(57)【要約】【課題】変性しやすい医療用タンパク質をより安定化でき、濃縮、保存等が容易で、投与するときは容易に元のタンパク質にできる方法を提供しようとする。【解決手段】医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、当該タンパク質がより安定化でき、輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。【選択図】図１
2018065765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の複合体を含有する水性懸濁液またはその濃縮物を含有する注射剤。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリグルタミン酸またはこれらの水溶性塩である請求項１または２に記載の複合体、水性懸濁液、その濃縮物または注射剤。
【請求項４】
前記水性懸濁液のｐＨが、３．５〜４．５である請求項２または３に記載の水性懸濁液。
【請求項５】
抗体タンパク質と、分子量１．５ｋＤａ〜５．５ｋＤａのポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体タンパク質を安定化させる方法。
【請求項６】
抗体タンパク質と分子量５．５ｋＤａ超のポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体タンパク質を安定化させる方法。
【請求項７】
前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸である請求項５または６に記載のタンパク質を安定化させる方法。
【請求項８】
抗体タンパク質を、ｐＨ３．５〜４．５で、ポリグルタミン酸と複合体を形成させ、前記複合体に電解質（塩）を添加して、かつｐＨを高くして前記抗体タンパク質を前記複合体から解離させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミノ酸のαへリックス構造を用いる医療用タンパク質との複合体、安定化方法とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の進歩により、1980年代以降、さまざまなタンパク質医薬品が開発されてきた。特に、分子標的薬として知られている抗体の進歩は目覚ましく、これまでに治療が困難だったがんや関節リウマチなどの難病治療に貢献してきた。
タンパク質医薬品の経口投与は、低分子化合物の医薬品とは異なり困難なので、注射によって体内に投与されることが多い。なかでも皮下注射は痛みも少なく、簡便で自己投与（患者の自己注射）も可能なので、新しい投与法として期待されている。しかし、皮下注射は投与量が1.5mL以下に制限されるため、通常、100mg/mL以上の高濃度のタンパク質溶液を調製する必要がある。
【０００３】
タンパク質医薬品の高濃度化には、粉末製剤を再溶解する方法が広く用いられている。凍結乾燥されたタンパク質の粉末を少量の溶液で溶かすだけだが、現実には難しい点がいくつかある。まず、タンパク質が不安定であることを考慮しなければならない。粉末状態のタンパク質を溶解させると、せん断応力や表面張力などの物理化学的ストレスがかかり、不可逆に変性することがある。さらに、変性タンパク質の凝集は、調製するタンパク質溶液が高濃度ほど起こりやすい。凝集体はタンパク質医薬品の有効性を低下させるだけでなく、好ましくない免疫反応を引き起こすなどの安全面にも悪影響を及ぼす。このようなタンパク質の不安定性のほかに、溶解に要する時間も現実的な課題になっている。高濃度の塩溶液を調製するような場合には、スターラーやボルテックスで撹拌すれば溶かすことが可能だが、タンパク質は不安定なので、変性させないよう慎重に取り扱う必要がある。実際の製剤では、バイアル中の粉末製剤に生理食塩水などの溶媒を加えたあと、バイアルを泡立てないようゆっくり振ることで溶解させる．そのため、タンパク質のすべての粉末を溶解させるために、数十分間から数時間かかってしまうこともある。
【０００４】
ほかのアプローチとして、タンパク質の濃縮がある。すなわち、低濃度のタンパク質溶液から溶媒を選択的に取り除き、溶媒量を減らして高濃度のタンパク質溶液を調製する方法である。代表的な濃縮法には限外ろ過やクロマトグラフィー、エバポレーション法があり、粉末製剤にして再溶解する方法では、凍結乾燥、スプレードライ法などが挙げられる。
しかし、操作工程が増えるので、設備や時間のコストが課題として残される。近年では、液‐液相分離やゲル化、結晶化など、装置が不要な新しい濃縮法の開発も進んでいるが、処理に伴うタンパク質の不可逆な変性などの課題は残されてしまう。このように、高濃度のタンパク質溶液を得るために、１）タンパク質を変性させずに、２）簡便で迅速な工程で、３）装置などの投資が不要な方法の開発が期待されている。さらに、今後もタンパク質医薬品の種類が増えることを考えると、抗体や酵素やホルモンなどによらず、４）多様なタンパク質に利用できる汎用的な方法であることが望ましい。
本出願人は、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤を特許文献１で開示した。タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤は、溶媒を除去して濃縮することが可能であり、低濃度の電解質を添加して当該タンパク質を解離して医薬品として利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５/０６４５９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
医療用タンパク質の安定化方法は多数提供されているが、さらなる要求がある。変性しやすい医療用タンパク質をより安定化でき、濃縮、保存等が容易で、簡便に調整でき、弱い力で投与できる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、医療用タンパク質を安定化することができ、医療用タンパク質の保存性を高くすることができる複合体を提供し、しかも必要な場合には複合体を直接生体内へ投与できる、ポリアミノ酸のαへリックス構造と医療用タンパク質の複合体、およびその用途を提供しようとする。
