(57)【要約】      （修正有）【課題】多くの生物学的、生化学的、診断または療法目的のため、外部および／または内部標準を用いる必要がなく、調製プロセスにおける全てのロスの追跡も必要としない、試料中の核酸の量または濃度を正確に決定する方法の提供。【解決手段】プロセシングしていない試料と、定義した量の参照試料を合わせ、それによって合わせた試料を得て、そのプロセシングした試料を得て、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）を実行し、プロセシングした試料および参照試料とを分析することによって、プロセシングしていない試料における関心対象の核酸の量または濃度を決定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
ａ）−関心対象の核酸を含有すると推測される、プロセシングしていない試料、および
−関心対象の核酸とは異なる参照核酸を含有することが知られる参照試料
を提供し；
ｂ）プロセシングしていない試料と、定義した量の参照試料を合わせ、それによって合わせた試料を得て；
ｃ）合わせた試料をプロセシングし、それによって、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に適した、プロセシングした試料を得て；
ｄ）プロセシングした試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および参照核酸の量または濃度を決定し；
ｅ）定義した量の参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって参照試料の定義した量における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｆ）工程ｄ）において決定した参照核酸の量または濃度を、工程ｅ）において決定したものに比較し、それによって、工程ｃ）における核酸の収率を決定し；そして
ｇ）工程ｄ）において決定した、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および工程ｆ）において決定した収率に基づいて、プロセシングしていない試料における、関心対象の核酸の量または濃度を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
ａ）関心対象の核酸を含有すると推測される、プロセシングしていない試料を提供し；
ｂ）関心対象の核酸とは異なる参照核酸を含有することが知られる参照試料を提供し；
ｃ）参照試料をプロセシングし、それによって、ｄＰＣＲに適した、プロセシングした試料を得て；
ｄ）プロセシングした参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、プロセシングした参照試料における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｅ）定義した量の、プロセシングしていない参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによってプロセシングしていない参照試料の定義した量における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｆ）工程ｄ）において決定した参照核酸の量または濃度を、工程ｅ）において決定したものに比較し、それによって、工程ｃ）における核酸の収率を決定し；
ｇ）プロセシングしていない試料をプロセシングし、それによってｄＰＣＲに適した、プロセシングした試料を得て、ここでプロセシング工程ｃ）およびｇ）は同一である；
ｈ）プロセシングした試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、関心対象の核酸の量または濃度を決定し；そして
ｉ）工程ｈ）において決定した、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および工程ｆ）において決定した収率に基づいて、プロセシングしていない試料における、関心対象の核酸の量または濃度を決定する
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
工程ａ）およびｇ）〜ｉ）の実行が、場所的および／または時間的、特に時間的に、工程ｂ）〜ｆ）の実行とは分離されている、請求項２の方法。
【請求項４】
−参照試料における参照核酸の量または濃度を参照値に比較し、それによって、参照試料を管理するか、あるいは参照試料中の参照核酸の量または濃度が未知であるかまたはあらかじめ決定されておらず；そして／または
−工程ｅ）における参照試料の量または濃度が工程ｂ）におけるものと同一である
請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
参照核酸が
−ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸であり；
−関心対象の核酸と同じプライマー結合部位を有し；
−関心対象の核酸のものと異なるプライマー結合部位を有し；
−関心対象の核酸のものと、最大５０％、最大２５％、最大１０％または最大５％異なる核酸長を有し；
−関心対象の核酸のものと少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一または少なくとも８０％同一である配列を有し；
−関心対象の核酸のものと、最大５０％、最大２５％、最大１０％または最大５％異なるＧおよびＣ含量を有し；そして／または
−関心対象の核酸の部分ではなく、そして参照核酸を検出するために用いる部分を含む
請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
関心対象の核酸が
−ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸であり；
−参照核酸の部分ではなく、そして関心対象の核酸を検出するために用いる部分を含み；そして／または
−微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標である
請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
プロセシングしていない試料が
−細胞培養、混入が推測される供給源または被験体から得られており、ここで特に被験体は、ヒト、動物および植物からなる群、特にヒトより選択される；そして／または
−体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床標本、臓器試料および組織試料からなる群より選択される
請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項８】
プロセシングが、希釈、溶解、遠心分離、抽出、沈殿、濾過および／または精製を含む、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
ｄＰＣＲを
−液体中、ゲル中、エマルジョン中、小滴中、小型化チャンバーのマイクロアレイ中、微少流体デバイスのチャンバー中、マイクロウェルプレート中、チップ上、キャピラリー中、核酸結合表面上またはビーズ上、特にマイクロアレイ中またはチップ上で行い；
−少なくとも１００反応領域、特に少なくとも１，０００反応領域、特に少なくとも５，０００反応領域で同一に行い；そして／または
−少なくとも１０，０００反応領域、特に少なくとも５０，０００反応領域、特に少なくとも１００，０００反応領域で同一に行う
請求項１〜８のいずれかの方法。
【請求項１０】
工程ｄ）およびｅ）を同じｄＰＣＲ実行中および／または同じｄＰＣＲデバイス上、特に同じマイクロアレイ中または同じチップ上で行う、請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
ｄＰＣＲが、関心対象の核酸および／または参照核酸を検出するため、特に消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとしての、または加水分解プローブとしての、１またはそれより多い蛍光プローブの使用を伴う、請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
蛍光プローブがフルオレセイン、ローダミンおよび／またはシアニンを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
関心対象の核酸の量または濃度、ならびに／あるいは参照核酸の量または濃度の決定が蛍光による、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
方法が、外部対照、例えば陰性対照および／または陽性対照の使用をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
−方法を、診断において、特に疾患、病原体、稀な遺伝子配列、稀な突然変異、コピー数変動または相対遺伝子発現の検出のために用い；そして／または
−方法を監視、特に患者の監視、特に療法監視または療法効率の決定に用いる
請求項１〜１４のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）を用いて、プロセシングした試料および参照試料を分析することによって、プロセシングしていない試料における、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法に関する。
【発明の概要】
【０００２】
多くの生物学的、生化学的、診断または療法目的のため、試料中の核酸の量または濃度を正確に決定することが必要である。この目的のため、通常、外部および／または内部標準を用いる。標準は、的確に知られている「真の濃度」を有すると仮定される。
【０００３】
ＵＶ吸収またはリアルタイムＰＣＲなどの比較的不正確な方法を用いる場合、これが真実ではない可能性があり、そして通常、容易には検証不能である。標準の濃度は、しばしば、例えばＷＨＯ標準まで遡る、一連の較正標準に頼り、したがって、定量化誤差はしばしば積み重なる。定量化標準は、１またはいくつかの二次標準を参照し、この二次標準は企業によって製造され、そして保存され、さらに、別の標準、例えばＷＨＯ標準を参照するため、定量化標準はしばしば不正確である。一連の参照が適切に行われ、そして正確であったとしても、最終標準が分解していたかまたは製造誤差に晒されていた可能性もあり、これは非常に厳密な品質管理を用いない限り、検証が困難である。
【０００４】
試験した試料中の核酸の正確な定量化を可能にする方法であっても、通常は、定量化反応のためにインプットとして用いられた反応混合物中のプロセシングしていない核酸よりも、精製された核酸の濃度を正確に決定することが可能であるのみである。しかし、真に関心が持たれるのは、特に医学的診断適用、例えば最初の診断あるいは疾患または療法監視（例えば最小残存病変監視における医学的決定時点）では、一次またはプロセシングしていない試料におけるターゲット濃度である。ピペッティング誤差があり、そして試料調製プロセスの効率が未知であるため、一次試料（例えばヒト血液由来の血漿）から定量化反応まで進む核酸の量はほとんど知られていない。
【０００５】
したがって、調製プロセスにおける全てのロスを追跡するため、一次試料に定量化標準を添加することが一般的なプラクティスである。しかし、最先端技術は、定量化標準の正確性に頼っており、すなわち上述の誤差を無視している。さらに、適切な外部標準（例えば商業的に入手可能な標準）を正確に知られる濃度で提供することは困難であり、そして高価である。さらに、一連の二次および三次標準によってルーチンに検証する必要があり、次に、こうした標準を規則的にチェックする必要がある。
【０００６】
したがって、上記の不都合な点を回避し、特に既知の濃度の標準を必要としない、関心対象の核酸を定量化する方法が必要である。
本発明の目的は、これらの方法を提供することである。
【０００７】
