(57)【要約】      （修正有）【課題】生物発光を用いた生体分析のための、最大発光波長４００ｎｍ（ブルーシフト型レニラルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）発光系）及び５００ｎｍ（人工ルシフェラーゼ（ＡＬｕｃ）発光系）に最適な高輝度基質の提供。【解決手段】式［Ｉ］で表されるセレンテラジン誘導体。2018158896.tif 000044（Ｒ１はＨ又はＯＨ；Ｒ２は−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ３又は炭素数１〜２のアルキル基；ｎは２〜５の整数；Ｒ３はＯＨ、メトキシ基、メチル基又はアジド基）【選択図】図１
2018158896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式[II]
【化１】
2018158896.tif 000039
式中、
Ａは、
【化２】
2018158896.tif 000040
式中
R1は、水素、水酸基若しくはフッ素、
R4は、水素、メチル基若しくはメトキシ基
又は
Ａは
【化３】
2018158896.tif 000041
、
R2は、
(1)  -O-(CH2)n-R3  ここで、ｎは１〜５の整数、R3は、水酸基、メトキシ基、メチル基若しくはアジド基、又は
(2)  炭素数１若しくは２のアルキル基である化合物。
【請求項２】
一般式[I]
【化４】
2018158896.tif 000042
式中、
R1は、水素又は水酸基、
R2は、
(1)  -O-(CH2)n-R3  ここで、ｎは２〜５の整数、R3は、水酸基、メトキシ基、メチル基若しくはアジド基、又は
(2)  炭素数１若しくは２のアルキル基
である化合物。
【請求項３】
前記R1及びR2が、それぞれ下記表１に示される基又は原子である請求項２記載の化合物。
【表１】
2018158896.tif 000043
【請求項４】
R1が-OH、R2が-O-(CH2)3-OHである請求項３記載の化合物。
【請求項５】
R1が-OH、R2が-O-(CH2)2-N3である請求項３記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物から成るルシフェラーゼ系酵素の発光基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規セレンテラジン化合物及びそのルシフェラーゼ系酵素の発光基質としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物発光を用いた生体分析は高感度であることから、微量分析やバイオイメージングにおける遺伝子発現解析等ライフサイエンスにおいて非常に有用である。生物発光とは、発光基質と発光酵素による酵素反応により光を発するため、蛍光測定での励起光由来のバックグランドシグナル影響がなく、その生物発光量子収率は化学発光量子収率よりも高いとされている。生物発光による生体分析に最も応用されているのは、ホタル発光系である。しかしホタル発光系では、発光過程においてATPやMgイオンといった補因子を必要とするため複雑な実験操作が必要となる。特に細胞内におけるMgイオン濃度変動は未知数であり、ホタル発光系による生体分析では信頼性かつ再現性あるデータが得られるとは限らない。一方でセレンテラジン(CTZ)を発光基質に用いるレニラルシフェラーゼ(RLuc)発光系は酸素分子以外の補因子を一切必要としないシンプルな発光システムであり、細胞内だけでなくATPの存在しない細胞外での再現性の高い分析を可能にする。RLuc発光系はホタル発光系と併用するデュアルルシフェラーゼアッセイやタンパク質間相互作用解析等に応用されているが、生物発光量子収率が0.05とホタル発光系と比較すると非常に低い値を示す。従ってCTZを発光基質に持つより高輝度な生物発光システムを構築すれば、より高感度な生体分析ツールとして今後ますます利用される。
【０００３】
高輝度生物発光系の構築には、酵素(ルシフェラーゼ)または基質(ルシフェリン)改変による手段が取られている。酵素改変による生物発光輝度向上に関する報告は報告されており、例えばRLucのアミノ酸残基を8つ改変したRLuc8はマウス血清中における安定性の向上のみでなく、基質セレンテラジン及びその誘導体に対しても酵素活性が大きく向上した高輝度発光酵素として2006年にLoeningらによって報告されている。近年開発された人工生物発光酵素ALuc(人工ルシフェラーゼ、Artificial Luciferase)は、RLuc発光系と同様CTZを発光基質とする発光系であり、その輝度はRLuc発光系の約50倍と非常に高輝度であり、優れた発光持続性(半減期20分)を持つ。しかし基質改変による発光輝度の向上は例が少なく、知見が浅い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hart C. R. et al. Biochem.,1979,18,2204-2210.
【非特許文献２】Levi J. et al. J.Am.Chem.Soc.,2007, 129,11900-11901.
【非特許文献３】Pfleger K.D.G. et al.,Nat.Protocols,2006,1,337-345.Gal es. et al.,Nat.Methods,2005,2,177-184.
