(57)【要約】【課題】細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ病原性が低い組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクターを提供すること。【解決手段】（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記（ａ）がボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡであることを特徴とするウイルスベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むことを特徴とするウイルスベクター。
【請求項２】
（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記（ａ）がボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項３】
（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるＭ遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
（ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項６】
（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項７】
（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、外来性遺伝子の３’末端側及び５’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の３’末端側の制限酵素サイトとＰ遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトとＬ遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるＭ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトとＭ遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号９に示す配列を含み、該外来性遺伝子の３’末端側の制限酵素サイトと配列番号９に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトと配列番号９に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
【請求項１１】
ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項９又は１０に記載の組換えウイルスの作製方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の組換えウイルス、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の組換えウイルス、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
【請求項１４】
請求項８に記載の組換えウイルス、又は請求項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、組換えウイルス及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。
【０００３】
しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばＤＮＡウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主（例えば、ヒト）への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。
【０００４】
さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。
【０００５】
ボルナウイルスは、非分節の一本鎖マイナス鎖のＲＮＡをゲノムとして持つモノネガウイルス目（Mononegavirales）に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。現在、ボルナウイルス科（Bornaviridae）ボルナウイルス属（Bornavirus）には、哺乳類に感染するボルナ病ウイルス（Borna disease virus：ＢＤＶ）の他、鳥類に感染する鳥ボルナウイルス（Avian Bornavirus：ＡＢＶ）等が同定されている。
【０００６】
ＢＤＶは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する（非特許文献１及び２等）。
【０００７】
ＢＤＶを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現カセットをＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてＧＦＰ遺伝子が発現したことが報告されている（非特許文献３）。
【０００８】
特許文献１には、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターが開示されている。
【０００９】
また、特許文献２には、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクターが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−２２３３８号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１１３６４７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】蛋白質  核酸  酵素、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．１０、ｐ．１１６８−１１７４（２００７）
【非特許文献２】朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第６０巻・第２号（2005年２月号別刷）、７９−８５頁
【非特許文献３】U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＢＤＶを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記ＢＤＶを用いる技術においては、組換えウイルスの回収効率が高くないことや遺伝子の導入効率が未だ十分ではないなどの課題があり、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、組換えウイルスの複製効率が高く、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターとして、更に優れるものが望まれていた。
【００１３】
本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞（例えば、脳神経系等の中枢神経系の細胞等）に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞に伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクター、組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法、外来性遺伝子導入剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明者らはＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）における外来性遺伝子の挿入について鋭意研究を行った。その結果、ＢＤＶゲノムにおいて外来性遺伝子を導入する際に、ＢＤＶゲノムにおけるＧ遺伝子とは遺伝子型が異なるＧ遺伝子を挿入する、即ち、ＢＤＶゲノムに外来性遺伝子と共に鳥ボルナウイルス（ＡＢＶ）のＧ遺伝子を導入したベクターを作製することで、得られる組換えウイルスの産生能及び回収率がより高い（該ベクターから産生される組換えウイルスの複製効率がより高い）ことを見出し、ひいては外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。
【００１５】
これまで、既存の組換えＢＤＶベクターにおいては、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域（特許文献１）又はゲノムの５’末端領域（非特許文献３）に挿入して該遺伝子を発現させていた。しかしながら、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域に挿入したベクターは、組換えウイルス産生能が低く、また、該ベクターから産生される組換えウイルスの細胞への感染は一過性であり、持続的に外来性遺伝子を発現できなかった。ゲノムの５’末端領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターは、遺伝子の導入効率が低かった。また、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターも検討されていた（特許文献２）が、該ベクターは組換えウイルス産生能が未だ十分ではなく、また、当該組換えウイルスの回収量も少ないことから、実用化には未だ問題があった。本発明者らは、ＢＤＶゲノムの配列に着目し、元来有するＧ遺伝子を破壊して、該Ｇ遺伝子とは遺伝子型が異なる別個なＧ遺伝子と共に外来性遺伝子を挿入することで、得られたＢＤＶベクターは、既存の組換えＢＤＶベクターよりウイルス産生能及びその回収効率も高いものであること、該ベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞においても高効率に感染することを見出し、長期間目的遺伝子を発現することができることから、これらを用いると様々な外来性遺伝子を目的細胞に効率よく導入することができることに想到した。
【００１６】
なお、ＢＤＶゲノムには、少なくとも６つの蛋白質、すなわち核蛋白質（Ｎ蛋白質）、Ｘ蛋白質、リン酸化蛋白質（Ｐ蛋白質）、マトリックス蛋白質（Ｍ蛋白質）、表面糖蛋白質（Ｇ蛋白質）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）がコードされている。図１は、ＢＤＶゲノムの構造を模式的に示す図である。図１において、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬは、それぞれの遺伝子のＯＲＦを模式的に示している。ＢＤＶゲノムは、図１に示すように、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの各遺伝子を、３’末端からこの順に有する。本明細書中、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質をコードするウイルスＲＮＡを、それぞれＧ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子という。また、例えば、「Ｇ遺伝子のｃＤＮＡ」とは、Ｇ遺伝子をコードするｃＤＮＡを意味する。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下の項１〜項１５に関する。
項１．  ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むことを特徴とするウイルスベクター。
項２．  （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記（ａ）がボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡであることを特徴とする、項１に記載のウイルスベクター。
項３．  （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるＭ遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである項２に記載のウイルスベクター。
項４．  （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである項２に記載のウイルスベクター。
項５．  （ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする項２〜４のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６．  （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする項２〜５のいずれかに記載のウイルスベクター。
