(57)【要約】【課題】グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）を含む組成物、およびこれを利用してがん転移の形成を減少させるまたは阻止するための方法を提供すること。【解決手段】本組成物は、局部局所送達用に製剤化してもよい。本組成物はがん抗原を実質的に含まなくてもよい。ＧＬＡによる処置は、ＣＯＸ２阻害剤およびベータ−アドレナリン遮断剤による処置と組み合わせることができる。一部の実施形態に従うと、本発明は、ＧＬＡの局部局所送達を使用した転移進行の減少または阻止を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願との相互参照
本出願は、２０１３年６月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８３０，６７５号に対する優先権の利益を主張する、２０１４年４月１８日に出願された米国特許出願第１４／２５６，８８１号に対して優先権の利益を主張し、これら全てはその全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、グルコピラノシル脂質アジュバント（例えば、ＧＬＡ、または短いＳＬＡなど）を単独でまたはＣＯＸ２阻害剤およびベータ−アドレナリン遮断剤と組み合わせて使用した転移進行の減少またはさらに阻止に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんの早期発見および治療的介入における改善にもかかわらず、全体的ながん生存率はこの１０年来著しく改善されてはおらず、大部分の固体悪性腫瘍において転移は依然として死亡の主な原因である。
【０００４】
原発腫瘍摘除術の周術期の期間、すなわち、外科手術直前、外科手術中および外科手術後の期間には、長期的ながん再発に対するいくつかの注意が払われていないリスクファクターが隠されており、したがって、既に存在する微小転移が激増することおよび新しい転移が開始することに対する高いリスクにより特徴付けられることが最近になって認識された。これら周術期のリスクの大部分は、原発腫瘍の外科的除去により誘発される様々な擾乱によるものであり、これは、いくつかの機序を介して、既に存在する微小転移の進展および新しい転移の開始を促進すると考えられており、これらの機序の一部がごく最近になって特定された。
【０００５】
多くの可溶性因子が、（ｉ）原発腫瘍の存在、（ｉｉ）生理学的および心理的ストレス、ならびに（ｉｉｉ）外科手技自体およびそれに付随する麻酔、鎮痛、輸血ならびに他の手術中の手技に対する患者の神経内分泌応答およびパラクリン応答の結果、周術期の期間中に全身的に増加する。これら可溶性化合物として、カテコールアミン、プロスタグランジン、グルココルチコイド、オピオイド、および投与された様々な麻酔剤および鎮痛剤が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてこれらの因子の多くは悪性細胞に直接作用し、腫瘍細胞増殖、接着、移動運動、細胞外マトリクス侵入能力、アポトーシスおよびアノイキスへの抵抗性、および血管新生促進因子の分泌を含む、腫瘍の転移活性に対して極めて重要であるいくつかの分子プロセスを活性化することが近年明らかとなった。さらに、ｉｎ
ｖｉｔｒｏならびにヒトおよび動物でのｉｎ  ｖｉｖｏの試験は、これらの可溶性因子の多くが、抗転移性細胞媒介免疫（ＣＭＩ）の抑制をもたらすことを示しており、実際これは一般的な周術期の現象である。
【０００６】
ＣＭＩ、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、手術前でも抑制され、手術後にはかなり抑制され、その抑制の程度は、外科手術による外傷および組織損傷の程度に対応する。とりわけ、ＣＭＩの抑制は、動物モデルにおいて、がん転移の促進を媒介する原因として示されており、臨床研究により、これは転移進行に対する感受性の増加と関連付けられた。
【０００７】
悪性組織を減少させるおよび／またはＣＭＩの抑制を阻止することを目的とする様々な処置の中で、がん患者における免疫療法はこの１０年で再び勢いを得た。具体的には、１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）および炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）は、ＣＭＩを顕著に増強することが公知であり、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの悪性細胞の根絶に重大な役割を果たしている。免疫刺激手法（ＩＳＡ）では、病原体関連の分子パターン（例えばＬＰＳ、ＣｐＧ）を含有する天然もしくは合成化合物、またはこれらの化合物が誘発する炎症誘発性／Ｔｈ１サイトカインを含む、確立した生物学的応答調節物質（ＢＲＭ）が一般的に利用される。
【０００８】
しかし、抗腫瘍ＩＳＡを利用した動物試験は前途有望な結果を示したものの、がん患者での臨床研究は、概して、あまり良い結果ではなかった。動物モデルにおいてヒトがんの進行を刺激する上でのいくつかの問題がこの乖離の根底にあることが示唆され、大部分は移植されたがん組織と宿主の生理機能の生物学における差に焦点を合わせ、これには、移植された組織に対する免疫感受性および適合性が含まれた。免疫抑制効果を誘発することが公知であり、がん患者を特徴付ける心理学的および生理学的状態から生じ、動物モデルでは存在しないストレス応答、もまたこの乖離の根底にあることが示唆された。
【０００９】
Ｎｅｅｍａｎら、（２０１２年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８巻（１８号）：４８９５〜９０２頁は、ベータ−アドレナリン作動性遮断およびＣＯＸ−２阻害を同時に使用してカテコールアミンおよびプロスタグランジンを周術期の標的とすることによって、術後のがん再発を減少させる手法について記載している。
【００１０】
Ａｖｒａｈａｍら、（２０１０年）Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  Ｉｍｍｕｎ．、２４巻（６号）：９５２〜８頁は、手術後の免疫抑制を阻止して術後の腫瘍進行を減少させる免疫刺激療法と内分泌遮断剤の薬理学的介入との統合について記載している。
【００１１】
周術期の期間の重要性が認識され、ＩＳＡを利用した動物試験において前途有望な結果が明らかとなったにもかかわらず、恐らく、手術という状況で命にかかわる感染症の徴候が、ＩＳＡの予想される発熱作用および有害作用と区別できないことから、免疫刺激性療法は、周術期の期間中に患者にほとんど利用されていない。本手法を試みた比較的少ない治験では、単一のＴｈ１（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）または炎症促進性（例えば、ＩＦＮ−α）サイトカインが利用され、白血球減少症、パフォーマンスステータスの悪化、発熱、嘔吐、および精神的抑うつを含む、これらの療法に対する重篤な有害反応が実際に報告された。病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）に基づく最近のＦＤＡ認可合成薬剤は、有効な、自己制御された、内因性の、複数のサイトカイン応答を誘発するが、有害反応を著しく少なくしか引き起こさないことが示されている。このようなＩＳＡとして、グルコピラノシル脂質アジュバントと呼ばれるＴＬＲ−４アゴニスト（ＵＳ８，２７３，３６１およびＷＯ２０１０／１４１８６１においてＧＬＡとして開示された）が挙げられ、これはＴ、Ｂ、および樹状細胞を活性化する。
【００１２】
ＵＳ８，２７３，３６１は、実質的に均質な化学物質形態で提供される、合成グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）の有用な免疫学的アジュバント特性の発見に基づき、免疫応答を誘発または向上させるためのワクチンおよび医薬組成物を含む組成物および方法を開示している。ＧＬＡならびに１種または複数の抗原、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、コアジュバントおよび担体、例えば、薬学的担体などを含むワクチンおよび医薬組成物もまた提供される。
【００１３】
ＷＯ２０１０／１４１８６１は、化合物、特に、交互の化学構造および特性を有するグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）化合物を開示している。免疫応答を誘発または向上するための医薬組成物、ワクチン組成物、および関連する方法もまた開示されている。
転移の進行に対するより有効な処置の必要性が依然として存在する。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、これらの全体がすべての目的のため、参照により本明細書に援用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第８，２７３，３６１号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１４１８６１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｎｅｅｍａｎら、（２０１２年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８巻（１８号）：４８９５〜９０２頁
【非特許文献２】Ａｖｒａｈａｍら、（２０１０年）Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  Ｉｍｍｕｎ．、２４巻（６号）：９５２〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）を使用してがん転移の形成を減少または阻止するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態に従うと、本発明は、ＧＬＡの局部局所送達を使用した転移進行の減少または阻止を対象とする。一部の実施形態に従うと、ＧＬＡは、がん抗原（規定のペプチド、タンパク質、またはペプチド、タンパク質もしくはフラグメントの混合物としてであろうと、あるいは不活化または改変したがん細胞調製物としてであろうと）の同時投与を行うことなく使用される。一部の実施形態に従うと、ＧＬＡはＣＯＸ２阻害剤およびベータ−アドレナリン遮断剤と組み合わせる。
【００１７】
本発明は、処置すべき腫瘍に隣接する空間もしくは空洞、あるいは代わりに、処置すべき腫瘍の排出リンパ節に隣接する空間もしくは空洞、または直接的に排出リンパ節へのＧＬＡの局部局所送達を初めて開示する。ＧＬＡのこのような局部局所送達はまた、原発腫瘍の除去後に、腫瘤の摘除術後に形成される空間または空隙に実施することもできる。したがって、本発明は、処置転帰を改善するための、より制御された方式でのＧＬＡ投与を提供する。有利には、局部局所送達は、活性成分のより持続した効果を提供することができる。さらに、ＧＬＡの局部局所送達は、ＧＬＡのより低い全身投薬量、およびがんの設定において全身性送達に関連し得る有害な副作用の減少を可能にすることができる。
【００１８】
本発明は、がん抗原、例えば、処置を受ける対象の腫瘍に由来する抗原、処置を受ける対象の腫瘍の種類に関連することが公知の抗原もしくは抗原を含有する抗原組成物、あるいは患者もしくは患者規定の腫瘍の混合物からの腫瘍細胞の投与物または腫瘍細胞の調製物に由来する抗原の調製物などの共投与を行うことなく、がん転移に対してＧＬＡを使用すること（したがって、がんワクチンのための組成物という状況でのＧＬＡの投与とは異なる）をさらに開示している。有利なことに、本発明において、ＧＬＡのこのような使用は、がんに特異的な抗原が同定されているがんの種類に限定されない。