【非特許文献４】Huang Q. et al. J.Biomed.Opt.,2007,12,1-10.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでにセレンテラジンの発光基質として作用する骨格を維持しながら、化学修飾によりその発光波長や輝度を変化させるセレンテラジン誘導体開発研究が盛んに行われて来た。このうちブルーシフト型誘導体DeepBlueC（商品名）（非特許文献１）の発光波長は天然のセレンテラジンより約80 nm短波長シフトした400 nm付近において発光を示し、緑色蛍光たんぱく質GFPの励起スペクトルと重なるかつGFPの発光を阻害しない事から、GFPと組み合わることによってタンパク質間相互作用解析等に応用されている。このようにセレンテラジン誘導体特有の光学特性は、セレンテラジンの生体分析ツールの利用幅を拡げる重要な役割を担っている。しかしDeepBlueC（商品名）はその構造改変による著しい発光輝度の低下が見られ、天然のRLuc発光系の約4%程度の輝度になる。従って、より高感度な生体分析をセレンテラジン発光系から可能にするためには新規セレンテラジン誘導体の開発が求められる。しかしRLuc並びにRLuc誘導体とセレンテラジンの詳細な酵素認識メカニズムは未解明であるために、有意な生物発光を示す誘導体の設計は困難である。またALucの開発により、500 nm付近で高輝度発光を示す生物発光系の開発は既に行われているものの、天然のセレンテラジンがALucに最適な基質であるとは限らない。
【０００６】
本発明の目的は、より高感度な生体分析のための最大発光波長400 nm(ブルーシフト型RLuc発光系)並びに500 nm(ALuc発光系)に最適な高輝度基質セレンテラジン誘導体を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、セレンテラジンの特定の部位を特定の置換基で置換することにより、ブルーシフト型RLuc発光系又はALuc発光系において、公知のセレンテラジン誘導体よりも発光輝度が高い新規なセレンテラジン誘導体を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、一般式[II]
【０００９】
【化１】
2018158896.tif 000003
式中、
Ａは、
【００１０】
【化２】
2018158896.tif 000004
式中
R1は、水素、水酸基若しくはフッ素、
R4は、水素、メチル基若しくはメトキシ基
又は
Ａは
【００１１】
【化３】
2018158896.tif 000005
R2は、
(1)  -O-(CH2)n-R3  ここで、ｎは１〜５の整数、R3は、水酸基、メトキシ基、メチル基若しくはアジド基、又は
(2)  炭素数１若しくは２のアルキル基である化合物
を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記本発明の化合物から成るルシフェラーゼ系酵素の発光基質を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の化合物は、ブルーシフト型RLuc発光系又はALuc発光系において、公知のセレンテラジン誘導体よりも発光輝度が高い。したがって、本発明の化合物をルシフェラーゼ系酵素の発光基質として用いることにより、従来よりも高感度、高精度の分析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例及び比較例の各化合物の、ルシフェラーゼ発光系における発光輝度を示す図である。
【図２】本発明の実施例及び比較例の各化合物の、RLuc8（左図）又はRLuc8.6（右図）における発光波長を示す図である。
【図３】本発明の実施例の化合物である6-Al2N3-CTZと公知のセレンテラミン誘導体であるNative CTZの各種ルシフェラーゼ発光系における発光輝度を示す図である。
【図４】本発明の実施例の化合物である6-Al2N3-CTZと公知のセレンテラミン誘導体であるNative CTZのALuc34における発光波長を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記のとおり、本発明の化合物は、前記一般式[II]で表されるものである。前記一般式[II]で表される化合物のうち、下記一般式[I]で表されるものが好ましい。
一般式[I]
【００１６】
【化４】
2018158896.tif 000006
式中、
R1は、水素又は水酸基、
R2は、
(1)  -O-(CH2)n-R3  ここで、ｎは２〜５の整数、R3は、水酸基、メトキシ基、メチル基又はアジド基、又は
(2)  炭素数１若しくは２のアルキル基
である化合物。
【００１７】
一般式[I]中、好ましいR1及びR2の組合せとして下記表１に記載のものを挙げることができる。
【００１８】
【表１】
2018158896.tif 000007
【００１９】
ちなみに、公知のCTZ(Native CTZ (「N-CTZ」と言うことがある))は、R1及びR2が共に-OHであり、公知のDeepBlueC（商品名）では、R1及びR2が共に-Hである。
【００２０】
本発明の化合物は、例えば下記の反応スキームに示すとおり、ケトアセタール化合物(式中、R1aはTBS(t-ブチルジメチルシリル）保護された水酸基または水素)とセレンテラミン誘導体（R2は上記と同義、以下同じ）を縮合することにより、製造することができる。
【００２１】
【化５】
2018158896.tif 000008
【００２２】
上記反応スキームにおいて、出発物質として用いられるセレンテラミン誘導体であって、一般式[I]中のR2が-O-(CH2)n-R3である化合物の製造に用いるものは、例えば下記の反応スキームにより製造することができる。なお、以下の全ての反応スキームにおいて、「Boronic acid」は、それぞれの反応スキーム中に示されるボロン酸誘導体を意味する。
【００２３】
【化６】
2018158896.tif 000009
【００２４】
また、上記反応スキームにおいて、出発物質として用いられるセレンテラミン誘導体であって、一般式[I]中のR2が炭素数１又は２のアルキル基である化合物の製造に用いるものは、例えば下記の反応スキームにより製造することができる。
【００２５】
【化７】
2018158896.tif 000010
【００２６】
なお、上記各スキームにおける各工程の具体的な条件は、当業者が適宜設定することができ、下記合成例にも具体的に記載されている。
【００２７】
本発明の化合物は、下記実施例に具体的に記載するように、ルシフェラーゼ系酵素の発光基質として用いることができる。ここで、ルシフェラーゼ系酵素としては、レニラルシフェラーゼ(RLuc)発光系のRLuc8（文献 Loening,A.M.et al.Protein Eng.Des.Sel.2006,19,391-400.,Loening,A.M.et al.J.Mol.Biol.2007,374,1017-1028., Loening,A.M.et al.Protein Eng.Des.Sel.2006,19,391-400.）及びRLuc8.6（文献Loening,A.M.et al.,Nat.Methods,2007,4,641-643.）、並びにALuc発光系（ALuc16, ALuc22, ALuc23, ALuc24、ALuc30、ALuc34等のALuc群（文献Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,2013,24,2067-2075.,Kim S.B. et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2014,448,418-423., Kim S.B. et al.,Anal.Sci.,2015,31,1-6., Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,27,354-362.）を挙げることができる。
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
合成方法
試薬は和光純薬、関東化学、東京化学、またはシグマアルドリッチから購入し精製せずそのまま用いた。セレンテラジン誘導体合成の際、シリカカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル (Merck社製1.07734.9025, silica gel 60 (0.063-0.200 mm), カラムクロマトグラフィー用 (70-230 mesh ASTM))を用いた。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、YAMAZEN社のYFLC-Al-560 クロマトグラフィーを用いた。また高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、日本分析工業株式会社のLC-918 リサイクル分注HPLC、ジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3分析カラム(C18, 5 μm, 20×250 mm)を用いて行った。1H-NMRまた13C-NMRはJEOL社のECA500を用いて内部標準としてテトラメチルシラン (TMS, 0 ppm)を用いた。また結合定数(J)はHzで示した。略号s, d, t, q, m, 及びbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、及び幅広線を示す。
【００３０】
[合成例1]    6-Al2OH-CTZの合成
【００３１】
【化８】
2018158896.tif 000011
【００３２】
[合成例1-1]
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(2-ブロモエトキシ(tert-ブチル)ジメチルシラン (812.0 mg, 3.4 mmol, 1.5 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で24時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、Tert-ブチルジメチル(2-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)エトキシ)シランを白色固体としてえた (307.0 mg, 36%)。
【００３３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD):δ (ppm) = 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.97 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 1.33(m, 12H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -5.05, 18.54, 24.99, 26.05, 62.07, 69.18, 83.66, 114.02, 136.61, 161.64. HR-MS: m/z calcd for C20H35BO4Si: 379.2476, found: 379.2477 [M+H]+.
