(57)【要約】【課題】細胞内において、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸。
【請求項２】
前記イントロン領域が配列番号１で表される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域を表す配列番号１における２８０〜８２２番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における８４９〜１２５８番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
前記イントロン領域を表す配列番号１における７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチド、７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチド若しくは８０７〜８２２番目のオリゴヌクレオチド又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤。
【請求項７】
リポフェクション用担体を更に含む、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の剤を対象（ヒトの個体を除く。）に接触させることを含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の剤を含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子は元来ＴＧＦ−βにより活性化される遺伝子として同定され、その後の解析から、ＭＥＸ３Ｂタンパク質は種々のｍＲＮＡに結合してそれらｍＲＮＡの機能（つまりタンパク質への翻訳）を制御する分子であることが知られている（例えば、非特許文献１）。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質であることが知られている（例えば、特許文献１）。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４４２９２６９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７；３５（４）：１２８９−３００．
【非特許文献２】Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０−１７１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景から、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制できる核酸医薬品の開発が求められている。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞内において、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂのゲノム遺伝子及びｍＲＮＡ前駆体中に存在し、スプライシングにより除去されてｍＲＮＡ中には存在しないイントロン中のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸をヒト肺がん細胞に供与することによりＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の通りである。
【０００８】
本発明の第１の態様は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸である。
【０００９】
本発明の第２の態様は、
第１の態様に係る核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤である。
本発明の第３の態様は、
第２の態様に係る剤を対象（ヒトの個体を除く。）に接触させることを含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法である。
本発明の第４の態様は、
第２の態様に係る剤を含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤である。
【発明の効果】
【００１０】
細胞内において、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤を提供することができる。
上記核酸、上記ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、上記予防又は治療剤は、副作用としての細胞毒性が少ない。
副作用として細胞毒性が少ない理由は、エクソン（特に、アミノ酸をコードする領域（ＣＤＳ））に比べ、イントロンの方が、ＭＥＸ３Ｂホモログとの相同性が低く、オフターゲット効果が生じ難いことに基づくものと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各ギャップマー型核酸のトランスフェクションによるＭＥＸ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルの抑制を示す図である。
【図２】各ギャップマー型核酸のトランスフェクションによるＭＥＸ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルの抑制を示す図である。
【図３】ＣＤＳを標的とするギャップマー型核酸により細胞毒性を受けた細胞の顕微鏡写真と、イントロンを標的とするギャップマー型核酸により細胞毒性を受けなかった細胞の顕微鏡写真とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００１３】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子はエクソン１、イントロン及びエクソン２を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。
後記の配列番号１はヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域の８３６塩基を示す。ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号２で表される配列を有する。ヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子において、上記イントロン領域は、配列番号２で表される配列における６９２番目の塩基と６９３番目の塩基との間に存在する。
配列番号１０は、スプライシング前のヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする塩基配列を示す。配列番号１０で表されるヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする配列における６９３〜１５２８番目の領域が、配列番号１で表されるヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域に相当する。
マウスＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号３で表される配列を有する。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質（例えば、後記の配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＭＥＸ３Ｂ遺伝子に属する。
【００１４】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号２〜５及び１０に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を単離することができる。
【００１５】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸＞
第１の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸（以下、単に「第１の態様に係る核酸」ともいう。）は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する。
上記イントロンは、スプライシングにより除去されるので、ＭＥＸ３Ｂのゲノム遺伝子及びｍＲＮＡ前駆体中に存在し、かつｍＲＮＡ中には存在しない。
第１の態様に係る核酸は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を発現する細胞の細胞質内のみならず、核内まで到達することができ、上記イントロンに作用してＭＥＸ３Ｂのゲノム遺伝子又はｍＲＮＡ前駆体を分解することにより、ＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制することができる。
例えば、上記イントロン中に含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な第１の態様に係る核酸とがハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）によりヌクレオチド鎖が分解されることが好ましい。
第１の態様に係る核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ｍＲＮＡ前駆体中のイントロンに含まれるオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する観点から、ＤＮＡであることが好ましい。
