(57)【要約】      （修正有）【課題】多糖水溶液を滅菌し、パッケージングする方法の提供。【解決手段】水に部分的に溶解する少なくとも１種の多糖と、水と、多糖水溶液の量に対して０．５質量％以上の量の３−ヒドロキシプロピオン酸と、緩衝系と、を含む滅菌多糖水溶液を含む、滅菌パッケージング手段。具体的には、ａ）少なくとも１種の多糖を水に溶解するステップと；ｂ）少なくとも０．５重量％以上、のβ−ラクトンを、ａ）で生成された多糖水溶液に添加するステップと；ｃ）少なくとも２４時間、４℃〜４０℃の温度にて混合物を保存するステップを含み；水溶液は燐酸系の緩衝系を含み；その緩衝能力が、滅菌された多糖水溶液のｐＨ値が滅菌されてない多糖水溶液のｐＨ値７．０〜８．０と等しくなるように、β−ラクトンの加水分解によって生成された３−ヒドロキシプロパン酸を緩衝するのに十分である方法。前記β−ラクトンが下記式で表されるβ−プロピオラクトンである方法。2018162259.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖水溶液を滅菌するための方法であって、
緩衝液の存在下でβ−ラクトンを多糖水溶液に添加し、混合物を少なくとも２４時間４℃から４０℃の温度にて保存することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記β−ラクトンが、一般式（Ｉ）によって表される化合物（ａ１）
【化１】
2018162259.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル残基、ハロゲン残基、ニトロ残基またはシアノ残基を表す）
および化合物（ａ１）の二量体からなる群から選択される化合物（ａ２）から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−ラクトンがβ−プロピオラクトン（ＣＡＳ番号５７−５７−８）であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記β−ラクトンが多糖水溶液の量に対して０．５重量％以上の量で添加されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖が、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロース、および酸化セルロースからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
７．０から８．０のｐＨ値、好ましくは７．４のｐＨ値を有するリン酸緩衝液が緩衝系として使用されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リン酸緩衝液が、リン酸水素カリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸二ナトリウムとリン酸の組み合わせ、リン酸三ナトリウムとリン酸水素ナトリウムの組み合わせ、およびリン酸三ナトリウムとリン酸の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
β−プロピオラクトンの加水分解によって生成された３−ヒドロキシプロピオン酸が、緩衝系の成分であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
３−ヒドロキシプロパン酸およびヒアルロン酸のナトリウム塩または３−ヒドロキシプロパン酸およびカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩が緩衝系を形成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記緩衝液の成分の全てが、０．５重量％以上の濃度で多糖水溶液中に一緒に溶解することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多糖水溶液の滅菌が、一次パッケージング手段内で行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記多糖水溶液および前記β−ラクトンが、前記多糖水溶液が一次パッケージング手段内に充填される直前に混合されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）少なくとも１種の多糖を水に溶解するステップと、
ｂ）少なくとも０．５重量％のβ−ラクトンを、ａ）で生成された多糖水溶液に添加するステップと、
ｃ）少なくとも２４時間、４℃から４０℃の温度にて混合物を保存するステップと
