(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞レベルにおいて、より正確なプロバイオティクスの被貪食能の評価方法であり、同時に、負担の大きい外科的手術などによらない方法で簡易に生体内に近い状態での、均一なプロバイオティクスの被貪食能の評価方法を提供する。【解決手段】細菌と接触したことがない貪食作用を有する細胞にプロバイオティクスを接触させる工程を含む、プロバイオティクスの被貪食能の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用なプロバイオティクスをスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＴＬＲ２を発現する貪食細胞と、候補プロバイオティクスとを接触させる工程、
（ｂ）前記貪食細胞による候補プロバイオティクスの貪食量を定量する工程、
（ｃ）得られた貪食量と基準値とを比較する工程、
を含み、貪食量が基準値よりも有意に大きい場合、プロバイオティクスとして有用であると判断する、前記方法。
【請求項２】
プロバイオティクスが、イムノバイオティクスである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＴＬＲ２を発現する貪食細胞が、未分化細胞から誘導されたものである、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
未分化細胞が、末梢血から単離した単球である、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
貪食細胞が、未成熟単球由来樹状細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
基準値が、ＴＬＲ２をブロッキングした貪食細胞と候補プロバイオティクスとを接触させた際に得られる貪食量である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合し、貪食される、Lactobacillus属菌。
【請求項８】
Lactobacillus jenseniiである、請求項７に記載のLactobacillus属菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクスの評価方法に関し、更に詳細には、細胞レベルでの定量的なプロバイオティクスの被貪食能の評価方法およびこれを利用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、薬による治療ではなく、消化管内のフローラ（細菌叢）を改善し、宿主に有益な作用をもたらしうる有用な微生物と、それらの増殖促進物質、いわゆるプロバイオティクスを利用して、治療する方法に注目が集まっている。例えば、特定のLactobacillus gasseri菌由来のオリゴヌクレオチドがトール様受容体（ＴＬＲ）９を介して認識されることにより、リンパ球幼若化活性やＮＦ−κＢ転写活性を増強することが知られている（特許文献１）。また、Lactobacillus jensenii菌ＴＬ２９３７株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２）が、ＩＦＮ−βの発現増加やＭＣＰ−１の発現抑制を誘導し、抗ウィルス性炎症作用を発揮することが記載されている（特許文献２）。
【０００３】
こうしたプロバイオティクスを投与した際に有用な効果を発揮するメカニズムを解明する上で、サイトカインや核内転写因子等の遺伝子レベル、蛋白質レベルでの解析は進められているが、細胞レベルにおいて、作用させたプロバイオティクスの挙動の解析は、十分とは言い難い。抗原に対する免疫の賦活化において、外来抗原に対する樹状細胞などの貪食細胞が抗原提示などの役割を果たしていることが知られており（非特許文献１および２）、また腸管免疫細胞群にも樹状細胞が存在していることが知られているが、プロバイオティクスがどのように免疫賦活化および免疫寛容に関係しているのかについては、現在のところほとんど未解明である。
【０００４】
これに関し、プロバイオティクスによる免疫賦活化を検証する場合、実際に腸管から樹状細胞を採取するには、樹状細胞の調製の際に採取元の動物を殺処分しなければならず、非常に非効率的である。一方、末梢血の単球から形質細胞様の樹状細胞を分化誘導できることが知られており、このようにして誘導された樹状細胞（ｐＤＣ）が、Lactococcus lactis JCM5805株を貪食して活性化し、ＩＦＮ産生が誘導されたとの報告がある（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２３２７９０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１１８０６０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shen et al., The Journal of Immunology, (1997) 158, 2723-2730
【非特許文献２】Rodriguez et al., Nature Cell Biology, (1999) 1, 362-368
【非特許文献３】Sugimura et al., Clinical Immunology, (2013) 149, 509-518
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞レベルにおいて、より正確なプロバイオティクスの有用性を簡便に評価する方法および、それを利用した有用なプロバイオティクスのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、プロバイオティクスの中でも特に免疫系に作用するプロバイオティクスについて研究する中で、プロバイオティクスと称される細菌の中でも、腸管の樹状細胞の貪食を受けやすいものと受けにくいものが存在するという新たな知見を得た。そしてこれらの差異について鋭意研究を続ける中で、樹状細胞に貪食されやすい細菌ほど、プロバイオティクスとして有用な効果を発揮するものであること、および貪食されやすい細菌の貪食においては、樹状細胞表面に発現するＴＬＲ２が関与していることを見出し、さらに研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下に関する。
＜１＞有用なプロバイオティクスをスクリーニングする方法であって、
（１）ＴＬＲ２を発現する貪食細胞と、候補プロバイオティクスとを接触させる工程
（２）前記貪食細胞による候補プロバイオティクスの貪食量を定量する工程
（３）得られた貪食量と基準値とを比較する工程
を含み、貪食量が基準値よりも有意に大きい場合、プロバイオティクスとして有用であると判断する、前記方法。
＜２＞プロバイオティクスが、イムノバイオティクスである、＜１＞のスクリーニング方法。
＜３＞ＴＬＲ２を発現する貪食細胞が、未分化細胞から誘導されたものである、＜１＞または＜２＞のスクリーニング方法。
＜４＞未分化細胞が、末梢血から単離した単球である、＜３＞のスクリーニング方法。
＜５＞貪食細胞が、未成熟単球由来樹状細胞である、＜１＞〜＜４＞のスクリーニング方法。
