(57)【要約】      （修正有）【課題】多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法。【解決手段】多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞であり、分化細胞が、心筋細胞である製造方法に関し、ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる分化細胞を含有する細胞集団を培養し、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程を含む、製造方法。前記ポリフェノール化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体から選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物であり、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物である、製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、
ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。
【請求項２】
前記ポリフェノール化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリフェノール化合物が、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ポリフェノール化合物が、下記一般式（１）又は（２）を有する、請求項１に記載の製造方法
【化１】
2018074983.tif 000012
【化２】
2018074983.tif 000013
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１２は、水酸基、アルコキシ基又はエステル基を表わし、Ａは、カルボニル基、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わし、かつ実線と破線とからなる二重線は、単結合又は二重結合を表わす）。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記人工多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記分化細胞が、心筋細胞である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減するために用いられる組成物であって、ポリフェノール化合物を含有する、組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団について、研究開発が盛んに行われている。これらの細胞集団（多能性幹細胞加工製品）は、医薬（細胞医薬品）として、あるいは創薬や発生等における研究ツールとしての有用性が注目されている。医薬として利用される場合はヒトの細胞が主に用いられるが、研究ツールとして利用する場合は特にヒト細胞に限定されず、幅広い生物由来の細胞が用いられている。目的に応じて、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞が幅広く利用されている。
【０００３】
しかし、これらの分化誘導細胞集団においては、未分化な状態のままの多能性幹細胞の残存及び混入が避けられない。いずれの目的で利用するにせよ、分化誘導細胞の純度は高いほうが好ましいため、この点は問題となる。特に、多能性幹細胞を用いる場合、未分化のままでは造腫瘍性を有するなど、分化誘導細胞集団に未分化多能性幹細胞が混入していると、医薬として用いる場合、安全面のリスクを伴う。
【０００４】
そのため、分化誘導細胞集団の純度をより向上させる技術が種々提案されている。これらの技術は、主に分化誘導効率を向上させる技術群と、分化誘導細胞を純化・精製する技術群とに大別される。後者としては、分化誘導細胞を選択的に選り分ける技術（ポジティブセレクション）と、不可避的に混入する未分化多能性幹細胞を除去する技術（ネガティブセレクション）とにさらに分けられる。分化誘導細胞を純化・精製する技術として提案されているものを手法の違いによって整理すると、以下の通りとなる。
【０００５】
例えば、特殊培地を用いたアプローチとして、メチオニン（−）培地を利用する方法（非特許文献１及び２）、及び無糖培地を利用する方法（非特許文献３及び４）等が提案されている。また、ＦＡＣＳソーティングを用いたアプローチとして、抗ＳＳＥＡ−５抗体によるパージング（非特許文献５）、糖鎖抗体（レクチン）を用いたパージング（非特許文献６）、及び抗ＣＤ３０抗体結合薬剤を用いた方法（特許文献１）が提案されている。さらに、低分子化合物を用いたアプローチとして、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ阻害剤を利用する方法（非特許文献７）、塩化ケレリトリン、コーヒー酸、イベルメクチンを利用する方法（特許文献２）、スタチン類を利用する方法（特許文献３、４）、３，４−ジヒドロキシベンジルアミン誘導体を利用する方法（非特許文献８）、ＢＥＴ阻害剤であるＪＱ１を利用する方法（特許文献１）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０７２５１９号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０７８１５３号
【特許文献３】国際公開第２０１３／１０００８０号
【特許文献４】特開２０１６−９３１７８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Matsuura K, Kodama F, Sugiyama K, Shimizu T, Hagiwara N, Okano T. Elimination of remaining undifferentiated iPS cells in the process of human cardiac cell sheet fabrication using a methionine-free culture condition. Tissue Eng Part C Methods. 2014 Sep 23. [Epub ahead of print]
【非特許文献２】Shiraki N, Shiraki Y, Tsuyama T, Obata F, Miura M, Nagae G, Aburatani H, Kume K, Endo F, Kume S. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metab. 2014 May 6;19(5):780-94.
