(57)【要約】      （修正有）【課題】増殖した造血細胞を投与可能な赤血球に分化させるための、および赤血球を含む細胞の投与可能なユニットの生産のための、造血細胞を増殖する方法の提供。【解決手段】胎盤灌流液由来の造血細胞と、臍帯血由来の造血細胞とを組み合わせた、造血細胞の増殖および分化を加速させ、造血細胞から赤血球を生産する方法であって、該方法は、支持細胞層の非存在下で造血細胞集団を増殖させることおよび造血細胞を赤血球または赤血球前駆体に分化させることを含む方法、および造血細胞の増殖および分化を行うことができるバイオリアクター。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）支持細胞が存在しない第１の培地中で、第１の造血細胞集団を増殖させて、増殖した造血細胞集団を得る工程であって、
上記第１の造血細胞集団の当初の細胞密度は、５×１０４個／ｍＬ以下であり、
上記第１の培地は、Ｅｐｏを１ＩＵ以下の濃度で含んでおり、かつ、ＳＣＦを１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度で含んでいる、工程と、
（ｂ）上記増殖した造血細胞集団を、第２の培地に接触させることによって、上記増殖した造血細胞集団中の複数の造血細胞を、赤血球へ分化させる工程であって、
上記増殖した造血細胞集団の当初の細胞密度は、２．７５×１０５個／ｍＬ超であり、
上記第２の培地は、Ｅｐｏを３ＩＵ／ｍＬ以上の濃度で含んでおり、かつ、ＳＣＦを５０ｎｇ／ｍＬ以下の濃度で含んでいる、工程と、
（ｃ）上記培地から上記赤血球を単離する工程と、
を含む、赤血球を生産する方法であって、
上記ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏは、上記第１の培地または第２の培地の定義されていない成分の中には含まれていないことを特徴とする、赤血球を生産する方法。
【請求項２】
上記第１の培地および第２の培地は、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−１１、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ホメオボックス−Ｂ４（ＨｏｘＢ４）またはメチルセルロースのうち、１つ以上を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＳＣＦは、上記第１の培地中に、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ＩＬ−３は、上記第１の培地中に、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記ＩＬ−３は、上記第１の培地中に、１〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ＩＬ−３は、上記第１の培地中に、５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記第２の培地は、免疫調節化合物を含み、
上記免疫調節化合物は、上記免疫調節化合物が存在しない状態で増殖した複数の造血細胞に比べて、造血細胞の数を増加させるものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記造血細胞が、ＣＤ３４+であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記造血細胞が、Ｔｈｙ−１+、ＣＸＣＲ４+、ＣＤ１３３+またはＫＤＲ+であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記造血細胞が、ＣＤ３４-ＣＤ１３３+またはＣＤ３４-ＣＤ１１７+であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記造血細胞が、ＣＤ４５-であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記造血細胞が、ＨＬＡ−ＤＲ-、ＣＤ７１-、ＣＤ２-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１６-、ＣＤ２４-、ＣＤ５６-、ＣＤ６６ｂ-および／またはグリコフォリンＡ-であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記造血細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄、胚性幹細胞または誘導された多能性細胞から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記造血細胞は、胎盤灌流液から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記造血細胞は、臍帯血および胎盤灌流液から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造のみを通る灌流液のパッセージによって得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造のみを通る灌流液のパッセージによって得られることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記造血細胞は、ヒトの造血細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記第１の培地は、さらに、１〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、および、１〜１０００μｇ／ｍＬの濃度である脂質を含み、
上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含み、
上記第２の培地は、０．０１〜１００μＭの濃度であるヒドロコルチゾン、または、０．０１〜１００μＭの濃度であるデキサメタゾンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記ＩＧＦ−１は、上記第１の培地中に、１０〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＩＧＦ−１は、上記第１の培地中に、２０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
上記脂質は、上記第１の培地中に、１０〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
上記脂質は、上記第１の培地中に、２０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
上記ヒドロコルチゾンは、上記第２の培地中に、０．１〜５０μＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
上記ヒドロコルチゾンは、上記第２の培地中に、０．５〜１０μＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
上記デキサメタゾンは、上記第２の培地中に、０．０５〜２０μＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
上記デキサメタゾンは、上記第２の培地中に、０．１〜１０μＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
上記造血細胞のうちの複数は、Ａ型、Ｏ型、ＡＢ型、Ｏ型の血液型；Ｒｈ陽性またはＲｈ陰性；Ｍ型、Ｎ型、Ｓ型、またはｓ型の血液型；Ｐ１型の血液型；Ｌｕａ型、Ｌｕｂ型、またはＬｕ（ａ）型の血液型；Ｋ（Ｋｅｌｌ）型、ｋ（ｃｅｌｌａｎｏ）型、Ｋｐａ型、Ｋｐｂ型、Ｋ（ａ＋）型、Ｋｐ（ａ−ｂ−）型またはＫ−ｋ−Ｋｐ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｌｅ（ａ−ｂ−）型、Ｌｅ（ａ＋ｂ−）型またはＬｅ（ａ−ｂ＋）型の血液型；Ｆｙ  ａ型、Ｆｙ  ｂ型またはＦｙ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｊｋ（ａ−ｂ−）型、Ｊｋ（ａ＋ｂ−）型、Ｊｋ（ａ−ｂ＋）型またはＪｋ（ａ＋ｂ＋）型の血液型を作る能力を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
上記造血細胞は、Ｏ型、Ｒｈ陽性；Ｏ型、Ｒｈ陰性；Ａ型、Ｒｈ陽性；Ａ型、Ｒｈ陰性；Ｂ型、Ｒｈ陽性；Ｂ型、Ｒｈ陰性；ＡＢ型、Ｒｈ陽性またはＡＢ型、Ｒｈ陰性を作る能力を有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願第６１／２２２，９３０号（出願日２００９年７月２日）に基づいて優先権を主張し、該特許仮出願の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【０００２】
〔１．技術分野〕
本明細書では、全体として、造血細胞集団（例えばＣＤ３４+細胞集団）を増殖させる方法、および当該細胞集団から投与可能な赤血球のユニット（units）を生産する方法を提供する。また、本明細書では、上記増殖および分化を達成するバイオリアクターを提供する。
【０００３】
〔２．背景技術〕
米国では毎年、およそ１３００万ユニットの血液が、輸血、または血小板等の救命用血液製剤の生産のために用いられている。赤十字および他の機関によって、約５００ｍＬ〜約１０００ｍＬの全血サンプルを得るために、自発的な献血が利用される。ＨＩＶおよび他の外来病原体（adventitious pathogen）の発生率が比較的低い米国および西欧では、自発的な献血のセルフスクリーニングは比較的安全かつ効果的である。しかし、ＨＩＶおよび肝炎が蔓延している国では、輸血用の安全な血液の獲得は、大いに問題になり得る。自発的な献血に代わるものとして、多くのグループが、長期の保存に耐えうる安全な人工代用血液を発達させようと試みている。これらの人工代用血液のいくつかは、外傷性失血の応急手当において大いに有望である一方、長期にわたって赤血球の機能の代わりになるようには作られていない。戦場または世界中に設置されている民間の病院の患者に投与可能である、安全かつ豊富な赤血球の供給を発達させる必要性が高まっている。
【０００４】
従来の赤血球の生産方法は、非効率であまりに規模が小さいか、または、赤血球の継続的な現地での生産を可能にするにはあまりに面倒であるかのどちらかである。従来のディッシュまたはフラスコをベースとした培養系は、断続的な培地の交換がつきものであり、一般的なディッシュベースの培養系は、１０9個を超える細胞を１バッチ（single batches）として扱うために用いることはできない。ディッシュからの論理的なさらなる発展は、バッグ技術（例えば、ウェーブバイオリアクター）である。バッグ技術においては、バッグを用いることで培地の体積を大幅に増加させ、浮遊性担体を用いることで細胞の付着面積を増加させることができる。しかし、バッグ型のリアクターは、一般的に２×１０6〜約６×１０6細胞／ｍｌ培地で運転され、培養中の大幅な培地の希釈および煩雑な１０〜１００倍のデバルキング（debulking）が必要である。さらに、バッグ技術、および一般的な全ての大型攪拌槽型バイオリアクターは、「通常の」細胞増殖および分化を促す組織のような生理的環境を提供するものではない。
【０００５】
〔３．発明の概要〕
本明細書において、増殖した造血細胞を投与可能な赤血球に分化させるため、および赤血球を含む細胞の投与可能なユニットの生産のために、造血細胞（例えば造血幹細胞または造血前駆細胞）を増殖する方法を提供する。
【０００６】
一つの側面では、本明細書は、赤血球を生産する方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、ヒト胎盤灌流液由来の造血細胞を赤血球に分化させることを含み、上記方法は、支持細胞層の非存在下で造血細胞集団を増殖させること；および造血細胞を赤血球または赤血球前駆体に分化させることを含む。
【０００７】
別の側面では、本明細書は、造血細胞の増殖および上記造血細胞の赤血球への分化のためのバイオリアクターを提供する。上記バイオリアクターは、バッチ法に比べて継続的な赤血球の生産を容易にすることで、現在の赤血球生産方法と同等の多数の赤血球を、より小さい体積で生産することができる。特定の実施形態では、上記バイオリアクターは、細胞培養部材、細胞分離部材、ガス供給部材、および／または培地供給部材を備える。上記バイオリアクターの特定の実施形態では、赤血球は、磁気ビーズによる分離によって集められる。上記方法の別の側面では、赤血球は、上記赤血球中のヘモグロビンを部分的または完全に脱酸素化し、磁場を用いて赤血球を表面に引き寄せることで集められる。
【０００８】
別の側面では、本明細書に記載されるバイオリアクターを用いて赤血球を生産する方法が、本明細書中で提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載される複数のバイオリアクターを用いて赤血球を生産することを含む、赤血球の生産方法が本明細書中で提供される。
【０００９】
一つの側面では、本明細書では、支持細胞が存在しない培地中で、造血細胞集団を増殖させる工程であって、当該増殖させる工程の間に、上記造血細胞集団中の複数の造血細胞が赤血球へ分化する工程と、上記培地から上記赤血球を単離する工程と、を含む、赤血球を生産する方法であって、上記培地は、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦ、約０．０１〜約５００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＬ−３、および、約０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含み、上記ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏは、上記培地の定義されていない成分（例えば血清）の中には含まれていないことを特徴とする、赤血球を生産する方法を提供する。上記方法の特定の実施形態では、上記培地は、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−１１、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ホメオボックス−Ｂ４（ＨｏｘＢ４）またはメチルセルロースのうち、１つ以上、またはいずれも含まない。他の特定の実施形態では、上記培地は、約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約１００ｎｇ／ｍＬ；約１〜約５０ｎｇ／ｍＬ；または約５ｎｇ／ｍＬの濃度でＩＬ−３を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；または約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度でＥｐｏを含む。
【００１０】
上記方法の別の特定の実施形態では、上記培地はさらに約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、および、約１〜約１０００μｇ／ｍＬの濃度である脂質を含み、上記脂質はたんぱく質とコレステロールとの混合物を含み；上記培地は、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるヒドロコルチゾン、または、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＩＧＦ−１を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で脂質を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約５０μＭ；または約０．５〜約１０μＭの濃度でヒドロコルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．０５〜約２０μＭ；または約０．１〜約１０μＭの濃度でデキサメタゾンを含む。
【００１１】
さらに特定の実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約３Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのデキサメタゾン、および４０μｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。別のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのヒドロコルチゾン、および５０ｎｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。
【００１２】
ある他の実施形態では、造血細胞は、ある実施形態で、ＳＣＦ；Ｅｐｏ；ＩＧＦ−１；脂質；並びに、ヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含む培地中において、継続的な方法で増殖および分化し、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物（例えば、Ｌｉｐｉｄｓ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｒｉｃｈ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ
ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ７３０５−１Ｇ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む。特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；または約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＧＦ−１を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００μｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度である脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５μＭ〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるヒドロコルチゾンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５μＭ〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。
【００１３】
別の特定の実施形態では、上記培地は、免疫調節化合物を含み、上記免疫調節化合物は、上記免疫調節化合物が存在しない状態で増殖した複数の造血細胞に比べて、造血細胞の数を増加させるものである。
【００１４】
上記のあらゆる培地の特定の実施形態では、培地は血清を含まない。
【００１５】
上記方法の別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤ３４+である。上記方法の別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、Ｔｈｙ−１+、ＣＸＣＲ４+、ＣＤ１３３+またはＫＤＲ+である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤ３４-ＣＤ１３３+またはＣＤ３４-ＣＤ１１７+である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤ４５-である。別の特定の実施形態では、造血細胞は、ＣＤ２-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１６-、ＣＤ１９+、ＣＤ２４-、ＣＤ５６-、ＣＤ６６ｂ-および／またはグリコフォリンＡ-である。
【００１６】
別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄、胚性幹細胞または誘導された多能性細胞から得られる。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、胎盤灌流液から得られる。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、臍帯血および胎盤灌流液から得られる。さらに特定の実施形態では、上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造のみを通る灌流液のパッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）によって得られる。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ヒトの造血細胞である。