＜６＞基準値が、ＴＬＲ２をブロッキングした貪食細胞と候補プロバイオティクスとを接触させた際に得られる貪食量である、＜１＞〜＜５＞のスクリーニング方法。
＜７＞貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合し、貪食される、Lactobacillus属菌。
＜８＞Lactobacillus jenseniiである、＜７＞のLactobacillus属菌。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、有用なプロバイオティクス、特に免疫機能に有用に作用するイムノバイオティクスを、簡便な手法でスクリーニングすることが可能となる。近年医薬の有効成分としてプロバイオティクスが注目されており、本発明によりスクリーニングされるプロバイオティクスは、特に自己免疫疾患や炎症性疾患に対する医薬の有効成分として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】末梢血由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋および末梢血由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋細胞と、腸管由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋および腸管由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋細胞のフローサイトメトリーのデータを用いた二重染色によるドットプロットである。
【図２】末梢血由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋細胞（ＡおよびＢ）および末梢血由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋細胞（ＣおよびＤ）と、腸管由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋細胞（ＥおよびＦ）および腸管由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋細胞（ＧおよびＨ）に、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を接触させた後のフローサイトメトリーのデータによるヒストグラムである。
【図３】腸管由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋の細胞に、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株、それぞれの株との接触時間における平均蛍光強度を示したグラフである。
【００１２】
【図４】ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を接触させた後の末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞（ＡおよびＢ）および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞（ＣおよびＤ）、および上記いずれの株とも接触させていない細胞（Ｅ）の走査型電子顕微鏡の写真である。
【図５】末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性における細胞に、ＴＬ２９３７株を接触させて、青色で核、赤色でエンドソーム、緑色で細菌を染色した後のレーザー顕微鏡の写真である。
【００１３】
【図６】末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞（Ａ、ＢおよびＣ）および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞（Ｄ、ＥおよびＦ）に、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を接触させた後の透過型電子顕微鏡の写真である。
【図７】末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞に、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を接触させた後、それぞれの細胞内部に取り込まれた細菌数を計測したグラフである。
【００１４】
【図８】ＴＬ２９３７株を用いたＴＬＲ２ブロッキング試験の結果を表すグラフである。抗ＴＬＲ２抗体を用いた場合に、コントロールおよびアイソタイプ抗体を用いた場合と比較して有意に蛍光強度が低減した。これはＴＬＲ２との結合により、ＴＬ２９３７の貪食細胞への付着および貪食が生じることを示唆する。
【図９】末梢血単球由来の各種免疫担当細胞におけるサイトカイン発現量をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す。未成熟末梢血単球由来樹状細胞において最も顕著にＴＬ２９３７株とＴＬ２７６６株の相違が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において「プロバイオティクス」とは、消化管内のフローラ（細菌叢）に作用して宿主に有益な作用をもたらしうる微生物および該微生物の増殖促進物質のみならず、これらの微生物が産生した物質（微生物の培養物を含む）も包含する。したがって、本発明のプロバイオティクスには、細菌叢を形成する、乳酸菌、ビフィズス菌、プロピオン酸菌、大腸菌などの細菌のみならず、かかる細菌の増殖を促進する物質や宿主に有益な作用をもたらしうる酵母、芽胞産生菌、真菌などの有用な微生物およびこれらの微生物が産生した物質（微生物の培養物を含む）を包含する。本発明において、「イムノバイオティクス」とは、プロバイオティクスの中でも特に腸管免疫系に作用し、これを調節する作用を有するプロバイオティクスを意味する。
【００１６】
本発明において、「貪食」、「食作用」または「貪食作用」とは、体内に存在するある程度の大きさの異物や異常代謝物を細胞内へと取り込み、分解する作用のことを言い、自然免疫に分類される細胞のメカニズムである。本発明において、「貪食細胞」とは、上記貪食作用を有する細胞を意味し、これに限定するものではないが、例えば単球、好中球、マクロファージ、白血球、樹状細胞などが挙げられる。
【００１７】
＜１＞本発明のスクリーニング方法
本発明の一側面において、有用なプロバイオティクスをスクリーニングするためのスクリーニング方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）トール様受容体（ＴＬＲ）２を発現する貪食細胞と、候補プロバイオティクスとを接触させる工程、
（ｂ）前記貪食細胞による候補プロバイオティクスの貪食量を定量する工程、
（ｃ）得られた貪食量と基準値とを比較する工程。
【００１８】
工程（ａ）において、ＴＬＲ２を発現する貪食細胞と、候補プロバイオティクスとを接触させる。これにより候補プロバイオティクスが貪食細胞に貪食される。用いる貪食細胞は、ＴＬＲ２を発現する貪食細胞であればいかなる細胞であってもよく、天然にＴＬＲ２を発現する貪食細胞であっても、ＴＬＲ２を強制発現させた貪食細胞であってもよいが、好ましくは天然にＴＬＲ２を発現する貪食細胞である。天然にＴＬＲ２を発現する貪食細胞の例としては、これに限定するものではないが、例えばパイエル板由来の樹状細胞（ＰＰＭＰ）、単球から分化誘導された樹状細胞（ＭｏＤＣ）などが挙げられる。