【００１９】
一部の実施形態では、ＧＬＡは、腫瘍切除手術後の固形腫瘍の転移の阻止のために利用される。手術前および手術後に投与されたＧＬＡが、転移進行の有効な阻害を達成することが現在開示されている。
【００２０】
本発明は、ＧＬＡ処置を、ベータ−アドレナリン遮断剤および／またはＣＯＸ２選択的阻害剤での処置と組み合わせて、転移阻害の転帰をさらに最適化することができることをさらに開示している。任意の特定の理論または作用機序に束縛されることなく、ベータ−アドレナリン遮断剤とＣＯＸ２阻害剤の組合せは、がん患者に生じ得るストレス誘発性免疫抑制に対抗し、したがってＧＬＡの効力の改善をもたらすことが企図される。本明細書で開示されている活性成分の組合せは、少なくとも相加的に、好ましくは相乗的に作用する。
【００２１】
一態様では、本発明は、がんを有する対象を処置する方法であって、該方法は、活性成分としてグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該投与は、がんを処置するのに有効である方法を提供する。
【００２２】
１つの態様によると、本発明は、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法であって、該方法は、活性成分としてグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該投与は、転移を減少させるまたは阻止するのに有効である方法を提供する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「転移」、「がんの転移」または「腫瘍の転移」という用語は、交換可能に使用され、１つの器官または組織に位置する原発性がん性腫瘍由来のがん性細胞が、別の、隣接しない器官または組織において成長することを指す。転移はまた微小転移も包含し、微小転移とは、元の原発性がん性腫瘍の器官に直接つながりのない器官または身体の部分における検出不能な量のがん性細胞の存在である。転移はまた、プロセスのうちのいくつかのステップ、例えば、元の腫瘍部位からのがん細胞の離脱、ならびに身体の他の部分へのがん細胞の遊走および／または侵入などとして定義することもできる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「転移進行の減少または阻止」とは、転移の拡散、進行および成長を遅延させるまたはさらに完全に阻害することを指す。この用語はまた、器官または組織内における転移の数を減少させること、ならびに本発明の組成物によって処置すべき既存のがんのサイズ、数または悪性腫瘍状態を減少させることも含み得る。当業者であれば理解しているように、転移進行の減少または阻止は、当技術分野で公知の様々な放射線写真、画像化、循環する腫瘍マーカー、動悸、直接測定または観察技術により測定した場合の腫瘍のサイズまたは数の減少を含む当技術分野で公知の標準的方法により測定することができる。したがって、転移進行の減少または阻止はまた、処置するがんの疾患状態に関連する徴候もしくは症状の減少、あるいは生存の延長または処置するがんの疾患の徴候もしくは症状の苦痛の減少により測定することができる。
【００２５】
一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩は局部局所送達で投与される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「局部局所送達」は、処置すべき腫瘍に隣接する空間もしくは空洞への送達、または処置すべき腫瘍の排出リンパ節に隣接する空間もしくは空洞、または直接的に排出リンパ節への送達を示す。腫瘍切除手術後に投与される場合、局部局所送達は、腫瘤の除去後に形成された空間または空隙への送達を含む。局部局所投与は、単一もしくは複数の局部局所空間への単回注射により、または同時もしくは少なくとも約１分間、数分間、数時間、数日もしくは数週間という期間にわたり与えられる一連の注射として実施することができる。本明細書で使用する場合、局部局所送達は、腫瘍内投与を含まない。さらに、局部局所投与は、医薬組成物が対象の体の外部表面に適用される局所的投与は含まない。
【００２７】
一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩はがん抗原なしで投与される。
【００２８】
一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩を含む、投与される医薬組成物はがん抗原を実質的に含まない。
【００２９】
「実質的に含まない」とは、本明細書で使用する場合、約１％未満、好ましくは約０．１％未満、約０．０１％（ｗ／ｗ）未満、約０．００１％（ｗ／ｗ）未満を指す。
【００３０】
一部の実施形態では、本方法は、腫瘍切除手術後に、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するために使用される。一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩は前記腫瘍切除手術の周術期の期間中に投与される。
【００３１】
「周術期の期間」とは、手術の直前、手術中および手術直後の期間を指す。これは、患者が手術のために準備している手術前の時間（「術前期間」）、これに続いて手術に費やされる時間（「術中期間」）および患者は回復中であり、通常合併症についてモニターされる手術後の時間（「術後期間」）を含む。周術期の期間は、病院、外科センターおよび／またはヘルスケアプロバイダーオフィスにおいて生じ得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、周術期の期間とは典型的には、腫瘍切除手術の２〜１０日前に始まり、前記手術の１４〜２１日後に終わる期間、例えば、手術の４〜５日前に始まり、手術の約１４日後に終わる期間、または手術の７日前に始まり、手術の約７日後に終わる期間を指す。
【００３３】
一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩は、手術前に少なくとも１回（例えば２回、３回、４回またはそれ超）投与される。一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩は、手術後に少なくとも１回（例えば２回、３回、４回またはそれ超）投与される。一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩は、手術前と手術後の両方に投与される。
【００３４】
ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩が複数回投与される一部の実施形態では、これは一定の用量で投与される。これらの実施形態にしたがえば、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩が投与されるたびに、これは同じ用量で投与される。ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩が複数回投与される他の実施形態では、これは変動する用量で投与される。これらの実施形態にしたがえば、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩の投与される用量は、処置期間全体を通して変動する。
【００３５】
一部の実施形態では、ＧＬＡは、以下の構造式（Ｉ）：
【化１】
2018162316.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０アルキルである）を有する。
【００３６】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４は、トリデシルである。
【００３７】
一部の実施形態では、ＧＬＡは、以下の構造式（ＩＩ）：
【化２】
2018162316.tif 000003
（式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、存在しないかまたは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ８〜Ｃ１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ６〜Ｃ１１アルキルである）を有する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるＧＬＡアジュバントは、以下の構造式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018162316.tif 000004
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである）を有し得る。
【００３９】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１１〜１４アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１２〜１５アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００４０】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１３アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００４１】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ９アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００４２】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（ＩＶ）：
【化４】
2018162316.tif 000005
を有する。
【００４３】
上記ＧＬＡ構造（式ＩＶ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルである。
【００４４】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（Ｖ）：
【化５】
2018162316.tif 000006
を有する。
【００４５】
上記ＧＬＡ構造（式Ｖ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルである。
【００４６】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（ＶＩ）：
【化６】
2018162316.tif 000007
を有する。
【００４７】
上記ＧＬＡ構造（式ＶＩ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルである。
【００４８】
ある特定の実施形態では、合成物質ＧＬＡは、以下の構造：
【化７】
2018162316.tif 000008
を有する。
【００４９】
ある特定の実施形態では、合成物質ＧＬＡは、以下の構造：
【化８】
2018162316.tif 000009
を有する。
【００５０】
