(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を特異的に認識することができるヒト抗体、抗原結合フラグメントおよび類似の抗原結合分子の提供。【解決手段】ヒト由来モノクローナル抗ＳＯＤ１抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントであって、ミスフォールドまたは凝集ＳＯＤ１に結合できることを特徴とし、且つ、生理的ＳＯＤ１二量体よりミスフォールドもしくは凝集ＳＯＤ１を優先的に認識し、該抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧを含むまたは該配列から成るＳＯＤ１エピトープに特異的に結合する、前記抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来モノクローナル抗ＳＯＤ１抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントであって、ミスフォールドまたは凝集ＳＯＤ１に結合できることを特徴とし、且つ、生理的ＳＯＤ１二量体よりミスフォールドもしくは凝集ＳＯＤ１を優先的に認識し、該抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントは、アミノ酸配列ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ（配列番号５１）を含むまたは該配列から成るＳＯＤ１エピトープに特異的に結合する、前記抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項２】
以下に示す６個の、ＶＨおよびＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、その可変領域内に含む、または配列番号６２および６３の配列中に示されるＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント、
ＶＨＣＤＲ１：配列番号６２の位置３１−３５，
ＶＨＣＤＲ２：配列番号６２の位置５０−６６，
ＶＨＣＤＲ３：配列番号６２の位置９９−１１２，
ＶＬＣＤＲ１：配列番号６３の位置２３−３３，
ＶＬＣＤＲ２：配列番号６３の位置４９−５５，
ＶＬＣＤＲ３：配列番号６３の位置８８−９７。
【請求項３】
ダイレクトＳＯＤ１  ＥＬＩＳＡにおいて、野生型（組み換え）ＳＯＤ１に対して１０ｐＭから１ｎＭの半最大有効濃度（ＥＣ５０）を有する、請求項１または２に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項４】
キメラマウス−ヒトもしくはマウス化抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項５】
一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントから成る群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項６】
ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
場合によっては、前記結合分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組み合わせで、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
（ｉ）検出可能に標識されており、好ましくは、その検出可能標識が、酵素、放射性同位体、蛍光体および重金属から成る群より選択される；ならびに／または
（ｉｉ）薬物に付けられている、
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の細胞を含む組成物であって、好ましくは、
（ｉ）医薬組成物であり、および医薬的に許容される担体をさらに含み、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症の治療に有用な追加の薬剤をさらに含む、または
（ｉｉ）診断用組成物であり、免疫または核酸ベースの診断方法に従来使用されている試薬を場合により含む、
組成物。
【請求項１２】
被験体における筋萎縮性側索硬化症の予防的もしくは治療的処置に使用するための、または筋萎縮性側索硬化症の進行もしくは筋萎縮性側索硬化症の処置に対する反応のモニタリングに使用するための、請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のベクターあるいは請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
被験体における筋萎縮性側索硬化症の進行を診断またはモニターする方法であって、診断すべき被験体からのサンプル中のミスフォールドまたは凝集ＳＯＤ１の存在を、請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントを用いて判定することを含み、ミスフォールドまたは凝集ＳＯＤ１の存在が、筋萎縮性側索硬化症の指標となり、および生理的ＳＯＤ１二量体のレベルと比較してミスフォールドまたは凝集ＳＯＤ１のレベルの増加が、該被験体における筋萎縮性側索硬化症の進行の指標となる方法。
【請求項１４】
ヒトまたは動物体内のＳＯＤ１の体内検出、または該ＳＯＤ１への治療薬および／もしくは診断薬の標的化に使用するための、請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントであって、好ましくは、該生体内画像診断が、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージングまたは磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）を含む、抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメントによって特異的に認識されるＳＯＤ１のエピトープを有する、１５アミノ酸からなるペプチドであって、請求項１で定義されるアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加されているその修飾配列を含みまたは該配列から成るペプチド。
【請求項１６】
筋萎縮性側索硬化症の進行の診断またはモニタリングに有用なキットであって、請求項１から６もしくは１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体またはそのＳＯＤ１結合フラグメント、請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のベクター、あるいは請求項９に記載の細胞、ならびに／あるいは請求項１５に記載のペプチドを、場合により試薬および／または使用説明書と共に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、スーパーオキシドジスムターゼ１またはＳＯＤ１としても公知のスーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］に特異的に結合する新規分子に関し、特に、ＳＯＤ１タンパク質およびミスフォールド／凝集形態のＳＯＤ１を認識するヒト抗体、それらのフラグメント、誘導体および変異体に関する。加えて、本発明は、血漿およびＣＳＦ中のＳＯＤ１およびミスフォールド／凝集ＳＯＤ１種を同定するための診断ツールとしても価値があり、ルー・ゲーリック病またはシャルコー病としても公知の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などのミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾患を治療するための受動的ワクチン接種戦略においても価値がある、上述の結合分子、抗体およびそれらの模倣物を含む医薬組成物および診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質蓄積、修飾および凝集は、非常に多くの神経変性病の病的態様である。運動ニューロン病としても公知の、神経変性病のサブグループは、運動ニューロンの漸進的変性および死滅を特徴とする。この疾患群の最も一般的なメンバーの１つ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、随意筋の制御に責任を負うニューロン、特に、脊髄、脳幹および運動皮質内の運動ニューロンを攻撃する、急速進行性で例外なく致死性の神経学的疾病である（Ｂｒｕｉｊｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７（２００４），７２３−７４９）。全ＡＬＳ症例の９０から９５パーセントにおける病因が不明であり、明確に関連づけられる危険因子がない（散発性ＡＬＳ、ｓＡＬＳ）。全ＡＬＳ症例の５から１０パーセントのみが遺伝性（家族性ＡＬＳ、ｆＡＬＳ）であり、それらの約２０パーセントは、スーパーオキシドジスムターゼ１またはＳＯＤ１としても公知の、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ−Ｚｎ］酵素を産生する遺伝子の突然変異に起因する（Ｂｒｕｉｊｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７（２００４）、７２３−７４９；Ｖａｌｅｎｔｉｎｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４（２００５）、５６３−５９３；Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．６（２００６）、３７−４６）。
【０００３】
ヒトＳＯＤ１は、３２ｋＤａホモ二量体金属酵素であり、染色体２１上にその遺伝子座があり、主として、サイトゾル、核およびペルオキシソーム内に局在するが、真核細胞のミトコンドリア膜間腔内にも局在する。それは、触媒銅イオンおよび構造亜鉛イオンに結合する活性部位を含有する。ＳＯＤ１の機能的役割は、スーパーオキシドラジカルの二原子酸素および過酸化水素への不均化を触媒し、そのようにしてスーパーオキシドの定常状態濃度および細胞への酸化ストレスを低下させる、抗酸化酵素として作用することである（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１（１９７８）、８７５−８７９）。
【０００４】
ＳＯＤ１タンパク質全体にわたって１００を超える異なる突然変異が公知であり（ｈｔｔｐ：／／ａｌｓｏｄ．ｉｏｐ．ｋｃｌ．ａｃ．ｕｋ／；Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ．Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．Ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．増刊号１（２０００）、Ｓ３１−４２；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ．Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．Ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．２（２００１）、６３−６９；Ｇａｕｄｅｔｔｅら、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ．Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．Ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．１（２０００）、８３−８９）、Ｄ９０Ａ突然変異を除く全てが優性遺伝病の原因となる。突然変異体ＳＯＤ１がどのようにしてＡＬＳをもたらすのかは完全には解明されていない。それぞれの突然変異体ＳＯＤ１−タンパク質の安定性、金属イオン親和性および酵素的活性に様々な影響を及ぼす突然変異もあるが、及ぼさないものもある（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４（２００５）、５６３−５９３；ＶａｌｅｎｔｉｎｅおよびＨａｒｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（２００３）、３６１７−３６２２；Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２、９７５４−９７５９；Ｔａｙｌｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（２００５）、１９９１−１９９５）。しかし、ＳＯＤ１ヌルマウスはＡＬＳを発現しない（Ｒｅａｕｍｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３（１９９６）、４３−４７）という事実と併せてこの疾病の優性遺伝は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１媒介毒性が、前記突然変異に起因する１つ以上の毒性機能の減少によってではなく獲得によって引き起こされることを示唆している。
【０００５】
３つ（Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａ）の公知ヒト突然変異は、トランスジェニックマウスモデルにおいて広範に特性付けされている（ＢｒｕｉｊｎおよびＣｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２２（１９９６）、３７３−８７；Ｇｕｒｎｅｙ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１（１９９４）、１７２１−１７２２；Ｒｉｐｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、６８９−９３；Ｗｏｎｇら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（１９９５）、１１０５−１６）。ヒト突然変異体タンパク質は、内因性マウスＳＯＤ１と等しいレベルまたはそれより数倍高いレベルでユビキタス発現される。野生型ヒトＳＯＤ１の過発現に反して、それらの突然変異型の過剰発現は、動物におけるヒト疾病に類似した病状を伴うＡＬＳの発現につながる。例えば、ＡＬＳ患者からの組織との比較対象となる、変異体ＳＯＤ１の凝集体に富むタンパク質性封入体が、ニューロンおよび星状膠細胞において（Ｓｔｉｅｂｅｒら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１７３（２０００）、５３−６２）神経細胞体沈着物としておよび様々なミトコンドリア区画に付随する高分子複合体として（ＭａｎｆｒｅｄｉおよびＸｕ、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ５（２００５）、７７−８７）、ならびに小胞体内で（Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（２００６）、６０２５−６０３０）発見された。
【０００６】
前記封入体は、ＳＯＤ１を単独で含有しない。これらの追加の、おそらく同様にＡＬＳの原因となる化合物の１つは、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）である。ＴＤＰ−４３をコードする遺伝子（ＴＡＲＤＢＰ）の病原性突然変異が、家族性および散発性ＡＬＳ患者において最近報告されており、ｆＡＬＳ症例の少なくとも３．３％の原因であるようである（Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４（２００６）、１３０−１３３；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．４（２００８）、ｅ１０００１９３）。
【０００７】
ＳＯＤ１は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）患者の脳における酸化障害の主標的であるとさらに報告されている。全ＳＯＤ１レベルが増加され、アミロイド老人斑および神経原線維変化に関連づけられるタンパク質性凝集体がＡＤ脳において発見された（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２００５），１１６４８−１１６５５）。
【０００８】
ＳＯＤ１の凝集につながる正確な機序は分かっていない。しかし、一般的な仮説は、突然変異によって誘導される立体構造変化に起因するタンパク質ミスフォールディングの結果としてのＳＯＤ１の凝集を示唆している（Ｂｒｕｉｊｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（１９９８）、１８５１−１８５４；ＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙおよびＶａｌｅｎｔｉｎｅ、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ．Ｓｉｇｎａｌ  １１（２００９）、１６０３−１６１４；Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（２００６）、７１４８−７１５３；Ｐｒｕｄｅｎｃｉｏら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８（２００９）、３２１７−３２２６；Ｗａｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．６、ｅ１７０（２００８））。ミスフォールド突然変異体またはｗｔＳＯＤ１はグリア細胞によって細胞外環境にも分泌され、そこで運動ニューロンの選択的死滅を誘発し得る（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９（２００６）。１０８−１１８ｆ）。これは、突然変異体ＳＯＤ１毒性の細胞非自律的性質、および最初の症状が発現し次第の病状の急速な進行についての説明となる可能性がある。
【０００９】
既に述べたように、全てのインシデントの９０〜９５パーセントを占める特発型のＡＬＳの原因は解明されていない。しかし、家族性ＡＬＳ型に関する観察に類似して、野生型（ｗｔ）ＳＯＤ１のミスフォールディングが大多数の散在性ＡＬＳ症例に随伴すると考えられてもいる（Ｂｏｓｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３（２０１０）、１３９６−１４０３）。野生型ＳＯＤ１は、大規模な翻訳後修飾、例えばサブユニット二量体化、残基Ｃｙｓ５７とＣｙｓ１４６間のサブユニット間ジスルフィド結合の構築、および銅と亜鉛の配位の対象となる。これらの過程の破壊は全て野生型ＳＯＤ１を凝集させることが証明されており（Ｄｕｒａｚｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００９）、１５９２３−１５９３１；Ｅｓｔｅｖｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（１９９９）、２４９８−２５００；Ｒａｋｈｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２００４）、１５４９９−１５５０４；Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（２００４）、１５８９３−１５８９８）、したがって、特発性ＡＬＳ型の可能性のある発症モデルをもたらすであろう。
【００１０】
突然変異体またはミスフォールドＳＯＤ１を標的にする免疫療法は、家族性ＡＬＳ型の動物モデルにおいて勇気づけられる成果をもたらした。能動免疫は、ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて、運動ニューロン減少を減弱し、ＳＯＤ１レベルを低減させることにより、疾病の発症および死ぬべき運命を遅延させた。その寿命延長は、抗体力価に相関した（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０４（２００７）、２４９５−２５００；Ｃａｓｈｍａｎ、ＮＤＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｕｐｐｓａｌａ  ２００９、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ（２０１０）、１０４４−１０５６）。
【００１１】
受動免疫は、体重減少および後肢反射障害を遅延させ、寿命も延長した（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０４（２００７）、２４９５−２５００；Ｃａｓｈｍａｎ、ＮＤＩ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｕｐｐｓａｌａ  ２００９；Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓ  Ｆｅｔａｌ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２０１０）。
【００１２】
これらの発見は、ＳＯＤ１を標的にする能動免疫療法アプローチに付随する潜在的恩恵を強調している。この高い潜在能力にかかわらず、能動免疫療法はもちろん受動免疫療法についてのアプローチも、特定の治療エンドポイントに向けてのそれらの効力に対して様々な効果を生じさせ得る。ＡＤの前臨床マウスモデルでのまたはヒトでのＡβ指向性アプローチについて証明されているように、それらは、有害事象、例えば、自己免疫病、髄膜脳炎、脳アミロイド血管症増加、および脳溢血の誘導を随伴する場合もある（Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８（２００２）、１３７９；Ｆｕｒｌａｎら、Ｂｒａｉｎ  １２６（２００３）、２８５−２９１；Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  １：２４（２００４）；Ｌｅｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（２００５）、２５６４−８；Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４４（２００７）、９５０−９６０；Ｓｃｈｅｎｋ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（２００２）、８２４−８２８；Ｏｒｇｏｇｏｚｏら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１（２００３）、４６−５４）。これは、大量の細胞外タンパク質沈着を伴わないＡＬＳの状況では然程問題にはならないであろうが、それでもやはり考慮に入れるべきである。
【００１３】
上で述べたことをまとめると、効果的で安全な治療法でミスフォールド／凝集ＳＯＤ１タンパク質に対処する新規治療戦略が、至急必要とされている。
【００１４】
ヒト免疫系によって進化的に最適化され、親和性成熟されるヒト抗体での受動免疫は、効力および安全性が優れている確率が高い、有望な新規治療手段をもたらすであろう。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、天然抗ＳＯＤ１特異的ヒトモノクローナル抗体の単離のために健常ヒト被験体のＳＯＤ１特異的免疫反応を利用する。詳細には、本発明に従って行った実験により、ＡＬＳの徴候のない健常ヒト被験体のプールからのモノクローナルＳＯＤ１特異的抗体の単離に成功した。
【００１６】
したがって、本発明は、ＳＯＤ１を特異的に認識することができるヒト抗体、抗原結合フラグメントおよび類似の抗原結合分子を対象とする。「ＳＯＤ１を特異的に認識する」、「ＳＯＤ１に／に対して特異的な抗体」および「抗ＳＯＤ１抗体」は、天然形態のＳＯＤ１またはミスフォールドもしくは凝集ＳＯＤ１アイソフォームに対する抗体を特異的に、一般的に、および集合的に意味する。完全長、ミスフォールドおよび凝集形態に対して選択的なヒト抗体を本明細書において提供する。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態において、前記ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１に示すように可変領域ＶＨおよび／またはＶＬを特徴とする抗体の免疫学的結合特性を明示する。
【００１８】
抗体の抗原結合フラグメントは、一本鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、または任意の他の抗原結合フラグメントであり得る。下記の特定の実施形態において、前記抗体またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体である。あるいは、前記抗体は、キメラヒト−マウスまたはマウス化抗体であり、後述のマウス化抗体は、動物における診断方法および研究に特に有用である。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明の抗体もしくはその活性フラグメントを含む、またはアゴニストおよび同族分子を含む、または代替的としてそのアンタゴニストを含む組成物に関し、ならびにミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾患、例えばＡＬＳ、の予防、診断または治療においてそのような組成物を使用する免疫治療および免疫診断方法であって、有効量の該組成物を、それを必要としている患者に投与する方法に関する。
【００２０】
必然的に、本発明は、下で定義する異なる独特な特性を有する抗体をそれぞれ産生する不死化ヒトＢ記憶リンパ球およびＢ細胞に及ぶ。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドにも関する。好ましくは、前記可変領域は、図１に示すように可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２２】
したがって、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および該ベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにＳＯＤ１に対して特異的である抗体および等価の結合分子の産生のためのそれらの使用も包含する。抗体およびそれらの模倣物の組み換え産生のための手段および方法、ならびに抗体であってもよいし、なくてもよい競合結合分子についてのスクリーニング方法は、当技術分野において公知である。しかし、本明細書に、特にヒトへの治療適用に関して、記載するように、本発明の抗体は、当該抗体に対する免疫反応であって、そうでなくキメラおよびさらにはヒト化抗体について観察される免疫反応が実質的にないという意味で、ヒト抗体である。
【００２３】
さらに、サンプル中のＳＯＤ１を同定するために使用することができる組成物および方法を本明細書に開示する。開示する抗ＳＯＤ１抗体を使用して、ヒト血液、ＣＳＦおよび尿をサンプル中のＳＯＤ１の存在について、例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイまたは表面適応アッセイ（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄａｐｔｅｄ  ａｓｓａｙ）によりスクリーニングすることができる。本明細書に開示する方法および組成物は、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾患、例えばＡＬＳ診断に役立つことができ、ならびに疾病進行および治療効力をモニターするために使用することができる。
【００２４】
したがって、本発明の特定の目的は、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療、診断または予防するための方法を提供することである。前記方法は、ＳＯＤ１を標的にする抗体である有効濃度のヒト抗体または抗体誘導体を、被験体に投与することを含む。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体によって特異的に認識されるＳＯＤ１のエピトープを有するペプチドを提供する。前記ペプチドは、下の「発明を実施するための形態」および「実施例」において示すようなアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加されているその修飾配列を含む、またはそれらの配列から成る。加えて、本発明は、被験体における筋萎縮性側索硬化症を診断するための方法を提供し、この方法は、該被験体の生体サンプル中の前記ペプチドに結合する抗体の存在を判定する段階を含む。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、後続の説明および実施例からはっきりと理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒト抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（Ａ）、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７（Ｂ）、ＮＩ−２０４．１０Ａ８（Ｃ）、ＮＩ−２０４．９Ｆ６（Ｄ）、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１（Ｅ）、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２（Ｆ）、ＮＩ−２０４．６Ｈ１（Ｇ）、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３（Ｈ）、ＮＩ−２０４．７Ｇ５（Ｉ）、ＮＩ−２０４．７Ｂ３（Ｊ）、ＮＩ−２０４．３４Ａ３（Ｋ）およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３（Ｌ）の可変領域、すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖、のアミノ酸およびヌクレオチド配列。枠組み（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を示し、ＣＤＲに下線を引く。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も示す。クローニング戦略のため、前記重鎖および軽鎖のＮ末端のアミノ酸配列は、ことによるとＦＲ１内にプライマー誘導改変を含有し得るが、該改変は、抗体の生物学的活性に実質的に影響を及ぼさない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、元のクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をデータベース内の該当するヒト生殖細胞系可変領域配列とアライメントし、該可変領域配列に従って調整した；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（英国、ケンブリッジ）により提供されているＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。ＰＣＲプライマーのためにコンセンサス生殖細胞系配列から外れる可能性があると考えられるアミノ酸であって、それ故、該アミノ酸配列内で置換されていると考えられるアミノ酸を太字で示す。
【図２】ヒト組み換え抗体のスーパーオキシドジスムターゼ１結合特異性。（Ａ）ダイレクトＥＬＩＳＡでのヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．１０Ｄ１２の特異的結合。（Ｂ）ダイレクトＥＬＩＳＡでのヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．１２Ｇ７の特異的結合。（Ｃ）ダイレクトＥＬＩＳＡでのヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．１０Ａ８の特異的結合。（Ｄ）ダイレクトＥＬＩＳＡでのヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．９Ｆ６の特異的結合。
【図３】組み換えヒト由来抗ＳＯＤ１抗体のＥＣ５０決定。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートを組み換えヒトＳＯＤ１で被覆し、示されている濃度の組み換えヒト由来抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（●）、ＮＩ−２０４．１０Ａ８（■）、ＮＩ−２０４．９Ｆ６（▲）またはＮＩ−２０４．１２Ｇ７（▼）と共にインキュベートした。抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７は、高親和性で組み換えヒトＳＯＤ１と結合し、それぞれ１０．０ｎＭ、２．７ｎＭおよび０．４ｎＭのＥＣ５０を有する。ＮＩ−２０４．９Ｆ６は、組み換えＳＯＤ１に結合し、１０４．８ｎＭというナノモル範囲内のＥＣ５０を有する。
【図４】立体構造エピトープの形成に好適であるヒトＳＯＤ１の漸増被覆濃度でのＥＣ５０分析。ダイレクトＥＬＩＳＡを使用する漸増被覆濃度（▼３０μｇ／ｍＬ；▲１０μｇ／ｍＬ；■１μｇ／ｍＬ；●０．１μｇ／ｍＬ；組み換えヒトＳＯＤ１の被覆濃度）の組み換えヒトＳＯＤ１に対するヒト抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（Ａ）、ＮＩ−２０４．１０Ａ８（Ｂ）、ＮＩ−２０４−９Ｆ６（Ｃ）およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７（Ｄ）のＥＣ５０決定、ならびにマウスモノクローナル抗体ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１結合親和性（Ｅ）。決定されたＥＣ５０値を下の表（Ｆ）に示す。  ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体（Ａ）およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体（Ｄ）は、ほぼ確実に露出しているもしくは高い被覆濃度で形成されるヒトＳＯＤ１のエピトープ、または組み換えヒトＳＯＤ１の付随するミスフォールドもしくは凝集を優先的に標的にする。ＮＩ−２０４．１０Ａ８（Ｂ）およびＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体（Ｃ）両方は、生理的タンパク質立体構造およびミスフォールド／凝集ＳＯＤ１両方に存在するヒトＳＯＤ１のエピトープを認識する。
【図５】ダイレクトＥＬＩＳＡを用いるスーパーオキシドジスムターゼ１凝集体（■）および生理的二量体（●）に対するＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．９Ｆ６のＥＣ５０決定ならびにＳＯＤ−１  ７２Ｂ１結合親和性。（Ａ）生理的ヒトＳＯＤ１二量体へではなくミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．１０Ｄ１２の高い結合親和性。（Ｂ）ヒト生理的ＳＯＤ１二量体とミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１の両方へのＮＩ−２０４．１０Ａ８の高い結合親和性。（Ｃ）生理的ヒトＳＯＤ１二量体へではなくミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．１２Ｇ７の高い結合親和性。（Ｄ）ミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１への組み換えＮＩ−２０４．９Ｆ６のわずかに優先的な結合。（Ｅ）市販ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１抗体のミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１への優先的結合なし。
【図６】ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０９．９Ｆ６は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスモデルにおいて病的スーパーオキシドジスムターゼ１凝集体を認識する。免疫組織化学分析は、疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ （ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニック動物の脊髄におけるＳＯＤ１病態および／または生理的ＳＯＤ１の、キメラＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体（Ａ）での；ヒトＮＩ−２０４−１０Ａ８抗体（Ｂ）での、ヒトＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体（Ｃ）での、ヒトＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体（Ｄ）でのおよびＥＰＲ１７２６抗ＳＯＤ１抗体（Ｅ）での検出を示す。
【図７】ＮＩ．２０４．１０Ｄ１２は、ペプスキャン分析によって評価すると、ヒトＳＯＤ１の中央ドメインに結合する。抗体結合は、アミノ酸８５−１０７をカバーするペプチドで発生する。したがって、ＮＩ．２０４．１０Ｄ１２結合エピトープは、配列ＤＧＶＡＤＶＳを有するアミノ酸９３−９９（配列番号２）を含む。
【図８】組み換えヒト由来抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２は、野生型ヒト、Ｇ９３Ａヒト突然変異体および野生型マウスＳＯＤ１タンパク質に由来するアミノ酸配列を有するＳＯＤ１合成ペプチドに、同等の親和性で結合する。これらの合成ペプチドは、同定ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２結合エピトープをカバーする。
【図９】疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニック脊髄の免疫組織化学分析。疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ （ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニック動物の脊髄におけるＳＯＤ１病態および／または生理的ＳＯＤ１の、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、５０ｎＭ（Ａ）；ＮＩ−２０４−１２Ｇ７、５ｎＭ（Ｂ）；ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、５ｎＭ（Ｃ）；ＮＩ−２０４．１０Ａ８、５０ｎＭ（Ｄ）；ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、５ｎＭ（Ｅ）；ＮＩ．２０４．６Ｈ１、５ｎＭ（Ｆ）；ＮＩ．２０４．１２Ｇ３、５０ｎＭ（Ｇ）；ＮＩ．２０４．７Ｇ５、５０ｎＭ（Ｈ）；ＮＩ．２０４．２５Ｈ３、５０ｎＭ（Ｉ）；ＮＩ．２０４．３４Ａ３、５０ｎＭ（Ｊ）；ＮＩ．２０４．７Ｂ３、５０ｎＭ（Ｋ）ならびに対照抗体Ｃ４Ｆ６（Ｌ）およびＢ８Ｈ１０（Ｍ）での検出。
【図１０】（Ａ）ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体で受動免疫したＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。ＰＢＳ（●）またはＮＩ−２０４．１０Ｄ１２  ＳＯＤ１特異的抗体（■）のいずれかで脳室内治療したＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。  （Ｂ）ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体での受動免疫に基づくＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスにおける体重減少の減弱。外科的ポンプ埋め込み後に判定した、ベースライン体重の百分率として表した、ＰＢＳ（破断線）またはＮＩ−２０４．１０Ｄ１２  ＳＯＤ１特異的抗体（普通の線）で脳室内治療したＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの体重；＊ｐ＜０．０５。
