(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＨｔｒＡ１抗体及びそれを使用する方法を提供する。【解決手段】ＨｔｒＡ１（セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１）に結合する単離された抗ＨｔｒＡ１抗体であって、該抗体は、（ｉ）ＨｔｒＡ１のＮ２２４、Ｋ２４８、又は両方を含むエピトープに結合し、（ｉｉ）ＩＣ５０≦３０ｎＭでＨｔｒＡ１を阻害する抗体。抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする核酸を含む宿主細胞から抗ＨｔｒＡ１抗体を回収する製造方法。更に、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療において使用のための方法を提供。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｔｒＡ１に競合的に結合する単離された抗体であって、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項２】
競合的結合がＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＨｔｒＡ１に結合する単離された抗体であって、該抗体は、（ｉ）ＨｔｒＡ１のＮ２２４、Ｋ２４８、又は両方を含むエピトープに結合し、（ｉｉ）ＩＣ５０≦３０ｎＭでＨｔｒＡ１を阻害する抗体。
【請求項４】
抗体は次の特性：（ｉ）ＨｔｒＡ１三量体の１つのサブユニットに対して１つの可変ドメインの比率でＨｔｒＡ１に結合すること、又は（ｉｉ）ＨｔｒＡ１の三量体形成を妨げないことの一又は複数を更に含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＩＣ５０が配列番号１２を有する基質によるセリンプロテアーゼアッセイを用いて決定される、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
抗体は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及びＨｔｒＡ４の一又は複数と交差反応しない、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体は、≦５００ｎＭの解離定数を有する、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
解離定数がＦａｂを使用したビアコアにより２５℃で決定される、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ＨｔｒＡ１に結合する抗体断片である、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７））；（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６）である）を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹＩＨを含むＨＶＲ−Ｈ１（ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号２５））；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）である）を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆＡを含むＨＶＲ−Ｌ１（ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号２３））；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４））を更に含む、請求項１から１２又は１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１から１２、１６又は１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１から１２、１６又は１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１から１２、１６又は１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１から１２、１６又は１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１又は２、１６又は１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
配列番号１７の重鎖可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ２）配列を更に含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、請求項１から２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
（ａ）配列番号３２を含むＶＨ配列；（ｂ）配列番号３１を含むＶＬ配列；又は（ｃ）配列番号３２を含むＶＨ配列及び配列番号３１を含むＶＬ配列を含む、請求項１から２７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号８のＶＨ配列を含む、請求項２７又は２８に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号７のＶＬ配列を含む、請求項２７又は２８に記載の抗体。
【請求項３１】
配列番号３０のＶＬ配列を含む、請求項２７又は２８に記載の抗体。
【請求項３２】
配列番号２８のＶＬ配列を含む、請求項２７又は２８に記載の抗体。
【請求項３３】
配列番号２９のＶＨ配列を含む、請求項２７又は２８に記載の抗体。
【請求項３４】
配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項３５】
配列番号２９のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列を含む抗体。
【請求項３６】
配列番号３０のＶＬ配列及び配列番号２９のＶＨ配列を含む抗体。
【請求項３７】
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む、ＨｔｒＡ１に結合する抗体。
【請求項３８】
（ａ）配列番号３２を含むＶＨ配列；（ｂ）配列番号３１を含むＶＬ配列；又は（ｃ）配列番号３２を含むＶＨ配列及び配列番号３１を含むＶＬ配列を含む、ＨｔｒＡ１に結合する抗体。
【請求項３９】
（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹＩＨを含むＨＶＲ−Ｈ１（ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号２５））；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）である）；（ｄ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆＡを含むＨＶＲ−Ｌ１（ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号２３））；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４））を含む抗体。
【請求項４０】
抗体は、（ａ）配列番号４、２０、及び４７−５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５及び５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６及び５３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１及び３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２及び３４−４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４４】
完全長ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である、請求項１から４３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項４５】
請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４７】
抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項４６に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項４８】
宿主細胞から抗ＨｔｒＡ１抗体を回収することを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項５０】
請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項５１】
医薬として使用のための、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５２】
加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療において使用のための、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５３】
乾燥型加齢黄斑変性の治療に使用のための、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
網膜細胞又は光受容細胞の変性の阻害に使用のための、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５５】
眼においてＨｔｒＡ１のプロテーアーゼ活性の阻害に使用のための、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５６】
医薬の製造における、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項５７】
医薬が、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療の処置のためである、請求項５６の使用。
【請求項５８】
加齢黄斑変性が乾燥型加齢黄斑変性である、請求項５７の使用。
【請求項５９】
医薬は、網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するためである、請求項５６の使用。
【請求項６０】
医薬は、眼においてＨｔｒＡ１のプロテーアーゼ活性を阻害するためである、請求項５６の使用。
【請求項６１】
請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症を有する個体を治療する方法。
【請求項６２】
加齢黄斑変性が乾燥型加齢黄斑変性である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
網膜又は光受容細胞の変性を阻害するために、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体における網膜又は光受容細胞の変性を阻害する方法。
【請求項６４】
眼におけるＨｔｒＡ１活性を阻害するために、請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼におけるＨｔｒＡ１活性を阻害する方法。
【請求項６５】
抗体は、（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６６】
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項１から１２、又は６５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６７】
（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体。
【請求項６８】
抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項６７に記載の抗体。
【請求項６９】
抗体は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１、３３、及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２、３４−４６、及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項６７又は６８に記載の抗体。
【請求項７０】
完全長ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である、請求項６５から６９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７１】
請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項７２】
請求項７１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項７３】
抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項７２に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項７４】
宿主細胞から抗ＨｔｒＡ１抗体を回収することを更に含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲート。
【請求項７６】
請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項７７】
医薬として使用のための、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７８】
加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療において使用のための、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７９】
乾燥型加齢黄斑変性の治療に使用のための、請求項７８に記載の抗体。
【請求項８０】
網膜細胞又は光受容細胞の変性の阻害に使用のための、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８１】
眼においてＨｔｒＡ１のプロテーアーゼ活性の阻害に使用のための、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８２】
医薬の製造における、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項８３】
医薬が、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療の処置のためである、請求項８２の使用。
【請求項８４】
加齢黄斑変性が乾燥型加齢黄斑変性である、請求項８３の使用。
【請求項８５】
医薬は、網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するためである、請求項８２の使用。
【請求項８６】
医薬は、眼においてＨｔｒＡ１のプロテーアーゼ活性を阻害するためである、請求項８２の使用。
【請求項８７】
請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症を有する個体を治療する方法。
【請求項８８】
加齢黄斑変性が乾燥型加齢黄斑変性である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
網膜又は光受容細胞の変性を阻害するために、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体における網膜又は光受容細胞の変性を阻害する方法。
【請求項９０】
眼におけるＨｔｒＡ１活性を阻害するために、請求項６５から７０の何れか一項に記載の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼におけるＨｔｒＡ１活性を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年１０月１４日に出願された米国仮出願第６１／５４７，６４９号の利益を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が本明細書中で参照することにより援用される。２０１２年１０月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ４７６１Ｒ１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴと命名され、大きさは４７２７３バイトである。
【技術分野】
【０００３】
発明の分野
本発明は、抗ＨｔｒＡ１抗体及びそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
セリンプロテアーゼＨｔｒＡ１（ＰＲＳＳ１１；Ｃｌａｎ ＰＡ、ファミリーＳ１）はＨｔｒＡタンパク質の進化的に保存されたファミリーに属する (Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol 12:152-62 (2011); Clausen, T., et al., Mol Cell 10:443-55 (2002))。ヒトにおいては、ＨｔｒＡ１、３、及び４は同じドメイン構造を共有する：Ｎ末端ＩＧＦＢＰ様モジュールおよびカザール様モジュール、トリプシン様フォールドを持つプロテアーゼドメイン、及びＣ末端ＰＤＺドメイン。ＨｔｒＡ１の生理的関連性は家族性虚血性脳小血管疾患を引き起こすヒトの機能喪失変異の同定によりしっかりと確立されている（Hara, K., et al., N Engl J Med 360:1729-39 (2009))。分子機構は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の増大をもたらす、ＨｔｒＡ１によるＴＧＦ−β阻害不全を含む (Hara et al., 2009)。異常なＨｔｒＡ１発現による調節不全ＴＧＦ−βシグナル伝達はまた、おそらく、様々な細胞外マトリックス成分のＨｔｒＡ１媒介性分解と併せて(Chamberland et al., J Biol Chem 284:27352-9 (2009); Grau, S., et al., J Biol Chem 281:6124-9 (2006); Hadfield, K.D., et al., J Biol Chem 283:5928-38 (2008); Tocharus, J., et al., Dev Growth Differ 46:257-74 (2004); Tsuchiya et al., 2005)、又は間接的にマトリックスメタロプロテアーゼのアップレギュレーションを介して(Grau et al., 2006)、関節炎疾患に寄与する可能性がある (Oka, C., et al., Development 131:1041-53 (2004); Tsuchiya, A., et al., Bone 37:323-36 (2005))。加えて、ヒト遺伝子研究は、加齢性黄斑変性の進行及びＨｔｒＡ１転写レベルの増加をもたらすＨｔｒＡ１プロモーター領域におけるＳＮＰとの間の強い相関関係を同定した (Dewan, A., et al., Science 314:989-92 (2006); Yang, Z., et al., Science 314:992-3 (2006))。従って、ＨｔｒＡ１酵素機能の阻害は、例えば加齢黄斑変性及び関節炎疾患において魅力的な治療アプローチである。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、抗ＨｔｒＡ１抗体及び診断及び治療目的のためにそれを使用する方法を提供する。
【０００６】
一態様において、本発明は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗体と競合的にＨｔｒＡ１へ結合する単離された抗体を提供する。競合的結合は、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定されてもよい。
【０００７】