を含み、前記水溶液は緩衝系を含み、その緩衝能力は、滅菌された多糖水溶液のｐＨ値が滅菌されてない多糖水溶液のｐＨ値と等しくなるように、β−ラクトンの加水分解によって生成された３−ヒドロキシプロパン酸を緩衝するのに十分であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記多糖水溶液が、水、水および３−ヒドロキシプロピオン酸、ならびに緩衝系に少なくとも部分的に溶解する少なくとも１種の多糖を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生成された滅菌多糖溶液。
【請求項１５】
前記緩衝系が、ナトリウムイオン、リン酸二水素イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、３−ヒドロキシプロピオン酸、および３−ヒドロキシプロピオネートを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の滅菌多糖溶液。
【請求項１６】
関節内補充療法のための手段として、ならびにヒトおよび獣医用医薬における医薬担体としての請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生成された滅菌多糖溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、多糖水溶液を滅菌するための方法および該方法によって生成された多糖溶液である。
【背景技術】
【０００２】
関節症（変形性関節症）は関節の一般的な変性疾患である。それは、軟骨表面に対する損傷（侵食）、軟骨小片の剥離、および軟骨小片によって引き起こされる滑膜の炎症を含む。軽度および中程度の関節症の場合、近年、患者の疼痛状態を改善し、同時に関節症の進行を低減させるためにヒアルロン酸の関節内注入（関節内補充療法（ｖｉｓｃｏ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ））を使用する試みがなされている。
【０００３】
ヒアルロン酸は滑液（関節液）の天然成分である。ヒアルロン酸は滑液中の潤滑剤として作用する。ヒアルロン酸水溶液は粘弾性であることが特に有益である。これにより、非常に良好な潤滑および滑り特性をもたらす。
【０００４】
有益な潤滑特性に基づいて、ヒアルロン酸溶液は、おおよそ過去２０年間、関節内補充療法のために使用されてきた。先行技術の現在の状態は、発酵によって生成され、滅菌ヒアルロン酸水溶液の形態で使用されるヒアルロン酸の使用である。さらに、関節内補充療法のためにカルボキシメチルセルロースおよびメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、ヒドロキシエチルデンプンなどのデンプン誘導体の使用もまた、原理的に可能である。
【０００５】
これまでガンマ放射線への曝露によってヒアルロン酸水溶液を滅菌することが一般的である。これに関して、２５ｋＧｙ以上の線量が一般的である。この滅菌は最終的にパッケージされたヒアルロン酸溶液で行われる。
【０００６】
しかしながら、ガンマ放射線への曝露は重大な欠点に関連している。ガンマ放射線の線量に応じて多かれ少なかれ低分子分解生成物が生成されるポリマー鎖の分解に加えて、ヒアルロン酸溶液の変色をもたらす副反応も起こり得る。ガンマ放射線の使用の別の欠点は、一般的なガンマ線源が球面照射野を有することである。結果として、照射線量は滅菌される物体の位置に応じて変化し得る。これは、最終粘度の不均一性と関連する可能性がある、不均一なポリマー分解をもたらす。滅菌されたヒアルロン酸溶液の再現可能な最終粘度は実質的に達成することが不可能である。さらに、ガンマ放射線は、通常は使い捨てプラスチック注射器である、パッケージング手段の脆弱化を導く可能性がある。
【０００７】
同様の欠点が、ヒアルロン酸およびプラスチックパッケージング手段に対する損傷を導く可能性のある、ヒアルロン酸水溶液の蒸気滅菌に関連する。
【０００８】
溶液の比較的高い粘性のために、ヒアルロン酸水溶液の濾過滅菌は基本的に実現可能ではないか、過度の労力を要するだけである。さらに、濾過滅菌は特定のサイズのみの微生物生命体を除去する。ウイルスは濾過滅菌によって除去または不活性化できない。
【０００９】
前記の物理的方法とは別に、医療品を滅菌するための化学化合物を使用することが慣習的になっている。
【００１０】
それらには、ホルムアルデヒド、グルタルジアルデヒド、ｏ−フタルジアルデヒドが含まれる。アルデヒドを使用する滅菌は、それらが、ヒトにおける使用の間の損傷を防ぐために、滅菌後に再び除去される必要があるという点で不都合がある。これにより、最終パッケージ中にヒアルロン酸水溶液がある場合のアルデヒドによる滅菌は除外される。アルデヒドは最終パッケージ中のヒアルロン酸溶液から再び除去することはできない。
【００１１】
過酸化水素、過ギ酸、過酢酸、次亜塩素酸塩などの酸化剤、およびクロラミンＴ２またはトリクロロイソシアヌル酸などの次亜塩素酸放出物質は、非常に有効な滅菌手段である。これらの薬剤は、溶解したヒアルロン酸の顕著な酸化分解を引き起こす点で不都合である。さらに、酸化剤の未反応残留物が、その最終的なパッケージングにおいてヒアルロン酸溶液中に残存したままの可能性があり、局所的に毒性効果を有する可能性がある。
