(57)【要約】【課題】黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼと特異的に結合し、黄色ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害するモノクローナル抗体の提供。【解決手段】モノクローナル抗体結合部分、組換えまたはハイブリドーマ細胞系、モノクローナル抗体またはその結合部分を含有する医薬組成物、ならびに黄色ブドウ球菌感染症および骨髄炎を治療する方法。前記モノクローナル抗体結合部分または医薬組成物を用いて、患者に整形外科用インプラントを導入する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬドメインの一方または両方を含む、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【請求項２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）がメチシリン耐性である、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗体または結合部分が、グルコサミニダーゼの保存されたエピトープと１０−９Ｍを上回る親和性で結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記抗体または結合部分が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼの触媒ドメイン内のエピトープと完全にまたは部分的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号１に示されるグルコサミニダーゼと結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号２のＶＨドメインと配列番号３のＶＬドメインとをともに含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
細胞に依存しない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）溶解を促進する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
Ｇｍｄの活性を少なくとも約９５％阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の阻害が、５００，０００ＣＦＵの生物発光黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染させた下腿インプラントを移植した動物モデルを用いて測定される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ヒト化された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体結合部分。
【請求項１３】
Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または請求項１２もしくは１３に記載の結合部分を発現する、細胞系。
【請求項１５】
ハイブリドーマ４Ａ１２である、請求項１４に記載の細胞系。
【請求項１６】
担体と、１種以上の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または１種以上の請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
前記担体が水溶液である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗生物質または免疫治療剤をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群より選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６に由来するモノクローナル抗体またはその結合部分をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
患者に整形外科用インプラントを導入する方法であって、
整形外科用インプラントを必要とする患者に有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２もしくは１３に記載のモノクローナル抗体結合部分、または請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することと、
前記患者に前記整形外科用インプラントを導入することと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記導入の前に前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記導入の後に前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与を全身に実施する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与を移植部位に直接実施する、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記整形外科用インプラントが、人工関節、移植片、または合成インプラントである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記人工関節が、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節、または人工足関節である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記移植片または合成インプラントが、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種移植片の前十字靭帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱もしくは回旋筋腱板である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記整形外科用インプラントが全関節再置換術のための人工関節であり、前記方法が、前記患者への前記整形外科用インプラントの前記導入の前に、感染した人工関節を前記患者から取り除くこと、および前記患者の前記感染を治療することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療が、有効量の抗生物質、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２もしくは１３に記載のモノクローナル抗体結合部分、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、またはその組合せを投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記全関節再置換術時の感染または再感染を予防するのに効果的である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を有する患者に有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２もしくは１３に記載のモノクローナル抗体結合部分、または請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与すること
を含む、方法。
【請求項３７】
前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与を全身に実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与を前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の部位に直接実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の部位が、皮膚、筋肉、心臓、気道、胃腸管、眼球、腎臓および尿路、または骨および関節の感染を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
骨髄炎を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症を有する患者に有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２もしくは１３に記載のモノクローナル抗体結合部分、または請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与すること
を含む、方法。
【請求項４５】
前記投与を繰り返すことをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記投与を全身に実施する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記投与を前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症の部位に直接実施する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が、５０歳を超えているかまたは免疫無防備状態である、請求項２２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
個人の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能を評価する方法であって、
前記個人由来の血清の存在下で黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）をＧｍｄの基質に曝露することと、
前記曝露後に基質に対するＧｍｄの活性を評価することと
を含み、
陰性対照と比したＧｍｄ活性の相対的減少が、前記個人の血清によって付与された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能の程度を示す、方法。
【請求項５３】
前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｇｍｄの基質がＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の細胞壁調製物である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記評価が、
前記曝露後、分光光度計を用いて細菌細胞壁懸濁液の吸光度値を測定することと、
前記血清の前記吸光度値を陽性対照または陰性対照の吸光度値と比較し、前記血清がＧｍｄの細胞壁溶解活性を阻害する能力を判定することと
を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記血清についてＧｍｄの細胞壁溶解活性のパーセント阻害率を計算することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記曝露前に前記個人から血清を分離することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記曝露および前記評価を、陰性対照、陽性対照、またはその両方と並行して実施する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記陰性対照が緩衝溶液である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記陽性対照が、少なくとも５０％のＧｍｄ活性阻害率が得られると考えられる濃度でモノクローナル抗Ｇｍｄ抗体またはその結合フラグメントを含む溶液である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記モノクローナル抗Ｇｍｄ抗体が、４Ａ１２、１Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、もしくは３Ａ８またはその結合フラグメントである、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２０１１年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５５４，７７７号の利益を主張するものであり、上記出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第Ｒ４３ ＡＩ０８５８４４号の下、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、特に骨髄炎の予防または治療および整形外科用のインプラントまたは移植片の移植のための黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染症に対する受動免疫処置に関する。上に挙げた目的のために、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合する抗体およびこれを含有する医薬組成物を用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
米国では整形外科装置による感染症が１年間で約１１２，０００件発生し、１件当たりにかかる病院コストが約１５，０００〜７０，０００ドルにのぼることから、慢性骨髄炎（ＯＭ）に対する新規な介入の必要性が高まっている（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））。手術手技の向上および積極的な抗生物質による予防により整形外科インプラント術後の感染症発生率が１〜５％まで減少したものの、骨髄炎（ＯＭ）は依然として深刻な問題であり、低侵襲手術からのものが、増加する傾向にあると思われる（Ｍａｈｏｍｅｄら，"Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｐ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）；ＷＨＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。この再来は８０％が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に起因するものであり、臨床分離株の約５０％がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）であるという事実によって、その重大性がさらに増大する。この１０年間、人工関節および骨折固定器具の感染症発生率はそれぞれ、全症例のわずか０．３〜１１％および５〜１５％である（ＬｅｗおよびＷａｌｄｖｏｇｅｌ，"Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｌａｎｃｅｔ  ３６４（９４３１）：３６９−７９（２００４）；Ｔｏｍｓら，"Ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｉ−Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｊｏｉｎｔ  Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ｂｒ．８８（２）：１４９−５５（２００６））が、この結果が切断または死亡をもたらす場合がある。さらに、「低侵襲手術」ではごくわずかな切開でも移植時に皮膚と接触した人工装具による合併症を引き起こすことが多いが、この低侵襲手術が選択的な全関節置換術（ＴＪＲ）に普及したことによりＯＭの頻度が著明に増加している（Ｍａｈｏｍｅｄら，"Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｐ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）；ＷＨＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。このような感染症にはきわめて高い費用の２段階の再置換術が必要であり、最近の報告では成功率が５０％にとどまり得ることが示唆されている（Ａｚｚａｍら，Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ  Ｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｋｎｅｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．４６７（７）：１７０６−１４（２００９））。しかし、最も懸念されるのは薬剤耐性株の出現であり、中でもＭＲＳＡは北米で最も死亡率の高い病原体としてＨＩＶを凌ぎ、慢性ＯＭの管理を依然として困難なものにしているため、新規な治療的介入の必要性が高まっている。特に、ＴＪＲの主要な受容者である免疫機能が低下した高齢者に対する代替的な介入戦略の必要性が高い。