【非特許文献３】Tohyama S, Hattori F, Sano M, Hishiki T, Nagahata Y, Matsuura T, Hashimoto H, Suzuki T, Yamashita H, Satoh Y, Egashira T, Seki T, Muraoka N, Yamakawa H, Ohgino Y, Tanaka T, Yoichi M, Yuasa S, Murata M, Suematsu M, Fukuda K. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 2013 Jan 3;12(1):127-37.
【非特許文献４】Hemmi N, Tohyama S, Nakajima K, Kanazawa H, Suzuki T, Hattori F, Seki T, Kishino Y, Hirano A, Okada M, Tabei R, Ohno R, Fujita C, Haruna T, Yuasa S, Sano M, Fujita J, Fukuda K. A Massive Suspension Culture System With Metabolic Purification for Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 2014 Oct 29. pii: sctm.2014-0072. [Epub ahead of print]
【非特許文献５】Onuma Y, Tateno H, Hirabayashi J, Ito Y, Asashima M. rBC2LCN, a new probe for live cell imaging of human pluripotent stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 15;431(3):524-9.
【非特許文献６】Lee MO, Moon SH, Jeong HC, Yi JY, Lee TH, Shim SH, Rhee YH, Lee SH, Oh SJ, Lee MY, Han MJ, Cho YS, Chung HM, Kim KS, Cha HJ. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 27;110(35):E3281-90.
【非特許文献７】Tang C, Lee AS, Volkmer JP, Sahoo D, Nag D, Mosley AR, Inlay MA, Ardehali R, Chavez SL, Pera RR, Behr B, Wu JC, Weissman IL, Drukker M. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat Biotechnol. 2011 Aug 14;29(9):829-34.
【非特許文献８】Mark Richards, Chee Wee Phoon, Gwendoline Tze Wei Goh, Eng Khuan Send, Xu Ming Guo, Cherine Mei Fong Tan, Woon-Khiong Chan, Joel Mun Kin Lee. A new class of pluripotent stem cell cytotoxic small molecules. PLoS One 2014 Mar 19; 9(3): 1-14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を、従来の方法よりも効率的に低減できることを見出した。本発明は、以下の態様を含む。
【００１０】
項１．
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、
ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。
項２．
前記ポリフェノール化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物である、項１に記載の製造方法。
項３．
前記ポリフェノール化合物が、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物である、項１に記載の製造方法。
項４．
前記ポリフェノール化合物が、下記一般式（１）又は（２）を有する、項１に記載の製造方法
【化１】
2018074983.tif 000002
【化２】
2018074983.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１２は、水酸基、アルコキシ基又はエステル基を表わし、Ａは、カルボニル基、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わし、かつ実線と破線とからなる二重線は、単結合又は二重結合を表わす）。
項５．
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
項６．
前記人工多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、項５に記載の製造方法。
項７．
前記分化細胞が、心筋細胞である、項５に記載の製造方法。
項８．
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減するために用いられる組成物であって、ポリフェノール化合物を含有する、組成物。
項９．
項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、細胞集団。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来のものよりも純度の高い分化誘導細胞集団を利用することができ、造腫瘍性等の副作用がより低減された医薬や、より精度の高い研究ツール等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】iPS細胞（253G1株）に対するレスベラトロールの作用（濃度依存性）を示すグラフである。
