(57)【要約】      （修正有）【課題】感染性疾患、自己免疫疾患、同種因子の投与に対する免疫反応、アレルギー性疾患、腫瘍の治療、移植片拒絶反応の予防、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスタンパク質に対する免疫化の予防に使用するための、活性を増加させるための、ＣＤ４＋ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞により認識されるエピトープを含有する新たなペプチドの提供。【解決手段】（ｉ）病原体関連抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオール−オキシドレダクターゼモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチド。さらにＮＫＴ細胞エピトープは、腫瘍関連抗原、同種抗原、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクター、に由来する上記ペプチド。【選択図】図３
2018011592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された免疫原性ペプチドであって、前記免疫原性ペプチドは、
（１）  抗原性タンパク質の［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］モチーフを有するナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞エピトープと、
（２）  前記ＮＫＴ細胞エピトープのすぐ隣に隣接するか、または、最大で７個のアミノ酸のリンカーにより前記ＮＫＴ細胞エピトープから分離された、チオレダクターゼ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフと、
（３）  ペプチドのＮおよび／またはＣ末端において１０個以下のアミノ酸の任意のフランキングアミノ酸配列とからなり、
ここにおいて、前記抗原性タンパク質は、その天然の配列において前記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するＮまたはＣ末端に１１個のアミノ酸の［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを含まず、ここにおいて、前記単離された免疫原性ペプチドはサバイビンフラグメントＣＨＧＣＦＫＥＬＥＧＷＥＰではない、ペプチド。
【請求項２】
単離された免疫原性ペプチドであって、前記免疫原性ペプチドは、
（１）  抗原性タンパク質の［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］モチーフを有する７個の連続するアミノ酸からなるナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞エピトープと、
（２）  前記ＮＫＴ細胞エピトープのすぐ隣に隣接するか、または、最大で７個のアミノ酸のリンカーにより前記ＮＫＴ細胞エピトープから分離された、チオレダクターゼ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフと、
（３）  ペプチドのＮおよび／またはＣ末端において１０個以下のアミノ酸の任意のフランキングアミノ酸配列とからなり、
ここにおいて、前記抗原性タンパク質は、その天然の配列において前記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するＮまたはＣ末端に１１個のアミノ酸の［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを含まない、ペプチド。
【請求項３】
ＮＫＴ細胞を活性化可能である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ＮＫＴ細胞エピトープがＦＫＥＬＥＧＷではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記抗原性タンパク質がサバイビンではない、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記抗原性タンパク質が腫瘍関連抗原性タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記腫瘍関連抗原性タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ＮＫＴ細胞エピトープは、［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷ］モチーフを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記チオレダクターゼモチーフは、配列Ｃ−ＸＸ−Ｃを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
医薬としての使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、または、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
細胞内病原体による感染症、自己免疫疾患、同種因子またはアレルゲン曝露に対する免疫応答、同種移植片拒絶反応、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに対する免疫応答からなる群から選択される病状に対する薬剤であって、前記薬剤は、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを含有するか、または、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸を含有する、薬剤。
【請求項１２】
哺乳類における、細胞内病原体による感染症、自己免疫疾患、同種因子またはアレルゲン曝露に対する免疫応答、同種移植片拒絶反応、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに対する免疫応答からなる群から選択される病状の予防または治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを含有するか、または、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸を含有する、医薬組成物。
【請求項１３】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の検出、調製および欠失のための請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドのインビトロでの使用。
【請求項１４】
ＮＫＴ細胞活性化を惹起することの可能なペプチドを調製するための方法であって、前記方法は、
（１）  ［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］モチーフを含有するＮＫＴ細胞エピトープを有する腫瘍関連抗原性タンパク質のペプチド配列を提供するステップと、
（２）  チオレダクターゼ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを含有する配列を、前記ペプチド配列に、前記チオレダクターゼモチーフおよび前記ＮＫＴ細胞エピトープが互いのすぐ隣に隣接するか、または、最大で７個のアミノ酸のリンカーにより分離されるように連結させるステップと、
（３）  任意に、ペプチドのＮおよび／またはＣ末端において１０個以下のアミノ酸のフランキングアミノ酸配列をさらに連結させるステップとを含む、方法。
【請求項１５】
チオレダクターゼＣ−ｘｘ−Ｃモチーフを有する配列を、前記ペプチド配列に連結させるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原は、その天然の配列において前記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するＮまたはＣ末端に１１個のアミノ酸の［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］モチーフを含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団を得るためのインビトロの方法であって、前記方法は、
インビトロで末梢血細胞を腫瘍関連免疫原性ペプチドと接触させるステップを含み、前記免疫原性ペプチドは、
（１）抗原性タンパク質の［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］モチーフを有するＮＫＴ細胞エピトープと、
（２）前記ＮＫＴ細胞エピトープのすぐ隣に隣接するか、または、最大で７個のアミノ酸のリンカーにより前記ＮＫＴ細胞エピトープから分離された、チオレダクターゼＣ−ＸＸ−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−ＸＸ−Ｃモチーフと、
（３）ペプチドのＮおよび／またはＣ末端において１０個以下のアミノ酸の任意のフランキングアミノ酸配列とからなり、前記方法はさらに、
ＩＬ−２またはＩＬ−１５またはＩＬ−７の存在下で前記細胞を増殖させるステップであって、ここにおいて前記抗原性タンパク質は、自己抗原、同種因子、アレルゲン、移植片より脱落した同種抗原、細胞内病原体の抗原、または、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターからの抗原である、ステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記チオレダクターゼモチーフがＣｘｘＣである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の方法により得られる、抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団。
【請求項２０】
医薬としての請求項１９に記載の抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団。
【請求項２１】
細胞内病原体による感染症、自己免疫応答、同種因子に対する免疫反応、アレルゲンに対する免疫応答、同種移植片拒絶反応、または、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスタンパク質に対する免疫応答からなる群から選択される病状に対する薬剤であって、前記薬剤は、請求項１９に記載の抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団を含有する、薬剤。
【請求項２２】
細胞内病原体による感染症、自己免疫応答、および同種因子に対する免疫反応、アレルゲンに対する免疫応答、同種移植片拒絶反応、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスタンパク質に対する免疫応答からなる群から選択される病状の予防または治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１９に記載の抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団を含有する、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫原性ペプチドに関し、さらに、感染症、自己免疫疾患、同種因子に対する免疫応答、アレルギー性疾患、腫瘍、移植片拒絶反応、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターに対する免疫応答を治療する際の免疫原性ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳類の多くの疾患の治療は、特定の医薬が存在しないことにより限定されている。
【０００３】
細胞内病原体により引起こされる感染症では、感染症は、感染細胞を認識して除去する免疫応答の不全のために存続する。多くの病原体が、この病原体により侵された細胞内のクラスＩの主要組織適合性複合体（クラスＩＭＨＣ）などの分子の表面発現を減少させることにより、細胞溶解免疫応答（cytolytic immune response）を惹起する免疫系の能力を減少させるが、細胞溶解免疫応答は、ＣＤ８＋系列のＴリンパ球が、病原体由来エピトープを提示するクラスＩＭＨＣを認識し、それらにより活性化されるときに惹起される。細胞溶解リンパ球が病原体により侵された細胞を除去し得る代替的な戦略が、非常に望ましいであろう。このような戦略として、同族エピトープを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）のアポトーシスを誘発する細胞溶解ＣＤ４＋Ｔ細胞を惹起するために、細胞内病原体に由来し、かつチオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合されたクラスＩＩ拘束性エピトープを使用する戦略が提案されている（欧州特許公開第２  ０５９  ２５６号）。しかしながら、細胞溶解Ｔ細胞の代替的なサブセットの動員および活性化には、細胞内病原体に感染した細胞の除去を増加させるという明確な可能性があるであろう。
【０００４】
自己免疫疾患では、同種因子の投与に対する免疫応答およびアレルギー性疾患と同様に、自己抗原、同種因子またはアレルゲンからのペプチドを提示する細胞を除去し、望ましくない免疫応答を予防することによって、このような望ましくない免疫応答に関連する疾患を予防することが有利である。このような状況下では、自己抗原、同種因子またはアレルゲンからのエピトープは、クラスＩＩＭＨＣ、および、エピトープとクラスＩＩ決定因子により活性化されたＣＤ４＋系列のＴリンパ球との間で形成される複合体によって主に提示される。この結果、Ｂリンパ球が活性化され、上記自己抗原、同種因子またはアレルゲンに対する抗体が産生される。細胞溶解によりＡＰＣを除去する方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を予防することにより、抗体の産生を予防するであろう。このような戦略として、自己抗原、またはアレルゲン、または同種因子のそれぞれのクラスＩＩ拘束性エピトープをチオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合させて使用する戦略が、特許出願ＷＯ２００８／０１７５１７Ａ１号に提案され、記載されている。上記モチーフに結合されたクラスＩＩ拘束性エピトープへの曝露により惹起される、細胞溶解クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同族エピトープを提示するＡＰＣの細胞死を誘発する。しかしながら、代替的な細胞溶解Ｔ細胞の動員および活性化は、有益な代替的戦略であろう。
【０００５】
腫瘍の場合、細胞は、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ決定因子の表面発現をダウンレギュレートすることにより除去を免れる。したがって、腫瘍抗原に特異的な細胞溶解Ｔ細胞が惹起される戦略があれば、腫瘍の治療に非常に望ましい戦略となるであろう。ＷＯ２００９／１０１２０５号は、腫瘍由来抗原のクラスＩＩ拘束性提示により活性化された細胞溶解Ｔ細胞が、腫瘍除去に有用であることを教示している。しかしながら、このアプローチは、腫瘍によるＭＨＣクラスＩＩ決定因子の不十分な発現により限定されている。
【０００６】
移植片拒絶反応では、慢性的拒絶反応の過程は、移植片より脱落し、レシピエントの抗原提示細胞により提示された抗原の、自己のＴリンパ球への間接的な提示により進行される。間接的な提示は、クラスＩおよびクラスＩＩエピトープの両方による移植片由来エピトープの提示により起きる。移植片抗原のクラスＩＭＨＣ提示により活性化されたＣＤ８系列のＴリンパ球は、移植片に移動して、移植された細胞上に直接あるそれらの同族エピトープを認識することより、拒絶反応を媒介する。しかし、ＣＤ８細胞の活性化は、クラスＩＩＭＨＣ決定因子による移植片由来抗原の間接的な提示により活性化されるＣＤ４細胞からの助けを必要とする。ＷＯ２００９／１００５０５号は、移植片に由来し、チオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合されたクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープの使用により、間接的な提示に加担するＡＰＣのアポトーシスによる除去が可能であることを教示している。しかしながら、細胞溶解Ｔ細胞の別のサブセットが生成される代替的な戦略が、非常に望ましいであろう。
【０００７】
同様に、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種などの新規な治療のアプローチは、遺伝子組換えまたはワクチン接種のために使用されるウイルスベクターに対する宿主免疫応答により、著しく限定されている。このような状況の両方において、ウイルスベクターに由来する抗原は、間接的な抗原提示、すなわち、ベクターで形質導入され、宿主ＡＰＣにより宿主リンパ球に提示された細胞より脱落する。注目すべきは、多くのウイルスベクターは適応免疫系を活性化し、特異的抗体の産生および特異的Ｔ細胞の活性化をもたらすだけでなく、これらのウイルスベクターは、自然免疫系も活性化することである。自然免疫の活性化は、適応応答のアジュバントとして役立つ。ＷＯ２００９／１０１２０４号は、ウイルスベクターに由来し、チオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合されたクラスＩＩ拘束性エピトープが、細胞溶解クラスＩＩ拘束性ＣＤ４Ｔ細胞の活性化を惹起できることを教示している。しかしながら、自然免疫系の活性化を抑制する代替的な戦略が、非常に望ましい。
【０００８】
ここに挙げるすべての例において、抗原特異的な細胞溶解Ｔ細胞が惹起され得ることにより、上記特異的抗原を提示するＡＰＣを抗原特異的に除去する代替的な戦略が、非常に有益であろうことが当業者には自明である。
【０００９】
本発明は、このような代替的戦略を提示する。
