(57)【要約】      （修正有）【課題】プライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を用いてキメラ動物を作製する方法の提供。【解決手段】プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞に対してアポトーシス抑制処理を行ない、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を誘導することを含んでなる、方法。ナイーブ型多能性幹細胞を回収することをさらに含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ動物を作製する方法であって、
哺乳動物由来のプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞または生殖細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。
【請求項２】
胚に導入される細胞が、細胞死抑制処理されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚に導入される細胞が、系列決定済み前駆細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
胚に導入される細胞が、内胚葉系列前駆細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
胚に導入される細胞が、Ｓｏｘ１７発現細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
胚に導入される細胞が、単一細胞化後にコロニーを形成できる多能性幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キメラ動物を作製する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなり、
該細胞が、細胞死抑制処理されていることを特徴とする、方法。
【請求項８】
哺乳動物由来のプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、
該細胞に対して細胞死抑制処理を行うことを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られた細胞。
【請求項１０】
細胞の分化能または細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に従ってキメラ動物を作製し（但し、評価対象の細胞を非ヒト哺乳動物の胚へ導入する細胞として用いる）、作製されたキメラ動物中の各組織への該細胞の寄与を調べることにより、細胞の各組織への分化能または細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価する、方法。
【請求項１１】
プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法であって、
プライム型多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理を行なうことを含んでなる、方法。
【請求項１２】
細胞死抑制剤を含んでなる、プライム型多能性幹細胞を対象とした初期化促進剤。
【請求項１３】
ナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
プライム型多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理を行なうことを含んでなる、方法。
【請求項１４】
細胞死抑制剤を含んでなる、プライム型多能性幹細胞に対して用いるためのナイーブ型多能性幹細胞の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する米国仮出願である６１／７５７，９１０（出願日：２０１３年１月２９日）、および、先行する日本国特許出願である特願２０１３−２３９３２７（出願日：２０１３年１１月１９日）の優先権の利益を享受するものであり、これらの開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、エピブラスト以降の発生段階の胚から得られる多能性幹細胞（pluripotent stem cell）などのプライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を用いてキメラ動物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得られる多能性幹細胞は、キメラ形成能が高いことで知られているが、より発生段階の進んだ胚（例えば、エピブラスト以降の胚）から得られる多能性幹細胞はキメラ形成能を損なっていると考えられている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brons et al., Nature (2007), 448 (7150): 191-195
【非特許文献２】Tesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199
【非特許文献３】Han et al., Cell (2010), 143: 617-627
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を用いてキメラ動物を作製する方法を提供する。
【０００６】
本発明者らは、キメラ動物を作製する際の胚導入細胞として、キメラ形成能を有さないと従来考えられていた哺乳動物細胞、例えば、エピブラスト以降の発生段階の多能性幹細胞などのプライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を用いることができることを見出した。本発明者らはまた、胚導入細胞が細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）された場合には、キメラ形成率が向上することを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明では、以下の発明が提供される。
（１）キメラ動物を作製する方法であって、
哺乳動物由来のプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞または生殖細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。
（２）胚に導入される細胞が、細胞死抑制処理されたものであることを特徴とする、上記（１）に記載の方法。
（３）胚に導入される細胞が、系列決定済み前駆細胞である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）胚に導入される細胞が、内胚葉系列前駆細胞である、上記（３）に記載の方法。
（５）胚に導入される細胞が、Ｓｏｘ１７発現細胞である、上記（４）に記載の方法。
（６）胚に導入される細胞が、単一細胞化後にコロニーを形成できる多能性幹細胞である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）キメラ動物を作製する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなり、
該細胞が、細胞死抑制処理されていることを特徴とする、方法。
【０００８】
（８）哺乳動物由来のプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、
該細胞に対して細胞死抑制処理を行うことを特徴とする、方法。
（９）上記（８）に記載の方法により得られた細胞。
（１０）細胞の分化能または細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価する方法であって、
上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法に従ってキメラ動物を作製し（但し、評価対象の細胞を非ヒト哺乳動物の胚へ導入する細胞として用いる）、作製されたキメラ動物中の各組織への該細胞の寄与を調べることにより、細胞の各組織への分化能または細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価する、方法。
（１１）プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法であって、
プライム型多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理を行なうことを含んでなる、方法。
（１２）細胞死抑制剤を含んでなる、プライム型多能性幹細胞を対象とした初期化促進剤。
（１３）ナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
プライム型多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理を行なうことを含んでなる、方法。
（１４）細胞死抑制剤を含んでなる、プライム型多能性幹細胞に対して用いるためのナイーブ型多能性幹細胞の誘導剤。
【０００９】
（１５）化合物のスクリーニング方法であって、
細胞と化合物を接触させることと、
該細胞を胚導入細胞として用いてキメラ動物を作製し、キメラ動物の体内での該細胞の分布を調べることにより、該細胞のキメラ形成能および／または分化能を評価することと、
評価結果に基づいて細胞のキメラ形成能および／または分化能に正または負の影響を与える化合物を選択することと、
を含んでなる化合物のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、マウスのエピブラスト幹細胞（以下、「ＥｐｉＳＣ」ということがある）にＢｃｌ−２をコードする遺伝子を導入する方法の概略を示す図（図１Ａ）、および、導入して得られた胎児または産仔の光学顕微鏡像（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｆおよび１Ｈ）および蛍光顕微鏡像を示す図（図１Ｃ、１Ｅ、１Ｇおよび１Ｉ）である。図１Ｂおよび１Ｃは、Ｂｃｌ−２を導入しないエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像（対照）を示し、図１Ｄおよび１Ｅは、Ｂｃｌ−２を導入したエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像を示し、図１Ｆ〜１Ｉは、Ｂｃｌ−２を導入したエピブラスト幹細胞を用いて得られた産仔の内臓の顕微鏡像を示す。図１Ｊは、２つのＥｐｉＳＣ株のキメラ形成率に対するＢｃｌ−２強制発現の効果を示す図である。図中のＬｖは肝臓、Ｐｃは膵臓、Ｓｔは胃、およびｔｅは精巣を示す。また、図１Ｋ〜１Ｐは、導入したＥｐｉＳＣの生殖系列への寄与を示す図である。図１Ｋ〜１Ｐは、ＥｐｉＳＣ由来の細胞であることを示すＤｓＲｅｄやｔｄＴが、生殖系列の細胞のマーカーであるｍｏｕｓｅ  ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｍｖｈ）と共局在していることを示す。
【図２】図２は、ラットのエピブラスト幹細胞にＢｃｌ−２をコードする遺伝子を導入して得られた胎児の光学顕微鏡像（図２Ａおよび２Ｃ）および蛍光顕微鏡像（図２Ｂおよび２Ｄ）である。図２Ａおよび２Ｂは、Ｂｃｌ−２を導入しないエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像（対照）を示し、図２Ｃおよび２Ｄは、Ｂｃｌ−２を導入したエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像を示す。図２Ｅは、ＥｐｉＳＣのキメラ形成率に対するＢｃｌ−２強制発現の効果を示す図である。図２Ｄの四角枠は、キメラを形成した胎児の存在を示す。
【図３】図３は、Ｓｏｘ１７レポーターを導入したマウスＥＳ細胞株であるＫ１７−５細胞からのマウスのＳｏｘ１７発現内胚葉系列前駆細胞の取得（図３Ａ）、および、得られたＳｏｘ１７発現内胚葉系列前駆細胞における、多能性幹細胞マーカー（図３Ｂ）、外胚葉マーカー（図３Ｃ）、中胚葉マーカー（図３Ｄ）および内胚葉マーカー（図３Ｅ）の発現レベルを示す図である。
【図４】図４は、Ｋ１７−５細胞にＢｃｌ−２をコードする遺伝子を導入したのちに分化誘導して得られた内胚葉系列前駆細胞を導入して得られた胎児の光学顕微鏡像（図４Ａおよび４Ｃ）、および、蛍光顕微鏡像（図４Ｂおよび４Ｄ）を示す図である。図４Ａおよび４Ｂは、Ｂｃｌ−２をコードする遺伝子を導入しないＫ１７−５細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像（対照）を示し、図４Ｃおよび４Ｄは、Ｂｃｌ−２をコードする遺伝子を導入したＫ１７−５細胞由来細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像を示す。図４Ｄの矢印は、キメラを形成した部分の存在を示す。
【図５】図５は、Ｂｃｌ−２をコードする遺伝子を導入したＫ１７−５細胞を用いて得られた胎児における、Ｋ１７−５細胞由来の細胞の局在を示す図である。図５Ｂ、４Ｅおよび４Ｈは、内胚葉マーカーであるＦｏｘａ２陽性細胞の局在を示し、図５Ｃ、４Ｆおよび４Ｉは、Ｋ１７−５細胞由来細胞の局在を示す。
【図６】図６は、マウスのエピブラスト幹細胞にＢｃｌ−ｘＬをコードする遺伝子を導入する方法の概略を示す図（図６Ａ）、および、導入して得られた胎児の光学顕微鏡像（図６Ｂおよび６Ｃ）および蛍光顕微鏡像（図６Ｄおよび６Ｅ）を示す図である。図６Ｂおよび６Ｄは、Ｂｃｌ−ｘＬを導入しないエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像（対照）を示し、図６Ｃおよび６Ｅは、Ｂｃｌ−ｘＬを導入したエピブラスト幹細胞を用いて得られた胎児の顕微鏡像を示す。
【図７】図７は、Ｂｃｌ−２を強制発現したＥｐｉＳＣにおける遺伝子発現プロファイルを、ＥｐｉＳＣおよびＥＳ細胞の遺伝子発現プロファイルとクラスター解析した結果である。
【図８】図８は、ＥＳ細胞、ＥｐｉＳＣおよびＢｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣにおける６つの遺伝子の発現量をより詳細に示す図である。
