(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の特定のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体及びそれをコードする単離された核酸分子の提供。【解決手段】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物および該抗体の投与による凝固における欠乏または欠損を処置する方法もまた提供される。特定の配列を有するヒト組織因子経路インヒビターのエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、特定の配列のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、及び、Ａｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体。【選択図】図１
2018172411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０
１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ
１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃ
ｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される
１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む、請求項１に記載の単離され
たモノクローナル抗体。
【請求項３】
該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５およびＡｓｐ１０２を含む、請求項
１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５、Ａｓｐ１０２およびＬｅｕ１３１
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１
０３、Ｇｌｙ１０４、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙ
ｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２お
よびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請
求項２−４のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６およびＣ
ｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離さ
れたモノクローナル抗体。
【請求項７】
該エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ
１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔ
ｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１
、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基
をさらに含む、請求項６に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項８】
該エピトープが、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む、請求項７に記載の単離され
たモノクローナル抗体。
【請求項９】
エピトープが、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む、請求項７に記載の単離された
モノクローナル抗体。
【請求項１０】
エピトープが、配列番号：１の残基Ｌｅｕ１３１を含む、請求項７に記載の単離された
モノクローナル抗体。
【請求項１１】
エピトープが、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１
０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙ
ｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、
Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を
さらに含む、請求項８−１０のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１２】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ
以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基を含む、単離され
たモノクローナル抗体。
【請求項１３】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４
、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選
択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１２に記載の単離されたモノクローナ
ル抗体。
【請求項１４】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４を含む、請求項１３に記載の単離され
たモノクローナル抗体。
【請求項１５】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４およびＧｌｕ６０を含む、請求項１３
に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１６】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が残基Ｐｒｏ３４、Ｌｙｓ３６およびＧｌｕ６０を含む
、請求項１３に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１７】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｃｙｓ３５
、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選択される１つ
またはそれ以上の残基を含む、請求項１４−１６のいずれかに記載の単離されたモノクロ
ーナル抗体。
【請求項１８】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌ
ｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、
Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２
７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求
項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１９】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ａｒｇ１０７を含む、請求項１８に記載の単離さ
れたモノクローナル抗体。
【請求項２０】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ｇｌｕ１０１を含む、請求項１８に記載の単離さ
れたモノクローナル抗体。
【請求項２１】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が残基Ｔｙｒ１０９を含む、請求項１８に記載の単離さ
れたモノクローナル抗体。
【請求項２２】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌ
ｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、
Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２
７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む
、請求項１９−２１のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２３】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４
、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選
択される１つまたはそれ以上の残基を含み、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１
００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒ
ｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、
Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択され
る１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体
。
【請求項２４】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５およびＣｙ
ｓ５９間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離された
モノクローナル抗体。
【請求項２５】
該エピトープが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉ
ｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基をさらに含む、請求項２４に記載の単離され
たモノクローナル抗体。
【請求項２６】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４
、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選
択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項２５に記載の単離されたモノクローナ
ル抗体。
【請求項２７】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌ
ｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、
Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２
７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、請求
項２５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２８】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基が、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４
、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２からなる群から選
択される１つまたはそれ以上の残基を含み、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基が、Ｇｌｕ１
００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒ
ｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、
Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８からなる群から選択され
る１つまたはそれ以上の残基を含む、請求項２２に記載の単離されたモノクローナル抗体
。
【請求項２９】
ＴＦＰＩに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ＴＦＰＩへの結合に対し
て、請求項１から２８のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する、単
離されたモノクローナル抗体。
【請求項３０】
ＴＦＰＩに結合する単離された二重特異性抗体であって、ＴＦＰＩへの結合に対して、
請求項１から２８のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する、二重特
異性抗体。
【請求項３１】
治療有効量の請求項１−３０のいずれかに記載のモノクローナル抗体および薬学的に許
容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
治療有効量の請求項１−３０のいずれかに記載の少なくとも２つのモノクローナル抗体
および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
第１のモノクローナル抗体が、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体を含み
、第２のモノクローナル抗体が、請求項１２に記載の単離されたモノクローナル抗体を含
む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
治療有効量の請求項３０−３２のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与することを
含む、凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法。
【請求項３５】
血友病Ａ、ＢまたはＣを処置する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
治療有効量の請求項３１−３３のいずれかに記載の医薬組成物を患者に投与することを
含む、出血時間を短縮するための方法。
【請求項３７】
請求項１−２９のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体をコードする、ヒト
組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する抗体をコードする、
単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体
ワン・ジュオジ、ジョン・マーフィー、トビアス・マルクヴァルト、ディーター・モー
スマイヤー。
【０００２】
配列表提出
本出願と関連する配列表をＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子形式において出願し、その全体
を出典明示により本明細書に包含させる。
【０００３】
態様の分野
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体
およびそれらのフラグメントを提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
血液凝固は、血液が安定な血餅を形成し、出血を停止させるプロセスである。該プロセ
スは、血液中に循環している多くのプロ酵素およびプロ補因子（または「凝固因子」）と
関連する。これらのプロ酵素およびプロ補因子は、いくつかの経路を介して相互作用し、
それらを介して、連続して、または同時にのいずれかで、活性化形態に変換される。最後
に、該プロセスは、第Ｖａ因子、イオン化カルシウムおよび血小板の存在下で活性化第Ｘ
因子（ＦＸａ）によるプロトロンビンのトロンビンへの活性化をもたらす。活性化トロン
ビンは、次に、血小板凝集を誘導し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、次に、活
性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋され、血餅を形成する。
【０００５】
第Ｘ因子の活性化を引き起こすプロセスは、２つの別個の経路：接触活性化経路（以前
は内因性経路として知られていた）および組織因子経路（以前は外因性経路として知られ
ていた）により行われ得る。凝固カスケードが共通の経路に接続した等しく重要な２つの
経路からなると以前に考えられていた。現在、血液凝固の開始のための主要な経路は組織
因子経路であることが知られている。
【０００６】
第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と一緒に組織因子（ＴＦ）により活性
化され得る。ＦＶＩＩａおよびその必須の補因子であるＴＦの複合体は、凝固カスケード
の強力な開始剤である。
【０００７】
凝固の組織因子経路は、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）によりネガティブ
コントロールされる。ＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ−依存性フィ
ードバックインヒビターである。それは、多価Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒ
ビターのメンバーである。生理学的に、ＴＦＰＩは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合し
、ヘテロダイマー複合体を形成し、次にＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用し、その活性
を阻害し、したがって凝固の組織因子経路を停止させる。原則として、ＴＦＰＩ活性のブ
ロックは、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させ、したがって組織因子経路の作
用期間を延長し、血友病ＡおよびＢにおける共通の欠陥であるＦＸａの産生を増幅させる
ことができる。
【０００８】
実際に、いくつかの予備的実験証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性のブ
ロックが長期凝固時間を正常化するか、または出血時間を短縮することが示されている。
例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇらは、血友病血漿の長期希釈プロトロンビン時間が、ＴＦＰＩ
に対する抗体での血漿処置後、正常化されることを示した（Thromb. Haemost., 1991, 66
(4): 464-467）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎらは、血友病Ａウサギモデルにおける出
血時間が抗ＴＦＰＩ抗体により有意に短縮されることを示した（Blood Coagulation and 
Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394）。これらの試験は、抗ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの
