(57)【要約】      （修正有）【課題】公知の血糖センサ用酵素と比較して、実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供する。【解決手段】特定の配列からなる配列と６０％以上の同一性を持つフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、特定の配列からなる配列のアミノ酸配列における６０位、９４位、１８２位、１８９位、２２８位、２３０位、３１７位、３９９位、４１１位、４１９位、４３９位、４６６位および６１９位からなる群から選ばれる１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を持つフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列における２２８位および２３０位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有し、該アミノ酸置換が以下の（ａ）または（ｂ）に示されるものであることを特徴とする改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（ａ）２２８位のスレオニンをバリン
（ｂ）２３０位のアルギニンをバリン
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を持つフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列における２２８位および２３０位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有し、該アミノ酸置換が以下の（ａ）または（ｂ）に示されるものであることを特徴とする改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（ａ）２２８位のスレオニンをバリン
（ｂ）２３０位のアルギニンをバリン
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列における２２８位および２３０位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有し、該アミノ酸置換が以下の（ａ）または（ｂ）に示されるものであることを特徴とする改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（ａ）２２８位のスレオニンをバリン
（ｂ）２３０位のアルギニンをバリン
【請求項４】
５５℃で３０分の加温処理後の残存活性率が６０％以上である請求項１から３のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
５５℃で３０分の加温処理後の残存活性率が７０％以上であるである請求項４に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１から５のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼをグルコースに作用させることを含むグルコース濃度の測定方法。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨとも表す。）に関し、また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤとも表す。）を補酵素とする改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨとも表す。）、前記ＦＡＤＧＤＨの製造方法、前記ＦＡＤＧＤＨを用いたグルコース測定方法、グルコースセンサ及びグルコースアッセイキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
ここで用いられる酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯとも表す。）等が挙げられる。ＧＯ（ＥＣ  １．１．３．４）を用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨとも表す。）（ＥＣ  １．１．５．２（旧ＥＣ  １．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。
【０００４】
ＦＡＤＧＤＨは、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。発明者らは、これまでに子嚢菌からのスクリーニングにより、マルトースやキシロースの影響を受けにくいＦＡＤＧＤＨを発見している。代表的なものとして、特許文献１記載のムコール・ヒエマリス由来のＦＡＤＧＤＨがある。該酵素は、熱安定性が５０℃未満であり、改善の余地を残していた。
【０００５】
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、ＧＤＨ溶液を反応層上に蒸発乾固させる工程を踏む。ここで、５０℃ないしはそれ以上の温度で加温することにより、蒸発乾固の効率を高め、製造の効率化を図ることが少なくない。かかる加温処理は製造の効率化に有効である一方、一般的にタンパク質は熱による変性が起こることが知られている。従って、十分な熱安定性を有さない酵素は、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要がある。
【０００６】
また作製後のセンサストリップは、通常においては室温程度の温度で最長２年の保証期間を設ける場合が多い。但し、グルコースセンサを使用する一般ユーザーにおいてはセンサストリップを保管する際に厳密な温度管理を行うことはまれであり、特に夏場において３５℃以上、あるいは時に４０℃を超える現状を踏まえれば、酵素自身の高い安定性が望まれることは想像に難くない。熱安定性に優れる酵素は、一般にその立体構造が安定であり、過酷な条件での長期保存により適しているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１１６１０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、高い耐熱性を付与された、血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、特許文献８記載のムコール属由来のＦＡＤＧＤＨの熱安定性向上箇所の探索を鋭意実施した結果、５５℃１５分処理における残存活性が５０％以上、即ち、実質活性的な活性損失が生じない酵素の開発に成功した。本発明は、係る研究と改良の結果完成したものであり、代表的な発明は、以下の通りである。
【００１０】
項１
配列番号１に記載の配列と６０％以上の同一性を持つフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列における６０位、９４位、１８２位、１８９位、２２８位、２３０位、３１７位、３９９位、４１１位、４１９位、４３９位、４６６位および６１９位からなる群から選ばれる１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
項２
項１に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。
項３
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項４
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
項５
項４に記載の形質転換体を培養することを含む、項１に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
項６
項１に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼをグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項７
項１に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
項８
