(57)【要約】【課題】微生物を用いて、製造コストを抑え、効率的かつ多量にポリヒドロキシアルカン酸を生産する方法を開発し、提供することを課題とする。【解決手段】液体培地を撹拌させながら遠赤色光を照射して紅色光合成細菌を培養することで、細胞内にPHAを蓄積した菌体を得るPHA生産方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅色光合成細菌を用いたポリヒドロキシアルカン酸の生産方法であって、
液体培地を撹拌させながら遠赤色光を照射して紅色光合成細菌を培養する培養工程を含む、前記生産方法。
【請求項２】
前記遠赤色光が720nm〜860nmにピーク波長を有する光である、請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記培養工程が、
紅色光合成細菌を増殖培地中で培養する増殖ステップ、
前記増殖ステップ後の培養液中の紅色光合成細菌を回収する菌体回収ステップ、及び
回収した紅色光合成細菌を有機酸及び／又は炭酸を炭素源とするポリヒドロキシアルカン酸生産培地で培養するポリヒドロキシアルカン酸蓄積ステップ
を含む、請求項１又は２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記増殖ステップにおいて、紅色光合成細菌を対数増殖期まで培養する、請求項３に記載の生産方法。
【請求項５】
前記ポリヒドロキシアルカン酸蓄積ステップにおいて、紅色光合成細菌を後期対数増殖期又は初期静止期まで培養する、請求項３又は４に記載の生産方法。
【請求項６】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産培地が増殖培地の炭素源を有機酸塩及び／又は炭酸塩に置換した培地である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシアルカン酸生産培地が窒素源、リン酸源、及びビタミンのいずれか一以上を欠乏している、請求項３〜６のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項８】
前記培養工程後の培養液に含まれる菌体を回収する回収工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項９】
前記培養工程後の培養液、又は紅色光合成細菌からポリヒドロキシアルカン酸を抽出する抽出工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１０】
紅色光合成細菌が海洋性光合成細菌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１１】
紅色光合成細菌がMarichromatium bheemlicum、Thiohalocapsa marina、Thiophaeococcus mangrovi、Afifella pfennigii、Afifella marina、Rhodovulum euryhalinum、Rhodovulum imhoffii、Rhodovulum sulfidophilum、Rhodovulum tesquicola、Rhodovulum visakhapatnamense、Roseospira goensis及びRoseospira marinaからなる群から選択される、請求項１０に記載の生産方法。
【請求項１２】
紅色光合成細菌がMarichromatium bheemlicum JCM13911、Thiohalocapsa marina JCM14780、Thiophaeococcus mangrovi JCM14889、Afifella pfennigii ATCC BAA1145、Afifella marina DSM2698、Rhodovulum euryhalinum DSM4868、Rhodovulum imhoffii JCM13589、Rhodovulum sulfidophilum ATCC35886、Rhodovulum tesquicola ATCC BAA1573、Rhodovulum visakhapatnamense JCM13531、Roseospira goensis JCM14191及びRoseospira marina ATCC BAA447からなる群から選択される、請求項１１に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紅色光合成細菌を用いて、バイオプラスチックであるポリヒドロキシアルカン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成樹脂、いわゆるプラスチックは、軽量かつ丈夫で成形や着色が容易であり、耐腐食性も高く、大量生産が可能等の優れた利点を有する素材である。利便性が高く、日常生活や産業分野において様々な形で利用され、現代生活において不可欠な素材となっているが、解決すべき大きな問題も抱えている。
【０００３】
例えば、現在使用されているプラスチックの多くは石油を原料としているが、石油は新興国の台頭に伴う国際的な消費量の増大により、将来の枯渇が懸念されている。また、非再生可能資源であるため、燃焼に伴い大気中に排出される二酸化炭素が地球温暖化の大きな原因になっている。
【０００４】
廃プラスチックの処理も問題となっている。例えば、プラスチックは、高い耐腐食性から微生物等により分解されることなく、自然界で残存し続ける。また、焼却処理した場合にも、多量の二酸化炭素が発生するだけでなく、ダイオキシン等の有害ガスも発生し得る。さらに、焼却時の発熱量が高いため焼却炉を破壊する原因になり得る。
【０００５】
そこで、上記石油系プラスチックに替わる新たなプラスチック素材として、バイオマスを原料とするバイオプラスチック（バイオマスプラスチック）の研究開発が進められており、その一部は既に実用化されている。バイオマスは、再生可能資源であり、化石燃料のような枯渇問題が生じない。また、バイオマスの燃焼に伴い発生する二酸化炭素は、元来、光合成生物による光合成によって大気中の二酸化炭素が固定化されたものであるためカーボンニュートラルであり、大気中の二酸化炭素量を上昇させることもない。それ故に、地球温暖化防止にも寄与し得る（非特許文献１）。