一態様において、本発明は、以下の特性の一以上を有するＨｔｒＡ１に結合する単離された抗体を提供する：（ｉ）一又は複数のＨｔｒＡ１基質に対して、ＩＣ５０が、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ未満、又はそれ以下；（ｉｉ）ＨｔｒＡ１三量体の１つのサブユニットに対して１つの可変ドメインの比率でＨｔｒＡ１に結合する（例えば、Ｆａｂは１つのＨｔｒＡ１三量体へ３つのＦａｂの比率でＨｔｒＡ１三量体に結合し、ＩｇＧは２つのＨｔｒＡ１三量体へ３つのＩｇＧの比率でＨｔｒＡ１三量体に結合する）、（ｉｉｉ）２つの可変ドメインを含む抗体について、図９に示したものと同様の「かご（ｃａｇｅ）」を形成することをもたらす様式でＨｔｒＡ１に結合する、（ｉｖ）ＨｔｒＡ１の三量体の形成を妨げない、（ｖ）ＨｔｒＡ１タンパク質のＣループ内の一以上の残基に結合する、（ｖｉ）ＨｔｒＡ１のプロテアーゼドメインに結合する、（ｖｉｉ）配列番号１３のアミノ酸Ｎ２２４又はＫ２４８又は異なるＨｔｒＡ１配列の等価なアミノ酸（例えば、配列番号１４のアミノ酸Ｎ２２４及びＫ２４８、図１０Ａ及びＢを参照）の一方又は両方を含むエピトープに結合する；（ｖｉｉｉ）配列番号１３の次の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８、Ｖ２０１、Ｔ２２３、Ｋ２４３、Ｋ２２５、Ｅ２４７及びＨ２２０又は異なるＨｔｒＡ１配列の等価なアミノ酸の一又は複数を含むエピトープに結合する；（ｉｘ）マウスＨｔｒＡ１と交差反応する：（ｘ）ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及び／又はＨｔｒＡ４と交差反応しない；（ｘｉ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗体と競合的にＨｔｒＡ１に結合する；（ｘｉｉ）≦５００ｎＭの解離定数でＨｔｒＡ１に結合する、又は（ｘｉｉｉ）ＨｔｒＡ１とα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の間の複合体形成を阻害する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ＨｔｒＡ１に結合する単離された抗体を提供し、ここでその抗体は、（ｉ）ＨｔｒＡ１のＮ２２４、Ｋ２４８、又は両方を含むエピトープに結合し、（ｉｉ）ＩＣ５０≦３０ｎＭでＨｔｒＡ１を阻害する。ある実施態様において、エピトープはＨｔｒＡ１の以下の残基：Ｖ２０１、Ｔ２２３、Ｋ２４３、Ｋ２２５、Ｅ２４７及びＨ２２０の一又は複数を更に含む。ある実施態様において、抗体は次の特性の一又は複数を更に含む：（ｉ）ＨｔｒＡ１三量体の１つのサブユニットに対して１つの可変ドメインの比率でＨｔｒＡ１に結合し、又は（ｉｉ）ＨｔｒＡ１の三量体形成を妨げない。ある実施態様において、ＩＣ５０は、配列番号１２を有する基質によるセリンプロテアーゼアッセイ、例えば、本明細書に記載されるＦＲＥＴアッセイを用いて決定される。
【０００９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及びＨｔｒＡ４の一又は複数と交差反応しない。
【００１０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、≦５００ｎＭの解離定数を有する。解離定数は、例えば、Ｆａｂを使用したビアコアにより決定されてもよい。
【００１１】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１２】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。
【００１３】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、ＨｔｒＡ１に結合する抗体断片である。
【００１４】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）；（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６）である）を含む。
【００１５】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
【００１６】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
【００１７】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
【００１８】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹＩＨを含むＨＶＲ−Ｈ１（ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号２５））；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）である）を含む。
【００１９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆＡを含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号２３）；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４）、を更に含む。
【００２０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２１】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【００２２】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【００２３】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【００２４】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。
【００２５】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２６】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２７】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００２８】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号１７の重鎖可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ２）配列を更に含む。
【００２９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。
【００３０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。
【００３１】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。
【００３２】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；（ｂ）配列番号３０のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は（ｃ）（ａ）のＶＨ配列及び（ｂ）のＶＬ配列を含む。
【００３３】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号３２を含むＶＨ配列；（ｂ）配列番号３１を含むＶＬ配列；又は（ｃ）配列番号３２を含むＶＨ配列及び配列番号３１を含むＶＬ配列を含む。
【００３４】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号８のＶＨ配列を含む。
【００３５】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号７のＶＬ配列を含む。
【００３６】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号３０のＶＨ配列を含む。
【００３７】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号２８のＶＬ配列を含む。
【００３８】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号２９のＶＬ配列を含む。
【００３９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号８のＶＨ配列、及び配列番号７のＶＬ配列を含む。
【００４０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号３０のＶＨ配列、及び配列番号２８のＶＬ配列を含む。
【００４１】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、配列番号３０のＶＨ配列、及び配列番号２９のＶＬ配列を含む。
【００４２】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹＩＨを含むＨＶＲ−Ｈ１、ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号２５）；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧを含むＨＶＲ−Ｈ２、ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６）；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹを含むＨＶＲ−Ｈ３、ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）である；（ｄ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆＡを含むＨＶＲ−Ｌ１、ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号２３）；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴを含むＨＶＲ−Ｌ３、ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４）を含む。
【００４３】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号４、２０、及び４７−５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５及び５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６及び５３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１及び３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２及び３４−４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４４】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４５】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４６】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００４７】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号８９））；（ｂ）アミノ酸配列ＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号８６））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号８８）である）を含む。
【００４８】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹを含むＨＶＲ−Ｈ１（ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号８７））；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号８８））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号８９）である）を含む。
【００４９】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆを含むＨＶＲ−Ｌ１（ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号８５））；（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）アミノ酸配列ＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号８６））を更に含む。
【００５０】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹを含むＨＶＲ−Ｈ１（ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号８７））；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏを含むＨＶＲ−Ｈ２（ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号８８））；及び（ｃ）アミノ酸配列ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹを含むＨＶＲ−Ｈ３（ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号８８）である）；アミノ酸配列ＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆを含むＨＶＲ−Ｌ１（ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号８５））；（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）アミノ酸配列ＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋを含むＨＶＲ−Ｌ３（ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号８６））を含む。
【００５１】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１、及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１、３３、及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２、３４−４６、及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００５２】
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、完全長ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体である。
【００５３】
別の態様において、本明細書に記載される抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。
【００５４】
別の態様において、本明細書に記載される抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００５５】
別の態様において、抗体を産生する方法が提供される。本方法は、抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で、抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を培養することを含み得る。本方法は、更に、宿主細胞培養物から抗ＨｔｒＡ１抗体を回収すること、抗ＨｔｒＡ１抗体を精製すること、又は薬学的に許容される賦形剤と共に抗ＨｔｒＡ１抗体を処方することを含む。
【００５６】
別の態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体及び細胞傷害性薬物を含むイムノコンジュゲートが提供される。
【００５７】
別の態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤が提供される。
【００５８】
別の態様において、本出願は、網膜又は光受容細胞の変性を阻害するため、又は眼においてＨｔｒＡ１プロテアーゼ活性を阻害するための、例えば、加齢性黄斑変性（湿潤又は乾燥）、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症の治療に使用するための医薬として使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。
【００５９】
別の態様において、本出願は、例えば網膜又は光受容細胞の変性を阻害するため、又は眼のＨｔｒＡ１プロテアーゼ活性を阻害するための、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ、湿潤又は乾燥）、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、又はポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）の治療用医薬などの医薬の製造のための抗ＨｔｒＡ１抗体の使用を提供する。
【００６０】
別の態様において、本出願は、個体に本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む、加齢性黄斑変性（湿潤又は乾燥）、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、又はポリープ状脈絡膜血管症を有する個体を治療する方法を提供する。
【００６１】
別の態様において、本出願は、網膜又は光受容体細胞の変性を阻害するために本明細書に記載されるように個体に抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む個体における網膜又は光受容細胞の変性を阻害する方法を提供する。
【００６２】
別の態様において、本出願は、眼の中のＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性を阻害するために本明細書に記載されるように個体に抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む個体の眼におけるＨｔｒＡ１セリンプロテアーゼ活性を阻害する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも一の図面が含まれる。カラー図面（複数）を含む本特許又は特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、抗ＨｔｒＡ１抗体９４（ＹＷ５０５．９４）の軽鎖可変ドメイン配列を示す（配列番号７）。図１Ｂは、抗ＨｔｒＡ１抗体９４（ＹＷ５０５．９４）の重鎖可変ドメイン配列を示す（配列番号８）。残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる (Kabat, E.A., et al., 1991, In: Sequences of proteins of immunological interest, 第五版、National Institutes of Health, Bethesda, MD)。ＹＷ５０５．９４の軽鎖可変ドメイン配列は、ヒトカッパＩ軽鎖のコンセンサス配列（配列番号９）と整列され、ＹＷ５０５．９４重鎖可変ドメイン配列は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖配列（配列番号１０）と整列される。取り囲まれた配列は、Ｋａｂａｔの定義に従ったＣＤＲである。抗ＨｔｒＡ１（ＹＷ５０５．９４）とコンセンサス配列の間の配列の違いは網掛けされている。
【図２】１３ファージ由来抗体（ＩｇＧ）のパネルのスクリーニング。単一濃度（０．０８−最終０．２８ｍｇ／ｍｌ）ＩｇＧをＨｕＨｔｒＡ１又はＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤとインキュベートし、酵素活性は、ＦＲＥＴアッセイで測定した。試験された１３抗体のうち、抗体ＹＷ５０３．５７、ＹＷ５０４．５７、ＹＷ５０４．６１及びＹＷ５０５．９４（Ａｂ９４又はＩｇＧ９４とも呼ばれる）がＨｕＨｔｒＡ１とＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ活性の両方を強く阻害した。
【図３】ＩｇＧ９４及びＦａｂ９４によるＨｕＨｔｒＡ１の阻害。ＨｔｒＡ１は３７℃で２０分間ＩｇＧ９４及びＦａｂ９４とともにインキュベートした。ペプチド基質Ｈ２−Ｏｐｔに対する酵素活性を測定し、分画活性（Ｖｉ／Ｖｏ）を決定された線速度から算出した。ＩｇＧ４は３００ｎＭで、トリプシン（１ｎＭ）又はエラスターゼ（１ｎＭ）によるＨ２−Ｏｐｔ加水分解を阻害しなかった。
【図４】ＩｇＧ４は、ＨｕＨｔｒＡ１及びＭｕＨｔｒＡ１による蛍光色素標識カゼイン（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）の加水分解を阻害する。ＨｕＨｔｒＡ１とＭｕＨｔｒＡ１は、３７℃で１５分間ＩｇＧ９４と共にインキュベートした。カゼインＢＯＤＩＰＹ ＦＬ試薬の加水分解は、３７℃でマイクロプレートリーダー上で測定し、蛍光増大の線形速度が決定され、阻害されない速度のパーセント（対照の％）として表した。
【図５】ＩｇＧ９４の特異性。ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ、ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤは、ＩｇＧ９４の濃度を増加させてインキュベートし、ペプチド基質Ｈ２−Ｏｐｔ（上のパネル）又はカゼインＢＯＤＩＰＹ ＦＬ試薬（下のパネル）に対する酵素活性が決定され、阻害されない速度のパーセント（対照の％）として表した。