【図１１】ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体での受動免疫によるＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスにおける握力の向上。外科的ポンプ埋め込み後の、ベースライン握力に対する百分率として表した、ＰＢＳ（破線）またはＮＩ−２０４．１０Ｄ１２  ＳＯＤ１特異的抗体（普通の線）いずれかで脳室内治療したＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの握力；＊ｐ＜０．０５。
【図１２】慢性ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体治療に基づくＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの脊髄における運動ニューロン減少の減弱。ＰＢＳまたはＮＩ−２０４．１０Ｄ１２  ＳＯＤ１特異的抗体いずれかでの脳室内治療したＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスにおける腰部脊髄腹側角における運動ニューロン数。（Ａ）ニッスル染色に基づく運動ニューロン数。データは平均±ＳＥＭを表す。（Ｂ）ＮｅｕＮ染色に基づく運動ニューロン数。データは平均±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
Ｉ．定義
タンパク質蓄積、修飾および凝集は、非常に多くの神経変性病、例えばハンチントン病、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）の病的態様である（Ｔａｙｌｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（２００５）、１９９１−１９９５）。タンパク質のミスフォールディング、凝集および沈殿は、これらの疾病では神経毒性に直接関係しているようである。天然ホモ二量体、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）タンパク質（野生型とＡＬＳ１変異体の両方）は、分子内ジスルフィド結合の不在下または結合した亜鉛イオンの不在下では線維状凝集体を形成する傾向がある。ルー・ゲーリック病またはシャルコー病としても公知の、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの疾患は、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関係づけられる。さらに、前に述べたように、同じくタンパク質のミスフォールディングを誘導し得るＳＯＤ１の酸化修飾がＡＤおよびＰＤにおいて認められており、ＳＯＤ１の凝集は、ＡＤ患者におけるアミロイド班および神経原線維変化と関連づけられ（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２００５）、１１６４８−１１６５５）これは、これらの疾病の病態における可能性のあるＳＯＤ１の役割を含意する。
【００２９】
ＡＬＳの臨床的特徴は、随意筋の制御に責任を負う運動ニューロン、特に、脊髄、脳幹および運動皮質における運動ニューロンの漸進的変性および死滅である。疾病の経過は急速進行性であり、顕著な特徴徴候として漸進的筋肉弱化を伴い、るいそう（萎縮）および捲縮（線維束性収縮）が患者の６０％に発生し、主として呼吸不全により例外なく致死性であり、平均生存期間は３から５年である。
【００３０】
ＡＬＳのほとんどの症例（約９０〜９５％）は、散発性（ｓＡＬＳ）であり、残りは家族性遺伝性（ｆＡＬＳ）である。ｆＡＬＳのおおよそ２０％は、ＳＯＤ１遺伝子の突然変異との遺伝的関連を示す。ＡＬＳの分子機構はほとんどの場合とらえどころがないが、幾つかの研究は、ｓＡＬＳおよびｆＡＬＳ両方の患者において異所性ＳＯＤ１種を見つけることができることを示すデータを提供し、それによりこのＳＯＤ１種を可能性のある共通起源として提案している（Ｇｒｕｚｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（２００７）、１２５２４−１２５２９）。
【００３１】
トランスジェニックＡＬＳマウスモデルにおいて、ＡＬＳ患者からの組織との比較対象となる、突然変異体ＳＯＤ１の凝集体に富むタンパク質性封入体が、ニューロンおよび星状膠細胞において（Ｓｔｉｅｂｅｒら、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１７３（２０００）、５３−６２）神経細胞体沈着物としておよび様々なミトコンドリア区画に付随する高分子複合体として（ＭａｎｆｒｅｄｉおよびＸｕ、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ５（２００５）、７７−８７）、ならびに小胞体内で（Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（２００６）、６０２５−６０３０）発見された。さらに、ミスフォールド突然変異体またはｗｔＳＯＤ１は、グリア細胞によって細胞外環境にも分泌され、そこで運動ニューロンの選択的死滅を誘発し得る（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９（２００６）。１０８−１１８）。これは、突然変異体ＳＯＤ１毒性の観察された細胞非自律的性質、および最初の症状が発現し次第の病状の急速な進行ついての説明となる可能性がある。
【００３２】
用語「ＳＯＤ１」を、ＳＯＤ１の天然単量体または二量体を特異的に指すために同義的に使用する。用語「ＳＯＤ１」を、ＳＯＤ１の他の立体構造異性体、例えばＳＯＤ１のオリゴマーまたは凝集体を一般に識別するためにも使用する。用語「ＳＯＤ１」を、ＳＯＤ１の全てのタイプおよび形態を集合的に指すためにも使用する。
【００３３】
ヒトＳＯＤ１についてのタンパク質配列は、ＭＡＴＫＡＶＣＶＬＫＧＤＧＰＶＱＧＩＩＮＦＥＱＫＥＳＮＧＰＶＫＶＷＧＳＩＫＧＬＴＥＧＬＨＧＦＨＶＨＥＦＧＤＮＴＡＧＣＴＳＡＧＰＨＦＮＰＬＳＲＫＨＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫＤＧＶＡＤＶＳＩＥＤＳＶＩＳＬＳＧＤＨＣＩＩＧＲＴＬＶＶＨＥＫＡＤＤＬＧＫＧＧＮＥＥＳＴＫＴＧＮＡＧＳＲＬＡＣＧＶＩＧＩＡＱ（配列番号１）である。
【００３４】
１５４ａａのＳＯＤ１のアミノ酸配列は、文献および適切なデータベースから検索することができる；例えばＳｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０（１９８３）、５４６５−９；Ｋａｊｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４（１９８８）、８５１−４；ＧｅｎＢａｎｋ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ｌｏｃｕｓ  ＳＯＤＣ＿ＨＵＭＡＮ、アクセッション番号Ｐ００４４１を参照されたい。「野生型」または組み換えヒトＳＯＤ１アミノ酸配列は、配列番号１による上述の配列によって表される。
【００３５】
本明細書に開示するヒト抗ＳＯＤ１抗体は、ＳＯＤ１およびそのエピトープに、ならびにＳＯＤ１の様々な立体構造およびそれらのエピトープに、特異的に結合する。例えば、ＳＯＤ１、完全長ＳＯＤ１および病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に特異的に結合する抗体を本発明において開示する。本明細書で使用する場合、ＳＯＤ１に「特異的に結合する」、「選択的に結合する」または「優先的に結合する」抗体への言及は、他の無関係なタンパク質に結合しない抗体を指す。一例では、本明細書に開示するＳＯＤ１抗体は、ＳＯＤ１またはそのエピトープに結合することができ、および他のタンパク質についてはバックグラウンドの約２倍より高い結合を示さない。ＳＯＤ１立体構造異性体に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」抗体は、ＳＯＤ１の全ての立体構造には結合しない、すなわち、少なくとも１つの他のＳＯＤ１立体構造異性体には結合しない抗体を指す。例えば、体外およびＡＬＳ組織両方においてＳＯＤ１の凝集形態に優先的に結合することができる抗体を本明細書に開示する。本発明のヒト抗ＳＯＤ１抗体は、ＳＯＤ１特異的免疫反応を呈する健常ヒト被験体のプールから単離されたので、それらの抗体が該被験体によって現実に発現されこと、および例えば、ヒト様抗体の提供を試みるための１つの一般的方法のこれまでの代表であったヒト免疫グロブリン発現ファージライブラリー、から単離されたものでないことを強調するために、本発明のＳＯＤ１抗体を「ヒト自己抗体」と呼ぶこともある。
【００３６】
「１つの（ａまたはａｎ」」のものという用語は、１つ以上のそのものを指し、例えば、「１つの抗体」は、１つまたはそれ以上の抗体を示すことを理解されることに留意されたい。また、「１つの（ａ（またはａｎ））」、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で同義的に使用することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」、ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（また、ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、生成物の特定の長さを指さない。したがって、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと同義的に使用され得る。
【００３８】
「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化反応、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断が挙げられるが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後の修飾、または非天然発生的なアミノ酸の修飾からなる生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物起源から派生する、または組み換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含む、任意の方法で生成され得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸の大きさからなり得る。ポリペプチドは、定義された３次元の構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するものではない。定義された３次元の構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと呼ばれ、定義された３次元の構造を有さず、むしろ、多数の異なる構造を取り入れることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。本明細書で使用される糖タンパク質という用語は、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基等のアミノ酸残基の酸素含有もしくは窒素含有の側鎖を介してタンパク質に付加される、少なくとも１つの炭水化物部分と共役するタンパク質を指す。
【００４０】
「単離（された）」ポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体により、その自然環境にはないポリペプチドを意図する。精製の特定の水準は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から除去することができる。組み換えによって生成されたポリペプチドおよび宿主細胞の発現したタンパク質は、任意の適した技法により、分離、断片化、または、部分的に、もしくは実質的には精製されている天然または組み換えポリペプチドである場合、本発明の目的のために単離されていると考えられる。
【００４１】
また、本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらのいずれかの組み合わせをも含む。「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドを指す場合、対応する天然結合分子、抗体、またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも幾つかを保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドのフラグメントは、本明細書の他の部分で論じられる特異抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメント、ならびに欠失フラグメントを含む。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上に記載のフラグメント、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入のため、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。変異体は、自然発生、または非自然発生のものであり得る。非自然発生変異体は、当技術分野において既知の突然変異生成技術を使用して、生成され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。例えば、本発明の抗体および抗体ポリペプチド等のSOD1特異的結合分子の誘導体は、天然ポリペプチドに認められない追加の特性を呈するために変化しているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。また、変異体ポリペプチドは、本明細書において、「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される、結合分子もしくはそのフラグメント、または抗体、または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。また、「誘導体」として、２０の標準アミノ酸からなる１つ以上の自然発生アミノ酸誘導体を含有する、これらのペプチドを含む。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換され得、５−ヒドロキシリジンは、リジンと置換され得、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換され得、ホモセリンは、セリンと置換され得、オルニチンは、リジンと置換され得る。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸、ならびに複数の核酸を包含することを意図し、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）等の単離核酸分子もしくは構築物を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合または非従来的結合（ペプチド核酸（ＰＮＡ）に認められるような、例えば、アミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント等のいずれか１つ以上の核酸セグメントを指す。「単離（された）」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から除去されている、核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有される抗体をコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のためには、単離されることが考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組み換えポリヌクレオチド、または溶液中で（部分的または実質的に）精製されるポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドの生体内または体外ＲＮＡの転写を含む。本発明に従って、単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成される当該の分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネータ等の調節要素であり得る、または含み得る。
【００４３】
本明細書で使用される「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部であると考えられ得るが、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロン等の任意のフランキング配列は、コーディング領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコーディング領域が、例えば、単一ベクター上の単一ポリヌクレオチド構築物、または、例えば、別々の（異なる）ベクター上の別々のポリヌクレオチド構築物に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一コーディング領域を含み得る、または２つ以上のコーディング領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、結合分子、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合される、あるいは融合していない、異種コーディング領域をコードし得る。異種コーディング領域としては、分泌シグナルペプチドまたは異種官能ドメイン等の特殊化した要素またはモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、プロモーターおよび／または１つ以上のコーディング領域と作用可能に連結する他の転写または翻訳調節要素を含み得る。作用可能な連結とは、例えば、ポリペプチド等の遺伝子生成物に対するコーディング領域が、調節配列の影響または制御下で、遺伝子生成物の発現を生じさせる方法において、１つ以上の調節配列に連結することである。２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコーディング領域およびそれに連結するプロモーター等）は、プロモーター機能の導入によって所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡの転写が生じる場合、および２つのＤＮＡフラグメント間の連鎖の性質が、遺伝子生成物の発現を誘導するための発現調節配列の能力を妨げない、または転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作用可能に連結する」又は「作動的に関連する」とされる。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写にもたらすことができる場合、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結する。プロモーターは、所定の細胞においてのみ、ＤＮＡの実質的な転写を誘導する細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーターのほかに、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナル等の他の転写調節要素が、細胞特異的な転写を誘導するために、ポリヌクレオチドと作用可能に連結することができる。適したプロモーターおよび他の転写調節領域を本明細書に開示する。
【００４５】
様々な転写調節領域が、当業者には公知である。これらは、サイトメガロウイルス（イントロンＡと共に、前初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス等）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメント等に限定されない、脊椎動物細胞に作用する、転写調節領域が挙げられるが、これらに限定されない。他の転写調節領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子、ならびに、真核生物細胞において遺伝子発現を制御可能な他の配列から派生するものを含む。追加の適した転写調節領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘発プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導できるプロモーター）を含む。
【００４６】
同様に、様々な翻訳調節要素は、当業者には公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、およびピコナウイルス（特に、内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）から派生する要素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形である、ＲＮＡである。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コーディング領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコーディング領域に連結し、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を誘導し得る。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体にわたる成長タンパク質鎖の輸出が開始されると、成熟タンパク質から開裂されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドは、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドを有し、ポリペプチドの分泌型または「成熟型」を生成するために、完全または「全長」ポリペプチドから開裂されることを承知している。ある実施形態において、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド等の天然シグナルペプチド、または、それと作用可能に連結するポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持するその配列の官能誘導体を使用する。代替として、異種哺乳類シグナルペプチド、またはその官能誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列と置換され得る。
【００４９】
別途記載されない限り、「疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」および「疾病（ｄｉｓｅａｓｅ）」という用語は、本明細書で同義的に使用される。
【００５０】
本発明の文脈で使用されるように、「結合分子」は、主として、抗体、およびそのフラグメントに関するが、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のシャペロン、ならびにカドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチン、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー等の細胞間接着分子が挙げられるが、これらに限定されない、ＳＯＤ１に結合する他の非抗体分子も指し得る。したがって、以下の実施形態のほとんどは、明確にする目的のみのためで、本発明の範囲を限定せず、治療薬および診断用薬の開発のために好ましい結合分子を示す抗体および抗体様分子に関して論じられる。
【００５１】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で同義的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む、ＳＯＤ１結合分子である。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。
【００５２】
下記でより詳細に論じるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる様々な広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者ならば、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロン（γ、μ、α、θ、δ、ε）として分類され、それらのクラスの中で、幾つかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）に分類されることを十分に理解するであろう。本鎖の特質が、抗体の「クラス」を、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定する。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等の免疫グロブリンのサブクラス（イソタイプ）は、よく特徴付けられており、機能的特殊性を与えることが知られている。これらのクラスおよびイソタイプのそれぞれの修飾された形は、本開示を考慮した当業者にはより容易に認識することができるので、それらは本発明の範囲内にある。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の議論は、概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関しては、標準免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２本の同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量約５３，０００〜７０，０００ダルトンの２本の同一の重鎖ポリペプチドを含む。これらの４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」の立体配置で、ジスルフィド結合により連結され、軽鎖は、「Ｙ」の入口で開始し、可変領域を通して継続する重鎖をひとまとめにする。
【００５３】
軽鎖は、カッパあるいはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖あるいはラムダ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般的に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合し、２本の重鎖の「末端」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、あるいは、遺伝子組み換え宿主細胞のいずれかにより産生される場合、ジスルフィド共有結合または非共有結合により互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ立体配置の二股の末端のＮ末端から各鎖の最後のＣ末端まで延びる。
【００５４】
軽鎖および重鎖は共に、構造的および機能的相同性の領域で分けられる。「定常」および「可変」という用語を、機能的に使用する。これに関し、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することは理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合性、補体結合性等の重要な生化学的特性を与える。慣習的に、定常領域ドメインの番号は、抗原結合部位または抗体のアミノ末端から離れるほど大きくなる。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は、定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。
【００５５】
上で示すとおり、可変領域により、抗体は抗原のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、一体となって可変領域を形成し、これは３次元の抗原結合部位を特徴付ける。この抗体の４次元構造は、Ｙの各アームの末端に存在するように抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のそれぞれにある３つのＣＤＲによって特徴付けられる。ＳＯＤ１に特異的結合するのに十分な構造を含む、任意の抗体または免疫グロブリンフラグメントは、本明細書において、「抗原結合性フラグメント」または「免疫特異性フラグメント」として、同義的に示される。
【００５６】
自然発生抗体では、抗体は、各抗原結合ドメインに存在する６つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる）を含む。これは、抗体が水性環境中で３次元立体構造を取る際、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置するアミノ酸の短い不連続の配列である。ＣＤＲは比較的保存された四つの「枠組み領域」または「枠組み」に隣接され、それは分子間変化がより少ない。枠組み領域は、主としてβシート立体構造を採り、ＣＤＲはβシート構造と接続し、時にはβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、枠組み領域は、鎖間の非共有相互作用により、ＣＤＲを正しい配向に配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原のエピトープと相補的な面を確定する。この相補的な面は、抗体がその類似したエピトープと非共有結合することを促進する。ＣＤＲおよび枠組み領域をそれぞれ含むアミノ酸は、正確に定義されているため、当業者により、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域に対して、容易に同定することができる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたく、これらは参照することによりその全体を本明細書に組み込む）。
【００５７】
当技術分野内で使用される、および／または認められる、２つ以上の用語の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、別様に明記されない限り、かかる全ての意味を含むことを意図する。具体的な例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用であり、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で認められる不連続の抗原結合部位を説明する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により記述されており、参照することにより本明細書に組み込まれ、定義には、互いに対して比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それでもなお、抗体、あるいはその変異体のＣＤＲを指すいずれの定義の適用も、本明細書で定義され使用される、用語の範囲内であることを意図する。上に記載のそれぞれの参考文献により定義される、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として、表Ｉに示される。特定のＣＤＲを包含する厳密な残基番号は、ＣＤＲの配列および大きさにより異なるであろう。当業者は、どの残基が抗体の可変領域アミノ酸配列を与えられた、ヒトIgGサブタイプ抗体の特定の超可変領域またはＣＤＲを含むのかを日常的に決定することができる。
【００５８】
【表１】
2018171051.tif 000002
１表I中の全てのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらにより説明される番号付けの取り決めに従う（下記参照）。
【００５９】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列に対する番号方式も定義した。当業者は、その配列自体を超えた任意の実験データに依存することなく、この、任意の可変ドメイン配列への「Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」体系を明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により説明される番号付け体系を指す。別途指定されない限り、本発明のその抗体または抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体の特異的アミノ酸残基配置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）体系に従うものである。但し、それは理論的なものであり、本発明の全ての抗体に対して同等に適用できない場合もあり得る。例えば、一番目のＣＤＲの位置に依存して、続くＣＤＲはいずれかの方向にシフトし得る。
【００６０】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体、または誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類抗体、マウス抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２等のエピトープ結合フラグメント、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬあるいはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される抗体への抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、免疫グロブリン分子のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスからなり得る。
【００６１】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＭでも、５価構造を有するその誘導体でもない。特に、本発明の特定の用途、特に治療上の使用において、ＩｇＭは、それらの５価構造によるＩｇＭおよび親和性成熟の欠失が、多くの場合、非特異的交差反応および非常に遅い親和性を示すため、ＩｇＧ、他の２価抗体、または対応する結合分子よりも有用ではない。
【００６２】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体ではない。すなわち、血漿免疫グロブリンサンプルから得られる抗体の混合物ではなく、実質的煮特定の１種類の抗体から構成される。
【００６３】
一本鎖抗体を含む抗体フラグメントは、単独で、または、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせて、可変領域を含み得る。また、本発明において、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有する可変領域の任意の組み合わせを含むＳＯＤ１結合フラグメントも含む。本発明の抗体またはその免疫特異性フラグメントは、鳥類および哺乳類を含む、任意の動物起源からであり得る。好ましくは、該抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施形態において、該可変領域は、軟骨魚綱（例えば、サメから）由来であり得る。
【００６４】
一態様において、本発明の抗体は、ヒトから単離されたヒトモノクローナル抗体である。場合により、ヒト抗体の枠組み領域をデータベース内の該当するヒト生殖細胞系可変領域配列とアライメントし、該可変領域配列に従って採用する；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（英国、ケンブリッジ）により提供されているＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照されたい。例えば、真の生殖細胞系配列から外れている可能性があると考えられるアミノ酸は、クローニング工程中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得る。ファージ提示抗体ライブラリーまたは異種マウスからの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）などの人工的に生成されたヒト様抗体と比較して、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代用動物のものではなくヒト免疫反応を用いて得られることを特徴とし、すなわち、本抗体は、ヒト体内でその適切な立体構造の天然ＳＯＤ１に反応して生成され、（ｉｉ）その個体を保護したことを特徴とし、またはＳＯＤ１の存在のために少なくとも有意であり、および（ｉｉｉ）本抗体はヒト起源のものであるので、自己抗原に対する交差反応の危険が最小限であることを特徴とする。したがって、本発明による用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」および「ヒト抗体」等は、ヒト起源のものであるＳＯＤ１結合分子、すなわち、ヒト細胞、例えばＢ細胞もしくはそのハイブリドーマ、から単離された、またはヒト細胞、例えばヒト記憶Ｂ細胞、のｍＲＮＡから直接クローニングされたｃＤＮＡから単離されたＳＯＤ１結合分子を示すために用いられる。ヒト抗体は、アミノ酸置換が該抗体内で例えば結合特性を向上させるためになされていたとしても、やはり「ヒト」である。
【００６５】
ヒト免疫グロブリンライブラリーに由来する抗体、または下に記載するおよび例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらにより米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されたような、１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物であって、内因性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体を、本発明の真のヒト抗体と区別するためにヒト様抗体と示す。
【００６６】
例えば、ファージディスプレイから概して単離される合成および半合成抗体などのヒト様抗体の重鎖および軽鎖の対合は、それが元のヒトＢ細胞中に存在したときの元の対合を必ずしも表さない。したがって、先行技術分野で一般に使用されているような組み換え発現ライブラリーから得られるＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメントは、免疫原性および安定性に対する可能性のある関連効果全てに関して人工的であると見なすことができる。
【００６７】
対照的に、本発明は、選択されたヒト被験体から単離された親和性成熟抗体であって、それらの治療上の有用性および人間におけるそれらの寛容性を特徴とする抗体を提供する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲと、マウス抗体配列に基づくアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含有するヒト枠組み領域とを含む抗体を指す。前記ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンを「親」または「アクセプター」と呼び、前記枠組み変化をもたらすマウス抗体を「ドナー」と呼ぶ。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、それらは、通常、マウス抗体定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一である。それ故、一部の実施形態において、完全長マウス化ヒト重または軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域と、ヒトＣＤＲと、多数の「マウス化」アミノ酸置換を有する実質的ヒト枠組みとを含有する。典型的に、「マウス化抗体」は、マウス化可変軽鎖および／またはマウス化可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えばキメラ抗体の可変領域全体が非マウスであるので、典型的キメラ抗体を包含しない。「マウス化」工程によって「マウス化」された修飾抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、通常、親抗体と比較してマウスにおける免疫原性が低い。
【００６９】