【０００５】
高リスクの患者、中でも、米国で１年間に実施される１５０万件のＴＪＲのほとんどを占める高齢の「ベビーブーマー」をＭＲＳＡから保護することができる予防的治療法は、現時点で存在しない。ＭＲＳＡの発生率を５０〜８０％減少させるワクチンがあれば、関節置換術および開放骨折修復処置の１番の合併症が減少するだけでなく、これと同じだけ医療負担も削減されることになろう。
【０００６】
慢性ＯＭの８０％が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に起因することが研究により示されている。この細菌には、菌を骨の病原菌にする因子が数種類含まれており、このような因子には菌と骨基質との結合を促進する数種類の細胞表面接着分子（Ｆｌｏｃｋら，"Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｅｍｂｏ．Ｊ．６（８）：２３５１−７（１９８７））、破骨細胞の活性増大（Ｍａｒｒｉｏｔｔら，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））により骨吸収を刺激することができる毒素（Ｎａｉｒら，"Ｓｕｒｆａｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０（５）：７２６−３４（１９９５））がある。感染症の進行および持続の律速段階となるのが移植装置周囲での生物膜形成である（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。インプラント術直後、インプラントの表面に条件を調節するための宿主由来のアドヘジン（フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびコラーゲンなど）からなる層が形成されて、隣接領域（創傷に隣接する皮膚）からの感染拡大、手術による骨内部への細菌播種または付随する軟組織骨外膜の著しい破壊を伴う外傷を含め、血行性播種に由来する浮遊細菌の付着を引き起こす（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））。その後数日の間に、細菌の細胞分裂、別の浮遊微生物の動員および細菌生成物（糖衣など）の分泌により生物膜が形成される。この生物膜は抗生物質、食細胞、抗体の作用から細菌を保護する主要なバリアとしての役割を果たし、リンパ球の機能を阻害する（Ｇｒａｙら，"Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｌｉｍｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，"Ｌａｎｃｅｔ  １（８３７３）：３６５−７（１９８４）；Ｊｏｈｎｓｏｎら，"Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｗｉｔｈ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｓｌｉｍｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５４（１）：１３−２０（１９８６）；Ｎａｙｌｏｒら，"Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ−Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．２６１：１２６−３３（１９９０））。
【０００７】
これとは別に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が骨基質にコロニーを形成するだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（９）：５２３５−４２（２００１））およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｒｅｉｌｌｙら，"Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂｙ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｃｈｉｃｋ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｂｏｎｅ  ２６（１）：６３−７０（２０００））で骨芽細胞によって取り込まれることが近年発見されている。これにより抗体および抗生物質に対抗するまた別の層がもたらされる。この感染段階は代謝活性が著しく低下した条件下で生じるものであり、その持続性を説明すると考えられる、いわゆる小コロニー変異体として出現することもある（Ｐｒｏｃｔｏｒら，"Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｌｌ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０（１）：９５−１０２（１９９５））。この時点で、細菌が抗菌剤療法に対する表現型的耐性を発現する場合もあり、これも同じく短期療法の失敗率が高いことを説明するものとなる（Ｃｈｕａｒｄら，"Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｔｏ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ，"Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３（６）：１３６９−７３（１９９１））。上に挙げた広範な病理発生機序により、ＯＭは数年間の静止期の後にすら再発する傾向があることでよく知られ、完全治癒が得られる見込みはないという考えが受け入れられている（ＭａｄｅｒおよびＣａｌｈｏｕｎ，"Ｌｏｎｇ−Ｂｏｎｅ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，"Ｈｏｓｐ．Ｐｒａｃｔ．（Ｏｆｆ  Ｅｄ）２９（１０）：７１−６，９，８３  ｐａｓｓｉｍ（１９９４））。
【０００８】
慢性ＯＭの分野で重要な疑問のひとつが、慢性ＯＭを調節する因子に関して現在得られている知見が何故これほど少ないのかということである。この１世紀の間に細菌の病原性遺伝子を明らかにするのに必要な実験ツールが利用できるようになったと考えられる。この異例の事態には３つの説明がある。１つ目は、骨髄炎の総症例数は多いものの、その１〜５％という発生率は、関節再建術が例外である可能性を除いて、厳密な前向き臨床試験をするには少なすぎるということである。２つ目は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養では、細胞外被膜を合成しない菌の増殖が迅速に選択されるため、生物膜の生物学はｉｎ  ｖｉｖｏモデルでのみ研究可能であることがよく知られているということである（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。このことは、生物膜形成前の初期の細菌の浮遊増殖相を評価することができる定量的な動物モデルが存在しないという、この分野における「最大の障害」の原因となっている。その病理発生に関する多くの知見はこれまで、ニワトリ（Ｄａｕｍら，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ，Ｓｅｐｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８（６）：８０４−１３（１９９０））、ラット（Ｒｉｓｓｉｎｇら，"Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：５８１−６（１９８５））、モルモット（Ｐａｓｓｌら，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ，"Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ２４（４）：３２３−６（１９８４））、ウサギ（Ｗｏｒｌｏｃｋら，"Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．６９（２）：２３５−４４（１９８８））、イヌ（Ｖａｒｓｈｎｅｙら，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ，"Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２７（９）：８１６−９（１９８９））、ヒツジ（Ｋａａｒｓｅｍａｋｅｒら，"Ｎｅｗ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．３３９：２４６−５２（１９９７））および最も近年ではマウス（Ｍａｒｒｉｏｔｔら，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））で開発された動物モデルから得られたものである（Ｎｏｒｄｅｎ，"Ｌｅｓｓｏｎｓ  Ｌｅａｒｎｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０（１）：１０３−１０（１９８８））。ここに挙げたモデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで明らかになった細菌接着の重要性が確認されているが（Ｃｈｕａｒｄら，"Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  ｏｎ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（４）：６２５−３２（１９９３）；Ｂｕｘｔｏｎら，"Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｔｏ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ，"Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８（６）：４４１−８（１９９０）；Ｓｗｉｔａｌｓｋｉら，"Ａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１）：９９−１０７（１９９３））、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、細菌量および骨溶解の評価基準がない。したがって、トランスジェニックマウスで薬物の効果、細菌変異株および宿主因子の役割を評価するのに上記モデルを効果的に用いることはできない。
【０００９】
１５０年に及ぶ研究に基づいて、微生物による病理発生を説明する明確なパラダイムが登場した。このモデルもＯＭに適用されるものである。感染の初期段階は、単細胞細菌が体内に侵入する際に生じる。この時点で、微生物は環境変化に応答して、自然免疫に打ち勝ち、宿主に付着するためのアドヘジン受容体が得られるよう病原性遺伝子を発現しなければならない。細菌はこのほか、壊死組織の宿主アドヘジンまたはインプラントなどの異物を利用できる確率に左右される。上に挙げた段階の完了に成功すると対数増殖期に入り、栄養分が枯渇し、かつ／または適応免疫が生じた時点でこの増殖期は停止する。対数増殖期の後、細菌は、潜伏増殖条件下で生物膜内に生存し続けざるを得なくなる。しかし、この時点で感染は慢性化しており、薬物でも宿主でも根絶されることはない。したがって、この分野における焦点は、細胞外マトリックス成分と特異的に相互作用し、ＭＳＣＲＡＭＭ（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（接着マトリックス分子を認識する微生物表面成分））として知られる細胞表面アドヘジンに絞られている（Ｐａｔｔｉら，"ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，"Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５−６１７（１９９４））。実際、これまでに開発された実質的にすべての抗黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ワクチンが、宿主組織コロニー形成および侵入に重要なＭＳＣＲＡＭＭに対するものである。このようなワクチンの目的は、上に挙げた表面抗原と結合し、宿主組織へのその接着を阻害する抗体を生成することである。また、これらの抗体は細菌表面をオプソニン化することによって、食細胞による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の排除を媒介することができる。残念ながら、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）にはアドヘジンが多種存在するため、１種または複数種のアドヘジンを阻害しても細菌接着を防ぐには十分ではない可能性がある。さらに、無血管組織では食細胞による細菌排除が制限される可能性があるため、ｍＡｂには、ｉｎ  ｖｉｖｏでの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の浮遊増殖を大幅に減少させ、全関節再置換術時の慢性ＯＭまたは再感染の確立を予防するため、追加の抗菌作用機序が必要とされ得る。
【００１０】
本発明は、上に挙げたものをはじめとする当該技術分野における欠陥を克服することに関する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第一の態様は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害するモノクローナル抗体またはその結合部分に関する。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその結合部分は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬドメインのうちの一方または両方を含む。
【００１２】
本発明の第二の態様は、本発明のモノクローナル抗体または結合部分を発現する細胞系に関する。一実施形態では、細胞系はハイブリドーマ細胞系である。別の実施形態では、細胞系は、その抗体を発現する組換え細胞系である。
【００１３】
本発明の第三の態様は、担体と、１種以上の本発明のモノクローナル抗体または結合部分とを含む医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明の第四の態様は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を有する患者に、有効量の本発明のモノクローナル抗体、結合部分または医薬組成物を投与することを含む、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の治療方法に関する。
【００１５】
本発明の第五の態様は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症を有する患者に、有効量の本発明のモノクローナル抗体、結合部分または医薬組成物を投与することを含む、骨髄炎の治療方法に関する。
【００１６】
本発明の第六の態様は、整形外科用インプラントを必要とする患者に、本発明の有効量のモノクローナル抗体、結合部分または医薬組成物を投与することと、その患者に整形外科用インプラントを導入することとを含む、整形外科用インプラントを患者に導入する方法に関する。本発明のこの態様では、モノクローナル抗体、結合部分または医薬組成物は予防剤として作用する。ある実施形態では、本発明のこの態様は、全関節再置換術時または全関節再置換術後のＯＭまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）再感染の予防に関する。
