(57)【要約】【課題】イソプレンモノマーの代替的な製造方法を提供すること。【解決手段】以下（Ａ）および（Ｂ）等のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法：（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；ならびに（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法：
（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質；
（Ｃ）配列番号２の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｅ）配列番号２の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｆ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質がギンコウバイに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質を産生する形質転換体の培養によりイソプレンモノマーが生成される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換体の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換体が、以下（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である、請求項３または４記載の方法：
（ａ）配列番号１の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列を含み、かつ５’末端に開始コドンをさらに含む、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【請求項６】
前記宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記宿主がエシェリヒア属細菌である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記宿主がエシェリヒア・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主がパントエア属細菌である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主が、パントエア・アナナティスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【請求項１３】
以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質：
（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質；
（Ｃ）配列番号２の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｅ）配列番号２の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｆ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
以下（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列を含み、かつ５’末端に開始コドンをさらに含む、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ
イソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【請求項１５】
請求項１３記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項１４記載のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結された異種プロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６記載の宿主細胞を用いて前記タンパク質を産生することを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレンモノマーの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパーム栽培との競合で農園拡大は困難である。したがって、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがあるが、原料モノマー（イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン））は、主にナフサのクラッキングにより得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。
【０００３】
このような要望に対して、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンモノマーを生産する方法が開示されている（特許文献１および２参照）。
【０００４】
また、イソプレンシンターゼとＭｇイオンとの関係を記載した先行技術としては、以下がある。
非特許文献１は、Ｖｅｌｖｅｔ  ｂｅａｎ（ムクナ）植物体から抽出して粗精製した画分を用いて、イソプレンシンターゼのＭｇイオン濃度依存性を解析している。
非特許文献２は、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｘ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ由来のイソプレンシンターゼと２価カチオンとの関係について、ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｃａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔが２０ｍＭであると記載している。
特許文献４は、ピーナッツ由来イソプレンシンターゼについて、２点のＭｇイオン濃度（１０ｍＭおよび２０ｍＭ）におけるイソプレン生産量の変化を報告している。
イソプレンシンターゼを利用した発酵によるイソプレンの製造方法を示す報告としては、特許文献１から５が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１７９７２２号
【特許文献２】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１８５６４号公報
【特許文献４】国際公開第２０１３／１６６３２０号
【特許文献５】国際公開第２０１３／０１６５９１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｋｕｚｍａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，１０１，４３５−４４０
【非特許文献２】ＪＰ．Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｌａｎｔａ，２００５，  ２２２，７７７−７８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、イソプレンモノマーの代替的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究した結果、ギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼが、既報のイソプレンシンターゼに比し、低いＭｇイオン（Ｍｇ２＋）濃度において高い活性を示すことを見出した。微生物内の生理学的Ｍｇイオン濃度は微生物の種類によっても異なる可能性があり、本発明者らの知る限り正確な値は報告されていないようであるが、従来のイソプレンシンターゼが高い活性を示すＭｇイオン濃度よりも低いと予想される。実際、本発明者らは、ギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼを微生物内で発現させたところ、従来のイソプレンシンターゼに比し高い活性を示した。以上より、本発明者らは、微生物内の生理学的Ｍｇイオン濃度の条件下で、従来のイソプレンシンターゼに比し高い活性を示し得るギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼを単離・同定すること、および当該イソプレンシンターゼを用いることによりイソプレンモノマーを効率的に生産できることなどを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本願発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法：
（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質；
（Ｃ）配列番号２の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｅ）配列番号２の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｆ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
〔２〕前記タンパク質がギンコウバイに由来する、〔１〕の方法。
〔３〕前記タンパク質を産生する形質転換体の培養によりイソプレンモノマーが生成される、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記形質転換体の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記形質転換体が、以下（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが宿主細胞に導入されることにより作製されたものである、〔３〕または〔４〕の方法：
（ａ）配列番号１の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列を含み、かつ５’末端に開始コドンをさらに含む、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔６〕前記宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔５〕の方法。
〔７〕前記宿主がエシェリヒア属細菌である、〔６〕の方法。
〔８〕前記宿主がエシェリヒア・コリである、〔７〕の方法。
〔９〕前記宿主が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔５〕の方法。
〔１０〕前記宿主がパントエア属細菌である、〔９〕の方法。
〔１１〕前記宿主が、パントエア・アナナティスである、〔１０〕の方法。
〔１２〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔１３〕以下（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるタンパク質：
（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質；
