(57)【要約】【課題】  効率的なタンパク質生産を可能にする組換え細胞およびその製造方法、並びにその細胞を用いたタンパク質の製造方法の提供。【解決手段】  外来性の目的遺伝子を含む発現単位が３以上組込まれてなる哺乳動物細胞であって、複数の発現単位の間に間隙配列を備え、この間隙配列を０．５ｋｂｐ以上の鎖長とし、かつ間隙配列を互いに異なる配列とする。このような細胞は、長期間、安定して組換えタンパク質を生産でき、とりわけ、その導入数と発現量との間に強い正の直線的な相関を示すことが可能である。【選択図】  図１２Ｂ
2018171056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性の目的遺伝子を含む発現単位が複数組込まれてなる哺乳動物細胞であって、
前記複数の発現単位の数が３以上であり、
前記複数の発現単位の間に外来性の間隙配列を備え、当該間隙配列が０．５ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の鎖長を有し、かつ前記間隙配列が互いに異なる配列であることを特徴とする、細胞
【請求項２】
前記間隙配列の鎖長が１ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記間隙配列の１つ以上が１ｋｂｐ以上の鎖長を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記目的遺伝子が複数種組み込まれてなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記複数の発現単位および間隙配列が、動物細胞内に導入されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記複数の発現単位および間隙配列が、動物細胞染色体に導入されてなる、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記動物細胞染色体の導入部位が、安定発現遺伝子座である、請求項５または６に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子座が、ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子座である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
隣り合う間隙配列の相同性が５５％以下、もしくは５０％以下のいずれか一方である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
互いに異なる間隙配列の相同性が５５％以下、もしくは５０％以下のいずれか一方である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記目的遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記タンパク質が抗体である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項の細胞を培養する工程を含んでなる、目的物質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞の製造方法であって、前記複数の発現単位および間隙配列が、ＡＧＩＳによって導入されてなることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的なタンパク質等の目的物質生産を可能にする組換え細胞およびその製造方法、並びにその細胞を用いたタンパク質等の目的物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産システムにおいて、原核生物や真核生物を宿主とした種々の方法が知られている。哺乳類動物細胞を宿主とした組換えタンパク質生産システムは、ヒトを始めとする高等動物由来のタンパク質に対し、糖鎖付加、フォールディング、リン酸化などの翻訳後修飾をより生体で作られるものと同じように施すことが可能である。
【０００３】
この翻訳後修飾は、タンパク質の本来有する生理活性を組換えタンパク質で再現するために必要なものであり、そのような生理活性が特に必要とされる医薬品などに用いられる組換えタンパク質の生産系には、哺乳類動物細胞を宿主としたタンパク質生産システムが用いられている。
【０００４】
タンパク質生産システム構築のために、細胞ゲノム中の標的遺伝子座に目的遺伝子を特異的な組み込み、長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を効率的に取得する手法が提案されている。
【０００５】
この標的遺伝子の一例としては、ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子が挙げられる。hprt遺伝子は、ヒト等のＸ染色体長腕に存在するハウスキーピング遺伝子の一つとして知られており、hprt遺伝子のノックアウト後の細胞は、薬剤６‐Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ（６ＴＧ）に対して耐性を示すため、陰性選択が容易に行われる。
【０００６】
ヒトの雄由来のＨＴ１０８０細胞株のhprt遺伝子座に目的遺伝子を組換えベクターにより導入し、選択薬剤非存在下で長期間、安定にタンパク質を発現しうる組換え細胞を取得したことが報告されている（特開２００７−３２５５７１号公報（特許文献１）、非特許文献１：Ｋｏｙａｍａ  Ｙ  Ｅｔ  Ａｌ．，（２００６）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９５，１０５２−１０６０）。
【０００７】
また、本発明者らの一部は、hprt遺伝子座に外来性の目的遺伝子の複数コピーを導入し哺乳動物細胞を用意し、この細胞を培養してタンパク質等の目的物質を産生する方法を提案している（ＷＯ０９／０２２６５６号公報（特許文献２））。さらにこの方法をＣＨＯ細胞に適用する手法を提案している（ＷＯ２０１１／０４０２８５号公報（特許文献３））。
【０００８】
本発明者らの知る限りでは、上記従来技術においても、遺伝子の発現単位を染色体の同一部位に複数導入すると、導入した遺伝子が期待どおりの量で発現しなかったり、発現が経時的に低下したりするなどの現象が見られた。
【０００９】
一方で、遺伝子増幅の手法として、例えば、組換え酵素Ｃｒｅと、スペーサー領域、並びにその左右にそれぞれ配置された左アーム領域及び右アーム領域からなる、Ｃｒｅのターゲットサイトとを用いた方法が提案されている（特開２００９−１８９３１８号公報（特許文献４）、Ｋａｍｅｙａｍａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ、１０５，１１０６（２０１０）（非特許文献２）、Ｉｎａｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２０、９９−１０６，２０１５（非特許文献３））。この方法は、逐次遺伝子組込みシステム（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＡＧＩＳ）と呼ばれ、この方法によれば、動物細胞の染色体上で目的遺伝子の増幅を行うことができ、得られた細胞は組換えタンパク質の大量生産のために用いることができるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３２５５７１号公報
【特許文献２】ＷＯ０９／０２２６５６号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０４０２８５号公報
【特許文献４】特開２００９−１８９３１８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｙａｍａ  Ｙ  Ｅｔ  Ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９５，  １０５２−１０６０（２００６）
【非特許文献２】Ｋａｍｅｙａｍａ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ、１０５，１１０６（２０１０）
【非特許文献３】Ｉｎａｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１２０、９９−１０６（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、今般、外来性の目的遺伝子を複数導入する際に、複数の目的遺伝子の発現単位の間の鎖長および配列を制御することで、長期間、より安定して組換えタンパク質等の目的物質を生産できる系が実現できるとの知見を得た。とりわけ、その導入数と発現量との間に強い正の直線的な相関を示すとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明は、効率的なタンパク質等の目的物質生産を可能にする組換え細胞およびその製造方法、並びにその細胞を用いた目的物質の製造方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そして、本発明による細胞は、
外来性の目的遺伝子を含む発現単位が複数組込まれてなる哺乳動物細胞であって、
前記複数の発現単位の数が３以上であり、
前記複数の発現単位の間に外来性の間隙配列を備え、当該間隙配列が０．５ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下の鎖長を有し、かつ前記間隙配列が互いに異なる配列であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明による細胞の製造方法は、前記複数の発現単位および間隙配列が、ＡＧＩＳによって導入されてなることを特徴とするものである。
【００１６】
さらに、本発明によるタンパク質等の目的物質の製造方法は、前記本発明による細胞を培養する工程を含んでなることを特徴とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】工程（１−１）における、トラスツズマブ重鎖発現単位ベクターの模式図である。（１）はベクター全体図であり、（２）は切り出したトラスツズマブ重鎖発現単位である。
【図２】工程（１−２）における、トラスツズマブ軽鎖発現単位ベクターの模式図である。（１）はベクター全体図であり、（２）は切り出したトラスツズマブ軽鎖発現単位である。
【図３Ａ】工程（１−３）における、ｘ１  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター１）作製方法の模式図である。
【図３ＢＣ】図３Ａ参照
【図４Ａ】工程（１−４）における、ｘ２  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター２）作製方法の模式図である。
【図４ＢＣ】図４Ａ参照
【図５Ａ】工程（１−５）における、ｘ３  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター３）作製方法の模式図である。
【図５ＢＣ】図５Ａ参照
【図６】工程（２−１）における、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクターの模式図である。
【図７Ａ】工程（２−３）における、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクターのＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子座への相同組換えによる導入の模式図および導入確認の結果である。ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター、ＣＨＯ細胞のｈｐｒｔ遺伝子領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図７Ｂ】図７Ａ参照
【図７Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図８Ａ】工程（２−４）における、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入ＣＨＯ細胞へのベクター１の逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ベクター１、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入ＣＨＯ細胞のＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図８Ｂ】図８Ａ参照
【図８Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図９Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞へのベクター２の逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ベクター２と、ベクター１導入ＣＨＯ細胞のベクター１領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図９Ｂ】図９Ａ参照
【図９Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図１０Ａ】ベクター１とベクター２導入ＣＨＯ細胞への、ベクター３の逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ベクター３と、ベクター１とベクター２導入ＣＨＯ細胞のベクター１とベクター２領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図１０Ｂ】図１０Ａ参照
【図１０Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図１１Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞、ベクター１とベクター２導入ＣＨＯ細胞、およびベクター１とベクター２とベクター３導入ＣＨＯ細胞の、トラスツズマブ重鎖とトラスツズマブ軽鎖のコピー数定量結果であり、各導入細胞染色体中のトラスツズマブ重鎖ＤＮＡとトラスツズマブ軽鎖ＤＮＡのコピー数定量結果である。
【図１１Ｂ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞、ベクター１とベクター２導入ＣＨＯ細胞、およびベクター１とベクター２とベクター３導入ＣＨＯ細胞の、トラスツズマブ重鎖とトラスツズマブ軽鎖のコピー数定量結果であり、各導入細胞染色体中のトラスツズマブ重鎖ｍＲＮＡとトラスツズマブ軽鎖ｍＲＮＡのコピー数定量結果である。
【図１２Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞、ベクター１とベクター２導入ＣＨＯ細胞、およびベクター１とベクター２とベクター３導入ＣＨＯ細胞の、抗体発現量の長期安定性確認結果である。
【図１２Ｂ】図１２Ａに、ベクター１とベクター２とベクター３導入ＣＨＯ細胞の１１２日、１６８日および２２４日間の継代培養後の抗体発現量を加えた結果である。
【図１３Ａ】比較例２における、ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクター作製方法の模式図である。
【図１３ＢＣ】図３Ａ参照