【００１７】
本発明の第七の態様は、個人の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能を評価する方法に関する。この方法は、個人由来の血清の存在下で黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼをグルコサミニダーゼの基質に曝露することと、上記曝露後に基質に対するグルコサミニダーゼの活性を評価することとを含み、陰性対照に対するグルコサミニダーゼ活性の相対的減少が、個人の血清によって付与された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能の程度を示す。
【００１８】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）などの抗生物質耐性変異株がブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染症に最もよくみられる困難な原因であるため、本発明の方法は、この微生物の増殖サイクルの重要な段階を中断させることを目的とする。本発明はこのほか、患者、例えば全関節置換術を受ける患者の感染症を予防するための受動免疫処置に関する。免疫処置のために選択される標的は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から分泌され有糸分裂時の細胞の分離である細胞質分裂を促進するグルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）である（Ｏｓｈｉｄａら，"Ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｔｈａｔ  ｈａｓ  ａｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２：２８５−９（１９９５）；Ｏｓｈｉｄａら，"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｇｅｎｅ（ａｔｌ）ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４２：６５５−９（１９９８）；Ｓｕｇａｉら，"Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  ｂｙ  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ：ａｔｌ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：２９５８−６２（１９９７）；およびＹａｍａｄａら，"Ａｎ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｒｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８：１５６５−７１（１９９６）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１９】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症、ＯＭおよびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染症に対する各種治療法を試験し評価するため、ステンレス鋼ピンに黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を塗布して脛骨骨端から経皮質的に移植する、インプラントによるＯＭの新規マウスモデルを用いた（Ｌｉら，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このモデルはグラム陽性の生物膜、骨溶解、腐骨片／骨柩形成を伴うきわめて再現性の高いＯＭが得られるものであり、臨床的ＯＭに酷似している。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを用いて細菌の浮遊増殖相を定量化することができ、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）を用いて感染骨組織のｎｕｃ遺伝子コピー数を決定し、総細菌数を定量することができ、マイクロＣＴを用いて骨溶解を定量化することができる。
【００２０】
骨髄炎の上記マウスモデルを用いて、Ｇｍｄに特異的な抗体が抗原投与マウスにおける良好な免疫応答に顕著な役割を果たすことを確認した。さらに、Ｎ末端Ｈｉｓ６（Ｇｍｄ−Ｈｉｓ）を有する組換えＧｍｄを含むワクチンにより、マウスモデルで少なくとも一部の免疫が誘発された。抗Ｇｍｄ抗体は細胞分裂サイクルの脆弱なポイントで、細胞分裂を直接阻止することによって、あるいは食細胞または補体などの宿主エフェクターを動員することによって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細胞分裂を阻止することができる。
【００２１】
モノクローナル抗体４Ａ１２およびそれから誘導したヒトキメラ抗体の作用を明らかにする実験を添付の実施例に記載する。実施例では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖培地における光散乱による検出によって、４Ａ１２およびそのマウス：ヒトキメラ型が、急速に分裂する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖を抑制することが示される。抗体４Ａ１２は、分裂細胞が互いに分離できない程度にＧｍｄの活性を低下させた。この効果は視覚的に明白で、用量依存性であり、各抗体とＧｍｄとの間の高親和性相互作用と一致するものであった。これらの効果は、組換えＧｍｄに対して生成した抗体が天然Ｇｍｄと効果的に反応し、その酵素活性を低下させることを示すものである。抗体４Ａ１２がｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおいて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害し、キメラ４Ａ１２が、ヒト患者、特に関節置換術または再置換術などの整形外科用インプラント導入を受けている患者において、同様に有用となるであろうと考えられる。
【００２２】
したがって、本出願人が権利を保有するように、いかなる既知の製品、製品を製造する工程、製品の使用方法も本発明に包含せず、それによって、いかなる既知の製品、工程、方法も放棄することを明らかにすることが本発明の一つの目的である。本発明が、ＵＳＰＴＯ（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１項）またはＥＰＯ（ＥＰＣの第８３条）の明細書記載要件および実施可能要件を満たさないいかなる製品、工程、製品の製造、製品の使用方法も本発明の範囲に包含せず、本出願人が権利を保有し、それにより既に記載されているいかなる製品、製品の製造工程、製品の使用方法も放棄することを明らかにすることが留意される。
【００２３】
本開示、特に請求項および／または節において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれに帰せられる意味を有し得るものであり、例えば、上記用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得るものであり、また「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれに帰せられる意味を有し、例えば、上記用語は明記されていない要素は許容するが、先行技術にみられる要素または本発明の基本的な特徴もしくは新規な特徴に影響を及ぼす要素は除外するものであることが留意される。
[本発明1001]
配列番号2のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号3のアミノ酸配列を有するＶＬドメインの一方または両方を含む、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1002]
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1003]
前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）がメチシリン耐性である、本発明1002のモノクローナル抗体。
[本発明1004]
前記抗体または結合部分が、グルコサミニダーゼの保存されたエピトープと10−9Ｍを上回る親和性で結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1005]
前記抗体または結合部分が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼの触媒ドメイン内のエピトープと完全にまたは部分的に結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1006]
配列番号1に示されるグルコサミニダーゼと結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1007]
配列番号2のＶＨドメインと配列番号3のＶＬドメインとをともに含む、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1008]
細胞に依存しない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）溶解を促進する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1009]
Ｇｍｄの活性を少なくとも約95％阻害する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1010]
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の阻害が、500，000ＣＦＵの生物発光黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染させた下腿インプラントを移植した動物モデルを用いて測定される、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1011]
ヒト化された、本発明1001〜1010のいずれかのモノクローナル抗体。
[本発明1012]
本発明1001のモノクローナル抗体結合部分。
[本発明1013]
Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分。
[本発明1014]
本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体または本発明1012もしくは1013の結合部分を発現する、細胞系。
[本発明1015]
ハイブリドーマ4Ａ12である、本発明1014の細胞系。
[本発明1016]
担体と、1種以上の本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、または1種以上の本発明1012のモノクローナル抗体結合部分とを含む、医薬組成物。
[本発明1017]
前記担体が水溶液である、本発明1016の医薬組成物。
[本発明1018]
抗生物質または免疫治療剤をさらに含む、本発明1016の医薬組成物。
[本発明1019]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群より選択される、本発明1018の医薬組成物。
[本発明1020]
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1018の医薬組成物。
[本発明1021]
1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、および3Ｈ6に由来するモノクローナル抗体またはその結合部分をさらに含む、本発明1018の医薬組成物。
[本発明1022]
患者に整形外科用インプラントを導入する方法であって、
整形外科用インプラントを必要とする患者に有効量の本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012もしくは1013のモノクローナル抗体結合部分、または本発明1016〜1021のいずれかの医薬組成物を投与することと、
前記患者に前記整形外科用インプラントを導入することと
を含む、方法。
[本発明1023]
前記導入の前に前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記導入の後に前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記投与を全身に実施する、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記投与を移植部位に直接実施する、本発明1022〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記整形外科用インプラントが、人工関節、移植片、または合成インプラントである、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記人工関節が、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節、または人工足関節である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記移植片または合成インプラントが、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種移植片の前十字靭帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱もしくは回旋筋腱板である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、本発明1022〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群より選択される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記整形外科用インプラントが全関節再置換術のための人工関節であり、前記方法が、前記患者への前記整形外科用インプラントの前記導入の前に、感染した人工関節を前記患者から取り除くこと、および前記患者の前記感染を治療することをさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1034]
前記治療が、有効量の抗生物質、本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012もしくは1013のモノクローナル抗体結合部分、本発明1016〜1021のいずれかの医薬組成物、またはその組合せを投与することを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記全関節再置換術時の感染または再感染を予防するのに効果的である、本発明1033または1034の方法。
[本発明1036]
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を有する患者に有効量の本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012もしくは1013のモノクローナル抗体結合部分、または本発明1016〜1021のいずれかの医薬組成物を投与すること
を含む、方法。
[本発明1037]
前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記投与を全身に実施する、本発明1036の方法。
[本発明1039]
前記投与を前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の部位に直接実施する、本発明1036の方法。
[本発明1040]