（Ｃ）配列番号２の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；
（Ｅ）配列番号２の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｆ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
〔１４〕以下（ａ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列を含み、かつ５’末端に開始コドンをさらに含む、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔１５〕〔１３〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または〔１４〕のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結された異種プロモーターを含む、発現ベクター。
〔１６〕〔１５〕の発現ベクターを含む宿主細胞。
〔１７〕〔１６〕の宿主細胞を用いて前記タンパク質を産生することを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れたイソプレンモノマー生産系を確立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ  プラスミドのマップを示す図である。
【図２】図２は、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のマップを示す図である。
【図３】図３は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のマップを示す図である。
【図４】図４は、ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０  ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＣ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換。Ｂ）ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｃ）ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。
【図５】図５は、ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０  ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＨ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換。Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｃ）ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。
【図６】図６は、ｐＥＡ３２０メガプラミドのΔｃｒｔ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の構築を示す図である。Ａ）ｐＥＡ３２０メガプラスミド中に配置されたＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ｃｒｔローカスの構造。Ｂ）ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０  ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるｃｒｔオペロンのλＲｅｄ依存性置換。Ｃ）ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込み。Ｄ）ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去。
【図７】図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＩｓｐＳＵとＩｓｐＳＭの分子質量の解析結果を示す図である。
【図８】図８は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ組込み型発現ベクターを示す図である。
【図９】図９は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）のマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜イソプレンシンターゼ＞
本発明は、イソプレン合成活性を有するタンパク質（イソプレンシンターゼ）を提供する。
【００１３】
イソプレンシンターゼ（ＥＣ：４．２．３．２７）は、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに転換する酵素である。本発明者らは、ギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼが、既報のイソプレンシンターゼに比し、低いＭｇイオン（Ｍｇ２＋）濃度条件下で高い活性を示すことを見出した。葉緑体移行シグナルを除いた配列で比較した場合、ギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼと、既知のイソプレンシンターゼとの間の同一性（％）は、以下のとおりである。
【００１４】
【表１】
2018148797.tif 000002
【００１５】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、以下である：
（Ａ）配列番号２の全長アミノ酸配列を含むタンパク質；ならびに
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含み、かつＮ末端に開始アミノ酸残基をさらに含む、タンパク質。
配列番号２のアミノ酸配列において、１〜２５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟イソプレンシンターゼをコードし得る。
天然では、Ｎ末端のメチオニン残基（開始アミノ酸残基）を含む葉緑体移行シグナルは、葉緑体移行後に除去される。したがって、葉緑体移行シグナルが除去されているにもかかわらず、開始アミノ酸残基をＮ末端に含む（Ｂ）のタンパク質、ならびに後述する（Ｄ）および（Ｆ）のタンパク質は、天然に生じるタンパク質ではない。なお、（Ｂ）のタンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列と同一である。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、用語「開始アミノ酸残基」とは、開始コドンによりコードされるアミノ酸残基をいう。開始コドンによりコードされるアミノ酸残基としては、例えば、メチオニン残基、バリン残基、イソロイシン残基、およびロイシン残基が挙げられるが、メチオニン残基が好ましい。
【００１７】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質の相同タンパク質である。このような相同タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：
（Ｃ）配列番号２の全長アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
アミノ酸配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００１８】
上述したアミノ酸配列および後述する塩基配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質の改変タンパク質である。このような改変タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる：
（Ｅ）配列番号２の全長アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｆ）配列番号２のアミノ酸配列中の２６〜５８１番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されているアミノ酸配列を含み、Ｎ末端に開始アミノ酸残基をさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質。
【００２０】
上記タンパク質では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、用語「イソプレン合成活性」とは、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンを生成する酵素活性をいう。本発明のタンパク質のイソプレン合成活性は、同一反応液〔例、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および４ｍＭ  ＤＭＡＰＰを含む反応液〕で測定された場合、上記（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質のイソプレン合成活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。また、本発明のタンパク質は、好ましくは、低濃度のＭｇイオン条件下で高いイソプレン合成活性を示すことができる。例えば、本発明のタンパク質は、２０ｍＭ  Ｍｇイオン濃度条件下よりも、１０ｍＭ  Ｍｇイオン濃度条件下でより高いイソプレン合成活性を示すことができる。例えば、イソプレン合成活性の比率「（１０ｍＭ  Ｍｇイオンを含む反応液中で測定されたイソプレン合成活性）／（２０ｍＭ  Ｍｇイオンを含む反応液中で測定されたイソプレン合成活性）」は、約１．１以上、約１．２以上、約１．３以上、約１．４以上、約１．５以上、約１．６以上、約１．７以上、約１．８以上、または約１．９以上であってもよい。上記比率はまた、特に限定されないが、約３．０以下、約２．５以下、または約２．０以下であってもよい。
【００２２】
本発明のタンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号２または４のアミノ酸配列、および他のイソプレンシンターゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２３】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２４】
本発明のタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００２５】
本発明のタンパク質はまた、本発明のタンパク質の産生が所望される宿主細胞の種類に応じて、翻訳後修飾（例、グリコシル化）タンパク質、または翻訳後非修飾（例、非グリコシル化）タンパク質であってもよい。本発明のタンパク質は、真核生物であるギンコウバイに由来するので、天然では翻訳後修飾（例、グリコシル化）される可能性があると考えられる。原核生物では、タンパク質が翻訳後修飾されないこと、ならびに動物細胞、植物細胞、昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）、および下等真核生物（例、酵母）では、タンパク質の翻訳後修飾が大きく異なることが一般に知られている〔例、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９），３０（１９），３−２００を参照〕。したがって、天然で植物細胞に由来するタンパク質を、このような異種宿主細胞で産生させた場合、天然では生じ得ない、翻訳後非修飾タンパク質、または異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を入手し得ると考えられる。
