(57)【要約】【課題】マーカーに特異的に結合するリガンドを介して、かかるがん細胞の逃避メカニズムを同定及び／又は印付け及び／又は破壊及び／又は無能化するために、細胞表面抗原を使用すること。【解決手段】ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であることを特徴とする、１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むリガンド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むリガンドであって、該リガンドが、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であることを特徴とする、リガンド。
【請求項２】
前記リガンドが、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の異なる抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原と組み合わせたＣＬＡに特異的な抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のリガンド。
【請求項４】
前記ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の抗原結合ドメインが、同一又は異なる膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインに連結されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリガンド。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ゼータの１種以上の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のリガンド。
【請求項６】
前記リガンドが、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な少なくとも１種の抗原結合ドメインを発現する遺伝子操作された細胞であることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載のリガンドとがん細胞を結合する方法。
【請求項８】
前記リガンドが、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の異なる抗原結合ドメインを含むことを特徴とする、請求項７に記載のがん細胞を結合する方法。
【請求項９】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の少なくとも１種のリガンドを発現する遺伝子操作された細胞の集団。
【請求項１０】
ヒトのがんの治療のための請求項９に記載の遺伝子操作された細胞の集団の使用。
【請求項１１】
請求項１から６までのいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトのがんの治療のための請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
化学療法剤、放射線、又は免疫調節剤と組み合わせた、がんの治療のための請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのがんの治療のための、ある抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むリガンド、例えばキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の使用、及び／又はかかるリガンドと共に提供される遺伝子操作された細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、無秩序な細胞成長を伴う広範囲の疾患の群である。がんにおいては、細胞が制御不能に分裂及び成長して、悪性腫瘍を形成し、そして身体の近くの部位に浸潤する。がんは、リンパ系又は血流を介して身体のより遠い部位にも拡散することがある。ヒトに影響する２００種を超える異なる公知のがんがある。良好な治療の選択肢が多くのがんのタイプについて存在する一方で、未だに対処されていない医学的必要性を示すものもある。
【０００３】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の技術は、がんのための養子細胞免疫療法についての見込みのあるアプローチを提供しうる。慣用的に、ＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインに結合した腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）を含む。例えば、周知のリンパ球活性化部分は、Ｔ細胞トリガー（例えばＣＤ３ζ）部分と並んで、Ｔ細胞共刺激性（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７）ドメインを含む。ＣＡＲ媒介養子免疫療法は、ＣＡＲを移植された細胞を、ＨＬＡに制限されない方法で、標的の腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識することを可能にする。
【０００４】
ＣＡＲに基づくがんのための免疫療法について重要なことは、それぞれの腫瘍細胞に特異的な抗原の選択である。本発明の目的は、非腫瘍細胞を攻撃することなくがん細胞を死滅させる／溶解するキラー細胞を設計するために、がん細胞に、特に膵臓がん細胞に特異的なかかる抗原を提供することであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞表面抗原の特定の群は、いくつかのヒトがん細胞上に、特にヒト膵臓がん細胞上に発現されるが、非悪性細胞では発現されないか、又は低いレベルで発現されることが見出されている。したがって、これらの抗原（「マーカー」とも呼ばれる）は、マーカーに特異的に結合するリガンドを介して、かかるがん細胞の逃避メカニズムを同定及び／又は印付け及び／又は破壊及び／又は無能化するために使用されうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むリガンドであって、該リガンドが、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であることを特徴とする、前記リガンドに関する。
【０００７】
本発明の他の目的は、がん細胞と、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むリガンドとを結合する方法である。
【０００８】
さらに開示される前記リガンドは、抗体又はＣＡＲ又は少なくとも１種のかかるリガンドを発現する遺伝子操作された細胞であってよい。
【０００９】
本発明の他の目的は、少なくとも１種の前記リガンドを発現する遺伝子操作された細胞の集団、前記遺伝子操作された細胞の集団を含む医薬組成物、及び／又はヒトのがんの治療のための前記遺伝子操作された細胞の集団又は前記医薬組成物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、特定の標的を認識することができるＣＡＲの一般的な構造を示す。
【図２】図２は、ＣＡＲの変異体を示す。
【図３】図３は、異種移植されたヒト膵臓がん細胞でのＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の発現を示す。
【図４】図４は、原発性ヒト膵臓がん細胞及び活発な腫瘍浸潤細胞でのＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の発現を示す。
【図５】図５は、原発性ヒト膵臓がん部位でのＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の発現を示す。
【図６】図６Ａは、トランスフェクション効率及び構築物発現の読み出しとして表面上でＬＮＧＦＲを発現する細胞の割合を示す。図６Ｂは、表面上でＣＡＲ構築物を発現する細胞の割合を示す。
【図７】図７は、膵臓がん細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅効率を示す。
【図８】図８（Ａ）は、ゲーティングを示し、図８（Ｂ）は、マーカーの同時発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第一の実施形態において、リガンドは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、前記リガンドは、ＣＬＡ及びＣＤ６６ｃに特異的な、又はＣＬＡ及びＴＳＰＡＮ８に特異的な抗原結合ドメインを含んでよい。
【００１２】
がん細胞を結合する好ましい方法において、がん細胞（又はがん細胞の集団）は、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の異なる抗原結合ドメインを含むリガンドと結合される。また、前記リガンドは、ＣＬＡ及びＣＤ６６ｃに特異的な、又はＣＬＡ及びＴＳＰＡＮ８に特異的な抗原結合ドメインを含んでよい。
【００１３】
定義
「腫瘍」の用語は、新生物として医学的に公知である。全ての腫瘍ががん性であるわけではなく、良性腫瘍は隣接組織に浸潤せず、かつ身体全体に拡散しない。
【００１４】
「がん」の用語は、悪性新生物として医学的に公知である。がんは、無秩序な細胞成長を伴う疾患の広範な群である。がんにおいて、細胞（がん性細胞）は、制御不能に分裂及び成長して、悪性腫瘍を形成し、そして身体の近くの部位に浸潤する。がんは、リンパ系又は血流を介して身体のより遠い部位にも拡散することがある。
【００１５】
「単離された」の用語は、天然な状態から変更された又は除去されたことを意味する。例えば、細胞の単離された集団は、かかる細胞の濃縮と、単離された細胞と天然に生じた状態で正常に会合している他の細胞からの分離とを意味する。細胞の単離された集団は、細胞の均一な集団である実質的に精製された細胞の集団を意味する。