【図２】iPS細胞に対するレスベラトロールの作用（経時変化）を示すグラフである。
【図３】皮膚線維芽細胞（NHDF）に対するレセスベラトロールの作用を示すグラフである。
【図４】レスベラトロール処理（７２、９６時間）による未分化細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図５】レスベラトロール処理（７２、９６時間）による心筋細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図６】レスベラトロール処理（７２、９６時間）による回収細胞数の変化を示すグラフである。
【図７】レスベラトロール処理（７２、９６時間）による回収心筋細胞数の変化を示すグラフである。
【図８】iPS細胞に対するエピガロカテキンガラートの作用（濃度依存性）を示すグラフである。
【図９】皮膚線維芽細胞に対するエピガロカテキンガラートの作用（濃度依存性）を示すグラフである。
【図１０】エピガロカテキンガラート処理（９６時間）による未分化細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図１１】エピガロカテキンガラート処理（９６時間）による心筋細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図１２】エピガロカテキンガラート処理（９６時間）による回収細胞数の変化を示すグラフである。
【図１３】エピガロカテキンガラート処理（９６時間）による回収心筋細胞数の変化を示すグラフである。
【図１４】エピガロカテキン処理（９６時間）による未分化細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図１５】エピガロカテキン処理（９６時間）による心筋細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図１６】エピガロカテキン処理（９６時間）による回収細胞数の変化を示すグラフである。
【図１７】エピガロカテキン処理（９６時間）による回収心筋細胞数の変化を示すグラフである。
【図１８】iPS細胞に対するクェルセチンの作用（濃度依存性）を示すグラフである。
【図１９】皮膚線維芽細胞に対するクェルセチンの作用（濃度依存性）を示すグラフである。
【図２０】クェルセチン処理（９６時間）による未分化細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図２１】クェルセチン処理（９６時間）による心筋細胞含有率の変化を示すグラフである。
【図２２】クェルセチン処理（９６時間）による回収細胞数の変化を示すグラフである。
【図２３】クェルセチン処理（９６時間）による回収心筋細胞数の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．多能性幹細胞
多能性幹細胞としては、特に限定されず、幅広く用いることができる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のいずれも用いることができる。
【００１４】
人工多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞等を用いることができる。胚性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＥＳ細胞等を用いることができる。これらの中でも、特に医薬としての利用を考えた場合、安全性等の面からｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が特に好ましい。特にヒト由来のｉＰＳ細胞（ｈ−ｉＰＳ細胞）が好ましい。
【００１５】
本発明は、後述する通り、具体的には、未分化の状態のまま残存している多能性幹細胞の特性に着目して純化を行う技術に関する。したがって、本発明においては、分化細胞の種類は特に限定されない。
【００１６】
特に限定されないが、分化細胞としては、心筋細胞、神経細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血液（造血）細胞、肝細胞、膵ベータ細胞、腎臓細胞、軟骨細胞及び生殖細胞等が挙げられる。これらの中でも特に心筋細胞が好ましい。
【００１７】
分化誘導方法は、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えば、ｈ−ｉＰＳ細胞からの心筋細胞への分化誘導方法としては、Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327に記載の方法、又はProc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 27;110(35):E3281-90.に記載の方法等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
２．本発明の製造方法により得られる細胞集団
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、特に限定されないが、未分化多能性幹細胞の含有割合が、通常は０．２％以下であり、好ましくは０．１％以下であり、より好ましくは０．０５％以下であり、さらに好ましくは０．０１％以下である。本発明の製造方法により得られる細胞集団は、未分化多能性幹細胞の含有割合が低いことが特徴であり、必要に応じて、分化誘導細胞及び未分化多能性幹細胞とは異なる細胞をさらに含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の製造方法により得られる細胞集団における未分化多能性幹細胞の含有割合は、フローサイトメトリーを用いた未分化細胞マーカー解析により求められるものとして定義できる。この解析は、具体的には以下のようにして行うことができる。
