(57)【要約】      （修正有）【課題】単糖、二糖、三糖を含むキチンオリゴ糖混合物より、四糖〜七糖のキチンオリゴ糖を、高純度かつ高収率で単離精製する方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるキチンオリゴ糖混合物から、ｎが４〜７の整数であるキチンオリゴ糖を単離精製する方法であって、（１）該キチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液を調製する工程と、（２）工程（１）で調製された水溶液に有機溶媒を加え、有機−水混合溶媒に不溶な成分を析出させる工程と、（３）工程（２）で析出させた不溶成分を回収する工程と、を含む、方法。工程（１）のキチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液が、酸を含む水溶液と混合して、調整される方法。好ましくは酸が塩酸である、方法。工程（２）の有機溶媒が、好ましくはアルコール類である、方法。2018080124.tif 000010（ｎは１〜７の整数）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2018080124.tif 000009
（式中、ｎは１〜７の整数を示す）
で表されるキチンオリゴ糖混合物から、ｎが４〜７の整数であるキチンオリゴ糖を単離精製する方法であって、
（１）該キチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製された水溶液に有機溶媒を加え、有機−水混合溶媒に不溶な成分を析出させる工程；および
（３）工程（２）で析出させた不溶成分を回収する工程
を含む、方法。
【請求項２】
キチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液が、キチンオリゴ糖混合物を、酸を含む水溶液と混合して調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸が塩酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒がアルコール類である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
単離精製されたｎが４〜７の整数であるキチンオリゴ糖の純度が７０％以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチンオリゴ糖の単離精製方法に関する。より詳細には、本発明は、単糖、二糖、三糖を含むキチンオリゴ糖混合物より、四糖以上のものを高純度で含むキチンオリゴ糖を高収率で単離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、カニやエビなどの甲殻類の殻の主要な構成成分であり、これらの殻からタンパク質やカルシウムを取り除いて精製される。キチンは簡単に言えば、Ｎ−アセチルグルコサミンの重合体であり、化学構造は、下記の式（Ｉ）：
【０００３】
【化１】
2018080124.tif 000002
【０００４】
（式中、ｎは重合度を示す。）
で表すことができる（以下、「（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ」と略す場合がある。）。キチンは、自然界ではセルロースに次いで豊富に存在する多糖である。その応用に関する研究は、本来廃棄される生物資源を有効利用する意味も持つ。
ここで、キチンオリゴ糖は、本来キチンのうちｎ＝４〜７程度の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを意味する。ｎが８以上の長鎖長の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは水に難溶であり、用途が限られる一方、ｎが７以下の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは比較的水溶性が高く、薬剤としても用いることができる。その応用用途としては、健康食品や植物活力剤としての利用が知られている。
これまで、実験室的ないしは工業的にキチンオリゴ糖が得られているが、従来の技術では、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを主成分とするキチンオリゴ糖の調製は容易ではなく、ｎ＝１〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの混合物を「キチンオリゴ糖」と称しているのが実情であった。
しかしながら、顕著な免疫賦活効果やエリシター（植物に病害抵抗反応を誘導する）活性が報告されているのは、ｎ＝４〜７、特にｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎであり（特許文献１〜５、非特許文献１〜３）、純度の高いキチンオリゴ糖が強く望まれている。
【０００５】
通常、天然物の単離精製は、カラムクロマトグラフィーによる精製等、言わば物理的な分離法により行われる（非特許文献４）。同法は一般にコストと時間を要し、純度と収率の両立にも難がある。ゆえに、純度の高いキチンオリゴ糖を得るための従来の技術は、実用的であるとはいえなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２２４２３０号公報
【特許文献２】特開２００４−２１０６６７号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２４５２号公報
【特許文献４】特開２００２−１７７０００号公報
【特許文献５】特開平１０−２８７５７２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】N. Shibuya and E. Minami；Physiol. Mol. Plant Pathol., 2001, 59, 223.
【非特許文献２】H. Yin, X. Zhao and Y. Du；Carbohydr. Polym., 2010, 82, 1
【非特許文献３】W.-J. Jung and R.-D. Park；Mar. Drugs, 2014, 12, 5328.