【００２６】
上述したような本発明のタンパク質としては、例えば、ギンコウバイに由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
【００２７】
＜イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド＞
本発明は、イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、ギンコウバイに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、以下に述べるポリヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、以下である：
（ａ）配列番号１の全長塩基配列を含むポリヌクレオチド；ならびに
（ｂ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列を含み、かつ５’末端に開始コドンをさらに含む、ポリヌクレオチド。
配列番号１の塩基配列は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。配列番号１の塩基配列において、１〜７５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルのアミノ酸配列をコードし、７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟イソプレンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。
配列番号１の塩基配列は、ｃＤＮＡに対応する。なぜならば、（ａ）のポリヌクレオチドは、真核生物（植物）であるギンコウバイに由来するためである。したがって、（ａ）のポリヌクレオチド、ならびに後述する（ｃ）および（ｅ）のポリヌクレオチドは、天然に生じるポリヌクレオチドではない。
また、天然では、配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、開始コドンに連結されていない。したがって、葉緑体移行シグナルをコードするポリヌクレオチドが除去されているにもかかわらず、開始コドンを５’末端に含む（ｂ）のポリヌクレオチド、ならびに後述する（ｄ）および（ｆ）のポリヌクレオチドは、天然に生じるポリヌクレオチドではない。なお、（ｂ）のポリヌクレオチドをコードする塩基配列は、配列番号３の塩基配列と同一である。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「開始コドン」とは、タンパク質の合成開始を指定するコドンをいう。開始コドンとしては、例えば、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）、バリン残基をコードするコドン（例、ＧＵＧ）、イソロイシン残基をコードするコドン（例、ＡＵＡ）、およびロイシン残基をコードするコドン（例、ＵＵＧ）が挙げられるが、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）が好ましい。本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明のポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。
【００３０】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドである。このような相同ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ｃ）配列番号１の全長塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
塩基配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００３１】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのアナログポリヌクレオチドである。このようなアナログポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ｅ）配列番号１の全長塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｆ）配列番号１の塩基配列中の７６〜１７４６番目のヌクレオチド残基からなる部分塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、５’末端に開始コドンをさらに含み、かつイソプレン合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００３３】
なおさらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、縮重ポリヌクレオチドである。このような縮重ポリヌクレオチドとしては、例えば、以下が挙げられる：
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
【００３５】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表２に示される低頻度コドンが知られている。
【００３６】
【表２】
2018148797.tif 000003
【００３７】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、本発明の縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明の縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
本発明の縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜５００個、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。
【００３８】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できるが、例えば、異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞の種類に適合するように作製されてもよい。異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞としては、例えば、後述する任意の微生物が挙げられるが、細菌および酵母が好ましい。このような細菌および酵母としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ならびにサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられる。したがって、このような微生物（例、細菌、酵母）における低頻度コドンの非低頻度コドンへの変更、およびゲノムＧＣ含量適合性等の要素の考慮が好ましい。
【００３９】
＜発現ベクター＞
本発明は、発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含む。
【００４０】
本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターをさらに含んでいてもよい。用語「異種プロモーター」とは、ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の天然プロモーター以外のプロモーターをいう。したがって、異種プロモーターとしては、例えば、ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼ遺伝子以外のギンコウバイ由来遺伝子のプロモーター、ギンコウバイ以外の他の生物（例、微生物、動物、昆虫、および植物）由来プロモーター、ウイルス由来プロモーター、ならびに人工合成プロモーターが挙げられる。異種プロモーターとしてはまた、異種タンパク質生産に汎用されるプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。
【００４１】
本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００４２】
本発明の発現ベクターはまた、開始コドンの上流にリボゾーム結合部位（例、シャイン・ダルガノ配列）をさらに含んでいてもよい。
【００４３】
本発明の発現ベクターはまた、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００４４】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、後述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、例えば、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーター等を有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００４５】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質を産生できる、または本発明のポリヌクレオチドを発現してタンパク質を産生できる宿主細胞である。具体的には、本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位とは、本発明のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする単位をいう。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞は、本発明のタンパク質および本発明のポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞はまた、上記プロモーターに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
【００４６】
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
【００４７】
グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、およびパントエアアナナティスＳＣ１７（０）株が挙げられる。パントエアアナナティスＳＣ１７（０）株は、２００５年９月２１にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイ  クロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  （ＶＫＰＭ），  ＧＮＩＩ  Ｇｅｎｅｔｉｋａ）（住所：Ｒｕｓｓｉａ，  １１７５４５  Ｍｏｓｃｏｗ，  １  Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ．  １）に受託番号ＶＫＰＭ  Ｂ−９２４６として登録されている。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｓａｋａｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．３４０−３４８，２００７）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人  産業技術総合研究所（現：国立研究開発法人  産業技術総合研究所）  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００４８】