項１に記載の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、高い基質特異性を有し、十分な熱安定性を有するとともに、好ましくは大腸菌、酵母、力ビ等を宿主細胞とした効率的な生産に適したＦＡＤＧＤＨを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】改変型ＦＡＤＧＤＨの温度安定性を示す図である。
【図２】改変型ＦＡＤＧＤＨの至適温度を示す図である。
【図３】改変型ＦＡＤＧＤＨの至適ｐＨを示す図である。
【図４】改変型ＦＡＤＧＤＨのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】改変型ＦＡＤＧＤＨを用いたグルコースセンサのグルコース溶液に対する応答を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号１に記載の配列と６０％以上の同一性を持つＦＡＤＧＤＨにおいて、配列番号１のアミノ酸配列における６０位、９４位、１８２位、１８９位、２２８位、２３０位、３１７位、３９９位、４１１位、４１９位、４３９位、４６６位および６１９位からなる群から選ばれる１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を導入することで取得することができる。
【００１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｆ．  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ６７５４に由来するＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列であり、出願人が過去に出願した特許文献８記載の諸特性を有する。
【００１５】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変元は、改変後のＦＡＤＧＤＨが野生型のＦＡＤＧＤＨと比較して熱安定性が改良されている限りにおいて、配列番号１に記載の配列と６０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性を持つＦＡＤＧＤＨであれば、特に限定されない。改変元は野生型であっても、すでに何らかの改変が施されたものであってもよい。
【００１６】
また、別の観点から、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの改変元のアミノ酸配列は、改変後のＦＡＤＧＤＨが野生型のＦＡＤＧＤＨと比較して熱安定性が改良されている限りにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなるものであっても良い。
【００１７】
本明細書において、「配列番号１のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と他のアミノ酸配列を有するＧＤＨとを、アラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００１８】
２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合のアミノ酸配列の対応関係、およびアミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ。（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出する。
【００１９】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列において６０位、９４位、１８２位、１８９位、２２８位、２３０位、３１７位、３９９位、４１１位、４１９位、４３９位、４６６位および６１９位からなる群の位置に属するアミノ酸のうち、少なくともひとつのアミノ酸置換を有するＦＡＤＧＤＨである。
【００２０】
より好ましくは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列において、Ａ６０Ｅ、Ｅ９４Ｐ、Ｓ１８２Ａ、Ｑ１８９Ｅ、Ｔ２２８Ｖ、Ｔ２３０Ｖ、Ｄ３１７Ａ、Ｒ４１１Ｍ、Ｗ４１９Ｙ、Ａ４３９Ｓ、Ｄ４６６Ｍ、Ａ６１９Ｓからなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨである。
【００２１】
本明細書において、あるアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、当該アミノ酸配列上のＮ末端からの順番を表す数字を、置換前のアミノ酸を示す１文字記号と置換後のアミノ酸を示す１文字記号とで挟むことにより表す。例えば、「Ａ６０Ｅ」とは、６０位のＡ（Ａｌａ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することをさす。
【００２２】
なお、前記ＦＡＤＧＤＨを構成するポリペプチドは、シグナルペプチド部分を欠失していてもよい。Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＴｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）により提供されているＳｉｇｎａｌＰ  ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ.ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌｐ／）を用いて、デフォルトの設定での推定によれば、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目から１７番目までがシグナル配列と予想される。したがって、この部分を欠失することは酵素特性に不都合な影響をもたらさないと推察される。
【００２３】
１−１．熱安定性
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のＦＡＤＧＤＨと比較して熱安定性が改良されている。
本明細書において、熱安定性は、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）に２Ｕ／ｍｌのＧＤＨが含まれる状態で１５分間の加温処理をした後も維持される活性で評価される。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、好ましくは５５℃で１５分加温した際の活性残存率が５０％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、好ましくは５５℃で３０分の加温処理後の活性残存率が３５％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である
さらに、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、好ましくは６０℃で１５分の加温処理後の活性残存率が２５％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上である
【００２４】
２．改変型ＧＤＨの製造法
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は特に限定されないが、例えば、上記の１−１．で示した改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む形質転換体を、栄養培地で培養し、得られた培養液を精製することにより製造することが可能である。
前記の製造方法に関係する、改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを組み込んだベクター、前記ベクターを含む形質転換体についても、それぞれ本発明の実施態様の一つである。
【００２５】
本明細書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。
【００２６】
