(57)【要約】【課題】ヌトリン３ａおよびペプチドを用いた肺線維症の阻害を提供すること。【解決手段】線維性肺線維芽細胞では、ｐ５３タンパク質（およびｍｉＲ−３４ａ）の基本レベルは、著しく抑制され、ｕＰＡおよびｕＰＡＲのｐ５３介在性阻害の減少、またはＰＡＩ−１の同時に起こる誘発がもたらされる。これらの変化は、過剰なＦＬ線維芽細胞増殖および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）産生に起因しており、従って、肺線維症である。これらの過程は、ｐ５３タンパク質のＭＤＭ２介在性分解の阻害により、ｐ５３レベルを増加させる、小有機分子ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）またはペプチド、ＣＳＰ−４（配列番号１）、もしくはこのペプチドの変異体もしくは誘導体もしくは多量体を用いた、該細胞の治療、および特発性肺線維症（ＩＰＦ）を患っている対象の治療により、回復に向かわせる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生化学および医学分野の本発明は、ｐ５３タンパク質レベルを増加させ、線維性肺（ＦＬ）における、ｕＰＡとｕＰＡＲを減少させて、ＰＡＩ−１発現を増加させ、およびそれらの増殖を減少させるため、ならびにヌトリン３ａおよびペプチドを使用して突発性肺線維症（ＩＰＦ）を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
突発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺移植以外治療法が存在しない、不明なところが多い進行性で致死的肺疾患である（Ｍａｓｏｎ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ８４：１１２１−８，２００７）。診断後５年での生存率中央値は、２０％未満である。間質性肺疾患のほとんどの型および肺線維症の他の型は、線維性病変、肺胞構造の進行性ひずみの発生および過剰の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着を有する線維性または瘢痕組織による置換により特徴付けられる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ
Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６１：６４６〜６６４，２０００；Ｎｏｂｌｅ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｓｔ  Ｍｅｄ  ２５：７４９〜７５８，２００４；Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３４：１３６〜１５１，２００１）。これは、進行性呼吸困難および肺機能損失をもたらす。特徴的な形態的病変は、完全に確立された線維症領域、顕微鏡レベルの蜂巣状部、および活発に増殖およびコラーゲン産生している線維芽細胞／筋線維芽細胞、いわゆる、「線維化巣」に直接的に隣接する正常な肺の領域に組み込まれる空間的および時間的多様性である。
【０００３】
ＩＰＦは、米国における１００，０００名の個人に対して推定発現数４０〜５０事例となる原因不明の最もよく見られる長期的、進行性および致死的肺疾患である。線維性肺（「ＦＬ」）線維芽細胞（または筋線維芽細胞）生存率増加、活性化、ＥＣＭの産生および沈着は、ＩＰＦ肺を典型的に表す（Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｒｕｇｓ  １６：３４１〜６２，２０１１；Ｓｈｅｔｔｙ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５：７８〜８７，１９９６；Ｚｈｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９７：Ｌ９７〜１０８，２００９；Ｓｕｇａｎｕｍａ
Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ  ５０：９８４〜９，１９９５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，上記参照；Ｎｏｂｌｅ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【０００４】
本発明（および他）による以前の研究では、ＩＰＦ患者の肺からのＦＬ線維芽細胞を含む肺線維芽細胞が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ｕＰＡ受容体、（ｕＰＡＲ）およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ−１）を発現することを示した（Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，上記参照；Ｓｈｅｔｔｙ
ＳおよびＩｄｅｌｌ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：Ｌ８７１〜Ｌ８８２，１９９８；Ｃｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：８１９６〜２０６，２０１０）。ｕＰＡは、正常な肺（ＮＬ）とＦＬ線維芽細胞の両方の分裂促進的であり、その過程は、ｕＰＡが、ｕＰＡ成長因子ドメインによりｕＰＡＲと結合することを含む（Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３：７５９〜６５，１９９６；Ｐａｄｒo  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ
Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：１９６１〜７１，２００２；Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８：Ｌ９７２〜Ｌ９８２，１９９５；Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ  ５：３０７〜３１４，１９９５）。加えて、ｕＰＡは、ｕＰＡＲ発現を増強する（Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２４５４９〜５６，２００１；Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０：６９〜７５，２００４）。数年前、本発明者らは、ＩＰＦ肺からのＦＬ線維芽細胞が、有意により多くのｕＰＡおよびｕＰＡＲを発現し、ＮＬ線維芽細胞より高い速度の基礎およびｕＰＡ介在増殖を示すことを報告した（Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，上記参照；１９９８，上記参照）。他のグループは、ＩＰＦを有する患者からのＦＬ線維芽細胞によるｕＰＡＲ発現増加は、移動行動の一因となる（Ｍａｃｅ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８：２５６７〜７７，２００５；Ｂａｓｉｒｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９５：６７８〜８８，２００６；Ｚｈｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，上記参照）。
【０００５】
本発明者らによる研究により、ｕＰＡが、転写後段階において、ｕＰＡ（Ｓｈｅｔｔｙ
Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９：３６４〜７２，２００８）、その受容体ｕＰＡＲ（Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７：５６０７〜１８，２００７）およびその主要なインヒビターＰＡＩ−１（Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２８３：１９５７０〜８０，２００８）の相互発現を制御するｐ５３（Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，上記参照）の調節により上皮細胞アポトーシス／生存を調節し、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、カベオリン１（「Ｃａｖ−１」）およびβ１インテグリン（Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，上記参照）間の新規細胞表面シグナリング相互作用を含むことが発見された。前述の認識に基づいて、本発明者らは、ＡＬＩおよびその結果として生じるリモデリング反応を治療するための新規組成物および方法を考え出すに至った
【０００６】
肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）（この用語は、「肺（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）」線維症」と互換的に使用される）の間、主に、腫瘍抑制タンパク質として公知の転写因子ｐ５３の発現は線維性線維芽細胞内で過剰に抑制され、ＰＡＩ−１発現が有意に阻害される一方、次々に、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現を誘発する。ｐ５３発現線維性線維芽細胞の阻害の結果として起こるＰＡＩ−１発現の抑制ならびにｕＰＡおよびｕＰＡＲの同時に起こる誘発は、線維芽細胞の増殖およびＥＣＭ沈着、すなわち線維症の原因となる。ｍｄｍ２のｐ５３との相互作用増加およびｐ５３の引き続き起こるｍｄｍ２介在ユビキチン化は、線維性線維芽細胞内のｐ５３の阻害の一因となる。
【０００７】
ｐ５３およびＮＦ−κＢの活性度間の相互関係は、がん細胞内で示されていたが、炎症過程中のｐ５３およびＮＦ−κＢ間の相互作用に関する情報はほとんどない。Ｌｉｕ  Ｇら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：５０６３〜７１（２００９））は、ｐ５３、（ｐ５３（−／−）の不足している好中球およびマクロファージが、ｐ５３（＋／＋）細胞より、細菌性脂質多糖体（ＬＰＳ）の刺激に対する大きな応答を有し、それらが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＭＩＰ−２を含む、より多量の炎症誘発性サイトカインを産生して、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性増強を示すことを発見した。ｐ５３（−／−）マウスは、ｐ５３（＋／＋）マウスより、ＬＰＳ誘発性急性肺障害（ＡＬＩ）に、よりかかりやすい。ＬＰＳに対するｐ５３（−／−）細胞の応答増加は、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４会合（例えば、ＭＡＰキナーゼの活性化、ＩκＢ−αまたはＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットのリン酸化、またはＩκＢ−αの分解の会合と関連する細胞内シグナル伝達現象の交互変化を含まない。ＬＰＳ刺激好中球およびマクロファージのヌトリン３ａを用いた培養は、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性および炎症誘発性サイトカインの産生を減弱した。マウスのヌトリン３ａ処理は、ＬＰＳ誘発性ＡＬＩの重症度を減少させた。著者らは、ｐ５３が、炎症細胞内のＮＦ−κＢ活性を調節すると結論し、ｐ５３の調節が、ＡＬＩなどの急性炎症状態で、治療効果の可能性を有し得ることを示唆した。
【０００８】
ヌトリン（またはヌトリン３ａ）（ＮＴＬと略す）
ヌトリンまたはヌトリン３ａとも名付けられた有機分子４−２−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−１−ピペラジン−２−オン（Ｃ３０Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ４Ｏ４）の化学構造は、以下に示される
【化１】
2018158952.tif 000002
ＮＴＬは、ＭＤＭ２のアンタゴニストであり、ｐ５３活性化因子およびアポトーシス誘導物質である。ＭＤＭ２は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質と結合し、その転写活性および安定性を負に調節することにより作用する。ＭＤＭ−ｐ５３相互作用の阻害は、ｐ５３の安定化、細胞周期停止およびアポトーシスをもたらす。ヌトリン３は、がん細胞内のｐ５３経路の活性化によるがん治療としての可能性を示した。（Ｔｏｖａｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１８８８〜１８９３（２００６）；Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｌ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３  ８４４〜８４８（２００４）；Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １１：２２９〜２３６（１９９８））。
【０００９】
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．７，８９３，２７８（Ｈａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）は、一般的、且つ、具体的に、キラルヌトリン３を開示した。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．６，７３４，３０２は、ラセミ体のヌトリン３を説明している。該‘２７８号特許は、式
【化２】
2018158952.tif 000003
の化合物を教示している。上記特許の両方とも、該Ｍｄｍ２−ｐ５３相互作用のインヒビターとして、およびがん治療での使用を考察している。
【００１０】
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ２０１１／０３０１１４２（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）は、ＬＰＡ１受容体アンタゴニストの治療効果量を、哺乳類に投与することを含む、該哺乳類の突発性肺線維症の治療方法を教示している。該アンタゴニストは、特定のイミダゾール誘導体であり得るが、ＮＴＬなどのイミダゾリン系化合物ではない。
【００１１】
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．６，５９６，７４４（Ｗａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、その全てが、明白に、ＮＴＬと異なる複素環式化合物を用いた、特定の線維症の治療または寛解方法を開示している。開示された疾病としては、線維性肥大または肺組織の線維症の症状として有する繊維性肺疾患が挙げられる。これらの疾病としては、肺線維症（または間質性肺疾患または間質性肺線維症）、突発性肺線維症、塵肺症の線維性因子、肺サルコイドーシス、線維化肺胞炎、嚢胞性線維症の線維性または肥大性因子、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸促迫症候群および肺気腫症が挙げられる。
【００１２】
Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２１７８〜８５（２００７）中、Ｄｅｙらは、ヌトリンが、ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用を阻害する、最初の強力で、特異的な小分子Ｍｄｍ２アンタゴニストとして、同定されたことを記載している。
【００１３】
前述の文書はいずれも、ヌトリン３ａを用いたＩＰＦ治療を開示していない。
【００１４】
カベオリン１由来のペプチド
本発明者らは、生体外および生体内で、ブレオマイシン（「ＢＬＭ」）誘発アポトーシスから、肺上皮細胞（ＬＥＣ）を保護および肺上皮損傷の減弱により、引き続く肺線維症を予防したカベオリン１（Ｃａｖ−１；下記配列番号３）の足場ドメインである２０個の残基ペプチドＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ（配列番号２）を発見した（Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌ１２／３９８，７５７、Ｕ．Ｓ．２００９−０２２７５１５Ａ１として公開（２００９年９月１０日）、その全文を参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）。本発明者らは、同様に、生体外および生体内で、ＢＬＭ誘発アポトーシスから、ＬＥＣを保護および肺上皮損傷の減弱により、引き続く肺線維症を予防した、ＰＰ−２と名付けられた、１７個の残基ペプチドＮＹＨＹＬＥＳＳＭＴＡＬＹＴＬＧＨ（配列番号４）も発見した。
【００１５】
Ｓｈｅｔｔｙら、２００９（上記参照）は、上記ペプチドを含むペプチド多量体および送達可能なポリペプチドだけでなく、これらのペプチドの生物活性置換、付加および欠失変異体、および前記ペプチド、変異体および多量体を含む医薬組成物も記載している。これらの組成物は、傷害または損傷した肺上皮細胞のアポトーシスを阻害および急性肺傷害および結果としての肺線維症／ＩＰＦを治療する。
【００１６】
前記文章は、配列ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）を有し、ＣＳＰの生物活性を有して、本発明の主題の部分を構成する、ＣＳＰ−４と名付けられた、ＣＳＰの特定のフラグメント（本発明の部分として、以下に開示）を同定していなかった。
ＩＰＦに対する診断不足および治療方法の欠如を考慮して、疾病進行を食い止めるまたは少なくとも遅延させるため、緊急に、新規の治療介入の必要性がある。この重要な治療の空白が、本発明により取り組まれる。
本発明は、本発明者らの前の発見（Ｓ．Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，２００８＆２００９、上記参照）を構成し、その延長である。下記セクションに記載の通り、該ｐ５３は、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１の発現を調節する。本過程は、ｐ５３  ｍＲＮＡに影響を与えないで、転写後段階におけるｐ５３タンパク質発現のＭＤＭ２介在制御を含む。これらの観察は、線維性修復でのｐ５３の発現および該ｕＰＡ線溶系の間の因果関係を示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第７８９３２７８号明細書
【特許文献２】米国特許第６７３４３０２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／０３０１１４２号明細書
【特許文献４】米国特許第６５９６７４４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０２２７５１５Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｍａｓｏｎ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ８４：１１２１−８，２００７
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６１：６４６〜６６４，２０００
【非特許文献３】Ｎｏｂｌｅ  ＰＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｓｔ  Ｍｅｄ  ２５：７４９〜７５８，２００４
【非特許文献４】Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３４：１３６〜１５１，２００１
【非特許文献５】Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｒｕｇｓ  １６：３４１〜６２，２０１１
【非特許文献６】Ｓｈｅｔｔｙ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５：７８〜８７，１９９６
【非特許文献７】Ｚｈｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９７：Ｌ９７〜１０８，２００９
【非特許文献８】Ｓｕｇａｎｕｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ  ５０：９８４〜９，１９９５
【非特許文献９】Ｓｈｅｔｔｙ  ＳおよびＩｄｅｌｌ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：Ｌ８７１〜Ｌ８８２，１９９８
【非特許文献１０】Ｃｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：８１９６〜２０６，２０１０
【非特許文献１１】Ｔｋａｃｈｕｋ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２３：７５９〜６５，１９９６
【非特許文献１２】Ｐａｄｒo  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：１９６１〜７１，２００２
【非特許文献１３】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８：Ｌ９７２〜Ｌ９８２，１９９５
【非特許文献１４】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ  ５：３０７〜３１４，１９９５
【非特許文献１５】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２４５４９〜５６，２００１
【非特許文献１６】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０：６９〜７５，２００４
【非特許文献１７】Ｍａｃｅ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８：２５６７〜７７，２００５
【非特許文献１８】Ｂａｓｉｒｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９５：６７８〜８８，２００６
【非特許文献１９】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３９：３６４〜７２，２００８
【非特許文献２０】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７：５６０７〜１８，２００７
【非特許文献２１】Ｓｈｅｔｔｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２８３：１９５７０〜８０，２００８
【非特許文献２２】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２：５０６３〜７１（２００９）
【非特許文献２３】Ｔｏｖａｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１８８８〜１８９３（２００６）
【非特許文献２４】Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｌ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３  ８４４〜８４８（２００４）
【非特許文献２５】Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １１：２２９〜２３６（１９９８）
【非特許文献２６】Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２１７８〜８５（２００７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ＮＴＬを用いた、ＭＤＭ２とのｐ５３タンパク質相互作用の阻害は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを阻害する一方、ｐ５３およびＰＡＩ−１を増強する。これらの変化は、ＢＬＭ誘発性促進的肺線維症を有するマウスの肺からだけでなく、ＩＰＦを有する患者の肺から単離された、線維性線維芽細胞のアポトーシスおよび線維性線維芽細胞の増殖阻害をもたらす。
【００２０】
本発明に従えば、ＮＴＬは、線維性線維芽細胞内でｐ５３発現を誘発または増強することにより、進行性および罹患している肺線維症を阻害する。従って、この化合物は、それを必要とする対象の肺線維症を治療するために有用である。
【００２１】
本発明者らは、ＦＬ線維芽細胞内の該ｕＰＡ線溶系の妨げられたｐ５３介在制御が、ＩＰＦの標的療法の基盤であることを着想した。ＦＬ線維芽細胞では、コラーゲンＩ（Ｃｏｌ−Ｉ）およびα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）などのＥＣＭタンパク質のレベルが増加する一方、ｐ５３のベースライン発現およびミクロＲＮＡ−３４ａは、顕著に抑制される。該ｍｄｍ２阻害化合物ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４のいずれかを用いた、ＦＬ線維芽細胞の治療は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの相互抑制しながら、ｐ５３およびＰＡＩ−１発現を増強する。ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４を用いた、ＦＬ線維芽細胞の治療は、ＥＣＭの産生も阻害する。本発明者らのこれらの先行発見および最近の刊行物は、肺線維症に至るＦＬ線維芽細胞中で、別様にゆがめられるｐ５３およびｕＰＡ線溶系の間のクロストークを回復するための介入性アプローチを正当化する。ｐ５３は、ｕＰＡ線溶系２が制御不能になる多面発現効果を有する。しかしながら、ＰＡＩ−１は、線維芽細胞および他細胞内のｐ５３の下流エフェクターである。
【００２２】
重要なことに、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３の修復は、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１の発現、細胞生存性ならびにＥＣＭの産生を調節する。ＦＬ線維芽細胞内の該ｐ５３−ｕＰＡ線溶系標的アプローチを、図１に示す。ｍｉＲ−３４ａが、ヒストン脱アセチル化酵素サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）の阻害により、ｐ５３のアセチル化を増強する一方、ｐ５３は、ｍｉＲ−３４ａ転写を誘導する。これは、ｍｄｍ２により介在されたその分解の阻害によって、ｐ５３タンパク質の安定化をもたらす。しかしながら、ＦＬ線維芽細胞内では、ｐ５３タンパク質およびｍｉＲ−３４ａの基本レベルは、カベオリン１の低ベースライン発現の結果として、ｍｄｍ２によるｐ５３タンパク質のユビキチン化増加によって、顕著に抑制される。これは、ｕＰＡおよびｕＰＡＲのｐ５３介在阻害減少、またはＰＡＩ−１の同時誘発をもたらす。この変化は、過剰なＦＬ線維芽細胞増殖およびＥＣＭの産生の一因となり、ＣＳＰ−４およびヌトリン３ａにより回復される。ＣＳＰ−４およびヌトリン３ａは、ｐ５３タンパク質のｍｄｍ２介在分解の阻害により、ｐ５３レベルを増加させる。ＦＬ線維芽細胞内の該ｕＰＡ線溶系でのｐ５３発現およびｐ５３介在変化の回復は、生存率の減衰をもたらし、ＥＣＭの産生および沈着を制限する。これらに細胞；ＰＡＩ−１に対するアポトーシス促進シグナルを誘発する一方、該増殖シグナルｕＰＡおよびｕＰＡＲを次々に抑制する、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３レベルの回復を経て、罹患している肺線維症を有するＢＬＭ投与後のマウス内で、線維症は阻害される。
【００２３】
本発明者らは、初めて、該ｕＰＡ線溶系のｐ５３介在変化が、肺線維症の病変形成の中核を成す肺線維芽細胞の線維化促進反応を調節し、この経路が、治療効果のため、標的になり得ることを示す。組織学的に「正常な」肺からのＮＬ線維芽細胞と異なり、線維性肺組織からの線維芽細胞／筋線維芽細胞を含むＦＬ線維芽細胞は、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現が高い一方、非常に低レベルのベースラインｐ５３、ｍｉＲ−３４ａおよびカベオリン１を発現する。ＣＳＰ−４、または低分子量化合物ヌトリン３ａを用いた、ＦＬ線維芽細胞の治療は、ｐ５３およびｍｉＲ−３４ａ発現を回復し、ＰＡＩ−１を誘発する。これらの変化が、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現を抑制し、ＥＣＭ沈着を阻害する。これらの薬剤は、ＢＬＭ誘発性肺線維症も回復に向かわせ、肺上皮も保護し、同様に、ｐ５３および該線溶系の調節の間のクロストークを示す。従って、肺線維症のＣＳＰ−４介在性またはヌトリン３ａ介在性緩和は、新規治療方法を示す。
【００２４】
現在、肺線維症を回復に向かわせる効果的治療はない。本発明は、この重要な空白に対処して、線維性肺疾患を効果的に治療するため、ＦＬ線維芽細胞およびｐ５３とｕＰＡ線溶系の間のクロストークを標的にする新規化合物および方法を提供する。
【００２５】
本発明は、物質の組成物にも関する。１つの実施形態では、該組成物は、好ましくは：
（ａ）その配列が、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、ＣＳＰ−４と指定されたペプチド；
（ｂ）約２０アミノ酸長までの該ＣＳＰ−４ペプチドの付加変異体であって、配列番号３の配列を有するカベオリン１（Ｃａｖ−１）の足場ドメイン（ＣＳＰ）でない変異体；
（ｃ）（ａ）の該ＣＳＰ−４ペプチドの共有結合的に修飾された化学誘導体、
（ｄ）（ｂ）の該変異体の共有結合的に修飾された化学誘導体、
（変異体または化学誘導体は、生体外または生体内アッセイにおいて、該ＣＳＰ−４ペプチドの、少なくとも、２０％の生物または生化学活性を有する）から成る群から選択されるＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加させ、ｕＰＡを減少させ、ＰＡＩ−１発現を増加させるペプチド化合物である。上記または下記、該ペプチド変異体、化学誘導体または多量体は、好ましくは、活性ＣＳＰ−４と比較して、次の活性を有する：少なくとも、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、約９５％、９７％、９９％、および例えば、約７０％〜約８０％、より好ましくは、約８１％〜約９０％；またはさらにより好ましくは、約９１％〜約９９％などの、そこで導き出せるいずれもの範囲。該ペプチド変異体化学誘導体または多量体は、１００％または１００％より大きなＣＳＰ−４活性を有し得る。この相対的活性は、本明細書中の開示、またはかかる活性を評価する分野で公知のいずれかの方法に基づき得る。
【００２６】
好ましい化合物は、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）で、ＣＳＰ−４と指定されたヘプタペプチドである。
【００２７】
好ましいペプチド多量体は、各モノマーが、ＣＳＰ−４ペプチド、変異体または化学誘導体である、少なくとも２つのモノマーを含み、該多量体が：
（ａ）式Ｐ１ｎを有し、式中、
（ｉ）Ｐ１は、上記、ペプチド、変異体または化学誘導体であり、および
（ｉｉ）ｎ＝２〜５であり、または
（ｂ）式（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、上記、ペプチド、変異体または化学誘導体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチド、変異体または誘導体であり、
（ｉｉｉ）Ｘは、４個までの酸素原子を含有する、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ポリエーテルであり；
（ｉｖ）ｍ＝０または１であり；および
（ｖ）ｎ＝１〜７であり、
（ｃ）式（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、ペプチド、変異体または誘導体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチドまたは変異体または誘導体であり；
（ｉｉｉ）ｚ＝０〜６であり；および
（ｉｖ）ｎ＝１〜２５である、
（式中、該ペプチド多量体は、好ましくは、生体外または生体内アッセイにおいて、該ＣＳＰ−４ペプチドの、少なくとも、２０％の生物活性を有する）である。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、送達可能なペプチド、または：
（ａ）上記、ペプチド、変異体、誘導体、ポリペプチド、または多量体、および
（ｂ）それと結合または会合または混合した送達または転移分子または部分
を含むポリペプチドもしくはペプチド多量体組成物に関する。好ましい転移分子または部分を以下に記載する。
【００２９】
（ａ）薬剤的に許容可能な担体または賦形剤および、
（ｂ）活性成分として、上記、ペプチド、ペプチド変異体、化学誘導体、ポリペプチドまたはペプチド多量体（ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）またはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体を含む医薬組成物と併用してもよく、ＮＴＬ類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、少なくとも２０％のＮＴＬの生物または生化学活性を有する）
を含む抗線維性医薬組成物も提供され；
随意に組み合わせたＮＴＬまたはＮＴＬ類似体が、好ましく、注射または経口投与用に処方されるのに対して、最も好ましくは、注射または肺点滴注入用に処方された上記ペプチド関連医薬組成物である。
【００３０】
本発明は、ｐ５３タンパク質とのＭＤＭ２相互作用およびｐ５３のＭＤＭ２介在分解を阻害する化合物の効果量を、ＦＬ線維芽細胞に提供することを含む、線維性肺（ＦＬ）線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを減少およびＰＡＩ−１を増加する方法に関し、該化合物が：
（ａ）ＮＴＬまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体；
（ｂ）  （ｉ）その配列が、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）であるＣＳＰ−４；
（ｉｉ）付加変異体が、２０アミノ酸長を超えない、該ＣＳＰ−４ペプチドの追加変異体；
（ｉｉｉ）ＣＳＰ−４ペプチドの共有結合的に修飾された化学誘導体
から成る群から選択されるペプチド、または
（ｃ）各モノマーが、該ＣＳＰ−４ペプチド、（ｂ）の変異体もしくは化学誘導体である、少なくとも２つの該モノマーを含むペプチド多量体、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせ
（該ＮＴＬ類似体、該ペプチド変異体、該ペプチド化学誘導体または該ペプチド多量体は、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬまたは該ＣＳＰ−４ペプチドの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）である。
【００３１】
上記または下記、ＮＴＬ類似体は、好ましくは、ＮＴＬの活性と比較して、次の活性を有する：少なくとも、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、約９５％、９７％、９９％、および、例えば、約７０％〜約８０％、より好ましくは、約８１％〜約９０％；またはさらにより好ましくは、約９１％〜約９９％などの、そこで導き出せるいずれもの範囲。該ＮＴＬ類似体は、１００％または１００％より大きなＮＴＬの活性を有し得る。この相対的な活性は、本明細書中の開示、またはかかる活性を評価する分野で公知のいずれかの方法に基づき得る。
【００３２】
上記方法の好ましい実施形態では、上記方法の該化合物は、ＮＴＬである。別の実施形態では、該化合物は、配列番号１のＣＳＰ−４ペプチドである。該方法の別の実施形態では、該化合物は、該ペプチド多量体、好ましくは、該ＣＳＰ−４ペプチド（配列番号１）のモノマーを含むものである。
【００３３】
好ましくは、上記方法が、ペプチド多量体を使用する：
（ａ）該ペプチド多量体が、式Ｐ１ｎを有し、式中、
（ｉ）Ｐ１は、該ペプチド、変異体または化学誘導体であり、および
（ｉｉ）ｎ＝２〜５であり、または
（ｂ）該ペプチド多量体が、式（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、該ペプチド、変異体または化学誘導体であり；
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチド、変異体または誘導体であり；
（ｉｉｉ）Ｘは、４個までの酸素原子を含有する、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ポリエーテルであり；
（ｉｖ）ｍ＝０または１であり；および
（ｖ）ｎ＝１〜７であり、または
（ｃ）該ペプチド多量体が、式（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、該ペプチド、変異体または誘導体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチドまたは変異体または誘導体であり；
（ｉｉｉ）ｚ＝０〜６であり；および
（ｉｖ）ｎ＝１〜２５である、
好ましくは、該多量体は、生体外または生体内アッセイにおいて、ＣＳＰ−４ペプチドの、少なくとも、２０％の生物活性を有する。
【００３４】
ｐ５３タンパク質のＭＤＭ２介在分解の阻害により、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加させ、ｕＰＡおよびｕＰＡＲレベルを減少させ、ＰＡＩ−１発現を増加させる化合物または組成物の効果量を、対象に投与することを含む、肺線維症（すなわち、ＩＰＦ）により特徴付けられる疾病または状態を有する、哺乳類対象、好ましくは、ヒトを治療する方法も提供される。この方法の好ましい実施形態では、該化合物または組成物は、
（ａ）ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）またはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するそのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体；
（ｂ）  （ｉ）その配列が、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）であるＣＳＰ−４、最も好ましいペプチド実施形態；
（ｉｉ）付加変異体が、２０アミノ酸長を超えない、該ＣＳＰ−４ペプチドの追加変異体；
（ｉｉｉ）ＣＳＰ−４ペプチドの共有結合的に修飾された化学誘導体
から成る群から選択されるペプチド、または
（ｃ）各モノマーが、該ＣＳＰ−４ペプチド、（ｂ）の変異体もしくは化学誘導体、最も好ましくは、ＣＳＰ−４の多量体である、少なくとも２つの該モノマーを含むペプチド多量体、
（ｄ）上記送達可能なペプチド、またはポリペプチドもしくはペプチド多量体組成物、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせ
（該ＮＴＬ類似体、または該ペプチド変異体、該ペプチド誘導体または該ペプチド多量体は、生体外または生体内アッセイにおいて、それぞれ、ＮＴＬまたは該ＣＳＰ−４ペプチドの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）である。
【００３５】
この方法では、該化合物は、好ましく、薬剤的に許容可能な担体または賦形剤を、さらに含む医薬組成物中にある。該化合物は、該ＮＴＬ、ＮＴＬ類似体またはペプチド化合物の薬剤的に許容可能な塩であり得る。該方法の好ましい実施形態では、該化合物は、ＮＴＬである。この方法の別の実施形態では、該化合物は、該ペプチド多量体、最も好ましくは、該ＣＳＰ−４ペプチドＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）のモノマーを含む多量体である。
【００３６】
本発明は、
（ａ）ｐ５３タンパク質レベルが増加するとき、ＦＬ線維芽細胞内のｕＰＡを減少およびＰＡＩ−１発現を増加させるため、または
（ｂ）肺線維症として特徴付けられる疾病または状態を治療するため、ＮＴＬ、上記ＮＴＬ類似体、上記ペプチド、変異体、化学誘導体または多量体の使用にも関する。
【００３７】