【０００６】
また、廃プラスチック処理の問題を解決するために、生分解性プラスチックが開発されている。生分解性プラスチックは、プラスチックとしての機能や物性を有しながら、自然界において微生物の酵素作用等により完全分解される性質を有するプラスチックで、例えば、石油から合成されたポリエステル等が挙げられる。生分解性プラスチックは、焼却しても発熱量が低いことから焼却炉を痛めることもなく、また有害物質も放出しない。
【０００７】
さらに、バイオプラスチックと生分解性プラスチックの双方の性質を有する生分解性バイオプラスチックも開発されている。生分解性バイオプラスチックには、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）、ポリ乳酸（PLA）、澱粉樹脂、及びポリブチレンサクシネート(PBS)等が知られている。
【０００８】
PHAは、微生物が体内に蓄積するバイオポリエステルの一種であり、微生物が貧栄養時に備えて、グルコースを炭素源として細胞内で合成、蓄積している炭素及びエネルギー貯蔵物質である。PHAの特性は、硬質系バイオプラスチックであり、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待されている。
【０００９】
PHAを微生物により生産させる方法は、これまでに種々開示されている。例えば、特許文献１には、アルカリゲネス属細菌を用いてPHAの一種であるポリヒドロキシブタン酸（PHB）を製造する方法が開示されている。しかし、特許文献１に開示の方法をはじめ、従来方法の多くは増殖用の資化性炭素源として有機炭素源を必要とする上に、生産性が低いため、製造コストが高くなるという問題があった。
【００１０】
そこで、有機炭素源の還元物質を必要とすることなく微生物から効率的にPHAを生産させる方法が種々模索された。例えば、非特許文献２には、光合成を行うシアノバクテリアを用いたPHAの製造方法が開示されている。シアノバクテリアは、自ら光合成によって資化性炭素源を獲得できる。有機炭素源を必要としない点でPHA生産のホスト細菌としては優れているが、PHAとして、ホモポリマーであるPHBしか生産することができない。PHBはポリプロピレンと同程度の融点（180℃）や破壊強度を有するが、ポリプロピレンよりも破壊伸びが低く、また結晶性が高いことから、硬くて脆いという物性的欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特公平７−１４３５２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Mooney B.M., 2009, Biochem. J., 418: 219-232
【非特許文献２】Osanai T., 2013, DNA Res., 20: 525-535
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、微生物を用いて、製造コストを抑え、効率的かつ多量にPHAを生産する方法を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、本発明者らはPHA生産のホスト細菌として光合成細菌に着目した。光合成細菌は、シアノバクテリアと同様に、自ら光合成によって資化性炭素源を獲得できることから有機炭素源を必要としない。さらに、海水域に生息する海洋性光合成細菌は、大量に存在する海水を培地として利用できるため、PHAの製造コストを削減することができる。また高塩濃度培地での培養となるため他の細菌のコンタミネーションが少ないという利点も有する。しかし、光合成細菌は、培養方法が十分に確立していないため、PHAを生産する上で効率的な培養が困難という問題があった。
【００１５】
そこで、本発明者らは、鋭意研究を重ね、紅色光合成細菌を培養期間中、遠赤色光を照射しながら培地を撹拌し続けることによって、菌体の増殖とPHAの効率的な生産及び蓄積を達成できる培養方法を確立した。また、紅色光合成細菌を用いた場合、紅色非硫黄細菌ではPHAがコポリマー（共重合体）として得られることを見出した。本願発明は、当該研究結果に基づくもので、以下を提供する。
【００１６】
（１）紅色光合成細菌を用いたPHAの生産方法であって、液体培地を撹拌させながら遠赤色光を照射して該紅色光合成細菌を培養する培養工程を含む、前記生産方法。
（２）前記遠赤色光が720nm〜860nmにピーク波長を有する光である、（１）に記載の生産方法。
（３）前記培養工程が、紅色光合成細菌を増殖培地中で培養する増殖ステップ、前記増殖ステップ後の培養液中の紅色光合成細菌を回収する菌体回収ステップ、及び回収した紅色光合成細菌を有機酸及び／又は炭酸を炭素源とするPHA生産培地で培養するPHA蓄積ステップを含む、（１）又は（２）に記載の生産方法。
（４）前記増殖ステップにおいて、紅色光合成細菌を対数増殖期まで培養する、（３）に記載の生産方法。
（５）前記PHA蓄積ステップにおいて、紅色光合成細菌を後期対数増殖期又は初期静止期まで培養する、（３）又は（４）に記載の生産方法。
（６）前記PHA生産培地が増殖培地の炭素源を有機酸塩及び／又は炭酸塩に置換した培地である、（３）〜（５）のいずれかに記載の生産方法。
（７）前記PHA生産培地が窒素源、リン酸源、及びビタミンのいずれか一以上を欠乏している、（３）〜（６）のいずれかに記載の生産方法。
（８）前記培養工程後の培養液に含まれる菌体を回収する回収工程を含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の生産方法。
（９）前記培養工程後の培養液、又は紅色光合成細菌からPHAを抽出する抽出工程をさらに含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の生産方法。