【図１４Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞へのｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターの逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターと、ベクター１導入ＣＨＯ細胞のベクター１領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ参照
【図１４Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図１５】ベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクター導入ＣＨＯ細胞の、抗体発現量の長期安定性確認結果である。
【図１６Ａ】実施例３における、ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクター作製方法の模式図である。
【図１６ＢＣ】図１６Ａ参照
【図１７Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞へのｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクターの逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクターと、ベクター１導入ＣＨＯ細胞のベクター１領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ参照
【図１７Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図１８】ベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクター導入ＣＨＯ細胞の、抗体発現量の長期安定性確認結果である。
【図１９Ａ】実施例４における、ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクター作製方法の模式図である。
【図１９ＢＣ】図１９Ａ参照
【図２０Ａ】ベクター１導入ＣＨＯ細胞へのｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクターの逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクターと、ベクター１導入ＣＨＯ細胞のベクター１領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式である。
【図２０Ｂ】図２０Ａ参照
【図２０Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図２１】ベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクター導入ＣＨＯ細胞の、抗体発現量の長期安定性確認結果である。
【図２２Ａ】実施例５における、ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター作製方法の模式図である。
【図２２ＢＣ】図２２Ａ参照
【図２３Ａ】実施例５における、ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクター作製方法の模式図である。
【図２３ＢＣ】図２３Ａ参照
【図２４Ａ】実施例５における、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入ＣＨＯ細胞へのｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターの逐次導入による導入の模式図である。ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入ＣＨＯ細胞のＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター領域の関係を示す模式図である。
【図２４Ｂ】図２４Ａ参照
【図２５Ａ】ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター導入ＣＨＯ細胞へのｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクターの逐次導入による導入の模式図および導入確認の結果である。ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターと、ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター導入ＣＨＯ細胞のｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター領域、および組換えＣＨＯ細胞のゲノムＰＣＲの指標となったＤＮＡの関係を示す模式図である。
【図２５Ｂ】図２５Ａ参照
【図２５Ｃ】ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる、ベクター導入確認の電気泳動結果である。
【図２６】ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターおよびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクター導入ＣＨＯ細胞の、抗体発現量の長期安定性確認結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
間隙配列
本発明による哺乳動物細胞に組込まれる「発現単位」は、外来性の目的遺伝子、つまり目的のタンパク質または核酸等の物質を発現させることができる構造のものであれば限定されないが、特にタンパク質の場合には、好ましくは、プロモーター、（転写開始点から終止コドンまでの）目的タンパク質のコード領域、ポリＡ配列を備えてなる単位を意味する。目的遺伝子他の、発現単位の構成要素の詳細は後述する。
【００１９】
「プロモーター」とは、ゲノムＤＮＡやウイルスゲノムから取得した、プロモーター機能を有する一つながりのＤＮＡ配列である。あるいは、公知のＤＮＡ構造物から、プロモーター機能を有する領域を含む配列を、適切な制限酵素で切り出したり、ＰＣＲ反応によって増幅して取り出したりしたものでもよい。
【００２０】
本発明による哺乳動物細胞には、発現単位が３以上組込まれ、さらにこの複数の発現単位と発現単位との間に「外来性の間隙配列」を備える。本発明にあっては、この間隙配列は０．５ｋｂｐ以上の鎖長を有し、かつ前記間隙配列が互いに異なる配列であることを特徴とする。発現単位と発現単位との間に、このような間隙配列を備えることで、その導入数に比例した発現の向上が安定的に得られる。
【００２１】
目的タンパク質の発現量は、導入された遺伝子の数に比例することが期待されるが、実際には、導入当初には遺伝子数に比例した発現量が得られても、時間の経過と共に発現量が減少してしまうことが従来の手法においては観察されたが、本発明にあっては、長期間にわたり、例えば５０日以上、好ましい条件下にあっては１００日以上、より好ましい条件下にあっては２００日であり、もっとも好ましい条件下にあっては３００日にわたり、安定した発現量を維持できる。安定した発現量とは、細胞樹立直後の比生産を好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、もっとも好ましくは９０％以上維持することを意味する。
【００２２】
本発明の一つの好ましい態様によれば、間隙配列の鎖長の好ましい下限は０．５ｋｂｐであり、より好ましくは１ｋｂｐであり、さらに好ましくは１．５ｋｂｐであり、もっとも好ましくは２ｋｂｐである。また、間隙配列の長さの好ましい上限は２０ｋｂｐであり、より好ましくは１０ｋｂｐであり、さらに好ましくは５ｋｂｐであり、もっとも好ましくは３ｋｂｐである。間隙配列の鎖長の好ましい範囲は、前記の下限値と上限値とを選択して、組み合わせることで決定される。
【００２３】
本発明の一つの態様によれば、複数の間隙配列の少なくとも一つが、１ｋｂｐ以上の鎖長を有するものとされることが、長期間の安定した組換えタンパク質の生産に有利である。
【００２４】
また、本発明において、複数の間隙配列は互いに異なる配列とされるが、好ましくは、相互の相同性が９９．５％以下、より好ましくは９５％以下、さらに好ましくは９０％以下、さらに好ましくは８７．５％以下、さらに好ましくは８５％以下、さらに好ましくは８２．５％以下、さらに好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７７．５％以下、さらに好ましくは７５％以下、さらに好ましくは７２．５％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６７．５％以下、さらに好ましくは６５％以下、さらに好ましくは６２．５％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５７．５％以下、さらに好ましくは５５％以下、さらに好ましくは５２．５％以下、もっとも好ましくは５０％以下とされる。
【００２５】
本発明において、相同性は、以下のようにして測定する。すなわち、比較したい二つの間隙配列のうち、短い方の配列全長に対し、長い方の配列内において、短い方の配列と同じ長さの任意の配列の相同性を測定していき、得られた相同性の最大値を相同性と定義する。具体的な相同性の測定方法として、遺伝子情報ソフトウェアのホモロジー検索機能を使用する方法等がある。より具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１０ソフトウェア（株式会社ゼネテックス）の、塩基配列×塩基配列ホモロジー検索を用いて比較することができる。
【００２６】
本発明において、この間隙配列は外来性であり、ここで外来性とは、組込まれる哺乳動物細胞が本来有していない配列に加え、組込まれる哺乳動物細胞が有する配列ではあるが、本来その位置に存在しない配列も含む意味に用いるものとする。
【００２７】
本発明において間隙配列は特に機能を有しないものであり、換言すれば、発現単位と発現単位との間の配列を間隙配列と定義してよいが、タンパク質等の目的物質の発現に本質的に悪影響を与えない限り、特定の機能を有する配列を含んでいてもよい。
【００２８】
従って、本発明の一つの態様によれば、間隙配列は、例えば、他の細胞や生物の染色体から任意に取得してきた配列、コンピューター上で設計した配列に基づき、合成して作製した配列、発現単位以外のベクター構成配列（単なるベクター骨格、選択マーカー、GFPなどのレポーターなど）、後記するＡＧＩＳ（逐次遺伝子組込みシステム）の結果残存するベクターパーツ、マーカー配列などから構成されてよい。
【００２９】
動物細胞への組込み部位となる配列
本発明において、発現単位の組込み部位は、発現単位を組込む手法などを考慮して適宜決定されてよい。例えば、安定遺伝子座に組込む方法、ランダムに好適部位に組込む方法、染色体外ベクターに組込む方法等が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、組込みの手法としては安定遺伝子座に組込む方法が挙げられ、ここで、安定遺伝子座としては、例えばヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（hprt）遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座領域、ＰｈｉＣ３１  ｐｓｅｕｄｏ  ａｔｔＰ部位等が挙げられる。また、ランダム挿入の場合には、染色体上の安定な部位に偶発的に導入された細胞を選別する方法が挙げられる。また、組込み部位は染色体上でなくても良く、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣベクター）、マウス人工染色体（ＭＡＣベクター）などの人工染色体上であっても良い。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、組込み部位として、hprt遺伝子座を用いる。この標的領域に発現単位を組込むことは、hprt遺伝子の転写・発現を阻害してhprt遺伝子の機能を不活化し、６−ＴＧ等を用いる陰性選択によって効率的に組換え細胞を取得する上でも好ましい。
【００３１】
また、本発明において標的領域は、目的遺伝子の発現を妨げない限り、hprt遺伝子座中において適宜決定してよい。具体的な配列は、ＷＯ２０１１／０４０２８５号公報（特許文献３）の記載を参考に決定することが出来る。この特許文献３の開示内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００３２】
哺乳動物細胞
また、本発明において、宿主細胞として用いられる哺乳動物細胞は、好ましくはチャイニーズハムスター由来のものであり、例えば、肺、卵巣、腎臓などの臓器由来の細胞を取り出し、株化した細胞株を利用できる。かかるチャイニーズハムスター細胞の具体的な例としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＧ４４（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ  ＧＳ（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＨＯＺＮ  ＤＨＦＲ（Ｍｅｒｃｋ）、およびその派生株等が挙げられる。
【００３３】
また、用いられる哺乳動物細胞は、ヒト由来、マウス由来、サル由来等も利用可能である。例えばヒト由来の具体的な例としては、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＨＴ１０８０等が挙げられる。また、マウス由来の具体的な例としては、ＮＳ０、ＢＨＫ、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４等が挙げられる。サル由来の具体的な例としては、ＣＯＳ等が利用できる。
【００３４】
目的遺伝子および発現単位
また、本発明において、目的遺伝子は、医薬として有用なタンパク質をコードしていることが好ましい。目的遺伝子は、ｃＤＮＡに由来する配列であっても、ゲノムＤＮＡに由来する天然イントロンを含む構造遺伝子であっても、好適に利用可能である。目的遺伝子がコードするタンパク質として具体的には、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、調節タンパク質、レセプター、機能性因子等が挙げられるが、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、エリスロポエチン、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子または顆粒球コロニー活性化因子等である。
【００３５】
本発明の一つの態様によれば、タンパク質をコードする目的遺伝子の配列長さは、好ましくは２００〜８０００ｂｐ、より好ましくは３００〜３０００ｂｐ、もっとも好ましくは４００〜２５００ｂｐである。
【００３６】
タンパク質の種類として、哺乳動物細胞によって生産されるタンパク質は哺乳動物細胞に特有の翻訳後修飾を受けて生成されることを目的とすることがあり、その様な態様として好ましくは、糖タンパク質であることが望ましい。糖タンパク質として具体的には、
