(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも１種のペプチド抗原集合体と、少なくとも１種のアジュバントとを含むワクチン製剤、及びワクチン製剤を利用して、哺乳動物における免疫応答を誘導し、疾患を治療する方法の提供。【解決手段】ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択されるカチオン性脂質をアジュバントとして含み、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される１種又は２種以上の抗原集合体を含むワクチン製剤。抗原集合体は、ミセル構造であるワクチン製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントと、抗原集合体とを含む、ワクチン製剤。
【請求項２】
前記アジュバントは、免疫調節剤である、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
前記アジュバントは、カチオン性脂質である、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである、請求項３または４に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
前記アジュバントは、カチオン性脂質のエナンチオマーである、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
前記エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである、請求項６に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
前記抗原集合体は、ミセル構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
前記抗原集合体は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される１種または２種以上の抗原を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである、請求項９に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である、請求項９または１０に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
１種または２種以上の抗原は、前記抗原の疎水性を高めるまたは低減させるよう修飾された抗原である、請求項９から１１のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT（配
列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番
号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番号１
０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項９から１２のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、前記ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む、方法。
【請求項１５】
有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与することを含む、前記哺乳動物における疾患を治療する方法であって、前記ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む、方法。
【請求項１６】
前記アジュバントは、免疫調節剤である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントは、カチオン性脂質である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントは、カチオン性脂質のエナンチオマーである、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原集合体は、ミセル構造である、請求項１４から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原集合体は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される１種または２種以上の抗原を含む、請求項１４から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
１種または２種以上の抗原は、前記抗原の疎水性を高めるまたは低減させるよう修飾された抗原である、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT（配
列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番
号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番号１
０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
人間が使用するための安全で効果的な免疫療法や治療用ワクチンの開発には、いまだ世界中の患者にとって医療上重要な需要がある。一般に、ワクチン製剤は、標的となる免疫応答を刺激するための抗原を含む。しかしながら、開発中のワクチンの中には、広範にわたる哺乳動物集団の免疫応答に対する弱い刺激因子であるがゆえに、効き目のないものがある。たとえば、ワクチン製剤の抗原は、哺乳動物における免疫原性に乏しいことがある。加えて、ワクチンによっては、哺乳動物の免疫系の抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）に抗原を効率的に送達できない。
【０００２】
さらに、ワクチン製剤に含まれるいくつかの抗原は、哺乳動物における免疫応答の劣った刺激因子であることが知られている。他の抗原は、効果を発揮するのに、特定の抗原エピトープへの哺乳動物の免疫系による処理を必要とすることがある。結果として、このような抗原を大量に送達する必要がある。しかしながら、このような大量の送達は、ナノ粒子送達系を用いて効果的かつ安全に達成されない場合がある。水溶液でのタンパク質およびペプチド抗原の投与も、一般にこのような抗原の免疫原性が弱く、ＡＰＣによってほとんど取り込まれないことから、有益ではないことがある。抗原をウイルス様粒子（ＶＬＰ）にする開発は成功しているが、あいにくＶＬＰは製造に費用がかかり、大きな組換えタンパク質を必要とする。これに、融合タンパク質や特定の複雑なアセンブリ技術が求められることも多い。さらに、ＶＬＰでは、ペプチド抗原の使用が除外される。
背景技術および発明の開示
また、ワクチンは一般に、ワクチン製剤中の抗原の効力を高めるべく、アジュバントを含む。たとえば、油中水型エマルション、ミョウバン（たとえば、アルミニウム塩）、他の化学物質などのアジュバントは一般に、哺乳動物における抗原応答を高めるために用いられる。従来のアジュバントに加えて、固有の免疫作用内で他のアジュバント（たとえば、インフルエンザビロソームおよびChironのMF59）を使用してもよい。しかしながら、これらのアジュバントも、動物モデルでの証拠（ＨＳＶおよびインフルエンザワクチンに関する臨床試験報告による）から、これらのアジュバントが動物におけるＴ細胞応答を高めるのではなく、単に中和抗体の生成を増すだけであることが示唆されるため、望ましくない。
【０００３】
したがって、哺乳動物における免疫応答を刺激するために、効果的に抗原を送達する、あるいは抗原提示細胞による抗原の取り込みを促進する新たなワクチン製剤に対する需要がある。さらに、おそらくは安全で効果的な免疫修飾因子（「免疫調節剤」）をワクチン製剤に含ませることで、哺乳動物における細胞媒介免疫応答を刺激するための効果的で新たな方法も、極めて望ましい。したがって、本開示は、望ましい特性を呈し、簡潔さ、抗原取り込み、哺乳動物における免疫応答の誘導という点で改善のための関連の利点を提供する、ワクチン製剤と、この製剤を使用する方法を提供する。
【０００４】
本開示は、少なくとも１種のペプチド抗原集合体と、少なくとも１種のアジュバントとを含む、ワクチン製剤を提供する。また、本開示は、ワクチン製剤を利用して、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法と、哺乳動物における疾患を治療する方法も提供する。
【０００５】
本開示によるワクチン製剤および方法は、従来技術の他の製剤および方法に比して、いくつかの利点を提供する。第一に、このワクチン製剤は、哺乳動物における適切な免疫応答を高める、指向する、または促進する免疫調節剤であるアジュバントを含む。免疫調節剤は、ワクチン製剤に含まれると、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を効果的にブーストする潜在性を有する。たとえば、免疫調節剤は、（１）抗原送達および／またはＡＰＣに
おける処理の改善、（２）細胞障害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）をはじめとする、抗原に対する免疫応答を生じさせるのに好都合で、よって細胞媒介免疫を促進する、免疫調節性サイトカイン産生の誘導、（３）効果的なワクチンに必要な免疫回数の低減または抗原量の低減、（４）ワクチン抗原の生物学的または免疫学的半減期の延長、（５）免疫抑制因子を阻害することによる、抗原に対する免疫寛容の克服のうち１つまたは２つ以上を、都合よく達成できる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ベースのアジュバントを、有効な免疫修飾アジュバントとして利用してもよく、ワクチン製剤で優れたＴ細胞応答および抗体免疫応答を誘発できる。
【０００６】
第２に、粒子状ワクチン製剤などのワクチン製剤は、ミセル構造または二重層構造などの天然に形成されるまたは自己形成される抗原集合体を含み、これは、従来のワクチン製剤に比して、ＡＰＣによる大量の抗原取り込みを効果的に促進する。このような抗原集合体は、哺乳動物においてＡＰＣによって取り込まれて処理される好適な形態での抗原の製剤を可能にし、一層強力な抗原特異的免疫応答が得られる。さらに、タンパク質またはペプチド抗原が、水性媒質中にて自然にミセル構造または二重層構造などの単純に組織化された粒子構造に形成されることで、ＡＰＣによって効果的に取り込まれ、処理されることが可能な構造が可能になる。結果として、強力なワクチン製剤を、混合物あるいはアジュバントとの併用で投与可能である。
【０００７】
第３に、抗原集合体に用いられるペプチドまたはタンパク質は、親水性基と親油性基との比が二重層またはミセル構造の形成を可能にするよう修飾されてもよい。タンパク質またはペプチド抗原の修飾は、親油性基（たとえば、炭化水素鎖または疎水性のアミノ酸配列）を親水性ペプチドに結合する、これとは逆に疎水性のタンパク質またはペプチドと結合するなど、さまざまな手段によって達成されてもよい。結合する基の大きさも、ペプチドの大きさや必要な疎水性または親水性の度合いに応じて変更してもよい。
【０００８】
最後に、本開示に示されるように、このようなワクチン製剤は、従来のリポソームまたはミセル封入ワクチン製剤による同一量の抗原およびアジュバントの投与に比して、ワクチンの免疫原性が有意に改善されることにつながる。
【０００９】
以下の番号を付した実施形態が企図され、限定されるものではない。