【図６】ＩｇＧ９４によるＨｕＨｔｒＡ１媒介性高分子基質の切断の阻害。ＩｇＧ９４の濃度を増加させて（βカゼインでは２．３−１５０ｎＭ；デコリンでは２−１２５ｎＭ；バイグリカンでは２．３−１５０ｎＭ）、ＨｕＨｔｒＡ１（β−カゼインでは１０ｎＭ、デコリンでは１２５ｎＭ、バイグリカンでは７５ｎＭ）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。基質であるβ−カゼイン、デコリン及びバイグリカン（５０μｇ／ｍｌ）を加え、２〜１４時間インキュベートした。ＳＤＳ−サンプル緩衝液の添加後、消化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し（非還元条件）、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【図７Ａ−Ｃ】ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ上ＩｇＧ９４の機能性エピトープのマッピング。図７Ａは、活性部位周囲の残基のアラニン置換を有するＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ変異体へのＩｇＧ９４の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。陰付きの行は５倍以上の結合の減少をもたらしたアラニン置換を示している。図７Ｂは、変異した残基が示されたＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（ＰＤＢ３ＮＷＵ）の構造を示している(Clausen, T., et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 12:152-62 (2011))。中濃度の灰色陰影は最初の実験でＩｇＧ９４の結合の損失を伴わない変異を示し、濃い灰色の陰影は、結合親和性の＞５倍の損失を伴う残基のサブセットを示す。表面の表示に示されているプロテアーゼドメイン三量体を形成する３つのモノマーは、薄い灰色で影付きされている。触媒トライアド残基であるＤ２５０及びＳ３２８には下線を付している。図７Ｃは、ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（ＰＤＢ３ＮＷＵ）のモノマー上のエピトープ残基Ｎ２２４およびＫ２４８を有するループの拡大図（薄い灰色、漫画として）を示している。また、触媒残基のＨ２２０も含まれる。
【図８Ａ−Ｂ】Ｆａｂ９４：ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体（図８Ａ）及びＩｇＧ９４：ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体（図８Ｂ）のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱）。示されるのは、ＳＥＣ（ｘ軸）による溶出ピークと個々のタンパク質との複合体の質量（ｙ軸、溶出ピークを横切る点線）である。
【図９】ＩｇＧ：ＨｕＨｔｒＡ１−ＰＤ複合体の仮想的な「かご（ｃａｇｅ）モデル」。
【図１０Ａ−Ｂ】ヒトＨｔｒＡ１（配列番号１３）、マウスＨｔｒＡ１（配列番号１４）、マウスＨｔｒＡ３（配列番号１５）、及びマウスＨｔｒＡ４（配列番号１６）のアラインメント。
【図１１】ＨｔｒＡ１ ｍＲＮＡの発現は、一定光露光のマウスモデルにおいて網膜において増加する（左上のパネル）。ＨｔｒＡ２レベルは同じモデルで有意に変化しない（右上のパネル）。ＨｔｒＡ１の発現は、ベースラインでマウス網膜でのＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及びＨｔｒＡ４の発現レベルよりも有意に高い（下のパネル）。
【図１２】一定光曝露のマウスモデルにおけるＨｔｒＡ１発現が無い場合の双極細胞／ミュラー細胞応答の増加。
【図１３】一定光曝露のマウスモデルにおけるＨｔｒＡ１発現が無い場合の網膜の温存。
【図１４】一定光曝露のマウスモデルにおけるＨｔｒＡ１発現が無い場合の外顆粒層（ＯＮＬ）光受容体細胞の温存。
【図１５】抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａの親和性が改善された変異体の軽鎖ＨＶＲ配列。
【図１６】抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａの親和性が改善された変異体の重鎖ＨＶＲ配列。
【図１７】ＨｕＨｔｒＡ１に対する親和性が改善されたＹＷ５０５．９４ａ変異体の結合を示すファージ競合アッセイの結果。
【図１８】ＭｕＨｔｒＡ１に対する親和性が改善されたＹＷ５０５．９４ａ変異体の結合を示すファージ競合アッセイの結果。
【図１９Ａ−Ｃ】ラット組織（図１９Ａ）、マウスの眼液（図１９Ｂ）及びマウス網膜組織（図１９Ｃ）におけるＨｔｒＡ１タンパク質のレベルを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明の実施態様の詳細な記述
定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００６５】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００６６】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００６７】
用語「抗ＨｔｒＡ１抗体」及び「ＨｔｒＡ１に結合する抗体」は、抗体が、ＨｔｒＡ１を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＨｔｒＡ１に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体の、無関係な非ＨｔｒＡ１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＨｔｒＡ１への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＨｔｒＡ１へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、異なる種由来のＨｔｒＡ１間で保存されているＨｔｒＡ１のエピトープに結合する。
【００６８】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６９】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００７０】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００７１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００７２】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７３】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００７４】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００７５】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００７６】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００７７】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７８】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００７９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００８０】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００８１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００８２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００８３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。本明細書で使用されるＨＶＲは、位置２４−３６（Ｌ１について）、４６−５６（Ｌ２について）、８９−９７（Ｌ３について）、２６−３５Ｂ（Ｈ１について）、４７−６５（Ｈ２について）、及び９３−１０２（Ｈ３について）の内に位置する残基の任意の番号を含む。従って、ＨＶＲは以前に記載された位置内の残基を含む：
Ａ）２４−３４（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３） (Chothia and Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987)；
Ｂ）Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。
Ｃ）３０−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、９３−１００ａ−ｊ（Ｈ３） (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)。
【００８４】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照のこと）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００８５】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００８６】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００８７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００８８】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外、その自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在しており、又はコードする配列のみを含む。
【００８９】
「抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００９０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００９１】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００９２】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００９３】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００９４】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００９５】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００９６】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００９７】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「高温要求関連Ａ」又は「ＨｔｒＡ１」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＨｔｒＡ１を指す。その用語は、「完全長」、未処理のＨｔｒＡ１並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＨｔｒＡ１を含む。その用語はまた、天然に存在するＨｔｒＡ１の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なＨｔｒＡ１のアミノ酸配列は、配列番号１３に示される。ヒトＨｔｒＡ１の典型的な断片は、アミノ酸Ｑ２３−Ｐ４８０又はＰ１６１−Ｋ３７９を含む、から本質的になる、又はからなる断片を含む。
【００９８】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００９９】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【０１００】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【０１０１】
組成物及び方法
一態様において、本発明は、ＨｔｒＡ１活性の減少が、眼、外顆粒層における光受容体細胞と網膜電図機能に対する保護作用を有するという発見に一部、基づいている。所定の実施態様において、ＨｔｒＡ１に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、加齢黄斑変性や地図状萎縮などの眼疾患を含むＨｔｒＡ１活性に関連する種々の疾患の診断または治療のために有用である。
【０１０２】
Ａ．典型的な抗ＨｔｒＡ１抗体
一態様において、本発明は、ＨｔｒＡ１に結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、以下の特性の一又は複数を有する：（ｉ）一又は複数のＨｔｒＡ１基質に対して、ＩＣ５０が、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ未満、又はそれ以下を有する；（ｉｉ）ＨｔｒＡ１三量体の１つのサブユニットに対して１つの可変ドメインの比率でＨｔｒＡ１に結合する（例えば、Ｆａｂは１つのＨｔｒＡ１三量体へ３つのＦａｂの比率でＨｔｒＡ１三量体に結合し、ＩｇＧは２つのＨｔｒＡ１三量体へ３つのＩｇＧの比率でＨｔｒＡ１三量体に結合する）、（ｉｉｉ）２つの可変ドメインを含む抗体について、図９に示したものと同様の「かご（ｃａｇｅ）」を形成することをもたらす様式でＨｔｒＡ１に結合する、（ｉｖ）ＨｔｒＡ１の三量体の形成を妨げない、（ｖ）ＨｔｒＡ１タンパク質のＣループ内の一以上の残基に結合する、（ｖｉ）ＨｔｒＡ１のプロテアーゼドメインに結合する、（ｖｉｉ）配列番号１３のアミノ酸Ｎ２２４又はＫ２４８又は異なるＨｔｒＡ１配列の等価なアミノ酸（例えば、配列番号１４のアミノ酸Ｎ２２４及びＫ２４８、図１０Ａ及びＢを参照）の一方又は両方を含むエピトープに結合する；（ｖｉｉｉ）配列番号１３の次の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８、Ｖ２０１、Ｔ２２３、Ｋ２４３、Ｋ２２５、Ｅ２４７及びＨ２２０又は異なるＨｔｒＡ１配列の等価なアミノ酸の一又は複数を含むエピトープに結合する；（ｉｘ）マウスＨｔｒＡ１と交差反応する：（ｘ）ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及び／又はＨｔｒＡ４と交差反応しない；（ｘｉ）配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗体と競合的にＨｔｒＡ１に結合する；（ｘｉｉ）≦５００ｎＭの解離定数でＨｔｒＡ１に結合する、又は（ｘｉｉｉ）ＨｔｒＡ１とα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の間の複合体形成を阻害する。
【０１０３】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１、及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１、３３、及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２、３４−４６、及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。
【０１０４】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０５】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０６】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号６及び５３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様において、抗体は、配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号３、１９、２２、３４−４６及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号３、１９、２２、３４−４６及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０７】
一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０８】
一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＨ３から選択される、少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。その他の実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様において、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１０９】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ１；（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ２；及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ２；（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１０】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１、１８、２１、３３及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号３、１９、２２、３４−４６及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。更なる実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１、１８、２１、３３及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号３、１９、２２、３４−４６及び５９から７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１１】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ２；及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１２】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ２；（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１３】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ２；（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲーＬ３から選択される、少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１４】
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。一実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１５】
別の実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４、２０、４７−５１及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１、１８、２１、３３、５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３、１９、２２、３４−４６及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１６】
別の実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１７】
別の実施態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１８】
その他の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも一つのＶＨ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＨ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも一つのＶＬ ＨＶＲ配列、少なくとも二つのＶＬ ＨＶＲ配列、又は三つ全てのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１１９】