【０００８】
すなわち本発明は、以下を提供する。
（１）医療用たんぱく質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体。
（２）上記（１）に記載の複合体を含有する水性懸濁液またはその濃縮物を含有する注射剤。
（３）前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリグルタミン酸またはこれらの水溶性塩である（１）または（２）に記載の複合体、水性懸濁液、その濃縮物または注射剤。
（４）前記水性懸濁液のｐＨが、３．５〜４．５である（２）または（３）に記載の水性懸濁液。
（５）抗体たんぱく質と分子量１．５ｋＤａ〜５．５ｋＤａのポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体たんぱく質を安定化させる方法。
（６）抗体たんぱく質と分子量５．５ｋＤａ超のポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成して、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、抗体たんぱく質を安定化させる方法。
（７）前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸である（５）または（６）に記載のタンパク質を安定化させる方法。
（８）抗体タンパク質を、ｐＨ３．５〜４．５で、ポリグルタミン酸と複合体を形成させ、前記複合体に電解質（塩）を添加して、かつｐＨを高くして当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させる方法。
【発明の効果】
【０００９】
医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成すると、従来得られていたポリアミノ酸のランダム構造との複合体より、当該タンパク質がより安定化でき、輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ポリグルタミン酸のｐＨ４でのαへリックス構造と、ｐＨ７のランダム構造とを説明する模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、表１の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、表１の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、表３の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、表３の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、表６の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、表６の結果を示すグラフである。横軸は、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図５】表７の振とうストレス前後の残存率の結果を示すグラフである。
【図６】表８の熱ストレス前後の残存率の結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、表９の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、表９の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、表１０の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、表１０の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、表１１の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、表１１の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、表１２の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の形成率を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、表１２の結果を示すグラフである。横軸は、抗TNFαモノクローナル抗体1質量部当りのポリ−Ｌ−グルタミン酸の質量部を示す濃度である。縦軸は、測定された複合体の回収率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔１．医療用タンパク質とαへリックス構造のポリアミノ酸との複合体〕
αヘリックス（Alpha helix）はタンパク質の二次構造の共通モチーフの１つで、バネに似た右巻きらせんの形をしている。溶液中の短いポリペプチド鎖は、ヘリックスを形成するのに要するエントロピーがヘリックスを結合することによる安定性によって補償されないため、αヘリックス構造を取ることはあまりない。異なったアミノ酸配列はαヘリックスの形成に対して異なった傾向を示す。メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リシンは特にヘリックスを作る傾向が強いが、プロリン、グリシン、チロシン、セリンはヘリックスを作りにくい。
本発明者等は、下記２つの新たな知見を得て本発明をなした。第一はポリグルタミン酸はある程度以上の鎖長のものは低ｐＨでαへリックス構造を取り、抗体タンパク質との複合体を形成した際の結合が強固になり、より安定化できる。第二はポリグルタミン酸はｐＨが高くなるとランダム構造をとるので抗体タンパク質との結合力が弱まり複合体からタンパク質を解離し易くなる。医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は水溶液中のすべてのタンパク質がαへリックス構造との複合体を形成している必要は無く、その一部がポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成していれば、ランダム構造との複合体より安定化できるので、水溶液中のタンパク質の一部がαへリックス構造との複合体を形成していればよい。