１．アジュバントと抗原集合体とを含む、ワクチン製剤。
２．製剤は、粒子状のワクチン製剤である、第１項に記載のワクチン製剤。
３．アジュバントおよび抗原集合体は、混合物である、第１項または第２項に記載のワクチン製剤。
４．アジュバントは、免疫調節剤である、第１項から第３項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５．アジュバントは、ナノ粒子である、第１項から第４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
６．アジュバントは、カチオン性脂質である、第１項から第５項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
７．カチオン性脂質は、精製されている、第６項に記載のワクチン製剤。
８．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される、第６項または第７項に記載のワクチン製剤。
９．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである、第６項から第８項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１０．カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡである、第６項から第８項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１１．カチオン性脂質は、ＤＯＥＰＣである、第６項から第８項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１２．アジュバントは、カチオン性脂質のエナンチオマーである、第１項から第５項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１３．エナンチオマーは、精製されている、第１２項に記載のワクチン製剤。
１４．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰである、第１２項または第１３項に記載のワクチン製剤。
１５．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである、第１２項から第１４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１６．エナンチオマーは、Ｓ−ＤＯＴＡＰである、第１２項から第１４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１７．抗原集合体は、自己集合構造である、第１項から第１６項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１８．抗原集合体は、ミセル構造である、第１項から第１７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
１９．抗原集合体は、脂質二重層構造である、第１項から第１７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２０．抗原集合体は、管状構造である、第１項から第１９項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２１．抗原集合体は、球状構造である、第１項から第１９項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２２．抗原集合体は、１種または２種以上の抗原を含む、第１項から第２１項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２３．１種または２種以上の抗原は、タンパク質ベースの抗原である、第１項から第２２項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２４．１種または２種以上の抗原は、ペプチドベースの抗原である、第１項から第２３項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２５．１種または２種以上の抗原は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される、第１項から第２４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２６．１種または２種以上の抗原は、ウイルス抗原である、第１項から第２５項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２７．１種または２種以上の抗原は、細菌抗原である、第１項から第２６項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２８．１種または２種以上の抗原は、病原性抗原である、第１項から第２７項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
２９．病原性抗原は、合成抗原または組換え抗原である、第２８項に記載のワクチン製剤。
３０．少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである、第１項から第２９項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
３１．少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である、第１項から第３０項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
３２．メラノーマ抗原は、ｇｐ１００（KVPRNQDWL［配列番号８］）、TRP2（SYVDFFVWL［配列番号９］）、ｐ５３（KYICNSSCM［配列番号１０］）、これらの組み合わせを含む群
から選択される、第３１項に記載のワクチン製剤。
３３．少なくとも１種の抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、疎水性が高められたまたは疎水性が低減されたアミノ酸配列で修飾されたタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、第１項から第３２項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
３４．１種または２種以上の抗原は、脂質付加抗原あるいは、当該抗原の疎水性を高めるよう修飾された抗原である、第１項から第３３項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。３５．少なくとも１種の抗原は、修飾されたタンパク質またはペプチドである、第１項から第３４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
３６．修飾されたタンパク質またはペプチドは、疎水性基に結合される、第３５項に記載
のワクチン製剤。
３７．疎水性基に結合される、修飾されたタンパク質またはペプチドは、抗原と疎水性基との間のリンカー配列をさらに含む、第３５項または第３６項に記載のワクチン製剤。
３８．疎水性基は、パルミトイル基である、第３７項に記載のワクチン製剤。
３９．少なくとも１種の抗原は、未修飾のタンパク質またはペプチドである、第１項から第３８項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４０．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT
（配列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配
列番号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番
号１０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）からなる群から選択される、第１項から第３９項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４１．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）である、第１項から第４０項
のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４２．少なくとも１種の抗原は、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）である、第１項から第
４１項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４３．少なくとも１種の抗原は、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）である、第１項から第４２項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４４．KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第４３項に記載のワクチン製剤。
４５．疎水性基は、パルミトイル基である、第４４項に記載のワクチン製剤。
４６．少なくとも１種の抗原は、YMLDLQPETT（配列番号４）である、第１項から第４５項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４７．少なくとも１種の抗原は、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）である、第１項から第４
６項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
４８．KSSYMLDLQPETT（配列番号５）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第４７
項に記載のワクチン製剤。
４９．疎水性基は、パルミトイル基である、第４８項に記載のワクチン製剤。
５０．少なくとも１種の抗原は、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）である、第１
項から第４９項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５１．KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）は、疎水性基をさらに含むよう修飾され
る、第５０項に記載のワクチン製剤。
５２．疎水性基は、パルミトイル基である、第５１項に記載のワクチン製剤。
５３．少なくとも１種の抗原は、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）である、第１項から第５２項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５４．KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第５３項に記載のワクチン製剤。
５５．疎水性基は、パルミトイル基である、第５４項に記載のワクチン製剤。
５６．少なくとも１種の抗原は、KVPRNQDWL（配列番号８）である、第１項から第５５項
のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５７．少なくとも１種の抗原は、SYVDFFVWL（配列番号９）である、第１項から第５６項
のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５８．少なくとも１種の抗原は、KYICNSSCM（配列番号１０）である、第１項から第５７
項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
５９．少なくとも１種の抗原は、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）である、第１項から第５８項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
６０．KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第５９項に記載のワクチン製剤。
６１．疎水性基は、パルミトイル基である、第６０項に記載のワクチン製剤。
６２．製剤は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路を活
性化することによって、哺乳動物における免疫応答を誘導する、第１項から第６１項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
６３．ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、細胞外シグナル制御キナーゼ（「ＥＲＫ」）−１、ＥＲＫ−２、ｐ３８のうちの少なくとも１つを刺激することによって活性化される、第６２項に記載のワクチン製剤。
６４．製剤は、哺乳動物における機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を高める、第１項から第６３項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
６５．哺乳動物は、ヒトである、第６２項から第６４項のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
６６．有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む、前記方法。
６７．免疫応答は、哺乳動物の免疫系の細胞におけるＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を介して活性化される、第６６項に記載の方法。
６８．ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ−２、ｐ３８のうちの少なくとも１つを刺激することで活性化される、第６７項に記載の方法。
６９．免疫応答は、哺乳動物における細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する、第６６項から第６８項のいずれか１項に記載の方法。
７０．細胞障害性Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、第６９項に記載の方法。
７１．投与は、哺乳動物における機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を高める、第６６項から第７０項のいずれか１項に記載の方法。
７２．免疫応答は、哺乳動物における抗体応答を活性化する、第６６項から第７１項のいずれか１項に記載の方法。
７３．免疫応答は、哺乳動物におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を活性化する、第６６項から第７２項のいずれか１項に記載の方法。
７４．製剤は、粒子状のワクチン製剤である、第６６項から第７３項のいずれか１項に記載の方法。
７５．アジュバントおよび抗原集合体は、混合物である、第６６項から第７４項のいずれか１項に記載の方法。
７６．アジュバントは、免疫調節剤である、第６６項から第７５項のいずれか１項に記載の方法。
７７．アジュバントは、ナノ粒子である、第６６項から第７６項のいずれか１項に記載の方法。
７８．アジュバントは、カチオン性脂質である、第６６項から第７７項のいずれか１項に記載の方法。
７９．カチオン性脂質は、精製されている、第７８項に記載の方法。
８０．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される、第７８項または第７９項に記載の方法。
８１．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである、第７８項から第８０項のいずれか１項に記載の方法。
８２．カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡである、第７８項から第８０項のいずれか１項に記載の方法。
８３．カチオン性脂質は、ＤＯＥＰＣである、第７８項から第８０項のいずれか１項に記載の方法。
８４．アジュバントは、カチオン性脂質のエナンチオマーである、第６６項から第７８項のいずれか１項に記載の方法。
８５．エナンチオマーは、精製されている、第８４項に記載の方法。
８６．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰである、第８４項または第８５項に記載の方法。
８７．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである、第８４項から第８６項のいずれか１項
に記載の方法。
８８．エナンチオマーは、Ｓ−ＤＯＴＡＰである、第８４項から第８６項のいずれか１項に記載の方法。
８９．抗原集合体は、自己集合構造である、第６６項から第８８項のいずれか１項に記載の方法。
９０．抗原集合体は、ミセル構造である、第６６項から第８９項のいずれか１項に記載の方法。
９１．抗原集合体は、脂質二重層構造である、第６６項から第８９項のいずれか１項に記載の方法。
９２．抗原集合体は、管状構造である、第６６項から第９１項のいずれか１項に記載の方法。
９３．抗原集合体は、球状構造である、第６６項から第９１項のいずれか１項に記載の方法。
９４．抗原集合体は、１種または２種以上の抗原を含む、第６６項から第９３項のいずれか１項に記載の方法。
９５．１種または２種以上の抗原は、タンパク質ベースの抗原である、第９４項に記載の方法。
９６．１種または２種以上の抗原は、ペプチドベースの抗原である、第９４項に記載の方法。
９７．１種または２種以上の抗原は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される、第９４項から第９６項のいずれか１項に記載の方法。
９８．１種または２種以上の抗原は、ウイルス抗原である、第９４項から第９７項のいずれか１項に記載の方法。
９９．１種または２種以上の抗原は、細菌抗原である、第９４項から第９７項のいずれか１項に記載の方法。
１００．１種または２種以上の抗原は、病原性抗原である、第９４項から第９７項のいずれか１項に記載の方法。
１０１．病原性抗原は、合成抗原または組換え抗原である、第１００項に記載の方法。
１０２．少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである、第９４項から第１０１項のいずれか１項に記載の方法。
１０３．少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である、第９４項から第１０２項のいずれか１項に記載の方法。
１０４．メラノーマ抗原は、ｇｐ１００（KVPRNQDWL［配列番号８］）、TRP2（SYVDFFVWL［配列番号９］）、ｐ５３（KYICNSSCM［配列番号１０］）、これらの組み合わせを含む
群から選択される、第１０３項に記載の方法。
１０５．少なくとも１種の抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、疎水性が高められたまたは疎水性が低減されたアミノ酸配列で修飾されたタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、第９４項から第１０４項のいずれか１項に記載の方法。
１０６．１種または２種以上の抗原は、脂質付加抗原あるいは、当該抗原の疎水性を高めるよう修飾された抗原である、第９４項から第１０５項のいずれか１項に記載の方法。
１０７．少なくとも１種の抗原は、修飾されたタンパク質またはペプチドである、第９４項から第１０６項のいずれか１項に記載の方法。
１０８．修飾されたタンパク質またはペプチドは、疎水性基に結合される、第１０７項に記載の方法。
１０９．疎水性基に結合される、修飾されたタンパク質またはペプチドは、抗原と疎水性基との間のリンカー配列をさらに含む、第１０７項または第１０８項に記載の方法。
１１０．疎水性基は、パルミトイル基である、第１０９項に記載の方法。
１１１．少なくとも１種の抗原は、未修飾のタンパク質またはペプチドである、第９４項から第１１０項のいずれか１項に記載の方法。
１１２．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番
号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番
号１０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）からなる群から選択される、第９４項から第１１１項のいずれか１項に記載の方法。
１１３．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）である、第９４項から第１
１２項のいずれか１項に記載の方法。
１１４．少なくとも１種の抗原は、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）である、第９４項か
ら第１１３項のいずれか１項に記載の方法。
１１５．少なくとも１種の抗原は、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）である、第９４項から第１１４項のいずれか１項に記載の方法。
１１６．KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１１５項に記載の方法。
１１７．疎水性基は、パルミトイル基である、第１１６項に記載の方法。
１１８．少なくとも１種の抗原は、YMLDLQPETT（配列番号４）である、第９４項から第１１７項のいずれか１項に記載の方法。
１１９．少なくとも１種の抗原は、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）である、第９４項から
第１１８項のいずれか１項に記載の方法。
１２０．KSSYMLDLQPETT（配列番号５）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１
１９項に記載の方法。
１２１．疎水性基は、パルミトイル基である、第１２０項に記載の方法。
１２２．少なくとも１種の抗原は、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）である、第
９４項から第１２１項のいずれか１項に記載の方法。
１２３．KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）は、疎水性基をさらに含むよう修飾さ
れる、第１２２項に記載の方法。
１２４．疎水性基は、パルミトイル基である、第１２３項に記載の方法。
１２５．少なくとも１種の抗原は、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）である、第９４項から第１２４項のいずれか１項に記載の方法。
１２６．KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１２５項に記載の方法。