接触させる候補プロバイオティクスは、貪食細胞の貪食作用に影響しない限り、任意に標識されていてよい。標識としては、例えば蛍光標識、放射線標識などが挙げられるがこれに限定されない。
【００１９】
工程（ｂ）において、貪食細胞に貪食された候補プロバイオティクスの貪食量を定量する。本発明において「貪食量」とは、貪食細胞が対象をどの程度貪食したかを表す定量的数値を意味する。本工程において定量される貪食量は、貪食細胞に貪食された候補プロバイオティクスの量を表す数値であればいかなるものであってもよく、これに限定するものではないが、例えば貪食された候補プロバイオティクス数、蛍光標識された候補プロバイオティクスの貪食細胞中の相対蛍光強度などが挙げられる。蛍光標識を用いる場合では、計測操作自体は簡便であるものの各プロバイオティクスによって菌体１個当たりの蛍光強度が異なるため、基準値として測定値と相対的比較が可能な基準値を用いるときには（例えば基準値としても同一のプロバイオティクスの蛍光強度を用いる場合など）好適に用いられる。貪食されたプロバイオティクス数を計数する場合は、貪食量として絶対的な基準となるため、汎用的により好適に用いることができる。
【００２０】
貪食量の定量は、当該技術分野において公知の方法を用いることができる。例えば貪食量を貪食された候補プロバイオティクス数とする場合、工程（ａ）において候補プロバイオティクスと接触させた貪食細胞を切片化し、顕微鏡で観察することで計数することができる。顕微鏡は計数するプロバイオティクスを観察することができればいかなる顕微鏡を用いてもよく、これに限定するものではないが、例えば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型レーザー顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などが挙げられる。計数の簡便さに鑑みると、ＴＥＭが好ましい。貪食量を候補プロバイオティクスの貪食細胞内の相対蛍光強度とする場合、蛍光強度を計測する方法は当該技術分野において知られており、当業者であれば適宜方法を選択することができ、例えば蛍光高度計による計測などが挙げられる。
【００２１】
工程（ｃ）において、上記得られた貪食量と基準値とを比較する。基準値としては、例えばプロバイオティクスとして有用でないことが判明している同種の細菌の同じ貪食細胞への貪食量、貪食細胞表面のＴＬＲ２をブロッキングした際の候補プロバイオティクスの貪食量など、ＴＬＲ２が関与しないと推測される貪食量であればいかなるものであってもよい。かかる基準値と比較した際に、得られた貪食量が基準値よりも有意に大きければ、候補プロバイオティクスが有用なプロバイオティクスであると判断することができる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされるプロバイオティクスは、ＴＬＲ２と高い結合性を有するプロバイオティクスであると考えられる。ＴＬＲは自然免疫の作動に関与するパターン認識受容体であり、したがってＴＬＲ２と高い結合性を有するプロバイオティクスは、自然免疫を作動させる性質を有するプロバイオティクスであることが期待される。したがって本発明によりスクリーニングされるプロバイオティクスは、好ましくはイムノバイオティクスである。本発明において「イムノバイオティクス」は、プロバイオティクスの中でも特に腸管免疫系に働きかけることで免疫賦活の作用に優れたプロバイオティクスを意味する。
【００２３】
本発明においては、上述のとおり貪食細胞による候補プロバイオティクスの貪食量を定量することにより、有用なプロバイオティクスをスクリーニングするものであるが、プロバイオティクスである以上当然貪食細胞としても腸管由来の貪食細胞（例えばＰＰＭＰなど）を用いるのが好適であると考えられる。しかしながら、腸管由来の細胞は（１）調製のために給源である動物を殺処理する必要がある、（２）調製時点において、既に細胞内に１以上のプロバイオティクスを貪食している可能性がある、などの点において不利な点を有する。前記不利な点を有しない好適な細胞として、本発明者らが、未分化細胞から誘導された貪食細胞を用い得ることを見出した。
【００２４】
未分化な細胞としては、これに限定するものではないが、例えばｉＰＳ細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、腸管幹細胞などの体性幹細胞、および単芽球、単球などの前駆細胞などが挙げられる。本発明者らにより、腸管樹状細胞と末梢血単球から分化誘導した樹状細胞が類似の表現型を有していること、プロバイオティクスのスクリーニングにおいて同等の性質を有していることが見出された。したがって本発明の未分化細胞としては、好ましくは末梢血から単離した単球を用いる。
【００２５】
上記未分化細胞は、ブタ、ウシ、サル、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、カモなどの鳥類などから採取することができる。また、未分化細胞として確立された細胞株を用いてもよい。
【００２６】
本発明の好ましい一態様において、貪食細胞として末梢血単球由来の樹状細胞を用いる。末梢血から単離した単球を樹状細胞に分化させる方法は、当該技術分野において知られている（例えばSilva-Campa et al, Virology., 2010;396:264-71参照）。一態様において、末梢血から単離した単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で刺激すると、未成熟な樹状細胞に分化する。未成熟な樹状細胞を更にリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激することにより、成熟した樹状細胞とすることができるが、本発明者らにより、成熟した樹状細胞と未成熟な樹状細胞では、プロバイオティクスの貪食に差異があることが見出された。すなわち、未成熟な樹状細胞は、成熟した樹状細胞と比較して、貪食するプロバイオティクスによってサイトカイン発現の差異が顕著になることが見出された。したがって本発明のより好ましい一態様において、末梢血単球由来の樹状細胞の中でも未成熟な樹状細胞が用いられる。
【００２７】
本発明は、プロバイオティクス、特にイムノバイオティクスとして有用な細菌が、貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合することにより、より多く貪食細胞に貪食されるという事実を見出したことに端を発する。すなわち、プロバイオティクスが貪食細胞に貪食される際にＴＬＲ２と結合するか否かを調べることにより、プロバイオティクスの有用性を評価することが可能になる。したがって本発明の一態様において、ＴＬＲ２をブロッキングした貪食細胞と候補プロバイオティクスとを接触させる工程を含む。
【００２８】
かかる態様において、（ｂ）の工程は必ずしも必要ではない。すなわち、貪食細胞表面のＴＬＲ２のブロッキングの有無による貪食量を比較し、その変化を定性的に評価することができれば、必ずしも貪食量を定量する必要はない。しかしながら、より精度の高い評価を行うことができるという観点から、好ましくは（ｂ）の工程を含む。かかる態様においては、（ｃ）の工程における基準値を、ＴＬＲ２をブロッキングした貪食細胞と候補プロバイオティクスとを接触させた際に得られる貪食量とすることができる。