【００３４】
[合成例1-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (150.0 mg, 0.56 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(2-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)エトキシ)シラン (307.0 mg, 0.8 mmol, 1.4 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (225.0 mg, 92%)。
【００３５】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.33 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.33-7.24 (m, 5H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.33 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.09 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 4.00 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 0.92 (s, 12H), 0.11 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = -5.02, 18.56, 26.07, 41.40, 62.13, 69.52, 115.00, 127.11, 127.15, 128.70, 129.10, 130.14, 136.99, 140.58, 142.77, 151.38, 159.26. HR-MS: m/z calcd for C25H33N3O2Si: 436.2420, found: 436.2426 [M+H]+.
【００３６】
[合成例1-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (47.9 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=6/4 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al2OH-CTZを黄色個体として得た (12.8 mg, 45%)。
【００３７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.63 (s, 1H), 7.56 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.39-7.21 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.08-4.06 (m, 4H), 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 33.20, 61.60, 70.74, 108.17, 116.07, 116.19, 128.13, 129.30, 129.74, 129.78, 130.78, 138.16, 156.97, 161.57. HR-MS: m/z calcd for C28H25N3O4: 468.1923, found: 468.1923 [M+H]+.
【００３８】
[合成例2] 6-Al3OH-CTZの合成
【００３９】
【化９】
2018158896.tif 000012
【００４０】
[合成例2-1]
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(3-ブロモプロポキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (690.0 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で13時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル(3-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)プロポキシ)シランを白色固体として得た (489.3 mg, 63%)。
【００４１】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) = 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.79 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.32 (s, 12H), 0.88 (s, 9H), 0.03 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -5.24, 18.45, 25.00, 26.05, 32.45, 59.57, 64.33, 83.67, 113.97, 136.60, 161.79. HR-MS: m/z calcd for C21H37BO4Si: 393.2632, found: 393.2609 [M+H]+.
【００４２】
[合成例2-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (308.0 mg, 1.16 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(3-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)プロポキシ)シラン (702.29 mg, 1.85 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(18時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (478.9 mg, 91%)。
【００４３】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.33 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.33-7.25 (m, 5H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.11 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.82 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.00 (quin, J = 6.0 Hz, 2H), 0.89 (s, 12H), 0.05 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = -5.21, 18.47, 26.07, 32.50, 41.42, 59.60, 64.67, 114.93, 127.11, 127.15, 128.71, 129.10, 129.93, 137.00, 140.58, 142.86, 151.34, 159.40. HR-MS: m/z calcd for C26H35N3O2Si: 450.2577, found: 450.2557 [M+H]+.
【００４４】
[合成例2-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (48.2 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5.5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=6/4 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al3OH-CTZを黄色個体として得た (6.55 mg, 20%)。
【００４５】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.61 (s, 1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38-7.20 (m, 5H), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.10 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.06 (s, 2H), 3.73 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.98 (q, J = 6.3 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 33.27, 59.44, 65.90, 108.10, 115.99, 116.20, 128.15, 129.27, 129.75, 130.67, 130.79, 138.13, 156.99, 161.65. HR-MS: m/z calcd for C29H27N3O4: 482.2080, found: 482.2051 [M+H]+.
【００４６】
[合成例3] 6-Al4OH-CTZの合成
【００４７】
【化１０】
2018158896.tif 000013
【００４８】
[合成例3-1]
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた(4-ブロモブトキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (721.6 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で13時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル(4-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ブトキシ)シランを白色固体として得た (881 mg, 95%)。
【００４９】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.73 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 4.00 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.68-3.63 (m, 2H), 1.86-1.81 (m, 2H), 1.70-1.65 (m, 2H), 1.32 (s, 12H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -5.16, 18.46, 24.98, 25.97, 26.09, 29.44, 62.91, 67.70, 83.63, 113.95, 136.60, 161.81. HR-MS: m/z calcd for C22H39BO4Si: 407.2789, found: 407.2779 [M+H]+.
【００５０】
[合成例3-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (180.0 mg, 0.68 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル(4-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ブトキシ)シラン (443.0 mg, 1.09 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (10 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(15時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ブトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (303.5 mg, 96%)。
【００５１】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.32 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.30-7.25 (m, 5H), 6.97 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.03 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.89-1.84 (m, 2H), 1.73-1.69 (m, 2H), 0.90 (s, 12H), 0.06 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -5.13, 18.49, 26.02, 26.11, 29.48, 41.42, 62.95, 68.04, 114.94, 127.12, 127.16, 128.71, 129.11, 129.94, 136.99, 140.58, 142.87, 151.34, 159.42. HR-MS: m/z calcd for C27H37N3O2Si: 467.2733, found: 464.2724 [M+H]+.
【００５２】
[合成例3-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ブトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.06 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (48.5 mg, 0.13 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で7時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:アセトニトリル/水=1/1 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al4OH-CTZを黄色個体として得た (6.96 mg, 20%)。
【００５３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.61 (s, 1H), 7.54 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.38-7.21 (m, 5H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.06 (s, 2H), 4.02 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.86-1.82 (m, 2H), 1.73-1.69 (m, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 26.86, 30.17, 33.24, 35.21, 62.61, 69.00, 108.10, 115.97, 116.19, 128.13, 129.25, 129.74, 129.77, 130.71, 130.78, 138.16, 156.97, 161.65. HR-MS: m/z calcd for C30H29N3O4: 496.2236, found: 496.2214 [M+H]+.