【００１６】
抗体のようなリガンドの、それらの断片の又はＣＡＲの抗原結合ドメインに関する「特異的に結合」又は「〜に特異的な」の用語は、特定の抗原を認識し結合するが、実質的に試料中で他の分子を認識せず又は結合しない抗原結合ドメインをいう。１つの種からの抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、他の種からの抗原にも結合してよい。この異種間反応は、特異的な抗原結合ドメインの定義に反しない。ある抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、その抗原の異なる対立遺伝子の形（対立遺伝子多型、スプライス変異体、アイソフォーム等）にも結合してもよい。この交差反応は、特異的な抗原結合ドメインの定義に反しない。
【００１７】
本明細書において使用される「遺伝子操作された細胞」及び「遺伝的に改変された細胞」の用語は、互換可能に使用できる。これらの用語は、細胞又はその子孫の遺伝子型又は表現型を順に改変する外来遺伝子又は核酸配列を含むこと及び／又は発現することを意味する。特に、これらの用語は、天然の状態でこれらの細胞中で発現されないペプチド又はタンパク質を安定して又は一過性で発現するために当業者に周知の組換え方法により操作された細胞、好ましくはＴ細胞をいう。例えば、Ｔ細胞は、それらの細胞表面で、人工的な構築物、例えばキメラ抗原レセプターを発現するために遺伝子操作される。例えば、ＣＡＲをコードする配列は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用して細胞中に送達されてよい。
【００１８】
それぞれ配列番号１〜３２において（アミノ酸の１文字コードで）提供されるアミノ酸配列は、定義されるような各アミノ酸配列の意図された機能を保持する、各アミノ酸配列の全ての一群をいう。したがって、アミノ酸配列レベルで、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列表において定義されたアミノ酸配列の全ての変異体は、本発明の範囲に含まれる。本発明の記載内容において、「配列同一性」は、当業者に周知のアミノ酸配列についてのアライメントプログラムを使用するペアワイズアライメントを使用して決定されてよい。
【００１９】
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たすリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）から区別されうる。それぞれ別々の機能を有するＴ細胞のいくつかのサブセットがある。
【００２０】
Ｔヘルパー細胞（ＴH細胞）は、免疫学的過程において他の白血球細胞を補佐し、免疫学的過程には、プラズマ細胞及びメモリーＢ細胞中へのＢ細胞の成熟と、細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化が含まれる。これらの細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞としても公知であり、それというのもそれらは、ＣＤ４糖タンパク質をそれらの表面上で発現するからである。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原で提示される場合に、活性化されるようになる。活性化されると、それらは、急速に分裂し、活性免疫応答において調節又は補佐するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。それらの細胞はいくつかの亜型の１つに分化でき、この亜型にはＴH１、ＴH２、ＴH３、ＴH１７、Ｔｈ９、又はＴFHが含まれ、これらは異なるタイプの免疫応答の引き金となる異なるサイトカインを分泌する。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定の亜型に向かわせる。
【００２１】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴC細胞又はＣＴＬ）は、感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応に影響もあたえる。これらの細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞としても公知であり、それというのもそれらは、ＣＤ８糖タンパク質をそれらの表面上で発現するからである。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上で存在するＭＨＣクラスＩ分子に会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。メモリーＴ細胞は、感染を解消させた後に長期間存続する抗原特異性Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種の抗原への再曝露の際に、多数のエフェクターＴ細胞に急速に拡大し、すなわち免疫系に過去の感染に対する「記憶」を提供する。メモリーＴ細胞は、以下の３つの亜型を含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）及び２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴEM細胞及びＴEMRA細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４+又はＣＤ８+のいずれかであってよい。メモリーＴ細胞は、典型的に、細胞表面分子ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【００２２】
以前は抑制Ｔ細胞として知られていた調節Ｔ細胞（Ｔreg細胞）は、免疫寛容の維持に極めて重要である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向けてＴ細胞媒介性免疫を停止し、そして胸腺における負の選択の過程を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４+Ｔreg細胞の２つの主な分類が記載されている（Ｆｏｘｐ３＋Ｔreg細胞及びＦｏｘｐ３−Ｔreg細胞）。
【００２３】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、自然免疫系を有する適応免疫系への架け橋となる。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。活性化されると、これらの細胞は、Ｔh及びＴc細胞の双方に起因する機能（すなわち、サイトカインの産生及び細胞溶解性分子／細胞死滅分子の放出）を行うことができる。
【００２４】
免疫療法は、「免疫応答を誘導、強化、又は抑制することによる疾患の治療」と定義される医学用語である。免疫応答を誘発又は増幅するために設計された免疫療法は、活性化免疫療法として分類され、一方で、減少又は抑制する免疫療法は、抑制免疫療法として分類される。活性化免疫療法としてのがん免疫療法は、腫瘍を拒絶及び破壊する免疫系を刺激することを試みる。養子細胞移入は、細胞主体、例えばＴ細胞主体の細胞傷害性応答を使用して、がん細胞を攻撃する。患者のがんに対して天然の又は遺伝子操作された反応性を有するＴ細胞は、インビトロで作出され、そしてがん患者に戻される。
【００２５】
「バイオマーカー」又は「マーカー」の用語は、当該技術分野で広く普及しており、かつその生物学的分子及び／又はそれらの検出可能な部分（例えば、核酸、ペプチド又は脂質、例えば糖脂質）を広く意味していてよく、その個体における定性的及び／又は定量的な評価は、個体の表現型及び／又は遺伝子型の１つ以上の側面に関して、予測的であり、又は情報を与える（例えば、予測の、診断の及び／又は予後の情報）。例えば、バイオマーカーは、個体におけるがんの化学療法的治療のための結果に関して予測的であり又は情報を与えるものである。バイオマーカーが当業者に公知の方法で検出可能である場合に、バイオマーカーは表示される（「バイオマーカーの表示」）。したがって、バイオマーカーの表示は、核酸レベル（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）及びタンパク質レベルでの表示だけでなく、細胞上の又は細胞中の他の生物学的構造、例えば糖脂質の、又はタンパク質の活性化の表示（存在）も含む。
【００２６】
本明細書において使用される「標的」の用語は、抗原結合ドメイン、例えば抗体又はＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識されるべき細胞に関連する抗原又はエピトープをいう。抗体の認識のための抗原又はエピトープは、細胞表面に結合することができるが、分泌され、細胞外膜の一部であり、又は細胞から脱落されてよい。
【００２７】
本明細書において使用される「抗体」の用語は、当業者に周知の方法により作出されてよいポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体及びそれらの断片をいう。抗体は、任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであってよい。治療目的のために、ヒトでない抗原結合断片が使用されるべきである場合に、当業者に公知の任意の方法によりヒト化することができる。抗体は、改変された抗体（例えば、オリゴマー、縮小された抗体、酸化された抗体、及び標識した抗体）であってもよい。
【００２８】
本明細書において使用される「キラー細胞」の用語は、他の細胞、例えばがん細胞を死滅させる／溶解することができる細胞をいう。最も頻繁に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及びマクロファージが、キラー細胞として使用されうる。
【００２９】
本明細書において使用される「遺伝子操作されたキラー細胞」の用語は、標的細胞の特異的な死滅を可能にするために遺伝的に改変されたキラー細胞、例えばそれぞれの標的を発現する腫瘍細胞を死滅させるために標的に対してＣＡＲで改変された細胞をいう。
