(57)【要約】【課題】測定物質を認識して蛍光強度が増大するようなナノ粒子を提供すること。【解決手段】蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する、ナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する、ナノ粒子。
【請求項２】
ナノ粒子の平均粒径が、１０ｎｍ〜１０００ｎｍである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
ナノ粒子が、機能性モノマーと架橋性モノマーと蛍光性モノマーと開始剤と測定物質とを混合して重合させることにより製造される、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
機能性モノマーが、メタクリル酸である、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項５】
架橋性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレートである、請求項３又は４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
蛍光性モノマーが、アリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−）を有する蛍光分子である、請求項３から５の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
蛍光性モノマーが、アリルフルオレセインである、請求項３から６の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
測定物質が、担体に固定されている測定物質である、請求項３から７の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
測定物質が、ビースに固定されている測定物質である、請求項３から８の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
測定物質が、ホルモン、神経伝達物質、がん細胞分泌物、抗菌剤、または抗凝固薬である、請求項１から９の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
測定物質が、セロトニンである、請求項１から１０の何れか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか一項に記載のナノ粒子に、測定物質を含有する試料を接触させ、蛍光強度の変化を検出することを含む、測定物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定物質を認識して蛍光強度が増大する分子インプリントナノ粒子、及び前記分子インプリントナノ粒子を用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子インプリント高分子（ＭＩＰ）は、認識対象物質（鋳型）の存在下で、それに対して親和性を持つモノマー（機能性モノマー）と架橋性モノマーとを共重合した後に、認識対象物質（鋳型）を抜き出すことにより得られる分子である。ＭＩＰは、認識対象物質（鋳型）に対する特異結合サイトを持った高分子であり、簡便かつ経済的なプロセスで、任意の対象物質に対してテーラーメイド的に調製できる分子認識素子である。
【０００３】
本発明者はこれまでに、表面にＭＩＰをグラフトした電極における酸化還元電流は、鋳型の濃度に依存することを見出した。これは鋳型とＭＩＰの特異的相互作用によって、レドックス種の基盤電極へのアクセシビリティの変化（ゲート効果）が生じるためと考えられる。この電流を測定することで鋳型を簡便かつ迅速にセンシングできる。この知見に基づいて、特許文献１には、分子インプリント高分子を固定化した基板から構成される抗凝固薬測定用センサが記載されている。また、特許文献２には、分子インプリント高分子を表面上に直接固定化した基板から構成されるセンサであって、レドックス種が、前記分子インプリント高分子及び／又は前記基板に固定化されている前記センサが記載されている。
【０００４】
また、非特許文献１には、蛍光性官能基を導入したＭＩＰは、消光性のある鋳型と特異結合すると、蛍光強度の減少から特異結合量を計測できることが記載されているが、この手法は、消光性のある鋳型にしか利用できないという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２／１２４８００号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１６／１４０３３７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gao, L., et al., Molecularly imprinted polymer microspheres for optical measurementof ultra trace nonfluorescent cyhalothrin in honey, Food Chem., 156, 1-6, 2014
【非特許文献２】Poma, A. et al, Solid-Phase Synthesis of Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles with a Reusable Template-“Plastic Antibodies”, Advanced Functional Materials, 23, 2821-2827, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
神経伝達物質は、神経細胞間の信号伝達を担う重要な生体関連物質である。ヒトを含む動物の行動や疾病において、各種伝達物質がどの場所でどのようなタイミングで分泌されるかは、情動や記憶、学習、判断などの脳神経機能やその障害のメカニズムを理解する上で重要である。しかし、現状においては、神経伝達物質をモニタリングする技術が存在しない。