目的は、二重機能で用いられる参照試料と組み合わせた、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に基づく方法によって解決された。まず、外部標準として、ｄＰＣＲ実行に添加する。次に、好ましくは一次試料に添加することによって、同じ参照試料を内部標準として用いる。関心対象の核酸（ターゲット核酸）と同じ方式で、全試料調製プロセスを実行する。ｄＰＣＲを用いて、内部および外部参照の両方を定量化する。内部対外部参照定量化の比は、ｄＰＣＲの前に、試料調製の収率を提供する。この収率がわかっていれば、一次試料中の最初のターゲット濃度を計算可能である。ｄＰＣＲで用いる参照は、ｄＰＣＲで用いる標準の完全な理解を導き、そしてピペッティングおよび希釈誤差による計算ミスの防止を補助する。正確でない標準であっても、ｄＰＣＲの絶対的な正確性はさらに改善され、そして標準をボーナスとして再較正することも可能である。
【０００８】
要約すると、本発明は、プロセシングしていない試料において、核酸を非常に正確に定量化する方法を提供するだけでなく、手製の定量化標準も確立する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の第一の側面にしたがった、プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法を例示する。
【図２】図２は、本発明の第二の側面にしたがった、プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法を例示する。
【図３−１】図３は、相対抽出収率を決定するためのアッセイ設計（Ａ）を例示し、そして（Ｂ）抽出プラットホーム１の１２の位置および（Ｃ）抽出プラットホーム２の１２の位置上で測定されるターゲット核酸（プールした試料）の収率を示す。白および灰色のバーは、それぞれ、正確に同じ条件下で実行した、第一および第二の抽出実行のデータに相当する。ｄＰＣＲを用い、そしてそれぞれの希釈因子を考慮に入れた、清浄ターゲットの直接定量化によって、１００％収率を決定した。
【図３−２】図３は、相対抽出収率を決定するためのアッセイ設計（Ａ）を例示し、そして（Ｂ）抽出プラットホーム１の１２の位置および（Ｃ）抽出プラットホーム２の１２の位置上で測定されるターゲット核酸（プールした試料）の収率を示す。白および灰色のバーは、それぞれ、正確に同じ条件下で実行した、第一および第二の抽出実行のデータに相当する。ｄＰＣＲを用い、そしてそれぞれの希釈因子を考慮に入れた、清浄ターゲットの直接定量化によって、１００％収率を決定した。
【図４−１】図４は、一次試料濃度の絶対定量化のためのアッセイ設計（Ａ）を例示し、そしてプラットホーム２の１２の位置で決定され、そしてこのアッセイに属する定量化標準を用いた、一次試料におけるターゲットの濃度（Ｂ）を示す。ターゲット濃度は、ｄＰＣＲを用いて直接（抽出なしに）決定した濃度に対して与えられる。
【図４−２】図４は、一次試料濃度の絶対定量化のためのアッセイ設計（Ａ）を例示し、そしてプラットホーム２の１２の位置で決定され、そしてこのアッセイに属する定量化標準を用いた、一次試料におけるターゲットの濃度（Ｂ）を示す。ターゲット濃度は、ｄＰＣＲを用いて直接（抽出なしに）決定した濃度に対して与えられる。
【図５】図５は、プロセスの異なる段階での、参照試料のコピー数、ならびにプロセシングしていない試料および参照試料を含有する試料のコピー数を示す図を示す。
【００１０】
Ｎ０（ｓ）：プロセシングしていない試料のコピー数
Ｎ０（ｒ）：参照試料中のコピー数
η：試料調製プロセスの収率
κ：ＰＣＲ反応混合物内に導入された溶出物の割合
【発明を実施するための形態】
【００１１】
実施例において、先行技術の方法を用いても、関心対象の核酸を的確にそして正確に定量化することは不可能であることが立証可能であった（表１および実施例２を参照されたい）。さらに、本発明の方法は、試料中の核酸を定量化する際に、より信頼性がある結果を提供することを示すことが可能であった（実施例３）。
【００１２】
したがって、第一の側面において、本発明は、プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
ａ）−関心対象の核酸を含有すると推測される、プロセシングしていない試料、および
−関心対象の核酸とは異なる参照核酸を含有することが知られる参照試料
を提供し；
ｂ）プロセシングしていない試料と、定義した量の参照試料を合わせ、それによって合わせた試料を得て；
ｃ）合わせた試料をプロセシングし、それによって、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に適した、プロセシングした試料を得て；
ｄ）プロセシングした試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および参照核酸の量または濃度を決定し；
ｅ）定義した量の参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって参照試料の定義した量における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｆ）工程ｄ）において決定した参照核酸の量または濃度を、工程ｅ）において決定したものに比較し、それによって、工程ｃ）における核酸の収率を決定し；そして
ｇ）工程ｄ）において決定した、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および工程ｆ）において決定した収率に基づいて、プロセシングしていない試料における、関心対象の核酸の量または濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【００１３】
第二の側面において、本発明は、プロセシングしていない試料において、関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
ａ）関心対象の核酸を含有すると推測される、プロセシングしていない試料を提供し；
ｂ）関心対象の核酸とは異なる参照核酸を含有することが知られる参照試料を提供し；
ｃ）参照試料をプロセシングし、それによって、ｄＰＣＲに適した、プロセシングした参照試料を得て；
ｄ）プロセシングした参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、プロセシングした参照試料における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｅ）定義した量の、プロセシングしていない参照試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによってプロセシングしていない参照試料の定義した量における参照核酸の量または濃度を決定し；
ｆ）工程ｄ）において決定した参照核酸の量または濃度を、工程ｅ）において決定したものに比較し、それによって、工程ｃ）における核酸の収率を決定し；
ｇ）プロセシングしていない試料をプロセシングし、それによってｄＰＣＲに適した、プロセシングした試料を得て、ここでプロセシング工程ｃ）およびｇ）は同一である；
ｈ）プロセシングした試料を用いてｄＰＣＲを実行し、それによって、関心対象の核酸の量または濃度を決定し；そして
ｉ）工程ｈ）において決定した、プロセシングした試料における関心対象の核酸の量または濃度、および工程ｆ）において決定した収率に基づいて、プロセシングしていない試料における、関心対象の核酸の量または濃度を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
【００１４】
上に詳述するように、プロセシングしていない試料における核酸の量または濃度を、信頼性を持って決定する方法は、いくつかの産業適用において、例えば医学分野において、特に関連がある。いくつかの側面に関して、試料中に核酸が存在するかどうかを明瞭にすることが必要であるだけでなく、プロセシングしていない試料、例えば患者または産物から得た試料において、核酸の量または濃度を、可能な限り的確にそして正確に決定する必要がある可能性もある。これは、例えば疾患の重症度の診断において、あるいは例えば混入物質または不純物を定義するために、環境技術または製品の品質管理において、関心が持たれる可能性もある。
【００１５】
試料が多い場合、問題の核酸を検出する方法を実行するために、採取した試料をプロセシングする必要がある。しばしば、プロセシング中、未知の量の核酸が失われる。さらに、通常、核酸を検出する方法、すなわちｄＰＣＲの準備において、試料を希釈するかまたは濃縮する必要がある。実際の希釈または濃縮は、例えばピペッティングの誤りまたは不正確性のため、意図されるものとは異なる可能性もある。
【００１６】
ｄＰＣＲ（デジタルポリメラーゼ連鎖反応、デジタルＰＣＲまたはＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物を含む核酸を直接定量化し、そして場合によってクローン性に増幅するために使用可能な、慣用的ポリメラーゼ連鎖反応法のバイオテクノロジー改良法である。ｄＰＣＲおよび伝統的ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）の間の重要な相違は、核酸量を測定する方法にあり、前者はＰＣＲよりもより的確な方法であるが、また、経験を積んでいない使用者の管理下では、特に必要な希釈（単数または複数）のために、より誤りやすい傾向がある。ｄＰＣＲはまた、試料内で単一の反応を実行するが、試料を多数の分配または反応領域に分離し、そして反応を各分配または反応領域において、個々に行う。この分離は核酸量のより信頼性がある収集および高感度の測定を可能にする。さらに、該方法は、正確な定量化を可能にする。
【００１７】
上に詳述するとおり、ｄＰＣＲ試料を分配して、試料内の個々の核酸分子が、多くの別個の領域（反応領域）内に局在し、そして濃縮されるようにする。試料の分配は、分子集団がポアソン分布にしたがうと仮定することによって、核酸数の概算を可能にする。その結果、各部分は、陰性または陽性反応（それぞれ「０」または「１」）を含有するであろう。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ最終産物陽性反応を含有する領域を計数することによって、核酸を定量化することも可能である。慣用的ＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅サイクルの数は、出発コピー数に比例する。しかし、ｄＰＣＲは、最初の試料量を決定するために、増幅サイクルの数には依存せず、ターゲット核酸を定量化するために、不確かな指数データへの依存を排除し、そしてしたがって、絶対定量化を提供する。通常、例えば試料を希釈して（ｄＰＣＲを可能にする核酸濃度を得て）、妨害構成要素を除去し、ｄＰＣＲに必要な試薬を添加するなどによって、ｄＰＣＲのために試料をプロセシングする必要がある。
【００１８】
本発明にしたがって、「プロセシングしていない試料」は、ｄＰＣＲのためにまだ準備ができていないかまたは適しておらず、そしてｄＰＣＲにおいて用いる前にさらなるプロセシングを必要とする試料に関する。プロセシングし、そしてｄＰＣＲで使用する準備ができた試料は、プロセシングした試料と称される。好ましくは、プロセシングしていない試料は、例えば被験体から得たままの試料である。技術的またはロジスティックな理由のため、本発明の第一の側面の方法において、参照核酸を、得たままの試料ではなく、より後の段階で添加することが意図される可能性もあり、例えば試料を例えば実験室に輸送しなければならない場合、または試料をまず破壊しなければならない場合がそうである。本発明の第一の側面の方法の工程ｃ）は、合わせた試料のプロセシングに関する。これにしたがって、工程ｃ）の前の試料は、プロセシングしていない試料または合わせた試料（参照核酸がすでに添加されている場合）と称され、そして工程ｃ）で得た試料は、プロセシングした試料と称される。上記コメントは、同様に、本発明の第二の側面の方法の工程ｇ）にも適用可能である。
【００１９】
