(57)【要約】【課題】細胞中の複数のエピトープを同定するためのダイナミックレンジを高めること。【解決手段】本発明は、標的分子を検出するための方法、組成物、キットおよびデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化された標的分子検出を可能にする。複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法であって、該方法は、該標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、ａ）該標的の同一性、およびｂ）タグが結合している該細胞の同一性を表すコードを含み、ここで、該複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１００倍よりも多くその相対存在量が変化する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ヒトの身体のすべての細胞は、同じ遺伝物質を含んでいるが、それらの細胞のすべてにおいて同じ遺伝子が活性であるわけではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に重大な影響を及ぼし得る。さらに、遺伝子産物（タンパク質）、そのバリアントおよび相互作用パートナーの動態および制御を理解することは、例えば、遺伝的障害／および環境的に誘導される障害の背後にあるメカニズムまたは薬物媒介性治療の影響を理解する際に不可欠である。この理解は、さらなる臨床上および診断上の分析にとって基本的根拠になる可能性がある。ゆえに、細胞内での遺伝子および／またはそれらの産物の発現および制御の同定および定量は、治療上および診断上の新しい標的の発見を助け得る。
【０００２】
これらの研究に極めて重要なことは、遺伝子発現および全タンパク質の特定のバリアント（例えば、スプライスバリアント、点変異、翻訳後修飾されたバージョンおよび環境的／治療的に誘導される改変）を定性的に決定できること、ならびにそれらの定量的調節を考察できることである。さらに、細胞内のたった１つではなく複数の標的分子からこれらの分析を行うことが、ますます重要になっている。これまでに利用可能な方法は、かなりの量の生物学的サンプルをなおも必要とするか、または細胞特異的な情報を提供しない。そのうえ、タンパク質サンプルに固有のさらなる難題のために、多重化されたタンパク質測定技術の方法は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、複雑な細胞集団の各細胞において標的分子を正確かつ高感度に検出、同定および定量する必要があり、ならびにその標的分子に関する細胞特異的な情報を保持する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、概して、サンプル中の標的分子の検出、同定および定量の分野に関する。本発明は、複雑な細胞集団の単一細胞内の個々の標的分子に関する細胞特異的な情報を保持しながらの、その標的分子の検出、同定および定量に部分的に関する。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、複数の標的が複数の細胞に存在するかどうかを同定するための方法に関し、その方法は、その標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、ａ）標的の同一性、およびｂ）タグが結合している細胞の同一性を表すコードを含み、ここで、その複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１００倍よりも多くその相対存在量が変化する。いくつかの実施形態において、その複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１０００倍超、１００００倍超、１０００００倍超、１００００００倍超、１０００００００倍超、１００００００００倍超またはそれよりも多くその相対存在量が変化する。いくつかの実施形態において、少なくとも第３の標的は、第１の標的対における両方の標的よりも１０倍超、１００倍超、１０００倍超、１００００倍超、１０００００倍超、１００００００倍超、１０００００００倍超、１００００００００倍超またはそれよりも多くその相対存在量が変化する。いくつかの実施形態において、上記複数の標的は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００個またはそれ以上の標的を含む。いくつかの実施形態において、同じ標的の同一性および細胞の同一性を有する少なくとも２個の異なるタグが存在する。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるタグは、同じプライマーのセットを用いて様々な速度で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く増幅する。いくつかの実施形態において、個々の細胞または標的の分離または単離は、結合工程に不必要である。いくつかの実施形態において、上記方法は、コードを検出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、個々の細胞または標的の分離または単離は、検出工程に不必要である。いくつかの実施形態において、検出工程は、配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、各標的は、タンパク質または核酸である。いくつかの実施形態において、各標的は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、タグは、核酸である。いくつかの実施形態において、タグは、ＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、標的のうちの１つに特異的である。いくつかの実施形態において、標的のうちの１つに特異的なＵＢＡは、標識ＵＢＡと未標識ＵＢＡとの混合物を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＥＳＢを含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、標的の同一性をコードする。いくつかの実施形態において、標識ＥＳＢと未標識ＥＳＢとの混合物を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、検出可能に異なるコードユニットを含む。いくつかの実施形態において、結合工程中、複数個のＡＰＳが、分割プール合成（ｓｐｌｉｔ  ｐｏｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の連続したラウンドの間に順序づけられた様式でタグに付加される。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多くのＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ライゲーションによって連結された、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよびＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよび／またはＵＢＡは、クリックケミストリーで連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよび／またはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、鋳型になり得る。
【０００６】
別の態様において、本発明は、ａ）第１の標的分子、ｂ）第１の標的分子に特異的な少なくとも２個の異なるユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｃ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、およびｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む組成物に関し、ここで、ＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＵＢＡは、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００のバリエーションで影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＵＢＡは、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００のバリエーションで影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域に連結されている。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＵＢＡは、様々な効率で、例えば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍より効率的に、ＥＳＢまたはＣＯＢを補充する１つ以上の結合領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＵＢＡは、様々な効率で、例えば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍より効率的に結合パートナーと会合する１つ以上の捕捉領域を含む。関連する態様において、本発明は、ａ）第１の標的分子、ｂ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｃ）少なくとも２個の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、およびｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む組成物に関し、ここで、ＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＥＳＢは、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００のバリエーションで影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＥＳＢは、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００のバリエーションで影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域に連結されている。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＥＳＢは、様々な効率で、例えば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍より効率的に、ＵＢＡまたはＣＯＢを補充する１つ以上の結合領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２個の異なるＥＳＢは、様々な効率で、例えば、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍より効率的に、結合パートナーと会合する１つ以上の捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多くのＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、ユニークなカウンタータグは、検出可能である。
【０００７】
なおも別の態様において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み、ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；およびｂ）同じ標的に特異的な少なくとも２個のユニーク結合物質（ＵＢＡ）を備える。関連する態様において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み、ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；およびｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）（その各々は、ＵＢＡ特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）と連結されており、少なくとも１つのＵＢＡの２個のサブタイプをさらに含み、ここで、その２個のサブタイプは、異なるＥＳＢに連結されている）を備える。なおも別の関連する態様において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み、ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；およびｃ）ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）（各ＥＳＢは、指定のＵＢＡと連結することが可能であり、同じＵＢＡに特異的である少なくとも１つのＥＳＢの少なくとも２個のサブタイプをさらに含む）を備える。いくつかの実施形態において、ｎは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い。いくつかの実施形態において、ｍは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、ユニークなカウンタータグは、検出可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、キットは、プローブをさらに備える。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法に関し、その方法は、ａ）（ｉ）標的分子を含む細胞の集団、（ｉｉ）複数の標的特異的ＵＢＡ混合物（少なくとも１つのＵＢＡ混合物は、標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを所定の比で含む）、（ｉｉｉ）ＵＢＡと会合することができる複数のＥＳＢ、および（ｉｖ）複数のラウンド特異的なＡＰＳセット（その各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を得る工程；（ｂ）そのＵＢＡの混合物を前記細胞の集団と接触させる工程（その標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡは、標的分子に結合する）；（ｃ）その複数のＥＳＢを前記細胞の集団と接触させる工程；および（ｄ）その複数のラウンド特異的なＡＰＳを使用して分割プール合成を行う工程を包含する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＥＳＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＥＳＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも優先的に枯渇される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも優先的に枯渇される。
【０００９】
なおもさらなる態様において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法に関し、その方法は、（ａ）（ｉ）標的分子を含む細胞の集団、（ｉｉ）複数の標的特異的ＵＢＡ、（ｉｉｉ）複数のＥＳＢ混合物（その各々は、ＵＢＡ混合物のうちの１つと会合することができ、少なくとも１つのＥＳＢ混合物は、標識ＥＳＢおよび未標識ＥＳＢを所定の比で含む）、および（ｉｖ）複数のラウンド特異的なＡＰＳセット（各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を得る工程；（ｂ）ＵＢＡを前記細胞の集団と接触させる工程；（ｃ）複数のＥＳＢを前記細胞の集団と接触させる工程（標識ＥＳＢおよび未標識ＥＳＢは、ＵＢＡに結合する）；および（ｄ）複数のラウンド特異的なＡＰＳを使用して分割プール合成を行う工程を包含する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＵＢＡと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＵＢＡと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも優先的に枯渇される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも優先的に枯渇される。いくつかの実施形態において、上記方法は、前記ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体の少なくとも一部を検出することによって、少なくとも１つの標的特異的シグナルを得る工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、標的特異的シグナルを乗数で正規化することによって、その標的特異的シグナルと関連する標的分子を定量する工程をさらに包含し、ここで、その乗数は、所定の比に基づく。いくつかの実施形態において、検出工程は、配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、乗数は、所定の（ｐｒｅｄｅｔｅｍｉｎｅｄ）比の逆数である。
【００１０】
なおも別の態様において、本発明は、ａ）細胞を含むサンプルを、標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを所定の比で含む混合物と接触させる工程、ならびにｂ）その標的に結合した標識ＵＢＡの量を検出し、その検出値をその所定の比に基づく係数（ｆａｃｔｏｒ）で正規化することによって、細胞に関連する標的の量の近似値を生成する工程を包含する方法に関し、ここで、その細胞は、分割プール合成に供される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＥＳＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＥＳＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＵＢＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも優先的に枯渇される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＵＢＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも優先的に枯渇される。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、ａ）細胞を含むサンプルを、ＵＢＡならびに標識ＥＳＢおよび未標識ＥＳＢを所定の比で含む混合物と接触させる工程、およびｂ）その標的に結合した標識ＥＳＢの量を検出し、その検出値をその所定の比に基づく係数で正規化することによって、細胞に関連する標的の量の近似値を生成する工程を包含する方法に関し、ここで、その細胞は、分割プール合成に供される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＵＢＡと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＵＢＡと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、ＣＯＢと優先的に会合する。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、優先的に検出される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０サイクルの増幅反応（例えば、ＰＣＲ）あたり少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍速く、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも優先的に増幅される。いくつかの実施形態において、第１の標識ＥＳＢは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも優先的に枯渇される。いくつかの実施形態において、第２の標識ＥＳＢは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００倍またはそれより多く、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも優先的に枯渇される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法に関し、その方法は：その標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、ａ）その標的の同一性およびｂ）タグが結合している細胞の同一性を表すコードを含む。いくつかの実施形態において、個々の細胞の分離または単離は、その結合工程に不必要である。いくつかの実施形態において、タグは、例えば、共有結合性結合または親和性による会合によって、互いに直接または間接的に関連させられる基本ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）を含む。いくつかの実施形態において、タグは、所定の位置における基本ブロックの重合によって形成される。いくつかの実施形態において、複数個の基本ブロックが、１つの工程において付加される。いくつかの実施形態において、単一の基本ブロックが、各工程において付加される。いくつかの実施形態において、細胞は、生存している。いくつかの実施形態において、細胞は、溶解されているかまたは固定されている。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的に関連する単一細胞を同定するための方法に関し、その方法は：その標的にタグを結合する工程を包含し、そのタグは、ａ）その標的およびｂ）その単一細胞を表すコードを含み；その結合において、その単一細胞は、細胞の集団から単離されず、かつその単一細胞を表すコードは、結合の前は未知である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的に関連する単一細胞を同定するための方法に関し、その方法は：その標的にタグを結合する工程を包含し、そのタグは、ａ）その標的およびｂ）その単一細胞を表すコードを含み；その結合において、その単一細胞は、細胞の集団から単離され、かつその単一細胞を表すコードは、結合の前は未知である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記コードを検出する工程をさらに包含し、ここで、個々の細胞の分離または単離は、その検出工程に不必要である。いくつかの実施形態において、各標的は、タンパク質または核酸である。いくつかの実施形態において、タグは、核酸またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、タグは、解読可能なコードを含む一連のモノマーサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、タグは、解読され得るコードされた分子構成物である。いくつかの実施形態において、タグは、タグの性質を決定するために解読され得る部分の組み合わせを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、タグは、ＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、標的のうちの１つに特異的である。いくつかの実施形態において、タグは、ＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＥＳＢを含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、標的の同一性をコードする。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、検出可能な検出可能に異なるコードユニットである。いくつかの実施形態において、結合工程中に、複数個のＡＰＳが、分割プール合成（ｓｐｌｉｔ  ｐｏｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の連続したラウンドにおいて順序づけられた様式で前記タグに付加される。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも１０個のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、タグは、ライゲーションによって連結される複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよびＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよび／またはＵＢＡは、クリックケミストリーで連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る（ｔｅｍｐｌａｔａｂｌｅ）。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、異なった識別可能構成物である（そのコードの１つの部分が、核酸であり得、別の部分が、ポリペプチドであり得、別の部分が、小分子などであり得ることを意味する）。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）第１の標的分子、ｂ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｃ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）およびｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む組成物に関し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、粒子（各々が少なくとも第１の標的分子を含む）の集団を含む組成物に関し、ここで、その第１の標的分子は：ａ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、ｂ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）およびｃ）第１の複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）と会合しており、ここで、その集団中の第１の粒子の第１の標的分子と会合している複数の順序づけられたＡＰＳは、その集団中の第２の粒子の第１の標的分子と会合している複数の順序づけられたＡＰＳとは検出可能に異なる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、２０個より多いＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記第１のＥＳＢは、前記第１のＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、複数の順序づけられたＡＰＳは、別個のラウンドにおけるＡＰＳの段階的付加によって形成される。いくつかの実施形態において、各ラウンドにおいて付加されるＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序でされている。いくつかの実施形態において、連結は、結合親和性を介して行われる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、化学的方法を用いて行われる。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態は、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結される。いくつかの実施形態は、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて連結される。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、複数のＡＰＳのうちの２つのＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、連結は、ライゲーションによって行われる。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグ（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｔａｇ）を含む。いくつかの実施形態において、ユニークなカウンタータグは、検出可能である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、二次産物をコードすることができる。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、プローブをさらに含む。いくつかの実施形態において、プローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ）の核酸、小分子または組立可能な複合分子（ｂｕｉｌｄａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的なユニーク結合物質（ＵＢＡ）を備える。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）（その各々は、ＵＢＡ特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）と連結されている）を備える。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットに関し、そのキットは、ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセット（その各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、その情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である）；ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｃ）ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）（各ＥＳＢは、指定のＵＢＡと連結することができる）を備える。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、１０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合することができる。いくつかの実施形態において、前記ＵＢＡは、標的分子に直接結合することができる。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、第１のセット中のＡＰＳは、第２のセット中のＡＰＳと連結可能である。いくつかの実施形態において、第１のセット中のＡＰＳは、順序づけられた形式で第２のセット中のＡＰＳとさらに連結可能である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、ＣｕＩの存在が、連結のために必要とされる。いくつかの実施形態において、キットの構成要素は、親和性結合によって組み立てられ得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む第１の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態において、キットは、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＥＳＢから選択される２つの構成要素に対する第３および第４の相補的領域を含む第２の連結オリゴヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態において、第１および第３の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、第２および第４の相補的領域は、同一である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、ライゲーションによって連結されることが可能である。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源のセットをコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、そのユニークなカウンタータグは、検出可能である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、二次産物をコードすることができる。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＡＰＳおよびＥＳＢは、連結される場合、ポリメラーゼ開始部位を構成する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、キットは、プローブをさらに備える。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、複数のＵＢＡは、２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多いＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、複数のＵＢＡは、最大２０００個のＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、共通の粒子起源を共有している標的分子を同定するための方法に関し、その方法は、ｘ個の粒子の集団中の第１の粒子の第１の複数の標的を第１の起源バーコードで標識する工程；およびｘ個の粒子の集団中の第２の粒子の第２の複数の標的を第２の起源バーコードで標識する工程を包含し、各起源バーコードは、ｎ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のセットを含み；ここで、ＡＰＳの第１および第２のセット中のそのｎ個のＡＰＳの各々は、ｍ個の異なるＡＰＳを含む群から選択され；第１および第２の起源バーコードは、ｃ＝１−［（１−１／ｘ）＾（ｍｎ）］の確実性で互いと検出可能に異なる。いくつかの実施形態において、ｘは、１，０００，０００より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｃは、９９．９９９９９％より大きい。いくつかの実施形態において、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、１０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ｍ個の異なるＡＰＳを含む少なくとも２つの群は、同一である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ｎ個のＡＰＳが、別個のラウンドにおいて付加される。いくつかの実施形態において、その別個のラウンドのＡＰＳは、連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、適切なｎおよび／またはｍは、細胞数ｘが与えられた場合に所望の確実性のレベルに基づいて選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、粒子の集団の粒子の構成要素に粒子特異的コードを付与する方法に関し、その方法は：アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第１の順序づけられたセットを粒子の集団の第１の粒子の第１の構成要素に連結する工程を包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、その方法は、第１の構成要素と連結されたＡＰＳの第１の順序づけられたセットを検出することによって、第１の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第２の順序づけられたセットを粒子の集団の第１の粒子の第２の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、その方法は、第２の構成要素と連結されたＡＰＳの第２の順序づけられたセットを検出することによって、第２の構成要素の粒子の起源を決定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、第１の粒子の第１および第２の構成要素と連結されたＡＰＳの第１および第２の順序づけられたセットは、同じである。いくつかの実施形態において、その方法は、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の第３の順序づけられたセットを粒子の集団の第２の粒子の第１の構成要素に連結する工程をさらに包含し、ここで、そのＡＰＳの順序は、検出可能である。いくつかの実施形態において、第１の粒子の第１の構成要素と連結されたＡＰＳの第１の順序づけられたセットは、第２の粒子の第１の構成要素と連結されたアッセイ可能ポリマーサブユニットの第３の順序づけられたセットと異なる。いくつかの実施形態において、その方法は、構成要素特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第１の構成要素に連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、構成要素特異的なＥＳＢを第２の構成要素に連結する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも上記粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳの順序づけられたセットの各ＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、二次産物をコードする。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ユニークなカウンタータグをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記分子の標的分子の量は、カウンタータグを用いて推定される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ラウンド特異的サブコードをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、デジタルである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的である。いくつかの実施形態において、検出は、質量分析を含む。いくつかの実施形態において、検出は、核酸配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ペプチド配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、大規模ゲル電気泳動（ｍａｓｓ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ＨＰＬＣまたは他のクロマトグラフィー分離を含む。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む。いくつかの実施形態において、そのシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。いくつかの実施形態において、その分離は、第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分ける。いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）は、ＡＰＳの順序づけられたセットのＡＰＳを用いて生成される。いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結される。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの��施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークなカウンタータグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークなカウンタータグの数は、特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法に関し、その方法は：ａ）ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団；ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）；ｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セット（その各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を提供する工程；ｂ）前記少なくとも第１の標的分子、前記第１のＵＢＡプローブおよび前記第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程；ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程（その各ラウンドは；ｉ）粒子の集団をｍ個の反応体積に分割する工程；ｉｉ）そのラウンドに特異的なＡＰＳセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程；ｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程を含む）；ｄ）その粒子の集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程を包含し、ここで、その特性の少なくとも１つは、その粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の別々の粒子を起源とする複数の特性を検出するための方法に関し、その方法は：ａ）ｉ）少なくとも第１の標的分子を含む粒子の集団；ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；ｉｉｉ）第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）；およびｉｖ）ラウンド特異的な複数のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セット（その各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む）を提供する工程；ｂ）前記少なくとも第１の標的分子、前記第１のＵＢＡプローブおよび前記第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程；ｃ）ｎラウンドの分割プール合成を行う工程（その各ラウンドは、ｉ）粒子の集団をｍ個の反応体積に分割する工程；ｉｉ）そのラウンドに特異的なＡＰＳセットのＡＰＳと１つ以上の反応体積とを接触させる工程；およびｉｉｉ）２つ以上の反応体積をプールする工程を含む）；ｄ）工程ｃ）のｉ）およびｃ）のｉｉ）を含む分割プール合成の別のラウンドを行う工程；ｅ）その粒子の集団の少なくとも１つの粒子から複数の特性を検出する工程を包含し、ここで、その特性の少なくとも１つは、その粒子に関連する標的分子についての量または同一性に関する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、分割プール法は、例えば、微小ウェルまたはマイクロ流体デバイス内での粒子の分離によって置き換えられる。いくつかの実施形態において、分離された細胞は、細胞起源バーコードで標識される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコードは、基本ブロックの段階的付加によって適当な位置において組立てられる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、ｍは、少なくとも２ラウンドの間で異なる。いくつかの実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、ｍは、２０より大きい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの別々の粒子は、細胞、リポソーム、細胞小器官、ミセル、液滴およびビーズからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、第１のＥＳＢは、第１の共通リンカー（ＣＬ）を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに直接結合され、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに直接結合される。いくつかの実施形態において、アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）セットのうちの少なくとも２つは、同一である。いくつかの実施形態において、各ラウンドにおいて付加されるＡＰＳは、第１の複合体に連結される。いくつかの実施形態において、連結は、ラウンドの順序においてされる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、二次産物をコードする。いくつかの実施形態において、その二次産物は、ＲＮＡまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳは、鋳型になり得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ユニークなカウンタータグをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記分子の標的分子の量は、カウンタータグを用いて推定される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ラウンド特異的サブコードをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、指定のラウンドのＡＰＳの存在の決定をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出は、デジタルである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的である。いくつかの実施形態において、検出は、質量分析を含む。いくつかの実施形態において、検出は、核酸配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、ペプチド配列決定を含む。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上の個々のＡＰＳに関連する１つ以上のシグナルの検出を含む。いくつかの実施形態において、そのシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。いくつかの実施形態において、その分離は、第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を第２の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）から分離する。いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、前記ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって連結される。いくつかの実施形態において、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）は、ラウンド特異的なＡＰＳセットのＡＰＳから生成される。いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡは、化学的方法を用いて連結される。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの２つの異なるラウンド特異的セットに関して異なる。いくつかの実施形態は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、そのＡＰＳのラウンド特異的セットをコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源の存在をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークなカウンタータグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークなカウンタータグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークなカウンタータグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークなカウンタータグの数は、特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、直前の分割によって作製された反応体積の各々に、ＡＰＳセットの異なるＡＰＳを投入する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のＵＢＡ、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢ（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）ＣＯＢの集団（そのＣＯＢの集団は、第２の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）ＣＯＢの集団を加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＣＯＢによって第２の複合体が形成され、第１のＣＯＢの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合され、ＣＯＢの集団のＣＯＢは、細胞の集団の細胞に会合している）；および（ｄ）第２の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）アッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の集団（そのＡＰＳは、第２の共通リンカー部分および第３の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）その集団を２つ以上のサンプルに分割する工程；（ｄ）工程（ｃ）の２つ以上のサンプルにＡＰＳの集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＡＰＳによって第２の複合体が形成され、第１のＡＰＳの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合される）；（ｅ）工程（ｃ）の２つ以上のサンプルを１つのサンプルにプールする工程；（ｆ）工程（ｅ）のサンプルを２つ以上のサンプルに分割する工程；（ｇ）工程（ｅ）の２つ以上のサンプルにＡＰＳの集団のＡＰＳを１サンプルあたり１つ加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢ、第１のＡＰＳおよび第２のＡＰＳによって第３の複合体が形成され、第２のＡＰＳの第２の共通リンカー部分は、第１のＡＰＳの第３のリンカー部分に結合され、第１のＡＰＳおよび第２のＡＰＳは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成する）；および（ｃ）第３の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｅ）から（ｇ）を繰り返す工程をさらに包含する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｂ）において複数の複合体を形成することによって複数の標的分子を検出する工程をさらに包含し、その各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで、そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、複数の複合体中の各ＣＯＢは、それと細胞の集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルを有する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記複合体は、配列決定または質量分析によって検出される。いくつかの実施形態において、第３の複合体は、第３の複合体の１つ以上の分子の存在を個別に計数する工程を包含する方法によって検出され、ここで、その第３の複合体の１つ以上の分子の存在は、細胞内の標的分子の濃度を示す。いくつかの実施形態において、個別に検出する工程は、デジタルのシグナルを検出する工程をさらに包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個または１０００個より多い異なる標的分子が、検出される。いくつかの実施形態において、最大２０００個の異なる標的分子が、検出される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体、ペプチド、アプタマー、ペプトイドおよび核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸、ビーズおよび化学サブユニットからなる群より選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、決定論的重量の核酸、小分子または組立可能な複合分子である。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、検出可能な標識が付着させられている相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる一本鎖核酸を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、第１のＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって第１のＥＳＢに付着させられる。いくつかの実施形態において、第２のＡＰＳは、ライゲーションまたは重合を介した伸長によって第１のＡＰＳに付着させられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、共通リンカー部分は、核酸である。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＵＳＢに付着させられる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記第１のＣＯＢは、複数のＡＰＳを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態は、工程（ｂ）において複数の複合体を形成する工程を包含する方法による複数の標的分子の検出をさらに含み、その各複合体は、（ｉ）少なくとも１つの標的分子、（ｉｉ）第１のＵＢＡ、および（ｉｉｉ）前記第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を含み、ここで、前記ＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含み、前記少なくとも１つの標的分子は、前記第１のＵＢＡに会合させられ、前記ＥＳＢは、前記ＵＢＡに会合させられる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、前記複数の複合体内の各ＣＯＢは、それと細胞の前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、化学的方法を用いて行われる。いくつかの実施形態において、その化学的方法は、クリックケミストリーを含む。いくつかの実施形態において、連結は、ＣｕＩの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ＡＢＳ、ＥＳＢまたはＵＢＡの連結は、結合親和性を用いて行われる。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＡＰＳまたはＥＳＢの連結は、連結される２つの構成要素に対する第１および第２の相補的領域を含む連結オリゴヌクレオチドを用いて行われる。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの集団内のＡＰＳ間で共有される。いくつかの実施形態において、第１または第２の相補的領域は、ＡＰＳの異なる集団に関して異なる。いくつかの実施形態は、ライゲーションをさらに含む。いくつかの実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳまたはＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、ＡＰＳの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＥＳＢの起源集団をコードするサブコードを有する。いくつかの実施形態において、個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子は、ユニークタグを含む。いくつかの実施形態において、検出は、ユニークタグの検出を含む。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢと関連しているユニークタグの数が、決定される。いくつかの実施形態において、検出されたユニークタグの数は、その特定のＥＳＢの初期量に関係する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、連結オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳまたはＥＳＢは、増幅プライマー結合領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ポリメラーゼ開始部位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態において、その親和性タグは、Ｈｉｓタグである。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも５個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも１０個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上のサンプルは、少なくとも２０個のサンプルを含む。いくつかの実施形態において、直前の分割によって作製されたサンプルの各々に、異なるＡＰＳを投入する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、２ラウンド以上の分割プール合成が使用される。いくつかの実施形態において、分割プール合成の各ラウンドは、異なるＡＰＳを各容器に加えることを含む。いくつかの実施形態において、所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列を含む。いくつかの実施形態において、最後のラウンドのＡＰＳは、相補的な増幅プライマー領域、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマー配列を含む。いくつかの実施形態において、最後のラウンドのＡＰＳは、正規化配列（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。例えば、図１２は、第２ラウンドからのＡＰＳに付加されたＳｅｑＰ１を有する、２ラウンド分割プール合成からのＡＰＳを図示している。
【００４７】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＳに相補的な１つ以上のスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）が使用される。いくつかの実施形態において、複数個のＡＰＳに対する複数個の結合部位を有する１つのユニバーサルスプリント（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｐｌｉｎｔ）が使用される。いくつかの実施形態において、分割ラウンドの数は、ユニバーサルスプリントの生成後に決定される。いくつかの実施形態において、ユニバーサルスプリントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの結合部位を有する。いくつかの実施形態において、ユニバーサルスプリント上のすべての結合部位が、ＡＰＳに結合される。いくつかの実施形態において、上記結合部位のすべてが使用されるとは限らない。例えば、ユニバーサルスプリントは、４個のＡＰＳだけにしか結合されない１０個の結合部位を有し得る。図１２は、２個のＡＰＳが結合したユニバーサルスプリントを図示している。
【００４８】
いくつかの実施形態において、複数個のユニバーサルスプリントが使用される。いくつかの実施形態において、その複数個のスプリントは、同一である。いくつかの実施形態において、その複数個のスプリントは、同一でない。いくつかの実施形態において、本発明は、細胞の集団中の細胞のＥＳＢに連結された標的分子を細胞起源バーコード（ＣＯＢ）で標識するための方法に関し、その方法は、各細胞を個々の反応体積に分離する工程；および化学的手段または親和性手段を介してＣＯＢをＥＳＢに付加する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その反応体積は、微小気泡、微小滴、ウェル、微小ウェル、マイクロ流体デバイス内の囲われた空間（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）（例えば、マイクロチャネル、マイクロチューブ中の囲われた空間、およびマイクロパターンがつけられた表面上の封じ込め空間（confinement））およびからなる群より選択される。いくつかの実施形
態において、その反応体積は、１０００μｌ、９００μｌ、８００μｌ、７００μｌ、６００μｌ、５００μｌ、４００μｌ、３００μｌ、２００μｌ、１００μｌ、５０μｌ、４０μｌ、３０μｌ、２０μｌ、１０μｌ、５μｌ、４μｌ、３μｌ、２μｌ、１μｌ、９００ｎｌ、８００ｎｌ、７００ｎｌ、６００ｎｌ、５００ｎｌ、４００ｎｌ、３００ｎｌ、２００ｎｌ、１００ｎｌ、５０ｎｌ、４０ｎｌ、３０ｎｌ、２０ｎｌ、１０ｎｌ、９ｎｌ、８ｎｌ、７ｎｌ、６ｎｌ、５ｎｌ、４ｎｌ、３ｎｌ、２ｎｌ、１ｎｌである。いくつかの実施形態において、その反応体積は、１ｎｌ未満である。いくつかの実施形態において、その反応体積は、１ｐｌ未満である。いくつかの実施形態において、その集団中の細胞の総数は、１、５、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００、２０００００、５０００００、１００万、２００万、５００万、１０００万または１０００万より多くである。いくつかの実施形態において、各個々の反応体積は、０または１個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、異なるＥＳＢの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。いくつかの実施形態において、そのＣＯＢは、誤り訂正配列（ｅｒｒｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。いくつかの実施形態において、そのＣＯＢは、誤り訂正配列を有さない。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、細胞が個々の反応体積に分離される前に、標的に連結される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、細胞が個々の反応体積に分離された後に、標的に連結される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞を起源とする種々のタイプの構成要素を解離する工程およびその構成要素を粒子上に配置する工程を包含する方法に関し、ここで、その構成要素は、前記粒子上で標識される。いくつかの実施形態において、その標識は、細胞の起源に従って標識する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その標識は、構成要素のタイプに従って標識する工程を包含する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、検出工程中のシグナルは、順序づけられている。いくつかの実施形態において、検出は、１つ以上のプローブの使用を含む。いくつかの実施形態において、そのプローブは、表面に付着させられている。いくつかの実施形態において、その表面は、アレイを含む。いくつかの実施形態において、その表面は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、検出は、分離を含む。いくつかの実施形態において、その分離は、多次元的である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるような少なくとも１つのＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳを調製するための方法を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳの集団を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるようなＵＢＡ、ＥＳＢおよびＡＰＳの集団ならびにそれを使用するための指示書を備えるキットを提供する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は、（ａ）（ｉ）標的分子を含む細胞の集団、（ｉｉ）前記標的分子に特異的なＵＢＡの集団、（ｉｉｉ）前記ＵＢＡに会合することができるＥＳＢの集団、（ｉｖ）前記ＥＳＢに会合することができるＡＰＳの集団を得る工程；（ｂ）前記ＥＳＢの少なくとも１つと会合した前記ＵＢＡのうちの少なくとも１つを含む標識ＵＢＡの集団を形成する工程；（ｃ）前記ＵＢＡのうちの少なくとも１つを含む未標識ＵＢＡの集団を形成する工程（その未標識ＵＢＡは、工程（ｄ）において検出されない）；（ｄ）前記標識ＵＢＡを前記未標識ＵＢＡと決定した比で混合する工程；（ｅ）標識ＵＢＡと未標識ＵＢＡとの混合物を前記細胞の集団に加える工程（その標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡは、標的分子に結合し得る）、（ｆ）前記ＡＰＳの集団を前記細胞の集団に加える工程（前記ＡＰＳのうちの少なくとも１つは、前記ＥＳＢのうちの少なくとも１つと会合して、少なくとも１つのＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体を形成し、そのＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体は、標的分子のうちの少なくとも１つと会合する）、（ｇ）前記ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体の少なくとも一部を検出する工程；（ｈ）検出されたＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体の数に、ある乗数を乗算することによって、前記標的分子の数え上げた数値を正規化する工程（その乗数は、（ｄ）における前記比によって決定される）を包含する。いくつかの実施形態において、例えば、ＵＢＡだけが１つの標的分子を標的化するとき、ＥＳＢは、省略される。いくつかの実施形態において、乗数は、上記比の逆数である。いくつかの実施形態において、乗数は、標識ＵＢＡの量の逆数の量に、標識ＵＢＡ＋未標識ＵＢＡの量の和を乗算したもの（すなわち（標識ＵＢＡ＋未標識ＵＢＡ）／標識ＵＢＡ）に等しい。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを既知の比で含む混合物をサンプルに加える工程、ｂ）標的に結合した標識ＵＢＡの量を検出することによって、そのサンプル中の標的の量の近似値を生成する工程を包含する方法を提供し、ここで、前記生成工程は、検出された標識ＵＢＡの量に、標識ＵＢＡと未標識ＵＢＡとの比によって決定される係数を乗算することを含む。いくつかの実施形態において、標識ＵＢＡは、ＥＳＢと会合する。いくつかの実施形態において、標識ＵＢＡは、ＡＰＳと会合する。いくつかの実施形態において、標識ＵＢＡは、ＣＯＢと会合する。いくつかの実施形態において、サンプルは、細胞のサンプルである。いくつかの実施形態において、細胞は、分割プール合成に供される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法であって、該方法は、該標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、
ａ）該標的の同一性、および
ｂ）タグが結合している該細胞の同一性
を表すコードを含み、ここで、該複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１００倍よりも多くその相対存在量が変化する、方法。
（項目２）
前記複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１０００倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複数のうちの少なくとも第１の標的対は、１００００倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目１に記載の方法。
（項目４）
少なくとも第３の標的が、前記第１の標的対における両方の標的よりも１０倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目１〜３のうちの一項に記載の方法。
（項目５）
少なくとも第３の標的が、前記第１の標的対における両方の標的よりも１００倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目１〜３のうちの一項に記載の方法。
（項目６）
少なくとも第３の標的が、前記第１の標的対における両方の標的よりも１０００倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目１〜３のうちの一項に記載の方法。
（項目７）
前記複数の標的は、少なくとも５の標的を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記複数の標的は、少なくとも１０の標的を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記複数の標的は、少なくとも２５の標的を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の標的は、少なくとも５０の標的を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記複数の標的は、少なくとも１００の標的を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
同じ標的の同一性および細胞の同一性を有する少なくとも２個の異なるタグをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも２個の異なるタグが、同じプライマーのセットを用いて様々な速度で増幅する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
個々の細胞または標的の分離または単離は、前記検出する工程に不必要である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記コードを検出する工程をさらに包含し、個々の細胞の分離または単離は、該検出する工程に不必要である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記検出する工程が配列決定することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
各標的が、タンパク質または核酸である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
各標的がｍＲＮＡである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記タグが、核酸である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記タグが、ＵＢＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ＵＢＡが、前記標的のうちの１つに特異的である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ＵＢＡが、標識されたＵＢＡと非標識のＵＢＡとの混合物を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＵＢＡが、抗体を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記タグが、ＥＳＢを含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ＥＳＢが、共通リンカー（ＣＬ）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＥＳＢが、該標的の同一性をコードする、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ＥＳＢが、標識ＥＳＢと未標識ＥＳＢとの混合物を含む、項目２６に記載の方法。（項目２８）
前記ＥＳＢが、核酸を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記タグが、ＡＰＳを含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記ＡＰＳが、検出可能に異なるコードユニットを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記結合する工程中に、複数個のＡＰＳが、分割プール合成の連続したラウンドにおいて順序づけられた様式で該タグに付加される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記タグが、少なくとも２個のＡＰＳを含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＡＰＳが、核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記タグが、ライゲーションによって連結された、複数個のＡＰＳ、ＥＳＢおよびＵＢＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記複数個のＡＰＳ、前記ＥＳＢまたは前記ＵＢＡが、クリックケミストリーで連結されることが可能である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ＡＰＳまたは前記ＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
ａ）第１の標的分子、
ｂ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
ｃ）少なくとも2個の異なる連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（
ＥＳＢ）、および
ｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）
を含み、該ＡＰＳの順序は、検出可能である、組成物。
（項目３９）
前記少なくとも２個の異なるＵＢＡが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域を含む、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記少なくとも２個の異なるＵＢＡが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域に連結されている、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
前記少なくとも２個の異なるＵＢＡが、ＥＳＢまたはＣＯＢを様々な効率で補充する１つ以上の結合領域を含む、項目３８に記載の組成物。
（項目４２）
前記少なくとも２個の異なるＵＢＡが、様々な効率で結合パートナーと会合する１つ以上の捕捉領域を含む、項目３８に記載の組成物。
（項目４３）
組成物であって、該組成物は、
ａ）第１の標的分子、
ｂ）該第１の標的分子に特異的な第１のユニーク結合物質（ＵＢＡ）、
第１の連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
ｃ）少なくとも２つの連結可能なＵＢＡ依存性のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）、および
ｄ）複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）
を含み、
ここで、ＡＰＳの順序が検出可能である、組成物。
（項目４４）
前記少なくとも２個の異なるＥＳＢが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域を含む、項目４３に記載の組成物。
（項目４５）
前記少なくとも２個の異なるＥＳＢが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも２個の異なるプライマー結合領域に連結されている、項目４３に記載の組成物。
（項目４６）
前記少なくとも２個の異なるＥＳＢが、ＵＢＡまたはＣＯＢを様々な効率で補充する１つ以上の結合領域を含む、項目４３に記載の組成物。
（項目４７）
前記少なくとも２個の異なるＥＳＢが、様々な効率で結合パートナーと会合する１つ以上の捕捉領域を含む、項目４３に記載の組成物。
（項目４８）
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、項目３８または４３に記載の組成物。
（項目４９）
前記複数の順序づけられたＡＰＳは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のＡＰＳを含む、項目３８または４３に記載の組成物。
（項目５０）
前記ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＡＰＳが、鋳型になり得る、項目３８または４３に記載の組成物。
（項目５１）
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、項目３８または４３に記載の組成物。
（項目５２）
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；および
（ｂ）同じ標的に特異的な少なくとも２個のユニーク結合物質（ＵＢＡ）
を備える、キット。
（項目５４）
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；および
（ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）であって、各々は、ＵＢＡ特異的なエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）と連結されており、少なくとも1個のＵ
ＢＡの２個のサブタイプをさらに含み、ここで、該2個のサブタイプが異なるＥＳＢに連