【００３０】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）
本発明によるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図１において実施例の方法により示される、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインに連結される抗原結合ドメインを含んでよい。
【００３１】
本発明の第一の実施形態において、リガンドは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である。
【００３２】
本発明の第二の実施形態において、リガンドは、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原と組み合わせたＣＬＡに特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。
【００３３】
本発明の第三の実施形態において、リガンドは、ＣＡＲであり、これは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含み、また、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の抗原結合ドメインを含み、これらは、同一又は異なる膜貫通ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ポリペプチドに連結されるハプテン（「ハプテン化」ポリペプチド）を結合し、その際ポリペプチドは、腫瘍関連抗原に結合してよい。かかるＣＡＲは、例えば、米国特許第９２３３１２５号Ｂ２（ＵＳ９２３３１２５Ｂ２）において開示されており、「抗タグ」ＣＡＲとして当業者に公知である。同様に、本発明のＣＡＲの細胞外部分は、標的細胞結合分子の一部であるリンカー／ラベルエピトープ（ＬＬＥ）に結合する抗原結合ドメインとして、リンカー／ラベルエピトープ（ＬＬＥ）結合ドメインを含んでよい。かかる「抗−ＬＬＥ ＣＡＲ」は欧州特許出願番号第１６１９６４８７．９（ＥＰ１６１９６４８７．９）において開示されている。双方のタイプのＣＡＲは、万能ＣＡＲ及び／又は適応ＣＡＲである。ハプテン及びＬＬＥの双方は、ポリペプチドに直接又は間接的に連結された「タグ」（タグ付けされたポリペプチド）であり、その際ポリペプチドは、標的細胞の（細胞）表面上で発現された腫瘍関連抗原に結合してよい。
【００３５】
この実施形態において、リガンドは、１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含み、該リガンドは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な抗原結合ドメインに連結されるタグに結合できる抗タグ結合領域を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であることを特徴としている。適したタグは、例えば、ビオチン、他のハプテン、ＦＩＴＣ又は他の蛍光色素分子、ＦＬＡＧ、ＨＩＳ、ＹＯＬ  ＭＹＣ、デキストラン、ＦｃＲ、抗原−アイソタイプ、人工的に遺伝子操作されたエピトープ、ＦＡＢ又はＦＡＢ２バインダーであるが、これらに制限されない。
【００３６】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含んでよく、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ゼータの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含む。
【００３７】
この実施形態の好ましい変形例において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、追加の抗原結合ドメイン又は追加のＣＡＲなしに、ＣＬＡに特異的な抗原結合ドメインを含み、その際、抗原結合ドメインは、１つの膜貫通ドメイン及び１つ以上のシグナル伝達ドメインに連結している。この変形例は、図２Ａにおける実施例により示される。
【００３８】
本発明の第二の変形例において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＣＬＡ（皮膚リンパ球抗原）、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される２種以上の抗原に特異的な少なくとも２種の抗原結合ドメインを含み、その際、抗原結合ドメインは、異なる膜貫通ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインに連結している。この変形例は、図２ｂにおける実施例により示される。
【００３９】
本発明の第三の変形例において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＣＬＡ（皮膚リンパ球抗原）、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される２種以上の抗原に特異的な少なくとも２種の抗原結合ドメインを含み、その際、抗原結合ドメインは、同一の（１つの）膜貫通ドメイン及びはシグナル伝達ドメインに連結している。この変形例は、図２ｃにおける実施例により示される。
【００４０】
本発明の第四の変形例において、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＣＬＡ（皮膚リンパ球抗原）、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される２種以上の抗原に特異的な少なくとも２種の抗原結合ドメインを含み、その際、抗原結合ドメインは、異なる膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン及び１つのベクターに由来する抗原結合ドメインに連結している。この変形例は、図２ｄにおける実施例により示される。
【００４１】
ＣＬＡは、皮膚リンパ球関連抗原（ＣＬＡ）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）の特殊化させた糖型である。これは、ＣＤ６２Ｅ（ＥＬＡＭ−１）及びＣＤ６２Ｌ（ＬＥＣＡＭ−１）を含むセレクチンのためのリガンドとして役立つ。ＣＬＡは、独自の皮膚ホーミングレセプターであり、かつ皮膚を浸潤するヒトＴ細胞の主要なサブセットで主に見出される。このＰＳＧＬ−１の翻訳後修飾は、末梢血から皮膚へのＣＤ４+及びＣＤ８+メモリー／エフェクターＴ細胞の組織特異的ホーミングを調節するためのメカニズムとして作用すると考えられ、多くの炎症中に及びある悪性の皮膚病に必須の役割を果たす。
【００４２】
末梢血において、ＣＬＡは、皮膚ホーミングメモリー／エフェクターＴ細胞において見出されるだけでなく、メモリー／エフェクターＢ細胞、ＮＫ細胞、血液樹状細胞で、及び単核細胞で発現されることも見出される。ＣＬＡは、さらに、皮膚におけるランゲルハンス細胞で見出される。
【００４３】
がん細胞の特異的な認識を高めるために、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の（例えば、２種、３種又は４種の）抗原と組み合わせたＣＬＡに特異的な抗原結合ドメインを含んでよい。膵臓がんに特異的な好ましい組み合わせは、ＣＬＡとＴＳＰＡＮ８、及びＣＬＡとＣＤ６６ｃである。
【００４４】
前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、それぞれ、標的抗原ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の１種以上に特異的な、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体又は二重抗体を含んでよい。
【００４５】
前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含んでよい。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含んでよい。
【００４６】
本発明は、開示されたマーカーに特異的なＣＡＲのアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）構築物も包含する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ構築物（ベクター、プラスミド）は、開示されたマーカーに特異的なＣＡＲについてコードして作出される。開示されたマーカーに特異的な抗原結合ドメインについてコードする核酸配列は、少なくとも、膜貫通ドメインをコードする核酸配列及び続いて細胞内ドメインをコードする核酸配列に融合される。かかる発現ベクターの構築は、当業者に周知の組換え方法により実施されてよい。あるいは、核酸配列は、合成的に生成されてよい。
【００４８】
あるいは、ＣＡＲは、他の部分、例えばリンカー及び／又はヒンジから構成されてよく、かつ／又は以下に記載されるように二重鎖又は多重鎖ＣＡＲとして構成されてもよい。
【００４９】
図１及び２において一般的に示したように、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含んでよい。細胞外ドメインは、リンカーにより膜貫通ドメインに連結されてよい。細胞外ドメインは、シグナルペプチドに連結されてもよい。
【００５０】
「シグナルペプチド」は、細胞内のタンパク質の輸送及び局在化を、例えばある細胞小器官（例えば小胞体）及び／又は細胞表面に向かうように指示するペプチド配列をいう。
【００５１】