ある特定の実施形態では、合成物質ＧＬＡは、以下の構造：
【化９】
2018162316.tif 000010
を有する。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明の方法は、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤を投与するステップをさらに含む。
【００５２】
一部の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤の投与は、腫瘍切除手術の周術期の期間中に行う。
【００５３】
一部の典型的な実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤は、別々の医薬組成物中に存在する。
【００５４】
一部の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤またはこれら両方は、手術前に少なくとも１回（例えば２回、３回、４回またはそれ超）投与される。追加的実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤またはこれらの両方は、手術後少なくとも１回（例えば２回、３回、４回またはそれ超）投与される。一部の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤またはこれらの両方は、手術前と手術後の両方に投与される。
【００５５】
一部の実施形態では、ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤は、周術期の期間中の同じ日に投与される。他の実施形態では、これらは別々の日に投与される。
【００５６】
一部の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤は、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール（ｏｘｙｐｒｅｎｏｌｏｌ）、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表している。特定の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤はプロプラノロールまたは薬学的に許容されるその塩である。
【００５７】
一部の実施形態では、ＣＯＸ２阻害剤は、セレコキシブ、シミコキシブ、エトリコキシブ、エトドラク、エオリコキシブ（ｅｏｒｉｃｏｘｉｂ）、ルミラコキシブ、メロキシカム、パレコキシブ、ロフェコキシブ、チラコキシブ、バルデコキシブ、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表している。特定の実施形態では、ＣＯＸ２阻害剤はエトドラクまたは薬学的に許容されるその塩である。
【００５８】
別の態様によると、本発明は、転移進行の減少または阻止における使用のための、活性成分としてＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物であって、がん抗原を実質的に含まない組成物を提供する。
【００５９】
一部の実施形態では、医薬組成物は、唯一の活性成分としてのＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩からなる。
【００６０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、局部局所送達のために製剤化される。
【００６１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍切除手術の周術期の期間中の使用のためのものである。
【００６２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍切除手術の周術期の期間中にベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤と共に使用するためのものである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法であって、該方法は、活性成分としてグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含み、該投与は、転移を減少させるまたは阻止するのに有効である、方法。
（項目２）
前記投与が局部局所送達によるものである、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩を含む前記医薬組成物が、がん抗原を実質的に含まない、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記医薬組成物が、腫瘍切除手術後に、前記対象における転移進行を減少させるまたは阻止するために投与される、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記投与が、前記腫瘍切除手術の周術期の期間中に行われる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記医薬組成物が、前記手術の前（術前）に少なくとも１回投与される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記医薬組成物が、前記手術の後（術後）に少なくとも１回投与される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記医薬組成物が一定の用量で投与される、項目６から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記医薬組成物が変動する用量で投与される、項目６から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＧＬＡが、以下の構造式（Ｉ）：
【化１９】
2018162316.tif 000011
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである）
を有する、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４が、トリデシルである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＧＬＡが、以下の構造式（ＩＩ）：
【化２０】
2018162316.tif 000012
（式中：
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、存在しないかまたは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ８〜Ｃ１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ６〜Ｃ１１アルキルである）を有する、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＧＬＡが、以下の構造：
【化２１】
2018162316.tif 000013
を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ベータ−アドレナリン遮断剤および／またはＣＯＸ２阻害剤を投与するステップをさらに含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記投与するステップが、腫瘍切除手術の周術期の期間中に行われる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤が、別々の医薬組成物中に存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤または両方が、前記手術前（術前）に少なくとも１回投与される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤または両方が、前記手術の後（術後）に少なくとも１回投与される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１９）
ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤を含む前記医薬組成物が、前記周術期の期間中の同じ日に投与される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目２０）
ＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩、ベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤を含む前記医薬組成物が、前記周術期の期間中の別々の日に投与される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目２１）
前記ベータ−アドレナリン遮断剤が、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、項目１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ベータ−アドレナリン遮断剤が、プロプラノロールまたは薬学的に許容されるその塩である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＣＯＸ２阻害剤が、セレコキシブ、シミコキシブ、エトリコキシブ、エトドラク、エオリコキシブ、ルミラコキシブ、メロキシカム、パレコキシブ、ロフェコキシブ、チラコキシブ、バルデコキシブ、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、項目１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＣＯＸ２阻害剤が、エトドラクまたは薬学的に許容されるその塩である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
活性成分としてＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物であって、転移進行の減少または阻止における使用のための、医薬組成物。
（項目２６）
がん抗原を実質的に含まない、項目２５に記載の医薬組成物。
（項目２７）
活性成分としてのＧＬＡまたは薬学的に許容されるその塩からなる、項目２５または２６に記載の医薬組成物。
（項目２８）
局部局所送達のために製剤化されている、項目２５から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目２９）
腫瘍切除手術の周術期の期間中の使用のためのものである、項目２５から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３０）
腫瘍切除手術の周術期の期間中にベータ−アドレナリン遮断剤および／またはＣＯＸ２阻害剤と共に使用するためのものである、項目２５から２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３１）
前記ＧＬＡが、以下の構造式（Ｉ）：
【化２２】
2018162316.tif 000014
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである）