その他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。一実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２０】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号４、２０、４７−５１及び７５−８０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５、５２及び８１−８２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６、５３及び８３−８４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１、１８、２１、３３、及び５４−５７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２及び５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３、１９、２２、３４−４６、及び５９−７４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１２１】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２２】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２３】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０１２４】
上記実施態様の何れかにおいて、抗ＨｔｒＡ１抗体はヒト化されている。一実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、上記実施態様の何れかにあるようなＨＶＲを含み、更に、配列番号１７のＦＲ２配列を含むＶＨを含む。
【０１２５】
別の態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、配列番号８又は２９の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＨｔｒＡ１へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号８又は２９において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＨｔｒＡ１抗体は、配列番号８、２９、又は３２のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号４、２０、２５及び４７−５１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号５、２６及び５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６、２７及び５３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される一つ、二つ又は三つのＨＶＲを含む。
【０１２６】
その他の態様において、配列番号７、２８、又は３０の何れか一のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨｔｒＡ１抗体は、ＨｔｒＡ１へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号７、２８又は３０において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＨｔｒＡ１抗体は、配列番号７、２８、３０又は３１のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号１、１８、２１、２３及び３３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３、１９、２２、２４、及び３４−３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される一つ、二つ又は三つのＨＶＲを含む。
【０１２７】
その他の態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体が提供され、その抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号３２及び配列番号３１のそれぞれＶＨとＶＬを含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号８及び配列番号７のそれぞれＶＨとＶＬを含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２９及び配列番号２８のそれぞれＶＨとＶＬを含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２９及び配列番号３０のそれぞれＶＨとＶＬを含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１２８】
更なる態様において、本発明は、本明細書に与えられた抗ＨｔｒＡ１抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様において、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を含む抗ＨｔｒＡ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１３の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８又は両方、又は異なるＨｔｒＡ１配列のそれらに等価な残基を含むＨｔｒＡ１のエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、ＨｔｒＡ１のエピトープは、配列番号１３の以下のアミノ酸残基Ｖ２０１、Ｔ２２３、Ｋ２４３、Ｋ２２５、Ｅ２４７及びＨ２２０、又は異なるＨｔｒＡ１配列のそれらに等価なアミノ酸を更に含む。ある実施態様において、配列番号１３の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８及びＶ２０１の一又は複数又は前述の全て、又は異なるＨｔｒＡ１配列のそれらに等価な残基を含むＨｔｒＡ１のエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１３の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８、Ｖ２０１、Ｔ２２３及びＫ２４３の一又は複数又は前述の全て、又は異なるＨｔｒＡ１配列のそれらに等価な残基を含むＨｔｒＡ１のエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、配列番号１３の残基Ｎ２２４、Ｋ２４８、Ｖ２０１、Ｔ２２３、Ｋ２４３、Ｋ２２５、Ｅ２４７及びＨ２２Ａの一又は複数又は前述の全て、又は異なるＨｔｒＡ１配列のそれらに等価な残基を含むＨｔｒＡ１のエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様において、エピトープは線状エピトープである。ある実施態様において、エピトープは立体構造エピトープである。
【０１２９】
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＨｔｒＡ１抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１３０】
ある実施態様において、上記実施態様の何れかに記載の抗ＨｔｒＡ１抗体は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号７のＶＬ配列を有する抗体ではない。
【０１３１】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様の何れかに記載の抗ＨｔｒＡ１抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０１３２】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【０１３３】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する（例えば、Presta等， (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ ＴＭ；Packard）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ ＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
【０１３４】
別の実施態様によると、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５, BIACORE Inc.）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズ ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ ＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１３５】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１３６】
ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１３７】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
【０１３８】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【０１３９】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１４０】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０１４１】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）；Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１４２】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０１４３】
４．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１４４】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ  技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０１４５】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０１４６】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１４７】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１４８】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０１４９】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
【０１５０】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＨｔｒＡ１に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＨｔｒＡ１の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＨｔｒＡ１を発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１５１】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブインホール(knob-in-hole)」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１５２】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【０１５３】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＨｔｒＡ１並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用(Dual Acting) ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【０１５４】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０１５５】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
2018046832.tif 000003
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１５６】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１５７】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０１５８】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０１５９】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１６０】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１６１】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【０１６２】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０１６３】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号, Presta, L;及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号，Adamsら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【０１６４】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
【０１６５】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【０１６６】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０１６７】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１６８】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【０１６９】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【０１７０】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【０１７１】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号(Hinton et al.)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１７２】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１７３】
ｄ）システイン改変抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１７４】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０１７５】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＨｔｒＡ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１７６】
抗ＨｔｒＡ１抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１７７】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１７８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１７９】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１８０】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１８１】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３Ｔ細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の評価については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。
【０１８２】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＨｔｒＡ１抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０１８３】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１８４】
その他の態様において、競合アッセイを、ＨｔｒＡ１への結合についてＦａｂ９４又はＩｇＧ９４と競合する抗体を同定するために用いることができる。ある実施態様において、このような競合する抗体は、Ｆａｂ９４又はＩｇＧ９４により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０１８５】
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＨｔｒＡ１は、ＨｔｒＡ１に結合する第一の標識された抗体（例えば、Ｆａｂ９４又はＩｇＧ９４）、及びＨｔｒＡ１への結合について第一の抗体と競合する能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＨｔｒＡ１が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体のＨｔｒＡ１への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化されたＨｔｒＡ１に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＨｔｒＡ１に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＨｔｒＡ１への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１８６】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＨｔｒＡ１抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、ＨｔｒＡ１の一以上の生物学的活性の遮断、拮抗、抑制、妨害、調節、及び／又は減少を含むことができる。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１８７】
ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体はＨｔｒＡ１に結合し、例えば以下の実施例に記載のＨ２−Ｏｐｔペプチド、βカゼイン又はＢＯＤＩＰＹ ＦＬカゼイン基質、又は任意の他の適切なＨｔｒＡ１基質を含む、一以上のＨｔｒＡ１基質に対するそのセリンプロテーアーゼ活性を減少させ又は阻害する。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、一以上のＨｔｒＡ１基質に対するＨｔｒＡ１のセリンプロテーアーゼ活性を、ＩＣ５０が、５０ｎＭで、３０ｎＭで、２５ｎＭで、２０ｎＭで、１５ｎＭで、１０ｎＭで、５ｎＭで、３ｎＭで、２．５ｎＭで、２ｎＭで、１ｎＭで、又はそれ未満で阻害する。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、分解から光受容体細胞を保護し、外顆粒層の厚みを保護し、又は以下の実施例に記載される一定光曝露マウスモデルなど眼疾患モデルにおける網膜電図機能活性を保護する。
【０１８８】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＨｔｒＡ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１８９】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１９０】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０１９１】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０１９２】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１９３】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０１９４】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＨｔｒＡ１抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＨｔｒＡ１の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、外顆粒層の細胞、内顆粒層、ミューラー細胞、毛様体上皮、又は網膜組織などを含むサンプルなどの細胞又は組織を含む。