（１０）紅色光合成細菌が海洋性光合成細菌である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）紅色光合成細菌がMarichromatium bheemlicum、Thiohalocapsa marina、Thiophaeococcus mangrovi、Afifella pfennigii、Afifella marina、Rhodovulum euryhalinum、Rhodovulum imhoffii、Rhodovulum sulfidophilum、Rhodovulum tesquicola、Rhodovulum visakhapatnamense、Roseospira goensis及びRoseospira marinaからなる群から選択される、（１０）に記載の生産方法。
（１２）紅色光合成細菌がMarichromatium bheemlicum JCM13911、Thiohalocapsa marina JCM14780、Thiophaeococcus mangrovi JCM14889、Afifella pfennigii ATCC BAA1145、Afifella marina DSM2698、Rhodovulum euryhalinum DSM4868、Rhodovulum imhoffii JCM13589、Rhodovulum sulfidophilum ATCC35886、Rhodovulum tesquicola ATCC BAA1573、Rhodovulum visakhapatnamense JCM13531、Roseospira goensis JCM14191及びRoseospira marina ATCC BAA447からなる群から選択される、（１１）に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のPHA生産方法によれば、紅色光合成細菌を安定的に培養することでPHAを効率的に生産することができる。また、一部の紅色光合成細菌を用いることで、PHAをコポリマーとして得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】選択した12種の紅色光合成細菌を各培地で培養した時の培養後の乾燥菌体重量を示す図である。
【図２】選択した12種の紅色光合成細菌を各培地で培養した後の細胞内に蓄積されたPHA量（乾燥菌体当たりの重量％）（A）と培地1L当たりのPHA量（mg）（B）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜ポリヒドロキシアルカン酸生産方法＞
本発明は、紅色光合成細菌を用いたポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の生産方法に関する。
【００２０】
１．用語の定義
本明細書で使用する以下の用語について定義する。
「光合成細菌」とは、酸素非発生型光合成を行う真正細菌であって、色素、電子供与体、好気又は嫌気条件での生育様式に従い、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、及び好気性光合成細菌の5科に分類される。
【００２１】
「紅色光合成細菌」とは、上記光合成細菌における紅色硫黄細菌及び紅色非硫黄細菌の総称である。本発明のPHAの生産方法では、紅色光合成細菌、すなわち紅色硫黄細菌又は紅色非硫黄細菌を使用する。紅色光合成細菌は、嫌気性の要求性が強くないことから比較的培養しやすく、また炭酸固定活性が強いことから、他の光合成細菌よりもPHA産生上、好ましい。
【００２２】
紅色光合成細菌は、生息環境により淡水性と海洋性に大別されるが、本発明で使用する紅色光合成細菌は、いずれでもよい。好ましくは、海洋性の紅色光合成細菌である。これは、前述のように、高塩濃度培地により他の細菌のコンタミネーションを抑制できる他、大量に存在する海水を培地として利用できるためバイオプラスチックの製造コストを抑えることができるからである。
【００２３】
紅色光合成細菌の具体例としては、後述する表１に示す紅色硫黄細菌や表２に示す紅色非硫黄細菌属の細菌が挙げられる。具体的には、紅色硫黄細菌に属する、Allochromatium属細菌、Ectothiorhodospira属細菌、Halochromatium属細菌、Halorhodospira属細菌、Marichromatium属細菌、Thiocapsa属細菌、Thiohalocapsa属細菌、及びThiophaeococcus属細菌等、また紅色非硫黄細菌に属する、Rhodobaca属細菌、Rhodobacter属細菌、Rhodobium属細菌、Afifella（Rhodobium）属細菌、Rhodothalassium属細菌、Rhodovulum属細菌、及びRoseospira属細菌等である。中でも海洋性紅色硫黄細菌であるMarichromatium bheemlicum、Thiohalocapsa marina及びThiophaeococcus mangroviの3種、及び海洋性紅色非硫黄細菌であるAfifella pfennigii (Rhodobium pfennigii)、Afifella marina (Rhodobium marinum)、Rhodovulum euryhalinum、Rhodovulum imhoffii、Rhodovulum sulfidophilum、Rhodovulum tesquicola、Rhodovulum visakhapatnamense、Roseospira goensis及びRoseospira marinaの9種は、本発明の紅色光合成細菌として好適である。これらの紅色光合成細菌は、RIKENバイオリソースセンター（日本）、NITE（日本）、ATCC（USA）、DSMZ（ドイツ）、NMLHC（カナダ）、ECACC（英国）、NIBSC（英国）、CNCM（フランス）、CBS（オランダ）、BCCM（ベルギー）、ABC（イタリア）、NMI（オーストラリア）、CCTCC（中国）、CGMCC（中国）等の各寄託機関から所定の手続きを経て入手することができる。
【００２４】
「ポリヒドロキシアルカン酸（polyhydroxyalkanoate)」（本明細書では、しばしば「PHA」と表記する）は、ある種の微生物が貯蔵エネルギーとして細胞内に蓄積することが知られているバイオポリエステルで、本発明の生産方法における対象生産物である。PHAは、以下の一般式１で表すことができる。
