(57)【要約】【課題】抗体よりも容易に細胞内に浸透させることができる低分子化合物を用いて、細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色するとともに、同一の細胞又は組織について任意にＨＥ染色等の公知の染色を行うことが可能な染色方法を提供する。【解決手段】［ａ］特定の化学式で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む染色液によって、細胞又は組織を染色し、前記細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色する染色工程Ｘを有する、染色方法。［ｂ］前記細胞又は組織を予め酸化処理することによって、前記細胞又は組織に含まれる多糖類が有する水酸基の少なくとも一部をアルデヒド基に変化させる酸化処理工程を有する前記染色方法。［ｃ］前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈを有する前記染色方法。［ｄ］前記細胞又は組織に含まれる酸性物質を染色する染色工程Ｅをさらに有する前記染色方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む染色液によって、細胞又は組織を染色し、前記細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色する染色工程Ｘを有する、染色方法。
【化１】
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［式（１）中、６個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜６の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（２）中、１０個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（３）中、８個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（４）中、ジアミノベンゼン構造の３，４，５，６位の４個の水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく、前記３，４位の水素原子が除かれて炭素数４〜７のシクロアルカンＱが縮合していてもよく、前記シクロアルカンＱを構成する１つ以上のメチレン基は、酸素同士が隣接する場合を除いて、（−Ｏ−）基又は（−ＮＨ−）基によって置換されていてもよく；
式（５）中、ベンゾフラザンが有する３個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよい。］
【請求項２】
前記細胞又は組織を予め酸化処理することによって、前記細胞又は組織に含まれる多糖類が有する水酸基の少なくとも一部をアルデヒド基に変化させる酸化処理工程を有する、請求項１に記載の染色方法。
【請求項３】
前記染色工程Ｘの前又は後に、前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈを有する、請求項１又は２に記載の染色方法。
【請求項４】
前記染色工程Ｈにおいて、ヘマトキシリンを含む染色液を用いて前記塩基性物質を染色する、請求項３に記載の染色方法。
【請求項５】
前記細胞又は組織に対して、前記染色工程Ｘと、
前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈと、を同時に行う、請求項１又は２に記載の染色方法。
【請求項６】
前記式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物及びヘマトキシリンを含む染色液を用いる、請求項５に記載の染色方法。
【請求項７】
前記染色工程Ｘと前記染色工程Ｈを経た前記細胞又は組織に対して、前記細胞又は組織に含まれる酸性物質を染色する染色工程Ｅをさらに有する、請求項３〜６の何れか一項に記載の染色方法。
【請求項８】
前記染色工程Ｅにおいて、エオジンを含む染色液を用いて前記酸性物質を染色する、請求項７に記載の染色方法。
【請求項９】
同一の組織切片に対して、前記染色工程Ｘと、ＨＥ染色を行う工程と、を有する請求項１に記載の染色方法。
【請求項１０】
同一の細胞検体に対して、前記染色工程Ｘと、パパニコロウ染色を行う工程と、を有する請求項１に記載の染色方法。
【請求項１１】
同一の血液標本に対して、前記染色工程Ｘと、ギムザ染色を行う工程と、を有する請求項１に記載の染色方法。
【請求項１２】
下記の式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む、染色剤。
【化２】
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［式（１）中、６個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜６の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（２）中、１０個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（３）中、８個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（４）中、ジアミノベンゼン構造の３，４，５，６位の４個の水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく、前記３，４位の水素原子が除かれて炭素数４〜７のシクロアルカンＱが縮合していてもよく、前記シクロアルカンＱを構成する１つ以上のメチレン基は、酸素同士が隣接する場合を除いて、（−Ｏ−）基又は（−ＮＨ−）基によって置換されていてもよく；
式（５）中、ベンゾフラザンが有する３個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよい。］
【請求項１３】
さらにヘマトキシリンが含まれている、請求項１２に記載の染色剤。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の染色剤を有する、染色キット。
【請求項１５】
前記染色剤とヘマトキシリンを含む染色剤とを有する、請求項１４に記載の染色キット。
【請求項１６】
エオジンを含む染色剤をさらに有する、請求項１４又は１５に記載の染色キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色方法、染色剤、及び染色キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、組織学や病理学等の基礎研究および病理診断等の医療現場において、組織切片を光学顕微鏡で観察する際にヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）が行われている。ヘマトキシリンは塩基性の細胞核を青紫色に染色する性質があり、エオジンは酸性の細胞質構成成分、内分泌顆粒などを赤桃色に染色する性質がある。これらの性質を利用してＨＥ染色された組織サンプルから、細胞の形態と病変に関する情報が得られる。
【０００３】
また、組織切片について、特定の細胞構成成分（抗原）に結合可能な抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）による免疫染色が行われることがある。
特許文献１には、ＨＥ染色と免疫染色とを同一の組織切片について行うことにより、組織の形態に関する情報と、特定の細胞構成成分に関する情報とを得る組織染色方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０３５６８８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫染色法で抗原に結合させる抗体は、抗原の大きさに比べて巨大なタンパク質分子であり、細胞膜を通過して細胞内の抗原に到達し難い問題がある。このため、組織切片をアルコールで処理することによって細胞膜を破壊し、抗体を細胞内へ侵入させる処理が行われる。しかしながら、細胞膜の破壊に伴う組織の形態変化の懸念があり、ＨＥ染色と免疫染色とを両立させることが難しい一面もある。
【０００６】
本発明は、抗体よりも容易に細胞内に浸透させることができる低分子化合物を用いて、細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色するとともに、同一の細胞又は組織について任意にＨＥ染色等の公知の染色を行うことが可能な染色方法を提供する。また、その染色方法に用いられる染色剤及び染色キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［１］  下記の式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む染色液によって、細胞又は組織を染色し、前記細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色する染色工程Ｘを有する、染色方法。