【０１９５】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＨｔｒＡ１の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＨｔｒＡ１抗体のＨｔｒＡ１への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＨｔｒＡ１抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＨｔｒＡ１抗体とＨｔｒＡ１との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＨｔｒＡ１が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＨｔｒＡ１抗体が抗ＨｔｒＡ１抗体による治療に好適な被検体を選択するために使用される。
【０１９６】
ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体による治療に適した患者は、ＨｔｒＡ１プロモーター多型ｒｓ１１２００６３８（Ｇ／Ａ）など、ＨｔｒＡ１遺伝子又はＨｔｒＡ１対照配列において一又は複数の多型を検出することにより同定され得る（例えば、A. DeWan, et al., Science 314: 989-992 (2006)を参照）。
【０１９７】
本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な障害には、眼障害、例えば、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、乾燥型加齢黄斑変性、地図状萎縮（ＧＡ）、糖尿病性網膜症（ＤＡ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、又はポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）などを含む。
【０１９８】
ある実施態様において、標識された抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０１９９】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＨｔｒＡ１抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２００】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２０１】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、ＡＭＤなど眼障害に関連する望ましくない新生血管形成を治療するために、ＬＵＣＥＮＴＩＳＴＭ（ラニビズマブ）などのような抗ＶＥＧＦ療法として、抗血管新生療法を提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。他の実施態様において、疾患又は障害に関連した望ましくない眼の血管新生の治療は、抗ＨｔｒＡ１抗体と光線力学的治療との併用を含み得る（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮＴＭ又はＶＩＳＵＤＹＮＥＴＭによる）。
【０２０２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）により、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０２０３】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０２０４】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２０５】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される任意の抗ＨｔｒＡ１抗体を治療方法に使用することができる。
【０２０６】
ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、眼障害に罹患し又は発症するリスクのある患者（例えば、ＨｔｒＡ１多型、眼中のＨｔｒＡ１発現の増加、少なくとも一方の眼のドルーゼンを有する患者）の眼の中の網膜細胞（例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）又は光受容細胞の変性を抑制するのに有用である。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、治療すべき眼にドルーゼンを有する患者の眼において乾燥型加齢黄斑変性又は後期地図状萎縮への進行を遅延させるために使用することができる。ある実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体による治療に適した患者は、患者の少なくとも一方の眼における疾患の発症を検出することによって同定することができる。例えば、特定の患者は、他方の目は無症状であるものの、片方の眼においてドルーゼン、地図状萎縮、又は脈絡膜血管新生を検出することにより選択することができる。このような患者は、例えば、無症状の目においてそのような症状（例えば、ドルーゼン、地図状萎縮、及び／又は脈絡膜血管新生）の発症を遅らせるか又は重症度を軽減するために、無症状の眼の予防的処置のための良好な候補であり得る。あるいは、症候性の眼が治療され得るか、又は症候性及び無症状の眼の両方が本明細書に記載の方法に従って治療されてもよい。従って、抗ＨｔｒＡ１抗体は、眼障害の進行を予防または阻害するために使用することができ、ここでは他方の眼ではドルーゼン、滲出型ＡＭＤ、又は地図状萎縮を発症しているが、治療を受けている目はまだ症候性ではない。あるいは、症候性の眼は治療され、又は症候性及び無症状の目の両方が治療される。
【０２０７】
別の実施態様において、抗ＨｔｒＡ１抗体は、関節炎を治療するのに有用である。
【０２０８】
一態様では、医薬として使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。更なる態様では、眼疾患又は障害を治療するのに使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体、例えばＡＭＤ（湿潤又は乾燥）、ＧＡ、ＤＲ、ＰＣＶ又はＲＯＰが提供される。ある実施態様において、治療の方法に使用される抗ＨｔｒＡ１抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、個体に抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む眼の疾患又は障害を有する個体を治療する方法における使用のための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、患者の眼の中の網膜細胞（例えば、ＲＰＥ細胞など）又は光受容細胞の変性の阻害に使用するための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するために抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体において網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害する方法で使用のための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。更なる実施態様において、本発明は、患者の眼においてＨｔｒＡ１セリンプロテーアーゼ活性を阻害することに使用のための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。ある実施態様において、本発明は、眼の中でＨｔｒＡ１セリンプロテーアーゼ活性を阻害するために抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼においてＨｔｒＡ１セリンプロテーアーゼ活性を阻害する方法で使用のための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。更なる実施態様において、本発明は、必要とする患者、例えばポリープ様動脈瘤性拡張を持つ脈絡膜血管網を有する患者においてＰＣＶを阻害することに使用のための抗ＨｔｒＡ１抗体を提供する。
【０２０９】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＨｔｒＡ１抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬は、眼疾患、例えばＡＭＤ（湿潤又は乾燥）、ＧＡ、ＤＲ、ＰＣＶ又はＲＯＰを治療するのに使用するためである。更なる実施態様において、医薬は、眼疾患を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、眼疾患を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、医薬は、個体の眼において、網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するためである。更なる実施態様にて、医薬は、網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するために医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体において網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害する方法で使用するためである。更なる実施態様において、医薬は、個体の眼において、ＨｔｒＡ１のセリンプロテーアーゼ活性を阻害するためである。更なる実施態様において、医薬は、眼の中でＨｔｒＡ１セリンプロテーアーゼ活性を阻害するために医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体の眼においてＨｔｒＡ１セリンプロテーアーゼ活性を阻害する方法で使用のためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２１０】
更なる態様において、本発明は、眼疾患、例えばＡＭＤ（湿潤又は乾燥）、ＧＡ、ＤＲ、ＰＣＶ又はＲＯＰを治療するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、眼疾患を有する個体に、抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つの付加的治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２１１】
更なる態様において、本発明は、個体において網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、個体において網膜細胞又は光受容細胞の変性を阻害するための抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２１２】
抗ＨｔｒＡ１抗体を用いて、眼の障害の治療の有効性は、例えば、目の検査を行うこと、眼圧を測定すること、視力を評価すること、スリットランプの圧力を測定すること、眼球内の炎症を評価すること、ＣＮＶの大きさを測定すること、ＣＮＶの漏出を測定すること（例えば、フルオレセイン血管造影法による）、ドルーゼンの量を測定すること、ドルーゼンの位置を測定すること等、眼疾患を評価する際に一般的に使用される様々なエンドポイントによって測定することができる。ある実施態様において、視力喪失は、例えば、ベースラインから所望の時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化を測定することによって（例えば、ＢＣＶＡが糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）に基づく場合、視力チャート及び４メートルの検査距離での判定）、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字より少ない視力を失う患者の割合を測定することによって、ベースラインと比較して所望の時点で１５文字以上を獲得する患者の割合を測定することによって、所望の時点で２０／２０００かそれより悪いスネレン等価視力を持つ患者の割合を測定することによって、又はＮＥＩ視覚機能質問票を測定することによって、評価することができる。
【０２１３】
更なる実施態様において、本発明は、個体の眼においてＨｔｒＡ１のセリンプロテーアーゼ活性を阻害するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、個体の眼においてＨｔｒＡ１のセリンプロテーアーゼ活性を阻害するための抗ＨｔｒＡ１抗体の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
【０２１４】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗ＨｔｒＡ１抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＨｔｒＡ１抗体の何れか及び薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＨｔｒＡ１抗体の何れかと、少なくとも一の付加的治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２１５】
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一の付加的治療剤と同時投与され得る。ある実施態様において、付加的治療剤は、眼の望ましくない血管新生に関連した眼疾患、例えば滲出型ＡＭＤの治療のために適した治療剤である。適切な治療剤は、例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳＴＭ（ラニビズマブ）のような抗ＶＥＧＦ療法など抗血管新生療法を含む。
【０２１６】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の抗体はまた、光力学療法と組み合わせて使用することができる（例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥＴＭ又はＭＡＣＵＧＥＮＴＭによる）。
【０２１７】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。例示的実施態様において、本発明の抗体（及び任意の付加的治療剤）は硝子体内注射によって投与することができる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内、硝子体内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２１８】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２１９】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。
【０２２０】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、抗ＨｔｒＡ１抗体の代わりか又は抗ＨｔｒＡ１抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２２１】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【０２２２】
上記の製造品のいずれかは、抗ＨｔｒＡ１抗体の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【０２２３】
重要な配列
抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４の軽鎖のＨＶＲＨＶＲ
Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１）
ＨＶＲ Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）
ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号３）
抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４の重鎖のＨＶＲＨＶＲ
Ｈ１：ＧＦＮＩＳＧＹＹＩＨ（配列番号４）
ＨＶＲ Ｈ２：ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）
ＨＶＲ Ｈ３：ＧＴＦＬＴＳＷＧＨＹＦＤＹ（配列番号６）
2018046832.tif 000004
2018046832.tif 000005
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ＹＷ５０５．９５ ＨＣ ＦＲ２
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（配列番号：１７）
抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａ．２８の軽鎖ＨＶＲ
ＨＶＲ Ｌ１：ＲＡＳＱＳＩＮＴＹＬＡ（配列番号１８）
ＨＶＲ Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）
ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＤＤＴＰＰＴ（配列番号１９）
抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａ．２８の重鎖ＨＶＲ
ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＳＩＳＧＹＹＩＨ（配列番号２０）
ＨＶＲ Ｈ２：ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）
ＨＶＲ Ｈ３：ＧＴＦＬＴＳＷＧＨＹＦＤＹ（配列番号６）
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抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａ．５４の軽鎖ＨＶＲ
ＨＶＲ Ｌ１：ＲＡＳＱＶＶＧＮＹＬＡ（配列番号２１）
ＨＶＲ Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）
ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＤＤＨＰＰＴ（配列番号２２）
抗ＨｔｒＡ１抗体ＹＷ５０５．９４ａ．５４の重鎖ＨＶＲ
ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＳＩＳＧＹＹＩＨ（配列番号２０）
ＨＶＲ Ｈ２：ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）
ＨＶＲ Ｈ３：ＧＴＦＬＴＳＷＧＨＹＦＤＹ（配列番号６）
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軽鎖ＨＶＲコンセンサス配列
ＨＶＲ Ｌ１：ＲＡＳＱＸａＸｂＸｃＸｄＸｅＸｆＡ，ここでＸａはＤ、Ｓ又はＶであり；ＸｂはＶ又はＩであり；ＸｃはＳ、Ｎ又はＧであり；ＸｄはＴ又はＮであり；ＸｅはＡ又はＹであり；及びＸｆはＶ又はＬである（配列番号２３）；
ＨＶＲ Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）
ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＸｇＸｈＸｉＸｊＰＸｋＴ，ここでＸｇはＳ、Ｖ又はＤであり；ＸｈはＹ、Ｄ又はＳであり；ＸｉはＴ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＮであり；ＸｊはＴ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＲであり；及びＸｋはＰ、Ｔ、Ａ又はＳである（配列番号２４）；
重鎖ＨＶＲコンセンサス配列
ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＸｌＩＸｍＸｎＹＹＩＨ，ここでＸｌはＮ、Ｓ又はＴであり；ＸｍはＳ、Ｄ、Ｙ又はＡであり；及びＸｎはＧ又はＤである（配列番号２５）；
ＨＶＲ Ｈ２：ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＸｏＹＡＤＳＶＫＧ，ここでＸｏはＮ又はＤである（配列番号２６）；
ＨＶＲ Ｈ３：ＧＴＦＬＴＸｐＷＧＨＹＦＤＹ，ここでＸｐはＳ又はＴである（配列番号２７）。
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ＹＷ５０５．９４ａ５１  ＨＶＲ Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＧＴＹＬＡ（配列番号３３）