前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の部位が、皮膚、筋肉、心臓、気道、胃腸管、眼球、腎臓および尿路、または骨および関節の感染を含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、本発明1036〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群より選択される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1041の方法。
[本発明1044]
骨髄炎を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症を有する患者に有効量の本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012もしくは1013のモノクローナル抗体結合部分、または本発明1016〜1021のいずれかの医薬組成物を投与すること
を含む、方法。
[本発明1045]
前記投与を繰り返すことをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記投与を全身に実施する、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記投与を前記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症の部位に直接実施する、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、本発明1044〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群より選択される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記免疫治療剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記患者が、50歳を超えているかまたは免疫無防備状態である、本発明1022〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
個人の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能を評価する方法であって、
前記個人由来の血清の存在下で黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）をＧｍｄの基質に曝露することと、
前記曝露後に基質に対するＧｍｄの活性を評価することと
を含み、
陰性対照と比したＧｍｄ活性の相対的減少が、前記個人の血清によって付与された黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能の程度を示す、方法。
[本発明1053]
前記黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記Ｇｍｄの基質がＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の細胞壁調製物である、本発明1052の方法。
[本発明1055]
前記評価が、
前記曝露後、分光光度計を用いて細菌細胞壁懸濁液の吸光度値を測定することと、
前記血清の前記吸光度値を陽性対照または陰性対照の吸光度値と比較し、前記血清がＧｍｄの細胞壁溶解活性を阻害する能力を判定することと
を含む、本発明1052の方法。
[本発明1056]
前記血清についてＧｍｄの細胞壁溶解活性のパーセント阻害率を計算することをさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記曝露前に前記個人から血清を分離することをさらに含む、本発明1052の方法。
[本発明1058]
前記曝露および前記評価を、陰性対照、陽性対照、またはその両方と並行して実施する、本発明1052の方法。
[本発明1059]
前記陰性対照が緩衝溶液である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記陽性対照が、少なくとも50％のＧｍｄ活性阻害率が得られると考えられる濃度でモノクローナル抗Ｇｍｄ抗体またはその結合フラグメントを含む溶液である、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記モノクローナル抗Ｇｍｄ抗体が、4Ａ12、1Ｃ11、2Ｄ11、3Ｈ6、1Ｅ12、もしくは3Ａ8またはその結合フラグメントである、本発明1060の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃはインプラントによる骨髄炎に起因する骨溶解の定量化を示す。代表的なマウスの一連の経時Ｘ線画像から、このモデルにおけるインプラントによる骨溶解の経時的進展が明らかである（図１Ａ）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を塗布した下腿ピンを移植し、示される日数で屠殺したマウス（Ｎ＝５）の代表的な脛骨の再構成したμＣＴ（マイクロコンピュータ断層撮影法）画像の正中面図である（図１Ｂ）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を塗布した下腿ピンを移植し、非経口ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔ）で処置した対照マウス、または無菌ピンを移植した対照マウスについても図示する。ピン周囲の骨溶解部位を既に記載されている通りに定量化し（Ｌｉら，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、データを平均±標準偏差で表す（第４日に対して＊ｐ＜０．０５；Ｇｅｎｔ第１８日に対して＊＊ｐ＜０．０５）（図１Ｃ）。ゲンタマイシン対照と無菌ピン対照との間に骨溶解部位の差は認められなかった。
【図２】図２Ａ〜２Ｈは、下腿インプラントによるＯＭの組織像を示す図である。無菌ピン（図２Ａ、２Ｄ、および２Ｇ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を塗布したピン（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、２Ｆ、および２Ｈ）の移植９日後の脛骨皮質（＃）に隣接するピン部位（＊）におけるＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）（図２Ａ〜２Ｃ）、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）（図２Ｄ〜２Ｆ）およびグラム染色（図３Ｇおよび３Ｈ）の組織切片を示す。無菌ピン（図２Ａ、２Ｄおよび２Ｇ）周囲に形成されている新たな骨（ｈ）と感染ピンに隣接する壊死腐骨片（ｓ）および骨柩（ｉ）に注目されたい。未感染試料にはＴＲＡＰ＋破骨細胞（黄色矢印）がほとんど存在しなかった（図２Ｄ）のに対して、多数の破骨細胞が感染ピンに隣接する皮質を活発に再吸収し、骨柩を包み込む新たな線維性骨を再構築しているように見える（図２Ｅおよび２Ｆ）。グラム染色により、無菌ピンの検体には細菌が存在せず（図２Ｇ）、感染ピン周囲の壊死骨内には細菌が存在する（黒色矢印）ことが確認された。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、慢性骨髄炎確立時の細菌量と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原に対する液性免疫との間の逆相関を示す。マウスの脛骨に１×１０６ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む感染経皮質ピンを移植し、示される日数で屠殺する経時的研究を実施した。屠殺時、感染脛骨からＤＮＡを精製し、ＲＴＱ−ＰＣＲを実施して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｎｕｃのＣｔ値を決定した。示される標準曲線を用いて、この数値を脛骨当たりの回収可能なｎｕｃ遺伝子数に変換した。試料の整合性を制御するため、各試料について脛骨当たりの回収可能なｎｕｃ遺伝子数の値をマウスβ−アクチンのＣｔ値に正規化した。この変換から、細菌量を「Ｎｕｃ遺伝子コピー数／脛骨」として得た。各マウスのデータを図３Ａに個別の点として示し、各時点の平均±標準偏差（ｎ＝５）を図３Ｂに示す。ＯＭ確立時の抗黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の特異的な抗体の発現を評価するため、第１８日に屠殺するグループの各マウスから感染前（第０日）ならびに感染後第４日、第７日、第１１日、第１４日、および第１８日に血清を採取した。図３Ｃに示されるように、この血清を黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）全抽出物のウエスタンブロットに一次抗体として使用し、次いで、マウスＩｇＧに特異的なＨＲＰ結合抗体でプローブした。データは、宿主が細菌に対して最初の特異的抗体を発現する第０日〜第１１日に細菌増殖が安定して増加することを示すものである。抗黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の力価が増大するにつれて細菌量が減少し、このことは抗体が防御作用を有することを示唆するものである。ウエスタンブロットではほかにも、２６、３４、３８、および５６ｋＤａの４種類の免疫優性抗原が明確に確認される（矢印）。このほか、Ｘｅｎ２９も上に挙げた同じ２６、３４、３８、および５６ｋＤａタンパク質に対して抗体を誘導することが示されている。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）自己溶菌酵素のグルコサミニダーゼが５６ｋＤａの免疫優性抗原であることを示す。図３で確認された新規な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原の分子属性を明らかにするため、免疫前および免疫後第１４日の血清を用いて、全細胞抽出物の２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥの差引き免疫ブロット分析を実施した。等電点電気泳動（ｐＨ４．０〜１０．０）後に３つの２Ｄゲルを泳動した。１つ目はクーマシーブルー染色したものである（図４Ａ）。他の２つは第０日の血清（図４Ｂ）または第１４日の血清（図４Ｃ）でウエスタンブロットを実施したものである。免疫血清によって、バックグラウンド反応に加え特異的ポリペプチド（約５３ｋＤａ；ｐＨ９：矢印）が検出された。５３ｋＤａのスポットをクーマシーゲルから取り出し、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩによって分析したところ、７０個の個々のペプチドピークがみられた。いずれのペプチドのアミノ酸配列も、５３．６ｋＤａでｐＩが９．６６である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）自己溶菌酵素のグルコサミニダーゼの既知の配列と１００％一致した。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、慢性骨髄炎確立時の細菌増殖の生物発光イメージング（ＢＬＩ）による定量化を示す。図５Ａは感染部位のＢＬＩレベル（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示し、無菌下腿ピンを移植したマウス（未感染）またはＸｅｎ２９黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を塗布したピンを移植したマウス（感染）を経時的に評価し、示される日数で撮像したものである。左上画像の丸で囲った部分は、各時点において各マウスでＢＬＩを評価した直径１．５ｃｍの目的領域（ＲＯＩ）を強調したものである。図５Ｂは、手術後の示される時点でＢＬＩにより縦断的に評価した未感染マウス（Ｎ＝５）、感染マウス（Ｎ＝５）または感染させ非経口抗生物質（ゲンタマイシン）で処置したマウス（Ｎ＝５）のデータを示している。データは平均±標準偏差で表されている（＊第０日に対して有意に大きい；ｐ＜０．０５）。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、機能的抗Ｇｍｄ  ＥＬＩＳＡにより組換えＧｍｄワクチンの有効性が明らかになったことを示す。図６Ａは、Ｈｉｓ−Ｇｍｄを抗原として使用し、高力価であることが知られている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染マウスの抗血清を用いて作製したマウス血清における抗Ｇｍｄ抗体の力価を評価した血清ＥＬＩＳＡを示している。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを用いて、２倍段階希釈した血清試料の段階希釈係数（Ｘ軸）および４５０ｎｍでの吸光度（Ｙ軸）をＸＹ平面にプロットする。希釈曲線の変曲点（矢印）から機能的力価（１：３６２３）が推定される。図６Ｂは、示されるワクチンでの免疫処置前、追加免疫処置前および抗原投与前のマウス血清における抗Ｇｍｄ抗体の力価を決定するのに用いたＥＬＩＳＡを示している。Ｈｉｓ−Ｇｍｄワクチンで免疫処置したマウスでのみ高い力価が得られたことに注目されたい。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、組換えＨｉｓ−ＧｍｄワクチンがインプラントによるＯＭからマウスを防御することを示す図である。添付の実施例に記載する通りに、Ｘｅｎ２９に感染させた下腿ピンでマウス（ｎ＝２０）に抗原投与し、第３日にＢＬＩを実施し、第１１日にｎｕｃ  ＲＴＱ−ＰＣＲ用にマウスを安楽死させた。グループ１および３の代表的なマウスから得られたＢＬＩの画像を示し（図７Ａ）、ＢＬＩの有意な減少を平均±標準偏差により示す（図７Ｂ）。この減少は、第１１日の増幅可能なｎｕｃ遺伝子（平均±標準偏差）の有意な減少に置き換えられる（図７Ｃ）。
【図８】ｍＡｂ  １Ｃ１１および４Ａ１２を用いて黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害を比較したグラフである。１Ｃ１１はＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１４０１１４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。対数期増殖の段階にある培養物の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＵＡＭＳ−１）１００ｃｆｕをＬＢ培地中、無関係なＩｇＧ  ｍＡｂ（ＣＴＬ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（抗Ｓｐａ）に対するｍＡｂ、または４Ａ１２もしくは１Ｃ１１抗Ｇｍｄ  ｍＡｂのいずれか５０μｇ／ｍＬとともに３７℃でインキュベートした。示される間隔で、４９０ｎｍにおける光散乱によって増殖をモニターした。ｍＡｂ  ４Ａ１２とｍＡｂ  １Ｃ１１は同程度の有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害を示した。
【図９】図９Ａ〜図９Ｄは、抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  ４Ａ１２による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の二分裂阻害を示す画像である。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｘｅｎ２９）を液体のルリアブロス（ＬＢ）培地中、無関係なＩｇＧ  ｍＡｂ（ＣＴＬ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡに対するｍＡｂ（抗Ｓｐａ）、または４Ａ１２および１Ｃ１１抗Ｇｍｄ  ｍＡｂの存在下で培養した。３７℃で１２時間培養した後、走査型電子顕微鏡用に懸濁培養のアリコートを採取した。娘細菌に輪郭が明確な細胞膜がみられる（白矢印）ことからＣＴＬおよび抗Ｓｐａ  ｍＡｂには二分裂に対する効果がないことを示す代表的な写真を示す。これに対して、娘細菌間に分裂板が伸長している（赤矢印）ことから明らかな通り、４Ａ１２および１Ｃ１１はともに二分裂を阻害する。明確に見える分裂板が存在しないことから、４Ａ１２の方が１Ｃ１１よりも阻害能が高い証拠となる。