【図９】図９は、Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣ株２種類について、ＣＤ３１の発現をＦＡＣＳを用いて定量した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣのうち、ＣＤ３１を高発現する細胞（図９の枠内の細胞）を単離し、接着培養した際に、細胞が形成するコロニーの形状を示す図である。
【図１１】図１１は、アポトーシス抑制因子としてＸｉａｐやｃｒｍＡを細胞に強制発現させて得た細胞のキメラ形成率を示す図である。図１１Ａは、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）のキメラ形成率を示し、図１１Ｂは、内胚葉系列前駆細胞のキメラ形成率を示す。図１１Ｃ〜Ｆは、内胚葉系列前駆細胞の胚への寄与を示す。図中の矢印は、内胚葉系列前駆細胞の存在を示す。
【図１２】図１２は、単一細胞化後にコロニー形成能を有する多能性幹細胞を胚導入細胞として用いたときのキメラ形成の結果を示す。
【図１３】図１３は、アポトーシス抑制処理をした始原生殖細胞の作製と得られた始原生殖細胞のキメラ形成能を示す図である。図１３Ｂでは、Ｃｈｉｍｅｒａ／ＴＥはレシピエントに移植された胚のうちのキメラ率、Ｃｈｉｍｅｒａ／Ｆｅｔｕｓは解析時に得られた胚のキメラ率を示す。
【図１４】図１４は、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）をマウス胚に導入してキメラ形成を観察した結果を示す図である。Ｂｃｌ−２（＋）は、Ｂｃｌ−２を強制発現したことを示し、Ｂｃｌ−２（−）は、対照細胞であることを示す。
【図１５】図１５は、マーモセットの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をマウス胚に導入してキメラ形成を観察した結果を示す図である。Ｂｃｌ−２（＋）は、Ｂｃｌ−２を強制発現したこと（ＣおよびＤ）を示し、対照は、Ｂｃｌ−２を発現していないこと（ＡおよびＢ）を示す。図１５ＥおよびＦはそれぞれ、図１５ＣおよびＤのアスタリスクで示した胚の拡大写真である。図１５Ｇは、マウス胚にマーモセット細胞が含まれることを示すＰＣＲ増幅断片の電気泳動図である。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本発明の方法では、キメラ動物を作製する際の胚導入細胞として、キメラ形成能を有さないと従来考えられていた哺乳動物細胞、例えば、エピブラスト以降の発生段階の多能性幹細胞などのプライム型の多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を用いることができる。
【００１２】
本発明の方法では、胚導入細胞は必ずしも細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を受けている必要は無いが、胚導入細胞が細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）されると、キメラ形成率が向上する。本発明の方法ではまた、胚導入細胞が細胞死耐性の細胞（例えば、アポトーシス耐性の細胞）であるときには、該細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）がなされなくてもよく、該細胞に高い効率でキメラを形成させることができる。
【００１３】
本発明では、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）は、細胞を胚に導入する前に行ってもよく、導入した後に（例えば、細胞を導入して得られた胚を仮親の子宮に移植した後に）行ってもよく、細胞を胚に導入する前および導入した後で行ってもよい。細胞死の抑制（例えば、アポトーシスの抑制）を確実に行う観点では、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）は、細胞を胚に導入する前および後で行うことが好ましい。
【００１４】
本発明の方法では、細胞は、非ヒト動物胚（例えば、非ヒト哺乳動物の胚または鳥類の胚などの非ヒト脊椎動物胚）、好ましくは、８細胞期、桑実胚期または胚盤胞期の胚に導入することができる。８細胞期の胚または桑実胚に細胞を導入する場合には、例えば、胚の中心付近に細胞を導入することができる。また、胚盤胞期の胚に細胞を導入する場合には、例えば、卵割腔に細胞を導入することができる。桑実胚期までの初期胚であれば、細胞を接触させることにより集合させてもよい。本発明の方法で、細胞を導入する胚としては、脊椎動物由来の胚、例えば、非ヒト哺乳動物由来の胚、例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどの非ヒト霊長類由来の胚；ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の胚（例えば、食肉類、偶蹄類、奇蹄類およびげっ歯類の胚）；並びに、ニワトリなどの鳥類の胚が挙げられる。
【００１５】
本明細書では、「キメラ形成能がない細胞」とは、着床前胚に移植した場合にキメラを形成しないか、またはキメラを形成する頻度が著しく低い細胞をいう。
【００１６】
本発明では、「多能性幹細胞（a pluripotent stem cell）」とは、多能性を有する幹細胞を意味し、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）およびエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）などの多能性を有する多能性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞には、例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）依存的に多能性を維持することをその特徴の一つとするナイーブ型多能性幹細胞と、繊維芽細胞成長因子２（Ｆｇｆ２）およびアクチビン依存的に多能性を維持することをその特徴の一つとするプライム型多能性幹細胞（ナイーブ型よりも分化段階が進んでおり、Ｘ染色体が不活化されている）とが存在する。げっ歯類のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に分類され、げっ歯類のエピブラスト幹細胞並びにげっ歯類以外の一部のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、プライム型多能性幹細胞に分類される。プライム型多能性幹細胞とナイーブ型多能性幹細胞とは、数々の点で異なる。例えば、コロニー形態において、プライム型多能性幹細胞は主に単層の扁平なコロニーを形成するのに対して、ナイーブ型多能性幹細胞は主に重層のコロニーを形成する。さらに、特異的マーカー遺伝子として、プライム型多能性幹細胞では、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＦｇｆ５が知られているのに対して、ナイーブ型多能性幹細胞では、ＣＤ３１、Ｒｅｘ１、Ｋｌｆ４およびＮｒＯｂ１などが知られている。このように、プライム型多能性幹細胞とナイーブ型多能性幹細胞とは、生化学的特徴および生理学的特徴において異なっている。当業者であれば、プライム型多能性幹細胞を取得すること、および、上記の性質などに基づいてプライム型多能性幹細胞を判別することは容易であろう。
【００１７】
本発明では、「エピブラスト幹細胞」とは、着床後の胚の後期エピブラストから樹立された細胞株、または着床前胚から得られた細胞であってエピブラスト幹細胞に対応する分化段階に至った細胞株をいう。エピブラスト幹細胞は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびアクチビンＡの存在下で培養することができ、接着培養を行うと単層で大きなコロニーを形成するという生理学的特徴を示し、雌性細胞においては２つのＸ染色体のうちの１つが不活性化しているという特徴をさらに示すが、この特徴は、プライム型のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が示す特徴と類似している。
【００１８】
本発明では、「プライム型の多能性幹細胞」とは、プライム型のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などのプライム型の多能性幹細胞を意味する。本発明では、「多能性幹細胞」としては、特に限定されないが、ヒトおよびサルなどの霊長類の多能性幹細胞、並びに、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類の多能性幹細胞などを挙げることができる。本発明では、多能性幹細胞は、好ましくは、ヒト多能性幹細胞である。プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能は、ナイーブ型多能性幹細胞のキメラ形成能に劣る。
【００１９】
本発明では、胚導入細胞としてプライム型多能性幹細胞を用いる場合、細胞死抵抗性の細胞（すなわち、細胞死を起こしにくい多能性幹細胞、例えば、アポトーシス抵抗性の多能性幹細胞（すなわち、アポトーシス能が低い多能性幹細胞））を用いることが好ましい。本発明では、例えば、細胞死抵抗性の細胞（例えば、アポトーシス抵抗性の細胞）はスクリーニングにより得てもよい。細胞死抵抗性のプライム型多能性幹細胞（例えば、アポトーシス抵抗性のプライム型多能性幹細胞）は、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）をせずに胚導入細胞としてキメラ動物の形成に用いることができる。本発明ではまた、胚導入細胞としてプライム型多能性幹細胞を用いる場合、例えば、単一細胞化後に接着培養においてコロニーを形成できるプライム型多能性幹細胞を用いることもできる。本発明では、単一細胞化後のコロニー形成率は、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。従って、単一細胞化した後にコロニー形成率が好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上であるプライム型多能性幹細胞を胚導入細胞として用いてもよい。本発明では、単一細胞化後にコロニーを形成できるプライム型多能性幹細胞は、単一細胞化した後にコロニー形成すること、および／または、その形成率が高いこと（例えば、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上であること）を指標としてスクリーニングすることができる。多能性幹細胞の細胞死抵抗性とコロニー形成能とには関連がある。従って、細胞死抵抗性の細胞は、単一細胞化した後のコロニー形成すること、および／または、その形成率が高いこと（例えば、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上であること）を指標としてスクリーニングして得ることができる。コロニー形成を調べる際には、通常の接着培養の培養条件と同じ条件で細胞を培養することができる。
【００２０】
多能性幹細胞以外の細胞では、アポトーシス抵抗性は、アクチノマイシンＤなどのアポトーシス誘導剤存在下で培養することにより検証することができ、例えば、アポトーシス抵抗性の細胞のスクリーニングの指標とすることができる。
【００２１】
多能性幹細胞以外の細胞では、ネクローシスなどの細胞死抵抗性は、ネクローシス誘導剤（例えば、Ｈ2Ｏ2などの活性酸素の誘導）および貧栄養培地での培養などにより検証することができ、例えば、細胞死抵抗性の細胞のスクリーニングの指標とすることができる。
【００２２】
本発明では、「組織幹細胞」とは、全能性（pluripotency）を有さないものの、複数種類の細胞に分化する能力を維持しながら自己複製能をもつ細胞をいい、体性幹細胞または成体幹細胞とも呼ばれることがある。組織幹細胞としては、外胚葉系列幹細胞、中胚葉系列幹細胞および内胚葉系列幹細胞が知られている。例えば、外胚葉系列幹細胞としては、例えば、神経幹細胞が挙げられる。神経幹細胞は、当業者により周知の方法、例えば、Kukekov et al.,Glia 21：399-407,1997に記載の方法により得ることができる。特に限定されないが、例えば、神経幹細胞は、胚の前脳または生後個体の脳室下帯（subventricular zone）から単離した細胞群を、市販されている神経前駆細胞基本培地などを用いて培養することにより得ることができる。得られた細胞が神経幹細胞であるか否かは、特異的マーカー遺伝子の発現、例えば、ネスチン（Nestin）の発現の有無により調べることができる。
【００２３】
本発明では、「前駆細胞」とは、子孫にあたる細胞が発現する特定の分化形質を発現していない未分化な親細胞をいう。前駆細胞は、組織幹細胞とは異なり、自己複製能をもたない。幹細胞がある特定な分化細胞の前駆細胞となることを細胞分化における決定（determination）または拘束（commitment）という。
【００２４】
本発明では、「系列決定済み前駆細胞」とは、外胚葉系列、中胚葉系列または内胚葉系列に分化運命が決定された前駆細胞をいう。外胚葉系列の系列決定済み前駆細胞（外胚葉系列前駆細胞）は、外胚葉由来の細胞の前駆細胞であり、例えば、神経前駆細胞が挙げられる。中胚葉系列の系列決定済み前駆細胞（中胚葉系列前駆細胞）は、中胚葉由来の細胞の前駆細胞であり、例えば、造血幹／前駆細胞および血管内皮前駆細胞が挙げられる。内胚葉系列の系列決定済み前駆細胞（内胚葉系列前駆細胞）は、内胚葉由来の細胞の前駆細胞であり、例えば、Ｓｏｘ１７発現内胚葉系列前駆細胞が挙げられる。また、生殖細胞の系列決定済み前駆細胞は、始原生殖細胞が挙げられる。これらの系列決定済み前駆細胞は、発生段階においては決定された系列以外の系列の細胞には分化しない。例えば、一度、内胚葉系列に分化運命が決定されると、初期化または脱分化しない限り生体内では内胚葉由来の細胞以外には分化しない。本発明では、系列決定済み前駆細胞を導入すると、導入された前駆細胞は決定された運命に従って分化するため、決定された系列以外の組織または臓器には寄与しない。系列決定済み前駆細胞を胚に導入する利点の一つは、系列決定済み前駆細胞を用いることにより、望まない臓器（例えば、脳、神経および生殖系列等）への寄与を抑えたキメラ動物の作製が可能となることである。本発明では、系列決定済み前駆細胞としては、ヒトおよびサルなどの霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳動物、並びにマウスおよびラットなどのげっ歯類由来の系列決定済み前駆細胞が挙げられる。