・  トラスツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、オビヌツズマブ、ベバシズマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、イピリムマブ、ダラツムマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、ペンブロリズマブ、モガムリズマブ、ブレンツキシマブ、イクセキズマブ、セクキヌマブ、ブロダルマブ、オマリズマブ、エボロクマブ、デノスマブ、イダルシズマブ、アリロクマブ、ディヌツキシマブ、レスリズマブ、アレンツズマブ、ブリアキヌマブ、オクレリズマブ、ロモソズマブ、ベズロトクスマブ、サリルマブ、ブロスマブ、ベンラリズマブ、サペリズマブ、レブリキズマブ、ファルレツズマブ、ガンテネルマブ、パトリツマブ、イネビリズマブ、アヅカツマブ、チルドラキズマブ、ファシヌマブ、マルゲツキシマブ、ボコシズマブ、デュピルマブ、エレヌマブ、ビマグルマブ、デュルバルマブ、ガルカネズマブ、リサンキズマブ、アンデカリキシマブ、アベルマブ、バダスツキシマブ、ベゲロマブ、スプタブマブ、デパツキシズマブ、オピシヌマブ、タネツマブ、オクラツズマブ、コルツキシマブ、パムレブルマブ、リリルマブ、フルラヌマブ、テプロツムマブ、ウレルマブ、ブレセルマブ、ランドグロズマブ、ネイフリズマブ、フォラルマブ、アンルキンズマブ、コドリツズマブ、イクルクマブ、グレンバツズマブ、ガニツマブ、アマツキシマブ、エンシツキシマブ、ナミルマブ、ポネズマブ、デクトレクマブ、イサツキシマブ、クラウディキシマブ、オロキズマブ、マブリリムマブ、フィクラツズマブ、モナリズマブ、クレネズマブ、ディリダブマブ、デムシズマブ、レンジルマブ、セリバンツマブ、ブロソズマブ、オンツキシズマブ、ロデルシズマブ、クラザキズマブ、ポラツズマブ、シムツズマブ、デニンツズマブ、アネツマブ、ネモリズマブ、インダツキシマブ、イマルマブ、オテレルツズマブ、タレックスツマブ、ルリズマブ、テシドルマブ、エミベツズマブ、アブリルマブ、ブラジクマブ、エマクツズマブ、ルムレツズマブ、ミルベツキシマブ、バルリルマブ、カブラリズマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、ピジリムマブ、ロバルピツズマブ、リヌクマブ、サシツズマブ、セラリズマブ、ビメキズマブ、ウブリツキシマブ、ロイコツキシマブ、ベセンクマブ、ウロクプルマブ、バンドルツズマブ、ソネプシズマブ、アティヌマブ、フランボツマブ、ブロンティクツズマブ、バンティクツマブ、コンシズマブ、セバシズマブ、エノブリツズマブ、ラルパンシズマブ、ネシツムマブ、オファツムマブ、ラムシルマブ、エロツズマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、エクリズマブ、パリビズマブ、エプラツズマブ、トレメリブマブ、トラロキヌマブ、エトロリズマブ、シルクマブ、オララツマブ、リサンキズマブ、リゲリズマブ、パノバクマブ、ティソムマブ、セツキシマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、シルツキシマブ、ウステキヌマブ、メポリズマブ、カナキヌマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ソラネツマブ、アニフロルマブ、ゲボキズマブ、グセルクマブ、エルゲンツマブ、エンフォルツマブ、クロテヅマブ、オレクルマブ、ゲリリムズマブ、ネスバクマブ、パルサツズマブ、ペラキズマブ、ナルナツマブ、エナバツズマブ、ソフィツズマブ、エノティクマブ、パテクリズマブ、ト���ツマブ、ピナツズマブ、フェザキヌマブ、プラクルマブ、サマリズマブ、オザネズマブ、バテリズマブ、アスクリンバクマブ、ダセツズマブ、カルルマブ、フレソリムマブ、イマガツズマブ、オナルツズマブ、オクセルマブ等のモノクローナル抗体、
・  エタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、リロナセプト、エフラロクトコグ、エフトレノナコグ、デュラグルチド、アタシセプト、ルスパテルセプト、バビネルセプト、アシネルセプト、ダランテルセプト、ソタテルセプト、イパフリセプト、ラマテルセプト、アスフォターゼ等の抗体融合タンパク質、
・  エリスロポエチン、ダルベポエチン、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、テネクテプラーゼ、レテプラーゼ、オクタコグ、ルリオクタコグ、モロクトコグ、ツロクトコグ、スソクトコグ、シモクトコグ、ノナコグ、トレノナコグ、エプタコグ、レノグラスチム、イミグルセラーゼ、ドルナーゼ、アガルシダーゼ、ラロニダーゼ、アルグルコシダーゼ、ベラグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、イズルスルファターゼ、タリグルセラーゼ、ヒアロニダーゼ、エロスルファーゼ、フォリトロピン、チロトロピン、セルリポナーゼ等の組換え糖タンパク質、
・  エミシズマブ、バヌシズマブ、イスティラツマブ、パシツキシズマブ、デュリゴツズマブ、デュボルツキシズマブ等の二重特異性抗体、または
・  糖鎖を有するワクチンおよびウイルス様粒子ＶＬＰ等が挙げられる。
【００３７】
また、糖鎖のないタンパク質としては、具体的には、
・  ＳｃＦｖ抗体、Ｆａｂ抗体、およびそれらの改変、融合タンパク質、
・  ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＶＡＭＰ８ 及びＳｎａｐ２３等の機能性因子、
・  ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＳＥＡＰ等のレポーター、
・  ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの受容体、糖鎖のないワクチン、ウイルス様粒子等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明において、目的遺伝子は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、ｍｉＲＮＡアンチセンス、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ、デコイ、ＣｐＧオリゴ等の機能性核酸、タンパク質と融合させて核酸融合タンパク質を構成させるための機能性核酸をコードしていることが好ましい。
【００３９】
また、本発明において発現単位は、プロモーター配列や転写終結シグナル配列等の発現に必要な要素を含む発現ユニットとして組込まれることが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、発現単位は、少なくともプロモーター配列および転写終結シグナル配列を含んでなる。
【００４０】
また、上記プロモーターや転写終結シグナルは、目的遺伝子の種類、性質等に応じて適宜決定してよく、かかるプロモーター配列の好適な例としては、ＣＨＥＦ１αプロモーター、ｈＥＦ１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＧＧプロモーター、リボソーマルプロテインを駆動するプロモーター、ヒートショックプロテインを駆動するプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｔｅｔ発現誘導プロモーター、クロラムフェニコール発現誘導プロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナル配列の好適な例としては、ＢＧＨポリＡシグナル配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列等が挙げられる。
【００４１】
また、プロモーター配列、転写終結シグナル配列の他の発現に必要な要素としては、例えば、目的遺伝子を効率的に発現させるための調節エレメント（例えば、エンハンサー、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列、ＵＣＯＥ、ＳＴＡＲ、ＭＡＲ、Ｐｏｗｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｅｌｅｍｅｎｔ等を適宜選択して用いてよい。調節エレメントはその性質に応じて、発現ユニットにおける適切な位置に配置することが可能である。これら発現に必要な要素は、タンパク質等の目的物質の生産性等を勘案して適宜選択される。
【００４２】
本発明の一つの態様によれば、一つの発現単位における目的遺伝子を異なるものとすることができる。このような複数種の目的遺伝子の発現を長期間、安定して生産できることは本発明の注目すべき利点である。
【００４３】
複数の発現単位および間隙配列の導入
本発明において、発現単位および間隙配列は、その複数が導入可能であれば、導入の方法は限定されないが、例えば段階的に導入する方法および一度に複数導入する方法が挙げられる。
【００４４】
段階的に導入する方法は例えば、Ｃｒｅ、φＣ３１、Ｒ４、Ｆｌｐ等の組換え酵素を用いる方法、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等に代表されるゲノム編集技術を用いる方法等が挙げられる。Ｃｒｅ組換え酵素を用いる方法の好ましい態様によれば、特開２００９−１８９３１８号公報（特許文献４）が開示する、逐次遺伝子組込みシステム（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＡＧＩＳ）により行われることが好ましい。この特許文献４の開示内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００４５】
一度に複数導入する方法は例えば、複数の発現単位および間隙配列全長を化学合成し、導入する方法等が挙げられる。
【００４６】
ＡＧＩＳ（逐次遺伝子組込みシステム）
この方法は、組換え酵素Ｃｒｅと、変異ＬｏｘＰ配列とを用い、染色体への目的遺伝子の導入を繰り返し行うことができる、換言すれば、染色体上での目的遺伝子の増幅を行うことができる方法である。この方法は、ＬｏｘＰのアーム変異とスペーサー変異の両者の特性を組み合わせることによって、Ｃｒｅ依存的に独立して不可逆的な挿入反応がおこることを利用したものであり、２回の組込反応の後に組換え可能なターゲットサイトが初期状態に戻るように設計する。これにより遺伝子組込み反応を原理的には無限に繰り返すことが可能となる。具体的には、
組換え酵素Ｃｒｅと、
スペーサー領域、並びにその左右にそれぞれ配置された左アーム領域及び右アーム領域からなる、Ｃｒｅのターゲットサイトと
を用いる遺伝子組換え方法であって：
（Ａ）スペーサー領域１、変異のある一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなるターゲットサイト１であって、宿主染色体に導入されたもの；
（Ｂ）遺伝子１、及び遺伝子１の両側にそれぞれ連結されたターゲットサイト２及びターゲットサイト３を含む組込カセットであって、
このときターゲットサイト２は、スペーサー領域１、及び変異のある、ターゲットサイト１とは反対側であって、かつ遺伝子１に近い側である一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなり、そして
ターゲットサイト３は、スペーサー領域１とは独立して機能可能なスペーサー領域２、及び変異のある、ターゲットサイト１と同じ側であって、かつ遺伝子１に近い側である一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなるもの；及び
（Ｃ）遺伝子２、遺伝子２の両側にそれぞれ連結されたターゲットサイト４及びターゲットサイト５を含む置換カセットであって、
このときターゲットサイト４は、スペーサー領域２、及び変異のある、ターゲットサイト１とは反対側であって、かつ遺伝子２に近い側の一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなるもの
このときターゲットサイト５は、スペーサー領域３（但し、スペーサー領域３は、スペーサー領域１と同じか、又はスペーサー領域１及び２各々とは独立して機能可能なものである。）、及び変異のある、ターゲットサイト１と同じ側であって、かつ遺伝子２に近い側の一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなるもの
を準備し；
（１）ターゲットサイト１と組込カセットとを、Ｃｒｅによって反応させ、反応生成物を得る工程；そして
（２）該反応生成物と置換カセットとを、Ｃｒｅよって反応させる
工程を含む、染色体上で２以上の組換えを行うための、遺伝子組換え方法である。
【００４７】
上記における、「（Ａ）スペーサー領域１、変異のある一方のアーム領域、及び野生型である他方のアーム領域からなるターゲットサイト１であって、宿主染色体に導入されたもの」の調製、すなわち導入起点の染色体への導入方法には、（１）例えばホモロジーアームベクターを用いて相相同組換えにより動物細胞の所定の部位に導入する方法、（２）遺伝子編集技術により、所定の部位に導入する方法、（３）ランダム挿入により好適な部位に偶発的に導入された細胞を選別する方法などにより行うことが出来る。
【００４８】
ベクター
本発明において、複数の発現単位および間隙配列は、ベクターに組込んで哺乳動物細胞ゲノムに導入することができる。このようなベクターシステムとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターまたは人工染色体ベクター等が挙げられる。
【００４９】
ベクターは、制限酵素切断反応およびライゲーション反応を組み合わせて好適に構築される。例えば、各構成ユニットの両末端に制限酵素の認識配列を含有させ、該認識配列用の制限酵素で切断反応を行い、不要なＤＮＡ配列（大腸菌内での操作用配列等）をゲル切り出し等の処理によって除去し、得られたユニットのライゲーション反応を行うことにより、ベクターを構築しうる。
【００５０】
ライゲーション反応により構築したベクターＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出等により精製し、ベクターの種類等を勘案して選択した大腸菌、酵母等の宿主細胞において増殖させることができる。
【００５１】
ベクターの導入
上記ベクターの導入方法としては、一般的に用いられる方法が好適に利用できる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法、ウイルスベクターを用いる方法などが挙げられる。ここで、ベクターが環状である場合、公知の方法により線状化して細胞に導入されてもよい。
【００５２】
また、ベクターやタンパク質等の目的物質の性質によっては、組換え細胞の取得効率等を勘案して、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムやＦｌｐ／ＦＲＴシステムなどのような、組換え酵素を利用した部位特異的導入システム、あるいはウイルス由来インテグラーゼ、またはウイルスベクター、もしくはＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等に代表されるゲノム編集技術を用いる方法も適宜適用してよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５３】
細胞株の選択
また、本発明による製造方法にあっては、上記導入後、細胞の選択を行うことが好ましい。選択工程は、マーカー遺伝子を用いる方法、目的遺伝子あるいは遺伝子産物の発現量を指標として選別する方法等を用いることにより、高い精度で細胞選択を行うことが可能となる。
【００５４】