阻害が血友病ＡまたはＢの処置のために有用であり得ることを示す。ポリクローナル抗Ｔ
ＦＰＩ抗体のみが、これらの試験において使用された。
【０００９】
ハイブリドーマ技術を使用して、組換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノク
ローナル抗体を製造し、同定した。（Yangら Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721参
照）。希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ
）におけるモノクローナル抗体の効果を試験した。実験は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗
体が、第ＩＸ因子欠乏血漿の希釈トロンボプラスチン凝固時間を短縮することを示した。
組織因子経路が生理学的凝固だけでなく血友病の出血においてもまた重要な役割を果たす
ことを示唆する（Yangら Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300）。
【００１０】
したがって、ＴＦＰＩに対して特異的な抗体は、血液疾患および癌を処置するために必
要である。
【００１１】
一般的に、ヒト疾患のための治療抗体は、マウス、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体
を創造するために、遺伝子操作を使用して産生されている。マウスモノクローナル抗体は
、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を引き起こすことができないこと、およびヒト
抗マウス−抗体の生産のため、治療剤として限定された使用であることが示された（Brek
ke and Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the T
wenty-first Century,” Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003）。キメラ抗体は、ヒト抗−
キメラ抗体応答を引き起こすことが示されている。ヒト化抗体はさらに、抗体のマウス成
分を最小限にする。しかしながら、完全ヒト抗体は、マウス成分と関連する免疫原性を完
全に回避する。したがって、遺伝的に操作されたモノクローナル抗体の他の形態と関連す
る免疫原性を回避するような完全ヒト抗体を開発する必要性が存在する。特に、慢性予防
処置、例えば、血友病処置は、ヒト化または好ましくは、完全ヒト抗体を必要とする。マ
ウス成分またはマウス起源を有する抗体が使用される場合、必要とされる非常に多くの投
与および長期の治療によって、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が治療に対する免疫応答の
発生の高い危険性を有する。例えば、血友病Ａに対する抗体治療は、患者の生存のために
毎週の投与を必要とし得る。これは、免疫系に対する継続的な抗原投与である。したがっ
て、血友病ならびに関連した凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損に対する抗
体治療のための完全ヒト抗体の必要性が存在する。
【００１２】
治療抗体は、“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefi
ned Specificity,” Nature 256, 495-497 (1975)においてＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎにより記載されているハイブリドーマ技術を介して作製されている。完全ヒト
抗体はまた、組換え的に原核生物および真核生物において作製され得る。ハイブリドーマ
生産よりむしろ宿主細胞における抗体の組換え生産が治療抗体のために好ましい。組換え
生産は、より良い生産物の一貫性、期待できるより高い生産レベル、および動物由来のタ
ンパク質の存在を最小限にするか、または除去するコントロールされた製造という利点を
有する。これらの理由のため、組換え的に生産されたモノクローナル抗ＴＦＰＩ抗体を有
することが望ましい。
【００１３】
加えて、ＴＦＰＩが高親和性で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合するため、有効な抗Ｔ
ＦＰＩ抗体は同程度の親和性を有するべきである。したがって、ＴＦＰＩ／ＦＸａ結合と
競合することができる結合親和性を有する抗ＴＦＰＩ抗体を有することが望ましい。
【発明の概要】
【００１４】
概要
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の特定のエピトープに対する特異的結合を
有するモノクローナル抗体を提供する。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をコードするポリ
ヌクレオチドも提供する。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含む医薬組成物ならびに凝固
における遺伝的および後天的欠乏または欠損、例えば、血友病ＡおよびＢの処置方法もま
た提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、サイズ排除分析によるＦａｂ  ＡおよびＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の複合体形成を示す。
【００１６】
【図２】図２は、ヒト組織因子経路インヒビターとその抗体（Ｆａｂ  Ａ）間の相互作用のアニメーション(cartoon)描写を示す。示されている可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメインを有するＦａｂ  Ａは、下部の構造として示される。ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、上部の構造として示される。
【００１７】
【図３】図３は、重要なエピトープ残基Ａｓｐ１０２（Ｄ１０２）、Ｉｌｅ１０５（Ｉ１０５）、Ａｒｇ１０７（Ｒ１０７）、Ｃｙｓ１０６−Ｃｙｓ１３０ジスルフィド架橋、およびＡ表面でのＴＦＰＩの結合を示す。
【００１８】
【図４】図４は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａ複合体およびトリプシン結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）の重ね合わせを示し、第Ｘａ因子およびＦａｂ  ＡへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。ＫＤ２およびＦａｂ  Ａは、アニメーション描写において示され、トリプシンは、透明な表面として示される。Ｆａｂ  Ａおよびトリプシンの立体障害も示す。
【００１９】
【図５】図５は、サイズ排除分析によるＦａｂ  ＢおよびＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２の複合体形成を示す。
【００２０】
【図６】図６は、第１の角度および第１の角度と比較して９０度回転された別の角度での、ヒト組織因子経路インヒビターとその抗体（Ｆａｂ  Ｂ）間の相互作用を示す２つのアニメーション描写を示す。示されている可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）ドメインを有するＦａｂ  Ｂは、図の下部の構造において示される（グレー色の影付き）。ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）は白色で示され、ＴＦＰＩＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は黒色で示される。
【００２１】
【図７】図７は、重要なエピトープ残基Ａｓｐ３１（Ｄ３１）、Ａｓｐ３２（Ｄ３２）、Ｐｒｏ３４（Ｐ３４）、Ｌｙｓ３６（Ｋ３６）、Ｇｌｕ６０（Ｅ６０）、Ｃｙｓ３５−Ｃｙｓ５９ジスルフィド架橋、Ｆａｂ  Ｂ表面でのＫｕｎｉｔｚドメイン１ＴＦＰＩの結合を示す。列挙されていないが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の結合も示される。
【００２２】
【図８】図８は、Ｆａｂ  ＢとＫｕｎｉｔｚドメイン２のエピトープ残基Ｇｌｕ１００（Ｅ１００）、Ｇｌｕ１０１（Ｅ１０１）、Ｐｒｏ１０３（Ｐ１０３）、Ｉｌｅ１０５（Ｉ１０５）、Ａｒｇ１０７（Ｒ１０７）、Ｔｙｒ１０９（Ｙ１０９）の結合および相互作用の２つの角度の光景を示す。Ａｒｇ１０７は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１のＧｌｙ３３（Ｇ３３）およびＣｙｓ３５（Ｃ３５）と相互作用する。
【００２３】
【図９】図９は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体ならびにＢＰＴＩ、第ＶＩＩａ因子および組織因子の複合体の重ね合わせを示し、第ＶＩＩａ因子／組織因子およびＦａｂ  ＢへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。Ｆａｂ  Ｂおよび第ＶＩＩａ因子ならびにＦａｂ  Ｂおよび組織因子の立体障害は、矢印により示される。
【００２４】
【図１０】図１０は、ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体およびトリプシン結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の重ね合わせを示し、第Ｘａ因子およびＦａｂ  ＢへのＴＦＰＩの同時結合の排除を示す。Ｆａｂ  ＢおよびトリプシンならびにＦａｂ  Ｂ結合Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびトリプシンの立体障害を示す。
【００２５】
【図１１−１】図１１は、（Ａ）Ｆａｂ  Ａの軽鎖および重鎖（配列番号：２および３）およびＦａｂ  Ｃの軽鎖および重鎖（配列番号：６および７）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ  Ｃの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａ  Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ  ＡおよびＦａｂ  Ｃにおいて異なるパラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、黒色においてアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。パラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、棒により示される。
【図１１−２】図１１は、（Ａ）Ｆａｂ  Ａの軽鎖および重鎖（配列番号：２および３）およびＦａｂ  Ｃの軽鎖および重鎖（配列番号：６および７）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ  Ｃの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａ  Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ  ＡおよびＦａｂ  Ｃにおいて異なるパラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、黒色においてアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。パラトープ残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、棒により示される。
【００２６】
【図１２−１】図１２は、（Ａ）Ｆａｂ  Ｂの軽鎖および重鎖（配列番号：４および５）およびＦａｂ  Ｄの軽鎖および重鎖（配列番号：８および９）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ  Ｄの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ  Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ  ＢおよびＦａｂ  Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、それぞれ明るいグレー色および黒色のアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。Ｆａｂ  ＢおよびＦａｂ  Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、棒により示される。
【図１２−２】図１２は、（Ａ）Ｆａｂ  Ｂの軽鎖および重鎖（配列番号：４および５）およびＦａｂ  Ｄの軽鎖および重鎖（配列番号：８および９）の配列アラインメント、ならびに（Ｂ）Ｆａｂ  Ｄの相同性モデルとＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ  Ｘ線構造の重ね合わせを示す。（Ａ）パラトープ残基は、太字であり、強調されている。Ｆａｂ  ＢおよびＦａｂ  Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、アステリスクで印を付けられている。（Ｂ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２）は、それぞれ明るいグレー色および黒色のアニメーションとして示される。Ｆａｂ構造は、グレー色のリボンとして示される。Ｆａｂ  ＢおよびＦａｂ  Ｄにおいて異なるパラトープ残基は、棒により示される。
【００２７】
【図１３】図１３は、（Ａ）ＴＦＰＩ上のＦＸａ結合をブロックするＦａｂ  ＣおよびＦａｂ  Ｄの表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）データ、ならびに、（Ｂ）ＴＦＰＩ上のＦＶＩＩａ／ＴＦ結合をブロックするＦａｂ  ＣおよびＦａｂ  Ｄの表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
定義
本明細書において使用される「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる用
語は、細胞により天然に発現されるヒトＴＦＰＩのあらゆる変異体、アイソフォームおよ
び種ホモログを示す。本発明の好ましい態様において、ＴＦＰＩへの本発明の抗体の結合
は血液凝固時間を減少させる。
【００２９】
本明細書において使用される「抗体」は、抗体全体およびあらゆる抗原結合フラグメン
ト（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を示す。該用語は、天然であるか
、または正常免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え方法により形成される全長免疫グ
ロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または特異的結合活性を保持する免疫グロブリン
分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗体フラグメントを含む。構造にかかわらず、抗
体フラグメントは、全長抗体により認識される抗原と同じ抗原に結合する。例えば、抗Ｔ
ＦＰＩモノクローナル抗体フラグメントは、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗
原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより行うことができる。抗体の「抗原結合部分
」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１
ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域で
ジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントで
あるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフ
ラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメ
ント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Wardら (1989) Nature 341:544
-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ジアボ
ディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ（例えば、Illら Protein Eng 19
97;10:949-57参照）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；および（ｉｘ）ＩｇＮＡＲを含む。さ
らに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコ
ードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって、一
価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Birdら (1988) Science 24
2:423-426;およびHustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）を
形成する単一のタンパク質鎖として作製されるようにすることができる合成リンカーによ
って結合させることができる。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」な
る用語内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られてい
る慣用の技術を使用して得られ、該フラグメントはインタクトな抗体と同じ方法で有用性
について分析される。
【００３０】
さらに、抗原結合フラグメントは、抗体模擬物に包含され得ることが考えられる。本明
細書において使用される「抗体模擬物」または「模擬物」なる用語は、抗体と同様の結合
を示すが、より小さい代替抗体または非抗体タンパク質であるタンパク質を意味する。こ
のような抗体模擬物は、スカフォールドに含まれ得る。「スカフォールド」なる用語は、
適合した機能および特性を有する新規産物の操作のためのポリペプチド基本骨格(platfor
m)を示す。
【００３１】
「エピトープ」なる用語は、抗体が特異的に結合または相互作用する抗原の地域または
領域を示し、いくつかの態様において、抗原が抗体との物理的接触であることを示す。逆
に、「パラトープ」なる用語は、抗原が特異的に結合する抗体の地域または領域を示す。
競合結合により特徴付けられるエピトープは、対応する抗体の結合が相互排他的であると
き、すなわち１つの抗体の結合が別の抗体の同時結合を排除するとき、重複であると言わ
れる。エピトープは、抗原が両方の対応する抗体の結合を同時に提供することができると