肺線維症として特徴付けられる疾病または状態を有する対象の治療用途の医薬製造のため、本明細書に定義されたＮＴＬ、上記ＮＴＬ類似体、上記ペプチド、変異体、化学誘導体またはペプチド多量体の使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、線維性肺（ＦＬ）線維芽細胞内のｐ５３の低ベースライン発現および該ｕＰＡ線溶系の混乱したｐ５３介在制御が、線維形成をもたらすことを示す略図である。ＩＰＦおよび本発明の方法および組成物による治療に関係する作用および経路の機序の概要を示す。
【図２】ＩＰＦ肺の線維性病巣は、ＦＬ線維芽細胞ｐ５３発現の減少を示す。ＩＰＦ患者からの肺切片および対照の「正常な」対象を、Ｈ＆Ｅ（図２Ａ）、ビメンチン（図２Ｂ）、トリクローム（図２Ｃ）、ｐ５３（図２Ｄ）、ＰＡＩ−１（図２Ｅ）、Ｋｉ−６７（図２Ｆ）、ＰＡＩ−１とＳＰ−Ｃに対する免疫蛍光（図２Ｇ）またはｐ５３とＳＰ−Ｃ（図２Ｈ）またはｐ５３とＰＡＩ−１（図２Ｉ）に対して染色した。１つの代表的な例を示す（ｎ＝５  ＩＰＦ肺検体）。
【図３】ｃｏｌ−Ｉの増加およびｍｉＲ−３４ａの阻害に関連するＩＰＦ肺からのヒトＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内で、カベオリン１、ｐ５３およびＰＡＩは減少し、ｕＰＡは増加する。（図３Ａ）正常肺（ＮＬ）およびＦＬ線維芽細胞からの細胞ライセートを、該タンパク質の変化に対して、免疫ブロットした。図は、ＮＬ線維芽細胞（ｎ＝１０セルライン）およびＦＬ線維芽細胞（ｎ＝１８セルライン）の典型的な結果を示す。（図３Ｂ）ＮＬ（ｎ＝３）およびＦＬ（ｎ＝４）線維芽細胞からの全ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により、ｍｉＲ−３４ａ発現について試験した。ｍｉＲ−３４ａ用３２Ｐ標識化アンチセンスプローブを用いて、代表的な試料からのＲＮＡのノーザンブロット解析およびローディングコントロールｓｎＲＮＡ（Ｕ６）を、当該棒の下部に示す。
【図４】ＩＰＦおよび「正常」肺からの線維芽細胞によるｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１の不同性発現。「正常」対象およびＩＰＦを有する患者から（図４Ａ）、またはＮＬ（ｎ＝６）およびＦＬ線維芽細胞（ｎ＝８）からの肺組織から単離された全ＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉ  ｍＲＮＡについて試験して、βアクチンｍＲＮＡの対応するレベルに正規化した。
【図５】マウスからのＦＬ対ＮＬ線維芽細胞によるｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現差異。他で記載のように、鼻腔内食塩水に曝露した対照マウスからのＢＬＭ傷害またはＮＬ線維芽細胞後、２１日目のマウスの肺から単離されたＦＬ線維芽細胞（Ｂａｎｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、上記参照）。ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞からのライセートを、ｐ５３、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉタンパク質の発現の変化に対して、免疫ブロットした（図５Ａ）。ＢＬＭ誘発性線維症を有するマウスまたは対照（食塩水）マウスの肺組織からのマウス肺組織（図５Ｂ）または単離したＮＬおよびＦＬ線維芽細胞（ｎ＝６）（図５Ｃ）から抽出した全ＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲ法により、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびコラーゲンＩ（ｃｏｌ−Ｉ）ｍＲＮＡについて試験した。マウスからのＮＬおよびＦＬ線維芽細胞を、ＤＭＥＭ培地中、１２ウェルプレートで培養した。３日後、線維芽細胞を、増殖速度を決定するため、カウントした（図５Ｄ）。
【図６】ＣＳＰ（ＣＳＰ４）は、ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内のｍｉＲ−３４ａの誘発により、ｐ５３発現を増強する。（図６Ａ）ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞（ｎ＝３）を、ＰＢＳ、ＣＳＰ−４（ＣＳＰ）または対照ペプチド（ＣＰ）で処置した。ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により、ｍｉＲ−３４ａについて分析した。（図６Ｂ）ＦＬ線維芽細胞を、ｍｉＲ−３４ａアンチセンス（ｍｉＲ−３４ａ−ＡＳ）またはプレｍｉＲ−３４ａまたは対照ｍｉＲＮＡ（Ｃｔｒ−ｍｉＲ）のあるなしで、ＰＢＳまたはＣＳＰまたはＣＰで処置した。条件培地（ＣＭ）を、ＰＡＩ−１およびｐ５３およびβアクチン用ライセート（ＣＬ）に対して免疫ブロットした。（図６Ｃ）ＦＬ線維芽細胞を、ｍｉＲ−３４ａ−ＡＳ、プレｍｉＲ−３４ａまたはＣｔｒ−ｍｉＲの存在下または非存在下、ＰＢＳまたはＣＳＰまたはＣＰで処置した。ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により、ｍｉＲ−３４ａの変化について分析した。（図６Ｄ）ＣＳＰ内で、一連の重複欠失をさせて、これらのペプチドを、ＦＬ線維芽細胞を処置するために使用した。その後、ｐ５３、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉの変化を、該ＣＳＰ効果に必要な最小限のアミノ酸を確認するために評価した。
【図７】ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内のｐ５３タンパク質のｍｄｍ２介在分解の増加。（図７Ａ）ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞（ｎ＝３）からのライセートを、ｐ５３、ｍｄｍ２およびβアクチンに対して、免疫ブロットした。（図７Ｂ）ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞からのライセートを、抗ｍｄｍ２抗体と共に免疫沈降（ＩＰ）して、関連するｐ５３タンパク質に対して、免疫ブロット（ＩＢ）した。
【図８】ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）のｐ５３線溶系クロストークの役割またはＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内のｃｏｌ−Ｉ発現のＣＳＰ−４介在阻害。（図８Ａ）ＦＬ線維芽細胞を、４８時間、ＰＢＳ、ヌトリン３ａ（１０μＭ）、ＣＳＰ−４（１０ｎＭ）または対照ペプチド（ＣＰ）に曝露した。該細胞ライセートを、Ｃｏｌ−Ｉ、ＰＡＩ−１、ｐ５３、ｕＰＡおよびβアクチンの発現に対して、免疫ブロットした。（図８Ｂ）ＤＭＥＭ培地中の１２ウェルプレート中で培養したＦＬ線維芽細胞を、媒体（ＰＢＳ）またはヌトリン３ａ、ＣＳＰ−４またはＣＰに曝露した。３日後、細胞を剥離して、カウントした。（図８Ｃ）ＦＬ線維芽細胞を、単独で空のアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＥＶ）またはｐ５３（Ａｄ−ｐ５３）、ＰＡＩ−１（Ａｄ−ＰＡＩ−１）もしくはカベオリン１（Ａｄ−Ｃａｖ−１）を発現するＡｄベクターで、形質導入した。４８時間後、細胞ライセートを、Ｃｏｌ−Ｉ、ｐ５３，ＰＡＩ−１、ｕＰＡおよびβアクチンに対して、免疫ブロットした。
【図９】ＮＬ線維芽細胞内のｃｏｌ−Ｉ発現の誘発でのｐ５３線溶系クロストークの役割。組織学的に「正常な」ヒト肺から単離されたＮＬ線維芽細胞を、ベースラインｐ５３発現を阻害するため、レンチウイルスベクター中のｐ５３  ｓｈＲＮＡで処置した。対照細胞を、非特異的（Ｃｔｒ）ｓｈＲＮＡで処置した。（図９Ａ）：細胞ライセートを、ｐ５３、α−ＳＭＡおよびβアクチンについて試験する一方、条件培地試料を、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、および可溶ｃｏｌ−Ｉに対して免疫ブロットした。（図８Ｂ）：対照またはｐ５３  ｓｈＲＮＡで処置したＮＬ線維芽細胞から単離された全ＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲ法により、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ｃｏｌ−ＩおよびβアクチンｍＲＮＡの発現の変化について分析した。
【図１０】ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）は、ＢＬＭ処置したマウス内の肺線維症を阻害する。マウスを、肺線維症を誘発するため、１４日間、ＢＬＭに曝露した。食塩水処置したマウスを、線維症対照として使用した。１４日後、ヌトリン３ａが、罹患している肺線維症を阻害するかどうか決定するため、ＢＬＭに曝露したマウスに、媒体またはヌトリン３ａ（１０ｍｇ／体重ｋｇ）（Ｚｈａｎｇ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３９：１５〜２１，２０１１）のいずれかを、静脈内注射した。ＢＬＭ傷害後２１日目、マウスを、線維症の程度を評価するため、ＣＴスキャンした（図１０Ａ）。１つの代表例を示す（ｎ＝９）。（図１０Ｂ）ヌトリン３ａ処置（ｎ＝９）後、肺機能の改善を評価するため、肺コンプライアンスおよび抵抗を、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔシステムを用いて、同じマウス内で測定した。（図１０Ｃ）肺線維症の指標として、肺構造およびコラーゲン沈着を評価するため、肺切片を、トリクローム染色に付した。（図１０Ｄ）ＥＣＭの変化の独立評価として、全コラーゲン（ヒドロキシプロリン）およびデスモシン含有量について、全肺ホモジネートを分析した。
【図１１】ＣＳＰ−４は、罹患している肺線維症を阻害して、肺機能を改善する。マウスを、肺線維症を誘発するため、ＢＬＭに曝露した。１４日後、媒体または１．５ｍｇ／体重ｋｇのＣＳＰ−４または対照ペプチド（「ＣＰ」）のスクランブル配列のいずれかを、マウスに、静脈内注射した。ＢＬＭ傷害後２１日目、罹患している肺線維症のＣＳＰ−４阻害を試験するため、マウスをＣＴスキャンした（図１１Ａ）。１つの代表例を示す（ｎ＝９）。（図１１Ｂ）：肺気量を、定量的ＣＴ表示を用いて、同じマウス内で測定した（ｎ＝９）。（図１１Ｃ）：肺線維症を示すような、コラーゲン沈着を評価するため、肺切片を、トリクロームおよびＨ＆Ｅ染色（図示せず）に付した。（図１１Ｄ）全ヒドロキシプロリン含有量に対する全肺ホモジネートの分析。
【図１２】ＣＳＰ−４またはヌトリン３ａ（ＮＴＬ）は、ＦＬ線維芽細胞の増殖を阻害する。マウスを、有意な肺線維症を誘発するため、ＢＬＭに１４日間、または食塩水（線維症対照）に曝露した。１４日後、ＢＬＭに曝露したマウスを、ＣＳＰ−４もしくはＣＰ、またはヌトリン３ａで処置した（図１０Ａ０Ｄ／１１Ａ〜Ｄ参照）。（図１２Ａ）：肺切片（ＢＬＭ傷害後２１日目）を、増殖を評価するため、Ｋｉ−６７に対する免疫組織化学法（ＩＨＣ）に付した。１つの代表例を示す（ｎ＝９）。線維芽細胞を、食塩水、ＢＬＭまたはＢＬＭ＋ヌトリン３ａに曝露したマウスの肺から単離（図１１Ａに記載の通り）して、ウェスタンブロッティング法により、ｃｏｌ−Ｉ、ｐ５３および下流ｕＰＡおよびＰＡＩ−１タンパク質の発現の変化（図１２Ｂ）：、および定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡ（図１２Ｃ）を試験した。
【図１３】ＣＳＰ−４またはヌトリン３ａを用いたＷＴマウス肺組織の生体外処置による、ＢＬＭ誘発性肺線維症の阻害。マウスを、肺線維症を誘発するため、２１日間、鼻腔内で、ＢＬＭに曝露した。これらのマウス（ｎ＝３）を殺し、肺を切除し、小片に細断して、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地を用いた培養皿に入れた。その後、該組織試料を、ＣＳＰ−４（１０ｎＭ）、対照ペプチド（ＣＰ）およびヌトリン３ａ（ＮＴＬ）（１０μＭ）で、７２時間、処置した。条件培地および組織ライセートを、調製して、ウェスタンブロッティング法により、ｃｏｌ−Ｉ、α−ＳＭＡおよびβアクチンの変化について分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明者らは、「腫瘍抑制」タンパク質、ｐ５３およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ−１）の基底発現が、ＩＰＦ患者の肺から得られたＦＬ線維芽細胞内で、著しく、減少していることを発見した。これは、ヒトＩＰＦの認められたモデルである、ＢＬＭ誘発性促進的肺線維症を有するマウスについてもそう言える。ｐ５３は、ｕＰＡ線溶（ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１）系の主要成分の発現を調節する。しかしながら、これらのタンパク質レベルの変化が、いかにして、肺線維症の一因となるのか、および、ｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの正常モードの修復が、肺線維症を緩和するのか否かは、明白でない。
【００４０】
本発明に従えば、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現の増加、およびＦＬ線維芽細胞内で、ｐ５３発現がないことによるＰＡＩ−１の同時に起こる阻害は、肺線維症の発症に対して重大な意味を持つ。ｐ５３発現の誘発、およびｕＰＡのｐ５３介在減少によるｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの修復、およびＦＬ線維芽細胞内のＰＡＩ−１発現の同時に起こる増加は、ＩＰＦを緩和し、ＮＴＬを用いて、この疾病を治療するための基礎である。
【００４１】
正常な肺（「ＮＬ」）線維芽細胞と異なり、ＩＰＦ（「ＦＬ」線維芽細胞）を有する患者の肺から、またはＢＬＭ誘発性肺線維症を有するマウスから得られた線維芽細胞は、最小限のｐ５３を発現する。さらに、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現が、著しく、増加する一方、ＦＬ線維芽細胞は、低レベルのＰＡＩ−１を産生する。
【００４２】
本発明は、世界的で協調的な方法で、ｕＰＡ線溶系の全３つの主要成分（ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１）を標的にする。同時に、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３発現の回復により、ｕＰＡ線溶系の全３つの主要成分を標的にすることは、線維症を緩和する。
【００４３】
従って、この治療は、生体外、および生体内で、ＩＰＦを有する患者から得られた一次ＦＬ線維芽細胞および肺組織に効果がある。これらの変化は、ヌトリン３ａの有益な効果の中間および下流の介在物質が定義される、罹患している肺線維症を有するマウスモデル中で、観察された。
【００４４】
ヌトリン３ａ
本発明の方法で有用な化合物としては、４−２−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−１−ピペラジン−２−オン（Ｃ３０Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ４Ｏ４）である、ヌトリン３ａ（ヌトリンおよびＮＴＬとも呼ばれる）が挙げられる。
【化３】
2018158952.tif 000004
この化合物は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．７，８９３，２７８（Ｈａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）（その全文を参照することにより、組み入れられる）に記載されている。ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害する特性を共有するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体のより広範な属も、本発明に有用である。ＮＴＬ類似体に関しては、該‘２７８特許に開示された分子属を対象とし、以下の式２により特徴付けられる。
【化４】
2018158952.tif 000005
式中、
Ｒは、少なくとも１個のヘテロ原子を含む飽和および非飽和５員および６員環から選択され；該ヘテロ原子が、Ｓ、ＮまたはＯであり得る。該環は、アルキルが、少なくとも１つの−Ｃ＝Ｏ−Ｒ１、−ＳＯ２ＣＨ３、または−ＣＨ２Ｃ＝ＯＣＨ３で、さらに置換され得る、低級アルキル基で置換され得、
Ｒ１は、Ｈ、−ＮＨ２、−Ｎ−低級アルキル、ヒドロキシで置換された低級アルキル、−ＮＨ２、および少なくとも１個のヘテロ原子（Ｓ、ＮまたはＯ）を含む５員または６員飽和環で置換された低級アルキルから成る群から選択され；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆから成る群から選択され、
Ｙ１およびＹ２は、各々独立して、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＮＯ２、−Ｃ＝Ｎ、および−Ｃ＝ＣＨから成る群から選択され、および
該イミダゾリン環の４位および５位における絶対立体化学は、それぞれ、ＳおよびＲである。
【００４５】
ＮＴＬ類似体と見なされる他化合物は、式中、Ｒが、低級アルキル、シクロアルキル、Ｃ＝ＯＲ１、ヒドロキシで置換された低級アルキル、−ＮＨ２で置換された低級アルキル、−Ｃ＝ＯＲ１で置換された低級アルキル、Ｎ−低級アルキル、−ＳＯ２ＣＨ３、＝Ｏ、−ＣＨ２Ｃ＝ＯＣＨ３、またはＣ１〜Ｃ３アルキル、−Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、−Ｃ＝ＯＣＨ３、−ＳＯ２ＣＨ３，−Ｃ＝Ｏ、−ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｃ＝ＯＣＨ２ＮＨ２、−Ｃ＝ＯＣＨ２ＯＨ、−Ｃ＝ＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ＝ＯＮ（ＣＨ２）２、−Ｃ＝ＯＮＨ２、および−Ｃ＝ＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ３、ピロリジニルおよびピペラジニルから選択される少なくとも１つの基で置換されたピペリジニルから選択される少なくとも１つの基で置換されたピペラジニルである、式２の化合物である。
【００４６】
好ましいものは、式中、オルト位のＸ１基が、低級アルコキシ、−ＯＣＨ２ＣＦ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆから選択され、パラ位のＸ２基が、低級アルコキシである、式２の化合物もある。さらに好ましいのは、オルト位のＸ１基が、エトキシ、イソプロポキシ、−ＯＣＨ２ＣＦ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆから選択され、パラ位のＸ２基が、メトキシおよびエトキシから選択される、化合物である。
【００４７】
