(57)【要約】      （修正有）【課題】動く観察対象物を安定して吸着し、リアルタイムでの観察を可能にする顕微鏡観察用スタビライザーを提供する。【解決手段】顕微鏡用スタビライザーは、基部２１と、前記基部２１に設けられ、観察対象物側において開口する第１開口部４２及び前記第１開口部４２と反対側において開口する第２開口部４３を有する少なくとも１つの吸着孔４１とを備え、前記第１開口部４２の開口幅は、前記第２開口部４２の開口幅よりも大きい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡用スタビライザーであって、
基部と、
前記基部に設けられ、観察対象物側において開口する第１開口部及び前記第１開口部と反対側において開口する第２開口部を有する少なくとも１つの吸着孔と
を備え、
前記第１開口部の開口幅は、前記第２開口部の開口幅よりも大きい、顕微鏡用スタビライザー。
【請求項２】
前記第１開口部の外縁が形成する図形の面積が、前記第２開口部の外縁が形成する図形の面積よりも大きい、請求項１に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項３】
前記吸着孔は、台形形状の断面を有する、請求項１又は２に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項４】
前記第２開口部の前記開口幅は、前記第１開口部の前記開口幅の０．５倍以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項５】
前記吸着孔の壁面と前記第１開口部の開口面とがなす角度をθとしたとき、ｔａｎθは、１．５以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項６】
前記ｔａｎθは、０．５以上である、請求項５に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項７】
前記吸着孔の高さは、３ｍｍ以下である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項８】
前記第１開口部の外縁が形成する図形及び前記第２開口部の外縁が形成する図形は、円形である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項９】
前記基部は、前記顕微鏡の対物レンズが配置される第１凹部と、前記第１凹部の底面に設けられ、透明部材が配置される第２凹部とを有し、
前記吸着孔の前記第２開口部は、前記第２凹部に設けられている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【請求項１０】
前記基部の底面から突出した突出部をさらに備え、
前記吸着孔は、前記基部と前記突出部とを貫通するように形成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡用スタビライザー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、顕微鏡用スタビライザーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、深部組織を低侵襲で観察することができる多光子励起顕微鏡が登場したことにより、実験動物を麻酔下で生かしたまま臓器を観察する“intravital imaging”が可能となった。Intravital imagingは、生きた状態で組織を観察する手法であるため、循環血流が保たれた生理的な組織中の細胞動態を観察することができる。
【０００３】
近年、心臓などの“動く”臓器の観察が試みられている。しかし、例えば、心臓を観察する場合、心臓の脈動中も心臓表面と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を一定に保つ必要があり、心臓の脈動中にリアルタイムで観察することは困難である。したがって、これまでの研究では、生体から取り出した心臓を組織標本にして観察していた。
【０００４】
一方、動く臓器のintravital imagingを試みた例が報告されている（特許文献１及び非特許文献１）。これらの文献では、心臓の動きを抑えるためにスタビライザーを用いることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３３８６３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vinegoni, C. et al.、“Imaging the beating heart in the mouse using intravital microscopy techniques”、Nat Protoc. 10, 1802-19, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１では、柱状の吸着孔を有するスタビライザーを用いた心臓のintravital imagingが試みられている。しかし、非特許文献１のスタビライザーでは、心臓の動きを抑えることができていない。非特許文献１では、動いている心臓から複数の画像を取得し、これらの画像をつなぎ合わせることにより画像を再構成している。よって、非特許文献１の技術では、動く心臓をリアルタイムで観察することができなかった。