１２７．疎水性基は、パルミトイル基である、第１２６項に記載の方法。
１２８．少なくとも１種の抗原は、KVPRNQDWL（配列番号８）である、第９４項から第１
２７項のいずれか１項に記載の方法。
１２９．少なくとも１種の抗原は、SYVDFFVWL（配列番号９）である、第９４項から第１
２８項のいずれか１項に記載の方法。
１３０．少なくとも１種の抗原は、KYICNSSCM（配列番号１０）である、第９４項から第
１２９項のいずれか１項に記載の方法。
１３１．少なくとも１種の抗原は、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）である、第９４項から第１３０項のいずれか１項に記載の方法。
１３２．KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１３１項に記載の方法。
１３３．疎水性基は、パルミトイル基である、第１３２項に記載の方法。
１３４．哺乳動物は、ヒトである、第６６項から第１３３項のいずれか１項に記載の方法。
１３５．有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における疾患を治療する方法であって、ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む、方法。
１３６．上記の方法は、予防的な治療である、第１３５項に記載の方法。
１３７．疾患は、癌である、第１３５項に記載の方法。
１３８．投与は、哺乳動物の免疫系の細胞におけるＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を介
した免疫応答を活性化する、第１３５項から第１３７項のいずれか１項に記載の方法。
１３９．ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ−２、ｐ３８のうちの少なくとも１つを刺激することで活性化される、第１３８項に記載の方法。
１４０．免疫応答は、哺乳動物における細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する、第１３５項から第１３９項のいずれか１項に記載の方法。
１４１．細胞障害性Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、第１４０項に記載の方法。
１４２．免疫応答は、哺乳動物における抗体応答を活性化する、第１３５項から第１４１項のいずれか１項に記載の方法。
１４３．免疫応答は、哺乳動物におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を活性化する、第１３５項から第１４２項のいずれか１項に記載の方法。
１４４．投与は、機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を高める、第１３５項から第１４３項のいずれか１項に記載の方法。
１４５．製剤は、粒子状のワクチン製剤である、第１３５項から第１４４項のいずれか１項に記載の方法。
１４６．アジュバントおよび抗原集合体は、混合物である、第１３５項から第１４５項のいずれか１項に記載の方法。
１４７．アジュバントは、免疫調節剤である、第１３５項から第１４６項のいずれか１項に記載の方法。
１４８．アジュバントは、ナノ粒子である、第１３５項から第１４７項のいずれか１項に記載の方法。
１４９．アジュバントは、カチオン性脂質である、第１３５項から第１４８項のいずれか１項に記載の方法。
１５０．カチオン性脂質は、精製されている、第１４９項に記載の方法。
１５１．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される、第１４９項または第１５０項に記載の方法。
１５２．カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである、第１４９項から第１５１項のいずれか１項に記載の方法。
１５３．カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡである、第１４９項から第１５１項のいずれか１項に記載の方法。
１５４．カチオン性脂質は、ＤＯＥＰＣである、第１４９項から第１５１項のいずれか１項に記載の方法。
１５５．アジュバントは、カチオン性脂質のエナンチオマーである、第１３５項から第１４８項のいずれか１項に記載の方法。
１５６．エナンチオマーは、精製されている、第１５５項に記載の方法。
１５７．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰである、第１５５項または第１５６項に記載の方法。
１５８．エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである、第１５５項から第１５７項のいずれか１項に記載の方法。
１５９．エナンチオマーは、Ｓ−ＤＯＴＡＰである、第１５５項から第１５７項のいずれか１項に記載の方法。
１６０．抗原集合体は、自己集合構造である、第１３５項から第１５９項のいずれか１項に記載の方法。
１６１．抗原集合体は、ミセル構造である、第１３５項から第１６０項のいずれか１項に記載の方法。
１６２．抗原集合体は、脂質二重層構造である、第１３５項から第１６０項のいずれか１項に記載の方法。
１６３．抗原集合体は、管状構造である、第１３５項から第１６２項のいずれか１項に記載の方法。
１６４．抗原集合体は、球状構造である、第１３５項から第１６２項のいずれか１項に記載の方法。
１６５．抗原集合体は、１種または２種以上の抗原を含む、第１３５項から第１６４項のいずれか１項に記載の方法。
１６６．１種または２種以上の抗原は、タンパク質ベースの抗原である、第１６５項に記載の方法。
１６７．１種または２種以上の抗原は、ペプチドベースの抗原である、第１６５項または第１６６項に記載の方法。
１６８．１種または２種以上の抗原は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される、第１６５項から第１６７項のいずれか１項に記載の方法。
１６９．１種または２種以上の抗原は、ウイルス抗原である、第１６５項から第１６８項のいずれか１項に記載の方法。
１７０．１種または２種以上の抗原は、細菌抗原である、第１６５項から第１６８項のいずれか１項に記載の方法。
１７１．１種または２種以上の抗原は、病原性抗原である、第１６５項から第１６８項のいずれか１項に記載の方法。
１７２．病原性抗原は、合成抗原または組換え抗原である、第１６５項から第１６８項のいずれか１項に記載の方法。
１７３．少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである、第１６５項から第１７２項のいずれか１項に記載の方法。
１７４．少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である、第１６５項から第１７３項のいずれか１項に記載の方法。
１７５．メラノーマ抗原は、ｇｐ１００（KVPRNQDWL［配列番号８］）、TRP2（SYVDFFVWL［配列番号９］）、ｐ５３（KYICNSSCM［配列番号１０］）、これらの組み合わせを含む
群から選択される、第１７４項に記載の方法。
１７６．少なくとも１種の抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、疎水性が高められたまたは疎水性が低減されたアミノ酸配列で修飾されたタンパク質またはペプチドからなる群から選択される、第１６５項から第１７５項のいずれか１項に記載の方法。
１７７．１種または２種以上の抗原は、脂質付加抗原あるいは、当該抗原の疎水性を高めるよう修飾された抗原である、第１６５項から第１７６項のいずれか１項に記載の方法。１７８．少なくとも１種の抗原は、修飾されたタンパク質またはペプチドである、第１６５項から第１７７項のいずれか１項に記載の方法。
１７９．修飾されたタンパク質またはペプチドは、疎水性基に結合される、第１７８項に記載の方法。
１８０．疎水性基に結合される、修飾されたタンパク質またはペプチドは、抗原と疎水性基との間のリンカー配列をさらに含む、第１７８項に記載の方法。
１８１．疎水性基は、パルミトイル基である、第１８０項に記載の方法。
１８２．少なくとも１種の抗原は、未修飾のタンパク質またはペプチドである、第１６５項から第１８１項のいずれか１項に記載の方法。
１８３．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番
号１０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）、からなる群から選択される、第１６５項から第１８２項のいずれか１項に記載の方法。
１８４．少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）である、第１６５項から第
１８３項のいずれか１項に記載の方法。
１８５．少なくとも１種の抗原は、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）である、第１６５項
から第１８４項のいずれか１項に記載の方法。
１８６．少なくとも１種の抗原は、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）である、第１６５項から第１８５項のいずれか１項に記載の方法。
１８７．KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、
第１８６項に記載の方法。
１８８．疎水性基は、パルミトイル基である、第１８７項に記載の方法。
１８９．少なくとも１種の抗原は、YMLDLQPETT（配列番号４）である、第１６５項から第１８８項のいずれか１項に記載の方法。
１９０．少なくとも１種の抗原は、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）である、第１６５項か
ら第１８９項のいずれか１項に記載の方法。
１９１．KSSYMLDLQPETT（配列番号５）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１
９０項に記載の方法。
１９２．疎水性基は、パルミトイル基である、第１９１項に記載の方法。
１９３．少なくとも１種の抗原は、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）である、第
１６５項から第１９２項のいずれか１項に記載の方法。
１９４．KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）は、疎水性基をさらに含むよう修飾さ
れる、第１９３項に記載の方法。
１９５．疎水性基は、パルミトイル基である、第１９４項に記載の方法。
１９６．少なくとも１種の抗原は、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）である、第１６５項から第１９５項のいずれか１項に記載の方法。
１９７．KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第１９６項に記載の方法。
１９８．疎水性基は、パルミトイル基である、第１９７項に記載の方法。
１９９．少なくとも１種の抗原は、KVPRNQDWL（配列番号８）である、第１６５項から第
１９８項のいずれか１項に記載の方法。
２００．少なくとも１種の抗原は、SYVDFFVWL（配列番号９）である、第１６５項から第
１９９項のいずれか１項に記載の方法。
２０１．少なくとも１種の抗原は、KYICNSSCM（配列番号１０）である、第１６５項から
第２００項のいずれか１項に記載の方法。