【０００８】
【化１】
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［式（１）中、６個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜６の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（２）中、１０個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（３）中、８個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（４）中、ジアミノベンゼン構造の３，４，５，６位の４個の水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく、前記３，４位の水素原子が除かれて炭素数４〜７のシクロアルカンＱが縮合していてもよく、前記シクロアルカンＱを構成する１つ以上のメチレン基は、酸素同士が隣接する場合を除いて、（−Ｏ−）基又は（−ＮＨ−）基によって置換されていてもよく；
式（５）中、ベンゾフラザンが有する３個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよい。］
［２］  前記細胞又は組織を予め酸化処理することによって、前記細胞又は組織に含まれる多糖類が有する水酸基の少なくとも一部をアルデヒド基に変化させる酸化処理工程を有する、［１］に記載の染色方法。
［３］  前記染色工程Ｘの前又は後に、前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈを有する、［１］又は［２］に記載の染色方法。
［４］  前記染色工程Ｈにおいて、ヘマトキシリンを含む染色液を用いて前記塩基性物質を染色する、［３］に記載の染色方法。
［５］  前記細胞又は組織に対して、前記染色工程Ｘと、前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈと、を同時に行う、［１］又は［２］に記載の染色方法。
［６］  前記式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物及びヘマトキシリンを含む染色液を用いる、［５］に記載の染色方法。
［７］  前記染色工程Ｘと前記染色工程Ｈを経た前記細胞又は組織に対して、前記細胞又は組織に含まれる酸性物質を染色する染色工程Ｅをさらに有する、［３］〜［６］の何れか一項に記載の染色方法。
［８］  前記染色工程Ｅにおいて、エオジンを含む染色液を用いて前記酸性物質を染色する、［７］に記載の染色方法。
［９］  同一の組織切片に対して、前記染色工程Ｘと、ＨＥ染色を行う工程と、を有する［１］に記載の染色方法。
［１０］  同一の細胞検体に対して、前記染色工程Ｘと、パパニコロウ染色を行う工程と、を有する［１］に記載の染色方法。
［１１］  同一の血液標本に対して、前記染色工程Ｘと、ギムザ染色を行う工程と、を有する［１］に記載の染色方法。
［１２］  下記の式（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む、染色剤。
【０００９】
【化２】
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［式（１）中、６個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜６の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（２）中、１０個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（３）中、８個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（４）中、ジアミノベンゼン構造の３，４，５，６位の４個の水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく、前記３，４位の水素原子が除かれて炭素数４〜７のシクロアルカンＱが縮合していてもよく、前記シクロアルカンＱを構成する１つ以上のメチレン基は、酸素同士が隣接する場合を除いて、（−Ｏ−）基又は（−ＮＨ−）基によって置換されていてもよく；
式（５）中、ベンゾフラザンが有する３個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよい。］
［１３］  さらにヘマトキシリンが含まれている、［１２］に記載の染色剤。
［１４］  ［１２］又は［１３］に記載の染色剤を有する、染色キット。
［１５］  前記染色剤とヘマトキシリンを含む染色剤とを有する、［１４］に記載の染色キット。
［１６］  エオジンを含む染色剤をさらに有する、［１４］又は［１５］に記載の染色キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の染色方法によれば、染色対象の細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質に対して、前記式（１）〜（５）で表される化合物を結合させ、前記化合物に由来する青色の蛍光を観測することにより、前記細胞又は組織内における前記物質に関する情報を得ることができる。また、本発明の染色方法と、ＨＥ染色、パパニコロウ染色、ギムザ染色等の従来の染色方法との両方を、同一の細胞又は同一の組織に対して実施することができる。これにより、例えば、同一の組織切片から、ＨＥ染色による組織形態に関する情報と、前記青色の蛍光観測による前記物質に関する情報とを得ることができる。つまり、従来は異なる２枚の組織切片について個別に行われていた２種類の染色を、１枚の同一組織切片について２種類の染色を同時に行うことができるので、病理診断をより迅速に且つより正確に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の染色方法における処理及び工程の順序の一例を示したフローチャートである。
【図２】実施例１で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３】実施例２で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図４】実施例３で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図５】実施例４で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図６】実施例４で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図７】実施例４で染色した組織切片の蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図８】実施例５で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図９】実施例５で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１０】実施例６で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図１１】実施例６で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１２】実施例７で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図１３】実施例７で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１４】実施例８で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図１５】実施例８で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１６】実施例９で染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図１７】実施例９で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１８】実施例１０で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図１９】実施例１０で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２０】実施例１１で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２１】実施例１１で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２２】実施例１２で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２３】実施例１２で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