(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト肝性リパーゼ量を正確に測定するモノクローナル抗体、試薬及び方法、並びにモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの提供。【解決手段】ヘパリンを投与していないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼに特異的に免疫反応性を有する、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。ヘパリンを投与していないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼ、及び、ヘパリンを投与したヒト血液中に遊離するヒト肝性リパーゼの両方に特異的に免疫反応性を有する、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。前記モノクローナル抗体であって、遺伝子組み換えにより得られたヒト肝性リパーゼと抗体との反応が、ヘパリンを投与していないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼにより阻害される、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を、被検試料と反応させるヒト肝性リパーゼの免疫学的測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼに特異的に免疫反応性を有することを特徴とするモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２】
ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼ、及び、ヘパリンが投与されたヒト血液中に遊離するヒト肝性リパーゼの両方に特異的に免疫反応性を有することを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載されたモノクローナル抗体であって、遺伝子組み換えにより得られたヒト肝性リパーゼと該抗体との反応が、ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼにより阻害されることを特徴とする、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を含有することを特徴とする、ヒト肝性リパーゼを免疫学的に測定するための試薬。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を、被検試料と反応させることを特徴とするヒト肝性リパーゼの免疫学的測定方法。
【請求項６】
被検試料中のＨＬの存否を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片と被検試料とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したＨＬを検出するステップ；
（ｃ）前記ステップにおいてＨＬが検出された場合には、被検試料中にＨＬが存在すると判定し、前記ステップにおいてＨＬが検出されなかった場合には、被検試料中にＨＬが存在しないと判定するステップを備える方法。
【請求項７】
被検試料中のＨＬのレベルを決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片と被検試料とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したＨＬ量を測定するステップ；
（ｃ）前記検出されたＨＬ量から、被検試料中のＨＬのレベルを算出するステップを備える方法。
【請求項８】
被検試料が、ヘパリンが投与されていないヒト血液である、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝性リパーゼ（以下、「ＨＬ」と省略する）を認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を使用した免疫学的測定試薬、及び該モノクローナル抗体を使用した免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬ（ＥＣ３．１．１．３）は、分子量６５ｋＤａの糖タンパク質で、モノマーで活性型である。ＨＬは、肝実質細胞で合成された後、類洞内皮細胞表面に転送され、ヘパラン硫酸様糖鎖を介して細胞表面に結合し、生理作用を発揮している。食餌由来の大型リポタンパク質であるカイロミクロンや肝臓由来の超低比重リポタンパク質（ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＶＬＤＬ）は、リポタンパク質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ：ＬＰＬ，ＥＣ３．１．１．３４）により小型化されてカイロミクロンレムナントや中間比重リポタンパク質（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＤＬ）を生じる。ＨＬは、カイロミクロンレムナントやＩＤＬを、低比重リポタンパク質（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＤＬ）へと代謝する。また、ＨＬは、高比重リポタンパク質（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）に含まれるトリグリセリドやリン脂質の水解に関与し、これらのリポタンパク質の異化代謝において重要な役割を担っている。
【０００３】
現在、ＨＬの測定は、合成基質に対する水解能を測定する方法と、イムノアッセイによりタンパク質を定量する方法とによって行われている。ＨＬは、類洞内皮細胞に結合していることから血中には存在していないか、存在していても極微量であると考えられている。このため、現在のＨＬ測定は、類洞内皮細胞に結合しているＨＬを遊離させるために、ヘパリン（３０〜５０Ｕ／Ｋｇ体重）を静注し、得られた血漿又は血清を被検試料として測定に供している。そのため、従来のＨＬの測定法は、患者の負担が重く、またヘパリン静注していない血液被検試料は測定の対象とできないという問題点があった。
【０００４】
このように従来の抗体は、ヘパリンが投与されていないヒトの血漿又は血清中に存在するＨＬと反応しないか反応しても反応性が極めて低いために、この様な抗体を使用した免疫学的測定法ではヘパリンが静注されていないヒトの血漿又は血清中に存在するＨＬを測定することが出来ず、その結果、ヘパリンが投与されていないヒトの血漿又は血清中にはＨＬは存在しないか、存在しても極微量であり、検出は不可能であると考えられていた。
【発明の概要】
【０００５】
このように、従来ヘパリンが投与されていないヒトの血液中のＨＬが抗体を用いて検出できるとは考えられていなかったにも拘らず、本発明者らは、種々の抗ＨＬモノクローナル抗体を作製し、ヘパリンが投与されていないヒトの血液サンプル及びヘパリンが投与されたヒトの血液サンプルについて免疫反応性を検討した。その結果、本発明者らは、抗体の選択方法を工夫することにより、ヘパリンを投与していないヒトの血液中にも、免疫反応を利用して検出可能なレベルのＨＬが存在していることを見出した。更に、本発明者らは、ヘパリン静注前及びヘパリン静注後の血液（例えば、血漿又は血清、本段落において以下同じ）中に存在するＨＬ濃度を正確に測定するには、ヘパリン静注前の血液中に存在するＨＬとヘパリン静注後に血液中に遊離してくるＨＬとの両方に対し高い反応性を示すモノクローナル抗体を使用することが重要と考えた。そこで、本発明者らは、ヘパリン静注前の血液中に存在するＨＬとヘパリン静注後の血液中に遊離するＨＬ（ポストヘパリンリンＨＬ）の両方に対して反応性を示すモノクローナル抗体の作製を試み、このような抗体を取得することに成功した。次いで、本発明者らは、このような新規なモノクローナル抗体によって、ヘパリン静注前（ヘパリン未投与）及びヘパリン静注後の血液中に存在するＨＬを正確に測定出来る免疫学的測定試薬と、測定方法の作製に成功し、本発明の提供にいたったものである。