項７．  （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、外来性遺伝子の３’末端側及び５’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の３’末端側の制限酵素サイトとＰ遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトとＬ遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるＭ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトとＭ遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号９に示す配列を含み、該外来性遺伝子の３’末端側の制限酵素サイトと配列番号９に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の５’末端側の制限酵素サイトと配列番号９に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする項２〜６のいずれかに記載のウイルスベクター。
【００１８】
項８．  項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
項９．  項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項１０．  項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項１１．  ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項９又は１０に記載の組換えウイルスの作製方法。
【００１９】
項１２．  項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
項１３．  項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項１４．  項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項１５．  項１〜７のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
【００２０】
本発明はまた、以下の方法、使用等も包含する。
項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法。
項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項８に記載の組換えウイルス、又は項９〜１１のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞には伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを高い生産性で産生できるウイルスベクター及び組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的にかつ効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞等の細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の組換えウイルスが持つＰ蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ボルナ病ウイルスのゲノム（野生型）の構造を模式的に示す図である。
【図２】図２（ａ）は、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおけるＰ遺伝子のＯＲＦとＭ遺伝子のＯＲＦとの間の非翻訳領域（ＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５〜１８９５）を模式的に示した図であり、（ｂ）は、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子挿入部位の一例を模式的に示した図である。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、本発明のウイルスベクターの元になるRNA配列構造の一例を模式的に示す図である。
【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、本発明のウイルスベクターの元になるRNA配列構造の一例を模式的に示す図である。
【図５】図５（ａ）及び（ｂ）は、本発明のウイルスベクターの元になるRNA配列構造の一例を模式的に示す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧの作製手順の概略を示す図である。
【図７】図７は、プラスミドｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬの作製手順の概略を示す図である。
【図８】図８は、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスをそれぞれ感染させた細胞における蛋白質の発現を示す顕微鏡写真の代表例を示す図（左図）及びその時のＧＦＰ陽性数を示す図（右図）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ボルナウイルスベクターに関するものであり、ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むことを特徴とする。かかるウイルスベクターがあれば外来性遺伝子を効率よく導入することができるため、本発明のウイルスベクターとしては、後で公知技術に従って外来性遺伝子を導入することもできることから該遺伝子の導入有無は問わない。また、一般に、ボルナ病ウイルスには各種遺伝子が様々なアライメントで配置されたものが含まれるため、以下に便宜的に、本発明のボルナウイルスベクターに好適なボルナ病ウイルスを用いて本発明を説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
１．ウイルスベクター
本発明の好適なウイルスベクターは、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているものであって、前記（ａ）がボルナ病ウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊される一方で、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるＧ遺伝子の配列が挿入されるものであることに一つの特徴を有する。かかるウイルスベクターのことを、態様Ａのウイルスベクターと記載する。
以下、上記（ａ）の組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを、単に「（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ」ともいう。態様Ａのウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）以外の配列を含んでもよい。
【００２５】
（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ
態様Ａにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ボルナ病ウイルスゲノム（ＢＤＶゲノム）における少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子が、該ＢＤＶゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、該ＢＤＶゲノムにおけるＧ遺伝子が破壊された配列において、外来性遺伝子と前記Ｇ遺伝子とは異なる遺伝子型を有する鳥ボルナウイルスゲノム（ＡＢＶゲノム）のＧ遺伝子（以降、Ｇ’遺伝子と記載することもある）が挿入された配列を有する。
ここで、遺伝子が破壊されたとは、通常、該遺伝子が蛋白質（例えばＧ遺伝子であればＧ蛋白質）をコードすることができる形態では存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。
【００２６】
本発明におけるＢＤＶゲノムとしては、態様Ａにおける場合も含めて、ボルナウイルス科（Bornaviridae）ボルナウイルス属（Bornavirus）哺乳類１ボルナウイルス（Mammalian 1 bornavirus）に属するボルナウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。哺乳類１ボルナウイルス（Mammalian 1 bornavirus）には、ボルナ病ウイルス１（Borna disease virus 1:BoDV-1）、ボルナ病ウイルス２（Borna disease virus 2:BoDV-2）等が含まれる。具体的には、例えば、He80、H1766、StrainV、huP2br等のウイルス株や、No/98、Bo/04w、HOT6の変異株を用いることができる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
Ｈｅ８０；GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
Ｈ１７６６；GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Ｓｔｒａｉｎ  Ｖ；GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J., Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
ｈｕＰ２ｂｒ；GenBank Accession# AB258389, Nakamura,Y., Takahashi,H., Shoya,Y., Nakaya,T., Watanabe,M., Tomonaga,K., Iwahashi,K., Ameno,K., Momiyama,N., Taniyama,H., Sata,T., Kurata,T., de la Torre,J.C., Ikuta,K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
Ｎｏ／９８；GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Ｂｏ／０４ｗ；GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
【００２７】
また、本発明におけるＡＢＶゲノムとしては、態様Ａにおける場合も含めて、ボルナウイルス科（Bornaviridae）ボルナウイルス属（Bornavirus）に属する鳥類に感染するボルナウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。鳥ボルナウイルスは遺伝的多様性に富んでおり、例えば、オウム目１ボルナウイルス（Psittaciform 1 bornavirus）としてオウムボルナウイルス１（Parrot bornavirus 1:PaBV-1）、オウムボルナウイルス２（Parrot bornavirus 2:PaBV-2）、オウムボルナウイルス３（Parrot bornavirus 3:PaBV-3）、オウムボルナウイルス４（Parrot bornavirus 4:PaBV-4）、オウムボルナウイルス７（Parrot bornavirus 7:PaBV-7）等；オウム目２ボルナウイルス（Psittaciform 2 bornavirus）としてオウムボルナウイルス５（Parrot bornavirus 5:PaBV-5）等；スズメ目１ボルナウイルス（Passeriform 1 bornavirus）としてカナリアボルナウイルス１（Canary bornavirus 1:CnBV-1）、カナリアボルナウイルス２（Canary bornavirus 2:CnBV-2）、カナリアボルナウイルス３（Canary bornavirus 3:CnBV-3）等；スズメ目２ボルナウイルス（Passeriform 2 bornavirus）としてカエデチョウボルナウイルス１（Estrildid finch bornavirus 1:EsBV-1）等；水鳥１ボルナウイルス（Waterbird 1 bornavirus）として水鳥ボルナウイルス１（Aquatic bird bornavirus 1:ABBV-1）、水鳥ボルナウイルス２（Aquatic bird bornavirus 2:ABBV-2）等が含まれる。また、前記以外に、オウムボルナウイルス６（Parrot bornavirus 6:PaBV-6）、オウムボルナウイルス８（Parrot bornavirus 8:PaBV-8）、キンバラボルナウイルス１（Munia bornavirus 1:MuBV-1）等を挙げることができる。前記したＡＢＶは、系統的には、オウム目２ボルナウイルス、スズメ目１ボルナウイルス、スズメ目２ボルナウイルス、水鳥１ボルナウイルス、水鳥２ボルナウイルスはClade2に、オウム目１ボルナウイルスはClade3に分類することもできる（Komorizono Rら.  Microbiol Immunol 60:437-441 (2016)参照）。これらのＡＢＶとしては、具体的には、例えば、PaBV-1, PaBV-2, PaBV-3, PaBV-4, PaBV-5, CnBV-1, CnBV-2, EsBV-1, ABBV-1, ABBV-2, MuBV-1等のウイルス株や、これらの変異株を用いることができる。これらのゲノム配列は、例えば、国際塩基配列データベースから以下のアクセッション番号で入手可能である。PaBV-1：GU249595、PaBV-2：EU781967、PaBV-3：FJ169440、PaBV-4：JN014948、PaBV-7：JX065210、PaBV-5：KR612223、CnBV-1：KC464471、CnBV-2：KC464478、CnBV-3：KC595273、EsBV-1：KF680099、ABBV-1：KF680099、ABBV-2：KJ756399、PaBV-6：FJ794743、PaBV-8：KJ950625。