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、非古典的ＭＨＣ複合体分子ＣＤ１ｄにより提示された抗原を認識する、非従来Ｔリンパ球の明確なサブセットを構成する。ＮＫＴ細胞の２つのサブセットが現在記載される。インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ）とも呼ばれる１型ＮＫＴ細胞は、最も豊富である。それらは、マウスではＶa１４、ヒトではＶa２４であるインバリアントα鎖からなるa−βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により特徴付けられる。このα鎖は、可変的であるが、限定的な数のβ鎖に結合する。２型ＮＫＴ細胞は、a−βＴＣＲを有するが、多形のa鎖を伴う。しかしながら、その表現型は未だ完全に規定されていないが、ＣＤ１ｄ分子との関連で提示される糖脂質により活性化されるという特徴を共有する、ＮＫＴ細胞の他のサブセットが存在することは明らかである。
【００１０】
ＮＫＴ細胞は、典型的には、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫ１．１を含む、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体の組合せを発現する。ＮＫＴ細胞は、完全なエフェクター能を取得する前に増殖を必要としないという点により、適応免疫系と識別することができる自然免疫系の一部である。それらのメディエーターのほとんどが事前形成され、転写を必要としない。ＮＫＴ細胞は、細胞内病原体および腫瘍拒絶反応に対する免疫応答における主要な役者であることが示されている。自己免疫疾患および移植拒絶反応の制御におけるそれらの役割も唱えられている。
【００１１】
認識単位であるＣＤ１ｄ分子は、β−２ミクログロブリンの存在を含めて、ＭＨＣクラスＩ分子に非常に似通った構造を有している。それは、２つのα鎖を境界とし、疎水性の高い残基を含有する深い間隙により特徴付けられ、間隙は脂質鎖を受容する。間隙は両末端で開いており、より長い鎖を収めることができる。ＣＤ１ｄについての基準リガンドは、合成aガラクトシルセラミド（aＧａｌＣｅｒ）である。しかしながら、糖リン脂質およびリン脂質、ミエリンに存在する天然脂質スルファチド、微生物ホスホイノシトールマンノシドおよびa−グルクロノシルセラミドを含む、多くの天然の代替的なリガンドが記載されている。当該技術分野における現在のコンセンサスは（Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368およびGodfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206などの概説を参照）、ＣＤ１ｄは、脂質鎖を含有するリガンドのみに結合するか、または、一般的には、ＣＤ１ｄ内に埋込まれる脂質尾部およびＣＤ１ｄから突き出す糖残基の頭部からなる共通の構造に結合するということである。
【００１２】
ペプチドは、ＣＤ１ｄによる提示を介してＮＫＴ細胞を活性化することが可能とはみなされない。しかしながら、嵩高いアミノ酸残基を含有する長い疎水性ペプチドが、ＣＤ１ｄに結合できたことが示唆された（Castano et al, Science 1995, 269: 223-226）。既定の生理学的関連性を有さないランダム配列ペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを使用して行なわれた観察により、理論的コンセンサスモチーフを確立することができた（Castano et al, Science 1995, 269: 223-226および以下を参照）。
【００１３】
実際に、Castano et alは、活性化された細胞がＮＫＴ細胞でなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞、すなわち、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞であることを示した。これらの発見は、疎水性ペプチドがＣＤ１ｄ分子によって提示されるという証拠は全くないことを当業者に教示している。Castano et alによりなされた主張の生理学的妥当性は、従来の免疫化プロトコルに基づいてＮＫＴ細胞を惹起することができなかったため、さらに疑問視された（Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368およびBrutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775）。ＣＤ１ｄを過剰発現するためにトランスフェクトされ、インビトロでオバルブミン由来ペプチドが添加された細胞による免疫化などの人工系は、ＮＫＴ細胞を惹起することができた。同様に、マウスＣＤ１ｄおよび同時刺激分子を伴うプラスミドＤＮＡによる皮内免疫化は、細胞溶解ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を誘発する（Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438）。ＣＤ１ｄ分子の各端部に配置された、ＣＤ１ｄ疎水性ポケットに結合するためのアンカー残基であるＰ１位およびＰ７位の芳香族残基と、Ｐ４位の脂肪族鎖とからなる構造モチーフを含有する疎水性ペプチドは、ＣＤ１ｄ結合エピトープに対するコアモチーフを含有することが、Castano et alにより主張された（Science 269: 223, 1995）。上記のように、Castano et alが達した結論は、データにより裏付けられていない。
【００１４】
我々は、疎水性アミノ酸配列を包含するペプチドが、実際には、ＮＫＴ細胞の活性化を惹起することができるという予期せぬ発見をした。このような配列の一例は、モチーフ［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷ］により表わされ、式中、［ＦＷ］は、フェニルアラニンまたはトリプトファンから選択されるアミノ酸であり、［ＩＬＭ］は、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンから選択されるアミノ酸である。Ｐ７の［ＦＷ］は、許容性であると言え、ＦまたはＷのいずれかの代わりにＴまたはＨを使用してもよいことを意味する。
【００１５】
我々はさらに、ＣＤ１ｄ結合モチーフは、チオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合されると、ＮＫＴ活性を特に効率的に調節することを発見した。このモチーフは、Ｃ−ＸＸ−Ｃの一般構造を表わし、式中、Ｃはシステイン、Ｘはチロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを除く任意のアミノ酸である。特許出願ＷＯ２００８／０１７５１７Ａ１号は、チオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合されたクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープが、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４Ｔ細胞の表現型および機能を、強力な細胞溶解細胞へと変換し、ＡＰＣのアポトーシスを誘発する性質を獲得することを教示している。この効果は、ＡＰＣとＴ細胞との間の増加したシナプス形成のためであり、これは、Ｔ細胞の表面でのＣＤ４分子の還元および異性化の結果である。
【００１６】
ＮＫＴ細胞の大多数はＣＤ４共受容体を有しているが、その役割は未だ明確に規定されていない。しかしながら、最近の刊行物では、ＣＤ４は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するのとほぼ同様に、ＣＤ１ｄ分子に結合することが示唆された（Thedrez et al Blood 110: 251-258, 2007）。さらに、ＣＤ４の存在は、ＮＫＴ細胞の完全な活性化に必要であることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明は、ＣＤ１ｄに結合する能力を有する疎水性ペプチドを使用することにより、チオール−オキシドレダクターゼモチーフに結合させたＮＫＴ細胞を動員し、活性化させることに関する。このようなペプチドは抗原特異性を確保し、下記の治療のための有益なアプローチとなる。
【００１８】
（１）感染細胞が、病原体に由来し、かつＣＤ１ｄに結合された疎水性ペプチドを提示する、細胞内病原体による感染性疾患。したがって、このようなＮＫＴ細胞の増加したＮＫＴ動員および／または活性は、感染細胞の除去と同時に起きるであろう。
【００１９】
（２）自己免疫疾患、同種因子の投与に対する免疫応答およびアレルギー性疾患。これらの３タイプの疾患の各々に関連する抗原は、ＣＤ１ｄにより提示される疎水性ペプチドを生成する。したがって、抗原特異的ＮＫＴ細胞の増加した動員および／または活性は、抗原提示細胞を除去する助けをすることにより、望ましくない免疫応答を除去し得る。
【００２０】
（３）腫瘍。腫瘍細胞は、ＮＫＴ細胞により認識され得る腫瘍特異的抗原を有するＣＤ１ｄをしばしば発現するためである。このようなＮＫＴ細胞の活性および動員を増加させることは、腫瘍除去の増加につながるであろう。
【００２１】
（４）移植片拒絶反応。宿主抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄとの関連で移植片に由来する疎水性ペプチドを提示するためである。宿主ＮＫＴ細胞によるこれらのペプチドの認識は、抗原提示細胞の除去につながり、慢性的移植片拒絶反応プロセスを中断させるであろう。
【００２２】
（５）ウイルスベクターに由来し、かつ形質導入された細胞より脱落した抗原が、ＣＤ１ｄ決定因子により提示される遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種。ウイルスベクター抗原の認識を介して宿主ＡＰＣを除去するＮＫＴ細胞の動員および活性化は、導入遺伝子発現の持続性および遺伝子ワクチン接種における導入遺伝子の完全な免疫原性の維持の両方に有益であろう。
【００２３】
本発明の治療目的に加えて、我々は、ＣＤ１ｄエピトープのフランキング残基内にオキシドレダクターゼモチーフを追加することにより、ＴＣＲ結合が増加し、その結果、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の非常に改善された検出が得られるという予期せぬ所見を得た。したがって、本発明に記載するような、天然ＣＤ１ｄ拘束性エピトープ、および、少なくとも１つのＣｘｘＣ型式のチオレダクターゼモチーフを包含するペプチド（式中、Ｃはシステイン、ｘは、システインまたは嵩高い残基を除く任意のアミノ酸を表わす）は、下記を主な目的とする。
【００２４】
（１）分析目的：ワクチン接種前のＮＫＴ細胞前駆体の頻度の検出、ＣＤ１ｄ複合体に対するペプチド結合親和性の評価、ワクチン接種の間または免疫抑制下での特異的ＮＫＴ細胞の検査、その生物活性に関わらない細胞の同定、疾患のメカニズムに関与する細胞の同定、特異的ＮＫＴ細胞の欠失、および臓器生検などにおけるインサイチューでのＮＫＴ細胞の検出。
【００２５】
（２）調製用目的：培養および精製用のＮＫＴ細胞の機能および調製の評価のための特異的ＮＫＴ細胞の調製。
【００２６】
（３）細胞療法を目的とした細胞集団の品質管理。
（４）臓器移植前の特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の欠失を含む、治療目的。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の概要
本発明は、対象における細胞内病原体による感染症の、当該細胞内病原体に由来する特異的抗原に対する免疫応答を増加させることによる、予防および治療のための単離された免疫原性ペプチドの使用に関する。
【００２８】
本発明は、自己免疫応答、同種因子の投与に対する免疫応答、およびアレルゲンへの曝露に対する免疫応答の予防および治療のための単離された免疫原性ペプチドの使用にも関する。
【００２９】
本発明はさらに、腫瘍の治療のための単離された免疫原性ペプチドの使用に関する。
本発明は、移植片拒絶反応の予防のための単離された免疫原性ペプチドの使用にも関する。
【００３０】
本発明は、遺伝子療法および／または遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスタンパク質に対する免疫応答の予防のための単離された免疫原性ペプチドの使用にも関する。
【００３１】
本発明は、ＮＫＴ細胞の検出、調製および欠失のためのペプチドにも関する。
本発明は、一局面では、（ｉ）病原体関連抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオール−オキシドレダクターゼモチーフ（簡略してチオレドックスモチーフ）とを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、対象における上記病原体による感染症を予防および／または治療するための医薬としての使用に関する。
【００３２】
さらなる局面では、本発明は、（ｉ）自己抗原、同種因子またはアレルゲンに由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、対象における自己抗原、同種因子および／またはアレルゲンに対する免疫応答の予防および／または治療のための医薬としての使用も包含する。
【００３３】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）腫瘍関連抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、対象における腫瘍を治療するための医薬としての使用も包含する。
【００３４】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）同種抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、対象における移植片の拒絶反応を予防するための医薬としての使用も包含する。
【００３５】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクターに由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、対象におけるウイルスベクターに対する免疫応答を予防するための医薬としての使用も包含する。
【００３６】
さらなる局面では、本発明は、（ｉ）病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、上記対象におけるＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の活性化、サイトカイン産生および細胞溶解活性を増加させるための医薬としての使用も包含する。
【００３７】
一般的に、本発明は、レシピエントにおけるＣＤ４＋ＮＫＴ細胞応答を増加させることにより、当該レシピエントにおいて、細胞内病原体による感染症を予防または治療する、自己抗原、同種因子、アレルゲンに対する免疫応答を予防または治療する、腫瘍を治療する、同種抗原またはウイルスベクター抗原に対する免疫化を予防する際に使用するための、（ｉ）病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原、またはウイルスベクター抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、免疫原性ペプチドを提供する。
【００３８】
本発明は、ＮＫＴ細胞の１型（ｉＮＫＴ）または２型のいずれかのサブセット、ならびに、より特徴付けが明確でないＮＫＴ細胞のＮＫＴサブセットにも関し、これらのすべては、ＣＤ４共受容体と、ＣＤ１ｄ結合ペプチドを認識することの可能なＴＣＲb鎖とを有するとして特徴付けられる。
【００３９】
本発明は、ＣＤ１ｄに結合してＮＫＴ細胞に提示可能な疎水性ペプチドにも関する。
本発明は、少なくとも１つのＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞エピトープを包含する疎水性ペプチドに関する。ＣＤ１ｄ分子の構造は、ＣＤ１ｄ間隙の末端に配置された、２つの疎水性ポケットを占有する疎水性アミノ酸残基が必要であり、脂肪族残基は、間隙の中央の位置を占有するべきであることを示す。したがって、ＣＤ１ｄ結合配列の一般的な例として、モチーフ［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］が使用され得、式中、［ＦＷ］は、ＦまたはＷのいずれかが第１のアンカー残基（Ｐ１）を占有し得ることを示し、Ｐ４位が、Ｉ、Ｌ、またはＭのいずれかにより占有され得ることを示し、Ｐ７が、Ｆ、Ｗ、ＴまたはＨにより占有され得ることを示す。この一般的なモデルモチーフにおけるｘは、任意のアミノ酸を表わす。これらのアミノ酸残基のさまざまな組合せが可能であることは当業者には明らかであるはずである。特定の実施形態では、一般的なモデルモチーフは、［ＦＷＴＨ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷ］などの反復配列として提示され得る。
【００４０】
上記チオレドックスモチーフは、コンセンサス配列（［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］）からなり、式中、［ＣＳＴ］は、システイン、セリンおよびトレオニンから選択されるアミノ酸であり、Ｘは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびトリプトファン（Ｗ）を除く任意のアミノ酸であり得る。上記チオレドックスモチーフは、ペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれか、または、各末端に加えられ、１から７個の間のアミノ酸のリンカーにより上記ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞エピトープから分離されていてもよい。
【００４１】
特定の実施形態では、上記リンカーは、天然フランキング残基の一部であるアミノ酸を含有する。
【００４２】
本発明はさらに、上に記載したようなＮＫＴ細胞の集団を得るかまたは誘発するための方法であって、方法は、
（ｉ）  単離された天然ＣＤ４＋Ｔ細胞を提供するステップと、