【図１０】マウス４Ａ１２モノクローナル抗体とヒト：マウスキメラ４Ａ１２モノクローナル抗体がＧｍｄの酵素活性を阻害する能力を比較したグラフである。マウスＩｇＧ１  ４Ａ１２ならびにそのヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトカッパ軽鎖とのキメラ型をＧｍｄ活性の基質である熱殺菌したＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の存在下、示される濃度でＧｍｄとともにインキュベートした。３７℃で６０分間インキュベートした後、４９０ｎｍにおける光散乱をｔ＝０のときの光散乱と比較することによって、細胞溶解の程度を測定した。式：阻害率（％）＝１００（１−（Δ６０ｍＡｂ／Δ６０ｎｏ  ｍＡｂ））を用いてＧｍｄの阻害率を計算した。Δ６０ｍＡｂ＝ｍＡｂの存在下で測定した６０分後のＡ４９０の変化；Δ６０ｎｏ  ｍＡｂ＝ｍＡｂの非存在下で測定した６０分後のＡ４９０の変化。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、抗Ｇｍｄ抗体の機能的力価のアッセイを示す。Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）細胞壁消化アッセイにより機能的力価を決定したものであり（図１１Ａ）、図中の四角で囲った部分はＨｉｓ−Ｇｍｄの有効濃度３．５μｇ／ｍｌを示している。アッセイの感度は、精製１Ｃ１１  ｍＡｂの希釈物による３．５μｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｇｍｄの阻害率（％）として決定され、力価は変曲点に対応する（図１１Ｂの矢印）。図１１Ｃは、抗原を投与しないマウス、抗原を投与したマウス、および免疫処置マウスから得られた１：１０の血清希釈物による機能アッセイの特異性を示すものである。図１１Ｄは、物理学的力価と機能的力価との間の線形回帰分析を示している（ＰＢＳで１：１０に希釈した血清での阻害率（％）；ｐ値＜０．０００２、ピアソン相関係数）。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、感染症患者と健常対照との間の物理学的力価（＊ｐ＜０．０２）および機能的力価（＊＊ｐ＜０．０００１）の差を示す。図１２Ｃは、物理学的力価と機能的力価との間の線形回帰分析を示している（＊ｐ＜０．０００１）。
【図１３】抗Ｇｍｄ抗体の受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
一態様では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害するモノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的にし得るものであり得る。
【００２６】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、天然源由来または組換え入手源由来の免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの免疫反応部分（すなわち、抗原結合部分）を包含することが意図される。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、実質的に純粋なモノクローナル抗体、抗体フラグメントまたは結合部分、キメラ抗体およびヒト化抗体を含めた様々な形態で存在するか、そのような形態で単離され得る（Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼまたはそのフラグメントと結合する特異性を特徴とする。抗体は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）自己溶菌酵素（Ａｔｌ）のグルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）サブユニット内の免疫優性エピトープと特異的に結合する。上記モノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する。
【００２８】
免疫優性抗原とは、免疫系によって最も容易に認識され、従って誘導される抗体の特異性に最も影響を及ぼす抗原決定基の一部分のことである。「免疫優性エピトープ」は、抗原上の他のエピトープを実質的に除外して宿主生物内の免疫応答を選択的に誘発する抗原上のエピトープを指す。
【００２９】
通常、免疫優性エピトープを有する可能性の高い抗原は、病原生物の外表面の抗原を選択することによって特定することができる。例えば、真菌、細菌およびウイルスなどの最も単純な生物体には、その病原生物の外表面に露出したタンパク質が１種類または２種類存在する。この外表面タンパク質がしかるべき抗原を有する可能性が最も高い。免疫優性エピトープを有する可能性が最も高いタンパク質は、病原生物に感染した生物体由来の血清に対して全タンパク質をゲル上で泳動するウエスタンアッセイで特定することができる。血清由来の結合抗体は、よく知られるＥＬＩＳＡ法の１つにおいて等で、標識した抗抗体によって特定される。免疫優性エピトープは、病原生物に感染した宿主生物由来の血清を検査することによって特定することができる。宿主生物内で免疫応答を引き起こす可能性の高い識別された抗原と結合する抗体の含有量について、血清を評価する。その抗原上に免疫優性エピトープが存在する場合、実質的に血清中の全抗体が免疫優性エピトープと結合し、抗原上の他のエピトープとはほとんど結合しないことになる。
【００３０】
Ａｔｌは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の触媒的に異なるペプチドグリカンヒドロラーゼのうちの１つであり、有糸分裂時に細胞壁を消化するのに必要とされる（ＢａｂａおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"ＥＭＢＯ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。増殖に不可欠な遺伝子であることに加えて、二分裂時に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と結合した抗Ａｔｌ抗体が細菌の細胞壁に覆われていない部位に局在することが、走査型電子顕微鏡による研究で明らかにされている（Ｙａｍａｄａら，"Ａｎ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｒｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）：１５６５−７１（１９９６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３１】
Ａｔｌ酵素は、同じＡｔｌ前駆体タンパク質から切断プロセスを介して生じるアミダーゼ（６２ｋＤ）とグルコサミニダーゼ（５３ｋＤ）とからなる（ＢａｂａおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）；Ｋｏｍａｔｓｕｚａｗａら，"Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ，ＡＴＬ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：４６９−７９（１９９７）；Ｏｓｈｉｄａら，"Ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｈａｓ  ａｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１）：２８５−９（１９９５）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この自己溶菌酵素は、３種類の約１５０アミノ酸の細胞壁結合ドメインＲ１、Ｒ２およびＲ３によって細胞壁に保持される。最終成熟段階では、タンパク質分解性の切断により、アミニダーゼドメインとそれに付随するＲ１およびＲ２ドメインがグルコサミニダーゼとそれに付随するＮ末端Ｒ３ドメインから分離される。
【００３２】
特に限定されないが、例を挙げると、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼの１つの典型例は、下の配列番号１のアミノ酸配列を含む：
2018162288.tif 000002
。配列番号１において、下線を施した残基はコードされる自己溶菌酵素の残基７８３〜９３１に対応し、Ｒ３ドメインを表す。残りのＣ末端残基（下線なし）は触媒グルコサミニダーゼドメインに対応する。
【００３３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｇｍｄは、固相または液相ペプチド合成、組換え発現によって合成するか、天然源から入手することができる。自動ペプチド合成装置をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）など多数の供給業者から購入することができる。化学的ペプチド合成の標準的な技術が当該技術分野で周知である（例えば、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ：Ａ  ＵＳＥＲＳ  ＧＵＩＤＥ  ９３−２１０（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｇｒａｎｔ編，１９９２）を参照されたい；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞および発現系を用いて、組換え発現によるタンパク質またはペプチド作製を実施することができる。組換えタンパク質／ペプチド発現の方法は当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  第２版，１９８９）によって記載されている。
【００３４】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過および逆相クロマトグラフィーを含めた当該技術分野で容易に知ることができるいくつかの方法のいずれか１つを用いて、組換え発現したペプチドを精製することができる。ペプチドは、従来の技術により純粋な形態（好ましくは、少なくとも約８０％または８５％の純度、より好ましくは、少なくとも約９０％または９５％の純度）で作製するのが好ましい。組換え宿主細胞が増殖培地中にペプチドを分泌するようにされている（Ｂａｕｅｒらの米国特許第６，５９６，５０９号を参照されたい；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）かどうかに応じて、遠心分離（分泌されたペプチドを含有する上清から細胞成分を分離するためのもの）、次いで上清の硫酸アンモニウム沈殿により、ペプチドを単離および精製することができる。ペプチドを含有する画分を適宜大きさを調節したデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでゲルろ過にかけ、ペプチドを他のタンパク質から分離する。必要に応じて、ＨＰＬＣによりペプチド画分をさらに精製する。
【００３５】
ある実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、１０−９Ｍを上回る親和性で黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼの保存されたエピトープと結合する。本明細書で使用される「エピトープ」は、モノクローナル抗体によって認識される黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼの抗原決定基を指す。本発明の抗体によって認識されるエピトープは直線状エピトープ、すなわち、グルコサミニダーゼのアミノ酸配列の一次構造であり得る。あるいは、本発明の抗体によって認識されるエピトープは、非直線状エピトープまたは立体構造エピトープ、すなわち、グルコサミニダーゼの三次構造であり得る。
【００３６】
ある実施形態では、モノクローナル抗体はＧｍｄの触媒ドメインと特異的に結合し得る。本発明の抗体の一典型例はモノクローナル抗体４Ａ１２である。４Ａ１２はエピトープマッピングアッセイで直線状のＧｍｄフラグメントと反応しなかったため、４Ａ１２は触媒ドメイン内に存在する可能性の高い立体構造エピトープを認識すると考えられる。
【００３７】
他の実施形態では、モノクローナル抗体はＲ３ドメインと特異的に結合し得る。Ｒ３ドメインと結合するモノクローナル抗体の例としては、特に限定されないが、ｍＡｂの１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６が挙げられる。
【００３８】
ある実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｇｍｄ阻害活性を有し、そのモノクローナル抗体はＧｍｄの活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％阻害する。他の実施形態では、モノクローナル抗体はＧｍｄの活性を少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％阻害する。モノクローナル抗体４Ａ１２は、ほぼ完全な阻害（＞９９％）に近い抗Ｇｍｄ阻害活性を有する。
【００３９】
Ｇｍｄ活性の阻害はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。１つの方法では、最初にＧｍｄの力価を予め測定し、６０分間でＡ４９０が約５０％減少する濃度を決定する。次いで、ＰＢＳＴで希釈した抗体５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた後、適宜希釈したＧｍｄ  ５０μＬを加え、この混合物を５分間以上インキュベートし、最後に０．１５％ｍＬを１００μＬ加え、初期Ａ４９０を測定する。プレートを３７℃でインキュベートし、３０分後および６０分後にＡ４９０を測定する。阻害率（％）を１００×（１−（阻害剤のΔ６０Ａ４９０／阻害剤なしの対照のΔ６０Ａ４９０））として計算する。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の密集もしくは凝集、細胞に依存しない黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）溶解またはその両方を引き起こす能力を有する。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の密集を引き起こす能力を有する抗体の例としては、特に限定されないが、モノクローナル抗体４Ａ１２、１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６が挙げられる。溶解抗体の１つの例はモノクローナル抗体１Ｃ１１である。
【００４１】
モノクローナル抗体４Ａ１２またはその結合フラグメントは、単独で使用することも、モノクローナル抗体１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６のうちの１種以上と組み合わせて使用することもできる（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１４０１１４号を参照されたい；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体はほかにも、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の阻害は、多数の適切な標準法に従って測定することができる。１つのこのような実施形態では、添付の実施例に記載するタイプの生物発光アッセイ法に従って、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を評価することができる。具体的には、生物発光黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｘｅｎ  ２９；ＡＴＣＣ  １２６００）（Ｆｒａｎｃｉｓら，"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３５９４−６００（２０００）；またＣｏｎｔａｇら，"Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｈｏｓｔｓ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（４）：５９３−６０３（１９９５）も参照されたい；上記文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、外科的移植前に５００，０００ＣＦＵで下腿インプラントに投与する。手術３日前に、５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに生理食塩水（ｎ＝１０）または生理食塩水０．２５ｍｌに溶かした１ｍｇの精製抗体を腹腔内注射することができる。様々な日数（例えば、０日、３日、５日、７日、１１日および１４日）でマウスを撮像して生物発光を評価し、ＢＬＩ画像を比較して、抗体が生理食塩水対照に比して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害するかどうかを評価することができる。