【非特許文献４】キチン、キトサンオリゴ糖の生産と利用；澱粉科学, １９９０，３７，７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、キチンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはこれまで、目的物質と共存成分との有機−水混合溶媒に対する溶解度の違いに基づく天然物の単離精製法を確立してきた（例えば、Analytical Sciences, 2015, 32, 85、Analytical Sciences, 2015, 32, 1273）。また、キチンの類縁体であるキトサンオリゴ糖については、疎水性アニオンとの沈殿生成、有機溶媒への再溶解、塩酸塩としての再沈殿に基づき、混合物から所定の重合度のものが単離できることを示してきた（Journal of Chitin and Chitosan Science, 2014, 2, 75）。
上記知見を（ＧｌｃＮＡｃ）ｎに適用したところ、（１）ＧｌｃＮＡｃ残基に対し過剰の酸を共存させることで、高濃度の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎが溶解した水溶液が得られる；（２）該水溶液に、水と混ざり合う有機溶媒を添加して、該水溶液の溶媒を有機−水混合溶媒とすると、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは前記混合溶媒にも溶解したままであるが、ｎが４以上の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは前記混合溶媒には溶解しにくく、析出して懸濁物となりやすい；（３）前記懸濁物について遠心分離操作を行い、懸濁された状態の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを沈降せしめることで、これを回収できる；ことを見出した。これらの操作により、ｎ＝１〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの混合物からｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを除去し、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを主成分とするキチンオリゴ糖が得られることを認めたことから、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］式（Ｉ）：
【００１１】
【化２】
2018080124.tif 000003
【００１２】
（式中、ｎは１〜７の整数を示す）
で表されるキチンオリゴ糖混合物から、ｎが４〜７の整数であるキチンオリゴ糖を単離精製する方法であって、
（１）該キチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製された水溶液に有機溶媒を加え、有機−水混合溶媒に不溶な成分を析出させる工程；および
（３）工程（２）で析出させた不溶成分を回収する工程
を含む、方法。
［２］キチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液が、キチンオリゴ糖混合物を、酸を含む水溶液と混合して調製される、［１］に記載の方法。
［３］酸が塩酸である、［２］に記載の方法。
［４］有機溶媒がアルコール類である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］単離精製されたｎが４〜７の整数であるキチンオリゴ糖の純度が７０％以上である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、ｎ＝１〜７のキチンオリゴ糖混合物から、ｎ＝４〜７のキチンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製することができる。
さらに、本発明の方法は、従来のカラムクロマトグラフィーによる精製と比較して、格段に短時間（例えば、カラムクロマトグラフィーによる精製は通常１日以上を要するのに対し、数分）で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の好適な実施の形態として、実施例の操作手順を示す。
【図２】図２は、実施例１〜３において、出発原料として用いたキチンオリゴ糖混合物［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝１〜７の整数］の１０ｍｇを、純水１０ｍＬに溶解させて調製した水溶液のクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、実施例１で出発原料であるキチンオリゴ糖１０ｍｇから単離精製されたキチンオリゴ糖混合物（精製物１）を、１０ｍＬの純水に溶解させた水溶液のクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、実施例２で単離精製されたキチンオリゴ糖混合物（精製物２）を、１０ｍＬの純水に溶解させた水溶液のクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、実施例３で単離精製されたキチンオリゴ糖混合物（精製物３）を、１０ｍＬの純水に溶解させた水溶液のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のキチンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製する方法（以下、本明細書において「本発明の方法」ともいう）は、以下の工程を含む。
（１）下記式（Ｉ）で表されるキチンオリゴ糖混合物の高濃度水溶液を調製する工程；
【００１６】
【化３】
2018080124.tif 000004
【００１７】
（式中、ｎは、１〜７の整数を示す。）
（２）工程（１）で調製された水溶液に有機溶媒を加え、有機−水混合溶媒に不溶な成分を析出させる工程；および
（３）工程（２）で析出させた不溶成分を回収する工程。
【００１８】
［工程（１）］
キチンオリゴ糖混合物の高濃度の水溶液は、キチンオリゴ糖混合物［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝１〜７の整数］の粉末を、酸を含む水溶液と混合して得ることができる。
上記酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の強酸が望ましく、食品添加物および医薬としての利用における安全性の観点から、塩酸の使用がより望ましい。
酸の使用量は、キチンオリゴ糖の重量１０ｍｇに対し、通常０．０１ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌであり、好ましくは０．０５ｍｍｏｌ〜０．５ｍｍｏｌであり、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ〜０．２ｍｍｏｌである。酸の使用量が０．０１ｍｍｏｌ未満であると、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの除去率が低下する場合がある。一方、酸の使用量が１ｍｍｏｌを超えると、後の工程に於いて有機溶媒を多量に添加せざるを得ない場合がある。
