(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫適合性および／または患者特異的ｈＰＳＣの確立のための技法の提供。【解決手段】活性化培地でインキュベーションして卵母細胞を活性化する段階、活性化された卵母細胞を活性化後培地（post-activation medium）でインキュベーションして単為生殖体を生成する段階、単為生殖体を培養培地でインキュベーションして胚盤胞を形成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞はｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を生成する方法。【選択図】図１
2018046839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を生成する方法であって、
活性化培地でインキュベーションして卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして単為生殖体を生成する段階と、
該単為生殖体を培養培地でインキュベーションして胚盤胞を形成させる段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階と、を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、方法。
【請求項２】
活性化培地がカルシウムイオノフォアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カルシウムイオノフォアが、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ボーベリシン、Ｘ−５３７Ａおよび／またはアベナシオリドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
活性化後培地が、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
活性化後培地が、第２極体放出を阻まない化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
卵母細胞が中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階卵母細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
卵母細胞が中期Ｉ（ＭＩ）段階卵母細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
卵母細胞が単一前核卵母細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が異型接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が同型接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が、集団の少なくとも１％と免疫適合性であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する  を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
単為生殖体由来胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞から分離された多能性細胞を含む、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）。
【請求項１６】
単為生殖体由来胚盤胞が、活性化培地で卵母細胞をインキュベーションして生成された単為生殖体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
活性化培地がカルシウムイオノフォアを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カルシウムイオノフォアが、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ボーベリシン、Ｘ−５３７Ａおよび／またはアベナシオリドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単為生殖体由来胚盤胞が、活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして生成された単為生殖体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
活性化後培地が、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が異型接合性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が同型接合性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が、集団の少なくとも１％と免疫適合性であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する多能性細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
多能性細胞が、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＳＳＥＡ−３、腫瘍拒絶抗原１−８１（Ｔｒａ−１−８１）、Ｔｒａ−１−６０、オクタマ結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−２（Ｓｏｘ−２）、nanog、ジンクフィンガータンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、lefty Ａ、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ）およびテロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１）からなる群から１または複数のマーカーを発現する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
多能性細胞が、内胚葉層、中胚葉層および外胚葉層由来の細胞に分化することができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
１または複数の請求項１５に記載の単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を含むｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株のライブラリー。
【請求項２９】
核移植ヒト多能性幹細胞株（ＮＴ−ｈＰＳＣ）を生成する方法であって、
卵母細胞の核を除去する段階と、
少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階と、
活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階と、を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加することが、直接注入を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加することが、体細胞融合を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
体細胞融合が、前記少なくとも１つのドナー細胞と、センダイウイルス、そのタンパク質または抽出物との接触を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのドナー細胞が体細胞または生殖細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
紫外線の不在下で遂行される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法によって生産されたＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株。
【請求項３８】
少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を卵母細胞に添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階と、
該卵母細胞の宿主核を除去する段階
を含む  核移植方法。
【請求項３９】
活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
他出願の相互参照
本出願は、米国で２０１３年２月１５日にそれぞれ出願された米国仮出願第６１／７６５，５４８号および同第６１／７６５，５６３号に対する３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）条の優先権を含む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者に特異的な多能性幹細胞（ｐＳＣ：pluripotent stem cell）を含む免疫適合性ｐＳＣに関する。単為生殖または核移植に係わる本明細書に記載された方法、および該技法によって生成された免疫適合性ｐＳＣの組成物は、再生医学治療法において広範囲な適用が見い出される。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、事実上体内で全ての体細胞類型に分化することができる驚くべき能力（多能性）を所有しながら、未分化状態で増殖能を維持する（自己再生）。ｈＰＳＣのかような固有の特徴は、糖尿病、骨関節炎およびパーキンソン病から、多くの他の疾病に至る疾患および状態の治療のために、移植可能な細胞および組織材料を生成する機会を提供する。多くの人間の損傷および疾患は、単一細胞種の欠陥を含む細胞欠陥が原因であるために、適切な幹細胞、前駆細胞、またはインビトロで分化された細胞と置き換えることは、臨床において、新規の治療的アプローチにつながる。また、生きているドナー、死体または胎児の供給源が、移植材料の供給源として役割を担ってきたが、多能性幹細胞の自己再生能は、ほぼ制限のない移植材料の資源をさらに提供する。追加的利点は、ｈＰＳＣが患者特異的方式で生成され、それによって、免疫拒絶反応の危険性を低減させる治療的アプローチおよび免疫寛容につながることである。従って、免疫適合性ｈＰＳＣおよび患者特異的ｈＰＳＣを含む再生細胞移植に対して大きな関心が寄せられている。
【０００４】
免疫適合性ｈＰＳＣ生成のための一戦略は、卵母細胞から単為生殖（すなわち、無性生殖）を促し、ｈＰＳＣ分離のための胚盤胞を生成することである。簡略にいえば、該アプローチは、精子受精の不在下で減数分裂および有糸分裂の過程を経るように卵母細胞を人工的に誘導して二倍体（２母系ゲノム）単為生殖体（parthenote）をもたらし、これをさらに胚盤胞へと培養し、ここからｈＰＳＣを分離することができる。単為生殖アプローチを利用して分離されたｈＰＳＣは、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ：parthenote-derived human pluripotent stem cell）として知られている。
【０００５】
代替的アプローチは、体細胞核移植（ＳＣＮＴ：somatic cell nuclear transfer）を介した患者特異的ｈＰＳＣの生成を可能にする。体細胞核移植は、ドナー患者の体細胞の核分離、および脱核されたレシピエント卵母細胞への挿入を含む。レシピエント卵母細胞の細胞質へのドナー核の移植は、体細胞遺伝子のサイレンシング、および胚遺伝子の活性化を介して、移植されたドナー核の再プログラミングをもたらす。再構築された卵母細胞から胚盤胞を培養物中に確立し、内部細胞塊（ＩＣＭ：inner cell mass）からｈＰＳＣを分離することができる。核移植ｈＰＳＣ（ＮＴ−ｈＰＳＣ）の結果は、患者の核遺伝物質を保有するために、これは、患者特異的である。２つの技法に係わる技術的手続きにおいて、有意の共通部分がある。例えば、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株を得るための初期試みは、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株生成の偶発的であって最初に知られた事例を引き起こした。
【０００６】
単為生殖およびＳＣＮＴの技法で嘱望される前進にもかかわらず、現在、実質的臨床的適用を不可能にする相当な限界がある。例えば、既存の単為生殖研究は、ドナー卵母細胞の約５０％において、成功裏の卵母細胞活性化を報告したが、核心的限界は胚盤胞形成の誘導であると見られ、これは、活性化された卵母細胞の１５％以下まで下がりうる。従来技法を利用する核移植に関連して、再構築された卵母細胞の２％以下のみが、胚盤胞形成に向かう８細胞限界点（threshold）を超える。同時に、それら限界は、ドナー卵母細胞の１０％未満がｐｎ−ｈＰＳＣに成功裏に培養されるということを意味する。後続ｐｎ−ｈＰＳＣは、異数性または核型不安定のような所望しない属性を経る。
【０００７】
一貫した再現可能な卵母細胞活性化および胚盤胞形成を可能とするメカニズムそのものは現在明らかでなく、現在ｐＳＣ株の生成を制限している障害は、これら過程のよりよい理解によって確実に一助を受けるであろう。
【０００８】
例えば、単為生殖において減数分裂期に発生する組み換え事象は、可変的な量の接合性を引き起こすことができる。従って、それら事象のリアルタイム視覚化は、胚盤胞形成およびｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株生成に係わる成功率を改善させるだけでなく、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞の特異的、遺伝的および免疫学的な特性を得ることを目標にした操作戦略の一助となる。同様に、ＮＴ−ｈＰＳＣを得るために通用するＳＣＮＴアプローチは、インビトロ受精クリニックから卵母細胞を利用する。また、異数性、核型不安定性および／または非効率的な核再プログラミングに起因した高い失敗率は、ＮＴ−ｈＰＳＣ誘導のために、さらに多数の卵母細胞を要求し、依然として患者特異的ではない細胞を生成するという限界がある。従って、ＳＣＮＴおよび／または単為生殖の技法を利用した、免疫適合で患者特異的なｈＰＳＣの一貫した効率的な生成を可能とする技法への、当該技術分野での大なる必要性がある。
【０００９】
免疫適合性および／または患者特異的ｈＰＳＣの確立のための技法を本明細書に記載する。一局面において、効率的なＳＣＮＴおよび／または単為生殖は、改善された技法を利用して説明する。これは、細胞損傷を減少させる顕微操作や、強い染色剤の使用および／またはＵＶ光露出なしでのリアルタイム視覚化のためのポロスコープ（poloscope）顕微鏡での改善を含む。さらに重要なこととしては、効率的な胚盤胞生成に係わる核心的障壁は、胚盤胞拡張を促進する精子誘導体からの有糸分裂構造（例えば、中心粒）の追加と共に、再構築された卵母細胞内でゲノム活性化を促進するメチル化変更剤（methylation-altering agent）の適用によって除去された。かような改善された技法の適用は、共通ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを発現するｐｎ−ｈＰＳＣのバンクの実現を可能とし、集団の広範囲な部分に免疫学的に適する細胞を提供する。全ての局面において、ｐｎ−ｈＰＳＣおよびＮＴ−ｈＰＳＣは動物タンパク質不含培養培地上で生育させることができ、これはヒト患者を最終的に含む臨床的適用において必須であり、遺伝的および後成的に（epigenetically）安定な、多能性である移植可能細胞を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
活性化培地でインキュベーションして卵母細胞を活性化する段階、活性化された卵母細胞を活性化後培地（post-activation medium）でインキュベーションして単為生殖体を生成する段階、単為生殖体を培養培地でインキュベーションして胚盤胞を形成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞はｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を生成する方法が本明細書に記載される。他の態様において、活性化培地は、カルシウムイオノフォアを含む。他の態様において、カルシウムイオノフォアは、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ボーベリシン（beauvericin）、Ｘ−５３７Ａおよび／またはアベナシオリド（avenaciolide）を含む。他の態様において、活性化後培地は、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む。他の態様において、活性化後培地は、第２極体放出を阻まない化合物を含む。他の態様において、卵母細胞は、中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階卵母細胞を含む。他の態様において、卵母細胞は、中期Ｉ（ＭＩ）段階卵母細胞を含む。他の態様において、卵母細胞は、単一前核（pronuclear）卵母細胞を含む。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、異型接合性（heterozygous）である。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、同型接合性（homozygous）である。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、集団の少なくとも１％と免疫適合するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する多能性細胞を含む。他の態様において、ＨＬＡハプロタイプは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲを含む。他の態様において、前記方法は、卵母細胞内に精子因子を注入する段階を含む。他の態様において、卵母細胞は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下でインキュベーションされる。
【００１１】
また、単為生殖体由来胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞から分離された多能性細胞を含む単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）が本明細書に記載される。他の態様において、単為生殖体由来胚盤胞は、卵母細胞を活性化培地でインキュベーションして生成された単為生殖体を含む。他の態様において、活性化培地は、カルシウムイオノフォアを含む。他の態様において、カルシウムイオノフォアは、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ボーベリシン（beauvericin）、Ｘ−５３７Ａおよび／またはアベナシオリドを含む。他の態様において、単為生殖体由来胚盤胞は、活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして生成された単為生殖体を含む。他の態様において、活性化後培地は、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、異型接合性である。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、同型接合性である。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、集団の少なくとも１％と免疫適合するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する多能性細胞を含む。他の態様において、多能性細胞は、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＳＳＥＡ−３、腫瘍拒絶抗原１−８１（Ｔｒａ−１−８１）、Ｔｒａ−１−６０、オクタマ（octamer）結合転写因子−４（Ｏｃｔ−４）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−２（Ｓｏｘ−２）、nanog、ジンクフィンガータンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、lefty Ａ、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ：teratocarcinoma-derived growth factor）およびテロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１：telomeric repeating binding factor）からなる群から１または複数のマーカーを発現する。他の態様において、多能性細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の胚葉層から由来した細胞に分化することができる。他の態様において、前記方法は、卵母細胞に精子因子を注入する段階をさらに含む。他の態様において、卵母細胞は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下でインキュベーションされる。また、１または複数のｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株を含む単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）のライブラリーが本明細書に記載される。