【００２８】
なお、ＢＤＶゲノム及びＡＢＶゲノムは、ボルナウイルスとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（通常１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。
【００２９】
態様Ａにおける組換えＢＤＶゲノムは、前記したＢＤＶゲノムにおいて、少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子が該ＢＤＶゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、Ｇ遺伝子が破壊された配列に、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子と任意の外来性遺伝子が挿入されているのであれば、ＢＤＶゲノムにおけるＭ遺伝子が更に配置されたものであってもよい。その場合、前記Ｍ遺伝子はＢＤＶゲノムにおける順序と同じ順序で配置される。
【００３０】
また、本発明におけるＡＢＶゲノムのＧ遺伝子としては、態様Ａにおける場合も含めて、組換え前のＢＤＶゲノムにおけるＧ遺伝子と遺伝子型が異なるものであればよく、組換え前のＢＤＶゲノムの種類に応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、組換え前のＢＤＶゲノムとしてボルナ病ウイルス１（BoDV-1）のゲノムを用いる場合には、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子としては、Clade2およびClade3のボルナウイルス属に属するＡＢＶのＧ遺伝子を使用できる。具体的には、オウムボルナウイルス２（PaBV-2）のＧ遺伝子、オウムボルナウイルス４（PaBV-4）のＧ遺伝子、オウムボルナウイルス５（PaBV-5）のＧ遺伝子、キンバラボルナウイルス１（MuBV-1）のＧ遺伝子などを１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。また、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子が本来の機能を保持しているのであれば、該Ｇ遺伝子にＢＤＶゲノムにおけるＧ遺伝子の一部が融合したもの（キメラ遺伝子）も用いることができる。
【００３１】
ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子の挿入箇所としては、特に限定されず、例えば、態様Ａの場合、ＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内、組換えＢＤＶゲノムがＢＤＶゲノムにおけるＭ遺伝子を該ＢＤＶゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には、Ｍ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内、ＢＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内などが挙げられる。
【００３２】
本発明における外来性遺伝子は、その種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーをコードするｃＤＮＡ等を用いることができる。本発明のウイルスベクターにおいては、１又は２以上の外来性遺伝子を使用することができる。
【００３３】
外来性遺伝子の挿入箇所としては、特に限定されないが、例えば、態様Ａの場合、ＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に挿入されることが好ましい。また、組換えＢＤＶゲノムがＢＤＶゲノムにおけるＭ遺伝子を該ゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域内に挿入されることが好ましい。外来性遺伝子がこのような箇所に挿入されていることにより、ウイルスベクターの組換えウイルス生産性、すなわち該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの複製効率をより高くすることができるため、効率よく組換えウイルスを産生することができる。また、該ウイルスベクターから産生（複製）される組換えウイルスは、細胞に導入した場合に外来性遺伝子を効率よく発現できるものとなる。従って、本発明のウイルスベクターを細胞に導入した際、又は該ウイルスベクターから産生される組換えＢＤＶ粒子を細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。図２（ａ）に示すように、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいて、Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域（すなわちＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）（例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５〜１８９５（すなわち配列番号１の１８７５〜１８９５番の塩基））には、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５〜１８８２）及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５〜１８９０）が存在する。Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（例えば、配列番号１の塩基の番号で１８７８〜１８９２の間）における外来性遺伝子の挿入部位としては、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及び／又はＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域が好ましく、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域がより好ましく、例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムであれば、配列番号１の塩基の番号で１８９０と１８９１の間等が更に好ましい。なお、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子の挿入箇所と外来性遺伝子の挿入箇所が同じ範囲内となる場合には、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子と外来性遺伝子のいずれが上流にあってもよく、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子、外来性遺伝子の順に、あるいは、外来性遺伝子、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子の順に挿入されることができる。外来性遺伝子が２以上ある場合は、別々に挿入されても、同一箇所に挿入されてもよい。
【００３４】
また、外来性遺伝子の挿入においては、その両側又は片側（好ましくは、両側）に制限酵素サイトを含むことができる。制限酵素サイトを有すると、外来性遺伝子をＢＤＶゲノムの配列中に容易に組み込みやすくなると共に、外来性遺伝子の蛋白質への翻訳効率が上昇するため好ましい。本発明において、外来性遺伝子の両側又は片側に配置することができる制限酵素サイトとしては、例えば、外来性遺伝子の３’末端側については、Ｂｓｔ  ＢＩサイト、Ｐａｃ  Ｉサイト、Ｓｓｅ８３８７  Ｉサイト、Ｓｗａ  Ｉサイト、Ｋｐｎ  Ｉサイト等が挙げられ、Ｂｓｔ  ＢＩサイトが好ましい。外来性遺伝子の５’末端側については、Ｐａｃ  Ｉサイト、Ｂｓｔ  ＢＩサイト、Ｓｓｅ８３８７  Ｉサイト、Ｓｗａ  Ｉサイト、Ｋｐｎ  Ｉサイト等が挙げられ、Ｐａｃ  Ｉサイトが好ましい。
【００３５】
また、態様Ａにおける組換えＢＤＶゲノムがＭ遺伝子を含む場合には、該組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＰ遺伝子のＯＲＦとの間、及び外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＭ遺伝子のＯＲＦとの間にそれぞれ、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（taaaaaaatcgaatca（配列番号９））を含む配列が存在することが好ましい。本発明における組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、例えば、図２（ｂ）にあるような配列で任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。図２（ｂ）には、一例としてＭ遺伝子を含む組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡが示されている。Ｍ遺伝子が削除されている場合にも、図２（ｂ）に示されるように、外来性遺伝子の下流にＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号９）を含む配列を有することが好ましい。Ｍ遺伝子が削除されている場合、図２（ｂ）に示される外来性遺伝子の下流のＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列は、外来性遺伝子の停止シグナル及びＬ遺伝子の開始シグナルとして機能する。なお、図２（ｂ）では、一例として外来性遺伝子の３’末端側にＢｓｔ  ＢＩサイト、外来性遺伝子の５’末端側にＰａｃ  Ｉサイトをそれぞれ挿入した場合を示しているが、外来性遺伝子の両側に配置する制限酵素サイトは、これらに限定されるものではない。
【００３６】
かくして、態様Ａの組換えＢＤＶゲノムにおける各遺伝子の配置を設定することができる。
【００３７】
このような組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとしては、前記したように各遺伝子が配置された配列をコードするｃＤＮＡの他、前記したように各遺伝子が配置された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡ、前記したように各遺伝子が配置された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを用いることができる。以下に、態様Ａの（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの好適態様を図３〜５に模式的に示す。
【００３８】
図３（ａ）は、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域にＧ’遺伝子、外来性遺伝子（図３中ではＧＦＰ）がこの順に挿入された配列を有する組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡである（態様１−１）。図３（ｂ）は、態様１−１においてＭ遺伝子が破壊（削除）された態様を示す（態様１−２）。
【００３９】
図４（ａ）は、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子（図４中ではＧＦＰ）が、Ｍ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内にＧ’遺伝子が挿入された配列を有する組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡである（態様２−１）。図４（ｂ）は、態様２−１においてＭ遺伝子が破壊（削除）された態様であり、この場合、Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域に外来性遺伝子、Ｇ’遺伝子がこの順に挿入された配列を示す（態様２−２）。
【００４０】
図５（ａ）は、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子（図５中ではＧＦＰ）が、Ｌ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内にＧ’遺伝子が挿入された配列を有する組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡである（態様３−１）。図５（ｂ）は、態様３−１においてＭ遺伝子が破壊（削除）された態様を示す（態様３−２）。
【００４１】
