(57)【要約】【課題】非特異的な増幅が生じることを抑制することができることができる核酸増幅反応容器を提供する。【解決手段】反応液が移動する流路を含み、前記流路は、第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、前記第１領域には、プライマーが配置され、前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、プライマーが配置され、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記ポリメラーゼは、非ホットスタート型である、核酸増幅反応容器。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記第１領域には、プローブが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記第１領域には、ｄＮＴＰが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記第１領域には、バッファーが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記プライマーおよび前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記プライマーおよび前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う、核酸増幅反応容器。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１０】
請求項９において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度の前記第１領域と、前記第１温度よりも低い第２温度の前記第２領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程を含む、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、例えば、二本鎖ＤＮＡを変性（解離）させるのに適した温度（変性温度）と、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度と、を周期的に反応溶液に施す処理である。
【０００４】
上記のようなＰＣＲでは、例えば、室温から温度を上げて核酸を変性させる場合、反応液が変性温度に達していない状態であっても、変性してしまうことがあり、これにより生じた一本鎖ＤＮＡにプライマーの一部が非特異的にアニーリング（標的配列以外の配列にアニーリング）することがある。ポリメラーゼは、温度が低くても、活性を失わない場合があり、非特異的な増幅（標的配列以外の配列が増幅）が生じることがある。
【０００５】
上記のような非特異的な増幅を防ぐために、ホットスタートＰＣＲが検討されている（例えば特許文献１参照）。ホットスタートＰＣＲは、高温状態で核酸増幅反応をスタートさせる方法であり、ホットスタートＰＣＲに用いられるポリメラーゼには、所定の温度より高い温度で一定時間晒されないと活性を持たないような工夫がされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３８１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、例えばホットスタートＰＣＲを行うためにポリメラーゼに工夫を施したとしても、ポリメラーゼの種類によっては完全に活性を抑えることが困難であり、低温でポリメラーゼとプライマーとが共存すると、非特異的な増幅が生じる場合がある。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、非特異的な増幅が生じることを抑制することができることができる核酸増幅反応容器を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を含む核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸増幅反応容器は、
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、プライマーが配置され、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている。
【００１０】
このような核酸増幅反応容器では、第１領域および第２領域を所定の温度まで加熱する前の状態（低温（例えば室温）の状態）でポリメラーゼとプライマーとが共存する（接触する）ことがなく、所定の温度まで加熱した状態でポリメラーゼとプライマーと接触させることができる。これにより、このような核酸増幅反応容器では、例えば低温の状態でプライマーの一部が非特異的にアニーリングして非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記ポリメラーゼは、非ホットスタート型であってもよい。
【００１２】
このような核酸増幅反応容器では、ホットスタート型のポリメラーゼを用いる場合に比べて、低コストで核酸増幅反応を行うことができる。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域には、プローブが配置されていてもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応容器では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域には、ｄＮＴＰが配置されていてもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応容器は、核酸増幅反応において、ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域には、バッファーが配置されていてもよい。
【００１８】
このような核酸増幅反応容器では、反応液のｐＨを調整することができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記プライマーおよび前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２０】
このような核酸増幅反応容器では、プライマーおよびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーとポリメラーゼとを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記プライマーおよび前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２２】
このような核酸増幅反応容器では、プライマーおよびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーとポリメラーゼとを、さらにより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行ってもよい。
【００２４】
このような核酸増幅反応容器では、核酸を増幅させることができる。
【００２５】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００２６】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を含むため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００２７】
本発明に係る核酸増幅反応装置において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含んでもよい。
【００２８】
このような核酸増幅反応装置では、反応液からの蛍光を検出することができる。
【００２９】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度の前記第１領域と、前記第１温度よりも低い第２温度の前記第２領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程を含む。
【００３０】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を用いるため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図３】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図４】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図５】本実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。
【図６】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図７】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図８】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図９】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を模式的に示す断面図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３３】
１．  核酸増幅反応容器
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す断面図である。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【００３４】
核酸増幅反応容器１００は、図１および図２に示すように、容器本体１０を含む。容器本体１０の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。核酸増幅反応容器１００は、容器本体１０によって形成された流路２０を含む。流路２０には、第１試薬２および第２試薬４が設けられている。