【００２５】
【化１】
2018133997.tif 000002
［式中、Rは同一でも異なっていてもよく、炭素数1〜14の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、nは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００２６】
PHAの具体例として、例えば、限定はしないが、以下の化学式１で表されるポリヒドロキシブタン酸（PHB:P(3HB)）（Poly-3-hydroxybutyrate）、化学式２で表されるポリヒドロキシバレリン酸（PHV：P(3HV)）（Poly-3-hydroxyvalerate）、化学式３で表されるポリヒドロキシヘキサン酸（PHH:P(3HH)）（Poly-3-hydroxyhexanoate）、化学式４で表されるポリヒドロキシブタン酸-ポリヒドロキシバレリン酸（PHBV:P(3HB-co-3HV)）（Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)）、化学式５で表されるポリヒドロキシブタン酸-ポリヒドロキシヘキサン酸（PHBH:P(3HB-co-3HH)）（Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)）、及び化学式６で表されるポリ3ヒドロキシブタン酸-ポリ4ヒドロキシブタン酸（PHBB:P(3HB-co-4HB)）（Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)）等が挙げられる。
【００２７】
【化２】
2018133997.tif 000003
［式中、nは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００２８】
【化３】
2018133997.tif 000004
［式中、nは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００２９】
【化４】
2018133997.tif 000005
［式中、nは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００３０】
【化５】
2018133997.tif 000006
［式中、m及びnは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００３１】
【化６】
2018133997.tif 000007
［式中、m及びnは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００３２】
【化７】
2018133997.tif 000008
［式中、m及びnは2以上の整数であり、好ましくは100以上の整数であり、好ましくは100,000以下の整数である]
【００３３】
本発明の生産方法で生産するPHAは、特に限定はしない。例えば、3HBの単一モノマーからなるP(3HB）のようなホモポリマーであってもよいし、2種以上のモノマーからなるP(3HB-co-3HV)やP(3HB-co-3HH)のようなコポリマーであってもよい。好ましくはコポリマーである。
【００３４】
２．方法
本発明のPHA生産方法は、培養工程を必須工程として含み、選択工程として、回収工程、及び抽出工程を含む。以下、各工程について、具体的に説明をする。
【００３５】
２−１．培養工程
本明細書において「培養工程」とは、紅色光合成細菌を特定条件下で培養することによって、菌体数を増やし、菌細胞内にPHAを蓄積させる工程である。
【００３６】
前記「特定の条件」とは、培養時における液体培地の撹拌と菌体への遠赤色光照射である。
【００３７】
本明細書において「撹拌」とは、液体を流動させることをいう。撹拌の方法は、液体を流動させることができれば特に限定はしない。例えば、撹拌子や撹拌棒により液体に回転流動を起こしてかき混ぜる方法や、振盪器等を用いて液体を入れた容器を振盪させる方法（反転方法を含む）、送液装置等により流路に液体を通流する方法等が挙げられる。撹拌は、培地中の成分や菌体を均一化することを目的とする。これによって、各菌体に栄養素や照射される光を均一に付与することが可能となる。
【００３８】
本明細書において「遠赤色光」(Far Red）とは、ピーク波長の波長域が700nm〜860nmの光をいう。「ピーク波長」とは、光の発光強度が最大となる波長である。培養工程で紅色光合成細菌に照射する遠赤光は前記波長域の光であればよく、限定はされないが、好適な遠赤色光は、ピーク波長が720nm〜860nmの光である。
【００３９】
本発明において「照射」とは、紅色光合成細菌を前記遠赤色光で曝光することをいう。照射は、連続照射であっても、また明暗期を有する明暗光であってもよい。ここでいう連続照射とは、連続的な照射だけでなく、極めて短時間に明暗期を繰り返すパルス光の照射も含む。明暗周期光の場合には、1日の明暗周期は特に限定はしないが、例えば、明期8時間：暗期16時間〜明期16時間:暗期8時間の範囲でよい。あるいは、明期中に周期的に又は非周期的に、肉眼で認識できる暗期（例えば、1秒以上、好ましくは数秒以上の暗期）が挿入される明暗光であってもよい。好ましい照射は、連続照射である。なお、照射する遠赤色光は、必ずしも一定のピーク波長を有する光である必要はなく、照射期間中、前記波長域の範囲で変化させることもできる。例えば、照射開始時にピーク波長730nmの光を照射し、照射8日目以降にピーク波長740nmの光に変更して照射する場合が挙げられる。
【００４０】
遠赤色光の放射照度は、0.1/m2〜15W/m2の範囲であればよい。好ましくは6W/m2〜10W/m2、より好ましくは8W/m2±1W/m2である。
【００４１】