本明細書で使用される「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖から派生するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、その変異体またはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明で用いる結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で用いる結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたはその一部）が欠失し得る。上記で説明される、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、アミノ酸配列に関して、自然発生する免疫グロブリン分子と異なるように、修飾され得ることを当業者により理解されるであろう。
【００７０】
本明細書に開示される、ある抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体において、マルチマーの１本のポリペプチド鎖の重鎖部分は、該マルチマーの第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分に同一である。代替として、本発明の重鎖部分含有モノマーは、同一ではない。例えば、各モノマーは、例えば、異なる標的結合部位を含み得、二重特異性抗体を形成する。
【００７１】
別の実施形態において、本明細書に開示する抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、１本のポリペプチド鎖で構成され、例えばｓｃＦｖであり、ならびに可能性のある生体内治療および診断適用のために細胞内で発現されることとなる（細胞内抗体）。
【００７２】
本明細書に開示される、診断および治療方法で用いる結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子から派生され得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子から派生するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子から派生するヒンジ領域を含み得る。別の例においては、重鎖部分は、一部において、ＩｇＧ１分子から派生するヒンジ領域、および一部において、ＩｇＧ３分子から派生するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部において、ＩｇＧ１分子から派生するキメラヒンジ領域、および一部において、ＩｇＧ４分子から派生するキメラヒンジ領域を含むことができる。
【００７３】
本明細書で使用される「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖から派生するアミノ酸配列を含む。好ましくは、該軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００７４】
抗体のためのペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小の大きさは、約４〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも９個、最も好ましくは、少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。ＣＤＲが、その三級形態において、抗原ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるため、エピトープを含むアミノ酸は、隣接する必要がなく、場合によっては、同じペプチド鎖上でなくてもよい。本発明において、本発明の抗体により認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５〜３０個のＳＯＤ１の連続または不連続アミノ酸の配列を含む。
【００７５】
本明細書で同義的に使用される「特異的に結合する」、または「特異的に認識する」により、結合分子、例えば、抗体は、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間で幾つかの相補性を引き起こすことを一般的に意味する。本定義によれば、無作為な非関連エピトープに結合するよりもさらに容易に、その抗原結合ドメインを介して、そのエピトープに結合する場合、抗体は、エピトープに「特異的に結合する」とされる。「特異性」という用語は、本明細書では、ある抗体があるエピトープに結合する相対的親和性を示す。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると考えられる、または抗体「Ａ」は、関連したエピトープ「Ｄ」に対して有するものよりも高い特異性があるエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【００７６】
存在する場合、その全ての文法形式での用語「免疫学的結合特性」または抗原との抗体の他の結合特性は、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を指す。
【００７７】
「選択的に結合する」とは、結合分子、例えば、抗体は、関連した、類似の、同種、または相似エピトープに結合するよりもさらに容易に、一つのエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、このような抗体が関連したエピトープと交差反応し得るとしても、関連したエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
【００７８】
非限定の例のために、結合分子、例えば、抗体は、第１のエピトープに、第２のエピトープの抗体のＫＤより少ない解離定数（ＫＤ）で結合する場合、選択的に、該第１のエピトープに結合すると考えられ得る。別の非限定の例において、抗体は、第１のエピトープに、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤより少なくとも１桁分少ないＫＤの親和性で結合する場合、選択的に、第１の抗原に結合すると考えられ得る。別の非限定の例において、抗体は、第１のエピトープに、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤより少なくとも２桁分少ないＫＤの親和性で結合する場合、選択的に、第１のエピトープに結合すると考えられ得る。
【００７９】
別の非限定の例において、結合分子、例えば、抗体は、第１のエピトープを第２のエピトープの抗体のＫ（オフ）より少ないオフ率（ｋ（オフ））で結合する場合、選択的に、第１のエピトープに結合すると考えられ得る。別の非限定の例において、抗体は、第１のエピトープに、その抗体の第２のエピトープに対するＫ（オフ）より少なくとも１桁分少ないＫ（オフ）の親和性で結合する場合、選択的に、第１のエピトープに結合すると考えられ得る。別の非限定の例において、抗体は、第１のエピトープに、その抗体の第２のエピトープに対するＫ（オフ）より少なくとも２桁分少ないＫ（オフ）の親和性で結合する場合、選択的に、第１のエピトープに結合すると考えられ得る。
【００８０】
結合分子、例えば、本明細書に開示された抗体もしくは抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体は、本明細書に開示されるＳＯＤ１またはそのフラグメントもしくは変異体に、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１以下のオフ率（ｋ（オフ））で結合すると言える。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示されたＳＯＤ１、またはそのフラグメントもしくは変異体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、もしくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１もしくは１０−７秒−１以下のオフ率（ｋ（オフ））で結合すると言える。
【００８１】
結合分子、例えば、本明細書に開示された抗体もしくは抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体は、本明細書に開示されたＳＯＤ１またはそのフラグメントもしくは変異体に、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン率（ｋ（オン））で結合すると言える。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示されたSOD1、またはそのフラグメントもしくは変異体に、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１もしくは１０７Ｍ−１秒−１以上のオン率（ｋ（オン））で結合すると言える。
【００８２】
結合分子、例えば、抗体は、ある程度まで、そのエピトープへの参照抗体の結合を遮断するほど、選択的にそのエピトープに結合する場合、参照抗体を所与のエピトープに結合することを競合的に阻害すると言われる。競合阻害は、当技術分野において任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより判定され得る。抗体は、参照抗体を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、所与のエピトープに結合することを競合的に阻害すると言うことができる。
【００８３】
本明細書で使用される「親和性」という用語は、個々のエピトープを結合分子、例えば、免疫グロブリン分子のＣＤＲで結合する強度の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、２７〜２８頁を参照されたい。本明細書で使用される「親和力」という用語は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の総合安定性、つまり、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的な混合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照されたい。親和力は、特異的エピトープを有する集団における個々の免疫グロブリン分子の親和性、また、免疫グロブリンと抗原の結合価の両方に関連する。例えば、ポリマー等の２価のモノクローナル抗体と、高度に反復しているエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高親和力の１つである。抗原に対する抗体の親和性または親和力は、任意の適した方法を用いて実験により決定することができる；例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ （１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載の方法を参照されたい。抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および表面プラズモン共鳴が挙げられる。特定の抗体−抗原相互作用の測定親和性は、異なる条件、例えば塩濃度、ｐＨのもとで測定すると変動し得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは、抗体および抗原の標準溶液、ならびに標準緩衝液を用いて行う。
【００８４】
本発明の結合分子、例えば、抗体もしくは抗原結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して説明される、または指定され得る。本明細書で使用される「交差反応性」という用語は、１つの抗原に対して特異的な抗体の、第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原物質の間での関連性の尺度を指す。したがって、抗体は、その形成を誘発するもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応性がある。交差反応性エピトープは、一般に、誘発するエピトープと、多くの同一の相補的構造上の特色を含み、場合によっては、原型よりもよく実際に適合し得る。
【００８５】
例えば、ある抗体は、関連するが、同一でないエピトープ、例えば、参照エピトープに対して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当技術分野において公知の方法を使用して算出され、本明細書に記載されるような）を有するエピトープに結合するという点において、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当技術分野において公知の方法を使用して算出され、本明細書に記載されるような）を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性がほとんどない、または交差反応性がないと言われ得る。抗体は、あるエピトープに対して、そのエピトープのいずれの他の類似体、オーソログ、またはホモログにも結合しない場合、「高度に特異的」と判断され得る。
【００８６】
結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体はまた、ＳＯＤ１へのそれらの結合親和性において、記載される、または特定され得る。好ましい結合親和性は、解離定数またはＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍを有するものを含む。
【００８７】
前に表されるように、サブユニット構造および様々な免疫グロブリンのクラスの定常領域の３次元構造は、公知である。本明細書で使用される「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（ほとんどのアミノ末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域へのアミノ末端である。
【００８８】
本明細書で使用される「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキーム（２４４〜３６０の残基、Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）体系、および２３１〜３４０の残基、ＥＵ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）体系）を使用して、抗体の約２４４〜３６０の残基から延在する重鎖分子部分を含む。前掲書中のＫａｂａｔ ＥＡらを参照されたい。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接して対にならないという点において、独特である。むしろ、２つのＮ結合型分枝炭水化物鎖を、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置く。また、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に延在し、約１０８の残基を含むことも文書で十分に立証される。
【００８９】
本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。本ヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、順応性がある故に、２つのＮ末端抗原結合領域を単独で移動させることが可能である。ヒンジ領域は、３つの異なるドメイン、すなわち上部、中間、および下方ヒンジドメインに再分割することができる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）：４０８３−４０９０）。
【００９０】
本明細書で使用される「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成する、または第２のチオール基で架橋することができる、チオール基を含む。ほとんどの自然発生するＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合により連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）体系（２２６位または２２９位、ＥＵ番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）体系）を使用して、２３９位および２４２位に対応する、２つのジスルフィド結合により連結される。
【００９１】
本明細書で使用される「連結される」、「融合される」、または「融合」は、同義的に使用される。これらの用語は、化学的結合を含む、いかなる手段または組み換え手段による、２つ以上の要素または成分の結合をも指す。「インフレームの融合」とは、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持するように、連続したより長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の結合を指す。したがって、組み換え融合タンパク質は、（セグメントは、本来は、通常、そのように結合しない）元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する、２つ以上のセグメントを含む、単一タンパク質である。本リーディングフレームは、このようにして、融合されたセグメントを通して連続するようにされるが、本セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列により、物理的に、または空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合され得るが、「融合した」ＣＤＲが、連続ポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリン枠組み領域、または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離し得る。
【００９２】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子が、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド等の生化学物質を生成する過程を指す。本過程は、遺伝子ノックダウン、ならびに、一時的発現および安定発現の両方が挙げられるが、これらに限定されない、細胞内での、遺伝子の機能的存在の任意の発現を含む。それは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはいずれの他のＲＮＡ生成物への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのこのようなｍＲＮＡの翻訳を含むが、これらに限定されない。最終の所望の生成物が生化学物質である場合、発現は、その生化学および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子生成物」を生成する。本明細書で使用される遺伝子生成物は、例えば、遺伝子の転写により生成されるメッセンジャーＲＮＡ等の核酸、あるいは転写から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子生成物は、例えば、ポリアデニル化等の転写後修飾した核酸、または、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質のサブユニットとの関連、タンパク質分解的切断等の転写後修飾したポリペプチドをさらに含む。
【００９３】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、被験体または患者から得た任意の生体材料を指す。一態様において、サンプルは、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）または尿を含み得る。他の態様において、サンプルは、全血、血漿、血液サンプルから濃縮されたＢ細胞、および培養細胞（例えば、被験体からのＢ細胞）を含み得る。サンプルとしては、生検材料、または神経組織をはじめとする組織サンプルも挙げることができる。さらに他の態様において、サンプルは、全細胞および／または細胞の溶解産物を含み得る。当技術分野において公知の方法によって血液サンプルを採集することができる。一態様では、２００μＬ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ＩＸ  Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤、ならびにＩＸ  Ｓｉｇｍａホスファターゼ阻害剤１および２）中、４℃でボルテックスすることによって、ペレットを再懸濁させることができる。その懸濁液を間欠的にボルテックスしながら２０分間氷上で保持することができる。１５，０００ｘｇで５分間、約４℃での回転後、上清のアリコートを約−７０℃で保存することができる。
【００９４】
本明細書で使用される「治療（処置）する」または「治療（処置）」という用語は、治療的処置および予防的もしくは再発防止の両方を指し、その目的は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進展等の望ましくない生理学的変化または疾患を予防する、または遅延する（軽減する）ことである。有益な、または所望の臨床結果は、検出可能または検出できないにかかわらず、症状の緩和、疾病の範囲の縮小、疾病の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾病の進行の遅延もしくは緩徐化、疾病状態の改善もしくは緩和、および鎮静（部分的または完全な）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合の予想される生存と比較して、生存期間の延長を意味することができる。治療を必要とする者は、状態もしくは疾患に既に罹患する者、ならびに、状態もしくは疾患を有する傾向がある者、または状態もしくは疾患の発現を予防している者を含む。
【００９５】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」、または「哺乳類」は、任意の対象、特に、哺乳類の対象、例えば、診断、予後、予防、または治療が望ましいヒト患者を意味する。
【００９６】
ＩＩ．抗体
本発明は、実施例において例証する抗体について略述するような免疫学的結合特性および／または生物学的特性を好ましくは明示するヒト抗ＳＯＤ１抗体およびそれらの抗原結合フラグメントに一般に関する。本発明に従って、ＳＯＤ１に対して特異的なヒトモノクローナル抗体を健常ヒト被験体のプールからクローニングした。
【００９７】
本発明に従って行った実験過程で、ヒト記憶Ｂ細胞培養物の調整培地中の抗体を、組み換えまたはミスフォールド／凝集ＳＯＤ１タンパク質への結合およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への結合について並行してスクリーニングした。組み換えまたはミスフォールド／凝集ＳＯＤ１については陽性だったがＢＳＡについては陽性でなかったＢ細胞培養物のみを抗体クローニングに付した。第二のスクリーニングラウンドでも、凝集ＳＯＤ１について陽性であったＢ細胞培養物を抗体クローニングに付した。
【００９８】
特異的抗体に単離する最初の試みは、血漿中の循環ＳＯＤ１抗体のレベル上昇を示唆する、ＳＯＤ１への高い血漿結合活性を有する健常ヒト被験体のプールに焦点を合わせた。意外にもこれらの試みはＳＯＤ１特異的ヒト記憶Ｂ細胞の産生に失敗したので、高いＳＯＤ１血漿反応性について予備選択されていないまたはＳＯＤ１に対して低い血漿反応性を有した健常ヒト被験体のプールから本発明に記載の抗体を単離した。
【００９９】
この措置のために、幾つかの抗体を単離することができた。選択された抗体をクラスおよび軽鎖サブクラス決定のためにさらに分析した。その後、記憶Ｂ細胞培養物からの選択された適切な抗体メッセージをＲＴ−ＰＣＲによって転写し、クローニングし、組み合わせて組み換え産生用の発現ベクターにする；添付の実施例を参照されたい。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞におけるヒト抗体の組み換え発現、その後の、ヒト組み換えＳＯＤ１に対する該ヒト抗体の結合特異性についての特性付け（図２および３）およびそれらの病的ミスフォールド／凝集形態への該ヒト抗体の示唆的結合についての特性付け（図４から図６）により、ＳＯＤ１に対して高特異的であり、病的ミスフォールド／凝集形態のＳＯＤ１タンパク質を示唆的に認識するヒト抗体が初めてクローニングされたことを確認した。第二の実験ラウンドにより、図９に示すように上の発見を確認した。本発明の抗体の結合親和性に関する情報をまとめてある表ＩＩＩも参照されたい。
【０１００】
したがって、本発明は、一般に、単離された自然発生ヒトモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体ならびにその結合フラグメント、誘導体および変異体に関する。本発明の一実施形態において、本抗体は、完全長組み換えＳＯＤ１および／または病的ミスフォールド／凝集形態の組み換えＳＯＤ１に（図４および実施例２参照）、生理的ＳＯＤ１二量体の凝集体に（図５および実施例３参照）ならびに生体内でＳＯＤ１凝集体に（図６および実施例４参照）特異的に結合することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、ＳＯＤ１のＣ末端に特異的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、ＳＯＤ１のＮ末端に特異的に結合する。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＳＯＤ１の中央ドメインに特異的に結合する（実施例５、および要約については表ＩＶを参照されたい）。
【０１０１】
一実施形態において、本発明は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３から成る群より選択される参照抗体と同じＳＯＤ１エピトープに特異的に結合する抗ＳＯＤ１抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を対象とする。エピトープマッピングにより、ａａ９３−９９ＤＧＶＡＤＶＳ（配列番号２）を含むヒトＳＯＤ１の微小管結合ドメイン内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２によって認識される独特な線状エピトープとして同定された。エピトープマッピングにより、本発明の抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８によって認識されるエピトープが局在しているａａ１０−６０を含むＳＯＤ１  Ｎ末端ドメイン内の配列が同定された。さらなるマッピングにより、本発明の抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８によって認識されるエピトープが、ａａ９−５５  ＬＫＧＤＧＰＶＱＧＩＩＮＦＥＱＫＥＳＮＧＰＶＫＶＷＧＳＩＫＧＬＴＥＧＬＨＧＦＨＶＨＥＦＧＤＮＴ（配列番号５２）を含む配列に限定された。実施例５および実施例５の表ＩＶに詳細に記載するように、本発明の以下の抗体のエピトープもマッピングした。それらは以下のものを含むＳＯＤ１配列内に局在する：抗体ＮＩ−２０４．１２Ｇ７についてはａａ７３−８３  ＧＧＰＫＤＥＥＲＨＶＧ（配列番号５１）；抗体ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１についてはａａ１１３−１１９  ＩＩＧＲＴＬＶ（配列番号５３）；抗体ＮＩ−２０４．６Ｈ１についてはａａ８５−９５  ＬＧＮＶＴＡＤＫＤＧＶ（配列番号５４）；抗体ＮＩ−２０４．１２Ｇ３についてはａａ１２１−１３５  ＨＥＫＡＤＤＬＧＫＧＧＮＥＥＳ（配列番号５５）；抗体ＮＩ−２０４．７Ｇ５についてはａａ１０１−１０７  ＥＤＳＶＩＳＬ（配列番号５６）；抗体ＮＩ−２０４．７Ｂ３についてはａａ１３７−１４３  ＫＴＧＮＡＧＳ（配列番号５７）；抗体ＮＩ−２０４．３４Ａ３についてはａａ８５−９５  ＬＧＮＶＴＡＤＫＤＧＶ（配列番号５８）；および抗体ＮＩ−２０４．２５Ｈ３についてはａａ７３−７９  ＧＧＰＫＤＥＥ（配列番号５９）。
【０１０２】
最も有利なこととして、本発明の抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２によって認識されるエピトープは、他の種、例えばマウスおよびラットにおいても高度に保存され、抗体を用いるそれぞれの動物モデルでの追加の研究ツールに本発明の抗体を備えさせることができる。さらに、初期の実験的観察に拘束されることを意図しないが、実施例４で実証し、図６に示すように、本発明のヒトモノクローナルＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗ＳＯＤ１抗体は、好ましいことに、病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に特異的に結合することおよび脊髄組織における生理的形態のＳＯＤ１を実質的に認識しないことを特徴とする。それ故、本発明は、結合特異性を有する、したがって、診断および治療のために特に有用である１セットのヒトＳＯＤ１抗体を提供する。本発明の結合特異性についてのさらなる詳細および概要についての図９および表ＩＩＩも参照されたい。
【０１０３】
一実施形態において、本発明の抗体は、実施例に記載するような例示的ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体の結合特性を呈する。加えて、または代替として、本発明のＳＯＤ１抗体は、詳細には実施例３および実施例４に従って分析したとき、生理的ＳＯＤ１二量体ではなく病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１を優先的に認識する。加えて、または代替として、本発明の抗ＳＯＤ１抗体は、ヒトＳＯＤ１の病因性突然変異体、特に、実施例４に記載するものに結合する。本文脈での結合特異性は、例示的ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体について図３、それぞれ図４に示すような範囲であり得、すなわち、約１０ｐＭから１００ｎＭの半最大有効濃度（ＥＣ５０）、最も好ましくは、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１０Ａ８について示すように野生型ＳＯＤ１に対して約１００ｐＭから１０ｎＭのＥＣ５０、またはＮＩ−２０４．１２Ｇ７について示すように野生型ＳＯＤ１に対して約１０ｐＭから１ｎＭのＥＣ５０を有する。加えてまたは代替として、前記結合特異性は、本発明の例示的抗体について実施例８および実施例８の表ＩＩＩに示すような範囲であり得、すなわち、野生型（組み換え）ＳＯＤ１に対して、ＮＩ−２０４．７Ｇ５およびＮＩ−２０４．７Ｂ３について示すように約１０ｐＭから１００ｎＭの半最大有効濃度（ＥＣ５０）、最も好ましくは約１００ｐＭから７５ｎＭのＥＣ５０；ＮＩ−２０４．６Ｈ１およびＮＩ−２０４．３４Ａ３について示すように約１０ｐＭから１００ ｎＭの、最も好ましくは約１００ｐＭから１０ｎＭのＥＣ５０；またはＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３について示すように約１００ｐＭから１０ｎＭの、最も好ましくは約１０ ｐＭから１ｎＭのＥＣ５０を有する。
【０１０４】
一部の精製抗体は、多彩な生体分子、例えばタンパク質に結合する。当業者には理解されるように、特異的なという用語を、本明細書では、ＳＯＤ−１タンパク質またはそのフラグメントより他の生体分子のほうが、抗原結合分子、例えば、本発明の抗体の１つ、に有意に結合しないことを示すために使用する。好ましくは、ＳＯＤ−１以外の生体分子への結合レベルは、結果として、ＳＯＤ−１への親和性の、それぞれ、多くとも２０％以下に過ぎない、１０％以下、５％以下に過ぎない、２％以下に過ぎないまたは１％以下に過ぎない（すなわち、少なくとも５、１０、２０、５０または１００倍低い）結合親和性となる。
【０１０５】
それ故、好ましくは、本発明の抗ＳＯＤ１抗体は、実施例３でダイレクトＥＬＩＳＡにより例示するように、および実施例４で説明する免疫組織化学的染色により脊髄に関して例示するように、病的形態のＳＯＤ１、例えば、病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に優先的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗ＳＯＤ１抗体は、実施例２および実施例３でダイレクトＥＬＩＳＡにより例示するように、組み換えＳＯＤ１と病的ミスフォールド／凝集形態のＳＯＤ１両方に優先的に結合する。
【０１０６】
前に述べたように、ＳＯＤ１凝集体はまた、ＡＤ患者のアミロイド老人斑および神経原線維変化に付随して見つけることができる。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、アルツハイマー病の治療に有用であり得る。
【０１０７】
本発明は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３から成る群より選択される抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体に関する。
【０１０８】
本発明は、幾つかのそのような結合分子、例えば、抗体およびその結合フラグメントであって、それらの可変領域、例えば結合ドメインに、図１に図示するアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨおよび／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴し得る結合分子をさらに例示する。上で特定した可変領域をコードする、対応するヌクレオチド配列を、下の表ＩＩに示す。ＶＨおよび／またはＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的セットを図１に図示する。しかし、以下で論ずるように、当業者は、加えてまたは代替として、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合、それらのアミノ酸配列が図１に示すものと１個、２個、３個またはさらにそれ以上のアミノ酸の点で異なるＣＤＲを使用できるということを十分に承知している。
【０１０９】
一実施形態において、本発明の抗体は、図１に図示するようなＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞中に存在したときと同種の重鎖−軽鎖対合の保存を特徴とする。あるいは、本発明の抗体は、図１に図示するようなＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つとＳＯＤ１への結合について競合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、誘導体もしくは変異体である。それらの抗体は、特に治療適用のために、ヒト抗体であってもよい。あるいは、前記抗体は、マウス、マウス化およびキメラマウス−ヒト抗体であり、これらは動物における診断方法および研究に特に有用である。
【０１１０】
一実施形態では、培養される単一またはオリゴクローナルＢ細胞の培養物と該Ｂ細胞によって産生された抗体を含有する該培養物の上清とを、それらの中の抗ＳＯＤ１抗体の存在および親和性についてスクリーニングすることにより、本発明の抗体を提供する。前記スクリーニング工程は、国際公開第ＷＯ２００４／０９５０３１号パンフレット（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているものなどの、感受性組織アミロイド班免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイ段階；国際公開第ＷＯ２００８／０８１００８号パンフレットに記載されているものなどの、脳および脊髄切片での凝集ＳＯＤ１への結合についてのスクリーニング段階；配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＳＯＤ１に由来するペプチドの結合についてスクリーニングする段階；配列番号１によって表されるアミノ酸配列の組み換えヒトＳＯＤ１の結合についてスクリーニングする段階；配列番号１によって表されるアミノ酸配列の生理的ＳＯＤ１二量体の凝集体の結合についてスクリーニングする段階、および結合が検出される抗体または該抗体を産生する細胞を単離する段階を含む。
【０１１１】
上で述べたように、ヒト免疫反応に基づいて産生されるため、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の病態に関連したものであるエピトープであって、例えばマウスモノクローナル抗体の産生のための免疫工程の場合およびファージディスプレイライブラリーの体外スクリーニングの場合には、それぞれ、利用できないまたは免疫原性が低いであろうエピトープを認識することとなる。したがって、本発明のヒト抗ＳＯＤ１抗体のエピトープが独特であり、本発明のヒトモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合し得る他の抗体が存在しないことを明記することは賢明である；抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２の独特なエピトープを示す図７、ならびに抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３の独特なエピトープを示す表ＩＶも参照されたい。
【０１１２】
したがって、本発明は、一般に、ＳＯＤ１への特異的結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＳＯＤ１抗体およびＳＯＤ１結合分子にも及ぶ。より具体的には、本発明は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３から成る群より選択される参照抗体と同じＳＯＤ１エピトープに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を対象とする。
【０１１３】
抗体間の競合は、試験下で免疫グロブリンがＳＯＤ１などの共通抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって判定される。非常に多くのタイプの競合的結合アッセイが公知である、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３）、２４２−２５３参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４−３６１９およびＣｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６（１９９０）、５４６−５５２参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照）、Ｉ１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７−１５およびＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．参照）。３２（１９９０），７７−８２．典型的に、このようなアッセイは、固体表面に結合された精製ＳＯＤ１またはその凝集体、またはこれらのいずれかを保有する細胞と、標識されていない試験免疫グロブリンと、標識された参照免疫グロブリン、すなわち本発明のヒトモノクローナル抗体との使用を伴う。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で前記固体表面または細胞に結合した標識の量を判定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。好ましくは、書き添える実施例においてＥＬＩＳＡアッセイについて説明するような条件下で競合的結合アッセイを行う。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および発生する立体障害のために参照抗体が結合するエピトープに十分近位の隣接抗体に結合する抗体が挙げられる。通常、競合抗体が過剰に存在すると、それは、共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０％または７５％阻害するであろう。それ故、本発明は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３から成る群より選択される参照抗体がＳＯＤ１に結合するのを競合的に阻害する抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体にさらに関する。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的には免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる、または免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離ポリペプチドを提供し、重鎖可変領域のうちの少なくとも１つのＶＨ−ＣＤＲ、または重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書に開示された抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示された抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によると、本発明の重鎖可変領域は、図１に示される群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、Ｋａｂａｔシステムにより定義されるＶＨ−ＣＤＲを示す一方、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムにより定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた、本発明に含み、図１に提示されるデータを使用して、当業者により容易に同定され得る。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、図１に示される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群に同一である、ポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的には免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる、または免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離ポリペプチドを提供する。