【０００６】
よって、本発明は、ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するＨＬと結合可能なモノクローナル抗体、特には、ヘパリンが投与されていないヒトの血液中に存在するＨＬとヘパリンが投与された血液中に遊離するＨＬとの両方に結合可能なモノクローナル抗体、及び当該抗体の免疫反応性断片に関する。また、本発明は、当該抗体を利用したＨＬを定量するための試薬および方法に関する。具体的には、本発明は、以下の発明に関する。
（１）  ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するＨＬ、及び、ヘパリンが投与されたヒト血液中に遊離するヒト肝性リパーゼの両方に免疫反応性を有することを特徴とするモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。
（２）  （１）に記載されたモノクローナル抗体であって、遺伝子組み換えにより得られたヒト肝性リパーゼと該抗体との反応が、ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するヒト肝性リパーゼにより阻害されることを特徴とする、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片。
（３）（１）又は（２）に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を含有することを特徴とする、ヒト肝性リパーゼを免疫学的に測定するための試薬。
（４）  （１）又は（２）に記載されたモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を、被検試料と反応させることを特徴とするＨＬの免疫学的測定方法。
【０００７】
（定義）
本明細書において、「ヒト肝性リパーゼ（ＨＬ）」とは、肝実質細胞で合成された後、類洞内皮細胞表面に転送され、ヘパラン硫酸様糖鎖を介して細胞表面に結合し、生理作用を発揮する分子量６５ｋＤａの糖タンパク質を意味する。ＨＬのｃＤＮＡ配列は既に知られている（ＲｅｆＳｅｑ：Ｐ１１１５０：配列番号１）。
【０００８】
本明細書において、「ヘパリンが投与されていないヒト血液」とは、少なくとも、２時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、又は４８時間前までにヘパリンが血中に投与されていないヒトから採取した血液を意味する。本明細書における、「ヘパリン静注前の血液」及び「ヘパリン未投与の血液」は、「ヘパリンが投与されていないヒト血液」と同意義である。また、「ヘパリンが投与されたヒト血液」とは、ヘパリンが静注などにより血中に投与された後のヒトから採取された血液を意味し、例えば、ヘパリンが投与されてから、５分以内、１０分以内、１５分以内、４５分以内、１時間以内、又は２時間以内に採取されたヒトの血液であってもよい。本明細書における、「ヘパリン静注後の血液」及び「ヘパリン投与後の血液」は、「ヘパリンが投与されたヒト血液」と同意義である。
【０００９】
「ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するＨＬ」及び「プレヘパリンＨＬ」とは、ヘパリンを投与しない状態でヒト血液中に放出されるＨＬを意味する。「ヘパリンが投与されたヒト血液中に遊離するＨＬ」及び「ポストヘパリンＨＬ」とは、ヘパリンが投与されることにより、血中に遊離するＨＬを意味する。これらのＨＬは、一次構造としては同じアミノ酸配列からなるが、本発明者らが検討した結果、プレヘパリンＨＬと結合する抗体は、ヘパリンが投与されていないヒト血液を用いなければ選択できなかったことから、リポタンパク質の結合位置が異なるなど血液中における存在様式や立体構造が異なると考えられる。
【００１０】
本明細書において、抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する（又は、結合する、以下同様）とは、その抗体又はその免疫反応性断片がＨＬ以外のタンパク質に対する親和性よりも、ＨＬに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。特に、本発明の抗体は血液サンプルに対して用いられることから、「特異的に」認識するとは、ＨＬ以外の血中成分に対する親和性よりも、ＨＬに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性で結合する」とは、所望の測定装置または方法（例えば、ＥＬＩＳＡやＥＩＡ）によって、ＨＬを他のアミノ酸配列や立体構造から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、ＥＬＩＳＡによるリコンビナントＨＬ、リコンビナントＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ）、及びリコンビナントＥＬ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｌｉｐａｓｅ）への結合試験において、リコンビナントＨＬに対してのみ顕著に強い結合（１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上など）が認められる抗体であってもよい。あるいは、実質的に高い親和性で結合するとは、被検抗体を用いて血液サンプルを免疫沈降することにより、実質的にＨＬタンパク質のみが沈降すること（例えば、沈降タンパク質の９０％以上、９５％以上、９９％以上などがＨＬタンパク質）、又はウェスタンブロット法により、ＨＬタンパク質のみが顕著に検出される（１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上など）ことを意味していてもよい。
【００１１】
本明細書全体において、「レベル」とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量あるいはその代わりとして用いることができる指標を含む。よって、レベルは蛍光強度等の測定値そのものであってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。また、レベルは、絶対的な数値（存在量、単位面積当たりの存在量など）であっても良いし、又は必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。
【００１２】
（抗体及びその免疫反応性断片）
本発明の抗体は、ＨＬと特異的に結合する。特に、本発明の抗体は、ヘパリンが投与されていないヒトから得られた血液サンプル中に存在するＨＬと結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ヘパリンが投与されていないヒトから得られた血液サンプル中に存在するＨＬ、及び、ヘパリンが投与されたヒトから得られた血液サンプル中に存在するＨＬの両方と結合する。一態様において、本発明の抗体は、遺伝子組み換えにより得られたＨＬとの結合が、ヘパリンが投与されていないヒト血液中に存在するＨＬにより阻害される抗体である。