ＹＷ５０５．９４ａ．１  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＶＹＳＨＰＰＴ（配列番号３４）
ＹＷ５０５．９４ａ．７  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＴＮＰＰＴ（配列番号３５）
ＹＷ５０５．９４ａ．２２  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＡＴＰＴＴ（配列番号３６）
ＹＷ５０５．９４ａ．３７  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＳＳＰＡＴ（配列番号３７）
ＹＷ５０５．９４ａ．３９  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＶＹＴＴＰＰＴ（配列番号３８）
ＹＷ５０５．９４ａ．４０  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＶＹＡＴＰＳＴ（配列番号３９）
ＹＷ５０５．９４ａ．４２  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＮＳＰＡＴ（配列番号４０）
ＹＷ５０５．９４ａ．４６  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＳＴＰＡＴ（配列番号４１）
ＹＷ５０５．９４ａ．５０  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＴＡＰＴＴ（配列番号４２）
ＹＷ５０５．９４ａ．５１  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＤＳＴＬＰＰＴ（配列番号４３）
ＹＷ５０５．９４ａ．５２  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＤＡＡＰＰＴ（配列番号４４）
ＹＷ５０５．９４ａ．７８  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ（配列番号４５）
ＹＷ５０５．９４ａ．８９  ＨＶＲ Ｌ３：ＱＱＳＹＴＲＰＰＴ（配列番号４６）
ＹＷ５０５．９４ａ．７  ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＳＩＳＤＹＹＩＨ（配列番号４７）
ＹＷ５０５．９４ａ．２６  ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＳＩＤＧＹＹＩＨ（配列番号４８）
ＹＷ５０５．９４ａ．３８  ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＴＩＹＤＹＹＩＨ（配列番号４９）
ＹＷ５０５．９４ａ．７８  ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＳＩＡＧＹＹＩＨ（配列番号５０）
ＹＷ５０５．９４ａ．８２  ＨＶＲ Ｈ１：ＧＦＴＩＳＤＹＹＩＨ（配列番号５１）
ＹＷ５０５．９４Ａ．４２  ＨＶＲ Ｈ２：ＷＩＤＰＹＧＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５２）
ＹＷ５０５．９４Ａ．４６  ＨＶＲ Ｈ３：ＧＴＦＬＴＴＷＧＨＹＦＤＹ（配列番号５３）
【０２２４】
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【実施例】
【０２２５】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２２６】
実施例１：抗ＨｔｒＡ１抗体の生成
ファージディスプレイ合成抗体ライブラリーは、Ｍ１３ファージ上に二価のＦａｂ断片を表示し、多様性は、重鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）内のオリゴ定方向突然変異誘発を用いて生成した。Ｆａｂライブラリの詳細は前述した(Lee, C.V., et al., J Mol Biol. 340:1073-93 (2004); Lee, C.V., et al., J Immunol Methods. 284:119-32 (2004))。ヌンク９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートはＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（１０μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩コーティングし、次いでファージブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）と共に室温で１時間ブロックした。抗体ファージライブラリーはＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤコーティングされたプレートに添加し、室温で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含む緩衝液を用いて洗浄し、結合したファージを３０分間、５０ｍＭ ＨＣｌ−５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の等量で中和した。回収したファージを大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞中で増幅した。続く選択ラウンドの間、抗原がコーティングされたプレートとの抗体ファージのインキュベーションは２ー３時間に減らし、プレート洗浄のストリンジェンシーは徐々に増加させた。同定された１３のクローンはＩｇＧに再フォーマットされ（Ｆａｂ９４については下記のように）、２９３細胞で発現し、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製された１３のＩｇＧが結合ＥＬＩＳＡにおいてＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤに結合した。
【０２２７】
抗ＨｔｒＡ１ Ｆａｂ９４及びＩｇＧ９４の発現及び精製。Ｆａｂ９４（ＹＷ５０５．９４）の重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、大腸菌のＦａｂ発現ベクター（ＡＥＰ１）にサブクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌の菌株３４Ｂ８に形質転換した。単一コロニーをカルベニシリンの５０μｇ／ｍｌを補充した３０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩増殖させた。５ｍｌの培養物は、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補充した５００ｍｌの完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地(Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002)) に播種し、２４時間３０℃で増殖させた。Ｆａｂ９４タンパク質は、プロテインＡアガロース樹脂を用いて精製した。
【０２２８】
Ｆａｂ９４の軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における一過性発現用に、ヒト軽鎖又は重鎖（ヒトＩｇＧ１）定常ドメインを含むｐＲＫ５ベースのプラスミドにクローニングした。ＩｇＧ９４タンパク質は、プロテインＡアガロースクロマトグラフィーの使用により精製した。
【０２２９】
Ｆａｂ９４（ＹＷ５０５．９４）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示されている。
【０２３０】
実施例２：ＨｔｒＡ１タンパク質の産生
タンパク質の構築物。全長ヒトＨｔｒＡ１（ＨｕＨｔｒＡ１）（Ｑ２３−Ｐ４８０）及び全長マウスＨｔｒＡ１（ＭｕＨｔｒＡ１）（Ｐ２４−Ｐ４８０）はＴａｑポリメラーゼを使用して完全長クローンからＰＣＲ増幅によってクローニングした。プライマーは、得られたＰＣＲ産物に制限酵素認識部位ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの部分を追加するために必要なヌクレオチドを含んでいた。ＰＣＲ断片は、Ｈｉｓ６配列（配列番号９０）を含む修飾されたｐＡｃＧＰ６７バキュロウイルストランスファーベクター（BD Pharmingen）にＢＡｍＨＩ制限部位の上流で連結され、ＨｔｒＡ１タンパク質上にＮ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号９０）を得た。
【０２３１】
Ｎ−ドメイン及びＰＤＺドメインを欠くヒトＨｔｒＡ１のプロテアーゼドメイン（ＨｔｒＡ１＿ＰＤ）（例えば、残基Ｄ１６１−Ｋ３７９を含む）はＰＣＲ増幅によってクローニングした。増幅されたＤＮＡは、修飾ｐＥＴベクターに挿入し、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号９０）を生じ、トロンビン切断部位はＨｔｒＡ１のＤ１６１コドンの上流に融合された。ＨｔｒＡ１＿ＰＤのＡｌａ変異体は、製造業者のプロトコルに従ってクイックチェンジＸＬ部位特異的突然変異誘発キットを使用して生成された(Agilent Technologies, Santa Clara CA)。構築物はＤＮＡ配列決定により確認した。マウスＨｔｒＡ１（ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ）（Ｇ１５６−Ｓ３６７）、マウスＨｔｒＡ３（ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ）（Ｐ１３３−Ｆ３５０）およびマウスＨｔｒＡ４（ＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤ）（Ｅ１５９−Ｙ３７１）のプロテアーゼドメインは、Ｐｆｕ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ポリメラーゼを使用して完全長クローンからクローニングした。プライマーは、得られたＰＣＲ産物に制限部位のＮｏｔ ＩとＳｔｕ Ｉを追加するために必要なヌクレオチドを含んでいた。ＰＣＲ断片は、ｐｈｏＡプロモーターを有する発現ベクターのｐＳＴ２３に連結した。この発現ベクターは、ＮｏｔＩ制限部位の上流にアミノ酸配列ＭＫ（ＨＱ）６ＭＨＱＳＴＡＡ（配列番号１１）を含有し、ロテアーゼドメインへのｕｎｉｚｙｍｅタグのＮ末端融合を生じる。
【０２３２】
本明細書に記載されるように、ｈｕＨｔｒＡ１、ｍｕＨｔｒＡ１、ｍｕＨｔｒＡ３、及びｍｕＨｔｒＡ４のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号１３−１６を参照して作成される。アミノ酸位置は、配列番号１３−１６の一つに含まれるその位置に従って一文字アミノ酸コードによって特定される。例えば、完全長ｈｕＨｔｒＡ１は、配列番号１３の２３位のグルタミンから始まり、配列番号１３の４８０位のプロリンで終わる配列、例えばＱ２３−Ｐ４８０を含む。同様に、ＨｔｒＡタンパク質内の特定の位置での変異は、開始アミノ酸によって指定され、配列番号１３−１６の一つに含まれる位置に従い、置換されたアミノ酸に従う。例えば、ＨｕＨｔｒＡ１（配列番号１３）の位置２４８のリジンのアラニンへの変異はＫ２４８Ａと呼ばれる。
【０２３３】
タンパク質発現及び精製ＨｕＨｔｒＡ１とＭｕＨｔｒＡ１はイラクサギンウワバ昆虫細胞で発現させた(Expression Systems LLC, Woodland, CA)。回収した昆虫細胞培地（ｐＨを６．８に調整した後）には、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌをそれぞれ１．０、２．５、及び１５０ｍＭの最終濃度へと添加された。
【０２３４】
ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ構築物（野生型及びＳ３２８Ａ変異体）を大腸菌ＢＬ２１(Stratagene)中で発現させた。大腸菌培養物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地中で３７℃でＡ６００が１．０に０．８に達するまで増殖させ、次いで０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２４時間１６℃で増殖させた。細菌細胞ペレットを、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌの１／１０の培養容積に再懸濁し、マイクロフルイダイザーを使って破壊した。溶解物を３０分間、３０，０００ｘｇで遠心分離した。
【０２３５】
ＨｕＨｔｒＡ１、ＭｕＨｔｒＡ１、ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ及びＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）は、ニッケル−ニトリロ三酢酸樹脂(Qiagen)を用いて精製した。昆虫細胞培地又は大腸菌溶解物をロードした後、カラムを、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌの１０カラム容量（ＣＶ）で、続いて５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールの１０ＣＶで洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．２５％ＣＨＡＰＳ、３００ｍＭイミダゾールで溶出した。プールした画分をＳ−２００カラム(GE Healthcare)上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製し、三量体タンパク質形態に対応するピーク画分を集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したタンパク質の純度は９０％を超え、タンパク質濃度はＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)を用いて決定した。
【０２３６】
ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤのＡｌａ変異体（Ｓ３２８Ａを除く１５の変異体のパネル）は、ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤの野生型形態（上記参照）について記載のように発現させた。溶解緩衝液(PopCulture, EMD Chemical, San Diego CA)は、細菌細胞ペレットに、５０ｍｌの溶解緩衝液／５００ｍｌペレットで添加した。ペレットを、ポリトロンを用いて溶解緩衝液中に完全に懸濁させ、３０分間室温で撹拌した。細胞溶解物を４℃で３０分間３３，７００×ｇで遠心分離し（ベックマン、ＬＡ−１６．２５０ローター）、得られた上清を０．２２μｍのフィルターユニット(Nalgene)を通して濾過した。濾過した上清を、５０ｍＭのトリス、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム（３ｍｌ、Qiagen）にロードした。ロードすると、カラムを緩衝液Ａの１２ＣＶで、続いて緩衝液Ａ＋０．１％トリトンＸ−１１４の２０ＣＶで洗浄した。カラムを緩衝液Ａの１５ＣＶで再び洗浄し、界面活性剤を除去した。タンパク質を、緩衝液Ａ＋２００ｍＭイミダゾール、０．２５％ＣＨＡＰＳで溶出した。プールした画分を、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．２５％ＣＨＡＰＳで平衡化したスーパーデックス２００(Hi load 16/60, 120 ml, GE Healthcare) で更に精製した。ＨｔｒＡ１＿ＰＤ三量体のピークに対応する画分をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したタンパク質の純度は９０％を超え、タンパク質濃度はＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)を用いて決定した。
【０２３７】
ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ、ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤは、大腸菌５８Ｆ３で発現させた(Szeto, W., et al., Cancer Res. 61:4197-205 (2001))。５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地中で３０℃で一晩増殖した大腸菌培養物は、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地(Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods. 263:133-47 (2002))を含有する大規模培養へ希釈された（１／１００ｖｏｌ）。播種後、大腸菌を３０℃で約２０時間増殖させた。ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤについて記載したように精製した（上記参照）。ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤとＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤを精製するため、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）を細菌細胞ペレットに添加した。ペレットを、ポリトロンを用いて溶解緩衝液中でホモジナイズし、細胞をマイクロフルイダイザーで破砕した。細胞溶解物を遠心分離し、得られた上清を０．２２μｍのフィルターユニット(Nalgene)を通して濾過した。濾過した上清を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール（緩衝液Ｂ）で予め平衡化した３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム(Qiagen)にロードした。ロード後、カラムを緩衝液Ｂの１２ＣＶで、続いて緩衝液Ｂ＋０．１％トリトンＸ−１１４の２０ＣＶで洗浄した。カラムを緩衝液Ｂの１５ＣＶで再び洗浄し、界面活性剤を除去した。タンパク質を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、０．２５％ＣＨＡＰＳで溶出した。プールした画分を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、０．２５％ＣＨＡＰＳで平衡化した、１２０ｍｌのスーパーデックス７５(GE Healthcare)上で更に精製した。プロテアーゼ三量体のピークに対応する画分をプールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したタンパク質の純度は９０％を超えていた。
【０２３８】
実施例３：ＦＲＥＴアッセイを用いた抗ＨｔｒＡ１抗体の阻害活性の測定
ペプチド基質の合成。もともとＨｔｒＡ２の基質として記載された(Martins, L.M., et al., J Biol Chem. 278:49417-27 (2003))ペプチドＨ２−Ｏｐｔ（Ｍｃａ−ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ）（配列番号１２）は、ＨＢＴＵによる標準的なカップリング手順を用いてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ｗａｎｇ樹脂上で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＤＮＰ）−ＯＨ（Ａｎａｓｐｅｃ）はＰ５’の位置に組み込まれた。ペプチドはＰ５まで合成され（Ｍｃａ、７−メトキシクマリン、Aldrich）、次いで、トリフルオロ酢酸、イソプロピルシラン(triisoproplysilane)及び水を用いて室温で２時間で固体支持体から切断した。ペプチドは、エチルエーテルから沈殿させ、酢酸、アセトニトリル、水で抽出し、そして凍結乾燥した。粗製の標識ペプチドを溶解し、アセトニトリル／水を使用して分取逆相Ｃ１８カラムで精製した。精製した画分を、プールし、凍結乾燥し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ社によって分析し、それらの計算された質量と一致することがわかった。
【０２３９】