【００２５】
外胚葉系列前駆細胞は、例えば、当業者により周知の方法、特に限定されないが、例えば、神経前駆細胞であれば、大脳皮質から神経球を単離し、市販されている神経前駆細胞基本培地などを用いて培養することにより得ることができる。得られた細胞が外胚葉系列前駆細胞であるか否かは、外胚葉マーカーの発現、例えば、Ｐａｘ６および／またはＯｌｉｇ２の発現の有無により調べることができる。
【００２６】
中胚葉系列幹細胞または中胚葉系列前駆細胞としては、例えば、造血幹／前駆細胞が挙げられる。造血幹／前駆細胞は、当業者により周知の方法、特に限定されないが、例えば、マウス成体骨髄または胎仔肝臓中の血球細胞のうち抗体染色によりＧｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＩＬ−７Ｒ、ＣＤ４１、ＣＤ４８抗体により染色されず、かつ、ＣＤ１５０抗体に染色される細胞としてＦＡＣＳ等を用いて選別することができる。
【００２７】
内胚葉系列前駆細胞は、例えば、当業者により周知の方法、例えば、ＥＳ細胞をアクチビンＡ存在下（例えば、１０μｇ／ｍＬ）で培養することにより得ることができる。得られた細胞が内胚葉系列前駆細胞であるか否かは、内胚葉マーカーの発現、特に限定されないが、例えば、Ｓｏｘ１７、Ｅｏｍｅｓ、Ｇａｔａ４および／またはＦｏｘａ２の発現の有無により調べることができる。
【００２８】
本発明では、「体細胞」とは、生殖細胞以外のすべての細胞をいう。
【００２９】
本発明では、「生殖細胞」とは、生殖を担うために特殊化した一倍体の細胞およびその母細胞並びに始原生殖細胞をいう。具体的には、生殖細胞としては、精子および卵子およびこれらの母細胞並びに始原生殖細胞が挙げられる。始原生殖細胞は、特に限定されないが、例えば、胚の性腺より単離する方法またはＥＳ細胞やｉＰＳ細胞または他の多能性幹細胞から分化誘導する方法で得られることが知られている。例えば、マウスの始原生殖細胞は、特に限定されないが、例えば、摘出した性腺をトリプシン溶液などで解離したのち、ＳＳＥＡ１抗体およびＣＤ６１抗体の両方で染色される細胞としてＦＡＣＳ等で選別することで単離することができる。例えば、マウスの始原生殖細胞は、特に限定されないが、例えば、Ｈａｙａｓｈｉら（Hayashi et al., Cell (2012), 146(4) 519-532）により報告された方法によりマウスＥＳ細胞から分化させて得ることができる。得られた細胞が始原生殖細胞であるか否かは、特異的マーカーの発現、特に限定されないが、例えば、Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａの発現の有無により調べることができる。
【００３０】
本発明では、胚と、胚に導入される細胞の種は、同種の関係であってもよいし、異種の関係であってもよい（例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459）。本発明では、胚と胚導入細胞の種の組み合わせとしては、マウスとラットとの組み合わせが挙げられ、マウスとラット間では胚盤胞補完によるキメラ動物の作製にも成功している（引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/021390およびWO2010/087459）。マウス−ラット間の遺伝的な距離は、ヒト−ブタ間の遺伝的距離に相当する。従って、マウス−ラット間での異種間キメラ動物の作製が成功するということは、それよりも遺伝的な距離の近い種間であれば十分に異種間キメラ動物を作製することができることを意味する。
【００３１】
また、本願実施例４Ｂおよび４Ｃによれば、マウスとヒトまたはマウスとマーモセット間でキメラ動物を作製することに成功している。従って、仮にげっ歯類と霊長類との組合せであったとしてもキメラ動物を形成させることは可能である。そして、げっ歯類と霊長類との相違と比べて小さな相違を有すると考えられる種間では異種間でキメラ動物を作製することができる。これらのことから、本発明で用いられ得る胚と胚導入細胞の異種間の組み合わせとしては、マウス−ラット以外では、例えば、非ヒト哺乳動物同士の組み合わせ、鳥類同士の組み合わせ、ヒトと非ヒト霊長類動物との組み合わせ、ヒトとニワトリの組み合わせ、ヒトとブタとの組み合わせ、ヒトとウシとの組み合わせ、ヒトとヤギとの組み合わせ、ヒトとヒツジとの組み合わせ、非ヒト霊長類動物同士の組み合わせ、非ヒト霊長類動物とブタ、ウシまたはヒツジとの組み合わせ、ウシとブタ、ヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせ、または、ブタとヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせなどを挙げることができる。また、ヒトと、食肉類、偶蹄類または奇蹄類のいずれかに属する動物との組み合わせとしてもよいし、同じ属、類または科に属する動物同士の組み合わせとしてもよいであろう。マウスとラットは染色体数が異なるが、マウス−ラット間ではキメラ動物の作製が可能であることから、染色体数が異なっていたとしても、キメラ動物の作製の可能性が否定されるものではない。
【００３２】
細胞死は、細胞の死を意味する。細胞死は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）、オートファジーおよびネクローシスに大別される。
【００３３】
細胞死抑制作用を有する化合物とは、細胞死を抑制し得るあらゆる化合物を意味し、細胞死阻害剤が挙げられる。本発明で用いられる細胞死阻害剤としては、例えば、アポトーシス阻害剤、オートファジー阻害剤およびネクローシス阻害剤が挙げられ、細胞死を抑制するために適宜用いることができる。
【００３４】
本発明で用いられるアポトーシス阻害剤としては、細胞のアポトーシスを抑制し得る限り限定されないが、例えば、カスパーゼ阻害剤およびＢｃｌ−２系のプロアポトーシス因子の阻害剤などが挙げられ、様々なアポトーシス阻害剤が市販されており、細胞のアポトーシスを抑制するために適宜用いることができる。
【００３５】
本発明で用いられるオートファジー阻害剤としては、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＥＲＫ阻害剤およびＪＮＫ阻害剤などが挙げられ、細胞のオートファジーを抑制するために用いることができる。
【００３６】
本発明で用いられるネクローシス阻害剤としては、ネクロスタチン−１などのＲＩＰ１〜３阻害剤（ＲＩＰ：受容体相互作用タンパク質）および２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノマレイミド（ＩＭ−５４）などの活性酸素阻害剤が挙げられ、細胞のネクローシスまたはネクロトーシスを抑制するために用いることができる。
【００３７】
本発明で発現誘導の対象となる抗アポトーシス因子としては、特に限定されないが、例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ−１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬなどが挙げられ、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬが好ましく用いられ得る。これらの因子の発現誘導の手段としては、直接的な手段、特に限定されないが、例えば、標的遺伝子発現ベクターの細胞への導入、細胞質へのｍＲＮＡ若しくはタンパク質若しくはその機能的なフラグメントの導入、または、ｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡを介した標的因子の発現誘導などが考えられる。これらの因子の発現誘導の手段としてはまた、間接的な手段、特に限定されないが、例えば、間接的に抗アポトーシス作用をもたらす、アポトーシス抑制因子の発現量および／または活性を高める因子、若しくは、抗アポトーシス因子のアゴニストの発現を高める発現ベクターの細胞への導入、細胞質へのｍＲＮＡ若しくはタンパク質若しくはその機能的なフラグメントの導入、または、ｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡを介した発現誘導などの方法で発現誘導することが考えられる。細胞の癌化などへの影響を考慮すると、発現誘導は一時的なものであることが好ましい。また、細胞のゲノムに傷を付けにくい方法を採用することが好ましい。一時的な発現誘導を可能とし、かつ、細胞ゲノムへの損傷を防ぐ目的では、アデノウイルスベクターを用いた方法およびプラスミドを用いた方法など様々なものを用いることができる。本明細書では、機能的なフラグメントとは、抗アポトーシス機能を保持したフラグメントを意味する。上記抗アポトーシス因子およびこれらの発現誘導手段は、アポトーシス抑制剤として用いることができる。なお、本明細書では、記載の都合上、種によらず、ヒトのＢＣＬ２もマウスのＢｃｌ２も同じくＢｃｌ−２と表記する。
【００３８】
本発明で発現抑制の標的となるアポトーシス因子としては、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９および１０、好ましくはカスパーゼ３、６および７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１が挙げられる。発現抑制は、直接的な手段、特に限定されないが、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡを介した標的因子の発現抑制などの当業者に周知の方法を用いて行うことができる。発現抑制はまた、間接的な手段、特に限定されないが、例えば、間接的にアポトーシス作用をもたらす、アポトーシス促進因子の発現量および／または活性を高める因子の発現および／または活性を低下させるために、ｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡを介した標的因子の発現抑制などの方法で増加させることが考えられる。また、アポトーシス促進因子のアンタゴニストを用いてアポトーシスを抑制する方法も考えられる。上記アポトーシス因子およびこれらの発現抑制手段は、アポトーシス抑制剤として用いることができる。
【００３９】
ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、例えば、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２５ｂｐまたは２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。このような二本鎖ＲＮＡは、当業者であれば、周知の方法を用いて、ノックダウンする標的遺伝子の遺伝子配列を元に設計し製造することができる。ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドとしてもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ中のＵとＴに置き換えてもよい。
【００４０】
ｓｈＲＮＡとは、生体内でダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により分解を受けてｓｉＲＮＡを生成することができるＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、二本鎖のステムとヘアピンループを含むステムループ構造を有する。このヘアピンループ部分の配列は特に限定されないが、５〜１２塩基の配列とすることができる（Kawasaki H. et. al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707、Paddison P. J. et. al., Genes and Dev. (2002) 16: 948-958、Lee N. S., Nat. Biotech. (2002) 20: 500-505およびSui G., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2002) 99: 5515-5520）。このようなｓｈＲＮＡは、当業者に周知の方法によりノックダウンする標的遺伝子の遺伝子配列を元に設計し製造することができる。
【００４１】
本発明では、胚導入細胞に対して細胞死（例えば、アポトーシス）を抑制することにより、プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を胚導入細胞として用いて高効率でキメラ動物を作製することができる。
【００４２】
本発明の方法によれば、細胞を導入して得られた胚を非ヒト仮親動物の母胎中で発生させて胎児または産仔を得ることをさらに含んでいてもよい。キメラ哺乳動物の作製は、一般的には、哺乳動物のＥＳ細胞などのキメラ形成能を有する細胞を、哺乳動物の胚に導入すること、得られた胚を仮親動物の子宮に移植すること、および仮親動物からキメラの産仔を得ることを含んでなる。本発明では、非ヒト仮親動物は、細胞を導入する胚と同種であり得る。
【００４３】
本発明は、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）をしたプライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞は、キメラ動物の作製を高効率化できる点で有用である。
【００４４】
遺伝子改変動物の作製においては、高いキメラ形成能を有する多能性幹細胞が求められるが、本発明は、高いキメラ形成能を有するプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を提供するものである。従って、本発明によれば、例えば、プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞若しくは生殖細胞（ここで、組織幹細胞および前駆細胞は、生殖細胞に分化し得る細胞である）に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことを特徴とする、非ヒト遺伝子改変動物を作製する方法が提供される。本発明の遺伝子改変動物を作製する方法では、本発明のキメラ動物を作製する方法において、胚に導入する細胞として遺伝子改変された細胞を用いることができる。