【０００８】
また、特許文献１の技術に関して、本願発明者らが同様の構成を用いて心臓のintravital imagingを試みたが、心臓組織を十分に吸着することができなかった。結果として、特許文献１の技術では、組織と対物レンズとの間の距離が変動してしまい、動く心臓をリアルタイムで観察することができなかった。
【０００９】
本開示は、動く観察対象物を安定して吸着し、リアルタイムでの観察を可能にする顕微鏡観察用スタビライザーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、スタビライザーの吸着孔の開口形状を鋭意検討した結果、上記課題が解決できることを見出した。
【００１１】
本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、顕微鏡用スタビライザーであって、基部と、前記基部に設けられ、観察対象物側において開口する第１開口部及び前記第１開口部と反対側において開口する第２開口部を有する少なくとも１つの吸着孔とを備え、前記第１開口部の開口幅は、前記第２開口部の開口幅よりも大きい、顕微鏡用スタビライザーが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本開示によれば、動く観察対象物を安定して吸着し、リアルタイムでの観察が可能となる。本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示の一実施形態に係る顕微鏡の一例を示す全体構成図である
【図２】本開示の一実施形態に係るスタビライザーの概略平面図及び断面図である。
【図３】本開示の一実施形態に係るスタビライザーの概略断面図である。
【図４】図２の点線部分Ａの拡大平面図及び拡大断面図である。
【図５】本開示の一実施形態に係るスタビライザーを使用した場合の吸着状態を説明する図である。
【図６】比較例のスタビライザーを使用した場合の吸着状態を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本開示の一実施形態について説明する。図１〜図５は本開示による一実施形態を説明するための図である。なお、本件明細書に添付する図面においては、図示と理解のしやすさの便宜上、適宜縮尺および縦横の寸法比等を、実物のそれらから変更している場合がある。
【００１５】
また、本明細書において用いる、形状や幾何学的条件並びにそれらの程度を特定する、例えば、「平行」、「直交」、「垂直」、「同一」等の用語や長さや角度の値等については、厳密な意味に縛られることなく、同様の機能を期待し得る程度の範囲を含めて解釈されるべきである。
【００１６】
本明細書等において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値のそれぞれを下限値及び上限値として含む範囲であることを意味する。
【００１７】
図１は、本開示の一実施形態に係る顕微鏡の一例を示す全体構成図である。顕微鏡の一例として多光子励起顕微鏡を説明するが、以下で説明する顕微鏡観察用スタビライザーは、正立型の他の顕微鏡にも適用可能である。
【００１８】
多光子励起顕微鏡１０は、観察対象物１１を載置するステージ１２と、ステージ１２上の観察対象物１１に対向配置される対物レンズ１３を備える顕微鏡ユニット１４と、ステージ１２の観察対象物１１を保持するスタビライザー１５とを備えている。
【００１９】
観察対象物１１は、例えば、哺乳動物などである。特に、スタビライザー１５は、哺乳動物の動く臓器（例えば、心臓）又は動く生体組織などを保持するのに好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、並びにウシ、ウマ及びブタなどの家畜が挙げられる。
【００２０】
ステージ１２は、固定式ステージでもよいし、移動式ステージでもよい。ステージ１２は、例えば、Ｘ、Ｙ、Ｚのうち少なくとも一方向に観察対象物１１を移動させることができるように構成されてもよい。
【００２１】
顕微鏡ユニット１４は、観察対象物１１に励起光を照射して、観察対象物１１から生じる多光子蛍光を検出するものである。多光子励起顕微鏡の一般的な構成は公知であるため、詳細な説明は省略する。例えば、顕微鏡ユニット１４は、パルスレーザ光を出射可能なパルスレーザ光源と、パルスレーザ光を観察対象物１１に導くための第１光学系と、観察対象物１１の所定の位置にパルスレーザ光を集光させる一方、観察対象物１１において蛍光物質が励起されることにより発せられた蛍光を集光する対物レンズ１３と、発せられた蛍光を波長毎に分岐する第２光学系と、蛍光を検出する光検出器とを備えている。光検出器は、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、又は、１つ若しくは複数の光電子増倍管のような検出器でもよい。なお、蛍光は、接眼レンズなどを通して直接観察されてもよい。
【００２２】
スタビライザー１５は、パイプ１６を介して吸引ポンプ１７に接続されている。スタビライザー１５を観察対象物１１に接触させた状態で吸引ポンプ１７を作動させることにより、スタビライザー１５と観察対象物１１との間の空間が大気圧よりも低い低圧状態となり、スタビライザー１５と観察対象物１１とが吸着状態に維持される。
