(57)【要約】【課題】天然物由来の骨代謝調整剤の提供を目的とする。【解決手段】ツバキ科ツバキ属に属する植物の葉から熱水で抽出した熱水抽出物からなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツバキ科ツバキ属に属する植物の葉から熱水で抽出した熱水抽出物からなる骨代謝調整剤。
【請求項２】
前記熱水抽出物を濃縮及び／又は凍結乾燥した請求項１記載の骨代謝調整剤。
【請求項３】
ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性を有し、且つＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）酵素活性を抑制する作用を有する請求項１又は２記載の骨代謝調整剤。
【請求項４】
骨芽細胞の分化を誘導し、破骨細胞の分化を抑制する請求項１又は２記載の骨代謝調整剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収からなる骨代謝のバランス調整に寄与する骨代謝調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の代謝は、骨吸収と骨形成のバランスにより血中のカルシウムの値を調整し、骨の強度を保つ働きがある。
骨吸収では、破骨細胞が骨を融解してカルシウムが血中に行き、血中のカルシウム濃度が上がる。
一方、骨形成では、骨芽細胞が骨表面を覆って新しい骨のもととなる骨基質蛋白を産生し、カルシウムを石灰化して沈着させる機能を有する。
したがって、骨代謝のバランスが崩れると、骨粗鬆症等の原因になる。
そこで本発明者は、人体に優しい天然物由来の骨代謝調整剤を検討した結果、本発明に至った。
【０００３】
特許文献１には、ツバキ花粉のエタノール抽出物を含有する抗骨粗鬆症剤を開示する。
しかし、ツバキの葉を用いた場合にエタノール抽出物では、マウス骨芽細胞前駆細胞株の継続培養実験にて、骨芽細胞の分化において誘導されるタンパク質ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）を例にその発現量を調査した結果、ツバキ葉の熱水抽出物よりも少ないことが明らかになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１８０１５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、天然物由来の骨代謝調整剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る骨代謝調整剤は、ツバキ科ツバキ属に属する植物の葉から熱水で抽出した熱水抽出物からなる。
ここで、熱水抽出物を濃縮及び／又は凍結乾燥してもよい。
【０００７】
本発明に係る骨代謝調整剤は、ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性を有し、且つＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）酵素活性を抑制する作用を有する。
また、骨芽細胞の分化を誘導し、破骨細胞の分化を抑制する。
本発明に係るツバキ科ツバキ属に属する植物としては、ツバキ（Camellia japonica）が代表的であり、ヤブツバキ，ユキツバキ，ユキバタツバキ等が例として挙げられる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る骨代謝調整剤は、骨芽細胞の分化を誘導し、破骨細胞の分化を抑制する作用があり、骨代謝のバランスの調整に有用で、例えば抗骨粗鬆症剤等の医薬組成物に適用できる。
医薬組成物の形態に制限はなく、錠剤，顆粒剤，カプセル剤，ドリンク剤等が例として挙げられる。
他のお茶飲料等の各種飲料に添加した飲料、あるいは種々の食品に添加してもよい。
このようなツバキ葉熱水抽出物添加飲料又は食品は、骨代謝の改善，骨代謝異常に伴う疾病の予防に用いることができる。
また、サプリメントとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ツバキ葉の、熱水抽出物とエタノール抽出物とのＡＬＰ染色結果を示す。
【図２】骨芽細胞の分化に関連する遺伝子の発現量の比較結果を示す。
【図３】ＴＲＡＰ活性の測定結果を示す。
【図４】破骨細胞の分化に関連する遺伝子の発現量の測定結果を示す。
【図５】破骨細胞の分化に関連する遺伝子の発現量の測定結果を示す。
