既知の分配比率で反射および透過させるハーフミラー６５と、ハーフミラー６５を透過した蛍光を集光して光検出器６３に入射させる集光レンズ６７と、蛍光の光路に対してハーフミラー６５を挿脱することにより蛍光の光路を切り替える光路切替部６９とを備えている。
【００８９】
光路切替部６９により、蛍光の光路上にハーフミラー６５を挿入すると、ハーフミラー６５の分配比率に応じた量の蛍光が光検出器２３，６３に同時に入射され、蛍光の光路上からハーフミラー６５を脱離させると、光検出器６３のみに蛍光が入射される。
【００９０】
フォトンカウンティング検出部３１は、例えば図１９に示すように、光検出器６３から出力された出力信号をフォトンカウンティング検出するようになっている。
入射光量推定部３３は、フォトンカウンティング検出部３１により計数された一定時間内に光検出器６３に入射したフォトン数と、ハーフミラー６５による蛍光の既知の分配比率とに基づいて、光検出器２３の入射光量、すなわちフォトン数Ｐｎを推定するようになっている。
【００９１】
シグナル積算検出部３５は、フォトンカウンティング検出部３１によるフォトンカウンティング検出と同じ条件下で、一定時間内に光検出器２３から出力される出力信号をシグナル時間積算して、シグナル積算値Ｓｉを算出するようになっている。
【００９２】
このように構成された顕微鏡装置６１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置６１において、光検出器２３の受光感度を推定する場合は、フォトンカウンティング検出部３１により、光検出器６３からから出力される出力信号をフォトンカウンティング検出し、入射光量推定部３３により、フォトンカウンティング検出部３１から送られてくる一定時間内に光検出器６３に入射したフォトン数とハーフミラー６５の既知の分配比率とに基づいて、光検出器２３の入射光量（フォトン数Ｐｎ）が推定される。
【００９３】
そして、受光感度算出部３７により、入射光量推定部３３から送られてくる推定されたフォトン数Ｐｎとシグナル積算検出部３５により算出されたシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度が算出される。
【００９４】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置６１によれば、光検出器６３の出力信号から得られるフォトン数により光検出器２３に入射する蛍光のフォトン数Ｐｎを推定することで、光検出器２３におけるフォトン数Ｐｎの計数とシグナル積算値Ｓｉの算出とを同時に行うことができる。
【００９５】
したがって、１つの光検出器２３によりフォトン数Ｐｎの計数とシグナル積算値Ｓｉの算出とを切り替えながら行う場合と比較して、光検出器２３の受光感度の推定を短時間で実施することができる。また、通常の観察を行っている最中も、光検出器６３の出力信号から得られるフォトン数により、観察に使用している光検出器２３に入射する蛍光のフォトン数Ｐｎを推定して、その光検出器２３の受光感度を推定することができる。
【００９６】
本実施形態においては、光検出器２３の受光感度を推定する場合を例示して説明したが、光検出器２３と光検出器６３とを入れ替えて、光検出器６３の受光感度を推定することとしてもよい。
【００９７】
また、本実施形態においては、ハーフミラー６５を採用することとしたが、これに代えて、ハーフミラー、反射ミラーおよび分光ダイクロイックミラー（いずれも図示略）を採用することとしてもよい。この場合、光路切替部６９として、これらハーフミラー、反射ミラーおよび分光ダイクロイックミラーを支持するターレット（図示略）を採用し、システム制御ユニット２９によりターレットを制御して、これらハーフミラー、反射ミラーおよび分光ダイクロイックミラーと空穴のいずれかを蛍光の光路上に択一的に配置することとすればよい。
【００９８】
