(57)【要約】      （修正有）【課題】ワクシニアウイルスのクローン株の提供。【解決手段】特定のヌクレオチド配列を含むクローン株以外の単離されたＬＩＶＰクローン株であって、クローン株が非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有するように改変されず、より高い抗腫瘍形成性および／または低下している毒性を有する、単離されたＬＩＶＰクローン株ウイルス調製物から弱毒化クローン株および腫瘍崩壊クローン株を同定および単離する方法も提供する。クローン株およびウイルス調製物は、診断および治療方法のために、特に、限定されるものではないが、固形腫瘍および血液がんなどの新生物疾患を含む増殖性障害の治療および診断またはモニタリング処置のために用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むクローン株以外である単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項２】
配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と比較し、より高い抗腫瘍形成性および／または低下した毒性を有する、請求項１に記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項３】
そのゲノム中に、非ウイルス異種核酸またはオープンリーディングフレームの欠失をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項４】
配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスと比較し、低下した毒性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項５】
配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較し、より高い抗腫瘍形成性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項６】
配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスと比較し、低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項７】
配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むが、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含まない、請求項１から６のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項８】
配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項９】
配列同一性が、逆位末端反復（ＩＴＲ）に対応するヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列のアラインメント、および末端ギャップがペナルティを受けないＧＡＰ配列アラインメントプログラムにより決定される全体的アラインメントの使用により決定される、請求項７または請求項８に記載の単離されたクローン株。
【請求項１０】
ａ）配列番号１のヌクレオチド１０，０７３〜１８０，０９５、配列番号２のヌクレオチド１１，２４３〜１８２，７２１、配列番号４のヌクレオチド６，２６４〜１８１，３９０、配列番号５のヌクレオチド７，０４４〜１８１，８２０、配列番号６のヌクレオチド６，６７４〜１８１，４０９、配列番号７のヌクレオチド６，７１６〜１８１，３６７もしくは配列番号８のヌクレオチド６，８９９〜１８１，８７０；または
ｂ）配列番号１のヌクレオチド１０，０７３〜１８０，０９５、配列番号２のヌクレオチド１１，２４３〜１８２，７２１、配列番号４のヌクレオチド６，２６４〜１８１，３９０、配列番号５のヌクレオチド７，０４４〜１８１，８２０、配列番号６のヌクレオチド６，６７４〜１８１，４０９、配列番号７のヌクレオチド６，７１６〜１８１，３６７もしくは配列番号８のヌクレオチド６，８９９〜１８１，８７０の配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から９のいずれかに記載の単離されたクローン株。
【請求項１１】
左および／または右の逆位末端反復を含む、請求項１０に記載の単離されたクローン株。
【請求項１２】
配列番号１、２、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列、配列番号１、２、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の単離されたクローン株。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰクローン株を増殖させることにより製造されるＬＩＶＰ調製物。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれかに記載のクローン株を含む細胞培養物または単離された細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞または細胞培養物を増殖させること；および
得られた細胞からＬＩＶＰクローンを単離すること
により製造される単離されたクローン株。
【請求項１６】
請求項１から１２または１５のいずれかに記載のＬＩＶＰクローン株のゲノム；およびそのゲノム中の異種遺伝子産物をコードする核酸
を含む、組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項１７】
異種遺伝子産物をコードする核酸が、ウイルスのゲノム中の非必須遺伝子もしくは領域に挿入されるか、またはウイルスのゲノム中の非必須遺伝子もしくは領域の代わりに挿入される、請求項１６に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項１８】
異種遺伝子産物をコードする核酸が、ウイルスのゲノム中のヘマグルチニン（ＨＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｆ１４．５Ｌ、ワクシニア成長因子（ＶＧＦ）、Ａ３５Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｅ２Ｌ／Ｅ３Ｌ、Ｋ１Ｌ／Ｋ２Ｌ、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子座、７．５Ｋ、Ｃ７−Ｋ１Ｌ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌまたは１４Ｌ遺伝子座に挿入されている、請求項１６または請求項１７に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項１９】
異種遺伝子産物が治療剤または診断剤である、請求項１６から１８のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２０】
異種遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変するかまたは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、ＰＥＴ画像化のための遺伝子ならびにＭＲＩ画像化のための遺伝子から選択される、請求項１６から１９のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２１】
抗転移剤が、転移定着を阻害するか、またはインビトロ細胞浸潤アッセイにおいて細胞浸潤を阻害する、請求項２０に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２２】
抗血管新生剤が腫瘍における血管形成を阻害する、請求項２０に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２３】
異種遺伝子産物が、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子から選択される治療剤である、請求項１６から２２のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２４】
異種遺伝子産物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、Ｔリンパ球上で発現される受容体であるＨＶＥＭについてＨＳＶ糖タンパク質と競合するリンホトキシン誘導性発現物（ＬＩＧＨＴ）、ｐ６０スーパー抗原、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ１α）、ＳＴＡＴ１β、プラスミノゲンｋ５ドメイン（ｈＫ５）、色素上皮分化因子（ＰＥＤＦ）、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体、一本鎖抗ＤＬＬ４抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＮＭ２３、カドヘリン１（ＥＣＡＤまたはｃｄｈ１）、リラキシン１（ＲＬＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マイクロＲＮＡ１２６（ｍｉＲ−１２６）、マイクロＲＮＡ１８１、マイクロＲＮＡ３３５、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ｎｐｐａ１）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＣＤＣ６、および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）から選択される治療剤である、請求項１６から２３のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２５】
一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体がＧ６と命名される、請求項２４に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２６】
異種遺伝子産物が、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質である診断剤である、請求項１６から２０のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２７】
異種遺伝子産物が、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、検出することができる造影剤、発色団、化合物もしくはリガンドに結合する、および／またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質から選択される診断剤である、請求項１６から２０または２６のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２８】
造影剤に結合する、および／またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質が鉄受容体、鉄輸送体、銅取込み輸送体である、請求項２７に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項２９】
異種遺伝子産物が、ヒカリコメツキムシ（ｇｅｅｎ  ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ）ルシフェラーゼ、ｌｕｘオペロン、赤外蛍光タンパク質、フラビンリダクターゼタンパク質、ｍＮｅｐｔｕｎｅ近赤外蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、セレンテラジン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ヒトエピネフリン受容体（ｈＮＥＴ）、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質、シトクロムｐ４５０ファミリー酵素、アロスタチンＡ受容体（ＡｌｓｔＲ）、Ｐｅｐ１受容体（ＰＥＰＲ−１）、ＬＡＴ−４、ステロール１４α−デメチラーゼ（Ｃｙｐ５１）、トランスフェリン受容体（ＴＲ）、フェリチン、二価金属輸送体（ＤＭＴ）、マグネトタクティックＡ（ＭａｇＡ）およびシスプラチン流入輸送体（ＣＴＲ１）から選択される診断剤である、請求項２７または請求項２８に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項３０】
組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子が、ｎｅｗｔＡＧ（ｎＡＧ）、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、Ｎｇｎ３、Ｐｄｘ１およびＭａｆａから選択される、請求項２０に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項３１】
異種遺伝子産物をコードする核酸が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項１６から３０のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項３２】
プロモーターが哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターである、請求項３１に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項３３】
プロモーターが、Ｐ７．５Ｋ、Ｐ１１Ｋ、ＰＳＥ、ＰＳＥＬ、ＰＳＬ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、Ｐ２８、Ｃ１１Ｒ、Ｇ８Ｒ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ３Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ａ３Ｌ、Ｈ１Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｈ８Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ４Ｒ、Ｄ５Ｒ、Ｄ９Ｒ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｐ４ｂまたはＫ１プロモーターから選択される、請求項３１または請求項３２に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれかに記載のウイルス株を含む組成物。
【請求項３５】
請求項１から３３のいずれかに記載のウイルス株を含む医薬組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
局部または全身投与のために製剤化された、請求項３５または３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
１つまたは複数の異なるウイルス株を含む、請求項３４から３７のいずれかに記載の組成物または医薬組成物。
【請求項３９】
抗ウイルスまたは抗がんワクチンとしての投与のために製剤化された、請求項３５から３８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４０】
請求項３５から３９のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、対象における増殖性障害を処置する方法。
【請求項４１】
増殖性障害の処置のための第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
増殖性障害ががんである、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
増殖性障害が腫瘍または転移である、請求項４０から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
対象がヒトまたは非ヒト動物である、請求項４０から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
非ヒト動物がウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、およびモルモットから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスが、投与の１サイクルにわたって少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕまたは約１ｘ１０５ｐｆｕまたは１ｘ１０５ｐｆｕである量で投与される、請求項４０から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスが、投与の１サイクルにわたって少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０８ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０９ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１０ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１１ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１２ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１３ｐｆｕもしくは少なくとも１ｘ１０１４ｐｆｕ、または約１ｘ１０５ｐｆｕ、約１ｘ１０６ｐｆｕ、約１ｘ１０７ｐｆｕ、約１ｘ１０８ｐｆｕ、約１ｘ１０９ｐｆｕ、約１ｘ１０１０ｐｆｕ、約１ｘ１０１１ｐｆｕ、約１ｘ１０１２ｐｆｕ、約１ｘ１０１３ｐｆｕもしくは約１ｘ１０１４ｐｆｕ、または１ｘ１０５ｐｆｕ、１ｘ１０６ｐｆｕ、１ｘ１０７ｐｆｕ、１ｘ１０８ｐｆｕ、１ｘ１０９ｐｆｕ、１ｘ１０１０ｐｆｕ、１ｘ１０１１ｐｆｕ、１ｘ１０１２ｐｆｕ、１ｘ１０１３ｐｆｕもしくは１ｘ１０１４ｐｆｕである量で投与される、請求項４０から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスの量が、投与のサイクルにわたって、２回、３回、４回、５回、６回または７回投与される、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ウイルスの量が、サイクルの１日目、サイクルの１および２日目、サイクルの最初の連続する３日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する４日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する５日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する６日間のそれぞれ、またはサイクルの最初の連続する７日間のそれぞれに投与される、請求項４７から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
投与のサイクルが７日間、１４日間、２１日間または２８日間である、請求項４７から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
投与のサイクルが複数回反復される、請求項４７から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
手術、放射線療法、免疫抑制療法および抗がん剤の投与から選択される他の処置をさらに含み、さらなる処置がウイルスを用いる前に、後に、同時に、または間欠的に行われる、請求項４０から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
さらなる処置が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤およびそれらの任意の組合せから選択される抗がん剤の投与である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
抗がん剤がシスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＶＥＧＦ抗体から選択される、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ウイルスと抗がん剤が連続的、同時的、または間欠的に投与される、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ウイルスが、全身的、静脈内的、動脈内的、腫瘍内的、内視鏡的、病変内的、筋肉内的、皮内的、腹腔内的、膀胱内的、関節内的、胸膜内的、経皮的、皮下的、経口的、非経口的、鼻内的、気管内的、吸入的、頭蓋内的、前立腺内的、硝子体内的、局所的、眼内的、経膣的、または直腸的に投与される、請求項４０から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
ウイルスが静脈内投与される、請求項４０から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１から３３のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルスまたはクローン株を対象に投与すること；および
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出すること
を含み、それによって検出が対象における腫瘍または転移の存在を示す、対象における腫瘍または転移を検出する方法。
【請求項６０】
検出が、対象を画像化することにより行われる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
検出が、組織または体液試料中の前記タンパク質またはシグナルを検出することにより行われる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質が、ルシフェラーゼ；蛍光タンパク質；生物発光タンパク質；検出することができる造影剤、発色団、化合物もしくはリガンドに結合する、および／もしくはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質から選択される、請求項５９から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、鉄受容体、鉄輸送体、ヒトエピネフリン受容体（ｈＮＥＴ）およびヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルが、高感度画像化、蛍光分光法、Ｘ線画像化、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）または単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）により検出される、請求項５９から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１から３３のいずれかに記載のウイルスを対象に投与すること；および
検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出すること
を含み、検出が、ウイルスが対象において複製していることを示す、宿主におけるウイルス複製を検出する方法。
【請求項６６】
対象が腫瘍またはがんを有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ウイルスの投与後に、対象から体液試料を取得すること；および体液中の検出可能なタンパク質またはシグナルを検出することを含む、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
体液が尿、血液、涙または脳脊髄液から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項１から３３のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルス株を含む、単離された宿主細胞または細胞培養物。
【請求項７０】
請求項１から３３のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルスまたはクローン株を含む、対象における増殖性疾患を処置するための使用のための組成物。
【請求項７１】
対象における増殖性障害の処置のための医薬組成物の調製のための請求項１から３３のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルスまたはクローン株の使用。
【請求項７２】
ウイルス株の濃度が１ｘ１０６〜１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌであるか、または少なくとも１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌもしくは少なくとも１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌである、または約１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌもしくは約１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌである、または１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌ、もしくは１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌである、請求項７０または請求項７１に記載の組成物または使用。
【請求項７３】
組成物が抗がん剤をさらに含む、請求項７０から７２のいずれかに記載の組成物または使用。
【請求項７４】
抗がん剤がサイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管形成阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤およびそれらの任意の組合せから選択される、請求項７３に記載の組成物または使用。
【請求項７５】
抗がん剤がシスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、ならびに抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＶＥＧＦ抗体から選択される、請求項７３または７４に記載の組成物または使用。
【請求項７６】
増殖性障害ががんである、請求項７０から７５のいずれかに記載の組成物または使用。
【請求項７７】
がんが乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんである、請求項７６に記載の組成物または使用。
【請求項７８】
がんが固形腫瘍がんまたは転移がんである、請求項７０から７７のいずれかに記載の組成物または使用。
【請求項７９】
腫瘍または転移が乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である、請求項７８に記載の組成物または使用。
【請求項８０】
組成物が全身または局部投与のために製剤化される、請求項７０から７９のいずれかに記載の組成物または使用。
【請求項８１】
組成物が静脈内投与のために製剤化される、請求項７０から８０のいずれかに記載の組成物または使用。
【請求項８２】
（ｉ）異なるゲノム配列を有するウイルス粒子の混合物を含有する第１のＬＩＶＰウイルス試料を用意すること；
（ｉｉ）試料から単一のクローン単離物を選択および単離すること；
（ｉｉｉ）毒性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること；
（ｉｖ）抗腫瘍形成性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること；ならびに
（ｖ）参照ＬＩＶＰウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性および低下した毒性を示すクローン株を選択すること
を含み、それによって低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を示すクローン単離物が、がんの治療または診断のためのＬＩＶＰクローン株であると同定される、がん療法およびがん診断のためのＬＩＶＰクローン株を選択する方法。
【請求項８３】
参照ＬＩＶＰウイルスが弱毒化組換えＬＩＶＰウイルスである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
参照ＬＩＶＰウイルスが、ゲノムが配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス（ＧＬＶ−１ｈ６８）である、請求項８２または請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
第１のＬＩＶＰウイルス試料が、配列番号１０に記載のゲノムまたは配列番号１０と少なくとも９９％同一であるゲノムを有するＬＩＶＰを含むＬＩＶＰウイルス株である、請求項８２から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
第１のＬＩＶＰウイルス試料が、ＬＩＶＰ株および他のウイルス株、ゲノムＤＮＡまたはクローニングされたＤＮＡに感染した細胞の増殖、次いで、培養物からのウイルス試料の単離により得られた混合物であり、前記試料が前記感染により生成された子孫ウイルスを含む、請求項８２から８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
他のウイルス株が、ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスおよび一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスから選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ＤＮＡウイルスが、アビポックスウイルス、粘液腫ウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘパドナウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのヘルペスウイルス；ならびにパルボウイルスなどの一本鎖ＤＮＡウイルスから選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
他のウイルス株がワクシニア株である、請求項８６から８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
二本鎖ＲＮＡウイルスが、ロタウイルスなどのレオウイルスである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスが、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルスまたはポリオウイルス、エンテロウイルスなどのピコルナウイルス；セムリキ森林熱ウイルスなどのトガウイルス；ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびレンチウイルスなどのレトロウイルスから選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス；ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルスまたはムンプスウイルスなどのパラミクソウイルス；および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスから選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
試料からの単一クローン単離物がプラークアッセイにより選択される、請求項８２から９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
プラークアッセイにおける最大のプラークが選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも最大の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個のプラークがクローン単離物として選択および単離され、それぞれがステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）で毒性および抗腫瘍形成性についてアッセイされる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
選択されるプラークがＬＩＶＰウイルス試料により生成されるプラークの平均プラークサイズよりも大きい、請求項９３から９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
請求項８２から９６のいずれかに記載の方法により製造されるクローン株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
優先権の利益が、それぞれ、Ａｌａｄａｒ  Ａ．  Ｓｚａｌａｙ、Ｎａｎｈａｉ  Ｃｈｅｎ、Ｙｏｎｇ  Ａ．  ＹｕおよびＱｉａｎ  Ｚｈａｎｇの、それぞれ「Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の表題の２０１１年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／５１７，２９７号および２０１１年１１月４日に出願された米国特許仮出願第６１／６２８，６８４号に対して主張される。
【０００２】
本出願は、米国特許仮出願第６１／５１７，２９７号および第６１／６２８，６８４号の優先権を主張する、「Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の表題の、本出願と同日に出願された米国特許出願番号（代理人整理番号３３３１６．０４８３２．ＵＳ０３／４８３２）と関連する。
【０００３】
認められた場合、上記参照出願の各々の主題はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
電子的に提供された配列表の参照による組込み
配列表の電子バージョンが本明細書と共に出願され、その内容はその全体が参照により組み込まれる。電子ファイルは、４．４４メガバイトのサイズであり、４８３２ｓｅｑＰＣ１．ｔｘｔのファイル名が付けられている。
【０００５】
発明の分野
ワクシニアウイルス単離物。
【背景技術】
【０００６】
ワクシニアは、腫瘍崩壊ウイルスであり、腫瘍中に蓄積する。治療および診断適用のために弱毒化ワクシニアウイルス株が開発されてきた。例えば、弱毒化ウイルスとしては、ウイルス遺伝子の発現の喪失もしくは低下またはウイルスタンパク質の不活化をもたらす１つまたは複数のウイルス遺伝子が改変された組換えウイルスが挙げられる。しかしながら、ウイルスを弱毒化する方法は、ウイルスの腫瘍崩壊特性を減少または低下させ得る。かくして、弱毒化腫瘍崩壊ウイルスおよび弱毒化腫瘍崩壊ウイルスを同定する方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＬＩＶＰ調製に由来する単離されたクローン株が提供される。実質的に同種のＬＩＶＰウイルス調製の調製物が提供される。また、単離されたクローン株の増殖から得られる調製物も提供される。特に、ゲノムが配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含有するクローン株以外のヌクレオチド配列を含有するゲノムを有する単離されたＬＩＶＰクローン株が本明細書で提供される。いくつかの例においては、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するが、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含まないヌクレオチド配列を有する。例えば、本明細書で提供される単離されたＬＩＶＰクローン株は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。そのような例において、配列同一性とは、逆位末端反復（ＩＴＲ）（それらが存在する場合）に対応するヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を整列させ、末端ギャップがペナルティを受けない、ＧＡＰを用いる全体的アラインメントを用いて決定される配列同一性を指す。特に、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたＬＩＶＰ株と比較して、より高い抗腫瘍形成性および／または低下した毒性を有する。
【０００８】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株の例においては、単離されたＬＩＶＰクローン株は、ＬＩＶＰ単離物中またはＬＩＶＰから増殖させたウイルス調製物中に存在するものであり、そのクローン株は配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較して低下した毒性および／またはより高い抗腫瘍形成性を有する。
【０００９】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株の他の例においては、単離されたＬＩＶＰクローン株は、非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有し、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較して低下した毒性および／または改善された抗腫瘍形成性を示す、非ウイルス異種核酸を含有しないゲノムを有するものである。
【００１０】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較して低下した毒性を有するクローン株を含む。他の例においては、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性を有するクローン株を含む。さらなる例においては、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルス株と比較して低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を有するクローン株を含む。
【００１１】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株のいずれかにおいて、ＬＩＶＰクローン株のゲノムは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するが、配列番号１０に記載のヌクレオチドの完全配列を含有しないヌクレオチド配列を有する。例えば、単離されたＬＩＶＰクローン株は、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。そのような例において、配列同一性は、逆位末端反復（ＩＴＲ）に対応するヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列のアラインメントにより、および末端ギャップがペナルティを受けない、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列とのＧＡＰを用いる全体的アラインメントを用いて決定される。
【００１２】
低下した毒性を示す提供されるＬＩＶＰクローン株のいずれかにおいて、低下した毒性を、対象への投与時に明らかにすることができる。例えば、対象は、ヒトまたは非ヒト動物、特に、家畜であってよい。限定されるものではないが、対象の生存期間の減少、体重の減少、発熱、発疹、アレルギー、疲労、腹痛、対象における免疫応答の誘導、膿疱形成および／またはＬＩＶＰ（配列番号１０に記載されるか、もしくは実質的に記載される、典型的には、少なくとも９９％記載されるゲノムを有するウイルス）もしくはＧＬＶ−１ｈ６８（配列番号９に実質的に記載される、典型的には、少なくとも９９％記載されるゲノムを有するウイルス）より高い程度での非腫瘍組織中へのウイルスのより少ない蓄積などの毒性を示すパラメータなどの毒性効果を評価するための任意の方法により、低下した毒性を決定することができる。特に、ウイルスが検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルもしくは他のそのようなマーカーを誘導するタンパク質を発現する例において、ウイルス蓄積を検出するための対象の画像化などの任意の好適な方法により、蓄積を検出することができる。また、体組織および／または体液をサンプリングすることにより、蓄積を検出することもできる。いくつかの例においては、低下した毒性とは、対象が、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスを投与された対象と比較して、少ない毒性効果を経験するか、または毒性効果を経験しないことを意味し、それによってＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスが前記クローン株と類似する量で、およびそれと同じ投薬レジメンで投与される。他の例においては、低下した毒性は、対象がウイルスの投与時に誘導される毒性効果に由来して死亡しないことを意味する。
【００１３】
いくつかの例においては、ＬＩＶＰクローン株は、配列番号９に記載のゲノムを有する株、特に、ＧＬ−ＯＮＣ１としても知られる、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名された株などのＬＩＶＰ参照株よりも低下した毒性およびまたより高い抗腫瘍活性、またはその組合せを示す。より高い抗腫瘍形成性を示す提供されるＬＩＶＰクローン株のいずれかを用いて、抗腫瘍形成性を、対象への投与時にインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で明らかにするか、または評価することができる。例えば、腫瘍細胞の感染性、腫瘍組織中へのウイルスの蓄積、ウイルス核酸の複製、ウイルス生成、ウイルス遺伝子発現、宿主細胞に対する効果、細胞傷害性、腫瘍細胞選択性、腫瘍細胞型選択性、免疫原性および腫瘍細胞中での複製量から選択される抗腫瘍形成性を示すパラメータをインビトロまたはインビボで評価することにより、より高い抗腫瘍形成性を決定することができる。いくつかの例においては、より高い抗腫瘍形成性とは、クローン株が、同じか、または類似する条件下で同じアッセイにおいて評価された配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスの抗腫瘍形成性と比較して、所与の期間における腫瘍サイズの変化などの抗腫瘍形成性を示すパラメータを評価するインビトロまたはインビボアッセイにおいて、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％以上または少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％以上または１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％以上の抗腫瘍形成性を示すことを意味する。
【００１４】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列中の対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列と比較して、ＯＲＦ中の１つまたは複数のヌクレオチドにおいて異なる任意のものを含む。その他は他の領域において異なっていてもよい。例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの差異は、１つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換または付加（すなわち、挿入）、特に、コードされるタンパク質の配列を変化させるヌクレオチド変化である。別の例においては、差異は、ＯＲＦのプロモーター領域における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換または付加である。さらなる例においては、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列中の対応するＯＲＦと異なるＯＲＦは、トランケートされたタンパク質、不活性タンパク質をコードするか、またはウイルスによるタンパク質の生成を消失させる。上記の例のいずれかにおいて、差異は、ｇｌ００１／２９０、ｇｌ００９／２８３、ｇｌ０１０／２８２、ｇｌ０１１／２８０、ｇｌ０１５、ｇｌ０３２、ｇｌ０３４、ｇｌ０３５、ｇｌ０３７、ｇｌ０６９、ｇｌ０７７、ｇｌ０７９、ｇｌ０８２、ｇｌ０８４、ｇｌ０８８、ｇｌ０９３、ｇｌ２２５、ｇｌ２３０、ｇｌ２３９、ｇｌ２４１、ｇｌ２５７、ｇｌ２６４、ｇｌ２７０、ｇｌ２７３、ｇｌ２７４、ｇｌ２７７／１０５、ｇｌ２８０／０１０およびｇｌ２８３／００９と命名されたＯＲＦから選択されるＯＲＦ中にあってよい。複数の差異があってもよい。正確な差異の知識は必要ではなく、むしろその株は、ウイルスをＧＬＶ−１ｈ６８よりも腫瘍処置または診断として特性において優れたものにする低下した毒性および／または抗腫瘍活性または両方の組合せを示すものである（すなわち、特性の１つがＧＬＶ−１ｈ６８の特性と比較して実質的により良いため、または特性の組合せが改善されているため）。
【００１５】
クローン株の例として、配列番号１のヌクレオチド１０，０７３〜１８０，０９５、配列番号２のヌクレオチド１１，２４３〜１８２，７２１、配列番号４のヌクレオチド６，２６４〜１８１，３９０、配列番号５のヌクレオチド７，０４４〜１８１，８２０、配列番号６のヌクレオチド６，６７４〜１８１，４０９、配列番号７のヌクレオチド６，７１６〜１８１，３６７または配列番号８のヌクレオチド６，８９９〜１８１，８７０の配列を含有するＬＩＶＰクローン株が本明細書で提供される。また、配列番号１のヌクレオチド１０，０７３〜１８０，０９５、配列番号２のヌクレオチド１１，２４３〜１８２，７２１、配列番号４のヌクレオチド６，２６４〜１８１，３９０、配列番号５のヌクレオチド７，０４４〜１８１，８２０、配列番号６のヌクレオチド６，６７４〜１８１，４０９、配列番号７のヌクレオチド６，７１６〜１８１，３６７もしくは配列番号８のヌクレオチド６，８９９〜１８１，８７０の配列に対して少なくとも約９９％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有するＬＩＶＰクローン株も本明細書で提供される。
【００１６】
他の例においては、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、左および／または右の逆位末端反復を含むヌクレオチド配列を含有する。例えば、配列番号１、２、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列を含有するＬＩＶＰクローン株が本明細書で提供される。また、配列番号１、２、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有するＬＩＶＰクローン株も本明細書で提供される。特に、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列または配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有するＬＩＶＰクローン株である。他の例においては、特に、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列または配列番号５に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有するＬＩＶＰクローン株である。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株の例のいずれかにおいて、ＬＩＶＰクローン株は、配列番号１、２、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１、２、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する株を増殖させた細胞培養物からＬＩＶＰクローンを単離することにより取得することができる。
【００１７】
本明細書で提供される上記のＬＩＶＰクローン株のいずれかのゲノムを含有するＬＩＶＰウイルス調製物またはウイルスが本明細書で提供される。
【００１８】
異種遺伝子産物をコードする核酸などの、ゲノム中に異種核酸も含有するように改変された上記のＬＩＶＰクローン株のいずれかのゲノムを含有する組換えまたは改変ＬＩＶＰウイルス株が本明細書で提供される。いくつかの例においては、異種遺伝子産物をコードするものなどの異種核酸を、ウイルスのゲノム中の非必須遺伝子または領域中に、またはその代わりに挿入する。例えば、異種遺伝子産物をコードする核酸を、ウイルスのゲノム中のヘマグルチニン（ＨＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｆ１４．５Ｌ、ワクシニア成長因子（ＶＧＦ）、Ａ３５Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｅ２Ｌ／Ｅ３Ｌ、Ｋ１Ｌ／Ｋ２Ｌ、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子座、７．５Ｋ、Ｃ７−Ｋ１Ｌ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌまたは１４Ｌ遺伝子座に挿入する。本明細書で提供されるウイルスを、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０５４９９６号、国際出願第ＷＯ２００９／１３９９２１号、米国特許出願公開第ＵＳ−２００９−００８１６３９号、第ＵＳ−２００９−００５３２４４号、第ＵＳ−２００９−００９８５２９号、ならびに米国特許第７，７５４，２２１号、第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号および第７，６６２，３９８号のいずれかに記載の改変および方法／使用を含む、当業者には公知の診断のため、ならびに診断および処置のための、腫瘍の処置、ゲノム中に挿入される抗原に由来する病原体に対するワクチンなどの任意の方法として改変する、および／またはそれにおいて用いることができる。
【００１９】
本明細書で提供される組換えまたは改変ＬＩＶＰウイルス株において、異種遺伝子産物は、１つまたは複数の治療剤および／もしくは診断剤または治療試薬および／もしくは診断試薬を含む。いくつかの例においては、異種遺伝子産物は、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変するかまたは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、ＰＥＴ画像化のための遺伝子ならびにＭＲＩ画像化のための遺伝子である。例えば、抗転移剤は、転移性定着を阻害するか、またはインビトロ細胞浸潤アッセイにおいて細胞浸潤を阻害するものである。別の例においては、抗血管新生剤は、腫瘍における血管形成を阻害するものである。さらなる例においては、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子は、ｎｅｗｔＡＧ（ｎＡＧ）、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、Ｎｇｎ３、Ｐｄｘ１またはＭａｆａである。
【００２０】
本明細書で提供される組換えまたは改変ＬＩＶＰウイルス株の例において、異種遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子から選択される治療剤である。例えば、異種遺伝子産物は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、Ｔリンパ球上で発現される受容体であるＨＶＥＭについてＨＳＶ糖タンパク質と競合するリンホトキシン誘導性発現物（ＬＩＧＨＴ）、ｐ６０スーパー抗原、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ１α）、ＳＴＡＴ１β、プラスミノゲンｋ５ドメイン（ｈＫ５）、色素上皮分化因子（ＰＥＤＦ）、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体、一本鎖抗ＤＬＬ４抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＮＭ２３、カドヘリン１（ＥＣＡＤまたはｃｄｈ１）、リラキシン（ｒｅｌａｘｉｎ）１（ＲＬＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マイクロＲＮＡ１２６（ｍｉＲ−１２６）、マイクロＲＮＡ１８１、マイクロＲＮＡ３３５、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ｎｐｐａ１）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＣＤＣ６、または骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）である。例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｇ６と命名される。
【００２１】
診断剤をコードする異種遺伝子産物を含有する本明細書に記載の組換えまたは改変ＬＩＶＰ株の例において、診断剤は、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質である。例えば、診断剤は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、造影剤、発色団、検出することができる化合物もしくはリガンドに結合する、および／またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質である。そのような例において、造影剤に結合する、および／またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質は、鉄受容体、鉄輸送体、または銅取込み輸送体である。特定の例においては、診断剤は、ヒカリコメツキムシ（Ｇｒｅｅｎ  ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ）ルシフェラーゼ、ｌｕｘオペロン、赤外蛍光タンパク質、フラビンリダクターゼタンパク質、ｍＮｅｐｔｕｎｅ近赤外蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、セレンテラジン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ヒトエピネフリン受容体（ｈＮＥＴ）、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質、シトクロムｐ４５０ファミリー酵素、アロスタチンＡ受容体（ＡｌｓｔＲ）、Ｐｅｐ１受容体（ＰＥＰＲ−１）、ＬＡＴ−４、ステロール１４α−デメチラーゼ（Ｃｙｐ５１）、トランスフェリン受容体（ＴＲ）、フェリチン、二価金属輸送体（ＤＭＴ）、マグネトタクティックＡ（ＭａｇＡ）またはシスプラチン流入輸送体（ＣＴＲ１）である。
【００２２】
本明細書で提供される組換えまたは改変ＬＩＶＰウイルス株においては、異種遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、ウイルスプロモーターを含む哺乳動物プロモーターである。いくつかの例においては、プロモーターは、Ｐ７．５Ｋ、Ｐ１１Ｋ、ＰＳＥ、ＰＳＥＬ、ＰＳＬ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、Ｐ２８、Ｃ１１Ｒ、Ｇ８Ｒ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ３Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ａ３Ｌ、Ｈ１Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｈ８Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ４Ｒ、Ｄ５Ｒ、Ｄ９Ｒ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｐ４ｂまたはＫ１プロモーターである。
【００２３】
上記で提供されたクローン株またはウイルス株のいずれかを含有する組成物が本明細書で提供される。また、上記で提供されたクローン株またはウイルス株のいずれかを含有する医薬組成物も本明細書で提供される。他の例においては、本明細書で提供される組成物または医薬組成物は、１つまたは複数の異なるウイルス株を含有してもよい。いくつかの例においては、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含有する。本明細書で提供される医薬組成物を、局部（ｌｏｃａｌ）または全身投与のために製剤化することができる。他の例においては、医薬組成物は、抗ウイルスもしくは抗がんワクチンまたは抗がん治療剤としての投与のために製剤化される。
【００２４】
本明細書で提供されるクローン株またはウイルス株のいずれかと、治療剤または診断剤とを含有する組合せが本明細書で提供される。いくつかの例においては、治療剤は、化学療法剤、免疫抑制剤および抗ウイルス剤から選択される。例えば、化学療法剤は、抗転移剤または抗血管新生剤である。いくつかの例においては、化学療法剤は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチンもしくは治療剤、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤またはそれらの任意の組合せである。他の例においては、化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの例においては、免疫抑制剤は、糖質コルチコイド、アルキル化剤、代謝拮抗物質、または抗体である。他の例においては、抗ウイルス剤は、シドフォビル、グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ガンシクロビル、アシクロビルまたはＳＴ−２４６である。例えば、抗ウイルス剤は、化学療法剤である。組合せに対して本明細書で提供される例のいずれかにおいては、ウイルスと、化学療法剤および／または抗ウイルス剤とが、単一の組成物として、または２つ以上の組成物中に別々に製剤化される。
【００２５】
上記のＬＩＶＰウイルス株のいずれか、上記の組成物もしくは医薬組成物のいずれかまたは上記の組合せのいずれか、ならびに所望により前記組成物の投与のための説明書を含有するキットが本明細書で提供される。
【００２６】
上記の医薬組成物のいずれか、例えば、本明細書で提供されるクローン株またはウイルス株のいずれかを含有する上記医薬組成物のいずれかを投与することによる、対象における増殖性障害を処置するのに使用するための方法、使用または組成物が本明細書で提供される。増殖性疾患は、がんであってよい。例えば、がんは、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がんまたは膵がんであってよい。増殖性障害は、腫瘍または転移であってよい。本明細書に記載の方法において、対象はヒトまたは非ヒト対象であってよい。
【００２７】
増殖性障害を処置するための本明細書に記載の使用のための方法、使用または組成物の例においては、ウイルスを、投与のサイクルにわたって少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕまたは約１ｘ１０５ｐｆｕまたは１ｘ１０５ｐｆｕである量で投与または製剤化することができる。例えば、ウイルスは、投与のサイクルにわたって少なくとも一度または少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０８ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０９ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１０ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１１ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１２ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは少なくとも１ｘ１０１４ｐｆｕまたは少なくとも約１ｘ１０５ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０７ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０８ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０９ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０１０ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０１１ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０１２ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは少なくとも約１ｘ１０１４ｐｆｕまたは１ｘ１０５ｐｆｕ、１ｘ１０６ｐｆｕ、１ｘ１０７ｐｆｕ、１ｘ１０８ｐｆｕ、１ｘ１０９ｐｆｕ、１ｘ１０１０ｐｆｕ、１ｘ１０１１ｐｆｕ、１ｘ１０１２ｐｆｕ、１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは１ｘ１０１４ｐｆｕである量で投与または製剤化される。例えば、本明細書に記載の使用のための方法、使用、または組成物のための製剤中のウイルス株の濃度は、１ｘ１０６〜１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌであるか、または少なくとも１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、少なくとも１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌ、もしくは少なくとも１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌであるか、または約１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、約１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌ、もしくは約１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌであるか、または１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１２ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１３ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、１ｘ１０１５ｐｆｕ／ｍｌ、もしくは１ｘ１０１６ｐｆｕ／ｍｌであってよい。そのような例においては、ウイルスの量は、投与のサイクルにわたって、２回、３回、４回、５回、６回または７回投与される。例えば、ウイルスの量は、サイクルの１日目、サイクルの１および２日目、サイクルの最初の連続する３日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する４日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する５日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する６日間のそれぞれ、またはサイクルの最初の連続する７日間のそれぞれに投与される。投与のサイクルは、７日間、１４日間、２１日間または２８日間であってよい。
【００２８】
本明細書に記載の方法においては、増殖性障害の処置のための第２の治療剤を投与することもできる。それをウイルスと共に、別々に、連続的に、または間欠的に投与することができる。当業者であれば、がんなどの増殖性障害の処置のための様々な治療剤に精通している。例えば、本明細書に記載の方法においては、増殖性障害のためのさらなる処置としては、限定されるものではないが、手術、放射線療法、免疫抑制療法および抗がん剤の投与が挙げられる。例えば、抗がん剤としては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、光感作剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナリング調節剤、代謝拮抗物質、抗がんワクチンもしくは処置、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤またはそれらの任意の組合せが挙げられる。抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＶＥＧＦ抗体であってよい。そのような例においては、ウイルスと抗がん剤とは、連続的に、同時的に、または間欠的に投与される。
【００２９】
限定されるものではないが、増殖性障害を処置するためなどの、本明細書で上記された方法または使用において、ウイルスは、静脈内的、動脈内的、腫瘍内的、内視鏡的、病変内的、筋肉内的、皮内的、腹腔内的、膀胱内的、関節内的、胸膜内的、経皮的、皮下的、経口的、非経口的、鼻内的、気管内的、吸入的、頭蓋内的、前立腺内的、硝子体内的、局所的、眼内的、経膣的、または直腸的などの局部的、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）または全身的に投与される。例えば、ウイルスは、静脈内的または腹腔内的に投与される。
【００３０】
本明細書で提供されるＬＩＶＰウイルスもしくはクローン株のいずれか、または本明細書で提供されるＬＩＶＰウイルス株もしくはクローン株のいずれかを含有する組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することにより、対象における腫瘍または転移を検出するための方法が本明細書で提供される。診断または検出のために、ウイルスは、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードし、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出する核酸を含有し、それによって、検出が対象における腫瘍または転移の存在を示す。本明細書に記載の検出のための方法においては、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、造影剤、発色団、検出することができる化合物もしくはリガンドに結合する、および／またはそれを輸送する受容体または輸送タンパク質から選択される。例えば、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、鉄受容体、鉄輸送体、ナトリウムまたは他の鉄輸送体、例えば、ヒトエピネフリン受容体（ｈＮＥＴ）またはヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質である。本明細書で提供される検出のための方法においては、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルは、高感度画像化、蛍光分光法、Ｘ線画像化、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）または単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）により検出される。
【００３１】
本明細書で提供されるＬＩＶＰウイルスまたはクローン株のいずれかを対象に投与することにより宿主中のウイルス活性を検出する方法が本明細書で提供される。ウイルスは、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードし、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出する核酸を含有し、それによって、検出が、ウイルスが活性であるか、または腫瘍崩壊活性を有することを示す。そのような例においては、対象は腫瘍またはがんを有する。前記方法の例においては、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を検出することは、対象から得た体液試料に由来する。例えば、体液は、尿、血液、涙または脳脊髄液である。
【００３２】
本明細書で提供されるＬＩＶＰウイルス株またはクローン株のいずれかを含有する宿主細胞が本明細書で提供される。
【００３３】
（ｉ）異なるゲノム配列を有するウイルス粒子の混合物を含有する第１のＬＩＶＰウイルス試料を用意すること；（ｉｉ）試料から単一のクローン単離物を選択および単離すること；（ｉｉｉ）毒性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること；（ｉｖ）抗腫瘍形成性についてそれぞれのクローン単離物をアッセイすること；ならびに（ｖ）参照ＬＩＶＰウイルス株と比較してより高い抗腫瘍形成性および低下した毒性を示すクローン株を選択することを含み、それによって低下した毒性およびより高い抗腫瘍形成性を示すクローン単離物が、がんの治療または診断のためのＬＩＶＰクローン株であると同定される、がんの治療および診断のためのＬＩＶＰクローン株を選択する方法が本明細書で提供される。本明細書に記載のＬＩＶＰクローン株を選択する方法においては、参照ＬＩＶＰウイルスは、第１のＬＩＶＰウイルス試料であってよい。いくつかの例においては、参照ＬＩＶＰウイルスは、弱毒化組換えＬＩＶＰウイルスである。例えば、参照ＬＩＶＰウイルスは、ゲノムが配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたウイルスである（ＧＬＶ−１ｈ６８）。
【００３４】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株を選択または同定する方法においては、第１のＬＩＶＰウイルス試料は、配列番号１０に記載のゲノム、もしくは配列番号１０と少なくとも９９％同一であるゲノムを有するＬＩＶＰウイルス株、または本明細書で提供される他の株のいずれかであってよい。他の例においては、第１のＬＩＶＰウイルス試料は、ＬＩＶＰ株および別のウイルス株、ゲノムＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡに感染した細胞の増殖、次いで、培養物からのウイルス試料の単離により得られた混合物であり、前記試料は前記感染により生成された子孫ウイルスを含む。例えば、他のウイルス株は、ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスまたは一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスであってよい。ＤＮＡウイルスは、アビポックスウイルス、粘液腫ウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのヘルペスウイルス；またはパルボウイルスなどの一本鎖ＤＮＡウイルスであってよい。例えば、他のウイルス株は、ワクシニア株である。いくつかの例においては、他のウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスであり、二本鎖ＲＮＡウイルスはロタウイルスなどのレオウイルスである。他のウイルスが一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスである例においては、一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスはセネカバレーウイルス、コクサッキーウイルスまたはポリオウイルス、エンテロウイルスなどのピコルナウイルス；セムリキ森林熱ウイルスなどのトガウイルス；およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）またはレンチウイルスなどのレトロウイルスである。他のウイルスが一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスであるさらなる例においては、一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスは、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス；ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルスもしくはムンプスウイルスなどのパラミクソウイルス；または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスである。
【００３５】
クローン株を選択または同定する本明細書に記載の方法においては、試料から単一のクローン単離物を選択する工程を、プラークアッセイにより実施することができる。例えば、プラークアッセイにおける最大のプラークが選択される。そのような例においては、最大の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個をクローン単離物として選択および単離し、それぞれ前記方法の工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において毒性および抗腫瘍形成性についてアッセイすることができる。他の例においては、選択されるプラークは、ＬＩＶＰウイルス試料により生成されるプラークの平均プラークサイズよりも大きい。
【００３６】
クローン株を選択する本明細書で提供される方法においては、工程ｉｉｉ）において、第１の対象への選択されたクローン単離物の投与時および第２の対象への参照ウイルスの投与時にインビボで毒性が評価され、ここで、第１および第２の対象は同じ種、サイズおよび性別のものであり、ウイルスは同じか、または類似する量で、および同じか、または類似する投薬レジメン下でそれぞれの対象に投与される；ならびに毒性を示すパラメータが毒性効果の指示因子として対象において評価および測定される。例えば、毒性を示すパラメータは、対象の生存期間の減少または低下、体重の減少、発熱、発疹、アレルギー、疲労、腹痛、対象における免疫応答の誘導または膿疱形成である。クローン株を選択する本明細書に記載の方法においては、工程ｖ）において、低下した毒性を示すウイルスの選択は、ａ）第１の対象と第２の対象との間で毒性を示す測定されたパラメータを比較すること；およびｂ）参照ウイルスにより示される毒性効果と比較して低下した毒性効果を示すクローン単離物を同定または選択することを含む。例えば、低下した毒性を示すクローン単離物は、第１の対象の体重の減少をもたらさないか、または第２の対象と比較して第１の対象の体重の減少の低下をもたらすものである。他の例においては、低下した毒性を示すクローン単離物は、第２の対象と比較して処置の経過にわたって第１の対象の生存期間の増加を示すものである。さらなる例においては、低下した毒性を示す選択されるクローン単離物は、処置の経過にわたって対象の死亡をもたらさないものである。
【００３７】
ウイルスクローン株を選択する本明細書で提供される方法においては、工程ｉｖ）において、選択されるクローン単離物および参照ウイルスの抗腫瘍形成性が、対象への投与時にインビトロまたはインビボで評価される；ならびに抗腫瘍形成性を示すパラメータが評価および測定される。例えば、投与時にインビボで抗腫瘍形成性を評価する場合、選択されるクローン単離物は第１の対象に投与され、参照ウイルスは第２の対象に投与され、ここで第１および第２の対象は同じ種、サイズおよび性別のものであり、ウイルスは同じか、または類似する量で、および同じか、または類似する投薬レジメン下でそれぞれの対象に投与される。抗腫瘍形成性を示すパラメータは、腫瘍細胞の感染性、腫瘍組織中へのウイルスの蓄積、腫瘍細胞中でのウイルス核酸の複製、腫瘍細胞中でのウイルス生成、腫瘍細胞中でのウイルス遺伝子発現、腫瘍細胞の細胞傷害性、腫瘍細胞選択性、腫瘍細胞型選択性、腫瘍サイズの減少、腫瘍体積の増加、腫瘍重量の減少、または特異的および非特異的抗腫瘍免疫応答の開始を含んでもよい。ウイルスクローン株を選択する本明細書で提供される方法においては、工程ｖ）において、より高い抗腫瘍形成性を示すウイルスの選択は、ｃ）選択されたクローン単離物および参照ウイルスにより示される抗腫瘍形成性を示す測定されたパラメータを比較すること；ならびにｄ）参照ウイルスにより示される抗腫瘍形成性と比較してより高い抗腫瘍形成性を示すクローン単離物を同定または選択することを含む。例えば、より高い抗腫瘍形成性とは、クローン単離物が、同じか、または類似する条件下で同じアッセイにおいて評価される参照ウイルスの抗腫瘍形成性と比較して抗腫瘍形成性を示すパラメータを評価するインビトロまたはインビボアッセイにおいて、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％以上、または少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％以上、または１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％以上の抗腫瘍形成性を示すことを意味する。
【００３８】
ウイルスクローン株を選択する本明細書に記載の方法においては、対象への投与時にインビボで毒性または抗腫瘍形成性を評価する工程は、非ヒト動物またはヒトである対象に対するものである。本明細書に記載の方法においては、対象は腫瘍またはがんを有してもよい。例えば、腫瘍は乳腺腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である。腫瘍は異種移植片、同種移植片、または自発的／天然腫瘍であってよい。
【００３９】
ウイルスクローン株を選択する本明細書に記載の方法においては、選択されるクローン株のゲノムを分析して、相同なゲノムを有する単離物のみが選択されるように、配列の相同性を評価することができる。例えば、ゲノムは、配列決定、制限酵素分析、ＰＣＲ、サザンブロットまたはタンパク質発現などの方法により分析される。
【００４０】
クローン株を選択する本明細書に記載の方法のいずれかにより製造または選択されたクローン株が本明細書で提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
概略
Ａ．定義
Ｂ．ワクシニアウイルスクローン株を単離する方法
１．親ウイルス調製物または混合物
２．クローン株の単離
３．抗腫瘍形成性
ａ．腫瘍関連複製指示因子
ｂ．細胞傷害性
ｃ．腫瘍成長
４．毒性／安全性
５．ゲノム分析
Ｃ．単離されたウイルスクローン株
１．ＬＩＶＰ
２．ＬＩＶＰクローン株
ＬＩＶＰクローン株の例
Ｄ．ＬＩＶＰ株の改変
１．異種核酸
２．改変例
ａ．診断遺伝子産物
ｂ．治療遺伝子産物
ｃ．抗原
ｄ．ウイルスの弱毒化を変化させるための改変
３．異種遺伝子発現の制御
４．改変ウイルスの作製方法
Ｅ．ウイルスの増殖および生成
１．増殖のための宿主細胞
２．濃度決定
３．保存方法
４．ウイルスの調製
Ｆ．医薬組成物、組合せおよびキット
１．医薬組成物
２．宿主細胞
３．組合せ
４．キット
Ｇ．治療、診断およびモニタリング方法
１．治療方法
２．診断およびモニタリング方法
３．投与
ａ．ウイルスを投与する前の工程
ｂ．投与の様式
ｃ．用量および投薬レジメン
ｄ．同時投与
ｉ．複数のウイルスの投与
ｉｉ．治療化合物
ｉｉｉ．免疫療法および生物療法
ｅ．対象の状態
４．モニタリング
ａ．ウイルス遺伝子発現のモニタリング
ｂ．腫瘍サイズのモニタリング
ｃ．抗体力価のモニタリング
ｄ．一般的健康診断のモニタリング
ｅ．処置と協調したモニタリング
Ｈ．実施例
【００４２】
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示を通じて言及されるすべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ウェブサイトならびに他の公開された材料は、別途注記しない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の用語について複数の定義が存在する場合、本セクションに記載のものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報は現れては消えることもあるが、インターネットおよび／または好適なデータベースを検索することなどにより、等価な情報は公知であり、容易にアクセスすることができると理解される。それに対する参照は、そのような情報の利用可能性および公共への普及を証明する。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（ＬＩＶＰ）またはＬＩＶＰウイルス株は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａのウシ皮膚への適合化により製造された弱毒化Ｌｉｓｔｅｒ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５４９）（Ａｌ’ｔｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｄｏｋｌ．  Ａｋａｄ．  Ｎａｕｋ  ＵＳＳＲ  ２８５：６９６−６９９）であるウイルス株を指す。ＬＩＶＰ株は、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ（例えば、Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：４８７−４９３を参照されたい）；Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＳＲＩ  ＳＲＣ  ＶＢ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｋｏｚｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４４：５１２１−５１２６）から取得するか、またはＭｏｓｃｏｗ  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｃ０３５５  Ｋ０６０２；Ａｇｒａｎｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ４０：３９２４−３９２９）から取得することができる。それはまた、当業者には周知でもある；それはＵＳＳＲにおいて、ならびにアジアおよびインドを通してワクチン接種のために用いられるワクチン株であった。現在その株は研究者によって用いられており、周知である（例えば、Ａｌｔｓｈｔｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｄｏｋｌ．  Ａｋａｄ．  Ｎａｕｋ  ＵＳＳＲ  ２８５：６９６−６９９；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １３４：１−９；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：４８７−４９３；Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２７３−２８３；Ｓｒｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：１３１１−１３２０；Ｚｉｎｏｖｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｇｅｎｅ  １４７：２０９−２１４；およびＣｈｋｈｅｉｄｚｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＦＥＢＳ  ３３６：３４０−３４２を参照されたい）。特に、ＬＩＶＰ株は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列、または配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも、もしくは少なくとも約９９％同一である配列を有するゲノムを含有するものである。ＬＩＶＰウイルス株は、細胞系における反復継代を通じたＬＩＶＰの増殖により得られる任意のウイルス株またはウイルス調製物を包含する。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰクローン株またはＬＩＶＰクローン単離物とは、プラーク単離、または単一のクローンが増殖される他の方法によりＬＩＶＰウイルス株から誘導され、配列が同種であるゲノムを有するウイルスを指す。したがって、ＬＩＶＰクローン株は、ゲノムがＬＩＶＰから増殖されたウイルス調製物中に存在するウイルスを含む。ＬＩＶＰクローン株は、異種核酸を導入するための組換えＤＮＡ法を用いる組換え手段により遺伝子操作された組換えＬＩＶＰウイルスを含まない。特に、ＬＩＶＰクローン株は、異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸を含有しないゲノムを有する。例えば、ＬＩＶＰクローン株は、非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有しないゲノムを有する。しかしながら、本明細書に記載の場合、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株はいずれも、組換えウイルスを作製するための組換え手段によりそのゲノムを改変することができると理解される。例えば、ＬＩＶＰクローン株を改変して、異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有するヌクレオチドの挿入を含有する組換えＬＩＶＰウイルスを作製することができる。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ１．１．１は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ２．１．１は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号２に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ４．１．１は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号４に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ５．１．１は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号５に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ６．１．１は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号６に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ７．１．１は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号７に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ８．１．１は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するゲノム、または配列番号８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するゲノムを有するＬＩＶＰクローン株である。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、改変ＬＩＶＰウイルス株とは、ＬＩＶＰ中に含まれないゲノムを有するが、ＬＩＶＰから誘導された株のゲノムの改変により製造されたウイルスであるＬＩＶＰウイルスを指す。典型的には、ウイルスのゲノムは、ヌクレオチドの置換（置き換え）、挿入（付加）または欠失（トランケーション）により改変される。改変は、遺伝子操作および組換えＤＮＡ法などの当業者には公知の任意の方法を用いて行うことができる。したがって、改変ウイルスは、親ウイルスのゲノムと比較してそのゲノムが変化したウイルスである。例示的改変ウイルスは、ウイルスのゲノム中に挿入された１つまたは複数の異種核酸配列を有する。典型的には、異種核酸は、異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。例えば、本明細書に記載の改変ウイルスは、異種遺伝子の発現のための遺伝子発現カセットの形態の１つまたは複数の異種核酸配列を含有してもよい。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「組換え方法による生成」または「組換えＤＮＡ法を用いる方法」またはその変形は、クローニングされたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法の使用を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現カセット」または「発現カセット」は、そのような配列と適合する宿主中での遺伝子の発現を行うことができる核酸エレメントを含有する核酸コンストラクトである。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび所望により、転写終結シグナルを含む。典型的には、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、転写させようとする核酸を含む。発現カセットは、例えば、治療遺伝子産物、または検出可能なタンパク質もしくは選択マーカーの遺伝子をコードする遺伝子を含有してもよい。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰ  ＧＬＶ−１ｈ６８は、それぞれ、Ｆ１４．５Ｌ、Ｊ２Ｒ（チミジンキナーゼ）およびＡ５６Ｒ（ヘマグルチニン）遺伝子座中に挿入された、ｒｕｃ−ｇｆｐ［ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質融合遺伝子（例えば、米国特許第５，９７６，７９６号を参照されたい）］、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）およびβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓＡ）リポーター遺伝子を含有するＬＩＶＰウイルスである。ＧＬＶ−１ｈ６８のゲノムは、配列番号９に記載のヌクレオチド配列、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、ウイルス調製物、例えば、ＬＩＶＰウイルス調製物は、培養系中でのインビボまたはインビトロでのウイルス株、例えば、ＬＩＶＰウイルス株、ＬＩＶＰクローン株または改変もしくは組換えウイルス株の増殖により得られたウイルス組成物を指す。例えば、ＬＩＶＰウイルス調製物は、典型的には、当技術分野で公知の標準的な方法を用いる培養系からの精製の際に、宿主細胞中でのウイルス株の増殖により得られたウイルス組成物を指す。ウイルス調製物は一般に、いくつかのウイルス粒子またはビリオンから作られる。必要に応じて、試料または調製物中のウイルス粒子の数を、プラークアッセイを用いて決定して、試料単位容量あたりのプラーク形成単位数（ｐｆｕ／ｍｌ）を算出し、形成されたそれぞれのプラークが１個の感染性ウイルス粒子を代表すると仮定することができる。調製物中のそれぞれのウイルス粒子またはビリオンは、他のウイルス粒子と比較して同じゲノム配列を有してもよく（すなわち、調製物が配列において同種である）、または異なるゲノム配列を有してもよい（すなわち、調製物が配列において異種である）。クローン単離の非存在下では、ウイルスのゲノムの異種性または多様性が、ウイルス株の天然の選択プロセスにおいて起こる相同組換え事象などにより、ウイルスが複製するにつれて生じ得ることが、当業者には理解される（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  （ｅｄｓ）  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９９））。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、ウイルス混合物は、そのゲノム配列が異なるいくつかのウイルス粒子を含有するウイルス調製物である。ウイルス混合物は、培養系、例えば、宿主細胞に、２つ以上の異なるウイルス株、または１つのウイルス株と、ゲノムＤＮＡもしくはクローニングされたＤＮＡとに感染させた後、得られたウイルスを増殖させ、精製することにより取得することができる。本明細書における目的のために、ＬＩＶＰウイルス調製物は、ＬＩＶＰ株および別のウイルス、ゲノムＤＮＡまたはクローニングされたＤＮＡに感染させた細胞を増殖させた後、培養物からウイルス調製物を単離することにより得られたウイルス混合物を含有してもよく、その調製物は感染により生成された子孫ウイルスを含有する。例えば、他のウイルス株は、アビポックスウイルス、粘液腫ウイルスまたは他のワクシニアウイルスなどのポックスウイルス；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのヘルペスウイルス；ならびにパルボウイルスなどの一本鎖ＤＮＡウイルスであってよい。他のウイルスは、弱毒化ウイルス、腫瘍崩壊ウイルスまたは公知の抗腫瘍活性および／または中程度から軽度の毒性を有する他のウイルスであってよい。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「ウイルス」とは、宿主細胞なしには増殖または複製することができない感染性実体の任意の大規模集団を指す。ウイルスは、典型的には遺伝物質のＲＮＡまたはＤＮＡコアを取り囲むタンパク質外被を含有するが、半透過性の膜を含有せず、生きている細胞中でのみ増殖および複製することができる。ウイルスとしては、限定されるものではないが、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ピコルナウイルス、シンドビスウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、およびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、腫瘍崩壊ウイルスとは、腫瘍を有する対象中の腫瘍細胞中で選択的に複製するウイルスを指す。いくつかの腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞の感染後に腫瘍細胞を殺傷することができる。例えば、腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞を溶解するか、または腫瘍細胞の細胞死を誘導することにより、腫瘍細胞の死を引き起こすことができる。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、ＬＩＶＰに関連する「弱毒化ＬＩＶＰウイルス」は、ＬＩＶＰと比較して低下したか、もしくは少ないビルレンス、毒性または病原性を示すウイルスを指す。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、ウイルスに関連する「毒性」（本明細書ではビルレンスまたは病原性ともいう）は、ウイルスの投与時の宿主に対する有害効果または毒性効果を指す。ＬＩＶＰなどの腫瘍崩壊ウイルスについては、ウイルスの毒性は非腫瘍性臓器または組織中へのその蓄積と関連し、これは宿主の生存に影響し得るか、または有害効果もしくは毒性効果をもたらし得る。毒性を示す１つまたは複数のパラメータを評価することにより、毒性を測定することができる。これらのものとしては、非腫瘍組織中への蓄積および体重に対する効果などの、それが投与された対象の生存能力または健康に対する効果が挙げられる。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「毒性を示すパラメータ」とは、その毒性、ビルレンスまたは病原性に関連するウイルスにより媒介される特性を指す。毒性を示すパラメータは、一般的には対象への投与時にインビボで評価される。毒性を示すパラメータの例としては、限定されるものではないが、対象の生存期間の減少、体重の減少、発熱、発疹、アレルギー、疲労、腹痛、対象における免疫応答の誘導および膿疱形成が挙げられる。上記のパラメータまたは当業者には公知の他の毒性特性のいずれかを評価するアッセイまたは手段は本明細書に記載されているか、または当業者には公知である。したがって、宿主中で任意の１つまたは複数の上記活性または特性を媒介するウイルスは、ある程度の毒性を示す。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「低下した毒性」は、宿主へのウイルスの投与時の毒性または有害効果が、ウイルスで処置されていない宿主と比較して、または別の参照もしくは対照ウイルスを投与された宿主と比較して弱毒化されるか、または減少することを意味する。本明細書における目的のために、参照または対照ウイルスの例は、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたＬＩＶＰウイルスである。毒性が低下したか、または減少したかどうかを、毒性を示すパラメータに対する、ウイルス、および必要に応じて、対照または参照ウイルスの効果を評価することにより決定することができる。２つ以上の異なるウイルスの活性を比較する場合、インビトロアッセイにおいて用いられるか、またはインビボで投与されるウイルスの量（例えば、ｐｆｕ）は、同じか、または類似し、インビトロアッセイまたはインビボでの評価の条件（例えば、インビボでの投薬レジメン）は同じか、または類似すると理解される。例えば、ウイルスおよび対照または参照ウイルスのインビボでの投与時の効果を比較する場合、対象は同じ種、サイズ、性別であり、ウイルスは同じか、または類似する投薬レジメン下で同じか、または類似する量で投与される。特に、低下した毒性を有するウイルスは、疾患の処置のためなどの宿主へのウイルスの投与時に、ウイルスが宿主に対する損傷もしくは損害をもたらす程度まで宿主の非腫瘍臓器および組織中に蓄積しないか、あるいは処置される疾患が影響するよりも高い程度で、または対照もしくは参照ウイルスが影響するよりも高い程度で、宿主の生存期間に影響することを意味する。例えば、低下した毒性を有するウイルスは、処置の経過にわたって対象の死亡をもたらさないウイルスを含む。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、特定の組織中へのウイルスの蓄積は、宿主の臓器または組織にウイルスが感染するのに十分長い、宿主へのウイルスの投与後の一定期間後の宿主生物の特定の組織中へのウイルスの分布を指す。当業者であれば認識できる通り、ウイルスの感染のための期間は、ウイルス、臓器（複数可）または組織（複数可）、宿主の免疫能力およびウイルスの用量に応じて変化するであろう。一般に、蓄積は、ウイルスによる感染後の約１日未満、約１日から約２、３、４、５、６または７日、約１週間から約２、３または４週間、約１カ月から約２、３、４、５、６カ月以上の時点で決定することができる。本明細書における目的のために、ウイルスは、炎症組織または腫瘍組織などの免疫特権組織中に選択的に蓄積するが、ウイルスの毒性が軽度であるか、または許容され、最大限でも、致命的ではない程度まで宿主中の非腫瘍組織などの他の組織および臓器から除去される。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「選択的蓄積」とは、第２の位置での蓄積よりも高いレベルでの第１の位置でのウイルスの蓄積を指す（すなわち、第１の位置でのウイルス粒子の濃度、または力価は、第２の位置でのウイルス粒子の濃度よりも高い）。かくして、正常な組織または臓器と比較して、炎症組織および腫瘍組織などの免疫特権組織（免疫系から保護される組織）中に選択的に蓄積するウイルスは、ウイルスが正常な組織または臓器中に蓄積するよりも高いレベル（すなわち、濃度またはウイルス力価）で、腫瘍などの免疫特権組織中に蓄積するウイルスを指す。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「抗腫瘍活性」または「抗腫瘍形成性」とは、対象においてインビトロまたはインビボで腫瘍の形成または増殖を防止または阻害するウイルス株を指す。抗腫瘍活性を示すパラメータまたは複数のパラメータを評価することにより、抗腫瘍活性を決定することができる。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「抗腫瘍活性または抗腫瘍形成活性を示すパラメータ」とは、抗腫瘍活性と関連するウイルスにより媒介される特性を指す。抗腫瘍活性を示すパラメータは、対象への投与時にインビトロまたはインビボで評価することができる。抗腫瘍活性を示すパラメータの例としては、限定されるものではないが、腫瘍細胞の感染性、腫瘍組織中へのウイルスの蓄積、腫瘍細胞中でのウイルス核酸の複製、腫瘍細胞中でのウイルス生成、腫瘍細胞中でのウイルス遺伝子発現、腫瘍細胞の細胞傷害性、腫瘍細胞選択性、腫瘍細胞型選択性、腫瘍サイズの減少、腫瘍体積の増加、腫瘍重量の減少、ならびに特異的および非特異的抗腫瘍免疫応答の開始が挙げられる。上記パラメータまたは他の抗腫瘍形成特性のいずれかを評価するアッセイは、当業者には公知である。アッセイの例は、本明細書に記載されている。したがって、任意の１つまたは複数の上記活性または特性を示すウイルスは、抗腫瘍活性を示す。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、抗腫瘍活性または抗腫瘍形成性に関連する「より高い」または「改善された」活性は、ウイルス株が、参照もしくは対照ウイルスよりも高い程度で、またはウイルスを用いる処置の非存在下よりも高い程度で、対象におけるインビトロまたはインビボでの腫瘍の形成または増殖を防止または阻害することができることを意味する。本明細書における目的のために、参照または対照ウイルスの例は、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名されたＬＩＶＰウイルスである。抗腫瘍活性が「より高い」か、または「改善された」かどうかを、抗腫瘍活性を示すパラメータに対する、ウイルスおよび必要に応じて、対照または参照ウイルスの効果を評価することにより決定することができる。２つ以上の異なるウイルスの活性を比較する場合、インビトロアッセイにおいて用いられるか、またはインビボで投与されるウイルスの量（例えば、ｐｆｕ）は、同じか、または類似し、インビトロアッセイまたはインビボでの評価の条件（例えば、インビボでの投薬レジメン）は同じか、または類似すると理解される。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、異種核酸（外因性核酸または外来核酸とも呼ばれる）は、それが発現される生物もしくはウイルスによって通常はインビボで生成されないか、または生物もしくはウイルスによって生成されるが、異なる遺伝子座にあるか、または転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスを行うことにより、ＤＮＡなどの内因性核酸の発現を変化させるメディエータを媒介するか、もしくはコードする核酸を指す。したがって、異種核酸は、それが導入されるウイルスにとって通常は内因性ではないことが多い。異種核酸は、同じ種または別の種を含む、同じ生物または別の生物中の別のウイルスに由来する核酸分子を指してもよい。しかしながら、異種核酸は、内因性であってもよいが、異なる遺伝子座から発現されるか、またはその発現もしくは配列が変化した核酸（例えば、プラスミド）である。かくして、異種核酸は、ＤＮＡなどの対応する核酸分子がゲノム中に見出される場合、正確な向きまたは位置に存在しない核酸分子を含む。一般的には、必須ではないが、そのような核酸は、ウイルスによって、またはそれが発現されるウイルス中で同じ方法で通常生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。当業者が、核酸が発現されるウイルスにとって異種、外因性または外来であると認識するか、または考えるＤＮＡなどの任意の核酸が、本明細書では異種核酸により包含される。異種核酸の例としては、限定されるものではないが、診断剤および／または治療剤などの、外因性ペプチド／タンパク質をコードする核酸が挙げられる。異種核酸によりコードされるタンパク質を、ウイルス内で発現させ、分泌させるか、または異種核酸が導入されたウイルスの表面上に発現させることができる。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、異種核酸を含有するウイルスクローン株またはウイルス株調製物は、親クローン株中に存在しない核酸を含有するそのような株を指す。例えば、配列が配列番号１０に記載のものであるウイルスはクローン株であるが、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名された、配列番号９のウイルスは、ＲＵＣ−ＧＦＰと命名された挿入物などの異種核酸を含有する。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、異種タンパク質または異種ポリペプチド（外因性タンパク質、外因性ポリペプチド、外来タンパク質または外来ポリペプチドとも呼ばれる）は、通常はウイルスにより生成されないタンパク質を指す。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列などの、ヌクレオチドの調節およびエフェクター配列への異種核酸の作動可能な連結は、ＤＮＡなどのそのような核酸と、そのようなヌクレオチド配列との関係を指す。例えば、プロモーターへの異種ＤＮＡの作動可能な連結は、そのようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識する、それに結合する、およびそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの物理的関係を指す。かくして、作動可能に連結されたか、または機能し得る形で会合したとは、ＤＮＡなどの核酸と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列などのヌクレオチドの調節およびエフェクター配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターへのＤＮＡの作動可能な連結は、そのようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識する、それに結合する、およびそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。発現および／または転写を最適化するためには、クローンの５’非翻訳部分を除去し、付加するか、または変化させて、余分の、潜在的に不適切な、代替的翻訳開始（すなわち、開始）コドンまたは転写もしくは翻訳のレベルで発現を阻害し得るか、もしくは低下させ得る他の配列を排除することが必要となり得る。さらに、コンセンサスリボゾーム結合部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入し、発現を増強することができる（例えば、Ｋｏｚａｋ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １９８６７−１９８７０  （１９９１）およびＳｈｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｌｇａｒｎｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５４（５４９５）：３４−３８  （１９７５）を参照されたい）。そのような改変の望ましさ（または必要性）を、経験的に決定することができる。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、異種プロモーターは、通常は野生型生物もしくはウイルス中には見出されないか、または野生型生物もしくはウイルスと比較して異なる遺伝子座にあるプロモーターを指す。異種プロモーターは、それが導入されるウイルスに対して内因性ではないことが多いが、別のウイルスから取得されたか、または合成的に調製されたものである。異種プロモーターは、同じ種または別の種などの、同じ生物または別の生物中の別のウイルスに由来するプロモーターを指してもよい。しかしながら、異種プロモーターは、内因性であってもよいが、その配列が変化したか、または異なる遺伝子座（例えば、ゲノム中もしくはプラスミド上の異なる位置）に生じるプロモーターである。かくして、異種プロモーターは、対応するプロモーターがゲノム中に見出される場合、正確な向きまたは位置に存在しないプロモーターを含む。