（ii）  当該細胞を免疫原性ペプチドと接触させるステップとを含み、免疫原性ペプチドは、ＣＤ１ｄ分子により提示されるＴ細胞エピトープと、上記Ｔ細胞エピトープに隣接するか、または、最大で７個のアミノ酸のリンカーにより上記Ｔ細胞エピトープから分離された、Ｃ−ＸＸ−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−ＸＸ−Ｃモチーフとを含有し、方法はさらに、
（iii）  上記細胞をＩＬ−２／ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させるステップを含む方法、に関する。
【００４３】
さらなる局面では、本発明は、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団を同定する方法であって、方法は、
（ｉ）  分離された天然ＣＤ４＋Ｔ細胞を提供するステップと、
（ii）  細胞傷害性であると考えられるＣＤ４＋Ｔ細胞を提供するステップと、
（iii）  ステップ（ｉ）で提供されたＴ細胞と比較して、ステップ（ii）で提供されたＴ細胞が、上に記載した特徴を示すことを判定するステップとを含む、方法を包含する。
【００４４】
上記の使用のいずれかにおいて、上記細胞内病原体関連抗原は、細胞内生活環を有するウイルス、バクテリア、マイコバクテリアまたは寄生生物に由来する任意の抗原であってもよい。
【００４５】
上記のいずれかにおいて、上記自己抗原は、自己免疫疾患に関連する任意の抗原であってもよい。このような疾患の例は、インスリン依存型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、および甲状腺炎を含む。
【００４６】
上記のいずれかにおいて、上記同種因子は、ポリペプチドまたはタンパク質であり、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびスタフィロキナーゼを含む、凝固異常または繊溶異常のための補充療法に使用される因子、インスリンおよび成長ホルモンなどのホルモン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび成長因子、アレルギー性疾患における抗ＩｇＥ抗体を含む、免疫応答の調節のための抗体、移植片拒絶反応および種々の自己免疫疾患における抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２０抗体、関節リウマチにおける抗ＴＮＦ−a抗体、ならびに、腎不全におけるエリスロポイエチンである。
【００４７】
上記のいずれかにおいて、上記アレルゲンは、イエダニ、花粉または飼育動物に由来する空中アレルゲン、落花生、オバルブミン、穀類、果物および豆果などの食物アレルゲン、ならびに、ラテックスなどの接触抗原である。アレルゲン感作を特徴付ける疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシーショック、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および接触皮膚炎を含む。
【００４８】
上記のいずれかにおいて、上記腫瘍関連抗原は、オンコジーン、プロトオンコジーン、ウイルス由来タンパク質、生存因子またはＢ細胞受容体に由来するイディオタイプ決定因子などのクローン形質決定因子である。
【００４９】
上記のいずれかにおいて、上記同種抗原は、主要組織適合性抗原、マイナー組織適合性抗原、または組織特異的抗原である。上記抗原は、細胞および組織移植片拒絶反応に関与している。
【００５０】
上記のいずれかにおいて、上記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスに由来する。
【００５１】
上記使用のいずれかにおいて、上記チオレドックスモチーフは、上記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するか、または、リンカーにより上記ＮＫＴ細胞エピトープから分離されてもよい。特定の実施形態では、リンカーは、最大で７個のアミノ酸からなる。
【００５２】
上記使用における免疫原性ペプチドのさらなる実施形態では、上記チオレドックスモチーフは、上記病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原におけるＮＫＴ細胞エピトープのＮまたはＣ末端に隣接する８個のアミノ酸の領域内では自然発生しない。特に、上記チオレドックスモチーフは、ＮＫＴ細胞エピトープのＮ末端に位置する。
【００５３】
上記使用のための免疫原性ペプチドの特定の実施形態では、免疫原性ペプチドは、エンドソーム標的配列をさらに含む。上記免疫原性ペプチドのいずれも化学合成または組換え発現により製造され得る。
【００５４】
本発明のさらなる方法は、ＮＫＴ細胞の集団を得ることを目的とし、方法は、
（ｉ）  細胞内病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原と、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する免疫原性ペプチドを提供するステップと、
（ii）  （アジュバントの存在下で）対象に免疫原性ペプチドを投与するステップと、
（iii）ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団を得るステップとを含む。
【００５５】
上記方法により得られるＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の集団も本発明の一部であり、同様に、対象において、上記細胞内病原体による感染症を予防または治療する、自己免疫疾患、同種因子に対する免疫応答を予防または治療する、アレルギー性疾患を予防または治療する、腫瘍を治療する、移植片拒絶反応を予防する、および、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに対する免疫応答を予防するための医薬としてのそれらの使用も本発明の一部である。
【００５６】
本発明のさらなる局面は、細胞内病原体関連抗原、または、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するか、または、リンカーによりＮＫＴ細胞エピトープから分離されたチオレドックスモチーフとを含有する、単離された免疫原性ペプチドに関する。
【００５７】
本発明のまたさらなる局面は、ＮＫＴ細胞の検出、調製または欠失のための、細胞内病原体関連抗原、または、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するか、または、リンカーによりＮＫＴ細胞エピトープから分離されたチオレドックスモチーフとを含有する、単離されたペプチドに関する。
【００５８】
本発明はさらに、ＮＫＴ細胞エピトープと、上記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するか、または、リンカーによりＮＫＴ細胞エピトープから分離されたチオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの病原体関連抗原、または少なくとも１つの自己抗原、または少なくとも１つの同種因子、または少なくとも１つのアレルゲン、または少なくとも１つの腫瘍関連抗原、または少なくとも１つの同種抗原、または少なくとも１つのウイルスベクター抗原を含有することを特徴とする、単離されたウイルスベクターを包含する。
【００５９】
より特定的には、本発明は、病原体関連抗原の少なくとも１つ、または自己抗原、または同種因子、またはアレルゲン、または腫瘍関連抗原、または同種抗原、またはウイルスベクター抗原に存在する少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープが、上記病原体関連抗原、上記自己抗原、上記同種因子、上記アレルゲン、上記腫瘍関連抗原、上記同種抗原、または上記ウイルスベクター抗原に、チオレドックスモチーフを、上記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接して、または、リンカーにより上記ＮＫＴ細胞エピトープから分離して挿入することにより修飾されていることを特徴とする、単離されたウイルスベクターを提供する。
【００６０】
定義
ここで用いられる「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によりつながっているが、特定の実施形態では非アミノ酸構造（たとえば、連結有機化合物など）を含有し得る、２から２００個の間のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する分子を指す。本発明に従うペプチドは、従来の２０個のアミノ酸のいずれか、もしくはそれらの修飾型を含有し得るか、または、化学ペプチド合成もしくは化学修飾もしくは酵素修飾により取込まれた非天然起源のアミノ酸を含有し得る。
【００６１】
「ペプチド」または「免疫原性ペプチド」という用語は同等に用いられるが、「免疫原性ペプチド」は、通常、治療目的で用いられるペプチドに好ましく、「ペプチド」は、ＮＫＴ細胞の検出、調製および欠失に好ましい。
【００６２】
ここで用いられる「エピトープ」という用語は、抗体もしくはその一部（Ｆａｂ′、Ｆａｂ２′など）またはＢもしくはＴ細胞リンパ球の細胞表面に提示される受容体により特異的に認識および結合され、上記結合により、免疫応答を誘発することの可能なタンパク質の（立体構造エピトープを規定してもよい）１またはいくつかの部分を指す。
【００６３】
ここで用いられる「抗原」という用語は、１以上のハプテンを含有する、および／または、１以上のＴ細胞エピトープを含有する、巨大分子の構造を指す。典型的には、上記巨大分子は、タンパク質またはペプチド（多糖の有無は問わない）であるか、または、タンパク質組成からなり、１以上のエピトープを含有する。ここで、上記巨大分子は、代替的に「抗原性タンパク質」または「抗原性ペプチド」と呼ばれ得る。
【００６４】
本発明との関連における「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ドミナント、サブドミナントまたはマイナーなＴ細胞エピトープを指し、すなわち、Ｔリンパ球の細胞表面で受容体により特異的に認識され、結合される抗原性タンパク質の一部を指す。エピトープがドミナントであるか、サブドミナントであるかまたはマイナーであるかは、エピトープに対して惹起される免疫反応に依存する。優性は、タンパク質のすべての可能なＴ細胞エピトープのうち、このようなエピトープがＴ細胞により認識され、それらを活性化することのできる頻度に依存する。特に、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により結合されるエピトープである。
【００６５】
「ＮＫＴ細胞エピトープ」という用語は、Ｔリンパ球の細胞表面で受容体により特異的に認識され、結合される抗原性タンパク質の一部を指す。特に、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子により結合されるエピトープである。
【００６６】
「ＣＤ４＋エフェクター細胞」は、その機能が、たとえばＢ細胞などの他の細胞を助けることである、Ｔ細胞のＣＤ４陽性サブセットに属する細胞を指す。これらのエフェクター細胞は、従来Ｔｈ細胞（Ｔヘルパー細胞のため）として報告されており、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞などの異なるサブセットを有する。
【００６７】
「ＮＫＴ細胞」という用語は、ＮＫ１．１およびＮＫＧ２Ｄなどの受容体を有し、ＣＤ１ｄ分子により提示されるエピトープを認識するということにより特徴付けられる、自然免疫系の細胞を指す。本発明の関連では、ＮＫＴ細胞は、１型（インバリアント）もしくは２型のサブセットのいずれかに属するか、または、１型もしくは２型ＮＫＴ細胞より多くの多形Ｔ細胞受容体を有する、より特徴付けられていないＮＫＴ細胞のいずれかに属し得る。
【００６８】
「ＣＤ１ｄ分子」は、両側で開かれた深い疎水性の溝に配列され、かつ、ＮＫＴ細胞に脂質、糖脂質または疎水性ペプチドを提示することの可能な、３つのα鎖およびβ鎖の逆平行なセットからなる非ＭＨＣ由来分子を指す。
【００６９】
「免疫障害」または「免疫疾患」という用語は、免疫系の反応が、生体における機能不全もしくは非生理的状態の原因であるか、または、それを持続させる疾患を指す。本発明の関連での免疫障害は、感染症要因および腫瘍監視により誘発される病態を指す。
【００７０】
「同種因子」という用語は、同じ種の２つの個体を比較したとき、多形を示すタンパク質、ペプチドまたは因子（すなわち、任意の分子）を指し、より一般的には、同種因子を受ける対象に（同種反応性）免疫応答を誘発する任意のタンパク質、ペプチドまたは因子を指す。
【００７１】
ここで用いられる「同種抗原」または「同種移植片抗原」という用語は、細胞または組織に由来する（そこから脱落した、および／または、その中に存在する）抗原であって、ドナーからレシピエントに移植されるとき、レシピエントのＢまたはＴ細胞受容体の抗体により認識され、結合され得るものを指す。同種抗原は、典型的には、多形遺伝子の産物である。同種抗原は、（同じ種に属する）ドナーとレシピエントとで比較すると、若干の構造差を示すタンパク質またはペプチドである。レシピエントの体内にこのようなドナー抗原が存在すると、レシピエントに免疫応答を惹起し得る。このような同種反応性免疫応答は、同種抗原に特異的である。
【００７２】
「チオール−オキシドレダクターゼモチーフ」、「チオレダクターゼモチーフ」、「チオレドックスモチーフ」または「レドックスモチーフ」という用語は、ここでは同義の用語として使用され、［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］からなる一般配列のモチーフを表わし、式中、Ｃはシステインを表わし、Ｓはセリンを表わし、Ｔはトレオニンを表わし、Ｘは、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンを除く任意のアミノ酸を表わす。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明のペプチドによる免疫化により得られた第ＶＩＩＩ因子特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）および細胞のコントロール群（Ｂ）によるＩＬ−４産生（左側パネル）およびＩＦＮγ産生を示す図である。
【図２】アデノウイルス５（Ａｄ５）を注入した（０、１および２回の注入）マウスにおける抗体の産生を示す図である。ヘキソンタンパク質（Ａｄ５）のＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフにより事前処置したマウスを黒色ヒストグラムで示す。非免疫化マウスを白抜きヒストグラムで示す。
【図３】腫瘍細胞の死を示す図である。左側ヒストグラムはコントロールを示す。中央ヒストグラムは、本発明のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下での腫瘍細胞の死を示す。右側ヒストグラムは、天然配列のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下での腫瘍細胞の死を示す。
【図４】腫瘍細胞の死を示す図である。左側ヒストグラムはコントロールを示す。中央ヒストグラムは、本発明のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下での腫瘍細胞の死を示す。右側ヒストグラムは、天然配列のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下での腫瘍細胞の死を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
発明の詳細な説明
本発明は、対象において、細胞内病原体による感染症を予防または治療するための方法を提供する。本発明はさらに、自己免疫疾患、同種因子の投与後またはアレルゲンに対する免疫応答を予防および治療するための方法を提供する。本発明はさらに、腫瘍を治療する、移植片拒絶反応を予防する、さらに、ウイルスベクターに対する免疫応答を予防するための方法を提供する。
【００７５】
特に、本発明は、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の増殖および機能活性を増強するための方法を提供する。このような細胞は、通常、２つの明確なサブセットである、インバリアントＴＣＲa鎖（マウスではＶa１４、ヒトではＶa２４）を有するＮＫＴ細胞の１型、または、多様なa鎖のレパートリを有する２型ＮＫＴ細胞に分類される。しかしながら、最近の証拠により、１型または２型のカテゴリに当てはまらないＮＫＴ細胞の代替的なサブセットが示唆された。本発明の目的は、ＣＤ４共受容体を有することを前提として、これらの非従来ＮＫＴ細胞を含むことである。ＣＤ１ｄに結合された抗原の提示の際、ＮＫＴ細胞は急速に活性化されて、多くのサイトカインを分泌するが、当該サイトカインは、自然免疫系および適応免疫系の両方に由来する他の細胞に影響を及ぼし、かつ、ＣＤ１ｄ＋抗原提示細胞の強力な死滅活性を発揮する決定因子であると考えられる。このメカニズムは、細胞内要因による感染症に対する防御のみならず、腫瘍細胞監視および腫瘍除去においても非常に重要であると見なされる。同じメカニズムが自己免疫疾患、同種因子またはアレルゲンに対する免疫応答においても生じるため、望ましくない免疫応答の制御のために役割を果たす。
【００７６】
移植片拒絶反応では、移植片から脱落した同種抗原は、間接的経路によりレシピエント対象の免疫系に提示される。このことは、脱落した同種移植片抗原は宿主抗原提示細胞により取込まれ、宿主抗原提示細胞が上記同種抗原をＣＤ１ｄ拘束的に宿主Ｔ細胞に提示することを意味する。したがって、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞による同族認識後の死滅により上記宿主抗原提示細胞が破壊されるメカニズムは、移植片レシピエントにとって有益である。
【００７７】
遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種に用いられるウイルスベクターに対する免疫応答では、移植片拒絶反応の場合と同様に、形質導入された細胞から脱落した抗原が宿主抗原提示細胞により取込まれ、その後間接的に提示される。
【００７８】