キチンオリゴ糖水溶液の体積は、キチンオリゴ糖の重量１０ｍｇに対し、通常０．０１ｍＬ〜１ｍＬであり、好ましくは０．０２ｍＬ〜０．５ｍＬであり、より好ましくは０．０５ｍＬ〜０．２ｍＬである。ある。該体積が０．０１ｍＬ未満であると、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの除去率が低下する場合がある。一方、該体積が１ｍＬを超えると、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの収率が低下する場合がある。
【００１９】
［工程（２）］
工程（１）で調製された水溶液に有機溶媒を加えて混合し、前記水溶液の溶媒を有機−水混合溶媒とする。この工程において、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは、有機−水混合溶媒に対し不溶性であることから、析出して前記溶媒中に懸濁された状態となる。一方、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎは、有機−水混合溶媒中に溶解して留まる。
上記有機溶媒としては、水と混ざり合い、なおかつ、その結果生じる有機−水混合溶媒に、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを溶解せしめる一方、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの溶解度が低いものであれば、特に限定されるものでなく、たとえば、アルコール類が挙げられ、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールがより好ましい。食品添加物および医薬としての利用における安全性の観点から、エタノールの使用が特に望ましい。
有機溶媒の使用量は、工程（１）で調製された水溶液の体積０．１ｍＬに対し、通常０．１ｍＬ〜４ｍＬであり、好ましくは０．２ｍＬ〜２ｍＬであり、より好ましくは０．５ｍＬ〜１ｍＬである。有機溶媒の使用量が０．１ｍＬ未満であると、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの収率が低下する場合がある。一方、有機溶媒の使用量が４ｍＬを超えると、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの除去率が低下する場合がある。
【００２０】
［工程（３）］
工程（２）で析出させた不溶性成分の懸濁液より、不溶性成分を回収する。不溶性成分の回収方法としては、有機−水混合溶媒に対して不溶性の成分を回収することができれば、特に限定されず、遠心分離により固液分離して沈降物を回収する方法、濾過により不溶性成分を回収する方法等が挙げられる。
遠心分離は、通常１０℃〜３０℃において、３，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍにて１分間〜５分間程度行う。また、濾過は、通常孔径０．５μｍ〜１０μｍ程度の濾紙またはメンブレンフィルターを用いて、１０℃〜３０℃で行うことができる。
このようにして、キチンオリゴ糖混合物［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝１〜７の整数］から、所望のキチンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝４〜７の整数］を単離精製することができる。
【００２１】
本発明の方法は、本発明の特徴を損なわない限り、通常化学物質の単離精製において行われる他の工程を含むことができる。
かかる工程としては、回収された精製物の洗浄、乾燥等が挙げられる。
工程（１）〜（３）を行うことにより得られた精製物の洗浄は、有機溶媒により行うことができる。
洗浄に用いる有機溶媒としては、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの溶解度が低いものであれば、特に限定されるものではなく、アルコール類、特に低級アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）が挙げられる。食品添加物および医薬としての利用における安全性の観点から、エタノールの使用がより望ましい。
精製物の洗浄における有機溶媒の使用量は、通常、工程（２）での有機溶媒の使用量の１／５倍から２倍であるが、特に限定されるものではない。
【００２２】
工程（１）〜（３）を行って得られた精製物の乾燥は、精製物中に残留する溶媒を除去するための通常の乾燥手段により、行うことができる。
精製物の乾燥手段としては、精製されたキチンオリゴ糖の物性、品質等に悪影響を及ぼさない限り特に限定されないが、自然乾燥または減圧乾燥等により、残留する溶媒を蒸発させて除去する方法、凍結乾燥等が挙げられる。
【００２３】
また、工程（１）〜（３）を行うことにより得られた精製物に対し、工程（１）〜（３）を再度行うことによって、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの除去率を高め、より精製されたキチンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝４〜７の整数］を得ることができる。
【００２４】
さらに、工程（１）〜（３）を行うことにより得られた精製物に対し、必要に応じて工程（１）〜（３）を複数回繰り返すことで、ｎ＝４の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎをも除去することができ、ｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎからなるキチンオリゴ糖を得ることができる。
【００２５】
本発明の方法により単離精製されたキチンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ；ｎ＝４〜７の整数］の純度は７０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。
【００２６】
本発明の方法により単離精製されたキチンオリゴ糖は、水溶性で、顕著な免疫賦活効果やエリシター活性の報告されている、重合度が４〜７のキチンオリゴ糖の含有量が高いため、医薬品、食品（保健機能食品、健康食品等）および植物活力剤の有効成分として、有用である。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下において、遠心分離はエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）社製遠心分離機「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４２７Ｒ」を用いて行った。
クロマトグラムは、以下の条件で測定して得た。
高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）装置：サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）社製、「ＭｕｌｔｉＭａｔｅ」
カラム：東ソー株式会社製、「ＴＳＫ−ゲルアミド−８０カラム」(４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ)
測定温度：７０℃
移動相：アセトニトリル−水混合溶媒（体積比＝７０／３０）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：１９０ｎｍでの吸光度（Ａ１９０）により検出
【００２８】
以下に記載する実施例の操作手順を図１に示す。
【００２９】
［実施例１］
工程（１）：