き、別（ユニーク(unique)）であると言われる。
【００３２】
本明細書において使用される「競合する抗体」なる用語は、本明細書に記載されている
ＴＦＰＩに対する抗体と、ほぼ、実質的にもしくは本質的に同じ、または同じエピトープ
に結合する抗体を示す。「競合する抗体」は、重複するエピトープ特異性を有する抗体を
含む。したがって、競合する抗体は、ＴＦＰＩへの結合に対して、本明細書に記載されて
いる抗体と有効に競合することができる。好ましくは、競合する抗体は、本明細書に記載
されている抗体と同じエピトープに結合することができる。別の見方をすれば、競合する
抗体は、本明細書に記載されている抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００３３】
本明細書において使用される「結合の阻害」および「結合のブロック」（例えば、ＴＦ
ＰＩへのＴＦＰＩリガンドの結合の阻害／ブロック）なる用語は、互換的に使用され、部
分的および完全阻害またはブロックの両方を含む。阻害およびブロックはまた、抗ＴＦＰ
Ｉ抗体と接触していないＴＦＰＩと比較して、抗ＴＦＰＩ抗体と接触しているとき、生理
学的基質へのＴＦＰＩの結合親和性におけるあらゆる測定可能な減少、例えば、ＴＦＰＩ
と第Ｘａ因子との相互作用またはＴＦＰＩ−第Ｘａ因子複合体と組織因子、第ＶＩＩａ因
子または組織因子／第ＶＩＩａ因子の複合体との相互作用を、少なくとも約１０％、２０
％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％または１００％ブロックすることを含むことを意図する。
【００３４】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成
物」なる用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は
、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒト
モノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変およ
び定常領域を有し、単一の結合特異性を示す抗体を示す。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖
細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロ
でのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入され
る変異）を含み得る。
【００３５】
本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗
体を実質的に含まない抗体を示すことを意図する（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離され
た抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒ
トＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、例
えば、他の種由来の他の関連抗原（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）に対する交差反応性を
有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に
含まないこともある。
【００３６】
本明細書において使用される「特異的結合」は、予め決定された抗原に対する抗体結合
を示す。一般的に、抗体は、少なくとも約１０５Ｍ−１の親和性で結合し、予め決定され
た抗原または密接に関連した抗原以外の不適切な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対
する結合に対する親和性よりも、高い、例えば少なくとも２倍高い親和性で予め決定され
た抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」なるフ
レーズは、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に使用
される。
【００３７】
本明細書において使用されるＩｇＧ抗体に対する「高親和性」なる用語は、少なくとも
約１０７Ｍ−１、いくつかの態様において、少なくとも約１０８Ｍ−１、いくつかの態様
において、少なくとも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１またはそれ以上
、例えば、最大１０１３Ｍ−１またはそれ以上の結合親和性を示す。しかしながら、「高
親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイ
プに対する「高親和性」結合は、少なくとも約１．０×１０７Ｍ−１の結合親和性を示す
。本明細書において使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコード
される抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を示す。
【００３８】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合される抗原の三次元構造に相補的である
Ｎ−末端抗原結合表面を形成する抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３
つの超可変領域の１つを示す。重鎖または軽鎖のＮ−末端から始めて、これらの相補性決
定領域はそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と示される。ＣＤＲ
は抗原抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原抗体結合に対して特異的なユニークな領域を
含む。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれのＣＤＲ領域を含
む６つのＣＤＲを含み得る。
【００３９】
本明細書において使用される「保存的置換」は、ポリペプチドの生物学的または生化学
的機能の喪失をもたらさない同様の生化学的特性を有するアミノ酸の１つ以上のアミノ酸
での置換を含むポリペプチドの修飾を示す。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が
、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するア
ミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側
鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、
グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリ
ン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族性側鎖（例
えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を
含む。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換を有していてもよく、活性を保持しているも
のを想定する。
【００４０】
核酸およびポリペプチドにおいて、「実質的な相同性」なる用語は、２つの核酸または
２つのポリペプチドまたはそれらの示された配列が、最適にアラインされ比較されたとき
、適当なヌクレオチドまたはアミノ酸挿入または欠失を有し、少なくとも約８０％のヌク
レオチドまたはアミノ酸、通常少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％または９５％、さらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８
％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％のヌク
レオチドまたはアミノ酸で同一であることを示す。あるいは、核酸に対する実質的な相同
性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイ
ズするとき存在する。本発明は、本明細書において記載されている特定の核酸配列および
アミノ酸配列と実質的な相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。
【００４１】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入
する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列により共
有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の＃／全位置の＃×１
００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴ
リズム、例えば、限定はしないが、ベクターＮＴＩＴＭのＡｌｉｇｎＸＴＭ（Invitrogen
Corp., Carlsbad, CA）を使用して成し遂げることができる。ＡｌｉｇｎＸＴＭにおいて
、複数のアラインメントのデフォルトパラメーターは、：ギャップオープンペナルティ：
１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アライン
メントディレイに関する同一性％：４０である。（http://www.invitrogen.com/site/us/
en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-an
alysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance
.reg.us.htmlでさらに詳細に見られる）。
【００４２】
グローバル配列アラインメントとしても示されるクエリー配列（本発明の配列）および
対象配列間の最も良い全体の一致を決定するための別の方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓら（Comp
uter Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191）のアルゴリズ
ムに基づくＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Thompsonら Nucleic Acids Res
earch, 1994, 2(22): 4673-4680）を使用して決定することができる。配列アラインメン
トにおいて、クエリーおよび対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。該グローバル配列ア
ラインメントの結果は同一性パーセントである。ペアワイズアラインメントを介して同一
性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて使
用される好ましいパラメーターは、マトリックス＝ＩＵＢ、ｋ−タプル＝１、トップ  ダ
イアゴナル数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャ
ップ伸長ペナルティ＝０．１である。多数のアラインメントにおいて、以下のＣＬＵＳＴ
ＡＬＷパラメーターが好ましい：ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラ
メーター＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アラインメントディレイに関す
る同一性％＝４０。
【００４３】
核酸は、全細胞、細胞溶解物中に存在し得、または部分的に精製された形態もしくは実
質的に純粋な形態において存在し得る。核酸は、天然環境と通常関連する他の細胞成分か
ら精製されるとき、「単離」または「実質的に純粋」（に）されている。核酸を単離する
ために、標準技術、例えば以下のものが使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ
バンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および他の当分野で
よく知られているもの。
【００４４】
ＴＦＰＩの特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体
本明細書において、配列番号：１に示されるヒトＴＦＰＩへの特異的結合を有するモノ
クローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体は
、ＴＦＰＩへのＴＦＰＩリガンドの結合を阻害する。したがって、いくつかの態様におい
て、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体は、ＴＦＰＩの活性を阻害し得る。
【００４５】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ
以上の残基を含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において
、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：２または配列番号：４に示される軽鎖を
含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：３または
配列番号：５に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナ
ル抗体は、配列番号：２に示される軽鎖および配列番号：３に示される重鎖を含む。いく
つかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：４に示される軽鎖お
よび配列番号：５に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクロ
ーナル抗体が、提供されるものと実質的な相同性を有する軽鎖または重鎖を含み得るとも
考慮される。例えば、実質的な相同性を含む単離されたモノクローナル抗体は、１つまた
はそれ以上の保存的置換を含み得る。
【００４６】
いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１
）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の
Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０
５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ
１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３
およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基を含む、単離されたモノ
クローナル抗体を提供する。
【００４７】
いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００を含む。い
くつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１０１を含む。いくつ
かの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む。いくつかの
態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｐｒｏ１０３を含む。いくつかの態様
において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０４を含む。いくつかの態様にお
いて、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。いくつかの態様において
、エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６を含む。いくつかの態様において、エ
ピトープは、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７を含む。いくつかの態様において、エピト
ープは、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０８を含む。いくつかの態様において、エピトープ
は、配列番号：１の残基Ｔｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、エピトープは、
配列番号：１の残基Ｌｙｓ１２６を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列
番号：１の残基Ｇｌｙ１２８を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号
：１の残基Ｇｌｙ１２９を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１
の残基Ｃｙｓ１３０を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残
基Ｌｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇ
ｌｙ１３２を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｎ
１３３を含む。
【００４８】
いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５およびＡｓ
ｐ１０２を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１
０５およびＬｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１
の残基Ｉｌｅ１０５、Ａｓｐ１０２およびＬｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において
、エピトープは、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌ
ｙ１０４、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、
Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２またはＡｓｎ１３３をさらに
含む。
【００４９】
いくつかの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１
）に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の
残基Ｃｙｓ１０６およびＣｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミ
ノ酸ループを含む、単離されたモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において
、エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１