２４】実施例１３で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２５】実施例１３で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２６】実施例１４で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２７】実施例１４で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２８】実施例１５で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図２９】実施例１５で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３０】実施例１６で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３１】実施例１６で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３２】実施例１７で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３３】実施例１７で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３４】実施例１８で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３５】実施例１９で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３６】実施例１９で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３７】実施例２０で染色した組織切片を顕微鏡で観察した透過画像である。
【図３８】実施例２０で染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【図３９】比較実験において、ＰＡＳ染色した組織切片を光学顕微鏡で観察した透過画像である。
【図４０】比較実験において、ＣＨＯ染色した組織切片を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
《染色対象》
本発明の染色方法が染色対象とする細胞又は組織は、生体由来の細胞又は組織であれば特に限定されず、ヒトを含めた動物に由来する細胞又は組織を染色する方法として好適である。前記細胞又は組織の種類や形態は特に限定されず、生体から分離された生きた状態の細胞又は組織であってもよいし、生体から分離された後で固定、凍結、パラフィン包埋、切片化等の従来の染色方法における公知の前処理が施された細胞又は組織であってもよい。
【００１３】
《染色方法》
本発明の第一態様は、下記の式（１）で表される化合物、式（２）で表される化合物、式（３）で表される化合物、式（４）で表される化合物及び式（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物を含む染色液によって、細胞又は組織を染色し、前記細胞又は組織に含まれるアルデヒド基を有する物質を染色する染色工程Ｘを有する、染色方法である。
【００１４】
【化３】
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［式（１）中、６個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜６の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（２）中、１０個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（３）中、８個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく；
式（４）中、ジアミノベンゼン構造の３，４，５，６位の４個の水素原子は任意の置換基で置換されていてもよく、前記３，４位の水素原子が除かれて炭素数４〜７のシクロアルカンＱが縮合していてもよく、前記シクロアルカンＱを構成するメチレン基の１つ以上が、酸素同士が隣接する場合を除いて、（−Ｏ−）基又は（−ＮＨ−）基によって置換されていてもよく；
式（５）中、ベンゾフラザンが有する３個の水素原子のうち少なくとも１つはＲで置換されており、Ｒはアミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基であり、ｎは１〜３の整数であり、Ｒで置換されていない水素原子は任意の置換基で置換されていてもよい。］
【００１５】
前記式（１）〜（５）中、環構造に結合する水素原子は任意の置換基によって置換されていてもよい。この任意の置換基としては、例えば、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖の脂肪族飽和炭化水素基、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖の脂肪族不飽和炭化水素基、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）、アセチル基（−ＣＯＣＨ３）、炭素数１〜４のアルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基等が挙げられる。さらに、前記任意の置換基として、前記脂肪族飽和炭化水素基又は前記脂肪族不飽和炭化水素基を構成する１つ以上のメチレン基が、酸素原子同士が結合する場合を除いて、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、又は−ＮＨ−によって置換された置換基も挙げられる。
前記任意の置換基が負電荷を有する酸基である場合、その酸基はナトリウム塩、カリウム塩等の塩を形成していてもよい。前記任意の置換基が水素原子を有する場合、その水素原子はハロゲン原子によって置換されていてもよい。
【００１６】
前記式（１）〜（５）中、環構造に結合する水素原子を置換する前記Ｒ（官能基Ｒ）は、アミノ基（−ＮＨ２）又はヒドラジン構造（−ＮＨ−ＮＨ２）を末端に有する。
官能基Ｒは炭素数１〜１０の２価の有機基を含んでいてもよい。
官能基Ｒとしては、例えば、−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２、等が挙げられる。これらの官能基Ｒにおいて、ｒは０〜１０の整数であり、１つ以上のメチレン基が含まれる場合、各メチレン基は、酸素同士が結合する場合を除いて、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、又は−Ｓ−によって置換されていてもよい。
前記式（１）〜（５）に複数の官能基Ｒが存在する場合、それらの官能基Ｒは互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００１７】
式（４）のジアミノベンゼン構造に縮合していてもよい前記シクロアルカンＱとしては、１つ以上のメチレン基が酸素に置換されていてもよい、炭素数５〜６のシクロアルカンが好ましい。このような縮合環を有する構造の具体例として、１，２−メチレンジオキシベンゼン構造が挙げられる。
【００１８】
前記式（１）〜（５）で表される化合物（以下、化合物（１）〜（５）と記す。）は、アミノ基又はヒドラジン構造を末端に有する官能基Ｒを１つ以上備えている。このため、化合物（１）〜（５）から選ばれる何れか１種以上の化合物を含む染色液を染色対象の細胞又は組織に接触させて染色する（以下、ＣＨＯ染色と記す。）ことにより、前記細胞又は前記組織に含まれるアルデヒド基（−ＣＨＯ）を有する物質に対して、化合物（１）〜（５）の官能基Ｒを結合させることができる。
【００１９】
ＣＨＯ染色によって化合物（１）〜（５）が結合する前記物質は、本来的にはアルデヒド基を有さずとも、細胞又は組織を染色前に前処理することによってアルデヒド基が形成された物質であってもよい。例えば、組織切片中に存在し、多糖類を含む粘液を生産する細胞（腺細胞）をＣＨＯ染色する場合、組織切片を過ヨウ素酸で処理し、組織切片中に含まれる多糖類を酸化することにより、多糖類分子中の水酸基をアルデヒド基に酸化する前処理が挙げられる。この前処理を説明する反応式を下記に示す。下記の反応式中、Ｒ１及びＲ２は多糖類の分子鎖の一部を表す。
【００２０】
【化４】
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【００２１】
前記多糖類としては、酸化剤によって酸化されてアルデヒド基を生成する多糖類であれば特に限定されず、例えば、グルコースを構成単位に有する多糖類が挙げられる。具体的には、例えば、グリコーゲン、粘液たんぱく、糖蛋白、糖脂質等が挙げられる。
【００２２】
ＣＨＯ染色によって前記細胞又は前記組織に含まれるアルデヒド基（−ＣＨＯ）を有する物質と、化合物（１）〜（５）の何れかをシッフ反応により結合させた後、形成された結合（シッフ塩基）を安定化する目的で、還元的アミノ化試薬を用いることができる。還元的アミノ化試薬でシッフ塩基を安定化することにより、化合物（１）〜（５）に由来する蛍光の発色を向上させることができる。