試料は、被験体由来の試料を含めて、問題の核酸を含有すると推測される任意の試料であってもよい。試料は、その物質（単数または複数）と同一であり、そしてそのより多い量を代表すると意図される、限定された量の物質である。試料を得る作業は、人によって、または自動的に実行可能である。試験、分析、検査、調査、実証、または試行使用のために、試料を採取するかまたは提供することも可能である。ある場合、試料採取は連続的に進行中であってもよい。試料は、個体、液体または気体を含むかまたはこれらからなってもよい；試料は、ゲルまたは痰、組織、生物またはこれらの組み合わせなどの、何らかの中間特性を持つ物質であってもよい。好ましくは、試料は、容易な分布を可能にする液体または懸濁物である。
【００２０】
物質試料が個々のアイテムとして計数できない場合であっても、試料の量はなお、体積、質量、サイズ、または他のこうした寸法に関して記述可能である。固形試料は、１つのまたはいくつかの別個の片として入手可能であるし、あるいは断片化されるか、顆粒であるかまたは粉末化されることも可能である。
【００２１】
現在の文脈の試料は、検出するかまたは測定しそして定量化しようとする、１またはそれより多い核酸を含有すると推測される、ある量の物質である。本明細書において、該用語には、限定されるわけではないが、標本（例えば生検または医学的標本）、培養物（例えば微生物学的培養）または環境試料、例えば水または土が含まれる。試料は被験体、例えば動物またはヒト由来であってもよいし、液体、固体（例えば糞便）、懸濁物または組織であってもよい。用語「被験体由来の試料」には、任意の所定の被験体から単離された、生物学的液体、排泄物および組織のすべてが含まれる。好ましくは、被験体は動物、より好ましくは哺乳動物、またはさらにより好ましくはヒトである。試料は、限定されるわけではないが有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜動物、ならびに野生動物の多様な科のすべてから得られてもよい。
【００２２】
試料の例には、限定されるわけではないが、細胞または組織培養物、血液、血清、血漿、針吸引物、尿、精液、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、胸水、羊水、腹水、間質液、痰、ミルク、リンパ液、気管支および他の洗浄液試料、または組織抽出物試料が含まれる。試料供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検または吸引物由来などの固形組織；あるいは被験体の妊娠または発生における任意の時点に由来する細胞であってもよい。
【００２３】
試料は、天然の試料の供給源と天然には混合されていない化合物、例えば保存剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定液、栄養素、抗生物質等を含有してもよい。
上に詳述するように、プロセシングしていない試料は、関心対象の核酸を含有し、その量または濃度を本発明の方法において決定するものとする。核酸は、任意の核酸であってもよく、その量は、例えば状態、生物環境または事象の指標であり、そしてしたがって、これらの検出において使用可能である。
【００２４】
核酸は、微生物（例えば病原体）の指標であることも可能であり、そして疾患、例えば感染の診断において有用でありうる。感染は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫または他の核酸含有対象によって引き起こされることも可能である。病原体は、外因性（環境または動物供給源から、あるいは他のヒトから獲得される）であっても、または内因性（正常フロラ由来）であってもよい。試料は、徴候および症状に基づいて選択されてもよく、疾患プロセスの代表であるべきであり、そして抗微生物剤の投与前に収集されるべきである。プロセシングしていない試料中の核酸の量は、疾患の重症度の指標でありうる。
【００２５】
あるいは、核酸は、遺伝子障害の指標であってもよい。遺伝子障害は、ゲノム中の１またはそれより多い異常によって引き起こされる遺伝的問題、特に誕生時から存在する状態（先天性）である。大部分の遺伝子障害は、非常に稀であり、そして数千または数百万人に１人が罹患する。遺伝子障害は、遺伝性、すなわち親の遺伝子から伝達されるものであってもまたはなくてもよい。非遺伝性遺伝子障害において、欠損は、ＤＮＡに対する新規突然変異または変化によって引き起こされてもよい。こうした場合、生殖系列で生じた場合にのみ、欠損は遺伝性であろう。同じ疾患、例えばいくつかの型の癌は、ある人々では遺伝性遺伝子状態によって、他の人々では新規突然変異によって、そして主に、さらに他の人々においては環境的原因によって、引き起こされうる。明らかに、突然変異を含む核酸の量は、疾患状態の指標でありうる。
【００２６】
本発明の方法において、核酸の量または濃度を決定する。物質量は、標準で定義される量である。国際単位系（ＳＩ）は、物質量を、存在する基本的実体の数に比例するよう定義し、アボガドロ定数の逆数が比例定数である（単位はｍｏｌ）。物質量に関するＳＩ単位はモルである。モルは、同位体炭素１２の１２ｇにある原子と等しい数の基本的実体を含有する物質の量と定義される。したがって、試料の物質量は、試料質量を物質のモル質量で割ったものとして計算される。
【００２７】
物質の濃度は、構成要素の存在量を混合物の総体積で割ったものである。いくつかのタイプの数学的説明：質量濃度、モル濃度、数濃度、および体積濃度が、区別可能である。用語、濃度は、任意の種類の化学的混合物に適用可能であるが、最も頻繁には、これは溶液中の溶質および溶媒を指す。モル（量）濃度は、正常濃度および浸透圧濃度などの変数を有する。好ましくは、濃度は、数で与えられた構成要素の量を、混合物の総体積で割ったものである。
【００２８】
本発明にしたがった、関心対象の核酸は、任意の核酸であり、その量または濃度を決定するものとする。核酸は、すべての既知の生命の形に必須であるバイオポリマーである。したがって、核酸は、特定の生物に関する指標として使用可能であるが、また、例えば、突然変異または天然存在変異体の場合には、疾患に関する指標としても使用可能である。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む核酸は、ヌクレオチドとして知られる単量体から作製される。各ヌクレオチドは３つの構成要素：五炭糖、リン酸基、および窒素性塩基を有する。糖がデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースである場合、ポリマーはＲＮＡである。核酸は、最も重要な生物学的巨大分子の１つである。これらは、すべての生物中に豊富に見られ、ここで、遺伝情報をコードし、伝達し、そして発現する際に機能し、言い換えると、情報は、核酸配列、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ分子内のヌクレオチドの順序を通じて伝達される。核酸の実験研究は、現代生物学および医学研究の主要部分を構成し、そしてゲノムおよび法医学科学ならびにバイオテクノロジーおよび薬学産業の基礎を形成する。したがって、本発明の方法は、これらの分野のいずれにおいて使用することも可能である。
【００２９】
本発明の方法において、参照試料を用いる。参照試料は、参照核酸を含有することが知られる任意の試料であってもよい。本発明の第一の側面において、参照核酸は、関心対象の核酸とは異なる。本発明の第二の側面において、参照核酸は、関心対象の核酸と同一であってもまたは異なってもよい。上に詳述するように、参照試料は、試料のプロセシングの監視を可能にし、そしてｄＰＣＲを管理するために使用可能である。
【００３０】
参照核酸は、ｄＰＣＲによって検出可能である限り、任意の核酸であってもよく、そして本発明の第一の側面において、ｄＰＣＲにおいて関心対象の核酸とは区別可能である。本発明の第一の側面において、核酸は、一方で関心対象の核酸、そしてもう一方で参照核酸の量の決定を可能にするために、関心対象の核酸とは異なるべきであることが明らかである。本発明の第二の側面において、参照核酸および関心対象の核酸は、同一であってもよい。さらに、参照核酸は、試料中に存在する他の核酸とは区別可能であるように選択されるべきである。参照は、商業的に入手可能であってもよく；許容される標準、例えばＷＨＯ指針にしたがった品質管理試料またはＮＩＳＴ（米国標準技術局）によって提供されるＤＮＡ標準であってもよい。これはまた自作の標準であってもよい。標準は、培養由来の核酸単離物から生じてもよく、あるいはバイオテクノロジー的または化学的手段によって生成されてもよい。特に、参照核酸は、化学合成および／または遺伝子操作によって生成される人工的配列であってもよい。問題の核酸と類似であるが異なる参照試料は、一般的に、試料プロセシングを監視する際に、そして場合によってｄＰＣＲを管理する際に好適であるはずであることが認識されるであろう。
【００３１】
本発明の方法の第一の工程（単数または複数）として、関心対象の核酸を含有すると推測されるプロセシングしていない試料、および参照核酸を含有することが知られる参照試料を提供する（工程ａ）（両方の側面）および工程ｂ）（第二の側面）を参照されたい）。好ましくは、提供する試料は液体中であり、さらなる方法工程を容易にする。好ましくは、いずれかまたは両方の試料の体積が知られる。第一の側面の方法において、次いで、参照試料をプロセシングしていない試料に添加するかまたはその逆のいずれかによって、プロセシングしていない試料および参照試料を合わせる（工程ｂ）を参照されたい）。
【００３２】
次の工程として、問題の試料（第一の側面の方法の場合、合わせた試料、または第二の側面の方法の場合、プロセシングしていない試料および参照試料）をプロセシングする（工程ｃ）（両方の側面）および工程ｇ）（第二の側面）を参照されたい）。プロセシングは、多数の異なる工程および技術を含んでいてもよく、これらは、試料の性質、関心対象の核酸のタイプおよび用いるｄＰＣＲ法を含む多様な側面に応じるであろう。典型的には、プロセシングには、精製工程および／または希釈または濃縮工程が含まれる。本発明の第二の側面において、工程ｇ）のプロセシングは、異なる試料を用いる（プロセシングしていない試料対参照試料）ことを例外として、工程ｂ）のものと同一である。
【００３３】
核酸を精製する方法は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定なしに、ホモジナイズ、洗浄、遠心分離、抽出等が含まれる。
試料を得た後、例えば試料を破壊することによって、保存剤を添加することによって、試料を凍結することによってまたは乾燥させることによって、試料を保存することが必要である可能性もある。得た試料を破壊するため、物理的な力（例えばポリトロン、粉砕または凍結）または化学的方法（例えば細胞の溶解）を用いてもよい。ホモジナイズのために界面活性剤またはカオトロープを用いてもよい。酸フェノール／クロロホルム、フィルター、ガラス粒子またはクロマトグラフィ（例えば結合パートナーとして適切な核酸を用いて）の使用によって、核酸を抽出してもよい。プロセシングの任意の時点で（プロセシングの開始時、プロセシング中、および／またはプロセシング終了時）、試料を保存することが必要である可能性もある。このため、適切な培地、例えば緩衝生理食塩水を添加することが必要であるかまたは適切である可能性もある。関心対象でないか、または妨害しうる、混入物質および／または核酸を除去することが必要である可能性もある。混入物質を除去するため（例えばＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよび／またはプロテイナーゼ）、または関心対象の核酸を保護するため（例えばＤＮアーゼ阻害剤またはＲＮアーゼ阻害剤）、酵素を用いてもよい。酵素を不活性化するため、加熱工程が適切である可能性もある。望ましくない構成要素、例えば二価カチオン（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）を取り除くため、除去剤を用いてもよい。培地を交換するために、洗浄工程が必要である可能性もある。
【００３４】