「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合する（それにより、抗原を含む細胞を標的にすることができる）ＣＡＲの領域をいう。本発明のＣＡＲは、１種以上の抗原結合ドメインを含んでよい。一般的に、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体又はそれらの断片を含んでよい。抗原結合ドメインは、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体又は二重抗体を含んでよい。所与の抗原に特異的に結合する任意の分子、例えば天然に生じるレセプター由来のアフィボディ又はリガンド結合ドメインが、抗原結合ドメインとして使用されうる。しばしば、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖにおいて、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変域は、可動性リンカーにより融合されて、ｓｃＦｖを形成する。かかるリンカーは、例えば、「（Ｇ4／Ｓ1）3−リンカー」であってよい。
【００５２】
場合により、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが使用される種と同一の種に由来することが有益である。例えば、それをヒトにおいて治療的に使用することが計画されている場合に、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトもしくはヒト化抗体又はそれらの断片を含むことが有益でありうる。ヒトもしくはヒト化抗体又はそれらの断片は、当業者に周知の種々の方法により製造されることができる。
【００５３】
本明細書において使用される「スペーサー」又は「ヒンジ」は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域をいう。本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含んでよいが、かかるスペーサーを通過させることも可能である。スペーサーは、抗体もしくはそれらの断片のＦｃ断片、抗体もしくはそれらの断片のヒンジ領域、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを含んでよい。スペーサーの著名な例は、ＣＤ８アルファヒンジである。
【００５４】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、かかるドメインのための任意の所望の天然源又は合成源に由来しうる。供給源が天然である場合に、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してよい。膜貫通ドメインは、例えばＣＤ８アルファ又はＣＤ２８に由来してよい。
【００５５】
本発明のＣＡＲの細胞質ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の少なくとも１つの通常のエフェクター機能の活性化に関与する。「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化された機能を意味し、例えば、Ｔ細胞におけるエフェクター機能は、細胞溶解活性又はヘルパー活性であってよく、これはサイトカインの分泌が含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、本発明のＣＡＲを発現する細胞に特殊化された機能を果たすように指示するタンパク質の部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全又は切断部分を含んでよい。
【００５６】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの著名な例は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原レセプターの誘導（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に続いてシグナル伝達を開始するために共同作用するコレセプターを含む。
【００５７】
一般的に、Ｔ細胞活性化は、２つの別個の分類の細胞質シグナル伝達配列により媒介されてよく、該細胞質シグナル伝達配列は、第一に、ＴＣＲにより抗原依存の一次活性を開始するもの（第一の細胞質シグナル伝達配列）、及び第二に、抗原非依存法において第二の又は共刺激シグナルを提供するために作用するもの（第二の細胞質シグナル伝達配列）である。
【００５８】
刺激様式で作用する第一の細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭ（免疫レセプター活性化チロシンモチーフシグナル伝達モチーフ）を含んでよい。
【００５９】
ＩＴＡＭの例は、しばしば、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＣＡＲにおいて使用される第一の細胞質シグナル伝達配列を含む。
【００６０】
ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを、それ自体だけで又は任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むために設計されてよい。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖タンパク質及び共刺激シグナル伝達領域を含んでよい。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部をいう。共刺激分子は、抗原レセプター又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、それらは、抗原に対するリンパ球の十分な応答のために要求される。共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３である。
【００６１】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部位内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムに又は特定の順で互いに連結されてよい。好ましくは２〜１０個のアミノ酸の長さである短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーが連結を形成してよい。著名なリンカーは、グリシン−セリンダブレットである。
【００６２】
一例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含んでよい。他の例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含んでよい。さらなる一例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含んでよい。
【００６３】
本発明のＣＡＲは、本明細書において記載されたような、特に図２ａ〜ｄにおいて示された変形例中に記載されているような、前記ドメインの任意の部分又は一部を含むように設計されてよい。抗原結合ドメインにより媒介される本発明のＣＡＲの特異性は、抗原ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の１種以上に対してであり、機能性ＣＡＲを構築するために必要な全ての他のドメインは、前記任意選択から選択されてよく、又は当業者に周知である。
【００６４】
リガンドを発現する遺伝子操作された細胞
本発明の他の実施形態において、リガンドは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上の抗原に特異的な少なくとも１種の抗原結合ドメインを発現する遺伝子操作された細胞（又はそれらの集団）である。
【００６５】
好ましい一実施形態において、遺伝子操作された細胞の集団は、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される１種以上のＣＡＲ及び／又は抗原と組み合わせたＣＬＡに特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）のようなリガンドを発現する。
【００６６】
遺伝子操作された細胞の集団は、Ｔ細胞、マクロファージ又はＮＫ細胞からなってよい。遺伝子操作された細胞の集団は、前記免疫治療において使用する前に、治療的有効量まで細胞を増加させてよい。
【００６７】
本発明の１種以上のＣＡＲ（変形例を含む）を発現する細胞を製造するために、本発明のＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を、当業者に周知の方法（例えば、ウイルスを基礎とするシステム、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により宿主細胞中にトランスフェクト又はトランスデュースさせてよい。宿主細胞において本発明のＣＡＲをコードする核酸を組込むために使用される方法に関わらず、結果として、宿主細胞は、開示されたようなマーカーに特異的であるＣＡＲを発現する。
【００６８】
本発明の一実施形態において、遺伝子操作された細胞は、かかる遺伝子操作された細胞を作出するためのトランスフェクション／トランスダクション法の後に、当業者に公知の方法、例えば、蛍光主体分離技術、例えばＦＡＣＳ（登録商標）、又は磁気細胞分離法、例えばＭＡＣＳ（登録商標）により、トランスフェクション／トランスダクションしていない細胞から単離（濃縮又は分離）される。
【００６９】
本発明の他の実施形態において、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の供給源は、被験体から得られる。免疫細胞、好ましくはＴ細胞は、種々の供給源、例えば末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血又は胸腺組織から得られてよい。これらの細胞の濃縮のために、当業者に周知の方法、例えばＦｉｃｏｌｌTM又はＰＥＲＣＯＬＬTM勾配を介した遠心分離、又は正／負の選択技術、例えば蛍光ソーティング（例えばＦＡＣＳ選別）又は磁気ソーティング（例えばＭＡＣＳ（登録商標））を使用することができる。
【００７０】