【０００８】
従来の神経伝達物質を検出する方法としては、脳内に中空糸透析膜を穿刺し、中空糸内部に拡散する伝達を回収して、液体クロマトグラフィーなどで分析するマイクロダイアリシス法が一般的である。しかし、マイクロダイアリシス法は、回収に分単位の時間が必要であるため、リアルタイムモニタリングには適さない。また神経組織に対して著しく侵襲的であるため、自然な分泌を反映しているかが問題となる。
【０００９】
神経伝達物質に特異的に反応して蛍光強度が変化するプローブがあれば、顕微鏡観察によってリアルタイムに分泌を検出できるだけでなく、分泌箇所も特定でき、しかも組織に対して侵襲性が低いという利点もあり、神経伝達物質の分泌、神経活動及び神経疾病の分析を著しく進めることができる。しかし、各々の神経伝達物質に対応したプローブを分子設計して合成することは困難である。MIPは任意の対象物質に特異的に結合する分子を簡単に作製できる手法であるが、特異結合を光信号に変換する方法は確立していない。
【００１０】
本発明は、測定物質を認識して蛍光強度が増大するようなナノ粒子を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
A. Pomaらは、測定物質（鋳型）をガラスビーズ表面に固定して、その周辺で機能性モノマーと架橋性モノマーとを共重合させた後、ガラスビーズから高分子を脱離させると、鋳型に対して特異的結合能を示すＭＩＰナノ粒子を合成できることを見出した（非特許文献２）。本発明者らは、このＭＩＰのナノ粒子が鋳型と特異結合することによって、粒径が変化することを見出した（吉見ら「電極におけるヘパリンインプリント高分子層の形成に関する考察」化学工学会79年会, 岐阜）。そこで本発明者らは、ＭＩＰナノ粒子に蛍光物質を導入することにより、鋳型との特異結合により蛍光強度が増大するプローブを提供することに成功した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１）  蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する、ナノ粒子。
（２）  ナノ粒子の平均粒径が、１０ｎｍ〜１０００ｎｍである、（１）に記載のナノ粒子。
（３）  ナノ粒子が、機能性モノマーと架橋性モノマーと蛍光性モノマーと開始剤と測定物質とを混合して重合させることにより製造される、（１）又は（２）に記載のナノ粒子。
（４）  機能性モノマーが、メタクリル酸である、（３）に記載のナノ粒子。
（５）  架橋性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレートである、（３）又は（４）に記載のナノ粒子。
（６）  蛍光性モノマーが、アリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−）を有する蛍光分子である、（３）から（５）の何れか一に記載のナノ粒子。
（７）  蛍光性モノマーが、アリルフルオレセインである、（３）から（６）の何れか一に記載のナノ粒子。
（８）  測定物質が、担体に固定されている測定物質である、（３）から（７）の何れか一に記載のナノ粒子。
（９）  測定物質が、ビースに固定されている測定物質である、（３）から（８）の何れか一に記載のナノ粒子。
（１０）  測定物質が、ホルモン、神経伝達物質、がん細胞分泌物、抗菌剤、または抗凝固薬である、（１）から（９）の何れか一に記載のナノ粒子。
（１１）  測定物質が、セロトニンである、（１）から（１０）の何れか一に記載のナノ粒子。
（１２）  （１）から（１１）の何れか一に記載のナノ粒子に、測定物質を含有する試料を接触させ、蛍光強度の変化を検出することを含む、測定物質の測定方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のナノ粒子は、測定物質を認識することにより蛍光強度が増大することから、測定物質をモニタリングするためのプローブとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＭＩＰナノ粒子の粒径に与える鋳型の影響を示す。
【図２】図２は、ＭＩＰの蛍光スペクトルと添加されたセロトニン（５−ＨＴ）とトリプトファン（Ｔｒｐ）との関係を示す。
【図３】図３は、ＭＩＰからの蛍光スペクトルのセロトニンおよびＬ−トリプトファンの濃度依存性を示す。
【図４】図４は、本発明のナノ粒子において推定される分子認識による蛍光強度増大のメカニズムを示す。
【図５】図５は、染色をしていない脳神経節の蛍光強度変化（Ｂｒａｎｋ）を示す。光学測定条件：時間分解能３．７０ｍｓ，画像分解能１８４×１２４，接眼レンズ倍率３．２，対物レンズ倍率６．４，フレーム数１０９２０
【図６】図６は、２４時間染色後の脳神経節の蛍光強度変化を示す。光学測定条件：時間分解能３．７０  ｍｓ，画像分解能１８４×１２４，接眼レンズ倍率３．２，対物レンズ倍率６．４，フレーム数１０９２０
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のナノ粒子は、蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する。
【００１６】
本発明のナノ粒子によれば、微小空間における任意の測定物質のセンシングが可能であり、生体における任意の測定物質の分泌をリアルタイムにイメージングでき、生体内の特定物質の分泌をリアルタイムにイメージングする診断技術を開発することが可能である。
【００１７】