結されている、標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）
を備える、キット。
（項目５５）
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
（ａ）ｍ個のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）のｎ個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み；ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット；
（ｂ）標的分子特異的な複数のユニーク結合物質（ＵＢＡ）；および
（ｃ）ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）であって、各ＥＳＢは、指定のＵＢＡと連結することが可能であり、同じＵＢＡに特異的である少なくとも１このＥＳＢの少なくとも２個のサブタイプをさらに含む、ＵＢＡ特異的な複数のエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）
を備える、キット。
（項目５６）
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目５７）
ｍが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目５８）
ｎが、１０より大きい、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目５９）
ｍが、２０より大きい、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目６０）
個々のＡＰＳ、ＥＳＢまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目６１）
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
ＡＰＳまたはＥＳＢが、増幅プライマー結合領域を含む、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目６３）
プローブをさらに含む、項目５３〜５５のうちの一項に記載のキット。
（項目６４）
サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）
（ｉ）該標的分子を含む細胞の集団、
（ｉｉ）複数の標的特異的ＵＢＡ混合物であって、少なくとも１つのＵＢＡ混合物は、標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを所定の比で含む、複数の標的特異的ＵＢＡ混合物、
（ｉｉｉ）該ＵＢＡと会合することができる複数のＥＳＢ、および
（ｉｖ）複数のラウンド特異的なＡＰＳセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む、複数のラウンド特異的なＡＰＳセット
を得る工程；
（ｂ）該ＵＢＡの混合物を該細胞の集団と接触させる工程であって、該標識ＵＢＡおよび該未標識ＵＢＡは、該標的分子に結合する、工程；
（ｃ）該複数のＥＳＢを該細胞の集団と接触させる工程；および
（ｄ）ラウンド特異的な該複数のＡＰＳを使用して分割プール合成を行う工程
を包含する、方法。
（項目６５）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＥＳＢと優先的に会合する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＥＳＢと優先的に会合する、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目６４に記載の方法。
（項目６８）
第２の標識ＵＢＡが、第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目６４に記載の方法。
（項目７０）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目６４に記載の方法。
（項目７２）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目６４に記載の方法。
（項目７４）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）
（ｉ）該標的分子を含む細胞の集団、
（ｉｉ）複数の標的特異的ＵＢＡ、
（ｉｉｉ）複数のＥＳＢ混合物であって、各々は、該ＵＢＡ混合物のうちの１つと会合することができ、少なくとも１つのＥＳＢ混合物は、標識ＥＳＢおよび未標識ＥＳＢを所定の比で含む、複数のＥＳＢ混合物、および
（ｉｖ）複数のラウンド特異的なＡＰＳセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のＡＰＳを含む、複数のラウンド特異的なＡＰＳセット
を得る工程；
（ｂ）該ＵＢＡを該細胞の集団と接触させる工程；
（ｃ）該複数のＥＳＢを該細胞の集団と接触させる工程であって、該標識ＥＳＢおよび該未標識ＥＳＢは、該ＵＢＡに結合する、工程；および
（ｄ）該複数のラウンド特異的なＡＰＳを使用して分割プール合成を行う工程
を包含する、方法。
（項目７６）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＵＢＡと優先的に会合する、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＵＢＡと優先的に会合する、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目７５に記載の方法。
（項目８１）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目７５に記載の方法。
（項目８３）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目７５に記載の方法。
（項目８５）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＡＰＳ複合体の少なくとも一部を検出することによって、少なくとも１つの標的特異的シグナルを得る工程をさらに包含する、項目６４または７５のうちの一項に記載の方法。
（項目８７）
前記標的特異的シグナルを乗数で正規化することによって、該標的特異的シグナルと関連している標的分子を定量する工程をさらに包含し、ここで、該乗数は、前記所定の比に基づく、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記検出工程が、配列決定することを含む、項目８６に記載の方法。
（項目８９）
前記乗数が、前記所定の比の逆数である、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
ａ）細胞を含むサンプルを、標識ＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを所定の比で含む混合物と接触させる工程、および
ｂ）細胞に関連する標的に結合した標識ＵＢＡの量を検出し、該検出値を該所定の比に基づく係数で正規化することによって、該標的の量の近似値を生成する工程
を包含する方法であって、ここで、該細胞は、分割プール合成に供される、方法。
（項目９１）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＥＳＢと優先的に会合する、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＥＳＢと優先的に会合する、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目９０に記載の方法。
（項目９４）
第２の標識ＵＢＡが、第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目９０に記載の方法。
（項目９６）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目９０に記載の方法。
（項目９８）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
第１の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第１の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目９０に記載の方法。
（項目１００）
第２の標識ＵＢＡが、同じ標的に対する第２の未標識ＵＢＡよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
ａ）細胞を含むサンプルを、ＵＢＡならびに標識ＥＳＢおよび未標識ＥＳＢを所定の比で含む混合物と接触させる工程、および
ｂ）細胞に関連する標的に結合した標識ＥＳＢの量を検出し、該検出値を該所定の比に基づく係数で正規化することによって、該標的の量の近似値を生成する工程
を包含する方法であって、ここで、該細胞は、分割プール合成に供される、方法。
（項目１０２）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、ＵＢＡと優先的に会合する、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＵＢＡと優先的に会合する、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、ＣＯＢと優先的に会合する、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０７）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に検出される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０９）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に増幅される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
第１の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第１の未標識ＥＳＢよりも、少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目１０１に記載の方法。
（項目１１１）
第２の標識ＥＳＢが、同じ標的に対する第２の未標識ＥＳＢよりも少なくとも１０倍、優先的に枯渇される、項目１１０に記載の方法。
【００５６】
参照による援用
本明細書中で述べられるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が、参照により援用されると明確かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書中に援用される。
【００５７】
本発明の新規特徴は、添付の請求項に特に示される。本発明の特徴および利点のより十分な理解は、本発明の原理が用いられている例証的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られるだろう：
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、各エピトープについての細胞起源の別個のシグネチャ（バーコード）を表している情報の量を表している。
【図２】図２は、本発明のエピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードの構成要素ならびにそれらの組み立ての１つの実施形態の図による表示を示している。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態のＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬を示している。
【図４−１】図４は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による、本発明の１つの実施形態における細胞の標識を表している。
【図４−２】図４は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による、本発明の１つの実施形態における細胞の標識を表している。
【図５】図５は、本発明の１つの実施形態のＥＳＢ−ＣＯＢ試薬を表している。
【図６】図６は、本発明の１つの実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図７】図７は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図８】図８は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図９】図９は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１０−１】図１０は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１０−２】図１０は、本発明の別の実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。
【図１１】図１１は、本発明の１つの実施形態に係るペプチドベースのＥＳＢ−ＣＯＢの読み出しを表している。
【図１２】図１２は、本発明の１つの実施形態に係るＥＳＢ−ＣＯＢの組み立てを表している。Ａ）ＳＣ１（ＡＰＳ１）、ＳＣ２（ＡＰＳ２）およびＳＣ３（ＡＰＳ３）は、１つのユニバーサルスプリントに結合される３つのＡＰＳである。ＳＣ３は、増幅プライマー結合領域ＳｅｑＰ１を含み；Ｂ）ＳＣ１（ＡＰＳ１）およびＳＣ２（ＡＰＳ２）は、１つのユニバーサルスプリントに結合される２個のＡＰＳであり、ここで、一方の相補的領域は、使用されない。ＳＣ２は、増幅プライマー結合領域ＳｅｑＰ１を含む。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
用語「核酸」は、ヌクレオチドポリマーのことを指し、別段限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能し得る（例えば、ハイブリダイズし得る）天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む。
【００６０】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログの重合形のことを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してよく、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖分析から定義される遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ、リボザイム、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）（通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写または増幅によって得られる、ｍＲＮＡのＤＮＡ表現である）；合成的にまたは増幅によって生成されるＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。ヌクレオチド構造に対する改変は、存在する場合、ポリマーの組み立ての前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素による結合体化などによって、重合後にさらに改変され得る。ポリヌクレオチド配列は、提供されるとき、別段述べられない限り、５’から３’の向きで列挙される。
【００６１】
核酸という用語は、二本鎖または三本鎖核酸ならびに一本鎖分子を包含する。二本鎖または三本鎖核酸において、核酸鎖は、同一の広がりを有する必要はない（すなわち、二本鎖核酸は、両鎖の全長にわたって二本鎖である必要はない）。
【００６２】
核酸という用語は、その任意の化学修飾（例えば、メチル化および／またはキャッピングによるもの）も包含する。核酸修飾は、個々の核酸塩基またはその核酸全体にさらなる電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および官能性を組み込む化学基の付加を含み得る。そのような修飾は、塩基の修飾（例えば、２’位の糖の修飾、５位のピリミジンの修飾、８位のプリンの修飾、シトシン環外アミンにおける修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換、骨格修飾、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの通常でない塩基対形成の組み合わせなど）を含み得る。
【００６３】
より詳細には、ある特定の実施形態において、核酸には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである他の任意のタイプの核酸、ならびに非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ｎｅｕｇｅｎｅとして、Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．から商業的に入手可能）ポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー（そのポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対の形成および塩基のスタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含む場合）が含まれ得る。核酸という用語は、米国特許第６，７９４，４９９号、同第６，６７０，４６１号、同第６，２６２，４９０号および同第６，７７０，７４８号（ＬＮＡの開示のために、その全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている連結型核酸（ＬＮＡ）も包含する。
【００６４】
上記核酸は、固相媒介性の化学合成などの完全化学合成プロセス、核酸を産生する任意の種からの単離によるものなどの生物学的供給源、または分子生物学ツールによる核酸の操作を含むプロセス（例えば、ＤＮＡ複製、ＰＣＲ増幅、逆転写またはそれらのプロセスの組み合わせ）から得ることができる。
【００６５】
核酸「プローブ」は、１つ以上のタイプの化学結合によって、一般に、相補的な塩基対形成によって、通常、水素結合形成によって、相補的配列の標的核酸に結合することができ、ゆえに、二重鎖構造を形成することができる、オリゴヌクレオチドである。そのプローブは、「プローブ結合部位」に結合するかまたはハイブリダイズする。そのプローブは、特にいったんそのプローブがその相補的な標的とハイブリダイズしたらプローブの容易な検出を可能にする検出可能な標識で標識され得る。あるいは、しかしながら、そのプローブは、標識されない場合もあるが、直接または間接的に標識されたリガンドとの特異的な結合によって検出可能であり得る。プローブのサイズは、有意に変動し得る。一般に、プローブは、少なくとも７〜１５ヌクレオチド長である。他のプローブは、少なくとも２０、３０または４０ヌクレオチド長である。なおも他のプローブは、それよりもいくらか長く、少なくとも５０、６０、７０、８０または９０ヌクレオチド長である。さらに他のプローブは、なおもそれより長く、少なくとも１００、１５０、２００ヌクレオチド長またはそれより長い。プローブは、上記の任意の値によって境界がなされる任意の範囲内の任意の長さ（例えば、１５〜２０ヌクレオチド長）でもあり得る。
【００６６】
プライマーまたはプローブは、標的核酸配列と完全に相補的であり得るか、または完全には相補的でないことがある。ある特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも７ヌクレオチドの配列にわたって、より代表的には、１０〜３０ヌクレオチドの範囲の配列にわたって、しばしば、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの配列にわたって、標的核酸配列の相補鎖と少なくとも６５％の同一性を有し、より頻繁には、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する。ある特定の塩基（例えば、プライマーの３’塩基）が、標的核酸配列の対応塩基と一般に望ましくは完全に相補的であることが理解されるだろう。プライマーおよびプローブは、代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にアニールする。
【００６７】
親和性に依存する、混合物中に存在する利用可能な結合相互作用は、２つ以上の構成要素の結合特異性に対する特異性を定義する。一般に、第１の相互作用における１つ以上の結合パートナーにとって利用可能である他の利用可能な相互作用の結合親和性と比較して、第１の相互作用に対する高い結合親和性は、高特異性をもたらす。高特異性を有する結合パートナーは、指定された結合パートナーを形成する。
【００６８】
ここで、本発明の特に好ましい実施形態に対して詳細に言及する。好ましい実施形態の例は、下記の実施例の項で例証される。
【００６９】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、その全体が参照により援用される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、生体分子サンプル中の個々の標的分子を検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、その標的分子に関する細胞特異的な情報を保持しつつ、複雑な細胞集団の各細胞内の個々の標的分子を検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、複雑な細胞集団を含むサンプル中の個々の標的分子を単一細胞ベースで検出および定量するための方法、組成物およびキットを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、各細胞について、その細胞に関連する各標的分子の量がアッセイされる。特に、本発明は、個々の標的分子に結合できるユニーク結合物質を提供する。本発明は、標的分子をタグ化するエピトープ特異的バーコードの使用も提供する。本発明は、細胞の起源を示す細胞起源バーコードの使用も提供する。エピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードを介することにより、ユニーク結合物質と標的分子との結合によって、その標的分子が同定される。そのようなユニーク結合物質および／またはエピトープ特異的バーコードおよび／または細胞起源バーコードを作製および使用する方法も提供される。本明細書中に記載される方法および組成物は、診断、予後診断、品質管理およびスクリーニングの適用などの多種多様の適用において使用され得る。本発明のいくつかの実施形態は、細胞を個別にタグ化するための方法、組成物およびキットに関する。
【００７１】
用語「エピトープ」および「標的分子」は、本明細書中に記載される方法によって検出および／または定量される目的の分子（その一部または分子全体）のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。
【００７２】
本発明のある特定の態様は、複数個の標的分子の検出に関する。本明細書中に記載される方法は、複数個の標的分子の検出、定量および感度の分野において潜在的な利益を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、複数個のタンパク質の測定および／または複数個の核酸の測定を研究するための高感度かつ高信頼性の方法および組成物を提供する。
【００７３】
１つのサンプル内で単一細胞レベルで多重化することが、このアプローチの重要な利点である。１つのサンプル内での多重化は、有意に労力を節約し、測定数に比例してサンプルの必要量を減少させ、サンプル取扱工程と測定工程とが別々であることにより悪化する誤差を排除することによって精度を改善する。さらに、複雑な細胞集団内の単一細胞中の複数個の標的分子の測定結果を得ることによって、個々の各細胞内の生理学的プロセスがより十分に理解される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、一度に分析されるプロセシング中に種々のサンプルを一緒にプールすることを可能にする。これにより、処理量の利点が提供され、種々のサンプルの分析が加速し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的分子を分析するためのユニーク結合物質（ＵＢＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化アッセイにおいて使用するためのＵＢＡ集団を提供する。その集団中の各ＵＢＡは、標的分子に特異的である。したがって、ＵＢＡは、細胞において認識される標的分子に対する特異性を提供する。次いで、標的分子とＵＢＡとの結合は、エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）および細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を用いて検出される。各ＥＳＢは、特定の標的分子に会合し得るユニークなコードを含む。各ＣＯＢは、特定の細胞の起源に会合し得るユニークなコードを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、直接または間接的にＵＢＡに付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞内またはサンプル中のＵＢＡに結合する。ユニークＣＯＢは、各ＣＯＢが特定の細胞内のＵＢＡに結合した標的分子と会合させられ得るように、その細胞内のＵＢＡと会合させられる。いくつかの実施形態において、特定のＥＳＢ／ＣＯＢの組み合わせは、標的分子またはエピトープの各々を表す情報の量として言及される（図１を参照のこと）。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、１つ以上のアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）から構成される。本発明のある特定の態様は、デザインされた（例えば、合成配列）ＡＰＳのライブラリーまたは集団の選択に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、デザインされた（例えば、合成の）ＡＰＳの集団を提供し、ここで、前記ＡＰＳは、ユニーク配列および／または検出可能分子を含み、各ＣＯＢにおける１つ以上の異なるＡＰＳの組み合わせは、その各ＣＯＢと前記集団中の他のＣＯＢとを区別する検出可能なシグナルまたは配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が付着させられているユニークな相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするユニーク配列（例えば、合成）を含むＡＰＳを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、配列決定によって検出される。したがって、本発明のある特定の態様は、ユニークＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢの集団を提供し、その各々は、ユニークＡＰＳに基づく組み合わせを含み、ここで、その集団中のＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢの各々は、その集団中の他のＣＯＢまたはＥＳＢ／ＣＯＢと異なる。ＡＰＳは、通常、ＣＯＢを含むコンストラクトを形成することができる。そのような形成を可能にする任意の化学構造が、ＡＰＳのために使用され得る。
【００７７】
ユニーク結合物質（ＵＢＡ）
ＵＢＡは、少なくとも１つの標的分子、少なくとも１つの標的分子代用物またはその両方と結合するようにデザインされた分子または構築部品（ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）であり；適切な条件下において、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、イオン、小分子、有機モノマーおよび薬物が挙げられるが、これらに限定されない。単に便宜のため、本明細書中に記載される実施形態のほとんどが、標的タンパク質または標的ｍＲＮＡに結合するＵＢＡに照らして説明される。しかしながら、これらの実施形態は、他の標的分子にも適用され得る。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「アミノ酸配列」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸または合成アミノ酸によって中断されてもよい。上記の用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素による結合体化などの他の任意の操作によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、天然および／もしくは非天然または合成のアミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含むがこれらに限定されない）のことを指す。
【００７８】
ＵＢＡは、代表的には配列特異的様式、コンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）特異的様式またはその両方での（例えば、抗原−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、少なくとも１つの標的分子、少なくとも１つの標的分子の少なくとも一部、少なくとも１つの標的分子代用物、標的分子代用物の少なくとも一部またはそれらの組み合わせとＵＢＡとの結合または相互作用を可能にする少なくとも１つの反応部分を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、同一性部分または同一性部分の少なくとも一部、例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＵＢＡの単離および／または表面へのＵＢＡの固定化のために使用される。その捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライド、アレイ、微小滴、マイクロ流体デバイス内の囲われた空間または当該分野の他の任意の好適な捕捉領域であり得る。いくつかの実施形態において、捕捉領域は、ＥＳＢであり、例えば、そのＥＳＢは、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））であり得る。捕捉領域は、本発明の組成物の操作を行うことができる反応体積を定義し得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、抗体である。本明細書中で使用されるとき、抗体という用語は、インタクトな抗体分子（例えば、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭであるがこれらに限定されない）だけでなく、少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する、抗体分子の任意の免疫反応性の構成要素も含むように広い意味で使用される。そのような免疫反応性の構成要素としては、ＦＡｂフラグメント、ＦＡｂ’フラグメント、ＦＡｂ’２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、ミニ抗体、ダイアボディ、架橋抗体フラグメント、ＡｆｆｉｂｏｄｙＴＭ、シクロチド、分子などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体操作またはタンパク質操作の手法を用いて得られる免疫反応性の産物もまた、明確に抗体という用語の意味の範囲内である。関連するプロトコルを含む、抗体および／またはタンパク質操作の詳細な説明は、とりわけ、Ｊ．Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９  ７６（２０００）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；米国特許第５，８３１，０１２号；およびＳ．Ｐａｕｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に見られる。
【００８１】
当業者は、抗体が、種々の供給源（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、組換え的に発現された抗体、ヒト化抗体、植物抗体などを含むがこれらに限定されない）から得ることができること；および種々の動物種（ウサギ、マウス、ヤギ、ラット、ヒト、ウマ、ウシ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、ロバ、ヒトなどを含む）から得ることができること認識するだろう。多種多様の抗体が商業的に入手可能であり、特注の抗体をいくつかの契約研究所から得ることができる。関連するプロトコルを含む、抗体の詳細な説明は、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎらｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年、２００３年８月までの改訂を含む）；Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ；Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｇ．Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂｅｔｈｅｌ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）；Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １  ａｎｄ
２，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ
ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．（１９９６）；Ｈ．Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２０００）；およびＳ．Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）に見られる。さらに、莫大な数の商業的に入手可能な抗体（標識されたかまたは標識されていない；ポリクローナル、モノクローナルおよび単一特異的抗体、ならびにそれらの免疫反応性の構成要素を含む）；カスタム抗体供給業者などは、とりわけ、ワールドワイドウェブ上のｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅａｒｃｈページ、ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐａｇｅおよびｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍにおけるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒページに見られる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、核酸、例えば、リンカーオリゴまたは核酸ＥＳＢに付着させられる。核酸を抗体に付着する方法は、当該分野で公知である。核酸を抗体に付着する任意の好適な方法が、本発明の方法に含まれる。本明細書中に記載される抗体は、Ｇｕｌｌｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ  １０１（２２）：２２８４２０−８４２４頁（２００４）；およびＢｏｏｚｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６（２３）：６９６７−６９７２頁（２００４）（両方が、本明細書中で参照により援用される）に記載されている方法によって、核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、ランダムなアミン付着によって核酸に付着させられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、１０対１の比の核酸と抗体とを使用するランダムなアミン付着によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中で参照により援用されるＫｏｚｌｏｖら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５：７３（５）：６２１−６３０頁（２００４）に記載されている方法によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、ヒドラジン化学によって核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中で参照により援用されるＮｏｌａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，１１−１２（２００５）に記載されているようにタドポール（ｔａｄｐｏｌｅ）を用いて核酸に付着させられ得る。本明細書中に記載される抗体は、本明細書中に記載される抗体を含む操作された抗体を作製する当該分野で公知の任意の好適な方法によって核酸に付着させられ得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、アプタマーである。アプタマーには、核酸アプタマー（すなわち、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子）およびペプチドアプタマーが含まれる。アプタマーは、高度に特異的なコンフォメーション依存的様式で、代表的には、非常に高い親和性で、標的分子に結合するが、それより低い結合親和性を有するアプタマーも所望であれば選択され得る。アプタマーは、非常に小さい構造的差異（例えば、メチル基またはヒドロキシル基の有無）に基づいて標的を区別すると示されており、ある特定のアプタマーは、Ｄ−エナンチオマーとＬ−エナンチオマーを区別し得る。小さな分子標的（薬物、金属イオンおよび有機色素を含む）、ペプチド、ビオチンおよびタンパク質（ストレプトアビジン、ＶＥＧＦおよびウイルスタンパク質を含むがこれらに限定されない）に結合するアプタマーが得られている。アプタマーは、ビオチン化後、フルオレセイン標識後、ならびにガラス表面およびミクロスフェアに付着させられたときに、機能活性を保持すると示されている。
【００８４】