【００４３】
一実施形態では、モノクローナル抗体は、次に挙げる配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む：
2018162288.tif 000003
。
【００４４】
一実施形態では、モノクローナル抗体は、次に挙げる配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む：
2018162288.tif 000004
。
【００４５】
モノクローナル抗体４Ａ１２は、配列番号２のＶＨドメインと配列番号３のＶＬドメインとを有する。
【００４６】
また本発明の抗体は、合成抗体であってもよい。合成抗体とは組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体、例えば、バクテリオファージによって発現される抗体のことである。あるいは、合成抗体は、本発明の抗体をコードし発現するＤＮＡ分子の合成、または抗体を規定するアミノ酸の合成によって作製され、この場合、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能で周知の合成ＤＮＡまたは合成アミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体はヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体とは、可変領域内に最小限の非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列を含む抗体のことである。このような抗体は、ヒト対象に投与した場合に抗原性およびヒト抗マウス抗体の反応を減弱させるよう治療に用いられる。実際には、ヒト化抗体は通常、非ヒト配列を最小限含む抗体ないし一切含まないヒト抗体である。ヒト抗体とは、ヒトによって産生される抗体またはヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体のことである。
【００４８】
ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のものに置換することによって、抗体をヒト化することができる（Ｊｏｎｅｓら，"Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのヒト化抗体をＦｖフレームワーク領域内および／または置き換えた非ヒト残基内のまた別の残基により置換してさらに改変し、抗体の特異性、親和性および／または能力を向上させ最適化することができる。
【００４９】
当該技術分野で公知の各種技術を用いて、ヒト化抗体を作製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化するか、標的抗原に対する抗体を産生する免疫化した個体から単離した不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる（例えば、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ７７（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ編，１９８５）およびＧａｒｒａｒｄの米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このほか、ヒト化抗体をファージライブラリーから選択することができ、この場合、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現するものである（Ｖａｕｇｈａｎら，"Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂ−Ｎａｎｏｍｏｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓら，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８（１９９２）；Ｍａｒｋｓら，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７（１９９１）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ほかにも、免疫化すると内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の全レパートリーを産生することができるヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスでヒト化抗体を作製することができる。この方法は、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号；Ｌｏｎｂｅｒｇらの同第５，５４５，８０６号；Ｌｏｎｂｅｒｇらの同第５，５６９，８２５号；Ｌｏｎｂｅｒｇらの同第５，６２５，１２６号；Ｌｏｎｂｅｒｇらの同第５，６３３，４２５号；およびＬｏｎｂｅｒｇらの同第５，６６１，０１６号に記載されており、上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
４Ａ１２のＶＨおよびＶＬドメインのヌクレオチド配列を用いたＢＬＡＳＴ検索に基づいて、ヒトゲノム内の相同配列が、ＶＬドメインについてはＩｇＫＶ１−２７＊０２およびＩｇＫＪ４＊０２として、ＶＨドメインについてはＩｇＨＶ１−４６＊０３およびＩｇＨＪ６＊０２として同定された。
【００５１】
本発明は全抗体のほかにも、このような抗体の結合部分を包含する。このような結合部分としては、一価のＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ）および単一可変ＶＨおよびＶＬドメインならびに二価のＦ（ａｂ'）２フラグメント、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トライアボディ、ミニボディなどが挙げられる。上に挙げた抗体フラグメントは、Ｊａｍｅｓ  Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ９８−１１８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８３）およびならびにＥｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）；Ｈｏｕｓｔｏｎら，"Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；Ｂｉｒｄら，"Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）（上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているタンパク質分解による断片化法などの従来の方法をはじめとする当該技術分野で公知の方法によって作製することができる。
【００５２】
特に抗体フラグメントの場合、抗体を改変してその血中半減期を増大させるのがさらに望ましいことがある。これは、例えば、抗体フラグメントのしかるべき領域の変異によりサルベージ受容体結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことによって、あるいはエピトープ結合部位をペプチドタグに組み込んだ後、これを抗体フラグメントの一端または中央に融合させる（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）ことによって達成することができる。
【００５３】
本発明による使用には、このほか抗体模倣物が適切である。多数の抗体模倣物が当該技術分野で公知であり、このようなものとして、特に限定されないが、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来しモノボディとして知られる抗体模倣物（Ｋｏｉｄｅら，"Ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１（１９９８）；Ｋｏｉｄｅら，"Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２５３−１２５８（２００２）；上記文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；およびブドウ球菌プロテインＡの安定なα−へリックス細菌受容体ドメインＺに由来しアフィボディとして知られる抗体模倣物（Ｎｏｒｄら，"Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｏｍａｉｎ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（８）：７７２−７７７（１９９７）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【００５４】
上に挙げた抗体模倣物の調製には、その抗体模倣物の可変ループ領域内にＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ配列をグラフトすることができる。グラフトでは、アミノ酸残基が少なくとも２個、ないしＣＤＲ配列の置換とともに特定のループ領域に現れる１個のアミノ酸残基を除き実質的にすべてが、欠失し得る。挿入は、例えば、特定のループ領域の１つ以上の位置におけるＣＤＲドメインの挿入であり得る。本発明の抗体模倣物は、本出願に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ鎖配列と少なくとも５０％相同であるアミノ酸配列を有することが好ましい。ポリペプチドでの欠失、挿入および置換は、組換え技術を用い、既知のヌクレオチド配列から開始して、達成することができる（下記参照）。
【００５５】
モノクローナル抗体作製の方法は、本明細書に記載の技術をはじめとする当該技術分野で周知の技術を用いて遂行し得る（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ―ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｍａｒｙ  Ａ．ＲｉｔｔｅｒおよびＨｅａｔｈｅｒ  Ｍ．Ｌａｄｙｍａｎ編，１９９５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この工程では一般に、目的とする抗原（すなわち、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼまたはそのペプチドフラグメント）で予め免疫化した哺乳動物の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を採取する。
【００５６】
次いで、その抗体分泌リンパ球を、細胞培養で無制限に複製することができるミエローマまたは形質転換細胞と融合させることにより、不死の免疫グロブリン分泌細胞系が作製される。細胞培養で無限に複製することが可能な哺乳動物ミエローマ細胞をはじめとする融合パートナーとの融合は、標準的な周知の技術によって、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめとする融合剤を用いることによって達成される（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ，"Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。不死細胞系は、マウスであることが好ましいが、他の哺乳動物種の細胞に由来するものであってもよく、特定の栄養素を利用するのに必要な酵素が欠損しており、速く増殖することが可能で、融合能に優れるよう選択する。得られた融合細胞またはハイブリドーマを培養し、生じたコロニーを所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。このような抗体を産生するコロニーをクローン化し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させて大量の抗体を産生させる。
【００５７】
したがって、本発明の第二の態様は、本発明のモノクローナル抗体を発現する細胞系に関する。一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、４Ａ１２と命名するハイブリドーマ細胞系によって産生される。別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体（またはその結合部分）は組換え細胞または細胞系によって産生される。
【００５８】
上述の通り、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている組換えＤＮＡ法を用いてモノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離される。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを適切な発現ベクター内にクローン化し、これをそのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体を発現し分泌する宿主細胞が得られる。このほか、ファージディスプレイライブラリーから所望の種の組換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントを単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，"Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，"Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ"Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；およびＭａｒｋｓら，"Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−Ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
本発明はほかにも、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。このようなＤＮＡ配列の例には、本発明のＶＨおよび／またはＶＬコード配列を含む配列がある。ハイブリドーマ４Ａ１２  ＶＨ（最もマッチする生殖細胞系列：Ｊ５５８．５９．１５５およびＪＨ４）をコードするＤＮＡ配列は次のようなヌクレオチド配列（配列番号４）を有する：
2018162288.tif 000005
。
【００６０】
４Ａ１２  ＶＬ（最もマッチする生殖細胞系列：ＲＦおよびＪＫ５）をコードするＤＮＡ配列は次のようなヌクレオチド配列（配列番号５）を有する：
2018162288.tif 000006
。