を有する、項目２５から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４が、トリデシルである、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３３）
前記ＧＬＡが、以下の構造式（ＩＩ）：
【化２３】
2018162316.tif 000015
（式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、存在しないかまたは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は、酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ８〜Ｃ１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じであるかまたは異なり、かつ独立して、Ｃ６〜Ｃ１１アルキルである）
を有する、項目２５から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記ＧＬＡが、以下の構造：
【化２４】
2018162316.tif 000016
を有する、項目２５に記載の医薬組成物。
【００６３】
本発明のこれらおよびさらなる態様および特徴は、以下に続く図、詳述された記載、実施例および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、雄のラットにおける、エピネフリンを使用した場合（図１Ａ）またはエピネフリンを使用しなかった場合（図１Ｂ）のＭＡＤＢ１０６  ＬＴＲに対するＧＬＡの効果の用量曲線である。図１Ａでは、ｎ＝３８；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０００１；＃アジュバントとの差、ｐ＜０．０５。図１Ｂでは、ｎ＝３７；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０５；＃アジュバントとの差、ｐ＜０．０５。
【００６５】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、雄のラット（図２Ａ）および雌のラット（図２Ｂ）におけるＧＬＡ効果の開始および持続時間についての時間経過である。図２Ａでは、ｎ＝７９；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０５；＊＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０００１；＃アジュバントとの差、ｐ＜０．０５。図２Ｂでは、ｎ＝９３；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０５；＃アジュバントとの差、ｐ＜０．０５。
【００６６】
【図３】図３は、ラットの肺におけるＭＡＤＢ１０６の転移の進行に対するＧＬＡの効果である。ｎ＝８６（雌４４匹）；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０５；＃アジュバントとの差、ｐ＜０．０１。
【００６７】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、未処置の動物とＮＫ枯渇させた動物と対比した場合（図４Ａ）および未処置の動物のみの場合（図４Ｂ）のＭＡＤＢ１０６  ＬＴＲに対するＧＬＡの効果である。図４Ａでは、「枯渇なし」について：ｎ＝２５；＊ＰＢＳとの差、ｐ＜０．０１；「枯渇」について：ｎ＝２７；群間差は明らかではなかった。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本発明は、転移形成の減少またはさらに阻止を対象とする。本明細書で開示されている手法は、ＧＬＡでの免疫刺激に基づく。ＧＬＡは、ＣＯＸ２阻害剤およびベータ−アドレナリン遮断剤と任意選択で組み合わせることができる。
医薬組成物
【００６９】
一態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種のＧＬＡ化合物を、薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。別の態様では、本発明の医薬組成物は一般的に、少なくとも１種のＧＬＡ化合物、ベータ−アドレナリン遮断剤、例えば、プロプラノロールなど、またはＣＯＸ２選択的阻害剤、例えば、エトドラクなどを、薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤と組み合わせて含む。本明細書に記載されている活性剤の薬学的に許容される塩もまた本発明の範囲内である。「薬学的に許容される塩」は、このような化合物と、有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）または有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）との組合せに由来する本明細書に記載されている化合物の塩を指す。本発明の組成物は、遊離塩基または塩の形態のいずれかで使用することができ、両方の形態が本発明の範囲内にあるとみなされる。
グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）：
【００７０】
ＧＬＡは、合成のＴＬＲ−４アゴニストであり、宿主における免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答を導き出すことが可能である。ＧＬＡは、完全に合成物質であること、ならびに規定の数、長さ、および位置の炭素鎖を有することにより、ＬＰＳ、ＭＰＬおよび３−ＤＭＰＬなどの他のＴＬＲ−４アゴニストとは異なる。ＧＬＡは効率的なＴｈ１活性化を導き出すことが可能である一方、最小のＴｈ２有害作用しか引き起こさない。ＧＬＡを含む組成物は、例えば、ＵＳ８，２７３，３６１およびＷＯ２０１０／１４１８６１に記載されている。
【００７１】
本発明の組成物と共に使用するためのＧＬＡ分子は、（ｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン１位と、還元末端グルコサミンのヘキソサミン６位との間のエーテル結合を介して非還元末端グルコサミンに結合した還元末端グルコサミンを有するジグルコサミン骨格と、（ｉｉ）非還元末端グルコサミンのヘキソサミン４位に結合したＯホスホリル基と、（ｉｉｉ）６つまでの脂肪族アシル鎖とを含み、脂肪族アシル鎖の１つがエステル結合を介して還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合し、脂肪族アシル鎖の１つがアミド結合を介して非還元末端グルコサミンの２−アミノに結合し、エステル結合を介して１２個超の炭素原子のアルカノイル鎖に結合したテトラデカノイル鎖を含み、脂肪族アシル鎖の１つが、エステル結合を介して非還元末端グルコサミンの３−ヒドロキシに結合し、エステル結合を介して１２個超の炭素原子のアルカノイル鎖に結合したテトラデカノイル鎖を含む。ＧＬＡは典型的には３’−ｄｅ−Ｏ−アシル化されていない。
【００７２】
本明細書で使用する場合、ＧＬＡは、以下の構造式（Ｉ）：
【化１０】
2018162316.tif 000017
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルである）を有し得る。
【００７３】
ある特定の実施例は、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４が、トリデシルであるＧＬＡである。
【００７４】
加えて、ＧＬＡは、本明細書で使用する場合、以下の構造式（ＩＩ）：
【化１１】
2018162316.tif 000018
（式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６は、同じであるかまたは異なり、かつ、独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じであるかまたは異なり、かつ、独立して、存在しないかまたは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じであるかまたは異なり、かつ、独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、同じであるかまたは異なり、かつ、独立して、Ｃ８〜Ｃ１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じであるかまたは異なり、かつ、独立して、Ｃ６〜Ｃ１１アルキルである）を有し得る。
【００７５】
使用することができる適切なＧＬＡ分子の例は、上記に述べられたＷＯ２０１０／１４１８６１および米国特許第８，７２２，０６４号に記載されている。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用されているＧＬＡアジュバントは、以下の構造式（ＩＩＩ）：
【化１２】
2018162316.tif 000019
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである）を有し得る。
【００７７】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１１〜１４アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１２〜１５アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００７８】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１３アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００７９】
より特定の実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ９アルキルである、上に記載された式ＩＩＩを有する。
【００８０】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（ＩＶ）：
【化１３】
2018162316.tif 000020
を有する。
【００８１】
上記ＧＬＡ構造（式ＩＶ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルである。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（Ｖ）：
【化１４】
2018162316.tif 000021
を有する。
【００８３】
上記ＧＬＡ構造（式Ｖ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９アルキルである。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡは合成物質であり、以下の構造式（ＶＩ）：
【化１５】
2018162316.tif 000022
を有する。
【００８５】
上記ＧＬＡ構造（式ＶＩ）のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【００８６】
ある特定の実施形態では、合成ＧＬＡは、以下の構造：
【化１６】
2018162316.tif 000023
を有する。
【００８７】
ある特定の実施形態では、合成ＧＬＡは、以下の構造：
【化１７】
2018162316.tif 000024
を有する。
【００８８】