２０２．少なくとも１種の抗原は、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）である、第１６５項から第２０１項のいずれか１項に記載の方法。
２０３．KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される、第２０２項に記載の方法。
２０４．疎水性基は、パルミトイル基である、第２０３項に記載の方法。
２０５．哺乳動物は、ヒトである、第１３５項から第２０４項のいずれか１項に記載の方法。
＝＝関連出願のクロスリファレンス＝＝
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１１年９月１２日にファイルされた米国仮特許出願第６１／５３３，５１２号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｅ７抗原を用いて同様に調製された従来のアジュバントとの比較で、ＨＰＶ−１６  Ｅ７ペプチド抗原に結合したさまざまなカチオン性脂質アジュバントの抗腫瘍免疫応答を示す。
【図２】抗原領域からアミノ酸４３から４８が欠けたＲ−ＤＯＴＡＰ／ｐＥ７49〜57複合体との比較で、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／ｐＥ７43〜57複合体のさまざまなリポソーム封入された製剤を用いた、腫瘍の退縮効果を示す。
【図３】中空Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子との比較で、修飾されたＨＶＰ−１６  Ｅ７43〜57ミセルと、Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰリポソームのアジュバントナノ粒子との混合物を用いる場合の腫瘍の退縮効果を示す。
【図４】パルミトイル−KSSGQAEPDRAHYNIVTF［配列番号３］からなる円柱状のｐＥ７43〜57Mミセルと、球状のカチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰナノ粒子とを含有するワクチン製剤のネガティブ染色法での電子顕微鏡画像を示す。
【図５】調製された混合物に共存する、パルミトイル−KSSYMLDLQPETT［配列番号５）を含む球状ミセル構造の抗原集合体と、球状のＲ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子を含むアジュバントとの混合物を含有するワクチン製剤のネガティブ染色法での電子顕微鏡画像を示す。
【図６】ｐＥ７1〜20Mまたはパルミトイル−KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT［配列番号６］と、球状のカチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰナノ粒子とで構成される構造を含有するワクチン製剤のネガティブ染色法での電子顕微鏡画像を示す。
【図７】Ｒ−ＤＯＴＡＰアジュバントに封入された、さまざまなメラノーマ抗原を含有するワクチン製剤と、Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームアジュバントと同時投与されるメラノーマペプチドミセル製剤で、メラノーマペプチドｇｐ１００に対する抗原特異的免疫応答を比較するＥＬＩＳＰＯＴ研究の結果を示す。
【図８】ミセルとして同一用量で調製され、さまざまなアジュバントと同時投与されるＨＰＶ−１６ペプチドと、リポソームアジュバントに封入されたＨＰＶ−１６ペプチドに対する抗原特異的免疫応答を比較するＥＬＩＳＰＯＴ研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のさまざまな実施形態を、本明細書にて以下のとおり説明する。本明細書に記載の一実施形態では、ワクチン製剤が提供される。このワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。
【００１２】
もうひとつの実施形態では、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法が提供される。この方法は、有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含み、当該ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。
【００１３】
さらに別の実施形態では、哺乳動物における疾患を治療する方法が提供される。この方法は、有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含み、当該ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。本明細書で使用する場合、「アジュバント」という用語は、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を高める、増すおよび／または増強する物質をいう。本明細書で使用する場合、「抗原集合体」という用語は、１種または２種以上の抗原を含有する組成物をいう。
【００１５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、粒子状のワクチン製剤である。いくつかの実施形態では、アジュバントと抗原集合体は、混合物である。
【００１６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、アジュバントは、免疫調節剤である。本明細書で使用する場合、「免疫調節剤」という用語は、哺乳動物における免疫応答を高める、指向するおよび／または促進する免疫修飾因子をいう。
【００１７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、アジュバントは、ナノ粒子である。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、大きさがナノメートル規模で測定される粒子をいう。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」とは、大きさが約１，０００ナノメートル未満の構造を有する粒子をいう。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、リポソームである。
【００１８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性脂質である。本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで正味の正電荷を持つか、あるいは、プロトン化可能な基を有し、かつｐＫａ未満のｐＨで正に荷電する多数の脂質種のうちの任意のものをいう。
【００１９】
本開示による好適なカチオン性脂質としては、３−β［4Ｎ−（1Ｎ，8Ｎ−ジグアニジ
ノスペルミジン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）；３−β［Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＴＣ）；Ｎ，Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3テトラ−メチルテトラパルミチルスペルミン（セルフェクチン）；Ｎ−ｔ−
ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）（ＤＯＳＰＡ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ−５０）；Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）または他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−三置換アンモニウムサーファクタント；トリメチルアンモニウム基がブタノールスペーサーアームを介して二重鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）に結合している１，２ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）またはコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）；ＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）またはＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）（ＤＯＲＩＥ）あるいはその類似体（ＷＯ  ９３／０３７０９に開示されているものなど）；１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）；コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、コレステリル−３β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートヨージド、コレステリル−３−Ｏ−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、３−β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、３−β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロールなどのリポポリアミン；Ｏ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リジルアスパルテート（ＤＭＫＥ）；Ｏ，Ｏ’−ジミリスチル−Ｎ−リジル−グルタメート（ＤＭＫＤ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ）；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオレオイルジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−パルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）があげられるが、これらに限定されるものではない。さらに、上
述したカチオン性脂質のいずれかの構造的な変異体および誘導体も、企図される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、これらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡである。他の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＥＰＣである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、精製されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性脂質のエナンチオマーである。「エナンチオマー」という用語は、たとえばＲエナンチオマーとＳエナンチオマーなど、対になる立体異性体の重ねることのできない鏡像であるカチオン性脂質の立体異性体をいう。さまざまな例では、エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰである。一例では、エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＴＡＰである。もうひとつの例では、エナンチオマーは、Ｓ−ＤＯＴＡＰである。いくつかの実施形態では、エナンチオマーは、精製されている。