さらに好ましいのは、式中、Ｒが、ピペラジニルおよび置換ピペラジニルから選択される、式２の化合物である。かかる化合物は、例えば：１−｛４−［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−メトキシ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−カルボニル］−ピペラジン−１−イル｝−エタノン；４−［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−メトキシ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−カルボニル］−ピペラジン−２−オン；［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−５−メトキシ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−イル］−（４−ピロリジン−１−イル−ピペラジン−１−イル）−メタノン；４−［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−エトキシ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−カルボニル］−ピペラジン−２−オン；１−｛４−［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−エトキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−カルボニル］−ピペラジン−１−イル｝−エタノン；２−｛４−［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−エトキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−カルボニル］−ピペラジン−１−イル｝−１−モルホリン−４−イル−エタノン；［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−エトキシ−フェニル）４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−イル］−［４−（２−メタンスルホニルエチル）−ピペラジン−１−イル］−メタノン；および［（４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ビス−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−イソプロポキシ−４−メトキシ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−イミダゾール−１−イル］−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンである。
【００４８】
これらの全分子の合成は、当分野で公知であり、そのいくつかは、該‘２７８特許に、記載されている。
【００４９】
Ｃａｖ−１配列に基づいたペプチド
該カベオリン１（Ｃａｖ−１）足場ドメインまたはペプチド（ＣＳＤまたはＣＳＰとも呼ぶ）は、ＳｒｃキナーゼとのＣａｖ−１の相互作用を妨害し、以下により詳細に述べるように、ｕＰＡおよび抗β１インテグリン抗体の複合効果を模倣する。未変性ヒトＣａｖ−１は、１７８アミノ酸長および２２ｋＤａの分子量を有する。Ｃａｖ−１のアミノ酸配列を、以下に示す（配列番号３）。
１      ＭＳＧＧＫＹＶＤＳＥ  ＧＨＬＹＴＶＰＩＲＥ  ＱＧＮＩＹＫＰＮＮＫ  ＡＭＡＤＥＬＳＥＫＱ  ＶＹＤＡＨＴＫＥＩＤ  ＬＶＮＲＤＰＫＨＬＮ
６１    ＤＤＶＶＫＩＤＦＥＤ  ＶＩＡＥＰＥＧＴＨＳ  ＦＤＧＩＷＫＡＳＦＴ  ＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹ  ＲＬＬＳＡＬＦＧＩＰ  ＭＡＬＩＷＧＩＹＦＡ
１２１  ＩＬＳＦＬＨＩＷＡＶ  ＶＰＣＩＫＳＦＬＩＥ  ＩＱＣＩＳＲＶＹＳＩ  ＹＶＨＴＶＣＤＰＬＦ  ＥＡＶＧＫＩＦＳＮＶ  ＲＩＮＬＱＫＥＩ
ＣＳＰは、上記下線の２０個の残基ペプチドであり、配列ＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲ（配列番号２）を有する。ＣＳＰ−４と指定された本発明の好ましいペプチドは、ＣＳＰのフラグメントＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）であり、Ｃａｖ−１配列内の二重下線で示されている。ＣＳＰ−４は、以下の実施例および図で示された活性を有し、如何に、ｐ５３が、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ（上方向）およびＰＡＩ−１発現（下方向）の協調的調節により、ＬＥＣ生存率を調節するかに影響し、この推定される機序により、生体内で、ＬＥＣまたは肺上皮を、アポトーシスから保護し、ＡＬＩに起因する線維症をブロックする。
【００５０】
本明細書に開示の研究では、「ＣＰ」と呼ばれる、ＣＳＰ−４に対する対照ペプチドは、より大きなＣＳＰ（配列番号２）と同じアミノ酸組成物を有するスクランブルペプチドであるが、異なる配列：ＷＧＩＤＫＡＦＦＴＴＳＴＶＴＹＫＷＦＲＹ（配列番号５）を有する。
【００５１】
修飾および変化は、ＣＳＰ−４の構造中で、および類似のまたは別の所望の特徴を有する分子を生成するため、起こり得る。かかる機能的誘導体または生物活性誘導体（これらの用語は、互換的に使用される）は、本発明内に包含される。
【００５２】
好ましい機能的誘導体は、付加変異体およびペプチドオリゴマー／多量体、および同様のものである。
【００５３】
これらは、合成で生成され得るが、組み換え製造によっても生成され、ＣＳＰ−４の結合特性または生物活性について試験され得る。該変異体の活性を測定する好ましい方法は、ペプチド変異体の性能が、可溶性ｕＰＡＲ（「ｓｕＰＡＲ」）を用いた、検出可能に標識されているものなど、可溶カベオリンの結合と競合する、競合結合アッセイである。
【００５４】
ＣＳＰ−４の異なる誘導体およびＣＳＰ−４を含むより長いポリペプチドは、本発明に従って、化学的（合成）方法または組み換え手段（より長いポリペプチドに好ましい）のいずれかにより、容易に、製造され得ると理解される。
【００５５】
いずれかの末端または両末端の付加の１〜５個のアミノ酸を、好ましく含む付加は、ＣＳＰ−４の機能的変異体の定義内に含められる。他の実施形態では（以下で述べられる該ペプチド多量体と異なるものとする）、さらなる付加残基は、約２０残基まで、付加され得る。ＣＳＰ−４の付加変異体では、配列番号１（核のＣＳＰ−４ペプチド）に対する付加残基Ｎ末端、および／またはＣ末端は、それらが、Ｃａｖ−１（配列番号４）の未変性配列内で起こる順序で、それらのいくつかを含み得る。しかしながら、該付加変異体は、配列番号３であり得ない。あるいは、他アミノ酸は、該付加変異対が、ＣＳＰ−４の生物活性および結合活性（下記のように、少なくとも２０％の活性、または好ましくは、それより大きい）を維持することを理解して、配列番号１のいずれかの末端において、付加され得る。
【００５６】
ＣＳＰ−４の好ましい置換変異体は、１、２または３個の残基が、異なる残基により置換された、同類置換である。タンパク質化学および構造の詳細な説明のため、Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９、およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９３（参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）参照。同類置換は、次の基の１つ内の交換として、本明細書で定義される：
Ｐｈｅは、大きい芳香族残基：Ｔｙｒ、Ｔｒｐにより、置換され得る。
Ｔｈｒは、小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙにより、置換され得る。
Ｖａｌは、大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓにより、置換され得る。
【００５７】
そうする前に、置換の正確な効果を予測することは、困難であるときでさえ、当業者は、該効果が、通例のスクリーニングアッセイ、好ましくは、本明細書に記載の生物および生化学アッセイにより、評価され得ることを認識するだろう。細胞ライセートまたは精製されたポリペプチドもしくはペプチド変異体の活性は、所望の特徴について、適切なスクリーニングアッセイで、スクリーニングされる。
【００５８】
該２０種の「標準」Ｌ−アミノ酸に加えて、Ｄ−アミノ酸または非標準、当分野で構造の明確な修飾または異例のアミノ酸も、本発明の用途に考えられる。これらとしては、例えば、βアラニン（β−Ａｌａ）および、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸、その他などのωアミノ酸；αアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ωアミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δアミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）：Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ−メチル化アミノ酸およびペプトイド（Ｎ−置換グリシン）が挙げられる。
【００５９】
他化合物は、ＣＳＰ−４と類似の方法で機能する合理的薬物設計により、設計され得る。合理的薬物設計のゴールは、生物活性化合物の構造的類似体を製造することである。かかる類似体を創造することにより、機能に影響する変化に対して低感受性である、天然分子（すなわち、ペプチド）より活性またはより安定である薬物を製造することは可能である。１つのアプローチは、例えば、ＮＭＲまたはＸ線結晶解析、コンピューターモデリングまたは組み合わせにより、ＣＳＰ−４の三次元構造を生成することである。代替のアプローチは、ＣＳＰ−４配列中の官能基をランダムに置換して、機能に対する影響を決定することである。
【００６０】
さらに、生物活性誘導体は、本明細書に記載のアッセイなど、結合または生物活性の生体外または生体内アッセイで、ＣＳＰ−４の活性を有する。好ましくは、該ポリペプチドは、少なくとも、約２０％のＣＳＰ−４の活性、または少なくとも、約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、約９５％、９７％、９９％、および、例えば、約７０％〜約８０％、より好ましくは、約８１％〜約９０％、さらにより好ましくは、約９１％〜約９９％など、そこで送達可能ないずれかの範囲の活性を有する、生体外または生体内で、ＢＬＭにより誘発されるＬＥＣのアポトーシスを阻害または予防する。該誘導体は、ＣＳＰ−４より、１００％またはそれより大きい活性さえ有し得る。
【００６１】
該ペプチドは、そのＮおよびＣ末端において、それぞれ、アシル（「Ａｃ｝と略す）およびアミド（「Ａｍ」と略す）基、例えば、該Ｎ末端において、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）および、該Ｃ末端において、アミド（−ＮＨ２）で、キャップされ得る。好ましくは、末端アミノ基との結合で、Ｎ末端キャッピング機能の広範な範囲は、例えば：ホルミル；
アセチル、プロピオニル、ブチリルなど、１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル；
ヘキサ−３−エノイルなど、１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル；
ヘキサ−５−イノイルなど、１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル；
ベンゾイルまたは１−ナフトイルなど、アロイル；
３−ピロイルまたは４−キノロイルなど、ヘテロアロイル；
メタンスルホニルなど、アルキルスルホニル；
ベンゼンスルホニルまたはスルファニリルなど、アリールスルホニル；
ピリジン−４−スルホニルなど、ヘテロアリールスルホニル；
４−アミノブチリルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルカノイル；
６−ヒドロキシ−ヘキサ−３−エノイルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケノイル；
３−ヒドロキシ−ヘキサ−５−イノイルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキノイル；
４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ナフタ−２−オイルなど、置換アロイル；
２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−オイルなど、置換ヘテロアロイル；
２−アミノエタンスルホニルなど、置換アルキルスルホニル；
５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルなど、置換アリールスルホニル；
１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニルなど、置換ヘテロアリールスルホニル；
カルバモイルまたはチオカルバモイル；
Ｒ’が、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリール、または置換ヘテロアリールである、置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）；
全て、上記定義の通り、Ｒ’が、アルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換アルカノイル、置換アルケノイル、置換アルキノイル、置換アロイル、または置換ヘテロアロイルである、置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）
が考えられる。
【００６２】
該Ｃ末端キャッピング機能は、該末端カルボキシルとのアミドまたはエステル結合のいずれかであり得る。アミド結合を提供するキャッピング機能は、Ｒ１およびＲ２が、独立して、次の基から引き出され得る、ＮＲ１Ｒ２と指定される：水素；
メチル、エチル、イソプロピルなど、好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル；
プロパ−２−エニルなど、好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル；
プロパ−２−イニルなど、好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル；
ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキル；
ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケニル；
ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニルなど、１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキニル；
フェナシルまたは２−ベンゾイルエチルなど、１０個までの炭素原子を有するアロイルアルキル；
フェニルまたは１−ナフチルなど、アリール；
４−キノリルなど、ヘテロアリール；
アセチルまたはブチリルなど、１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル；
ベンゾイルなど、アロイル；
３−キノロイルなど、ヘテロアロイル；
Ｒ’およびＲ’’が、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフィニル、またはＳＯ２−Ｒ’’’またはＳＯ−Ｒ’’’（Ｒ’’’は、置換または非置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはアルキニルである）である、ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’。
【００６３】
エステル結合を提供するキャッピング機能は、ＯＲとして指定され、Ｒは：アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアリールオキシ；アラルキルオキシ；ヘテロアラルキルオキシ；置換アルコキシ；置換アリールオキシ；置換ヘテロアリールオキシ；置換アラルキルオキシ；または置換ヘテロアラルキルオキシであり得る。
【００６４】
Ｎ末端あるいはＣ末端キャッピング機能のいずれか、または両方は、該キャップされた分子が、該活性薬物を放出するため、身体内で、自然または酵素変換反応および該親薬物分子の送達特性を改善するプロドラッグ（該親薬物分子の薬理的に不活性な誘導体）として機能するような構造であり得る（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  Ｈ，Ｅｄ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ
Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）。
【００６５】
キャッピング基の賢明な選択が、該ペプチドに、他活性の付与を可能とする。例えば、ＮまたはＣ末端キャップと結合したスルフヒドリル基の存在は、該誘導化されたペプチドを、他分子と結合することを可能にするだろう。
【００６６】
ＣＳＰ−４の化学誘導体
ＣＳＰ−４の「化学誘導体」と見なされる、上記、キャッピング基に加えて、ＣＳＰ−４の好ましい化学誘導体は、追加の化学部分、通常ではなく、ＣＳＰ−４に導入され得るタンパク質またはペプチドの部分または本明細書で定義された化学誘導体を構成する公知の方法により、ＣＳＰ−４の付加変異体を含み得る。該ペプチドの共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。かかる誘導化部分は、溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。かかる効果を媒介可能な部分は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，ＡＲ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２１ｓｔＥｄ，２００５（または最新版）に開示されている。
【００６７】
かかる修飾は、該ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応可能である有機誘導化剤と反応させることにより、該分子に導入され得る。別の修飾は、該ペプチドの環化であり、一般に、環式ペプチドを生成するため、ジスルフィド結合により結合され得る末端Ｃｙｓ残基の付加により達成される。別の、架橋可能なＬｙｓ（Ｋ）は、１つの末端に付加され、他の末端にＧｌｕ（Ｅ）が付加される。
【００６８】
システイニル残基（例えば、環化目的で添加）を、最も通常、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得るため、α−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導される。
【００６９】
付加されたリジニル残基（例えば、環化のため）および該アミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物を用いて、誘導され得る。環式カルボン酸無水物を用いた誘導化は、リジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アミノ含有残基を誘導化するための他の適切な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル類；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【００７０】
二機能性試薬を用いた誘導化は、該ペプチドまたはオリゴマーまたは多量体を、水不溶性支持体マトリックスまたは他の高分子担体に、架橋させるために有用である。通常、使用される架橋剤としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル類、４−アジドサリチル酸とのエステル類、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド類が挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオンイミデートなどの誘導化試薬は、光存在下、架橋結合を形成可能である光活性化可能な中間体を得る。あるいは、シアン臭化物活性化炭化水素およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｓ．３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７：および４，３３０，４４０に記載の反応性基質などの反応性水不溶性マトリックスが、タンパク質固定化用に使用される。
【００７１】
他の修飾としては、ヒドロキシル化リジン、スレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、（付加）リジン残基鎖の側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記参照）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および場合によっては、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。１つ以上のＤ−アミノ酸が、１つ以上のＬ−アミノ酸で置換されるペプチドも挙げられる。