シュピーゲルマー（ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒ）を含む核酸アプタマーは、試験管内進化法（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＥＬＥＸ）として公知のインビトロ選択プロセスによって同定される。このＳＥＬＥＸプロセスでは、オリゴヌクレオチドの非常に大きなコンビナトリアルライブラリー、例えば、６０〜１００ヌクレオチド長の大きさであることが多い１０１４〜１０１５個の個々の配列が、インビトロ選択および増幅の反復プロセスによって慣例的にスクリーニングされる。ほとんどの標的が、８〜１５サイクル以内に親和性濃縮され、そのプロセスは、自動化されており、より迅速なアプタマー単離が可能になっている。ペプチドアプタマーは、代表的には、当該分野で公知のいくつかの異なるタンパク質操作手法（ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、選択的感染ファージ技術（ＳＩＰ）などを含むがこれらに限定されない）によって同定される。当業者は、核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーが、従来の手順に従って、かつ過度の実験を行うことなく、得ることができることを理解するだろう。関連するプロトコルを含む、アプタマーの詳細な説明は、とりわけ、Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２３）：１３５８１  ８４（１９９５）；Ｓ．Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０（１９９９）；Ｖ．Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１０）：９５５−６０（１９９８）；Ｄ．Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６１１−４７（１９９９）；Ｌ．Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，３１：１７９−８４（２００２）；Ｓ  Ｓ．Ｓｐａｄａら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７８：４４５−５６（１９９７）；Ｂ．Ｗｌｏｔｚｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：８８９８−８９０２（２００２）に見られる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、アプタマーは、リンカーオリゴまたは核酸ＥＳＢなどの核酸にライゲートされるかまたはハイブリダイズされる。アプタマーのハイブリダイゼーションまたはライゲーションは、当該分野で公知の任意の好適な方法によって行われ得る。例えば、ライゲーションは、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼまたは少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼであるがこれらに限定されない）によって酵素的に行われ得る。ライゲーションは、活性化剤および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線）を用いる化学的ライゲーションによっても行われ得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ペプトイドである。ペプトイドは、タンパク質に結合するＮ−置換グリシン合成ペプチドの短い配列である。いくつかの実施形態において、小さいサイズのペプトイドは、拡散および本明細書中に記載される方法の動態を改善する。ペプトイドを作製する当該分野で公知の任意の好適な方法は、本明細書中に記載される方法に包含される。Ｓｉｍｏｎら、ＰＮＡＳ  １５；８９（２０）：９３６７−９３７１（１９９２）（本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、核酸配列、例えば、標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡである。その核酸配列は、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的特異的配列は、約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００または５０〜１００ヌクレオチド長である。他の実施形態において、標的特異的配列は、約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０または６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０または５０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００８８】
複数のＵＢＡが、単一の標的に対して使用され得る。その複数のもののメンバーは、標的および／または組み立てられるエレメントの残りの部分、例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、スプリントもしくはＣＬに対して異なる親和性を有し得る。その複数のものの１つ以上のメンバーは、標識、またはそれらの構造の残りの部分（例えば、結合領域、例えば、ＥＳＢと結合相互作用を確立する領域）の組み立てに必要な構成要素を欠き得る。場合によっては、その複数のものの１つ以上のメンバーは、標的に会合する組み立て品の少なくとも一部の増幅に必要なプライマー結合領域またはプライマー配列などの構成要素を欠き得る。
【００８９】
ＵＢＡは、本明細書中の他の箇所に核酸についてさらに詳細に記載されているような１つ以上の特徴を有し得る。例えば、ＵＢＡは、１つ以上のプライマー結合領域、バーコード、複数ラウンドの分割プール合成のうちのＡＰＳ組み立て用のラウンド特異的コード、計数を可能にするバーコード、サンプルから分子の少なくとも一部を枯渇させるための捕捉領域および／または親和性結合領域を有し得る。捕捉領域は、サンプルから存在量の多い標的を枯渇させるために標的化され得る。
【００９０】
エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）
いくつかの実施形態において、本発明は、エピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）を提供する。各ＥＳＢは、特定の標的分子と会合し得るユニークなコードを含む。ＥＳＢは、少なくとも１つのＵＢＡまたはＵＢＡの一部と結合するようにデザインされた分子または構築部品であり；適切な条件下において、ＥＳＢ、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。
【００９１】
ＥＳＢは、代表的には配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方での（例えば、ＵＢＡ−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、ＥＳＢと少なくとも１つのＵＢＡとの結合または相互作用を可能にする少なくとも１つの同一性同定部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、直接または間接的にＵＢＡに付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞またはサンプル中のＵＢＡに結合する。
【００９２】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、固体表面または捕捉領域であり、例えば、ＥＳＢは、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、その捕捉領域に直接または間接的に付着させられる。
【００９３】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分、例えば、リンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、共通リンカーオリゴは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成するアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）における共通リンカーオリゴと相補的である。
【００９４】
ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＥＳＢの単離および／または表面へのＥＳＢの固定化のために使用される。捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライドまたはアレイであり得る。いくつかの実施形態において、捕捉領域は、検出可能なビーズ（例えば、ユニークなスペクトルシグネチャを有するビーズ（例えば、赤色および赤外フルオロフォアで内部的に染色されたビーズ））である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、上に記載されたような抗体もしくはそのフラグメント、アプタマー、核酸またはペプトイドである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸である。いくつかの実施形態において、その核酸の一部は、例えば、当該分野で公知のとおりのＰＣＲ、分枝鎖またはローリングサークルアプローチを用いた適切な方法によって増幅される。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ペプトイドである。ペプトイドは、タンパク質に結合するＮ−置換グリシン合成ペプチドの短い配列である。いくつかの実施形態において、小さいサイズのペプトイドは、拡散および本明細書中に記載される方法の動態を改善する。ペプトイドを作製する当該分野で公知の任意の好適な方法は、本明細書中に記載される方法に包含される。Ｓｉｍｏｎら、ＰＮＡＳ  １５；８９（２０）：９３６７−９３７１（１９９２）（本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、核酸配列、例えば、相補的な標的核酸配列に対するアンチセンス核酸である。その核酸配列は、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的特異的配列は、約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００または５０〜１００ヌクレオチド長である。他の実施形態において、標的特異的配列は、約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０または６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０または５０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００９９】
複数のＥＳＢが、単一の標的に対して使用され得る。その複数のもののメンバーは、標的および／または組み立てられるエレメントの残りの部分、例えば、ＣＯＢ、スプリントもしくはＣＬに対して異なる親和性を有し得る。その複数のものの１つ以上のメンバーは、標識、またはそれらの構造の残りの部分（例えば、結合領域、例えば、ＵＢＡ、ＡＰＳ、ＣＬ、スプリントおよび／またはＣＯＢと結合相互作用を確立する領域）の組み立てに必要な構成要素を欠き得る。場合によっては、その複数のものの１つ以上のメンバーは、標的に会合する組み立て品の少なくとも一部の増幅に必要なプライマー結合領域またはプライマー配列などの構成要素を欠き得る。
【０１００】
ＥＳＢは、本明細書中の他の箇所に核酸についてさらに詳細に記載されているような１つ以上の特徴を有し得る。例えば、ＥＳＢは、１つ以上のプライマー結合領域、バーコード、複数ラウンドの分割プール合成のうちのＡＰＳ組み立て用のラウンド特異的コード、計数を可能にするバーコード、サンプルから分子の少なくとも一部を枯渇させるための捕捉領域および／または親和性結合領域を有し得る。捕捉領域は、サンプルから存在量の多い標的を枯渇させるために標的化され得る。
【０１０１】
細胞起源バーコード（ＣＯＢ）
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を提供する。各ＣＯＢは、特定の細胞の起源に会合し得るユニークなコードを提供する。いくつかの実施形態において、ＥＳＢに会合する共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）にＣＯＢを結合する際、ＣＯＢコードは、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体が結合する標的分子の細胞起源を同定する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＣＯＢは、２つの主要な部分：（ｉ）ＵＢＡ／ＥＳＢプローブに会合する共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）に特異的な配列；および（ｉｉ）特定の細胞起源に会合し得るユニークなコードを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、モジュラー構造である。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、複数の異なるアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、ある特定の基本的エレメント：（ｉ）骨格を形成する直鎖状の組み合わせで付着させられた、標識付着領域を含む複数のＡＰＳ、および（ｉｉ）その骨格の標識付着領域に相補的であり、かつそれに付着させられた、標識を含む相補的なポリヌクレオチド配列を含む分子実体である。標識付着領域という用語は、検出可能分子に対する個別の付着点として働き得る所与の骨格内の規定のポリヌクレオチド配列の領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数の異なるＡＰＳを含み、そのＡＰＳは、決定論的重量の小分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くのユニークＡＰＳを含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、直鎖状の組み合わせで付着させられた４個またはそれより多くのＡＰＳを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳは、ユニークにデザインされた核酸配列を含み得る。さらに、ＣＯＢ内の直鎖状の組み合わせで付着させられた複数のＡＰＳは、少なくとも１つの鋳型を含み得る；例えば、少なくとも１つの核酸配列、例えば、直鎖状のもしくは直鎖化可能なウイルスゲノムの少なくとも一部、例えば、アデノウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルスなどのゲノム、またはバクテリオファージ、例えば、ラムダ、Ｍ１３、φＸ−１７４、Ｔシリーズバクテリオファージなど、例えば、クローニングカセット、ポリリンカーなどを含むその誘導体、クローニングカセット、ポリリンカーなどを含むその誘導体を含むプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣシリーズプラスミドなど）；合成鋳型；人工配列を含む鋳型などであるがこれらに限定されない。当業者は、核酸の実質的に任意のピースが、少なくとも２個のＡＰＳを含むのに十分大きいか、または組み合わされた配列が少なくとも２個のＡＰＳを含むのに十分大きくなるように少なくとも１つの他の核酸配列と組み合わされ得るならば、その断片がＣＯＢを作製するための鋳型として働き得ることを理解するだろう。いくつかの実施形態において、本発明のＥＳＢ、ＡＰＳまたはＣＯＢは、鋳型になり得る基本ブロックに関する。いくつかの実施形態において、本発明のＵＢＡは、鋳型になり得る分子に関する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、共通リンカー部分（例えば、共通リンカーオリゴ）を含む１つ以上のＡＰＳも含む。その共通リンカー部分は、ＡＰＳに直接または間接的に付着させられ得る。したがって、その共通リンカー部分は、ＣＯＢに共有結合的に付着させられ得るか、またはその共通リンカー部分は、後でアッセイにおいてＣＯＢに結合され得る。共通リンカー部分という用語は、約１０〜約２５ヌクレオチドの直列反復配列を含む。共通リンカー部分は、ＣＯＢの５’領域または３’領域において付着させられ得、イメージングまたは検出のためのＣＯＢの捕捉および固定化（例えば、共通リンカー部分と相補的な配列を固体基材に付着することによる）のために使用され得る。
【０１０５】
ＣＯＢのエレメントは、単一の分子実体（単独のＣＯＢ）または２つの異なる分子実体（二重のＣＯＢ）として見られ得る。各分子実体は、１つの分子、または共有結合性もしくは非共有結合性手段によって互いに付着させられた２つ以上の分子から構成され得る。いくつかの実施形態において、二重のＣＯＢの各構成要素は、同じ標的分子上の異なる部位に結合する標的分子特異的ＵＢＡ／ＥＳＢを有する。二重のＣＯＢシステムを使用するとき、一方のＣＯＢは、標識されないことがある。いくつかの実施形態において、標識されないＣＯＢは、捕捉領域を含み得る。
【０１０６】
本発明の様々な実施形態において、ＣＯＢは、個々のＡＰＳ基本ブロックから組み立てられる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、直鎖状に組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＰＳから組み立てられたＣＯＢは、そのＡＰＳの順序を維持する。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、分枝構造を含む。いくつかの実施形態において、分枝ＣＯＢ構造は、ＡＰＳ付加の順序に関する情報を含む。様々な実施形態において、ＣＯＢを形成している個々のＡＰＳが、解読され得る。いくつかの実施形態において、ＣＯＢを形成しているＡＰＳの順序または付加の順序が、解読され得る。理論に拘束されるものではないが、ＡＰＳ付加順序の保護および解読を可能にするプラットフォームは、同数のＡＰＳ基本ブロックからより多数の異なるＣＯＢが作製されるのに役立つ。ＣＯＢ分子タイプの総数が多いほど、ある集団内の２つの細胞／粒子が同じＣＯＢで標識される可能性は低下する。したがって、本発明の様々な実施形態の方法は、細胞／粒子の同一性を決定するためのより高い統計的有意性を可能にする。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳに付着させられた相補的なポリヌクレオチド配列は、ＡＰＳに検出可能分子を付着するかまたはモノマーを標識するように働く。その相補的なポリヌクレオチド配列は、例えば、相補的なポリヌクレオチド配列への１つ以上の検出可能分子の共有結合性の組み込みによって、直接標識され得る。あるいは、相補的なポリヌクレオチド配列は、相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチンまたは特異的なリガンド相互作用が可能な他の分子の組み込みなどによって、間接的に標識され得る。そのような場合、リガンド（例えば、相補的なポリヌクレオチド配列へのビオチンの組み込みの場合、ストレプトアビジン）が、検出可能分子に共有結合的に付着させられ得る。ＡＰＳに付着させられた検出可能分子が、相補的なポリヌクレオチド配列に直接組み込まれない場合、この配列は、検出可能分子とＡＰＳとの間の架橋として働き、架橋分子、例えば、架橋核酸と呼ばれることがある。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸ベースのＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体は、ＣＯＢの定常領域（例えば、共通リンカー部分、捕捉領域または親和性タグ）と相補的なオリゴヌクレオチドなどの核酸を用いて親和性精製され得るかまたは固定化され得る核酸を含む。上で述べたように、いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、精製および／または固定化（例えば、固体表面への）のための親和性タグとして働き得る少なくとも１つの共通リンカー部分を含む。その共通リンカー部分は、一連の１５塩基反復などの反復ヌクレオチドの２つ以上の直列反復領域を含み得る。そのような例示的な実施形態において、ＣＯＢは、ＥＳＢ、ＥＳＢ／ＵＢＡ、標的分子／ＵＢＡ／ＥＳＢまたはその他のものと複合体化されているかに関係なく、繰り返しユニットの逆相補鎖である１５塩基オリゴヌクレオチドでコーティングされた親和性試薬によって精製または固定化され得る。
【０１０９】
ＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体は、２つ以上の親和性選択工程において精製され得る。例えば、ＣＯＢがＥＳＢ／ＵＢＡ複合体に付着させられる実施形態では、ＣＯＢは、親和性タグを含み得る。他の実施形態において、二重のＣＯＢが使用されるとき、一方のＣＯＢは、第１の親和性タグを含み得、他方のＣＯＢは、第２の（異なる）親和性タグを含み得る。それらのＣＯＢは、標的分子と混合され、二重のＣＯＢの２つのプローブを含む複合体は、一方または両方の個々の親和性タグに対する親和性精製によって未結合物質と分離される。
【０１１０】
第１の工程において、その混合物は、第１の親和性タグに対する親和性試薬と結合され得、第１の親和性タグおよび所望の複合体を含むプローブだけが精製される。結合した物質は、第１の親和性試薬から放出され、必要に応じて、第２の親和性タグに対する親和性試薬に結合されて、第１の親和性タグを含むＣＯＢから複合体が分離される。この時点では、完全な複合体だけが結合している。その複合体が、最後に、第２の親和性タグに対する親和性試薬から放出され、次いで、本明細書中に記載される方法によって分析される。その親和性試薬は、親和性タグに対する結合パートナーでコーティングされた任意の固体表面（例えば、結合パートナーでコーティングされたカラム、ビーズ（例えば、ラテックスまたは磁気ビーズ）またはスライド）であり得る。当該分野で公知の種々の親和性タグが、例えば、ＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体を精製および／または固定化するために、使用され得る。いくつかの実施形態において、ビオチンアンカーが、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはＵＢＡに付着させられることにより、ストレプトアビジン表面（例えば、コーティングされたスライドまたはビーズ）上へのＣＯＢ、ＣＯＢ−ＥＳＢ複合体またはＣＯＢ／ＥＳＢ／ＵＢＡ複合体の固定化が可能になる。いくつかの実施形態において、親和性タグは、例えば、ＵＢＡを精製および／または固定化するために、ＵＢＡに付着させられる。親和性タグは、精製を含むがこれに限定されない種々の有用な適用のためにビーズまたは他のマトリックスに付着するために使用され得る。親和性タグならびにそれらを作製するおよび／または核酸に付着する方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号；米国出願番号１０／５４２，４５８；１２／３２４，３５７；１１／６４５，２７０および１２／５４１，１３１（それらの全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＵＢＡ、ＡＰＳおよびＣＯＢのうちの少なくとも２つが、本明細書中に記載される異なる化学組成物または当該分野で公知の他の任意の好適な組成物を含む。例えば、ＥＳＢは、ペプチドおよび／または核酸を含み得、ＡＰＳは、ペプチドまたはペプトイドを含む。記載された化学の任意の組み合わせが、本発明の範囲内で構想される。
【０１１１】
様々な実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、鋳型であり得、順序づけられ得、およびまたは解読され得る。いくつかの実施形態において、コンストラクト中の任意のこれらのサブユニットの順序が、検出され得る。ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、例えば、核酸または当該分野で公知の他の任意の好適な化学的相補性を介して、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢのうちの別のいずれか１つを付加するための鋳型を提供し得る。ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢは、別の核酸またはペプチドをコードする核酸などの二次産物をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび／またはＣＯＢの検出は、それを解読する工程、例えば、アンプリコンを生成する工程、またはＥＳＢ、ＡＰＳおよび／もしくはＣＯＢからペプチドを発現させる工程、ならびにその生成物を配列決定するかまたは別途検出する工程を包含する。
【０１１２】
所与の細胞のＣＯＢの様々なＡＰＳと会合する標識モノマーによって提供される配列、重量またはシグナルは、ＣＯＢのユニークな同定を可能にする。例えば、核酸配列を使用するとき、ユニーク同一性またはユニーク配列シグネチャを有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと会合させられる。ＣＯＢ配列の検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。別の例において、蛍光標識を使用するとき、ユニーク同一性またはユニークスペクトルシグネチャを有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと会合させられる。蛍光標識されたＣＯＢのスペクトルコードなどのＣＯＢシグナルの検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。なおも別の例において、コンビナトリアル合成法に従って小分子を使用するとき、ユニークな決定論的重量を有するＣＯＢは、特定の標的分子またはその一部を認識するＵＢＡと会合させられる。ＣＯＢの決定論的重量の検出（例えば、質量分析を介して）は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性的分析）。所与のシグネチャ（例えば、スペクトルコード、ユニーク配列またはユニーク決定論的重量）に関連するコード（例えば、配列、標識モノマーまたは決定論的重量）を計数およびまたは定量することによって、ＣＯＢに結合されたＵＢＡに会合している混合物中のすべての分子の計数または定量が可能になる（定量的分析）。したがって、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、公知の生物学的マーカーの定量的分析による種々の生物学的状態（例えば、疾患対健常）の診断または予後診断にとって有用である。
【０１１３】
さらに、本発明のＣＯＢによって提供される単一分子の検出および定量の鋭敏な感度は、新しい診断および予後診断マーカー（種々の生物学的状態の間の変動が従来の分子方法を用いて特定の生物学的状態との相関を検出するには少なすぎるマーカーを含む）の同定を可能にする。ＣＯＢに基づく分子検出の感度は、少量の生物学的サンプル中の治療用および診断用薬剤の詳細な薬物動態分析を可能にする。
【０１１４】
ＣＯＢの合成は、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法によって行われ得る。
【０１１５】
様々な実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）の段階的付加によって合成されるＣＯＢに関する。ＣＯＢは、共通リンカー（ＣＬ）を介してＵＢＡに付着させられ得る。ＣＬは、オリゴヌクレオチドの一部でもあり得る。いくつかの実施形態において、エピトープ特異的バーコードも、オリゴヌクレオチドとして提供される。場合によっては、そのエピトープ特異的バーコードは、共通リンカーを含むオリゴヌクレオチドに含められ得る。いくつかの実施形態において、ＣＬ、ＥＳＢおよびＡＰＳはすべて、オリゴヌクレオチド配列を含む。したがって、オリゴヌクレオチドＣＬは、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＡＰＳにライゲートされ得る。実質的に相補的または厳密に相補的なアニーリング領域が、ハイブリダイゼーションに使用され得る。アニーリング領域は、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＡＰＳの両端に提供され得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、分割プール合成または当該分野で公知の他の任意の好適な段階的合成の様々な工程において付加される。段階的合成の各工程に特異的なアニーリング領域が、上記オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。理論に拘束されるものではないが、オリゴヌクレオチドの付加が工程中にスキップされる場合、次のオリゴヌクレオチドの工程特異的アニーリング領域は、利用可能な以前のオリゴヌクレオチドの工程特異的アニーリング領域に効率的にハイブリダイズしない。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上のＡＰＳを欠損しているＣＯＢの合成を止める方法を提供する。
【０１１６】
ＣＯＢおよび／またはＣＬは、本明細書中の他の箇所に核酸についてさらに詳細に記載されているような１つ以上の特徴を有し得る。例えば、ＣＯＢは、１つ以上のプライマー結合領域、バーコード、複数ラウンドの分割プール合成のうちのＡＰＳ組み立て用のラウンド特異的コード、計数を可能にするバーコード、サンプルから分子の少なくとも一部を枯渇させるための捕捉領域および／または親和性結合領域を有し得る。
【０１１７】
ＡＰＳは、相補鎖上のスプリントを使用して、互いに連結され得る。場合によっては、複数個のスプリントが、交互の鎖において使用される。それらのスプリントは、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢに共有結合的に連結され得る。場合によっては、スプリントは、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢにハイブリダイズし得る。スプリントは、本明細書中の他の箇所に核酸についてさらに詳細に記載されているような１つ以上の特徴を有し得る。例えば、スプリントは、１つ以上のプライマー結合領域、バーコード、複数ラウンドの分割プール合成のうちのＡＰＳ組み立て用のラウンド特異的コード、計数を可能にするバーコード、サンプルから分子の少なくとも一部を枯渇させるための捕捉領域および／または親和性結合領域を有し得る。スプリントは、組み立て構成要素の一部（例えば、ＵＢＡ、ＥＳＢまたはＣＬ）として提供され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、異なるＣＬオリゴヌクレオチド（その各々が、ＵＢＡに特異的なユニークＥＳＢ配列および共通のアニーリング領域を有する）で標識される。多くの場合、ＡＰＳは、分割プール合成のラウンドにおいて、ＣＯＢに組み立てられる。これらの場合、各ラウンドにおいて、サンプルがｎ個の異なる容器に分割される。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳが、各容器に加えられ得る（合計ｍ個の異なるＡＰＳ）。いくつかの実施形態において、ｎおよびｍは、同じである。他の実施形態において、ｎは、ｍより大きいか、またはｍは、ｎより大きい。各ＡＰＳは、それより前のラウンドにおいて付加されたアニーリング領域と選択的にハイブリダイズするようにデザインされ得る（図６）。様々な実施形態において、ラウンド特異的アニーリング領域の対が、各ＡＰＳに組み込まれる。そのアニーリング領域は、ＡＰＳの各端に組み込まれ得る。ＡＰＳの各端に組み込まれるアニーリング領域は、異なり得る。したがって、付加されるＡＰＳのアニーリング領域は、以前のラウンドの利用可能なアニーリング領域に相補的であり得、それにより組み立てが促される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ＡＰＳは、アニーリングプライマーを用いて互いにおよび／またはＣＬにステッチされる（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）（図７および８）。そのアニーリングプライマーは、ＣＬまたは段階的合成の前のラウンドに付加されたＡＰＳに対する第１の相補的領域を含み得る。そのアニーリングプライマーは、このラウンドに付加されるＡＰＳに対する第２の相補的領域も含み得る。したがって、そのアニーリングプライマーは、その後のラウンドの２つのオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし、それらを互いにステッチし得る。いくつかの実施形態において、各ラウンドのアニーリングプライマーの第１の相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第１の相補的領域と異なる（図７）。いくつかの実施形態において、各ラウンドのアニーリングプライマーの第２の相補的領域は、他のラウンドのアニーリングプライマーの第２の相補的領域と異なる。いくつかの実施形態において、異なるラウンドのアニーリングプライマーの第１または第２の相補的領域は、ラウンドの間で共有される（図８）。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＣＬオリゴヌクレオチドは、ループアニーリング領域の対を含む（図９および１０）。したがって、ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされ得、各端においてループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのループアニーリング領域は、そのラウンドに特異的であり得る。ハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ得る。それらのＡＰＳは、本明細書中に記載される任意の方法または当該分野で公知の他の通常の方法を用いて互いに連結され得る。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされ得る。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＣＯＢが、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）合成され得る。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０１２１】
所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列を含み得る（図６〜１１）。そのサブコードは、ユニークヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２２】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、検出されたＣＯＢのその後の正規化を可能にするランダムなタグ領域をさらに含み得る（図６〜１１）。そのようなランダムなタグ領域内のバーコードは、下流の事象（代表的には、標的分子に対する組み立て品の少なくとも一部を増幅することを含む）の前に出発分子の数を数え上げるために使用され得る。そのようなランダムなタグ領域を利用する好適な方法の変法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｃａｓｂｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３９：１２，ｅ８１）を参照のこと。場合によっては、そのランダムなタグ領域は、各配列バリアントに会合する鋳型分子の数を推定する分子カウンターとして機能し得る。場合によっては、分子カウンターは、増幅反応、例えば、ＰＣＲの前に、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢに組み込まれる。縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含む分子カウンターのライブラリーが、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢに組み込まれ得る。ライブラリー内のユニークＤＢＲの数は、通常、ＤＢＲの長さおよび塩基組成によって限定される。例えば、ＤＢＲ内の単一のヌクレオチドは、４つの可能性のある異なるカウンター（各塩基につき１つ）を可能にし得る。ＤＢＲが長くなるほど、ユニークなカウンター配列の数が多くなり得る。配列のライブラリー由来の分子カウンターは各々、ＣＬ、ＥＳＢ、ＡＰＳまたは組み立てられたＣＯＢにおいて組み込まれ得る。その分子カウンターは、配列バリアントが、単一の鋳型分子に会合するのかあるいは複数個の鋳型分子に会合するのかを決定するために使用され得る。１つの配列バリアントに会合する異なるＤＢＲ配列の数は、最初の鋳型分子の数の直接的な尺度として働き得る。この情報は、各配列バリアントのリード数（例えば、増幅反応、例えば、ＰＣＲの後のリード数を含む）によって提供される情報を補い得るかまたは置き換え得る。ＤＢＲは、配列バリアントが、増幅反応中のポリメラーゼエラーに由来するかまたは増幅反応、例えば、ＰＣＲの前の真の起源バリアントである確率を決定するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、ユニーク結合物質（ＵＢＡ）は、ＣＯＢの組み立ての前またはそれと同時にそれらの標的に固定される。
【０１２３】
図１２は、標的特異的および／または細胞特異的な組み立て品のさらなる例示的な特徴を示している。ある場合においては、各々が１つ以上のＡＰＳに対する相補的領域を有する２個以上のスプリントが使用される一方で、いくつかの実施形態は、複数個のＡＰＳに対する複数個の結合部位を有する単一のユニバーサルスプリントを使用する。それらのスプリントは、代表的には、ＡＰＳに結合するようにデザインされた、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く結合部位を有し得る。スプリントは、１つ以上のプライマー伸長反応、例えば、増幅反応または配列決定反応のためのプライマー結合領域も有し得る。これらのプライマー結合領域の一部または全部が、例えば、様々な数の増幅反応に核酸を補充するために、異なる組み立てにおいて使用され得、代表的には、それらの存在量が正規化される。場合によっては、差次的に増幅された配列の定量は、例えば、数え上げるためのランダムタグ領域を使用することによって、なおも行うことができる（この方法の詳細は、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されている）。いくつかの実施形態において、あるスプリントのＡＰＳ結合部位のすべてが、ＡＰＳによって標的化される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ結合部位のすべてが、使用されるとは限らない。例えば、あるスプリントは、１０個のＡＰＳ結合部位を有し得るが、４個のＡＰＳだけとしか会合されないことがある。図１２は、２個のＡＰＳが結合されているユニバーサルスプリントを図示している。
【０１２４】
１つ以上のスプリントは、１つ以上のプローブを使用することによって、標的および／またはＵＢＡに連結され得る。１つ以上のプローブ、標的および／またはＵＢＡは、核酸構成要素を有し得る。プライマー結合領域は、核酸について他の箇所にさらに詳細に記載されている任意の特徴の下流または上流に位置し得、増幅および配列決定を含むプライマー伸長反応において、本明細書中に記載される組み立て品の部分を排除するためまたは含めるために標的化され得る。このようにインターカレートされたプライマー結合領域は、互いにステッチされ得る重複する配列決定リードを開始するために使用され得る。
【０１２５】
例えば、図１２ＡおよびＢは、３個のＡＰＳ結合部位を有するスプリントにおける例示的な組み立て品を図示している。図１２Ａにおいて、３個のＡＰＳは、スプリント上に組み立てられているが、図１２Ｂでは、２個のＡＰＳだけが組み立てられており、第３のＡＰＳに対する結合領域は、未使用のままである。任意のＡＰＳ、例えば、図１２Ａにおける第３のＡＰＳおよび図１２Ｂにおける第２のＡＰＳが、プライマー配列またはプライマー結合領域に寄与し得る。１つ以上のプローブもまた、プライマー配列またはプライマー結合領域に寄与し得る。例えば、図１２は、増幅、組み立ておよび／または配列決定を可能にするプライマーに対する標的であるプローブ２を図示している。プライマー部位は、ＡＰＳ３（図１２Ａ）またはＡＰＳ２（図１２Ｂ）からそのような伸長産物にコピーされ得、好適なプライマーを用いて伸長産物の複製が可能になる。
【０１２６】