【００２９】
本明細書において貪食細胞表面の「ＴＬＲ２のブロッキング」は、ＴＬＲ２としての機能を低減、好ましくは無効化することを意味し、当該技術分野において公知の方法で行うことができる。また、「ＴＬＲ２のブロッキングの有無による貪食量」を比較する場合には、貪食細胞表面のＴＬＲ２が機能している細胞と、同貪食細胞において細胞表面のＴＬＲ２が機能していないかまたは細胞表面にＴＬＲ２が発現していない細胞を用いることで達成することができる。したがって、細胞表面のＴＬＲ２としての機能を低減または無効化する方法としては、細胞表面のタンパク質の機能を阻害する物質を用いる方法、タンパク質の発現そのものをコントロールする方法などが挙げられ、具体的には、これに限定するものではないが、例えばＴＬＲ２に結合する抗体やアンタゴニストを用いて候補プロバイオティクスとの結合を阻害する方法、ＴＬＲ２を発現する貪食細胞とＴＬＲ２のｓｉＲＮＡなどによって同細胞においてＴＬＲ２遺伝子の発現を阻害した細胞株とを用いる方法、ＴＬＲ２を発現しない貪食細胞と同細胞においてＴＬＲ２を形質転換などにより強制発現させた細胞株とを用いる方法などが挙げられる。
【００３０】
＜２＞本発明のLactobacillus属菌
本発明の一側面において、プロバイオティクス、特にイムノバイオティクスとして有用な細菌を提供するものである。本発明者らにより、プロバイオティクスの中に、貪食細胞に貪食される際に、貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合し、それをトリガーとして貪食が開始されるものが存在すること、およびかかるプロバイオティクスは特に腸内免疫系にとって有用な性質を有することが見出された。したがって本発明は、貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合し、貪食される特徴を有するプロバイオティクスに関する。
【００３１】
貪食細胞表面のＴＬＲ２と結合し、貪食されるプロバイオティクスであるか否かは、例えば貪食細胞表面のＴＬＲ２をブロッキングした場合に貪食量が低減するか否かを定性的または定量的に評価することにより確認することができる。したがって、一態様において本発明のプロバイオティクスは、貪食細胞表面のＴＬＲ２をブロッキングした際に貪食量が有意に低減するプロバイオティクスである。
【００３２】
かかるプロバイオティクスは、プロバイオティクスとなり得る菌として知られた菌であればいかなる種類のものであってもよく、これに限定するものではないが、例えばLactobacillus属菌、Bifidobacterium属菌、Lactococcus属菌、Streptococcus属菌などが挙げられる。本発明の一態様において、本発明のプロバイオティクスはLactobacillus属菌である。
【００３３】
Lactobacillus属菌としては、これに限定されるものではないが、例えばLactobacillus delbrueckii subsp. burgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus oris、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarumなどが挙げられ、好ましくはLactobacillus casei、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus gasseriなどが挙げられる。本発明の一態様において、本発明のプロバイオティクスはLactobacillus jenseniiである。
【００３４】
本発明者らにより、本発明のプロバイオティクスは、腸内免疫系に有用に作用することが見出され、特に腸内免疫系において、過剰な免疫反応を抑制し、抗炎症効果などを発揮することができることがわかっている。したがって本発明のプロバイオティクスを有効成分として含む抗炎症剤、または本発明のプロバイオティクスを抗炎症剤として用いる方法もまた、本発明に包含される。
【００３５】
また、本発明のプロバイオティクスは、例えば経口的に摂取あるいは経管、経鼻などにより、腸管まで送達されて効果を発揮するものである。したがって本発明はまた、本発明のプロバイオティクスを含む腸管用組成物も包含する。本発明において「腸管用組成物」とは、腸管に送達され、腸管で効果を発揮する組成物を意味する。腸管用組成物は、腸管に送達され得る経路で対象に投与される。腸管に送達され得る経路としては、これに限定するものではないが、典型的には経口投与であり、他の経路としては例えば経鼻投与、経管投与、経腸投与、胃ろうなどが挙げられる。経口投与用組成物としては、ヒトを含む哺乳動物または鳥類が、通常経口により摂取するものであればいかなるものであってもよく、これに限定するものではないが、例えば食品組成物、飲料組成物、飼料組成物、医薬組成物などが挙げられ、これらには栄養補助食品（サプリメント）、食品添加剤、飼料添加剤なども含まれる。食品組成物としては、例えば発酵乳、チーズなどを含む発酵食品が好ましい。
【００３６】
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
以下、末梢血由来により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの末梢血由来に限定されない。
【実施例】
【００３７】
例１．細胞の調製
（１）末梢血由来の細胞の調製
感染症などに罹患していない、出荷の１カ月前の成熟ブタ（LandraceとLarge YorkshireのＦｌにDurocを交配させた、ＬＷＤブタ（ヒルズ））の外頚静脈から採血し、真空採血管（TERUMO）に入れた。そして、Lympholyte-Mammal（CEDARLANE）の比重法を用いて、この血液からLympholyteを分注したチューブに、細胞懸濁液を静かに重層してから、遠心分離法（１８００ｒｐｍ、６０分間、２０℃）を用いて、単核球細胞を分画した。ここで、この単核球細胞を１×１０７個／ウェルで播種し、１時間で保持して付着させた。その後に、ＩＬ−４（R&D system）と、ＧＭ−ＣＳＦ（R&D system）を２０ｎｇ／ｍＬずつで含むＲＰＭＩ培地を添加してから培養（３７℃、５％のＣＯ２の条件下）し、この培養の開始から７２時間後に、新たな培地に交換した。さらに、この培養（３７℃、５％のＣＯ２の条件下）を５日間で継続して、分化誘導した末梢血由来の樹状細胞を得た。
【００３８】
（２−１）フローサイトメトリーによる細胞の調製
上記の末梢血由来の細胞について、ブタ樹状細胞の表面マーカーであるＣＤ１７２ａとＣＤ１１Ｒ１を、それぞれフィエリスリン（ＰＥ）およびペリオジニン（ＰｅｒＣＰ）で共染色し、フローサイトメトリーに供した。その結果として、二重染色によるドットプロット解析を図１に示した。なお、縦軸はＣＤ１７２ａ陽性細胞数、横軸はＣＤ１１Ｒ１陽性細胞数である。そして、図１Ａの上の四角は、両表面マーカーの発現が高い細胞集団のＣＤ１７２ａ＋  ＣＤ１１Ｒ１＋サブセットを示し、（図１Ａ）、図１Ａの下の四角は、ＣＤ１７２ａの発現が低くて、ＣＤ１１Ｒ１の発現が高い細胞集団のＣＤ１７２ａｌｏｗ  ＣＤ１１Ｒ１＋サブセットを示す（図１Ａ）。