【００３５】
１．１．  流路
流路２０は、反応液６が移動することができる流路である。なお、図１では、流路２０に反応液６が配置される前の状態を示し、図２では、流路２０に反応液６が配置された状態を示している。
【００３６】
反応液６は、標的核酸（鋳型核酸、検体）を含む鋳型核酸溶液と、容器本体１０内に配置された第１試薬２と、が接触することによって調整（生成）される。したがって、反応液６は、鋳型核酸および第１試薬２を（鋳型核酸の成分および第１試薬２の成分を）含むこととなり、核酸増幅反応を進行させる場となる。さらに、反応液６は、第２試薬４と接触し、第２試薬４を（第２試薬４の成分を）含む。鋳型核酸は、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよい。
【００３７】
流路２０には、液体（図示せず）が収容されている。液体は、反応液６とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体は、反応液６と異なる比重を有していてもよい。具体的には、液体の比重は、反応液６の比重よりも小さくてもよい。液体は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。液体は、容器本体の内壁を覆っており、流路に反応液６が配置された際に反応液６の表面を覆う。液体は、流路に充填されていない。これにより、核酸増幅反応容器では、液体が流路を充填する場合に比べて、反応液６を速く移動させることができる。
【００３８】
流路２０は、例えば、直線状の流路である。流路２０の形状は、例えば、直方体である。流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有している。
【００３９】
流路２０の第１領域３０は、例えば、流路２０の一方側の端部である。第１領域３０は、第１温度に加熱される領域である。第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第１温度に加熱される。第１温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性）に適した温度であり、例えば、８０℃以上１０５℃以下である。第１領域３０は、例えば、流路２０の、第１加熱部４０（図３参照）に設けられた開口部４０ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第１領域３０の形状は、長方形である。
【００４０】
流路２０の第１領域３０は、図２に示すように、標的核酸（鋳型核酸）を含む鋳型核酸溶液を導入する導入口３１と連通してもよい。図示の例では、導入口３１は、蓋１２によって塞がれている。核酸増幅反応容器１００では、例えば、蓋１２を開けて鋳型核酸溶液を流路２０に導入することができる。容器本体１０および蓋１２によって、流路２０は、密封されていてもよい。
【００４１】
流路２０の第２領域３２は、例えば、流路２０の他方側の端部（第１領域３０とは反対側の端部）である。第２領域３２は、第１温度よりも低い第２温度に加熱される領域である。第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第２温度に加熱される。第２温度は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。第２領域３２は、例えば、流路２０の、第２加熱部４２（図３参照）に設けられた開口部４２ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第２領域３２の形状は、長方形である。
【００４２】
流路２０は、図２に示すように、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれている。第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂは、容器本体１０の内壁である。内壁１０ａ，１０ｂによって、流路２０は形成されている。第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。具体的には、距離Ｄは、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下である。距離Ｄを０．５ｍｍ以上とすることにより、核酸増幅反応容器１００の製造が困難になることを抑制することができる。距離Ｄを３ｍｍ以下とすることにより、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００４３】
核酸増幅反応容器１００は、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行うための容器である。
【００４４】
１．２．  第１試薬
第１試薬２は、図１に示すように、第１領域３０に配置されている。第１試薬２は、第２試薬４と離間した状態で配置されている。第１試薬２は、導入口３１から第１領域３０に導入されてもよい。導入口３１は、第１試薬２が導入された後、蓋１２によって塞がれてもよい。第１試薬２は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第１試薬２は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第１試薬２は、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００４５】
第１試薬２は、核酸を増幅させるための試薬である。第１試薬２は、例えば、プライマーと、ｄＮＴＰと、プローブと、バッファーと、を含む。
【００４６】
プライマーは、鋳型核酸にアニーリングするよう設計されている。アニーリングとは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。第１試薬２は、プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。
【００４７】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００４８】
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。容器本体１０の、少なくとも第２領域３２を規定する部分は、プローブが混合された反応液６からの蛍光、および蛍光を得るための励起光を透過することができる材料で構成されている。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上７．２μＭ以下であり、好ましくは０．９μＭ以上３．６μＭ以下である。
【００４９】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有しているポリメラーゼを用いる。
【００５０】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないＫＯＤポリメラーゼを用いる。例えばＫＯＤポリメラーゼがあるが、この酵素は、一般的に用いられるＴａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５１】
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、反応液６のｐＨを調整することができる。バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。第２試薬４が混合された反応液６に含まれる２価の陽イオンの濃度は、例えば、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００５２】
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、第１試薬２は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００５３】
第１試薬２が凍結乾燥されている場合、第１試薬２は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、特にトレハロースは、凍結保護剤としての機能が高く、強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、第１試薬２の各成分を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。なお、第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第２試薬４も糖を含んでもよい。
【００５４】
１．３．  第２試薬
第２試薬４は、第２領域３２に配置されている。第２試薬４は、第２領域３２と連通する導入口（図示せず）から第２領域３２に導入されてもよい。該導入口は、第２試薬４が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第２試薬４は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第２試薬４は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第２試薬４は、第２領域３２を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００５５】
第２試薬４は、核酸増幅反応を行うための試薬である。第２試薬４は、例えば、例えば、ポリメラーゼを含む。第２試薬４は、ポリメラーゼのみから構成されていてもよい。
【００５６】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型などを用いる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００５７】
ポリメラーゼは、例えば、非ホットスタート型である。非ホットスタート型とは、ホットスタートＰＣＲを行うためのホットスタート処置が行われていないポリメラーゼのことであり、所定の温度より高い温度で一定時間晒されなくても、活性を有する。
【００５８】