なお、天然型ＢＤＶゲノムにおいては、Ｌ遺伝子はＧ遺伝子により分断されているが、態様Ａにおける組換えＢＤＶゲノムにおいてはＧ遺伝子が削除されることもあるため、Ｌ遺伝子のイントロンも削除されて、Ｌ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）が連結されていてもよい。これにより、組換えウイルスの複製能力、すなわち細胞内での外来性遺伝子の発現効率がより向上する。また、Ｌ遺伝子のイントロンを削除することにより、より大きな外来性遺伝子を挿入することが可能となる。Ｌ遺伝子のイントロンの除去は、公知の方法により行うことができる。
【００４２】
また、態様Ａの組換えＢＤＶゲノムにおいてＭ遺伝子が削除されている場合には、天然型ＢＤＶゲノムからＧ遺伝子とＭ遺伝子が削除されることになるため、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの病原性がより低減され、安定性がより高いものとなる。
【００４３】
組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡゲノムから、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、所望の配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することもできる。あるいは、公知のＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により行うことができる。
【００４４】
（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ
リボザイムとしては、（ａ）組換えウイルスのｃＤＮＡから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。（ｂ）としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、１〜数個（数個とは、例えば、１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、更に好ましくは２個である）の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）が好ましい。また、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの上流、すなわち３’末端側に（ｂ１）ＨａｍＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）が配置され、かつ、該（ａ）の下流、すなわち５’末端側に（ｂ２）ＨＤＶＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）配列が配置されていることがより好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
【００４５】
ＨａｍＲｚの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
ＨＤＶＲｚの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A.  Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)等に記載されている。
本発明においては、これらの文献に記載されているＨａｍＲｚの塩基配列をコードするｃＤＮＡ及びＨＤＶＲｚの塩基配列をコードするｃＤＮＡを用いることができる。本発明における好ましいＨａｍＲｚの塩基配列及びＨＤＶＲｚの塩基配列を以下に示す。
ＨａｍＲｚ：
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’
（配列番号２）
ＨＤＶＲｚ：
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
（配列番号３）
【００４６】
（ｃ）プロモーター配列
本発明における（ｃ）プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼＩ系のプロモーター配列、Ｔ７ポリメラーゼ系のプロモーター配列が挙げられる。中でもＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーターが挙げられる。中でも、ＣＡＧＧＳプロモーターが好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
【００４７】
態様Ａのウイルスベクターにおける（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の配置としては、（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていれば特に限定はないが、好ましい態様としては、（ａ）の上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている態様が挙げられる。また、（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターの下流に配置されている態様が挙げられる。またさらに、（ａ）の上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置され、かつ、（ａ）及び（ｂ１）が（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターの下流に配置されている態様が挙げられる。
【００４８】
（ｄ）その他の塩基配列
本発明のウイルスベクターは、態様Ａの場合も含めて、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）以外に、その他の塩基配列として、ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含む場合には、該配列は（ａ）及び（ｂ）の下流に配置されていることが好ましい。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡの複製開始点／プロモーター領域配列の一部としては、ＳＶ４０複製開始点／プロモーター領域内の５’側の１１３塩基からなる断片が好適である。
ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列（配列番号４）は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
【００４９】
本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
【００５０】
本発明のウイルスベクターは、線状ＤＮＡであっても環状ＤＮＡであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、態様Ａのウイルスベクターの必須の配列である上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のＤＮＡ、並びに必要に応じて含まれる上記（ｄ）のＤＮＡが、上述した所定の順番で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。
【００５１】
２．ウイルスベクターの作製方法
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。具体的には、例えば、態様Ａのウイルスベクターの場合、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、ＣＡＴ遺伝子をＢＤＶのゲノム配列に置き換え、さらにＰ遺伝子の下流に連結する非翻訳領域（Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）内に目的とする外来性遺伝子を挿入して得られたウイルスベクターを鋳型にして、ＰＣＲ等によりＧ遺伝子に欠損変異等を挿入することで、Ｇ遺伝子が欠損したウイルスベクター（Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターともいう）を作製する。ついで、得られたＧ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターの所望の領域に、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型（持続感染型）のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターとしては、例えば、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を外来性遺伝子の上流に挿入した場合、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子と外来性遺伝子をこの順に挿入した組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ（例えば、図３（ａ）に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのｃＤＮＡ）を有するものである。なお、Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターの作製において、好ましくは、Ｌ遺伝子のイントロン部分も同様にＰＣＲにより削りとることができる。また、Ｍ遺伝子についても、同様に、Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを鋳型にＰＣＲ等により欠損させて作製することができる（Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターともいう）。
【００５２】
ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ領域、（ｃ）プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で１箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。
【００５３】
本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型ＢＤＶゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを有する組換え型ＢＤＶである。
【００５４】
３．組換えウイルス
上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含む組換えウイルスも、本発明の１つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びに態様Ａのウイルスベクターを用いた場合はＢＤＶのＮ蛋白質、ＢＤＶのＰ蛋白質、ＢＤＶのＬ蛋白質及びＡＢＶのＧ蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えＢＤＶゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりＢＤＶのＭ蛋白質を有していてもよい。
【００５５】
本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。また、本発明においては、例えば、態様Ａのウイルスベクターを用いて組換えウイルスとして上記した組換えＢＤＶゲノムを含むものが産生されるのであれば、組換えＢＤＶゲノムにおける各遺伝子を個別にヘルパープラスミドにより導入して産生してもよい。例えば、ヘルパープラスミドとして、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドを用いることができる。すなわち、上記ウイルスベクターとして、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を組み入れる前のＧ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群とＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。このような組換えウイルスの作製方法も、本発明の１つである。このような方法により、in vitroで組換えウイルスを産生することができる。ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入するin vitroの細胞は、通常、培養細胞である。
【００５６】
また、態様ＡのウイルスベクターにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、更に、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入することが好ましい。すなわち、Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いる場合には、上記ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、あるいは、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群とＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドと共に、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することができる。