本発明の様々な実施形態は、細胞の表面上でのＣＯＢの組み立てに関する。ＣＯＢは、例えば、細胞表面の構成要素を標的にしているＵＢＡに会合した状態で組み立てられ得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ＣＯＢの組み立ての前またはそれと同時に細胞表面の構成要素に固定される。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、細胞または細胞内コンパートメントに送達される。いくつかの実施形態において、ＣＯＢは、細胞または細胞内コンパートメント内のＵＢＡと会合した状態で組み立てられる。細胞は、ＵＢＡ、ＥＳＢの付加の前またはＣＯＢ組み立ての前に固定され得る。好適な細胞透過処理方法は、当該分野で公知であり、それを用いることにより、アッセイの構成要素を細胞および細胞構成要素に送達することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、上記アッセイは、細胞ではない物体上で行われる。当該分野で公知の好適な支持物質（例えば、ビーズまたは表面コーティング）が、細胞が作用するのと同じ様式で作用することにより、独自の結合表面を提供し得る。支持物質は、結合標的で修飾され得る。いくつかの実施形態において、支持物質は、結合標的を互いから空間的に離す。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、上記アッセイは、１次結合標的、および１次標的に結合することができる１つ以上の２次結合標的を含み得る。支持物質は、例えば、１つ以上の１次標的でコーティングされ得る。２次標的のライブラリーは、１次標的に結合するように提供され得る。ＵＢＡは、１次および／または２次標的のエピトープに結合するように提供され得る。ＣＯＢは、他のタイプの標的について記載されるように、これらのＵＢＡに会合した状態で組み立てられ得る。１次標的に対する２次標的の相互依存性結合は、ＣＯＢを分析することによってモニターされ得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、複数個のＣＯＢが、同じＵＢＡ分子上に組み立てられる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢまたは組み立てられたＣＯＢは、誘導配列をコードする。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ポリヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ＲＮＡ配列をコードし得る。場合によっては、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ペプチド配列をコードする。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、ペプチド配列を直接コードし得る。あるいは、ＣＯＢは、ペプチド配列を、間接的に、例えば、中間ＲＮＡ配列を介してコードし得る。例えば、ポリヌクレオチドＥＳＢまたはＣＯＢは、オープンリーディングフレームをコードし得る。場合によっては、そのペプチド配列は、ペプチド発現を可能にするコンストラクトにＥＳＢまたはＣＯＢを導入した後に翻訳される。いくつかの実施形態において、そのコンストラクトは、ベクターである。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよびＣＯＢは、オリゴヌクレオチドから組み立てられる。その連結剤は、リガーゼであり得る。いくつかの実施形態において、リガーゼは、周知の手順を用いるＴ４  ＤＮＡリガーゼである（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））。他のＤＮＡリガーゼも使用してよい。ライゲーションに関しては、好熱性の生物に由来するリガーゼなどの他のリガーゼを使用してもよく、ゆえに、高温でのライゲーションが可能になり、より長いオリゴヌクレオチド（特異性が高い）をＥＳＢ、ＣＬまたはＡＰＳとして使用することが可能になり、それにより、そのようなオリゴヌクレオチドのアニーリングにとって通常許容される高温下でアニーリングとライゲーションが同時に行われ得る。しかしながら、そのライゲーションは、酵素による必要はなく、したがって、アニーリング（ａｎｅｅａｌｉｎｇ）領域にヌクレオチド塩基対のミスマッチが無い限り、連結剤は、ＥＳＢとＡＰＳとを連結させる化学剤であってもよい。簡単にするために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを連結剤として使用する本発明のいくつかの実施形態が記載される。この酵素は、隣接するオリゴヌクレオチド上の３’ＯＨ基に接続される、５’末端におけるリン酸基の存在を必要とする。
【０１３２】
オリゴが、互いに積み重なることにより、それらの末端の接合点において完全一致でアニーリング領域に結合すると、そのアニーリング領域に対する特異的な結合が生じる。ＣＬ、ＥＳＢおよびＡＰＳは、ライゲートされることにより、ＥＳＢに連結したＣＯＢを形成し得る。その後、そのＥＳＢに連結したＣＯＢは、検出のために使用され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの組み立ては、クリックケミストリーの使用を含む。クリックケミストリーを用いて様々な分子を連結する好適な方法が、当該分野で公知である（オリゴヌクレオチドのクリックケミストリー連結については、例えば、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）を参照のこと）。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの組み立ては、細胞の内部で起きる。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳが、第１に、細胞の内部で組み立てられる。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、細胞の内部で連結される。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、細胞の外部で連結される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、組み立てられた生成物は、増幅され、必要に応じて、その結果が、参照サンプルからの同様の標的核酸の増幅と比較される。いくつかの実施形態において、ＡＰＳのライゲート産物が、増幅され、必要に応じて、その結果が、参照サンプルからの同様のＣＯＢの増幅と比較される。増幅は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。場合によっては、ライゲート産物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。使用され得るＰＣＲ法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＫ−ＲＦＬＰＩＲＴ−ＰＣＲ−ＩＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニー（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｏｎｙ）ＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライム（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライム（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書中で使用され得る他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅は、細胞の内部で行われる。
【０１３６】
上記実施形態のいずれかにおいて、ライゲート産物の増幅は、支持体（例えば、ビーズまたは表面）上で行われ得る。本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、ＣＯＢは、単一細胞由来の標的上で組み立てられ得る。
【０１３７】
プローブの集団中の各ＵＢＡ／ＥＳＢプローブのユニークさのおかげで、複数の標的分子の多重分析が可能になる。さらに、プローブの集団中の各ＣＯＢプローブのユニークさのおかげで、単一細胞における複数の標的分子の多重分析が可能になる。
【０１３８】
例えば、いくつかの実施形態において、各ＣＯＢは、６つのＡＰＳを含む。それらのＡＰＳが、配列決定されることになり、そのＡＰＳについて可能性のあるユニーク配列が２０個存在する場合、この例では、３．８４×１０８個の可能性のあるＣＯＢが存在し得る。したがって、この例では、３．８４×１０８個の細胞およびそれらの対応するＵＢＡ／ＥＳＢプローブが分析され得る。配列決定の際、一部の蛍光法に存在する色の制約が無いならば、細胞１つあたり複数個のＵＢＡ／ＥＳＢプローブを分析することができる。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６５、７０、９０、１００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００個またはそれより多くの異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大１０００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。いくつかの実施形態において、細胞１つあたり最大２０００個の異なるＵＢＡ／ＥＳＢが分析される。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、検出方法は、多重アッセイにおいて行われ、それにより、複数の標的分子が、同じアッセイ（単一の反応混合物）において検出される。好ましい実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。好ましい実施形態において、そのアッセイは、複数の標的分子が単一細胞において同時に検出される、ハイブリダイゼーションアッセイまたは親和性結合アッセイである。ある特定の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、少なくとも２個、少なくとも５個の異なる標的分子、少なくとも１０個の異なる標的分子、少なくとも２０個の異なる標的分子、少なくとも５０個の異なる標的分子、少なくとも７５個の異なる標的分子、少なくとも１００個の異なる標的分子、少なくとも２００個の異なる標的分子、少なくとも５００個の異なる標的分子または少なくとも７５０個の異なる標的分子または少なくとも１０００個の異なる標的分子である。他の実施形態において、同じアッセイにおいて検出される複数の標的分子は、最大５０個の異なる標的分子、最大１００個の異なる標的分子、最大１５０個の異なる標的分子、最大２００個の異なる標的分子、最大３００個の異なる標的分子、最大５００個の異なる標的分子、最大７５０個の異なる標的分子、最大１０００個の異なる標的分子、最大２０００個の標的分子または最大５０００個の標的分子である。なおも他の実施形態において、検出される複数の標的分子は、前述の数の間の任意の範囲の異なる標的分子（例えば、２０〜５０個の異なる標的分子、５０〜２００個の異なる標的分子、１００〜１０００個の異なる標的分子、５００〜５０００個の異なる標的分子などであるがこれらに限定されない）である。
【０１４０】
本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されている組成物および方法は、本発明の様々な実施形態に従って、複数の標的を検出するための実験装置のダイナミックレンジを高めるために使用され得る。サンプル内またはサンプルのサブセット内、例えば、単一細胞内の複数の標的のうちの２個の標的は、１：１０未満、１：１００未満、１：１０００未満、１：１００００未満、１：１０００００未満、１：１００００００未満、１：１０００００００未満、１：１００００００００未満、１：１０００００００００未満、１：１００００００００００未満、１：１０００００００００００未満またはそれより少ない存在比を有し得、複数の標的における標的の数は、本明細書中の他の箇所に記載されているように変化し得る。ダイナミックレンジを高めるための好適な方法としては、存在量が少ない標的またはそれの上に組み立てられる構造物の不均衡な濃縮、存在量が多い標的またはそれの上に組み立てられる構造物の不均衡な枯渇、および存在量が多い標的またはそれの上に組み立てられる構造物のシグナルの読み出しにおける表示の減少が挙げられるが、これらに限定されない。存在量が少ない標的またはそれの上に組み立てられる構造物の不均衡な濃縮は、例えば、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されているように様々な親和性を有するプライマー結合領域を使用した、会合する核酸の優先的な増幅によって達成され得る。存在量が多い標的またはそれの上に組み立てられる構造物の不均衡な枯渇は、例えば、存在量が多い標的またはそれの上に組み立てられる構造物に特異的に結合する捕捉物質を滴定することによって達成され得る。存在量が多い標的またはそれの上に組み立てられる構造物のシグナルの読み出しにおける表示の減少は、存在量の多い標的上に組み立てられる構造物を形成する構成要素、例えば、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＬ、スプリントまたはＣＯＢの標識されたバージョンと未標識のバージョンとの混合物を使用することによって達成され得る。標識とは、直接検出可能な標識、または下流の工程において表示を可能にするもしくは妨げる標識（例えば、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されているようにまたは別途当該分野で公知であるように、増幅またはＣＯＢの形成をできなくすることによって）のことを指し得る。例えば、標識は、プライマー結合領域であり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、検出は、デジタルの検出である。いくつかの実施形態において、検出は、直接的であり、すなわち、その方法は、検出される実体が直接発するシグナルを取得するものである。いくつかの実施形態において、検出は、間接的であり、すなわち、検出される実体の操作は、シグナルを取得する前に行われる。いくつかの実施形態において、検出される実体の複数の構成要素が、直接または間接的に検出シグナルを生じる。いくつかの実施形態において、それらの複数の構成要素の順序が、本明細書中に記載される検出方法によって決定され得る。そのような検出方法は、順序づけられた検出方法または順序づけられたシグナルを用いる検出方法としても記載される。
【０１４２】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＣＯＢの検出または定量分析は、配列決定によって達成され得る。ＡＰＳサブユニットまたはＣＯＢ全体が、本明細書中に記載される配列決定方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００によるすべてのＤＮＡタグの全長の配列決定を介して検出され得る。
【０１４３】
配列決定は、当該分野で周知である従来のＳａｎｇｅｒ配列決定法によって達成され得る。配列決定は、ハイスループットシステムを用いても達成され得、そのシステムの一部は、配列決定されるヌクレオチドを成長鎖に組み込んだ直後または組み込む際に、そのヌクレオチドの検出を可能にし、すなわち、リアルタイム（ｒｅｄ  ｔｉｍｅ）または実質的にリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループット配列決定は、１時間あたり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００個の配列リードを生成し；各リードは、１リードあたり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ２０００装置が利用可能な技術の使用が必要である。この装置は、合成化学による可逆的ターミネーターに基づく配列決定を用いる。この装置は、８日間で２０００億個のＤＮＡリードを処理できる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍが利用可能な技術の使用が必要である。この遺伝子分析プラットフォームは、ビーズに連結されたクローン増幅されるＤＮＡフラグメントの大規模並列の配列決定を可能にする。この配列決定方法は、色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いた連続的なライゲーションに基づく。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＭＧ）が利用可能な技術の使用が必要である。このＰＧＭは、２時間で１０００万個のリードを処理できる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、合成による単一分子配列決定（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＭＳＳ）法などのＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が利用可能な技術の使用が必要である。ＳＭＳＳは、最大２４時間でヒトゲノム全体の配列決定を可能にするので、ユニークである。この高速の配列決定法は、ある配列におけるＳＮＰヌクレオチドを実質的にリアルタイムまたはリアルタイムで検出することも可能である。最後に、ＳＭＳＳは、ＭＩＰ法のように、ハイブリダイゼーションの前の事前増幅工程を必要としないので、強力である。実際に、ＳＭＳＳは、いかなる増幅も必要としない。ＳＭＳＳは、米国公開出願番号２００６００２４７１Ｉ；２００６００２４６７８；２００６００１２７９３；２００６００１２７８４；および２００５０１００９３２に一部記載されている。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、その機器のＣＣＤカメラによって記録される、配列決定反応によって生成される化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｎｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを透過する光ファイバープレートを含むＰｉｃｏ  Ｔｉｔｅｒ
Ｐｌａｔｅデバイスなどの４５４  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）が利用可能な技術の使用が必要である。この光ファイバーの使用によって、４．５時間で最低２０００万塩基対の検出が可能である。
【０１４９】
ビーズ増幅の後の光ファイバー検出を使用するための方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；ならびに米国公開出願番号２００２００１２９３０；２００３００５８６２９；２００３０１００１０２；２００３０１４８３４４；２００４０２４８１６１；２００５００７９５１０、２００５０１２４０２２；および２００６００７８９０９に記載されている。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）、または可逆的ターミネーター化学反応を利用する合成ごとの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）を用いて行われる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号；同第６，８９７，０２３号；同第６，８３３，２４６号；同第６，７８７，３０８号；および米国公開出願番号２００４０１０６１３０；２００３００６４３９８；２００３００２２２０７；ならびにＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００３，１７（１３）：３６に一部記載されている。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡのハイスループット配列決定は、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｊｐｓ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われ得る。特に、ＡｎｙＤｏｔ−ｃｈｉｐｓは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０倍〜５０倍の増強を可能にする。ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓおよびそれらの使用方法は、国際公開出願番号ＷＯ０２／０８８３８２、ＷＯ０３／０２０９６８、ＷＯ０３／０３１９４７、ＷＯ２００５／０４４８３６、ＰＣＴ／ＥＰ０５／１０５６５７、ＰＣＴ／ＥＰ０５／１０５６５５；ならびに独国特許出願番号ＤＥ１０１４９７８６、ＤＥ１０２１４３９５、ＤＥ１０３５６８３７、ＤＥ１０２００４００９７０４、ＤＥ１０２００４０２５６９６、ＤＥ１０２００４０２５７４６、ＤＥ１０２００４０２５６９４、ＤＥ１０２００４０２５６９５、ＤＥ１０２００４０２５７４４、ＤＥ１０２００４０２５７４５およびＤＥ１０２００５０１２３０１に一部記載されている。
【０１５２】
他のハイスループット配列決定システムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４
Ｍａｒｃｈ  ２０００；およびＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；ならびに米国公開出願番号２００３００４４７８１および２００６／００７８９３７に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
【０１５３】
様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドＥＳＢまたはＣＯＢは、直接同定される。その直接的な同定は、上に記載された核酸配列決定を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＳ配列は、同様に同定される誘導配列をコードする。例えば、ポリヌクレオチドＥＳＢおよびＣＯＢは、ペプチド配列に翻訳され得る。次いで、そのペプチド配列は、当該分野で公知の好適な方法を用いて同定され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢまたはＥＳＢに相当する配列は、質量分析を用いて同定される。質量分析を含む配列決定方法が、当該分野で公知である。様々な実施形態において、ペプチドなどの誘導配列が、質量分析方法を用いて配列決定される。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、フラグメンテーションを含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、Ｎ末端の配列決定を含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、Ｃ末端の配列決定を含む。いくつかの実施形態において、質量分析方法は、エドマン分解を含む。様々な実施形態において、誘導配列は、同定の前に分離プロセスに供される。いくつかの実施形態において、その分離プロセスは、クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、その分離プロセスは、ＨＰＬＣを含む。その分離プロセスのための好適な分離方法は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。イオン交換クロマトグラフィーは、強酸性（代表的には、スルホン酸基、例えば、ナトリウムポリスチレンスルホネートまたはポリＡＭＰＳ）、強塩基性（四級アミノ基、例えば、トリメチルアンモニウム基、例えば、ポリＡＰＴＡＣ）、弱酸性（主にカルボン酸基）または弱塩基性（一級、二級および／または三級アミノ基、例えば、ポリエチレンアミン）である官能基を含む任意のマトリックス物質を使用し得る。その分離方法は、例えば、マトリックスとしてスルホン化ポリスチレンを使用し、酸溶液中にアミノ酸を加え、ｐＨを徐々に上昇させる緩衝液をカラムに通し得る。ｐＨがそれぞれの等電点に達したら、アミノ酸は溶出する。逆相クロマトグラフィーの使用による疎水性相互作用クロマトグラフィーが使用され得る。多くの商業的に入手可能なＣ８およびＣ１８シリカカラムでは、溶出勾配を用いることによる溶液中のペプチドの分離の成功が証明されている。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢに相当するペプチド配列は、検出の簡便さを改善するようにデザインされる。場合によっては、ペプチド配列は、質量分析計におけるフラグメンテーションパターンを改善するようにデザインされ得る。ペプチド配列中の結合のフラグメンテーション効率が配列依存性であることは、当該分野で周知である（例えば、Ｔａｂｂら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｍａｒｃｈ
１；７５（５）：１１５５およびＫｌａｍｍｅｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８，２４：３４８−３５６を参照のこと）。その配列依存性のフラグメンテーション効率は、所望のフラグメンテーションパターンを有する代表的なペプチド配列をデザインするために使用され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢに相当するペプチド配列は、ある特定の物理的および化学的特徴をペプチド分子に付与するようにデザインされる。例えば、代表的なペプチド配列は、水性溶液中で所望の範囲内の溶解性を有するペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。別の例では、代表的なペプチド配列は、所望の程度の二次もしくは三次構造を有するかまたはそれらを欠くペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。なおも別の例では、代表的なペプチド配列は、ジスルフィド結合を有するかまたはそれを欠くペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。なおもさらなる例では、代表的なペプチド配列は、選択された標的に対して所望の結合特性を有するペプチド分子をもたらすようにデザインされ得る。ＥＳＢ、ＣＬ、ＡＰＳおよび得られるＣＯＢの配列は、特別にロードされたｔＲＮＡをタンパク質発現系において利用するようにさらにデザインされ得る。したがって、得られるペプチド分子に非天然アミノ酸を組み込むことができる。
【０１５７】
様々な実施形態が、ＥＳＢに連結したＣＯＢまたはペプチド配列などの誘導配列を検出前に分離することに関する。いくつかの実施形態において、その分離は、それらの分子の好適な生理化学的特性に基づく。これらの分離のタイプは、分子を検出器に連続的に方向づけ、それによって検出時のそれらの相対存在量およびシグナルの複雑度を高めるために特に有用である。様々な実施形態は、配列標的化様式での分子の分離を含む。例えば、特定のＥＳＢを含むすべての分子が、そのＥＳＢ配列を十分に相補的な配列とハイブリダイズさせるか、ＥＳＢ特異的に連結されたタグを用いて親和性精製するか、そのＥＳＢ配列によってコードされる誘導配列を用いて親和性精製することによって、または当該分野で公知の他の任意の好適な方法によって単離され得る。分離方法は、細胞特異的ＣＯＢまたはその一部も標的にし得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよびＣＯＢを含むコンストラクトが、分離に供される。例えば、そのコンストラクトは、勾配またはＥＳＢに従った親和性精製選別に供され得る。いくつかの実施形態において、その分離は、複数の次元、例えば、２、３、４、５、６、７またはそれより多くの次元を含み得る。例えば、そのコンストラクトは、１つの次元において第１のＡＰＳに従って選別し、別の次元において第２のＡＰＳに従って選別し、そして必要に応じて、第３の次元においてＥＳＢに従って選別して、分離され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、分離方法は、電磁場を用いたゲル上での勾配による分離および／または当該分野で公知の他の任意の好適な分離方法を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢを含むコンストラクトは、検出前に分離され得る。例えば、そのコンストラクトは、ＥＳＢに従って分離され得、そのコンストラクト中のＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、その分離後に検出され得る。その検出は、モル比検出、酵素検出、配列決定、勾配もしくはゲルにおける親和性差異、電磁場、例えば、ＵＶ、蛍光もしくは化学発光、本明細書中に記載される任意の検出方法、または当該分野で公知の他の任意の好適な検出方法であり得る。いくつかの実施形態において、分離は、コンストラクトの固定化を含む。例えば、そのコンストラクトは、アレイ表面上またはビーズ上に固定化され得る。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの一部が、そのコンストラクトを固定化するために使用され得る。ＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、固定化の位置から検出され得る。１つの例において、オリゴヌクレオチドを含むＥＳＢおよび／またはＣＯＢは、相補的なオリゴヌクレオチドでコーティングされたビーズ上またはマイクロアレイ上に固定化され得る。
【０１６０】
検出可能分子または標識モノマー
本発明のＣＯＢは、任意の種々の標識モノマー（例えば、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接（例えば、発光によって）もしくは間接的に（例えば、蛍光標識された抗体の結合によって）検出され得る当該分野で公知の他のモノマー）で標識され得る。通常、ＣＯＢ内の標識されたＡＰＳの１つ以上が、１つ以上の標識モノマーで標識され、ＣＯＢのＡＰＳに付着させられた標識モノマーによって提供されるシグナルが、ＵＢＡＣＯＢが結合する標的を同定する検出可能なコードを構成する。ある特定の実施形態において、ＡＰＳからの所与のシグナルの欠損（例えば、暗点）もまた、ＣＯＢのコードの一部を構成し得る。
【０１６１】
本明細書中に記載されるＣＯＢとともに使用され得る標識モノマーおよび標識モノマーをＣＯＢに組み込む方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号；米国出願番号１０／５４２，４５８；１２／３２４，３５７；１１／６４５，２７０および１２／５４１，１３１（それらの全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【０１６２】
検出可能分子または標識モノマーをＣＯＢに付加するとき、本発明のＣＯＢによって提供される定性的な分析能力およびそれに基づく分析技術に加えて、本発明のＣＯＢは、定量的分析を行うのにユニークに好適である。生体分子サンプル中の本発明のＣＯＢとそれらの標的分子との間の１対１の結合を提供することによって、そのサンプルに存在する標的分子の全部または代表的な一部が、同定され得、計数され得る。この様々な分子種の個々の計数は、その生体分子サンプル中の標的分子の絶対濃度または相対濃度を決定するための正確かつ直接的な方法を提供する。さらに、混合物中の各分子を個別に扱う能力は、高感度、最小のサンプル必要量、小容積での溶液相の動態によってもたらされる高反応速度、および最終的には非常に低い試薬コストをはじめとした小型化の利点に影響する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、単一サンプルから、少なくとも１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００、１００００００００、１０００００００００またはそれより多くの相対存在量を有する２個以上の標的を検出し得る。
【０１６３】
標的分子
標的分子またはエピトープは、それとＵＢＡとの結合によって検出または測定される分子（ＵＢＡの標的特異的領域が認識する）である。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、小分子、有機モノマーまたは薬物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の方法によって分析され得る核酸としては：二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）およびＲＮＡヘアピンが挙げられる。単に便宜のため、本明細書中に記載される方法は、タンパク質またはｍＲＮＡの分析に照らして主に説明される。しかしながら、本明細書中に記載される実施形態は、非タンパク質または非ｍＲＮＡ標的を検出するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。
【０１６４】
標的分子は、他の構成要素を含む生体分子サンプルの一部であり得るか、またはそのサンプルの唯一のもしくは主要な構成要素であり得る。標的分子は、細胞もしくは組織の全体、細胞もしくは組織の抽出物、それらの分画された溶解産物または実質的に精製された分子の構成要素であり得る。標的分子は、溶液相または固相（例えば、チップ、マイクロアレイまたはビーズなどの固体表面を含む）において付着させられ得る。また、標的分子は、既知または未知の構造または配列を有し得る。
【０１６５】
本明細書中に開示される組成物、方法およびキットは、サンプル中の標的分子の存在を決定する多種多様の適用においても使用され得る。例えば、限定されないが、その組成物、方法およびキットは、薬物動態学的研究（薬物代謝、ＡＤＭＥプロファイリングおよび毒性研究；創薬のための標的の確認；遺伝子発現プロファイリング、タンパク質発現プロファイリング；プロテオーム分析；メタボロミクス研究；翻訳後修飾研究（グリコシル化、リン酸化、アセチル化およびアミノ酸修飾（例えば、ガンマ−カルボキシグルタメートを形成するグルタメートの修飾およびヒドロキシル化を形成するプロリンのヒドロキシル化）を含むがこれらに限定されない）；特定の血清または粘膜抗体レベルの分析；非核酸の診断指標の評価；外来抗原の検出；などを含むがこれらに限定されない）にとって有用である。
【０１６６】
ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＵＢＡ、少なくとも１つのＥＳＢまたはＵＢＡとＥＳＢの両方が、少なくとも１つの標的分子と特異的に反応する少なくとも１つの抗体、アプタマーまたはペプトイドを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのＵＢＡ、少なくともＥＳＢまたはＵＢＡとＥＳＢの両方が、少なくとも１つの標的分子と特異的に相互作用する結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分を含む。
【０１６７】
当業者は、本明細書中に記載される分子複合体および分子複合体の少なくとも一部が、とりわけ、特定の分子複合体または切断可能な構成要素の性質ならびに用いられるＳＭＤ法および検出装置に応じて、基材に繋ぎ止められているかもしくは付着させられている間にまたは溶液中で、個別に検出され得ることを認識するだろう。
【０１６８】
方法
本発明は、生体分子サンプル中の標的分子を検出および定量するための方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができるＵＢＡを提供する。本発明は、ＥＳＢおよびＣＯＢの使用も提供する（図２を参照のこと）。ＥＳＢおよびＣＯＢのコードによって、ＵＢＡと標的分子との結合が、単一細胞内での標的分子の同定をもたらす。いくつかの実施形態において、ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、標的分子および細胞の起源を表す情報の量を表す（図１を参照のこと）。そのようなＵＢＡおよび／またはＥＳＢならびにＣＯＢを作製および使用する方法も提供される。
【０１６９】
１つの態様において、本発明は、複雑な細胞集団の各細胞において複数個の標的分子を同定する方法およびその標的分子に関する細胞特異的な情報を保持する方法を提供する。ゆえに、各細胞について、その細胞に関連する各標的分子の量がアッセイされる。いくつかの実施形態において、複数の情報の量が、複雑な細胞集団の各細胞において複数個の標的分子を同定するために決定される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的分子を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの標的分子を潜在的に含む細胞の集団、（ｉｉ）第１の標的分子に特異的な第１のＵＢＡ、（ｉｉｉ）第１のＵＢＡのある領域に特異的な第１のエピトープ特異的バーコードＥＳＢ（そのＥＳＢは、第１の共通リンカー部分を含む）、および（ｉｖ）ＣＯＢの集団（そのＣＯＢの集団は、第２の共通リンカー部分を含み、その第２のリンカー部分は、第１のＥＳＢの第１の共通リンカー部分と相補的である）を提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブおよび第１のＥＳＢを含む少なくとも第１の複合体を形成する工程（その少なくとも１つの標的分子は、第１のＵＢＡに結合され、ＥＳＢは、ＵＢＡに結合される）；（ｃ）ＣＯＢの集団を加える工程（ここで、少なくとも１つの標的分子、第１のＵＢＡプローブ、第１のＥＳＢおよび第１のＣＯＢによって第２の複合体が形成され、第１のＣＯＢの第２の共通リンカー部分は、第１のＥＳＢの第１のリンカー部分に結合され、ＣＯＢの集団のＣＯＢは、細胞の集団の細胞に会合している）；および（ｄ）第２の複合体または第３の複合体の少なくとも一部を検出する工程を包含する。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供する。ＵＢＡは、代表的には、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で（例えば、抗原−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）ＵＢＡが標的分子に結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの反応部分を含む（図２および３を参照のこと）。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、少なくとも１つの第１のプローブおよび少なくとも１つの第２のプローブを含む少なくとも１つのプローブセットの一部であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡプローブセットを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供し、ここで、そのＵＢＡプローブセットは、第１のＵＢＡプローブおよび第２のＵＢＡプローブを含む。第１のＵＢＡプローブおよび第２のＵＢＡプローブは、例えば、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で、それらのプローブが標的分子の異なる領域に結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの反応部分を含む。いくつかの実施形態において、ＵＢＡプローブおよび／または第２のＵＢＡプローブは、本明細書中に記載されるような捕捉領域を含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態において、ＵＢＡは、同一性部分または同一性部分の少なくとも一部、例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴを含む。その同一性部分は、本明細書中に記載される方法の検出工程において、標的分子に結合されているＵＢＡの有無の同定を可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＵＢＡを標的分子に結合することによって標的分子を検出および／または定量するための方法を提供し、ここで、ＵＢＡは、同一性部分（例えば、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＥＳＢおよび／またはリンカーオリゴ）を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、標的分子は、細胞内においてエピトープ特異的バーコード（ＥＳＢ）で間接的にタグ化される。各ＥＳＢは、特定の標的分子に会合し得るユニークなコードを含む。ＥＳＢは、少なくとも１つのＵＢＡまたはＵＢＡの一部に結合するようにデザインされた分子または構築部品であり；適切な条件下において、ＥＳＢ、ＵＢＡおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。ＥＳＢは、代表的には、配列特異的様式、コンフォメーション特異的様式またはその両方で（例えば、ＵＢＡ−抗体結合、アプタマー−標的結合などであるがこれらに限定されない）、ＥＳＢが少なくとも１つのＵＢＡに結合するかまたはそれと相互作用するのを可能にする少なくとも１つの同一性同定部分を含む。いくつかの実施形態において、ＥＳＢは、ＵＢＡに直接または間接的に付着させられる。他の実施形態において、ＥＳＢは、例えば、アッセイ手順の一部として、細胞またはサンプル中でＵＢＡに結合する。ある特定の実施形態において、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢは、捕捉領域を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、ＵＢＡ／ＥＳＢの単離および／または表面へのＵＢＡ／ＥＳＢの固定化のために使用される。その捕捉領域は、親和性タグ、ビーズ、スライドまたはアレイであり得る。ある特定の実施形態において、ＥＳＢは、共通リンカー部分、例えば、リンカーオリゴを含む。ある特定の実施形態において、共通リンカーオリゴは、細胞起源バーコード（ＣＯＢ）を形成するアッセイ可能ポリマーサブユニット（ＡＰＳ）における共通リンカーオリゴに相補的である。