ホットスタート処理としては、例えば、抗体をポリメラーゼと反応させて複合体を形成する処理（抗体形成処理）、化学物質をポリメラーゼのアミノ酸と共有結合させる処理（化学修飾処理）、ワックスをポリメラーゼに付着させる処理、金属イオンをポリメラーゼと反応させる処理などがある。
【００５９】
抗体形成処理を行ったポリメラーゼは、抗体によって不活化しているが、例えば７０℃以上の温度を一定時間加えることで、抗体が不可逆的に熱変性してポリメラーゼから遊離する。これにより、ポリメラーゼの伸長反応の活性が復活する（ポリメラーゼが賦活化する）。ただし、抗体形成処理を行ったポリメラーゼは、低温の状態において、活性が完全に抑えられておらず、例えばＴＯＹＯＢＯ社製の抗体を反応させたポリメラーゼにおいて、不活化できるのは、４５℃で９５％という報告がある。また、ポリメラーゼの種類によっては、抗体が作りづらい。また、抗体形成処理を行ったポリメラーゼは、非ホットスタート型に比べて、高価である。また、抗体形成処理を行ったポリメラーゼは、活性化のための加熱処理に時間がかかる場合がある。また、抗体形成処理を行ったポリメラーゼは、抗体により、反応液が汚染される可能性がある。
【００６０】
化学修飾処理を行ったポリメラーゼは、化学物質によって不活化しているが、加熱することによって化学物質とポリメラーゼとの共有結合が切断されて、ポリメラーゼの伸長反応の活性が復活する。ただし、化学修飾処理を行ったポリメラーゼは、活性化に１０分間〜１５分間の加熱が必要であり、核酸増幅工程が長くなったり、さらに鋳型核酸やポリメラーゼにダメージが加わったりする可能性がある。
【００６１】
したがって、第２試薬４に含まれるポリメラーゼは、ホットスタート処理が行われたホットスタート型であってもよいが、非ホットスタート型であることが好ましい。
【００６２】
核酸増幅反応容器１００は、例えば、以下の特徴を有する。
【００６３】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有し、第１領域３０には、プライマーが配置され、第２領域３２には、ポリメラーゼが配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０および第２領域３２を所定の温度まで加熱する前の状態（低温（例えば室温）の状態）でポリメラーゼとプライマーとが共存する（接触する）ことがなく、所定の温度まで加熱した状態でポリメラーゼとプライマーと接触させることができる。これにより、核酸増幅反応容器１００では、例えば低温の状態でプライマーの一部が非特異的にアニーリングして非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００６４】
核酸増幅反応容器１００では、ポリメラーゼは、非ホットスタート型である。そのため、核酸増幅反応容器１００では、ホットスタート型のポリメラーゼを用いる場合に比べて、低コストで核酸増幅反応を行うことができる。
【００６５】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、プローブが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００６６】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、ｄＮＴＰが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸増幅反応において、ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００６７】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、バッファーが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、反応液６のｐＨを調整することができる。
【００６８】
核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよびポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている。具体的には、プライマーおよびポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーとポリメラーゼとを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよびポリメラーゼの保存安定性を高めることができる。
【００６９】
なお、第１試薬２と第２試薬４とを、互いに離間させた状態で配置させておくことができれば、第１試薬２および第２試薬４の少なくとも一方は、液体の状態で配置されていてもよい。
【００７０】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０は、例えば、標的核酸を導入する導入口３１と連通する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、例えば、標的核酸を導入口３１から第１領域３０へ導入することができる。
【００７１】
核酸増幅反応容器１００では、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行う。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸を増幅させることができる。
【００７２】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれ、第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。そのため、核酸増幅反応容器１００では、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００７３】
２．  核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図３は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す断面図である。図４は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。図５は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００の機能ブロック図である。
【００７４】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置２００について説明する。
【００７５】
核酸増幅反応装置２００は、図３〜図５に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、駆動機構５０と、検出機構６０と、処理部７０と、操作部７２と、表示部７４と、記憶部７６と、核酸増幅反応容器１００と、を含む。
【００７６】
なお、便宜上、図３および図４では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図５では、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２の図示を省略している。
【００７７】
第１加熱部４０および第２加熱部４２は、核酸増幅反応容器１００に接して設けられている。加熱部４０，４２は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器１００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【００７８】
第１加熱部４０は、流路２０の第１領域３０を第１温度に加熱する。第１加熱部４０は、例えば、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６を第１温度に加熱する。第１加熱部４０には、開口部４０ａが設けられている。図示の例では、開口部４０ａは、有底の穴である。第１領域３０は、開口部４０ａに挿入された領域である。開口部４０ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。
【００７９】
第２加熱部４２は、流路２０の第２領域３２を、第１温度よりも低い第２温度に加熱する。第２加熱部４２は、例えば、第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６を第２温度に加熱する。第２加熱部４２には、開口部４２ａが設けられている。図示の例では、開口部４２ａは、有底の穴である。第２領域３２は、開口部４２ａに挿入された領域である。開口部４２ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。第２加熱部４２には、開口部４２ｂが設けられている。開口部４２ｂは、開口部４２ａと連通している。開口部４２ｂは、後述する検出機構６０からの励起光を第２領域３２に導き、かつ、反応液６からの蛍光を検出機構６０に導くための開口部である。
【００８０】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０および第２領域３２に移動するように、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす機構である。駆動機構５０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす。駆動機構５０は、図示はしないが、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を支持する支持部と、該支持部を動かすモーターと、を有していてもよい。
【００８１】
検出機構６０は、反応液６からの蛍光を検出する機構である。検出機構６０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、反応液６に励起光を照射し、反応液６からの蛍光を検出する。検出機構６０としては、蛍光を検出することができれば特に限定されず、例えば、公知の蛍光測定器を用いる。
【００８２】