例えば、被験体の血液試料のＴ細胞を、例えばＣＤ４に及びＣＤ８に、又は代わりにＣＤ６２Ｌにそれぞれ特異的な抗体に連結した磁気ビーズで磁気ラベルし、洗浄し、磁気的に濃縮し、そして採取する。それからこれらのＴ細胞を、開示された抗原又は好ましい抗原の組み合わせをそれらの細胞表面上で発現するために遺伝子操作してよい。
【００７１】
本発明の一実施形態において、遺伝的に改変される前又は改変された後の開示された抗原又は好ましい抗原の組み合わせを発現する単離／濃縮された遺伝子操作されたＴ細胞を、当業者に公知の一般的な方法、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノマトリックス（欧州特許番号第２７１１４１８号Ａ１（ＥＰ２７１１４１８Ａ１）において開示されている）でのポリクローナル刺激を使用して活性化及び増加させて、遺伝子操作されたＴ細胞の量を増加させてよい。好ましくは、前記遺伝子操作されたＴ細胞の量は、治療的有効量まで増加される。
【００７２】
本発明の一実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞が作出される。本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡを、当業者に周知の方法（例えば、ウイルスを基礎とするシステム、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）により宿主細胞中にトランスフェクト又はトランスデュースさせてよい。一般的に、かかる「ＲＮＡで遺伝子操作された細胞」は、国際公開第２０１３／０４０５５７号（ＷＯ２０１３／０４０５５７）において詳細に開示されている。宿主細胞において本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡを組込むために使用される方法に関わらず、結果として、宿主細胞は、開示された抗原又は好ましい抗原の組み合わせに特異的であるＣＡＲを発現する。「ＲＮＡで遺伝子操作された細胞」を使用することは、ＣＡＲが限られた時間で細胞中で発現されること（一過性発現）を導く。
【００７３】
本発明の一実施形態において、遺伝子操作された細胞は、閉鎖型細胞培養系において自動的に作出される。かかる方法は、以下のステップを含む：
ａ）細胞試料を準備するステップ
ｂ）前記細胞試料を遠心分離により調製するステップ
ｃ）前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を、磁気分離するステップ
ｄ）濃縮した前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を、調節剤を使用して活性化するステップ
ｅ）前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を、遺伝的に改変して、開示された１種以上のＣＡＲ又はＣＡＲ／抗原の好ましい組み合わせを発現させるステップ
ｆ）遺伝的に改変された前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を、培養容器中で増加させるステップ
ｇ）培養した前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を、洗浄するステップ。
全ての前記ステップは、閉鎖及び滅菌系で実施されてよい。
【００７４】
前記方法は、遺伝子改変された細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞を製造するために特に適しており、その際、濃縮した前記細胞、好ましくはＴ細胞、Ｔ細胞サブセット又はＴ細胞前駆細胞は、ウイルスベクター及び／又は非ウイルスベクターを使用することにより遺伝子改変される。これらのステップのいずれかを掛け合わせるか、省略するか、又は異なる順で行ってよい。本発明の変法において、調節剤は、アゴニスティック抗体及び／又はサイトカインから選択される。
【００７５】
細胞改変のための閉鎖及び滅菌系として、完全自動細胞プロセシング装置ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）及び関連チュービングセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してよい（国際公開第２００９／０７２００３号（ＷＯ２００９／０７２００３））。この閉鎖系は、ほとんどあらゆる種類の細胞生成物のＧＭＰ等級処理の要件を満たし、クリーンルーム要件を低減させ、細胞製造プロセスの技術移転及び技術調和を改善しうる。これは、細胞性治療剤の製造プロセスを完全に自動化し、標準化するために開発された。この機器は、試料ローディング、細胞洗浄、赤血球低減及び血漿回収を含む密度ベースの細胞分離、磁気分離、細胞活性化、細胞改変（トランスダクション）、細胞培養、及び最終生成物製剤化を実施できる。
【００７６】
したがって、閉鎖された自動化された安全なＧＭＰ遵守ワークフローへのプロセスモジュール（「ステップ」）の柔軟な組込みを可能にし、複雑な所望の生物学的プロセスを再現する。
【００７７】
本発明の一実施形態において、遺伝的に改変された細胞は、標的の１つを発現する。遺伝的に改変された細胞集団間の死滅を回避するために、この標的は、一時的又は永久に、キラー細胞上でノックダウン又はノックアウトされる。一時的又は永久的なノックダウン又はノックアウトは、当業者に周知の方法、例えば一時的なノックダウンのためのｓｉＲＮＡ又は永久的なノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲシステムにより誘発されてよい。これらの方法を使用して標的発現を阻害するために、これは、標的をコードする全遺伝子、遺伝子の一部、例えば特定のエキソン、プロモーター領域、又は制御因子、例えば転写因子を直接標的化することによって達成されうる。糖構造を表す標的構造、例えばＣＬＡの場合に、これは、骨格タンパク質上の又はグリコシル化を触媒する１つ以上の酵素上のグリコシル化部位を変更することによっても達成されうる。
【００７８】
使用方法
本発明の他の実施形態は、がん細胞と、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも２種の異なる抗原に特異的な少なくとも２種の異なる抗原結合ドメインを含むリガンドとを結合する方法である。言い換えれば、がん細胞は、２種の異なる抗原結合ドメインを含むリガンドと結合され、その際、第一の抗原結合ドメインは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも１種の抗原に特異的であり、かつ第二の抗原結合ドメインは、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８からなる群から選択される少なくとも１種の他の抗原に特異的である。好ましい組み合わせは、ＣＬＡとＣＤ６６ｃ、及びＣＬＡとＴＳＰＡＮ８を含む。
【００７９】
抗原に結合し、この抗原を発現するがん性細胞の生存能力に影響を及ぼし、好ましくはがん性細胞を死滅させる作用剤と組み合わせて、本発明によるリガンドを使用してよい。かかる作用剤の例は、腫瘍崩壊性ウイルス、ＢｉＴＥｓ（登録商標）、ＡＤＣＣ及びイムノトキシンである。
【００８０】
腫瘍崩壊性ウイルスは、好ましくはがん細胞に感染し、死滅させるウイルスである。感染したがん細胞が細胞溶解により破壊されるため、それらは、新たな感染性ウイルス粒子を放出して、残る腫瘍の破壊を手助けする。腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘍細胞の分解を引き起こすだけでなく、宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激すると考えられる。特定のターゲティング（例えば開示された抗原に対するターゲティング／ライゲーション）は、腫瘍細胞を標的とするウイルス被覆タンパク質（例えば、開示された抗原に特異的な抗原結合ドメインでの）を改変することを含み、非腫瘍細胞への侵入を低減させる。
【００８１】
二重特異性Ｔ細胞誘導（Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ：ＢｉＴＥｓ（登録商標））は、抗がん剤としての使用のために研究されている人工二重特異性モノクローナル抗体の種類である。それらは、宿主の免疫系、より具体的にはがん細胞に対するＴ細胞の細胞傷害活性を導く。ＢｉＴＥｓは、約５５キロダルトンのペプチド単鎖上の異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は４つの異なる遺伝子からのアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの１つは、ＣＤ３レセプターを介してＴ細胞に結合し、他方は、腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する。他の二重特異性抗体と同様に、また通常のモノクローナル抗体とは異なり、ＢｉＴＥｓ（登録商標）は、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の結合を形成する。これは、ＭＨＣ Ｉ又は共刺激性分子の存在とは無関係に、パーフォリン及びグランザイムのようなタンパク質を生成することによって、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を作用するＴ細胞を生じる。これらのタンパク質は、腫瘍細胞に入り、細胞のアポトーシスを開始する。この作用は、腫瘍細胞に対するＴ細胞攻撃中に観察される生理学的プロセスを模倣する。