図１は、ポリグルタミン酸のｐＨ４でのαへリックス構造と、ｐＨ７におけるランダム構造とを説明する模式図である。ランダム構造では静電的相互作用によって複合体が形成される。αへリックス構造との複合体は静電的相互作用以外の疎水的相互作用がさらに働いていると考えられる。
【００１２】
医療用タンパク質はポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体を形成すると、ポリアミノ酸のランダム構造との複合体に比べて、タンパク質との結合力の高い安定した複合体が得られ、タンパク質の用途が広がる。一般にタンパク質医薬品の安定化には、賦形剤、界面活性剤、安定化剤等の添加剤が用いられるが、これらを用いる際には、タンパク質医薬品毎にその種類や組合せ、添加量を最適化するための複雑かつ膨大な検討が必要となる。本発明の水性懸濁剤は、ポリアミノ酸との複合体を形成することで簡便に安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がなく、その有用性を高めることができる。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま投与する、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解させて水性液として投与することができる。さらに、タンパク質が高濃度であっても複合体の水性懸濁液は粘度が低いという特徴を有するため、使用時に容器中に残存し無駄となる量を減らすことができ、また、シリンジを用いて投与する際には、同濃度のタンパク質水溶液に比べ弱い力で投与することができる。
【００１３】
用いる医療用タンパク質は限定されない。分子量は０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａが好ましく、ヒュミラ（登録商標）の有効成分として知られるアダリムマブ、ランマーク（登録商標）の有効成分として知られるデノスマブなど医薬製剤として有用性の高い抗体タンパク質を用いることが好ましい。
（抗体）
例えば、ムロモナブ-ＣＤ３、卜ラスツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、卜シリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベパシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、力ナキヌマブ、デノスマブ、モガムリズマブ、セル卜リズマブペゴル、オファツムマブ、ペルツズマブ、卜ラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ナタリズマブ、ニポルマブ、アレムツズマブ、ヨウ素１３１修飾卜シツモマブ、力ツマキソマブ、アデ力ツムマブ、エドレコロマブ、アブシキシマブ、シルツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オビヌツズマブ、ベドリズマブ、ペムブロリズマブ、イクセキズマブ、ジリダブマブ、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマフがある。
(融合タンパク質)
例えば、エタネルセプ卜、アバタセプ卜、ロミプロスチム、アフリベルセプ卜がある。
その他の医療用タンパク質としては、酵素、血液凝固線溶系因子、血清タンパク質、ホルモン、ワクチン、インターフェロン類、エリスロポエチン類、サイトカイン類が挙げられる。
【００１４】
（ポリアミノ酸）
本発明の複合体はタンパク質とポリアミノ酸とを水溶液中でｐＨ調整してポリアミノ酸がα構造をとる条件でたんぱく質と結合させて製造することができる。複合体を含有する水性懸濁液は、水、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびｐＨ調整剤を適宜組合せて含有することができる。しかし、ここで記載する成分以外の添加剤を含有しないことが好ましい。また、複合体を含有する水性懸濁液を濃縮することでタンパク質を濃縮することができる。複合体を含有する水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して複合体を解離してタンパク質を得ることができる。
複合体は主として静電相互作用を介して形成されるので、タンパク質とそれと反対の電荷をもつポリアミノ酸とを組み合わせて複合体とする。
カチオン性のタンパク質に用いるアニオン性ポリアミノ酸の例は、ポリグルタミン酸（ＭＷ：７５０〜５０００、ｐＩ：２．８１〜３．４６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：３０００〜１５０００、ｐＩ：２．３６〜３．００）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：１５０００〜５００００、ｐＩ：１．８５〜２．３６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：５００００〜１０００００、ｐＩ：１．５６〜１．８５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：２０００〜１１０００、ｐＩ：２．０６〜２．７５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１．９３〜２．３９）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのアニオン性ポリアミノ酸であり、これらとカチオン性タンパク質との複合体が形成できる。