【００７４】
合成プロモーターは、天然には見出されないヌクレオチド配列を有する異種プロモーターである。合成プロモーターは、合成配列または天然プロモーターもしくはその一部から誘導された配列を有する核酸分子であってよい。合成プロモーターはまた、異なる天然プロモーターから誘導される異なるエレメントから構成されるハイブリッドプロモーターであってもよい。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、投与レジメンとは、投与される薬剤、例えば、ウイルスまたは他の薬剤の量、および投与のサイクルの経過にわたる投与の頻度を指す。投与レジメンは、処置しようとする疾患または状態の関数であり、かくして、変化してもよい。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、投与の頻度は、投与のサイクルの間に薬剤が投与される回数を指す。例えば、頻度は、日、週または月であってよい。例えば、頻度は、投与のサイクル中の１回、２回、３回、４回、５回、６回または７回の投与であってよい。頻度は、投与のサイクル中の連続する日数を指してもよい。特定の頻度は、処置される特定の疾患または状態の関数である。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、「投与のサイクル」とは、連続する投与にわたって反復されるウイルスの投与の投与レジメンの反復スケジュールを指す。例えば、投与のサイクルの例は、２８日サイクルである。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、状態、障害または疾患を有する対象の処置は、状態、障害または疾患の症状が改善されるか、またはさもなければ有益に変化する任意の処置様式を意味する。処置は、本明細書に記載され、提供されるウイルスの任意の医薬的使用を包含する。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、疾患または障害は、例えば、感染または遺伝的欠陥の結果生じ、同定可能な症状を特徴とする生物における病理学的状態を指す。本明細書に記載の疾患の例は、がんなどの新生物疾患である。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、新生物疾患は、腫瘍の発生、増殖、転移および進行などの、がんを含む任意の障害を指す。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、がんは、転移がん、リンパ腫瘍、および血液のがんなどの、任意の種類の悪性腫瘍により引き起こされるか、またはそれを特徴とする疾患に関する用語である。がんの例としては、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫、膵がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、グリオーマ腫瘍、腺癌、肝がんおよび皮膚がんが挙げられる。ヒトにおけるがんの例としては、膀胱腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳およびＣＮＳのがん（例えば、グリオーマ腫瘍）、子宮頸がん、絨毛癌、結腸および直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼のがん；頭部および頸部のがん；胃がん；上皮内新生物；腎がん；喉頭がん；白血病；肝がん；肺がん（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫；メラノーマ；骨髄腫、神経芽腫、口腔がん（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣がん；膵がん、網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸がん、腎がん、呼吸器系のがん；肉腫、皮膚がん；胃がん、精巣がん、甲状腺がん；子宮がん、泌尿器系のがん、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられる。イヌ、ネコおよび他のペットにおいて一般的に診断されるがんの例としては、限定されるものではないが、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、メラノーマ、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、気管支腺癌、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、ミクログリオーマ、神経芽腫、破骨細胞腫、口腔新生物、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖器扁平細胞癌、可移植性性器腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平細胞癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫および嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平細胞癌が挙げられる。フェレットなどのげっ歯類において診断されるがんの例としては、限定されるものではないが、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺がんが挙げられる。農業用家畜に作用する新生物の例としては、限定されるものではないが、白血病、血管周囲細胞腫およびウシの眼の新生物（畜牛における）；包皮線維肉腫、潰瘍性扁平細胞癌、包皮癌、結合組織新生物および脂肪細胞腫（ウマにおける）；肝細胞癌（ブタにおける）；リンパ腫および肺腺腫症（ヒツジにおける）；肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、網膜内皮腫、線維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫およびリンパ性白血病（鳥類における）；網膜芽腫、肝臓新生物、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞白血病および浮袋肉腫（魚における）、乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）：コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌により引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性感染性接触伝染性疾患、ならびにヤーグジークテにより引き起こされるヒツジ���接触伝染性肺腫瘍が挙げられる。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、「転移」とは身体のある部分から別の部分へのがんの拡散を指す。例えば、転移プロセスにおいては、悪性腫瘍細胞は、悪性腫瘍細胞が生じた一次腫瘍の部位から拡散し、リンパ管および血管中に移動し、細胞を生物中の他の場所の正常組織に輸送し、そこで細胞が増殖し続ける。転移により拡散した細胞により形成された腫瘍は、「転移腫瘍」、「二次腫瘍」または「転移」と呼ばれる。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、腫瘍または転移などの新生物疾患を有する対象の処置は、新生物疾患を有する症状が改善されるか、またはさもなければ有益に変化する任意の処置様式を意味する。典型的には、対象における腫瘍または転移の処置は、腫瘍の血管形成、腫瘍細胞の分裂、腫瘍細胞の移動の阻害または基底膜もしくは細胞外マトリックスの分解などの、腫瘍成長の遅延化、腫瘍細胞の溶解、腫瘍サイズの低下、新しい腫瘍成長の防止、または一次腫瘍の転移の防止をもたらす任意の処置様式を包含する。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、特定の医薬組成物の投与などによる、特定の障害の症状の改善または軽減は、組成物の投与に帰するか、またはそれと関連し得る、永続的であっても、一時的であってもよい、持続的または一過的な任意の減少を指す。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、特定の疾患を処置するためのウイルスまたは化合物の有効量、または治療上有効量は、疾患に伴う症状を改善するか、またはいくつかの様式で低下させる量である。その量は、個体間で変化し、限定されるものではないが、患者の年齢、体重、全体的な身体状態および疾患の重篤度などのいくつかの因子に依存するであろう。治療上有効量を単回用量として投与するか、またはレジメンに従って複数回用量で投与することによって、それが有効となるようにすることができる。前記量は、疾患を治癒させることができるが、典型的には、疾患の症状を改善するために投与される。症状の望ましい改善を達成するためには、反復投与が必要となることがある。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、腫瘍または転移などの新生物疾患を処置するためのウイルスまたは化合物の有効量、または治療上有効量は、限定されるものではないが、腫瘍成長の遅延化、腫瘍細胞の溶解、腫瘍サイズの減少、新しい腫瘍成長の防止、または一次腫瘍の転移の防止などの新生物疾患に伴う症状を改善するか、またはいくつかの様式では、低下させる量である。
【００８７】
本明細書で用いられる場合、腫瘍の処置に関する「治療指数」とは、腫瘍成長の遅延化および／または腫瘍体積の低下を引き起こす、本明細書で提供されるウイルスを用いる処置または本明細書で提供されるウイルスを用いる組合せ療法などの、処置の能力を指す。典型的には、治療指数は、ウイルスを用いる処置を行わない場合などの対照処置に対する比として表される。治療指数が高くなるほど、処置が腫瘍成長を遅延させる、および／または腫瘍体積を低下させるのにより有効になる。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「複製遅延」とは、治療ウイルスが腫瘍中で効率的に複製することができないことを指す。複製遅延を示す治療ウイルスは、腫瘍の細胞中で複製する能力を有するが、より遅い複製速度でそうすることができる。腫瘍の感染後に腫瘍における複製遅延を示すウイルスは、複製遅延を示さないウイルスほど腫瘍の治療にとって有効ではない。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、用語「治療ウイルス」とは、がん、腫瘍および／もしくは転移などの新生物疾患または炎症または創傷などの疾患もしくは障害の処置またはその診断ならびに／またはその両方のために投与されるウイルスを指す。一般に、本明細書の治療ウイルスは、抗腫瘍活性および最小限の毒性を示すものである。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、新生物としても知られる腫瘍は、細胞が異常に速い速度で増殖する場合にもたらされる異常な組織塊である。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的連携の部分的または全体的欠如を示し得る。腫瘍は、良性（がん性ではない）、または悪性（がん性）であってよい。本明細書で用いられる場合、腫瘍は造血腫瘍ならびに固形腫瘍を包含することが意図される。
【００９１】
悪性腫瘍は、３つの主要な型に広く分類することができる。癌腫は、上皮構造（例えば、乳房、前立腺、肺、結腸、膵臓）から生じる悪性腫瘍である。肉腫は、結合組織、または間葉細胞、例えば、筋肉、軟骨、脂肪または骨を起源とする悪性腫瘍である。白血病およびリンパ腫は、免疫系の構成要素などの造血構造（血液細胞の形成に関する構造）に作用する悪性腫瘍である。他の悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、神経系の腫瘍（例えば、神経線維腫）、胚細胞腫瘍、および芽球性腫瘍が挙げられる。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、増殖性障害は、限定されるものではないが、新生物疾患などの、細胞の異常な増殖（すなわち、細胞が正常な組織増殖と比較してより急速に増殖する）を含む任意の障害を含む。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、「腫瘍細胞」は、腫瘍の一部である任意の細胞である。典型的には、本明細書で提供されるウイルスは、正常細胞と比較して対象中の腫瘍細胞に選択的に感染する。
【００９４】
本明細書で用いられる場合、「転移細胞」は、転移のための能力を有する細胞である。転移細胞は、対象中の第１の腫瘍から転移する能力を有し、対象中の異なる部位の組織に定着して、その部位で第２の腫瘍を形成することができる。
【００９５】
本明細書で用いられる場合、「腫瘍形成細胞」は、対象中の好適な部位に導入された場合、腫瘍を形成することができる細胞である。この細胞は、非転移性または転移性であってよい。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「正常細胞」は、腫瘍に由来しない細胞である。
【００９７】
本明細書で用いられる場合、用語「細胞」は、生物科学において一般的に理解されている通り、生きている生物の構造および機能の基本単位を指す。細胞は、自給自足でき、他の細胞とは完全に無関係に機能的なものとして存在することができる単細胞生物であってもよい。細胞はまた、それが天然に存在する環境から単離されていない場合、２種類以上の細胞から作られる多細胞生物の一部であるものであってもよい。「非生物」または「非生物」細胞のものと考えることができるそのような細胞は、一般的には、それが多細胞生物により全体として実施される機能のサブセットのみを実施する点で特殊化されている。かくして、この種類の細胞は単細胞生物ではない。そのような細胞は、原核細胞または哺乳動物細胞、ヒト細胞および非ヒト動物細胞または非ヒト哺乳動物細胞などの動物細胞を含む原核細胞または真核細胞であってよい。動物細胞は、動物に見出され得る動物起源の任意の細胞を含む。かくして、動物細胞として、例えば、動物の様々な臓器、組織および系を作る細胞が挙げられる。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、「単離された細胞」は、インビトロで存在し、それが元々由来した生物から分離された細胞である。
【００９９】
本明細書で用いられる場合、「細胞系」は、多くの世代にわたってインビトロで安定に増殖することができる一次細胞から誘導された細胞の集団である。細胞系は一般的には、インビトロで連続的に増殖するその能力を説明するために「不死化」細胞系と呼ばれる。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、「腫瘍細胞系」は、最初は腫瘍から誘導された細胞の集団である。そのような細胞は、典型的には、それらが理論的には有限の期間でのみ培養することができる一次細胞と違って、培養物中での無制限の増殖を有するように、インビボでいくらかの変化を受けている。さらに、そのような細胞は、好ましくは、それらが罹患した動物中に注入された後に腫瘍を形成することができる。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「一次細胞」は、対象から単離された細胞である。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、「宿主細胞」または「標的細胞」は、ウイルスにより感染させることができる細胞を意味するように互換的に用いられる。
【０１０３】
本明細書で用いられる場合、用語「組織」とは、一般的に生物内で特定の機能を実施するように作用する類似する細胞の群、集合または凝集物を指す。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、用語「免疫特権細胞」および「免疫特権組織」とは、免疫系から隔離された、固形腫瘍などの細胞および組織を指す。一般的には、対象へのウイルスの投与は、対象からウイルスを除去する免疫応答を惹起する。しかしながら、免疫特権部位は、免疫応答から保護または隔離されており、ウイルスの生存および一般的には複製を許容する。免疫特権組織としては、腫瘍組織などの増殖中の組織が挙げられる。
【０１０５】
本明細書で用いられる場合、治療剤は、疾患もしくは障害の症状を改善するか、または疾患もしくは障害を改善する薬剤である。治療剤、治療化合物、または治療レジメンは、当業者には公知であり、本明細書の他の場所に記載される処置または防止（すなわち、特定の疾患または障害を得るリスクを低下させること）のためのワクチンなどの、従来の薬物および薬物治療剤を含む。新生物疾患の処置のための治療剤としては、限定されるものではないが、細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を促進する部分、細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を促進するために活性化することができる部分、または細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を促進するための別の薬剤を活性化する部分が挙げられる。本明細書で提供される方法における使用のための治療剤は、例えば、抗がん剤であってよい。治療剤の例としては、例えば、治療ウイルスおよび細菌などの治療用微生物、サイトカイン、成長因子、光感作剤、放射性核種、毒素、代謝拮抗物質、シグナリング調節剤、抗がん抗生物質、抗がん抗体、血管新生阻害剤、放射線療法、化学療法化合物またはその組合せが挙げられる。
【０１０６】
本明細書で用いられる場合、抗がん剤または化合物（「抗腫瘍または抗新生物剤」と互換的に用いられる）とは、抗がん処置において用いられる任意の薬剤、または化合物を指す。これらのものは、単独で、または他の化合物もしくは処置と組み合わせて用いた場合、新生物疾患、腫瘍およびがんに関連する臨床症状または診断マーカーを軽減する、低下させる、改善する、防止する、または寛解の状態に置く、もしくはそれを維持することができ、本明細書で提供される方法、組合せおよび組成物において用いることができる任意の薬剤を含む。抗がん剤は、抗転移剤を含む。抗がん剤の例としては、限定されるものではないが、化学療法化合物（例えば、毒素、アルキル化剤、ニトロソウレア、抗がん抗体、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤）、サイトカイン、成長因子、ホルモン、光感作剤、放射性核種、シグナリング調節剤、抗がん抗体、抗がんオリゴペプチド、抗がんオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）、血管新生阻害剤、放射線療法、またはその組合せが挙げられる。化学療法化合物の例としては、限定されるものではないが、Ａｒａ−Ｃ、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ゲムシタビン、カンプトテシン、イリノテカン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、およびメトトレキサートが挙げられる。本明細書で用いられる場合、抗がん剤または化学療法剤に対する参照は、別途指摘しない限り、抗がん剤または化学療法剤の組合せまたは複数の抗がん剤または化学療法剤を含む。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、「化学感作剤」は、所与の化学療法剤または化合物に対する細胞または生物の耐性を調節する、弱める、逆転させる、またはそれに作用する薬剤である。用語「モジュレータ」、「調節剤」、「アテニュエータ」、「弱毒化剤」、または「化学増感剤」は、「化学感作剤」を意味するように互換的に用いることができる。いくつかの例においては、化学感作剤は、化学療法剤であってもよい。化学感作剤の例としては、限定されるものではないが、放射線、カルシウムチャネル遮断剤（例えば、ベラパミル）、カルモジュリン阻害剤（例えば、トリフルオペラジン）、インドールアルカロイド（例えば、レセルピン）、キノリン（例えば、キニン）、リソソーム指向性薬剤（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、クロロキン）、ステロイド（例えば、プロゲステロン）、トリパラノール類似体（例えば、タモキシフェン）、界面活性剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ）、テキサフィリン、および環状抗生物質（例えば、シクロスポリン）が挙げられる。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、腫瘍または他の免疫特権部位で生成される化合物とは、１つまたは複数の遺伝子産物を発現する、導入されたウイルス、一般的には組換えウイルスの存在に基づいて腫瘍または腫瘍環境中で生成される任意の化合物を指す。例えば、腫瘍中で生成される化合物は、例えば、コードされたポリペプチドもしくはＲＮＡ、代謝物、または組換えポリペプチドおよび腫瘍もしくは免疫特権を有する組織もしくは細胞の細胞機構により生成される化合物であってよい。
【０１０９】
本明細書で用いられる場合、対象は、診断、スクリーニング、モニタリングまたは処置が想定される動物などの任意の生物を含む。動物としては、霊長類および家畜などの哺乳動物が挙げられる。霊長類の例は、ヒトである。患者とは、疾患状態に罹患したか、または疾患状態が決定されるか、または疾患状態のリスクが決定される、哺乳動物、霊長類、ヒト、または家畜対象などの対象を指す。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、投与のためのデリバリービヒクルとは、宿主対象へのデリバリーのための、本明細書で提供されるウイルスなどの薬剤と会合するリポソーム、ミセルまたは逆ミセルなどの脂質に基づく、または他のポリマーに基づく組成物を指す。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合、ベクター（またはプラスミド）とは、異種核酸の発現またはその複製のために前記核酸を細胞中に導入するのに用いられる個別のエレメントを含有する核酸コンストラクトを指す。ベクターは、典型的には、エピソームに残存するが、ゲノムの染色体中への遺伝子またはその一部の安定な組込みを行うように設計することができる。そのようなベクターの選択および使用は、当業者には周知である。発現ベクターとしては、ＤＮＡ断片の発現を行うことができるプロモーター領域などの調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡを発現することができるベクターが挙げられる。かくして、発現ベクターは、好適な宿主細胞中への導入時に、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらすプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。好適な発現ベクターは当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能であるものならびにエピソームに残存するもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合、用語「ウイルスベクター」は、当技術分野で認識されるその意味に従って用いられる。それは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージすることができる核酸ベクターを指す。ウイルスベクター粒子を、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸をインビトロまたはインビボのいずれかで細胞中に導入するために用いることができる。ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアベクター）、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、ＨＳＶ）、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルスベクター、サルウイルス（ＳＶ４０）ベクター、セムリキ森林熱ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
【０１１３】
本明細書で用いられる場合、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であってよい。核酸は、例えば、ポリペプチド、調節ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび機能的ＲＮＡなどの遺伝子産物をコードしてもよい。
【０１１４】
本明細書で用いられる場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、ＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列は、一般的には、中程度の、または高いストリンジェンシー条件下でＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二本鎖を形成することができる十分な相補性を有するヌクレオチド配列を意味する。したがって、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖（すなわち、ｄｓＲＮＡ）をアッセイすることができるか、または三本鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、それが含有し、依然として安定な二本鎖（または場合によっては三本鎖）を形成することができるコードＲＮＡとの塩基不一致が多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用により、許容される不一致度を確認することができる。
【０１１５】
本明細書で用いられる場合、検出可能な標識または検出可能な部分または診断部分（また、画像化標識、画像化剤、または画像化部分）は、原子、分子または組成物の存在を直接または間接に測定することができる原子、分子または組成物を指す。検出可能な標識を用いて、１つまたは複数の任意の本明細書で提供されるウイルスを画像化することができる。検出可能な標識を、本明細書で提供される方法のいずれかにおいて用いることができる。検出可能な標識としては、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種、および金属が挙げられる。標識を検出する方法は当技術分野で周知である。そのような標識は、例えば、視覚的検査により、蛍光分光法により、反射率測定により、フローサイトメトリーにより、Ｘ線により、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）および磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）などの様々な磁気共鳴法により検出することができる。検出方法はまた、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＡＴ）、電子線コンピューター断層撮影（ＥＢＣＴ）、高解像度コンピューター断層撮影（ＨＲＣＴ）、下環状断層撮影、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、スパイラルコンピューター断層撮影、および超音波断層撮影などの様々な断層撮影法のいずれかを含む。検出可能な標識の直接検出とは、例えば、Ｘ線またはＭＲＩなどの、標識自体のエネルギーまたは粒子放出または吸収などの、検出可能な標識自体の物理的現象の測定を指す。間接的検出とは、検出可能な標識に直接または間接に結合する原子、分子または組成物の、エネルギーまたは粒子放出または吸収などの検出可能な標識に直接または間接に結合する原子、分子または組成物の物理的現象の測定を指す。間接的検出の非限定例においては、検出可能な標識は、アビジンへの結合により検出することができるビオチンであってよい。標識されていないアビジンを全身投与して、非特異的結合を遮断した後、標識されたアビジンを全身投与することができる。かくして、検出可能な標識または検出可能な部分の範囲内に含まれるのは、標識または部分が別の原子、分子または組成物に結合する結果として、原子、分子または組成物の存在を検出することができる、原子、分子または組成物を指す、結合可能な標識または結合可能な部分である。検出可能な標識の例としては、例えば、金コロイド、鉄、ガドリニウム、およびガリウム−６７などの金属、蛍光部分、ならびに放射性核種が挙げられる。蛍光部分および放射性核種の例は、本明細書の他の場所に提供される。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、放射性核種、ラジオアイソトープまたは放射性同位体は、不安定な核を有する原子を指すように互換的に用いられる。その核は、核内に新しく作られた放射粒子、または他に原子内電子に与えられるために利用可能である過剰なエネルギーを特徴とする。放射性核種は、このプロセスにおいて、放射性崩壊を受け、γ線および／または亜原子粒子を放射する。そのような放射を、限定されるものではないが、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または平面ガンマ画像化などの方法によりインビボで検出することができる。ラジオアイソトープは、天然のものであってよいが、人工的に製造されたものであってもよい。インビボでの画像化における使用のための放射性核種の例としては、限定されるものではないが、１１Ｃ、１３Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、５２Ｆｅ、５１Ｃｒ、５５Ｃｏ、５５Ｆｅ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５７Ｎｉ、５９Ｆｅ、６０Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ（ＩＩ）、６７Ｃｕ（ＩＩ）、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１０３Ｐｄ、１０６Ｒｕ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１５３Ｇｄ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２４１Ａｍが挙げられる。ラジオアイソトープを、代謝化合物などの化合物中に組み込むか、またはそれに結合させることができる。ヌクレオシド類似体などの代謝化合物に組み込むか、または連結することができる放射性核種の例としては、限定されるものではないが、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、１９Ｆ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒおよび３Ｈが挙げられる。放射性標識化合物の例としては、限定されるものではないが、放射標識された形態の１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−インドウラシル（ＦＩＡＵ）、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−エチルウラシル（ＦＥＡＵ）、１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）、３’−デオキシ−３’−フルオロチミジン（ＦＬＴ）、９−［４’−フルオロ−３’−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（ＦＨＢＧ）および９−［（３’−フルオロ−１’−ヒドロキシ−２’−プロポキシ）メチル］グアニン（ＦＨＰＧ）、例えば、［１２５Ｉ］−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−インドウラシル（［１２５Ｉ］−ＦＩＡＵ）、［１２４Ｉ］−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−インドウラシル（［１２４Ｉ］−ＦＩＡＵ）、［１８Ｆ］−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−インドウラシル（［１８Ｆ］−ＦＩＡＵ）、［１８Ｆ］−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−エチルウラシル（［１８Ｆ］−ＦＥＡＵ）、［１８Ｆ］−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（［１８Ｆ］−ＦＭＡＵ）、［１８Ｆ］−３’−デオキシ−３’−フルオロチミジン（［１８Ｆ］−ＦＬＴ）、［１８Ｆ］−９−［４’−フルオロ−３’−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］−ＦＨＢＧ）および［１８Ｆ］−９−［（３’−フルオロ−１’−ヒドロキシ−２’−プロポキシ）メチル］グアニン（［１８Ｆ］−ＦＨＰＧ）などのヌクレオシド類似体が挙げられる。
【０１１７】
本明細書で用いられる場合、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）とは、固体、特に、ヒト細胞、組織および臓器中の特定の原子および分子構造の電子画像を作製するための核磁気共鳴分光計の使用を指す。ＭＲＩは、臓器および他の身体内部構造の断面画像を作製するために核磁気共鳴を用いる非侵襲的な診断技術である。対象は、強力な電磁気を含有する大きな中空の円筒の内部に横たわり、体内の特定の原子の核（例えば、１Ｈ、１３Ｃおよび１９Ｆなど）が磁気的に整列するのを引き起こす。次いで、対象を電波にかけ、整列した核のフリップを引き起こす；電波が引き出された時、核はその元の位置に戻って電波を放射し、次いで、受信機によって検出され、コンピューターにより二次元の像に翻訳される。いくつかのＭＲＩ手順については、ガドリニウムなどの造影剤を用いて、画像の正確性を増加させる。
【０１１８】
本明細書で用いられる場合、Ｘ線とは、０．０１〜１０ナノメートルの近似範囲の波長を有する、比較的高エネルギーの光子、またはそのような光子の流れを指す。Ｘ線はまた、Ｘ線を用いて撮影された写真も指す。
【０１１９】
本明細書で用いられる場合、ある部分にコンジュゲートされた化合物とは、部分に結合した化合物を含む複合体を指し、化合物と部分との結合は１つまたは複数の共有結合または非共有相互作用、例えば、水素結合、または静電相互作用を生じ得る。コンジュゲートはまた、化合物を部分に接続するリンカーを含んでもよい。化合物の例としては、限定されるものではないが、ナノ粒子および親鉄剤が挙げられる。部分の例としては、限定されるものではないが、検出可能な部分および治療剤が挙げられる。
【０１２０】
本明細書で用いられる場合、発光とは、発エルゴン的化学プロセスの励起された生成物が光の放射と共にその基底状態に戻る時に生成される、検出可能な電磁気（ＥＭ）放射線、一般的には、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）または可視的ＥＭ放射線を指す。化学発光は、化学反応の結果生じる発光である。生物発光は、基質および／または酵素として生物分子（または合成型もしくはその類似体）を用いる化学反応の結果生じる化学発光である。蛍光は、可視色の光が、光または紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）もしくは可視的ＥＭ放射線などの他の形態の放射線による刺激または励起下で物質から放射される発光である。
【０１２１】
本明細書で用いられる場合、化学発光とは、エネルギーがある分子に特異的に向かい、それを電気的に励起させ、続いて、光子を放出させることによって可視光を放射する化学反応を指す。温度はこの向かったエネルギーには寄与しない。かくして、化学発光は、化学的エネルギーの光エネルギーへの直接的変換を含む。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、化学発光の種類である生物発光は、生物分子、特に、タンパク質による光の放射を指す。生物発光のための必須条件は、基質であるルシフェリンに対して作用する、オキシゲナーゼであるルシフェラーゼの存在下で結合したか、または遊離した酸素分子である。生物発光は、酸素分子の存在下で基質であるルシフェリン（生物発光基質）に対して作用し、基質を励起状態に変換し、より低いエネルギーレベルに戻る際に、光の形態のエネルギーを放出するオキシゲナーゼである酵素または他のタンパク質（ルシフェラーゼ）により生成される。
【０１２３】
本明細書で用いられる場合、生物発光をもたらすための基質および酵素は、一般的には、それぞれルシフェリンおよびルシフェラーゼと呼ばれる。明確にするためにその特定の種を参照する場合、それぞれの一般的用語は、例えば、コメツキムシルシフェラーゼまたは蛍ルシフェラーゼなどの、それが由来する生物の名称と共に用いられる。
【０１２４】
本明細書で用いられる場合、ルシフェラーゼは、光放射反応を触媒するオキシゲナーゼを指す。例えば、細菌ルシフェラーゼは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）および脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、その反応は光を生成する。特に海洋節足動物に見出される別のクラスのルシフェラーゼは、ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）［バルグラ（Ｖａｒｇｕｌａ）］ルシフェリンの酸化を触媒し、別のクラスのルシフェラーゼは甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）ルシフェリンの酸化を触媒する。かくして、ルシフェラーゼは、生物発光反応（生物発光をもたらす反応）を触媒する酵素または光タンパク質を指す。蛍およびガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）およびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、触媒的に作用し、生物発光生成反応の間に変化しない酵素である。ルシフェリンが非共有結合したエクオリン光タンパク質などのルシフェラーゼ光タンパク質は、生物発光生成反応の間にルシフェリンの放出などにより変化する。ルシフェラーゼは、生物またはその変異体もしくは突然変異体、例えば、天然タンパク質とは異なる、熱安定性などの１つまたは複数の特性を有する突然変異誘発により作製された変異体に天然で存在するタンパク質、またはタンパク質の混合物（例えば、細菌ルシフェラーゼ）である。ルシフェラーゼおよびその改変された突然変異体または変異体は周知である。本明細書の目的のために、ルシフェラーゼに対する参照は、光タンパク質またはルシフェラーゼのいずれかを指す。
【０１２５】
例えば、レニラルシフェラーゼに対する参照は、レニラ属のメンバーから単離された酵素または別の関連するカイアシ類などの任意の他の起源から得られた、もしくは合成的に調製された同等の分子を指す。活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を有するレニラルシフェラーゼを包含することが意図される。アミノ酸の保存的置換は当業者には公知であり、一般的には得られる分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、一般的に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換が生物活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８７，  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  ｃｏ．，  ｐ．２２４を参照されたい）。
【０１２６】
本明細書で用いられる場合、生物発光基質とは、ルシフェラーゼおよび任意の必要な活性化因子の存在下で酸化され、光を生成する化合物を指す。これらの基質は、本明細書ではルシフェリンと呼ばれ、生物発光反応において酸化を受ける基質である。これらの生物発光基質としては、任意のルシフェリンもしくはその類似体またはルシフェラーゼが相互作用して光を生成する任意の合成化合物が挙げられる。典型的な基質としては、光生成反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存在下で酸化されるものが挙げられる。かくして、生物発光基質は、当業者がルシフェリンと認識する化合物を含む。ルシフェリンとしては、例えば、蛍ルシフェリン、ウミホタル（バルグラとしても知られる）ルシフェリン（セレンテラジン）、細菌ルシフェリン、ならびにこれらの基質の合成類似体または生物発光をもたらす反応においてルシフェラーゼの存在下で酸化される他の化合物が挙げられる。
【０１２７】
本明細書で用いられる場合、生物発光基質に変換できることとは、生物発光基質をもたらす酸化または還元などの化学反応を受けやすいことを指す。例えば、生物発光細菌の発光生成反応は、フラビンリダクターゼ酵素によるフラビンモノヌクレオチド基（ＦＭＮ）の還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）への還元を含む。次いで、還元フラビンモノヌクレオチド（基質）は、酸素（活性化因子）および細菌ルシフェラーゼと反応して、ペルオキシフラビン中間体を形成し、長鎖アルデヒドの存在下でさらなる反応を受けて光を生成する。この反応に関して、還元フラビンおよび長鎖アルデヒドは、生物発光基質である。
【０１２８】
本明細書で用いられる場合、生物発光生成系とは、生物発光反応を行うのに必要とされる試薬のセットを指す。かくして、特定のルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび他の基質、溶媒ならびに生物発光反応を完了するのに必要とされ得る他の試薬が、生物発光系を形成する。かくして、生物発光生成系は、好適な反応条件下で、生物発光をもたらす任意の試薬のセットを指す。好適な反応条件とは、ｐＨ、塩濃度および温度などの、生物発光反応が起こるのに必要な条件を指す。一般的には、生物発光系は、生物発光基質、ルシフェリン、ルシフェラーゼ酵素および光タンパク質を含むルシフェラーゼならびに１つまたは複数の活性化因子を含む。特定の生物発光系は、ルシフェラーゼが由来する特定の生物を参照することにより同定することができる。例えば、レニラ生物発光系は、レニラから単離されたか、もしくは組換え方法を用いて製造されたルシフェラーゼまたはこれらのルシフェラーゼの改変物などの、レニラルシフェラーゼを含む。この系はまた、酸素と、ルシフェラーゼが酸素の存在下で反応して光を生成する基質となどの生物発光反応を完了するのに必要な特定の活性化因子を含む。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合、蛍光タンパク質（ＦＰ）とは、蛍光を発する（すなわち、ある波長でエネルギーを吸収し、それを別の波長で放射する）能力を有するタンパク質を指す。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、５１０ｎｍまたは約５１０ｎｍでの放射スペクトルにピークを有するポリペプチドを指す。様々な波長で放射する様々なＦＰが当技術分野で公知である。ＦＰの例としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、遠赤色蛍光タンパク質、または近赤外蛍光タンパク質が挙げられる。青色、シアン、橙色、黄色および赤色の変異体への蛍光タンパク質の利用可能な色のスペクトルの拡張は、融合タンパク質のマルチカラートラッキング（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｔｒａｃｋｉｎｇ）のための方法を提供する。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰとは、エクオレア属に由来するＧＦＰおよびその突然変異体または変異体を指す。そのような変異体ならびにアントゾア（Ａｎｔｈｏｚｏａ）のサンゴ、アネモニア（Ａｎｅｍｏｎｉａ）のイソギンチャク、レニラのウミシイタケ、ガラキセア（Ｇａｌａｘｅａ）のサンゴ、アクロポラ（Ａｃｒｏｐｏｒａ）の褐色サンゴ、トラキフィリア（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ）およびペクチニイダ（Ｐｅｃｔｉｎｉｉｄａｅ）のイシサンゴおよび他の種などの他の種に由来するＧＦＰが周知であり、当業者には利用可能であり、公知である。ＧＦＰ変異体の例としては、限定されるものではないが、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰおよびＯＦＰが挙げられる。蛍光タンパク質およびそれらの変異体の例としては、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、Ｋａｅｄｅ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＣｏｐＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ／Ａｘｘｏｒａ、ＬＬＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などのＧＦＰタンパク質；Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｒｉｚｚｏ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２（４）：４４５−９  （２００４））、ｍＣＦＰ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９  （２００４））、ＡｍＣｙａｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＭｉＣｙ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、およびＣｙＰｅｔ（Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（３）：３５５−６０  （２００５））などのＣＦＰタンパク質；ＥＢＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）などのＢＦＰタンパク質；ＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＹＰｅｔ（Ｎｇｕｙｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（３）：３５５−６０  （２００５））、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０（１）：８７−９０  （２００２））、ＺｓＹｅｌｌｏｗ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９  （２００４））などのＹＦＰタンパク質；ｃＯＦＰ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｍＫＯ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、およびｍＯｒａｎｇｅなどのＯＦＰタンパク質；ならびにその他（例えば、Ｓｈａｎｅｒ  ＮＣ，  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ  ＰＡ，  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２（１２）：９０５−９  （２００５）を参照されたい）が挙げられる。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、赤色蛍光タンパク質、またはＲＦＰとは、コラリモルフス目ジスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）（Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９６９−９７３（１９９９））から単離されたジスコソマＲＦＰ（ＤｓＲｅｄ）、ならびにヘテラクティス（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ）のサンゴおよびアクチニア（Ａｃｔｉｎｉａ）またはエンタクメア（Ｅｎｔａｃｍａｅａ）のイソギンチャク、ならびにその変異体などの任意の他の種に由来する赤色または遠赤色蛍光タンパク質を指す。ＲＦＰとしては、例えば、モノマー赤色蛍光タンパク質１（ｍＲＦＰ１）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９  （２００４））、ＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびＤｓＲｅｄ−Ｔ１（Ｂｅｖｉｓ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ，  Ｎａｔ．    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：  ８３−８７  （２００２））、アントメデューサ（Ａｎｔｈｏｍｅｄｕｓａ）のＪ−Ｒｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）およびアネモニアのＡｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）などの、ジスコソマ変異体が挙げられる。遠赤色蛍光タンパク質としては、例えば、アクチニアのＡＱ１４３（Ｓｈｋｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３９２（Ｐｔ  ３）：６４９−５４  （２００５））、エンタクメアのｅｑＦＰ６１１（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９（１８）：１１６４６−５１  （２００２））、ｍＰｌｕｍおよびｍＲａｓｂｅｒｒｙ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．．，  ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１（４８）：１６７４５−９  （２００４））などのジスコソマ変異体、ならびにヘテラクティスのＨｃＲｅｄ１およびｔ−ＨｃＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、インビボ法とは、対象の生体内で行われる方法を指す。
【０１３３】
本明細書で用いられる場合、遺伝的療法または遺伝子療法は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの異種核酸の、そのような療法が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特に、ヒトの特定の細胞、標的細胞への導入を含む。本明細書で用いられる場合、遺伝的療法または遺伝子療法は、ＤＮＡなどの異種核酸の、そのような療法が求められる障害または状態を有する、哺乳動物、特に、ヒトに導入することができる微生物（例えば、ウイルス）への導入を含んでもよい。ＤＮＡなどの核酸は、ＤＮＡなどの異種核酸が発現され、それによりコードされる治療産物が生成されるような様式で、例えば、直接的または間接的に、選択された標的細胞中に導入される。あるいは、ＤＮＡなどの異種核酸は、いくつかの様式で、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介するか、またはそれは、いくつかの様式で、治療産物であるか、もしくは直接的もしくは間接的に、治療産物の発現を媒介するペプチドもしくはＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ）などの産物をコードしてもよい。また、遺伝的療法を用いて、欠陥遺伝子を置き換えるか、またはそれが導入される哺乳動物もしくは細胞により生成される遺伝子産物を補給する遺伝子産物をコードする核酸を送達することもできる。導入される核酸は、治療化合物をコードしてもよい。治療産物をコードする、ＤＮＡなどの異種核酸を改変した後、罹患した宿主の細胞中に導入して、前記生成物またはその発現を増強するか、またはさもなければ変化させることができる。遺伝的療法はまた、遺伝子発現の阻害剤または抑制剤または他のモジュレータのデリバリーを含んでもよい。
【０１３４】
本明細書で用いられる場合、細胞中で作られる物質、分子、化合物または組成物を参照して用いられる場合の用語「過剰生成する」または「過剰発現する」とは、細胞による物質、分子、化合物または組成物の生成または発現のベースライン、正常または通常レベルよりも高いレベルでの生成または発現を指す。生成または発現のベースライン、正常または通常レベルは、生成／発現がないこと、または限定された、制限された、もしくは調節された生成／発現を含む。そのような過剰生成または過剰発現は、典型的には、細胞の改変により達成される。
【０１３５】
本明細書で用いられる場合、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調節する薬剤または化合物は、タンパク質の活性を減少させるか、もしくは増加させるか、もしくはさもなければ変化させるか、またはいくつかの様式では、細胞中での核酸の発現を上方もしくは下方調節するか、もしくはさもなければ変化させる。
【０１３６】
本明細書で用いられる場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であってよい。蛍光または放射標識などの検出可能な標識などで所望により標識されるプローブまたはプライマーを参照する場合、一本鎖分子が想定される。そのような分子は、典型的には、それらの標的が、ライブラリーをプローブ化するか、またはプライミングするために統計的にユニークであるか、または低いコピー数（典型的には、５個未満、一般的には、３個未満）のものであるような長さのものである。一般的には、プローブまたはプライマーは、対象とする遺伝子と相補的な、またはそれと同一である少なくとも１４、１６または３０個の連続するヌクレオチド配列を含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００個以上の核酸の長さであってよい。
【０１３７】
本明細書で用いられる場合、ペプチドとは、２アミノ酸長以上である、および４０アミノ酸長以下であるポリペプチドを指す。
【０１３８】
本明細書で用いられる場合、本明細書で提供されるアミノ酸の様々な配列中に生じるアミノ酸は、それらの公知の３文字または１文字の省略形に従って同定される（表１）。様々な核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に用いられる標準的な一文字記号表示を用いて指定される。
【０１３９】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含有する。本明細書の目的のために、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【０１４０】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸残基」とは、そのペプチド結合でのポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸を指す。本明細書に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体にあると推定される。「Ｄ」異性体にある残基は、そのように指定された場合、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基に置換することができる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４３：３５５７−３５５９  （１９６８）および採用された３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２２に記載された標準的なポリペプチド命名法に沿って、アミノ酸残基の省略形が表１に示される。
【０１４１】
表１−対応表
【表１】
2018171059.tif 000002
【０１４２】
本明細書に式で表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向に、左から右の向きを有する。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に列挙されるアミノ酸ならびに３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２２で言及され、参照により本明細書に組み込まれるものなどの、改変アミノ酸および非通常アミノ酸を含むと定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始め、または終わりのダッシュ記号は、１つもしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列、ＮＨ２などのアミノ末端基、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに留意されたい。
【０１４３】
本明細書で用いられる場合、「天然α−アミノ酸」は、荷電したｔＲＮＡ分子の、ヒトにおけるその同族ｍＲＮＡコドンによる特異的認識によりタンパク質中に組み込まれる天然に見出される２０種のα−アミノ酸の残基である。かくして、非天然アミノ酸は、例えば、２０種の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、限定されるものではないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマーが挙げられる。非天然アミノ酸の例は本明細書に記載されており、当業者には公知である。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合、ＤＮＡコンストラクトは、天然には見出されない様式で組み合わせ、並置されたＤＮＡのセグメントを含む一本鎖または二本鎖の、線状または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトによる操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
【０１４５】
本明細書で用いられる場合、ＤＮＡセグメントは、特定の属性を有するより大きいＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、５’から３’方向に向かって読んだ場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードするプラスミドまたはプラスミド断片などの、より長いＤＮＡ分子の一部である。
【０１４６】
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然の起源から単離する、インビトロで合成する、または天然分子と合成分子との組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書ではヌクレオチド（「ｎｔ」と省略される）または塩基対（「ｂｐ」と省略される）を単位として与えられる。用語「ヌクレオチド」は、文脈が許す場合、一本鎖および二本鎖分子について用いられる。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を示すために用いられ、用語「塩基対」と等価であると理解される。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖がその長さにおいてわずかに異なっていてもよく、その末端がずれていてもよいことを認識できる。かくして、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは対形成しなくてもよい。そのような非対形成末端は、一般には、長さ２０ヌクレオチドを超えない。
【０１４７】
本明細書で用いられる場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸が、配列表に記載のものなどの開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸に「一致する」という記述は、ＧＡＰアルゴリズムなどの、標準的なアラインメントアルゴリズムを用いて同一性を最大化するために開示された配列と整列させた際に同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸を指す。配列を整列させることにより、当業者であれば、例えば、指針として保存された同一のアミノ酸残基を用いて、一致する残基を同定することができる。一般的には、一致する位置を同定するために、アミノ酸の配列はより高い次数の一致が得られるように整列される（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３を参照されたい）。
【０１４８】
本明細書で用いられる場合、「配列同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における同一であるか、または類似するアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。配列同一性は、類似性または同一性の領域を同定するための核酸またはタンパク質配列の配列アラインメントにより決定することができる。本明細書の目的のために、配列同一性は、一般的には同一の残基を同定するためのアラインメントにより決定される。アラインメントは、部分的（ｌｏｃａｌ）または全体的（ｇｌｏｂａｌ）であってよい。比較された配列間の一致、不一致およびギャップを同定することができる。ギャップは、同一であるか、または類似する文字が整列されるように整列された配列の残基間に挿入された無効なアミノ酸またはヌクレオチドである。一般的には、内部および末端ギャップが存在してもよい。配列同一性は、同一の残基の数／最も短い配列の長さｘ１００としてギャップを考慮に入れることにより決定することができる。ギャップペナルティを用いる場合、配列同一性は、末端ギャップのペナルティなしに決定することができる（例えば、末端ギャップはペナルティを受けない）。あるいは、配列同一性は、同一の位置の数／整列された配列全体の長さｘ１００としてギャップを考慮に入れずに決定することができる。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、「全体的（ｇｌｏｂａｌ）アラインメント」は、各配列中の各文字を１回だけ整列させる、２つの配列を始めから終わりまで整列させるアラインメントである。配列間に類似性または同一性が存在するかどうかに拘らず、アラインメントは生成される。例えば、「全体的アラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、それぞれ１００ヌクレオチド長の２つの比較された配列の全配列のアラインメントにおいて、５０％の残基が同じであることを意味する。全体的アラインメントはまた、整列された配列の長さが同じではない場合でも配列同一性を決定するのに用いることができると理解される。配列の末端における差異は、「末端ギャップについてペナルティなし」が選択されない限り、配列同一性の決定において考慮に入れられる。一般的には、全体的アラインメントは、その長さの多くにわたって有意な類似性を共有する配列に対して用いられる。全体的アラインメントを実施するためのアルゴリズムの例としては、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３  （１９７０））が挙げられる。全体的アラインメントを実施するためのプログラムの例は、公共的に利用可能であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で利用可能なＧｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ、およびｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌで利用可能なプログラムが挙げられる。
【０１５０】
本明細書で用いられる場合、「部分的（ｌｏｃａｌ）アラインメント」は、２つの配列を整列させるが、類似性または同一性を共有する配列の部分だけを整列させるアラインメントである。したがって、部分的アラインメントは、ある配列のサブセグメントが別の配列中に存在する場合に決定する。類似性がない場合、アラインメントは戻さない。部分的アラインメントアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：  ４８２  （１９８１））が挙げられる。例えば、「部分的アラインメント」に基づく５０％の配列同一性は、任意の長さの２つの比較された配列の全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の領域中で同じである５０％の残基を有することを意味する。
【０１５１】
本明細書の目的のために、配列同一性は、それぞれの供給業者により確立されたデフォルトのギャップペナルティと共に用いられる標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムにより決定することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータとしては、（１）単項比較マトリックス（同一性について１の値および非同一性について０の値を含む）およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，  ｅｄｓ．，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．  ３５３−３５８  （１９７９）により記載された、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：  ６７４５  （１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対して３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して０．１０の追加ペナルティ；ならびに（３）末端ギャップに対してペナルティなしを含んでもよい。任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％「同一」または同一性％を記述する他の類似する変形であるヌクレオチド配列を有する（または任意の２つのポリペプチドがそのようなアミノ酸配列を有する）かどうかを、部分的または全体的アラインメントに基づいて公知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定することができる（例えば、多くの公知の公共的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供する、ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｓｏｆｔｗａｒｅを参照されたい）。一般的には、本明細書の目的のために、配列同一性は、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＣＭＤ＝Ｗｅｂ＆Ｐａｇｅ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＨｏｍｅ）で利用可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ全体的配列アラインメントツール；ＬＡｌｉｇｎ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  （Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  （１９９１）  １２：３３７−３５７））；およびｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌで利用可能なＸｉａｏｑｕｉ  Ｈｕａｎｇからのプログラムなどの全体的アラインメントに基づくコンピューターアルゴリズムを用いて決定される。一般的には、本明細書のヌクレオチド配列を比較する場合、末端ギャップに対するペナルティを含まない（例えば、末端ギャップがペナルティを受けない）アラインメントを用いる。
【０１５２】
したがって、本明細書で用いられる場合、用語「同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアラインメントを表す。ある非限定例においては、「少なくとも９０％同一」とは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較した９０〜１００％の同一性％を指す。９０％以上のレベルでの同一性は、例示目的で、１００アミノ酸またはヌクレオチドの試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さを比較すると仮定すると、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中のアミノ酸またはヌクレオチドの１０％以下（すなわち、１００のうち１０）が参照ポリペプチドのものと異なるという事実を示す。試験および参照ポリヌクレオチドの間でも同様の比較を行うことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布した点突然変異として表すことができるか、またはそれらは最大限許容可能な、例えば、１０／１００のアミノ酸の差異（約９０％の同一性）までの様々な長さの１つまたは複数の位置にクラスターを形成してもよい。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失として定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムにも、設定されたギャップパラメータにも、依存しないはずであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らずとも容易に評価することができる。
【０１５３】
本明細書で用いられる場合、核酸の２つの配列を参照する場合の「等価性」とは、問題の２つの配列が同じアミノ酸配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。等価性が２つのタンパク質またはペプチドまたは他の分子に関して用いられる場合、それは２つのタンパク質またはペプチドが、アミノ酸置換（限定されるものではないが、保存的変化など）または構造のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有すること、および任意の変化がタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないことを意味する。等価性が特性を参照する場合、その特性は同じ程度で存在する必要はないが（例えば、２つのペプチドが異なる速度の同じ種類の酵素活性を示してもよい）、その活性は通常、実質的に同じである。２つのヌクレオチド配列を参照する場合、相補性は２つのヌクレオチド配列が、典型的には、向かい合うヌクレオチド間で２５％、１５％または５％未満の不一致でハイブリダイズすることができることを意味する。必要に応じて、相補性の百分率を特定する。典型的には、２つの分子が高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするように、それらを選択する。
【０１５４】
本明細書で用いられる場合、実質的に純粋とは、そのような純度を評価するために当業者によって用いられる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な分析方法により決定された場合、容易に検出可能な不純物を含まないと考えられるほど十分に均質であること、またはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能な程度に変化させないように十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は、当業者には公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体または異性体の混合物であってもよい。そのような例においては、さらなる精製は、化合物の比活性を増加させることができる。
【０１５５】
本明細書で用いられる場合、用語「評価すること」または「決定すること」は、生成物の活性の絶対値を得る、およびまた、活性のレベルを示す指数、比、百分率、視覚的値または他の値を得る意味における定量的および定性的決定を含むことが意図される。評価は、直接的または間接的であってよい。
【０１５６】
本明細書で用いられる場合、活性とは、本明細書で提供される化合物またはウイルスのインビトロまたはインビボでの活性を指す。例えば、インビボでの活性とは、その（または化合物もしくは他の混合物の）インビボでの投与後に得られる生理学的応答を指す。かくして、活性は、そのような化合物、組成物および混合物の得られる治療効果および薬学的活性を包含する。活性は、そのような活性を試験または使用するために設計されたインビトロおよび／またはインビボ系で観察することができる。
【０１５７】
本明細書で用いられる場合、「組成物」とは、２つ以上の生成物または化合物の任意の混合物を指す。それは、水性、非水性、またはその任意の組合せの溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストであってよい。
【０１５８】
本明細書で用いられる場合、「組合せ」とは、２つ以上の項目または要素の間の任意の会合を指す。組合せの例としては、限定されるものではないが、２つ以上の医薬組成物、２つのウイルス、またはウイルスと抗がん剤、例えば、化学療法化合物、２つ以上のウイルス、ウイルスと治療剤、ウイルスと画像化剤、ウイルスと複数の治療剤および／もしくは画像化剤、またはその任意の会合などの、２つ以上の活性成分を含有する組成物が挙げられる。そのような組合せを、キットとして包装することができる。
【０１５９】
本明細書で用いられる場合、キットは、所望により、組合せの使用ならびに／またはそのような使用のための他の反応物および成分に関する説明書を含む、包装された組合せである。
【０１６０】
本明細書で用いられる場合、「対照」または「標準」とは、それが試験パラメータで処理されないか、またはそれが血漿試料である場合は、それが対象とする状態に罹患していない正常なボランティアに由来するものであってよいことを除いて、試験試料と実質的に同一である試料を指す。対照はまた、内部対照であってもよい。例えば、対照は、公知の特性または活性を有するウイルスなどの試料であってもよい。
【０１６１】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に区別しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、薬剤（「ａｎ」ａｇｅｎｔ）に対する参照は、１つまたは複数の薬剤を含む。
【０１６２】
本明細書で用いられる場合、用語「または」は、代替物のみ、または代替物が相互に排他的であることを指すように明示的に示さない限り、「および／または」を意味するように用いられる。
【０１６３】
本明細書で用いられる場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲と表現することができる。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５塩基」は「約５塩基」を意味すると共に「５塩基」も意味する。
【０１６４】
本明細書で用いられる場合、「所望による（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「所望により（または〜されていてもよい）（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、それに続けて記載される事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその説明が、前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。例えば、置換されていてもよい基とは、その基が無置換であるか、または置換されていることを意味する。
【０１６５】
本明細書で用いられる場合、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に関する省略形は、別途指摘しない限り、その一般的な使用、認識される省略形、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６を参照されたい）に従うものとする。
【０１６６】
開示を明確にするために、および限定されるものではないが、詳細な説明を以下のサブセクションに分割する。
【０１６７】
Ｂ．ワクシニアウイルスクローン株を単離する方法
出発ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株もしくは単離物よりも良好な抗腫瘍応答ならびに類似するか、または低い病原性／毒性を有するワクシニアウイルス調製物または混合物から、ウイルスのクローン単離物を単離する方法が本明細書で提供される。この方法は、存在するウイルス株と比較して低下した毒性および改善されたか、またはより高い抗腫瘍形成特性を有するワクシニアウイルス株の選択および同定において用いられる。
【０１６８】
ワクシニアは、その効率的な複製、細胞溶解、拡散、宿主域および腫瘍組織への天然の指向性のため、腫瘍崩壊ベクターとして用いられている（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １１：１８０）。例えば、ワクシニアウイルスは、アデノウイルスベクターよりも複製および拡散において強力である。それにもかかわらず、ワクシニアは抗腫瘍形成特性を有する公知の弱毒化ウイルスであるが、組換え株などのワクシニアの多くの存在する株はビルレンスおよび安全性における変動を示し、その多くが臨床適用には適していない。また、存在する腫瘍崩壊ワクシニアウイルス候補は、例えば、ウイルスの毒性を最小化するため、または抗腫瘍形成特性を増強もしくは増加させるために、ウイルスゲノム中に挿入された外来遺伝子を含有する組換えウイルスである。それ自体、導入された外来遺伝子の非存在下で最小限の毒性を有する高度に抗腫瘍形成性であるウイルスを選択することができることが本明細書に見出される。かくして、例えば、この方法の目的は、異種遺伝子の挿入とは無関係である改善された抗腫瘍形成特性を保持するか、または有しながら、病原性および毒性などの改善された安全性プロフィールを有するクローン単離物を選択することである。特に、選択されるクローン株は、腫瘍の診断および治療のための腫瘍崩壊ウイルス候補である。ワクシニアの単離されたクローン株を、がんなどの増殖性障害の処置における使用のため、ならびに本明細書に記載の他の治療および／または診断方法における使用のための治療ウイルスとして用いることができる。さらに、クローン株を、ワクチン接種の方法において用いることもできる。選択された、または同定されたクローン株を、組換え腫瘍崩壊ウイルスの構築における親ワクシニアウイルスとして用いることもできる。
【０１６９】
前記方法においては、異なるゲノム配列を有するゲノムを有するいくつかのウイルス粒子を含有する親ワクシニアウイルス調製物または混合物が選択される。親ウイルス調製物または混合物は、混合された集団である、すなわち、それが配列において非クローンであるか、または同種ではない任意のワクシニアウイルス株であってよい。以下でさらに考察する通り、前記調製物は培養系中でのウイルスの反復的増殖から取得することができる。ウイルス調製物は、異なるワクシニアウイルス株を一緒に混合して、インビトロまたはインビボのいずれかで組換えを起こさせることによって混合物として取得することもできる。この混合物はまた、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）株とワクシニアウイルス株とを混合することなどの異なる種類のウイルスを混合することから取得されたものであってもよい。前記方法においては、親ウイルス調製物はインビトロまたはインビボで増殖または増幅され、クローン単離物が得られる（例えば、プラークアッセイによる）。単離された、および選択されたウイルスクローンは、インビトロおよび／またはインビボアッセイにおいて抗腫瘍形成性および病原性／毒性について試験される。１つの特性が、腫瘍崩壊候補の選択における決定要因であるわけではなく、したがって、クローンは抗腫瘍形成性および毒性または安全性特性について試験される。例えば、著しい抗腫瘍形成特性を示すが、毒性が極端に高いウイルスクローンは、理想的な腫瘍崩壊候補ではない。かくして、これらの特性のバランスが望ましい。最良の抗腫瘍応答を有するが、最小限の毒性を有するウイルスクローンが、候補として選択される。特に、同定されるか、または選択されるウイルスクローンは、参照ウイルス株と比較してより良好な毒性および抗腫瘍形成特性を有するものである。
【０１７０】
一例においては、親ウイルス調製物または他の参照ウイルス株（例えば、組換えウイルス）と比較して低い毒性を有する選択されたウイルスは、毒性を示すパラメータを評価するためのアッセイまたは方法において、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス株の０％〜９９％、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下の毒性を示す。他の例においては、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス株（例えば、組換えウイルス）と比較して改善された、またはより良好な抗腫瘍形成活性を有する選択されたウイルスは、抗腫瘍形成性を示すパラメータを評価するためのアッセイまたは方法において、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス株の１２０％〜１０００％、例えば、少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上の抗腫瘍形成活性を示す。いくつかの例においては、毒性を示すパラメータを評価するためのアッセイまたは方法において、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス株（例えば、組換えウイルス）の７０％〜１２０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％もしくは少なくとも１２０％、または約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１１５％もしくは約１２０％または７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１１５％もしくは１２０％の毒性または抗腫瘍形成活性などの、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス株と比較して類似する毒性および／もしくは抗腫瘍形成活性を保持するか、または有するウイルスが選択される。
【０１７１】
方法の工程の説明が以下のサブセクションに提供される。以下に記載の工程は任意の順序で実施することができると理解される。例えば、ウイルス調製物もしくは混合物または個々の単離物の毒性を示すパラメータを評価した後、その抗腫瘍形成性を示すパラメータを評価することができる。別の例においては、ウイルス調製物の抗腫瘍形成特性を評価した後にクローンを個別に単離し、それによって個々のクローンの単離前に抗腫瘍形成特性を有するクローンについて予備選択することができる。代替例においては、個々のクローン単離物をウイルス調製物から単離した後、個々のクローンの抗腫瘍形成特性またはビルレンス特性を評価することができる。特定の例においては、前記方法は、ウイルス調製物または混合物を選択し、細胞培養物中で前記調製物または混合物を継代し、単一のクローンを単離し（例えば、インビトロでのプラークアッセイによる）、培養系からそれぞれのクローンを増殖させ、精製し、抗腫瘍形成性を示すパラメータについてそれぞれのクローン株を評価し、抗腫瘍形成性であるクローン株を選択し、選択されたクローン株から、毒性を示すパラメータを評価し、最小限の毒性を有するサブセットを選択することにより実施される。抗腫瘍形成性および毒性を評価する工程は、インビトロまたはインビボで実施することができる。典型的には、選択されたクローン株は、抗腫瘍形成特性および毒性特性について動物モデルにおいてインビボで試験される。クローン株のゲノムを配列決定して、それが同種であることを確認することができる。
【０１７２】
さらに、示される特性を有するクローン株の選択または同定において、前記方法の工程の全部またはそのいくつかを、ウイルスの選択を補助するための比較目的で参照株と平行して実施することができる。例えば、抗腫瘍形成性または毒性を評価する工程において、出発ウイルス調製物または混合物の抗腫瘍形成特性または毒性特性を評価し、試験されるクローン株を比較して、出発ウイルス調製物または混合物と比較して保持された（すなわち、類似する）か、または改善されたか、もしくはより良好な抗腫瘍形成性もしくは毒性特性を有するものを同定することができる。
【０１７３】
別の例においては、公知の弱毒化組換えウイルスを、その抗腫瘍形成特性または毒性特性について評価し、試験されたクローン単離物を比較して、組換えウイルスと比較して保持された（すなわち、類似する）か、または改善されたか、もしくはより良好な抗腫瘍形成性もしくは毒性特性を有するものを同定することができる。組換えＤＮＡ技術を用いる組換えウイルスの作製のための方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，７６９，３３０号；第４，６０３，１１２号；第４，７２２，８４８号；第４，２１５，０５１号；第５，１１０，５８７号；第５，１７４，９９３号；第５，９２２，５７６号；第６，３１９，７０３号；第５，７１９，０５４号；第６，４２９，００１号；第６，５８９，５３１号；第６，５７３，０９０号；第６，８００，２８８号；第７，０４５，３１３号；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５（５）：２５０９−２５１４；Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：９１６−９１９；およびＨｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｅｖ．  ３：１５３−１７０を参照されたい）。弱毒化および抗腫瘍形成性組換えワクシニアウイルスは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ＧＬＶ−１ｈ６８（配列番号９に記載；ＬＩＶＰの誘導体、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２８２：４１７−４３５を参照されたい）、ＧＬＶ−１ｈ６４（配列番号３２６に記載）、および公開された特許または特許出願に記載の任意のもの（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００３−００５９４００、ＵＳ２００３−０２２８２６１、ＵＳ２００９−０１１７０３４、ＵＳ２００９−００９８５２９、ＵＳ２００９−００５３２４４、ＵＳ２００９−００８１６３９およびＵＳ２００９−０１３６９１７；米国特許第７，５８８，７６７号および第７，７６３，４２０号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３９９２１号を参照されたい）が挙げられる。他の組換えワクシニアウイルス株としては、限定されるものではないが、ＶＶｈＥＡ（Ｌｉｓｔｅｒの誘導体、例えば、Ｔｙｓｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １６：１２２３−１２３３を参照されたい）、ｒＶＶ−ｐ５３（Ｌｉｓｔｅｒの誘導体；例えば、Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １４：８４５−８５４を参照されたい）、ＪＸ−５９４（Ｗｙｅｔｈ株の誘導体、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １４：３７０を参照されたい）およびＪＸ−９６３（ＷＲ株の誘導体、例えば、Ｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓ．，  １１７：３３５０を参照されたい）が挙げられる。
【０１７４】
１．親ウイルス調製物または混合物
前記方法において、ワクシニアウイルスの出発もしくは親調製物またはワクシニアウイルスの混合物および配列において同種であるゲノムを有さない他のウイルスが、方法における使用のために選択される。前記調製物または混合集団中のワクシニアウイルスは、典型的には、異種遺伝子を含有するように遺伝子操作されていない非組換えウイルス株である。したがって、前記方法は、挿入された遺伝子とは無関係に抗腫瘍形成性および最小限の毒性を示すワクシニアウイルスクローン株の同定を可能にする。以下に考察される通り、得られる選択された株は、ウイルスの特性をさらに調節するための外来遺伝子の挿入によりさらに改変または遺伝子操作することができる。
【０１７５】
典型的には、ウイルスの出発調製物または混合物は、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）の弱毒化株などの弱毒化ウイルスであるか、またはそれを含む。ワクシニアウイルスの様々な株が公知であり、当業者にとって利用可能である。ワクシニア株の例は、表２に列挙され、限定されるものではないが、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（Ｃｏｐ）、Ｂｅｒｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、Ｗｙｅｔｈ（ＤＲＹＶＡＸ）、ＩＨＤ−Ｊ、ＩＨＤ−Ｗ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ａｎｋａｒａ、ＣＶＡ３８２、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、Ｄａｉｒｅｎ  Ｉ、ＬＣ１６ｍ８、ＬＣ１６Ｍ０、ＬＩＶＰ、ＡＣＡＭ２０００、ＷＲ６５−１６、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＣＢＨ）、ＥＭ−６３、またはＮＹＶＡＣワクシニアウイルスが挙げられる。ＬＩＶＰは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａにおいてウシ皮膚に適合化されたＬｉｓｔｅｒ株を起源とする（Ａｌ’ｔｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ，  ２８５：６９６−６９９）。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）は、マウス脳における反復的継代によりＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＣＢＨ）株から誘導される（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９９９）  Ｓｍａｌｌｐｏｘ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ．    Ｉｎ：  Ｐｌｏｔｋｉｎ  Ｓ，  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ｗ  （ｅｄｓ）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐｐ．  ７４−９７）。
【０１７６】
【表２】
2018171059.tif 000003
【０１７７】
配列において異種であるワクシニアウイルスの混合集団などのウイルス調製物を、当技術分野で公知の様々な方法により作出することができる。例えば、ウイルス調製物における多様性を、ウイルス株の天然の選択プロセスにおいて生じる相同組換え事象に基づいて作製することができる。例えば、ポックスウイルス間の相同組換えは、細胞が２つのウイルスに同時感染した場合、または１つのウイルスとゲノムＤＮＡまたはクローニングされたＤＮＡに感染した場合に起こることが知られている（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  （ｅｄｓ）  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９９））。かくして、一例においては、ウイルス調製物を、点突然変異または組換え事象の蓄積をもたらし得る、組織培養物中での１つもしくは複数のウイルス株の反復的継代によるか、または腫瘍組織もしくは他の哺乳動物組織の感染を介してインビボで（例えば、ウシ皮膚上での継代）作製することができる。いくつかの例においては、２つ以上のウイルス株の継代を作製することができる。ワクシニアウイルスなどのウイルスによるインビトロでの細胞の感染および動物対象のインビボでの感染のための方法は、当技術分野で周知である。ウイルスまたはウイルスの混合物の継代のための腫瘍を含有する動物モデルの作製も当技術分野で周知であり、本明細書の他の場所に記載される。
【０１７８】
別の例においては、１つまたは複数のウイルス株の突然変異誘発を行って、様々な遺伝的改変を含むウイルス調製物を作出することができる。この例においては、ウイルス保存液の様々な突然変異誘発戦略を用いて、ウイルスのプールを無作為に突然変異誘発させることができる。例えば、亜硝酸を用いて、無作為突然変異を行うことができる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７１）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  １１：９５−１０１を参照されたい）。得られるウイルス調製物は、異種ゲノムを有するものであってよい。
【０１７９】
典型的には、親ウイルス調製物または混合物は、前記方法における使用の前に接種物をクローンとして精製する試みが行われない調製物である。いくつかの例においては、インビボで１回または複数回、ウイルス株を継代することにより、ウイルス調製物が得られる。いくつかの例においては、インビトロで１回または複数回、継代することにより、ウイルス調製物が得られる。いくつかの例においては、インビトロで１回または複数回、およびインビボでさらに１回または複数回継代することにより、ウイルス調製物が得られる。別の例においては、培養系を、ワクシニアのクローン株、ワクシニアの非クローン株、またはワクシニアウイルスのクローン株と非クローン株との組合せなどの、ウイルス株の集団に感染させることにより誘導される混合物の増殖により、ウイルス調製物が得られる。
【０１８０】
特定の例においては、親ウイルス調製物または混合物は、Ｌｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株を含む。別の例においては、親ウイルス株調製物または混合物は、細胞培養物中で継代されたＬｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株から誘導されたウイルス株を含む。特定の例においては、親ウイルス株調製物または混合物は、例えば、腫瘍細胞培養物などの細胞培養物中で継代されたＬｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株から誘導される。特定の例においては、親ウイルス株調製物または混合物は、例えば、移植された腫瘍中などのインビボで継代されたＬｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株から誘導される。特定の例においては、親ウイルス株混合物は、例えば、ウシ皮膚の接種などの対象の皮下接種によりインビボで継代されたＬｉｓｔｅｒワクシニアウイルス株から誘導される。
【０１８１】
本明細書に記載の方法における使用のための親ウイルス株調製物または混合物の例としては、配列において同種ではないゲノムを有するＬＩＶＰワクシニアウイルスが挙げられる。Ｌｉｓｔｅｒ株を起源とするＬＩＶＰ（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５４９）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａにおいてウシ皮膚に適合化されたものである（Ａｌ’ｔｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ，  ２８５：６９６−６９９）。ＬＩＶＰ株を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ（Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １３：４８７−４９３）；Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＳＲＩ  ＳＲＣ  ＶＢ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｋｏｚｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４４：５１２１−５１２６）から取得するか、またはＭｏｓｃｏｗ  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｃ０３５５  Ｋ０６０２；  Ａｇｒａｎｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，  ４０：３９２４−３９２９）から取得することができる。それはまた、当業者には周知である；それはＵＳＳＲにおいて、ならびにアジアおよびインドを通してワクチン接種のために用いられるワクチン株である。現在、その株は研究者によって用いられており、周知である（例えば、Ａｌｔｓｈｔｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｄｏｋｌ．  Ａｋａｄ．  Ｎａｕｋ  ＵＳＳＲ  ２８５：６９６−６９９；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １３４：１−９；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：４８７−４９３；Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２７３−２８３；Ｓｒｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：１３１１−１３２０；Ｚｉｎｏｖｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｇｅｎｅ  １４７：２０９−２１４；およびＣｈｋｈｅｉｄｚｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＦＥＢＳ  ３３６：３４０−３４２を参照されたい）。ＬＩＶＰはＷＲ株よりも低いビルレンスを示す。ＧＬＶ−１ｈ６８（配列番号９に記載；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ４１０３０４）およびＧＬＶ−１ｈ６４（配列番号３２６に記載）と命名された、ＬＩＶＰの組換え誘導体は、腫瘍標的化特性ならびにその親ＬＩＶＰ株（配列番号１０に記載）およびＷＲ株（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２８２：４１７−４３５）と比較して改善された安定性プロフィールを示す。
【０１８２】