【００１２】
また、卵母細胞の核を除去する段階、少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階、活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化する段階、活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる、核移植ヒト多能性幹細胞株（ＮＴ−ｈＰＳＣ）を生成する方法が本明細書に記載される。他の態様において、前記方法は、直接注入を含む少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加する段階を含む。他の態様において、前記方法は、体細胞融合を含む少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加する段階を含む。他の態様において、体細胞融合は、少なくとも１つのドナー細胞と、センダイウイルス、そのタンパク質または抽出物との接触を含む。他の態様において、少なくとも１つのドナー細胞は、体細胞または生殖細胞を含む。他の態様において、前記方法は、紫外線の不在下で遂行される。他の態様において、前記方法は、卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む。他の態様において、卵母細胞は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下でインキュベーションされる。また、卵母細胞の核を除去する段階、少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階、活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階、活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる、方法によって生産されたＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株が本明細書に記載される。
【００１３】
また、少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を卵母細胞に添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階、および卵母細胞の宿主核を除去する段階を含む核移植方法が本明細書に記載される。他の態様において、前記方法は、活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階、活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる。他の態様において、前記方法は、卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む。他の態様において、卵母細胞は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下でインキュベーションされる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
例示的な態様は、参照された図面に図示される。本明細書に開示された態様および図面は、制限的であるとするより、例示的なことであるように見なされるように意図される。
【図１】卵母細胞の脱核。「ナイフピペット」の形状は、（Ａ）堅固で尖った微細な先端を介して、（Ｂ）保持ピペットによって静止状態で保持された細胞の側面エッジに対して先端が接近するとき、透明帯の効果的な穿通を可能にする。（Ｃ）穿通に続く、裂け目（fissure）の「ピンチング（pinching）」のための、丸い引きのばされたビーズ末端を介した卵母細胞操作、および（Ｄ）裂け目のエッジに近い極体の位置設定。ユーザがナイフピペットをより容易につまむことができるバルク構造を提供するさらに大きい中空チューブ本体で、（Ｅ）裂け目近くに位置した極体はその後、（Ｆ）抽出のために圧搾される。
【図２】ＮＴ−ＰＳＣの誘導。（Ａ）体細胞核移植された胚盤胞、（Ｂ）透明帯除去後のプレーティングされた胚、（Ｃ）ＮＴ胚の初期成長体（initial outgrowth）、（Ｄ）３継代後に形成された胚細胞様コロニー。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本願に引用された全ての参照文献は、完全に記載されたように、それらの全文が参照として組み入れられる。取り立てて定義されない限り、本明細書に使用された技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者らによって一般的に理解されるところと同一の意味を有する。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012); およびGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012) は、通常の技術者に、本出願で使用された多くの用語に係わる一般的な案内を提供する。抗体を調製する方法に係わる参照のために、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U. S. Patent No. 5,585,089 (1996 Dec); およびRiechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162): 323-7を参照する。
【００１６】
当業者は、本明細書に記載されたところと類似しているか、あるいは同等な多くの方法および物質を認識し、それは、本発明の実施に使用される。実際に、本発明は、いかなる方式であっても、本願に記載された方法に制限されるものではない。本発明の目的のために、次の用語は下記のように定義される。
【００１７】
本明細書で使用されている「投与」および／または「投与する」は、薬剤学的組成物を患者に送達する任意の経路を意味する。送達経路は、非侵襲的経口（口を介する）、局所（皮膚）、粘膜（鼻、口腔／舌下、膣、眼球および直腸）および吸入経路だけではなく、非経口経路、および当業界に公知された他の方法を含んでもよい。非経口的ということは、眼窩内、注入、動脈内、頚動脈内、関節嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、脊髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、皮膜下、皮下、経粘膜または経気管を含み、一般的に注入に係わる送達経路を意味する。非経口経路を介して、組成物は、注入または注射のための溶液または懸濁液の形態であり得、または凍結乾燥された粉末でもあり得る。
【００１８】
本明細書で使用されている「調節（modulation）」、「調節する（modulates）」または「調節すること（modulating）」は、応答の上向き調節（すなわち、活性化または刺激）、下向き調節（すなわち、阻害または抑制）、またはそれら２つの組み合わせもしくはそれぞれを意味する。
【００１９】
本明細書で使用されている「薬学的に許容される担体」は、本発明に有用である従来の薬学的に許容される担体を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されている「促進する」および／または「促進」は、細胞または有機体の特定作用での増大を意味する。
【００２１】
本明細書で使用されている「個体（subject）」は、哺乳類、伴侶動物、農場動物および動物園動物を含むが、それらにのみ制限されない他の動物を含む全ての動物を含む。用語「動物」は、例えば、哺乳動物、鳥、類人猿、犬、猫、馬、牛、齧歯類などを含む範囲である任意の生きている多細胞脊椎動物有機体を含んでもよい。同様に、用語「哺乳動物」は、人間および人間以外の哺乳動物をいずれも含む。
【００２２】
本明細書で使用されている「治療的有効量」は、治療中の個体において、目的とする効果を得るに十分な特定組成物または組成物中の活性剤の量である。治療的有効量は、個体の生理的状態（年齢、性別、疾病類型およびその段階、一般的な身体状態、与えられた服量に対する応答性、所望する臨床効果を含む）および投与経路を含むがそれらのみに制限されない各種因子によって変わりうる。臨床分野および薬理学的分野の当業者であるならば、通常の実験を介して、治療的有効量を決定することができるであろう。
【００２３】
本明細書で使用されている「治療」、「処置」および「処理」は、治療的処置および予防的または防止手段の両方を意味し、その目的は、治療が最終的に成功するものではないにしても、目的とする状態、疾病または障害（総体的に「疾患」）を防止したり、あるいは遅らせたり（軽減させたり）することである。治療が必要な者は、すでにその疾患にかかった者だけではなく、その疾患にかかる傾向がある者、またはその疾患が防止されなければならない者を含んでもよい。
【００２４】
記載されているように、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分離および特性分析、ならびに哺乳類での単為生殖および／または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）での新たな発見は、組織復旧、および移植医学での潜在的な適用と共に、研究に使用するための潜在的に制限されないｈＰＳＣの細胞源（source）生成の可能性を作り出した。
【００２５】
単為生殖に関して、結果として得られる細胞での父系寄与の除去が適用され、一部の例において、それは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の多様性を最小化するためである。それは、広い範囲の患者集団と広く免疫適合性である単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ）の生成を可能にする。同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の生成は、異型接合性変異を除去することによって、潜在的な免疫適合性をさらに改善する。ただ１つの対立形質セットの同型接合性発現の例において、それは、結果として得られるｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株がさらに容易に患者に適するものにする。例えば、一般的なハプロタイプに対して選択された、ほんの１０個のＨＬＡ同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株のパネルが、４０％近くの英国人レシピエントに完全なＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの一致を提供し、６５％近くに有益な一致を提供することができるということが報告された。治療的設定でのＳＣＮＴの適用を考慮するとき、類似した利点が存在する。ＳＣＮＴを介して得られた細胞（ＮＴ−ｈＰＳＣ）は、患者の核の遺伝物質を有し、この点において、個別の患者に特異的である。かような形態の自家移植は、免疫拒絶の危険性が有意に低い、患者への細胞移植を可能にする。
【００２６】
単為生殖およびＳＣＮＴの技法はいずれも、人為的な卵母細胞活性化を含み、それは、自然な精子受精の間に起こるカルシウム信号変化の模倣による。正常な卵母細胞の発達は、卵母細胞を中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階で停止させる（arrest）ための高レベルの中期促進因子（ＭＰＦ：metaphase promoting factor）活性による。ＭＩＩ卵母細胞の停止は、精子進入に起因した細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）レベルの変化によって妨害される。その後、サイクリンＢ（ＭＰＦ調節サブユニット）の標的分解が起こり、それは、細胞周期停止、前核形成、ならびに減数分裂および有糸分裂の過程から卵母細胞を解放する。
【００２７】
最初の段階として、単為生殖性卵母細胞活性化は、培養された卵母細胞を細胞周期停止から解放するための、人為的なカルシウム変更戦略による。例示は、カルシウムイオノフォア、脂質二重層を通過してイオンを伝達する脂溶性分子、例えば、イオノマイシンおよびＡ２３８１７の添加を含む。代替的な戦略は、電気的活性、またはイオンの直接的な注入による。単為生殖における２番目の主要段階は、第２極体放出（２ＰＢＥ）の放出を阻むＭＰＦ／サイクリンＢ阻害を維持することを含む。それは、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞分離のために、胚盤胞にさらに培養される二倍体（２母系ゲノム）単為生殖体の生成を誘導する。ＳＣＮＴに関連して、核移植された（すなわち、再構築された）卵母細胞の再構築の後にまた、カルシウム変更技法を使用した卵母細胞活性化が続く。
【００２８】
しかし、かようなＳＣＮＴおよび／または単為生殖の技法それぞれにおいて、著しい制限が存在する。例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤であるカフェインをヒツジ卵母細胞へ添加すると、成熟促進因子（ＭＰＦ：maturation promoting factor）、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性を増大させるということが報告され、類似の利点がサル卵母細胞で報告された一方、胚盤胞形成の頻度は上昇していない。また、カルシウムイオノフォア、電気的活性化、または直接的な注入を介したカルシウム活性化は、自然発生的な受精と同一のタイミング、空間的調節またはカルシウム振動の持続を起こさない。さらなる複雑性を加えるのは、カルシウムに対する影響は、種特異的なものでもあるようだということである。一部の例において、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）のようなキナーゼ阻害剤、エタノール、およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）のようなタンパク質合成阻害剤でのさらなる処理の使用は、牛、マウスおよび他の動物モデルで知られているように、ＭＰＦ不活性化を増大させるために使用される。かような薬剤の添加は、効果的である一方、他の問題点を示しうる。例えば、単為生殖性活性化の間、６−ＤＭＡＰの添加は、第２極体放出および二倍体細胞の生成を阻む一方、かようなアプローチは、さらに広範囲に免疫適合性である同型接合性ｈＰＳＣ細胞株の生成を可能にするものではない。
【００２９】
ＳＣＮＴに関係して、既存の技法は、異数性、および非効率的な核再プログラミングによって妨害され、それは、高レベルの発達停止および細胞死を誘導する。卵母細胞活性化非効率性と共に、核の除去、再構築の間の構造的および遺伝毒性的なストレス、ならびにＳＣＮＴ接合体の第１有糸分裂の間の欠陥は、いずれもＳＣＮＴを使用した望ましくない発達率に寄与すると提唱された。
【００３０】
免疫適合性および／または患者特異的ｈＰＳＣの生成のための効率的な技法を確立するために、本発明者らは、１）再構築、２）活性化、および３）ドナー細胞、においてバリエーションを有する異なるプロトコルを比較した。３つの局面いずれにおいても改善された理解は、効果的なＳＣＮＴ技法を提供することができる一方、卵母細胞活性化の改善された方法は、単為生殖に対する優れたアプローチを提供することができる。従って、ここに記載された技法は、再構築、活性化およびドナー細胞選択バリエーションの能力比較を提供し、ヒト単為生殖および／またはＳＣＮＴに対する効果的な条件を成功裏に特定する。
【００３１】
ここに記載されたところは、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）のための方法である。一態様において、ＳＣＮＴのための方法は、卵母細胞の核を除去する段階、一つまたは複数のドナー核を移植する段階、再構築された核移植された卵母細胞（胚）を活性化する段階、選択的に、胚盤胞にさらに培養する段階、および胚盤胞から多能性幹細胞（ｐＳＣ）を誘導する段階を含む。他の態様において、それは、脱核された卵母細胞への注入のための一つまたは複数のドナー核を分離する段階を含む。
【００３２】
多様な態様において、卵母細胞の核を除去する段階は、中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階での卵子紡錘糸を除去する段階を含む。多様な態様において、第１極体（１ＰＢＥ）が除去される。また、他の態様において、前記方法は、卵丘細胞を成熟完了前に剥皮（denude）する段階を含む。一態様において、卵母細胞は、リアルタイムで１ＰＢＥに対する非ＵＶ光ベースの観察で観察される。また、他の態様において、該観察は、染色または標識化剤、例えば、ヘキスト染色（Hoechst staining）の不在下で行われる。一態様において、それは、ポロスコープ、例えば、Research Instruments （ＣＲｉ） Oosight（商標）イメージングシステムの使用を含む。例えば、それは、５４５ｎｍ偏光によって収集されたＭＩＩ卵母細胞での透明帯および紡錘糸の複合体を視覚化する段階を含む。また、他の態様において、卵母細胞の核を除去する段階は、卵母細胞膜の穿刺および卵母細胞からの１ＰＢＥ除去を可能にする形付（contoured）マイクロピペットの使用を含む。また、他の態様において、卵母細胞の核を除去する段階は、圧電ドリル（piezoelectric drill）の使用を含む。他の態様において、核を除去する段階は、サイトカラシンＢ、および選択的に、タンパク質ホスファターゼ阻害剤、例えば、カフェインを含む脱核培地で遂行される。
【００３３】
他の態様において、ドナー核を移植する段階は、卵母細胞膜構造を変更する薬剤の使用を含む。一態様において、卵母細胞膜構造を変更する薬剤の使用を介した卵母細胞の核を除去する段階は、体細胞との融合を含む。例えば、ドナー核を移植する段階は、注入ピペット（例えば、１２μｍ径）で、３〜４個のドナー細胞を提供する段階、パラミクソウイルス、またはパラミクソウイルスタンパク質、例えば、センダイウイルス外被タンパク質を含む溶液の一定量中にドナー細胞を排出する段階を含んでもよい。その後、線形に配列されたドナー細胞から一定距離離れ（４〜５細胞長）、注入ピペットを使って細胞を回収する段階、保持ピペットで卵母細胞を保持する段階、ドナー細胞を有する注入ピペットを卵母細胞に前進させる段階が後に続く。注入ピペットを前進させる段階は、卵黄原形質膜の非破壊を含み、かつ核ドナー細胞を透明帯下に位置する卵黄原形質膜と接触させるために、卵母細胞の透明帯、および細胞膜間の空間である囲卵腔（perivitelline space）への１つの核ドナー細胞の挿入を含む。多様な態様において、ピペットの回収は、卵黄膜とドナー細胞との接触を妨害しない。多様な態様において、卵母細胞はさらにインキュベートされる。多様な態様において、細胞は、ドナー細胞挿入１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５分、またはそれ以上の後に融合される。多様な態様において、該細胞は、ドナー細胞挿入１０分後に融合される。選択的に、前記過程は、成功裏に融合されていない細胞に対して反復される。多様な態様において、ポロスコープ、例えば、Oosight（商標）イメージングシステムが全過程において使用される。