【００１６】
第１の態様に係る核酸としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも１１ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、少なくとも１２ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも１３ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、少なくとも１４ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
【００１７】
また、第１の態様に係る核酸の塩基長の上限値としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する４０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する３０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する２５ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する２０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する１７ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
第１の態様に係る核酸としては、例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸が挙げられ、上記イントロン領域を表す配列番号１における２８０〜８２２番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における８４９〜１２５８番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸であることが好ましく、上記イントロン領域を表す配列番号１における２８０〜２９５番目のオリゴヌクレオチド、７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチド、７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチド、７３０〜７４５番目のオリゴヌクレオチド若しくは８０７〜８２２番目のオリゴヌクレオチド又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における８４９〜８６４番目のオリゴヌクレオチド、８８９〜９０４番目のオリゴヌクレオチド、９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチド、１０９３〜１１０８番目のオリゴヌクレオチド若しくは１２４３〜１２５８番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸であることがより好ましく、上記イントロン領域を表す配列番号１における７０８〜８２２番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における８８９〜１１０８番目の配列中の連続する１２〜２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸であることが更に好ましく、上記イントロン領域を表す配列番号１における７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチド、７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチド若しくは８０７〜８２２番目のオリゴヌクレオチド又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸であることが特に好ましく、上記イントロン領域を表す配列番号１における７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチド若しくは７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチド又はヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸であることが最も好ましい。
なお、配列番号１０における８４９〜８６４番目のオリゴヌクレオチド、８８９〜９０４番目のオリゴヌクレオチド、９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチド、１０９３〜１１０８番目のオリゴヌクレオチド及び１２４３〜１２５８番目のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、上記イントロン領域を表す配列番号１における１５７〜１７２番目のオリゴヌクレオチド、１９７〜２１２番目のオリゴヌクレオチド、２１６〜２３１番目のオリゴヌクレオチド、４０１〜４１６番目のオリゴヌクレオチド及び５５１〜５６６番目のオリゴヌクレオチドに相当する。
【００１８】
第１の態様に係る核酸としては、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、２’，４’−ＢＮＡ（２’，４’−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の架橋構造、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化（２’−ＭＯＥ）等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びｍＲＮＡの結合能を向上することができる。
【００１９】
第１の態様に係る核酸において、ヌクレオチド同士をつなぐ少なくとも１つのリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することが好ましく、第１の態様に係る核酸中のリン酸ジエステル結合のうちの５０％以上がホスホロチオエート構造を有することがより好ましく、第１の態様に係る核酸中のリン酸ジエステル結合のうちの７０％以上がホスホロチオエート構造を有することが更に好ましく、第１の態様に係る核酸中のリン酸ジエステル結合のうちの９０％以上がホスホロチオエート構造を有することが特に好ましく、第１の態様に係る核酸の全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート構造を有することが最も好ましい。
第１の態様に係る核酸において、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、第１の態様に係る核酸の両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく（いわゆるギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、第１の態様に係る核酸の両末端において、独立して、末端から４塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から２又は３塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
第１の態様に係る核酸は、ＤＮＡ合成機及び公知の有機合成技術を用いて常法により製造することができる。
【００２０】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）又はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、細胞内、好ましくは核内への取り込みは、第１の態様に係る核酸を細胞に接触させること、例えば、任意の細胞を培養する培地中に、第１の態様に係る核酸を添加することにより達成することができるが、第１の態様に係る核酸が、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することにより、細胞内、好ましくは核内への取り込みを更に向上させることができる。
第１の態様に係る核酸は、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、後述するリポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内、好ましくは核内への取り込みを更に向上させることができる。
【００２１】
第１の態様に係る核酸の細胞への導入方法としては、適当なベクター中に挿入し、更に適当な宿主細胞に導入する方法であってもよい。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
【００２２】
また、第１の態様に係る核酸は、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又は真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されていてもよい。組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