特定の例においては、ワクシニアウイルスの混合集団を含有するウイルス調製物は、細胞または組織を、ＬＩＶＰなどのワクシニア株、および別のウイルス型またはゲノムＤＮＡもしくはクローニングされたＤＮＡに感染させることにより作出される。他のウイルス型の例としては、限定されるものではないが、他のポックスウイルス（例えば、アビポックスウイルス、粘液腫ウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのＤＮＡウイルス；パルボウイルスなどの一本鎖ＤＮＡウイルス；レオウイルス（例えば、ロタウイルス）などの二本鎖ＲＮＡウイルス；ピコルナウイルス（例えば、セネカバレーウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス）、トガウイルス（例えば、セムリキ森林熱ウイルス）およびレトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、レンチウイルス）などの一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルス；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）およびラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））などの一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスが挙げられる。
【０１８３】
２．クローン株の単離
ワクシニアウイルスの混合集団を含有するウイルス調製物から、クローン単離物を選択する。ウイルス混合物から個々のクローンを単離する方法は、当業者には周知である。そのような方法の例は、標準的なプラークアッセイである。プラークアッセイは、ウイルスによる細胞単層の感染後の細胞のウイルス溶解の領域であるウイルスプラークの形成を測定する。それぞれ個々のプラークは、単一のウイルスクローン株を表す。
【０１８４】
典型的なプラークアッセイにおいては、細胞単層を集密近くまで増殖させた後、本明細書に記載のウイルス調製物または混合物の連続希釈液に感染させる。ウイルスによる細胞の感染は、細胞溶解および直接隣接する細胞の感染をもたらし、プラークは細胞の一群の感染を反映する。一般的には、それぞれのプラークは、同種のゲノム配列を有する単一のウイルスを表す。ウイルスの連続希釈液を用いて、単一のウイルスクローン株を表す明確に定義されたプラークの単離を確保する。典型的には、アガロースのオーバーレイを用いて、細胞を安定に保ち、ウイルスの拡散を制限する。個々のプラークを単離することにより、ウイルスクローン株を精製することができる。
【０１８５】
様々な細胞型のいずれかを、感染のために用いることができる。当業者であれば、プラークアッセイにおける使用のための好適な標的細胞系を同定することができる。プラークアッセイのための好適な細胞系の選択は、例えば、細胞感染性および標的細胞中で増殖し、それを溶解するウイルスの能力などの、公知の因子に依存し得る。プラークアッセイにおいてＤＮＡウイルス感染に日常的に用いられる細胞系の例としては、限定されるものではないが、ＣＶ−１（サル腎臓）、Ｖｅｒｏ（サル腎臓）、ＢＨＫ（ハムスター腎臓）、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）およびＨＥＫ−２９３（ヒト胚性腎臓）細胞が挙げられる。いくつかの例においては、例えば、ＨＴ２９（結腸）、Ａ５４９（肺）、Ｈ２００９（肺）、ＤＵ１４５（前立腺）、ＰＣ−３（前立腺）、ＭＢ２３１（乳房）、ＧＩ−１０１Ａ（乳房）、Ｐａｎｃ−１（膵臓）、Ｈｌａｃ（頭部および頸部）または細胞単層を形成することができる他の腫瘍細胞系などの、腫瘍細胞系の細胞単層の感染により、ウイルスを選択することができる。
【０１８６】
一例においては、細胞を、ワクシニアウイルス調製物または混合物に感染させ、細胞単層を記載のように増殖させる。一般的には、他のプラークに由来するウイルスとの汚染を回避するために、５０個より少ないプラークを含有するプレートからプラークを選択する。一度、特定のプラークが選択されたら、標準的な方法を用いる回収によりウイルスクローン株を精製することができる。例えば、プラークのすぐ上のアガロースプラグを、組織培養培地を含有する新鮮なチューブ中に取り出すことにより、滅菌マイクロピペットまたはチューブを用いて選択されたプラークを拾うことができる。チューブを混合するか、または回転させることにより、ウイルス粒子をアガロースから溶出させることができる。溶出した培地を、細胞を含有する細胞培養皿またはプレートのウェル中で希釈し、インキュベートしてウイルスを増殖させることができる。ウイルス上清を収集し、遠心分離して破片を除去し、保存することができる。さらなる保存のために連続継代を用いることができるが、継代の回数は最小化し、記録すべきである。１回または複数回の連続的プラーク選択を用いて、単一のウイルスクローン株の単離を確保することができる。配列決定、制限酵素分析、ＰＣＲ、サザンブロットまたはタンパク質発現により、ウイルスの同一性を確認することができる。
【０１８７】
本明細書の方法の特定の例においては、腫瘍または転移の処置にとって望ましい特性に基づいて、ウイルスクローン株を選択する。例えば、プラークアッセイにおいて形成されるプラークは、ウイルスの複製または感染特性に起因して形成される。プラークのサイズは、感染性およびウイルス生成を示すものである。例えば、プラークのサイズが大きくなるほど、細胞溶解およびウイルス拡散の速度が速い。腫瘍処置のためには、一般的には、ウイルスが高い感染率および／または高い細胞溶解速度を有することが望ましい。したがって、選択されるウイルスプラークは、典型的にはサイズが大きい（すなわち、大きい直径）。かくして、本明細書に記載の方法のいくつかの例においては、プラークアッセイにおける最大のプラーク（例えば、プレート上の）を選択する。例えば、プラークの選択において、プラークのサイズが異なる場合、最大のプラークを選択する、例えば、少なくとも最大の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上のプラークを選択する。それぞれの選択されたプラークを単離し、増殖させ、ウイルスクローンを回収する。それぞれのウイルスクローン保存液を、抗腫瘍形成性および毒性について試験することができる。
【０１８８】
別の例においては、ウイルスクローンの単離前に、ウイルスの抗腫瘍形成性または毒性についてウイルス調製混合物を予備選択することができる。例えば、予備選択は、腫瘍細胞系におけるインビトロでのウイルス混合物の継代（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：２６４０−２６５０）または腫瘍動物モデルにおけるインビボでの継代（Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：８９２８）または健康な動物モデルにおけるインビボでの継代によるものであってよい。様々な腫瘍細胞系または腫瘍動物モデルが、当業者には公知であり、本明細書に記載される。例えば、ウイルス混合物を用いて、インビトロの腫瘍細胞または動物を感染させ、複数回の選択にかけることができる。例えば、インビトロでの選択のために、ウイルスを腫瘍細胞系中で連続継代し、細胞変性（ｃｙｏｐａｔｈｉｃ）効果（ＣＰＥ）を伴う細胞からウイルスを回収することができる。別の例においては、インビボでの選択のために、ウイルスを連続的に用いて腫瘍担持動物を感染させ、体重および腫瘍体積をモニターし、腫瘍成長阻害を伴うマウスの血液または腫瘍からウイルスを回収することができる。さらなる例においては、毒性について予備選択するためのインビボでの選択のために、ウイルスを連続的に用いて正常な動物を感染させ、体重をモニターし、体重の最小限の減少を伴うマウスの血液からウイルスを回収することができる。次いで、その抗腫瘍形成特性および／または毒性特性について予備選択された、回収されたウイルスを、プラークアッセイを用いて単離することができる。上記の通り、最大のプラークを選択して、高い複製または感染特性を有するウイルスクローンを単離することができる。
【０１８９】
ウイルスの調製物または混合物からの１つまたは複数のウイルスクローン株の単離後、その抗腫瘍形成特性および毒性特性に基づいて、治療剤の候補として、ウイルスクローン株をさらに選択することができる。
【０１９０】
３．抗腫瘍形成性
単離されたウイルスを、その抗腫瘍形成特性を示すパラメータについてさらに試験する。一般的には、選択されるパラメータは、腫瘍または転移の処置などの増殖性疾患および障害の処置にとって望ましいものである。例えば、ウイルスは、ウイルスの連続的増幅が隣接する細胞の感染およびその後のそれらの破壊をもたらすように複製することにより、腫瘍細胞を破壊することができる。腫瘍崩壊ウイルスもまた、がん細胞に対して細胞傷害性であるタンパク質の発現により抗腫瘍形成性を示す。さらなる例においては、ウイルスは、特異的および非特異的な抗腫瘍免疫応答の開始、例えば、感染した細胞（例えば、ＴＮＦ）からの、または特異的応答を介する（例えば、ＣＴＬ応答）サイトカイン発現の開始により、抗腫瘍形成性を示すことができる。したがって、上記パラメータのいずれかを、ウイルスの抗腫瘍形成性を示すものとして評価することができる。
【０１９１】
例えば、単離されたウイルスを、感染性、ウイルス核酸の複製、ウイルス生成、腫瘍細胞からのウイルス遺伝子発現、宿主細胞に対する効果、腫瘍細胞の細胞傷害性、腫瘍細胞選択性、腫瘍細胞型選択性、特異的および非特異的免疫応答、ならびに治療効果を評価する１つまたは複数のさらなるインビトロおよび／またはインビボアッセイにおいて試験する。抗腫瘍形成性を示すパラメータを、インビトロまたはインビボで評価することができる。特定の例においては、抗腫瘍形成性をインビボで評価する。抗腫瘍形成性のインビボでのパラメータとしては、限定されるものではないが、がんの動物モデルにおける望ましい治療指数、腫瘍抗原の放出および投与後の腫瘍組織中へのウイルスの選択的蓄積が挙げられる。そのようなパラメータを評価するためのアッセイまたは方法の例は、以下に記載される。
【０１９２】
ａ．腫瘍関連複製指示因子
治療の候補としての選択のため、ウイルスは一般的には腫瘍細胞中での複製および／または感染性を示す。したがって、腫瘍細胞中で複製するクローン株が選択される。測定される複製指示因子は、典型的には、腫瘍細胞への投与の１日以内のウイルス複製のレベルまたは量または相対量を評価するか、または推測することができる任意のパラメータである。いくつかの例においては、例えば、ウイルス力価（すなわち、プラークアッセイにおいて生成されるプラークの数により評価される）またはウイルス遺伝子発現もしくは宿主遺伝子発現の変化（例えば、米国特許出願公開第２００９−０１３６９１７号を参照されたい）などの、ウイルス複製指示因子の測定により、複製を評価することができる。例えば、試験ウイルスを腫瘍細胞中に感染させるか、または導入し、特定の時間に、または時間の関数として複製指示因子を評価することにより、複製を決定することができる。これを、所定の標準物、例えば、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株（例えば、組換えウイルス）と比較するか、または他の試験候補クローン株と比較することができる。インビトロまたはインビボで評価した場合に腫瘍細胞中で複製するウイルスを選択する。特定の例においては、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で選択的に複製するウイルスを選択する。
【０１９３】
複製を評価するためのアッセイを、様々な腫瘍細胞系、一次組織または細胞ならびに生検などに由来する腫瘍細胞中でインビトロで増殖させたウイルスの細胞溶解物上で実施することができる。例えば、組織または細胞試料を、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物対象）から取得し（例えば、生検）、試料を１つまたは複数の種類のウイルスに感染させることができる。他の例においては、腫瘍細胞系を用いることができる。腫瘍細胞系は公知であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、当業者に利用可能である。腫瘍細胞系はまた、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ＤＣＴＤ）Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ；ｄｔｐ／ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）からも入手可能である。腫瘍細胞系の例としては、ヒトおよび他の動物細胞系が挙げられ、限定されるものではないが、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰヒト前立腺がん細胞、ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞、ＭＲＣ−５ヒト肺線維芽細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８ヒト乳癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞、ＰＣ３ヒト前立腺がん細胞、Ｔ４７Ｄヒト乳がん細胞、ＴＨＰ−１ヒト急性骨髄性白血病細胞、Ｕ８７ヒトグリア芽腫細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞、Ｓａｏｓ−２ヒト細胞、Ａ５４９ヒト肺癌細胞、Ａ２７８０ヒト卵巣癌細胞、ＨＣＴ１１６ヒト結腸細胞、ＨＴ−２９ヒト結腸細胞、ＳＷ２６０ヒト結腸細胞、ＨＴ−１８０ヒト線維肉腫、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵癌細胞、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓細胞、ＣＭＴ６４  Ｃ５７ＢＬ／６マウス細胞、ＪＣマウス乳房細胞、ＴＩＢ−７５マウス肝臓細胞、ＣＴ２６ＷＴマウス結腸癌細胞、ＭＣ−３８マウス腺癌細胞、Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞、４Ｔ１マウス乳癌細胞およびハムスター膵臓腫瘍ＨＰ−１細胞が挙げられる。
【０１９４】
例えば、細胞または細胞系を、プレートのウェル上に播種することができる。次いで、ウイルスを添加し、細胞に感染させることができる。感染の終わりに、培地を交換して、残留ウイルスを除去し、細胞をさらにインキュベートすることができる。次いで、細胞を培地中に擦り取り、採取することができる。例えば、凍結−解凍および／または超音波処理により細胞を溶解して、ウイルスを含有する溶解物を得ることができる。以下にさらに記載されるようなウイルス力価または遺伝子の発現の決定などにより、複製の程度を測定することができる。ウイルスの複製の程度および複製度ならびに／または感染効率が様々な腫瘍細胞型間で異なると理解される。
【０１９５】
複製を評価するためのアッセイは、腫瘍担持動物の感染時にインビボで増殖させた腫瘍から収穫されたウイルスに対して実施することもできる。そのようなアッセイは、腫瘍組織中のウイルスの蓄積の測定である。以下で考察される通り、異なる腫瘍細胞型の埋込みにより、腫瘍を動物中で確立することができる。例えば、腫瘍担持動物をウイルスに感染させ、ウイルスを腫瘍中で増殖させ、ウイルスまたは腫瘍をそれから抽出することができる。以下にさらに記載されるような、ウイルス力価または遺伝子の発現の決定などにより、複製の程度を測定することができる。
【０１９６】
一例においては、感染細胞または腫瘍細胞抽出物からの細胞培養上清または細胞溶解物を感染後に取得し、ウイルス力価を測定するためのアッセイにかけることができる。例えば、標準的なプラークアッセイを用いることができる。プラークアッセイは、異なる腫瘍細胞型などの異なる細胞型における生物活性を示し得る。プラークアッセイによるウイルスの力価測定は当業者には公知である。プラークアッセイの一例においては、腫瘍またはウイルスに感染した細胞の上清または細胞溶解物を収穫し、プラークアッセイを実施することができる。典型的には、ウイルス上清または溶解物の連続希釈液を、１０−２（１：１００）〜１０−１０、特に、１０−５〜１０−１０の範囲で作製する。希釈されたウイルスを細胞の単層、例えば、ＣＶ−１、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＲＫ１３またはＨＥＫ−２９３細胞系などの許容状態の細胞系の単層に添加し、ウイルスと共にインキュベートする。いくつかの例においては、腫瘍細胞が単層を形成することができるという条件で、プラークアッセイを腫瘍細胞の細胞単層に対して直接実施することができる。インキュベーション後、細胞を除去することなく、アガロースオーバーレイを細胞の単層に添加し、プラークが見えるようになるまでプレートをさらにインキュベートする。ニュートラルレッドなどの、死んだ細胞ではなく健康な細胞により取り込まれる染料または染色剤溶液を、それぞれのウェルまたはプレートに添加する。インキュベーション後、プラークは透明に観察されるが、非溶解細胞は染色されたままになるように、染料または染色剤を除去する。ウェル中のプラーク数を計数し、希釈係数（ｄ）およびウェルに添加された希釈ウイルスの容量（Ｖ）で除算することにより（プラーク数／ｄｘＶ）、力価（ｐｆｕ／ｍＬ）を算出する。試料中に存在するウイルスの総量を、試料中の元々感染した細胞の数で除算することにより、ウイルス収率をｐｆｕ／細胞に変換することができる。
【０１９７】
一般に、本明細書に記載の方法において、ウイルスは、ｐｆｕ／ｍｌが５ｘ１０３〜１ｘ１０９などの、１ｘ１０２〜１ｘ１０１０であるか、または約１ｘ１０２〜１ｘ１０１０である、例えば、１ｘ１０４〜１ｘ１０８である、特に、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、もしくは１ｘ１０９であるか、または少なくとも１ｘ１０３、少なくとも１ｘ１０４、少なくとも１ｘ１０５、少なくとも１ｘ１０６、少なくとも１ｘ１０７、少なくとも１ｘ１０８、もしくは少なくとも１ｘ１０９である場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。他の例においては、本明細書に記載の方法において、ウイルスは、ｐｆｕ／細胞が１０〜５０００などの、２〜１００００であるか、または約２〜１００００である、例えば、１００〜２０００である、特に、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００以上であるか、または少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００以上である場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。典型的には、ウイルスは、複製（ｐｆｕ／ｍｌまたはｐｆｕ／細胞）が上記の参照ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス（例えば、組換えタンパク質）と類似するか、またはより良好である場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。
【０１９８】
他の複製の指示因子を評価することもできる。例えば、腫瘍細胞中でのウイルス複製および／または感染性と相関する、ウイルス遺伝子、腫瘍タンパク質および／またはハウスキーピング遺伝子の発現を評価することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９−０１３６９１７号を参照されたい）。例えば、ウイルス複製および感染性と関連する腫瘍細胞中でのハウスキーピング遺伝子または他の遺伝子の発現を評価することができる（米国特許出願公開第２００９−０１３６９１７号）。例えば、発現がウイルスによる感染時に腫瘍細胞中で増加するハウスキーピング遺伝子などの複数のそのような遺伝子の発現を評価する。評価することができるそのような遺伝子の例は、特に、ＩＬ−１８（インターロイキン−１８）、ＭＣＰ−５（単球走化性タンパク質−５；ＣＣＬ１２）、ＩＬ−１１（インターロイキン−１８）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、ＴＩＭＰ−１（１型メタロプロテイナーゼの組織阻害因子）、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、フィブリノゲン、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ−９）、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＧＣＰ−２（顆粒球走化性タンパク質−２；ＣＸＣＬ６）、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、組織因子（ＴＦ）、ＳＡＰ（血清アミロイドＰ）、塩基性ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＭＣＰ−３（単球走化性タンパク質−３；ＣＣＬ７）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＰ−２、トロンボポエチン、がん抗原１２５、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＥＮＡ−７８、フェリチン、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１６、ＭＭＰ−２、ＰＡＩ−１、ＴＮＦＲＩＩ、ＴＮＦ−βおよびＶＣＡＭ−１から選択されるタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を含む。別の例においては、発現がウイルスによる感染時に腫瘍細胞中で減少する、ハウスキーピング遺伝子などの複数の遺伝子の発現を評価する。そのような遺伝子の例としては、特に、ＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症タンパク質−１β）、ＭＤＣ（マクロファージ由来ケモカイン；ＣＣＬ２２）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症タンパク質−１α；ＣＣＬ３）、ＫＣ／ＧＲＯα（メラノーマ成長刺激活性タンパク質）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、エンドセリン−１、ＭＩＰ−３β（マクロファージ炎症タンパク質−３β；Ｅｘｏｄｕｓ−３またはＥＬＣ）、β−２ミクログロブリン、ＩＬ−５（インターロイキン−５）、ＩＬ−１α（インターロイキン−１α）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、リンホタクチン（ＸＣＬ１）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、ＭＩＰ−１γ（マクロファージ炎症タンパク質−１γ；ＣＣＬ４）、ＩＬ−１β（インターロイキン−１β）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、がん抗原１９−９、がん胎児抗原、Ｃ反応性タンパク質、ＥＧＦ、脂肪酸結合タンパク質、第ＶＩＩ因子、成長ホルモン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＤＣ、前立腺酸ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、フリー（ｆｒｅｅ）、幹細胞因子、組織因子、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦおよびＶｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａ���ｄ因子から選択されるタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子が挙げられる。
【０１９９】
インビトロまたはインビボで一定時間、腫瘍試料とウイルスとを接触させ、１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子または他の遺伝子の発現のレベルを測定した後、遺伝子発現をアッセイすることができる。腫瘍中での遺伝子の発現を評価するために用いることができる任意の当技術分野で公知の方法を用いることができる。例えば、用いることができるタンパク質発現レベルを測定するための方法としては、限定されるものではないが、マイクロアレイ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロッティング、または特定のタンパク質の定量のための任意の他の技術が挙げられる。ＲＮＡレベルについては、用いることができる技術の例としては、マイクロアレイ分析、定量的ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション、または特定の核酸の定量のための任意の他の技術が挙げられる。いくつかの例においては、約２倍未満、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍または約１００倍を超える、接触生物試料と非接触生物試料との同じマーカーの発現の差異は、腫瘍細胞の特異的複製および／または感染性を示す。本明細書に記載の方法においては、ウイルスは、複製（増加した、または減少した遺伝子発現）が、参照ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照ウイルス（例えば、組換えタンパク質）と類似するか、またはそれより良好である場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。
【０２００】
ウイルス感染および複製速度の比較のために、アッセイは典型的には経時的に実施される。例えば、ウイルス複製の評価のための試料を、典型的には、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日以上などの、細胞のウイルス感染後の選択された時点で取得する。当業者であれば、他の公知のウイルス株と比較したウイルスの相対感染性に基づいてウイルス複製の評価のための好適な時点を選択することができる。
【０２０１】
試験ウイルスと、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照もしくは標準ウイルスとの間で複製の遅延を決定することができる。腫瘍細胞の感染後の腫瘍細胞中での複製遅延を示すウイルスは、特定の細胞型の治療にとって有効ではないと予測される。同様に、インビトロまたはインビボでの腫瘍細胞の感染後のウイルスの効率的および早期複製は、インビボでのウイルスによる腫瘍治療に対する好ましい応答を示す。かくして、一般的には、非遅延複製プロフィールを示すウイルスが、増殖性疾患および障害の治療のための候補ウイルスとしての選択にとって望ましい。選択する特定の時間値は、必要に応じて経験的に決定することができる。かくして、複製指示因子を決定することができる、例えば、複製遅延または非複製遅延を示す標準と比較することができる。この標準は、非複製遅延または複製遅延を表す指示因子の値のデータベースなどの所定のものであってよい。かくして、例えば、複製指示因子を、腫瘍細胞型に関する所定の値のデータベースと比較して、複製指示因子が非複製遅延を示す値を有するかどうかを決定することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９−０１３６９１７号を参照されたい）。
【０２０２】
ウイルスの変化する用量／感染多重度（ＭＯＩ；ウイルスと細胞の比率）を評価して、様々な感染レベルでウイルス感染およびウイルス生成の速度を評価することができる。一般的には、より低いＭＯＩで高い複製速度を示すウイルスが、増殖性障害または疾患の治療のための候補ウイルスとして選択にとって望ましい。例えば、０．５〜５などの、０．１〜１０、例えば、０．５〜２のＭＯＩ、例えば、０．２５、０．５、１、１．５、２以上または少なくとも０．２５、０．５、１、１．５、２以上のＭＯＩで細胞を感染させることができる。
【０２０３】
ウイルスの複製または感染性を評価する本明細書に記載の例のいずれかにおいて、ウイルスの腫瘍細胞選択性を評価することもできる。例えば、正常な細胞および腫瘍細胞をウイルスに感染させた後、本明細書に記載の、または当業者には公知のアッセイのいずれかを用いて複製および／または感染性を評価することができる。例えば、プラークアッセイまたは以下に記載されるような遺伝子の発現によるウイルス力価の測定を、ウイルスに感染した腫瘍細胞対ウイルスに感染した正常細胞において決定することができる。正常細胞または非形質転換細胞としては、限定されるものではないが、ＭＲＣ−５肺線維芽細胞、Ｂｅａｓ−２Ｂ気管支上皮細胞、正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）、末梢気道気管支上皮（ＳＡＥＣ）が挙げられる。腫瘍細胞は本明細書に記載の、または当業者には公知の任意のものを含み、限定されるものではないが、Ａ２７８０、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＨＴ１０８０、ＬＮＣａＰまたはＳＷ６２０細胞が挙げられる。いくつかの例においては、腫瘍と非腫瘍細胞系の対をウイルスに感染させ、比較することができる。対応する、または対になった腫瘍および非腫瘍細胞系の例は当業者には公知である（例えば、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ７８：７６６−７７４，  Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ３７：１４７７−１４８２；  Ｎｉｅｄｂａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １５５：２９７−３０３を参照されたい）。他の例においては、インビボで感染した腫瘍を収穫し、また、同じ感染動物から抽出された正常細胞または組織と比較することができる。正常細胞および腫瘍細胞中でのウイルスの感染および複製を評価し、比較することができる。ウイルスの治療指数を、正常細胞と比較した腫瘍細胞中での複製の比率により決定することができる（例えば、細胞１個当たりに生成されるウイルス；ｐｆｕ／細胞）。本明細書に記載の方法においては、１０〜５０００などの、２〜５０００である、または約２〜５０００である、例えば、１００〜２０００、特に、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、例えば、少なくとも１０００または少なくとも２０００である治療指数または比率を有するウイルスを選択する。
【０２０４】
ｂ．細胞傷害性
治療のための候補としての選択のために、ウイルスは一般的には、腫瘍細胞に対する細胞傷害性細胞変性活性を示す。したがって、細胞傷害性であるか、または腫瘍細胞を殺傷するクローン株を選択する。クローン単離物を、細胞死および／または腫瘍細胞の溶解（すなわち、腫瘍崩壊）の誘導により腫瘍細胞を排除するその能力について選択することができる。ウイルスの細胞殺傷活性を、限定されるものではないが、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイおよび他の関連するテトラゾリウム塩に基づくアッセイ（例えば、ＸＴＴ、ＭＴＳもしくはＷＳＴ）などの、ウイルス感染後の細胞壊死および／またはアポトーシスを測定するのに用いることができる細胞傷害性／細胞生存能力アッセイ、ＡＴＰアッセイ、感染細胞のＴＵＮＥＬ染色などのアポトーシスアッセイ、ＤＮＡ断片化アッセイ、ＤＮＡラダリングアッセイ、およびシトクロムＣ放出アッセイなどの、当技術分野で公知の様々な技術により評価することができる。そのようなアッセイは、当業者には周知である。
【０２０５】
例えば、ウイルス感染細胞の生存能力を評価することができる。例えば、上記のいずれか、または当業者に公知の様々な腫瘍細胞系を、９６ウェルプレート（例えば、５，０００細胞／ウェルもしくは約５，０００細胞／ウェル）または他のサイズのウェルのプレート中に播種し、一晩増殖させた後、ウイルスの連続希釈液に感染させることができる。例えば、様々なＭＯＩのウイルスを試験することができる。ＭＯＩは、例えば、１０００〜０．０００１、例えば、１００〜０．００１または１０〜０．０１の範囲であってよい。使用する好適なＭＯＩ範囲を経験的に選択するか、または決定することは当業者のレベルの範囲内にある。一度感染したら、細胞を一定期間インキュベートした後、細胞傷害性を評価することができる。例えば、細胞傷害性の評価のための試料を、典型的には、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、１．５日、２日、２．５日、３日、４日、５日、６日以上などの細胞のウイルス感染後の選択された時点で取得する。当業者であれば、他の公知のウイルス株と比較したウイルスの相対感染性に基づいてウイルス複製の評価のための好適な時点を選択することができる。一般的には、感染を少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間以上進行させる。
【０２０６】
指定された期間の感染後、培地を交換し、当業者には公知の任意のアッセイまたは手順に基づいて細胞の生存能力を決定する。生存能力を評価するためのアッセイの例は、代謝活性に基づいて細胞を可視化し、テトラゾリウム塩の着色したホルマザン生成物への還元能力を測定する比色アッセイ（例えば、ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイまたはＸＴＴアッセイ）である。他の酸化還元アッセイとしては、酸化還元染料レサズリンを蛍光最終生成物レソルフィンに変換する細胞の能力を測定するアッセイが挙げられる（ＭｃＭｉｌｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，  １８：１５７−１７３；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。他の例においては、正常細胞と比較した損傷した、または死んだ細胞を介する送信電界の存在に基づく電界多項目細胞計数システムである、ＣＡＳＹ細胞計数技術を用いて生存能力を評価することができる（例えば、ＣＡＳＹ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ；Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ）。さらなる例としては、限定されるものではないが、トリパンブルーまたはヨウ化プロピジウム染料排除アッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼの測定（ＬＤＨ；例えば、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３０１１７を参照されたい）、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ（例えば、ＣｙｔｏＳｃａｎ（商標）ＳＲＢ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７８６−２１３）、ＷＳＴアッセイ（例えば、Ｃｙｔｏｓｃａｎ（商標）ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７８６−２１２）、クローン形成アッセイおよびルシフェラーゼに基づくＡＴＰに基づくアッセイ（例えば、ＣｅｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｘｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【０２０７】
一般的には、様々な対照を用いてアッセイを実施する。例えば、生存能力を評価するための任意のアッセイは、一般的には、細胞のみを含有する未処理のウェル（例えば、１００％の生存）ならびに無細胞のウェル（０％の生存）を用いて実施する。また、クローン株試験ウェルに加えて、他の対照ウイルスを試験することができる。例えば、出発ウイルス調製物または混合物を、その細胞傷害効果について試験することができる。別の例においては、参照ウイルス株、例えば、公知の弱毒化組換え株を試験することができる。そのような株の例は、ＧＬＶ−１ｈ６８または挿入された異種遺伝子を含有するその誘導体である。対照としてウイルスを添加する例においては、用いられるウイルスのＭＯＩ範囲は、試験されたウイルスクローン単離物と同じである。
【０２０８】
細胞変性効果または細胞傷害効果を示すウイルスを選択する。例えば、試験クローン株は、それが細胞のみを含有する未処理のウェル（１００％の生存）と比較して細胞生存能力の低下を示すことが決定された場合、細胞変性効果を示すものとして選択される。他の例においては、試験クローン株は、それが親ウイルス混合物で処理されたウェル中での細胞の生存能力と比較して細胞生存能力の低下を示すことが決定された場合、細胞変性効果を示すものとして選択される。さらなる例においては、試験クローン株は、それが弱毒化組換えウイルス（例えば、ＧＬＶ−１ｈ６８またはその誘導体）などの公知の参照弱毒化ウイルス株で処理されたウェル中での細胞の生存能力と比較して細胞生存能力の低下を示すことが決定された場合、細胞変性効果を示すものとして選択される。上記の例のいずれにおいても、試験クローン株は、所与のＭＯＩにおいて、細胞生存能力が対照細胞（未処理の細胞、ウイルス混合物で処理された細胞、または対照ウイルス株で処理された細胞）の生存能力の１００％未満である場合、例えば、対照処理細胞の生存能力の約０％〜９９％である場合、細胞傷害性を示すものとして選択される。
【０２０９】
細胞生存能力の低下または減少は、試験されるクローン単離物が、対照処理細胞と比較して増加した細胞傷害性を示すことを意味する。細胞傷害性は、試験クローン株で処理された細胞と比較した対照処理細胞の細胞生存能力の比（生対照処理細胞％／生試験クローン株処理細胞％）として決定することができる。１．０より高い、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００より高い細胞傷害性の比を示すウイルスクローン株が選択される。特定の例においては、結果を、細胞層の５０％が生きているＭＯＩ（ＥＤ５０）として提示する。細胞傷害性を、試験クローン株処理細胞と比較した対照処理細胞のＥＤ５０の比（対照処理細胞のＥＤ５０／試験クローン株処理細胞のＥＤ５０）として決定することができる。１．０より高い、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６以上より高い細胞傷害性の比を示すウイルスクローン株が選択される。１．２または５などである活性の比は、ウイルスが参照または対照の細胞傷害性の１２０％または５００％などを示すことを意味すると理解される。
【０２１０】
ｃ．腫瘍成長
治療のための候補としての選択のために、ウイルスは、それが腫瘍サイズの縮小を引き起こす、および／または腫瘍進行を遅延させる場合、抗腫瘍形成性を示すパラメータを示すものとして選択される。したがって、腫瘍成長またはサイズの減少を示すクローン株が選択される。腫瘍サイズは、腫瘍を担持するヒトまたはウイルスで処理された動物モデルにおいてインビボで評価することができる。腫瘍の縮小または腫瘍サイズを、体重、体積または身体測定などの当技術分野で公知の様々なアッセイにより評価することができる。
【０２１１】
腫瘍担持動物モデルを作製することができる。腫瘍細胞を免疫不全げっ歯類に接種するか、または埋込むこと（例えば、皮下注射による）により作製された異種移植腫瘍、マウスまたはラット腫瘍細胞系を対応する免疫応答性マウスまたはラット株に接種すること（例えば、皮下注射による）により作製された同系腫瘍モデル、動物モデルに埋込まれた一次腫瘍の転移により作製された転移腫瘍、腫瘍細胞の起源として同じ種に腫瘍細胞を埋込むことにより作製された同種移植腫瘍、および動物の遺伝子操作により作製された自然発生腫瘍などの任意の公知の方法により、インビボでの腫瘍を作製することができる。腫瘍細胞のその起源となる組織または臓器への注入、例えば、乳房腫瘍細胞のマウス乳房脂肪体への埋込みにより、腫瘍モデルを同所的に作製することができる。上記モデルはいずれも、腫瘍細胞増殖を評価し、ならびに腫瘍質量を評価するための容易なアクセスを可能にするための一貫した再現性のある手段を提供する。
【０２１２】
特定の例においては、異種移植モデルまたは同系モデルが用いられる。例えば、異なる腫瘍細胞型の細胞懸濁液（例えば、１ｘ１０６〜５ｘ１０６細胞／動物）を免疫応答性宿主（同系）または免疫不全宿主（例えば、ヌードもしくはＳＣＩＤマウス；異種移植）の右腋窩に皮下注射することにより、腫瘍を確立することができる。ヌードまたはＳＣＩＤマウスなどの、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルの例としては、限定されるものではないが、ヒト肺癌（Ａ５４９細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）；ヒト乳房腫瘍（ＧＩ−１０１Ａ細胞、Ｒａｔｈｉｎａｖｅｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  １７：１３３−１４６  （１９９９））；ヒト卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３細胞、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１６１）；ヒト膵癌（ＰＡＮＣ−１細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２０）；ＤＵ１４５細胞（ヒト前立腺がん細胞、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１）；ヒト前立腺がん（ＰＣ−３細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）；結腸癌（ＨＴ−２９細胞）；ヒトメラノーマ（８８８−ＭＥＬ細胞、１８５８−ＭＥＬ細胞または１９３６−ＭＥＬ細胞；例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２６：１３７２−１３７７を参照されたい）；ならびにヒト線維肉腫（ＨＴ−１０８０細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２１）およびヒト中皮腫（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞）が挙げられる。マウスにおけるラット腫瘍異種移植モデルの例としては、限定されるものではないが、グリオーマ腫瘍（Ｃ６細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０７）が挙げられる。マウス腫瘍同種移植モデルの例としては、限定されるものではないが、マウスメラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１０細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５）が挙げられる。マウスにおけるネコ腫瘍異種移植モデルとしては、限定されるものではないが、ネコ線維肉腫（ＦＣ７７．Ｔ細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６１０５）が挙げられる。マウスにおけるイヌ腫瘍異種移植モデルの例としては、限定されるものではないが、イヌ骨肉腫（Ｄ１７細胞；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８３）が挙げられる。ヒト異種移植モデルおよび同系腫瘍モデルの非限定例を、以下の表３および表４に記載する。
【０２１３】
【表３】
2018171059.tif 000004
【０２１４】
【表４】
2018171059.tif 000005
【０２１５】
腫瘍サイズおよび体積を、当業者には公知の技術に基づいてモニターすることができる。例えば、腫瘍サイズおよび体積を、ラジオグラフィー、超音波画像化、検視、カリパスの使用、マイクロＣＴまたは１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴによりモニターすることができる。腫瘍サイズは視覚的に評価することもできる。特定の例においては、腫瘍サイズ（直径）は、カリパスを用いて直接測定される。他の例においては、腫瘍体積は、カリパスまたは超音波評価により得られた腫瘍直径（Ｄ）の測定の平均値を用いて測定することができる。体積は、式Ｖ＝Ｄ３ｘπ／６（カリパスを用いて測定された直径について）またはＶ＝Ｄ２ｘｄｘπ／６（ｄが深さもしくは厚さである超音波を用いて測定された直径について）から決定することができる。例えば、カリパスの測定値は、腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）からなり、腫瘍体積を、長さｘ幅２ｘ０．５２として算出することができる。別の例においては、マイクロＣＴスキャンを用いて、腫瘍体積を測定することができる（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰＮＡＳ，  １０６：３４２６−３４３０を参照されたい）。そのような例においては、マウスにＯｐｔｉｒａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｙのロベルソール（ｌｏｖｅｒｓｏｌ）注射７４％造影剤（例えば、７４１ｍｇのロベルソール／ｍＬ）を注射し、マウスを麻酔し、ＭｉｃｒｏＣａｔ１Ａスキャナーまたは他の類似するスキャナー（例えば、ＩＭＴｅｋ）（４０ｋＶ、６００μＡ、１９６回転ステップ、全角度もしくは回転＝１９６）を用いてＣＴ走査を行うことができる。ソフトウェア（例えば、ＲＶＡ３ソフトウェアプログラム；ＩｍＴｅｋ）を用いて画像を再構成することができる。腫瘍体積を、利用可能なソフトウェア（例えば、Ａｍｉｒａ  ３．１ソフトウェア；Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることにより決定することができる。
【０２１６】
一度、埋込まれた腫瘍が所定のサイズまたは体積に達したら、モデルを、ウイルスによる処置のために用いることができる。正確な最終腫瘍体積は経験的に決定することができ、特定の腫瘍型ならびに分析の評価項目の関数である。一般的には、腫瘍体積が３ｃｍ３より大きい場合、マウスを屠殺する。
【０２１７】
腫瘍担持動物をウイルスに感染させる。感染のための投与経路は、皮下などの腹腔内であってよく、または腫瘍内もしくは静脈内であってもよい。ウイルスを、変化する用量で投与することができる。例えば、ウイルスを、１ｘ１０５〜１ｘ１０７ｐｆｕなどの約１ｘ１０４〜１ｘ１０８ｐｆｕ、例えば、少なくとも１ｘ１０６、少なくとも２ｘ１０６、少なくとも３ｘ１０６、少なくとも４ｘ１０６もしくは少なくとも５ｘ１０６ｐｆｕまたは約１ｘ１０６、約２ｘ１０６、約３ｘ１０６、約４ｘ１０６もしくは約５ｘ１０６ｐｆｕで腫瘍担持動物に投与することができる。進行中の腫瘍を可視化し、当業者には公知の任意の技術を用いて腫瘍サイズおよび腫瘍体積を測定することができる。例えば、腫瘍体積または腫瘍サイズを、本明細書に記載の技術のいずれかを用いて測定することができる。腫瘍体積およびサイズを、ウイルス感染後一定期間にわたって定期的な間隔で、例えば、感染後１時間毎、６時間毎、１２時間毎、２４時間毎、３６時間毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、１週間毎、３週間毎、１カ月毎またはそれ以上で評価または測定することができる。経時的な腫瘍体積の変化の中央値のグラフを作成し、曲線下総面積（ＡＵＣ）を算出することができる。これを実施例４に例示する。また、治療指数を、式ＡＵＣ未処置の動物−ＡＵＣウイルスで処置した動物／ＡＵＣ未処置ｘ１００を用いて算出することもできる。
【０２１８】
一般的には、同じ様式で、同時に、および同じ種類の腫瘍細胞を用いて作製された腫瘍担持動物を対照として用いる。そのような対照腫瘍担持動物は、未処置のままである（ウイルスに感染していない）ものを含む。さらなる対照動物としては、親ウイルス調製物もしくは混合物または公知の弱毒化組換え株などの参照ウイルス株に感染させたものが挙げられる。そのような株の例は、ＧＬＶ−１ｈ６８または挿入された異種遺伝子を含有するその誘導体である。腫瘍担持動物を対照としての親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株に感染させる例においては、投与されるウイルス量（例えば、ｐｆｕ）は、試験されるウイルスクローン株と同じである。
【０２１９】
対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較して腫瘍サイズ（例えば、直径）、体積または体重の減少を媒介するウイルスが選択される。対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較した腫瘍サイズ、体積または体重の減少は、ウイルス自体が腫瘍の退縮もしくは縮小を媒介するか、またはウイルスが対照処置もしくは未処置腫瘍担持動物と比較して腫瘍進行の遅延を媒介することを意味すると理解される。腫瘍の縮小または腫瘍進行の遅延は、抗腫瘍形成性を示すパラメータである。
【０２２０】
例えば、試験クローン株は、対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較して動物中の腫瘍サイズの視覚的評価に基づいて腫瘍サイズまたは体積の減少を媒介するものとして選択される。他の例においては、試験クローン株は、未処置腫瘍担持動物と比較して、または親ウイルス混合物もしくは別の参照ウイルス株（例えば、弱毒化組換えウイルス）で処置された腫瘍担持動物と比較して当技術分野で公知の任意の測定法（例えば、カリパスの使用）により評価された場合に腫瘍サイズの直径が減少している場合、腫瘍サイズまたは体積の減少を媒介するものとして選択される。さらなる例においては、試験クローン単離物は、未処置腫瘍担持動物と比較して、または親ウイルス調製物もしくは混合物または別の参照ウイルス株（例えば、弱毒化組換えウイルス）で処置された腫瘍担持動物と比較して、当業者には公知の任意の技術により評価された場合に腫瘍体積が減少している場合、腫瘍サイズまたは体積の減少を媒介するものとして選択される。腫瘍サイズまたは体積の比較は感染後の任意の所定の時間に行うことができ、当業者によって経験的に決定することができると理解される。いくつかの例においては、比較を、未処置の対照を屠殺する日に行うことができる。他の例においては、総ＡＵＣの分析を行い、ＡＵＣ値を、感染期間にわたって腫瘍のサイズおよび体積の指示因子として比較することができる。
【０２２１】
腫瘍サイズまたは体積に対するウイルスの効果を、試験クローン株で処置された動物と比較した、対照処置動物の感染後の指定の時間での腫瘍サイズまたは体積の比として提示することができる（対照処置動物の腫瘍サイズまたは体積／クローン単離物処置動物の腫瘍サイズまたは体積）。１．０より高い、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上である腫瘍縮小の比を示すウイルスクローンが選択される。特定の例においては、結果を、処置の経過中の総ＡＵＣ面積の比として提示する（対照処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ／クローン単離物処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ）。１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上より高いＡＵＣにより測定された腫瘍縮小の比を示すウイルスクローンが選択される。１．２または５などの比は、ウイルスが腫瘍サイズまたは体積の減少をもたらし、参照または対照と比較して１２０％または５００％などの抗腫瘍形成活性を示すことを意味すると理解される。
【０２２２】
特定の例においては、治療指数は、腫瘍サイズまたは体積に対するウイルスの効果の尺度として決定される。親ウイルス調製物もしくは混合物または対照参照ウイルス株（例えば、弱毒化組換えウイルス）の治療指数と比較して、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％以上であるか、または少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％以上であるか、または１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％以上である治療指数を示すウイルスクローンが選択される。
【０２２３】
さらなる例においては、腫瘍を動物から収穫し、計量することができる。ウイルスに感染させなかった対照腫瘍担持動物から収穫された腫瘍と比較して腫瘍重量の減少をもたらすウイルスを選択することができる。その重量を、感染後の同じ時間に対照処置動物から収穫された腫瘍と比較することもできる。重量の変化を、腫瘍重量の比として提示することができる（対照処置動物の腫瘍重量／クローン単離物処置動物の腫瘍重量）。１．０より高い、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０以上より高い腫瘍重量の比を示すウイルスクローンが選択される。１．２または５などである腫瘍重量の比は、ウイルスが腫瘍重量の減少をもたらし、参照または対照と比較して１２０％または５００％などの抗腫瘍形成活性を示すことを意味すると理解される。
【０２２４】
さらなる例においては、収穫された腫瘍を溶解することができる。例えば、腫瘍の溶解は、動物から腫瘍を取り出した直後に数回（例えば、少なくとも２回、３回または４回）、収穫された腫瘍を凍結解凍することによるものであってよい。例えば、腫瘍を、除去の２時間以内の３回の凍結解凍サイクルにより溶解する。腫瘍溶解物中のウイルスを上記のように力価測定し（ｔｉｔｔｅｒ）、それぞれの腫瘍試料中のウイルス量を決定することができる。いくつかの例においては、ウイルス力価を、組織重量に対して正規化された組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍｇ組織）として表すことができる。
【０２２５】
特定の例においては、動物中の他の臓器または組織に対するウイルスの効果を評価することができる。例えば、他の臓器を動物から収穫し、計量し、ウイルス力価決定のために溶解することができる。
【０２２６】
４．毒性／安全性
単離されたウイルスを、その毒性／安全性特性を示すパラメータについてさらに試験する。ウイルスは、宿主の健康状態を悪化させる１つまたは複数の化合物を製造することによってその宿主に対して毒性となり得る。宿主に対する毒性は、敗血性ショック、神経学的作用、または筋肉作用などの様々な様式のいずれかで現れ得る。宿主に対して低下した毒性を有する本明細書で提供されるウイルスが選択される。本発明の方法および組成物のウイルスの低下した毒性は、宿主が毒性効果を経験しない毒性から、宿主が典型的には微生物の毒性効果で死亡しない毒性までの範囲であってよい。
【０２２７】
ウイルスの毒性または安全性を示すパラメータを、インビトロまたはインビボで試験することができる。典型的には、評価はインビボである。例示的方法としては、対象（例えば、動物モデル）へのウイルスの投与ならびに限定されるものではないが、対象の生存期間、体重の減少、発熱、発疹もしくは他のアレルギー、疲労または腹痛などの副作用の存在、対象における免疫応答の誘導、ウイルスの組織分布、放出される腫瘍抗原の量および膿疱形成の減少速度などの毒性と関連する１つまたは複数の特性の評価が挙げられる。したがって、上記パラメータのいずれかを、ウイルスの毒性／安全性を示すものとして評価することができる。最小限の毒性を示すウイルスが選択される。
【０２２８】
上記の通り、対象（例えば、腫瘍担持動物モデルなどの動物）をウイルスに感染させる。感染のための投与経路は、皮下などの腹腔内であってよく、または腫瘍内もしくは静脈内であってよい。ウイルスを様々な用量で投与することができる。例えば、ウイルスを、１ｘ１０５〜１ｘ１０７ｐｆｕなどの約１ｘ１０４〜１ｘ１０８ｐｆｕ、例えば、少なくとも１ｘ１０６、少なくとも２ｘ１０６、少なくとも３ｘ１０６、少なくとも４ｘ１０６もしくは少なくとも５ｘ１０６ｐｆｕまたは約１ｘ１０６、約２ｘ１０６、約３ｘ１０６、約４ｘ１０６もしくは約５ｘ１０６ｐｆｕまたは１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６もしくは５ｘ１０６ｐｆｕで腫瘍担持動物に投与することができる。ヒトについては、ウイルスを、１ｘ１０７〜１ｘ１０１０ｐｆｕまたは１ｘ１０９〜１ｘ１０１０ｐｆｕなどの約１ｘ１０７〜１ｘ１０１４ｐｆｕ、例えば、少なくとも１ｘ１０９、少なくとも２ｘ１０９、少なくとも３ｘ１０９、少なくとも４ｘ１０９、もしくは少なくとも５ｘ１０９ｐｆｕまたは約１ｘ１０９、約２ｘ１０９、約３ｘ１０９、約４ｘ１０９、もしくは約５ｘ１０９ｐｆｕで投与することができる。対象の生存期間および体重などの毒性を示すパラメータを、経時的にモニターすることができる。例えば、生存期間および体重を、ウイルス感染後に一定期間にわたって定期的な間隔で、例えば、感染後１時間毎、６時間毎、１２時間毎、２４時間毎、３６時間毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、週毎、３週毎、毎月またはそれ以上の間隔でモニターすることができる。
【０２２９】
一般的には、対照対象（例えば、腫瘍担持動物モデルなどの動物モデル）を同様にモニターする。そのような対照対象は、未処置のままである（ウイルスに感染させていない）ものを含む。さらなる対照対象としては、親ウイルス調製物もしくは混合物または公知の弱毒化組換え株などの参照ウイルス株に感染させたものが挙げられる。そのような株の例は、ＧＬＶ−１ｈ６８または挿入された異種遺伝子を含有するその誘導体である。対象を対照として親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株に感染させる例においては、投与されるウイルス量（例えば、ｐｆｕ）は、試験されるウイルスクローン単離物と同じである。
【０２３０】
いくつかの実施形態においては、ウイルスは、宿主が典型的には、腫瘍、転移または壊死臓器または組織に対する効果を超えて、宿主中のウイルスの存在から有意な長期的効果を有さないような低下した毒性のものである。例えば、低下した毒性は、約１カ月未満継続する少しの発熱または少しの感染、および発熱または感染後に宿主が発熱または感染の結果もたらされる副作用を経験しないことであってよい。別の例においては、低下した毒性を、微生物の投与後の宿主の体重の約５％以下の意図せぬ減少として測定することができる。他の例においては、ウイルスは宿主に対する毒性を有さない。
【０２３１】
例えば、ウイルスは、対照または参照株と比較した対象の生存期間の効果に基づいて選択される。親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株（例えば、弱毒化株）で処置した対象と比較して類似する生存期間を有する対象をもたらすウイルスが選択される。特に、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株（例えば、弱毒化株）で処置した対象と比較してより良好な、または改善された生存期間を有する対象をもたらすウイルスが選択される。一般的には、処置された期間にわたって試験された対象の１００％の生存をもたらすウイルスが選択される。例えば、０％の対照未処置対象が生存する期間で対象の１００％の生存をもたらすウイルスが選択される。
【０２３２】
いくつかの例においては、ウイルスは、対照または参照ウイルスと比較した対象の体重に対する効果に基づいて選択される。一般的には、処置の経過にわたる対象の体重の減少または低下は、処置の毒性または病原性と関連する。いくつかの例においては、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株（例えば、組換え株）で処置された対象と類似する対象の体重に影響するウイルスが選択される。他の例においては、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株（例えば、組換え株）で処置された対象と比較して対象の体重の減少をもたらさないか、または対象の体重のより少ない減少をもたらすウイルスが選択される。特に、ウイルスによる処置の経過にわたって、対象の体重の増加をもたらすウイルスクローンが選択される。
【０２３３】
５．ゲノム分析
所望により、クローン単離物を精製し、ゲノムを分析して選択された単離物の配列の同種性を評価することができる。一般的には、配列が同種であるクローン株が選択される。限定されるものではないが、配列決定、制限酵素分析、ＰＣＲ、サザンブロットまたはタンパク質発現などの様々な方法を用いて、ウイルスの同一性および／または同種性を確認することができる。例えば、選択されたクローン単離物を、許容状態の細胞中で増殖させ、細胞を収穫し、ウイルス粒子を回収することができる。ゲノムウイルスＤＮＡを、当業者には公知の様々な手順を用いて抽出することができる。例えば、プロテイナーゼＫ、次いで、フェノール−クロロホルム抽出を用いて、精製されたビリオンからＤＮＡを抽出することができる（Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ３，  ｐａｇｅｓ  １６．１７．１−１６．１９−７  （１９９８）を参照されたい）。ＤＮＡの配列決定を、当業者には公知の任意の方法により完了することができる。例えば、ショットガン手法、次いで、様々なソフトウェア、例えば、ＴＩＧＲ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒソフトウェア（Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈ．，  １：９−１９）またはＬｉｎｕｘプラットフォーム上のＳｔａｄｅｎソフトウェアパッケージ（Ｓｔａｄｅｎ  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：３９０７−３９１１；  Ｂｏｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２３：４９９２−４９９９）を用いる、および様々なギャップ充填戦略（例えば、Ｆｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＤＮＡ  Ｓｅｑ．，  ８：２４１−２４５を参照されたい）を用いるアセンブリーにより；ランダムプライミング法（例えば、Ｄｊｉｋｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ９：５）により；または全ゲノム増幅および直接配列決定技術（Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １３：３２２−３２４）により、配列決定を行うことができる。
【０２３４】
Ｃ．単離されたウイルスクローン株
ワクシニアウイルス株ＬＩＶＰの単離されたウイルスクローンが本明細書で提供される。このクローン株は、ワクシニアウイルス株ＬＩＶＰに由来する。
【０２３５】
１．ＬＩＶＰ
ＬＩＶＰは、Ｌｉｓｔｅｒ（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５４９）に由来するワクシニア株である。ワクシニアウイルスは、単一の連続ポリヌクレオチド鎖から作られる約１８０，０００塩基対の長さの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する（Ｂａｒｏｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｃｅｌｌ，  ２８：３１５−３２４）。その構造は１０，０００塩基対の逆位末端反復（ＩＴＲ）の存在に起因する。ＩＴＲはゲノム複製に関与する。ゲノム複製は、高分子量コンカテマー（感染細胞から単離される）の形成を誘導し、続いて、それが切断され、修復されてウイルスゲノムを作る自己プライミングを含むと考えられる。例えば、Ｔｒａｋｔｍａｎ，  Ｐ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７，  Ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ｐｐ．  ７７５−７９８，  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい。そのゲノムは、約２５０個の遺伝子をコードする。一般的には、中央に位置する遺伝子がウイルス複製にとって必須である（かくして、保存される）が、２つの末端の近くの遺伝子が宿主範囲およびビルレンスなどのより末梢の機能を行うように、セグメント化されていない非感染性ゲノムが配置される。ワクシニアウイルスは、一般的原理として、重複しないセット中に配置されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を用いることにより示差的遺伝子発現を実施する。
【０２３６】
本明細書の他の場所に記載される通り、ＬＩＶＰ株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ；Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＳＲＩ  ＳＲＣ  ＶＢ  Ｖｅｃｔｏｒから取得するか、またはＭｏｓｃｏｗ  Ｉｖａｎｏｖｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｃ０３５５  Ｋ０６０２）から取得することができる。親ＬＩＶＰ株は、配列が異種であることが報告されている（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２８２：４１７−４３５を参照されたい）。ＬＩＶＰの親ゲノムの配列は、配列番号１０に記載される。
【０２３７】
挿入された異種ＤＮＡの非存在下で存在する組換えＬＩＶＰウイルスと比較して改善された特性を示すＬＩＶＰクローン株が本明細書で提供される。組換えＬＩＶＰウイルスが作製された。例えば、ＧＬＶ−１ｈ６８（ＲＶＧＬ２１とも命名される、配列番号９；米国特許出願公開第２００５−００３１６４３号、現在は米国特許第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号、第７，６６２，３９８号に記載されている）は、Ｆ１４．５Ｌ（ＬＩＶＰ中ではＦ３とも命名されている）遺伝子座、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座、およびヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子座中に検出可能なマーカータンパク質をコードする発現カセットである、遺伝子座中にＤＮＡ挿入物を含有する弱毒化ウイルスである。特に、ＧＬＶ−１ｈ６８は、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子座中に挿入されたワクシニア合成初期／後期プロモーターＰＳＥＬ（（ＰＳＥＬ）Ｒｕｃ−ＧＦＰ）の制御下のＲｕｃ−ＧＦＰ  ｃＤＮＡ分子（レニラルシフェラーゼをコードするＤＮＡとＧＦＰをコードするＤＮＡとの融合物）を含有する発現カセット；ＴＫ遺伝子座中に挿入されたワクシニア初期／後期プロモーターＰ７．５Ｋ（（Ｐ７．５Ｋ）ＬａｃＺ）の制御下のβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡおよびワクシニア合成初期／後期プロモーターＰＳＥＬ（（ＰＳＥＬ）ｒＴｒｆＲ）に対して転写にとって逆方向に位置するラットトランスフェリン受容体をコードするＤＮＡを含有する発現カセット（得られるウイルスは、そのタンパク質をコードするＤＮＡ分子がカセット中のプロモーターに対して転写にとって逆方向に位置するため、トランスフェリン受容体タンパク質を発現しない）；ならびにＨＡ遺伝子座中に挿入されたワクシニア後期プロモーターＰ１１ｋ（（Ｐ１１ｋ）ｇｕｓＡ）の制御下のβ−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ分子を含有する発現カセットを含む。他の組換えＬＩＶＰウイルスは、ＧＬＶ−１ｈ６８から誘導され、遺伝子産物または複数の遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含有する（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００３−００５９４００、ＵＳ２００３−０２２８２６１、ＵＳ２００９−０１１７０３４、ＵＳ２００９−００９８５２９、ＵＳ２００９−００５３２４４、ＵＳ２００９−００８１６３９およびＵＳ２００９−０１３６９１７；米国特許第７，５８８，７６７号および第７，７６３，４２０号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３９９２１号を参照されたい）。そのような組換えウイルスの例は、ＧＬＶ−１ｈ６４（配列番号３２６に記載される）である。
【０２３８】
２．ＬＩＶＰクローン株
本明細書で提供されるクローン株は、ＬＩＶＰに由来し、配列番号１０に記載の親配列とは異なるゲノムを有する。本明細書で提供されるクローン株は、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えまたは改変ウイルス株（配列番号９に記載のゲノムを有する）と比較してより高い抗腫瘍形成性および／または低下した毒性を示す。特に、本明細書で提供されるクローン株は、ＬＩＶＰから増殖させたウイルス調製物中に存在する。したがって、このクローン株は、非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有しない。
【０２３９】
本明細書で提供されるクローン株は、配列番号１０に対して少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。例えば、前記クローン株は、配列番号１０に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％の同一性を有するが、１００％未満同一であるヌクレオチド配列を有する。本明細書で提供されるそのようなＬＩＶＰクローンウイルスは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有する親ＬＩＶＰ株と比較して１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において異なるウイルスを含む。例えば、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローンウイルスは、配列番号１０に記載のアミノ酸の配列を有する親ＬＩＶＰ株と比較して１つまたは複数のＯＲＦにおいて異なるウイルスを含む。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローンウイルス株は、配列番号１０と比較して任意のＯＲＦ中の任意の１つもしくは複数のヌクレオチド中にヌクレオチドの欠失もしくは突然変異を含んでもよく、または配列番号１０と比較してウイルスＤＮＡの付加もしくは挿入を含んでもよい。例えば、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローンウイルス株は、配列番号１０と比較して、ｇｌ００１／２９０、ｇｌ００９／２８３、ｇｌ０１０／２８２、ｇｌ０１１／２８０、ｇｌ０１５、ｇｌ０３２、ｇｌ０３４、ｇｌ０３５、ｇｌ０３７、ｇｌ０６９、ｇｌ０７７、ｇｌ０７９、ｇｌ０８２、ｇｌ０８４、ｇｌ０８８、ｇｌ０９３、ｇｌ２２５、ｇｌ２３０、ｇｌ２３９、ｇｌ２４１、ｇｌ２５７、ｇｌ２６４、ｇｌ２７０、ｇｌ２７３、ｇｌ２７４、ｇｌ２７７／１０５、ｇｌ２８０／０１０およびｇｌ２８３／００９と命名されたＯＲＦ中の１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド欠失、突然変異または付加（すなわち、挿入）を含んでもよい。一例においては、トランケートされたタンパク質をコードするＯＲＦを有するＬＩＶＰクローンウイルス株が提供される。他の例においては、ＯＲＦのプロモーター領域中に挿入、欠失または突然変異を含有するＬＩＶＰクローンウイルス株が本明細書で提供される。特定の例においては、ＯＲＦ中の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または突然変異は、非機能的タンパク質（例えば、活性ではない）の生成をもたらすか、またはウイルスによるタンパク質の生成を排除する。
【０２４０】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸を含むように改変された改変または組換えウイルス株を含まない。例えば、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、ＧＬＶ−１ｈ６８（配列番号９に記載される）と命名された組換えウイルスまたはそれから誘導される他の組換えウイルス、例えば、ＧＬＶ−１６４（配列番号３２６に記載される）と命名されたウイルスもしくはＧＬＶ−ｌｉ６９（配列番号３に記載される）と命名されたウイルスに含まれるヌクレオチド配列を含まない。一例においては、本明細書で提供されるクローン株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株と比較して改善されたか、またはより良好な抗腫瘍形成性を示し、ＬＩＶＰ株は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有し、および／またはＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株は配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する。特定の例においては、本明細書で提供されるクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する組換えＬＩＶＰ株ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、類似する抗腫瘍形成性または低い腫瘍形成性（すなわち、改善されたか、もしくはより良好な抗腫瘍形成性）を示す。例えば、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株と比較して改善されたか、またはより良好な抗腫瘍形成活性を示し、ＬＩＶＰ株は配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有し、および／またはＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株は配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有し、例えば、１２０％〜１０００％、例えば、少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上の抗腫瘍形成活性を示す。上記のセクションＢに記載された抗腫瘍形成性を示すパラメータに関するインビトロまたはインビボ試験のいずれかを用いて、抗腫瘍形成性を決定することができる。例えば、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株および／または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株と比較して、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、インビトロまたはインビボでのアッセイまたはモデルにおける腫瘍細胞の増加した細胞傷害性；インビトロまたはインビボでのアッセイまたはモデルにおける腫瘍成長の減少または腫瘍縮小の増加；インビトロまたはインビボでのアッセイまたはモデルにおける腫瘍体積、サイズまたは体重の減少；インビトロまたはインビボでのアッセイまたはモデルにおける腫瘍細胞中での複製または蓄積の増加；およびインビトロまたはインビボでのアッセイまたはモデルにおける腫瘍細胞中でのウイルス遺伝子、腫瘍タンパク質ならびに／またはウイルス複製および／もしくは感染性と相関するハウスキーピング遺伝子の発現の増加を示す。
【０２４１】
別の例においては、本明細書で提供されるクローン株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株および／または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株と比較して、低毒性（すなわち、低ビルレンス）である。他の例においては、本明細書で提供されるクローン株は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する組換えＬＩＶＰ株ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して類似する毒性または低い毒性を示す。毒性またはビルレンスを示すパラメータとしては、限定されるものではないが、対象の生存率の低下または減少、体重の減少、発熱、発疹もしくは他のアレルギー、疲労または腹痛などの副作用の存在、対象における免疫応答の誘導、ウイルスの組織分布、放出される腫瘍抗原量および膿疱形成速度の減少が挙げられる。上記のセクションＢに記載のインビトロまたはインビボ試験のいずれかを用いて、毒性またはビルレンスを決定することができる。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株および／または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株と比較して、０％〜９９％、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満またはそれより低い毒性を示す。他の例においては、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、毒性を示すパラメータを評価するためのアッセイまたは方法において、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、７０％〜１２０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％もしくは少なくとも１２０％、または約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１１５％もしくは約１２０％または７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１１５％もしくは１２０％の毒性または抗腫瘍形成活性を示す。
【０２４２】
特定の例においては、本明細書で提供されるクローン株は、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株および／または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株と比較して低毒性（すなわち、低ビルレンス）であり、改善された抗腫瘍形成性を示す。例えば、本明細書で提供されるクローン株は、ＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株（配列番号９）と比較して低毒性であり、改善されたか、またはより高い抗腫瘍形成性を示す。
【０２４３】
例えば、前記クローン株は、抗腫瘍形成活性を誘導するのに有効な量で対象に投与した場合に低毒性（すなわち、低ビルレンス）である。当業者であれば、そのような量を経験的に決定することができ、それは特定の対象、処置される疾患または状態、腫瘍またはがんの種類、疾患のステージまたは進行および他の同様の因子などの様々な因子に依存する。マウスまたは他の類似するサイズの対象の処置のためには、クローン株の治療量の例は、１ｘ１０５〜１ｘ１０７ｐｆｕなどの約１ｘ１０４〜１ｘ１０８ｐｆｕの範囲にある、例えば、少なくとも１ｘ１０４、少なくとも１ｘ１０５、少なくとも１ｘ１０６、少なくとも２ｘ１０６、少なくとも３ｘ１０６、少なくとも４ｘ１０６もしくは少なくとも５ｘ１０６ｐｆｕまたは約１ｘ１０４、約１ｘ１０５、約１ｘ１０６、約２ｘ１０６、約３ｘ１０６、約４ｘ１０６もしくは約５ｘ１０６ｐｆｕまたは１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６もしくは５ｘ１０６ｐｆｕである。ヒト対象または他の類似するサイズの対象の処置のためには、クローン株の治療量の例は、１ｘ１０９〜１ｘ１０１０ｐｆｕなどの約１ｘ１０７〜１ｘ１０１０ｐｆｕまたは１ｘ１０７から１ｘ１０１０ｐｆｕまでの間の範囲にある、例えば、少なくとも１ｘ１０７、少なくとも１ｘ１０８、少なくとも１ｘ１０９、少なくとも２ｘ１０９、少なくとも３ｘ１０９、少なくとも４ｘ１０９もしくは少なくとも５ｘ１０９ｐｆｕまたは約１ｘ１０７、約１ｘ１０８、約１ｘ１０９、約２ｘ１０９、約３ｘ１０９、約４ｘ１０９もしくは約５ｘ１０９ｐｆｕである。投薬レジメンは、本明細書の他の場所に記載のように変化してもよい。特に、本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、処置レジメンの経過にわたって、対象の１００％の生存を示し、処置の経過にわたって対象の体重の影響する減少または低下を伴わない。一例においては、本明細書で提供されるクローン株は、対象に投与された場合、同じか、または類似する治療量のＬｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａから得られたＬＩＶＰ株、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を有するＬＩＶＰ株および／または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と命名された組換えＬＩＶＰ株を投与された対象の生存率と比較して増加した生存率を示す。
【０２４４】
本明細書で提供される単離されたＬＩＶＰクローンウイルスは、細胞系中での反復継代により増殖させたＬＩＶＰのプラーク単離から誘導することができる。例えば、ＬＩＶＰクローン単離物を、孵化鶏卵培養物、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、ＨｅＬＡ  Ｓ３細胞、ＣＶ−１細胞またはＢＨＫ−２１細胞中でのウイルスの継代により取得することができる。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン単離物は、配列において同種である。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローンウイルスの例は、抗腫瘍形成特性および低下した毒性を示す本明細書に記載の方法において選択されたクローン単離物である。
【０２４５】
ＬＩＶＰクローン株の例
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株としては、配列番号１のヌクレオチド１０，０７３〜１８０，０９５、配列番号２のヌクレオチド１１，２４３〜１８２，７２１、配列番号４のヌクレオチド６，２６４〜１８１，３９０、配列番号５のヌクレオチド７，０４４〜１８１，８２０、配列番号６のヌクレオチド６，６７４〜１８１，４０９、配列番号７のヌクレオチド６，７１６〜１８１，３６７もしくは配列番号８のヌクレオチド６，８９９〜１８１，８７０、またはその相補体に対応するヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株は、一般的には、左および／または右の逆位末端反復（ＩＴＲ）に対応する末端ヌクレオチドも含む。本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株の例としては、配列番号１、２、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列を有するもの、またはその相補体、または配列番号１、２、３、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列を有するクローン株と類似する毒性および抗腫瘍形成性を示すものが挙げられる。
【０２４６】
本明細書で提供されるＬＩＶＰクローン株はまた、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列を有するウイルスの配列と類似するが、同一ではない配列を有する、これらのウイルスのいずれかの変異体も含む。特に、ウイルス変異体は、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも９７％、９８％または９９％以上同一である、例えば、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ウイルス変異体は、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７もしくは８に記載のヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、９９．９９５％または９９．９９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含んでもよい。クローン株変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８に記載のヌクレオチド配列を有するクローン株と類似する毒性および抗腫瘍形成性を示す。
【０２４７】
本明細書で提供されるＬＩＶＰのクローン株の例は、ＬＩＶＰ１．１．１、ＬＩＶＰ２．１．１、ＬＩＶＰ４．１．１、ＬＩＶＰ５．１．１、ＬＩＶＰ６．１．１、ＬＩＶＰ７．１．１もしくはＬＩＶＰ８．１．１またはクローン株ＬＩＶＰ１．１．１、ＬＩＶＰ２．１．１、ＬＩＶＰ４．１．１、ＬＩＶＰ５．１．１、ＬＩＶＰ６．１．１、ＬＩＶＰ７．１．１もしくはＬＩＶＰ８．１．１のいずれかと類似する毒性および抗腫瘍形成性を示すクローン株である。クローン株またはその調製物を、親ＬＩＶＰ、ＬＩＶＰ１．１．１、ＬＩＶＰ２．１．１、ＬＩＶＰ４．１．１、ＬＩＶＰ５．１．１、ＬＩＶＰ６．１．１、ＬＩＶＰ７．１．１もしくはＬＩＶＰ８．１．１、またはその変異体が培養された培養細胞から単離することができる。例えば、クローン株またはその調製物を、親ＬＩＶＰ、ＬＩＶＰ１．１．１、ＬＩＶＰ２．１．１、ＬＩＶＰ４．１．１、ＬＩＶＰ５．１．１、ＬＩＶＰ６．１．１、ＬＩＶＰ７．１．１もしくはＬＩＶＰ８．１．１、またはその変異体が増殖された細胞培養物からＬＩＶＰクローンを単離することにより取得することができる。いくつかの例においては、クローン株は、親ウイルス調製物もしくは混合物または他の参照株と比較して改善された抗腫瘍形成性および最小限の毒性を示すクローン株を同定するための上記の方法によりウイルス混合物から単離される。本明細書で提供される単離されたＬＩＶＰクローンウイルス株の例としては、ウシ皮膚上へのＬｉｓｔｅｒ株の適合化により生成されたＬＩＶＰ混合物（Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａにより生成されたＬＩＶＰ）から選択される単離されたＬＩＶＰクローンウイルス株が挙げられる。
【０２４８】
Ｄ．ＬＩＶＰ株の改変
そのゲノム配列が改変された改変ＬＩＶＰウイルス株が本明細書で提供される。ワクシニアウイルスの線状ｄｓＲＮＡウイルスゲノムは約２００ｋｂのサイズであり、合計約２５０個の遺伝子をコードする。ワクシニアウイルスゲノムは、外来遺伝子の大きい運搬能力を有し、最大で２５ｋｂの外因性ＤＮＡ断片（ワクシニアゲノムサイズの約１２％）を挿入することができる。いくつかのワクシニア株のゲノムは完全に配列決定されており、多くの必須および非必須遺伝子が同定されている。異なる株間での高い配列相同性に起因して、あるワクシニア株からのゲノム情報を、他の株において改変ウイルスを設計および作製するために用いることができる。最後に、遺伝子操作による改変ワクシニア株の製造のための技術は、確立されている（Ｍｏｓｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ３：  ８６−９０  （１９９３）；  Ｂｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｅａｒｌ，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：  ２２３−２４５  （１９９９）；  Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：  ５３４−５４０  （２００１））。
【０２４９】
例えば、配列番号１（ＬＩＶＰ１．１．１）、配列番号２（ＬＩＶＰ２．１．１）、配列番号４（ＬＩＶＰ４．１．１）、配列番号５（ＬＩＶＰ５．１．１）、配列番号６（ＬＩＶＰ６．１．１）、配列番号７（ＬＩＶＰ７．１．１）、配列番号８（ＬＩＶＰ８．１．１）または配列番号９（ＧＬＶ１ｈ６８）に記載のゲノム配列と比較してゲノム配列が改変されたＬＩＶＰウイルスが本明細書で提供される。改変は、核酸の突然変異、挿入、欠失、もしくは置換（置き換え）などのウイルスのゲノムに対する任意の変化またはウイルスのゲノム配列の他の改変を含んでもよい。例えば、本明細書で提供されるウイルスを、ウイルスのゲノム中に挿入されたか、またはゲノム中で置き換えられた１つまたは複数の異種核酸分子を含有するように改変することができる。一例においては、改変は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個以上のヌクレオチドなどの、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または置き換えを含んでもよい。
【０２５０】
異種核酸分子は、オープンリーディングフレームを含んでもよく、または非コード配列であってよい。いくつかの事例においては、異種核酸はウイルス遺伝子の全部または一部を置き換える。ウイルス遺伝子を、別のウイルスに由来する相同な遺伝子または異なる遺伝子と置き換えることができる。他の例においては、本明細書で提供されるウイルスを、１つまたは複数の異種核酸分子の挿入により改変することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異種核酸分子を挿入することができる。一般的には、挿入される異種核酸は、オープンリーディングフレームを含有し、遺伝子のコード領域に対応するヌクレオチドの連続配列である。例えば、異種遺伝子をコードする異種核酸分子を挿入することができる。一般的には、異種遺伝子は、非ウイルスタンパク質をコードする遺伝子である。挿入されるか、または置き換えられる遺伝子を、腫瘍細胞などの宿主細胞の感染後にウイルスゲノムから転写および／または翻訳させることができる。以下に記載のように、異種核酸は、遺伝子の発現を制御する調節配列を含有してもよい。例えば、異種核酸を、オープンリーディングフレームの発現のためのプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０２５１】
本明細書で提供されるウイルスの改変は、毒性または抗腫瘍形成性を示すパラメータと関連するものなどの、ウイルスの特徴または特性の改変をもたらし得る。挿入、突然変異または欠失の例は、改変を含有しないクローン株に対する弱毒化ワクシニアウイルスをもたらすものである。例えば、挿入、突然変異または欠失は、例えば、毒性を低下させる、感染性を低下させる、複製する能力を低下させる、またはワクシニアウイルスが蓄積することができる非腫瘍臓器もしくは組織の数を低下させることにより、クローン株の病原性を減少させることができる。挿入、突然変異または欠失の他の例としては、限定されるものではないが、ウイルスの抗原性を増加させるもの、検出または画像化を可能にするもの、ウイルスの弱毒性を変化させるもの、および感染性を変化させるものが挙げられる。改変を、例えば、ヌクレオチド代謝、宿主相互作用およびウイルス形成に関与する遺伝子中で行うことができる。
【０２５２】
例えば、本明細書で提供される改変クローン株は、改変を含有しないクローン株と比較して低下した毒性または病原性を示すことができる。別の例においては、本明細書で提供される改変クローン株は、改変を含有しないクローン株と比較して改善された抗腫瘍形成性を示すことができる。例えば、改変クローン株は、腫瘍中に選択的に蓄積する能力、細胞を溶解するか、または細胞死を引き起こす能力、腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起する能力、免疫原性および複製能力の改善を示すことができる。他の例においては、改変クローン株は、低下した毒性および増加した抗腫瘍形成性を示す。
【０２５３】
他の例においては、タンパク質の発現および／またはＲＮＡ分子の発現のための遺伝子をコードする異種核酸分子の挿入により、改変を行うことができる。１つまたは複数の異種核酸分子が、例えば、治療遺伝子産物；診断、モニタリングもしくは画像化に用いることができる遺伝子産物などの、検出可能な遺伝子産物または検出可能なシグナルを誘導することができる遺伝子産物；腫瘍治療のための抗原などの抗原（例えば、スーパー抗原）をコードしてもよい。本明細書で提供されるウイルスにより発現される異種遺伝子のいずれかを、発現された遺伝子産物を収穫する目的で作製することができる。
【０２５４】
１．異種核酸
本明細書で提供されるウイルスなどの、大きいゲノムサイズのポックスウイルスは、異種ＤＮＡの大きい挿入物および／または異種ＤＮＡの複数の挿入物をゲノム中に組み込むことができる（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９８３）  Ｇｅｎｅ  ２５（１）：２１−２８）。本明細書で提供されるウイルス、例えば、本明細書で提供される任意のクローン株を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異種ＤＮＡ分子の挿入により改変することができる。一般的には、１つまたは複数の異種ＤＮＡ分子が、ウイルスゲノムの非必須領域中に挿入される。例えば、１つまたは複数の異種ＤＮＡ分子が、腫瘍細胞などの増殖している細胞中での複製にとって非必須であるウイルスゲノムの遺伝子座中に挿入される。例示的な挿入部位は以下に提供され、当技術分野で公知である。
【０２５５】
いくつかの例においては、ウイルスを改変して、外因性または異種遺伝子を発現させることができる。外因性遺伝子産物の例としては、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。改変されたウイルスは、治療遺伝子産物、検出可能な遺伝子産物、製造または収穫のための遺伝子産物、抗体収穫のための抗原遺伝子産物、またはウイルス遺伝子産物を発現することができる。そのような遺伝子産物の特徴は、本明細書および他の場所に記載される。
【０２５６】
いくつかの例においては、ウイルスを改変して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の遺伝子産物などの２つ以上の遺伝子産物を発現させることができ、２つ以上の遺伝子産物の任意の組合せは、１つまたは複数の検出可能な遺伝子産物、治療遺伝子産物、製造もしくは収穫のための遺伝子産物または抗体収穫のための抗原遺伝子産物またはウイルス遺伝子産物であってよい。一例においては、ウイルスを改変して、抗がん遺伝子産物を発現させることができる。別の例においては、ウイルスを改変して、検出のための２つ以上の遺伝子産物または２つ以上の治療遺伝子産物を発現させることができる。いくつかの例においては、ルシフェラーゼ基質の生合成に関与する１つまたは複数のタンパク質を、ルシフェラーゼと共に発現させることができる。２つ以上の外因性遺伝子を導入する場合、その遺伝子を同じか、または異なる調節配列下で調製することができる、およびその遺伝子を、単一または複数の遺伝子操作工程において、ウイルスゲノムの同じか、または異なる領域中に挿入することができる。いくつかの例においては、検出可能な遺伝子産物をコードする遺伝子などの１つの遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にあってよいが、治療遺伝子産物をコードする遺伝子などの第２の遺伝子は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。ウイルスに２つ以上の遺伝子を挿入するための方法は当技術分野で公知であり、様々な外因性遺伝子、調節配列および／または他の核酸配列を用いて様々なウイルスについて容易に実施することができる。
【０２５７】
特に、本明細書で提供されるウイルスは、インビボおよびインビトロで遺伝子を発現させるために改変することができる。いくつかの例においては、ウイルスは、宿主細胞から分泌される異種遺伝子を発現することができる。いくつかの例においては、ウイルスは、細胞死、感染中の細胞膜からの溶解、漏出の際に宿主細胞から放出される異種遺伝子を発現することができる。いくつかの例においては、ウイルスは、腫瘍または他の患者生物試料、例えば、血液もしくはリンパ液試料からの異種遺伝子の産物の収穫を可能にするのに十分に高いレベルで異種遺伝子を発現することができる。いくつかの例においては、ウイルスは、対象における免疫応答の誘導のための腫瘍抗原を発現することができる。そのような例においては、抗原に対する抗体を収穫することができる。
【０２５８】
例えば、遺伝子の例としては、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙその他のＤｒ．Ｖｉｃｔｏｒ  Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋおよび彼の同僚により著され編集された、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によるワールドワイドウェブのために開発されたヒト遺伝子および遺伝子障害の一覧を含む遺伝子一覧；オンライン上のＭｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ、ＯＭＩＭ（商標）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｅｒ、Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）、１９９９；ならびにＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベース（例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭを参照されたい）で利用可能なものが挙げられる。これらの遺伝子としては、限定されるものではないが、２３９ｆ２ｈ９，３ｐｋ，４ｅｂｐ１，４ｅｂｐ２，ａｌ１，ａｌ２ｍ１，ａｌ２ｍ２，ａｌ２ｍ３，ａｌ２ｍ４，ａｌ５，ａ１ｂ，ａｌｂｇ，ａｌｓｔ，ａ２ｍ，ａ２ｍｒ，ａ２ｍｒａｐ，ａａ，ａａａ，ａａａ，ａａｂｔ，ａａｃ１，ａａｃ２，ａａｃｔ，ａａｄａｃ，ａａｎａｔ，ａａｒｓ，ａａｓ，ａａｔ，ａａｖｓ１，ａｂｃ１，ａｂｃ２，ａｂｃ３，ａｂｃ７，ａｂｃ８，ａｂｃｒ，ａｂｉ１，ａｂｌ１，ａｂｌ２，ａｂｌ１，ａｂｏ，ａｂｐ，ａｂｐ１，ａｂｐａ，ａｂｐｘ，ａｂｒ，ａｃａａ，ａｃａｃ，ａｃａｃａ，ａｃａｃｂ，ａｃａｄ１，ａｃａｄｍ，ａｃａｄｓ，ａｃａｄｓｂ，ａｃａｄｖ１，ａｃａｔ，ａｃａｔ１，ａｃａｔ２，ａｃｃ，ａｃｃｂ，ａｃｃｎ１，ａｃｃｎ２，ａｃｃｐｎ，ａｃｅ１，ａｃｈ，ａｃｈｅ，ａｃｈｍ１，ａｃｈｍ２，ａｃｈｒｂ，ａｃｈｒｄ，ａｃｈｒｇ，ａｃｌｓ，ａｃｌｙ，ａｃｏ１，ａｃｏ２，ａｃｏｘ，ａｃｏｘ１，ａｃｏｘ２，ａｃｏｘ３，ａｃｐ１，ａｃｐ２，ａｃｐ５，ａｃｐｐ，ａｃｒ，ａｃｒｖ１，ａｃｓ３，ａｃｓ３，ａｃｓ４，ａｃｔ２，ａｃｔ３５，ａｃｔａ１，ａｃｔａ２，ａｃｔａ３，ａｃｔｂ，ａｃｔｃ，ａｃｔｇ１，ａｃｔｇ２，ａｃｔ１１，ａｃｔｎ１，ａｃｔｎ２，ａｃｔｎ３，ａｃｔｓａ，ａｃｕｇ，ａｃｖｒ１，ａｃｖｒ２ｂ，ａｃｖｒｌ１，ａｃｖｒｌｋ１，ａｃｖｒｌｋ２，ａｃｖｒｌｋ３，ａｃｙ１，ａｄ１，ａｄ２，ａｄ３，ａｄ４，ａｄ５，ａｄａ，ａｄａｍ１０，ａｄａｍ１１，ａｄａｍ１２，ａｄａｍ３，ａｄａｍ３ａ，ａｄａｍ３ｂ，ａｄａｍ８，ａｄａｒ，ａｄａｒｂ１，ａｄａｒｂ２，ａｄｃｐ１，ａｄｃｐ２，ａｄｃｙ１，ａｄｃｙ２，ａｄｃｙ３，ａｄｃｙ３，ａｄｃｙ４，ａｄｃｙ５，ａｄｃｙ６，ａｄｃｙ７，ａｄｃｙ８，ａｄｃｙ９，ａｄｃｙａｐ１，ａｄｃｙａｐｌｒ１，ａｄｄ１，ａｄｄ２，ａｄｄ３，ａｄｄ１，ａｄｆｎ，ａｄｈ１，ａｄｈ２，ａｄｈ３，ａｄｈ４，ａｄｈ５，ａｄｈ７，ａｄｈａｐｓ，ａｄｈｃ１＠，ａｄｈｒ，ａｄｈｒ，ａｄｋ，ａｄ���，ａｄｍ，ａｄｍｌｘ，ａｄｏｒａ１，ａｄｏｒａ２ａ，ａｄｏｒａ２ｂ，ａｄｏｒａ２１，ａｄｏｒａ２１，ａｄｏｒａ３，ａｄｐｒｔ，ａｄｒａ１ａ，ａｄｒａ１ｂ，ａｄｒａ１ｃ，ａｄｒａ１ｄ，ａｄｒａ２ａ，ａｄｒａ２ｂ，ａｄｒａ２ｃ，ａｄｒａ２１１，ａｄｒａ２１２，ａｄｒａ２ｒ，ａｄｒｂ１，ａｄｒｂ１ｒ，ａｄｒｂ２，ａｄｒｂ２ｒｌ１，ａｄｒｂ３，ａｄｒｂｋ１，ａｄｒｂｋ２，ａｄｓ１，ａｄｓｓ，ａｄｔｂ１，ａｄｘ，ａｄｘｒ，ａｅ１，ａｅ２，ａｅ３，ａｅｇｌ１，ａｅｍｋ，ａｅｓ，ａｆ１０，ａｆ１７，ａｆ４，ａｆ６，ａｆ８ｔ，ａｆ９，ａｆｄ１，ａｆｄｎ，ａｆｇ３，ａｆｇ３１１，ａｆｍ，ａｆｐ，ａｆｘ１，ａｇａ，ａｇｃ１，ａｇｅｒ，ａｇ１，ａｇｍｘ１，ａｇｍｘ２，ａｇｐ１，ａｇｐ７，ａｇｐｓ，ａｇｒｎ，ａｇｒｐ，ａｇｒｔ，ａｇｓ，ａｇｔ，ａｇｔｉ１，ａｇｔｒ１，ａｇｔｒ１ａ，ａｇｔｒ２，ａｇｔｒｌ１，ａｇｘｔ，ａｈｃ，ａｈｃｙ，ａｈｄ，ａｈｄｓ，ａｈｎａｋ，ａｈｏ２，ａｈｒ，ａｈｓｇ，ａｈｘ，ａｉｂ１，ａｉｃ，ａｉｃ１，ａｉｅｄ，ａｉｈ１，ａｉｈ２，ａｉｈ３，ａｉｍ１，ａｉｒ，ａｉｒｃ，ａｉｒｅ，ａｋ１，ａｋ２，ａｋ３，ａｋａｐ１４９，ａｋｔ１，ａｋｔ２，ａｋｕ，ａｌａｄ，ａｌａｓ１，ａｌａｓ２，ａｌｂ，ａｌｂ２，ａｌｂａ，ａｌｃａｍ，ａｌｄ，ａｌｄｈ１，ａｌｄｈ１０，ａｌｄｈ２，ａｌｄｈ３，ａｌｄｈ４，ａｌｄｈ５，ａｌｄｈ６，ａｌｄｈ９，ａｌｄ１１，ａｌｄｏａ，ａｌｄｏｂ，ａｌｄｏｃ，ａｌｄｒ１，ａｌｄｓ，ａｌｋ，ａｌｋ１，ａｌｋ２，ａｌｋ３，ａｌｋ６，ａｌｍｓ１，ａｌｏｘ１２，ａｌｏｘ１５，ａｌｏｘ５，ａｌｐ，ａｌｐｉ，ａｌｐ１，ａｌｐｐ，ａｌｐｐ１２，ａｌｒ，ａｌｒ，ａｌｓ１，ａｌｓ２，ａｌｓ４，ａｌｓ５，ａｌｓｓ，ａｍｂｎ，ａｍｂｐ，ａｍｃｄ１，ａｍｃｄ２ｂ，ａｍｃｎ，ａｍｃｎ１，ａｍｃｘ１，ａｍｄ１，ａｍｄｍ，ａｍｅｌｘ，ａｍｅｌｙ，ａｍｆｒ，ａｍｇ，ａｍｇ１，ａｍｇｘ，ａｍｈ，ａｍｈｒ，ａｍｈｒ２，ａｍｌ１，ａｍｌ１ｔ１，ａｍｌ２，ａｍｌ３，ａｍｏｇ，ａｍｐｄ１，ａｍｐｄ２，ａｍｐｄ３，ａｍｐｈ，ａｍｐｈ１，ａｍｐｋ，ａｍｔ，ａｍｙ１ａ，ａｍｙ１ｂ，ａｍｙ１ｃ，ａｍｙ２ａ，ａｍｙ２ｂ，ａｎ２，ａｎｃ，ａｎｃｒ，ａｎｇ，ａｎｇ１，ａｎｈ１，ａｎｋ１，ａｎｋ２，ａｎｋ３，ａｎｏｐ１，ａｎｏｖａ，ａｎｐ，ａｎｐｅｐ，ａｎｐｒａ，ａｎｐｒｂ，ａｎｐｒｃ，ａｎｓ，ａｎｔ１，ａｎｔ２，ａｎｔ３，ａｎｔ３ｙ，ａｎｘ１，ａｎｘ１１，ａｎｘ１３，ａｎｘ２，ａｎｘ２１４，ａｎｘ３，ａｎｘ４，ａｎｘ５，ａｎｘ６，ａｎｘ７，ａｎｘ８，ａｏａｈ，ａｏｃ２，ａｏｘ１，ａｐ２ｔｆ，ａｐａｈ１，ａｐｂａ１，ａｐｂａ２，ａｐｂｂ１，ａｐｂｂ２，ａｐｃ，ａｐｃｓ，ａｐｅ，ａｐｅｃｅｄ，ａｐｅｈ，ａｐｅｘ，ａｐｉ１，ａｐｉ２，ａｐｉ３，ａｐｊ，ａｐｌｐ，ａｐｌｐ１，ａｐｌｐ２，ａｐｎｈ，ａｐｏ３１，ａｐｏａ１，ａｐｏａ２，ａｐｏａ４，ａｐｏｂ，ａｐｏｂｅｃ１，ａｐｏｃ１，ａｐｏｃ２，ａｐｏｃ３，ａｐｏｃ４，ａｐｏｄ，ａｐｏｅ，ａｐｏｅｒ２，ａｐｏｈ，ａｐｏｌｍｔ，ａｐｏｌｐ１＠，ａｐｏｌｐ２＠，ａｐｐ，ａｐｐｂｐ１，ａｐｐ���１，ａｐｒｆ，ａｐｒｔ，ａｐｓ，ａｐｔ１，ａｐｔｌ１ｇ１，ａｐｘ１，ａｐｙ，ａｑｄｑ，ａｑｐ０，ａｑｐ１，ａｑｐ２，ａｑｐ２１，ａｑｐ３，ａｑｐ４，ａｑｐ５，ａｑｐ６，ａｑｐ７，ａｒ，ａｒ１，ａｒａ，ａｒａｆ１，ａｒａｆ２，ａｒｃｎ１，ａｒｄ１，ａｒｄ１，ａｒｅｇ，ａｒｆ１，ａｒｆ２，ａｒｆ３，ａｒｆ４１，ａｒｆ５，ａｒｇ，ａｒｇ１，ａｒｇｓ，ａｒｈ１２，ａｒｈ６，ａｒｈ９，ａｒｈａ，ａｒｈｂ，ａｒｈｃ，ａｒｈｇ，ａｒｈｇａｐ２，ａｒｈｇａｐ３，ａｒｈｇａｐ６，ａｒｈｇｄｉａ，ａｒｈｇｄｉｂ，ａｒｈｈ，ａｒｉｘ，ａｒｌ２，ａｒｍｄ１，ａｒｎｔ，ａｒｎｔ１，ａｒｏ，ａｒｐ，ａｒｐ１，ａｒｐｋｄ，ａｒｒ３，ａｒｒｂ１，ａｒｒｂ２，ａｒｓａ，ａｒｓａｃｓ，ａｒｓｂ，ａｒｓｃ１，ａｒｓｃ２，ａｒｓｄ，ａｒｓｅ，ａｒｓｆ，ａｒｔ，ａｒｔ１，ａｒｔ３，ａｒｔ４，ａｒｔｓ，ａｒｖｄ１，ａｒｖｄ２，ａｒｖｄ３，ａｒｖｄ４，ａｓ，ａｓａｔ，ａｓｂ，ａｓｃｌ１，ａｓｃｌ２，ａｓｃｔ１，ａｓｄ１，ａｓｄ２，ａｓｇｒ１，ａｓｇｒ２，ａｓｈ１，ａｓｉｐ，ａｓ１，ａｓｌｎ，ａｓｍ１，ａｓｍａ，ａｓｍｄ，ａｓｍｔ，ａｓｍｔｌｘ，ａｓｍｔｙ，ａｓｎｒｓ，ａｓｎｓ，ａｓｐａ，ａｓｓ，ａｓｔｍ１，ａｓｔｎ，ａｓｖ，ａｔ，ａｔ１，ａｔ２ｒ１，ａｔ３，ａｔａ，ａｔｂｆ１，ａｔｃａｙ，ａｔｆ１，ａｔｈ１，ａｔｈｓ，ａｔｍ，ａｔｏｈ１，ａｔｏｘ１，ａｔｐ１ａ１，ａｔｐ１ａ２，ａｔｐ１ａ３，ａｔｐ１ａ１１，ａｔｐ１ｂ１，ａｔｐ１ｂ２，ａｔｐ１ｂ３，ａｔｐ１ｂ１１，ａｔｐ１ｇ１，ａｔｐ２ａ１，ａｔｐ２ａ２，ａｔｐ２ａ３，ａｔｐ２ｂ，ａｔｐ２ｂ１，ａｔｐ２ｂ２，ａｔｐ２ｂ２，ａｔｐ２ｂ３，ａｔｐ２ｂ４，ａｔｐ４ａ，ａｔｐ４ｂ，ａｔｐ５，ａｔｐ５ａ，ａｔｐ５ｂ，ａｔｐ５ｇ１，ａｔｐ５ｇ２，ａｔｐ５ｇ３，ａｔｐ５ｏ，ａｔｐ６ａ，ａｔｐ６ｂ１，ａｔｐ６ｃ，ａｔｐ６ｅ，ａｔｐ６ｎ１，ａｔｐ７ａ，ａｔｐ７ｂ，ａｔｐｍ，ａｔｐｓｂ，ａｔｐｓｋ１，ａｔｐｓｋ２，ａｔｑ１，ａｔｒ，ａｔｒ，ａｔｒ１，ａｔｒ１，ａｔｒ２，ａｔｒｃ１，ａｔｒｃ２，ａｔｒｘ，ａｔｓ，ａｔｓｖ，ａｔｘ１，ａｔｘ２，ａｕ，ａｕｆ１，ａｕｆ１ａ，ａｕｔ，ａｖｃｄ，ａｖｅｄ，ａｖｐ，ａｖｐｒ１ａ，ａｖｐｒ１ｂ，ａｖｐｒ２，ａｖｐｒ３，ａｖｒｐ，ａｖｓｄ，ａｗａ１，ａｘ１，ａｘｌ１ｇ，ａｘｓｆ，ａｚｆ１，ａｚｆ２，ａｚｇｐ１，ａｚｕ１，ｂ１２０，ｂ１４４，ｂｌｇ１，ｂ２９，ｂ２ｍ，ｂ２ｍｒ，ｂ３ｇａｌｔ４，ｂ４ｇａｌｔ１，ｂａ２ｒ，ｂａｂ１，ｂａｇ１，ｂａｉ１，ｂａｉ２，ｂａｉ３，ｂａｋ１，ｂａｍ２２，ｂａｐ１，ｂａｐ１３５，ｂａｐｘ１，ｂａｒｄ１，ｂａｒｋ２，ｂａｓ，ｂａｔ１，ｂａｔ２，ｂａｔ３，ｂａｔ４，ｂａｔ５，ｂａｘ，ｂｂ１，ｂｂｂｇ１，ｂｂｂｇ２，ｂｂｓ１，ｂｂｓ２，ｂｂｓ３，ｂｂｓ４，ｂｂｓ５，ｂｃａｓ１，ｂｃａｔ１，ｂｃａｔ２，ｂｃａｔｅ２，ｂｃｄ１，ｂｃｅｉ，ｂｃｈｅ，ｂｃｋｄｈａ，ｂｃｋｄｈｂ，ｂｃｌ１，ｂｃｌ１０，ｂｃｌ２，ｂｃｌ２ａ１，ｂｃｌ２１２，ｂｃｌ３，ｂｃｌ５，ｂｃｌ６，ｂｃｌ７，ｂｃｌ７ａ，ｂｃｌ８，ｂｃｌ９，ｂｃｌｗ，ｂｃｍ，ｂｃｍ１，ｂｃｍａ���ｂｃｎｓ，ｂｃｎｓ，ｂｃｐ，ｂｃｐｍ，ｂｃｐｒ，ｂｃｒ，ｂｃｒｌ２，ｂｃｒｌ３，ｂｃｒｌ４，ｂｃｓｇ１，ｂｃｔ１，ｂｃｔ２，ｂｄｂ，ｂｄｂ１，ｂｄｃ，ｂｄｅ，ｂｄｋｒｂ１，ｂｄｋｒｂ２，ｂｄｍｆ，ｂｄｍｒ，ｂｄｎｆ，ｂｅｄ，ｂｅｄｐ，ｂｅｋ，ｂｅｎｅ，ｂｅｖｉ，ｂｆ，ｂｆ１，ｂｆ２，ｂｆｈｄ，ｂｆｉｃ，ｂｆｌｓ，ｂｆｎｃ２，ｂｆｐ，ｂｆｓｐ１，ｂｆｔ，ｂｇｌａｐ，ｂｇｍｒ，ｂｇｎ，ｂｇｐ，ｂｈｄ，ｂｈｐｃｄｈ，ｂｈｒ１，ｂｉｃｄ１，ｂｉｄ，ｂｉｇｈ３，ｂｉｎ１，ｂｉｒ，ｂｊｓ，ｂｋｍａ１，ｂｌａｓｔ１，ｂｌａｕ，ｂｌｋ，ｂｌｍ，ｂｌｍｈ，ｂｌｔｒ，ｂｌｖｒａ，ｂｌｖｒｂ，ｂｌｙｍ，ｂｍａｌ１，ｂｍｄ，ｂｍｈ，ｂｍｉ１，ｂｍｐ１，ｂｍｐ２，ｂｍｐ２ａ，ｂｍｐ２ｂ１，ｂｍｐ３，ｂｍｐ４，ｂｍｐ５，ｂｍｐ６，ｂｍｐ７，ｂｍｐ８，ｂｍｐｒ１ａ，ｂｍｐｒ１ｂ，ｂｍｘ，ｂｍｙｂ，ｂｎ５１ｔ，ｂｎｃ，ｂｎｃ１，ｂｎｐ，ｂｏｒ，ｂｐａｄ，ｂｐａｇ１，ｂｐａｇ２，ｂｐｅｓ，ｂｐｅｓ１，ｂｐｅｓ２，ｂｐｇｍ，ｂｐｈ１，ｂｐｉ，ｂｒ，ｂｒ１４０，ｂｒａｆ，ｂｒｃａ１，ｂｒｃａ２，ｂｒｃａ３，ｂｒｃａｃｏｘ，ｂｒｃｄ１，ｂｒｃｄ２，ｂｒｄｔ，ｂｒｆ１，ｂｒｈｃ，ｂｒｉｃ，ｂｒｋｓ，ｂｒｎ３ａ，ｂｒｎ３ｂ，ｂｒｎ３ｃ，ｂｒｒｎ１，ｂｒｗ１ｃ，ｂｓ，ｂｓａｐ，ｂｓｅｐ，ｂｓｆ２，ｂｓｇ，ｂｓｎｄ，ｂｓｓ１，ｂｓｔ１，ｂｓｔ２，ｂｔａｋ，ｂｔｃ，ｂｔｄ，ｂｔｅｂ，ｂｔｅｂ１，ｂｔｇ１，ｂｔｇ２，ｂｔｈｓ，ｂｔｋ，ｂｔｋ１，ｂｔｎ，ｂｔｓ，ｂｕｂ１ｂ，ｂｕｂｒ１，ｂｗｒ１ａ，ｂｗｒ１ｂ，ｂｗｓ，ｂｗｓｃｒ１ａ，ｂｗｓｃｒ１ｂ，ｂｚｒｐ，ｂｚｘ，ｃ１１ｏｒｆ１３，ｃ１ｎｈ，ｃ１ｑａ，ｃ１ｑｂ，ｃ１ｑｂｐ，ｃ１ｑｇ，ｃ１ｒ，ｃ１ｓ，ｃ２，ｃ２１ｏｒｆ１，ｃ２１ｏｒｆ２，ｃ２１ｏｒｆ３，ｃ２ｔａ，ｃ３，ｃ３ｂｒ，ｃ３ｄｒ，ｃ３ｇ，ｃ４ａ，ｃ４ｂ，ｃ４ｂｐａ，ｃ４ｂｐｂ，ｃ４ｆ，ｃ４ｓ，ｃ５，ｃ５ａｒ，ｃ５ｒ１，ｃ６，ｃ７，ｃ８ａ，ｃ８ｂ，ｃ８ｇ，ｃ９，ｃａ１，ｃａ１２，ｃａ１２５，ｃａ２，ｃａ２１ｈ，ｃａ３，ｃａ４，ｃａ５，ｃａ６，ｃａ７，ｃａ８，ｃａ９，ｃａａｆ１，ｃａｂｐ９ｋ，ｃａｃ，ｃａｃ＠，ｃａｃａ，ｃａｃｄ，ｃａｃｎａ１ａ，ｃａｃｎａ１ｂ，ｃａｃｎａ１ｃ，ｃａｃｎａ１ｄ，ｃａｃｎａ１ｅ，ｃａｃｎａ１ｆ，ｃａｃｎａ１ｓ，ｃａｃｎ