また、本発明による製造方法にあっては、組換え細胞を取得後、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  培地などに馴化させることにより無血清下での培養も可能である。かかる馴化条件は、組換え細胞の状態に応じて適宜決定することができる。
【００５５】
目的物質の製造方法
また、本発明の別の態様によれば、上記組換え細胞を用意し、該細胞を培養してタンパク質等の目的物質を産生することを含んでなる、タンパク質等の目的物質の製造方法が提供される。上記方法によれば、タンパク質等の目的物質を効率的かつ安定に取得することができる。
【００５６】
上記培養工程における培地としては、組換え細胞の状態に応じて公知の培地を適宜選択してよいが、無血清培地が好ましい。また、上記培地は、培養コストおよび精製コストを勘案すれば、選択薬剤を添加しないものが好ましい。上記培地の好適な例としては、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ培地等が挙げられる。
【００５７】
上記培養方法としては、バッチカルチャー法、フェッド−バッチカルチャー法、還流培養法など公知の方法が適用可能である。
【実施例】
【００５８】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５９】
下記の実施例において用いたＬｏｘＰ配列は以下の通りとした。
【表１】
2018171056.tif 000003
【００６０】
実施例１、２および比較例１の細胞の作製および評価
工程１：互いに異なる配列の間隙配列を発現単位間にもつ逐次導入ベクターの作製
工程（１−１）  トラスツズマブ重鎖発現単位ベクター作製
マウスＩｇκの分泌シグナルペプチド（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に、トラスツズマブ重鎖のアミノ酸配列（独立行政法人医薬品医療機器総合機構の平成２０年１月１６日のトラスツズマブ（遺伝子組換え）審査報告書より取得）を結合し、この配列をコードするＤＮＡ配列を設計した。次に、配列の５’側には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列（下線部）とコザック配列（小文字）（ＧＡＡＴＴＣｇｃｃｇｃｃａｃｃ）を付加し、３’末端には終止コドンと制限酵素ＸｈｏＩ認識配列（ｔｇａＣＴＣＧＡＧ）を付加した。この配列に基づいてＤＮＡを合成し、トラスツズマブ重鎖遺伝子断片を作製した。
【００６１】
次に、ｐｍａｘＧＦＰプラスミド（ａｍａｘａ）を鋳型として、ＳＶ４０ｐＡ‐ｓ／ＳＶ４０ｐＡ‐ａプライマーセットによるＰＣＲ反応でＳＶ４０ポリＡを増幅し、ＳＶ４０ポリＡ断片を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＸｈｏＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＣｌａＩ認識配列（下線部）を付加している。
ＳＶ４０ｐＡ‐ｓプライマー：５’‐ＣＴＣＧＡＧｃｔｃｇａｔｇａｇｔｔｔｇｇａｃａａａｃ‐３’（（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＳＶ４０ｐＡ‐ａプライマー：５’‐ＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴｔａｃｃａｃａｔｔｔｇｔａｇａｇｇｔｔ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【００６２】
次に、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のゲノムＤＮＡをＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）で抽出し、このＤＮＡを鋳型として、ＣＨＥＦ１αプロモーター‐ｓ／ＣＨＥＦ１αプロモーター‐ａプライマーセットによるＰＣＲ反応を行い、ＣＨＯ内在性のＥＦ１αプロモーターを増幅し、ＣＨＥＦ１αプロモーター断片を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＣｌａＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（下線部）を付加している。
ＣＨＥＦ１αプロモーター‐ｓプライマー：５’‐ＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴｃｃａｃａｃａａｔｃａｇａａｃｃａｃａ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＣＨＥＦ１αプロモーター‐ａプライマー：５’‐ＧＡＡＴＴＣｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｃａａｃａｃｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
【００６３】
次に、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型として、ｐＵＣ‐ｓ／ｐＵＣ‐ａプライマーセットでＰＣＲ反応を行い、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、および複製起点を増幅し、プラスミドの基本骨格を得た。センスプライマーの５’端と、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＣｌａＩ認識配列（下線部）をそれぞれ付加している。
ｐＵＣ‐ｓプライマー：５’‐ＡＴＣＧＡＴＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＴＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ｐＵＣ‐ａプライマー：５’‐ＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
【００６４】
作製、取得したＣＨＥＦ１αプロモーター断片、トラスツズマブ重鎖遺伝子断片、ＳＶ４０ポリＡ断片、およびプラスミドの基本骨格を、末端の制限酵素切断とライゲーションで連結し、図１（１）のトラスツズマブ重鎖発現単位ベクターを作製した。
【００６５】
得られたトラスツズマブ重鎖発現単位ベクターを制限酵素ＭｌｕＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、図１（２）のトラスツズマブ重鎖発現単位を切り出して抽出した。
【００６６】
工程（１−２）  トラスツズマブ軽鎖発現単位ベクター作製
上記工程（１−１）と同様に、マウスＩｇκの分泌シグナルペプチドに、トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（上記工程（１−１）と同じ審査報告書より取得）を結合し、この配列をコードするＤＮＡ配列を設計した。次に、配列の５’側には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列（下線部）とコザック配列（小文字）（ＧＡＡＴＴＣｇｃｃｇｃｃａｃｃ）を付加し、３’末端には終止コドン（小文字）と制限酵素ＸｈｏＩ認識配列（下線部）（ｔｇａＣＴＣＧＡＧ）を付加した。この配列に基づいてＤＮＡを合成し、トラスツズマブ軽鎖遺伝子断片を作製した。
【００６７】
上記工程（１−１）で取得、作製したＣＨＥＦ１αプロモーター断片、ＳＶ４０ポリＡ断片、プラスミドの基本骨格、およびトラスツズマブ軽鎖遺伝子断片を、末端の制限酵素切断とライゲーションで連結し、図２（１）のトラスツズマブ軽鎖発現単位ベクターを作製した。
【００６８】
こうして得られたトラスツズマブ軽鎖発現単位ベクターを制限酵素ＭｌｕＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、図２（２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位を切り出して抽出した。
【００６９】
工程（１−３）  ｘ１  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター１）作製
ｐＱＢＩ２５プラスミドベクター（和光純薬工業）を鋳型として、ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ１／ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ１プライマーセットでＰＣＲ反応を行い、複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（１）を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ８’配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）を付加している。
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ１プライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＣｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａａａｇｔａｔｃｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ１プライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣｔｃｇｃｇｔａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
【００７０】
次に、ｐＢＡｐｏ−ＥＦ１α  Ｐｕｒベクター（ＴａＫａＲａ）を鋳型とし、ｐｕｒｏ‐ｓ／ｐｕｒｏ‐ａプライマーセットでＰＣＲ反応を行い、ピューロマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｗｔ配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ１０配列の相補配列（小文字）を付加している。
ｐｕｒｏ‐ｓプライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＣＡＣＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ｐｕｒｏ‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａａｔｔａｔｇｇｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＡＣＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
【００７１】
上で得られた複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（１）と、ピューロマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を連結し、ｘ１基本ベクターを作製した。
【００７２】
次に、ヒト胎児腎細胞由来のＨＥＫ２９３（ＪＣＲＢ  ＩＤ：９０６８）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ダミー配列‐ｓ／ダミー配列‐ａプライマーセットで３１３０ｂｐのダミー配列を増幅した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）を付加している。
ダミー配列‐ｓプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
ダミー配列‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＧＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【００７３】
さらに、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ａ‐ｓ／間隙配列Ａ‐ａプライマーセットで２０５１ｂｐの間隙配列Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＭｌｕＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ａ‐ｓプライマー：５’‐ＡＣＧＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
間隙配列Ａ‐ａプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＡＧＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
【００７４】
上で得られたｘ１基本ベクターのＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ａを挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間にダミー配列を挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図３に示すベクター１を作製した。
【００７５】
工程（１−４）  ｘ２  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター２）作製
ｐＱＢＩ２５プラスミドベクターを鋳型として、ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ２／ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ２プライマーセットでＰＣＲ反応を行い、複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（２）を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ１０’配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）を付加している。
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ２プライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＣｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａａｃｃａｔａａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ２プライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣｔｃｇｃｇＴａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
【００７６】
次に、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型とし、Ｈｙｇｒｏ‐ｓ／Ｈｙｇｒｏ‐ａプライマーセットでＰＣＲ反応を行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｗｔ配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ８配列の相補配列（小文字）を付加している。
Ｈｙｇｒｏ‐ｓプライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