【００５７】
ヘルパープラスミドは、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＭ遺伝子、並びにＡＢＶゲノムのＧ遺伝子それぞれを発現することができるものであればよく、これらの遺伝子の２つ以上が１つのプラスミドに含まれていてもよく、これらの遺伝子がそれぞれ別のプラスミドに含まれていてもよい。例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド又はプラスミド群等が好適に用いられる。また、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドとしては、下記（１）〜（４）において各項の１又は２以上のプラスミドにＡＢＶゲノムのＧ遺伝子が適宜組み込まれたものであっても、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を個別に発現するプラスミドであってもよい。本発明で用いられるヘルパープラスミドとしては、（１）〜（３）のいずれかのプラスミド（群）とＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドのセット、あるいは（１）〜（３）に記載のいずれかのプラスミドにＡＢＶゲノムのＧ遺伝子が組み込まれたプラスミドを含む（１）〜（３）のいずれかのプラスミド（群）が好ましい。
（１）ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶゲノムのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶゲノムのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶゲノムのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
【００５８】
また、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミドとしては、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドの他、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子とＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。
【００５９】
ヘルパープラスミドは、組換えＢＤＶゲノムの複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある組換えウイルスを産生することができる。また、本発明の組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びその好ましい態様としては、上述したのと同様である。
【００６０】
本発明におけるヘルパープラスミド（群）は、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現することができるものであればよい。例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶゲノムのＮ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶゲノムのＰ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶゲノムのＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶゲノムのＬ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＡＢＶゲノムのＧ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶゲノムのＭ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。また、２以上の遺伝子を発現するプラスミドは、プロモーター配列の下流に所望の遺伝子のｃＤＮＡを所望の順で配置されたプラスミドを用いることができる。
【００６１】
また、外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質は、通常膜貫通型蛋白質であり、そのアミノ酸配列中に、細胞外に位置する領域（細胞外配列）、細胞膜貫通領域（細胞膜貫通配列）、及び細胞内に位置する領域（細胞内配列）を含む。本発明においては、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子としては、ＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列、細胞膜貫通配列及び細胞外配列を有するものが好ましいが、少なくとも、ＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列を含むものであればよい。細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする外殻遺伝子をヘルパープラスミドに用いると、遺伝子が由来するウイルスの種類により、産生されるウイルスの細胞指向性を変化させることができる。よって、本発明においては、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、本発明の効果を損なわない範囲内で、その他の外殻遺伝子を発現するものであってもよい。具体的には、例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等の宿主細胞膜を外殻として利用する全てのエンベロープウイルスの外殻遺伝子の他、ＢＤＶもしくはカワリリスボルナウイルス（VSBV-1）のＧ遺伝子の一部が含まれていてもよい。また、例えば、上皮系、呼吸器系細胞等に組換えウイルスを感染させる場合には、上皮系、呼吸器系細胞等への指向性が高いウイルス（例えば麻疹ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス等）の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＡＢＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いることが好ましい。
【００６２】
ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｐ遺伝子のｃＤＮＡ及びＬ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子のｃＤＮＡは、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子の配列情報の他、公知の外殻遺伝子の配列情報に基づいて調製することができる。ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子の配列情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡから、配列逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＲＮＡの配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００６３】
ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＭ遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C.  Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子としては、例えば、上述した国際塩基配列データベースから以下のアクセッション番号：PaBV-1：GU249595、PaBV-2：EU781967、PaBV-3：FJ169440、PaBV-4：JN014948、PaBV-7：JX065210、PaBV-5：KR612223、CnBV-1：KC464471、CnBV-2：KC464478、CnBV-3：KC595273、EsBV-1：KF680099、ABBV-1：KF680099、ABBV-2：KJ756399、PaBV-6：FJ794743、PaBV-8：KJ950625に記載されている配列の遺伝子をそれぞれ用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、ＢＤＶゲノムのＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ蛋白質、あるいはＡＢＶゲノムのＧ蛋白質それぞれで保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知の各遺伝子の配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＲＴ−ＰＣＲによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明における各遺伝子は該遺伝子にコードされる蛋白質が、それぞれ該当する蛋白質が元来有する機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。
【００６４】
このようなＮ遺伝子として、例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＮ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶゲノムのＮ遺伝子として使用できる。また、ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＰ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶゲノムのＰ遺伝子として使用できる。ＢＤＶゲノムのＬ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＬ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶゲノムのＬ遺伝子として使用できる。ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＧ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＡＢＶゲノムのＧ遺伝子として使用できる。ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＭ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶゲノムのＭ遺伝子として使用できる。配列同一性は、CLUSTAL W ，GCG program, GENETYX，BLAST searchにより決定される。
【００６５】
水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等のＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子として、例えば、水疱性口内炎ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ,Ｎｏ：Ｊ０２４２８．１、狂犬病ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ，Ｎｏ：ＡＢ０４４８２４．１に記載されている配列の遺伝子等を用いることができる。好ましくは、これらの外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列を用いる。外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列は、Garry CE, Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene). Virol J. 145(6), Sep-18(2009)等に記載されている。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、このような外殻遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつ外殻蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるウイルスの外殻遺伝子として使用できる。
【００６６】
ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のｃＤＮＡが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターが好ましい。
【００６７】
これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶゲノムのＬ遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。
【００６８】