【００１７】
上記方法のある実施形態では、上記造血細胞のうちの複数は、Ａ型、Ｏ型、ＡＢ型、Ｏ型の血液型；Ｒｈ陽性またはＲｈ陰性；Ｍ型、Ｎ型、Ｓ型、またはｓ型の血液型；Ｐ１型の血液型；Ｌｕａ型、Ｌｕｂ型、またはＬｕ（ａ）型の血液型；Ｋ（Ｋｅｌｌ）型、ｋ（ｃｅｌｌａｎｏ）型、Ｋｐａ型、Ｋｐｂ型、Ｋ（ａ＋）型、Ｋｐ（ａ−ｂ−）型またはＫ−ｋ−Ｋｐ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｌｅ（ａ−ｂ−）型、Ｌｅ（ａ＋ｂ−）型またはＬｅ（ａ−ｂ＋）型の血液型；Ｆｙ  ａ型、Ｆｙ  ｂ型またはＦｙ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｊｋ（ａ−ｂ−）型、Ｊｋ（ａ＋ｂ−）型、Ｊｋ（ａ−ｂ＋）型またはＪｋ（ａ＋ｂ＋）型の血液型である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞は、Ｏ型、Ｒｈ陽性；Ｏ型、Ｒｈ陰性；Ａ型、Ｒｈ陽性；Ａ型、Ｒｈ陰性；Ｂ型、Ｒｈ陽性；Ｂ型、Ｒｈ陰性；ＡＢ型、Ｒｈ陽性またはＡＢ型、Ｒｈ陰性である。上記方法の他の特定の実施形態では、上記造血細胞のうちの９０％、９５％、９８％もしくは９９％を超える割合、またはそれぞれがＡ型、Ｏ型、ＡＢ型、Ｏ型の血液型；Ｒｈ陽性またはＲｈ陰性；Ｍ型、Ｎ型、Ｓ型、またはｓ型の血液型；Ｐ１型の血液型；Ｌｕａ型、Ｌｕｂ型、またはＬｕ（ａ）型の血液型；Ｋ（Ｋｅｌｌ）型、ｋ（ｃｅｌｌａｎｏ）型、Ｋｐａ型、Ｋｐｂ型、Ｋ（ａ＋）型、Ｋｐ（ａ−ｂ−）型またはＫ−ｋ−Ｋｐ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｌｅ（ａ−ｂ−）型、Ｌｅ（ａ＋ｂ−）型またはＬｅ（ａ−ｂ＋）型の血液型；Ｆｙ  ａ型、Ｆｙ  ｂ型またはＦｙ（ａ−ｂ−）型の血液型；Ｊｋ（ａ−ｂ−）型、Ｊｋ（ａ＋ｂ−）型、Ｊｋ（ａ−ｂ＋）型またはＪｋ（ａ＋ｂ＋）型の血液型である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞は、Ｏ型、Ｒｈ＋；Ｏ型、Ｒｈ陰性；Ａ型、Ｒｈ陽性；Ａ型、Ｒｈ陰性；Ｂ型、Ｒｈ陽性；Ｂ型、Ｒｈ陰性；ＡＢ型、Ｒｈ陽性またはＡＢ型、Ｒｈ陰性である。
【００１８】
さらに、上述したあらゆる方法によって作られた組成物、例えば、赤血球を含む組成物が、本明細書中で提供される。上記組成物の特定の実施形態では、上記組成物中の、ヘモグロビンを有する細胞の総数に対する胎児型ヘモグロビンを有する細胞の割合が約７０〜約９９％である。特定の実施形態では、ヘモグロビンを有する細胞の総数に対する成体型ヘモグロビンを有する細胞の割合が約５〜約４０％である。
【００１９】
ある実施形態では、赤血球が分化する培地から赤血球を単離する工程が、継続的に行われる。他の特定の実施形態では、赤血球を単離する工程が、上記造血細胞が増殖および分化する工程の間に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０分ごと、または、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間ごと、またはそれ以上で、定期的に行われる。別の特定の実施形態では、例えば、特定の細胞密度での培養の達成；１ミリリットルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカー（例えばＣＤ３６もしくはグリコフォリンＡ）を発現する培養の達成等、１つ以上の培養条件が満たされた場合に、上記赤血球の単離が定期的に行われる。
【００２０】
別の側面では、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度である幹細胞刺激因子ＳＣＦ、約０．０１〜約５００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＬ−３、および約０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含む、造血細胞の成長または分化のための培地であって、上記ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏは、上記培地の定義されていない成分の中に含まれていないことを特徴とする培地が、本明細書中で提供される。特定の実施形態では、上記培地は、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−１１、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ホメオボックス−Ｂ４（ＨｏｘＢ４）またはメチルセルロースのうち、１つ以上を含まない。他の特定の実施形態では、上記培地は、約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約１００ｎｇ／ｍＬ；約１〜約５０ｎｇ／ｍＬ；または約５ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＬ−３を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含む。
【００２１】
別の特定の実施形態では、上記培地は、さらに約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、および、約１〜約１０００μｇ／ｍＬの濃度である脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含み、上記培地は、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるヒドロコルチゾン、または、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＧＦ−１を含む。さらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度である脂質を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約５０μＭ；約０．５〜約１０μＭの濃度であるヒドロコルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．０５〜約２０μＭ；約０．１〜約１０μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約３Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのデキサメタゾン、および４０μｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。別のさらに実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのヒドロコルチゾン、および５０ｎｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。
【００２３】
別の特定の実施形態では、上記培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地またはＲＰＭＩを含み、さらに、１％ウシ血清アルブミン；１０μｇ／ｍＬの組み換えヒトインスリン；１００μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（鉄飽和）；および０．１μＭの２−メルカプトエタノール；２ｍＭのＬ−グルタミンが追加されている。
【００２４】
ある他の実施形態では、上記培地は、ＳＣＦ；Ｅｐｏ；ＩＧＦ−１；脂質；並びに、ヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物（例えば、Ｌｉｐｉｄｓ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｒｉｃｈ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ７３０５−１Ｇ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む。特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；または約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＧＦ−１を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００μｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度である脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるヒドロコルチゾンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５μＭ〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、用語「造血細胞」は造血幹細胞および造血前駆細胞、すなわち赤血球に分化することができる血球を包含する。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、特定の細胞マーカーの存在を示すために用いられる「＋」は、細胞マーカーが、蛍光活性化セルソーターにおいて、アイソタイプコントロールを超えて検出可能に存在する、または、定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超えて検出可能である、ということを意味する。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、特定の細胞マーカーの存在を示すために用いられる「−」は、細胞マーカーが、蛍光活性化セルソーターにおいて、アイソタイプコントロールを超えて検出可能には存在しない、または、定量的もしくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、バックグラウンドを超えて検出可能ではない、ということを意味する。
【００２８】
〔４．図面の簡単な説明〕
図１：ＨＰＰ由来のＣＤ３４+／ＣＤ４５-およびＣＤ３４+／ＣＤ４５+細胞のフローサイトメトリー分析。
【００２９】
図２Ａ、図２Ｂ：ＣＤ３４+細胞のフローサイトメトリー分析。（Ａ）：単離前のＣＤ３４+細胞；（Ｂ）単離後のＣＤ３４+細胞。
【００３０】
図３Ａ、図３Ｂ：ポマリドマイドが追加されたＩＭＤＭ培地中での細胞の増殖。図３Ａ：全有核細胞（ＴＮＣ）の増殖倍率。図３Ｂ：ＣＤ３４+細胞の増殖倍率。
【００３１】
図４Ａ−４Ｃ：ＣＤ３４+培養物の増殖能力。図４Ａ：ＴＮＣの増殖倍率。図４Ｂ：ＣＤ３４+細胞の増殖倍率。図４Ｃ：細胞数で表したＣＤ３４+細胞の増殖。「化合物１」はポマリドマイドである。
【００３２】
図５：培地組成ＣおよびＥ１中での細胞増殖。
【００３３】
図６：培地の最適化−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４。エラーバーは３人のドナーの集団平均（population mean）に対して計算した標準偏差を表す。
【００３４】
図７：細胞増殖における細胞密度の効果。
【００３５】
図８：ＢＭ由来およびＣＢ由来のＣＤ３４+細胞の増殖ポテンシャルの比較。標準偏差は３人のドナーの集団平均に対して計算した。
【００３６】
図９Ａ、９Ｂ：Ｅ３培地中での長期培養。（Ａ）細胞増殖倍率；（Ｂ）集団倍加。
【００３７】
図１０Ａ、１０Ｂ：ＨｂＦおよびＨｂＡ産物のＥＬＩＳＡ分析。（Ａ）ＨｂＦ産物；（Ｂ）ＨｂＡ産物。標準偏差は３反復の平均に対して計算した。
【００３８】
図１１：ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準実験計画（ＤＯＥ：ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）。全要因実験計画。
【００３９】
図１２Ａ−１２Ｃ：ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。細胞分化への要因の効果を示すキューブプロット（図１２Ａ）；細胞増殖および分化におけるＳＣＦ（図１２Ｂ）およびＥｐｏ（図１２Ｃ）の相互作用プロット。
【００４０】
図１３Ａ−１３Ｃ：ＳＣＦ、Ｅｐｏおよび細胞密度間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。図１３Ａ：細胞増殖および分化への因子の効果を示すキューブプロット；低細胞密度、高ＳＣＦ濃度（図１３Ｂ）または高細胞密度、低ＳＣＦ濃度（図１３Ｃ）での細胞増殖および分化におけるＳＣＦおよび細胞密度の相互作用プロット。
【００４１】
図１４：細胞サイズによって選別した赤血球。赤血球集団（Ｐ１）は前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を用いて他の未熟な集団（Ｐ２およびＰ３）と区別できる。
【００４２】
図１５：ＤＲＡＱ染色によって選別した赤血球。
【００４３】
〔５．発明の詳細な説明〕
本明細書では、増殖した造血細胞（例えば、造血幹細胞および／または造血前駆細胞）から赤血球を生産する方法を提供する。一実施形態では、造血細胞は、例えば胎盤灌流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、および／または骨髄等の細胞供給源から集められる。上記造血細胞は、支持細胞を用いることなしに、継続的に増殖および分化される。当該単離、増殖および分化は中央施設内で行われ、当該中央施設は、使用する場所で増殖および分化が行えるように輸送するために、増殖された造血細胞を提供する。上記使用する場所とは、例えば、病院、軍隊の基地、軍隊の前線等である。上記方法で生産された赤血球の採集は、例えば分化の間に、継続的または定期的に行われる。上記方法において継続的または定期的に分離できることにより、例えばバッチ法を用いる場合に比べ、実質的により小さな空間で赤血球の生産を行うことができる。造血細胞の採集および増殖にかかる時間は、およそ５〜１０日であり、典型的には約７日であった。上記造血細胞の増殖および赤血球への分化にかかる時間は、およそ２１〜２８日であった。ある実施形態では、赤血球はその後、その場で精製され、投与可能なユニットに包装される。
【００４４】
一つの側面では、本明細書では、支持細胞が存在しない培地中で造血細胞集団を増殖させ、上記造血細胞集団中の複数の造血細胞が上記増殖の間に赤血球へと分化すること、および上記培地から上記赤血球を単離することを含み、上記培地は約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦ、約０．０１〜約５００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＬ−３、および約０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含み、上記ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏは上記培地の定義を与えられていない成分（例えば血清）中には含まれないことを特徴とする、赤血球を生産する方法を提供する。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）における上記赤血球の単離は継続的に行われる。他の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）における上記赤血球の単離は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分ごとに、または１、１．５、２、２．５、３、３・５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間ごと、またはそれ以上で、定期的に行われる。別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）における上記赤血球の単離は、１つ以上の培養条件が満たされたときに、定期的に行われる。当該培養条件とは、例えば、特定の細胞密度での培養の達成、ある赤血球マーカー（例えば、ＣＤ３６またはグリコフォリンＡ）で表現されるミリリットルあたりの特定の細胞数の培養の達成、等である。造血細胞の増殖および分化の方法は、後述のセクション５．２．２でより詳細に記載される。
【００４５】
＜５．１．造血細胞＞
本明細書で開示される方法に役立つ造血細胞は、赤血球に分化することができるあらゆる造血細胞を含み、例えば、前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞等が挙げられる。造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血等、またはそれらの組み合わせの組織供給源から得られる。造血細胞は胎盤からも得ることができる。特定の実施形態では、上記造血細胞は胎盤灌流液から得られる。胎盤灌流液由来の造血細胞は、胎児の造血細胞と母体の造血細胞との混合物を含み得る。当該混合物は、例えば母体の造血細胞を造血細胞の総数の５％よりも多く含んでいる。胎盤灌流液由来の造血細胞は少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の胎児型細胞を含んでいることが好ましい。
【００４６】
ある実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+である。ＣＤ３４+造血細胞は、ある実施形態では、細胞マーカーＣＤ３８を発現または欠失していてもよい。従って、特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に役立つ造血細胞は、ＣＤ３４+ＣＤ３８+またはＣＤ３４+ＣＤ３８-である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ３８-Ｌｉｎ-である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤ２-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１６-、ＣＤ１９-、ＣＤ２４-、ＣＤ５６-、ＣＤ６６ｂ-およびグリコフォリンＡ-のうちの１つ以上である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤ２-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１６-、ＣＤ１９-、ＣＤ２４-、ＣＤ５６-、ＣＤ６６ｂ-およびグリコフォリンＡ-である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+およびＣＤ１３３+；ＣＤ３４+およびＣＤ１３３-；ＣＤ３４+およびＣＤ１１７+；またはＣＤ３４+およびＣＤ１１７-である。別のさらに特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ３３-ＣＤ１１７-である。別のさらに特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ３３-ＣＤ１１７-ＣＤ２３５-ＣＤ３６-である。
【００４７】
別の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ４５-である。特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ４５-である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ４５+である。
【００４８】