【００２３】
図２は、本開示の一実施形態に係るスタビライザー１５の概略平面図及び断面図である。スタビライザー１５は、基部２１と、基部２１から水平方向に延びる第１支持部２２及び第２支持部２３と、基部２１の底面から観察対象物１１側に突出する突出部２４とを備える。基部２１は、対物レンズ１３が配置される第１凹部２５と、第１凹部２５の底面２５ａに設けられ、透明部材３１（図３参照）が配置される第２凹部２６とを備える。
【００２４】
第１支持部２２は、２本のアーム部２２ａ及び２２ｂを備えている。図１及び図２に示すように、ステージ１２には、ネジ棒１８が取付けられており、ネジ棒１８が２本のアーム部２２ａ及び２２ｂの間に配置される。また、２つのナット１９及び２０が、ネジ棒１８に取付けられ、かつ、アーム部２２ａ及び２２ｂの上下に配置される。２つのナット１９及び２０によってアーム部２２ａ及び２２ｂを上下から挟むことで、スタビライザー１５のＸ、Ｙ、Ｚ方向の位置を固定することができる。なお、第２支持部２３は、第１支持部２２と同様に、２本のアーム部２３ａ及び２３ｂを備えている。２本のアーム部２３ａ及び２３ｂでの固定方式は第１支持部２２と同じであるため、説明を省略する。
【００２５】
図３は、本開示の一実施形態に係るスタビライザー１５の概略断面図であり、観察時のスタビライザー１５の状態を示す。第１凹部２５には、対物レンズ１３が配置されている。この構成によれば、基部２１に第１凹部２５を設けることにより、対物レンズ１３を観察対象物１１に近接して配置することができる。また、第２凹部２６には、透明部材３１が配置されている。透明部材３１は、例えば、ガラス基板である。第２凹部２６の高さは、透明部材３１の厚さと実質的に同一である。したがって、透明部材３１を第２凹部２６に配置したとき、透明部材３１の対物レンズ１３側の表面と第１凹部２５の底面２５ａは、実質的に段差がなく、同一平面上にある。
【００２６】
図４は、図２の点線部分Ａの拡大平面図及び拡大断面図である。基部２１は、吸着孔４１を有する。吸着孔４１は、基部２１と突出部２４とを貫通するように形成されている。より詳細には、吸着孔４１は、基部２１の第２凹部２６の底面２６ａと突出部２４とを貫通するように形成されている。吸着孔４１は、観察対象物１１側において開口する第１開口部４２と、第１開口部４２と反対側（対物レンズ１３側）において開口する第２開口部４３とを有する。第１開口部４２は、突出部２４の観察対象物１１側の面２４ａに設けられており、第２開口部４３は、第２凹部２６の底面２６ａに設けられている。
【００２７】
吸着孔４１は、観察対象物１１と基部２１との間において、円錐台の空間を形成している。突出部２４には、パイプ孔２４ｂが設けられており、パイプ１６は、パイプ孔２４ｂを介して吸着孔４１に接続されている。なお、複数のパイプが、突出部２４を介して吸着孔４１に接続されてもよい。この構成によれば、吸引ポンプ１７を作動させることにより、第２凹部２６に配置された透明部材３１と吸着孔４１と観察対象物１１とによって囲まれた空間を、大気圧よりも低い低圧状態にできる。これにより、吸着孔４１に観察対象物１１を吸着させることができる。
【００２８】
図４に示すように、吸着孔４１の断面（基部２１の高さ方向（Ｚ方向）で切った断面）の図形は台形であることが好ましい。この構成によれば、観察対象物１１を透明部材３１側に吸着しやすくなる。なお、吸着孔４１の断面図形は、これに限定されない。例えば、吸着孔４１の壁面４１ａが曲線形状の断面を有してもよい。
【００２９】
図４に示すように、第１開口部４２及び第２開口部４３の外縁が形成する図形（以下、「外縁図形」という）は、円形である。第１開口部４２及び第２開口部４３の外縁図形は、特に限定されず、円（円形、略円形、楕円形などを含む）の形状でもよいし、三角形又は四角形等の多角形の形状でもよい。外縁図形は、好ましくは円形である。なお、第１開口部４２の外縁図形と第２開口部４３の外縁図形とが異なってもよい。
【００３０】
本実施形態の特徴として、吸着孔４１の第１開口部４２の開口幅Ｗ１は、第２開口部４３の開口幅Ｗ２よりも大きい。第１開口部４２及び第２開口部４３の外縁図形が円形である場合、「開口幅」とは、円の直径をいう。第１開口部４２及び第２開口部４３の外縁図形が三角形又は四角形等の多角形である場合、「開口幅」とは、図形の外縁の任意の２点間の最大距離をいう（例えば、四角形の場合、対角線の長さである）。
【００３１】
また、図４に示すように、上面視において、第１開口部４２の外縁図形の面積が、第２開口部４３の外縁図形の面積よりも大きくなるように構成されている。
【００３２】
第２開口部４３の開口幅Ｗ２は、好ましくは、第１開口部４２の開口幅Ｗ１の０．４倍以上であり、より好ましくは、第１開口部４２の開口幅Ｗ１の０．５倍以上である。
【００３３】
また、図４の示す吸着孔４１の壁面４１ａと第１開口部４２の開口面（円錐台の底面）とがなす角度をθとしたとき、ｔａｎθは、好ましくは、２以下であり、より好ましくは、１．５以下である。また、ｔａｎθは、好ましくは、０．５以上であり、より好ましくは、０．７以上である。
【００３４】
吸着孔４１の高さ（基部２１の底面の高さＨ１＋突出部２４の高さＨ２）は、観察対象物１１を透明部材３１に吸着させ易くするために、できるだけ小さい方が良い。吸着孔４１の高さは、好ましくは、５ｍｍ以下であり、より好ましくは、３ｍｍ以下である。