【０１１６】
別の実施形態において、本発明は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除いて、図１に示される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群に同一である、ポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、本質的には免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる、または免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的には免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる、または免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離ポリペプチドを提供し、軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つのＶＬ−ＣＤＲ、または軽鎖可変領域のうちの少なくとも２つのＶＬ−ＣＤＲは、本明細書に開示された抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示された抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態に従い、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチドに関連してＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１は、Ｋａｂａｔシステムにより定義されるＶＬ−ＣＤＲを示す一方、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムにより定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた、本発明に含む。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、図１に示される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３群に同一である、ポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的には免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる、または免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離ポリペプチドを提供する。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおいて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換を除いて、図１に示される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３群に同一である、ポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む、本質的には免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる、または免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。
【０１２０】
免疫グロブリンまたはそのコードするｃＤＮＡは、さらに修飾され得る。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ−フラグメント、二重特異的抗体、融合抗体、標識化抗体、またはそれらのうちのいずれか１つの類似体を生成するためのステップのうちのいずれか１つを含む。対応する方法は、当業者には公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載される。該抗体の誘導体は、ファージ提示法により得られる場合、ＢＩＡｃｏｒｅシステムに利用される、表面プラズモン共鳴は、本明細書に記載の抗体のうちのいずれか１つのファージ抗体と同一のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、国際公開第ＷＯ８９／０９６２２号に記載される。ヒト化抗体の産生方法は、例えば、欧州特許第ＥＰ−Ａ１ ０ ２３９ ４００号および国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号に記載される。本発明に従って、利用される抗体のさらなる起源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体等の異種抗体の産生のための一般的原理は、例えば、国際公開第ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９４／０２６０２号、第ＷＯ９６／３４０９６号、および第ＷＯ９６／３３７３５号に記載される。上記に論じられるように、本発明の抗体は、様々な型に存在し、完全抗体のほかに、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２を含む、ならびに一本鎖を含み得る。例えば、国際公開第ＷＯ８８／０９３４４号を参照されたい。
【０１２１】
本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当技術分野において既知の従来の技法を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組み換え、および／または単独、あるいは組み合わせのいずれかで、当術分野において既知のいずれの他の修飾を使用することにより、さらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列におけるこのような修飾を導入する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照されたい。本発明の抗体の修飾は、１つ以上の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的誘導体化を含み、例えば、側鎖修飾、骨格修飾、ならびにＮおよびＣ末端修飾、例えば、アセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、および炭水化物または脂質部分、共同因子等の付着を含む。同様に、本発明は、記載の抗体またはカルボキシル末端での免疫刺激リガンド等の異種分子に融合されたアミノ末端での幾つかのそのフラグメントを含む、キメラタンパク質の産生を包含する。例えば、対応する技術的詳細に関しては、国際公開第ＷＯ００／３０６８０号を参照されたい。
【０１２２】
さらに、本発明は、上に記載される、結合分子を含むもの、例えば、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、抗原抗体相互作用において、さらに高い変動率、および優勢な関与を有する領域であることが、しばしば、観察されているため、言及された抗体、特に、重鎖のＣＤＲ３のうちのいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域を含む、小ペプチドを包含する。このようなペプチドは、本発明に従って、有用な結合剤を生成するための組み換え手段により、容易に合成される、または生成され得る。このような方法は、当業者には公知である。ペプチドは、例えば、市販の自動ペプチドシンセサイザーを使用して、合成することができる。ペプチドは、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を発現ベクターに変えてペプチドを産生することにより、組み換え技術によって、産生することができる。
【０１２３】
それ故、本発明は、本発明のヒト抗ＳＯＤ１抗体に指向され、言及した特性を提示する、すなわちＳＯＤ１を特異的に認識する任意の結合分子、例えば抗体またはその結合フラグメントに関する。このような抗体および結合分子を、本明細書に記載のＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学によってそれらの結合特異性および親和性について試験することができる。例えば実施例を参照されたい。前記抗体および結合分子のこれらの特性をウエスタンブロットによって試験することもできる。本発明に従って行ったその後の実験の予備的結果により、本発明の抗体のヒト抗ＳＯＤ１抗体、特に抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７は、ヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ１を過発現するトランスジェニックマウスにおいてＳＯＤ１病態に別様に結合することが明らかになった。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７は、後角でより前角ならびに白質の前および後柱でのほうが見つけられる頻度が高い、ヒト筋萎縮性側索硬化症の際に見られるものに類似した神経フィラメントに富むスフェロイドにおいて、および神経フィラメントに富む封入体で満たされた肥厚ジストロフィー性神経突起において、病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１への強い結合指向性を示す。抗体の優先的結合は、スーパーオキシドジスムターゼ１の異常凝集体から主として成る、細胞内分散封入体、レヴィー小体様封入体および細胞外凝集体内でも観察され得る；実施例４および図６を参照されたい。これらの実験（実施例４および図９参照）の反復により、上述の評価が裏付けられ、本発明のさらなる抗体の結合特異性についての予備発見が拡大される。上記所見に従って、本発明の抗体は、ＡＬＳモデルマウスの腰部脊髄における異なるＳＯＤ１病態パターンを明らかにすることができる。特に、抗体ＮＩ−２０４−１２Ｇ７ならびにさらに抗体ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ．２０４．６Ｈ１、ＮＩ．２０４．１２Ｇ３、ＮＩ．２０４．２５Ｈ３、ＮＩ．２０４．３４Ａ３およびＮＩ．２０４．７Ｂ３は、細胞質ＳＯＤ１封入体（主として運動ニューロンにおけるもの）および細胞外ＳＯＤ１凝集体を含むＳＯＤ１病態の可視化のために本発明に従って使用することができる。動物組織中の病的形態のＳＯＤ１に対するこの結合特異性により、本明細書（実施例３および８参照）に示す生化学実験に加えて、脳内でのミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の出現を随伴する疾病の治療および診断における本発明の抗体の有用性が強調される。
【０１２４】
抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８は、上で説明した実験においてヒト生理的ＳＯＤ１二量体およびミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１への同等の結合親和性を示した。しかし、実験の部（実施例８）で詳細に示すように、抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８での反復実験は、生理的ＳＯＤ１および凝集ＳＯＤ１に対する結合親和性の有意な減少も示した。これらの発見は、前記抗体の保存感受性を示すように思われ、少なくとも一部は、この保存感受性が、２０ｎＭ、実施例３において算出するとそれぞれ３０ｎＭから、表ＩＩＩに示すように両方の形態のＳＯＤ１について１００ｎＭを超えるまでの生理的ＳＯＤ１立体構造とミスフォールド／凝集ＳＯＤ１立体構造両方について観察される親和性変化の原因であるだろう。
【０１２５】
この態様での一実施形態において、本発明は、温度および／または保存非感受性抗体であって、長期保存期間にわたっておよび／または非生理的温度、すなわち４℃未満の温度への曝露、特に約−８０℃から−２０℃での保存の後にそれらの結合能力を少なくとも大部分保持する抗体を提供する。さらに、一実施形態において、本発明は、長期保存後に改良された結合親和性および／または親和性を示す、温度および／または保存感受性である抗体をさらに提供する。本明細書で言及するこの親和性変化を、生理的ＳＯＤ−１タンパク質およびそれぞれのミスフォールド／凝集ＳＯＤ−１タンパク質の識別的結合から非識別的結合への変化と定義する。
【０１２６】
予備的染色結果について、図９に示す全ての抗体は、適切な抗体濃度を用いると、細胞内分散封入体、びまん性細胞質構造および空胞構造の染色を示す。参照抗体Ｂ８Ｈ１０との比較対象となるより大きな凝集体の染色（図９Ｍ）により、本発明の抗体は２群に分けられる：抗体ＮＩ２０４−１２Ｇ７、ＮＩ２０４−１１Ｆ１１、ＮＩ２０４−６Ｈ１、ＮＩ２０４−１２Ｇ３、ＮＩ２０４−７Ｇ５、ＮＩ２０４−２５Ｈ３、ＮＩ２０４−３４Ａ３およびＮＩ２０４−７Ｂ３（図９Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ およびＫ）は、脊髄腹側角におけるこれらの凝集体を染色し、これに対してＮＩ２０４−１０Ｄ１２、ＮＩ２０４−１０Ａ８およびＮＩ２０４−６７Ｅ１２（図９Ａ、Ｄおよび Ｅ）は、これらの構造を染色せず、可溶性ミスフォールド形態の突然変異体ヒトＳＯＤ１に対して特異的である参照抗体Ｃ４Ｆ６（図９Ｌ）に類似している（Ｂｏｓｃｏら、２０１０、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３（１１）；１３９６−１４０３）。加えて、抗体ＮＩ２０４−１０Ｄ１２、ＮＩ２０４−６Ｈ１およびＮＩ２０４−７Ｇ５は、脊髄背側角切片における膠様質のびまん性染色を示す。
【０１２７】
Ｂ細胞またはＢ記憶細胞の培養から直接免疫グロブリンを得るための代替手段として、細胞を、その後の発現および／または遺伝子操作に対して、再配列された重鎖および軽鎖遺伝子座の起源として使用することができる。再配列された抗体遺伝子を適切なｍＲＮＡから逆転写し、ｃＤＮＡを産生することができる。必要に応じて、重鎖定常領域は、異なるイソタイプの重鎖定常領域と交換する、または共に除去することができる。該可変領域は、一本鎖Ｆｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を連結し、利用することができる、１つ以上の標的またはキメラ重鎖および軽鎖の組み合わせに結合能力を与えることができる。遺伝物質が利用可能となると、所望の標的に結合する能力を共に保有する上に記載の類似体の設計は容易である。抗体可変領域のクローニング方法、および組み換え抗体の産生方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７（１９９６），１−２０、Ｄｏｅｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１（１９９７），１７８７−１７９２に記載される。
【０１２８】
一旦、適切な遺伝物質を得、必要に応じて、類似体をコードするために修飾されると、最小限に、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするものを含むコード配列を、標準組み換え宿主細胞にトランスフェクトすることができるベクター上に含まれる、発現系に挿入することができる。このような様々な宿主細胞を使用し得るが、効率的過程のためには、哺乳類細胞が好ましい。本目的のために有用な典型的な哺乳類細胞株としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
抗体または類似体の産生は、その後、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適切な培養状態下で、修飾された組み換え宿主を培養することにより行われる。抗体は、その後、培養物からそれらを単離することにより回復される。発現系は、得られる抗体を培地中に分泌されるが、細胞内産生も可能であるように、シグナルペプチドを含むように設計されることが好ましい。
【０１３０】
上記に従って、本発明はまた、本発明の抗原または結合分子をコードするポリヌクレオチドに関し、該抗体の場合、好ましくは、上に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域である。典型的には、ポリヌクレオチドによりコードされる該可変領域は、該抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１３１】
当業者は、上に記載の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインを、他のポリペプチドまたは所望の特異性および生物学的機能の抗体の構築物のために使用することができることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上に記載の可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、有利に、添付の実施例に記載される、抗体と同一または類似の結合特性を実質的に有する、ポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、結合親和性が、ＣＤＲ内または超可変環状内でアミノ酸置換を作製することにより増進し得ることを理解しており（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２  （１９８８），  ３２３−３２７）、それは、Ｋａｂａｔに定義されるように、ＣＤＲで部分的に重複する。したがって、本発明はまた、抗体に関し、１つ以上の記述されたＣＤＲは、１つ以上のアミノ酸置換、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖のうちの１つまたは両方において、図１に記載されるように、可変領域の２つまたは全て３つのＣＤＲを含む。
【０１３２】
結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当業者に公知のように、１つ以上のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、相補体のＣ１成分の抗体定常領域への結合は、相補体系を活性化し得る。相補体の活性化は、細胞の病原体のオプソニン化および溶解において重要である。相補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏性にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上におけるＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して、様々な細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、抗体の異なるクラスに対して特異的である、多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上で抗体のＦｃ受容体への結合は、多くの重要かつ様々な生物学的反応を誘発し、それには、抗体被覆された粒子の巻き込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞により抗体被覆された標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、またはＡＤＣＣと称する）、炎症性メディエータの放出、免疫グロブリン産生の胎盤通過および制御が含まれる。
【０１３３】
従って、本発明のある実施形態は、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、１つ以上の定常領域ドメインのうちの少なくとも一部分は、ほぼ同一の免疫原性の全不変抗体と比較する場合、低減されたエフェクター機能、非共有結合的に二量化する能力、ＳＯＤ１凝集および蓄積の部位で特定するための増大する能力、血中半減期の低減、もしくは増大する血中半減期等の所望の生化学的性質を提供するために、削除される、またはそれ以外の方法で改変される。例えば、本明細書に記載される、診断および治療方法で用いる、ある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠失する、ドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、修飾抗体の定常領域の１つの全ドメインを欠失する、例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたはその一部を欠失する。他の実施形態において、本明細書に記載される診断および治療方法で用いる、ある抗体は、定常領域、例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域を有し、グリコシル化を排除するために改変され、本明細書の他の部分にアグリコシル化抗体または「アグリ」抗体と言われる。このような「アグリ」抗体は、酵素的に、ならびに、定常領域において、合意のグリコシル化部位を改変することにより調製され得る。理論により結合されないが、「アグリ」抗体は、生体内で改善された安全かつ安定性のあるプロファイルを有し得ると考えられている。アグリコシル化抗体を産生し、所望のエフェクター機能を有する方法は、例えば、国際公開第ＷＯ２００５／０１８５７２号に認められ、その全体において参照することにより組み込まれる。
【０１３４】
本明細書に記載される、ある抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体において、当技術分野において既知の技術を使用して、Ｆｃ部分を変異させ、エフェクター機能を削減され得る。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段によって）は、循環する修飾抗体の結合するＦｃ受容体を削減し、それにより、ＳＯＤ１局在を増大する。他の場合において、本発明と一致する定常領域修飾は、相補体結合を緩和し、ひいては、血中半減期および共役された細胞毒素の非特異性の関連性を削減し得る。定常領域のさらに別の修飾は、増大する抗原特異性または抗体柔軟性のため、局在化の強化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾するために使用され得る。得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、およびＳＯＤ１局在、生体内分布、ならびに血中半減期等の修飾の他の生化学的影響は、過度な実験を行うことなく、公知の免疫学的技法を使用して、容易に測定および定量化され得る。
【０１３５】
本明細書に記載するある抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体では、Ｆｃ部分を突然変異させて、または代替タンパク質配列に交換して、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰもしくはＴｈｙ１受容体による抗体の受容体媒介エンドサイトーシスを増進することにより、または抗体を生細胞に該細胞を害することなくシャトルすることを可能にすると言われている「スーパー抗体技術（Ｓｕｐｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），２３７−２４１）により、抗体の細胞取り込み量を増加させることができる。例えば、抗体結合領域と、細胞表面受容体の同族タンパク質リガンドとの、または細胞表面受容体ばかりでなくＳＯＤ１にも結合する特異的配列を有する二重もしくは多重特異性抗体との融合タンパク質の産生を、当技術分野において公知の技術を用いて巧みに実行することができる。本明細書に記載する一定の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体では、Ｆｃ部分を突然変異させるもしくは代替タンパク質配列に交換することができ、または該抗体を、その血液脳関門透過を増加させるように化学的に修飾することができる。
【０１３６】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の修飾型は、当技術分野において既知の技法を使用して、全前駆体または親抗体から作製され得る。例示的な技法は、本明細書でさらに詳細に論じられる。  本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を、当技術分野において既知の技法を使用して、作製または製造することができる。ある実施形態において、抗体分子またはそのフラグメントは、「組み換え技術によって産生された」、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子またはそのフラグメントを作製する例示的な技法は、本明細書の他の部分でさらに詳細に論じられる。
【０１３７】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体はまた、修飾される、例えば、共有結合は、抗体がその類似したエピトープに特異的に結合することを阻止しないように、抗体への任意の型の分子の共有結合による誘導体も含む。例えば、限定されないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化反応、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等により修飾される、抗体を含む。任意の多数の化学修飾を、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が挙げられるが、これらに限定されない、公知の技法により実施することができる。さらに、本誘導体は、１つ以上の非古典的なアミノ酸を含み得る。
【０１３８】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、処置される動物、例えば、ヒトにおける、有害免疫反応を引き出さない。ある実施形態において、結合分子、例えば、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、患者、例えば、ヒト患者から派生し、有害免疫反応の発生を緩和する、または最小化する、例えば、ヒトから派生する同一の種に実質的に使用される。
【０１３９】
脱免疫化をもまた、抗体の免疫原性を低減するために使用することができる。本明細書で使用される「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するために、抗体の改変を含む（例えば、国際公開第ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、第ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照されたい）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析し、それぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の重要な残基に関してエピトープの配置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を変化させる危険性が低い、代替的アミノ酸置換を同定するために、分析される。一連の代替的ＶＨおよびＶＬ配列は、アミノ酸置換の組み合わせを含み、設計され、これらの配列は、本明細書に開示された診断および治療方法で用いる、一連の結合ポリペプチド、例えば、ＳＯＤ１特異的抗体、またはその免疫特異性フラグメントに実質的に組み込まれ、それらは、その後、機能に対する試験をする。典型的には、１２個から２４個の変異抗体を生成し、試験する。修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む、完全な重鎖および軽鎖遺伝子は、その後、発現ベクターにクローンされ、次のプラスミドを全抗体の産生のために細胞株に導入した。該抗体は、その後、適切な生化学的および生物学的アッセイで比較され、最適変異体を同定する。
【０１４０】
モノクローナル抗体を当技術分野において既知の広範な技法を使用して調製することができ、それらの技法には、ハイブリドーマ、組み換え、ファージ提示法、またはそれらの組み合わせの使用が含まれる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に教示されているものを含む、ハイブリドーマ技法を使用して産生することができる（該参考文献は、その全体において、参照することにより組み込まれる）。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、それを産生する方法でなく、任意の真核性、原核生物、またはファージクローンを含む、単一クローンから派生する抗体を指す。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体を、当技術分野において既知の広範な技法を使用して、調製することができる。ある実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載されるように、エプスタイン・バー・ウイルスでの転換を介して不死化されているヒトＢ細胞から派生される。
【０１４１】
公知のハイブリドーマ過程（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））において、哺乳類からの比較的短命、または致命的なリンパ球、例えば、本明細書に記載される、ヒト対象から派生されるＢ細胞が、不死腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）で融合され、したがって、ハイブリッド細胞、または「ハイブリドーマ」を産生し、それらは共に、不死であり、Ｂ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生することができる。得られるハイブリッドを、選択、希釈、および単一抗体の形成のための特異的遺伝子を含む、それぞれの個々の株で再生により、単一の遺伝子株に分離される。これらは、抗体を産生し、所望の抗原に対して同種であり、その純粋な遺伝起源（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｒｅｎｔａｇｅ）に関して「モノクローナル抗体」と呼ばれる。
【０１４２】
そのようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない、親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む、適した培養培地中に播種および培養する。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞株、および培地が、多くの供給元から市販され、標準化プロトコルが確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、所望の抗原に対してモノクローナル抗体の産生のために分析される。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、本明細書に記載される、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ネオエピトープ結合法等の体外検定により決定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、希釈過程を限定することによりサブクローン化し、標準方法により増殖され得る（例えばＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、もしくは親和性クロマトグラフィー等の従来の精製手順により、培養培地、腹水、もしくは血清から分離され得ることをさらに理解されよう。
【０１４３】
別の実施形態において、リンパ球は、マイクロマニピュレーションにより選択すし、可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫がある、または免疫が生まれつきある、例えば、ヒト等の哺乳類から単離し、約７日間体外で培養することができる。培養物は、審査基準に合う特定のＩｇＧに対してスクリーニングされる。陽性ウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳにより、または補体媒介溶血プラークアッセイにおいて、それらを同定することにより、単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、１つの管にマイクロマニピュレーションすることができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０１４４】
代替として、抗体産生細胞株は、熟練者に公知の技法を使用して、選択および培養され得る。このような技法は、様々な実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載される。この点において、以下に記載されるように、本発明で用いる適した技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載され、それは、その全体において参照することにより本明細書に組み込まれ、それには、付録物を含む。
【０１４５】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを公知の技術によって産生することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換え産生することができ、または酵素、例えば（Ｆａｂフラグメントを産生するために）パパインもしくは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシン、を使用して免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断により生産することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。このようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分を放射性同位体などの検出試薬に結合することを含む免疫診断手順での使用に十分なものである。
【０１４６】
本明細書に記載するものなどのヒト抗体は、ヒト患者での治療目的使用に特に望ましい。本発明のヒト抗体は、健常ヒト被験体であって、彼らの年齢のため、神経変性疾患、例えばＡＬＳを発現する危険があると推測され得る被験体から、または前記疾患を有する患者であるが、疾病経過が異常に安定しているまたは異常に軽度な疾病形態である患者から単離される。しかし、老人の健常で無症状の被験体は、それぞれに、若年被験体より規則的に抗ＳＯＤ１防御抗体を発現するであろうと予想するのが賢明だが、本発明のヒト抗体を得るための源として若年被験体もまた使用することがある。これは、家族型のＡＬＳの発現する素因を有するが、高齢の成人より効率的に免疫系が機能するので無症状のままである若年患者に特に当てはまる。
【０１４７】
一実施形態において、本発明の抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象抗体に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的抗体分子をここで説明する。
【０１４８】
本発明の抗体は、抗体の合成のための当技術分野において既知の任意の方法、特に、化学合成により、または好ましくは、本明細書に記載される、組み換え発現技法により、産生することができる。
【０１４９】
一実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、合成定常領域を含み、１つ以上のドメインは、部分的に、または完全に欠失される（「ドメイン欠失抗体」）。ある実施形態において、適合する修飾抗体は、ドメイン欠失された構築物または変異体を含み、完全ＣＨ２ドメインは除去されている（ΔＣＨ２構築物）。他の実施形態に関して、短い連結ペプチドは、欠失ドメインと置換され、可変領域に対して運動の柔軟性および自由度を提供し得る。当業者は、このような構築物が、抗体の異化作用率におけるＣＨ２ドメインの調節特性の故、特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して、派生することができる（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号および第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照されたい）。本ベクターを改変し、ＣＨ２ドメインを欠失し、ドメインを欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供する。
【０１５０】
ある実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ミニ抗体である。ミニ抗体は、当技術分野に記載の方法を使用して生成することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際公開第ＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照されたい）。
【０１５１】
一実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、単量体サブユニット間での関連を可能にする限り、数個のアミノ酸またはただ１個のアミノ酸だけの、欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択されたエリアにおける単一アミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低減するのに十分であり、それにより、ＳＯＤ１局在を増大し得る。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、相補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷のままにする一方、抗体の選択された特性（血中半減期）を改善し得る。さらに、上記で触れたように、開示された抗体の定常領域は、得られる構築物のプロファイルを強化する１つ以上のアミノ酸の変異または置換を通じて合成され得る。この点において、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）により提供される活性を阻害し、修飾抗体の立体構造および免疫原性プロファイルを実質的に維持することが可能であり得る。さらに別の実施形態は、エフェクター機能等の望ましい特性を強化するために、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含み、または、さらに細胞毒素または炭水化物の付着を提供する。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインから派生する特定配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。