【００２０】
未分化多能性幹細胞を分化誘導した後、約１×１０５〜５×１０５個の分化細胞にＡｃｃｕｔａｓｅ等の細胞剥離液を３７℃、５分間作用させ、分化細胞を剥離及び遠心回収する。分化細胞をＰＢＳ１００μＬずつに懸濁し、蛍光標識された抗ヒトＴＲＡ―１−６０抗体及びアイソタイプコントロール抗体をそれぞれ添加し、４℃、暗所で２０分間反応させる。分化細胞をＰＢＳで洗浄し遠心回収後、それぞれＰＢＳ３００μＬずつに懸濁し、セルストレイナーを通した後ＦＡＣＳチューブに回収する。フローサイトメトリーにおいては、標識蛍光に対応した検出器でその蛍光発光を検出し定量化する。アイソタイプコントロール抗体で染まる分画を陰性分画と定義し、それに比して蛍光強度の高い分画を陽性分画と定義する。抗ヒトＴＲＡ―１−６０抗体で染まる分画のうち、陽性分画に属する割合をパーセンテージで定量表記する。
【００２１】
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、特に限定されず、幅広い用途に用いることができる。例えば、未分化多能性幹細胞の含有割合がより低減されているため、医薬（細胞医薬品）として利用する場合、安全面のリスクがより少なく、好ましい。医薬としての用途、すなわち対象疾患、用量・用法等については、分化細胞の種類によって適宜決定することができる。特に限定されないが、例えば分化細胞が心筋細胞である場合、本発明の細胞集団は、心筋梗塞や心筋症（拡張型心筋症など）に伴う重症心不全等の治療の目的で使用することができる。
【００２２】
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、医薬として用いる場合、造腫瘍等の安全面のリスクが低減されているという効果を有する。
【００２３】
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、医薬として用いる場合、医薬組成物における有効成分として使用できる。この医薬組成物は、特に限定されず、いわゆる細胞医薬品において含まれうる種々のその他の成分を含有していてもよい。
【００２４】
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、上記の通り説明される細胞集団を、使用目的等に応じて適宜、細胞培養培地中に含有していてもよいし、シート化していてもよい。
【００２５】
３．本発明の製造方法
本発明の製造方法は、ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
ポリフェノール化合物としては、特に限定されず、幅広く使用することができる。
【００２７】
ポリフェノール化合物としては、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物を使用できる。
【００２８】
ポリフェノール化合物が、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物であれば好ましい。これらのうち、特に、スチルベン骨格又はフラバン骨格を有するポリフェノール化合物が好ましい。
【００２９】
スチルベン骨格を有するポリフェノール化合物としては、例えば、下記一般式（１）を有するものが挙げられる。
【００３０】
【化３】
2018074983.tif 000004
【００３１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示す）。
【００３２】
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７の少なくとも一つが水素原子を示すものが挙げられる。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７が全て水素原子であるものも挙げられる。
【００３３】
これらのポリフェノール化合物の具体例として、レスベラトロール及びピセアタンノール等が挙げられる。これらのポリフェノール化合物をさらに修飾したものも使用できる。
【００３４】
なお、本発明において「フラバン骨格」には、以下の構造がいずれも含まれる。
【００３５】
【化４】
2018074983.tif 000005
【００３６】
【化５】
2018074983.tif 000006
【００３７】
これらのうち、前者は、いわゆる狭義のフラバン骨格として知られる。また、後者は、クェルセチンの部分構造に相当する。
【００３８】
フラバン骨格を有するポリフェノール化合物としては、例えば、下記一般式（２）を有するものが挙げられる。
【００３９】
【化６】
2018074983.tif 000007
【００４０】
（式中、Ｒ７〜Ｒ１１は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１２は、水酸基、アルコキシ基又はエステル基を表わし、Ａは、カルボニル基、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わし、かつ実線と破線とからなる二重線は、単結合又は二重結合を表わす）。
【００４１】
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１１の少なくとも一つが水素原子を示すものが挙げられる。Ｒ７、Ｒ９及びＲ１１が全て水素原子であるものも挙げられる。
【００４２】
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、かつ、Ａが、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わすものが挙げられる。より好ましい例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、かつ、Ａが、メチレン基を表わすものが挙げられる。より好ましい例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、Ａが、メチレン基を表わし、かつＲ７、Ｒ９及びＲ１１が全て水素原子であるものが挙げられる。