ａ２，ｃａｃｎｂ１，ｃａｃｎｂ２，ｃａｃｎｂ３，ｃａｃｎｂ４，ｃａｃｎｇ，ｃａｃｎｌ１ａ１，ｃａｃｎｌ１ａ２，ｃａｃｎｌ１ａ３，ｃａｃｎｌ１ａ４，ｃａｃｎｌ１ａ５，ｃａｃｎｌ１ａ６，ｃａｃｎｌ２ａ，ｃａｃｎｌｂ１，ｃａｃｎｌｇ，ｃａｃｐ，ｃａｃｔ，ｃａｃｙ，ｃａｄ，ｃａｄ１１，ｃａｄａｓｉ１，ｃａｅ１，ｃａｅ３，ｃａｆ，ｃａｆ１ａ，ｃａｇａ，ｃａｇｂ，ｃａｉｎ，ｃａｋ，ｃａｋ１，ｃａｌ１１，ｃａｌｂ１，ｃａｌｂ２，ｃａｌｂ３，ｃａｌｃ１，ｃａｌｃ２，ｃａｌｃａ，ｃａｌｃｂ，ｃａｌｃｒ，ｃａｌｄ１，ｃａｌｌａ，ｃａｌｍ１，ｃａｌｍ２，ｃａｌｍ３，ｃａｌｍ１１，ｃａｌｍ１３，ｃａｌｎａ，ｃａｌｎａ３，ｃａｌｎｂ，ｃａｌｎｂ１，ｃａｌｒ，ｃａｌｓ，ｃａｌｔ，ｃａｌｕ，ｃａｍ，ｃａｍｋ４，ｃａｍｋｇ，ｃａｍｌ１，ｃａｍｌｇ，ｃａｍｐ，ｃａｎ，ｃａｎｐ３，ｃａｎｘ，ｃａｐ２，ｃａｐ３，ｃａｐ３７，ｃａｐｂ，ｃａｐｇ，ｃａｐ１，ｃａｐｎ１，ｃａｐｎ２，ｃａｐｎ３，ｃａｐｎ４，ｃａｐｐａ２，ｃａｐｐｂ，ｃａｐｒ，ｃａｐｓ，ｃａｐｚａ２，ｃａｐｚｂ，ｃａｒ，ｃａｒｐ，ｃａｒｓ，ｃａｒｔ１，ｃａｓ，ｃａｓ２，ｃａｓｉ１，ｃａｓｐ１，ｃａｓｐ１０，ｃａｓｐ２，ｃａｓｐ３，ｃａｓｐ３，ｃａｓｐ４，ｃａｓｐ５，ｃａｓｐ６，ｃａｓｐ７，ｃａｓｐ８，ｃａｓｑ１，ｃａｓｑ２，ｃａｓｒ  ｃａｓｔ，ｃａｔ，ｃａｔ１，ｃａｔ４，ｃａｔｆ１，ｃａｔｍ，ｃａｖ１，ｃａｖ２，ｃａｖ３，ｃｂｂｍ，ｃｂｄ，ｃｂｆａ１，ｃｂｆａ２，ｃｂｆａ２ｔ１，ｃｂｆａ３，ｃｂｆｂ，ｃｂｇ，ｃｂ１，ｃｂｌ２，ｃｂｌｎ２，ｃｂｐ，ｃｂｐ，ｃｂｐ２，ｃｂｐ６８，ｃｂｒ１，ｃｂｓ，ｃｂｔ，ｃｂｔ１，ｃｃ１０，ｃｃａ，ｃｃａ１，ｃｃａ１１，ｃｃａ１２，ｃｃｂ１１，ｃｃｃｋｒ５，ｃｃｇ１，ｃｃｇ２，ｃｃｈｌ１ａ１，ｃｃｈｌ１ａ２，ｃｃｈｌ１ａ３，ｃｃｈ１ｂ１，ｃｃｋ，ｃｃｋａｒ，ｃｃｋｂｒ，ｃｃ１，ｃｃｍ１，ｃｃｍ２，ｃｃｍ３，ｃｃｎ１，ｃｃｎａ，ｃｃｎｂ１，ｃｃｎｃ，ｃｃｎｄ１，ｃｃｎｄ２，ｃｃｎｄ３，ｃｃｎｅ，ｃｃｎｆ，ｃｃｎｇ１，ｃｃｎｈ，ｃｃｎｔ，ｃｃｎｔ１，ｃｃｏ，ｃｃｒ１０，ｃｃｒ２，ｃｃｒ３，ｃｃｒ９，ｃｃｓｐ，ｃｃｔ，ｃｃｖ，ｃｃｚｓ，ｃｄ，ｃｄ１０，ｃｄ１１ａ，ｃｄ１１ｂ，ｃｄ１１ｃ，ｃｄ１３，ｃｄ１３７，ｃｄ１４，ｃｄ１５，ｃｄ１５１，ｃｄ１５６，ｃｄ１６，ｃｄ１６４，ｃｄ１８，ｃｄ１９，ｃｄ１ａ，ｃｄ１ｂ，ｃｄ１ｃ，ｃｄ１ｄ，ｃｄ１ｅ，ｃｄ２，ｃｄ２０，ｃｄ２２，ｃｄ２３，ｃｄ２４，ｃｄ２６，ｃｄ２７，ｃｄ２７１，ｃｄ２８，ｃｄ２８１ｇ，ｃｄ２８１ｇ２，ｃｄ３０，ｃｄ３２，ｃｄ３３，ｃｄ３４，ｃｄ３６，ｃｄ３６１１，ｃｄ３６１２，ｃｄ３７，ｃｄ３８，ｃｄ３９，ｃｄ３９１１，ｃｄ３ｄ，ｃｄ３ｅ，ｃｄ３ｇ，ｃｄ３ｚ，ｃｄ４，ｃｄ４０，ｃｄ４０１ｇ，ｃｄ４１ｂ，ｃｄ４３，ｃｄ４４，ｃｄ４５，ｃｄ４６，ｃｄ４７，ｃｄ４８，ｃｄ４９ｂ，ｃｄ４９ｄ，ｃｄ５，ｃｄ５３，ｃｄ５７，ｃｄ５８，ｃｄ５９，ｃｄ５１，ｃｄ６，ｃｄ６３，ｃｄ６４，ｃｄ６８，ｃｄ６９，ｃｄ７，ｃｄ７０，ｃｄ７１，ｃｄ７２，ｃｄ７４，ｃｄ７９ａ，ｃｄ７９ｂ，ｃｄ８０，ｃｄ８１���ｃｄ８２，ｃｄ８２，ｃｄ８６，ｃｄ８ａ，ｃｄ８ｂ，ｃｄ８ｂ１，ｃｄ９，ｃｄ９４，ｃｄ９５，ｃｄ９７，ｃｄ９９，ｃｄａ，ｃｄａ１，ｃｄａ３，ｃｄａｎ１，ｃｄａｎ２，ｃｄａｎ３，ｃｄｂ２，ｃｄｃ２，ｃｄｃ２０，ｃｄｃ２５ａ，ｃｄｃ２５ｂ，ｃｄｃ２５ｃ，ｃｄｃ２７，ｃｄｃ２１１，ｃｄｃ２１２，ｃｄｃ２１４，ｃｄｃ３４，ｃｄｃ４２，ｃｄｃ５１，ｃｄｃ７，ｃｄｃ７１１，ｃｄｃｄ１，ｃｄｃｄ２，ｃｄｃｄ３，ｃｄｃ１１，ｃｄｃｒｅ１，ｃｄｇ１，ｃｄｇｄ１，ｃｄｇｇ１，ｃｄｇｓ２，ｃｄｈ１，ｃｄｈ１１，ｃｄｈ１２，ｃｄｈ１３，ｃｄｈ１４，ｃｄｈ１５，ｃｄｈ１６，ｃｄｈ１６，ｃｄｈ１７，ｃｄ２，ｃｄｈ３，ｃｄｈ３，ｃｄｈ５，ｃｄｈ７，ｃｄｈ８，ｃｄｈｂ，ｃｄｈｈ，ｃｄｈｐ，ｃｄｈｓ，ｃｄｋ２，ｃｄｋ３，ｃｄｋ４，ｃｄｋ５，ｃｄｋ７，ｃｄｋ８，ｃｄｋ９，ｃｄｋｎ１，ｃｄｋｎ１ａ，ｃｄｋｎ１ｂ，ｃｄｋｎ１ｃ，ｃｄｋｎ２ａ，ｃｄｋｎ２ｂ，ｃｄｋｎ２ｄ，ｃｄｋｎ３，ｃｄｋｎ４，ｃｄｌ１，ｃｄｍ，ｃｄｍｐ１，ｃｄｍｔ，ｃｄｐｘ１，ｃｄｐｘ２，ｃｄｐｘｒ，ｃｄｒ１，ｃｄｒ２，ｃｄｒ３，ｃｄｒ６２ａ，ｃｄｓｎ，ｃｄｓｐ，ｃｄｔｂ，ｃｄｗ５０，ｃｄｘ１，ｃｄｘ２，ｃｄｘ３，ｃｄｘ４，ｃｅａ，ｃｅｂｐ，ｃｅｂｐａ，ｃｅｂｐｂ，ｃｅｂｐｄ，ｃｅｂｐｅ，ｃｅｃｒ，ｃｅ１，ｃｅｌ１，ｃｅｎ１，ｃｅｎｐａ，ｃｅｎｐｂ，ｃｅｎｐｃ，ｃｅｎｐｃ１，ｃｅｎｐｅ，ｃｅｎｐｆ，ｃｅｒｄ４，ｃｅｓ，ｃｅｓ１，ｃｅｔｎ１，ｃｅｔｐ，ｃｆ，ｃｆ２ｒ，ｃｆａｇ，ｃｆａｇ，ｃｆｃ，ｃｆｄ１，ｃｆｅｏｍ１，ｃｆｅｏｍ２，ｃｆｈ，ｃｆｌ１，ｃｆｌ２，ｃｆｎｄ，ｃｆｎｓ，ｃｆｔｒ，ｃｇ１，ｃｇａ，ｃｇａｔ，ｃｇｂ，ｃｇｄ，ｃｇｆ１，ｃｇｈ，ｃｇｒｐ，ｃｇｓ２３，ｃｇｔ，ｃｇｔｈｂａ，ｃｈａｃ，ｃｈａｔ，ｃｈｃ１，ｃｈｄ１，ｃｈｄ２，ｃｈｄ３，ｃｈｄ４，ｃｈｄ５，ｃｈｄｒ，ｃｈｅ１，ｃｈｅ２，ｃｈｅｄ，ｃｈｅｋ１，ｃｈｇａ，ｃｈｇｂ，ｃｈｇｃ，ｃｈｈ，ｃｈｉ３１１，ｃｈｉｐ２８，ｃｈｉｔ，ｃｈｋ１，ｃｈｌｒ１，ｃｈｌｒ２，ｃｈｍ，ｃｈｍ１，ｃｈｎ，ｃｈｎ１，ｃｈｎ２，ｃｈｏｐ１０，ｃｈｒ，ｃｈｒ３９ａ，ｃｈｒ３９ｂ，ｃｈｒ３９ｃ，ｃｈｒｍ１，ｃｈｒｍ２，ｃｈｒｍ３，ｃｈｒｍ４，ｃｈｒｍ５，ｃｈｒｎａ１，ｃｈｒｎａ２，ｃｈｒｎａ３，ｃｈｒｎａ４，ｃｈｒｎａ５，ｃｈｒｎａ７，ｃｈｒｎｂ１，ｃｈｒｎｂ２，ｃｈｒｎｂ３，ｃｈｒｎｂ４，ｃｈｒｎｄ，ｃｈｒｎｅ，ｃｈｒｎｇ，ｃｈｒｓ，ｃｈｓ１，ｃｈｘ１０，ｃｉｉｐｘ，ｃｉｐ１，ｃｉｒｂｐ，ｃｉｓｈ，ｃｋ２ａ１，ｃｋａｐ１，ｃｋｂ，ｃｋｂｂ，ｃｋｂｅ，ｃｋｍ，ｃｋｍｍ，ｃｋｍｔ１，ｃｋｍｔ２，ｃｋｎ１，ｃｋｎ２，ｃｋｒ３，ｃｋｒ１１，ｃｋｒ１３，ｃ１，ｃｌ１００，ｃｌａ１，ｃｌａ１，ｃｌａｃ，ｃｌａｐｂ１，ｃｌａｐｍ１，ｃｌａｐｓ３，ｃｌｃ，ｃｌｃ７，ｃｌｃｋ２，ｃｌｃｎ１，ｃｌｃｎ２，ｃｌｃｎ３，ｃｌｃｎ４，ｃｌｃｎ５，ｃｌｃｎ６，ｃｌｃｎ７，ｃｌｃｎｋａ，ｃｌｃｎｋｂ，ｃｌｄ，ｃｌｄｎ３，ｃｌｄｎ５，ｃｌｇ，ｃｌｇ１，ｃｌｇ３，ｃｌｇ４ａ，ｃｌｇ４ｂ，ｃｌｉ，ｃｌｉｍ１，ｃｌｉｍ２，ｃｌｋ２，ｃｌｋ３，ｃｌｎ１���ｃｌｎ２，ｃｌｎ３，ｃｌｎ５，ｃｌｎ６，ｃｌｎ８０，ｃｌｎｓ１ａ，ｃｌｎｓ１ｂ，ｃｌｐ，ｃｌｐｐ，ｃｌｐｓ，ｃｌｔａ，ｃｌｔｂ，ｃｌｔｃ，ｃｌｔｃ１１，ｃｌｔｄ，ｃｌｔｈ，ｃｌｕ，ｃｍａ１，ｃｍａｈ，ｃｍａｒ，ｃｍｄ１，ｃｍｄ１ａ，ｃｍｄ１ｂ，ｃｍｄ１ｃ，ｃｍｄ１ｄ，ｃｍｄ１ｅ，ｃｍｄ１ｆ，ｃｍｄ３ａ，ｃｍｄｊ，ｃｍｈ１，ｃｍｈ２，ｃｍｈ３，ｃｍｈ４，ｃｍｈ６，ｃｍｋｂｒ１，ｃｍｋｂｒ２，ｃｍｋｂｒ３，ｃｍｋｂｒ５，ｃｍｋｂｒ６，ｃｍｋｂｒ７，ｃｍｋｂｒ８，ｃｍｋｂｒ９，ｃｍｋｂｒ１２，ｃｍｋｌｒ１，ｃｍｋｒ１１，ｃｍｋｒ１２，ｃｍｌ，ｃｍｍ，ｃｍｍ２，ｃｍｏａｔ，ｃｍｐ，ｃｍｐｄ１，ｃｍｐｄ２，ｃｍｐｄ２，ｃｍｐｄ３，ｃｍｐｘ１，ｃｍｔ１ａ，ｃｍｔ１ｂ，ｃｍｔ２ａ，ｃｍｔ２ｂ，ｃｍｔ２ｄ，ｃｍｔ２ｄ，ｃｍｔ４ａ，ｃｍｔ４ｂ，ｃｍｔｎｄ，ｃｍｔｘ１，ｃｍｔｘ２，ｃｎａ１，ｃｎａ２，ｃｎｂｐ１，ｃｎｃ，ｃｎｃｇ１，ｃｎｃｇ２，ｃｎｃｇ３１，ｃｎｄ，ｃｎｇ３，ｃｎｇａ１，ｃｎｇａ３，ｃｎｇｂ１，ｃｎｎ１，ｃｎｎ２，ｃｎｎ３，ｃｎｐ，ｃｎｒ１，ｃｎｓｎ，ｃｎｔｆ，ｃｎｔｆｒ，ｃｎｔｎ１，ｃｏ，ｃｏｃａ１，ｃｏｃａ２，ｃｏｃｈ，ｃｏｄ１，ｃｏｄ２，ｃｏｈ１，ｃｏｉｌ，ｃｏｌ１０ａ１，ｃｏｌ１１ａ１，ｃｏｌ１１ａ２，ｃｏｌ１２ａ１１，ｃｏｌ１３ａ１，ｃｏｌ１５ａ１，ｃｏｌ１６ａ１，ｃｏｌ１７ａ１，ｃｏｌ１８ａ１，ｃｏｌ１９ａ１，ｃｏｌ１ａ１，ｃｏｌ１ａ２，ｃｏｌ１ａｒ，ｃｏｌ２ａ１，ｃｏｌ３ａ１，ｃｏｌ４ａ１，ｃｏｌ４ａ２，ｃｏｌ４ａ３，ｃｏｌ４ａ４，ｃｏｌ４ａ５，ｃｏｌ４ａ６，ｃｏｌ５ａ１，ｃｏｌ５ａ２，ｃｏｌ６ａ１，ｃｏｌ６ａ２，ｃｏｌ６ａ３，ｃｏｌ７ａ１，ｃｏｌ８ａ１，ｃｏｌ８ａ２，ｃｏｌ９ａ１，ｃｏｌ９ａ１，ｃｏｌ９ａ２，ｃｏｌ９ａ３，ｃｏｌｑ，ｃｏｍｐ，ｃｏｍｔ，ｃｏｐｅｂ，ｃｏｐｔ１，ｃｏｐｔ２，ｃｏｒｄ１，ｃｏｒｄ２，ｃｏｒｄ５，ｃｏｒｄ６，ｃｏｒｔ，ｃｏｔ，ｃｏｘ１０，ｃｏｘ４，ｃｏｘ５ｂ，ｃｏｘ６ａ１，ｃｏｘ６ｂ，ｃｏｘ７ａ１，ｃｏｘ７ａ２，ｃｏｘ７ａ３，ｃｏｘ７ａｍ，ｃｏｘ８，ｃｐ，ｃｐ１０７，ｃｐ１１５，ｃｐ２０，ｃｐ４７，ｃｐ４９，ｃｐａ１，ｃｐａ３，ｃｐｂ２，ｃｐｂ２，ｃｐｄ，ｃｐｅ，ｃｐｅｔｒ２，ｃｐｍ，ｃｐｎ，ｃｐｎ１，ｃｐｎ２，ｃｐｏ，ｃｐｐ，ｃｐｐ３２，ｃｐｐ３２，ｃｐｐｉ，ｃｐｓ１，ｃｐｓｂ，ｃｐｓｄ，ｃｐｔ１ａ，ｃｐｔ１ｂ，ｃｐｔ２，ｃｐｕ，ｃｐｘ，ｃｐｘ，ｃｐｘｄ，ｃｒ１，ｃｒ２，ｃｒ３ａ，ｃｒａｂｐ１，ｃｒａｂｐ２，ｃｒａｐｂ，ｃｒａｒｆ，ｃｒａｔ，ｃｒｂｐ１，ｃｒｂｐ２，ｃｒｄ，ｃｒｄ１，ｃｒｅｂ１，ｃｒｅｂ２，ｃｒｅｂｂｐ，ｃｒｅｂ１１，ｃｒｅｍ，ｃｒｆｂ４，ｃｒｆｒ２，ｃｒｈ，ｃｒｈｂｐ，ｃｒｈｒ，ｃｒｈｒ１，ｃｒｈｒ２，ｃｒｉｐ，ｃｒｋ，ｃｒｋ１，ｃｒｍ１，ｃｒｍｐ１，ｃｒｍｐ２，ｃｒｐ，ｃｒｐ１，ｃｒｓ，ｃｒｓ１ｃ，ｃｒｓ２，ｃｒｓ３，ｃｒｓａ，ｃｒｔ，ｃｒｔｌ１，ｃｒｔｍ，ｃｒｘ，ｃｒｙ１，ｃｒｙ２，ｃｒｙａ１，ｃｒｙａ２，ｃｒｙａａ，ｃｒｙａｂ，ｃｒｙｂ１，ｃｒｙｂ２，ｃｒｙｂ３，ｃｒｙｂａ１，ｃｒｙｂａ２，ｃｒｙｂａ４，ｃｒｙｂｂ１���ｃｒｙｂｂ２，ｃｒｙｂｂ３，ｃｒｙｇ１，ｃｒｙｇ２，ｃｒｙｇ３，ｃｒｙｇ４，ｃｒｙｇ８，ｃｒｙｇ＠，ｃｒｙｇａ，ｃｒｙｇｂ，ｃｒｙｇｃ，ｃｒｙｇｄ，ｃｒｙｇｓ，ｃｒｙｍ，ｃｒｙｚ，ｃｓ，ｃｓａ，ｃｓｂ，ｃｓｂｐ１，ｃｓｃｉ，ｃｓｄ，ｃｓｄ２，ｃｓｄａ，ｃｓｅ，ｃｓｅ１１，ｃｓｆ１，ｃｓｆ１ｒ，ｃｓｆ２，ｃｓｆ２ｒａ，ｃｓｆ２ｒｂ，ｃｓｆ２ｒｙ，ｃｓｆ３，ｃｓｆ３ｒ，ｃｓｈ１，ｃｓｈ２，ｃｓｋ，ｃｓｍｆ，ｃｓｎ１，ｃｓｎ１０，ｃｓｎ２，ｃｓｎ３，ｃｓｎｂ１，ｃｓｎｂ２，ｃｓｎｂ３，ｃｓｎｋ１ａ１，ｃｓｎｋ１ｄ，ｃｓｎｋ１ｅ，ｃｓｎｋ１ｇ２，ｃｓｎｋ２ａ１，ｃｓｎｋ２ａ２，ｃｓｎｋ２ｂ，ｃｓｎｕ３，ｃｓｏ，ｃｓｐｂ，ｃｓｐｇ１，ｃｓｐｇ２，ｃｓｐｇ３，ｃｓｒ，ｃｓｒｂ，ｃｓｒｐ，ｃｓｒｐ１，ｃｓｒｐ２，ｃｓｔ１，ｃｓｔ１，ｃｓｔ２，ｃｓｔ３，ｃｓｔ４，ｃｓｔ４，ｃｓｔ５，ｃｓｔ６，ｃｓｔａ，ｃｓｔｂ，ｃｓｘ，ｃｔ２，ｃｔａａ１，ｃｔａａ２，ｃｔａｇ，ｃｔｂ，ｃｔｂｐ１，ｃｔｂｐ２，ｃｔｇｆ，ｃｔｈ，ｃｔｈｍ，ｃｔｋ，ｃｔｌａ１，ｃｔｌａ３，ｃｔｌａ４，ｃｔｌａ８，ｃｔｍ，ｃｔｎｎａ１，ｃｔｎｎａ２，ｃｔｎｎｂ１，ｃｔｎｎｄ，ｃｔｎｎｄ１，ｃｔｎｒ，ｃｔｎｓ，ｃｔｐ，ｃｔｐｃｔ，ｃｔｐｓ，ｃｔｒ１，ｃｔｒ２，ｃｔｒｂ１，ｃｔｒ１，ｃｔｓａ，ｃｔｓｂ，ｃｔｓｃ，ｃｔｓｄ，ｃｔｓｅ，ｃｔｓｇ，ｃｔｓｇ１２，ｃｔｓｈ，ｃｔｓｋ，ｃｔｓ１，ｃｔｓｓ，ｃｔｓｗ，ｃｔｓｚ，ｃｔｘ，ｃｕｂｎ，ｃｕｌ３，ｃｕｌ４ｂ，ｃｕｌ５，ｃｕｔｌ１，ｃｖａｐ，ｃｖｄ１，ｃｖｌ，ｃｘ２６，ｃｘ３１，ｃｘ３２，ｃｘ３７，ｃｘ４０，ｃｘ４３，ｃｘ４６，ｃｘ５０，ｃｘｂ３ｓ，ｃｘｃｒ４，ｃｘｏｒｆ４，ｃｙｂ５，ｃｙｂ５６１，ｃｙｂａ，ｃｙｂｂ，ｃｙｃ１，ｃｙｋ４，ｃｙｌｄ１，ｃｙｍｐ，ｃｙｐ１，ｃｙｐ１１ａ，ｃｙｐ１１ｂ１，ｃｙｐ１１ｂ２，ｃｙｐ１７，ｃｙｐ１９，ｃｙｐ１ａ１，ｃｙｐ１ａ２，ｃｙｐ１ｂ１，ｃｙｐ２１，ｃｙｐ２４，ｃｙｐ２７，ｃｙｐ２７ａ１，ｃｙｐ２７ｂ１，ｃｙｐ２ａ，ｃｙｐ２ａ３，ｃｙｐ２ａ６，ｃｙｐ２ｂ，ｃｙｐ２ｃ，ｃｙｐ２ｃ１９，ｃｙｐ２ｃ９，ｃｙｐ２ｄ，ｃｙｐ２ｄ＠，ｃｙｐ２ｅ，ｃｙｐ２ｅ１，ｃｙｐ２ｆ１，ｃｙｐ２ｊ２，ｃｙｐ３ａ４，ｃｙｐ４ａ１１，ｃｙｐ４ｂ１，ｃｙｐ５１，ｃｙｐ７，ｃｙｐ７ａ１，ｃｙｒ６１，ｃｙｒｎ１，ｃｙｒｎ２，
ｃｚｐ３，ｄ１０ｓ１０５ｅ，ｄ１０ｓ１７０，ｄ１０ｓ１７０，ｄ１１ｓ３０２ｅ，ｄ１１ｓ６３６，ｄ１１ｓ８１３ｅ，ｄ１１ｓ８３３ｅ，ｄ１２ｓ２４８９ｅ，ｄ１２ｓ５３ｅ，ｄ１３ｓ１０５６ｅ，ｄ１３ｓ２５，ｄ１４ｓ４６ｅ，ｄ１５ｓ１２，ｄ１５ｓ２２６ｅ，ｄ１５ｓ２２７ｅ，ｄ１６ｓ２５３１ｅ，ｄ１６ｓ４６９ｅ，ｄ１７ｓ１３６ｅ，ｄ１７ｓ８１１ｅ，ｄ１８ｓ８９２ｅ，ｄ１９ｓ２０４，ｄ１９ｓ３８１ｅ，ｄ１ｓ１１１，ｄ１ｓ１５５ｅ，ｄ１ｓ１６６ｅ，ｄ１ｓ１７３３ｅ，ｄ１ｓ２２２３ｅ，ｄ１ｓ６１，ｄ２ｈ，ｄ２ｓ２０１ｅ，ｄ２ｓ４４８，ｄ２ｓ４８８ｅ，ｄ２ｓ６９ｅ，ｄ３ｓ１２３１ｅ，ｄ３ｓ１３１９ｅ，ｄ３ｓ４８ｅ，ｄ４，ｄ４ｓ９０，ｄ５ｓ１７０８，ｄ５ｓ３４６，ｄ６，ｄ６ｓ１１０１，ｄ６ｓ２０７ｅ，ｄ６ｓ２２４５ｅ，ｄ６ｓ２２８ｅ，ｄ６ｓ２２９ｅ，ｄ６ｓ２３０ｅ，ｄ６ｓ２３１ｅ，ｄ６ｓ５１ｅ，ｄ６ｓ５２ｅ，ｄ６ｓ５４ｅ，ｄ６ｓ８１ｅ，ｄ６ｓ８２ｅ，ｄ７ｓ４３７，ｄ８ｓ２２９８ｅ，ｄ９ｓ４６ｅ，ｄａ１，ｄａ２ｂ，ｄａｂ２，ｄａｃ，ｄａｄ１，ｄａｆ，ｄａｇ，ｄａｇ１，ｄａｇ２，ｄａｇｋ１，ｄａｇｋ４，ｄａｍ１０，ｄａｍ６，ｄａｍｏｘ，ｄａｎ，ｄａｏ，ｄａｐ，ｄａｐ３，ｄａｐ５，ｄａｐｋ１，ｄａｒ，ｄａｔ１，ｄａｘ１，ｄａｘｘ，ｄａｚ，ｄａｚｈ，ｄａｚ１，ｄｂａ，ｄｂｃｃｒ１，ｄｂｃｎ，ｄｂｈ，ｄｂｉ，ｄｂｉ，ｄｂ１，ｄｂｍ，ｄｂｎ１，ｄｂｐ，ｄｂｐ，ｄｂｐ１，ｄｂｐ２，ｄｂｐａ，ｄｂｔ，ｄｂｘ，ｄｂｙ，ｄｃｃ，ｄｃｅ，ｄｃｉ，ｄｃｋ，ｄｃｎ，ｄｃｏｈ，ｄｃｐ１，ｄｃｒ，ｄｃｒ３，ｄｃｔ，ｄｃｔｎ１，ｄｃｘ，ｄｄｂ１，ｄｄｂ２，ｄｄｃ，ｄｄｈ１，ｄｄｈ２，ｄｄｉｔ１，ｄｄｉｔ３，ｄｄｏｓｔ，ｄｄｐ，ｄｄｐａｃ，ｄｄｒ，ｄｄｘ１，ｄｄｘ１０，ｄｄｘ１１，ｄｄｘ１２，ｄｄｘ１５，ｄｄｘ１６，ｄｄｘ２ａ，ｄｄｘ３，ｄｄｘ５，ｄｄｘ６，ｄｄｘ９，ｄｅｃ，ｄｅｃｒ，ｄｅｆ１，ｄｅｆ４，ｄｅｆ５，ｄｅｆ６，ｄｅｆａ１，ｄｅｆａ４，ｄｅｆａ５，ｄｅｆａ６，ｄｅｆｂ１，ｄｅｆｂ２，ｄｅｋ，ｄｅｎｎ，ｄｅｎｔｓ，ｄｅｐ１，ｄｅｒ１２，ｄｅｓ，ｄｆｆ１，ｄｆｆａ，ｄｆｆｒｘ，ｄｆｆｒｙ，ｄｆｎ１，ｄｆｎ２，ｄｆｎ３，ｄｆｎ４，ｄｆｎ６，ｄｆｎａ１，ｄｆｎａ１０，ｄｆｎａ１１，ｄｆｎａ１２，ｄｆｎａ１３，ｄｆｎａ２，ｄｆｎａ２，ｄｆｎａ４，ｄｆｎａ５，ｄｆｎａ６，ｄｆｎａ７，ｄｆｎａ８，ｄｆｎａ９，ｄｆｎｂ１，ｄｆｎｂ１２，ｄｆｎｂ１３，ｄｆｎｂ１４，ｄｆｎｂ１６，ｄｆｎｂ１７，ｄｆｎｂ１８，ｄｆｎｂ２，ｄｆｎｂ３，ｄｆｎｂ４，ｄｆｎｂ５，ｄｆｎｂ６，ｄｆｎｂ７，ｄｆｎｂ８，ｄｆｎｂ９，ｄｇｃｒ，ｄｇｃｒ２，ｄｇｃｒ２，ｄｇｃｒ６，ｄｇｉ１，ｄｇｋａ，ｄｇｋｑ，ｄｇｐｔ，ｄｇｐｔ，ｄｇｓ，ｄｇｓ２，ｄｇｓｉ，ｄｇｕ，ｄｈｃ２，ｄｈｃｒ７，ｄｈｆｒ，ｄｈｌａｇ，ｄｈｐ，ｄｈｐｒ，ｄｈｐｓ，ｄｈｒｄ，ｄｈｔｒ，ｄｉ，ｄｉ１，ｄｉａ，ｄｉａ１，ｄｉａ２，ｄｉａ４，ｄｉａｐｈ１，ｄｉａｐｈ２，ｄｉｆ２，ｄｉｆｆ６，ｄｉｐｉ，ｄｉｒ，ｄｋｃ，ｄｋｃ１，ｄｌｃ１，ｄｌｄ，ｄｌｇ１，ｄｌｇ２，ｄｌｇ３，ｄｌｇ４，ｄｌｓｔ，ｄｌｘ１，ｄｌｘ２，ｄｌｘ２，ｄｌ３，ｄｌｘ４，ｄｌｘ５，ｄｌｘ６，ｄｌｘ７，ｄｌｘ８，ｄｍ，ｄｍ２，ｄｍａｈｐ，ｄｍｂｔ１，ｄｍｄ，ｄｍｄａ１，ｄｍｄ１，ｄｍｈ，ｄｍｋ，ｄｍｐ１，ｄｍｐｋ，ｄｍｓｆｈ，ｄｍｔ，ｄｍｔ１，ｄｍｔｎ，ｄｎａ２１，ｄｎａｈ，ｄｎａｈ１，ｄｎａｈ１１，ｄｎａｈ１２，ｄｎａｈ２，ｄｎａｈｃ１，ｄｎａｈｃ１１，ｄｎａｈｃ２，ｄｎａｈｃ３，ｄｎａｓｅ１，ｄｎａｓｅ１１１，ｄｎａｓｅ１１３，ｄｎａｓｅ２，ｄｎｃｈ２，ｄｎｃ１，ｄｎｃｍ，ｄｎｅｃ１，ｄｎｅ１１，ｄｎ１，ｄｎ１１，ｄｎ１１１，ｄｎｍ１，ｄｎｍｔ１，ｄｎｍｔ２，ｄｎｐｋ１，ｄｎｓ，ｄｎｔｔ，ｄｏ，ｄｏｃ１，ｄｏｃ２，ｄｏｃｋ１，ｄｏｃｋ１８０，ｄｏｄ，ｄｏｋ１，ｄｏｍ，ｄｐ１，ｄｐ１，ｄｐ２，ｄｐ３，ｄｐａｇｔ２，ｄｐｃ４，ｄｐｄ，ｄｐｄｅ１，ｄｐｄｅ２，ｄｐｄｅ３，ｄｐｄｅ４，ｄｐｅｐ１，ｄｐｈ２１２，ｄｐｐ，ｄｐｐ４，ｄｐｐ６，ｄｐｔ，ｄｐｙｄ，ｄｐｙｓ，ｄｐｙｓ１１，ｄｐｙｓ１２，ｄｒ１，ｄｒ３，ｄｒ３１ｇ，ｄｒ５，ｄｒａ，ｄｒａｄ，ｄｒａｄａ，ｄｒａ１，ｄｒｄ１，ｄｒｄ１ｂ，ｄｒｄ１ｂ，ｄｒｄ１１２，ｄｒｄ２，ｄｒｄ３，ｄｒｄ４，ｄｒｄ５，ｄｒｉ１１，ｄｒｐ１，ｄｒｐ１，ｄｒｐ２，ｄｒｐ２，ｄｒｐ３，ｄｒｐ１ａ，ｄｒｔ，ｄｓｃ１，ｄｓｃ２，ｄｓｃ３，ｄｓｃ３，ｄｓｃ４，ｄｓｃａｍ，ｄｓｃｒ，ｄｓｇ１，ｄｓｇ２，ｄｓｇ３，ｄｓｐ，ｄｓｐｇ３，ｄｓｐｐ，ｄｓｓ，ｄｓｓ１，ｄｔｄ，ｄｔｄｐ２，ｄｔｄｓｔ，ｄｔｎａ，ｄｔｒ，ｄｔｓ，ｄｕｓ，ｄｕｓｐ１，ｄｕｓｐ１１，ｄｕｓｐ２，ｄｕｓｐ３，ｄｕｓｐ４，ｄｕｓｐ５，ｄｕｓｐ６，ｄｕｓｐ７，ｄｕｓｐ８，ｄｕｔ，ｄｖ１，ｄｖ１１，ｄｖ１１，ｄｖ１３，ｄｘｆ６８ｓ１ｅ，ｄｘｓ１２７２ｅ，ｄｘｓ１２８，ｄｘｓ１２８３ｅ，ｄｘｓ４２３ｅ，ｄｘｓ４３５ｅ，ｄｘｓ５２２ｅ，ｄｘｓ６４８，ｄｘｓ７０７，ｄｘｓ８２３７ｅ，ｄｘｙｓ１５５ｅ，ｄｙｌｘ２，ｄｙｒｋ，ｄｙｓ，ｄｙｓｆ，ｄｙｔ１，ｄｙｔ３，ｄｙｔ５，ｄｙｔ６，ｄｙｔ７，ｄｙｔ８，ｄｙｔ９，ｄｙｘ１，ｄｙｘ２，ｅ１１ｓ，ｅ１４，ｅ１ｂ，ｅ２ａ，ｅ２ｆ１，ｅ２ｆ２，ｅ２ｆ３，ｅ２ｆ４，ｅ３，ｅ４ｆ，ｅ４ｆ１，ｅ４ｔｆ１ａ，ｅ４ｔｆ１ｂ，ｅａ１，ｅａａｃ１，ｅａａｔ１，ｅａａｔ２，ｅａｃ，ｅａｄ，ｅａｇ，ｅａｐ，ｅａｒｌ，ｅａｒ２，ｅａｒ３，ｅｂａｆ，ｅｂｆ，ｅｂｉ１，ｅｂｍ，ｅｂｎ１，ｅｂｎ１，ｅｂｎ２，ｅｂｒ２ａ，ｅｂｓ１，ｅｂｖｍ１，ｅｂｖｓ１，ｅｃ１，ｅｃａ１，ｅｃｂ２，ｅｃｅ１，ｅｃｇｆ１，ｅｃｈ１，ｅｃｈｓ１，ｅｃｋ，ｅｃｍ１，ｅｃｐ，ｅｃｓ１，ｅｃｔ２，ｅｄ１，ｅｄ２，ｅｄ３，ｅｄ４，ｅｄａ，ｅｄａ３，ｅｄｄｒ１，ｅｄｇ３，ｅｄｇ６，ｅｄｈ，ｅｄｈ１７ｂ２，ｅｄｈ１７ｂ２，ｅｄｈ１７ｂ３，ｅｄｍ１，ｅｄｍ２，ｅｄｍ３，ｅｄｍｄ，ｅｄｍｄ２，ｅｄｎ，ｅｄｎ１，ｅｄｎ２，ｅｄｎ３，ｅｄｎｒａ，ｅｄｎｒｂ，ｅｅｃ１，ｅｅｃ２，ｅｅｆ１ａ１，ｅｅｆ１ａ２，ｅｅｆ１ｂ１，ｅｅｆ１ｂ２，ｅｅｆ１ｂ３，ｅｅｆ１ｂ４，ｅｅｆ２，ｅｅｇ１，ｅｅｇｖ１，ｅｅｋ，ｅｅｎ，ｅｆ１ａ，ｅｆ２，ｅｆｅ２，ｅｆｅｍｐ１，ｅｆｌ６，ｅｆｍｒ，ｅｆｎａ１，ｅｆｎａ３，ｅｆｎａ４，ｅｆｎｂ１，ｅｆｎｂ２，ｅｆｎｂ３，ｅｆｐ，ｅｆｔｕ，ｅｇｆ，ｅｇｆｒ，ｅｇｉ，ｅｇｒ１，ｅｇｒ２，ｅｇｒ３，ｅｇｒ４，ｅｈｈａｄｈ，ｅｈｏｃ１，ｅｉ，ｅｉｆ１ａ，ｅｉｆ２ｇ  Ａ，ｅｉｆ２ｓ３  Ａ，ｅｉｆ３ｓ１０，ｅｉｆ３ｓ６，ｅｉｆ４ａ１，ｅｉｆ４ａ２，ｅｉｆ４ｃ，ｅｉｆ４ｅ，ｅｉｆ４ｅｂｐ１，ｅｉｆ４ｅ２，ｅｉｆ４ｅ１１，ｅｉｆ４ｅ１２，ｅｉｆ４ｇ，ｅｉｆ４ｇ１，ｅｉｆ４ｇ２，ｅｉｆ５ａ，ｅｊｍ１，ｅｌ１，ｅｌａ１，ｅｌａ２，ｅｌａｍ１，ｅｌａｎｈ２，ｅｌａｖ１１，ｅｌａｖ１２，ｅｌａｖ１４，ｅｌｃ，ｅｌｅ１，ｅｌｆ３，ｅｌｋ１，ｅｌｋ２，ｅｌｋ３，ｅｌｋ４，ｅｌ１，ｅｌｎ，ｅｍ９，ｅｍａｐ，ｅｍａｐ１，ｅｍｄ，ｅｍｄ２，ｅｍｋ  １，ｅｍｐ１，ｅｍｐ５５，ｅｍｒ１，ｅｍｓ１，ｅｍｔ，ｅｍｔｂ，ｅｍｘ１，ｅｍｘ２，ｅｎ１，ｅｎ２，ｅｎａ７８，ｅｎｄ，ｅｎｄｏｇ，ｅｎｆｌ２，ｅｎｇ，ｅｎ１，ｅｎｏ１，ｅｎｏ２，ｅｎｏ３，ｅｎｐｅｐ，ｅｎｔ１，ｅｎｔｋ，ｅｎｕｒ１，ｅｎｕｒ２，ｅｎｘ２，ｅｏｓ，ｅｐ３，ｅｐ３００，ｅｐａ，ｅｐｂ３，ｅｐｂ３１１，ｅｐｂ４１，ｅｐｂ４１１２，ｅｐｂ４２，ｅｐｂ４９，ｅｐｂ７２，ｅｐｈａ１，ｅｐｈａ２，ｅｐｈａ３，ｅｐｈａ８，ｅｐｈｂ１，ｅｐｈｂ２，ｅｐｈｂ３，ｅｐｈｂ４，ｅｐｈｂ６，ｅｐｈｔ１，ｅｐｈｔ２，ｅｐｈｔ３，ｅｐｈｘ１，ｅｐｈｘ２，ｅｐｉｍ，ｅｐｌｇ１，ｅｐｌｇ２，ｅｐｌｇ３，ｅｐｌｇ４，ｅｐｌｇ５，ｅｐｌｇ８，ｅｐｍ１，ｅｐｍ２，ｅｐｍ２ａ，ｅｐｍｒ，ｅｐｏ，ｅｐｏｒ，ｅｐｐｋ，ｅｐｒｓ，ｅｐｓ１５，ｅｐｓ８，ｅｐｔ，ｅｒｂａ１，ｅｒｂａ２，ｅｒｂａ１２，ｅｒｂａ１３，ｅｒｂｂ２，ｅｒｂｂ３，ｅｒｂｂ４，ｅｒｃ５５，ｅｒｃｃ１，ｅｒｃｃ２，ｅｒｃｃ３，ｅｒｃｃ４，ｅｒｃｃ５，ｅｒｃｃ６，ｅｒｃｍ１，ｅｒｄａ１，ｅｒｆ１，ｅｒｇ，ｅｒｇ３，ｅｒｇｉｃ５３，ｅｒｈ，ｅｒｋ，ｅｒｋ１，ｅｒｋ２，ｅｒｋ３，ｅｒｍ，ｅｒｐ１１，ｅｒｖ１，ｅｒｖ１，ｅｒｖ３，ｅｒｖｒ，ｅｒｖｔ１ｅｒｖｔ２，ｅｒｖｔ３，ｅｒｖｔ４，ｅｒｖｔ５，ｅｒｙｆ１，ｅｓ１，ｅｓ１３０，ｅｓａ，ｅｓａ１，ｅｓａ４，ｅｓａｔ，ｅｓｂ３，ｅｓｄ，ｅｓｇ，ｅｓｒ，ｅｓｒ１，ｅｓｒ２，ｅｓｒ１１，ｅｓｒ１２，ｅｓｒｒａ，ｅｓｒｒｂ，ｅｓｒｒｇ，ｅｓｓ１，ｅｓｔ，ｅｓｔ，ｅｓｔ２，ｅｓｔ２５２６３，ｅｓｘ，ｅｔｆａ，ｅｔｆｂ，ｅｔｆｄｈ，ｅｔｋ１，ｅｔｋ２，ｅｔｍ１，ｅｔｍ２，ｅｔｏ，ｅｔｓ１，ｅｔｓ２，ｅｔｖ１，ｅｔｖ３，ｅｔｖ４，ｅｔｖ５，ｅｔｖ６，ｅｖｃ，ｅｖｃ１，ｅｖｄａ，ｅｖｄｂ，ｅｖｉ１，ｅｖｉ２，ｅｖｉ２ａ，ｅｖｉ２ｂ，ｅｖｐ１，ｅｖｒ１，ｅｖｘ１，ｅｖｘ２，ｅｗｓ，ｅｗｓｒ１，ｅｘｌｍ１，ｅｘｔ１，ｅｘｔ２，ｅｘｔ３，ｅｘｔ１１，ｅｘｔ１２，ｅｙａ１，ｅｙａ２，ｅｙａ３，ｅｙｃ１１，ｅｙｃ１３，ｅｚｈ１，ｅｚｈ１，ｅｚｈ２，ｆ１０，ｆ１１，ｆ１２，ｆ１３ａ，ｆ１３ａ１，ｆ１３ｂ，ｆ２，ｆ２ｒ，ｆ２ｒｌ２，ｆ２ｒｌ３，ｆ３，ｆ５，ｆ５ｆ８ｄ，ｆ７，ｆ７ｅ，ｆ７ｒ，ｆ８ａ，ｆ８ｂ，ｆ８ｃ，ｆ８ｖｗｆ，ｆ９，ｆａ，ｆａ１，ｆａａ，ｆａｂｐ１，ｆａｂｐ２ｆａｂｐ３，ｆａｂｐ４，ｆａｂｐ６，ｆａｃ１，ｆａｃａ，ｆａｃｃ，ｆａｃｄ，ｆａｃｅ，ｆａｃ１１，ｆａｃ１２，ｆａｃ１３，ｆａｃ１４，ｆａｃｖ１１，ｆａｄ，ｆａｄｄ，ｆａｄｋ，ｆａｈ，ｆａｋ２，ｆａｌｄｈ，ｆａｌ１３９，ｆａｌｚ，ｆａｎｃａ，ｆａｎｃｃ，ｆａｎｃｄ，ｆａｎｃｅ，ｆａｎｃｇ，ｆａｐ，ｆａｐａ，ｆａｒｒ，ｆａｓ，ｆａｓ１，ｆａｓｎ，ｆａｓｔ１，ｆａｔ，ｆａｕ，ｆｂｌｎ１，ｆｂｌｎ２，ｆｂｎ１，ｆｂｎ２，ｆｂｎ１，ｆｂｐ１，ｆｃａｒ，ｆｃｃ１，ｆｃｅ，ｆｃｅ２，ｆｃｅｒ１ａ，ｆｃｅｒ１ｂ，ｆｃｅｒ１ｇ，ｆｃｅｒ２，ｆｃｇｒ１ａ，ｆｃｇｒ１ｂ，ｆｃｇｒ１ｃ，ｆｃｇｒ２ａ，ｆｃｇｒ３ａ，ｆｃｇｒｔ，ｆｃｍｄ，ｆｃｎ１，ｆｃｎ２，ｆｃｐ，ｆｃｐ１，ｆｃｐｘ，ｆｃｔ３ａ，ｆｄｃ，ｆｄｆｔ１，ｆｄｈ，ｆｄｐｓ１１，ｆｄｐｓ１２，ｆｄｐｓ１３，ｆｄｐｓ１４，ｆｄｐｓ１５，ｆｄｘ１，ｆｄｘｒ，ｆｅ６５，ｆｅ６５１１，ｆｅａ，ｆｅｂ１，ｆｅｂ２，ｆｅｃｂ，ｆｅｃｈ，ｆｅｎ１，ｆｅｏ，ｆｅｏｍ，ｆｅｏｍ１，ｆｅｏｍ２，ｆｅｒ，ｆｅｓ，ｆｅｔ１，ｆｅｖｒ，ｆｆｍ，ｆｇａ，ｆｇａｒａｔ，ｆｇｂ，ｆｇｃ＠，ｆｇｄ１，ｆｇｄｙ，ｆｇｆ１，ｆｇｆ１０，ｆｇｆ１１，ｆｇｆ１２，ｆｇｆ１３，ｆｇｆ１４，ｆｇｆ２，ｆｇｆ２，ｆｇｆ３，ｆｇｆ４，ｆｇｆ５，ｆｇｆ６，ｆｇｆ７，ｆｇｆ８，ｆａｆ９，ｆｇｆａ，ｆｇｆｂ，ｆｇｆｒ１，ｆｇｆｒ２，ｆｇｆｒ３，ｆｇｆｒ４，ｆｇｇ，ｆｇｒ，ｆｇｓ１，ｆｈ，ｆｈ，ｆｈ３，ｆｈｃ，ｆｎｆ１，ｆｈｆ３，ｆｈｆ４，ｆｈｈ２，ｆｈｉｔ，ｆｈ１１，ｆｈ１２，ｆｈｒ２，ｆｉｃ１，ｆｉｇｆ，ｆｉｈ，ｆｉｍ，ｆｉｍ１，ｆｉｍ３，ｆｉｍｇ，ｆｋｂｐ１２，ｆｋｂｐ１ａ，ｆｋｂｐ２，ｆｋｈ２，ｆｋｈ１１，ｆｋｈ１１０，ｆｋｈ１１２，ｆｋｈ１１５，ｆｋｈ１１６，ｆｋｈ１１７，ｆｋｈ１２，ｆｋｈ１５，ｆｋｈ１６，ｆｋｈ１７，ｆｋｈ１８，ｆｋｈ１９，ｆｋｈｒ，ｆｋｈｒ１１，ｆｌｇ，ｆｌｉ１，ｆｌｉｉ，ｆｌｎ１，ｆｌｎ２，ｆｌｎａ，ｆｌｎｂ，ｆｌｎｍｓ，ｆｌｏｔ２，ｆｌｔ１，ｆｌｔ２，ｆｌｔ３，ｆｌｔ４，ｆｍｆ，ｆｍｎ，ｆｍｏ１，ｆｍｏ２，ｆｍｏ３，ｆｍｏｄ，ｆｍｒ１，ｆｍｒ２，ｆｍｓ，ｆｌ１，ｆｎ１２，ｆｎｒａ，ｆｎｒｂ，ｆｎｒｂ１，ｆｎｔａ，ｆｎｔｂ，ｆｏｌｈ，ｆｏｌｈ１，ｆｏｌｒ１，ｆｏｌｒ２，ｆｏｌｔ，ｆｏｓ，ｆｏｓｂ，ｆｏｓ１１，ｆ
ｏｓ１２，ｆｐａｈ，ｆｐｃ，ｆｐｄ１，ｆｐｄｍｍ，ｆｐｆ，ｆｐｇｓ，ｆｐ１，ｆｐｐ，ｆｐｒ１，ｆｐｒｈ１，ｆｐｒｈ２，ｆｐｒ１１，ｆｐｒ１２，ｆｐｒｐ，ｆｐｓ１２，ｆｐｓ１３，ｆｐｓ１４，ｆｐｓ１５，ｆｒ，ｆｒａｐ１，ｆｒａｘａ，ｆｒａｘｅ，ｆｒａｘｆ，ｆｒｄａ，ｆｒｅａｃ２，ｆｒｅａｃ６，ｆｒｅａｃ９，ｆｒｇ１，ｆｒｐ１，ｆｒｖ１，ｆｒｖ２，ｆｒｖ３，ｆｓｇ１，ｆｓｇｓ，ｆｓｈｂ，ｆｓｈｄ１ａ，ｆｓｈｍｄ１ａ，ｆｓｈｐｒｈ１，ｆｓｈｒ，ｆｓｓｖ，ｆｔｈ１，ｆｔｈ１６，ｆｔ１，ｆｔｚ１，ｆｔｚｆ１，ｆｕｃａ１，ｆｕｃａ２，ｆｕｒ，ｆｕｓ，ｆｕｓｅ，ｆｕｔ１，ｆｕｔ２，ｆｕｔ３，ｆｕｔ４，ｆｕｔ５，ｆｕｔ６，ｆｕｔ７，ｆｕｔ８，ｆｖｔ１，ｆｘｒ１，ｆｘｙ，ｆｙ，ｆｙｎ，ｆｚｄ１，ｆｚｄ２，ｆｚｄ３，ｆｚｄ５，ｆｚｄ６，ｆｚｄ７，ｆｚｒ，ｇ０ｓ８，ｇ１０ｐ１，ｇ１０ｐ２，ｇ１７，ｇ１７ｐ１，ｇ１９ｐ１，ｇ１ｐ１，ｇ１ｐ２，ｇ１ｐ３，ｇ２２ｐ１，ｇ６ｐｃ，ｇ６ｐｄ，ｇ６ｐｄ１，ｇ６ｐｄ１，ｇ６ｐｔ，ｇ６ｐｔ１，ｇ６ｓ，ｇ７ｐ１，ｇａ２，ｇａａ，ｇａｂａｔｒ，ｇａｂｐａ，ｇａｂｐｂ１，ｇａｂｒａ１，ｇａｂｒａ２，ｇａｂｒａ３，ｇａｂｒａ４，ｇａｂｒａ５，ｇａｂｒａ６，ｇａｂｒｂ１，ｇａｂｒｂ２，ｇａｂｒｂ３，ｇａｂｒｄ，ｇａｂｒｅ，ｇａｂｒｇ１，ｇａｂｒｇ２，ｇａｂｒｇ３，ｇａｂｒｒ１，ｇａｂｒｒ２，ｇａｄ１，ｇａｄ２，ｇａｄ３，ｇａｄｄ１５３，ｇａｄｄ４５，ｇａｋ，ｇａ１，ｇａｌｂｐ，ｇａｌｃ，ｇａｌｅ，ｇａｌｇｔ，ｇａｌｋ１，ｇａｌｋ２，ｇａｌｎ，ｇａｌｎａｃｔ，ｇａｌｎｒ，ｇａｌｎｒ１，ｇａｌｎｓ，ｇａｌｎｔ１，ｇａｌｎｔ２，ｇａｌｎｔ３，ｇａｌｒ１，ｇａｌｔ，ｇａｎ，ｇａｎ１，ｇａｎａｂ，ｇａｎｃ，ｇａｐ，ｇａｐ１ｍ，ｇａｐ４３，ｇａｐｄ，ｇａｒ２２，ｇａｒｐ，ｇａｒｓ，ｇａｒｔ，ｇａｓ，ｇａｓ１，ｇａｓ２，ｇａｓ４１，ｇａｓ６，ｇａｓ７，ｇａｓｒ，ｇａｓｔ，ｇａｔａ１，ｇａｔａ２，ｇａｔａ３，ｇａｔａ４，ｇａｔａ６，ｇａｙ１，ｇｂａ，ｇｂａｓ，ｇｂｂｂ１，ｇｂｂｂ２，ｇｂｅ１，ｇｂｐ１，ｇｂｘ２，ｇｃ，ｇｃａｐ，ｇｃａｐ２，ｇｃｄｈ，ｇｃｆ１，ｇｃｆ２，ｇｃｆｘ，ｇｃｇ，ｇｃｇｒ，ｇｃｈ１，ｇｃｋ，ｇｃｋｒ，ｇｃｎ５１１，ｇｃｎ５１２，ｇｃｎｆ，ｇｃｎｔ１，ｇｃｎｔ２，ｇｃｐ，ｇｃｐ２，ｇｃｓ，ｇｃｓ１，ｇｃｓｆ，ｇｃｓｆｒ，ｇｃｓｐ，ｇｃｔｇ，ｇｃｙ，ｇｄａ，ｇｄｅ，ｇｄｆ５，ｇｄｆ８，ｇｄｈ，ｇｄｉ１，ｇｄｉ２，ｇｄｉｄ４，ｇｄｌｄ，ｇｄｎｆ，ｇｄｎｆｒ，ｇｄｎｆｒａ，ｇｄｎｆｒｂ，ｇｄｘ，ｇｄｘｙ，ｇｅ，ｇｅｍ，ｇｅｎｅｙ，ｇｅｙ，ｇｆ１，ｇｆ１，ｇｆａｐ，ｇｆｅｒ，ｇｆｅｒ，ｇｆｉ１，ｇｆｐｔ，ｇｆｒａ１，ｇｆｒａ２，ｇｇｃｘ，ｇｇｔ１，ｇｇｔ２，ｇｇｔａ１，ｇｇｔｂ１，ｇｇｔｂ２，ｇｈ１，ｇｈ２，ｇｈｃ．ＲＴＭ．，ｇｈｄｘ，ｇｈｎ，ｇｈｒ，ｇｈｒｆ，ｇｈｒｈ，ｇｈｒｈｒ，ｇｈｓ，ｇｈｖ，ｇｉｆ，ｇｉｆｂ，ｇｉｐ，ｇｉｐ，ｇｉｐｒ，ｇｉｒｋ１，ｇｉｒｋ２，ｇｉｒｋ３，ｇｉｒｋ４，ｇｊａ１，ｇｊａ３，ｇｊａ４，ｇｊａ５，ｇｊａ８，ｇｊｂ１，ｇｊｂ２，ｇｊｂ３，ｇｋ，ｇｋ２，ｇｌａ，ｇｌａｔ，ｇｌｂ１，ｇｌｂ２，ｇｌｃ１ａ，ｇｌｃ１ｂ，ｇｌｃ１ｃ，ｇｌｃ１ｄ，ｇｌｃ１ｆ，ｇｌｃ３ａ，ｇｌｃ３ｂ，ｇｌｃ１ｃ，ｇｌｃ１ｒ，ｇｌｃｔ２，ｇｌｃｔ３，ｇｌｄｃ，ｇｌｅｐｐ１，ｇｌｇ１，ｇｌｉ，ｇｌｉ２，ｇｌｉ３，ｇｌｉ４，ｇｌｎｎ，ｇｌｎｓ，ｇｌｏ１，ｇｌｏ２，ｇｌｐ１ｒ，ｇｌｒａ１，ｇｌｒａ２，ｇｌｒａ３，ｇｌｒｂ，ｇｌｒｘ，ｇｌｓ，ｇｌｕｄ１，ｇｌｕｄ２，ｇｌｕ１，ｇｌｕｒ１，ｇｌｕｒ２，ｇｌｕｒ３，ｇｌｕｒ４，ｇｌｕｒ５，ｇｌｕｒ６，ｇｌｕｒ７，ｇｌｕｔ１，ｇｌｕｔ２，ｇｌｕｔ３，ｇｌｕｔ４，ｇｌｕｔ５，ｇｌｖｒ１，ｇｌｖｒ２，ｇｌｙ９６，ｇｌｙａ，ｇｌｙｂ，ｇｌｙｓ１，ｇｌｙｔ１，ｇｌｙｔ１，ｇｌｙｔ２，ｇｍ２ａ，ｇｍａ，ｇｍｃｓｆ，ｇｍｄｓ，ｇｍ１，ｇｍｐｒ，ｇｍｐｓ，ｇｎａ１１，ｇｎａｌ５，ｇｎａｌ６，ｇｎａｉ１，ｇｎａｉ２，ｇｎａｉ２ａ，ｇｎａｉ２ｂ，ｇｎａｉ２１，ｇｎａｉ３，ｇｎａ１，ｇｎａｏ１，ｇｎａｑ，ｇｎａｓ，ｇｎａｓ１，ｇｎａｔ１，ｇｎａｔ２，ｇｎａｚ，ｇｎｂ１，ｇｎｂ２，ｇｎｂ３，ｇｎｇ５，ｇｎ１１，ｇｎｐｔａ，ｇｎｒｈ１，ｇｎｒｈ２，ｇｎｒｈｒ，ｇｎｓ，ｇｎｔ１，ｇｏｌｇａ４，ｇｏｔ１，ｇｏｔ２，ｇｐ１３０，ｇｐ１ｂａ，ｇｐ１ｂｂ，ｇｐ２，ｇｐ２ｂ，ｇｐ３９，ｇｐ３ａ，ｇｐ７５，ｇｐ７８，ｇｐ９，ｇｐａ，ｇｐａｍ，ｇｐａｔ，ｇｐｂ，ｇｐｃ，ｇｐｃ１，ｇｐｃ３，ｇｐｃ４，ｇｐｄ，ｇｐｄ１，ｇｐｄ２，ｇｐｄｓ１，ｇｐｅ，ｇｐｉ，ｇｐｉ２，ｇｐｍ６ａ，ｇｐｍ６ｂ，ｇｐｏａ，ｇｐｒ１，ｇｐｒ１０，ｇｐｒ１１，ｇｐｒ１２，ｇｐｒ１３，ｇｐｒ１５，ｇｐｒ１７，ｇｐｒ１８，ｇｐｒ１９，ｇｐｒ２，ｇｐｒ２０，ｇｐｒ２１，ｇｐｒ２２，ｇｐｒ２３，ｇｐｒ２５，ｇｐｒ２９，ｇｐｒ３，ｇｐｒ３０，ｇｐｒ３１，ｇｐｒ３２，ｇｐｒ３５，ｇｐｒ３７，ｇｐｒ３９，ｇｐｒ４，ｇｐｒ５，ｇｐｒ６，ｇｐｒ７，ｇｐｒ８，ｇｐｒ９，ｇｐｒｃｙ４，ｇｐｒｋ２１，ｇｐｒｋ４，ｇｐｒｋ５，ｇｐｒｋ６，ｇｐｒｖ２８，ｇｐｓａ，ｇｐｓｃ，ｇｐｔ，ｇｐｘ１，ｇｐｘ２，ｇｐｘ３，ｇｐｘ４，ｇｒ２，ｇｒｂ１，ｇｒｂ１０，ｇｒｂ２，ｇｒｆ２，ｇｒｉａ１，ｇｒｉａ２，ｇｒｉａ３，ｇｒｉａ４，ｇｒｉｄ２，ｇｒｉｋ１，ｇｒｉｋ２，ｇｒｉｋ３，ｇｒｉｋ４，ｇｒｉｋ５，ｇｒｉｎ１，ｇｒｉｎ２ａ，ｇｒｉｎ２ｂ，ｇｒｉｎ２ｃ，ｇｒｉｎ２ｄ，ｇｒｉｎａ，ｇｒｋ１，ｇｒｋ５，ｇｒｋ６，ｇｒ１，ｇｒ１１１，ｇｒｍ３，ｇｒｍ８，ｇｒｍｐ，ｇｒｎ，ｇｒｏ１，ｇｒｏ２，ｇｒｏ３，ｇｒｐ，ｇｒｐ５８，ｇｒｐ７８，ｇｒｐｒ，ｇｒｘ，ｇｓ，ｇｓ１，ｇｓａｓ，ｇｓｃ，ｇｓｃ１，ｇｓｅ，ｇｓｈｓ，ｇｓ１，ｇｓｍ１，ｇｓｎ，ｇｓｐ，ｇｓｐｔ１，ｇｓｒ，ｇｓｓ，ｇｓｔ１２，ｇｓｔ１１，ｇｓｔ２，ｇｓｔ２，ｇｓｔ３，ｇｓｔ４，ｇｓｔ５，ｇｓｔａ１，ｇｓｔａ２，ｇｓｔｍ１，ｇｓｔｍ１１，ｇｓｔｍ２，ｇｓｔｍ３，ｇｓｔｍ４，ｇｓｔｍ５，ｇｓｔｐ１，ｇｓｔｔ２，ｇｔ１，ｇｔ３３５，ｇｔａ，ｇｔｂ，ｇｔｂｐ，ｇｔｄ，ｇｔｆ２ｅ２，ｇｔｆ２ｆ１，ｇｔｆ２ｈ１，ｇｔｆ２ｈ２，ｇｔｆ２ｈ４，ｇｔｆ２ｉ，ｇｔｆ２ｓ，ｇｔｆ３ａ，ｇｔｇ，ｇｕｃ１ａ２，ｇｕｃ１ａ３，ｇｕｃ１ｂ３，ｇｕｃ２ｃ，ｇｕｃ２ｄ，ｇｕｃ２ｆ，ｇｕｃａ１ａ，ｇｕｃａ１ｂ，ｇｕｃａ２，ｇｕｃａ２，ｇｕｃａ２ａ，ｇｕｃａ２ｂ，ｇｕｃｓａ３，ｇｕｃｓｂ３，ｇｕｃｙ１ａ２，ｇｕｃｙ１ａ３，ｇｕｃｙ１ｂ３，ｇｕｃｙ２ｃ，ｇｕｃｙ２ｄ，ｇｕｃｙ２ｆ，ｇｕｋ１，ｇｕｋ２，ｇｕｌｏ，ｇｕｌｏｐ，ｇｕｓｂ，ｇｕｓｍ，ｇｕｓｔ，ｇｘｐ１，ｇｙｐａ，ｇｙｐｂ，ｇｙｐｃ，ｇｙｐｅ，ｇｙｓ，ｇｙｓ１，ｇｙｓ２，ｇｚｍａ，ｇｚｍｂ，ｇｚｍｈ，ｇｚｍｍ，ｈ，ｈ１４２ｔ，ｈ１９，ｈ１ｆ０，ｈ１ｆ１，ｈ１ｆ２，ｈ１ｆ３，ｈ１ｆ４，ｈ１ｆ５，ｈ１ｆｖ，ｈ２ａ，ｈ２ａｘ，ｈ２ａｚ，ｈ２ｂ，ｈ２ｂ，ｈ３ｆ２，ｈ３ｆ３ｂ，ｈ３ｆｔ，ｈ３ｔ，ｈ４，ｈ４ｆ２，ｈ４ｆ５，ｈ４ｆａ，ｈ４ｆｂ，ｈ４ｆｅ，ｈ４ｆｇ，ｈ４ｆｈ，ｈ４ｆｉ，ｈ４ｆｊ，ｈ４ｆｋ，ｈ４ｆ１，ｈ４ｆｍ，ｈ４ｍ，ｈ６，ｈａ２，ｈａｂｐ１，ｈａｄｈａ，ｈａｄｈｂ，ｈａｄｈｓｃ，ｈａｆ，ｈａｇｈ，ｈａｈ１，ｈａｉｐ１，ｈａ１，ｈａｐ，ｈａｐ１，ｈａｐ２，ｈａｒｓ，ｈａｓ２，ｈａｔ１，ｈａｕｓｐ，ｈｂ１，ｈｂ１，ｈｂ６，ｈｂａ１，ｈｂａ２，ｈｂａｃ＠，ｈｂｂ，ｈｂｂｃ＠，ｈｂｄ，ｈｂｅ１，ｈｂｅｇｆ，ｈｂｆ２，ｈｂｇ１，ｈｂｇ２，ｈｂｇｒ，ｈｂｈｒ，ｈｂｍ，ｈｂｐ，ｈｂｑ１，ｈｂｚ，ｈｃ２，ｈｃ３，ｈｃａ，ｈｃａｔ２，ｈｃｃｓ，ｈｃｄｈ，ｈｃｆ２，ｈｃｆｃ１，ｈｃｇ，ｈｃｋ，ｈ１１，ｈｃ１２，ｈｃ１３，ｈｃｌｓ１，ｈｃｐ，ｈｃｐ１，ｈｃｓ，ｈｃｖｓ，ｈｄ，ｈｄａｃ１，ｈｄｃ，ｈｄｇｆ，ｈｄｈｃ７，ｈｄｌｂｐ，ｈｄｌｄ，ｈｄｌｄｔ１，ｈｄｒ，ｈｅｄ，ｈｅｄ，ｈｅｇｆ１，ｈｅｋ，ｈｅｋ３，ｈｅｌｎ１，ｈｅｍ１，ｈｅｍａ，ｈｅｍｂ，ｈｅｍｃ，ｈｅｍｐａｓ，ｈｅｎ１，ｈｅｎ２，ｈｅｐ，ｈｅｐ１０，ｈｅｒ２，ｈｅｒ４，ｈｅｒｇ，ｈｅｒｖ１，ｈｅｓ１，ｈｅｓｘ１，ｈｅｔ，ｈｅｘａ，ｈｅｘｂ，ｈｆ１，ｈｆ１０，ｈｆｃ１，ｈｆｅ，ｈｆｅ２，ｈｆｈ１１，ｈｆｓｐ，ｈｇｄ，ｈｇｆ，ｈｇｆ，ｈｇｆ１，ｈｇ１，ｈｈ，ｈｈ７２，ｈｈｃ１，ｈｈｃ２，ｈｈｄ，ｈｈｈ，ｈｈｍｊｇ，ｈｈｒ２３ａ，ｈｈｔ１，ｈｈｔ２，ｈｉａｐ２，ｈｉｇｍ１，ｈｉｌｄａ，ｈｉｎｔ，ｈｉｏｍｔ，ｈｉｐ，ｈｉｐ１，ｈｉｐ１１６，ｈｉｐ２，ｈｉｒ，ｈｉｒａ，ｈｉｓ１，ｈｉｓ２，ｈｉｖｅ１，ｈｉｖｅｐ１，ｈｉｖｅｐ２，ｈｊｃｄ，ｈｋ１，ｈｋ２，ｈｋ３，ｈｋ３３，ｈｋｅ４，ｈｋｅ６，ｈｋｒ１，ｈｋｒ２，ｈｋｒ３，ｈｋｒ４，ｈｌ  １１，ｈｌ１９，ｈｌａ−ａ，ｈｌａ−ｂ，ｈｌａ−ｃ，ｈｌａ−ｃｄａ１２，ｈｌａ−ｄｍａ，ｈｌａ−ｄｍｂ，ｈｌａ−ｄｎａ，ｈｌａ−ｄｏｂ，ｈｌａ−ｄｐａ１ｈｌａ−ｄｐｂ１，ｈｌａ−ｄｑａ１，ｈｌａ−ｄｒｌｂ，ｈｌａ−ｄｒａ，ｈｌａ−ｅ，ｈｌａ−ｆ，ｈｌａ−ｇ，ｈｌａ−ｈａ２，ｈｌａｄｐ，ｈｌａｆ，ｈｌａｌｓ，ｈｌｃｓ，ｈｌｍ２，ｈｌｐ，ｈｌｐ３，ｈｌｒ１，ｈｌｒ２，ｈｌｔ，ｈｌｘ１，ｈｌｘｂ９，ｈｍａａ，ｈｍａｂ，ｈｍａｔ１，ｈｍｂｓ，ｈｍｃｓ，ｈｍｇ１，ｈｍｇ１４，ｈｍｇ１７，ｈｍｇ２，ｈｍｇｃ１，ｈｍｇｃｒ，ｈｍｇｃｓ１，ｈｍｇｃｓ２，ｈｍｇｉｃ，ｈｍｇｉｙ，ｈｍｇｘ，ｈｍｍｒ，ｈｍ���２，ｈｍｏｘ１，ｈｍｏｘ２，ｈｍｒ，ｈｍｓ１，ｈｍｓｎ１，ｈｍｘ１，ｈｍｘ２，ｈｎｄ，ｈｎｆ１ａ，ｈｎｆ２，ｈｎｆ３ａ，ｈｎｆ３ｂ，ｈｎｆ４ａ，ｈｎｐ３６，ｈｎｐｃｃ６，ｈｎｒｐａ１，ｈｎｒｐａ２ｂ１，ｈｎｒｐｄ，ｈｎｒｐｆ，ｈｎｒｐｇ，ｈｎｒｐｈ１，ｈｎｒｐｈ２，ｈｎｒｐｈ３，ｈｎｒｐｋ，ｈｏｍｇ，ｈｏｐｓ，ｈｏｘ１０，ｈｏｘ１１，ｈｏｘ１２，ｈｏｘ１＠，ｈｏｘ１ａ，ｈｏｘ１ｂ，ｈｏｘ１ｃ，ｈｏｘ１ｄ，ｈｏｘ１ｅ，ｈｏｘ１ｆ，ｈｏｘ１ｇ，ｈｏｘ１ｈ，ｈｏｘ１ｉ，ｈｏｘ１ｊ，ｈｏｘ２＠，ｈｏｘ２ａ，ｈｏｘ２ｂ，ｈｏｘ２ｃ，ｈｏｘ２ｄ，ｈｏｘ２ｅ，ｈｏｘ２ｆ，ｈｏｘ２ｇ，ｈｏｘ２ｈ，ｈｏｘ２ｉ，ｈｏｘ３＠，ｈｏｘ３ａ，ｈｏｘ３ｂ，ｈｏｘ３ｃ，ｈｏｘ３ｄ，ｈｏｘ３ｅ，ｈｏｘ３ｆ，ｈｏｘ３ｇ，ｈｏｘ４＠，ｈｏｘ４ａ，ｈｏｘ４ｂ，ｈｏｘ４ｃ，ｈｏｘ４ｄ，ｈｏｘ４ｅ，ｈｏｘ４ｆ，ｈｏｘ４ｇ，ｈｏｘ４ｈ，ｈｏｘ４ｉ，ｈｏｘ７，ｈｏｘ８，ｈｏｘａ１，ｈｏｘａ１０，ｈｏｘａ１１，ｈｏｘａ１３，ｈｏｘａ３，ｈｏｘａ４，ｈｏｘａ５，ｈｏｘａ６，ｈｏｘａ７，ｈｏｘａ９，ｈｏｘａ＠，ｈｏｘｂｌ，ｈｏｘｂ２，ｈｏｘｂ３，ｈｏｘｂ４，ｈｏｘｂ５，ｈｏｘｂ６，ｈｏｘｂ７，ｈｏｘｂ８，ｈｏｘｂ９，ｈｏｘｂ＠，ｈｏｘｃ１２，ｈｏｘｃ１３，ｈｏｘｃ４，ｈｏｘｃ５，ｈｏｘｃ６，ｈｏｘｃ８，ｈｏｘｃ９，ｈｏｘｃ＠，ｈｏｘｄ１，ｈｏｘｄ１０，ｈｏｘｄ１１，ｈｏｘｄ１２，ｈｏｘｄ１３，ｈｏｘｄ３，ｈｏｘｄ４，ｈｏｘｄ８，ｈｏｘｄ９，ｈｏｘｄ＠，ｈｏｘｈｂ９，ｈｐ，ｈｐ４，ｈｐａｆｐ，ｈｐｃ１，ｈｐｃ２，ｈｐｃａ，ｈｐｃａ１１，ｈｐｃｘ，ｈｐｄ，ｈｐｄｒ１，ｈｐｄｒ２，ｈｐｅ１，ｈｐｅ２，ｈｐｅ３，ｈｐｅ４，ｈｐｅ５，ｈｐｅｃｔ１，ｈｐｆｈ，ｈｐｆｈ２，ｈｐｇｄ，ｈｐｌｈ１，ｈｐｌｈ２，ｈｐｎ，ｈｐｒ，ｈｐｒｔ，ｈｐｒｔ１，ｈｐｓ，ｈｐｔ，ｈｐｔ１，ｈｐｔｐ，ｈｐｔｘ，ｈｐｖ１８ｉ１，ｈｐｖ１８ｉ２，ｈｐｘ，ｈｒ，ｈｒａｓ，ｈｒｂ，ｈｒｃ，ｈｒｃ１，ｈｒｃａ１，ｈｒｄ，ｈｒｅｓ１，ｈｒｆ，ｈｒｇ，ｈｒｇａ，ｈｒｈ１，ｈｒｈ２，ｈｒｍｔ１１１，ｈｒｐｔ２，ｈｒｘ，ｈｒｘ，ｈｒｙ，ｈｓａ１１，ｈｓａ１２，ｈｓａｎ１，ｈｓａｓ１，ｈｓｃｒ２，ｈｓｄ１１，ｈｓｄ１１ｂ１，ｈｓｄ１１ｂ２，ｈｓｄ１１ｋ，ｈｓｄ１１１，ｈｓｄ１７ｂ１，ｈｓｄ１７ｂ２，ｈｓｄ１７ｂ３，ｈｓｄ
１７ｂ４，ｈｓｄ３ｂ１，ｈｓｄ３ｂ２，ｈｓｈ，ｈｓｎ１，ｈｓｏｒｃ１，ｈｓｐ２７，ｈｓｐ７３，ｈｓｐａ１ａ，ｈｓｐａ１ｂ，ｈｓｐａ１１，ｈｓｐａ２，ｈｓｐａ３，ｈｓｐａ４，ｈｓｐａ５，ｈｓｐａ６，ｈｓｐａ７，ｈｓｐａ８，ｈｓｐａ９，ｈｓｐｂ１，ｈｓｐｂ２，ｈｓｐｃ２，ｈｓｐｃａ１１，ｈｓｐｃａ１２，ｈｓｐｃａ１３，ｈｓｐｃａ１４，ｈｓｐｃｂ，ｈｓｐｇ１，ｈｓｐｇ２，ｈｓｒ１，ｈｓｓｔ，ｈｓｔｄ，ｈｓｔｆ１，ｈｔｃ２，ｈｔｆ４，ｈｔｋ，ｈｔｋ１，ｈｔ１，ｈｔｌｆ，ｈｔｌｖｒ，ｈｔｎ１，ｈｔｎ２，ｈｔｎ３，ｈｔｎｂ，ｈｔｏｒ，ｈｔｒ１ａ，ｈｔｒ１ｂ，ｈｔｒ１ｄ，ｈｔｒ１ｅ，ｈｔｒ１ｅ１，ｈｔｒ１ｆ，ｈｔｒ２ａ，ｈｔｒ２ｂ，ｈｔｒ２ｃ，ｈｔｒ３，ｈｔｒ４，ｈｔｒ５ａ，ｈｔｒ６，ｈｔｒ７，ｈｔｒｘ１，ｈｔｓ１，ｈｔｔ，ｈｔｘ，ｈｔｘ１，ｈｕｂ，ｈｕｄ，ｈｕｐ２，ｈｕｒ，ｈｕｓ，ｈｖｌｓ，ｈｖｂｓ１，ｈｖｂｓ６，ｈｖｂｓ７，ｈｖｅｍ，ｈｖｈ２，ｈｖｈ３，ｈｖｈ８，ｈｘｂ，ｈｘｂ１，ｈｙ，ｈｙａ，ｈｙａ１１，ｈｙｄ２，ｈｙｇｎ１，ｈｙ１，ｈｙｐ，ｈｙｐｌｉｐ１，ｈｙｐｐ，ｈｙｐｘ，ｈｙｒ，ｈｙｒｃ１，ｈｙｓ，ｉａ１，ｉａ２，ｉａｐ，ｉａｐｐ，ｉａｒ，ｉａｒｓ，ｉｂｄ１，ｉｂｄ２，ｉｂｍ２，ｉｂｓｐ，ｉｃａ１，ｉｃａｍ１，ｉｃａｍ２，ｉｃａｍ３，ｉｃｃａ，ｉｃｈ１，ｉｃｒ２，ｉｃｒ２ｂ，ｉｃｓ１，ｉｄ１，ｉｄ２，ｉｄ３，ｉｄ４，ｉｄａ，ｉｄｄ，ｉｄｄｍ１，ｉｄｄｍ１０，ｉｄｄｍ１１，ｉｄｄｍ１２，ｉｄｄｍ１３，ｉｄｄｍ１５，ｉｄｄｍ１７，ｉｄｄｍ２，ｉｄｄｍ３，ｉｄｄｍ４，ｉｄｄｍ５，ｉｄｄｍ６，ｉｄｄｍ７，ｉｄｄｍ８，ｉｄｄｍｘ，ｉｄｅ，ｉｄｇ２，ｉｄｈ１，ｉｄｈ２，ｉｄｈ３ａ，ｉｄｈ３ｇ，ｉｄｏ，ｉｄｓ，ｉｄｕａ，ｉｅｒ１，ｉｅｒ３，ｉｅｘ１，ｉｆ，ｉｆｃｒ，ｉｆｇｒ２，ｉｆｉ１６，ｉｆｉ２７，ｉｆｉ３５，ｉｆｉ４，ｉｆｉ５１１１，ｉｆｉ５４，ｉｆｉ５６，ｉｆｉ６１６，ｉｆｉ７８，ｉｆｎａ１，ｉｆｎａ１０，ｉｆｎａ１３，ｉｆｎａ１４，ｉｆｎａ１６，ｉｆｎａ１７，ｉｆｎａ２１，ｉｆｎａ６，ｉｆｎａ７，ｉｆｎａ８，ｉｆｎａ＠，ｉｆｎａｉ１，ｉｆｎａｒ１，ｉｆｎａｒ２，ｉｆｎｂ１，ｉｆｎｂ２，ｉｆｎｂ３，ｉｆｎｇ，ｉｆｎｇｒ１，ｉｆｎｇｒ２，ｉｆｎｇｔ１，ｉｆｎｒ，ｉｆｎｗ１，ｉｆｒｄ２，ｉｇａ，ｉｇａｔ，ｉｇｂ，ｉｇｂｐ１，ｉｇｄ１，ｉｇｄａ１，ｉｇｄｃ１，ｉｇｄｓ２，ｉｇｅｒ，ｉｇｅｓ，ｉｇｆ１，ｉｇｆ１ｒ，ｉｇｆ２，ｉｇｆ２ｒ，ｉｇｆｂｐ１，ｉｇｆｂｐ１０，ｉｇｆｂｐ２，ｉｇｆｂｐ３，ｉｇｆｂｐ４，ｉｇｆｂｐ６，ｉｇｆｂｐ７，ｉｇｆｒ１，ｉｇｆｒ２，ｉｇｆｒ３，ｉｇｈ＠，ｉｇｈａ１，ｉｇｈａ２，ｉｇｈｄ，ｉｇｈｄｙ２，ｉｇｈｅ，ｉｇｈｇ１，ｉｇｈｇ２，ｉｇｈｇ３，ｉｇｈｇ４，ｉｇｈｊ，ｉｇｈｍ，ｉｇｈｍｂｐ２，ｉｇｈｒ，ｉｇｈｖ＠，ｉｇｉ，ｉｇｊ，ｉｇｋ＠，ｉｇｋｃ，ｉｇｋｄｅ１，ｉｇｋｊ，ｉｇｋｊｒｂ１，ｉｇｋｖ，ｉｇｌｃ，ｉｇｌｃ１，ｉｇ１ｊ，ｉｇｌｐ１，ｉｇｌｐ２，ｉｇｌｖ，ｉｇｍ，ｉｇｏ１，ｉｇｓｆ１，ｉｈｈ，ｉｋ１，ｉｋｂａ，ｉｌ１０，ｉｌ１０ｒ，ｉｌ１１，ｉｌ１１ｒａ，ｉｌ１２ａ，ｉｌ１２ｂ，ｉｌ１２ｒｂ１，ｉｌ１２ｒｂ２，ｉｌ１３，ｉｌ１３ｒａ１，ｉｌ１３ｒａ２，ｉｌ１５，ｉｌ１５ｒａ，ｉｌ１７，ｉｌ１ａ，ｉｌ１ｂ，ｉｌ１ｂｃ，ｉｌ１ｒ１，ｉｌ１ｒ２，ｉｌ１ｒａ，ｉｌ１ｒａｐ，ｉｌ１ｒｂ，ｉｌ１ｒｎ，ｉｌ２，ｉｌ２ｒ，ｉｌ２ｒａ，ｉｌ２ｒｂ，ｉｌ２ｒｇ，ｉｌ３，ｉｌ３ｒａ，ｉｌ３ｒａｙ，ｉｌ４，ｉｌ４ｒ，ｉｌ４ｒａ，ｉｌ５，ｉｌ５ｒａ，ｉｌ６，ｉｌ６ｒ，ｉｌ６ｓｔ，ｉｌ７，ｉｌ７ｒ，ｉｌ８，ｉｌ８ｒａ，ｉｌ８ｒｂ，ｉｌ９，ｉｌ９ｒ，ｉｌａ，ｉｌｆ１，ｉｌｌｂｐ，ｉｍｄ１，ｉｍｄ２，ｉｍｄ４，ｉｍｄ５，ｉｍｄ６，ｉｍｐａ１，ｉｍｐｄｈ１，ｉｍｐｄｈ２，ｉｍｐｄｈ１１，ｉｍｐｇ１，ｉｍｐｔ１，ｉｎｄｘ，ｉｎｆａ２，ｉｎｆａ４，ｉｎｆａ５，ｉｎｇ１，ｉｎｈａ，ｉｎｈｂａ，ｉｎｈｂｂ，ｉｎｈｂｃ，ｉｎｉ１，ｉｎｋ４ｂ，ｉｎｌｕ，ｉｎｐ１０，ｉｎｐｐ１，ｉｎｐｐ５ａ，ｉｎｐｐ５ｂ，ｉｎｐｐ５ｄ，ｉｎｐｐ１１，ｉｎｓ，ｉｎｓｉｇ１，ｉｎｓ１，ｉｎｓ１３，ｉｎｓ１４，ｉｎｓｒ，ｉｎｓｒｒ，ｉｎｔ１，ｉｎｔ１１１，ｉｎｔ２，ｉｎｔ３，ｉｎｔ４，ｉｎｔ６，ｉｏｓｃａ，ｉｐ２，ｉｐｆ１，ｉｐ１，ｉｐｍ１５０，ｉｐｏｘ，ｉｐｐ，ｉｐｐ２，ｉｐｗ，ｉｑｇａｐ１，ｉｒ１０，ｉｒ２０，ｉｒｅｂ１，ｉｒｅｂ２，ｉｒｆ１，ｉｒｆ２，ｉｒｆ４，ｉｒｆ４，ｉｒｒ，ｉｒｓ１，ｉｓａ，ｉｓｃｗ，ｉｓ１１，ｉｓｌｒ，ｉｓｏｔ，ｉｓｓｘ，ｉｔ１５，ｉｔｂａ１，ｉｔｂａ２，ｉｔｆ，ｉｔｆ２，ｉｔｇａ１，ｉｔｇａ２，ｉｔｇａ２ｂ，ｉｔｇａ４，ｉｔｇａ５，ｉｔｇａ６，ｉｔｇａ７，ｉｔｇａｄ，ｉｔｇａ１，ｉｔｇａｍ，ｉｔｇａｖ，ｉｔｇａｘ，ｉｔｇｂ１，ｉｔｇｂ２，ｉｔｇｂ３，ｉｔｇｂ４，ｉｔｇｂ６，ｉｔｇｂ７，ｉｔｉ，ｉｔｉｈ１，ｉｔｉｈ２，ｉｔｉｈ３，ｉｔｉｈ４，ｉｔｉｈ１１，ｉｔｉ１，ｉｔｋ，ｉｔｍ１，ｉｔｐａ，ｉｔｐｋａ，ｉｔｐｋｂ，ｉｔｐｒ１，ｉｔｐｒ２，ｉｔｐｒ３，ｉｔｓｎ，ｉｖｄ，ｉｖ１，ｊａｇ１，ｊａｋ１，ｊａｋ２，ｊａｋ３，ｊｂｓ，ｊｃａｐ，ｊｈ８，ｊｉｐ，ｊｋ，ｊｍｅ，ｊｍｊ，ｊｏａｇ，ｊｐｄ，ｊｒｋ，ｊｒｋ１，ｊｔｋ１４，ｊｔｖ１，ｊｕｎ，ｊｕｎｂ，ｊｕｎｄ，ｊｕｐ，ｊｖ１８，ｊｗｓ，ｋ１２ｔ，ｋａｉ１，ｋａｌ１，ｋａｒ，ｋａｒｓ，ｋａｔｐ１，ｋｃｎａ１，ｋｃｎａ１０，ｋｃｎａ１ｂ，ｋｃｎａ２ｂ，ｋｃｎａ３，ｋｃｎａ４，ｋｃｎａ５，ｋｃｎａ６，ｋｃｎａ７，ｋｃｎａ８，ｋｃｎａ９，ｋｃｎａｂ１，ｋｃｎａｂ２，ｋｃｎｂ１，ｋｃｎｃ１，ｋｃｎｃ２，ｋｃｎｃ３，ｋｃｎｃ４，ｋｃｎｅ１，ｋｃｎｈ１，ｋｃｎｈ２，ｋｃｎｊ１，ｋｃｎｊ１０，ｋｃｎｊ１１，ｋｃｎｊ１２，ｋｃｎｊ１５，ｋｃｎｊ３，ｋｃｎｊ４，ｋｃｎｊ５，ｋｃｎｊ６，ｋｃｎｊ６，ｋｃｎｊ７，ｋｃｎｊ８，ｋｃｎｊｎ１，ｋｃｎｋ１，ｋｃｎｋ２，ｋｃｎｋ３，ｋｃｎｍａ１，ｋｃｎｑ１，ｋｃｎｑ２，ｋｃｎｑ３，ｋｃｎｑ４，ｋｃｎｓ２，ｋｄ，ｋｄｒ，ｋｅ１，ｋｅｒａ，ｋｆ１，ｋｆｓ，ｋｆｓｄ，ｋｆｓ１，ｋｈｋ，ｋｉａａ０１２２，ｋｉｄ，ｋｉｄ１，ｋｉｆ２，ｋｉｆ３ｃ，ｋｉｆ５ｂ，ｋｉｐ１，ｋｉｐ２，ｋｉｓｓ１，ｋｉｔ，ｋｌｃ２，ｋｌｋ１，ｋｌｋ２，ｋｌｋ３，ｋｌｋ３，ｋｌｋｂ１，ｋｌｋｒ，ｋｌｒｂ１，ｋｌｒｃ１，ｋｌｒｃ２，ｋｌｒｃ３，ｋｌｒｃ４，ｋｌｒｄ１，ｋｌｓｔ，ｋｍｓ，ｋｍｓ，ｋｎｇ，ｋｎｏ，ｋｎｓ１，ｋｎｓ２，ｋｎｓ１１，ｋｎｓ１４，ｋｏｘ１，ｋｏｘ１１，ｋｏｘ１２，ｋｏｘ１３，ｋｏｘ１５，ｋｏｘ１６，ｋｏｘ１８，ｋｏｘ１９，ｋｏｘ２，ｋｏｘ２，ｋｏｘ２２，ｋｏｘ２５，ｋｏｘ３０，ｋｏｘ３２，ｋｏｘ４，ｋｏｘ５，ｋｏｘ６，ｋｏｘ７，ｋｏｘ９，ｋｐｎａ３，ｋｐｐｓ１，ｋｐｐｓ２，ｋｒａｇ，ｋｒａｓ１ｐ，ｋｒａｓ２，ｋｒｅｖ１，ｋｒｇ２，ｋｒｎ１，ｋｒｎ１１，ｋｒｏｘ２０，ｋｒｔ１，ｋｒｔ１０，ｋｒｔ１２，ｋｒｔ１３，ｋｒｔ１４，ｋｒｔ１５，ｋｒｔ１６，ｋｒｔ１７，ｋｒｔ１８，ｋｒｔ１９，ｋｒｔ２ａ，ｋｒｔ２ｅ，ｋｒｔ３，ｋｒｔ４，ｋｒｔ５，ｋｒｔ６ａ，ｋｒｔ６ｂ，ｋｒｔ７，ｋｒｔ８，ｋｒｔ９，ｋｒｔｈａ２，ｋｒｔｈａ５，ｋｒｔｈｂ１，ｋｒｔｈｂ６，ｋｓ，ｋｔｎ１，ｋｕ７０，ｋｕｐ，ｋｖｌｑｔ１，ｋｗｅ，１１．２，１１  ｃａｍ，１２３ｍｒｐ，ｌａｂ７，ｌａｂ７２，ｌａｃ，ｌａｃｉ，ｌａｃｓ，ｌａｄ，ｌａｄ，ｌａｄ１，ｌａｆ４，ｌａｇ３，ｌａｇ５，ｌａｉｒ１，ｌａｋ１，ｌａｌｂａ，ｌａｌ１，ｌａｍ１，ｌａｍａ１，ｌａｍａ２，ｌａｍａ３，ｌａｍａ３，ｌａｍａ４，ｌａｍａ５，ｌａｍｂ１，ｌａｍｂ２，ｌａｍｂ２，ｌａｍｂ２ｔ，ｌａｍｂ３，ｌａｍｂｒ，ｌａｍｃ１，ｌａｍｃ２，ｌａｍｍ，ｌａｍｎｂ２，ｌａｍｐ，ｌａｍｐ１，ｌａｍｐ２，ｌａｍｒ１，ｌａｍｓ，ｌａｐ，ｌａｐ１８，ｌａｐｔｍ５，ｌａｒ，ｌａｒ１，ｌａｒｄ，ｌａｒｇｅ，ｌａｒｓ，ｌｂｐ，ｌｂｒ，ｌｃａ，ｌｃａ１，Ｉｃａｄ，Ｉｃａｍｂ，ｌｃａｔ，ｌｃｃｓ，ｌｃｆｓ２，ｌｃｈ，ｌｃｋ，ｌｃｎ１，ｌｃｎ２，ｌｃｏ，ｌｃｐ１，ｌｃｐ２，ｌｃｔ，ｌｄ，ｌｄ７８，ｌｄｂ１，ｌｄｂ２，ｌｄｃ，ｌｄｈ１，ｌｄｈ３，ｌｄｈａ，ｌｄｈｂ，ｌｄｈｃ，ｌｄｌｒ，ｌｅ，ｌｅｃｔ２，ｌｅｆ１，ｌｅｆｔｙ１，ｌｅｆｔｙ２，ｌｅｐ，ｌｅｐｒ，ｌｅｒｋ５，ｌｅｒｋ８，ｌｅｕ１，ｌｅｕ７，ｌｅｕｔ，ｌｆａ１ａ，ｌｆａ３，ｌｆｈ１１，ｌｆｐ，ｌｇａ１ｓ１，ｌｇａ１ｓ３，ｌｇａ１ｓ３ｂｐ，ｌｇａ１ｓ７，ｌｇｃｒ，Ｉｇｍｄ１，ｌｇｍｄ１ａ，ｌｇｍｄ１ｂ，ｌｇｍｄ１ｃ，ｌｇｍｄ１ｄ，ｌｇｍｄ２ｂ，ｌｇｍｄ２ｃ，ｌｇｍｄ２ｄ，ｌｇｍｄ２ｅ，ｌｇｍｄ２ｆ，ｌｇｍｄ２ｇ，ｌｇｍｄ２ｈ，ｌｇｓ，ｌｇｔｎ，ｌｈｂ，ｌｈｃｇｒ，ｌｈｓ，ｌｈｘ１，ｌｈｘ３，ｌｉ，ｌｉ２，ｌｉｆ，ｌｉｆｒ，ｌｉｇ１，ｌｉｇ３，ｌｉｇ４，ｌｉｍ１，ｌｉｍ２，ｌｉｍａｂ１，ｌｉｍｋ１，ｌｉｍｐｉｉ，ｌｉｐ２，ｌｉｐａ，ｌｉｐｂ，ｌｉｐｃ，ｌｉｐｄ，ｌｉｐｅ，ｌｉｐｏ，ｌｉｓ１，ｌｉｓ２，ｌｉｓｘ，ｌｉｔａｆ，ｌｋｂ１，ｌｋｎ１，ｌｌｇ１１，ｌｍａｎ１，ｌｍｎ１，ｌｍｎ２，ｌｍｎａ，ｌｍｎｂ１，ｌｍｎｂ２，ｌｍｏ１，ｌｍｏ２，ｌｍｏ３，ｌｍｏ４，ｌｍｏ５，ｌｍｐ１０，ｌｍｐ２，ｌｍｐ７，ｌｍｐｘ，ｌｍｓ，ｌｍｘ１，ｌｍｘ１ａ，ｌｍｘ１ｂ，ｌｍｙｃ，ｌｎｈｒ，ｌｎｒｈ，ｌｏｃｒ，ｌｏｈ１１ｃｒ２ａ，ｌｏｒ，ｌｏｔ１，ｌｏｘ，ｌｏｘ１，ｌｏｘ１１，ｌｐａ，ｌ���ａａｂ，ｌｐａａｔａ，ｌｐａｐ  ｌｐｃ１，ｌｐｃ２ｄ，ｌｐｄ１，ｌｐｈ，ｌｐｉ，ｌｐ１，ｌｐｎａ３，ｌｐｐ，ｌｐｓ，ｌｐｓａ，ｌｑｔ１，ｌｑｔ２，ｌｑｔ３，ｌｑｔ４，ｌｒ３，ｌｒｅｌ，ｌｒｅ２，ｌｒｐ，ｌｒｐ１，ｌｒｐ２，ｌｒｐ５，ｌｒｐ７，ｌｒｐ８，ｌｒｐａｐ１，ｌｒｐｒ１，ｌｒｓ１，ｌｓａｍｐ，ｌｓｉｒｆ，ｌｓ１，ｌｓｎ，Ｉｓｐ１，ｌｓｓ，ｌｓｔ１，ｌｔａ，ｌｔａ４ｈ，ｌｔｂ，ｌｔｂ４ｒ，ｌｔｂｐ１，ｌｔｂｐ２，ｌｔｂｐ２，ｌｔｂｐ３，ｌｔｂｐ３，ｌｔｂｒ，ｌｔｃ４ｓ，Ｉｔｆ，ｌｔｋ，ｌｔｎ，ｌｕ，ｌｕｍ，ｌｕｘｓ，ｌｕｚｐ，ｌｗ，ｌｙ６４，ｌｙ６ｅ，ｌｙ９，ｌｙａｍ１，ｌｙｂ２，ｌｙｆ１，ｌｙ１１，ｌｙｎ，ｌｙｐ，ｌｙｓｔ，ｌｙｔ１０，ｌｙｚ，ｌｚｔｒ１，ｍ１１ｓ１，ｍ１３０，ｍ１７ｓ１，ｍ１７ｓ２，ｍ１９５，ｍ１ｓ１，ｍ３ｓ１，ｍ４ｓ１，ｍ６ａ，ｍ６ｂ，ｍ６ｐ２，ｍ６ｐｒ，ｍ６ｓ１，ｍ７ｖ１，ｍ７ｖｓ１，ｍａｂ２１１，ｍａｃ１ａ，ｍａｃ２，ｍａｃ２５，ｍａｃａｍ１，ｍａｃｓ，ｍａｄ，ｍａｄ２１１，ｍａｄｄ，ｍａｄｈ１，ｍａｄｈ２，ｍａｄｈ３，ｍａｄｈ４，ｍａｄｈ５，ｍａｄｈ６，ｍａｄｈ６，ｍａｄｈ７，ｍａｄｈ９，ｍａｄｍ，ｍａｄｒ１，ｍａｆ，ｍａｆｄ１，ｍａｆｄ２，ｍａｇ，ｍａｇｅ１，ｍａｇｅｂ３，ｍａｇｅｂ４，ｍａｇｅ１１，ｍａｇｏｈ，ｍａｇｐ，ｍａｇｐ１，ｍａｇｐ２，ｍａｋ，ｍａ１，ｍａ１１，ｍａｎ２ａ２，ｍａｎａ１，ｍａｎａ２，ｍａｎａ２ｘ，ｍａｎｂ，ｍａｎｂ１，ｍａｎｂａ，ｍａｏａ，ｍａｏｂ，ｍａｐ１ａ，ｍａｐ１ａ１ｃ３，ｍａｐ１ｂ，ｍａｐ１ｂ１ｃ３，ｍａｐ２，ｍａｐ４，ｍａｐ８０，ｍａｐ９７，ｍａｐｋ１，ｍａｐｋａｐ３，ｍａｐｋｋｋ４，ｍａｐｔ，ｍａｒ，ｍａｒｋ３，ｍａｒｓ，ｍａｓ１，ｍａｓｐ１，ｍａｔ１ａ，ｍａｔ２ａ，ｍａｔａ１，ｍａｔａ２，ｍａｔｋ，ｍａｔｎ１，ｍａｔｎ３，ｍａｘ，ｍａｚ，ｍｂ，ｍｂｄ１，ｍｂ１，ｍｂ１２，ｍｂｐ，ｍｂｐ１，ｍｂｓ，ｍｂｓ２，ｍｃ１ｒ，ｍｃ２ｒ，ｍｃ３ｒ，ｍｃ４ｒ，ｍｃ５ｒ，ｍｃａｄ，ｍｃｃ，ｍｃｄｃ１，ｍｃｄｒ１，ｍｃｆ２，ｍｃｆ３，ｍｃｆｄ１，ｍｃｈ２，ｍｃｈ３，ｍｃｈ４，ｍｃｈ５，ｍｃｋｄ，ｍｃ１，ｍｃ１１，ｍｃｍ，ｍｃｍ２，ｍｃｍ２，ｍｃｍ３，ｍｃｍ６，ｍｃｍ７，ｍｃｍｔ，ｍｃｏｐ，ｍｃｏｒ，ｍｃｐ，ｍｃｐ１，ｍｃｐ３，ｍｃｐｈ１，ｍｃｒ，ｍｃｓ，ｍｃｓ
ｆ，ｍｃｓｐ，ｍｃｔ１，ｍｄ１，ｍｄｂ，ｍｄｃ，ｍｄｃｒ，ｍｄｄｃ，ｍｄｅｇ，ｍｄｆ１，ｍｄｇ，ｍｄｇ１，ｍｄｈ１，ｍｄｈ２，ｍｄｋ，ｍｄｋ，ｍｄｍ２，ｍｄｍ４，ｍｄｒ１，ｍｄｒ３，ｍｄｒｓ１，ｍｄｒｖ，ｍｄｓ，ｍｄｓ１，ｍｄｕ１，ｍｄｕ２，ｍｄｕ３，ｍｄｘ，ｍｅ１，ｍｅ２，ｍｅａ，ｍｅａ６，ｍｅｃ１１，ｍｅｃｐ２，ｍｅｄ，ｍｅｆ，ｍｅｆ２ａ，ｍｅｆ２ｂ，ｍｅｆ２ｃ，ｍｅｆ２ｄ，ｍｅｆｖ，ｍｅｈｍｏ，ｍｅｉｓ１，ｍｅｉｓ２，ｍｅｋｋ，ｍｅｋｋ１，ｍｅｋｋ４，ｍｅ１，ｍｅｌ１８，ｍｅｌｆ，ｍｅｍｏ１，ｍｅｎ１，ｍｅｎ２ａ，ｍｅｏｘ１，ｍｅｏｘ２，ｍｅｐ１ａ，ｍｅｐ１ｂ，ｍｅｒ２，ｍｅｒ６，ｍｅｓｔ，ｍｅｔ，ｍｅｔｒｓ，ｍｆａｐ１，ｍｆａｐ２，ｍｆａｐ３，ｍｆａｐ４，ｍｆｄ１，ｍｆｉ２，ｍｆｓ１，ｍｆｓ２，ｍｆｔ，ｍｆｔｓ，ｍｇ５０，ｍｇａ，ｍｇａ１，ｍｇａ３，ｍｇａｔ１，ｍｇａｔ２，ｍｇａｔ５，ｍｇｃ１，ｍｇｃｎ，ｍｇｃｒ，ｍｇｃｔ，ｍｇｄｆ，ｍｇｅａ，ｍｇｆ，ｍｇｉ，ｍｇｍｔ，ｍｇｐ，ｍｇｓａ，ｍｇｓｔ１，ｍｇｓｔ２，ｍｈｃ，ｍｈｃ２ｔａ，ｍｈｐ２，ｍｈｓ，ｍｈｓ２，ｍｈｓ３，ｍｈｓ４，ｍｈｓ６，ｍｉａ，ｍｉｃ１０，ｍｉｃ１１，ｍｉｃ１２，ｍｉｃ１７，ｍｉｃ１８，ｍｉｃ２，ｍｉｃ２ｘ，ｍｉｃ２ｙ，ｍｉｃ３，ｍｉｃ４，ｍｉｃ７，ｍｉｃａ，ｍｉｃｂ，ｍｉｄ１，ｍｉｄａｓ，ｍｉｆ，ｍｉｆ，ｍｉｇ，ｍｉｐ，ｍｉｐ２ａ，ｍｉｐ２ｂ，ｍｉｐ３ｂ，ｍｉｐｅｐ，ｍｉｔｆ，ｍｉｗｃ，ｍｊｄ，ｍｋ，ｍｋｉ６７，ｍｋｋｓ，ｍｋｐ２，ｍｋｐ３，ｍｋｐｘ，ｍｋｓ，ｍｋｓ，ｍｋｓ１，ｍｋｓ２，ｍｌａ１，ｍｌｃｋ，ｍｌｆ１，ｍｌｆ２，ｍｌｈ１，ｍｌｋ１，ｍｌｋ３，ｍｌ１，ｍｌ１２，ｍｌ１ｔ１，ｍｌ１ｔ２，ｍｌ１ｔ３，ｍｌ１ｔ４，ｍｌ１ｔ６，ｍｌ１ｔ７，ｍｌｍ，ｍｌｍ，ｍｌｎ，ｍｌｐ，ｍｌｒ，ｍｌｒｇ，ｍｌｒｗ，ｍｌｓ，ｍｌｔｎ，ｍｌｖａｒ，ｍｌｖｉ２，ｍｌｖｔ，ｍｍａｃ１，ｍｍｅ，ｍｍｐ１，ｍｍｐ１０，ｍｍｐ１１，ｍｍｐ１２，ｍｍｐ１３，ｍｍｐ１４，ｍｍｐ１５，ｍｍｐ１６，ｍｍｐ１７，ｍｍｐ１９，ｍｍｐ２，ｍｍｐ２１，ｍｍｐ２２，ｍｍｐ３，ｍｍｐ７，ｍｍｐ８，ｍｍｐ９，ｍｎ，ｍｎ，ｍｎｂ，ｍｎｂｈ，ｍｎｄａ，ｍｎｇ１，ｍｎｋ，ｍｎｓ，ｍｎｔ，ｍｏｃｏｄ，ｍｏｃｓ１，ｍｏｃｓ２，ｍｏｄｙ１，ｍｏｄｙ３，ｍｏｇ，ｍｏｋ２，ｍｏｍ１，ｍｏｓ，ｍｏｔ２，ｍｏｖ３４，ｍｏｘ１，ｍｏｘ２，ｍｏｘ４４，ｍｏｚ，ｍｐ１９，ｍｐｂ１，ｍｐｄ１，ｍｐｄｚ，ｍｐｅ，ｍｐｅ１６，ｍｐｇ，ｍｐｉ，ｍｐｉｆ２，ｍｐ１，ｍｐ１１ｇ，ｍｐｏ，ｍｐｐ１，ｍｐｐ２，ｍｐｐ３，ｍｐｐｂ，ｍｐｒｉ，ｍｐｒｎ，ｍｐｓ２，ｍｐｓ３ａ，ｍｐｓ３ｃ，ｍｐｓ４ａ，ｍｐｓｈ，ｍｐｔｓ，ｍｐｖ１７，ｍｐｚ，ｍｒ１，ｍｒ７７，ｍｒｂｃ，ｍｒｃ１，ｍｒｅ１１，ｍｒｅ１１ａ，ｍｒｇ１，ｍｒｇｈ，ｍｒｏｓ，ｍｒｐ，ｍｒｐ，ｍｒｐ１，ｍｒｐ１２３，ｍｒｓ，ｍｒｓｄ，ｍｒｓｒ，ｍｒｓｔ，ｍｒｘ１，ｍｒｘ１４，ｍｒｘ２，ｍｒｘ２０，ｍｒｘ２１，ｍｒｘ２３，ｍｒｘ２９，ｍｒｘ４１，ｍｒｘ４８，ｍｒｘ４９，ｍｒｘ９，ｍｒｘａ，ｍｒｘｓ１，ｍｒｘｓ２，ｍｒｘｓ３，ｍｒｘｓ４，ｍｒｘｓ５，ｍｒｘｓ６，ｍｒｘｓ８，ｍｓ３３１５，ｍｓ３３６，ｍｓｇ１，ｍｓｈ２，ｍｓｈ３，ｍｓｈ４，ｍｓｈ６，ｍｓｉ１，ｍｓｋ１６，ｍｓｋ３９，ｍｓｋ４１，ｍｓｌｒ１，ｍｓｍｂ，ｍｓｎ，ｍｓｒ１，ｍｓｓ１，ｍｓｓ４，ｍｓｓ４，ｍｓｓｅ，ｍｓｔ，ｍｓｔ１，ｍｓｔ１ｒ，ｍｓｔｄ，ｍｓｔｎ，ｍｓｕｄ１，ｍｓｘ１，ｍｓｘ２，ｍｔ１ａ，ｍｔ１ｂ，ｍｔ１ｅ，ｍｔ１ｆ，ｍｔ１ｇ，ｍｔ１ｈ，ｍｔ１ｉ，ｍｔ１ｊ，ｍｔ１ｋ，ｍｔ１ｌ，ｍｔ１ｘ，ｍｔ２，ｍｔ２ａ，ｍｔ３，ｍｔａｃｒ１，ｍｔａｐ，ｍｔｂｔ１，ｍｔｃｐ１，ｍｔｅｒｆ，ｍｔｆ１，ｍｔｈ１，ｍｔｈｆｃ，ｍｔｈｆｄ，ｍｔｈｆｒ，ｍｔｋ１，ｍｔｍ１，ｍｔｍｒ１，ｍｔｍｘ，ｍｔｎｒ１ａ，ｍｔｎｒ１ｂ，ｍｔｐ，ｍｔｐａ，ｍｔｒ，ｍｔｒｎｓ，ｍｔｒｒ，ｍｔｓ，ｍｔｓ，ｍｔｓ１，ｍｔｓ１，ｍｔｓ２，ｍｔｔｆ１，ｍｔｘ，ｍｔｘｎ，ｍｕ，ｍｕｃ１，ｍｕｃ２，ｍｕｃ３，ｍｕｃ４，ｍｕｃ５，ｍｕｃ５ａｃ，ｍｕｃ５ｂ，ｍｕｃ６，ｍｕｃ８，ｍｕ１，ｍｕｍ１，ｍｕｐｐ１，ｍｕｓｋ，ｍｕｔ，ｍｖｋ，ｍｖｌｋ，ｍｖｗｆ，ｍｗｆｅ，ｍｘ，ｍｘ１，ｍｘ２，ｍｘｉ１，ｍｘｓ１，ｍｙｂ，ｍｙｂ１１，ｍｙｂ１２，ｍｙｂｐｃ１，ｍｙｂｐｃ２，ｍｙｂｐｃ３，ｍｙｂｐｃｆ，ｍｙｂｐｈ，ｍｙｃ，ｍｙｃ１１，ｍｙｃ１２，ｍｙｃｌｋ１，ｍｙｃｎ，ｍｙｄ８８，ｍｙｆ３，ｍｙｆ４，ｍｙｆ５，ｍｙｆ６，ｍｙｈ１，ｍｙｈ１０，ｍｙｈ１１，ｍｙｈ１２，ｍｙｈ２，ｍｙｈ３，ｍｙｈ４，ｍｙｈ６，ｍｙｈ７，ｍｙｈ８，ｍｙｈ９，ｍｙｋ１，ｍｙ１，ｍｙ１１，ｍｙ１２，ｍｙ１３，ｍｙ１４，ｍｙ１５，ｍｙｌｋ，ｍｙｍｙ，ｍｙｏ１０，ｍｙｏ１５，ｍｙｏ１ａ，ｍｙｏ１ｃ，ｍｙｏ１ｄ，ｍｙｏ１ｅ，ｍｙｏ５ａ，ｍｙｏ６，ｍｙｏ７ａ，ｍｙｏ９ｂ，ｍｙｏｃ，ｍｙｏｄ１，ｍｙｏｇ，ｍｙｐ１，ｍｙｐ２，ｍｙｐ３，ｍｙｒ５，ｍｚｆ１，ｎ３３，ｎａｂ１，ｎａｂ２，ｎａｂｃ１，ｎａｃ１ａ，ｎａｃａ，ｎａｃａｅ，ｎａｃｐ，ｎａｄｍｒ，ｎａｇａ，ｎａｇｃ＠，ｎａｇｌｕ，ｎａｇｒ１，ｎａｉｐ，ｎａｍｓｄ，ｎａｎｔａ３，ｎａｐ１１４，ｎａｐ２，ｎａｐ２１，ｎａｐｂ，ｎａｐｔｂ，ｎａｒｓ，ｎａｔ１，ｎａｔ１，ｎａｔ２，ｎｂ，ｎｂ４ｓ，ｎｂａｔ，ｎｂｃ３，ｎｂｃｃｓ，ｎｂｃｃｓ，ｎｂｉａ１，ｎｂｓ，ｎｂｓ，ｎｂｓ１，ｎｃａ，ｎｃａｄ，ｎｃａｍ１，ｎｃａｎ，ｎｃｂｐ，ｎｃｃ１，ｎｃｃ２，ｎｃｃ３，ｎｃｃ４，ｎｃｃｔ，ｎｃｆ１，ｎｃｆ２，ｎｃｆ４，ｎｃｋ，ｎｃ１，ｎｃｓｔ２，ｎｃｘ１，ｎｃｘ２，ｎｄ，ｎｄｈｉｉ，ｎｄｎ，ｎｄｐ，ｎｄｓｔ１，ｎｄｕｆａ１，ｎｄｕｆａ２，ｎｄｕｆａ５，ｎｄｕｆａ６，ｎｄｕｆａ７，ｎｄｕｆｂ８，ｎｄｕｆｂ９，ｎｄｕｆｓ１，ｎｄｕｆｓ２，ｎｄｕｆｓ４，ｎｄｕｆｓ７，ｎｄｕｆｓ８，ｎｄｕｆｖ１，ｎｄｕｆｖ２，ｎｄｕｆｖ３，ｎｅｂ，ｎｅｃ１，ｎｅｃ２，ｎｅｄｄ１，ｎｅｄｄ２，ｎｅｄｄ４，ｎｅｆｈ，ｎｅｆ１，ｎｅｇｆ１，ｎｅｇｆ２，ｎｅ１１１，ｎｅｂ１１２，ｎｅｍ１，ｎｅｏ１，ｎｅｐ，ｎｅｔ，ｎｅｔ１，ｎｅｕ，ｎｅｕ，ｎｅｕｄ４，ｎｅｕｒｏｄ，ｎｅｕｒｏｄ２，ｎｅｕｒｏｄ３，ｎｆ１，ｎｆ１ａ，ｎｆ２，ｎｆａｔｃｌ，ｎｆａｔｃ２，ｎｆａｔｐ，ｎｆｅ１，ｎｆｅ２，ｎｆｅ２１１，ｎｆｅ２１２，ｎｆｅ２ｕ，ｎｆｉａ，ｎｆｉｂ，ｎｆｉｃ，ｎｆｉｘ，ｎｆｋｂ１，ｎｆｋｂ２，ｎｆｋｂ３，ｎｆｋｂｉａ，ｎｆｋｂｉ１１，ｎｆｒｋｂ，ｎｆｙａ，ｎｆｙｂ，ｎｇａ１，ｎｇｂｅ，ｎｇｆｂ，ｎｇｆｇ，ｎｇｆｉｃ，ｎｇｆｒ，ｎｇ１，ｎｇｎ，ｎｈｂｐ，ｎｈｃｐ１，ｎｈｃｐ２，ｎｈｅ１，ｎｈｅ３，ｎｈｅ４，ｎｈｅ５，ｎｈｌｈ１，ｎｈｌｈ２，ｎｈｐ２１１，ｎｈｓ，ｎｉｄ，ｎｉｄｄｍ１，ｎｉｎｊ１，ｎｉｐｐ１，ｎｉｐｓｎａｐ１，ｎｉｐｓｎａｐ２，ｎｉｓ，ｎｋｌｒ，ｎｋｃｃ１，ｎｋｃｃ２，ｎｋｇ２，ｎｋｇ２ａ，ｎｋｇ２ｃ，ｎｋｇ２ｅ，ｎｋｇ２ｆ，ｎｋｈｃ，ｎｋｎａ，ｎｋｎａｒ，ｎｋｎｂ，ｎｋｒｐ１ａ，ｎｋｓ１，ｎｋｓｆ２，ｎｋｔｒ，ｎｋｘ２ａ，ｎｋｘ３．２，ｎｋｘ３ａ，ｎｋｘ６ａ，ｎｌｉ，ｎｍ，ｎｍ１，ｎｍ２３，ｎｍｂ，ｎｍｂｒ，ｎｍｄａｒ１，ｎｍｄａｒ２ａ，ｎｍｄａｒ２ｂ，ｎｍｄａｒ２ｃ，ｎｍｄａｒ２ｄ，ｎｍｄａｒａ１，ｎｍｅ１，ｎｍｅ２，ｎｍｅ４，ｎｍｏｒ１，ｎｍｏｒ２，ｎｍｓ１，ｎｍｙｃ，ｎｎａｔ，ｎｍｎｔ，ｎｎｏ１，ｎｏｇ，ｎｏｌｌ，ｎｏｓ１，ｎｏｓ２ａ，ｎｏｓ２ｂ，ｎｏｓ２ｃ，ｎｏｓ３，ｎｏｔ，ｎｏｔｃｈ１，ｎｏｔｃｈ２，ｎｏｔｃｈ３，ｎｏｔｃｈ４，ｎｏｖ，ｎｏｖ，ｎｏｖ２，ｎｏｖａ１，ｎｏｖａ３，ｎｏｖｐ，ｎｐ，ｎｐ１０，ｎｐａｔ，ｎｐｃ，ｎｐｃ１，ｎｐｄ，ｎｐｈ１，ｎｐｈ２，ｎｐｈｌ２，ｎｐｈｎ，ｎｐｈｐ１，ｎｐｈｐ２，ｎｐｈｓ１，ｎｐｍ１，ｎｐｐａ，ｎｐｐｂ，ｎｐｐｃ，ｎｐｐｓ，ｎｐｒ１，ｎｐｒ２，ｎｐｒ３，ｎｐｓ１，ｎｐｔ１，ｎｐｔ２，ｎｐｔｘ２，ｎｐｙ，ｎｐｙ１ｒ，ｎｐｙ２ｒ，ｎｐｙ３ｒ，ｎｐｙ５ｒ，ｎｐｙ６ｒ，ｎｑｏ２，ｎｒａｍｐ，ｎｒａｍｐ１，ｎｒａｍｐ２，ｎｒａｐ，ｎｒａｓ，ｎｒｂ５４，ｎｒｃａｍ，ｎｒｄ１，ｎｒｆ１，ｎｒｆ１，ｎｒｆ２，ｎｒｇｎ，ｎｒｉｐ１，ｎｒｋ２，ｎｒ１，ｎｒｔｎ，ｎｒｕ，ｎｓ１，ｎｓｆ，ｎｓｐ，ｎｓｐ１１，ｎｓｒｄ９，ｎｔ４，ｎｔ５，ｎｔ５，ｎｔｃｐ１，ｎｔｃｐ２，ｎｔｆ３，ｎｔｆ４，ｎｔｆ５，ｎｔｈ１１，ｎｔｎ，ｎｔｎ，ｎｔｎ２１，ｎｔｒｋ１，ｎｔｒｋ２，ｎｔｒｋ３，ｎｔｒｋ４，ｎｔｒｋｒ１，ｎｔｒｋｒ３，ｎｔｓ，ｎｔｔ，ｎｔｔ，ｎｕｃ１，ｎｕｃｂ１，ｎｕｍａ１，ｎｕｐ２１４，ｎｕｐ９８，ｎｕｒｒ１，ｎｖ１，ｎｙｓ１，ｎｙｓ２，ｎｙｓａ，ｏａ１，ｏａ２，ｏａ３，ｏａｒ，ｏａｓｄ，ｏａｔ，ｏａｔ１１，ｏａｔ２２，ｏａｔ２３，ｏａｔｐ，ｏａｚ，ｏｂ，ｏｂ１０，ｏｂｆ１，ｏｂｐ，ｏｂｒ，ｏｃａ２，ｏｃｍ，ｏｃｐ２，ｏｃｒ１，ｏｃｒ１１，ｏｃｔ，ｏｃｔ１，ｏｃｔ１，ｏｃｔ２，ｏｃｔ２，ｏｃｔ３，ｏｃｔ７，ｏｃｔｎ２，ｏｃｔｓ３，ｏｄｃ１，ｏｄｄｄ，ｏｄｆ１，ｏｄｇ１，ｏｄｏｄ，ｏｆｃ１，ｏｆｃ２，ｏｆｃ３，ｏｆｄ１，ｏｆｅ  ｏｇ２２，ｏｇｄｈ，ｏｇｇ１，ｏｇｒ１，ｏｇｓ１，ｏｇｓ２，ｏｈｄｓ，ｏｈｓ，ｏｉａｓ，ｏｉｐ１，ｏｋ，ｏｌｆ１，ｏｌｆｍｆ，ｏｌｆｒ１，ｏｌｆｒ２，ｏｍｇ，ｏｍｇｐ，ｏｍｐ，ｏｎ，ｏｐ２，ｏｐａ１，ｏｐａ２，ｏｐａ３，ｏｐｃａ３，ｏｐｃｍ１，ｏｐｄ１，ｏｐｇ１，ｏｐｈｎ１，ｏｐ１１，ｏｐｎ，ｏ���ｐｇ，ｏｐｒｄ１，ｏｐｒｋ１，ｏｐｒｍ１，ｏｐｒｔ，ｏｐｔａ２，ｏｐｔｂ１，ｏｑｔ１，ｏｒｌｄ２，ｏｒｌｆ１，ｏｒｃ１１，ｏｒｃ２１，ｏｒｃ４１，ｏｒｃ５１，ｏｒｆｘ，ｏｒｍ１，ｏｒｍ２，ｏｒｗ，ｏｓｂｐ，ｏｓｍ，ｏｓｐ，ｏｓｔ，ｏｓｔ４８，ｏｓｘ，ｏｔｃ，ｏｔｆ１，ｏｔｆ２，ｏｔｆ３，ｏｔｍ，ｏｔｏｆ，ｏｔｓ，ｏｔｘ１，ｏｔｘ２，ｏｖｃ，ｏｖｃｓ，ｏｖｏ１１，ｏｘ４０，ｏｘａ１１，ｏｘｃｔ，ｏｘｔ，ｏｘｔｒ，ｏｚｆ，ｐ，ｐ，ｐ１，ｐ１５，ｐ１６，ｐ１６７，ｐ２８，ｐ２ｒｘ３，ｐ２ｒｘ４，ｐ２ｒｙ１，ｐ２ｒｙ２，ｐ２ｒｙ４，ｐ２ｒｙ７，ｐ２ｕ，ｐ２ｘ３，ｐ２ｘ４，ｐ２ｙ１，ｐ２ｙ２，ｐ２ｙ２，ｐ２ｙ４，ｐ３ｐ４０ｐｈｏｘ，ｐ４５０ｃ１１，ｐ４５０ｃ１７，ｐ４５０ｃ２ａ，ｐ４５０ｃ２ｄ，ｐ４５０ｃ２ｅ，ｐ４５０ｓｃｃ，ｐ４ｈａ，ｐ４ｈａ１，ｐ４ｈａ１，ｐ４ｈｂ，ｐ５ｃｄｈ，ｐ７９ｒ，ｐａ２ｇ４，ｐａｂ１，ｐａｂ２，ｐａｂｐ２，ｐａｂｐ１１，ｐａｃ１，ｐａｃ１，ｐａｃａｐｒ，ｐａｃｅ，ｐａｃｅ４，ｐａｅｐ，ｐａｆ１，ｐａｆ２，ｐａｆａｈ，ｐａｆａｈ１ｂ１，ｐａｆａｈ１ｂ２，ｐａｆａｈ１ｂ３，ｐａｇａ，ｐａｈ，ｐａｈｘ，ｐａｉ１，ｐａｉ２，ｐａｉｃｓ，ｐａｋ１，ｐａｋ３，ｐａｌｂ，ｐａｌｓ，ｐａｍ，ｐａｎｇ，ｐａｐ，ｐａｐａ，ｐａｐａ２，ｐａｐｐａ，ｐａｒ１，ｐａｒ１，ｐａｒ２，ｐａｒ３，ｐａｒ４，ｐａｒ４，ｐａｒ５，ｐａｒｋ１，ｐａｒｋ２，ｐａｒｋ３，ｐａｗｒ，ｐａｘ１，ｐａｘ２，ｐａｘ３，ｐａｘ４，ｐａｘ５，ｐａｘ６，ｐａｘ７，ｐａｘ８，ｐａｘ９，ｐｂｃａ，ｐｂｃｒａ，ｐｂｆｅ，ｐｂｇ  ｐｂｔ，ｐｂｘ１，ｐｂｘ２，ｐｂｘ３，ｐｃ，ｐｃ１，ｐｃ２，ｐｃ３，ｐｃ３，ｐｃａ１，ｐｃａｄ，ｐｃａｐ，ｐｃａｒ１，ｐｃｂｃ，ｐｃｂｄ，ｐｃｂｐ１，ｐｃｂｐ２，ｐｃｃａ，ｐｃｃｂ，ｐｃｄｈ７，ｐｃｄｘ，ｐｃｈｃ，ｐｃｈｃ１，ｐｃｉ，ｐｃｋ１，ｐｃ１，ｐｃ１ｐ，ｐｃｍ１，ｐｃｍ１，ｐｃｍｔ１，ｐｃｎａ，ｐｃｎｔ，ｐｃｏｌｃｅ，ｐｃｐ，ｐｃｐ４，ｐｃｓ，ｐｃｓｋ１，ｐｃｓｋ２，ｐｃｓｋ３，ｐｃｓｋ４，ｐｃｓｋ５，ｐｃｓｋ６，ｐｃｔｋ１，ｐｃｔｋ３，ｐｃｙｔ１，ｐｄｂ，ｐｄｂ２，ｐｄｃ，ｐｄｃ，ｐｄｃｄ１，ｐｄｃｄ２，ｐｄｄｒ，ｐｄｅ１ａ，ｐｄｅ１ｂ，ｐｄｅ１ｂ１，ｐｄｅ３ｂ，ｐｄｅ４ａ，ｐｄｅ４ｂ，ｐｄｅ４ｃ，ｐｄｅ４ｄ，ｐｄｅ５ａ，ｐ
ｄｅ６ａ，ｐｄｅ６ｂ，ｐｄｅ６ｃ，ｐｄｅ６ｄ，ｐｄｅ６ｇ，ｐｄｅ６ｈ，ｐｄｅ７ａ，ｐｄｅａ，ｐｄｅａ２，ｐｄｅｂ  ｐｄｅｂ，ｐｄｅｇ，ｐｄｅｓｌｂ，ｐｄｇｂ，ｐｄｇｆａ，ｐｄｇｆｂ，ｐｄｇｆｒ，ｐｄｇｆｒａ，ｐｄｇｆｒｂ，ｐｄｈａ１，ｐｄｈａ２，ｐｄｈｂ，ｐｄｊ，ｐｄｋ４，ｐｄｎｐ１，ｐｄｎｐ２，ｐｄｎｐ３，ｐｄｒ，ｐｄｓ，ｐｄｓ１，ｐｄｘ１，ｐｄｙｎ，ｐｅ１，ｐｅａ１５，ｐｅｂｐ２ａ１，ｐｅｂｐ２ａ３，ｐｅｃａｍ１，ｐｅｄ，ｐｅｄ，ｐｅｄｆ，ｐｅｅ，ｐｅｇ１，ｐｅｇ３，ｐｅｍｐ，ｐｅｎｋ，ｐｅｎｔ，ｐｅｏ，ｐｅｏ１，ｐｅｏ２，ｐｅｐａ，ｐｅｐｂ，ｐｅｐｃ，ｐｅｐｄ，ｐｅｐｅ，ｐｅｐｎ，ｐｅｐｓ，ｐｅｒ，ｐｅｒ２，ｐｅｔａ３，ｐｅｔｓ１，ｐｅｘ１，ｐｅｘ５，ｐｅｘ６，ｐｅｘ７，ｐｆ４，ｐｆ４ｖ１，ｐｆａｓ，ｐｆｂｉ，ｐｆｃ，ｐｆｄ，ｐｆｈｂ１，ｐｆｉｃ１，ｐｆｉｃ２，ｐｆｋｆｂ１，ｐｆｋｆｂ２，ｐｆｋ１，ｐｆｋ−ｍｎ，ｐｆｋｐ，ｐｆｋｘ，ｐｆ１，ｐｆｍ，ｐｆｎ１，ｐｆｎ２，ｐｆｒｘ，ｐｇａ３，ｐｇａ４，ｐｇａ５，ｐｇａｍ１，ｐｇａｍ２，ｐｇａｍｍ，ｐｇｃ，ｐｇｄ，ｐｇｆ，ｐｇｆｔ，ｐｇｋ１，ｐｇｋ２，ｐｇｋａ，ｐｇ１，ｐｇｌ１，ｐｇｌ２，ｐｇｍ１，ｐｇｍ２，ｐｇｍ３，ｐｇｍ５，ｐｇｎ，ｐｇｐ，ｐｇｐ１，ｐｇｒ，ｐｇｓ，ｐｇｔ，ｐｇｙ１，ｐｇｙ３，ｐｈａ１，ｐｈａ２，ｐｈａ２ａ，ｐｈａ２ｂ，ｐｈａｐ１，ｐｈｂ，ｐｈｃ，ｐｈｅ１ａ，ｐｈｅ３，ｐｈｅｘ，ｐｈｆ１，ｐｈｈｉ，ｐｈｈｉ，ｐｈｋ，ｐｈｋａ１，ｐｈｋａ２，ｐｈｋｂ，ｐｈｋｄ，ｐｈｋｇ１，ｐｈｋｇ２，ｐｈ１，ｐｈｌ１１，ｐｈｏｇ，ｐｈｏｘ１，ｐｈｏｘ２ａ，ｐｈｐ，ｐｈｐ１ｂ，ｐｈｐｘ，ｐｈｙｈ，ｐｉ，ｐｉ１０，ｐｉ３，ｐｉ４，ｐｉ５，ｐｉ６，ｐｉ７，ｐｉ８，ｐｉ９，ｐｉｇａ，ｐｉｇｃ，ｐｉｇｆ，ｐｉｇｈ，ｐｉｇｒ，ｐｉｋ３ｃ２ｂ，ｐｉｋ３ｃａ，ｐｉｋ３ｒ１，ｐｉｋ４ｃｂ，ｐｉ１，ｐｉｍ１，ｐｉｎ，ｐｉｎ１，ｐｉｎ１１，ｐｉｐ，ｐｉｐ５ｋ１ｂ，ｐｉｒ１，ｐｉｒ５１，ｐｉｔ，ｐｉｔ１，ｐｉｔｐｎ，ｐｉｔｘ１，ｐｉｔｘ２，ｐｉｔｘ３，ｐｊｓ，ｐｋ１，ｐｋ１２０，ｐｋ３，ｐｋ４２８，ｐｋｃａ，ｐｋｃｂ，ｐｋｃｃ，ｐｋｃｇ，ｐｋｃｓ１，ｐｋｄ１，ｐｋｄ２，ｐｋｄ４，ｐｋｄｔｓ，ｐｋｈｄ１，ｐｋｌｒ，ｐｋｍ２，ｐｋｐ１，ｐｋｓ１，ｐｋｓ１，ｐｋｓ２，ｐｋｕ１，ｐｌ，ｐｌａ２，ｐｌａ２ａ，ｐｌａ２ｂ，ｐｌａ２ｇ１ｂ，ｐｌａ２ｇ２ａ，ｐｌａ２ｇ４，ｐｌａ２ｇ４ａ，ｐｌａ２ｇ５，ｐｌａ２１，ｐｌａ２１，ｐｌａｇ１，ｐｌａｇ１１，ｐｌａｎｈ１，ｐｌａｎｈ２，ｐｌａｎｈ３，ｐｌａｔ，ｐｌａｕ，ｐｌａｕｒ，ｐｌｂ，ｐｌｃ，ｐｌｃ１，ｐｌｃｂ３，ｐｌｃｂ４，ｐｌｃｄ１，ｐｌｃｅ，ｐｌｃｇ１，ｐｌｃｇ２，ｐｌｃ１，ｐｌｄ１，ｐｌｅｃ１，ｐｌｇ，ｐｌｇｆ，ｐｌｇ１，ｐｌｉ，ｐｌｎ，ｐｌｏｄ，ｐｌｏｄ２，ｐｌｏｓ１，ｐｌｐ，ｐｌｓ，ｐｌｓ１，ｐｌｔ１，ｐｌｔｎ，ｐｌｔｐ，ｐｌｚｆ，ｐｍｃａ１，ｐｍｃａ２，ｐｍｃａ３，ｐｍｃａ４，ｐｍｃｈ，ｐｍｃｈ１１，ｐｍｃｈ１２，ｐｍｄ，ｐｍｅ１１７，ｐｍｉ１，ｐｍ１，ｐｍｍ１，ｐｍｍ２，ｐｍｐ２，ｐｍｐ２２，ｐｍｐ３５，ｐｍ���６９，ｐｍｐ７０，ｐｍｓ１，ｐｍｓ２，ｐｍｓ１１，ｐｍｓ１２，ｐｍｘ１，ｐｎ１，ｐｎｄ，ｐｎｅｍ，ｐｎｋｄ，ｐｎｌｉｐ，ｐｎｍｔ，ｐｎｏｃ，ｐｏｄ１，ｐｏｄｘ１，ｐｏｆ，ｐｏｆ１，ｐｏ１２ｒｂ，ｐｏｌａ，ｐｏｌｂ，ｐｏｌｄ１，ｐｏｌｄ２，ｐｏｌｅ，ｐｏｌｇ，ｐｏｌｒ２ａ，ｐｏｌｒ２ｃ，ｐｏｌｒ２ｅ，ｐｏｌｒ２ｇ，ｐｏｌｒ２ｉ，ｐｏｌｒｍｔ，ｐｏｌｚ，ｐｏｍｃ，ｐｏｎ，ｐｏｎ１，ｐｏｎ２，ｐｏｎ３，ｐｏｒ，ｐｏｒｃ，ｐｏｔｘ，ｐｏｕ１ｆ１，ｐｏｕ２ａｆ１，ｐｏｕ３ｆ１，ｐｏｕ３ｆ２，ｐｏｕ３ｆ３，ｐｏｕ３ｆ４，ｐｏｕ４ｆ１，ｐｏｕ４ｆ３，ｐｏｕ５ｆ１，ｐｐ，ｐｐｌ４，ｐｐ２，ｐｐ４，ｐｐ５，ｐｐａｃ，ｐｐａｒｄ，ｐｐａｒｇ，ｐｐａｒｇ１，ｐｐａｒｇ２，ｐｐａｔ，ｐｐｂｐ，ｐｐｃｄ，ｐｐｄ，ｐｐｅｆ１，ｐｐｅｆ２，ｐｐｆｉａ３，ｐｐｇｂ，ｐｐｈ，ｐｐｈ１，ｐｐｉａ，ｐｐｉｄ，ｐｐｉｌ１，ｐｐｋｂ，ｐｐｋｓ１，ｐｐｋｓ２，ｐｐ１，ｐｐｌａ２，ｐｐｍｘ，ｐｐｎｄ，ｐｐｎｏｃ，ｐｐｏ１，ｐｐｏｘ，ｐｐｐ１ａ，ｐｐｐ１ｃａ，ｐｐｐ１ｃｂ，ｐｐｐ１ｃｃ，ｐｐｐ１ｒ２，ｐｐｐ１ｒ５，ｐｐｐ１ｒ７，ｐｐｐｄ１ｒ８，ｐｐｐ２ｂ，ｐｐｐ２ｃａ，ｐｐｐ２ｃｂ，ｐｐｐ２ｒ１ｂ，ｐｐｐ２ｒ４，ｐｐｐ２ｒ５ａ，ｐｐｐ２ｒ５ｂ，ｐｐｐ２ｒ５ｃ，ｐｐｐ２ｒ５ｄ，ｐｐｐ２ｒ５ｅ，ｐｐｐ３ｃａ，ｐｐｐ３ｃｂ，ｐｐｐ３ｃｃ，ｐｐ３ｒ１，ｐｐｐ４ｃ，ｐｐｐ５ｃ，ｐｐｔ，ｐｐｔ２，ｐｐｘ，ｐｐｙ，ｐｐｙｒ１，ｐｒ＠，ｐｒａｄ１，ｐｒｂ１，ｐｒｂ２，ｐｒｂ３，ｐｒｂ４，ｐｒｃａ１，ｐｒｃａ２，ｐｒｃｃ，ｐｒｃｐ，ｐｒｅ１ｐ，ｐｒｅｐ，ｐｒｆ１，ｐｒｇ，ｐｒｇ１，ｐｒｇ１，ｐｒｇｓ，ｐｒｈ１，ｐｒｈ２，ｐｒｉｍ１，ｐｒｉｍ２ａ，ｐｒｉｍ２ｂ，ｐｒｉｐ，ｐｒｋ１，ｐｒｋａａ１，ｐｒｋａａ２，ｐｒｋａｂ１，ｐｒｋａｃａ，ｐｒｋａｃｂ，ｐｒｋａｃｇ，ｐｒｋａｇ１，ｐｒｋａｇ２，ｐｒｋａｒ１ａ，ｐｒｋａｒ１ｂ，ｐｒｋａｒ２ｂ，ｐｒｋｃａ，ｐｒｋｃｂ１，ｐｒｋｃｄ，ｐｒｋｃｇ，ｐｒｋｃｉ，ｐｒｋｃｌ１，ｐｒｋｃｎｈ１，ｐｒｋｃｑ，ｐｒｋｃｓｈ，ｐｒｋｄｃ，ｐｒｋｇ１，ｐｒｋｇ１ｂ，ｐｒｋｇ２，ｐｒｋｇｒ１ｂ，ｐｒｋｇｒ２，ｐｒｋｍ１，ｐｒｋｍ３，ｐｒｋｍ４，ｐｒｋｍ９，ｐｒｋｎ，ｐｒｋｒ，ｐｒｋｘ，ｐｒｋｙ，ｐｒ１，ｐｒｌｒ，ｐｒｍ１，ｐｒｍ２，ｐｒｍｔ２，ｐｒｎｐ，ｐｒｏａ，ｐｒｏｃ，ｐｒｏｄｈ，ｐｒｏｈｂ，ｐｒｏｐ１，ｐｒｏｓ１，ｐｒｏｓ３０，ｐｒｏｘ１，ｐｒｐ８，ｐｒｐｈ，ｐｒｐｓ１，ｐｒｐｓ２，ｐｉｐｓａｐ１，ｐｒｒ１，ｐｒｒ２，ｐｒｓ，ｐｒｓｃ１，ｐｒｓｓ１，ｐｒｓｓｌ１，ｐｒｓｓ２，ｐｒｓｓ７，ｐｒｓｓ８，ｐｒｓｓ１１，ｐｒｔｎ３，ｐｒｔｓ，ｐｓａ，ｐｓａ，ｐｓａｃｈ，ｐｓａｐ，ｐｓｂｇ１，ｐｓｂｇ２，ｐｓｃ２，ｐｓｃ５，ｐｓｃａ，ｐｓｄ，ｐｓｅｎ１，ｐｓｅｎ２，ｐｓｆ１，ｐｓｆ２，ｐｓｇ１，ｐｓｇ１１，ｐｓｇ１２，ｐｓｇ１３，ｐｓｇ２，ｐｓｇ３，ｐｓｇ４，ｐｓｇ５，ｐｓｇ６，ｐｓｇ７，ｐｓｇ８，ｐｓｇ１１，ｐｓｋｈ１，ｐｓｍ，ｐｓｍａ１，ｐｓｍａ２，ｐｓｍａ３，ｐｓｍａ５，ｐｓｍｂ１，ｐｓｍｂ１０，ｐｓｍｂ２，ｐｓｍｂ３，���ｓｍｂ４，ｐｓｍｂ５，ｐｓｍｂ８，ｐｓｍｂ９，ｐｓｍｃ１，ｐｓｍｃ２，ｐｓｍｃ３，ｐｓｍｃ５，ｐｓｍｄ７，ｐｓｍｄ９，ｐｓｍｅ１，ｐｓｍｅ２，ｐｓｏｒｓ１，ｐｓｏｒｓ２，ｐｓｏｒｓ３，ｐｓｐ，ｐｓｐｓ１，ｐｓｐｓ２，ｐｓｓ１，ｐｓｓｔ，ｐｓｔ，ｐｓｔ，ｐｓｔ１，ｐｓｔｉ，ｐｔａｆｒ，ｐｔｃ，ｐｔｃ，ｐｔｃ，ｐｔｃｈ，ｐｔｄ，ｐｔｅｎ，ｐｔｇｄｓ，ｐｔｇｅｒ１，ｐｔｇｅｒ２，ｐｔｇｅｒ３，ｐｔｇｆｒ，ｐｔｇｆｒｎ，ｐｔｇｉｒ，ｐｔｇｓ１，ｐｔｇｓ２，ｐｔｈ，ｐｔｈｌｈ，ｐｔｈｒ，ｐｔｈｒ１，ｐｔｈｒ２，ｐｔｋ１，ｐｔｋ２，ｐｔｋ２ｂ，ｐｔｋ３，ｐｔｋ７，ｐｔｌａｈ，ｐｔｍａ，ｐｔｍｓ，ｐｔｎ，ｐｔｏｓ１，ｐｔｐ１８，ｐｔｐ１ｂ，ｐｔｐ４ａ１，ｐｔｐ４ａ２，ｐｔｐａ，ｐｔｐａ，ｐｔｐｄ，ｐｔｐｇ，ｐｔｐｇ１，ｐｔｐｇｍｃ１，ｐｔｐｎ１，ｐｔｐｎ１０，ｐｔｐｎ１１，ｐｔｐｎ１２，ｐｔｐｎ１３，ｐｔｐｎ１４，ｐｔｐｎ２，ｐｔｐｎ５，ｐｔｐｎ６，ｐｔｐｎ７，ｐｔｐｒａ，ｐｔｐｒｂ，ｐｔｐｒｃ，ｐｔｐｒｃａｐ，ｐｔｐｒｄ，ｐｔｐｒｅ，ｐｔｐｒｆ，ｐｔｐｒｇ，ｐｔｐｒｈ，ｐｔｐｒｊ，ｐｔｐｒｋ，ｐｔｐｒ１１，ｐｔｐｒｌ２，ｐｔｐｒｍ，ｐｔｐｒｎ，ｐｔｐｒｏ，ｐｔｐｒｓ，ｐｔｐｒｚ１，ｐｔｐｔ，ｐｔｓ，ｐｔｓ１ｒ，ｐｔｘ１，ｐｔｘ３，ｐｕｊｏ，ｐｕｍ，ｐｕｒ１，ｐｕｒ１，ｐｕｒａ，ｐｖａｌｂ，ｐｖｒ，ｐｖｒ１１，ｐｖｒ１２，ｐｖｒｒ１，ｐｖｒｒ２，ｐｖｓ，ｐｖｔ１，ｐｗｃｒ，ｐｗｐ２，ｐｗｐ２ｈ，ｐｗｓ，ｐｘａａａ１，ｐｘｅ，ｐｘｅ１，ｐｘｆ，ｐｘｍｐ１，ｐｘｍｐ１１，ｐｘｍｐ３，ｐｘｒ１，ｐｙｃｒ１，ｐｙｃｓ，ｐｙｇｂ，ｐｙｇ１，ｐｙｇｍ，ｐｙｋ２，ｐｙｓｔ１，ｐｙｓｔ２，ｐｚｐ，ｑａｒｓ，ｑｄｐｒ，ｑｉｎ，ｑｍ，ｑｐｃ，ｑｐｒｓ，ｒａｂ，ｒａｂ１，ｒａｂ１３，ｒａｂ１ａ，ｒａｂ２１，ｒａｂ３ａ，ｒａｂ３ｂ，ｒａｂ４，ｒａｂ５，ｒａｂ５ａ，ｒａｂ６，ｒａｂ７，ｒａｂｇｄｌａ，ｒａｂｇｄｉｂ，ｒａｂｇｇｔａ，ｒａｂｇｇｔｂ，ｒａｂｉｆ，ｒａｃ２，ｒａｃ３，ｒａｄ１，ｒａｄ１７，ｒａｄ２３ａ，ｒａｄ２３ｂ，ｒａｄ５１ａ，ｒａｄ５１ｃ，ｒａｄ５１ｄ，ｒａｄ５３１１，ｒａｄ５２，ｒａｄ５４，ｒａｄ６ａ，ｒａｄ６ｂ，ｒａｆ１，ｒａｆａ１，ｒａｇ１，ｒａｇ２，ｒａｇｅ，ｒａｌａ，ｒａｌｂ，ｒａｌｇｄｓ，ｒａｍｐ，ｒａｎｂｐ２１１，ｒａｎｂｐ３，ｒａｏ，ｒａｐ１ａ，ｒａｐ１ｂ，ｒａｐ１ｇａ１，ｒａｐ１ｇｄｓ１，ｒａｐ２ａ，ｒａｐ７４，ｒａｐｓｎ，ｒａｒａ，ｒａｒｂ，ｒａｒｇ，ｒａｒｓ，ｒａｓａ１，ｒａｓａ２，ｒａｓｇｆｒ３，ｒａｓｋ２，ｒｂ１，ｒｂｂｐ２，ｒｂｂｐ５，ｒｂｂｐ６，ｒｂ１１，ｒｂ１２，ｒｂｍ１，ｒｂｍ２，ｒｂｍ３，ｒｂｍｙ１ａ１，ｒｂｐ１，ｒｂｐ２，ｒｂｐ３，ｒｂｐ４，ｒｂｐ５，ｒｂｐ５６，ｒｂｐ６，ｒｂｑ３，ｒｂｔｎ１，ｒｂｔｎ１１，ｒｂｔｎ１２，ｒｃａ１，ｒｃａｃ＠，ｒｃｃ１，ｒｃｃｐ１，ｒｃｃｐ２，ｒｃｄ１，ｒｃｄ２，ｒｃｄｐ１，ｒｃｎ１，ｒｃｎ２，ｒｃｐ，ｒｃｖ１，ｒｄ，ｒｄｂｐ，ｒｄｃ７，ｒｄｐ，ｒｄｐａ，ｒｄｒｃ，ｒｄｓ，ｒｄｔ，ｒｄｘ，ｒｅｃａ，ｒｅｃｃ１，ｒｅｃｑ１，ｒｅｄ１，���ｅｄ２，ｒｅｇ，ｒｅｇ１ａ，ｒｅｇ１，ｒｅ１，ｒｅｌａ，ｒｅｌｎ，ｒｅｎ，ｒｅｎｂｐ，ｒｅｎｓ１，ｒｅｎｔ１，ｒｅｐ８，ｒｅｑ，ｒｅｔ，ｒｅｖ３，ｒｅｖ３１，ｒｆｃ１，ｒｆｃ２，ｒｆｃ３，ｒｆｃ４，ｒｆｃ５，ｒｆｐ，ｒｆｘ１，ｒｆｘ２，ｒｆｘ５，ｒｆｘａｎｋ，ｒｆｘａｐ，ｒｇｃ１，ｒｇｒ，ｒｇｓ，ｒｇｓ１，ｒｇｓ１４，ｒｇｓ１６，ｒｇｓ２，ｒｇｓ２，ｒｇｓ３，ｒｇｓ５，ｒｈ５０ａ，ｒｈａｇ，ｒｈｂｄ１，ｒｈｃ，ｒｈｃｅ，ｒｈｄ，ｒｈｅｂ２，ｒｈｏ，ｒｈｏ７，ｒｈｏｇａｐ２，ｒｈｏｇａｐ３，ｒｈｏｈ１２，ｒｈｏｈ６，ｒｈｏｈ９，ｒｈｏｋ，ｒｈｏｍ１，ｒｈｏｍ２，ｒｈｏｍ３，ｒｉｅｇ１，ｒｉｅｇ２，ｒｉｇｅ，ｒｉｇｕｉ，ｒｉｎｇ１，ｒｉｎｇ１０，ｒｉｎｇ１１，ｒｉｎｇ１２，ｒｉｎｇ３，ｒｉｎｇ３１，ｒｉｎｇ４，ｒｉｎｇ５，ｒｉｎｇ６，ｒｉｎｇ７，ｒｉｐ，ｒｉｐ１４０，ｒｉｚ，ｒｋ，ｒ１，ｒｌｂｐ１，ｒｌｆ，ｒｌｎ１，ｒｌｎ２，ｒｍｃｈ１，ｒｍｄ１，ｒｍｒｐ，ｒｍｒｐｒ，ｒｎ５ｓ１＠，ｒｎａｓｅ１，ｒｎａｓｅ２，ｒｎａｓｅ３，ｒｎａｓｅ４，ｒｎａｓｅ５，ｒｎａｓｅ６，ｒｎａｓｅ１，ｒｎａｓｅｌｉ，ｒｎｅ１，ｒｎｆ１，ｒｎｆ３，ｒｎｆ４，ｒｎｆ５，ｒｎｈ，ｒｎｐｅｐ，ｒｎｐｕｌｚ，ｒｎｒ１，ｒｎｒ２，ｒｎｒ３，ｒｎｒ４，ｒｎｒ５，ｒｎｓ１，ｒｎｓ２，ｒｎｓ３，ｒｎｓ４，ｒｎｓ４，ｒｎｓ４ｉ，ｒｎｔｍｉ，ｒｎｕ１，ｒｎｕ１５ａ，ｒｎｕ１７ａ，ｒｎｕ１７ｂ，ｒｎｕｌａ，ｒｎｕ２，ｒｎｕ３，ｒｏ５２，ｒｏｍ１，ｒｏｍｋ１，ｒｏｎ，ｒｏｒ１，ｒｏｒａ，ｒｏｒｂ，ｒｏｒｃ，ｒｏｒｇ，ｒｏｓ１，ｒｏｓｐ１，ｒｏｘ，ｒｐ１，ｒｐ１０，ｒｐ１０５，ｒｐ１１，ｒｐ１２，ｒｐ１３，ｒｐ１４，ｒｐ１５，ｒｐ１７，ｒｐ１８，ｒｐ１９，ｒｐ２，ｒｐ２２，ｒｐ２４，ｒｐ２５，ｒｐ３，ｒｐ４，ｒｐ６，ｒｐ７，ｒｐ９，ｒｐａ１，ｒｐａ２，ｒｐａ３，ｒｐｄ３１１，ｒｐｅ，ｒｐｅ６５，ｒｐｅ１１９ｒｐ１２２，ｒｐ１２３ａ，ｒｐ１２３１，ｒｐ１２９，ｒｐ１３０，ｒｐ１３５ａ，ｒｐ１３６ａ，ｒｐ１７ａ，ｒｐｍｓ１２，ｒｐｎ１，ｒｐｎ２，ｒｐｏ１２，ｒｐｓ１１，ｒｐｓ１４，ｒｐｓ１７，ｒｐｓ１７ａ，ｒｐｓ１７ｂ，ｒｐｓ１７１１，ｒｐｓ１７１２，ｒｐｓ１８，ｒｐｓ２０ａ，ｒｐｓ２０ｂ，ｒｐｓ２４，ｒｐｓ２５，ｒｐｓ３，ｒｐｓ４ｘ，ｒｐｓ４ｙ，ｒｐｓ６，ｒｐｓ６ｋａ１
，ｒｐｓ６ｋａ２，ｒｐｓ６ｋａ３，ｒｐｓ８，ｒｐｓｍ１２，ｒｐｔｐｍ，ｒｐｕ１，ｒｐｘ，ｒｒａｄ，ｒｒａｓ，ｒｒｂｐ１，ｒｒｅｂ１，ｒｒｍ１，ｒｒｍ２，ｒｒｐ，ｒｒｐ２２，ｒｓ１，ｒｓ１，ｒｓｃｌａ１，ｒｓｋ１，ｒｓｋ２，ｒｓｋ３，ｒｓｎ，ｒｓｓ，ｒｓｔｓ，ｒｓｕ１，ｒｔ６，ｒｔｅｆ１，ｒｔｋｎ，ｒｔｎ１，ｒｔｎ２，ｒｔｓ，ｒｔｓ，ｒｔｔ，ｒｗｓ，ｒｘｒａ，ｒｘｒｂ，ｒｘｒｇ，ｒｙｒ１，ｒｙｒ２，ｒｙｒ３，ｒｚｒｂ，ｒｚｒｇ，ｓ１００ａ１，ｓ１００ａ１０，ｓ１００ａ１１，ｓ１００ａ１２，ｓ１００ａ１３，ｓ１００ａ２，ｓ１００ａ３，ｓ１００ａ４，ｓ１００ａ５，ｓ１００ａ６，ｓ１００ａ７，ｓ１００ａ８，ｓ１００ａ９，ｓ１００ｂ，ｓ１００ｄ，ｓ１００ｅ，ｓ１００，ｓ１００ｐ，ｓ１５２，ｓ４，ｓ７，ｓａａ１，ｓａａ２，ｓａａ４，ｓａｃｓ，ｓａｆｂ，ｓａｇ，ｓａｈ，ｓａｈｈ，ｓａｉ１，ｓａｋａｐ８４，ｓａｌ１１，ｓａｌ１２，ｓａｍｓ１，ｓａｍｓ２，ｓａｐ，ｓａｐ１，ｓａｐ１，ｓａｐ２，ｓａｐ６２，ｓａｒ，ｓａｒ１，ｓａｒ２，ｓａｒｄ，ｓａｓ，ｓａｔ，ｓａｔｂ１，ｓａｔｔ，ｓｂｍａ，ｓｃ，ｓｃ１，ｓｃ５ｄ１，ｓｃａ１，ｓｃａ１０，ｓｃａ２，ｓｃａ２，ｓｃａ３，ｓｃａ４，ｓｃａ５，ｓｃａ６，ｓｃａ７，ｓｃａ８，ｓｃａ８，ｓｃａｒ，ｓｃｃａ１，ｓｃｃａ２，ｓｃｃｄ，ｓｃｄ，ｓｃｅｈ，ｓｃｇ１，ｓｃｇ２，ｓｃｇ３，ｓｃｈａｄ，ｓｃｉｄａ，ｓｃｉｄｘ，ｓｃｉｄｘ１，ｓｃ１，ｓｃｌｃ１，ｓｃｌ１，ｓｃｎ，ｓｃｎ１ａ，ｓｃｎ１ｂ，ｓｃｎ２ａ，ｓｃｎ２ａ１，ｓｃｎ２ａ２，ｓｃｎ２ｂ，ｓｃｎ３ａ，ｓｃｎ４ａ，ｓｃｎ５ａ，ｓｃｎ６ａ，ｓｃｎ８ａ，ｓｃｎｎ１ａ，ｓｃｎｎ１ｂ，ｓｃｎｎ１ｄ，ｓｃｎｎ１ｇ，ｓｃｏｔ，ｓｃｐ，ｓｃｐ１，ｓｃｐ２，ｓｃｐｎ，ｓｃｒａ１，ｓｃｒａ１，ｓｃｓ，ｓｃｔｒ，ｓｃｙａ１，ｓｃｙａ１１，ｓｃｙａ１３，ｓｃｙａ１４，ｓｃｙａ１５，ｓｃｙａ１６，ｓｃｙａ１９，ｓｃｙａ２，ｓｃｙａ２１，ｓｃｙａ２２，ｓｃｙａ２４，ｓｃｙａ２５，ｓｃｙａ３，ｓｃｙａ３１１，ｓｃｙａ４，ｓｃｙａ５，ｓｃｙａ７，ｓｃｙａ８，ｓｃｙｂ５，ｓｃｙｂ６，ｓｃｙｄ１，ｓｃｚｄ１，ｓｃｚｄ２，ｓｃｚｄ３，ｓｃｚｄ４，ｓｃｚｄ５，ｓｃｚｄ６，ｓｃｚｄ７，ｓｃｚｄ８，ｓｄｃ１，ｓｄｃ２，ｓｄｃ４，ｓｄｆ１，ｓｄｆ２，ｓｄｈ１，ｓｄｈ２，ｓｄｈａ，ｓｄｈｂ，ｓｄｈｃ，ｓｄｈｄ，ｓｄｈｆ，ｓｄｓ２２，ｓｄｔｙ３，ｓｄｙｓ，ｓｅ，ｓｅａ，ｓｅｃ１３１１，ｓｅｃ１３ｒ，ｓｅｃ１４ｌ，ｓｅｃ７，ｓｅｄ１，ｓｅｄｔ，ｓｅｆ２，ｓｅｌ１ｌ，ｓｅｌｅ，ｓｅｌ１，ｓｅｌｐ，ｓｅｌｐ１ｇ，ｓｅｍａ３ｆ，ｓｅｍａ４，ｓｅｍａ５，ｓｅｍｇ，ｓｅｍｇ１，ｓｅｍｇ２，ｓｅｎ１，ｓｅｐ，ｓｅｐｐ１，ｓｅｒｃａ１，ｓｅｒｃａ３，ｓｅｒｋ１，ｓｅｓ１，ｓｅｔ，ｓｅｘ，ｓｆ，ｓｆ１，ｓｆａ１，ｓｆｄ，ｓｆｍｄ，ｓｆｒｓ１，ｓｆｒｓ２，ｓｆｒｓ７，ｓｆｔｂ３，ｓｆｔｐ１，ｓｆｔｐ２，ｓｆｔｐ４，ｓｆｔｐａ１，ｓｆｔｐａ２，ｓｆｔｐｂ，ｓｆｔｐｃ，ｓｆｔｐｄ，ｓｇｂ，ｓｇｃａ，ｓｇｃｂ，ｓｇｃｄ，ｓｇｃｇ，ｓｇｄ，ｓｇｋ，ｓｇｌｔ１，ｓｇｌｔ２，ｓｇｍ１，ｓｇｎｅ１，ｓｇｐ２，ｓｇｐａ，ｓｇｓｈ，ｓｈ２ｄ１ａ，ｓｈ３ｂｐ２，ｓｈ３ｄ１ａ，ｓｈ３ｇｂｒ，ｓｈ３ｐ１７，ｓｈｂ，ｓｈｂｇ，ｓｈｃ１，ｓｈｃ１１，ｓｈｆｄ１，ｓｈｆｄ２，ｓｈｆｍ１，ｓｈｆｍ２，ｓｈｆｍ３，ｓｈｈ，ｓｈｉｐ，ｓｈｍｔ１，ｓｈｍｔ２，ｓｈｏｃ２，ｓｈｏｔ，ｓｈｏｘ，ｓｈｏｘ２，ｓｈｐｓ１，ｓｈｓ，ｓｈｓｆ１，ｓｉ，ｓｉａｈ１，ｓｉａｈ２，ｓｉａｓｄ，ｓｉａｔ１，ｓｉａｔ４，ｓｉａｔ４ｃ，ｓｉａｔ８，ｓｉｄｓ，ｓｉ１，ｓｉｌｖ，ｓｉｍ１，ｓｉｍ２，ｓｉｐａ１，ｓｉｓ，ｓｉｖ，ｓｉｘ１，ｓｉｘ５，ｓｊａ，ｓｊｓ，ｓｋｉ，ｓｋｉ２，ｓｋｉ２ｗ，ｓｋｉｖ２１，ｓｋｐ１ａ，ｓｋｐ１ｂ，ｓｋｐ２，ｓｌａ，ｓｌａｐ，ｓｌｂｐ，ｓｌｃ，ｓｌｃ１０ａ１，ｓｌｃ１０ａ２，ｓｌｃ１２ａ１，ｓｌｃ１２ａ２，ｓｌｃ１２ａ３，ｓｌｃ１４ａ１，ｓｌｃ１４ａ２，ｓｌｃ１５ａ１，ｓｌｃ１６ａ１，ｓｌｃ１６ａ２，ｓｌｃ１７ａ１，ｓｌｃ１７ａ２，ｓｌｃ１８ａ１，ｓｌｃ１８ａ２，ｓｌｃ１８ａ３，ｓｌｃ１９ａ１，ｓｌｃ１ａ１，ｓｌｃ１ａ２，ｓｌｃ１ａ３，ｓｌｃ１ａ４，ｓｌｃ１ａ５，ｓｌｃ２０ａ１，ｓｌｃ２０ａ２，ｓｌｃ２０ａ３，ｓｌｃ２１ａ２，ｓｌｃ２１ａ３，ｓｌｃ２２ａ１，ｓｌｃ２２ａ２，ｓｌｃ２２ａ５，ｓｌｃ２ａ１，ｓｌｃ２ａ２，ｓｌｃ２ａ３，ｓｌｃ２ａ４，ｓｌｃ２ａ５，ｓｌｃ２ｃ，ｓｌｃ３ａ１，ｓｌｃ４ａ１，ｓｌｃ４ａ２，ｓｌｃ４ａ６，ｓｌｃ５ａ１，ｓｌｃ５ａ２，ｓｌｃ５ａ３，ｓｌｃ５ａ５，ｓｌｃ６ａ１，ｓｌｃ６ａ１０，ｓｌｃ６ａ１２，ｓｌｃ６ａ２，ｓｌｃ６ａ３，ｓｌｃ６ａ４，ｓｌｃ６ａ６，ｓｌｃ６ａ８，ｓｌｃ６ａ９，ｓｌｃ７ａ１，ｓｌｃ７ａ２，ｓｌｃ７ａ４，ｓｌｃ７ａ５，ｓｌｃ７ａ７，ｓｌｃ８ａ１，ｓｌｃ８ａ２，ｓｌｃ９ａ１，ｓｌｃ９ａ２，ｓｌｃ９ａ３，ｓｌｃ９ａ４，ｓｌｃ９ａ５，ｓｌｄ，ｓｌｅ１，ｓｌｅｂ１，ｓｌｉｍ１，ｓｌｎ，ｓｌｏ，ｓｌｏｓ，ｓｌｐ７６，ｓｌｓ，ｓｌｕｇ，ｓｍ１，ｓｍ２２，ｓｍａ４，ｓｍａｄ１，ｓｍａｄ１，ｓｍａｄ２，ｓｍａｄ３，ｓｍａｄ４，ｓｍａｄ５，ｓｍａｄ６，ｓｍａｄ７，ｓｍａｄ９，ｓｍａ１，ｓｍａｍ１，ｓｍａｒｃａ１，ｓｍａｒｃａ２，ｓｍａｒｃａ３，ｓｍａｒｃａ５，ｓｍａｒｃｂ１，ｓｍａｘ２，ｓｍｃ１，ｓｍｃｃ，ｓｍｃｒ，ｓｍｃｘ，ｓｍｃｙ，ｓｍｌ１，ｓｍｎ，ｓｍｎ１，ｓｍｎ２，ｓｍｎｒ，ｓｍｏ，ｓｍｏｈ，ｓｍｐｄ１，ｓｍｓ，ｓｍｔ３，ｓｍｔ３ｈ１，ｓｍｔｎ，ｓｍｕｂｐ２，ｓｎ，ｓｎａｐ２５，ｓｎａｔ，ｓｎｃａ，ｓｎｃｂ，ｓｎｃｇ，ｓｎｆ２ｈ，ｓｎｆ２１１，ｓｎｆ２１２，ｓｎｆ２１３，ｓｎｆ５，ｓｎ１，ｓｎｎ，ｓｎｒｐ７０，ｓｎｒｐａ，ｓｎｒｐｅ，ｓｎｒｐｎ，ｓｎｔ１，ｓｎｔ２ｂ１，ｓｎｔ２ｂ２，ｓｎｔｂ１，ｓｎｔ１，ｓｎｘ，ｓｏａｔ，ｓｏｄ１，ｓｏｄ２，ｓｏｄ３，ｓｏｌｈ，ｓｏｎ，ｓｏｒｄ，ｓｏｒ１１，ｓｏｓ１，ｓｏｓ２，ｓｏｘ１，ｓｏｘ１０，ｓｏｘ１１，ｓｏｘ２，ｓｏｘ２０，ｓｏｘ２２，ｓｏｘ３，ｓｏｘ４，ｓｏｘ９，ｓｐ１，ｓｐ１，ｓｐ３，ｓｐ３，ｓｐ４，ｓｐａ１，ｓｐａｇ１，ｓｐａｇ４，ｓｐａｍ１，ｓｐａｒｃ，ｓｐａｔ，ｓｐｂｐ，ｓｐｃｈ１，ｓｐｄ，ｓｐｆ３０，ｓｐｇ３ａ，ｓｐｇ４，ｓｐｇ５ａ，ｓｐｇ６，ｓｐｇ７，ｓｐｇ８，ｓｐｇ９，ｓｐｇｐ，ｓｐｇｙｌａ，ｓｐｈ２，ｓｐｉ１，ｓｐｉｎｋ１，ｓｐｋ，ｓｐｍｄ，ｓｐｎ，ｓｐｐ１，ｓｐｐ２，ｓｐｐｍ，ｓｐｒ，ｓｐｒｋ，ｓｐｒｒ１ａ，ｓｐｒｒ１ｂ，ｓｐｒｒ２ａ，ｓｐｒｒ２ｂ，ｓｐｒｒ２ｃ，ｓｐｒｒ３，ｓｐｓ１，ｓｐｓｍａ，ｓｐｔａ１，ｓｐｔａｎ１，ｓｐｔｂ，ｓｐｔｂｎ１，ｓｒａ１，ｓｒａ２，ｓｒｃ，ｓｒｃ１，ｓｒｃ１，ｓｒｃ２，ｓｒｄ５ａ１，ｓｒｄ５ａ２，ｓｒｅｂｆ１，ｓｒｅｂｆ２，ｓｒｉ，ｓｒｋ，ｓｒｍ，ｓｒｎ１，ｓｒｐ１４，ｓｒｐ１９，ｓｒｐ４６，ｓｒｐｒ，ｓｒｐｘ，ｓｒｓ，ｓｒｖｘ，ｓｒｙ，ｓｓ，ｓｓ，ｓｓａ，ｓｓａ１，ｓｓａ２，ｓｓａｄｈ，ｓｓａｖ１，ｓｓｂｐ，ｓｓｄｄ，ｓｓｒ２，ｓｓｒｃ，ｓｓｔ，ｓｓｔｒ１，ｓｓｔｒ２，ｓｓｔｒ３，ｓｓｔｒ４，ｓｓｔｒ５，ｓｓｘ１，ｓｓｘｔ，ｓｔ２，ｓｔ３，ｓｔ４，ｓｔ５，ｓｔ６，ｓｔ８，ｓｔａ，ｓｔａｃ，ｓｔａｍ，ｓｔａｒ，ｓｔａｔ，ｓｔａｔ１，ｓｔａｔ３，ｓｔａｔ４，ｓｔａｔ５，ｓｓｘ１，ｓｔｃ１，ｓｔｃｈ，ｓｔｄ，ｓｔｄ，ｓｔｅ，ｓｔｅｐ，ｓｔｆ１，ｓｔｆａ，ｓｔｆｂ，ｓｔｇｄ１，ｓｔｇｄ２，ｓｔｇｄ３，ｓｔｇｄ４，ｓｔｈｅ，ｓｔｋ１，ｓｔｋ１１，ｓｔｋ１５，ｓｔｋ２，ｓｔｋ６，ｓｔ１，ｓｔｍ，ｓｔｍ２，ｓｔｍ７，ｓｔｍｙ１，ｓｔｍｙ２，ｓｔｍｙ３，ｓｔｐ，ｓｔｐ１，ｓｔｐ２，ｓｔｓ，ｓｔｓ１，ｓｔｘ，ｓｔｘｌｂ，ｓｔｘ７，ｓｔｘｂｐ１，ｓｔｘｂｐ２，ｓｕｌｔｌｃ１，ｓｕｐｔ６ｈ，ｓｕｒ，ｓｕｒ１，ｓｕｒｆ１，ｓｕｒｆ２，ｓｕｒｆ３，ｓｕｒｆ４，ｓｕｒｆ５，ｓｕｒｆ６，ｓｖｃｔ２，ｓｖｍｔ，ｓｗ，ｓｘｉ２，ｓｙｂ１，ｓｙｂ２，ｓｙｂ１１，ｓｙｃｐ１，ｓｙｋ，ｓｙｍ１，ｓｙｎ１，ｓｙｎ２，ｓｙｎ３，ｓｙｎｇａｐ，ｓｙｎｓ１，ｓｙｐ，ｓｙｔ，ｓｙｔ１，ｓｙｔ２，ｓｙｔ３，ｓｙｔ４，ｓｙｔ５，ｔ，ｔ３ｄ，ｔａａ１６，ｔａｃ１ｒ，ｔａｃ２，ｔａｃ２ｒ，ｔａｃ３，ｔａｃｒ１，ｔａｃｒ２，ｔａｆ２，ｔａｆ２ａ，ｔａｆ２ａ，ｔａｆ２ｄ，ｔａｆ２ｈ，ｔａｆ２ｎ，ｔａｆｉｉ１００，ｔａｇｌｎ，ｔａｋ１，ｔａｌ１，ｔａｌ２，ｔａｌｄｏ１，ｔａｍ，ｔａｎ１，ｔａｐ１，ｔａｐ２，ｔａｐａ１，ｔａｐｂｐ，ｔａｐｖｒ１，ｔａｒｓ，ｔａｓ，ｔａｓｋ，ｔａｔ，ｔａｕｔ，ｔａｘ，ｔａｘ１，ｔａｚ，ｔｂｇ，ｔｂｐ，ｔｂｐ１，ｔｂｓ，ｔｂｘ１，ｔｂｘ２，ｔｂｘ３，ｔｂｘ５，ｔｂｘａ２ｒ，ｔｂｘａｓ１，ｔｃ１，ｔｃ２，ｔｃｂｐ，ｔｃｄ，ｔｃｅａ１，ｔｃｅｂ１１，ｔｃｅｂ３，ｔｃｆ１，ｔｃｆ１２，ｔｃｆ１３，ｔｃｆ１３１１，ｔｃｆ１４，ｔｃｆ１５，ｔｃｆ１７，ｔｃｆ１９，ｔｃｆ２，ｔｃｆ２０，ｔｃｆ２１，ｔｃｆ３，ｔｃｆ４，ｔｃｆ５，ｔｃｆ６１１，ｔｃｆ６１２，ｔｃｆ７，ｔｃｆ８，ｔｃｆ９，ｔｃｆｅｂ，ｔｃｆ１１，ｔｃｆ１４，ｔｃｌ１，ｔｃｌ１ａ，ｔｃｌ２，ｔｃｌ３，ｔｃｌ４，ｔｃｌ５，ｔｃｎ１，ｔｃｎ２，ｔｃｏ，ｔｃｏｆ１，ｔｃｐ１，ｔｃｐ１０，ｔｃｐ１１，ｔｃｐ２２８，ｔｃｐｔ，ｔｃｒａ，ｔｃｒｂ，ｔｃｒｄ，ｔｃｒｇ，ｔｃｒｚ，ｔｃｓ１，ｔｃｔａ，ｔｃｔｅ１，ｔｃｔｅ３，ｔｃｔｅ１１，ｔｄｆ，ｔｄｆａ，ｔｄｆｘ，ｔｄｇ，ｔｄｇｆ１，ｔｄｎ，ｔｄｏ，ｔｄｏ２，ｔｄｔ，ｔｅａｄ４，ｔｅｃ，ｔｅｃ，ｔｅｃｋ，ｔｅｃｔａ，ｔｅｆ，ｔｅｇｔ，ｔｅｋ，ｔｅ１，ｔｅｍ，ｔｅｐ１，ｔｅｒｃ，ｔｅｒｆ１，ｔｅｒｔ，ｔｅｓ１，ｔｅｓｋ１，ｔｅｘ２８，ｔｆ，ｔｆ２ｓ，ｔｆ６，ｔｆａ，ｔｆａｍ，ｔｆａｐ２ａ，ｔｆａｐ２ｂ，ｔｆａｐ２ｃ，ｔｆａｐ４，ｔｆｃｏｕｐ１，ｔｆｃｏｕｐ２，ｔｆｃｐ２，ｔｆｄｐ１，ｔｆｄｐ２，ｔｆｅ３，ｔｆｆ１，ｔｆｆ２，ｔｆｆ３，ｔｆｉｉｉａ，ｔｆｎ，ｔｆｐｉ，ｔｆｐｉ２，ｔｆｒ，ｔｆｒｃ，ｔｆｓ１，ｔｆｔ，ｔｇ，ｔｇ７３７，ｔｇｂ１，ｔｇｂ２，ｔｇｄ，ｔｇｆａ，ｔｇｆｂ１，ｔｇｆｂ２，ｔｇｆｂ３，ｔｇｆｂ４，ｔｇｆｂｉ，ｔｇｆｂｒ１，ｔｇｆｂｒ２，ｔｇｆｂｒ３，ｔｇｆｂｒｅ，ｔｇｆｒ，ｔｇｍ１，ｔｇｍ２，ｔｇｍ３，ｔｇｍ４，ｔｇｎ３８，ｔｇｎ４６，ｔｈ，ｔｈａｓ，ｔｈｂｄ，ｔｈｂｐ１，ｔｈｂｓ１，ｔｈｂｓ２，ｔｈｂｓ３，ｔｈｃ，ｔｈｈ，ｔｈ１，ｔｈｏｐ１，ｔｈｐｏ，ｔｈｒ１，ｔｈｒａ，ｔｈｒａ１，ｔｈｒａ１，ｔｈｒｂ，ｔｈｒｍ，ｔｈｒｓｐ，ｔｈｙ１，ｔｉａｌ１，ｔｉａｍ１，ｔｉａｒ，ｔｉｃ，ｔｉｅ，ｔｉｅ１，ｔｉｅ２，ｔｉｇｒ，ｔｉ１，ｔｉｌ３，ｔｉｌ４，ｔｉｍ，ｔｉｍｐ，ｔｉｍｐ１，ｔｉｍｐ２，ｔｉｍｐ３，ｔｉｎｕｒ，ｔｉｔｆ１，ｔｉｔｆ２，ｔｊｐ１，ｔｋ１，ｔｋ２，ｔｋｃ，ｔｋｃｒ，ｔｋｒ，ｔｋｔ，ｔｋｔ２，ｔｋｔ１１，ｔｌａ５１９，ｔｌｃｎ，ｔｌｅ１，ｔｌｅ２，ｔｌｅ３，ｔｌｈ１，ｔｌｎ，ｔｌｒ１，ｔｌｒ２，ｔｌｒ３，ｔｌｒ４，ｔｌｒ５，ｔｍ４ｓｆ１，ｔｍ４ｓｆ２，ｔｍ７ｓｆ２，ｔｍｃ，ｔｍｄ，ｔｍｄｃｉ，ｔｍｅｍ１，ｔｍｆ１，ｔｍｉｐ，ｔｍｏｄ，ｔｍｐ，ｔｍｐｏ，ｔｍｐｒｓｓ２，ｔｍｓ，ｔｍｓａ，ｔｍｓｂ，ｔｍｖｃｆ，ｔｎａ，ｔｎｄｍ，ｔｎｆ，ｔｎｆａ，ｔｎｆａｉｐ１，ｔｎｆａｉｐ２，ｔｎｆａｉｐ４，ｔｎｆａｉｐ６，ｔｎｆａｒ，ｔｎｆｂ，ｔｎｆｂｒ，ｔｎｆｃ，ｔｎｆｃｒ，ｔｎｆｒ１，ｔｎｆｒ２，ｔｎｆｒｓｆ１０ｂ，ｔｎｆｒｓｆ１２，ｔｎｆｒｓｆ１４，ｔｎｆｒｓｆ１６，ｔｎｆｒｓｆ１７，ｔｎｆｒｓｆ１ａ，ｔｎｆｒｓｆ１ｂ，ｔｎｆｒｓｆ４，ｔｎｆｒｓｆ５，ｔｎｆｒｓｆ６，ｔｎｆｒｓｆ６ｂ，ｔｎｆｒｓｆ７，ｔｎｆｒｓｆ８，ｔｎｆｒｓｆ９，ｔｎｆｓｆ１１，ｔｎｆｓｆ１２，ｔｎｆｓｆ５，ｔｎｆｓｆ６，
ｔｎｆｓｆ７，ｔｎｎｃ１，ｔｎｎｃ２，ｔｎｎｉ１，ｔｎｎｉ２，ｔｎｎｉ３，ｔｎｎｔ１，ｔｎｎｔ２，ｔｎｎｔ３，ｔｎｐ１，ｔｎｐ２，ｔｎｒ，ｔｎｓ，ｔｎｘ，ｔｎｘａ，ｔｏｃ，ｔｏｐ１，ｔｏｐ２，ｔｏｐ２ａ，ｔｏｐ２ｂ，ｔｏｐ３，ｔｐ１，ｔｐ１２０，ｔｐ２５０，ｔｐ５３，ｔｐ５３ｂｐ２，ｔｐ６３，ｔｐ７３，ｔｐａ，ｔｐｂｇ，ｔｐｃ，ｔｐｃ，ｔｐｈ，ｔｐｈ２，ｔｐｉ１，ｔｐ１２，ｔｐｍ１，ｔｐｍ２，ｔｐｍ３，ｔｐｍ４，ｔｐｍｔ，ｔｐｏ，ｔｐｏ，ｔｐｐ２，ｔｐｒ，ｔｐｒ１，ｔｐｒｄ，ｔｐｓ１，ｔｐｓ２，ｔｐｓｎ，ｔｐｓｔ１，ｔｐｓｔ２，ｔｐｔ，ｔｐｔ１，ｔｐｔｐｓ，ｔｐｘ，ｔｐｘ１，ｔｒ，ｔｒ２，ｔｒ４，ｔｒａ１，ｔｒａｆ１，ｔｒａｆ５，ｔｒａｉｌｒ２，ｔｒａｎ，ｔｒａｎｃｅ，ｔｒａｐ１７０，ｔｒｃ３，ｔｒｃ８，ｔｒｅ，ｔｒｅｂ３６，ｔｒｅｋ，ｔｒｆ１，ｔｒｇ１，ｔｒｈ，ｔｒｈｒ，ｔｒｉｃ５，ｔｒｉｏ，ｔｒｉｐ１，ｔｒｉｐ１４，ｔｒｉｐ６，ｔｒｋ，ｔｒｋ１，ｔｒｋａ，ｔｒｋｂ，ｔｒｋｃ，ｔｒｋｅ，ｔｒｌ１，ｔｒｌ２，ｔｒｍ１，ｔｒｍ１，ｔｒｍ２，ｔｒｍａ，ｔｒｍｉ１，ｔｒｍｉ２，ｔｒｎ，ｔｒｎ１，ｔｒｏ，ｔｒｐ１，ｔｒｐ１，ｔｒｐ２，ｔｒｐ３，ｔｒｐｃ１，ｔｒｐｍ２，ｔｒｐｏ，ｔｒｐｓ１，ｔｒｐｓ２，ｔｒｑ１，ｔｒｒ，ｔｒｒ３，ｔｒｒａｐ，ｔｒｓｐ，ｔｒｔ１，ｔｒｔ２，ｔｒｖ１，ｔｒｖ２，ｔｒｖ３，ｔｒｖ４，ｔｒｖ５，ｔｒｙ１，ｔｒｙ２，ｔｓ，ｔｓ１３，ｔｓ５４６，ｔｓｂｎ５１，ｔｓｃ  ｔｓｃ１，ｔｓｃ２，ｔｓｄ，ｔｓｅ１，ｔｓｇ１０１，ｔｓｇ７，ｔｓｈｂ，ｔｓｈｒ，ｔｓｉｘ，ｔｓｐ３，ｔｓｐｙ，ｔｓｓｃ３，ｔｓｔ１，ｔｓｔ１，ｔｓｔａ３，ｔｓｙ，ｔｔｃ１，ｔｔｃ３，ｔｔｆ，ｔｔｆ１，ｔｔｆ２，ｔｔｇ２，ｔｔｉｍ１，ｔｔｎ，ｔｔｐ，ｔｔｐ１，ｔｔｐａ，ｔｔｒ，ｔｕｂａ３，ｔｕｂａｌ１，ｔｕｂｂ，ｔｕｆｍ，ｔｕｆｔ１，ｔｕｌｐ１，ｔｕｐｌｅ１，ｔｗ，ｔｗｅａｋ，ｔｗｉｋ１，ｔｗｉｓｔ，ｔｘｇｐ１１，ｔｘｋ，ｔｘｎ，ｔｘｎｒ，ｔｘｎｒｄ１，ｔｙｈ，ｔｙｋ１，ｔｙｋ２，ｔｙｋ３，ｔｙｍｓ，ｔｙｒ，ｔｙｒ１，ｔｙｒｏ３，ｔｙｒｐ１，ｔｙｒｐ２，ｔｙｓ，ｕ１７ｈｇ，ｕｌｒｎｐ，ｕ２２ｈｇ，ｕ２ａｆ１，ｕ２ａｆｌｒｓ１，ｕ２ａｆｌｒｓ２，ｕ２ａｆｌｒｓ３，ｕｂａ５２，ｕｂｂ，ｕｂｃ，ｕｂｃ４，ｕｂｃ７，ｕｂｃ８，ｕｂｃｈ２，ｕｂｃ１，ｕｂｅ１，ｕｂｅ２，ｕｂｅ２ａ，ｕｂｅ２ｂ，ｕｂｅ２ｅ２，ｕｂｅ２ｇ，ｕｂｅ２ｇ２，ｕｂｅ２ｈ，ｕｂｅ２ｉ，ｕｂｅ２１１，ｕｂｅ２ｖ１，ｕｂｅ３ａ，ｕｂｈ１，ｕｂｉｄ４，ｕｂ１１，ｕｃｈ１１，ｕｃｎ，ｕｃｐ１，ｕｃｐ２，ｕｃｐ３，ｕｄｐｇｄｈ，ｕｅｖ１，ｕｆｄ１１，ｕｆｓ，ｕｇａｌｔ，ｕｇｂ，ｕｇｃｇ，ｕｇｄｈ，ｕｇｎ，ｕｇｐ１，ｕｇｐ２，ｕｇｐｐ２，ｕｇｔ１，ｕｇｔ１ａ１，ｕｇｔ２ｂ１１，ｕｇｔ２ｂ１５，ｕｇｔ２ｂ１７，ｕｇｔ２ｂ４，ｕｇｔ２ｂ７，ｕｇｔ２ｂ８，ｕｇｔ２ｂ９，ｕｇｔ１，ｕｈｇ，ｕｈｘ１，ｕｋｈｃ，ｕｍｏｄ，ｕｍｐｈ２，ｕｍｐｋ，ｕｍｐｓ，ｕｎｃ１８，ｕｎｃ１８ｂ，ｕｎｄ，ｕｎｇ，ｕｎｒ，ｕｎｒ，ｕｏｘ，ｕｐ，ｕｐｋ１ｂ，ｕｐｓ，ｕｑｂｐ，ｕｑｃｒｂ，ｕｑ���ｒｃ１，ｕｑｃｒｃ２，ｕｑｃｒｆｓ１，ｕｑｏｒ１，ｕｑｏｒ１３，ｕｑｏｒ２２，ｕｒｋ，ｕｒｋｒ，ｕｒｏｃ，ｕｒｏｄ，ｕｒｏｓ，ｕｓｆ１，ｕｓｆ２，ｕｓｈ１，ｕｓｈ１ａ，ｕｓｈ１ｂ，ｕｓｈ１ｃ，ｕｓｈ１ｄ，ｕｓｈ１ｅ，ｕｓｈ１ｆ，ｕｓｈ２ａ，ｕｓｈ３，ｕｓｐ１１，ｕｓｐ５，ｕｓｐ７，ｕｓｐ９ｘ，ｕｓｐ９ｙ，ｕｔ１，ｕｔ２，ｕｔｅ，ｕｔｒ，ｕｔｒｎ，ｕｔｘ，ｕｔｙ，ｕｖ２０，ｕｖ２４，ｕｖｏ，ｖａｃｈｔ，ｖａｃｍ１，ｖａｍｐ１，ｖａｍｐ２，ｖａｒｓ１，ｖａｓｐ，ｖａｔ１，ｖａｔ２，ｖａｖ，ｖａｖ１，ｖａｖ２，ｖｂｃｈ，ｖｂｐ１，ｖｃａｍ１，ｖｃｆ，ｖｃ１，ｖｃｐ，ｖｄａｃ１，ｖｄａｃ２，ｖｄｄ１，ｖｄｉ，ｖｄｒ，ｖｅｇｆ，ｖｅｇｆｂ，ｖｅｇｆｄ，ｖｅｇｆｒ３，ｖｇｆ，ｖｇ１，ｖｇｒ１，ｖｈ１，ｖｈｒ，ｖｉｌ１，ｖｉｌ２，ｖｉｍ，ｖｉｐ，ｖｉｐｒ１，ｖｉｐｒ２，ｖｉｓ１，ｖｌａ１，ｖｌａ５ａ，ｖｌａｃｓ，ｖｌｃａｄ，ｖｌｄｌｒ，ｖｍａｔ１，ｖｍｃｍ，ｖｍｄ１，ｖｍｄ２，ｖｎｒａ，ｖｎｔ，ｖｐ，ｖｐｐ１，ｖｐｐ３，ｖｐｒｅｂ１，ｖｐｒｅｂ２，ｖｒｆ，ｖｒｋ１，ｖｒｋ２，ｖｒｎｆ，ｖｒｎｉ，ｖｓｎ１１，ｖｔｎ，ｖｗｆ，ｖｗｓ，ｗａｆ１，ｗａｒｓ，ｗａｓ，ｗｂｓ，ｗｄ１，ｗｄｒ２，ｗｅｅ１，ｗｆｒｓ，ｗｆｓ，ｗｆｓ１，ｗｇｎ１，ｗｈｃｒ，ｗｉ，ｗｉｓｐ１，ｗｉｓｐ２，ｗｉｓｐ３，ｗｎｄ，ｗｎｔ１，ｗｎｔ１０ｂ，ｗｎｔ１３，ｗｎｔ１４，ｗｎｔ１５，ｗｎｔ２，ｗｎｔ３，ｗｎｔ５ａ，ｗｎｔ７ａ，ｗｎｔ７ｂ，ｗｎｔ８ｂ，ｗｒｂ，ｗｒｎ，ｗｓ１，ｗｓ２ａ，ｗｓ２ｂ，ｗｓ４，ｗｓｎ，ｗｓｓ，ｗｓｓ，ｗｔ１，ｗｔ２，ｗｔ３，ｗｔ４，ｗｔ５，ｗｔｓ，ｗｔｓ１，ｗｗｓ，ｘ１１，ｘｂｐ１，ｘｂｐ２，ｘｃｅ，ｘｄｈ，ｘｅ１６９，ｘｅ７，ｘｅ７ｙ，ｘｇ，ｘｇｒ，ｘｈ２，ｘｉａｐ，ｘｉｃ，ｘｉｓｔ，ｘｋ，ｘｌａ，ｘｌａ２，ｘｌｐ，ｘｌｐｄ，ｘｌｒｓ１，ｘｍ，ｘｐａ，ｘｐｂ，ｘｐｃ，ｘｐｃｃ，ｘｐｃｔ，ｘｐｆ，ｘｐｆ，ｘｐｇ，ｘｐｍｃ２ｈ，ｘｐｎｐｅｐ２，ｘｐｏ１，ｘｒｃｃ１，ｘｒｃｃ２，ｘｒｃｃ３，ｘｒｃｃ４，ｘｒｃｃ５，ｘｒｃｃ９，ｘｒｓ，ｘｓ，ｘｗｎｔ２，ｙｂ１，ｙｅｓ１，ｙｋ１４０，ｙ１１，ｙｒｒｍ１，ｙｔ，ｙｗｈａ１，ｙｗｈａｂ，ｙｗｈａｈ，ｙｗｈａｚ，ｙｙ１，ｚａｃ，ｚａｇ，ｚａｎ，ｚａｐ７０，ｚｆ８７，ｚｆｍ１，ｚｆｐ３，ｚｆｐ３６，ｚｆｐ３７，ｚｆｘ，ｚｆｙ，ｚｉｃ１，ｚｉｃ２，ｚｉｃ３，ｚｉｐｋ，ｚｎｆ１，ｚｎｆ１０，ｚｎｆ１１７，ｚｎｆ１１ａ，ｚｎｆ１１ｂ，ｚｎｆ１２，ｚｎｆ１２１，ｚｎｆ１２３，ｚｎｆ１２４，ｚｎｆ１２５，ｚｎｆ１２６，ｚｎｆ１３，ｚｎｆ１４，ｚｎｆ１４１，ｚｎｆ１４４，ｚｎｆ１４６，ｚｎｆ１４７，ｚｎｆ１５７，ｚｎｆ１６，ｚｎｆ１６０，ｚｎｆ１６２，ｚｎｆ１６３，ｚｎｆ１６５，ｚｎｆ１６９，ｚｎｆ１７３，ｚｎｆ１７９，ｚｎｆ１８９，ｚｎｆ１９，ｚｎｆ１９２，ｚｎｆ１９３，ｚｎｆ１９５，ｚｎｆ１９８，ｚｎｆ２，ｚｎｆ２０，ｚｎｆ２００，ｚｎｆ２０４，ｚｎｆ２１７，ｚｎｆ２２，ｚｎｆ２３，ｚｎｆ２４，ｚｎｆ２５，ｚｎｆ２６，ｚｎｆ２７，ｚｎｆ２９，ｚｎｆ３，ｚｎｆ３２，ｚｎｆ３４，ｚ���ｆ３５，ｚｎｆ３６，ｚｎｆ３８，ｚｎｆ４，ｚｎｆ４０，ｚｎｆ４１，ｚｎｆ４２，ｚｎｆ４４，ｚｎｆ４５，ｚｎｆ４６，ｚｎｆ５，ｚｎｆ６，ｚｎｆ６９，ｚｎｆ７，ｚｎｆ７０，ｚｎｆ７１，ｚｎｆ７２，ｚｎｆ７３，ｚｎｆ７４，ｚｎｆ７５，ｚｎｆ７５ａ，ｚｎｆ７５ｃ，ｚｎｆ７６，ｚｎｆ７７，ｚｎｆ７９，ｚｎｆ８，ｚｎ８０，ｚｎｆ８１，ｚｎｆ８３，ｚｎｆ９，ｚｎｆｃ１５０，ｚｎｆｃ２５，ｚｎｆｘｙ，ｚｎｔ３，ｚｎｔ４，ｚｐ３ａ，ｚｐ３ｂ，ｚｐｋ，ｚｗｓ１，およびｚｙｘ［ＳＵ１］が挙げられる。
【０２５９】
さらに、細菌、植物、酵母、および哺乳動物（例えば、マウス）に由来する遺伝子を、本明細書で提供される微生物と共に用いることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子の非限定例としては、ａａｒＦ，ａａｓ，ａａｔ，ａｂｐＳ，ａｂｓ，ａｃｃＡ，ａｃｃＢ，ａｃｃＣ，ａｃｃＤ，ａｃｄ，ａｃｅＡ，ａｃｅＢ，ａｃｅＥ，ａｃｅＦ，ａｃｅＫ，ａｃｋＡ，ａｃｋＢ，ａｃｎＡ，ａｃｎＢ，ａｃｐＤ，ａｃｐＰ，ａｃｐＳ，ａｃｐＸ，ａｃｒＡ，ａｃｒＢ，ａｃｒＣ，ａｃｒＤ，ａｃｒＥ，ａｃｒＦ，ａｃｒＲ，ａｃｓ，ａｄａ，ａｄｄ，ａｄｈＢ，ａｄｈＣ，ａｄｈＥ，ａｄｈＲ，ａｄｉＡ，ａｄｉＹ，ａｄｋ，ａｅｇＡ，ａｅｒ，ａｅｓ，ａｇａＡ，ａｇａＢ，ａｇａＣ，ａｇａＤ，ａｇａＩ，ａｇａＲ，ａｇａＳ，ａｇａＶ，ａｇａＷ，ａｇａＺ，ａｇｐ，ａｈｐＣ，ａｈｐＦ，ａｉｄＢ，ａｉｓ，ａｌａＳ，ａｌａＴ，ａｌａＵ，ａｌａＶ，ａｌａＷ，ａｌａＸ，ａｌｄＡ，ａｌｄＢ，ａｌｄＨ，ａｌｋＡ，ａｌｋＢ，ａｌｐＡ，ａｌｒ，ａｌｓＡ，ａｌｓＢ，ａｌｓＣ，ａｌｓＥ，ａｌｓＫ，ａｌｘ，ａｍｉＡ，ａｍｉＢ，ａｍｎ，ａｍｐＣ，ａｍｐＤ，ａｍｐＥ，ａｍｐＧ，ａｍｐＨ，ａｍｔＢ，ａｍｙＡ，ａｎｓＡ，ａｎｓＢ，ａｐａＧ，ａｐａＨ，ａｐｈＡ，ａｐｐＡ，ａｐｐＢ，ａｐｐＣ，ａｐｐＹ，ａｐｔ，ａｑｐＺ，ａｒａＡ，ａｒａＢ，ａｒａＣ，ａｒａＤ，ａｒａＥ，ａｒａＦ，ａｒａＧ，ａｒａＨ，ａｒａＪ，ａｒｃＡ，ａｒｃＢ，ａｒｇＡ，ａｒｇＢ，ａｒｇＣ，ａｒｇＤ，ａｒｇＥ，ａｒｇＦ，ａｒｇＧ，ａｒｇＨ，ａｒｇＩ，ａｒｇＭ，ａｒｇＰ，ａｒｇＱ，ａｒｇＲ，ａｒｇＳ，ａｒｇＴ，ａｒｇＵ，ａｒｇＶ，ａｒｇＷ，ａｒｇＸ，ａｒｇＹ，ａｒｇＺ，ａｒｏＡ，ａｒｏＢ，ａｒｏＣ，ａｒｏＤ，ａｒｏＥ，ａｒｏＦ，ａｒｏＧ，ａｒｏＨ，ａｒｏＩ，ａｒｏＫ，ａｒｏＬ，ａｒｏＭ，ａｒｏＰ，ａｒｏＴ，ａｒｓＢ，ａｒｓＣ，ａｒｓＲ，ａｒｔＩ，ａｒｔＪ，ａｒｔＭ，ａｒｔＰ，ａｒｔＱ，ａｓｃＢ，ａｓｃＦ，ａｓｃＧ，ａｓｄ，ａｓｌＡ，ａｓｌＢ，ａｓｍＡ，ａｓｎＡ，ａｓｎＢ，ａｓｎＣ，ａｓｎＳ，ａｓｎＴ，ａｓｎＵ，ａｓｎＶ，ａｓｎＷ，ａｓｐＡ，ａｓｐＣ，ａｓｐＳ，ａｓｐＴ，ａｓｐＵ，ａｓｐＶ，ａｓｒ，ａｓｕ，ａｔｏＡ，ａｔｏＢ，ａｔｏＣ，ａｔｏＤ，ａｔｏＳ，ａｔｐＡ，ａｔｐＢ，ａｔｐＣ，ａｔｐＤ，ａｔｐＥ，ａｔｐＦ，ａｔｐＧ，ａｔｐＨ，ａｔｐＩ，ａｖｔＡ，ａｚａＡ，ａｚａＢ，ａｚｌ，ｂａｃＡ，ｂａｅＲ，ｂａｅＳ，ｂａｒＡ，ｂａｓＲ，ｂａｓＳ，ｂａｘ，ｂｃｐ，ｂｃｒ，ｂｅｔＡ，ｂｅｔＢ，ｂｅｔＩ，ｂｅｔＴ，ｂｆｄ，ｂｆｍ，ｂｆｒ，ｂｇｌＡ，ｂｇｌＢ，ｂｇｌＦ，ｂｇｌＧ，ｂｇｌＪ，ｂｇｌＴ，ｂｇｌＸ，ｂｉｏＡ，ｂｉｏＢ，ｂｉｏＣ，ｂｉｏＤ，ｂｉｏＦ，ｂｉｏＨ，ｂｉｏＰ，ｂｉｐＡ，ｂｉｒＡ，ｂｉｓＣ，ｂｉｓＺ，ｂｌｃ，ｂｏｌＡ，ｂＲＮＱ，ｂｒｎＲ，ｂｒｎＳ  ｂｒｎＴ，ｂｔｕＢ，ｂｔｕｃ，ｂｔｕＤ，ｂｔｕＥ，ｂｔｕＲ，ｂｙｍＡ，ｃａｄＡ，ｃａｄＢ，ｃａｄＣ，ｃａｆＡ，ｃａｉＡ，ｃａｉＢ，ｃａｉＣ，ｃａｉＤ，ｃａｉＥ，ｃａｉＦ，ｃａｉＴ，ｃａｌＡ，ｃａｉＣ，ｃａｌＤ，ｃａｎ，ｃａｒＡ，ｃａｒＢ，ｃｂｌ，ｃｂｐＡ，ｃｂｔ，ｃｃａ，ｃｃｍＡ，ｃｃ���Ｂ，ｃｃｍＣ，ｃｃｍＤ，ｃｃｍＥ，ｃｃｍＦ，ｃｃｍＧ，ｃｃｍＨ，ｃｄｄ，ｃｄｅ，ｃｄｈ，ｃｄｓＡ，ｃｄｓＳ，ｃｅｄＡ，ｃｅｌＡ，ｃｅｌＢ，ｃｅＩＣ，ｃｅｌＤ，ｃｅｌＦ，ｃｆａ，ｃｆｃＡ，ｃｈａＡ，ｃｈａＢ，ｃｈａＣ，ｃｈｅＡ，ｃｈｅＢ，ｃｈｅＲ，ｃｈｅＷ，ｃｈｅＹ，ｃｈｅＺ，ｃｈｐＡ，ｃｈｐＢ，ｃｈｐＲ，ｃｈｐＳ，ｃｉｒＡ，ｃｉｔＡ，ｃｉｔＢ，ｃｌｄ，ｃｉｐＡ，ｃｌｐＢ，ｃｌｐＰ，ｃｌｐＸ，ｃｌｓ，ｃｍｋ，ｃｍｌＡ，ｃｍｒ，ｃｍｔＡ，ｃｍｔＢ，ｃｏａＡ，ｃｏｂＳ，ｃｏｂＴ，ｃｏｂＵ，ｃｏｄＡ，ｃｏｄＢ，ｃｏｆ，ｃｏｇ？，ｃｏｒＡ，ｃｐｄＡ，ｃｐｄＢ，ｃｐｓＡ，ｃｐｓＢ，ｃｐｓＣ，ｃｐｓＤ，ｃｐｓＥ，ｃｐｓＦ，ｃｐｓＧ，ｃｐｘＡ，ｃｐｘＢ，ｃｐｘＰ，ｃｐｘＲ，ｃｒｃＡ，ｃｒｃＢ，ｃｒｅＡ，ｃｒｅＢ，ｃｒｅＣ，ｃｒｅＤ，ｃｒｇ，ｃｒｌ，ｃｒｐ，ｃｒｒ，ｃｓｄＡ，ｃｓｇＡ，ｃｓｇＢ，ｃｓｇＤ，ｃｓｇＥ，ｃｓｇＦ，ｃｓｇＧ，ｃｓｉＡ，ｃｓｉＢ，ｃｓｉＣ，ｃｓｉＤ，ｃｓｉＥ，ｃｓｉＦ，ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，ｃｓｐＣ，ｃｓｐＤ，ｃｓｐＥ，ｃｓｐＧ，ｃｓｒＡ，ｃｓｒＢ，ｃｓｔＡ，ｃｓｔＣ，ｃｕｐ，ｃｕｔＡ，ｃｕｔＣ，ｃｕｔＥ，ｃｕｔＦ，ｃｖａＡ（ＣｏｌＶ），ｃｖａＢ（ＣｏｌＶ），ｃｖａＣ（Ｃｏ−ｌＶ），ｃｖｉ（ＣｏｌＶ），ｃｖｐＡ，ｃｘｍ，ｃｙａＡ，ｃｙｂＢ，ｃｙｂＣ，ｃｙｃＡ，ｃｙｄＡ，ｃｙｄＢ，ｃｙｄＣ，ｃｙｄＤ，ｃｙｎＲ，ｃｙｎＳ，ｃｙｎＴ，ｃｙｎＸ，ｃｙｏＡ，ｃｙｏＢ，ｃｙｏＣ，ｃｙｏＤ，ｃｙｏＥ，ｃｙｓＡ，ｃｙｓＢ，ｃｙｓＣ，ｃｙｓＤ，ｃｙｓＥ，ｃｙｓＧ，ｃｙｓＨ，ｃｙｓＩ，ｃｙｓＪ，ｃｙｓＫ，ｃｙｓＭ，ｃｙｓＮ，ｃｙｓＰ，ｃｙｓＱ，ｃｙｓＳ，ｃｙｓＴ，ｃｙｓＵ，ｃｙｓＷ，ｃｙｓＸ？，ｃｙｓＺ？，ｃｙｔＲ，ｄａｃＡ，ｄａｃＢ，ｄａｃＣ，ｄａｃＤ，ｄａｄＡ，ｄａｄＢ，ｄａｄＱ，ｄａｄＸ，ｄａｍ，ｄａｐＡ，ｄａｐＢ，ｄａｐＤ，ｄａｐＥ，ｄａｐＦ，ｄｂｐＡ，ｄｃｄ，ｄｃｍ，ｄｃｐ，ｄｃｒＢ，ｄｃｔＡ，ｄｃｔＢ，ｄｃｕＡ，ｄｃｕＢ，ｄｃｕＣ，ｄｄＩＡ，ｄｄｌＢ，ｄｄｐＡ，ｄｄｐＢ，ｄｄｐＣ，ｄｄｐＤ，ｄｄｐＦ，ｄｄｐＸ，ｄｅａＤ，ｄｅｄＡ，ｄｅｄＤ，ｄｅｆ，ｄｅｇＰ，ｄｅｇＱ，ｄｅｇＳ，ｄｅｌ，ｄｅｏＡ，ｄｅｏＢ，ｄｅｏＣ，ｄｅｏＤ，ｄｅｏＲ，ｄｆｐ，ｄｇｄ，ｄｇｋＡ，ｄｇｋＲ，ｄｇｏＡ，ｄｇｏＤ，ｄｇｏＫ，ｄｇｏＲ，ｄｇｏＴ，ｄｇｓＡ，ｄｇｔ，ｄｉｃＡ，ｄｉｃＢ，ｄｉｃＣ，ｄｉｃＦ，ｄｉｎＢ，ｄｉｎＤ，ｄｉｎＦ，ｄｉｎＧ，ｄｉｎＩ，ｄｉｎＹ，ｄｉｐＺ，ｄｊｌＡ，ｄｋｓＡ，ｄｌｄ，ｄｍｓＡ，ｄｍｓＢ，ｄｍｓＣ，ｄｎａＡ，ｄｎａＢ，ｄｎａＣ，ｄｎａＥ，ｄｎａＧ，ｄｎａＩ，ｄｎａＪ，ｄｎａＫ，ｄｎａＬ，ｄｎａＮ，ｄｎａＱ，ｄｎａＴ，ｄｎａＸ，ｄｐｐＡ，ｄｐｐＢ，ｄｐｐＣ，ｄｐｐＤ，ｄｐｐＦ，ｄｐｐＧ，ｄｐｓ，ｄｓｂＡ，ｄｓｂＢ，ｄｓｂＣ，ｄｓｂＧ，ｄｓｄＡ，ｄｓｄＣ，ｄｓｄＸ，ｄｓｒＡ，ｄｓｒＢ，ｄｕｔ，ｄｖｌ，ｄｘｓ，ｅｂｇＡ，ｅｂｇＢ，ｅｂｇＣ，ｅｂｇＲ，ｅｃｆａ，ｅｃｏ，ｅｃｐＤ，ｅｄａ，ｅｄｄ，ｅｆｐ，ｅｎｉｒＡ，ｅｍｒＢ，ｅｍｒＤ，ｅｍｒＥ，ｅｎｄＡ，ｅｎｏ，ｅｎｔＡ，ｅｎｔＢ，ｅｎｔＣ���ｅｎｔＤ，ｅｎｔＥ，ｅｎｔＦ，ｅｎｖＮ  ｅｎｖＰ，ｅｎｖＱ，ｅｎｖＲ，ｅｎｖＴ，ｅｎｖＹ，ｅｎｖＺ，ｅｐｄ，ＥｐｐＡ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＢ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＣ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＤ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＥ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＧ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ＥｐｐＨ，ｍｉｎｉｇｅｎｅ，ｅｒａ，ｅｓｐ，ｅｖｇＡ，ｅｖｇＳ，ｅｘｂＢ，ｅｘｂＣ，ｅｘｂＤ，ｅｘｐＡ，ｅｘｕＲ，ｅｘｕＴ，ｆａｂＡ，ｆａｂＢ，ｆａｂＤ，ｆａｂＦ，ｆａｂＧ，ｆａｂＨ，ｆａｂＩ，ｆａｂＺ，ｆａｄＡ，ｆａｄＢ，ｆａｄＤ，ｆａｄＥ，ｆａｄＨ，ｆａｄＬ，ｆａｄＲ，ｆａｒＲ，ｆａｔＡ，ｆｂａＡ，ｆｂａＢ，ｆｂｐ，ｆｃｌ，ｆｃｓＡ，ｆｄｈＤ，ｆｄｈＥ，ｆｄｈＦ，ｆｄｎＧ，ｆｄｎＨ，ｆｄｎＩ，ｆｄｏＧ，ｆｄｏＨ，ｆｄｏＩ，ｆｄｒＡ，ｆｄｘ，ｆｅａＢ，ｆｅａＲ，ｆｅｃＡ，ｆｅｃＢ，ｆｅｃＣ，ｆｅｃＤ，ｆｅｃＥ，ｆｅｃＩ，ｆｅｃＲ，ｆｅｏＡ，ｆｅｏＢ，ｆｅｐＡ，ｆｅｐＢ，ｆｅｐＣ，ｆｅｐＤ，ｆｅｐＥ，ｆｅｐＧ，ｆｅｓ，ｆｅｘＢ，ｆｆｈ，ｆｆｓ，ｆｈｌＡ，ｆｈｌＢ，ｆｈｕＡ，ｆｈｕＢ，ｆｈｕＤ，ｆｈｕＥ，ｆｈｕＦ，ｆｉｃ，ｆｉｍＡ，ｆｉｍＢ，ｆｉｍＣ，ｆｉｍＤ，ｆｉｍＥ，ｆｉｍＦ，ｆｉｍＧ，ｆｉｍＨ，ｆｉｍＩ，ｆｉｐＢ，ｆｉｐＣ，ｆｉｓ，ｆｉｕ，ｆｉｘＡ，ｆｉｘＢ，ｆｉｘＣ，ｆｉｘＸ，ｆｋｌＢ，ｆｋｐＡ，ｆｌｄＡ，ｆｌｇＡ，ｆｌｇＢ，ｆｌｇＣ，ｆｌｇＤ，ｆｌｇＥ，ｆｌｇＦ，ｆｌｇＧ，ｆｌｇＨ，ｆｌｇＩ，ｆｌｇＪ，ｆｌｇＫ，ｆｌｇＬ，ｆｌｇＭ，ｆｌｇＮ，ｆｌｈＡ，ｆｌｈＢ，ｆｌｈｃ，ｆｌｈＤ，ｆｌｉＡ，ｆｌｉＣ，ｆｌｉＤ，ｆｌｉＥ，ｆｌｉＦ，ｆｌｉＧ，ｆｌｉＨ，ｆｌｉＩ，ｆｌｉＪ，ｆｌｉＫ，ｆｌｉＬ，ｆｌｉＭ，ｆｌｉＮ，ｆｌｉＯ，ｆｌｉｐ，ｆｌｉＱ，ｆｌｉＲ，ｆｌｉＳ，ｆｌｉＴ，ｆｌｉＹ，ｆｌｉＺ，ｆｌｋ，ｆｌｕ，ｆｍｔ，ｆｎｒ，ｆｏｃＡ，ｆｏｃＢ，ｆｏｌＡ，ｆｏｌＣ，ｆｏｌＤ，ｆｏｌＥ，ｆｏｌＫ，ｆｏｌＰ，ｆｏｌＸ，ｆｐｒ，ｆｒｄＡ，ｆｒｄＢ，ｆｒｄＣ，ｆｒｄＤ，ｆｒｒ，ｆｒｕＡ，ｆｒｕＢ，ｆｒｕＫ，ｆｒｕＲ，ｆｓｒ，ｆｔｎ，ｆｔｓＡ，ｆｔｓＥ，ｆｔｓＩ，ｆｔｓＪ，ｆｔｓＫ，ｆｔｓＬ，ｆｔｓＮ，ｆｔｓＱ，ｆｔｓＷ，ｆｔｓＸ，ｆｔｓＹ，ｆｔｓＺ，ｆｕｃＡ，ｆｕｃＩ，ｆｕｃＫ，ｆｕｃＯ，ｆｕｃＰ，ｆｕｃＲ，ｆｕｍＡ，ｆｕｍＢ，ｆｕｍＣ，ｆｕｒ，ｆｕｓＡ，ｆｕｓＢ，ｇａｂＣ  ｇａｂＤ，ｇａｂＰ，ｇａｂＴ，ｇａｄＡ，ｇａｄＢ，ｇａｄＲ，ｇａｌＥ，ｇａｌＦ，ｇａｌＫ，ｇａｌＭ，ｇａｌＰ，ｇａｉＲ，ｇａｌＳ，ｇａｌＴ，ｇａｌＵ，ｇａｐＡ，ｇａｐＣ，ｇａｒＡ，ｇａｒＢ，ｇａｔＡ，ｇａｔＢ，ｇａｔＣ，ｇａｔＤ，ｇａｔＲ，ｇａｔＹ，ｇａｔＺ，ｇｃｄ，ｇｃｌ，ｇｃｐＥ，ｇｃｖＡ，ｇｃｖＨ，ｇｃｖＰ，ｇｃｖＲ，ｇｃｖＴ，ｇｄｈＡ，ｇｅｆ，ｇｇｔ，ｇｉｄＡ，ｇｉｄＢ，ｇｉｐ，ｇｌｃＢ，ｇｌｃＣ，ｇｌｃＤ，ｇＩｃＥ，ｇｌｃＧ，ｇｌｄＡ，ｇｌｆ，ｇｌｇＡ，ｇｌｇＢ，ｇｌｇＣ，ｇｌｇＰ，ｇｌｇＳ，ｇｌｇＸ，ｇｌｋ，ｇｌｍＭ，ｇｌｍＳ，ｇｌｍＵ，ｇｌｍＸ，ｇｌｎＡ，ｇｌｎＢ，ｇｌｎＤ，ｇｌｎＥ，ｇｌｎＧ，ｇｌｎＨ，ｇｌｎＫ，ｇｌｈＬ，ｇｌｎＰ，ｇｌｎＱ，ｇｌｎＲ，ｇｌｎＳ，ｇｌｎＴ，ｇｌｎＵ，ｇｌｎＶ，ｇｌｎＷ，ｇｌｎＸ，ｇｌｏＡ，ｇｌｐＡ，ｇｌｐＢ，ｇｌｐＣ，ｇｌｐＤ，ｇｉｐＥ，ｇｉｐＦ，ｇｉｐＧ，ｇｌｐＫ，ｇｌｐＱ，ｇｉｐＲ，ｇｌｐＴ，ｇｌｐＸ，ｇＩｔＡ，ｇｌｔＢ，ｇｌｔＤ，ｇｌｔＥ，ｇｌｔＦ，ｇｌｔＨ，ｇｌｔＪ，ｇｌｔＫ，ｇｌｔＬ，ｇｌｔＭ，ｇｌｔＰ，ｇｌｔＲ，ｇｌｔＳ，ｇｌｔＴ，ｇｌｔＵ，ｇｌｔｖ，ｇｌｔＷ，ｇｌｔＸ，ｇｌｙＡ，ｇｌｙＱ，ｇｌｙＳ，ｇｌｙＴ，ｇｌｙＵ，ｇｌｙｖ，ｇｌｙＷ，ｇｌｙＸ，ｇｌｙＹ，ｇｍｄ，ｇｍｋ，ｇｍｍ，ｇｎｄ，ｇｎｔＫ，ｇｎｔＰ，ｇｎｔＲ，ｇｎｔＳ，ｇｎｔＴ，ｇｎｔＵ，ｇｎｔＶ，ｇｏａＧ，ｇｏｒ，ｇｐｈ，ｇｐｍＡ，ｇｐｐ，ｇｐｒＡ，ｇｐｒＢ，ｇｐｓＡ，ｇｐｔ，ｇｒｅＡ，ｇｒｅＢ，ｇｒｏＬ，ｇｒｏＳ，ｇｒｐＥ，ｇｒｘＡ，ｇｒｘＢ，ｇｒｘＣ，ｇｓｈＡ，ｇｓｈＢ，ｇｓｋ，ｇｓｐ，ｇｓｐ＊，ｇｓｔ，ｇｕａＡ，ｇｕａＢ，ｇｕａＣ，ｇｕｒＢ，ｇｕｒＣ，ｇｕｔＭ，ｇｕｔＱ，ｇｙｒＡ，ｇｙｒＢ，ｈｃａＢ，ｈｃａＣ，ｈｃａＤ，ｈｃａＥ，ｈｃａＦ，ｈｃａＲ，ｈｃａＴ，ｈｄｅＡ，ｈｄｅＢ，ｈｄｅＤ，ｈｄｈＡ，ｈｅｌＤ，ｈｅｍＡ，ｈｅｍＢ，ｈｅｍＣ，ｈｅｍＤ，ｈｅｍＥ，ｈｅｍＦ，ｈｅｍＧ，ｈｅｍＨ，ｈｅｍＫ，ｈｅｍＬ，ｈｅｍＭ，ｈｅｍＸ，ｈｅｍＹ，ｈｅｐＡ，ｈｅｔ，ｈｆｌＢ，ｈｆｌＣ，ｈｆｌＫ，ｈｆｌＸ，ｈｆｑ，ｈｈａ，ｈｉｐＡ，ｈｉｐＢ，ｈｉｓＡ，ｈｉｓＢ，ｈｉｓＣ，ｈｉｓＤ，ｈｉｓＦ，ｈｉｓＧ，ｈｉｓＨ，ｈｉｓＩ，ｈｉｓＪ，ｈｉｓＭ，ｈｉｓＰ，ｈｉｓＱ，ｈｉｓＲ，ｈｉｓＳ，ｈｉｐＡ，ｈｌｙＥ，ｈｍｐ，ｈｎｓ，ｈｏｌＡ，ｈｏｌＢ，ｈｏｌＣ，ｈｏｌＤ，ｈｏｌＥ，ｈｏｐＢ，ｈｏｐＣ，ｈｏｐＤ，ｈｐｔ，ｈｒｐＡ，ｈｒｐＢ，ｈｒｓＡ，ｈｓｃＡ，ｈｓｃＢ，ｈｓｄＭ，ｈｓｄＲ，ｈｓｄＳ，ｈｓｌＣ，ｈｓｌＤ？，ｈｓｌＥ−Ｈ，ｈｓｌＪ，ｈｓｌＫ，ｈｓＩＬ−Ｎ，ｈｓｌＯ−Ｒ，ｈｓｌＵ，ｈｓｌＶ，ｈｓｌＷ，ｈｔｇＡ，ｈｔｐＧ，ｈｔｐＸ，ｈｔｒＢ，ｈｔｒＣ，ｈｔｒＥ，ｈｔｒＬ，ｈｕｐＡ，ｈｕｐＢ，ｈｙａＡ，ｈｙａＢ，ｈｙａＣ，ｈｙａＤ，ｈｙａＥ，ｈｙａＦ，ｈｙｂＡ，ｈｙｂＢ，ｈｙｂＣ，ｈｙｂＤ，ｈｙｂＥ，ｈｙｂＦ，ｈｙｂＧ，ｈｙｃＡ，ｈｙｃＢ，ｈｙｃＣ，ｈｙｃＤ，ｈｙｃＥ，ｈｙｃＦ，ｈｙｃＧ，ｈｙｃＨ，ｈｙｃＩ，ｈｙｄＡ，ｈｙｄＧ，ｈｙｄＨ，ｈｙｄＮ，ｈｙｆＡ