【００６１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗体または結合部分をコードするＤＮＡ分子と、ＤＮＡ分子の５'に作動可能に連結したプロモーター効果ＤＮＡ分子と、ＤＮＡ分子の３'に作動可能に連結した転写終結ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物である。本発明はこのほか、本発明のＤＮＡ構築物を挿入する発現ベクターを包含する。本発明のポリペプチドの合成遺伝子を、変異誘発を容易にするのに好都合な制限部位を含み、高レベルのタンパク質発現に特定のコドンを用いるように設計することができる（Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，"Ｔｈｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｌｏｔ：Ｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：５３９−５４９（１９８４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６２】
遺伝子は以下のように組み立てることができる：まず、遺伝子配列を、設計された制限部位の境界で複数の部分に分割し、各部分について、反対側の鎖をコードしかつ約１５塩基の相補的な重複を有する１対のオリゴヌクレオチドを合成し、この２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いて単一鎖領域を埋め、この二本鎖オリゴヌクレオチドをフラグメント末端の制限酵素部位を用いてｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などのベクター内にクローン化し、その配列をＤＮＡシーケンサーによって確認し、上記段階をそれぞれの部分に対して繰り返して、全遺伝子を得ることができる。この方法は、遺伝子を組み立てるのに１段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法よりも時間がかかる（Ｓａｎｄｈｕら，"Ｄｕａｌ  Ａｓｙｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ：Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，"ＢｉｏＴｅｃｈ．１２：１４−１６（１９９２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｔａｑポリメラーゼによる忠実度の低い複製によって変異が導入される可能性が高く、多大な時間を要する遺伝子編集が必要となる。ＳＡＭＢＲＯＯＫおよびＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版，１９８９）（特に明記されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って組換えＤＮＡ操作を実施することができる。１段階ＰＣＲで変異が導入されるのを避けるため、当該技術分野で公知のように高忠実度／低エラーのポリメラーゼを用いることができる。
【００６３】
カセット変異誘発法、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発技術（ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，"Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ  ａｎｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｂｙ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ａ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｓｉｔｅ，"Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１−８８（１９９２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）またはＫｕｎｋｅｌ変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれかを用いて、本発明のポリペプチド配列に所望の変異を導入することができる。
【００６４】
カセット変異誘発法および部位特異的変異誘発法は、ともに、特に望ましいヌクレオチドコード配列を調製するのに用いることができる。上記遺伝子構築物と同じプロトコルを用いてカセット変異誘発法を実施することができ、新たな配列をコードする二本鎖ＤＮＡフラグメントを適切な発現ベクター内にクローン化することができる。新たに合成された鎖（変異をコードするもの）と遺伝子合成に使用されるオリゴヌクレオチドとを組み合わせることによって、多数の変異を作製することができる。本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に変異を導入するのに用いる方法に関係なく、塩基配列決定を実施して、設計された変異が変異誘発反応により導入されたこと（および他の変異は導入されていない）ことを確認することができる。
【００６５】
これに対して、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発法は、スクリーニング用のポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを調製するのに使用できる複数の変異ポリペプチドコード配列をランダムに作製するのに用いることができる。基本的には、ＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの混合物を表し、ＫはＧとＴの混合物を表す）を用いて、標的となるループ領域（またはＣ末端もしくはＮ末端のテール領域）をランダム化することができる（Ｋｕｎｋｅｌら，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子の調製に用いる方法に関係なく、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて核酸を宿主細胞内に組み込むことができる。これは一般に、ＤＮＡ分子とは異種の発現系（すなわち、通常は存在しない）にＤＮＡ分子を挿入するものである。異種ＤＮＡ分子をセンス方向、正しいリーディングフレーム内にあるよう発現系またはベクターに挿入する。ベクターには、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素（プロモーター、サプレッサー、オペレーター、転写終止配列など）が含まれている。発現ベクターに挿入する前に組み換え遺伝子またはＤＮＡ構築物を調製することができる。例えば、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、プロモーター効果ＤＮＡ分子と、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の５'とを作動可能に連結し、転写終結（すなわち、ポリアデニル化配列）をその３'と作動可能に連結することができる。
【００６７】
本発明のこの態様では、本発明のポリヌクレオチドを、その分子とは異種の発現系またはベクターに挿入する。異種核酸分子をプロモーターおよび他の任意の５'制御分子に対して適切なセンス（５'→３'）方向、正しいリーディングフレームになるよう発現系またはベクターに挿入する。核酸構築物の調製は、ＳＡＭＢＲＯＯＫおよびＲＵＳＳＥＬＬ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている当該技術分野で周知の標準的なクローニング法を用いて実施することができる。このほか、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒの米国特許第４，２３７，２２４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、制限酵素による切断およびＤＮＡリガーゼによるライゲーションを用いる組換えプラスミド形態の発現系の作製が記載されている。
【００６８】
適切な発現ベクターとしては、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むものが挙げられる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を宿主細胞として用いる場合、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８またはｐＢＲ３２２などのプラスミドを使用し得る。昆虫宿主細胞を用いる場合、昆虫宿主細胞と適合性のある適切なトランスファーベクターとしては、所望のタンパク質と融合した分泌シグナルを組み込むｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＧＰ６７およびｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ、ならびにＧＳＴおよび６×Ｈｉｓタグを含むｐＡｃＧＨＬＴおよびｐＡｃＨＬＴ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）が挙げられる。本発明のこの態様の実施に使用するのに適したウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ノダウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。その他の適切な発現ベクターはＳＡＭＢＲＯＯＫおよびＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。核酸構築物の調製、変異誘発、塩基配列決定、細胞内へのＤＮＡ導入と遺伝子発現およびタンパク質の分析における核酸の操作のための既知の技術およびプロトコルがＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，２００３）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に多数記載されている。
【００６９】
様々な遺伝シグナルおよびプロセシング事象が多数のレベルでの遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）と、それに続いて宿主細胞によって産生および発現される抗体または抗体フラグメントの量を制御している。ＤＮＡの転写はプロモーターの存在に依存しており、このプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令することによりｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列のことである。プロモーターには様々な「強さ」（すなわち、転写を促進する能力）がある。クローン化した遺伝子を発現させる目的には、高レベルの転写、したがって発現を得るため、強いプロモーターを使用するのが望ましい。用いる宿主系に応じて、多数の適切なプロモーターのうちのいずれか１つを用いることができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、そのバクテリオファージまたはプラスミドを用いる場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーターをはじめ、特に限定されないがｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどを含めたプロモーターを用いて、隣接するＤＮＡセグメントの高レベルの転写を指令することができる。さらに、組換えＤＮＡやその他の合成ＤＮＡ技術によって作製されたハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターをはじめとする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターを用いて、挿入された遺伝子を転写させることができる。昆虫細胞を用いる場合、適切なバキュロウイルスプロモーターとしては、３９Ｋタンパク質プロモーターまたは塩基性タンパク質プロモーターなどの後期プロモーターならびにｐ１０および多面体プロモーターなどの超後期プロモーターが挙げられる。いくつかの場合には、複数のバキュロウイルスプロモーターを含むトランスファーベクターを使用するのが望ましいこともある。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適し、よく用いられるプロモーターとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、前初期、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサーならびにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられる。プロモーターは構成的プロモーターであっても、あるいは組織特異的または誘導性プロモーターであってもよい。さらに、いくつかの状況では、誘導性（ＴｅｔＯｎ）プロモーターを使用することができる。
【００７０】
原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は適切な原核生物のシグナルの存在に依存し、そのシグナルは真核生物のものとは異なる。原核生物でｍＲＮＡが効率的に翻訳されるには、ｍＲＮＡ上にシャイン・ダルガーノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位が必要である。この配列は開始コドン、通常はタンパク質のアミノ末端メチオニンをコードするＡＵＧの前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３'末端に相補的であり、ｒＲＮＡと二重鎖を形成してリボソームを正確な位置に調節することによって、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進する。遺伝子発現を最大限にすることに関する概説については、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒ，"Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：４７３−８２（１９７９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００７１】
本発明はほかにも、本発明のＤＮＡ構築物によって形質転換した宿主細胞を包含する。宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。本発明のポリペプチドを発現するのに適した宿主細胞としては、比較的よく用いられているいずれかのグラム陰性細菌が挙げられる。適切な微生物としては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ胃腸炎（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（チフィミリウム（ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ））、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．エンテリディティス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ菌（Ｓ．ｓｏｎｎｉｅ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｈ．プルロニューモニア（Ｈ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモリチカ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ．マルチロシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｉｌｏｃｉｄａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｔ．デンチコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、Ｔ．オラレス（Ｔ．ｏｒａｌｅｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア菌種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｐ．モルガニ（Ｐ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒ．ｒｉｃｈｅｔｔｓｉｉ）、ジンジバリス菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．インテルメディス（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｓ）、カンピロバクター・フィタス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、フランシセラ・ツラレニシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｉｓｉｓ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バークホルデリエ・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉｅ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．スシ（Ｂ．ｓｕｓｉ）、ヤギ流産菌（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、イヌ流産菌（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、鼠咬症スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｉｎｕｓ）、鼻疽菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。