処理部７０は、例えば記憶部７６に記憶されているプログラムに従って、駆動機構５０および検出機構６０を制御するための処理を行う。処理部７０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。
【００８３】
操作部７２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部７０に送る処理を行う。操作部７２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。
【００８４】
表示部７４は、処理部７０によって生成された画像を表示する。表示部７４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）等により実現される。
【００８５】
記憶部７６は、処理部７０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部７６は、処理部７０の作業領域として用いられ、処理部７０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部７６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。
【００８６】
核酸増幅反応装置２００では、核酸増幅反応容器１００を含むため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができることができる。
【００８７】
３．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図６は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図７および図８は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図７および図８では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図７および図８では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置２００を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【００８８】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器１００が装着された核酸増幅反応装置２００の加熱部４０，４２を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定する処理を行う（ステップＳ１）。本工程により、第１領域３０と第２領域３２との間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。本工程では、核酸増幅反応容器１００の配置は、第１配置である。第１配置では、図７に示すように、第１領域３０は、第２領域３２よりも重力作用方向において下方に位置する。図示の例では、流路２０の延出方向（長手方向）は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。処理部７０は、例えば、第１領域３０および第２領域３２がそれぞれ第１温度および第２温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【００８９】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認下の後に、核酸増幅反応容器１００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図７に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ２）。
【００９０】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から反応液６を調整した旨の信号を受けると、処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を、第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ３）。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第１の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。ホットスタート処理が行われるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。
【００９１】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ４）。第２配置では、図８に示すように、第２領域３２は、第１領域３０よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。これにより、反応液６に対して、プライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第２の時間は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。図示の例では、流路２０の延出方向は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【００９２】
次に、処理部７０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的には、ステップＳ４の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ５）。処理部７０は、ステップＳ４の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数と、を比較する。
【００９３】
処理部７０は、ステップＳ５においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図６において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【００９４】
一方、処理部７０は、ステップＳ５においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図６において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ６に移行する。
【００９５】
ステップＳ６では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第３の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第３の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【００９６】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ４へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う。
【００９７】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与することができ、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、核酸増幅反応容器１００をシーソー運動させて、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。
【００９８】
処理部７０は、さらに、例えば、ステップＳ４において、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置２００では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部７０は、ステップＳ４において、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置に保持するごとに検出機構６０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部７０は、検出機構６０の測定結果として検出機構６０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部７６に記憶する。処理部７０は、予め記憶部７６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部７０は、算出した核酸の増幅量を、表示部７４に表示させる処理を行ってもよい。
【００９９】
ここで、図９は、核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図８のＩＸ−ＩＸ線断面図である。図９に示すように、第２配置では、第２領域３２は、検出機構６０と対向した位置にある。検出機構６０からの励起光は、開口部４２ｂを通って反応液６に至り、反応液６からの蛍光は、開口部４２ｂを通って検出機構６０に至る。
【０１００】
核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器１００を用いるため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができることができる。
【０１０１】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１０２】
２…第１試薬、４…第２試薬、６…反応液、８…液体、１０…容器本体、１０ａ…第１内壁、１０ｂ…第２内壁、１２…蓋、２０…流路、３０…第１領域、３１…導入口、３２…第２領域、４０…第１加熱部、４０ａ…開口部、４２…第２加熱部、４２ａ，４２ｂ…開口部、５０…駆動機構、６０…検出機構、７０…処理部、７２…操作部、７４…表示部、７６…記憶部、１００…核酸増幅反応容器、２００…核酸増幅反応装置
【図１】
2018046765.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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