【００１２】
例えば、ワクチンなどのタンパク質水溶液が、酸化滅菌剤および様々な物理的滅菌方法、例えばガンマ放射線による滅菌の作用に対して非常に感受性が高いことは医薬品業界から知られている。この理由のために、これらのタンパク質水溶液は最初に濾過滅菌に供され、次いでウイルスを不活性化するために少量のβ−プロピオラクトンが添加される。β−プロピオラクトンはウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質のアミノ基をアシル化する。溶媒として存在する水は、β−プロピオラクトンをゆっくりと分解することができるので、短時間の後にタンパク質水溶液中に活性β−プロピオラクトンはもはや存在しない。これまでに気体のβ−プロピオラクトンが内生胞子を不可逆的に不活性化できることが知られている（非特許文献１）。さらに、β−プロピオラクトンは、非水性有機モノマー／モノマー混合物および有機モノマーを含有するペースト状セメント中の内生胞子を不活性化することが知られている（特許文献１）。
【００１３】
しかしながら、栄養型以外に、微生物もまた、内生胞子のような生殖型も有する。これらの生殖生存形態の微生物は、望ましくない生育条件の間に存続する手段として、グラム陽性菌、特にバチルス属およびクロストリジウム属によって形成される。それらの休止状態では、内生胞子は活性代謝を有さず、胞子のコアを化学物質の作用および他の環境作用から大部分保護する多層胞子カプセルを有する。これは胞子を熱および化学物質の作用に対して極めて抵抗性にする（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。それらの高い耐性のために、内生胞子は、滅菌プロセスの有効性の検証および制御のための生物学的指標として使用される。これは、内生胞子の不活性化が栄養型の微生物が全て死滅していることを示すという仮定に基づく。グラム陽性細菌の内生胞子は国際的な耐性クラスＩＩＩに分類される。耐性クラスＩは非胞子形成細菌および胞子形成細菌の栄養型を含み、耐性クラスＩＩは１０５℃の蒸気流中で数分間以内に死滅する胞子を含む。ＤＡＢ  ２００８（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｂｕｃｈ）によれば、耐性クラスＩ−ＩＩＩの全ての微生物は不可逆的に死滅または不活性化されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第２５９６８１２  Ｂ１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｒ．Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｂ．Ｗａｒｓｈｏｗｓｋｙ：Ｂｅｔａ−Ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ  Ｖａｐｏｒ  ａｓ  ａ  Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９５８  Ｓｅｐｔ．；６（５）：３５８−３６２
【非特許文献２】Ｂｏｒｉｃｋ，Ｐ．Ｍ．：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒｓ．Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０（１９６８）２９１−３１２
【非特許文献３】Ｇｏｕｌｄ，Ｇ．Ｗ．：Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｏｒｅｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４２（１９７７）２９７−３０９
【非特許文献４】Ｇｏｕｌｄ，Ｇ．Ｗ．：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｏｒｍａｎｃｙ．  ｐ．１７３−２０９  Ｉｎ  Ｈｕｒｓｔ，Ａ．およびＧｏｕｌｄ，Ｇ．Ｗ．（ｅｄ．）、Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｏｒｅ．ｖｏｌ．２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、多糖水溶液を滅菌するための方法を開発することである。この方法は、溶解した多糖ポリマーを著しく分解することなく滅菌を可能にすることである。
【００１７】
さらに、開発される滅菌方法は、多糖水溶液と接触するパッケージング手段の内壁を含む、それらの最終パッケージに保存された多糖水溶液の滅菌に適している。開発される滅菌方法は耐性レベルＩＩＩの微生物を安全に不活性化する。