【００３９】
（２−２）磁気ビーズ分離（ＭＡＣＳ）法による細胞の調製
磁気ビーズ分離法を用いて、上記の末梢血由来の細胞から、ＣＤ１７２ａ陽性細胞を分離するため、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳを含むＭＡＣＳバッファーで洗浄し、上記の末梢血由来の細胞の１×１０７個に対して、それぞれ、Mouse anti-porcine Monocyte/Granulocyte-Biotin（Southern Biotech、Catalog Number 4525-08）（ａｎｔｉ−ＣＤ１７２ａ）を１０μＬで添加してから、インキュベート（４℃、１０分間）した。その後に、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、それぞれ、Streptavidin標識マイクロビーズ（MiltenyiBiotec）を１０μＬで添加してから、インキュベート（４℃、１５分間）した。さらに、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、ＭＡＣＳバッファーに懸濁させた。
【００４０】
次に、ＬＳカラム（MiltenyiBiotec、Catalog Number 130-042-401）を、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、磁気ビーズで標識した末梢血由来の細胞の懸濁液をカラムへ流した。さらに、ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、プランジャーを用いて、カラムに保持されているＣＤ１７２ａ陽性細胞を押し出し、末梢血由来のＣＤ１７２ａ陽性細胞を得た。
【００４１】
（３）腸管由来の細胞の調製
感染症などに罹患していない、健康な成熟ブタ（ＬＷＤ）の腸管組織から、パイエル板を採取し、１重量％のStreptomycin/Penicilin（Invitrogen）を含むＰＢＳで洗浄した。次に、ハサミを用いて、そのパイエル板の組織をホモジナイズした。そして、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼおよび１５μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ培地を添加してから、振とう培養（３７℃、６０分間）した。ここで、この組織液の上清をアスピレーターにて除去し、１０％（v/v）のFetal calf serum（ＦＣＳ）、０．０２重量％のＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加してから、インキュベート（３７℃、５分間）した。さらに、PETRI DISH（Corning）に、二枚重ねのガーゼを敷き、その上で培養したパイエル板の組織を押し潰して、細胞懸濁液を調製した。
【００４２】
さらに、上記の細胞懸濁液の上清をアスピレーターにて除去し、０．２重量％のＮａＣｌ溶液を添加してから軽く混ぜ合わせて、赤血球を破裂した。そして、直ちに等量の１．５重量％のＮａＣｌ溶液を添加してから、生理食塩水と同程度に戻した。次に、ＲＰＭＩ培地を適量で添加してから、上清をアスピレーターにて除去し、再びＲＰＭＩ培地に懸濁した。そして、Cell Strainer（BD）を用いて、ＲＰＭＩ培地を濾過した後に、Lympholyte-Mammalの比重法を用いて、免疫担当細胞を分画し、腸管由来の樹状細胞を得た。
【００４３】
（４−１）フローサイトメトリーによる細胞の調製
フローサイトメトリーを用いて、上記（２−１）と同様に、上記の腸管由来の細胞を調製した。ここで、図１Ｂの上の四角は、ＣＤ１７２ａ＋  ＣＤ１１Ｒ１＋サブセットを示し（図１Ｂ）、図１Ｂの下の四角は、ＣＤ１７２ａｌｏｗ  ＣＤ１１Ｒ１＋サブセットを示す（図１Ｂ）。
【００４４】
（４−２）磁気ビーズ分離（ＭＡＣＳ）法による細胞の調製
磁気ビーズ分離法を用いて、（２−２）と同様に、上記の腸管由来の細胞から、ＣＤ１７２ａ陽性細胞を得た。
【００４５】
（５）細菌（菌株）の調製
上記の各細胞に接触させる菌株には、株式会社明治が保有するLactobacillus (L.) plantarum TL2766（以下、ＴＬ２７６６株と称することがある）およびLactobacillus (L.) jensenii TL2937（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２）（以下、ＴＬ２９３７株と称することがある）を用いた。このとき、ＭＲＳ培地を用いて、上記の２菌株を培養（３７℃、２４時間）することを１回の継代とし、３回で継代した。
【００４６】
そして、ＴＬ２９３７株では、１．０×１０１１個に対して、Carboxyfluorescein Diacetate（Sigma）（以下、単にＣＦＤＡと称することがある）を１５ｍｇの割合となるように、ＰＢＳで混和し、ＴＬ２７６６株では、１．０×１０１１個に対して、ＣＦＤＡを０．１５ｍｇの割合となるように、ＰＢＳで混和した。さらに、ウォーターバスを用いて、これらＰＢＳの混和液を遮光しながら加熱処理（３７℃、６０分間）して、ＣＦＤＡを菌株内に取り込ませた。その後に、ＰＢＳを用いて、それぞれの菌株を３回で洗浄し、ＣＦＤＡ標識したＴＬ２９３７株およびＴＬ２７６６株を得た。次に、この標識したＴＬ２９３７株およびＴＬ２７６６株を殺菌処理（６０℃、４５分間）してから、プロバイオティクスの被貪食能を評価するために、これらの菌株を用いた。
【００４７】
なお、本発明に用いたＴＬ２９３７株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD, AIST）（日本国  〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２０１０年５月１４日付、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２として寄託されている。なお、Budapest Notification No. 282 (http://www.wipo.int/treaties/en/notifications/budapest/treaty_budapest_282.html)に記載されるとおり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（IPOD, NITE）が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD, AIST）より特許微生物寄託業務を承継したため、現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（IPOD, NITE）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７２）。
【００４８】
例２．フローサイトメトリーを用いた観察