【００４５】
遺伝子改変動物を作製する方法としては、例えば、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を作製する方法が周知である。遺伝子改変動物では、遺伝子改変された多能性幹細胞（例えば、遺伝子改変されたＥＳ細胞）を胚盤胞の卵割腔に導入し、仮親の子宮に移植してキメラ動物である産仔を得る。ノックアウト動物を得る場合には、キメラ動物を得た後は、野生型動物と交配させて、キメラ動物からさらに遺伝子改変されたゲノムをヘテロで有する産仔を得る、あるいは、得られたヘテロの産仔同士をさらに掛け合わせて遺伝子改変されたゲノムをホモで有する産仔を得るのが一般的であろう。本発明の方法でも、プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、若しくは生殖細胞（ここで、組織幹細胞および前駆細胞は、生殖細胞に分化し得る細胞である）を遺伝子改変し、得られた遺伝子改変された細胞を非ヒト動物（例えば、げっ歯類以外の非ヒト哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の胚（８細胞期、桑実胚期または胚盤胞期の胚）に導入して、胚を仮親の子宮に戻すことによりキメラ動物を作製することができる。キメラ動物中では、導入したプライム型多能性幹細胞は生殖系列に寄与していたことから、本発明によれば、げっ歯類以外の哺乳動物においてプライム型多能性幹細胞を胚導入細胞として用いて遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変動物の作製においては、好ましくは、導入される細胞と胚との関係は同種である。得られた遺伝子改変された細胞は、胚に導入される前および／または後に細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことができる。また、本発明においては系列決定した前駆細胞を細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）の有無に関わらず、元々の発生運命に従ったままキメラ動物に寄与させることができることが示された。また、系列決定した前駆細胞を細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）することにより、キメラ形成率が飛躍的に向上した。この原理を始原生殖細胞や始原生殖細胞から生じる生殖系列細胞に適用することで、効率的に遺伝子改変動物を作製することができる。より具体的には多能性幹細胞から誘導した始原生殖細胞（生殖細胞）または胚から採取した始原生殖細胞（生殖細胞）に遺伝子改変を行い、得られた細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）をした後に胚に移植すれば、遺伝子改変細胞由来の生殖細胞を効率的に得ることができる。移植を受ける胚に生殖細胞を欠損する変異体を用いれば、さらに効率的に遺伝子改変細胞由来の生殖細胞が得られる。ニワトリに代表される鳥類においては多能性幹細胞移植によりキメラ動物は作製できるが、胚導入細胞が生殖系列に寄与しにくいことが知られており、特に鳥類の遺伝子改変動物の作製において、本発明の方法は有利である。
【００４６】
キメラ形成能を有する細胞は、胚盤胞補完を利用した臓器の再生に用いることができる（引用することにより本出願の一部とされるWO2008/102602およびWO2010/021390）。従って、本発明によれば、目的臓器を製造する方法であって、ａ）プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を調製する工程；ｂ）非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程；ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程；およびｄ）該産仔個体から、目的臓器を取得する工程を含み、非ヒト哺乳動物は、発生段階において、製造する臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト哺乳動物である方法が提供される。ここで、細胞および製造される臓器は、該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来であり得る。本発明の一つの実施態様では、細胞を導入する胚は、発生段階において目的臓器の発生が生じない異常を有する非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物、げっ歯類以外の非ヒト哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の胚であり、導入される細胞は、該非ヒト動物とは異個体の動物（例えば、非ヒト哺乳動物、げっ歯類以外の哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の細胞である。細胞は、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）することにより、キメラ形成率を飛躍的に向上させる。このようにすることで、非ヒト哺乳動物またはげっ歯類以外の非ヒト哺乳動物において、細胞を導入する胚で発生しない目的臓器が、導入した細胞により補完されたキメラ動物を極めて高効率に得ることができる。従って、本発明の方法は、細胞に対して細胞死抑制処理する工程をさらに含んでいてもよい。導入する細胞と胚とは、同種の関係であっても、異種の関係であってもよい。移植医療に臓器を用いるという観点では、導入する細胞と胚とは、異種の関係であることが好ましく、導入される細胞は、ヒト由来の細胞であることが好ましい。
【００４７】
本発明ではまた、胚盤胞補完により作製したキメラ哺乳動物から目的臓器を回収することができる。従って、本発明によれば、本発明の方法によりキメラ哺乳動物を作製し、得られたキメラ哺乳動物から目的臓器を回収することにより、目的臓器を製造する方法が提供される。得られた目的臓器は、例えば、移植用途に用いることができる。
【００４８】
通常、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有するノックアウト動物は、生存困難であり、産仔を得ることができない。従って、このような動物は、通常は、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をヘテロで有し、生存可能な動物同士を掛け合わせることにより得ることとなる。この場合、メンデルの法則によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する動物は、生存可能な動物同士を掛け合わせて得られる産仔のうち理論上２５％の確率でしか得られない。しかし、引用することにより本出願の一部とされるWO2009/104794では、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する動物を胚盤胞補完により生殖可能年齢まで成長させる方法が開発されている。この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する非ヒト動物同士（例えば、ノックアウト非ヒト哺乳動物）の交配により、次世代では生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する産仔を理論上１００％の確率で得ることが可能である。従って、この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する哺乳動物（ファウンダー哺乳動物）を得ることができる。
【００４９】
キメラ形成能を有する細胞は、上記の胚盤胞補完を利用したファウンダー哺乳動物の作製に用いることができる。従って、本発明によれば、ファウンダー哺乳動物を製造する方法であって、ａ）プライム型多能性幹細胞、または、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞若しくは生殖細胞を調製する工程；ｂ）非ヒト哺乳動物の胚盤胞期の受精卵中に、該細胞を移植する工程；ｃ）該受精卵を非ヒト仮親哺乳動物の母胎中で発生させて、産仔を得る工程；およびｄ）該産仔個体を生殖可能年齢にまで成長させる工程を含み、非ヒト哺乳動物は、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子を有する非ヒト哺乳動物である方法が提供される。ここで、細胞および製造される臓器は、該非ヒト哺乳動物とは異なる個体の異個体哺乳動物由来であり得る。本発明の一つの実施態様では、細胞を導入する胚は、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子を有する非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物、げっ歯類以外の非ヒト哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）由来の胚であり、導入される細胞は、該非ヒト哺乳動物とは異個体の哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物、げっ歯類以外の哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の細胞である。細胞は、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）することにより、キメラ形成率を飛躍的に向上させる。従って、本発明の方法は、細胞に対して細胞死抑制処理する工程をさらに含んでいてもよい。細胞を導入する胚と細胞とは、同種であっても異種であってもよいが、単にファウンダーを生殖可能年齢まで生存させる観点では、同種であることが好ましい。本発明では、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥は、導入された細胞によって補完される。
【００５０】
本発明では、胚に導入する細胞として特定の臓器または身体部分にしか寄与しない組織幹細胞、系列決定済み前駆細胞、体細胞または生殖細胞を用いると、特定の臓器または身体部分のみがキメラである、非ヒトキメラ動物を作製することができる。例えば、異種間キメラ動物を作製する場合には、胚導入細胞は、特定の臓器または身体部分、特に限定されないが、例えば、脳や生殖系列に寄与しないものを用いることが好ましい場合がある。そのため、本発明では、胚導入細胞の特定の臓器または身体部分への寄与を制限するために、胚導入細胞として、特定の臓器または身体部分に寄与しない細胞、例えば、特定の臓器または身体部分に寄与しない組織幹細胞、系列決定済み前駆細胞、体細胞または生殖細胞を用いることができる。また、胚導入細胞として、特定の臓器または身体部分にしか寄与しない細胞、例えば、特定の臓器または身体部分にしか寄与しない組織幹細胞、系列決定済み前駆細胞、体細胞または生殖細胞を用いることにより、特定の組織または臓器のみがキメラであるキメラ動物を作製することもできる。別の観点からは、組織幹細胞、系列決定済み前駆細胞、体細胞または生殖細胞は、通常、分化運命が定まっており、全身に寄与することはないと考えられている。従って、組織幹細胞、系列決定済み前駆細胞、体細胞または生殖細胞を用いると、特定の臓器または身体部分のみがキメラであるキメラ動物を作製することができる。ここで、特定の臓器または身体部分とは、１つまたは複数の臓器または身体部分であってもよい。後述するように、細胞を導入する胚が、発生段階において臓器の発生が生じない異常を有する哺乳動物の胚である場合、または、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子を含んでなる非ヒト動物の胚である場合には、その欠陥を補うことのできる細胞（例えば、該臓器または身体部分に分化し得る細胞）を用いることが好ましい。上述のように、胚導入細胞が細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）された細胞である場合には、細胞はその分化運命を維持したままそのキメラ形成率を飛躍的に向上させる。従って、本発明のある態様では、胚導入細胞は細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）された細胞または細胞死抵抗性の細胞（例えば、アポトーシス抵抗性の細胞）である。
【００５１】
本発明では、「臓器」とは、動物の内臓を構成する器官をいう。臓器としては、特に限定されないが、例えば、心臓、肺、腎臓、膵臓、胸腺、脾臓、肝臓、小脳、小腸、結腸および膀胱などが挙げられ、本発明で補完することができる。臓器は、例えば、膵臓、腎臓または胸腺とすることができる。
【００５２】
本発明では、「身体部分」とは、身体のいずれかの部分をいう。身体部分としては、血管、血液、リンパ球、骨および毛髪などが挙げられ、本発明で補完することができる。身体部分は、例えば、リンパ球または毛髪とすることができる。本明細書では、組織も身体部分に含まれる。
【００５３】
本発明では、「該非ヒト動物とは異個体の動物の細胞」とは、非ヒト動物の胚が有する異常または欠陥を補完できる細胞をいい、例えば、野生型の細胞および蛍光タンパク質等を発現する細胞などが挙げられる。
【００５４】
細胞死（例えば、アポトーシス）を抑制することで細胞はキメラ形成能を向上させた。従って、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞または生殖細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、該細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことを特徴とする方法が提供される。
【００５５】