【００１８】
本発明の範囲において、滅菌はＥＮ５５６−１：２００１に従って生存微生物を含まない状態を意味すると理解されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、請求項１に記載の多糖水溶液を滅菌するための方法により解決される。本発明によれば、β−ラクトンが緩衝液の存在下で多糖水溶液に添加され、混合物は４℃から４０℃の温度で少なくとも２４時間保存される。
【００２０】
好ましい方法は、
ａ）少なくとも１種の多糖を水に溶解するステップと、
ｂ）少なくとも０．５重量％のβ−ラクトンを、ａ）で生成された多糖水溶液に添加するステップと、
ｃ）少なくとも２４時間、４℃から４０℃の温度にて混合物を保存するステップと
を含み、水溶液は緩衝系を含み、その緩衝能力は、滅菌された多糖水溶液のｐＨ値が滅菌されてない多糖水溶液のｐＨ値と等しくなるように、β−ラクトンの加水分解によって生成された３−ヒドロキシプロパン酸を緩衝するのに十分であることを特徴とする。
【００２１】
この目的はまた、上記の方法のいずれか１つに従って生成された請求項１４による滅菌多糖溶液によっても満たされる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
驚くべきことに、多糖水溶液は、実に最小のポリマー分解進行で請求項１に記載の方法の使用によって滅菌することができることが証明された。このことは、滅菌した多糖溶液の還元比粘度と滅菌していない多糖溶液の還元比粘度の比率が０．８以上で維持され得ることを意味する。この比率を決定する際に、還元比粘度、動的粘度または動粘性率を測定するかどうかは重要ではない。ゲル浸透クロマトグラフィーに適した多糖水溶液の場合、滅菌した多糖の数平均モル質量と滅菌していない多糖の数平均モル質量の比率は０．８以上で維持され得る。さらに、本発明による滅菌方法は滅菌プロセスの間の副反応に起因する変色を引き起こさない。
【００２３】
多糖水溶液中に懸濁された耐性レベルＩＩＩの内生胞子はβ−ラクトンの作用によって本発明の方法により不活性化される。これに関連して、多糖溶液は、滅菌された多糖溶液のｐＨ値が、以前に滅菌されていない多糖溶液のｐＨ値と等しくなるように、β−ラクトンの加水分解によって放出される３−ヒドロキシプロピオン酸を緩衝するのに十分な能力の緩衝液を含有する。これに関連して、β−ラクトンと同じ量の緩衝液を使用することが好ましい。
【００２４】
本発明はさらに、驚くべきことに、β−ラクトンが、滅菌の間に多糖の顕著なポリマー分解を進行せずに、緩衝液の存在下で多糖水溶液の滅菌を行うことを可能にするという発見に基づく。本発明による滅菌の特別な利点は滅菌前後の多糖溶液の粘度が等しく保たれることである。関節内補充療法のための多糖水溶液の使用に関して、このことは、滅菌プロセスに起因する粘度の変化がないので、溶液の粘度が滅菌前に正確に調節され得ることを意味する。結果として、粘度および他のレオロジー特性に関して正確に調節された滅菌多糖溶液を関節内補充療法のために提供することができる。滅菌に起因する多糖水溶液の変色がないという別の利点もある。
【００２５】
多糖は、多数（少なくとも１０個）の単糖がグリコシド結合によって互いに結合している炭水化物である。本発明の範囲内の水溶性多糖は、単糖、二糖、さらにそれらのオリゴマーまたは誘導体からなり、同様に互いに連結されている多糖である。
【００２６】
本発明によれば、多糖は天然多糖および人工多糖である。本発明によれば、誘導体は、塩、エーテル、酸のエステルまたはエステル、特にアルカリ金属塩、特にナトリウム塩およびカリウム塩であると理解される。例としては、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースエーテル、デンプン、デンプンエーテル、グアーガム、キチン、キトサンが挙げられる。
【００２７】
好ましくは、多糖は、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロース、および酸化セルロースからなる群から選択される。
【００２８】
本発明によれば、多糖は上記の多糖の混合物であってもよい。
【００２９】
多糖は、好ましくは、少なくとも０．５重量％の量で使用される。さらに、好ましくは、多くとも５重量％の量で使用される。特に多糖を１〜２重量％の量で使用することが好ましい。各場合、量は水中の多糖の量を指す。
【００３０】
β−ラクトンは一般式（Ｉ）によって表される化合物（ａ１）であり得る。
【化１】
2018162259.tif 000002
【００３１】
前記式において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル残基、ハロゲン残基、ニトロ残基またはシアノ残基を表し得る。
【００３２】