本発明のＦＡＤＧＤＨを産生させるためのＤＮＡへの変異導入方法としては、例えば置換しようとするアミノ酸残基をコードするコドンに相当する部分を、置換後のアミノ酸をコードするコドンに換えた配列を有するミスマッチプライマーを作製し、このプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いて配列番号１をコードするＤＮＡ（たとえば、特許文献８に記載されている配列番号６で示されるＤＮＡ）を鋳型に変異が導入された配列を有するＤＮＡを伸長作製する方法が利用される。このような遺伝子の部位特異的改変を行うに際しては、市販の各種サイトダイレクト変異導入キットを使用することも可能であり、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、  あるいはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などが適用可能であるが、これらに限定されない。
【００２７】
また、本発明のＧＤＨ生産に用いるＤＮＡの入手方法としては、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、本発明のＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。
【００２８】
上記の理由から、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。このような使用頻度の高いコドンとしては、例えば宿主が大腸菌Ｋ１２株である場合にあっては、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。
【００２９】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状
態にて宿主微生物に移入され、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
ＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うことができる。
【００３０】
本酵素をコードするＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記ベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＡＤＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバチルス属、コリネバクテリウム属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、コリネバクテリウム・グルタミカムなどが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンデイダ属、ピキア属、クリプトコッカス属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、クリプトコッカス・エスピーなどが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。
宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ムコール属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・レセイ、ムコール・ヒエマリス等を例示することができる。
本発明においては、ＦＡＤＧＤＨが単離されたムコール属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
形質転換体は、好ましくは、上記の発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。
【００３１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型ＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培養方法及び培養条件は、本発明のＦＡＤＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＡＤＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００３２】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。
【００３３】
培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００３４】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＡＤＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＡＤＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。
【００３５】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００３６】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００３７】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３８】
なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。
【００３９】
各精製工程では原則としてＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。
【００４０】
３．グルコースの測定方法等
本発明の別の実施形態は、上記の特性を有する本発明のＦＡＤＧＤＨの用途である。用途としては、グルコースの測定方法が例示でき、血糖値の測定や食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに好適に利用できる。
また、本発明のさらに別の実施形態は、グルコースアッセイキットやグルコースセンサなど、上記の特性を有する本発明のＦＡＤＧＤＨを含む、グルコースを測定するための種々のプロダクトである。なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のＦＡＤＧＤＨを含むものを意味する。
【００４１】
ＦＡＤＧＤＨを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＡＤＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されない。
【００４２】
３−１．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、ＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。
なお、本発明の  
【００４３】
３−２．グルコースセンサ
本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。本発明のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性に優れるため、比較的高温度（例えば、５０℃や５５℃）の条件下で固定化を実施することができる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。
【００４４】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液、ＧＤＨ、メディエーターとして２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を含む反応液を入れ、一定温度に維持する。そこにグルコースを含む試料を加え、一定温度で一定時間反応させる。この間、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、メディエーターとしてｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ  （ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ  ｂｌｕｅ  （ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用するメディエーターおよび発色試薬はこれらに限定されない。