０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙ
ｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、
Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む
。いくつかの態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。他
の態様において、エピトープは、配列番号：１の残基Ａｓｐ１０２を含む。他の態様にお
いて、エピトープは、配列番号：１の残基Ｌｅｕ１３１を含む。いくつかの態様において
、エピトープは、配列番号：１のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｐｒｏ１
０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙ
ｒ１０９、Ｌｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、
Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３から選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含む
。
【００５０】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の１つまたはそれ
以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ以上の残基を含む、単離され
たモノクローナル抗体も提供する。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル
抗体は、配列番号：６または配列番号：８に示される軽鎖を含む。いくつかの態様におい
て、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：７または配列番号：９に示される重鎖
を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号：６に示
される軽鎖および配列番号：７に示される重鎖を含む。いくつかの態様において、単離さ
れたモノクローナル抗体は、配列番号：８に示される軽鎖および配列番号：９に示される
重鎖を含む。いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体が、提供されるも
のと実質的な相同性を有する軽鎖または重鎖を含み得るとも考慮される。例えば、実質的
な相同性を含む単離されたモノクローナル抗体は、１つまたはそれ以上の保存的置換を含
み得る。
【００５１】
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１のＡｓｐ３
１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌ
ｕ６０およびＡｓｎ６２およびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基
を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残
基Ａｓｐ３１を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列
番号：１の残基Ａｓｐ３２を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の
残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ３３を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚ
ドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４を含む。いくつかの態様において、
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５を含む。いくつかの態
様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｌｙｓ３６を含む。
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ
５９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１
の残基Ｇｌｕ６０を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、
配列番号：１の残基Ａｓｎ６２を含む。
【００５２】
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒ
ｏ３４およびＧｌｕ６０を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残
基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４およびＬｙｓ３６を含む。いくつかの態様において
、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ３４、Ｌｙｓ３６および
Ｇｌｕ６０を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１のＧｌｕ１
００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒ
ｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、
Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８およびそれらの組合せか
ら選択される１つまたはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚ
ドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１００を含む。いくつかの態様において
、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１０１を含む。いくつか
の態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｐｒｏ１０３を
含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基
Ｇｌｙ１０４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列
番号：１の残基Ｉｌｅ１０５を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２
の残基は、配列番号：１の残基Ｃｙｓ１０６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉ
ｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７を含む。いくつかの態様にお
いて、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１０８を含む。いく
つかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｔｙｒ１０
９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の
残基Ｐｈｅ１１４を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、
配列番号：１の残基Ａｓｎ１１６を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイ
ン２の残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｕ１２３を含む。いくつかの態様において、Ｋｕ
ｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１２４を含む。いくつかの態様
において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｌｙｓ１２６を含む。
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ｔｙｒ
１２７を含む。
【００５４】
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒ
ｇ１０７およびＧｌｕ１０１を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２
の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７およびＴｙｒ１０９を含む。いくつかの態様
において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の残基Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ
１０１およびＴｙｒ１０９を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の
残基は、配列番号：１の残基Ｇｌｙ１２８を含む。
【００５５】
いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１のＡｓｐ１
０２、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２およびＡｓｎ１３３お
よびそれらの組合せから選択される１つまたはそれ以上の残基をさらに含み得る。
【００５６】
いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２
、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡ
ｓｎ６２から選択される１つまたはそれ以上の残基を含むＫｕｎｉｔｚドメイン１の残基
；ならびに、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５
、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１
１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８か
ら選択される１つまたはそれ以上の残基を含むＫｕｎｉｔｚドメイン２の残基を含む。
【００５７】
ヒト組織因子経路インヒビターのエピトープ（配列番号：１）に結合する単離されたモ
ノクローナル抗体であって、該エピトープは、配列番号：１の残基Ｃｙｓ３５およびＣｙ
ｓ５９間のジスルフィド架橋により連結される２つのアミノ酸ループを含む、単離された
モノクローナル抗体も提供する。いくつかの態様において、エピトープは、Ｋｕｎｉｔｚ
ドメイン１の１つまたはそれ以上の残基およびＫｕｎｉｔｚドメイン２の１つまたはそれ
以上の残基をさらに含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基は、
配列番号：１のＡｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ｇｌｙ３３、Ｐｒｏ３４、Ｃｙｓ３５、Ｌｙｓ
３６、Ｃｙｓ５９、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２から選択される１つまたはそれ以上の残
基を含む。いくつかの態様において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の残基は、配列番号：１の
Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０
６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ
１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、Ｔｙｒ１２７およびＧｌｙ１２８から選択される
１つまたはそれ以上の残基を含む。
【００５８】
ＴＦＰＩへの結合に対して本明細書に記載されているいずれかの抗体と競合することが
できる抗体も提供する。例えば、本明細書に記載されている抗体と同じエピトープに結合
する抗体は、ＴＦＰＩの結合に対して有効に競合することができる。いくつかの態様にお
いて、ＴＦＰＩに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、本明細書に記載され
ているいずれかの単離されたモノクローナル抗体と競合する単離されたモノクローナル抗
体を提供する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番
号：６または配列番号：８に示される軽鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様にお
いて、抗体は、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９に示され
る重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：２に示さ
れる軽鎖および配列番号：３に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様に
おいて、抗体は、配列番号：４に示される軽鎖および配列番号：５に示される重鎖を有す
る抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は、配列番号：６に示される軽鎖およ
び配列番号：７に示される重鎖を有する抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体
は、配列番号：８に示される軽鎖および配列番号：９に示される重鎖を有する抗体と競合
する。
【００５９】
ＴＦＰＩへの結合に対して本明細書に記載されているいずれかの抗体と競合することが
できる二重特異性抗体も提供する。例えば、このような二重特異性抗体は、上記１つまた
はそれ以上のエピトープに結合し得る。
【００６０】
抗体は種特異的であり得、または多数の種と交差反応し得る。いくつかの態様において
、抗体は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、ブタ、イヌ、ネコまたは
他の哺乳動物種のＴＦＰＩと特異的に反応するか、または交差反応し得る。
【００６１】
抗体は、種々のクラスの抗体のいずれか、例えば、限定はしないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ
２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇ
Ｅ抗体であり得る。
【００６２】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
モノクローナル抗体のアミノ酸配列が提供されているが、核酸配列は、いずれかのこれ
らのモノクローナル抗体をコードするように設計することができると考慮される。このよ
うなポリヌクレオチドは、抗ＴＦＰＩ抗体の軽鎖または重鎖をコードし得る。いくつかの
態様において、このようなポリヌクレオチドは、破壊することができる結合により分離さ
れる抗ＴＦＰＩ抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードし得る。さらに、上記の抗体は、任
意の上記のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターおよ
びこのようなベクターを含む宿主細胞を使用して生産することができる。
【００６３】
ＴＦＰＩに対する抗体を製造する方法
モノクローナル抗体は、本発明の態様のモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌ
クレオチド配列を宿主細胞において発現させることにより組換え的に生産され得る。発現
ベクターの手助けで、該ヌクレオチド配列を含む核酸を、生産のために適当な宿主細胞に
トランスフェクトし、発現させ得る。したがって、
（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞にトラスフェクトす
ること、
（ｂ）宿主細胞を培養し、宿主細胞において該モノクローナル抗体を発現すること、およ
び所望により
（ｃ）生産されたモノクローナル抗体を単離し、精製すること
を含む、ヒトＴＦＰＩと結合するモノクローナル抗体を生産するための方法であって、該
核酸分子は本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む方法もまた
提供する。
【００６４】
１つの例において、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、標準分子生
物学技術により得られる部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が
転写および翻訳コントロール配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入さ
れる。この文脈において、「作動可能に連結される」なる用語は、ベクター内の転写およ
び翻訳コントロール配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果た
すように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベ
クターおよび発現コントロール配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択さ
れる。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されるか、ま
たはより一般的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され得る。抗体遺伝子は、
標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクターにおける相補的制限酵素認識
部位のライゲーション、または制限酵素認識部位が存在しないとき、平滑末端ライゲーシ
ョン）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重
鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内でＣＨセグメントに作動可能に連結され、Ｖ
Ｌセグメントがベクター内でＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイ
ソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入すること
により、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創造するために使用することができ
る。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促