アニオン性のタンパク質に用いるカチオン性ポリアミノ酸の例は、ポリリジン（ＭＷ：１０００〜５０００、ｐＩ：１０．８５〜１１．５８）、ポリリジン（ＭＷ：４０００〜１５０００、ｐＩ：１１．４９〜１２．０６）、ポリリジン（ＭＷ：１５０００〜３００００、ｐＩ：１２．０６〜１２．３７）、ポリリジン（ＭＷ：３００００〜、ｐＩ：１２．３７〜）、ポリアルギニン（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１３．４９〜１３．９７）、ポリアルギニン（ＭＷ：１５０００〜７００００、ｐＩ：１３．９８〜１４．００）、ポリアルギニン（ＭＷ：７００００〜、ｐＩ：１４．００）、ポリヒスチジン（ＭＷ：５０００〜２５０００、ｐＩ：７．７４〜８．３０）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのカチオン性ポリアミノ酸であり、これらとアニオン性タンパク質との複合体が形成できる。
【００１５】
電解質としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等が例示できるが、好ましくは生体適合性が最も高いＮａＣｌが選択される。電解質濃度は限定されないが５質量％以下で、複合体が溶解する十分量を用いることができる。
【００１６】
〔緩衝液〕
本発明に使用する緩衝液は、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液を指し、緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないように調整された水溶液である。緩衝液は通常化学的に用いられるものであれば特に限定されないが、生物学的に用いられる緩衝液が好ましい。より好ましい形態の緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ‐ＨａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝液、ＴｒｉｓＨＣl緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液）、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−pｉｐｅｒａｚｉｎｅ  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、グリシンＮａＯＨ緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液）、イミダゾール緩衝液等の生体試料に適したもので、生体への投与が可能な緩衝液を用いることができる。緩衝液の、複合体を含有する水性懸濁液への配合は、予め複合体を解離させずに投与でき、投与後体内でタンパク質を解離させて使用する投与方法に好適である。
【００１７】
本発明の複合体、複合体を含有する水性懸濁液またはその濃縮物、これらを含有する注射剤は、一般毒性がないことが解っている。非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む任意の投与の経路用に、ならびに必要であれば、局部治療、病変内投与用に製剤化される。非経口注入としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下の投与が挙げられる。好ましくは、注射によって、最も好ましくは、静脈内または皮下の注射によって投与される。局所、特に、経皮、経粘膜、直腸、経口の投与、または例えば、所望の部位の近くに置かれた力テーテルを通じた局部投与を含む。投与の経路に応じて、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含んでもよい。そのような賦形剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒等が例示できる。
医療用タンパク質とポリアミノ酸のαへリックス構造との複合体は、低ｐＨで形成でき、医療用タンパク質とポリアミノ酸のランダム構造との複合体より安定である。そのため投与するまでは複合体としてより長期に安定で常温での保存が可能となり、体内に投与するとｐＨ７の環境となり、複合体のαへリックス構造がランダム構造になりタンパク質が容易に解離するので医療用タンパク質として有効に利用することができる。
【００１８】
２．複合体の製造方法
ポリアミノ酸がαへリックス構造をとるのは比較的低ｐＨであり、例えばｐＨ３．５〜４．５の緩衝液中でポリアミノ酸とタンパク質とを接触させて複合体を製造できる。製造したポリアミノ酸のαへリックスとタンパク質との複合体は、同じポリアミノ酸のランダム構造との複合体に比べて安定性が高い。必要な場合は電解質（塩）を、複合体を含有する水性懸濁液に加えて、そのまま、またはｐＨを高くして解離させ、タンパク質を得る。
〔沈澱−再溶解法〕
タンパク質の原液に（Ｓｔｅｐ１）、αへリックス構造とする条件で反対の電荷をもつポリアミノ酸を加え，沈殿性の複合体を形成させる（Ｓｔｅｐ２）。次に，この複合体を沈殿させ（Ｓｔｅｐ３）、沈殿から上清を取り除くことで、タンパク質溶液を濃縮できる（Ｓｔｅｐ４）。この後、そのまま複合体を生体内に投与することで、ポリアミノ酸がランダム構造をとるｐＨとなり、タンパク質は解離し易くなり元のネイティブ状態のタンパク質が得られる。解離に必要な濃度の塩を加えてあらかじめ複合体を再溶解させる、またその後生体内に投与することもできる（Ｓｔｅｐ５）。具体的な条件として，再溶解時の塩の終濃度は，生理食塩水と同等の１５０ ｍＭに設定するのが好ましい。
【実施例】
【００１９】
以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
例における形成率および回収率の測定と算出方法は限定されないが、例えば、水性懸濁液中のタンパク質・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体の形成率は、複合体を沈殿させた後、上清をサイズ排除クロマトグラフ（以下、ＳＥＣということがある）法で測定し、タンパク量が０％であれば、全てのタンパク質が複合体になっているとし、形成率１００％とする。また、回収率は、複合体を解離させた溶液をＳＥＣで測定し、形成率を加味した上で、タンパク濃度が複合体形成前の薬液濃度と比較して同じであれば、全てのタンパク質が形成かつ解離されたとし、回収率１００％として得た値とすることができる。