【００４５】
またグルコース濃度の測定は、以下のようにしても行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＧＤＨ、および必要に応じてメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４６】
４．グルコース脱水素酵素活性測定法
グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
【００４７】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、種々の方法が知られているが、本書では、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定する方法を適用する。具体的な試薬組成や測定条件は、特にことわらない限り下記のとおりである。
【００４８】
＜試薬＞
０．３Ｍ  Ｄ−グルコースを含む１５０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．５（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）
１．６４ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
上記Ｄ−グルコースを含むリン酸緩衝液２０ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１０ｍＬ、を混合して反応試薬とする。
【００４９】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度１ＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示しない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
【００５０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１    サッカロマイセスを宿主としたＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーの構築
特許文献８の実施例には、ｐＹＥＳＭｈ６７５４の記載がある。該プラスミドを用いて、エラープローンＰＣＲにより、ＦＡＤＧＤＨ遺伝子へのランダム変異の導入を実施した。ｐＹＥＳＭｈ６７５４上にはＦＡＤＧＤＨ遺伝子を挟んで、ＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターが配置されている。ＧＡＬ１プロモーターとＣＹＣ１ターミネーターに相補的に結合可能な、ユニバーサルプライマーを用い、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、当製品に添付のプロトコールに従ってランダム変異の導入を実施した。これにより、一定の割合で変異が導入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。
【００５２】
次に、取得した一定の割合で変異が導入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及び、ＮｏｔＩにて処理し、同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで処理したベクターｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このように、ライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、プラスミド内に挿入されたＦＡＤＧＤＨ遺伝子内に一定の割合で変異が導入されたランダム変異プラスミドライブラリーを得た。
続いて、サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）へ、ランダム変異プラスミドライブラリーの形質転換を行った。生育したコロニー約２０００株をサッカロマイセスを宿主としたＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーとした。
【００５３】
実施例２    熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨの探索
実施例２で構築したサッカロマイセスを宿主としたＦＡＤＧＤＨランダム変異ライブラリーを、ＳｃｒｅｅｎＭａｔｅｓ（マトリックス・テクノロジー社）の各培養セルに分注した、３％  酵母エキス、１％  ポリペプトン、３％    ガラクトースを含む培地に植菌し、２５℃にて６０時間の振とう培養を行った。次に、得られた培養液を、２０００ｒｐｍにて１５分間遠心し培養上清を得た。得られた培養上清を粗酵素液として、５５℃３０分の加温を行い、上記１−５．に示したＦＡＤＧＤＨ活性測定方法を用いてＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を測定した。
【００５４】
その結果、変異処理を行わないｐＹＥＳＭｈ６７５４を含む形質転換体より得られたＦＡＤＧＤＨ（以下、野生型）と比較して耐熱性が向上した本発明のＧＤＨを１３種類取得した。これら１３種類のプラスミドをそれぞれｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ２、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ３、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ４、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ５、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ６、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ７、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ８、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ９、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１０、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１１、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１２、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１３と命名し、それぞれのプラスミド中のＦＡＤＧＤＨ配列を、マルチキャビラリ一Ｄ  Ｎ  Ａ  解析システムＡＢＩ３７００（アプライドバイオシステム社）を用いて決定した。
【００５５】
その結果、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１ではＡ６０Ｅ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ２ではＥ９４Ｐ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ３ではＳ１８２Ａ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ４ではＱ１８９Ｅ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ５ではＴ２２８Ｖ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ６ではＲ２３０Ｖ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ７ではＤ３１７Ａ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ８ではＧ３９９Ｎ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ９ではＲ４１１Ｍ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１０ではＷ４１９Ｙ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１１ではＡ４３９Ｓ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１２ではＤ４６６Ｍ、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１３ではＡ６１９Ｓにアミノ酸が置換されていた。結果を表に示す。