【００３４】
一態様において、ドナー核を移植する段階は、電気的細胞操作、例えば、電気融合（electrofusion）を含んでもよい。他の態様において、前記方法は、体細胞核ドナー、幹細胞核ドナー、および生殖細胞核ドナーの核を分離する段階を含んでもよい。他の態様において、前記方法は、ＳＣＮＴのための体細胞核を分離する段階後に、ピペットまたは圧電注入（piezoelectric injection）を介して、一つまたは複数のドナー核を挿入する段階を含む。多様な態様において、ドナー核は、細胞、例えば、皮膚線維芽細胞、白血球、毛嚢、または他の体細胞核ドナーに由来する。また、他の態様において、本発明は、生殖細胞ドナーからの核の分離および調製を含む方法を開示する。異なる態様において、核の分離は、組織生検、血液採取、または組織試料を得るための他の方法、機械的分離、コラゲナーゼ消化、洗浄、遠心分離に基づく密度勾配分離による組織の加工、および／または標準培養培地での培養を含む。
【００３５】
他の態様において、前記方法は、体細胞核ドナー、幹細胞核ドナーおよび生殖細胞核ドナーの核を分離および／または修飾する段階を含んでもよい。多様な態様において、それは、メチル化変更剤、例えば、後成的クロマチン（epigenetic chromatin）および／またはヒストン修飾剤および／またはＤＮＡ修飾剤を含む。特定態様において、それは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ１）および共活性化因子関連アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（coactivator-associated arginine methyltransferase １）（ＣＡＲＭ １／ＰＲＭＴ４）、またはオーファン核内受容体エストロゲン（orphan nuclear receptor estrogen）関連受容体β（Ｅｓｒｒｂ）タンパク質を含む。特定態様において、メチル化変更剤および／またはＤＮＡ修飾剤は、修飾された組み換えタンパク質として発現される。例えば、ＣＡＲＭ １およびＥｓｒｒｂは、７Ｘアルギニン（７Ｒ）細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、または細胞膜および核膜を通過してタンパク質およびペプチドの透過を増進させ、ＤＮＡとの結合および／または転写活性化を増進させると知られた他のタンパク質で、修飾される。他の態様において、前記方法は、転写因子に基づく再プログラミングを使用して、オクタマ結合転写因子４（octamer binding transcription factor−４）（Ｏｃｔ−４）、性決定部位Ｙ−ボックス−２（sex determining region Ｙ−box−２）（Ｓｏｘ−２）、nanog、クルッペル類似因子４（Kruppel−like factor−４）（Ｋｌｋ−４）、ＭｙｏＤ、ｃ−Ｍｙｃ、ジンクファインダタンパク質−４２（zinc finder protein−４２）（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、レフティＡ（lefty Ａ）、奇形癌腫由来成長因子（teratocarcinoma−derived growth factor）（Ｔｄｇｆ）および／またはテロメア反復結合因子（telomeric repeating binding factor）（Ｔｅｒｆ−１）で核ドナー細胞を後成的に再プログラミングする段階を含む。多様な態様において、前記方法は、直接的な圧電注入、ウイルス性注入、リポソーム性注入、または他の方法の細胞質内注入を含む。多様な態様において、転写因子は、脱核された卵母細胞への核移植の前に適用されるｍＲＮＡ、タンパク質および／または細胞抽出物の形態で送達されうる。他の態様において、前記方法は、ＨＤＡＣ阻害剤（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、またはＤＮＭＴ３ａ阻害剤およびＤＮＭＴ３ｂ阻害剤の使用を含んでもよい。
【００３６】
他の態様において、本発明は、再構築され核移植された卵母細胞を活性化する方法を開示する。一態様において、再構築され核移植された卵母細胞の活性化は、核移植卵母細胞を活性化培地で３７℃５分間処理する段階に続く、卵割培地（cleavage medium）で洗浄する段階を含む。異なる態様において、活性化培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地（cleavage assist medium）、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地、またはグローバルヒト胚培養培地（global human embryo culture medium）である。特定態様において、活性化培地は、カルシウムイオノフォアを含む。異なる態様において、カルシウムイオノフォアは、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ビュベリシン、Ｘ−５３７Ａ、アベナシオリド、モノマクロサイクリックポリエーテル（monomacrocyclic polyether）、あるいはマクロバイオサイクリック化合物（macrobiocyclic compound）またはクリプテート（cryptate）である。異なる態様において、活性化培地は、アルコール、例えば、エタノールを含む。異なる態様において、活性化培地は、チメロサールを含む。多様な態様において、活性化培地は、１、２、３、４、５、５μＭ、またはそれ以上のイオノマイシンを含む。他の態様において、前記方法は、ＭＩＩ段階卵母細胞の電気的活性化を含む。一態様において、電気的活性化は、電気的細胞融合培地での電気的パルスを含む。多様な態様において、電気的細胞融合培地は、０．１〜０．５Ｍマンニトール、０．０１〜１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、１〜１０ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．００５〜０．５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。一態様において、電気的細胞融合培地は、０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、３ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。一態様において、再構築され核移植された卵母細胞を活性化する段階は、クロマチン凝縮、紡錘糸形成および化学的活性化を可能にする。他の態様において、電気的パルスの組み合わせ後に、選択的に、６−ＤＭＡＰが適用され、例えば、０．２５Ｍ ｄ−ソルビトールバッファおよび６−ＤＭＡＰ（２ｍＭ、４時間）中（２×５０μｓ ＤＣパルス、２．７ｋＶ／ＣＭ）である。他の態様において、多様な開示された培地、例えば、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚培養培地は、選択的に、成長因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＧＦ１を含む。多様な態様において、成長因子は、核移植、１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以降に添加される。
【００３７】
多様な態様において、核移植卵母細胞は、完全な活性化のために、活性化後培地で処理される。異なる態様において、活性化され再構築された核移植卵母細胞は、その後活性化後培地でインキュベーションされる。異なる態様において、活性化後培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚培養培地である。異なる態様において、活性化後培地は、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む。異なる態様において、活性化された卵母細胞は、活性化後培地で、３０分未満、３０〜４５分未満、４５〜６０分未満、６０〜９０分未満、９０〜１２０分未満、１２０〜１５０分未満、１５０〜１８０分未満、１８０〜２１０分未満、２１０〜２４０分未満、２４０分未満〜２７０分未満、３００〜３３０分未満、３３０〜３６０分未満、３６０〜３９０分未満、または３９０分を超えて、インキュベーションされる。特定態様において、活性化された卵母細胞は、２４０、３００または３６０分間インキュベーションされる。多様な態様において、活性化段階および活性化後段階は、低酸素条件下で遂行される。特定態様において、低酸素条件は、約８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５％またはそれ以上のＮ２、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれ以上の０２、および約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％、またはそれ以上のＣＯ２を含む。特定態様において、低酸素条件は、約９０％のＮ２、約５％のＯ２、および約５％のＣＯ２を含む。多様な態様において、活性化後培地は、気体混合物、例えば、約９０％のＮ２、約５％のＯ２および約５％のＣＯ２において、１、２、３、４、５、または５以上の時間、例えば、３７℃でインキュベーションされた、卵割培地で、１、２、３、４、５、または５以上のｍＭの６−ＤＭＡＰを含む。
【００３８】
活性化後培地でのインキュベーション後、活性化後卵母細胞は、洗浄培地でインキュベーションされる。異なる態様において、洗浄培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地である。また、他の態様において、培養培地は、グローバルヒト胚培養培地のように、連続の培地交換を要求しない。特定態様において、洗浄培地は、ＴＳＡを含む。特定態様において、活性化後卵母細胞は、ＴＳＡを含む洗浄培地で、２４０、３００または３６０分間インキュベーションされる。一態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、洗浄され、さらに培養される。一態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、６−ＤＭＡＰ除去培地で洗浄される。他の態様において、多様な開示された培地、例えば、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚培養培地は、選択的に、成長因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＧＦ１を含む。多様な態様において、成長因子は、核移植後１、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以降に添加される。
【００３９】
他の態様において、活性化および／または活性化後段階は、精子から分離された因子、その派生物および抽出物を添加する段階を含む。一態様において、ヒト精子因子は、記載された注入方法のいずれかを使用して活性化され再構築された卵子に注入される。一態様において、ヒト精子因子は、記載された注入方法のいずれかを使用して、活性化後の再構築された卵子に注入される。多様な態様において、約１、２、３または４日後に、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、卵割培地に移される。特定態様において、約１日後に、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、卵割培地に移される。多様な態様において、精子因子は、例えば、精子細胞の内部または外部に存在する細胞タンパク質から分離された因子を含む。一態様において、全精子抽出物は、界面活性剤、および射精された精子の機械的混合を使用して得られる。また、他の態様において、全細胞抽出物は、ＤＮＡａｓｅ ＩおよびＲＮＡａｓｅで処理される。また、他の態様において、粗抽出物は、バッファで洗浄されて遠心分離（２時間２０，０００ｇ）される。他の態様において、新鮮な射精されたヒト精子が集められ、精液血漿を除去するために、１０分間９００ｇで遠心分離した後、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むスパームＴＡＬＰ（Sperm−ＴＡＬＰ）でペレットの再懸濁をし、同じ設定で遠心分離した後、上澄み液の除去、および核分離培地（ＮＩＭ：１２５ｍＭ ＫＣｌ、２．６ｍＭ ＮａＣｌ、７．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｍＭ ＥＤＴＡジナトリウム塩；ｐＨ７．４５）で、最終濃度２０×１０８sperm／ｍＬで、ペレットの再懸濁をし、スパームＴＡＬＰを除去するために遠心分離する。スパームＴＡＬＰが除去された後、１ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭロイペプチン、１００ｍＭアンチパインおよび１００ｍｇ／ｍＬ大豆トリプシン阻害剤を含むＮＩＭで、同一の体積でペレットを再懸濁した後、２℃５０分間２０，０００Ｘで、密集した精子ペレット形成と共に、４周期の凍結（液体Ｎ２において、各周期当たり５分）、および解凍（１５℃で、各周期当たり５分）が続く。最後に、結果として得られる上澄み液は、注意深く除去され、アリコートされ、使用されるまで−８０℃に維持される。
【００４０】
多様な態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、胚盤胞にさらに培養される。一態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、ＳＡＧＥ卵割培地、例えば、クイン培地（Quinn's medium)でさらに培養される。また、他の態様において、培地、例えば、３ｉ培地（神経基底培地（neuro basal medium）５０％、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ５０％、Ｎ２添加物１／２００ｖ／ｖ、Ｂ２７添加物１／１００ｖ／ｖ、１００ｍＭ Ｌ−グルタミン１／１００ｖ／ｖ、０．１Ｍ β−ＭＥ１／１，０００ｖ／ｖ、ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害剤）２μＭ、ＰＤ１８４３５２（ＥＲＫカスケード阻害剤）０．８μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）３μＭ）、または修飾３ｉ培地（ＰＤ０３２５９０１（ＭＡＰＫ阻害剤）０．４μＭ含む）は、多能性を促進する。一態様において、さらなる培養は、１、２、３、４、５日、または５日以上の間である。一態様において、さらなる培養は、再プログラミング因子および／またはメチル化変更剤を有する培養培地で提供される。多様な態様において、さらなる培養は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂが添加されたＧ２培地で、３日間である。例えば、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂは、それぞれ０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５μｇ／ｍｌ、またはそれ以上の培地における濃度で提供される。一部態様において、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂは、それぞれ２μｇ／ｍｌの培地における濃度で提供される。
【００４１】
多様な態様において、胚盤胞へのさらなる培養、および胚盤胞からの多能性幹細胞（ｐＳＣ）の誘導は、透明帯（ＺＰ）を除去するために培養された胚盤胞を、酸性タイロード溶液（acidic Tyrode's solution）で処理する段階を含む。多様な態様において、該処理は、数秒間（例えば、１〜５秒間）である。多様な態様において、ＺＰの除去後、ＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ培地での洗浄が後に続く。多様な態様において、内部細胞塊（ＩＣＭ）の分離は、胚盤胞の栄養胞（trophoblast）を廃棄する段階を含む。多様な態様において、ＩＣＭ細胞は、プレーティング１日前に調製されたマウス胚フィーダ層（ＭＥＦ：mouse embryonic feeder）にプレーティングされる。一部態様において、全胚盤胞がＭＥＦにプレーティングされる。例えば、該方法は、胚盤胞の透明帯を剥皮する段階を含む。多様な態様において、前記方法は、Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１％のプロナーゼ（pronase）で、胚盤胞の透明帯を除去する段階を含む。一態様において、前記方法は、Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で、０．５％プロナーゼで、胚盤胞の透明帯を除去する段階を含む。また、他の態様において、前記方法は、１〜１０秒間、１０〜２０秒間、２０〜３０秒間、３０〜６０秒間、６０〜１２０秒間、１２０〜１８０秒間、または１８０秒間以上、ＴＨ３培地（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）において、プロナーゼを適用する段階を含む。また、他の態様において、３０〜６０秒間ＨＴＦ培地で、０．５％プロナーゼを適用する段階を含む。一態様において、該胚盤胞は、卵母細胞の単為生殖から得られた単為生殖体に由来する。一態様において、ｈＰＳＣ細胞株は、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ）細胞株である。また、他の態様において、胚盤胞は、レシピエント卵母細胞へのドナー細胞核の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）から得られた再構築され核移植された卵母細胞に由来する。一態様において、ｈＰＳＣ細胞株は、体細胞核移植ヒト多能性ｈＰＳＣ（ＮＴ−ｈＰＳＣ）細胞株である。また、他の態様において、本発明は、栄養外胚葉性細胞（trophectodermal cell）からの内部細胞塊（ＩＣＭ）が機械的拡散（mechanical dispersion）する段階を含む免疫切除術（immunosurgery）のための方法を含む。多様な態様において、剥皮された胚盤胞は、３７℃で、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または６０分間ウサギ抗ヒト脾臓血清で処理される。一態様において、剥皮された胚盤胞は、３７℃で約３０分間、ウサギ抗ヒト脾臓血清で処理される。一態様において、前記方法は、剥皮された胚盤胞をＴＨ３（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）で洗浄する段階、３７℃で３０分間ＨＥＣＭ−９（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）で再構築されたギニアピッグ補体で、インキュベーションする段階を含む。異なる態様において、拡張された胚盤胞の透明帯は、ＴＨ３（ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ）培地で、０．５％プロナーゼまたは酸性タイロード溶液への若干の露出（４５〜６０秒）で除去される。一態様において、前記方法は、選択的に、栄養外胚葉性細胞から内部細胞塊を分離するために、小孔径ピペッティング（small bore pipetting）、Ｅｈｓｍｓ ｚｉｌｏｓ−ｔｋ Unit（Hamilton Thorne）を使用したレーザ補助孵化方法（laser assisted hatching method）を使用して、細胞を機械的に拡散する段階を含む。
【００４２】