上に詳述するように、ｄＰＣＲのため、問題の核酸は、ｄＰＣＲ中、適切な量または濃度で存在する必要がある。したがって、適切な希釈または濃縮工程が必要である可能性がある。核酸希釈は、通常、溶媒（例えば続く工程のための適切な培地、例えばｄＰＣＲ培地またはｄＰＣＲ緩衝液）を添加することによって行われる。例えば、望ましくない構成要素の除去、または特定の最終濃度を得るための濃縮が、意図されるかまたは必要である場合、これには、洗浄工程が伴ってもよい。濃縮は、任意の濃縮法、例えば免疫捕捉、遠心分離、アルコール沈殿、および結合マトリックスの使用のいずれによって行ってもよい。
【００３５】
プロセシングの典型的な工程を、以下に詳述する：分析しようとする核酸は、問題の液体試料内の溶液中に遊離しておらず、例えば細胞またはウイルスなどの閉鎖構造内に位置する。診断アッセイにおいて、しばしば、液体試料、例えば臨床試料中の、特に病原性細胞またはウイルスを同定することが目的である。こうした病原体は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）等のようなＲＮＡウイルス、または例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＣ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のようなＤＮＡウイルス、または例えばトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＮＧ）等のような細菌を含むことも可能である。したがって、プロセシングは、試料中に潜在的に存在する細胞および／またはウイルスカプシドを溶解することによる、細胞および／またはウイルス環境からの核酸の放出を含む。細胞またはウイルス粒子の内容物を放出させるため、これらを酵素または化学薬品で処理して、細胞壁またはウイルス粒子を溶解するか、分解するかまたは変性させることも可能である。細胞および／またはウイルスカプシドまたは類似の構造を溶解させるために適した剤は、一般的に、溶解緩衝液中に提供され、そしてカオトロープ剤（例えばチオシアン酸グアニジンまたは塩酸グアニジンまたは塩化グアニジンまたはイソチオシアン酸グアニジンなどのグアニジン塩、尿素、過塩素酸塩、例えば過塩素酸カリウム、他のチオシアン酸塩またはヨウ化カリウム）、緩衝剤（例えばクエン酸緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、またＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）緩衝剤、例えばＴｒｉｓ  ＨＣｌ、リン酸緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、酢酸緩衝剤）、アルコール（例えばポリドカノール）および還元剤（例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）または２−メルカプトエタノール）の群より選択される１またはそれより多い構成要素を含んでもよい。これらの核酸分解酵素が存在する可能性もある。したがって、酵素または望ましくないタンパク質を迅速に分解させるプロテアーゼが存在していてもよい。
【００３６】
典型的な次の工程として、核酸を複合溶解混合物から抽出する。核酸を精製するためのいくつかの方法がある。精製目的のために特に興味深いのは、ガラス表面への核酸の吸着であるが、他の表面も可能である。近年、ガラス表面への核酸の結合特性を使用することによって、天然環境から核酸を単離するための多くの方法が提唱されてきている。修飾されていない核酸がターゲットである場合、他の理由のなかでもとりわけ、核酸が修飾されている必要がなく、そして天然の核酸であっても結合可能であることから、シリカ表面を持つ物質への核酸の直接結合が好ましい。これらのプロセスは多様な文書によって詳細に記載される。方法は、カオトロピック塩溶液における、ガラス表面への核酸の選択的結合、およびアガロース、タンパク質または細胞残渣などの混入物質からの核酸の分離を伴う。混入物質からガラス粒子を分離するため、粒子を遠心分離してもよいし、またはガラスファイバーフィルターを通じて液体を抜き取る。最も好ましい磁気ガラス粒子およびその使用が、ＷＯ  ０１／３７２９１に記載される。非常に好ましいプロセシング法が、ＷＯ  ２０１２／０１３７３３の図１として示される。
【００３７】
最後に、核酸濃度を、ｄＰＣＲに必要であるように調整することによって、プロセシングを終了する。
プロセシング後、試料は、ｄＰＣＲのための準備ができており、これは、それぞれ、第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の工程ｄ）およびｅ）または工程ｅ）およびｈ）にしたがう。
【００３８】
ｄＰＣＲにおいて、問題の核酸を増幅し、そして検出し、ここで、多くの個々の分子は、各々、別個の反応領域に単離される。各反応領域（ウェル、チャンバー、ビーズ、エマルジョン等）は、出発分子が存在しない場合は陰性結果、またはターゲットとされる出発分子が存在する場合は、増幅および検出に関する陽性結果のいずれかを有するであろう。これは、反応の一部がテンプレート分子を持たず、そして陰性増幅結果を与えるように、多くの別個のＰＣＲ反応に渡って、試料の限界希釈を行う技術である。反応終点で、陽性ＰＣＲ反応混合物反応の数を計数する際、元来の試料に存在する個々のテンプレート分子を１つ１つ計数する。ＰＣＲに基づく技術は、増幅可能である分子を計数するだけであるさらなる利点を有し、例えばこれは、配列決定ワークフローにおける、大規模な平行ＰＣＲ工程に適している。デジタルＰＣＲに基づく方法において、分析しようとする核酸を多くの異なる反応領域（例えばウェル、ビーズ、エマルジョン、ゲルスポット、微少流体デバイス中のチャンバー等）に分配する。いくつかであるがすべてではない反応領域が少なくとも１つの分子を含有することが重要である。典型的には、各反応領域は、１つまたはゼロの分子を含有するであろう。実際、反応領域、例えばウェルには、分子のランダムな分布があるであろう。反応領域のある割合（例えば８０％）が陽性である場合、多くの領域は、１またはそれより多い分子（例えばウェルあたり平均２．２分子）を含有するであろう。統計法を用いて、異なる反応領域の数および陽性の数に基づいて、試料中の分子の予期される総数を計算することも可能である。これは、異なる反応領域に適用された、部分中の核酸の計算量または濃度を生じるであろう。試料採取および確率に基づくいくつかの統計法を用いて、この濃度に到達することも可能である。こうした分析の例は、ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ、引用ａｒＸｉｖ：０８０９．１４６０ｖ２［ｑ−ｂｉｏ．ＧＮ］に見られる、２００８年９月８日に最初にアップロードされた、Ｄｕｂｅら，  ａｒＸｉｖ：０８０９．１４６０ｖ２  「デジタルＰＣＲを用いた、ナノ流体デバイス上でのコピー数偏差の最大解像度の計算（２００８）」に提供される。該刊行物は、デジタルＰＣＲアレイ中で用いられる反応領域の数および陽性結果の数に基づいて、分子濃度および統計信頼区間を概算するために使用可能な一連の等式を提供する。このタイプの計算の別の例は、米国特許出願ＵＳ  ２００９／０２３９３０８  Ａ１に見出されうる。
【００３９】
通常、ポアソン分布は、単一のＤＮＡアンプリコンのみが、ランダムに離散化された体積の反応装置中に存在して、反応体積あたり、関心対象のＤＮＡアンプリコンが１つのみであることを支持する場合のデジタル体制を予測するために用いられる。この方式で、各反応装置体積から放出されるＰＣＲ増幅シグナル（例えば蛍光）は、１つのアンプリコンのみの産物であり、そしてすべての他の別個の反応装置体積からは分離されている。次いで、どれだけ多くのデジタル反応装置が、挿入色素または特定のＤＮＡポリメラーゼプローブ配列に対応する増幅された蛍光シグナルを放出するかを計数することによって、定量化を達成する。デジタル体制において、各反応装置体積は、単一のＤＮＡ鎖より多くを含まないように限定されているため、その１つのＤＮＡ鎖ならびに対応するプライマーおよびプローブセットのみから増幅された蛍光シグナルの１００％が生じると正しく仮定することが可能である。
【００４０】
ｄＰＣＲに関するいくつかの方法論が存在する。例えば、クローン性に増幅されたＤＮＡを伴う小ビーズを調製するエマルジョンＰＣＲが用いられてきており、本質的には、各ビーズは、ｄＰＣＲの１つのタイプのアンプリコンを含有する。ＰＣＲ産物に対して「ｉｎ  ｓｉｔｕで」（すなわち同じウェル中で）実行可能な蛍光プローブに基づく技術は、この適用に特によく適している。米国特許第６，４４０，７０５号は、この増幅法のより詳細な説明を含有する。これらの増幅を、エマルジョンまたはゲル中、ビーズ上またはマルチウェルプレート中で実行することも可能である。
【００４１】
ｄＰＣＲにはまた、チャネルおよびポンプを用いて、分子をいくつかの反応領域に送達する、微少流体に基づく技術も含まれる。適切な微少流体デバイスが当該技術分野に知られる。
【００４２】
ｄＰＣＲは、本質的に慣用的ＰＣＲのように行われる。適切な培地中の核酸（参照または関心対象）を、プライマー、プローブおよび熱安定性ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）と接触させ、そして熱サイクリングを実行する（鎖分離および酵素的複製のための、反応の反復加熱および冷却サイクル）。培地は通常、デオキシヌクレオチド、緩衝溶液およびイオン（例えばＭｇ２＋）を含有する。ＰＣＲの選択性は、特定の熱サイクリング条件下で、増幅のためにターゲティングされる領域に相補的であるプライマーの使用から生じる。生じた増幅産物を、通常は標識、例えば蛍光標識されている、適切なプローブの使用によって検出する。ｍＲＮＡに基づくＰＣＲのため、ＲＮＡ試料をまず、逆転写酵素で、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する。
【００４３】
典型的には、ＰＣＲプロセスは、２５〜５０回反復される一連の温度変化からなる。これらのサイクルは、通常、３つの段階からなる:第一の約９５℃は、核酸二重鎖の分離を可能にし；第二の約５０〜６０℃の温度は、ＤＮＡテンプレートとプライマーの結合を可能にし；第三の６８〜７２℃の間の温度は、ＤＮＡポリメラーゼによる重合を促進する。断片サイズが小さいことにより、酵素が整列段階および変性段階の間の変化中に断片の数を増加させることが可能であるため、このタイプのＰＣＲにおいては、最後の工程は、通常、省略される。さらに、非特異的色素を用いる際、プライマー二量体の存在によって引き起こされるシグナルを減少させるため、シグナル、例えば蛍光を、例えば８０℃の温度で測定する。用いる温度およびタイミングは、非常に多様なパラメーター、例えば：ＤＮＡを合成するために用いる酵素、反応中の二価イオンおよびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の濃度、ならびにプライマーの結合温度に依存する。
【００４４】
１つの態様において、ユニークなプローブ配列各々をコードする、多数の色、時間的および強度の組み合わせを用いることによって、より多数の蛍光プローブ配列（例えばＴａｑＭａｎプローブ配列）を同定するユニークな能力を可能にするｄＰＣＲ法を提供する。さらに、より高価でない非ＴａｑＭａｎプローブリアルタイムＰＣＲ増幅指標、例えばＳＹＢＲまたはＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて、時間的キューのみ、強度キューのみ、または強度および時間的キューの組み合わせに基づく多重ｄＰＣＲを達成し、こうして有意なコスト減少を伴って、より高い度合いでプライマー対を区別することも可能である。これらはまた、望ましい場合、より高い正確性に向けて、対照を増進し、そして結果を標準化するために用いることも可能である。典型的な五重ｑＰＣＲからの典型的な多重化限界は、蛍光レポーターを用いて、限定されるスペクトルバンドを伴う百重ｄＰＣＲまで増加させることが可能である。
【００４５】
工程ｆ）において、工程ｄ）で決定した参照核酸の量または濃度を、工程ｅ）で決定したものと比較し、それによって工程ｃ）における核酸の収率を決定する。