ペプチド基質を用いた酵素アッセイ．ＨＴＲＡ１は、９６ウェル黒色光学底プレート(Nalge Nunc Int., Rochester, NY)中で、３７℃で２０分間、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ（アッセイ緩衝液）で連続希釈したＩｇＧ９４またはＦａｂ９４とともにインキュベートした。１３ファージ由来の抗ＨｔｒＡ１抗体のパネルの最初の試験では、単一濃度のＩｇＧ（最終濃度０．１６ｍｇ／ｍｌ−０．２８ｍｇ／ｍｌ）をＨｕＨｔｒＡ１又はＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤとインキュベートした。ＤＭＳＯ中のペプチド基質Ｍｃａ−ＩＲＲＶＳＹＳＦ（Ｄｎｐ）ＫＫ（配列番号１２）（Ｈ２−Ｏｐｔ）の１０ｍＭのストック溶液は予め３７℃に温めた水で１２．５μＭまで希釈し、次いで、反応混合物に添加した。反応物の最終濃度は、５ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１又はＭｕＨｔｒＡ１、０．００５−３００ｎＭのＩｇＧ９４、０．０２−９００ｎＭのＦａｂ９４、２．５μＭのＨ２−Ｏｐｔであった。蛍光シグナル（励起３２８ｎｍ、発光３９３ｎｍ）の増加は、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で測定し、そしてＨ２−Ｏｐｔ切断の線形速度（ｍＲＦＵ／分）を測定した。トリプシ(Roche)及びエラスターゼ(MP Biomedicals) のＩｇＧ９４阻害による実験は、最終酵素濃度が１ｎＭ、ＩｇＧ９４濃度が３００ｎＭ、そしてインキュベーション時間が１５分であったことを除き、同じように実施された。
【０２４０】
図２に示すように、１３のファージ由来抗体（ＩｇＧ）のパネルは、ＨｕＨｔｒＡ１又はＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤと共にインキュベートされ、酵素活性を測定した。試験された１３抗体のうち、抗体ＹＷ５０３．５７、ＹＷ５０４．５７、ＹＷ５０４．６１及びＹＷ５０５．９４（Ｆａｂ９４、抗体９４、Ａｂ９４又はＩｇＧ９４とも呼ばれる）がＨｕＨｔｒＡ１とＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ活性の両方を強く阻害した。
【０２４１】
図３に示すように、ＩｇＧ９４はＨ２Ｏｐｔ基質に対するＨｕＨｔｒＡ１の酵素活性を、ＩＣ５０値が１．８ｎＭで濃度依存的に阻害した。完全な阻害は３０ｎＭ超のＩｇＧ９４で達成された。対照的に、トリプシン様セリンプロテアーゼファミリーの他の二つのメンバーである、トリプシンおよびエラスターゼは、３００ｎＭでＩｇＧ９４によって阻害されず、ＩｇＧ９４がＨｕＨｔｒＡ１に対する特異性を有することを示している。Ｆａｂ９４はまた、ＨｕＨｔｒＡ１を濃度依存的に阻害したが、ＩＣ５０値が２９．１ｎＭによって示されるように、ＩｇＧ９４よりも作用は弱かった。これらの結果は、表面プラズモン共鳴実験によって決定された３１．１ｎＭのＫＤの値と良く一致している（下記表１参照）。結果は、ＩｇＧ９４及びＦａｂ９４は小さな合成ペプチド基質に対するＨｕＨｔｒＡ１の酵素活性を完全に中和することができる及びこの活性が特異的であることことを示しいる。更に、Ｆａｂ９４に対するＩｇＧ９４の効力の約１６倍の増加は、質量分析に基づいて「かご状」ＩｇＧ９４：ＨｔｒＡ１複合体から予測された結合活性作用と一致している（例えば表２及び図９を参照）。
【０２４２】
親和性が改善された変異体抗体ＹＷ５０５．９４ａ．２８の阻害効力もまた、蛍光消光ペプチド基質Ｈ２−Ｏｐｔ、及び１．０ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１又は１．５ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤを用いた上記のアッセイを用いて測定された。結果は以下に示される。
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【０２４３】
実施例４：高分子基質を用いた抗ＨｔｒＡ１抗体の阻害活性の測定
ウシβカゼイン(Sigma-Aldrich)を、ＭｏｎｏＱイオン交換カラム上で再精製し、高度に精製された物質を得た。ＨｕＨｔｒＡ１を、エッペンドルフチューブ中で、３７℃で１５分間、アッセイ緩衝液中のＩｇＧ９４の濃度を増加させてインキュベートし、その後高分子基質を添加した。βカゼイン消化については、反応物の最終濃度は、１０ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１、５０μｇ／ｍｌのβカゼイン、２．３−１５０ｎＭのＩｇＧ９４であった。デコリンについては、最終濃度は、１２５ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１、５０μｇ／ｍｌのデコリン(R & D Systems)、２−１２５ｎＭのＩｇＧ９４であった。バイグリカンについては、最終濃度は、７５ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１、５０μｇ／ｍｌのデコリン(R & D Systems)、２．３−１２５ｎＭのＩｇＧ９４であった。３７℃でのインキュベーション（βカゼインでは２時間、デコリンでは１４時間、バイグリカンでは６時間）の後、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加、サンプルは煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）で分析した。
【０２４４】
蛍光色素標識カゼイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬカゼイン(Invitrogen)の加水分解は、９６ウェル黒色光学底プレート(Nalge Nunc Int., Rochester, NY)中で行った。ＨｕＨｔｒＡ１とＭｕＨｔｒＡ１は、３７℃で１５分間アッセイ緩衝液中で連続希釈されたＩｇＧ９４と共にインキュベートした。アッセイ緩衝液中にＢＯＤＩＰＹ ＦＬの添加後、反応物濃度は次の通りである：３０ｎＭ ＨｕＨｔｒＡ１、３０ｎＭ ＭｕＨｔｒＡ１、５μｇ／ｍｌ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、０．２４−２５０ｎＭ ＩｇＧ９４。蛍光シグナル（励起４８４ｎｍ、発光５３５ｎｍ）の増加は、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で測定し、そしてＢＯＤＩＰＹ ＦＬ切断の線形速度（ｍＲＦＵ／分）を測定し、阻害されない速度（対照）のパーセントとして表した。
【０２４５】
図６に示すように、ＨｕＨｔｒＡ１は、高分子基質、βカゼイン、デコリン及びバイグリカンを分解した（レーン２）。ＨｕＨｔｒＡ１の非存在下で、基質は、実験期間中に無傷のままであった（図６、レーン１）。ＩｇＧ９４の濃度の増加を伴うＨｕＨｔｒＡ１のプレインキュベーション（図６、レーン９−レーン３）では、基質分解の濃度依存性阻害をもたらした。試験したＩｇＧ９４の最高濃度で、βカゼイン、デコリン及びバイグリカンの分解を完全に防止された（図６、レーン３）。結果は、ＩｇＧ９４は、３つの高分子基質に対するＨｕＨｔｒＡ１活性を強力かつ効果的に阻害することを示している。
【０２４６】
図４に示すように、ＩｇＧ９４は、ＨｕＨｔｒＡ１とＭｕＨｔｒＡ１両方によるＢＯＤＩＰＹ ＦＬ加水分解をそれぞれ８．３ｎＭ及び５．４ｎＭでのＩＣ５０値で濃度依存的に阻害した。結果は、ＩｇＧ９４は高分子基質ＢＯＤＩＰＹ ＦＬに対するＨｕＨｔｒＡ１とＭｕＨｔｒＡ１両方の酵素活性を認識し、完全に中和することを示している。
【０２４７】
実施例５：ＨｔｒＡ１に対する抗ＨｔｒＡ１抗体の特異性の決定
ＩｇＧ９４の特異性は、構造的に関連するプロテアーゼＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤを阻害するその能力と比較して、ｍｕＨｔｒＡ１＿ＰＤを阻害するその活性を測定することによって評価した（図５参照）。特異性は、ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ、ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤの濃度がそれぞれ６ｎＭ、２０ｎＭ、及び２０ｎＭであり、そしてＩｇＧ９４の濃度範囲が０．２−４００ｎＭであったことを除いて、実施例３で上述したようにＦＲＥＴアッセイを用いて決定した。特異性はまた、ＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ、ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤの濃度が５０ｎＭであり、そしてＩｇＧ９４の濃度範囲が１．４−１０００ｎＭであったことを除いて、実施例４で上述したようにＢＯＤＩＰＹ ＦＬカゼイン基質を用いて分析した。ＩｇＧ９４は、Ｈ２−Ｏｐｔ（図５、上部パネル）及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（図５、下パネル）のＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ切断を阻害したが、ＭｕＨｔｒＡ３＿ＰＤ及びＭｕＨｔｒＡ４＿ＰＤによる同じ基質の切断を、Ｈ２−ＯｐｔとＢＯＤＩＰＹ ＦＬ基質のそれぞれにおいて４００ｎＭ及び１０００ｎＭの濃度まで阻害しなかった。結果は、ＩｇＧ９４は優れた特異性を有し、関連するプロテアーゼの活性を弱めないことを示唆している。
【０２４８】
実施例６：ＢＩＡｃｏｒｅ（ビアコア）による抗体親和性の決定
単一サイクル反応速度論によるＦａｂ９４の結合親和性を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ Ｔ１００機器による表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）測定を使用した。簡潔には、シリーズＳセンサーチップＣＭ５は、供給業者の説明書に従ってＥＤＣ及びＮＨＳ試薬で活性化し、ストレプトアビジン(Pierce)を約２０００応答単位（ＲＵ）を達成するためにカップリングさせ、続いて１Ｍのエタノールで未反応の基をブロッキングした。
【０２４９】
反応速度測定のために、ビオチン化ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ又はＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤをまず、ＦＣ１（参照セル）を除いた３つの異なるフローセル（ＦＣ）で約１００ＲＵを捕捉するために１０μｌ／分の流量で注入し、次いで０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０によるＦａｂ９４の５倍連続希釈液（０．４８ｎＭ−３００ｎＭ）を注入され（流量：３０μｌ／分）、注入の間には再生を伴わなかった。センサーグラムは記録され、基準細胞シグナルを差し引いた後、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ Ｔ１００評価ソフトウェア（バージョン２．０）によって評価された。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤへ及びＭｕＨｔｒＡ１＿ＰＤへのＦａｂ９４の結合反応速度は非常に類似していた。ＫＤ値は、それぞれ３１．１ｎＭ及び２８．９ｎＭであった。
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【０２５０】
実施例７：ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ上のＩｇＧ９４のエピトープマッピング
ＩｇＧ９４の機能的結合エピトープを同定するために、独自のアラニン変異を有するＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ変異体のパネルが結合実験のために生成された。変異した残基の大半は、活性部位の周囲の表面ループに位置しており、また、触媒セリン（Ｓ３２８）及びアスパラギン酸（Ｄ２５０）を含んでいた。変異体は、大腸菌で発現させ、三量体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施例２に記載したように精製した。結合は、１時間、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ変異体でコーティングされ、続いて室温で１時間、ＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）でブロッキングしたＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭマイクロタイタープレートを用いて行われるＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定された。ＰＢＳＴ緩衝液中の５倍連続希釈Ｉｇ９４（５０ｎＭから０．０００６ｎＭ）を添加し、３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＴ緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Invitrogen)を添加し（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００）、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴ緩衝液で洗浄し、テトラメチルベンジジン基質を添加することによって展開した(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)。４５０ｎｍの吸光度を溶液中の抗体濃度の関数としてプロットし、ＥＣ５０値を決定した。次いで結合を生じさせる変異体の位置をＨｔｒＡ１の構造上にマッピングした。
【０２５１】
結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧ９４は変異体ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｎ２２４Ａ）及びＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｋ２４８Ａ）への結合の最大の減少を示した（図７Ａを参照）。プレートをコーティングするために低濃度のＨｔｒＡ１（１μｇ／ｍｌ）及び短縮したインキュベーションの時間（１時間から２０分のインキュベーションに短縮）を用いた実験を繰り返す際、ＩｇＧ９４はまたＨｕＨｔｒＡ１変異Ｖ２０１Ａ、Ｈ２２０Ａ、Ｔ２２３Ａ、Ｋ２２５Ａ、Ｋ２４３ＡおよびＥ２４７Ａへの結合において、少なくとも５倍の減少を示した（図７Ａ参照）。結果は、ＩｇＧ９４はループＢ及びループＣに位置する残基Ｎ２２４及びＫ２４８を含むエピトープに結合することを示している（図７Ｂ及び７Ｃを参照）。トリプシン様セリンプロテアーゼにおいて、これらのループは基質と相互作用する特異性決定領域の一部であることが知られている。Ｋ２４８（ループＣ）は、触媒Ｈ２２０に対して触媒Ｄ２５０及びＮ２２４に非常に近い。従って、これらの残基へのＩｇＧ９４の結合は、ループのＣ残基を認識する抗ＨＧＦＡ中和抗体について見出されるように、直接的な立体障害、又は間接的なアロステリック機構のどちらかにより触媒クレフトに対する基質の接近を損なう可能性がある(Ganesan, R., et al., Structure 17:1614-1624 (2009); Wu, Y., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:19784-9 (2007))。あるいは、結合抗体は、直接触媒三残基Ｄ２５０及び／又はＨ２２０に影響を与えることによって、触媒作用を阻害することができる。
【０２５２】
実施例８：サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）によるＦａｂ９４及びＩｇＧ９４とのＨｔｒＡ１＿ＰＤの複合体の化学量論
触媒的に不活性型のＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）を、複合体形成のために使用した。Ｆａｂ９４：ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）及びＩｇＧ９４：ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体がトリス緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．２５％ＣＨＡＰＳ）中で形成された。複合体及び個々の成分のみを、一晩４℃でインキュベートし、次いでＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００１０／３００ ＧＬカラム(GE Healthcare)にトリス緩衝液中で０．５ｍＬ／分の流量で注入され分離された。データは１８角度の光散乱検出器（ＱＥＬＳを装備したＤａｗｎ Ｈｅｌｉｏｓ ＩＩ）及びWyatt Technologiesの屈折率検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ ｒｅＸ）を用いて収集した。分析は、Ａｓｔｒａ５ソフトウェアにより行われ、溶出時間とは独立にモル質量を得た。正規化は、対照ＩｇＧを用いて行った。
【０２５３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ実験は、ＩｇＧ９４は異なる質量を有するＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）とＦａｂ９４と複合体を形成することを示している。決定された複合体の質量及び推定される化学量論を表２に示す。
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【０２５４】
Ｆａｂ９４：ＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体の決定された質量２１０１００Ｄａは、一つのＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）三量体に結合する３つのＦａｂの複合体（３：１複合体）と一致している。このような３：１複合体の実験質量と理論質量の相違はわずか４．２％である。従って、一のＦａｂは一のＨｔｒＡホモ三量体内で各ＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）単量体に結合することができる。
【０２５５】
ＩｇＧ９４：ＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体の決定された質量６１８，６００Ｄａは、３つのＩｇＧ分子が２つのＨｕＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）三量体に結合するという点において、３：２化学量論に良く適合する。このような３：２複合体の実験質量と理論質量の相違はわずか１．９％である。
【０２５６】
解明された化学量論は、ＨｔｒＡ１三量体内の各単量体はＩｇＧの一のＦａｂ又は一のＦａｂアームに結合しているという点で、Ｆａｂ９４とＩｇＧ９４は、完全にＨｔｒＡ１活性を阻害することができるという知見と一致している。従って、これらの複合体において、利用可能な「遊離の」ＨｔｒＡ１単量体は存在せず、Ｆａｂ９４とＩｇＧ９４によるＨｔｒＡ１酵素活性の完全な阻害と一致する。我々は、３つのＩｇＧのＦａｂアームは、各Ｆａｂアームが一の単量体に結合し、２つの三量体を架橋しているＩｇＧ９４：ＨｔｒＡ１＿ＰＤ（Ｓ３２８Ａ）複合体の「かご」モデルを提案する（図９参照）。本モデルはまた、ＩｇＧ９４はＨｔｒＡ１＿ＰＤ三量体へのその結合における結合活性効果から強く利益を得ているという点において、酵素アッセイにおけるＦａｂ９４に対するＩｇＧ９４の約１６倍増加した効力を説明する（例えば、図３を参照）。
【０２５７】
実施例９：ＹＷ５０５．９４の親和性成熟
抗ＨｔｒＡ１親和性成熟のためのライブラリーを構築する。クローンＹＷ５０５．９４ａは、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するためＣＤＲ Ｈ１内でカバット残基Ｎ２８をセリンに改変することによりＹＷ５０５．９４［Ａｂ９４］から生じた。ファージミドｐＷ０７０３は、全てのＣＤＲ−Ｌ３の位置に終止コドン（ＴＡＡ）を含み、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価のＦａｂを示す、ファージミドｐＶ０３５０−２ｂから生じ(Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))、親和性成熟のためのクローンＹＷ５０５．９４ａの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を移植するためのライブラリテンプレートとしての役割を果たした。ハード及びソフトランダム化の両方の戦略を、親和性成熟のために使用した。ハードランダム化のため、３つの軽鎖ＣＤＲに選択した位置を持つ一の軽鎖ライブラリー（Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ハード）を天然のヒト抗体を模倣するように設計されたアミノ酸を用いてランダム化し、設計されたＤＮＡの縮重は記載された通りであった（Ｌｅｅら、２００４）。ソフトランダム化のため、カバットによる位置、ＣＤＲ−Ｌ３の９１、９２、９３、９４、及び９６、ＣＤＲ−Ｈ１の２８−３５、ＣＤＲ−Ｈ２の５０−５８、及びＣＤＲ−Ｈ３の９５−１００で選択された残基は、ＣＤＲループの二つの異なる組み合わせ、Ｌ３／Ｈ１ソフト、Ｌ３／Ｈ２ソフト及びＬ３／Ｈ３ソフトを含み、ランダム化の標的とされた。選択された位置に約５０％の突然変異率を導入する、ソフトランダム化条件を達成するために、変異原性ＤＮＡを、野生型ヌクレオチドを好む塩基の７０−１０−１０−１０混合物を用いて合成した(Gallop et al., J. of Med. Chem. 37, 1233-1251 (1994))。
【０２５８】