以下に記載する例の中で、形成率および回収率のいずれも高い場合は本発明の水性懸濁液はそのままタンパク質製剤として利用可能であり、形成率および回収率のいずれかが優れている場合は条件を検討して改良してタンパク質製剤として利用できる。形成率および回収率がいずれも小さい場合は、その条件を検討して本発明の複合体形成の機構の研究に有用である。
以下の表では、目安として、形成率および回収率が優れている結果とそれ以外の結果とを区別できるよう例の番号の列に縦線を引いている。
【００２０】
１．  〔RANKL（receptor activator for nuclear factor-κB ligand）を標的とするヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の調製〕
（試験例１）
［複合体の形成］
１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．０４〜０．１４ 質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ１：ＭＷ:１．５ｋＤａ−５．５ｋＤａ）を加え、ヒト型ＩｇＧ２ モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。この水性懸濁液を１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清部を採取して、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥＣ）（測定機器  島津ＬＣ−２０Ａ）によりタンパク質含量を測定した。また、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（例１−１）として調製し、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥＣ）によりタンパク質含量を測定し、水性懸濁液の上清部のタンパク含量を差し引き、複合体の形成率とした。
［複合体の解離］
得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加え、当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥＣ）によりタンパク質含量を測定した。また、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（例１−１）として調製し、ＳＥＣによりタンパク質含量を測定し、対照液のタンパク質濃度を１００％とする相対値で回収率を算出した。結果を表１、図２Ａおよび図２Ｂに示す。形成率、回収率とも同様な曲線が得られた。
【００２１】
【表１】
2018065765.tif 000003
【００２２】
（試験例２）
ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体を用いて試験例１と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が１５０mM となるよう調製した塩化ナトリウム−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で解離させて、試験例１と同様に回収率を測定した。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
2018065765.tif 000004
【００２４】
（試験例３）
ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体１質量部に対し ０．０４〜０．１３ 質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加えた以外は試験例  １と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加え、ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）をランダム構造として当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、試験例１と同様に回収率を測定した。結果を表３、図３Ａおよび図３Ｂに示す。分子量の高いポリグルタミン酸との複合体形成率は高く、回収率も高かった。
【００２５】
【表３】
2018065765.tif 000005
【００２６】
（試験例４）
ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体１質量部に対し ０．０４〜０．１３ 質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加えた以外は試験例  １と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が１５０mM となるよう調製した塩化ナトリウム−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で解離させて、試験例１と同様に回収率を測定した。結果を表４に示す。分子量の高いポリグルタミン酸との複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
【００２７】
【表４】
2018065765.tif 000006
【００２８】
試験例４の結果から、ポリグルタミン酸はｐＨ４付近でαへリックス構造をとり、ポリグルタミン酸の側鎖が長くなると解離できない、より安定な複合体が形成されていることが解る。この作用は疎水的相互作用だけでは説明できない。また、αへリックス構造のポリグルタミン酸と結合した抗体タンパク質の複合体は、従来のランダム構造との複合体より安定であり、ｐＨ７にしてポリグルタミン酸をランダム構造にして解離させれば回収率も高くなることから、αへリックス構造のポリグルタミン酸と結合した抗体タンパク質の複合体は、生体内に投与した際に解離されることが解る。
【００２９】
（試験例５）