【００２２】
本明細書に記載のさまざまな実施形態では、抗原集合体は、自己集合構造である。本明細書に記載のさまざまな実施形態では、抗原集合体は、ミセル構造である。本明細書で使用する場合、「ミセル」という用語は、コロイド系におけるものなどの分子の凝集体をいう。他の実施形態では、抗原集合体は、脂質二重層構造である。いくつかの実施形態では、抗原集合体は、管状構造である。さらに他の実施形態では、抗原集合体は、球状構造である。
【００２３】
本明細書に記載のさまざまな実施形態では、抗原集合体は、１種または２種以上の抗原を含む。本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、免疫系を有する哺乳動物に（直接的に、あるいは、たとえばＤＮＡワクチン中に含める形で発現時に）導入されると、この哺乳動物の免疫系によって認識され、免疫応答を誘発できる任意の作用剤（たとえば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸またはこれらの組み合わせ）をいう。本明細書で定義するように、抗原誘導免疫応答は、体液性であっても細胞媒介性であってもよく、その両方であってもよい。作用剤は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）など、免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できる場合に、「抗原性」であるとされる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、１種または２種以上の抗原は、タンパク質ベースの抗原である。他の実施形態では、１種または２種以上の抗原は、ペプチドベースの抗原である。さまざまな実施形態では、１種または２種以上の抗原は、癌抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、病原性抗原からなる群から選択される。「微生物抗原」とは、本明細書で使用する場合、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫、感染性真菌を含むがこれらに限定されるものではない。微生物抗原は、インタクトな微生物ならびに、その天然単離体、フラグメントまたは誘導体、さらには、天然に生じる微生物抗原と同一または類似の合成化合物であってもよく、好ましくは、（天然に生じる微生物抗原の起源である）対応の微生物に対する免疫応答を誘導する。一実施形態では、抗原は、ウイルス抗原である。もうひとつの実施形態では、抗原は、細菌抗原である。さまざまな実施形態では、抗原は、病原性抗原である。いくつかの実施形態では、病原性抗原は、合成抗原または組換え抗原である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。「癌抗原」とは、本明細書で使用する場合、腫瘍または癌細胞に関連し、ＭＨＣ分子の文脈で、抗原提示細胞の表面において発現すると免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘発できる分子または化合物（たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タン
パク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）である。たとえば、癌抗原は、腫瘍関連抗原であってもよい。腫瘍関連抗原は、自己抗原のみならず、癌とは特異的に関連しないこともあるが、それにもかかわらず、哺乳動物に投与されると腫瘍または癌細胞に対する免疫応答を高めるおよび／または腫瘍または癌細胞の増殖を低減する他の抗原を含む。一実施形態では、少なくとも１種の抗原は、ＨＰＶタンパク質またはペプチドである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、メラノーマ抗原である。一実施形態では、メラノーマ抗原は、ｇｐ１００（KVPRNQDWL［配列番号８］）、TRP2（SYVDFFVWL［配列番号９］）、ｐ５３（KYICNSSCM［配列番号１０］）、これらの組み合わせを含む
群から選択される。
【００２７】
さまざまな実施形態では、少なくとも１種の抗原は、リポタンパク質、リポペプチド、疎水性が高められたまたは疎水性が低減されたアミノ酸配列で修飾されたタンパク質またはペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１種または２種以上の抗原は、当該抗原の疎水性を高めるよう修飾された抗原である。一実施形態では、少なくとも１種の抗原は、修飾されたタンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、修飾されたタンパク質またはペプチドは、疎水性基に結合される。他の実施形態では、疎水性基に結合される、修飾されたタンパク質またはペプチドは、抗原と疎水性基との間のリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。さらに他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、未修飾のタンパク質またはペプチドである。
【００２８】
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１
）、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号２）、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）、YMLDLQPETT
（配列番号４）、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）、KVPRNQDWL（配列番号８）、SYVDFFVWL（配列番号９）、KYICNSSCM（配列番号１０）、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）からなる群から
選択される。一実施形態では、少なくとも１種の抗原は、RAHYNIVTF（配列番号１）であ
る。もうひとつの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、GQAEPDRAHYNIVTF（配列番号
２）である。さらに別の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）である。いくつかの実施形態では、KSSGQAEPDRAHYNIVTF（配列番号３）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される。一実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。
【００２９】
他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、YMLDLQPETT（配列番号４）である。もうひとつの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）である
。さらに別の実施形態では、KSSYMLDLQPETT（配列番号５）は、疎水性基をさらに含むよ
う修飾される。一実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。
【００３０】
他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６
）である。もうひとつの実施形態では、KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT（配列番号６）は、疎
水性基をさらに含むよう修飾される。一実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。
【００３１】
他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）である。いくつかの実施形態では、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号７）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される。一実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KVPRNQDWL（配列番号８）である
。他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、SYVDFFVWL（配列番号９）である。さら
に他の実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KYICNSSCM（配列番号１０）である。も
うひとつの実施形態では、少なくとも１種の抗原は、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）である。いくつかの実施形態では、KSSKVPRNQDWL（配列番号１１）は、疎水性基をさらに含むよう修飾される。一実施形態では、疎水性基は、パルミトイル基である。
【００３３】
本明細書に記載のさまざまな実施形態では、ワクチン製剤は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路を活性化することで、哺乳動物で免疫応答を誘導する。カチオン性脂質などのアジュバントによる免疫応答の誘導については、たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７６７８（ＷＯ／２００８／１１６０７８；「 Stimulation of an Immune Response by Cationic Lipids」）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４０
５００（ＷＯ／２００９／１２９２２７；「 Stimulation of an Immune Response by Enantiomers of Cationic Lipids」）に記載されており、両者の開示内容全体を本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、細胞外シグナル制御キナーゼ（「ＥＲＫ」）−１、ＥＲＫ−２、ｐ３８のうちの少なくとも１つを刺激することで、活性化される。他の実施形態では、この製剤は、機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を高める。「哺乳動物」という用語は、当業者間で良く知られている。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００３４】
本明細書に記載の一実施形態では、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法が提供される。この方法は、有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含み、当該ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。ワクチン製剤についての上述した実施形態を、本明細書に記載の哺乳動物における免疫応答を誘導する方法に、適用可能である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、哺乳動物の免疫系の細胞のＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を介して活性化される。さまざまな実施形態では、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ−２、ｐ３８のうちの少なくとも１つを刺激することで、活性化される。