蛍光の光路にハーフミラーを配置すれば光検出器２３，６３により蛍光の検出を同時に行うことができ、反射ミラーを配置すれば光検出器２３により蛍光を検出することができ、空穴を配置すれば光検出器６３により蛍光を検出することができ、分光ダイクロイックミラーを配置すれば光検出器２３，６３により多色蛍光を同時に観察することができる。そして、必要に応じてターレットによりハーフミラー、反射ミラー、分光ダイクロイックミラーおよび空穴を切り替えるだけで、通常の観察や光検出器２３，６３の受光感度の推定を切り替えることができる。
【００９９】
本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、光検出器６３およびフォトンカウンティング検出部３１に代えて、例えば図２０に示すような、標本Ｓからの蛍光を検出して、そのフォトンを計数する半導体検出器であるマルチピクセルフォトンカウンタ（ＭＰＰＣ：Ｍｕｌｔｉ  Ｐｉｘｅｌ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）７１を採用することとしてもよい。
【０１００】
この場合、入射光量推定部３３が、マルチピクセルフォトンカウンタ７１により一定時間内に計数されるフォトンの数とハーフミラー６５の分配比率とに基づいて、ＰＭＴ等の光検出器２３に一定時間内に入射するフォトン数Ｐｎを推定することとすればよい。そして、受光感度算出部３７が、入射光量推定部３３により推定されたフォトン数Ｐｎと、シグナル積算検出部３５により算出される光検出器２３の出力信号のシグナル積算値Ｓｉとに基づいて、光検出器２３の受光感度を推定することとしてもよい。
【０１０１】
例えば図２１に示すように、ＰＭＴは、フォトンカウンティング検出を正確に検出できる入射光量のダイナミックレンジが狭いのに対し、マルチピクセルフォトンカウンタ７１は、強い光が入射しても正確にフォトンカウンティング検出を実施でき、ダイナミックレンジが広い。
【０１０２】
したがって、本変形例によれば、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の入射光量を低減する必要がなく、ＰＭＴ等の光検出器２３によりシグナル時間積算で観察するときと同等レベルの光量を入射してフォトンカウンティング検出することができる。
【０１０３】
なお、ＰＭＴ等の光検出器２３とマルチピクセルフォトンカウンタ７１とでは、受光面感度の波長特性が異なる。そのため、マルチピクセルフォトンカウンタ７１を基準に光検出器２３の受光感度を直接推定するのではなく、装置初期時にマルチピクセルフォトンカウンタ７１と光検出器２３の初期感度状態における感度−波長特性の相対的な比較ＬＵＴ（ルックアップテーブル）を構築してメモリ保存しておき、これを用いることで、使用を重ねて感度が劣化した後の光検出器２３の受光感度を推定することができる。
【０１０４】
この場合は、前提として、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の受光感度の波長特性と、仮想的な基準ＰＭＴの受光感度の波長特性（補正基準）とが既知で、これらの相対的な感度比の対応関係を図２２に示すようなルックアップテーブル（ＬＵＴ）等で相互に参照できるようにする。
【０１０５】
このことについて詳細に説明する。
一定時間内に光検出器２３に入射するフォトン数Ｐｎとその一定時間内に光検出器２３から出力される出力信号のシグナル積算値Ｓｉとの関係は、段落［００３４］で述べたように以下式で表されるものであった。
Ｓｉ＝α×（Ｐｎ＋γ）＋β
ここでは感度の波長特性を扱うため、この式をより厳密な表現として考える必要がある。まず、γとβは簡単のために０とする。次に、段落［００１３］で説明したように、光検出器２３の感度は、光電面感度と増倍感度とに分かれており、総合的感度はこれらを乗じたものである。ここで、光電面感度には入射光の波長依存性があるため、光電面感度をＱｐ（λ）とし、一方で、増倍感度には波長依存性は無いものの使用時間に応じた劣化が伴うため、増倍感度をα（ｔ）とする。そして光検出器２３に入射するフォトン数は光検出器２３から出力される出力信号をフォトンカウンティング検出した検出カウント数としてのＰｎではなく、光検出器２３に入射する厳密な光子数としてＰｉを持ち出すと、Ｓｉを表す厳密な式としては、