進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子の
アミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニング
することができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シ
グナルペプチド（すなわち、非免疫タンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【００６５】
抗体鎖コード遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体
鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。「調節配列」なる用語は、抗体鎖
遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現
コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。こ
のような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzy
mology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列の
選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の
発現レベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細
胞発現のための調節配列の例は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指向
するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス
４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａ
ｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
あるいは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプ
ロモーターが使用され得る。
【００６６】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば
、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能
なマーカー遺伝子を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている
宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２
１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選
択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において薬物、例えば、
Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を与える。選択可能な
マーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサー
ト選択／増幅でのｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のための）およびネオ遺伝子（Ｇ４１
８選択のための）を含む。
【００６７】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技
術により宿主細胞にトランスフェクトされる。種々の形態の「トランスフェクション」な
る用語は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使
用される多種多様の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または
真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることが理論的に可能であるが
、真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性
な抗体を集合させ分泌しやすいため、真核細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞におけ
る抗体の発現が最も好ましい。
【００６８】
組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-
621に記載されているＤＨＦＲ選択可能なマーカーを使用するUrlaub and Chasin, (1980)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含
む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺
伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、抗体は、宿
主細胞における抗体の発現または宿主細胞が培養される培養培地への抗体の分泌を可能に
する十分な期間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は、標準タンパク質精
製方法、例えば、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーおよび遠心分離を使用して、培養培地から回収することができる。
【００６９】
インタクトな抗体を発現させるための部分的抗体配列の使用
抗体は、６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して主に標的抗原と
相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも
個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が非常に抗体抗原相互作用に関与するため
、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上にグラフトされた特定の天
然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特
性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L.ら 1998, Na
ture 332:323-327; Jones, P.ら 1986, Nature 321:522-525;およびQueen, C.ら 1989, P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033参照）。このようなフレームワーク配列
は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから得ることができる。
これらの生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟中のＶ（Ｄ）Ｊ連結により形成される完全に集
合された可変遺伝子を含まないため、成熟抗体遺伝子配列と異なる。起源の抗体と同様の
結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再創造するために、特定の抗体の全ＤＮＡ配
列を得る必要はない（ＷＯ９９／４５９６２参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖お
よび軽鎖配列が、一般的に、この目的のために十分である。部分的な配列は、生殖細胞系
列可変および連結遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与することを決定するた
めに使用される。次に、生殖細胞系列配列は、可変領域の欠損部分を満たすために使用さ
れる。重鎖および軽鎖リーダー配列は、タンパク質成熟中に開裂され、最終抗体の特性に
起因しない。この理由のため、発現構築物のために対応する生殖細胞系列リーダー配列を
使用することが必要である。欠損配列を加えるため、クローンｃＤＮＡ配列は、ライゲー
ションまたはＰＣＲ増幅により合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あ
るいは、全可変領域は、短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成され、ＰＣＲ増
幅により組み合わせられ、完全に合成可変領域クローンを創造することができる。このプ
ロセスは、特定の制限酵素認識部位の除去または包含、または特定のコドンの最適化のよ
うなある利点を有する。
【００７０】
重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、天然配列と同一のアミノ酸コード能力
を有する合成Ｖ配列を創造するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計する
ために使用される。合成重鎖および軽鎖配列は、３つの点において天然配列と異なり得る
：繰り返されたヌクレオチド塩基の連続が、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を
容易にするため中断され；最適な翻訳開始部位が、Ｋｏｚａｋのルール（Kozak, 1991, J
. Biol. Chem. 266:19867-19870）にしたがって組み込まれ；制限エンドヌクレアーゼ部
位が、翻訳開始部位の上流に操作される。
【００７１】
重鎖および軽鎖可変領域両方において、最適化されたコードおよび対応する非コード鎖
配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０−５０ヌクレオチド断
片に分解される。したがって、それぞれの鎖において、オリゴヌクレオチドは、１５０−
４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複二本鎖セットに集合され得る。次に、プー
ルは、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生産するために鋳型として使用さ
れる。一般的に、単一の可変領域オリゴヌクレオチドセットは、別々に増幅され、２つの
重複ＰＣＲ産物を産生する２つのプールに分解される。次に、これらの重複産物をＰＣＲ
増幅により組み合わせて、完全可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物中に容易
にクローニングすることができるフラグメントを産生するために、ＰＣＲ増幅において重
鎖または軽鎖定常領域の重複フラグメントを含むことが望ましいことがある。
【００７２】
次に、再構築された重鎖および軽鎖可変領域をクローン化されたプロモーター、翻訳開
始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化および転写終止配列と組み合わせ、発現ベク
ター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物は、単一のベクター中に組み合わせら
れ、次に両方の鎖を発現する宿主細胞を形成するように融合される宿主細胞に共トランス
フェクトされるか、連続トランスフェクトされるか、または別々にトランスフェクトされ
得る。
【００７３】
したがって、別の局面において、ヒト抗ＴＦＰＩ抗体の構造的特徴は、ＴＦＰＩへの結
合の機能を保持する構造的に関連したヒト抗ＴＦＰＩ抗体を創造するために使用される。
さらに具体的に、本発明のモノクローナル抗体の具体的に同定された重鎖および軽鎖領域
の１つまたはそれ以上ＣＤＲは、本発明のさらに組換え的に操作されたヒト抗ＴＦＰＩ抗
体を創造するために、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に組み合わ
され得る。
【００７４】
医薬組成物
治療有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬
組成物もまた提供する。「薬学的に許容される担体」は、調製物を製剤化または安定化さ
せるための手助けとなり、患者に有意な有害毒物学的効果を引き起こさない活性成分に加
えられ得る物質である。このような担体の例は当業者によく知られており、水、糖、例え
ば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む
。他の担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinにおい
て記載されている。このような組成物は、治療有効量の少なくとも１つの抗ＴＦＰＩモノ
クローナル抗体を含む。いくつかの態様において、このような組成物は、治療有効量の１
つまたはそれ以上の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含み得る。いくつかの態様において
、医薬組成物は、上記Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に特異的に結合する抗体および上記Ｋｕｎ
ｉｔｚドメイン１および２に特異的に結合する抗体を含み得る。
【００７５】
薬学的に許容される担体は、滅菌の水溶液または分散媒体および滅菌の注射可能な溶液
または分散媒体の即時調製物のための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこの
ような媒体および薬剤の使用は、当分野で知られている。該組成物は、好ましくは非経口
注射のために製剤化される。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまた
は他の高薬物濃度に適当な規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水
、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポ
リエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であ
り得る。いくつかの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マン
ニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含む。
【００７６】
滅菌の注射可能な溶液は、必要なとき、上記成分の１つまたは組合せを有する適当な溶
媒中に必要な量の活性化合物を含み、次に精密濾過で滅菌することにより調製することが
できる。一般的に、分散媒体は、基本的な分散媒体および上記成分からの必要な他の成分
を含む滅菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌の注射可能な
溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のいくつかの方法は、真空乾燥およびフリーズ
ドライ（凍結乾燥）であり、予め滅菌ろ過処理した溶液から、活性成分プラス任意の付加
的な所望の成分の粉末が得られる。
【００７７】
医薬的使用
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するた
めの治療目的のために使用することができる。例えば、上記態様におけるモノクローナル
抗体は、ＴＦＰＩとＦＸａとの相互作用をブロックするか、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ活性
のＴＦＰＩ依存性阻害を防止するために使用され得る。さらに、モノクローナル抗体はま
た、ＦＸａのＴＦ／ＦＶＩＩａ−駆動産生を回復させ、ＦＸａのＦＶＩＩＩ−もしくはＦ
ＩＸ−依存性増幅の欠乏を迂回させるために使用され得る。
【００７８】
モノクローナル抗体は、止血の障害、例えば、血小板減少症、血小板障害および出血性
障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃ）の処置における治療的使用を有する
。このような障害は、治療有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者に投
与することにより処置され得る。モノクローナル抗体はまた、適応症におけるコントロー
ルされていない出血、例えば、外傷および出血性脳卒中の処置において治療的使用を有す
る。したがって、治療有効量の本発明の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を必要とする患者
に投与することを含む出血時間を短縮するための方法もまた提供する。
【００７９】
抗体は、単剤療法または止血障害に対する他の治療と組み合わせて使用することができ
る。例えば、１つまたはそれ以上の本発明の抗体と凝固因子、例えば、第ＶＩＩａ因子、
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子との共投与は、血友病を処置するために有用であると考
えられる。１つの態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第１の
量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与
することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための方法で
あって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有効であ
る方法を提供する。別の態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する
第１の量のモノクローナル抗体および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の第２の量
を投与することを含む凝固における遺伝的および後天的欠乏または欠損を処置するための
方法であって、該第１および第２の量は合わせて、該欠乏または欠損を処置するために有
効であり、さらに、第ＶＩＩ因子は共投与されない方法を提供する。本発明はまた、治療
有効量の本発明のモノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組合せを
含む医薬組成物であって、第ＶＩＩ因子を含まない組成物を含む。「第ＶＩＩ因子」は、
第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子を含む。これらの組合せ治療は、凝固因子の必要な注
入頻度を減少させる可能性がある。共投与または併用療法は、それぞれ別々に製剤化され
た、または１つの組成物中で共に製剤化された２つの治療薬物の投与を意味し、別々に製
剤化されたとき、ほぼ同時で、または同じ治療期間にわたってであるが異なる時間で投与
される。
【００８０】
医薬組成物は、出血症状の重症度により変化し得る、または予防治療の場合、患者の凝
固欠乏の重症度により変化し得る用量および頻度で、血友病ＡまたはＢに罹患している対
象に非経口的に投与され得る。
【００８１】
組成物は、ボーラスとして、または連続的な注入により必要とする患者に投与され得る
。例えば、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体のボーラス投与は、０．０