２以上の遺伝子を発現するプラスミドとして、例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、具体的には、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶゲノムのＰ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶゲノムのＬ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ただし、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡ領域とＬ遺伝子又はＰ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された領域との間の領域にＬ遺伝子又はＰ遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。
【００６９】
ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するプラスミドは、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子又はＰ遺伝子を発現するヘルパープラスミドの作製において、例えば、ＢＤＶゲノムのＮ遺伝子のｃＤＮＡの代わりにＡＢＶゲノムのＧ遺伝子のｃＤＮＡを用いることによって作製することができる。また、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドにＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現させてもよく、当該プラスミドは、例えば、ｐＥＦ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ、Ｂ，and C(Invitrogen)に添付の説明書に記載されている方法に従って作製することができる。
【００７０】
ＡＢＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、例えば、ＡＢＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なって、任意のウイルス外殻遺伝子の細胞内配列をコードする配列をＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換することにより作製することができる。このようなヘルパープラスミドは、例えば、ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列をＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換してもよく、ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列としては、例えば配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムでは３７１２〜３７４７番目の配列（配列番号１の３７１２〜３７４７番目の塩基）である。
【００７１】
上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。
【００７２】
ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ＤＮＡ濃度として約０．２５〜２．０μｇ／μＬのウイルスベクターを含むことが好ましい。
【００７３】
ベクター組成物中の例えば、各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター１μｇに対して約０．０１２５〜０．１２５μｇとすることが好ましい。
【００７４】
上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをin vitroで細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター１μｇに対して通常約１×１０３〜１×１０７個、好ましくは約１×１０４〜１×１０７個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。
【００７５】
ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における組換えウイルスを産生することができる哺乳類の培養細胞等であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞が挙げられる。
【００７６】
Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いる場合には、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に、所望の外殻遺伝子を発現する各種プラスミドを用いて、該外殻遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に記載された方法に従って、該プラスミド内に該外殻遺伝子を導入することにより製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、上述したＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するヘルパープラスミドも好適に用いることができる。また、Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いる場合には、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に同様の方法で前記遺伝子を導入することにより製造される。
【００７７】
次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる。組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、２９３Ｔ細胞又はＢＨＫ細胞を用いる場合は、通常約３６〜３７℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグル培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約２４〜９６時間、好ましくは約３６〜４８時間とする。
【００７８】
上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶゲノムのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質、Ｌ蛋白質及びＡＢＶゲノムのＧ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶゲノムのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質、Ｌ蛋白質及びＡＢＶゲノムのＧ蛋白質に加えて、ＢＤＶゲノムのＭ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。
【００７９】
ウイルスベクターを導入した細胞において組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてＢＤＶゲノムが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ラットグリア由来Ｃ６細胞、ヒトグリア由来ＯＬ細胞などに感染をさせることで確認される。組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
【００８０】
本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して組換えウイルスを産生させた後、効率よく組換えウイルスを増殖させるために、該組換えウイルスを産生した細胞（例えば、２９３T細胞、ＢＨＫ細胞）を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等が好適である。組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、組換えウイルスを産生した細胞１個に対して増殖速度の速い細胞を通常０．１〜１０個程度、好ましくは０．２〜２個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞を用いる場合には、培養温度を通常約３６〜３７℃とし、ダルベッコ変法イーグル培地で通常３日〜５週間程度、好ましくは３日〜３週間程度培養を行なう。
【００８１】
Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するヘルパープラスミドにより外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。さらに、Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、ＡＢＶゲノムのＧ遺伝子とＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等に、前記遺伝子を発現するプラスミドを用いて該遺伝子を導入することにより作製することができる。前記遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に所望の遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このようなプラスミドとしては、上述したＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するヘルパープラスミド、ＢＤＶゲノムのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。
【００８２】
本発明の作製方法においては、細胞に組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを精製する工程を行うことが好ましい。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。
【００８３】
例えば、組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離（例えば、４℃、８００ｇで１０分間程度）等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、０．２２μｍ又は０．４５μｍのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。また、この組換えウイルスを含む上澄みを公知の手法により濃縮して用いることもできる。
生体細胞（動物個体中の細胞）に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
【００８４】
４．外来性遺伝子の導入方法
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の１つである。
【００８５】
組換えウイルスを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトが更に好ましい。組換えウイルスを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。また、ＢＤＶは神経系細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経系細胞が好ましく、中でも、脳神経系細胞がより好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経系細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。哺乳類の脳神経系細胞としては、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞胞等が挙げられる。哺乳類の脳神経細胞の培養細胞としては、ＯＬ、Ｃ６、Ｕ３７３、Ｎ２a、Ｎ１８、ＰＣ１２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞等が好適である。
【００８６】
Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶのウイルスベクター及びＡＢＶゲノムのＧ遺伝子を発現するヘルパープラスミドとして他のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて産生された組換えウイルスは、該外殻遺伝子が由来するウイルスの種類に応じた感染指向性を示す。例えば、ヘルパープラスミドにおいてＡＢＶ以外のウイルスの外殻遺伝子（好ましくは、ＡＢＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＡＢＶゲノムのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子）を使用した場合、得られる組換えウイルスは、該ウイルスが感染指向性を示す細胞に好適に感染させることができるものである。
【００８７】
組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル培地等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞等であれば、通常ＭＯＩ(multiplicity of infection、感染価)約０．０１〜１０(細胞１個に対してウイルス粒子０．０１から１０個が感染する量)、好ましくはＭＯＩ約１〜１０となるようにする。この希釈液を用いて、組換えウイルスを細胞に感染させる。