【０１７５】
場合によっては、標的上に組み立てられる構造物の一部分は、ＥＳＢを欠損していることがあり、例えば、ＣＯＢの組み立てのためのＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはスプリント上のハイブリダイゼーション領域を欠損することによって、ＵＢＡ−ＥＳＢの組み立ておよび／またはＣＯＢの組み立てが妨げられることがある。場合によっては、標的上に組み立てられる構造物の一部分は、１つ以上の標識、例えば、増幅を可能にする標識を欠損していることがある。そのような一部分は、存在量が少ない標的に対してより少ないかまたは存在しないことがある。複数のプライマー結合領域を使用すること、および完全ではないセットを標的の様々な一部分に組み込むことによって、標的および／またはそれの上に組み立てられる構造物は、様々な数の連続した増幅反応（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の増幅反応（各々が、１以上のラウンド、例えば、少なくとも１、２、３、４，５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ラウンドまたはそれより多くを含む））において増幅され得る。場合によっては、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＣＬまたはスプリントのサブタイプを受け取るように設定された標的分子の一部分は、９９．９９９％未満、９９．９９％未満、９９．９％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．０００１％未満またはそれより少なくてよい。同じ実験において存在量が少ないおよび多い標的を検出するためのダイナミックレンジは、そのような方法を用いて高められ得る。
【０１７６】
図３および４は、分割プール合成アプローチを用いて標的分子／ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体に対してＣＯＢを付加する本発明の実施形態のうちの１つの模式図を示している。工程１としての図３は、ＵＢＡ−ＥＳＢ−ＣＬ試薬による細胞の標識を示している。このＵＢＡは、細胞内で認識される標的分子に対する特異性を提供する。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、ＣＤ８のような表面マーカーまたはＳｔａｔ−３などのキナーゼ上のホスホ−エピトープのような細胞内エピトープに特異的な抗体であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡは、固定された細胞内の標的ｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡであり得る。そのＵＢＡは、ＣＬ部分を有するＥＳＢを用いて同定され、ＣＬ部分は、細胞特異的なタグ化情報を後で付加するためのものである。工程２である図４は、分割プール合成の始めの部分を示している。この例では、細胞集団が、２０本のチューブに分割される。細胞集団は、ウェル、ビーズまたは当該分野で公知の任意の好適な表面に分割され得る。工程３では、ＡＰＳユニットが、各チューブに加えられる。そのＡＰＳは、ＡＰＳおよびＥＳＢにおける相補的なＣＬを介してＵＢＡ／ＥＳＢ複合体に結合する。工程４では、所与のチューブ内の各細胞が、次に、チューブの内容物によって定義される同じサブユニット（この例では１〜２０のＡＰＳのうちの１つ）を各ＵＢＡ−ＥＳＢ対に付加する。工程３の分割された各集団が、次に、その細胞内のすべてのＤＢＡＡに付加されたＤＡＰＳ「タグ」ポリマーサブユニットを有する。工程５では、その２０本のチューブの細胞が、１本のチューブにまとめられる。それらの細胞の１／２０が、同じＡＰＳサブユニットを有する。工程６では、工程２〜４が繰り返されて、先のＡＰＳに第２のＡＰＳが付加される。この例では、１本のチューブ内の細胞は、細胞の混合物（そのすべてが、２ラウンド目のＡＰＳサブユニットおよび１ラウンド目に使用された２０個のＡＰＳのうちの１つを統計的に等しい分布で有する）を有する。したがって、２ラウンド目において、個々の各チューブ混合物内では、すべてのポリマーが、同じＡＰＳの付加によって伸長される。必要に応じて、このプロセスが繰り返される。連結された細胞起源シグネチャとともにエピトープ／バーコードは、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の任意の方法によって読まれる。
【０１７７】
必要とされる分割プールのラウンド数は、アッセイにおける細胞数、および各細胞に対してＣＯＢがユニークであるのを保証するタグの数の過剰提示をもたらし得るものの統計的推定値によって定義される。これは、以下の式：
必要とされるタグの数＝
【数１】
2018046856.tif 000002
によって与えられ、ここで、Ｃ＝過剰提示の確実性であり、Ｎ＝細胞数である。
【０１７８】
したがって、１００万個の細胞を有しており、タグのユニークさに関して９９．９％の確実性を要求する場合、
【数２】
2018046856.tif 000003
すなわち、およそ７００万個のタグが必要である。様々な実施形態において、高確実性のタグユニークさは、細胞／粒子を異なる実体として同定することに対して高い統計的有意性を保証する。理論に拘束されるものではないが、高確実性のタグユニークさ（ｔａｇ  ｕｎｉｑｅｎｅｓｓ）は、２つの同一のＣＯＢ標識が同じ細胞／粒子を起源とする高い可能性を提供する。
【０１７９】
しかしながら、１０６個の細胞の場合、７００万個のタグでは、１０００個の細胞対が「同じ」細胞として標識され得ることを意味する。ゆえに、一対の二つ組の細胞が存在することのわずか１０に１つの可能性を有するために、上記式は、９９．９９９９９％に設定されるべきである。
【数３】
2018046856.tif 000004
したがって、細胞より１６倍多いタグが必要となる。
【０１８０】
バーコードを作製するための所与の数のサブユニットが与えられて、ラウンド数を決定するために：
【数４】
2018046856.tif 000005
から、
【数５】
2018046856.tif 000006
が導かれる。２０個のサブユニットを有しているならば、１．７×１０７個のタグの場合、以下のＡＰＳ付加サイクルが必要である：
【数６】
2018046856.tif 000007
これは、６ラウンドのＡＰＳ付加サイクルに切り上げることができる。１００個のサブユニットを有している場合、わずか３．６ラウンド、すなわち切り上げて４ラウンドのＡＰＳ付加サイクルが必要となる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、必要とされるバーコードの数は、「誕生日」問題として公知の暗号学的アプローチによって推定され、ｎ（ｐ；ｄ）が、［１，ｄ］個の異なる細胞起源バーコードから引き出されたバーコードを有するランダムな細胞の数を表す場合、少なくとも２個のバーコードが同じである確率ｐは、以下の関係式を用いて推定され得る：
【数７】
2018046856.tif 000008
【０１８２】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内の標的分子をＥＳＢで間接的にタグ化するための方法を提供する。細胞集団を、細胞の起源を示す第２のシグネチャすなわち細胞起源バーコードをエピトープ特異的バーコードに付加する分割プール合成アプローチにおいて処理する。ＵＢＡは、タンパク質の場合、抗体、ダイアボディなど、またはＲＮＡの場合、アンチセンスＤＮＡタグおよび核酸の場合、ＤＮＡであり得る。ＥＳＢは、ハイスループット配列決定アプローチによって可読な核酸または質量分析アプローチによってアッセイ可能な化学サブユニットであり得る。ＣＯＢは、ハイスループット配列決定アプローチによって可読な核酸または質量分析アプローチによってアッセイ可能な化学サブユニットであり得る。
【０１８３】
ＡＰＳは、ＤＮＡまたはＤＮＡ模倣物の特定の鎖であり得る。ＡＰＳは、リガーゼによって連結され得る。ライゲーションのために使用され得る酵素の例としては、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。化学的ライゲーションは、活性化剤および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線）を用いて行われ得る。ライゲーション法（例えば、ギャップフィリング（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）ライゲーション（ギャップフィリングＯＬＡおよびＬＣＲを含むがこれらに限定されない）、架橋オリゴヌクレオチドライゲーションおよび訂正ライゲーション）も本発明の範囲内である。これらの手法の説明は、とりわけ、米国特許第５，１８５，２４３号、公開された欧州特許出願ＥＰ３２０３０８およびＥＰ４３９１８２ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０１０６９およびＷＯ０１／５７２６８に見られる。ＡＰＳは、ポリメラーゼによって伸長され得る。
【０１８４】
これらのＡＰＳサブユニットは、本明細書中に記載される配列決定方法を含む当該分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００、ＨｉＳｅｑ  ２０００、ＨｉＳｅｑ  １５００、ＨｉＳｅｑ  １０００、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩＸ、またはＭｉＳｅｑパーソナルシークエンサーによるすべてのＤＮＡタグの全長配列決定によって検出され得る。
【０１８５】
ＡＰＳは、コンビナトリアル合成法に従った小分子または決定論的重量の組立可能な複合分子であり得る。これらのサブユニットは、質量分析を介して検出され得る。
【０１８６】
したがって、いくつかの実施形態において、細胞特異的情報は、その会合しているＣＯＢに連結されているＵＢＡ（認識されるエピトープに対するバーコード）を介して組み立てられる（その情報がどの細胞を起源にしているか）（図５を参照のこと）。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体は、本明細書中に記載されるような捕捉領域を介して単離される。いくつかの実施形態において、その捕捉領域は、表面へのＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体の固定化のために使用される。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡに関する情報は、本明細書中に記載される方法（例えば、分枝鎖またはローリングサークルアプローチ）を含む当該分野で公知の任意の好適な増幅法によって、その後のＣＯＢ手順（分割プール）の前に、増幅され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、誤りの訂正および検出は、サブユニットにコードされ得る。誤りの検出および訂正を達成するための一般的な概念は、いくらかの冗長性（すなわち、いくらか余分なデータ）をメッセージに付加するということであり、それを受取側は、送達されたメッセージの一貫性を確認するため、および誤っていると決定されたデータを回復するために使用できる。誤りの検出および訂正のスキームは、系統的または非系統的であり得る：系統的スキームでは、伝達側は、元のデータを送り、一定数のチェックビット（またはパリティデータ）（それは、ある決定的アルゴリズムによってそのデータビットから得られる）を添付する。誤りの検出だけが必要とされる場合、受取側は、単純に、受け取ったデータビットに同じアルゴリズムを適用し、その結果を受け取ったチェックビットと比較し得る；その値が一致しない場合は、誤りが伝達中のどこかの点に存在している。非系統的コードを使用するシステムでは、元のメッセージが、その元のメッセージと少なくとも同じビット数を有するコードされたメッセージに変換される。誤りの検出および訂正のスキームは、反復符号、パリティビット、チェックサム、巡回冗長検査（ＣＲＣ）、暗号学的ハッシュ関数、誤り訂正符号、自動再送要求、ハイブリッドＡＲＱ、誤り訂正符号、畳み込み符号、ブロック符号（例えば、ハミング符号、多次元パリティ検査符号、リード・ソロモン符号、ターボ符号および低密度パリティ検査符号（ＬＤＰＣ））を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、ポリマーが付加しなかった場合、各ラウンドにおける鎖は、さらなる付加から保護される。これは、各ラウンドが、相補的な付加のために異なるオーバーハングを使用する場合、ポリマーユニットとしてのＤＮＡによって達成され得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、連結された細胞起源シグネチャとともにエピトープ／バーコードが、本明細書中に記載される方法を含む当該分野で公知の方法を用いる配列決定によって読まれる。各１００ｂｐリードがＥＳＢ−ＣＯＢ対に相当すると仮定する配列決定アプローチに対する感度は、標的タンパク質に対して、以下のとおりである。目的の分子のタンパク質コピー数は、１００〜１００，０００の範囲である。下記の大まかな分布を有する１００種のタンパク質を読みたいと仮定する：
【表１】
2018046856.tif 000009
【０１９２】
テスト１では、細胞内の１００種すべてのタンパク質に到達するためには、細胞１つあたり２，２３２，０００個の配列を読むことができる必要がある。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００などの２×１０９個のリードを処理できる配列決定法を用いるとき、これは、そのアプローチが、約１，０００個の細胞において１００種のタンパク質を読むことができることを意味する。しかしながら、高コピー数のタンパク質を完全に回避することによって、または正規化によってその表示を「キャッピング」することによって、その高コピー数のタンパク質を制限する場合（いくつかのアプローチがこのために機能し得る）、到達可能な細胞数を増加させることができる。ゆえに、１００，０００コピーを１０，０００コピーの限度に正規化およびキャッピングするとすると（テスト２）、リードの総数は、４３２，０００個となる。つまり、約５０００個の細胞において１００種のタンパク質を読むことができる。
【０１９３】
ｍＲＮＡの場合、ＲＮＡは、代表的には一層より少なく発現されるので、その数は異なる。目的の分子のＲＮＡコピー数は、５〜１０００の範囲であり（Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｅｎｅｓの数に基づくと）；アクチンまたはＩｇのような大量に産生されるタンパク質の特定のｍＲＮＡを計数しない。したがって、下記の大まかな分布を有する１００種のｍＲＮＡを読みたいと仮定する：
【表２】
2018046856.tif 000010
【０１９４】
テスト１では、細胞内の１００種すべてのｍＲＮＡに到達するためには、細胞１つあたり１２，３００個の配列を読むことができる必要がある。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００などの２×１０９個のリードを処理できる配列決定法を用いるとき、これは、そのアプローチが、約１６２，０００個の細胞において１００種のｍＲＮＡを読むことができることを意味する。これは、高パラメータフローサイトメトリーの実施と等しい。同じ分布を有する２００種のｍＲＮＡは、約８０，０００個の細胞において読まれると直線的に概算され得る。
【０１９５】
当業者に明らかであるように、リードの数が増えるほど、細胞数および到達可能なパラメータ（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）が増える。
【０１９６】
様々な実施形態において、同じ実験において存在量が少ないおよび多い標的（例えば、タンパク様標的または核酸標的）に対する検出のダイナミックレンジは、読み出しにおける異なる存在量の標的の表示を適切に変更することによって高められる。例えば、そのシグナルにおける存在量が多い標的の表示は、少なくとも１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍またはそれより多く減少し得る。場合によっては、そのシグナルにおける存在量が少ない標的の表示は、少なくとも１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００倍またはそれより多く増加し得る。
【０１９７】
様々な実施形態において、同じ実験において存在量が少ないおよび多い標的（例えば、タンパク様標的または核酸標的）に対する検出のダイナミックレンジは、配列含有量の正規化によって高められる。適切な手法としては、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓｈａｇｉｎａら、Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０１０；４８：４５５−４５９およびＳｏａｒｅｓら、Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ：ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ
ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ＼ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５３３：１０９−２２．）、ＤＮＡサブトラクションおよび他のハイブリダイゼーション法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９８】
いくつかの方法が、単一サンプル中の様々な存在量を有する複数の標的を検出するためのダイナミックレンジを高めるために使用され得る。様々な実施形態において、本明細書中に記載されるプライマー結合領域は、１つ以上のプライマー伸長反応に対する開始部位として働き得る。それらのプライマー結合領域は、本明細書中に記載される様々なエレメント（ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＬ、ＡＰＳ、スプリントおよび／またはアニーリングプライマーを含むがこれらに限定されない）の組み立ての前は不完全であり得、複数個のそのような構成要素は、プライマー結合領域に寄与し、複数のエレメントからの配列寄与によって生成され得る。異なるプライマー結合領域が、標的の同一性に基づいて、本明細書中に記載される組み立てられた組成物に組み込まれ得る。例えば、直接または間接的に第１の標的に連結されたまたは結合するようにデザインされた、第１のＵＢＡ、ＣＬ、スプリントまたはＥＳＢは、第１のプライマー結合領域を有し得、直接または間接的に第１の標的に連結されたまたは結合するようにデザインされた、第２のＵＢＡ、ＣＬ、スプリントまたはＥＳＢは、第２のプライマー結合領域を有し得る。場合によっては、第１のＥＳＢまたはＵＢＡは、第１のプライマー結合領域を有する第１のＣＬまたはスプリントに連結され得るか、またはそれらにハイブリダイズするようにデザインされ得、第２のＥＳＢまたはＵＢＡは、第２のプライマー結合領域を有する第１のＣＬもしくはスプリントに連結され得るか、またはそれらにハイブリダイズするようにデザインされ得る。本明細書中に記載される組み立て品は、複数個のプライマー結合領域を有し得る。そのプライマー結合領域は、入れ子状態（ｎｅｓｔｅｄ）であり得る。異なるプライマー結合領域は、プライマーセットに対して異なる親和性を有し得る。本明細書中に記載されるプライマー結合領域は、他のものよりも１つの核酸組み立て品を優先的に増幅し得る（代表的には、より存在量が多い標的の組み立て品よりも、より存在量が少ない標的に会合する組み立て品を優先的に増幅する）増幅反応において使用され得る。このようにして、単一起源から複数の標的を検出するためのダイナミックレンジが、高められ得る。例示的な増幅反応としては、ネステッドＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、単一プライマー等温増幅を含む単一プライマー増幅、または本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されているかもしくは別途当該分野で公知である、所望の核酸を優先的に増幅するための他の好適な増幅反応が挙げられるがこれらに限定されない。プライマーセット内のプライマーは、１つ以上の標的分子に会合する複数個のプライマー結合領域を標的化していることがあり、そのプライマーセットのサブセットは、標的またはそれの上の標的特異的組み立て品の第１の事前に選択された閾値濃度以上で検出可能なアンプリコンを生成することができる。そのプライマーセットの別のサブセットは、標的またはそれの上の標的特異的組み立て品の第２の事前に選択された閾値濃度以上で検出可能なアンプリコンを生成することが可能であり得る。複数のそのような閾値濃度は、米国特許第５，８５８，７３２号（その全体が参照により本明細書中に援用される）にさらに記載されているように選ばれ得る。
【０１９９】
連続したアッセイ環境および／またはアッセイ試薬（各々が、異なる標的存在量の範囲を標的化している）が、使用され得、必要に応じて、より存在量が多い標的および／またはそれの上に組み立てられた構造物が枯渇し、より存在量が少ない標的の検出がより現実的になる。一連のアッセイおよび／または試薬を記載している例示的な方法は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．Ｕ．Ｓ．２０１１／０１６００７８、ＰＣＴ  Ｐｕｂ．および米国特許第６，３５０，５７９号（これらの両方は、その全体が参照により本明細書中に援用される）にさらに記載されている。
【０２００】
場合によっては、存在量が多いおよび少ない標的は、標的および／もしくはそれの上に組み立てられた任意の構造物またはそれらの増幅産物を、異なるプローブまたはプライマー（存在量が少ない標的に会合するエレメントに、より高い頻度でハイブリダイズするようにデザインされた）にハイブリダイズすることによって区別され得、ゆえに、その存在量または表示が増加し得る。あるいは、プローブまたはプライマーの優先的なハイブリダイゼーションは、枯渇のために、存在量の多い標的に会合するエレメントに操作され得る。ダイナミックレンジを高めるためにプローブおよびプライマーの様々な頻度のハイブリダイゼーションを使用する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２００６／０２４６４７５（その全体が参照により本明細書中に援用される）にさらに詳細に記載されており、そのような方法は、標的の上に組み立てられた構造物を使用することによって、存在量が異なる２個の異なる標的に適用され得る。
【０２０１】
複数の標的を検出するためにダイナミックレンジを高めるための方法は、単一の細胞または集団のデータからそのような標的の存在量のレベルに対する経験的予測を利用し得る。場合によっては、そのようなデータは、細胞型、サンプルのタイプ、組織型、発生段階、疾患の状態、実験上のインプット（例えば、薬物の送達または他の外部刺激）または実験の期間に特異的であり得る。標的を定量するための好適な方法およびデータソース／そのような情報が配置され得るデータベース（本明細書中の他の箇所にさらに詳細に記載されている種々のタイプのサンプルまたはサンプル構成要素の遺伝子発現プロファイルまたはタンパク質発現プロファイルを含む）は、当該分野で公知である。核酸分子を定量するためのいくつかの例示的な方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ．Ｐｕｂ．ＵＳ２０１１／０１６００７８およびその中の参考文献（これらのすべては、その全体が、参照により本明細書中に援用される）に詳細に記載されている。
【０２０２】
本明細書中に記載される任意の実施形態が、複数個の標的分子の検出において使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明は、標的分子の分析のためのＵＢＡを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化アッセイにおいて使用するためのＵＢＡ集団を提供する。その集団内の各ＵＢＡは、標的分子に特異的である。次いで、その標的分子とＵＢＡとの結合が、ＥＳＢ−ＣＯＢ対を用いて検出される。各ＥＳＢ−ＣＯＢ対は、本明細書中に記載されるような特定の標的分子および細胞起源に会合し得るユニークな標識コードを含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、下に記載されるＥＳＢ−ＣＯＢの検出は、１分子ずつ計数されるという点でデジタルの性質である。コードを読むために蛍光が用いられるが、そのシグナルは高く、かつスポットが存在するかまたは存在しないことから、デジタルの検出である。シグナルを定量するために使用されるアナログの蛍光シグナルではなくデジタルの検出を用いることにより、より正確な定量がもたらされる。したがって、本明細書中に記載される方法は、より正確な定量およびできる限りより高感度であるために、現在可能なレベルを超えるレベルへの多重化を可能にする。
【０２０４】
生体分子サンプル
本発明のＵＢＡおよびＥＳＢ／ＣＯＢシステムは、任意の生体分子サンプル中の標的分子を検出するために使用され得る。当業者によって認識されるように、そのサンプルは、生物学的サンプル（例えば、実質的に任意の生物の細胞（初代細胞と培養細胞株の両方を含む）、細胞溶解産物または抽出物、組織および組織抽出物）；体液（血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌物、汗および精液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の他の任意の部位から得られる流体）または関節（例えば、正常関節または疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または化膿性関節炎）に罹患した関節）から得られる流体を含むがこれらに限定されず、哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい）；環境サンプル（大気、農業、水および土壌のサンプルを含むがこれらに限定されない）；生物学的兵器剤サンプル；研究サンプル（細胞外液、細胞培養物の細胞外の上清、細菌における封入体、細胞内コンパートメント、細胞周辺質、ミトコンドリアコンパートメントなどを含む）を含むがこれらに限定されない任意の数のものを含み得る。
【０２０５】
上記生体分子サンプルは、生物学的検体から間接的に得られることがある。例えば、目的の標的分子が、タンパク質キナーゼである場合、本発明の生体分子サンプルは、細胞溶解産物由来の単離されたタンパク質を含むサンプルであり得る。別の例では、本発明の生体分子サンプルは、生物学的検体を分画、例えば、サイズ分画または膜分画に供することによって生成される。
【０２０６】
タンパク質単離の手法は、当該分野で周知でもあり、これらの手法のうちの少なくともいくつかを使用するキットが、商業的に入手可能である。タンパク質単離の手法は、代表的には、以下のうちの１つ以上を使用する：浸軟および細胞溶解（物理的、化学的および酵素的方法を含む）；遠心分離；分子量による分離（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分取電気泳動）；選択的沈殿、例えば、塩溶および塩析手順；様々なクロマトグラフィー方法；など。タンパク質精製の手法の詳細な説明および関連するプロトコルは、とりわけ、Ｍａｒｃｈａｋら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄ．Ｓｐｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇｏｌｄｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｒ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；およびＤ．Ｌｉｅｂｌｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に見られる。商業的に入手可能なキット（例えば、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ．ＲＴＭ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能な、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ．ＴＭ．Ｐａｒｔｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐ−ＰＥＫ）およびＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ．ＴＭ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｃ−ＰＥＫ）であるがこれらに限定されない）も使用され得る。当業者は、本発明の組成物、方法およびキットとともに使用するための非核酸被検体が、そのような精製法および市販のキットを用いて過度の実験を行うことなく容易に入手できることを認識するだろう。
【０２０７】
本発明の生体分子サンプルは、天然のもの、例えば、操作もしくは処理に供されていないものであってもよいし、処理されたもの（それは、任意の数の処理（薬物を含む候補物質への曝露、遺伝子操作（例えば、遺伝子の付加または欠失）などを含む）を含み得る）であってもよい。
【０２０８】
生体分子サンプルは、環境サンプル（例えば、細菌または他の生物（例えば、珪藻類、渦鞭毛藻類、藻類、とりわけ、例えば、ある特定の海洋または地上のサンプル中のもの）を含むサンプル）も含み得る。
【０２０９】
ＣＯＢの検出
ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体は、所与のＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上の特定の配列またはシグナルを検出することができる当該分野において利用可能な任意の手段によって検出される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報が、増幅され得る。増幅は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。場合によっては、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。使用され得るＰＣＲ法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニーＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書中で使用され得る他の増幅方法としては、米国特許第５，２４２，７９４号；同第５，４９４，８１０号；同第４，９８８，６１７号；および同第６，５８２，９３８号に記載されているものが挙げられる。
【０２１１】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報の増幅は、ビーズ上で行われ得る。本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、標的核酸は、単一細胞から得られることがある。
【０２１２】
本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせに関する情報は、増幅工程（例えば、ＰＣＲ）の前に予め増幅され得る。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせが、定量される。核酸を定量するための方法は、当該分野で公知であり、それらとしては、ガスクロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む）、電気泳動（キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー、等速電気泳動、一時的等速電気泳動およびキャピラリーゲル電気泳動を含む）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、マイクロアレイ、ビーズアレイおよびハイスループットジェノタイピング（例えば、分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ：ＭＩＰ）の使用によるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせの定量は、ある状態、すなわち胎児の異常もしくはがんを診断するために、遺伝子／または対立遺伝子のコピー数、遺伝子またはエキソンレベル発現、メチル化状態分析を決定するため、または新規転写物を検出するために使用され得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせが、配列決定される。配列決定は、当該分野で周知の従来のＳａｎｇｅｒ配列決定法によって達成され得る。配列決定は、ハイスループットシステムを用いても達成され得、そのシステムの一部は、配列決定されるヌクレオチドを成長鎖に組み込んだ直後または組み込む際に、そのヌクレオチドの検出を可能にし、すなわち、リアルタイムまたは実質的にリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループット配列決定は、１時間あたり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００個の配列リードを生成し；各リードは、１リードあたり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩＸ、ＭｉＳｅｑパーソナルシークエンサーまたはＨｉＳｅｑシステム（例えば、ＨｉＳｅｑ  ２５００装置、ＨｉＳｅｑ  １５００装置、ＨｉＳｅｑ  ２０００装置またはＨｉＳｅｑ  １０００装置を用いるもの）によって利用可能な技術の使用を含む。これらの装置は、合成化学による可逆的ターミネーターに基づく配列決定を用いる。これらの装置は、８日間で２０００億個またはより多くのＤＮＡリードを処理できる。３、２、１またはより少ない回数以内の運転には、より小さなシステムが利用され得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、ＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍが利用可能な技術の使用が必要である。この遺伝子分析プラットフォームは、ビーズに連結されたクローン増幅されるＤＮＡフラグメントの大規模並列の配列決定を可能にする。この配列決定方法は、色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いた連続的なライゲーションに基づく。
【０２１８】
次世代の配列決定法は、イオン半導体配列決定法（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの技術（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）を使用して）を含み得る。イオン半導体配列決定法は、ヌクレオチドがＤＮＡ鎖に組み込まれるとき、イオンが放出され得るという事実を活用し得る。イオン半導体配列決定法を行うために、微細加工されたウェルの高密度アレイが、形成され得る。各ウェルは、単一のＤＮＡ鋳型を保持し得る。そのウェルの下は、イオン感受性層であり得、そのイオン感受性層の下は、イオンセンサーであり得る。ヌクレオチドがＤＮＡに付加されるとき、Ｈ＋が放出され得、それが、ｐＨの変化として測定され得る。Ｈ＋イオンは、電圧に変換され得、半導体センサーによって記録され得る。アレイチップには、ヌクレオチドが次々に連続的に注ぎ込まれ得る。スキャン、光またはカメラを不要にすることができる。場合によっては、ＩＯＮＰＲＯＴＯＮＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、核酸が配列決定される。場合によっては、ＩＯＮＰＧＭＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅｒが使用される。Ｔｈｅ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）。ＰＧＭは、２時間で１０００万リードを処理できる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）法などのＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が利用可能な技術の使用が必要である。ＳＭＳＳは、最大２４時間でヒトゲノム全体の配列決定を可能にするので、ユニークである。最後に、ＳＭＳＳは、米国公開出願番号２００６００２４７１１；２００６００２４６７８；２００６００１２７９３；２００６００１２７８４；および２００５０１００９３２に一部記載されている。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定には、その機器のＣＣＤカメラによって記録される、配列決定反応によって生成される化学発光シグナルを透過する光ファイバープレートを含むＰｉｃｏ  Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅデバイスなどの４５４  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）が利用可能な技術の使用が必要である。この光ファイバーの使用によって、４．５時間で最低２０００万塩基対の検出が可能である。
【０２２１】
ビーズ増幅の後の光ファイバー検出を使用するための方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；ならびに米国公開出願番号２００２００１２９３０；２００３００６８６２９；２００３０１００１０２；２００３０１４８３４４；２００４０２４８１６１；２００５００７９５１０、２００５０１２４０２２；および２００６００７８９０９に記載されている。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）または可逆的ターミネーター化学反応を利用する合成ごとの配列決定（ＳＢＳ）を用いて行われる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号；同第６，８９７，０２３号；同第６，８３３，２４６号；同第６，７８７，３０８号；および米国公開出願番号２００４０１０６１１０；２００３００６４３９８；２００３００２２２０７；およびＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００３，１７（１３）：３６に一部記載されている。