第１の態様に係る核酸又はそれを含むベクターを導入される宿主細胞は、高等真核細胞、細菌、酵母、真菌等が挙げられるが、哺乳類細胞であることが好ましい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス細胞（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス胎児繊維芽細胞）等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００２４】
第１の態様に係る核酸によるＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現の抑制は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、インビボ、インビトロでも、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより検出することができる。
特に、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット等の常法により行うことができる。
【００２５】
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の連続した１０〜６０残基、好ましくは１０〜４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００２６】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤＞
第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤（以下、単に「第２の態様に係る剤」ともいう。）は、第１の態様に係る核酸を含む。
第２の態様に係る剤は、細胞内、好ましくは核内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含むことが好ましい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜、好ましくは核膜との親和性の高い担体（例えばリポソームやコレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
第１の態様に係る核酸がホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内、好ましくは核内への取り込みを更に向上させることができる。
例えば、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有する第１の態様に係る核酸を、リポフェクション用担体共存下において、後述の対象と接触させることが好ましい。
【００２７】
第２の態様に係る剤は、第１の態様に係る核酸、上記リポフェクション用担体及びその他任意成分（例えば、水、緩衝液等）を混合して含む形態であってもよいが、第１の態様に係る核酸及びその他任意成分と、上記リポフェクション用担体及びその他任意成分とが個別の容器内に包装されたキットの形態であってもよい。
第２の態様に係る剤の形態としては、特に限定されるものではないが、液体、顆粒、錠剤、カプセル剤、貼り薬等の形態で使用することができる。インビボの場合には、第２の態様に係る剤を組織に直接暴露してもよい。より好ましくは生体に暴露（液体等）又は経口投与、あるいは、静脈又は動脈等の血管内、経口内、舌下、直腸内、腹膣内、皮膚、皮下、皮内、膀胱内、気管（気管支）、眼、鼻、耳内等への注入、噴霧、又は塗布等の手段により生体内に投与すればよい。
【００２８】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法＞
第３の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法は、第２の態様に係る剤を対象に接触させることを含む。
対象としては、生物個体、微生物、原虫、生物組織、生物組織切片、ヒト細胞、動物細胞等が挙げられる。
接触させる形態としては特に制限はないが、例えば、第２の態様に係る剤を、対象を含む媒体（例えば、培地、溶液、緩衝液等）に添加するか又は第２の態様に係る剤を予め含有する前記媒体を準備してもよい。接触させる際の温度、時間等は、特に制限はないが、対象の種類等に応じて適宜設定される。
【００２９】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤＞
第４の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤は、第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤を含む。
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、炎症、造血、骨代謝、腫瘍増悪などに関与する重要なサイトカインであり、その活性は主に急性炎症から獲得免疫反応への移行や慢性炎症性疾患の発症に寄与することが知られている（例えば、Ｊ  Ａｓｔｈｍａ．２００８；４５  Ｓｕｐｐｌ  １：４１−４．）。
インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、炎症性サイトカインとして末梢組織でのアレルギー性炎症をより増強する役割を担うことが知られており、アレルギー性喘息の主な要因であるアレルギー反応を促進するという側面のみならず、ステロイド剤が効かなくなるという喘息の難治化に関与することが知られている。またＩＬ−１３は、喘息のみならず、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎においてもその病態形成に関与している（例えば、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  （Ｃａｉｒｏ）．２０１２；２０１２：３１６０４９、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５：１０８８−１０９８）。
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）、中でも、ＴＮＦ−αは、炎症反応を誘発するシグナル因子であり、感染防御の観点では重要な因子であるが、一方で炎症が亢進することによる障害にも同時に関与することが知られている。すなわち様々な疾患でＴＮＦは病態の悪化に関与しており、主に関節疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、がん（卵巣がん、乳がん）、精神疾患（うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症）、心血管疾患（心不全、動脈硬化）、呼吸器疾患（気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害）、二型糖尿病、腎疾患（虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎）などに関与することが知られている（例えば、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｊａｎ；１２１（１）：５−１０、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００８  Ｊａｎ；２１４（２）：１４９−６０．）。
また、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子：Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）は顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用があることが知られている。
また、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦも、喘息の重症化に関与することが知られている（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３  Ｄｅｃ；２５（６）：７５５−６０．）。
【００３０】
また、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５は炎症性ケモカインＣＸＣサブファミリーに属する。
気道粘膜における過剰な炎症の亢進により肺組織内でＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５が分泌された場合には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５の受容体であるＣＸＣＲ２を高発現する好中球の浸潤が促される。結果的にはステロイド耐性の好中球浸潤が重症喘息を引き起こすことにより気道の不可逆的なリモデリングを誘導する慢性炎症を誘発する。
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子がＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の発症に関わることを見出している。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５発現増加に起因する疾病（例えば、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等の中でもＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等（Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｊａｎ；２７（１）：２１−９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１６  Ｊａｎ；６（１）：８０−９５．））の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