ＮＫＴ細胞が、チオレダクターゼ活性を含むように修飾されたペプチドにより活性化されるとき、後者は、ＮＫＴ細胞の特性を大きく増加させることにより、細胞内微生物および腫瘍細胞を有する細胞の死滅を増加させる。抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞による自己抗原、同種因子またはアレルゲンを提示する細胞の死滅により、当該自己抗原、同種因子またはアレルゲンに対する免疫応答が抑制される。移植片または形質導入された細胞に由来する抗原を提示する宿主細胞の死滅により、ウイルスベクター抗原に対する拒絶反応または応答がそれぞれ中断される。
【００７９】
したがって、より多くの数の感染症疾患において、ＮＫＴ細胞の重要性が証明されている。これらは、(マイコバクテリウム結核を含む)マイコバクテリア、リーシュマニア属などの寄生生物、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ菌、緑膿菌（pseudomonas aeruginosa）、肺炎球菌（streptococcus pneumoniae）およびボレリア属などのバクテリア、ならびに単純性疱疹ウィルスなどのウイルスによる感染症を含む（Chiba et al Journal of Immunology 181: 2292-2302, 2008; Mattner et al Nature 434: 525529, 2005; Tupin et al Nature Reviews. Microbiology 5: 405-417, 2007）。感染細胞の直接的死滅に加えて、ＮＫＴ細胞は、高濃度のサイトカイン、特にＩＦＮγを産生するそれらの能力により、感染細胞内に非特異的な死滅メカニズムを引起こすことができる。これらのメカニズムは、インドールアミンオキシダーゼ、一酸化窒素シンターゼの誘発および活性酸素種の産生を含む。
【００８０】
自己免疫疾患における、または、同種因子もしくはアレルゲンに対する免疫応答の制御へのＮＫＴ細胞の加担は、数多くの機会に報告されてきた（Jahng et al Journal of experimental Medicine 199: 947-957, 2004; Van Belle and von Herrath, Molecular Immunology 47: 8-11, 2009）が、説明が比較的難しい。本発明の関連では、我々は、ペプチドがＣＤ１ｄ分子により提示され得るという予期しない所見を得た。ＣＤ１ｄ分子の特徴は、２つの逆平行なb鎖からなるプラットフォームの上に位置する間隙を形成する２つの逆平行なa鎖からなることである。間隙は、狭くて深く、疎水性残基のみを受容し、疎水性残基は、古典的には、脂質のみと見なされる。実際に、疎水性残基を有するペプチドは、ＣＤ１ｄ間隙に結合する能力を有する。さらに、間隙は両側で開いているため、７個のアミノ酸よりも長いペプチドを収めることができる。ＣＤ１ｄモチーフを有する疎水性ペプチドは、自己抗原、同種因子およびアレルゲン中に存在することにより、当該自己抗原、同種因子またはアレルゲンに、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を活性化させる能力を付与する。当該自己抗原、同種因子またはアレルゲンを提示する細胞の死滅による直接的除去により、これらの抗原／因子に対する免疫応答を開始する能力が除去される。
【００８１】
ＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞に対する自然応答および適応応答の両方を強化することの可能なサイトカインを産生することにより間接的に、または、ＮＫＴ細胞により認識される脂質エピトープを提示する腫瘍細胞を死滅させることにより直接的に、腫瘍に対する防御に加担することが証明されている（Crowe et al, Journal of experimental Medicine 196: 119-127, 2002; Tachibana et al, Clinical Cancer Research 11: 7322-7327, 2005; Dhodapkar et al, Journal of experimental Medicine 197: 1667-1676, 2003; Song et al, Journal of clinical Investigation 119: 15241536, 2009）。直接的死滅は、グランザイムおよびパーフォリン産生を伴う。発癌性要因またはｐ５３腫瘍抑制遺伝子の欠失により誘発される肉腫などの実験腫瘍、および、骨髄腫などの自発性腫瘍は、ＮＫＴ細胞により抑制されることが示されている。本発明により治療されやすい腫瘍は、一部のメラノーマまたはチロシンキナーゼで同定されるＭＡＧＥなど、外胚葉起原の癌腫で同定されるＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）などのオンコジーン、腎臓または副甲状腺、および多発性骨髄腫におけるものなど、軟繊維癌腫で発現されるサイクリンＤ１などのプロトオンコジーン、一部の癌腫におけるエプスタインバーウイルスおよび一部のホジキン型リンパ腫におけるものなどのウイルス由来タンパク質、サバイビン（surviving）またはｂｃｌ２などの生存因子、ならびに、濾胞性リンパ腫もしくは多発性骨髄腫におけるＢ細胞受容体に由来するイディオタイプ決定因子またはＴ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定因子などのクローン形質決定因子を発現する腫瘍を含む。
【００８２】
組織移植片または細胞内移植片のいずれであっても、移植片の一部である細胞は、ＣＤ１ｄ分子を有しないか、または最低限しか有しない。同様のことが、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種で形質導入された細胞についても当てはまる。これらの両方の状況下で、移植片拒絶反応またはウイルスベクターに対する免疫化を引起こす望ましくない免疫応答が、宿主抗原提示細胞による宿主Ｔ細胞への間接的な抗原提示により惹起される。ＮＫＴ細胞との同族相互反応後の宿主抗原提示細胞の死滅による直接的除去により、同種因子またはウイルスベクター抗原に対する免疫応答を開始する能力が除去される。
【００８３】
本発明は、ＣＤ１ｄ分子に結合する能力を授与する、疎水性残基を含有するペプチドの製造に関する。投与後、このようなペプチドは、ＡＰＣにより取込まれ、後期エンドソームに導かれて、ＣＤ１ｄ上に添加され、ＡＰＣの表面で提示される。上記疎水性ペプチドは、一般配列［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］または［ＦＷＴＨ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷ］に対応するモチーフにより特徴付けられ、式中、Ｐ１位およびＰ７位は、フェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）などの疎水性残基により占有される。しかしながら、Ｐ７は、トレオニン（Ｔ）またはヒスチジン（Ｈ）など、フェニルアラニンまたはトリプトファンに代替的な疎水性残基を受容するという意味で、許容性である。Ｐ４位は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）などの脂肪族残基によって占有される。
【００８４】
国際出願ＷＯ２００９／１０１２０６号は、ペプチドＣＧＨＣＧＧＦＴＮＭＦＡＴＷＳＰＳＫを含む、主要組織適合性クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋細胞の活性化を惹起することができる免疫原性ペプチドを開示している。ＷＯ２００９／１０１２０６号からは、ペプチドがＣＤ１ｄ分子に結合する能力を有することはわからない。したがって、本発明は、ペプチドがＣＧＨＣＧＧＦＴＮＭＦＡＴＷＳＰＳＫでないことを条件として、ＣＤ１ｄに結合し、ＮＫＴ細胞を活性化させるペプチドに関する。
【００８５】
本発明は、ＣＤ１ｄ結合モチーフを自然に構成する疎水性残基からなるペプチドに関する。ある実施形態では、上記モチーフのアミノ酸残基は、通常、ＣＤ１ｄに結合する能力を増加させる残基による置換によって、修飾される。特定の実施形態では、モチーフは、一般モチーフ［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］により近く合うように修飾される。より特定的には、ペプチドは、７位にＦまたはＷを含有するように製造される。
【００８６】
本発明のペプチドは、疎水性残基に隣接するか、または、リンカーによりこのような残基から分離されたチオレダクターゼモチーフも含有する。ＣＤ１ｄ分子により一旦提示されると、チオレダクターゼモチーフは、ＮＫＴ細胞を活性化させる能力を向上させることにより、それらの抗感染活性および／または抗腫瘍活性、自己抗原、同種因子、アレルゲン、同種移植片抗原および遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスベクターからの抗原に対する免疫応答を抑制するそれらの能力を増加させる。
【００８７】
したがって、完全モチーフの一般的な記述は、チオレダクターゼモチーフがアミノ末端またはカルボキシ末端に加えられ得るということに従うと、［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］−リンカー−［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］、または、［ＦＷ］−ｘｘ−［ＩＬＭ］−ｘｘ−［ＦＷＴＨ］−リンカー−［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］となり得る。リンカーの追加は随意的である。このようなリンカーが存在するとき、１から７個以下の間のアミノ酸であり得る。この一般的な記述が、本発明の一般的な理解のためだけに設けられることが当業者には明らかであるべきである。
【００８８】
本発明は、病原体により感染された細胞、自己抗原、同種因子またはアレルゲンに由来するペプチドを提示する細胞、腫瘍細胞、移植片または遺伝子療法／遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスタンパク質から脱落した同種抗原を提示する細胞を除去するための能力を増加させるために、宿主に受動再投与されるための、インビトロで得られ、活性化されたＮＫＴ細胞にも関する。ＣＤ１ｄ陽性ＡＰＣによるＮＫＴ細胞のインビトロでの刺激の代替法として、本発明は、免疫原性ペプチドの後期エンドソームへの発現を進行させて、ＣＤ１ｄ分子上に添加させることの可能な遺伝子構築物を用いた、ＡＰＣのトランスフェクションまたは形質導入の方法にも適用される。
【００８９】
特に、本発明は、結果的に増加された活性を有する特異的ＮＫＴ細胞を増殖させる方法を提供し、方法は、限定されないが、
（ｉ）  増加したサイトカイン産生
（ii）  抗原提示細胞の増加した接触依存的かつ可溶性因子依存的な除去、を含む。
【００９０】
したがって、結果として、細胞内病原体、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍細胞に対するより効率的な応答が得られ、さらに、移植片および遺伝子療法／遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスタンパク質に対する免疫応答のより効率的な抑制が得られる。
【００９１】
本発明は、体液または臓器中で必要とされる特性を有するＮＫＴ細胞の同定にも関する。方法は、ＮＫ１．１、ＣＤ４、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ２４４の発現を含む、その表面発現型によるＮＫＴ細胞の同定を含む。次に、細胞は、ＣＤ１ｄ分子により提示されることの可能なペプチドとして規定されるＮＫＴ細胞エピトープと接触される。次に、細胞は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５またはＩＬ−７の存在下でインビトロで増殖される。
【００９２】
したがって、本発明は、ＮＫＴ細胞の検出、調製および欠失のための、ＣＤ１ｄ結合モチーフおよびチオレダクターゼモチーフを含有するペプチドを提供する。好ましい実施形態では、このようなペプチドは、単量体または、好ましくは多量体のいずれかである、単離されたＣＤ１ｄ分子上に添加される。ＣＤ１ｄ分子は、可溶型であっても、固体担体に結合されることもできる。
【００９３】
本発明は、感染症に罹患しているか、または、腫瘍が既に存在するときのいずれかに投与される、治癒的療法として見なされるべきである。これは、ＮＫＴ細胞は、記憶のサイクルには入らないと考えられるためである。ＮＫＴ細胞が活性化されると、それらは数日間の期間にわたって増殖し、その後、集団は、罹患期（contraction phase）に入り、短期間の非応答性に入る可能性がある。しかしながら、いくつかの状況下では、予防的状況において本発明のペプチドによる能動免疫化による療法を適用することが賢明であり得る。これらの例は、たとえば、感染した個体との接触直後のように、感染症疾患に感染する高い危険性にある患者である。したがって、本発明は、能動ワクチン接種または細胞の受動移入のいずれかによる、治療の予防的使用も包含する。
【００９４】
本発明は、一局面では、（ｉ）病原体関連抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオール−オキシドレダクターゼモチーフ（簡略するとチオレドックスモチーフ）とを含有する、少なくとも１つの単離された疎水性免疫原性ペプチドの、対象における上記病原体による感染症を予防および／または治療するための医薬としての使用に関する。
【００９５】
さらなる局面では、本発明は、（ｉ）自己抗原、同種因子またはおよびアレルゲンに由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された疎水性免疫原性ペプチドの、対象における自己抗原、同種因子および／またはアレルゲンに対する免疫応答を予防および／または治療するための医薬としての使用も包含する。
【００９６】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）腫瘍関連抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された疎水性免疫原性ペプチドの、対象における腫瘍を治療するための医薬としての使用も包含する。
【００９７】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）同種抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された疎水性免疫原性ペプチドの、対象における移植片の拒絶反応を予防するための医薬としての使用も包含する。
【００９８】
またさらなる局面では、本発明は、（ｉ）遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクターに由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された疎水性免疫原性ペプチドの、対象におけるウイルスベクターに対する免疫応答を予防するための医薬としての使用も包含する。
【００９９】
さらなる局面では、本発明は、（ｉ）病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、同種抗原またはウイルスベクター抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープと、（ii）チオレドックスモチーフとを含有する、少なくとも１つの単離された免疫原性ペプチドの、上記対象におけるＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の活性化、サイトカイン産生および細胞溶解活性を増加させるための医薬としての使用も包含する。
【０１００】
本発明の追加的な利点は、ＣＤ１ｄ分子の非常に限定された度合いの多形性に関する。これにより、ヒトまたは動物などの非近交系集団の療法のための単一または限定数のペプチドの使用が可能となる。さらに、１のドナーから惹起されたＮＫＴ細胞を、複数のレシピエントでの受動移入のために用いることができ得る。これは、ペプチドはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子により提示されるが、その多形により、単一のペプチドの複数のレシピエントのための使用が妨害される状況とは非常に対照的である。
【０１０１】
ＮＫＴ細胞エピトープの一般構造は、Ｐ１位およびＰ７位に疎水性残基を含有し、Ｐ４位は脂肪族鎖により占有されている。したがって、結局、一般構造は、［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］として規定され得、式中、ｘは任意のアミノ酸を表わす。列挙したアミノ酸のいずれかがＰ１位、Ｐ４位およびＰ７位に存在し得る。アミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の例は、Ｄ−アミノ酸を含む。
【０１０２】
一般的に、還元活性を有する有機化合物は、ペプチド配列である。還元活性を有するペプチドフラグメントは、グルタレドキシン、ヌクレオレドキシン、チオレドキシンおよび他のチオール/ジスルフィドオキシドレダクターゼを含む、小さなジスルフィド還元酵素であるチオレダクターゼに存在する。それらは、保存活性ドメインコンセンサス配列：Ｃ−ＸＸ−Ｃ、Ｃ−ＸＸ−Ｓ、Ｃ−ＸＸ−Ｔ、Ｓ−ＸＸ−Ｃ、Ｔ−ＸＸ−Ｃ（Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表わす）内のレドックス活性システインを介して、タンパク質（酵素など）上のジスルフィド結合に対する還元活性を及ぼす。このようなドメインは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣなどのより大きなタンパク質中にも存在する。特に、免疫原性ペプチドは、レドックスモチーフとして、チオレダクターゼ配列モチーフ［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］を含有し、そのさらなる実施形態では、上記［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］モチーフは、Ｔ細胞エピトープのＮ末端に位置する。より特定的には、上記レドックスモチーフでは、［ＣＦＴ］位の少なくとも１つは、Ｃｙｓにより占有されるため、モチーフは、［Ｃ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−ＸＸ−［Ｃ］のいずれかである。本出願において、このようなテトラペプチドを「モチーフ」または「レドックスモチーフ」と呼ぶ。より特定的には、免疫原性ペプチドは、配列モチーフ［Ｃ］−ＸＸ−［ＣＳ］または［ＣＳ］−ＸＸ−［Ｃ］を含有し得る。さらにより特定的には、免疫原性ペプチドは、配列モチーフＣ−ＸＸ−Ｓ、Ｓ−ＸＸ−ＣまたはＣ−ＸＸ−Ｃを含有する。