一態様において、ＳＣＮＴのための方法は、卵母細胞の核を除去する段階、ドナー核を移植する段階、再構築され核移植された卵母細胞を活性化する段階、および選択的に、胚盤胞にさらに培養する段階、胚盤胞から多能性幹細胞（ｐＳＣ）に誘導する段階を含む。一態様において、卵母細胞の核を除去する段階は、中期ＩＩ段階卵子紡錘糸を除去する段階を含む。多様な態様において、第１極体（１ＰＢＥ）は、除去される。一態様において、ドナー核を移植する段階は、注入ピペット（例えば、１２μｍ径）で、３〜４個のドナー細胞を提供する段階、センダイウイルス外被タンパク質を含む溶液の一定量中にドナー細胞を排出する段階、線形に配列されたドナー細胞を分離する距離（４〜５細胞長）で注入ピペットを使用して細胞を回収する段階、保持ピペットで卵母細胞を保持する段階、ドナー細胞を有する注入ピペットを卵母細胞に前進させる段階を含む。多様な態様において、注入ピペットを前進させる段階は、卵黄原形質膜の非破壊を含み、かつ核ドナー細胞を透明帯下に位置する卵黄原形質膜と接触させるために、囲卵腔への１つの核ドナー細胞の挿入を含む。多様な態様において、ピペットの回収は、卵黄膜とドナー細胞との接触を妨害しない。多様な態様において、卵母細胞は、さらにインキュベーションされる。多様な態様において、細胞は、ドナー細胞挿入１０分後に融合される。選択的に、前記過程は、成功裏に融合されていない細胞に対して反復される。多様な態様において、ポロスコープ、例えば、Oosight（商標）イメージングシステムが、全過程において使用される。他の態様において、核を除去する段階は、サイトカラシンＢ、および選択的に、タンパク質ホスファターゼ阻害剤、例えば、カフェインを含む脱核培地で遂行される。他の態様において、前記方法は、プロテアソーム阻害剤、例えば、ＭＧ１３２の使用を含む。特定態様において、ＳＣＮＴの方法は、一つまたはそれ以上のドナー核を移植する段階後に、卵母細胞の核を除去する段階が後に続く。
【００４３】
一態様において、再構築され核移植された卵母細胞を活性化する段階は、再構築された核移植卵母細胞を活性化培地で３７℃５分間処理する段階に続く、卵割培地で洗浄する段階を含む。多様な態様において、活性化培地は、５μＭのイオノマイシンを含む。多様な態様において、核移植卵母細胞は、完全な活性化のために、活性化後培地で処理される。多様な態様において、活性化後培地は、５％ ＣＯ２／５％ Ｏ２／９０％ Ｎ２の大気において、３７℃４時間の卵割培地で、２ｍＭ ６−ＤＭＡＰを含む。一態様において、活性化された核移植卵母細胞は、洗浄され、さらに培養される。一態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、６−ＤＭＡＰ不含培地で洗浄される。一態様において、活性化後の再構築され核移植された卵母細胞は、ＳＡＧＥ卵割培地でさらに培養される。一態様において、さらなる培養は、２日間である。一態様において、さらなる培養は、再プログラミング因子および／またはメチル化変更剤を有する培養培地で提供される。多様な態様において、さらなる培養は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂが添加されたＧ２培地で３日間である。多様な態様において、活性化された核移植された卵母細胞は、胚盤胞にさらに培養される。多様な態様において、胚盤胞へのさらなる培養、および胚盤胞からの多能性幹細胞（ｐＳＣ）の誘導は、透明帯（ＺＰ）を除去するために培養された胚盤胞を、酸性タイロード溶液（例えば、ｐＨ２．０）で処理する段階を含む。多様な態様において、該処理は、数秒間（例えば、１〜５秒）である。多様な態様において、ＺＰの除去後、ＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ培地での洗浄が後に続く。多様な態様において、内部細胞塊（ＩＣＭ）の分離は、胚盤胞の栄養胞を廃棄する段階を含む。多様な態様において、ＩＣＭ細胞は、プレーティング１日前に調製されたマウス胚フィーダ（ＭＥＦ）にプレーティングされる。一部態様において、胚全体がＭＥＦにプレーティングされる。多様な態様において、ＰＳＣ誘導培地は、血清代替物（５％ ＳＲ、Invitrogen）が添加されたノックアウトＤＭＥＭ、ＦＢＳ（１０％、Hyclone）、プラズマメート（plasmamate）（５％）、ｂＦＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＬＩＦ（２，０００units／ｍＩ、Sigma−Aldrich）で構成される。
【００４４】
体細胞核移植に由来するヒト多能性幹細胞株（ＮＴ−ｈＰＳＣ）も、本明細書に開示する。多様な態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣは、ドナー核と遺伝的に同一であるか、あるいはほぼ同一である。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、正常な４６染色体、ＸＸ／ＸＹ核型を含む。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、３つの胚葉形成がいずれも可能である。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、一つまたはそれ以上の多能性マーカーを発現し、多能性マーカーは、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＳＳＥＡ−３、腫瘍拒絶抗原１−８１（Ｔｒａ−１−８１）、Ｔｒａ−１−６０、オクタマ結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、性決定部位Ｙ−ボックス−２（Ｓｏｘ−２）、nanog、ジンクファインダタンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、レフティＡ（lefty Ａ）、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ）、テロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１）、および発達多能性関連遺伝子２（Ｄｐｐａ−２）を含む。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、劣性致死性（recessive lethality）を含まない。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、高アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ: high alkaline phosphatase）および／またはテロメラーゼ活性を保有する。異なる態様において、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株は、免疫不全動物内で、懸濁液において胚様体および／または３つの胚葉全部に由来した細胞を含む奇形種を形成することができる。
【００４５】
また、ヒト卵母細胞の単為生殖のための方法を本明細書において記載する。一態様において、前記方法は、単為生殖性卵母細胞の形成を始めるために、中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階卵母細胞を活性化培地でインキュベーションする段階を含む。特定態様において、活性化培地は、カルシウムイオノフォアを含む。異なる態様において、カルシウムイオノフォアは、イオノマイシン、Ａ２３１８７、ビュベリシン、Ｘ−５３７Ａ、アベナシオリド、モノマクロサイクリックポリエーテル、あるいはマクロバイオサイクリック化合物またはクリプテートである。異なる態様において、活性化培地は、アルコール、例えば、エタノールを含む。異なる態様において、活性化培地は、チメロサールを含む。異なる態様において、活性化培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地、あるいはグローバルヒト胚培養培地である。他の態様において、前記方法は、ＭＩＩ段階卵母細胞の電気的活性化を含む。一態様において、電気的活性化は、電気融合培地での電気的パルスを含む。多様な態様において、電気融合培地は、０．１〜０．５Ｍマンニトール、０．０１〜１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、１〜１０ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．００５〜０．５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。一態様において、電気融合培地は、０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、３ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。他の態様において、一つまたはそれ以上の卵母細胞は、まず精子因子が注入され、その後電気的に活性化される。
【００４６】
特定態様において、ＭＩＩ段階卵母細胞は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれ以上の温度で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分、またはそれ以上の間、活性化培地でインキュベーションされ、その後洗浄培地で洗浄される。特定態様において、ＭＩＩ段階卵母細胞は、３７℃温度で５分間、カルシウムイオノフォアに露出され、その後洗浄培地で洗浄される。異なる態様において、洗浄培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地である。
【００４７】
異なる態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、その後活性化後培地でインキュベーションされる。異なる態様において、活性化後培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚培養培地である。異なる態様において、活性化後培地は、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む。異なる態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、活性化後培地で、３０、３０〜４５、４５〜６０、６０〜９０、９０〜１２０、１２０〜１５０、１５０〜１８０、１８０〜２１０、２１０〜２４０、２４０〜２７０、３００〜３３０、３３０〜３６０、３６０〜３９０分未満、または３９０分を超える間インキュベーションされる。特定態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、２４０、３００または３６０分間インキュベーションされる。多様な態様において、活性化および活性化後段階は、低酸素条件下で遂行される。特定態様において、低酸素条件は、約８０〜８５％、８５〜９０％。９０〜９５％、９５％またはそれ以上のＮ２、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれ以上の０２、および約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、あるいは１０％またはそれ以上のＣＯ２を含む。特定態様において、低酸素条件は、約９０％ Ｎ２、約５％ Ｏ２および約５％ ＣＯ２を含む。
【００４８】
活性化後培地でのインキュベーション後、活性化後の単為生殖性卵母細胞は、洗浄培地でインキュベーションされる。異なる態様において、洗浄培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地である。また、他の態様において、培養培地は、グローバルヒト胚培養培地のように、連続の培地交換を要求しない。特定態様において、洗浄培地は、ＴＳＡを含む。特定態様において、活性化後の卵母細胞は、ＴＳＡを含む洗浄培地で、２４０、３００または３６０分間インキュベーションされる。
【００４９】
洗浄培地でのインキュベーション後、活性化後の単為生殖性卵母細胞は、培養培地に移される。異なる態様において、培養培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地である。また、他の態様において、培養培地は、グローバルヒト胚培養培地のように、連続の培地交換を要求しない。異なる態様において、活性化後の単為生殖性卵母細胞は、１日、２日、３日、４日、または４日以上の間、卵割培地で培養される。特定態様において、卵割培地での培養は、２日間である。卵割培地で培養した後、卵母細胞は、１日、２日、３日、４日、または４日以上の間、胚盤胞形成培地で培養される。特定態様において、胚盤胞形成培地での培養は、３日間である。
【００５０】
一態様において、卵母細胞を活性化する段階は、３７℃５分間活性化培地でインキュベーションする段階に続く、卵割培地で洗浄する段階を含む。多様な態様において、活性化培地は、５μＭのイオノマイシンを含む。多様な態様において、卵母細胞は、完全な活性化のために、活性化後培地で処理される。多様な態様において、活性化後培地は、５％ ＣＯ２／５％ Ｏ２／９０％ Ｎ２の大気中で、３７℃４時間の卵割培地において、２ｍＭ ６−ＤＭＡＰを含む。一態様において、活性化された卵母細胞は、洗浄され、かつさらに培養される。一態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、６−ＤＭＡＰ除去培地で洗浄される。一態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、ＳＡＧＥ卵割培地、例えば、クイン培地でさらに培養される。また、他の態様において、培地、例えば、３ｉ培地（神経基底培地５０％、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ５０％、Ｎ２添加物１／２００ｖ／ｖ、Ｂ２７添加物１／１００ｖ／ｖ、１００ｍＭ Ｌ−グルタミン１／１００ｖ／ｖ、０．１Ｍ β−ＭＥ１／１，０００ｖ／ｖ、ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害剤）２μＭ、ＰＤ１８４３５２（ＥＲＫカスケード阻害剤）０．８μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）３μＭ）または修飾３ｉ培地（ＰＤ０３２５９０１（ＭＡＰＫ阻害剤）０．４μＭ含む）は、多能性を促進する。一態様において、さらなる培養は、２日間である。一態様において、さらなる培養は、再プログラミング因子および／またはメチル化変更剤を有する培養培地で提供される。多様な態様において、さらなる培養は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂが添加されたＧ２培地で３日間である。多様な態様において、活性化された単為生殖性卵母細胞は、胚盤胞にさらに培養される。多様な態様において、胚盤胞へのさらなる培養、および胚盤胞からの多能性幹細胞（ｐＳＣ）の誘導は、透明帯（ＺＰ）を除去するために培養された胚盤胞を、酸性タイロード溶液（例えば、ｐＨ２．０）で処理する段階を含む。多様な態様において、処理は、数秒間（例えば、１〜５秒）である。多様な態様において、ＺＰの除去後、ＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ培地での洗浄が後に続く。多様な態様において、内部細胞塊（ＩＣＭ）の分離は、胚盤胞の栄養胞を廃棄する段階を含む。多様な態様において、ＩＣＭ細胞は、プレーティング１日前に調製されたマウス胚フィーダ（ＭＥＦ）にプレーティングされる。一部態様において、胚全体がＭＥＦ上にプレーティングされる。多様な態様において、ＰＳＣ誘導培地は、血清代替物（５％ ＳＲ、Invitrogen）、ＦＢＳ（１０％、Hyclone）、プラズマネート（５％）、ｂＦＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＬＩＦ（２，０００units／ｍＩ、Sigma−Aldrich）で補充されたノックアウトＤＭＥＭで構成される。
【００５１】
単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ）株が本明細書に記載される。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、異型接合性または同型接合性の卵母細胞に由来する。特定態様において、異型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、民族（ethnic）集団における対立形質変異頻度によって決定されたような、民族集団の１％、２％、３％、４％、５％、または６％以上と免疫適合性であるＨＬＡ血清型を有するＨＬＡハプロタイプの対立形質変異を含む。特定態様において、同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、一前核卵母細胞の単為生殖を利用して導き出される。特定態様において、同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、一前核同型接合性卵母細胞の単為生殖を利用して導き出される。他の態様において、同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、第２極体放出を含む単為生殖を利用して得られる。特定態様において、同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、民族集団における対立形質変異頻度によって決定されたような、民族集団の１％、２％、３％、４％、５％、または５％以上と免疫適合性であるＨＬＡ血清型を有するＨＬＡハプロタイプを含む。例えば、ＨＬＡハプロタイプＡ＊０１，Ｂ＊０８，ＤＲＢ１＊０３は、白人人種において、５％を超える頻度で提示される。他の態様において、ＨＬＡ血清型は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲの対立形質変異体（allelic variant）を含む。他の態様において、ＨＬＡ血清型は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの対立形質変異体を含む。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、中期Ｉ（ＭＩ）段階卵母細胞に由来する。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階卵母細胞に由来する。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、ドナー卵母細胞と同一であるか、あるいはほぼ同一であるミトコンドリアゲノムを含む。
【００５２】
他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、正常な４６染色体、ＸＸ核型を含む。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、３種全ての胚葉層を形成することができる。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＳＳＥＡ−３、腫瘍拒絶抗原１−８１（Ｔｒａ−１−８１）、Ｔｒａ−１−６０、オクタマ結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−２（Ｓｏｘ−２）、nanog、ジンクフィンガータンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、lefty Ａ、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ）、テロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１）、および発達多能性関連遺伝子２（Ｄｐｐａ−２）を含む１つまたは複数の多能性マーカーを発現する。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、劣性致死性を含まない。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、高アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）および／またはテロメラーゼ活性を所有する。他の態様において、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株は、懸濁液で胚様体および／または免疫不全動物でテラトーマを形成することができる。
【００５３】