キチンオリゴ糖混合物（甲陽ケミカル株式会社製、「コーヨーキチンオリゴ糖」）の１０ｍｇに、１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸水溶液（和光純薬工業株式会社製、「容量分析用塩酸溶液」）の０．１ｍＬを加え、１００ｇ／Ｌの濃度でキチンオリゴ糖混合物を含む水溶液を調製した。
【００３０】
出発物質、即ち、上記工程で用いたキチンオリゴ糖混合物の１０ｍｇを純水１０ｍＬに溶解させて得た水溶液のクロマトグラムを図２に示した。図２において、ｎ＝１〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの各ピークが観察され、出発原料がｎ＝１〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎを含む混合物であることが確認できた。
なお、ｎ＝２〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのそれぞれについて標準試料を得るのは容易ではないため、単純にピーク面積比が組成比と等しいと仮定して、出発原料１０ｍｇ中に含まれるｎ＝１、２、３、４、５、６、７の各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの含有量を算出し、結果を表１に示した。
【００３１】
【表１】
2018080124.tif 000005
【００３２】
表１より、出発原料として用いたキチンオリゴ糖混合物中におけるｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの含有率は、３３．３％と算出された。
【００３３】
工程（２）：
工程（１）で調製した水溶液に、０．９ｍＬのエタノール（和光純薬工業株式会社製、特級）を加えて攪拌し、エタノール−水混合溶媒に不溶な成分を析出させ、懸濁液を得た。
【００３４】
工程（３）：
工程（２）で得た懸濁液を、２５℃にて１５，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、沈降物と上澄みに固液分離させた。上澄みを捨てて、エタノール−水混合溶媒に不溶な成分を回収した（以下「精製物１」と呼ぶ）。
【００３５】
精製物１をエタノールで洗浄した。洗浄した精製物１を純水１０ｍＬに溶解させた水溶液について得られたクロマトグラムを図３に示した。図３において、ｎ＝１〜７の各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピークのピーク面積より、精製物１中における各重合度の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの含有量を算出し、表２に示した。
【００３６】
【表２】
2018080124.tif 000006
【００３７】
表２より、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎがほとんど除去されたことが確認できた。一方、精製物１中におけるｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの含有率は、９５．７％と算出された。
図２および図３における各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピーク面積の比較により、ｎ＝４、５、６、７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの収率は、それぞれ、３９％、８９％、９５％および１００％と算出され、ｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎが高収率で回収できたことが示された。
【００３８】
［実施例２］
実施例１で得られた精製物１に対し、上記実施例１の工程（１）〜（３）を再度行って、エタノール−水混合溶媒に不溶な成分を回収し、エタノールで洗浄した（以下、「精製物２」と呼ぶ）。精製物２を純水１０ｍＬに溶解させた水溶液について得られたクロマトグラムを図４に示した。
図４において、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピークが観察されたが、ｎ＝１〜３の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピークはもはや有意に検出されず、ｎ＝４〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの純度が極めて高い（＞９９％）ことが確認できた。図４における各ピーク面積から、精製物２中のｎ＝４、５、６、７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ含有量を算出し、表３に示した。
【００３９】
【表３】
2018080124.tif 000007
【００４０】
また、図２および図４における各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピーク面積の比較により、ｎ＝４、５、６、７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの収率は、１４％、８０％、９３％および１００％と算出された。これより、精製物２においても、ｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎが、中でも特に、ｎ＝６〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎが高収率で回収できたことが示された。
【００４１】
［実施例３］
実施例１で得られた精製物１に対し、工程（１）〜（３）を４回繰り返して、エタノール−水混合溶媒に不溶な成分を回収し、エタノールで洗浄した（以下、「精製物３」と呼ぶ）。精製物３を純水１０ｍＬに溶解させた水溶液について得られたクロマトグラムを図５に示した。
図５において、ｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピークが観察されたが、もはや、ｎ＝４の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピークは有意に検出されず、精製物３におけるｎ＝５〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの純度は極めて高いことが確認できた。図５における各ピークのピーク面積より、精製物３中におけるｎ＝５、６、７の各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの含有量を算出し、表４に示した。
【００４２】
【表４】
2018080124.tif 000008
【００４３】
図２および図５における各（ＧｌｃＮＡｃ）ｎのピーク面積の比較により、ｎ＝５、６、７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎの収率は、４７％、８４％および１００％と算出された。これより、精製物３においては、ｎ＝６〜７の（ＧｌｃＮＡｃ）ｎが高収率で回収されたことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の方法により、四糖から七糖までのキチンオリゴ糖を、高純度かつ高収率で単離精製することができる。
さらに、本発明の方法は、従来のカラムクロマトグラフィーによる精製と比較して、格段に短時間で行うことができる。
【図１】
2018080124.tif 000011
【図２】
2018080124.tif 000012
【図３】
2018080124.tif 000013
【図４】
2018080124.tif 000014
【図５】
2018080124.tif 000015