別の実施形態では、上記造血細胞はＴｈｙ−１+である。特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+Ｔｈｙ−１+である。別の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ１３３+である。特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ１３３+またはＣＤ１３３+Ｔｈｙ−１+である。別の特定の実施形態では、上記ＣＤ３４+造血細胞はＣＸＣＲ４+である。別の特定の実施形態では、上記ＣＤ３４+造血細胞はＣＸＣＲ４-である。別の実施形態では、上記造血細胞はＫＤＲ（血管増殖因子受容体２）に対して陽性である。特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＫＤＲ+、ＣＤ１３３+ＫＤＲ+またはＴｈｙ−１+ＫＤＲ+である。ある他の実施形態では、上記造血細胞はアルデヒド脱水素酵素に対して陽性（ＡＬＤＨ+）であり、例えばＣＤ３４+ＡＬＤＨ+である。
【００４９】
ある実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４-である。
【００５０】
上記造血細胞は、分化系列決定を示すあるマーカーを欠失していてもよい。または発達の自由さ（developmental naivete）を欠く。例えば、別の実施形態では、上記造血細胞はＨＬＡ−ＤＲ-である。特定の実施形態では、上記造血細胞はＣＤ３４+ＨＬＡ−ＤＲ-、ＣＤ１３３+ＨＬＡ−ＤＲ-、Ｔｈｙ−１+ＨＬＡ−ＤＲ-またはＡＬＤＨ+ＨＬＡ−ＤＲ-である。別の実施形態では、上記造血細胞は細胞系統マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよびグリコフォリンＡのうちの１つ以上、好ましくは全て、に対して陰性である。
【００５１】
従って、造血細胞集団は、未分化状態を示すマーカーが存在することに基づいて、または少なくともいくつかの系列分化が起こることを示す細胞系統マーカーが存在しないことに基づいて、本明細書で開示される方法に使用するために選択されてもよい。特定のマーカーの存在または非存在に基づいて細胞を単離する方法は、例えば、後述するセクション５．１．２で詳細に述べる。
【００５２】
本明細書で提供される方法で用いられる造血細胞は、ほぼ均一な集団、例えば単一の組織供給源由来の造血細胞を少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％含む集団、または同一の造血細胞関連細胞マーカーを示す造血細胞を含む集団であってもよい。例えば、種々の実施形態では、上記造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血、または胎盤（例えば胎盤灌流液）に由来する造血細胞を、少なくとも約９５％、９８％、９９％含んでいてもよい。
【００５３】
本明細書で提供される方法で用いられる造血細胞は、単一の個体（例えば、単一の胎盤）、もしくは複数の個体から得たものであってもよく、または、例えば、プールされたものであってもよい。上記造血細胞を複数の個体から得てプールした場合、上記造血細胞は同じ組織供給源から得ることが好ましい。従って、種々の実施形態では、上記プールされた造血細胞は、全て胎盤由来（例えば胎盤灌流液由来）、全て胎盤血由来、全て臍帯血由来、全て末梢血由来等である。
【００５４】
本明細書で提供される方法で用いられる造血細胞は、２つ以上の組織供給源由来の造血細胞を含んでいてもよい。好ましくは、２つ以上の組織供給源由来の造血細胞を本明細書の方法で用いるために組み合わせる場合、赤血球を生産するために用いられる上記造血細胞の複数は、胎盤（例えば胎盤灌流液）由来の造血細胞を含む。種々の実施形態では、赤血球を生産するために用いられる上記造血細胞は、胎盤由来および臍帯血由来；胎盤由来および末梢血由来；胎盤由来および胎盤血由来、または胎盤由来および骨髄由来の造血細胞を含む。好ましい実施形態では、上記造血細胞は、臍帯血由来の造血細胞と組み合わせられた胎盤灌流液由来の造血細胞を含み、上記臍帯血および胎盤は同一の個人由来である。すなわち、上記灌流液および臍帯血は相性がよい。上記造血細胞が２つの組織供給源由来の造血細胞を含む実施形態では、上記供給源由来の造血細胞は例えば、１：１０、２：９、３：８、４：７、５：６、６：５、７：４、８：３、９：２、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１または９：１の割合で組み合わせてもよい。
【００５５】
好ましくは、本明細書で提供される方法に従って造血細胞から生産された赤血球は、血液型に関して同一である。例えば当該赤血球は、細胞表面マーカーまたは抗原等に関して同一である。当該同質性は、例えば、所望の血液型を有する単一の個体から造血細胞を得ることによって達成できる。造血細胞が複数の個体からプールされる実施形態では、それぞれの個体が少なくとも１つ、少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、またはそれ以上の抗原血液決定基を共有することが好ましい。種々の実施形態では、例えば、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｏ型、Ａ型、Ｂ型、またはＡＢ型の血液型である。他の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｒｈ陽性またはＲｈ陰性である。特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｏ陽性かつＲｈ陰性である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｏ陽性、Ｏ陰性、Ａ陽性、Ａ陰性、Ｂ陽性、Ｂ陰性、ＡＢ陽性、またはＡＢ陰性である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｍ型、Ｎ型、Ｓ型、またはｓ型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｐ１型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｌｕａ型、Ｌｕｂ型、またはＬｕ（ａ）型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｋ（Ｋｅｌｌ）型、ｋ（ｃｅｌｌａｎｏ）型、Ｋｐａ型、Ｋｐｂ型、Ｋ（ａ＋）型、Ｋｐ（ａ−ｂ−）型またはＫ−ｋ−Ｋｐ（ａ−ｂ−）型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｌｅ（ａ−ｂ−）型、Ｌｅ（ａ＋ｂ−）型またはＬｅ（ａ−ｂ＋）型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｆｙ  ａ型、Ｆｙ  ｂ型またはＦｙ（ａ−ｂ−）型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Ｊｋ（ａ−ｂ−）型、Ｊｋ（ａ＋ｂ−）型、Ｊｋ（ａ−ｂ＋）型またはＪｋ（ａ＋ｂ＋）型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体は、Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｘｇｍ  Ｓｃｉａｎｎａ、Ｂｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｅｉｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｇｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、またはＪＭＨの血液型に分類することができる。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、血液分類系または抗原決定基のグループが同一の血液型であり、上記血液分類系または抗原決定基のグループは、Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ、Ｘｇｍ  Ｓｃｉａｎｎａ、���ｏｍｂｒｏｃｋ、Ｃｏｌｔｏｎ、Ｌａｎｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｅｉｎｅｒ、Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｇｅｒｓ、Ｈｈ、Ｋｘ、Ｇｅｒｇｉｃｈ、Ｃｒｏｍｅｒ、Ｋｎｏｐｓ、Ｉｎｄｉａｎ、Ｏｋ、Ｒａｐｈ、またはＪＭＨである。
【００５６】
＜５．１．１．胎盤造血幹細胞＞
ある実施形態では、本明細書で提供される方法に用いられる造血細胞は、胎盤造血細胞である。本明細書で用いられる場合、「胎盤造血細胞」は胎盤血または臍帯血ではなく、胎盤そのものから得られた造血細胞を意味する。一実施形態では、胎盤造血細胞はＣＤ３４+である。特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞は、大部分（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）がＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞である。別の特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞は、大部分（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）がＣＤ３４+ＣＤ３８+細胞である。胎盤造血細胞は、当業者に公知のあらゆる方法、例えば灌流によって、分娩後の哺乳類（例えばヒト）の胎盤から得られるものであってもよい。
【００５７】
別の実施形態では、上記胎盤造血細胞はＣＤ４５-である。特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ４５-である。他の特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞はＣＤ３４+ＣＤ４５+である。
【００５８】
＜５．１．１．１．灌流によって胎盤造血細胞を得る＞
胎盤造血細胞は灌流を利用して得てもよい。胎盤造血細胞を含む細胞を得るために哺乳類の胎盤を灌流する方法は、米国特許第７，０４５，１４８号（タイトル「Ｍｅｔｈｏｄ
ｏｆ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」）、米国特許第７，２５５，８７９号（タイトル「Ｐｏｓｔ−Ｐａｒｔｕｍ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｐｌａｃｅｎｔａ，  Ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ」）、および米国特許出願第２００７／０１９００４２号（タイトル「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」）に開示されており、開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【００５９】
胎盤造血細胞は、例えば食塩水（例えばリン酸緩衝塩、または０．９％ＮａＣｌ溶液等）、培地または器官保存溶液を灌流溶液として用いて、例えば胎盤脈管構造（placental vasculature）を介して灌流によって集めてもよい。一実施形態では、哺乳類の胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈の両方またはどちらかに灌流溶液を通過させることで灌流される。胎盤を通る灌流溶液の流れは、例えば重力による胎盤への流れを利用して達成される。好ましくは、灌流溶液は、ポンプ（例えば蠕動ポンプ）を用いて胎盤へと流される。臍帯静脈は、例えばカニューレ（例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチック製のカニューレ）が挿入されていてもよい。当該カニューレは、例えば滅菌された管等の滅菌された接続装置と接続されており、もう一方の端部は灌流連結管（perfusion manifold）と接続されている。
【００６０】
灌流のための準備において、胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に位置するように配向される（例えば吊るされる）ことが好ましい。胎盤は胎盤脈管構造および周囲の組織に灌流液を通過させることによって灌流されてもよい。また、胎盤は、臍帯静脈および複数の臍帯動脈に灌流液を通過させること、または臍帯動脈および複数の臍帯静脈に灌流液を通過させることによって灌流されてもよい。
【００６１】
一実施形態では、例えば臍帯動脈および臍帯静脈は、例えば可撓性の接続装置を介して灌流溶液の貯蔵部と接続されたピペットに同時に接続されている。灌流溶液は臍帯動脈および臍帯静脈を通過する。灌流溶液は、血管の壁から胎盤の周囲の組織へと滲出および／または通過して、妊娠期間中に母体の子宮と接着している胎盤表面から、適切な開放された容器（例えば滅菌された皿）の中に集められる。灌流溶液は、臍帯の開口部を介して導入されてもよく、母体の子宮の壁と連結している胎盤の壁中の開口部から流出または浸透させることができる。「パン」法と呼ばれる上記方法によって集められた胎盤細胞は、一般的に胎児の細胞と母体の細胞との混合物である。
【００６２】
別の実施形態では、灌流溶液は、臍帯静脈および複数の臍帯動脈中を、または臍帯動脈および複数の臍帯静脈中を通過する。「閉鎖循環」法と呼ばれる上記方法によって集められた胎盤細胞は、一般的にほぼ全て胎児由来のものである。
【００６３】
閉鎖循環灌流方式は、一実施形態として以下のように行ってもよい。分娩後の胎盤は、産後約４８時間以内に得られる。臍帯はクランプし、クランプの上部で切断する。臍帯は廃棄してもよく、または、例えば臍帯幹細胞を得るため、および／もしくは生体適合材料の生産のために臍帯膜を加工するために処理してもよい。羊膜は灌流の間保持されていてもよく、または、例えば指による鈍的切開（blunt dissection）によって絨毛膜から分離してもよい。灌流前に羊膜が絨毛膜から分離される場合、羊膜は、例えば廃棄されてもよく、または例えば酵素の消化作用によって幹細胞を得るため、もしくは例えば羊膜生体適合材料を生産するために処理されてもよい。例えば上記生体適合材料は米国特許出願公報第２００４／００４８７９６号に開示されており、開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【００６４】
例えば滅菌されたガーゼを用いて、認識できる全ての血塊および残った血液を胎盤から取り除いた後、例えば臍帯の断面を露出させるために臍帯膜を部分的に切ることで、臍帯の管を露出させる。例えば閉じたわに口クランプを管の切断した一端から挿入することで、管は確認され、開かれる。その後、装置（例えば、灌流装置または蠕動ポンプに接続されたプラスチック製の管）がそれぞれの胎盤動脈に挿入される。ポンプは目的に適していればいずれのポンプであってもよく、例えば蠕動ポンプが挙げられる。その後、滅菌された採集貯蔵器（例えば、２５０ｍＬ採集バッグ等の血液バッグ）に接続された管が胎盤静脈に挿入される。または、ポンプに接続された管が胎盤静脈に挿入され、貯蔵器に接続された管が胎盤動脈のうちの一つもしくは両方に挿入される。その後、胎盤には、一定量の灌流溶液（例えば、約７５０ｍＬの灌流溶液）が灌流される。その後、灌流液中の細胞は、例えば遠心分離によって採集される。
【００６５】
一実施形態では、臍帯の基部は灌流の間、クランプされており、より好ましくは、臍帯が胎盤に入り込んだ４〜５ｃｍ（センチメートル）の部位の中でクランプされる。
【００６６】
全採血処理の間、哺乳類の胎盤からの灌流液の最初の採集は、一般的に臍帯血および／または胎盤血の残った赤血球で染まる。灌流が進行し、残りの臍帯血の赤血球が胎盤から取り除かれるにつれて、灌流液はより無色に近くなる。一般的に３０から１００ｍｌ（ミリリットル）の灌流液が、最初に胎盤から全採血を行うために適切であるが、観察結果によって用いられる灌流液の量が多くなったり少なくなったりしてもよい。
【００６７】
胎盤造血細胞を採集するために用いられる灌流液の体積は、採集する造血細胞の数、胎盤のサイズ、一つの胎盤から作られるコレクションの数に応じて変化してもよい。種々の実施形態で灌流液の体積は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、７５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、であってもよい。一般的に、全採血後に７００ｍＬ〜８００ｍＬの灌流液で胎盤に灌流を行う。
【００６８】
胎盤造血細胞を得るために、数時間または数日にわたって複数回、胎盤に灌流を行ってもよい。胎盤に複数回の灌流を行う場合、胎盤は、コンテナまたは他の適切な容器中に無菌状態で維持または培養されてもよい。上記胎盤は、幹細胞集合組成物（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｌｌｅｃｉｔｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（米国特許出願公報第２００７／０１９００４２号参照。開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。）、または標準灌流溶液（例えば、リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）等の通常の塩溶液）を用いて灌流される。上記標準灌流溶液は、抗凝血薬（例えばヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）および／または抗真菌薬（例えばβ−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば４０〜１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（例えば４０Ｕ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（例えば０．５μｇ／ｍｌ））とともに用いてもよいし、ともに用いなくてもよい。一実施形態では、単離された胎盤は灌流液を採集せずに、ある期間維持または培養される。上記胎盤は、例えば灌流および灌流液の採集の前に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間、または、２、３日、もしくはそれ以上の期間、維持または培養される。灌流された胎盤は、さらに追加で１回以上維持されてもよく、時間は例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれ以上の時間であり、二回目は例えば７００〜８００ｍＬの灌流液を用いて灌流される。胎盤は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の回数で灌流されてもよく、例えば１、２、３、４、５または６時間ごとに１回灌流されてもよい。好ましい実施形態では、胎盤の灌流、および、灌流溶液（例えば幹細胞集合組成物）の採集は、回収される有核細胞の数が１００細胞／ｍｌ以下に低下するまで繰り返される。異なる時点での灌流液は、さらに、時間に依存する細胞集団（例えば胎盤造血細胞集団）を回収するために、個別に処理される。また、異なる時点での灌流液はプールされてもよい。
【００６９】
＜５．１．１．２．組織破壊によって胎盤造血細胞を得る＞
造血細胞は、１つ以上のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、キモトリプシン、サブチリシン、ヒアルロニダーゼ；カテプシン、カスパーゼ、カルパイン、キモシン、プラズメプシン、またはペプシン等）を含む溶液を灌流することによって胎盤から単離されてもよい。特定の実施形態では、胎盤または胎盤の一部（羊膜の膜、羊膜および絨毛膜、胎盤小葉または胎盤葉、臍帯、または上記のあらゆる組み合わせ）を２５℃〜３７℃の状態にし、１つ以上の組織破壊酵素とともに２００ｍＬの培地中で３０分間培養する。灌流液由来の細胞を採集し、４℃の状態にし、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトールおよび２ｍＭのベータ−メルカプトエタノールを含む冷たい阻害因子混合物で洗浄する。幹細胞は数分後、冷たい（例えば４℃）幹細胞採集組成物で洗浄する。
【００７０】
一実施形態では、胎盤は、造血細胞を得るために機械的に（例えば、破砕する、混和する、さいの目に切る、または切り刻む等の方法によって）破壊されてもよい。胎盤は、全体を用いてもよいし、または、物理的破壊および／もしくは酵素による消化、並びに造血細胞の回収の前に構成要素に解剖してもよい。例えば、造血細胞は、羊膜の膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉、または上記のあらゆる組み合わせから得てもよい。