照射方法は、培養液中の紅色光合成細菌を十分に曝光できる方法であれば特に限定はしない。例えば、透明な培養槽の周囲に光源を設置して培養槽全体に対して光を照射する方法、一方向又は複数方向から培養槽に光を照射し、培養槽内の培養液を撹拌することで培養液全体に光を行き渡す方法等が挙げられる。光の照射は、光源からの直接照射が好ましいが、培養液全体に光を行き届かせる目的等のために反射板等を介した間接照射であってもよい。間接照射の場合、照射した光が減衰する可能性があることから、光強度が前述の範囲となるように、必要に応じて光源の光強度を高めることが好ましい。
【００４２】
光照射は、紅色光合成細菌の増殖培養期間（後述する「増殖ステップ」期間）、及び／又は紅色光合成細菌によるPHAの生合成と細胞内蓄積を促進させる期間（後述する「PHA蓄積ステップ」期間）に行えばよい。最大で本発明のPHA生産方法の全期間を通して照射することもできる。好ましい照射期間は、増殖ステップ期間及びPHA蓄積ステップ期間である。
【００４３】
本工程で使用する光源は、前記波長域の光を放射可能な光源であれば特に限定はしない。例えば、遠赤色光を含む白色光を放射可能な白色発光ダイオード（Light Emitting Diode：以下、本明細書では、しばしば「LED」と表記する）、高輝度放電（HID：High Intensity Discharge）ランプ、ハロゲン電球、白熱電球及び太陽光等が挙げられる。連続照射や電力コストを考慮すれば、700nm〜860nmの波長域内、好ましくは720nm〜860nmの波長域内にピーク波長を有するLEDを利用するのが好ましく、また効果的である。
【００４４】
本工程では、前述の「特定の条件」以外の培養条件については、制限はなく、細菌培養分野で公知の方法に準じて行えばよい。
【００４５】
例えば、本工程で使用する培地は、紅色光合成細菌を培養できる増殖培地であれば特に限定はしない。例えば、紅色硫黄細菌であれば、増殖用培地として0.05% KH2PO4, 1.5×10-3% CaCl2・2H2O, 0.2% MgSO4・7H2O, 6.4×10-3% NH4Cl, 2% NaCl, 0.3% ピルビン酸ナトリウム, 0.04% yeast extract, 2×10-4％ ビタミンB12, 2.4×10-3％ Na2S・9H2O, 0.15% Na2S2O3・5H2O, 0.15% FeCl2・6H2O, 7×10-3％ ZnCl2・5H2O, 0.01％ MnCl2・4H2O, 6.2×10-3％ H3BO3, 1.9×10-3％ CoCl2・6H2O, 1.7×10-3％ CuCl2・2H2O, 2.4×10-3％ NiCl2・6H2O, 3.6×10-3％ Na2MoO4・H2O（培地pH7.5）の組成を有する増殖培地Aの他、市販の培地、例えばDifco社のMarine Agar 2216等を使用することができる。また、紅色非硫黄細菌増殖用であれば、0.05％ KH2PO4, 2.5×10-3％ CaCl2・2H2O, 0.3％ MgSO4・7H2O, 6.8×10-3％ NH4Cl, 2％ NaCl, 0.3％ リンゴ酸ナトリウム, 0.3％ ピルビン酸ナトリウム, 0.04％ イースト・エクストラクト, 5×10-4% クエン酸酸化鉄, 2×10-4％ ビタミンB12, 7×10-3 ％ ZnCl2・5H2O, 0.01％ MnCl2・4H2O, 6×10-3％ H3BO3, 0.02％ CoCl2・6H2O, 2×10-3％ CuCl2・2H2O, 2×10-3％ NiCl2・6H2O, 4×10-3％ Na2MoO4・H2O（培地pH6.8）の組成を有する増殖培地Bを使用することができる。
【００４６】
培養温度は、紅色光合成細菌が生育及び／又は増殖可能な温度範囲であればよい。例えば、紅色光合成細菌を入手した各寄託機関で公開されている培養温度を用いることができる。23℃〜32℃の範囲内の温度であれば良く、通常は28℃〜30℃の範囲であれば足りる。
【００４７】
本工程の開始時に、培地に紅色光合成細菌を植菌する際、細胞数は特に限定はしないが、植菌後のOD660値が0.05〜0.3の範囲、好ましくは0.05〜0.15となるような細胞数であればよい。
【００４８】
前記培養工程は、必要に応じて増殖ステップ、菌体回収ステップ、及びPHA蓄積ステップを含むことができる。当該工程を含む培養工程では、増殖ステップ及びPHA蓄積ステップで異なる培地を使用することを特徴とする。培養に関する他の条件は、原則として既述の条件と同じでよい。したがって、ここでは記述の培養条件に関しては、その説明を省略し、各ステップの特徴的な点について、以下で具体的に説明をする。
【００４９】
（１）増殖ステップ
「増殖ステップ」とは、紅色光合成細菌を増殖培地中で培養するステップであり、主に培養液中の細菌数の増加を目的とする。
【００５０】
本ステップで使用する培地は、増殖培地である。増殖培地は、紅色光合成細菌を培養可能であれば任意の培地を用いることが可能で、培地の種類や組成は特に限定しない。当該分野において、紅色光合成細菌用として公知の培地を用いることができる。例えば、前述の紅色硫黄細菌用の増殖培地Aや紅色非硫黄細菌用の増殖培地Bが挙げられる。市販の培地も利用可能である。
【００５１】
本ステップの培養期間は、植菌した紅色光合成細菌が対数期（log-phase）、好ましくは中期対数期（mid-log phase）〜後期対数期（late-log phase）に達するまでが好ましい。具体的には、培養液のOD660値が0.5〜4.0の範囲、0.5〜2.0の範囲、0.5〜1.5の範囲又は0.6〜1.2の範囲、好ましくは0.8〜1.1の範囲、より好ましくは0.9〜1.0の範囲になるまで培養すればよい。
【００５２】
（２）菌体回収ステップ
「菌体回収ステップ」は、前記増殖ステップ後の培養液中の紅色光合成細菌を回収するステップであり、増殖ステップで培養した紅色光合成細菌をPHA蓄積ステップのPHA生産培地に移す際に培養液から増殖培地や粗雑物等をできる限り除去することを目的とする。
【００５３】
ただし、本ステップは、他の２つのステップと異なり、必要に応じて行えばよい選択ステップである。すなわち、増殖ステップ後の紅色光合成細菌を回収することなく、増殖ステップ後の培養液の一部をそのままPHA蓄積ステップのPHA生産培地に植え継ぐことも可能である。
【００５４】