還元的アミノ化試薬としては、例えば、２−ピコリンボラン等が挙げられる。なかでも、２−ピコリンボランは溶媒の種類を問わずに使用でき、安定な化合物であるため好ましい。還元的アミノ化試薬はＣＨＯ染色で用いる化合物（１）〜（５）の何れかを含む染色液に適当な濃度で予め添加しておくことができる。
【００２３】
ＣＨＯ染色で用いる化合物のうち、化合物（１）〜（３）及び化合物（５）は、それらの骨格構造自体が蛍光性を有する。化合物（４）は染色対象が有する物質のアルデヒド基と反応して環構造を形成することによって蛍光性を獲得する（後述の反応式を参照）。したがって、アルデヒド基を有する前記物質に結合した化合物（１）〜（５）は、光で励起された後に蛍光を発する。この蛍光を蛍光顕微鏡等で観測することにより、ＣＨＯ染色した細胞又は組織におけるアルデヒド基を有する前記物質の分布を調べることができる。
【００２４】
下記の反応式は、化合物（４）の一例がアルデヒド基を有する物質と反応することにより、蛍光性の環構造を形成する様子を示している。下記の反応式中、Ｒ３は前記物質を構成する有機基を表す。
【００２５】
【化５】
2018162986.tif 000007
【００２６】
化合物（１）〜（５）が前記物質と結合した後に発する蛍光波長は、発光時の化合物の骨格構造に概ね依存し、３６５ｎｍ〜４０５ｎｍ付近の波長で励起され、可視領域の波長の蛍光として観測される。これらの蛍光波長は、既存のヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）、パパニコロウ染色、及びギムザ染色で使用される染色物質が励起波長（３６５ｎｍ〜４０５ｎｍ）で生じる可視領域波長の蛍光と重ならない。したがって、同一の染色対象について、既存の染色とＣＨＯ染色の両方を行うことができる。このことは病理検査の分野において極めて大きなメリットとなる。例えば、組織切片についてＨＥ染色とＣＨＯ染色の両方を行うことにより、その組織切片をＨＥ染色して着目した部位について、ＣＨＯ染色で染まる物質の有無（例えば、多糖類を含む腺細胞の有無）を調べることができる。従来の病理検査においては、第一の組織切片についてＨＥ染色を行い、精査すべき箇所が観察された場合には、第一の組織切片に隣接する第二の組織切片をＰＡＳ染色で染めて、その精査すべき箇所における多糖類の有無を調べる方法が行われている。この従来方法であると、第一の組織切片と第二の組織切片とは厳密には物理的な位置が異なる箇所を観察しているため、第一の組織切片に含まれる物質又は細胞が第二の組織切片には含まれていない、という事態が現実には起こりうる。このため、正確な病理診断を行えない事態が少なからず生じていた。また、２枚の組織切片について２種類の染色を個別に行うため、染色作業の時間やコストをより多く必要とした。しかしながら、本発明が提案するように、同一の組織切片についてＨＥ染色、パパニコロウ染色及びギムザ染色等から選ばれる既存の染色と、ＣＨＯ染色の両方を行うことによって、病理診断をより正確且つ迅速に行うことができる。さらに、従来の免疫染色法で用いられる巨大な抗体よりも細胞／又は組織に対する浸透性が高い低分子の化合物（１）〜（５）を用いているので、より高感度に目的の物質を染色することができる。
【００２７】
ＣＨＯ染色で用いる化合物（１）〜（５）は、前記物質に結合した後又は前に紫外線領域（３６５ｎｍ〜４０５ｎｍ付近）の波長で励起され、可視領域の波長の蛍光を発する。この蛍光は紫外線励起によって生じるので、可視光によって生じるＨＥ染色等の既存の染色で用いられる染色物質の自家蛍光（赤色〜緑色）と区別可能であり、蛍光顕微鏡による観察に適している。また、通常の光学顕微鏡で可視光域を観察する場合にはほぼ無色であるので、ＨＥ染色等の既存の染色後の光学顕微鏡観察を妨げない。したがって、化合物（１）〜（５）によるＣＨＯ染色は、既存の染色とＣＨＯ染色の両方を同一の染色対象に対して行う場合に特に有用である。さらに、化合物（１）〜（５）は、ヘマトキシリンを含む染色液に混合して使用できること、従来のＨＥ染色と同時にほぼ同じ手順でＣＨＯ染色を並行して行えること、ＣＨＯ染色後に硬化剤で封入した後の退色が少ないのでＣＨＯ染色した標本を半永久的に保存できること、等の優れた利点を有する。
以下に、化合物（１）〜（５）の好適な具体例を示す。
【００２８】
【化６】
2018162986.tif 000008
【００２９】
【化７】
2018162986.tif 000009
【００３０】
【化８】
2018162986.tif 000010
【００３１】
（染色工程Ｘ）
染色工程Ｘの具体的な方法としては、例えば、化合物（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる何れか１種以上の化合物を任意の濃度で含む染色液に、細胞又は組織を室温で１５〜３０分程度浸漬させた後、取り出し、過剰な化合物を水洗する方法が挙げられる。
前記染色液に含まれる前記１種以上の化合物の合計の濃度としては、例えば０．０１ｇ／Ｌ〜０．２ｇ／Ｌが挙げられる。
前記１種以上の化合物が有するアミノ基又はヒドラジン構造が、前記細胞又は組織に含まれるアルデヒド基に反応してシッフ塩基を形成することが容易になる観点から、前記染色液のｐＨは酸性であることが好ましい。前記染色液のｐＨを酸性にするためは、例えば、前記染色液に塩酸を濃度０．０２ｍｏｌ／Ｌ程度で添加することが好ましい。
さらに、シッフ塩基の安定化のため、還元的アミノ化試薬を添加することが望ましく、例えば２−ピコリンボランを濃度５０ｍｇ／Ｌ程度となるように添加することが挙げられる。
前記染色液には、ＣＨＯ染色を阻害しない範囲において、その他の任意成分が含まれてもよい。
【００３２】
（酸化処理工程）
本発明の第一態様の染色方法は、染色工程Ｘの前に、染色対象である細胞又は組織を予め酸化処理することによって、前記細胞又は組織に含まれる多糖類が有する水酸基の少なくとも一部をアルデヒド基に変化させる酸化処理工程を有していてもよい。酸化処理工程は、染色工程Ｘに含まれるサブ工程と見なしてもよいし、染色工程Ｘとは独立した工程と見なしてもよい。
【００３３】
前記酸化処理工程の方法としては、例えば、多糖類を染色する従来のＰＡＳ染色で行われる公知の酸化処理方法が適用できる。その具体的な方法としては、例えば、公知の酸化剤に染色対象の細胞又は組織を室温で１５〜３０分程度浸漬した後、軽く水洗する方法が挙げられる。酸化剤の具体例は後述する。
【００３４】
（染色工程Ｈ）
本発明の第一態様の染色方法は、染色工程Ｘの前又は後に、前記細胞又は組織に含まれる塩基性物質を染色する染色工程Ｈを有していてもよい。
同一の細胞又は組織試料に対して、染色工程Ｘと染色工程Ｈの両方を行うことができる。
前記塩基性物質は、前記細胞又は組織中で負（−）に帯電している部位、例えばリン酸基、カルボキシル基を有する物質であり、例えば、細胞核が挙げられる。
前記塩基性物質を染色する方法としては、従来のヘマトキシリン（Hematoxylin）を色素（色ラック）として染色するヘマトキシリン染色（Ｈ染色）が好ましい。Ｈ染色はヘマトキシリンを含む染色液を用いて従来方法と同様に行うことができる。
また、Ｈ染色に代えて、メチルグリーンやケルンエヒトロートを用いた核染色によって前記塩基性物質を染色してもよい。メチルグリーン及びケルンエヒトロートもヘマトキシリンと同様に青色の蛍光を発生せず、ＣＨＯ染色を妨げることがない。
【００３５】
本発明の第一態様の染色方法において、染色工程Ｘと染色工程Ｈを同時に行ってもよい。例えば、ＣＨＯ染色とＨ染色を同時に行うことができる。ＣＨＯ染色とＨ染色を同時に行う方法としては、ＣＨＯ染色の染色液とＨ染色の染色液とを混合した混合染色液を細胞又は組織に接触させて同時に染色する方法が挙げられる。具体的には、例えば、化合物（１）〜（５）で表される化合物の群から選ばれる何れか１種以上の化合物及びヘマトキシリンをそれぞれ任意の濃度で含む混合染色液に細胞又は組織を浸漬させて染色する方法が挙げられる。
【００３６】
（染色工程Ｅ）
本発明の第一態様の染色方法は、染色工程Ｘの前又は後に、或いは、染色工程Ｈの前又は後に、前記細胞又は組織に含まれる酸性物質を染色する染色工程Ｅをさらに有していてもよい。
同一の細胞又は組織試料に対して、染色工程Ｘ及び染色工程Ｈの少なくとも一方と、染色工程Ｅとを行うことができる。
前記酸性物質は、前記細胞又は組織中で正（＋）に帯電している部位を有する物質であり、例えば、細胞質の構成成分が挙げられる。
前記酸性物質を染色する方法は、例えば、従来のエオジン（Eosin）を色素（カラーアニオン）として、前記細胞又は組織の陽性荷電部に結合して赤色に染色するエオジン染色（Ｅ染色）が好ましい。Ｅ染色は水溶性エオジンＹを含む染色液を用いて従来方法と同様に行うことができる。
【００３７】
従来のヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）は、染色工程Ｈの後に染色工程Ｅを行うので、本発明の第一態様の染色方法においても、染色工程Ｈの後に染色工程Ｅを行う順序が好ましい。この順序において、染色工程Ｘ（例えばＣＨＯ染色）は、染色工程Ｈ（例えばＨ染色）の前に又は後に、或いは染色工程Ｅ（例えばＥ染色）の後に行うことができる。染色工程Ｘ、染色工程Ｈ、染色工程Ｅを行う順序の例を図１のフローチャートに示す。