本発明のナノ粒子の応用の一例としては、本発明による蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子を、神経細胞に付着させ、鋳型とした伝達物質を蛍光顕微鏡で観察しながら高速ビデオ撮影（ミリ秒単位）することにより、脳内の伝達物質の分泌のタイミングと位置を特定し、行動との関係を解析することが可能である。さらに別の例としては、がん細胞から分泌される物質を測定物質（鋳型）として、本発明による蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子を用いてがん患部を染色することにより、活発ながんや腫瘍を可視化でき、外科手術の効率化を図ることができる。
【００１８】
上記の通り、本発明のナノ粒子は、化学センサ・バイオセンサ、機能性高分子、医療用デバイス、再生医療及び細胞診断などの分野で利用可能である。
【００１９】
本発明のナノ粒子の平均粒径（測定物質（鋳型）が存在しない場合）は特に限定されないが、一般的には１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍであり、より好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍである。本明細書における平均粒径は、動的光散乱法により測定された値で示すものとする。
【００２０】
特定の測定物質（鋳型）とそれに可逆的に結合する機能性モノマーが自己組織した状態で、機能性モノマーを架橋性モノマーと共重合させることで鋳型の分子構造を記憶し、それと特異的に再結合する分子インプリント高分子を合成することができる。この分子インプリント高分子は、生体高分子に比べると化学的かつ物理的安定性に富み、低コストかつ短時間に調製できる。
【００２１】
本発明のナノ粒子は、機能性モノマーと架橋性モノマーと蛍光性モノマーと開始剤と測定物質とを混合して重合させることにより製造することができる。
【００２２】
本発明で用いる機能性モノマーは、特に限定されず、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、ビニルフェニルボロン酸、アクリルアミドボロン酸、2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、2-（トリフルオロメチル）アクリル酸などを使用することができる。
【００２３】
また、ヘパリン等を測定する場合には、カチオン性モノマーを使用することもできる。ヘパリンは、スルホン酸基を多数含むため、カチオン性の機能性モノマーを使用することにより、ヘパリンと特異結合する分子インプリント高分子を合成することが可能になる。カチオン性モノマーとしては、１〜３級アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、１〜３級アミノ基含有（メタ）アクリレート、４級アンモニウム塩基含有（メタ）アクリルアミド、４級アンモニウム塩基含有（メタ）アクリレート、ジアリルジアルキルアンモニウムハライド等のように、分子内にカチオン性基を有するものである。３級アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。３級アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート等が挙げられる。また、１〜２級アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチル（メタ）アクリルアミドなどの１級アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、或は、メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、エチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ｔ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドなどの２級アミノ基含有（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。１〜２級アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレートなどの１級アミノ基含有（メタ）アクリレート、或は、メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、エチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチルアミノエチル（メタ）アクリレートなどの２級アミノ基含有（メタ）アクリレート等が挙げられる。４級アンモニウム塩基含有（メタ）アクリルアミドおよび４級アンモニウム塩基含有（メタ）アクリレートとしては、３級アミノ基含有（メタ）アクリルアミド又は３級アミノ基含有（メタ）アクリレートを、塩化メチル、塩化ベンジル、硫酸メチル、エピクロルヒドリンなどの４級化剤で４級化したモノ４級塩基含有モノマーが挙げられる。具体的には、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドプロピルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、メタクリロイロキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリロイロキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリロイルアミノエチルトリメチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリロイルアミノエチルトリエチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリロイロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリロイロキシエチルトリエチルアンモニウムクロリドなどが挙げられる。上記の中でも、カチオン性モノマーの具体例としては、例えば、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、ビニルピリジン、ジエチルアミノエチルメタクリレートなどがある。これらを１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