【００５４】
[合成例4]     6-Al5OH-CTZの合成
【００５５】
【化１１】
2018158896.tif 000014
【００５６】
[合成例4-1]
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた((5-ブロモペンチル)オキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン (759.5 mg, 2.7 mmol, 1.2 eq.)、ヨウ化カリウム (20 mg, 0.1 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で7時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=9/1→8/2)にて精製し、tert-ブチルジメチル((5-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ペンチル)オキシ)シランを白色固体として得た (916 mg, 96%)。
【００５７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.98 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.64-3.60 (m, 2H), 1.81-1.78 (m, 2H), 1.59-1.48 (m,4H), 1.33 (s, 12H), 0.89 (s, 9H), 0.04 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -5.13, 18.50, 22.47, 24.99, 26.11, 29.13, 32.66, 63.15, 67.79, 83.64, 113.97, 136.61, 161.84. HR-MS: m/z calcd for C23H41BO4Si: 421.2945, found: 421.2927 [M+H]+.
【００５８】
[合成例4-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (180.0 mg, 0.68 mmol, 1 eq.)、 tert-ブチルジメチル((5-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ)ペンチル)オキシ)シラン (458.0 mg, 1.09 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (10 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=8/2→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-((5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンチル)オキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (253.0 mg, 52%)。
【００５９】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.32 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.30-7.25 (m, 5H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.01 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.64 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.84-1.81 (m, 2H), 1.61-1.57 (m, 2H), 1.54-1.51 (m, 2H), 0.90 (s, 12H), 0.06 (s, 6H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = -5.11, 18.51, 22.51, 26.13, 29.20, 32.70, 41.42, 63.17, 68.13, 114.95, 127.12, 128.61, 128.71, 129.10, 129.93, 136.98, 140.58, 142.87, 151.34, 159.45. (the signal for one carbon could not be assigned due to broading) HR-MS: m/z calcd for C28H39N3O2Si: 478.2890, found: 478.2876 [M+H]+.
【００６０】
[合成例4-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-((5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンチル)オキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (34.5 mg, 0.07 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (55.8 mg, 0.15 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣を逆相HPLCカラムクロマトグラフィー(溶離液:メタノール/水=1/1 + 0.1%ギ酸)にて精製し、6-Al5OH-CTZを黄色個体として得た (8.77 mg, 21%)。
【００６１】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.61 (s, 1H), 7.53 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.38-7.14 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.06 (s, 2H), 4.00 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.61-1.52 (m, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 23.52, 30.14, 33.21, 33.36, 62.82, 69.09, 108.14, 115.95, 116.18, 128.09, 129.23, 129.39, 129.71, 129.78, 130.78, 138.24, 156.95, 161.65. HR-MS: m/z calcd for C31H31N3O4: 510.2393, found: 510.2376 [M+H]+.
【００６２】
[合成例5] 6-Al3OMe-CTZの合成
【００６３】
【化１２】
2018158896.tif 000015
【００６４】
[合成例5-1] (公知化合物)
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (300.0 mg, 1.3 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (246 mg, 1.7 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1-ブロモ-3-メトキシプロパン (416.2 mg, 2.7 mmol, 2 eq.), ヨウ化カリウム (12 mg, 0.06 mmol, 0.05 eq.)を加え、70℃で一晩(19時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=9/1)にて精製し、2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (287.3 mg, 73%)。
【００６５】
[合成例5-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (176.9 mg, 0.6 mmol, 2 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (1.6 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=7/3→1/1)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (127.3 mg, 96%)。
【００６６】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 8.32 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.33-7.26 (m, 5H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.17 (s, 2H) 4.11 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.33(m, 12H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 6H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 29.75, 41.38, 58.87, 65.06, 69.36, 114.95, 127.11, 128.58, 128.70, 129.08, 130.04, 132.26, 136.97, 140.57, 142.77, 151.36, 139.31.
【００６７】
[合成例5-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (35.0 mg, 0.1 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (70.5 mg, 0.2 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で6時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al3OMe-CTZを黄色個体として得た (18.2 mg, 52%)。
【００６８】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.61 (s, 1H), 7.47 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.27-7.12 (m, 5H), 6.92 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 4.36 (s, 2H), 4.03 (s, 4H), 3.53 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.02-1.97 (m, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ (ppm) = 30.50, 33.19, 35.16, 58.91, 66.04, 70.29, 108.15, 115.66, 115.91, 116.21, 127.84, 128.14, 129.20, 129.55, 129.74, 12977, 130.63, 130.79, 138.08, 156.99, 161.53. 
【００６９】
[合成例6]   6-Al2N3-CTZの合成
【００７０】
【化１３】
2018158896.tif 000016
【００７１】
[合成例6-1] (公知化合物)
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (1.0 g, 4.5 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (0.82 g, 5.9 mmol, 1.3 eq. )をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1,2-ジブロモエタン (4.1 g, 22.7 mmol, 22.7 eq.)、ヨウ化カリウム (0.02 g, 0.1 mmol, 0.02 eq.)を加え、70℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を塩化メチレンで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム→クロロホルム/メタノール=49/1)にて精製し、2-(4-(2-ブロモエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (359.0 mg, 24%)。
【００７２】
[合成例6-2] (公知化合物)
窒素雰囲気下、2-(4-(2-ブロモエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (350 mg, 1.0 mmol, 1.0 eq.)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 ml)に溶解させ、これにアジ化ナトリウム (83 mg, 1.2 mmol, 1.2 eq.)を加え、100℃で1時間撹拌した。反応終了後、トルエンで抽出、蒸留水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。2-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色個体として得た (299.0 mg, 97%)。
【００７３】
[合成例6-3]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (250.0 mg, 0.9 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (358.0 mg, 1.2 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (2.0 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(17時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/酢酸エチル=19/1→9/1)にて精製し、5-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-3-ベンジルピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (122.0 mg, 50%)。
【００７４】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.33 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.34-7.26 (m, 5H), 7.01 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.21 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.63 (t, J = 4.8 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 41.37, 50.29, 67.14, 115.02, 127.16, 127.21, 128.69, 129.10, 130.82, 136.91, 137.04, 140.61, 142.48, 151.49, 158.47. 