【００４３】
Ｒ１２が、エステル基である場合、そのエステル基の例としては、炭素数１〜１２の、置換されていてもよく、官能基を有していてもよい炭化水素部分を有するエステル基が挙げられる。
【００４４】
炭化水素部分に任意に含まれる置換構造は、特に限定されず、例えば、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、エステル結合、アミド結合及びカルボニル基等が挙げられる。当該炭化水素部分は、これら置換構造群から選択される少なくとも二種で置換されていてもよい。
【００４５】
当該炭化水素部分は、飽和又は不飽和であってもよい。また、当該炭化水素部分は、直鎖状、分岐状、環状、又はこれらのうち少なくとも二種を組み合わせた構造であってもよい。炭化水素部分の好ましい具体例としては、芳香族基等が挙げられる。
【００４６】
炭化水素部分に任意に含まれる官能基は、特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基等が挙げられる。
【００４７】
官能基を有する炭化水素部分の好ましい具体例としては、フェノール基、ジヒドロキシベンゼン基及びトリヒドロキシベンゼン基等が挙げられる。
【００４８】
Ｒ１２が、エステル基である場合、Ｒ１２の好ましい例として、ガラート基等が挙げられる。
【００４９】
これらのポリフェノール化合物の具体例として、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート等が挙げられる。これらのポリフェノール化合物をさらに修飾したものも使用できる。
【００５０】
未分化多能性幹細胞は、ポリフェノール化合物の存在下で培養することにより死滅する。ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減することができる。
【００５１】
ポリフェノール化合物の細胞培地中における濃度は、１０μＭ〜１０００μＭが好ましく、５０μＭ〜５００μＭがより好ましく、７０μＭ〜２００μＭがさらに好ましい。
【００５２】
培養時間は、多能性幹細胞の種類等に応じて適宜設定できるが、１２時間〜９６時間が好ましく、２４時間〜７２時間がより好ましく、３６時間〜６０時間がさらに好ましい。
【００５３】
（３）その他の薬剤
本発明の製造方法では、さらに他の薬剤の存在下で未分化多能性幹細胞を培養してもよく、そのような他の薬剤として例えば、未分化細胞マーカーとして知られるＣＤ３０を特異的に認識する抗体からなる抗ＣＤ３０抗体結合薬剤等が挙げられる。
【００５４】
ＣＤ３０は、ＴＮＦ−Ｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属し、一部のリンパ腫に発現している。正常組織では活性化リンパ球に発現するのみとされる。下流のシグナルとしてＮＦ−κＢやＭＡＰＫ経路が知られ、これらを介して生存に寄与するとされる。
【００５５】
具体的には、この抗ＣＤ３０抗体結合薬剤は、細胞を死滅させる活性を有する薬剤を細胞内環境で開裂するリンカーで結合させた抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）である。この抗ＣＤ３０抗体結合薬剤は、抗体認識した細胞内に侵入し、薬剤が細胞内に放出されることによって、その細胞を選択的に死滅させることができる。
【００５６】
薬剤としては、特に限定されないが、例えば、微小管阻害剤ＭＭＡＥ等が挙げられる。
また、リンカーとしては、特に限定されないが、例えば、蛋白質分解酵素により開裂するリンカー等が挙げられる。
【００５７】
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤として、特に限定されないが、例えば、抗体医薬として市販されているＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）（ＳＧＮ−３５）（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ社、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ社及び武田薬品）等を用いることができる。なお、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）は、適応疾患をＣＤ３０陽性リンパ腫として、ＦＤＡ承認を２０１１年に受けているほか、日本においても薬事承認を２０１４年４月に受けている。
【００５８】
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減することができる。
【００５９】
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤の細胞培地中における濃度は、多能性幹細胞の種類等に応じて適宜設定することができるが、５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがより好ましく、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがさらに好ましい。
【００６０】
４．本発明の組成物
本発明はさらに、上記の方法のために用いられる組成物であって、ポリフェノール化合物を少なくとも含有する、組成物を包含する。
【００６１】
本発明の組成物は、細胞培養液中に添加して使用する。より詳細には、細胞培養液中に、ポリフェノール化合物が含まれるようにするために使用する。
【００６２】
これらの組成物における、ポリフェノール化合物の配合濃度は、特に限定されず、要求される保存安定性や使用目的等に応じて適宜設定することができる。