【０１０３】
上記免疫原性ペプチドにおけるモチーフは、ペプチド内のエピトープ配列のすぐ隣に隣接して、または、リンカーによりＴ細胞エピトープから分離して配置される。より特定的には、リンカーは、７個以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する。最も特定的には、リンカーは、１、２、３、または４個のアミノ酸を含有する。リンカーに用いられる典型的なアミノ酸は、セリンおよびトレオニンである。本発明に従うリンカーを有するペプチドの例は、Ｃ−ＸＸ−Ｃ−Ｇ−エピトープ、Ｃ−ＸＸ−Ｃ−ＧＧ−エピトープ  Ｃ−ＸＸ−Ｃ−ＳＳＳ−エピトープ  Ｃ−ＸＸ−Ｃ−ＳＧＳＧ−エピトープなどである。さらに別の特定の実施形態では、リンカー配列は、ＣＤ１ｄ結合モチーフが由来するポリペプチド配列に自然に存在するアミノ酸を包含する。可変数のこのような天然アミノ酸は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、または、両端に含まれ得る。
【０１０４】
免疫原性ペプチドは、ＮＫＴ細胞エピトープおよび還元性化合物（モチーフ）を含有する（人工）配列のＮまたはＣ末端に、追加の短いアミノ酸配列を含有し得る。このようなアミノ酸配列は、一般的に、ここでは「フランキング配列」と呼ばれる。フランキング配列は、免疫原性ペプチドにおけるレドックスモチーフおよび／またはＴ細胞エピトープのＮ末端および／またはＣ末端に位置し得る。免疫原性ペプチドがエンドソーム標的配列を含有するとき、フランキング配列は、エピトープとエンドソーム標的配列との間、および／または、還元性化合物（たとえば、モチーフ）とエンドソーム標的配列との間に存在し得る。より特定的には、フランキング配列は、１０個以下のアミノ酸、または、１から７個の間のアミノ酸の配列であり、たとえば、２個のアミノ酸の配列である。より特定的には、フランキング配列は、ペプチドをＣＤ１ｄ分子へと安定化させるのに有用な、嵩高いアミノ酸残基を含有する。
【０１０５】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性ペプチドのレドックスモチーフは、エピトープからＮ末端に位置する。
【０１０６】
上に詳述したように、免疫原性ペプチドは、ＮＫＴ細胞エピトープ配列に連結された、ここに記載するような還元性モチーフを含有する。特定の場合には、ＮＫＴ細胞エピトープは、それらの未変性の天然配列内に、目的のＮＫＴ細胞エピトープに隣接するＮまたはＣ末端に１１個のアミノ酸の配列以内のレドックス特性を有するアミノ酸配列を含有しないタンパク質に由来する。
【０１０７】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは細胞内病原体に由来する。このような病原体は、ウイルス、バクテリアまたは寄生生物であり得る。ウイルスは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、例としては、ヘルペスウイルス、フラビウイルスおよびピコルナウイルス、インフルエンザ、麻疹および免疫不全ウイルスである。バクテリアおよびマイコバクテリアは、結核菌、ヒトまたは動物に病原性の他のマイコバクテリア、エルシニア属、ブルセラ属、クラミジア属、マイコプラズマ属、リケッチア属、サルモネラ属およびシゲラ属を含む。寄生生物は、プラスモディウム属、リーシュマニア属、トリパノゾーマ属、トキソプラズマ・ゴンディ、リステリア菌、ヒストプラスマ属を含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、甲状腺疾患におけるＴＳＨ受容体；インスリン（プロインスリン）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５、１型糖尿病における膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）；自己免疫副腎炎における２１−ＯＨヒドロキシラーゼ；自己免疫多内分泌腺症候群における、１７−aヒドロキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ；自己免疫胃炎および悪性貧血におけるＨ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ内因子；多発性硬化症におけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）；重症筋無力症におけるアセチルコリン受容体；自己免疫視覚症候群におけるレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）；自己免疫内耳疾患におけるＩＩ型およびＩＸ型コラーゲン；セリアック病における組織トランスグルタミナーゼ；炎症性腸疾患におけるｐＡＮＣＡヒストンＨｌタンパク質；アテローム動脈硬化における熱ショックタンパク質ＨＳＰ６０およびオキシ低比重リポタンパク質（oxy-light density lipoproteins）；ならびに、パーキンソン病におけるシヌクレインを含む、自己抗原に由来する。
【０１０９】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、次の使用される任意のペプチドまたはポリペプチドを含む、同種因子に由来する。（１）第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびスタフィロキナーゼを含む、凝固異常または繊溶異常のための補充療法のため。（２）成長ホルモンまたはインスリンなどのホルモン。（３）インターフェロンα、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび成長因子。（４）アレルギー性疾患における抗ＩｇＥ抗体、移植片拒絶反応および種々の自己免疫疾患における抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ４抗体、非ホジキンリンパ腫における抗ＣＤ２０抗体を含む、免疫応答の調節のための抗体。（５）腎不全におけるエリスロポイエチン。（６）遺伝子修飾抗原。
【０１１０】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、イエダニ、花粉または飼育動物などに由来する空中アレルゲン、落花生、オバルブミン、穀物、果物および豆果などの食物アレルゲン、ならびに、ラテックスなどの接触アレルゲンを含む、アレルゲンに由来する。アレルゲン感作を特徴付ける疾患は、アレルギー性喘息、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシーショック、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および接触皮膚炎を含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、次に由来する任意のペプチドまたはポリペプチドを含む、腫瘍に由来する。（１）一部のメラノーマで同定されるＭＡＧＥなどのオンコジーン、（２）腎臓または副甲状腺、および多発性骨髄腫におけるものなど、軟繊維癌腫に発現されるサイクリンＤ１などのプロトオンコジーン、（３）一部の癌腫におけるエプスタインバーウイルスおよび一部のホジキン型リンパ腫におけるものからなどのウイルス由来タンパク質、（４）サバイビンまたはｂｃｌ２などの抗アポトーシス因子である生存因子、（５）濾胞性リンパ腫または多発性骨髄腫におけるＢ細胞受容体に由来するイディオタイプ決定因子、または、Ｔ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定因子などのクローン形質決定因子。
【０１１２】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、主要組織適合性クラスＩもしくはクラスＩＩ決定因子、マイナー組織適合性複合体または組織関連抗原に由来する任意のペプチドまたはポリペプチドを含む、同種抗原に由来する。上記ペプチドまたはポリペプチドは、細胞または実質臓器の拒絶反応に関与し得る。細胞移植片は、さい帯血細胞移植片、幹細胞移植片、または膵島細胞移植片を含む。実質臓器移植片は、腎臓、肺、心臓、肝臓、膵臓、骨、皮膚、または軟線維を含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＲＮＡウイルス（γレトロウイルスおよびレンチウイルス）またはＤＮＡウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス）の任意のペプチドまたはポリペプチドを含む、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに由来する。
【０１１４】
本発明の免疫原性ペプチドにより惹起され、活性化されるＮＫＴ細胞は、一層複合的な抗原のため、病原体を抑制することができる。このような細胞が活性化されるための最低条件は、ＣＤ１ｄ分子により提示された同族ペプチドを認識することであり、それにより、病原体が添加された細胞の死滅、または、自己抗原、同種因子もしくはアレルゲンを提示するＡＰＣの死滅、または、腫瘍細胞の死滅、または、同種抗原を提示するＡＰＣの死滅、または、ウイルスベクターに由来する抗原を提示するＡＰＣの死滅につながる。
【０１１５】
上記の状況すべてにおいて、上記免疫原性ペプチドは、ＩＦＮγなどのサイトカインの産生を活性化することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む他のエフェクター細胞を活性化する。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方とも、細胞内病原体、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍抗原、同種抗原またはウイルスベクターに由来する抗原を提示する細胞の除去に加担することができる。
【０１１６】
対象に複数の抗原が存在する状況では、同一のＡＰＣはすべての関連抗原を提示しない可能性がある。なぜなら、このような抗原は、潜在的に異なるＡＰＣにより取込まれる可能性があるためである。したがって、２つ以上の免疫原性ペプチドの組合せを疾患の予防または治療のために用いてもよいことが予期される。上記免疫原性ペプチドの如何なる組合せも企図されることは当業者には明らかであるはずである。このような組合せの例は、凝固経路の第ＶＩＩＩ因子などの同種因子に対する抗体の産生を抑制するペプチドと、血友病Ａ（機能的第ＶＩＩＩ因子の不在）の遺伝子療法のために用いられるウイルスベクターに対する免疫応答の抑制のためのペプチドとを含む。他の例は、ＨＩＶおよびマイコバクテリア感染症などの、病原体による感染症の組合せを含む。
【０１１７】
本発明の関連で用いられる免疫原性ペプチドは、当業者に既知の方法により同定される。好ましい実施形態では、一般配列［ＦＷＨＹ］−ｘｘ−［ＩＬＭＶ］−ｘｘ−［ＦＷＨＹ］を含むペプチドが同定され得る。上記ペプチドは、オンラインでアクセス可能なアルゴリズムを用いて当業者により既知の方法により同定される。たとえば、ペプチドは、次のウェブサイト上の配列を入力することにより同定することができる。http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
次に、ペプチドは、たとえば、当該技術分野で周知であるｆｍｏｃ固相合成を用いた合成により製造することができる。
【０１１８】
しかしながら、ここに設けられた一般配列は、ペプチドがＣＤ１ｄ結合モチーフを含有するということの示唆として考えられるべきである。次に、上記ペプチドは、ＮＫＴ細胞との反応性についてインビトロで試験されるべきである。この目的のために、ＣＤ１ｄ＋ＡＰＣは、動物またはヒトのいずれかのソースから調製される。次に、細胞は、目的のペプチドおよびＮＫＴ細胞のソースとインキュベートされる。後者の活性化は、ＩＦＮγおよびＩＬ−４および表面マーカなどのサイトカインの増殖、産生により同定することができる。これらの方法は当該技術分野ではよく記載されている。さらに、本発明のペプチドが添加された後に、ＣＤ１ｄ分子の三量体を用いて、このようなペプチドに特異的なＮＫＴ細胞を検出することができる。１つの可能性としては、蛍光標識三量体および蛍光選別システム（facs）を用いた検出を用いることである。
【０１１９】
本発明の免疫原性ペプチドは、バクテリア細胞、酵母菌、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞などの発現系を用いた組換え技術により製造することができる。
【０１２０】
本発明に従うと、細胞内病原体による感染症の治療のため、自己免疫疾患の治療のため、同種因子もしくはアレルゲンに対する免疫応答の治療のため、腫瘍の治療のため、移植片拒絶反応の治療のため、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに対する免疫応答の治療のための医薬が企図される。これらの状況の多くでは、治療は予防的療法として想定され得る。本発明の医薬は、通常、必ずしもそうではないが、有効成分として、本発明の免疫原性ペプチドの少なくとも１つ、上記免疫原性ペプチドについてのＮＫＴ細胞の集団または上記免疫原性ペプチドを発現することの可能な遺伝子療法ベクターを含有する（医薬）製剤である。有効成分以外に、このような製剤は、（医薬上許容される）希釈剤、キャリアまたはアジュバントの少なくとも１つを含有する。特に、本発明の医薬組成物は、予防または治療用途のためのワクチンである。
【０１２１】
本発明に従うと、自己免疫疾患の治療、同種因子に対する免疫応答の治療、アレルギー性疾患の治療、腫瘍の治療、移植片拒絶反応の治療、ならびに、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターに対して惹起される免疫応答の治療のための医薬が企図される。
【０１２２】
したがって、本発明は、配列［ＣＳＴ］−ＸＸ−［ＣＳＴ］のチオレダクターゼモチーフに結合された、病原体関連抗原、自己抗原、アレルゲン、同種因子、腫瘍抗原、移植片から脱落したか、または、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスベクターに由来する抗原の少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープを含有する、免疫原性ペプチドに関する。
【０１２３】
モチーフ中のアミノ末端システインは、標的タンパク質上のジスルフィド架橋に対して求核攻撃を及ぼす。ジスルフィド架橋は還元され、モチーフの第２のシステインとの電子交換により、標的タンパク質が還元された形態で放出され、その後、標的タンパク質の異性化および／またはホモ二量体化が起こる。いくつかの場合では、ヘテロ二量体化が、異なるタンパク質との電子交換により生じ得る。最終結果としては、標的タンパク質構成（異性化）が変化するか、または、二量体もしくはより高次の高分子が形成される。このメカニズムはここに一例として設けられ、限定的意図は一切ない。
【０１２４】
ＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフは、リンカー配列により随意に分離される。さらなる随意的な実施形態では、免疫原性ペプチドは、追加的に、エンドソーム標的配列（たとえば、後期エンドソーム標的配列）および／または追加的な「フランキング」配列を含有する。
【０１２５】
さらに以下に詳細に説明するように、本発明の免疫原性ペプチドは、非天然アミノ酸の取込みを可能にする化学合成により作製することができる。したがって、チオレダクターゼモチーフのシステイン残基は、メルカプトバリン、ホモシステインまたはチオール機能を有する他の天然もしくは非天然アミノ酸など、チオール基を有する別のアミノ酸により置換え可能である。還元活性を有するためには、システイン残基はシステインジスルフィド架橋の一部として生じるべきではない。しかしながら、システイン残基はメチル化を介するなどして修飾されることができる。なぜなら、メチル化システインは、インビボで遊離チオール基を有するシステインに変換されるためである。
【０１２６】
上に記載したチオレダクターゼモチーフを含有する本発明の免疫原性ペプチドにおいて、上記モチーフは、エピトープがＣＤ１ｄ溝内に嵌まるとき、上記モチーフはＣＤ１ｄ結合溝の外側に残るように配置される。上記モチーフは、ペプチド内のエピトープ配列のすぐ隣に隣接するか、または、リンカーによりＴ細胞エピトープから分離されて配置される。より特定的には、リンカーは、７個以下のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する。最も特定的には、リンカーは、１、２、３、または４個のアミノ酸を含有する。本発明のペプチドのこれらの特定的な実施形態では、上記モチーフがエピトープ配列に隣接する場合、これは、エピトープ配列と比較して、Ｐ−４位〜Ｐ−１位またはＰ＋１位〜Ｐ＋４位として示される。ペプチドリンカー以外に、リンカーとして他の有機化合物を用いて免疫原性ペプチドの部分を互いに連結させることができる。
【０１２７】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性ペプチドにおけるチオレダクターゼモチーフは、エピトープからＮ末端に配置される。
【０１２８】