Ｓｉ（ｔ、λ）＝α（ｔ）×Ｐｎ（λ）＝α（ｔ）×Ｑｐ（λ）×Ｐｉ・・・式（Ａ）
ということになる。ここまでの議論では光検出器２３の増倍感度にだけ着目しており光電面感度Ｑｅ（λ）の波長依存性を議論する必要はなかったため、Ｑｐ（λ）×Ｐｉを波長に無関係なＰｎとして省略して議論できたが、ここでは波長依存性を議論するため簡単化せず上式のように表す必要がある（Ｐｎ（λ）＝Ｑｐ（λ）×Ｐｉ）。
【０１０６】
式（Ａ）で、光検出器２３が初期状態で感度良好の状態である時点をｔ＝ｔ１とすると、
Ｓｉ（ｔ１、λ）＝α（ｔ１）×Ｑｐ（λ）×Ｐｉ・・・式（Ｂ）
と表すことができる。
これに対し、光検出器２３が使用を重ねて感度が劣化した状態である時点をｔ＝ｔ２とすると、
Ｓｉ（ｔ２、λ）＝α（ｔ２）×Ｑｐ（λ）×Ｐｉ・・・式（Ｃ）
と表すことができる。
【０１０７】
一方で、マルチピクセルフォトンカウンタ７１に入射する厳密な光子数を同じくＰｉとし、その光電面感度をＱｍ（λ）としたとき、マルチピクセルフォトンカウンタ７１が検出するフォトンカウント値は、以下の式（Ｄ）のＰｍとして求められる。
Ｐｍ（λ）＝Ｑｍ（λ）×Ｐｉ・・・式（Ｄ）
マルチピクセルフォトンカウンタ７１の出力はアナログ信号強度ではなく、フォトンカウント値そのものであるため、光検出器２３における増倍感度α（ｔ）に該当する係数は存在しない。
【０１０８】
さて、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の出力感度の波長特性の表現として、式（Ｄ）における係数Ｑｍ（λ）を横軸波長λとしてプロットしたものが、図２２における実線である。対して、光検出器２３が初期状態のときの出力感度の波長特性の表現として式（Ｂ）における係数α（ｔ１）×Ｑｐ（λ）を同様に考えればよいのだが、各々の式の左辺が示す物理量は、式（Ｂ）はシグナル積算値であり、式（Ｄ）はフォトンカウント値であるため、互いに違う意味の量である。
しかしながら、光検出器２３の感度劣化を補正するためには、装置初期時にこれらの波長特性を組み合わせパラメータとして規格化してＬＵＴ化してメモリに保存しておけば十分である。例えば、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の感度波長特性Ｑｍ（λ）の全波長帯域における最大値と、光検出器２３の感度波長特性α（ｔ１）×Ｑｐ（λ）の全波長帯域における最大値を１００％として規格化するための規格化係数Ｎｒｍを用いて、式（Ｂ）は、
Ｓｉ＿ｎ（ｔ１、λ）＝Ｎｒｍ×α（ｔ１）×Ｑｐ（λ）×Ｐｉ・・・式（Ｅ）
とすることができる。そして、式（Ｅ）の各波長の感度Ｎｒｍ×α（ｔ１）×Ｑｐ（λ）を横軸波長λとしてプロットすると、図２２の破線となる。ここで双方は規格化しているので実線と破線の最大値は同じである。
【０１０９】
そして、式（Ｅ）に対して光検出器２３が使用を重ね感度がα（ｔ２）に劣化したときの感度波長特性Ｎｒｍ×α（ｔ２）×Ｑｐ（λ）を同様に図示したのが図２２の一点鎖線である。ここで、感度の劣化は波長とは無関係にα（ｔ１）がα（ｔ２）に劣化しただけのことである。よって、初期感度のときの破線に対し波長とは無関係に一律α（ｔ２）／α（ｔ１）に縦軸を縮小したものが劣化時感度の一点鎖線ということになる。
【０１１０】
ここまで前置きしたところで、マルチピクセルフォトンカウンタ７１を用いて光検出器２３の感度劣化を推定しこれを補正した出力を得る方法について説明する。
まず、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の感度波長特性（図２２の実線）と光検出器２３が初期感度のときの感度波長特性（図２２の破線）は、上述のとおり、装置初期に組み合わせパラメータとしてＬＵＴ化しておいたので既知である。例えば、標本Ｓからの蛍光が波長４２０ｎｍであったとき、装置初期状態であればマルチピクセルフォトンカウンタ７１の出力Ｐｍ（λ＝４２０）と初期感度の光検出器２３の規格化シグナル積算値Ｓｉ＿ｎ（ｔ１、λ＝４２０）は、
Ｓｉ＿ｎ（ｔ１、λ＝４２０）／Ｐｍ（λ＝４２０）＝８０／１００