【００１３】
本発明において、「モノクローナル抗体」は、単一な抗原決定基と反応する、構造がほぼ均一な抗体である。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウス、ラット又はウサギの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってプレヘパリンＨＬと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってプレヘパリンＨＬと特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。例えば、本発明の抗体を治療、予防、又は体内に投与することにより用いる診断に使用する場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト・非ヒト動物のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【００１４】
本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラス（アイソタイプ）であってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体がＩｇＧの場合、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。また、本発明の抗体は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性抗体）、トリスペシフィック（三重特異性抗体）（例えば、ＷＯ１９９１／００３４９３号）であってもよい。
【００１５】
抗体はその可変領域（特には、ＣＤＲｓ）が結合特性を付与していることが知られており、完全抗体でない抗体断片であってもその結合特性を利用可能であることが当業者に広く知られている。本明細書において、「免疫反応性断片」とは、抗体の一部分（部分断片）を含むタンパク質又はペプチドであって、抗体の抗原への作用（免疫反応性・結合性）を保持するタンパク質又はペプチドを意味する。このような免疫反応性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２９（１）：５−６  （２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ  Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２５（７）（２００７）：３０７−３１６；及び、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  ｓｔｅｉｎら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８−１２３（２０１２）参照）。本明細書において、免疫反応性断片は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性）、トリスペシフィック（三重特異性）、及びマルチスペシフィック（多重特異性）のいずれであってもよい。
【００１６】
（核酸分子・ベクター・宿主細胞）
別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子に関する。更に、本発明は、前記核酸分子を有するベクターを包含する。このようなベクターとしては、抗体の発現に利用可能なベクターであれば特に制限されるものではなく、適切なプラスミドベクターなどを使用する宿主に応じて選択することができる。別の態様において、本発明は、前記ベクターを含有する宿主細胞に関する。宿主細胞としては、抗体の発現に利用可能な宿主細胞であれば特に制限されるものではなく、哺乳類細胞（マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ヒト細胞など）、酵母、微生物（大腸菌など）を挙げることができる。
【００１７】
（キット）
また、別の態様において、本発明は、上述の抗体又はその免疫結合性断片を備えるキットに関する。また、一態様において、本発明の測定用キットは、ＨＬの検出用又は測定用のキットであり得る。別の態様において、本発明のキットは、ヘパリンが投与されていないヒト血液サンプル中に存在するＨＬの検出用又は測定用とすることができる。また、本発明は、このようなキットを製造するための、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用を含む。
【００１８】
本発明のキットは、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の検出及び／又は測定方法に基づくことができる。本明細書において、「抗体分子を用いた公知の検出及び／又は測定方法」は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）用キット、簡易ＥＩＡ法用キット、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）用キット、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法用キット）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）用キット等の標識化免疫測定法用キット；ウェスタンブロッティング法用キット等のイムノブロッティング法用キット；金コロイド凝集法用キット等のイムノクロマト法用キット；イオン交換クロマトグラフィ法用キット、アフィニティークロマトグラフィ法用キット等のクロマトグラフィ法用キット；比濁法（ＴＩＡ法）用キット；比ろう法（ＮＩＡ法）用キット；比色法用キット；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）用キット；粒子計数法（ＣＩＡ法）用キット；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）用キット；沈降反応法用キット；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）用キット；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）用キット；比較干渉法用キット等を含む。本発明のキットが、所望の検出及び／又は測定を実施することが可能であるか否かは、標準被検試料又は目的の被検試料を用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出及び／又は測定可能であるか否かを判定することにより確認することができる。
【００１９】
例えば、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）標識化された抗ＨＬ抗体である第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。また、前記第一抗体を標識化抗体とし、前記第二抗体を固定化抗体としてもよい。
または、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）抗ＨＬ抗体である第二抗体が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。また、前記第一抗体をハプテン結合抗体とし、前記第二抗体を固相固定化抗体としてもよい。