上記のように、本発明に従う免疫原性ペプチドは、チオレダクターゼモチーフに加えて、病原体関連抗原、自己もしくは同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片より脱落した抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープも含有する。タンパク質配列中のＮＫＴ細胞エピトープは、機能アッセイおよび／または１以上のインシリコの予測アッセイにより同定することができる。ＮＫＴ細胞エピトープ配列中のアミノ酸は、ＣＤ１ｄタンパク質の結合溝におけるそれらの位置に従って番号付けられる。特定の実施形態では、本発明のペプチド内に存在するＮＫＴ細胞エピトープは、７から２５個の間のアミノ酸、さらにより特定的には、７から１６個の間のアミノ酸、さらに最も特定的には、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸からなる。より特定的な実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは７個のアミノ酸の配列からなる。さらなる特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子によりＮＫＴ細胞に提示されるエピトープである。本発明の特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープ配列は、ＣＤ１ｄタンパク質の間隙内に嵌まるエピトープ配列であり、より特定的には、ＣＤ１ｄ間隙内に嵌まる７個のアミノ酸のペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドのＮＫＴ細胞エピトープは、タンパク質の天然エピトープ配列に対応するか、または、天然ＮＫＴ細胞エピトープ配列と同様の、ＣＤ１ｄ間隙内に結合する能力を保持することを条件とする、その修飾された形態であり得る。修飾ＮＫＴ細胞エピトープは、天然エピトープと同様のＣＤ１ｄタンパク質への結合親和性を有し得るが、低下した親和性も有し得る。特定の実施形態では、修飾ペプチドの結合親和性は、元のペプチドよりも１０倍以上低く、より特定的には、５倍以上低い。本発明のペプチドがタンパク質複合体に対して安定化作用を有することは発見である。したがって、ペプチド−ＣＤ１ｄ複合体の安定化作用は、修飾エピトープのＣＤ１ｄ分子に対する低下した親和性を補う。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明の免疫原性ペプチドは、ペプチドを（後期）エンドソーム内に取込み、プロセシングおよびＣＤ１ｄ決定因子内に提示することを促進するアミノ酸配列（または別の有機化合物）をさらに含有する。後期エンドソーム標的化は、タンパク質の細胞質尾部内に存在するシグナルにより媒介され、ジロイシン系［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬモチーフ（たとえば、ＤＸＸＸＬＬ）、チロシン系ＹＸＸOモチーフまたはいわゆる酸性クラスタモチーフなど、よく同定されるペプチドモチーフに対応する。記号Oは、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐなどの嵩高い疎水性側鎖を有するアミノ酸残基を表わす。後期エンドソーム標的配列は、ＣＤ１ｄ分子による抗原由来Ｔ細胞エピトープのプロセシングおよび効率的な提示を可能にする。このようなエンドソーム標的配列は、たとえば、ｇｐ７５タンパク質（Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820）、ヒトＣＤ３γタンパク質、ＨＬＡ−ＢＭβ（Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027）、ＤＥＣ２０５受容体の細胞質尾部（Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683）内に含まれる。エンドソームへの局在化シグナルとして機能するペプチドの他の例は、Bonifacio and Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447の概説に開示される。代替的には、配列は、病原体関連由来ＮＫＴ細胞エピトープ、自己または同種因子由来ＮＫＴ細胞エピトープ、アレルゲン由来ＮＫＴ細胞エピトープ、腫瘍抗原由来ＮＫＴ細胞エピトープ、または、移植片より脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種で用いられるウイルスベクターからの抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープに対するＮＫＴ細胞応答を克服することなく、後期エンドソーム内への取込みを促進する、タンパク質からのサブドミナントまたはマイナーなＴ細胞エピトープの配列であり得る。
【０１３０】
さらなる特定の実施形態では、本発明の免疫原性ペプチドは、天然配列内にチオレダクターゼモチーフを含有しないＮＫＴ細胞エピトープを含有するペプチドである。しかしながら、代替的な実施形態では、ＣＤ１ｄ間隙に結合するＮＫＴ細胞エピトープは、そのエピトープ配列内にここに記載されるようなチオ−オキシドレダクターゼモチーフを含有してもよい。このようなＮＫＴ細胞エピトープを含有する本発明に従う免疫原性ペプチドは、（間隙内に埋められたエピトープ中に存在するチオ−オキシドレダクターゼモチーフとは対照的に）結合した残基が還元活性を確保できるように、エピトープのＮまたはＣ末端に（隣接して、またはリンカーにより分離されて）結合される、別の遊離チオ−オキシドレダクターゼモチーフをさらに含有しなければならない。
【０１３１】
本発明の別の局面は、ここに記載する本発明の免疫原性ペプチドを生成するための方法に関する。このような方法は、病原体関連抗原、目的の自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、移植片から脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原からのＮＫＴ細胞エピトープの同定を含む。ＮＫＴ細胞エピトープのインビトロおよびインシリコの同定のための方法は、当該技術分野で広く知られており、いくつかの局面は下記に詳述する。このような方法は、同定されたＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフ（リンカー、フランキング配列またはエンドソーム標的配列の有無を問わない）を含む本発明の免疫原性ペプチドの生成をさらに含む。生成された免疫原性ペプチドは、次に、病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片から脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターに由来する抗原に、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を誘発する能力について評価される。
【０１３２】
本発明に従う免疫原性ペプチドは、病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍、同種抗原、または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターのＮＫＴ細胞エピトープから開始して生成される。
【０１３３】
特に、使用されるＮＫＴ細胞エピトープは、ドミナントなＮＫＴ細胞エピトープであってもよい。本発明の関連で使用されるための病原体関連抗原、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片より脱落した同種抗原、または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原からのＮＫＴ細胞エピトープの同定および選択は、当業者に既知である。たとえば、病原体関連抗原、自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片より脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原から単離されたペプチド配列は、ペプチド配列がＮＫＴ細胞応答を惹起するかどうかを判定するために、たとえば、Ｔ細胞生物学技術により試験される。ＮＫＴ細胞応答を惹起することが判明したペプチド配列は、ＮＫＴ細胞刺激活性を有するとして規定される。ヒトＮＫＴ細胞刺激活性は、病原体関連抗原、自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片より脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原に感作された個体から得られたＮＫＴ細胞を、上記抗原に由来するペプチド／エピトープと培養し、たとえば、トリチウム標識チミジンの細胞取込みによる測定により、ペプチド／エピトープに応答してＮＫＴ細胞の増殖が生じるかどうかを判定することにより、さらに試験することができる。ＮＫＴ細胞によるペプチド／エピトープに対する応答についての刺激指数は、ペプチド／エピトープに応答した最大ＣＰＭをコントロールＣＰＭにより除算した値として計算することができる。バックグラウンドレベルの２倍以上のＮＫＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、「陽性」として考えられる。陽性結果は、試験したペプチド／エピトープの群についての各ペプチド／エピトープの平均刺激指数を計算するために用いられる。非天然（または修飾）ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子に対する結合親和性についてさらに随意に試験され得る。ＣＤ１ｄ分子への非天然（または修飾）ＮＫＴ細胞エピトープの結合は、さまざまな方法で行なわれ得る。たとえば、可溶性ＣＤ１ｄ分子は、合成または化学的結合により得られ、三量体にされる。ＣＤ１ｄ分子は、親和性クロマトグラフィにより精製される。可溶性ＣＤ１ｄ分子は、そのＣＤ１ｄ分子に対する強い結合親和性に従って製造されたビオチン標識参照ペプチドとインキュベートされる。ＣＤ１ｄ結合について評価されるべきペプチドは、次に、異なる濃度でインキュベートされ、ニュートラアビジンの添加により、そのＣＤ１ｄ結合から参照ペプチドを置換える能力が計算される。方法は、たとえば、Texieret al., (2000)J. Immunology 164, 3177-3184)に記載されている。本発明の免疫原性ペプチドは、２．０以上の平均ＮＫＴ細胞刺激指数を有する。２．０以上のＮＫＴ細胞刺激指数を有する免疫原性ペプチドは、予防または治療剤として有用であると考えられる。より特定的には、本発明に従う免疫原性ペプチドは、少なくとも２．５、少なくとも３．５、少なくとも４．０、または少なくとも５．０までもの平均ＮＫＴ細胞刺激指数を有する。さらに、このようなペプチド��、典型的には、少なくとも約１００、少なくとも１５０、少なくとも約２００または少なくとも約２５０の陽性指数（Ｐ．Ｉ．）を有する。ペプチドについての陽性指数は、ウイルスベクター抗原に対して感受性のある個体（たとえば、少なくとも９個、少なくとも１６個、または少なくとも２９もしくは３０個、またはそれよりも多く）の集団において、ペプチドに応答するＮＫＴ細胞を有する個体の百分率を、平均ＮＫＴ細胞刺激指数に掛けることにより求められる（したがって、ＳＩにペプチド／エピトープの乱雑性（promiscuous nature）を掛けるのに相当する）。したがって、陽性指数は、ウイルスベクター抗原に感受性のある個体の集団における、ペプチドに対するＮＫＴ細胞応答の強度（Ｓ．Ｉ．）およびペプチドに対するＮＫＴ細胞応答の頻度の両方を表わす。たとえば、微細マッピング技術により最適なＮＫＴ細胞エピトープを求めるためには、Ｔ細胞生物学技術による判定により、Ｔ細胞刺激活性を有するため、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有するペプチドは、ペプチドのＮまたはＣ末端のいずれかでのアミノ酸残基の追加または欠失により修飾され、修飾ペプチドに対するＮＫＴ細胞反応性の変化を求めるために試験される。未変性タンパク質配列中にオーバーラップ領域を共有する２つ以上のペプチドが、Ｔ細胞生物学技術による判定により、ヒトＮＫＴ細胞刺激活性を有することが判明した場合、このようなペプチドのすべてまたは一部を含有する追加のペプチドを製造することができ、これらの追加のペプチドは、同様の手順により試験することができる。この技術に従って、ペプチドを選択し、組換えまたは合成により製造する。ＮＫＴ細胞エピトープまたはペプチドは、個体の集団における、ペプチド／エピトープに対するＮＫＴ細胞応答の強度（たとえば、刺激指数）およびペプチドに対するＮＫＴ細胞応答の頻度を含む、さまざまな要因に基づいて選択される。
【０１３４】
病原体関連抗原、自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍由来抗原、移植片より脱落した同種抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスベクターに由来する抗原の同定のために用いられる方法は、当該技術分野で既知である。したがって、ポジショナルクローニングまたは発現クローニング戦略が、抗原候補を同定するために用いられ得る。方法論の完全な説明については、たとえば、Mendoza et al, Immunity, 7: 461-472, 1997を参照。代替的には、実際にＡＰＣによりＣＤ１ｄ分子中に提示されたペプチドは、さまざまなクロマトグラフィ法により溶出し、分離され得る。このような方法論の完全な説明は、Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000に記載されている。抗原候補を１以上のインビトロのアルゴリズムによりスクリーニングして、抗原性タンパク質内のＮＫＴ細胞エピトープ配列を同定することができる。好適なアルゴリズムは、限定されないが、次のウェブサイトに記載されるものを含む。http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
より特定的には、このようなアルゴリズムにより、ＣＤ１ｄ分子の溝内に嵌まる１以上のペプチド配列の抗原性タンパク質内の予測が可能になる。
【０１３５】
本発明の免疫原性ペプチドは、たとえば、バクテリア細胞（たとえば、Escherichia coli）、酵母菌（たとえば、Pichia種、Hansenula種、Saccharomyces種またはSchizosaccharomyces種）、昆虫細胞（たとえば、Spodoptera frugiperdaまたはTrichoplusia ni）、植物細胞または哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞）での組換え発現により製造することができる。一方で、斯くして必要となる好適な発現ベクターの構築（プロモータおよび終始配列などのさらなる情報を含む）には、標準的な組換えＤＮＡ技術が必要とされる。本発明の組換えにより製造される免疫原性ペプチドは、たとえば、免疫原性ペプチドのＮおよび／またはＣ末端に隣接して挿入された酵素切断部位の酵素切断に続いて、好適な精製を介して、より大きな前駆体タンパク質に由来し得る。
【０１３６】
本発明の免疫原性ペプチドの限定的な長さを考慮して、ペプチドは、異なるアミノ酸を互いに結合することにより調製される、化学的ペプチド合成により調製され得る。化学合成は、たとえば、Ｄアミノ酸、非天然起源の側鎖を有するアミノ酸、または、メチル化システインなどの修飾側鎖を有する天然アミノ酸などの含有に特に好適である。化学的ペプチド合成法はよく記載されており、ペプチドは、アプライドバイオシステムおよび他の会社などの会社から注文することができる。ペプチド合成は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）または溶液相ペプチド合成の反対のいずれかとして行なうことができる。最もよく知られているＳＰＰＳ法は、当業者に広く知られているｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相化学である。さらに、ペプチドは、Kent（Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193）に最初に記載され、たとえば、Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205に概説されるように、連結戦略（２つの非保護ペプチドフラグメントの化学選択的結合）を用いて、互いに連結させ、より長いペプチドを形成することができる。これにより、ＳＰＰＳの範囲を超えたタンパク質合成が達成され得るという非常に大きな潜在性が得られる。１００から３００個の残基のサイズを有する多くのタンパク質が、この方法により合成に成功している。ＳＰＰＳにおける極めて大きな進歩のために、合成ペプチドは、生化学、薬理学、神経生物学、酵素学および分子生物学の研究分野においてより一層強まる決定的な役割を果たし続けている。
【０１３７】
目的の免疫原性ペプチドの物理的および化学的特性（たとえば、溶解性、安定性など）は、ペプチドが治療用組成物において用いられるのに好適である／あろうかどうかを判定するために調べられる。典型的には、これは、ペプチドの配列を調整することにより最適化される。随意に、ペプチドは、当該技術分野で知られる技術を用いて合成後に修飾することができる（たとえば、官能基の添加／欠失などによる化学的修飾）。
【０１３８】
したがって、またさらなる局面では、本発明は、インビボまたはインビトロ（エクスビボ）で、病原体関連抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞、または自己抗原もしくは同種因子特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞、またはアレルゲン特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞、または腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞、または、移植片から脱落した同種抗原に特異的なＣＤ４＋ＮＫＴ細胞、または、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスタンパク質からの抗原に特異的なＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を生成するための方法を提供する。特に、上記ＮＫＴ細胞は、上記抗原を提示する任意の細胞に対して強い増殖特性で応答し、細胞集団として得られる。さらに、特に、上記ＮＫＴ細胞は、自己もしくは同種抗原、アレルゲン、移植片から脱落した抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスタンパク質に由来する抗原を提示する任意の細胞に対して強い抑制特性で応答し、細胞集団として得られる。