本発明で用いる架橋性モノマーとしては、例えば、メチレンビスアクリルアミド、１，４−ブチルジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ノナエチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ペンタエリスリトールジメタクリレート、トリメチロールプルパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート、エポキシアクリレート、ポリエステルアクリレート、ウレタンアクリレートなどが挙げられる。上記の中でも特に好ましくは、例えば、メチレンビスアクリルアミド、ポリエチレングリコールジメタクリレートなどがある。これらを１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
重合の際には、架橋度調整用モノマーを使用することができる。架橋度調整用モノマーとしては、アクリルアミドなどを使用することができる。これらを１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
本発明で用いる蛍光性モノマーは、特に限定されないが、アリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−）などの重合性基を有する蛍光分子であることが好ましい。
蛍光分子としては、フルオレセイン系化合物（フルオレセイン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン））、ローダミン系化合物（ローダミン、ＲＯＸ（カルボキシ−６−ローダミン）、ＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）など）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）化合物（例、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）、ＡＴＴＯ化合物（ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ６４７Ｎ）、テキサスレッド、シアニン系化合物（Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５など）などが挙げられる。
【００２７】
分子インプリント高分子を製造する際に使用する測定物質は、担体（好ましくは、ビーズ等）に固定されている測定物質であることが好ましい。
【００２８】
本発明のセンサを用いて測定する測定物質は特に限定されず、ホルモン・神経伝達物質（セロトニン、ドーパミン、アドレナリン、アセチルコリン、γ-アミノ酪酸など）、がん細胞分泌物（乳酸、増殖因子など）、微生物が分泌する物質（バイオフイルム、微生物間の情報伝達物質等を含む）、抗菌剤（バンコマイシン、テイコプラニンなど）、抗凝固薬、麻酔薬、農薬、抗がん剤（ゲフィチニブ、フルオロウラシル、メトトレキサートなど）など任意の物質を測定することができる。
【００２９】
抗凝固薬としては、ヘパリン、ヘパリン類似物質（低分子量ヘパリンなどを含む）、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオンなどを挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明によれば、上記したナノ粒子に、測定物質を含有する試料を接触させ、蛍光強度の変化（蛍光強度の増大）を検出することによって、測定物質を測定することができる。試料としては、全血または血液成分（例えば、血漿又は血清など）を使用することができる。あるいは、本発明によれば、上記したナノ粒子を生体に投与して、生体内における蛍光強度の変化（蛍光強度の増大）を検出することによって測定物質の存在や量などを分析することができる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：蛍光性モノマーの合成
既報（Gao, L., et al., Molecularly imprinted polymer microspheres for optical measurementof ultra trace nonfluorescent cyhalothrin in honey, Food Chem., 156, 1-6, 2014）の方法に準じて、臭化アリルを蛍光色素フルオレセインのカルボキシル基とアルカリ条件下で結合させ、蛍光性モノマーであるアリルフルオレセインを合成した。
【００３３】
実施例２：セロトニンのガラスビーズの固定
既報（Poma, A. et al, Solid-Phase Synthesis of Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles with a Reusable Template-“Plastic Antibodies”, Advanced Functional Materials, 23, 2821-2827, 2013）に方法に準じて、粒径５０μｍのガラスビーズを３Ｍの硝酸中で煮沸して洗浄して、純水で洗浄して乾燥した。その後１０％のアミノプロピルトリメトキシシラン水溶液に２０分間浸漬して撹拌し、表面をアミノ化した。メタノールで洗浄した後、真空乾燥した。これを１０％グルタルアルデヒド水溶液中にて撹拌し、表面にアルデヒド基を導入した。これをそしてガラスビーズを０．５ｍＭセロトニン水溶液中（ｐＨ７．４のリン酸緩衝塩を含む）に加えてガラスビーズに鋳型物質であるセロトニンを固定した。
【００３４】
実施例３：セロトニンを鋳型とした分子インプリント高分子ナノ粒子（ＭＩＰ  ＮＰ）の合成