【００７２】
多量体またはオリゴマーペプチド
本発明は、抗アポトーシスおよびＣＳＰ−４の保護活性を有する、ＣＳＰ−４の繰り返し単位から造られるより長いペプチドまたはその機能性誘導体も含む。かかる多量体の好ましいペプチド単位は、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である。該多量体の「単位」であり得るこのペプチドの付加変異体は、好ましくは、１〜４個の付加アミノ酸を含む。
【００７３】
ペプチド多量体は、ペプチドモノマーの異なる組み合わせを含み得る（配列番号１もしくはその付加変異体のいずれかまたは両方、または該ペプチドの化学的誘導体を含み得る）。かかるオリゴマーまたは多量体ペプチドは、本明細書で述べた化学合成または組み換えＤＮＡにより、製造され得る。化学合成で製造されるとき、該オリゴマーは、好ましくは、コアペプチド配列の２〜５個の繰り返しを有し、該多量体のアミノ酸の全数は、約１６０残基を超えるべきではなく、好ましくは、１００残基以下（または、リンカーもしくはスペーサーを含むとき、それらの均等物）である。
【００７４】
好ましい合成化学ペプチド多量体は、式
Ｐ１ｎ
を有し、式中、該コアペプチドＰ１は、配列番号１であり、ｎ＝２〜５であり、単独またはオリゴもしくは多量体の形態の該コアペプチドは、かかる活性の生体外または生体内バイオアッセイで、本明細書に開示のＣＳＰ−４の生物活性を有する。
【００７５】
別の実施形態では、好ましい合成化学ペプチド多量体は、式
（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２
を有する。Ｐ１およびＰ２は、付加変異体を含む、上記コアペプチドであり、式中、
（ａ）  Ｐ１およびＰ２は、同じでも、異なっていてもよく；さらに、該多量体中のＰ１の各存在は、異なるペプチド（または変異体）であり得；
（ｂ）  Ｘは、
（ｉ）  短い有機鎖、好ましくは、４個までの酸素原子を含有するＣ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ポリエーテル、式中、ｍ＝０または１であり、ｎ＝１〜７であり；または
（ｉｉ）  Ｇｌｙｚ（式中、ｚ＝１〜６）
を含むまたはから成るスペーサーであり、
および、単独または多量体の形態の該コアペプチドは、かかる活性の生体外または生体内バイオアッセイで、本明細書に開示のＣＳＰ−４の生物活性を有する。
【００７６】
組み換えで製造されるとき、好ましいスペーサーは、上記Ｇｌｙｚであり、ｚ＝１〜６であり、該多量体は、該発現系が、例えば、２〜約２５の繰り返しを可能とするほど、多くの繰り返しの該コアペプチド配列を有し得る。好ましい組み換えで製造されたペプチド多量体は、式：
（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２
を有し、式中：
（ａ）  Ｐ１およびＰ２は、独立して、配列番号１もしくは３、またはその付加変異体もしくは誘導体であり、Ｐ１およびＰ２は、同じでも、異なっていてもよく；さらに、該多量体中のＰ１の各存在は、異なるペプチド（または変異体）であり得；
式中、
ｎ＝１〜２５およびｚ＝０〜６であり；（ｎの好ましい範囲は、ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜１５、または１〜２０を含む）
および、単独または多量体の形態の該コアペプチドは、かかる活性の生体外または生体内バイオアッセイで、本明細書に開示のＣＳＰ−４の生物活性を有する。
【００７７】
本ペプチド多量体では、Ｐ１またはＰ２のいずれかは、好ましくは、配列番号１またはその付加変異体もしくは化学誘導体である。該多量体は、キャップされていてもよい。かかる多量体は、本明細書に記載のペプチドまたは変異体のいずれかから作られ得ると理解される。該ペプチド多量体は、配列番号３と異なるべき（すなわち、未変性ヒトＣａｖ−１でなく、好ましくは、未変性哺乳類Ｃａｖ−１ホモログでない）であるとも理解される。
【００７８】
ペプチド模倣薬
ＣＳＰ−４の生物効果を模倣するペプチド模倣薬化合物も、本発明の範囲内に含まれる。ペプチド模倣薬は、それが、ＣＳＰ−４の結合活性および生物活性を有するように、ＣＳＰ−４の結合エレメントの立体空間的特性を再現する不自然なペプチドまたは非ペプチド薬剤であり得る。生物的に活性なＣＳＰ−４ペプチド、ペプチド多量体と同様に、ペプチド模倣薬は、結合面（ＣＳＰ−４が結合するいずれかのリガンドと相互作用する）および非結合面を有するだろう。また、ＣＳＰ−４と同様に、ペプチド模倣薬の該非結合面は、ペプチド模倣薬の該結合面を修飾することなく、様々な治療的部分とカップリングすることにより、修飾され得る官能基を含むだろう。ペプチド模倣薬の好ましい実施形態は、該分子の非結合面に、アニリンを含むことになる。アニリンのＮＨ２基は、ｐＫａ約４．５を有し、従って、該ペプチド模倣薬の結合面上のいずれものＮＨ２官能基を修飾することなく、いずれかのＮＨ２−選択的試薬により修飾され得るはずである。他のペプチド模倣薬は、それらの結合面上に、いずれのＮＨ２官能基も有さず、従って、ｐＫａにこだわらずに、いずれのＮＨ２も、結合部位として、非結合面に見られるはずである。加えて、−ＳＨおよび−ＣＯＯＨなどの他の修飾可能な官能基は、結合部位として、ペプチド模倣薬の非結合面中に組み入れられるはずである。治療的部分も、ペプチド模倣薬の合成中に、直接、組み入れられ、優先的に、該分子の非結合面上に見られ得る。
【００７９】
本発明は、部分的なペプチド特性を保持する化合物も含む。例えば、本発明のペプチド内のいずれものタンパク分解性に不安定な結合は、該分子の残りがそのペプチド性の性質を保持する一方、アイソスター（Ｎ−メチル化；Ｄ−アミノ酸）またはペプチド性結合の減少などの非ペプチド性要素により、選択的に置き換えられ得る。
【００８０】
ペプチド模倣薬化合物、アゴニスト、基質またはインヒビターのいずれかは、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼ、他など、いくつかの生理活性ペプチド／ポリペプチドについて、記載されている。ペプチド模倣薬化合物の設計および製造方法は、当分野で公知である（Ｈｒｕｂｙ，ＶＪ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３〜１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７〜３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１〜１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１〜７８（１９９７））。二次構造を模倣する特定の模倣薬は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ
Ｈａｌｌ（Ｅｄｓ．），ＮＹ，１９９３に記載されている。これらの方法は、少なくとも、該ＣＳＰ−４の結合能および特異性を有する、好ましくは、生物活性も有するペプチド模倣薬を製造するため、使用される。当業者が入手可能なペプチド化学および一般有機化学の知識は、かかる化合物を設計して合成するため、本開示の観点で、十分である。
【００８１】
例えば、かかるペプチド模倣薬は、遊離またはリガンド（例えば、可溶性ｕＰＡＲまたはそのフラグメント）と複合体を形成して結合した、本発明のペプチドの三次元構造の検査により、同定され得る。あるいは、そのリガンドに結合した本発明のペプチドの構造は、核磁気共鳴分光法の技術により、得られ得る。そのリガンドまたは受容体との該ペプチドの相互作用の立体化学のさらに深い知識は、かかるペプチド模倣薬の合理的設計を可能とするだろう。リガンドの非存在下、本発明のペプチドまたはポリペプチドの構造は、模倣分子の設計の骨格も提供し得るはずである。
【００８２】
送達可能なペプチドおよびペプチド多量体
本発明の１つの実施形態は、本発明のペプチドを、ヒト細胞などの動物細胞中への導入方法を含む。「送達可能な」または「細胞送達可能な」または「細胞標的」ペプチドまたはポリペプチドと呼ばれる、この方法に有用な組成物は、「内部移行配列」または細胞送達系の役割をするさらなる成分と結合または会合している本発明に記載の生物活性ペプチド、好ましくは、ＣＳＰ−４、またはその機能誘導体、またはそのペプチド多量体を含む。「会合している」という語は、共有または他結合または力であろうとなかろうと、化学的に結合または連結、または混合物として、組み合わされたものを含み得る。本明細書で使用されるとき、「送達」は、細胞中で、ペプチド／ポリペプチドを内部移行することを表す。本明細書で考えられる送達分子は、細胞侵入に影響する他のものにより使用されるペプチド／ポリペプチドを含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：１１７３〜６，２００１参照。好ましい戦略は、次の通りである：本発明のアポトーシス阻害（「生物活性」）ペプチドを、細胞、好ましくは、ヒト細胞へのその侵入を促進する特に設計されたペプチドと結合または混合する。この送達系は、生物活性ペプチドまたはポリペプチド（好ましいにもかかわらず）に融合または化学的に結合される該送達ペプチドを必要とせず、それに、生物活性ペプチドまたはポリペプチドも、該送達または内部移行過程前に、変性される必要がない。初期送達系の不都合は、送達および引き続く細胞内再生前に、「ペイロード」タンパク質の変性を必要とすることである。これらの実施形態は、細胞中へのタンパク質の転移を促進するための公知のアプローチに基づいている。
【００８３】
「転移／内部移行を促進する「送達」ペプチド／ポリペプチドの１つの型は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質（Ｆｒａｎｋｅｌ，ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９〜９３（１９９８））、およびアンテナペディアホメオドメイン（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４〜５０（１９９４）；Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２１：９９〜１０３（２０００）；Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．（２０００）；Ｍａｎｉｔｉ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５ｅ１５８１９（２０１０））を含む。「ペネトラチン」としても公知の後者のペプチドは、野生型配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６）またはＷ４８Ｆ（ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号７）およびＷ５６Ｆ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ、配列番号８）と指定された２つの類似体／変異体を有する１６アミノ酸ペプチドである（Ｃｈｒｉｓｔｉａｅｎｓ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２，２６９：２９１８〜２９２６）。上記変異の両方を有する別の変異体は、ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号９）である。トランスポータン、細胞透過性ペプチドは、付加Ｌｙｓ残基により、マストパランの配列と結合した神経ペプチドガラニンのＮ末端から１２機能性アミノ酸を含む２７アミノ酸長ペプチドである（Ｐｏｏｇａ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：６７〜７７（１９９８））。トランスポータンの配列は、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１０）である。ペネトラチンおよびトランスポータンの類似体は、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０００により記載されている。
【００８４】
別のタンパク質（ファミリー）としては、ＶＰ２２、細胞間輸送の著しい特性を有し、タンパク質を多くの周囲の細胞に分配する単純ヘルペスウイルスタンパク質が挙げられる（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜３３；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．６，０１７，７３５）。例えば、ｐ５３と結合したＶＰ２２（Ｐｈｅｌａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４４０〜３）または生体外で、周囲の細胞に、結合されたタンパク質の核酸を促進するチミジンキナーゼ（Ｄｉｌｂｅｒ，ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：１２〜２１）。ＨＳＶ−１  ＶＰ２２と相同性を共有し（Ｋｏｐｔｉｄｅｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４０：３５５〜６２）、外因性適用後の細胞間輸送が可能であることが分かっている（Ｄｏｒａｎｇｅ  ｅｔ
ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８１：２２１９）、トリマレック病ウイルス（ＭＤＶ）タンパク質ＵＬ４９など、他のヘルペスウイルスのＶＰ２２ホモログも有用である。これらのタンパク質全ては、本発明の該ペプチド、変異体、および多量体の細胞取込みを増強するアプローチを提供する細胞間拡散の特性を共有する。
【００８５】
本明細書で、生物活性ペプチドと名付ける相同性アミノ酸置換変異体、フラグメントまたは化学誘導体を含む、ＨＩＶ−ＴＡＴまたはＶＰ２２など、上記細胞間拡散の「機能性誘導体」または「送達」「送達」または「内部移行」タンパク質およびペプチドも挙げられる。機能性誘導体は、例えば、治療など、本生物活性ペプチドの有用性を促進する、所望のポリペプチドの侵入を促進する、測定可能な転移または細胞間拡散（ＶＰ２２様）活性を保持する。「機能性誘導体」は、該用語が、接続語または選択肢で使用されるかどうかにかかわらず、変異体（好ましくは、同類置換変異体）およびフラグメントを包含する。
【００８６】
上記輸送タンパク質は、ＣＳＰ−４またはその変異体もしくは多量体など、それらが輸送する該ペプチドと結合または別の結合するとき、最良に作用すると言われているので、それらを使用するのは、いくつかの不都合がある。該生物活性ペプチドと混合され得およびその作用のため、化学的に結合する必要がない、より効果的送達ポリペプチドは、両親媒性アミノ酸配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）を有する「Ｐｅｐ−１」として、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に記載されている。Ｐｅｐ−１は、３つのドメインから成る：
（１）  ５つのＴｒｐ残基ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷ（上記配列番号１１の残基１〜１２）を含む疎水性Ｔｒｐリッチモチーフ。このモチーフは、細胞膜に対する効果的ターゲティングおよびタンパク質との疎水性相互作用中に侵入するため、望ましい、または必要である；
（２）ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原の核局在配列由来であり、細胞内送達およびペプチド溶解性を改善する、親水性ＬｙｓリッチドメインＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１の６つのＣ末端残基）；および
（３）上記２つの活性ドメインを分離し、疎水性および親水性ドメインの両方の可動性および結合性を改善するＰｒｏを含む、スペーサー「ドメイン」ＳＱＰ（配列番号１２の３つの内部残基）。
従って、本発明の別の実施形態では、上記のＣＳＰ−４またはその機能性誘導体、およびそれに結合またはそれと会合した送達または転移分子または部分を含む送達可能なペプチドまたはポリペプチドである。該送達分子は、ペプチドまたはポリペプチド、例えば、
（ａ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転移性に活性な誘導体、
（ｂ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号８）を有するペネトラチン、
（ｃ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号７）を有するペネトラチン変異体Ｗ４８Ｆ
（ｄ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号１３）を有するペネトラチン変異体Ｗ５６Ｆ
（ｅ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号１６）を有するペネトラチン変異体
（ｆ）配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１０）を有するトランスポータン
（ｇ）  ＭＤＶタンパク質ＵＬ４９など、異なるヘルペスウイルスからの単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転移性に活性なホモログ；または
（ｈ）  配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）を有するＰｅｐ−１
であり得る。
【００８７】
上述の該ペプチドおよびタンパク質など、送達部分が、本発明の生物活性ペプチドと結合または融合するとき、該送達部分は、該生物活性ペプチドのＮ末端である。
【００８８】
組成物の生体外試験
本明細書に記載および／または例示されたいずれか１つのアッセイまたは当分野で周知の他のものを用いて、本発明の化合物を、それらの生物活性、例えば、抗線維性活性、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡの発現に影響する、肺線維芽細胞増殖を阻害する、その他のそれらの性能について試験する。
【００８９】
組成物の生体内試験
化合物（ＢＬＭ処置したマウス内の肺線維症を阻害するＮＴＬ類似体またはＣＳＰ−４変異体または誘導体またはペプチド多量体など）の性能は、該化合物の機能活性を評価するための好ましい試験である。同じ型の活性を測定する当分野で公知の他の試験も、使用され得る。
【００９０】
肺傷害および線維症の予防または治療方法
本明細書に記載の化合物および組成物は、生体外または生体内で、ｐ５３タンパク質とのＭＤＭ２相互作用を阻害、およびＡＬＩおよび肺線維症／ＩＰＦに関連する疾病または状態を治療するための方法で使用される。
【００９１】
医薬および治療組成物ならびにそれらの投与
本発明の医薬組成物で使用され得る化合物は、これらの化合物の薬剤的に許容可能な塩だけでなく、ＮＴＬ、および上記全ペプチド化合物を含む。「薬剤的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の生物効果および特性を保持する、従来の酸付加塩または塩基付加塩を表し、適切な非毒性有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される。実例の酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸由来のもの、およびｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマール酸、および同類のものなど、有機酸由来のものが挙げられる。実例となる塩基付加塩としては、アンモニウム、カリウム、ナトリウム由来のもの、例えば、水酸化テトラメチルアンモニウムなど、水酸化第四級アンモニウムが挙げられる。医薬化合物（すなわち、薬物）の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性および溶解性を改善するための、医薬化学者に周知の技術である。例えば、Ｈ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（６ｔｈＥｄ．１９９５）ｐｐ．１９６および１４５６〜１４５７参照。
【００９２】
先に述べたように、本発明の化合物は、ｐ５３タンパク質とのＭＤＭ２相互作用を阻害する性能を有し、急性肺傷害および、特に、肺線維症の治療に活用される。
【００９３】