あるいは、本発明のキットは、（ｉ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片である第一抗体が固定化した不溶性担体、及び、（ｉｉ）抗ＨＬ抗体である第二抗体が固定化した不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。いずれのキットにおいても、前記第一抗体と前記第二抗体はＨＬの異なる部位を認識する。また、前述の抗体の両方又はいずれか一方を抗体の免疫反応性断片としてもよい。
【００２０】
本発明のキットが標識化された抗体又はその免疫結合性断片を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、トリチウム等の放射能標識；β−ガラクトオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【００２１】
本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、被検試料前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。更に、本発明のキットは、紙箱又はプラスチックケース等のキットの構成物を格納するパッケージ、及び取扱い説明書等を含んでいてもよい。本発明のキットに用いる被検試料としては、血液又はその分画物若しくは処理物（例えば、血漿、血清など）を挙げることができる。本発明のキットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００２２】
（検出・測定用の試薬）
別の態様において、本発明は、本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、ＨＬの検出及び／又は測定に使用するための試薬に関する。あるいは、本発明は、前記試薬を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。本発明の試薬は、生体外で使用する（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ）ための試薬であってもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の抗体を使用することにより、ヘパリンを投与していない被験者由来の血液サンプル中ＨＬを正確に測定することが可能であることから、低侵襲性の診断が可能となり、脂質代謝だけに留まらず、他の領域への応用も期待出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】リコンビナントＨＬ精製タンパク質のＣＢＢ染色の写真である。
【図２】リコンビナントＨＬ、プレヘパリン血漿中のＨＬ、及びポストヘパリン血漿中のＨＬによる、リコンビナントＨＬとモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１との結合阻害を示すグラフである。縦軸は、ＰＢＳ（ネガティブコントロール）添加時のリコンビナントＨＬとモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１との結合を１００％とした場合の、それぞれ、リコンビナントＨＬ、プレヘパリン血漿中のＨＬ、及びポストヘパリン血漿中のＨＬの存在下におけるリコンビナントＨＬとモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１との結合割合（％）を示す。横軸は、添加した阻害剤（リコンビナントＨＬ、プレヘパリン血漿中のＨＬ、及びポストヘパリン血漿中のＨＬ）又はコントロール物質を示す。プレヘパリン血漿中のＨＬ及びポストヘパリン血漿中のＨＬはＰＢＳで１６倍希釈したものを用いた。リコンビナントＨＬは７４．２５ｎｇ／ｍＬの濃度で用いた。上段はモノクローナル抗体９Ａ１の結果を、下段はモノクローナル抗体１４１Ａ１の結果を示す。
【図３】抗原ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１のＨＬへの結合特異性を示すグラフである。縦軸は吸光度（結合量を反映）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。いずれの抗体も、ＨＬへの結合が顕著であり、特異的であることが示された。
【図４】免疫沈降法によるモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１のＨＬへの特異性を示す写真である。リコンビナントＨＬ、プレヘパリン血漿、及びポストヘパリン血漿をモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１で免疫沈降したサンプルは、いずれもＨＬの分子量においてモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１による免疫染色されるバンドが確認され、ＨＬと特異的に結合していることが示された。一方で、ネガティブコントロールとして用いたＨＬとは結合しないモノクローナル抗体４８Ａ１で免疫沈降したサンプルには、モノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１による免疫染色されるバンドは存在しなかった。
【図５】モノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた、プレヘパリンＨＬ及びポストヘパリンＨＬ測定の希釈直線性を示すグラフである。縦軸はＨＬ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表し、横軸は、測定値を表す。ＨＬ濃度は、リコンビナントＨＬ（標準物質）を用いて作成した検量線から算出した。
【図６】モノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したヘパリン静注前後の血漿中のＨＬ濃度を示すグラフである。縦軸はＨＬ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【図７】本モノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定したプレヘパリン血清中ＨＬの濃度を示すグラフである（ｎ＝３６）。本測定結果から得られた平均値は３８．２ｎｇ／ｍＬであった。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（抗体の取得）