メタクリル酸３６０μＬ、エチレングリコールジメタクリレート１２８６ｍｇ及びアリルフルオレセイン０．０１ｇをジエチルジオチルカルバメートベンジル（開始剤）０．１５ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド６ｍＬおよび蒸留水９００μＬの混合溶媒に溶かした重合溶液を調製した。上記の重合溶液に、セロトニンを固定したガラスビーズを浸した。次に重合溶液に窒素を流入し、ガラスビーズが流動した状態でキセノンランプを照射してＭＩＰ  ＮＰを合成した。そして処理したガラスビーズをジメチルホルムアミド、水で洗浄した後、６０℃の１Ｍ  ＮａＣｌ溶液でガラスビーズからＭＩＰを遊離させた。合成したＭＩＰ  ＮＰ分散溶液を、セルロースチューブ膜の中に封入して、リン酸緩衝液中で透析し、ＭＩＰ  ＮＰ以外の溶質を除去した。
【００３５】
実施例４：動的光散乱法を用いたＭＩＰ  ＮＰの粒径測定
ＭＩＰ  ＮＰ分散溶液にセロトニンまたはトリプトファンを０−１５μＭ添加し、ＭＩＰ  ＮＰの平均粒径を動的光散乱分光器（ＤｅｌｓａＭａｘ  Ｐｒｏ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。
【００３６】
ＭＩＰの平均粒径の測定結果を図１に示す。ＭＩＰの粒径はセロトニンの存在によって、粒径が２倍以上増大したのに対し、Ｌ−トリプトファンによる変化は２０％程度の増大のみであった。
【００３７】
実施例５：蛍光分光光度計を用いたＭＩＰ  ＮＰの蛍光評価
ｐＨ  ７．４リン酸緩衝溶液にＭＩＰ  ＮＰ分散を溶液の蛍光強度を蛍光分光器Ｆ７５０（日本分光）で測定した。またＭＩＰ  ＮＰ分散溶液にセロトニンおよびＬ−トリプトファンを５０μＭ添加した時の蛍光強度スペクトルを測定した。ＭＩＰ  ＮＰ分散溶液にセロトニンまたはトリプトファンを０−１５μＭ添加し、ピーク蛍光強度と濃度の関係を観察した。
【００３８】
ＭＩＰからの蛍光スペクトルのセロトニンおよび構造類似物Ｌ−トリプトファンの添加（５０μＭ）による変化を図２に示す。セロトニンの場合は約４０％の強度増加が認められたが、Ｌ−トリプトファンの場合は約１３％の増加であった。また、ＭＩＰからの蛍光スペクトルのセロトニンおよびＬ−トリプトファンの濃度依存性を図３に示す。
【００３９】
上記した結果から本発明のナノ粒子において推定される分子認識による蛍光強度増大のメカニズムを図４に示す。
本発明の分子インプリントナノ粒子にはフルオレセイン基等の蛍光性基が高密度に存在すると考えられる。そのため蛍光性基同士で消光し合う自己消光が起こっている可能性がある。ＭＩＰナノ粒子が鋳型との特異相互作用によって膨潤することにより、フルオレセイン基等の蛍光性基の密度が低下し、蛍光性基周囲の水による消光が減じられ、蛍光強度が増大したことが考えられる。
【００４０】
実施例６：分子インプリント高分子ナノ粒子（ＭＩＰ  ＮＰ）によるアメフラシ神経細胞の染色
（１）サンプルの作製
アメフラシから摘出した脳神経節を、シリコーン製のセルに固定ピンで固定した。脳神経節のニューロンを覆う神経上膜を微小ハサミで剥離し、ニューロンを露出させた。その後、ＭＩＰナノ粒子と人工海水（ＡＳＷ）を１：１で混合した溶液２．５ｍＬを、神経節固定チャンバー内に注ぎ、セル全体をアルミホイルで包んで遮光し、室温で６０分間静置した。
【００４１】
（２）脳神経節の観察
脳神経節固定チャンバー内の溶液を、パスツールピペットを用いてＡＳＷと入れ換えた。
以上より作製した測定サンプルを、セルごと蛍光顕微鏡下に設置し、蛍光顕微鏡により観察した。
また、解剖後、ＭＩＰナノ粒子による染色を行わなかった脳神経節をＢｒａｎｋとして、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４２】
（３）結果・考察
図５に、Ｂｒａｎｋとして染色をしていない脳神経節の蛍光強度変化チャートを示し、図６にはＭＩＰナノ粒子２４時間染色後の脳神経節の蛍光強度変化を示した。
蛍光強度変化は図５では、最大０．１％見られた。細胞のみでも蛍光していることより、自家蛍光であることが考えられるが、その上蛍光強度変化が生じていることから、細胞内の蛍光物質の蛍光強度変化が測定されてしまった可能性がある。しかし、ＭＩＰナノ粒子による蛍光強度変化は理論上０．３％程度であると推測されているため、自家蛍光による強度変化が０．１％程度であるならば、判別は可能である。
図６では蛍光強度変化と見られる変化はなかった。細胞のみで蛍光強度変化が見られ、ＭＩＰナノ粒子では蛍光強度変化が見られないことから、自家蛍光による強度変化と、ＭＩＰナノ粒子による強度変化が互いに打ち消し合っている可能性が考えられる。
【００４３】
染色がされているか、されていないかの指標として蛍光顕微鏡のＳａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｖｅｒａｇｅとＳａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍａｘ（飽和度）の値を記録し、表１に示した。この飽和度は青色レーザーの位置を調節している際に、最も値が大きくなり、安定したときの値を記録した。
【００４４】
【表１】
2018132527.tif 000002
【００４５】
染色なしの場合でも飽和度は７０％と高い値になっていたが、２４時間染色後には飽和度は１００％となり、平均値も５５％と明確な蛍光強度の変化が見られた。このことから、ＭＩＰナノ粒子による神経節の染色はなされている可能性が高いことが判明した。
【図１】
2018132527.tif 000003
【図２】
2018132527.tif 000004
【図３】
2018132527.tif 000005
【図４】
2018132527.tif 000006
【図５】
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【図６】
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