ある特定の実施形態では、合成ＧＬＡは、以下の構造：
【化１８】
2018162316.tif 000025
を有する。
【００８９】
「アルキル」とは、１〜２０個の炭素原子を含有し、ある特定の好ましい実施形態では、１１〜２０個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝の、非環式または環式の、不飽和または飽和の脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとして、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ、例えば、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどが挙げられる一方で、飽和分枝のアルキルとして、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとして、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる一方で、不飽和の環式アルキルとして、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。環式アルキルはまた、本明細書で「単素環」または「単素環式環」とも呼ばれる。不飽和アルキルは、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの２重または３重結合を含有する（「アルケニル」または「アルキニル」とそれぞれ呼ばれる）。代表的な直鎖および分枝アルケニルとして、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる一方で、代表的な直鎖および分枝アルキニルとして、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが挙げられる。
【００９０】
「酸官能基」とは、水媒体中でプロトンを供与することが可能な官能基を意味する（すなわちブレンステッド−ローリー酸）。プロトンを供与した後、酸官能基は、負に帯電した種（すなわち、酸官能基の共役塩基）となる。酸官能基の例として、これらに限定されないが：−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（ホスフェート）、−ＯＳ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（スルフェート）、−ＯＳ（ＯＨ）２（スルファイト）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボキシレート）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（アスパルテート）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（スクシネート）、および−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（カルボキシメチルホスフェート）が挙げられる。
【００９１】
ＧＬＡは商業的に得られる。ＧＬＡの合成のための方法は、例えば、上記に述べられたＷＯ２０１０／１４１８６１および米国特許第８，７２２，０６４号に提供されている。
【００９２】
ＧＬＡ製剤は、実質的に均質な形態で調製することができ、この均質な形態とは、ＧＬＡ分子について、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の純度のＧＬＡ調製物を指す。所与のＧＬＡ調製物の純度の程度の決定は、適当な分析化学的方法、例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析および／または核磁気共鳴分析などを用いて、当業者により容易に行われ得る。
【００９３】
本発明のＧＬＡを含む医薬組成物は、好ましくはがんに特異的な抗原を実質的に含まず、免疫応答、例えば、非特異的免疫応答を刺激するために対象に投与される。
【００９４】
「実質的に含まない」とは、本明細書で使用する場合、約１％未満、好ましくは約０．１％未満、約０．０１％未満（ｗ／ｗ）、約０．００１％未満（ｗ／ｗ）を指す。
【００９５】
「約」という用語は、測定可能な値、例えば量などについて言及している場合、特定された値から＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、さらにより好ましくは＋／−１％、なおより好ましくは＋／−０．１％のばらつきを包含するように本明細書で使用されており、よってばらつきは意図した目的を達成するのに適当である。
【００９６】
ＧＬＡは、好ましくは安定エマルジョンに製剤化することができる。一つの特定の実施形態では、例えば、がん抗原を実質的に含まない安定エマルジョン内にＧＬＡを含む組成物が提供される。エマルジョン系として、当技術分野で公知のような単相または多相のエマルジョン系が挙げられる。
【００９７】
一部の実施形態では、組成物は、水中油型エマルジョンの形態である。他の実施形態では、組成物は油中水型エマルジョンの形態である。さらに他の実施形態において、組成物は微小粒子の形態である。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は水中油型のエマルジョンを含み、ＧＬＡは油相内に組み込まれている。
【００９９】
任意の水中油型組成物がヒト投与に適切なものとなるためには、エマルジョン系の油相が代謝可能な油を含むことが好ましい。代謝可能な油という用語の意味は当技術分野では周知である。代謝可能とは、「代謝により変換することが可能である」と定義することができる。油は、任意の植物油、魚油、動物性油脂または合成油であってよく、レシピエントに対して毒性がなく、代謝により変換可能なものである。ナッツ（例えば、ピーナッツ油など）、種子、および穀粒が植物油の一般的な原料である。合成油もまた本発明の一部であり、市販の油、例えば、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）およびその他を含むことができる。適切な油の非限定的例はスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）である。
【０１００】
本発明の油エマルジョン調製物は、抗酸化剤、例えば、油のα−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）を含み得る。
【０１０１】
ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、スクアレン、α−トコフェロール、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０に基づくエマルジョンアジュバント組成物を開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、ステロールを油相に添加することによる、これらのスクアレンエマルジョンに対する改良を開示している。さらに、トリグリセリド、例えば、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などを、エマルジョンを安定化させるために油相に添加することができる（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０１０２】
安定した水中油エマルジョン内に見出される油滴のサイズは、フォトン相関関係分光法で測定した場合、好ましくは約１ミクロン未満であり、約３０〜６００ｎｍ、好ましくは約３０〜５００ｎｍほどの直径、そして最も好ましくは約１５０〜５００ｎｍの直径の範囲、特に約１５０ｎｍの直径であってよい。この関連で、好ましくは、数で約８０％の油滴が好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは約９０％超、最も好ましくは約９５％超の油滴（数）が規定のサイズ範囲内にあるべきである。本発明の油エマルジョン中に存在する構成部分の量は慣例的に約２〜１０％の範囲の油、例えば、スクアレンなど；存在する場合、約２〜１０％のアルファトコフェロール；約０．３〜３％の界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどである。好ましくは、油：アルファトコフェロールの比は、より安定したエマルジョンが得られるので、１と等しいかまたはそれ未満である。Ｓｐａｎ８５もまた約１％のレベルで存在してもよい。ある場合には、本発明のＧＬＡ組成物が安定剤をさらに含有するのが有利であり得る。
【０１０３】
水中油型エマルジョンを生成する方法は当業者には周知である。一般的に、この方法は、油相を、界面活性剤、例えば、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などと混合するステップ、これに続いてホモジナイザーを使用してホモジナイズするステップを含む。例えば、混合物をシリンジ針に１回、２回またはそれ超、通すステップを含む方法は、少容量の液体をホモジナイズするのに適切である。同等に、マイクロフルダイザーにおける乳化プロセス（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス機器、最大５０通路、６バールの最大圧力インプットで２分間（約８５０バールの出力圧力））は、より少量またはより大量のエマルジョンを生成するように適応させることができた。この適応は、必要とされる直径の油滴を有する調製物が達成されるまで、生成したエマルジョンを測定することを含むルーチン実験により達成することができた。
【０１０４】
ＧＬＡの例示的用量は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約６０μｇ／ｋｇ、または約５μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明のＧＬＡを含む医薬組成物は、局部局所送達用に製剤化する。投与の適切な経路の例として、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内が挙げられる。投与の回数および頻度は、宿主の応答に依存することは当業者には明らかである。
ベータ−アドレナリン遮断剤（アンタゴニスト）−例えば、プロプラノロール：
【０１０６】
プロプラノロールは、ＣＡＳ登録番号５２５−６６−６により特定することができる。プロプラノロールは市販されており、当技術分野で公知の方法で合成することもできる。医薬組成物のためには、塩酸プロプラノロールが典型的には使用される。適切な製剤として、例えば、約１０〜８０ｍｇの塩酸プロプラノロールを含有する固体経口投与剤形、約２０〜４０ｍｇ／５ｍｌの塩酸プロプラノロールを含有する液体経口投与剤形、約６０〜１６０ｍｇの塩酸プロプラノロールを含有する持続放出性経口投与剤形、および約１ｍｇ／ｍｌの塩酸プロプラノロールを含有する静脈内注射用液体剤形が挙げられる。
ＣＯＸ２選択的阻害剤−例えば、エトドラク：
【０１０７】
エトドラクは、ＣＡＳ登録番号４１３４０−２５−４により特定することができる。エトドラクは市販されており、当技術分野で公知の方法で合成することもできる。適切な製剤として、例えば、約２００〜５００ｍｇを含有する固体経口投与剤形、約４００〜６００ｍｇを含有する持続放出性経口投与剤形が挙げられる。
【０１０８】