【００３８】
（封入工程）
上述の各染色工程の後、アルコール濃度が段階的に高められたアルコール溶液に前記細胞又は組織を浸して脱水し、キシロールによる透徹処理を行い、封入することができる。
封入された前記細胞又は組織を蛍光顕微鏡で観察すると、前記細胞又は組織を構成するアルデヒド基に結合した化合物（１）〜（５）に由来する青色の蛍光を測定することができる。例えば、酸化された多糖類を含む腺細胞が青色の蛍光で染まった様子が観察される。
また、封入された前記細胞又は組織を光学顕微鏡で観察すると、染色工程Ｈ、染色工程Ｅで用いた色素（染色剤）に由来する色が観察される。例えば、Ｈ染色によって青色に染まった細胞核、Ｅ染色によって赤色に染まった細胞質が観察される。
【００３９】
＜パパニコロウ染色、ギムザ染色との併用＞
後述する実施例で示すように、本発明の第一態様の染色方法において、同一の染色対象に対して、従来のパパニコロウ染色又はギムザ染色を、染色工程Ｘの前又は後に行うことができる。パパニコロウ染色とＣＨＯ染色、及びギムザ染色とＣＨＯ染色は、それぞれ互いに干渉せずに、各染色を単独で行う場合と同様の良好な染色結果を示す。
【００４０】
《染色剤》
本発明の第二態様は、前記式（１）で表される化合物、前記式（２）で表される化合物、前記式（３）で表される化合物、前記式（４）で表される化合物及び前記式（５）で表される化合物の群から選ばれる１種以上の化合物（１）〜（５）を含む染色剤である。
前記染色剤の形態は、化合物（１）〜（５）を含む粉末又は錠剤等の固体であってもよいし、化合物（１）〜（５）が任意の溶媒に任意の濃度で溶解又は分散された液体であってもよい。前記溶媒は化合物（１）〜（５）を溶解又は分散可能なものであれば特に限定されず、例えば、精製水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の第１級アルコール、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ヘキサン等のその他の有機溶媒等が挙げられる。
第二態様の染色剤には、さらにヘマトキシリンが含まれていてもよい。
【００４１】
《染色キット》
本発明の第三態様は、第二態様の染色剤を有する染色キットである。
前記染色キットは、染色前の組織切片を予め酸化処理する酸化剤を有していてもよい。
前記酸化剤としては、例えば、多糖類を酸化してアルデヒド基を生成する化合物Ｏｘが挙げられる。具体的な化合物Ｏｘとしては、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等の化合物が挙げられる。前記酸化剤の形態は、前記化合物Ｏｘを含む粉末又は錠剤等の固体であってもよいし、前記化合物Ｏｘが任意の溶媒に任意の濃度で溶解又は分散された液体であってもよい。
前記染色キットの使用前において、第二態様の染色剤と前記酸化剤とは個別の容器内に入れて保管されることが好ましい。
【００４２】
前記染色キットは、ヘマトキシリンを含む染色剤Ｈを他の染色剤とは別に有していてもよい。染色剤Ｈの形態は、ヘマトキシリンを含む粉末又は錠剤等の固体であってもよいし、ヘマトキシリンが任意の溶媒に任意の濃度で溶解又は分散された液体であってもよい。
前記染色キットにおいて、ヘマトキシリンは第二態様の染色剤の一成分として第二態様の染色剤に任意の濃度で含まれていてもよい。
【００４３】
前記染色キットは、エオジンを含む染色剤Ｅを有していてもよい。染色剤Ｅに含まれるエオジンの形態は、エオジンを含む粉末又は錠剤等の固体であってもよいし、エオジンが任意の溶媒に任意の濃度で溶解又は分散された液体であってもよい。
前記染色キットの使用前において、第二態様の染色剤及び染色剤Ｈと、染色剤Ｅとは個別の容器内に入れて保管されることが好ましい。
【００４４】
前記染色キットには、細胞又は組織切片を染色するために使用される市販の染色キットに含まれる、任意のその他の薬剤、容器、取り扱い説明書等が同梱されていてもよい。
【実施例】
【００４５】
［試薬の調製］
＜ＣＨＯ染色剤（１）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）（０．０１ｇ）と１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を溶解した。得られた溶液（約１０ｍｌ）に対して、エチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（０．５ｍｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（１）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（２）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、５−アミノ−１−ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩水和物（ＳＡＮ）(０．００５ｇ）と１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を溶解した。得られた溶液（約１０ｍｌ）に対して、エチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（０．５ｍｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（２）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（３）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、１，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン，二塩酸塩（ＭＤＢ）（０．００２５ｇ）と１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を溶解した。得られた溶液（約１０ｍｌ）に対して、エチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（０．５ｍｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（３）を調製した。
【００４６】
＜ＣＨＯ染色剤（４）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、３−アミノ−クマリン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）と、エチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（１ｍｌ）を添加し、ＲＯ水を加えて５０ｍｌにメスアップした。得られた溶液（５０ｍｌ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（４）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（５）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、１−アミノ−ピレン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（４）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（５）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（６）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、４−（２−アミノエチルアミノ）−７−（Ｎ，Ｎ―ジメチルスルファモイル）ベンゾフラザン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（４）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（６）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（７）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、モノ−７−アミノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸カリウム一水和物（１００ｍｇ／ｍｌ、水溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（４）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（７）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（８）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）クマリン（１００ｍｇ／ｍｌ、水溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（８）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（８）を調製した。