【００３１】
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質であることが知られている（例えば、特許第４４２９２６９号公報）。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０−１７１３）。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、神経変性疾患の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
【００３２】
第４の態様に係る予防又は治療剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
有効成分である第１の態様に係る核酸の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
≪実施例１≫
＜ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型核酸の調製＞
イントロン領域を表す配列番号１における２８０〜２９５番目のオリゴヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸、７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸、７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸、７３０〜７４５番目のオリゴヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸、８０７〜８２２番目のオリゴヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸を調製した。
各ギャップマー型核酸の両末端には２又は３塩基のＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化し、全長は１６塩基とした。
【００３６】
＜ギャップマー型核酸のトランスフェクション＞
上記調製した各ギャップマー型核酸を用いてトランスフェクション（細胞導入）した。
ギャップマー型核酸のトランスフェクションに用いた細胞はヒト肺がん細胞株Ａ５４９細胞であり、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とその推奨プロトコルを採用して最終濃度２０ｎＭにて細胞に導入した。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
トランスフェクション４８時間後に顕微鏡下にて細胞の状態を観察した後に細胞を回収して溶解バッファーＴＲＩｓｕｒｅ（ＢＩＯＬＩＮＥ社製）を用いて全ＲＮＡを回収した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。
その後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（ＲＯＣＨＥ社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ試験に用いたプライマー配列は以下である。
ヒトＭＥＸ３Ｂプライマー１Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧ−３’（配列番号６）
ヒトＭＥＸ３Ｂプライマー１Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号７）
ヒトＧＡＰＤＨプライマー１Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号８）
ヒトＧＡＰＤＨプライマー１Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号９）
【００３８】
図１に示した定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果から明らかなように、ギャップマー型核酸によるトランスフェクションを行っていないコントロールに対し、各ギャップマー型核酸を用いてトランスフェクションを行った細胞ではヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が検出された。
特に、イントロン領域を表す配列番号１における７２１〜７３６番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸、及び７０８〜７２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸に、ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が検出された。
【００３９】
≪実施例２≫
＜ギャップマー型核酸の調製＞
イントロン領域の表１に示した各標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−３３（配列番号１１）、ｈｍｒＧＤ−３４（配列番号１２）、ｈｍｒＧＤ−３５（配列番号１３）、ｈｍｒＧＤ−３６（配列番号１４）又はｈｍｒＧＤ−３７（配列番号１５）、ネガティブコントロールとしてのギャップマー型核酸（配列番号１６）、及び比較例としてＣＤＳ領域の表１に示した標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−６８（配列番号１７）を調製した。
なお、各ギャップマー型核酸の両末端には２塩基のＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化し、ネガティブコントロールのギャップマー型核酸の全長は１５塩基とし、それ以外のギャップマー型核酸の全長は１６塩基とした。
【００４０】
【表１】
2018011593.tif 000003
なお、ネガティブコントロールとしてのギャップマー型核酸（配列番号１６）の配列は、ヒトＭＥＸ３Ｂとは相補性がない配列としてデザインされた配列である。
【００４１】
＜ギャップマー型核酸のトランスフェクション＞
上記調製した各ギャップマー型核酸を用いること以外は実施例１と同様にしてトランスフェクションを行った。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
ＰＣＲプライマーとして以下のプライマーを用いること以外は実施例１と同様にして定量的ＲＴ−ＰＣＲ試験を行った。
ヒトＭＥＸ３Ｂプライマー２Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧ−３’（配列番号１８）
ヒトＭＥＸ３Ｂプライマー２Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１９）
ヒトＧＡＰＤＨプライマー２Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号２０）
ヒトＧＡＰＤＨプライマー２Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２１）
【００４２】
図２に示した定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果から明らかなように、コントロールのギャップマー型核酸をトランスフェクションした細胞に対し、イントロン領域を標的領域とする各ギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−３３、ｈｍｒＧＤ−３４、ｈｍｒＧＤ−３５、ｈｍｒＧＤ−３６又はｈｍｒＧＤ−３７を用いてトランスフェクションを行った細胞ではヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が検出された。
ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における９０８〜９２３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−３５は、ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が特に強く検出された。
【００４３】
図３に示したように、ＣＤＳ領域の配列に相補的なギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−６８を用いてトランスフェクションを行った細胞では、細胞毒性が著しく高く、多くの細胞が培養皿の底から剥がれて丸くなって浮いており、多くの細胞が死滅することが確認された。
一方、図３に示したように、イントロン領域の配列に相補的なギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ−３３、ｈｍｒＧＤ−３４、ｈｍｒＧＤ−３５、ｈｍｒＧＤ−３６又はｈｍｒＧＤ−３７を用いてトランスフェクションを行った細胞では、ネガティブコントロールと同様に、細胞毒性などの副作用は見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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