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
その他、本発明に用いられる宿主としては、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および／またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を備えていれば特に限定されず、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌は、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を固有に有し得る。また、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌は、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を固有に有し得る。
表現「ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能」については、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｃ  Ｙ  Ｃｈａｎｇ  およびＪａｙ  Ｄ  Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６７４−６８１（２００６）を参照のこと。
表現「メバロン酸（ＭＶＡ）経路」については、Ｋｕｚｕｙａｍａ  ＴおよびＳｅｔｏ  Ｈ，  Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．８８，４１−５２（２０１２）；Ｍｉｚｉｏｒｋｏ  ＨＭ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５０５，１３１−１４３（２０１１）を参照のこと。
表現「メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路」については、Ｋｕｚｕｙａｍａ  ＴおよびＳｅｔｏ  Ｈ，Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．８８，４１−５２（２０１２）；Ｇｒaｗｅｒｔ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６８，３７９７−３８１４（２０１１）を参照のこと。
【００４９】
本発明の形質転換体は、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはまた、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、エシェリヒア・コリ）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する１または複数（例、１種、２種、３種または４種以上）の酵素を発現するものであってもよい。
【００５０】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。
【００５１】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。
【００５２】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。
【００５３】
遺伝子が組込まれた発現ベクターの宿主への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００５４】
さらに、本発明の形質転換体において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
このような酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。
【００５５】
本発明の形質転換体では、１箇所または複数（例、２、３、４または５箇所）の特定のゲノム領域（例、コーディングまたはノンコーディング領域）が、破壊されていてもよい。このようなゲノム領域としては、例えば、ｃｒｔオペロン（ポリプレニルシンテターゼ、ベータ−カロテンヒドロキシラーゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、リコペンシクラーゼ等のイソプレノイド生合成経路をコードする）、ａｍｐ遺伝子（例、ａｍｐＣ遺伝子、またはａｍｐＨ遺伝子）が挙げられる。例えば、ｃｒｔオペロンの破壊は、イソプレノイド化合物の生成を抑制できるので有利であり得る。ａｍｐ遺伝子の破壊は、アンピシリン耐性遺伝子（薬剤耐性選択マーカー）が利用可能になるので有利であり得る。
遺伝子について用語「破壊」とは、遺伝子よりコードされるタンパク質の機能または発現を低下または完全消失させるように、遺伝子コーディング領域が改変されることを意味する。オペロンについて用語「破壊」とは、オペロンの機能を低下または完全消失させるように、オペロンに対応するゲノム領域が改変されることを意味する。エンハンサーとして作用し得るオペロン（例、上述したｃｒｔオペロン）の機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が低下または完全消失し得る。一方、リプレッサーとして作用し得るオペロンの機能が低下または完全消失すると、当該オペロンに作動可能に連結されている遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が向上し得る。当該改変としては、例えば、挿入、欠失および交換が挙げられるが、これらに限定されない。
ゲノム領域は、例えば、既知の遺伝子ターゲティング法にしたがい上述の遺伝子（例、イソプレンシンターゼ遺伝子）を当該ゲノム領域に導入することにより、破壊されてもよい。
【００５６】
イソプレンシンターゼは、本発明の形質転換体から精製されてもよい。精製方法としては、例えば、塩析法、および各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。イソプレンシンターゼがヒスチジンタグ等の異種部分を含むように設計されている場合、ニッケル等の金属、または異種部分に親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムにより、イソプレンシンターゼを精製することができる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
【００５７】
＜イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造方法＞
本発明は、本発明のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。
【００５８】
一実施形態では、本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のタンパク質自体を用いて行うことができる。本発明のタンパク質として、天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または本発明の形質転換体から得ることができる。本発明のタンパク質は、未精製、粗精製または精製タンパク質として利用することができる。反応系としては、例えば、本発明のタンパク質、基質（ＤＭＡＰＰ）およびＭｇイオンを含む緩衝液（例、ｐＨ６．０〜９．０）を利用することができる。Ｍｇイオン（Ｍｇ２＋）濃度は、特に限定されないが、本発明のタンパク質は低いＭｇイオン濃度で高い活性を示し得ることから、例えば、１５ｍＭ以下、１２ｍＭ以下または１０ｍＭ以下のＭｇイオン濃度で反応が行われてもよい。
【００５９】
別の実施形態では、本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明の形質転換体を用いて行うことができる。本発明の形質転換体は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産することができるため、形質転換体により発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーを回収することができる。イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。あるいは、ジメチルアリル二リン酸を培地に加えてもよい。
【００６０】
本発明の形質転換体を培養する培地としては、メバロン酸またはイソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６１】
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
【００６２】
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
【００６３】
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
【００６４】
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００６５】
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００６６】
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
【００６７】
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
【００６８】
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
【００６９】
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
【００７０】
本発明において、形質転換体の培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【００７１】
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
本発明の形質転換体において、目的タンパク質の発現を維持するために、糖、金属塩、抗菌物質等を培地に添加しておくことが好ましい。
【００７２】
本発明の形質転換体の培養条件としては、目的タンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５〜約９であることが好ましい。
また、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
【００７３】
培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
【００７４】
バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
【００７５】
流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
【００７６】
連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。
【００７７】
発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）等の誘導剤を添加して、目的タンパク質の発現を誘導してもよい。
【００７８】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。
【００７９】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。
ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
【００８０】
イソプレンモノマーの回収は一段階又は多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
【００８１】
更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
【００８２】
本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【００８３】
工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学的な合成法）により行うことができる。
【実施例】
【００８４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８５】
実施例１：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＧ１０２６５の構築
１−１）ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
１−１−１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号５、及び配列番号６にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号７に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。
【００８６】
１−１−２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号８、及び配列番号９にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号１０に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。
【００８７】
１−１−３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号１１と配列番号１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号１３と配列番号１４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号１５と配列番号１６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを鋳型として配列番号１７と配列番号１８に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号１１と配列番号１４に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号１５と配列番号１８に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。
【００８８】
１−２）ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築
先ず、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を含む発現ベクターの構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋ（ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１の実施例７−２）を参照）を鋳型とし配列番号１９〜２２の塩基配列からなるプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉ（ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１の実施例７−２）を参照）を鋳型とし配列番号１９〜２２の塩基配列からなるプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）の塩基配列を配列番号２３に示す。
【００８９】
次いで、得られたｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）（配列番号２３）にＩｓｐＳ（Ｋ）を付加したプラスミドｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築は以下の手順で行った。
ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）を制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で消化処理し、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを得た。ｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＫを鋳型とし、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＳ＿６０８３−１０−１（配列番号２４）、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＡ＿６０８３−１０−２（配列番号２５）をプライマーとし、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（配列番号２６）と命名した。
【００９０】
１−３）ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ−Ｍｍａｍｖｋの構築
１−３−１）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来メバロン酸キナーゼの化学合成
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏ１由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿００３９０１．１（２１０１８７３．．２１０２７７８、ＬＯＣＵＳ  ＴＡＧ  ＭＭ＿１７６２，アミノ酸配列の番号：ＮＰ＿６３３７８６．１））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号２７、及び配列番号２８にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｍａｍｖｋと名付けた。Ｍｍａｍｖｋの塩基配列を配列番号２９に示す。Ｍｍａｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
【００９１】
１−３−２）Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼとＭＶＫ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子とを発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号３０と配列番号３１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号３２と配列番号３３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫと命名した。次に、ｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋを鋳型として、配列番号３４と配列番号３５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｍａｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫを、配列番号３６と配列番号３７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｍａｍｖｋ遺伝子と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
【００９２】
１−４）ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐの構築
次に、ＭＶＫ発現プラスミド（ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ−Ｔｔｒｐ）を構築した。
先ず、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来メバロン酸キナーゼの塩基配列およびアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＮＣ＿０１５４１６．１（２１８９０５１．．２１９０００４，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，ＬＯＣＵＳ  ＴＡＧ  ＭＣＯＮ＿２５５９）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＹＰ＿００４３８４８０１．１（ＧｅｎＰｅｐｔ））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３８、及び配列番号３９にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｃｌｍｖｋと名付けた。Ｍｃｌｍｖｋの塩基配列を配列番号４０に示す。Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋと名付けた。
【００９３】
ｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋを鋳型として、Ｍｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号４１）とＭｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号４２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３０６９６３４Ａ１を参照）を、ＰｔＴｔ２１９ｆ（配列番号４３）とＰｔＴｔ２１９ｒ（配列番号４４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｃｌｍｖｋ遺伝子と、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＭｃｌｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐと名付けた。