【００８２】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、標的細胞の表面に結合した抗体の存在を必要とする免疫系による攻撃のメカニズムである。抗体は、標的抗原に結合する結合領域（Ｆａｂ）と、それらの表面上のＦｃレセプターを介して免疫細胞により検出されうるＦｃ領域とから形成される。これらのＦｃレセプターは、ナチュラルキラー細胞を含む免疫系の多くの細胞の表面上に見出される。ナチュラルキラー細胞が抗体で被覆された細胞に出会う場合に、Ｆｃ領域は、それらのＦｃレセプターと相互作用し、パーフォリン及びグランザイムＢの放出を導く。これらの２つの化学物質は、腫瘍細胞にプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導する。細胞死滅のこの方法を誘発することが知られている抗体には、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）及びアレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）が含まれる。現在開発中の第三世代抗体は、ＡＤＣＣの速度を劇的に増加させることができる特定のタイプのＦｃレセプター、ＦｃγＲＩＩＩＡについてより高い親和性を有するＦｃ領域を改変させている。
【００８３】
イムノトキシンは、トキシンに結合した標的部位からなるヒトが作るタンパク質である。このタンパク質が前記細胞に結合した場合に、イムノトキシンは、エンドサイトーシスによって取り込まれ、トキシンが細胞を死滅させる。これらのキメラタンパク質は、通常、改変された抗体又は抗体断片から作られ、トキシンの断片に付着される。「標的部位」は、細胞によって、好ましくは特定の細胞型によって発現された抗原に特異的に結合する抗体のＦｖ部分から構成される。トキシンは、通常、Ｆｖがトキシンを標的細胞上の抗原に向かうように、天然の結合ドメインが除去されている細菌又は植物タンパク質に由来する細胞傷害性タンパク質である。
【００８４】
医薬組成物
本発明の別の目的は、既に開示されているＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の集団を、任意にＣｏｍｐｏｓｏｌ又はＮａＣｌ溶液のような製剤学的に許容されるキャリヤーと共に含む医薬組成物である。
【００８５】
がんの治療のための使用
開示された遺伝子操作された細胞の集団及び／又は遺伝子操作された細胞の集団を含む医薬組成物は、開示された標的分子を発現する細胞でのヒトのがん、特にヒト膵臓がんの治療のための方法において使用されてよい。
【００８６】
前記医薬組成物は、好ましくは、既に請求項１〜７のいずれかに１項に記載されたＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の集団を含む。本発明の変法において、医薬組成物は、がんの治療のための化学療法剤、放射線、又は免疫調節剤と組み合わせて使用される。
【００８７】
治療されるべきがんは、血液がん、骨髄異形成症候群、膵臓がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、メラノーマもしくは他の血液学的がん、及び充実性腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態において、がんは、血液学的がん、例えば白血病（例えば慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えばマントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫）、又は多発性骨髄腫、又はそれらの任意の組み合わせを含む。さらに、がんは、口腔及び咽頭のがん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系のがん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系のがん（喉頭、肺及び気管支）、骨、並びに関節のがん、軟組織のがん、皮膚のがん（メラノーマ、基底細胞がん及び扁平上皮がん）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、グリア芽腫、神経膠腫）、並びに乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓及び腎盂、尿管）、眼及び眼窩、内分泌系（甲状腺）、並びに脳、並びに他の神経系のがん、又はそれらの任意の組み合わせを含む成人がん腫を含んでよい。
【００８８】
がんの治療は、開示された少なくとも１種の抗原又は標的分子として開示された抗原の任意の組み合わせを含む任意の方法を包含してよい。かかる方法は、例えば、抗原に結合し、この抗原を発現するがん性細胞の生存能力に影響を及ぼし、好ましくはがん性細胞を死滅させる作用剤での治療であってよい。その例は、既に開示されている腫瘍崩壊性ウイルス、ＢｉＴＥｓ（登録商標）、ＡＤＣＣ及びイムノトキシンである。
【００８９】
治療のために、被験体の免疫細胞、例えばＴ細胞を単離してよい。被験体は、がんに罹患してよく、又は健康な被験体であってもよい。これらの細胞は、インビトロ又はインビボで遺伝的に改変されて、本発明の１種以上のＣＡＲを発現する。これらの遺伝子操作された細胞は、インビトロ又はインビボで活性化及び増加されてよい。細胞療法において、これらの遺伝子操作された細胞は、それを必要とするレシピエントに注入されてよい。これらの細胞は、医薬組成物（前記細胞＋製剤学的に許容されるキャリヤー）であってよい。注入された細胞は、レシピエントにおける開示された抗原の１種以上を発現するがん性細胞を死滅させる（又はがん性細胞の成長を少なくとも停止させる）ことができる。レシピエントは、細胞を得た同一の被験体であってよく（自己細胞療法）、又は同種の別の被験体からであってもよい（同種細胞療法）。
【００９０】
本発明の一実施形態において、膵臓がんに罹患している被験体は、免疫調節剤と共に本発明の医薬組成物で治療することができ、免疫調整剤はラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１もしくはＣＴＬＡ４シグナル伝達を遮断する作用剤であるが、これに制限されない。
【００９１】
本発明の一実施形態において、開示された抗原の１種以上を発現するがん性細胞が被験体のがん性細胞の部分母集団のみでありうることにより、被験体は、さらに化学療法又は放射線療法で処置されてよい。がんを治療するために適している化学療法剤及び放射線剤は、当業者に周知である。
【００９２】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞は、がん、特に膵臓がんに罹患している被験体に、前記で開示されている細胞療法として適用されるが、同一の遺伝子操作された細胞でも発現され、１種以上の開示された抗原を発現するがん性細胞上の追加のエピトープを認識する第二の活性化ＣＡＲとの組み合わせで適用して、双方のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の特異性を増加する。このエピトープは、膜結合、細胞外マトリックスの一部、又は可溶性成分であってよい。
【００９３】
本発明の一実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞は、前記で開示されている細胞療法としてがんに罹患している被験体に適用されるが、同一の遺伝子操作された細胞でも発現され、エピトープを認識する第二の阻害ＣＡＲとの組み合わせで適用して、双方のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の特異性を増加する。このエピトープは、膜結合、細胞外マトリックスの一部、又は可溶性成分であってよい。
【００９４】
免疫細胞、好ましくは開示された抗原の１種以上を発現するために遺伝子操作されたＴ細胞は、単独で、又は希釈剤と及び／又は他の成分、例えばＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてよい。簡潔には、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載された遺伝的に改変された細胞の細胞集団を、１種以上の製剤学的又は生理学的に許容されるキャリヤー、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含んでよい。かかる組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン；補助剤（例えば水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含んでよい。
【００９５】
好ましくは、本発明の組成物は、静脈内投与のために調製される。被験体への細胞組成物の投与を、当業者に公知の任意の適切な方法で実施してよい。
【００９６】
本発明の医薬組成物を、治療されるべき疾患に適した方法で投与してよい。適した投与形は、臨床試験により決定されてよい。しかし、投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によっても決定及び影響される。本明細書において開示される免疫細胞、好ましくはＴ細胞を含む医薬組成物は、体重１ｋｇあたり１０4〜１０9個の細胞、好ましくは体重１ｋｇあたり１０5〜１０6個の細胞の投与量で投与されてよい。細胞組成物を、これらの投与量で数回投与してもよい。細胞組成物を、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注入してよい。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、本発明のより詳細な説明を目的とするが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
【００９８】
実施例１：膵臓がんでの標的の発現
異種移植したヒト膵臓がん細胞でのＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８の発現は、腫瘍微環境に依存せずに膵臓がん細胞でのこれらのマーカーの強い存在度を示す（図３）。さらに、全てのマーカーは、初代ヒト膵臓がん細胞（Ｅｐｃａｍ＋と印される）で高レベルで再現性よく発現されるが、しかし、健常な腫瘍浸潤白血球（ＣＤ４５＋と印される）又は他の健康な組織常在細胞型（二重陰性（Ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）と印される）では再現性よく発現されない。これらの結果を、ヒト膵臓がんにおける標的発現の免疫組織化学に基づく検出を使用してさらに検証した（図５）。