【図６】骨代謝のメカニズムを模式的に示す。
【図７】破骨細胞形成アッセイによる評価結果を示す。
【図８】フローサイトメトリーによるＣＤ１１ｂの発現比較を示す。
【図９】フローサイトメトリーによるＣＤ４４の発現比較を示す。
【図１０】フローサイトメトリーによるＣＤ６１の発現比較を示す。
【図１１】ＣＨＥ投与によるマウスの体重、子宮重量の変化量を示す。
【図１２】血清中成分の測定結果を示す。
【図１３】マウスの大腿骨の断面写真を示す。
【図１４】図１３に示した大腿骨の骨重量と海綿骨領域長さの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
骨代謝のメカニズムを図６に模式的に示す。
骨芽細胞の分化及び破骨細胞の分化誘導の各段階で発現する因子に着目して、実験を行った。
ツバキの葉を細断し、１５分間熱水（沸騰）にて抽出を行った。
熱水抽出の条件は８０℃以上の温水でもよいが、本実験ではツバキ葉を沸騰水に１０〜１５分間浸けた。
後述するＡＬＰ染色においては、濾液をフィルター減菌し、タンパク質濃度をＤＣプロテインアッセイ（ＢＩＵ  ＲＡＤ社）を使用して定量し、実験に使用した。
また、骨芽細胞関連及び破骨細胞関連の評価には、エバポレーターで濃縮し、さらに凍結乾燥して得られた粉末を用いた。
以下、必要に応じてツバキ葉熱水抽出物をＣＨＥと表現する。
【００１１】
図６に示したように骨芽細胞分化前・中期には、ＡＬＰの発現量が増加することから、ＡＬＰ活性の有無を調査した。
なお、熱水抽出とエタノール抽出とを比較した。
＜＜ＡＬＰ染色の実験手順＞＞
１．１０％ＦＢＳ添加条件下で、マウス骨芽細胞前駆細胞株，ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播種し、２４時間の前培養を実施した。
２．前培養後、ツバキ葉熱水抽出物（ＣＨＥ）を０．１２〜３．９１μｇ／ｍｌ（タンパク質濃度）、骨芽細胞分化誘導因子であるβ−グリセロリン酸（１０ｍＭ）とＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳを添加し、１０日間の継続培養を実施した。
３．継続培養後、ＡＬＰ陽性細胞数を評価するためにＴＲＡＰ／ＡＬＰ染色キット（和光純薬株式会社）を使用して、ＡＬＰ染色を行った。
ここで、各略語は次のとおりである。
ＡＬＰ：Alkaline Phosphatase（アルカリフォスファターゼ）
ＴＲＡＰ：Tartarate-resistant acid phosphatase （酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）
その結果を図１のグラフに示す。
ツバキ葉抽出物を添加しないコントロールに対しては、熱水抽出物，エタノール抽出物のいずれの添加も染色面積が増大したが、熱水抽出物の方がエタノール抽出物よりも染色面積が大きく、優れたＡＬＰ活性を有していた。
【００１２】
次に、骨芽細胞の分化マーカーとして知られているＯＰＮ，ＯＣＮ，ＯＳＮの発現の有無を調査した。
＜＜骨芽細胞遺伝子発現評価の実験手順＞＞
１．１０％ＦＢＳ添加条件下でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播種し、２４時間の前培養を実施した。
２．前培養後、ツバキ葉熱水抽出物（ＣＨＥ）を０．０１〜１μｇ／ｍｌ、β−グリセロリン酸（１０ｍＭ）、Ｌ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳを添加し、１０日間の継続培養を実施した。
３．継続培養後、ＩＳＯＧＥＮ２（ニッポン・ジーン社）でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。
さらにＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用してｃＤＮＡを合成した。
その後、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）でＰＣＲ反応を行い、骨芽細胞分化マーカーであるＯＰＮ，ＯＣＮ，ＯＳＮの遺伝子発現を評価した。
なお、比較対象としてＢＭＰ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）についても評価した。
ここで、各略語は次の通りである。
ＯＰＮ：Osteopontin（オステオポンチン）
ＯＣＮ：Osteocalcin（オステオカルシン）