試験例１のポリ−Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ１：ＭＷ:１．５ｋＤａ−５．５ｋＤａ）複合体の形成において、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とした以外は試験例１と同様にした。得られた複合体からタンパク質を解離させる場合は、等張となる生理的緩衝塩類溶液（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加えた。試験例１と同様にして測定した結果を表５に示す。ポリ−Ｌ−グルタミン酸（Ｅ１：ＭＷ:１．５ｋＤａ−５．５ｋＤａ）複合体の形成において、ｐＨ７．０では複合体形成率が低く回収率も低かった。
【００３０】
【表５】
2018065765.tif 000007
【００３１】
（試験例６）
ヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．０１〜０．０４質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加え、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とした以外は試験例１と同様に複合体を形成した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加え、当該抗体タンパク質をｐＨ７で前記複合体から解離させて、試験例１と同様に回収率を測定した。結果を表６、図４Ａおよび図４Ｂに示す。ｐＨ７で形成されたＥ４との複合体は形成率が多少下がり回収率も下がった。
【００３２】
【表６】
2018065765.tif 000008
【００３３】
２．〔RANKL（receptor activator for nuclear factor-κB ligand）を標的とするヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレス耐性〕
（試験例７）
例１−７（Ｅ１／ｐＨ４）、例３−５（Ｅ４／ｐＨ４)、例６−５（Ｅ４／ｐＨ７)  のヒト型ＩｇＧ２ モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を充填したポリプロピレン製ディスポーサブルチューブを、振とう機（バイオシェーカー・ＶＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で２７日間振とうした。また、各緩衝液中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製しｐＨ４、ｐＨ７とした対照液（例  １−１、６−１）を、同時に振とうした。なお表中製剤希釈（例７−１）は、ｐＨ５の商品名ランマーク製剤を希釈して対照液とした。
【００３４】
［振とう残存率の測定］
振とう前および後のヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液を１４０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離し、上清部を採取して、ＳＥＣにより懸濁液および対照液に含まれるタンパク質含量を測定した。振とう前のタンパク質含量を１００％として振とう後のタンパク質含量の測定結果を表７および図５に示す。
【００３５】
【表７】
2018065765.tif 000009
【００３６】
表７の結果から、振とうストレスに対する安定性は抗体タンパク質をαへリックス構造との複合体とすれば非常に高くなることが解る。複合体は、ｐＨ４で形成された複合体の方がｐＨ７で形成された複合体より安定性が高いことが解る。
【００３７】
３．〔RANKL（receptor activator for nuclear factor-κB ligand）を標的とするヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の耐熱性〕
（試験例８）
試験例７と同様の別に用意した、例１−７（Ｅ１／ｐＨ４）、例３−５(Ｅ４／ｐＨ４)、例６−５（Ｅ４／ｐＨ７)  のヒト型ＩｇＧ２モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を充填したポリプロピレン製ディスポーサブルチューブに入れ、7日間、６０℃に保った。また、各緩衝液中において、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液をｐＨ４、ｐＨ７とした対照液（例  １−１、６−１）を、同様に７日間、６０℃に保った。なお表中製剤希釈（例７−１）は、ｐＨ５の商品名ランマーク製剤を希釈して対照液とした。
【００３８】
［加熱残存率の測定］
加熱前および後のヒト型IgG2 モノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液を１４０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離し、上清部を採取して、ＳＥＣにより懸濁液および対照液に含まれるタンパク質含量を測定した。加熱前のタンパク質含量を１００％として加熱後のタンパク質含量の測定結果を表８および図６に示す。
【００３９】
【表８】
2018065765.tif 000010
【００４０】
表８の結果から、熱ストレスに対する安定性は抗体タンパク質を複合体とすれば非常に高くなることが解る。複合体の安定性は、ｐＨ４で形成された複合体とｐＨ７で形成された複合体とはそれほど違いがなかった。
【００４１】
４．〔抗TNFαモノクローナル抗体製剤・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の調製〕
（試験例９）
［複合体の形成］