また、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ）のライブラリーが本明細書に記載される。特定態様において、ライブラリーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０個以上のｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株を含む。多様な態様において、該ライブラリーは、民族集団の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上と免疫適合性であるＨＬＡ血清型を有するｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株を含む。例えば、ＨＬＡハプロタイプＡ＊０１，Ｂ＊０８，ＤＲＢ１＊０３は、白人人種において、５％を超える頻度で現れる。他の態様において、ＨＬＡ血清型は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲの対立形質変異体を含む。他の態様において、ＨＬＡ血清型は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの対立形質変異体を含む。例えば、それは、ＨＬＡ−Ａ血清型Ａ１−Ａ３、Ａ９−Ａ１１、Ａ２３−Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０−３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４およびＡ８０、ＨＬＡ−Ｂ血清型Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７−Ｂ７２、Ｂ７５−Ｂ７８、Ｂ８１、Ｂ＊８２ Ｂ＊８３、ＨＬＡ−Ｃ血清型ＣＷ０１−ＣＷ０８を含む。主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）は、ＨＬＡ−ＤＰ血清型ＤＰＡ１およびＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ血清型ＤＱ２−ＤＱ９、ＨＬＡ−ＤＲ血清型ＤＲ１−Ｄ１８を含む。
【００５４】
他の態様において、前記ライブラリーは、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株を含み、そのそれぞれがヒト集団で提示された少なくとも１つのＭＨＣ対立形質に対して、半接合性または同型接合性であり、前記ｐｎ−ｈＰＳＣのライブラリーの各構成員は、ライブラリーの残留構成員に相対的にＭＨＣ対立形質の異なるセットに対して、半接合性または同型接合性である。追加態様において、ヒト胚幹細胞のライブラリーは、ヒト集団で提示された全てのＭＨＣ対立形質に対する半接合性または同型接合性であるｐｎ−ｈＰＳＣのライブラリーを含む。記載された方法は、ｐｎ−ｈＰＳＣのライブラリー生成に適用され、そのそれぞれは、ヒト集団で提示された少なくとも１つのＭＨＣ対立形質に対して、半接合性または同型接合性であり、ｐｎ−ｈＰＳＣの前記ライブラリーの各構成員は、ＭＨＣ対立形質の異なる集合に対して、半接合性または同型接合性である。追加態様において、該方法は、ヒト集団で提示された半接合性または同型接合性であるｐｎ−ｈＰＳＣのライブラリーを生成する。従って、本発明はまた、そのような方法によって製造されたｐｎ−ｈＰＳＣのライブラリーを提供する。
【００５５】
また「ナイフピペット」と記載される、特別に形づくられた（specifically contoured）脱核ピペットが本明細書に記載される。一態様において、形付（contoured）脱核ピペットは、滅菌ガラス管を引きのばした後に割り、加熱研磨（fire-polishing）によって融かして鈍くなった丸いビーズ末端とし、マイクロフォージに接触させて再び引きのばして尖らせることによって、調製される。多様な態様において、形付脱核ピペットは、１）堅固で尖った微細な先端、２）引きのばしたビーズ末端によるやや丸い形状のエッジ、および３）直径が約５０μｍより大きい中空チューブ本体、を含む。
【００５６】
多様な態様において、本明細書に記載された任意の脱核方法が、いずれも形付脱核ピペットを用いて遂行される。例えば、脱核は、一方でマイクロピペットで卵母細胞を保持し、卵母細胞側面エッジに対して形付脱核ピペットの微細な先端を前進させ、穿通に続いて、丸い引きのばされたビーズ末端を介して穿通された裂け目をピンチングするための卵母細胞操作をし、裂け目のエッジ近くの極体の位置設定をすることによって実施することができ、裂け目の近くに位置した極体は、抽出のために圧搾される。
【００５７】
ヒト卵母細胞の放出誘導および／または分離を行う方法が本明細書に記載される。一態様において、放出および／または分離されたヒト卵母細胞は、単為生殖に利用される。他の態様において、放出および／または分離されたヒト卵母細胞は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に利用される。多様な態様において、卵巣過剰刺激は、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）類似体による複数の卵子の生産を刺激し、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）作用物質／拮抗物質（agonist／antagonist）またはその他黄体形成ホルモン（ＬＨ）サージ阻害剤の使用によって自然排卵を阻む。他の態様において、前記方法は、２Ｄまたは３Ｄの超音波およびエストラジオールレベルモニタリングによる濾胞成熟追跡を含む。
【００５８】
他の態様において、前記方法は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）またはｈＣＧ類似体を利用した、卵巣濾胞内におけるヒト卵母細胞のインビボ成熟を利用する。一態様において、最終卵巣濾胞成熟は、ｈＣＧ刺激によって、卵母細胞ドナー中で発生する。他の態様において、コースティング（coasting）は、ＯＨＳＳ（卵巣過剰刺激症侯群）の危険性を低減させる。他の態様において、前記方法は、胞状卵胞計数のための２Ｄまたは３Ｄ超音波検査の利用を含む。
【００５９】
他の態様において、前記方法は、第１極体放出（１ＰＢＥ）に対するリアルタイムの非ＵＶ光ベースのモニタリングを利用して、ｈＣＧ刺激なしでのヒト卵母細胞の分離と、インビトロで卵母細胞成熟を終了させることを含む。他の態様において、方法は、卵母細胞成熟率を定量化するために１ＰＢＥ率を決定することを含む。他の態様において、前記方法は、単為生殖および／またはＳＣＮＴに伴う胚盤胞形成率を強化するために卵母細胞成熟率を改善することを含み、それにより、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）生産の効率を改善する。
【００６０】
他の態様において、前記方法は、ＩＶ鎮静、全身麻酔、または子宮頚管周囲遮断麻酔による経膣アプローチを利用して、卵巣濾胞の吸引補助超音波誘導針吸入術によって、複数の成熟卵母細胞を収集するための経膣卵子回収の利用を含む。他の態様において、局所麻酔は利用されない。
【実施例】
【００６１】
下記実施例は、特許請求された発明を例示するために提供されたものであり、本発明の範囲を制限するものであると解釈されてはならない。特定物質が言及される範囲まで、例示の目的に過ぎず、発明を制限するものではない。当業者は、独創的な能力の発揮なしで、かつ本発明の範囲を外れることなしに、同等な手段、組成物または反応物を開発することができる。
【００６２】
実施例１
単為生殖に係わる一般的過程
単為生殖のための重要な過程は、１）ヒトＭＩＩ段階卵母細胞の調製、２）卵母細胞の活性化、３）単為生殖体の生成、４）胚盤胞段階まで追加インビトロ培養、および５）培養された胚盤胞からのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の誘導を含む。該方法を介して誘導された細胞は、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ−ｈＰＳＣ）である。
【００６３】
実施例２
ＳＣＮＴに係わる一般的過程
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）は、単為生殖と重複する技法を含むが、主な差異は、ドナー核のレシピエント卵母細胞への移植および胚再構築を含む。さらに具体的には、ＳＣＮＴは、１）核ドナー細胞の調製、２）ヒトＭＩＩ段階卵母細胞の調製、３）卵母細胞の脱核、４）脱核された卵母細胞への体細胞核移植、５）体細胞核移植された（再構築された）卵子の活性化、６）再構築された卵子の胚盤胞段階までのインビトロ培養、および７）それら胚からの胚幹細胞株の誘導を含む。この方法を介して由来した細胞は、体細胞核移植ヒト多能性幹細胞（ＮＴ−ｈＰＳＣ）である。
【００６４】
実施例３
成体線維芽細胞を使用した核ドナー細胞の調製
ドナー患者の線維芽細胞は、トリプシン処理または類似のプロセスによって単層から回収された個別細胞を含む皮膚生検から成長させることができる。
１．局所麻酔下で皮膚または他の組織生検を得る（５０ｍｇ、０．５×０．５ｃｍ）。
２．ＰＢＳで２回組織断片を洗浄する。
３．１００ｍｍ培養ディッシュで、組織を外科用ブレード（blade）で機械的に刻み、刻まれた組織からＰＢＳを用心深く除去する。
４．１０％ ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸および１０μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン溶液で補充された４．５ｍｌ ＤＭＥＭ、およびコラゲナーゼＩＩ型の５００μｌ（２，０００unit／ｍｌ）（Life Technologies）に組織ペレットを再懸濁する。
５．インキュベータに一晩置く。
６．３分間３００×Ｇで遠心分離し、１０％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭに細胞ペレットを再懸濁する。
７．細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに分注し、続いて１０％ ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸および１０μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭにコンフルエント（confluent）になるまで、３７℃、５％ ＣＯ２および９５％空気中で培養する。
８．細胞が８０％培養密度（confluency）に逹すれば、初期成長体の１／２を凍結保存し、残余細胞を１：３の比率に分け、それらを前述の培地で培養する。この過程をさらに２回繰り返し、ＳＣＮＴおよびその後の遺伝子型判別分析のための十分な細胞を得る。細胞培養の終りに、１０％ ＤＭＳＯで補充されたＦＢＳに残余細胞をいずれも凍結保存する。新鮮に調製された細胞または凍結保存された細胞のいずれかを、核ドナーとして使用することができる。
【００６５】
実施例４
卵丘細胞を利用した核ドナー細胞株の調製
ＳＣＮＴのために、下記のとおりドナーの卵丘細胞から、または商業的に入手可能な成体幹細胞を含むその他組織から、ドナー核を得ることができる。その後、下記例示プロトコルを使用して、卵丘細胞から核を得ることができる。
１．各個体に由来した細胞調製物の約半分が、核ドナーとしてＳＣＮＴのために使用され、残りが遺伝子型判別のためにスナップ凍結（snap-frozen）される。
２．剥皮過程の間、１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに卵丘細胞を収集する。Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦを１．５ｍｌまで添加し、１分間１，２００ｒｐｍで遠心分離する。
３．上澄みを移し、細胞ペレットのみを残して、ペレットに１００μｌの４％ ＰＶＰ溶液（ＰＶＰ、ＭＷ ３６０００、Calbiochem、San Diego、ＣＡ）を添加して混合する。それら細胞はすぐに核注入に利用できる。
【００６６】
実施例５
卵巣刺激プロトコルおよび卵母細胞回収
患者は、７〜１４日間、低用量経口避妊薬で予備処置される。経口避妊薬を中止した後、ゴナドトロピン（Ｇｏｎａｌ−Ｆまたはフォリスチム、および、マイクロ用量Lupronor ｈＣＧまたはMenopur）が投与される。投与開始は、患者特性（年齢、３日目ＦＳＨ、ＡＰＣ）に基づいて、個別医師によって決定される。卵胞成長および子宮内膜厚の経膣超音波評価は、６日目に始まり、血清Ｅ２レベルが８回の連続的臨床訪問のうち１回で測定される。その後、超音波検査確認および血清Ｅ２レベルに基づいて、モニタリングの頻度およびゴナドトロピンの量を調整することができる。
【００６７】
ｈＣＧ触発の日（および刺激の全ての日）は、濾胞のサイズおよび数、ならびに血清Ｅ２レベルに基づく。ルプロン（Lupron）またはｈＣＧの投与量は、２５０μｇ用量で投与される。卵子回収は、ｈＣＧの投与３６時間後に行われる。前記患者は、卵子回収の次の日に経口避妊薬を再開する。
【００６８】
実施例６
具体的な卵巣活性化
卵子回収は、下記実施例過程を使用して行われる。
１．２０〜３４歳の健康な女性ドナーを、７〜１４日間の低用量経口避妊薬処理後、組み換え濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（フォリスチム、１００〜１５０単位、Schering−Plough）で処理し、１日目（day １）から始めるマイクロ用量組み換えＬＨ（LupronまたはｈＣＧ、２５０μｇ）ＥＭＤ Seronoを処理する。
２．前記ＦＳＨは、一般的に１００〜１５０単位で始め、濾胞形成が進むにつれて調整される。
３．２個の主要濾胞が１８ｍｍ径に逹したら、単一用量のルプロンまたはｈＣＧ（２５０μｇ）を与えて卵母細胞成熟を誘導する。
【００６９】
実施例７
卵母細胞収集
卵母細胞の収集は、下記実施例過程を利用して行われる。
１．クインアドバンテージ受精培地（Quinn's Advantage Fertilization Medium）（ＳＡＧＥカタログ＃１０２１）を有する５０×９ｍｍペトリディッシュに、吸引された濾胞液（aspirated follicular fluid）から卵丘塊を収集する。
２．収集された卵丘塊を、３７℃、５％ ＣＯ２加湿インキュベータで、約２〜３分間、卵丘細胞が分散するまでヒアルロニダーゼ（４０Ｕ／ｍｌ）で処理する。
３．Stripper Tip（Mid-Atlantic Diagnostic、＃ＭＸＬ３−１００ ｕ）を使用して残余顆粒膜細胞を除去する。
４．卵母細胞をクイン受精培地で２回洗浄する。
５．Willco-Dishガラスペトリディッシュ（５０×９ｍｍ）に、ミネラルオイルで覆われた５０μｌ滴を調製する。
【００７０】
実施例８
卵母細胞の回収および調製
卵母細胞の回収および調製を、緑色光（波長＞５００ｎｍ）で照明された実験室で行う。
１．患者に対するルプロン注入またはｈＣＧ注入３６時間後、ミダゾラム５〜７．５ｍｇ（Versed、RocheおよびNutley、ＮＪ、米国）およびフェンタニル５０〜７５μｇ（Abbott Pharmaceutical、Abbott Park、ＩＬ、米国）で鎮静させた後、先に述べたように超音波ガイダンスを使用して卵母細胞を回収する。
２．ＩＶＦ培地（Quinn's ＩＶＦ培地、ＳＡＧＥ Biopharma、Bedminster、ＮＪ）中で、新鮮に分離された卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ：cumulus-oocyte cell complex）を洗浄し、５％ ＣＯ２を有する加湿インキュベータ中で２時間インキュベートする。
３．ＣＯＣをヒアルロニダーゼ（１００ＩＵ／ｍｌ、Sigma、Ｓｔ．Louis、ＭＯ、米国）で２分間処理し、小孔径マイクロピペット（small bore micropipette）（１５０μｍ径）で剥皮する。単一第１極体を有する剥皮された卵母細胞を、中期ＩＩ（ＭＩＩ）として分類し、ＳＣＮＴに使用する。
【００７１】
実施例９
体細胞核移植
中期ＩＩ（ＭＩＩ）紡錘糸を、Oosight（商標）紡錘イメージングシステム（Cambridge Research & Instrumentation、Woburn、ＭＡ、米国）を使用して、脱核のために視覚化する。このアプローチは、ヘキスト染色およびＵＶ光露出を回避する。卵母細胞を、５分間０．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＨＥＰＥＳ（Cooper Surgical）を有するQuinn's Advantage（登録商標）培地で予備インキュベートする。
【００７２】
卵母細胞の脱核を、脱核ピペット（２０μｍ径）と共に圧衝撃ドリル（piezo impact drill）（PrimeTech、東京、日本）を使用して行う。中期紡錘糸の除去は、操作ピペット内の明るい楕円形の核複合体の存在によって確認される。ドナーヒト線維芽細胞（または、細胞の同等なその他類型）が調製される。それら核ドナー細胞を、脱核のために使用される同一のシステムを使用して融合させたり注入させたりする。全ての過程を蛍光との直接的接触なしで遂行する。
【００７３】
実施例１０
体細胞核移植Ｉ：直接注入方法
Ａ）卵母細胞の脱核
１．明らかな第１極体を有する卵母細胞（１０）の配置を、サイトカラシンＢ（５μｇ／ｍｌ）を含む予備平衡化された（pre-equilibrated）培養培地に移動させる。
２．卵母細胞を、顕微操作ディッシュ上に準備された少量の脱核培地（Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ＋５μｇ／ｍｌ サイトカラシンＢ、Cooper Surgical）に移す。
３．卵母細胞を有するディッシュを、加熱されたステージを有する顕微操作システムにローディングする。
４．卵母細胞を、Oosight（商標）イメージングシステム（Cambridge Research & Instrumentation、Woburn、ＭＡ、米国）を使用して、中期板を２時と４時との間の位置に保持して紡錘を可視化する。
５．脱核ピペットを透明帯の表面に置き（３時の位置）、ＰＩＥＺＯ（PrimeTech、東京、日本）パルスを送達し、透明帯に孔（hole）を開ける。
６．透明帯に穿孔した直後、脱核ピペット（ごくわずかな陽圧下）を、衝撃を受けた領域に前進させる。
７．染色体−紡錘複合体を、小体積の細胞質と共に吸入して除去する。
８．全ての卵母細胞に対して過程を繰り返す。
９．脱核された卵母細胞を培養培地（卵割培地、Cooper Surgical）で十分に洗浄して残りのサイトカラシンＢを除去し、核注入前に１０〜１５分間新鮮な培養培地で培養する。
【００７４】
Ｂ）核移植
ＮＴ前に、３７℃で３０秒間、０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ（Life Technologies）でトリプシン処理し、単層膜から個別胚盤胞細胞（または、核ドナー細胞の他の類型）を回収し、その後ＮＴのために使用した。ドナー線維芽細胞少量を、クイン受精培地と徐々に混合する。ドナー核は、剥皮された細胞、および／または核移植前に後成的修飾を受けた細胞に由来する。
１．核ドナー細胞（卵丘細胞、皮膚胚盤胞細胞）をＨｅｐｅｓ−ＨＴＦ（ＳＡＧＥ Biopharma）で洗浄し、遠心分離し、４％ ＰＶＰ溶液で再構築する。
２．さまざまなパルスを印加し、ＰＩＥＺＯシステムを利用した激しいピペッティングで核を分離させる。
３．前記核を、ＰＩＥＺＯシステムを利用して脱核された卵母細胞の卵細胞質に注入する。
４．注入された卵母細胞を新鮮な培養培地に取りのけ、タンパク質注入の前に３０分間培養する。
５．注入された卵母細胞を、中心体コアタンパク質の混合物（ヒトオーロラＢキナーゼ＋ｈＳＥＴ＋ＮｕＭＡ）を注入するために操作ディッシュに取りのける。全てのタンパク質は、ＣＢＩ'ｓ ｌａｂから購入可能である。
６．前記タンパク質を卵子当たり約４ｐＬ注入する。
７．前記注入された卵母細胞を、活性化の前に３０分間培養培地に取りのけて培養する。
【００７５】
Ｃ）再構築された卵子の活性化
１．活性化培地（５μＭイオノマイシン）で、３７℃５分間ＮＴ卵子を処理し、卵割培地でそれらを十分に洗浄する。
２．活性化後培地（５ｎＭトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を含む卵割培地での２ｍＭ ６−ＤＭＡＰ）で、４時間前記卵子を再処理する。
３．前記活性化された卵子を６−ＤＭＡＰ除去培地で洗浄し、５ｎＭ ＴＳＡを含む培養培地（卵割培地）で６時間培養し、それらを正常培養培地に移す。