ＯＳＮ：Osteonectin（オステオネクチン）
ＭＢＰ−２：Bone morphogenetic protein-2（骨形成タンパク質２）
その結果を、図２のグラフに示す。
図２のグラフ中「ＣＨＥ」は、ツバキ葉熱水抽出物をいい、このＣＨＥを添加することでコントロールを１とした相対量で、ＯＰＮ：約３倍，ＯＣＮ：約６倍の発現量の増加を確認できた。
【００１３】
次に破骨細胞に関連する評価を実施した。
まずは、破骨細胞の分化に特異的に発現するマーカー酵素であるＴＲＡＰについて調査した。
＜＜ＴＲＡＰ活性の実験手順＞＞
１．ｄｄＹ系統メスマウス大腿骨から骨髄細胞を回収後２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞密度で播種し、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（和光純薬株式会社）添加条件下で３日間培養した。
２．培養後、ツバキ葉熱水抽出物（ＣＨＥ）を０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、さらに１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）添加条件下で４日間の継続培養を実施した。
なお、ＣＨＥを添加していないＲＡＮＫＬ（−）とＲＡＮＫＬ（＋）を設けた。
３．継続培養後、培地を除去し、以下のように調製したＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
６００ｍＭ  ＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）
・１７．６ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ
・９．２ｍｇ／ｍｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ
・３．６ｍｇ／ｍｌ  ４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｓｏｄｉｕｍ
・０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
・６ｍＭ  ＥＤＴＡ
・６００ｍＭ  ＮａＣｌ
・６００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ
ここで、各略語は次のとおりである。
Ｍ−ＣＳＦ：Macrophage colony-stimulating factor（マクロファージコロニー刺激因子）
ＲＡＮＫＬ：Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand（ＮＦ−Ｂ活性化受容体リガンド）
その結果を図３のグラフに示す。
グラフ中、ＮＣ：Ｍ−ＣＳＦ（＋），ＲＡＮＫＬ（＋）及びＰＣ：Ｍ−ＣＳＦ（＋），ＲＡＮＫＬ（−）条件とした。
なお、ＲＡＮＫＬは破骨細胞の分化に必須のサイトカインである。
この結果、ＣＨＥは、ＴＲＡＰ酵素活性を抑制することが明らかになった。
【００１４】
次に、他の分化マーカーの発現についても評価した。
＜＜破骨細胞関連遺伝子発現評価の実験手順＞＞
１．マウスから骨髄細胞を回収後２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ添加条件下で３日間培養した。
２．培養後、ツバキ葉熱水抽出物を１〜１０μｇ／ｍｌ、さらに１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ添加条件下で４日間の継続培養を実施した。
なお、比較対象としてＣＨＥを添加していないＲＡＮＫＬ（−）とＲＡＮＫＬ（＋）を設けた。
３．継続培養後、ＩＳＯＧＥＮ２でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。
さらにＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅを使用してｃＤＮＡを合成した。
その後、Ｔａｋａｒａ  ＴａｑでＰＣＲ反応を行い、破骨細胞分化マーカーである、ＴＲＡＰ、ＭＭＰ−９、ＮＦＡＴｃ１、ＲＡＮＫの遺伝子発現を評価した。
ここで、各略語は次のとおりである。
ＴＲＡＰ：Tartarate-resistant acid phosphatase（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）