本発明の背景において、収率は、プロセシングを伴わずに検出したものに比較した、プロセシング後にｄＰＣＲによって検出した核酸の量／濃度である。したがって、収率は、パーセント収率または分画収率または相対収率であり、プロセシングの有効性を測定するように働く。これは、プロセシング後にｄＰＣＲによって検出した核酸の量／濃度を、プロセシングを伴わずにｄＰＣＲによって検出した核酸の量／濃度によって割ることによって、計算される。濃度を用いる場合、体積（異なる場合）を考慮に入れる必要がある。計算は、試料プロセシング中に、通常、核酸が失われ、そして試料中の核酸の量または濃度の決定において、この損失を考慮しなければならないという知識に基づく。損失は、上記事象のためでありうる。しかし、損失は、典型的には、混合物から望ましい産物を分離し、そして精製する際に起こる。
【００４６】
本発明の方法の最後の工程として、プロセシングしていない試料中の関心対象の核酸の量または濃度を、工程ｄ）（第一の側面）またはｈ）（第二の側面）で決定した、プロセシングした試料中の関心対象の核酸の量または濃度、ならびに工程ｆ）で決定した収率に基づいて決定する。このため、プロセシングした試料中の関心対象の核酸の量または濃度を、工程ｆ）で決定した収率によって割る。元来得た際の試料中の関心対象の核酸の量または濃度を決定する際には、さらなる方法工程を考慮してもよい。
【００４７】
本発明の第二の側面の方法の好ましい態様において、工程ａ）およびｇ）〜ｉ）の実行は、場所的および／または時間的、特に時間的に、工程ｂ）〜ｆ）の実行とは分離されている。
【００４８】
これにしたがって、工程ａ）およびｇ）〜ｉ）を、例えば、工程ｂ）〜ｆ）のもの以外の、デバイス上の位置で、そして／または時点で、行ってもよい。本発明の１つの好ましい態様において、プロセシングおよびｄＰＣＲの効率を決定するために、方法の工程ｂ）〜ｆ）を用いてもよい。
【００４９】
１つの例において、工程ｂ）〜ｆ）をウェルで、そして再現性を持って定義される方法で行い、プロセシングおよびｄＰＣＲの収率決定を生じることも可能である。工程ａ）およびｇ）〜ｉ）を、同じセッティングで、すなわち同じプロセシングおよびｄＰＣＲ法を用いて、しかし異なる時点で実行して、プロセシングしていない試料における関心対象の核酸の量または濃度を決定するために、収率に関して得た値を用いてもよい。工程ａ）およびｇ）〜ｉ）を含む続く多数の方法に、収率に関する値を用いてもよい。したがって、プロセシングおよびｄＰＣＲを特徴付けるために、工程ｂ）〜ｆ）を用いてもよい。工程ｂ）の核酸および工程ｆ）のものの間の関係（すなわち収率）は、関心対象の１またはそれより多い核酸の量または濃度の続く決定におけるものであってもよい。この方法設計において、工程の各々、特にプロセシング（工程ｃ）およびｇ））およびｄＰＣＲ（工程ｄ）、ｅ）およびｈ））を、本質的に同一の方式で行うことが重要である。これは、収率の偏差を排除するかまたは少なくとも最小限にするために、同じまたは少なくとも類似のデバイス、装置、化学薬品等を用いることを意味する。１つの態様において、方法工程ｂ）〜ｆ）を先に実行し、そして生じる収率を報告し、そして続く方法工程ａ）およびｇ）〜ｉ）で用い、これを別の人またはチームによって、そして／または別の場所で行ってもよい。
【００５０】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の態様において、参照試料中の参照核酸の量または濃度を、参照値に比較して、それによって、参照試料または参照値を管理する。あるいは、参照試料中の参照核酸の量または濃度は、未知であるかまたはあらかじめ決定されない。これにしたがって、定量化標準（例えば商業的に入手可能な定量化標準）または任意の他の適切な試料を参照核酸として用いてもよい。該方法を用いて、標準を検証するか、新規標準を提供するか、または参照核酸を定量化することも可能である。
【００５１】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の好ましい態様において、工程ｅ）における参照試料の量は、工程ｂ）におけるものと同一である。工程ｂ）およびｅ）は、それぞれ、プロセシングおよび非プロセシング経路で元来使用された参照核酸を定量化し、これを、プロセシングの収率を決定するために比較する。比較に影響を有しうる、例えば希釈またはアッセイ設計の相違によって引き起こされる、両方の経路の相違を最小限にするため、両方の経路に同じ量を用いると、明らかに好都合である。
【００５２】
上に詳述するように、核酸（ターゲットまたは参照）は、ｄＰＣＲに適した任意の核酸であってもよい。核酸は、適切な長さを有するべきである。核酸は、非核酸構成要素を含有してもよい。核酸は、天然存在であっても、化学的に合成されても、またはバイオテクノロジー的に操作されていてもよい。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物、または任意の他のタイプの核酸からなる群より選択される。第一および第二の側面にしたがった、本発明の別の好ましい態様において、参照核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸である。さらにまたはあるいは、関心対象の核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸である。
【００５３】
関心対象の核酸および参照核酸の間のプロセシング効率の潜在的に妨害性の相違を最小限にするため、両方の核酸がある程度の類似性を共有することが好ましい。したがって、参照核酸は、関心対象の核酸と構造特徴を共有していてもよい。
【００５４】
参照核酸は、好ましくは、関心対象の核酸と同じプライマー結合部位を有してもよい。プライマー結合部位は、ｄＰＣＲ中の増幅を可能にするため、プライマーの結合のために必要である。同一の結合部位は、増幅効率の変動を減少させうる。
【００５５】
さらに、参照核酸は、好ましくは、関心対象の核酸のものと、最大５０％、最大２５％、最大１０％または最大５％異なる、核酸長を有してもよい。核酸長は、ＰＣＲによって増幅される配列、例えば順方向および逆方向プライマーの間のおよびこれらを含む配列と定義されうる。
【００５６】
さらにまたはあるいは、参照核酸は、好ましくは、関心対象の核酸のものと、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一または少なくとも８０％同一である配列を有してもよい。配列同一性は、２つの異なる配列間で正確にマッチする核酸の量である。それによって、ギャップは通常、計数されず、そして測定は、一般的に、２つの配列のより短い方に関連付けられる。配列同一性を決定するための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野に周知である。
【００５７】
さらに、参照核酸は、好ましくは、関心対象の核酸のものと、最大５０％、最大２５％、最大１０％または最大５％異なるＧおよびＣ含量を有しうる。ＧＣ含量は、核酸分子上の、グアニンまたはシトシン（アデニンおよびチミン／ウラシルもまた含む、４つの異なるものの可能性から）のいずれかである窒素性塩基の割合である。ＧＣ対は、３つの水素結合によって結合し、一方、ＡＴＵ対は２つの水素結合によって結合する。高いＧＣ含量を持つＤＮＡは、低いＧＣ含量を持つＤＮＡよりもより安定であり、これはＰＣＲ中に関連しうる。さらに、プライマーのＧＣ含量を用いて、テンプレートＤＮＡへのアニーリング温度を予測する。より高いＧＣ含量レベルは、より高い融点を示す。
【００５８】
しかし、アッセイ設計は、関心対象の核酸の部分ではなく、そして参照核酸を検出するために用いる、参照核酸の部分を必要とするかまたは好ましいとする可能性もある。さらにまたはあるいは、関心対象の核酸は、参照核酸の部分ではなく、そして関心対象の核酸を検出するために用いる部分を含む。これは、本発明の第一の側面の方法に特に適しており、この場合、両方の核酸が合わせた試料中に存在し、そして同じｄＰＣＲにおいて決定されるはずであるため、両方の核酸が異なる必要がある。あるいは、参照核酸が、関心対象の核酸のものとは異なるプライマー結合部位を含むことが望ましい可能性もある。これは、例えば、商業的標準または法令標準を用い（ようとす）る場合に関心対象となりうる。
【００５９】
関心対象の核酸と類似の参照核酸を与えるかまたはこれを保護する場合、参照核酸は、装甲（ａｒｍｏｒｅｄ）核酸であってもよい。
ＲＮＡは、アルカリｐＨ、リボヌクレアーゼ等の影響により、ＤＮＡよりもより分解されやすいため、ＲＮＡでできた参照核酸は、好ましくは、装甲粒子として提供される。装甲粒子、例えば特に装甲ＲＮＡは、例えばＥＰ９１０６４３に記載される。簡潔には、化学的に、または好ましくは、例えば細菌、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）によって異種性に産生可能であるＲＮＡは、ウイルスコートタンパク質中に少なくとも部分的に被包される。後者は、外部の影響、特にリボヌクレアーゼに対して、ＲＮＡに耐性を与える。ＤＮＡもまた、装甲粒子として提供可能であると理解されなければならない。装甲ＲＮＡおよびＤＮＡは、本発明の背景において、参照核酸として有用である。好ましい態様において、ＲＮＡ対照核酸は、大腸菌において、ＭＳ２コートタンパク質で装甲される。さらなる好ましい態様において、ＤＮＡ核酸は、ラムダファージＧＴ１１を用いて装甲される。
【００６０】
装甲核酸は、リボヌクレアーゼへの曝露および血清または血漿中の長期保存によりよく耐える。パッケージングはまた、天然存在ウイルスを模倣し、精製および検出前に、装甲核酸を試料にスパイク処理することを可能にし、全アッセイ処置の間、核酸単離および検出における変数を監視することを可能にする。
【００６１】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、関心対象の核酸は、微生物、ウイルス、細菌、真菌、細胞、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標である。
【００６２】
本発明の方法は、診断または療法監視などの医学分野において特に関心が持たれ、そしてこれを、特定の微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標となる、関心対象の核酸を検出し、そして／または定量化するために使用してもよい。これにしたがって、病原体の検出において、方法を用いてもよい。病原体は、疾患を引き起こす潜在能力を有する。典型的な病原体を用いて、ウイルス、細菌、プリオン、真菌、またはさらに別の微生物などの感染性病原体を記載する。もちろん、本発明の方法を用いて、非病原性微生物を検出することもまた可能である。
【００６３】
例示的な病原体には、限定なしに、以下が含まれる：
−細菌：連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、エシェリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
−ウイルス：アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ロタウイルスおよびエボラウイルス
−真菌：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）およびスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）
−寄生虫：原生動物寄生虫、蠕虫動物寄生虫および節足動物寄生虫。
【００６４】
病原体の信頼性がある検出および場合によって定量化は、疾患の存在および重症度の診断において、非常に適している可能性があることが明らかである。