【０１５２】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、本質的にはそれらからなる、またはそれらからなる、抗体を提供し、抗体またはそれらのフラグメントは、ＳＯＤ１に免疫特異的に結合する。アミノ酸置換を生じる部位特異的な突然変異生成およびＰＣＲ媒介突然変異生成が挙げられるが、これらに限定されない当業者に既知の標準技法を、抗体をコードするヌクレオチド配列において、変異体を導入するために使用することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３に関して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷がある側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の電荷がある側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。代替として、変異体を、例えば、飽和突然変異生成等によって、コード配列の全て、またはその一部に沿って無作為に導入し、結果として得られた変異体は、生物学的活性に対してスクリーニングされ、活性（例えば、ＳＯＤ１に結合する能力）を維持する変異体を同定することができる。
【０１５３】
例えば、抗体分子の枠組み領域においてのみ、またはＣＤＲ領域においてのみ、変異を導入することは可能である。導入された変異は、例えば、抗原を結合するための抗体の能力に影響がない、またはほとんどない、サイレントまたは中性ミスセンス変異であり得、実際には、幾つかのこのような変異は、どんなものであれ、アミノ酸配列を変化しない。変異のこれらの型は、コドン使用頻度を最適化する、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。本発明の抗体をコードするコドン向けに最適化されたコーディング領域は、本明細書の別の場所に開示される。代替として、非中性のミスセンス変異は、抗原を結合する抗体の能力を変化し得る。ほとんどのサイレントおよび中性ミスセンス変異体の局在は、枠組み領域内であり得るが、ほとんどの非中性ミスセンス変異の局在は、絶対条件ではないが、ＣＤＲ内であり得る。当業者は、抗原結合活性において変化なし、または結合活性において変化あり（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変更）等の所望の特性を有する、変異分子を設計し、試験することができるであろう。突然変異生成に続き、コードされたタンパク質は、定期的に発現され得、コードされたタンパク質（例えば、ＳＯＤ１の少なくとも１つのエピトープを免疫特異的に結合する能力）の機能的および／または生物学的活性は、本明細書に記載の技法を使用して、または当技術分野において既知の定期的に修飾する技法により、決定することができる。
【０１５４】
ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得、それらは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはさらに典型的には、二本鎖もしくは一本鎖と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含む、ハイブリッド分子からなり得る。加えて、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む、三本鎖領域からなり得る。抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性もしくは他の理由のために修飾された、１つ以上の修飾塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシン等の異常塩基を含む。様々な修飾を、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができるので、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された型を包含する。
【０１５５】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）から派生するポリペプチドの非自然的変異体をコードする単離ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することにより、生成することができる。変異は、部位特異的な突然変異生成およびＰＣＲ媒介突然変異生成等の標準技法により導入され得る。好ましくは、保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０１５６】
公知のとおり、ＲＮＡは、元のＢ細胞、あるいは、他の形質転換された細胞から、グアニジンイソチオシアネート抽出法および遠心分離またはクロマトグラフィーに続く調製法等の標準技法によって単離され得る。望ましい場合、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロース上におけるクロマトグラフィー等の標準技法により総ＲＮＡから単離され得る。適した技法は、当技術分野においては熟知されている。一実施形態において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、公知の方法に従って、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時、あるいは別々のいずれかで行われ得る。ＰＣＲは、公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡ、ならびにアミノ酸配列に基づいて、合意定常領域プライマーまたはさらに特異的なプライマーにより開始され得る。上で論じられるように、ＰＣＲも、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合において、ライブラリーは、合意プライマーまたはマウス定常領域プローブ等のさらに大きい相同プローブによりスクリーニングされ得る。
【０１５７】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当技術分野において既知の技法を使用して、細胞から単離され、例えば、組み換えＤＮＡ法に関する前述の参照において、詳しく記載される標準の公知の技法に従って、制限地図および配列され得る。当然のことながら、ＤＮＡは、単離過程またはその後の分析中、任意の点で、本発明に従って合成され得る。
【０１５８】
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的には免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸からなる、または免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸からなる単離ポリヌクレオチドを提供し、重鎖可変領域のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、または重鎖可変領域のうちの少なくとも２つのＶＨ−ＣＤＲは、本明細書に開示された抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示された抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によると、本発明の重鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関してＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、本質的には免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸からなる、または免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸からなる単離ポリヌクレオチドを提供し、軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つのＶＬ−ＣＤＲ、または軽鎖可変領域のうちの少なくとも２つのＶＬ−ＣＤＲは、本明細書に開示された抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示された抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態に従い、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関してＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明は、図１に示される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３群に同一である、ポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、本質的にはそれらからなる、またはそれらからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１６１】
当技術分野において既知のとおり、２つのポリペプチドもしくは２つのポリヌクレオチドの間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドのアミノ酸もしくは核酸配列を、第２のポリペプチドもしくポリヌクレオチドの配列と比較することにより決定される。本明細書で論じられる場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドに少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるか否かは、例えば、（それに限定されないが）ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）等、当技術分野において既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して、決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局在相同アルゴリズムを使用し、２つの配列の間で相同の最良のセグメントを見つける。特定の配列が、例えば、本発明に従って、参照配列に９５％同一であるか否かを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の別の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然ながら、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列におけるアミノ酸の総数の最大５％の相同性における格差が許容されるように、パラメータを設定する。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示すような抗ＳＯＤ１抗体のＶＨまたはＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む、該核酸から本質的に成る、または該核酸から成る。この点において、前記軽および／または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが、両方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードすることもあり、または一方だけの免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードすることもあることは、当業者には容易に理解されるであろう。
表ＩＩ：ＳＯＤ１特異的抗体のＶＨおよびＶＬ領域のヌクレオチド配列。
【０１６３】
【表２−１】
2018171051.tif 000003
【０１６４】
【表２−２】
2018171051.tif 000004
【０１６５】
【表２−３】
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【０１６６】
【表２−４】
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【０１６７】
【表２−５】
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【０１６８】
【表２−６】
2018171051.tif 000008
【０１６９】
本発明はまた、他の部分で記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントも含む。さらに、本明細書に記載されるように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により考慮される。
【０１７０】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において任意の方法により産生または製造され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるもの）から構成され得、それらは、簡潔に述べると、抗体をコードする、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリング、およびライゲーションする配列の一部を含む、重複するオリゴヌクレオチドの合成、その後、ＰＣＲによりライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅に関与する。
【０１７１】
代替として、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適した源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを入手することができないが、抗体分子の配列が分かっている場合、抗体をコードする核酸は、３’および５’末端の配列にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅により、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、クローニングすることにより、適したソース（例えば、抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞等のＳＯＤ１特異抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から生成された抗体ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、あるいはそこから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から化学的に合成される、または得られ得る。ＰＣＲにより生成された増幅核酸は、その後、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１７２】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のために当技術分野において公知の方法、例えば、組み換えＤＮＡ技法、部位特異的な突然変異生成、ＰＣＲ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載の技法であり、それらは、それらの全体において、本明細書に参照することにより共に組み込まれる）を使用して、操作され得、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するように、例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を行う。
【０１７３】
ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を提供するために単離遺伝物質を操作した後、抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量の抗体を産生するために使用され得る宿主細胞に導入するために発現ベクターに挿入される。抗体もしくはそのフラグメント、誘導体、または類似体の組み換え発現、例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖または軽鎖を、本明細書に記載した。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはその一部（好ましくは、重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する）が得られた後、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野において公知の技法を使用して、組み換えＤＮＡ技術により産生され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法を本明細書に記載する。当業者に公知の方法を使用して、配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルをコードする抗体を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、体外組み換えＤＮＡ技法、合成技法、および生体内遺伝子組み換えが挙げられる。本発明は、したがって、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロモーターに作動可能に連結される、重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号、国際公開第ＷＯ８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインを、重鎖または軽鎖全ての発現に対するこのようなベクターにクローンし得る。
【０１７４】
本明細書に使用される「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明に従って、宿主細胞における所望の遺伝子に導入し、発現する賦形剤として使用されるベクターを意味する。当業者に既知のとおり、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、適切な制限部位を含み、所望の遺伝子のクローニング、および真核生物または原核生物細胞中に侵入する、および／または複製する能力を促進する。本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を利用し得る。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスから派生するＤＮＡ要素を利用する。他のベクターは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡを染色体に統合する細胞は、導入宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、バイオサイド耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属への耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子を、発現するようにＤＮＡ配列に直接結合、または同時形質転換により同一の細胞への導入かのいずれかを行うことができる。追加の要素もまた、ｍＲＮＡの最適合成に必要とされ得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
【０１７５】
特に好ましい実施形態において、クローン可変領域遺伝子を、上で論じられたた重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）と共に、発現ベクターに挿入する。一実施形態において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号に開示）と称される、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の専用発現ベクターを使用して達成される。本ベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびリーダー配列を含有する。本ベクターは、可変および定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、次いで、培地およびメトトレキサート増幅を含有するＧ４１８において選択すると、抗体の非常に高いレベルの発現を生じることが認められている。当然ながら、真核生物細胞における発現を引き出すことが可能な任意の発現ベクターを、本発明において使用し得る。適したベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから市販、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、免疫グロブリンが重鎖および軽鎖である場合、適切に高レベルを発現する多数の形質転換細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットシステムにより実行することができる、日常的な実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号に教示されるが、これらのそれぞれは、その全体において、本明細書に参照することにより組み込まれる。本系は、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日等の、高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０１７６】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１ Ａ１号に開示されるもの等のポリシストロニック構築物を使用して、発現され得、その特許はその全体において、本明細書に組み込まれる。これらの発現系において、抗体の重鎖および軽鎖等の関心対象となる多数の遺伝子生成物を、単一のポリシストロニック構築物から産生し得る。これらの系は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用し、抗体の比較的高いレベルを提供する。適合するＩＲＥＳ配列は、本明細書にも組み込まれる米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。当業者は、このような発現系を使用し、本願に開示される全ての抗体を効果的に産生し得ることを理解するであろう。
【０１７７】
さらに一般的には、抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターを、適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に公知の様々な技法により達成することができる。これらは、リポトランスフェクション（例えばFufene（登録商標）又はリポフェクタミンを用いる）を含むトランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを使った細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷のウイルスによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入は標準的なリン酸カルシウム共沈降法によってなされる。発現構築物を内部に持つ宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で増殖され、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成に対して分析される。例示的なアッセイ技法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等を含む。
【０１７８】
発現ベクターは、従来の技法により宿主細胞に導入され、トランスフェクト細胞は、その後、従来の技法により培養され、本明細書に記載の方法で用いるための、抗体を産生する。したがって、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、または異種プロモーターに作動可能に連結される、その重鎖もしくは軽鎖を含む。二重鎖抗体の発現のために好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖を共にコードするベクターは、下記の詳細のように、全免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞において、共発現され得る。
【０１７９】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターである、ポリペプチドを派生した重鎖をコードする第１のベクター、およびポリペプチドを派生した軽鎖をコードする第２のベクターを用いて同時形質導入し得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同じ発現を可能にする、同一選択可能なマーカーを含有し得る。代替として、重鎖および軽鎖ポリペプチドの双方をコードし得る単一ベクターを使用することができる。このような状況において、軽鎖は、過度の毒性のない重鎖を避けるために重鎖の前に有利に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１８０】
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ技法を使用し、少なくとも１つの異種遺伝子をコードし、構築されたベクターを内部に持つ細胞を指す。組み換え宿主からの抗体の単離のための過程の記述において、「細胞」および「細胞培養」という用語は、同義的に使用され、別途明らかに特定されない限り、抗体の起源を意味する。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、沈降された全細胞、または培地および懸濁した細胞の双方を含有する細胞培養からのいずれかからのものを意味し得る。
【０１８１】
様々な宿主発現ベクター系を、本明細書に記載の方法で用いる抗体分子を発現するために利用することができる。このような宿主発現系は、関心対象となるコード配列が、産生、次いで、精製され得る媒体を示すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされる際、そのままで、本発明の抗体分子を発現し得る細胞も示す。これらは、抗体をコードする配列を含有する、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリア（例えば、大腸菌、枯草菌）等の微生物；抗体をコードする配列を含有する、組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属、ピチア属）、抗体をコードする配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、もしくは抗体をコードする配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、または、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から派生するプロモーターを含有する、組み換え発現構築物を内部に持つ哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＯＳ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌等の細菌性細胞、さらに好ましくは、特に、全組み換え抗体分子の発現のための真核生物細胞が、組み換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間早期遺伝子プロモーター要素等のベクターと共に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳類細胞は、抗体のために有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１８２】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、多くの場合、哺乳類起源からなり、当業者は、その中で発現する所望の遺伝子生成物に最も適している、特定の宿主細胞株を選択的に決定する能力があると考えられる。例示的な宿主細胞株は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４、およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞および２９３細胞が、特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業源、アメリカ組織培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、または発表された文献から入手可能である。
【０１８３】
加えて、挿入配列の発現を調節、または所望の特定の方法において、遺伝子生成物を修飾および処理する、宿主細胞株を選ぶことができる。このような修飾（例えば、グリコシル化）およびタンパク質生成物の過程（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後の過程および修飾に対する、特性および特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選び、発現した異種タンパク質の正しい修飾および過程を確保することができる。この最後に、遺伝子生成物の１次転写、グリコシル化、およびリン酸化反応の適切な過程のための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞を使用し得る。
【０１８４】
長期間、組み換えタンパク質の高収率生産には、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株を改変して生成得る。複製のウイルス起源を含有する発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）、および選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、改変細胞は、１〜２日間、強化培地で増殖させ、その後、選択可能な培地に取り替えることができる。組み換えプラスミドにおいて選択可能なマーカーは、選択への耐性を与え、細胞が染色体へのプラスミドを安定的に取り込み、同様に、細胞株をクローンし、拡大することができる病巣を形成することを可能にする。本方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を改変するのに有利に使用され得る。
【０１８５】
数多くの選択系を、すなわち、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子を、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ細胞で利用することができることを含むが、これらに限定されず、使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の各遺伝子の選択の基礎として使用することができる。メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））、マイコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を与えるｎｅｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）、およびハイグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４）。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の当技術分野において一般に既知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、それらは、その全体において参照することにより組み込まれる。
【０１８６】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る（閲覧用として、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照されたい）。ベクター系発現抗体におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子の複写の数を増加させるであろう。増幅領域が抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生はまた、増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１８７】
体外生成は、大量の所望のポリペプチドを与えるためにスケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）を可能にする。組織培養条件下で、哺乳類細胞培養のための技法は、当技術分野において既知であり、例えば、エアリフト型リアクター、もしくは連続撹拌式リアクター等における均質懸濁物培養、または、例えば、ホローファイバー内、マイクロカプセル、あるいはアガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ状での固定化もしくは捕捉化細胞培養が挙げられる。必要ならば、および／または所望であるならば、ポリペプチドの溶液は、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの選択的生合成後、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィーステップ前もしくは、その後に、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィー等の通常のクロマトグラフィー法により精製することができる。
【０１８８】
本発明の遺伝子コード抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体はまた、バクテリアまたは昆虫または酵母または植物細胞等の非哺乳類細胞を発現することができる。核酸を容易に受け入れるバクテリアは、大腸菌もしくはサルモネラ属の株等の腸内細菌科、枯草菌等のバシラス科、肺炎球菌、連鎖球菌、およびインフルエンザ菌のメンバーを含む。バクテリアにおいて発現する場合、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部になることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは、単離、精製され、その後、機能分子に組織化されなければならない。抗体の四価型が望ましい場合には、サブユニットは、その後、四価抗体に自己組織化するであろう（国際公開第ＷＯ０２／０９６９４８号）。
【０１８９】
バクテリア系において、数多くの発現ベクターが、発現される抗体分子を対象とした使用により異なるが有利に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のために、大量のこのようなタンパク質を産生する場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベルの発現を誘導するベクターは、望ましいものであり得る。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））が挙げられるが、これに限定されず、そこでは、抗体をコードする配列は、融合タンパク質を産生するように、ｌａｃＺコーディング領域を有するフレーム内のベクター、およびｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等に個々にライゲーションされ得る。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現するために、使用され得る。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、次いで、遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。このｐＧＥＸベクターは、このクローニングされた標的遺伝子生成物は、ＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１９０】
原核生物に加えて、真核微生物も使用され得る。数多くの他の株、例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、一般に入手可能であるが、出芽酵母、または一般のパン酵母は、真核微生物の中で最も一般に使用される。サッカロミセス属の発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）、Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４４０７６またはＰＥＰ４−１に増殖する能力を欠失する酵母の変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷部の存在は、そこで、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出する有効環境を提供する。
【０１９１】
昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、典型的に使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウイルスの非必須の領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。
【０１９２】
本発明の抗体分子を組み換え発現させたら、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡの後に特異的抗原に対する親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、例えば硫酸アンモニウム沈殿法によるものまたはタンパク質精製のための他の標準的な技術によるものを含む、当技術分野の標準的手順に従って精製することができる；例えばＳｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。あるいは、本発明の抗体の親和性を増加させるために好ましい方法が米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７号Ａ１明細書に開示されている。
【０１９３】
Ｖ．融合タンパク質および複合体
ある実施形態において、抗体ポリペプチドは、アミノ酸配列、または通常、抗体と関連しない１つ以上の部分を含む。例示的な修飾物を、さらに詳細を以下に記載する。例えば、本発明の一本鎖ｆｖ抗体フラグメントは、柔軟性リンカー配列を含む、または修飾し、機能部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または蛍光、放射性、酵素、核磁気、重金属などの標識）を加えることができる。
【０１９４】
本発明の抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、本質的にはそれらからなる、またはそれらからなり得る。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種部分、すなわち、本来は自然に連結されない一部を有する、ＳＯＤ１結合ドメインを含む、キメラ分子である。アミノ酸配列は、通常は、融合ポリペプチドにおいて統合される別々のタンパク質に存在し得る、またはそれらは、通常は、同一のタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチドにおいて新しい配置に置かれる。融合タンパク質は、例えば、ポリヌクレオチドを化学合成、または作成し、翻訳することにより、作成され得、ペプチド領域が所望の関係をもってコードされる。
【０１９５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される、「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体の残りのものとは異なる実体から派生することを意味する。例えば、本明細書で使用される、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくはその類似体に融合される、「異種ポリペプチド」は、同一の種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドから派生する。
【０１９６】