培養液から菌体を回収する方法は、当該分野で公知の常法を用いればよい。例えば、培養液を遠心又は濾過によって培地を除去する方法が挙げられる。具体的には、培養液を遠心機により適当な重力加速度（g）で適当な時間遠心した後に、上清を除去して菌体を回収する方法や、紅色光合成細菌の細胞サイズよりも小さい孔径を有するフィルターで濾過して培養液を除去し、フィルターに残った菌体を回収する方法が挙げられる。回収した菌体は、必要に応じて培養工程に用いた培地、又は当該培地と同程度の浸透圧を有するバッファ若しくは生理食塩水で1回以上洗浄してもよい。
本ステップで回収した菌体は、次のPHA蓄積ステップで使用する。
【００５５】
（３）PHA蓄積ステップ
「PHA蓄積ステップ」とは、増殖ステップで培養した紅色光合成細菌をPHA生産培地に移して培養するステップであり、細菌によるPHAの生合成と細胞内蓄積を促進させることを目的とする。
【００５６】
本ステップで使用する培地は、PHA生産培地である。この培地は増殖培地の炭酸源を有機酸塩及び／又は炭酸塩に置換した培地である。増殖培地の炭酸源を有機酸塩、又は有機酸塩及び炭酸塩に置換した培地が好ましい。有機酸塩、及び炭酸塩は、水和物であってもよい。
【００５７】
有機酸塩には、例えば、アルカン酸塩（例えば、蟻酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、及びカプロン酸塩を含む）、クエン酸塩、リンゴ酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、及び乳酸塩が挙げられる。酢酸塩は特に好適である。酢酸塩の例としては、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。また、炭酸塩の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
【００５８】
PHA生産培地の例として、前記紅色硫黄細菌用の増殖培地Aにおいて、炭素源であるピルビン酸ナトリウムを0.1% 炭酸水素ナトリウム及び0.5% 酢酸ナトリウムに置換した紅色硫黄細菌用のPHA生産培地や、紅色非硫黄細菌用の増殖培地Bにおいて、炭素源であるリンゴ酸ナトリウムとピルビン酸ナトリウムを炭酸水素ナトリウム0.1% 及び酢酸ナトリウム5g/Lに置換した紅色非硫黄細菌用のPHA生産培地が挙げられる。
【００５９】
PHA生産培地は、炭素源の置換に加えて、さらに増殖培地から窒素源、リン酸源、及びビタミンのいずれか一以上を除いた欠乏培地にしてもよい。具体的には、窒素欠乏培地、リン酸欠乏培地、ビタミン欠乏培地、窒素・リン酸欠乏培地、窒素・ビタミン欠乏培地、リン酸・ビタミン欠乏培地、窒素・リン酸・ビタミン欠乏培地が挙げられる。ビタミンの種類は特に限定しないが、ビタミンB1（チアミン）、ビタミンB5（パントテン酸）、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、及びピリドキサミン）、ビタミンB7（ビオチン）、ビタミンB12（コバラミン）が好ましい。欠乏させるビタミンは複数種であってもよい。
【００６０】
これは、光合成細菌におけるPHA生産が窒素、リン酸、及び／又はビタミンの制限により促進されることが知られているためである（例：H. Brandl, et al., 1989, Int J Biol Macromol. 11, 49-55.）。
【００６１】
本ステップでは、増殖ステップ後に回収した菌体を必要に応じて適宜希釈して、PHA生産培地に植菌し、培養する。本ステップ開始時の培地中の細胞数は、限定はしないが、培養液のOD660値が0.03〜2.0の範囲、0.03〜1.5の範囲、0.03〜1.0の範囲又は0.05〜0.8の範囲、好ましくは0.1〜0.5の範囲、より好ましくは0.1〜0.3の範囲になるように調節すればよい。
【００６２】
培養期間は、植菌した紅色光合成細菌が後期対数増殖期又は初期静止期（early stationary phase）まで、具体的には、培養液のOD660値が0.8〜2.0の範囲又は0.8〜1.2の範囲、好ましくは0.8〜1.0の範囲になるまで培養すればよい。
【００６３】
２−２．回収工程
「回収工程」とは、前記培養工程の培養液から紅色光合成細菌を回収する工程である。本工程は、選択工程で、培養液から培地や粗雑物等を除去して、細胞内にPHAを蓄積した紅色光合成細菌を回収することを目的とする。
培養液から菌体を回収する方法は、前述の菌体回収工程に記載の方法に準ずる。
【００６４】
本工程により、細胞内にPHAを蓄積した紅色光合成細菌をスラリーとして得ることができる。必要であれば、回収した紅色光合成細菌を公知の乾燥方法により乾燥してもよい。
【００６５】
乾燥方法は、水分を減じることができれば特に限定はしない。例えば、送風装置等を用いて温風若しくは冷風を当てる通風乾燥法、加熱により水分蒸発させる無風乾燥法、スラリーを適当なバッファで懸濁した後、その懸濁液を気体中に噴霧して急速乾燥させる噴霧乾燥、凍結乾燥（フリーズドライ）法、密閉容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法、外気に晒して放置する自然乾燥法（天日干しを含む）、又はその組み合わせが挙げられる。実際に菌体を乾燥させる場合、上記方法を応用した各種乾燥装置を用いて行えばよい。例えば、ドラムドライヤー、遠赤バンド乾燥機、連続式真空乾燥装置、スプレードライヤー、フリーズドライヤー等が挙げられる。
乾燥後の藻体は、固形状態、顆粒状態又は粉末状態のいずれであってもよい。
【００６６】
２−３．抽出工程
「抽出工程」とは、前記培養工程後の培養液、又は培養液中若しくは回収工程後の紅色光合成細菌（細胞破砕物を含む）からPHAを抽出する工程である。本工程は、選択工程であって、紅色光合成細菌の細胞内に蓄積されたPHAを採取することを目的とする。
【００６７】
本工程で培養液や紅色光合成細菌の細胞からPHAを抽出する方法は、当該分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。
【００６８】