【００５６】
【表１】
2018046816.tif 000002
【００５７】
実施例３  変異の蓄積によるさらなる熱安定性の向上
Ｓ１８２Ａの変異が導入されたｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ３のプラスミドを鋳型として、３９９番目のＧｌｙをＡｓｎに置換するよう設計した配列番号２、３の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いて、当製品に添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。次に、得られた反応液を、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１４を抽出した。次に、得られたプラスミドｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１４を鋳型として、４３９番目のＡｌａをＳｅｒに置換するよう設計した配列番号４、５の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いて、当製品に添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。次に、得られた反応液を、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１５を抽出した。
【００５８】
また、Ｓ１８２Ａの変異が導入されたｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ３のプラスミドを鋳型として、４３９番目のＡｌａをＳｅｒに置換するよう設計した配列番号６、７の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いて、当製品に添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。次に、得られた反応液を、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１６を抽出した。
【００５９】
上記手順により得られた、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１３、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１４、ｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１５をサッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）へ形質転換を行った。次に、得られた形質転換体を、３％  酵母エキス、１％  ポリペプトン、３％    ガラクトースを含む培地で２５℃にて６０時間培養し、培養液を１２０００ｒｐｍにて５分間遠心することで培養上清を得た。次に、得られた培養上清を、分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）を用いて濃縮し、濃縮液に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えるという工程を繰り返し、低分子を取り除いた。その後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、夾雑タンパクのみを吸着させ、得られた溶出液を粗精製液とした。得られた粗精製液に対して、５５℃１５分、５５℃３０分、６０℃１５分の加温をそれぞれ行い、上記１−５．に示したＦＡＤＧＤＨ活性測定方法を用いてＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を測定した。
【００６０】
その結果、変異の蓄積による熱安定性の向上が確認された。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2018046816.tif 000003
【００６２】
実施例４  熱安定性の向上した変異型ＦＡＤＧＤＨの精製
実施例３で最も耐熱性が向上した変異体であるｐＹＥＳＭｈ６７５４―Ｍ１５が組み込まれたサッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）をトリプトファン要求培地を用いて、２５℃２０時間の培養を行い、種培養液とした。
次に、６．０Ｌの生産培地（ガラクトース３．０％、イーストイクストラクト３．０％、ペプトン１．０％、ｐＨ５．５）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度３８０ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液を４５００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清を分画分子量３０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株））を用いて濃縮し、濃縮液に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えるという工程を繰り返し、低分子を取り除いた。
その後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）カラムにかけ、夾雑タンパクのみを吸着させた。その後、溶出液をＣＭセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）カラムにかけタンパク質を吸着させた後、０．５Ｍ塩化ナトリウム  ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。さらに、溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ社）で濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア社）カラムにかけ、精製酵素を得た。
ここで得られた精製酵素を改変型ＦＡＤＧＤＨと呼ぶ。
【００６３】
実施例５  改変型ＦＡＤＧＤＨの温度安定性
実施例４で得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、改変型ＦＡＤＧＤＨ酵素液を各温度（４℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃）で１５分間処理した後、上記１−５．に示したＦＡＤＧＤＨ活性測定方法を用いてＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を測定した。結果を図１に示す。
【００６４】
その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨは、４℃〜５５℃の範囲の温度での処理後、９５％以上の残存率を有していた。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨは、５５℃までの加温処理で実質的な失活が起こらないことが確認された。
【００６５】
実施例６    改変型ＦＡＤＧＤＨの至適活性温度