４．前記活性化された卵子を、最初の２日間ＳＡＧＥ卵割培地で、次の３日間ＳＡＧＥ胚盤胞培地で培養する。
【００７６】
実施例１１
卵母細胞の脱核のための改善された技法
卵母細胞の脱核のためのいくつかの主要な技法には、前述の圧電ドリル穿孔（piercing）および吸引、または中空針点穿刺および放出が含まれる。また、他の周知の技法には、大孔径吸入保持ピペット（large bore suction holding pipette）および微細先端ピペットを介した卵母細胞の側面エッジ穿刺（lateral edge puncture）を使用し、かつ細胞膜の一部を剪断（shearing）する「チョップスティック（chopstick）」法が含まれる。剪断運動を介して、微細先端ピペットは、穿刺孔（puncture tear）と、抽出のための微細先端ピペットとの間に、極体の隔離（sequestration）を介して、遺伝物質の抽出を可能にする。これら技法の短所は、操作された卵母細胞に与えられる機械的応力であり、それは、減弱した細胞生存力および非効率的な細胞株生成をもたらしうる。
【００７７】
特別に設計された脱核ピペットを使用する改善された脱核技法が本明細書に記載される。この「ナイフピペット」は、滅菌ガラスチューブを引きのばした後に割り、加熱研磨によって融かして、鈍い丸いビーズ末端とすることによって調製することができる。このピペットの鈍い丸いビーズ末端をマイクロフォージに接触させて再び引きのばして尖らせた。該方法は、多様な特徴を含む「ナイフピペット」形成をもたらす：１）堅固で尖った微細な先端、２）引きのばしたビーズ末端から生じる、やや丸い輪郭、および３）約５０μｍ径の、さらに大きい中空チューブ本体。ヒト成熟卵母細胞を静止させて保持するのに使用される加熱研磨された保持ピペット（外径：１２０〜１５０μｍ；内径：２０〜３０μｍ）と組み合わせて、脱核のための優れた顕微操作が達成される。
【００７８】
例えば、図１から分かるように、「ナイフピペット」の形状は、（Ａ）堅固で尖った微細な先端を介して、（Ｂ）保持ピペットによって静止状態で保持された細胞の側面エッジに対して先端が前進する場合、透明帯の効果的な穿通を可能にする。（Ｃ）裂け目の「ピンチング」のための、丸い引きのばされたビーズ末端を介した卵母細胞操作、および（Ｄ）裂け目のエッジに近い極体の位置設定が、穿通に続く。ユーザがナイフピペットをさらに容易につまむためのバルク構造体を提供するさらに大きい中空チューブ本体で、（Ｅ）裂け目近くに位置した極体はその後、（Ｆ）抽出のために圧搾される。単一核除去ピペットにおけるこれら特徴の組み合わせは、単一装置による各段階の迅速な遂行を可能にし、卵母細胞の物理的操作を減らし、細胞膜の裂け目の大きさを小さくする。脱核は、その後Oosight（商標）イメージングシステム（ポロスコープ顕微法）によって確認できる。
【００７９】
実施例１２
体細胞核移植ＩＩ：体細胞融合方法
Ａ）卵母細胞の脱核、前記の通りである。
【００８０】
Ｂ）囲卵腔（perivitellin space）での体細胞の移植
１．注入ピペット（１２μｍ径）で、３〜４個のドナー細胞を１列にして取り上げる。その過程の間、用心して形質膜を妨害しないように遂行されなければならない。
２．保持ピペットで卵母細胞を保持する。
３．透明帯の表面に注入ピペットを位置させ、ＰＩＥＺＯパルスを印加して、透明帯を貫通する孔を作る。
４．卵子細胞膜を破らずに、前記卵母細胞に、ドナー細胞を含む注入ピペットを前進させ、卵子細胞膜に近接するように１つの核ドナー細胞を囲卵腔にゆっくりと挿入する。
５．前記ピペットを、最初は相対的に迅速に、その後ゆっくりと柔らかに後退させる。
６．卵母細胞の全体群に対する該過程を完了させ、それらをインキュベータに戻す。
【００８１】
Ｃ）卵母細胞−体細胞の融合
電気細胞融合を、０．５ｍｍ電気融合チャンバを利用したＢＴＸ ２００ Electro Cell Manipulator（商標）（ＢＴＸ Harvard Apparatus、Holliston、ＭＡ、米国）を有する電気融合バッファ（０．３ＭＤ−ソルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリドン、５０μＭ Ｄ−ｍｙｏ−２，４，Ｓ、イノシトールトリホスフェート）で行う。
１．電気細胞融合バッファで覆われた電気細胞融合チャンバの２本の電線間に、３〜４個の卵母細胞−体細胞対（couplet）を整列させる。
２．１６０Ｋｅｖ／ＣｍのＤＣパルスを５μｓ間印加させる。または代わりに、２０μｓのようなさらに長い期間印加させる。
３．前記再構築された卵母細胞を胚培養培地で十分に洗浄し、それらをグローバル培地（Global medium）（０．３％ヒト血清アルブミン＋グローバル培地）で、４ウェルディッシュ（１０cells／well）で培養する。
４．初期パルス後３０分で融合を確認する。融合されていない対のためにさらにもう一回繰り返す。
【００８２】
Ｄ）再構築された卵子の活性化
体細胞核移植Ｉと同一の方法を利用して、再構築された卵母細胞を活性化する。
【００８３】
実施例１３
センダイウイルスに基づく卵母細胞−体細胞融合
卵母細胞−体細胞融合を達成するための改善された技法が本明細書に記載され、それは、ネガティブセンス一本鎖ＲＮＡセンダイウイルス（ＳｅＶ）からの組み換えタンパク質外被の適用による。ＳｅＶウイルスは、真核生物の融合のためのその能力が知られていて、遺伝物質のない組み換えＳｅＶ表面外被タンパク質（ＳｅＶ−Ｅ）が、感染能または増殖能の危険性なしに適用できる。
【００８４】
卵母細胞−体細胞融合のためのＳｅＶ適用は、製造者プロトコル（GenomＯＮＥ−ＣＦＥＸ、Ishihara Sangyo Kaisha、Ｃａｔ ＃ＩＳＫ−ＣＦ００１−ＥＸ）による懸濁バッファ（suspension buffer）に凍結乾燥されたＳｅＶ−Ｅを調製することで始まる。懸濁バッファ中のＳｅＶ−Ｅは次に、前もって希釈された２０×細胞融合バッファに添加される。組み合わされた混合物バッファ中のＳｅＶ−Ｅはその後、ドナー核体細胞を含むピペット先端とレシピエント脱核卵母細胞との間に位置する微細液滴添加（microdroplet addition）を介して添加される。前記細胞は、剥皮された細胞、および／または核移植前に後成的修飾を受けた細胞に由来しうる。ドナー核体細胞およびレシピエント脱核卵母細胞の細胞膜表面の微細液滴を介した混合物バッファ中のＳｅＶ−Ｅによるコーティングにより、電気融合の使用なしに体細胞融合が生じる。レシピエント卵母細胞に対する物理的応力および電気生理的応力の低減が細胞生存性および効率的細胞株生成を増進させる。
【００８５】
実施例１４
センダイウイルスに基づく体細胞融合を利用した改善された技法
Ａ）卵母細胞の脱核
ＭＩＩ卵子紡錘複合体を、実施例１１および他のところ（図１）に記載された「ナイフピペット」法を利用して除去する。全過程を通してOosight（商標）（Spindle view）を使用し、卵母細胞のＵＶ光への露出を除去した。卵母細胞ごとに第１極体を除去することは重要であり、そうでなければ、それは融合過程の間に卵母細胞と融合される。
【００８６】
Ｂ）囲卵腔における体細胞の移植
１．注入ピペット（１２μｍ径）で、３〜４個のドナー細胞を１列につまみ上げる。その過程の間、原形質膜を妨害しないように注意深く遂行されなければならない。
２．ドナー細胞をセンダイウイルス外被タンパク質の小滴中に排出（expel）し、それらをそれぞれの細胞間が短い距離（４〜５細胞長）になるように再びつまみ上げる。
３．保持ピペットで卵母細胞を保持する。
４．卵子細胞膜を破らずに、ドナー細胞を含む注入ピペットを前記卵母細胞に前進させ、卵子細胞膜に近接するように１つの核ドナー細胞を囲卵腔に挿入する。
５．前記ピペットを、卵子細胞膜に触れずに、ドナー細胞の接触なしに徐々に後退させる。
６．卵母細胞の全体群に対する該過程を完了し、それらをインキュベータに戻す。
７．ドナー細胞の挿入１０分後、融合を点検する。融合過程は比較的に迅速に起こるため、融合が細胞融合後１５分以内に起こらない場合は、前記過程を反復する。
【００８７】
Ｄ）再構築された卵子の活性化および培養
１．活性化培地（５μＭイオノマイシン）で３７℃５分間ＮＴ卵子を処理し、卵割培地でそれらを完全に洗浄する。
２．活性化後培地（卵割培地において２ｍＭ ６−ＤＭＡＰ）で、前記卵子を５％ ＣＯ２／５％ Ｎ２／９０％ Ｎ２の大気で３７℃４時間再処理する。
【００８８】
実施例１５
再構築された卵母細胞活性化のための改善された技法
現在、ＮＴの様々な報告が、卵母細胞発生が母系ＲＮＡに基づく転写から宿主ゲノム活性化に転換され、効率的な細胞株生成を防止する制限的な段階である８細胞期での、再構築された核移植卵母細胞（胚）の活性化を示唆している。再構築された卵母細胞の２％のみがこの重要な限界点を超えるが、どの生物学的因子がゲノム活性化を増進させるかということは現在知られていない。
【００８９】
精子頭部、特に中間連結部、および精子尾部に存在する因子などの精子因子を、再構築された卵母細胞のゲノム活性化をＮＴの間に増進させるために適用しうるという、これまでに知られていない発見が本明細書に記載される。特定理論に拘束されず、中心小体、有糸分裂紡錘形成に要求される重要な複合体が、ＭＩＩ段階卵母細胞にない。再構築された卵母細胞において中心小体の不在が、ＮＴの間のゲノム活性化に対する主な限界を説明しうる。しかし、それらタンパク質は、ヒト精子の精子頭部と中間連結部との連結部内に位置することが知られており、活性化過程の間の精子因子の追加は、有糸分裂に必要な生物学的機構を提供することによりゲノム活性化を改善することができる。
【００９０】
実施例１６
卵母細胞活性化のための精子因子の調製
さらに具体的には、精子因子は、精子細胞の内部または外部に存在する細胞タンパク質を、射精された精子を洗剤および機械的ブレンディングで処理して分離し、その後、全精子抽出物を、ＤＮＡａｓｅ ＩおよびＲＮＡａｓｅで処理して遺伝物質汚染物を除去して得られる。最終段階は、粗抽出物をバッファで洗浄し、遠心分離（２時間２０，０００ｇ）で濃縮させることである。
１．新鮮な射精されたヒト精子を収集し、１０分間９００ｇで遠心分離して精漿（seminal plasma）を除去する。
２．ペレットを、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むSperm−ＴＡＬＰに再懸濁し、同一セッティングで遠心分離する。
３．上澄み液を除去し、精子ペレットを核分離培地（（ＮＩＭ：１２５ｍＭ ＫＣｌ、２．６ｍＭ ＮａＣｌ、７．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｍＭ ＥＤＴＡジナトリウム塩；ｐＨ７．４５（Kuretake ｅｔ ａｌ．，１９９６））で、２０×１０８精子／ｍＬの最終濃度まで再懸濁して遠心分離し、Sperm−ＴＡＬＰを除去する。
４．ペレットを、１ｍＭジチオトレイトール、１００ｍＭロイペプチン、１００ｍＭアンチパインおよび１００ｍｇ／ｍＬ大豆トリプシン阻害剤を含むＮＩＭで同一の体積で再懸濁する。
５．次に、上澄み液に、４周期の凍結（液体Ｎ２で、周期当たり５分）および解凍（１５℃で周期当たり５分）を行い、その後精子は、２℃５０分間、２０，０００×でペレット化される。
６．結果として得られる上澄み液を注意深く除去してアリコートし、使用するまで−８０℃で維持する。
【００９１】
ヒト精子因子をその後、記載の注入方法を利用して、再構築された卵子に注入する。約２４時間後、卵母細胞は、卵割培地に転換される。さらに２４時間後、卵母細胞をＧ２培養培地に移動させる。このアプローチを利用して、本発明者は、成功裏に再構築された卵母細胞活性化の４０〜８０％成功率まで達成することができ、成功を収めうるＮＴに関して以前には大変であった障害を事実上除去することができる。
【００９２】
実施例１７
多能性幹細胞株確立のための改善された技法
培養された胚盤胞から多能性幹細胞を確立するための一般的な技法が、去る１０年間有意に発展した一方、ＮＴに対する成功裏の適用は、まだ達成されていない。任意の特定理論によって拘束されることなしに、少なくとも１つの有意な制限は、ドナー核の後成的状態であるようである。特に、成人核のメチル化状態、または他の後成的因子は、レシピエント卵母細胞の胚発達過程に移される場合、効果的な再プログラミングを阻みうる。それと係わって、ＮＴ前の、胚のメチル化状態に対するドナー細胞およびその核の修飾が、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株の生成における障害を回避する機会を提示しうる。
【００９３】
２つのアプローチが提案される。第１のアプローチは、ＮＴ前に核ドナー細胞に送達された再プログラミング因子の利用を含む。再プログラミング因子の例は、オクタマ結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−２（Ｓｏｘ−２）、クルッペル類似因子４（ＫＬＦ−４）、ｃ−ｍｙｃおよびnanogを含む。かような再プログラミング因子は、以前より成人体細胞からの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）生成において利用されており、それにより、さらに原始的な発達状態に向かって核状態を変更するそれらの潜在力を立証している。核への再プログラミング因子の接近性が、標的細胞における再プログラミング効果の効率を強化しうるために、オーファン核内受容体エストロゲン関連受容体β（Ｅｓｒｒｂ）のような、他のさらに最近に記述された再プログラミング因子が同様に適用できる。同様に、ＭｙｏＤのような、他の初期胚転写因子のトランス活性化ドメインが、同効果を得るために再プログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４−ＭｙｏＤ融合タンパク質）と共に融合されうる。
【００９４】
第２のアプローチは、ＮＴ前に、ドナー核のメチル化状態を変化させるメチル化変更剤によるのである。このアプローチを利用して、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ１）および共活性因子関連アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＣＡＲＭ １／ＰＲＭＴ４）のようなメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチル化を変化させることに関与することが知られている共活性因子関連タンパク質は、ＮＴ前にドナー核ドナー細胞に送達することができる。これらメチル化変更タンパク質の適用は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株生成を可能とする後成的修飾を生じるメカニズムを提供する。
【００９５】
本明細書に記載されているように、本発明者らは、７×アルギニン（７Ｒ）細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）と結合された２個の組み換えタンパク質、ＥｓｒｒｂおよびＣＡＲＭ １を適用して、活性化され再構築された卵母細胞から３０％近い効率でＮＴ−ｈＰＳＣを再現性あるように生成することに成功した。ヒト短タンデム反復（ＳＴＲ：short tandem−repeat）プローブを利用する分子ＤＮＡ指紋分析は、核ドナーと同一であるか、あるいはほぼ同一の特性を所有する結果ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株を確認した。多様な適用において、多能性を支持すると知られている培養状態を適用することが有利である。それは、例えば、３ｉ培地（神経基底培地５０％、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ５０％、Ｎ２補充剤１／２００ｖ／ｖ、Ｂ２７補充剤１／１００ｖ／ｖ、１００ｍＭ Ｌ−グルタミン１／１００ｖ／ｖ、０．１Ｍ β−ＭＥ１／１，０００ｖ／ｖ、ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害剤）２μＭ、ＰＤ１８４３５２（ＥＲＫカスケード阻害剤）０．８μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）３μＭ）、または修飾３ｉ培地（ＰＤ０３２５９０１（ＭＡＰＫ阻害剤）０．４μＭ含む）の適用を含む。
【００９６】
任意の特定理論に制限されることなしに、ＥｓｒｒｂおよびＣＡＲＭ １の適用は、多能性の確立および維持に関与する核心的な転写因子との相互作用を利用するということが、示唆される。例えば、Ｅｓｒｒｂは、未分化状態の維持に重要な役割を果たし、幹細胞および胚において、転写因子として、Ｏｃｔ−４遺伝子およびnanog遺伝子の発現を調節する。ＣＡＲＭ １は、Ｈ３アルギニン残基１７（Ｈ３Ｒ１７）およびＲ２６をメチル化し、多様な転写因子の調節を介して多くの遺伝子の発現を制御することが知られていた。ＣＰＰ−ＥｓｒｒｂおよびＣＰＰ−ＣＡＲＭ １の処理が、成人幹細胞のＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２およびnanogの発現を上向き調節するということが報告された。それぞれの場合、細胞膜を通した穿通、および培養培地へ単純に添加した後の核の侵入が、多能性マーカー発現に寄与するようである。また、培養培地中のＣＰＰ−ＥｓｒｒｂおよびＣＰＰ−ＣＡＲＭ １は、Ｏｃｔ４の発現を増加させうる。それにより、かような相互作用は、ガラス化凍結された（vitrified／warmed）マウス胚、およびクローン化されたヒト胚に由来する胚盤胞の細胞数の助けになると見られる。
【００９７】
ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株生成におけるこの画期的な業績達成は、ＮＴ前におけるドナー核の修飾が、再プログラミング因子および／またはメチル化変更剤を利用して、成功裏のＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株生成に係わる核心的段階であるという概念の検証を立証する。
【００９８】
実施例１８
多能性幹細胞株を確立するための改善された技法を利用した結果
Ａ）卵母細胞の脱核
実施例１１、１４およびそれ以外の部分（図１）に記載された方法によって、「ナイフピペット」を利用して、ＭＩＩ段階卵子の紡錘複合体（spindle complex）を除去する。
【００９９】
Ｂ）囲卵腔での体細胞移動
実施例１４およびそれ以外の部分に記載されているように、体細胞ドナー核を移動させる。
【０１００】
Ｄ）再構築された卵子の活性化および培養
１．活性化培地で、ＮＴ卵子を５分間３７℃で処理し（５μＭイオノマイシン）、卵割培地で十分に洗浄する。
２．５％ ＣＯ２／５％ Ｎ２／９０％ Ｎ２の大気において、４時間３７℃で、活性化後培地（卵割培地において２ｍＭ ６−ＤＭＡＰ）で卵子を再処理する。
３．６−ＤＭＡＰを含まない培地で活性化された卵子を洗浄し、活性化された卵子を、ＳＡＧＥ卵割培地で最初の２日間、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂが補充された（各２μｇ／ｍｌ）Ｇ２培地でその後３日間、培養する。
【０１０１】
Ｅ）多能性幹細胞の誘導
１．培養された胚盤胞を酸性タイロード溶液（ｐＨ２．０）で数秒間処理して透明帯（ＺＰ）を除去する。ＺＰの除去後、胚をＨｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で激しく洗浄し、微量のタイロード溶液までも除去する。
２．ＩＣＭが確認される場合、レーザ補助胚盤胞切除システム（Hamilton-Thorne Inc.）を利用して、内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離する。胚盤胞の残余部分（栄養膜）を廃棄し、胚盤胞が無傷でないことを確実にする。
３．プレーティング１日前に準備されたＭＥＦ上にＩＣＭをプレーティングする。しかし、クローン化された胚盤胞が区別不可能なＩＣＭを有する場合は、胚全体をプレーティングする。ｈＰＳＣ誘導培地は、血清代替物（serum replacement）（５％ ＳＲ、Invitrogen）、ＦＢＳ（１０％、Hyclone）、プラズマメート（５％）、ｂＦＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＬＩＦ（２，０００units／ｍＩ、Sigma−Aldrich）が補充されたノックアウトＤＭＥＭからなる。
４．同一培地で３日間何も変えずにＩＣＭを培養する。
５．４日目に培地のおよそ１／３を入れ替える。
６．６日目から隔日で培地の１／２を入れ替える。