Ｈｙｇｒｏ‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴＴａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａｇｇａｔａｃｔｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
【００７７】
上で得られた複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（２）と、ハイグロマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を連結し、ｘ２基本ベクターを作製した。
【００７８】
次に、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｃ‐ｓ／間隙配列Ｃ‐ａプライマーセットで２０４５ｂｐの間隙配列ＣをＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＭｌｕＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｃ‐ｓプライマー：５’‐ＡＣＧＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
間隙配列Ｃ‐ａプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＴＣＡＴＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
【００７９】
さらに、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｂ‐ｓ／間隙配列Ｂ‐ａプライマーセットで３０９３ｂｐの間隙配列Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｂ‐ｓプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＣＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
間隙配列Ｂ‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＡＧＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）
【００８０】
上で得られたｘ２基本ベクターのＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に間隙配列Ｂを挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図４に示すベクター２を作製した。
【００８１】
工程（１−５）  ｘ３  ＡＧＩＳ  トラスツズマブ発現ベクター（ベクター３）作製
ｐＱＢＩ２５プラスミドベクターを鋳型として、ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ３／ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ３プライマーセットでＰＣＲ反応を行い、複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（３）を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ８’配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）を付加している。
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ｓ３プライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＣｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａａａｇｔａｔｃｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）
ｐＵＣ‐ａｍｐ‐ａ３プライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣｔｃｇｃｇＴａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）
【００８２】
次に、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｌａｃＺベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を鋳型とし、Ｂｓｄ‐ｓ／Ｂｓｄ‐ａプライマーセットでＰＣＲ反応を行い、ブラストサイジン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を得た。センスプライマーの５’端には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｗｔ配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）および表１のＬｏｘＰｓｐ１０配列の相補配列（小文字）を付加している。
Ｂｓｄ‐ｓプライマー：５’‐ＧＧＡＴＣＣａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
Ｂｓｄ‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａａｔｔａｔｇｇｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＡＣＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）
【００８３】
上で得られた複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む断片（３）と、ブラストサイジン耐性遺伝子とＳＶ４０ポリＡを含む断片を連結し、ｘ３基本ベクターを作製した。
【００８４】
次に、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｅ‐ｓ／間隙配列Ｅ‐ａプライマーセットで２０３３ｂｐの間隙配列ＥをＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＭｌｕＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｅ‐ｓプライマー：５’‐ＡＣＧＣＧＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＴＡＧＡＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）
間隙配列Ｅ‐ａプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
【００８５】
さらに、ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｄ‐ｓ／間隙配列Ｄ‐ａプライマーセットで３００１ｂｐの間隙配列Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｄ‐ｓプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）
間隙配列Ｄ‐ａプライマー：５’‐ＡＣＴＡＧＴＣＧＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＴＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）
【００８６】
上で得られたｘ３基本ベクターのＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に間隙配列Ｄを挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図５に示すベクター３を作製した。
【００８７】
工程２：互いに異なる配列の間隙配列を発現単位間にもつ逐次導入ベクターのＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座への逐次導入
工程（２−１）  ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター作製
ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｈＥＦ１‐ｓ／ｈＥＦ１‐ａプライマーセットでｈＥＦ１プロモーター配列を増幅した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＭｌｕＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端にはリン酸基（Ｐ）を付加している。
ｈＥＦ１‐ｓプライマー：５’‐ＡＣＧＣＧＴａｇｃｃｇａａｃｃｔｃｔｃｇｃａａｇｔｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）
ｈＥＦ１‐ａプライマー：５’Ｐ‐ＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＧＧＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＣＡＣ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）
【００８８】
次に、ＴＯＴＯ株式会社所有のＥＧＦＰ遺伝子配列とＳＶ４０ポリＡ配列を含むベクターを鋳型として、ＥＧＦＰ‐ｓ／ＥＧＦＰ‐ａプライマーセットでＥＧＦＰ遺伝子配列＋ＳＶ４０ポリＡ配列を増幅した。センスプライマーの５’端にはリン酸基（Ｐ）と表１のＬｏｘＰｗｔ配列（小文字）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＸｂａＩ認識配列（下線部）と表１のＬｏｘＰｓｐ８配列の相補鎖（小文字）を付加している。
ＥＧＦＰ‐ｓプライマー：５’Ｐ‐ＡＴＧａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）
ＥＧＦＰ‐ａプライマー：５’‐ＴＣＴＡＧＡｔａｃｃｇｔｔｃｇｔａｔａｇｇａｔａｃｔｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）
【００８９】
次に、ｈＥＦ１プロモーター配列とＥＧＦＰ遺伝子配列＋ＳＶ４０ポリＡ配列のＰＣＲ増幅産物をライゲーション反応によって連結し、ｈＥＦ１プロモーター＋ＥＧＦＰ＋ＳＶ４０ポリＡ断片を作製した。
【００９０】
次に、ＷＯ０９／０２２６５６号公報（特許文献２）に記載のＣＨＯ  ２．５ｋｂｘ２  重鎖ベクターを制限酵素ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで切断し、３．１ｋｂｐの断片を除去し、前項で作製したｈＥＦ１プロモーター＋ＥＧＦＰ＋ＳＶ４０ポリＡ断片を、挿入し、図６に示すＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクターを作製した。
【００９１】
工程（２−２）  Ｃｒｅ発現プラスミドの作製
７０５−Ｃｒｅ  ｃｍ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（フナコシ）を鋳型として、Ｃｒｅ‐ｓ／Ｃｒｅ‐ａプライマーセットでＰＣＲ反応を行い、Ｃｒｅ組換え酵素遺伝子を増幅した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＫｐｎＩ認識配列（下線部）を、アンチセンスプライマーの５’端には制限酵素ＢｇｌＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
Ｃｒｅ‐ｓプライマー：５’‐ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣａｔｇｔｃｃａａｔｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）
Ｃｒｅ‐ａプライマー：５’‐ＡＧＡＴＣＴｃｔａａｔｃｇｃｃａｔｃｔｔｃｃａｇｃａ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）
【００９２】
次に、ｐｍａｘＧＦＰプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、ＧＦＰ配列を除去し、前項のＣｒｅ組換え酵素遺伝子増幅産物を挿入してＣｒｅ発現プラスミドを作製した。
【００９３】
工程（２−３）  ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクターのＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座への導入
ＣＨＯ―Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を、無血清浮遊培養に馴化した株を準備した。この細胞株をＡＭＥＭ培地（組成；Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％［ｖ／ｖ］ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で、３７℃、８％ＣＯ２の条件で２日間培養した。
【００９４】
この培養細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で剥離し、ＡＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。この細胞ペレットをＰＢＳ（和光純薬工業）で洗浄後、遠心し、ＰＢＳで懸濁した。ＰＢＳ細胞懸濁液は細胞密度を測定し、２×１０６  ｃｅｌｌｓを遠心し、得られたペレットをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｍａｘａ）で懸濁した後、線状化したＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター２μｇと混合した。得られた混合液はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（ａｍａｘａ）プログラムＵ−０２３により電圧印加を行った。
【００９５】
電圧印加を行った細胞をＡＭＥＭ培地５ｍＬに懸濁し、段階希釈しながら９６ウェルマイクロプレートに播種した後、３７℃、８％ＣＯ２の条件で培養した。トランスフェクションから２日後にＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた（最終濃度；５００μｇ／ｍＬ）。  さらに４日後にＧ４１８（最終濃度；５００μｇ／ｍＬ）および６−ＴＧ（最終濃度；５０μＭ）（和光純薬工業）を加え、さらに６日間培養した。
【００９６】
培養後、全ウェルを確認し、Ｇ４１８／６ＴＧ耐性コロニーを単離した。単離したクローンを、Ｇ４１８と６ＴＧを添加したＡＭＥＭ培地で９６ウェルプレートから、２４ウェルプレート、６ウェルプレート、１００ｍｍディッシュに拡大培養した。
【００９７】