【０１３９】
本発明は、ここに記載される方法により得られる、このような抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞（の集団）まで拡張する。
【０１４０】
一実施形態では、末梢血細胞の単離、単離された末梢血細胞と本発明に従う免疫原性ペプチドとを接触させることによるインビトロでの細胞集団の刺激、および、刺激された細胞集団の、より特定的にはＩＬ−２またはＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下での、増殖を含む方法が提供される。本発明に従う方法は、より多数のＣＤ４＋ＮＫＴ細胞が製造され、病原体関連抗原、または自己もしくは同種抗原、アレルゲン、腫瘍関連抗原、移植片から脱落した抗原または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種において用いられるウイルスタンパク質からの抗原に特異的な上記細胞を（抗原特異的エピトープを含有するペプチドを用いることにより）生成することができるという利点を有する。
【０１４１】
代替的な実施形態では、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、ここに提供された免疫原性ペプチドを対象に投与し、インビボで生成されたＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を回収することにより、インビボで生成することができる。
【０１４２】
上記方法により得られる病原体関連抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、対象におけるウイルス、バクテリアまたは寄生生物による感染症に関連する罹患率および／または死亡率を予防するための医薬としての使用を特に目的とする。上記方法により得られる自己抗原または同種因子特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、自己免疫疾患または同種因子に対する反応に関連する罹患率および／または死亡率を抑制するための医薬としての使用を特に目的とする。上記方法により得られるアレルゲン特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、アレルギー性疾患に関連する罹患率および／または死亡率を抑制するための医薬としての使用を特に目的とする。上記の方法により得られる腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、腫瘍に関連する罹患率および／または死亡率を抑制するための医薬としての使用を特に目的とする。上記方法により得られる移植片同種抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、移植片拒絶反応を予防することを特に目的とする。上記方法により得られるウイルスタンパク質特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に関連する罹患率および／または死亡率を抑制するための医薬としての使用を特に目的とする。
【０１４３】
本発明の免疫原性ペプチドの上記の使用のいずれかについて、上記ペプチドは、上記ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞により置換され得る。同種遺伝子および自己遺伝子細胞の両方の使用が企図される。上記抗原特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞をそれを必要とする対象に投与する（すなわち、細胞内病原体による感染症に関連する罹患率を予防するため、自己免疫疾患、同種因子に対する反応、アレルゲンへの曝露、腫瘍、移植片拒絶反応およびウイルスベクター抗原に対する反応に関連する罹患率を予防または治療するため）ことを含む任意の方法は、本発明の一部である。
【０１４４】
本発明は、本発明の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列、および、たとえば、組換え発現のためまたは遺伝子療法におけるそれらの使用のための方法にも関する。特に、上記核酸配列は、本発明の免疫原性ペプチドを発現することが可能である。
【０１４５】
本発明の免疫原性ペプチドは、任意の好適な遺伝子療法を用いて、それを必要とする対象に投与され得る。病原体に関連する罹患率／死亡率の予防、または、自己抗原もしくは同種因子に対する免疫応答の抑制のための本発明の任意の使用または方法において、本発明の免疫原性ペプチドによる免疫化は、養子細胞移入と組合されてもよい。組合せると、上記免疫化、養子細胞移入および遺伝子療法は、同時に、または、任意の可能な組合せで順次用いることができる。
【０１４６】
遺伝子療法では、免疫原性ペプチドをコードする組換え核酸分子は、ネイキッドＤＮＡとして用いるか、または、標的細胞への送達のためのリポソームもしくは他の脂質系において用ることができる。プラスミドＤＮＡを細胞内に直接移入するための他の方法は、ヒト遺伝子療法での使用のために当業者に周知であり、プラスミドＤＮＡをタンパク質に複合化することにより、ＤＮＡを細胞上の受容体に標的化することを含む。最も単純な形態では、遺伝子移入は、微量注入のプロセスを介して、微量のＤＮＡを細胞の核内に注入することにより単純に行なわれ得る。組換え遺伝子が一旦細胞内に導入されると、細胞正常メカニズムにより認識されて、転写および翻訳が行なわれ得、遺伝子産物が発現される。ＤＮＡをより多数の細胞内に導入するために他の方法も試みられている。これらの方法は、ＤＮＡがリン酸カルシウムとともに沈殿され、ピノサイトーシスにより細胞内に取込まれるトランスフェクション、細胞を大電圧パルスに曝露し、正孔を膜内に導入する）電気穿孔法、標的細胞と融合する親油性小胞内にＤＮＡを詰込むリポフェクション／リポソーム融合、小さな発射体に結合されたＤＮＡを用いた微粒子銃を含む。ＤＮＡを細胞内に導入するための別の方法は、ＤＮＡを化学的修飾タンパク質に結合させることである。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し、ＤＮＡの細胞内への取込みを向上させることが可能である。ＤＮＡ複合体を含有する溶液にアデノウイルスを混合するか、または、タンパク質架橋剤を用いてアデノウイルスに共有結合されたポリリシンにＤＮＡを結合させることにより、組換え遺伝子の取込みおよび発現が大幅に向上する。アデノ随伴ウイルスベクターを血管細胞内への遺伝子送達のために用いることもできる。ここで用いられる「遺伝子移入」とは、遺伝子によりコードされた特定の産物の発現を可能にするために一般的に行なわれる、細胞内に外来性核酸分子を導入するプロセスを意味する。上記産物は、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、または酵素的に活性なＲＮＡを含んでもよい。遺伝子移入は、培養細胞で行うか、または、哺乳類内への直接投与により行なうこともできる。別の実施形態では、本発明に従う免疫原性ペプチドをコードする核酸分子配列を含有するベクターが提供される。特定の実施形態では、ベクターは、核酸分子配列が特定の組織においてのみ発現されるように生成される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法は、たとえば、本発明の免疫原性ペプチドをコードする配列を、ペプチドの発現を１以上の組織または臓器中に特異的に誘導するプロモータの制御下に置くなど、当該技術分野で周知である。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが、本発明に従うペプチド、そのホモログまたは誘導体をコードする核酸配列（たとえば、ｃＤＮＡ）の、標的組織内または細胞集団内への送達のために用いることができる。このようなコード配列を含有する組換えウイルスベクターを構築するためには、当業者に周知な方法を用いることができる。代替的には、本発明に従う免疫原性ペプチドをコードする核酸分子を含有する設計された細胞を遺伝子療法に用いてもよい。
【０１４７】
遺伝子療法に用いられるペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドまたはポリペプチドがそれに由来する完全抗原の一部であってもよいことは、当業者には明らかであるべきである。
【０１４８】
本発明に従う１以上のペプチドの投与が遺伝子移入を介して確保される場合（すなわち、投与の際に、インビボで本発明に従うペプチドの発現が確保される核酸の投与）、核酸の適切な投与量は、導入された核酸の結果として発現されるペプチドの量に基づいて求められ得る。
【０１４９】
本発明の医薬は、通常、必ずしもそうではないが、有効成分として、本発明の免疫原性ペプチドの少なくとも１つ、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞免疫原性ペプチド（の集団）または上記免疫原性ペプチドを発現することの可能な遺伝子療法ベクターを含有する（医薬）製剤である。有効成分以外に、このような製剤は、（医薬上許容される）希釈剤、キャリアまたはアジュバントの少なくとも１つを含有する。典型的には、医薬上許容される化合物（希釈剤、キャリアおよびアジュバントなど）は、たとえば、薬局方ハンドブック（たとえば、米国、欧州または国際薬局方）で探すことができる。本発明の医薬または医薬組成物は、通常、（予防上または治療上）有効な量の有効成分を含有し、その有効性は、予防または治療されるべき病状または障害に相対的である。特に、本発明の医薬組成物は、予防または治療用途のためのワクチンである。
【０１５０】
本発明の医薬または医薬組成物は、上記医薬または組成物の多数回の投与を含む予防または治療レジメンの一部として、それを必要とする対象に投与されることが必要であり得る。上記複数回の投与は、通常順次行なわれ、２回の投与の間の時間間隔は異なり得、有効成分の性質および治療または予防されるべき病状の性質に合わせて調整される。１回の投与でそれを必要とする対象に与えられる有効成分の量は異なり得、対象の身体的状態（たとえば、体重、年齢）、予防または治療されるべき病状、および治療する医者、外科または看護婦の経験などの要因に依存する。
【０１５１】
「希釈剤」という用語は、たとえば、生理食塩水を指す。「アジュバント」という用語は、通常、それら単独で与えられると、存在しても少ししか直接的な作用を有しないが、他の薬剤（たとえば、薬、ワクチンなど）の作用を改変する（好ましくは増大させる）薬理剤または免疫剤を指す。アジュバントの一例として、本発明の免疫原性ペプチドが吸着され得る水酸化アルミニウム（ミョウバン）が挙げられる。さらに、多くの他のアジュバントが当該技術分野において既知であり、ＣＤ１ｄ中のペプチド提示およびＮＫＴ細胞の活性化を促進させる限り、使用することができる。「医薬上許容されるキャリア」という用語は、たとえば、上記組成物を溶解、分散または拡散させることにより、治療されるべき座位へのその適用または播種を促進させ、および／または、その有効性を損なうことなく保管、輸送または取扱いを容易化するために、ともに有効成分が製剤化される任意の材料または物質を意味する。それらは、任意またはすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤（たとえば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノールなど）、等張液（たとえば、糖類または塩化ナトリウム）などを含む。組成物中の有効成分の作用の持続時間を制御するために、追加の成分が含まれてもよい。医薬上許容されるキャリアは、液体を形成するように圧縮された固体または液体または気体であってよく、すなわち、本発明の組成物は、濃縮液、乳剤、溶液、顆粒、粉末、噴霧剤、エアゾール剤、懸濁液、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、ペレット剤または散剤として好適に用いられ得る。上記医薬組成物およびそれらの製剤中で用いられる好適な医薬キャリアは、当業者に周知であり、本発明の範囲内におけるこれらの選択に特に制限はない。それらは、医薬上の慣習に適合する限り、すなわち、哺乳類に永続的な損傷を与えないキャリアおよび添加物である限り、湿潤剤、分散剤、固着剤、粘着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤（たとえば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノールなど）、等張液（糖類または塩化ナトリウムなど）などの添加物も含み得る。本発明の医薬組成物は、たとえば、選択されたキャリア材料、および、所望により、表面活性剤などの他の添加物とともに、１ステップまたは複数ステップの手順で、有効成分を均質に混合し、コーティングし、および／または粉砕することにより、任意の既知の方法で調製されてもよい。本発明の医薬組成物は、たとえば、通常約１から１０μｍの直径を有するマイクロスフェアの形態で得ることを意図して、すなわち、有効成分の制御放出または徐放のためのマイクロカプセルの製造のために、微粒子化により調製することもできる。
【０１５２】
本発明に従う免疫原性ペプチド、そのホモログまたは誘導体（および、それらの生理上許容される塩または医薬組成物はすべて「有効成分」という用語に含まれる）は、予防または治療するべき病状に適切であり、かつ、ここでは投与されるべき免疫原性タンパク質である化合物に適切な任意の経路により投与され得る。可能な経路は、部分的、全身、経口（固体形態または吸入）、直腸、鼻、局所(眼、頬および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、鞘内および硬膜外を含む）を含む。好ましい投与経路は、たとえば、レシピエントの病状または予防もしくは治療されるべき病状により異なり得る。
【０１５３】
製剤は、単位投与形態で簡便に提示されてもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかにより調製されてもよい。経口投与に好適な本発明の製剤は、各々が所定量の有効成分を含有するカプセル剤、サシェ（cachets）または錠剤などの個別単位として、粉剤または顆粒剤として、水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として、油中水液体乳剤または水中油液体乳剤として提示されてもよい。有効成分は、ボーラス、舐剤またはペースト剤として提示されてもよい。錠剤は、随意に１以上の補助成分とともに、圧縮または成形することにより作られ得る。圧縮錠剤は、好適な機械で、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤または分散剤などと随意に混合された、散剤または顆粒剤などの自由流動形態の有効成分を圧縮することにより調製され得る。成形された錠剤は、好適な機械で、不活性な液状希釈剤により湿らせた粉剤化化合物の混合物を成形することにより作られ得る。錠剤は、随意に、コーティングされたり、刻み目を入れられてもよく、その中の有効成分の徐放または制御放出が得られるように製剤化すればよい。
【０１５４】
本発明のさらなる局面は、病原体関連抗原、自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍関連抗原、移植片から脱落した同種抗原、または遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスからの抗原からのＮＫＴ細胞エピトープと、上記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するか、または、リンカーにより上記ＮＫＴ細胞エピトープから分離された、チオレダクターゼモチーフとを含有する、単離された免疫原性ペプチドに関する。
【０１５５】
遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種の目的でのウイルスベクターは、組換え核酸技術による修飾に非常に適用可能である。上記を考慮して、当業者はさらに、本発明に従う免疫原性ペプチドおよびそれらの使用に適用される、ウイルスベクターＮＫＴ細胞エピトープの修飾が、ウイルスベクター自体に直ちに導入できることを容易に想定するであろう。したがって、病原体関連抗原、自己抗原または同種因子、アレルゲン、腫瘍に関連する抗原、移植片からの同種抗原、遺伝子療法もしくは遺伝子ワクチン接種のために用いられるウイルスベクターの抗原のＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを含有する免疫原性ペプチドによるワクチン接種（および／または、対応する遺伝子ワクチン接種および／または、対応する養子細胞移入）は、同じ有益な効果が修飾ウイルスベクターによって得られるため、余分となる可能性がある。したがって、本発明はさらに、単離されたウイルスベクターとして規定される修飾ウイルスベクターであって、ウイルスベクタータンパク質の少なくとも１つに存在する少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープが、チオレダクターゼモチーフを、上記ＮＫＴ細胞エピトープに隣接するように、または、リンカーにより上記ＮＫＴ細胞エピトープから分離されるように、上記ウイルスベクタータンパク質に挿入することにより修飾されることを特徴とする、修飾ウイルスベクターをさらに包含する。その一実施形態では、上記ウイルスベクターはさらに、上記修飾ＮＫＴ細胞エピトープが、ＣＤ１ｄ分子により提示されることが可能であることを特徴とする。別の実施形態では、上記単離されたウイルスベクターはさらに、それらの細胞形質導入特性が、ＮＫＴ細胞エピトープ修飾を有さない同じウイルスベクターと比較して大幅に変わらないことを特徴とする。
【０１５６】
以下、本発明を次の実施例により説明するが、実施例は、限定的意図は一切無しに設けられる。さらに、ここに記載されるすべての参照文献は、参考によりここに明確に含まれる。
【実施例】
【０１５７】
実施例−１
フランキング残基中にＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを含有するペプチドによる免疫化による、第ＶＩＩＩ因子に特異的なクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の制御