【０２２３】
次世代の配列決定法は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるリアルタイム（ＳＭＲＴＴＭ）技術を含み得る。ＳＭＲＴでは、４種のＤＮＡ塩基の各々が、４つの異なる蛍光色素のうちの１つに結合され得る。これらの色素は、リン連結型であり得る。単一のＤＮＡポリメラーゼが、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）の底において単一分子の鋳型一本鎖ＤＮＡに固定化され得る。ＺＭＷは、ＺＭＷの内外に急速に拡散し得る（単位はマイクロ秒）蛍光性ヌクレオチドのバックグラウンドに対して、ＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする閉じ込め構造であり得る。成長中の鎖にヌクレオチドを組み込むには、数ミリ秒を要し得る。この時間の間に、蛍光標識は、励起されて蛍光シグナルを生成し得、蛍光タグが、切り離され得る。ＺＭＷは、下から照らされ得る。励起ビームから減衰した光は、各ＺＭＷの下端２０〜３０ｎｍを透過し得る。２０ゼプトリットル（１０”リットル）の検出限界を有する顕微鏡が、創り出され得る。この小さい検出容積は、バックグラウンドノイズの低下において１０００倍の改善を提供し得る。その色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が組み込まれたかを示し得る。このプロセスは、繰り返され得る。
【０２２４】
場合によっては、次世代の配列決定法は、ナノポア配列決定｛例えば、Ｓｏｎｉ  ＧＶ
ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６−２００１を参照のこと）である。ナノポアは、直径がおおよそ約１ナノメートルの小さな穴であり得る。ナノポアを導電性流体に浸漬し、それに対して電位を印加すると、ナノポアを通過するイオンの伝導に起因して、わずかな電流が生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性であり得る。ＤＮＡ分子が、ナノポアを通過するとき、そのＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、異なる程度にナノポアを塞ぎ得る。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときにそのナノポアを通過する電流の変化が、ＤＮＡ配列の読みに相当し得る。ナノポア配列決定技術は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるもの；例えば、ＧｒｉｄｌＯＮシステムであり得る。単一のナノポアが、マイクロエウェルの上部を通ってポリマー膜に挿入し得る。各マイクロウェルは、個々の感知のための電極を有し得る。マイクロウェルは、１チップあたり１００，０００個以上のマイクロウェル（例えば、２００，０００個超、３００，０００個超、４００，０００個超、５００，０００個超、６００，０００個超、７００，０００個超、８００，０００個超、９００，０００個超または１，０００，０００個超）を有するアレイチップに製作され得る。機器（またはノード）が、チップを分析するために使用され得る。データは、リアルタイムで分析され得る。１つ以上の機器が、一度に稼働され得る。ナノポアは、タンパク質ナノポア、例えば、タンパク質アルファ−溶血素、七量体タンパク質ポアであり得る。ナノポアは、合成膜（例えば、ＳｉＮｘまたはＳｉ０２）において、作製された固体状態のナノポア、例えば、その膜に形成されたナノメートルサイズの穴であり得る。ナノポアは、ハイブリッドポア（例えば、固体状態の膜へのタンパク質ポアの組み込み）であり得る。ナノポアは、組み込まれたセンサー（例えば、トンネル電極検出器、容量検出器またはグラフェンベースのナノギャップもしくはエッジ状態検出器（例えば、Ｇａｒａｊら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照のこと））を有するナノポアであり得る。ナノポアは、特定のタイプの分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を分析するための官能性を有し得る。ナノポア配列決定法は、ＤＮＡがそのポアを移動するとき、リアルタイムで配列決定しながら、インタクトなＤＮＡポリマーがタンパク質ナノポアを通過し得る、「鎖配列決定」を含み得る。ある酵素が、二本鎖ＤＮＡの鎖を分離して、ナノポアを通る鎖を供給し得る。そのＤＮＡは、一方の端にヘアピンを有し得、このシステムは、両方の端を読むことができる。場合によっては、ナノポア配列決定法は、個々のヌクレオチドが、前進型エキソヌクレアーゼ（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によってＤＮＡ鎖から切断され得、それらのヌクレオチドが、タンパク質ナノポアを通過し得る、「エキソヌクレアーゼ配列決定法」である。それらのヌクレオチドは、ポア内の分子（例えば、シクロデキストラン）に一過性に結合し得る。電流の特徴的な妨害が、塩基を同定するために使用され得る。
【０２２５】
ＧＥＮＩＡのナノポア配列決定技術が、使用され得る。操作されたタンパク質ポアが、脂質二重膜中に組み込まれ得る。「アクティブコントロール（Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）」技術を使用することにより、効率的なナノポア−膜の組み立ておよびチャネルを介したＤＮＡの移動の制御が可能になり得る。場合によっては、ナノポア配列決定技術は、ＮＡＢｓｙｓによるものである。ゲノムＤＮＡが、約１００ｋｂの平均長の鎖に断片化され得る。その１００ｋｂのフラグメントは、一本鎖にされ、続いて、６ｍｅｒのプローブにハイブリダイズされ得る。そのプローブを有するゲノムフラグメントは、ナノポアを通過するように促され得、それにより、電流対時間の記録（ｃｕｒｒｅｎｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｉｍｅ  ｔｒａｃｉｎｇ）が作製され得る。その電流の記録は、各ゲノムフラグメント上のプローブの位置を提供し得る。そのゲノムフラグメントを並べることにより、そのゲノムに対するプローブマップが作製され得る。このプロセスは、プローブのライブラリーに対して並行して行われ得る。各プローブに対するゲノム長プローブマップが、生成され得る。「ハイブリダイゼーションによるムービングウインドウ配列決定法（ｍｏｖｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ｍｗＳＢＨ）」と呼ばれるプロセスによって、誤りが修正され得る。場合によっては、ナノポア配列決定技術は、ＩＢＭ／Ｒｏｃｈｅによるものである。電子線を使用して、ナノポアサイズの開口部がマイクロチップに作製され得る。電場を使用することにより、ＤＮＡを引き寄せるまたはナノポアに通すことができる。そのナノポアにおけるＤＮＡトランジスタデバイスは、ナノメートルサイズの金属層および誘電体層を交互に備え得る。ＤＮＡ骨格における不連続な電荷が、ＤＮＡナノポアの内側の電場によって捕捉されるようになり得る。ゲート電圧をオフおよびオンにすることにより、ＤＮＡ配列を読むことが可能になり得る。
【０２２６】
上記次世代配列決定は、ＤＮＡナノボール配列決定を含み得る（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって実施されるような；例えば、Ｄｒｍａｎａｃら（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：７８−８１を参照のこと）。ＤＮＡは、単離され、断片化され、サイズ選択され得る。例えば、ＤＮＡは、約５００ｂｐの平均長に（例えば、超音波処理によって）断片化され得る。アダプター（Ａｄ１）が、上記フラグメントの末端に結合され得る。上記アダプターは、配列決定反応用のアンカーにハイブリダイズするために使用され得る。各末端に結合したアダプターを有するＤＮＡが、ＰＣＲ増幅され得る。そのアダプター配列は、相補的な一本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように、改変され得る。上記ＤＮＡは、後の工程で使用されるＩＩＳ型制限酵素による切断からそのＤＮＡを保護するために、メチル化され得る。アダプター（例えば、右側のアダプター）は、制限酵素認識部位を有し得、この制限酵素認識部位は、メチル化されないままであり得る。上記アダプターにおけるメチル化されていない制限酵素認識部位は、制限酵素（例えば、ＡｃｕＩ）によって認識され得、そのＤＮＡは、右側のアダプターの１３ｂｐ右側でＡｃｕＩによって切断されて、直鎖状の二本鎖ＤＮＡを形成し得る。その直鎖状のＤＮＡのいずれかの末端に、第２ラウンドの右側および左側のアダプター（Ａｄ２）がライゲートされ得、両方のアダプターが結合したすべてのＤＮＡが、（例えば、ＰＣＲによって）ＰＣＲ増幅され得る。Ａｄ２配列は、互いに結合して環状ＤＮＡを形成できるように、改変され得る。上記ＤＮＡは、メチル化され得るが、制限酵素認識部位は、左側のＡｄ１アダプター上ではメチル化されないままであり得る。制限酵素（例えば、ＡｃｕＩ）が適用され得、ＤＮＡが、Ａｄ１の１３ｂｐ左側で切断されて、直鎖状のＤＮＡフラグメントが形成され得る。その直鎖状のＤＮＡの右側および左側に、第３ラウンドの右側および左側のアダプター（Ａｄ３）がライゲートされ得、得られたフラグメントが、ＰＣＲ増幅され得る。これらのアダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成し得るように改変され得る。ＩＩＩ型制限酵素（例えば、ＥｃｏＰ１５）が、加えられ得る；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の２６ｂｐ左側およびＡｄ２の２６ｂｐ右側で、そのＤＮＡを切断し得る。この切断は、ＤＮＡの大きいセグメントを除去し得、そのＤＮＡを再度直線化し得る。そのＤＮＡに、第４ラウンドの右側および左側のアダプター（Ａｄ４）がライゲートされ得、そのＤＮＡが（例えば、ＰＣＲによって）増幅され得、互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように改変され得る。
【０２２７】
ＤＮＡの小さいフラグメントを増幅するために、ローリングサークル複製（例えば、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用する）が使用され得る。４つのアダプター配列が、ハイブリダイズし得るパリンドローム配列を含み得、一本鎖が、それ自体に対して折り畳むことにより、直径が平均しておよそ２００〜３００ナノメートルであり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢＴＭ）を形成し得る。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（配列決定フローセル）に結合され得る（例えば、吸着によって）。そのフローセルは、二酸化ケイ素、チタンおよびヘキサメチルジシラザン（ｈｅｘａｍｅｈｔｙｌｄｉｓｉｌａｚａｎｅ）（ＨＭＤＳ）ならびにフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウエハであり得る。配列決定は、蛍光プローブをＤＮＡにライゲートすることによって、非鎖状配列決定（ｕｎｃｈａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって行われ得る。調査した位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって可視化され得る。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性が、決定され得る。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われ得る。特に、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０倍〜５０倍の増強を可能にする。ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓおよびそれらの使用方法は、国際公開出願番号ＷＯ０２０８８３８２、ＷＯ０３０２０９６８、ＷＯ０３０３１９４７、ＷＯ２００５０４４８３６、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５７、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５５；ならびに独国特許出願番号ＤＥ１０１４９７８６、ＤＥ１０２１４３９５、ＤＥ１０３５６８３７、ＤＥ１０２００４００９７０４、ＤＥ１０２００４０２５６９６、ＤＥ１０２００４０２５７４６、ＤＥ１０２００４０２５６９４、ＤＥ１０２００４０２５６９５、ＤＥ１０２００４０２５７４４、ＤＥ１０２００４０２５７４５およびＤＥ１０２００５０１２３０１に一部記載されている。
【０２２９】
他のハイスループット配列決定システムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４
Ｍａｒｃｈ  ２０００；およびＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；ならびに米国公開出願番号２００３００４４７８１および２００６／００７８９３７に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されるヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される組み立て品から粒子の起源および標的を同定するために必要な配列の長さは、核酸鎖１本あたりの特定の配列分析装置のリード長よりも短い。例えば、ＣＯＢ／ＥＳＢの組み合わせを同定するためのリードの全長は、そのＤＮＡ配列分析装置のＤＮＡ鎖１本あたりのリード長より短いことがある。所与の組み立て品のＣＯＢおよびＥＳＢを同定するために、１００、９０、８０、７０、５０、４０、３０、２０または１０未満のヌクレオチドで十分であり得る。対照的に、ＤＮＡ配列分析装置の潜在的な配列リードは、１リードあたり１００、２０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００塩基対超またはそれより長くてよい。そのような場合、より短いＣＯＢ−ＥＳＢの組み立て品またはそれらの全部もしくは一部の複製物が、例えば、ライゲーションおよび重合によって、ＤＮＡ配列分析装置の配列リードの全長まで互いに追加され得る。したがって、各配列リードは、複数の組み立て品、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００個の組み立て品またはそれより多くの粒子起源および標的を同定し得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせの配列分析は、４つの位置のうちの１つに対するアンカープライマーのハイブリダイズを含む、ライゲーションスキーム（縮重ライゲーション）による４色配列決定を含み得る。次いで、蛍光色素で標識された縮重九量体の集団とアンカープライマーとの酵素的ライゲーション反応が行われる。任意の所与のサイクルにおいて、使用される九量体の集団は、その位置のうちの１つの同一性が、その九量体に付着させられたフルオロフォアの同一性と相関するような構造である。そのリガーゼが、問い合わされた位置における相補性について判別する限りにおいては、蛍光シグナルは、塩基の同一性の推測を可能にする。ライゲーションおよび４色イメージングを行った後、アンカープライマー：九量体複合体は、取り除かれ、新しいサイクルが開始する。ライゲーションを行った後に配列情報を画像化する方法は、当該分野で公知である。
【０２３２】
１つ以上のＵＢＡ、ＥＳＢ、ＣＯＢ、ＵＢＡ／ＥＳＢ複合体、ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢ複合体、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体および／またはそれらの組み合わせ複合体は、組み立てられた目的の検出複合体の存在を検出および／または定量する任意の方法によって検出および／または定量され得る。そのような方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、共焦点顕微鏡を用いるかまたは用いない免疫蛍光組織化学、ラマン分光法、Ｘ線オートラジオグラフィー、Ｘ線ラジオグラフィー、ルミネセンス分光法、逆相アッセイ、均一酵素免疫測定法および関連する非酵素的手法、ウエスタンブロット、全細胞染色、免疫電子顕微鏡法、核酸増幅、遺伝子アレイ、タンパク質アレイ、質量分析、パッチクランプ、２次元ゲル電気泳動、ディファレンシャルディスプレイゲル電気泳動、ミクロスフェアベースの多重化タンパク質アッセイ、無標識細胞アッセイならびにフローサイトメトリーなどが挙げられ得る。米国特許第４，５６８，６４９号には、シンチレーション測定法を用いるリガンド検出システムが記載されている。これらの手法は、改変されたタンパク質パラメータにとって特に有用である。タンパク質および他の細胞決定因子についての細胞の読み出しは、蛍光または別の方法でタグ化されたレポーター分子を用いて得ることができる。形態学的背景においてパラメータを測定するためには顕微鏡法が有用である。細胞内のパラメータを測定するためにはフローサイトメトリー法が有用である。
【０２３３】
蛍光標識された構成要素を本発明の方法および組成物において使用するとき、種々のタイプの蛍光モニタリングシステム、例えば、サイトメトリー測定デバイスシステムを用いることにより本発明が実施され得ることが認識されるだろう。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーシステム、またはハイスループットスクリーニング専用のシステム、例えば、９６ウェルもしくはそれ以上のマイクロタイタープレートが使用される。例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｂ．，Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｉｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，ｅｄ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．＆Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｌ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ｐｐ．２１９−２４３；Ｔｕｒｒｏ，Ｎ．Ｊ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｌ，Ｉｎｃ．（１９７８），ｐｐ．２９６−３６１。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体が、蛍光標識される場合、適切な励起源の適切な考慮が検討され得る。可能性のある励起源としては、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオードまたはそれらのいくつかの組み合わせが挙げられ得るがこれらに限定されない。適切な励起源は、適切な光学的検出システム、例えば、倒立蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される。好ましくは、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上のスポットの配列を決定するのに十分な空間分解能での検出を可能にし得る顕微鏡が使用される。例えば、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体が、３つの異なる色、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ６４７で標識される場合（それぞれ１、２および３と表示される）、色１、２および３は各々、異なるチャネルにおいて取得され、第１および第２のレジスター（それらは、スポットの列として見ることができる）は、数画素ずつ移動することにより、各レジスターを個別に示すことができる。本発明の方法において使用され得る複数個の色を検出するための方法の例は、米国特許第７，４７３，７６７号、米国特許公開番号２００７／０１６６７０８、米国出願番号１１／６４５，２７０およびＰＣＴ出願番号ＵＳ０６／０４９２７４（その全体が本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【０２３４】
サンプル中の蛍光は、蛍光光度計を用いて測定され得る。蛍光を検出する他の方法、例えば、量子ドット法（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：６３７８−８２；Ｐａｔｈａｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３：４１０３−４；およびＲｅｍａｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）１８：５５３−８（各々明確に本明細書中で参照により援用される）を参照のこと）ならびに共焦点顕微鏡も使用してよい。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳ細胞選別機（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ，ＬＳＲＩＩまたはＣａｎｔｏ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）が、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の有無に基づいて細胞を選別および回収するために使用される。ポジティブ細胞を含む液滴に電磁電荷（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ
ｃｈａｒｇｅ）を与えることによって、それらの細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、ポジティブ選択された細胞は、滅菌された回収容器に収集され得る。これらの細胞選別手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ．Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌに詳細に記載されており、特に、３−１１から３−２８および１０−１から１０−１７の項を参照のこと（それらは、上記装置についてその全体が本明細書によって参照により援用される）。
【０２３６】
別の実施形態において、ポジティブ細胞は、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在に基づく細胞の磁気分離を用いて選別され得る。そのような分離手法では、まず、ポジティブ選択される細胞を、回収可能な粒子（例えば、磁力的に反応性の粒子）を含むＣＯＢ／ＥＳＢ複合体と接触させる。次いで、その細胞を、例えば、磁場を用いて、ポジティブでないかまたは標識されていない細胞から物理的に分離し得る。磁力的に反応性の粒子を使用するとき、ポジティブまたは標識された細胞は、磁場を用いて容器内に保持され得るが、ネガティブ細胞は、除去される。これらのおよび類似の分離手順は、例えば、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｓｏｌｅｘトレーニングマニュアル（その全体が本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞が、９６ウェルプレートまたは他の商業的に入手可能なマルチウェルプレートのウェルに含められる。代替の実施形態では、反応混合物または細胞が、サイトメトリー測定デバイスに入れられる。本発明において有用な他のマルチウェルプレートとしては、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートが挙げられるが、これらに限定されない。反応混合物または細胞を含めるため、かつ本発明において有用ななおも他の容器は、当業者に明らかであろう。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在量は、誘導結合プラズマ質量分析計（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて測定される。特定の元素で標識されたＵＢＡは、ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体に結合する。細胞がＩＣＰに導入されると、それは、霧状にされて、イオン化される。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体を含む細胞の元素組成が測定される。ＣＯＢ／ＥＳＢ複合体上の標識に対応するシグナルの存在および強度は、その細胞上のＣＯＢ／ＥＳＢ複合体の存在量を示唆する（Ｔａｎｎｅｒら、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｔｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，（２００７），６２（３）：１８８−１９５）。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、「フローサイトメーター」は、複数個のチャネルの並列セットにおける検出デバイスを細胞が通り過ぎるように指示するように工夫されたチャネルにおいて、細胞の測定または細胞の内容物の測定のいくつかが行われるマイクロ流体デバイスである。米国特許第７，３７８，２８０号；同第７，２９４，５０３号；同第７，２９４，２９８号；および同第６，８３０，９３６号を参照のこと。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、細胞またはそれらの内容物のいくらかの一部は、超音波によって液体の個々の液滴内に被包され、個々の各液滴の特徴およびそのような液滴内の物質を測定するようにデザインされた検出デバイスを用いて調べられる。
【０２４１】
適応性のあるハードウェアおよびソフトウェアのおかげで、複数の適用に装置を適合させることができる。ソフトウェアプログラムモジュールが、方法の作製、改変および実行を可能にする。システム診断モジュールが、装置の配列、正しい接続および電動操作を可能にする。カスタマイズされたツール、実験器具、ならびに液体、粒子、細胞および生物の移動パターンが、種々の適用法の実行を可能にする。データベースが、方法およびパラメータの保存を可能にする。ロボットおよびコンピュータのインターフェースが、装置間の通信を可能にする。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、液体を取扱う構成要素の使用を含む。その液体を取扱うシステムは、任意の数の構成要素を備えるロボットシステムを含み得る。さらに、本明細書中に概説される工程のいずれかまたはすべてが、自動化されてよい；したがって、例えば、それらのシステムは、完全または部分的に自動化されてよい。
【０２４３】
当業者に認識されるように、使用され得る多種多様の構成要素が存在し、それらとしては、１つ以上のロボットアーム；マイクロプレートの位置調整のためのプレートハンドラー；非相互汚染プレート上のウェルに対する蓋をはずして交換するための自動化された蓋またはキャップハンドラー；使い捨てチップを備えたサンプル分配用のチップアセンブリ；サンプル分配用の洗浄可能なチップアセンブリ；９６ウェルローディングブロック；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（必要に応じて冷却される）；プレートおよびチップ用のスタッキングタワー；およびコンピュータシステムが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４４】
完全にロボットのまたはマイクロ流体のシステムには、スクリーニング適用の全工程を行う、ハイスループットピペッティングを含む自動化された液体、粒子、細胞および生物の取扱いが含まれる。これには、液体、粒子、細胞および生物の操作（例えば、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容積移動；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに単一サンプルの吸引からの複数個の送達に対して同一の容積の繰返しのピペッティング）が含まれる。これらの操作は、相互汚染のない液体、粒子、細胞および生物の移動である。この装置は、フィルター、膜および／または娘プレートへのマイクロプレートサンプルの自動化された複製、高密度移動、全プレートの連続希釈ならびに大容量の操作を行う。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、アッセイの構成要素に対して特異性を有する、化学的に誘導体化された粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁性粒子または他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、チューブまたは任意の固相マトリックスの結合表面としては、無極性表面、高極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドに結合する親和性媒体、表面に固定されたタンパク質（例えば、組換えプロテインＡまたはＧ）、ヌクレオチドレジンまたはコーティングおよび他の親和性マトリックスが挙げられ、本発明において有用である。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、音波レビテーションおよび封入、深ウェルプレート、マイクロ遠心管、クライオバイアル、四角形のウェルプレート、フィルター、チップ、マイクロチャネルチップ、マイクロ流体チップ、光ファイバー、ビーズおよび他の固相マトリックスに対するプラットフォーム、または様々な容量を有するプラットフォームが、さらなる能力のためにアップグレードできるモジュラープラットフォームに収容される。このモジュラープラットフォームは、供給源のサンプル、サンプルおよび試薬希釈のための速度可変式オービタルシェーカーおよびマルチポジションワークデッキ、アッセイプレート、サンプルおよび試薬レザバー、ピペットチップならびにアクティブウォッシュステーションを備える。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プレートリーダーの使用を含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、サンプルのインキュベートを０℃から１００℃まで正確に温度制御するための制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるために、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）および温度制御システムが使用される。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、単一もしくは複数個の磁性プローブ、親和性プローブまたはピペッターを備える相互交換可能であるピペットヘッド（単一またはマルチチャネル）は、液体、粒子、細胞および生物をロボット制御で操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気選別機またはプラットフォームは、単一または複数個のサンプルの形式で液体、粒子、細胞および生物を操作する。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、計測装置は、標識およびアッセイに応じて多種多様の異なる検出器であり得る検出器を備え得る。いくつかの実施形態において、有用な検出器としては、蛍光の複数個のチャネルを備える顕微鏡；一波長および二波長エンドポイントおよび動力学的能力、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ルミネセンス、クエンチング、二光子励起ならびに強度再分配（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を伴った蛍光、紫外線および可視光の分光光度的検出を提供するプレートリーダー；データおよび画像を捕捉して定量化可能な形式に変換するためのＣＣＤカメラ；ならびにコンピュータワークステーションが挙げられる。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、ロボット装置は、バスを介してメモリーおよび入力／出力デバイスセット（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）と通信する中央処理装置を備える。また、下で概説されるように、これは、ＣＰＵに加えてまたはその代わりに、本発明のデバイスを多重化するためのものであり得る。中央処理装置とメモリーと入力／出力デバイスとバスとの間の一般的な相互作用は、当該分野で公知である。したがって、行われる実験に応じて、種々の異なる手順がＣＰＵメモリーに蓄えられる。
【０２５１】
これらのロボットによる流体取扱いシステムは、任意の数の異なる試薬（緩衝液、試薬、サンプル、洗浄液、標識プローブなどのアッセイ構成要素などを含む）を使用し得る。
【０２５２】
標的分子検出の適用
本発明の組成物および方法は、診断、予後診断、治療、患者の層別化、薬物の開発、処置の選択およびスクリーニングの目的のために、使用され得る。本発明は、多くの異なる標的分子が、本発明の方法を用いて単一の生体分子サンプルから一度に分析され得るという利点を提供する。このおかげで、例えば、いくつかの診断テストを１つのサンプルにおいて行うことが可能になる。単一のサンプル内で分析される異なる標的分子の量は、少なくとも、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００、１００００００００、１０００００００００またはそれより多くの範囲に及び得る。
【０２５３】
本発明の組成物および方法は、プロテオミクスにおいて使用され得る。本明細書中に記載される方法は、代表的には、答えを迅速に出し、これは、この適用法にとって非常に望ましい。本明細書中に記載される方法および組成物は、診断または予後診断のためにならびに健康および疾患の指標として使用され得る生物学的マーカーを見つけ出すプロセスにおいて使用され得る。本明細書中に記載される方法および組成物は、薬物をスクリーニングするため、例えば、薬物の開発、処置の選択、処置の有効性の決定、および／または医薬開発のための標的を同定するために、使用され得る。タンパク質は、体内の最終的な遺伝子産物であるので、薬物が関与するスクリーニングアッセイにおいてタンパク質発現を試験できることは、非常に重要である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物は、タンパク質と遺伝子発現の両方を同時に測定し得、これは、行われている特定のスクリーニングに関する最大量の情報を提供し得る。
【０２５４】
本発明の組成物および方法は、遺伝子発現分析において使用され得る。本明細書中に記載される方法は、ヌクレオチド配列を区別する。標的ヌクレオチド配列間の差異は、例えば、単一核酸塩基の差異、核酸の欠失、核酸の挿入または再配列であり得る。２つ以上の塩基が関わるそのような配列の差異も、検出され得る。いくつかの実施形態において、ＵＢＡ、例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、それらが実質的に類似のハイブリダイゼーション条件において標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さを有する。結果として、本発明のプロセスは、感染症、遺伝性疾患およびがんを検出することができる。本発明のプロセスは、環境モニタリング、法医学および食品科学においても有用である。核酸において行われ得る遺伝子分析の例としては、例えば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出、ＲＮＡ発現分析、プロモーターメチル化、遺伝子発現、ウイルス検出、ウイルス細分類および薬物耐性が挙げられる。
【０２５５】
本方法は、生体分子サンプル中に病的な細胞型が存在するか否か、その疾患のステージ、患者の予後、その患者が特定の処置に応答する能力またはその患者に対する最良の処置を決定するために、その患者から得られたかまたはその患者に由来するサンプルの分析に適用され得る。本方法は、特定の疾患に対する生物学的マーカーを同定するためにも適用され得る。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、ある状態の診断において使用される。本明細書中で使用されるとき、用語「診断する」またはある状態の「診断」は、その状態を予測するかまたは診断すること、その状態に対する素因を決定すること、その状態の処置をモニターすること、その疾患の治療的応答を診断すること、ならびにその状態、状態の進行およびその状態の特定の処置に対する応答を予後診断することを含む。例えば、血液サンプルが、本明細書中に記載される方法のいずれかに従ってアッセイされて、そのサンプル中の疾患または悪性細胞タイプのマーカーの存在および／または量を測定することにより、疾患またはがんが診断され得るかまたはステージ決定され得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物は、ある状態の診断および予後診断に使用される。
【０２５８】
数多くの免疫学的、増殖性および悪性の疾患および障害が、本明細書中に記載される方法に特に適用できる。免疫学的疾患および障害としては、アレルギー性疾患および障害、免疫機能の障害ならびに自己免疫疾患および状態が挙げられる。アレルギー性疾患および障害としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーが挙げられるがこれらに限定されない。免疫不全としては、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、好酸球増多症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症ＩおよびＩＩ型、高ＩｇＥ症候群、チェディアック・東、好中球増加症、好中球減少症、無形成症、無ガンマグロブリン血症、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ／口蓋心臓顔面（Ｖｅｌｏｃａｒｄｉａｌ−ｆａｃｉａｌ）症候群ならびにインターフェロンガンマ−ＴＨ１経路欠陥が挙げられるがこれらに限定されない。自己免疫性障害および免疫調節不全障害としては、関節リウマチ、糖尿病、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、グレーブス眼症、クローン病、多発性硬化症、乾癬、全身性硬化症、甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ａｅｒａｔａ）、自己免疫性心筋炎、硬化性苔癬、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、萎縮性胃炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および炎症性腸疾患、同種移植片拒絶反応、ならびに感染性微生物または環境抗原に対するアレルギー反応による組織破壊が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５９】
本発明の方法によって評価され得る増殖性疾患および障害としては、新生児血管腫症；二次性進行型多発性硬化症；慢性進行型骨髄変性疾患；神経線維腫症；節神経腫症；ケロイド形成；骨パジェット病；線維嚢胞性疾患（例えば、乳房または子宮の）；サルコイドーシス；ＰｅｒｏｎｉｅｓおよびＤｕｐｕｔｒｅｎ線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症ならびに血管再狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６０】