１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、抗TNFαモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗TNFαモノクローナル抗体１質量部に対し ０．０１〜１．０ 質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ１：ＭＷ:１．５ｋＤａ−５．５ｋＤａ）を加え抗TNFαモノクローナル抗体・ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。この水性懸濁液を１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清部を採取して、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥＣ）（測定機器  島津ＬＣ−２０Ａ）によりタンパク質含量を測定した。また、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中において、抗TNFαモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液として調整し、ＳＥＣによりタンパク質含量を測定し、水性懸濁液の上清部のタンパク質含量を差し引き、複合体の形成率とした。
【００４２】
［複合体の解離］
得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加え、当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、ＳＥＣによりタンパク質含量を測定し、対照液のタンパク質濃度を１００％とする相対値で回収率を算出した。結果を表９、図７Ａおよび図７Ｂに示す。形成率、回収率とも同様な曲線が得られた。
【００４３】
【表９】
2018065765.tif 000011
【００４４】
（試験例１０）
抗TNFαモノクローナル抗体１質量部に対し試験例９と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が１５０mM となるよう調製した塩化ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で解離させて、試験例９と同様に回収率を測定した。結果を表１０、図８Ａおよび図８Ｂに示す。複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
【００４５】
【表１０】
2018065765.tif 000012
【００４６】
表１０の結果からｐＨ４でポリグルタミン酸のαへリックスと結合した複合体は、静電的相互作用以外の疎水的相互作用がさらに働いていることから、塩だけでは解離せず、回収率が悪いことが解る。
【００４７】
（試験例１１）
抗TNFαモノクローナル抗体１質量部に対し ０．０１〜１．４ 質量部のポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加えた以外は試験例９と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体に、等張となる生理的緩衝塩類溶液（商品名ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ」）を加え、ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（Ｅ４：ＭＷ:５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）をランダム構造として当該抗体タンパク質を前記複合体から解離させて、試験例９と同様に回収率を測定した。結果を表１１、図９Ａおよび図９Ｂに示す。複合体形成率は高く、質量比が増大するにつれて、回収率も増大した。
【００４８】
【表１１】
2018065765.tif 000013
【００４９】
（試験例１２）
抗TNFαモノクローナル抗体１質量部に対し試験例１１と同様にして、ｐＨ４でαへリックスとの複合体を形成し、形成率を測定した。得られた複合体を最終濃度が１５０mM となるよう調製した塩化ナトリウム―酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で解離させて、試験例９と同様に回収率を測定した。結果を表１２、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。複合体形成率は高かったが、回収率は低かった。
【表１２】
2018065765.tif 000014
【００５０】
表１２の結果からｐＨ４でポリグルタミン酸（Ｅ４）のαへリックスと結合した複合体は、静電的相互作用以外の疎水的相互作用がさらに働いていることから、塩だけでは解離せず、回収率が悪いことが解る。
今回の実験においても、ヒト型IgG2 モノクローナル抗体と同様に、塩を含んだ中性の溶液にすることによって、複合体からタンパク質を回収できることから、ポリグルタミン酸のαヘリックスと結合したタンパク質の複合体は、生体に投与された際に解離することが解った。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の複合体とそれを利用する方法を用いれば、迅速かつ簡便にタンパク質溶液を高濃度化できる。さらに，本発明で得られるαへリックス構造との複合体は通常のランダム構造の複合体より安定である。これまでの医療現場では、タンパク質の凝集体や沈殿物は
嫌われる存在であり，製剤として取り扱う可能性は検討されてこなかった。しかし，制御された凝集や沈殿は，タンパク質の濃縮や安定化にも有効であり、タンパク質製剤としての有用性が高い。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018065765.tif 000019
【図４Ａ】
2018065765.tif 000020
【図４Ｂ】
2018065765.tif 000021
【図５】
2018065765.tif 000022
【図６】
2018065765.tif 000023
【図７Ａ】
2018065765.tif 000024
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2018065765.tif 000026
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2018065765.tif 000028
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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