【００７１】
また、胎盤造血細胞は、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、キモトリプシン、サブチリシン、ヒアルロニダーゼ；カテプシン、カスパーゼ、カルパイン、キモシン、プラスメプシン、またはペプシン等の組織破壊酵素を用いて胎盤を破壊することによって得てもよい。酵素による消化では、好ましくは酵素の組み合わせ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせ、例えばコラゲナーゼとディスパーゼとの組み合わせ、を用いる。一実施形態では、酵素による胎盤組織の消化には、ヒアルロン酸を消化するためにマトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびムコ多糖類加水分解酵素（ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）の組み合わせを用いる。上記組み合わせは、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼの組み合わせ、または、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄ．）およびヒアルロニダーゼの組み合わせである。胎盤組織を破壊するために用いることができる他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼ）が挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ２ミクログロブリンによって阻害され得るので、消化に用いる培地には通常、血清は含まれない。ＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅは、細胞回収効率を上げるため、酵素消化処理に一般的に用いられる。粘性のある消化物中に幹細胞が捉えられることを避けるために、消化物は希釈されることが好ましい。
【００７２】
組織消化酵素はいかなる組み合わせで用いてもよい。組織消化酵素の一般的な濃度としては、例えばコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶは５０〜２００Ｕ／ｍＬ、ディスパーゼは１〜１０Ｕ／ｍＬ、並びにエラスターゼは１０〜１００Ｕ／ｍＬが含まれる。プロテアーゼは組み合わせて、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同一の消化反応で用いてもよいし、または胎盤幹細胞を遊離するために連続して用いてもよい。例えば、一実施形態では、胎盤または胎盤の一部を、まず約２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩを用いて３０分間消化し、次に０．２５％のトリプシンを用いて３７℃で１０分間消化を行う。セリンプロテアーゼは、好ましくは他の酵素の使用後に連続して用いる。
【００７３】
別の実施形態では、例えばエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸を、幹細胞を含む幹細胞採集組成物、または、胎盤造血細胞の単離前に組織を破壊および／もしくは消化した溶液に加えることで、組織をさらに破壊してもよい。
【００７４】
胎盤全体または胎盤の一部が胎児および母体の細胞を両方含んでいる場合（例えば胎盤の一部が絨毛膜または胎盤葉を含む場合）、採集された胎盤造血細胞は、胎児および母体の両方の供給源に由来する胎盤幹細胞の混合物であることが好ましい。胎盤の一部が母体の細胞（例えば羊膜）を全く含んでいない、またはごくわずかな数しか含んでいない場合、採集された胎盤幹細胞は、ほぼ胎児由来の胎盤幹細胞のみを含んでいる。
【００７５】
＜５．１．２．細胞の単離、選別、および特定＞
あらゆる供給源（例えば哺乳類の胎盤）に由来する造血細胞を含む細胞は、初めに、例えばフィコール密度勾配遠心分離法、ヘタスターチ処理または塩化アンモニウム処理によって他の細胞から精製（すなわち、単離）されていてもよい。遠心分離機、例えばフィコール遠心分離機（例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１４４０−０３）は、遠心分離速度等について、いかなる標準プロトコルに従ってもよい。一実施形態では、例えば、胎盤から採集された細胞は、室温で１５分、１５０  ｘ  ｇで遠心分離を行うことで灌流液から回収される。当該遠心分離は、例えば混入している残骸および血小板から細胞を分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液は約２００ｍｌに濃縮され、緩やかにフィコール上に層を形成する。そして約２２℃で２０分間、約１１００  ×  ｇで遠心分離され、低密度の細胞の中間層が更なる工程のために採集される。
【００７６】
特定の制限されない実施形態では、ヘタスターチ（たとえばＨｅｔａＳｅｐ、Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、カタログ  Ｎｏ．０７９０６）処理は、１部（1 part）のヘタスターチ溶液を５部（5 parts）の、例えば適切なサイズのチューブ中のヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ：ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）または臍帯血に加えることで行ってもよい。十分に混合した後、サンプルを、血漿／ＲＢＣの界面が総量のおよそ５０％になるまで安定させる。任意で、当該ステップのためにチューブを３７℃のインキュベーター中に設置して沈降速度を増加させる。明確な界面が、ＲＢＣ画分とＲＢＣが消耗された（有核細胞が豊富な）画分との間に、ヘタスターチ溶液を介してＲＢＣ沈殿物として形成される。その後、白血球が豊富な層を回収し、５０ｍＬのチューブ中に入れる。当該画分は、例えば少なくとも４倍の体積の適切な培地によって、一度洗浄される。血小板を除去するために、例えば室温（１５〜２５℃）で１０分間、１２０  ×  ｇでブレーキなしで遠心分離することによって、ゆっくりしたスピンを行う。ある他の実施形態では、塩化アンモニウム（例えばＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、カタログ  Ｎｏ．０７８５０）処理を、例えば緩衝化した塩化アンモニウム溶液をＨＰＰまたは臍帯血に、例えば体積の割合が４：１になるように加えることで行ってもよい。細胞懸濁液をボルテックスにかけ、赤血球を溶解させるために１０分間氷上に置く。細胞は、使用する前に任意で、適切な培地で二度洗浄される。
【００７７】
細胞沈殿物を、例えば未使用の食塩水、または、幹細胞維持に適した培地（例えば２Ｕ／ｍｌのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）を含むＩＭＤＭ無血清培地）の中で再び懸濁してもよい。全ての単核細胞画分を、例えばＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（登録商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて、製造者の推奨する処理に従って、単離してもよい。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、胎盤細胞、例えば胎盤造血細胞または胎盤幹細胞を含む細胞を「単離する」とは、単離された細胞が実際の組織（例えば哺乳類の胎盤）の中で通常結合している細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を除去することを意味する。細胞が、幹細胞が実際の器官中で通常結合している細胞の５０％よりも少ない数を含む細胞集団中に存在する場合、組織由来の細胞が「単離された」といえる。
【００７９】
哺乳類の胎盤から採集された細胞の数および型は、例えば形態の変化、および、例えばフローサイトメトリー、セルソーティング、免疫細胞化学的方法（例えば組織特異的または細胞マーカー特異的な抗体を用いた染色）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）等の標準的な細胞検出技術を用いた細胞表面マーカーの測定、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡を用いた細胞の形態の検査、並びに／または、例えばＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイル等の当業者によく知られた技術を用いた遺伝子発現の変化の測定によって、観察することができる。これらの技術は、１つ以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を特定するためにも、用いることができる。例えば、ＣＤ３４を用いれば、上述の技術を用いて、ＥＬＩＳＡ、もしくはＲＩＡ等のアッセイで、またはＦＡＣＳによって、細胞がＣＤ３４を検出可能の量で含んでいるかどうか測定することができ、検出可能であればＣＤ３４+であると判断できる。同様に、細胞が、例えばＯＣＴ−４をコードするＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって検出するために十分な量で含んでいれば、当該細胞はＯＣＴ−４+である。細胞表面マーカー（例えばＣＤ３４等のＣＤマーカー）に対する抗体、および、ＯＣＴ−４等の幹細胞に特異的な配列は、当業者にとって周知である。
【００８０】
胎盤細胞、特に、例えばフィコール分離、ヘタスターチ処理、塩化アンモニウム処理、差次接着法（differential adherence）、またはそれらの組み合わせによって単離される細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて選別することができる。ＦＡＣＳは、細胞を含む粒子を、当該粒子の蛍光特性に基づいて分離する、周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ，１９８７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １５１：１５０−１６５）。個々の粒子の蛍光成分をレーザー励起することで、小さな電荷が生み出され、混合物から正の粒子および負の粒子を電磁分離することができる。一実施形態では、細胞表面マーカーに特異的な抗体またはリガンドは、識別できる蛍光ラベルによって標識されている。細胞を細胞選別器によって処理することで、使用した抗体と結合する能力に基づいて、細胞の分離を行うことができる。ＦＡＣＳによって選別した粒子は、分離およびクローニングを促進するために、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接配置されてもよい。
【００８１】
一実施形態では、胎盤由来の幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ２００、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇのうち、一つ以上のマーカーの発現に基づいて、選別され、例えば、単離される。
【００８２】
別の実施形態では、例えば、ＣＤ３４+、ＣＤ１３３+、ＫＤＲ+またはＴｈｙ−１+である造血細胞は、未分化の造血細胞のマーカー特性に基づいて、選別され、例えば、単離される。当該選別工程は、例えば、選別されていない細胞集団であって、例えば、灌流液または組織消化物に由来する細胞集団であって、ＣＤ３４+細胞が集団に存在する細胞の中で少数である細胞集団に対して、行われてもよい。また、上記選別工程は、大半（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を超える数）が造血細胞である細胞集団に対して、例えば精製工程において行われてもよい。例えば、特定の実施形態では、ＣＤ３４+細胞、ＫＤＲ+細胞、Ｔｈｙ−１+細胞、および／またはＣＤ１３３+細胞は、未分化造血細胞集団を生産するために、選抜工程の間、維持される。
【００８３】
別の実施形態では、細胞（例えば造血細胞）は、系統分化細胞のマーカーに基づいて選別され、例えば排除される。例えば、ＣＤ２+、ＣＤ３+、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ１４+、ＣＤ１６+、ＣＤ１９+、ＣＤ２４+、ＣＤ５６+、ＣＤ６６ｂ+および／またはグリコフォリンＡ+である、造血細胞集団中の細胞は、未分化造血細胞集団を生産するために、造血細胞集団から選別する工程の間、排除される。
【００８４】
別の実施形態では、造血細胞は、例えば細胞系統マーカーの発現がないことに基づいて選別され、例えば単離される。特定の実施形態では、造血細胞（例えばＣＤ３４+細胞）は、例えば、細胞がＣＤ２-、ＣＤ３-、ＣＤ１１ｂ-、ＣＤ１１ｃ-、ＣＤ１４-、ＣＤ１６-、ＣＤ１９-、ＣＤ２４-、ＣＤ５６-、ＣＤ６６ｂ-および／またはグリコフォリンＡ-のうちの１つ以上であるという判定に基づいて、単離されてもよい。
【００８５】
別の実施形態では、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、細胞を分離するために用いてもよい。上記細胞が磁気ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）と結合する能力に基づいて、粒子を選別する方法である、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を用いて選別してもよい。磁気ミクロスフェアにおいて、種々の有用な修正が行われてもよく、上記修正には、特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合付加が含まれる。上記ビーズはその後、結合のために細胞と混合される。その後、細胞は磁場を通過し、特定の細胞マーカーを有する細胞が分離される。一実施形態では、その後、上記細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合している磁気ビーズと再度混合してもよい。上記細胞は、再度、磁場を通過し、両方の抗体と結合している細胞が単離される。上記細胞を、その後、クローン単離のためのマイクロタイター皿等の分離皿に希釈してもよい。
【００８６】
別の実施形態では、胎盤幹細胞（例えば胎盤造血細胞または付着胎盤幹細胞）を、コロニー形成ユニットアッセイによって識別および特定してもよい。コロニー形成ユニットアッセイは当業者に一般的に知られており、ＭＥＣＥＮＣＵＬＴTM培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）等が挙げられる。
【００８７】
胎盤幹細胞を、当業者に知られた標準的な技術を用いて、生存率、増殖力、または寿命について評価してもよい。上記技術には、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロビジウム取り込みアッセイ（生存率を評価する）；およびチミヂン取り込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（増殖を評価する）等が挙げられる。寿命は、増殖した培養物における集団倍加（population doubling）の最大数を測定すること等の、当業者によく知られた方法によって測定してもよい。
【００８８】
胎盤幹細胞は、当業者に知られた他の技術を用いて、他の胎盤細胞から分離してもよい。上記技術には、例えば、所望の細胞の選択的増殖（正の選択）、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば、大豆凝集素を用いた、混合集団において区別できる細胞凝集能に基づく分離；凍結融解処理；ろ過；従来のゾーン遠心分離；遠心溶出法（逆流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動等が挙げられる。
【００８９】
＜５．２．造血細胞の増殖＞
一度、造血細胞集団を得られれば、集団を増殖させることができる。赤血球の一つのユニットは、約１〜２×１０12個の赤血球を含むとされる。造血幹細胞の集団倍加には、およそ３６時間が必要である。従って、標準の方法に従って、約５×１０7個の造血細胞から開始し、増殖および分化における効率が１００％であると仮定すると、赤血球のユニットの生産には、およそ１４回の造血細胞の集団倍加、すなわち、およそ３週間が必要である。以下で詳細に説明する方法は、造血細胞の培養条件を改善し、増殖の間の、単位時間あたりの造血細胞の数を増加させることで、標準の方法を改善するものである。
【００９０】
＜５．２．１．短縮された造血細胞の増殖時間＞
造血細胞を含む細胞は、細胞周期調節機構を備えており、当該機構は、細胞分裂の速度を調節するサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を含んでいる。細胞では、細胞周期の進行を監視および制御するために、細胞周期チェックポイントが用いられている。細胞が、ある段階での要件を満たさなければ、当該要件を満たされるまでは次の段階に進行することができない。細胞が、細胞周期の異なる段階に進行する条件に関連する過程（チェックポイント制御）は比較的ゆっくりであり、最適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件下でさえ哺乳類の細胞で観察される、比較的穏やかな細胞分裂速度の一因となっている。
【００９１】
赤血球の生産方法の一実施形態では、上記方法には、低減された集団倍加時間を有する造血細胞が用いられる。特定の実施形態では、上記造血細胞は、細胞周期活性化因子を通常より高いレベルで発現するように、または、細胞周期阻害因子を通常より低いレベルで発現するように改変されており、上記設計された細胞は、改変されていない造血細胞に比べて、検出可能な程度に短い倍加時間を有する。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞は、細胞周期活性化因子であるサイクリンＴ２（ＣＣＮＴ２）、サイクリンＴ２Ｂ（ＣＣＮＴ２Ｂ）、ＣＤＣ７Ｌ１、ＣＣＮ１、サイクリンＧ（ＣＣＮＧ２）、サイクリンＨ（ＣＣＮＨ）、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＤＫ４、サイクリンＤ１、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｈｅｓ１、Ｈｏｘ遺伝子および／またはＦｏｘＯのうち１つ以上を通常より高いレベルで発現するように改変されている。
【００９２】
別のさらに特定の実施形態では、上記造血細胞は、ＣＤＫ阻害因子ｐ２１、ｐ２７および／またはＴＲｅＰ−１３２を通常より低いレベルで発現する。ＣＤＫ阻害因子の発現の低減は、当業者に知られたあらゆる方法によって達成できる。上記方法には、例えば、低分子阻害剤、ｐ２１、ｐ２７および／またはＴＲｅＰ−１３２のＤＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ配列、ＲＮＡｉ等の使用が挙げられる。
【００９３】
赤血球を生産する本方法と関連した、造血前駆細胞の改変は、赤血球は除核されており、複製することができないので、治療上安全であると考えられる。
【００９４】
別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、細胞周期活性化因子を通常より高いレベルで発現するように改変されており、上記設計された細胞は、改変されていない造血細胞に比べて、検出可能な程度に短い倍加時間、または検出可能な程度に増加した増殖速度を有し、上記細胞周期活性化因子の発現の増加は誘導可能である。上記改変された造血細胞を構築するために、当業者に知られたあらゆる誘導性プロモーターを用いることができ、上記誘導性プロモーターには、ＣＭＶプロモーターの制御下で安定的に発現する、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を用いたテトラサイクリン誘導遺伝子発現系（例えばＲＥＶＴＥＴ−ＯＮ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）；米国特許出願公報第２００７／０１６６３６６号「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ａｌｌｏｗｉｎｇ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ」；および米国特許出願公報第２００７／０１２２８８０号「Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」が挙げられ、それぞれの開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【００９５】