上記（２−１）および（４−１）で得られた細胞を、それぞれ５×１０６個／ウェルで播種し、一晩培養した。次に、これらの培地に対して、ＴＬＲ２抗体（BioLegend.、Catalog Number 309710）とＴＬＲ４抗体（BioLegend.、Catalog Number 312808）を２００ｎｇ／ｍＬで添加してから、インキュベート（３７℃、一晩）した。そして、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を殺菌処理してから、前記の菌体を５×１０８個／ウェルで接触させた。
【００４９】
次に、ピペッティングにより、蛍光標識した菌株と接触させた細胞を回収し、これらの細胞を２×１０６個／ウェルで播種し、２％(v/v)のＦＣＳ、０．０１重量％のＮａＮ３／ＰＢＳを含む洗浄バッファーを用いて、それぞれの細胞を２回で洗浄した。その後に、それぞれの細胞を、抗ＣＤ１７２ａ抗体（SouthernBiotech.、Catalog Number 4525-09）および抗ＣＤ１１Ｒ１抗体（AbD.、Catalog Number MCA1220）と反応（４℃、４０分間）させてから、洗浄バッファーを用いて、それぞれの細胞を２回で洗浄した。その後に、二次抗体（Santa Cruz Biotechnology.、Catalog Number sc-45103）を添加して、抗体反応（４℃、４０分間）させてから、洗浄バッファーを用いて、それぞれの細胞を２回で洗浄した。その後に、各ウェルに、１重量％のパラホルムアルデヒドを含む洗浄バッファーを５０μＬで添加してから、固定処理（４℃、１５分間）した。さらに、洗浄バッファーを用いて、それぞれの細胞を洗浄した後に、洗浄バッファーの１５０μＬに懸濁させた。
【００５０】
FACSAccuri C6（BD）を用いて、細胞の１個あたりの細菌蛍光強度を測定し、上記の蛍光標識した菌体と接触させた細胞を計数して、各細胞の表面および内部に存在する菌体量を数値化した。そして、FlowJoソフトウェア（Tree star）を用いて、これらの数値を解析した。このとき、ＦＳＣおよびＳＳＣにより、ゲートを設定し、ＣＤ１７２ａ陽性顆粒球を除いて、これらの数値を解析した。
【００５１】
ヒストグラムを用いて、菌株と無接触の細胞（対照の細胞）、ＴＬ２７６６株と接触させた細胞およびＴＬ２９３７株と接触させた細胞について、ＦＬ１（ＣＦＤＡ）の蛍光値を示した（図２）。ここで、横軸は、細菌の蛍光強度を、縦軸は、細胞数を示しており、点線のヒストグラムは、対照の細胞の結果を、実線のヒストグラムは、ＴＬ２７６６株と接触させた細胞およびＴＬ２９３７株と接触させた細胞の結果を示している。また、ヒストグラムの上側にあるバーは、ゲートを、バーの下にある数値は、ゲートに存在する細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、バーの上にある数値は、全体に占めるゲートの細胞の割合を示している。そして、対照の細胞で得られたピークを含むゲートおよび、それを含まないゲートの２つを作製し、それぞれにおいて細胞の集団に占める細胞の割合と平均蛍光強度を算出した。なお、菌株による蛍光強度の差異をなくすため、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を殺菌処理してから、それらの蛍光値を測定して、蛍光値を補正した。
【００５２】
末梢血由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋細胞では、ＴＬ２７６６株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合は８．６２％であったのに対して、ＴＬ２９３７株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合は６８．０％であった（図２Ａ、図２Ｂ）。また、末梢血由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋では、ＴＬ２７６６株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合は４．３１％であったのに対して、ＴＬ２９３７株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合は９．４６％であった（図２Ｃ、図２Ｄ）。つまり、何れの細胞においても、ＴＬ２７６６株の蛍光量に比べて、ＴＬ２９３７株の蛍光量が多くなる結果となった。
【００５３】
なお、腸管由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋および腸管由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋においても、ＴＬ２７６６株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合に比べて、ＴＬ２９３７株と接触させて、高い蛍光量を示した細胞の割合は多くなる結果となった（図２Ｅ〜図２Ｈ）。
【００５４】
また、腸管由来ＣＤ１７２ａ＋ＣＤ１１Ｒ１＋の細胞に、ＴＬ２７６６株とＴＬ２９３７株をそれぞれ接触させた。５分、３０分、６０分、１２０分間、それぞれの株に接触させた後、各細胞の平均蛍光強度を測定した。さらに、測定した細胞の各株（菌体）の接触時間と、その接触時間における平均蛍光強度との関係を示した（図３）。その結果、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞の方が、測定開始から２時間後、高い蛍光量を示し、以降も高いレベルを維持した。また、５分程度、ＴＬ２９３７株と接触させると、１２０分間接触させたことと、同等の蛍光量を示すことから、ＴＬ２９３７株は、迅速に貪食されていることが示された。
【００５５】
これらの結果から、腸管由来の細胞と同様に、末梢血由来の細胞でも、細胞質の内部に、菌体が貪食されていることが示唆された。つまり、末梢血由来の細胞でも、腸管由来の細胞と同等の性質を示すことが示唆されており、末梢血由来の細胞を用いてもプロバイオティクスの性質を調べられること、すなわち、プロバイオティクスの腸管免疫系への効果を末梢血由来の細胞で評価できることが示唆された。
【００５６】
例３．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いた観察
塩酸で希釈したコラーゲン（新田ゼラチン）を用いて、トランズウェルインサート（０．４μｍの小孔ポリエステルメンブレン（Corning））の膜表面をコートしてから、上記の磁気ビーズ分離法で得られた末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性の細胞を５×１０６個／ウェルで播種し、細胞を定着（一晩）させた。ここで、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を殺菌処理してから、これらの菌体を５×１０８個／ウェルで接触（３７℃、２時間）させた。その後に、０．２ＭのＨＥＰＥＳバッファーで洗浄してから、２．５％のグルタルアルデヒド（日新ＥＭ）で固定処理（２５℃、２時間）した。さらに、ＨＥＰＥＳバッファーで洗浄してから、ＰＢＳを用いて、５回で洗浄した。そして、０．２５％のタンニン酸で固定処理（２５℃、１５分間）してから、０．５％のタンニン酸で固定処理（２５℃、１５分間）した後に、１％のタンニン酸で固定処理（２５℃、１時間）した。ここで、５０％、７０％、９０％および１００％のエタノールで脱水（１０分間）してから、ｔ−ブチルアルコールに２回で浸漬（３０分間）し、ｔ−ブチルアルコールに置換した。さらに、凍結乾燥（一晩）してから、細胞の表面を白金で処理し、これらの細胞を走査型電子顕微鏡で観察した。