次に、各クローンをＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで剥離し、ＡＭＥＭ培地で反応を停止後、遠心分離した。得られた細胞ペレットをＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（組成；ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で洗浄後、再度遠心し、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地に懸濁した。前記細胞懸濁液は１２５ｍｌフラスコで、３７℃、８％ＣＯ２、１２８ｒｐｍの条件で継代培養した。
【００９８】
得られた陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）で抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ１／ｐｒｉｍｅｒ２プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ４プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
ｐｒｉｍｅｒ１：５’―ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧ―３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）
ｐｒｉｍｅｒ２：５’―ＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧ―３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）
ｐｒｉｍｅｒ３：５’―ＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴ―３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）
ｐｒｉｍｅｒ４：５’―ＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣ―３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）
【００９９】
図７Ｂに示すように、正しい相同組換えクローンの場合、ホモロジーアーム１側では３１３２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ホモロジーアーム２側では２９１４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図７Ｃに示されるとおりであった。解析した８クローン全てにおいて、ホモロジーアーム１側で３１３２ｂｐ、およびホモロジーアーム２側で２９１４ｂｐの増幅断片が増幅した。そこで、クローンＮｏ．１をＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入株として、以下の実験に用いた。
【０１００】
工程（２−４）  ベクター１のＣＨＯのｈｐｒｔ遺伝子座への導入
上記工程（２−３）で作製したＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入株に、上記工程（２−３）と同様に電圧印加によりベクター１を２μｇとＣｒｅ発現プラスミド０．２μｇを導入し、９６ウェルプレートに播種した。
【０１０１】
播種から２日後、６日後の培地交換、および拡大培養にはＡＭＥＭ培地＋ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（最終濃度；１２μｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
【０１０２】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ５／ｐｒｉｍｅｒ６プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ７／ｐｒｉｍｅｒ８プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
ｐｒｉｍｅｒ５：５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）
ｐｒｉｍｅｒ６：５’−ＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）
ｐｒｉｍｅｒ７：５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）
ｐｒｉｍｅｒ８：５’−ＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）
【０１０３】
図８Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では５７３ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺では２０４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図８Ｃに示されるとおりであった。解析した１０クローン中１０クローンにおいて、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺で５７３ｂｐ、ＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺で２０４ｂｐの増幅断片が増幅した。そこで、クローンＮｏ．６をベクター１導入株として、以下の実験に用いた。
【０１０４】
工程（２−５）  ベクター１導入株へのベクター２の逐次導入：細胞例１の作製
上記工程（２−４）で作製したベクター１導入株に、上記工程（２−３）と同様に電圧印加によりベクター２を２ｕｇとＣｒｅ発現プラスミド０．２ｕｇを導入し、９６ウェルプレートに播種した。
【０１０５】
播種から２日後、６日後の培地交換、および拡大培養にはＡＭＥＭ培地＋Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（最終濃度；５００μｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
【０１０６】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ９／ｐｒｉｍｅｒ１０プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１１／ｐｒｉｍｅｒ１２プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
ｐｒｉｍｅｒ９：５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）
ｐｒｉｍｅｒ１０：５’−ＧＣＡＡＴＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）
ｐｒｉｍｅｒ１１：５’−ＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）
ｐｒｉｍｅｒ１２：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）
【０１０７】
図９Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では６８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺では３７６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図９Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺の解析を行ったところ、２４クローン中１０クローンで３７６ｂｐの増幅産物が増幅した。その１０クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、１０クローン中１０クローンで６８４ｂｐの増幅産物が増幅した。そこで、クローンＮｏ．１をベクター１およびベクター２導入株（細胞例１）として、以下の実験に用いた。
【０１０８】
工程（２−６）  ベクター１およびベクター２導入株へのベクター３の逐次導入：細胞例２の作製
上記工程（２−４）で作製したベクター１およびベクター２導入株に、上記工程（２−４）と同様に電圧印加によりベクター３を２μｇとＣｒｅ発現プラスミド０．２μｇを導入し、９６ウェルプレートに播種した。
【０１０９】
播種から２日後、６日後の培地交換、および拡大培養にはＡＭＥＭ培地＋Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（最終濃度；１２μｇ／ｍＬ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
【０１１０】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ１３／ｐｒｉｍｅｒ１４プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１５／ｐｒｉｍｅｒ１６プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
ｐｒｉｍｅｒ１３：５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）
ｐｒｉｍｅｒ１４：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）
ｐｒｉｍｅｒ１５：５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＧＴＧＣＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）
ｐｒｉｍｅｒ１６：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）
【０１１１】
図１０Ｂに示すように、正しい逐次導入細胞の場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では１１１８ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺では２２６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図１０Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺の解析を行ったところ、２３クローン中１１クローンで２２６ｂｐの増幅産物が増幅した。その１１クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、１1クローン中１１クローンで１１１８ｂｐの増幅産物が増幅した。そこで、クローンＮｏ．２２をベクター１とベクター２とベクター３導入株（細胞例２）として、以下の評価に用いた。
【０１１２】
評価：互いに異なる配列の間隙配列を発現単位間にもつ逐次導入ベクター導入ＣＨＯの評価
評価１  間隙配列の相同性の測定
工程（１−３）、（１−４）および（１−５）で作製したベクター１、ベクター２およびベクター３の、間隙配列同士の相同性を下記のとおりに測定した。
【０１１３】
ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１０ソフトウェアに間隙配列の電子ファイルを読み込み、「Ｈｏｍｏｌｏｇｙ」コマンドの「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ」を選択した。
【０１１４】
次に、「パラメーター」ダイアログの「Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の両方にチェックを入れ、「Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ」の値を「６」に、「Ｓｃｏｒｅｓ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」の値を「１００」に設定した。
【０１１５】
次に、比較したい間隙配列の電子ファイルを「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」ダイアログで「Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」に追加し、「ＯＫ」を選択して実行した。
【０１１６】
出力された測定結果の「Ｉｄｅｎｔｉｔｙ（％）」の値のうち、最も高い値を相同性の値として採用した。
【０１１７】
その結果、各間隙配列間の相同性はそれぞれ、間隙配列Ａ−間隙配列Ｂは５１％、間隙配列Ａ−間隙配列Ｃが４５％、間隙配列Ａ−間隙配列Ｄが４８％、間隙配列Ａ−間隙配列Ｅが４５％、間隙配列Ｂ−間隙配列Ｃが４４％、間隙配列Ｂ−間隙配列Ｄ：５２％、間隙配列Ｂ−間隙配列Ｅが４６％、間隙配列Ｃ−間隙配列Ｄが４４％、間隙配列Ｃ−間隙配列Ｅが４５％、そして間隙配列Ｄ−間隙配列Ｅが４５％であった。
【０１１８】
評価２  ベクター１導入株（比較例１）、ベクター１およびベクター２導入株（実施例１）、およびベクター１、ベクター２およびベクター３導入株（実施例２）のトラスツズマブ重鎖、軽鎖の発現量解析
工程（２−４）、（２−５）および（２−６）で作製した、ベクター１導入株（以下、「比較例１」という）、ベクター１とベクター２導入株（以下、「実施例１」という）、およびベクター１とベクター２とベクター３導入株（以下、「実施例２」という）のゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽出したゲノムＤＮＡトラスツズマブ重鎖、軽鎖のコピー数を、リアルタイムＰＣＲで定量した。
【０１１９】
トラスツズマブ重鎖のコピー数定量は、重鎖フォワードプライマー／重鎖リバースプライマーのプライマーセットと、重鎖ＴａｑＭＡＮプローブで実施した。
重鎖フォワードプライマー：５’−ＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）
重鎖リバースプライマー：５’−ＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）
重鎖ＴａｑＭＡＮプローブ：５’−ＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）
【０１２０】
トラスツズマブ軽鎖のコピー数定量は、軽鎖フォワードプライマー／軽鎖リバースプライマーのプライマーセットと、軽鎖ＴａｑＭＡＮプローブで実施した。
軽鎖フォワードプライマー：５’−ＴＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）
軽鎖リバースプライマー：５’−ＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＴ−３’ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）
軽鎖ＴａｑＭＡＮプローブ：５’−ＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴ−３’ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）
【０１２１】
リアルタイムＰＣＲ装置は７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＣＨＯ内在性ＧＡＰＤＨのコピー数によって上記定量値を標準化した。