その薬剤的に許容可能な塩だけでなく、本発明の化合物は、カプセル剤、浸透性ウェハー剤、錠剤または、好ましくは、注射可能な製剤など、都合よい剤形中に、組み入れられ得る。固体または液体の薬剤的に許容可能な担体が、使用され得る。薬剤的に許容可能な担体、賦形剤、その他など、「薬剤的に許容可能な」は、薬理学的に許容可能であり、特定の化合物が投与される対象に対して、実質的に無毒を意味する。
【００９４】
固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が挙げられる。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、生理食塩水、水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。同様に、該担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル、単独またはワックスと一緒など、いずれかの持続放出物質を含み得る。液体担体が使用されるとき、該製剤は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、ソフトゼラチンカプセル剤、アンプル剤、または水性もしくは非水性液懸濁剤などの無菌性注射可能液体（例えば、液剤）の形態であり得る。かかる医薬組成物の概要は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，ＡＲ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２１ｓｔＥｄ，２００５（または最新版）で見られ得る。
【００９５】
該医薬製剤は、錠剤に必要なとき、混合、顆粒化および圧縮、または経口、非経口、局所的、経皮、腟内、陰茎内、鼻腔内、気管支内、頭蓋内、眼内、耳内および直腸内投与用の所望の製品を得るため、必要に応じて、成分を混合、充填および溶解などの工程を含む、医薬化学の従来技術に従って製造される。該医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、少量の無毒性補助物質も含み得る。
【００９６】
本発明は、いくつかの動物属および種のいずれかの治療で使用され得、ヒトまたは獣医の診療で、等しく適用可能である。従って、該医薬組成物は、鳥類および、より好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ヒトを含む飼育および商業用動物を治療するため、使用され得る。
【００９７】
「全身投与」という語は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または点滴など、対象の循環器系中に、該組成物を導入させる方法、さもなければ、身体中に、それを拡散可能にする方法で、本明細書に記載のＮＴＬまたはペプチドなど、組成物または薬物を投与することを表す。「局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）」投与は、肺内、好ましい経路、または胸膜内、硬膜内、硬膜下、または特定臓器への点滴など、特異的、およびいくらか、より限定的な、解剖学的空間中への投与を表す。他の例としては、肺内、気管支内、耳内または眼内、他の点滴に対応する１つの経路である鼻腔内が挙げられる。「局所（ｌｏｃａｌ）投与」は、皮下（ｓ．ｃ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射など、限定された、または限局性の解剖学的空間中に、組成物または薬物を投与することを表す。当業者は、局所（ｌｏｃａｌ）投与または局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与も、しばしば、該循環器中に、すなわち、ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．も、全身投与の経路であるように、組成物の侵入をもたらす。点滴可能、注射可能または点滴可能な製剤は、液剤もしくは懸濁剤、注射または点滴前に、液剤または液中の懸濁剤に適切な固形、または乳剤としてのいずれか、従来の形態で製剤され得る。投与の好ましい局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与は、肺中であるが、該医薬組成物は、肺中への点滴と別々、または同時のいずれかで、全身的にまたは局所的にまたは経皮的に投与され得る。
【００９８】
本発明の組成物のための他の薬剤的に許容可能な担体は、リポソームであり、該活性ポリペプチドが、脂質層に付着している水性同心円層から成る小体中に分散あるいは多様に存在して含まれる医薬組成物である。該活性ポリペプチドは、好ましくは、水性層中および脂質層中、内側または外側、または、いずれにしても、リポソーム懸濁液として一般に公知の非均一系中に存在する。該疎水性層、または脂質層は、一般に、但し、限定的ではなく、レクチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、多かれ少なかれ、リン酸ジセチル、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸などのイオン性界面活性剤、および／または疎水性の性質の他の物質を含む。当業者は、本リポソームの処方物の他の適切な実施形態を認識するだろう。
【００９９】
投与される治療投与量は、当業者に公知または容易に確認されるように、治療効果のある量である。用量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、同時治療の種類、たとえあったにしても、治療の頻度、および所望の効果の性質にも依存する。
【０１００】
治療方法
本発明の方法は、それを必要とする対象の肺線維症またはＩＰＦを治療するため、使用され得る。「治療」という語は、少なくとも次に示す：治療または予防される疾病または状態の症状の頻度および／または再発回数、または重症度を含む発症または再発を阻害、減少、寛解、予防、減少することを含むと広義に定義される。これは、上皮細胞死の阻害、線維芽細胞増殖の阻害、ＩＰＦに関連または原因となる、本明細書に記載のいずれかの他の生物学的または生化学的機序の結果として起こり得る。
【０１０１】
該ＮＴＬ、ＮＴＬ類似体、またはペプチドもしくはペプチド誘導体またはその薬剤的に許容可能な塩は、好ましくは、上記医薬組成物の形態で投与される。
【０１０２】
該化合物の用量は、好ましくは、該ＮＴＬまたはペプチドの効果量を含む医薬用量単位を含む。単位剤形は、哺乳類対象用の単位投薬量として適した理学的不連続単位を表し；各単位は、必要な医薬担体と合わせて、所望の治療効果を生じさせるために算出された所定量の活性物質を含む。本発明の単位剤形の規格は、（ａ）該活性物質の独自の特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）個体対象の治療、および感受性のためのかかる活性化合物の調剤技術に固有の制限によりおよび直接依存して示される。
【０１０３】
効果量は、疾病のいずれかの関連するパラメーターで、測定可能な減少をもたらす、生体内の領域濃度または定常状態濃度を達成するのに十分な量を意味するものとする。
【０１０４】
投与される活性化合物の量は、選択された該ＮＴＬ、ＮＴＬ誘導体、ペプチドまたはその誘導体、正確な疾病または状態、投与経路、レシピエントの健康および体重、他の同時に受けている治療の存在、たとえあったにしても、治療頻度、所望の効果の性質、および熟練者の判断に依存する。
【０１０５】
対象、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、それが原因のＩＰＦを罹患している、または罹りやすいヒトを治療するため、１日に１回投与される、好ましい単一用量は、例えば、点滴注入により（吸入により）、約０．２ｍｇ／ｋｇと約２５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは、約１０ｍｇ／ｋｇと約５０ｍｇ／ｋｇの間である。かかる用量は、約３日〜１週間以上、どこにでも、毎日、投与され得る。該用量は、当分野でよく理解されているように、下方に調節される必要があり得るが、長期の投与も可能である。しかしながら、前述の範囲は、個体の治療レジメンの変数の数が大きく、これらの好ましい値からかなりの変動が予想されることが示唆される。
【０１０６】
例えば、下記いくつかの実験で使用された浸透圧ポンプなど、ポンプシステムによる、連続的投与のため、約１〜２週間の時間経過に対する全投薬量は、好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは、２０〜３００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、５０〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。かかる連続的投薬レジメン後、該活性化合物の全濃度は、好ましくは、約０．５〜約５０μＭ、好ましくは、約１〜約１０μＭの範囲である。
【０１０７】
生体外で、アポトーシス阻害を阻害または予防するための該活性化合物の効果的濃度は、約０．５ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは、約２ｎＭ〜約２０ｎＭの範囲である。効果的用量および最適用量範囲は、本明細書に記載の方法を用いて、生体外で決定され得る。
【０１０８】
なお、一般的に、本発明を説明したが、例証によって提供される次の実施例を参照することにより、より容易に理解されるだろうが、指定がない限り、本発明を限定するものではない。該実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。続く実施例に開示される技術が、本発明の実践において、十分に機能することを、発明者により発見された技術を示しており、従って、その実践のための好ましい方法を構成すると見なされ得ることは、当業者により、認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、多くの変更が、開示される具体的実施形態で成され得、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、それでもなお、同様または類似の結果を得ることを理解するべきである。
【実施例】
【０１０９】
実施例Ｉ
ＩＰＦ肺の線維性病巣のＦＬ線維芽細胞ｐ５３発現の減少
免疫組織化学（ＩＨＣ）を含む、様々な試薬を用いた、ＩＰＦ患者の肺切片および対照「正常」対象の染色（図２Ａ〜２Ｉ）は、ＩＰＦ組織が、ＥＣＭが密集する線維性病巣を示すことを明らかにした。ビメンチンリッチな病巣に分散されたＦＬ線維芽細胞は、ｐ５３およびＰＡＩ−１抗原に対する最小の染色を示した。しかしながら、ＳＰ−Ｃ、ＰＡＩ−１、ｐ５３および活性カスパーゼ３（図示せず）に対する免疫蛍光染色は、該線維性病巣周囲の肺胞型ＩＩ（ＡＴＩＩ）細胞が、ｐ５３およびＰＡＩ−１抗原に対する強い染色性を示し、輪状ＡＴＩＩ細胞のアポトーシスを示す、活性カスパーゼ３に対してポジティブであることを示した。該ＩＨＣの結果は、線維性病巣を包むＡＴＩＩ細胞が、ｐ５３およびＰＡＩ−１の発現増加によって、連続的に死ぬことを明らかにしている。これらの傷は、最小の基本ｐ５３およびＰＡＩ−１を示す活性化された線維芽細胞で置き換わり、強いｋｉ−６７染色が、ｐ５３およびＰＡＩ−１発現の抑制に起因する増殖を示す。
【０１１０】
実施例ＩＩ
ＩＰＦ肺からのヒトＦＬ線維芽細胞内のカベオリン１、ｐ５３およびＰＡＩの減少ならびにｕＰＡの増加
ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞からの細胞ライセートを、該タンパク質およびｍｉＲＮＡの変化を明らかにするため、免疫ブロットした。図３Ａ〜３Ｂ参照。基本ｍｉＲ−３４ａ発現は、ＦＬ線維芽細胞内で、有意により低く、ｐ５３発現の減少および結果としてのｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの変化が、線維形成に起因していることを示した。かかる変化は、ｃｏｌ−Ｉの増加およびｍｉＲ−３４ａの阻害に関連している。結果は、ｐ５３の増加が、ｍｉＲ−３４ａ転写を誘発する、またはｍｉＲ−３４ａ介在性ヒトＦＬ線維芽細胞内のｐ５３の安定化が、肺線維症を緩和し得ることをさらに示した。
【０１１１】
実施例ＩＩＩ
ＩＰＦおよび「正常」肺からの線維芽細胞によるｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉ
ｍＲＮＡの不同性発現
「正常」対象およびＩＰＦを有する患者から、またはＮＬからの肺組織から単離された全ＲＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉ  ｍＲＮＡについて試験し、βアクチンｍＲＮＡの対応するレベルに正規化した。結果を、図４Ａ〜４Ｂに示す。
【０１１２】
ｕＰＡ  ｍＲＮＡが減少する一方、ｃｏｌ−ＩおよびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡの発現は、ＩＰＦ肺組織内で、有意に増加した。興味深いことに、ＩＰＦ肺組織と異なり、ＮＬ線維芽細胞と比較して、ＦＬ線維芽細胞内で、ｃｏｌ−ＩおよびｕＰＡ  ｍＲＮＡおよびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡ発現のより低いレベルが発見された。ｕＰＡＲタンパク質およびｍＲＮＡも、ＦＬ線維芽細胞内で増加した。該肺組織内のＰＡＩ−１の増加は、ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞よりむしろ、肺上皮細胞またはマクロファージによるＰＡＩ−１の発現増加に起因する。これは、ＩＰＦ肺からのＦＬ線維芽細胞内のｃｏｌ−Ｉ、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現増加、およびＰＡＩ−１タンパク質の減少と一致する（図３Ａ参照）。
【０１１３】
実施例ＩＶ
マウスからのＦＬ対ＮＬ線維芽細胞によるｕＰＡおよびＰＡＩ−１の発現差異
ＦＬ線維芽細胞を、ＢＬＭ傷害後２１日目のマウスの肺から単離し、または対象マウスからのＮＬ線維芽細胞を、他で２６、記載の鼻腔内の食塩水に曝露した。ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞からのライセートを、免疫ブロットした。ｐ５３、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉタンパク質の発現変化を、ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞の細胞ライセートの免疫ブロット法により検出した（図５Ａ〜５Ｄ）。全ＲＮＡを、ＢＬＭ誘発性線維症を有するまたは対照（食塩水処置）のマウスの肺組織からのマウス肺組織ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞から抽出し、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉ  ｍＲＮＡについて試験した。マウスからのＮＬおよびＦＬ線維芽細胞の増殖速度を比較した。ＩＰＦ肺２からのＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞と一致して、マウスのＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞の増殖のベースライン速度は、ＮＬ線維芽細胞（食塩水処置マウスから）より、有意に高かった。ｐ５３に阻害されたｕＰＡ遺伝子転写は、同時に該ＰＡＩ−１プロモーターを結合し、ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡ転写を増強した３３〜３４。該ＰＡＩ−１転写の安定化の一方、ｐ５３は、それらの転写の不安定化により、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現も阻害した２３〜２５。最後に、ｕＰＡまたはｕＰＡＲのいずれかの阻害は、ｐ５３発現およびＰＡＩ−１の下流のｐ５３介在誘発を増強し、それにより、細胞老化およびアポトーシスを増加させる。転写および転写後レベルにおいて、ｕＰＡ線溶系のｐ５３介在調節は、ｐ５３発現不足によって、ＦＬ線維芽細胞内で損なわれると結論された。これは、これらの細胞内で、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを増加させ、ＰＡＩ−１の阻害をもたらす。
【０１１４】
実施例Ｖ
ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内のｍｉＲ−３４ａの誘発により、ＣＳＰがｐ５３発現を増強する。
ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞を、ＰＢＳ、ＣＳＰまたはＣＰで処置し、ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により、ｍｉＲ−３４ａについて分析した。また、ＦＬ線維芽細胞を、ｍｉＲ−３４ａアンチセンス（ｍｉＲ−３４ａ−ＡＳ）またはプレｍｉＲ−３４ａ（対照ｍｉＲＮＡ）のあるなしで、ＰＢＳまたはＣＳＰまたはＣＰの存在下、培養した。これらの培養から条件培地（ＣＭ）を、ＰＡＩ−１に対して、免疫ブロットし、細胞ライセート（ＣＬ）を、ｐ５３に対して、免疫ブロットした。１つの実験では、ＦＬ線維芽細胞を、ｍｉＲ−３４ａ−ＡＳ、プレｍｉＲ−３４ａまたは対照ｍｉＲの存在または非存在下、ＰＢＳまたはＣＳＰまたはＣＰで処置した。ＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により、ｍｉＲ−３４ａの変化について分析した。結果は、図６Ａ〜６Ｃで見られる。
【０１１５】
一連の重複欠失を、ＣＳＰ中で行い、これらのペプチドフラグメントを、ｐ５３、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉの変化について、ＦＬ線維芽細胞で試験した（図６Ｄ）。
【０１１６】
ＣＳＰは、ＦＬ線維芽細胞内で、ｍｉＲ−３４ａおよびｐ５３発現を、有意に増加させたが、ＮＬ線維芽細胞では、そうでなかった。ＣＳＰによるｐ５３誘発を、プレｍｉＲ−３４ａ単独の発現により、模倣し、ｍｉＲ−３４ａ−ＡＳによるｍｉＲ−３４ａの阻害により、無効にした。これは、ｐ５３の誘発が、ｍｉＲ−３４ａ介在安定化を通して起こることを示した。
【０１１７】
ＣＳＰの２０量体の欠失分析は、ＣＳＰ−４と名付けられ、配列ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）を有する、内部７アミノ酸フラグメントが、全長ペプチドの活性を有することを明らかにした。これは、ＦＬ線維芽細胞または罹患している肺線維症を有するマウスのＣＳＰ−４の有益な効果（図１１Ａ〜１１Ｄ参照）が、ｐ５３およびｍｉＲ−３４ａ発現の制御を含むという結論を支持している。
【０１１８】
実施例ＶＩ
ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内のｐ５３タンパク質のｍｄｍ２介在性分解増加
ＮＬおよびＦＬ線維芽細胞からのライセートを、ｐ５３、およびｍｄｍ２に対して免疫ブロット、または抗ｍｄｍ２抗体で免疫沈降のいずれかをし、会合したｐ５３タンパク質に対して、免疫ブロット（ＩＢ）した。該結果は、ＦＬ線維芽細胞内のｍｄｍ２レベル上昇にかかわらず、ＦＬ線維芽細胞内に存在しない、ＮＬ線維芽細胞内の頑強なｍｄｍ２−ｐ５３相互作用を示した（図７Ａ〜７Ｂ参照）。従って、ｐ５３タンパク質のｍｄｍ２介在性分解の増加は、ＦＬ線維芽細胞内のベースラインｐ５３レベルの著しい抑制に起因し、ｍｄｍ２およびｐ５３の相互作用を標的化するため、本明細書に開示の治療処置の使用を支持した。
【０１１９】
実施例ＶＩＩ
ＦＬ（ＩＰＦ）線維芽細胞内ｃｏｌ−Ｉ発現のヌトリン３ａ−（ＮＴＬ）またはＣＳＰ−４介在性阻害：ｐ５３線溶系クロストークの役割
ＦＬ線維芽細胞を、ＰＢＳ（対照）、ヌトリン３ａ（１０μＭ）、ＣＳＰ−４（１０ｎＭ）またはＣＰに、４８時間、曝露した。ライセートを、Ｃｏｌ−Ｉ、ＰＡＩ−１、ｐ５３、およびｕＰＡの発現に対して、免疫ブロットした。結果を、図８Ａ〜８Ｂに示す。培養したＦＬ−を、媒体（ＰＢＳ）またはヌトリン３ａ、ＣＳＰ−４もしくはＣＰに曝露し、増殖を評価するため、カウントした。結果は、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４の両方が、ｃｏｌ−Ｉ発現およびＦＬ線維芽細胞の増殖を阻害した。該過程は、ｐ５３の誘発およびＰＡＩ−１発現、およびｕＰＡの同時阻害を含む。
【０１２０】