本明細書の他の部分でさらに詳細に論じられるように、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、さらに、ＮもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組み換えによって融合され得る、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に接合され得る（共有および非共有接合を含む）。例えば、抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子および、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、もしくは毒素等のエフェクター分子に、組み換えによって融合され得る、または接合され得る。例えば、国際公開第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許出願第ＥＰ３９６，３８７号を参照されたい。
【０１９７】
本発明の抗体、または抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチド等配電子体によって互いにつながれたアミノ酸からなり得、２０個の遺伝子をコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。抗体は、翻訳後の過程等の自然過程、または当技術分野において公知の化学修飾法により修飾され得る。このような修飾は、基本の教科書、およびより詳細な論文、ならびに膨大な研究文献において十分に記載される。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を含む抗体、または炭水化物等の部分においてなど、どこでも生じることができる。修飾の同一の型は、所与の抗体における幾つかの部位で、同一、または異なる程度で存在し得ることを理解されよう。また、所与の抗体は、修飾の多くの型を含有し得る。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として、分枝され得、それらは、分枝の有無にかかわらず、環状であり得る。環状、分枝、および分枝環状抗体は、翻訳後自然過程に由来し得る、または合成方法により作成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有交差結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解過程、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化等のトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２ｎｄ Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【０１９８】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質も提供する。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の１つ以上のＶＨ領域のアミノ酸配列、または本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体の任意の１つ以上のＶＬ領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有する、ポリペプチドを含む、本質的にはそれらからなる、またはそれらからなる。別の実施形態において、本明細書に開示された診断および治療方法で用いるための融合タンパク質は、抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の任意の１つ、２つ、３つのＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列、または抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の任意の１つ、２つ、３つのＶＬ−ＣＤＲのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有する、ポリペプチドを含む、本質的にはそれらからなる、またはそれらからなる。一実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有する、ポリペプチドを含み、融合タンパク質は、ＳＯＤ１の少なくとも１つのネオエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有する、ポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、ＳＯＤ１の少なくとも１つのネオエピトープに特異的に結合する、単一源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書に開示される診断および治療方法で用いる、融合タンパク質は、抗体の任意の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上ＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列、抗体、またはそのフラグメント、変異体の任意の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有する、ポリペプチドを含む。好ましくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＶＨ−ＣＤＲまたはＶＬ−ＣＤＲは、本発明の単一源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子はまた、本発明により含有される。
【０１９９】
文献に報告される例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２９３６−２９４０（１９８７））、ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１（１９８９）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０（１９８９）、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７−３５３（１９９０）、およびＢｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０（１９９０））、Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）、およびＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７（１９９１））、ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３（１９９０））、ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））、ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））、ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４（１９９１））、ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）、Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）、およびＰｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））、ならびにＩｇＥ受容体（Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８）等の融合を含む。
【０２００】
本明細書の他の場所に論じられるように、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野において既知の方法を使用して、ポリペプチドの生体内の半減期を増大する、またはイムノアッセイで用いるために、異種ポリペプチドに融合され得る。例えば、一実施形態において、ＰＥＧは、本発明の抗体に接合され、生体内の半減期を増大することができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６（２００１）、Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）、またはＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２（２００２）を参照。
【０２０１】
さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、それらの精製または検出を促進するためのペプチド等のマーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）に提供されるタグ等のヘクサヒスチジン（ｈｅｘａ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）ペプチド（ＨＩＳ）であり、それらの多くは、市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘクサヒスチジン（ｈｅｘａ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から派生するエピトープに対応する、「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「フラッグ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
融合タンパク質は、当技術分野において公知の方法を使用して、調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照されたい）。融合が行われる精密な部位を、実験的に選択し、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化し得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡを、その後、発現のための宿主細胞にトランスフェクトする。
【０２０３】
本発明の抗体は、非接合型で使用され得る、または、例えば、分子の治療的な特性を改善するため、標的検出を促進するため、または画像化、もしくは患者の治療のために、様々な分子のうちの少なくとも１つに接合され得る。
【０２０４】
本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、精製を実施する場合、精製前または精製後のいずれかで、標識化または接合することができる。特に、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、またはＰＥＧに接合され得る。
【０２０５】
従来の抗体を含む抗毒素である複合体は、当技術分野において広範に説明される。毒素は、従来の結合技法により、抗体に結合され得る、またはタンパク質毒素部分を含有する抗毒素を融合タンパク質として産生することができる。本発明の抗体を、対応する方法で使用し、このような抗毒素を取得することができる。このような抗毒素の実例は、Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９−７０およびＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１２（１９９１），５１−５４により記載されるものである。
【０２０６】
当業者は、複合体がまた、接合される選択された薬剤により異なる様々な技法を使用して、組み立てられ得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンを有する複合体は、例えば、ＳＯＤ１結合ポリペプチドをビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のビオチンの活性化エステルと反応させることにより調製される。同様に、蛍光マーカーを有する複合体は、結合剤、例えば、本明細書に記載されるものの存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくは、フルオレセインイソチオシアネートとの反応により、調製され得る。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体の複合体は、類似の方法において調製される。
【０２０７】
本発明は、診断薬または治療薬に接合された本発明の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体をさらに包含する。前記抗体を診断使用して、例えば、神経変性病の存在を立証することができ、神経変性病を獲得する危険性を示すことができ、例えば施した治療および／または予防レジメンの効力を判定するための臨床試験手順の一部として、神経変性病、すなわちミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の出現を示すまたはミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病、の発現または進行をモニターすることができる。前記抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を検出可能物質に結合することによって、検出を助長することができる。検出可能物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々な陽電子放射断層撮影を用いる陽電子放射性金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる；例えば、本発明に従って診断薬として使用するための抗体に接合することができる金属イオンについては米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。適した酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに適した放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２０８】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体はまた、化学発光化合物にそれを結合することにより検出可能に標的化することもできる。化学発光タグ抗体の存在は、その後、化学反応の経過中に起こる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０２０９】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を検出可能に標的化することができる方法の１つは、それを酵素に連結することにより、および酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において、連結生成物を使用するものである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７（１９７８））、Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１）。抗体に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法、または視覚的方法により検出することができる、化学部分を産生するための方法において、適切な基質、好ましくは、発色性基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識化するために使用することができる酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファグリセロリン酸塩、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、ブドウ糖酸化酵素、ベータガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコーゼ−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出は、酵素に対する発色性基質を利用する比色分析法により達成することができる。検出はまた、同様に調製された標準と比較すると、基質の酵素反応の範囲の目視比較により達成され得る。
【０２１０】
検出はまた、様々な他のイムノアッセイを使用して、達成され得る。例えば、抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体を放射活性物質で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して、抗体を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６））、それらは本明細書に参照することにより組み込まれる）。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない、手段により検出することができる。
【０２１１】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体はまた、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のもの等の蛍光放出金属を使用して、検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を使用して、抗体に付着させることができる。
【０２１２】
抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体に、様々な部分を接合するための技法は公知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０２１３】
ある実施形態において、結合分子、例えば、結合ポリペプチドの安定性または有効性を強化する一部分、例えば、抗体またはその免疫特異フラグメントを接合することができる。例えば、一実施形態において、ＰＥＧは、本発明の結合分子に接合され、生体内の半減期を増大することができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６（２００１）、Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）、またはＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２（２００２）を参照されたい。
【０２１４】
ＶＩ．組成物および使用方法
本発明は、組成物であって、上述のＳＯＤ１結合分子、例えば本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらの誘導体もしくは変異体、あるいは本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含むことがある。さらに、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の所期の用途に依存してインターロイキンまたはインターフェロンなどのさらなる薬剤を含むことがある。ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の出現を示すまたはミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した神経変性病の治療、例えば、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病の治療において使用するための追加の薬剤は、有機小分子、抗ＳＯＤ１抗体、およびそれらの組み合わせから成る群より選択することができる。それ故、特定の好ましい実施形態において、本発明は、神経変性病の予防的および治療的処置用の、被験体における神経変性病の進行もしくは神経変性病処置に対する反応のモニター用の、または被験体の神経変性病発現危険度の判定用の医薬組成物または診断用組成物を調製するための、ＳＯＤ１結合分子、例えば、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれらのうちのいずれか１つの結合特異性と実質的に同じ結合特異性を有する結合分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞の使用に関する。
【０２１５】
それ故、一実施形態において、本発明は、脳および中枢神経系それぞれにおけるＳＯＤ１の異常蓄積および／または沈着を特徴とする神経変性疾患を治療する方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明の上述のＳＯＤ１結合分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のうちのいずれか１つをそれを必要とする被験体に投与することを含む。用語「神経変性障害」は、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、ダウン症候群、およびパーキンソン病（ＰＤ）などの疾病を含むが、これらに限定されない。用語「神経筋疾患」は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの疾病を含むが、これらに限定されない。別の言明がない限り、神経変性のという用語と神経性のという用語を同義的に使用する。筋萎縮性側索硬化症の記述に限定して、神経変性のという用語、神経性のという用語、および神経筋のという用語も、同義的に使用する。
【０２１６】
本発明の治療アプローチの特別な利点は、本発明の抗体が、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の出現を示すまたはミスフォールド／凝集に関連した疾患、例えばＡＬＳ、の徴候がない健常ヒト被験体からのＢ細胞またはＢ記憶細胞に由来すること、およびそれ故、一定の確率で、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した臨床的に顕性の疾病を予防することができるまたは該臨床的に顕性の疾病の発症もしくは進行を遅延することができることに存する。典型的に、本発明の抗体は、体性胞成熟（ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変異による標的ＳＯＤ１分子への高親和性結合の選択性および有効性についての最適化、も既に首尾よく完了している。
【０２１７】
生体内の、例えばヒトにおけるこのような細胞が、自己免疫反応またはアレルギー反応という意味で、類縁もしくは他の生理的タンパク質または細胞構造によって活性化されないという知識も医学的に大いに重要である。これは、臨床試験相を通してうまく生存する機会のかなりの増加を意味するからである。言ってみれば、少なくとも１名のヒト被験体での予防的または治療的抗体の前臨床および臨床開発前に効率、認容性および耐容性が既に実証されている。したがって、本発明のヒト抗ＳＯＤ１抗体は、治療薬としてのその標的構造特異的効率と、その副作用の確率減少の両方が、その臨床成功確率を有意に増加されると予想することができる。
【０２１８】
本発明は、上記の成分、例えば本発明の抗ＳＯＤ１抗体、その結合フラグメント、誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞、の１つ以上を充填した１つ以上の容器を含む、製薬用および診断用それぞれのパックまたはキットも提供する。医薬またはバイオ製品の製造、使用または販売を監督する政府機関により定められた形式の注意書きであって、ヒトへの投与のための製造、使用または販売についての該機関による承認を表す注意書きを、そのような容器（単数または複数）に付随させることができる。加えてまたは代替として、前記キットは、適切な診断アッセイで使用するための試薬および／または説明書を含む。前記組成物、例えば、本発明のキットは、もちろん、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の存在を随伴する疾患の危険度評価、診断、予防および治療に特に適しており、ならびに特に、例えば筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、ダウン症候群またはパーキンソン病の治療に適用することができる。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知の方法に従って調合することができる；例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）、ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２を参照されたい。適した製薬用担体は当技術分野において周知であり、それらとしては、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物を周知の従来の方法によって調合することができる。これらの医薬組成物を適した用量で被験体に投与することができる。適した組成物の投与を、異なる方法で、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所または皮内投与または脊髄もしくは脳内送達によって果たすことができる。エーロゾル製剤、例えば、鼻内噴霧製剤は、保存薬および等張剤を伴う、活性薬剤の精製水溶液または他の溶液を含む。好ましくは、そのような製剤は、鼻粘膜と適合性のｐＨおよび等張状態に調整する。直腸内または膣内投与用の製剤は、適した担体を用いて坐剤として提供することができる。
【０２２０】
さらに、本発明は、本発明の薬物を投与するために頭骨に小さな穴をあける今では標準的な（しかし幸いにも滅多に行われない）技術を含むが、好ましい態様では、前記結合分子、特に、本発明の抗体または抗体ベースの薬物は、血液脳関門を横断することができ、それにより静脈内または経口投与が可能である。
【０２２１】
用量レジメンは、主治医および臨床学的因子により決定されるであろう。医学的分野において公知のとおり、任意の１人の患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、健康状態全般、および同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子により異なる。典型的な用量は、例えば、０．００１から１０００μｇ（または本範囲における発現もしくは発現の抑制のための核酸の）範囲であり得るが、特に、前述の要因を考慮して、本例示的範囲を下回るもしくは上回る用量も想定される。一般に、用量は、例えば、宿主体重の約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常は、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であり得る。例えば、用量は、体重あたり１ｍｇ／ｋｇもしくは体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の用量中間体はまた、本発明の範囲内であることを意図する。対象は、このような用量を毎日、代替日に、毎週、または実証的分析により決定される任意の他の計画に従って、投与され得る。例示的な治療は、長期、例えば、少なくとも６ヶ月にわたって、反復投与における投与を必要とする。追加の例示的な治療レジメンは、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。例示的な用量計画は、連続日において、１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、代替日において、３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週、６０ｍｇ／ｋｇを含む。幾つかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、そこでは、投与されるそれぞれの抗体の用量は指示された範囲内である。経過は、定期評価により監視され得る。非経口的投与の調製は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水溶性担体は、食塩水および緩衝培地を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液を含む。非経口用賦形剤は、塩化ナトリウム液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油を含む。静脈内賦形剤は、液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルのデキストロース等に基づく等）等を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の保存剤および他の添加剤も存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的により異なるが、ドーパミン等の薬剤または精神薬理薬物をさらに含み得る。
【０２２２】
さらに、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の所期の用途に依存してドーパミンまたは精神薬理学的薬物などの薬剤をさらに含むことがある。
【０２２３】
さらに、本発明の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物が受動免疫のために抗ＳＯＤ１抗体またはその結合フラグメント、誘導体もしくは変異体を含む場合、該医薬組成物をワクチンとして調合することができる。背景技術の部で述べたように、凝集ＳＯＤ１種は、血漿およびＣＳＦにおいて細胞外で報告されており（Ｇｒｕｚｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（２００７）、１２５２４−１２５２９）、ならびにヒト化マウス抗体での能動的および受動的ワクチン接種を用いるトランスジェニックマウス系統での研究により、脳内のＳＯＤ１凝集体についての脳内レベル低減、行動障害の進行遅速、および死亡遅延が明らかになった（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（２００７）、２４９５−２５００）。したがって、本発明のヒト抗ＳＯＤ１抗体および等価のＳＯＤ１結合分子での受動免疫は、背景技術の部で既に論じたような能動免疫療法概念の幾つかの有害作用を回避するのに役立つと予想するのが賢明である。したがって、本発明の本抗ＳＯＤ１抗体およびそれらの等価物は、例えば筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、ダウン症候群またはパーキンソン病などの、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の存在を示すまたはミスフォールド／凝集によって引き起こされる疾病の予防または改善のためのワクチンとして特に有用であろう。
【０２２４】
一実施形態では、本発明の抗体の組み換え二重または多重特異性構築物を使用することが有益であり得る。参考のために、ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｇｅｒ、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７）、３−１４を参照されたい。そのような二重特異性分子を、１つの結合アームがＳＯＤ１を標的にし、第二の結合アームが別のエンティティー、例えばＡβもしくはアルファ−シヌクレイン、またはＳＯＤ１の病的立体構造を標的にするように設計することができるであろう。あるいは、脳内への抗体の透過を助長するために脳血液関門に存在するタンパク質を標的にするように第二の結合アームを設計することができる。
【０２２５】
一実施形態では、細胞膜をより容易に透過できるであろう本発明の抗体の組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）および一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することが有益であり得る。例えば、ＡβのＮ末端領域内のエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラ組み換えＦａｂ（ｒＦａｂ）および一本鎖フラグメント（ＳｃＦｖ）の使用を記載している、オンライン先行発表のＲｏｂｅｒｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）Ｏｃｔ  １６；Ｓ１７４１−０１３４を参照されたい。前記改変フラグメントは、（ｉ）アミロイド線維形成を予防することができ、（ｉｉ）既製Ａβ１−４２原線維を脱凝集させることができ、および（ｉｉｉ）全ＩｇＧ分子と同様に効率的に体外でＡβ１−４２オリゴマー媒介神経毒性を阻害することができた。前記エフェクター機能のない小型ＦａｂおよびｓｃＦｖ改変抗体形式の使用について認められている利点としては、血液脳関門のより効率的な通過、および炎症性副作用を誘発する危険性の最小化が挙げられる。さらに、ｓｃＦｖおよび単一ドメイン抗体は、完全長抗体の結合特異性を保持することに加えて、該抗体を単一遺伝子として発現させることができ、および細胞内抗体として哺乳動物細胞において細胞内発現させることができ、それらの標的のフォールディング、相互作用、修飾または細胞内局在を改変する可能性がある；総説については、例えばＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２（２００５）、３９４−４０１を参照されたい。
【０２２６】
異なるアプローチで、Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７−２４１には、 抗体を生細胞に、それらを害することなく、シャトルすることができると言われている技術プラットフォーム、いわゆる「スーパー抗体技術」が記載されている。このような細胞透過抗体は、新たな診断および治療の窓を開く。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」は、これらの抗体のために作られた。
【０２２７】
さらなる実施形態において、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の出現に関連した疾病の治療に有用な他の抗体の共投与または逐次投与が望ましいことがある。一実施形態では、それらの追加の抗体を本発明の医薬組成物に含める。被験体を治療するために使用することができる抗体の例としては、ベータ−アミロイド、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３およびタウをターゲットにする抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
さらなる実施形態において、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病の治療に有用な他の神経保護薬の共投与または逐次投与が望ましいことがある。一実施形態では、それらの追加の薬剤を本発明の医薬組成物に含める。被験体を治療するために使用することができる神経保護薬の例としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、グルタミン酸作動性受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、抗炎症薬、ジバルプロエクスナトリウムまたはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の医薬組成物と併用することができる他の神経保護薬の例は、当技術分野において記述されている；例えば国際公開第ＷＯ２００７／０１１９０７号パンフレットを参照されたい。一実施形態において、それらの追加の薬剤は、ドーパミンまたはドーパミン受容体アゴニストである。
【０２２９】
治療有効用量または量は、症状または状態を改善するのに十分な活性成分の量を指す。上述の組成物の治療効力および毒性、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。治療効果と毒性効果の間の用量比が治療指数であり、それを比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。好ましくは、前記組成物中の治療薬は、例えば筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、ダウン症候群またはパーキンソン病の場合、正常な行動および／または認知特性を回復するまたは保つのに十分な量で存在する。
【０２３０】
上述のことから、本発明が、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＳＯＤ１結合分子の任意の使用、特に、上述のミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾患、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、の診断および／または治療のための使用を包含することは明白である。好ましくは、前記結合分子は、本発明の抗体またはその免疫グロブリン鎖である。加えて、本発明は、本明細書において上で説明した言及抗体のいずれか１つの抗イディオタイプ抗体に関する。これらは、抗原結合部位付近の抗体可変領域に位置する独特な抗原性ペプチド配列に結合する抗体または他の結合分子であり、例えば、被験体のサンプル中の抗ＳＯＤ１抗体の検出に有用である。
【０２３１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の上記ＳＯＤ１結合分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のいずれか１つと、場合により、適する検出手段、例えば免疫または核酸ベースの診断方法で従来使用されている試薬、とを含む診断用組成物に関する。本発明の抗体は、例えばイムノアッセイでの使用に適しており、イムノアッセイでは本発明の抗体を液相で利用することができ、または固相担体に結合させることができる、本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接的または間接的いずれかの形式での競合および非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体を多くの異なる担体に結合させることができ、それらを使用して、それらに特異的に結合する細胞を単離することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が挙げられる。本発明のために、担体の性質は、可溶性であってもよいし、または不溶性であってもよい。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。本発明において使用することができる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられる；本明細書において上で論じた実施形態も参照されたい。
【０２３２】
さらなる実施形態により、ＳＯＤ１結合分子、特に本発明の抗体を、個体における疾患を診断するための方法にも使用することができ、この方法は、血液サンプル、リンパサンプルまたは任意の他の体液サンプルであってよい体液サンプルを被験個体から得ること、および抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で本発明の抗体とその体液サンプルを接触させることによるものである。その後、そのような複合体のレベルを当技術分野において公知の方法によって判定し、対照サンプル中で生ずるものより有意に高いレベルはその被験個体における疾病を示す。同様に、本発明の抗体が結合している特異的抗原も使用することができる。それ故、本発明は、結合分子、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む体外イムノアッセイに関する。
【０２３３】
これに関連して、本発明は、このために特に設計された手段にも関する。例えば、抗体ベースのアレイを使用することができ、例えば、ＳＯＤ１を特異的に認識する本発明の抗体または等価の抗原結合分子をそのアレイに負荷する。マイクロアレイイムノアッセイの設計は、Ｋｕｓｎｅｚｏｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６）、１６８１−１６９６に要約されている。したがって、本発明は、本発明に従って同定されたＳＯＤ１結合分子が負荷されたマイクロアレイにも関する。
【０２３４】