【００７５】
[合成例6-4]
アルゴン雰囲気下、5-(4-(2-アジドエトキシ)フェニル)-3-ベンジルピラジン-2-アミン (121.0 mg, 0.3 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (197.0 mg, 0.5 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (10 ml)、milliQ (1.0 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.5 ml)を加え、80℃で一晩(15時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al2N3-CTZを黄色個体として得た (29.0 mg, 17%)。
【００７６】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 8.09 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.39-7.22 (m, 5H), 7.12 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.08 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.47 (s, 2H), 4.22 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 4.13 (s, 2H), 3.62 (t, J = 4.5 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 33.14, 35.08, 51.05, 68.24, 108.14, 115.90, 116.05, 127.97, 129.13, 129.55, 129.62, 130.47, 130.62, 137.75, 156.56, 160.59. 
【００７７】
[合成例7] 6-Alkyl3CTZの合成
【００７８】
【化１４】
2018158896.tif 000017
【００７９】
[合成例7-1] (公知化合物)
窒素雰囲気下、4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノール (500.0 mg, 2.2 mmol, 1 eq.)、炭酸カリウム (410 mg, 2.9 mmol, 1.3 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させ、室温で撹拌した。これにアセトン(20 ml)に溶解させた1-ブロモブタン (622.6 mg, 4.5 mmol, 2 eq.)、ヨウ化カリウム (0.02 g, 0.1 mmol, 0.02 eq.)を加え、70℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、再び減圧濃縮した。2-(4-ブトキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを白色固体状の粗生成物として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
【００８０】
[合成例7-2]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、2-(4-ブトキシフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (167.0 mg, 0.4 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (2.0 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(13時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=4/1→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-ブトキシフェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (121.6 mg, 96%)。
【００８１】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.33 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.33-7.23 (m, 5H), 6.98 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.34 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.01 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.52 (m, 2H), 0.99 (t, J = 7.4 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) =14.02, 19.39, 31.45, 41.42, 67.92, 114.95, 127.12, 127.15, 128.71, 129.10, 129.89, 136.99, 140.58, 142.87, 151.34, 159.48. 
【００８２】
[合成例7-3]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-ブトキシフェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (63.4 mg, 0.17 mmol, 2.0 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で6時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Alkyl3-CTZを黄色個体として得た (12.8 mg, 30%)。
【００８３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 7.57 (s, 1H), 7.51 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.31-7.18 (m, 5H), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.72 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 4.02 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.81-1.75 (m, 2H), 1.54-1.49 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 14.09, 19.87, 31.95, 68.55, 107.73, 115.64, 115.90, 127.83, 128.78, 129.39, 129.43, 130.39, 137.39, 156.22, 161.15. 
【００８４】
[合成例8]     6-Al2OH-2H-CTZの合成
【００８５】
【化１５】
2018158896.tif 000018
【００８６】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(2-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)エトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (71.3 mg, 0.16 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(72.7 mg, 0.32 mmol, 2 eq.)をエタノール (4 ml)、milliQ (0.4 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.2 ml)を加え、80℃で14時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al2OH-2H-CTZを黄色個体として得た (17.9 mg, 24%)。
【００８７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.69 (s, 1H), 7.51 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.29-7.11 (m, 8H), 6.97 (d, J = 8.5 Hz, 2H) 4.38 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.04 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 5.1 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 33.78, 33.36, 35.39, 61.56, 70.72, 108.51, 116.02, 126.15, 127.44, 127.85, 128.21, 129.27, 129.48, 129.76, 129.81, 132.36, 137.87, 139.71, 161.61. HR-MS: m/z calcd for C28H25N3O3: 452.1974, found: 452.1968 [M+H]+.
【００８８】
[合成例9] 6-Al3OH-2H-CTZの合成
【００８９】
【化１６】
2018158896.tif 000019
【００９０】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)プロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (20.0 mg, 0.04 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(19.7 mg, 0.08 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で14時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1→10/1)にて精製し、6-Al3OH-2H-CTZを黄色個体として得た (9.38 mg, 45%)。
【００９１】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.60 (s, 1H), 7.52 (s, 2H), 7.38-7.14 (m, 10H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 4.09 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.98 (q, J = 6.0 Hz, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 18.36, 33.27, 116.00, 128.19, 129.30, 129.48, 129.77, 129.82, 138.04, 139.91, 161.71. HR-MS: m/z calcd for C29H27N3O3: 466.2131, found: 466.2112 [M+H]+.
【００９２】
[合成例10] 6-Al4OH-2H-CTZの合成
【００９３】
【化１７】
2018158896.tif 000020
【００９４】
3-ベンジル-5-(4-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ブトキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (35.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(35.7 mg, 0.16 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で13.5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al4OH-2H-CTZを黄色個体として得た (7.73 mg, 20%)。
【００９５】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.61 (s, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.38-7.14 (m, 10H), 6.97 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.15 (s, 2H), 4.02 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.87-182 (m, 2H), 1.72-1.67 (m, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 26.86, 30.17, 62.60, 69.01, 108.20, 115.98, 127.39, 128.19, 129.29, 129.48, 129.77, 129.82, 138.03, 139.91, 161.71. HR-MS: m/z calcd for C30H29N3O3: 480.2287, found: 480.2265 [M+H]+.
【００９６】
[合成例11]     6-Al5OH-2H-CTZの合成
【００９７】
【化１８】
2018158896.tif 000021
【００９８】
3-ベンジル-5-(4-((5-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)ペンチル)オキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン (35.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン(35.7 mg, 0.16 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で13.5時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=10/1)にて精製し、6-Al5OH-2H-CTZを黄色個体として得た (5.81 mg, 14%)。
【００９９】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.62 (s, 1H), 7.54 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.39-7.15 (m, 10H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 4.01 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.83-1.79 (m, 2H), 1.62-1.52 (m, 4H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 23.53, 30.14, 33.36, 62.82, 69.12, 108.19, 116.00, 127.39, 128.19, 129.31, 129.48, 129.56, 129.77, 129.83, 131.37, 138.05, 139.93, 161.78. HR-MS: m/z calcd for C31H31N3O3: 494.2444, found: 494.2415 [M+H]+.