細胞周期阻害因子または負の細胞周期制御因子をコードする遺伝子の発現を、例えば、標準的方法を用いた相同組み換え、または非相同組み換えによって、造血細胞中で阻害してもよい。細胞周期阻害因子または負の細胞周期制御因子の発現の阻害は、例えばｐ２１、ｐ２７および／またはＴＲｅＰ−１３２に対するアンチセンス分子を用いて、行ってもよい。
【００９６】
別の実施形態では、赤血球を生産するために用いる造血細胞を、ノッチ１リガンド（notch 1 ligand）を発現するように改変する。上記ノッチ１リガンドの発現によって、上記造血細胞の老化が、改変されていない造血細胞に比べて、検出可能な程度に低減される。Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第２００４／００６７５８３「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ」を参照されたい。開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【００９７】
別の特定の実施形態では、上記造血細胞が増殖する培地は、正確なＤＮＡの複製を促進する。例えば、上記培地は、一つ以上の酸化防止剤を含む。
【００９８】
好ましい実施形態では、上記赤血球を生産する方法は、本明細書で開示される方法で生産され、単離された赤血球の最終的な集団から、あらゆる改変された造血細胞、または前赤血球前駆体を排除する工程を含む。上記分離は、本明細書にあらゆる箇所に開示されるように、赤血球に十分に分化していない造血細胞を特徴づける、一つ以上のマーカーに基づいて、達成することができる。上記排除工程は、赤血球特異的マーカー（例えばＣＤ３６および／またはグリコフォリンＡ）に基づいて赤血球を選択する単離工程に続いて行われる。
【００９９】
＜５．２．２．指示細胞に依存しない造血細胞の増殖および分化＞
ある実施形態では、本明細書で提供される方法に用いられる造血細胞（例えば幹細胞、または前駆細胞）は、支持細胞を用いない培地で増殖および分化する。本明細書で提供される造血細胞の培養によって、造血細胞の継続的な増殖、および上記細胞からの赤血球の分化がもたらされる。
【０１００】
支持細胞に依存しない造血細胞の増殖および分化は、細胞培養および増殖に適合した、あらゆる容器中で行うことができ、当該容器には、例えば、フラスコ、試験管、ビーカー、シャーレ、複数のウェルを有するプレート、バッグ等が挙げられる。特定の実施形態では、支持細胞に依存しない造血細胞の増殖は、バッグ（例えば、柔軟性を有するガス透過性のフルオロカーボン培養バッグ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ製））中で行われる。特定の実施形態では、上記造血細胞が増殖する容器は、例えば病院または戦地等の場所への輸送に好適であり、上記増殖した造血細胞は、例えば後述するバイオリアクターを用いることで、さらに増殖および分化する。
【０１０１】
ある実施形態では、造血細胞は、ある実施形態では、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）を含む培地において、継続的な方法で増殖および分化する。
【０１０２】
従って、一つの側面では、支持細胞が存在しない培地中で、造血細胞集団を増殖および分化させる工程であって、当該増殖させる工程の間に、上記造血細胞集団中の複数の造血細胞が赤血球へ分化する工程と、上記培地から上記赤血球を単離する工程と、を含む、赤血球を生産する方法であって、上記培地は、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦ、約０．０１〜約５００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＬ−３、および、約０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含み、上記ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏは、上記培地の定義されていない成分（例えば、血清）の中には含まれていないことを特徴とする、赤血球を生産する方法が、本明細書で提供される。上記方法の特定の実施形態では、上記培地は、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−１１、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ホメオボックス−Ｂ４（ＨｏｘＢ４）またはメチルセルロースのうち、１つ以上、またはいずれも含まない。他の特定の実施形態では、上記培地は、約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約１００ｎｇ／ｍＬ；約１〜約５０ｎｇ／ｍＬ；または約５ｎｇ／ｍＬの濃度でＩＬ−３を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；または約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度でＥｐｏを含む。
【０１０３】
ある実施形態では、上記培地は、培地中の造血幹細胞、例えばＣＤ３４+造血幹細胞の増殖を促進し、上記細胞は５×１０5個／ｍＬ以下、２．７５×１０4個／ｍＬ以下、または５×１０4個／ｍＬ以下で播種され、Ｅｐｏは５ＩＵ／ｍＬ以下、３ＩＵ／ｍＬ以下、または１ＩＵ／ｍＬ以下で存在し（例えば、培地に含まれる）、ＳＣＦは１ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、または１００ｎｇ／ｍＬ以上で存在する（例えば、培地に含まれる）。特定の実施形態では、上記細胞は５×１０4個／ｍＬ以下で播種され、上記培地は、１ＩＵ／ｍＬ以下のＥｐｏおよび１００ｎｇ／ｍＬ以上のＳＣＦを含む。
【０１０４】
上記方法の別の特定の実施形態では、上記培地はさらに約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度であるインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、および、約１〜約１０００μｇ／ｍＬの濃度である脂質を含み、上記脂質はたんぱく質とコレステロールとの混合物（例えば、Ｌｉｐｉｄｓ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｒｉｃｈ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ７３０５−１Ｇ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含み；上記培地は、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるヒドロコルチゾン、または、約０．０１〜約１００μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＩＧＦ−１を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；または約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で脂質を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．１〜約５０μＭ；または約０．５〜約１０μＭの濃度でヒドロコルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約０．０５〜約２０μＭ；または約０．１〜約１０μＭの濃度でデキサメタゾンを含む。
【０１０５】
上記方法のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約３Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのデキサメタゾン、および４０μｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。上記方法の別のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２Ｕ／ｍＬのＥｐｏ、約４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約１μＭのヒドロコルチゾン、および５０ｎｇ／ｍＬの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。
【０１０６】
ある他の実施形態では、造血細胞は、ある実施形態で、ＳＣＦ；Ｅｐｏ；ＩＧＦ−１；脂質；並びに、ヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含む培地中において、継続的な方法で増殖および分化し、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物（例えば、Ｌｉｐｉｄｓ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｒｉｃｈ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ
ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ７３０５−１Ｇ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含む。特定の実施形態では、上記培地は、約１０〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約２０００ｎｇ／ｍＬ；約５０〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１００ｎｇ／ｍＬ；または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度であるＳＣＦを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約５ＩＵ／ｍＬ；または約２〜約３ＩＵ／ｍＬの濃度であるＥｐｏを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００ｎｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度であるＩＧＦ−１を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約１〜約１０００μｇ／ｍＬ；約１０〜約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０〜約１００ｎｇ／ｍＬ；または約４０ｎｇ／ｍＬの濃度である上記脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５μＭ〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるヒドロコルチゾンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約０．１μＭ〜約１０μＭ；約０．５μＭ〜約５μＭ；または約１μＭの濃度であるデキサメタゾンを含む。
【０１０７】
上記方法に加えて、組成物として上述したあらゆる培地が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるあらゆる方法または組成物のある実施形態では、上記培地は、無血清培地、例えばＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）（Ｃａｔ．Ｎｏ．０９６５０，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  Ｃａｎａｄａ）であってもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、造血細胞は、免疫調節化合物（例えばＴＮＦ−α阻害化合物）と接した状態で、当該細胞を培養することで、増殖する。当該細胞は、免疫調節化合物と接していない同数の造血細胞と比べて、与えられた時間内の造血細胞の増殖が検出可能な程度で増加するために十分な時間および量で、免疫調節化合物と接する。例えば、米国特許出願公報第２００３／０２３５９０９号を参照されたい。当該開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。好ましい実施形態では、上記免疫調節化合物は、３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドル−２−ｙｌ）−ピペリジン−２，６−ジオン；３−（４’アミノイソリンドリン−１’−オン）−１−ピペリジン−２，６−ジオン；４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン；４−アミノ−２−[（３ＲＳ）−２，６−ジオキソピペリジン−３−イル]−２Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン；α−（３−アミノフタルイミド）グルタルイミド；ポマリドマイド、レナリドマイド、またはサリドマイドである。別の実施形態では、上記免疫調節化合物は、以下の構造を有し、
【０１０９】
【化１】
2018148913.tif 000003
【０１１０】
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹのもう一方はＣ＝ＯまたはＣＨ2であり、Ｒ2は水素もしくは低級アルキルである化合物であり、またはそれらの薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性体、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、上記免疫調節化合物は、以下の構造を有し、
【０１１１】
【化２】
2018148913.tif 000004
【０１１２】
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、もう一方はＣＨ2またはＣ＝Ｏであり、
Ｒ1は、水素、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ1−Ｃ6）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ2−Ｃ5）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ3、Ｃ（Ｓ）Ｒ3、Ｃ（Ｏ）ＯＲ4、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−Ｎ（Ｒ6）2、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−ＯＲ5、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ5、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ3、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ3、Ｃ（Ｏ）ＮＲ3Ｒ3’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ3Ｒ3’、または（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ5であり、
Ｒ2は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、または（Ｃ2−Ｃ8）アルキニルであり、
Ｒ3およびＲ3’は独立して、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ1−Ｃ6）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ2−Ｃ5）ヘテロアリール、（Ｃ0−Ｃ8）アルキル−Ｎ（Ｒ6）2、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−ＯＲ5、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ5、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ5、またはＣ（Ｏ）ＯＲ5であり、
Ｒ4は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、（Ｃ1−Ｃ4）アルキル−ＯＲ5、ベンジル、アリール、（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ1−Ｃ6）ヘテロシクロアルキル、または（Ｃ0−Ｃ4）アルキル−（Ｃ2−Ｃ5）ヘテロアリールであり、
Ｒ5は、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、ベンジル、アリール、または（Ｃ2−Ｃ5）ヘテロアリールであり、
それぞれに存在するＲ6は独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ2−Ｃ5）ヘテロアリール、もしくは（Ｃ0−Ｃ8）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ5であるか、または、上記Ｒ6基はヘテロシクロアルキル基を形成していてもよく、
ｎは０または１であり、
＊は不斉炭素中心を表す、化合物、
または、それらの薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性体、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、上記免疫調節化合物は、以下の構造を有し、
【０１１３】
【化３】
2018148913.tif 000005
【０１１４】
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、もう一方はＣＨ2またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ2ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4のそれぞれは、他とは独立して、ハロ、炭素原子数１〜４のアルキル、もしくは炭素原子数１〜４のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4のうちの一つがニトロ、もしくは−ＮＨＲ5であり、残りのＲ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4が水素であり、
Ｒ5は、水素、または炭素原子数１〜８のアルキルであり、
Ｒ6は、水素、炭素原子数１〜８のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであり、
Ｒ’は、Ｒ7−ＣＨＲ10−Ｎ（Ｒ8Ｒ9）であり、
Ｒ7は、ｍ−フェニレンもしくはｐ−フェニレン、または−（ＣnＨ2n）−であって、ｎは０〜４の値であり、
Ｒ8およびＲ9のそれぞれは、他方とは独立して、水素、もしくは炭素原子数１〜８のアルキルであるか、または、Ｒ8およびＲ9はともに、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、または−ＣＨ2ＣＨ2Ｘ1ＣＨ2ＣＨ2−であって、Ｘ1は−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であり、
Ｒ10は、水素、炭素原子数８までのアルキル、またはフェニルであり、
＊は不斉炭素中心を表す、化合物、
または、それらの薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性体、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。
【０１１５】