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ｌｓｐＡ，ｌｙｓＡ，ｌｙｓＣ，ｌｙｓＰ，ｌｙｓＱ，ｌｙｓＲ，ｌｙｓＳ，ｌｙｓＴ，ｌｙｓＵ，ｌｙｓＶ，ｌｙｓＷ，ｌｙｓＸ，ｌｙｓＹ，ｌｙｓＺ，ｌｙｔＡ，ｌｙｔＢ，ｌｙｘ，ｍａａ，ｍａｃ，ｍａｅ，ｍａｆＡ，ｍａｆＢ，ｍａｌＥ，ｍａｌＦ，ｍａｌＧ，ｍａｌＩ，ｍａｌＫ，ｍａｌＭ，ｍａｌＰ，ｍａｌＱ，ｍａｌＳ，ｍａｌＴ，ｍａｌＸ，ｍａｌＹ，ｍａｌＺ，ｍａｎＡ，ｍａｎＣ，ｍａｎＸ，ｍａｎＹ，ｍａｎＺ，ｍａｐ，ｍａｒＡ，ｍａｒＢ，ｍａｒＲ，ｍｂｒＢ，ｍｃｒＡ，ｍｃｒＢ，ｍｃｒＣ，ｍｃｒＤ，ｍｄａＢ，ｍｄｈ，ｍｄｏＢ，ｍｄｏＧ，ｍｄｏＨ，ｍｅｂ，ｍｅｌＡ，ｍｅｌＢ，ｍｅｌＲ，ｍｅｎＡ，ｍｅｎＢ，ｍｅｎＣ，ｍｅｎＤ，ｍｅｎＥ，ｍｅｎＦ，ｍｅｐＡ，ｍｅｓＪ，ｍｅｔＡ，ｍｅｔＢ，ｍｅｔＣ，ｍｅｔＤ，ｍｅｔＥ，ｍｅｔＦ，ｍｅｔＧ，ｍｅｔＨ，ｍｅｔＪ，ｍｅｔＫ，ｍｅｔＬ，ｍｅｔＲ，ｍｅｔＴ，ｍｅｔＵ，ｍｅｔＶ，ｍｅｔＷ，ｍｅｔＹ，ｍｅｔＺ，ｍｆｄ，ｍｇｌＡ，ｍｇｌＢ，ｍｇｌＣ，ｍｇｌＲ，ｍｇｓＡ，ｍｇｔＡ，ｍｈｐＡ，ｍｈｐＢ，ｍｈｐＣ，ｍｈｐＤ，ｍｈｐＥ，ｍｈｐＦ，ｍｈｐＲ，ｍｉａＡ，ｍｉａＤ，ｍｉｃＦ，ｍｉｎＣ，ｍｉｎＤ，ｍｉｎＥ，ｍｉｏＣ，ｍｌｔＡ，ｍｌｔＢ，ｍｌｔＣ，ｍｌｔＤ，ｍｍｒＡ（ｒｈｌＢ？），ｍｎｇ，ｍｎｔＡ，ｍｏａＡ，ｍｏａＢ，ｍｏａＣ，ｍｏａＤ，ｍｏａＥ，ｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ，ｍｏｃ，ｍｏｄＡ，ｍｏｄＢ，ｍｏｄＣ，ｍｏｄＥ，ｍｏｄＦ，ｍｏｅＡ，ｍｏｅＢ，ｍｏｇ，ｍ��ｌＲ，ｍｏｔＡ，ｍｏｔＢ，ｍｐｌ，ｍｐｐＡ，ｍｐｒＡ，ｍｒａＡ−−？，ｍｒａＹ，ｍｒｃＡ，ｍｒｃＢ，ｍｒｄＡ，ｍｒｄＢ，ｍｒｅＢ，ｍｒｅＣ，ｍｒｅＤ，ｍｒｐ，ｍｒｒ，ｍｓｂＡ，ｍｓｂＢ，ｍｓｃＬ，ｍｓｒＡ，ｍｓｙＢ，ｍｔｇ，ｍｔｇＡ，ｍｔｌＡ，ｍｔｌＤ，ｍｔｌＲ，ｍｔｒ，ｍｔｔＡ，ｍｔｔＢ，ｍｔｔＣ，ｍｕｋＢ，ｍｕｋＥ，ｍｕｋＦ，ｍｕｌ，ｍｕｒＡ，ｍｕｒＢ，ｍｕｒＣ，ｍｕｒＤ，ｍｕｒＥ，ｍｕｒＦ，ｍｕｒＧ，ｍｕｒＨ，ｍｕｒＩ，ｍｕｔＧ（ｐｕｔａｔｉｖｅ），ｍｕｔＨ，ｍｕｔＬ，ｍｕｔＭ，ｍｕｔＳ，ｍｕｔＴ，ｍｕｔＹ，ｎａｃ，ｎａｄＡ，ｎａｄＢ，ｎａｄＣ，ｎａｄＥ，ｎａｇＡ，ｎａｇＢ，ｎａｇＣ，ｎａｇＤ，ｎａｇＥ，ｎａｌＢ，ｎａｌＤ，ｎａｎＡ，ｎａｎＥ，ｎａｎＫ，ｎａｎＲ，ｎａｎＴ，ｎａｐＡ，ｎａｐＢ，ｎａｐＣ，ｎａｐＤ，ｎａｐＦ，ｎａｐＧ，ｎａｐＨ，ｎａｒＧ，ｎａｒＨ，ｎａｒＩ，ｎａｒＪ，ｎａｒＫ，ｎａｒＬ，ｎａｒＰ，ｎａｒＱ，ｎａｒＵ，ｎａｒＶ，ｎａｒＷ，ｎａｒＸ，ｎａｒＹ，ｎａｒＺ，ｎｄｈ，ｎｄｋ，ｎｅａＢ，ｎｅｉ，ｎｅｍＡ，ｎｆｉ，ｎｆｎＡ，ｎｆｎＢ，ｎｆｏ，ｎｆｒＡ，ｎｆｒＢ，ｎｆｒＤ，ｎｆｓＡ，ｎｈａＡ，ｎｈａＢ，ｎｈａＲ，ｎｉｋＡ，ｎｉｋＢ，ｎｉｋＣ，ｎｉｋＤ，ｎｉｋＥ，ｎｉｒＢ，ｎｉｒＣ，ｎｉｒＤ，ｎｌｐＡ，ｎｌｐＢ，ｎｌｐＣ，ｎｌｐＤ，ｎｍｐＣ（ｑｓｒ’），ｎｏｎ，ｎｐｒ，ｎｒｄＡ，ｎｒｄＢ，ｎｒｄＤ，ｎｒｄＥ，ｎｒｄＦ，ｎｒｄＧ，ｎｒｆＡ，ｎｒｆＢ，ｎｒｆＣ，ｎｒｆＤ，ｎｒｆＥ，ｎｒｆＦ，ｎｒｆＧ，ｎｔｈ，ｎｔｐＡ，ｎｕｏＡ，ｎｕｏＢ，ｎｕｏＣ，ｎｕｏＥ，ｎｕｏＦ，ｎｕｏＧ，ｎｕｏＨ，ｎｕｏＩ，ｎｕｏＪ，ｎｕｏＫ，ｎｕｏＬ，ｎｕｏＭ，ｎｕｏＮ，ｎｕｐＣ，ｎｕｐＧ，ｎｕｓＡ，ｎｕｓＢ，ｎｕｓＧ，ｎｕｖＡ，ｎｕｖＣ，ｏｇｒＫ，ｏｇｔ，ｏｍｐＡ，ｏｍｐＣ，ｏｍｐＦ，ｏｍｐＧ，ｏｍｐＲ，ｏｍｐＴ，ｏｍｐＸ，ｏｐｐＡ，ｏｐｐＢ，ｏｐｐＣ，ｏｐｐＤ，ｏｐｐＥ，ｏｐｐＦ，ｏｐｒ，ｏｐｓ，ｏｒａＡ，ｏｒｄＬ，ｏｒｆ−２３（ｐｕｒＢ，ｒｅｇ）ｏｒｆｌ９５（ｎｉｋＡ−ｒｅｇ），ｏｒｎ，ｏｓｍＢ，ｏｓｍＣ，ｏｓｍＥ，ｏｓｍＹ，ｏｔｓＡ，ｏｔｓＢ，ｏｘｙＲ，ｏｘｙＳ，ｐａｂＡ，ｐａｂＢ，ｐａｂＣ，ｐａｃ，ｐａｌ，ｐａｎＢ，ｐａｎＣ，ｐａｎＤ，ｐａｎＦ，ｐａｒＣ，ｐａｒＥ，ｐａｔ，ｐｂｐＧ，ｐｃｋ，ｐｃｍ，ｐｃｎＢ，ｐｄｈＲ，ｐｄｘＡ，ｐｄｘＢ，ｐｄｘＨ，ｐｄｘＪ，ｐｄｘＫ，ｐｄｘＬ，ｐｄｘＹ，ｐｅｐＡ，ｐｅｐＤ，ｐｅｐＥ，ｐｅｐＮ，ｐｅｐＰ，ｐｅｐＱ，ｐｅｐＴ，ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ，ｐｆｌＡ，ｐｆｌＢ，ｐｆｌＣ，ｐｆｌＤ，ｐｆｓ，ｐｇｉ，ｐｇｋ，ｐｇｌ，ｐｇｍ，ｐｇｐＡ，ｐｇｐＢ，ｐｇｓＡ，ｐｈｅＡ，ｐｈｅＰ，ｐｈｅＳ，ｐｈｅＴ，ｐｈｅＵ，ｐｈｅＶ，ｐｈｎＣ，ｐｈｎＤ，ｐｈｎＥ，ｐｈｎＦ，ｐｈｎＧ，ｐｈｎＨ，ｐｈｎＩ，ｐｈｎＪ，ｐｈｎＫ，ｐｈｎＬ，ｐｈｎＭ，ｐｈｎＮ，ｐｈｎＯ，ｐｈｎＰ，ｐｈｏＡ，ｐｈｏＢ，ｐｈｏＥ，ｐｈｏＨ，ｐｈｏＰ，ｐｈｏＱ，ｐｈｏＲ，ｐｈｏＵ，ｐｈｒＢ，ｐｈｘＢ，ｐｉｎ，ｐｉｏＯ，ｐｉｔ，ｐｌｄＡ，ｐｌｄＢ，ｐｌｓＢ，ｐｌｓＣ，ｐｌｓＸ，ｐｍｂＡ，ｐｎｃＡ，ｐｎｃＢ，��ｎｐ，ｐｎｔＡ，ｐｎｔＢ，ｐｎｕＣ，ｐｏａＲ，ｐｏｌＡ，ｐｏｌＢ，ｐｏｐＤ，ｐｏｔＡ，ｐｏｔＢ，ｐｏｔＣ，ｐｏｔＤ，ｐｏｔＥ，ｐｏｔＦ，ｐｏｔＧ，ｐｏｔＨ，ｐｏｔＩ，ｐｏｘＡ，ｐｏｘＢ，ｐｐａ，ｐｐｃ，ｐｐｈＡ，ｐｐｈＢ，ｐｐｉＡ，ｐｐｉＢ，ｐｐｉＣ，ｐｐｋ，ｐｐｐＡ，ｐｐｓ，ｐｐｘ，ｐｑｉＡ，ｐｑｉＢ，ｐｑｑＬ，ｐｑｑＭ，ｐｒｃ，ｐｒｆＡ，ｐｒｆＢ，ｐｒｆＣ，ｐｒｉＡ，ｐｒｉＢ，ｐｒｉＣ，ｐｒｌＣ，ｐｒｌＺ，ｐｒｍＡ，ｐｒｍＢ，ｐｒｏＡ，ｐｒｏＢ，ｐｒｏＣ，ｐｒｏＫ，ｐｒｏＬ，ｐｒｏＭ，ｐｒｏＰ，ｐｒｏＱ，ｐｒｏＳ，ｐｒｏＴ，ｐｒｏＶ，ｐｒｏＷ，ｐｒｏＸ，ｐｒｐＡ，ｐｒｐＣ，ｐｒｐＲ，ｐｒｒ，ｐｒｓ，ｐｓｄ，ｐｓｉＦ，ｐｓｐＡ，ｐｓｐＢ，ｐｓｐＣ，ｐｓｐＥ，ｐｓｐＦ，ｐｓｓＡ，ｐｓｓＲ，ｐｓｔＡ，ｐｓｔＢ，ｐｓｔＣ，ｐｓｔＳ，ｐｓｕ，ｐｔａ，ｐｔｈ，ｐｔｒＡ，ｐｔｒＢ，ｐｔｓＧ，ｐｔｓＨ，ｐｔｓＩ，ｐｔｓＮ“−”，ｐｔｓＰ，ｐｕｒＡ，ｐｕｒＢ，ｐｕｒＣ，ｐｕｒＤ，ｐｕｒＥ，ｐｕｒＦ，ｐｕｒＨ，ｐｕｒＫ，ｐｕｒＬ，ｐｕｒＭ，ｐｕｒＮ，ｐｕｒＰ，ｐｕｒＲ，ｐｕｒＴ，ｐｕｒＵ，ｐｕｓ，ｐｕｔＡ，ｐｕｔＰ，ｐｙｋＡ，ｐｙｋＦ，ｐｙｒＢ，ｐｙｒＣ，ｐｙｒＤ，ｐｙｒＥ，ｐｙｒＦ，ｐｙｒＧ，ｐｙｒＨ，ｐｙｒＩ，ｑｍｅＣ，ｑｍｅＤ，ｑｍｅＥ，ｑｏｒ，ｑｕｅＡ，ｒａｃＣ，ｒａｃＲ，ｒａｄＡ，ｒａｄＣ，ｒａｎＡ，ｒａｒＤ，ｒａｓ，ｒｂｆＡ，ｒｂｎ，ｒｂｓＡ，ｒｂｓＢ，ｒｂｓＣ，ｒｂｓＤ，ｒｂｓＫ，ｒｂｓＲ，ｒｃｓＡ，ｒｃｓＢ，ｒｃｓＣ，ｒｃｓＦ，ｒｄｇＡ，ｒｄｇＢ，ｒｅｃＡ，ｒｅｃＢ，ｒｅｃＣ，ｒｅｃＤ，ｒｅｃＥ，ｒｅｃＦ，ｒｅｃＧ，ｒｅｃＪ，ｒｅｃＮ，ｒｅｃＯ，ｒｅｃＱ，ｒｅｃＲ，ｒｅｃＴ，ｒｅｌＡ，ｒｅｌＢ，ｒｅｌＥ，ｒｅｌＦ，ｒｅｌＸ，ｒｅｐ，ｒｅｒ，ｒｆａＢ，ｒｆａＣ，ｒｆａＤ，ｒｆａＦ，ｒｆａＧ，ｒｆａＨ，ｒｆａＩ，ｒｆａＪ，ｒｆａＫ，ｒｆａＬ，ｒｆａＰ，ｒｆａＱ，ｒｆａＳ，ｒｆａＹ，ｒｆａＺ，ｒｆｂＡ，ｒｆｂＢ，ｒｆｂＣ，ｒｆｂＤ，ｒｆｂＸ，ｒｆｃ，ｒｆｅ，ｒｆｆＡ，ｒｆｆＣ，ｒｆｆＤ，ｒｆｆＥ，ｒｆｆＧ，ｒｆｆＨ，ｒｆｆＭ，ｒｆｆＴ，ｒｈａＡ，ｒｈａＢ，ｒｈａＤ，ｒｈａＲ，ｒｈａＳ，ｒｈａＴ，ｒｈｌＢ，ｒｈｌＥ，ｒｈｏ，ｒｉｂＡ，ｒｉｂＢ，ｒｉｂＣ，ｒｉｂＤ，ｒｉｂＥ，ｒｉｂＦ，ｒｉｄＡ，ｒｉｄＢ，ｒｉｍＢ，ｒｉｍＣ，ｒｉｍＤ，ｒｉｍＥ，ｒｉｍＧ，ｒｉｍＨ，ｒｉｍＩ，ｒｉｍＪ，ｒｉｍＫ，ｒｉｍＬ，ｒｉｍＭ，ｒｉｔ，ｒｌｐＡ，ｒｌｐＢ，ｒｌｕＡ，ｒｌｕＣ，ｒｌｕＤ，ｒｍｆ，ｒｎａ，ｒｎｂ，ｒｎｃ，ｒｎｄ，ｒｎｅ，ｒｎｈＡ，ｒｎｈＢ，ｒｎｋ，ｒｎｐＡ，ｒｎｐＢ，ｒｎｒ，ｒｎｔ，ｒｏｂ，ｒｏｒＢ，ｒｐｅ，ｒｐｈ，ｒｐｉＡ，ｒｐｉＢ，ｒｐｉＲ，ｒｐｌＡ，ｒｐｌＢ，ｒｐｌＣ，ｒｐｌＤ，ｒｐｌＥ，ｒｐｌＦ，ｒｐｌＩ，ｒｐｌＪ，ｒｐｌＫ，ｒｐｌＬ，ｒｐｌＭ，ｒｐｌＮ，ｒｐｌＯ，ｒｐｌＰ，ｒｐｌＱ，ｒｐｌＲ，ｒｐｌＳ，ｒｐｌＴ，ｒｐｌＵ，ｒｐｌＶ，ｒｐｌＷ，ｒｐｌＸ，ｒｐｌＹ，ｒｐｍＡ，ｒｐｍＢ，ｒｐｍＣ，ｒｐｍＤ，ｒｐｍＥ，ｒｐｍＦ，ｒｐｍＧ，ｒｐｍＨ，ｒｐｍＩ，ｒｐｍＪ，ｒｐｏＡ，ｒｐｏＢ，ｒｐ��Ｃ，ｒｐｏＤ，ｒｐｏＥ，ｒｐｏＨ，ｒｐｏＮ，ｒｐｏＳ，ｒｐｏＺ，ｒｐｓＡ，ｒｐｓＢ，ｒｐｓＣ，ｒｐｓＤ，ｒｐｓＥ，ｒｐｓＦ，ｒｐｓＧ，ｒｐｓＨ，ｒｐｓＩ，ｒｐｓＪ，ｒｐｓＫ，ｒｐｓＬ，ｒｐｓＭ，ｒｐｓＮ，ｒｐｓＯ，ｒｐｓＰ，ｒｐｓＱ，ｒｐｓＲ，ｒｐｓＳ，ｒｐｓＴ，ｒｐｓＵ，ｒｒｆＡ，ｒｒｆＢ，ｒｒｆＣ，ｒｒｆＤ，ｒｒｆＥ，ｒｒｆＦ，ｒｒｆＧ，ｒｒｆＨ，ｒｒｌＡ，ｒｒｌＢ，ｒｒｌＣ，ｒｒｌＤ，ｒｒｌＥ，ｒｒｌＧ，ｒｒｌＨ，ｒｒｍＡ，ｒｒｓＡ，ｒｒｓＢ，ｒｒｓＣ，ｒｒｓＤ，ｒｒｓＥ，ｒｒｓＧ，ｒｒｓＨ，ｒｓｄ，ｒｓｅＡ，ｒｓｅＢ，ｒｓｅＣ，ｒｓｐＡ，ｒｓｐＢ，ｒｓｓＡ，ｒｓｓＢ，ｒｓｕＡ，ｒｔｃＡ，ｒｔｃＢ，ｒｔｃＲ，ｒｔｎ，ｒｕｓ（ｑｓｒ’），ｒｕｖＡ，ｒｕｖＢ，ｒｕｖＣ，ｓａｄ，ｓａｎＡ，ｓａｐＡ，ｓａｐＢ，ｓａｐＣ，ｓａｐＤ，ｓａｐＦ，ｓｂａＡ，ｓｂｃＢ，ｓｂｃＣ，ｓｂｃＤ，ｓｂｍＡ，ｓｂｍＣ（ｇｙｒＩ），ｓｂｐ，ｓｄａＡ，ｓｄａＢ，ｓｄａＣ，ｓｄｈＡ，ｓｄｈＢ，ｓｄｈＣ，ｓｄｈＤ，ｓｄｉＡ，ｓｄｓ，ｓｅｃＡ，ｓｅｃＢ，ｓｅｃＤ，ｓｅｃＥ，ｓｅｃＦ，ｓｅｃＧ，ｓｅｃＹ，ｓｅｌＡ，ｓｅｌＢ，ｓｅｌＣ，ｓｅｌＤ，ｓｅｍＡ，ｓｅｑＡ，ｓｅｒＡ，ｓｅｒＢ，ｓｅｒＣ，ｓｅｒＲ  ｓｅｒＳ，ｓｅｒＴ，ｓｅｒＵ，ｓｅｒＶ，ｓｅｒＷ，ｓｅｒＸ，ｓｆａ，ｓｆｃＡ，ｓｆｉＣ，ｓｆｓＡ，ｓｆｓＢ，ｓｈｉＡ，ｓｉｐＣ，ｓｉｐＤ，ｓｉｒ，ｓｉｘＡ，ｓｌｏＢ，ｓｌｐ，ｓｌｒ，ｓｌｔ，ｓｌｙＤ，ｓｌｙＸ，ｓｍｐ，ｓｍｔＡ，ｓｏｄＡ，ｓｏｄＢ，ｓｏｄＣ，ｓｏｈＡ，ｓｏｈＢ，ｓｏｌＡ，ｓｏｘＲ，ｓｏｘＳ，ｓｐｅＡ，ｓｐｅＢ，ｓｐｅＣ，ｓｐｅＤ，ｓｐｅＥ，ｓｐｅＦ，ｓｐｅＧ，ｓｐｆ，ｓｐｏＴ，ｓｐｐＡ，ｓｐｒ，ｓｒｌＡ，ｓｒｌＢ，ｓｒｌＤ，ｓｒｌＥ，ｓｒｌＲ，ｓｒｍＢ，ｓｒｎＡ，ｓｓａＥ，ｓｓａＧ，ｓｓａＨ，ｓｓｂ，ｓｓｅＡ，ｓｓｅＢ，ｓｓｐＡ，ｓｓｐＢ，ｓｓｒＡ，ｓｓｒＳ，ｓｓｙＡ，ｓｓｙＤ  ｓｔｆＺ，ｓｔｋＡ，ｓｔｋＢ，ｓｔｋＣ，ｓｔｋＤ，ｓｔｐＡ，ｓｔｒＣ，ｓｔｒＭ，ｓｔｓＡ，ｓｕｃＡ，ｓｕｃＢ，ｓｕｃＣ，ｓｕｃＤ，ｓｕｆＩ，ｓｕｇＥ，ｓｕｈＡ，ｓｕｈＢ，ｓｕｌＡ，ｓｕｐＱ，ｓｕｒＡ，ｓｕｒＥ，ｓｙｄ，ｔａｂＣ，ｔａｇ，ｔａｌＡ，ｔａｌＢ，ｔａｎＡ，ｔａｎＢ，ｔａｐ，ｔａｒ，ｔａｓ，ｔａｕＡ，ｔａｕＢ，ｔａｕＣ，ｔａｕＤ，ｔｂｐＡ，ｔｄｃＡ，ｔ
ｄｃＢ，ｔｄｃＣ，ｔｄｃＤ，ｔｄｃＥ，ｔｄｃＦ，ｔｄｃＧ，ｔｄｃＲ，ｔｄｈ，ｔｄｉ  ｔｄｋ，ｔｅｈＡ，ｔｅｈＢ，ｔｅｓＡ，ｔｅｓＢ，ｔｇｔ，ｔｈｄＡ，ｔｈｄＣ，ｔｈｄＤ，ｔｈｉＢ？，ｔｈｉＣ，ｔｈｉＤ，ｔｈｉＥ，ｔｈｉＦ，ｔｈｉＧ，ｔｈｉＨ，ｔｈｉＩ，ｔｈｉＪ，ｔｈｉＫ，ｔｈｉＬ，ｔｈｉＭ，ｔｈｒＡ，ｔｈｒＢ，ｔｈｒＣ，ｔｈｒＳ，ｔｈｒＴ，ｔｈｒＵ，ｔｈｒＶ，ｔｈｒＷ，ｔｈｙＡ，ｔｉｇ，ｔｋｔＡ，ｔｋｔＢ，ｔｌｄＤ，ｔｌｎＡ，ｔｍｋ，ｔｎａＡ，ｔｎａＢ，ｔｎａＣ，ｔｎｍ，ｔｏｌ−ｏｒｆ１，ｔｏｌ−ｏｒｆ２，ｔｏｌＡ，ｔｏｌＢ，ｔｏｌＣ，ｔｏｌＤ，ｔｏｌＥ，ｔｏｌＩ，ｔｏｌＪ，ｔｏｌＭ，ｔｏｌＱ，ｔｏＩＲ，ｔｏｎＢ，ｔｏｐＡ，ｔｏｐＢ，ｔｏｒＡ，ｔｏｒＣ，ｔｏｒＤ，ｔｏｒＲ，ｔｏｒＳ，ｔｏｒＴ，ｔｐｉＡ，ｔｐｒ，ｔｐｘ，ｔｒｅＡ，ｔｒｅＢ，ｔｒｅＣ，ｔｒｅＦ，ｔｒｅＲ，ｔｒｇ，ｔｒｋＡ，ｔｒｋＤ，ｔｒｋＧ，ｔｒｋＨ，ｔｒｍＡ，ｔｒｍＢ，ｔｒｍＣ，ｔｒｍＤ，ｔｒｍＥ，ｔｒｍＦ，ｔｒｍＨ，ｔｒｍＵ，ｔｒｎＡ，ｔｒｐＡ，ｔｒｐＢ，ｔｒｐＣ，ｔｒｐＤ，ｔｒｐＥ，ｔｒｐＲ，ｔｒｐＳ，ｔｒｐＴ，ｔｒｕＡ，ｔｒｕＢ，ｔｒｘＡ，ｔｒｘＢ，ｔｒｘＣ，ｔｓａＡ，ｔｓｆ，ｔｓｍＡ，ｔｓｒ，ｔｓｘ，ｔｔｄＡ，ｔｔｄＢ，ｔｔｋ，ｔｕｆＡ，ｔｕｆｆＢ，ｔｕｓ，ｔｙｎＡ，ｔｙｒＡ，ｔｙｒＢ，ｔｙｒＰ，ｔｙｒＲ，ｔｙｒＳ，ｔｙｒＴ，ｔｙｒＵ，ｔｙｒＶ，ｕｂｉＡ，ｕｂｉＢ，ｕｂｉＣ，ｕｂｉＤ，ｕｂｉＥ，ｕｂｉＦ，ｕｂｉＧ，ｕｂｉＨ，ｕｂｉＸ，ｕｃｐＡ［］，ｕｄｋ，ｕｄｐ，ｕｇｐＡ，ｕｇｐＢ，ｕｇｐＣ，ｕｇｐＥ，ｕｇｐＱ，ｕｈｐＡ，ｕｈｐＢ，ｕｈｐＣ，ｕｈｐＴ，ｕｉｄＡ，ｕｉｄＢ，ｕｉｄＲ，ｕｍｕＣ，ｕｍｕＤ，ｕｎｇ，ｕｐｐ，ｕｐｐＳ，ｕｐｓ，ｕｒａＡ，ｕｓｇ−１，ｕｓｂＡ，ｕｓｐＡ，ｕｕｐ，ｕｖｈ，ｕｖｒＡ，ｕｖｒＢ，ｕｖｒＣ，ｕｖｒＤ，ｕｖｓ，ｕｘａＡ，ｕｘａＢ，ｕｘａＣ，ｕｘｕＡ，ｕｘｕＢ，ｕｘｕＲ，ｖａｌＳ，ｖａｌＴ，ｖａｌＵ，ｖａｌＶ，ｖａｌＷ，ｖａｌＸ，ｖａｌＹ，ｖａｌＺ，ｖｓｒ，ｗｒｂＡ，ｘａｐＡ，ｘａｐＢ，ｘａｐＲ，ｘａｓＡ，ｘｅｒＣ，ｘｅｒＤ，ｘｎｉ，ｘｓｅＡ，ｘｓｅＢ，ｘｔｈＡ，ｘｙｌＡ，ｘｙｌＢ，ｘｙｌＥ，ｘｙｌＦ，ｘｙｌＧ，ｘｙｌＨ，ｘｙｌＲ，ｙｃｃＡ，ｙｈｈＰ，ｙｉｈＧ，ｙｊａＢ，ｆｌ４７，ｙｊａＤ，ｙｏｈＦ，ｙｑｉＥ，ｙｒｆＥ，ｚｉｐＡ，ｚｎｔＡ，ｚｎｕＡ，ｚｎｕＢ，ｚｎｕＣ，ｚｕｒ，およびｚｗｆが挙げられる。
【０２６０】
マウス遺伝子の非限定例としては、Ｉｌｒ１，Ｉｌｒ２，Ｇａｓ１０，Ｔｎｐ１，Ｉｎｈｂｂ，Ｉｎｈａ，Ｃｒｅｂ１，Ｍｐｍｖ３４，Ａｃｒｄ，Ａｃｒｇ，Ｉｌ１１０，Ｏｔｆ１，Ｒａｂ１１ｂ−ｒ，Ａｂｌ１，ａｌｄ，Ａｍｈ−ｒｓ１，Ｂｃ１２Ｂ，Ｃｃｈｌｌａ３，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ２，Ｇｐｃｒ１６，Ｈｔｒ５ｂ，Ｉｄｄ５，Ｉｇｆｂｐ２，Ｉｇｆｂｐ５，Ｉ１８ｒｂ，Ｋｒａｓ２−ｒｓ１，Ｍｏｖ７，Ｍｐｍｖ６，Ｍｐｍｖ１６，Ｍｐｍｖ２２，Ｍｐｍｖ２５，Ｍｐｍｖ２９，Ｍｐｍｖ４２，Ｍｔｖ７，Ｍｔｖ２７，Ｍｔｖ３９，Ｏｐｒｋ１，Ｏｔｆ３−ｒｓ１，Ｏｔｆ８，Ｏｔｆ１１−ｒｓ１，Ｐｔｇｓ２，Ｒｅｎ１，Ｒｅｎ２，Ｒｉｌ３，Ｓｘｖ，Ｔａｚ４−ｒｓ１，Ｔｇｆｂ２，Ｗｎｔ６，Ｘｍｍｖ６，Ｘｍｍｖ９，Ｘｍｍｖ３６，Ｘｍｍｖ６１，Ｘｍｍｖ７４，Ｘｍｖ２１，Ｘｍｖ３２，Ｘｍｖ４１，Ｉ１２ｒａ，Ａｂ１，Ｍｐｍｖ３，Ｒａｐ１ａ−ｐｓ２，ａｎｘ，Ｍｐｍｖ４３，Ｒｙｒ３，Ｒａｓ１２−４，Ａｄｒａ２ｂ，Ａｖｐ，Ｇｌｖｒ１，Ｉｌ１ａ，Ｉｌ１ｂ，Ｍｐｍｖ２８，Ｏｘｔ，Ｐｃｓｋ２，ａ，Ｘｍｖ１０，Ｔｃｆ４，Ａｃｒａ，Ａｃｒａ４，Ａｋ１，Ｂｄｎｆ，ｂｓ，Ｃｙｃｔ，Ｃｙｐ２４，Ｄｂｈ，Ｆｓｈｂ，Ｇｃｇ，Ｇｄｆ５，Ｇｎａｓ，Ｇｐｃｒ８，Ｇｒｉｎ１，Ｈｃｓ４，Ｈｉｏｒ２，Ｈｓｐ８４−２，Ｉｄｄ１２，Ｉｌｒｎ，Ｊｕｎｄ２，Ｋｒａｓ３，Ｍｃ３ｒ，Ｍｐｍｖ１４，Ｍｔｖ４０，Ｍｘｉ１−ｒｓ１，Ｏｔｆ３−ｒｓ２，Ｐｔｇｓ１，Ｐｔｐｒａ，Ｒａｐｓｎ，Ｓｒｃ，Ｓｖｐ１，Ｓｖｐ３，Ｔｃｆ３ｂ，Ｗｔ１，Ｘｍｍｖ７１，Ｘｍｖ４８，Ｃｃｎａ，Ｆｇｆ２，Ｆｔｈ−ｒｓ１，Ｃｓｆｍ，Ｍｏｖ１０，Ｅｇｆ，Ａｃｒｂ２，Ｃａｐ１，Ｃｒｈ，Ｆｉｍ３，Ｆｐｓ１１，Ｇｌｕｔ２，Ｇｐｃｒ２，Ｇｒｉａ２，Ｈｓｄ３ｂ−１，Ｈｓｄ３ｂ−２，Ｈｓｄ３ｂ−３，Ｈｓｄ３ｂ−４，Ｈｓｐ８６−ｐｓ２，Ｉｄｄ３，Ｉ１２，Ｉ１７，Ｍｐｖｍｖ９，Ｍｐｍｖ２０，Ｍｔｖ４．８，Ｎｇｆｂ，Ｎｐｒａ，Ｎｒａｓ，Ｎｒａｓ，Ｎｔｒｋ，Ｏｔｆ３−ｒｓ３，Ｏｔｆ３−ｒｓ４，Ｒａｐ１ａ，Ｔｓｈｂ，Ｘｍｍｖ２２，Ｘｍｍｖ６５，Ｍｏｓ，Ｒａｓ１２−７，Ｌｙｒ，Ｉｆａ，Ｉｆｂ，Ｊｕｎ，ａｚｈ，ｄｂ，Ｉｐｐ，Ｍｐ１，Ｄｏ１，Ａｋ２，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ４，Ｃｄｃ２１１，Ｃｇａ，Ｆｇｒ，Ｆｏｃ１，Ｆｐｓ１２，Ｇａｂｒｒ１，Ｇａｂｒｒ２，Ｇｄｆ６，Ｇｌｕｔ１，Ｇｎｂ１，Ｇｐｃｒ１４，Ｇｒｂ２−ｐｓ，Ｇｒｉｋ３，Ｇｒｉｋ５，Ｈｓｐ８６−１ｐｓ４，Ｈｔｒ１ｄａ，Ｈｔｒ１ｄｂ，Ｉｄｄ９，Ｉｆａ１，Ｉｆａ２，Ｉｆａ３，Ｉｆａ４，Ｉｆａ５，Ｉｆａ６，Ｉｆａ７，Ｉｆａ８，Ｉｆａ９，Ｉｆａ１０，Ｌａｐ１８，Ｌｍｙｃ１，Ｍｐｍｖ１９，Ｍｐｍｖ４４，Ｍｔｖ１３，Ｍｔｖ１４，Ｍｔｖ１７，Ｎｐｐｂ，Ｏｔｆ６，Ｏｔｆ７，Ｒｉ１２，Ｓｋｉ，Ｔｎｆｒ２，Ｗｎｔ４，Ｘｍｍｖ８，Ｘｍｍｖ２３，Ｘｍｍｖ６２，Ｘｍｖ１，Ｘｍｖ２，Ｘｍｖ８，Ｘｍｖ９，Ｘｍｖ１４，Ｘｍｖ４４，Ｘｐａ，Ｔｅｃ，Ｆｇｆ５，Ｎｏｓ１，Ｔｃｆ１，Ｅｐｏ，Ｇｎｂ２，Ｆｌｔ１，Ｆｌｔ３，Ａｃｈｅ，Ａｄｒａ２ｃ，Ａｄｒｂｋ２，Ａｆｐ，Ａｌｂ１，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１，Ｃｌｏｃｋ，Ｃｙｐ３，Ｃｙｐ３ａ１１，Ｃｙｐ３ａ１３，Ｄｒｄ１ｂ，Ｄｒｄ５，Ｆｇｆｒ３，Ｆｌｋ１，Ｇｃ，Ｇｎｒｈｒ，Ｇｐｃｒ１，Ｈｃｓ５，Ｈｎｆ１，Ｈｔｒ５ａ，Ｉ１５ｒ，Ｉ１６，Ｋｉｔ，Ｌｔｒｍ３，Ｍｇｓａ，Ｍｐｍｖ７，Ｍｐｍｖ１３，Ｍｐｍｖ２３，Ｍｔｖ３２，Ｍｔｖ４１，Ｐｄｇｆａ，Ｐｄｇｆｒａ，Ｐｏｒ，Ｔｘｋ，Ｘｍｍｖ３，Ｘｍｍｖ５，Ｘｍｍｖ５２，Ｘｍｖ１７，Ｘｍｖ２８，Ｘｍｖ３４，Ｘｍｖ３８，Ｘｍｖ４５，Ｚｐ３，Ｔｒｈ，Ｒａｆ１，Ｆｔｈ−ｒｓ２，Ｎｔｆ３，Ｋｒａｓ２，Ｐｔｈｌｈ，Ｍｏｖ１，Ａｌｏｘ５，Ｂｒａｆ２，Ｃｆｔｒ，Ｅｇｒ４，Ｆｐｓｌ１０，Ｆｇｆ６，Ｇｄｆ３，Ｇｈｒｆｒ，Ｇｌｕｔ３，Ｇｒｉｎ２ａ，Ｈｉｏｒ３，Ｈｏｘａ１０，ｈｏｐ，Ｉｃａ１，Ｉ１５ｒ，Ｉｎｔ４１，Ｉｔｐｒ１，Ｋｒａｇ，Ｍａｄ，Ｍｅｔ，Ｍｉ，Ｍｔｖ８，Ｍｔｖ２３，Ｍｔｖ２９，Ｍｔｖ３３，Ｍｔｖ３４，Ｎｋｎａ，Ｎｐｙ，ｏｂ，Ｏｔｆ３−ｒｓ５，Ｔｇｆａ，Ｔｎｆｒ１，Ｗｎｔ２，Ｗｎｔ５Ｂ，Ｗｎｔ７Ａ，Ｘｍｍｖ２７，Ｘｍｖ２４，Ｘｍｖ６１，Ｆｏｓｂ，Ｒｙｒ１，Ｎｇｆａ，Ｕｆｏ，Ｘｒｃｃ１，Ａｂｐａ，Ａｂｐｇａ，Ｇａｂｒａ４，Ｇａｓ２，Ａｃｒａ７，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ７，Ｅｇｆｂｐ３，Ｘｍｖ３０，Ｚｐ２，Ｆｅｓ，Ｐｃｓｋ３，Ｃａｌｃ，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１０，Ｐｔｈ，Ａｄ，Ｂｃ１３，Ｃｅａ，Ｃｅａ２，Ｃｅａ３，Ｃｅａ４，Ｃｅａ５，Ｃｅａ６，Ｃｅｂｐ，Ｄｍ９，Ｄｍ１５，Ｄｒｄ４，Ｅｇｆｂｐ１，Ｅｇｆｂｐ２，Ｅｒｃｃ２，Ｆｇｆ３，Ｆｇｆｒ２，Ｇａｂｒａ５，Ｇａｂｒｂ３，Ｇｔｘ，Ｈｃｓ１，Ｉｇｆ１ｒ，Ｉｇｆ２，Ｉ１４ｒ，Ｉｎｓ２，Ｉｎｔ４０，Ｌｈｂ，Ｍｐｍｖ１，Ｍｔｖ１，Ｍｔｖ３５，Ｎｇｆｇ，Ｎｔｆ５，Ｏｔｆ２，２，Ｐｋｃｃ，Ｒａｓ１４，Ｒｒａｓ，Ｒｙｒ，Ｓｖｐ２，Ｔｃｆ３ｇ，Ｔｇｆｂ１，ｔｕｂ，Ｘｍｍｖ３１，Ｘｍｍｖ３５，Ｘｍｍｖ７３，Ｘｍｖ３３，Ｘｍｖ５３，Ｔａｚ８３，Ａｄｒｂ３，Ｊｕｎｂ，Ｊｕｎｄ１，Ｍｅ１，Ｇｐｃｒ１９−ｒｓ２，Ａｇｔ，Ｃａｄｐ，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ９，Ｅ，Ｆｇｆｒ１，Ｇａｓ６，Ｇｎｂ−ｒｓ１，Ｈｃｓ２，Ｉｎｓｒ，Ｍａｆ，Ｍｏｖ３４，Ｍｐｍｖ２１，Ｍｐｍｖ４１，Ｍｔｖ２１，Ｍｔｎｒ１ａ，Ｐｌａｔ，Ｒａｓ１５−２，Ｒａｓ１６，Ｓｎｔｂ２，Ｘｍｍｖ２９，Ｘｍｖ１２，Ｘｍｖ２６，Ｘｍｖ６２，Ｅｐｏｒ，Ｇｐｃｒ１３，Ｏｔｆ１１，Ｐｔｈｒ，Ａｃｒａ３，Ａｃｒａ５，Ａｃｒｂ４，Ｃａｍｋ１，Ｃｄｃ２５Ｍｍ，Ｃｒｂｐ，Ｃｒｂｐ２，Ｃｓｋ，Ｃｙｐ１１ａ，Ｃｙｐ１９，Ｄｒｄ２，Ｅｔｓ１，Ｆｌｉ１，Ｇｎａｉ２，Ｇｎａｔ１，Ｇｐｃｒ６，Ｇｒｉａ４，Ｈｇｆ１，Ｈｉｏｒ１，Ｈｐｘ，Ｈｓｐ８６−１ｐｓ３，Ｈｓｔ２，Ｉｄｄ２，Ｉ１１ｂｃ，Ｌａｇ−ｒｓ１，Ｌａｐ１８−ｒｓ１，Ｍ１１，Ｍｐｍｖ２７，Ｐｅｎｋ，Ｐｇｒ，Ｒａｓ１２−２，Ｔｐ１１，Ｔｒｆ，Ｘｍｍｖ２，Ｘｍｍｖ６７，Ｘｍｖ１５，Ｘｍｖ１６，Ｘｍｖ２５，Ｘｍｖ６０，Ｍｇｆ，Ａｍｈ，Ｂｒａｆ，Ｃｄｃ２ａ，Ｄｍｄ１，Ｅｓｔｒ，Ｆｐｓ１３，Ｆｐｓ１４，Ｆｐｓ１５，Ｇｌｉ，Ｇｐｃｒ１７，Ｇｒｉｋ２，Ｉｆｇｒ，Ｉｇｆ１，Ｍｐｍｖ５，Ｍｐｍｖ１２，Ｍｐｍｖ４０，Ｍｙｂ，Ｏｐｒｍ，Ｐｇ，Ｐｍｃｈ，Ｒｏｓ１，Ｘｍｖ３１，Ｘｍｖ５１，Ｘｍｖ５４，Ｃａｍｋ２ｂ，Ｅｇｆｒ，Ｉｎｔ６，Ｌｉｆ，Ｍｔｖ４４，Ｅｗｓ，Ｃｓｆｇｍ，Ｆｌｔ４，Ｉ１３，Ｉ１４，Ｉ１５，Ｉｒｆ１，Ｇｒｉａ１，Ｇｌｕｔ４，Ｃｒｈｒ，Ｃｓｆｇ，Ｍｏｖ９，Ｘｍｖ２０，Ａｃｒｂ，Ｍｐｍｖ４，Ｍｐｍｖ１５，Ｎｇｆｒ，Ｎｏｓ２，Ｒａｒａ，Ｔａｚ４，Ｔｃｆ２，Ｘｍｖ４２，Ｍｔｖ３，Ａｄｒａ１，Ｃｒｋｏ，ｄｆ，Ｅｒｂｂ２，Ｇａｂｒａ１，Ｇａｂｒａ６，Ｇａｂｒｇ２，Ｇｈ，Ｇｌｒａ１，Ｇｒｂ２，Ｈｎｆ１ｂ，Ｈｓｐ８６−ｐｓ１，Ｉｄｄ４，Ｉｇｆｂｐ１，Ｉｇｆｂｐ３，Ｉ１１３，Ｉｎｔ４，Ｍｐｍｖ２，Ｍｐｍｖ８，Ｍｐｍｖ１８，Ｍｔｖ４５，ｎｕ，Ｐｋｃａ，Ｒａｂ１，Ｒｅ１，Ｓｈｂｇ，Ｔｃｆ７，Ｔｈｒａ，Ｔｎｚ１，Ｔｒｐ５３，Ｗｎｔ３，Ｗｎｔ３Ａ，Ｘｍｖ４，Ｘｍｖ５，Ｘｍｖ４７，Ｘｍｖ４９，Ｘｍｖ６３，Ａｋｔ，Ａｍｈ−ｒｓ４，Ｃｃｓ１，Ｆｐｓ１６，Ｆｏｓ，Ｇｄｆ７，Ｈｃｓ３，Ｈｓｐ７０−２，Ｈｓｐ８４−３，Ｈｓｐ８６−１，ｈｙｔ，Ｌｔｒｍ１，Ｍａｘ，Ｍｐｍｖ１１，Ｍｐｍｖ２４，Ｍｔｖ９，Ｍｔｖ３０，Ｐｏｍｃ１，Ｔｃｆ３ａ，Ｔｄａ２，Ｔｇｆｂ３，Ｔｐｏ，Ｔｓｈｒ，Ｘｍｍｖ２１，Ｘｍｍｖ２５，Ｘｍｍｖ３４，Ｘｍｍｖ５０，Ｇｌｉ３，Ｘｍｖ５５，Ｒｙｒ２，Ｉｎｈｂａ，Ｇａｓ１，Ｐｃｓｋ１，Ａｍｈ−ｒｓ２，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ６，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１３，Ｃｒｈｐｂ，Ｄａｔ１，Ｄｒｄ１ａ，Ｆｇｆｒ４，Ｆｐｓ１７，Ｆｉｍ１，Ｇｐｃｒ１５，Ｇｐｃｒ１８，Ｈｂｖｉ，Ｈｉｌｄａ，Ｈｔｒ１ａ，Ｉｄｄ１１，Ｉ１９，Ｌｔｒｍ４，Ｍａｋ，ｍｅｓ，Ｐ１１，Ｐ１２，Ｐｒ１，Ｒａ１，Ｒａｓａ，Ｓｒｄ５ａ１，Ｔｐｂｐ，Ｘｍｖ１３，Ｘｍｖ２７，Ｒａｒｂ，Ｒｂｐ３，Ｈｔｒ２，Ｒｂ１，Ａｃｒａ２，Ｃａｍｋｇ，Ｃｃｈ１１ａ２，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ５，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１２，Ｇｎｒｈ，Ｍｔｖ１１，Ｎｒａｓ−ｐｓ，Ｏｔｆ３−ｒｓ６，Ｐｌａｕ，Ｐｔｐｒｇ，Ｔｒｐ５３−ｐｓ，Ｗｎｔ５Ａ，Ｘｍｖ１９，Ｇｈｒ，Ｉ１７ｒ，Ｌｉｆｒ，Ｍｌｖｉ２，Ｐｒｌｒ，Ｍｙｃ，Ｒｉｌ１，ｃｏｇ，Ａｍｈ−ｒｓ７，Ｉ１２ｒｂ，Ｐｄｇｆｂ，Ａｃｒ，ＣＰ２，Ｒａｒｇ，Ｓｐ１−１，Ｗｎｔ１，Ａｆｒ１，Ａｔｆ４，Ｂｚｒｐ，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ１１，Ｃｙｐ１１ｂ，Ｉ１３ｒｂ１，Ｉ１３ｒｂ２，Ｉｎｓ３，Ｉｔｇａ，Ｍｌｖｉ１，Ｍｌｖｉ３，Ｍｔｖ３６，Ｐｄｇｆｅｃ，Ｓｖｐ５，Ｔｅｆ，Ｔｒｈｒ，Ｗｎｔ７Ｂ，Ｘｍｍｖ５５，Ｘｍｍｖ７２，Ｘｍｖ３７，Ｔｎｐ２，Ｅｔｓ２，Ｃａｓｒ，Ｃｈｕｃｋ−ｒｓ１，ｄｉｎ，Ｄｒｄ３，Ｅｒｇ，Ｇ２２ｐ１，Ｇａｐ４３，Ｇａｓ４，Ｇｒｉｋ１，Ｈｔｒ１ｆ，Ｉｆｇｔ，Ｉｎｔ５３，Ｌｔｒｍ２，Ｍｐｍｖ１７，Ｍｔｖ６，Ｍｔｖｒ１，Ｐｉｔ１，Ｘｍｖ３，Ｘｍｖ３５，Ｘｍｖ５０，Ｉｇｆ２ｒ，Ｍａｓ，Ｔｃｄ３，Ｇｌｐ１ｒ，Ｉｄｄ１，Ｔｌａ，Ａｅｇ１，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ３，Ｃｄｃ２ｂ，Ｃｓｉ，Ｃｙｐ２１，Ｃｙｐ２１−ｐｓ１，Ｆｐｓ１８，Ｇｎａ−ｒｓ１，Ｇｐｃｒ１９−ｒｓ１，Ｇｒｒ１，Ｇｒｒ２，Ｈｏｍ１，Ｈｓｃ７０ｔ，Ｈｓｐ７０，Ｈｓｐ７０−１，Ｈｓｐ７０−３，Ｈｓｐ８４−１，Ｈｓｔ１，Ｈｓｔ４，Ｈｓｔ５，Ｈｓｔ６，Ｈｙｅ，Ｉｎｔ３，Ｉｔｐｒ３，Ｌａｐ１８−ｒｓ２，Ｏｔｆ３，Ｐｔｐｒｓ，Ｒａｂ１１ｂ，Ｒａｓ１２−１，Ｒａｓ１２−３，Ｒａｓ１３，Ｒｒｓ，Ｒｘｒｂ，Ｔａｓ，Ｔｃｄ１，Ｔｃｄ２，Ｔｅｒａ１，Ｔｌａ−ｒｓ，Ｔｎｆａ，Ｔｎｆｂ，Ｔｐｘ１，Ｔｐｘ２，Ｘｍｍｖ１５，Ｘｍｖ３６，Ｘｍｖ５７，Ｃｓｆｍｒ，Ｐｄｇｆｒｂ，Ａｄｒｂ２，Ａｐｃ，Ｃａｍｋ２ａ，Ｃａｍｋ４，Ｄｃｃ，Ｆｇｆ１，Ｇｎａ１，Ｇｐｃｒ７，Ｇｒ１１，Ｇｒｐ，Ｈｓｐ７４，Ｍｃｃ，Ｍｔｖ２，Ｍｔｖ３８，Ｐｔｐｎ２，Ｔｐ１２，Ｘｍｖ２２，Ｘｍｖ２３，Ｘｍｖ２９，Ｆｔｈ，Ｃｓｆｇｍｒａ，Ｍｘｉ１，Ａｄｒａ２ａ，Ａｄｒｂ１，Ａｄｒｂｋ１，Ｃｈｕｃｋ，Ｃｙｐ１７，Ｇｎａ１４，Ｇｎｂ−ｐｓ１，Ｈｃｓ６，Ｈｔｒ７，Ｉｄｅ，Ｉｎｓ１，Ｌｐｃ１，Ｐｏｍｃ２，Ｓｅａｏ，Ｔｌｘ１，Ｘｍｍｖ４２，Ｘｍｖ１８，Ｔｃｆｅ３，Ａｒａｆ，Ａｖｐｒ２，ｍｄｘ，Ａｒ，Ｚｆｘ，Ｏｔｆ９，Ｃｃｇ１，Ｃｃｎｂ１−ｒｓ８，Ｆｐｓ１９，Ｇａｂｒａ３，Ｇｌｒａ２，Ｇｌｒａ４，Ｇｒｉａ３，Ｇｒｐｒ，Ｈｓｐ７４−ｐｓ１，Ｈｓｔ３，Ｈｔｒ１ｃ，Ｉ１２ｒｇ，Ｍｏｖ１４，Ｍｏｖ１５，Ｍｔｖ２８，Ｏｔｆ３−ｒｓ８，Ｓｔｓ，Ｓｘａ，Ｓｘｒ，Ｘｔａ，Ｔｄｙ，Ｈｙａ，Ｚｆｙ１，Ｚｆｙ２，Ｍｏｖ１５，Ｍｏｖ２４，Ｍｔｖ３１，Ｍｔｖ４２，Ｓｄｍａ，Ｓｐｙ，Ｓｔｓ，Ｓｘａ，Ｓｘｒ，ＸｍｍｖＹ，Ｘｍｖ７，Ｘｍｖ１１，およびＸｍｖ４０が挙げられる。
【０２６１】
ファセオラス・バルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）遺伝子の非限定例としては、Ａｃｃ，ａｃｅ，Ａｄｋ，Ａｍ，Ａｍｖ−１，Ａｍｖ−２，Ａｎｅ，ａｐｈ，Ａｒｃ，Ａｒｅ，ａｒｇ，Ａｒ１  （Ａｒｃ），ａｓｐ，Ｂ，ｂｃ−ｕ，ｂｃ−１．ｓｕｐ．１，ｂｃ−１．ｓｕｐ．２，ｂｃ−２．ｓｕｐ．１，ｂｃ−２．ｓｕｐ．２，ｂｃ−３，Ｂｃｍ，Ｂｅｇ，Ｂｉｐ，ｂｌｕ，Ｂｐｍ，Ｂｓｍ，Ｂｙ−１，Ｂｙ−２，Ｃ，Ｃ／ｃ，ｃ．ｓｕｐ．ｃｒ，Ｃ．ｓｕｐ．ｃｉｒ，Ｃ．ｓｕｐ．ｍａ  （Ｍ，Ｒ．ｓｕｐ．ｍａ），Ｃ．ｓｕｐ．ｒ，Ｃ．ｓｕｐ．ｒｅｓ，Ｃ．ｓｕｐ．ｒｈｏ，Ｃ．ｓｕｐ．ｓｔ，［Ｃ．ｓｕｐ．ｓｔ  Ｒ  Ａｃｃ］  （Ａｅｑ），ｃ．ｓｕｐ．ｕ  （ｉｎｈ，ｉ．ｓｕｂ．ｅ），［ｃ．ｓｕｐ．ｕ  Ｐｒｐ．ｓｕｐ．ｉ］  （Ｐｒｐ，ｃ．ｓｕｐ．ｕｉ，Ｎｕｄ），［ｃ．ｓｕｐ．ｕｐｒｐ．ｓｕｐ．ｓｔ］  （ｐｒｐ．ｓｕｐ．ｓｔ），［Ｃ  Ｐｒｐ］  （Ｐｒｐ），ｃ．ｓｕｐ．ｖ，［Ｃ  Ｒ］  （Ｒ），［Ｃ  ｒ］  （ｒ），Ｃａ，Ｃａｍ，Ｃａｖ，ｃｃ，ｃｈ１，ｃ１，ｃｍ１，Ｃｏ−１  （Ａ），Ｃｏ−２  （Ａｒｅ），Ｃｏ−３  （Ｍｅｘｉｑｕｅ  １），Ｃｏ−３．ｓｕｐ．２，Ｃｏ−４  （Ｍｅｘｉｑｕｅ  ２），Ｃｏ−５  （Ｍｅｘｉｑｕｅ  ３），Ｃｏ−６，Ｃｏ−７，ｃｒ−１  ｃｒ−２，ｃｒｙ，ｃｓ，Ｃｔ，ｃｔｖ−１  ｃｔｖ−２，ｃｙｖ  （ｂｙ−３），Ｄ  （Ｃａｎ，Ｉｎｓ），Ｄａ，Ｄｂ，ｄｅｆ，ｄｇｓ  （ｇ１，ｌｅ），ｄｉａ，Ｄｉａｐ−１，Ｄｉａｐ−２，ｄｉｆｆ，ｄｉｓ，Ｄ１−１  Ｄ１−２  （ＤＬ．ｓｕｂ．１  ＤＬ．ｓｕｂ．２），ｄｏ，ｄｓ  （ｔｅ），ｄｔ−１．ｓｕｐ．ａ  ｄｔ−２．ｓｕｐ．ａ，ｄｔ−１．ｓｕｐ．ｂ  ｄｔ−２．ｓｕｐ．ｂ，ｄｗ−１  ｄｗ−２，Ｅａ  Ｅｂ，ｅｒｓ  （ｒｅｓｔｒ），ｅｒｓ−２，Ｅｓｔ−１，Ｅｓｔ−２，ｅｘｐ，Ｆ，Ｆａ，ｆａｓｔ，Ｆｂ  Ｆｃ，ｆａ  ｆｂ  ｆｃ，Ｆｃｒ，Ｆｃｒ−２，ｆｄ，Ｆｅ−１  Ｆｅ−２，Ｆｉｎ  （ｉｎ），Ｆｏｐ−１，Ｆｏｐ−２，Ｆｒ，Ｆｒ−２，Ｇ  （Ｆｌａｖ，Ｃａ，Ｏｃｈ），Ｇａ，ｇａｓ，ｇｌｂ，Ｇｐｉ−ｃ１，Ｇｒ，Ｈｂ１  （Ｌ．ｓｕｂ．ＨＢ−１），Ｈｂｎｃ  （ＳＣ．ｓｕｂ．ＨＢ−１），Ｈｂｐ  （ＰＤ．ｓｕｂ．ＨＢ−１），ｈｍｂ，Ｈｓｓ，Ｈｓｗ，Ｈｔ−１  Ｈｔ−２  （Ｌ−１  Ｌ−２），Ｉ，Ｉａ  Ｉｂ，ｉａｎ−１  ｉａｎ−２  （ｉａ），ｌｂｄ，ｉｃｏ，Ｉｇｒ  （Ｉｈ），ｉｌｏ，ｉｐ，ｉｔｅｒ，ｉｖ，ｉｗ，Ｊ  （Ｓｈ），Ｋｅ，Ｌ，ｌａ，Ｌａｎ，Ｌｄ，Ｌｄｓ  （Ｄｓ），Ｌｅｃ，Ｌｉ  （Ｌ），ｌｏ，Ｉｒ−１  ｌｒ−２，ｍａｒ，Ｍｅ，Ｍｅｌ  （Ｍｅ），Ｍｅｌ−２  （Ｍｅ−２），ｍｅｌ−３  （ｍｅ−３），Ｍｆ，ｍｉ，ｍｉａ，Ｍｉｃ  （Ｍｉｐ），ｍｉｖ，Ｍｒｆ，Ｍｒｆ．ｓｕｐ．２，ｍｒｆ，ｍｓ−１，Ｍｕｅ，ｍｕ  ｍｕｔａｔｏｒ，Ｎａｇ，Ｎｄ−１  Ｎｄ−２  （Ｄ−１  Ｄ−２），ｎｉｅ，ｎｎｄ  （ｓｙｍ−１），ｎｎｄ−２，Ｎｏ，ｎｔｓ  （ｎｏｄ），Ｎｕｄｕｓ，ｏｌ，Ｐ，ｐ．ｓｕｐ．ｇｒｉ  （Ｇｒｉ，ｖ．ｓｕｐ．Ｐａｌ），ｐａ，ｐｃ，ｐｇ  （ｐａ．ｓｕｂ．１），Ｐｈａ，Ｐｍｖ，ｐｐｄ  （ｎｅｕ），Ｐｒ，ｐｒｃ  （ｐｃ），Ｐｒｘ，ｐｕｎｃ，ｒａｍ，Ｒｂｃｓ  （ｒｂｃＳ），ｒｆ−１���ｒｆ−２，ｒｆ−３，ｒｆｉ  （ｉ），Ｒｆｓ  （ｍ），Ｒｋ，ｒｋ，ｒｋ．ｓｕｐ．ｄ  （ｌｉｎ），ｒｎ−１  ｒｎ−２  （ｒ  ｒ），ｒｎｄ，Ｒｏ，Ｓａｌ，ｓｂ，ｓｂ．ｓｕｐ．ｍｓ，ｓｂ−２，ｓｂ−３，ｓｉ１，Ｓｋｄｈ，ｓ１，Ｓｍｖ，Ｓｔ，Ｓｕｒ，ｓｗ−１  ｓｗ−２，Ｔ，ｔ  （ｚ−１），Ｔｈ−１  Ｔｈ−２，Ｔｍ，Ｔｏ，Ｔｏｒ  （Ｔ），Ｔｒ，ｔｒｉ，ｔｒｖ，Ｔｓ，ｔｗ，ｕｎｉ，Ｕｎｉ−２，ｕｎｉ．ｓｕｐ．ｎｄｅ，ｕｎｉ．ｓｕｐ．ｎｉｅ，Ｕｒ−１，Ｕｒ−２，Ｕｒ−２．ｓｕｐ．２，Ｕｒ−３  （Ｕｒ−３，Ｕｒ−４），Ｕｒ−３．ｓｕｐ．２，Ｕｒ−４，（Ｕｐ−２，Ｕｒ−Ｃ），Ｕｒ−５，（Ｂ−１９０），Ｕｒ−６  （Ｕｒ．ｓｕｂ．ａ，Ｕｒ−Ｇ），Ｕｒ−７  （Ｒ．ｓｕｂ．Ｂ１１），Ｕｒ−８  （Ｕｐ−１），Ｕｒ−９  （Ｕｒ．ｓｕｂ．ｐ），ｕｓ，Ｖ  （Ｂ１），ｖ．ｓｕｐ．ｌａｅ  （Ｃｏｒ），ｖ，ｖａｒ，ｖｉ  （ｖｉｒ．ｓｕｂ．ｆ），ｗｂ，Ｗｍｖ，Ｘ．ｓｕｐ．ｓｕ，ｙ，およびＺが挙げられる。
【０２６２】
サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子の非限定例としては、ＰＲＥ３，ＰＵＰ１，ＰＵＰ３，ＰＲＥ２，ＰＲＥ１０，ＰＲＥ１，ＰＲＥ８，ＳＣＬ１，ＰＵＰ２，ＰＲＥ５，ＰＲＥ７，ＰＲＥ４，ＲＰＴ２，ＲＰＴ３，ＲＰＮ３，ＲＰＮ１１，ＲＰＮ１２，ＲＰＴ６，ＲＰＮ１，ＲＰＮ２，ＲＰＴ１，ＲＰＴ５，ＲＰＴ４，ＳＫＩ６，ＲＲＰ４，ＤＩＳ３，ＴＳＣ１０，ＲＡＴ１，ＧＮＤ１，ＥＸＯ７０，ＥＲＧ１０，ＡＣＣ１，ＲＰＰ０，ＡＣＴ１，ＡＲＰ１００，ＡＲＰ３，ＰＡＮ１，ＡＲＰ２，ＡＲＰ４，ＡＲＰ９，ＳＰＥ２，ＣＹＲ１，ＡＬＡ１，ＴＰＳ１，ＴＵＢ１，ＡＢＦ１，ＤＥＤ８１，ＮＩＰ１，ＹＨＣ１，ＳＮＵ７１，ＡＴＭ１，ＭＡＫ５，ＲＯＫ１，ＤＥＤ１，ＳＰＢ４，ＡＵＲ１，ＰＳＥ１，ＡＬＧ１，ＴＵＢ２，ＢＰＬ１，ＭＳＬ５，ＥＲＧ２４，ＥＲＧ２６，ＥＲＧ２５，ＣＭＤ１，ＨＣＡ４，ＳＨＥ９，ＳＨＥ１０，ＣＡＫ１，ＰＩＳ１，ＣＨＯ１，ＣＤＳ１，ＥＳＲ１，ＮＵＤ１，ＣＤＣ４７，ＣＤＣ１３，ＣＤＣ３７，ＣＤＣ１，ＣＤＣ４，ＣＤＣ２０，ＣＤＣ６，ＣＤＣ４６，ＣＤＣ３，ＫＡＲ１，ＢＢＰ１，ＨＲＰ１，ＣＣＴ２，ＣＣＴ３，ＨＳＰ１０，ＳＭＣ１，ＳＭＣ２，ＣＨＣ１，ＣＦＴ２，ＣＬＰ１，ＣＯＰ１，ＳＥＣ２６，ＳＥＣ２７，ＲＥＴ２，ＳＥＣ２１，ＣＯＦ１，ＣＣＴ４，ＣＣＴ１，ＣＣＴ６，ＳＥＣ２４，ＳＥＣ７，ＰＣＦ１１，ＲＮＡ１５，ＲＮＡ１４，ＦＩＰ１，ＹＳＨ１，ＴＦＢ４，ＴＳＭ１，ＡＰＣ２，ＡＰＣ５，ＳＥＣ３１，ＴＡＦ４７，ＴＡＰ４２，ＭＰＰ１０，ＣＤＣ５３，ＣＫＳ１，ＣＤＣ２８，ＫＩＮ２８，ＣＮＳ１，ＥＲＧ１１，ＤＢＰ１０，ＤＢＰ８，ＰＲＯ３，ＤＹＳ１，ＡＬＲ１，ＴＩＤ３，ＤＮＡ２，ＳＳＬ２，ＲＡＤ３，ＲＦＡ３，ＲＦＡ２，ＲＦＡ１，ＲＦＣ４，ＲＦＣ５，ＲＦＣ３，ＲＦＣ２，ＲＦＣ１，ＴＯＰ２，ＲＡＰ１，ＲＰＣ２５，ＰＲＩ２，ＰＲＩ１，ＰＯＬ１，ＰＯＬ１２，ＨＵＳ２，ＣＤＣ２，ＰＯＬ２，ＤＰＢ２，ＲＰＢ１０，ＲＰＡ１３５，ＲＰＡ１９０，ＲＰＡ４３，ＲＰＢ８，ＲＰＯ２６，ＲＰＢ５，ＲＰＣ４０，ＲＰＣ１９，ＳＲＢ７，ＳＲＢ４，ＲＧＲ１，ＲＰＢ１１，ＳＲＢ６，ＲＰＢ２，ＲＰＢ７，ＲＰＯ２１，ＲＥＴ１，ＲＰＯ３１，ＲＰＣ３１，ＲＰＣ３４，ＲＰＣ５３，ＲＰＣ８２，ＲＰＢ１２，ＲＰＢ３，ＤＰＭ１，ＤＩＰ２，ＲＮＴ１，ＣＤＣ８，ＣＤＣ１４，ＤＵＴ１，ＵＢＡ２，ＵＢＡ１，ＵＢＣ９，ＣＤＣ３４，ＥＮＰ１，ＥＲＤ２，ＳＳＳ１，ＳＥＣ６１，ＳＥＣ６３，ＳＥＣ６２，ＧＮＡ１，ＧＰＩ８，ＤＡＭ１，ＤＵＯ１，ＩＲＲ１，ＰＲＰ３，ＴＩＭ９，ＨＳＨ４９，ＳＵＰ３５，ＥＸＭ２，ＭＥＸ６７，ＥＲＧ９，ＥＲＧ２０，ＦＡＳ２，ＦＡＳ１，ＮＯＰ１，ＦＡＤ１，ＡＯＳ１，ＦＢＡ１，ＮＣＢ２，ＢＲＮ１，ＴＵＢ４，ＧＤＩ１，ＧＯＧ５，ＳＲＭ１，ＣＤＣ２５，ＳＰＴ１６，ＹＩＦ２，ＢＥＴ４，ＣＤＣ４３，ＭＲＳ６，ＢＥＴ２，ＰＲＯ１，ＧＬＮ１，ＧＬＮ４，ＧＲＳ１，ＹＩＰ１，ＦＯＬ２，ＧＰＡ１，ＣＤＣ４２，ＳＡＲ１，ＹＰＴ１，ＳＥＣ４，ＧＳＰ１，ＴＥＭ１，ＲＨＯ１，ＣＤＣ２４，ＲＮＡ１，ＧＵＫ１，ＶＭＡ１６，ＰＭＡ１，ＨＫＲ１，ＳＩＳ１，ＭＧＥ１，ＨＳＰ６０，ＨＳ���１，ＨＡＳ１，ＭＯＴ３，ＨＴＳ１，ＥＳＡ１，ＨＳＬ７，ＨＯＭ６，ＲＩＢ７，ＳＬＹ１，ＣＳＬ４，ＰＵＲ５，ＣＳＥ１，ＩＰＰ１，ＭＤＭ１，ＵＳＯ１，ＳＯＦ１，ＭＡＫ１１，ＬＡＳ１，ＴＥＬ２，ＤＰＢ１１，ＳＧＤ１，ＦＡＬ１，ＭＴＲ３，ＭＴＲ４，ＳＰＰ２，ＳＩＫ１，ＲＲＰ７，ＰＯＰ４，ＲＲＰ１，ＰＯＰ３，ＢＦＲ２，ＣＤＣ５，ＮＲＤ１，ＭＥＴ３０，ＭＣＭ６，ＲＲＰ４６，ＳＡＳ１０，ＳＣＣ２，ＥＣＯ１，ＰＲＰ４３，ＢＥＴ３，ＢＥＴ５，ＳＴＮ１，ＮＦＳ１，ＩＤＩ１，ＳＲＰ１，ＫＡＰ９５，ＣＢＦ２，ＳＫＰ１，ＣＥＰ３，ＣＴＦ１３，ＥＲＧ７，ＫＲＳ１，ＰＳＡ１，ＰＭＩ４０，ＡＬＧ２，ＳＳＦ１，ＭＥＤ７，ＲＳＣ４，ＣＤＣ５４，ＭＣＭ２，ＡＦＧ２，ＥＲＧ１２，ＭＶＤ１，ＣＤＣ４８，ＭＨＰ１，ＥＲＶ１，ＳＳＣ１，ＴＩＭ４４，ＴＩＭ１７，ＴＩＭ２３，ＴＯＭ２２，ＴＯＭ４０，ＭＡＳ１，ＭＣＤ１，ＭＭＣ１，ＳＴＵ１，ＪＡＣ１，ＡＢＤ１，ＣＥＧ１，ＰＡＢ１，ＭＴＲ２，ＳＥＣ１６，ＲＯＴ１，ＩＮＯ１，ＭＬＣ１，ＭＹＯ２，ＧＰＩ２，ＳＰＴ１４，ＮＡＴ２，ＮＭＴ１，ＴＲＭ１，ＮＣＰ１，ＮＢＰ１，ＡＣＦ２，ＳＰＰ４１，ＮＵＴ２，ＬＣＰ５，ＰＲＰ１９，ＮＭＤ３，ＲＦＴ１，ＮＮＦ１，ＮＤＣ１，ＣＲＭ１，ＫＡＲ２，ＮＩＰ２９，ＮＡＢ２，ＮＩＣ９６，ＮＵＰ１４５，ＮＵＰ４９，ＮＵＰ５７，ＮＵＰ１５９，ＮＳＰ１，ＮＵＰ８２，ＣＤＣ３９，ＮＰＬ４，ＰＯＰ７，ＮＴＦ２，ＭＡＫ１６，ＮＰＬ３，ＮＯＰ２，ＮＯＰ４，ＮＨＰ２，ＮＯＰ１０，ＧＡＲ１，ＮＢＰ３５，ＷＢＰ１，ＳＴＴ３，ＳＷＰ１，ＯＳＴ２，ＯＳＴ１，ＯＲＣ１，ＯＲＣ６，ＯＲＣ５，ＯＲＣ４，ＯＲＣ３，ＲＲＲ１，ＳＡＴ２，ＰＷＰ２，ＰＥＸ３，ＴＯＲ２，ＰＩＫ１，ＳＥＣ１４，ＳＴＴ４，ＭＳＳ４，ＰＣＭ１，ＧＰＭ１，ＳＥＣ５３，ＥＲＧ８，ＹＰＤ１，ＰＡＰ１，ＮＡＢ３，ＲＲＮ７，ＳＥＮ１，ＣＦＴ１，ＰＲＰ１１，ＰＲＰ２１，ＰＲＰ３９，ＰＲＰ２４，ＰＲＰ９，ＳＬＵ７，ＰＲＰ２８，ＰＲＰ３１，ＩＦＨ１，ＰＴＡ１，ＳＵＢ２，ＦＭＩ１，ＭＡＳ２，ＥＳＳ１，ＰＦＹ１，ＰＯＬ３０，ＰＯＰ１，ＰＤＩ１，ＲＡＭ２，ＣＤＣ７，ＳＭＰ３，ＣＤＣ１５，ＹＴＨ１，ＱＲＩ２，ＹＡＥ１，ＳＦＩ１，ＳＥＣ１，ＢＥＴ１，ＳＥＣ６，ＳＥＣ１３，ＳＥＣ２，ＳＥＣ８，ＣＢＦ５，ＣＤＣ１９，ＹＲＢ１，ＲＨＣ１８，ＤＢＦ４，ＳＤＳ２２，ＭＣＭ３，ＣＥＦ１，ＡＬＧ１１，ＧＡＡ１，ＭＯＢ１，ＮＩＰ７，ＴＩＰ２０，ＳＥＣ５，ＳＥＣ１０，ＧＰＩ１０，ＲＲＰ３，ＣＤＣ４５，ＤＩＢ１，ＭＩＦ２，ＨＯＰ２，ＰＢＮ１，ＮＯＰ５，ＲＰＰ１，ＰＯＰ５，ＰＯＰ８，ＰＯＰ６，ＥＲＯ１，ＭＰＴ１，ＤＮＡ４３，ＥＳＰ１，ＳＭＣ３，ＬＳＴ８，ＳＴＳ１，ＲＰＭ２，ＲＮＲ１，ＲＮＲ２，ＲＮＲ４，ＲＰＳ２０，ＲＰＬ２５，ＲＰＬ３，ＲＰＬ３０，ＲＰＬ３２，ＲＰＬ３７Ａ，ＲＰＬ４３Ａ，ＲＰＬ５，ＲＰＬ１０，ＲＰＳ３，ＣＥＴ１，ＹＲＡ１，ＳＮＭ１，ＧＬＥ１，ＤＢＰ５，ＤＲＳ１，ＤＢＰ６，ＢＲＲ２，ＲＲＮ３，ＲＲＮ６，ＲＲＮ１１，ＭＥＤ６，ＰＲＰ１６，ＲＰＲ２，ＤＩＭ１，ＲＲＰ４３，ＲＲＰ４２，ＲＲＰ４５，ＳＥＣ２０，ＢＯＳ１，ＣＤＣ１２，ＧＬＣ７，ＰＫＣ１，ＩＰＬ１，ＳＧ���１，ＮＲＫ１，ＲＡＤ５３，ＬＣＢ２，ＬＣＢ１，ＭＰＳ１，ＳＥＳ１，ＳＰＣ３，ＳＥＣ１１，ＲＩＯ１，ＡＲＰ７，ＮＥＯ１，ＹＪＵ２，ＰＯＢ３，ＡＲＨ１，ＩＱＧ１，ＨＲＴ１，ＨＹＭ１，ＭＡＫ２１，ＦＵＮ２０，ＦＵＮ９，ＮＢＮ１，ＳＴＢ５，ＹＩＦ１，ＳＭＸ４，ＹＫＴ６，ＳＦＴ１，ＳＭＤ１，ＰＲＰ６，ＬＳＭ２，ＮＵＦ１，ＳＰＣ９７，ＳＰＣ４２，ＳＰＣ９８，ＣＤＣ３１，ＳＰＣ１９，ＳＰＣ２５，ＳＰＣ３４，ＳＰＣ２４，ＮＵＦ２，ＰＲＰ４０，ＭＣＤ４，ＥＲＧ１，ＳＭＣ４，ＣＳＥ４，ＫＲＲ１，ＳＭＥ１，ＴＲＡ１，ＲＬＰ７，ＳＣＨ９，ＳＭＤ３，ＳＮＰ２，ＳＳＦ２，ＳＰＣ７２，ＣＤＣ２７，ＣＤＣ２３，ＣＤＣ１６，ＡＰＣ１，ＡＰＣ１１，ＡＰＣ４，ＡＲＣ１９，ＲＰＮ６，ＲＰＮ５，ＲＳＣ６，ＲＳＣ８，ＳＴＨ１，ＳＦＨ１，ＴＩＭ１２，ＴＩＭ２２，ＴＩＭ１０，ＳＱＴ１，ＳＬＳ１，ＪＳＮ１，ＳＴＵ２，ＳＣＤ５，ＳＳＵ７２，ＡＳＭ４，ＳＥＤ５，ＵＦＥ１，ＳＹＦ１，ＳＹＦ２，ＣＣＴ５，ＴＢＦ１，ＴＯＡ２，ＴＯＡ１，ＳＵＡ７，ＴＡＦ９０，ＴＡＦ６１，ＴＡＦ２５，ＴＡＦ６０，ＴＡＦ１７，ＴＡＦ１４５，ＴＡＦ１９，ＴＡＦ４０，ＴＡＦ６７，ＴＦＡ２，ＴＦＡ１，ＦＣＰ１，ＴＦＧ１，ＴＦＧ２，ＴＦＢ１，ＣＣＬ１，ＳＳＬ１，ＴＦＢ３，ＴＦＢ２，ＰＺＦ１，ＢＲＦ１，ＴＦＣ５，ＴＦＣ４，ＴＦＣ３，ＴＦＣ７，ＴＦＣ６，ＴＦＣ１，ＳＰＴ１５，ＴＨＩ８０，ＴＨＳ１，ＳＰＴ６，ＳＰＴ５，ＲＯＸ３，ＲＥＢ１，ＭＣＭ１，ＭＥＤ４，ＭＯＴ１，ＭＥＤ８，ＥＦＢ１，ＹＥＦ３，ＳＵＩ１，ＣＤＣ９５，ＴＩＦ１１，ＳＵＩ３，ＧＣＤ１１，ＳＵＩ２，ＧＣＤ６，ＧＣＤ７，ＧＣＤ２，ＧＣＤ１，ＲＰＧ１，ＧＣＤ１０，ＰＲＴ１，ＴＩＦ３４，ＣＤＣ３３，ＴＩＦ５，ＳＵＰ４５，ＧＣＤ１４，ＴＩＭ５４，ＳＥＣ１７，ＴＰＴ１，ＴＲＬ１，ＣＣＡ１，ＳＥＮ５４，ＳＥＮ２，ＳＥＮ１５，ＳＥＮ３４，ＷＲＳ１，ＳＬＮ１，ＴＹＳ１，ＳＮＵ５６，ＰＲＰ４２，ＣＵＳ１，ＰＲＰ４，ＰＲＰ８，ＳＮＵ１１４，ＵＳＳ１，ＵＦＤ１，ＳＭＴ３，ＲＳＰ５，ＱＲＩ１，ＡＬＧ７，ＵＧＰ１，ＶＴＩ１，ＶＡＳ１，ＳＥＣ１８，ＣＴＲ８６，およびＺＰＲ１［ＳＵ２］が挙げられる。
【０２６３】
特に、本明細書で提供されるウイルスを改変して、抗腫瘍抗体、抗転移遺伝子もしくは転移抑制遺伝子；細胞マトリックス分解遺伝子；ホルモン；成長因子；インターロイキンもしくはインターフェロンなどのサイトカイン、ＣＸＣケモカインなどのケモカイン、共刺激分子などの免疫調節分子；リボザイム；輸送タンパク質；抗体もしくはその断片；アンチセンスＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ；マイクロＲＮＡ；タンパク質リガンド；有糸分裂阻害タンパク質；抗有糸分裂オリゴペプチド；抗がんポリペプチド；抗がん抗生物質；血管新生阻害剤；抗血管新生因子；組織因子；プロドラッグ変換酵素；組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子；検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変するか、または抗体により検出可能である酵素；ウイルス弱毒化因子；スーパー抗原；造影剤、発色団、もしくは検出することができるリガンドの化合物に結合することができるタンパク質；腫瘍抑制因子；細胞傷害性タンパク質；細胞増殖抑制タンパク質；光学画像化もしくは検出のための遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはＧＦＰ様タンパク質、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、セルリアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、もしくは青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ならびにフィコエリトリン（赤色）およびフィコシアニン（青色）などの、特定のシアノバクテリアおよび真核性藻類に由来するフィコビリタンパク質；ＰＥＴ画像化のための遺伝子；ＭＲＩ画像化のための遺伝子；またはウイルスの弱毒性を変化させる遺伝子を発現させることができる。例えば、本明細書に記載のウイルスの改変（例えば、挿入）のための異種遺伝子の例が、表５に記載される。
【０２６４】
本明細書に記載のウイルスの改変のための異種遺伝子の例は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００３−００５９４００、ＵＳ２００３−０２２８２６１、ＵＳ２００９−０１１７０３４、ＵＳ２００９−００９８５２９、ＵＳ２００９−００５３２４４、ＵＳ２００９−００８１６３９およびＵＳ２００９−０１３６９１７；米国特許第７，５８８，７６７号および第７，７６３，４２０号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３９９２１号を参照されたい）。本明細書で提供されるウイルス株の改変のための異種タンパク質をコードする例示的遺伝子の非限定的説明が、以下の表５に記載される。遺伝子およびコードされるタンパク質の配列は、文献から当業者には公知である。したがって、表５に列挙される異種タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチドを含有する、本明細書で提供されるクローンウイルスのいずれかを含むウイルス株が本明細書で提供される。
【０２６５】
【表５−１】
2018171059.tif 000006
【表５−２】
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【０２６６】
【表５−３】
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【表５−４】
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【０２６７】
【表５−５】
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【表５−６】
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【０２６８】
【表５−７】
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【表５−８】
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【０２６９】
【表５−９】
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【表５−１０】
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【０２７０】
【表５−１１】
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【表５−１２】
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【０２７１】
【表５−１３】
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【表５−１４】
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【０２７２】
２．改変例
ａ．診断遺伝子産物
いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスは、産物が検出可能であるか、または産物が検出可能なシグナルを誘導することができる１つまたは複数のさらなる遺伝子を発現することができる。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスは、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導することができるタンパク質をコードする核酸を含有する。そのようなタンパク質の発現は、インビトロおよびインビボでのウイルスの検出を可能にする。検出可能なタンパク質などの、様々な検出可能な遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供されるウイルスと共に用いることができる。
【０２７３】
そのようなタンパク質の例は、検出可能な反応を触媒するか、または例えば、コメツキムシルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼもしくはβ−グルクロニダーゼ（ＧｕｓＡ）などの検出可能な生成物の形成を触媒する酵素である。また、そのようなタンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質を含む、検出可能なシグナルを放出するタンパク質である。検出可能なシグナルを放出することができるか、または発光もしくは蛍光タンパク質などの検出可能な反応を触媒することができるタンパク質をコードする様々なＤＮＡ配列が公知であり、本明細書で提供されるウイルスおよび方法において用いることができる。光放出タンパク質をコードする遺伝子の例としては、例えば、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）に由来する細菌ルシフェラーゼ（Ｂｅｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８  （１９８２），  ７９１−７９３）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ）に由来する細菌ルシフェラーゼ（Ｆｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６  （１９８８），  １７７）、蛍ルシフェラーゼ（ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７  （１９８７），  ７２５−７３７）、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来するエクオリン（Ｐｒａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６  （１９８７），  １３２６−１３３２）、レニラ・レンフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｆｏｒｍｉｓ）に由来するレニラルシフェラーゼ（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８  （１９９１），  ４４３８−４４４２）およびエクオレア・ビクトリアに由来する緑色蛍光タンパク質（Ｐｒａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １１１：  ２２９−２３３  （１９８７））に由来する遺伝子が挙げられる。細菌ルシフェラーゼのｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子を融合させて、融合遺伝子（Ｆａｂ２）を生成し、これを発現させて、完全に機能的なルシフェラーゼタンパク質（Ｅｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ８６：  ６５２８−６５３２  （１９８９））を生成させることができる。ウイルス中のこれらの遺伝子の形質転換および発現は、例えば、高感度および／または蛍光画像化カメラを用いるウイルス感染の検出を可能にする。いくつかの例においては、ウイルスにより発現されるルシフェラーゼは、光放出のためのデカナールまたはセレンテラジンなどの外因的に添加される基質を必要とし得る。他の例においては、ウイルスは、デカナールなどのルシフェラーゼ基質を提供することができるタンパク質を含んでもよい、完全なｌｕｘオペロンを発現することができる。例えば、完全なｌｕｘオペロン配列を含有するウイルスは、腹腔内、筋肉内、または静脈内に注射された場合、生きたマウス中での微生物の可視化および局在化を可能にし、ルシフェラーゼ光放出が組織に浸透し、外部で検出することができることを示す（Ｃｏｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １８：  ５９３−６０３）。
【０２７４】
検出可能なタンパク質の例としては、トランスフェリン受容体またはフェリチンなどの、造影剤、発色団、または検出することができる化合物もしくはリガンドに結合することができるタンパク質；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）などのリポータータンパク質も挙げられる。
【０２７５】
また、検出可能なタンパク質の例は、限定されるものではないが、受容体、金属結合タンパク質（例えば、親鉄剤、フェリチン、トランスフェリン受容体）、リガンド結合タンパク質、および抗体などの検出可能な化合物に特異的に結合することができる遺伝子産物である。検出可能なタンパク質の例は、検出可能な分子に結合し、これを輸送することができる輸送タンパク質でもある。そのような分子は、画像化を含む適用のためなど、ウイルスの検出のために用いることができる。様々な検出可能な化合物のいずれかを使用することができ、様々な公知の画像化方法のいずれかにより画像化することができる。化合物の例としては、受容体リガンドおよび抗体のための抗原が挙げられる。リガンドは、用いられる画像化方法に従って標識することができる。画像化方法の例としては、限定されるものではないが、Ｘ線、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）および磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）などの磁気共鳴法、ならびにコンピューター断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＡＴ）、電子線コンピューター断層撮影（ＥＢＣＴ）、高解像度コンピューター断層撮影（ＨＲＣＴ）、下環状断層撮影、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、スパイラルコンピューター断層撮影、および超音波断層撮影などの断層撮影法が挙げられる。
【０２７６】
Ｘ線画像化のための好適な標識は当技術分野で公知であり、例えば、ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）もしくは鉛（ＩＩ）；放射性イオン、例えば、６７銅、６７ガリウム、６８ガリウム、１１１インジウム、１１３インジウム、１２３ヨウ素、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１９７水銀、２０３水銀、１８６レニウム、１８８レニウム、９７ルビジウム、１０３ルビジウム、９９テクネチウムもしくは９０イットリウム；核磁気スピン共鳴アイソトープ、例えば、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）もしくはイッテルビウム（ＩＩＩ）；またはローダミンもしくはフルオレセインが挙げられる。
【０２７７】
磁気共鳴画像化のための好適な標識は当技術分野で公知であり、例えば、ガドリニウムキレートおよび酸化鉄が挙げられる。造影剤におけるキレートの使用は当技術分野で公知である。断層撮影画像化法のための好適な標識は当技術分野で公知であり、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏもしくは６４Ｃｕなどのβ−放射体または１２３Ｉなどのγ−放射体が挙げられる。例えば、ＰＥＴのためのトレーサーとして用いることができる他の放射性核種の例としては、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６０Ｃｕ（ＩＩ）、６７Ｃｕ（ＩＩ）、５７Ｎｉ、５２Ｆｅおよび１８Ｆ（例えば、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ））が挙げられる。有用な放射性核種標識剤の例は、６４Ｃｕ標識遺伝子操作抗体断片（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：  ８４９５−８５００）、６４Ｃｕ標識ソマトスタチン（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４２：  １３４１−１３４７）、６４Ｃｕ−ピルバルデヒド−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）（６４Ｃｕ−ＰＴＳＭ）（Ａｄｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９：  ３０３０−３０３５）、５２Ｆｅ−クエン酸（Ｌｅｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．  Ｎｅｕｒａｌ．  Ｔｒａｎｓｍ．  Ｓｕｐｐｌ．  ４３：  １２３−１３２）、５２Ｆｅ／５２ｍＭｎ−クエン酸（Ｃａｌｏｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７３：  ２０４７−２０５５）および５２Ｆｅ標識鉄（ＩＩＩ）ヒドロキシド−スクロース複合体（Ｂｅｓｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １０４：  ２８８−２９５，２９６−３０２）である。
【０２７８】
検出可能なタンパク質の例は、ＭＩＢＧおよび他の標識分子（例えば、Ｎａ１２５Ｉ）などの検出可能な分子に結合し、これを細胞中に輸送することができるヒトエピネフリン輸送体（ｈＮＥＴ）またはヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）などの、検出可能な分子に結合し、それを輸送することができる輸送タンパク質である。
【０２７９】
他の検出可能なタンパク質の例は、メラニン合成に関する遺伝子によりコードされるタンパク質である。多くの遺伝子がメラニン生合成に関与することが知られている（例えば、Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ，  ２２：５６３−７９を参照されたい）。メラニンは、茶色っぽい／黒いユーメラニンおよび赤茶色のフェオメラニンにさらに分割することができる色素である。そのような遺伝子の例としては、限定されるものではないが、マウスチロシナーゼ（ｍＴＹＲ）、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）およびヒトドーパクロムトートメラーゼ／チロシナーゼ関連タンパク質２（ＤＣ２）が挙げられる。メラニン合成に関する遺伝子を発現するウイルスを用いて宿主または細胞を感染させて、可視スペクトル全域にわたって高い吸光率を有する細胞を取得することができる。得られた細胞または動物を、可視スペクトル全域にわたって、および／または異なる浸透スケールにわたって高い吸光率を検出することができる任意の画像化システムを用いて画像化することができる。例えば、（マルチスペクトル）光／光音響断層撮影［（ＭＳ）ＯＡＴ］を用いることができる（例えば、Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ７：６０３−１４；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １２：１−３を参照されたい）。
【０２８０】
２つ以上の検出可能な遺伝子産物、検出可能なシグナルを生成する遺伝子産物、検出可能な化合物に結合することができる遺伝子産物、または他の分子に結合して検出可能な生成物を形成できる遺伝子産物を検出するためのインビトロおよび／またはインビボでの二重画像化の目的などの、画像化のためにウイルスを用いる目的でウイルスを改変することができる。いくつかの例においては、２つ以上の遺伝子産物が異なるウイルスにより発現されるが、他の例においては、２つ以上の遺伝子産物が同じウイルスにより生成される。例えば、ウイルスは、検出可能なシグナルを放出する遺伝子産物を発現し、また、検出可能な反応を触媒する遺伝子産物を発現することができる。他の例においては、ウイルスは、検出可能なシグナルを放出する１つもしくは複数の遺伝子産物、検出可能な反応を触媒する１つもしくは複数の遺伝子産物、検出可能な化合物に結合することができるか、もしくは検出可能な生成物を形成することができる１つもしくは複数の遺伝子産物、またはその任意の組合せを発現することができる。そのような遺伝子産物の任意の組合せを、本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができ、本明細書で提供される方法のいずれかと共に用いることができる。そのような遺伝子産物の画像化を、例えば、本明細書に記載の、および当技術分野で公知の様々な画像化方法（例えば、蛍光画像化、ＭＲＩ、ＰＥＴ、特に他の多くの検出方法）により実施することができる。遺伝子産物の画像化を、同じ方法を用いて実施し、それによって、遺伝子産物を、放出される光の波長の差異などのその特性により区別する。例えば、ウイルスは放出される光の波長において異なる２つ以上の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰおよびＲＦＰ）を発現することができる。別の非限定例においては、ＲＦＰをルシフェラーゼと共に発現させることができる。さらに他の非限定例においては、蛍光遺伝子産物を、磁気共鳴画像化に用いられる、フェリチンまたはトランスフェリン受容体などの遺伝子産物と共に発現させることができる。２つ以上の検出可能な遺伝子産物を発現するウイルスまたは２つ以上の検出可能な遺伝子産物を発現する２つ以上のウイルスを、そのような方法を用いてインビトロまたはインビボで画像化することができる。いくつかの例においては、２つ以上の遺伝子産物は、融合タンパク質などの単一ポリペプチドとして発現される。例えば、蛍光タンパク質を、ルシフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。
【０２８１】
ｂ．治療遺伝子産物
本明細書で提供されるウイルスは、１つまたは複数の治療遺伝子産物をコードする異種核酸分子をも含んでもよい。治療遺伝子産物としては、細胞死を引き起こすか、または抗腫瘍免疫応答を引き起こす生成物が挙げられる。毒性もしくはアポトーシスタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの様々な治療遺伝子産物が当技術分野で公知であり、本明細書で提供されるウイルスと共に用いることができる。治療遺伝子は、例えば、チャネル形成もしくは他の溶解タンパク質として、宿主細胞を直接殺傷することにより、またはアポトーシスを誘発させることにより、または必須細胞プロセスを阻害することにより、または細胞に対する免疫応答を誘発することにより、または同様の効果を有する化合物と相互作用することにより、例えば、活性の低い化合物を細胞傷害性化合物に変換することにより作用することができる。
【０２８２】
本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる治療遺伝子産物の例としては、限定されるものではないが、抗がん剤、抗転移剤、または抗血管新生剤などの腫瘍治療にとって有用なものなどの遺伝子産物（すなわち、タンパク質およびＲＮＡ）が挙げられる。例えば、腫瘍治療にとって有用なタンパク質の例としては、限定されるものではないが、腫瘍抑制因子、細胞増殖抑制タンパク質および共刺激分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、または他の免疫調節分子、抗がん抗体、例えば、一本鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、毒素、有糸分裂阻害タンパク質、抗腫瘍オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、または組織因子が挙げられる。例えば、本明細書で提供されるウイルスおよび方法における腫瘍処置のために発現させることができる多数の治療タンパク質が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、輸送体、細胞表面受容体、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシスタンパク質、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗血管新生因子（例えば、ｈｋ５）、血管新生阻害剤（例えば、プラスミノゲンクリングル５ドメイン、抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ｓｃＡｂ、ｔＴＦ−ＲＧＤ、トランケートされたヒト組織因子−αｖβ３−インテグリンＲＧＤペプチド融合タンパク質）、抗がん抗体、例えば、一本鎖抗体（例えば、抗腫瘍抗体または抗血管新生抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体もしくは抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体）、毒素、腫瘍抗原、プロドラッグ変換酵素、リボザイム、ＲＮＡｉ、およびｓｉＲＮＡが挙げられる。
【０２８３】
本明細書で提供される方法のための共刺激分子としては、インビボおよび／またはインビトロで抗原／病原体に対する免疫応答を増強することができる任意の分子が挙げられる。共刺激分子はまた、機能が免疫応答にとって重要であるか、または必須であるリンパ球および／または他の細胞の活性化、増殖、分化、成熟または維持を促進する任意の分子も包含する。
【０２８４】
治療タンパク質の非限定的一覧の例としては、ＩＬ−２４などの腫瘍成長抑制因子、ＷＴ１、ｐ５３、シュードモナスＡ内毒素、ジフテリア毒素、Ａｒｆ、Ｂａｘ、ＨＳＶ  ＴＫ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アンギオスタチンおよびエンドスタチン、ｐ１６、Ｒｂ、ＢＲＣＡ１、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）、第ＶＩＩＩ因子、低密度リポタンパク質受容体、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、インスリン、副甲状腺ホルモン、α−１−抗トリプシン、ｒｓＣＤ４０Ｌ、Ｆａｓ−リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、抗体、ミクロシンＥ４９２、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シガ毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ベロ毒素１、ならびにハイパーフォリンが挙げられる。サイトカインの例としては、限定されるものではないが、ケモカインおよび古典的サイトカイン、例えば、インターロイキン、例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６およびインターロイキン−１２、腫瘍壊死因子、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチンが挙げられ、ケモカインの例としては、限定されるものではないが、ＣＸＣケモカイン、例えば、ＩＬ−８  ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１；ＣＣケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−５／ＨＣＣ−２、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ；リンホタクチン；およびフラクタルキンが挙げられる。他の共刺激分子の例としては、Ｂ７．１、Ｂ７．２などのサイトカインの免疫グロブリンスーパーファミリーが挙げられる。
【０２８５】
本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができ、本明細書で提供される方法において用いることができる治療タンパク質の例としては、限定されるものではないが、エリスロポエチン（例えば、配列番号３２９）、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体（例えば、配列番号２１）、プラスミノゲンＫ５ドメイン（例えば、配列番号１９０）、ヒト組織因子−αｖβ３−インテグリンＲＧＤ融合タンパク質（例えば、配列番号１４）、インターロイキン−２４（例えば、配列番号９８）、または免疫刺激因子、例えば、ＳＩＬ−６−ＳＩＬ−６受容体融合タンパク質（例えば、配列番号９７）が挙げられる。
【０２８６】
いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスは、活性の低い化合物を、腫瘍細胞死を引き起こす化合物に変換するタンパク質である１つまたは複数の治療遺伝子産物を発現することができる。そのようなプロドラッグ化合物の変換方法の例としては、酵素的変換および光分解的変換が挙げられる。様々なタンパク質／化合物対が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、バリセラ・ゾスターチミジンキナーゼ／ガンシクロビル、バリセラ・ゾスターチミジンキナーゼ／ＢＶＤＵ、バリセラ・ゾスターチミジンキナーゼ／（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＢＶａｒａＵ）、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロウラシル、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ／６−メチルプリンデオキシリボシド、βラクタマーゼ／セファロスポリン−ドキソルビシン、カルボキシペプチダーゼＧ２／４−［（２−クロロエチル）（２−メシルオキシエチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸（ＣＭＤＡ）、カルボキシペプチダーゼＡ／メトトレキサート−フェニルアミン、シトクロムＰ４５０／アセトミノフェン、シトクロムＰ４５０−２Ｂ１／シクロホスファミド、シトクロムＰ４５０−４Ｂ１／２−アミノアントラセン、４−イポメアノール、西洋ワサビペルオキシダーゼ／インドール−３−酢酸、ニトロリダクターゼ／ＣＢ１９５４、ウサギカルボキシルエステラーゼ／７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシ−カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、マッシュルームチロシナーゼ／ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、βガラクトシダーゼ／１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンザ［ｅ］インドール、βグルクロニダーゼ／エピルビシングルクロニド、チミジンホスホリラーゼ／５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、デオキシシチジンキナーゼ／シトシンアラビノシド、およびリナメラーゼ／リナマリンが挙げられる。
【０２８７】
本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる他の治療遺伝子産物としては、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ分子が挙げられる。ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子は、限定されるものではないが、がん遺伝子、成長因子、血管新生促進遺伝子、または受容体などの腫瘍促進因子の発現に対するものであってよい。ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子はまた、細胞成長、細胞複製または細胞生存にとって必須の任意の遺伝子の発現に対するものであってよい。ｓｉＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ分子はまた、細胞膜を安定化するか、またはさもなければ、腫瘍細胞から放出される腫瘍細胞抗原の数を制限する任意の遺伝子の発現に対するものであってよい。ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの設計を、ｓｉＲＮＡの選択された標的に従って容易に決定することができる。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの設計ならびに遺伝子の下方調節の方法は当技術分野で公知であり、米国特許出願公開第２００３−０１９８６２７号および第２００７−００４４１６４号、ならびにＺｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３  （２００２）に例示されている。
【０２８８】
治療遺伝子産物は、抗ウイルスタンパク質などのウイルス弱毒化因子を含む。抗ウイルスタンパク質またはペプチドを、本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる。抗ウイルスタンパク質またはペプチドの発現は、ウイルスの病原性を制御することができる。ウイルス弱毒化因子の例としては、限定されるものではないが、ウイルス特異的抗体、ムチン、トロンボスポンジン、ならびに限定されるものではないが、ＴＮＦα、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγ）およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８）などのサイトカインなどの可溶性タンパク質が挙げられる。
【０２８９】
本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる別の治療遺伝子産物の例は、抗腫瘍オリゴペプチドなどのタンパク質リガンドである。抗腫瘍オリゴペプチドは、腫瘍に対する高い親和性および特異性を有する短いタンパク質ペプチドである。そのようなオリゴペプチドを、腫瘍関連ファージライブラリーを用いて富化および同定することができる（Ａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９７（１０）：１０７５−１０８１）。これらのオリゴペプチドは、化学療法を増強することが示されている（米国特許第４，９１２，１９９号）。オリゴペプチドを、本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる。オリゴペプチドの発現は、それ自体で、または他の化学療法剤と組み合わせた場合、抗がん活性を惹起することができる。抗腫瘍オリゴペプチド群の例は、限定されるものではないが、ツブライシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）（Ｋｈａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  ７（４）：６７８−６８３）、ホモプシン（ｐｈｏｍｏｐｓｉｎ）、ヘミアスタリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、タルトブリン（ｔａｌｔｏｂｕｌｉｎ）（ＨＴＩ−２８６、３）、およびクリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）などの抗有糸分裂ペプチドである。ツブライシンは、粘液細菌に由来し、細胞微小管の枯渇を誘導し、アポトーシスプロセスを誘発し得る。抗有糸分裂ペプチドは、本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができ、それ自体で、または他の治療様式と組み合わせた場合、抗がん活性を惹起することができる。
【０２９０】
本明細書で提供されるウイルスにより発現させることができる別の治療遺伝子産物の例は、腫瘍成長に必要とされる分子または栄養素を隔離するタンパク質である。例えば、前記ウイルスは、鉄に結合し、鉄を輸送するか、もしくは鉄を貯蔵するか、またはその組合せである１つまたは複数のタンパク質を発現することができる。そのようなタンパク質の発現による鉄取込みおよび／または貯蔵の増加は、ウイルスが蓄積する腫瘍または組織の可視化および検出のための対比を増加させるだけでなく、腫瘍環境から鉄を枯渇させる。腫瘍環境からの鉄の枯渇は、腫瘍から必要不可欠な栄養素を除去し、それによって腫瘍細胞中での鉄恒常性を脱調節し、腫瘍進行を遅延させ、および／または腫瘍を殺傷する。
【０２９１】
さらに、鉄、または他の標識金属を、単独で、またはコンジュゲート形態のいずれかで、腫瘍担持対象に投与することができる。鉄コンジュゲートは、例えば、画像化部分または治療剤にコンジュゲートされた鉄を含んでもよい。いくつかの事例においては、画像化部分と治療剤は同じであり、例えば、放射性核種である。腫瘍、創傷、炎症または感染の領域における鉄の内在化は、鉄のみ、補給的画像化部分、または治療剤（腫瘍細胞に対して特異的に細胞傷害性を送達するか、または創傷、炎症もしくは感染の領域の処置のための治療剤を送達することができる）の内在化を可能にする。これらの方法を、本明細書で提供される他の方法のいずれかと組み合わせることができる。
【０２９２】
ｃ．抗原
本明細書で提供されるウイルスを改変して１つまたは複数の抗原を発現させることができる。抗原の例としては、限定されるものではないが、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生動物抗原、寄生虫抗原およびマイトジェンが挙げられる。スーパー抗原は、Ｔ細胞の多数の反応によりもたらされることが多い、多数の免疫応答を活性化することができる抗原である。様々なスーパー抗原が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ジフテリア毒素、ブドウ球菌内毒素（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＤ、ＳＥＥおよびＳＥＨ）、毒素ショック症候群毒素１、剥離毒素（Ｅｘｆｔ）、連鎖球菌発熱性外毒素Ａ、ＢおよびＣ（ＳＰＥ  Ａ、ＢおよびＣ）、マウス乳頭腫瘍ウイルスタンパク質（ＭＭＴＶ）、連鎖球菌Ｍタンパク質、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）腸毒素（ＣＰＥＴ）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）抗原ｐ６０、およびマイコプラズマ関節炎スーパー抗原が挙げられる。
【０２９３】
多くのスーパー抗原は毒素でもあるため、毒性が低下したウイルスの発現が望ましい場合、スーパー抗原を、その毒性を低下させながら、そのスーパー抗原性の少なくともいくらかを保持するように改変し、トキソイドなどの化合物を得ることができる。様々な組換えスーパー抗原およびスーパー抗原のトキソイドが当技術分野で公知であり、本明細書で提供されるウイルス中で容易に発現させることができる。トキソイドの例としては、米国特許第６，４５５，６７３号に例示されたジフテリア毒素のトキソイドおよび米国特許出願公開第２００３−０００９０１５号に例示されたブドウ球菌腸毒素のトキソイドが挙げられる。
【０２９４】
ｄ．ウイルスの弱毒化を変化させるための改変
本明細書で提供されるウイルスを、ウイルスゲノム中の核酸の付加、欠失および／または改変によりさらに弱毒化することができる。一例においては、ウイルスを、１つまたは複数の遺伝子産物（例えば、本明細書の他の場所に記載の診断遺伝子産物または治療遺伝子産物）をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸の付加により弱毒化する。別の例においては、ウイルスを、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含有する異種核酸の改変により弱毒化する。さらなる例においては、異種核酸を、オープンリーディングフレームの長さの増加、オープンリーディングフレームの全部もしくは一部の除去またはオープンリーディングフレームの全部もしくは一部の置き換えにより改変する。そのような改変は、１つもしくは複数のウイルス遺伝子の破壊によるか、またはウイルス上での転写および／もしくは翻訳量の増加もしくは減少により、ウイルス毒性に影響し得る（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１００２９２号を参照されたい）。
【０２９５】
別の例においては、ウイルスを、ウイルス中に含まれる１つまたは複数のプロモーターの改変または置き換えにより弱毒化することができる。そのようなプロモーターを、より強いか、またはより弱いプロモーターにより置き換えることができ、その置き換えはウイルスの弱毒化の変化をもたらす。一例においては、本明細書で提供されるウイルスのプロモーターを、天然のプロモーターと置き換える。一例においては、本明細書で提供されるウイルスのプロモーターを、合成プロモーターと置き換える。ウイルス中に含まれるプロモーターを置き換えることができるプロモーターの例は、ワクシニアウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターであってよく、ワクシニア初期、中期、初期／後期または後期プロモーターを含んでもよい。ウイルスプロモーターのさらなる例は、本明細書に提供され、当技術分野で公知であり、これを用いてウイルス中に含まれるプロモーターを置き換えることができる。
【０２９６】
別の例においては、ウイルス中に含まれる異種核酸分子の全部または一部の除去により、ウイルスを弱毒化することができる。除去される異種核酸の部分は、１、２、３、４、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、１０００個以上、５０００個以上のヌクレオチド塩基であってよい。別の例においては、第１の異種核酸分子の全部または一部の除去によるウイルス中に含まれる異種核酸の改変およびウイルスの弱毒化のレベルを変化させる、第２の異種核酸分子による置き換えにより、ウイルスを弱毒化する。第２の異種核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、または非コード核酸分子であってよい。いくつかの例においては、第２の異種核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームを含有する。第２の異種核酸分子は、１つもしくは複数のオープンリーディングフレームまたは１つもしくは複数のプロモーターを含有してもよい。さらに、第２の異種核酸分子の１つまたは複数のプロモーターは、１つもしくは複数のより強いプロモーターまたは１つもしくは複数のより弱いプロモーターであってもよく、またはその組合せもしくはその両方であってよい。
【０２９７】
弱毒化ワクシニアウイルスは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００５−００３１６４３号、現在は米国特許第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号および第７，６６２，３９８号、ＵＳ２００８−０１９３３７３、ＵＳ２００９−００９８５２９、ＵＳ２００９−００５３２４４、ＵＳ２００９−０１５５２８７、ＵＳ２００９−００８１６３９、ＵＳ２００９−０１１７０３４およびＵＳ２００９−０１３６９１７、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０４７４５８号、第ＷＯ２００８／１００２９２号および第ＷＯ２００８／１５０４９６号に記載されている。
【０２９８】
本明細書で提供されるウイルスはまた、その感染性または中和抗体に対する耐性を変化させる改変を含有してもよい。ある非限定例においては、ワクシニアＬＩＶＰ株中のＡ３５Ｒ遺伝子の欠失は、ウイルスの感染性を減少させることができる。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスを、Ａ３５Ｒ遺伝子の欠失を含むように改変することができる。そのようなウイルスを作製するための方法の例は、Ａ３５Ｒ遺伝子の欠失を含む、ワクシニアＬＩＶＰウイルスＧＬＶ−１ｊ８７、ＧＬＶ−１ｊ８８およびＧＬＶ−１ｊ８９を記載するＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１００２９２号に記載されている。
【０２９９】
別の非限定例においては、ウイルス外被タンパク質（例えば、ウイルス外被糖タンパク質をコードするＡ３４Ｒ）の、より高いビルレンスまたはより低いビルレンスのウイルス株に由来する外被タンパク質による置き換えは、対象からのウイルスの消失を増加または減少させることができる。一例においては、ワクシニアＬＩＶＰ株中のＡ３４Ｒ遺伝子を、ワクシニアＩＨＤ−Ｊ株に由来するＡ３４Ｒ遺伝子と置き換えることができる。そのような置き換えは、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）型のワクシニアウイルスを増加させ、中和抗体に対するウイルスの耐性を増加させることができる。
【０３００】
３．異種遺伝子発現の制御
いくつかの例においては、異種核酸はまた、異種ＲＮＡおよび／またはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの発現を調節するための１つまたは複数の調節配列を含有してもよい。例えば、哺乳動物宿主細胞中で機能的である好適な調節配列は、当技術分野で周知である。また、ウイルスにより発現される１つもしくは複数のタンパク質またはＲＮＡ分子により、発現は影響され得る。プロモーターおよびエンハンサーなどの遺伝子調節エレメントは、細胞型特異的活性を有し、応答エレメントを介して特定の誘導因子（例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞増殖抑制剤、照射、熱ショック）により活性化することができる。これらの遺伝子の制御された、および制限された発現を、ウイルスベクターコンストラクト中の治療遺伝子の発現を駆動する内部プロモーターとしてそのような調節エレメントを用いて達成することができる。
【０３０１】
例えば、１つまたは複数の異種核酸分子を、異種ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸は、発現カセットとも呼ばれる。したがって、本明細書で提供されるウイルスは、１つまたは複数の異種遺伝子を発現する能力を有してもよい。遺伝子発現は、遺伝子によりコードされたタンパク質の発現および／または遺伝子によりコードされたＲＮＡ分子の発現を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍からの外因性遺伝子の産物の収穫を可能にするのに十分に高いレベルで外因性遺伝子を発現することができる。異種遺伝子の発現を、構成的プロモーターによるか、または誘導性プロモーターにより制御することができる。他の例においては、臓器または組織特異的発現を、調節配列により制御することができる。標的臓器、例えば、処置しようとする腫瘍のみにおける発現を達成するために、外来ヌクレオチド配列を組織特異的プロモーターに連結し、遺伝子療法に用いることができる。そのようなプロモーターは当業者には周知である（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  １２：  １１−２４  （１９９４）；  Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：  ８３３−８４０  （１９９０）；  Ｍａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８１：  ８９１−９０４  （１９９５）；  およびＰｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １：  ２６８−７６  （１９８７）を参照されたい）。
【０３０２】
異種遺伝子の発現のためのプロモーターの例は当技術分野で公知である。異種核酸を、天然プロモーターまたはウイルスにとって天然ではない異種プロモーターに作動可能に連結することができる。合成および天然および改変プロモーターなどの任意の好適なプロモーターを用いることができる。プロモーターの例としては、合成ウイルスおよび動物プロモーターなどの合成プロモーターが挙げられる。天然プロモーターまたは異種プロモーターとしては、限定されるものではないが、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターが挙げられる。
【０３０３】
一例においては、プロモーターは、例えば、ワクシニアウイルスプロモーターなどのポックスウイルスプロモーターである。１つまたは複数の異種遺伝子の発現のためのワクシニアウイルスプロモーターは、合成または天然プロモーターであってよく、ワクシニア初期、中期、初期／後期および後期プロモーターを含む。異種遺伝子発現を制御するためのワクシニアウイルスプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｐ７．５Ｋ、Ｐ１１Ｋ、ＰＳＥ、ＰＳＥＬ、ＰＳＬ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、Ｐ２８、Ｃ１１Ｒ、Ｇ８Ｒ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ３Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ａ３Ｌ、Ｈ１Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｈ８Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ４Ｒ、Ｄ５Ｒ、Ｄ９Ｒ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｐ４ｂまたはＫ１プロモーターが挙げられる。他のウイルスプロモーターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルス後期プロモーター、牛痘ＡＴＩプロモーター、またはＴ７プロモーターが挙げられる。強力な後期プロモーターを用いて、異種遺伝子の高レベルの発現を達成することができる。初期および中間段階のプロモーターを用いることもできる。一例においては、プロモーターは、初期および後期プロモーターエレメント、例えば、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰ７．５Ｋ、ワクシニア後期プロモーターＰ１１Ｋ、合成初期／後期ワクシニアＰＳＥＬプロモーター（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ９４３１−９４３５；  Ｄａｖｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，  （１９８９）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１０：  ７４９−７６９；  Ｄａｖｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：  ４２８５−４２８６；  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７），  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：  １０９４−１０９７）を含む。本明細書で提供されるウイルスは、より強いプロモーター対弱いプロモーターとを用いる結果として、弱毒化などの特徴の差異を示すことができる。例えば、ワクシニアにおいては、合成初期／後期および後期プロモーターは比較的強いプロモーターであるが、ワクシニア合成初期、Ｐ７．５Ｋ初期／後期、Ｐ７．５Ｋ初期、およびＰ２８後期プロモーターは比較的より弱いプロモーターである（例えば、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（６）  １０９４−１０９７を参照されたい）。異なるプロモーターの組合せを用いて、同じウイルスまたは２つの異なるウイルス中で異なる遺伝子産物を発現させることができる。
【０３０４】
当技術分野で公知のように、調節配列は外因性遺伝子の構成的発現を可能にするか、または外因性遺伝子の誘導性発現を可能にすることができる。さらに、調節配列は、外因性遺伝子の発現レベルを制御することができる。遺伝子産物の製造および収穫などのいくつかの例においては、調節配列は構成的な高レベルの遺伝子発現をもたらすことができる。抗（遺伝子産物）抗体収穫などのいくつかの例においては、調節配列は構成的なより低レベルの遺伝子発現をもたらすことができる。腫瘍治療の例においては、治療タンパク質は、内部的に誘導されるプロモーターまたは外部的に誘導されるプロモーターの制御下にあってよい。
【０３０５】
したがって、異種遺伝子の発現を、構成的プロモーターによるか、または誘導性プロモーターにより制御することができる。誘導性プロモーターを用いて、異種遺伝子の組織特異的発現を提供するか、またはプロモーターの一時的な特異的誘導を提供するための調節分子の添加により誘導することができる。いくつかの例においては、誘導性発現は、腫瘍細胞中に存在するか、またはウイルスに感染した腫瘍細胞中に存在する細胞因子または他の因子の制御下にあってよい。さらなる例においては、誘導性発現は、ＩＰＴＧ、ＲＵ４８６または他の公知の誘導化合物などの投与可能な物質の制御下にあってよい。さらなる調節配列を用いて、１つまたは複数の異種遺伝子が挿入されたウイルスの発現を制御することができる。様々な調節配列のいずれかが、公知の因子および設計選択性に従って当業者に利用可能である。
【０３０６】
４．改変ウイルスの作製方法
本明細書で提供されるウイルスを、ウイルスを改変するための当業者には周知の標準的な方法を用いて、本明細書に記載の挿入、欠失、置き換えまたは突然変異、例えば、異種核酸の挿入または置き換えにより改変することができる。改変のための方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ  （１９８９）および本明細書に開示される実施例に記載のような、例えば、インビトロ組換え技術、合成方法、直接的クローニング、およびインビボ組換え法が挙げられる。
【０３０７】
例えば、組換えポックスウイルスなどの組換えウイルスの作製は当技術分野で周知であり、典型的には、分子生物学における標準的な技術を用いる遺伝子カセットまたは導入ベクターの作製を含む（例えば、組換えＬＩＶＰワクシニアウイルスの作製方法の例を記載する米国特許第７，５８８，７６７号およびＵＳ２００９−００５３２４４−Ａ１を参照されたい）。そのような技術としては、様々な核酸操作技術、核酸導入プロトコル、核酸増幅プロトコル、および当技術分野で公知の他の分子生物学技術が挙げられる。例えば、点突然変異または小さい挿入もしくは欠失を、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的突然変異誘発の使用により対象の遺伝子に導入することができる。別の例においては、相同組換えを用いて、核酸配列中に突然変異または対象の標的配列中に核酸分子の挿入もしくは欠失を導入することができる。いくつかの例においては、特定の遺伝子中の核酸の突然変異、挿入または欠失を、陽性または陰性選択圧を用いるために選択することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。核酸増幅プロトコルとしては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはウイルスもしくは生物、例えば、限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞などを介する増幅が挙げられる。プラスミド、ベクター、プロモーターおよび他の調節配列などの核酸手段の使用は、様々なウイルスおよび細胞生物について当技術分野で周知である。核酸導入プロトコルとしては、塩化カルシウム形質転換／トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性核酸導入、Ｎ−［１−（２，３−ジオロイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート媒介性形質転換などが挙げられる。さらに様々な核酸手段が、多くの異なる起源、例えば、種々の商業的起源から入手可能である。当業者であれば、当技術分野の知識および設計選択に従って任意の特定のウイルスの遺伝的改変のための好適な手段および方法を容易に選択することができる。
【０３０８】
したがって、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的方法を用いて、様々な改変のいずれかを容易に達成することができる。改変は、典型的には、ウイルスゲノムの１つまたは複数のトランケーション、欠失、突然変異または挿入である。一例においては、改変は、ウイルスゲノム中の特定の配列に特異的に対するものであってよい。改変は、限定されるものではないが、ウイルスゲノムの調節配列、遺伝子コード配列、遺伝子間配列、既知の役割を有さない配列、または非必須領域などの、ウイルスゲノムの様々な領域のいずれかに対するものであってよい。改変に利用できるウイルスゲノムの任意の様々な領域が、ＬＩＶＰなどの多くのウイルスについて当技術分野で容易に公知である。
【０３０９】
異種核酸分子は、典型的には、非必須ウイルス遺伝子産物をコードする遺伝子間領域または遺伝子座中でウイルスゲノムに挿入される。そのような部位での異種核酸の挿入は、一般的には、標的組織でのウイルス感染または複製に有意に影響しない。挿入部位の例は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、Ｊ２Ｒ（チミジンキナーゼ（ＴＫ））、Ａ５６Ｒ（ヘマグルチニン（ＨＡ））、Ｆ１４．５Ｌ、ワクシニア成長因子（ＶＧＦ）、Ａ３５Ｒ、Ｎ１Ｌ、Ｅ２Ｌ／Ｅ３Ｌ、Ｋ１Ｌ／Ｋ２Ｌ、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子座、７．５Ｋ、Ｃ７−Ｋ１Ｌ（宿主範囲遺伝子領域）、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ（出血領域）、Ａ２６Ｌ（Ａ型封入体領域（ＡＴＩ））またはＩ４Ｌ（大サブユニット、リボヌクレオチドリダクターゼ）遺伝子座が挙げられる。本明細書で提供されるウイルスのための挿入部位としては、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスなどの他のポックスウイルスに記載の遺伝子内領域に対応する部位（米国特許第７，５５０，１４７号に記載の例示的部位）、ＮＹＶＡＣ（米国特許第５，７６２，９３８号に記載の例示的部位）も挙げられる。
【０３１０】
組換えＤＮＡ技術を用いる組換えウイルスの作製方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，７６９，３３０号；第４，６０３，１１２号；第４，７２２，８４８号；第４，２１５，０５１号；第５，１１０，５８７号；第５，１７４，９９３号；第５，９２２，５７６号；第６，３１９，７０３号；第５，７１９，０５４号；第６，４２９，００１号；第６，５８９，５３１号；第６，５７３，０９０号；第６，８００，２８８号；第７，０４５，３１３号；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５（５）：２５０９−２５１４；Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：９１６−９１９；およびＨｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｅｖ．  ３：１５３−１７０を参照されたい）。組換えワクシニアウイルスの作製方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｅｖ．  ３：１５３−１７０、米国特許出願公開第２００５−００３１６４３号、現在は米国特許第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号、第７，６６２，３９８号ならびに米国特許第７，０４５，３１３号を参照されたい）。
【０３１１】
例えば、異種遺伝子産物を発現する組換えワクシニアウイルスの作製は、典型的には、所望によりプロモーターに作動可能に連結された異種核酸と、その異種核酸にフランキングするワクシニアウイルスＤＮＡ配列とを含有し、ウイルスゲノムへの遺伝子の相同組換えおよび挿入を容易にする組換えプラスミドの使用を含む。一般的には、異種遺伝子にフランキングするウイルスＤＮＡは、前記遺伝子が非必須位置に挿入されるように、ワクシニアウイルスＤＮＡの非必須セグメントと相補的である。組換えプラスミドを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で増殖させ、それから精製し、例えば、限定されるものではないが、ＣＶ−１、ＢＳＣ−４０、ＢＳＣ−１およびＴＫ−１４３細胞などの好適な宿主細胞中に導入することができる。次いで、トランスフェクトされた細胞を、複製サイクルを開始するワクシニアウイルスに重感染させる。異種ＤＮＡは、相同組換えによりワクシニアウイルスゲノム中に組み込まれ、感染子孫中にパッケージングされ得る。当技術分野で公知の方法により、例えば、異種遺伝子産物の発現の検出または陽性もしくは陰性選択法（米国特許第７，０４５，３１３号）の使用などにより、組換えウイルスを同定することができる。
【０３１２】
別の例においては、異種遺伝子産物を発現する組換えワクシニアウイルスを、直接的クローニングにより作製することができる（例えば、米国特許第６，２６５，１８３号およびＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ９９７７−９９８１を参照されたい）。そのような方法においては、所望によりプロモーターに作動可能に連結された異種核酸を、標的ウイルス中のユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位中への挿入のための制限エンドヌクレアーゼ切断部位にフランキングさせる。標準的な技術を用いてウイルスＤＮＡを精製し、配列がウイルスゲノム中のユニークな部位である場合、配列特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて切断する。ウイルスゲノム中の任意のユニークな部位を用いることができるが、但し、その部位での改変がウイルス複製を阻害しないことが条件である。例えば、ワクシニアウイルス株ＬＩＶＰにおいては、ＮｏｔＩ制限部位は、未知の機能を有するＦ１４．５Ｌ遺伝子をコードするＯＲＦ中に位置する（Ｍｉｋｒｙｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ  ４：  ４４２−４４９  （１９８８））。表６は、例示的ＬＩＶＰ株に含まれるユニークな制限部位の概要を提供し、それぞれのヌクレオチド位置を指定する。そのようなＬＩＶＰ株を、直接的クローニングおよび部位もしくは複数の部位への異種ＤＮＡの挿入によりここで改変することができる。一般的には、挿入は、ウイルスゲノムの非必須領域中に位置する部位中にある。例えば、本明細書に記載の例示的改変は、ＮｏｔＩ消化されたウイルスＤＮＡ中への外来ＤＮＡ配列の挿入を含む。
【０３１３】
【表６】
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【０３１４】
いくつかの例においては、最初に、ウイルスゲノムＤＮＡを、ウイルス中に１つまたは複数のユニークな制限部位を導入するための相同組換えにより改変する（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８５７−８６４を参照されたい）。制限エンドヌクレアーゼによる切断後、切断されたＤＮＡを所望によりホスファターゼで処理して、エンドヌクレアーゼによる切断によって生成されたＤＮＡセグメントの末端からリン酸部分を除去する。典型的には、制限部位にフランキングする挿入のための異種ＤＮＡを含有するプラスミドベクターを作製する。ウイルスへの挿入の前に、異種ＤＮＡを配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる切断によってプラスミドから切り出す。次いで、異種ＤＮＡを切断されたウイルスＤＮＡに連結し、限定されるものではないが、鶏痘（ｆｏｗｐｏｘ）ウイルスまたはｐｕｖ不活化ヘルパーワクシニアウイルスなどのヘルパーウイルスを用いる細胞の感染により許容状態の細胞系中にパッケージングさせ、連結されたＤＮＡを感染細胞にトランスフェクトする。
【０３１５】
いくつかの例においては、前記方法は、相同組換えおよび／またはウイルス中でのユニークな制限部位の使用を含む。例えば、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子中（例えば、ＬＩＶＰ単離物のＮｏｔＩ制限部位中）に挿入を含む組換えＬＩＶＰワクシニアウイルスを、以下の工程：（ａ）（ｉ）ベクター中の制限部位が標的挿入部位の親ウイルス配列にフランキングする、制限部位Ｘ（例えば、ＮｏｔＩ）に挿入された改変（例えば、遺伝子発現カセットもしくは改変Ｆ１４．５Ｌ遺伝子）を含有するワクシニアシャトル／導入プラスミドおよび（ｉｉ）制限部位Ｘ（例えば、ＮｏｔＩ）で消化され、所望により脱リン酸化されたＬＩＶＰウイルスＤＮＡを作製すること；（ｂ）細胞をＰＵＶ不活化ヘルパーワクシニアウイルスに感染させ、工程ａの（ｉ）および（ｉｉ）のコンストラクトの混合物を用いて感染した宿主細胞をトランスフェクトすること；ならびに（ｃ）トランスフェクタントから組換えワクシニアウイルスを単離することにより調製することができる。当業者は、どのようにそのような方法を実施するかを知っている（例えば、Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：  ５３４−５４０  （２００１）を参照されたい）。典型的には、制限部位Ｘは、上記のようにウイルス中のユニークな制限部位である。
【０３１６】
一例においては、前記方法は、ウイルス中に１つまたは複数の遺伝的改変を導入した後、その改変を反映する特性について、または他の望ましい特性についてウイルスをスクリーニングすることを含む。いくつかの例においては、改変は完全に、または部分的に無作為であってよく、その際、任意の特定の改変ウイルスの選択を、改変ウイルスの望ましい特性に従って決定することができる。
【０３１７】
Ｅ．ウイルスの増殖および生成
本明細書で提供されるウイルスを、当業者には公知の方法により生成させることができる。得られる本明細書で提供されるウイルスを、以下のセクションＦに記載のように治療および診断適用において用いることができる。
【０３１８】
前記ウイルスを、宿主細胞中で増殖させ、定量し、本明細書に記載の方法において使用するために最終的に調製される前に保存のために調製する。ウイルスを好適な宿主細胞中で増殖させて、保存物を増大させ、次いでその濃度を決定することができる。いくつかの例においては、プラークアッセイなどにより、感染力価を決定する。ウイルス粒子の総数を決定することができる。ウイルスを、経時的な感染性の喪失が最小化されるように、ウイルスの安定性および完全性を促進する条件で保存する。いくつかの例においては、大量のウイルスを生成させ、既知の濃度の小アリコート中で保存し、長期間にわたって複数の手順のために用いることができる。様々なウイルスにとって最も好適である条件は異なり、当技術分野で公知であるが、典型的には、凍結乾燥などの凍結または乾燥を含む。ウイルスを、１０５〜１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、例えば、１０７〜１０９ｐｆｕ／ｍＬ、例えば、少なくとも１０６ｐｆｕ／ｍＬ、少なくとも１０７ｐｆｕ／ｍＬ、少なくとも１０８ｐｆｕ／ｍＬもしくは少なくとも１０９ｐｆｕ／ｍＬまたは約１０６ｐｆｕ／ｍＬ、約１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約１０８ｐｆｕ／ｍＬもしくは約１０９ｐｆｕ／ｍＬまたは１０６ｐｆｕ／ｍＬ、１０７ｐｆｕ／ｍＬ、１０８ｐｆｕ／ｍＬもしくは１０９ｐｆｕ／ｍＬの濃度で保存することができる。本明細書で提供される方法における使用の直前に、保存されたウイルスを再構成させ（保存のために乾燥させた場合）、好適な媒体または溶液中に希釈する。以下のセクションは、本明細書で提供される方法のいずれかにおける使用のためのウイルスの生成および増殖に用いることができる例示的方法を提供する。
【０３１９】
１．増殖のための宿主細胞
本明細書で提供されるクローンウイルス株またはその組換えウイルス株を、好適な宿主細胞中で増殖させることができる。そのような細胞は、単一の種類の細胞の群または異なる種類の細胞の混合物であってよい。宿主細胞としては、培養細胞系、一次細胞、および増殖性細胞が挙げられる。これらの宿主細胞は、ニワトリ胚、ウサギ、ハムスター、およびサル腎臓細胞などの、ワクシニアウイルスなどのウイルスの感染に罹りやすい哺乳動物、鳥類および昆虫の細胞および組織などの様々な動物細胞のいずれかを含んでもよい。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞（全能細胞、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞（例えば、骨格筋、心筋または平滑筋）、線維芽細胞、ならびに例えば、ＣＶ−１、ＢＳＣ４０、ＶｅｒｏおよびＢＳＣ−１などの細胞系、およびヒトＨｅＬａ細胞が挙げられる。典型的には、単層で、または懸濁液中で増殖させることができる細胞系中でウイルスを増殖させる。例えば、ワクシニアウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、ＣＶ−１、ＢＳＣ４０、Ｖｅｒｏ、ＢＧＭ、ＢＳＣ−１およびＲＫ−１３細胞が挙げられる。アデノウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、ＨｅＬａ、ＭＫ、ＨＥＫ２９３およびＨＤＦ細胞が挙げられる。ヘルペスウイルスの増殖のための細胞系の例としては、限定されるものではないが、ＷＩ−３８およびＨｅＬａ細胞が挙げられる。様々なウイルスの増殖にとって好適な他の細胞系は当技術分野で周知である。系からの培養株の精製を、標準的な方法を用いて行うことができる。
【０３２０】
２．濃度決定
溶液中のウイルスの濃度、またはウイルス力価を、当技術分野で公知の様々な方法により決定することができる。いくつかの方法においては、感染性ウイルス粒子数の決定が行われるが（典型的には、プラーク形成単位（ＰＦＵ）と呼ばれる）、他の方法においては、感染性であるか、またはそうではないウイルス粒子の総数の決定が行われる。感染性ビリオン数を算出する方法としては、限定されるものではないが、ウイルスの力価測定を細胞単層上で増殖させ、数日後から数週間後にプラーク数を計数するプラークアッセイ、および１ｌｏｇなどの特定範囲内で力価を決定するエンドポイント希釈法が挙げられる。感染性および非感染性粒子を含むウイルス粒子の総数を決定する方法としては、限定されるものではないが、ウイルス抗原を認識する抗体を利用し、顕微鏡観察またはＦＡＣＳ分析により可視化することができる免疫組織化学染色法；２６０ｎｍなどでの吸光度；ならびにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または蛍光染料を用いて標識することによる定量などによるウイルス核酸の測定が挙げられる。
【０３２１】
３．保存方法
一度、ウイルスが精製され（または所望の純度まで）、その力価が決定されたら、その感染完全性を最適に維持する条件でウイルスを保存することができる。典型的には、光は時間と共にウイルスを不活化するように働くため、ウイルスは暗室中で保存される。保存液中でのウイルスの安定性は通常、温度に依存する。いくつかのウイルスは熱安定性であるが、多くのウイルスは室温で２日以上で安定ではなく、生存能力の低下を示す（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｉｎｆ．  Ｄｉｓ．  １８７：１３１９−１３２２）。短期間、例えば、１日、２日、４日または７日のウイルス保存のためには、約４℃の温度が一般的に推奨される。長期間の保存のためには、多くのウイルスを−２０℃、−７０℃または−８０℃で保持することができる。これらの温度でＰＢＳまたはＴｒｉｓ溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ＮａＣｌ、２〜３％グリセロールもしくはスクロース）などの簡単な溶液中で凍結された場合、ウイルスは６カ月から１年、またはさらにより長い期間、安定であってよい。しかしながら、反復的凍結−解凍サイクルはウイルス力価の減少を引き起こし得るため、一般的にはそれを避ける。ウイルスはまた、ウイルスの完全性をさらに保つことができる保存溶液中に他の補給物質を含有する媒体中で凍結することもできる。例えば、−８０℃で保存されたウイルス溶液への血清またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加は、長期間にわたって、および数回の凍結−解凍サイクルを通してウイルスの生存能力を保持するのに役立ち得る。他の例においては、ウイルス試料を、周囲温度での長期保存のために乾燥させる。限定されるものではないが、凍結乾燥、気泡乾燥、噴霧乾燥および脱水などの様々な技術を用いてウイルスを乾燥させることができる。周囲温度、冷蔵温度または冷凍温度でのウイルスの保存のための他の方法は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、米国特許第５，１４９，６５３号；第６，１６５，７７９号；第６，２５５，２８９号；第６，６６４，０９９号；第６，８７２，３５７号；および第７，０９１，０３０号；ならびに米国特許出願公開第２００３−０１５３０６５号、第２００４−００３８４１号および第２００５−００３２０４４号に記載のものが挙げられる。
【０３２２】