フランキング残基内にＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープおよびＣ−ＸＸ−Ｃチオレダクターゼモチーフを含有する（配列番号１）、ペプチド２１９６  ５０μｇにより、ＢＡＬＢ／ｃ第ＶＩＩＩ因子ＫＯマウス（Ａ群）を１週間間隔で４回免疫化した。
【０１５８】
配列番号１：ＣＧＨ  ＣＧＧ  ＦＴＮ  ＭＦＡ  ＴＷＳ  ＰＳＫ
次に、ヒト第ＶＩＩＩ因子を、１週間に分けた５回の機会に、１回注入当たり１０ＩＵを用いた皮下経路により注入した。最後の免疫化後１０日目にマウスを屠殺し、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気細胞分離により調製した。このような細胞を免疫化ペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子によりインビトロで２回刺激し、その後、ＩＬ−４およびＩＦＮγの産生による測定により、それらの活性化状態を評価した。コントロール群（Ｂ）を同じプロトコルに従って処置したが、ペプチドワクチン接種は受けなかった。
【０１５９】
結果（図１）は、コントロール群と比較して、ペプチドにより免疫化したマウスから得られた第ＶＩＩＩ因子特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞により、ＩＬ−４産生の１０倍の低下、および、ＩＦＮγ産生における７倍の低下が示される。
【０１６０】
結果は、平均＋ＳＥＭとして示される。
実施例−２
ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを含有するペプチドによる免疫化による抗Ａｄ５ＩｇＧ抗体応答の抑制
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）を、１週間間隔で行なったミョウバン中の配列番号２のペプチド５０μｇの４回の皮下注入により免疫化した。
【０１６１】
配列番号２：ＣＨＧ  ＣＧＧ  ＦＩＧＬＭＹＹ
このようなペプチドは、フランキング残基中に、アデノウイルス５（Ａｄ５）のヘキソンタンパク質のＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを含有する。マウスのコントロール群（ｎ＝６）は、ペプチドの代わりにミョウバン中の生理血清を受けた。次に、すべてのマウスは、１週間に分けて、ＩＶ経路により１０9Ａｄ５ウイルス粒子の注入を２回受けた。最後のＡｄ５注入後１０日目に、マウスを出血させて、Ａｄ５粒子に対する全ＩｇＧ抗体の濃度を直接結合ＥＬＩＳＡで測定した。簡潔に述べると、Ａｄ５ウイルス粒子をポリスチレンプレート上に不溶化させ、続いて、マウス血清の希釈により洗浄およびインキュベートした。二度目の洗浄後、マウス抗Ａｄ５抗体の結合を、ヤギ抗血清のマウスＩｇＧへの添加により検出した。ペプチドで事前処置したマウス（黒色ヒストグラム、図２）は、有意な量の抗体を産生しなかったが、非免疫化マウス（白抜きヒストグラム）は、二度目のＡｄ５注入の後に活発な応答を生じる。結果は、平均＋ＳＥＭとして任意の単位で示す。
【０１６２】
**は、ｐ＜０．００１での有意性を示す。
実施例−３
チオレダクターゼモチーフを含有するＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴエピトープを包含するペプチドによるマウス免疫化により惹起されたＣＤ４＋ＮＫＴ細胞による腫瘍細胞のアポトーシスの誘発
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）を、１週間間隔で行なったミョウバン中の配列番号３のペプチド５０μｇの４回の皮下注入により免疫化した。
【０１６３】
配列番号３：ＣＧＨ  ＣＧＧ  ＦＤＫＬＰＧＦ
このようなペプチドは、フランキング残基中に、オバルブミンに由来するＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを含有する。マウスのコントロール群（ｎ＝６）は、ペプチドの代わりにミョウバン中の生理血清を受けた。最後の免疫化後１０日目に、マウスを屠殺し、磁気細胞分離により、脾臓ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を調製した。このような細胞を免疫化ペプチドによりインビトロで２回刺激し、その後、ＩＬ−４およびＩＦＮγの産生による測定により、活性化状態を評価した。
【０１６４】
次に、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞株を、ＥＧ７腫瘍細胞を死滅させる能力についてインビトロで評価した。ＥＧ７腫瘍細胞（Ｈ−２ｂ）は、卵構築物により形質導入された胸腺腫に由来する。ＣＤ１ｄ拘束性卵エピトープは上記細胞により提示されるが、これは、ＮＫＴ活性化および腫瘍細胞の死滅を引起こすには不十分であることが知られている。
【０１６５】
ＥＧ７細胞を１μｍのＤｉＯＣ18（インビトロジェンによる３，３’過塩素酸ジオクタデシクロキサカルボシアニン（3,3'-dioctadecycloxacarbocyanine perchlorate））で膜レベルで標識化した。次に、ＥＧ７細胞（１ウェル当たり１×１０5）を１／１から１／５の比（ＥＧ７細胞対ＮＫＴ細胞）でのＮＫＴ細胞株の存在下で、３７℃で１８時間培養した。まず、配列番号３のペプチドを添加した抗原提示細胞によりＮＫＴ細胞株をインビトロで４時間刺激した。１８時間後、細胞を採取し、メーカーの指示（アポトーシス検出キット、ＢＤバイオサイエンス）に従って、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメータ（ＢＤバイオサイエンス）で分析した。
【０１６６】
結果は、配列番号３のペプチドにより免疫化されたマウスから得られたＮＫＴ細胞株とインキュベートしたＥＧ７細胞は、アポトーシスへと誘発されるが、ペプチドの代わりに生理血清を受けたコントロールマウスから得られたＮＫＴ細胞は、有意な度合いの腫瘍細胞アポトーシスを誘発しなかった。
【０１６７】
実施例−４
ＭＯＧ特異的ＣＤ４＋ＮＫＴリンパ球の検出のためのＣＤ１ｄ分子の三量体の使用
多発性硬化症は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）などの自己抗原に対するＣＤ４＋ＮＫＴ細胞が重要な役割を果たす可能性の高い、慢性的脱髄疾患である。その実験等価物であるＥＡＥ（実験的自己免疫脳脊髄炎）は、ヒト疾患の特徴の大部分を模倣し、病原性メカニズムを理解し、新たな治療を描写するために用いられる。
【０１６８】
したがって、ＭＯＧ特異的ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を数え上げることは、疾患予後の予測となり得るであろう。
【０１６９】
ＣＤ１ｄ結合エピトープは、上に記載したように、配列２００から２０６に対応して、アルゴリズムおよび機能アッセイの組合せによりマウスＭＯＧタンパク質において同定される。
【０１７０】
ＥＡＥが誘発されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を調製する。まず、ＣＤ４（−）細胞を磁気ビーズを用いて脾臓細胞浮遊液から除去する。
【０１７１】
ＣＤ１ｄ分子（Ｈ−２ｂ）の三量体は、フィコエリスリンなどの蛍光標識を含み、当該技術分野で知られるように作られる。
【０１７２】
１晩のインキュベーションにより、ＣＤ１ｄ拘束性ＭＯＧ  ＮＫＴ細胞エピトープおよびチオレダクターゼモチーフを包含する合成ペプチドが製造される。
【０１７３】
チオレダクターゼモチーフ（ＣＧＰＣ）およびＣＤ１ｄ結合モチーフを連結するリンカーを含有する、ＣＧＰＣＧＧＦＬＲＶＰＣＷＫＩ（配列番号４）。
【０１７４】
三量体に配列番号４のペプチドを室温で１晩添加する。次に、添加した三量体を洗浄し、３７℃で２時間ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートする。次に、浮遊液を蛍光活性化細胞分離システムにより測定し、ＭＯＧペプチドに特異的なＮＫＴ細胞の割合を評価する。
【０１７５】
実施例−５
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に由来するＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープで惹起したＮＫＴ細胞によるＨ−２ｂ腫瘍細胞（Ｒ１１３）の直接的死滅
未分化リンパ腫キナーゼは、個体発生中に多くの細胞上で発現されるが、成体期の外肺葉起源の腫瘍上にのみ発現される膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。したがって、それは、動物モデルおよびヒト腫瘍の両方に示されるような外肺葉起源のすべての腫瘍に直接関連するオンコジーンとして考えられる。たとえば、ヒト乳癌の６０％以下がＡＬＫを発現する。マウス起源のＡＬＫ＋腫瘍細胞株が入手可能であり、本発明のＡＬＫ特異的細胞溶解ＣＤ４＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させることが可能であるかどうかを評価するのに用いられ得る。
【０１７６】
フランキング残基内にＣｘｘＣ型のチオレダクターゼモチーフを追加した、ＡＬＫのＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープを添加した自己樹状細胞により、無感作マウスの脾臓から得られたＣＤ４Ｔ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｈ−２ｂバックグラウンド）を４回刺激した。（配列番号５：ＣＨＧＣＧＧＷＬＱＩＶＴＷＷＧＰＧＳのペプチド（チオレダクターゼモチーフが下線で示され、２つのグリシンがモチーフとＣＤ１ｄ拘束性エピトープとの間のリンカーとして使用された））
ＮＫＴ細胞自体が細胞溶解活性を有するため、我々は、チオレドックスモチーフ（ＷＬＱＩＶＴＷＷＧＰＧＳ）なしで、天然配列の同じＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴエピトープに曝露することにより、並行実験で刺激された細胞を含めた。
【０１７７】
最後の刺激から１０日目に、ＣＤ４Ｔ細胞を洗浄し、２対１の比（ＣＤ４対腫瘍細胞）で１０4  Ｒ１１３腫瘍細胞を含有する細胞培養マイクロプレートに添加した。Ｒ１１３は、ＡＬＫを恒常的に発現するＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた腫瘍Ｂ細胞株である。
【０１７８】
２０時間の共培養後、Ｒ１１３腫瘍細胞を、細胞アポトーシスのマーカとして使用したアネキシンＶ結合について評価した。
【０１７９】
図３は、配列１のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下では、単独で培養した腫瘍細胞と比較して（３．８％、左側ヒストグラム）、腫瘍細胞死において４．５倍の増加がある（１８％、中央ヒストグラム）ことを示している。予測したように、ＣＤ１ｄおよび天然配列のペプチドとの同族相互作用により活性化されたＮＫＴ細胞は、中間％の細胞死を示す（１１％、右側ヒストグラム）。３回繰返しの平均±ＳＤ。
【０１８０】
したがって、次のように結論付けられる。
（１）  ペプチドは、ＣＤ１ｄ決定因子と関連して提示され得る。
【０１８１】
（２）  本物の腫瘍細胞は、ＣＤ１ｄ拘束性エピトープの同族認識を介した活性化により得られるＮＫＴ細胞への曝露により、アポトーシスへと誘発され得る。
【０１８２】
（３）  ＮＫＴ細胞が、フランキング残基内にチオレダクターゼモチーフを含有するＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞エピトープへの曝露により活性化されるとき、より有意に高い割合の腫瘍細胞がアポトーシスへと誘発される。
【０１８３】
第２の実験では、代替的な遺伝的バックグラウンド（ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｈ−２ｄバックグラウンド）からの未変性のＣＤ４Ｔ細胞を無感作マウスの脾臓から得、配列番号５のペプチドを添加した自己樹状細胞で４回刺激した。
【０１８４】
ＢＡＬＢ／ｃ由来ＡＬＫ＋腫瘍細胞株（ＶＡＣ）との共培養を上述のように行なった。腫瘍細胞のアポトーシスを、faccsによりアネキシンＶ結合を評価することにより測定し
た。
【０１８５】
図４は、配列１のペプチドと培養したＮＫＴ細胞の存在下では、単独で培養した腫瘍細胞（５．６％、左側ヒストグラム）または天然配列のペプチドの存在下で培養した腫瘍細胞（１５％、右側ヒストグラム）と比較して、腫瘍細胞死において有意な増加がある（２５％、中央ヒストグラム）ことを示している。３回繰返しの平均±ＳＤ
これらのデータは、ＮＫＴ細胞に曝露されたとき、第２の無関係の腫瘍細胞株がアポトーシスへと誘発され得、この効果は、ＮＫＴ細胞が、フランキング残基内にチオレダクターゼモチーフを含有するＣＤ１ｄ拘束性エピトープに曝露されることにより刺激されたときに有意に増加することを示唆している。
【０１８６】
実施例−６
ＣＤ１ｄ結合およびチオレダクターゼモチーフを含有するペプチドによる予備免疫化によるＥＡＥの予防
ＥＡＥ（実験的自己免疫脳脊髄炎）は、中枢神経系脱髄が起こり、多発性硬化腫の実験同等物として考えられるモデル疾患である。少数の自己抗原が疾患の惹起および維持に関与すると考えられ、その中にＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）がある。疾患は、ＭＯＧアミノ酸３５〜５５を包含するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを使用して、ＭＯＧ免疫化によりＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて惹起され得る。
【０１８７】
ＭＯＧは、ＣＤ１ｄに結合し、ＮＫＴ細胞を活性化する配列を含有する。したがって、配列ＰＨＦＬＲＶＰＣＷＫＩのペプチドは、合成および、配列ＣＨＧＣＧＧＦＬＲＶＰＣＷＫＩ（チオレダクターゼモチーフが下線で示され、２つのグリシンのリンカーが当該モチーフとＣＤ１ｄ結合モチーフとの間にある、配列番号６のペプチド）のチオレダクターゼ含有ペプチドにより製造される。
【０１８８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群を、配列番号６のペプチドにより皮下経路で４回免疫化し（５０μｇ）、コントロールとして、天然配列のペプチドにより免疫化する。最後の免疫化後１０日目に、無感作の非免疫化動物の群を含むすべてのマウスに、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５ペプチド  １００μｇ／Mycobacterium butyricum  ４００μｇの皮下注入およびＮＯａＣｌ中のBortetella pertussis  ３００ｎｇのｉｐ注入により、疾患を誘発させる。＋２日目に、B. pertussisの二度目の注入を与える。
【０１８９】
ＥＡＥの兆候を時間と共に追跡する。配列番号６のペプチドにより予備免疫化されたマウスは、ＥＡＥを発症しないが、コントロール無感作マウスおよび天然配列のペプチドで予備免疫化された群は、有意な疾患兆候を発症することが観察される。
【０１９０】
実施例−７
ＧＡＤ６５由来ペプチドによる突発性インスリン依存型糖尿病の予防および抑制
非肥満（ＮＯＤ）マウスは、突発性インスリン依存型肥満のための好適な動物モデルとなる。このような動物では、ヒトと同様に、自己抗原グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）に対する早期免疫応答が、インスリン炎が見られる時点で観察され、応答はそれから分子内および分子間拡散により延長する。新生仔へのタンパク質の投与によりＧＡＤ６５への耐性を誘発することにより、糖尿病の発症が予防される。
【０１９１】
ＧＡＤ６５は、ＣＤ１ｄに結合する能力を有するアミノ酸配列を含有する。したがって、ＧＡＤ６５のアミノ酸５０１から５０７に相当する配列ＰＱＨＴＮＶＣＦＷＦＶ、および、フランキング残基内にチオレダクターゼモチーフを包含するその相当物である、配列番号７：ＣＨＧＣＧＧＨＴＮＶＣＦＷＦＶのペプチド（チオレダクターゼモチーフに下線が引かれ、２つのグリシンのリンカーが当該モチーフとＣＤ１ｄ結合モチーフとの間にある）が、合成により製造される。
【０１９２】
雌ＮＯＤマウスを、配列番号７または天然配列のいずれかのペプチドの４回の皮下注入により、４週齢から免疫化し、非免疫化群との比較により、これらの群の各々で血糖を追跡する。配列番号７のペプチドで予備免疫化されたＮＯＤマウスは、高血糖が予防されるが、天然配列のペプチドで処置したマウスおよび非免疫化動物は、１４週目以降から始まり高血糖を発症する。
【０１９３】
実施例−８
アレルゲンDer p 1への曝露により誘発される喘息の予防
イエダニD. pteronyssinusからのアレルゲンは、アレルギー性喘息にしばしば関与する。Der p 1は、D. pteronyssinusの主なアレルゲンである。Der p 1の配列は、アミノ酸配列３８から４４に相当するＣＤ１ｄ結合モチーフを含有する。配列ＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳのペプチドおよびチオレダクターゼモチーフを含有するその相当物が、合成により製造される。したがって、配列番号８  ＣＧＰＣＧＧＦＳＧＶＡＡＴＥＳのペプチドは、チオレダクターゼモチーフ（下線部分）およびモチーフとＣＤ１ｄ結合モチーフとの間の２つのグリシンのリンカーを含有する。
【０１９４】
アレルギー性喘息は、３日間連続投与される１００μｇのDer p 1の経鼻点滴注入によりＢＡＬＢ／ｃマウスに誘発され得る。喘息は、気管支過敏症および肺内に浸潤する好酸球の誘因により特徴付けられる。
【０１９５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを５０μｇの配列番号８のペプチドまたはコントロールとして天然配列のペプチドのいずれかの４回の注入により免疫化する。最後の免疫化後１０日目に、Der p 1を経鼻点滴注入により投与する。配列番号８のペプチドにより予備免疫化したマウスは、メタコリンの吸入に対する気管反応性を発症せず、好酸球による肺の浸潤を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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