ＭＭＰ９：Matrix metalloproteinase 9（マトリックスメタロプロテアーゼ９）
ＮＦＡＴｃｌ：Nuclear factor of activated T cell c1
ＲＡＮＫ：Receptor activator of nuclear factor kappa-B（ＮＦ−κＢ活性化受容体）
その結果を図４，図５のグラフに示す。
ＣＨＥの添加により、破骨細胞の細胞内シグナル伝達因子における遺伝子の発現が抑制されているのが分かる。
【００１５】
図７に破骨細胞形成アッセイを用いて実験評価した結果を示す。
実施方法は、Ｄｅｎｔｉｎ  ｓｌｉｃｅ上でｄｄＹマウス骨髄細胞由来マクロファージを培養し破骨細胞へと分化させた。
同時にＣＨＥを添加した。
１２日後、Ｄｅｎｔｉｎ  ｓｌｉｃｅを取り出しマイクロチューブに回収した。
細胞を剥離させるため、１  Ｍ  アンモニア水にＤｅｎｔｉｎ  ｓｌｉｃｅを浸透させ、超音波処理を行った。
超音波処理後のＤｅｎｔｉｎ  ｓｌｉｃｅを蒸留水で洗浄し、水分を除いた後、固定処理を行い、ギムザ液に浸透させ染色した。
染色後は蒸留水で洗浄し、Ｄｅｎｔｉｎ  ｓｌｉｃｅを乾燥させた。
骨吸収窩のレベルを比較すると、破骨細胞の分化に必須のＲＡＮＫＬを添加したものに対して、ＣＨＥを０．１，１，５μｇ／ｍｌ添加すると、骨溶解能が抑制されていた。
【００１６】
図８〜１０に、フローサイトメトリーにより各因子の発現を比較した結果を示す。
具体的には、ｄｄＹマウスから骨髄細胞を調製し、破骨細胞分化誘導と同時にＣＨＥを添加し、１２日間培養した。
培養後、細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識ＣＤ１１ｂ抗体、ＦＩＴＣ標識ＣＤ４４抗体、ＦＩＴＣ標識ＣＤ６１抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー解析を行った。
図８は、骨髄系細胞に強く発現するＣＤ１１ｂをＲＡＮＫＬ（＋）とＣＨＥ１０μｇ／ｍｌにて比較した結果を示し、ＣＨＥの添加によりＣＤ１１ｂの発現が上昇していた。
図９は、破骨細胞の分化過程にて増大することが知られているＣＤ４４の発現を比較した結果を示し、ＣＨＥ１０μｇ／ｍｌ添加することで、ＣＤ４４の発現を抑制することが確認できた。
図１０は、細胞接着因子ＣＤ６１の発現を比較した結果を示し、ＣＥＥ１０μｇ／ｍｇの添加により、このＣＤ６１の発現が抑えられていた。
【００１７】
次にマウスを用いて、ＣＨＥの投与試験を行った。
７週齢のｄｄＹマウスを１週間の予備飼育後、卵巣摘出コントロール群をＯＶＸ群、ＯＶＸマウスにツバキ葉熱水抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与するＣＨＥ１００群、ＯＶＸマウスにツバキ葉熱水抽出物を２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与するＣＨＥ２５０群、ＯＶＸマウスにツバキ葉熱水抽出物を５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ経口投与するＣＨＥ５００群、疑似手術を行ったｓｈａｍ群の計５群（各群５匹）に分別した。
図１１は、２８日間ＣＨＥを経口投与行った後、マウスの体重測定を行った結果及びマウスの子宮重量を測定した結果を示す。
ＣＨＥ投与により体重は大きく変化しなかったが、子宮重量が大きく増大した。
全てのマウスから血液を回収し、血清を調製し、図１２は血清中のカルシウム、リン、マグネシウム濃度の測定結果を示し、濃度の測定にはそれぞれカルシウムＥ−テストワコー、ホスファＣ−テストワコー、マグネシウムＢ−テストワコー（いずれも和光純薬）を使用した。
その結果、ＣＨＥ投与により血清中のＣａ，Ｐ，Ｍｇが減少していた。
図１４左に、マウスから摘出した大腿骨を５０℃の乾燥機で３日間乾燥させた後に、大腿骨から筋肉片を取り除き、重量を測定した結果を示す。
図１３に乾燥させた大腿骨の研磨標本を作製し、顕微鏡で観察を行った結果を示し、図１４右にデジタルノギス（ミツトヨ社）を使用して海綿骨領域の長さを測定した結果を示す。
これらから、ＣＨＥ経口投与により骨重量が増加し、海綿骨領域の範囲が増加することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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