例えば、紅色光合成細菌の細胞内に蓄積したPHAを抽出する場合であれば、物理的方法及び／又は化学的方法により細胞を破砕し、得られた細胞抽出物からPHAを単離する方法が挙げられる。ここでいう細胞抽出物は、固形抽出物、及び液体抽出物（培養液中に混在する細胞抽出物を含む）を包含する。
【００６９】
菌体を破砕する物理的方法としては、例えば、圧潰・圧搾法、超音波法、浸透圧ショック法、又はそれらの組み合わせによる方法が挙げられる。
【００７０】
菌体を破砕する化学的方法としては、例えば、アルカリ法、酵素法が挙げられる。細菌菌体を溶解する具体的な方法については、例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参照すればよい。
【００７１】
得られた細胞抽出物に対して、必要に応じて細胞破砕等のタンパク質を変性除去する処理を行ってもよい。
【００７２】
細胞抽出物からPHAを分離精製する方法は、特に制限しない。例えば、PHAが溶解可能な有機溶媒を抽出溶媒として細胞抽出物に加えて混合し、その後、その抽出溶媒よりも溶解度の低い他の有機溶媒を析出溶媒として加えることで、溶解度の低下により目的のPHAを沈殿させて精製する方法がある。具体的には、例えば、細胞抽出物に抽出溶媒としてクロロホルムを加えPHAを溶解し、続いて、析出溶媒としてヘキサンを加え、沈降したPHAを回収すればよい。抽出溶媒又は析出溶媒としての有機溶媒には、メタノール、エタノールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素を使用することができる。その他、特開2005-348640等に記載の公知の精製方法を用いて分離精製してもよい。
【００７３】
PHAが紅色光合成細菌の菌体外に漏出又は排出され、培養液中に含まれる場合であれば、培養液に前記抽出溶媒を直接加えて混合し、遠心した後、有機溶媒層を回収する。その後、析出溶媒を加え、上記と同様に沈殿したPHAを回収すればよい。
【実施例】
【００７４】
（目的）
本発明のPHA生産方法を用いて、紅色光合成細菌を培養することで目的のPHAが細胞内に蓄積することを確認した。
【００７５】
（方法）
１．紅色光合成細菌
本実施例における紅色光合成細菌は、以下の表１に示す海洋性の紅色硫黄細菌16株、及び表２に示す海洋性の紅色非硫黄細菌17株の計33株を寄託機関から入手して使用した。表中の「Resource number」で「JCM」のコードを有する株はRIKENバイオリソースセンター（日本）から、「DSM」のコードを有する株はDSMZ（ドイツ）から、そして「ATCC」のコードを有する株はATCC（USA）から、入手した。また、表中の「生育温度」は、各寄託機関で公開されている培養温度である。
【００７６】
【表１】
2018133997.tif 000009
【００７７】
【表２】
2018133997.tif 000010
【００７８】
上記33株のうち、下記増殖培地を用いて、下記培養方法で培養を行った結果、液体培地と寒天培地の少なくとも一方で、3〜7日の比較的短い期間内で良好な生育が見られた12株（紅色硫黄細菌3株、紅色非硫黄細菌9株：表１及び２で種名に星印を付した株）を選択し、PHA生産能に関する解析に使用した。
【００７９】
２．細菌培養
本実施例における紅色光合成細菌は、以下の培地や培養方法で培養した。
【００８０】
（１）培地
・増殖培地A（紅色硫黄細菌増殖用）
（組成）
KH2PO4: 0.5g/L, CaCl2・2H2O: 0.15g/L, MgSO4・7H2O: 2.0g/L, NH4Cl: 0.64g/L, NaCl: 20g/L, ピルビン酸ナトリウム: 3.0g/L, yeast extract: 0.4g/L, ビタミンB12: 2mg/L, Na2S・9H2O: 240mg/L, Na2S2O3・5H2O: 1.5g/L, FeCl2・6H2O: 1.5g/L, ZnCl2・5H2O: 70mg/L, MnCl2・4H2O: 100mg/L, H3BO3: 62mg/L, CoCl2・6H2O: 190mg/L, CuCl2・2H2O: 17mg/L, NiCl2・6H2O: 24mg/L, Na2MoO4・H2O: 36mg/L
培地のpHは7.5に調整した。
【００８１】
・増殖培地B（紅色非硫黄細菌増殖用）
（組成）
KH2PO4: 0.5g/L, CaCl2・2H2O: 0.25g/L, MgSO4・7H2O: 3.0g/L, NH4Cl: 0.68g/L, NaCl: 20g/L, リンゴ酸ナトリウム: 3.0g/L, ピルビン酸ナトリウム: 3.0g/L, イースト・エクストラクト: 0.4g/L, クエン酸酸化鉄: 5mg/L, ビタミンB12: 2mg/L, ZnCl2・5H2O: 70 mg/L, MnCl2・4H2O: 100mg/L, H3BO3: 60mg/L, CoCl2・6H2O: 200 mg/L, CuCl2・2H2O: 20mg/L, NiCl2・6H2O: 20mg/L, Na2MoO4・H2O: 40mg/L
培地のpHは6.8に調整した。
【００８２】
・PHA生産培地A（紅色硫黄細菌PHA生産用）
（組成）
増殖培地AからNH4Cl及びピルビン酸ナトリウムを除き、炭素源として、1Lあたり1g 炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）及び／又は5g 酢酸ナトリウム（CH3COONa）を添加した。培地のpHは増殖培地Aと同様に7.5に調整した。
【００８３】
・PHA生産培地B（紅色非硫黄細菌PHA生産用）
（組成）
増殖培地BからNH4Cl、リンゴ酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウムを除き、炭素源として、1Lあたり1g 炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）及び／又は5g 酢酸ナトリウム（CH3COONa）を添加した。培地のpHは増殖培地Bと同様に6.8に調整した。
【００８４】
（２）培養方法
・増殖培養