特定の実施形態では、造血細胞の増殖は、２０％ＢＩＴＳ（ＢＳＡ、組み換えヒトインスリンおよびトランスフェリン）、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン（０．０５％ＤＭＳＯ中で１０μＭ）が追加されたＩＭＤＭ中で行われる。さらに特定の実施形態では、約５×１０7個の造血細胞（例えばＣＤ３４+細胞）は、培地中で、約５×１０10個〜約５×１０12個に増殖し、増殖された造血細胞集団を生産するために、１００ｍＬのＩＭＤＭ中に再び懸濁される。増殖された造血細胞集団は、好ましくは輸送を容易にするために低温保存される。
【０１１６】
上述した方法および培地による赤血球の生産は、好ましくは、バイオリアクター（例えば本明細書中のあらゆる箇所で実証されているバイオリアクター）の中で行われる。
【０１１７】
種々の特定の実施形態では、造血細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％は、赤血球および／または多染赤血球に分化する。
【０１１８】
一実施形態では、造血細胞（例えば上述の増殖された造血細胞）の分化を、免疫調節化合物（例えば上述したＴＮＦ−α阻害化合物）と接した状態で、当該細胞を培養することで、達成してもよい。当該細胞は、免疫調節化合物と接していない同数の造血細胞と比べて、与えられた時間内の造血細胞の増殖が検出可能な程度で増加するために十分な時間および量で、免疫調節化合物と接する。例えば、米国特許出願公報第２００３／０２３５９０９号を参照されたい。当該開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【０１１９】
ある実施形態では、上記造血細胞の増殖および分化の方法は、本明細書で記載されるように、増殖および分化の間に、１ミリリットルあたり約２×１０4個から約２×１０5個の間で細胞が維持されるように上記造血細胞を含む細胞集団を維持する工程を含む。ある他の実施形態では、上記造血細胞の増殖および分化の方法は、本明細書で記載されるように、１ミリリットルあたり約１×１０5個以下の細胞が維持されるように上記造血細胞を含む細胞集団を維持する工程を含む。
【０１２０】
上記造血細胞から赤血球への分化は、例えばフローサイトメトリーによって、赤血球特異的マーカーを検出することで、評価することができる。赤血球特異的マーカーは、限定されるものではないが、ＣＤ３６およびグリコフォリンＡが挙げられる。分化は、顕微鏡下での細胞の目視検査によって評価してもよい。典型的な両凹面（biconcave）の細胞の存在によって、赤血球の存在を確認できる。赤血球（網状赤血球を含む）の存在は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３、ＤＲＡＧ５等の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の染色によって確認できる。赤血球の有核前駆体は、ＤＮＡ検出染色で一般的に陽性であるが、一方、赤血球および網状赤血球は、一般的に陰性である。造血細胞から赤血球への分化は、分化の間の、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現、および／または色素レーザースチリル染色の進行的消失によって評価することもできる。例えば、Ｂｅｓｓｉｓ  Ｍ  ａｎｄ  Ｍｏｈａｎｄａｓ  Ｎ，  “Ａ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ，”  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １：３０７（１９７５）；Ｍｏｈａｎｄａｓ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ，”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６６：５６３（１９８０）；Ｇｒｏｎｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｅｗ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ  ｗｉｔｈ
ｔｈｅ  Ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，”  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２６：１４３５（１９８０）を参照されたい。十分に分化した赤血球は、約８０〜約１０８ｆＬ（フェムトリットル）の平均赤血球容積（ＭＣＶ）、約１７〜約３１ｐｇの平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、および約２３％〜約３６％の平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を有する。
【０１２１】
造血細胞から赤血球への分化に要する時間は、約３日から約１２０日である。一実施形態では、上記分化時間は、約７日〜約３５日である。別の実施形態では、上記分化時間は、約１４日〜約２８日である。
【０１２２】
＜５．３．前駆体からの赤血球の分離＞
上述した方法によって生産された赤血球は、好ましくは、造血細胞から分離され、ある実施形態では、赤血球の前駆体から分離される。上記分離は、例えば、ＣＤ３６および／またはグリコフォリンＡに対する抗体を用いることで、達成することができる。分離は、既知の方法によって達成してもよく、例えば、抗体を介した磁気ビーズ分離、蛍光活性化セルソーティング、ＣＤ３６および／またはグリコフォリンＡに対する抗体を含む表面またはカラムに対する細胞の通過等が挙げられる。別の実施形態では、赤血球を含む培地から酸素を除去し、続いて脱酸素された赤血球を他の細胞から磁気分離することで、赤血球の分離を達成する。
【０１２３】
赤血球は、細胞集団（例えば上述したような二番目の増殖された造血細胞集団）から継続的に分離することができ、または、周期的に分離することができる。ある実施形態では、例えば、赤血球の単離は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０分ごと、または、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間ごと、またはそれ以上、または例えば、特定の細胞密度での培養の達成；１ミリリットルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカー（例えばＣＤ３６、もしくはグリコフォリンＡ）を発現する培養の達成等、１つ以上の培養条件が満たされた場合に、行われる。細胞集団からの赤血球の分離は、好ましくは、後述するようなバイオリアクターを用いて行われる。
【０１２４】
＜５．４．バイオリアクターによる赤血球の生産＞
赤血球の生産方法の別の側面では、造血細胞は、支持細胞の存在しないバイオリアクター中で増殖および分化する。造血細胞が分化するバイオリアクターは、造血細胞が増殖するバイオリアクターと同じであってもよいし、または別のバイオリアクターでもよい。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、造血細胞の増殖を完全にバイオリアクター中で促進するように構築される。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、支持細胞を用いずに造血細胞の増殖を行えるように構築される。
【０１２５】
別の実施形態では、上記バイオリアクターは、培地中における細胞の継続的な流れを実現し、分化した赤血球をバイオリアクター中の残りの細胞から継続的に分離することを可能にするように構築される。上記継続的な流れおよび細胞の分離によって、上記バイオリアクターを、赤血球を生産するバッチ法を用いるバイオリアクターと比べて、大幅に小さい体積で構築することができる。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、培地中の細胞の、周期的な流れ（例えば断続的な流れ）を実現し、分化した赤血球をバイオリアクター中の残りの細胞から周期的に分離することを可能にするように構築される。上記周期的な流れおよび細胞の分離によって、上記バイオリアクターを、赤血球を生産するバッチ法を用いるバイオリアクターと比べて、大幅に小さい体積で構築することが好ましい。特定の実施形態では、赤血球の単離は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０分ごと、または、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間ごと、またはそれ以上で行われる。別の特定の実施形態では、例えば、特定の細胞密度での培養の達成；１ミリリットルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカー（例えばＣＤ３６、もしくはグリコフォリンＡ）を発現する培養の達成等、１つ以上の培養条件が満たされた場合に、赤血球の単離が行われる。
【０１２６】
ある実施形態では、上記バイオリアクターは使い捨てである。
【０１２７】
一実施形態では、上記バイオリアクターは、培養部材および細胞分離部材を備える。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、培地ガス供給部材を備える。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、一つ以上の生物活性化合物を含む細胞因子部材を備える。別の実施形態では、上記バイオリアクターの部材は、モジュール式であり、例えば、お互いから分離することができ、および／または、独立して使用できる。一実施形態では、上記バイオリアクターの容量は、約１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、もしくは約９００ｍＬ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０リットルである。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、全ての部品を含むと、約４７立方フィート以下である。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、例えば造血細胞を、約１０10個、１０11個、または約１０12個、培養することができる。
【０１２８】
一実施形態では、上記培養部材は、培地（例えば造血細胞を培養する培地）を受容することができる区画を備える。上記培養部材は、培養のために、培地および／または造血細胞を導入することができるポートを備える。上記ポートは、上記装置のための、技術的に許容可能なポートであれば、いかなるポートであってもよく、例えばルアーロックシールポートが挙げられる。また、上記培養部材は、培地を上記細胞分離部材へと通すために一つ以上のポートを備える。上記培養部材は、任意でさらに、生物活性化合物を上記培養部材の内部に導入するためのポートを備えており、当該ポートには、例えば、上記細胞因子部材と上記培養部材との接続を容易にするポートが挙げられる。特定の実施形態では、分化している造血細胞を含む、上記培養部材中の造血細胞は、赤血球、および／または網状赤血球、および／または他の赤血球前駆体を単離するために、細胞分離部材（下記参照）へと培地中で継続的に循環される。
【０１２９】
上記培養部材は、特定の実施形態では、複数の内部表面または内部構造を備え、当該内部表面または内部構造には、例えば、チューブ、シリンダー、中空糸、多孔性物質等が挙げられる。上記表面は、細胞の培養に好適なあらゆる材料から構築することができ、当該材料には、例えば、組織培養プラスチック、可塑医薬品グレードプラスチック、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリウレタン、ポリヒドロキシエチルメタクリル樹脂等が挙げられる。中空糸は、一般的に直径約１０μｍ〜約１０００μｍであり、一般的に、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１７５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３５０ｋＤａ、４００ｋＤａ、４５０ｋＤａ、または５００ｋＤａ以下の分子を通過させることができる孔を備える。
【０１３０】
上記細胞分離部材は、上記培養部材から、細胞を含む培地を受容するために、少なくとも一つのポートを備える。上記細胞分離部材は、少なくとも一つの種類の細胞（例えば赤血球）を、上記培養部材由来の培地中の細胞から分離することを容易にする、または可能にする、一つ以上の部品を備える。当該分離は、例えば、ＣＤ３６および／またはグリコフォリンＡに対する抗体を用いることで達成される。分離は、既知の方法によって達成してもよく、例えば、抗体を介した磁気ビーズ分離、蛍光活性化セルソーティング、ＣＤ３６および／またはグリコフォリンＡに対する抗体を含む表面またはカラムに対する細胞のパッセージ等が挙げられる。分離は、細胞サイズまたは細胞密度に基づいて達成してもよい。特定の実施形態では、上記細胞分離部材は、上記細胞培養部材と接続されており、培地は造血細胞を含み、分化している造血細胞および赤血球は、細胞（例えば赤血球）を上記培地から継続的に取り除くために、上記細胞分離部材を継続的に通過する。
【０１３１】
別の実施形態では、赤血球の分離は、赤血球を含む培地から酸素を除去し、続いて磁気を用いて、脱酸素された赤血球を、例えば採集物の表面または他の部分へ引き寄せることで、達成される。
【０１３２】
別の実施形態では、上記バイオリアクターは、細胞分離部材を備える。上記細胞分離部材は、培地中の赤血球から、一つ以上の非赤血球系細胞（例えば、未分化の、または、分化が終わっていない造血細胞）を分離することができる部品を備えていてもよい。ある実施形態では、上記細胞分離部材は、生産された赤血球のおよその数を計算することができるか、または、ユーザーが事前に設定したパラメータに従って、あるユニットを構成するために十分な数の赤血球が生産されたことをユーザーに知らせることができる。
【０１３３】
上記バイオリアクターは、別の実施形態では、さらに、培地環境に適切なガスを供給するガス供給部材を備え、例えば、当該ガス供給部材は、上記培地を、８０％の空気と１５％のＯ2と５％のＣＯ2との混合物、または、空気中の５％のＣＯ2等に接触させる。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、上記培地、上記バイオリアクター、またはその両方を、一定の温度（例えば、約３５℃〜約３９℃、または約３７℃）に維持する、温度部材を備える。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、上記培地を、一定のｐＨ（例えば約ｐＨ７．２〜ｐＨ７．６、または約ｐＨ７．４）に維持する、ｐＨモニタリング部材を備える。特定の実施形態では、上記温度部材および／またはｐＨモニタリング部材は、温度および／またはｐＨが、設定されたパラメータを超えるか、または設定されたパラメータ以下になったときに作動する警報装置を備える。他の特定の実施形態では、上記温度部材および／またはｐＨモニタリング部材は、ある範囲から外れた温度および／またはｐＨを補正することができる。
【０１３４】
特定の実施形態では、上記バイオリアクターが、細胞分離部材、および上記培養環境にガスを供給するガス供給部材を備えることによって、上記ガス供給部材が、赤血球の部分的または完全な脱酸素化を可能にし、赤血球に含まれるヘモグロビンの磁気的特性に基づいた赤血球の分離を可能にする。さらに特定の側面では、上記バイオリアクターは、当該バイオリアクター中で生産された赤血球を規則的に、または、繰り返し脱酸素化することができる部材を備え、上記赤血球の磁気的採集を容易にする。
【０１３５】
別の実施形態では、上記バイオリアクターの機能は自動化され、例えば、コンピューターで制御される。上記コンピューターは例えば、デスクトップパーソナルコンピューター、ラップトップコンピューター、Ｈａｎｄｓｐｒｉｎｇ、ＰＡＬＭ（登録商標）、または同様の手持ちサイズの装置、ミニコンピューター、メインフレームコンピューター等であってもよい。
【０１３６】
＜５．５．造血細胞から生産される赤血球のユニット＞
上記のように詳細に説明した方法に従って生産された赤血球のユニットは、あらゆる利用しやすい数の遺伝的背景、または遺伝的背景の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１３７】
種々の実施形態では、本明細書で提供される方法によって生産された赤血球のユニットは、少なくとも、多くとも、または約１×１０8、５×１０8、１×１０9、５×１０9、１×１０10、５×１０10、１×１０11、５×１０11、１×１０12個の赤血球である。種々の他の実施形態では、上記赤血球のユニットは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の完全に分化した赤血球を含む。種々の他の実施形態では、上記赤血球のユニットは、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％より少ない、あらゆる種類の赤血球前駆体を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される方法によって生産された赤血球のユニットは、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１４％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％より少ない、網状赤血球、または他の非赤血球系造血細胞を含む。別の実施形態では、上記ユニットは、単一の個体に由来する造血細胞に由来する赤血球を含む。別の実施形態では、上記ユニットは、複数の個体に由来する造血細胞から分化した赤血球を含む。別の実施形態では、上記ユニットは、調和したヒト胎盤灌流液および臍帯血に由来する造血細胞に由来する赤血球を含む。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、Ｏ型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、Ａ型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、Ｂ型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、ＡＢ型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、Ｒｈ陽性である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て（例えば９９％を超える）は、Ｒｈ陰性である。
【０１３８】
天然に存在する赤血球は、血液が毛細血管を流れることを可能にする、ある特性を有している。例えば、凝集体中の赤血球は、非ニュートン流動を示し、例えば、血液の粘性は、せん断速度に大きく依存する。通常の赤血球は、変形しやすく、凝集体／連銭を形成する。赤血球の変形能は、血液中の寿命（約１００〜１２０日）に関連していると考えられ、血液からの赤血球の除去には、変形能の喪失が関連していると考えられる。赤血球の通常の凝集能は、毛細血管における細胞の流れを容易にするが、一方、異常に増加または減少した凝集能は、流れを低減させる。従って、好ましい実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産された赤血球のユニットは、品質管理の一部として、例えば、天然由来の赤血球の一つ以上の特性について、分析される。ある実施形態では、本明細書で開示される方法によって生産された赤血球のサンプルを、天然または人工の血漿中に懸濁し、粘性、粘弾性、緩和時間、変形能、凝集能、血液／赤血球懸濁液降伏応力、および機械的脆弱性について、通常の血液または通常の赤血球をコントロールまたはコンパレーター（comparator）として用いて測定する。ある他の実施形態では、酸素運搬容量および酸素放出容量について、本明細書で開示される方法によって生産された赤血球のサンプルを、通常の血液または同数の天然の赤血球をコントロールとして分析する。
【０１３９】
〔６．実施例〕
＜６．１．実施例１：ヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）および臍帯血（ＵＣＢ）由来のＣＤ３４+細胞の特性＞
臍帯血（ＵＣＢ）を、インフォームドコンセントの下で、分娩後の胎盤から除去した。その後、放血した胎盤を灌流し、ＨＰＰを得た。当該方法は、米国特許第７，０４５，１４８号に記載されており、開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。赤血球（ＲＣＢ）を除去した後、全有核細胞（ＴＮＣ）を採集し、凍結した。ＵＣＢから単離されるＴＮＣが約５億個であるのに対し、当該方法によれば、一般的には、約１〜２．５×１０9個のＴＮＣが採集できる。