【００６３】
これらの組成物は、上記の方法を阻害しない限りにおいて、さらに他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、特に限定されないが、例えば、グルコース、マルトース、シュークロース、ラクトース、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、ヒドロキシエチル澱粉及びプルラン等の糖質、グルコン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、β−ヒドロキシ酪酸及びクエン酸等の有機酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウム等の電解質、Ｌ−アスコルビン酸及びビタミンＥ等のビタミン、グリシン、グルタミン酸及びリジン等のアミノ酸、抗利尿ホルモン及びインスリン等のホルモン、クエン酸、クエン酸塩、ヘパリン及びエデト酸ナトリウム等の抗凝固剤、カルシウム拮抗剤、アドレナリンβ受容体拮抗剤及びアンギオテンシン変換酵素阻害剤等の降圧剤、アデノシン三リン酸等の核酸塩基、凍結防止蛋白質等の凍結防止剤；並びに活性酸素消去剤、細胞賦活剤、抗生物質、抗血小板因子、肝障害抑制剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、粘性剤、再吸収促進剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤等が挙げられ、これらの少なくとも一種を必要に応じて配合することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６５】
＜試験例＞
細胞増殖アッセイ（ＣＣＫ−８アッセイ）
細胞を96ウェルプレートに播種し、3−4日培養後、被験物質を含む維持培地に交換し、一定時間３７度５％ＣＯ２でインキュベートし、その後各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ、３４７−０７６２１）を添加し、一定時間３７度５％ＣＯ２でインキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０nmの吸光度を測定する。
【００６６】
細胞増殖アッセイ（セルカウント）
細胞を０．５×Triple Select 又は、０．０５％Tripsin/EDTAで酵素処理し、それに維持培地を加え１０００rpm、５分遠心を行う。沈殿した細胞を維持培地に懸濁する。細胞懸濁液とトリパンブルー液を１：１で混合し、カウンテス（invitrogen）を用い、生細胞数を測定する。
【００６７】
Lin28発現細胞に関する定量的ＰＣＲ
セルカウント後の培養細胞からPure Link RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific社製)を用い全mRNA抽出を行った。mRNAからSuper Script VIRO Mater Mix (Thermo Fisher Scientific社製)を用いてcDNAを合成し、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixe (Thermo Fisher Scientific社製)を用い、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific社製)により未分化細胞のマーカーとしてＬｉｎ２８の測定を行った。
【００６８】
cTnT発現細胞に関するＦＡＣＳ
セルカウントを行った細胞サンプルを、0.5% BSA/PBSで洗浄後、細胞を固定・透過処理剤（BD Cytofix Cytoperm、Fixation/Permeabilization Solution Kit、BD社製）で固定、透過処理し、処理後の細胞を抗cTnT抗体（Troponin T-C antibody(CT3)、マウスIgG2a、Santa Cruz biotechnology社製）、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor 647結合マウスIgG2a抗体、Life technology社製）と反応することにより行った。
標識した細胞を、BD FACS Canto IIフローサイトメーターおよびBD FACS Divaソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。
【００６９】
実施例１．ｉＰＳ細胞および正常細胞に対するレスベラトロールの作用
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を９６穴プレートへ播種した（細胞密度：２０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）。播種３−４日後、各ウェルにレスベラトロールを０〜２００μＭ添加し（以後培地交換なし）、細胞数を反映する細胞増殖アッセイ （ＣＣＫ−８アッセイ）によって生細胞の定量的評価を行った。その結果、濃度依存的に細胞死が誘導され、レスベラトロール２００μＭ添加群において、２４時間後に６０〜７０％の細胞死が誘導されることが確認された（図１）。
【００７０】
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を6cm2ディッシュへ播種した。播種４日後（細胞密度：８０−９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）、各ディッシュにレスベラトロールを５０μＭ添加し（以後培地交換なし）、培養１、３、６、２４、４８時間ごとにセルカウントによって生細胞の定量的評価を行った。その結果、継時的に細胞死が誘導され、レスベラトロール添加４８時間後に９０％以上の細胞死が誘導されることが確認された（図２）。
【００７１】