【００９９】
実施例２：ＣＡＲを認識する膵臓がんに特異的な標的の構造
使用したリンカーは、図１において示されるＣＡＲの検出を可能にするエピトープ／タグを含んでよい。エピトープ／タグの例は、ＹＯＬ、ｃＭＹＣ、又はＨＩＳである。膵臓がんの標的特異的結合断片は、ＣＬＡ、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及び／又はＴＳＰＡＮ８に特異的な１種又は複数の抗体に由来する。ヒンジ領域は、例えばＩｇＧドメイン、ＣＤ８α、又はＣＤ２８に由来してよく、ＣＡＲの検出を可能にするエピトープ／タグを含んでよい。膜貫通ドメインは、３つのシグナル伝達ドメインに続くＣＤ８α又はＣＤ２８に由来してよい。これらのドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、又はＣＤ３ゼータに由来してよい。
【０１００】
実施例３：二重のＣＡＲを認識する膵臓がんに特異的な標的の構造
２種以上の標的の認識を、１つのＣＡＲ分子上で複数の抗原結合部位を組み合わせることによって、又は１つの細胞で発現され、かつ組み合わせでのみ作用する複数のＣＡＲ分子によって、例えば単独で使用した場合に細胞活性化に対して非効率的であるそれぞれのＣＡＲ構築物のためのシグナル伝達ドメインを使用することによって解決できる（図２）。
【０１０１】
実施例４：ＣＬＡに特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＬＡに特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＬＡに特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＬＡを作出することができる。配列番号１及び配列番号２で示される配列は、抗原ＣＬＡに特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＬＡに特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０２】
実施例５：ＣＤ１４２に特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ１４２に特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ１４２に特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ１４２を作出することができる。配列番号３及び配列番号４で示される配列は、抗原ＣＤ１４２に特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ１４２に特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０３】
実施例６：ＣＤ７３に特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ７３に特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５及び配列番号６において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ７３に特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ７３を作出することができる。配列番号５及び配列番号６で示される配列は、抗原ＣＤ７３に特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ７３に特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０４】
実施例７：ＣＤ４９ｃに特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ４９ｃに特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び配列番号８において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ４９ｃに特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ４９ｃを作出することができる。配列番号７及び配列番号８で示される配列は、抗原ＣＤ４９ｃに特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ４９ｃに特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０５】
実施例８：ＣＤ６６ｃに特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ６６ｃに特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９及び配列番号１０において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ６６ｃに特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ６６ｃを作出することができる。配列番号９及び配列番号１０で示される配列は、抗原ＣＤ６６ｃに特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ６６ｃに特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０６】
実施例９：ＣＤ１０４に特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ１０４に特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ１０４に特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ１０４を作出することができる。配列番号１１及び配列番号１２で示される配列は、抗原ＣＤ１０４に特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ１０４に特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０７】
実施例１０：ＣＤ３１８に特異的な抗体のアミノ酸配列
ＣＤ３１８に特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＣＤ３１８に特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＣＤ３１８を作出することができる。配列番号１３及び配列番号１４で示される配列は、抗原ＣＤ３１８に特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＣＤ３１８に特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０８】
実施例１１：ＴＳＰＡＮ８に特異的な抗体のアミノ酸配列
ＴＳＰＡＮ８に特異的に結合する使用した抗体のイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の可変部のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６において示した。抗原結合について特異性を生じる関連部位は、配列中に下線を引いたＩＭＧＴ（免疫グロブリン又は抗体のための国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム）定義にしたがったＣＤＲである。これらの配列又はＴＳＰＡＮ８に特異性を有するこれらに由来する任意の配列を使用して、ＣＡＲ認識ＴＳＰＡＮ８を作出することができる。配列番号１５及び配列番号１６で示される配列は、抗原ＴＳＰＡＮ８に特異的である配列の単なる例示のみである（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。他の配列を、抗体の又は抗原ＴＳＰＡＮ８に特異的でもあるＣＡＲの抗原結合ドメインを作出するために使用してよい。
【０１０９】
実施例１２：ＣＡＲ発現の確認
７５．０００ ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、４８ウェル中に播種した。細胞を、ＭＡＣＳｆｅｃｔｉｎトランスフェクションプロトコルを使用して２４時間後に０．５μｇのプラスミドでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に、１ｍＭのＥＤＴＡを補ったＰＢＳを使用して分離した。１種のプラスミドでトランスフェクトした細胞の３分の１を、抗ＣＤ２７１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で推奨されるプロトコルにしたがって染色した。別の３分の１を、３０分４℃で、ヤギで生産した抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂに特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度でインキュベートした。洗浄ステップ後に、細胞を、ニワトリで生産した抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）吸着処理二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３０分間４℃で、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度でインキュベートした。残りの３分の１を、バックグラウンド対照として二次抗体で記載されているように単独で染色した。試料を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０分析器を使用して測定した。図６Ａはトランスフェクション効率及び構築発現の読み出しとして表面上でＬＮＧＦＲを発現する細胞の割合を示す。図６Ｂは表面上でのＣＡＲ構築を発現する細胞の割合を示す。いくつかの例外を除いて、全てのＣＡＲ分子をうまく発現できた。