実施例４で得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ酵素液（２．５μｇ／ｍＬ）を用いて、至適活性温度を調べた。３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５２℃、６０℃におけるＧＤＨ活性を求めた。結果を図２に示す。
【００６６】
その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨは、６０℃において最も高い活性値を示した。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨの至適活性温度は６０℃以上に至適活性をもつことが示された。
【００６７】
実施例８    至適活性ｐＨ
実施例５で得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ酵素液（０．５Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図中■印でプロット）１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図１中□印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３−７．７、図１中▲でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−８．９、図中△印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図３に示す。
【００６８】
その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨの至適活性ｐＨは、リン酸カリウム緩衝液を使用した場合のｐＨ６．３において最も高い活性値を示した。また、ｐＨ６．３〜６．５の範囲で、ｐＨ６．３における活性を１００％とした場合と比較して９０％以上の相対活性を示した。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨの至適活性ｐＨはｐＨ６．３〜６．５であることが示された。
【００６９】
実施例９  ｐＨ安定性
実施例５で得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ２．５−３．５、図中■でプロット）、１００ｍＭ  酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５−ｐＨ５．５：図３中□印でプロット）、１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ６．５：図３中▲印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図３中△印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０：図３中●印でプロット）、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−ｐＨ１０．５：図３中○印でプロット）を用い、２５℃、１６時間、各緩衝液中で酵素を維持した後のグルコースを基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図３に示す。
【００７０】
その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ３．５〜ｐＨ１０．３の範囲で９０％以上の活性残存率を示した。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨの安定ｐＨ域はｐＨ３．５〜ｐＨ１０．３であることが示された。
【００７１】
実施例１０    基質特異性
上記１−５．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースを基質とした場合の活性を測定した。Ｄ−グルコースを基質とした場合の活性を１００％とし、それと比較した他の糖に対する活性を求めた。各糖の濃度は２００ｍＭとした。結果を表２に示す。なお、酵素濃度については、グルコースに対しては最終濃度２．７μｇ／ｍＬ、それ以外の糖については、最終濃度０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で反応を行った。結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
2018046816.tif 000004
【００７３】
表３の結果から、本発明のＦＡＤＧＤＨの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する見かけの活性は、いずれも１％以下であり、本発明のＦＡＤＧＤＨは基質特異性に優れていることが示された。
【００７４】
実施例１１  グルコースセンサ
絶縁性基板に作用電極、対向電極、および参照電極を配した電極センサを、有限会社バイオデバイステクノロジー社（石川県能美市）より入手した。本電極センサは、４．０ｍｍ×１７ｍｍの基板に電極が印刷されている。このセンサの作用電極（面積約１．３ｍｍ２）上に試薬層となる水溶液を３μＬ分注した。試薬層となる水溶液には、下記の組成が含まれる。
・ＦＡＤ−ＧＤＨ
・２００ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
ここで、ＦＡＤ−ＧＤＨとしては、実施例４で精製した改変型ＦＡＤＧＤＨを用いた。これを５０℃で１５分加温することにより乾燥させ、グルコースセンサチップとした。
続いて、濃度１０ｍＭ、２０ｍＭ、３５ｍＭのグルコース溶液を作製した。ポテンショスタットに接続した上記チップに、これら試料溶液１５μＬをマイクロピペットで滴下し、滴下から３５秒後に＋３００ｍＶの電圧を印加、電流値を測定した。図５にはそれぞれの濃度のグルコース濃度における電流応答値の結果を示す。
【００７５】
その結果、少なくとも１０ｍＭ〜３５ｍＭのグルコース濃度において、本発明のグルコースセンサは濃度依存的な電流応答値の上昇が見られる。
【００７６】
実施例１２  グルコースセンサ上での他の糖類の影響の確認
実施例１１で用いたものと同じ電極センサを用いて、下記組成からなる水溶液３μＬから実施例１１と同様の要領でグルコースセンサチップを作製した。
・ＦＡＤＧＤＨ（実施例６で精製したもの）
・２００ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
上記のように作製したチップをそれぞれポテンショスタットに接続し、電極上に１５μＬのグルコース溶液（濃度１０ｍＭ）をマイクロピペットを用いて滴下し、滴下から３５秒後に＋３００ｍＶの電圧を印加、電流値を測定した。つづいて濃度１０ｍＭのグルコースと、さらに濃度２０ｍＭマルトース・ガラクトース・キシロースのうちいずれか一種類の糖を含む液を作製し、同様に反応させた。表３に、グルコースのみを含む液を用いた場合と、グルコースにさらに他の糖を加えた液を用いた場合との応答シグナルを比較した結果を示す。なお、表３中の数値は、他の糖を加えない場合の電気化学シグナルの強度を１００とした場合の相対値として示す。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
その結果改変型ＦＡＤＧＤＨを用いたセンサにおいては、マルトース・ガラクトース・キシロースの共存によるシグナル値の増大はみられなかった。
【００７９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００８０】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のＦＡＤＧＤＨは熱安定性に優れ、グルコースセンサ作成時の酵素失活を抑えることができると共に、グルコース量をより正確に測定することを可能にする。従って本発明のＦＡＤＧＤＨは血糖測定などに好適といえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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