化合物（ａ１）の立体化学は決して限定されない。好ましくは、本発明の範囲は、化合物（Ｉ）として、それらの正確な立体配置にかかわらず、一般式（Ｉ）により表される全ての異性体を含む。
【００３３】
アルキル残基は、互いに独立して、置換または非置換アルキル残基であってもよい。置換アルキル残基の少なくとも１つの置換基は、好ましくは、ハロゲン残基、ニトロ残基およびシアノ残基からなる群から選択される。
【００３４】
アルキル残基は、互いに独立して、飽和または不飽和のアルキル残基であってもよい。好ましくは、不飽和アルキル残基は少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む。
【００３５】
アルキル残基は、互いに独立して、分枝または非分枝アルキル残基であってもよい。アルキル残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、非分枝アルキル残基であることが好ましい。
【００３６】
互いに独立して、アルキル残基は、１〜４個の範囲の炭素原子の主鎖長、より好ましくは１〜２個の範囲の炭素原子の主鎖長、さらにより好ましくは１個の炭素原子を有する。
【００３７】
フッ素残基、塩素残基および臭素残基は、一般式（Ｉ）の好ましいハロゲン残基である。前記残基の各々は、互いに独立して、残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つ以上を表し得る。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々は、Ｈを表す。
【００３９】
別の好ましい実施形態によれば、残基Ｒ１はメチル残基を表し、残基Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はＨを表す。
【００４０】
別の好ましい実施形態によれば、残基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＨを表し、残基Ｒ４はメチル残基を表す。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態によれば、残基Ｒ１およびＲ３はＨを表し、残基Ｒ２およびＲ４はメチル残基を表す。
【００４２】
特に好ましい実施形態によれば、化合物（ａ１）はβ−プロピオラクトン（ＣＡＳ番号５７−５７−８）である。
【００４３】
β−プロピオラクトンは、化合物（ａ１）のいずれかの二量体である化合物（ａ２）であってもよい。化合物（ａ２）の立体化学は決して限定されない。
【００４４】
本発明によれば、ｐＨ値が７．０〜８．０のリン酸緩衝液が緩衝液として好ましく、ｐＨ値が７．４のリン酸緩衝液が特に好ましい。
【００４５】
特に、リン酸水素カリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸二ナトリウムとリン酸の組み合わせ、リン酸三ナトリウムとリン酸水素ナトリウムの組み合わせ、およびリン酸三ナトリウムとリン酸の組み合わせが、リン酸緩衝液の生成に適している。
【００４６】
好ましくは、リン酸緩衝液の全ての成分を一緒に、０．５重量％以上の濃度で多糖水溶液に溶解する。
【００４７】
本発明によれば、β−プロピオラクトンの加水分解によって生成される３−ヒドロキシプロピオン酸は緩衝液の成分である。
【００４８】
本発明によれば、３−ヒドロキシプロパン酸およびヒアルロン酸または３−ヒドロキシプロパン酸のナトリウム塩およびカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩が緩衝液を形成する。
【００４９】
多糖水溶液の滅菌が一次パッケージング内で行われることが本発明にとって重要である。結果として、ガンマ放射線または電子による照射またはオートクレーブなどのさらなる労力は必要とされない。結果として、かなりの生産コストを節約できる。
【００５０】
多糖水溶液およびβ−プロピオラクトンは、多糖水溶液を一次パッケージング手段内に充填する直前に混合されることが首尾良い滅菌のために重要である。これにより、十分な滅菌剤が、多糖溶液および一次パッケージング手段の内壁の両方の滅菌のために利用可能であることが確実にされる。対照的に、多糖溶液およびβ−プロピオラクトンが一次パッケージング手段を充填する前に長時間混合される場合、温度および一次パッケージング手段を充填する前に経過した時間に応じて３−ヒドロキシプロピオン酸を生成する加水分解に起因してβ−プロピオラクトンの損失が起こる可能性がある。これは、特に、一次パッケージング手段の内壁の滅菌を疑わしいものにする可能性がある。
【００５１】
本発明の範囲は、本発明の方法によって生成された滅菌多糖水溶液を含む。この滅菌多糖溶液は、多糖水溶液が、水、水および３−ヒドロキシプロピオン酸、ならびに緩衝系に少なくとも部分的に溶解する少なくとも１種の多糖を含有することを特徴とする。
【００５２】