細胞死（例えば、アポトーシス）を抑制することで細胞がキメラ形成能を向上させる理由は以下のように考察される。すなわち、特に着床前などの発生初期において胚の発生段階と導入される細胞の発生段階または発生運命が時間的空間的に大きく異なる場合（例えば、胚盤胞にエピブラスト幹細胞を導入する場合）には、細胞はキメラ動物に寄与することが困難である。しかし、細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うと、細胞はキメラ動物に寄与しやすくなる。このことから、導入された細胞は、発生段階の異なる胚に導入されると細胞死（例えば、アポトーシス）を起こし死滅してしまい、そのためにキメラ動物に寄与することができなかった可能性が考えられる。また、細胞死（例えば、アポトーシス）を抑制すると、胚の発生段階と細胞の発生段階が同調するまで死滅することなく生存することが可能になると考えられ、これがキメラ形成能を失った細胞からキメラ動物を作製することが可能になった理由であると考えられる。例えば、系列決定済み前駆細胞を用いた場合では、この細胞と発生段階が一致するまで胚が発生し、発生段階が同調するまで細胞を生存させることができたために、系列決定済み前駆細胞がそれ以降は胚の中で発生分化することができたと考えられる。
【００５６】
本発明では、アポトーシス抑制処理を行ったエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）は、生殖細胞への分化能を示した。従って、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞に生殖細胞への分化能を付与または向上させる方法であって、該多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことを特徴とする方法が提供される。
【００５７】
本発明ではまた、アポトーシス抑制処理を行ったＥｐｉＳＣは、通常のＥｐｉＳＣとは異なる遺伝子発現パターンを示す一方で、ナイーブ型ＥＳ細胞に類似した遺伝子発現パターンを示した。特に、エピブラスト幹細胞は、該細胞に対してアポトーシス抑制処理を行うことにより、ナイーブ型多能性幹細胞の遺伝子発現パターンを示すようになった。また、コロニーの形態も、プライム型ではなくナイーブ型多能性幹細胞の形態へと変化した。このことから、本発明では、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことにより、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変化させる（変換する）ことができたと考えられる。本発明ではまた、得られたナイーブ型多能性幹細胞は、ＣＤ３１陽性細胞であった。従って、本発明は、アポトーシス抑制処理を行なった多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画することをさらに含んでなってもよい。このようにすることで、キメラ形成能を向上させた多能性幹細胞集団からその一部を構成するナイーブ型多能性幹細胞を効果的に回収することができる。ＣＤ３１陽性細胞の分画は、当業者に周知の方法により（例えば、セルソーターと抗ＣＤ３１抗体などを用いて）行なうことができる。
【００５８】
上述のように、本発明では、アポトーシス抑制処理を行うことにより、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることができた。従って、本発明によれば、哺乳類のプライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞または生殖細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことにより、該細胞をより未分化な状態にする方法が提供される。本発明の一つの態様では、より未分化な状態にする細胞は、哺乳類のプライム型多能性幹細胞である。
【００５９】
また、本発明のある態様によれば、プライム型多能性幹細胞（例えば、げっ歯類のエピブラスト幹細胞などのプライム型多能性幹細胞またはげっ歯類以外の哺乳類のプライム型多能性幹細胞）に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことを特徴とする、該プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を作製する方法およびこの方法により作製されたナイーブ型多能性幹細胞が提供される。細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）は、例えば、細胞が接着培養中に形成するコロニーの形態がナイーブ型多能性幹細胞様になるまで行うことができる。プライム型多能性幹細胞がナイーブ型多能性幹細胞になったかどうかは、生化学的特徴および／または生理学的特徴の変化を確認することにより判別することができる。
【００６０】
また、本発明のある態様によれば、プライム型多能性幹細胞から接着培養において細胞が重層したコロニーを形成できる多能性幹細胞を作製する方法であって、プライム型多能性幹細胞（例えば、げっ歯類のエピブラスト幹細胞などのプライム型多能性幹細胞またはげっ歯類以外の哺乳類のプライム型多能性幹細胞）に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行うことを特徴とする方法、および、この方法により作製された多能性幹細胞が提供される。細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）は、例えば、細胞が接着培養中に形成するコロニーの形態が、細胞が重層してなる形態になるまで行うことができる。
【００６１】
本発明では、プライム型多能性幹細胞の初期化促進剤であって、細胞死抑制剤（例えば、アポトーシス抑制剤、ネクローシス抑制剤またはオートファジー抑制剤）を含んでなる、初期化促進剤が提供される。本明細書では、「初期化促進剤」とは、プライム型多能性幹細胞の完全な初期化状態（ナイーブ状態またはグランド状態）への移行を促進する作用剤を意味する。本明細書では、「初期化促進剤」は、必ずしも完全な初期化状態を達成させる作用剤を意味しない。本発明の初期化促進剤は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための薬剤である。本発明の初期化促進剤は、場合によっては、プライム型多能性幹細胞を未分化な状態にしてナイーブ型多能性幹細胞を生み出すことができる。従って、本発明では、プライム型多能性幹細胞に対して用いるためのナイーブ型多能性幹細胞の誘導剤が提供される。本発明では、細胞死抑制剤としては、上記の通り、細胞の細胞死を抑制し得るあらゆる化合物を用い得る。
【００６２】
本発明は、プライム型多能性幹細胞の初期化促進剤を製造するための細胞死抑制剤（例えば、アポトーシス抑制剤、ネクローシス抑制剤またはオートファジー抑制剤）の使用に関する。本発明はまた、プライム型多能性幹細胞に対して用いるためのナイーブ型多能性幹細胞の誘導剤を製造するための細胞死抑制剤（例えば、アポトーシス抑制剤、ネクローシス抑制剤またはオートファジー抑制剤）の使用に関する。本発明はまた、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型幹細胞を製造するための細胞死抑制剤（例えば、アポトーシス抑制剤、ネクローシス抑制剤またはオートファジー抑制剤）の使用に関する。
【００６３】
本発明では、キメラ形成能を有さない細胞またはキメラ形成能力を有さないと考えられてきたを胚導入細胞として用いてキメラ動物を作製することができる。キメラ形成能を有さない細胞を胚導入細胞として用いてキメラ動物を作製し、キメラ動物の体内でどのような組織に分化したかを調べることにより、胚導入細胞として用いた細胞の分化能を評価することができる。従って、本発明によれば、細胞の分化能を評価する方法であって、本発明の方法に従ってキメラ哺乳動物を作製し（但し、評価対象の細胞を非ヒト哺乳動物の胚へ導入する細胞として用いる）、作製された哺乳動物キメラ中の各組織への該細胞の寄与を調べることにより、細胞の各組織への分化能を評価する方法が提供される。胚導入細胞のキメラ哺乳動物内での分布を確認するためには、胚導入細胞は、特に限定されないが、標識されていることが好ましい。標識は、胚と胚導入細胞とを識別できるものであれば特に限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ビーナス、ＤｓＲｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびこれらの改変体などの蛍光タンパク質、並びに、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質とすることができる。例えば、胚導入細胞にこれらの蛍光タンパク質またはその改変体を強制発現させておくことで、得られたキメラ動物内での胚導入細胞に由来する細胞の分布を容易に解析することができる。分化能を評価する際には、胚導入細胞または胚を胚に導入する前に化合物処理してもよい。化合物処理の有無による分化能の変化を調べることにより、該化合物が細胞の分化能に与える影響を調べることが可能である。分化能を評価する際にはまた、胚導入細胞に特定の遺伝子を発現誘導させ、または、特定の遺伝子を発現抑制し、該遺伝子が胚導入細胞の分化に与える影響を評価してもよい。また、培養下で多能性幹細胞から作製された各種細胞は、その機能性と安全性の評価（例えば、正常な機能を有するか、細胞の癌化等のおそれがないか等の評価）を行っておくことが望ましい。本発明では、そのような細胞を胚導入細胞として用いることで、細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価することができる。従って、本発明によれば、細胞の各組織への分化能に加えて、細胞の生体内での機能若しくは安全性を評価する方法が提供される。
【００６４】
また、本発明の上記評価方法は、化合物のスクリーニングに用いることができる。従って、本発明によれば、細胞のキメラ形成能および／または分化能を増強または低下させる化合物のスクリーニング方法であって、
細胞と化合物を接触させることと、
該細胞を胚導入細胞として用いてキメラ動物を作製し、キメラ動物の体内での該細胞の分布を調べることにより、該細胞のキメラ形成能および／または分化能を評価することと、
評価結果に基づいて細胞のキメラ形成能および／または分化能に正の影響または負の影響を与える化合物を選択することと、
を含んでなる化合物のスクリーニング方法が提供される。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法は、細胞の分化誘導作用を有する化合物、細胞をより未分化な状態にする作用を有する化合物、細胞の分化運命決定作用を有する化合物などのスクリーニングに用いることができる。キメラ形成能および／または分化能の評価においては、臓器毎または組織毎に細胞のキメラ動物への寄与を調べてもよい。
【００６６】
本発明のキメラ動物の製造方法では、プライム型多能性幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、体細胞または生殖細胞を胚に導入し、かつ、場合によっては該細胞に対して細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）を行ってもよいが、これ以外は通常のキメラ哺乳動物を作製する方法に従って実施することができる。具体的には、キメラ哺乳動物は、キメラ形成能を有する細胞を、同種異個体または異種個体の胚に導入し（例えばマイクロマニピュレーション技術を用いて導入することができる）、その後、細胞が導入された胚を偽妊娠した仮親の子宮に移植して発生させることにより作製することができる。キメラ動物は出産により産仔として得ることができる。キメラ動物は産仔を成長させて成体として得ることもできる。
【００６７】
本発明では、ヒトｉＰＳ細胞をアポトーシス抑制処理することによってそのキメラ形成能を向上させることができた。従って、本発明によれば、ヒト多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、ヒト多能性幹細胞に対して細胞死抑制処理を行なうことを含んでなる方法が提供される。本発明によればまた、キメラ動物を作製する方法であって、ヒト多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなり、該細胞が細胞死抑制処理されていることを特徴とする方法が提供される。ヒト多能性幹細胞としては、ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が挙げられ、本発明で用いることができる。本発明では、ｉＰＳ細胞がキメラ形成能の高いもの（例えば、平均よりも高いもの）から選択されることにより、キメラ形成率をさらに向上させ得る。
【実施例】
【００６８】
実施例１Ａ：エピブラスト幹細胞を用いたキメラマウスの作製
本実施例では、マウスエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）を用いてキメラマウスの作製を試みた。
【００６９】
まず、実施例で用いるＥｐｉＳＣ株（メインポピュレーション）は、Tesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199に記載の方法に基づいて作製した。すなわち、細胞は、マウスのエピブラストを切り裂いて得た細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で解離させた後に、フィーダー細胞として増殖不活性化処理したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を播種したＭＥＦコートプレートに播種し、次いで増殖したコロニーをクローン化してＥｐｉＳＣ株を樹立した。
【００７０】
ＥｐｉＳＣは１５％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１％非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、２ｍＭ  グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）またはＬ−グルタミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｄ−ＭＥＭから構成される培地中で維持した。ＥｐｉＳＣは、完全にコンフルエントになる前に３〜５日おきに継代した。
【００７１】
ＥｐｉＳＣは、ｔｄＴｏｍａｔｏという蛍光タンパク質で標識した。具体的には、ＥｐｉＳＣは、ＣＡＧプロモーターにより発現されるｔｄＴｏｍａｔｏ（タカラバイオ）を発現するレンチウイルス発現ベクターを感染させた。その後、注入前にＦＡＣＳ（ＭｏＦｌｏ：ベックマン・コールター社；Ａｒｉａ：ベクトン・ディッキンソン社）を用いてｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞を単離した。