７．プレーティング後７日以内に初期成長体が確認される。
８．１２日目以前に、コロニーを拡張して凍結保存する。
【０１０２】
記述されているように、通常の技法を用いると、再構築された卵母細胞の最大２％のみが８細胞限界点を超えることにより、胚盤胞形成誘導の失敗を介してＮＴ−ｈＰＳＣ生成を効果的に制限する。しかし、本明細書に記述された技法を利用して、本発明者らは、ＣＡＲＭおよびＥｓｒｒｂのようなメチル化変更剤を利用して該障害を除去した。表１に示されているように、未処理再構築卵母細胞は、１６個の試料において、初期胚盤胞形成に進んでいない。現存の報告と一致し、そのような卵母細胞の大多数が、４細胞および８細胞期を超えて発達することに失敗する。対照的に、ＣＡＲＭ処理再構築卵母細胞は、４７個の試料から９個が初期胚盤胞期に逹している。顕著にも、それらＣＡＲＭ処理再構築卵母細胞において、ほぼ２／３がさらに拡張胚盤胞を形成することができた。同様に、３個のＥｓｒｒｂ処理再構築卵母細胞が、６個の試料から初期胚盤胞を形成することができたが、これらの再構築卵母細胞はいずれも拡張胚盤胞を形成しなかった。いずれの場合も、ＣＡＲＭおよび／またはＥｓｒｒｂ処理は明らかに、対照群に比べて、８細胞期を超えて再構築された卵母細胞の発達を可能にし、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞の生成について以前には対処することができなかった障壁を除去する（表１）。
【０１０３】
（表１）ＳＣＮＴ胚培養に対するＣＡＲＭタンパク質およびＥｓｒｒｂタンパク質の効果
2018046839.tif 000003
【０１０４】
ＮＴ−ｈＰＳＣを分離し培養することができる、胚盤胞を形成する細胞の能力を立証する、再構築された卵母細胞をさらに培養し、マウス胚フィーダ層（ＭＥＦ）に記述されているようにプレーティングし、ここで初期成長体が観察された。追加の培養後、内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞が栄養外胚葉から分離され、最初の継代で生存することができた。
【０１０５】
図２で、（Ａ）体細胞核移植胚盤胞が示され、これはその後、（Ｂ）透明帯の除去後にプレーティングされた。（Ｃ）ＮＴ胚の初期成長体が観察され、そのような細胞は生存することができた。ＩＣＭ細胞の分離は、（Ｄ）３継代後に形成された胚細胞様コロニーを提供した。少なくとも１つのＣＡＲＭ処理の例において、胚盤胞から分離された細胞が３継代を超えて生存することができ、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株の成功裏の発生を立証した（表２）。
【０１０６】
（表２）ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞誘導に対するＣＡＲＭタンパク質の効果
2018046839.tif 000004
【０１０７】
実施例１９
卵母細胞の単為生殖
単為生殖は、ｈＰＳＣ細胞の発生に利用されうる第２の特徴的なアプローチである。単為生殖体誘導ｈＰＳＣ（ｐｎ−ｈＰＳＣ）と本明細書に記述された単為生殖を介したｈＰＳＣ細胞の生産はドナー卵母細胞と遺伝的に同一であり、卵子を生産する任意の女性のためにｈＰＳＣ細胞を生産するための方法を提供する。また、単為生殖は、父系の寄与を含まないので、父系の寄与を利用して生じたｈＳＰＣ細胞に比べ、ｐｎ−ｈＰＳＣのＨＬＡ複雑性が実質的に低減される。ｐｎ−ｈＰＳＣは、正確な遺伝的組織マッチングが欠如していても、集団の相当部分との広範囲な適合性のために操作できるので、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞の低減されたＨＬＡ複雑性は、組織適合性問題を大きく低減させる。例えば、高程度のＨＬＡ多形性が存在しているが、それは、米国白人集団内に存在する約２００個の共通ＨＬＡハプロタイプに過ぎない。共通ハプロタイプに対して選択されたわずか１０個のＨＬＡ同型接合ｈＰＳＣ細胞株パネルが、英国人レシピエントの４０％近くに完全なＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲのマッチングを提供し、６５％近くに有益なマッチングを提供することができると見積もられている。かような広範囲集団との免疫適合性は、移植材料の再生可能な源泉として、ｈＰＳＣ細胞銀行の可能性を創出する。必須的に、広範囲な組織適合性を有する幹細胞銀行内のｈＰＳＣ細胞株の自家再生能は、新たな卵母細胞の持続的な供給のための要求を低減させる。
【０１０８】
実施例２０
単為生殖的活性化に対する可変的アプローチ：ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の特性
前述の過程を介して得られたＭＩＩ段階卵子のいくつかを、単為生殖性胚細胞株を生成するために用いることができる。ｐｎ−ＨＰＳＣの生成のために、無傷の卵母細胞を、体細胞核移植Ｉで記述された同一の手続きを利用して活性化して培養した。
【０１０９】
卵母細胞活性化および活性化後の技法の違いが、結果として得られるｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の免疫学的特徴を定義する遺伝的要素に直接的影響を有するということを、ヒト単為生殖の既存の報告が立証するということを考慮することが重要である。例えば、２つの特異的アプローチは、卵母細胞ドナーとＨＬＡが完全にマッチングする異型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣ、または集団の相当な部分と組織適合性である同型接合性ｐｎ−ｈＰＳＣの生成である。単為生殖が、父系寄与の除去を介してｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株で遺伝的なバリエーションを低減させることができる一方、同型接合性ｈＰＳＣ生成は、対立形質バリエーションの一供給源を除去し、広範囲な個体と組織適合性の細胞を提供することによって、ＨＬＡハプロタイプの生成を介する遺伝的不均一性をさらに低減させる。
【０１１０】
実施例２１
単為生殖Ｉ：異型接合ｐｎ−ｈＰＳＣの生成
前述のように、卵母細胞活性化のための一般的な方法は、通常は精子が入ることによって誘発されるカルシウム変更効果を模倣するものである。一例として、異型接合ＨＬＡ ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が、卵母細胞活性化のためのイオノマイシンの適用、およびそれに続くピューロマイシン類似体６−ＤＭＡＰ（６−aimtheylamino−purine）の添加によって生成され、それは、ヒストンＨ１キナーゼの活性化を阻害することによって、自発的な卵核胞（germinal vesicle）崩壊を可逆的に防止する。
【０１１１】
イオノマイシンおよび６−ＤＭＡＰの段階的な添加が、まずカルシウムの流れを開始させ、タンパク質リン酸化の阻害を誘導し、これら過程は、減数分裂の完了なしに前核形成を誘導する。その他のアプローチは、卵母細胞の電気的活性化、ならびにそれに続くイオノマイシンおよび６−ＤＭＡＰの添加による。しかし、それらの技法に共通するのは、前核形成を促進する６−ＤＭＡＰの添加が、第２極体の放出を阻み、二倍体細胞の生成を誘導することである。これは通常、初期胚発生の間、キアズマ形成（父系および母系のゲノム組み換え）による同型接合ｈＰＳＣ細胞株の生成を可能としない。従って、最初の減数分裂後、残っている卵母細胞核は、母系および父系のゲノムをいずれも所有した異型接合性である。
【０１１２】
さらに具体的には、異型接合ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の生成のための卵母細胞の単為生殖は、下記過程を介して得られる。
【０１１３】
Ａ）卵母細胞の回収および準備
１．卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）をヒアルロニダーゼ（１００ＩＵ／ｍｌ、Sigma、Ｓｔ．Louis、ＭＯ、米国）で２分間処理し、小孔径マイクロピペット（直径１５０μｍ）で剥皮する。卵核胞（ＧＶ）を有するか、あるいは第１極体がない、剥皮された卵母細胞は、使用しない。単一の第１極体を有する剥皮された卵母細胞を、中期ＩＩ（ＭＩＩ）卵母細胞として分類する。
【０１１４】
あるいは、ＣＯＣをSynVitro Hyadaseで処理し、卵丘細胞を除去することができ、その後、パラフィンオーバレイ（Paraffin overlay）と共にＩＶＦ培地で３０分間インキュベーションを行う。
【０１１５】
Ｂ）卵母細胞の活性化
１．活性化培地で、ＭＩＩ卵母細胞を５分間３７℃で処理し（５μＭイオノマイシン）、卵割培地で完全に洗浄する。
２．活性化後培地（５ｎＭトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）含有卵割培地における１〜２ｍＭ ６−ＤＭＡＰ）中で４時間、卵子を再処理する。
３．６−ＤＭＡＰを含まない培地で、活性化された卵子を洗浄し、５ｎＭ ＴＳＡを含む卵割培地で６時間インキュベーションしてから、通常培養培地に移す。
４．活性化された卵子をＳＡＧＥ卵割培地で最初の２日間培養した後、続く３日間ＳＡＧＥ胚盤胞培地で培養する。
【０１１６】
あるいは、５分間の５μＭイオノマイシン、および４時間の１〜２ｍＭ ６−ＤＭＡＰへの連続露出、注意深い洗浄、およびパラフィンオーバレイを有する新鮮なＩＶＦ培地における培養の後、パラフィンオーバレイを有するＩＶＦ培地で活性化を行うことができ、それに続いて翌日に卵割培地で培養を行うことができる。
【０１１７】
実施例２２
単為生殖ＩＩ：同型接合ｐｎ−ｈＰＳＣの生成
対照的に、ＨＬＡ同型接合ｈＰＳＣ細胞株の生成のための直接的なアプローチは、単前核卵母細胞（one-pronuclear oocyte）を含むＨＬＡ同型接合卵母細胞ドナーから、そのような細胞株を生成させるものである。しかし、該アプローチの重要な不利な点は、集団において同型接合ドナーが相対的に少ないことである。代替的に、ＨＬＡ同型接合ｈＰＳＣ細胞株は、第２極体放出（２ＰＢＥ）を可能とするために、６−ＤＭＡＰ添加を除く方法によって、異型接合ドナーから得ることができる。
【０１１８】
活性剤、例えば、Ｃａ２＋イオノフォア、Ａ２３８１７またはイオノマイシンの初期添加、およびその後のサイトカラシンＢなしでのピューロマイシンまたはシクロヘキサミドの添加による該アプローチは、第２極体の放出を可能にし、中期ＩＩ染色体セットの半分のみを有する半数体（haploid）単為生殖体を提供する。これら半数体単為生殖体は、同型接合遺伝子型の形成のために、さらに二倍体胚盤胞に培養される。
【０１１９】
さらに具体的には、同型接合ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の生成のための卵母細胞の単為生殖が下記過程を介して得られる。
【０１２０】
Ａ）卵母細胞の回収および準備、前記の通り
【０１２１】
Ｂ）卵母細胞の活性化
１．活性化培地でＭＩＩ卵母細胞を５分間３７℃で処理し（５μＭ Ａ２３１８７）、卵割培地で完全に洗浄する。
２．活性化後培地（１０μｇ／ｍＬピューロマイシン卵割培地、またはサイトカラシンＢがないシクロヘキサミド）で４時間、卵子を再処理する。
３．活性化された卵子を洗浄し、卵割培地で２４時間、または２細胞期胚に発達するまでインキュベーションする。その後、２個の割球を、マニトル（manitol）またはソビトル（sobitol）ベースの融合培地で、電気融合機器（ＢＴＸ ２０００、Harvard Electric）を利用して、２０μｓ間１６０ｍＶの電気を印加することによって電気融合させる。選択的に、単一パルスを印加してもよく、これは、割球を融合させるのに十分であることが示されている。融合された卵子を、さらに１日、ＳＡＧＥ卵割培地で培養し、それに続いて３日間ＳＡＧＥ胚盤胞培地で培養する。
【０１２２】
実施例２３
ｈＰＳＣ細胞株の生成
単為生殖体の生成（単為生殖を介する）後、後続培養により胚盤胞形成に続き、これから、周辺の栄養外胚葉（trophectodermal）組織の分離を介して、ｈＰＳＣが内部細胞塊から得られる。
１．培養された胚盤胞をプロナーゼ（０．５％、Sigma−Aldrich）または酸性タイロード溶液（ｐＨ２．０）で数秒間処理し、透明帯（ＺＰ）を除去する。ＺＰ除去後、Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で、胚を強く洗浄し、プロナーゼ溶液またはタイロード溶液の痕跡を除去する。
２．レーザ補助胚盤胞切除システム（Hamilton−Thorne Ｉｎｃ．）を利用して、内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離する。胚盤胞の残留部分（栄養膜）を廃棄し、胚盤胞が無傷でないことを確実にする。
３．プレーティング１日前に調製されたＭＥＦ上にＩＣＭをプレーティングする。ｈＰＳＣ誘導培地は、血清代替物（１０％ ＳＲ、Invitrogen）、ＦＢＳ（５％Hyclone）、プラズマメート（５％）、ｂＦＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＬＩＦ（２，０００units／ｍＩ、Sigma−Aldrich）が補充されたノックアウトＤＭＥＭで構成される。
４．同一培地で３日間何も変えずにＩＣＭを培養する。
５．４日目に培地のおよそ１／３を入れ替える。
６．６日目から隔日で、培地の１／２を入れ替える。
７．プレーティング後７日以内に初期成長体が見られる。
８．１２日目の前に、コロニーを拡張して凍結保存する。
【０１２３】
実施例２４
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株およびＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株の特性究明
結果として生じたｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株およびＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株の特性を究明するために、さまざまなゲノム、トランスクリプトーム、エピジェネティック、タンパク質、および／または機能的な研究を行うことができる。一例として、ｈＰＳＣ多能性マーカーが、転写物（例えば、マイクロアレイ、ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはタンパク質レベル（例えば、ウェスタンブロット、免疫細胞化学、２−Ｄゲル）で測定される。これら多能性マーカーは、特に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＳＳＥＡ−３、腫瘍拒絶抗原１−８１（Ｔｒａ−１−８１）、Ｔｒａ−１−６０、オクタマ結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−２（Ｓｏｘ−２）、nanog、ジンクフィンガータンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２）、lefty Ａ、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ）、テロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１）、および発達多能性関連遺伝子（Ｄｐｐａ−２）を含む。
【０１２４】
さらに、ヒト短タンデム反復（ＳＴＲ）プローブによるＤＮＡ指紋分析が、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株およびＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株のゲノム分析に利用できる。ｐｎ−ｈＰＳＣの場合、結果として得られる細胞株は、卵母細胞ドナーと同一であるか、あるいはほぼ同一である。ＮＴ−ｈＰＳＣの場合、結果として得られる細胞株は、核ドナーと同一であるか、あるいはほぼ同一の特性を所有する。ＮＴ−ｈＰＳＣの成功裏の生成確認における他の核心的争点は、脱核失敗およびそれに後く単為生殖的活性化の可能性の除去である。他の例において、ゲノムＤＮＡは、遺伝的等価性を決定するために、一塩基多形（ＳＮＰ）マイクロアレイを利用して分析される。一例において、バイナリー（binary）ＳＮＰマーカーの異型接合性は、０．５の最大値を有し、分析は、０．３７５を超える（集団において０．２５超過０．７５未満の頻度）異型接合性を有するＳＮＰマーカーで行われる。他の例において、０．１ｃＭのようなマーカー間距離は、それらが個別的基準においてさらに少ない情報を提供するために、密接連関（tight linkage）のＳＮＰマーカーの排除に利用される。
【０１２５】
他の例において、後成的研究を行うことができる。例えば、ＣｐＧ部位の調査（interrogation）を可能とする、亜硫酸水素塩処理に続いてアレイに適用されるゲノムＤＮＡを利用して、メチル化を分析することもできる。
【０１２６】
つきつめると、ｈＰＳＣの核心的特性は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の３層全ての胚葉層から体細胞に分化する多能性、および自己再生である。このように、多能性は、適切な動物モデル（例えば、ＳＣＩＤマウス）への筋肉内（ＩＭ）注入を介したテラトーマ形成を介して、または低付着条件での培養に続く胚様体（ＥＢ）形成によって、評価することができる。さらに、自己再生能は、高い増殖、および長期間（例えば、１年、＞５０継代）にかけた継続的増殖、テロメラーゼ活性レベル、ならびに／または安定した核型によって観察することができる。
【０１２７】
実施例２５
ＭＨＣ−ＨＬＡマッチング
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチングは、器官寄贈の間、免疫寛容のために重要である。ＭＨＣ−ＨＬＡマッチングの不在下では、免疫抑制薬が要求される。免疫拒絶の危険性の程度は、ドナーとレシピエントとの間の細胞表面抗原提示タンパク質の離隔度（disparity）の関数であるために、多様な記載された方法によって生成されたｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株およびＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株のＭＨＣ−ＨＬＡプロファイルを評価することが重要である。
【０１２８】
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ ＨＬＡハプロタイプは、親から共に遺伝されたＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座（locus）対立形質の特定セットである。高度のＨＬＡ多形が存在するが、米国白人集団内には約２００個のみの共通ＨＬＡハプロタイプが存在する。
【０１２９】
このＭＨＣ−ＨＬＡマッチングは、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株の生成で単為生殖エラーが発生しなかったというさらなる証拠を提供する。ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株と関連して、意図されない単為生殖活性化を排除するために成功裏の核移植を立証することが重要である。各ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株が偶然に生成されたｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株ではないことを確立するために、全てのＨＬＡイソタイプについて各ドナーのものに対してＮＴ−ｈＰＳＣを確認する。
【０１３０】
実施例２６
ＭＨＣ−ＨＬＡ Ｉ血清型およびＩＩ血清型
異なる例において、ＨＬＡ遺伝形質分析は、血液または卵丘細胞のような、多様なドナー供給源からゲノムＤＮＡを抽出し、かつ対立形質特異的シーケンシングプライマーのＰＣＲを介した対立形質変異を分析することによって行われる。主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）は、ＨＬＡ−Ａ血清型Ａ１−Ａ３、Ａ９−Ａ１１、Ａ２３−Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０−３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４およびＡ８０、ＨＬＡ−Ｂ血清型Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７−Ｂ７２、Ｂ７５−Ｂ７８、Ｂ８１、Ｂ＊８２ Ｂ＊８３、ＨＬＡ−Ｃ血清型ＣＷ０１〜ＣＷ０８を含む。主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）は、ＨＬＡ−ＤＰ血清型ＤＰＡ１およびＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ血清型ＤＱ２−ＤＱ９、ＨＬＡ−ＤＲ血清型ＤＲ１−Ｄ１８を含む。