【００３５】
本実施形態の効果を説明する。図５は、本開示の一実施形態に係るスタビライザー１５を使用した場合の吸着状態を説明する図である。本実施形態のスタビライザー１５の場合では、動く観察対象物１１（ラットの心臓）は第２開口部４３の位置まで引き込まれ、透明部材３１に十分に吸着された（図５（ｂ）の状態）。本実施形態のスタビライザー１５を用いた場合、心臓の組織と対物レンズ１３との間の距離を一定に保つことができ、動く観察対象物１１をリアルタイムに観察することができた。
【００３６】
図６は、比較例のスタビライザーを使用した場合の吸着状態を説明する図である。比較例のスタビライザー６０は、円柱状の空間を形成する吸着孔６１を有する。すなわち、スタビライザー６０において、観察対象物１１側に開口する第１開口部６２の開口幅Ｄ１と、対物レンズ１３側に開口する第２開口部６３の開口幅Ｄ２が同じ幅である。比較例のスタビライザー６０では、組織の硬さが吸引力に勝るため、観察対象物１１を第２開口部６３の位置まで引き込めず、透明部材３１への吸着が不十分であった（図６（ｂ）の状態）。結果として、心臓の組織と対物レンズ１３との間の距離が変動してしまい、リアルタイムでの観察はできなかった。
【００３７】
［実験例１］
次に、実験例１について説明する。全身麻酔下のGFP-ラットに気管挿管した上で開胸し、生きたまま心臓表面を露出させた。この実験例に使用したスタビライザー１５において、Ｗ１は１０ｍｍであり、Ｗ２は６ｍｍである。また、基部２１の底面の高さＨ１は１．４ｍｍであり、突出部２４の高さＨ２は１．６ｍｍであり、すなわち、吸着孔４１の高さ（Ｈ１＋Ｈ２）は３ｍｍであった。また、１ｍｍ径の真鍮パイプをパイプ孔２４ｂを介して吸着孔４１に接続した。
【００３８】
スタビライザー１５の第１開口部４２をラットの心臓表面に押し付けた状態でステージ１２に固定した。その後、吸引ポンプ１７を作動させることにより、透明部材３１（カバーガラス）に心臓表面を吸着させた。当該吸着状態において、二光子顕微鏡（A1R MP+, Nikon）を用いて超高速レゾナントモードで心臓を撮影した(25倍水浸対物レンズ、CFI Apo 25xW MP, Nikon)。その結果、サルコメア構造を有する心臓組織が拍動する様子をリアルタイムで観察することができた。
【００３９】
［実験例２］
実験例２について説明する。冠状動脈（左前下行枝）を結紮し、虚血モデルラットを作成した。５分後に血流を再開させて、虚血再灌流モデルラットとした。このラットを用いて、実験例１と同様のスタビライザー１５及び方法で、心臓組織内の細胞をリアルタイムで観察した。その結果、時間経過に伴い心臓組織中の細胞が死んでいき、GFPの蛍光強度が弱くなっていくことが観察できた。さらに、白血球が凝集していく様子も観察することができた。
【００４０】
本実施形態によれば、動く観察対象物１１の観察領域を透明部材３１側に十分に吸着し、かつ、その吸着状態を維持でき、観察時に観察対象物１１と対物レンズ１３との間の距離を一定に保つことができる。これにより、リアルタイムで安定して観察対象物１１の挙動を観察することが可能となる。これにより、例えば、心臓内の細胞のintravital imagingが可能となり、新規治療薬の薬物動態の解析や不整脈のメカニズム解明などにつながると考えられる。
【００４１】
なお、本開示は上述した実施形態に限定されるものではなく、他の様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施形態は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることがあり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００４２】
上述の実施形態では、基部２１が１つの吸着孔４１を備える構成を説明したが、基部２１に２つ以上の吸着孔が設けられてもよい。
【００４３】
上述の実施形態では、対物レンズ１３を観察対象物１１に近づけるために、基部２１が第１凹部２５を備えているが、これに限定されない。基部２１が必ずしも第１凹部２５を備える必要はなく、スタビライザー１５の基部２１は、観察対象物１１を吸着させるための吸着孔を少なくとも備えていればよい。
【００４４】
上述の実験例でのＷ１、Ｗ２、Ｈ１、Ｈ２の数値は、一例であり、これに限定されない。これらの数値は、観察対象物１１の大きさなどに合わせて適宜設定されればよい。
【符号の説明】
【００４５】
１０    …多光子励起顕微鏡
１１    …観察対象物
１２    …ステージ
１３    …対物レンズ
１４    …顕微鏡ユニット
１５    …スタビライザー
１６    …パイプ
１７    …吸引ポンプ
１８    …ネジ棒
１９    …ナット
２１    …基部
２２    …第１支持部
２３    …第２支持部
２４    …突出部
２５    …第１凹部
２６    …第２凹部
３１    …透明部材
４１    …吸着孔
４２    …第１開口部
４３    …第２開口部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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