０２５から１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０から
０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０−０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。連続的な注入
のために、Ｆａｂフラグメントとして存在する本願発明の抗体は、０．００１から１００
ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から０．７
５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０−０．５０ｍｇ
／ｋｇ／分で１−２４時間、１−１２時間、２−１２時間、６−１２時間、２−８時間ま
たは１−２時間、投与され得る。全長抗体（完全定常領域を有する）として存在する本願
発明の抗体の投与のための投与量は、約１−１０ｍｇ／ｋｇ体重、２−８ｍｇ／ｋｇまた
は５−６ｍｇ／ｋｇであり得る。このような全長抗体は、一般的に３０分から３時間の期
間に延長され注入により投与される。投与の頻度は状態の重症度に依存する。頻度は、週
に３回から２または３週間毎に１回の範囲であり得る。
【００８２】
さらに、組成物は、皮下注射を介して患者に投与され得る。例えば、１０から１００ｍ
ｇの用量の抗ＴＦＰＩ抗体を、１週間毎、２週間毎または１月毎に皮下注射を介して患者
に投与することができる。
【００８３】
本明細書において使用される「治療有効量」は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体、また
は、このような抗体およびインビボで凝固時間を有効に増加させるか、またはさもなけれ
ば必要とする患者にインビボで測定可能な利益を与えるために必要である第ＶＩＩＩ因子
または第ＩＸ因子の組合せの量を意味する。正確な量は、限定はしないが、治療組成物の
成分および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の検討などを含む多数の因子に
依存し、当業者により容易に決定することができる。
【００８４】
実施例
実施例１．大腸菌からの組換えＴＦＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン２）の発現および精製
発現系
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎと表される目的ベクター（Ｇａｔｅｗａｙ命名法にしたがって）を
利用した。ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎは、ｐＥＴ−１６  ｂ（Novagen）に基づき、さらに、Ｈ
ｉｓ１０およびＮｕｓＡタグならびにＨｉｓ１０／ＮｕｓＡおよび興味あるタンパク質か
らなる融合タンパク質の発現のためのＧａｔｅｗａｙクローニングカセットをコードする
。
【００８５】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２のＮ−末端（Ｌｙｓ９３からＰｈｅ１５４、参照Ｕｎｉｐｒｏ
ｔ  １０６４６）およびＧａｔｅｗａｙ結合部位（ａｔｔＢ１−５＃、ａｔｔＢ２−３＃
、Invitrogen）に融合したトロンビン切断部位をコードするＴＦＰＩ構築物を、ｐＤ  Ｅ
ｃｏ５  Ｎ  ベクターにクローニングし、ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ＴＦＰＩ  ＫＤ２と表さ
れる発現ベクターを得た。ＢＬ２１  ＤＥ３（Novagen）発現株を利用した。
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ＴＦＰＩ  ＫＤ２を使用して発現される融合タンパク質のアミノ酸
配列、６００ＡＡ
【表１】
2018172411.tif 000003
【表２】
2018172411.tif 000004
配列構成要素
【表３】
2018172411.tif 000005
【００８６】
発現
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ＃２０９で形質転換されたＢＬ２１  ＤＥ３株を、１４時間３７
℃で１８０ｒｐｍの撹拌速度で２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを有する２×５０ｍＬの
ＬＢ培地中で前培養として培養した。次に、４００ｍＬのＣｉｒｃｌｅｇｒｏｗ培地（Q-
Biogene）を有する８つの震盪フラスコをそれぞれ、８ｍＬの前培養物で植菌し、１８０
ｒｐｍの撹拌速度で３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００の培養密度で、ＩＰＴＧ（
１００ｍＭの最終濃度）を遺伝子誘導のために加え、１８０ｒｐｍで１７℃で２４時間さ
らに培養した。大腸菌を遠心分離（３０００ｇ、１０分）によりペレット化し、−８０℃
で貯蔵した。
【００８７】
精製
３．２Ｌの培養物からのペレット化された大腸菌集団を、２００ｍＬの溶解バッファー
（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｗ）
グリセロール、４０ｍＭのイミダゾール、プロテアーゼインヒビターカクテル  Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−フリー（Roche））に再懸濁し、高圧デバイス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕ
ｉｄｓ）でホモジェナイズし、次に、溶解物を遠心した（１００．０００ｇ、６０分、４
℃）。いくつかの精製工程をＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ系を使用して行った。濃縮され
たサンプルを、最初のＩＭＡＣ  クロマトグラフィー工程において、２連結５ｍＬ単位の
Ｈｉ−Ｔｒａｐ−セファロース  ＨＰ  マトリックス（ＧＥ）に付した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ
−セファロース  ＨＰ  マトリックスの平衡、融合タンパク質結合および洗浄を、バッフ
ァーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭの
イミダゾール）を使用して行った。ＮｕｓＡ−ＴＦＰＩ融合タンパク質の溶離のために、
バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、
４０から５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配を使用した。溶離画分をプールし、（Ａｍ
ｉｃｏｎ  限外ろ過デバイスを使用する６−７のファクターによる）濃縮し、バッファー
をＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０と交換した。濃縮されたサンプル（６−７ｍＬ）を、Ｔ
ｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０中Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−１００（ＸＫ２６／７４）を使用す
るサイズ排除クロマトグラフィーにさらに付した。融合タンパク質を含む主なピークの画
分を貯め、限外ろ過（Amicon）により５ｍＬの容量に濃縮した。トロンビン（ＨＴＩ）を
サンプル（比率  酵素：融合タンパク質、１：５０ｗ／ｗ）に加え、２１℃で５時間イン
キュベートし、最後に反応をＰＭＳＦ（１ｍＭの最終濃度）により停止した。次に、第２
のサイズ排除クロマトグラフィー工程（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０中Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ−１００  （ＸＫ２６／７４））を行い、ピーク画分をＰＡＧＥによりモニタリング
した。単量体ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２なしの画分を回収し、濃縮し（Amicon）
、３．２Ｌの大腸菌培養物から約４ｍｇの産物を得た。
【００８８】
実施例２．ＴＦＰＩに対する組換えモノクローナル抗体Ｆａｂ  Ａの生産、大腸菌におけ
る発現およびその精製
発現
Ｆａｂ  Ａを、発現ベクターｐＥＴ２８ａおよび大腸菌株  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ  ＤＥ
３を使用して共発現した。発現ベクターにおいてコードされる軽鎖および重鎖領域をそれ
ぞれ、Ｎ−末端にてペリプラズムのシグナル配列に融合した。重鎖領域は、Ｆａｂの精製
のためにＣ−末端にＨｉｓ６タグもコードした。ＴＢ−Ｉｎｓｔａｎｔ  一晩発現培地に
おいて培養された形質転換された大腸菌株を、組換えタンパク質発現の自己誘導のために
使用した（#71491, Novagen）。簡潔には、１０ｍＬの形質転換された大腸菌培養物（５
０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中）を、３７℃で１４時間、３０μｇ／ｍＬのカナマイシ
ンを有するＬＢ培地中で前培養として培養し、１８０ｒｐｍで撹拌した。次に、５００ｍ
ＬのＴＢ−Ｉｎｓｔａｎｔ一晩発現培地を有する４つのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを
それぞれ、２ｍＬの前培養物で植菌し、１８０ｒｐｍで３０℃で２４時間インキュベート
した。培養物を１０，０００ｇで１０℃で３０分間遠心し、Ｆａｂを含む上清を、さらな
る産物精製のために即座に使用されるか、または−２０または−８０℃で貯蔵した。
【００８９】
あるいは、Ｆａｂを、１０Ｌのバイオリアクター（Sartorius）中で、発現ベクターｐ
ＥＴ２８ａおよび大腸菌株  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ  ＤＥ３を使用して発現させた。５００
ｍＬの形質転換された大腸菌培養物を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有するＬＢ培地
中で３７℃で１７時間培養し、１６５ｒｐｍで撹拌し、次に、１０Ｌの自己誘導培地を有
する撹拌されるバイオリアクターを植菌するために使用した。自己誘導培地は１リットル
あたり以下の成分を含んだ：１２ｇのトリプトン、２４ｇの酵母抽出物、９．９ｇのグリ
セロール（８７％）、１２．５４ｇのＫ２ＨＰＯ４、２．３１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２
５ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇのグルコース、２．５ｇのラクトース、３０ｍｇのカ
ナマイシン。バイオリアクターでの培養を２４時間（３０℃で３５０−最大８００ｒｐｍ
で）行い、次に、培養上清物を、遠心機（Heraeus）における遠心分離によりバイオマス
を除去することにより回収した。
【００９０】
精製
Ｆａｂを、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ｓデバイスで２工程クロマトグラフィー
方法を使用して精製した。中空繊維モジュール（１０ｋＤａカットオフ閾値）を、１Ｌの
透明な培養上清を１００ｍＬの最終容量に濃縮し、バッファーＡ（５０ｍＭのリン酸Ｎａ
ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）を有するバッファー組
成物で平衡にするために適用した。Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ系を有する最初の固定化
金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）工程において、濃縮されたサンプル
を、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローマトリックス（Qiagen）に付した。Ｎｉ−ＮＴ
Ａマトリックスの平衡、サンプル結合および洗浄を、バッファーＡ（結合は２１℃で行い
、全ての他のクロマトグラフィー工程は４℃で行った）を使用して行った。Ｆａｂの溶離
のために、バッファーＡ中、１０から２５０ｍＭのイミダゾールの直線勾配を使用した。
単一の溶離ピークからの画分をプールし（６０ｍＬ全容量）、限外ろ過により１０ｍＬに
濃縮し、Ｈｉ−Ｐｒｅｐ２６／１０  脱塩カラムを使用してバッファーをＰＢＳ  ｐＨ７
．４に調整した。次に、ＰＢＳで平衡化された２ｍＬの抗カッパ軽鎖抗体マトリックス（
ＢＡＣからのＫａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ、０８３３．１
０）を、撹拌下で室温で１時間、濃縮されたＩＭＡＣ溶出液とインキュベートした。結合
したサンプルを有するマトリックスを、クロマトグラフィーカラムに移し、ＰＢＳで洗浄
した。Ｆａｂサンプルを２ｍＬのグリシンｐＨ２．０で溶離し、１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ
７．５で中和し、バッファーをＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ、１７−０８５１−０１）でＰ
ＢＳに調整した。
【００９１】
Ｆａｂを１０Ｌのバイオリアクター（Sartorius）を使用して大腸菌において発現させ
るとき、以下の精製方法を使用した。遠心された培養上清物を、５および０．２μｍの細
孔径を有する２つの使い捨てフィルターモジュール（ＧＥ、ＫＭＰ−ＨＣ−９２０４ＴＴ
；ＫＧＦ−Ａ−０５０４ＴＴ）を介して連続して濾過した。中空繊維モジュール（１０ｋ
Ｄａカットオフ閾値）を、透明な培養上清を１５００ｍＬの最終容量に濃縮し、バッファ
ー組成物をバッファーＡに調整するために適用した。２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡスーパーフ
ローマトリックス（Qiagen、バッファーＡにおいて平衡化された）を、濃縮されたサンプ
ルに加え、２１℃で１．５時間インキュベートした。結合したサンプルを有するマトリッ
クスを、空のクロマトグラフィーカラム（２５×１２５ｍｍ）に移し、Ａｋｔａ  Ｅｘｐ
ｌｏｒｅｒ  クロマトグラフィーデバイスに接続し、バッファーＡ（約２５０ｍＬ）で洗
浄した。Ｆａｂの溶離のために、５％（３０ｍＬ）および１０％（３５ｍＬ）のバッファ
ーＢでの２つの後の段階勾配、次に、１００％までのバッファーＢの直線溶離勾配を適用
した。次に、プールした溶離画分（７２ｍＬ）を以下のとおり処理した：遠心分離限外ろ
過デバイス（カットオフ１０ｋＤａ、Amicon）で２０ｍＬの最終容量に濃縮、バッファー
をＰＢＳ  ｐＨ７．４に調整した脱塩カラム（ＧＥ  ＨｉＰｒｅｐ、２６／１０）に３回
に分けて加える、および遠心分離限外ろ過デバイス（Amicon）において４０ｍＬの最終容
量へのさらなる濃縮。濃縮されたサンプルを、撹拌下で室温で１時間、５ｍＬの抗カッパ
軽鎖抗体マトリックス（Kappa Select Affinity Media、ＢＡＣ、ＰＢＳで平衡化された
）とインキュベートした。結合したサンプルを有するセファロースマトリックスを、クロ
マトグラフィーカラムに移し、以下の洗浄工程の順序で処理した、１５ｍＬのＰＢＳで４
回；５ｍＬの洗浄バッファー（１００ｍＭのリン酸Ｎａ  ｐＨ６．０、１００ｍＬのＮａ
Ｃｌ、５００ｍＭのアルギニン）で２回。溶離工程は、バッファー１００ｍＭのグリシン
ＨＣｌｐＨ３．０の５ｍＬの適用の３回からなる。溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ
ｐＨ８．０で即座に中和し、形成された沈殿物を遠心分離（１０分、３．２００ｇ）に
より取り出した。サンプルを限外ろ過（Amicon）により濃縮し、ＴＢＳバッファーを有す
るＡｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  クロマトグラフィー系におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５
分取グレード  １６／６０  カラムに付した。ピーク画分をＰＡＧＥにより分析し、１
．１モル比におけるＦａｂの重鎖および軽鎖を示す画分をプールし、限外ろ過（Amicon）
により１ｍＬの最終容量に再び濃縮した。約４ｍｇのＦａｂ  Ａを１０Ｌの大腸菌培養物
上清物から単離した。
【００９２】
分析サイズ排除クロマトグラフィー（Akta Micro system、Ｓ７５  ５／１５０  カラ
ム、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐｈ７．５）を使用し、Ｆａｂ  Ａ／ＴＦＰＩ  Ｋ
Ｄ２複合体形成を証明した。したがって、Ｆａｂ  Ａ、ＴＦＰＩ  ＫＤ２およびＦａｂ  
ＡプラスＴＦＰＩ  ＫＤ２の混合物を別々に分析した（図１）。
【００９３】
実施例３．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａ複合体の結晶化およびＸ線構造決定
結晶化
ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２およびモノクローナル抗体Ｆａｂ  Ａの共結晶を、
シッティング・ドロップ(sitting-drop)方法を使用して２０℃で成長させた。タンパク質
複合体を９ｍｇ／ｍＬに濃縮し、等容量のタンパク質溶液およびウェル溶液（１５％  Ｐ
ＥＧ８０００、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５）を沈殿剤として混合することにより結晶
化した。結晶は次の日に現れた。
【００９４】
データ回収および処理
結晶を、低温保護のために結晶化バッファー中３０％のグリセロールにおいて液体窒素
にて急速冷凍した。データを、ＭＡＲ  ＣＣＤ検出器におけるビームラインＢＬ１４．１
、ＢＥＳＳＹシンクロトロン（Berlin）で回収した。データを、ＸＤＳ（W. Kabsch (201
0) Acta Cryst. D66, 125-132）またはＩＭＯＳＦＬＭ（The CCP4 Suite: Programs for 
Protein Crystallography (1994) Acta Cryst. D50, 760-763; A.G.W. Leslie, (1992), 
Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, No. 26）で指数化し
、組み込み、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82）でス
ケーリングのために調製し、ＳＣＡＬＡ（P.R. Evans, (2005) Acta Cryst. D62, 72-82
）でスケーリングした。結晶は、最大２．６Åで回折し、セル定数ａ＝６５．７、ｂ＝１
１４．７、ｃ＝１５１．９；α＝β＝γ＝９０°で空間群Ｐ２１２１２１、および非対称
ユニットにおける２つのＴＦＰＩ−Ｆａｂ複合体を有した。
【００９５】
構造決定および精密化
ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２およびモノクローナル抗体Ｆａｂ共構造を、ＰＨＡ
ＳＥＲ（A.J. McCoyら (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674）ならびに公開されたサー
チモデルとしてＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（ｐｄｂコード１ｔｆｘ）およびＦａ
ｂフラグメント（ｐｄｂコード３ｍｘｗ）のＸ線構造を使用して分子置換により解析した
。分子置換の前に、Ｆａｂモデル配列を、ＣＨＡＩＮＳＡＷ（N. Stein, (2008) J. Appl
. Cryst. 41, 641 - 643）で修飾した。ＣＯＯＴ（P. Emsleyら (2010) Acta Cryst. D66
:486-501）でのモデル構築およびＲＥＦＭＡＣ５．５（G.N. Murshudovら (1997) Acta C
ryst. D53, 240-255）を使用する最尤精密化の反復繰り返しによって、モデルを完成した
。ＫＤ２の領域Ｐｈｅ  Ａ  ３１−Ａｓｎ  Ａ  ３５、Ｐｒｏ  Ｂ  ９、Ｌｙｓ  Ｍ  １
３９−Ｓｅｒ  Ｍ  １４２、およびＡｓｐ１４０−Ｐｈｅ１５４は、弱い電子密度を示し
、モデルに含まれなかった。データセットおよび精密化統計値は、表１に要約される。
【００９６】
表１．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａ複合体に対するデータセットおよび精密化統計値
【表４】
2018172411.tif 000006
【００９７】
実施例４．Ｆａｂ  ＡのＸ線構造ベースのエピトープマッピング
ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ａの複合体（図２）は、非対称ユニットあたり２つのコピーの複合
体として結晶化した。複合体の主鎖は、関連ＴＦＰＩエピトープに結合されるそれぞれの
Ｆａｂと０．７Åの総標準偏差（ＲＭＳＤ）で重なる。Ｆａｂ  Ａ（エピトープ）と接触
するＴＦＰＩの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＣＣＰ４プログラムＡＲＥＡ
ＩＭＯＬ（P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38）で分析した。最小５Å２埋め
込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表２）。Ｔ
ＦＰＩ（パラトープ）と接触するＦａｂ  Ａの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を
、ＡＲＥＡＩＭＯＬで分析した。最小５Å２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込ま
れる表面での残基は、接触と考える（表３）。
【００９８】
表２：Ｆａｂ  Ａと接触するＴＦＰＩの残基。Ｃ鎖およびＮ鎖は、非対称ユニットにお
けるそれぞれの複合体のＴＦＰＩに対応する。
【表５】
2018172411.tif 000007
【００９９】
表３：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ  Ａの残基。Ａ鎖、Ｂ鎖およびＬ鎖、Ｍ鎖は、非対称
ユニットにおけるそれぞれの複合体のＦａｂ  Ａの軽鎖および重鎖を示す。
【表６】
2018172411.tif 000008
【０１００】
Ｆａｂ  Ａにより認識される非直線エピトープは、領域Ｇｌｕ１００−Ａｒｇ１０９お
よびＬｙｓ１２６、Ｇｌｙ１２８−Ａｓｎ１３３により定義される。Ｆａｂ  Ａにおける
パラトープは、軽鎖（ｌｃ）残基ｌｃ＿Ｔｙｒ３７、ｌｃ＿Ｔｙｒ９６、ｌｃ＿Ａｓｐ９
７、ｌｃ＿Ｓｅｒ９８、ｌｃ＿Ｔｙｒ９９およびｌｃ＿Ｌｅｕ１０１ならびに重鎖（ｈｃ
）残基ｈｃ＿Ａｓｎ３２、ｈｃ＿Ｓｅｒ３３、ｈｃ＿Ａｌａ３５、ｈｃ＿Ｉｌｅ５２、ｈ
ｃ＿Ｔｙｒ５４、ｈｃ＿Ａｒｇ５６、ｈｃ＿Ｌｙｓ５８、ｈｃ＿Ｔｙｒ６０、ｈｃ＿Ａｒ
ｇ６２、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０２、ｈｃ＿Ｓｅｒ１０４、ｈｃ＿Ａｓｐ１０５およびｈｃ＿Ｔ
ｒｐ１０８を含む。ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、接触の数に基づ
いて主な相互作用部位であることを示す。
【０１０１】
エピトープは、Ｃｙｓ１０６およびＣｙｓ１３０間のジスルフィド架橋により連結され
る２つのループからなる（図３）。ジスルフィド架橋は、ＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ｔｒｐ１
０８に対して積み重なっているが、隣接Ｉｌｅ１０５およびＬｅｕ１３１は、ｈｃ＿Ａｌ
ａ３５、ｈｃ＿Ｉｌｅ５２、ｈｃ＿Ｔｙｒ５４（ＣＤＲ−Ｈ２）、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０２（
ＣＤＲ−Ｈ３）、およびｌｃ＿Ｔｙｒ９６、ｌｃ＿Ｓｅｒ９８、ｌｃ＿Ｔｙｒ９９、ｌｃ
＿Ｌｅｕ１０１（ＣＤＲ−Ｌ３）により作られる疎水性裂隙において埋め込まれる。接触
の数に基づいて、Ｉｌｅ１０５およびＬｅｕ１３１は、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ２およ
びＣＤＲ−Ｈ３との疎水性接触における重要なエピトープ残基である。
【０１０２】
ＴＦＰＩ領域Ｇｌｕ１０１−Ｉｌｅ１０５は、ＣＤＲ−Ｈ２と相互作用する。接合面は
、ｈｃ＿Ｔｙｒ５４、ｈｃ＿Ｔｙｒ６０およびｈｃ＿Ａｒｇ６２により強く特徴付けられ
る。Ｈｃ＿Ｔｙｒ５４は、Ａｓｐ１０２の側鎖との極性相互作用を示す。Ｈｃ＿Ｔｙｒ６
０は、Ｇｌｕ１０１の主鎖カルボニル酸素との極性相互作用を示し、ｈｃ＿Ａｒｇ６２は
、Ａｓｐ１０２の側鎖およびＧｌｙ１３２の主鎖カルボニル酸素との極性相互作用を示す
。
【０１０３】
Ａｓｐ１０２は、ＣＤＲ−Ｈ２のｈｃ＿Ｔｙｒ５４およびｈｃ＿Ａｒｇ６２との極性相
互作用における重要なエピトープ残基である。Ｆａｂ  Ａにおけるアルギニンへの野生型
ｈｃ＿Ａｓｐ６２の置換は、１２０倍の親和性の増加をもたらす。Ｘ線構造に基づいて、
これは、ｈｃ＿Ａｓｐ６２およびＡｓｐ１０２間の反発からｈｃ＿Ａｒｇ６２およびＡｓ
ｐ１０２、および主鎖カルボニル酸素の極性相互作用への切り替えにより説明することが
できる。
【０１０４】
Ａｒｇ１０７のグアニジン基は、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ａｓｎ３２
およびｈｃ＿Ａｓｐ１０５の側鎖のそれぞれと直接相互作用する。Ａｒｇ１０７は、第Ｘ
ａ因子の阻害のために重要であると示されている（M.S. Bajajら (2001) Thromb Haemost
86(4):959-72.）。Ｆａｂ  Ａは、該重要な残基を占有し、第Ｘａ因子を阻害するＡｒｇ
１０７機能と競合する。
【０１０５】
実施例５．Ｆａｂ  Ａおよびその最適化された変異体Ｆａｂ  Ｃのパラトープ比較
Ｆａｂ  Ａの最適化された変異体であるＦａｂ  ＣによるＴＦＰＩエピトープ結合の一
貫性を評価するために、Ｆａｂ  Ｃの軽鎖および重鎖の配列アラインメント（図１１Ａ）
および相同性モデル（図１１Ｂ）を、Ｆａｂ  ＣにおけるＦａｂ  Ａパラトープ残基の保
存について分析した。相同性モデルを、インプット鋳型構造として本発明者らのＴＦＰＩ
−Ｆａｂ  Ａ  Ｘ線構造を使用して、ＤＳ  ＭＯＤＥＬＥＲ（ACCELRYS, Inc; Fiser, A.
and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493）で計算した。相同性モデル
は、ＲＭＳＤ＜０．５ÅでＦａｂ  Ａと比較してほぼ同一の骨格構造を示す。ＴＦＰＩ−
Ｆａｂ  Ａ複合体において観察される２０個のパラトープ残基のうち、ｈｃ＿Ａｓｎ３２
は、Ｆａｂ  Ｃにおいて、異なる唯一のパラトープ残基であり、そこでは、アスパラギン
酸残基がその位置にある（図１１）。Ｈｃ＿Ａｓｎ３２は、ＴＦＰＩ  Ａｒｇ１０７と相
互作用する。そのカルボキシレート基およびＡｒｇ１０７のグアニジン基との有望な相互
作用を考慮すると、Ｆａｂ  ＣのＡｓｐ３２は、ＴＦＰＩとよりしっかりと相互作用する
はずである。Ｆａｂ  ＡおよびＦａｂ  Ｃパラトープ残基および予期される同一の骨格構
造間の高い配列保存に基づいて、Ｆａｂ  Ｃは、Ｆａｂ  Ａと同じＴＦＰＩエピトープを
恐らく認識する。
【０１０６】
実施例６．ＴＦＰＩ−第Ｘａ因子相互作用の阻害に関するＸ線構造ベースの理論的根拠
Ｆａｂ  Ａは、ＴＦＰＩ−第Ｘａ因子相互作用および阻害を予測する。ＴＦＰＩ−Ｆａ
ｂ  Ａ複合体とＴＦＰＩ−トリプシンの構造との重ね合わせ（M.J. Burgeringら (1997) 
J Mol Biol. 269(3):395-407）は、Ｆａｂ  Ａのエピトープを含むＴＦＰＩ領域が第Ｘａ
因子に対する代替物であるトリプシンとの相互作用のために重要であることを示す。Ｘ線
構造に基づいて、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２上の観察されるエピトープへのＦａｂ  Ａの結
合は、立体障害により第Ｘａ因子の結合を排除するはずである（図４）。
【０１０７】
実施例７．組換えＴＦＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２）の生産、大腸菌における発現
およびその精製
発現系
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎと表される目的ベクター（Ｇａｔｅｗａｙ命名法にしたがって）は
、ＥＴ−１６  ｂ（Novagen）に基づく。該ベクターはまた、Ｈｉｓ１０およびＮｕｓＡ
タグならびにＨｉｓ１０／ＮｕｓＡおよび興味あるタンパク質からなる融合タンパク質の
発現のためのＧａｔｅｗａｙクローニングカセットをコードする。
【０１０８】
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２のＮ−末端（Ａｓｐ１からＰｈｅ１５４、参照Ｕｎｉｐｒ
ｏｔ  １０６４６、成熟ＴＦＰＩアルファ）およびＧａｔｅｗａｙ結合部位（ａｔｔＢ１
−５＃、ａｔｔＢ２−３＃、Invitrogen）に融合したＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコー
ドするＤＮＡ構築物を、ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ベクターにクローニングし、ｐＤ  Ｅｃｏ
５  Ｎ  ＴＦＰＩ  ＫＤ１＋２と表される発現ベクターを得た。使用される発現株はＢＬ
２１  ＤＥ３（Novagen）であった。
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ＴＦＰＩ  ＫＤ１＋２を使用して発現される融合タンパク質のアミ
ノ酸配列、６００ＡＡ
【表７】
2018172411.tif 000009
配列構成要素
【表８】
2018172411.tif 000010
【０１０９】
発現
ｐＤ  Ｅｃｏ５  Ｎ  ＴＦＰＩ  ＫＤ１＋２で形質転換されたＢＬ２１  ＤＥ３株を、
１８０ｒｐｍの撹拌をしながら、３７℃で１４時間、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを
有する２×１００ｍＬのＬＢ培地中で前培養として培養した。１０Ｌ培養容量（ＬＢ培地
、２００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を有するバイオリアクター（Sartorius Stedim Bio
tech）を２００ｍＬの前培養物で植菌し、１５０ｒｐｍの撹拌をしながら３７℃でインキ
ュベートした。ＯＤ６００の培養密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−チオガラク
トシド）を、遺伝子誘導のために１００ｍＭの最終濃度に加え、５０％のｐＯ２最小レベ
ルおよび１８０−８００ｒｐｍの撹拌速度で１７℃で２４時間さらに培養した。大腸菌を
遠心分離（３０００ｇ、１０分）によりペレット化し、−８０℃で貯蔵した。
【０１１０】
精製
１０Ｌの培養物からのペレット化された大腸菌集団を、５００ｍＬの溶解バッファー［
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｗ）グ
リセロール、４０ｍＭのイミダゾール、プロテアーゼインヒビターカクテル  Ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ  ＥＤＴＡ−フリー（Roche）］に再懸濁し、高圧デバイス（Microfluids）でホモ
ジェナイズし、次に、溶解物を遠心した（１００．０００ｇ、６０分、４℃）。いくつか
の精製工程をＡｋｔａ精製系を使用して行った。遠心された可溶性溶解物画分を、最初の
ＩＭＡＣクロマトグラフィー工程において、５０ｍＬのＮｉ−セファロース  ＨＰ  マト
リックス（ＧＥ）を含むカラムに付した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ−セファロース  ＨＰ  マトリ
ックスの平衡、融合タンパク質結合および洗浄を、バッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール）を使用して行っ
た。ＮｕｓＡ−ＴＦＰＩ融合タンパク質の溶離のために、バッファーＢ（５０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中、４０から５００ｍＭのイミダゾ
ールの直線勾配を使用した。溶離画分をプールし（全容量１４０ｍＬ）、５０ｍＭのＴｒ
ｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２を有するバッフ
ァーへの交換のために、脱塩カラム  Ｈｉ  Ｐｒｅｐ  ２６／１０（ＧＥ）（２つの連結
カラムユニット）に画分において付した。Ｎｕｓ  Ａタグの除去のために、Ｈｉｓ６−タ
グ化ＴＥＶでのタンパク質分解消化を、１：６６ｗ／ｗの酵素  対  融合タンパク質比率
で、４℃で１６時間行った。サンプルを、５０ｍＬのＮｉ−セファロース  ＨＰ  マトリ
ックス（ＧＥ）を含むカラムに再び付し、未開裂融合タンパク質およびＨｉｓ−ＴＥＶか
ら遊離ＴＦＰＩを分離した。次に、ＩＭＡＣ工程の溶出液を、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、カラム  Ｓ１００、ＧＥ）に付し、単量
体ＴＦＰＩ画分を単離し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ、３ｋＤａ−カットオフ範囲でのユニ
ット）により約１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。精製された最終ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚド
メイン１＋２サンプルは、約１８ｋＤａの見かけの分子量で、ＰＡＧＥにおいて二重バン
ドで現れた。さらなる分析（ＳＥＣ、ウェスタンブロット）は、上部のバンドに対応する
タンパク質のみが、Ｆａｂ  Ｂと免疫反応性であったことを示した。
【０１１１】
実施例８．ヒト  ＩｇＧ１由来のＦａｂ  Ｂのタンパク質分解処理および精製
発現
Ｆａｂ  Ｂを、そのヒトＩｇＧ１形態からタンパク質分解処理した。Ｆａｂ  Ｂ＿Ｉｇ
Ｇ１は、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３）において分泌タンパク質として発現した。ＩｇＧ
１単離のために、１．６Ｌの培養上清を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲＥの
２つの連結カラム（ＧＥから、５ｍＬベッド容量、流速１．５ｍＬ／分、４℃、１６時間
）に付した。カラム洗浄および平衡のために、ＰＢＳおよび５００ｍＭのＮａＣｌからな
るバッファーを使用した。結合したＩｇＧ１を溶離し（５０ｍＭの酢酸Ｎａ、５００ｍＭ
のＮａＣｌ  ｐＨ３．５、次に、ｐＨ３．０で同じバッファー）、中和し（２．５ＭのＴ
ｒｉｓ＞１１）、約１３ｍｇ／ｍＬに限外ろ過により濃縮した。
【０１１２】
固定されたパパイン（Ｐｉｅｒｃｅ、２０ｍＬのスラリー）を、１．５ｍＬのＥｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ反応チューブ中、２２画分を使用して、約２７０ｍｇ（１２．５ｍＬ中）のＩ
ｇＧ１の消化のために使用した（インキュベーション１６時間、３７℃、撹拌１４００ｒ
ｐｍ）。処理後、サンプルを遠心し、上清を回収し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、上清お
よび除去される洗浄物の両方をプールした。
【０１１３】
消化されたサンプルを、ＦｃおよびＦａｂ物質の分離を可能にする２つの連結ＨｉＴｒ
ａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（２×５ｍｌ）に再び付した。プールされた単
離されたＦａｂ  Ｂ画分を、限外濾過により約８ｍｇ／ｍＬ（全収量１２０ｍｇ）に濃縮
した。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（カラム２６／６０、ＰＢＳでの流速２．５ｍＬ／
分）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、さらなる精製のために使用した。さらなる濃
度および滅菌濾過後、Ｆａｂ  Ｂの最終収量は、８．５ｍｇ／ｍＬの濃度で１１５ｍｇで
あった。
【０１１４】
分析サイズ排除クロマトグラフィー（Ａｋｔａ  Ｍｉｃｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｓ７５  
５／１５０  カラム、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を使用し、Ｆａｂ  
Ｂ／ＴＦＰＩ  ＫＤ１＋２複合体形成を証明した（図５）。Ｆａｂ  Ｂにおいて、ＳＥＣ
カラムにおいて予想外に長期の保持時間が、ＴＦＰＩ  ＫＤ１＋２に対して検出される分
子量と非常に類似である２０ｋＤａの見かけの分子量に対応して、観察された。
【０１１５】
実施例９．Ｆａｂ  Ｂとの複合体ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２の生産
免疫複合体を形成するために、ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２およびＦａｂ  
Ｂを、約１：１．５（ｗ／ｗ）の比率で混合した。したがって、３．８５ｍｇの濃縮され
た単量体ＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１＋２タンパク質（Ｓ１００  プールされた画
分から）を７．４ｍｇのＦａｂ  Ｂ（ＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５から）と混合し、２
１℃で１６時間インキュベートした。複合体形成は、分析ＳＥＣ（Ｓ２００／１５０）お
よびウェスタンブロットを介して証明された。複合体を、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中でＳＥＣ（Ｓ２００  ２６／２６）によりさ