【００７２】
得られたＥｐｉＳＣ（以後、「ＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ」ということがある）は、胚盤胞期の胚にマイクロインジェクションにより導入して、キメラ胚を作製した。具体的には、まず、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ；ＤＢＡ１  Ｆ１）またはＩＣＲ系統マウスの胚をＭｅｄｉｕｍ２（ミリポア社製）で培養して、８細胞期または桑実胚期とした。得られた胚をＫＳＯＭ培地（ミリポア社製）中に移動し、２４時間培養して胚盤胞期まで発生させた。胚に注入するＥｐｉＳＣは、トリプシン処理して単一細胞にまで解離し、培地で懸濁した。顕微鏡下で、ピエゾに基づくマイクロマニピュレータを用いて透明体に穴を空け、帯下の空間に胚当り約１０個のＥｐｉＳＣを注入して、キメラ胚を作製した。
【００７３】
注入後、胚を割球になるまでＫＳＯＭ培地中で培養し、その後、偽妊娠のレシピエントＩＣＲメスマウスの子宮に移植した。
【００７４】
胚は、移植１０日後（正常に発生した胚では胎生期１２．５日（Ｅ１２．５）に対応する）に回収した。胚は、蛍光顕微鏡下で確認したところ、ｔｄＴｏｍａｔｏのシグナルは観察されなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。すなわち、このＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ株は、キメラを形成することができなかった。この結果は、従来の報告（例えば、Tesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199）と整合する結果である。
【００７５】
実施例２Ａ：Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣを用いたキメラマウスの作製
そこで、発明者らは、様々な因子を検討したところ、抗アポトーシス因子として知られるＢｃｌ−２遺伝子を導入したＥｐｉＳＣは、キメラ形成能を有することを見出した。
【００７６】
Ｂｃｌ−２遺伝子としてはヒトＢＣＬ−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０２７２５８．１）またはマウスＢｃｌ−２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０９５９６４．１）を用いた。Ｂｃｌ−２遺伝子は、Ｔｅｔ−ｏｎ  ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ誘導性レンチウイルスベクター（ＡｉＬＶ；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１２）を用いてＥｐｉＳＣ−ｔｄＴに導入した。具体的には、Ｔｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答エレメントおよびリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｅｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒｔＴＡ））を用いて構築した（図１Ａ）。この系では、テトラサイクリンやその誘導体であるドキシサイクリンの添加により、細胞内でＢｃｌ−２を発現させることができる。なお、ウイルスがインテグレートした細胞としていない細胞とを見分けるために、このＴｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶには、ヒトユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーターにより駆動されるｒｔＴＡにＥＧＦＰを発現可能に導入した。
【００７７】
Ｔｅｔ−ｏｎ−Ｂｃｌ−２が導入されたＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ（ＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２）は、ＥＧＦＰの蛍光強度を指標としてＦＡＣＳにより単離した。胚盤胞に注入する２４〜４８時間前から、細胞を培地中で１μｇ／ｍＬドキシサイクリンで処理し、Ｂｃｌ−２の発現を誘導した。
【００７８】
マイクロマニピュレータを用いて得られたＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２をマウス胚盤胞に注入し、胚は、上述の通りにレシピエントマウスの子宮に移植した。レシピエントマウスは、胚の移植後１週間は、２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン水を与えた。Ｅ１２．５にて胚を回収し、蛍光顕微鏡下で胚を観察した。すると、ＥｐｉＳＣ−ｔｄＴ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２に由来する細胞は、胎児の全身に寄与していた（図１Ｄおよび１Ｅ）。すなわち、Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣを胚導入細胞として用いることにより高効率のキメラ動物の作製が可能となった。
【００７９】
このようにして得られたキメラマウスは、正常に発生し、出生した。出生後９日でマウスを解剖して観察したところ、導入したＥｐｉＳＣは、観察されたすべての組織（肺、膵臓、胃、生殖系列（精巣）およびその他の臓器など）に寄与していた（図１Ｆ、１Ｇ、１Ｈおよび１Ｉ）。さらに、生殖系列への細胞の寄与を明確にするために、組織切片を生殖細胞のマーカーであるｍｏｕｓｅ  ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｍｖｈ）との局在を確認したところ、組織切片上で、導入ＥｐｉＳＣとＭｖｈ発現細胞とが共局在を示した（図１Ｋ〜１Ｐ）。共局在は、以下のように観察した。まず、Ｅ１２．５でキメラマウス胚から生殖腺を摘出し、１０％パラホルムアルデヒド溶液中で２時間固定したのち、３０％スクロース溶液中に一晩置いた。その後、生殖腺をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（テッシュー・テック社）に包埋したのち、凍結ブロックを作成した。凍結ブロックからクリオスタット（LEICA社  CM3050S）で７μｍ厚の凍結切片を作成した。凍結切片に生殖細胞のマーカーであるｍｏｕｓｅ  Ｖａｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｍｖｈ）に対する抗体（Ａｂｃａｍ社  ＃１３８４０）を一次抗体、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体とした蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社  ＢＺ−９０００）にて観察した。観察の結果、ＥｐｉＳＣ−Ａ−ＴＲＥ−ＢＣＬ２細胞を移植して作製されたキメラマウス由来の生殖腺において（図１Ｋ〜Ｍ）、ＤｓＲｅｄ陽性の移植細胞の一部が、Mvhを発現していた（図１Ｌおよび１Ｍ中の矢印）。また、ＥｐｉＳＣ−Ｂ−ＴＲＥ−ＢＣＬ２細胞を移植して作製されたキメラマウス由来の生殖腺においても（図１Ｎ〜１Ｐ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性の移植細胞の一部が、Ｍｖｈを発現していた（図１Ｏおよび１Ｐ中の矢印）。この結果から、移植されたエピブラスト幹細胞株が生殖細胞を形成できることが示された。
【００８０】
また、ＥｐｉＳＣ−ｔｄＴの代わりに、ＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣ（ＥｐｉＳＣ−Ａ−Ｂｃｌ２）やＢＤＦ−１由来のＥｐｉＳＣ（ＥｐｉＳＣ−Ｂ−Ｂｃｌ２）を用いてキメラマウスを作製した場合でも、キメラ形成能を確認することができ、キメラ形成率はそれぞれ、約２５％および約６０％であった（図１Ｊ）。このように、ＥｐｉＳＣは、Ｂｃｌ−２を導入して強制発現させることで、キメラ形成能を向上させることができた。なお、ＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣ（ＥｐｉＳＣ−Ａ）とは、ＥＢ３ＤＲ  ＥＳ細胞に由来し、ＣＡＧ発現ユニットの制御下にＤｓＲｅｄ−Ｔ４遺伝子が連結された遺伝子を有するＥｐｉＳＣである。ＥＢ３ＤＲマウスＥＳ細胞株は丹羽仁史博士（理化学研究所  発生・再生センター）より供与を受けた。ＥＢ３ＤＲをマウス胚に移植して作製したキメラエピブラスト胚よりＥｐｉＳＣを樹立したのち、ＦＡＣＳを用いてＤｓＲｅｄ発現細胞を単離した。これにｔｅｔ−ｏｎ−ＢＣＬ２発現ベクターを導入し、Ｂｃｌ−２発現細胞（ＥｐｉＳＣ−Ａ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２）を調製した。
【００８１】
マウスＥｐｉＳＣの代わりに本実施例に記載の通りにＢｃｌ−２を強制発現するラットＥｐｉＳＣ（ＢＬＫ−ＲＴ２−ＥｐｉＳＣ−ＢＣＬ２）をマウス胚盤胞に導入して異種間キメラが作製できるかを検証したところ、ラットＥｐｉＳＣを胚導入細胞として用い、かつ、異種であるマウスの胚に導入しても、キメラを作製するができた（図２ＤおよびＥ）。ラットＢＬＫ−ＲＴ２−ＥｐｉＳＣは、Ｒｏｓａ２６プロモーターによってｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＢＬＫ−ＲＴ２ラットＥＳ細胞（Kobayashi et al., 2012）をマウス胚盤胞胚に移植して作製した異種間キメラエピブラスト胚から実施例１Ａと同様にＥｐｉＳＣを樹立し、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞をＦＡＣＳで選別することで得られた。これに実施例１Ａと同様にｔｅｔ−ｏｎ−ＢＣＬ２遺伝子を導入した（ＢＬＫ−ＲＴ２−ＥｐｉＳＣ−ＢＣＬ２）。ラットにおいても、異種間キメラにおいても、ＢＣＬ２遺伝子の発現によってキメラ形成が可能になった。
【００８２】
本実施例で用いたＢｃｌ−２遺伝子としては、ヒト由来の遺伝子を用いたが、マウスおよびラットの中で正常に機能させることができた。従って、ＥｐｉＳＣにキメラ形成能を付与するには、同種由来のＢｃｌ−２遺伝子を用いる必要が無いことが明らかとなった。マウス由来のＢｃｌ−２遺伝子を導入した場合でも同様の結果であった（データ非掲載）。さらに、Ｂｃｌ−２を強制発現するＥｐｉＳＣは、異種間キメラ動物の作製に胚導入細胞として用いることができることも明らかとなった。
【００８３】
実施例３Ａ：内胚葉系列前駆細胞を用いたキメラマウスの作製
本実施例では、ＥｐｉＳＣよりもさらに分化した内胚葉系列前駆細胞であっても、Ｂｃｌ−２遺伝子の強制発現によりキメラ動物の作製に利用できるかを検証した。
【００８４】
細胞を内胚葉系列の細胞に代える以外は実施例１Ａと同じ方法により、Ｂｃｌ−２遺伝子を強制発現する内胚葉系列前駆細胞を得た。内胚葉系列前駆細胞を得るために、内在性のＳｏｘ１７遺伝子座にヒトＣＤ２５がノックインされ、Ｓｏｘ１７が発現するとヒトＣＤ２５も同時に発現するように改変されたＫ１７−５マウスＥＳＣ株（Ｙａｓｕｎａｇａら、２００５）を用いた。この細胞株を用いると、ヒトＣＤ２５の発現を指標としてＳｏｘ１７の発現を評価することができ、それにより、内胚葉系列前駆細胞を簡便に単離することができる。
【００８５】
まず、Ｋ１７−５マウスＥＳＣ株にＫ１７−５細胞に実施例１Ａに記載の通りにＢｃｌ−２遺伝子を発現するＴｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶを感染させ、ＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現細胞を単離して、Ｂｃｌ−２遺伝子が組み込まれたＫ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２細胞を得た。次に、ＥＧＦＰシグナルを高めるために、細胞にさらにＣＡＧプロモーターに連結したＥＧＦＰ発現レンチウイルスベクターを感染させ、より強いＥＧＦＰシグナルを伴う細胞（Ｋ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２−ＧＦＰ）をＦＡＣＳによって単離した。得られた細胞を増殖させた後、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および１０μｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加したＳ−ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−Ｏ3培地（ＥＩＤＩＡ社製）中でコラーゲンＩＶコートプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種した。Ｋ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２−ＧＦＰは、分化培養５日後からＳｏｘ１７の発現を開始した（図３Ａ）。内胚葉系列前駆細胞は、分化培養６日目に、ＥＧＦＰを発現する細胞の中からヒトＣＤ２５発現細胞をソーティングすることにより単離して得た。
【００８６】
得られた内胚葉系列前駆細胞は、Ｔａｑｍａｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｒｒａｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて製造者マニュアルに従って解析し、結果をＥＢ３ＤＲマウス胚性幹細胞（ＥＢ３ＤＲ  ｍＥＳＣ）およびＥＢ３ＤＲ由来ＥｐｉＳＣと比較し、ＥＳ細胞の値で標準化した。その結果、Ｋ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２−ＧＦＰ由来のヒトＣＤ２５陽性細胞（すなわち、Ｓｏｘ１７を発現する細胞）は、多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１）の発現は見られず、また、神経分化マーカー（Ｐａｘ６およびＯｌｉｇ２）および中胚葉マーカーの発現も見られなかった（図３Ｂ〜２Ｄ）。しかしながら、Ｋ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２−ＧＦＰ由来のＣＤ２５陽性細胞は、内胚葉マーカーを強く発現していた（図３Ｅ）。これらの結果から、Ｋ１７−５−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２−ＧＦＰ由来のヒトＣＤ２５陽性細胞は、多能性幹細胞ではなく、内胚葉系列前駆細胞であることが確かめられた。