ヒト正常細胞（皮膚線維芽細胞：ＮＨＤＦ）に対してレスベラトロールが及ぼす影響を調べる目的で、ヒトｉＰＳ細胞の場合と同様の条件で細胞増殖アッセイを行った。ヒト線維芽細胞を１０cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：５０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）、４８時間培養した。培養後、各ウェルにレスベラトロールを１００μＭ添加し（以後培地交換なし）、４８時間培養後にセルカウントによって生細胞の定量的評価を行った。その結果、ヒト線維芽細胞に対しては、レスベラトロール１００μＭの添加では４８時間経過しても、ほぼ細胞死の誘導は認められなかった（図３）。
【００７２】
実施例２．ｉＰＳ−ＣＭに対するレスベラトロールの作用による未分化細胞除去
ヒトｉＰＳ細胞株（253G1）から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてレスベラトロールの作用を検討した。ｉＰＳ−ＣＭは心筋細胞の他、造腫瘍性を有する未分化細胞および平滑筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞も含有すると考えられる。
【００７３】
心筋への分化誘導方法は、Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｋ, ｅｔ ａｌ. Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ. Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０１２、 ４２５（２）、ｐｐ．３２１−７に従った。
ｉＰＳ−ＣＭを6cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：４×106）、播種と同時に、各ディッシュにレスベラトロールをそれぞれ０、５０、７５、１００、２００μＭ添加し（以後培地交換なし）、７２、９６時間培養した。まず、培養後のサンプルから全ｍＲＮＡを抽出し、未分化マーカーであるＬｉｎ２８発現量を定量的ＰＣＲで測定し、未分化細胞を定量した。また、同じサンプルから心筋細胞マーカーである心臓トロポニンＴ（cTnT）発現細胞を免疫染色し、FACSによって心筋細胞を定量した。レスベラトロールの処理濃度と処理時間に対して、回収細胞に含まれる未分化細胞、心筋細胞の割合（含有率）及び回収心筋細胞数を表１に示す。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
Ｌｉｎ２８発現量を指標とした未分化細胞の解析から、レスベラトロール添加群でＬｉｎ２８の発現量は濃度依存的に減少した。純粋なヒトｉＰＳ細胞のＬｉｎ２８発現量を１００％とした場合、コントロール群では培養７２および９６時間でＬｉｎ２８発現量はそれぞれ０．０３６％、０．０２８％であったのに対し、レスベラトロール２００μＭ添加群では７２、９０時間後に０．０１４％、０．０１１％に減少し、いずれもコントロール群の値の３９％ほどに減少した（表１、図４）。
【００７６】
また、cTnT発現量を指標とする心筋細胞の解析から、レスベラトロール添加群でcTnT発現量は濃度依存的に増加した。コントロール群では培養７２および９６時間でcTnT発現細胞含有率はそれぞれ３４．７％、３５．７％であったのに対し、レスベラトロール２００μＭ添加群では７２、９０時間後の含有率はそれぞれ７７．４％（２．２倍）、７１％（２倍）に増加した（表１、図５）。
【００７７】
ｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、レスベラトロール添加量に依存して僅かに減少するものの、培養７２、９６時間のレスベラトロール２００μＭ処理においても、それぞれコントロールの６５％、９１％の細胞数が維持された（図６）。
ｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、レスベラトロール添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養７２、９６時間のレスベラトロール２００μＭ処理においても、それぞれコントロールの１４５％、１８２％の心筋細胞数が維持された（図７）。
【００７８】
以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール（２００μＭ）で９８時間処理することによって、Ｌｉｎ２８陽性の未分化細胞含有率を０．０１１％までを除去できることが判明した。また、この処理により心筋細胞含有率はコントロールの３６％から７１％まで向上し、ｉＰＳ−ＣＭの精製法として優れていることが明らかになった。
【００７９】
実施例３．ｉＰＳ−ＣＭに対するエピガロカテキンガラートによる未分化細胞除去
実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞および皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対するエピガロカテキンガラートの作用を検討した。
エピガロカテキンガラートはヒトｉＰＳ細胞に対して高濃度（１００μＭ）において細胞障害性を示し、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対しては強い細胞障害性を示さなかった（図８、図９）。
【００８０】
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてエピガロカテキンガラートの作用を検討した。ｉＰＳ−ＣＭを１０cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：１２×106）エピガロカテキンガラート（５０μＭ及び１００μＭ）で９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．２７８％からそれぞれ０.０７４％および０．０１％まで低下した（表２、図１０）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は５８．２％からそれぞれ６７．９％及び８８．２％まで向上した（表２、図１１）。