【００３６】
他の実施形態では、免疫応答は、哺乳動物における細胞障害性Ｔリンパ球を活性化する。一実施形態では、細胞障害性Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。もうひとつの実施形態では、投与は、機能的な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を高める。さらに別の実施形態では、免疫応答は、哺乳動物における抗体応答を活性化する。他の実施形態では、免疫応答は、哺乳動物におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を活性化する。
【００３７】
本明細書に記載の一実施形態では、哺乳動物における疾患を治療する方法が提供される。この方法は、有効量のワクチン製剤を哺乳動物に投与するステップを含み、当該ワクチン製剤は、アジュバントと、抗原集合体とを含む。ワクチン製剤および哺乳動物における免疫応答を誘導する方法についての上述した実施形態を、本明細書に記載の哺乳動物における疾患を治療する方法に、適用可能である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、感染性の病原体との兼ね合いで本明細書にて使用する場合、「治療」、「治療する」、「治療して」とは、病原体による感染に対する被検体の耐性を高めるあるいは、被検体が病原体に感染してしまう尤度を下げる予防的な治療および／または感染と闘う（たとえば、感染を低減または排除する、あるいは、感染が悪化するのを防ぐ）ために、被検体が感染したあとの治療をいう。一実施形態では、この方法は、予防的な治療である。
【実施例】
【００３９】
実施例１
アジュバントおよび抗原含有アジュバントの調製
アジュバントは、カチオン性脂質だけを用いて調製できる。あるいは、アジュバントを、カチオン性脂質と他の免疫調節剤との混合物を用いて調製してもよい。ワクチン製剤は、抗原含有カチオン性脂質ベースの製剤を用いて調製できる。本実施例では、例示的なカチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを使用し、例示的な抗原としては、ＨＰＶタンパク質Ｅ７ペプチド抗原を使用した。
【００４０】
カチオン性脂質をリポソームに調製するすべての手順で、注射用滅菌水（ＷＦＩ）または緩衝液を使用した。この実施例では、脂質膜を用いてリポソームを調製した。リポソームに取り込むのに用いたＥ７抗原は、ＨＰＶ  １６  Ｅ７タンパク質由来のＨ−２Ｄb拘
束性ＣＴＬエピトープ（アミノ酸４９〜５７、RAHYNIVTF［配列番号１］）であった。脂
質膜は、（１）クロロホルムなどの有機溶媒に脂質を溶解し、（２）乾燥窒素ガスの安定した流れのもとでクロロホルム溶液を蒸発させることによって、ガラスバイアルにて作製した。膜を一晩、真空下に維持することで、微量の有機溶媒を除去した。その後、最終濃度４〜１０ｍｇ／ｍＬまで必要な量のＷＦＩまたは緩衝液を加えて、脂質膜を水和させた。この懸濁液を２００ｎｍの大きさに押し出し、４℃で保管した。
【００４１】
抗原含有カチオン性脂質の調製用に、Ｅ７ペプチドの水溶液で、ＤＯＴＡＰ脂質膜を再水和させた。当業者間で周知の一般的なリポソーム調製で用いられる他の方法を用いてもよい。
【００４２】
実施例２
抗原ペプチド粒子構造の調製
ペプチド配列は、本発明と併用する抗原として調製できる。本実施例では、ＨＰＶタンパク質Ｅ７ペプチド抗原を、例示的な抗原として使用した。ペプチド配列は、親水性が好適になるよう選択されてもよく、疎水性の分子または配列をＮ末端のアミノ酸残基に結合して修飾されてもよい。たとえば、パルミチン酸部分などの疎水性鎖が、ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基に共有結合してもよい。得られる抗原ペプチド粒子構造は、たとえば、ミセルであっても二重層であってもよい。
【００４３】
この実施例では、ペプチド配列を選択し、２０から５０μｇ／μｌの範囲の濃度で好適な溶媒に懸濁させた。具体的なワクチンの所望の特性にもとづいて、他の濃度が適することもある。
【００４４】
この実施例では、脂質付加ペプチドの原液を、選択された水性媒質中で希釈して、ミセルまたは二重層を作製した。これらの希釈液は一般に、該当ペプチドを０．５〜２ｍｇ／ｍｌ含有するが、具体的なワクチンの所望の特性に必要な抗原量に応じて、変わることもある。
【００４５】
その後、このペプチド粒子構造を１：１（ｖ／ｖ）で、カチオン性脂質を含む中空リポソームのナノ粒子と混合した。
【００４６】
実施例３
従来のアジュバントに比した、カチオン性脂質アジュバントの抗腫瘍効果
アジュバントとして用いられるカチオン性脂質の抗腫瘍効果を、抗原特異的ＣＴＬ活性を誘導することが知られている従来の良く知られたアジュバントと比較できる。この実施例では、さまざまな脂質アジュバントを、ＨＰＶタンパク質Ｅ７ペプチド抗原RAHYNIVTF
（配列番号１）と共にリポソームとして調製した（ａｋａ「Ｅ７」）。さまざまなカチオン性脂質に、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣを含むようにした。アニオン脂質には
、ＤＯＰＧを含むようにした。また、この実施例では、従来の良く知られたアジュバントであるＣｐＧおよび完全フロイントアジュバント（「ＣＦＡ」）もＥ７と共に調製した。
【００４７】
カチオン性脂質／Ｅ７製剤が腫瘍に対する免疫応答を誘導する効力を他のアジュバントと比較するために、腫瘍の樹立後に、１製剤あたり６から１２匹の腫瘍保持マウスを、Ｅ７ペプチド配合リポソームで６日間処理した。このカチオン性脂質アジュバント製剤は、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＴＭＡ）を、カチオン性脂質の１００ｎｍｏｌｅ用量の組成で含んでいた。アニオン脂質アジュバント製剤は、ＤＯＰＧを含んでいた。従来の良く知られたアジュバント製剤は、十分に樹立された強力なアジュバントＣＦＡまたはＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６を含んでいた。対照群には、処置なしと、ｅ７抗原のみ（すなわち、アジュバントなし）を含めた。
【００４８】
０日目に１０5個のＴＣ−１細胞を各マウスの側腹部に注射することによって、マウス
で、皮下にＨＰＶ陽性腫瘍を樹立した。６日目に、マウスに製剤を０．１０ｍｌの注射で１回皮下注射した。
【００４９】
図１に示すように、ＣＦＡまたはＣｐＧ製剤およびさまざまなカチオン性脂質製剤を注射されたマウスは、２６日目に、いずれも対照群と比較して腫瘍の成長の効果的な阻害が認められた。アニオン脂質製剤を注射されたマウスは、腫瘍の退縮を示さなかった。カチオン性脂質ベースの製剤であるＤＯＴＡＰ／Ｅ７、ＤＯＴＭＡ／Ｅ７およびＤＯＥＰＣ／Ｅ７製剤を注射されたマウスは、確立されたアジュバントベースの製剤であるＣｐＧ／Ｅ７またはＣＦＡ／Ｅ７で調製したものよりも良い抗癌活性（ｐ＜０．０１）を呈した。
【００５０】
実施例４
カチオン性脂質ナノ粒子および抗原集合体を含むワクチン製剤の抗腫瘍効果
腫瘍の退縮を評価することで、ワクチン製剤の抗腫瘍効果を評価することが可能である。この実施例では、ワクチン製剤は、カチオン性脂質ナノ粒子と、管状構造のペプチド抗原集合体とを含む。さらに、本実施例における例示的なカチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰであり、例示的な抗原集合体は、ＨＰＶ−１６  Ｅ７ミセルである。
【００５１】
この実施例では、ＨＰＶ  １６  Ｅ７タンパク質由来のＨ−２Ｄb拘束性ＣＴＬエピト
ープ（アミノ酸４９〜５７、RAHYNIVTF［配列番号１］）を、アミノ酸４３〜５７まで伸
長させ、GQAEPDRAHYNIVTF［配列番号２］とした。次に、配列番号２をさらにアミノ酸Ｋ
ＳＳで伸長させ、長くなったペプチドに、疎水性のパルミトイル鎖を結合した。結果として、ミセルまたは二重層の形成が効果的に促進された（すなわち、パルミトイル−KSSGQAEPDRAHYNIVTF［配列番号３］。配列番号２は、調製して評価すると、配列番号１と同様に、弱い抗原であることが観察された。
【００５２】
約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ（０．１〜０．２ｍＭ）のペプチド抗原を、Ｒ−ＤＯＴＡＰを含む２ｍｇ／ｍｌ（２．９ｍＭ）のリポソームナノ粒子に封入したところ、弱い免疫応答が生じ、効果的な腫瘍の退縮が欠如した（図２参照）。しかしながら、ペプチド抗原配列を配列番号３のみからなる粒子構造に調製すると、カチオン性脂質アジュバント送達系で送達するよりも高用量の抗原を送達できる。よって、ペプチドの弱い抗原性を克服する効果的な手段が得られる。
【００５３】
この手法を評価するために、上記の実施例で説明したようにして、ＨＰＶ陽性腫瘍を樹立した。６日目に、マウス（１群あたり５匹）に、さまざまなワクチン製剤を１回皮下注射した。
【００５４】
−製剤１（負の対照）：Ｒ−ＤＯＴＡＰを含む中空リポソームナノ粒子。
【００５５】
−製剤２：Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子２．３ｍｇ／ｍｌと、ミセルとしての配列番号３のペプチド抗原集合体１．１ｍｇ／ｍｌとの混合物（０．１０ｍｌを注射）。
【００５６】
−製剤３：Ｓ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子２．３ｍｇ／ｍｌと、ミセルとしての配列番号３のペプチド抗原集合体１．１ｍｇ／ｍｌとの混合物（０．１０ｍｌを注射）。
【００５７】
図３は、製剤２を注射したマウスにおける効果的な腫瘍の退縮を示す。ネガティブ染色法での走査型電子顕微鏡観察によって、調製されたワクチン混合物に共存する球状Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子でのアジュバントと管状ミセル構造の抗原集合体との混合物の存在が示される（図４）。本実施例は、アジュバント（たとえば、Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子）と抗原集合体（たとえば、ミセル粒子としてのＨＰＶ  Ｅ７ペプチド抗原）を含むワクチン製剤が、動物において腫瘍の退縮を効果的に促進できることを示している。
【００５８】
実施例５
カチオン性脂質ナノ粒子と、単一のペプチド抗原を含有する抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合のヒト化ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける免疫応答
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の誘導は、活性化された抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）に起因することが知られており、動物における効果的な治療免疫応答の発生に重要である。カチオン性脂質ナノ粒子と抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合のヒト化ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける免疫応答は、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイでＩＦＮ−γの誘導を測定することによって評価可能である。この実施例では、ワクチン製剤は、カチオン性脂質ナノ粒子（たとえば、Ｒ−ＤＯＴＡＰ）と、さまざまな組成および構造のペプチド抗原集合体とを含む。