【００８７】
内胚葉系列前駆細胞を用いたキメラ形成は実施例１Ａに記載の通りに行った。対照としては、Ｋ１７−５−ＧＦＰ発現細胞を用いた。胚はＥ９．５にて実施例１Ａの記載の通りに分析した。Ｂｃｌ−２の強制発現の無い対照細胞を用いた実験では、キメラの形成は観察されなかった（図４ＡおよびＢ）。これに対して、Ｂｃｌ−２を強制発現させた内胚葉系列前駆細胞を用いた実験では、キメラの形成が観察された（図４ＣおよびＤ）。Ｂｃｌ−２を強制発現させた内胚葉系列前駆細胞を用いた実験では、キメラ形成率は、３回の繰り返し実験を行ったところ、９〜５８％程度であった。Ｂｃｌ−２の強制発現の無い対照細胞を用いた実験では、キメラ形成率は、０％であった（ｎ＝２５）。
【００８８】
内胚葉系列前駆細胞由来の細胞の組織内分布をより詳細に解析するために、キメラ胚を固定し、凍結切片を作製して免疫組織化学染色を行った。
【００８９】
切片は、抗Ｆｏｘａ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｓｃ−６５５４）を用いて内胚葉系列前駆細胞を染色し、抗ＧＦＰ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１１２２）を用いて導入された細胞を染色し、４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて核を染色して蛍光顕微鏡下で観察した。ＥＧＦＰ陽性細胞はＦｏｘａ２陽性内胚葉細胞中またはその付近に見出された（図５Ａ〜Ｉ）。また、外胚葉マーカーであるＴｕｊ１とは共局在しなかった（データ非掲載）。
【００９０】
この結果から、Ｂｃｌ−２遺伝子を強制発現した内胚葉系列前駆細胞は、キメラ形成能を有すること、および、その細胞運命（内胚葉系列）を失わずにキメラを形成することが明らかとなった。すなわち、系列決定済みの幹細胞を用いることで、導入する細胞の組織への寄与をその系列に限定することができた。つまり、系列決定済み前駆細胞を用いることにより、望まない臓器への寄与を抑えたキメラ動物の作製が可能となったと言える。
【００９１】
実施例４Ａ：Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の強制発現の検討
本実施例では、Ｂｃｌ−２遺伝子以外の遺伝子として、Ｂｃｌ−２同様に抗アポトーシス機能を有するＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０８９０１６）の導入を試みた。
【００９２】
実施例１Ａに記載された方法により、ｔｅｔ−ｏｎ  Ｂｃｌ−ｘＬ  ＡｉＬＶベクターを構築し、ＥｐｉＳＣに導入した。実施例１Ａ同様にＥＧＦＰの発現を指標としてＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−ｘＬ細胞を得た（図６Ａ）。対照としては、ＣＡＧプロモーターにＥＧＦＰを連結させたＥＧＦＰ発現レンチウイルスベクターを導入したＥｐｉＳＣを用いた。細胞をマウス胚盤胞に導入し、実施例１Ａの通りにレシピエントマウスの子宮に移植した。Ｅ９．５にて胚を回収して蛍光顕微鏡下で観察したところ、Ｂｃｌ−ｘＬを発現しないＥｐｉＳＣはキメラを形成しなかったが、Ｂｃｌ−ｘＬを発現するＥｐｉＳＣは、完全なキメラを形成していることが明らかとなった（図６Ｂ〜６Ｅ）。
【００９３】
このことから、アポトーシスを抑制することにより、ＥｐｉＳＣにキメラ形成能を付与することができることが明らかとなった。
【００９４】
哺乳類の多能性幹細胞の発生段階は、齧歯類のＥｐｉＳＣの発生段階に相当することが知られていることから、本発明により、哺乳類の多能性幹細胞を用いてキメラ動物を効率的に作製する途が切り拓かれたと言える。
【００９５】
このことは、齧歯類のＥｐｉＳＣや齧歯類以外の哺乳動物のプライム型のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を用いた場合でも、遺伝子改変動物の作製や胚盤胞補完による効率的な臓器再生（例えば、ＷＯ２００８／１０２６０２）が可能となることを意味する。
【００９６】
実施例５Ａ：アポトーシスを抑制する処理をしたＥｐｉＳＣの遺伝子発現解析
実施例２Ａ〜４Ａでは、アポトーシスを抑制する処理をした細胞は、キメラ形成能を向上させていた。そこで、本実施例では、アポトーシスを抑制する処理をしたＥｐｉＳＣの遺伝子発現解析を行い、ＥｐｉＳＣおよびＥＳ細胞の遺伝子発現と比較した。
【００９７】
実施例２Ａに記載される通りに調製したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２を１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで２４時間以上処理して、ＥｐｉＳＣにＢｃｌ−２を発現させた。
【００９８】
ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ、実施例１ＡにおいてTesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199により報告されたマウスのＥｐｉＳＣとＥＳＣの遺伝子発現データ（ＧＳＥ７８６６）とを元に、実施例１Ａで樹立したＥｐｉＳＣ−ＡおよびＥｐｉＳＣ−Ａ−ＴＲＥ−ＢＣＬ２株の遺伝子発現プロファイルを網羅的に比較し、クラスター解析を行った。ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ、および３種のマウスＥＳ細胞株（mES_ESF58/1、mES_ESF175/1およびmES_ESF122）を比較対照として遺伝子発現プロファイルのクラスター解析を行った。
【００９９】
遺伝子発現プロファイルは、以下のように行った。まず、ＥｐｉＳＣ−ＡまたはＥｐｉＳＣ−Ａ−ＴＲＥ−ＢＣＬ２に、ドキシサイクリン処理を行ったもの、ドキシサイクリンを除去後２４時間経過したもの、ドキシサイクリンを除去後４８時間経過したもの、の各条件の細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ  １００ｎｇを鋳型とし、Ａｇｉｌｅｎｔ社が推奨する一色法のプロトコルに準じてラベル化ｃＲＮＡを得た。このｃＲＮＡをマイクロアレイチップ  Ａｇｉｌｅｎｔ−０１４８６８  Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４ｘ４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ社  Ｇ４１２２Ｆ）とハイブリダイゼーションさせ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒでスキャニングを行った。得られたデータはアレイ間ノーマライズを行い、ＧＳＥ７８６６と比較できるようにした。解析にはＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １１．５．１（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いた。ＧＳＥ７８６６のマウスＥＳ細胞の遺伝子発現データセット（ｍＥＳ＿ＥＳＦ５８／１、ｍＥＳ＿ＥＳＦ１７５／１、ｍＥＳ＿ＥＳＦ１２２；図７中ｍＥＳＣ−１、ｍＥＳＣ−２、ｍＥＳＣ−３に対応）とマウスＥｐｉＳＣの遺伝子発現データセット（ＥｐｉＳＣ−５、ＥｐｉＳＣ−７＿Ｐ２０、ＥｐｉＳＣ−７＿Ｐ２５；図７中ｍＥｐｉＳＣ−１、ｍＥｐｉＳＣ−２、ｍＥｐｉＳＣ−３に対応）との間で発現量に１０倍以上の差があった遺伝子群について、ＧＳＥ７８６６、ＥｐｉＳＣ−Ａ、ＥｐｉＳＣ−Ａ−ＴＲＥ−ＢＣＬ２の各条件との間でクラスター解析を行った。
【０１００】
その結果、Ｂｃｌ−２を強制発現するＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２は、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣとは、異なるクラスターに分類された（図７）。ドキシサイクリン非存在下で培養したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２でもＢｃｌ−２の発現がリークしており、ドキシサイクリンの存在よりもＢＣＬ２導入の影響が大きく、ＥｐｉＳＣの遺伝子発現パターンをＥＳ細胞よりに変化させていることがわかった（図７）。
【０１０１】
次に、比較する遺伝子を６つに絞り込んで各遺伝子の発現量の詳細を比較した（表１および図８）。
【０１０２】
【表１】
2018046833.tif 000002
【０１０３】
表１および図８に示される通り、Ｒａｘ１、Ｆｇｆ５、ＴおよびＧｓｃなどにおいて、Ｂｃｌ−２を強制発現するＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｂｃｌ−２は、ＥｐｉＳＣとＥＳ細胞との中間的な値を示した。このことから、ＥｐｉＳＣは、Ｂｃｌ−２を強制発現したことにより、より未分化な状態へと移行したことが示唆された。
【０１０４】
さらに、Ｂｃｌ−２強制発現後のＥｐｉＳＣのＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）の発現を分析した。ＣＤ３１は、ＥＳ細胞では発現するが、ＥｐｉＳＣでは発現が見られないことで知られた細胞表面マーカーである。ＡＰＣコンジュゲート−ラット−抗マウスＣＤ３１抗体（eBioscience社製, 17-0311）を用いてＣＤ３１の発現量をＦＡＣＳにより確認した。その結果、Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣ（ＥｐｉＳＣ−ＡおよびＢ）では２種類ともＣＤ３１の発現を高発現する細胞が確認された（図９）。このことから、Ｂｃｌ−２を強制発現させたＥｐｉＳＣは生化学的にＥＳ細胞の特徴を示すことが明らかとなった。
【０１０５】
さらに、ＡＰＣコンジュゲート−ラット−抗マウスＣＤ３１抗体（eBioscience社製, 17-0311）を用いてＣＤ３１を発現するＥｐｉＳＣをＦＡＣＳにより選別し（図９の枠内）、前述のＥｐｉＳＣの培地中で接着培養したところ、播種後２日目には細胞質が少なく、さらに、細胞間の境界が不明瞭で立体的なコロニーを形成した（図１０Ｃ）。このコロニー形状は、ＥＳ細胞が形成するコロニーに特徴的な形状である（図１０Ａおよび１０Ｃ）。なお、ＥｐｉＳＣおよびＢｃｌ−２を強制発現したにも関わらずＣＤ３１陰性のＥｐｉＳＣは、細胞質が比較的多く、また、扁平なコロニーを形成した（図１０ＢおよびＤ）。従って、Ｂｃｌ−２を強制発現させた細胞のうちＣＤ３１を高発現する細胞は、生理学的にＥＳ細胞の特徴を示すことが明らかとなった。
【０１０６】
Ｂｃｌ−２を強制発現させた細胞のうちＣＤ３１を高発現する細胞は、接着培養において細胞が重層したコロニーを形成できる多能性幹細胞に変化したことから、ＥＳ細胞（すなわち、ナイーブ型多能性幹細胞）に初期化した可能性がある。
【０１０７】
実施例１Ｂ：アポトーシス抑制因子の導入によるキメラ動物の作製
上記実施例では、アポトーシス抑制因子として、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬを用いたが、本実施例では、さらにＸｉａｐおよびｃｒｍＡをアポトーシス抑制因子として細胞に強制発現させ、細胞のキメラ形成能を確認した。
【０１０８】
ＸｉａｐはマウスのＸｉａｐを用い、ｃｒｍＡは牛痘ウイルス由来のｃｒｍＡを用いた。実施例１に記載された方法により、ｔｅｔ−ｏｎ  Ｘｉａｐ  ＡｉＬＶベクターまたはｔｅｔ−ｏｎ  ｃｒｍＡ  ＡｉＬＶベクターを構築し、それぞれをＥｐｉＳＣまたは実施例３Ａで作製した内胚葉系列前駆細胞に導入した。これらアポトーシス抑制因子の導入の効果を明らかにするため、それぞれの未処理細胞（すなわち、遺伝子導入前のＥｐｉＳＣまたは内胚葉系列前駆細胞）と比較した。
【０１０９】
それぞれのキメラ形成率を確認したところ、結果は、図１１ＡおよびＢに示される通りであった。図１１ＡおよびＢに示されるように、いずれかのアポトーシス抑制因子を導入した細胞も、キメラ形成能を大きく向上させた。また、未処理細胞は、キメラ形成能を有しないと考えられてきた細胞であったが、意外にもキメラ動物に寄与することができた。また、未処理細胞も、寄与した細胞は、内胚葉系列に限られていた（図１１Ｃ〜Ｆ）。
【０１１０】
この結果から、アポトーシス抑制処理が細胞のキメラ形成能を向上させることがさらに確認できた。また、従来キメラ形成能が無いと信じられてきた上記細胞が、アポトーシス抑制処理の有無に関わらず、意外にもキメラ形成能を有することが明らかとなった。さらに、内胚葉系列前駆細胞にＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬまたはｃｒｍＡを強制発現させると、そのキメラ形成能が向上し、内胚葉系列前駆細胞は、その細胞運命を失わずにキメラを形成することが再確認された。
【０１１１】
従来、キメラ形成能を有するとされる細胞は極めて限られ、仮に多能性幹細胞であってもキメラ形成能を有しないものが存在することが知られていた。そして、組織幹細胞、組織前駆細胞、体細胞または生殖細胞などの細胞は、多能性幹細胞よりも発生段階が進んでいることから、キメラ形成能を当然有しないと考えられてきた。ところが、今回の実験により、組織前駆細胞であり、かつ、系列決定済み前駆細胞である、内胚葉系列前駆細胞が、割合は低いながらもキメラ形成能を有していることが明らかとなった。
【０１１２】
また、キメラ形成能は発生段階が進むにつれて失われるものであることから、内胚葉系列前駆細胞よりも発生段階が早い細胞である、プライム型多能性幹細胞や組織幹細胞もキメラ形成能を有していると考えられる。さらには、体細胞や生殖細胞も、キメラ形成能を有していると考えられる。
【０１１３】
実施例２Ｂ：細胞死抵抗性のエピブラスト細胞を導入することによるキメラ動物の作製
実施例１Ｂでは、アポトーシス抑制処理をしない場合でも、割合は低いながら内胚葉系列前駆細胞がキメラに寄与した。エピブラスト幹細胞においても同様の結果が得られるかを確認するため、本実施例では、アポトーシス抑制処理がなされていないエピブラスト幹細胞のキメラ形成能を検証した。