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＬタンパク質を免疫原として免疫動物に投与し、脾臓等から得た免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、次いで、ガイハイブリドーマが産生する抗体を、ＨＬとの反応性について１次選択し、選択された抗体をさらにプレヘパリンＨＬによる阻害について２次選択し、プレヘパリンＨＬで阻害される抗体を選択することにより得ることができる。免疫原としてはリコンビナントＨＬタンパク質、ヒト生体試料より調整されたＨＬタンパク質、または、フラグメントＨＬペプチドなどが挙げられる。免疫に使用する動物としては特に限定されないが、一般的にはマウス、ラットなどが使用される。免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは、フロインド・コンプリート・アジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う方法が挙げられる。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宜決定されるが、通常の投与量は、１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度とするのが適当である。細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３〜４日後に摘出した脾臓細胞およびリンパ節細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる他方の親細胞としての骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては既に確立されている公知の各種細胞株、例えば、マウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ−Ａｇ４４４４−１）〔Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１−５１９（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９（１９７８）〕、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３〔Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３：１５４８（１９７９）〕、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１〔Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８１：１（１９７８）〕等や、ラットにおけるＹ３−Ａｇ１．２．３〔Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１３１−１３３（１９７９）〕、ＹＢ２／Ｏ（ＹＢ２／３ＨＬ／Ｐ２．Ｇ１１．  １６Ａｇ．２０）〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３Ｂ：１（１９８１）〕等が挙げられる。細胞融合には通常用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合は通常の方法と同様にすればよく、例えば免疫細胞は骨髄細胞に対して約１〜１０倍で、ポリエチレングリコールは平均分子量１０００〜６０００のものを３０〜６０％の濃度で使用し、免疫細胞と骨髄細胞の混合ペレットに滴下し混ぜ合わせる方法が挙げられる。ハイブリドーマの選択は、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン含む培地）を用いて行えばよい。
【００２６】
ＨＡＴ培地で培養後、得られたハイブリドーマの培養上清を、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫沈降法で検索し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法で単一クローン化が行われる。これによりプレヘパリンＨＬおよびポストヘパリンＨＬの両方に対して反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体を選択するには、次のような方法が挙げられる。
（ｉ）一次選択法として、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したＨＬに培養上清を反応させる。次に、酵素標識二次抗体を反応させ、ＨＬと反応する抗体を産生するクローンを選択する。
（ｉｉ）二次選択法として、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したＨＬに、一次選択されたクローンの培養上清とヘパリン静注前の血清又は血漿との混合液を反応させる。次に、酵素標識二次抗体を反応させ、ヘパリン静注前の血清又は血漿で反応が阻害される抗体を産生するクローンを選択する。
【００２８】
かくして得られる抗体産生ハイブリドーマからの抗体の製造は、常法に従いハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、あるいは、前記ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により実施できる。
【００２９】
（核酸、ベクター、宿主細胞）
本発明の核酸は、上述において得られた抗体を産生するハイブリドーマからクローニングするか、あるいは、上述において得られた抗体またはその免疫反応性断片のアミノ酸配列を基に、適宜核酸配列を設計することにより得ることができる。本発明のベクターは、得られた核酸を適宜発現に適したベクターに組み込むことにより得ることができる。本発明のベクターは、本発明の核酸の他、発現に必要な領域（プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでいてもよい。また、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターを適切な細胞株（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、大腸菌等の微生物）に導入することにより得ることができる。
【００３０】
（標識）
抗体又はその免疫反応性断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００３１】
（キット）
また、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有する、ＨＬ検出又は測定キットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体又はその免疫反応性断片を用いて、目的に応じて当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
【００３２】
（ＨＬの検出及び／又は測定方法）
本発明の抗体を用いて、従来の任意の免疫学的測定方法によりＨＬを測定することができる。よって、一態様において、本発明は、ＨＬの検出及び／又は測定方法に関し、より具体的には、本発明のモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片を、被検試料と反応させることを特徴とするヒト肝性リパーゼの免疫学的測定方法に関する。本発明のＨＬの検出及び／又は測定方法は、基本的な構成として、被検試料と本願発明の抗体又はその免疫反応性断片を接触させるステップ、及び、本願発明の抗体又はその免疫反応性断片に結合したＨＬを検出及び／又は測定するステップを備える。また、本発明の検出及び／又は測定方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。また、本発明の検出方法は定性的に行われ、本発明の測定方法は定量的に行われるものであってよい。
【００３３】
被検試料としては血液又はその分画物若しくは処理物（例えば、血漿又は血清）（本段落において総称して「血液等」という）が用いられる。本発明の抗体は、プレヘパリンＨＬ及びポストヘパリンＨＬの両方と結合することができることから、被検試料は、ヘパリン投与後の血液等及びヘパリン未投与の血液等のいずれであってもよい。
【００３４】