本発明の方法は、特定の細胞、例えば細胞の下位集団を検出し、そして定量化するために使用可能である。こうした細胞の例には：癌細胞、例えば循環腫瘍細胞または循環腫瘍微小塞栓、特に血球、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、好酸球等が含まれる。細胞は稀な細胞でああってもよく、特に、集団において、総細胞に対する稀な細胞の比は、最大５％、好ましくは最大１％、特に最大０．１％、例えば最大０．０１％である。稀な細胞は、特に、患者血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）であってもよい。「稀な」腫瘍細胞（１ｍｌの血液中のおよそ１０００万の白血球および５０億の赤血球と混合されたわずか数個のＣＴＣ）の発見および定量化、ならびにこれらを他の細胞、特に上皮非腫瘍細胞および白血球から区別する能力は、癌の早期検出に特に適している。これらの細胞を、腫瘍自体が検出可能になるよりはるかに前に検出することが可能であり、これは明らかに、癌性疾患の治療において非常に好適である。
【００６５】
癌細胞は、特定のマーカーによって特徴づけられ、その核酸は、癌の検出および定量化に使用可能である。言及可能な例は：特に発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、ｒａｓファミリーｅｒｂ−Ｂ２の遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、ｍｄｍ２、ｃ−ｆｏｓ、ＤＰＣ４、ＦＡＰ、ｎｍ２３、ＲＥＴ、ＷＴ１等、ＬＯＨ、例えばｐ５３に関するもの、ＤＣＣ、ＡＰＣ、Ｒｂ等、ならびにまた遺伝性腫瘍中のＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２のマイクロサテライト不安定性、ＭＬＨ１、ＷＴ１等；また、腫瘍性ＲＮＡ、例えばＣＥＡ、サイトケラチン、例えばＣＫ２０、ＢＣＬ−２、ＭＵＣ１、特にその腫瘍特異的スプライス変異体、ＭＡＧＥ３、Ｍｕｃ１８、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＢＡ４６，Ｍａｇｅ−１等、あるいは別に、形態形成性ＲＮＡ、例えばマスピン、ｈＣＧ、ＧＩＰ、モティリン、ｈＴＧ、ＳＣＣＡ−１、ＡＲ、ＥＲ、ＰＲ、多様なホルモン等；さらに、特に転移プロファイルに影響を及ぼすＲＮＡおよびタンパク質、すなわち血管形成、運動性、接着およびマトリックス分解に関与する分子の発現、例えばｂＦＧＦ、ｂＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、例えばＶＥＧＦ−Ｒ１またはＶＥＧＦ−Ｒ２、Ｅ−カドヘリン、インテグリン、セレクチン、ＭＭＰ、ＴＩＭＰ、ＳＦ、ＳＦ−Ｒ等、細胞周期プロファイルまたは増殖プロファイルに関与する分子、例えばサイクリン（例えばサイクリンＤ、ＥおよびＢの発現比）、Ｋｉ６７、ｐ１２０、ｐ２１、ＰＣＮＡ等、あるいはアポトーシスプロファイルに関与する分子、例えばＦＡＳ（Ｌ＋Ｒ）、ＴＮＦ（Ｌ＋Ｒ）、パーフォリン、グランザイムＢ、ＢＡＸ、ｂｃｌ−２、カスパーゼ３等がある。
【００６６】
本発明の方法によって決定可能な別の細胞には、心臓血管細胞または血管細胞または炎症プロセスによって放出された血管細胞または胎児細胞、例えば母親の血液中の胎児細胞、幹細胞（例えば癌性幹細胞）、微小残存疾患を示す細胞、癌細胞（例えば白血病細胞）が含まれる。この背景において、方法を遺伝子型決定、診断、予後診断、治療監視等に用いることも可能である。
【００６７】
方法はまた、哺乳動物種の細胞の含量（例えば食品管理において）、遺伝子状態（例えば遺伝性障害の検出または監視の際）、または疾患（上記および下記を参照されたい）を検出しそして定量化するためにも使用可能である。
【００６８】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法のさらに別の好ましい態様において、プロセシングしていない試料は
−細胞培養、混入が推測される供給源、または被験体から得られており、ここで特に被験体は、ヒト、動物および植物からなる群、特にヒトより選択される；そして／または
−体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床標本、臓器試料および組織試料からなる群より選択される。
【００６９】
上に詳述するように、「試料」は、定量化しようとする関心対象の核酸を含有すると推測される物質の量を意味する。本明細書において、該用語には、標本（例えば生検または医学的標本）または培養物（例えば微生物学的培養物）が含まれる。試料は、ヒトを含めて、植物または動物由来であってもよく、液体、固体（例えば糞便）または組織であってもよい。試料には、患者から採取された物質が含まれてもよく、限定されるわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、ミルク、リンパ液、痰、精液、針吸引物等が含まれる。試料は、限定されるわけではないが、有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜動物、ならびに野生動物の多様な科のすべてから得られてもよい。ヒト試料または「組織試料」または「患者試料」または「患者細胞または組織試料」または「標本」に関して、各々は、被験体または患者の組織から得られる、類似の細胞あるいは生物学的または生化学的化合物のコレクションを意味する。組織試料の供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検または吸引物由来などの固形組織；血液または任意の血液構成要素；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液；あるいは被験体の妊娠または発生における任意の時点に由来する細胞であってもよい。組織試料は、天然の組織と天然には混合されていない化合物、例えば保存剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定液、栄養素、抗生物質等を含有してもよい。
【００７０】
さらに、第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、プロセシングは、希釈、溶解、遠心分離、抽出、沈殿、濾過および／または精製を含む。プロセシングのためのこれらの方法に関するさらなる詳細を上記に提供する。
【００７１】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、ｄＰＣＲは、液体中、ゲル中、エマルジョン中、小滴中、小型化チャンバーのマイクロアレイ中、微少流体デバイスのチャンバー中、マイクロウェルプレート中、チップ上、キャピラリー中、核酸結合表面上またはビーズ上、特にマイクロアレイ中またはチップ上で行われる。本発明で使用可能な、利用可能なｄＰＣＲ系は多数ある。商業化されているデジタルＰＣＲプラットホームには、Ｆｌｕｉｄｉｇｍのマイクロウェルチップに基づくＢｉｏＭａｒｋ（登録商標）  ｄＰＣＲ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのスルーホールに基づくＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１２ｋ  ｆｌｅｘ  ｄＰＣＲおよび３Ｄ  ｄＰＣＲ、ならびにＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）の小滴に基づくｄｄＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）  ＱＸ１００およびＱＸ２００、ならびにＲａｉｎＤａｎｃｅ（登録商標）のＲａｉｎＤｒｏｐが含まれる。微少流体チップに基づくｄＰＣＲは、パネルあたり最大数百の分配を有しうる。小滴に基づくｄＰＣＲは、通常、およそ２０，０００の分配された小滴を有し、そして反応あたり、最大１０，０００，０００を有しうる。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２ｋ  ｄＰＣＲは、サブアレイあたり６４の分配を含有し、そして総数４８のサブアレイを含有し、アレイあたり総数３０７２分配に等しい、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）プレート上で、デジタルＰＣＲ分析を行う。
【００７２】
小滴ｄＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、水−油エマルジョン小滴技術に基づく。試料を多数の小滴（例えば約２０，０００）に分画し、そしてテンプレート分子のＰＣＲ増幅が、各個々の小滴において起こる。ｄｄＰＣＲ技術は、小滴形成化学を含む最も標準的なＴａｑＭａｎプローブに基づくアッセイに関して用いるものと類似の試薬およびワークフローを用いる。また、挿入染料、例えばＥｖａｇｒｅｅｎを用いてもよい。大規模な試料分配は、ｄｄＰＣＲ技術の重要な側面である。
【００７３】
明らかに、より多い数の反応領域を用いることによって、ｄＰＣＲによる決定の正確性が改善されうる。およそ１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、７００またはそれより多い反応領域を用いることが可能であり、これらは、ＰＣＲによって問題の量または濃度を決定するために用いられる。第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の好ましい態様において、少なくとも１００の反応領域、特に少なくとも１，０００の反応領域、特に少なくとも５，０００の反応領域で、同一にｄＰＣＲを行う。第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の好ましい態様において、少なくとも１０，０００の反応領域、特に少なくとも５０，０００の反応領域、特に少なくとも１００，０００の反応領域で、同一にｄＰＣＲを行う。
【００７４】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、工程ｄ）およびｅ）を、同じｄＰＣＲ実行および／または同じｄＰＣＲデバイス上、特に同じマイクロアレイ中または同じチップ上で行う。関心対象の核酸および参照核酸の間の相違の数を減少させれば、定量化誤差は明らかに最小限になりうる。したがって、関心対象の核酸および参照核酸を同じ反応領域中で同時に（場所的にもまた時間的にも分離されずに）決定する場合、これは非常に好ましい。
【００７５】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、関心対象の核酸の量または濃度および／または参照核酸の量または濃度の決定は、蛍光による。
【００７６】
ＰＣＲ適用（例えばリアルタイムＰＣＲ）において、蛍光はしばしば、増幅産物を検出するために用いられる。通常、各試料を少なくとも１つの明記する波長の光ビームで照射し、そして励起されたフルオロフォアによって放出される蛍光を検出する能力を伴う、サーマルサイクラー中でこれを実行する。サーマルサイクラーはまた、試料を迅速に加熱し、そして冷却することが可能であり、それによって、核酸およびＤＮＡポリメラーゼの物理化学特性を利用する。
【００７７】
ｄＰＣＲは、関心対象の核酸および／または参照核酸を検出するため、特に消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとして、または加水分解プローブとして、１またはそれより多い蛍光プローブの使用を伴うことも可能である。
【００７８】