【０１４０】
放血した胎盤から単離されたＴＮＣのフローサイトメトリー分析によって、従来の臍帯血（ＵＣＢ）から得られた細胞産物に比べ、高い割合のＣＤ３４+細胞集団が示される。ＵＣＢ中のＴＮＣでは、約０．３％〜１％のＣＤ３４+細胞を含むのに対し、上記の方法で採集した、ＨＰＰ由来のＴＮＣは、約２％〜６％のＣＤ３４+細胞を含む。
【０１４１】
ＨＰＰから単離されたＴＮＣのフローサイトメトリー分析によって、高い割合のＣＤ３４+細胞集団は、ＣＤ４５-であることが示される（図１）。
【０１４２】
ＨＰＰ由来のＣＤ３４+細胞をコロニー形成ユニットアッセイによって培養し、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）に対する赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の割合（％）を、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球、赤血球、単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）とともに測定した（表１）。また、コロニー形成能についても評価した（表１）。
【０１４３】
【表１】
2018148913.tif 000006
【０１４４】
コロニー形成ユニットアッセイは、製造者のプロトコルに従って行った（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。端的に言えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）を追加したメチルセルロース培地に、プレートあたり細胞１００個、３００個、および１０００個で、ＣＤ３４+細胞懸濁液を加えた。それぞれの細胞密度において、３反復のアッセイを行い、その後、２〜３週間培養した。コロニーの評価および計数は、光学顕微鏡を用いて行った。
【０１４５】
別の実験では、ＨＰＰおよびＵＣＢ由来のＣＤ３４+細胞に対する（ＢＦＵ−Ｅ）／（ＣＦＵ−Ｅ）の割合は、それぞれ４６％および３０％であった（３人のドナーに対する平均値に基づいている）。
【０１４６】
これらの結果は、ＵＣＢ由来の幹細胞に比べて、ＨＰＰ由来の幹細胞は、赤血球生成活性が増加した、多数のＣＤ３４+細胞を含むことを示唆している。
【０１４７】
＜６．２．実施例２：造血幹細胞（ＨＳＣ）の回収＞
ＨＰＰおよびＵＣＢ由来の細胞は、一般的に、全有核細胞（ＴＮＣ）を得るために、フィコール、ヘタスターチ、または塩化アンモニウムのいずれかを用いて、実施例１に記載したように精製される。その後、ＴＮＣを用いて、ＣＤ３４+細胞を単離するための正の選択処理を行った。当該処理には、製造者（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって提供されるプロトコルに従って、抗ＣＤ３４ビーズおよびＲｏｂｏｓｅｐを用いた。当該実験では、ＣＤ３４+細胞が、９０％を超える精製度で単離された（図２）。また、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、負の選択処理を行い、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌをモノクローナル抗体とともに用いて、系列決定済みの細胞を除去した。上記モノクローナル抗体は以下のヒト細胞表面抗原に対する抗体である：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂおよび／またはグリコフォリンＡ。負の選択工程を利用して、９０％のＣＤ３４+細胞を原料から回収した。回収したＨＳＣの細胞組成を、表２に要約する。
【０１４８】
単離されたＣＤ３４+細胞のコロニー形成ユニットアッセイによって、負の選択をされたＨＳＣのコロニー形成頻度は、正の選択をされたＨＳＣと同程度であり、負の選択をされたＨＳＣのＢＦＵ−Ｅ形成頻度は、正の選択されたＨＳＣの形成頻度より高いことが示された。
【０１４９】
【表２】
2018148913.tif 000007
【０１５０】
＜６．３．実施例３：ＣＤ３４+造血細胞集団の増殖＞
ヒト臍帯血（ＵＣＢ）ユニットにおけるＣＤ３４+細胞の含有量は、多くの場合、成人患者に対して造血細胞の移植を行うには十分ではない。ＵＣＢ由来のＣＤ３４+細胞のｅｘ−ｖｉｖｏでの増殖は、上記のＣＤ３４+細胞の投与の制限を克服するための一つのアプローチである。本実施例では、特定の免疫調節薬剤、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン（本実施例では、ポマリドマイドと呼ぶ）を用いたＣＤ３４+細胞の増殖について、実証する。
【０１５１】
短期間の無血清サイトカイン追加培養系において、ポマリドマイド（pomalidomide）がヒトＵＣＢ由来ＣＤ３４+細胞の増殖を促進する能力を評価した。ＣＤ３４+前駆細胞を、低温保存したＵＳＢユニットから９０％を超える精製度で濃縮し、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ−３リガンド（５０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、１ｍＬの培地中に播種した（１０４個のＣＤ３４+細胞）。当該培地は、ＩＭＤＭおよび代替血清ＢＩＴ（ＢＳＡ、組み換えヒトインスリン、およびトランスフェリン、２０％）を含む。ポマリドマイドは、ＤＭＳＯ中に溶解させ、２．７μｇ／ｍＬで追加した。上記培養物を３７℃、５％ＣＯ2で１２日間培養し、７日目に新鮮な培地を加えた。ＤＭＳＯ（０．０５％ｖ／ｖ）とポマリドマイドとを含む培養物、および、ＤＭＳＯを含まず、かつポマリドマイドを含まない培養物、をコントロールとして用いた。
【０１５２】
一実施形態では、ポマリドマイドの追加によって、全有核細胞の増殖に影響を与えることなく、増殖した集団中でのＣＤ３４+の発現を大幅に高めることができた（２００〜３５０倍）。ＣＤ３４+の表現型は、コントロールでは１０〜３０％であったのに比べて、ポマリドマイドを加えて増殖した集団中では、４０〜６０％であった。さらに、ポマリドマイドは、培養細胞におけるＣＤ３８の発現を抑制すると考えられた。ポマリドマイドを加えて増殖したＣＤ３４+細胞は、主にＣＤ３８に対して陰性であり（９５％）、ＣＤ１３３を低レベルで発現した（コントロールで４０％であったのに対し、１５％）。ポマリドマイドを加えて増殖したＣＤ３４+細胞は、増殖したコントロールと比較して、累積コロニー形成ユニットにおいて十分な改善が見られることが証明された。別の同様な実験では、ポマリドマイドの追加によって、全有核細胞の増殖に影響を与えることなく、増殖した集団中でのＣＤ３４+の発現を大幅に高めることが確かめられた。（２００〜３５０倍）。ＣＤ３４+の表現型は、コントロールでは１０〜３０％であったのに比べて、ポマリドマイドを加えて増殖した集団中では、４０〜６０％であった（図３）。さらに、ポマリドマイドは、培養細胞におけるＣＤ３８の発現を抑制すると考えられた。ポマリドマイドを加えて増殖したＣＤ３４+細胞は、主にＣＤ３８に対して陰性であり（９７％）、ＣＤ１３３を低レベルで発現した（コントロールで３２．３％であったのに対し、１１．５％）。ポマリドマイドを加えて増殖したＣＤ３４+細胞は、増殖したコントロールと比較して、累積コロニー形成ユニットにおいて十分な改善が見られることが証明された。
【０１５３】
より多くのＣＤ３４+細胞の生産を実証するため、ポマリドマイドに基づくＣＤ３４+細胞の増殖工程の規模を拡大した。ＣＤ３４+細胞を、柔軟性を有するガス透過性のフルオロカーボン培養バッグ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ製）中で、１０4／ｍＬのポマリドマイド追加培地中に播種した。７日間培養した後、当該培養物を遠心分離し、当初の体積になるように未使用のポマリドマイド追加培地と３回交換した。１２日目までのＴＮＣおよびＣＤ３４+の増殖は、それぞれ３５０倍（幅：２５０〜７００）および２００倍（幅：１００〜４５０）であった（図４）。トリパンブルーによって評価した生存率は８６％（幅：８０〜９０％）であった。全部で２０００万個のＣＤ３４+細胞を採集した。これらの結果から、ポマリドマイドは、胎盤由来のＣＤ３４+前駆体のｅｘ−ｖｉｖｏでの増殖を大幅に促進すること、および、上記工程により、赤血球の分化に十分な量のＣＤ３４+細胞を生産できることが証明された。
【０１５４】
＜６．４．実施例４：支持細胞を用いない造血幹細胞の増殖および造血幹細胞の赤血球への分化＞
本実施例では、ＳＣＦ、ＩＬ−３、およびＥｐｏを含み、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、およびＩＬ−１１を含まない培地を用いた、造血幹細胞または前駆細胞の継続的な増殖、および造血幹細胞または前駆細胞の赤血球への継続的な分化について実証する。
【０１５５】
ＣＤ３４+臍帯血細胞を、下記の組成の培地中で培養し、細胞のアリコート（aliquots）を、細胞計数、細胞生存率、および赤血球分化の評価に用いた。
【０１５６】
Ｃ培地：１％脱イオンＢＳＡ（Ｃａｔ＃  Ａ４９１９，  Ｓｉｇｍａ）、１２０μｇ／ｍＬの鉄飽和ヒトトランスフェリン（Ｃａｔ＃  Ｔ０６６５，  Ｓｉｇｍａ）、９００ｎｇ／ｍＬの硫酸鉄（Ｃａｔ＃  Ｆ８０４８，  Ｓｉｇｍａ）、９０ｎｇ／ｍＬの硝酸酸化鉄（Ｃａｔ＃  Ｆ８５０８，  Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍＬのインスリン（Ｃａｔ＃  Ｉ０９０８，  Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１μＭのヒドロコルチゾン（Ｃａｔ＃  Ｈ０１３５，  Ｓｉｇｍａ）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、および３ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ（Ｃａｔ＃  ２８７−ＴＣ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を追加したＩＭＤＭ培地。
【０１５７】
Ｅ１培地：２ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ、１μＭの合成糖質コルチコイドデキサメタゾン（Ｄｅｘ  Ｃａｔ＃  Ｄ４９０２，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、４０ｎｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１  Ｃａｔ＃  ２９１−Ｇ１−２５０，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および４０μｇ／ｍＬの脂質（コレステロールに富んだ脂質混合物、Ｃａｔ＃  Ｃ７３０５−１Ｇ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を追加した無血清培地（ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）、Ｃａｔ＃  ０９６５０，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）。
【０１５８】
Ｅ２培地：２ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ、１μＭのヒドロコルチゾン、４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および４０μｇ／ｍＬの脂質を追加した無血清培地ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）。
【０１５９】
Ｅ３培地：３ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ、１μＭのＤｅｘ、４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、および４０μｇ／ｍＬの脂質を追加した無血清培地ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）。
【０１６０】
Ｅ４培地：３ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ、１μＭのヒドロコルチゾン、４０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、および４０μｇ／ｍＬの脂質を追加した無血清培地ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）。
【０１６１】
図５は、培地組成ＣおよびＥ１における、２１日目の細胞増殖を示す。要約すると、Ｃ培地における細胞増殖のレベルは、最高２．５×１０5倍であり、平均７．０×１０4倍であった（ｎ＝１３）。また、Ｃ培地におけるＣＤ２３５Ａ+細胞のレベルは、最高３７．６％であり、除核のレベルは、最高２８．１％であった。Ｅ培地における細胞増殖のレベルは、最高２．６×１０5倍であり、平均１．０×１０5倍であった（ｎ＝１０）。また、Ｅ培地におけるＣＤ２３５Ａ+細胞のレベルは、最高９２．９％であり、除核のレベルは、最高４８．２％であった。Ｃ培地およびＥ培地において増殖した細胞は、全て９０％を超える生存率を示した。Ｅ１培地において増殖した細胞は、ＣＤ２３５Ａ+細胞および除核細胞の高い割合で示されるように、最も大幅な赤血球の分化を示した。
【０１６２】
三つのさらなる培地組成Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４における細胞増殖を調べた（図６）。培養物が２１日目に達し、さらに２８日目に達した時、Ｅ１培地およびＥ２培地中の細胞は、増殖安定期（growth plateau）を示しており、一方、Ｅ３培地およびＥ４培地においては、大幅な細胞増殖が見られた。２１日間培養した細胞について、免疫表現型の特性、ＦＡＣＳに基づいた、除核（ＴＯ−ＰＲＯ−３、Ｃａｔ＃  Ｔ３６０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに、胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ−ＰＥ、Ｃａｔ＃  ５６００４１、ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および成体型ヘモグロビン（ＨｂＡ−ＦＩＴＣ、Ｃａｔ＃  ｓｃ−２１７５７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の生産の分析を行った（表３）。
表３Ａ、３Ｂ。２１日間培養された細胞の特性。（Ａ）免疫表現型の特性、（Ｂ）除核、ＨｂＦおよびＨｂＡの特性。標準偏差は３人のドナーの母集団平均に対して計算された。
【０１６３】
【表３】
2018148913.tif 000008
【０１６４】
【表４】
2018148913.tif 000009
【０１６５】
さらに、ＨＳＣマーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３３を含む）および赤血球マーカー（ＣＤ２３５Ａ、ＣＤ３６、およびＣＤ７１を含む）のＦＡＣＳ分析を、Ｅ３培地中の培養物において連続的な時間間隔で、培養物のアリコートを用いて行った。赤血球の系列決定は、７日目までに、ＣＤ１１７+およびＣＤ１３３+細胞集団とともに、ＣＤ３４+細胞集団における未熟な前駆体マーカーの発現が減少し、一方、増殖した細胞の５６％はＣＤ２３５Ａ+であったことから、明らかになった。続く最終分化は、７日目、１４日目、２１日目および２８日目を通してのＣＤ２３５Ａの発現の継続的な増加、特に１４日目と２１日目との間における除核細胞の存在の増加、並びに、７日目、１４日目、２１日目および２８日目を通してのＨｂＦおよびＨｂＡの両方の生産の増加によって、実証された。２１日目の培養物において、増殖した細胞の５０％近くが除核されており、８０％がＨｂＦ+、３０％がＨｂＡ+であった。
【０１６６】
正の選択処理および負の選択処理によって単離された細胞について、Ｂ培地における増殖性および分化を調べた（表４）。正の選択を受けた細胞は、２．２×１０4±２．０×１０4の平均増殖倍率を示し、ＣＤ２３５+細胞の割合は、３２．２％±１４．８％であり、除核細胞の割合は２３．９％±７％であった。負の選択を受けた細胞は、４．０×１０4±３．８×１０4の平均増殖倍率を示し、ＣＤ２３５+細胞の割合は、４０．９％±１１．０％であり、除核細胞の割合は１９．１％±４．８％であった。上記の結果に基づくと、正の選択処理および負の選択処理に由来する細胞間では、増殖倍率および分化について大きな差異は観察されなかった。
【０１６７】
【表５】
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【０１６８】
＜６．５．実施例５：ＨＳＣの増殖における細胞密度の効果＞
ＨＳＣは、実施例１に記載したように、臍帯血から得た。ＨＳＣの培養は、実施例４に記載したように、濃縮したＣＢ由来のＨＳＣを含むＥ３培地を培養することによって開始した。３〜４日ごとに、培養細胞について、細胞計数および特性付けを行った。その後、培養細胞を、新鮮な培地を用いて、所望の密度になるまで希釈した。
【０１６９】
６段階の細胞密度について、Ｅ３培地中での２６日間の培養を通した細胞増殖への効果を調べた（図７および表５）。２〜５×１０4個／ｍＬの範囲で維持された細胞は、最も大幅な増殖を示した。５×１０5個／ｍＬを超える値で保たれた細胞は、緩やかな増殖を示した。
【０１７０】
【表６】
2018148913.tif 000011
【０１７１】
＜６．６．実施例６：増殖および赤血球への分化における、胎盤および骨髄に由来するＣＤ３４+細胞＞
本実施例では、Ｅ３培地中で、ＣＢ由来のＣＤ３４+細胞と骨髄（ＢＭ）由来のＣＤ３４+細胞との間の、細胞増殖および分化ポテンシャルの比較を行った。実施例１に記載されているように、ＢＭまたはＣＢの３ユニットに由来する細胞を、評価実験に用いた。ＣＢ由来のＣＤ３４+細胞は、ＢＭ由来のＣＤ３４+細胞に比べて、高い増殖ポテンシャルを示したが（図８）、一方、分化ポテンシャルは同等であった（表６Ａ）。成体型ヘモグロビン（ＨｂＡ）および胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を含む細胞の割合を表６Ｂに示す（ヘモグロビンを含む細胞の総数と比較した）。
表６Ａ、６Ｂ。ＢＭ由来のＣＤ３４+細胞とＣＢ由来のＣＤ３４+細胞における分化ポテンシャルの比較。標準偏差は３人のドナーの母集団平均に対して計算された。
【０１７２】
【表７】
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【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
＜６．７．実施例７：長期にわたる増殖および赤血球への分化＞
本実験では、Ｅ３培地（上述の実施例４参照）、並びに、単一のドナーおよび混合ドナーに由来するＣＤ３４+細胞を用いて、長期にわたる細胞増殖を行った。高いＲＢＣ成熟効率を伴う、最高６３日間にわたる継続した細胞増殖が実証された（図９）。６３日目には、混合ドナー細胞では１×１０9倍の増殖、単一ドナー細胞では１．８×１０9倍の増殖が、それぞれ観察され、単一ドナーでは、７７％のＣＤ２３５Ａ+、および５６％の除核が達成された（表７）。
【０１７５】
【表９】
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【０１７６】
図１０は、単一ドナーに由来する長期の培養物におけるＨｂＦおよびＨｂＡの生産のＥＬＩＳＡ分析を、末梢血（ＰＢ）ＲＢＣにおけるＨｂＦおよびＨｂＡの生産と比較して示している。本実験では、示された時点において採集された２×１０5個の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、２５００  ×  ｇで１０分間、スピンさせた。細胞の沈殿物を、１００ＬＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ＃  ７８５０１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶解させ、混合物を１０分間穏やかに混合し、続いて、１４，０００  ×  ｇで１５分間遠心分離させた。その後、ＥＬＩＳＡキットを用いたヘモグロビン分析のために、上清を新しいチューブに移した。ＥＬＩＳＡキットには、ヒトヘモグロビンＥＬＩＳＡ定量セット（Ｃａｔ＃