【００８８】
組換えウイルスを生体細胞（動物）に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させることが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価（focus-forming unit (FFU)）を約１×１０-１〜１×１０９ＦＦＵとして個体に接種することが好ましい。また、組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに接種する際には、ウイルス力価を通常約１×１０-１〜１×１０７ＦＦＵとすることが好ましい。イヌ又はネコ、ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０〜１×１０８ＦＦＵとすることが好ましく、ウシ又はウマに接種する際には、ウイルス力価を通常１×１０５〜１×１０１２ＦＦＵとすることが好ましい。ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１×１０５〜１×１０９ＦＦＵとすることが好ましい。また、組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、後述する外来性遺伝子導入剤も好適に用いることができる。
【００８９】
例えば、哺乳類の脳神経系細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等の動物実験において脳神経系細胞に感染させる場合には、動物の脳内に組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では１回につき通常約５μＬ〜１ｍＬ、脳内接種では１回につき通常約１〜５０μＬ接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、１回につき通常約５〜２００μＬ、好ましくは約１０〜１００μＬ接種する。
【００９０】
脳神経細胞以外の生体細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を非経口投与することが好ましい。例えば、哺乳類の腹腔内、血管内、筋肉内等に接種する方法等が好適である。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約１×１０-１〜１×１０９ＦＦＵとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば１回につき通常約５〜５００μＬ、好ましくは約２０〜２００μＬ接種する。
【００９１】
５．外来性遺伝子導入剤
（１）上記ウイルスベクター、（３）上記組換えウイルス又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の１つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞（動物）に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。
【００９２】
本発明の外来性遺伝子導入剤の好ましい態様の１つは、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤である。脳神経系細胞としては、哺乳類の脳神経系細胞が好ましく、例えば、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞等が挙げられる。本発明の外来性遺伝子導入剤は、さらに、神経疾患治療剤等の他の薬剤等を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。本発明の外来性遺伝子導入剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。
【００９３】
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、組換えウイルスを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質；アミノデキストラン等のポリサッカライド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００９４】
本発明の外来性遺伝子導入剤に含まれる組換えウイルスの量は、外来性遺伝子導入剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約０．０００１〜１００ｗ／ｖ％の範囲から適宜選択して決定することができる。外来性遺伝子導入剤の投与方法及び投与量は、上述した外来性遺伝子の導入方法における方法及び組換えウイルスの投与量と同様である。本発明の外来性遺伝子導入剤は、例えば、動物の脳神経系疾患治療、Ｃ型肝炎等の慢性肝疾患、抗腫瘍薬及びワクチン等のための遺伝子デリバリー用組成物として有用である。本発明の外来性遺伝子導入剤の投与対象は、上述した哺乳動物が好適である。
【００９５】
６．ウイルスベクターの利用
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質（例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等）の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
【００９６】
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、日本脳炎等のウイルス性脳炎の治療又は予防にも使用できる。また、実験動物、伴侶動物又は生産動物の脳神経系疾患、例えば、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）、狂犬病等にも好適に使用できる。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。伴侶動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。生産動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。
【００９７】
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、脳神経科学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、本発明のウイルスベクターは、機能性ＲＮＡ分子を発現できるＲＮＡウイルスベクターとしても有用であり、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子としてｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡをコードする配列を用いると、所望の細胞においてこれらの機能性ＲＮＡ分子を発現させることができる。本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを用いると、脳内において一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現させることもできる。
【００９８】
また外殻蛋白質を他のウイルス由来のものにすることで、腫瘍細胞に特異的に感染するウイルスベクター又は組換えウイルスに改良し、腫瘍細胞に薬剤遺伝子や過剰に発現した遺伝子を抑えるｓｉＲＮＡを導入すること等で、抗腫瘍ウイルスベクターとしても利用可能である。さらに、外来性遺伝子としてＨＩＶ、インフルエンザウイルス等に対する中和活性をもつ遺伝子(例えば、HIVのenv、gag等；インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子等)等を導入することで、本発明のウイルスベクター又は組換えウイルスを組換えワクチンに利用することも可能である。そして、HCV等の慢性経過をたどる感染症に対しては、標的となるウイルスのゲノムに対するsiRNAを導入することで、機能性ＲＮＡを利用した感染症に対する新たな治療法の開発にも有効である。
【００９９】
また、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを、様々な細胞由来の幹細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞、そして癌幹細胞に感染させることにより、前記した疾患の治療に利用可能な安全な細胞集団を取得することができる。
【０１００】
上記ウイルスベクターを含有する外来性遺伝子導入用キットも、本発明の１つである。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０２】
＜実施例１＞
１．プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドｐＣＡＧ−ＨＲ−ＳＶ３を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのＨｅ／８０株のゲノムの配列（配列番号１）に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
【０１０３】
サイトメガウイルス（ＣＭＶ）由来のＢＤＶミニゲノムベクター（ｐＣＭＶ−ＨＲ）を得るために、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027）及びＢＤＶの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)）をアニールし、ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社、San Diego， CA）のKpnI及びXhoIサイトに連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨｄＲｚ）と融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲと、ＢＤＶ  Ｈｅ／８０株のゲノムをコードするｃＤＮＡクローンを挿入してプラスミドｐｃ−ＨＲを得た。なお、ＨｄＲｚと融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲは、プラスミドｐｈｕＰｏｌ  Ｉ−ＭＧ（Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104）から増幅した。最後に、ｐｃ−ＨＲのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）のBamHI及びXbaIサイトに挿入することによって、ｐＣＭＶ−ＨＲを作製した。
【０１０４】
ＣＡＧ（Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体）由来のＢＤＶミニゲノムベクターｐＣＡＧ−ＨＲは、ＣＡＧプロモーターをpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクローニングすることによって得た（ｐＢＳ−ＣＡＧ）。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスＩＥエンハンサーにニワトリβ−アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。ｐＣＭＶ−ＨＲのＨａｍＲｚとＨｄＲｚの配列にまたがる領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧのSalI及びEcoRIサイトの平滑末端に挿入した。
【０１０５】
次に、ＳＶ４０開始点／プロモーター内の５’側の１１３塩基からなる断片（ＳＶ３領域）を、ＰＣＲ（Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA）によってｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech社製）から増幅し、ｐＣＡＧ−ＨＲのＮｏｔＩサイトに挿入した。これにより、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔを得た。
【０１０６】
２．Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にＧＦＰを挿入したＢＤＶゲノムプラスミド（ｐＣＡＧ−Ｆｃt−Ｐ／Ｍ−ＧＦＰ）の作製
Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍを作製した。
Ａ）上記１で作製したｐＣＡＧ−Ｆｃｔ（ボルナウイルスのＨｅ８０株のｃＤＮＡ（配列番号１）がクローニングされているプラスミド）を鋳型に、ＥｃｏＴ２２ＩからＢｓｔ１１０７Ｉサイトまでの領域をプライマー１及び４、並びにプライマー２及び３を用いてそれぞれＰＣＲで増幅した。その後、両方のＰＣＲ産物を０．５μＬずつ混合し、プライマー１及び２にて再度増幅し、Ｐ−Ｍ遺伝子間にＢｓｔＢＩサイト及びＰａｃＩサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