【００５７】
走査型電子顕微鏡を用いて３０００倍で観察した細胞を図４Ａ〜図４Ｅに示す。末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性細胞では、いずれもＴＬ２７６６株と接触させた細胞（図４Ａ、図４Ｃ）に比べて、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞（図４Ｂ、図４Ｄ）において、細胞の表面への菌体の付着量が多いことがわかった。
【００５８】
また上記いずれの株とも接触させていない無接触の細胞（図４Ｅ）と比較した場合も、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞では、細胞表面への菌体の付着量が多いことが確認された。点線で囲んだ部分は、１つの無接触の細胞を示す。
【００５９】
これらの結果から、腸管由来の細胞と同様に、末梢血由来の細胞でも、その表面に菌体が付着していることが観察された。つまり、末梢血由来の細胞でも、腸管由来の細胞と同等の性質を示すことが示唆されており、プロバイオティクスを用いた実験系において、末梢血由来の末梢血由来の細胞を用いることで、腸管由来の腸管由来の細胞の性質を調べられること、すなわち、腸管免疫系への効果を末梢血由来の細胞で評価できることが確認された。
【００６０】
例４．レーザー顕微鏡を用いた観察
顕微鏡観察用のディスク（カバーガラス、φ１２ｍｍ、ブタ腱由来のペプシン可溶性のコラーゲンタイプＩコート（IWAKI））に、上記の磁気ビーズ分離法で得られた末梢血由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋および腸管由来ＣＤ１７２ａ−ＣＤ１１Ｒ１＋の細胞を播種した。そして、培地の１ｍＬに対して５０μＬの割合で、CellLight Early Endosomes-RFP（Life technologies）をウェルに添加してから、細胞のエンドソームを染色（３７℃、一晩）した。ここで、ＴＬ２９３７株を殺菌処理してから、これらの菌体をウェルで接触させた。その後に、ＰＢＳで洗浄してから、４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定処理（２５℃、２０分間）した。さらに、ＰＢＳで洗浄してから、Fluoroshield with DAPI（ImmunoBioScience）で封入した後に、細胞の内部への菌体（ＴＬ２９３７株）の被貪食能を共焦点レーザスキャン顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy、LSM-700）で観察した。
【００６１】
レーザー顕微鏡を用いて観察した結果を図５に示す。ここで、青色は、核を、赤色は、エンドソームを、緑色は、菌体（細菌）を示し、白いバーは、１００μｍを表す。このとき、腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性および末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性では、細胞質の内部のエンドソームに、蛍光標識された菌体が取り込まれていることが観察された（図５）。なお、図５Ｂと図５Ｄは、図５Ａと図５Ｃの垂直断面による観察の結果である。このとき、末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性では、ＴＬ２７６６株と接触させた細胞において、その細胞質の内部に、ほとんど菌体は観察されなかった（データは示していない）。
【００６２】
これらの結果から、腸管由来の細胞と同様に、末梢血由来の細胞でも、その表面に菌体が付着していることと、細胞質の内部に、菌体が貪食されていることが観察された。つまり、末梢血由来の細胞でも、腸管由来の細胞と同等の性質を示すことが定性的に目視で確認されており、プロバイオティクスを用いた実験系において、末梢血由来の細胞を用いることで、腸管由来の腸管由来の細胞の性質を調べられること、すなわち、腸管免疫系への効果を末梢血由来の細胞で確認できることが確認された。さらに、実際に計数する細菌毎に検量線を作製することで、細胞を定量的に観察できることが確認された。
【００６３】
例５．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた観察
（１）顕微鏡による観察
塩酸で希釈したコラーゲン（新田ゼラチン）を用いて、トランズウェルインサート（０．４μｍの小孔ポリエステルメンブレン（Corning））の膜表面をコートしてから、上記の磁気ビーズ分離法で得られた末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性および腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性の細胞を５×１０６個／ウェルで播種し、細胞を定着（１時間）させた。ここで、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株を殺菌処理してから、これらの菌体を５×１０８個／ウェルで接触（３７℃、２時間）させた。その後に、０．２ＭのＨＥＰＥＳバッファーで洗浄してから、２．５％(v/v)のグルタルアルデヒド（日新ＥＭ）で固定処理（４℃、一晩）した。さらに、０．２ＭのＰＢＳで洗浄してから、４重量％の四酸化オスミウムで固定処理（４℃、４時間）した。ここで、５０％(v/v)、７０％(v/v)、８０％(v/v)、９０％(v/v)、９５％(v/v)および１００％(v/v)のエタノールで脱水（１０分間）してから、ＱＹ１（ｎ−ブチルグリシジルエーテル）で置換した。さらに、エポン樹脂に置換して、チャンバーから膜を切除し、エポン樹脂に膜を包埋した。そして、熱風乾燥（６０℃、３日間）してから、標本をトリミングした後に、ウルトラミクロトーム（ウルトラカットＳ、Ｌｅｉｃｈｅｒｔ）に、ガラスナイフを装着して、厚さが０．２μｍの超薄切片を作製した。さらに、これらの切片をグリッドの上に載せて、白金ブルーと鉛染色液で電子染色して乾燥させ、これらの細胞を透過型電子顕微鏡（ZeroA H-7650）で観察した。
【００６４】
透過型電子顕微鏡を用いて所定の倍率で観察した結果を図６に示す。このとき、腸管由来ＣＤ１７２ａ陽性では、ＴＬ２７６６株と接触させた細胞に比べて、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞において、細胞質の内部に菌体が多く観察された。しかし、無接触の細胞（対照の細胞）においても、細胞質の内部に菌体が多く観察され、細胞に接触させた菌体と、腸管から取り込まれる前から既に内在していた細菌を区別しにくかった。一方、末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性では、対照の細胞において、細胞質の内部に菌体は観察されず、ＴＬ２９３７株で接触させた細胞において、細胞質の内部にＴＬ２９３７株らしき菌体が観察された。
これらの結果から、細胞質の内部に貪食された菌体（細菌）を定量的に計数できることを確認できた。
【００６５】
（２）細胞内部に取り込まれた細菌（菌体）の計測（カウント）