しばしば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がＲＴ−ＰＣＲ中で検出される。ＦＲＥＴは、２つの分子間、本発明の場合、２つのプローブ間の相互作用を測定するための技術である。この技術において、２つの異なる蛍光分子（フルオロフォアまたは標識）を、核酸の検出に適したプローブ対に遺伝子融合させる。ＦＲＥＴの原理は、２つの標識の組み合わされた特性に基づく。標識が特定の波長（吸収周波数）の光で励起される場合、これは、異なる波長（放出周波数）でエネルギーを再放出する。ＦＲＥＴにおいて、第一の標識が励起され、これが次に、放出周波数を有する光を放出する。第一の標識（ドナー）の放出ピークが第二の標識（アクセプター）の励起ピークと重複している場合、第一の標識がエネルギーを第二の標識に移動させ、そして第二の標識が、それ自体の放出周波数の光を放出するため、２つの標識が近接していることを決定可能である。正味の結果は、通常放出するであろうエネルギーよりも少ないエネルギーをドナーが放出する（光として放射するエネルギーのある程度が、その代わり、アクセプターに移動するため）一方、アクセプターはその励起周波数で、より多くの光エネルギーを放出する（ドナーフルオロフォアから余分なエネルギーインプットを得ているため）。消光剤と蛍光色素の組み合わせもまた使用可能である。消光剤が、蛍光色素に近接していれば、蛍光放出が排除される。蛍光部分が消光剤から分離されれば、第一の蛍光部分の放出は、適切な波長の光での励起後に、検出可能である。分子ビーコンは、内在性に消光されたフルオロフォアを持つヘアピン状のプローブであり、その蛍光は、これらがターゲット核酸配列に結合した際に回復する。検出しようとする核酸が、ループ中の鎖に相補性である場合、核酸およびループの間で形成される二重鎖は、ステムのものよりより安定であり、これは前者の二重鎖がより多くの塩基対を含むためである。これは、フルオロフォアおよび消光剤の分離を引き起こす。フルオロフォアがひとたび消光剤から離れると、光でハイブリッドを照射した際、蛍光放出が生じる。放出の存在は、ハイブリダイゼーション事象が起こったことを報告し、そしてしたがって、ターゲット核酸配列は、試験試料中に存在する。加水分解プローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’端に共有結合したフルオロフォアおよび３’端の消光剤からなる。フルオロフォアおよび消光剤が近接している限り、消光は、いかなる蛍光シグナルも阻害する。プローブは、プライマーの特異的セットによって増幅されるＤＮＡ領域内にアニーリングするように設計されている。ポリメラーゼがプライマーを伸長させ、そして新生鎖を合成するにつれて、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性は、テンプレートにアニーリングしているプローブを分解する。プローブの分解は、そこからフルオロフォアを放出し、そして消光剤と近接しないようにし、したがって、消光効果から解き放ち、そしてフルオロフォアからの蛍光発光を可能にする。したがって、検出される蛍光は、問題の核酸の存在の指標である。
【００７９】
ＦＲＥＴ技術における多様なアクセプター蛍光部分とともに使用可能な代表的なドナー蛍光部分には、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクーマリン、スクシニミジル１−ピレンブチレート、および４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が含まれる。代表的なアクセプター蛍光部分には、用いたドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ−レッド６１０、ＬＣ−レッド６４０、ＬＣ−レッド６７０、ＬＣ−レッド７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リザミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、五酢酸ジエチレントリアミンまたはランタニドイオン（例えばユーロピウムまたはテルビウム）の他のキレートが含まれる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得られうる。
【００８０】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、蛍光プローブは、フルオレセイン、ローダミンおよび／またはシアニンを含む。例えば、ドナー蛍光部分は、フルオレセインであってもよく、そして／またはアクセプター蛍光部分は、ＬＣ−レッド６１０、ＬＣ−レッド６４０、ＬＣ−レッド６７０、ＬＣ−レッド７０５、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５からなる群より選択されてもよく、好ましくはＬＣ−レッド６１０またはＬＣ−レッド６４０である。より好ましくは、ドナー蛍光部分はフルオレセインであり、そしてアクセプター蛍光部分はＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド６１０である。
【００８１】
いくつかの異なるフルオロフォア（例えば６−カルボキシフルオレセイン、頭字語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、頭字語：ＴＥＴ）および消光剤（例えばテトラメチルローダミン、頭字語：ＴＡＭＲＡ）が入手可能である。
【００８２】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、方法には、外部対照、例えば陰性対照および／または陽性対照の使用がさらに含まれる。デジタルＰＣＲは、ｑＰＣＲに必要な較正および内部対照を必要としないが、例えばＧＬＰまたは法的必要性にしたがうか、あるいはアッセイの傾向（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認するため、本発明の方法にしたがって、これらを使用することが意図されるかまたは必要とされうる。陰性対照には、テンプレート不含対照または酵素不含対照が含まれていてもよい。陽性対照は、陰性結果の検証のために必要である可能性もあり、そして陽性対照反応は、試料と同じ構成要素を含有するが、反応が計画したように進んだ場合、増幅することが確実であるテンプレートを含まなければならない。これは、外部陽性対照であってもよく、外部陽性対照は、対照テンプレートを含有する別個の試料である。こうした外部対照反応は、反応がサイクラーまたは反応構成要素の問題のために失敗した際、あるいは阻害剤が反応を抑制している際に検出することを補助しうる。あるいは、内部陽性対照（ＩＰＣ）を用いることも可能である。ＩＰＣで反応を実行するため、対照ターゲットのためのテンプレートおよびプライマーを、関心対象のターゲットのためのものとともに、反応に含める。対照ターゲットは、もちろん、関心対象のターゲットから容易に区別可能でなければならない。別個の反応を必要としない利点を有することに加えて、ＩＰＣは、試料反応に生得的である問題を示しうるため、有用である。
【００８３】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、方法は、診断、特に疾患、病原体、稀な遺伝子配列、稀な突然変異、コピー数変動または相対遺伝子発現の検出に使用される。
【００８４】
一般的に、ＰＣＲは、患者試料における疾患の早期診断を可能にする。したがって、ｄＰＣＲアッセイを、ゲノムＤＮＡ試料に対して直接実行して、疾患または病原体を検出することも可能である。ＰＣＲが、細菌またはウイルスによって引き起こされるものを含めて、感染性疾患の迅速でそして非常に特異的な診断を可能にすることが周知である。ＰＣＲはまた、組織培養アッセイおよび動物モデルに由来する、培養不能または緩慢増殖微生物、例えばマイコバクテリウム、嫌気性細菌またはウイルスの同定も可能にする。微生物学におけるＰＣＲ診断適用の基礎は、特定の遺伝子による、感染性病原体の検出および病原性株からの非病原性株の区別である。ウイルスＤＮＡも同様に、ＰＣＲによって検出可能である。用いるプライマーは、ウイルスＤＮＡ中のターゲティングされる配列に特異的でなければならず、そしてＰＣＲをウイルスゲノムの診断分析またはＤＮＡ配列決定に用いてもよい。ＰＣＲが高感度であるため、ウイルス検出は感染後まもなく可能となり、そして疾患開始前であっても可能である。こうした早期検出によって、医師は、治療において、有意なリードタイムを得ることも可能である。患者におけるウイルスの量（「ウイルス負荷」）もまた、ＰＣＲに基づくＤＮＡ定量化技術によって定量化可能である。さらに、本発明の方法を、例えば稀な遺伝子配列、稀な突然変異、コピー数変動または相対遺伝子発現を伴う疾患、例えば癌の診断に用いることも可能である。稀な遺伝子変異体の発見は加速している。これらの配列変異体のいくつかは、疾患を引き起こすものであり、そして臨床診断に使用可能である。コピー数変動は、ヒトにおける遺伝子多様性の供給源である。多くのコピー数変動が、多様なゲノム分析で同定されている。コピー数変動形成は、組換えに基づくおよび複製に基づく機構の両方によって生じる可能性もあり、そして新規の遺伝子座特異的突然変異率は、ＳＮＰに関するよりもはるかに高いようである。遺伝子投薬、遺伝子破壊、遺伝子融合、位置効果等を含む、多様な分子機構によって、コピー数変動は、複雑な疾患と関連する可能性があり、または良性の多型変異に相当する可能性もある。また、１またはそれより多い遺伝子の発現プロファイルは、情報を提供することも可能であり、これを疾患の診断に用いることも可能である。特に、相対遺伝子発現を分析することによって、疾患の存在または重症度を決定することも可能である。
【００８５】
第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、方法を、監視、特に患者の監視、特に療法監視または療法効率の決定に用いる。上記詳細にしたがって、異なる時点または条件で供給源から得られる試料において、核酸の変化を検出するため、方法を、監視に用いることも可能である。疾患および病原体の監視は、疾患状態の変化の同定を可能にする。療法がそもそも有効であるかまたはその効率がどの程度かを評価するため、方法を用いてもよい。これには、疾患の進行または後退、および合併症の発展に関してチェックする、慢性疾患に関するルーチンの受診が含まれてもよい。治療を調整することが必要でありうる。
【００８６】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語、ならびに任意の頭字語は、本発明の技術分野の一般的な当業者によって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ刊行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗら（監修），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．刊行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（監修），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．刊行，  １９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出されうる。
【００８７】
本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコル、および試薬には限定されず、これはこれらが多様でありうるためである。本明細書に記載するものと類似のまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施において使用可能であるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。さらに、本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを記載する目的のためであり、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８８】
本明細書において、そして付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」および「ｅｎｃｏｍｐａｓｓ」は、排他的であるよりも包括的であるように解釈されるものとする。同様に、単語「ｏｒ」は、文脈が明らかに別に指示しない限り、「ａｎｄ」を含むと意図される。用語「複数」は、２またはそれより多くを指す。
【００８９】
以下の実施例は、本発明の多様な態様を例示するよう意図される。こうしたものとして、論じる特定の修飾は、本発明の範囲に対する限定とは見なされないものとする。本発明の範囲から逸脱することなく、多様な同等物、変化、および修飾を実行可能であることが当業者には明らかであり、そしてしたがって、こうした同等の態様は、本明細書に含まれるものとすることが理解されるものとする。
【実施例】
【００９０】
実施例１：異なる方法の総分析誤差の比較