ウイルスはそれぞれの保存方法に対して示差的に反応し得る。例えば、ポリオウイルスは水性懸濁液中、室温で容易に分解され、０℃で２週間だけ安定であり、凍結乾燥により破壊される。この特定のウイルスのために、保存方法は典型的には、−７０℃での凍結または４℃での冷蔵を含む。対照的に、ワクシニアウイルスは非常に安定であると考えられ、４℃で溶液中で保存し、例えば、−２０℃、−７０℃もしくは−８０℃で凍結し、または凍結乾燥することができ、生存能力の喪失はわずかである（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｉｎｆ．  Ｄｉｓ．  １８７：１３１９−１３２２、Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｃｌｉｎ．    Ｍｉｃｒｏｂ．    Ｒｅｖ．  ３：１５３−１７０）。特定のウイルスの保存にとって好適な方法および条件は当技術分野で公知であり、それを用いて本明細書で提示される方法において用いられるウイルスを保存することができる。
【０３２３】
水は、保存中のウイルスを分解するほぼすべての破壊経路における反応物である。さらに、水は、タンパク質のアンフォールディングおよび凝集を可能にする可塑剤として作用する。水はほぼすべての分解経路に関与するため、ウイルスの水性溶液の乾燥粉末への低下は、そのような試料の安定性を増強するための代替的な製剤化方法を提供する。凍結乾燥、または凍結−乾燥は、ウイルスを保存するために用いられる乾燥技術である（例えば、Ｃｒｙｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｖ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３（３），  ９７３−３８３を参照されたい）。凍結−乾燥には３つの段階；凍結、一次乾燥および二次乾燥が存在する。これらの段階の間に、材料は急速に凍結され、高真空下で脱水される。一度凍結乾燥されたら、乾燥されたウイルスを周囲温度で長期間保存し、必要に応じて水性溶液を用いて再構成することができる。様々な安定剤を溶液中に含有させた後、ウイルスの保存を増強するために凍結−乾燥することができる。例えば、血清、血清アルブミンまたはゼラチンなどの高分子量構造添加物は凍結中のウイルス凝集を防止するのに役立ち、凍結乾燥状態または乾燥状態での構造的および栄養的支援を提供することが知られている。アルギニンおよびグルタミン酸などのアミノ酸、トレハロースなどの糖、ならびにマンニトール、ソルビトールおよびイノシトールなどのアルコールは、凍結乾燥中および凍結乾燥状態でのウイルスの感染性の保存を増強することができる。凍結乾燥前にウイルス溶液に添加された場合、尿素およびアスコルビン酸は水和状態を安定化し、脱水期間中の浸透圧バランスを維持する。典型的には、約７．０の比較的一定のｐＨが凍結乾燥を通じて維持される。
【０３２４】
４．ウイルスの調製
使用の直前に、ウイルスを好適な媒体中で好適な濃度で調製し、使用まで氷上などの低温で維持することができる。保存のためにウイルスを凍結乾燥したか、またはさもなければ乾燥した場合、それを好適な水性溶液中で再構成させることができる。ウイルスが調製される水性溶液は、典型的には、アッセイにおいて用いられる媒体（例えば、ＤＭＥＭもしくはＲＰＭＩ）または緩衝化塩溶液（例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、Ｈｅｐｅｓ溶液）などの適合するものである。医薬適用のためには、ウイルスを直接調製するか、または医薬溶液中で再構成させることができる。使用のためのいくつかの薬学的に許容される溶液が当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）  ｅｄ．  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  １９９０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａを参照されたい）。一例においては、ウイルスを、アジュバントもしくは担体と共に、またはそれを用いずに、滅菌食塩水もしくは滅菌緩衝化食塩水などの生理的に許容される溶液中に希釈することができる。他の例においては、医薬溶液は、粘度をもたらす成分（例えば、グリセロール）および／または殺菌特性を有する成分（例えば、フェノール）を含有してもよい。いくつかの例においては、ウイルスは、アッセイにおいて少量のみが必要とされるように比較的濃縮された溶液中で調製される。例えば、１ｘ１０６ｐｆｕのウイルスが９６ウェルプレート中の腫瘍細胞に添加される場合、１０μｌだけが各ウェルに添加されるように、１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍＬの濃度でウイルスを調製することができる。当業者であれば、特定の用途に応じて、特定の濃度を経験的に決定することができる。
【０３２５】
Ｆ．医薬組成物、組合せおよびキット
本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物、組合せおよびキットが本明細書で提供される。医薬組成物は、本明細書で提供されるウイルスと、医薬担体とを含んでもよい。組合せは、例えば、２種以上のウイルス、ウイルスと検出可能な化合物、ウイルスと治療化合物、ウイルスとウイルス発現調節化合物、またはその任意の組合せを含んでもよい。キットは、１つもしくは複数の本明細書で提供される医薬組成物もしくは組合せ、および使用のための説明書などの１つもしくは複数の構成要素、対象に医薬組成物もしくは組合せを投与するためのデバイス、対象に治療もしくは診断化合物を投与するためのデバイスまたは対象におけるウイルスを検出するためのデバイスを含んでもよい。
【０３２６】
医薬組成物、組合せまたはキット中に含有されるウイルスは、本明細書に記載の任意の単離されたウイルスクローン株などの、本明細書で提供される任意のウイルスを含んでもよい。医薬組成物、組合せまたはキットは、本明細書で提供されるウイルスまたは他の治療もしくは診断ウイルスから選択することができる１つまたは複数のさらなるウイルスを含んでもよい。
【０３２７】
１．医薬組成物
本明細書で提供されるウイルスと、好適な医薬担体とを含有する医薬組成物が本明細書で提供される。薬学的に許容される担体としては、ウイルスのための媒体担体または培地として作用する固体、半固体または液体材料が挙げられる。本明細書で提供される医薬組成物を、様々な形態、例えば、固体、半固体、水性、液体、粉末または凍結乾燥形態で製剤化することができる。本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物の例としては、限定されるものではないが、滅菌注射溶液、滅菌包装粉末、点眼剤、錠剤、ピル、粉末、ロゼンジ剤、サチェット剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、もしくは液体培地中）、軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、ならびに坐剤が挙げられる。
【０３２８】
好適な医薬担体の例は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、特に、水、バッファー、食塩水溶液、リン酸緩衝食塩水溶液、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ゼラチン、グリセリン、ラクトース、スクロール、デキストロース、アミロースもしくはスターチなどの炭水化物、ソルビトール、マンニトール、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、粉末が挙げられる。本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、酸化防止剤、保存剤、鎮痛剤、結合剤、崩壊剤、着色剤、希釈剤、賦形剤、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定剤、等張剤、媒体、粘性剤、香料、甘味料、油／水乳濁液などの乳濁液、乳化剤および懸濁剤、例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ベントナイト、カルボマー、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、コレステロール、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、オクトキシノール９、オレイルアルコール、ポビドン、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリルアルコール、トラガカント、キサンタンゴム、およびその誘導体、溶媒、ならびに限定されるものではないが、特に、結晶性セルロース、微結晶性セルロース、クエン酸、デキストリン、液体グルコース、乳酸、ラクトース、塩化マグネシウム、メタリン酸カリウム、スターチなどの雑多な成分などの他の添加物を含有してもよい。そのような担体および／または添加物を、従来の方法により製剤化し、好適な用量で対象に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート剤などの安定化剤は、体内での分解から組成物を保護することができる。医薬組成物における使用のための他の好適な製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２００５，  Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＆  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）に見出すことができる。
【０３２９】
注射または粘膜デリバリーのための本明細書で提供されるウイルスを含む医薬製剤は、典型的には、注射もしくは粘膜投与のための好適なバッファー中で提供されたウイルスの水性溶液または注射もしくは粘膜投与のための好適なバッファー中での再構成のための凍結乾燥形態のウイルスを含む。そのような製剤は、所望により、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の１つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または添加物を含有してもよい。経口投与のための液体組成物は、一般的には水性溶液、好適に風味を付けたシロップ、水性もしくは油性懸濁液、およびトウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、もしくはピーナッツ油などの食用脂を含む風味付けされた乳濁液、ならびにエリキシル剤および同様の医薬媒体を含む。
【０３３０】
本明細書で提供される医薬組成物を、当技術分野で公知の手順を用いることにより、本明細書に記載のウイルスの迅速な、持続的、または遅延放出を提供するように製剤化することができる。錠剤などの固体組成物を調製するためには、本明細書で提供されるウイルスを医薬担体と混合して、固体組成物を形成させる。所望により、錠剤またはピルを被覆するか、またはさもなければ混合して、対象における延長された作用の利点が得られる剤形を提供する。例えば、錠剤またはピルは、内部用量成分と外部用量成分とを含み、後者は前者の上のエンベロープの形態にある。この２つの成分を、例えば、胃の中での崩壊に抵抗し、内部成分を無傷のまま十二指腸に通過させ、放出を遅延させるように働く腸溶層により分離することができる。例えば、いくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸と、シェラック、セチルアルコール、およびセルロースアセテートなどの材料との混合物などの、様々な材料がそのような腸溶層または腸溶コーティングに用いられる。
【０３３１】
吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または通気（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）のための組成物としては、薬学的に許容される水性もしくは有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。これらの液体または固体組成物は、所望により本明細書に記載の、または当技術分野で公知の好適な薬学的に許容される賦形剤および／または添加物を含有してもよい。そのような組成物は、例えば、局所または全身効果のために経口または鼻呼吸経路により投与される。薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により噴霧される。噴霧された溶液は、例えば、噴霧デバイスから直接的に、装着されたフェイスマスクテントから、または間欠的陽圧呼吸装置から吸入される。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、例えば、吸入器の使用などの好適な様式で製剤を送達するデバイスから、経口的または経鼻的に投与される。
【０３３２】
本明細書で提供される医薬組成物を、経皮デリバリーデバイス（「パッチ」）を介する経皮的デリバリーのために製剤化することができる。そのような経皮パッチを用いて、本明細書で提供されるウイルスの連続的または非連続的注入を提供する。薬剤のデリバリーのための経皮パッチの構築および使用を、当技術分野で公知の方法に従って実施する。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号を参照されたい。そのようなパッチは、本明細書で提供されるウイルスの連続的デリバリー、パルスデリバリー、またはオンデマンドデリバリーのために構築される。
【０３３３】
ウイルスのデリバリーに用いることができるコロイド分散系としては、大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質に基づく系、例えば、水中油乳濁液（混合）、ミセル、リポソームならびにリポプレックスが挙げられる。コロイド系の例は、リポソームである。臓器特異的または細胞特異的リポソームを用いて、所望の組織のみに対するデリバリーを達成することができる。当業者であれば、リポソームの標的化を、一般的に公知の方法を適用することにより実行することができる。この標的化は、受動的標的化（洞様毛細血管を含む臓器中のＲＥＳの細胞に分布するリポソームの自然傾向を用いる）または能動的標的化（当業者には公知の方法を用いることにより、例えば、特異的リガンド、例えば、抗体、受容体、糖、糖脂質およびタンパク質にリポソームをカップリングさせることによる）を含む。モノクローナル抗体を用いて、特異的細胞表面リガンドを介して、リポソームを特定の組織、例えば、腫瘍組織に標的化することができる。
【０３３４】
２．宿主細胞
本明細書で提供されるウイルスを含有する宿主細胞が提供される。そのような細胞を、例えば、本明細書で提供される診断または治療方法に記載のように、インビトロでの使用またはインビボでの使用において用いることができる。宿主細胞は、単一の種類の細胞の群または異なる種類の細胞の混合物であってよい。宿主細胞としては、培養細胞系、一次細胞および増殖性細胞が挙げられる。宿主細胞は、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターもしくはウサギ）およびニワトリ胚細胞などの、ウイルスによる感染に罹りやすい哺乳動物、鳥類および昆虫の細胞および組織などの様々な動物細胞のいずれかを含んでもよい。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞（全能性細胞、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞（例えば、骨格筋、心筋または平滑筋）、線維芽細胞、腫瘍細胞ならびに例えば、ＣＶ−１、ＢＳＣ４０、Ｖｅｒｏ、ＢＳＣ４０およびＢＳＣ−１などの細胞系、ならびにヒトＨｅＬａ細胞が挙げられる。宿主細胞を感染させ、および／または形質転換し、感染細胞または形質転換体を表現型により選択する方法、ならびに他のそのような方法は当技術分野で公知である。
【０３３５】
３．組合せ
本明細書で提供されるウイルスと、第２のウイルスまたは他の治療剤もしくは診断剤などの第２の薬剤との組合せが提供される。組合せは、本明細書で提供されるウイルスと、例えば、１つまたは複数のさらなる診断または治療ウイルスなどの１つまたは複数のさらなるウイルスとを含んでもよい。組合せは、本明細書で提供されるウイルスを含有する医薬組成物または本明細書に記載のウイルスを含有する宿主細胞を含んでもよい。組合せはまた、例えば、抗ウイルス剤または化学療法剤などの、本明細書で提供される方法に従うその弱毒化を行うための任意のウイルスまたは試薬を含んでもよい。組合せはまた、ウイルスによりコードされる内因性または異種遺伝子からの遺伝子発現の調節のために用いられる化合物を含有してもよい。
【０３３６】
本明細書で提供される組合せは、ウイルスと、治療化合物とを含んでもよい。本明細書で提供される組成物のための治療化合物は、例えば、抗がん化合物または化学療法化合物であってよい。治療化合物の例としては、例えば、サイトカイン、成長因子、光感作剤、放射性核種、毒素、ｓｉＲＮＡ分子、酵素／プロＥ薬剤（ｐｒｏ  Ｅ  ｄｒｕｇ）対、代謝拮抗物質、シグナリング調節剤、抗がん抗生物質、抗がん抗体、血管新生阻害剤、化学療法化合物、抗転移化合物またはその任意の組合せが挙げられる。本明細書で提供されるウイルスを、白金配位複合体などの抗がん化合物と組み合わせることができる。白金配位複合体の例としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ３２９５および２５４−Ｓが挙げられる。化学療法剤の例としては、限定されるものではないが、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、非糖含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスチン、ポリフェプロサン、ＭＭ１２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ロメトレキソール／ＬＹ２６４６１８、グラモレック、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトキサントロン、メタレット／スラミン、ＢＢ−９４／バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳ１６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マリマスタット、ＢＢ２５１６／マリマスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、バルルビシン／ＡＤ３２、ストロンチウム−８９／メタストロン、テモダール／テモゾロミド、ユータキサン／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、パクセクス／パクリタキセル、シクロパックス／経口パクリタキセル、ゼローダ／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、経口トキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳがん遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフル／ウラシル）、エルガミゾール／レバミゾール、カンプト／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプトサール／イリノテカン、トムデックス／ラルチトレキセド、ロイスタチン／クラドリビン、キャエリクス／リポソーム性ドキソルビシン、マイオセット／リポソーム性ドキソルビシン、ドキシル／リポソーム性ドキソルビシン、エバセット／リポソーム性ドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルモルビシン／エピルビシン、ＤｅｐｏＣｙｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタリミ��、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、ゲムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ１１６、ヨウ素種、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォスファミド、イフェックス／メスネックス／イフォスファミド、ブモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プラチノール／シスプラチン、ＶｅＰｅｓｉｄ／エポシン／エトポホス／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルファランおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンＨＣｌ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（窒素マスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサルビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンが挙げられる。本明細書で提供される医薬組成物および組合せにおける使用のためのさらなる治療化合物の例は、本明細書の他の場所に見出すことができる（例えば、サイトカイン、成長因子、光感作剤、放射性核種、毒素、ｓｉＲＮＡ分子、酵素／プロドラッグ対、代謝拮抗物質、シグナリング調節剤、抗がん抗生物質、抗がん抗体、血管新生阻害剤、および化学療法化合物の例については、例えば、セクションＩを参照されたい）。
【０３３７】
いくつかの例においては、組合せは、例えば、ウイルスによりコードされ、発現される酵素のための基質である化合物などのさらなる治療化合物、またはウイルスと協調して作用する本明細書で提供されるか、もしくは当技術分野で公知の他の治療化合物を含んでもよい。例えば、ウイルスは、プロドラッグを、がん細胞を殺傷するための活性な化学療法剤に変換する酵素を発現することができる。したがって、本明細書で提供される組合せは、プロドラッグなどの治療化合物を含有してもよい。例示的なウイルス／治療化合物組合せは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードするウイルスと、プロドラッグであるガンシクロビルとを含んでもよい。本明細書で提供される組合せにおける使用のための、さらなる例示的酵素／プロドラッグ対としては、限定されるものではないが、バリセラ・ゾスターチミジンキナーゼ／ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロウラシル、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ／６−メチルプリンデオキシリボシド、βラクタマーゼ／セファロスポリン−ドキソルビシン、カルボキシペプチダーゼＧ２／４−［（２−クロロエチル）（２−メシルオキシエチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸、シトクロムＰ４５０／アセトミノフェン、西洋ワサビペルオキシダーゼ／インドール−３−酢酸、ニトロリダクターゼ／ＣＢ１９５４、ウサギカルボキシルエステラーゼ／７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、マッシュルームチロシナーゼ／ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニルアミノメタノン２８、βガラクトシダーゼ／１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンザ［ｅ］インドール、βグルクロニダーゼ／エピルビシン−グルクロニド、チミジンホスホリラーゼ／５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、デオキシシチジンキナーゼ／シトシンアラビノシド、β−ラクタマーゼおよびリナメラーゼ／リナマリンが挙げられる。組合せにおける使用のためのさらなる例示的プロドラッグを、本明細書の他の場所に見出すこともできる（例えば、セクションＩを参照されたい）。本明細書で提供されるか、またはさもなければ当技術分野で公知の様々な公知の組合せのいずれかを、本明細書で提供される組合せ中に含有させることができる。
【０３３８】
いくつかの例においては、組合せは、ウイルスを殺傷するか、またはウイルス増殖もしくは毒性を阻害することができる化合物を含んでもよい。そのような化合物を用いて、ウイルス感染の結果生じ得る１つまたは複数の有害な副作用を軽減することができる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００９−０１６２２８−Ａ１号を参照されたい）。本明細書で提供される組合せは、感染の処置のための抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤または抗ウイルス化合物を含有してもよい。いくつかの例においては、抗ウイルス化合物は、ウイルス増殖または毒性を阻害する化学療法剤である。本明細書で提供されるウイルスとの組合せ中に含有させることができる抗生物質の例としては、限定されるものではないが、セフタジジム、セフェピム、イミペネム、アミノグリコシド、バンコマイシンおよび抗シュードモナスβ−ラクタムが挙げられる。本明細書で提供されるウイルスとの組合せ中に含有させることができる抗真菌剤の例としては、限定されるものではないが、アンホテリシンＢ、ダプソン、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、クロトリマゾール、ナイスタチン、およびその組合せが挙げられる。本明細書で提供されるウイルスとの組合せ中に含有させることができる抗ウイルス剤の例としては、限定されるものではないが、シドフォビル、シドフォビルのアルコキシアルキルエステル（ＣＤＶ）、環状ＣＤＶ、および（Ｓ）−９−（３−ヒドロキシ−２ホスホニルメトキシプロピル）アデニン、５−（ジメトキシメチル）−２’−デオキシウリジン、イサチン−β−チオセミカルバゾン、Ｎ−メタノカルバチミジン、ブリブジン、７−デアザネプラノシンＡ、ＳＴ−２４６、グリベック、２’−β−フルオロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、ネビラピン、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、およびその組合せが挙げられる。典型的には、抗ウイルス剤との組合せは、組合せのウイルスに対して有効であることが知られる抗ウイルス剤を含有する。例えば、組合せは、抗ウイルス化合物、例えば、シドフォビル、シドフォビルのアルコキシアルキルエステル、ガンシクロビル、アシクロビル、ＳＴ−２４６、グリベック、およびその誘導体と共にワクシニアウイルスを含有することができる。
【０３３９】
いくつかの例においては、組合せは、検出可能な化合物を含んでもよい。検出可能な化合物としては、例えば、ウイルスによりコードされ、発現されるタンパク質もしくはＲＮＡと相互作用する、および／もしくはそれに特異的に結合することができるリガンド、基質または他の化合物が挙げられ、断層撮影、分光分析、磁気共鳴、または他の公知の技術により検出可能なシグナルなどの検出可能なシグナルを提供することができる。いくつかの例においては、タンパク質またはＲＮＡは、外因性タンパク質またはＲＮＡである。いくつかの例においては、ウイルスにより発現されるタンパク質またはＲＮＡは、改変された化合物が検出可能なシグナルを放出する検出可能な化合物を改変する。例示的な検出可能な化合物は、磁気共鳴、超音波または断層撮影画像化剤、例えば、放射性核種などの画像化剤であってもよいか、またはそれを含有してもよい。検出可能な化合物は、本明細書の他の場所に提供されるか、またはさもなければ当技術分野で公知である様々な化合物のいずれかを含有してもよい。ウイルスにより発現させることができる例示的タンパク質および検出に用いられる検出可能な化合物の組合せとしては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼおよびルシフェリン、β−ガラクトシダーゼおよび（４，７，１０−トリ（酢酸）−１−（２−β−ガラクトピラノシルエトキシ）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン）ガドリニウム（Ｅｇａｄ）、ならびに当技術分野で公知の他の組合せが挙げられる。
【０３４０】
いくつかの例においては、組合せは、ウイルスによりコードされる１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する遺伝子発現調節化合物を含んでもよい。遺伝子発現を調節する化合物は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、転写活性化因子、誘導因子、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤およびＲＮＡ結合化合物、例えば、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムが挙げられる。当技術分野で公知の様々な遺伝子発現調節化合物のいずれかを、本明細書で提供される組合せ中に含有させることができる。典型的には、本明細書で提供される組合せ中にウイルスと共に含有される遺伝子発現調節化合物は、転写因子または組合せのウイルスのＲＮＡなどの遺伝子発現において活性である、１つまたは複数の化合物に結合し、それを阻害するか、またはそれと反応することができる化合物である。例示的なウイルス／発現調節因子組合せは、酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインに融合された突然変異ヒトプロゲステロン受容体を有し、また、アデノウイルス主要後期Ｅ１Ｂ  ＴＡＴＡボックスの上流の一連のＧＡＬ４認識配列を含有する合成プロモーターを含有するキメラ転写因子複合体をコードするウイルスであってよく、その場合、化合物はＲＵ４８６であってよい（例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６８：１６９−１７８を参照されたい）。当技術分野で公知の様々な他のウイルス／発現調節因子組合せを、本明細書で提供される組合せ中に含有させることもできる。
【０３４１】
いくつかの例においては、組合せは、ナノ粒子を含有してもよい。ナノ粒子は、それらが本明細書で提供される１つまたは複数の治療剤を担持するように設計することができる。さらに、ナノ粒子を腫瘍細胞に標的化する分子を担持するように、ナノ粒子を設計することができる。ある非限定例においては、ナノ粒子を放射性核種および所望により、腫瘍関連抗原と免疫反応する抗体で被覆することができる。
【０３４２】
いくつかの例においては、組合せは、診断または処置のための１つもしくは複数のさらなる治療および／もしくは診断ウイルスまたは他の治療および／もしくは診断微生物（例えば、治療および／もしくは診断細菌）を含有してもよい。当技術分野で公知である治療および／または診断ウイルスの例としては、限定されるものではないが、治療および／または診断ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレオウイルスが挙げられる。
【０３４３】
４．キット
本明細書で提供されるウイルス、細胞、医薬組成物または組合せをキットとして包装することができる。キットは、所望により、使用のための説明書、デバイスおよびさらなる試薬などの１つまたは複数の構成要素、ならびに方法の実施のためのチューブ、容器およびシリンジなどの構成要素を含んでもよい。例示的キットは、本明細書で提供されるウイルスを含んでもよく、所望により、使用のための説明書、対象中のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを対象に投与するためのデバイス、またはさらなる薬剤もしくは化合物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。
【０３４４】
一例においては、キットは、説明書を含んでもよい。説明書は、典型的には、ウイルスならびに、所望により、キットに含まれる他の構成要素、および投与の方法、例えば、ウイルスを投与するための、対象の適切な状態、適切な用量、および適切な投与方法を決定するための方法を説明する具体的な表現を含む。説明書はまた、処置時間の持続期間にわたって対象をモニターするための指針を含んでもよい。
【０３４５】
別の例においては、キットは、対象中のウイルスを検出するためのデバイスを含んでもよい。対象中のウイルスを検出するためのデバイスは、例えば、ルシフェラーゼから放出されたか、または緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質から発せられた光を検出するための高感度画像化デバイス、ＭＲＩもしくはＮＭＲデバイスなどの磁気共鳴測定デバイス、ＰＥＴ、ＣＴ、ＣＡＴ、ＳＰＥＣＴもしくは他の関連するスキャナーなどの断層撮影スキャナー、超音波デバイス、または対象内でウイルスにより発現されたタンパク質を検出するのに用いることができる他のデバイスを含んでもよい。典型的には、キットのデバイスは、キットのウイルスにより発現された１つまたは複数のタンパク質を検出することができる。ウイルスおよび検出デバイスを含む様々なキットのいずれか、例えば、ルシフェラーゼを発現するウイルスおよび高感度画像化装置または緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質を発現するウイルスおよび高感度画像化装置を、本明細書で提供されるキット中に含有させることができる。
【０３４６】
本明細書で提供されるキットはまた、対象にウイルスを投与するためのデバイスを含んでもよい。薬剤、医薬組成物およびワクチンを投与するための当技術分野で公知の様々なデバイスのいずれかを、本明細書で提供されるキット中に含有させることができる。デバイスの例としては、限定されるものではないが、皮下注射針、静脈内注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。例えば、静脈内注射により全身送達しようとするウイルスを、皮下注射針およびシリンジと共にキット中に含有させることができる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスと適合する；例えば、高圧注入デバイスなどの無針注入デバイスを、高圧注入により損傷されないウイルスと共にキット中に含有させることができるが、典型的には、高圧注入により損傷されるウイルスと共にキット中に含有させない。
【０３４７】
本明細書で提供されるキットはまた、さらなる薬剤または化合物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。薬剤を対象に投与するための当技術分野で公知の様々なデバイスのいずれかを、本明細書で提供されるキット中に含有させることができる。デバイスの例としては、限定されるものではないが、皮下注射針、静脈内注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットの化合物を投与するためのデバイスは、化合物の投与の望ましい方法と適合する。例えば、全身的または皮下的に送達される化合物を、皮下注射針およびシリンジと共にキット中に含有させることができる。
【０３４８】
Ｇ．治療、診断およびモニタリング方法
本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、診断、モニタリングおよび治療方法において用いることができる。例えば、治療方法においては、ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、新生物、腫瘍、転移および他の免疫特権細胞または組織、例えば、創傷もしくは炎症組織の処置などの増殖性障害または状態の処置に用いることができる。本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、腫瘍および転移モニタリング処置の検出および画像化のための診断方法において用いることができる。他の例においては、ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、宿主中でのウイルス活性を検出するための診断またはモニタリング方法において用いることができる。本明細書で提供される診断および治療方法としては、限定されるものではないが、腫瘍および／または転移を含む対象への本明細書で提供されるウイルスの投与が挙げられる。他の例においては、本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、ワクチン接種方法におけるワクチンとして用いることができる。
【０３４９】
投与されるウイルスは、弱毒化された病原性、低い毒性、腫瘍における選択的蓄積、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化する能力、免疫原性、複製能力、さらなる外因性診断および／または治療遺伝子を発現する能力、ならびに発現された遺伝子産物に対する抗体生成を惹起する能力などの１つまたは複数の特徴を有する。このウイルスを、限定されるものではないが、ヒトおよび他の哺乳動物、例えば、限定されるものではないが、げっ歯類、イヌ、ネコ、霊長類および家畜などの対象の診断、モニタリング、例えば、モニタリング治療、および／または治療のために投与することができる。本明細書で提供されるウイルスを、ＬＩＶＰウイルスが用いられたか、またはそれを用いることができる任意の公知の方法（または使用）における使用のために用いるか、または改変することができる。ＧＬＶ−１ｈ６８ウイルスおよびその誘導体などの任意のＬＩＶＰウイルスを、以下に記載の、および本開示を通じて考察される治療および診断方法における使用のために使用および／または改変することができる。
【０３５０】
１．治療方法
ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、例えば、がん細胞、新生物、腫瘍、転移、がん幹細胞、および他の免疫特権細胞または組織、例えば、創傷もしくは炎症組織の処置（阻害など）などの増殖性障害または状態の処置に用いることができる。本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍または転移に選択的に蓄積する。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスの投与は、腫瘍成長の遅延をもたらす。他の例においては、本明細書で提供されるウイルスの投与は、腫瘍の排除または根絶などの、腫瘍体積の減少をもたらす。しかしながら、本明細書で提供される治療方法および使用は、投与されたウイルスが腫瘍細胞を殺傷するか、または腫瘍サイズを減少させる必要はない。その代わりに、本明細書で提供される方法は、対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含む。いくつかの例においては、本明細書で提供されるウイルスを、対象においてウイルス誘導性疾患を引き起こすことなく対象に投与することができる。いくつかの例においては、ウイルスは対象における抗腫瘍免疫応答を惹起することができ、典型的には、ウイルス媒介性抗腫瘍免疫応答は、例えば、数日、１週間以上、１０日以上、２週間以上、または１カ月以上にわたって生じてもよい。いくつかの例示的方法においては、ウイルスは、腫瘍中に存在してもよく、腫瘍成長を防止するために十分な腫瘍細胞死をウイルス自体が引き起こすことなく、抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができる。いくつかの例においては、腫瘍は、単剤治療用の腫瘍または単剤治療用のがんであり、その腫瘍またはがんはウイルスまたは治療剤のみで処置された場合、体積が減少しない。
【０３５１】
いくつかの例においては、本明細書で提供される治療方法は、対象における腫瘍成長を阻害し、その方法は腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができるウイルスを対象に投与することを含む。ウイルスが腫瘍または転移に蓄積した結果として誘導された抗腫瘍免疫応答は、腫瘍成長の阻害をもたらすことができる。
【０３５２】
いくつかの例においては、本明細書で提供される治療方法は、対象における転移の成長または形成を阻害し、その方法は、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含む。ウイルスが腫瘍または転移に蓄積した結果として誘導された抗腫瘍免疫応答は、転移の成長または形成の阻害をもたらすことができる。
【０３５３】
他の例においては、本明細書で提供される治療方法は、対象における腫瘍および／または転移のサイズを減少させ、その方法は、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含む。ウイルスが腫瘍または転移に蓄積した結果として誘導された抗腫瘍免疫応答は、腫瘍および／または転移のサイズの減少をもたらすことができる。
【０３５４】
いくつかの例においては、本明細書で提供される治療方法は、対象から腫瘍および／または転移を排除し、その方法は、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含む。ウイルスが腫瘍または転移に蓄積した結果として誘導された抗腫瘍免疫応答は、対象からの腫瘍および／または転移の排除をもたらすことができる。
【０３５５】
腫瘍成長を低下させるか、もしくは阻害する方法、転移の成長および／もしくは形成を阻害する方法、腫瘍もしくは転移のサイズを減少させる方法、腫瘍もしくは転移を排除する方法ならびに／または本明細書で提供されるがん幹細胞もしくは他の腫瘍治療方法は、宿主における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することを含む。天然で抗腫瘍性である、宿主の免疫応答を、ウイルスが蓄積した腫瘍および／または転移に対して高めることができ、対象へのウイルスの投与後に形成する腫瘍および／または転移などの、ウイルスが蓄積しなかった腫瘍および／または転移に対しても高めることができる。したがって、成長もしくは形成が阻害されるか、またはサイズが減少するか、または排除される腫瘍および／または転移は、ウイルスが蓄積した腫瘍および／もしくは転移であってよく、またはウイルスが蓄積しなかった腫瘍および／もしくは転移であってもよい。したがって、腫瘍成長を低下させるか、もしくは阻害する方法、転移の成長および／もしくは形成を阻害する方法、腫瘍もしくは転移のサイズを減少させる方法、腫瘍もしくは転移を排除する方法、または他の腫瘍治療方法であって、本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含み、ウイルスが少なくとも１つの腫瘍または転移に蓄積し、対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強し、免疫応答もまたウイルス細胞が蓄積しなかった腫瘍および／または転移に対して高まる前記方法が、本明細書で提供される。別の例においては、新生物疾患の再発を阻害もしくは防止するか、または新しい腫瘍成長を阻害もしくは防止するための方法であって、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含み、抗腫瘍免疫応答が新生物疾患の再発を阻害もしくは防止するか、または新しい腫瘍成長を阻害もしくは防止することができる、前記方法が提供される。
【０３５６】
腫瘍成長を低下させるか、もしくは阻害する方法、転移の成長および／もしくは形成を阻害する方法、腫瘍もしくは転移のサイズを減少させる方法、腫瘍もしくは転移を排除する方法、または他の腫瘍治療方法などの、本明細書で提供される腫瘍または新生物疾患治療方法はまた、腫瘍細胞溶解または腫瘍細胞死を引き起こすことができる本明細書で提供されるウイルスを対象に投与することを含んでもよい。そのようなウイルスは、対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができるウイルスと同じウイルスであってよい。本明細書で提供されるウイルスなどのウイルスは、内因性遺伝子の発現の結果として、または外因性遺伝子の結果として、細胞溶解または腫瘍細胞死を引き起こすことができる。内因性または外因性遺伝子は、当技術分野で公知のように、溶解チャネル形成またはアポトーシス経路の活性化などの直接的または間接的作用の結果として、腫瘍細胞溶解を引き起こすか、または細胞増殖を阻害することができる。外因性遺伝子産物などの遺伝子産物は、プロドラッグを活性な細胞傷害性形態に活性化するように機能し、そのような遺伝子が発現された場合に細胞死をもたらすことができる。
【０３５７】
腫瘍および／または転移の処置のそのような方法は、遺伝子療法、がん遺伝子療法、またはワクチン治療などの治療のための本明細書で提供されるウイルスの投与を含んでもよい。そのようなウイルスを用いて、体液性および／または細胞性免疫応答を刺激し、そのような応答から利益を得ることができる対象における強力な細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導する。例えば、前記ウイルスは、免疫反応抗原（Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：  ７２８−８３１  （１９８６）；  Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３２：  ８７８−８８０  （１９８７））、細胞腫瘍関連抗原（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ６８５４−６８５８  （１９８７）；  Ｅｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  １０５２−１０５６  （１９８８）；  Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８４：  １０８４−１０９１  （１９９２）；  Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：  ４７８１−４７８６  （１９９６））および／もしくはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）、共刺激分子（Ｂ７−１、Ｂ７−２）（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５６：  ３３５７−３３６５  （１９９６）；  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：  ２８３２−２８３６  （１９９６）；  Ｏｅｒｔｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：  ３１２１−３１２５  （１９９６）；  Ｑｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：  １８５３−１８６０  （１９９６）；  ＭｃＡｎｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．３：  ４９５−５００  （１９９６））、または他の治療タンパク質を発現するウイルスを用いた腫瘍または病変からの細胞の拒絶による、ウイルスにより感染した腫瘍または他の感染症に対する予防および治療効果を提供することができる。
【０３５８】
以前に示された通り、固形腫瘍を、ワクシニアウイルスなどのウイルスで処置し、大量の腫瘍特異的ウイルス複製をもたらし、腫瘍中での腫瘍タンパク質抗原およびウイルスタンパク質生成を誘導し（米国特許出願公開第２００５−００３１６４３号、現在は米国特許第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号、第７，６６２，３９８号）、ＧＬＶ−１ｈ６８ウイルスおよびその誘導体を提供し、例示することができる。マウスへのワクシニアウイルスの投与は、感染した腫瘍細胞の溶解およびその結果としての腫瘍細胞特異的抗原の放出をもたらした。体内へのこれらの抗原の連続的漏出は、マウスにおいて腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質、およびウイルスにコードされる遺伝子操作されたタンパク質に対する非常の高レベルの抗体力価をもたらした（約７〜１４日以内に）。新しく合成された抗腫瘍抗体および増強されたマクロファージ、好中球計数が、血管系を介して腫瘍に連続的に送達され、それによって、腫瘍に対する活性化された免疫系の動員を提供した。次いで、活性化された免疫系は、ウイルス粒子などの腫瘍の外来化合物を排除した。外来抗原のこの相互接続された放出は、腫瘍タンパク質に対する抗体生成および抗体の連続的応答を強化し、ワクシニアウイルス感染および複製、次いで細胞溶解、タンパク質漏出および抗体生成の増強により開始される自己免疫ワクチン接種系のように機能する。かくして、本明細書で提供されるウイルスおよび本明細書で提供される方法を用いて作製されたウイルスを、特権を有するウイルス増殖の部位として免疫特権腫瘍部位を有するすべての腫瘍系に適用することができる完全なプロセスにおいて投与し、宿主自体の免疫系による腫瘍排除をもたらすことができる。
【０３５９】
一例においては、処置される腫瘍は、膵臓がん、非小細胞肺がん、多発性骨髄腫または白血病などのがんであるが、がんはこれに限定されず、他の転移性疾患を本明細書で提供される組合せにより処置することができる。例えば、処置される腫瘍は、肺および気管支、乳房、結腸および直腸、腎臓、胃、食道、肝臓および肝内胆管、膀胱、脳および他の神経系、頭部および頸部、口腔および咽頭、頸部、子宮体部、甲状腺、卵巣、精巣、前立腺、悪性メラノーマ、胆管癌、胸腺腫、非メラノーマ皮膚がんのものなどの固形腫瘍、ならびに小児白血病およびリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚起源のリンパ腫、急性リンパ芽球性、急性骨髄性もしくは慢性骨髄性白血病などの急性および慢性白血病、形質細胞新生物、リンパ系新生物およびＡＩＤＳに関連するがんなどの血液腫瘍および／または悪性病変であってよい。腫瘍の例としては、例えば、膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、頸部腫瘍および乳房腫瘍が挙げられる。一例においては、腫瘍は、例えば、卵巣腫瘍または膵臓腫瘍などの癌腫である。
【０３６０】
他の例においては、対象を免疫する方法であって、対象が免疫応答を生じる抗原に対する１つまたは複数の抗原を発現するウイルスを前記対象に投与することを含む前記方法が提供される。免疫化抗原は、天然痘、麻疹、おたふく風邪に対して免疫するのに用いられるワクシニアウイルス上のワクシニア抗原などのウイルスに対して内因性であってよく、または免疫化抗原はウイルスキャプシド表面上に発現されるインフルエンザもしくはＨＩＶ抗原などのウイルスにより発現される外因性抗原であってもよい。天然痘の場合、例えば、腫瘍特異的タンパク質抗原を天然痘ワクチンのための弱毒化ワクシニアウイルス（ウイルスゲノムによりコードされる）により担持させることができる。かくして、改変ワクシニアウイルスなどの本明細書で提供されるウイルスを、ワクチンとして用いることができる。
【０３６１】
いくつかの例においては、対象における選択された抗原または選択された抗原型に対する抗体生成を惹起または増強する方法であって、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、腫瘍からの選択された抗原または選択された抗原型の放出を引き起こすことができるウイルスを対象に投与することを含み、選択された抗原または選択された抗原型に対する抗体生成をもたらす前記方法が、本明細書で提供される。ウイルスにより発現される外因性遺伝子産物などの選択された抗原、または腫瘍のウイルス感染の結果として腫瘍から放出される（例えば、溶解、アポトーシス、分泌もしくは腫瘍からの抗原放出を引き起こす他の機構による）１つもしくは複数の腫瘍抗原などの選択された抗原型などの、様々な抗原のいずれかを、本明細書で提供される方法において標的化することができる。
【０３６２】
いくつかの例においては、一連の日数、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間または少なくとも１カ月間にわたって選択された抗原または選択された抗原型の放出を維持することが望ましい。対象内での持続的抗原放出を提供する方法であって、腫瘍および／または転移に蓄積することができ、抗原の持続的放出を引き起こすことができるウイルスを対象に投与し、抗原に対する抗体生成をもたらすことを含む前記方法が、本明細書で提供される。抗原の持続的放出は、ウイルスに感染した宿主による免疫応答をもたらし、宿主は抗原に対する抗体を生じる、および／または宿主は腫瘍細胞に対する免疫応答などの、抗原を発現する細胞に対する免疫応答を高めることができる。かくして、抗原の持続的放出は、腫瘍細胞に対する免疫化をもたらすことができる。いくつかの例においては、ウイルスにより媒介される持続的抗原放出に誘導される腫瘍細胞に対する免疫応答は、すべての腫瘍細胞の完全な除去または殺傷をもたらすことができる。
【０３６３】
２．診断およびモニタリング方法
本明細書で提供されるウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、がん細胞、腫瘍、がん幹細胞および転移モニタリング処置の検出および画像化のための診断方法において用いることができる。上記で考察された通り、本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍または転移に蓄積することができる。したがって、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードするウイルス株を投与することにより対象における腫瘍または転移を検出する方法であって、それにより検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質の検出が腫瘍または転移の存在を示す前記方法が、本明細書で提供される。検出可能なタンパク質または検出可能なシグナリングを誘導するタンパク質は、当業者には公知の任意の画像化技術により検出することができる。
【０３６４】
他の例においては、ウイルスクローン株などの本明細書で提供されるウイルスを、診断またはモニタリング方法において用いることができる。例えば、本明細書で提供されるウイルスを、複製活性などの宿主におけるウイルス活性を検出するための方法において用いることができる。本明細書で提供されるウイルスは、腫瘍崩壊ウイルスであり、したがって、腫瘍細胞を殺傷し、溶解する。腫瘍細胞に感染し、その中で複製する活性ウイルスはタンパク質（例えば、内因性またはトランスジーンにコードされる）を発現し、その際、腫瘍細胞の溶解物は腫瘍細胞から浸出し、体内に循環することができる。したがって、ウイルスにコードされるタンパク質を、ウイルスの腫瘍崩壊活性の尺度である複製活性などの活性の尺度として、腫瘍または他の体液中で検出することができる。さらに、活性ウイルスは腫瘍細胞中に選択的に蓄積し、複製するので、前記方法はまた、腫瘍の直接的診断を可能にし、腫瘍担持患者における腫瘍定着の成功を確認する。薬物動態アッセイを用いて、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質を測定して、ウイルスの感染および／または活性を経時的にモニターすることができる。例えば、ウイルスにより発現されたタンパク質または検出可能なタンパク質を、ウイルスの投与後に腫瘍または体液から検出し、ウイルスによる処置の数分後、数時間後、または数日後にモニターすることができる。例えば、試料を対象から取得し、ウイルスにより発現されたタンパク質もしくは検出可能なタンパク質について評価するか、または対象を、ウイルスの投与後５分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間以上以内に検出可能なタンパク質の存在について画像化にかけることができる。他の例においては、ウイルスにより発現されたタンパク質または検出可能なタンパク質を、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎または７日毎にアッセイすることができる。ウイルス活性を検出する方法においては、検出は、対象からの体液の取得などの侵襲的方法によるか、または画像化などの非侵襲的方法によるものであってよい。
【０３６５】
診断、検出またはモニタリングの方法においては、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルは、ウイルスが発現するように改変された上記のセクションＤに提供されたような遺伝子によりコードされる任意のタンパク質であってよい。例えば、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質としては、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、造影剤、発色団、検出することができる化合物もしくはリガンドに結合し、および／またはそれを輸送する受容体もしくは輸送タンパク質、またはメラニン合成のための遺伝子によりコードされるメラニンが挙げられる。いくつかの例においては、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、鉄受容体、鉄輸送体、鉄輸送体、ヒトエピネフリン受容体（ｈＮＥＴ）およびヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）タンパク質である。
【０３６６】
これらの例のいずれかにおいて、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを、画像化方法により検出することができる。画像化方法の例としては、例えば、高感度画像化、蛍光分光法、Ｘ線画像化、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または（マルチスペクトル）光／光音響断層撮影［（ＭＳ）ＯＡＴ］が挙げられる。検出される特定の検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルに応じて好適な画像化技術を選択することは、当業者のレベルの範囲内にある。
【０３６７】
対象または患者の採取された体液からなどの侵襲的方法によりウイルス活性を検出する例においては、任意の体液を採取し、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質の存在またはレベルについてアッセイすることができる。体液の非限定例としては、限定されるものではないが、尿、血液、涙または脳脊髄（ＣＳＦ）液が挙げられる。例えば、蛍光分光計または顕微鏡；蛍光−発光マイクロプレートリーダー；または蛍光活性化細胞選別を用いる、蛍光または発光検出法の任意の方法を用いることができる。活性ウイルスまたはウイルス腫瘍定着を検出するためのこの方法の一例においては、β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）により活性化することができるプローブを、ＧｕｓＡをコードするウイルスをあらかじめ投与した対象からの血清などの体液試料に添加することができる。そのようなプローブの例は、ＦＤＧｌｃＵおよび４−ＭＵＧなどのＧｕｓＡにより活性化される化合物である。体液は、ウイルスによる対象の感染後の特定の時間の後に採取される試料であってよい。試料を、活性化された蛍光化合物について分析することができる。
【０３６８】
３．投与
本明細書で提供されるウイルスを、腫瘍を有するか、もしくは新生物細胞を有する対象、または免疫しようとする対象などの対象に投与することができる。投与されるウイルスは、本明細書で提供されるウイルスまたは本明細書で提供される方法を用いて作製された任意の他のウイルスであってよい。いくつかの例においては、投与されるウイルスは、弱毒化された病原性、低い毒性、腫瘍における選択的蓄積、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化する能力、高い免疫原性、複製能力および外因性タンパク質を発現する能力、ならびにその組合せなどの特徴を含むウイルスである。
【０３６９】
ａ．ウイルスを投与する前の工程
いくつかの例においては、対象へのウイルスの投与の前に、１つまたは複数の工程を実施することができる。限定されるものではないが、ウイルス投与にとって好適な状態を有する対象の診断、対象の免疫能力の決定、対象の免疫化、化学療法剤による対象の処置、放射線による対象の処置、または対象の外科的処置などの、任意の様々な先行工程を実施することができる。
【０３７０】
治療目的での腫瘍担持対象へのウイルスの投与を含む例については、対象は典型的には新生物状態を有すると以前に診断されている。診断方法はまた、新生物状態の種類を決定すること、新生物状態のステージを決定すること、対象における１つもしくは複数の腫瘍のサイズを決定すること、対象のリンパ節中の転移細胞もしくは新生物細胞の存在もしくは非存在を決定すること、または対象の転移の存在を決定することを含んでもよい。対象にウイルスを投与するための治療方法のいくつかの例は、一次腫瘍のサイズまたは新生物疾患のステージを決定する工程を含んでもよく、一次腫瘍のサイズが体積閾値と等しいか、もしくはそれを上回る場合、または新生物疾患のステージがステージ閾値と等しいか、もしくはそれを上回る場合、ウイルスは対象に投与される。同様の例においては、一次腫瘍のサイズが体積閾値を下回る場合、または新生物疾患のステージがステージ閾値にあるか、もしくはそれを下回る場合、ウイルスはまだ対象に投与されない。そのような方法は、腫瘍サイズまたは新生物疾患ステージが閾値量に達するまで対象をモニターした後、ウイルスを対象に投与することを含んでもよい。閾値サイズは、腫瘍の成長速度、腫瘍に感染するウイルスの能力、および対象の免疫能力などのいくつかの因子に応じて変化し得る。一般的には、閾値サイズは、ウイルスが宿主の免疫系により完全に除去されることなく腫瘍中に、または腫瘍の近くに蓄積し、複製するのに十分なサイズであり、典型的には、宿主が腫瘍細胞に対する免疫応答を高めるのに十分長い時間、典型的には、約１週間以上、約１０日間以上、または約２週間以上、ウイルス感染を持続するのに十分なサイズでもある。ワクシニアウイルスなどのウイルスのための腫瘍サイズ閾値の例は、少なくとも約１００ｍｍ３、少なくとも約２００ｍｍ３、少なくとも約３００ｍｍ３、少なくとも約４００ｍｍ３、少なくとも約５００ｍｍ３、少なくとも約７５０ｍｍ３、少なくとも約１０００ｍｍ３、または少なくとも約１５００ｍｍ３である。新生物疾患ステージ閾値もまた、特定の新生物疾患を段階評価するための特定の要件、新生物疾患の成長の浸潤性、腫瘍または転移に感染するウイルスの能力、および対象の免疫能力などのいくつかの因子に応じて変化し得る。一般的には、ステージ閾値は、宿主の免疫系により完全に除去されることなくウイルスが腫瘍または転移中に蓄積し、複製するのに十分なステージであり、典型的には、宿主が新生物細胞に対する免疫応答を高めるのに十分長い時間、典型的には、約１週間以上、約１０日間以上、または約２週間以上、ウイルス感染を持続するのに十分なサイズでもある。ステージ閾値の例は、最も低いステージを超える任意のステージ（例えば、ステージＩもしくは等価物）、または一次腫瘍が閾値サイズよりも大きい任意のステージ、または転移細胞が検出される任意のステージである。
【０３７１】
他の例においては、ウイルスを対象に投与する前に、対象の免疫能力を決定することができる。本明細書で提供される対象にウイルスを投与する方法は、対象における免疫応答を引き起こすか、または増強することを含んでもよい。したがって、対象にウイルスを投与する前に、免疫応答を高める対象の能力を決定することができる。当技術分野で公知の任意の様々な免疫能力の試験を、本明細書で提供される方法において実施することができる。免疫能力試験の例は、ＡＢＯ赤血球凝集価（ＩｇＭ）、白血球接着不全症（ＬＡＤ）、顆粒球機能（ＮＢＴ）、ＴおよびＢ細胞定量、破傷風抗体力価、唾液ＩｇＡ、皮膚試験、扁桃腺試験、補体Ｃ３レベル、およびＢ因子レベル、ならびにリンパ球計数を検査することができる。当業者であれば、対象の免疫能力のレベルに従って、ウイルスの免疫原性に従って、および所望により、処置しようとする新生物疾患の免疫原性に従って、対象にウイルスを投与する望ましさを決定することができる。典型的には、当業者が、対象がウイルスに対する免疫応答を十分に高める能力を有すると決定することができる場合、対象は免疫能力を有すると考えることができる。
【０３７２】
いくつかの例においては、本明細書で提供される方法に従ってウイルスを対象に投与する前に、対象を免疫することができる。免疫化は、ウイルスに対する免疫応答を高める対象の能力を増加させる、または対象がウイルスに対する免疫応答を高めることができる速度を増加させるのに役立ち得る。免疫化はまた、ウイルスの病原性の対象に対するリスクを減少させるのにも役立ち得る。いくつかの例においては、免疫化を、投与しようとする治療ウイルスと類似する免疫化ウイルスを用いて実施することができる。例えば、免疫化ウイルスは、治療ウイルスの複製能力のない変異体であってよい。他の例においては、免疫化材料は、投与しようとする治療ウイルスの消化物であってよい。公知のウイルスに対して対象を免疫するための任意の様々な方法が当技術分野で公知であり、本明細書で用いることができる。一例においては、例えば、１マイクログラムのプソラレンおよび３６５ｎｍの紫外線で４分間処理されたワクシニアウイルスの複製能力をなくすことができる。別の例においては、対象が、例えば、小児期のワクチン接種において以前に免疫されたウイルスと同じか、または類似するものとしてウイルスを選択することができる。
【０３７３】
別の例においては、対象は、腫瘍および／もしくは転移の化学療法、放射線療法または外科的除去などのがん処置の任意の予備工程なしに、対象はウイルスを投与されていてもよい。本明細書で提供される方法は、ウイルスが腫瘍の近くに進入するか、または局在化する能力を利用するものであり、腫瘍細胞を対象の免疫系から保護することができる。次いで、ウイルスはそのような免疫保護された領域中で増殖し、また、腫瘍から、対象の免疫系が腫瘍抗原を認識し、免疫応答を高めることができる位置への腫瘍抗原の放出、典型的には、持続的放出を引き起こすこともできる。そのような方法においては、十分なサイズまたは十分に発達した免疫保護状態の腫瘍の存在が、腫瘍へのウイルスの投与の成功および十分な腫瘍抗原生成にとって有利であり得る。腫瘍が外科的に除去される場合、他の新生物細胞（例えば、小さい転移）は、ウイルスが生存および増殖することができる免疫保護環境を作るのに未だに十分に成熟していないため、ウイルスはそのような細胞に局在化することができないか、またはウイルスが新生物細胞に局在化することができる場合であっても、細胞数または腫瘍塊のサイズが、宿主が抗腫瘍免疫応答を高めるための腫瘍抗原の持続的放出を引き起こすにはそのウイルスにとって小さすぎることがある。かくして、例えば、ウイルスが、一次腫瘍を除去することなく腫瘍もしくは新生物疾患を有する対象、または少なくともいくつかの腫瘍もしくは新生物細胞が対象中に残存することが意図的に許容される腫瘍もしくは新生物疾患を有する対象に投与される腫瘍または新生物疾患を処置する方法が本明細書で提供される。化学療法または放射線療法などの他の典型的ながん処置方法においては、そのような方法は典型的には、対象の免疫系を弱める副作用を有する。化学療法または放射線療法による対象のこの処置は、抗腫瘍免疫応答を高める対象の能力を低下させ得る。かくして、例えば、ウイルスが、化学療法または放射線療法などの、免疫系を弱める治療を用いて対象を処置することなく腫瘍または新生物疾患を有する対象に投与される腫瘍または新生物疾患を処置する方法が本明細書で提供される。
【０３７４】
代替的な例においては、ウイルスを対象に投与する前に、一次腫瘍を除去しないか、または対象の免疫系を弱めない１つまたは複数のがん処置工程において、対象を処置することができる。外科的除去または免疫系を弱める治療なしに腫瘍を処置することができる様々なより洗練されたがん処置方法が開発されている。方法の例としては、免疫系を弱めることなく腫瘍もしくは新生物細胞の増殖の速度を減少させる（例えば、腫瘍抑制化合物を投与するか、もしくは腫瘍細胞特異的化合物を投与することによる）化合物を投与すること、または血管新生阻害化合物を投与することが挙げられる。かくして、ウイルスを対象に投与することを含む組合せ方法は、がん療法をさらに改善することができる。かくして、例えば、対象の免疫系を弱めることなく腫瘍成長を遅延させる化合物または腫瘍の血管形成を阻害する化合物を、投与すると共に、その前に、またはその後に、対象にウイルスを投与する方法が本明細書で提供される。
【０３７５】
ｂ．投与の様式
投与の様式がウイルスの腫瘍または転移への進入を可能にするという条件で、ウイルスの対象への投与の任意の様式を用いることができる。投与の様式としては、限定されるものではないが、全身、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経真皮、皮内、動脈内（例えば、肝動脈注入）、膀胱内かん流、胸膜内、関節内、局所、腫瘍内、病変内、内視鏡、多穿刺（例えば、天然痘ワクチンについて用いられる）、吸入、経皮、皮下、鼻内、気管内、経口、腔内（例えば、カテーテルを介する膀胱への投与、坐剤もしくは浣腸による腸への投与）、経膣、直腸、頭蓋内、前立腺内、硝子体内、耳内、または眼内投与が挙げられる。いくつかの例においては、本明細書の他の場所に記載の診断剤または治療剤も同様に投与することができる。
【０３７６】
当業者であれば、対象およびウイルスと適合し、またウイルスが到達する腫瘍および／または転移をもたらす可能性がある任意の投与の様式を選択することができる。当業者であれば、疾患の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物中に含まれる特定のウイルスなどの様々な因子のいずれかに従って投与経路を選択することができる。標的部位への投与を、例えば、弾丸デリバリー（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）により、コロイド分散系として実施するか、または全身投与を動脈への注射により実施することができる。
【０３７７】
ｃ．用量および投薬レジメン
投薬レジメンは、任意の様々な方法および量であってよく、当業者であれば公知の臨床因子に従って決定することができる。医学界では公知のように、任意の一人の患者のための用量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫能力、および一般的健康、投与しようとする特定のウイルス、投与の期間および経路、疾患の種類および段階、例えば、腫瘍サイズ、ならびに他の処置または化合物、例えば、同時に投与される化学療法剤などの多くの因子に依存し得る。上記因子に加えて、当業者であれば決定できるように、そのようなレベルは、ウイルスの感染性、およびウイルスの性質により影響され得る。
【０３７８】
本発明の方法においては、ウイルスの好適な最小用量レベルおよび投薬レジメンは、ウイルスが腫瘍または転移中で生存し、増殖し、複製するのに十分なレベルであってよい。一般的には、ウイルスは、投与のサイクルにわたって少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕまたは約１ｘ１０５ｐｆｕまたは１ｘ１０５ｐｆｕである量で投与される。ウイルスを６５ｋｇのヒトに投与するための最小レベルの例としては、少なくとも約１ｘ１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、少なくとも約５ｘ１０５ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも約５ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０７ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０８ｐｆｕ、少なくとも約１ｘ１０９ｐｆｕ、または少なくとも約１ｘ１０１０ｐｆｕが挙げられる。例えば、ウイルスは、投与のサイクルにわたって少なくとも１回、少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０６ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０７ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０８ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０９ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１０ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１１ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１２ｐｆｕ、少なくとも１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは少なくとも１ｘ１０１４ｐｆｕ、または約１ｘ１０５ｐｆｕ、約１ｘ１０６ｐｆｕ、約１ｘ１０７ｐｆｕ、約１ｘ１０８ｐｆｕ、約１ｘ１０９ｐｆｕ、約１ｘ１０１０ｐｆｕ、約１ｘ１０１１ｐｆｕ、約１ｘ１０１２ｐｆｕ、約１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは約１ｘ１０１４ｐｆｕ、または１ｘ１０５ｐｆｕ、１ｘ１０６ｐｆｕ、１ｘ１０７ｐｆｕ、１ｘ１０８ｐｆｕ、１ｘ１０９ｐｆｕ、１ｘ１０１０ｐｆｕ、１ｘ１０１１ｐｆｕ、１ｘ１０１２ｐｆｕ、１ｘ１０１３ｐｆｕ、もしくは１ｘ１０１４ｐｆｕである量で投与される。
【０３７９】
投薬レジメンにおいては、ウイルスの量を、投与のサイクルにわたって単回投与として、または複数回投与することができる。したがって、本明細書で提供される方法は、対象へのウイルスの単回投与または対象へのウイルスの複数回投与を含んでもよい。いくつかの例においては、単回投与は腫瘍中でウイルスを確立するのに十分なものであり、ウイルスは増殖することができ、対象における抗腫瘍応答を引き起こすか、または増強することができる；そのような方法は、対象における抗腫瘍応答を引き起こすか、または増強するためにウイルスの追加投与を必要とせず、例えば、腫瘍成長の阻害、転移成長もしくは形成の阻害、腫瘍もしくはサイズの低下、腫瘍もしくは転移の排除、新生物疾患の再発もしくは新しい腫瘍形成の阻害もしくは防止、または他のがん療法効果をもたらし得る。
【０３８０】
他の例においては、ウイルスを、異なる時に、時間において分離して、典型的には、少なくとも１日置いて投与することができる。例えば、ウイルスを、投与の間に１日以上、２日以上、１週間以上、または１カ月以上空けて、２回、３回、４回、５回、または６回以上投与することができる。別々の投与は、以前の投与がウイルスを腫瘍または転移に送達させるのに有効ではなかった腫瘍または転移にウイルスを送達させる可能性を増加させることができる。別々の投与は、ウイルス増殖が起こり得るか、またはさもなければ腫瘍中に蓄積したウイルスの力価を増加させることができる腫瘍または転移上の位置を増加させ、宿主の抗腫瘍免疫応答を惹起または増強する際に腫瘍からの抗原または他の化合物の放出の規模を増加させ、また、所望により、ウイルスに基づく腫瘍崩壊または腫瘍細胞死のレベルを増加させることができる。ウイルスの別々の投与は、ウイルス抗原に対する対象の免疫応答をさらに延長させ、ウイルスが蓄積した腫瘍または転移に対する宿主の免疫応答を延長させ、抗腫瘍免疫応答を高める宿主の可能性を増加させることができる。
【０３８１】
別々の投与を実施する場合、それぞれの投与は、他の投与投薬量と比較して同じか、または異なる投薬量であってよい。一例においては、すべての投与投薬量は同じである。他の例においては、最初の投薬量は、１つまたは複数のその後の投薬量よりも大きい投薬量、例えば、その後の投薬量よりも少なくとも１０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍大きい投薬量であってよい。最初の投薬量が１つまたは複数のその後の投薬量より多い別々の投与の方法の一例においては、すべてのその後の投薬量は、最初の投与と比較して同じであるか、より少ない量であってよい。
【０３８２】
別々の投与は、２、３、４、５または６回の投与などの２回以上の投与の任意の回数を含んでもよい。当業者であれば、治療方法をモニタリングするための当技術分野で公知の方法および本明細書で提供される他のモニタリング方法に従って１つまたは複数のさらなる投与を実施する投与の回数または実施する望ましさを容易に決定することができる。したがって、本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングし、モニタリングの結果に基づいて、１回または複数回のさらなる投与を提供するかどうかを決定することにより、投与の回数を決定することができる、ウイルスの１回または複数回の投与を対象に提供する方法を含む。１回または複数回の投与を提供するかどうかの決定は、限定されるものではないが、腫瘍成長の示唆もしくは腫瘍成長の阻害、新しい転移の出現もしくは転移の阻害、対象の抗ウイルス抗体力価、対象の抗腫瘍抗体力価、対象の全体的な健康、対象の体重、腫瘍および／もしくは転移中でのウイルスのみの存在、正常組織もしくは臓器中のウイルスの存在などの、様々なモニタリング結果に基づくものであってよい。
【０３８３】
投与間の期間は、任意の様々な期間であってよい。投与間の期間は、投与の回数に関して記載されるモニタリング工程、対象が免疫応答を高める期間、対象が正常組織からウイルスを消失させる期間、または腫瘍もしくは転移中でのウイルス増殖のための期間などの任意の様々な因子の関数であってよい。一例においては、期間は、対象が免疫応答を高める期間の関数であってよい。例えば、期間は、対象が免疫応答を高める期間より多いもの、例えば、約１週間よりも多い、約１０日間よりも多い、約２週間よりも多い、または約１カ月よりも多いものであってよい。別の例においては、期間は、対象が免疫応答を高める期間よりも少ないもの、例えば、約１週間より少ない、約１０日間よりも少ない、約２週間よりも少ない、または約１カ月よりも少ないものであってよい。別の例においては、期間は、対象が正常組織からウイルスを消失させる期間の関数であってよい。例えば、期間は、対象が正常組織からウイルスを消失させる期間よりも多いもの、例えば、約１日よりも多い、約２日よりも多い、約３日よりも多い、約５日よりも多い、または約１週間よりも多いものであってよい。別の例においては、期間は、腫瘍または転移中でのウイルス増殖のための期間の関数であってよい。例えば、期間は、検出可能なマーカーを発現するウイルスの投与後、検出シグナルが腫瘍または転移中に生じる時間量よりも多いもの、例えば、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１カ月であってよい。
【０３８４】
例えば、ウイルスの量は、投与のサイクルにわたって、２回、３回、４回、５回、６回または７回投与される。ウイルスの量を、サイクルの１日目、サイクルの１および２日目、サイクルの最初の連続する３日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する４日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する５日間のそれぞれ、サイクルの最初の連続する６日間のそれぞれ、またはサイクルの最初の連続する７日間のそれぞれに投与することができる。一般的には、投与のサイクルは、７日間、１４日間、２１日間または２８日間であってよい。患者の応答性または予後に応じて、投与のサイクルは、数カ月または数年の過程にわたって反復される。
【０３８５】
一般的には、ウイルスの好適な最大用量レベルまたは投薬レジメンは、宿主に対して毒性ではないレベル、３倍以上の脾腫を引き起こさないレベル、約１日後または約３日後または約７日後に正常組織または臓器中にコロニーまたはプラークをもたらさないレベルである。
【０３８６】
ｄ．同時投与
また、異なる治療ウイルスまたは治療化合物などのさらなる治療物質を投与する方法も提供される。これらのものを、第１のウイルスと同時に、連続的に、または間欠的に投与することができる。さらなる治療物質は、ウイルスもしくはその遺伝子産物と相互作用するか、またはさらなる治療物質はウイルスとは無関係に作用することができる。
【０３８７】
組合せ療法処置は、１）それが単剤耐性を回避する；２）異種腫瘍集団において、それが異なる機構により細胞を殺傷することができる；および３）非重複毒性を有する薬剤を選択することにより、それぞれの薬剤を完全用量で使用して最大の効果および相乗効果を引き出すことができる点で有利である。組合せ療法は、診断／治療ウイルスを、１つまたは複数の下記抗がん剤：化学療法剤、治療抗体、ｓｉＲＮＡ、毒素、酵素−プロドラッグ対または放射線と組み合わせることにより行うことができる。
【０３８８】
ｉ．複数のウイルスの投与
２つ以上のウイルスを対象に投与する方法が提供される。投与を、同時的に、連続的に、または間欠的に行うことができる。複数のウイルスを、単一の組成物として、または２つ以上の組成物として投与することができる。２つ以上のウイルスは、少なくとも２つのウイルスを含んでもよい。特定の例においては、２つのウイルスが存在する場合、両ウイルスはワクシニアウイルスである。別の例においては、１つのウイルスはワクシニアウイルスであり、第２のウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、フォーミーウイルス、インフルエンザウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、または本明細書に記載の、もしくは当技術分野で公知の任意の他のウイルスのいずれか１つである。ウイルスを、それらが作用する経路に基づいて選択することができる。例えば、活性化Ｒａｓ経路を標的とするウイルスを、ｐ５３発現が欠損した腫瘍細胞を標的とするウイルスと組み合わせることができる。
【０３８９】
複数のウイルスを、投与のためにパッケージされたウイルスを含み、所望によりその説明書を含む、含有する組成物の組合せおよび／またはキットとして提供することができる。組成物は、単回投与のため（すなわち、直接投与のため）に製剤化されたウイルスを含有し、希釈液または他の添加剤を必要としてもよい。
【０３９０】
一例においては、少なくとも１つのウイルスは、低い病原性、低い毒性、腫瘍における選択的蓄積、腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化する能力、免疫原性、複製能力、外因性タンパク質を発現する能力、およびその組合せなどの特徴を有する、本明細書で提供されるものなどの改変ウイルスである。ウイルスを、ほぼ同時に投与するか、または異なる時間に投与することができる。ウイルスを、同じ組成物中で、もしくは同じ投与方法において投与するか、または別々の組成物中で、もしくは異なる投与方法により投与することができる。
【０３９１】
投与間の期間は、当業者によって決定することができるような、所望の効果を達成する任意の期間であってよい。異なるウイルスの投与間の期間の選択は、モニタリング工程からの結果、対象が免疫応答を高める期間、対象が正常組織からウイルスを消失させる期間、または腫瘍もしくは転移中でのウイルス増殖のための期間などの、同じウイルスの投与間の期間を選択するためのものと類似するパラメータに従って決定することができる。一例においては、期間は、対象が免疫応答を高める期間の関数であってよい。例えば、期間は、対象が免疫応答を高める期間よりも多いもの、例えば、約１週間より多い、約１０日間より多い、約２週間より多い、または約１カ月よりも多いものであってよい。別の例においては、期間は、対象が免疫応答を高める期間より少ないもの、例えば、約１週間より少ない、約１０日間より少ない、約２週間より少ない、または約１カ月より少ないものであってよい。別の例においては、期間は、正常組織からウイルスを消失させる期間の関数であってよい。例えば、期間は、対象が正常組織からウイルスを消失させる期間よりも多いもの、例えば、約１日より多い、約２日より多い、約３日より多い、約５日より多い、または約１週間より多いものであってよい。別の例においては、期間は、腫瘍または転移中でのウイルス増殖のための期間の関数であってよい。例えば、期間は、検出可能なマーカーを発現するウイルスの投与後、検出可能なシグナルが腫瘍または転移中に生じる時間量よりも多いもの、例えば、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１カ月であってよい。
【０３９２】
ｉｉ．治療化合物
任意の治療剤または抗がん剤を、本明細書で提供される組合せがん処置方法における第２の治療剤または抗がん剤として用いることができる。前記方法は、対象へのウイルスまたは複数のウイルスの投与に加えて、対象への１つまたは複数の治療化合物を投与することを含んでもよい。治療化合物は、腫瘍治療効果のために、独立して、またはウイルスと一緒になって作用してもよい。
【０３９３】
独立して作用することができる治療化合物としては、ウイルスが腫瘍中に蓄積する、腫瘍中で複製する、および対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強する能力を低下させることなく、腫瘍成長を阻害する、転移の成長および／または形成を阻害する、腫瘍または転移のサイズを減少させる、腫瘍または転移を排除する任意の様々な公知の化学療法化合物が挙げられる。
【０３９４】
ウイルスと一緒になって作用する治療化合物としては、例えば、ウイルスの発現を変化させる化合物またはウイルスにより発現される遺伝子と相互作用することができる化合物、またはウイルスに対して毒性である化合物などの、ウイルス増殖を阻害することができる化合物が挙げられる。ウイルスと一緒になって作用することができる治療化合物としては、例えば、ウイルスの増殖、毒性、腫瘍細胞殺傷または免疫応答惹起特性を増加させる治療化合物が挙げられ、また、例えば、ウイルスの増殖、毒性または細胞殺傷特性を減少させる治療化合物も挙げられる。所望により、治療剤は、本明細書の他の場所に記載のような画像化剤としてのその使用を可能にする特性などの、さらなる特性を示すか、または現すことができる。
【０３９５】
治療化合物としては、限定されるものではないが、化学療法剤、ナノ粒子、放射線療法、ｓｉＲＮＡ分子、酵素／プロドラッグ対、光感作剤、毒素、マイクロ波、放射性核種、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害タンパク質（例えば、ｃｄｃ６）、抗腫瘍オリゴペプチド（例えば、抗有糸分裂オリゴペプチド、高親和性腫瘍選択的結合ペプチド）、シグナリング調節剤、抗がん抗体、またはその組合せも挙げられる。
【０３９６】
光感作剤の例としては、限定されるものではないが、例えば、インドシアニングリーン、トルイジンブルー、アミノレブリン酸、テキサフィリン、ベンゾポルフィリン、フェノチアジン、パタロシアニン、ナトリウムポルフィマーなどのポルフィリン、クロリン、例えば、テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリンもしくはスズ（ＩＶ）クロリンｅ６、プルプリン、例えば、エチルエチオプルプリンスズ、プルプリンイミド、バクテリオクロリン、フェオホルビド、ピロフェオホルビドまたはカチオン染料が挙げられる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、光感作剤と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０３９７】
放射性核種の量および適用に応じて、放射性核種を診断および／または処置のために用いることができる。それらのものとしては、限定されるものではないが、例えば、３２リン、６０コバルト、９０イットリウム、９９テクニチウム、１０３パラジウム、１０６ルテニウム、１１１インジウム、１１７ルテチウム、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１３７セシウム、１５３サマリウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１９２イリジウム、１９８金、２１１アスタチン、２１２ビスマスもしくは２１３ビスマスを含有する化合物または分子が挙げられる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、放射性核種と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０３９８】
毒素としては、限定されるものではないが、化学療法化合物、例えば、限定されるものではないが、５−フルオロウリジン、カリケアミシンおよびメイタンシンが挙げられる。シグナリング調節剤としては、限定されるものではないが、例えば、マクロファージ阻害因子の阻害剤、ｔｏｌｌ様受容体アゴニストおよびｓｔａｔ３阻害剤が挙げられる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、毒素またはシグナリング調節剤と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０３９９】
化学療法剤と治療ウイルスとの組合せ療法は、単剤処置が有効ではない状況において有効／治癒的であり得る。化学療法化合物としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾデパ、カルボクオン、メツレデパおよびウレデパ；エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルメラミン窒素マスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノボビオシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、葉酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォスファミド；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモル；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ポリサッカリド−Ｋ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（ファレストン）などの抗エストロゲン；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節するか、または阻害するように作用する抗ホルモン剤も挙げられる。本明細書で用いることができるそのような化学療法化合物としては、一般的な全身化学療法方法において毒性が化合物の使用を除外する化合物が挙げられる。化学療法剤としては、新しいクラスの標的化化学療法剤、例えば、イマチニブ（米国でグリベックという商品名でＮｏｖａｒｔｉｓにより販売されている）、ゲフィチニブ（イレッサという商品名でＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａにより開発されている）およびエルロチニブなども挙げられる。特定の化学療法剤としては、限定されるものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ３２９５、および２５４−Ｓビンクリスチン、プレドニゾン、ドキソルビシンおよびＬ−アスパラギナーゼ；メクロレタミン、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン（ＭＯＰＰ）、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン（Ｃ−ＭＯＰＰ）、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルが挙げられる。化学療法剤の例は、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ３２９５、および２５４−Ｓである。非限定例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ＤＷＡ２１１４Ｒ、ＮＫ１２１、ＩＳ３２９５、および２５４−Ｓなどの白金配位複合体と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。腫瘍、がんおよび転移は、本明細書で提供されるもののいずれかであってよく、特に、膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、子宮頚部腫瘍または乳房腫瘍であってよい；腫瘍の例は膵臓腫瘍および卵巣腫瘍である。腫瘍、がんおよび転移は、単剤治療耐性腫瘍、例えば、ウイルスのみ、または抗がん剤のみを用いる治療には応答しないが、ウイルスと抗がん剤との組合せを用いる治療に応答するものなどであってよい。典型的には、ウイルスの治療上有効量が対象に全身投与され、ウイルスは腫瘍中に局在化し、蓄積する。ウイルスを投与した後、対象は治療上有効量の抗がん剤、例えば、シスプラチンを投与される。一例においては、シスプラチンは、連続する５日間にわたって１日１回投与される。当業者であれば、例えば、インビボ動物モデルを用いてウイルスの後にいつ抗がん剤を投与するかを決定することができる。本明細書で提供される方法を用いて、ウイルスと抗がん剤、例えば、シスプラチンの投与は、腫瘍体積の低下を引き起こし、腫瘍成長の停止もしくは遅延を引き起こすか、または対象からの腫瘍の排除を引き起こすことができる。処置後の腫瘍、がんおよび転移の状態を、本明細書で提供され、当技術分野で公知の任意の方法を用いてモニターすることができる。
【０４００】
抗がん抗生物質の例としては、限定されるものではないが、アントラサイクリン、例えば、塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン）、塩酸イダルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸エピルビシンおよび塩酸ピラルビシン、フレオマイシン、例えば、フレオマイシンおよび硫酸ペプロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、例えば、アクチノマイシンＤ、ジノスタチンスチマラマー（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎｓｔｉｍａｌａｍｅｒ）ならびにポリペプチド、例えば、ネオカルジノスタチンが挙げられる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、抗がん抗生物質と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０４０１】
一例においては、ナノ粒子が本明細書で提供される１つまたは複数の治療剤を担持するように、それらを設計することができる。さらに、ナノ粒子を腫瘍細胞に標的化する分子を担持するようにナノ粒子を設計することができる。ある非限定例においては、ナノ粒子を、放射性核種、および所望により、腫瘍関連抗原と免疫反応する抗体で被覆することができる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、本明細書で提供される任意の治療剤を担持するナノ粒子と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０４０２】
放射線療法は、多くのがん患者のための処置の第一選択になっている。放射線処置の幅広い使用は、γ−照射が、正常組織の機能を保存しながら、標的細胞における不可逆的な損傷を誘導する能力に由来する。電離放射線は、がん細胞におけるアポトーシス、内在的な細胞死機構を誘発し、アポトーシスの活性化は、電離放射線への曝露後にがん細胞が死ぬ原理的様式であると考えられる。一例においては、本明細書で提供されるワクシニアウイルスなどのワクシニアウイルスは、放射線療法と組み合わせて腫瘍、がんまたは転移を有する対象に投与される。
【０４０３】
かくして、ウイルスと一緒になって作用して、ウイルスの増殖、毒性、腫瘍細胞殺傷、または免疫応答惹起特性を増加させることができる１つまたは複数の治療化合物を対象に投与する方法が本明細書で提供される。また、ウイルスと一緒になって作用して、ウイルスの増殖、毒性、または細胞殺傷特性を減少させることができる１つまたは複数の治療化合物を対象に投与する方法も本明細書で提供される。投与される治療化合物は、本明細書で提供されるか、または当技術分野で提供されるもののいずれかであってよい。
【０４０４】
ウイルスと一緒になって作用して、ウイルスの増殖、毒性、腫瘍細胞殺傷または免疫応答惹起特性を増加させることができる治療化合物は、変化した遺伝子発現が対象における腫瘍細胞の殺傷の増加または抗腫瘍免疫応答の増加をもたらすことができる、遺伝子発現を変化させることができる化合物である。遺伝子発現を変化させる化合物は、例えば、内因性ウイルス遺伝子および／または外因性ウイルス遺伝子などの、１つまたは複数のウイルス遺伝子の発現の増加または減少を引き起こすことができる。例えば、遺伝子発現を変化させる化合物は、細胞溶解もしくは細胞死を引き起こすことができる、免疫応答を誘発することができる、プロドラッグ様化合物の変換を触媒することができる、または腫瘍細胞遺伝子の発現を阻害することができる外因性遺伝子などの、ウイルス中での遺伝子の転写を誘導するか、または増加させることができる。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６などの、遺伝子発現を変化させることができる任意の様々な化合物が当技術分野で公知である。発現を上方調節することができる遺伝子の例としては、毒素、プロドラッグを抗腫瘍剤に変換することができる酵素、サイトカイン、転写調節タンパク質、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムなどの、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。別の例においては、遺伝子発現を変化させる化合物は、ウイルスの毒性を低下させるか、またはウイルスの増殖を低下させることができる異種遺伝子などの、ウイルス中の遺伝子の転写を阻害するか、または減少させることができる。ｓｉＲＮＡ化合物、転写阻害剤または転写活性化因子の阻害剤などの、遺伝子発現を低下させるか、または阻害することができる任意の様々な化合物を、本明細書で提供される方法において用いることができる。発現を下方調節することができる遺伝子の例としては、溶解、ヌクレオチド合成または増殖を抑制するウイルスタンパク質またはＲＮＡ、および細胞死、免疫反応性、溶解、またはウイルス複製を抑制する細胞タンパク質またはＲＮＡ分子などの、タンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。
【０４０５】
別の例においては、ウイルスと一緒になって作用してウイルスの増殖、毒性、腫瘍細胞殺傷、または免疫応答惹起特性を増加させることができる治療化合物は、ウイルスにより発現された遺伝子産物と相互作用することができる化合物であり、そのような相互作用は対象における腫瘍細胞の殺傷の増加または抗腫瘍免疫応答の増加をもたらすことができる。ウイルスにより発現された遺伝子産物と相互作用することができる治療化合物としては、例えば、対象に投与される形態では毒性をほとんど有さないか、または全く有さないか、または他の生物活性を有するが、ウイルスにより発現された遺伝子産物との相互作用後に、その化合物が、限定されるものではないが、細胞傷害性、アポトーシスを誘導する能力、または免疫応答を誘発する能力などの、腫瘍細胞死をもたらす特性を生じることができるプロドラッグまたは他の化合物が挙げられる。ある非限定例においては、ウイルスはがん細胞中に酵素を運搬する。一度、酵素ががん細胞中に導入されたら、不活性型の化学療法剤（すなわち、プロドラッグ）が投与される。不活性プロドラッグががん細胞に到達した時、酵素はプロドラッグを活性な化学療法剤に変換し、それはがん細胞を殺傷することができる。かくして、処置はがん細胞に対してのみ標的化され、正常細胞には影響しない。プロドラッグは、ウイルスと同時に、またはウイルスと連続的に投与することができる。様々なプロドラッグ様物質が当技術分野で公知であり、そのような化合物の例示的セットは本明細書の他の場所に開示されており、そのような化合物として、ガンシクロビル、５−フルオロウラシル、６−メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン−ドキソルビシン、４−［（２−クロロエチル）（２−メシルオキシエチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸、アセトアミノフェン、インドール−３−酢酸、ＣＢ１９５４、７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン、ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニル−アミノメタノン２８、１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール、エピルビシン−グルクロニド、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、リナマリン、およびヌクレオシド類似体（例えば、フルオロウリジン、フルオロデオキシウリジン、フルオロウリジンアラビノシド、シトシンアラビノシド、アデニンアラビノシド、グアニンアラビノシド、ヒポキサンチンアラビノシド、６−メルカプトプリンリボシド、テオグアノシンリボシド、ネブラリン、５−ヨードウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、５−ブロモデオキシウリジン、５−ビニルデオキシウリジン、９−［（２−ヒドロキシ）エトキシ］メチルグアニン（アシクロビル）、９−［（２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル）−エトキシ］メチルグアニン（ＤＨＰＧ）、アザウリジン、アザシチジン、アジドチミジン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシチミジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシシチジン、３’−デオキシイノシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミジン）が挙げられる。
【０４０６】
別の例においては、ウイルスと一緒になって作用してウイルスの増殖、毒性または細胞殺傷特性を減少させることができる治療化合物は、ウイルス複製を阻害する、ウイルス毒素を阻害するか、またはウイルス死を引き起こすことができる化合物である。ウイルス複製を阻害する、ウイルス毒素を阻害するか、またはウイルス死を引き起こすことができる治療化合物は、一般的には、限定されるものではないが、ウイルスＤＮＡ複製、ウイルスＲＮＡ転写、ウイルス外被タンパク質アセンブリー、外膜または多糖アセンブリーを阻害することができる化合物などの、ウイルス生活環における１つまたは複数の工程を遮断することができる化合物を含んでもよい。任意の公知の抗ウイルス化合物（例えば、シドフォビル）、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ウイルスＤＮＡ複製またはＲＮＡ転写を調節するタンパク質の阻害剤などの、ウイルス生活環における１つまたは複数の工程を遮断することができる任意の様々な化合物が当技術分野で公知である。別の例においては、ウイルスは、所望により、宿主生物に対して非毒性である化合物により阻害することができるＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどのウイルス生活環タンパク質をコードする遺伝子を含有してもよい。
【０４０７】
化学療法剤と本明細書で提供されるウイルスとの組合せ療法に加えて、他のより複雑な組合せ療法戦略を同様に適用することができる。例えば、組合せ療法は、化学療法剤、治療抗体、および本明細書で提供されるウイルスを含んでもよい。あるいは、別の組合せ療法は、放射線療法抗体、および本明細書で提供されるウイルスの組合せであってよい。したがって、組合せ療法の概念はまた、１つまたは複数の以下の治療様式、すなわち、化学療法剤、放射線療法、治療抗体、温熱または低温治療、ｓｉＲＮＡ、診断／治療細菌、診断／治療哺乳動物細胞、免疫療法、および／または標的化毒素（抗体、リポソームおよびナノ粒子により送達される）と共に、本明細書で提供されるウイルスの適用に基づくものであってもよい。
【０４０８】
組合せ療法のそれぞれの成分の効率的なデリバリーは、本明細書で提供される方法の重要な態様である。一態様によれば、以下に考察される投与様式は、１つまたは複数の鍵となる特徴を活用するものである：（ｉ）最も高いウイルス力価および最も高い治療効果を達成するために行う投与様式による腫瘍への本明細書で提供されるウイルスのデリバリー；（ｉｉ）最適な治療効果を達成するための投与様式による腫瘍への任意の他の記載された治療様式のデリバリー。投与される組合せ療法の用量スキームは、２つ以上の治療様式の組合せが治療上有効であるようなものである。用量は、患者の年齢、健康、性別、サイズおよび体重、投与経路、薬剤の毒性、処置の頻度ならびにそれぞれの治療様式に対するがんの相対的感受性などの因子に応じて変化するであろう。