さらに、本発明によれば、滅菌多糖水溶液は、ナトリウムイオン、リン酸二水素イオン、リン酸水素イオン、リン酸イオン、３−ヒドロキシプロピオン酸および３−ヒドロキシプロピオネートからなる緩衝系を含有する。カリウムイオンもその中に含まれていてもよい。
【００５３】
本発明によれば、滅菌した多糖溶液の還元粘度と滅菌していない多糖溶液の還元粘度の比率は０．８超である。
【００５４】
本発明の範囲はまた、関節内補充療法のための手段として、ならびにヒトおよび獣医用の医薬における医薬担体としての滅菌多糖水溶液の使用を含む。
【００５５】
本発明は、本発明の範囲を限定するものではないが、以下に示される実施例によって例示される。
【実施例】
【００５６】
以下の多糖および／または多糖誘導体を本明細書以下に記載される実験において使用した：
ヒアルロン酸のナトリウム塩（Ｍｎ  約１３０万ダルトン、Ｋｒａｅｂｅｒ  ＧｍｂＨ）、
カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（Ｍｎ  約９０，０００ダルトン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、
メチルセルロース（ＳＭ−４０００、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、
ヒドロキシエチルセルロース（６０ＳＨ−４０００、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ）。
【００５７】
７．４のｐＨ値を有するリン酸緩衝液を生成した。この目的のために、１．６５ｇのリン酸水素カリウムおよび９．７１ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和物を１リットルの蒸留水に溶解した。
【００５８】
実施例１
それぞれ３０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ値７．４）を使用して多糖溶液を生成した。
【００５９】
【表１】
2018162259.tif 000003
【００６０】
バチルス・アトロフェウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈｅｕｓ）の胞子懸濁液の合計１０６ｃｆｕを、滅菌２５ｍＬプラスチックチューブ中の多糖溶液の各々５ｍＬに加えた。次いで、ボルテックスミキサーを使用して胞子を均一に懸濁した。続いて、０．５重量％、１．０重量％、および２．０重量％のβ−プロピオラクトンを、予め胞子と混合した多糖溶液の各々５ｍＬに添加した。次いで、試料を再びボルテックスミキサー中でホモジナイズした。β−プロピオラクトンで処理していない多糖溶液を陽性対照として使用した。室温で４８時間保存した後、多糖溶液を、ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＰ  １１７３７、パート２に従って滅菌性について試験した。アッセイは２連で行った。
【００６１】
【表２】
2018162259.tif 000004
【００６２】
β−プロピオラクトンで滅菌した多糖溶液は、陽性対照として使用した未処理の多糖溶液と比較して変色を全く示さない。
【００６３】
実施例２
下記の多糖を本明細書以下に記載されている実験に使用した：
ＮａＨｙａ  １：ヒアルロン酸のナトリウム塩（Ｍｎ  約１００万ダルトン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＮａＨｙａ  ２：ヒアルロン酸のナトリウム塩（Ｍｎ  約１３０万ダルトン、Ｋｒａｅｂｅｒ  ＧｍｂＨ）、
ＮａＨｙａ  ３：ヒアルロン酸のナトリウム塩（Ｍｎ  約２００，０００ダルトン、二酸化塩素で分解したヒアルロン酸）。
【００６４】
ヒアルロン酸を、各々１重量％の濃度であるようにリン酸緩衝液ｐＨ７．４に溶解した。合計５ｍＬの各々のヒアルロン酸溶液を１００μｌのβ−プロピオラクトンと混合し、室温にて４８時間保存した。並行して、β−プロピオラクトンで処理していないヒアルロン酸溶液も対照として保存した。さらなる比較において、β−プロピオラクトンで処理していないヒアルロン酸溶液をガンマ線で滅菌した。ヒアルロン酸溶液のガンマ線滅菌は、２５．２ｋＧｙの線量でＣｏ６０源を使用してＢＢＦ  Ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔｉｏｎｓｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨによって行った。
【００６５】
滅菌されていない状態のヒアルロン酸溶液は７．４のｐＨ値を有し、β−プロピオラクトンで滅菌後のｐＨも７．４であった。β−プロピオラクトンで滅菌したヒアルロン酸溶液は、滅菌されていないヒアルロン酸溶液と比較して変色を全く示さない。滅菌されていないヒアルロン酸溶液およびβ−プロピオラクトンで滅菌されたヒアルロン酸溶液の両方は目視によると透明で無色であった。対照的に、ガンマ放射線によって滅菌したヒアルロン酸溶液はわずかに黄色の変色を示した。