【０１３１】
実施例２７
ＨＬＡ同型接合性ＨＬＡ型ＥＳ細胞株のバンキング
先に言及したように、高度のＨＬＡ多形が存在するが、米国白人集団には約２００個のみのＨＬＡハプロタイプが存在する。共通ハプロタイプについて選択された１０個ほどの少ないＨＬＡ同型接合性ｈＰＳＣ細胞株のパネルが、英国人レシピエントの４０％近くに対して完全なＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲマッチを、および６５％近くに対して有益なマッチを提供するということが推算された。この広範囲な集団に対する免疫適合性は、移植材料の再生可能な供給源としてのｈＰＳＣ細胞バンキングの可能性を生成する。重大なこととして、幅広い組織適合性を有する幹細胞のバンク内のｈＰＳＣ細胞株の自己再生能は、新しい卵母細胞の持続的な供給に対する要求を低減させるであろう。
【０１３２】
ＨＬＡ同型接合性ｈＰＳＣ細胞株の生成のための直接的なアプローチは、ＨＬＡ同型接合性ドナーから得られた体細胞を利用するそのような細胞株を生成することである。しかし、このアプローチの主要な弱点は、集団における同型接合性ドナーの相対的な希少性である。この弱点を克服するための一戦略は、バンキングされた臍帯血細胞をスクリーニングすることである。ほとんどの場合、所与の臍帯血のＨＬＡ型は凍結保管前にテストされて記録されているため、単純な文書スクリーニングによって、それらのＨＬＡ同型接合性臍帯血細胞（特に、単核細胞、ＣＤ３４＋）試料は容易に発見され、核移植ドナー細胞として分類、入手、利用できる。３０〜５０個の間のいずれかのＨＬＡ同型接合性細胞株が、移植材料として生成されてバンキングされる。
【０１３３】
全ての核移植手続きおよび胚幹細胞誘導手続きは、本出願で記載されたところと同一である。
【０１３４】
前述の多様な方法および技術は、本発明を遂行するための複数のやり方を提供する。記載された全ての目的または利点が、本願に記載された任意の特定態様によって必ずしも達成されるものではないということが理解されなければならないということは言うまでもない。従って、例えば、当業者は、本願で教示または提案されうる他の目的または長所を必ずしも達成せずに、本願に教示された１つの長所または一群の長所を達成または最適化するように方法を遂行しうることを認識するであろう。さまざまな有利あるいは不利な代案が本願に言及されている。一部の好ましい態様は、一つ、もう一つ、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方、他の態様は、一つ、もう一つ、またはいくつかの有利ではない特徴を具体的に排除し、さらに他の態様は、一つ、もう一つ、またはいくつかの有利な特徴を含むことによって、現在の不利な特徴を具体的に緩和させるということが理解されなければならない。
【０１３５】
また、当業者は、異なる態様からの多様な特徴の適用性を認識するであろう。同様に、前述の考察した多様な要素、特徴および段階は、それぞれのかような要素、特徴または段階に係わる他の公知の等価物と同様に、当業者によって組み合わされて、本明細書に記載された原理によって方法を遂行する。多様な要素、特徴および段階のうち一部は、具体的に多様な態様に含まれ、他のものは、多様な態様から排除される。
【０１３６】
本発明は特定の態様および実施例の脈絡で開示されたが、本発明の態様は、具体的に開示された態様を越え、他の代替的な態様、ならびに／または用途およびその修飾および等価物に拡張されるということが当業者によって理解されるであろう。
【０１３７】
多くの変形および代替的要素が本発明の態様に開示されている。また、さらなる変形および代替的要素は当業者に明白であろう。かような変形には、制限なしに、単為生殖方法、体細胞核移植方法、単為生殖または体細胞核の移植技法で使用された細胞を調製、分離または修飾する方法、前述の技法からの多能性細胞株の誘導方法、本発明の教示に係わる疾患および／または状態の治療方法、そこで利用された技法、ならびに組成物および溶液の用途、ならびに本発明の教示を介して生成された産物の特定用途がある。本発明の多様な態様は、具体的に任意のこれらの変形または要素を含んだり排除したりする。
【０１３８】
一部態様において、本発明の特定態様を記載し、特許請求するために使用された成分の量、濃度、反応条件のような特性を表現する数字は、場合によって、用語「約（about）」によって修飾されるものであると理解されなければならない。従って、一部態様において、書面明細書および添付された特許請求の範囲に示された数値パラメータは、特定態様によって得ようとする所望する特性によって変わりうる近似値である。一部態様において、数値媒介変数は、報告された有効数字の数の観点から、かつ通常の四捨五入技法を適用することによって解釈されなければならない。本発明のいくつかの態様の広範囲な範囲を示す数値範囲および媒介変数が近似値であるにもかかわらず、特定例に記載された数値は、正確に実行可能なものであると報告されている。本発明の一部態様に示された数値は、それらのそれぞれの試験測定値において見られる標準偏差の結果必然的に一定のエラーを含みうる。
【０１３９】
一部態様において、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」、および本発明の特定態様を記載する脈絡で使用された類似の言及（特に、特許請求の範囲の一定の項の脈絡において）は、単数および複数のいずれもカバーするように解釈される。本願において、値の範囲の引用は、ただその範囲内に属するそれぞれの別個の値を個別的に指す略式表現法となるように意図される。本願に取り立てて指示されない限り、それぞれの個別的な値は、まさにそれが個別的に本願に引用されたように明細書に組み入れられる。本願に記載された全ての方法は、本願に取り立てて指示されたり、文脈上明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で遂行される。本願の特定態様と係わって提供された任意および全ての例、または例示的な言語（例えば、「のような（such as）」）の使用は、ただ本発明をさらに良好に照らし出すように意図され、取り立てて要求されない限り、本発明の範囲に対するいかなる制限も付与するものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に必須な任意の特許請求されていない要素として解釈されてはならない。
【０１４０】
本願に開示された発明の代替要素、または態様のグループ化は、制限として解釈されてはならない。それぞれのグループ構成員は、個別的に、または本願で発見されたグループの他の構成員、または他の要素と組み合わせて言及されて特許請求される。１グループの１または複数の構成員が、便宜上および／または特許可能性の理由で含まれたり、あるいはそこから削除されたりする。任意のかような包含または削除が発生するとき、本願の明細書は、修正されたグループを含み、それによって添付された特許請求の範囲に使用された全てのMarkushグループの書面説明を充足すると見なされる。
【０１４１】
本発明を実施するために本発明者が知っている最善のモードを含む本発明の望ましい態様が、本願に記載されている。かような望ましい態様に係わる変形は、次の説明を読むことにより、当業者に明白であろう。当業者は、かような変形を適切に使用することができ、本発明は、本願に具体的に記載されたところと異なって実行されることが予想される。従って、本発明の多くの態様は、適用可能な法律によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題の全ての修飾および同等物を含む。さらに、全ての可能な変形において、前記要素の任意の組み合わせは、本願に取り立てて指示されたり、あるいは文脈によって確かに矛盾したりするものではない限り、本発明に包含される。
【０１４２】
また、本明細書全体にわたって、特許および印刷出版物に対して数多くの引用がなされている。引用された参照文献および印刷された出版物はそれぞれが、それらの全体が参照により個別に本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
最後に、本明細書に開示された本発明の態様は、本発明の原理を例示するものであると理解されなければならない。使用される他の修飾は、本発明の範囲内にある。従って、制限するものではないが、例えば、本発明の代替的な構成が、本明細書の教示に従って利用される。従って、本発明の態様は、正確に図示されて説明されたところに制限されるものではない。
【図１】
2018046839.tif 000005
【図２】
2018046839.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月24日(2017.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を生成する方法であって、
活性化培地でインキュベーションして卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして単為生殖体を生成する段階と、
該単為生殖体を培養培地でインキュベーションして胚盤胞を形成させる段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階と、を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、少なくとも１つのドナー細胞の少なくとも１つの核を卵母細胞に添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階、および卵母細胞の宿主核を除去する段階を含む核移植方法が本明細書に記載される。他の態様において、前記方法は、活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階、活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階、および胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、ＩＣＭ細胞は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株にさらに培養することができる。他の態様において、前記方法は、卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む。他の態様において、卵母細胞は、ＣＡＲＭ １および／またはＥｓｒｒｂの存在下でインキュベーションされる。
[本発明1001]
単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を生成する方法であって、
活性化培地でインキュベーションして卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして単為生殖体を生成する段階と、
該単為生殖体を培養培地でインキュベーションして胚盤胞を形成させる段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階と、を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、方法。
[本発明1002]
活性化培地がカルシウムイオノフォアを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
カルシウムイオノフォアが、イオノマイシン、Ａ23187、ボーベリシン、Ｘ−537Ａおよび／またはアベナシオリドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
活性化後培地が、6−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
活性化後培地が、第2極体放出を阻まない化合物を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
卵母細胞が中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階卵母細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
卵母細胞が中期Ｉ（ＭＩ）段階卵母細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
卵母細胞が単一前核卵母細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が異型接合性である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が同型接合性である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が、集団の少なくとも1％と免疫適合性であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する多能性細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
ＣＡＲＭ 1および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、本発明1001の方法。
[本発明1015]
単為生殖体由来胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞から分離された多能性細胞を含む、単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）。
[本発明1016]
単為生殖体由来胚盤胞が、活性化培地で卵母細胞をインキュベーションして生成された単為生殖体を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
活性化培地がカルシウムイオノフォアを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
カルシウムイオノフォアが、イオノマイシン、Ａ23187、ボーベリシン、Ｘ−537Ａおよび／またはアベナシオリドを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
単為生殖体由来胚盤胞が、活性化された卵母細胞を活性化後培地でインキュベーションして生成された単為生殖体を含む、本発明1016の方法。
[本発明1020]
活性化後培地が、6−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン、エタノール、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および／またはサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が異型接合性である、本発明1015の方法。
[本発明1022]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が同型接合性である、本発明1015の方法。
[本発明1023]
ｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株が、集団の少なくとも1％と免疫適合性であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する多能性細胞を含む、本発明1015の方法。
[本発明1024]
多能性細胞が、ステージ特異的胚抗原−4（ＳＳＥＡ−4）、ＳＳＥＡ−3、腫瘍拒絶抗原1−81（Ｔｒａ−1−81）、Ｔｒａ−1−60、オクタマ結合転写因子4（Ｏｃｔ−4）、性決定領域Ｙ−ｂｏｘ−2（Ｓｏｘ−2）、nanog、ジンクフィンガータンパク質−42（Ｒｅｘ−1／Ｚｆｐ−42）、lefty Ａ、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ）およびテロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−1）を含む群から1または複数のマーカーを発現する、本発明1015の方法。
[本発明1025]
多能性細胞が、内胚葉層、中胚葉層および外胚葉層由来の細胞に分化することができる、本発明1015の方法。
[本発明1026]
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、本発明1015の方法。
[本発明1027]
ＣＡＲＭ 1および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、本発明1015の方法。
[本発明1028]
1または複数の本発明1015の単為生殖体由来ヒト多能性幹細胞株（ｐｎ−ｈＰＳＣ）を含むｐｎ−ｈＰＳＣ細胞株のライブラリー。
[本発明1029]
核移植ヒト多能性幹細胞株（ＮＴ−ｈＰＳＣ）を生成する方法であって、
卵母細胞の核を除去する段階と、
少なくとも1つのドナー細胞の少なくとも1つの核を添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階と、
活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階と、を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、方法。
[本発明1030]
前記少なくとも1つのドナー細胞の少なくとも1つの核を添加することが、直接注入を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記少なくとも1つのドナー細胞の少なくとも1つの核を添加することが、体細胞融合を含む、本発明1029の方法。
[本発明1032]
体細胞融合が、前記少なくとも1つのドナー細胞と、センダイウイルス、そのタンパク質または抽出物との接触を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記少なくとも1つのドナー細胞が体細胞または生殖細胞を含む、本発明1029の方法。
[本発明1034]
紫外線の不在下で遂行される、本発明1029の方法。
[本発明1035]
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、本発明1029の方法。
[本発明1036]
ＣＡＲＭ 1および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、本発明1029の方法。
[本発明1037]
本発明1029の方法によって生産されたＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株。
[本発明1038]
少なくとも1つのドナー細胞の少なくとも1つの核を卵母細胞に添加し、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階と、
該卵母細胞の宿主核を除去する段階
を含む  核移植方法。
[本発明1039]
活性化培地でインキュベーションしてＮＴ卵母細胞を活性化させる段階と、
該活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階と、
該胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を分離する段階を含み、
該ＩＣＭ細胞が、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株としてさらに培養可能である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
卵母細胞に精子因子を注入する段階を含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
ＣＡＲＭ 1および／またはＥｓｒｒｂの存在下で卵母細胞がインキュベーションされる、本発明1039の方法。
【外国語明細書】
2018046839000001.pdf
2018046839000002.pdf
2018046839000003.pdf
2018046839000004.pdf