【０４０９】
化学療法化合物との組合せ療法のために、そのような化合物の投与のための用量は、当技術分野で公知であるか、または当業者であれば公知の臨床因子（例えば、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫能力、および一般的な健康、投与の期間および経路、疾患の種類およびステージ、例えば、腫瘍サイズ、ならびに同時に投与される、他のウイルス、処置、または化合物、例えば、他の化学療法剤）に従って決定することができる。上記因子に加えて、そのようなレベルは、当業者であれば決定できるような、ウイルスの感染性、およびウイルスの性質により影響され得る。例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−白金、プラチノール；ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金；およびｃＤＤＰとも呼ばれる）は、精巣がん、卵巣腫瘍および様々な他のがんの治療において用いられることが多い、幅広いクラスの水溶性の白金配位化合物の代表である（例えば、Ｂｌｕｍｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５５（５）：  １１１８−１１２２  （１９８５）；  Ｆｏｒａｓｔｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９（４）：  １０８８−１０９５  （２００１）を参照されたい）。シスプラチンを臨床的に用いる方法は当技術分野で周知である。例えば、シスプラチンは、遅い静脈内注入により、月に１回、６時間にわたって１日投与されている。局在化された病変については、シスプラチンを局部注射により投与することができる。腹腔内注入を用いることもできる。シスプラチンは、多剤レジメンの一部の場合、または患者がより高用量に対して有害な反応を有する場合、処置あたり１０ｍｇ／ｍ２の低用量で投与することができる。一般的には、臨床用量は、処置あたり約３０〜約１２０または１５０ｍｇ／ｍ２である。
【０４１０】
典型的には、白金含有化学療法剤は、例えば、上記で考察された、遅い静脈内注入によるか、または局部注射により、非経口的に投与される。シスプラチンの病変内（腫瘍内）およびＩＰ投与の効果は、Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｐ．  ７１（９）：  ８２５−８２９  （１９８７）；およびＴｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ２０２（２）：  ２６１−７．  （１９９３）に記載されている。
【０４１１】
一例においては、ウイルスが、０〜６０日空けたそれぞれの投与については１回、２〜６回以上投与され、その後、１〜３０日は抗がん処置が投与されず、次いで、シスプラチンが１〜５日間にわたって毎日投与され、その後、１〜３０日は抗がん処置は投与されない。治療のそれぞれの成分、ウイルスまたはシスプラチン処置、またはウイルスとシスプラチンの組合せ療法を反復することができる。別の例示的な例においては、シスプラチンが１〜５日間にわたって毎日投与され、その後１〜１０日は抗がん処置が投与されず、次いで、ウイルスが０〜６０日空けて１回または２〜６回投与される。そのような処置スキームを反復することができる。別の例示的な例においては、シスプラチンが１〜５日間にわたって毎日投与され、その後、１〜１０日は抗がん処置が投与されず、次いで、ウイルスが０〜６０日空けて１回または２〜６回投与される。この後、５〜６０日は抗がん処置が投与されず、次いで、シスプラチンが１〜５日間再度投与される。そのような処置スキームを反復することができる。
【０４１２】
ゲムシタビン（ゲムザール（登録商標））は、乳がん、非小細胞肺がん、および膵臓がんの治療において用いられる別の化合物である。ゲムシタビンは、抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類似体である。ゲムシタビンを臨床的に用いる方法は、当技術分野で周知である。例えば、ゲムシタビンは、１０００ｍｇ／ｍ２の用量で３０分間にわって週に１回、最大で７週間（または毒性が用量の低下もしくは保持を必要とするまで）、静脈内注入により、次いで、膵臓がんの処置から１週間の休止により投与されている。その後のサイクルは、４週間毎から連続する３週間にわたって週に１回の注入を含んでもよい。ゲムシタビンはまた、がん療法においてシスプラチンと組み合わせて用いられている。
【０４１３】
例示的な一例においては、ウイルスが、０〜６０日空けて１回または２〜６回投与され、その後、１〜３０日は抗がん処置は投与されず、次いで、ゲムシタビンが０〜３０日空けて１〜７回投与され、その後、１〜３０日は抗がん処置は投与されない。そのような処置スキームを反復することができる。別の例においては、ゲムシタビンが０〜３０日空けて１〜７回投与され、その後、１〜１０日は抗がん処置が投与されず、次いで、ウイルスが０〜６０日空けて１回または２〜６回投与される。この後、５〜６０日は抗がん処置が投与されない。そのような処置スキームを反復することができる。別の例示的な例においては、ゲムシタビンが０〜３０日空けて１〜７回投与され、その後、１〜１０日は抗がん処置が投与されず、次いで、ウイルスが０〜６０日空けて１回または２〜６回投与される。この後、５〜６０日は抗がん処置が投与されず、次いで、ゲムシタビンが０〜３０日空けて１〜７回再度投与される。そのような処置スキームを反復することができる。
【０４１４】
当業者であれば理解できるように、最適な処置レジメンは変化し、処置下の疾患の状態ならびに最適な治療組合せを決定するための１つまたは複数のサイクルの組合せ療法の前、および後の患者の一般的健康を評価することは、処置方法の範囲内にある。
【０４１５】
ｉｉｉ．免疫療法および生物療法
治療化合物としては、限定されるものではないが、免疫療法効果を示す化合物、免疫系を刺激もしくは抑制する化合物、治療化合物を運搬する化合物、またはその組合せも挙げられる。所望により、治療剤は、本明細書の他の場所に記載のような画像化剤としてのその使用を可能にする特性などの、さらなる特性を示すか、または明示することができる。そのような治療化合物としては、限定されるものではないが、抗がん抗体、放射線療法、ｓｉＲＮＡ分子および免疫系を抑制する化合物（すなわち、免疫抑制因子、免疫抑制剤）が挙げられる。いくつかの事例においては、ウイルスに対する有害反応を最小化するためのウイルスの投与の前に、免疫系を抑制するために対象に免疫抑制剤を投与することが望ましい。免疫抑制剤の例としては、限定されるものではないが、糖質コルチコイド、アルキル化剤、代謝拮抗物質、インターフェロンおよび免疫抑制抗体（例えば、抗ＣＤ３および抗ＩＬ２受容体抗体）が挙げられる。
【０４１６】
免疫療法はまた、例えば、免疫刺激分子（タンパク質に基づくか、または非タンパク質に基づく）、細胞および抗体を含む。免疫療法処置は、より効率的に働くか、または腫瘍細胞または腫瘍関連抗原を免疫系に認識されるようにする（すなわち、許容性を破壊する）ために免疫細胞を刺激することを含んでもよい。
【０４１７】
サイトカインおよび成長因子としては、限定されるものではないが、インターロイキン、例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６およびインターロイキン−１２、腫瘍壊死因子、例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アンギオゲニン、ならびに組織因子が挙げられる。
【０４１８】
抗がん抗体としては、限定されるものではないが、リツキシマブ、ＡＤＥＰＴ、トラスツズマブ（ハーセプチン）、トシツモマブ（ベキサール）、セツキシマブ（アービタックス）、イブリツモマブ（ゼバリン）、アレムツズマブ（キャンパス−１Ｈ）、エプラツズマブ（リンホシド）、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ）、ベバシマブ（アバスチン）、タルセバ（エルロチニブ）、ＳＵＴＥＮＴ（リンゴ酸スニチニブ）、パノレックス（エドレコロマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ゼバリン（９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）およびキャンパス（アレムツズマブ）が挙げられる。
【０４１９】
かくして、ウイルスと一緒になって作用して免疫系を刺激または増強し、それによって、ウイルスの効果を増強することができる１つまたは複数の治療化合物を対象に投与する方法が本明細書で提供される。そのような免疫療法は、別々の治療様式として送達することができるか、または投与されるウイルスによりコードされ得る（免疫療法がタンパク質に基づく場合）。
【０４２０】
生物療法は、天然の身体物質または天然の身体物質から作製された薬剤を使用する処置である。それらは、がんを処置し、化学療法などの他のがん処置により引き起こされる副作用を制御するのに役立ち得る。生物療法はまた、それらががんに生物学的に（または天然に）応答するように身体を刺激するため、生体応答調節療法（ＢＲＭ）、生物学的薬剤または単に「生物製剤」と呼ばれることもある。免疫療法は、身体が感染および疾患と闘うために用いる天然物質を用いる処置である。それは天然物質を用いるため、免疫療法もまた生物療法である。用語「生物療法」の部類に入るいくつかの型の薬剤が存在する：これらのものとしては、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、がんワクチン、血液細胞のための成長因子、がん成長阻害剤、抗血管新生因子、インターフェロンα、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、遺伝子療法および膀胱がんのためのＢＣＧワクチンが挙げられる。
【０４２１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ユニークな抗原に対する結合特異性および大量配布のために実験室で大量に製造する能力のため、がんを処置するために特に興味深い。モノクローナル抗体を、免疫系のタンパク質と同じ方法で作用する：すなわち、ウイルスなどの、身体中の外来物質を探し出し、これを殺傷するように遺伝子操作することができる。モノクローナル抗体は、がん細胞の表面上のエピトープを認識するように設計することができる。抗体標的はそのエピトープに特異的に結合し、がん細胞を殺傷するか、または治療剤をがん細胞に送達する。治療剤を抗体にコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で周知である。異なる種類のがんには異なる抗体を作製しなければならない；例えば、リツキシマブは非ホジキンリンパ腫細胞の外部のＣＤ２０タンパク質を認識する；ＡＤＥＰＴは腸（結腸）がんを認識する抗体を用いる処置である；およびトラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２タンパク質を過剰に生成する乳がん細胞（「ＨＥＲ２陽性」）を認識する。他の抗体としては、例えば、トシツモマブ（ベキサール）、セツキシマブ（アービタックス）、イブリツモマブ（ゼバリン）、アレムツズマブ（キャンパス−１Ｈ）、エプラツズマブ（リンホシド）、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ）およびベバシマブ（アバスチン）が挙げられる。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において１つまたは複数のモノクローナル抗体と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態で、さらなる治療が施される。
【０４２２】
インフルエンザウイルスの場合などのように、感染を防止しようとするよりもむしろ、がんワクチンは、一度がんが生じたらそのがんを処置するのに役立つ。がんワクチンの目的は、免疫応答を刺激することである。がんワクチンとしては、例えば、抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞ワクチン、ＤＮＡワクチンおよび抗イディオタイプワクチンが挙げられる。抗原ワクチンは、腫瘍関連抗原から作製するか、またはがん細胞により生成されるワクチンである。抗原ワクチンは、がんを攻撃するように対象の免疫系を刺激する。全細胞ワクチンは、ワクチンを作製するために全がん細胞に由来する特異的抗原だけでなく、全がん細胞を用いるワクチンである。このワクチンは、対象自体のがん細胞、別の対象のがん細胞または実験室で増殖させたがん細胞から作製される。細胞を、それらが増殖できないように、通常は放射線を用いて実験室で処理し、それらががんを攻撃するように免疫系を刺激することができるように、注射を介して、または血流への静脈内点滴により対象に投与する。１つの型の全細胞ワクチンは、免疫系ががん細胞などの異常細胞を認識し、これを攻撃するのに役立つ樹状細胞ワクチンである。樹状細胞ワクチンは、実験室でがん細胞と一緒に樹状細胞を増殖させることにより作製される。このワクチンは、がんを攻撃するように免疫系を刺激するために投与される。抗イディオタイプワクチンは、がん細胞に対する抗体を作るように身体を刺激するワクチンである。がん細胞は、免疫系が外来物と認識するいくつかの腫瘍関連抗原を作る。しかし、がん細胞は非がん細胞と類似しているため、免疫系は弱く応答し得る。ＤＮＡワクチンは免疫応答を強化する。ＤＮＡワクチンは、腫瘍関連抗原のための遺伝子を担持するがん細胞に由来するＤＮＡから作製される。ＤＮＡワクチンが注入された場合、それは免疫系の細胞が腫瘍関連抗原を認識するのを可能にし、免疫系の細胞を活性化する（すなわち、許容性を破壊する）。ＤＮＡワクチンを用いることから得られる最も有望な結果は、メラノーマの処置におけるものである。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において全細胞ワクチンと同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２３】
成長因子は、血液細胞を作るように骨髄を刺激する天然物質である。組換え技術を用いて、血液中の白血球、赤血球および幹細胞の数を増加させるために対象に投与することができる成長因子を作製することができる。白血球を増強するためにがん処置において用いられる成長因子としては、フィルグラスチム（ニューポゲン）またはレノグラスチム（グラノサイト）とも呼ばれる顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）ならびにモルグラモスチムとも呼ばれる顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。貧血を処置するのに役立つ成長因子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。ＥＰＯは、より多くの赤血球を作るように身体を促し、次いで、体組織中のヘモグロビンレベルおよび酸素レベルを増加させる。血小板を強化することができる他の成長因子が開発されている。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において、ＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２４】
がん成長阻害剤は、がん細胞などの細胞の成長および複製を制御する細胞シグナリング分子を用いる。これらのシグナリング分子を遮断する薬剤は、がんの成長および分裂を停止させることができる。がん成長因子としては、限定されるものではないが、チロシンキナーゼが挙げられる。かくして、チロシンキナーゼを遮断する薬剤は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。ＴＫＩの例としては、限定されるものではないが、エルロチニブ（タルセバ、ＯＳＩ−７７４）、イレッサ（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）およびイマチニブ（グリベック、ＳＴＩ５７１）が挙げられる。別の種類の成長阻害剤は、多発性骨髄腫およびいくつかの他のがんのためのボルテゾミブ（ベルケード）である。ベルケードは、プロテアソーム阻害剤である。プロテオソームは、すべての細胞中に見出され、細胞中のタンパク質を破壊するのに役立つ。プロテオソームの作用の阻害は、毒性レベルまでの細胞中でのタンパク質の増加を引き起こし、それによってがん細胞を殺傷する。がん細胞は、正常細胞よりもベルケードに対する感受性が高い。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において、ベルケードなどのがん成長阻害剤と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２５】
がんは、それらがより大きくなるにつれて、それ自体の血管を拡張し、成長するために血液供給を必要とする。それ自体の血液供給がなければ、がんは栄養素および酸素の欠如のため成長することができない。抗血管新生剤は、腫瘍自体の血管の発達を停止させる。これらの種類の薬剤の例としては、限定されるものではないが、主に骨髄腫の処置のためであるが、他の種類のがんの臨床試験においても用いられているサリドマイド、および腸のがんのために調査されているモノクローナル抗体の種類であるベバシズマブ（アバスチン）が挙げられる。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において抗血管新生剤と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２６】
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は、免疫応答の一部として非常に少量で体内で生成される天然物質である。ＩＦＮ−αは、免疫系を増強する処置として投与され、腎細胞（腎臓）がん、悪性メラノーマ、多発性骨髄腫およびいくつかの種類の白血病などのがんと闘うのに役立つ。ＩＦＮ−αはいくつかの方法で働く：それはがん細胞の成長を停止させるのに役立ち得る、それはまた免疫系を増強し、それががんを攻撃するのに役立つ、またそれはがん細胞への血管供給に影響し得る。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置においてＩＦＮ−αと同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２７】
ＩＬ−２の投与は、それが免疫系により天然に生成されるため、生物療法剤である。かくして、それは免疫療法でもある。インターロイキン２は腎細胞（腎臓）がんの処置において用いられ、いくつかの他の種類のがんに関する臨床試験において試験されている。ＩＬ−２は、細胞の成長および増殖を阻害することによりがん細胞に対して直接働く；それはキラーＴ細胞およびがん細胞を攻撃する他の細胞の増殖を促進することにより免疫系を刺激する；またそれは免疫系の細胞を誘引する化学誘引物質を分泌するようにがん細胞を刺激する。ＩＬ−２は一般的には、１日１回、５日間、次いで、２日おいて皮膚の直下への皮下注射として投与される。注射のサイクルを４週間繰り返した後、１週間は処置しない。処置レジメンおよび投与されるサイクル数は、がんの種類およびそれがどのように処置に応答するかに依存する。ＩＬ−２は自己投与するか、または医療専門家により投与することができる。あるいは、ＩＬ−２は注射または点滴により静脈内投与することができる。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置においてＩＬ−２と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２８】
遺伝子療法は、がん細胞中の異常遺伝子を遮断し、がん細胞中の異常遺伝子を修復し、もしくは置き換え、さらに多くの遺伝子ががん細胞中で異常になるのを促進して、それらが死ぬか、もしくは処置に対して感受性になるようにし、処置を活性化する酵素をがん細胞中に運搬するウイルスを使用するか、またはその組合せによりがんを処置することを含む。結果として、がん細胞は、細胞中の損傷のため死ぬ。がん細胞は、それらの遺伝子のいくつかにおけるいくつかの種類の突然変異の結果として生じる。標的遺伝子としては、限定されるものではないが、細胞の複製を促進するもの（すなわち、がん遺伝子）、細胞の複製を停止させる遺伝子（すなわち、腫瘍抑制遺伝子）および他の損傷した遺伝子を修復する遺伝子が挙げられる。遺伝子療法は、損傷したがん遺伝子の修復またはがん遺伝子が生成するタンパク質の遮断を含んでもよい。腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３は、多くのヒトのがんにおいて損傷される。ウイルスは、損傷されていないｐ５３遺伝子をがん細胞に送達するために用いられており、改変されたｐ５３生成ウイルスを用いてがんを処置することに目を向ける初期の臨床試験が現在進行中である。遺伝子療法を用いて、損傷されたＤＮＡ修復遺伝子を置き換えることができる。代替的な例においては、腫瘍細胞内のＤＮＡ損傷を増加させる方法は、腫瘍細胞の死を促進するか、または放射線療法もしくは化学療法などの他のがん処置に対する腫瘍細胞の感受性の増加を引き起こすことができる。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置において本明細書で提供されるか、または当技術分野で公知の任意の遺伝子療法法と同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４２９】
初期膀胱がんの処置は、膀胱内処置と呼ばれ、高悪性度（グレード３もしくはＧ３）であるＴ１ステージの膀胱がんまたは膀胱のｉｎ  ｓｉｔｕの癌腫（ＴｉｓもしくはＣＩＳとしても知られる）を処置するのに主に用いられる。ＢＣＧは結核（ＴＢ）のためのワクチンであり、ＣＩＳを処置し、膀胱がんの再発を防止するのにも有効であることが見出されている。いくつかの事例においては、ＢＣＧワクチンは、グレード２の初期膀胱がんを処置するために用いられている。膀胱がんは膀胱内壁のどこにでも生じ得るため、それを乳頭状初期膀胱がんと同じ方法で除去することはできない。むしろ、ＢＣＧワクチンは膀胱内治療を用いて投与される；すなわち、まず、カテーテル（管）を膀胱に挿入した後、ＢＣＧワクチンおよび／または化学療法のカテーテル内投与を行う。ＢＣＧ処置は、膀胱がんに対する効果に応じて６週間以上にわたって毎週行う。膀胱がんのＢＣＧ処置は、化学療法（膀胱内）、ＩＬ−２、細胞を光、ビタミンおよび光力学治療に対して感受性にする薬剤を用いる処置の投与などの、他の種類の処置と組み合わせることができる。かくして、本明細書で提供されるウイルスを、がんの処置においてＢＣＧワクチンと同時に、または連続的に投与することができる。一例においては、本明細書で提供される１つまたは複数の任意の他の処置様式の形態でさらなる治療が施される。
【０４３０】
ｅ．対象の状態
別の例においては、対象にウイルスを投与するための本明細書で提供される方法を、麻酔された対象、警戒した対象、体温が上昇した対象、体温が低下した対象、または腫瘍中でのウイルスの蓄積に影響することが知られる他の状態の対象などの、任意の様々な状態の対象に対して実施することができる。本明細書で提供されるように、麻酔された対象は麻酔されていない対象と比較して腫瘍中のウイルスの低下した蓄積速度を有し得ることが決定された。さらに本明細書で提供されるように、体温が低下した対象は、正常な体温を有する対象と比較して、腫瘍中のウイルスの低下した蓄積速度を有し得ることが決定された。したがって、対象が、全身麻酔などの麻酔下にない対象にウイルスを投与することを含んでもよい、対象にウイルスを投与する方法が本明細書で提供される；例えば、対象は局部麻酔下にあるか、または麻酔されていなくてもよい。また、体温が変化した対象にウイルスを投与することを含んでもよく、体温の変化が腫瘍中にウイルスが蓄積する能力に影響し得る、対象にウイルスを投与する方法も本明細書で提供される；典型的には、体温の低下は、腫瘍中にウイルスが蓄積する能力を低下させ得る。かくして、例示的な一例においては、対象の体温を正常より高い温度に上昇させ、対象にウイルスを投与することを含み、ウイルスが正常な体温を有する対象の腫瘍中にウイルスが蓄積する能力と比較してより高い体温を有する対象においてより容易に腫瘍中にウイルスが蓄積することができる、対象にウイルスを投与するための方法が提供される。別の例においては、腫瘍周囲の領域における温度の局部的上昇を用いて、腫瘍中でのウイルスの蓄積を増加させることができる。
【０４３１】
４．モニタリング
本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および／または対象に投与されたウイルスをモニタリングする１つまたは複数の工程をさらに含んでもよい。限定されるものではないが、腫瘍サイズのモニタリング、抗（腫瘍抗原）抗体力価のモニタリング、転移の存在および／またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーなどの他の健康指示因子のモニタリング、抗（ウイルス抗原）抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物のウイルス発現のモニタリング、ならびに対象の腫瘍、組織もしくは臓器中のウイルス力価の直接的モニタリングなどの、任意の様々なモニタリング工程を、本明細書で提供される方法に含有させることができる。
【０４３２】
モニタリングの目的は、単に対象の健康状態もしくは対象の治療処置の進行を評価するためのものであってよく、または同じか、もしくは異なるウイルスのさらなる投与が正当化されるかどうかを決定するためのもの、または化合物が治療方法の効果を増加させるように作用するか、もしくは化合物が対象に投与されたウイルスの病原性を減少させるように作用することができる前記化合物を対象にいつ投与するか、または投与するかどうかを決定するためのものであってよい。
【０４３３】
ａ．ウイルス遺伝子発現のモニタリング
いくつかの例においては、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数のウイルスに発現された遺伝子をモニタリングすることを含んでもよい。ウイルスは、限定されるものではないが、検出可能なタンパク質（例えば、発光もしくは蛍光タンパク質）または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質（例えば、検出可能な化合物を結合するか、もしくは輸送するか、またはシグナルを生成するように基質を改変するタンパク質）などの１つまたは複数の検出可能な遺伝子産物を発現することができる。かくして、感染した細胞／組織を、１つまたは複数の光学または非光学画像化法により画像化することができる。
【０４３４】
本明細書で提供されるように、ウイルスにより発現された検出可能な遺伝子産物の測定は、対象中に存在するウイルスのレベルの正確な決定を提供することができる。本明細書でさらに提供されるように、例えば、限定されるものではないが、磁気共鳴、蛍光、および断層撮影法などの画像化方法による検出可能な遺伝子産物の位置の測定は、対象におけるウイルスの局在化を決定することができる。したがって、検出可能なウイルス遺伝子産物のモニタリングを含む本明細書で提供される方法を用いて、対象の１つもしくは複数の臓器もしくは組織中でのウイルスの存在もしくは非存在、および／または対象の腫瘍もしくは転移中のウイルスの存在もしくは非存在を決定することができる。さらに、検出可能なウイルス遺伝子産物のモニタリングを含む本明細書で提供される方法を用いて、１つまたは複数の臓器、組織、腫瘍または転移に存在するウイルスの力価を決定することができる。対象におけるウイルスの局在化および／または力価のモニタリングを含む方法は、ウイルスの病原性を決定するのに用いることができる；正常な組織および臓器のウイルス感染、および特に感染のレベルは、プローブの病原性を示し得るため、対象におけるウイルスの局在化および／またはウイルス量をモニタリングする方法を用いて、ウイルスの病原性を決定することができる。本明細書で提供される方法を用いて、対象における任意の特定の位置でウイルス量をモニターすることができるため、対象におけるウイルスの局在化および／または力価のモニタリングを含む方法を、複数の時点で実施することができ、したがって、対象の１つもしくは複数の臓器もしくは組織におけるウイルス複製の速度などの、対象におけるウイルス複製の速度を決定することができる；したがって、ウイルス遺伝子産物のモニタリング方法を、ウイルスの複製能力を決定するために用いることができる。本明細書で提供される方法を用いて、様々な臓器もしくは組織、および腫瘍もしくは転移中に存在するウイルス量を定量することもでき、それにより、対象中のウイルスの選択的蓄積の程度を示すことができる；したがって、本明細書で提供されるウイルス遺伝子産物モニタリング方法を、正常な組織または臓器に優先して腫瘍または転移中に蓄積するウイルスの能力を決定する方法において用いることができる。本明細書で提供される方法において用いられるウイルスは腫瘍全体中に蓄積するか、または腫瘍中の複数の部位に蓄積することができ、転移中にも蓄積することができるため、ウイルス遺伝子産物をモニタリングするための本明細書で提供される方法を用いて、対象中に存在する腫瘍のサイズまたは転移の数を決定することができる。一定時間にわたる腫瘍または転移中のウイルス遺伝子産物のそのような存在のモニタリングを用いて、腫瘍の成長もしくは縮小、または新しい転移の発生または転移の消失などの腫瘍または転移における変化を評価し、また、これを用いて腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新しい転移の発生もしくは転移の消失、または腫瘍の成長もしくは縮小または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度の変化を決定することもできる。したがって、腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新しい転移の発生もしくは転移の消失、または腫瘍の成長もしくは縮小または新しい転移の発生もしくは転移の消失の速度の変化を決定することにより、ウイルス遺伝子産物のモニタリング方法を、対象における新生物疾患をモニタリングするか、または新生物疾患の処置の効果を決定するために用いることができる。
【０４３５】
様々な検出可能なタンパク質のいずれかを、本明細書で提供されるモニタリング方法において検出することができる；そのような検出可能なタンパク質の例示的な非限定的一覧としては、様々な蛍光タンパク質のいずれか（例えば、緑色もしくは赤色蛍光タンパク質）、様々なルシフェラーゼ、トランスフェリンもしくは他の鉄結合タンパク質のいずれか；または受容体、結合タンパク質もしくは抗体に特異的に結合する化合物が検出可能な薬剤であってよいか、もしくは検出可能な物質（例えば、放射性核種もしくは画像化剤）で標識することができる、前記受容体、結合タンパク質、および抗体；または検出可能な分子に結合し、これを細胞に輸送することができる輸送タンパク質（例えば、ｈＮＥＴもしくはｈＮＩＳ）が挙げられる。検出可能なタンパク質を発現するウイルスを、本明細書で提供され、当技術分野で公知の方法の組合せにより検出することができる。１より多い検出可能なタンパク質を発現するウイルスまたは様々な検出可能なタンパク質を発現する２つ以上のウイルスを、二重画像化方法により検出し、識別することができる。例えば、蛍光タンパク質および鉄結合タンパク質を発現するウイルスを、それぞれ、高感度蛍光画像化および磁気共鳴によりインビトロまたはインビボで検出することができる。別の例においては、２つ以上の蛍光タンパク質を発現するウイルスを、異なる波長での蛍光画像化により検出することができる。インビボでの二重画像化を、２つ以上の検出可能な遺伝子産物を発現するウイルスまたはそれぞれ１つもしくは複数の検出可能な遺伝子産物を発現する２つ以上のウイルスを投与された対象に対して実施することができる。
【０４３６】
ｂ．腫瘍サイズのモニタリング
また、腫瘍および／または転移のサイズおよび位置をモニタリングする方法も本明細書で提供される。腫瘍および／または転移のサイズを、外部評価方法または断層撮影法もしくは磁気画像化方法などの当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによりモニターすることができる。当技術分野で公知の方法に加えて、例えば、ウイルス遺伝子発現をモニタリングする、本明細書で提供される方法を、腫瘍および／または転移のサイズをモニタリングするために用いることができる。
【０４３７】
いくつかの時点にわたるサイズのモニタリングは、腫瘍または転移のサイズの増加または減少に関する情報を提供し、対象におけるさらなる腫瘍および／または転移の存在に関する情報も提供することができる。いくつかの時点にわたる腫瘍サイズのモニタリングは、対象における新生物疾患の処置の効果などの、対象における新生物疾患の発生に関する情報を提供することができる。
【０４３８】
ｃ．抗体力価のモニタリング
本明細書で提供される方法はまた、対象へのウイルスの投与に応答して生成される抗体などの、対象における抗体力価をモニタリングすることを含んでもよい。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスは、内因性ウイルス抗原に対する免疫応答を惹起することができる。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスはまた、ウイルスにより発現された外因性遺伝子に対する免疫応答を惹起することもできる。本明細書で提供される方法において投与されるウイルスはまた、腫瘍抗原に対する免疫応答を惹起することもできる。ウイルス抗原、ウイルスにより発現される外因性遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングを、ウイルスの毒性をモニタリングする方法、処置方法の効果をモニタリングする方法、または生成および／もしくは収穫のために遺伝子産物もしくは抗体のレベルをモニタリングする方法において用いることができる。
【０４３９】
一例においては、抗体力価のモニタリングを用いて、ウイルスの毒性をモニターすることができる。ある特定の時点で、低い抗（ウイルス抗原）抗体力価がより高い毒性を示すが、他の時点では、高い抗（ウイルス抗原）抗体力価がより高い毒性を示し得る場合、ウイルスに対する抗体力価は、対象へのウイルスの投与後の期間にわたって変化してもよい。本明細書で提供される方法において用いられるウイルスは免疫原性であってよく、したがって、対象にウイルスを投与した直後に免疫応答を惹起することができる。一般的には、対象の免疫系が強力な免疫応答を急速に高めることができるウイルスは、対象の免疫系がすべての正常な臓器または組織からウイルスを除去することができる場合に低毒性を有するウイルスであってよい。かくして、いくつかの例においては、ウイルスを対象に投与した直後のウイルス抗原に対する高い抗体力価は、ウイルスの低い毒性を示し得る。対照的に、高度に免疫原性ではないウイルスは、宿主に対してウイルスのより高い毒性をもたらし得る、強力な免疫応答を惹起することなく、宿主生物に感染することができる。したがって、いくつかの例においては、対象にウイルスを投与した直後のウイルス抗原に対する高い抗体力価は、ウイルスの低い毒性を示し得る。
【０４４０】
他の例においては、抗体力価のモニタリングを用いて、処置方法の効果をモニターすることができる。本明細書で提供される方法においては、抗（腫瘍抗原）抗体力価などの抗体力価は、新生物疾患を処置するための治療方法などの治療方法の効果を示し得る。本明細書で提供される治療方法は、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすか、または増強することを含んでもよい。かくして、抗（腫瘍抗原）抗体力価をモニタリングすることにより、腫瘍および／または転移に対する免疫応答を引き起こすか、または増強する際の治療方法の効果をモニターすることができる。本明細書で提供される治療方法はまた、腫瘍中に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができるウイルスを対象に投与することを含んでもよい。したがって、対象が抗腫瘍免疫応答も高めたことを示すか、または対象が抗腫瘍免疫応答を高める可能性があることを示すか、または対象が抗腫瘍免疫応答を高めることができることを示し得る、腫瘍または転移中に蓄積したウイルスに対する免疫応答を高める宿主の能力をモニターすることができる。
【０４４１】
他の例においては、抗体力価のモニタリングを、生成および／または収穫のための遺伝子産物または抗体のレベルのモニタリングに用いることができる。本明細書で提供されるように、腫瘍中に蓄積したウイルス中で外因性遺伝子を発現させることにより、タンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物を生成させるための方法を用いることができる。さらに、腫瘍中に蓄積したウイルスの外因性遺伝子発現により生成されたタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に対する抗体を生成させるための方法が本明細書で提供される。タンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に対する抗体力価のモニタリングは、腫瘍に蓄積したウイルスによるタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物の生成のレベルを示し、また、そのようなタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接示すことができる。
【０４４２】
ｄ．一般的健康診断のモニタリング
本明細書で提供される方法はまた、対象の健康をモニタリングする方法を含んでもよい。本明細書で提供されるいくつかの方法は、新生物疾患治療方法などの治療方法である。対象の健康のモニタリングを用いて、当技術分野で公知のように、治療方法の効果を決定することができる。本明細書で提供される方法はまた、対象にウイルスを投与する工程を含んでもよい。対象の健康のモニタリングを用いて、対象に投与されるウイルスの病原性を決定することができる。新生物疾患、感染症、または免疫関連疾患などの疾患をモニタリングするための様々な健康診断方法のいずれかを、当技術分野で公知のようにモニターすることができる。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、顔色、体温または他の観察可能な状態は、対象の健康を示し得る。さらに、対象からの試料中に１つまたは複数の構成要素の存在または非存在またはレベルは、対象の健康を示し得る。典型的な試料は、血液および尿試料を含んでもよく、１つまたは複数の構成要素の存在または非存在またはレベルを、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断テストを実施することにより決定することができる。対象の健康を示す構成要素の例としては、限定されるものではないが、白血球計数、ヘマトクリット、または反応性タンパク質濃度が挙げられる。
【０４４３】
ｅ．処置と協調したモニタリング
また、治療決定がモニタリングの結果に基づくものであってよい、治療をモニタリングする方法も本明細書で提供される。本明細書で提供される治療方法は、腫瘍および／または転移中に選択的に蓄積することができ、抗腫瘍免疫応答を引き起こすか、または増強することができるウイルスを対象に投与することを含んでもよい。そのような治療方法は、特定のウイルスの複数回の投与、第２のウイルスの投与、または治療化合物の投与を含む様々な工程を含んでもよい。対象に投与するためのウイルスまたは化合物の量、タイミングまたは種類の決定は、対象のモニタリングからの１つまたは複数の結果に基づくものであってよい。例えば、対象における抗体力価を用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、投与するウイルスもしくは化合物の種類、例えば、低い抗体力価がさらなるウイルスを投与する望ましさを示し得る場合、異なるウイルス、またはウイルス遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を決定することができる。別の例においては、対象の全体的な健康状態を用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、および投与するウイルスもしくは化合物の種類、例えば、対象が健康であることの決定が、さらなるウイルスを投与する望ましさを示し得る場合、異なるウイルス、またはウイルス遺伝子発現を誘導する化合物などの治療化合物を決定することができる。別の例においては、検出可能なウイルスにより発現された遺伝子産物のモニタリングを用いて、ウイルスもしくは化合物を投与することが望ましいかどうか、投与するウイルスもしくは化合物の量、および投与するウイルスもしくは化合物の種類を決定することができる。そのようなモニタリング方法を用いて、治療方法が有効であるかどうか、治療方法が対象に対して病原性であるかどうか、ウイルスが腫瘍または転移中に蓄積したかどうか、およびウイルスが正常な組織または臓器中に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような決定に基づいて、さらなる治療方法の望ましさおよび形態を誘導することができる。
【０４４４】
一例においては、治療方法が有効であるかどうかの決定を用いて、さらなる治療方法を誘導することができる。任意の様々なモニタリング方法を用いて、本明細書で提供されるように、またはさもなければ当技術分野で公知のように、治療方法が有効であるかどうかを決定することができる。モニタリング方法が、治療方法が有効であることを示す場合、ウイルスもしくは化合物のさらなる投与を含んでもよい、現在の治療経過を維持する決定を下すか、またはさらなる投与は必要ないとの決定を下すことができる。モニタリング方法が、治療方法が有効ではないことを示す場合、モニタリングの結果は、処置の経過を中止すべき（例えば、ウイルスが対象に対して病原性である場合）、または変更すべき（例えば、ウイルスが宿主生物を害することはないが、抗腫瘍免疫応答を惹起することもなく腫瘍中に蓄積する場合）、または頻度もしくは量を増加させるべき（例えば、ウイルスが腫瘍中にほとんどもしくは全く蓄積しない場合）かどうかを示し得る。
【０４４５】
一例においては、モニタリングは、ウイルスが対象に対して病原性であることを示してもよい。そのような例においては、対象へのウイルスの投与を終結させる、対象により低レベルのウイルスを投与する、対象に異なるウイルスを投与する、またはウイルスの病原性を低下させる化合物を対象に投与する決定を下すことができる。一例においては、病原性であると決定されたウイルスの投与を終結させることができる。別の例においては、病原性であると決定されたウイルスの投薬量を、その後の投与について減少させることができる；そのような例の１つの変形において、対象を、対象への病原性ウイルスの再投与の前に、腫瘍中に蓄積する病原性ウイルスの能力を増加させることができる別のウイルスで予備処置することができる。別の例においては、対象は、対象に対して病原性であるウイルスを投与されていてもよい；そのような病原性ウイルスの投与は、例えば、抗ウイルス化合物（例えば、シドフォビル）、病原性弱毒化化合物（例えば、溶解もしくはアポトーシス遺伝子産物の発現を下方調節する化合物）、または本明細書の他の場所に記載のように、ウイルスの増殖、毒性、もしくは細胞殺傷特性を減少させることができる他の化合物の投与を伴ってもよい。そのような例の１つの変形においては、ウイルスの局在化をモニターし、ウイルスが正常な組織または臓器中ではなく、腫瘍および／または転移中に蓄積されるとの決定の際に、抗ウイルス化合物または病原性弱毒化化合物の投与を終結させ、ウイルスの病原性活性を活性化または増加させるが、腫瘍および／または転移に限定させることができる。そのような例の別の変形においては、抗ウイルス化合物または病原性弱毒化化合物の投与を終結させた後、ウイルスの存在および／またはウイルスの病原性をさらにモニターし、ウイルスが、例えば、正常な臓器もしくは組織に拡散する、毒素を血管系に放出する、またはさもなければ腫瘍もしくは転移を超えて到達する病原性効果を有することにより、宿主に対して脅威を与えると決定された場合、そのような化合物の投与を再開することができる。
【０４４６】
別の例においては、モニタリングは、ウイルスが対象の腫瘍または転移中に蓄積したかどうかを決定することができる。そのような投与の際に、さらなるウイルス、異なるウイルスまたは化合物を対象にさらに投与する決定を下すことができる。別の例においては、腫瘍中のウイルスの存在のモニタリングを、ある化合物がウイルスの病原性、増殖、もしくは免疫原性を増加させることができる場合、またはさもなければある化合物がウイルスの増殖、毒性、腫瘍細胞殺傷、もしくは免疫応答惹起特性を増加させるウイルスと一緒になって作用することができる場合、その化合物を対象に投与する決定において用いることができる；そのような例の１つの変形においては、ウイルスは、例えば、そのような化合物の非存在下では溶解または細胞殺傷能力をほとんどまたは全く有さなくてもよい；そのような例のさらなる変形においては、腫瘍または転移中のウイルスの存在のモニタリングを、ウイルスが腫瘍または転移中に存在し、正常な臓器または組織中には全く存在しないか、または実質的に存在しない場合に化合物を投与する場合、正常な組織または臓器中のウイルスの非存在のモニタリングと結び付けることができる；そのような例のさらなる変形においては、ウイルスが十分なレベルで腫瘍または転移中に存在する場合に化合物を投与する場合、腫瘍または転移中のウイルスの量をモニターすることができる。
Ｈ．実施例
【０４４７】
以下の実施例は、説明の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例１】
【０４４８】
ＬＩＶＰのクローン単離物の単離
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１細胞［ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］を、ウェル当たり５×１０５細胞で６ウェルプレート中で平板培養し、細胞が９０％の培養密度に達した場合に、５％のＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて、３７℃で、一晩、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中で成長させた。ＣＶ−１細胞は、ワクシニアウイルスＬＩＶＰ［子ウシ皮膚にＬｉｓｔｅｒ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１５４９）を適合させることによって元々誘導したワクシニアウイルス株］の１０倍段階希釈溶液により二通り感染させた（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａ，  Ａｌ’ｔｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｄｏｋｌ．  Ａｋａｄ．  Ｎａｕｋ  ＵＳＳＲ  ２８５：６９６−６９９））。段階希釈溶液は、十分に分離されたプラークの単離を確実にするために感染のために用いた。感染の２日後、プレート上の他のプラークに比べて大きなプラーク表現型を示す、８つの十分に単離されたプラークを採集した。これらのプラークは、ＣＶ−１細胞において、さらに２回のプラーク精製にかけ、それぞれ、ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１と呼んだ。ＬＩＶＰ  １．１．１および４．１．１は、ＣＶ−１細胞において、他の単離物よりも大きなプラークを形成した。
【実施例２】
【０４４９】
様々な正常およびがん細胞株のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）感染
様々な正常およびがん細胞型におけるＬＩＶＰクローン単離物の成長を分析し、親ＬＩＶＰ株、ＬＩＶＰの２つの誘導株、ＧＬＶ−１ｈ６８（米国特許第７，５８８，７６７号を参照されたい）ならびにＧＬＶ−１ｈ７４（米国特許出願公開第２００９−００９８５２９号および第２００９−００５３２４４号を参照されたい）、ならびにワクシニアウイルスＷＲ（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１３５４）の成長と比較した。ＧＬＶ−１ｈ６８は、ＬＩＶＰ株の遺伝子座中にＤＮＡ挿入を含有する（配列番号９）。ＧＬＶ−１ｈ６８は、Ｆ１４．５Ｌ（ＬＩＶＰにおいてＦ３とも呼ばれる）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、および赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子座において検出可能なマーカータンパク質をコードする発現カセットを含有する。ワクシニア合成初期／後期プロモーターＰＳＥＬの制御下のＲｕｃ−ＧＦＰ  ｃＤＮＡ分子（ウミシイタケルシフェラーゼをコードするＤＮＡおよびＧＦＰをコードするＤＮＡの融合物）を含有する発現カセット（（ＰＳＥＬ）Ｒｕｃ−ＧＦＰ）を、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子座の中に挿入した；ワクシニア初期／後期プロモーターＰ７．５ｋの制御下にベータ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ分子（（Ｐ７．５ｋ）ＬａｃＺ）およびワクシニア合成初期／後期プロモーターＰＳＥＬに関して転写について逆向きに位置するラットトランスフェリン受容体をコードするＤＮＡ（（ＰＳＥＬ）ｒＴｒｆＲ）を含有する発現カセットを、ＴＫ遺伝子座の中に挿入した（タンパク質をコードするＤＮＡ分子がカセットにおいてプロモーターに関して転写について逆向きに位置するので、結果として生じるウイルスは、トランスフェリン受容体タンパク質を発現しない）；ワクシニア後期プロモーターＰ１１ｋの制御下にβ−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ分子を含有する発現カセット（（Ｐ１１ｋ）ｇｕｓＡ）を、ＨＡ遺伝子座の中に挿入した。Ｆ１４．５Ｌ、Ｊ２Ｒ、およびＡ５６Ｒ遺伝子座の３つの挿入物すべての欠失によってＧＬＶ−１ｈ６８から誘導したＧＬＶ−１ｈ７４。ＧＬＶ−１ｈ７４は、（ＰＳＥＬ）Ｒｕｃ−ＧＦＰの代わりにＦ１４．５Ｌ遺伝子座の中に挿入された非コードＤＮＡ分子、（ＰＳＥＬ）ｒＴｒｆＲおよび（Ｐ７．５ｋ）ＬａｃＺの代わりにＴＫ遺伝子座の中に挿入された非コードＤＮＡ分子、ならびに（Ｐ１１ｋ）ｇｕｓＡの代わりにＨＡ遺伝子座の中に挿入された非コードＤＮＡ分子を含有する。
【０４５０】
細胞株は、下記に示されるようにウイルスにより感染させ、ウイルス収量は、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中で成長させたＣＶ−１細胞［ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］に対して力価測定によって決定した。
【０４５１】
Ａ．  正常細胞株
１．  ＭＥＦマウス胚線維芽細胞
ＭＥＦ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ；カタログ＃００３２１）は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシン抗菌−抗真菌溶液［Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ（ＶＡ）］、３．５μＬ／Ｌ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｍ３１４８−２５ｍｌ）、および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、４．５ｇ／ＬグルコースおよびＬ−グルタミンを含み、ピルビン酸ナトリウムを含まない、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０−０１７−ＣＶ）中で成長させた。細胞は、５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０４５２】
感染のために、ＭＥＦ細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養培地中で１２−ウェルプレート（ウェル当たり１．５×１０５細胞で平板培養）において成長させ、３７℃で、１時間、０．０１のＭＯＩで、２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養培地中で、ワクシニアウイルスＷＲ、ＬＩＶＰ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、またはＬＩＶＰクローン単離物（１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１）により感染させた（８０〜９０％の培養密度で）。接種材料を吸引し、細胞単層を、２ｍＬのＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）により２回洗浄し、続いて、２ｍＬの細胞培養培地を、それぞれのウェルに追加した。それぞれのウイルス接種材料についてウイルス力価は、感染の同じ日にＣＶ−１細胞において確認した。それぞれのウイルスについて３つのウェルを、感染の１、２４、４８、および７２時間後に（ｈｐｉ）収集した。収集した細胞は、３サイクルの凍結融解にかけ、力価測定の前に全出力で１分間、３回超音波処理した。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４５３】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表７に示す。ＬＩＶＰ  ７．１．１は、試験した他のすべての単離物および株よりもよく複製し、株ＷＲは、わずかにだけ低い効率で複製した。ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、およびＬＩＶＰ  ２．１．１は、ＭＥＦ細胞において十分に複製しなかった。ＬＩＶＰ  ４．１．１は、親ＬＩＶＰおよびＬＩＶＰ  １．１．１、３．１．１、５．１．１よりもよく複製し、８．１．１は、親ＬＩＶＰよりもゆっくりと複製した。
【０４５４】
【表７】
2018171059.tif 000021
【０４５５】
Ｂ．  がん細胞株
１．  Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞
マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］は、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中で成長させた。細胞は、５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０４５６】
感染のために、Ｂ１６−Ｆ１０細胞は、６ウェルプレートにおいて成長させ（２％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で）、３７℃で、１時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＷＲ、ＬＩＶＰ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、またはＬＩＶＰクローン単離物（１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１）により感染させた。接種材料を吸引し、細胞単層を、２ｍＬのＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）により２回洗浄し、続いて、２ｍＬの細胞培養培地を、それぞれのウェルに追加した。それぞれのウイルス接種材料についてウイルス力価は、感染の同じ日にＣＶ−１細胞において確認した。それぞれのウイルスについて３つのウェルを、感染の２４、４８、および７２時間後に（ｈｐｉ）収集した。収集した細胞は、３サイクルの凍結融解にかけ、力価測定の前に全出力で１分間、３回超音波処理した。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４５７】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりのプラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表８に示す。ＧＬＶ−１ｈ６８は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞において最小限だけ複製した。ＧＬＶ−１ｈ７４は、検査したすべての時点でＧＬＶ−１ｈ６８よりもよく有意に（Ｐ＜０．０５）複製し、ＧＬＶ−１ｈ６８における異種遺伝子挿入物が、これらの細胞におけるこのウイルスの複製の速度を落としたことを示した。ＬＩＶＰ単離物２．１．１、３．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１は、複製がＧＬＶ−１ｈ７４と同様であったまたはそれよりもわずかにゆっくりであった。ＬＩＶＰ  ５．１．１は、２４および４８ｈｐｉで、ＧＬＶ−１ｈ７４よりもよく有意に（Ｐ＜０．０１）複製した。ＬＩＶＰ  １．１．１および親ウイルスＬＩＶＰは、同様にであるが、２４および４８ｈｐｉでＬＩＶＰ  ５．１．１よりもよく有意に（Ｐ＜０．０５）複製した。ＬＩＶＰ  ４．１．１は、２４ｈｐｉで複製において親ウイルスＬＩＶＰと同様であったが、４８（Ｐ＝０．０５７）および７２（Ｐ＝０．００３）ｈｐｉでＬＩＶＰよりもよかった。ワクシニアウイルスＷＲは、試験した他のすべてのウイルスよりもよく複製した。ＬＩＶＰ単離物の間のＢ１６−Ｆ１０細胞における複製能力における差異は、親ＬＩＶＰウイルス集団における遺伝的多様性を示した。
【０４５８】
【表８】
2018171059.tif 000022
【０４５９】
２．  ＤＵ  １４５ヒト前立腺癌細胞
ヒト前立腺癌ＤＵ  １４５細胞［ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］は、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、および１０％ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中で成長させた。細胞は、５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０４６０】
感染のために、ＤＵ１４５細胞は、６ウェルプレートにおいて成長させ（２％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ）、３７℃で、１時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＷＲ、ＬＩＶＰ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、またはＬＩＶＰクローン単離物（１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１）により感染させた。接種材料を吸引し、細胞単層を、２ｍＬのＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）により２回洗浄し、続いて、２ｍＬの細胞培養培地を、それぞれのウェルに追加した。それぞれのウイルス接種材料についてウイルス力価は、感染の同じ日にＣＶ−１細胞において確認した。それぞれのウイルスについて３つのウェルを、感染の２４、４８、および７２時間後に（ｈｐｉ）収集した。収集した細胞は、３サイクルの凍結融解にかけ、力価測定の前に全出力で１分間、３回超音波処理した。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４６１】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりのプラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表９に示す。ＧＬＶ−１ｈ６８は、ＤＵ  １４５細胞において適切に十分に複製した。ＧＬＶ−１ｈ７４は、検査したすべての時点でＧＬＶ−１ｈ６８よりもよく有意に（Ｐ＜０．０１）複製し、ＧＬＶ−１ｈ６８の外来挿入物が、ＤＵ  １４５細胞におけるこのウイルスの複製の速度を落としたことを示した。野生型ワクシニアウイルスＷＲは、ＤＵ  １４５細胞における複製においてＧＬＶ−１ｈ６８と同様であった。ＬＩＶＰ  ３．１．１およびＧＬＶ−１ｈ７４は、感染後の最初の２４時間、同様に複製した。４８および７２ｈｐｉでのＧＬＶ−１ｈ７４のウイルス収量は、ＬＩＶＰ  ３．１．１よりも有意に高度であった（Ｐ＜０．０１）。ＬＩＶＰならびにＬＩＶＰ単離物１．１．１、２．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１は、同様に複製したが、感染後の最初の２４時間、ＧＬＶ−１ｈ７４よりもよく有意に（Ｐ＜０．０１）複製した。
【０４６２】
【表９】
2018171059.tif 000023
【０４６３】
３．  ＣＴ２６．ＷＴマウス結腸癌細胞
マウスＣＴ２６．ＷＴ結腸癌細胞［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］は、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％ストレプトマイシン／アムホテリシン抗菌／抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％ＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、５．６ｍＬ／Ｌ  ４５％グルコース溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、および１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩにおいて成長させた。細胞は、５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０４６４】
感染のために、ＣＴ２６．ＷＴ細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培養培地中で６ウェルプレート（ウェル当たり５×１０５細胞で平板培養）において成長させ、２０分毎に回転させながら、３７℃で、１時間、０．０１のＭＯＩで、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培養培地中で、ワクシニアウイルスＷＲ、ＬＩＶＰ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、またはＬＩＶＰクローン単離物（１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１）により感染させた（８０〜９０％の培養密度で）。接種材料を吸引し、細胞単層を、２ｍＬのＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）により２回洗浄し、続いて、２ｍＬの細胞培養培地を、それぞれのウェルに追加した。それぞれのウイルス接種材料についてウイルス力価は、感染の同じ日にＣＶ−１細胞において確認した。それぞれのウイルスについて３つのウェルを、感染の１、２４、４８、および７２時間後に（ｈｐｉ）収集した。収集した細胞は、３サイクルの凍結融解にかけ、力価測定の前に全出力で１分間、３回超音波処理した。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４６５】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１０に示す。ＧＬＶ−１ｈ６８は、ＣＴ２６．ＷＴ細胞において最小限だけ複製した。ＧＬＶ−１ｈ７４は、検査したすべての時点でＧＬＶ−１ｈ６８よりもよく複製した。ワクシニアウイルスＷＲは、試験した他のすべてのウイルスよりもよく複製した。ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、ＬＩＶＰ  ４．１．１、および親ウイルスＬＩＶＰは、同様に複製し、それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ７４よりもよく複製した。ＬＩＶＰ単離物２．１．１、６．１．１、および７．１．１は、複製が同様であったまたはＧＬＶ−１ｈ７４よりもわずかにゆっくりであった。
【０４６６】
【表１０】
2018171059.tif 000024
【０４６７】
４．  ＭＣ−３８マウス腺がん細胞
マウスＭＣ−３８腺がん細胞（Ｊｏｃｈｅｎ  Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ）１％ピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％ストレプトマイシン／アムホテリシン抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、１％ＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、５．６ｍＬ／Ｌ  ４５％グルコース溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、および１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩにおいて成長させた。細胞は、５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０４６８】
感染のために、ＭＣ−３８細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培養培地中で６ウェルプレート（ウェル当たり５×１０５細胞で平板培養）において成長させ、３７℃で、１時間、０．０１のＭＯＩで、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培養培地中で、ワクシニアウイルスＷＲ、ＬＩＶＰ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４、またはＬＩＶＰクローン単離物（１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１）により感染させた（８０〜９０％の培養密度で）。接種材料を吸引し、細胞単層を、２ｍＬのＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）により２回洗浄し、続いて、２ｍＬの細胞培養培地を、それぞれのウェルに追加した。それぞれのウイルス接種材料についてウイルス力価は、感染の同じ日にＣＶ−１細胞において確認した。それぞれのウイルスについて３つのウェルを、感染の１、２４、４８、および７２時間後に（ｈｐｉ）収集した。収集した細胞は、３サイクルの凍結融解にかけ、力価測定の前に全出力で１分間、３回超音波処理した。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４６９】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１１に示す。ＧＬＶ−１ｈ６８は、ＭＣ−３８細胞において最小限だけ複製した。ＬＩＶＰ  ５．１．１は、１、２４、および４８時間の時点で最もよく複製し、ＷＲのみが７２時間の時点でよりよく複製した。ＬＩＶＰは、ＧＶ−１ｈ７４よりもわずかによく複製した。ＬＩＶＰ単離物２．１．１、６．１．１、および８．１．１は、複製が同様であったまたはＧＬＶ−１ｈ７４よりもわずかにゆっくりであった。
【０４７０】
【表１１】
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【実施例３】
【０４７１】
抗ＶＥＧＦ単鎖抗体をコードするウイルスの構築
１．  ＧＬＶ−１ｈ１６４
本実施例において、ＶＡＣＶ合成後期プロモーターの制御下のＡ５６Ｒ遺伝子座に挿入された単鎖抗ＶＥＧＦ抗体遺伝子（Ｇ６；配列番号７３）を含む遺伝子（ＧＬＡＦ−２）を含有するＧＬＶ−１ｈ１６４を、二重相互乗換えによってＧＬＶ−１ｈ１００から生成した。ＧＬＶ−１ｈ１００は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）相同組換えを通して、ｈＮＥＴ発現カセットと、Ｊ２Ｒ遺伝子座のβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを交換することによって、ＧＬＶ−１ｈ６８から誘導した（米国特許第７，５８８，７６７号および米国特許公開第２００９−０１１７０３４を参照されたい）。
【０４７２】
【表１２】
2018171059.tif 000026
【０４７３】
Ｉｇカッパ軽鎖リーダー配列、Ｇ６  ＦａｂのＶＨ鎖配列、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列、Ｇ６  ＦａｂのＶＬ鎖配列、およびＣ末端ＤＤＤＤＫ配列（配列番号１８）を含有する単鎖抗ＶＥＧＦ抗体ＧＬＡＦ−１（配列番号１２および２１）をコードするＤＮＡを含有するプラスミド０６０８９９７−ｐＧＡ４を、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。鋳型としてのこのベクターを使用して、プライマーＰ−Ｇ６−ｆｏｒ−ｂ（５’−ｇｔｃｇａｃｃｃａｃｃａｔｇｇａｇａｃ−３’、配列番号１９）およびＰ−Ｇ６−ｒｅｖ−ｂ（５’−ｔｔａａｔｔａａｔｔａｔｃｇｃｔｔａａｔｃｔｃａａｃｃｔｔｇｇｔｃｃｃ−３’、配列番号２０）を用いてＰＣＲを実行し、ＤＤＤＤＫ配列を有していない、ＧＬＡＦ−１（配列番号１２および２１）の遺伝子配列のバージョンを増幅した（ＧＬＡＦ−２、配列番号２２）。最終的なプラスミドを構築するために、二重相互乗換えを通してのＶＡＣＶゲノムにおけるＡ５６Ｒ遺伝子座の中への外来遺伝子の相同組換えのためにあらかじめ構築した、ＶＡＣＶ  ＤＮＡ相同性ベースのシャトルプラスミドｐＨＡ−ＰＳＬ−ｈＮＥＴ−１（配列番号２３）を使用した。ＧＬＡＦ−２断片は、ＳａｌＩおよびＰａｃＩ部位を介してフレームワークプラスミドの中にクローニングし、それによって、ｈＮｅｔ−１  ｃＤＮＡ配列をＧＬＡＦ−２  ｃＤＮＡと交換し、プラスミドｐＨＡ−ＰＳＬ−ＧＬＡＦ−２がもたらされた。
【０４７４】
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＣＣＬ−７０（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］を、ウイルス生成および産生のために使用した。細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。ＣＶ−１細胞は、１時間、０．１のＭＯＩでＧＬＶ−１ｈ１６４により感染させた。その後、感染細胞は、ｐＨＡ−ＰＳＬ−ＧＬＡＦ−２導入ベクターによりＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してトランスフェクトした。感染の２日後に、感染／トランスフェクト細胞を、収集し、組換えウイルスを選択し、以前に記載されるような標準的な方法を使用してプラークを精製した（Ｆａｌｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９９０）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６４：３１０８−３１１１）。
【０４７５】
コンフルエントなＣＶ−１細胞（感染の前日にフラスコ当たり２×１０７細胞で接種）の１０本のＴ２２５フラスコを、０．１のＭＯＩでそれぞれのウイルスにより感染させた。感染細胞は、感染の２日後に収集し、ガラス製ダンス型ホモジェナイザーを使用して溶解した。細胞溶解物は、５分間、１，８００ｇでの遠心分離によって浄化し、その後、３６％スクロースのクッション上で層にし、２時間、ＨＢ−６ローター、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにおいて１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。ウイルスペレットは、１ｍｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０中に再懸濁し、無菌の２４％〜４０％の連続スクロース勾配上にロードし、５０分間、２６，０００ｇで遠心分離した。ウイルスバンドを収集し、２容量の１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を使用して希釈し、その後、６０分間、ＨＢ−６ローターにおいて１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。最終的なウイルスペレットは、１ｍｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０中に再懸濁し、力価を、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７０）において決定した。
【０４７６】
２．  ＧＬＶ−１ｈ１０９
ＧＬＶ−１ｈ１０９の生成は、米国特許第８，０５２，９６８号において記載される。ＧＬＶ−１ｈ１０９は、Ａ５６Ｒ遺伝子座の中へのＧＬＡＦ−１（配列番号１２および２１）をコードする遺伝子によるＬａｃＺ遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ）の交換によってＧＬＶ−１ｈ６８株（配列番号９）から誘導した。ＧＬＡＦ−１遺伝子は、抗ＶＥＧＦ単鎖抗体Ｇ６をコードするが、ＶＡＣＶ合成後期（ＳＬ）プロモーターの制御下にある。
【０４７７】
３．  ＧＬＶ−１ｈ１５８
ＧＬＶ−１ｈ１５８は、Ｊ２Ｒ遺伝子座の中へのＧＬＡＦ−２（配列番号２２）をコードする遺伝子によるｇｕｓＡ遺伝子（ベータ−グルクロニダーゼ）の交換によってＧＬＶ−１ｈ６８株（配列番号９）から誘導した。ＧＬＡＦ−２遺伝子は、抗ＶＥＧＦＲ単鎖抗体Ｇ６をコードするが、ＶＡＣＶ合成初期／後期（ＳＥＬ）プロモーターの制御下にある。
【０４７８】
４．  ＧＬＶ−１ｈ１６３
ＧＬＶ−１ｈ１６３は、Ａ５６Ｒ遺伝子座の中へのＧＬＡＦ−２（配列番号２２）をコードする遺伝子によるｇｕｓＡ遺伝子（ベータ−グルクロニダーゼ）の交換によってＧＬＶ−１ｈ１００株（上記、実施例３．１において記載される）から誘導した。ＧＬＡＦ−２遺伝子は、ＶＡＣＶ合成初期／後期（ＳＥＬ）プロモーターの制御下にある。さらに、ＧＬＶ−１ｈ１６３は、Ｊ２Ｒ遺伝子座の中にＶＡＣＶ合成初期（ＳＥ）プロモーターの制御下のヒトノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）を持つ。
【実施例４】
【０４７９】
ＬＩＶＰ単離物１．１．１によるインビトロウイルス複製研究
本実施例において、いくつかのがん細胞株におけるＬＩＶＰ単離物１．１．１のインビトロウイルス複製を検査し、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８（実施例１および米国特許第７，５８８，７６７号において記載される）ならびにＧＬＶ−１ｈ１６４（実施例３において上述される）と比較した。さらに、ウイルスはそれぞれ、下記に記載されるように、照射による前処理の後に評価した。
【０４８０】
１．  Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞
マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］は、ＤＭＥＭ培地中で成長させ、３７℃で、２４、４８、または７２時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰクローン単離物１．１．１により感染させた。
【０４８１】
放射線処理：細胞は、ウイルス感染の１日前に６Ｇｙの線量で照射した、または放射線を受けなかった。照射は、ＲＳ２０００  Ｘ−ｒａｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、１回の分割として投与した。放射線の線量率は、１Ｇｙ／分とした。
【０４８２】
ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１３に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０細胞におけるウイルス複製の増強を有意に示した。
【０４８３】
【表１３】
2018171059.tif 000027
【０４８４】
２．  Ａ５４９ヒト肺癌細胞
ヒトＡ５４９肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で成長させ、３７℃で、２４、４８、または７２時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４８５】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１４に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、Ａ５４９細胞におけるウイルス複製の増強を示した。
【０４８６】
【表１４】
2018171059.tif 000028
【０４８７】
３．  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣ）は、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地中で成長させ、３７℃で、２４、４８、または７２時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４８８】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１５に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるウイルス複製の増強を有意に示した。
【０４８９】
【表１５】
2018171059.tif 000029
【０４９０】
４．  ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵癌細胞
ヒトＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵癌細胞（ＡＴＣＣ）は、ＤＭＥＭ培地中で成長させ、３７℃で、２４、４８、または７２時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４９１】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１６に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞におけるウイルス複製の増強を示した。
【０４９２】
【表１６】
2018171059.tif 000030
【０４９３】
５．  ＰＣ−３ヒト前立腺がん細胞
ヒトＰＣ−３前立腺がん細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で成長させ、３７℃で、２４、４８、および７２時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４９４】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１７に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、ＰＣ−３細胞におけるウイルス複製の増強をわずかに示した。
【０４９５】
【表１７】
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【０４９６】
６．  Ｕ−８７ＭＧヒト膠芽腫星状細胞腫細胞
ヒトＵ−８７ＭＧ膠芽腫星状細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）は、ＤＭＥＭ中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。ウイルスは、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において二通り、力価を測定した。
【０４９７】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１８に示す。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４と比較して、Ｕ−８７細胞におけるウイルス複製の増強を示した。
【０４９８】
【表１８】
2018171059.tif 000032
【実施例５】
【０４９９】
ＬＩＶＰ単離物５．１．１によるインビトロウイルス複製研究
本実施例において、ＬＩＶＰ単離物５．１．１のインビトロウイルス複製を、Ａ５４９ヒト肺癌および４Ｔ１マウス乳がん細胞において検査し、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８（実施例１および米国特許第７，５８８，７６７号において記載される）と比較した。ウイルス成長は、上清および細胞溶解物において評価した。
【０５００】
１．  Ａ５４９ヒト肺癌細胞
ヒトＡ５４９肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で２４ウェルプレートにおいて成長させ、３７℃で、０．１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８またはＬＩＶＰ単離物５．１．１により感染させた。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の１、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間後に収集し、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において三通り、力価を測定した。
【０５０１】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表１９に示す。データは、ＬＩＶＰ  ５．１．１が、Ａ５４９細胞において、ＧＬＶ−１ｈ６８よりも効率的に複製することができることを示す。
【０５０２】
【表１９】
2018171059.tif 000033
【０５０３】
２．  ４Ｔ１マウス乳がん細胞
マウス４Ｔ１乳がん細胞（ＡＴＣＣ）は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４ウェルプレートにおいて成長させ、３７℃で、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８またはＬＩＶＰ単離物５．１．１により感染させた。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の２、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間後に収集し、標準的な方法を使用して、ＣＶ−１細胞において三通り、力価を測定した。
【０５０４】
結果は、１ミリリットル（ｐｆｕ／ｍＬ）当たりの平均プラーク形成単位として表現される複製効率および標準偏差を記載する下記の表２０に示す。データは、ＬＩＶＰ  ５．１．１が、４Ｔ１細胞において、ＧＬＶ−１ｈ６８よりも効率的に複製することができることを示す。
【０５０５】
【表２０】
2018171059.tif 000034
【実施例６】
【０５０６】
ＬＩＶＰクローン単離物のインビトロ細胞傷害性
本実施例において、ＬＩＶＰ単離物１．１．１および５．１．１のウイルス細胞傷害性は、ＸＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、様々ながん細胞株においてインビトロにおいて測定した。毒性は、事前の放射線処理ありまたはなしで測定した。
【０５０７】
Ａ．ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１のインビトロ細胞傷害性
１．  Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞
マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞［ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］は、ＤＭＥＭ培地中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰクローン単離物１．１．１により感染させた。
【０５０８】
放射線処理（ＸＲＴ）：細胞は、ウイルス感染の１日前に６Ｇｙの線量で照射し、放射線を受けなかった細胞と比較した。照射は、ＲＳ２０００  Ｘ−ｒａｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、１回の分割として投与した。放射線の線量率は、１Ｇｙ／分とした。
【０５０９】
細胞毒性は、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ）により感染の１、３、５、および７日後に測定した。ウイルス感染後のそれぞれの時点で、５０μＬ  ＸＴＴ標識混合物をウェル当たりに追加し、６．５％ＣＯ２と共に３７℃で４時間インキュベートした。試料の分光光度的吸光度は、マイクロプレート（ＥＬＩＳＡ）リーダーを使用して測定した。ホルマザン産物の吸光度を測定するための波長は、使用するＥＬＩＳＡリーダーに利用可能なフィルターによれば４５０〜５００ｎｍである。基準波長は、６５０ｎｍを超えた。
【０５１０】
結果は、下記の表２１に記載する。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、感染の３〜５日後に、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞のわずかにより高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞における細胞傷害性を増強しなかった。
【０５１１】
【表２１】
2018171059.tif 000035
【０５１２】
２．  Ａ５４９ヒト肺癌細胞
ヒトＡ５４９肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の１、３、５、および７日後に測定した。
【０５１３】
結果は、下記の表２２に記載する。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、Ａ５４９肺癌細胞の有意により高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、Ａ５４９細胞における細胞傷害性を増強しなかった。
【０５１４】
【表２２】
2018171059.tif 000036
【０５１５】
３．  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（ＡＴＣＣ）は、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の１、３、５、および７日後に測定した。
【０５１６】
結果は、下記の表２３に記載する。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の有意により高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＬＩＶＰ  １．１．１の細胞傷害性を増強しなかったが、ＧＬＶ−１ｈ１６４株の細胞傷害性を増強した。
【０５１７】
【表２３】
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【０５１８】
４．  ＭＩＡ  ＰａＣａ−２ヒト膵癌細胞
ヒトＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵癌細胞（ＡＴＣＣ）は、ＤＭＥＭ培地中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射したまたは放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の１、３、５、および７日後に測定した。
【０５１９】
結果は、下記の表２４に示す。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵癌細胞の有意により高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、ＭｉａＰａＣａ−２細胞におけるＬＩＶＰ  １．１．１の細胞傷害性をわずかに増強した。
【０５２０】
【表２４】
2018171059.tif 000038
【０５２１】
５．  ＰＣ−３ヒト前立腺がん細胞
ヒトＰＣ−３前立腺がん細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の１、３、５、および７日後に測定した。
【０５２２】
結果は、下記の表２５に記載する。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、ＰＣ−３前立腺がん細胞のより高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、ＰＣ−３細胞におけるＬＩＶＰ  １．１．１の細胞傷害性をわずかに増強した。
【０５２３】
【表２５】
2018171059.tif 000039
【０５２４】
６．  Ｕ−８７ＭＧヒト膠芽腫星状細胞腫細胞
ヒトＵ−８７ＭＧ膠芽腫星状細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）は、成長させ、３７℃で、２４時間、０．０１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１６４、またはＬＩＶＰ単離物１．１．１により感染させた。細胞は、上述されるように、６Ｇｙのガンマ線により照射した、または放射線処理を受けなかった。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の１、３、５、および７日後に測定した。
【０５２５】
結果は、下記の表２６に記載する。細胞傷害性有効性は、未処理に対して標準化した細胞生存度（細胞死なし＝１）として表現する。表において示されるように、ＬＩＶＰ  １．１．１は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＧＬＶ−１ｈ１６４処理と比較して、Ｕ−８７ＭＧ膠芽腫星状細胞腫細胞の有意により高度な細胞傷害性を誘導した。放射線処理は、Ｕ−８７ＭＧ細胞におけるＬＩＶＰ  １．１．１の細胞傷害性を増強しなかったが、ＧＬＶ−１ｈ１６４株の細胞傷害性をわずかに増強した。
【０５２６】
【表２６】
2018171059.tif 000040
【０５２７】
Ｂ．  ＬＩＶＰクローン単離物５．１．１のインビトロ細胞傷害性
１．  Ａ５４９ヒト肺癌細胞
ヒトＡ５４９肺癌細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地中で四通り２４ウェルプレートにおいて成長させ、３７℃で、２４時間、０．１のＭＯＩで、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＶＰ単離物５．１．１、ＰＢＳ、ＧＬＶ−１ｈ６８＋５μＭ  ＳＴ−２４６、ＬＩＶＰ  ５．１．１＋５μＭ  ＳＴ−２４６、またはＰＢＳ＋５μＭ  ＳＴ−２４６により感染させた。細胞毒性は、上述されるように、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）、Ｒｏｃｈｅにより感染の２４、４８、および７２時間後に測定した。
【０５２８】
結果は、平均細胞生存および標準偏差を記載する下記の表２７に示す。ＬＩＶＰ  ５．１．１ウイルス感染は、細胞培養において、ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、Ａ５４９細胞のより効率的な根絶をもたらした。５μＭ  ＳＴ−２４６の追加は、ＬＩＶＰ  ５．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８によるＡ５４９細胞の根絶を低下させた。
【０５２９】
【表２７】
2018171059.tif 000041
【実施例７】
【０５３０】
インビボにおける生存および腫瘍成長に対するＬＩＶＰクローン単離物の効果
Ａ．  ＤＵ１４５ヒト前立腺癌異種移植片に対するウイルスの効果
ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１のインビボ効果は、ヒト前立腺がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；４〜５週齢）に、ＤＵ１４５細胞［ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］を皮下注射し（１００μＬ  ＰＢＳ中１．０×１０７細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の１３日後に、マウスのグループに、７．０×１０５ｐｆｕ  ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、もしくは８．１．１、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ７４  または野生型ＬＩＶＰ（１００μＬのＰＢＳ中）、またはＰＢＳのみを後眼窩注射（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を介して投与した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の１３、２０、２７、３４、４１、４８、５５、６２、および６９日後に測定した。
【０５３１】
それぞれのウイルスについて治療係数は、式：ＡＵＣ未処理−ＡＵＣウイルス／ＡＵＣ未処理＊１００を使用して計算した。試験したそれぞれのグループについての曲線下面積（ＡＵＣ）は、時間（ｘ）に対する腫瘍体積の変化中央値（ｙ）のグラフを使用して計算した。それぞれのグループについてのプロットデータのＡＵＣは、台形公式を使用して計算した。手短かに言えば、それぞれの時間間隔（７日）について、［（その時間間隔の最終日の腫瘍体積における変化中央値）＋（その時間間隔の第１の日の腫瘍体積における変化中央値）／２＊（間隔の間の時間）（７日）］の式を、その時間間隔についてのＡＵＣを計算するために使用した。それぞれのプロット系についてのＡＵＣの合計は、それぞれの時間間隔についてのＡＵＣを足し（腫瘍移植後５５日目まで）、７（第１の時間間隔）を掛けることによって計算した。
【０５３２】
ウイルスの毒性を測定するために、実験の経過にわたるマウスの正味の体重および生存をモニターした。正味の体重（グラム）は、動物の全体重から腫瘍（腫瘍体積／１０００）の重量を引くことによって計算した。最終的な重量は、腫瘍を含まない動物の重量に相当する。
【０５３３】
結果は、下記の表２８〜３１に記載する。表２８は、腫瘍体積中央値を記載する。表２９は、それぞれのウイルスについての最終的なＡＵＣおよび治療指標を記載する。表３０は、マウスの正味の体重を記載する。表３１は、マウスの生存率のパーセンテージについてのデータを記載する。ＬＩＶＰ  １．１．１、５．１．１、６．１．１、およびＧＬＶ−１ｈ６８は、最も毒性ではなく、すべてのマウスが、腫瘍細胞移植後５７日間生存し、体重を維持した。試験したウイルスはすべて、腫瘍細胞成長における低下を引き起こした。ＬＩＶＰクローン単離物はすべて、ＧＬＶ−１ｈ６８よりも高度な治療指標を有した。ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、５．１．１、および６．１．１は、好適な腫瘍低下を示し、いかなる細胞傷害性副作用も有しなかった。
【０５３４】
【表２８】
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【０５３５】
【表２９】
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【０５３６】
【表３０】
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【０５３７】
【表３１】
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【０５３８】
Ｂ．  ＤＵ１４５ヒト前立腺癌異種移植片に対するウイルスの効果−用量研究
ＬＩＶＰ  １．１．１、５．１．１、および６．１．１の用量の増加についてのインビボにおける効果は、ヒト前立腺がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの様々な用量についての安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；４〜５週齢；グループ当たりｎ＝８）に、ＤＵ１４５細胞［ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］を皮下注射し（１００μＬ  ＰＢＳ中６．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の１３日後に、グループのマウスに、ＬＩＶＰ単離物１．１．１（７．０×１０５ｐｆｕ、２．０×１０６ｐｆｕ、もしくは１×１０７ｐｆｕ）、５．１．１（７．０×１０５ｐｆｕ、２．０×１０６ｐｆｕ、もしくは１×１０７ｐｆｕ）、または６．１．１（７．０×１０５ｐｆｕ、２．０×１０６ｐｆｕ、もしくは１×１０７ｐｆｕ）、ＧＬＶ−１ｈ６８（７．０×１０５ｐｆｕ、２．０×１０６ｐｆｕ、もしくは１×１０７ｐｆｕ（１００μＬのＰＢＳ中）、または、ＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の１３、２０、２７、３４、４１、４８、５５、６２、および６９日後に測定した。ＡＵＣ、治療指標、および生存率は、上の実施例７Ａにおいて記載されるように計算した。
【０５３９】
結果は、下記の表３２〜３５に記載する。表３２は、腫瘍体積中央値を記載する。表３３は、それぞれのウイルスについての最終的なＡＵＣおよび治療指標を記載する。表３４は、マウスの正味の体重を記載する。表３５は、マウスの生存率のパーセンテージについてのデータを記載する。ＤＵ１４５腫瘍成長における減少は、ＬＩＶＰ単離物１．１．１、５．１．１、６．１．１、およびＧＬＶ−１ｈ６８のすべての用量による処理の後に観察された。２．０×１０６ｐｆｕの投薬により、試験したすべてのウイルスについて最も高度な治療指標がもたらされた。ＧＬＶ−１ｈ６８は、最も毒性であり、ＬＩＶＰ  ５．１．１は、最も毒性ではなく、ＬＩＶＰ単離物１．１．１および６．１．１は、同様の毒性を有する。
【０５４０】
【表３２】
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【０５４１】
【表３３】
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【０５４２】
【表３４】
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【０５４３】
【表３５】
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【０５４４】
Ｃ．  ＯＥ１９ヒト食道癌異種移植片に対するＬＩＶＰ  １．１．１の効果
ＬＩＶＰ  １．１．１のインビボにおける効果は、ヒト食道がんのマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；４〜５週齢；グループ当たりｎ＝５）に、ＯＥ１９細胞（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を皮下注射し（１００μＬ  ＰＢＳ中２．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の１３日後に（腫瘍サイズ＞３００ｍｍ３）、グループのマウス（ｎ＝５）に、２．０×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ単離物１．１．１、ＧＬＶ−１ｈ６８、またはＧＬＶ−１ｈ１６４（１００μＬのＰＢＳ中）、またはＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の１３、２０、２７、３４、４１、４８、５５、および６２日後に測定した。
【０５４５】
ウイルスの毒性を測定するために、実験の経過にわたるマウスの正味の体重および生存をモニターした。正味の体重（グラム）は、動物の全体重から腫瘍（腫瘍体積／１０００）の重量を引くことによって計算した。最終的な重量は、腫瘍を含まない動物の重量に相当する。
【０５４６】
結果は、下記の表３６〜３８に記載する。表３６は、腫瘍体積中央値を記載する。表３７は、マウスの正味の体重を記載する。表３８は、マウスの生存率のパーセンテージについてのデータを記載する。ＬＩＶＰ単離物１．１．１は、ＯＥ１９腫瘍細胞成長を低下させるのに最も有効であった。未処理マウスおよびＧＬＶ−１ｈ６８により処理したマウスは、腫瘍サイズおよび／または健康に関する問題により３５日目までに安楽死させた。ＧＬＶ−１ｈ６４およびＬＩＶＰ単離物１．１．１による処理は、腫瘍サイズおよび全体的な健康状態を低下させ、生存率を増加させた。
【０５４７】
【表３６】
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【０５４８】
【表３７】
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【０５４９】
【表３８】
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−＝マウスはマウスの腫瘍サイズおよび／または健康状態により殺した
【０５５０】
Ｄ．  Ｕ−８７ＭＧヒト膠芽腫異種移植片に対するＬＩＶＰ  １．１．１の効果
ＬＩＶＰ  １．１．１のインビボにおける効果は、ヒト神経膠腫のマウスモデルを使用して評価した。ウイルスの安全性および抗腫瘍性の有効性を評価するために、オスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；４〜５週齢）に、Ｕ−８７ＭＧ膠芽腫星状細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射し（１００μＬ  ＰＢＳ中５．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）、腫瘍を確立した。腫瘍細胞移植の１４日後に（腫瘍サイズ＞２００ｍｍ３）、グループのマウス（ｎ＝８）に、２．０×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ単離物１．１．１もしくはＧＬＶ−１ｈ６８（１００μＬのＰＢＳ中）またはＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の−１、２、６、９、１３、１６、２０、２３、２７、３０、３４、３７、４１、４４、４８、５１、および５５日後に測定した。
【０５５１】
ウイルスの毒性を測定するために、実験の経過にわたるマウスの正味の体重および生存をモニターした。正味の体重（グラム）は、動物の全体重から腫瘍（腫瘍体積／１０００）の重量を引くことによって計算した。最終的な重量は、腫瘍を含まない動物の重量に相当する。
【０５５２】
腫瘍体積中央値の結果は、表３９に提供する。腫瘍成長は、腫瘍体積の比（Ｖ／Ｖｏ）によって示されるように、表４０に記載する。正味の体重は、表４１に記載する。正味の体重は、すべての動物についての安定したままであった。ＬＩＶＰ単離物１．１．１は、対照よりもわずかによかったＧＬＶ−１ｈ６８よりも腫瘍成長を阻害するのにより有効であった。
【０５５３】
【表３９】
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【０５５４】
【表４０】
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【０５５５】
【表４１】
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【０５５６】
Ｅ．  Ｕ８７ヒト膠芽腫異種移植片に対する、照射前および／または照射後と組み合わせた、ＬＩＶＰ  １．１．１の効果