ある特定の状態の処置に有効となる本発明の組成物中の化合物の量は、状態の性質に依存し、標準的臨床技術により決定することができる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ；Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．、Ｏｒａｄｅｌｌ、Ｎ．Ｊ．、１９９５年；およびＤｒｕｇ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ、Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、１９９３年を参照されたい。
【０１０９】
製剤に利用するべき正確な用量はまた、投与経路、および疾患の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況により決定されるべきである。
方法および使用
【０１１０】
本発明の態様に従うと、本発明は、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法を提供する。
【０１１１】
一部の実施形態では、本方法は、活性成分として、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、活性成分としてグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、さらにベータ−アドレナリン遮断剤および／またはＣＯＸ２阻害剤の対象への投与と組み合わせて、対象に投与するステップを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＧＬＡを、単独でまたはベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤と組み合わせて、対象に、局部局所に投与することによって、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍切除することなく、ＧＬＡを、単独でまたはベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤と組み合わせて、対象に、局部局所に投与することによって、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法が提供される。
【０１１３】
一部の実施形態では、腫瘍切除手術の周術期の期間中、ＧＬＡを、単独でまたはベータ−アドレナリン遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤と組み合わせて、対象に投与し、これにより手術後の転移進行を減少させるまたは阻止することにより、腫瘍切除手術後、対象における転移進行を減少させるまたは阻止するための方法が提供される。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＧＬＡは手術前（術前）および手術後（術後）に投与される。一部の実施形態では、ベータ−アドレナリン遮断剤、ＣＯＸ２阻害剤または両方は、手術前（術前）および手術後（術後）に投与される。
【０１１５】
当技術分野で公知のいずれの投与方法も使用することができる。一部の実施形態では、ＧＬＡの投与は典型的には、局部局所送達により実施される。ある特定の状況下、例えば、周術期の期間中、全身投与が使用される。全身投与は、本明細書で使用する場合、静脈内投与を含まない。
【０１１６】
ＧＬＡ投与は、単回の注射または複数回の注射として実施することができる。
【０１１７】
典型的には、本発明の方法は、がん抗原なしでＧＬＡを投与するステップを含む。投与されるＧＬＡの医薬組成物は好ましくはがん抗原を実質的に含まない。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明の方法は、周術期の期間中のベータ−アドレナリン遮断剤とＣＯＸ２阻害剤の共投与をさらに含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＧＬＡは、術前に投与され、その一方でベータ−アドレナリン遮断剤および／またはＣＯＸ２阻害剤は術前および術後に投与される。
【０１２０】
一部の実施形態では、すべての３種の活性成分は手術前と手術後の両方に投与される。
【０１２１】
活性成分のそれぞれの特定の用量、ならびに摘除手術に関するこれらの具体的な投与日は、腫瘍の種類、重症度および患者の全体的状況に基づき医師により決定されるべきである。
【０１２２】
本発明の方法により処置される対象は、固形および非固形腫瘍を含む、がんに悩まされている哺乳動物、典型的にはヒトである。各可能性は本発明の別々の実施形態を表している。一部の実施形態では、対象は、まさに腫瘍摘除術を受けようとしている原発性の固形腫瘍に悩まされているヒトである。対象は、任意の種類の固形悪性腫瘍、例えば、癌、例えば、呼吸器系癌、消化器系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫などに悩まされていることもある。例示的癌として、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭部および頸部、結腸ならびに卵巣の組織から形成するもの、さらに癌肉腫（例えば、癌性および肉腫組織で構成される悪性腫瘍が挙げられる）および腺癌（腺組織由来のものまたは腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するもの）が挙げられる。本明細書で開示されている方法で処置すべき悪性腫瘍の追加の例として、肉腫、すなわち支持的組織または結合組織、例えば骨または軟骨の悪性腫瘍、およびリンパ腫、すなわち、リンパ組織の腫瘍が挙げられる。ある特定の実施形態では、がんの例として、これらに限定されないが、腺癌、リンパ腫、胞胚、黒色腫、および肉腫を含めたがんが挙げられる。このようながんのより具体例として、扁平上皮細胞がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌など）、消化器がん、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、グリア芽細胞腫、子宮頸がん、陰影、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝臓癌および血腫など）、膀胱がん、乳がん、大腸がん、直腸結腸がん、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓がん（例えば、腎臓細胞癌およびウィルムス腫瘍など）、基底細胞癌、黒色腫、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、食道がん、ならびに様々な種類の頭部および頸部がんが挙げられる。
【０１２３】
腫瘍摘除術後の転移の形成は、画像化技術、生検、血液試験などを含む当技術分野で公知の方法を使用して、対象において経過観察することができる。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態をより完全に例示するために提示されている。しかし、これらは、本発明の広い範囲を制限するものであると決して解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく本明細書で開示されている原理の多くの変化形および改変を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１２５】
材料および方法
１．動物
Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設内で、月齢４〜８カ月（実験間で年齢は変動した）の雄および雌のＦｉｓｃｈｅｒ３４４（Ｆ３４４）ラットを、１ケージ当たり３〜４匹ずつ飼育し、１２：１２明暗サイクル、２２±１℃で、食物および水は自由に入手できる状態にした。動物は、実験前、最低４回取り扱うことによって、潜在的な手順上のストレスを減少させた。体重、性別、および薬物投与は、すべての実験手順を通して釣り合いを取った。飼育の状態は、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによりモニターされ、この委員会はまた本明細書に記載されているすべての試験を承認した。
２．薬物
１．ＧＬＡおよびその投与
【０１２６】
安定エマルジョン（ＳＥ）（２０００μｇ／ｍｌ）に溶解させたＧＬＡ（ＩＤＲＩ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を、３μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの最終濃度（関連する実験による）となるようにＰＢＳで希釈した。ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞接種の直前、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、または９６ｈ前（関連する実験による）に、選択された濃度からの１００μｌを各動物（０．３μｇ〜２０μｇ／動物）に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。
２．安定エマルジョン（ＳＥ）／アジュバントエマルジョン
【０１２７】
ＳＥ（安定エマルジョン；ＩＤＲＩ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を希釈し、ＧＬＡのように正確な方式で投与した。
３．抗ＮＫＲ−Ｐ１
【０１２８】
抗ＮＫＲ−Ｐ１は、ラットにおいて、新鮮なＩＬ−２−活性化したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に、またずっと低い程度ではあるが、多形核球（ＰＭＮ）細胞上に発現するＮＫＲ−Ｐ１表面抗原に結合するＩＧｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（元はｍＡｂ３．２．３と呼ばれる）である。抗ＮＫＲ−Ｐ１を用いたラットのｉｎ  ｖｉｖｏでの処置は、ＮＫ細胞を選択的に枯渇させ、ＮＫ依存性および抗体依存性非ＭＨＣ拘束性細胞傷害を排除する。Ｔ細胞機能およびＴ細胞のパーセンテージ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびＰＭＮは影響を受けない。この抗体は（アイソタイプ対照抗体ではそうではない）、投与すると直ちにｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞を無効にし、１日のうちにＮＫ細胞を選択的に枯渇させることが以前に示されている。抗体は、軽いイソフルラン麻酔下で、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞接種と同時にｉ．ｖ．注射した。
３．腫瘍細胞株
１．ＭＡＤＢ１０６
【０１２９】