【０１００】
[合成例12] 6-Al3OMe-2H-CTZの合成
【０１０１】
【化１９】
2018158896.tif 000022
【０１０２】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(3-メトキシプロポキシ)フェニル)ピラジン-2-アミン(30.0 mg, 0.08 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (38.0 mg, 0.17 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(16時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Al3OMe-2H-CTZを黄色個体として得た (22.6 mg, 55%)。
【０１０３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 7.54 (s, 1H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.27-7.12 (m, 6H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.36 (s, 2H), 4.15 (s, 2H), 4.03 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.03-1.98 (m, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 30.36, 34.06, 34.96, 58.91, 65.90, 70.06, 108.09, 115.83, 125.75, 127.24, 127.72, 128.06, 129.32, 129.61, 129.66, 129.69, 137.76, 139.65, 152.49, 161.35.
【０１０４】
[合成例13]     6-Alkyl3-2H-CTZの合成
【０１０５】
【化２０】
2018158896.tif 000023
【０１０６】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-ブトキシフェニル)ピラジン-2-アミン (32.7 mg, 0.09 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (43.7 mg, 0.19 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(21時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Alkyl3-2H-CTZを黄色個体として得た (27.4 mg, 60%)。
【０１０７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 7.45 (s, 1H), 7.48 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.28-7.13 (m, 6H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 3.96 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.78-1.72 (m, 2H), 1.52-1.47 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 14.15, 20.08, 32.18, 34.08, 34.84, 68.71, 107.99, 115.79, 127.19, 128.03, 129.01, 129.27, 129.58, 129.61, 129.65, 137.69, 139.55, 161.46. 
【０１０８】
[合成例14]     6-Ethyl-CTZの合成
【０１０９】
【化２１】
2018158896.tif 000024
【０１１０】
[合成例14-1]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (100.0 mg, 0.3 mmol, 1 eq.)、 2-(4-エチルフェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (140.4 mg, 0.6 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (1 ml)、トルエン (6 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (1.6 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(12時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-エチルフェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (100.4 mg, 0.3 mmol, 91%)。
【０１１１】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.37 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.33-7.25 (m, 7H), 4.37 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 2.70 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.28-1.25 (m, 3H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 15.78, 28.79, 41.42, 76.90, 77.16, 77.41, 125.91, 127.16, 128.48, 128.71, 129.11, 134.87, 136.95, 137.44, 140.67, 142.96, 144.47, 151.66. 
【０１１２】
[合成例14-2]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-エチルフェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.1 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (72.6 mg, 0.20 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で一晩(21時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ethyl-CTZを黄色個体として得た (9.6 mg, 21%)。
【０１１３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.65 (s, 1H), 7.53 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.30-7.20 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.06 (2H), 2.68 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.22 (q, J = 7.4 Hz, 3H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ (ppm) = 15.98, 29.58, 33.27, 108.54, 116.21, 127.87, 128.18, 129.58, 129.76, 130.59, 130.80, 138.06, 147.38, 157.01.  
【０１１４】
[合成例15] 6-Ethyl-2H-CTZの合成
【０１１５】
【化２２】
2018158896.tif 000025
【０１１６】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-エチルフェニル)ピラジン-2-アミン(35.7 mg, 0.12 mmol, 1 eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (54.9 mg, 0.24 mmol, 2 eq.)をエタノール (3 ml)、milliQ (0.3 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.15 ml)を加え、80℃で一晩(14時間)撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ethyl-2H-CTZを黄色個体として得た (48.85 mg, 94%)。
【０１１７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 7.48 (s, 1H), 7.41 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.30-7.15 (m, 10H), 4.39 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 2.65 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.23 (q, J = 7.7 Hz, 3H). 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 15.68, 29.07, 34.00, 34.48, 108.07, 124.81, 126.74 126.85, 127.14, 127.25, 127.72, 128.20, 128.42, 128.70, 128.93, 129.05, 129.24, 129.27, 129.30, 136.42, 137.00, 138.94, 146.65.  
【０１１８】
[合成例16] 6-Ether-CTZ（比較化合物）の合成
【０１１９】
【化２３】
2018158896.tif 000026
【０１２０】
[合成例16-1]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (166.0 mg, 0.6 mmol, 1 eq.)、 2-(4-(メトキシメチル)フェニル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン (249.5 mg, 1.0 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(13時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=1/2→1/1)にて精製し、3-ベンジル-5-(4-(メトキシメチル)フェニル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (169.5 mg, 0.5 mmol, 88%)。
【０１２１】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.39 (s, 1H), 7.93 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.43-7.25 (m, 5H), 4.51 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.4 (s, 2H). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 41.42, 58.18, 74.53, 76.90, 77.16, 77.41, 125.91, 127.21, 128.33, 128.71, 129.13, 136.85, 137.65, 138.17, 140.74, 142.51, 151.88. 
【０１２２】
[合成例16-2]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(メトキシメチル)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.0 mg, 0.09 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (69.2 mg, 0.19 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で4時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ether-CTZを黄色個体として得た (13.8 mg, 31%)。
【０１２３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.70 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.39-7.18 (m, 7H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.44 (s, 2H), 4.38 (s, 2H), 4.05 (s, 2H), 3.31-3.30 (m, 3H). 3C-NMR (150 MHz, CD3OD): δ (ppm) = 33.22, 35.34, 58.47, 74.94, 108.97, 116.22, 127.80, 128.16, 129.15, 129.27, 129.75, 129.79, 129.89, 130.57, 130.78, 138.05, 141.20, 157.02.
【０１２４】
[合成例17]     6-Ether-2H-CTZ（比較化合物）の合成
【０１２５】
【化２４】
2018158896.tif 000027
【０１２６】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(4-(メトキシメチル)フェニル)ピラジン-2-アミン (30.4 mg, 0.09 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (44.2 mg, 0.19 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で4時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1)にて精製し、6-Ether-2H-CTZを黄色個体として得た(29.35 mg, 68%)。
【０１２７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 8.32 (s, 1H), 7.83 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.45-7.23 (m, 11H), 4.52 (s, 2H), 4.49 (s, 2H), 4.27 (s, 2H), 3.40 (m, 3H). 3C-NMR (150 MHz, CD3OD, CDCl3): δ (ppm) = 31.67, 37.69, 58.55, 74.86, 110.68, 127.81, 127.84, 128.22, 129.19, 129.41, 129.62, 129.66, 130.01, 133.74, 136.89, 138.30, 141.41, 146.26.