ＬＩＶＰ  １．１．１のインビボにおける効果は、ヒト神経膠腫のマウスモデルを使用して評価した。実験の詳細は、下記の表４２に記載する。腫瘍は、オスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；４〜５週齢）に、Ｕ−８７ＭＧ膠芽腫星状細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射することによって（１００μＬ  ＰＢＳ中５．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の１３日後に、いくつかのグループのマウスは、６Ｇｙもしくは３．５Ｇｙで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍細胞移植の１４日後に（腫瘍サイズ＞２００ｍｍ３）、グループのマウスに、２．０×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ単離物１．１．１もしくはＧＬＶ−１ｈ６８（１００μＬのＰＢＳ中）またはＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。ウイルス注射の１日後に、いくつかのグループのマウスは、６Ｇｙもしくは３．５Ｇｙで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の−１、３、６、９、１３、１６、２０、２３、２７、３０、３４、３７、４１、および４４日後に測定した。健康な器官におけるＬＩＶＰ  １．１．１のウイルス分布は、感染後３および７日目にウイルス力価（ｐｆｕ）を測定することによって評価した。
【０５５７】
【表４２】
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【０５５８】
データは、下記の表４３〜５０に記載する。表４３および４４は、ＬＩＶＰ  １．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８についての腫瘍体積中央値および分数の腫瘍体積（Ｖ／Ｖｏ）によって示される腫瘍成長を記載する。表４５および４６は、ＬＩＶＰ  １．１．１および６Ｇｙ放射線についての腫瘍体積中央値および分数の腫瘍体積（Ｖ／Ｖｏ）によって示される腫瘍成長を記載する。表４７および４８は、ＬＩＶＰ  １．１．１および３．５Ｇｙ放射線についての腫瘍体積中央値および分数の腫瘍体積（Ｖ／Ｖｏ）によって示される腫瘍成長を記載する。正味の体重は、表４９に記載する。表５０は、健康な器官におけるＬＩＶＰ  １．１．１のウイルス分布を記載する。
【０５５９】
ＬＩＶＰ単離物１．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８は、注射の２０日後から開始して腫瘍成長を低下させた。６Ｇｙの放射線による処理は、腫瘍成長におけるわずかな遅延をもたらした。ＬＩＶＰ  １．１．１の投与前および後の処理６Ｇｙ放射線は、腫瘍成長における著しい減少をもたらした。３．５Ｇｙの放射線の２回の線量による処理は、３日間、腫瘍成長を遅延させたが、成長を阻害しなかった。ＬＩＶＰ  １．１．１の投与の１日前および１日後の処理３．５Ｇｙ放射線は、腫瘍成長における著しい減少をもたらした。正味の体重は、すべての動物についての安定したままであった。
【０５６０】
【表４３】
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【０５６１】
【表４４】
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【０５６２】
【表４５】
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【０５６３】
【表４６】
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【０５６４】
【表４７】
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【０５６５】
【表４８】
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【０５６６】
【表４９】
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【０５６７】
【表５０】
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【０５６８】
Ｆ．  マウスメラノーマ同種移植片に対する照射前と組み合わせたＬＩＶＰ  １．１．１の効果
ＬＩＶＰ  １．１．１のインビボにおける効果は、メラノーマの同種移植片マウスモデルを使用して評価した。実験の詳細は、下記の表５１に記載する。腫瘍は、メスマウス（Ｈａｒｌａｎ）に、Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射（１００μＬ  ＰＢＳ中２．０×１０５細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）することによってＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の１３日後に、いくつかのグループのマウスは、６Ｇｙもしくは４Ｇｙで照射した、または処理を受けなかった。腫瘍細胞移植の１４日後に（腫瘍サイズ＞２００ｍｍ３）、グループのマウスに、５．０×１０７ｐｆｕ  ＬＩＶＰ単離物１．１．１もしくはＧＬＶ−１ｈ６８（１００μＬのＰＢＳ中）またはＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。いくつかのグループのマウスは、ウイルス注射の１、６、および８日後にさらに４Ｇｙの用量の放射線を受けた、または処理を受けなかった。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射の−１、２、６、８、１３、１６、および２０日後に測定した。
【０５６９】
【表５１】
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【０５７０】
平均腫瘍体積の結果は、表５２に提供する。分数の腫瘍体積（Ｖ／Ｖｏ）は、表５３に記載する。表５４は、腫瘍が５０の分数の腫瘍体積（５０のＦＴＶ）に達する平均時間を記載する。５０のＦＴＶは、３７５０ｍｍ３〜５０００ｍｍ３の腫瘍体積、マウスを実験から除去しなければならないエンドポイントに相当する。ＬＩＶＰ  １．１．１による処理は、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞における腫瘍体積のわずかな減少をもたらした。６Ｇｙの放射線およびＬＩＶＰ  １．１．１による処理は、６Ｇｙの放射線のみによる処理と同様であり、５０の分数の腫瘍体積に達する時間における、およそ７日間の遅延をもたらした。４Ｇｙの放射線の４回の線量およびＬＩＶＰ  １．１．１による処理は、腫瘍体積を低下させ、５０のＦＴＶに達する平均時間を１４日間まで遅延させた。
【０５７１】
【表５２】
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【０５７２】
【表５３】
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【０５７３】
【表５４】
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【０５７４】
Ｇ．  Ａ５４９ヒト肺癌異種移植片に対するＬＩＶＰ  ５．１．１の効果
ＬＩＶＰ  ５．１．１のインビボにおける効果は、ヒト肺がんのマウスモデルを使用してさらに評価した。腫瘍は、メスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；６〜８週齢）に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射（１００μＬ  ＰＢＳ中５．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）することによってヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の１７日後に（腫瘍サイズ＞２５０ｍｍ３）、グループのマウスに、５．０×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ  ５．１．１、ＧＬＶ−１ｈ６８（１００μＬのＰＢＳ中）、ＬＩＶＰ  １．１．１＋２．５μＭ  ＳＴ−２４６、ＧＬＶ−１ｈ６８＋２．５μＭ  ＳＴ−２４６、またはＰＢＳのみを後眼窩注射を介して投与した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、がん細胞注射後、週に二度測定した。マウスは、移植の４２日後に安楽死させ、ウイルス力価は、標準的な技術を使用して腫瘍および器官において決定した。
【０５７５】
腫瘍体積中央値の結果は、表５５に提供する。平均体重は、表５６に記載する。腫瘍および器官におけるウイルス力価は、腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、血清、および脳についてのｐｆｕ／組織グラムのウイルス力価を列挙する下記の表５７に記載する。ウイルスにより処理したマウスはすべて、ＰＢＳ対照と比較して、有意な腫瘍低下を示した。ＬＩＶＰ  ５．１．１を注射した動物の腫瘍後退は、ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、多少増加した。ＬＩＶＰ  ５．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８に加えて２．５μＭ  ＳＴ−２４６、抗ウイルス剤を追加すると、ウイルスがそれぞれ腫瘍サイズを低下させる能力を減少させたが、腫瘍低下は、ＰＢＳのみによる処理よりも大きかった。ＧＬＶ−１ｈ６８は、平均体重における減少によって証拠付けられるように、マウスに対してわずかに毒性であった。ＳＴ−２４６の追加は、ＧＬＶ−１ｈ６８により処理したマウスにおいて毒性を低下させた。ＧＬＶ−１ｈ６８およびＬＩＶＰ単離物５．１．１は、主に腫瘍組織において同定され、脳および肝臓もまた、ウイルス粒子を含有した。
【０５７６】
【表５５】
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【０５７７】
【表５６】
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【０５７８】
【表５７】
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【実施例８】
【０５７９】
Ａ５４９細胞および腫瘍におけるＬＩＶＰ  ５．１．１およびＧＬＶ−１Ｈ６８の画像化
Ａ．  Ａ４５９肺癌細胞におけるプラーク形態
Ａ５４９肺癌細胞におけるプラーク形態は、ワクシニアに対する抗体およびＨｏｅｃｈｓｔにより染色することによって決定した。ヒトＡ５４９肺癌細胞は、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ａ５４９細胞は、２４ウェルプレートにおいてカバースリップ上に接種した。１００％のコンフルエンス時に、細胞に、５０ｐｆｕ／ウェルのＧＬＶ−１ｈ６８またはＬＩＶＰ単離物５．１．１を感染させた。感染の３日後に（ｄｐｉ）、細胞は、１０分間、５００μＬ  ４％ＰＦＡにより固定し、１×ＰＢＳにより３回洗浄した。遮断および透過処理のために、細胞は、ウェル当たり５００μＬ遮断溶液（１×ＰＢＳ／５％  ＦＣＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）と共に１５分間インキュベートした。ワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗体［遮断溶液中で１：５００に希釈、（ａｂ３５２１９、ａｂｃａｍ）］を追加し、細胞を、振盪機上で４℃で一晩インキュベートした。続いて、プレートは、１×ＰＢＳにより３回洗浄した。遮断および透過処理のために、細胞は、ウェル当たり５００μＬ  １×ＰＢＳ／５％  ＦＣＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００と共に１５分間インキュベートした。二次抗体［Ｃｙ２コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ、遮断溶液中で１：２００に希釈した（７１１−２２５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＨｏｅｃｈｓｔ（１：４００に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（８６１４０５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）］を追加し、４５分間インキュベートした。最終的に、細胞は、１×ＰＢＳにより３回洗浄し、カバースリップは、プレート上に包埋した。結果は、ＧＬＶ−１ｈ６８感染細胞と比較した、ＬＩＶＰ  ５．１．１感染細胞におけるプラークサイズの増加を示す。
【０５８０】
Ｂ．  Ａ５４９腫瘍の蛍光免疫染色
腫瘍は、メスヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；６〜８週齢）に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を皮下注射（１００μＬ  ＰＢＳ中５．０×１０６細胞を右外側大腿にｓ．ｃ．）することによってヌードマウスにおいて確立した。腫瘍細胞移植の１７（１７）日後に（腫瘍サイズ＞２５０ｍｍ３）、マウスに、５．０×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ  ５．１．１、ＧＬＶ−１ｈ６８（１００μｌのＰＢＳ中）、またはＰＢＳのみを尾静脈注射を介して投与した。マウスは、移植の４２日後に安楽死させ、腫瘍は収集し、凍結させた。凍結させた腫瘍は、振盪機上で４℃で４％ＰＦＡ中で一晩固定した。その後、腫瘍は、１×ＰＢＳにより３０分間、５回洗浄した。腫瘍を半分にし、６ウェルプレートの中に１×ＰＢＳ中５％低融点アガロースにより包埋した。アガロース切片（１００μｍ）をｖｉｂｒａｔｏｍｅにより調製し、１×ＰＢＳと共に４８ウェルプレートに直接移した。染色のために、切片は、ウェル当たり５００μＬ遮断溶液（１×ＰＢＳ／０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００／５％ＦＣＳ）により１時間遮断し、透過処理した。一次抗体を、振盪機上で室温で一晩インキュベートした。一次抗体は、ワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗体［遮断溶液中で１：１００に希釈した、（ａｂ３５２１９、ａｂｃａｍ）］およびラット抗マウスＭＨＣクラスＩＩ抗体［遮断溶液中で１：２００に希釈した、（１４−５３２１−８５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）］を含んだ。１×ＰＢＳによる３回の洗浄後に、二次抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（遮断溶液中で１：４００に希釈した）を追加し、振盪機上で室温で４時間インキュベートした。二次抗体は、Ｃｙ２コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ［遮断溶液中で１：２００に希釈した（７１１−２２５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）］、Ｃｙ３コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ラットＩｇＧ［遮断溶液中で１：２００に希釈した（７１２−１６５−１５３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）］を含む。腫瘍は、１×ＰＢＳにより３回洗浄し、Ｍｏｖｉｏｌ中に包埋した。結果は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＬＩＶＰ  ５．１．１に感染した腫瘍の間で、ウイルス拡散または免疫細胞誘引もしくは局在化において有意差を示さなかった。
【実施例９】
【０５８１】
異種移植片マウスモデルにおけるイヌ軟部組織肉腫に対するＬＩＶＰ  １．１．１の効果
本実施例において、ＬＩＶＰ  １．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８の治療効果を、異種移植片マウスモデルにおけるイヌ軟部組織肉腫において検査した。
【０５８２】
Ａ．  材料および方法
１．  細胞培養
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞（ＣＶ−１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。Ｍｏｒｒｉｓ（ＭＴＨ５２ｃ）は、軟部組織肉腫に由来する［Ａｎｙ  ＭａｃＮｅｉｌｌ、非公開データ］。細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、ＣＶ−１については抗菌性溶液（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００ユニット／ｍｌストレプトマイシン）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、また、ＭＴＨ５２ｃについては２０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で培養した。
【０５８３】
２．  ウイルス株
ＧＬＶ−１ｈ６８およびＬＩＶＰ  １．１．１ワクシニア株は、本研究に使用した、また、実施例１において記載される。
【０５８４】
３．  細胞生存度アッセイ
細胞は、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に接種した。培養の２４時間後に、細胞は、０．１および１．０の感染多重度（ＭＯＩ）を使用して、ＬＩＶＰ  １．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。細胞は、１時間、３７℃でインキュベートし、感染培地を除去し、続いて、細胞を新鮮な成長培地中でインキュベートした。感染後の生細胞の量は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。感染の２４、４８、７２、または９６時間後に、培地は、フェノールレッドなしのＲＰＭＩ  １６４０中に溶解した、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴの濃度の０．５ｍｌ  ＭＴＴ溶液と交換し、５％ＣＯ２大気中、３７℃で２時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液の除去の後に、発色反応は、イソプロパノール中に希釈した１Ｎ  ＨＣｌを追加することによって停止させた。光学濃度は、５７０ｎｍの波長で測定した。非感染細胞は基準として使用し、１００％生存可能であると見なした。
【０５８５】
４．  インビトロにおけるウイルス複製
ウイルス複製アッセイのために、２４ウェルプレートにおいて成長させられた細胞を、０．１のＭＯＩでＬＩＶＰ  １．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。２０分毎の緩やかな撹拌を伴う３７℃でのインキュベーションの１時間後に、感染培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。１、６、１２、２４、４８、７２、および９６時間後に、細胞および上清を収集した。３回の凍結融解サイクルの後に、溶解物の段階希釈溶液をＣＶ−１細胞に対する標準的なプラークアッセイによって力価を測定した。試料はすべて、三通り測定した。
【０５８６】
５．  ウエスタンブロット分析
感染の３日前に、Ｍｏｒｒｉｓ細胞を２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に接種した。その他に示されない限り、９０％コンフルエントな細胞層を偽感染させた，または３７℃で１時間、１．０のＭＯＩでＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。ウイルス含有培地を吸引し、２０％ＦＢＳを含有する新鮮な培地と交換した。タンパク質単離および検出のために、感染の１、１２、２４、４８、７２、および９６時間後に（ｈｐｉ）、細胞を収集し、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）試料バッファー中に再懸濁した。タンパク質試料は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧｍｂＨ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロットした。その後、膜は、抗ベータアクチンマウスモノクローナル抗体（ａｂ６２７６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）またはポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス（抗ＶＡＣＶ）抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と共にインキュベートし、検出は、マウス（ａｂ６７２８、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）またはウサギ（ａｂ６７２１、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して得、その後、増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を続けた。
【０５８７】
６．  蛍光画像化
ウイルス感染細胞および動物のＧＦＰシグナルは、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ；Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および蛍光立体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＭＺ  １６  ＦＡ；Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりそれぞれ分析した。画像はデジタルカメラにより取り込み、ＭＥＴＡ−ＭＯＲＰＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ；Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）およびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して処理した。
【０５８８】
７．Ｍｏｒｒｉｓ異種移植片のワクシニアウイルス媒介性の治療
腫瘍は、６〜８週齢メスヌードマウス（ＮＣＩ／Ｈｓｄ／Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の右後肢に１００μｌ  ＰＢＳ中の１×１０６細胞を皮下に移植することによって生成した。腫瘍成長は、デジタルキャリパーを使用して、二次元で毎週モニターした。腫瘍体積は、［（長さ×幅２）／２］として計算した。２８日目に、ＬＩＶＰ１．１．１または、ＧＬＶ−１ｈ６８ウイルス（１００μｌ  ＰＢＳ中１×１０７プラーク形成単位［ｐｆｕ］）の単一用量を、尾静脈（ｉ．ｖ．）の中に注射した。対照動物は、ＰＢＳのみをｉ．ｖ．注射した。
【０５８９】
結果の有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって計算した。結果は、平均値±ｓ．ｄ．（標準偏差）として示す。＜０．０５のＰ値は、有意であると見なした。
【０５９０】
動物は、頚椎脱臼によって安楽死させた。動物実験はすべて、Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎの政府によって承認され、ドイツの動物愛護ガイドラインに従って行った。
【０５９１】
Ｂ．  結果
１．  培養におけるイヌ肉腫細胞に対するＬＩＶＰ  １．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８の細胞傷害性
Ｍｏｒｒｉｓ細胞は、２４ウェルプレート中に感染の３日前に接種した。その後、細胞は、それぞれ１．０および０．１のＭＯＩを使用してＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。細胞生存度は、セクションＡにおいて記載されるように、ＭＴＴアッセイによって、感染の２４、４８、７２、および９６時間後（ｈｐｉ）に分析した。結果は、表５８に示す。値は、それぞれの非感染対照のパーセンテージとして示す。
【０５９２】
０．１および１．０のＭＯＩでのウイルスＧＬＶ−１ｈ６８感染の９６時間後に、わずか１９．１％および１３．１３％のＭｏｒｒｉｓ細胞が処理後も生存した。ＬＩＶＰ  １．１．１感染の後、ある時点およびＭＯＩで生きているＭｏｒｒｉｓ細胞は、わずか１０．１％および５．１％であった。これらの結果は、ＬＩＶＰ１．１．１ウイルス感染が、ＧＬＶ−１ｈ６８と比較して、培養中のイヌ肉腫細胞のわずかにより効率的な根絶につながることを示す。
【０５９３】
【表５８】
2018171059.tif 000072
【０５９４】
２．  Ｍｏｒｒｉｓ細胞における、ＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８の複製の有効性。
「Ｍｏｒｒｉｓ」細胞は、上述されるように、０．１のＭＯＩでＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。ウイルス力価は、ＣＶ−１細胞単層において、標準的なプラークアッセイによって、三通り、ウェル当たりｐｆｕとして感染の経過の間に様々な時点で決定した。結果は、表５９に示す。
【０５９５】
最大のウイルス力価は、ＬＩＶＰ  １．１．１（２．１４×１０７＋／−５．３×１０６ｐｆｕ／ウェル）およびＧＬＶ−１ｈ６８（２．３９×１０６＋／−７．４×１０５ｐｆｕ／ウェル）について９６ｈｐｉで観察された。これらのデータは細胞死と非常によく相関し、ＬＩＶＰ  １．１．１が、これらの実験条件下でＭｏｒｒｉｓ細胞においてＧＬＶ−１ｈ６８よりも効率的に複製することを実証した。
【０５９６】
【表５９】
2018171059.tif 000073
【０５９７】
３．  顕微鏡検査法によるＭｏｒｒｉｓ細胞に対するＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８感染の効果の分析
Ｍｏｒｒｉｓ細胞に対するＬＩＶＰ  １．１．１−またはＧＬＶ−１ｈ６８感染の有効性はまた、それぞれ０．１および１．０のＭＯＩで蛍光顕微鏡検査法によっても分析した。この目的のために、感染の経過の間に、ウイルスにより処理したＭｏｒｉｓ細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ−１２２２２染色（核に対して青色）またはヨウ化プロピジウム染色（死細胞に対して赤色）によって可視化し、蛍光顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢを使用して、様々な時点（１、２４、４８、７２、および９６ｈｐｉ）で分析した。その後、画像は、感染および細胞の溶解の程度を示すためにマージした。ＧＬＶ−１ｈ６８感染の場合には、組換えウイルスマーカー遺伝子ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現についてさらに分析した。
【０５９８】
これらの実験の設定において、０．１および１．０のＭＯＩでＧＬＶ−１ｈ６８により感染させたＭｏｒｒｉｓ細胞は、４８および７２時間に最も強力なＧＦＰ発現を示した。さらに、死細胞特異的ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用すると、ほとんどの感染細胞が９６ｈｐｉでＰＩポジティブとなることもまた分かった。これらのデータは、発明者らの細胞生存度アッセイのデータと非常によく相関した。写真は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ蛍光顕微鏡のデジタルカメラにより感染後の様々な時点で撮り、すべての細胞に対する死細胞の量を示すためにマージした。Ｍｏｒｒｉｓ細胞に対するＬＩＶＰ  １．１．１感染の分析は、ＬＩＶＰ  １．１．１処理が、非感染細胞と比較して、Ｍｏｒｒｉｓ細胞における有意により高度な死亡率につながったことを実証した。
【０５９９】
４．  ＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８による感染の後のＭｏｒｒｉｓ細胞におけるウイルス媒介性のタンパク質発現のウエスタンブロット分析
細胞は、２４ウェルプレート中に接種し、９０％のコンフルエンスに達するまで成長させた。その後、細胞は、３７℃で、１時間、１．０のＭＯＩでＬＩＶＰ  １．１．１またはＧＬＶ−１ｈ６８により感染させた。上清を、吸引し、Ｍｏｒｒｉｓ細胞のための新鮮な成長培地と交換した。タンパク質単離および検出のために、細胞は、様々な時点（１、２４、４８、７２、および９６ｈｐｉ）で収集し、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）バッファー中に再懸濁した。試料は、３７℃で３０分間、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅにより処理した。タンパク質試料は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、続いて、ニトロセルロース膜上にブロットした。その後、膜は、抗ベータアクチンマウスモノクローナル抗体（１：１０，０００）または抗ワクシニアウイルスウサギポリクローナル抗体（１：１０００）と共にインキュベートし、マウス（１：２，０００）またはウサギ（１：１０，０００）に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して検出し、その後、増強化学発光を続けた。ウエスタンブロット分析もまた、ＬＩＶＰ１．１．１感染試料におけるワクシニアウイルス抗体のより強力なシグナルによって示されるように、Ｍｏｒｒｉｓ細胞における、ＧＬＶ−１ｈ６８と比較した、ＬＩＶＰ  １．１．１のより効率的な複製を確認した。
【０６００】
５．  ＧＬＶ−１ｈ６８およびＬＩＶＰ１．１．１によるＭｏｒｒｉｓ異種移植片の全身性の処理
６〜８週の１２匹のメス無胸腺ヌードＦｏｘＮ１マウスに、１×１０６  Ｍｏｒｒｉｓ細胞を移植した。移植の４週間後に、ヌードマウスはすべて、約７００〜１１００ｍｍ３の体積を有する腫瘍を発達させた。動物は、３つのグループ（ｎ＝４）に分離し、それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＰＶ１．１．１、またはＰＢＳ（対照）を注射した。腫瘍サイズは、毎週測定した。
【０６０１】
感染後２１日目までに、対照グループのマウスがすべて、３０００ｍｍ３を超える体積を有する腫瘍を発達させ、そのため、研究は、このグループのために終了した。対照的に、ウイルスにより処理したマウスはすべて、この時点の対照と比較して、有意な腫瘍低下を示した。結果は、表６０に示す。
【０６０２】
ウイルス注射は、すべてのＬＩＶＰ  １．１．１処理マウスにおいて有意な腫瘍後退を引き起こした。これは、４匹のマウスのうちの２匹が、３５ｄｐｉで３０００ｍｍ３を超える体積を有する腫瘍を発達させたＧＬＶ−１ｈ６８処理グループについて当てはまらなかった。このデータは、ＬＩＶＰ  １．１．１がＭｏｒｒｉｓの異種移植片においてＧＬＶ−１ｈ６８よりも高度な腫瘍崩壊の可能性を有することを示唆する。
【０６０３】
【表６０】
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−＝３０００ｍｍ３を超える腫瘍サイズによりマウスが殺された
【０６０４】
【表６１】
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【０６０５】
マウスの対照グループと比較して、ＬＩＶＰ  １．１．１を注射したマウスの生存における有意な改善があったことが分かった。死亡は、３９日目まで、ＬＩＶＰ  １．１．１を注射したマウスにおいて観察されず、最終のマウスは、１０５日目に死亡した。比較すると、ＬＩＶＰ  １．１．１処理を受けなかった対照マウスは、マウスの全体的な健康状態に非常に影響を与えた３０００ｍｍ３を超える腫瘍サイズにより１７および２４日目に安楽死させた。これらの結果は、表６２に示す。
【０６０６】
【表６２】
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＊＝３０００ｍｍ３を超える腫瘍サイズによりマウスが殺された
【実施例１０】
【０６０７】
ＬＩＶＰ単離物についての配列データの分析
本実施例において、ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１を配列決定し、分析し、結果は、ワクシニアウイルス株ＧＬＶ−１ｈ６８、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、およびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎについての知られている配列と比較した。
【０６０８】
ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１は、ＣＶ−１細胞単層において増殖させ、力価を測定した。ＬＩＶＰクローン単離物１．１．１、２．１．１、３．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、または、８．１．１により感染させたＣＶ−１細胞は、遠心分離によって収集し、凍結と解凍の３サイクルによって破壊した。細胞デブリおよびヌクレイン酸は、低速遠心分離によって細胞溶解物から除去した。回収したウイルス粒子は、標準的なプロトコールを使用して、スクロースクッションおよびスクロース勾配（２０〜４０％）を通して遠心分離によって精製した。ゲノムウイルスＤＮＡは、プロテイナーゼＫによる処理およびその後に続くフェノール−クロロホルム抽出の後に精製ビリオンから抽出した［Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ３，  ｐａｇｅｓ  １６．１７．１−１６．１９−７  （１９９８）を参照されたい］。
【０６０９】
ゲノムＤＮＡは、ショットガンアプローチによって配列決定し、ＡＧＯＷＡ  ＧｍｂＨによってアセンブルした。ギャップ閉鎖（ｇａｐ  ｃｌｏｓｕｒｅ）は、ショットガンクローンに対するさらなる配列決定の実行によってまたはウイルスゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲによって実行した。末端逆位配列は、逆の相補配列をその配列と比較し、同一の配列を同定し、フランキング配列を伸長することによって再構築した。ＯＲＦは、知られているワクシニアＧＬＶ−１ｈ６８株（配列番号９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ４１０３０４）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株（配列番号１９１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２）、およびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（配列番号１９２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）のものと比較した。これらの株における主なおよび小さなＯＲＦを比較する表は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２８２：４１７−４３８  （２００９）において見つけることができる。それぞれの個々のＬＩＶＰクローン単離物の配列は、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能なＰａｉｒｗｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを使用して、ＧＬ−ＯＮＣ−１親ＬＩＶＰ単離物（配列番号１０）に対してアライメントした（ｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ；  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．  （１９９４）  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０：２２７−２３５）。アライメントは、「ＧＡＰありのグローバルアライメント」として計算した。ＧＡＰプログラムは、末端のギャップにペナルティを科すことなく、２つの配列の最適なグローバルアライメントを計算する。より短い配列における長いギャップには、一定のペナルティが与えられる。２つの配列は、同じタイプのものでなければならない、すなわち、両方ともＤＮＡ配列であるかまたは両方ともタンパク質配列である。ＧＡＰは、線形領域（ｌｉｎｅａｒ  ｓｐａｃｅ）におけるアライメントを達成し、そのため、長い配列をアライメントすることができる。デフォルトパラメータは、「Ｍａｘ  Ｍａｔｃｈ」スコア１０、「Ｍｉｎ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ」スコア−１５、「Ｇａｐ−Ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ」スコア３０、および「Ｇａｐ−Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ」スコア３に設定した。
【０６１０】
下記の表６３は、配列番号、ゲノムサイズ、末端逆位配列に対応するヌクレオチド、およびＧＬ−ＯＮＣ−１親ＬＩＶＰ単離物（配列番号１０）に対する同一性パーセント（％）を含むクローン単離物を記載する。配列決定により、ＬＩＶＰ  ｌ  ３．１．１単離物が少なくとも２つの配列の混合物であったことが明らかにされた。
【０６１１】
【表６３】
2018171059.tif 000077
【０６１２】
下記の表６４は、単離物およびＧＬＶ−１ｈ６８についての名称／機能、ヌクレオチドの長さ、ならびに該当する場合、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、および／またはＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（ＣＯＰ）において同定される、対応するＯＲＦを含む、予測されるＯＲＦを記載する。断片化されたＯＲＦは、星印（＊）で示す。表６５は、腫瘍崩壊活性および毒性における差異の原因であることが推定されるＯＲＦを記載する。
【０６１３】
下記の表６４において示されるように、いくつかの単離物は、様々なＯＲＦにおいて切断を含有した。例えば、分泌ケモカイン結合タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおけるｇｌ００１／２９０、ＷＲ００１／２１８、およびＣ２３ｌ／Ｂ２９Ｒに対応する）は、ＬＩＶＰ単離物１．１．１において欠失によって切断されている。それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおけるｇｌ０９３、ＷＲ０７１、およびＩ２Ｌに対応する仮説タンパク質は、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＬＩＶＰ単離物２．１．１において切断されている。プロフィリン様タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおけるｇｌ２２５、ＷＲ１６７、およびＡ４２Ｒに対応する）は、ＬＩＶＰ単離物５．１．１において切断されている。アンキリン様タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおけるｇｌ２５７、ＷＲ１８８、およびＢ６Ｒに対応する）は、ＬＩＶＰ単離物４．１．１において切断されている。
【０６１４】
様々な対応するオープンリーディングフレームの長さの多様性は、様々なワクシニアウイルス株の中で以前に観察された。例えば、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）結合タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８およびＷＲにおけるｇｌ０１５／２７７およびＷＲ０１３に対応する）は、ワクシニアＷＲ株、Ｌｉｓｔｅｒ株、およびＶＡＣＶ−３７３７株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ３７７９４５）において３８１ｂｐであり、ワクシニアＤＵＫＥ株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４３９８１５）、ＬＣ１６株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６７８２７７）、Ａｃａｍ３株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４８）、およびＡｃａｍ  ２０００株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）において３７５ｂｐである。表６４におけるＬＩＶＰ単離物の中で、Ｃ−末端の長さの小さな差異が、ＩＬ−１８結合タンパク質ＯＲＦをもたらし、単離物１．１．１、２．１．１、４．１．１、および８．１．１において３８１ｂｐであり、単離物５．１．１、６．１．１、および７．１．１において３７５ｂｐである。アルファアマニチン感受性タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいてｇｌ０３４、ＷＲ０２９、およびＮ２Ｌに対応する）は、株ＷＲ、ＧＬＶ−１ｈ６８、およびＬＩＶＰ単離物５．１．１において５２８ｂｐであるが、ＬＩＶＰ単離物１．１．１、２．１．１、４．１．１、６．１．１、７．１．１、８．１．１、および株Ａｃａｍ３０００（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）においてわずか５１３ｂｐである（５アミノ酸欠失に相当する）。アンキリン様タンパク質（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおけるｇｌ０３５、ＷＲ０３０、およびＭ１Ｌに対応する）は、様々なワクシニアウイルス株において１４１９ｂｐ、１４１３ｂｐ、または１４１０ｂｐであることが決定された。下記の表６４において示されるように、ＬＩＶＰ単離物５．１．１において、このＯＲＦは１４１９ｂｐであるのに対して、残りのＬＩＶＰ単離物は、このＯＲＦが１４１３塩基対を含有する。Ｔｏｌｌ／ＩＬ１受容体（それぞれ、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいてｇｌ２３０、ＷＲ１７２、およびＡ４６Ｒに対応する）は、ワクシニアＷＲ株、ＬＩＶＰ単離物１．１．１、５．１．１、および７．１．１において７２３ｂｐであり、ＬＩＶＰ単離物２．１．１、４．１．１、６．１．１、および８．１．１において７１１ｂｐであり、ワクシニアＣｏｐ株においてわずか６４５ｂｐである。同様の多様性は、ビロソームのＯＲＦＳが豊富な構成成分（ＯＲＦＳ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいて、ｇｌ０７７、ＷＲ０６１、およびＥ５Ｒに対応する）ならびにＤＮＡポリメラーゼ（それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいて、ｇｌ０８４、ＷＲ０６５、およびＥ９Ｌに対応する）について観察される。
【０６１５】
ＬＩＶＰ単離物６．１．１および８．１．１は、未知のタンパク質（それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいて、ｇｌ２６４、ＷＲ１９３、およびＢ１１Ｒに対応する）においてＤＴリピート伸張（ＤＴ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を有することが決定され、残りの単離物およびＧＬＶ−１ｈ６８における２１９ｂｐとは対照的に２５５塩基対である。アンキリン様タンパク質（それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいて、ｇｌ２７３、ＷＲ１９９、およびＢ１８Ｒに対応する）は、ワクシニアＷＲ株、Ｃｏｐ株、ＤＵＫＥ株、Ａｃａｍ３株、Ａｃａｍ２０００株、およびＡｃａｍ３０００株において１７２５ｂｐであるが、ＬＩＶＰ単離物１．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、および８．１．１において大きな欠失によって切断されている。ＩＬ−１ベータ阻害剤（それぞれＧＬＶ−１ｈ６８、ＷＲ、およびＣｏｐにおいて、ｇｌ２７０、ＷＲ１９７、およびＢ１６Ｒに対応する）は、一般的に９８１ｂｐであるが、ワクシニアＣｏｐ株（８７３ｂｐ）において断片化されており、ＬＩＶＰ単離物１．１．１、２．１．１、５．１．１、および７．１．１において欠失を含有する。
【０６１６】
ＯＲＦにおける変異に加えて、配列決定は、いくつかのＯＲＦのプロモーター領域において、挿入および欠失を含む差異を明らかにした。例えば、ＬＩＶＰ単離物１．１．１は、セリンプロテアーゼ阻害剤様ＳＰＩ−１  ＯＲＦ（ｇｌ００９／２８３）のプロモーター領域において６ヌクレオチド挿入を有する。ＬＩＶＰ単離物８．１．１は、分泌上皮増殖因子様タンパク質（ｇｌ０１０／２８２）のプロモーター領域において欠失を有する。ＬＩＶＰ単離物５．１．１は、アンキリン様タンパク質ＯＲＦ（ｇｌ０３７）のプロモーター領域において８ヌクレオチド欠失を有する。ＬＩＶＰ単離物６．１．１は、未知のタンパク質をコードするＯＲＦ（ｇｌ０７９に対応する）のプロモーター領域において欠失を有する。ＬＩＶＰ単離物１．１．１、４．１．１、６．１．１、および７．１．１は、未知のタンパク質をコードするＯＲＦ（ｇｌ０８８に対応する）のプロモーター領域において１９ヌクレオチド欠失を含有する。ＬＩＶＰ単離物４．１．１は、２つの欠失を有し、単離物５．１．１は、プロフィリン様タンパク質についてのＯＲＦ（ｇｌ２２５）のプロモーター領域において１つの欠失を有する。
【０６１７】
【表６４−１】
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【表６４−２】
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【０６１８】
【表６４−３】
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【表６４−４】
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【０６１９】
【表６４−５】
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【表６４−６】
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【０６２０】
【表６４−７】
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【表６４−８】
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【０６２１】
【表６４−９】
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【表６４−１０】
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【０６２２】
【表６４−１１】
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【表６４−１２】
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【０６２３】
【表６５−１】
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【表６５−２】
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【実施例１１】
【０６２４】
ＬＩＶＰクローン単離物の中への、異種タンパク質をコードする遺伝子の導入
本実施例において、異種タンパク質をコードする遺伝子は、１）直接的なクローニングまたは２）相同組換えによってＬＩＶＰクローン単離物の中に挿入する。
【０６２５】
Ａ．  直接的なクローニング
本実施例において、異種タンパク質をコードするＬＩＶＰウイルスは、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ９９７７−９９８１および米国特許第６，２６５，１８３号において記載される方法に従って直接的なクローニングによって構築する。この方法において、異種タンパク質をコードする核酸は、ウイルスゲノムにおける非必須領域に位置するユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位の中に挿入される。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ２．１．１、ＬＩＶＰ  ３．１．１、ＬＩＶＰ  ４．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、ＬＩＶＰ  ６．１．１、ＬＩＶＰ  ７．１．１、ＬＩＶＰ  ８．１．１、およびＧＬＶ−１ｈ６８のＮｏｔＩ部位の中に挿入される（ＧＬ−ＯＮＣ１）。例示的なコード異種タンパク質およびコード核酸配列（配列番号）のリストを、下記の表６６に記載する。
【０６２６】
【表６６−１】
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【表６６−２】
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【０６２７】
【表６６−３】
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【表６６−４】
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【０６２８】
【表６６−５】
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【表６６−６】
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【０６２９】
【表６６−７】
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【０６３０】
手短かに言えば、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、ワクシニアウイルスプロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子をコードする核酸を含有する遺伝子カセットを、最初に構築する。カセットはまた、組換えウイルスの選択のための、ワクシニアウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカータンパク質をコードする核酸をも含有する。本実施例において、ワクシニアウイルスＰ７．５プロモーターに作動可能に連結された大腸菌キサンチン（グアニン）ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が、カセット中に含まれる。遺伝子カセットは、特異的制限エンドヌクレアーゼ切断部位の核酸が側面に位置する。本実施例において、カセットは、ＮｏｔＩ切断部位配列ＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１９３）が側面に位置する。遺伝子カセットは、細菌における増殖のために、クローニングベクターの中にライゲーションする。
【０６３１】
ＬＩＶＰウイルスＤＮＡは、標準的な方法（例えばＧｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３６：  ３２−３８を参照されたい）に従って調製し、精製する。ウイルスＤＮＡは、本実施例において、特異的制限エンドヌクレアーゼ、ＮｏｔＩにより切断し、フェノール／クロロホルム抽出によってなどに標準的な方法に従って精製する。ＬＩＶＰウイルスベクターアームの完全性は、フィールドインバージョンゲル電気泳動によって制御する（例えば２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ氷酢酸／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中１％アガロースゲル；７Ｖ／ｃｍ、その後、１秒間の休止と共に前方および逆パルスを交替−１）Ｆ６  Ｒ３（４時間）；２）Ｆ４  Ｒ２（４時間）；３）Ｆ２  Ｒ１（４時間）；４）Ｆ８  Ｒ４（８時間）。異種タンパク質およびマーカータンパク質をコードする遺伝子カセットは、ＮｏｔＩによる消化によってクローニングベクターから切り取り、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＮｏｔＩ切断ウイルスＤＮＡの調製物にライゲーションした。
【０６３２】
ウイルスのパッケージングのために、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１のコンフルエントな単層を、１時間、ヘルパーウイルス、鶏痘ＨＰ１．４４１により０．５のＭ．Ｏ．Ｉで感染させる。ライゲーションしたウイルスＤＮＡは、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、感染細胞の中にトランスフェクトする。インキュベーションの３日後に、細胞を収集し、粗ウイルスストックを調製する。その後、ウイルスストックはｇｐｔ選択下で単層ＣＶ−１細胞を感染させるために使用する［Ｉｓｓａｃｓ，  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００４）を参照されたい］。大腸菌ｇｐｔ遺伝子を組み込み、発現するウイルス組換え体は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ、プリン代謝の阻害剤）およびヌクレオチド前駆体キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する培地においてプラークを形成することができる（Ｆａｌｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９８８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２（６）：  １８４９−１８５４を参照されたい）。
【０６３３】
Ｂ．  相同組換え
本実施例において、異種タンパク質（表６６中に記載される）をコードする遺伝子を、米国特許第７，５８８，７６７号、米国特許公開第２００９−０１１７０３４号、およびＦａｌｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９９０）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３１０８−３１１１に記載されるものに類似する方法に従って、インビボ相同組換えによって、ＬＩＶＰウイルス、例えばＬＩＶＰ  １．１．１、２．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、８．１．１、およびＧＬＶ−１ｈ６８（ＧＬ−ＯＮＣ１）の中に挿入する。この方法において、異種タンパク質をコードする遺伝子は、ＬＩＶＰクローン単離物中の特定の遺伝子座を標的とするシャトルプラスミド中にクローニングする。その後、遺伝子は、二重相互乗換えによってクローン単離物のゲノムの中に挿入する。
【０６３４】
手短かに言えば、異種遺伝子をコードする核酸を含有するシャトル導入ベクターを構築し、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、ワクシニアＤＮＡの所望のセグメントを含有するプラスミドの中に挿入する。典型的に、ＤＮＡは、非必須遺伝子、例えばＦ１４．５、Ａ５６ＲまたはＨＡ遺伝子の中に挿入し、ワクシニアプロモーターに連結させる。例示的な異種タンパク質のリストを上記の表６６に記載する。プラスミドはまた、組換えウイルスの選択のための、ワクシニアウイルスプロモーターに作動可能に連結された有力な選択マーカータンパク質を含むことができる。シャトル導入ベクターは、細菌における増殖のためにクローニングベクターの中にライゲーションする。
【０６３５】
アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞ＣＶ−１細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＣＣＬ−７０（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）］を、ウイルス生成および産生のために使用する。細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃で、１％抗菌−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を補足した、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させる。ＣＶ−１細胞は、１時間、０．１のＭＯＩでＬＩＶＰクローン単離物により感染させる。その後、感染細胞は、シャトル導入ベクターによりＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してトランスフェクする。感染の２日後に、感染／トランスフェクト細胞を、収集し、組換えウイルスを選択し、以前に記載されるような標準的な方法を使用してプラークを精製する［Ｆａｌｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９９０）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６４：３１０８−３１１１］。例えば、大腸菌ｇｐｔ遺伝子を組み込み、発現するウイルス組換え体は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ、プリン代謝の阻害剤）およびヌクレオチド前駆体キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する培地においてプラークを形成することができる［Ｆａｌｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ  （１９８８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２（６）：  １８４９−１８５４を参照されたい］。
【実施例１２】
【０６３６】
進行がんを有するヒト患者に対するウイルスの静脈内投与
本実施例において、それぞれのＬＩＶＰウイルス１．１．１、２．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、８．１．１、またはＧＬＶ−１ｈ６８を、進行がんを有する患者に対して静脈注射として投与する。ウイルスはそれぞれ、２８日間のサイクルにわたり、８（８）つの投薬計画またはコホートを使用して投与し、毒性効果および応答を決定し、コホートの間で比較する。それぞれのコホートに３人の患者がいる。
【０６３７】
コホート１〜５については、ＬＩＶＰウイルス１．１．１、２．１．１、４．１．１、５．１．１、６．１．１、７．１．１、８．１．１、またはＧＬＶ−１ｈ６８を、段階的に上昇する用量（それぞれ１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、および１×１０９ｐｆｕ）で、静脈内注入として、２８日間のサイクルの１日目に投与する。コホート６〜７は、２８日間のサイクルの１〜３日目に、それぞれ、１．６６７×１０７または１．６６７×１０８ｐｆｕウイルスを受ける。コホート８は、２８日間のサイクルの最初の連続５（５）日間、１×１０９ｐｆｕウイルスを受ける。患者は、ベースラインおよび表在性のまたは粘膜病変を有する患者に対してそれぞれのサイクルの間に画像処理する。エンドポイントはまた、安全性、耐用性、ウイルス複製、腫瘍デリバリー、中和抗体発生、および抗腫瘍活性を含めて毎日評価する。疲労、発熱、硬直、筋肉痛、インフルエンザ様症状、ワクシニア発疹、貧血、脂性肌／毛、および白血球増加などのような毒性作用を評価する。例えば、ウイルスプラークアッセイ（ＶＰＡ）は、ウイルス排出について血液、尿、便、および痰に対してサイクルのそれぞれの日に実行する。
【０６３８】
患者はまた、患者が、処理の間に改善する（「応答する」）、同様にとどまる（「安定している」）、または悪化する（「進行」）かどうかを決定するために、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ；  ＲＥＣＩＳＴ  １．１、２００９年１月に公開）を使用して、療法に対する応答についても評価する。安定疾患または部分応答を有する患者は、処置の続くサイクルを受け続ける。進行性の疾患を有する患者は、治験から外す。患者が補完的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）応答を有する場合、処置もまた停止し、患者を経過観察し、状態をモニターする。
【実施例１３】
【０６３９】
メラノーマ宿主細胞因子の転写プロファイルおよび腫瘍崩壊ワクシニアウイルスの初期遺伝子発現−ウイルス感染および複製
１．  転写分析およびデータ処理のための方法
メラノーマ細胞株８８８−ＭＥＬおよび１９３６−ＭＥＬ（Ｓａｂａｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６８：１２２−１３１およびＭｏｎｓｕｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ８：１０において記載されるように誘導した時間的に別個の皮膚転移由来のよく知られているメラノーマ細胞株；例えばＲｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：６０３６−４７；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２６：１３７２−７もまた参照されたい）を、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でワクシニア単離物ＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、またはＬＩＶＰ  ６．１．１により感染させた。ネガティブ対照として、細胞株はまた、ウイルスなしの感染培地によっても処理した。感染の後に、細胞は、収集まで、示す時間、３７℃で細胞培養培地中でインキュベートした。細胞は、感染の２、６、１０、２４、および４８時間後に（ｈｐｉ）収集した。ウイルス力価は、複製効率を決定するためにＣＶ−１細胞単層上で標準的なプラークアッセイによって決定した。全ＲＮＡを、標準的な手順を使用して単離し、増幅し、精製し、標識した。
【０６４０】
転写プロファイルは、３６，０００（３６ｋ）ヒトアレイプラットフォーム［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ．  ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ３：２８］または注文生産のワクシニア（ＶＡＣＶ）アレイプラットフォーム（ＶＡＣＧＬａ５２０４４５Ｆ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ；Ｗｏｒｓｃｈｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０：３０１を参照されたい）を介して生成した。３６ｋヒトアレイハイブリダイゼーションについては、２つの色の系を使用した；基準および試験ａＲＮＡの両方を、基準についてはＣｙ３と共に、試験試料についてはＣｙ５と共に、ＵＬＳ  ａＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して直接標識し、スライドに同時にハイブリダイズさせた。４２℃での２０時間のインキュベーションの後に、アレイを洗浄し、乾燥し、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーを使用してスキャンした。ワクシニア（ＶＡＣＶ）−遺伝子発現は、いくつかのＶＡＣＶ株のゲノムの組み合わせを包含する２１９遺伝子に相当する３０８のプローブ、ウミシイタケルシフェラーゼ−エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）緑色蛍光融合遺伝子、および３３７のヒトまたはマウス「ハウスキーピング」遺伝子（３９３プローブ）を含む、注文生産のＶＡＣＶアレイプラットフォーム（ＶＡＣＧｌａ５２０４４５Ｆ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ）によって評価した［例えばＷｏｒｓｃｈｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １０：３０１を参照されたい］。アレイ品質は、以前に記載されるように、立証された［Ｗａｎｇ  Ｅ  （２００５）  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ３：２８］。
【０６４１】
６．５μｇ  ａＲＮＡは、メーカーの指示に従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  ３’  ＩＶＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、全ＲＮＡから増幅し、チップにハイブリダイズさせた。４５℃でのハイブリダイゼーションオーブンにおける１６時間のインキュベーションの後に、アレイを洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してＦｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎにおいて染色した。アレイは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してスキャンした。
【０６４２】
転写データは、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｍＡｄｂ；ｍａｄｂ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ  ｏｒ  ｎｃｉａｒｒａｙ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能）にアップロードし、適宜、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒａｎｃｈ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって開発されたＢＲＢＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ（ｌｉｎｕｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；例えばＪｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５：５５を参照されたい）またはＰａｒｔｅｋ（商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用してさらに分析した。遺伝子比は、実験試料にわたって平均補正し（ａｖｅｒａｇｅ  ｃｏｒｒｅｃｔ）、中心化されない相関（ｕｎｃｅｎｔｅｒｅｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）アルゴリズムに従って示した。統計分析については、感染後の全部のデータセット発現プロファイルは、有益な転写物を多くするために、すべての実験にわたって９５％の遺伝子の存在および２倍の変化のみを含めむようにフィルターした（９５％、２倍をフィルター）。クラス比較は、パラメトリック独立スチューデントｔ検定または３−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して実行した。これとは別に、標準的な統計が感染試料から対照試料を分離しなかったので、標準偏差（ＳＴＤＥＶ）による除外／包含もまた、元の遺伝子リスト（あらかじめフィルターしたものではない）に適用した。このために、第１のフィルターは、対照の間でＳＴＤＥＶ＞０．２５を有する遺伝子を除外し、ウイルス感染に対して特異的でない細胞培養の作用によって種々に発現された遺伝子を排除し、第２のフィルターは、ＳＴＤＥＶ＞０．７（８８８−ＭＥＬ）または＞０．４（１９３６−ＭＥＬ）を有する遺伝子を含め、第１のフィルタリングステップによって選択した遺伝子の中で、感染試料において高度なＳＴＤＥＶを有するもののみを含めた。遺伝子機能の解釈は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に基づくものとした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームから回収したデータは、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）アプローチを使用して標準化した。
【０６４３】
２．  結果
ａ．  ヒト遺伝子転写の変化
様々な時点で採取した非感染試料は、標準的な統計（ＡＮＯＶＡ）を適用した後でさえ、培養の時間（細胞培養の作用）に従って感染試料と一緒に分離した。ＳＴＤＥＶ包含／除外基準を使用して、ワクシニアウイルス感染によって特異的に影響を及ぼされた遺伝子のリストを得た（表６７および６８を参照されたい）。詳細には、設計した連続的な統計アプローチから、５０７および４８０の遺伝子が、それぞれ、８８８および１９３６株においてウイルスによって影響を及ぼされた。９０％フィルターの適用後、８８８−ＭＥＬ細胞株において変化した４００の遺伝子が同定され、１９３６−ＭＥＬ細胞株において変化した３７０の遺伝子が同定され、全体で、ウイルス感染により特異的に変化した７０３のヒト遺伝子が同定された。ウイルスにより影響を及ぼされた遺伝子は、細胞死、細胞の成長および増殖、タンパク質合成およびフォールディング、ならびにＤＮＡ複製、組換え、および修復などのような広範囲の細胞の機能に関与した。
【０６４４】
【表６７−１】
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【表６７−２】
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【０６４５】
【表６７−３】
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【表６７−４】
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【０６４６】
【表６７−５】
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【表６７−６】
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【０６４７】
【表６７−７】
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【表６７−８】
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【０６４８】
【表６７−９】
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【表６７−１０】
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【０６４９】
【表６７−１１】
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【０６５０】
【表６８−１】
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【表６８−２】
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【０６５１】
【表６８−３】
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【表６８−４】
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【０６５２】
【表６８−５】
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【表６８−６】
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【０６５３】
【表６８−７】
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【表６８−８】
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【０６５４】
【表６８−９】
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【表６８−１０】
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【０６５５】
【表６８−１１】
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【表６８−１２】
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【０６５６】
【表６８−１３】
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【０６５７】
ｂ．  ワクシニアウイルス遺伝子転写の変化
３つのアレイクラスターを分析した（対照、２ｈｐｉ；初期遺伝子、および１０ｈｐｉ；後期遺伝子）。さらに、４つの主な遺伝子クラスターもまた、分析した（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ａ／３ｂ、およびＣ４）。アレイクラスターは、時点および感染が、対照、２ｈｐｉ、および１０ｈｐｉの間の分離に基づいて示されるように、遺伝子発現パターンに最も影響を及ぼすことを示した。遺伝子クラスターは、特異的なパターンを示し、それによって、ＶＡＣＶ侵入および伝播、ＶＡＣＶ構造およびアセンブリー、ＶＡＣＶ  ＤＮＡ複製およびＲＮＡ転写、宿主相互作用および免疫調整、ならびに他の／未知の機能などのような、様々な一時的な発現クラスおよび機能カテゴリーを反映した。結果は、初期／後期遺伝子の２および１０時間のｈｐｉで同様の低度の発現があり、遺伝子が、すべてのカテゴリーの全体にわたって散在したことを示した。構造およびアセンブリークラスにおいて豊富な遺伝子と共に、後期遺伝子について１０ｈｐｉで発現が増加した。初期およびＤＮＡ複製／ＲＮＡ転写クラスにおいて豊富な初期／後期遺伝子について１０ｈｐｉで発現が減少した。ＤＮＡ複製／ＲＮＡ転写および宿主相互作用／免疫修飾因子において豊富であった初期および初期／後期遺伝子について２および１０ｈｐｉで同様の高度な発現もまたあった。したがって、結果は、感染後のある期間にわたるワクシニアウイルス遺伝子転写の変化が、ワクシニアウイルス侵入および伝播、構造およびアセンブリー、ＤＮＡ複製／ＲＮＡ転写、宿主相互作用／免疫調整に関与する遺伝子に関係することを示した。機能が未知の他の遺伝子もまた、転写の変化に関連した。
【０６５８】
ｃ．  複製効率
複製効率は、０〜１０ｈｐｉの時点で得たウイルス力価についての成長曲線から決定した。力価は、１０６細胞当たりのプラーク形成単位とした。試験したすべてのウイルスについて、複製効率は、最初、２ｈｐｉで減少したが、１０ｈｐｉで時間依存性の様式で着実に増加した。ＧＬＶ−１ｈ６８は、最も低い複製効率を示した。ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、およびＬＩＶＰ  ６．１．１は、同様の複製効率を示したが、ＬＩＶＰ  ６．１．１は、最も高度な力価を示した。ＬＩＶＰ  ５．１．１およびＬＩＶＰ  １．１．１は、同等の複製効率を示した。
【０６５９】
複製効率を、ワクシニア遺伝子転写レベルと比較した。７（７）つのワクシニア初期遺伝子（Ｖ１４９、Ｖ１９４、Ｖ１８９、Ｖ１０４、Ｖ０６９、Ｖ１６７、およびＶ１０６）を、発現レベルの階層クラスタリングによる相関分析に使用した。７つのウイルス初期遺伝子のセットにおける遺伝子発現のレベルの階層は、２ｈｐｉで、それぞれの複製効率と一致した（２ｈｐｉでの遺伝子の発現レベルを記載する表６９および７０を参照されたい）。複製効率の結果と同様に、ＧＬＶ−１ｈ６８は、最も低い平均値遺伝子転写レベルを示したのに対して、ＬＩＶＰ  ６．１．１は最も高度な発現値を示した。ＬＩＶＰ  １．１．１およびＬＩＶＰ  ５．１．１は、２ｈｐｉで同等の転写のレベルを示した。これらのデータは、ワクシニア初期遺伝子転写およびワクシニア初期ゲノム複製の間の相関性を示す。
【０６６０】
【表６９】
2018171059.tif 000123
【０６６１】
【表７０】
2018171059.tif 000124
【０６６２】
さらに、複製効率はまた、ヒト遺伝子転写レベルと比較した。結果は、１１４のヒト遺伝子が、平均ワクシニア初期遺伝子転写と強力な相関性（Ｒ２≧０．６）を示したことを示した。これらの遺伝子は、以下のネットワークに組織化された：翻訳後修飾、遺伝子発現、細胞死、ならびに細胞成長および増殖。上位の分子機能は、細胞周期、細胞移動、成長および増殖、ならびに細胞間シグナル伝達であった。それらの転写の挙動によって同定したウイルス候補遺伝子は、ウイルス複製に特徴的であるが、これらのウイルス遺伝子、したがって複製効率に影響を及ぼすことができたヒト遺伝子があるかどうかを調べるために使用した。ウイルス転写と最も強力なポジティブな相関を有するヒト遺伝子は、発現レベルの階層クラスタリングによる相関分析（ピアソンの相関、Ｒ２＝０．８）から決定されるように、ＭＬＬ５、ＬＲＲＦＩＰ２、ＣＳＲＮＰ２、ＥＦＨＤ１、ＴＸＮＲＤ３、ＡＲＦＩＰ２、ＥＮＴＰＤ６、ＩＴＰＫＡ、ＹＴＨＤＦ２、ＭＲＳＰＳ１１、およびＰＲＥＰであった。宿主遺伝子発現およびウイルス候補遺伝子の間の相関分析は、ヒト遺伝子のセットとの強力なネガティブまたはポジティブな相関を明らかにした。
【０６６３】
３．  要約
結果は、ウイルス複製、初期遺伝子発現、およびそれぞれの宿主応答の間の直接的な相関を示す。
【実施例１４】
【０６６４】
ＳＴＳＡ−１と呼ばれるイヌ軟部組織肉腫（ＣＳＴＳ）細胞株の生成
細胞株ＳＴＳＡ−１は、左の前肢上に、固く、痛みを伴う、紅斑性の腫瘤の症状を示した７歳のオスの去勢したゴールデンレトリーバー犬の腫瘍から誘導した。腫瘤は、深い指の屈筋および屈筋手根筋肉に腫瘍が広範囲に浸潤していたので、それらの切除により外科的に減量した。対象は、全過程の放射線療法を受けた。３カ月で、再確認検査、胸部の放射線写真、および腹部の超音波は、転移の形跡を示さなかったが、左前肢の放射線写真は、遠位尺骨、尾状遠位橈骨、および手根骨の重症の溶解を明らかにした。肥大した左肩甲骨前リンパ節の細針穿刺液を、細胞診によって転移性間葉系新形成と診断した。この時に、肢を切断し、肥大したリンパ節を摘出した。肢および腋窩および肩甲骨前リンパ節のホルマリン固定試料に対する組織学的検査により、病変が、血管侵入、骨髄腔の中への腫瘍細胞の浸潤、および流入領域リンパ節への転移を有する中等度の分類の軟部組織肉腫と一致していたことを確認した。
【０６６５】
細胞を、培養のために腫瘤から無菌的に単離した。手短かに言えば、腫瘍を外科的に切除し、脂肪および壊死組織を、腫瘍の固定していない部分から切り取った。その後、腫瘤を、１ミリメートルの立方体に細かく切り、２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に置き、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ−Ｃ）、および１０％ＦＢＳを補足した、アール塩ありの最小必須培地の続く追加と共に、室温で１０分間付着させ、その後、３７℃、５％ＣＯ２、および１００％湿度でインキュベートした。細胞がフラスコ表面のおよそ８０％を覆った場合または組織外植片が腐食していた場合はもっと早くに、培養細胞のトリプシン処理および継代を実行した。一度、初代培養物が確立されたら、それは１０％ＦＢＳを有するＭＥＭ−Ｃ中で維持し、上記のようにインキュベートした。
【０６６６】
細胞型は、細胞化学および免疫細胞化学的染色によって分析した。手短かに言えば、初代細胞は、上記に記載されるような３５ｍｍ直径プレート（Ｎｕｎｃ）中で成長させた。その後、細胞は、トリプシン処理し、１０％ＦＢＳを有するＭＥＭ−Ｃ中に収集し、５分間４００ｘｇでの遠心分離によってペレットにした。細胞のペレットは、１ｍＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に浮遊させ、このうち、細胞の１００μＬ一定分量を、荷電スライドガラス上で３分間１０００ｒｐｍで細胞遠心した。続いて、付着細胞は、骨、肝臓、腎臓、および腸に由来する細胞において検出可能であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を検出するために、ＢＣＩＰ／ＮＢＴホスファターゼ基質（ＫＰＬ，  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）と共に１０分間インキュベートした。付着細胞はまた、組織球性細胞のマーカーであるマウス抗イヌＣＤ１８モノクローナル抗体により直接免疫染色した（ＣＡ１６．３Ｃ１０、Ｄｒ．  Ｐｅｔｅｒ  Ｍｏｏｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｄａｖｉｓ、ＣＡから）。さらなるスライドは、デクローキング（ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ）チャンバー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）において抗原回復にかけ、サイトケラチン（上皮起源の細胞内に見つけられる）を検出するためにマウスモノクローナル抗ＡＥＬおよび抗ＡＥ３抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）のカクテルまたはマウスモノクローナル抗ビメンチン抗体（Ｖ−９、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）（間葉細胞中に存在する）と共にインキュベートした。結果は、細胞が、ビメンチンに対してポジティブであるが、他のタンパク質に対してネガティブことを示し、これは軟部組織肉腫診断を支持する。
【０６６７】
マルチプレックス種特異的ＰＣＲおよび縦列型反復配列分析により、細胞がイヌ起源であることもまた確認した（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ２３：７８０−７８５）。
【実施例１５】
【０６６８】
様々なイヌがん細胞株に対する、イヌ異種移植片マウスモデルにおけるＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、およびＬＩＶＰ  ６．１．１の効果
１．  イヌがん細胞株のパネルに対するインビトロにおけるＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果
２４ウェルプレートにおいて成長させた様々なイヌがん細胞株を、表７０において記載されるように、０．１または１．０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ワクシニアウイルスＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１０９、ＧＬＶ−１ｈ１６３、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、および／またはＬＩＶＰ  ６．１．１のうちの１つにより別々に感染させた。試験したイヌがん細胞株は、ＳＴＳＡ−１（Ｅｘａｍｐｌｅ  １４において記載される）、ＤＴ０８／４０（Ｄｒ．  Ｎｏｌｔｅ、Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙにより提供された）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−１８３）、またはＣＨＡＳ（Ｄｒ．  Ｇｒｅｇ  Ｏｇｉｌｖｉｅ、Ａｎｇｅｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡにより提供された）であった。細胞は、２０分毎の緩やかな撹拌と共に１時間３７℃でインキュベートした。その後、感染培地を除去し、新鮮な成長培地と交換した。ウイルス上清および細胞溶解物は、感染の１、６、２４、４８、７２、および９６時間後に収集し、ウイルス複製および細胞傷害性を含む、治療効果に関連する様々なパラメータを、評価した。
【０６６９】
【表７１】
2018171059.tif 000125
【０６７０】
ａ．  ウイルス複製
収集した細胞溶解物３回の凍結融解サイクルの後に、溶解物の段階希釈溶液を、上記に記載されるように、ＣＶ−１細胞に対する標準的なプラークアッセイによって力価を測定した。試料はすべて、三通り測定した。結果は、効率的なウイルス複製が、すべての細胞株において、すべての試験したウイルス株によって観察されたことを示した。一般的に、４８時間または７２時間にわたり１００倍を超える力価の増加があった。
【０６７１】
ｂ．  細胞傷害性
細胞傷害性は、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａｎ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、感染細胞の生存度を測定することによって評価した。細胞の感染の２４、４８、７２、または９６時間後に、培地は、フェノールレッドなしのＲＰＭＩ  １６４０中に溶解した、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴの濃度の０．５ｍｌ  ＭＴＴ溶液と交換し、５％ＣＯ２大気中、３７℃で２時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液の除去の後に、発色反応は、イソプロパノール中に希釈した１Ｎ  ＨＣｌを追加することによって停止させた。その後、光学濃度は、５７０ｎｍの波長で測定した。非感染細胞は基準として使用し、１００％生存可能であると見なした。結果は、表７１に示し、感染の７２時間後（ｈｐｉ；９６ｈｐｉで評価したＤＴ０８／４０に対するＬＩＶＰ  ６．１．１の細胞傷害性の活性を除く）に死滅した細胞のパーセントを記載する。
【０６７２】
【表７２】
2018171059.tif 000126
＊感染の９６時間後（ｈｐｉ）の細胞傷害性の活性
【０６７３】
２．  イヌ成長および療法に対する、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、およびＬＩＶＰ  ６．１．１の効果
軟部組織肉腫異種移植片モデル（ＳＴＳＡ−１）、イヌメラノーマ異種移植片モデル（ＣＨＡＳ）、イヌ骨肉腫異種移植片モデル（Ｄ１７）、およびイヌ前立腺癌異種移植片成長モデル（ＤＴ０８／４０）を、インビボにおけるウイルス株の効果を試験するために生成した。
【０６７４】
ａ．  イヌ軟部組織肉腫
軟部組織肉腫腫瘍皮下異種移植片の進行に対するＧＬＶ−１ｈ６８、ＧＬＶ−１ｈ１０９、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１、およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果は、８週間（ウイルス感染後４２日間）、週に二度、ウイルスにより処理した腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、６〜８週齢メスヌードマウス（ＮＣＩ／Ｈｓｄ／Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）の右後肢に１×１０６ＳＴＳＡ−１のイヌの軟部組織肉腫細胞を皮下に移植することによって生成した。移植の４週間後に、マウスはすべて、約４００〜５００ｍｍ３の体積を有する腫瘍を発達させた。
【０６７５】
１）  ＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＶＰ  １．１．１、ＬＩＶＰ  ５．１．１
２８日目に、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＶＰ  １．１．１、またはＬＩＶＰ  ５．１．１の単一用量（１×１０７ｐｆｕ）を、外側尾静脈に静脈注射した（ｉ．ｖ．）。対照動物は、ＰＢＳのみをｉ．ｖ．注射した（ｎ＝６／グループ）。腫瘍体積は、週に二度、測定した。過度の腫瘍量（＞３０００ｍｍ３）により、対照グループの動物はすべて、ウイルス感染の２１日目に殺された。結果は、ＧＬＶ−１ｈ６８、ＬＩＶＰ  １．１．１、またはＬＩＶＰ  ５．１．１の全身投与が、対照マウスと比較して、腫瘍成長の有意な阻害につながったことを示す。ＬＩＶＰ  ５．１．１およびＧＬＶ−１ｈ６８の両方が対照動物と比較して腫瘍成長を遅らせたが、これらの処理グループのそれぞれの６匹のマウスのうちの２匹は、ウイルスの感染の３５日後までに３０００ｍｍ３を超える体積を有する腫瘍を発達させた。これらのデータは、ＬＩＶＰ  １．１．１が、イヌ軟部組織肉腫異種移植片に対して、ＧＬＶ−１ｈ６８またはＬＩＶＰの５．１．１よりも高度な腫瘍崩壊の可能性を有したことを示す。
【０６７６】
実験の第２のセットにおいて（ｎ＝４）、イヌ軟部組織肉腫ＳＴＳＡ−１異種移植片へのＬＩＶＰ  １．１．１の単一のｉ．ｖ．注射は、毒性が観察されることなく、４２日間の期間にわたりほぼ完全な腫瘍後退につながった。
【０６７７】
さらに、長期生存実験において、ＬＩＶＰ  １．１．１の注射は、ＰＢＳ処理対照マウスと比較して、肉腫を有するマウスの生存における有意な改善をもたらした［Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔありの二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりＰ＝０．００３９］。
【０６７８】
２）  ＧＬＶ−１ｈ１０９およびＬＩＶＰ  ６．１．１
ＧＬＶ−１ｈ１０９およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果は、上述されるものと同じモデルにおいて評価した。この場合、ウイルスの注射前の平均出発腫瘍体積は、腫瘍発達の後期段階に相当する、マウスがすべて、６００〜１０００ｍｍ３の用量を有する腫瘍を発達させた移植後５週間後であった。動物は、４つのグループ（ｎ＝６／グループ）に分離し、単一用量のＧＬＶ−１ｈ６８（１×１０７ｐｆｕ）、ＬＩＶＰ  ６．１．１（１×１０７ｐｆｕ）、ＬＩＶＰ  ６．１．１（５×１０６ｐｆｕ）、またはＰＢＳを外側尾静脈に静脈注射した。腫瘍体積は、週に二度、測定した。過度の腫瘍量（＞３０００ｍｍ３）により、対照ＰＢＳのグループの動物はすべて、感染の１４日後に安楽死させた。対照動物と比較した、腫瘍成長の阻害は、すべての試験した時点で、すべてのウイルスにより処理したグループについて一般的に同じであり、対照と比較して、腫瘍成長における有意差をもたらした。例えば、感染の２１、２８、および３５日後に、すべての、ウイルスにより処理したグループについての腫瘍体積は、約５００ｍｍ３から約１０００ｍｍ３の間であり、対照動物と比較して、腫瘍量において実質的な低下を証明した。結果は、１×１０７ｐｆｕまたは５×１０６ｐｆｕ  ＬＩＶＰ  ６．１．１により処理した動物の間で同様であった。
【０６７９】
ｂ．  イヌメラノーマ異種移植片成長
イヌメラノーマ腫瘍異種移植片の進行に対するＧＬＶ−１ｈ１６３およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果は、８週間を超える間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、オスヌードマウス（Ｈｓｄ／Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の右外側大腿に対して５×１０６ＣＨＡＳ細胞を皮下注射することによって生成した。移植の３間後に、マウスはすべて、約４００〜５００ｍｍ３の体積を有する腫瘍を発達させた。移植の３週間後に、グループのマウス（ｎ＝５〜６）に、２×１０６ｐｆｕのＬＩＶＰ  ６．１．１またはＧＬＶ−１ｈ１６３またはＰＢＳを後眼窩注射した。腫瘍体積は、毎週１回測定した。結果は、ＬＩＶＰ  ６．１．１ではなくＧＬＶ−１ｈ１６３が、感染の４２日後に、腫瘍成長における有意な遅延をもたらしたことを示す。感染の４２日後に、ＧＬＶ−１ｈ６３により処理したマウスの腫瘍体積は、約２０００ｍｍ３であったが、対照マウスまたはＬＩＶＰ  ６．１．１により処理したマウスの腫瘍体積は、約４０００ｍｍ３であった。対照およびＬＩＶＰ  ６．１．１により処理したグループ由来のマウスは、４２日目に安楽死させた。
【０６８０】
ｃ．  イヌ骨肉腫異種移植片成長
イヌ骨肉腫異種移植片の進行に対するＧＬＶ−１ｈ１６３およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果は、８週間を超える間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、オスヌードマウス（Ｈｓｄ／Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の右外側大腿に対して５×１０６  Ｄ１７細胞を皮下注射することによって生成した。移植の４４日後に、グループのマウス（ｎ＝５〜６）に、２×１０６ｐｆｕのＬＩＶＰ  ６．１．１またはＧＬＶ−１ｈ１６３ウイルスを後眼窩注射した。対照グループのマウスにＰＢＳを投与した。結果は、ＬＩＶＰ  ６．１．１およびＧＬＶ−１ｈ１６３の両方による処理が、骨肉腫成長を遅延させ、感染の２１日後から始まったことを示す。例えば２８〜４２日目に（２８、３５、および４２日目に測定）、ＬＩＶＰ  ６．１．１またはＧＬＶ−１ｈ１６３により処理した動物の腫瘍体積は、約１２００ｍｍ３〜２５００ｍｍ３の範囲であったのに対して、対照動物は、これらの時点で、腫瘍成長において安定した増加を示し、腫瘍体積は、それぞれ、約２８００ｍｍ３、３８００ｍｍ３、および７８００ｍｍ３であった。
【０６８１】
ｄ．  イヌ前立腺癌異種移植片成長
イヌ前立腺腫瘍異種移植片の進行に対するＧＬＶ−１ｈ１０９およびＬＩＶＰ  ６．１．１の治療効果は、７週間、週に一度、ウイルスにより処理した、腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍体積を測定することによってインビボにおいて評価した。腫瘍は、６〜８週齢ヌードマウス（ＮＣＩ／Ｈｓｄ／Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の右後肢に５×１０６  ＤＴ０８／４０細胞を皮下に移植することによって生成した。腫瘍細胞移植の４９日後に、グループのマウス（ｎ＝７／グループ）に、５×１０６ｐｆｕのＬＩＶＰ  ６．１．１またはＧＬＶ−１ｈ１０９ウイルスを外側尾静脈に静脈注射（ｉ．ｖ．）した。対照グループのマウスにＰＢＳを投与した。結果は、ＬＩＶＰ  ６．１．１またはＧＬＶ−１ｈ１０９ワクシニアウイルスによる単一の注射が、感染の１４日後から始まる対照ＰＢＳ動物と比較して、腫瘍成長の有意な阻害につながり、２つのウイルスにより処理した動物グループの間で同様であったことを示す。例えば、２１〜４９日目に（２１、２８、３５、４２、および４９日目に測定）、ウイルスにより処理した動物グループの腫瘍体積は、一般的に、約２５０ｍｍ３〜３００ｍｍ３であった。これらの時点の間の動物の対照グループについて、腫瘍成長は、着実に増加し、腫瘍体積は、それぞれ、約３８０ｍｍ３、４４０ｍｍ３、４８０ｍｍ３、５８０ｍｍ３、および７５０ｍｍ３であった。
【０６８２】
修飾が当業者らに明らかであるので、本発明が添付の請求項の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【配列表】
2018171059000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月22日(2018.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むクローン株以外の単離されたＬＩＶＰクローン株であって、
クローン株が非ウイルス異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する非ウイルス異種核酸を含有するように改変されず；
クローン株が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
クローン株が、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有するＧＬＶ−１ｈ６８と比較し、より高い抗腫瘍形成性および／または低下している毒性を有する、
単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項２】
配列番号１０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むが、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含まない、請求項１に記載の単離されたＬＩＶＰクローン株。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＬＩＶＰクローン株のゲノム；および
前記ゲノムに挿入される異種遺伝子産物をコードする核酸； 
を含み、要すれば、そのウイルスゲノムの非必須領域から核酸が削除されている、
組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項４】
異種遺伝子産物が治療剤または診断剤である、請求項３に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項５】
異種遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、抗原、細胞マトリックス分解遺伝子、組織再生およびヒト体細胞の多能性細胞への再プログラミングに関する遺伝子、検出可能な生成物もしくはシグナルを生成するように基質を改変する、あるいは抗体により検出可能である酵素、造影剤に結合することができるタンパク質、光学画像化または検出のための遺伝子、ＰＥＴ画像化のための遺伝子ならびにＭＲＩ画像化のための遺伝子の中から選択される、請求項３または４に記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項６】
異種遺伝子産物が、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、リボザイム、輸送タンパク質、一本鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、血管新生阻害剤、腫瘍抑制因子、細胞傷害性タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質および組織因子の中から選択される治療剤である、請求項３から５のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項７】
異種遺伝子産物が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、Ｔリンパ球上で発現される受容体であるＨＶＥＭについてＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシン誘導性発現物（ＬＩＧＨＴ）、ｐ６０スーパー抗原、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ１α）、ＳＴＡＴ１β、プラスミノゲンｋ５ドメイン（ｈＫ５）、色素上皮分化因子（ＰＥＤＦ）、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体、一本鎖抗ＤＬＬ４抗体、一本鎖抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＮＭ２３、カドヘリン１（ＥＣＡＤまたはｃｄｈ１）、リラキシン１（ＲＬＮ１）、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マイクロＲＮＡ１２６（ｍｉＲ−１２６）、マイクロＲＮＡ１８１、マイクロＲＮＡ３３５、マンガナーゼスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ｎｐｐａ１）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＣＤＣ６、および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の中から選択される治療剤である、請求項３から６のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルス株を含む、細胞培養物または単離された細胞。
【請求項９】
薬学的に許容される担体中に請求項１から７のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルス株を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
対象における腫瘍または転移の検出に使用するための組成物であって、
前記組成物は、請求項３から７のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株を含み；かつ
ウイルスが、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、組成物。
【請求項１１】
対象における腫瘍または転移を検出するための医薬組成物の調製における使用のための請求項３から７のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株の使用であって、ウイルスが、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用。
【請求項１２】
宿主におけるウイルス複製の検出に使用するための組成物であって、
前記組成物が、請求項３から７のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株を含み；かつ
ウイルスが、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、組成物。
【請求項１３】
宿主におけるウイルス複製を検出するための医薬組成物の調製における使用のための請求項３から７のいずれかに記載の組換えＬＩＶＰウイルス株の使用であって、
ウイルスが、検出可能なタンパク質または検出可能なシグナルを誘導するタンパク質をコードする核酸を含む、使用。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれかに記載のＬＩＶＰウイルス株を含む、対象における増殖性疾患を処置するための使用のための組成物。
【請求項１５】
対象における増殖性障害の処置のための医薬組成物の調製のための、請求項１から７のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰウイルス株の使用。
【請求項１６】
増殖性障害が、がんである、請求項１４に記載の組成物または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、または膵がんである、請求項１６に記載の組成物または使用。
【請求項１８】
がんが、固形腫瘍がんまたは転移がんである、請求項１６または１７に記載の組成物または使用。
【請求項１９】
腫瘍または転移が、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、または膵腫瘍である、請求項１８に記載の組成物または使用。
【請求項２０】
ウイルス株を調製するための方法であって、
請求項１から７のいずれかに記載の単離されたＬＩＶＰウイルス株を含む単離された宿主細胞または細胞培養物を、前記ウイルス株が産生される条件下で増殖させ、要すれば、ウイルスを単離する、方法。
【外国語明細書】
2018171059000001.pdf