免疫学的測定方法としては、通常の競合法、サンドイッチ法によるＲＩＡ又はＥＩＡ等が挙げられる。これらの方法において、本発明の抗体を上述の通り標識して用いることもできる。また、抗体を各種プラスチックウェル、各種プラスチックビーズ等の担体に固相化して用いても良い。
【００３５】
より具体的には、本発明の検出方法は、例えば、以下の方法であってもよい：
（ａ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片と被検試料とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したＨＬを検出するステップ；
（ｃ）前記ステップにおいてＨＬが検出された場合には、被検試料中にＨＬが存在すると判定し、前記ステップにおいてＨＬが検出されなかった場合には、被検試料中にＨＬが存在しないと判定するステップを備える、被検試料中のＨＬの存否を決定する方法。
【００３６】
また、本発明の測定方法は、例えば、以下の方法であってもよい：
（ａ）本発明の抗体又はその免疫反応性断片と被検試料とを接触させるステップ、
（ｂ）前記抗体又はその免疫反応性断片へ結合したＨＬ量を測定するステップ；
（ｃ）前記検出されたＨＬ量から、被検試料中のＨＬのレベルを算出するステップを備える、被検試料中のＨＬのレベルを決定する方法。
【００３７】
本発明の測定方法を定量的に行う場合、予め適宜既知の濃度に段階希釈された標準物質（例えば、精製したリコンビナントＨＬ）を被検試料の検出と同時又は別々に用いて検量線を作成し、当該検量線を基に被検試料中の測定値からＨＬの濃度を計算して求めることができる。
【００３８】
本明細書において、「抗体又はその免疫反応性断片と被検試料とを接触させるステップ」及び「被検試料中のＨＬを検出（又は定量）するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、ＥＬＩＳＡプレートに固相化した本発明のモノクローナル抗体に、被検試料又は希釈した被検試料を接触させて反応させること、洗浄すること、更に、ＨＬと結合可能な酵素標識した異なる抗ＨＬモノクローナル抗体と接触させて反応させること、非結合抗体を洗浄により除去すること、当該抗体の標識（例えば、色素）の存在、量又は強度（例えば、発色など）を検出又は測定すること（例えば、吸光度の測定など）、及び、被検試料中に存在するＨＬタンパク質量を計算することを含むことができる。これらの測定は、通常の免疫学的測定法と同様に０〜４０℃のいずれの温度で行うこともできる。
【００３９】
また、イムノクロマトにより検出を行う場合には、ＨＬと結合可能な標識化抗体に被検試料を接触させた後、当該混合物を本発明の抗体又はその免疫反応性断片が特定部位に固定化された担体と接触させ、当該部位における前記標識化抗体を検出することにより行うことができる。本段落の記載においては、ＨＬと結合可能な標識化抗体の代わりに、標識化された本発明の抗体又はその免疫反応性断片を使用し、かつ、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の代わりに、ＨＬと結合可能な抗体を使用してもよい。
【００４０】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４１】
（実施例１）モノクローナル抗体の調製
（１）ハイブリドーマの調製
ヒトＨＬ  ｃＤＮＡのクロ−ニングおよび哺乳類細胞系での発現：
発表されているヒトＨＬ  ｃＤＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ：Ｐ１１１５０：配列番号１）に基づいて合成したフォワ−ドプライマー（配列番号３）およびリバ−スプライマー（配列番号４）を用いて、ヒト肝ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）からＨＬの全長ｃＤＮＡを増幅させた。増幅産物をＥＣｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社製）の形質転換に用いた。シーケンス解析の結果、ＰＣＲによってクロ−ン化したＨＬ  ｃＤＮＡは完全に配列決定された。
【００４２】
次に、ＨＬタンパク質を恒常的に発現する細胞株の作製を行った。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（日本、ＩＢＬ社製）中で５％ＣＯ２、３７℃で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒトＨＬ全長／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をトランスフェクションした。得られた細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（ＧＩＢＣＯ）を用いて１０日間選択後、限界希釈法を用いクローニングを行った。１０日間の培養の後、培養液を無血清培地ＡＳＦ１０４Ｎに交換、更に一日培養を行った。無血清において培養した各ウェルの上清を１００ｍＭ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）において希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に固相化、抗ヒトＨＬウサギ抗体（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を反応させ、続いてペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（ＩＢＬ社製）を反応させ、基質液により発色させた。その中より、ヒトＨＬタンパク質全長を恒常的に発現する株、クローン９Ａ８を選択した。
【００４３】
９Ａ８株の培養によって得られたリコンビナントＨＬタンパク質を含有する上清より、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）モノクローナル抗体アフィニティーゲル（ＳＩＧＭＡ社製）を用い精製を行った。具体的には、ＦＬＡＧ融合ＨＬタンパク質産生株９Ａ８の培養により得られた培養液を、アフィニティーゲルへ流し入れ、その後ゲルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄、Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を添加することによってＨＬタンパク質を溶出させた。直ちにＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）塩酸（ｐＨ８．０）で中和した。培養上清より精製したＨＬタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行うことにより可視した。結果を図１に示す。
【００４４】
得られた免疫原（ＨＬタンパク質）と完全フロイントアジュバンド（ＧＩＢＣＯ社製）とを１対１で混和乳化し、０．１ｍｇ／０．１ｍＬ（エマルジョン）で６週齢の雌ＢＡＬＢ／ＣマウスおよびＷｉｓｔａｒラットの皮下および皮内に１週間間隔で４回投与後、最終免疫の２日後にリンパ節を摘出した。摘出したリンパ節から得られたリンパ節細胞と骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とを５対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞はリンパ節細胞として２．５×１０６細胞／ｍＬになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．１ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマが生育したウェルの培養上清について、ハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化後、以下の一次選択及び二次選択に従って有望抗体産生株を選択した。