Ｅ８０−１３５）およびヒト胎児型ヘモグロビンＥＬＩＳＡ定量セット（Ｃａｔ＃  Ｅ８０−１３６）が含まれる。１００万個のＰＢ赤血球から２４５ｎｇのＨｂＡが生産された一方、培養細胞は、培養１４日目から開始して、１．３μｇＨｂＡを生産した。
【０１７７】
表８は、単一ドナーに由来する長期の培養物における、いくつかの遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を示している。細胞のアリコートを様々な時点で採集し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析には、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＥＫＬＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００６１０５９２＿ｍ１）、ＧＡＴＡ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００２３１１１２＿ｍ１）、ＧＡＴＡ２、ＨＢβ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００７５８８８９＿ｓ１）、ＨＢγ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１）、ＬＭＯ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００２７７１０６＿ｍ１）、およびＺＦＰＭ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃  Ｈｓ００４１９１１９＿ｍ１）を用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果によって、継続的な増殖および赤血球への分化は、ＨＢβ、ＨＢγ、並びに、ＥＫＬＦ、ＧＡＴＡ１、ＬＭＯ２およびＺＦＰＭ１を含む、赤血球の分化に重要ないくつかの転写因子の発現の増加と相関があることが示された。
表８。単一ドナーに由来する長期の培養物におけるｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ａ）遺伝子発現の変化倍率。（Ｂ）遺伝子の説明。標準偏差は２反復の変化倍率の平均に対して計算された。
【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】
【表１１】
2018148913.tif 000016
【０１８０】
＜６．８．実施例８：Ｅ３培地の最適化＞
本実施例では、ＨＳＣの増殖および赤血球への分化を改善するために、３水準（３要因：ＳＣＦ、Ｅｐｏ、およびＩＬ−３）全要因実験計画（3-level full factorial experiment design）を用いて、Ｅ３培地をさらに最適化した（図１１）。ＣＤ３４+細胞を、図１で記載したように得て、Ｅ３培地には、表９に示すＳＣＦ、ＩＬ−３およびＥｐｏを追加した。細胞計数、生存率、ＣＤ２３５Ａ+細胞の割合、および除核細胞の割合について、表１０に示す時点で調べた。一つの組成（＃７、６５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、７ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、および３ＩＵ／ｍＬのＥｐｏ）では、Ｅ３培地組成に比べて、ＣＤ２３５Ａ+細胞の割合の増加、および除核細胞の割合の増加が見られた。
【０１８１】
【表１２】
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【０１８２】
【表１３】
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【０１８３】
本研究によって、２１日間の細胞増殖実験での、ＨＳＣの増殖および赤血球への分化における、ＳＣＦおよびＥｐｏの異なる効果が特定された（図１２Ａ−１２Ｃ）。Ｅｐｏは、ＳＣＦが高レベルである場合、初期の増殖を増加させるように相乗的に働くが、ＳＣＦが低レベルである場合、増殖を抑制させる。ＳＣＦが低レベルである場合、Ｅｐｏは、ＣＤ２３５Ａの発現の増加に対してより効果的であり、一方、ＳＣＦが高レベルである場合、Ｅｐｏは、赤血球の分化を抑制させる。
【０１８４】
二番目のＤＯＥ試験では、細胞播種密度のＳＣＦおよび／またはＥｐｏに対する相互作用を評価するために、３水準（ＳＣＦ、Ｅｐｏ、および細胞密度）全要因実験計画を利用した（図１３Ａ）。ＣＤ３４+細胞を、図１で記載したように得て、Ｅ３培地には、表１１に示す異なる細胞密度で、ＳＣＦおよびＥｐｏを追加した。低Ｅｐｏ条件（最高３倍）、低細胞密度、および高ＳＣＦ濃度において、増殖の大幅な促進（約１０倍）が達成されることが実証された（図１３Ｂ）。さらに、赤血球の分化は、高細胞播種密度および低ＳＣＦ濃度で、改善されることが実証された（図１３Ｃ）。
【０１８５】
【表１４】
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【０１８６】
＜６．９．実施例９：赤血球のユニットを生産するための方法およびバイオリアクター＞
本実施例では、赤血球の生産方法、および、成熟した赤血球のユニットの生産を可能にするバイオリアクターを提供する。特定の実施例では、バイオリアクターは、５段階の工程によって、投与可能な赤血球のユニットの生産を可能にする。最初の工程では、造血細胞（例えばＣＤ３４+細胞）を単離する。二番目の工程では、ＣＤ３４+細胞を、免疫調節化合物（例えばポマリドマイド）を用いて、増殖させる。三番目の工程では、本明細書に例示するバイオリアクター中で、付着胎盤幹細胞との共培養で、系列決定済み細胞の除去と同時に、ＣＤ３４+細胞を増殖させる。四番目には、残った未分化の造血細胞を赤血球に分化させる。最後に、五番目の工程で、赤血球を単離し、投与可能なユニットに採集する。
【０１８７】
工程１および２、すなわち造血細胞の単離および初期の増殖は、上述の実施例３および４に記載されたように達成される。
【０１８８】
工程３および４は、バイオリアクターによって達成される。上記バイオリアクターは、胎盤幹細胞（２）が播種された中空糸チャンバー（１）、および培地へのガス供給のための部材（３）を備える。上記バイオリアクターは、さらに、系列決定済の造血細胞、完全に分化した赤血球、またはその両方を継続的に分離することができる、連結した細胞選別／分離部材（４）を備える。上記細胞分離部材は、例えば、磁気細胞分離または蛍光活性化セルソーティング技術を用いて、細胞を造血細胞から分離することができる。
【０１８９】
細胞の培養を始めるために、およそ５×１０7個の造血細胞（例えばＣＤ３４+造血細胞）を、上記バイオリアクターに植えつける。
【０１９０】
＜６．１０．赤血球の採集＞
本実施例では、赤血球を他の系列決定済み細胞から分離する、いくつかの方法を例示する。
【０１９１】
方法１：赤血球（例えば、本明細書で例示したバイオリアクターの細胞分離部材から採集された赤血球）およびヘタスターチ溶液をバクスター採集バッグ中で３：１（ｖ／ｖ）で混合し、血漿抽出器（ｐｌａｓｍａ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）上に直立位置で配置する。赤血球は５０〜７０分後に堆積する。堆積していない細胞は、血漿抽出器によって強制排出する。バッグに残った堆積した赤血球を、さらに、４００  ×  ｇで１０分間の遠心分離によって採集する。上清を取り除いた後、赤血球を適切な量の所望の培地に再び懸濁する。
【０１９２】
方法２−免疫磁気的分離：グリコフォリンＡ+細胞（例えば、本明細書で例示したバイオリアクターの細胞分離部材から採集された赤血球）を、グリコフォリンＡ（ＣＤ２３５ａ）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって磁気的に標識する。その後、細胞懸濁液をチューブに入れ、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）マグネットの磁場の中に配置する。磁気的に標識されたグリコフォリンＡ+細胞はチューブの内側に残り、一方、標識されていない細胞は、チューブの外へ流れ出る。チューブを磁場から取り除いた後、磁気的に維持されたグリコフォリンＡ+細胞を磁気ビーズから分離し、適切な量の所望の培地に再び懸濁することができる。
【０１９３】
方法３−フローサイトメトリー細胞分離：赤血球（例えば、本明細書で例示したバイオリアクターの細胞分離部材から採集された赤血球）を、１μＬのＦｃ  Ｂｌｏｃｋ（１／５００）を含む５００μＬのＰＢＳ／ＦＢＳに加える。１５０μＬの細胞懸濁液を、９６ウェルＶ底ディッシュの各ウェルに加える。５０μＬの１°Ａｂ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（当該混合物は、ＰＢＳ／ＦＢＳにそれぞれの一次Ａｂを１／２５で希釈したものである。）を上記細胞に加える。１つのウェルには、補正を設定するための単一のポジティブコントロールとしてそれぞれの一次Ａｂが含まれるのと同様に、電圧を設定するためのアイソタイプコントロールの組み合わせが含まれる。上記細胞を４℃で６０分間培養し、その後、１５００ＲＰＭで２分間遠心分離する。上清は捨てる。ウェルはそれぞれ、２００μＬのＰＢＳ／ＦＢＳで洗浄し、ピペットを用いて混合する。その後、上記細胞を即座に、１５００ＲＰＭで２分間スピンさせ、上清を捨てる。１５０μＬの二次Ａｂ（すなわち、ストレプトアビジン−ＴＣ）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを加え、４℃で３０分間培養し、その後、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。堆積物は、２００〜５００μＬのＰＢＳ／ＦＢＳに再び懸濁し、５ｍＬの流管に移す。その後、細胞を、フローサイトメーターを用いて分離する。
【０１９４】
方法４：赤血球を含む培地を、細胞培養部材と細胞分離部材との間の継続的な流れの中で、ガス供給部材からの酸素の供給を低減または停止させることによって、脱酸素化し、細胞分離部材中で磁石を作動させる。培地を、細胞分離部材を介して、十分な時間、磁石の磁場を通過させ、細胞分離部材の表面に赤血球を集める。一旦、所定の数の赤血球が集まるか、または採集が所定の時間行われれば、培地に酸素が送り込まれ、赤血球は表面から解放される。
【０１９５】
方法５：堆積に基づいた、赤血球の濃縮。赤血球の濃縮は、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、中断することで行うことができる。白血球（一番上の白い層）、未熟な赤血球（中間のピンクの層）、および赤血球（一番下の赤い層）を分離できる。その後、赤血球を底から採集し、適切な量の所望の培地に再び懸濁する。
【０１９６】
＜６．１１．赤血球の採集＞
本実施例では、フローサイトメトリーを用いた、赤血球の採集を実証する。
【０１９７】
赤血球の濃縮は、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いた細胞選別法によって行われる。ＦＡＣＳＡｒｉａを用いた細胞選別法では、光散乱を利用した細胞サイズによる赤血球の選択（前方散乱および側方散乱、図１４および表１２）、またはＤＲＡＱ５標識を利用した除核の選択（リニアＡＰＣチャンネル蛍光、図１５および表１３）を行う。
【０１９８】
ＦＡＣＳＡｒｉａによる細胞選別の後、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３によってゲート（gated）された細胞について、フローサイトメトリーによってＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+の割合を評価した。最も小さい細胞サイズを示すＰ１細胞が、ＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+について最も高い割合を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
【０１９９】
【表１５】
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【０２００】
表１２では、細胞を、細胞透過性ＤＮＡ相互作用試薬ＤＲＡＱ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログＮｏ．＃４０８４）によって染色し、その後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いた細胞選別を行い、Ｑ１およびＱ２によってゲートされた細胞について、フローサイトメトリーによってＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+の割合を評価する。ＤＲＡＱ染色では陰性であったＱ１細胞は、Ｑ２細胞に比べて、ＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+について高い割合を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
【０２０１】
【表１６】
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【０２０２】
表１３で示したように、細胞を、細胞透過性ＤＮＡ相互作用試薬ＤＲＡＱ５によって染色した。ＦＡＣＳＡｒｉａによる細胞選別の後、ＱＰ１、Ｐ２およびＱＰ３によってゲートされた細胞について、フローサイトメトリーによってＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+の割合を評価した。ＤＲＡＱ染色では陰性であり、最も小さい細胞サイズを示すＱＰ１細胞は、Ｑ２細胞に比べて、ＨｂＡ+、除核、およびＣＤ２３５Ａ+について高い割合を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
【０２０３】
＜６．１２．実施例１１：赤血球を生産するためのバイオリアクター＞
本実施例では、造血細胞からの赤血球の生産を改善することができるバイオリアクターの設計について説明する。上記バイオリアクターは、造血細胞を培養する中空糸を有する培養部材を備える。造血細胞（例えば造血前駆細胞）を、５×１０5個／投与量でバッグ中に追加する。上記１回の投与量は、１ユニットの血液をもたらす。上記細胞を、第一のポートを介して加えられた５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、３ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＥｐｏ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１を含むＩＭＤＭ培地の存在下で増殖させる。造血細胞が培養されている上記培地に、２．７μｇ／ｍＬのポマリドマイドを追加する。培養の間、培養部材中のガス、培地の代謝産物、および培地のｐＨを継続的にモニタリングし、必要に応じて、プログラム可能な制御装置を用いて、補充または交換できる。培養部材中の培地のｐＨはおよそ７で維持され、培養温度は約３７℃で維持される。系列決定済みの細胞（例えば分化した細胞）は、細胞分離部材を用いて、培地から継続的に分離および回収される。上記バイオリアクターは、遠隔地、例えば、造血細胞を初めに得る場所から離れた場所において動作できるように、独立した電源を備えている。
【０２０４】
装置、組成物、および方法を含む本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態の範囲に限定されるものではない。実際には、本明細書の記載に加えて種々の変更が可能であることが、当業者であれば上記の説明から理解できるであろう。そのような変更も、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【０２０５】
本明細書で引用された全ての参照文献は、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的に、かつ個別に、全ての目的について全体が参照によって引用されるのと同じ程度に、全ての目的について全体が参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【０２０６】
いずれの刊行物の引用も、出願日に先行して開示されていたためであり、先行発明を理由として、本開示が上記刊行物に先行する資格がないことを認めたと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】ＨＰＰ由来のＣＤ３４+／ＣＤ４５-およびＣＤ３４+／ＣＤ４５+細胞のフローサイトメトリー分析。
【図２】ＣＤ３４+細胞のフローサイトメトリー分析。（Ａ）：単離前のＣＤ３４+細胞；（Ｂ）単離後のＣＤ３４+細胞。
【図３Ａ】ポマリドマイドが追加されたＩＭＤＭ培地中での細胞の増殖。全有核細胞（ＴＮＣ）の増殖倍率。
【図３Ｂ】ポマリドマイドが追加されたＩＭＤＭ培地中での細胞の増殖。ＣＤ３４+細胞の増殖倍率。
【図４Ａ】ＣＤ３４+培養物の増殖能力。ＴＮＣの増殖倍率。「化合物１」はポマリドマイドである。
【図４Ｂ】ＣＤ３４+培養物の増殖能力。ＣＤ３４+細胞の増殖倍率。「化合物１」はポマリドマイドである。
【図４Ｃ】ＣＤ３４+培養物の増殖能力。細胞数で表したＣＤ３４+細胞の増殖。「化合物１」はポマリドマイドである。
【図５】培地組成ＣおよびＥ１中での細胞増殖。
【図６】培地の最適化−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４。エラーバーは３人のドナーの集団平均に対して計算した標準偏差を表す。
【図７】細胞増殖における細胞密度の効果。
【図８】ＢＭ由来およびＣＢ由来のＣＤ３４+細胞の増殖ポテンシャルの比較。標準偏差は３人のドナーの集団平均に対して計算した。
【図９Ａ】Ｅ３培地中での長期培養。（Ａ）細胞増殖倍率。
【図９Ｂ】Ｅ３培地中での長期培養。（Ｂ）集団倍加。
【図１０Ａ】ＨｂＦおよびＨｂＡ産物のＥＬＩＳＡ分析。（Ａ）ＨｂＦ産物。標準偏差は３反復の平均に対して計算した。
【図１０Ｂ】ＨｂＦおよびＨｂＡ産物のＥＬＩＳＡ分析。（Ｂ）ＨｂＡ産物。標準偏差は３反復の平均に対して計算した。
【図１１】ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準実験計画（ＤＯＥ：ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）。全要因実験計画。
【図１２Ａ】ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。細胞分化への要因の効果を示すキューブプロット。
【図１２Ｂ】ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。細胞増殖および分化におけるＳＣＦの相互作用プロット。
【図１２Ｃ】ＳＣＦ、ＥｐｏおよびＩＬ−３間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。細胞増殖および分化におけるＥｐｏの相互作用プロット。
【図１３Ａ】ＳＣＦ、Ｅｐｏおよび細胞密度間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。細胞増殖および分化への因子の効果を示すキューブプロット。
【図１３Ｂ】ＳＣＦ、Ｅｐｏおよび細胞密度間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。低細胞密度、高ＳＣＦ濃度（図１３Ｂ）での細胞増殖および分化におけるＳＣＦおよび細胞密度の相互作用プロット。
【図１３Ｃ】ＳＣＦ、Ｅｐｏおよび細胞密度間の相互作用を表す３水準ＤＯＥ。高細胞密度、低ＳＣＦ濃度での細胞増殖および分化におけるＳＣＦおよび細胞密度の相互作用プロット。
【図１４】細胞サイズによって選別した赤血球。赤血球集団（Ｐ１）は前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を用いて他の未熟な集団（Ｐ２およびＰ３）と区別できる。
【図１５】ＤＲＡＱ染色によって選別した赤血球。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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