末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性における細胞の透過型電子顕微鏡の写真から以下の基準により、細胞の内部に貪食された菌体数を定量的に計数した。すなわち、（１）細胞内のエンドソーム（空隙）に有る黒い物体を、細胞の内部に貪食された菌体とした。（２）菌体を１つ以上で取り込んだ細胞を、計数の対象とした。（３）細胞膜が破壊された細胞を、計数の対象から除外した。（４）計数の対象の細胞を、ランダムに選定した。
【００６６】
末梢血由来ＣＤ１７２ａ陽性におけるＴＬ２７６６株と接触させた細胞およびＴＬ２９３７株と接触させた細胞の２７個ずつについて、それぞれ細胞の内部に貪食された菌体数を定量的に計数（評価）した。そして、これらの菌体数から計算した算術平均を表１に示す。
【表１】
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【００６７】
ここで、ＴＬ２７６６株と接触させた細胞の菌体数の平均は、６．３個であるのに対して、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞の菌体数の平均は、１７．４個であることを確認できた。つまり、ＴＬ２７６６株およびＴＬ２９３７株の被貪食能を定量的に計数（評価）できることが示された。なお、ＴＬ２７６６株では、２０個以上の菌体を取り込んだ細胞を認められなかったのに対して、ＴＬ２９３７株では、全体に占める２０個以上の菌体を取り込んだ細胞の割合が３７％に上った。
【００６８】
また、ＴＬ２７６６株とＴＬ２９３７株（菌体）をそれぞれ、細胞に接触させた後、細胞当たりの貪食された菌体数をカウントし、カウントした数をグラフにした（図７）。なお、細菌の計測（カウント）方法は、上記した（１）〜（４）の方法による。その結果、ＴＬ２９３７株と接触させた細胞の方が、貪食する菌体数が多くなる傾向が確認された。細胞内に小胞が認められ、その中に菌体（黒色に見える）を計測した（図７）。なお、図７中のバー（**）は２群間に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【００６９】
例６．ＴＬＲ２の貪食への関与の確認
本発明者らの研究により、ＴＬ２９３７株は、腸管上皮細胞に発現するＴＬＲ２やＴＬＲ４と結合することにより、サイトカイン発現を抗炎症的に調節していることがわかっている。そこで、上記貪食量の差にＴＬＲ２が関与しているか否かを確認するためのブロッキング試験を行った。
【００７０】
上記（４−１）で得られた細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートされた１２ウェルプレートに、それぞれ１．５×１０６個／ウェルで播種した。一部のウェルには、さらに抗ヒトＴＬＲ２ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz, CA）またはアイソタイプ抗体を加え、１２時間インキュベートした。これに５×１０８個／ｍｌの蛍光標識したＴＬ２９３７株およびＴＬ２７６６株を加え、１２時間刺激し、平均蛍光強度を観察した。
結果を図８に示す。ＴＬ２９３７株においては、ＴＬＲ２のブロッキングにより、平均蛍光強度が有意に低下したことがわかる。一方、ＴＬ２７６６株においては、平均蛍光強度に変化が見られなかった（データ示さず）。したがってこの結果は、ＴＬ２９３７株がＴＬＲ２と結合することにより、貪食細胞表面への付着および貪食が生じていることを示唆している。
【００７１】
例７．ＲＴ−ＰＣＲによるサイトカイン発現の解析
細胞の内部に取り込まれた菌体数の計数から、ＴＬ２７６６株に比べて、ＴＬ２９３７株では、細胞への被貪食能が高いことが示された。そこで、末梢血由来の各種免疫担当細胞における、各プロバイオティクスによるサイトカインの発現の変化について、ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。
【００７２】
具体的には、例１（１）の比重法で得られた細胞を末梢血単球、例１（１）で得られた細胞を未成熟末梢血単球由来樹状細胞、さらに未成熟末梢血単球由来樹状細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、Sigma）で刺激した細胞を成熟末梢血単球由来樹状細胞とし、Shimazu et al., Infect Immun. 2012 Jan;80(1):276-88に記載されたリアルタイムPCRによる定量的発現解析と同様の方法で行った。簡潔には、上記例６と同様に各細胞をプロバイオティクスで刺激し、ＴＲＩｚｏｌ（Sigma）を用いて全ＲＮＡを採取し、Quantitect Reverse Transcription kit（Qiagen）を用いてｃＤＮＡを合成し、7300 Real-time PCR System（Applied Biosystems, Warrington, UK）およびPlatinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG with ROX（Invitrogen）を用いて行った。分析に用いたプライマーは、Villena et al., Immunol. 2012;19:1038-53およびMoue et al., Biochim Biophys Acta. 2008;1780:134-44に記載のＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０プライマーを用い、５０℃で２分間、９５℃で２分間、その後９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間のサイクルを４０サイクルというＰＣＲ条件で行った。内部標準としてはβ−アクチンを用いた。
【００７３】
結果を図９に示す。図中の「＊」、「＊＊」、「＊＊＊」は、それぞれの対照に比べた有意差として、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１を表す。
まず、末梢血由来単球においては、ＴＬ２９３７株とＴＬ２７６６株においては差異が認められなかった。ＩＬ−１βの発現に関しては、成熟および未成熟の樹状細胞で、いずれも両株に差異が認められたが、ＩＬ−１２ｐ４０の発現では未成熟の樹状細胞でのみ両株の差異が認められ、ＩＬ−１０の発現では未成熟の樹状細胞では対照、ＴＬ２９３７株およびＴＬ２７６６株にそれぞれ差異が認められたものの、成熟樹状細胞ではそれらに差異が認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により、簡便な方法を用いて、腸管免疫系に有用に作用するプロバイオティクスをスクリーニングすることが可能となる。有用なプロバイオティクスは現在医薬の有効成分としても注目されており、これらプロバイオティクスを経口摂取用組成物に配合することにより、ヒトや家畜において効果的に炎症性消化管障害などを抑制することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図６ＥＦ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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