【００８１】
【表２】
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【００８２】
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラート存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキンガラート添加によって減少するものの、培養９６時間のエピガロカテキンガラート５０μＭおよび１００μＭ処理においてもコントロールのそれぞれ９２％及び５３％の細胞数が維持された（図１２）。
【００８３】
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラート存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキンガラート添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のエピガロカテキンガラート５０μＭ及び１００μＭ処理においても、それぞれコントロールの１０７％、８０．６％の心筋細胞数が維持された（図１３）。
エピガロカテキンガラートはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラートで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。
【００８４】
実施例４．ｉＰＳ−ＣＭに対するエピガロカテキンによる未分化細胞除去
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてエピガロカテキンの作用を検討した。その結果、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン（１００μＭ）で９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．３４％から０．０１％まで低下した（表３、図１４）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は３９．３％から８２．１％まで向上した（表３、図１５）。
【００８５】
【表３】
2018074983.tif 000010
【００８６】
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキン添加によって減少するものの、培養９６時間のエピガロカテキン１００μＭ処理においてもコントロールの５５％の細胞数が維持された（図１６）。
【００８７】
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキン添加によって減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のエピガロカテキン１００μＭ処理においても、コントロールの１１６％の心筋細胞数が維持された（図１７）。
【００８８】
エピガロカテキンはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。
【００８９】
実施例５．ｉＰＳ−ＣＭに対するクェルセチンによる未分化細胞除去
実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞および皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対するクェルセチンの作用を検討した。
クェルセチンはヒトｉＰＳ細胞に対して高濃度（１００μＭ）において細胞障害性を示し、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対しては強い細胞障害性を示さなかった（図１８、図１９）。
【００９０】
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてクェルセチンの作用を検討した。その結果、ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン１００μＭで９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．３２％からそれぞれ０.１％まで低下した（表４、図２０）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は３９．５％からそれぞれ５５．５％まで向上した（表４、図２１）。
【００９１】
【表４】
2018074983.tif 000011
【００９２】
ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、クェルセチン添加によって減少するものの、培養９６時間のクェルセチン１００μＭ処理においてもコントロールのそれぞれ６４％の細胞数が維持された（図２２）。
【００９３】
ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、クェルセチン添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のクェルセチン１００μＭ処理においても、それぞれコントロールの９０％の心筋細胞数が維持された（図２３）。
【００９４】
クェルセチンはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチンで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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