【００５９】
本実施例では、２種類の異なるワクチン製剤を評価した。製剤１は、カチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子を含み、十分に樹立されたＨＰＶ−１６  Ｅ７  ＨＬＡ−Ａ２抗原性ヒトペプチド抗原YMLDLQPETT［配列番号４］を利用していた。３つのアミノ酸とパルミチン酸を結合することで配列番号４を修飾し、パルミトイル−KSSYMLDLQPETT［配列番号５］の配列を得た。本明細書に記載の方法に従って、粒子状のペプチド構造
を自然に形成した。製剤１は、約２．８ｍｇ／ｍｌのＲ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子のアジュバントと、約０．８３ｍｇ／ｍｌの配列番号５のペプチドの抗原集合体とを含有していた。
【００６０】
０日目と７日目に、マウスに０．１ｍｌの製剤１を注射した。これらのマウスを屠殺し、１４日目に、評価用にそれぞれのマウスから脾細胞を取り出した。免疫したマウスから脾細胞を回収し、９６ウェルプレートのウェルに播種した（１ウェルあたり脾細胞約２５０，０００個）。その後、個々のウェルをペプチド抗原YMLDLQPETT［配列番号４］に曝露し、免疫応答を分析した。アッセイで生じた各スポットは単一の反応性脾細胞を示し、分析結果を読み取ることで、９６ウェルのプレートで形成されるスポットの数が得られる。このように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、抗原YMLDLQPETTに対して結果として生じる免疫応答を効果的に判断するための定量的アッセイとなった。製剤１の高い効力を表すＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を、表１にあげておく。
【００６１】
【表１】
2018065821.tif 000002
【００６２】
製剤２は、カチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子を含み、ＨＰＶ−１６
Ｅ７タンパク質のＮ末端から最初の２０のアミノ酸を選択したペプチドを利用していた。このペプチドを修飾して、パルミトイル−KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT［配列番号６］と
した。本明細書に記載の方法に従って、粒子状のペプチド構造を自然に形成した。製剤２は、約２．８ｍｇ／ｍｌのＲ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子のアジュバントと、約０．９５ｍｇ／ｍｌの配列番号６のペプチドの抗原集合体とを含有していた。
【００６３】
０日目と７日目に、マウスに０．１ｍｌの製剤２を注射した。これらのマウスを屠殺し、１４日目に、評価用にそれぞれのマウスから脾細胞を取り出した。ここでも、表１に示すように、製剤２での免疫化に応答して、強い免疫応答が認められた。
【００６４】
ネガティブ染色法での走査型電子顕微鏡観察によって、調製された混合物に共存する、パルミトイル−KSSYMLDLQPETTを含む球状ミセル構造の抗原集合体と、球状のＲ−ＤＯＴ
ＡＰリポソームナノ粒子を含むアジュバントとの混合物（すなわち、製剤１）の存在が示された（図５参照）。
【００６５】
図６は、調製された混合物に共存する、パルミトイル−KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETTを含
む管状ミセル構造の抗原集合体と、球状のＲ−ＤＯＴＡＰリポソームナノ粒子を含むアジュバント（すなわち、製剤２）を示す。
【００６６】
実施例６
カチオン性脂質ナノ粒子と、複数のペプチド抗原を含有する抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合のヒト化ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける免疫応答
実施例５と同様に、カチオン性脂質ナノ粒子と抗原集合体とを含むワクチン製剤の効力を評価するのに、ＥＬＩＰＳＯＴを利用できる。この実施例では、ワクチン製剤は、カチオン性脂質ナノ粒子（たとえば、Ｒ−ＤＯＴＡＰ）と、３種類のペプチド抗原を含むペプチド抗原集合体と、を含む。
【００６７】
本実施例の製剤は、カチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子と、３種類のペプチド抗原を含む混合ミセル構造の抗原集合体とを含んでいた。ペプチド配列YMLDLQPETTに対する免疫応答を評価した。この混合ペプチド粒子は、配列番号５、配列番号６、パルミトイル−KSSLLMGTLGIVCPICSQKP［配列番号７］で構成されていた。この製剤は、約２．８ｍｇ／ｍｌのＲ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子のアジュバントと、約１ｍｇ／ｍＬの各ペプチドの抗原集合体とを含有していた。
【００６８】
０日目と７日目に、マウスに０．１ｍｌの製剤を注射した。これらのマウスを屠殺し、
１４日目に、評価用にそれぞれのマウスから脾細胞を取り出した。表２に示すように、この製剤での免疫化に応答して、強力な免疫応答が認められた。
【００６９】
【表２】
2018065821.tif 000003
【００７０】
実施例７
カチオン性脂質ナノ粒子と、ミセルメラノーマ抗原を含有する抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合の免疫応答
カチオン性脂質ナノ粒子と、抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価することが可能である。この実施例では、ワクチン製剤は、カチオン性脂質ナノ粒子（たとえば、Ｒ−ＤＯＴＡＰ）と、ミセル構造のメラノーマ抗原のペプチド抗原集合体とを含む。
【００７１】
この実施例では、製剤Ａは、カチオン性脂質Ｒ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子と、３種類のメラノーマ抗原すなわち、ｇｐ１００（KVPRNQDWL［配列番号８］）、TRP２（SYVDFFVWL［配列番号９］）、ｐ５３（KYICNSSCM［配列番号１０］）を封入した抗原集合体とを含んでいた。製剤Ａは、約４．３ｍＭのＲ−ＤＯＴＡＰアジュバントナノ粒子のアジュバントと、約０．２５ｍＭのｇｐ１００ペプチドとを含有していた。
【００７２】
大量のｇｐ１００抗原を送達するために、ミセル製剤を開発した。修飾された抗原パルミトイル−KSS KVPRNQDWL［配列番号１１］を使用して、ミセル製剤を開発した。製剤Ｂ
は、約４．４ｍＭのリポソームＲ−ＤＯＴＡＰ封入ＴＲＰ２と、約０．４６ｍＭのｇｐ１００のミセル製剤とを含んでいた。修飾された抗原から作製するミセルは、実施例２に記載したようにして調製した。ＥＬＩＳＰＯＴによって、実施例５で説明したようにして、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるワクチンの有効性を評価した。
【００７３】
図７は、リポソームに封入されたｇｐ１００抗原との比較で、ミセル製剤でのｇｐ１００抗原を含む製剤に対する免疫応答の２０倍を超える増加を示す。免疫応答は、ミセル製剤によって送達されるｇｐ１００抗原の量がほぼ倍になるがゆえに高まると思われる。
【００７４】
実施例８
ミセル抗原集合体およびリポソーム封入抗原集合体を用いる場合のワクチン製剤における免疫応答の比較
異なるカチオン性脂質ナノ粒子と、異なる抗原集合体とを含むワクチン製剤を用いる場合の免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価することが可能である。この実施例では、さまざまなカチオン性脂質ナノ粒子（たとえば、ＤＯＥＰＣまたはＤＯＴＭＡ）またはエマルションアジュバントMontanideを用いて、ワクチン製剤を調製可能である。さらに、
ミセル構造またはリポソーム封入構造のいずれかの抗原集合体を用いて、ワクチン製剤を
調製可能である。
【００７５】
本実施例では、さまざまに異なるワクチン製剤を評価した。一製剤では、抗原集合体は、ペプチド抗原［配列番号２］（０．１１ｍＭ）とカチオン性脂質アジュバントＤＯＥＰＣ（１ｍＭ）とを含んでいた。第２の製剤では、抗原集合体は、ミセルの形成を可能にするよう修飾されたペプチド抗原［配列番号３］（０．１１ｍＭ）と、カチオン性脂質アジュバントＤＯＥＰＣ（１ｍＭ）とを含んでいた。第３の製剤では、抗原集合体は、ペプチド抗原［配列番号２］（０．１１ｍＭ）と、カチオン性脂質アジュバントＤＯＴＭＡ（１ｍＭ）とを含んでいた。第４の製剤では、抗原集合体は、修飾されたペプチド抗原［配列番号３］（０．１１ｍＭ）と、カチオン性脂質アジュバントＤＯＴＭＡ（１ｍＭ）とを含んでいた。第５の製剤では、抗原集合体は、ペプチド抗原［配列番号２］（０．１１ｍＭ）と、エマルションアジュバントMontanideとを含んでいた。第６の製剤では、抗原集合
体は、修飾されたペプチド抗原［配列番号３］（０．１１ｍＭ）と、エマルションアジュバントMontanideとを含んでいた。
【００７６】
抗原集合体が未修飾のペプチド抗原［配列番号２］を含んでいた製剤では、抗原集合体をリポソーム封入されたものとして調製した。比較して、抗原集合体が修飾されたペプチド抗原［配列番号３］を含んでいた製剤では、対応するリポソーム製剤に対して、同一の抗原およびアジュバント含有量を維持するために、抗原集合体をミセルとして調製し、アジュバントと１：１の比で混合した。リポソーム封入された抗原集合体およびミセル抗原集合体については、それぞれ実施例１および実施例２のプロトコールに沿って作製した。ＥＬＩＳＰＯＴによって抗原特異的免疫応答を求めることで、さまざまなワクチン製剤の力価を評価した。
【００７７】
図８は、本実施例の結果を示す。同一用量の抗原とアジュバントは、抗原集合体が特定のアジュバントと共にミセル形態で送達されると、非常に優れた抗原特異的免疫応答につながる。重要なのは、リポソーム封入形態で送達される抗原集合体を用いると、観察される免疫応答が非常に弱いということである。
【００７８】
また、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、Montanideで見られるように、観察される免疫応答は
、ミセル抗原と共に投与される具体的なアジュバントに左右される。ＤＯＴＭＡ製剤では、ＤＯＥＰＣ製剤よりも優れた免疫応答が認められ、どちらのカチオン性脂質製剤も、エマルションアジュバントMontanideより優れていた。
【００７９】
以上、本発明について図示し、上記の明細書にて詳細に説明してきたが、このような図示および説明は例示的なものであって、特徴を限定するものではないとみなされる。また、ここでは例示的な実施形態を説明したにすぎず、本発明の範囲内に包含される変更および改変がすべて保護されることが望ましい旨は、理解されたい。当業者であれば、本明細書に記載の特徴を１つまたは２つ以上を取り入れ、よって本開示の範囲に包含される自らの実現形態を、容易に考案できるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月13日(2017.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントと、抗原集合体とを含む、ワクチン製剤。
【外国語明細書】
2018065821000001.pdf