Ｂ）Ａ）のＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢｓｔ１１０７Ｉを用いてｐＣＡＧ−Ｆｃｔへと組込み、ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍを完成させた。
Ｃ）ＢｓｔＢＩとＰａｃＩを用いてＧＦＰを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍ−ＧＦＰを完成させた。
（プライマー）
プライマー１：5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3（配列番号５）
プライマー２：5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3（配列番号６）
プライマー３：5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3（配列番号７）
プライマー４：5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3（配列番号８）
【０１０７】
３．Ｇ遺伝子を欠損させたＢＤＶゲノムプラスミド（ｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬ）の作製
上記で作製したｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍ−ＧＦＰを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるＧ遺伝子をＰＣＲを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、Ｇ遺伝子に存在する２つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号（すなわち配列番号１の塩基）2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図６に、Ｇ遺伝子欠損型ＢＤＶウイルスをコードするプラスミドであるｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧの作製手順の概略を示す。先ずｐ／ｍＧＦＰを鋳型に表１に示す配列のプライマーＡ１及びＢ１、並びにプライマーＣ１及びＤ１を用いてＰＣＲ（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃  0.5又は1分を25サイクル）を行った（図６（ａ））。
【０１０８】
次に双方の増幅産物(１ｓｔＰＣＲ産物)を鋳型に、上記のプライマーＡ１及びＤ１を用いて再びＰＣＲ（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃  1.5分を25サイクル）を行った（図６（ｂ））。増幅産物（２ｎｄＰＣＲ産物）はＧ遺伝子のメチオニンがスレオニンへと変異しており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるｐ／ｍＧＦＰと組換えて（図６（ｃ））、ｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧを得た。
【０１０９】
さらに、不要になったＬ遺伝子イントロン領域（本来この部分はＧ遺伝子の領域）を削りＬ遺伝子を直結した(L linearize)。具体的な方法として、制限酵素サイトBst1107I（配列番号１の2166〜2171番目の塩基配列）からＬ遺伝子のエクソン前半部までとＬ遺伝子のエクソン後半部(NheIサイト（配列番号１の6158〜6163番目の塩基配列）まで)をそれぞれ増幅し両者を結合させてｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧに組込んだ。この手順の概略を、図７に示す。先ず、表１に示すプライマーＡ１及びＥ１、並びに及びプライマーＦ１及びＤ１を用いてｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧを鋳型にＰＣＲ（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃  0.5分を25サイクル）を行った（図７（ａ））。次に双方の増幅産物(１ｓｔＰＣＲ産物)を鋳型にプライマーＡ１及びＤ１を用いてＰＣＲ（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃  1分を25サイクル）を行った（図７（ｂ））。増幅産物（２ｎｄＰＣＲ産物）は、Ｌ遺伝子のイントロン部分が削除されており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧと組換えて、ｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを得た（図７（ｃ））。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
４．ＡＶＢのＧ遺伝子を挿入させたＢＤＶゲノムプラスミド（ｐ／ｍ  ＰａＢＶ４Ｇ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬ）の作製
上記で作製したｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを元に、Ｐ遺伝子とＧＦＰ遺伝子の間に、Ｓ３とＴ２の配列と、外来遺伝子挿入カセットとしてSse8387IとAscI、AsiSI、SwaIサイトを挿入したｐ／ｍ  ｔａｎｄｅｍ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを作製した。
Ｓ３：5-TAAAAAAATCGAATCA-3（配列番号１６）
Ｔ２：5-TAAAAAAA-3（配列番号１７）
【０１１２】
次にｐ／ｍ  ｔａｎｄｅｍ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬの挿入カセットに、ＰａＢＶ−４のＧ遺伝子のｃＤＮＡを挿入したｐ／ｍ  ＰａＢＶ４Ｇ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを作製した。ＰａＢＶ−４のＧ遺伝子のｃＤＮＡを鋳型にプライマー５及び６を用いてＰＣＲ（98度  10秒、55度  5秒、72度  10秒、30サイクル）をおこなった。ＰＣＲ産物をAscI及びAsiSIを用いてｐ／ｍ  ｔａｎｄｅｍ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬと組換えて、ｐ／ｍ  ＰａＢＶ４Ｇ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを得た（図３（ａ））。
プライマー５：5’-AAAGGCGCGCCATGCTGCATTCAACGTATTCTCGTT-3’（配列番号１８）
プライマー６：5’-AAAGCGATCGCTTATTCCGACCACCTTCCGAG-3’ （配列番号１９）
【０１１３】
５．ヘルパープラスミドの作製
ヘルパープラスミド、すなわちＢＤＶゲノムのＮ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＮ）、ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子発現プラスミド（ｐＣＸＮ２−Ｐ）及びＢＤＶゲノムのＬ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＬ）を以下の手順で作製した。
ｐｃＮは、ｐＨＡ−ｐ４０Ｎプラスミド（Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001))からＮ遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧ（上述）へと挿入することで作製した。
ｐＣＸＮ２−Ｐは、ｐｃＤ−Ｐ（Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003)）からゲル抽出した断片をｐＣＸＮ２（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199）のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
ｐｃＬについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。
【０１１４】
６．組換えウイルスの作製
ｐ／ｍ  ＰａＢＶ４Ｇ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬ及びヘルパープラスミド（Ｎ遺伝子発現プラスミド、Ｐ遺伝子発現プラスミド及びＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２−Ｐ及びｐｃＬ）を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)又Lipofectamine（登録商標）2000（Invitrogen社）を用いて２９３Ｔ細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、１×１０４〜１×１０６の細胞（２９３Ｔ細胞）に対して、ｐ／ｍ  ＰａＢＶ４Ｇ  ＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬを１〜４μｇ使用し、ｐｃＮ（０．１２５〜０．５μｇ）、ｐＣＸＮ２−Ｐ（０．０１２５〜０．０５μｇ）、ｐｃＬ（０．１２５〜０．５μｇ）の割合でヘルパープラスミドを加えた。
【０１１５】
ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをLipofectamine(商標登録)2000（Invitrogen社）を用いて２９３Ｔ細胞へ導入した。遺伝子導入後、３７℃で培養し、遺伝子導入３日後に細胞を継代し、その際にVero細胞と共培養を行った後、該Vero細胞をPaBV-4G発現キメラウイルス感染Vero細胞として回収した。
【０１１６】
培養細胞への感染後、４８時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスベクターの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法又は上清中のウイルス力価をVero細胞へ継代することにより調べたところ、感染後２４時間後よりウイルスの産生が観察され始めることが確認された。
【０１１７】
＜実施例２＞
シュードタイプウイルスの回収
上記で作製したｐ／ｍＧＦＰ  ΔＧ  ＬＬ及びヘルパープラスミド（Ｎ遺伝子発現プラスミド、Ｐ遺伝子発現プラスミド及びＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２−Ｐ及びｐｃＬ）を用いて、実施例１を参照にしてＧ遺伝子欠損組換えＢＤＶ細胞を取得した。得られた細胞を10cmシャーレに播種し（3.0×106cells）、10 μgのＧ蛋白質発現プラスミドをTransIT（登録商標）-293 (TaKaRa)を用いて導入した。Ｇ蛋白質発現プラスミドには、Variegated squirrel bornavirus（VSBV）、Parrot bornavirus 4（PaBV-4）、Parrot bornavirus 5（PaBV-5）、Munia bornavirus 1（MuBV-1）のＧ蛋白質を用いた。プラスミドを導入した細胞を、３７℃でウシ胎児血清（ＦＣＳ）を10％含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。４８時間後に細胞をＤＭＥＭで2回洗浄した後、1.2 mLのＤＭＥＭを加え、シャーレを−８０℃に一時間静置した。−８０℃と室温での凍結融解を2度おこない、シャーレ中の培養液を回収した。回収した培養液を3,000 rpm、４℃で５分間遠心し、上清をシュードタイプウイルス溶液として用いた。
【０１１８】
上記の方法で回収したシュードタイプウイルスをVero細胞へ接種した。接種後４日で該Vero細胞を蛍光顕微鏡で観察した像が図８左図である。この時のGFP陽性数（相対値）をグラフにしたのが図８右図である。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的にかつ効率的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがＲＮＡであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、本発明のウイルスベクターはボルナ病ウイルスを利用するものであるが、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を脳神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができるため有用である。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。従って、本発明は、医療、動物医療、治験、研究等の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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