【０１１０】
実施例１３：レンチウイルス発現ベクターの製造
膵臓がんに特異的なＣＡＲを、ヒトＰＧＫプロモーターの制御下で、第三世代ＳＩＮ−レンチウイルスベクター構築物にクローニングした。この発現プラスミド並びに構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖ及びＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードするさらなるプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションは、上清へのウイルスベクター粒子の放出をもたらした。続いて、そのウイルスベクター粒子を、低速遠心分離によって濃縮し、−７０℃で保存した。
【０１１１】
実施例１４：Ｔ細胞分離及び膵臓がんに特異的なＣＡＲでの遺伝的改変
一次Ｔ細胞を、ドナーアフェレーシス又はバフィコート試料からマイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）及びＭＡＣＳ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離し、９０％を超える純度（ＣＤ３＋細胞）に達した。磁気的に濃縮した細胞を、洗浄し、そして２００ ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補ったＴｅｘＭＡＣＳ培地で再懸濁した。そして、そのＴ細胞を、ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ ＣＤ３／ＣＤ２８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加により刺激した。
【０１１２】
２４時間後に、Ｔ細胞の刺激がうまくいったことを、Ｔ細胞をＣＤ２５及びＣＤ６９抗体で染色することにより確認し、そしてＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのフローサイトメトリーにより分析した。そして刺激したＴ細胞を、膵臓がんに特異的なＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをＭＯＩ＝０．５〜２で添加することによりトランスダクションした。静的培養の４日後に、その細胞を洗浄して、過剰なウイルスベクター及びＴｒａｎｓＡｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔを取り除き、そしてさらに５〜１０日間培養した。ウイルスのトランスダクション効率を、抗ヒトＦｃ蛍光色素及びフローサイトメトリーを使用して、生きているＣＤ３＋細胞中の膵臓がんに特異的なＣＡＲの表面発現を染色することによって測定した。遺伝子を印付けられたＴ細胞の数は、使用したＭＯＩに依存して、１０〜６０％の範囲であった。
【０１１３】
実施例１５：膵臓がんに特異的なＣＡＲの機能性
１種以上の膵臓がんに特異的な標的を発現する細胞又はこれらの標的を発現しない細胞を、５〜２４時間、膵臓がんに特異的なＣＡＲを発現する増加させたＴ細胞で、又は対照として非トランスダクションＴ細胞で、様々なエフェクターと標的細胞との割合でインキュベートした。特定の標的細胞の死滅を、フローサイトメトリーによって分析した。代わりに、エフェクター細胞を、標的に陽性又は陰性である細胞株で再刺激した。サイトカイン生産（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α）及び脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）を、フローサイトメトリーによって分析した。膵臓がんに特異的なＣＡＲを持つＴ細胞のみが、標的細胞を死滅させることができ、増加したサイトカイン生産及び脱顆粒マーカーのアップレギュレーションを示した。
【０１１４】
さらに、死滅効率及び速度論を、ＣＡＲ Ｔ細胞及び膵臓がん細胞の長期の共培養により分析した。Ｔ細胞を、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、健康なドナーの全供血から単離した。単離したＴ細胞を、４０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補ったＴｅｘＭＡＣＳTMＧＭＰ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して活性化した。２４時間後に、Ｔ細胞を、ＣＡＲ構築物を含むレンチウイルスベクターで、ＭＯＩ＝２でトランスデュースした。続いて、Ｔ細胞を、４０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補ったＴｅｘＭＡＣＳTMＧＭＰ培地中で培養した。トランスダクションの１２日後に、ＣＡＲ発現を、レポータータンパク質ＬＮＧＦＲのフローサイトメトリー測定により評価した。ＣＡＲに陽性のＴ細胞を、同数まで調整し、そして９６ウェルプレートに膵臓腺がんの細胞株ＢｘＰＣ３と共に２００μｌのＴｅｘＭＡＣＳTMＧＭＰ培地中で植え付けた。このアッセイの前に、ＢｘＰＣ３細胞を、ＧＦＰを含むレンチウイルスベクターでトランスデュースした。ＧＦＰに陽性である細胞を追跡し、そしてＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。「グリーン オブジェクト コンフルエンス（Ｇｒｅｅｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）」を、ＧＦＰを発現する付着標的細胞の特異的溶解とは逆相関するため、読み取り値として使用した。全てのＣＡＲ構築物は、モック対照と比較して腫瘍細胞の効率的な死滅を媒介した。結果を、図７において示す。
【０１１５】
実施例１６：ＣＬＡを認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＬＡを認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１１６】
実施例１７：ＣＤ１４２を認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ１４２を認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号１９又は配列番号２０のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１１７】
実施例１８：ＣＤ７３を認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ７３を認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１１８】
実施例１９：ＣＤ４９ｃを認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ４９ｃを認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１１９】
実施例２０：ＣＤ６６ｃを認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ６６ｃを認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号２５又は配列番号２６のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１２０】
実施例２１：ＣＤ１０４を認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ１０４を認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号２７又は配列番号２８のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１２１】
実施例２２：ＣＤ３１８を認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＣＤ３１８を認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号２９又は配列番号３０のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１２２】
実施例２３：ＴＳＰＡＮ８を認識するＣＡＲ結合ドメインのアミノ酸配列
ＴＳＰＡＮ８を認識するＣＡＲに特異的な抗原結合ドメインについて、配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ｀ｓを使用した（配列はアミノ酸の１文字コードで示される）。
【０１２３】
実施例２４：一次ヒト膵臓がん細胞でのＣＬＡと、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８との同時発現
ヒト膵臓腺がん組織を分離し、染色し、そして分析した。図６Ａは、一般的なゲーティング戦略を示す：デブリ排除の後に、死滅細胞をヨウ化プロピジウム染色で排除した。望ましくないダブレットを、前方散乱のための範囲に対して高さをプロットすることによって排除した。ＥｐＣＡＭ＋、ＣＤ４５＋及びＣＤ４５−／ＥｐＣＡＭ−の細胞を区別し、そして標的に特異的なＰＥ又はＡＰＣ連結抗体で分析した。図６Ｂは、一次ヒト膵臓がん細胞でのＣＬＡと、ＣＤ１４２、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０４、ＣＤ３１８及びＴＳＰＡＮ８との同時発現を示す。結果は、二重標的化のための前提条件であるこれらのマーカー間の強い同時発現を示す（図８Ａ及びＢ）。
【０１２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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