らに精製し、限外ろ過（Amicon、５ｋＤａ−カットオフ範囲でのユニット）により１０．
３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、これを結晶化のために使用した。
【０１１６】
実施例１０．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体の結晶化およびＸ線構造決定
結晶化
ＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（ＫＤ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（ＫＤ２
）を含むタンパク質構築物ならびにモノクローナルＴＦＰＩ抗体Ｆａｂ  Ｂの共結晶を、
シッティング・ドロップ方法を使用して４℃で成長させた。タンパク質複合体を１０ｍｇ
／ｍＬに濃縮し、等容量のタンパク質溶液およびウェル溶液（２０％  ＰＥＧ８０００）
を沈殿剤として混合することにより結晶化した。結晶は３日後に現れた。
【０１１７】
データ回収および処理
結晶を、低温保護のために結晶化バッファー中３０％のグリセロールにおいて液体窒素
にて急速冷凍した。１つの結晶のデータを、ＭＡＲ  ＣＣＤ検出器におけるビームライン
ＢＬ１４．１、ＢＥＳＳＹシンクロトロン（Berlin）で回収した。データを、ＩＭＯＳＦ
ＬＭ（A.G.W. Leslie, (1992), Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crysta
llography, No. 26）で指数化し、組み込み、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳ（P.R. Evans, (2005) 
Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングのために調製し、ＳＣＡＬＡ（P.R. Evans, (2
005) Acta Cryst. D62, 72-82）でスケーリングした。結晶は、最大２．３Åで回折し、
セル定数ａ＝８０．３、ｂ＝７１．９、ｃ＝１０８．８；β＝９２．５°で空間群Ｐ２１
、および非対称ユニットにおける２つのＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２−Ｆａｂ複合体を有
した。
【０１１８】
構造決定および精密化
ＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２およびモノクローナル抗体Ｆａｂの共構造を、ＰＨＡＳＥ
Ｒ（A.J. McCoyら (2007) J. Appl. Cryst. 40, 658-674）、ＭＯＬＲＥＰ（A.Vagin and
A.Teplyakov (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-10）ならびにサーチモデルとしてＴＦ
ＰＩ−ＫＤ２（ｐｄｂコード１ｔｆｘ）およびＦａｂフラグメント（ｐｄｂコード１ｗ７
２）の社内で公開されたＸ線構造を使用して分子置換により解析した。分子置換の前に、
ＦａｂおよびＫＤ１モデルを、ＣＨＡＩＮＳＡＷ（N. Stein, (2008) J. Appl. Cryst. 4
1, 641 - 643）で処理した。ＣＯＯＴ（P. Emsleyら (2010) Acta Cryst. D66:486-501）
でのモデル構築およびＲＥＦＭＡＣ５．５（G.N. Murshudovら (1997) Acta Cryst. D53,
240-255）を使用する最尤精密化の反復繰り返しによって、モデルを完成した。両方のＦ
ａｂの領域ｈｃ＿Ｓｅｒ１３１−ｈｃ＿Ｓｅｒ１３６、ＴＦＰＩ残基Ａｓｐ１−Ｌｅｕ２
１、Ａｓｐ１４９−Ｐｈｅ１５４、およびＫＤ１−ＫＤ２リンカー残基Ａｒｇ７８−Ｇｌ
ｕ９２は、弱い電子密度を示し、モデルに含まれなかった。データセットおよび精密化統
計値は、表４に要約される。
【０１１９】
表４．ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体に対するデータセットおよび精密化統計値
【表９】
2018172411.tif 000011
【０１２０】
実施例１１．Ｘ線構造ベースのエピトープマッピング
ＴＦＰＩ−ＫＤ１、−ＫＤ２、およびＦａｂ  Ｂの複合体（図６）は、非対称ユニット
あたり２つのコピーの複合体として結晶化した。複合体の主鎖は、関連ＴＦＰＩ−ＫＤ１
および−ＫＤ２のエピトープに結合されるそれぞれのＦａｂ  Ｂと１．０ÅのＲＭＳＤで
重なる。両方のＫｕｎｉｔｚドメインは、Ｆａｂ  Ｂと直接的に、または水介在相互作用
を介して相互作用する。ＫＤ１およびＫＤ２はまた、互いに相互作用する。Ｆａｂ  Ｂ（
エピトープ）と接触するＴＦＰＩの残基およびそれぞれの埋め込まれる表面を、ＣＣＰ４
プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（P.J. Briggs (2000) CCP4 Newsletter No. 38）で分析し
た。最小５Å２埋め込まれる表面または５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と
考える（表５）。ＴＦＰＩ（パラトープ）と接触するＦａｂ  Ｂの残基およびそれぞれの
埋め込まれる表面を、ＡＲＥＡＩＭＯＬで分析した。最小５Å２埋め込まれる表面または
５０％以上埋め込まれる表面での残基は、接触と考える（表６）。
【０１２１】
表５：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ  Ｂの残基。Ｃ鎖、Ｄ鎖およびＮ鎖、Ｏ鎖は、非対称
ユニットにおけるそれぞれの複合体のＴＦＰＩ  Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉ
ｔｚドメイン２を示す。
【表１０】
2018172411.tif 000012
【表１１】
2018172411.tif 000013
【０１２２】
表６：ＴＦＰＩと接触するＦａｂ  Ｂの残基。Ａ鎖、Ｂ鎖およびＬ鎖、Ｍ鎖は、非対称
ユニットにおけるそれぞれの複合体のＦａｂ  Ｂの軽鎖および重鎖を示す。
【表１２】
2018172411.tif 000014
【表１３】
2018172411.tif 000015
【０１２３】
Ｆａｂ  Ｂは、ＴＦＰＩ−ＫＤ１の残基Ａｓｐ３１−Ｌｙｓ３６、Ｃｙｓ５９（これは
、Ｃｙｓ３５とジスルフィド架橋を形成する）、Ｇｌｕ６０およびＡｓｎ６２ならびにＴ
ＦＰＩ−ＫＤ２のＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、領域Ｐｒｏ１０３−Ｃｙｓ１０６（これ
は、Ｃｙｓ１３０とジスルフィド架橋を形成する）、残基Ａｒｇ１０７−Ｔｙｒ１０９、
Ｐｈｅ１１４、Ａｓｎ１１６、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４および残基Ｌｙｓ１２６−Ｇ
ｌｙ１２８により定義されるＫＤ１およびＫＤ２の非直線エピトープを認識した。ＴＦＰ
Ｉ−ＫＤ１と相互作用するＦａｂ  Ｂにおけるパラトープは、ｌｃ＿Ｌｅｕ２７−ｌｃ＿
Ｔｙｒ３１、ｌｃ＿Ａｓｐ５０、ｌｃ＿Ａｓｎ６５、ｌｃ＿Ｔｒｐ９０、ｌｃ＿Ａｓｐ９
２、ｌｃ＿Ｇｌｙ９３、およびｈｃ＿Ａｒｇ１０１およびｈｃ＿Ｔｙｒ１０２を含む。Ｔ
ＦＰＩ−ＫＤ２と相互作用するＦａｂ  Ｂにおけるパラトープは、ｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ｌ
ｃ＿Ｔｙｒ４８およびｌｃ＿Ｔｙｒ４９、およびｈｃ＿Ｔｈｒ２８、ｈｃ＿Ａｒｇ３０−
ｈｃ＿Ｔｙｒ３２、ｈｃ＿Ｔｙｒ１００、ｈｃ＿Ａｒｇ１０１、ｈｃ＿Ｔｒｐ１０３、お
よびｈｃ＿Ａｓｐ１０５を含む。軽鎖ＣＤＲは、接触の数に基づいて、ＴＦＰＩ−ＫＤ１
に対して主な相互作用部位であり、重鎖ＣＤＲは、ＴＦＰＩ−ＫＤ２に対して主な相互作
用部位であることを示す。
【０１２４】
ＴＦＰＩ−ＫＤ１における非直線エピトープは、Ｃｙｓ３５およびＣｙｓ５９間のジス
ルフィド架橋により連結される２つのループ領域からなる。該エピトープは、Ａｓｐ３１
、Ａｓｐ３２、Ｇｌｕ６０、およびＬｙｓ３６とＦａｂ  Ｂとの極性相互作用の三角形に
より取り囲まれているＰｒｏ３４の中央疎水性相互作用により特徴付けられる（図７）。
【０１２５】
Ｐｒｏ３４は、ＣＤＲ−Ｌ１のｌｃ＿Ｔｙｒ３０およびｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ＣＤＲ−Ｌ
３のｌｃ＿Ｔｒｐ９０およびＣＤＲ−Ｈ３のｈｃ＿Ｔｙｒ１０２により作られる疎水性裂
隙にある。Ａｓｐ３１およびＡｓｐ３２は、ＣＤＲ−Ｈ３との極性相互作用およびｈｃ＿
Ａｒｇ１０１、ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２、および水分子との水素結合ネットワークを有する。
Ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２側鎖は、Ｐｒｏ３４との疎水性相互作用、Ａｓｎ３１との極性相互作
用、およびＣＤＲ−Ｌ３のｌｃ＿Ｔｒｐ９０との芳香族性π−π相互作用を有する位置に
置かれる。
【０１２６】
Ａｓｐ３１およびＡｓｐ３２とＣＤＲ−Ｈ３との相互作用は、重要なエピトープ特徴で
あり、ｈｃ＿Ｔｙｒ１０２およびｈｃ＿Ａｒｇ１０１の方向および相互作用は極めて重要
なようである。野生型残基ｈｃ＿Ｌｙｓ９９のロイシンへの突然変異は、２０倍の親和性
増加をもたらした。Ｈｃ＿Ｌｅｕ９９は、軽鎖および重鎖間の疎水性接合面に位置し、Ｃ
ＤＲ−Ｈ３ループに続く。極性およびフレキシブルな(flexible)リジン側鎖は、該位置で
不利な点であり、最適なＣＤＲ−Ｈ３構造および抗原相互作用を妨げる。
【０１２７】
極性の三角形の第２コーナーを形成するＧｌｕ６０は、ｌｃ＿Ｔｙｒ３０の側鎖（ＣＤ
Ｒ−Ｌ１）、ｌｃ＿Ｔｒｐ９０およびｌｃ＿Ｇｌｙ９３の主鎖窒素（ＣＤＲ−Ｌ３）と相
互作用する。
【０１２８】
三角形の第３コーナーは、Ｌｙｓ３６により形成される。Ｌｙｓ３６は、ＴＦＰＩによ
る第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体の阻害のために重要な残基である（M.S. Bajajら (20
01) Thromb Haemost 86(4):959-72.）。Ｆａｂ  Ｂとの複合体において、Ｌｙｓ３６は、
ＣＤＲ−Ｌ１  ｌｃ＿Ｌｅｕ２７、ｌｃ＿Ａｒｇ２８、ｌｃ＿Ａｓｎ２９、ｌｃ＿Ｔｙｒ
３１、ＣＤＲ−Ｌ２  ｌｃ＿Ａｓｐ５０、および水分子と有意に接触し、埋め込まれる。
Ｆａｂ  Ｂへの結合の間、Ｌｙｓ３６と第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体との相互作用お
よびその阻害は、排除されるようである。
【０１２９】
ＴＦＰＩ−ＫＤ２における非直線エピトープは、残基Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ｐ
ｒｏ１０３−Ｔｙｒ１０９、Ｐｈｅ１１４；Ａｓｎ１１６およびＧｌｕ１２３；Ａｒｇ１
２４、Ｌｙｓ１２６−Ｇｌｙ１２８を含む３つの区画からなる。ＫＤ２−エピトープは、
Ｆａｂ  Ｂ  ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ１、および−Ｈ３と極性および疎水性相互作用
を形成する（図８）。
【０１３０】
Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｒｇ１０７およびＴｙｒ１０９は、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｇ
ｌｕ１００およびＧｌｕ１０１との相互作用）ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ３（Ａｒｇ１
０７との相互作用）、およびＣＤＲ−Ｌ２、−Ｈ３（Ｔｙｒ１０９との相互作用）により
作られるＦａｂ  Ｂの３つの分離された表面領域と接触して、強い極性または疎水性固定
点を提供する重要なエピトープ残基である。
【０１３１】
Ａｒｇ１０７は、ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｈ３のそれぞれのｌｃ＿Ｔｙｒ３１、ｌｃ
＿Ｔｙｒ４９、ｈｃ＿Ａｒｇ１０１、およびｈｃ＿Ｔｙｒ１０２により有意に接触され、
ＫＤ１のＧｌｙ３３およびＣｙｓ３５とさらに相互作用する。Ａｒｇ１０７は、第Ｘａ因
子の阻害のために重要であることが示されている（M.S. Bajajら (2001) Thromb Haemost
86(4):959-72.）。Ｆａｂ  Ｂは、該重要な残基を占有し、第Ｘａ因子を阻害するＡｒｇ
１０７機能を排除する。
【０１３２】
Ｇｌｕ１００およびＧｌｕ１０１は、ＣＤＲ−Ｈ１残基ｈｃ＿Ａｒｇ３０、ｈｃ＿Ｓｅ
ｒ３１、およびｈｃ＿Ｔｈｒ２８およびｈｃ＿Ｔｙｒ３２との水素結合を形成する。
【０１３３】
Ｔｙｒ１０９は、ＣＤＲ−Ｌ２  ｌｃ＿Ｔｙｒ４８、およびＣＤＲ−Ｈ３残基ｈｃ＿Ｔ
ｙｒ１００、およびｈｃ＿Ｔｒｐ１０３により作られる疎水性ニッチにあり、ｈｃ＿Ａｓ
ｐ１０５との水素結合を形成する。
【０１３４】
実施例１２．Ｆａｂ  Ｂおよびその最適化された変異体Ｆａｂ  Ｄのパラトープ比較
Ｆａｂ  Ｂの最適化された変異体であるＦａｂ  ＤによるＴＦＰＩエピトープ結合の一
貫性を評価するために、Ｆａｂ  Ｄの軽鎖および重鎖の配列アラインメント（図１２Ａ）
および相同性モデル（図１２Ｂ）によって、Ｆａｂ  ＤにおけるＦａｂ  Ｂパラトープ残
基の保存について分析した。相同性モデルを、インプット鋳型構造として本発明者らのＴ
ＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ  Ｘ線構造を使用して、ＤＳ  ＭＯＤＥＬＥＲ（ACCELRYS, Inc; Fis
er, A. and Sali A. (2003) Methods in Enzymology, 374:463-493）で計算した。相同性
モデルは、ＲＭＳＤ＜０．５ÅでＦａｂ  Ｂと比較してほぼ同一の骨格構造を示す。ＴＦ
ＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体において観察される２９個のパラトープ残基のうち、７つの残基
（５つの軽鎖残基、２つの重鎖残基）は、Ｆａｂ  Ｄと異なる（図１２）。Ｌｃ＿Ａｒｇ
２８；ｌｃ＿Ａｓｎ２９、ｌｃ＿Ａｓｐ９２、およびｌｃ＿Ｇｌｙ９３は、ＴＦＰＩエピ
トープ残基との主鎖相互作用を示す。Ｆａｂ  Ｄにおけるこれらの残基の交換は、異なる
ＴＦＰＩエピトープへの結合を誘導することが予期されない。Ｆａｂ  Ｄにおけるｌｃ＿
Ｔｙｒ４８およびｈｃ＿Ｇｌｎ１のフェニルアラニンおよびグルタミン酸による置換は、
極性側鎖相互作用がＸ線構造において観察されないため、無視できる。Ｈｃ＿Ａｒｇ３０
は、ＴＦＰＩのＧｌｕ１００との極性相互作用を示し、Ｆａｂ  Ｄにおけるセリンと交換
される。該位置で、アルギニンは、ＴＦＰＩと相互作用するため、セリンよりも好ましい
はずである。Ｆａｂ  ＢおよびＦａｂ  Ｄパラトープ残基間の分析される交換、全配列保
存およびＦａｂ  Ｄ相同性モデルの低いＲＭＳＤの予期される影響に基づいて、Ｆａｂ  
Ｄは、Ｆａｂ  Ｂと同じＴＦＰＩエピトープを認識すると考えられる。
【０１３５】
実施例１３  第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体とのＴＦＰＩ相互作用の
阻害に関するＸ線構造ベースの理論的根拠
Ｆａｂ  Ｂは、ＴＦＰＩのＫＤ１およびＫＤ２の両方に結合する。ＫＤ２は、第Ｘａ因
子に結合し、阻害する。ＫＤ１は、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体に結合し、阻害する
。トリプシンとの複合体におけるＫＤ２（M.J. Burgeringら (1997) J Mol Biol. 269(3)
:395-407）ならびにＴＦの細胞外部分および第ＶＩＩａ因子との複合体におけるＢＰＴＩ
（E. Zhangら (1999) J Mol Biol 285(5):2089-104.）のＸ線構造は、報告されている。
トリプシンは第Ｘａ因子に対する代替物であり、ＢＰＴＩはＴＦＰＩ−ＫＤ１のホモログ
である。ＴＦＰＩ−Ｆａｂ  Ｂ複合体とＫＤ２−トリプシンまたはＢＰＴＩ−第ＶＩＩａ
因子／組織因子のいずれかとの重ね合わせは、抗体結合が、ＫＤ１およびＫＤ２の、それ
らの天然リガンド、第ＶＩＩａ因子／組織因子および第Ｘａ因子それぞれへの結合を排除
することを示す（図９、図１０）。
【０１３６】
実施例１４．Ｆａｂ  ＣおよびＦａｂ  Ｄは、ＦＸａおよびＦＶＩＩ／ＴＦとのＴＦＰＩ
結合をブロックした
Ｆａｂ  ＣおよびＦａｂ  Ｄが、ＴＦＰＩにおいてＦＶＩＩａ／ＴＦ−複合体またはＦ
Ｘａ−結合をブロックすることができることを確認するために、本発明者らは、表面プラ
ズモン共鳴（Biacore）試験を行った。ＣＭ５チップを、アミンカップリングキット（GE 
Healthcare）を使用して１７０ＲＵのヒトＴＦＰＩで固定した。６０μＬのＦａｂ  Ｃ、
Ｆａｂ  ＤまたはネガティブコントロールＦａｂの容量を注射し、６０μＬの５μｇ／ｍ
ＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体またはＦＸａをチップ上に注射した。凝固因子の注射後、ｐ
Ｈ１．５での３０から４５μＬの１０ｍＭのグリシンを注射し、チップを再生した。ネガ
ティブコントロールＦａｂ後に産生された凝固因子の相対単位（ＲＵ）を１００％と表し
、Ｆａｂ  ＣまたはＦａｂ  Ｄが注射された後に産生された凝固因子のＲＵを計算した。
図１３Ａに示されるとおり、０．３μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度で、ＴＦＰＩに
おけるＦａｂ  Ｃ結合は、ＦＸａ結合を４２．６％および５．２％にそれぞれ有意な減少
を引き起こした。同様に、０．３および１μｇ／ｍＬの濃度でのＦａｂ  Ｄは、ＦＸａ結
合を２０．８％および７．６％にそれぞれ減少させた。ＦＶＩＩａ／ＴＦ結合の結果を、
図１３Ｂに示した。０．３および１μｇ／ｍＬの濃度で、Ｆａｂ  Ｃは、ＦＶＩＩａ／Ｔ
Ｆ結合を２５．１％および１０．０％にそれぞれ減少させたが、Ｆａｂ  Ｄは、ＦＶＩＩ
ａ／ＴＦ結合を完全にブロックし、ＴＦＰＩのＫＤ  １へのＦａｂ  Ｄの直接結合による
可能性が高かった。
【０１３７】
本発明は、特定の態様および実施例に関して記載しているが、種々の修飾および変化が
行われ得ること、均等物が本発明の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得
ることを理解すべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的意味よりもむし
ろ説明的意味であると考えるべきである。さらに、本明細書において言及されている全て
の文献、参考書、特許出願および特許は、出典明示によりそれらの全体を本明細書に包含
させる。
【図１】
2018172411.tif 000016
【図２】
2018172411.tif 000017
【図３】
2018172411.tif 000018
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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