【００４７】
＜ＣＨＯ染色剤（９）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、４−クロロ−１，２−フェニレンジアミン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を添加し、ＲＯ水を加えて５０ｍｌにメスアップした。得られた溶液（５０ｍｌ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（９）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（１０）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩（１００ｍｇ／ｍｌ、水溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（４）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（１０）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（１１）＞
３−アミノ−クマリンに代えて、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩（１０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を用いた以外は、ＣＨＯ染色剤（４）と同様にして、ＣＨＯ染色剤（１１）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（１２）＞
エチルアルコール：酢酸＝９：１（体積比）の混合液（５０ｍｌ）に、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩（１００ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を添加し、さらにエチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（１ｍｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（１２）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（１３）＞
エチルアルコール：酢酸＝９：１（体積比）の混合液（５０ｍｌ）に、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホンサン三ナトリウム塩（１０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ溶液）（１０μｌ）を添加し、さらにエチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（１ｍｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（１３）を調製した。
＜ＣＨＯ染色剤（１４）＞
５０％エチルアルコール（１０ｍｌ）に、７‐アミノ‐４‐メチルクマリン‐３‐酢酸（０．００７ｇ）を添加し、ＲＯ水を加えて５０ｍｌにメスアップした。得られた溶液（５０ｍｌ）に、エチルアルコール（１０ｍｌ）に２−ピコリンボラン（０．０５ｇ）を溶解した溶液（１ｍｌ）と、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μｌ）を添加し、ＣＨＯ染色剤（１４）を調製した。
【００４８】
＜マイヤーのヘマトキシリン溶液＞
精製水（３００ｍｌ）に硫酸カリウムアルミニウム（５０ｇ）を溶解した溶液Ａを得た。
精製水（６００ｍｌ）にヘマトキシリン（３ｇ）を溶解し、ヨウ素酸ナトリウム（０．５ｇ）を加えて溶解した溶液に、前記溶液Ａを加えて混合し、抱水クロラール（５０ｇ）及びクエン酸一水和物（１．２ｇ）をさらに加えて溶解し、マイヤーのヘマトキシリン溶液を得た。
＜エオジン溶液＞
蒸留水（１００ｍｌ）にエオジンＹ（１ｇ）を溶解し、１Ｎ塩酸を１０ｍｌ加えて沈殿させた。得られた沈殿物を精製水で洗浄して風乾させ、粉末Ｙを得た。次いで、粉末Ｙ（０．５ｇ）をエチルアルコール（１０００ｍｌ）に加え、保存用の溶液Ｙを得た。使用時には、精製水（１４０ｍｌ）に溶液Ｙ（６０ｍｌ）と酢酸（０．０１ｍｌ）を加え、エオジン溶液を得た。
＜ギルのヘマトキシリン溶液＞
精製水（７３０ｍｌ）にエチレングリコール（２５０ｍｌ）とヘマトキシリン（２ｇ）とヨウ素酸ナトリウム（０．２ｇ）と、硫酸アルミニウム（１７．６ｇ）と酢酸（２０ｍｌ）を溶解し、ギルのヘマトキシリン溶液を得た。
【００４９】
［実施例１；ＣＨＯ染色］
まず、常法により準備された人体組織のパラフィン包埋切片について、キシレン、アルコール、イオン交換水の順に浸漬する公知方法によって脱パラフィン処理を行った組織切片を得た。
次に、０．５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液に前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この酸化処理により、前記組織切片中の多糖類が有する水酸基の少なくとも一部がアルデヒド基に変化した。
続いて、ＣＨＯ染色剤（１）５０ｍｌに、前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対してＡＭＣが結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００５０】
前記組織切片標本を蛍光顕微鏡で観察した画像を図２に示す。
図２は蛍光顕微鏡で青色の波長域を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００５１】
［実施例２；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（２）を用いた以外は、実施例１と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図３に示す。
図３は蛍光顕微鏡で青色の波長域を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００５２】
［実施例３；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（３）を用いた以外は、実施例１と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図４に示す。
図４は蛍光顕微鏡で青色の波長域を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００５３】
［実施例４；Ｈ染色＋ＣＨＯ染色→Ｅ染色］
まず、常法により準備された人体組織のパラフィン包埋切片について、キシレン、アルコール、イオン交換水の順に浸漬する公知方法によって脱パラフィン処理を行った組織切片を得た。
次に、０．５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液に前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この酸化処理により、前記組織切片中の多糖類が有する水酸基の少なくとも一部がアルデヒド基に変化した。
続いて、ＣＨＯ染色剤（１）１０ｍｌを前記マイヤーのヘマトキシリン溶液４０ｍｌに混合した溶液に、前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対してＡＭＣが結合するＣＨＯ染色がなされたとともに、細胞核等の塩基性物質に対してヘマトキシリンが結合するヘマトキシリン染色がなされた組織切片を得た。
次いで、前記エオジン溶液に前記組織切片を３分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、細胞質等の酸性物質に対してエオジンが結合するエオジン染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色及びＨＥ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００５４】
前記組織切片標本を光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した画像を図５〜７に示す。
図５は通常の光学顕微鏡で観察した透過画像である。細胞核（青色）、細胞質（赤色〜桃色）等の組織構造をはっきりと識別することができる。
図６は蛍光顕微鏡で青色の波長域を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができる。