【０１２８】
[合成例18]     6-Metyl-CTZの合成
【０１２９】
【化２５】
2018158896.tif 000028
【０１３０】
[合成例18-1]
窒素雰囲気下、3-ベンジル-5-ブロモピラジン-2-アミン (123.91 mg, 0.4 mmol, 1 eq.)、 p-トリルボロン酸 (102.02 mg, 0.7 mmol, 1.6 eq.)をエタノール (2 ml)、トルエン (12 ml)に溶かし、これに1M炭酸ナトリウム水溶液 (3 ml)を加え室温で撹拌した。反応溶液を真空脱気し、触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(ミクロスパチュラ1杯程度)を加え、再び真空脱気し、100℃で一晩(19時間)撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過によりパラジウム触媒を除去した。得られた残渣を酢酸エチルで抽出、蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/酢酸エチル=4/1→7/3)にて精製し、3-ベンジル-5-(p-トリル)ピラジン-2-アミンを黄色個体として得た (123.97 mg, 96%)。
【０１３１】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 8.38 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.32-7.23 (m, 7H), 4.53 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 2.39 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ(ppm) = 21.36, 41.34, 125.76, 127.16, 128.68, 129.09, 129.63, 134.50, 136.83, 138.07, 140.92, 142.98, 151.48.
【０１３２】
[合成例18-2]
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(p-トリル)ピラジン-2-アミン (32.6 mg, 0.11 mmol, 1eq.)、3-(4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)フェニル)-1,1-ジエトキシプロパン-2-ワン (83.68 mg, 0.23 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で21時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=20/1→10/1)にて精製し、6-Methyl-CTZを黄色個体として得た (23.12 mg, 50%)。
【０１３３】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 7.57 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.27-7.13 (m, 7H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.36 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 2.28 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 21.24, 33.28, 35.13, 108.51, 116.22, 127.62, 127.80, 128.16, 129.74, 129.77, 130.56, 130.62, 130.80, 138.01, 140.89, 157.00. 
【０１３４】
[合成例19]
【０１３５】
【化２６】
2018158896.tif 000029
【０１３６】
アルゴン雰囲気下、3-ベンジル-5-(p-トリル)ピラジン-2-アミン (32.0 mg, 0.11 mmol, 1eq.)、1,1-ジエトキシ-3-フェニルプロパン-2-ワン (51.66 mg, 0.23 mmol, 2 eq.)をエタノール (2 ml)、milliQ (0.2 ml)に溶解させ、0℃に冷却した。反応溶液を真空脱気し、濃塩酸 (0.1 ml)を加え、80℃で4時間撹拌した。室温まで放冷後、減圧濃縮し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール40/1→20/1)にて精製し、6-Methyl-2H-CTZを黄色個体として得た (24.08 mg, 54%)。
【０１３７】
1H-NMR (500 MHz, CD3OD, CDCl3): δ(ppm) = 7.45 (s, 1H), 7.41 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31-7.17 (m, 10H), 4.39 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 2.37 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ(ppm) = 21.35, 34.03, 34.35, 108.11, 126.94, 127.16, 127.81, 129.02, 129.34, 129.35, 129.58, 130.30, 137.15, 139.08, 140.43. 
【０１３８】
(44) 生物発光輝度測定方法 (レニラルシフェラーゼ発光系)
天然のレニラルシフェラーゼ(RLuc)の配列(商品名pGL4.75、Promega社より販売)を含むベクター(pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販)またはその誘導体であるRLuc8並びにRLuc8.6-535の配列(文献Loening,A.M.et al.,Nat.Methids,2007,4,641-643.)を含むベクター（商品名pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販）を用いてCOS7細胞中に酵素を発現させた。PromegaのRenilla Luciferase Buffer (E291A)を用いて細胞を溶解し、その溶出液を酵素溶液としてそのまま用いた。発光基質は、天然のセレンテラジン (Nanolight technology社製)、6-Al2OH-CTZ、6-Al2OH2H-CTZ、6-Al3OH-CTZ、6-Al3OH2H-CTZ、6-Al4OH-CTZ、6-Al4OH2H-CTZ、6-Al5OH-CTZ、6-Al5OH2H-CTZ、6-Al3OMe-CTZ、6-Al3OMe2H-CTZ、6-Alkyl3-CTZ、6-Alkyl3-2H-CTZ、6-Methoxy-CTZ、6-Methoxy-2H-CTZ、6-Ethyl-CTZ、6-Ethyl-2H-CTZ、6-Methyl-CTZ、6-Methyl-2H-CTZ、6-Ether-CTZ（比較化合物）、6-Ether-2H-CTZ（比較化合物）また既存のブルーシフト型誘導体DeepBlueC (商品名、Nanolight technology社製)を比較対象として用いた。生物発光測定はPromega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って行った。発光基質をメタノールに溶解させ、2 mMの溶液とした。これをPBS buffer (pH7.4)で2 μMに希釈、これを基質溶液とした。この溶液200 μLに対してRLuc、RLuc8またはRLuc8.6-535を含む細胞溶出液4μLを加え、発光反応を開始した。発光輝度はベルトールド社製Lumat LB9507にて1秒間測定し、最大発光強度値(I)で示した。また天然のセレンテラジンのRLuc8における発光強度を1.0と規格化し、生物発光強度の比較を行った。結果を図１及び下記表２に示す。
【０１３９】
【表２】
2018158896.tif 000030
N.D.: 発光輝度が低く検出されず（以下同じ）
【０１４０】