本発明の方法によって評価され得る悪性疾患および障害には、血液悪性腫瘍と固形腫瘍の両方が含まれる。
【０２６１】
血液悪性腫瘍は、血液由来の細胞の変化を伴うので、そのような悪性腫瘍は、サンプルが血液サンプルであるとき本発明の方法に特に適用できる。そのような悪性腫瘍には、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非Ｂ細胞リンパ腫および他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、骨髄線維症、非定型免疫リンパ球増殖（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ）および形質細胞障害が含まれる。
【０２６２】
本発明の方法によって評価され得る形質細胞障害には、多発性骨髄腫、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。
【０２６３】
固形腫瘍の例としては、結腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝臓がん、骨肉腫および他の骨がん、精巣がん腫および卵巣がん腫、頭頸部腫瘍ならびに頸部新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６４】
遺伝性疾患もまた、本発明のプロセスによって検出され得る。これは、染色体および遺伝子の異常または遺伝性疾患についての出生前または出生後のスクリーニングによって行うことができる。検出可能な遺伝性疾患の例としては：２１水酸化酵素欠損症、嚢胞性線維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ダウン症候群または他のトリソミー、心疾患、単一遺伝子疾患、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ・サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、異常肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、血友病、先天性代謝異常および糖尿病が挙げられる。
【０２６５】
本明細書中に記載される方法は、病原体感染、例えば、細胞内の細菌およびウイルスによる感染を、それぞれサンプル中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量を決定することによって、診断するために使用され得る。
【０２６６】
多種多様の感染症が、本発明のプロセスによって検出され得る。代表的には、これらは、細菌、ウイルス、寄生生物および真菌の感染病原体によって引き起こされる。薬物に対する様々な感染病原体の耐性も、本発明を用いて決定することができる。
【０２６７】
本発明によって検出され得る細菌の感染病原体としては、大腸菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＫｌＥＳＢｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、ＮｏｃａｒｄｉａおよびＡｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓが挙げられる。
【０２６８】
本発明によって検出され得る真菌の感染病原体としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ、藻菌類（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、ＣｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓおよびＭａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓが挙げられる。
【０２６９】
本発明によって検出され得るウイルスの感染病原体としては、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルスおよびレオウイルスが挙げられる。
【０２７０】
本発明によって検出され得る寄生物質としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｌａｔｉｄｉｕｍ
ｃｏｌｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｓｉｓ、ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉおよびＮｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｉｓが挙げられる。
【０２７１】
本発明は、感染病原体による薬物耐性の検出にとっても有用である。例えば、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、多剤耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスのすべてが、本発明を用いて同定され得る。
【０２７２】
したがって、本発明の組成物および方法を用いて検出される標的分子は、患者マーカー（例えば、がんマーカー）または外来性物質による感染のマーカー（例えば、細菌またはウイルスマーカー）であり得る。
【０２７３】
ＵＢＡ／ＥＳＢ／ＣＯＢの定量的性質のおかげで、本発明の組成物および方法を用いることにより、標的分子（その存在量は、生物学的状態または疾患状態を示す）、例えば、疾患状態の結果としてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる血液マーカーを定量することができる。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、サイトカイン検出のために使用され得る。本明細書中に記載される方法が低感度であれば、例えば、ある状態の生物学的マーカーとしてのサイトカインの早期検出、がんなどの疾患の診断または予後診断、および無症候性の状態の同定にとって有益であり得る。
【０２７５】
キット
本発明は、本発明の１つ以上の構成要素を備えるキットをさらに提供する。そのキットは、例えば、１つ以上のＵＢＡ、１つ以上のＥＳＢおよび／または１つ以上のＡＰＳを備え得る。そのキットは、上に記載された目的を含む当業者に明らかな任意の目的のために使用され得る。
【０２７６】
ある特定の実施形態において、本発明は、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長および選択的固定化にとって有用なキットも提供する。そのキットは、固定化のための基材、ならびにＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長または固定化を促進する１つ以上の結合パートナーを備え得る。その結合パートナーは、ある特定の実施形態において、適切な力における、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの伸長にとって有用な部分を含み得る。ある特定の実施形態において、その結合パートナーは、表面へのＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの固定化または選択的固定化を促進し得る。さらなる実施形態において、キットは、ＣＯＢ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせを伸長することができるデバイスを備え得る。
【０２７７】
上記キットは、本明細書中に記載されるようなＣＯＢ、ＡＰＳ、ＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはそれらの組み合わせの集団を備え得る。標的に特異的な１つ以上のＵＢＡ、ＥＳＢおよび／またはＣＯＢの一部分は、標識を欠き得るか、またはそうでなければ、標的分子の代表的な検出を妨害され得る。
【０２７８】
上記キットは、ＡＰＳを標識するための１つ以上の構成要素で予め標識されたＡＰＳまたは標識されていないＡＰＳを備え得る。さらに、キット内に提供されるＥＳＢおよび／またはＡＰＳは、予め付着させられたＵＢＡを有していてもよいし、有していなくてもよい。１つの実施形態において、ＥＳＢおよび／またはＡＰＳに付着させられていないＵＢＡが、キット内に提供される。
【０２７９】
上記キットは、リンカーオリゴおよび架橋オリゴなどの他の試薬を備え得る。いくつかの実施形態において、そのキットは、種々のプレミックスにＵＢＡを分離し得る。
【０２８０】
上記キットは、他の試薬、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行うための緩衝液、リンカー、制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ  Ｉリガーゼも備え得る。
【０２８１】
上記キットは、キットの構成要素を使用するためならびに／あるいはＡＰＳ、ＣＯＢ、ＵＢＡおよび／またはＥＳＢを作製および／もしくは使用するための指示書も備え得る。
【実施例】
【０２８２】
仮想実施例（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ  Ｅｘａｍｐｌｅ）１−オリゴヌクレオチド調製
当該分野で公知の標準的な手法に従って、オリゴヌクレオチドが合成され得る。例えば、３９４Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）においてオリゴヌクレオチドが合成され得る。
【０２８３】
そのオリゴヌクレオチドを、５５℃で一晩脱保護した後、エタノール沈殿によって精製する。ＰＣＲ増幅に使用されるそのオリゴヌクレオチドのプライマー特異的部分を、１０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。電気泳動後にオリゴヌクレオチドを、照射スクリーン（ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）に対するＵＶシャドーイングによって可視化し、そのゲルから切り出す（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，１９９２）。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、ＴＮＥ（すなわちＴｒｉｓ−ナトリウムＥＤＴＡ）緩衝液（５００ｍＭ
ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中で６４℃において一晩溶出し、Ｓｅｐ  Ｐａｋカートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を製造者の指示書に従って使用して溶出物から回収する。
【０２８４】
オリゴヌクレオチドを、１００μｌのＴＥ（すなわち、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）に再懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの原液の代表的な濃度は、約１μｇ／μｌまたはおよそ７４ｐｍ／μｌである。
【０２８５】
ライゲーション反応に対する必要条件として、それらのオリゴヌクレオチドを、５’末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。２００ｐｍに等しいそれらのオリゴヌクレオチドのアリコートを、１０μｌの１０×キナーゼ緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２０Ｕ  Ｔ４キナーゼ、および１００μｌという最終容積を得るのに十分な水−ＭＥと組み合わせる。リン酸化を３７℃で３０分間行った後、８５℃で１０分間インキュベートすることにより、Ｔ４酵素を不活性化する。
【０２８６】
そのオリゴヌクレオチドの溶液を好都合な濃度に調整する。キナーゼ処理された（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチド溶液を水で４倍希釈して、１０００ｆｍ／μｌという濃度を得る。２００ｐｍに等しいオリゴヌクレオチドの容積を、４００μｌという最終容積を得るのに十分な水と組み合わせることによって、オリゴヌクレオチドの溶液を作製する。これにより、各オリゴヌクレオチドにおいて１０００ｆｍ／μｌの溶液が生成された。キナーゼ処理されたオリゴヌクレオチドおよびキナーゼ処理されていないオリゴヌクレオチドのアリコート（２０μｌ）をその後の使用のために凍結する。
【０２８７】
クリックケミストリー用のオリゴヌクレオチドの合成および精製の一般的方法
Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているようにオリゴヌクレオチドを合成する。簡潔には、標準的なＤＮＡホスホラミダイト、固体支持体およびさらなる試薬をＬｉｎｋ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入する。酸触媒脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよびヨウ素酸化の標準的な０．２または１．０μモルのホスホラミダイトサイクルを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置においてオリゴヌクレオチドを合成する。すべてのβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーを、使用の直前に無水アセトニトリルに０．１Ｍの濃度に溶解する。通常のＡ、Ｇ、ＣおよびＴモノマーに対するカップリング時間は、３５秒であるのに対し、逆アミダイト（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｍｉｄｉｔｅ）に対するカップリング時間は、１８０秒である。アルキンホスホラミダイトモノマー（図２の２ｃ、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）および他の非標準的モノマーは、３６０秒間カップリングされる。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、濃アンモニア水性溶液に室温で６０分間曝露した後、密閉チューブ内において５５℃で５時間加熱することによって達成される。そのオリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム中のアセトニトリルの勾配（３０分間にわたる０％〜５０％緩衝液Ｂ、流速４ｍＬ／分）、緩衝液Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ：５０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．０でＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＢＥＨ３００  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  １０μＭ  １０×２５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用するＧｉｌｓｏｎシステムにおける逆相ＨＰＬＣで精製する。３０５または２９５ｎｍにおけるＵＶ吸収によって溶出をモニターする。ＨＰＬＣ精製後、オリゴヌクレオチドを、ＮＡＰ−１０カラムを使用して脱塩し、ゲル電気泳動によって分析する。
【０２８８】
ｉ）３’−アルキンオリゴヌクレオチドの合成
３’−アルキンオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（３５）：１５３２９−１５３３４）に従って、３’−プロパルギルチミジンホスホラミダイトモノマー２ｃを用いて、ならびにＡ、Ｇ、ＣおよびＴの３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）デオキシリボヌクレオシド−５’−ホスホラミダイト（逆ホスホラミダイト，Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるか、または５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−プロパルギル−５−メチル−デオキシシチジンを固体支持体（３３μｍｏｌ／ｇのローディング，ＡＭポリスチレン，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に付着することによって、必要とされる配列を５’から３’の方向で組み立てて、３’−アルキンオリゴヌクレオチドを合成する。レジンをツイストカラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に詰め、次いでそれを用いて、必要とされる配列を標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成によって３’から５’の方向で組み立てる。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように切断し、脱保護し、精製する。
【０２８９】
ｉｉ）５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成
５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、通常の５’−ＨＯ−ｄＣ、５’−ＨＯ−ｄＴを用いて（またはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製の商業的に入手可能な５’−ヨードｄＴモノマーを使用する５’−ヨード−ｄＴを用いて）、一般的方法（上記）に記載されたような０．２または１．０μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドを組み立てる（トリチルオフ）。５’−ヒドロキシル基を５’−ヨードに変換するために、合成カラムに付着させられた保護されたオリゴマーを、ＤＭＦ中のヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウムの０．５Ｍ溶液（１．０ｍＬ）で処理し、それは、室温において１５分間にわたって２本の１ｍＬ注射器によって一定間隔をあけて上記カラムに通す。次いで、そのカラムを乾燥ＤＭＦで数回洗浄する。その５’−ヨード（ｄＴまたはｄＣ）を５’−アジド（ｄＴまたはｄＣ）に変換するために、アジ化ナトリウム（５０ｍｇ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に懸濁し、７０℃で１０分間加熱し、次いで、冷却し、上清を１ｍＬ注射器に吸い上げ、カラムに往復させて通し、次いで、室温で一晩（または５５℃で５時間）放置する。次いで、そのカラムをＤＭＦおよびアセトニトリルで洗浄し、アルゴンガス流を通すことによって乾燥する。得られる５’−アジドオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように固体支持体から切断し、脱保護し、精製する。
【０２９０】
ｉｉｉ）３’−アルキン−５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成
３’−アルキン−５’アジドオリゴヌクレオチドの合成を、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，２０１１）に記載されているように行う。簡潔には、ポリスチレン固体支持体上の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−プロパルギル−５−メチルデオキシシチジンをツイストカラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に詰め、それを用いて、５’末端に５’−ヨードｄＴ、５’−ＨＯ−ｄＴまたは５’−ＨＯ−ｄＣを有する必要とされる配列を３’から５’の方向で組み立てる（標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成）。次いで、その５’−ヒドロキシルまたはヨード基を、５’−アジドオリゴヌクレオチドの合成のための上に記載した条件を用いてアジドに変換する。
【０２９１】
仮想実施例２．クリックケミストリーライゲーション
オリゴヌクレオチドＡＰＳを、鋳型にアニールさせ、４℃で一晩維持する。ＣｕＩクリック触媒の溶液を、Ｃｈａｎらに記載されているようなｔｒｉｓ−ヒドロキシプロピルトリアゾールリガンド（Ｃｈａｎ  ＴＲ，Ｈｉｌｇｒａｆ  Ｒ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，＆  Ｆｏｋｉｎ  ＶＶ（２００４）Ｐｏｌｙｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ａｓ  ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．６（１７）：２８５３−２８５５；０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の２．８μｍｏｌ，３８．０μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の４．０μｍｏｌ，８．０μＬ）およびＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．２Ｍ  ＮａＣｌ中の０．４μｍｏｌ，４．０μＬ）から調製する。この溶液を、アニールされたオリゴヌクレオチドに加え、その反応混合物を０℃で１時間維持し、次いで、室温でさらに１時間維持する。ＮＡＰ−２５ゲル濾過カラムを用いて、試薬を除去する。
【０２９２】
仮想実施例３．ビーズ上でのＣＯＢの分割プール合成
この実施例では、ＣＯＢをビーズに付着させられた状態で合成する。ＡＰＳをＣＯＢに組み立てるために４つの異なる方法が使用される。
【０２９３】
パッチワークＣＯＢ（図６）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２９４】
１ラウンド目において、各ＡＰＳは、一方の末端に、ＣＬオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補的なアニーリング領域１、および他方の末端にアニーリング領域２を含む。そのオリゴヌクレオチドＡＰＳは、加えられると、相補的なアニーリング領域１に沿ってＣＬオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。アニーリング領域２は、一本鎖のままであり、その後のラウンドに加えられるＡＰＳとのハイブリダイゼーションに利用可能である。その後のラウンドにおいて、各ＡＰＳは、一方の末端に、前のラウンドのＡＰＳの利用可能なアニーリング領域に相補的なアニーリング領域、および他方の末端にさらなるアニーリング領域を含む。加えられたＡＰＳは、相補的なアニーリング領域に沿って前のラウンドに加えられたＡＰＳとハイブリダイズする。
【０２９５】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０２９６】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０２９７】
各ラウンドにおいてＡＰＳを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いて互いに継ぎ合わされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０２９８】
プライマーの特異的アニーリングを用いたステッチＣＯＢ（図７）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０２９９】
アニーリングプライマーも加える。１ラウンド目において、そのアニーリングプライマーは、ＣＬオリゴヌクレオチドに対する相補的領域およびＡＰＳに対する相補的領域を有する。そのアニーリングプライマーは、その両方とハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。その後のラウンドにおいて、アニーリングプライマーは、その前のラウンドに加えられたＡＰＳに対する相補的領域およびそのラウンドにおいて加えられているＡＰＳに対する相補的領域を有する。同様に、アニーリングプライマーは、その後のラウンドのＡＰＳとハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。アニーリングプライマーの相補的領域は、各ラウンドに特異的であり、それにより、その前のラウンドとそのラウンドのサブユニットとだけの効率的なハイブリダイゼーションが可能になる。したがって、アニーリングプライマーは、それより前のラウンドのサブユニット（そのラウンドのアニーリングプライマーに対する相補的領域を有しない）にハイブリダイズしないので、特定のラウンドのサブユニットを欠くＣＯＢのさらなる合成が阻止される。
【０３００】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０３０１】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０３０２】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０３０３】
共通の相補的領域を有するプライマーのアニーリングを用いたステッチＣＯＢ（図８）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つおよび共通のアニーリング領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０３０４】
アニーリングプライマーも加える。１ラウンド目において、そのアニーリングプライマーは、ＣＬオリゴヌクレオチドに対する第１の相補的領域およびこのラウンドにおいて加えられるＡＰＳに対する第２の相補的領域を有する。そのアニーリングプライマーは、その両方とハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。その後のラウンドにおいて、アニーリングプライマーは、その前のラウンドに加えられたＡＰＳに対する第１の相補的領域およびそのラウンドにおいて加えられているＡＰＳに対する第２の相補的領域を有する。同様に、アニーリングプライマーは、その後のラウンドのＡＰＳとハイブリダイズして、それらを互いにステッチする。アニーリングプライマーの２つの相補的領域のうち、第１の相補的領域は、各ラウンドに特異的であり、それにより、その前のラウンドのサブユニットとだけの効率的なハイブリダイゼーションが可能になる。したがって、アニーリングプライマーは、それより前のラウンドのサブユニット（そのラウンドのアニーリングプライマーに対する相補的領域を有しない）にハイブリダイズしないので、特定のラウンドのサブユニットを欠くＣＯＢのさらなる合成が阻止される。
【０３０５】
最後のサブユニットは、必要に応じて、ＰＣＲまたは配列決定プライマーのハイブリダイゼーションのための第２の増幅プライマー相補的領域を含む。
【０３０６】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０３０７】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０３０８】
ループＣＯＢ（図９）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの１つ、６対のＡＰＳ特異的ループアニーリング領域および自由選択の第２の増幅プライマー相補的領域を有する）で標識する。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
【０３０９】
上記ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされており、各端において、そのラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ、次いでそれらは、互いに連結される。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされている。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）ＣＯＢが合成される。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０３１０】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０３１１】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、ポリメラーゼ／リガーゼを用いるかまたは実施例１に記載されたようにクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０３１２】
ポリメラーゼなしでのＣＯＢ−ＥＳＢ連結（図１０）
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）ビーズを、１０個の異なるＣＬオリゴヌクレオチド（各々が、１０個の異なるループＥＳＢ配列のうちの１つに特異的な１対のループアニーリング領域および６対のＡＰＳ特異的ループアニーリング領域を有する）で標識する。１０個のループＥＳＢ配列のすべてを加えることにより、ループ形状でＣＬのループＥＳＢ特異的部分にアニールさせる。ループＥＳＢ配列は、ＣＬのループＥＳＢ特異的領域の残りの部分に対する非特異的なアニーリングを最小にするようにデザインされている。ループＥＳＢ配列は、自由選択の第１の増幅プライマー相補的領域、ＥＳＢ配列、およびＣＬ中のループＥＳＢ特異的ループアニーリング領域に十分に相補的な１対のアニーリング領域を含む。６ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを２０個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドＡＰＳを各容器に加える（合計２０個の異なるＡＰＳ）。所与のラウンドにおける各ＡＰＳは、そのラウンドにおける残りのＡＰＳと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。最後のラウンドのＡＰＳは、必要に応じて、第２の増幅プライマー相補的領域をさらに含む。
【０３１３】
上記ＡＰＳは、ループ形状でＣＬにハイブリダイズするようにデザインされており、各端において、そのラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬにハイブリダイズする。そのハイブリダイゼーションは、ＣＬに沿ってＡＰＳを配置させ、次いでそれらは、互いに連結される。それらのＡＰＳは、他のラウンドに特異的なループアニーリング領域に沿ってＣＬに効率的にハイブリダイズしないようにデザインされている。その結果として、特定のラウンドのＡＰＳが欠けていると、それらのＡＰＳは、連結プロセスに依存して、首尾良く互いに連結されないことがある。あるいは、ＡＰＳが欠けた状態で（その位置は、ループアニーリング領域の対が隣接する）ＣＯＢが合成される。次いで、得られたＣＯＢは、しかるべく分析され得、処分され得るか、またはその代わりに、引き出された情報が処理され得る。
【０３１４】
ＣＬまたは１つ以上のＡＰＳは、ランダムなタグ領域をさらに含み、それは、上に記載されたような分子カウンターとして作用し、それにより、検出されたＣＯＢのその後の正規化が可能になる。
【０３１５】
各ラウンドにおいてＡＰＳおよびアニーリングプライマーを加えたら、ビーズをプールし、新しい２０個のプールに分け、次のラウンドを開始する。各ラウンドにおいて、上に記載されたような１対のラウンド特異的アニーリング領域を有する新しい２０個のＡＰＳのセットを加える。６個のＡＰＳを加えた後、ビーズ上のハイブリダイズされたＡＰＳは、実施例２に記載されたようなクリックケミストリーを用いて互いに永続的にステッチされる。ＣＯＢは、必要に応じて、ＣＬ上および最後のＡＰＳサブユニット上の増幅プライマー相補的領域を標的にするプライマーを用いて、配列決定のためにＰＣＲ増幅される。
【０３１６】
仮想実施例４．核酸配列決定による検出
実施例３における方法のいずれかに由来する、組み立てられた、ＥＳＢに連結したＣＯＢを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ２０００装置によって配列決定する。得られた配列は、１０個の異なるＥＳＢ配列のうちの少なくとも１つ、ランダムなタグ領域、および６ラウンドの分割プール合成中にその特定のビーズに付加されたＡＰＳを起源とする６個のサブコードの組み合わせを含む。
【０３１７】
仮想実施例５．ペプチド配列決定による検出（図１１）
実施例３における方法のいずれかを用いて、ＥＳＢに連結したＣＯＢを合成する。得られた配列は、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６開始部位、開始コドン、ＥＳＢ、ＣＯＢ、および必要に応じて、Ｈｉｓ（６）タグをコードする領域を含む（図１１）。Ｔ７プロモーターおよびＳＰ６開始部位は、ＥＳＢを組み込むために使用されたのと同じ方法を用いて、ＥＳＢに連結される配列に組み込まれ得る。あるいは、これらの配列は、最後のＡＰＳ内に組み込まれ得る。必要に応じて、Ｈｉｓ（６）タグをコードする領域は、最後のＡＰＳまたはＥＳＢに組み込まれて連結され得る。
【０３１８】
組み立てられたＥＳＢに連結したＣＯＢは、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｍａｘｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、転写され、ペプチド配列に翻訳される。そのペプチド配列は、アフィニティークロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣを用いて単離された後、タンデム型質量分析計を使用して配列決定される。
【０３１９】
仮想実施例６．細胞表面上でのＣＯＢの分割プール合成
白血球細胞株（ＨＬ６０、ＪＹおよびＵ９３７）上の細胞表面レセプターは、細胞表面上でのＣＯＢの分割プール合成を用いて検出および定量される。Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を使用して、ＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４に対する抗体が、実施例３に記載されたアミン修飾ＣＬオリゴヌクレオチドと結合体化される。個々に標識された抗体が、ＣＬオリゴヌクレオチド中の配列を標的とする相補的なオリゴヌクレオチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離され、各抗体上の標識の数が、質量分析を用いて検証される。１０７個の細胞の細胞懸濁液を、好適な条件下で上記抗体の組み合わせとインキュベートした後、６ラウンドの分割プール合成を行う。得られたＥＳＢに連結したＣＯＢは、実施例３または実施例４に記載されているように検出される。ＣＯＢに連結したＥＳＢに関連する検出されたシグナルが、各ＣＯＢ組み合わせについて定量される。それらの細胞上でのＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ４抗原の各々の同時発現が、ペアワイズでプロットされる。主成分分析を用いることにより、発現プロファイルにおける最も強い相関を特定する。
【０３２０】
仮想実施例７．細胞内でのＣＯＢの分割プール合成
メタノールを−２０℃に冷却する。１０７個のＨｅＬａ細胞を含む細胞培養物を、当該分野で公知の好適な組織培養条件を用いて増殖させる。その増殖培地を吸引によって除去する。細胞を直ちに固定し、５０ｍＬの冷メタノールを加えることによって透過処理する。それらの細胞を、外界温度で１０分間、静かに振盪しながらインキュベートする。メタノールを吸引によって慎重に除去する。それらの細胞を１００ｍＬの１×ＰＢＳで３回すすぐ。
【０３２１】
上記細胞を、静かに振盪することによって０．２％ＰＢＳ中の１５０ｍｌの０．１％カゼイン溶液で室温において１．５時間ブロッキングする。ウサギ抗切断カスパーゼ−３、ウサギ抗ｐｈｏｓ−ｐ３８、ウサギ抗ｐｈｏｓ−ＥＲＫ２、マウス抗ＥＲＫ２およびマウス抗β−チューブリン（クローンＡＡ２）を、実施例５に記載されたようにＣＬに結合体化する。細胞を、静かに振盪して、ＣＬに結合体化された抗体と４℃で一晩インキュベートする。それらの細胞を、１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、室温で５回洗浄した後、６回の分割プール合成を行う。
【０３２２】
得られたＥＳＢに連結したＣＯＢを、実施例３または実施例４に記載されたように検出する。ＣＯＢに連結したＥＳＢに関連する検出されたシグナルを、各ＣＯＢ組み合わせについて定量する。それらの細胞におけるホスホ−ｐ５３、ＥＲＫ１の各々の同時発現をペアワイズでプロットする。主成分分析を用いることにより、発現プロファイルにおける最も強い相関を特定する。
【０３２３】
仮想実施例８．検出ラウンドに対する標的数の制限
読まれる所与の細胞の標的数は、検出機器がその最大容量に達する場合、制限され得る。この実施例では、配列分析装置によって読まれる配列の最大数は、１０００である。読まれる標的の総数は、１４００である：８００コピーの標的Ａ、２００コピーの標的Ｂおよび４００コピーの標的Ｃ。標的Ａ、ＢおよびＣに特異的なＵＢＡが作製され得るので、各ＵＢＡ集団は、いずれかのＥＳＢで標識されたＵＢＡおよび未標識ＵＢＡを例えば１：３の比で含む。したがって、例えば、標的ＡのＵＢＡ集団は、標的ＡのＵＢＡ−ＥＳＢおよびＥＳＢを有しない標的ＡのＵＢＡを含み得る。（いくつかの実施形態において、未標識ＵＢＡは、リンカー部位を有しないヌクレオチドに結合したＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、未標識ＵＢＡは、増幅結合物質部位を有しないヌクレオチドに結合したＵＢＡを含む。いくつかの実施形態において、未標識ＥＳＢは、ＵＢＡを含むが、その配列は、下流の工程において容易に増幅可能でなく、例えば、１つ以上のプライマー部位（ｃｉｔｅｓ）が欠損しているか、またはリンカー領域が欠損しているか、またはＣＯＢが形成できないように改変されている）。
【０３２４】
ここでは、標識ＵＢＡ（ＥＳＢを有するＵＢＡ）と未標識ＵＢＡとの比は、標的Ａに対しては２００：６００、標的Ｂに対しては５０：１５０、および標的Ｃに対しては１００：３００であり得る。標識ＵＢＡと未標識ＵＢＡとの比が判明すると、必要とされる配列リードの数を減少させることができる（例えば、３５０）。標識ＵＢＡからのシグナルをその比に基づいて（例えば、４で）乗算することによって、元のサンプル中の標的の総数の近似値が生成され得る。ここでは、３５０個の標識された全標的を配列決定し、検出が完了したら、その結果に４を乗算する。
【表３】
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【０３２５】
さらなる実験では、標識ＵＢＡと未標識ＵＢＡとの異なる比を各標的に対して使用する。標識ＵＢＡ（ＥＳＢを有するＵＢＡ）と未標識ＵＢＡとの比は、標的Ａに対しては１００：７００、標的Ｂに対しては１５０：５０および標的Ｃに対しては２００：２００であり得る。この場合、各標的は、その異なる比に基づくそれ自体の乗数を有する。
【０３２６】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され、記載されてきたが、そのような実施形態が単に例として提供されていることが当業者には明らかだろう。当業者には数多くのバリエーション、変更および置換が本発明から逸脱することなく思い浮かぶだろう。本明細書中に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項が、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が本明細書によって包含されると意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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