図７は蛍光顕微鏡で緑色の波長域を観察した蛍光画像である。エオジンの自家蛍光が観察されている。図５〜７を見比べて、ＣＨＯ染色とＨＥ染色は互いに干渉せずに、各々の染色が充分に行われており、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００５５】
［実施例５；Ｈ染色＋ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（１）１０ｍｌと前記ギルのヘマトキシリン溶液４０ｍｌとを混合した溶液に、実施例４と同様に酸化処理された組織切片を浸漬した。その後、軽く水洗し、０．５％塩酸エチルアルコールに浸漬し、過剰なヘマトキシリンを洗浄した。その他は実施例４と同様に、同一の組織切片について、ＣＨＯ染色及びギルのヘマトキシリン染色を同時に行った。
【００５６】
その結果、実施例４と同様に、光学顕微鏡の透過画像においてギルのヘマトキシリン染色による青色に染色された鮮明な核構造が観察された（図８）。さらに、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてギルのヘマトキシリン染色によって干渉されず、多糖類を含む腺細胞等の組織構造が鮮明に観察された（図９）。
【００５７】
［実施例６；ＣＨＯ染色→Ｈ染色→Ｅ染色］
まず、実施例４と同様に、脱パラフィン及び酸化処理を行った組織切片を得た。
次に、ＣＨＯ染色剤（１）１０ｍｌを蒸留水４０ｍｌに混合した溶液に、前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対してＡＭＣが結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
続いて、前記マイヤーのヘマトキシリン溶液に、前記組織切片を３分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、細胞核等の塩基性物質に対してヘマトキシリンが結合するヘマトキシリン染色がなされた組織切片を得た。
最後に、実施例４と同様にエオジン染色を行い、組織切片標本を得た。
【００５８】
本実施例では同一の組織切片についてＣＨＯ染色した後にＨＥ染色した。その結果、実施例４と同様に、光学顕微鏡の透過画像においてＨＥ染色による青色及び赤色に染色された鮮明な組織構造が観察された（図１０）。さらに、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてＨＥ染色によって干渉されず、多糖類を含む腺細胞等の組織構造が鮮明に観察された（図１１）。
【００５９】
［実施例７；Ｈ染色→Ｅ染色→ＣＨＯ染色］
まず、実施例１と同様に、脱パラフィンを行った組織切片を得た。この組織切片については酸化処理を行わずに染色工程へ供した。
次に、前記マイヤーのヘマトキシリン溶液に、前記組織切片を５分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、細胞核等の塩基性物質に対してヘマトキシリンが結合するヘマトキシリン染色がなされた組織切片を得た。
続いて、前記エオジン溶液に前記組織切片を５分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、細胞質等の酸性物質に対してエオジンが結合するエオジン染色がなされた組織切片を得た。
次に、酸化処理を施しＣＨＯ染色剤（１）１０ｍｌを蒸留水４０ｍｌに混合した溶液に、前記組織切片を１５分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対してＡＭＣが結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、実施例４と同様に脱水及び封入処理を行い、組織切片標本を得た。
【００６０】
本実施例では同一の組織切片についてＨＥ染色した後にＣＨＯ染色した。その結果、実施例４と同様に、光学顕微鏡の透過画像においてＨＥ染色による青色及び赤色に染色された鮮明な組織構造が観察された（図１２）。さらに、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてＨＥ染色によって干渉されず、多糖類を含む腺細胞等の組織構造が鮮明に観察された（図１３）。
【００６１】
［実施例８；ＣＨＯ染色→パパニコロウ染色］
従来のパパニコロウ染色に供される細胞検体と同様に、脱パラフィン処理を行った細胞検体を得た。この細胞検体は、組織切片と同様に扱うことができるように、スライドガラス上に固定されている。
まず、前記細胞検体を実施例４と同様に酸化処理を行った。
次いで、ＣＨＯ染色剤（１）１０ｍｌと前記ギルのヘマトキシリン溶液４０ｍｌとを混合した溶液に、前記細胞検体を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。さらに０．５％塩酸アルコールを用いて分別した後、７０％エタノールから９５％エタノールまで段階的にエタノール濃度を上昇させて親和した。
続いて、得られた細胞検体について、市販のオレンジＧ−６染色液（ＯＧ−６）、及び市販のＥＡ５０染色液を用いて、順に常法によって染色した。
最後に、エタノールで脱水して、キシレンで封入して細胞検体標本を得た。
【００６２】
本実施例では同一の細胞検体について、ＣＨＯ染色とパパニコロウ染色を行った。その結果、光学顕微鏡の透過画像において、通常のパパニコロウ染色と同様の青色〜赤色に染色された鮮明な組織構造が観察された（図１４）。さらに、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてパパニコロウ染色によって干渉されず、多糖類を含む腺細胞等の組織構造が鮮明に観察された（図１５）。
【００６３】
［実施例９；ＣＨＯ染色→ギムザ染色］
従来のギムザ染色に供される血球検体と同様に、スライドガラスに血球検体を塗布し、１００％メタノールを用いて固定した。
まず、前記血球検体を実施例４と同様に酸化処理を行った。
次いで、ＣＨＯ染色剤（１）５０ｍｌに、前記血球検体を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。
続いて、得られた血球検体について、市販のギムザ染色液を用いて、常法によって染色した。軽く水洗した後、乾燥して、キシレンに浸してから封入して血球検体標本を得た。
【００６４】
本実施例では同一の血球検体について、ＣＨＯ染色とギムザ染色を行った。その結果、光学顕微鏡の透過画像において、通常のギムザ染色と同様に青紫色に染色された（図１６）。さらに、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてギムザ染色によって干渉されず、多糖類が存在すると考えられる部位に青色の蛍光が観察された（図１７）。
【００６５】
［実施例１０；ＣＨＯ染色］
まず、常法により準備された人体組織のパラフィン包埋切片について、キシレン、アルコール、イオン交換水の順に浸漬する公知方法によって脱パラフィン処理を行った組織切片を得た。
次に、０．５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液に前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この酸化処理により、前記組織切片中の多糖類が有する水酸基の少なくとも一部がアルデヒド基に変化した。
続いて、ＣＨＯ染色剤（４）５０ｍｌに、前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対して３−アミノクマリンが結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００６６】
前記組織切片標本を蛍光顕微鏡で観察した画像を図１８，図１９に示す。
図１８は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図１９は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００６７】
［実施例１１；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（５）を用いた以外は、実施例１０と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図２０，図２１に示す。
図２０は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図２１は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００６８】
［実施例１２；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（６）を用いた以外は、実施例１０と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図２２，図２３に示す。
図２２は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青緑色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図２３は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００６９】