図１及び表１より本発明の新規化合物は酵素RLuc8、RLuc8.6-535に認識され有意な発光を示している。特に6-Alkyl3OH-CTZ/RLuc8.6-535の組み合わせは、従来のブルーシフト型RLuc発光系(DeepBlueC（商品名）/RLuc8)の32倍の発光輝度であることが分かった。
【０１４１】
(45) 生物発光スペクトル測定方法 (レニラルシフェラーゼ発光系)
上記生物発光輝度測定方法と同様に、Promega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って発光スペクトル測定を行った。発光スペクトルはATTO社製LumiFLを用いて行った。最大発光波長は最大発光強度を1.0として規格化する事で求めた。
【０１４２】
【表３】
2018158896.tif 000031
【０１４３】
上記項目(44)にて高輝度発光を示した6-Alkyl3OH-CTZ/RLuc8.6-535発光系は従来のブルーシフト型RLuc発光系(DeepBlueC（商品名）/RLuc8)とほぼ同様の生物発光波長(415 nm)であることが分かった。つまり世界で最も高輝度なブルーシフト型RLuc発光系の開発に成功したと言える。
【０１４４】
(46) 生物発光輝度測定方法 (人工生物発光酵素ALuc系)
GLuc、RLuc8.6-535または人工生物発光酵素ALuc群(ALuc16, ALuc22, ALuc23, ALuc34)の配列(文献Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,2013,24,2067-2075.,Kim S.B. et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2014,448,418-423., Kim S.B. et al.,Anal.Sci.,2015,31,1-6., Kim S.B. et al.,Bioconjugate Chem.,27,354-362.)を含むベクター（pcDNA3.1(+)、Invitrogen社より市販）を用いてCOS7細胞中に酵素を発現させた。Promega社のRenilla Luciferase Buffer (E291A)を用いて細胞を溶解し、その溶出液を酵素溶液としてそのまま用いた。発光基質は、天然のセレンテラジン (Nanolight technology社製)並びに6-Al2N3-CTZ（実施例１７）を用いた。生物発光測定はPromega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って行った。発光基質をメタノールに溶解させ、1 mMの溶液とした。これをPromega bufferで1 μMに希釈、これを基質溶液とした。この溶液40 μLに対してRLuc8.6-535, ALuc16, ALuc22, ALuc23並びにALuc34を含む細胞溶出液10μLを加え、発光反応を開始した。富士フィルム社製LAS-4000を用いて酵素反応開始後0分後、20分後の発光輝度を測定した。結果を図３に示す。また、図３に示す生物発光強度結果より、NCTZ/ALuc34の発光輝度を100%と規格化し、下記表４−１及び表４−２にまとめた。
【０１４５】
【表４−１】
2018158896.tif 000032
【０１４６】
【表４−２】
2018158896.tif 000033
【０１４７】
人工生物発光酵素(ALuc)と天然のCTZの組み合わせは、従来のRLuc発光系と同波長領域(480-500 nm)で約50倍の発光輝度を示す超高輝度生物発光系であり、今後ALucを用いた高感度な生体分析が可能になる。図３は新たに開発した6-Alkyl2N3-CTZと天然のCTZのGLuc、RLuc8.6-535、ALuc群(ALuc16, ALuc22, ALuc23, ALuc24, ALuc30, ALuc34)での生物発光輝度を示す。図３並びに表４により、測定開始直後は、新規誘導体6-Alkyl2N3-CTZ/ALuc34発光系は天然のCTZ/ALuc34の約3.4倍の発光輝度である事が分かった。
【０１４８】
(47) 生物発光スペクトル測定方法 (人工生物発光酵素ALuc系)
上記生物発光輝度測定方法と同様に、Promega社のRenilla Luciferase Assay System (Cat.No. E2810)のプロトコルに従って発光スペクトル測定を行った。発光スペクトルはATTO社製LumiFLを用いて行った。最大発光波長は最大発光強度を1.0として規格化する事で求めた。結果を下記表５及び図４に示す。
【０１４９】
【表５】
2018158896.tif 000034
【０１５０】
本発明の実施例１７の化合物6-Alkyl2N3-CTZ/ALuc34発光系は天然のCTZ/ALuc34とほぼ同発光波長領域にある事が分かった。つまり新たな高輝度ALuc発光系の構築に成功したと言える。
【０１５１】
本発明で得たCTZ誘導体の設計は、他の生物発光系に対しても応用可能である。例えばトゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)は、発光基質にCTZを利用する。近年では、トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼNanoLuc（商品名）(Promega社)(文献Hall P.M. et al.,ACS. Chem. Biol.,2012,7,1848-1857.)が開発されており、新規基質furimazine（下記式[III]）と組み合わせる事で、ホタルルシフェラーゼ発光系の約100倍の発光輝度を持つ新たな生物発光システムを構築した。またNanoLuc（商品名）(Promega社)はその高い発光輝度から、高いS/N比での生体分析を可能にする。実際にレポーターアッセイだけでなく、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)機構を利用したタンパク質間相互作用解析を始めとする様々なバイオアッセイ系への応用が実証されている(文献England G.C.et al.,Bioconjugate Chem.,2016,27,1175-1187.)
【０１５２】
NanoLuc（商品名）(Promega社)に対する基質合成研究では、CTZの6位及び2位の誘導体が報告されている(文献Hall P.M. et al.,ACS. Chem. Biol.,2012,7,1848-1857.,Shakhmin A. et al.,Chem.Eur.J.,2016,22,10369-10375.)が、いずれも2位置換基の酵素活性に対する影響が重点的に調べられている。本発明よりCTZ6位置換基改変の酵素活性への影響は大きく、CTZ6位を改変した新規基質開発により、NanoLuc（商品名）(Promega社)の更なる高輝度化が望める。
【０１５３】
トゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)の発光酵素オプロフォーラスルシフェラーゼ(OLase)は、分子量19kDaのタンパク質ドメインが発光を触媒する機能を持ち、19kOLaseとして認識されている。NanoLuc（商品名）(Promega社)とnanoKAZ(文献Inouye S. et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun., 2013,437,23-28.)はこの19kOLaseの変異体として知られている。これら19kOLase、nanoKAZ、NanoLucTM(Promega社)と既知のCTZ誘導体との構造活性相関研究結果を基に、以下に新規基質（下記式[IV]及び式[V]を提案する。
【０１５４】
【化２７】
2018158896.tif 000035
【０１５５】
【化２８】
2018158896.tif 000036
【０１５６】
【化２９】
2018158896.tif 000037
【０１５７】
式[V]中、R1及びR2は、下記表６に示す通りである。
【０１５８】
【表６】
2018158896.tif 000038
【図１】
2018158896.tif 000045
【図２】
2018158896.tif 000046
【図３】
2018158896.tif 000047
【図４】
2018158896.tif 000048