であることがＬＵＴから分かる。ここで、使用を重ね感度が劣化したときのＳｉ＿ｎ（ｔ２、λ＝４２０）を実測で得て同様の比較を行ったところ、
Ｓｉ＿ｎ（ｔ２、λ＝４２０）／Ｐｍ（λ＝４２０）＝６０／１００
であったとする。初期感度であればＰｍの８０％で得られたはずのシグナルが６０％に減衰したということになるので、現時点の光検出器２３の感度を初期感度に補正するためには、光検出器２３の出力に係数として８０／６０を乗ずればよいということになる。
【０１１１】
一方で、標本Ｓからの蛍光が波長６２０ｎｍであったとき、マルチピクセルフォトンカウンタ７１の出力Ｐｍ（λ＝６２０）と初期感度の光検出器２３の規格化シグナル積算値Ｓｉ＿ｎ（ｔ１、λ＝６２０）がＬＵＴから、
Ｓｉ＿ｎ（ｔ１、λ＝６２０）／Ｐｍ（λ＝６２０）＝１６０／１００
であったとする。ここで、使用を重ね感度が劣化したときのＳｉ＿ｎ（ｔ２、λ＝６２０）を実測で得て同様の比較を行ったところ、
Ｓｉ＿ｎ（ｔ２、λ＝６２０）／Ｐｍ（λ＝６２０）＝１２０／１００
であったとする。初期感度であればＰｍの１６０％で得られたはずのシグナルが１２０％に減衰したということになるので、現時点の光検出器２３の感度を初期感度に補正するためには光検出器２３の出力に係数として１６０／１２０を乗ずればよいことになる。
【０１１２】
ここで、λ＝４２０ｎｍのときの補正係数とλ＝６２０ｎｍのときの補正係数はそれぞれ８０／６０と１６０／１２０であり、これは通分すれば係数として同じである。これは単なる偶然ではなく、光検出器２３の初期感度α（ｔ１）がα（ｔ２）に劣化するときには波長に無関係に一律劣化するので、当然である。
【０１１３】
このようにして、初期感度時のＰＭＴ受光感度と感度劣化時の受光感度が波長に対して相似であれば、ある波長（例えば、波長４２０ｎｍ）にて算出した光検出器２３の感度を初期感度に補正するための補正係数は、他波長（例えば、波長６２０ｎｍ）においても適用することが可能である。
【０１１４】
本変形例においては、例えば、ハーフミラー６５に代えて反射ミラーを採用し、光検出器２３とマルチピクセルフォトンカウンタ７１の光路切り替えを反射ミラーの挿脱により行うこととしてもよい。そして、入射光量測定時には蛍光の光路から反射ミラーを脱離させて、マルチピクセルフォトンカウンタ７１に蛍光を１００％入射させ、通常観察時は蛍光の光路に反射ミラーを挿入して、光検出器２３に蛍光を１００％入射させることとすれば、同じ蛍光光量の状況下で光検出器２３の受光感度の推定を行うことができる。
【０１１５】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、第２実施形態の顕微鏡装置６１の構成に、第１実施形態の第１変形例から第４変形例の構成を適用するなど、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【０１１６】
また、上記各実施形態においては、顕微鏡装置１，６１として多光子励起レーザ顕微鏡を例示して説明したが、顕微鏡装置としては、例えば、対物レンズ１５の焦点位置と共役な位置に開口するピンホールを備える共焦点レーザ顕微鏡を採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【０１１７】
１、６１    顕微鏡装置
１５        対物レンズ
２３，６３  光検出器
３１        フォトンカウンティング検出部（フォトン計数部）
３５        シグナル積算検出部（出力信号積分部）
３７        受光感度算出部
４１        可変ＮＤフィルタ（光量調節部）
４５        光量調節相殺演算部
４７        受光感度変化測定部
４９        対基準感度比算出部
５１        感度補正出力部
５３        検出波長変更部
７１        マルチピクセルフォトンカウンタ
Ｓ          標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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