【００９４】
１−５）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
【００９５】
ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図１）。
【００９６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ遺伝子、および葛由来ｉｓｐＳ遺伝子のコーディング部分を含むｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ部位中にサブクローニングし、得られたプラスミドを、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）と命名した（図２）。
【００９７】
Ｐｔａｃの制御下にあるｉｓｐＳ（Ｍ）およびｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）遺伝子を含むｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ−ＭｍａｍｖｋのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、組込み型ベクターｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＢａｍＨＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、図３に示す。
【００９８】
１−６）ｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位をゲノムの異なる部位に保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）誘導体の構築
ａｍｐＣ遺伝子、ａｍｐＨ遺伝子またはｃｒｔオペロンを置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）誘導体を構築した（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として入手可能）。これらの株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報の手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ−アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるａｍｐＣおよびａｍｐＨ遺伝子ならびにｃｒｔオペロンの置換に用いたＤＮＡフラグメントを、それぞれ、オリゴヌクレオチド１および２、３および４、ならびに５および６（表３）を用いた反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を、これらの反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と命名した。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表３）を、それぞれ、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ゲノム改変体のマップを、それぞれ、図４Ａ）、図５Ａ）および図６Ａ）に示す。
【００９９】
カナマイシン耐性マーカーからの構築株のキュアリングを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表３）を、それぞれ、得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。
【０１００】
１−７）ＩＳＰ３−Ｓ株の構築
１−５）に記載されるｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３−ｃａｔを用いて、１−６）に記載されるＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および７、ならびに１４および８（表３）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、λファージのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子を保有するｐＭＷｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分からキュアした。その結果、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を得た。オリゴヌクレオチド７および１５（表３）を、カナマイシン感受性誘導体のＰＣＲによる検証のために用いた。ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築を図４Ｃに示す。
【０１０１】
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて上記ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株から単離したゲノムＤＮＡを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法にしたがって、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株にエレクトロポレーションした。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０変異の移入を、プライマー９および１０を用いたＰＣＲにより確認した。
【０１０２】
得られた株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、ｐｈｉ８０  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性手法（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて行った。得られたＫｍＳ組換え体においてプライマー７および１５を用いてΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体をＰＣＲにより検証した後、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株を選択した。
【０１０３】
上記ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミド（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および９、ならびにオリゴヌクレオチド１４および１０（表３）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。この組込み体を、ファージλ  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分を除去した。染色体からのベクターの除去は、プライマー９および１６を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、マーカーを含まないＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳを得た。ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築物を、図５に示す。
【０１０４】
１−５）に記載されるｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドを、既報に記載されるプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミド組込みを、プライマー１１および１３ならびに１２および１４を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。
【０１０５】
このようにして構築された染色体改変体ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡによるエレクトロポレーションの方法を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ株に移した。得られた組込み体を、ファージλ  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分を除去した。最終構築物Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）の構造（図６Ｄ）は、プライマー１１および１７を用いたＰＣＲで確認した。
【０１０６】
この最終株に導入された組込み型発現カセットをＰＣＲにより検証したところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を含むＫＫＤｙＩオペロンの５’−部分で幾つか予想外に再構成していることが判明した。このカセットを修復するため、既報の手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）にしたがい、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株から単離したゲノムＤＮＡをこの株にエレクトロポレーションした。得られた株は、イソプレン産生に必要な全ての遺伝子を含んでいた。
【０１０７】
ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（上記を参照）のベクター部分からファージλ  Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性で除去した後、マーカーを含まないＩＳＰ３−Ｓ株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０）を得た。
【０１０８】
１−８）異なるメバロン酸キナーゼ遺伝子を保有する組込み型プラスミドの構築
ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＫｐｎＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。その結果、ｔａｃプロモーターの制御下にあるＭ．ｃｏｎｃｉｌｌｉ由来ＭＶＫ遺伝子を保有するｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを構築した。
【０１０９】
１−９）ＡＧ１０２６５株の構築
１−８）に記載されるｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）のプロトコルにしたがい、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム中に組み込んだ。
【０１１０】