［実施例１３；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（７）を用いた以外は、実施例１０と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図２４，図２５に示す。
図２４は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図２５は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００７０】
［実施例１４；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（８）を用いた以外は、実施例１０と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図２６，図２７に示す。
図２６は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青緑色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図２７は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００７１】
［実施例１５；ＣＨＯ染色］
実施例１０と同様に脱パラフィン処理及び酸化処理を行った組織切片を得た。
次いで、５５℃に加熱したＣＨＯ染色剤（９）５０ｍｌに、前記組織切片を１５分間浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対して４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンが結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００７２】
前記組織切片標本を蛍光顕微鏡で観察した画像を図２８，図２９に示す。
図２８は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青緑色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図２９は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００７３】
［実施例１６；ＣＨＯ染色］
実施例１０と同様に脱パラフィン処理及び酸化処理を行った組織切片を得た。
次いで、５５℃に加熱したＣＨＯ染色剤（１０）５０ｍｌに、前記組織切片を３０分間浸漬した後、２ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対して８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸が結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００７４】
前記組織切片標本を蛍光顕微鏡で観察した画像を図３０，図３１に示す。
図３０は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図３１は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００７５】
［実施例１７；ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（１１）を用いた以外は、実施例１６と同様にＣＨＯ染色を行った。
得られた組織切片標本の蛍光顕微鏡で観察した画像を図３２，図３３に示す。
図３２は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
図３３は蛍光顕微鏡で緑色の波長域（４８０ｎｍ）を観察した蛍光画像である。組織構造をはっきりと識別することができる。
【００７６】
［実施例１８；ＣＨＯ染色］
まず、常法により準備された人体組織のパラフィン包埋切片について、キシレン、アルコール、イオン交換水の順に浸漬する公知方法によって脱パラフィン処理を行った組織切片を得た。
次に、０．５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液に前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この酸化処理により、前記組織切片中の多糖類が有する水酸基の少なくとも一部がアルデヒド基に変化した。
続いて、ＣＨＯ染色剤（１４）５０ｍｌに、前記組織切片を２０分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、アルデヒド基が形成された前記多糖類に対して７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸が結合するＣＨＯ染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００７７】
前記組織切片標本を蛍光顕微鏡で観察した画像を図３４に示す。
図３４は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００７８】
［実施例１９；Ｈ染色＋ＣＨＯ染色→Ｅ染色］
ＣＨＯ染色剤（１４）２０ｍｌと前記マイヤーのヘマトキシリン溶液２０ｍｌとを混合した溶液に、実施例１８と同様に酸化処理された組織切片を浸漬した。その後、軽く水洗した。
次いで、前記エオジン溶液に前記水洗した組織切片を３分間室温で浸漬した後、水洗した。この染色により、細胞質等の酸性物質に対してエオジンが結合するエオジン染色がなされた組織切片を得た。
最後に、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色及びＨＥ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００７９】
前記組織切片標本を顕微鏡で観察した透過画像を図３５に示し、蛍光顕微鏡で観察した画像を図３６に示す。
図３６は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００８０】
［実施例２０；Ｈ染色＋ＣＨＯ染色］
ＣＨＯ染色剤（１４）２０ｍｌと前記マイヤーのヘマトキシリン溶液２０ｍｌとを混合した溶液に、実施例１８と同様に酸化処理された組織切片を浸漬した。その後、軽く水洗した。
その後、常法により前記組織切片に対して脱水処理及び封入処理を行い、ＣＨＯ染色及びＨ染色がなされた組織切片標本を得た。
【００８１】
前記組織切片標本を顕微鏡で観察した透過画像を図３７に示し、蛍光顕微鏡で観察した画像を図３８に示す。
図３８は蛍光顕微鏡で青色の波長域（３６５ｎｍ）を観察した蛍光画像である。多糖類を含む腺細胞（青色）の組織構造を黒色の背景にはっきりと識別することができ、病理診断に用いことができる高品質の画像であることが確認された。
【００８２】
［比較例１］
化合物（１）に代えて、化合物（１）〜（５）に該当しない骨格構造を有するフルオレセインイソチアシアネート（ＦＩＴＣ）（０．００５ｇ）を使用した以外は、実施例４の手順に沿って、同一の組織切片について染色を行った。
その結果、光学顕微鏡の透過画像においてはＦＩＴＣによる黄色の着色が、ＨＥ染色による青色及び赤色に干渉して、組織構造を従来のＨＥ染色と同様に観察することは困難であった。
一方、蛍光顕微鏡の蛍光画像においてはＦＩＴＣによる蛍光の波長（黄色）を観察し得ると予測していたが、実際に行ったところ、蛍光を観測できなかった。この理由として、エオジン染色が酸性条件で行われていたため、ＦＩＴＣから蛍光が発生しなかった又は消光したと考えられる。
以上の結果から、ＦＩＴＣによる染色結果を充分に把握することができなかった。
【００８３】
［比較実験］
まず、実施例１と同様に、脱パラフィンを行った２枚の組織切片を得た。これらの組織切片は、組織において互いに隣接する部位から切り出されたものである。
得られた１枚目の組織切片を常法によってＰＡＳ染色した。２枚目の組織切片については、実施例１と同様にＣＨＯ染色剤（１）を用いてＣＨＯ染色した。染色後、常法により脱水及び封入の処理を行って、２枚の組織切片標本を得た。
ＰＡＳ染色した標本を光学顕微鏡で観察した透過画像（図３９）と、ＣＨＯ染色した標本を蛍光顕微鏡で観察した蛍光画像（図４０）と、の両方共に鮮明な画像であった。
両方の画像を比較すると、ＰＡＳ染色よりもＣＨＯ染色の方が、染色されている部位同士の分解能（解像度）が高く、感度が優れていた。
【００８４】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、公知の構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、細胞や組織切片を染色する技術分野、例えば、病理診断や細胞組織学の研究などの医学及び医療分野に広く適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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