各紅色光合成細菌は、遠赤色（far-red）のLED光条件下（ピーク波長730nm、放射照度8W/m2)、30℃にて、multi position stirrer（リモート・マルチ60型  アイシス）を用いてスクリューキャップビン（IWAKI）中で連続振盪しながら培養した。
【００８５】
・PHA生産培養
紅色硫黄細菌を増殖培地Aで、また紅色非硫黄細菌を増殖培地Bで、それぞれ増殖培養条件で培養し、対数期（OD660＝約1.0）の時点で細菌細胞を回収した。回収した細胞は、PHA産生培地で洗浄した後、開始時のOD660が0.1となるようにPHA産生培地で希釈した後、30℃にて、multi position stirrerを用いてスクリューキャップビン中で連続振盪しながら1週間培養した。細胞を1週間後に回収し、20mM Tris-HCl (pH7.0)で洗浄した後、凍結乾燥した。
【００８６】
３．ポリマーの量及び組成の解析
約0.5〜2mgの凍結乾燥細胞を100％エタノール中で70℃にて1時間インキュベートして色素を除いた。これらの細胞を用いて、250μLのクロロホルム、100μLの塩酸、及び850μLのエタノール存在下で、100℃にて4時間、エタノリシス（エタノールを用いたエステル交換反応）を行った。冷却後、反応混合液にリン酸バッファ(pH 8.1)を加えて、0.65N NaOHで中和した。1,500rpmで5分間遠心した後、クロロホルム層を、無水硫酸ナトリウムを通して濾過し、分子篩で30分間インキュベートした。PHAの量と組成を30m × 0.25 mm DB-1キャピラリ―ガスクロマトグラフィーカラム(Agilent Technologies)を装備したGCMS-QP2010 Ultra（Shimadzu）を用いて決定した。
【００８７】
1μLのサンプル溶液にキャリアガスであるヘリウムを3.30mL/分で注入した。45℃で1分間、温度傾斜７℃/分で117℃まで上昇させる温度プログラムを用いて、エチルエステルを分離した。界面温度及びイオン源温度は、それぞれ250℃及び230℃とした。3HB量は、較正曲線から決定した。3HVの相対量は、3HBの構成極性から推定した。PHA量は、乾燥細胞重量％として算出した。
【００８８】
４．PHAの抽出
PHAは、クロロホルム中で凍結乾燥細胞から抽出した。抽出物は、濾紙（5C ADVANTEC）を用いて濾過し、ロータリー・バキューム・エバポレーター（アズワン）を用いて濃縮した。その後、クロロホルム抽出したPHAをヘキサンで沈降させることによってPHA精製を行った。PHA沈降物は濾過した後、一晩風乾した。クロロホルム中に溶解したPHAを、ロータリー・バキューム・エバポレーター（アズワン）を用いて再度濃縮し、冷却メタノールで沈降させることによって精製した。PHA沈降物は濾過した後、一晩風乾した。精製したPHAをクロロホルムに溶解し、さらなる解析に用いた。
【００８９】
５．PHAの特徴付け
精製したPHAをプロトン核磁気共鳴(1H NMR) (JNM-Excalibur 270; JEOL, Ltd.)により解析し、詳細な化学構造及び組成を決定した。NMR用サンプルは、CDCl3中に0.05 v/v %のテトラメチルシラン（TMS) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）を用いて4 mg/mLの濃度で溶解した。PHAの分子量は、40℃で、Shodex K- 806M、K802及びK-Gカラムを備えたゲル浸透クロマトグラフィー(GPC) (RI-2031, PU-2086, AS-2055, CO-2056; JASCO)により決定した。クロロホルムを流速0.8 mL/分の移動相として用いた。精製したPHAの濃度は、約1 mg/mLであった。またその分子量は、分子量1.32 × 103、3.25 × 103、1.01 × 104、2.85 × 104、6.60 × 104、1.56 × 105、4.60 × 105、1.07 × 106、及び3.15 × 106のポリスチレン標準物との比較によって推定した。
【００９０】
（結果）
結果を、表３及び４、図１及び２に示す。
【００９１】
【表３】
2018133997.tif 000011
【００９２】
【表４】
2018133997.tif 000012
【００９３】
表３は、選択した12種の紅色光合成細菌を増殖培地のみで培養したとき（Growth condition）、及び増殖培地で培養後、増殖培地から窒素源であるNH4Clを除き、炭素源を0.1％の炭酸水素ナトリウム及び0.5％の酢酸ナトリウムに置換したPHA生産培地（w/o NH4Cl；0.1% NaHCO3＋0.5% accetate）で培養したときの、乾燥菌体重量あたりのPHA量、及びPHAにおけるポリマーの組成を示している。
【００９４】
表４は、選択した12種の紅色光合成細菌を増殖培地で培養後、増殖培地から窒素源であるNH4Clを除き、炭素源を0.1％の炭酸水素ナトリウムのみに置換したPHA生産培地（w/o NH4Cl；0.1% NaHCO3）、及び0.5％の酢酸ナトリウムのみに置換したPHA生産培地（w/o NH4Cl； 0.5% accetate）でそれぞれ培養したときの、乾燥菌体重量あたりのPHA量、及びPHAにおけるポリマーの組成を示している。
【００９５】
表で示すように検証した全ての紅色光合成細菌がPHAを蓄積できることが判明した。
紅色硫黄細菌3種、及び紅色非硫黄細菌Afifella marina、Rhodovulum tesquicola及びRoseospira visakhapatnamensisの3種は、生育条件下と比較して窒素制限下で顕著なPHAの蓄積が確認できた。他の6種については、窒素制限によるPHA蓄積量の変化は見られなかった。
【００９６】
また、本実施例で検証した紅色硫黄光合成細菌は、PHAとして3-ヒドロキシブタン酸（3HB）のみからなるモノポリマー（モノポリエステル）を産生した。一方、本実施例で検証した全ての紅色非硫黄光合成細菌は、3-ヒドロキシブタン酸（3HB）及び3-ヒドロキシバレリン酸（3HV）からなるコポリエステルを産生することが明らかとなった。
【図１】
2018133997.tif 000013
【図２】
2018133997.tif 000014