構築されたΔｃｒｔ：：ｐＡＨ１２３−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）染色体改変体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋから単離したゲノムＤＮＡのエレクトロポレーションを介して、ＩＳＰ３−Ｓ株〔１−７）を参照〕に移入した。得られた組込み体を、ＡＧ１０２６５（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０  Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−ａｔｔＲｐｈｉ８０）と命名した。
【０１１１】
【表３】
2018148797.tif 000004
【０１１２】
実施例２：各植物種由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドの調製
２−１）Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）  ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ等の腸内細菌で効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫと名付けた。なお、ＩｓｐＳＫ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭの配列は、ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１に開示されるものと同一である。
【０１１３】
２−２）Ｍｕｃｕｎａ  ｐｕｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｍ．ｐｕｒｕｒｉｅｎｓ由来イソプレンシンターゼの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．  ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルを切断したものをＩｓｐＳＭと名付けた。ＩｓｐＳＭ遺伝子は、化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭと名付けた。なお、ＩｓｐＳＭ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭの配列は、ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１に開示されるものと同一である。
【０１１４】
２−３）Ｔｒｕｅ  ｍｙｒｔｌｅ（ギンコウバイ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｔ．ｍｙｒｔｌｅ由来イソプレンシンターゼの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルを切断したもの（但し、Ｎ末端にメチオニン残基を有する）をＩｓｐＳＵと名付けた。ＩｓｐＳＵの塩基配列を配列番号６２に示す。ＩｓｐＳＵ遺伝子は、それぞれ化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＵと名付けた。
【０１１５】
２−４）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ等の腸内細菌で各植物種由来ＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ）を化学合成した。得られたＰｔａｃ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流にＩｓｐＳ遺伝子をクローニングすることで、ＩｓｐＳ遺伝子の発現増幅が可能となる。なお、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐは、ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１に開示されるものと同一である。
【０１１６】
２−５）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ等の腸内細菌でＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＵ）遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号６３と配列番号６４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号６５と配列番号６６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＵを鋳型として、配列番号６７と配列番号６８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＵ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号６９と配列番号７０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＵ遺伝子遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＵ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＵと命名した。なお、プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫおよびＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭは、ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１に開示されるものと同一である。
【０１１７】
実施例３：パントエア・アナナティスを用いたイソプレンモノマーの生産
３−１）菌株の構築
構築したＡＧ１０２６５に対し、常法に従い葛及びムクナ、ギンコウバイ由来のイソプレンシンターゼを導入したイソプレン生産菌を構築した（表４）。
【０１１８】
【表４】
2018148797.tif 000005
【０１１９】
３−２）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのイソプレン生産菌における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのイソプレン生産菌におけるグルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＫ、ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＭ、ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＵを、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて４８時間培養を行った。Ｍ９グルコース培地の組成は表５に記載のとおりである。
【０１２０】
【表５】
2018148797.tif 000006
【０１２１】
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表６に各菌株の培養終了時のＯＤあたりイソプレン濃度を記載した。
【０１２２】
以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  Ｔｕｒｂｏ  Ｍａｔｒｉｘ  ４０）
バイアル保温温度  ４０℃
バイアル保温時間  ３０ｍｉｎ
加圧時間  ３．０ｍｉｎ
注入時間  ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度  ７０℃
トランスファー温度  ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）  １２４ｋＰａ
【０１２３】
ガスクロマトグラフィー（島津社製  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ：  長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ  ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度  ３７℃
圧力  ２４．８ｋＰａ
カラム流量  ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法  スプリット  １：０（実測１：１８）
トランスファー流量  ９０ｍＬ
ＧＣ注入量  １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量  ０．１ｍＬ
注入口温度  ２５０℃
検出機  ＦＩＤ（水素  ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気  ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス  ヘリウム  ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度  ２５０℃
【０１２４】
イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。
【０１２５】
【表６】
2018148797.tif 000007
【０１２６】
上記株は、生産菌ゲノムに１コピー導入されたＩｓｐＳＫと、プラスミドで導入されたいずれか一つのイソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＫ、またはＩｓｐＳＵ）との組み合わせを発現している。バックグラウンドとして、生産菌ゲノム上のＩｓｐＳＫ由来の一定のイソプレン生産が認められるものの、３種の株でいずれも同等程度で、かつ、著しく低いイソプレン生産量であろうと推定される。したがって、上記値は、３種のイソプレンシンターゼのイソプレン生産性の差に由来すると考えられる。
【０１２７】
表６の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＵ、ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＫ、ＡＧ１０２６５／ＩｓｐＳＭとなった。上記の結果から、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのイソプレン生産菌では、ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
【０１２８】
実施例４：イソプレン合成活性のマグネシウムイオン（Ｍｇイオン）濃度依存性の比較
既存種であるムクナ由来イソプレンシンターゼＩｓｐＳ（ＩｓｐＳＭ）の調製法は先行特許（特許文献：ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１）に記載した通りである。ここでは、ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼＩｓｐＳ（ＩｓｐＳＵ）の調製法について述べる。
【０１２９】
４−１）発現用プラスミドの構築
ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼ（ＩｓｐＳＵ）の大量発現用プラスミドを次の手順に従って構築した。まず、ベクター部分については、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ（ＴａＫａＲａバイオ社製、＃３３６５、配列情報はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＢ２１３６５４）を鋳型とし、配列番号７１と配列番号７２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法で増幅した。ＩｓｐＳＵをコードするＤＮＡ断片についてはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＵ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社製）を鋳型とし、配列番号７３と配列番号７４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ法のポリメラーゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａバイオ社製）を利用した。また、反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、反応条件は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。得られたこれらのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａバイオ社製）を用いて連結した。構築したプラスミドをｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＵと名付けた。ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＵの塩基配列を配列番号７５に示す。
この発現ベクターでは、イソプレンシンターゼはｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）をＮ末端に融合した蛋白質として発現するよう設計した。ＴＦとイソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳと命名した。ギンコウバイ由来イソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳＵと名付けた。
ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＵをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ＢＬ  ２１（ＤＥ３）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にヒートショック法により形質転換を行った。４２℃、３０秒のヒートショックの後、ＳＯＣ培地を用いた回復培養を３７℃、１時間、１２０ｒｐｍの条件で実施した。その後、アンピシリン０．１ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレートに全量播種し、３７℃、１４時間静置培養した。
【０１３０】
４−２）イソプレンシンターゼの大量調製のための培養
プレート上に形成されたコロニーをピックし、アンピシリン０．１ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬ  ＬＢ培地に植菌した後、ＯＤ６６０＝１．０になるまで３７℃、２００ｒｐｍで培養した。当該ＯＤ値への到達を確認後、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地１００ｍＬを張り込んだ２５０ｍＬ容量の坂口フラスコに全量を植菌し、ＯＤ６６０＝１．０に到達するまで３７℃、１２０ｒｐｍで培養した。その後、１Ｍイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク社）を終濃度１ｍＭになるよう添加し、１５℃、１００ｒｐｍで終夜培養した。培養終了後、８００×ｇ、１０分で遠心分離して菌体を回収し、精製操作を行うまで−８０℃にて保存した。
【０１３１】
４−３）イソプレンシンターゼの精製
上で述べた通り、ＴＦ−ＩｓｐＳＵの精製は、文献（特許文献：ＷＯ２０１３／１７９７２２Ａ１）に記載したＴＦ−ＩｓｐＳＭの精製方法と同様に行った。すなわち、培養終了後のブロス１００ｍＬより得られた菌体を５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ８）、５００ｍＭ  ＮａＣｌからなる破砕バッファー２４０ｍＬに懸濁し、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、Ｂａｒａｎｓａｎ社製）を用いて、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  ５０％、ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ６の条件にて、８分間、氷上にて超音波破砕を実施した。超音波破砕後、２００００  ×ｇ、２０分の遠心分離操作により破砕上清を得た。以下の精製操作は全て４℃にて実施した。ｐｏｌｙｐｒｅｐ  ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ社製）にＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ  （Ｓｉｇｍａ社製）を、ベッドボリューム２ｍＬ相当をアプライし、重力法により充填した。次に破砕バッファー１０ｍＬをアプライし、重力法で平衡化した。このカラムに対し超音波破砕後の破砕上清を全量アプライし、ＴＦ−ＩｓｐＳＵをカラムに吸着させた。
アプライした破砕上清の全量がカラムを通過したことを確認した後、破砕バッファー１０ｍＬでカラムを洗浄した。更に、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる活性測定用バッファー１０ｍＬでカラムを追加洗浄した。その後、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅからなる洗浄液をカラムに４ｍＬアプライし、通過液を廃棄した。最後に、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅからなる溶出液を４ｍＬカラムにアプライし、ＴＦ−ＩｓｐＳの溶出を行った。溶出後のＴＦ−ＩｓｐＳを遠心式フィルター濾過（ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ＭＷＣＯ  １００ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社））で濃縮した。
続いて、ＴＦ−ＩｓｐＳＵ融合タンパク質のＴＦを切断した。切断には、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を利用した。反応バッファーは、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２からなり、２６ＵのＦａｃｔｏｒ  Ｘａを添加し、４℃にて、１４時間反応を行った。反応終了後の反応液を、Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌに通過させることにより、ＴＦのみがＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌに吸着する事を利用して、反応液中からＴＦを除去した。続いてゲル濾過カラム（ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ＭＷＣＯ５０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＩｓｐＳを濃縮した。得られた濃縮液をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で展開したところ、ＩｓｐＳＵをアプライしたレーンでＩｓｐＳＭのバンドと泳動度が一致するバンドが検出された（図７）。
このようにして得られたＩｓｐＳＵ溶液は、活性測定用バッファーに対して終濃度５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを添加して活性測定に供するまで−８０℃冷凍庫で保存した。
【０１３２】
４−４）イソプレンシンターゼのＭｇイオン濃度依存性の比較
イソプレンシンターゼが反応を触媒する際のＭｇイオン濃度の依存性を調べた。反応に供するＩｓｐＳＭ，  ＩｓｐＳＵを氷上で解凍した後、ｇｌｙｃｅｒｏｌを除去するためにバッファー交換した。また、反応に供する酵素濃度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の比色定量により定量した。反応液の組成は５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  ４ｍＭ  ＤＭＡＰＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐａｈａｔｅ：Ｃａｙｍａｎ社）である。Ｍｇイオン濃度依存性を調べる為に金属イオンとして１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２あるいは２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を反応液に添加した。反応の際１μｇのＩｓｐＳを反応液に添加し、最終的な液量を５０μＬに合わせた。このようにして調整した反応液５０μＬを０．２ｍＬ容積のＰＣＲ  ｔｕｂｅ（日本ジェネティクス社製）に入れ、ニードル（テルモ社製）で蓋に穴を穿った。次に、当該チューブを２２ｍＬ  バイアル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に入れ、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で直ちに密栓した。イソプレン生成反応は３７℃にて１時間実施した。発生したイソプレンの定量は、実施例３に従った。各条件において測定したイソプレン発生量を、１０ｍＭ  Ｍｇイオン添加時のＩｓｐＭにより発生したイソプレン量で規格化して表７に示した。Ｔａｌｂｅ１から、２０ｍＭ  Ｍｇイオンを添加した場合ＩｓｐＳＵとＩｓｐＳＭは酵素量当たりのイソプレン変換能が同等であった。一方、１０ｍＭ  Ｍｇイオンを添加した場合、ＩｓｐＳＵのイソプレン変換能は同条件下のＩｓｐＳＭのイソプレン変換能の１．９倍程度であった。このことから、１０ｍＭ  Ｍｇイオンを添加する反応条件ではＩｓｐＳＵが優れたイソプレン変換能をもつことが明らかとなった。
【０１３３】
【表７】
2018148797.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、合成ゴムの原料として使用できるイソプレンモノマーの製造などに有用である。
【図１】
2018148797.tif 000009
【図２】
2018148797.tif 000010
【図３】
2018148797.tif 000011
【図４】
2018148797.tif 000012
【図５】
2018148797.tif 000013
【図６】
2018148797.tif 000014
【図７】
2018148797.tif 000015
【図８】
2018148797.tif 000016
【図９】
2018148797.tif 000017
【配列表】
2018148797000001.app