【００４５】
（１）一次選択法
リコンビナントＨＬタンパク質を１００ｍＭ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、細胞融合１０日後の培養液を希釈液にて２倍に調整し、５０μＬ／ウェル加え室温で３０分反応した。洗浄液で４回洗浄した後、マウス・モノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ウェル加え、ラット・モノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗ＲａｔＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１５分インキュベートした。同様に洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を５０μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加え、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、リコンビナントＨＬに反応を示すクローンを選択した。
【００４６】
（２）二次選択法
リコンビナントＨＬを１００ｍＭ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、一次選択されたクローンの培養上清と、ヘパリンを投与していないヒトから得た血漿（以下、「プレヘパリン血漿」という）を混合した後、プレートと反応させた。洗浄液で４回洗浄した後、マウス・モノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ウェル加え、ラット・モノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗Ｒａｔ  ＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１５分インキュベートした。同様に洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を５０μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加え、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その中より、プレヘパリン血漿でリコンビナントＨＬとの反応が阻害される抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
【００４７】
一次選択法及び二次選択法により選択した結果、図２に示す如く、プレヘパリン血漿中のＨＬにより、リコンビナントＨＬとの反応が阻害されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ９Ａ１および１４１Ａ１を選択した。
【００４８】
（２）モノクローナル抗体の調製
あらかじめ２週間前にプリスタン０．２ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌Ｓｃｉｄマウスに、ハイブリドーマ９Ａ１を細胞数１×１０７個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ＭＮａＣｌ−１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ，ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ファルマシア）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させてモノクローナル抗体９Ａ１を精製した。一方、ハイブリドーマ１４１Ａ１はＩｎｔｅｇｒａ  ｃｌａｓｓｉｃ１０００（Ｉｎｔｅｇｒａ社製）において高密度培養し、上清を等量の吸着用緩衝液（２０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐＨ７．０）と混和後、この培養上清を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＧカラム（ファルマシア）に通して抗体をカラムに吸着させ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させてモノクローナル抗体１４１Ａ１を精製した。
【００４９】
（実施例２）モノクローナル抗体の特異性
（１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による抗体の特異性
実施例１で得た抗体が、ＨＬに対する抗体であることを確認するため、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により解析した。具体的には、リコンビナントＨＬ、リコンビナントＬＰＬ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｐａｓｅ）、及びリコンビナントＥＬ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｌｉｐａｓｅ）を１００ｍＭ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、両モノクローナル抗体を希釈液にて１０００〜７．８ｎｇ／ｍＬに調整し、５０μＬ／ウェル加え室温で３０分反応した。洗浄液で４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）およびペルオキシダーゼ標識抗Ｒａｔ  ＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１５分インキュベートした。同様に洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５０】
図３に示す如く、両モノクローナル抗体がリコンビナントＨＬに反応し、リコンビナントＬＰＬおよびリコンビナントＥＬに反応しないことが示された。よって、両モノクローナル抗体がＨＬタンパク質特異的であることが確認された。
【００５１】
（２）免疫沈降法、ウェスタンブロット法による抗体の特異性
実施例１で得た抗体が、ＨＬに対する抗体であることを確認するため、免疫沈降法、ウェスタンブロット法により解析した。具体的には、リコンビナントＨＬタンパク質、ヘパリンを投与していないヒトから得た血清（以下、「プレヘパリン血清」という）、及びヘパリンを投与した後にヒトから採取した血清（以下、「ポストヘパリン血清」という）に対して、モノクローナル抗体９Ａ１を結合させたアフィニティーゲル又はモノクローナル抗体１４１Ａ１を結合させたアフィニティーゲルを反応させた。また、ネガティブコントロールとして、同様にモノクローナル抗体４８Ａ１を結合させたアフィニティーゲルを反応させたサンプルも用意した。その後、そのタンパク質複合体を洗浄し、ＳＤＳ，２メルカプトエタノールサンプルバッファーに懸濁させ、熱処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に電気的に転写した。次いで、３％スキムミルクを含むＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１時間ブロッキング後、下記の方法で調製したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体９Ａ１およびペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体１４１Ａ１を反応させた。