【０１２２】
定量結果は図１１Ａに示されるとおりであった。トラスツズマブ重鎖遺伝子とトラスツズマブ軽鎖遺伝子のコピー数は、導入したそれぞれのコピー数と一致していた。
【０１２３】
次に、比較例１、実施例１、および実施例２の細胞を、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地で３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２５ｍＬフラスコで、３７℃、８％ＣＯ２、１２８ｒｐｍの条件で２日間培養した。
【０１２４】
前項の培養液を遠心し、細胞ペレットをＰＢＳ（ＴａＫａＲａ）で洗浄し、５×１０４  ｃｅｌｌｓからｍＲＮＡをＴａｑ  Ｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ―ｔｏ  ―ＣＴ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で抽出し、同キットを用いてｃＤＮＡを合成した。調整したｃＤＮＡのトラスツズマブ重鎖とトラスツズマブ軽鎖のコピー数を、重鎖フォワードプライマー／重鎖リバースプライマーのプライマーセットと、重鎖ＴａｑＭＡＮプローブを用いてリアルタイムＰＣＲで定量した。内在性ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡコピー数によって上記定量値を標準化し、トラスツズマブ遺伝子導入コピー数１の細胞株を１．０とした相対コピー数を算出した。
【０１２５】
定量結果は図１１Ｂに示されるとおりであった。トラスツズマブ重鎖ｍＲＮＡの相対コピー数は、トラスツズマブ重鎖遺伝子導入コピー数が１、２、および３コピーの細胞株において、それぞれ１．０、１．８、および２．５であり、遺伝子コピー数にほぼ比例して増加していた。
【０１２６】
また、図１１Ｂに示されるように、トラスツズマブ軽鎖ｍＲＮＡの相対コピー数は、トラスツズマブ軽鎖遺伝子導入コピー数が１、２、３コピーの細胞株において、それぞれ１．０、１．６、２．７であり、遺伝子コピー数にほぼ比例して増加していた。
【０１２７】
評価２  比較例１、実施例１、および実施例２の細胞のトラスツズマブ生産性および長期発現安定性の解析
比較例１、実施例１、および実施例２の細胞それぞれを、１２５ｍＬフラスコで、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地、３７℃、８％ＣＯ２、１２８ｒｐｍの条件で継代培養維持し、適時、各細胞株のトラスツズマブ生産量を測定した。
【０１２８】
トラスツズマブ生産量測定は、次のように実施した。樹立直後、あるいは継代維持中の細胞株を、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地で２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２５ｍＬフラスコで３７℃、８％ＣＯ２、１２８ｒｐｍの条件で8日間培養した。培養８日目の培養液の細胞密度を測定し、培養液を遠心して培養上清を取得した。Ｂｌｉｔｚ装置（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）でＢｉｏｓｅｎｓｏｒ/Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｔｒａｙ（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）を用いて、培地上清中のトラスツズマブ量を測定した。
【０１２９】
比較例１のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で４８．０ｍｇ／Ｌであった。また、２２４日間の継代培養において発現量が安定に維持された（図１２Ａ）。
【０１３０】
実施例１のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で９７．１ｍｇ／Ｌであった。継代培養５６日後までで１１３ｍｇ／Ｌに増加し、以降は１６８日間の継代培養中、１１６ｍｇ／Ｌで安定に維持された（図１２Ａ）。
【０１３１】
実施例２のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１６４ｍｇ／Ｌであった。また、５６日間の継代培養において発現量が安定に維持された（図１２Ａ）。
【０１３２】
比較例１、実施例１、および実施例２の細胞における、トラスツズマブ遺伝子の導入コピー数に対する発現量は、強い正の直線的な相関を示した。また、継代培養による発現量低下は起こらず、長期間の安定発現が確認された（図１２Ａ）。
【０１３３】
更に、実施例２の細胞を継代培養維持し、上記と同様に１１２日、１６８日および２２４日間の継代培養後のトラスツズマブ生産量を測定した。そして、これら日数における比較例１および実施例１の細胞の生産量と比較した。その際、日間での定量誤差を出来るだけなくすため、図１２Ａに結果が示される上記試験において、培養上清を保存しておき、これらにおけるトラスツズマブ発現量を再測定した。すなわち、比較例１につき、樹立直後、２８日、５６日、１１２日、１６８日および２２４日間の−８０℃で保存しておいた培養上清について、トラスツズマブ発現量を同時に再測定した。また、同様に実施例１につき、樹立直後、２８日、５６日、１１２日および１６８日間の−８０℃で保存しておいた培養上清について、トラスツズマブ発現量を同時に再測定した。また、実施例２について、上記日数以前の生産量についても、定量誤差を考慮して、樹立直後、２８日、５６日間の−８０℃で保存しておいた培養上清について、トラスツズマブ発現量を同時に再測定した。
【０１３４】
再測定した、比較例１のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で６２．３ｍｇ／Ｌであった。また、２２４日間の継代培養において発現量が安定に維持された（図１２Ｂ）。
【０１３５】
再測定した、実施例１のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１３５ｍｇ／Ｌであった。継代培養５６日後までで１４８ｍｇ／Ｌに増加し、以降は１６８日間の継代培養中、１５９ｍｇ／Ｌで安定に維持された（図１２Ｂ）。
【０１３６】
再測定した、実施例２のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で２２０ｍｇ／Ｌであった。また、２２４日間の継代培養において発現量が安定に維持された（図１２Ｂ）。
【０１３７】
比較例２：互いに異なる間隙配列の相同性が１００％である細胞例
間隙配列Ａの全長と同一の配列を間隙配列としてもつ、「ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクター」を下記のとおり作製した。
【０１３８】
間隙配列Ａ’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）の配列を人工遺伝子合成して取得した。本配列は、５’端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（ＡＡＧＣＴＴ）を、３’端には制限酵素ＳｐｅＩ認識配列（ＡＣＴＡＧＴ）を付加している。また、３’端のＳｐｅＩ直前までの２０４３ｂｐは、工程（１−３）の間隙配列Ａの２０５１ｂｐに含まれる配列と完全に同一配列である。一方、５’端のＨｉｎｄＩＩＩ認識配列以降の１ｋｂｐは、工程（１−４）の間隙配列Ｂと同一の配列である。
【０１３９】
工程（１−４）で作製したｘ２基本ベクターの、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ｃを挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に間隙配列Ａ’を挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図１３に示すｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターを作製した。
【０１４０】
次に、ベクター１導入株に、ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターを以下のとおり逐次導入し、細胞を作製した。
【０１４１】
工程（２−４）で作製したベクター１導入株に、工程（２−３）と同様にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクターを導入し、陽性クローンを取得した。
【０１４２】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ９／ｐｒｉｍｅｒ１０プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１６／ｐｒｉｍｅｒ１２プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
ｐｒｉｍｅｒ１６：５’−ＴＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：６６）
【０１４３】
図１４Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では６８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺では６３６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図１４Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺の解析を行ったところ、１３クローン中８クローンで６３６ｂｐの増幅産物が増幅した。その８クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、１０クローン中８クローンで６８４ｂｐの増幅産物が増幅した。
【０１４４】
クローンＮｏ．３を選択し、ゲノムＤＮＡのトラスツズマブ重鎖、軽鎖のコピー数を評価１と同様にしてリアルタイムＰＣＲで定量した。
【０１４５】
その結果、トラスツズマブ重鎖コピー数は１．９±０．１、軽鎖コピー数は１．９±０．１であり、導入した遺伝子数２とほぼ一致していた。そこで、クローンＮｏ．３をベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａベクター導入株（以下、この細胞を「比較例２」という）として、以下の評価に用いた。
【０１４６】
評価：互いに相同な配列の間隙配列を発現単位間にもつベクター導入ＣＨＯ株の評価
評価３  比較例２の細胞のトラスツズマブ重鎖、軽鎖の発現量解析
比較例２の細胞を評価２と同様に継代培養維持し、適時、細胞株のトラスツズマブ生産量を測定した。
【０１４７】
比較例２のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１３７ｍｇ／Ｌであった。継代培養を続けると生産量が減少していき、継代１１２日後では９５．５ｍｇ／Ｌまで低下した（図１５）。
【０１４８】
実施例３：１つの間隙配列が０．５ｋｂｐの細胞例（＃１）  実施例１の間隙配列Ｂを０．５ｋｂｐの鎖長に変更した細胞例
１つの間隙配列が５４１ｂｐである、「ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクター」を下記のとおり作製した。
【０１４９】
ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｂ５００‐ｓ／間隙配列Ｂ‐ａプライマーセットで５４１ｂｐの間隙配列Ｂ５００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｂ５００‐ｓプライマー：５’‐ＡＡＧＣＴＴａａｔｃｔｔｔｇｔｃａｇｃａｇｔｔｃｃｃ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）
【０１５０】
工程（１−４）で作製したｘ２基本ベクターの、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ｃを挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に間隙配列Ｂ５００を挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図１６Ａに示すｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクターを作製した。
【０１５１】
次に、ベクター１導入株にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクターを以下のとおり逐次導入し、細胞を作製した。
【０１５２】
工程（２−４）で作製したベクター１導入株に、工程（２−３）と同様にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクターを導入し、陽性クローンを取得した。
【０１５３】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽
出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ９／ｐｒｉｍｅｒ１０プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１１／ｐｒｉｍｅｒ１２プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
【０１５４】
図１７Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では６８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺では３７６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図１７Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺の解析を行ったところ、１０クローン中６クローンで３７６ｂｐの増幅産物が増幅した。その６クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、６クローン中６クローンで６８４ｂｐの増幅産物が増幅した。
【０１５５】
クローンＮｏ．２を選択し、ゲノムＤＮＡのトラスツズマブ重鎖、軽鎖のコピー数を評価１と同様にしてリアルタイムＰＣＲで定量した。
【０１５６】
その結果、トラスツズマブ重鎖コピー数は１．９±０．１、軽鎖コピー数は２．０±０．２であり、導入した遺伝子数２とほぼ一致していた。そこで、クローンＮｏ．２をベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｂ５００ベクター導入株（以下、「実施例３」という）として、以下の評価に用いた。
【０１５７】
評価：１つの間隙配列が０．５ｋｂｐ（５４１ｂｐ）であるベクター導入ＣＨＯ株の評価
評価４  実施例３の細胞のトラスツズマブ重鎖、軽鎖の発現量解析
実施例３の細胞を評価２と同様に継代培養維持し、適時、細胞株のトラスツズマブ生産量を測定した。
【０１５８】
実施例３のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１１０ｍｇ／Ｌであった。継代１１２日後では１１９ｍｇ／Ｌであり、発現量が安定に維持された（図１８）。
【０１５９】