一実施形態において、本発明は、被験体におけるミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾患を診断する方法に関し、この方法は、本発明の少なくとも１つの抗体、そのＳＯＤ１結合フラグメント、またはそれらのうちのいずれか１つの結合特異性と実質的に同じ結合特異性を有するＳＯＤ１結合分子を用いて、診断すべき患者からのサンプル中のＳＯＤ１および／またはミスフォールド／凝集ＳＯＤ１の存在を判定することを含み、この場合、病的ミスフォールドおよび／または凝集ＳＯＤ１の存在は、神経変性疾患の指標となり、ならびに生理的ＳＯＤ１二量体形態のレベルと比較して病的ミスフォールドおよび／または凝集ＳＯＤ１のレベルの増加は、該被験体における神経変性疾患の進行についての指標となる。
【０２３５】
診断すべき被験体は、その疾病について無症状または症状発現前であることもある。好ましくは、前記対照被験体は、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病、例えば、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＣＤ）、ダウン症候群またはパーキンソン病を有し、この場合、病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１のレベルと参照基準の間の類似性は、診断すべき被験体が神経変性病を有することを示す。代替としてまたは加えて、第二の対照としての対照被験体は神経変性疾患を有さず、この場合、生理的ＳＯＤ１量体のレベルならびに／または病的ミスフォールドおよび／もしくは凝集ＳＯＤ１のレベルと参照基準の間の差は、診断すべき被験体が神経変性疾患を有することを示す。好ましくは、診断すべき被験体と対照被験体（単数または複数）の年齢を合わせる。分析すべきサンプルは、病的ミスフォールドおよび／または凝集ＳＯＤ１を含有すると推測される任意の体液、例えば、血液、ＣＳＦまたは尿サンプルであり得る。
【０２３６】
生理的ＳＯＤ１二量体のレベルならびに／または病的ミスフォールドおよび／もしくは凝集ＳＯＤ１のレベルを当技術分野において公知の任意の適した方法によって評価することができ、この評価は、例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分光分析（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）続いてのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、およびレーザーデンシトメトリーから選択される１つ以上の技術によってＳＯＤ１を分析することを含む。好ましくは、ＳＯＤ１の前記生体内画像診断は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光イメージングまたは磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）を含む。 
【０２３７】
本発明に従って適応することができる抗体および関連手段を使用する、ＳＯＤ１の検出のための、およびミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病、例えばＡＬＳ、の進行をモニターするための、およびそのような疾病の治療をモニターするための抗体ベースの方法は、国際公開第ＷＯ２００７／０９８６０７号および同第ＷＯ２００７／０２５３８５号パンフレット（全ての内容が参照により本明細書に組み込まれている）にも記載されている。本発明のＳＯＤ１特異的抗体、結合フラグメント、誘導体または変異体を用いることを除いて、これらの方法を記載されているとおりに適用することができる。
【０２３８】
ＶＩＩ．立体構造特異的ＳＯＤ１エピトープを有するペプチド
さらなる態様において、本発明は、本発明の任意の抗体によって特異的に認識されるＳＯＤ１のエピトープを有するペプチドに関する。好ましくは、このようなペプチドは、配列番号２、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８もしくは配列番号５９で示されるアミノ酸配列、または１つ以上のアミノ酸が置換、欠失および／もしくは付加されているそれらの修飾配列を含み、または該配列から成り、該ペプチドは、本発明の任意の抗体によって、好ましくは抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３それぞれによって抗体ＮＩ−２０４．２５Ｈ３によって、認識される。
【０２３９】
本発明の一実施形態において、そのようなペプチドは、前記被験体の生体サンプル中のペプチドに結合する抗体の存在を判定する段階を含む、被験体におけるミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病、例えばＡＬＳ、の診断に使用することができ、ならびに本発明の上記ペプチドを認識する抗体のレベルを測定することおよびそれらの測定値を、比較対象となる年齢および性別の健常被験体において認められるレベルと比較することによる該被験体における該疾病の診断に使用することができる。本発明の前記ペプチドに対して特異的な測定抗体レベルの上昇は、該被験体においてミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に関連した疾病を診断する指標となるであろう。本発明のペプチドを、本明細書において前に説明したようなアレイ、キットおよび組成物にそれぞれ調合することができる。
【０２４０】
これらおよび他の実施形態は、本発明の記述および実施例により開示され、包含される。本発明に従って用いられる材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献を、例えば電子デバイスを用いて、公的ライブラリーおよびデータベースから検索することができる。例えば、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および／または国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって提供されている公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＥＭＢＬ）の一部である欧州バイオイフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）のものは、当業者に公知であり、およびインターネット検索エンジンを用いてそれらを得ることができる。生物工学に関する特許情報の総説、ならびに遡及検索および文献速報のために有用な特許情報の適切な供給源の通覧は、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）、３５２−３６４に与えられている。
【０２４１】
上の開示は、本発明を一般に説明するものである。別の言明がない限り、本明細書で使用する用語には、２０００年に改訂され、２００３年に再版されたＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７、ＩＳＢＮ  ０  １９ ８５０６７３  ２に提供されているような定義が与えられている。本明細書の本文を通して幾つかの文書が引用されている。完全な文献引用情報は、特許請求の範囲の直ぐ前の本明細書末尾において見つけることができる。全ての引用参考文献（本願中の至る所で引用されている参考文献、発行特許、公開特許出願、ならびに製造業者の仕様書および説明書などを含む）の内容は、参照により本明細書に特に組み込まれているが、引用されているいずれかの文書が実際に本発明についての先行技術であることを認めるものではない。
【０２４２】
以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができるが、これらの実施例は、単に例証を目的として本明細書に提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０２４３】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するものであるが、いかなる点においても本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。実施例１から７における下記実験を、クローニングした抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３、すなわち、ヒト可変重および軽鎖の生殖細胞系（ＧＬ）配列に合わせていない枠組み１（ＦＲ１）Ｉｇ可変領域に関して例証し、説明する；図１参照。
【０２４４】
材料および方法
本明細書において用いるものなどの従来の方法についての詳細な説明は、引用文献の中で見つけることができる；ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗにより編集された「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、第１７版（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ．２００３）も参照されたい。
【０２４５】
本発明の実施は、別の指示がない限り、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いることとなる。本発明の実施に有用な一般技術のさらなる詳述について、実施者は、細胞生物学および組織培養に関する標準的な教科書および総説を参照することができる；本実施例に引用する参考文献も参照されたい。分子生化学および細胞生化学に関する一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＦｒｅｓｈｎｅｙおよびＡｌａｎ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版（Ａｕｓｕｂｅｌら編）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｔｔおよ���Ｌｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；ならびにＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤｏｙｌｅおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的教科書の中で見つけることができる。本開示において言及する遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈから入手できる。細胞培養および培地回収に関する一般技術は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７）、１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７（１９９１）、７３）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１）、３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０）、２５１）；Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ、Ｈｅｒｚｅｌら、ＣＨＡＯＳ  １１（２００１）、９８−１０７に概説されている。
【０２４６】
ＳＯＤ１特異的Ｂ細胞の同定方法およびそれぞれの抗体のクローニング方法
特に記載のない限り、ＳＯＤ１特異的Ｂ細胞の同定、および所望の特異性を提示する抗ＳＯＤ１抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組み換え発現および機能の特性付けは、一般に、国際公開第ＷＯ２００８／０８１００８号として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３号の実施例および補足的方法の部に記載されているとおりに行った、または行うことができ、該参考文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＳＯＤ１特異的Ｂ細胞の同定および所望の特異性を提示するＳＯＤ１抗体の分子クローニングならびにそれらの組み換え発現および機能の特性付けのための新規方法を本願の中で提供する。上で説明したように、本発明の一実施形態では、単一またはオリゴクローナルＢ細胞の培養物を培養し、該Ｂ細胞によって産生された抗体を含有する該培養物の上清を、その中の新規抗ＳＯＤ１抗体の存在および親和性についてスクリーニングする。このスクリーニング工程は、国際公開第ＷＯ２００４／０９５０３１号パンフレット（この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているような感受性組織アミロイド班免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイ段階；実施例４に記載し、図６に示すような、突然変異ヒトＳＯＤ１形態を発現するトランスジェニックマウスの脊髄組織を用いてＳＯＤ１の病的凝集体についてスクリーニングする段階；類似に実施例５に記載し、図７に示すような配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＳＯＤ１に由来するペプチドと抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２についてのエピトープ立体構造実験によるペプチドの結合についてスクリーニングする段階；配列番号１によって表される前記アミノ酸配列の完全長ＳＯＤ１の結合についてスクリーニングし、国際公開第ＷＯ２００８／０８１００８号パンフレットに記載されているように、ならびに実施例１に記載し、図２、５および７に示すように、結合が検出される抗体または該細胞を産生する細胞を単離する段階を含む。
【０２４７】
ＳＯＤ１抗原
組み換えヒトＳＯＤ１は、Ｂｉｏｍｏｌ（ドイツ国ハンブルク）から購入した。ヒト赤血球からの野生型ＳＯＤ１（生理的二量体）および他の全ての試薬は、別途言及しなければＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（スイス国ブーフス）から購入した。
【０２４８】
ヒトＳＯＤ１抗体スクリーニング
ＥＬＩＳＡ：
被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２、ｐＨ９．６）中３．３μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した組み換えヒトＳＯＤ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）のいずれかで９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を一晩、４℃で被覆した。あるいは、被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中３４μｇ／ｍＬの濃度の体外酸化ヒトＳＯＤ１で被覆した９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用する。プレートをＰＢＳ−Ｔ  ｐＨ７．６中で洗浄し、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）を含有する、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて１時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。Ｂ細胞調整培地を記憶Ｂ細胞培養物プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）を使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。培地中に含有された抗体の、ＢＳＡへの結合ではなく、組み換えＳＯＤ１への結合を示したＢ細胞培養物のみを、抗体クローニングに付した。
【０２４９】
ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）マイクロプレートスクリーニング
標準９６ウェル１０−Ｓｐｏｔ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国）を、ＰＢＳ中３０ｕｇ／ｍＬのＳＯＤ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）で被覆した。３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔで非特異的結合部位を１時間、室温でブロックし、その後、Ｂ細胞調整培地と共に１時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、その後、ＳＵＬＦＯ−Ｔａｇ接合抗ヒトポリクローナル抗体（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国）と共にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国）を使用する電気化学発光測定により、抗体の結合を検出した。
【０２５０】
ＳＯＤ１抗体の分子クローニング
記憶Ｂ細胞を含有するサンプルを健常ヒト被験体から得た。選択された記憶Ｂ細胞培養物の生Ｂ細胞を回収し、ｍＲＮＡを調製する。その後、ネステッドＰＣＲアプローチを用いて、免疫グロブリン重および軽鎖配列を得る。
【０２５１】
ヒト免疫グロブリン生殖細胞系レパートリーの全ての配列ファミリーを表すプライマーの組み合わせを、リーダーペプチド、ＶセグメントおよびＪセグメントの増幅に使用する。５’末端にはリーダーペプチド特異的プライマーを、および３’末端には定常領域特異的プライマー使用して、第一ラウンド増幅を行う（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．４（２００９），３７２−３８４）．重鎖およびカッパ軽鎖のための第二ラウンド増幅は、５’末端にはＶセグメント特異的プライマーを、および３’末端にはＪセグメント特異的プライマーを使用して行う。ラムダ軽鎖のための第二ラウンド増幅は、５’末端にはＶセグメント特異的プライマーを、および３’末端にはＣ領域特異的プライマーを使用して行う（Ｍａｒｋｓら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１−５９７；ｄｅ  Ｈａａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９），１８２１８−１８２３０）．
【０２５２】
所望の特異性を有する抗体クローンの同定を、完全抗体の組み換え発現に基づくＥＬＩＳＡでの再スクリーニングによって行う。完全ヒトＩｇＧ１抗体またはキメラＩｇＧ２ａ抗体の組み換え発現は、「正しい読み枠内の」可変重鎖および軽鎖配列の発現ベクターへの挿入により、該発現ベクターが、リーダーペプチドをコードする配列を該可変領域配列の５’末端に、および適切な定常ドメイン（単数または複数）をコードする配列を３’末端に補足することによって果たされる。そのために、前記プライマーは、前記可変重および軽鎖配列の抗体発現ベクターへのクローニングを助長するように設計された制限部位を含有した。シグナルペプチドとヒト免疫グロブリンガンマ１またはマウス免疫グロブリンガンマ２ａの定常ドメインとを有する重鎖発現ベクターにインフレームの免疫グロブリン重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を挿入することによって、重鎖免疫グロブリンを発現させる。シグナルペプチドとヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを供給する軽鎖発現ベクターにインフレームのカッパ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を挿入することにより、カッパ軽鎖免疫グロブリンを発現させる。シグナルペプチドとヒトまたはマウスラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを供給するラムダ軽鎖発現ベクターにインフレームのラムダ軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物を挿入することにより、ラムダ軽鎖免疫グロブリンを発現させる。
【０２５３】
Ｉｇ重鎖発現ベクターおよびカッパまたはラムダＩｇ軽鎖発現ベクターのＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞（またはヒトもしくはマウス起源の任意の他の適切なレシピエント細胞系統）への同時トランスフェクションにより、機能的組み換えモノクローナル抗体を得る。その後、標準的なプロテインカラム精製を用いて調整培地から組み換えヒトモノクローナル抗体を精製する。一過的にトランスフェクトされた細胞または安定的にトランスフェクトされた細胞いずれかを使用して、無制限量の組み換えヒトモノクローナル抗体を産生することができる。直接Ｉｇ発現ベクターを使用すること、またはＩｇ可変領域を異なる発現ベクターに再クローニングすること、いずれかによって、組み換えヒトモノクローナルを産生する細胞系統を確立することができる。Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびｓｃＦｖなどの誘導体もこれらのＩｇ可変領域から産生することができる。
【０２５４】
抗体
マウスモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体７２Ｂ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国サンタクルーズ）およびウサギモノクローナル抗ＳＯＤ１抗体ＥＰＲ１７２６（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、米国バーリンゲーム）を製造業者のプロトコルに従って使用した。組み換えヒトまたはキメラＳＯＤ１抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３， ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３は、本発明の抗体である。別の言明がない限り、それらをＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞において発現させ、調整培地から精製し、その後の用途に直接使用した。実施例１から４では、本発明の精製組み換え抗体を使用した。
【０２５５】
ダイレクトＥＬＩＳＡ
炭酸塩ＥＬＩＳＡ被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中３．３／ｍＬの濃度に希釈した組み換えヒトＳＯＤ１タンパク質（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）で、４℃で一晩、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を被覆した。２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）と０．５％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有するＰＢＳを用いて２時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。ＨＲＰと接合したロバ抗ヒトＩｇＧｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）を使用して本発明のヒト抗体（ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．９Ｆ６、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．１０Ａ８）の結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国サンディエゴ）を使用する非線形回帰により、ＥＤ５０値を推定した。
【０２５６】
トランスジェニックマウス
Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスを使用して、本発明のＳＯＤ１抗体（およびそれらの結合特異性を有する分子）を検証した。
【０２５７】
前記トランスジェニックマウス系統は、ＡＬＳについての非常によく確立され、特性付けされているマウスモデルである。このＡＬＳマウスモデルの脊髄に関する顕著な神経病理学的特徴は、後角でより前角ならびに白質の前および後柱でのほうが見つけられる頻度が高い、ヒト筋萎縮性側索硬化症の際に見られるものに類似した神経フィラメントに富むスフェロイドの存在；免疫反応性神経フィラメントに富む封入体で満たされた肥厚ジストロフィー性神経突起の存在；神経細胞体の空胞、グリア増殖症および星状細胞増多症の存在を特徴とする運動ニューロン変性である。スーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質の異常凝集体から主として成る、細胞内分散封入体、レヴィー小体様封入体および細胞外凝集体が、追加の顕著な神経病理学的特徴である。
【０２５８】
実施例１  ヒトＳＯＤ１抗体の標的および結合特異性の検証
単離された抗体の認識標的としてのＳＯＤ１を検証するために、上で説明したようにダイレクトＥＬＩＳＡアッセイを行った。例示的組み換えヒトＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６およびＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体については、炭酸塩ＥＬＩＳＡ被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中３．３μｇ／ｍＬの濃度に希釈した、組み換えヒトＳＯＤ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）でまたはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を被覆し、該抗体の結合効率を試験した。ＥＬＩＳＡにより、例示的ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６およびＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体は、ヒトＳＯＤ１に特異的に結合する。ＢＳＡへの結合は観察されなかった；図２参照。
【０２５９】
例示的抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．９Ｆ６およびＮＩ−２０４．１０Ａ８の半最大有効濃度（ＥＣ５０）の決定のために、様々な抗体濃度で追加のダイレクトＥＬＩＳＡ実験を行った。炭酸塩ＥＬＩＳＡ被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中３．３μｇ／ｍＬの濃度に希釈した組み換えヒトＳＯＤ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を被覆し、前記抗体の結合効率を試験した。ＨＲＰと接合したロバ抗ヒトＩｇＧｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）を使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。
【０２６０】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（米国サンディエゴ）ソフトウェアを使用する非線形回帰により、ＥＤ５０値を推定した。組み換えヒト由来抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７は、高親和性で組み換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ１と結合し、それぞれ１０．０ｎＭ、２．７ｎＭおよび０．４ｎＭのＥＣ５０を有する。抗体ＮＩ−２０４．９Ｆ６は、組み換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ１に結合し、ナノモル範囲（１０４．８ｎＭ）のＥＣ５０を有する；図３参照。したがって、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、 ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体は、家族性ＡＬＳのための適したヒト由来候補薬であり、スーパーオキシドジスムターゼ１突然変異体を過発現する確立されたトランスジェニックマウスモデルでそれらを研究することができる。
【０２６１】
実施例２  ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の漸増被覆濃度についての、したがって立体構造エピトープの形成の選好についてのＥＣ５０分析
立体構造エピトープへのＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．９Ｆ６の結合能力を判定するために、被覆用緩衝液中、異なる４つの被覆濃度（０．１；１；１０または３０μｇ／ｍＬ）のヒト組み換えＳＤＯ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国ハンブルク）を用いてダイレクトＥＬＩＳＡ実験を行った。一次抗体ヒトＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ヒトＮＩ−２０４．１０Ａ８、ヒトＮＩ−２０４．９Ｆ６およびマウスモノクローナル抗体ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国サンタクルーズ）を、示されている濃度（図４）に希釈し、１時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）またはロバ抗ヒトＩｇＧｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）抗体いずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（米国サンディエゴ）ソフトウェアを使用する非線形回帰により、ＥＤ５０値を推定した。
【０２６２】
ダイレクトＳＯＤ１  ＥＬＩＳＡを用いて、低および高被覆濃度のヒト組み換えＳＯＤ１について、抗体の作用強度を示す半最大有効濃度（ＥＤ５０）を判定した。２４ｎＭのＥＣ５０を有する組み換えＮＩ−２０４．１０Ｄ１２の高い親和性が、高いヒトＳＯＤ１タンパク質被覆密度（１０または３０μｇ／ｍＬ）について観察された（図４ＡおよびＦ）。より低いヒトＳＯＤ１被覆濃度で親和性の実質的降下が観察され、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２についてはＥＣ５０が相応じて２５倍近くまで増加した（図４ＡおよびＦ）。０．４ｎＭのＥＣ５０を有する組み換えＮＩ−２０４．１２Ｇ７の非常に高い親和性結合が、高いヒトＳＯＤ１タンパク質被覆濃度（１０または３０μｇ／ｍＬ）について観察された（図４ＤおよびＦ）。より低いヒトＳＯＤ１被覆濃度で親和性の実質的降下が観察され、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７についてはＥＣ５０が相応じて１９５倍近くまで増加した（図４ＤおよびＦ）。対照的に、ＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体は、既に低いヒトＳＯＤ１タンパク質被覆密度（０．１および１μｇ／ｍＬ）で高結合性で結合し、それぞれ９６ｎＭおよび１９ｎＭのＥＣ５０を有する（図４ＢおよびＦ）。１０μｇ／ｍＬのヒトＳＯＤ１タンパク質被覆濃度でＮＩ−２０４．１０Ａ８の結合親和性のさらなる増加が観察され、ＥＣ５０は２ｎＭに増加した（図４ＢおよびＦ）。ＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体は、ＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体の結合特性に非常に類似している組み換えヒトＳＯＤ１タンパク質への結合特性を示す（図４Ｃ）。しかし、ＮＩ−２０４．９Ｆ６結合親和性は、ＮＩ−２０５．１０Ａ８について判定された結合親和性よりはるかに低い（図４Ｂ、ＣおよびＦ）。
【０２６３】
市販ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１抗体は、より低いヒトＳＯＤ１被覆密度で結合親和性の強い増加を示さなかった（図４Ｄ）。
【０２６４】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１被覆濃度を増加させるＮＩ−２０４．１０Ｄ１２のＥＣ５０分析は、高いＳＯＤ１被覆濃度で親和性の強い獲得を明示した。２４ｎＭのＥＣ５０が１０μｇ／ｍＬの被覆で測定されたが、この値は、低いＳＯＤ１被覆密度（０．１μｇ／ｍＬ）については２５倍近くに増加した。これは、親和性の相当な降下を示唆する。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２に類似して、ＮＩ−２０４．１２Ｇ抗体のＥＣ５０分析は、高いＳＯＤ１被覆濃度で親和性の非常に強い獲得を明示した。０．４ｎＭのＥＣ５０が１０μｇ／ｍＬの被覆で測定されたが、この値は、低いＳＯＤ１被覆密度（０．１μｇ／ｍＬ）については１９５倍近くに増加した。これは、親和性の相当な降下を示唆する。これらの発見は、ＥＬＩＳＡプレート上での高い局所濃度の組み換えヒトＳＯＤ１ついての起こり得る自然凝集によって説明される可能性が高く、ならびにＳＯＤ１ミスフォールディングまたは凝集体形成により露出されるＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体のエピトープを示す。対照的に、ＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体の高いＳＯＤ１被覆濃度（１０μｇ／ｍＬ）での親和性の獲得と共に低密度被覆（０．１μｇ／ｍＬ）での高い親和性結合は、この抗体が、生理的タンパク質立体構造で存在するヒトＳＯＤ１のエピトープを認識できることを示す。ＮＩ−２０４．９Ｆ６は、全てのＳＯＤ１濃度でＮＩ−２０４．１０Ａ８より低い結合親和性と、高い被覆濃度でのわずかな親和性獲得を示し、これは、この抗体が、生理的立体構造で存在するヒトＳＯＤ１のエピトープも認識することができることを示唆している。
【０２６５】
実施例３  生理的ＳＯＤ１二量体へのおよび体外ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１への結合分析
金属触媒酸化反応を用いて体外スーパーオキシドジスムターゼ１凝集を誘導した（Ｒａｋｈｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９  （２００４）、１５４９９−５０４）。ヒト赤血球からの野生型ＳＯＤ１（二量体）および多の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）から購入した。凝集のために、４ｍＭアスコルビン酸と０．２ｍＭ  ＣｕＣｌ２とを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０中で１０μＭヒトＳＯＤ１を４８時間３７℃でインキュベートした。対照として、１０μＭヒトＳＯＤ１を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０中で４８時間、３７℃でインキュベートした。
【０２６６】
生理的ヒトＳＯＤ１二量体または体外凝集ヒトＯＳＤ１二量体のいずれかを被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中３４μｇ／ｍＬの濃度で用いて９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を被覆した。２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）を含有する、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を用いて１時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。一次抗体ヒトＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．９Ｆ６およびマウスモノクローナル抗体ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国サンタクルーズ）を、示されている濃度に希釈し、１時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）またはロバ抗ヒトＩｇＧｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）いずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国サンディエゴ）を使用する非線形回帰により、ＥＤ５０値を推定した。
【０２６７】
ヒトＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（図５Ａ）およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７（図５Ｃ）抗体は、ミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１に優先的に結合し、それぞれ１５ｎＭおよび３．６ｎＭのＥＣ５０を有する。ヒトＮＩ−２０４．９Ｆ６（図５Ｄ）抗体は、ミスフォールド／凝集ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１にわずかに優先的に結合し、１２７ｎＭのＥＣ５０を有する。これらの発見は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体が、生理的形態ではなくミスフォールド／凝集形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ１の病理学的に意味のある立体構造の、露出されるヒトＳＯＤ１のエピトープを優先的に標的にすることを示唆している。
【０２６８】
対照的に、ＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体は、ヒト生理的ＳＯＤ１二量体およびミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１と同等の親和性で結合し（図５Ｂ）、それぞれ、１９．１ｎＭおよび２９．５ｎＭのＥＣ５０を有する。これらの発見は、ミスフォールド／凝集形態および生理的形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ１の病理学的に意味のある立体構造両方の、露出されるヒトＳＯＤ１のエピトープを標的にすることを示唆している。
【０２６９】
市販ＳＯＤ−１  ７２Ｂ１抗体は、ヒト生理的ＳＯＤ１二量体およびミスフォールド／凝集ヒトＳＯＤ１にほぼ同等の親和性で結合する；図５Ｅ参照。
【０２７０】
金属触媒酸化によって誘導されるＳＯＤ１凝集体は、ＡＬＳ生体内スーパーオキシドジスムターゼ１凝集体でのものと同一の特性を有する。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（図５Ａ）およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７（図５Ｃ）は、ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１などの治療上意味のある病的形態のヒトＳＯＤ１への顕著な結合を示す。ＳＯＤ１凝集体への結合は、生理的二量体より選好されるようである。ＮＩ−２０４．９Ｆ６（図５Ｄ）は、治療上意味のある病的形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ１へのわずかに優先的な結合を示す。しかし、ＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体のミスフォールド／凝集ＳＯＤ１に対する結合親和性は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体について判定された親和性より低い。
【０２７１】
興味深いことに、ＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体（図５Ｂ）は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７およびＮＩ−２０４．９Ｆ６抗体とは対照的に、生理的二量体よりＳＯＤ１凝集体への優先的結合を示さない。この抗体は、低ナノモル範囲で、高親和性で、両方のＳＯＤ１種に結合する。
【０２７２】