先行技術の文書の分析ならびに新規実験に基づいて、定量化法の定性的比較を行った。このため、以下の定義および等式を考慮して、核酸分析の典型的な誤差値を概算した：
不正確性（Ｉｎａｃｃｕｒａｃｙ）：不正確性は、参照値に対する多数のセットの測定値の平均の偏差を指す。これは通常、参照値に対して表され、そしてパーセントで提供される。定量的核酸試験のため、試料ｃ０の参照濃度を、対応するＷＨＯ標準によって提供する。したがって、不正確性は：（ｃ平均−ｃ０）／ｃ０＊１００（％）によって表される。
【００９１】
不的確性（Ｉｍｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）：不的確性は、多数のセットの複製物から決定される平均値の割合で表される、複製測定の標準偏差を指す。濃度測定の場合：ＳＴＤＥＶ（ｃ）／ｃ平均＊１００（％）。
【００９２】
総（分析）誤差：総誤差ＴＥは、すべての測定の９５％を超えないであろう、参照値からの単一の測定値の偏差を示す。これは：ＴＥ＝不正確性＋２＊不的確性によって表される。
【００９３】
本実施例において、上に定義するように、定量的核酸試験に関する２つの最新技術の方法の不的確性および不正確性からなる総分析誤差（表１ａおよびｂ）を、本発明が記載する方法に比較する（表１ｄ）。
【００９４】
さらに、以下の表で概算する典型的な誤差は、適用の観点から最も適切であるとみなされる、「医学的決定ポイント」の範囲の試料濃度を指す。
以下の側面に取り組んだ：
−ＦＤＡが認可するＣＭＶ監視アッセイを用いた２つのＮＡＴシステム上で決定される、参照ＨＣＶ試料の濃度の比較（参考文献１と称される、Ｃａｌｉｅｎｄｏら，  ２００６，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４４：１７２６−３２）
参考文献１の図５は、Ｂａｙｅｒ  ｂＤＮＡおよびＲｏｃｈｅ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイの間の一致を示す（ＨＣＶウイルス負荷試験に関して、現在最も広く用いられている製品）。点線は、試料に関する平均相違を示す。試料間変動が大きく、＋／−０．５ｌｏｇ１０（例えば遺伝子型２に関して）および＋／−１．０ｌｏｇ１０（例えば遺伝子型３に関して）の間の不的確性が示されることがわかる。さらに、不正確性（すべての試料の平均バイアス）は、−０．１ｌｏｇ１０〜＋０．８ｌｏｇ１の間で多様である。
【００９５】
−異なる試験アッセイを用いた異なるプラットホーム上の、ＣＭＶおよびＥＭＶに関する参照試料のウイルス負荷の比較（参考文献２と称される、Ｈａｙｄｅｎら，  ２０１２，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５０：３３７−３４５）。
【００９６】
参考文献２の図２および３は、異なるプラットホーム上での、ＣＭＶおよびＥＭＶに関する参照試料のウイルス負荷の比較を例示する。異なるプラットホーム上で決定した中央値力価は、およそ１０の係数で異なる（１ｌｏｇ１０の相違）。プラットホーム内の不的確性は、アッセイおよびプラットホームに応じて、１．２から最大１０の係数まで多様である。
【００９７】
−異なるプラットホーム上で決定した、その名目上の値に対する、商業的に入手可能な定量化標準の不正確性（またはバイアス）（参考文献３と称される、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５年５月  ５３：５  １５００−１５０５）
参考文献３の図１は、５核酸試験プラットホーム上で評価される、ＣＭＶ試験のために用いた異なる供給業者由来の一般的な定量化標準の濃度の不正確性を示す。論文中に論じられるように、２つのｄＰＣＲプラットホーム（ＢｉｏＲａｄおよびＲａｉｎｄａｎｃｅ）は、最も一貫して、そして正確な結果を提供した。
【００９８】
−各ロット放出に関して収集したＲｏｃｈｅ由来の定量化標準の典型的な不的確性および不正確性値
以下の表（参考文献４と称されるＲｏｃｈｅのデータ）はＲｏｃｈｅ核酸試験系で測定した、観察されるおよび割り当てられた力価値の間の典型的な偏差を例示する。この実験において、二次標準の８つの複製物の測定される定量化結果を、４．２６ｌｏｇ１０の割り当てられた力価値と比較する。これは、１．７＊１Ｅ４コピー／ｍｌの濃度に対応する。平均相違は、不正確性に等しい一方、相違の標準偏差は、力価値の不的確性に等しい。このデータを、特定の装置および特定のロット由来の試薬で収集した。したがって、本明細書に示す不的確性および不正確性の値には、装置間変動および試薬のロット間変動は含まれない。
【００９９】
【表１】
2018046818.tif 000002
【０１００】
−２つのプラットホーム由来のｄＰＣＲ定量化結果の比較（参考文献５と称されるＲｏｃｈｅデータ）。
Ｒｏｃｈｅ  ｄＰＣＲデバイスを用い、そしてＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００系に比較して、Ｒｏｃｈｅで測定した定量化結果の比較。複製物の不的確性が３．５〜５％の間の範囲である一方、２つのプラットホーム上で決定した平均値は、２つのターゲットに関して、２．５および５％の偏差であった。分析は以下の結果に基づいた：
【０１０１】
【表２】
2018046818.tif 000003
【０１０２】
【表３】
2018046818.tif 000004
【０１０３】
−４つのプラットホームに由来するｄＰＣＲ定量化結果の比較（参考文献６と称される、認証されたプラスミドＤＮＡ参照材料のＤＮＡコピー数の正確な定量化のための、４つのデジタルＰＣＲプラットホームの比較、  Ｄｏｎｇら，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：論文番号１３１７４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１３１７４）
参考文献６の表１は、４つのｄＰＣＲプラットホームの定量化結果の比較を要約する。直鎖化プラスミドでの結果は、２〜６％のラットホーム内の不的確性、および０〜６％の不正確性を示す。
【０１０４】
上記データ分析の結果を、以下の表１ａ〜ｄに要約する。
表１ａ：定量的ＰＣＲの総誤差
【０１０５】
【表４】
2018046818.tif 000005
【０１０６】
定量的ＰＣＲアッセイは、定量化標準（ＱＳ）の正確性および的確性に頼る。定量化標準を既知の体積および濃度で一次試料（血漿試料）にスパイク処理する。したがって、それは、全試料調製工程、反応セットアップ工程およびＰＣＲを通じて、定量化しようとする試料核酸と同じ方式でプロセシングされる。ターゲットおよび定量化標準の両方のリアルタイムＰＣＲ曲線の特性を用いて、ターゲット濃度の計算を行う。
【０１０７】
表１ｂ：一次および二次標準を通じて認定される定量化標準ＱＳを用いたｄＰＣＲの総誤差
【０１０８】
【表５】
2018046818.tif 000006
【０１０９】
表１ｃ：定量化標準を伴わないデジタルＰＣＲの総誤差
【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
表１ｄ：工程内較正定量化標準を用いたｄＰＣＲの総誤差（一次および二次標準に関する言及が必要とされない）
【０１１２】
【表７】
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【０１１３】
実施例２  相対抽出収率の決定
当該技術分野の方法の正確性を立証するため、ターゲットＤＮＡを血漿に移し、そして抽出した（プラットホーム１：Ｒｏｃｈｅ試料調製ＭＰ２４またはプラットホーム２：ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００）。溶出物をｄＰＣＲで定量化した。プラットホーム１の１２の位置およびプラットホーム２の１２の位置で、ターゲット核酸（プール試料）の収率を測定した。ｄＰＣＲで直接定量化したターゲットＤＮＡを１００％にセットした。アッセイ設計を図３Ａに例示する。
【０１１４】
実験セットアップ−プラットホーム１：
Ｒｏｃｈｅ試料調製ＭＰ２４  ＃０００５０３、ターゲット：ＨＢＶ  ＥｕｒｏＨｅｐプラスミド（４．３３Ｅ＋０５ｃｐ／ｍＬまたは８．２３Ｅ＋４  ＩＵ／ｍＬ）；ヒトＥＤＴＡ血漿（ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ陰性）、試料インプット体積：５００μＬ、溶出体積：１０５μＬ
実験セットアップ−プラットホーム２：
ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００、装置：１２００，試薬：ｃｏｂａｓ（登録商標）ＨＢＶキット、ターゲット：ＨＢＶ  ＥｕｒｏＨｅｐプラスミド（４．３３Ｅ＋０５ｃｐ／ｍＬまたは８．２３Ｅ＋４  ＩＵ／ｍＬ）、ヒトＥＤＴＡ血漿（ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ陰性）、試料インプット体積：５００μＬ、溶出体積：５０μＬ
実験セットアップ―ｄＰＣＲ：
試薬：充填対照としての１００ｎＭ  ＴＥＸＲを含むＰＬＳ  ＭＭｘ（ＲＣ０９）、ＭＰ２４／ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００からの溶出物、レーンあたり２μＬのターゲット、分離液：添加剤を含まないＰＭＸ  ２００  ５０ｃｓ、充填ステーションＦＭ／分離Ｖ１．４、インプット体積：１０μＬ、検出ＦＭ：設定Ｆ／１０００ｍｓ統合、ｄＰＣＲサイクラーＦＭ１０５／１０４、プロファイル：ＮＧ適合
結果を図３Ｂ（プラットホーム２）および３Ｃ（プラットホーム１）に示す。白および灰色のバーは、それぞれ、正確に同じ条件下で実行した、第一および第二の抽出実行のデータに相当する。ｄＰＣＲを用い、そしてそれぞれの希釈因子を考慮に入れた、清浄ターゲットの直接定量化によって、１００％収率を決定した。収率は、異なるプラットホーム間（ここでは：約係数２）および同じプラットホーム上の位置間（ここでは：最大２の係数）で実質的に多様でありうる。したがって、収率は、較正因子を定量化するために知られていなければならず、これは次に、定量化標準を較正するために用いられるため、未知の収率は、絶対定量化に誤差を導入する。
【０１１５】
実施例３  一次試料濃度の絶対定量化
当該技術分野の方法に比較して、本発明の方法の正確性の改善を立証するため、ターゲットＤＮＡを血漿に移し、そして抽出した（プラットホーム２：ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００）。溶出物を定量化標準ＱＳを伴うｑＰＣＲ（ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００）（最新技術）または参照核酸を含むｄＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ｄＰＣＲ系）のいずれかで定量化した。ｄＰＣＲで直接定量化したターゲットＤＮＡを１００に設定した。アッセイ設計を図４Ａに例示する。実験詳細に関しては、上記実施例２を参照されたい。
【０１１６】
結果を図４Ｂに示す。一次試料中のターゲットの濃度を、プラットホーム２の１２の位置上で、そしてこのアッセイに属する定量化標準を用いて決定した。ｄＰＣＲを用いて、直接（抽出を伴わずに）決定した濃度に比較したターゲット濃度を提供する。この実験に用いるターゲット核酸が、この特定のアッセイに関して、系を較正するために用いる標準較正因子ターゲットと同一であることに注目されたい。
【０１１７】
定量化標準およびｑＰＣＲを用いた絶対定量化は、真の濃度から実質的に偏差する可能性もあり、この場合、約４０％過小定量化される（図４Ｂのカラム１〜１２を参照されたい）。その理由は、例えば、（二次）較正因子標準の誤った定量化、または定量化標準のロット間変動のためでありうる。これとは対照的に、本発明の方法では、濃度は、正しく決定された（図４Ｂのカラム１３を参照されたい）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【外国語明細書】
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