ＭＡＤＢ１０６は、Ｆ３４４ラットにおいて化学的に誘発させた乳房の腺癌（ＭＡＤＢ１００）の肺への転移から得た選択された変異細胞株である。ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞は肺にしか転移せず、このモデルにおいて、肺腫瘍保持（ＬＴＲ）（これは、数週間後に進行する転移の数を高度に示唆する）はＮＫ細胞に依存する。さらに、ＭＡＤＢ１０６の転移プロセスは、主に接種後最初の２４ｈの間ＮＫ活性に対して感受性があるので、ＬＴＲは、実際の転移数よりもｉｎ  ｖｉｖｏのＮＫ活性レベルをより反映する。湿度１００％、３７℃、５％ＣＯ２において、ＭＡＤＢ１０６細胞株を、完全培地（１０％加熱不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２ｍＭのｌ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｉｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）中の単層培養物中に維持した。トリプシン溶液（ＰＢＳ中０．２５％）により培養物フラスコから細胞を取り出し、完全培地で洗浄した。この細胞株を、肺腫瘍保持のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価と、ＮＫ細胞傷害性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験の両方に使用した。
２．ＹＡＣ−１
【０１３０】
ＹＡＣ−１リンパ腫は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのげっ歯類のＮＫ細胞傷害性の評価のために使用される標準的な標的細胞株である。湿度１００％、３７℃、５％ＣＯ２において、細胞株を完全培地中の懸濁培養物内で維持した。
４．ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の放射標識および肺腫瘍保持率の評価
【０１３１】
０．５μＣｉ／ｍｌの１２５ヨウ化デオキシウリジン（１２５ＩＤＵＲ、Ｄａｎｙｅｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）を細胞培養物に２４ｈ添加することによって、ＬＴＲの評価のための腫瘍細胞のＤＮＡ放射標識を達成した。腫瘍細胞注射のため、ラットをイソフルランで軽く麻酔し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２ｍｌ／ｋｇＰＢＳ中の４×１０５／ｋｇのＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞をこれらの尾静脈に注射した。一部の実験ではまた、肺におけるＭＡＤＢ１０６保持の増幅のために、徐放性エマルジョン（４部のＰＢＳ、３部の鉱油（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）、および１部のマンナイド−モノオレエート（非特異的表面活性乳化剤、Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ））中に溶解したエピネフリン（雌には１．８ｍｇ／ｋｇおよび雄には０．６ｍｇ／ｋｇ）の追加の０．５ｍｌのｓ．ｃ．注射を利用し、より優れた群識別を可能にした。ＬＴＲの評価のために、動物をＣＯ２で屠殺し、１２５ＩＤＵＲ−標識した腫瘍細胞の接種の２４ｈ後にこれらの肺を取り出し、γ−カウンターに配置して、この器官内に保持される放射能のパーセントを評価した。以下の式を使用してＬＴＲを計算した：（肺の放射能カウント−バックグラウンド放射能）×１００／（注射した全細胞懸濁液の放射能カウント−バックグラウンド放射能）。
５．ＮＫ細胞傷害性のＥＸ  ｖｉｖｏ評価
１．ＮＫ細胞傷害性の評価のための循環白血球、肺の辺縁（ＭＰ）白血球、および肝臓の辺縁（ＭＨ）白血球の収集および調製
【０１３２】
ラットを過量のイソフルランで屠殺し、腹腔および胸腔を開放した。５〜８ｍｌの血液（それぞれ雌および雄）を心臓の右心室からヘパリン処置したシリンジに採取した。１ｍｌの血液を３ｍｌのＰＢＳで１回（４００ｇで１０ｍｉｎ）そして３ｍｌの完全培地で２回洗浄し、その元の体積へ再構成した。心臓に３０Ｕ／ｍｌのヘパリン処置したＰＢＳを潅流させることでＭＰ白血球を収集した。ＰＢＳを右心室に注射し、潅流液を左心室から採取した。血液が混入した最初の３ｍｌの潅流液は廃棄し、その後の２５ｍｌを採取し、１ｍｌに濃縮した。これは、潅流液を遠心分離し（４００ｇで１０ｍｉｎ）、上清を廃棄し、ペレットを３ｍｌの完全培地中に懸濁させ、潅流液を再び遠心分離し（４００ｇで１０ｍｉｎ）、潅流液を１ｍｌに濃縮することによって達成した。肝臓に３０Ｕ／ｍｌのヘパリン処置したＰＢＳを潅流させることによって、ＭＨ白血球を同様に収集した。ＰＢＳを肝門脈に注射し、潅流液を大静脈から採取した。血液が混入した最初の５ｍｌの潅流液を廃棄し、その後の２５ｍｌを採取し、ＭＰ白血球について記載したものと同じ方法で濃縮した。
２．ＮＫ細胞傷害性の評価
【０１３３】
標準的全血５１Ｃｒ放出アッセイを使用した。この手順では、試験する白血球集団（末梢血単核細胞、ＭＰまたはＭＨ白血球）を事前に精製することなく、１ｍｌのエフェクター細胞当たりの抗腫瘍ＮＫ細胞の細胞傷害性（ＮＫＣＣ）を評価する。この手順を使用して測定した細胞傷害性は、ＮＫ細胞の選択的枯渇がすべての標的細胞の死滅を廃絶することから、他の細胞型または可溶性因子ではなく、ＮＫ細胞に起因することが以前の試験で示された。この手順の利点として、持続時間がより短いこと、エフェクター細胞の干渉がより少ないこと、および細胞組成物の元のｉｎ  ｖｉｖｏでの環境がより良好に代表されることが挙げられる。
【０１３４】
６種の異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を、１５０μｌアリコートのエフェクター細胞調製物をマイクロタイタープレート内で連続希釈することによって形成した。次いで、１００μｌの完全培地中の５０００個の放射標識した標的細胞（ＭＡＤＢ１０６またはＹＡＣ−１）を各ウェルのエフェクター細胞調製物の上に添加した。１００μｌの生理食塩水、１００μｌのＦＣＳ、および５０μｌの完全培地中で、１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ｒｏｔｅｍ  Ｔａａｓｓｉｏｔ、Ｄｉｍｏｎａ、Ｉｓｒａｅｌ）と共に１ｈインキュベートすることによって、標的細胞の放射標識を行った。このインキュベーション後、標的細胞を完全培地内で３回洗浄し（３００ｇで１０ｍｉｎ）、これらの濃度を５×１０４／ｍｌに調節した。エフェクター細胞を完全培地またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）と置換することによって、放射能の自然および最大放出をそれぞれ決定した。４ｈのインキュベーション期間（湿度１００％、３７℃、５％ＣＯ２）の前および後に、プレートを遠心分離した（４００ｇで１０ｍｉｎ、それぞれ２５および４℃）。これによって、赤血球の表面上に白血球および腫瘍細胞の「バフィーコート」を作製し、効率的なエフェクターと標的の相互作用を可能にした。最後に、γ−カウンターでの放射能の評価のために１００μｌの上清の試料を回収した。具体的な死滅を、１００×［（試料の放出×ＨＣＦ−自然放出）／（最大放出−自然放出）］として計算した。ヘマトクリット値補正率（ＨＣＦ）は、異なるＥ：Ｔ比に対してヘマトクリット値−上清体積における変化を補正する。放出された放射性分子が分散する無細胞培地の体積の変化を考慮するようにこの補正率が含まれている。
６．フローサイトメトリー
【０１３５】
標準的手順を使用して、フローサイトメトリー解析のための細胞を調製した。両方の血液、肺潅流液および肝臓潅流液の中のＮＫ細胞をＣＤ１６１ｂｒｉｇｈｔ細胞としてＡＰＣ−コンジュゲート抗ＣＤ１６１ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により同定した。この判定基準は、ＮＫ活性を示す細胞の９５％超を排他的に同定することが示されている。ＰＥ−コンジュゲート抗ＣＤ５ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用してＴ細胞を同定し、ＮＫＴ細胞をＣＤ１６１＋ＣＤ５＋リンパ球として同定した。ＮＫ活性化マーカーを、ＦＩＴＣ−コンジュゲートＮＫｐ４６（ＢｉｏｓｓＵＳＡ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）およびＣｙ７−コンジュゲートＬＡＭＰ−１（ＢｉｏｓｓＵＳＡ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）で同定した。顆粒球およびリンパ球を前方散乱および側方散乱に基づき同定した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。試料１μｌ当たりの細胞の絶対数（または具体的な細胞サブタイプ）を評価するために、試料１μｌ当たり３００個のポリスチレンマイクロビーズ（２０μｍ、Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）を各試料に添加し、以下の式を使用した：（試料中の細胞数／試料中のマイクロビーズ数）×３００。
７．統計解析
【０１３６】
０．０５を所定の有意レベルとして、一元または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。有意な群間差が認められた場合、フィッシャーの制約つき最小有意差（フィッシャーのＰＬＳＤ）対比を実施して、先天的仮定に基づき、群の特定の対を比較した。
（実施例１）
雄のラットにおけるＭＡＤＢ１０６  ＬＴＲに対するＧＬＡの効果の用量曲線
【０１３７】
将来の実験のためのＧＬＡ投与についての強力な投薬量を確立するために実験を行った。
手順：
【０１３８】
７５匹の月齢３カ月のＦ３４４雄のラットを、７つの実験群のうちの１つにランダムに分け、ＰＢＳ、ＳＥ、またはＧＬＡを、０．３μｇ、０．７μｇ、２．５μｇ、１０μｇ、および２０μｇの用量／動物で投与した。群の割り当てに従って、各動物に１００μｌの薬物をｓ．ｃ．注射し、２４ｈ後、ＭＡＤＢ１０６細胞を播種した（上記セクション４に詳述する通り）。これら７つの群のそれぞれを２つの別々の群にさらに細分化した。１つの群には腫瘍接種中にエピネフリン注射し、第２の群にはビヒクルを注射した。２４時間後、動物を屠殺し、肺をＬＴＲ評価のために取り出した（セクション４に詳述する通り）。
結果：
【０１３９】
ＬＴＲに対する処置（ＳＥ、およびＧＬＡ用量）の有意な主要な効果は、エピネフリン群（Ｆ（６，３１）＝１４．３７５、ｐ＜０．０００１）およびビヒクル群（Ｆ（６，３０）＝３．３５４、ｐ＜０．０５）の両方で明らかであった。これは、肺からがん細胞を排除する宿主の能力の改善（ＬＴＲの低減）を示している。図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。
【０１４０】
エピネフリン群におけるフィッシャーのＰＬＳＤ事後比較では、ＰＢＳに対するＳＥ（ｐ＜０．００１）について、およびＰＢＳに対するすべてのＧＬＡ用量（ｐ＜０．０００１）について有意な改善が示された。ＳＥに対するＧＬＡの相加効果について調査すると（ＧＬＡはもともとＳＥ中に溶解し、ＳＥは部分的にその効果に関与しているという事実のため）、有意な改善が０．７μｇ、２．５μｇ、１０μｇ、および２０μｇの用量について発見された（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１、およびｐ＜０．００１）。
【０１４１】
ビヒクル群内では、フィッシャーのＰＬＳＤ事後比較で、ＳＥ単独については効果が生じず、ＰＢＳに対するＧＬＡについては、０．７μｇ、２．５μｇ、１０μｇ、および２０μｇの用量（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５、およびｐ＜０．０１）において有意な改善が生じた。