これらの発見は、病理学的に意味のある立体構造のＳＯＤ１タンパク質に標的化されるヒト由来ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体の治療上魅力的なプロファイル、ならびにＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体がＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体のものとは異なる生化学的特性を保有することを強調する。したがって、ヒト由来ＮＩ−２０４．１０Ａ８は、分子ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７のものとは異質の特性を有する、ＡＬＳのための可能性のある治療抗体に相当する。
【０２７３】
さらに、これらの発見は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１の被覆濃度を増加させる前記結合分析と一致する。
【０２７４】
実施例４  トランスジェニックマウス脊髄組織におけるＳＯＤ１の病的凝集体に結合するＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．９Ｆ６の結合の評価
疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの脊髄をリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋し、５μｍ切片に切断した。ギ酸前処理後、切片を異なる抗スーパーオキシドジスムターゼ１抗体：キメラＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（５０ｎＭ）、ヒトＮＩ２０４−１０Ａ８（５０ｎＭ）、ヒトＮＩ−２０４．１２Ｇ７（２０ｎＭ）、ヒトＮＩ−２０４．９Ｆ６（５０ｎＭ）およびＥＰＲ１７２６抗ＳＯＤ１（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、１：１００００）と共にインキュベートし、その後、ビオチン化ロバ抗マウスまたはビオチン化ロバ抗ヒトまたはビオチン化ロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ；１：２５０）のいずれかと共にインキュベートした。抗体シグナルをＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で増幅し、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）で検出した。
【０２７５】
スーパーオキシドジスムターゼ１へのＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．９Ｆ６の結合を疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスからの脊髄切片の免疫組織化学分析により特性付けした。
【０２７６】
ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２は、主として、ＳＯＤ１病態ならびに細胞内分散封入体のびまん性染色を示す；図６Ａ参照。
【０２７７】
ＮＩ−２０４．１２Ｇ７は、細胞質ＳＯＤ１封入体、主として運動ニューロンにおけるもの、および細胞外ＳＯＤ１凝集体を含む、ＳＯＤ１病態の顕著な染色を示す（図６Ｃ）。
【０２７８】
ＮＩ−２０４．１０Ａ８は、細胞質ＳＯＤ１封入体、主として運動ニューロンにおけるもの、および細胞外ＳＯＤ１凝集体を含む、ＳＯＤ１病態の顕著な染色を示す（図６Ｂ）。さらに、この抗体は、脊髄組織の強いびまん性染色によって証明されるように、高感度で病的ＳＯＤ１も認識するようである（図６Ｂ）。
【０２７９】
これらの発見は、前記３つの抗体の生化学的結合特性と一致する：ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１への強い結合選好性を示すＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７抗体、ならびに生理的ＳＯＤ１二量体およびミスフォールド／凝集ＳＯＤ１への同等の結合親和性を示すＮＩ−２０４．１０Ａ８抗体。
【０２８０】
ＮＩ−２０４−９Ｆ６抗体は、被験染色条件下で非常に弱く反応し、主として細胞内ＳＯＤ１および細胞内分散ＳＯＤ１封入体を検出する；図６Ｄ参照。
【０２８１】
ヒトＳＯＤ１を特異的に検出するが、マウスＳＯＤ１を検出しない、市販ＥＰＲ１７２６抗ＳＯＤ−１抗体は、生理的ＳＯＤ１および病的ＳＯＤ１凝集体両方に高感度で結合する；図６Ｅ。
【０２８２】
本発明の全ての抗体を試験するために、上記の実験を反復した。図９に示すように、ヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体は、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの腰部脊髄において、異なるＳＯＤ１病態パターン、例えば、分散されたパターン、細胞内封入体パターン、細胞質封入体パターンおよびより大きいパターン、主として細胞外のＳＯＤ１凝集体パターンを明示した。
【０２８３】
図９に示した全ての抗体は、適切な抗体濃度を用いると、細胞内分散封入体、びまん性細胞質構造および空胞構造の染色を示す。参照抗体Ｂ８Ｈ１０との比較対象となるより大きな凝集体の染色（図９Ｍ）により、本発明の抗体は２群に分けられる：抗体ＮＩ−２０４．１２Ｇ７（図９Ｂ）、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１（図９Ｃ）、ＮＩ−２０４．６Ｈ１（図９Ｆ）、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３（図９Ｇ）、ＮＩ−２０４．７Ｇ５（図９Ｈ）、ＮＩ−２０４．２５Ｈ３（図９Ｉ）、ＮＩ−２０４．３４Ａ３（図９Ｊ）およびＮＩ−２０４．７Ｂ３（図９Ｋ）は、脊髄腹側角においてこれらの凝集体を染色し、これに対してＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（図９Ａ）、ＮＩ−２０４．１０Ａ８（図９Ｄ）、ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２（図９Ｅ）は、これらの構造を染色せず、可溶性、ミスフォールド形態の突然変異体ヒトＳＯＤ１（Ｂｏｓｃｏら、２０１０、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３（１１）；１３９６−１４０３）に特異的である参照抗体Ｃ４Ｆ６（図９Ｌ）に類似している。加えて、抗体ＮＩ２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ２０４．６Ｈ１およびＮＩ２０４．７Ｇ５は、脊髄背側角切片において膠様質のびまん性染色を示す。
【０２８４】
さらに、前記抗体の一部 （ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２（図９Ａ）、ＮＩ−２０４．１０Ａ８（図９Ｄ）およびＮＩ−２０４．６７Ｅ１２（図９Ｅ））は、脊髄組織の強いびまん性染色によって証明されるように、高感度で生理的ＳＯＤ１も認識するようである。
【０２８５】
市販Ｃ４Ｆ６（ＭｅｄｉＭａｂｓ、カナダ；＃ＭＭ−００７０−２）およびＢ８Ｈ１０（ＭｅｄｉＭａｂｓ、カナダ；＃ＭＭ−００７０）抗体を対照抗体として使用した。Ｃ４Ｆ６抗体またはＢ８Ｈ１０抗体とのインキュベーションに続いて、ビオチン化ウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１：２５０）とのインキュベーションを行った。抗体シグナルをＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で増幅し、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）で検出した。この染色は、２つの異なる染色パターンを明示した：Ｃ４６Ａ抗体は、点状／びまん性染色を示した（図９Ｌ）のに対し、Ｂ８Ｈ１０抗体は、主として、粒状ＳＯＤ１封入体およびＳＯＤ１凝集体を染色した（図９Ｍ）。
【０２８６】
結論
これらのデータは、ＮＩ−２０４抗体がＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスモデルにおいて病的スーパーオキシドジスムターゼ１構造を認識することを立証する。
【０２８７】
実施例５  ＮＩ−２０４抗体エピトープマッピング
オーバラップペプチドのスキャンをエピトープマッピングのために用いた。ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１の全配列を、個々のペプチド間に１１ａａオーバーラップがある合計３６の直鎖状１５量体ペプチドとして合成し（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ベルリン）、ニトロセルロース膜にスポットした。その膜を５分間、メタノール中で活性化し、その後、室温でＴＢＳ中で１０分間洗浄した。非特異的結合部位を２時間、室温で、Ｒｏｔｉ（登録商標）−Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  Ｇｍｂｈ＋Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ国カールスルーエ）でブロックした。ヒトＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３それぞれＮＩ−２０４．２５Ｈ３抗体（１μｇ／ｍＬ）を３時間、室温で、Ｒｏｔｉ（登録商標）−Ｂｌｏｃｋ中でインキュベートした。ＨＲＰ接合ロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、一次抗体の結合を判定した。ＥＣＬおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ３５０検出（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スイス国オッテルフィンゲン）を使用してブロットを現像した。
【０２８８】
ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３それぞれによりＮＩ−２０４．２５Ｈ３抗体により認識されるスーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質内のエピトープをマッピングするために、ペプスキャン膜（ｐｅｐｓｃａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と全スーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質配列をカバーする３６の１５ａａペプチド（ペプチド間に１１のアミノ酸のオーバーラップ）を使用した。図７に具体例として示すように、ペプチド番号２２、２３および２４へのＮＩ−２０４．１０Ｄ１２の顕著な結合が観察され、これは、この抗体によって認識されるエピトープがＳＯＤ１の中央ドメインに局在することを示す。したがって、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２結合エピトープは、ＳＯＤ１アミノ酸９３−９９内に局在すると予測される。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２は、脂肪および配列ＤＧＶＡＤＶＳの下線の付いたアミノ酸９３−９９（配列番号２）から成る中央ドメインに結合する。本発明のヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１１Ｆ１１、ＮＩ−２０４．６Ｈ１、ＮＩ−２０４．１２Ｇ３、ＮＩ−２０４．７Ｇ５、ＮＩ−２０４．７Ｂ３、ＮＩ−２０４．３４Ａ３およびＮＩ−２０４．２５Ｈ３の類似に同定された結合エピトープを下の表ＩＶにまとめる。
【０２８９】
表ＩＶ：ヒトＳＯＤ１タンパク質配列の示されているアミノ酸配列内の異なるヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体の同定結合エピトープ。
【０２９０】
【表４】
2018171051.tif 000009
ＮＤ：ＰｅｐＳｐｏｔ技術の使用により結合エピトープ同定なし。
【０２９１】
実施例６  野生型、Ｇ９３Ａ突然変異体およびマウスＳＯＤ１由来ペプチドへのＮＩ−２０４．１０Ｄ１２結合
スーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質のＮＩ−２０４／１０Ｄ１２結合エピトープをカバーするビオチン化ペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ベルリン）をＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬの濃度で用いて４℃で一晩、ストレプトアビジン被覆９６ウェルマイクロプレート（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を被覆した。２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）を含有する、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて１時間、室温で、非特異的結合をブロックした。一次抗体キメラＮＩ−２０４．１０Ｄ１２を示されている濃度に希釈し、１時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、英国ニューマーケット）を使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。
【０２９２】
キメラ組み換えＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体は、野生型ヒト、Ｇ９３Ａヒトおよびマウススーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質に由来する同定ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２結合エピトープをカバーするアミノ酸配列を有する合成ペプチドに、濃度依存的様式で結合する（図８）。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２は、前記３つの異なるＳＯＤ１種に同等の親和性で結合する。ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１におけるＮＩ−２０４．１０Ｄ１２エピトープ内にある位置９３でのアミノ酸交換は、家族性形態のＡＬＳに結び付けられる。これらの発見は、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体が散発性および家族性ＡＬＳの治療に適した候補薬であることを示す。
【０２９３】
実施例７  本発明の抗体の生体内試験
上で既に説明したしょうに、抗ヒトＳＤＯ１抗体の直接脳室内注入に基づく受動免疫アプローチを用いるトランスジェニックマウス系統での研究により、そのような治療が、ＳＯＤ１  ｆＡＬＳマウスモデルにおいて寿命を延長することおよび運動ニューロン減少を減弱することにより疾病を軽減し得ることは証明されている（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４（２００７）、２４９５−２５００；Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２０１０）１１３、１１８８−１１９９）。対照的に、能動的ワクチン接種アプローチは、有意な防御を付与することができなかった（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４ （２００７）、２４９５−２５００）。しかし、能動的ワクチン接種は、老人集団の有意な割合がワクチン接種に対する非応答者であると予想されるので、ヒトでは特に利用できないことがある。さらに、ＳＯＤ１に対する免疫反応に随伴する潜在的副作用は、制御が難しい場合がある。本発明のＳＯＤ１結合分子が、マウス抗体について上で説明したのと同様のＳＯＤ１凝集体の脳内レベル低減を果たすことは、病的ミスフォールド／凝集ＳＯＤ１種に対するそれらの同様の結合特性のため、合理的に予想することができる。
【０２９４】
しかし、ヒト免疫系内での進化的最適化および親和性成熟のため、本発明の抗体は、健常ヒト被験体から単離され、安全性プロファイルが優れているおよび免疫原性がない可能性が高いため、価値ある治療ツールをもたらす。マウス抗体の代わりにヒト抗体を用いて上述の出版物に記載の試験方法により、これらの予想される治療効果を、確認することができる。詳細には、スクリーニングすべき抗体を動物に多様な可能な経路、例えば、腹腔内抗体注射、頭蓋内注射、脳室内脳内注入で適用し、治療効果について試験した。
【０２９５】
ＡβおよびＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）突然変異体の共発現は、ダブルトランスジェニックマウスにおいて緩衝液不溶性ＳＯＤ１凝集体の上昇をもたらし、これはＡＬＳ発現におけるＡβの潜在的役割を示唆している（Ｌｉら、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．５（２００６）、１５３−１６５）。ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脳へのベータ−アミロイド調製物の事前の脳内注射後に、上述のいずれかの適用可能性を利用して、Ａβ誘導ＳＯＤ１病態に対する治療効果を評価することができる。
【０２９６】
本発明の抗体の治療効果の評価および確認は、前記マウスの筋肉萎縮の発症に起因する体重変化および全生存時間をモニターすることにより行うことができる。筋肉萎縮の発症前に、協調運動または動作いずれかに関する多様な運動障害を、治療の結果としての発生遅延について試験することができる。これは、例えば回転棒、握力試験、伸展反射試験、足把持持久力試験（ｐａｗ  ｇｒｉｐ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）、Ｙ迷路、新規物体認識試験またはオープンフィールド活動などの、標準的な行動試験によって行うことができる（Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．（２０００）Ｗｈａｔ’ｓ  Ｗｒｏｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｙ  Ｍｏｕｓｅ？：Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０２９７】
さらに、毒性細胞内封入体の形成のモニタリング、脊髄切片を用いる運動ニューロンの染色および計数、全ヒトＳＯＤ１染色、ならびに／または逐次的脊髄抽出による脊髄可溶性および不溶性ＳＯＤ１レベルの生化学的判定を含む、組織化学的方法を用いることができる（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４（２００７），２４９５−２５００）。
【０２９８】
実施例８  天然ＳＯＤ１二量体、変性／酸化ＳＯＤ１および組み換えＳＯＤ１への結合分析
方法
体外スーパーオキシドジスムターゼ１凝集
金属触媒酸化反応を用いて体外スーパーオキシドジスムターゼ１凝集（Ｒａｋｈｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２００４）、１５４９９−１５５０４に従って）を誘導した。ヒト赤血球からの天然ＳＯＤ１（二量体）および多の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）から購入した。凝集のために、４ｍＭアスコルビン酸と０．２ｍＭ  ＣｕＣｌ２とを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０中で１０μＭヒトＳＯＤ１を４８時間３７℃でインキュベートした。対照として、１０μＭヒトＳＯＤ１を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０中で４８時間、３７℃でインキュベートした。
【０２９９】
体外スーパーオキシドジスムターゼ１変性
Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１７（２０１１）、９１−９９に従って、スーパーオキシドジスムターゼ１変性反応を行った。ヒト赤血球からの天然ＳＯＤ１（二量体）および多の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）から購入した。変性のために、２３μＭヒトＳＯＤ１を３．５Ｍ塩化グアニジウムおよび２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中で４時間、２２℃でインキュベートした。その後、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を含有するＰＢＳに対して変性溶液を透析し、２０，０００ｇで遠心分離してＳＯＤ１凝集体を除去し、変性ＳＯＤ含有上清を回収した。
【０３００】
ダイレクトＥＬＩＳＡ
天然ヒトＳＯＤ１二量体または体外変性／酸化ヒトＳＯＤ１または組み換えＳＯＤ１（Ｂｉｏｍｏｌ、ドイツ国）のいずれかを被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）中２０μｇ／ｍＬの濃度で用いて９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を被覆した。２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス国ブーフス）を含有する、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を用いて１時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。一次抗体を示されている濃度に希釈し、１時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰと接合したロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的抗体、またはＨＲＰと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）特異的抗体のいずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでＨＲＰ活性を測定した。
【０３０１】
ＥＣ５０決定
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国サンディエゴ）を使用する非線形回帰により、ＥＤ５０値を推定した。
【０３０２】
結果
天然ヒトＳＯＤ１二量体、変性／酸化ヒトＳＯＤ１および組み換えＳＯＤ１に対する異なるヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体のＥＣ５０を、それらの異なるＳＯＤ１種を２０μｇ／ｍＬ濃度で被覆してダイレクトＥＬＩＳＡにより決定した。前記異なるＳＯＤ１種に対する前記ヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体について判定された結合親和性を下の表ＩＩＩにまとめる。
【０３０３】
表ＩＩＩ：異なるＳＯＤ１種に対する異なるヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体の結合親和性。
【０３０４】
【表３】
2018171051.tif 000010
ＮＤ：判定されなかった
【０３０５】
ヒトＳＯＤ１特異的抗体は、組み換えおよび変性／凝集ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１に優先的に結合し、ピコモルから低ナノモル値の範囲のＥＣ５０を有する。これらの発見は、ＮＩ−２０４抗体の大部分が、天然形態ではなく変性／酸化形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ１の病理学的に意味のある立体構造の、露出されるヒトＳＯＤ１のエピトープを優先的に標的にすることを示唆している。抗体ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２、ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．９Ｆ６だけは、異なるＳＯＤ１種を区別せず、 ＮＩ−２０４．６７Ｅ１２抗体はピコモルの高い総合結合親和性を有し、ならびに抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．９Ｆ６はナノモル範囲の親和性を有する。
【０３０６】
結論
金属触媒酸化によって誘導されるスーパーオキシドジスムターゼ１凝集体およびフォールディングされていないＳＯＤ１は、ＡＬＳ関連、体内スーパーオキシドジスムターゼ１凝集体に類似したまたは該凝集体と同一の特性を保有する。幾つかのヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体は、治療上意味のあるミスフォールド形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ１、例えば、フォールディングされていない／酸化されたＳＯＤ１への顕著な結合を示す。フォールディングされていない／酸化されたスーパーオキシドジスムターゼ１への結合は、天然二量体より選好されるようである。これらの発見は、病理学的に意味のある立体構造のスーパーオキシドジスムターゼ１タンパク質に対して標的化される本発明のヒト由来ＳＯＤ−１抗体の治療上魅力的なプロファイルを強調する。
【０３０７】
その後、間に数か月の遅延期間を設けて実施例３および８を行った。この間、抗体ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２、ＮＩ−２０４．１２Ｇ７、ＮＩ−２０４．１０Ａ８およびＮＩ−２０４．９Ｆ６は、数か月間の凍結・融解に起因する損傷を最小にするためにＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２不含のリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で少量ずつ、４℃で、または好ましくは−２０℃、もしくは−８０℃で保存した。
【０３０８】
一般に、結合親和性に関して類似したデータが両方の実験で得られた場合、抗体ＮＩ−２０４．１０Ａ８は、生理的ＳＯＤ−１に対しておよび凝集ＳＯＤ−１に対しても、２０ｎＭ、実施例３において算出するとそれぞれ３０ｎＭから、表ＩＩＩに示すように両方の形態のＳＯＤ１について１００ｎＭを超えるまでの結合親和性の有意な減少を示した。 
【０３０９】
タンパク質が、そのような安定性の減少につながることがある氷−水表面変性、凍結濃縮および低温変性を冷凍中に被ることは公知である。例えば、ＫｏｌｈｅおよびＢａｄｋａｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２７（２０１１）、４９４−５０４；Ｈａｗｅら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．３８（２００９）、７９−８７；Ｌｕ  Ｙら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９７（２００８）、１８０１−１８１２；ならびにＧｌｉｃｋ  ＳＭ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３７（１９７３），４６１−４６２を参照されたい。本態様において、本発明が提供する抗体は異なる安定性プロファイルを示し、使用前に少なくとも数か月という長期間にわたって保存することができる抗体（例えば、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２およびＮＩ−２０４．１２Ｇ７）もあり、産生後に凍結段階なしで使用しなければならない抗体（例えば、ＮＩ−２０４．１０Ａ８）もある。
【０３１０】
実施例９  ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２治療効力：生体内概念実証
抗ヒトＳＤＯ１抗体の直接脳室内注入に基づく受動免疫アプローチを用いるトランスジェニックマウス系統での研究により、そのような治療が、ＳＯＤ１  ｆＡＬＳマウスモデルにおいて寿命を延長することおよび運動ニューロン減少を減弱することにより疾病を軽減し得ることは証明されている（Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４（２００７）、２４９５−２５００；Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２０１０）１１３、１１８８−１１９９）。 
【０３１１】
Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウス系統をヒト由来ＳＯＤ−１抗体の治療効力の評価に使用した。このトランスジェニックマウス系統は、ＡＬＳについてのよく確立され、特性付けされているマウスモデルである。ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体の治療効力の評価および確認を、前記マウスの筋肉萎縮の発症に起因する体重変化および全生存期間をモニターすることによって行った。筋肉萎縮の発症前に、動作に関する運動障害を、治療の結果としての発生遅延について足把持持久力試験により試験した。さらに、運動ニューロン減少のＮＩ−２０４．１０Ｄ１２媒介減弱を評価するための脊髄切片での運動ニューロンの染色および計数に、組織化学的方法を用いた。慢性治療レジメン中のマウス抗ヒト抗体反応を回避するために、マウスＩｇ２ａ定常ドメインに融合したＮＩ−２０４．１０Ｄ１２ヒト可変ドメインから成るキメラバージョンのＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体を研究に使用した。
【０３１２】
方法
脳内注入のためのＡｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ミニポンプの外科的埋め込み
６０日齢Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスに深麻酔（フェンタニル／ミダゾラム／メデトミジン）し、小さな正中切開を施して頭骨を露出させ、抗体溶液またはＰＢＳを充填した滅菌Ａｌｚｅｔ（登録商標）ミニポンプ（ＡＬＺＥＴ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ；Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、米国カリフォルニア、モデル１００４、長さ１．５ｃｍ、直径０．６ｃｍおよび空重量０．４ｇ加重）を挿入することができるようにマウスの背部の肩甲骨中央領域に皮下ポケットを作製した。その後、脳定位固定装置内にマウスの頭部を固定し、骨縫合接合部ブレグマを基準点として使用して頭骨に穴をあけ、Ａｌｚｅｔ（登録商標）脳内注入キット３カニューレを左側脳室へと低下させた；ブレグマに従って調整する；ＡＰ、−０．２ｍｍ；ＭＬ、０．９ｍｍ；およびＤＶ、２．５ｍｍ。カニューレの配置後、２本の小さなネジを頭骨内に配置し、歯科用セメントを塗布して頭骨にしっかりと取り付けた。ナロキソン（５６９５２（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、ＯｒＰｈａ  Ｓｗｉｓｓ  ＧｍｂＨ、スイス国キュスナハト）、フルマゼニル（４８２８０（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）、スイス国ライナッハ）／アチパメゾール（６０５６２（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｄｒ．Ｅ．Ｇｒａｕｂ  ＡＧ、スイス国ベルン）およびメタカム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ドイツ国）を解毒剤および術後鎮痛薬として皮下投与し、さらに飲料水中のメタカムおよびブプレノルフィン（４１９３１、４４１００（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）／フェニルブタゾン（４２７２６（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｓｔｒｅｕｌｉ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、スイス国ウツナッハ）／アミノフェナゾン／ベンジルペニシリン（５６２７１（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｇｒｕｎｅｎｔｈａｌ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、スイス国グラールス）／ジヒドロストレプトマイシン（４２７９０（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ｓｔｒｅｕｌｉ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、スイス国ウツナッハ）を鎮痛薬／抗生物質として１週間与えた。術後、回復を促進するためおよび脱落を低減するために、マウスを３日間、ヒートパッド上で飼育し、カーゴの床に含水飼料を置いた。
【０３１３】
Ａｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ミニポンプモデル１００４が、抗体またはＰＢＳ溶液を１時間につき０．１１μＬ＝１日につき２．６４μＬの持続注入速度で合計２８日の期間にわたって側脳室に送る。ポンプ内の抗体溶液の濃度を、１日につき０．１ｍｇ／ｋｇ体重になるように選択した。
【０３１４】
ポンプ交換
２８日ごとに浸透圧ミニポンプを交換した。Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスに吸入麻酔（３．５％Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎ（５３２１１（Ｓｗｉｓｓｍｅｄｉｃ）、Ａｂｂｏｔｔ  ＡＧ、スイス国バール）によって深麻酔し、ポンプの上に小切開を施し、ポンプを脳内注入用カニューレから取り外し、取り出した。新たに充填されたポンプを挿入し、注入用カニューレに接続し、創傷クリップを使用して切開部位を閉じた。
【０３１５】
握力分析
握力測定装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア国コメロ、カタログ番号４７１０６）を使用して、マウスの握力を測定した。このシステムにはセンサーに接続しているグリッドが備えられている。４本の足がグリッドをつかむまでマウスを低下させ、その後、握った足を離すまで穏やかに引き戻した。３回の施行にわたってマウスが達成した最大の力を電子的に記録した。
【０３１６】
臨床エンドポイント
マウスが横向きに寝てから１５秒以内に自らを起こすことができないことにより、重症動作不能運動ニューロン病の臨床エンドポイントを定義した。運動ニューロン病の被定義臨床エンドポイントに、実験時間中の任意の時点で、到達していなかったマウスのカプラン・マイヤー生存分析によって、生存確率を試験した。
【０３１７】
免疫組織化学および運動ニューロン計数
疾病末期のＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの脊髄をリン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋し、５μｍ切片に切断した。ニッスル染色（０．５％クレシルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ５０４２））については、切片をニッスル溶液で３分間、室温で染色し、その後、３分間、蒸留水で洗浄した。標準プロトコルに従って、切片をさらに処理した。ＮｅｕＮ染色については、ギ酸前処理後、切片をモノクローナルＮｅｕＮ抗体、１：１０００希釈（ＭＡＢ３７７；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベートした。抗体シグナルを標準ＤＡＢ検出システムで増幅した。ＮｅｕＮ染色は、自動Ｌｅｉｃａ  ＢｏｎｄＭａｘ（商標）染色システム（Ｌｅｉｃａ、ドイツ国ヴェッツラー）で行った。
【０３１８】
動物１匹につき８個の腰部脊髄切片（それぞれ１００μｍの間隔をあけた）の両方の側腹角における３０μｍより大きい直径を有するニッスル陽性またはＮｅｕＮ陽性ニューロンを計数した。
【０３１９】
結果
ＳＯＤ１を標的にするヒト由来抗体の薬理学的治療効果を評価するために、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスに、日齢６０日で開始して３ヶ月間、直接脳室内脳内注入によりＮＩ−２０４．１０Ｄ１２抗体を慢性投与した。慢性２０４．１０Ｄ１２抗体治療は、ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの寿命を１１日まで有意に延長し、平均生存時間は、慢性ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２注入を受けたマウスでは１６４±３日であり、これに対してビヒクル処置群では１５３±４日であった（ｐ＜０．０５；図１０（Ａ））。さらに、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウスの慢性ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２治療は、ＰＢＳ治療対照群と比較して、全疾病経過を通して体重減少の有意な遅延をもたらした（図１０（Ｂ））。ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて疾病進行中に観察された重度進行性運動障害は、ビヒクル対照と比較して抗体治療群での握力動作改善によって明らかであるように、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２治療によって改善された（図１１）。腰部脊髄側腹角における運動ニューロンの補足の定量分析は、ビヒクル治療マウスと比較してＮＩ−２０４．１０Ｄ１２で治療したマウスにおける運動ニューロン減少の有意な減弱を明示した。これは、ＮＩ−２０４．１０Ｄ１２治療が突然変異体ＳＯＤ−１過発現によって媒介される運動ニューロンの変性から保護できることを示唆している（図１２）。これらの発見は、慢性投与により疾病発症を遅延することができ、生存を延長することができ、体重および運動動作を向上させることができ、ならびに神経変性を改善することができる、ヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体の絶大な治療効果を強調する。したがって、ヒト由来ＳＯＤ１特異的抗体は、ＡＬＳの治療のための有望な新規候補薬である。
【０３２０】
実施例１０  ＳＯＤ１抗体のＩｇＧ生殖細胞系ファミリー分類
異なるヒトＳＯＤ１特異的抗体の可変領域の配列分析により、ＮＩ−２０４抗体を生殖細胞系ＩｇＧファミリーに分類することができる（表Ｖ）。
【０３２１】
ヒトＮＩ−２０４抗体を生殖細胞系Ｖセグメントファミリーに分類するために、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（英国ケンブリッジ）によって提供されているデータベースＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）で、元の可変領域のヌクレオチド配列をヒト生殖細胞系配列とアラインした。それらの生殖細胞系を、重鎖についてはそれらの遺伝子座によって、および軽鎖についてはそれらのＶｂａｓｅ登録番号によって特定した（下の表Ｖを参照されたい）。
【０３２２】
表Ｖ：生殖細胞系免疫グロブリン配列比較によるＮＩ−２０４抗体ファミリーの分類（抗体名の最後の文字がそれらのタイプを示す：Ｈ−重、Ｋ−カッパ、Ｌ−ラムダ）
【０３２３】
【表５】
2018171051.tif 000011
【図１−１】
2018171051.tif 000012
【図１−２】
2018171051.tif 000013
【図１−３】
2018171051.tif 000014
【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018171051.tif 000019
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018171051.tif 000023
【図１０】
2018171051.tif 000024
【図１１】
2018171051.tif 000025
【図１２】
2018171051.tif 000026
【配列表】
2018171051000001.app