【０１１４】
実施例１Ａと同様の方法でＥｐｉＳＣ−ｔｄＴを作製し、維持培養した株（以下、「ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂ」という）を、アポトーシス抑制処理せずに胚に導入してキメラを形成させた。
【０１１５】
具体的には、ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂを、実施例１に記載された方法でマウスの胚盤胞に導入し、キメラ個体が形成されるか否かを確認した。すると、驚くべきことに割合は低いながらＥｐｉＳＣ−ｓｕｂを導入した胚からは、キメラ動物を得ることができた（図１２ＣおよびＤ）。キメラ形成率は、約１０％であった。
【０１１６】
ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂの細胞死抵抗性を検証した。多能性幹細胞は、単一細胞化すると細胞死を起こして死滅することが知られている（Ohgushi M. et al., Cell Stem Cell, 7: 225-239, 2010）。そこで、ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂを単一細胞化して、その後、細胞を接着培養し、コロニー形成率を確認した。
【０１１７】
具体的にはまず、トリプシンでＥｐｉＳＣ−ｓｕｂおよびｍＥｐｉＳＣ−Ｂ（対照）をそれぞれ処理して単一細胞化した。その後、セルソーターＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、ＭＥＦフィーダーでコートした９６穴プレートの１穴あたり１細胞を播種した。７−１０日間の培養の後に、コロニー形成が認められたウェルの数を数え、コロニー形成率を求めた。その結果、ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂは高いコロニー形成率を示した（約６５％）。この実験により、ＥｐｉＳＣ−ｓｕｂは、細胞死抵抗性のＥｐｉＳＣであることが分かった。一方、ＥｐｉＳＣ−ＡおよびＥｐｉＳＣ−Ｂでは、単一細胞化後にはコロニー形成能はほとんど見られず、キメラ形成能も示さなかった。
【０１１８】
実施例２Ｂからは、エピブラスト幹細胞には、高いキメラ形成能を有するものが存在することが明らかとなった。また、単一細胞化後にコロニー形成能を有する細胞（すなわち、細胞死抵抗性の細胞）を用いた場合には、アポトーシス抑制処理をしなくてもキメラ形成に寄与することが明らかとなった。また、細胞の細胞死抵抗性を向上させることにより、細胞のキメラ形成能を向上させることができると考えられた。
【０１１９】
実施例３Ｂ：始原生殖細胞を導入することによるキメラ動物の作製
本実施例では、内胚葉前駆細胞と同様に、始原生殖細胞においても細胞死抑制によってキメラの作製が可能になるかどうかを検証し、さらに導入した始原生殖細胞の生殖細胞への寄与を確認した。
【０１２０】
まず、われわれはマウスＥＳ細胞に対して、実施例１Ａに記載の通りにＢｃｌ−２遺伝子を発現するＴｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶを感染させ、ＢＣＬ２誘導性マウスＥＳ細胞を作製した。次に、分化誘導に先立ち、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結させたｔｄＴｏｍａｔｏを含むベクター（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏベクター）を導入して、細胞を蛍光標識した。その後、正常なＥＳ細胞とＢＣＬ２誘導性マウスＥＳ細胞とをそれぞれ始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）に分化誘導した。ＰＧＣＬＣの分化誘導の条件は、Hayashi et al., Cell, 2011に記載の分化条件とした。これらの細胞は分化誘導に先立ち、ＣＡＧプロモーターによってｔｄＴｏｍａｔｏを恒常的に発現するレンチウイルスベクターで標識している。また、分化誘導の後に、ＳＳＥＡ−１およびＣＤ６１を共に発現する細胞を始原生殖細胞としてセルソーターで分離した（図１３Ａ、破線部）。
【０１２１】
このようにして選別された始原生殖細胞はマウス胚盤胞に移植され、胚はレシピエントの子宮に移植された。１０日後（胚の発生段階は１２．５日胚相当）、胚を解析した。その結果、正常なＥＳ細胞から作製された始原生殖細胞様細胞はキメラをほとんど形成しなかったのに対し、Ｂｃｌ−２を導入した始原生殖細胞は高頻度でキメラを形成した（図１３Ｂ）。摘出された生殖腺では、Ｂｃｌ−２を発現させなかった細胞では、キメラ形成は確認されなかったが（図１３ＣおよびＤ）、Ｂｃｌ−２を強制発現させた細胞では、移植細胞が高いキメリズムを示した（図１３ＥおよびＦ）。なお、図１３ＣおよびＥは、明視野像である。さらに、生殖腺から凍結切片を作製して蛍光免疫染色法により詳細に移植細胞の局在を検証したところ、生殖細胞のマーカーであるＶａｓａ（図１３Ｇ）とｔｄＴｏｍａｔｏの発現（図１３Ｈ）は、共染色されることが示された（図１３ＧおよびＦ中の矢じり）。これにより、Ｂｃｌ−２の強制発現によって細胞死を抑制した始原生殖細胞様細胞を胚に導入しても、高頻度にキメラ形成が可能になることが示された。また、導入された始原生殖細胞様細胞は、生殖系列の細胞に効果的に寄与した。
【０１２２】
実施例４Ｂ：アポトーシス抑制処理したヒトｉＰＳ細胞を導入することによるキメラ動物の作製
本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞のキメラ形成能に対する、細胞死抑制処理の効果を検証した。
【０１２３】
まず、ヒトｉＰＳ細胞は、ヒト末梢血由来細胞にセンダイウィルスを用いて初期化因子を導入して作製した。具体的には、ヒト末梢血を比重遠心して得た単核細胞にＯＣＴ４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，ＭＹＣをポリシストロニックに発現するセンダイウィルスを導入し、ＭＥＦフィーダーコートプレートに播種したのち、２週間ほど培養を続けて、ヒトｉＰＳ細胞を得た。次に、ヒトｉＰＳ細胞はコロニーごとに分けて株化したのち、細胞質にｓｉＲＮＡを導入することでセンダイウィルスベクターを取り除いた。このようにして得られたｉＰＳ細胞は、外来性遺伝子を有さない。ヒトｉＰＳ細胞は、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結されたｔｄＴｏｍａｔｏを恒常的に発現するレンチウイルスベクターにより蛍光標識した。
【０１２４】
次に、得られたｉＰＳ細胞に、実施例１Ａに記載の通りにＢｃｌ−２遺伝子を発現するＴｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶを感染させ、ドキシサイクリン依存的にＢｃｌ−２を発現するヒトｉＰＳ細胞を得た。対照としては、Ｂｃｌ−２遺伝子を導入していないヒトｉＰＳ細胞を用いた。
【０１２５】
１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで１０時間以上処理して、ヒトｉＰＳ細胞にＢｃｌ−２を発現させてから、細胞を胚盤胞期のマウス胚に移植して培養下で胚をエピブラスト期相当の発生段階まで発生させた。対照群の胚には、Ｂｃｌ−２遺伝子を導入していないヒトｉＰＳ細胞を導入した。移植後７日目までの胚中の移植細胞の分布を蛍光顕微鏡により観察した。
【０１２６】
その結果、対照群の胚では、ｉＰＳ細胞は胚中からすぐに消失したが（図１４Ｇ、Ｈ、ＫおよびＬ）、Ｂｃｌ−２を発現させたｉＰＳ細胞は、マウス胚の発生段階が進んでも長期間にわたって胚中で生存していた（図１４Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、ＭおよびＮ）。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞を胚導入細胞として用いた場合でも、細胞をアポトーシス抑制処理することにより細胞はキメラに寄与した。このことは、ヒトｉＰＳ細胞が、アポトーシス抑制処理により高いキメラ形成能を得たことを意味する。
【０１２７】
実施例４Ｃ：アポトーシス抑制処理したマーモセットＥＳ細胞を導入することによるキメラ動物の作製
本実施例では、マーモセットＥＳ細胞のキメラ形成能に対する、細胞死抑制処理の効果を検証した。
【０１２８】
まず、マーモセットからＥＳ細胞を常法により取得した（Sasaki et al, 2005, Stem Cells）。次に、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を実施例１Ａに記載の作製方法にならってｔｅｔ−ｏｎ  ＡｉＬＶを用いて強制発現させたマーモセットＥＳ細胞を作製した（試験群）。マウス胚の細胞と区別するために、マーモセットＥＳ細胞は、実施例３Ｂに記載の方法にならってＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏベクターを導入して蛍光標識した。対照としては、単にＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏベクターを導入して蛍光標識したマーモセットＥＳ細胞を用いた。
【０１２９】
Ｂｃｌ−２発現マーモセットＥＳ細胞は、移植１０時間前から最終濃度１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理してＢｃｌ−２を発現させた。マーモセットＥＳ細胞をマウス胚盤胞に移植してキメラ胚を作製し、得られたキメラ胚をレシピエントマウスの子宮に移植した。その後、試験群および対照のいずれの場合も、解析までレシピエントマウスには２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン水溶液を与えて、Ｂｃｌ−２の発現を維持させた。移植４日後（マウス胚の発生段階で妊娠６．５日相当）にマウス胚を解析した。
【０１３０】
結果は、図１５に示される通りであった。図１５によれば、Ｂｃｌ−２を導入しなかった対照ＥＳ細胞を導入したマウス胚では、マーモセットＥＳ細胞が寄与していることを示す蛍光は観察されなかったが（図１５ＡおよびＢ）、Ｂｃｌ−２を強制発現させたマーモセットＥＳ細胞では、マーモセットＥＳ細胞が胚に寄与し、キメラ胚を形成しているようすが観察された（図１５Ｃ〜Ｆ）。また、Ｂｃｌ−２を強制発現させたマーモセットＥＳ細胞を用いると、キメラ形成率が約５８％（３回の実験の平均、ｎ＝３８）であり、非常に高いキメラ形成率を示した。なお、対照ＥＳ細胞を用いるとキメラの形成は観察されなかった（２回の実験の平均、ｎ＝３１）。さらに、ＰＣＲ法によりマウス胚中にマーモセット由来の細胞が寄与していることを確認した。具体的には、それぞれのβアクチン遺伝子（ＡＣＴＢ遺伝子）を特異的に増殖するプライマーを設計しＰＣＲ法によりキメラが形成されていることを確認した。マウスＡＣＴＢ遺伝子増幅用のプライマーとしては、ＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴとＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴを用い、マーモセットＡＣＴＢ遺伝子のプライマーとしてはＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡとＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡを用いた。すると、図１５Ｇに示されるように、取り出したマウス胚からマーモセットＧＡＰＤＨの存在が確認され、導入したＥＳ細胞が確かにマウス胚中に寄与していることが明らかとなった。
【０１３１】
実施例４Ｂおよび４Ｃの結果は、ヒトやマーモセットなどのげっ歯類以外の哺乳動物の多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）に対しても、アポトーシス抑制処理がキメラ形成能を向上させる上で有効であることを示すものである。
【０１３２】
実施例４Ｂおよび４Ｃの結果はまた、ヒトｉＰＳ細胞またはマーモセットＥＳ細胞をマウスの胚に導入してもキメラ動物が得られたというものである。ヒトまたはマーモセットとマウスとでは、種が大きく異なる点は特に注目されるべき点である。より近縁の種同士で異種間のキメラ動物が得られるであろうことは、当業者であればこの結果に基づき十分に理解できる。
【０１３３】
考察
実施例２Ａ〜４Ａ、１Ｂおよび２Ｂにおいてキメラ形成能の低い細胞またはキメラ形成能を有しない細胞を用いて、高効率にキメラ動物を作製できるようになった理由としては以下のようなことが考えられる。本実施例の結果を考慮すると、発生過程の細胞は、異なる時間腔得間的環境、例えば、本来の発生運命と異なる領域に置かれた際に細胞死またはアポトーシスを起こしている可能性が示唆される。そのため、本発明で観察された現象は、細胞のアポトーシスを抑制することにより、細胞は胚発生の段階が適合する時期まで生き延びることができるのではないかと考えられる。
【０１３４】
実施例３Ａおよび３Ｃによれば、発生段階の進んだ系列決定済み前駆細胞ですらキメラ動物を形成した。このことから、細胞死抑制処理（例えば、アポトーシス抑制処理）により実施例３Ａおよび３Ｃで用いた系列決定済み前駆細胞を許容しうる程度に発生するまで細胞を生存させておくことができれば、細胞は胚の環境中で組織に寄与することができるようになるのではないかと考えられる。
【０１３５】
さらに本発明では、プライム型多能性幹細胞であるＥｐｉＳＣからナイーブ型多能性幹細胞を得ることができた。従って、同様にげっ歯類以外の哺乳動物のプライム型多能性幹細胞からもナイーブ型多能性幹細胞が得られると考えられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月17日(2017.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法であって、
プライム型多能性幹細胞に対してアポトーシス抑制処理を行ない、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を誘導すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ナイーブ型多能性幹細胞を回収することをさらに含む、方法。