実施例４：１つの間隙配列が０．５ｋｂｐの細胞例（＃２）  実施例１の間隙配列Ｃを０．５ｋｂｐの鎖長に変更した細胞例
１つの間隙配列が４９３ｂｐである、「ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクター」を下記のとおり作製した。
【０１６０】
ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ｃ５００‐ｓ／間隙配列Ｃ‐ａプライマーセットで４９３ｂｐの間隙配列Ｃ５００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ｃ５００‐ｓプライマー：５’ ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＧＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）
【０１６１】
工程（１−４）で作製したｘ２基本ベクターの、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ｃ５００を挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に間隙配列Ｂを挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図１９Ａに示すｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクターを作製した。
【０１６２】
次に、ベクター１導入株にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクターを以下のとおり逐次導入し、細胞を作製した。
【０１６３】
工程（２−４）で作製したベクター１導入株に、工程（２−３）と同様にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクターを導入し、陽性クローンを取得した。
【０１６４】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽
出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ９／ｐｒｉｍｅｒ１０プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１１／ｐｒｉｍｅｒ１２プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
【０１６５】
図２０Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では６８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺では３７６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図２０Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺の解析を行ったところ、１１クローン中６クローンで３７６ｂｐの増幅産物が増幅した。その６クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、６クローン中６クローンで６８４ｂｐの増幅産物が増幅した。
【０１６６】
クローンＮｏ．５を選択し、ゲノムＤＮＡのトラスツズマブ重鎖、軽鎖のコピー数を評価１と同様にしてリアルタイムＰＣＲで定量した。
【０１６７】
その結果、トラスツズマブ重鎖コピー数は２．０±０．４、軽鎖コピー数は１．８±０．５であり、導入した遺伝子数２とほぼ一致していた。そこで、クローンＮｏ．５をベクター１およびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００ベクター導入株（以下、この「実施例４」という）として、以下の評価に用いた。
【０１６８】
評価：１つの間隙配列が０．５ｋｂｐ（４９３ｂｐ）であるベクター導入ＣＨＯ株の評価
評価５  実施例４の細胞のトラスツズマブ重鎖、軽鎖の発現量解析
実施例４の細胞を評価２と同様に継代培養維持し、適時、細胞株のトラスツズマブ生産量を測定した。
【０１６９】
実施例４のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１１１ｍｇ／Ｌであった。継代１０２日後では１１８ｍｇ／Ｌであり、発現量が安定に維持された（図２１）。
【０１７０】
実施例５：実施例１の間隙配列Ａ、Ｂ、Ｃを全て０．５ｋｂｐの鎖長に変更した細胞例
１つの間隙配列が５０２ｂｐである、「ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター」を下記のとおり作製した。
【０１７１】
ＨＥＫ２９３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、間隙配列Ａ５００‐ｓ／間隙配列Ａ‐ａプライマーセットで５０２ｂｐの間隙配列Ａ５００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）をＰＣＲ増幅し、増幅産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で確認した。センスプライマーの５’端には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（下線部）を付加している。
間隙配列Ａ５００‐ｓプライマー：５’ ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧ‐３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）
【０１７２】
工程（１−３）で作製したｘ１基本ベクターの、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に間隙配列Ａ５００を挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間にダミー配列を挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図２２Ａに示すｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターを作製した。
【０１７３】
次に、２つの間隙配列がそれぞれ４９３ｂｐ、５４１ｂｐである、「ｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクター」を下記のとおり作製した。
【０１７４】
工程（１−４）で作製したｘ２基本ベクターの、ＭｌｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に工程（５−１）の間隙配列Ｃ５００を挿入し、次にＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ部位間に工程（４−１）の間隙配列Ｂ５００を挿入し、次にＭｌｕＩ部位に工程（１−１）のトラスツズマブ重鎖発現単位断片を挿入し、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位に工程（１−２）のトラスツズマブ軽鎖発現単位断片を挿入し、図２３Ａに示すｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクターを作製した。
【０１７５】
次に、ＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入株にｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターを以下のとおり逐次導入した。
【０１７６】
工程（２−３）で作製したＣＨＯ  ｈｐｒｔ  ＡＧＩＳ起点ベクター導入株に、工程（２−２）と同様に電圧印加によりｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターを２μｇとＣｒｅ発現プラスミド０．２μｇを導入し、９６ウェルプレートに播種した。
【０１７７】
播種から２日後、６日後の培地交換、および拡大培養にはＡＭＥＭ培地＋ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（最終濃度；１２μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１７８】
増殖が認められたウェルの細胞を採取し、ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター導入細胞とした。
【０１７９】
次に、ｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター導入株にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクターを以下のとおり逐次導入し、実施例５の細胞を作製した。
【０１８０】
工程（６−３）で作製したｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクター導入株に、工程（２−３）と同様にｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクターを導入し、陽性クローンを取得した。
【０１８１】
取得した陽性クローンのゲノムＤＮＡを、ＭＡＧ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒで抽出した。抽
出したゲノムＤＮＡを、ｐｒｉｍｅｒ７／ｐｒｉｍｅｒ８プライマーセット、ｐｒｉｍｅｒ９／ｐｒｉｍｅｒ１０プライマーセット、およびｐｒｉｍｅｒ１１／ｐｒｉｍｅｒ１２プライマーセットを用いたゲノムＰＣＲで解析した。
【０１８２】
図２５Ｂに示すように、正しい逐次導入クローンの場合、ＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺では６８４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。また、ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺では３７６ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。さらに、ＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺では２０４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。解析結果は図２５Ｃに示されるとおりであった。ＬｏｘＰｓｐ１０組換え部位周辺の解析を行ったところ、１０クローン中７クローンで３７６ｂｐの増幅産物が増幅した。その７クローンについてＬｏｘＰｗｔ組換え部位周辺の解析を行ったところ、７クローン中７クローンで６８４ｂｐの増幅産物が増幅した。また、その７クローンについてＬｏｘＰｓｐ８組換え部位周辺解析を行ったところ、７クローン中７クローンで２０４ｂｐの増幅産物が増幅した。
【０１８３】
クローンＮｏ．２を選択し、ゲノムＤＮＡのトラスツズマブ重鎖、軽鎖のコピー数を評価１と同様にしてリアルタイムＰＣＲで定量した。
【０１８４】
その結果、トラスツズマブ重鎖コピー数は１．８±０．１、軽鎖コピー数は２．０±０．３であり、導入した遺伝子数２とほぼ一致していた。そこで、クローンＮｏ．２をｘ１  ＡＧＩＳ  間隙配列Ａ５００ベクターおよびｘ２  ＡＧＩＳ  間隙配列Ｃ５００−Ｂ５００ベクター導入株（以下、「実施例５」という）として、以下の評価に用いた。
【０１８５】
評価：間隙配列が３つ全て０．５ｋｂｐであるベクター導入ＣＨＯ株の評価
評価６  実施例５の細胞のトラスツズマブ重鎖、軽鎖の発現量解析
実施例５の細胞を評価２と同様に継代培養維持し、適時、細胞株のトラスツズマブ生産量を測定した。
【０１８６】
実施例５のバッチ培養でのトラスツズマブ発現量は、樹立直後で１２３ｍｇ／Ｌであった。継代２８日後では１２７ｍｇ／Ｌで、安定に維持されていた（図２６）。
【図１】
2018171056.tif 000004
【図２】
2018171056.tif 000005
【図３Ａ】
2018171056.tif 000006
【図３ＢＣ】
2018171056.tif 000007
【図４Ａ】
2018171056.tif 000008
【図４ＢＣ】
2018171056.tif 000009
【図５Ａ】
2018171056.tif 000010
【図５ＢＣ】
2018171056.tif 000011
【図６】
2018171056.tif 000012
【図７Ａ】
2018171056.tif 000013
【図７Ｂ】
2018171056.tif 000014
【図７Ｃ】
2018171056.tif 000015
【図８Ａ】
2018171056.tif 000016
【図８Ｂ】
2018171056.tif 000017
【図８Ｃ】
2018171056.tif 000018
【図９Ａ】
2018171056.tif 000019
【図９Ｂ】
2018171056.tif 000020
【図９Ｃ】
2018171056.tif 000021
【図１０Ａ】
2018171056.tif 000022
【図１０Ｂ】
2018171056.tif 000023
【図１０Ｃ】
2018171056.tif 000024
【図１１Ａ】
2018171056.tif 000025
【図１１Ｂ】
2018171056.tif 000026
【図１２Ａ】
2018171056.tif 000027
【図１２Ｂ】
2018171056.tif 000028
【図１３Ａ】
2018171056.tif 000029
【図１３ＢＣ】
2018171056.tif 000030
【図１４Ａ】
2018171056.tif 000031
【図１４Ｂ】
2018171056.tif 000032
【図１４Ｃ】
2018171056.tif 000033
【図１５】
2018171056.tif 000034
【図１６Ａ】
2018171056.tif 000035
【図１６ＢＣ】
2018171056.tif 000036
【図１７Ａ】
2018171056.tif 000037
【図１７Ｂ】
2018171056.tif 000038
【図１７Ｃ】
2018171056.tif 000039
【図１８】
2018171056.tif 000040
【図１９Ａ】
2018171056.tif 000041
【図１９ＢＣ】
2018171056.tif 000042
【図２０Ａ】
2018171056.tif 000043
【図２０Ｂ】
2018171056.tif 000044
【図２０Ｃ】
2018171056.tif 000045
【図２１】
2018171056.tif 000046
【図２２Ａ】
2018171056.tif 000047
【図２２ＢＣ】
2018171056.tif 000048
【図２３Ａ】
2018171056.tif 000049
【図２３ＢＣ】
2018171056.tif 000050
【図２４Ａ】
2018171056.tif 000051
【図２４Ｂ】
2018171056.tif 000052
【図２５Ａ】
2018171056.tif 000053
【図２５Ｂ】
2018171056.tif 000054
【図２５Ｃ】
2018171056.tif 000055
【図２６】
2018171056.tif 000056
【配列表】
2018171056000001.app