【００５２】
ペルオキシダーゼ標識抗体の調製は、実施例１で得たモノクローナル抗体９Ａ１及び１４１Ａ１を用い以下の操作を行った。各抗体をＶｉｖａｓｐｉｎ２０−５０，０００Ｄａｌｔｏｎ（ザルトリウス社製）を用いて約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮後、０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）で一晩透析した。抗体を回収し、１０ｍｇ／ｍＬに調整したペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）を抗体の１／４０量添加し、３７℃で２時間反応させた。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ１６／６０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でゲル濾過した。Ｆ（ａｂ）’２分画を回収し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を算出（Ａ２８０＝１．４８＝１ｍｇ／ｍＬ）した。続いて、回収したＦ（ａｂ）’２分画をＶｉｖａｓｐｉｎ２０−１０，０００Ｄａｌｔｏｎ（ザルトリウス社製）を用いて２．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．１Ｍ−２メルカプトエタノール（ＢｉｏＲａｄ社製）にて３７℃で２時間還元した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ１６／６０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて０．１Ｍ−リン酸緩衝液，５ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）でゲル濾過し、Ｆａｂ’分画を回収して２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を算出（Ａ２８０＝１．４８＝１ｍｇ／ｍＬ）した。
【００５３】
続いて、ペルオキシダーゼのマレイミド化を行った。具体的には、ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を濃度が６．７ｍｇ／ｍＬとなるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、８０ｍｇ／ｍＬ−ＥＭＣＳ（同人化学社製）をペルオキシダーゼタンパク質量の１／９量添加して、３７℃で１時間反応させた。続いて、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にて０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に交換した。次に、Ｆａｂ’分画をＶｉｖａｓｐｉｎ２０−１０，０００Ｄａｌｔｏｎ（ザルトリウス社製）を用いて５ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮し、マレイミド化されたペルオキシダーゼと（Ｆａｂ’：ＨＲＰ＝１：０．９）の割合で混合し、４℃で一晩静置して反応させた。翌日、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ１６／６０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にてＰＢＳを用いてゲル濾過後、２８０ｎｍ及び４０３ｎｍの２波長の吸光度を測定し、標識体の濃度を算出（（Ａ２８０−Ａ４０３／３．１）／１．４８）した。
【００５４】
次に、標識抗体と反応させたＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ジアミノベンジジンを基質として加え発色させた。図４に示す如く、両モノクローナル抗体がリコンビナントＨＬタンパク質、プレヘパリンＨＬ、ポストヘパリンＨＬに反応することが示された。
【００５５】
（実施例３）測定系の確立
実施例１で得たモノクローナル抗体９Ａ１を１００ｍＭ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に１００μＬ／ウェルで加え、４℃で二夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、希釈液にて希釈した、リコンビナントＨＬタンパク質（標準物質）、プレヘパリン血清（希釈倍率１０〜１２８０倍、１０倍希釈より２倍連続希釈）、及びポストヘパリン血清（希釈倍率５０〜６４００倍、５０倍希釈より２倍連続希釈）を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で一晩インキュベートした。洗浄液で４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体１４１Ａ１を１００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０分インキュベートした。同様に洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＬ／ウェル加えた。３０分後、１．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェルで加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５６】
図５に示す如く、プレヘパリン血清及びポストヘパリン血清は、それぞれ、ｙ＝３．３６３２Ｘ＋０．０１６１、Ｒ２＝０．９９６８、及びｙ＝５．２０８３Ｘ−０．０２５１、Ｒ２＝０．９９９８と良好な希釈直線性を示し、プレヘパリン血清及びポストヘパリン血清中のＨＬを測定できることが示された。
【００５７】
（実施例４）プレヘパリンＨＬ、及びポストヘパリンＨＬとの反応性
実施例３において作製したＥＬＩＳＡ法により、ヘパリン静注前（プレヘパリン）及びヘパリン静注後（ポストヘパリン）の血清中のＨＬを測定した。図６に示す如く、ヘパリン静注前の血清中にもＨＬが存在することが示された。
【００５８】
（実施例５）プレヘパリンＨＬ濃度
健常者３６人について、ヘパリン静注前（プレヘパリン）の血清中のＨＬ濃度を、実施例３において作製したＥＬＩＳＡ法により測定した。図７に、結果を示す。測定された健常者３６人のヘパリン静注前の血清中のＨＬの平均濃度は３８．２ｎｇ／ｍｌとなった。
【００５９】
以上から、本発明のハイブリドーマ９Ａ１、１４１Ａ１が産生するモノクローナル抗体９Ａ１、１４１Ａ１は次の性質を有することが示された。
（ｉ）ヘパリン未投与の血漿及び血清中に存在するヒト肝性リパーゼとヘパリン静注後に遊離してくるヒト肝性リパーゼの両方に反応する。
（ｉｉ）遺伝子組み換えにより得られたヒト肝性リパーゼとの反応が、血漿及び血漿中に存在するヒト肝性リパーゼで阻害される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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