【００６６】
ヒアルロン酸試料の分子量および分子量分布は、プルラン標準を使用したゲル浸透クロマトグラフィーによって測定した。屈折率検出器（ＲＩ検出器）を検出器として使用した。この測定はＪａｓｃｏ製のＧＰＣ機器を使用して二連で行った。
【００６７】
【表３】
2018162259.tif 000005
【００６８】
β−プロピオラクトンによる多糖溶液の滅菌はポリマーの分解に影響を与えなかった。比較して、ガンマ線滅菌は顕著なポリマー分解を引き起こした。
【００６９】
実施例３
以下の多糖誘導体を本明細書以下に記載される実験に使用した：
カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（Ｍｗ  約９０，０００ダルトン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、
ヒドロキシエチルセルロース（６０ＳＨ−４０００、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ）。
【００７０】
多糖溶液は各々３０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ値７．４）を使用して生成した。
【００７１】
【表４】
2018162259.tif 000006
【００７２】
合計１００ｍｇのβ−プロピオラクトンを５ｍＬの各々の多糖溶液に添加し、混合し、室温にて４８時間保存した。未処理の多糖溶液を対照として使用した。溶液の粘度測定のために、溶液を０．２重量％および０．４重量％の多糖濃度に希釈した。高度のポリマー分解のために、ガンマ線照射によって滅菌された多糖溶液を希釈せずに測定した。
【００７３】
β−プロピオラクトンで滅菌したヒアルロン酸溶液は、滅菌していない多糖溶液と比較して変色を全く示さない。
【００７４】
希釈した多糖溶液を、Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ粘度計（キャピラリーＩ、Ｋ＝０．０１０２５７）を使用して２５℃にて測定した（５倍測定）。
【００７５】
【表５】
2018162259.tif 000007
【００７６】
備考：目視により透明であったメチルセルロース溶液を使用した。しかしながら、透明ゲル粒子がメチルセルロース溶液中に存在している可能性を排除できない。このことは、滅菌していないメチルセルロース溶液と比較して、滅菌したメチルセルロース溶液のわずかに高い動粘性率により説明することができる。滅菌したメチルセルロース溶液中にゲル粒子が存在した可能性が高い。
【００７７】
β−プロピオラクトンで滅菌した多糖溶液の動粘性率は、基本的に、滅菌していない多糖溶液の動粘性率と同じである。β−プロピオラクトンによる多糖溶液の滅菌はポリマー分解に関連していない。対照的に、ガンマ線で滅菌した多糖溶液の動粘性率と滅菌していない多糖溶液の動粘性率との比較から証明されるように、ガンマ線での滅菌はかなりのポリマー分解をもたらす。
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月31日(2018.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に少なくとも部分的に溶解する少なくとも１種の多糖と、水と、多糖水溶液の量に対して０．５質量％以上の量の３−ヒドロキシプロピオン酸と、緩衝系と、を含む滅菌多糖水溶液を含む、滅菌パッケージング手段。
【請求項２】
前記多糖は、ヒアルロン酸のナトリウム塩、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロース、及び酸化セルロースからなる群から選択される、請求項１に記載の滅菌パッケージング手段。
【請求項３】
ｐＨ値７．０〜８．０、好ましくはｐＨ値７．４のリン酸緩衝液が前記緩衝系として使用される、請求項１又は２に記載の滅菌パッケージング手段。
【請求項４】
前記リン酸緩衝液は、リン酸水素カリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの組み合わせ、リン酸二ナトリウムとリン酸の組み合わせ、リン酸三ナトリウムとリン酸水素ナトリウムの組み合わせ、及びリン酸三ナトリウムとリン酸の組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の滅菌パッケージング手段。
【請求項５】
関節内補充療法のための手段のための、並びに、ヒト及び獣医用の医薬における医薬担体としての、請求項１から４のいずれかに記載された滅菌パッケージング手段に保存された滅菌多糖水溶液の使用。
【外国語明細書】
2018162259000001.pdf