別の実験（図８Ｃの結果）では、ＦＬ線維芽細胞を、ｐ５３、ＰＡＩ−１またはカベオリン１を発現するアデノウイルスベクター、または適切なベクター対照で形質導入し、２日間培養し、その時間において、細胞ライセートを、Ｃｏｌ−Ｉ、ｐ５３、ＰＡＩ−１、およびｕＰＡに対して、免疫ブロットした。Ａｄ−Ｃａｖ−１を有するＩＰＦ肺からのＦＬ線維芽細胞の形質導入は、ｕＰＡおよびｃｏｌ−Ｉ発現を阻害する一方で、ｐ５３およびＰＡＩ−１を誘発した。ＦＬ線維芽細胞に対するヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４の効果を、ｐ５３またはＰＡＩ−１のいずれか、またはカベオリン１単独の発現により、模倣した。従って、ＰＡＩ−１のｐ５３介在性誘発およびｕＰＡ発現の阻害は、ｃｏｌ−Ｉの阻害に起因している。興味深いことに、ＩＰＦ患者または組み換えＰＡＩ−１タンパク質を有するＢＬＭ処置マウスの肺からのＦＬ線維芽細胞の処置は、外因性ＰＡＩ−１増加が、生体外および生体内の両方で、ＡＴＩＩ細胞アポトーシスを誘発したのに対して、アポトーシスまたは老化（図示せず）を誘発しなかった。ＦＬ線維芽細胞の外因性ＰＡＩ−１に対する耐性は、これらの細胞が、ＩＰＦまたはＢＬＭ傷害の肺のＰＡＩ−１タンパク質リッチな環境下で繁茂することを可能にするはずである。
【０１２１】
実施例ＶＩＩＩ
ＮＬ線維芽細胞内のｃｏｌ−Ｉ発現の誘発でのｐ５３線溶系クロストークの役割
組織学的に「正常な」ヒト肺２から単離されたＮＬ線維芽細胞（Ｓ．Ｓｈｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、上記参照）を、ベースラインｐ５３発現を阻害するため、ｐ５３
ｓｈＲＮＡを輸送するレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。対照細胞を、同様に、非特異的ｓｈＲＮＡで処理した。該培養からの条件培地を、ＰＡＩ−１、ｕＰＡ、および可溶性ｃｏｌ−Ｉに対して、免疫ブロットし、細胞ライセートを、ｐ５３およびα−ＳＭＡについて試験した。これらの線維芽細胞から単離された全ＲＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびｃｏｌ−Ｉ  ｍＲＮＡの発現の変化について分析した。結果（図９Ａ〜９Ｂ）は、ＮＬ線維芽細胞内のｐ５３発現の阻害が、ｕＰＡ、ｃｏｌ−Ｉおよびα−ＳＭＡを増強したが、ＰＡＩ−１を阻害したことを示す。これは、該ｕＰＡ系および線維形成のｐ５３介在性変化間のここに記載の結合を支持する。
【０１２２】
実施例ＩＸ
ヌトリン３ａは、ＢＬＭ処置マウスの肺線維症を阻害する
肺線維症を誘発するため、１４日間、ＢＬＭ（または、対照で食塩水）に曝露したマウスに、測定するため、ヌトリン３ａ（１０ｍｇ／体重ｋｇ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）または媒体対照を、静脈内注射し、罹患している肺線維症に対する効果を試験した。線維症を、ＣＴスキャニングにより評価し、肺機能（コンプライアンスおよび抵抗）を、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔシステムを用いて、測定した。肺切片を、肺切片を、線維症の指標として、肺構造およびコラーゲン沈着を評価するため、トリクローム染色およびＨ＆Ｅ染色（後者は図示せず）に付した。最終的に、全肺ホモジネートを、該ＥＣＭの独立した評価として、全コラーゲン（ヒドロキシプロリン）およびデスモシン含有量について分析した（Ｂｈａｎｄａｒｙ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０２：Ｌ４６３〜７３，２０１２；Ｂｈａｎｄａｒｙ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１８３：１３１〜４３  ２０１３）。全ての上記試験の結果（図１０〜１０Ｄ）は、肺線維症に対する、ヌトリン３ａの有益な効果を示した。ＢＬＭ傷害後１４日間のヌトリン３ａの経口投与は、同様に、マウスの肺線維症を阻害した。
【０１２３】
実施例Ｘ
ＣＳＰ−４ペプチドは、罹患している肺線維症を阻害して、肺機能を改善する。
マウスを、肺線維症を誘発するため、ＢＬＭに曝露した。１４日後、該マウスに、媒体または１．５ｍｇ／体重ｋｇのいずれかを、静脈内注射した
【０１２４】
１．５ｍｇ／体重ｋｇのＣＳＰ−４（配列番号１）または対照ペプチド（同じアミノ酸のスクランブル配列；ＣＰ、配列番号５）または媒体を、１４日前にＢＬＭに曝露したマウスに、静脈内注射した。１週間後、マウスを、肺線維症を評価するため、ＣＴスキャニングにより試験した。肺気量を、定量的ＣＴ表示を用いて、同じマウスで測定した。肺切片を、肺線維症の指標として、コラーゲン沈着を評価するため、染色（トリクロームおよびＨ＆Ｅ）に付した。全ホモジネートを、全ヒドロキシプロリンおよびデスモシン含有量（後者の結果は図示せず）について分析した。結果は、図１１Ａ〜１１Ｄ中である。全試験は、ＣＳＰ−４が、ＢＬＭ誘発肺線維症を阻害することを示した。ＩＰＦ肺からのＦＬ線維芽細胞に対する、ＣＳＰおよびＣＳＰ−４両方の生体外効果と一致して（図６Ｄ参照）、ＣＳＰ−４は、罹患している肺線維症に対する生体内の有益な効果を及ぼし、全長ペプチド、ＣＳＰ（配列番号３）の有益な効果を模倣した。
【０１２５】
実施例ＸＩ
ＣＳＰ−４ペプチドおよびヌトリン３ａは、ＦＬ線維芽細胞の増殖を阻害する。
１４日前にＢＬＭに曝露したマウスを、ＣＳＰ−４またはその対照（ＣＰ）またはヌトリン３ａで、静脈内（実施例ＩＸとＸのように）処置した。７日後、肺切片を得て、細胞増殖を評価するため、Ｋｉ−６７に対するＩＨＣに付した（図１２Ａ参照）。線維性マウスの肺切片で観察された、ｋｉ−６７抗原に対する染色増加は、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４での処置により、有意に減少した。これらの動物（実施例Ｘに記載の通り）の肺から単離された線維芽細胞を、ウェスタンブロッティング法により、ｃｏｌ−Ｉ、ｐ５３ならびに下流のｕＰＡおよびＰＡＩ−１タンパク質、および定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡの発現の変化について試験した（図１２Ｂ〜１２Ｃ参照）。罹患しているＢＬＭ誘発性線維症を有するマウスからのＦＬ線維芽細胞は、肺傷害のないマウスからのＮＬ線維芽細胞と比較して、ｕＰＡおよびｃｏｌ−Ｉ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の増加を示した。これらの細胞は、最小のｐ５３およびＰＡＩ−１発現も示した。しかしながら、ヌトリン３ａで処置したマウスからの線維芽細胞では、ｕＰＡおよびｃｏｌ−Ｉタンパク質およびｍＲＮＡ発現は、有意に抑制された。これらの変化は、ｐ５３タンパク質、およびＰＡＩ−１タンパク質およびｍＲＮＡ発現の著しい誘発と関連し、ｐ５３線溶系クロストークの回復が、線維症を緩和することを示した。
【０１２６】
実施例ＸＩＩ
ＣＳＰ−４またはヌトリン３ａでの生体外処置による線維性変化の阻害
マウスを、肺線維症を誘発するため、２１日間、鼻腔内ＢＬＭに曝露し、犠牲にして、それらの肺を切除し、小片に細断して、培養培地に入れた。その後、これらの組織試料を、１０ｎＭのＣＳＰ−４ペプチド、対照ペプチド（ＣＰ）またはヌトリン３ａで、７２時間、処置した。条件培地および組織ライセートを、ウェスタンブロッティング法により、ｃｏｌ−Ｉおよびα−ＳＭＡの変化について分析した。結果（図１３）は、線維性肺組織移植片のＣＳＰ−４またはヌトリン３ａでの処置が、生体外で、線維症を阻害することを示した。全長ＣＳＰペプチドは、ｃｏｌ−Ｉおよびα−ＳＭＡ（結果図示せず）の同様な阻害を得た。ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４は、生体外で、ヒトＩＰＦ肺組織に影響するように、同様に作用することが期待される。本明細書で提供された本発明者らの結果および最近の報告（例えば、Ｂｈａｎｄａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、２０１３、上記参照）で、ｕＰＡおよびＰＡＩ−１のｐ５３介在性下流変化が、ＦＬ線維芽細胞の生存率を調節するという概念を、強く支持する。
【０１２７】
実施例ＸＩＩＩ
ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３発現およびｕＰＡ線溶系の下流逆転は、生体内で、肺線維症を緩和する。
本明細書および他で報告された結果（Ｂｈａｎｄａｒｙ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、上記参照）（Ｓｈｅｔｔｙ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７：４７４〜８３，２０１２）は、ＢＬＭ後最初の１４日、野生型（ＷＴ）マウス（図１０Ａ〜１０Ｄ）内に、ＣＳＰまたはＣＳＰ−４の腹腔内もしくは静脈内投与（図１１Ａ〜１１Ｄ）、またはヌトリン３ａの静脈内もしくは経口投与は、罹患している肺線維症を緩和する。従って、ｐ５３タンパク質のｍｄｍ２介在性分解および下流ｐ５３−ｕＰＡ系クロストークの減少は、生体内で、ＦＬ線維芽細胞生存率およびＥＣＭの産生を増加させ、肺構造破壊および肺機能損失をもたらす。患者は、しばしば、ＩＰＦの進行期で症状が見つかる（初期診断時において）ので、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４が、罹患している肺線維症を阻害する機序が評価され、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４の下流ターゲットが同定される。これらの試験は、ＩＰＦ患者およびＢＬＭ肺傷害による進行した肺線維症を有するマウスからの肺組織を利用する。ｐ５３−ｕＰＡ系クロストークの寄与および特異性は、ｕＰＡ−、ｕＰＡＲ−、ＰＡＩ−１−およびｐ５３−欠損マウスを使用することにより、確認される。
【０１２８】
Ａ．生体外で、ＦＬ（ＩＰＦ）組織を用いた、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４処置の線維症に対する効果の決定。
ＩＰＦ患者から新たに切開されたＦＬ肺組織を、３〜７日間、ヌトリン３ａ（１０μＭ）またはＣＳＰ−４（１０ｎＭ）で処置する（図１３参照）。肺組織を、ホモジナイズして、ＥＣＭ（ヒドロキシプロリンおよびデスモシン）の変化について試験する。対照は、媒体または対照ペプチド、ＣＰまたは培養培地中で維持された未処置肺組織で処置されたＩＰＦ患者からの線維性肺（ＦＬ）組織を含む。他の対照は、組織学的に「正常な」肺から切除されたＮＬ組織を含む。移植に適切でなかったおよび医学研究に寄付された非同定患者（「正常」およびＩＰＦ）の肺を、ＩＩＡＭ（ニュージャージー州エジソン）およびＮＤＲＩ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）を通して得て、生体外試験に使用する。線維芽細胞を、これらの組織から単離し、ｐ５３、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１発現、ＥＣＭの産生および生存率の変化について分析する。ＥＣＭ合成速度の変化も、測定する。ＩＰＦを有する患者からのＦＬ組織移植片は、対照対象からのＮＬ組織の切片の発現レベルと比較したとき、ＥＣＭ合成が増加する。しかしながら、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４のいずれかで処置されたＦＬ肺移植片は、未処置のまま、または媒体単独またはＣＰのいずれかに曝露したものと比較したとき、ＥＣＭ合成速度の有意な減少を示す。ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４のいずれかで処置されたＦＬ肺移植片から単離された線維芽細胞は、ｐ５３、ｍｉＲ−３４ａおよびＰＡＩ−１のレベル上昇、およびｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現の減少を示す。Ａｋｔのリン酸化およびＰＤＧＦＲ−β  ｍＲＮＡタンパク質の発現も、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４で処置されたＩＰＦ移植片からの線維芽細胞内で減少する。これらの線維芽細胞の増殖速度およびＥＣＭの産生は、未処置または媒体−もしくはＣＰ−処置された対照からのＦＬ線維芽細胞より、有意に低いが、ＮＬ組織から単離された線維芽細胞のものと同程度である。
【０１２９】
Ｂ．肺線維症の対照中のｐ５３およびｍｉＲ−３４ａの役割
上記結果に基づいて、ＦＬ線維芽細胞によるｐ５３およびｍｉＲ−３４ａ発現の欠損が、肺線維症に起因し、ｍｉＲ−３４ａの誘発によるヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４によるベースラインｐ５３発現の回復が、肺線維症を緩和することが予想される。最大の肺線維症が、ＢＬＭ傷害後、１４〜２８日間で起こる（Ｂｈａｎｄａｒｙ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、上記参照；Ｂｈａｎｄａｒｙ  ＹＰ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、上記参照；およびここで示したデータ）ので、ＢＬＭ肺傷害後１４および２１日目において、プレｍｉＲ−３４ａを有するプロα２（Ｉ）コラーゲンプロモーターを含むレンチウイルス（ＬＶ）の静脈内注射によるマウス肺線維芽細胞内で発現する。肺線維症を、２８日後、評価する。肺線維症のヌトリン３ａ−またはＣＳＰ−４介在性緩和でのｍｉＲ−３４ａの役割は、線維性肺中、プロα２（Ｉ）プロモーターを用いて、線維芽細胞内のｍｉＲ−３４ａ−ＡＳのＬＶ発現により確認される。
【０１３０】
肺線維症に対する有益な効果でのｐ５３の役割は、ｍｉＲ−３４ａの阻害のあるなしで、プロα２（Ｉ）コラーゲンプロモーターを含むＬＶまたはＡｄ−ｐ５３を用いて、罹患している線維症を有するマウスの肺線維芽細胞内で、ｐ５３を発現することにより、直接確認される。肺線維症およびｍｉＲ−３４ａ発現を、例えば、ＢＬＭ傷害後２８日、評価する。あるいは、または加えて、ｐ５３発現を、ＢＬＭ誘発性肺線維症を有するＷＴマウス内のＬＶ  ｓｈＲＮＡまたは罹患している肺線維症を有するｐ５３欠損マウスを用いて、阻害する（Ｄａｖｉｓ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：８５７〜８６９，２０００）。それから、これらのマウスを、例えば、ＢＬＭ傷害後１４および２１日目、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４に曝露する。肺線維症を有する対照マウスを、非特異的ｓｈＲＮＡまたは未処置ＷＴマウスに曝露し、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４で処置する。該マウスを、例えば、ＢＬＭ傷害開始後２８日目、肺線維症およびｍｉＲ−３４ａ発現について試験する。ｐ５３−ｕＰＡ系クロストークの寄与を、肺線維症を誘発するため、１４〜２１日間、ＷＴ、ｐ５３−、ｕＰＡ−、ｕＰＡＲ−およびＰＡＩ−１−欠損マウスを、ＢＬＭに曝露し、上記のように、線維芽細胞内のｍｉＲ−３４ａを変化させ、例えば、ＢＬＭ傷害後２８日目に、線維症に対する効果を試験することにより確認する。
【０１３１】
Ｃ．ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４によるｐ５３発現および下流ｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの回復は、肺線維症を阻害する。
マウス中、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４による肺線維症の緩和でのｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの寄与は、例えば、ＢＬＭ傷害後２８日目、これらのマウスから、線維芽細胞を単離することにより確認される。これらの細胞を、ｐ５３、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１発現およびＥＣＭの産生の変化について試験した。ＢＬＭ傷害を有するマウスの肺から単離されたＦＬ線維芽細胞が、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの増加、生存率およびＥＣＭの産生を示すだろうことを発見することを期待する。これらのＦＬ線維芽細胞は、未損傷肺からのＮＬ線維芽細胞と比較して、最小のｐ５３およびＰＡＩ−１発現を示す。しかしながら、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４に曝露された、ＢＬＭ誘発性線維症を有するマウスの肺からの線維芽細胞は、ｐ５３の増加を示す。これらの細胞は、最小のＥＣＭ産生と、より小さい増殖性である。ＢＬＭ傷害マウスから得られたＦＬ線維芽細胞と比較して、ＰＡＩ−１が増加する一方、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現は、減少する。ＢＬＭ＋ヌトリン３ａまたはＢＬＭ＋ＣＳＰ−４処置マウスの肺線維芽細胞内のｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１レベルは、未損傷マウスから単離されたＮＬ線維芽細胞と同程度である。
【０１３２】
ｐ５３−ｕＰＡ系クロストークの関与を確認するため、ＢＬＭ傷害マウス肺から抽出されたＦＬ線維芽細胞を、Ａｄ−ｐ５３で形質導入する。ＣＰまたはＡｄ−ＥＶに曝露されたものが、ネガティブコントロールである一方、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４に曝露されたＢＬＭ傷害肺からの該線維芽細胞は、ポジティブコントロールである。該細胞を、ｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＰＡＩ−１の変化について試験する。
【０１３３】
Ａｄ−ｐ５３の形質導入またはヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４を用いた処置は、ＰＡＩ−１を増強し、ｕＰＡおよびｕＰＡＲ発現を阻害する。これらの細胞は、ＣＰまたはＡｄ−ＥＶに曝露されたＦＬ線維芽細胞と比較して、ＥＣＭの産生および増殖速度を抑制する。ＢＬＭマウスからのＦＬ線維芽細胞は、著しく低レベルのカベオリン１を発現し、カベオリン１の発現は、ＥＣＭの過剰な産生を緩和する。従って、ｕＰＡ線溶系のｐ５３およびｐ５３介在性下流変化、ＥＣＭおよび細胞生存率が、Ａｄ−ＥＶで処置したものと比較して、減少するかどうかを知るため、ＦＬ線維芽細胞を、Ａｄ−Ｃａｖ−１で形質導入する。
【０１３４】
Ｄ．肺線維症の緩和するとき、Ａｋｔリン酸化の阻害でのヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４の役割。
ＦＬ線維芽細胞は、Ａｋｔのリン酸化の増加および生存シグナルを提供するＰＤＧＦＲ−βの発現を示す（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８：３１７〜２５，２００１；Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：２５３〜６６，２００４；Ｈｏｙｌｅ  ＧＷ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５４：  １７６３〜７５，１９９９；Ｍｅｉｎｅｃｋｅ
ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １４：１１９：５９３１〜４２，２０１２）。さらに、ＰＡＩ−１が、Ａｋｔリン酸化を阻害する（Ｓｈｅｔｔｙ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，上記参照；Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照、Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｙ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５：９８〜１０４，２０１２）一方、ｐ５３は、ＰＴＥＮの発現を増強し（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照；Ｍａｙｏ  ＬＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：５４８４〜８９，２００２）、ＰＤＧＦＲ−βを阻害する（Ｗｉｄａｕ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：４２７０〜８２，２０１２；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ４：１３１６〜９，２００５）。Ａｄ−Ｃａｖ−１でのＦＬ線維芽細胞の形質導入は、ＰＴＥＮ活性の増加により、Ａｋｔのリン酸化を阻害する（Ｔｏｕｒｋｉｎａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｅｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｊ．６：１１６〜２２，２０１２；Ｗａｎｇ  ＸＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２８９５〜９０６，２００６；Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７６：２６２６〜３７，２０１０）。
【０１３５】
本明細書で提供される結果は、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４が、ｐ５３を増強し、ＦＬ線維芽細胞内のＥＣＭ産生を抑制し、ＢＬＭ誘発性肺線維症を緩和する。従って、本発明者らは、ｐ５３の誘発およびｐ５３−ｕＰＡ線溶系クロストークの変化による、ＦＬ線維芽細胞内のＡｋｔおよびＰＤＧＦＲ−β生存シグナルの阻害が、線維症を緩和すると考えた。これをテストするため、ＢＬＭ傷害マウス肺からのＦＬ線維芽細胞を、Ａｋｔのリン酸化およびＰＤＧＦＲ−βの発現について試験する。応答を、ＢＬＭ傷害後、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４またはＣＰで処置されたマウスから抽出された線維芽細胞で比較する。ＢＬＭ傷害マウスからのＦＬ線維芽細胞は、最小のベースラインｐ５３発現およびＡｋｔのリン酸化増加を有すると期待される。ＰＤＧＦＲ−βの発現は、ＦＬ線維芽細胞内で増加することが期待される。ｐ５３は、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４のいずれかで処置されたマウスからの線維芽細胞内で増強され、Ａｋｔリン酸化およびＰＤＧＦＲ−β発現の阻害をもたらすだろう。ＢＬＭ傷害マウスからのＦＬ線維芽細胞が、より多くのｕＰＡおよびｕＰＡＲを発現するので、これらの線維芽細胞は、ＢＬＭ＋ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４で処置されたマウスからの線維芽細胞と比較して、生存率およびＥＣＭの増加を明らかにするだろう。しかしながら、Ａｄ−ｐ５３またはＡｄ−Ｃａｖ−１を有するＢＬＭマウスからのＦＬ線維芽細胞の形質導入は、Ａｄ−ＥＶ処置した対照細胞と比較して、ＡｋｔおよびＰＴＥＮのリン酸化、ＰＤＧＦＲ−βの発現、細胞生存率およびＥＣＭ産生を減少させるだろう。ｓｈＲＮＡを用いたＰ５３の阻害は、ＥＣＭ産生、ＰＤＧＦＲ−βの発現およびＡｄ−Ｃａｖ−１またはヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４に曝露されたＦＬ線維芽細胞の生存能を阻害するだろう。これらの細胞は、対照ｓｈＲＮＡの存在下、Ａｄ−Ｃａｖ−１またはヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４で形質導入されたＦＬ線維芽細胞と比較して、最小のＰＡＩ−１とともに、ｕＰＡおよびｕＰＡＲの増加を示すだろう。
【０１３６】
本発明に従って、ＩＰＦ患者は、しばしば、診断時に、進行した線維性疾患の症状が見つかるので、ＦＬ線維芽細胞のターゲティングは、ＡＴＩＩ細胞アポトーシスまたは上皮間葉転換の予防より臨床的利点を有する。ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４は、ＮＬ線維芽細胞または傷害肺のＡＴＩＩ細胞と比較して、ＦＬ線維芽細胞内のベースラインｐ５３の著しい減少およびｍｄｍ２発現の増加のため、ＦＬ線維芽細胞内でのみ、効果的に、ｐ５３を誘発する。これは、ＡＴＩＩ細胞カベオリン１およびｐ５３発現で、特に当てはまり、ＩＰＦを有する患者またはＢＬＭ肺傷害を有するマウスの肺で、著しく増加する。この経験に基づいて、ＡＴＩＩ細胞内のｐ５３のさらなる誘発は、ＢＬＭまたはＩＰＦ肺のベースラインレベル上昇のため、ヌトリン３ａまたはＣＳＰ−４に対する応答は見込まれない。実際に、本発明者らは、ＣＳＰまたはＣＳＰ−４が、タンパク質脱リン酸化酵素２Ａ−Ｃ（Ｖｏｌｏｎｔｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：５４６２〜６６，２００９）のため、ＢＬＭ傷害により、ＡＴＩＩ細胞内で別に誘発されるカベオリン１との競合により、ｐ５３のＡＴＭキナーゼ介在性セリン−１５リン酸化をブロックすることにより、ＢＬＭ−またはたばこの煙誘発性ＡＴＩＩ細胞ｐ５３発現およびアポトーシス（Ｂｈａｎｄａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，２０１３、上記参照；Ｓｈｅｔｔｙ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７：４７４〜８３，２０１２）を阻害することを発見した。加えて、好中球およびマクロファージのヌトリン３ａの作用は、ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性および炎症誘発性サイトカインの産生のｐ５３介在性阻害により、炎症に対する有益な効果を有するはずである（Ｌｉｕ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２：５０６３〜７１，２００９）。
【０１３７】
従って、ヌトリン３ａおよびＣＳＰ−４の治療介入の利点は、いかなる潜在的有害なまたはオフターゲットな効果も凌ぐ。該ＦＬ線維芽細胞によるプロα（Ｉ）コラーゲンの過剰な増殖および産生は、マウスのＢＬＭ誘発性肺線維症後のＬＶを用いたＦＬ線維芽細胞内のプレｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−３４ａアンチセンスの効果的発現をもたらすだろう（Ｌｉｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９８：Ｌ８１９〜２９，２０１０；Ｍｅｒｋｅｌ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ９：２７６４〜８，２０１０）。
【０１３８】
Ａｄ−ｃａｖ−１でのＢＬＭ傷害肺の形質導入（Ｗａｎｇ  ＸＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２８９５〜９０６，２００６）は、ＢＬＭ傷害中のＡＴＩＩ細胞によるカベオリン１発現の増加にもかかわらず、線維症を阻害する。これは、たとえ、それらが、罹患している肺線維症を有するマウスのＦＬ線維芽細胞だけでなく、ＮＬ線維芽細胞を形質導入しても、ｐ５３、プレｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−３４ａアンチセンスの発現が、まだ効果的であろうことを示唆する。
【０１３９】
上記引用文献は、特に、組み入れられているか否かにかかわらず、全て、参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする。
【０１４０】
なお、本発明を全て説明したが、されらを、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、および不要な実験をすることなく、均等なパラメーター、濃度、および条件の広範囲内で、実施し得ることは、当業者により理解されるだろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）その配列が、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、ＣＳＰ−４と指定されたペプチド；
（ｂ）配列番号３の配列のカベオリン１（Ｃａｖ−１）の足場ドメインでない、約２０アミノ酸長までの前記ＣＳＰ−４ペプチドの付加変異体であるペプチド；
（ｃ）（ａ）の前記ＣＳＰ−４ペプチドの共有結合的に修飾された化学誘導体、
（ｄ）（ｂ）の前記変異体の共有結合的に修飾された化学誘導体、
（変異体または化学誘導体は、生体外または生体内アッセイにおいて、前記ＣＳＰ−４ペプチドの、少なくとも、２０％の生物または生化学活性を有する）
から成る群から選択される、線維性肺（ＦＬ）線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加させ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を減少させ、およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター１（ＰＡＩ−１）発現を増加させるペプチド。
（項目２）
ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、項目１記載のペプチド
（項目３）
少なくとも２つのモノマーを含むペプチド多量体であって、各モノマーが、項目１または２のいずれかに記載の前記ＣＳＰ−４ペプチド、前記変異体または前記化学誘導体であり、前記多量体が：
（ａ）式Ｐ１ｎを有し、式中、
（ｉ）Ｐ１は、前記ペプチド、変異体または化学誘導体であり、および
（ｉｉ）ｎ＝２〜５であり、または
（ｂ）式（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、前記ペプチド、変異体または化学誘導体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチド、変異体または誘導体であり、
（ｉｉｉ）Ｘは、４個までの酸素原子を含有する、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ポリエーテルであり；
（ｉｖ）ｍ＝０または１であり；および
（ｖ）ｎ＝１〜７であり、または
（ｃ）式（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２を有し、式中、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、独立して、前記ペプチド、変異体または誘導体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２の各々は、同じまたは異なるペプチドまたは変異体または誘導体であり；
（ｉｉｉ）ｚ＝０〜６であり；および
（ｉｖ）ｎ＝１〜２５であり、
式中、前記ペプチド多量体は、生体外または生体内アッセイにおいて、前記ＣＳＰ−４ペプチドの、少なくとも２０％の生物活性を有する前記ペプチド多量体。
（項目４）
（ａ）項目１〜３のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、または多量体、および
（ｂ）それと結合または会合した送達または転移分子または部分
を含む送達可能なペプチドまたはポリペプチド組成物。
（項目５）
前記送達または転移分子または部分が、
（ｉ）ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質またはその転移性に活性な誘導体；
（ｉｉ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６）を有するペネトラチン；
（ｉｉｉ）配列ＲＱＩＫＩＦＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号７）を有するペネトラチン変異体Ｗ４８Ｆ；
（ｉｖ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号８）を有するペネトラチン変異体Ｗ５６Ｆ；
（ｖ）配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＦＫＫ（配列番号９）を有するペネトラチン変異体；
（ｖｉ）配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１０）を有するトランスポータン；
（ｖｉｉ）  ＭＤＶタンパク質ＵＬ４９など、異なるヘルペスウイルスからの単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２またはその転移性に活性なホモログ；および
（ｖｉｉｉ）  配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１）を有するＰｅｐ−１
から成る群から選択される、項目４記載の送達可能なペプチドまたはポリペプチド組成物。
（項目６）
（ａ）項目１または２のいずれかに記載のペプチド、変異体または化学誘導体、または項目３記載のペプチド多量体；および
（ｂ）薬剤的に許容可能な担体または賦形剤
を含む抗線維性医薬組成物。
（項目７）
（ａ）項目４または５のいずれかに記載の送達可能なペプチドまたはポリペプチド組成物；および
（ｂ）薬剤的に許容可能な担体または賦形剤
を含む抗線維性医薬組成物。
（項目８）
（ｉ）項目６または７に記載の医薬組成物、および
（ｉｉ）ヌトリン３ａ（ＮＴＬ）またはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体（前記類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）
の組み合わせを含む抗線維性医薬組成物。
（項目９）
注射または肺点滴注入用に処方された、項目６〜８のいずれか１つに記載の抗線維性医薬組成物。
（項目１０）
肺点滴注入用に処方された、項目８記載の抗線維性医薬組成物。
（項目１１）
ｐ５３タンパク質とのＭＤＭ２の相互作用およびｐ５３のＭＤＭ２介在性分解を阻害する化合物または組成物の効果量を、前記ＦＬ線維芽細胞に提供することを含む、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加させ、ｕＰＡおよびｕＰＡＲを減少させ、ＰＡＩ−１発現を増加させ、および線維芽細胞増殖を減少させる方法であって、前記化合物または組成物が：
（ａ）ＮＴＬまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体（前記類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）；
（ｂ）項目１または２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド変異体；
（ｃ）項目３記載のペプチド多量体；
（ｄ）項目４または５のいずれかに記載の送達可能なペプチド、ポリペプチドまたは多量体組成物；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせ；または
（ｆ）項目６〜１０のいずれかに記載の医薬組成物
である前記方法。
（項目１２）
前記化合物が、ＮＴＬである、項目１１記載の方法。
（項目１３）
前記化合物が、前記ＣＳＰ４ペプチドＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、項目１１記載の方法。
（項目１４）
前記化合物が、前記ペプチド多量体である、項目１１記載の方法。
（項目１５）
前記ペプチド多量体が、ペプチドモノマーを含み、前記モノマーの各々が、ＣＳＰ−４ペプチドＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、項目１４記載の方法。
（項目１６）
前記ＮＴＬまたはＮＴＬ類似体が、ＮＴＬである、項目１１記載の方法。
（項目１７）
前記提供が、生体内である、項目１１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
ｐ５３タンパク質のＭＤＭ２介在性分解を阻害することにより、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質レベルを増加、ｕＰＡレベルを減少、およびＰＡＩ−１発現を増加させる化合物または組成物の効果量を、対象に投与することを含む、肺線維症により特徴付けられる疾病または状態を有する哺乳類の前記対象の治療方法。
（項目１９）
前記化合物または組成物が：
（ａ）ＮＴＬまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体（前記類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）；
（ｂ）項目１または２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド変異体；
（ｃ）項目３記載のペプチド多量体；
（ｄ）項目４または５のいずれかに記載の送達可能なペプチド、ポリペプチドまたは多量体組成物；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせ；または
（ｆ）項目６〜９のいずれか１つに記載の医薬組成物
である、項目１８記載の方法。
（項目２０）
前記化合物が、ＮＴＬである、項目１９記載の方法。
（項目２１）
前記化合物が、ＣＳＰ−４であり、その配列が、ＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、項目１９記載の方法。
（項目２２）
前記化合物が、前記ペプチド多量体である、項目１９記載の方法。
（項目２３）
前記ペプチド多量体が、ペプチドモノマーを含み、前記モノマーの各々が、ＣＳＰ−４ペプチドＦＴＴＦＴＶＴ（配列番号１）である、項目２２記載の方法。
（項目２４）
前記対象が、ヒトである、項目１８〜２１のいずれか１つに記載の方法。
（項目２５）
肺線維症を治療するための化合物または組成物の使用であって、前記化合物が、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質のＭＤＭ２介在性分解を阻害して、ｐ５３タンパク質レベルを増加、ｕＰＡレベルを減少およびＰＡＩ−１発現を増加させる前記使用。
（項目２６）
前記化合物が：
（ａ）ＮＴＬまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体（前記類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）；
（ｂ）項目１または２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド変異体；または
（ｃ）項目３記載のペプチド多量体；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの前記化合物いずれかの組み合わせ
である、項目２３記載の使用。
（項目２７）
前記組成物が、項目４または５のいずれかに記載の送達可能なペプチド、ポリペプチドまたは多量体組成物である、項目２５記載の使用。
（項目２８）
前記組成物が、項目６〜１０のいずれかに記載の医薬組成物である、項目２５記載の使用。
（項目２９）
肺線維症の治療用薬物製造のための化合物または組成物の使用であって、前記化合物が、ＦＬ線維芽細胞内のｐ５３タンパク質のＭＤＭ２介在性分解を阻害して、ｐ５３タンパク質レベルを増加、ｕＰＡレベルを減少およびＰＡＩ−１発現を増加させる前記使用。
（項目３０）
前記化合物が：
（ａ）ＮＴＬまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用を阻害するＮＴＬのキラルｃｉｓ−イミダゾリン類似体（前記類似体が、生体外または生体内アッセイにおいて、ＮＴＬの少なくとも２０％の生物または生化学活性を有する）；
（ｂ）項目１または２のいずれかに記載のペプチドまたはペプチド変異体；または
（ｃ）項目３記載のペプチド多量体；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の前記化合物のいずれかの組み合わせ
である、項目２９記載の使用。
（項目３１）
前記組成物が、項目４または５のいずれかに記載の送達可能なペプチド、ポリペプチドまたは多量体組成物である、項目２９記載の使用。
（項目３２）
前記組成物が、項目６〜１０のいずれか１つに記載の医薬組成物である、項目２９記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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