親和性が改善された変異体を単離するファージ選別戦略。親和性改善選択のため、ファージライブラリーは、最初のラウンドでプレート選別に供され、続いて４ラウンドの溶液選別を行った。プレート選別の最初のラウンドにおいて、４つのライブラリ（Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３ハード、Ｌ３／Ｈ１ソフト、Ｌ３／Ｈ２ソフト及びＬ３／Ｈ３ソフト）は、ヒトＨｔｒＡ１（ＨｕＨｔｒＡ１）をコーティングされたプレート（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート）に対して、室温で１時間、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、約３Ｏ．Ｄ．／ｍｌで、ファージインプットにより別々に選別された。プレート選別の第一ラウンドの後、ストリンジェンシーを増加させるために４ラウンドの溶液選別を行った。溶液選別のため、プレート選別の最初のラウンドから増殖したファージの１ＯＤ／ｍｌを、室温（ＲＴ）で少なくとも１時間、１％のスーパーブロック(Pierce biotechnology)及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１００μｌの緩衝液中の５００ｎＭのビオチン化ＨｕＨｔｒＡ１とともに培養した。混合物を１％のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで１０倍に更に希釈し、室温で１５分間、ニュートラビジンコーティングウェルに１００ｕｌ／ウェル（１０ｕｇ／ｍｌ）を、ビオチン化ＨｕＨｔｒＡ１がファージに結合することができるように穏やかに振とうしながら、適用した。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により１０回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化ＨｕＨｔｒＡ１選択を伴わないファージを含む対照ウェルは、ニュートラアビジンコーティングプレート上で捕捉した。結合したファージを、２０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出し、１ＭトリスＰＨ１１の１／１０容量で中和し、力価を測定し、次のラウンドのために増殖させた。次に、溶液選別を、同時に選択ストリンジェンシーを増加させる２つの方法を使用して更に３ラウンド実施した。第一の方法は、オンレート選択(on-rate selection)のためであり、ビオチン化標的タンパク質濃度を１０ｎＭから０．１ｎＭへ低下させる。第二の方法は、オフレート選択(off-rate selection)のためであり、より弱い結合剤を争うため非ビオチン化ＨｕＨｔｒＡ１タンパク質の過剰量（１００〜１０００倍以上）を追加する。また、ファージインプットは、バックグラウンドファージ結合を低下させるために減少させた（０．１−０．５ＯＤ／ｍｌ）。
【０２５９】
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ（単一スポットの競合）。コロニーを第５ラウンドのスクリーニングから選択し、９６ウェルブロック中で５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１ｅ １０／ｍｌのＫＯ７を含む２ＹＴ培地の３５０ｕｌ／ウェル中で３７℃で一晩増殖させた。同じプレートから、ＸＬ−１感染親ファージのコロニーを対照として選択した。９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートは、室温で２時間ＰＢＳ中１００ｕｌ／ウェルのＨｔｒＡ１タンパク質（２μｇ／ｍｌ）を用いてコーティングした。プレートを１時間、０．５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰｂｅｎｅｆｉｔＳ（ＰＢＳＴ緩衝液）の１００ｕｌでブロッキングした。
【０２６０】
ファージ上清は、１００ｕｌの総容量中に５ｎＭのＨｕＨｔｒＡ１を含み又は含まないＰＢＳＴ緩衝液で１：５に希釈し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。その後、混合物の７５ｕｌをＨｕＨｔｒＡ１コーティングしたプレートに移した。ＨｔｒＡ１をコーティングされたプレートに結合していないファージの捕獲を可能にするために、プレートを１５分間穏やかに振とうした。プレートをＰＢＳ（ＰＢＴ緩衝液）中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０により５回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を添加することによって（１：５０００）定量し、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＴ緩衝液で５回洗浄した。次に、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質及びペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）の１：１比率の１００ｕｌ／ウェル(Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))をウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。反応は、各ウェルに１００ｕｌの１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することにより停止させ、室温で５分間インキュベートさせた。各ウェルのＯＤを４５０ｎｍで標準的ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定した。ＯＤの減少（％）を次式により算出した。
ＯＤ４５０ｎｍの減少（％）＝［（競合者のウエルのＯＤ４５０ｎｍ）／（競合者の無いウェルのＯＤ４５０ｎｍ）］＊１００
【０２６１】
親ファージのウェル（１００％）のＯＤ４５０ｎｍの減少（％）と比較して、５０％未満のＯＤ４５０ｎｍの減少（％）であったクローンを配列分析のために選んだ（図１５、図１６参照）。ファージ競合ＥＬＩＳＡによって、結合親和性を決定するために（ファージＩＣ５０）、ユニークなクローンがファージ調製のために選択された（図１７、図１８参照）。その後、親和性が改善されたほとんどのクローン（ＹＷ５０５．９４ａ．２８＆ＹＷ５０５．９４ａ．５４）は、抗体産生、さらにＢＩＡｃｏｒｅ結合速度論的解析のためのヒトＩｇＧ１に再フォーマットされた。
【０２６２】
ＩＣ５０を決定するファージ競合ＥＬＩＳＡ．ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭマイクロタイタープレートを室温で２時間、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌでのＨｕＨｔｒＡ１でコーティングし、次いで室温で更に１時間ＰＢＳＴ緩衝液でブロックした。培養上清から精製されたファージを、１時間、組織培養マイクロタイタープレート中でＰＢＳＴ緩衝液中で連続希釈ＨｕＨｔｒＡ１又はＭｕＨｔｒＡ１と共にインキュベートし、その後、混合物の８０μｌを、未結合ファージを捕捉するために１５分間でＨｕＨｔｒＡ１コーティングされたウェルに移した。プレートをＰＢＴ緩衝液で洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｍ１(Amersham Pharmacia Biotech)を１時間添加した（ＰＢＳＴ緩衝液中で１：５０００）。プレートをＰＢＴ緩衝液で洗浄し、テトラメチルベンジジン基質を添加することによって展開した(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)。４５０ｎｍの吸光度を溶液中のＨｕＨｔｒＡ１又はＭｕＨｔｒＡ１濃度の関数としてプロットし、ファージのＩＣ５０を決定した。これは、ファージの表面に示されたＦａｂクローンの親和性の推定として使用した。図１７は、ＨｕＨｔｒＡ１に対する親和性が改善されたＹＷ５０５．９４ａ変異体の結合を示すファージ競合アッセイからの結果を示す。図１８は、ＭｕＨｔｒＡ１に対する親和性が改善されたＹＷ５０５．９４ａ変異体の結合を示すファージ競合アッセイからの結果を示す。
【０２６３】
ＢＩＡｃｏｒｅによる抗体親和性の決定。単一サイクル反応速度論によるＨｔｒＡ１抗体の結合親和性を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭＴ１００機器による表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）測定を使用した。簡潔には、シリーズＳセンサーチップＣＭ５は、供給業者の説明書に従ってＥＤＣ及びＮＨＳ試薬で活性化し、ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を約２０００応答単位（ＲＵ）を達成するためにカップリングさせ、続いて１Ｍのエタノールで未反応の基をブロッキングした。
【０２６４】
反応速度測定のために、ビオチン化ヒト又はマウスＨｔｒＡ１を最初に、ＦＣ１（参照セル）を除いた３つの異なるフローセル（ＦＣ）で約１００ＲＵを捕捉するために１０μｌ／分の流量で注入し、次いでＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）による抗ＨｔｒＡ１のＦａｂの５倍連続希釈液が低（０．４８ｎＭ）から高（３００ｎＭ）へ［５点］注入され（流量：３０μｌ／分）、注入の間には再生を伴わなかった。センサーグラムは、記録され、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭＴ１００評価ソフトウェア（バージョン２．０）による評価の前に、参照及び緩衝液の差し引きに供された。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。結果を下の図３に示す。
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【０２６５】
実施例１０：一定光曝露後ＨｔｒＡ１の欠損下での、光受容体、外顆粒層（ＯＮＬ）及び機能性応答の温存。
ＨｔｒＡ１ノックアウトマウスの構築。ＨｔｒＡ１（＋／−）胚性幹細胞を生成するため、直線化された標的化ベクターＤＮＡを、エクソン１の領域５’及びエクソン１の領域３’にＦｌｏｘ部位を導入するためにＢａｌｂ／ｃバックグラウンドのＥＳ細胞に電気穿孔し、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）を導入した。ネオマイシン耐性ＥＳクローンを選択し、エキソン１とネオマイシンカセットは、ｃｒｅリコンビナーゼを発現する発現プラスミドを用いてＥＳ細胞を電気穿孔ことによって切除した。相同組換えは、標的ＥＳ細胞における全ＨｔｒＡ１遺伝子座と上流プロモーター領域の配列決定によって確認した。標的化クローンは、生殖細胞系伝達の雄キメラマウスを生成するためにＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入した。＋／−雌マウス及び＋／−雄マウスの異種交配が行われ、Ｂａｌｂ／ｃバックグランド上で−／−雌ＨｔｒＡ１マウス又は−／−雄ＨｔｒＡ１マウスを生成した。ＨｔｒＡ１の欠失の成功は、ＨｔｒＡ１のｗｔマウスおよびｋｏマウスからの卵巣のＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
【０２６６】
一定光曝露モデル。雄のＢａｌｂ／ｃ Ｈｔｒａ１ｗｔ／ｗｔ又はｋｏ／ｋｏマウスは８〜１３週齢で、一定光曝露（ＣＬＥ）の開始まで通常に収容されている（ケージ内で＜１００ルクス）。ＣＬＥを開始するため、マウスは、フィルタートップなしで、ワイヤーラックだけで覆われた通常のケージ内に単独で収容される。栄養のための食物ペレットとヒドロゲルは、ケージに入る光を妨げないように、ワイヤー上でなくケージの底部に配置される。１０のケージは。蛍光灯を装備して、最大１４日間、マウスに〜１２００ルクスを送達するするために、白のパネルで囲まれてメトロラックに配置されている。ケージは等しい露光量を確実にするために、ＣＬＥの間、毎日、ラックの周囲に反時計回りに回転している。複数の棚が使用される場合、ケージはまた等しい露光量を確実にするために棚の間で回転している。
【０２６７】
光コヒーレンス・トモグラフィー光コヒーレンス・トモグラフィー（ＯＣＴ）は、網膜の厚さのベースライン測定値を提供するために、光露光の前に４〜７日間行われる。ＯＣＴは、ハイデルベルグＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ＋ＯＣＴカメラを使用して実行される。動物は、１５０−３００ｕｌの滅菌生理食塩水中、７０−８０ｍｇ／ｋｇのケタミン／１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔し、眼を１％のトロピカミド滴で拡張させ、網膜の厚さをＯＣＴによって測定する。人工涙液が、白内障を防止するために眼を湿性に保つために使用される。ＯＣＴの後で、動物を麻酔から回復させ、それらのケージと光のラックに戻される。
【０２６８】
網膜電図網膜電図（ＥＲＧ）ＥＲＧが、光曝露の前７日間とＣＬＥ後１５日間実施される。ＥＲＧは、Diagnosys LLC Espion 2視覚的電気生理学的システム及び光源としてColordomeデスクトップ全体野を使用して実行され、記録される。マウスは、光受容体を平衡化するために暗部屋で一晩暗順応される。一度暗順応されると、その後の全ての手順は、照明用の赤色光のみで暗闇の中で実行される。動物は、２００ｕｌのＰＢＳ中で７５−８０ｍｇ／ｋｇのケタミン＆７．５−１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを腹腔内投与で麻酔される。マウスの体温は、制御部に接続された恒温性プレートを用いて３７℃に維持される。瞳孔は１％トロピカミドで拡張される。両眼からのＥＲＧは、ブリアン・アレン銀及び白金線ループ電極により同時に記録される。マウスをプラットフォーム上に配し、参照電極が前額部を介して皮下に挿入され、接地電極は尾の基部で皮下に挿入される。角膜と電極との間の電気的接触を確立し、そして実験中の乾燥から眼を保護するために、Ｇｏｎａｋのヒプロメロース溶液が角膜上に配される。電極が左右の眼に配置され、マウスはＣｏｌｏｒＤｏｍｅ光刺激装置に挿入される。眼は白光により刺激され（７回のフラッシュ強度は４ｅ−５、２ｅ−５、０．５、２、５、１０、２０ｃｄ．ｓ／ｍ２）、信号は０．１５〜１０００Ｈｚでバンドパスフィルターされ、２ｋＨｚでサンプリングされる。
【０２６９】
マウス網膜及び卵巣におけるＨｔｒＡ ｍＲＮＡレベルの決定。眼の全体を摘出し、網膜を除去し、ＲＬＴ緩衝液(Qiagen)に入れ、均質化するまで−８０℃で凍結した。網膜は均質化され、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｍチューブ（Miltinyi Biotec)により寸断された。網膜と同様に、卵巣は、雌のＨｔｒＡ１ｗｔ、ｈｅｔ、ｋｏマウスから単離し、網膜について記載したようにホモジナイズした。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌｕｓ ＲＮｅａｓｙキットを用いて単離し；ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット(Applied Biosystem)を用いて生成し；Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲは、２０ｕｇのｃＤＮＡ、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(Applied Biosystem)及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙプライマー(Applied Biosystem)を用いてエクソン１−２（網膜及び卵巣）、エクソン３−４（卵巣）とエクソン５−６（卵巣）まで行い、そしてＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム(Applied Biosystem)上で実行された。ＨｔｒＡの発現は１８ｓ発現に正規化した（Applied Biosystemからのプライマー）。
【０２７０】
図１１に示すように、一定光曝露のマウスモデルにおいてＨｔｒＡ１ ｍＲＮＡ発現が増加する。しかし、同じモデルで、ＨｔｒＡ２レベルは網膜において増加しない。加えて、非曝露マウスの網膜において、ＨｔｒＡ１のレベルは、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ３及びＨｔｒＡ４レベルよりも有意に高い。
【０２７１】
更に、我々は、光誘起変性症のマウスモデルにおいて、ＨｔｒＡ１発現を欠くマウスは、光受容体（図１３）、外顆粒層（ＯＮＬ）（図１４）、及び機能的応答（ＥＲＧ）（図１２）の温存を示すことを見いだした。
【０２７２】
実施例１１：一定光曝露のラットモデルにおける抗ＨｔｒＡ１抗体の作用
ラットはマウスについて上記載のように一定光曝露に供される。光照射による変性からラットの目を保護するための抗ＨｔｒＡ１抗体の有効性が評価される。ラットの眼は、実験期間中の眼における抗ＨｔｒＡ１抗体の有効濃度を維持するのに適した投与量と頻度で抗ＨｔｒＡ１抗体の硝子体内注射を受けることになる。ラットの眼は、マウスモデルについて上述したようにＯＣＴにより網膜の厚さを、ＥＲＧにより機能性を決定するために、光曝露の後に監視されることになる。
【０２７３】
実施例１２：ＨｔｒＡ１の発現はラット硝子体で豊富であり光ストレス時にマウスの眼流体及び眼組織内に蓄積する
ＥＬＩＳＡアッセイ。ラット組織の分析のために、抗ｍｕＨｔｒＡ１ウサギポリクローナル抗体(Genentech)は１２５ｎｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈され、一方マウスの眼の液体と網膜組織の分析用に、抗ｈｕＨｔｒＡ１マウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、２５０ｎｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈され、４℃で一晩インキュベーション中に３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート(Nunc; Neptune, NJ)上にコーティングされた。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による２時間のインキュベーションの間にブロックした。これと続く全てのインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。組換えマウスＨｔｒＡ１標準物質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びラット又はマウス組織のサンプルは、サンプル／標準希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍのプロクリン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、０．２％のＢｇＧ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中）で希釈し、洗浄したプレートに加えて、１．５−２時間インキュベートした。プレートに結合したＨｔｒＡ１は、ラット組織については１００ｎｇ／ｍＬに希釈したビオチン化抗ｍｕＨｔｒＡ１ウサギポリクローナル抗体(Genentech)との１時間のインキュベーション中に検出され、マウスの眼液と網膜組織については、ビオチン化ａｎｔｉｈｕＨｔｒＡ１マウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は２００ｎｇ／ｍＬに希釈され（両方ともアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍのプロクリン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０による）、その後洗浄工程、そしてやはりアッセイ緩衝液で希釈した（１：２００００）ストレプトアビジン−ＨＲＰ(GE Healthcare; Piscataway, NJ)との３０分間のインキュベーションが続いた。最終洗浄後、テトラメチルベンジジン(KPL, Gaithersburg, MD)を添加し、色は１０−１５分間現像し、反応は１Ｍのリン酸で停止させた。プレートをマイクロプレートリーダーを用いて６２０ｎｍのリファレンスにより４５０ｎｍで読み取った。ラット又はマウスＨｔｒＡ１の濃度はｍｕＨｔｒＡ１標準曲線の４パラメーターの適合から算出した。
【０２７４】
図１９Ａに示すように、ＨｔｒＡ１の発現は、ラット硝子体中のＨｔｒＡ１の発現レベルと比較して、ラット卵巣、脳、脾臓、および全眼組織において低かった。図１９Ｂに示すように、マウスの眼液中のＨｔｒＡ１のレベルは、対照と比較して一定光曝露のモデルにおいて増加した。図１９Ｃに示すように、マウスの網膜組織のＨｔｒＡ１のレベルは、対照と比較して一定光曝露のモデルにおいて増加した。
【０２７５】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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