【０１４２】
これらの結果は、ＬＴＲに対するＧＬＡの有利な効果においてＳＥ構成物質が果たす部分的関与、および動物１匹当たり０．７μｇと等しいまたはそれ超の投薬量について、ＳＥ効果に対するＧＬＡの相加効果を示す。この実験後、動物１匹当たり２μｇのＧＬＡの作業投薬量が決定されたが、これは、ＳＥ−関連効果を超えるＧＬＡ−関連効果に基づいた最小であり、しかも有効な薬物用量を可能にする。
【０１４３】
また、すでに以前に報告された通り、ＭＡＤＢ１０６細胞接種と共にエピネフリンを投与することは、宿主に対してより過酷な条件を導き、ＬＴＲレベルを増加させることによって、群間のより優れた識別を可能にする。エピネフリンを与えたＰＢＳ動物と、ビヒクルを与えた動物との間の差を分析することによって、ＬＴＲに対する特異的なエピネフリン効果、およびエピネフリン群内においてＧＬＡにより引き起こされる関連減少効果（これはその投薬量と正の相関を示す）を計算することが可能であった。
（実施例２）
ＧＬＡ効果の開始および持続時間についての時間経過
【０１４４】
ＧＬＡ投与について効果の持続時間を決定するため、およびその使用について最適な時点を評価するために実験を行った。
手順：
【０１４５】
最初の実験では、７５匹の月齢６カ月のＦ３４４雄のラットを、腫瘍接種前の５つの注射時点−０ｈ、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、および４８ｈのうちの１つにランダムに分けた。各群を３つの実験薬物群、ＰＢＳ、ＳＥ、および２μｇのＧＬＡのうちの１つにさらに細分化した。各動物には、その関連する薬物群に従い、その指定された時点で、１００μｌをｓ．ｃ．注射した。０ｈの時間において、ＭＡＤＢ１０６細胞をエピネフリンと共に注射した（セクション４に詳述する通り）。４匹の追加の雄のＦ３４４ラットをＰＢＳ群に加え、エピネフリンの効果を確立するためのアンカーとしての役目を果たすためにこれらにはエピネフリンを注射しなかった（ビヒクルを与えた）。２４時間後、動物を屠殺し、ＬＴＲ評価のため肺を取り出した（セクション４に詳述された通り）。
【０１４６】
第２の実験では、雌のラットにおいて同様の実験を行った。８９匹の月齢６カ月の雌のＦ３４４ラットを６つの注射時点−０ｈ、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、および９６ｈのうちの１つにランダムに分けた。各群を３つの実験薬物群、ＰＢＳ、ＳＥ、および２μｇのＧＬＡのうちの１つにさらに細分化した。他のすべての手順は、上記の雄の通りであった。
結果：
【０１４７】
両方の実験で、ＰＢＳおよびＳＥ群内の異なる時点は、一貫したまたは有意な差を示さなかったので、これらの条件に十分な動物を蓄積するようにこれらを合わせた。
【０１４８】
最初の実験（雄）では、処置のＬＴＲに対する有意な主要効果が明らかであり（Ｆ（７，７１）＝５．９９０、ｐ＜０．０００１）、宿主の抵抗性を改善した。図２Ａを参照されたい。フィッシャーのＰＬＳＤ事後比較は、ＳＥ単独については効果を示さず、時点４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、および４８ｈにおけるＧＬＡとＰＢＳとの間で有意な差を示した（４ｈに対してｐ＜０．０５、他はｐ＜０．０００１）。
【０１４９】
第２の実験（雌）では、処置のＬＴＲに対する有意な主要効果が明らかであった（Ｆ（８，８４）＝３．２２９、ｐ＜０．０１）。図２Ｂを参照されたい。フィッシャーのＰＬＳＤ事後比較は、ＳＥ単独について効果を示さず、時点２４ｈおよび４８ｈにおけるＧＬＡとＰＢＳとの間で有意な差を示した（両方ともｐ＜０．０５）。
【０１５０】
これらの結果は、雄および雌の両方において、ＧＬＡの単一の低用量の注射について急速かつ長期持続の効果を示しているが、この用量での処置に対して雄においてより良好な応答を示唆している。
（実施例３）
肺におけるＭＡＤＢ１０６転移の実際の進行に対するＧＬＡ効果の評価のための３週間の試験
【０１５１】
この実験は、ＬＴＲというより短い指標に焦点を合わせるよりもむしろ、肺におけるがん転移の実際の進行に対するＧＬＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を評価するために行った。手順：
【０１５２】
８６匹の月齢６カ月のＦ３４４ラット（雌４４匹）を３つの実験群に分けた（２μｇのＧＬＡ、ＳＥ、およびＰＢＳ）。群の割り当てに従い、各動物に１００μｌをｓ．ｃ．注射した。２４ｈｒ後、動物をイソフルランで軽く麻酔し、０．５ｍｌのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡを補充）中の１０５個のＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞（およそ４×１０５／ｋｇ）をこれらの尾静脈に注射した。３週間後、ラットを屠殺し、これらの肺を取り出し、ブアン液（７２％ピクリン酸飽和溶液、２３％ホルムアルデヒド（３７％溶液）および５％氷酢酸）中に２４ｈ置いた。エタノールで洗浄した後、目視可能な表面の転移を、各肺の起源を知らされていない研究者がカウントした。
結果：
【０１５３】
処置の転移の数に対する有意な主要効果は明らかであった（Ｆ（２，８３）＝５．４０５、ｐ＜０．０１）。図３を参照されたい。
【０１５４】
フィッシャーのＰＬＳＤ事後比較は、ＳＥ単独について効果を示さず、ＧＬＡとＰＢＳとの間（ｐ＜０．０５）およびＧＬＡとＳＥとの間で（ｐ＜０．０１）有意な差、すなわちＧＬＡは転移の数を減少させたことを示した。明らかな有意な性別差はなかった。
（実施例４）
未処置およびＮＫ枯渇した動物におけるＭＡＤＢ１０６のＬＴＲに対するＧＬＡの効果
【０１５５】
この実験は、ＬＴＲに対するＧＬＡ投与の有利な影響の媒介におけるＮＫ細胞の役割を評価するために行った。
手順：
【０１５６】
５４匹の月齢４カ月のＦ３４４雄のラットを２つの群（抗ＮＫＲ−Ｐ１  ｍＡｂの投与によるＮＫ枯渇、またはビヒクル投与）に分け、各群を３つ（２μｇのＧＬＡ、ＳＥ、およびＰＢＳ）にさらに細分化した。その薬物条件の割当に従い、各動物に１００μｌをｓ．ｃ．注射し、２４ｈ後にＭＡＤＢ１０６細胞を、抗ＮＫＲ−Ｐ１  ｍＡｂまたはビヒクルのいずれかと同時に投与した。２４時間後、動物を屠殺し、肺をＬＴＲ評価のために取り出した（セクション４に詳述する通り）。
結果：
【０１５７】
２×３ＡＮＯＶＡ（枯渇×薬物注射）により、枯渇について有意な効果を明らかになり（Ｆ（１，４６）＝７１２．０６５、ｐ＜０．０００１）、ＮＫ枯渇した動物におけるおよそ２０倍高いレベルのＬＴＲ、したがって、肺からのＭＡＤＢ１０６の排除におけるＮＫ細胞の突出した役割が示された。図４Ａを参照されたい。
【０１５８】
枯渇群および非枯渇群を別々に調査した場合、明らかな枯渇群間の差はなかった。このことは、この条件下でＧＬＡまたはＳＥのいずれについても効果がないことを示すが、その一方で枯渇なしの条件下では群についての有意な効果が見出された（Ｆ（２，２２）＝６．４４７、ｐ＜０．０１）。枯渇なしの条件についてのフィッシャーのＰＬＳＤ事後比較は、ＳＥ単独について効果を示さず、ＧＬＡとＰＢＳとの間で有意な差を示した（ｐ＜０．０１）。図４Ｂを参照されたい。これらの発見は、ＧＬＡの有利な効果は、ＮＫ細胞により顕著に媒介されることを示している。
【０１５９】
この実験手法を利用した以前の研究でもまた、他の操作がＮＫ枯渇した動物においてＬＴＲを増加または低減させることが示された。このことは、この実験手法における潜在的、方法論的障害、例えば、天井効果または床効果を否定している。
（実施例５）
手術後の自然転移のマウスモデルにおけるＧＬＡ、β遮断剤およびＣＯＸ２阻害剤の試験
【０１６０】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、同系Ｂ１６Ｆ１０．９−黒色腫またはＬｅｗｉｓ肺癌を足蹠内播種し、進行した腫瘍が１００ｍｌを上回った時点で足を切断する。ＧＬＡ、ベータ−アドレナリン作動性アンタゴニストプロプラノロール、および／またはシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤エトドラクを切断術前に１回（またはそれ超）投与し、再発のない生存をモニターする。ＧＬＡが切断術前に１回投与され、プロプラノロールとエトドラクとが切断術後１回投与される、さらなる実験を行う。
【０１６１】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄および雌のマウスを週齢６週間で購入し、動物施設内で１ケージ当たり３〜４匹を飼育し、１２：１２明／暗のサイクル、２２  ６  １℃で食物および水は自由に入手できるようにしておく。１０〜１４週間の週齢で動物を使用し、各実験においてすべての群を通して週齢を一致させる。腫瘍投与および薬物投与の順序は、すべての実験群を通して釣り合いを取り、対照動物にはビヒクルを注射する。
【０１６２】
ＰＢＳ、鉱油、およびＡｒｌａｃｅｌ（８：７：１）のエマルジョン中のプロプラノロールをｓ．ｃ．注射（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）する。エトドラクをコーン油に溶解し、ｓ．ｃ．注射する（５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）。０．１μ〜５０μｇの範囲の用量／動物でＧＬＡをｓ．ｃ．注射する。
【０１６３】
各マウスに、５×１０４個のＢ１６Ｆ１０．９黒色腫細胞またはｄ１２２  Ｌｅｗｉｓ肺癌（０．１％ＢＳＡを含有する２０ｍｌのＰＢＳ中）を足蹠内注射し、腫瘍は目視により毎日検査する。腫瘍が１００〜１５０ｍｌの体積に到達したら、マウスを２％イソフルランで麻酔し、特定の薬物処置を施し、腫瘍を足切断術により切除する。指定された腫瘍体積を達成したマウスは、事前に決定した釣り合いをとる順序に基づき特定の薬物処置群に割り当て、したがって異なる薬物群間で、切除時点において腫瘍サイズおよび腫瘍年齢の等しい分布を確実にする。切断術を行う実験者は、薬物処置群について知らされていない。マウスは、その後、８０ｄの期間の間（かつ最後の病的状態の出現から２ｗｋ以上）毎日病的状態の徴候についてモニターする。病気の挙動、または明らかながん再発を示すマウスにはイソフルランを過量投与し、解剖して悪性の病巣を決定する。病気の挙動は、遅い身体運動、環境刺激への無反応性、顕著な体重減少、または振戦により定義される。
【０１６４】
特定の実施形態の前述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、現在の知識を適用することによって、過度な実験を行うことなく、一般的概念から逸脱することなく、様々な用途のために、このような特定の実施形態を他者は容易に改変および／または適応させることができ、そのためこのような適応および改変は、開示された実施形態の同等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、理解されることを意図する。本明細書で利用されている語法または用語は、記載目的のためであり、制限する目的ではないことを理解されるべきである。様々な開示された機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく様々な代替の形態を取ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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