【００７２】
細菌細胞に加えて、動物細胞、特に哺乳動物および昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、または藻類細胞も、本発明の単離ポリヌクレオチド分子を保有する組換え発現ベクターのトランスフェクション／形質転換に適した宿主細胞である。当該技術分野でよく用いられる哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、およびその他多数のものが挙げられる。適切な昆虫細胞系としては、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞を含めたバキュロウイルス感染にしやすい細胞系が挙げられる。
【００７３】
発現ベクターにより宿主細胞を形質転換／トランスフェクトする方法は当該技術分野で周知であり、ＳＡＭＢＲＯＯＫおよびＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、選択される宿主系によって決まる。細菌細胞では、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。真核細胞では、適切な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他の任意のウイルスベクターを用いる形質導入が挙げられる。昆虫細胞では、本発明のポリヌクレオチド構築物を含むトランスファーベクターをＡｃＮＰＶなどのバキュロウイルスＤＮＡとコトランスフェクトし、組換えウイルスの産生を促進する。これに続くＳｆ細胞の組換えウイルス感染により、組換えタンパク質の産生率が高くなる。タンパク質産生の促進に使用する発現系および宿主細胞に関係なく、発現された本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣物は、当該技術分野において公知で、ＰＨＩＬＩＰ  Ｌ．Ｒ．ＢＯＮＮＥＲ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ２００７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている標準的な精製方法を用いて容易に精製することができる。
【００７４】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（１つまたは複数）を組換えＤＮＡ技術を用いてさらに改変して、別の抗体を作製することができる。例えば、上述のように、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインをヒト抗体の定常領域に置換してヒト化（キメラ）抗体を作製することができる。あるいは、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを非免疫グロブリンポリペプチドに置換して融合抗体を作製することができる。他の実施形態では、定常領域を切断または除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを作製することができる。さらに、可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性および親和性を最適化することができる。
【００７５】
本発明のまた別の態様は、担体と、本発明による１種以上のモノクローナル抗体または１種以上のその結合部分とを含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、２つ以上の抗体または結合フラグメントを含有し得、すべての抗体または結合フラグメントが同じエピトープを認識する。あるいは、医薬組成物は、抗体または結合フラグメント混合物を含有し、１種以上の抗体または結合フラグメントが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｇｍｄの１つのエピトープを認識し、１種以上の抗体または結合フラグメントが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｇｍｄのこれと異なるエピトープを認識するものであり得る。例えば、混合物は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼのＲ３ドメインと特異的に結合する１種以上の本発明の抗体を、グルコサミニダーゼ触媒ドメインと結合する抗体などのグルコサミニダーゼと結合する他の任意の抗体とともに含有し得る。本発明の医薬組成物は、以下に記載するように、薬学的に許容される担体をはじめとする薬学的に許容される成分をさらに含有する。
【００７６】
一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に抗体４Ａ１２、その結合フラグメント、またはそのキメラ変異体を含む。
【００７７】
別の実施形態では、医薬組成物は、１種以上のｍＡｂｓ  １Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、および３Ａ８、その結合フラグメントまたはそのキメラ変異体をさらに含む。
【００７８】
本発明の抗体を含有する医薬組成物をブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染症に罹患しているか、それに罹患するリスクのある対象に投与することができる。各種の送達系が知られており、本発明の抗体を投与するのに用いることができる。導入する方法としては、特に限定されないが、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられる。治療剤は、例えば、注入またはボーラス注入によって、上皮または皮膚粘膜の内皮（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）からの吸収によって投与することができ、また化学療法剤、抗生物質またはその他の免疫治療剤などの他の生物学的に活性な薬剤とともに投与することができる。投与は全身投与であっても、局所投与、すなわちブドウ球菌感染部位への投与または手術部位もしくはインプラント部位への直接投与であってもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、患者に第二の治療剤を投与することをさらに含み得るものであり、第二の治療剤は抗生物質または免疫治療剤である。抗生物質の例としては、特に限定されないが、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、カルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３、およびその組合せが挙げられる。免疫治療剤の例としては、特に限定されないが、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、Ａｕｒｅｘｉｓ（商標）、およびその組合せが挙げられる。抗生物質および免疫治療剤の上記一覧は非限定的な例を意図するものであり、したがって、他の抗生物質または免疫治療剤も企図される。ほかにも、第二の治療剤の組合せまたは混合物を本発明の目的に使用することができる。ここに挙げた薬剤は、同時に投与しても単一製剤として投与してもよい。
【００８０】
医薬組成物は通常、１種以上の医薬担体（例えば、無菌の液体、例えば、水、および石油、動物、植物、または合成由来のものを含めた油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）を含む。医薬組成物を静脈内に投与する場合、水がより典型的な担体である。このほか、液体担体として、生理食塩水ならびにブドウ糖およびグリセロール水溶液を特に注射用液に使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、ブドウ糖、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はこのほか、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を必要に応じて少量含有し得る。上記組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとり得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態が得られるよう、治療有効量の核酸またはタンパク質を通常は精製された形態で、適切な量の担体とともに含有する。製剤は投与様式に対応したものとなる。
【００８１】
上記細菌感染症の治療のための本発明の組成物の有効量は、投与様式、標的部位、患者の生理的状態、投与される他の薬剤、および治療が予防目的であるか治療目的であるかを含めた多くの様々な因子によって異なる。予防適用では、長期間にわたって、比較的低頻度の間隔で、比較的低用量を投与する。一部の患者は生涯にわたって治療を受け続ける。治療適用では、疾患が軽減するか終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または全面的な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要になることがある。その後、患者に予防レジメンを実施し得る。ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）による細菌感染に対する予防処置には、個人が細菌に曝露される前に本発明の医薬組成物（１つまたは複数）を投与し、生じた免疫応答により細菌感染症の重症度が抑制または軽減されることにより、細菌がその個人から排除され得ることが意図される。例えば、モノクローナル抗体または医薬組成物は、関節置換術または人工装具移植を伴う任意の手術などの外科的処置の前、最中および／または直後に投与することができる。
【００８２】
本発明の抗体または結合フラグメントによる受動免疫処置では、用量は宿主の体重当たり約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は約１ｍｇ／ｋｇ体重または約１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあり得る。治療レジメンのひとつの典型例では、２週間に１回、１か月に１回または３〜６か月に１回の投与を実施することになる。いくつかの方法では、異なる結合特異性をもつ２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与する各抗体の用量は、示された範囲内にある。通常、抗体を繰り返し投与する。単回投与の間隔は毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。いくつかの方法では、血漿中抗体濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌになるよう用量を調節する。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与することができ、この場合、より低頻度の投与が必要とされる。患者体内での抗体の半減期によって用量および頻度が異なる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体がこれに次ぐ。
【００８３】
本発明の別の態様は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の治療方法に関するものであり、この方法は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を有する患者に有効量の本発明のモノクローナル抗体もしくはその結合フラグメントまたは医薬組成物を投与することを含む。
【００８４】
本発明のこの態様の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の治療方法は、前記投与を繰り返すことをさらに含む。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を治療する方法は、全身に投与するものであっても、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の部位に直接投与するものであってもよい。
【００８５】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の治療方法を用いて、特に限定されないが、皮膚、筋肉、心臓、気道、消化管、眼球、腎臓および尿路の感染症ならびに骨または関節感染症を含めた各部位における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を治療することができる。
【００８６】
一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による骨または関節感染症を有する患者に有効量の本発明のモノクローナル抗体もしくはその結合フラグメントまたは医薬組成物を投与することによって骨髄炎を治療するために、この方法を実施する。上記薬剤または組成物の投与は上記経路のいずれを用いて実施してもよいが、骨または関節感染症の部位に直接投与するのが好ましい。
【００８７】
本発明のまた別の態様は、患者に整形外科用インプラントを導入する方法に関するものであり、この方法は、整形外科用インプラントを必要とする患者に有効量の本発明のモノクローナル抗体、結合部分または医薬組成物を投与することと、患者に整形外科用インプラントを導入することとを含む。
【００８８】
一実施形態では、整形外科用インプラントを導入する方法は、整形外科用インプラントを必要とする患者の移植部位に有効量のモノクローナル抗体もしくは結合フラグメントまたはこれを含有する医薬組成物を直接投与することを含む。あるいはこれに加えて、整形外科用インプラントを移植部位に移植する前、最中または直後にモノクローナル抗体もしくは結合フラグメントまたはこれを含有する医薬組成物で整形外科用インプラントをコーティングまたは処理することができる。
【００８９】
整形外科用インプラントは人工関節、移植片、または合成インプラントであり得る。人工関節の例としては、特に限定されないが、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節および人工足関節が挙げられる。ほかにも、他の人工装具を使用することができる。移植片または合成インプラントの例としては、特に限定されないが、人工椎間板、半月板インプラントまたは合成もしくは同種移植片の前十字靭帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱および回旋筋腱板が挙げられる。ほかにも、他の移植片またはインプラントを使用することができる。
【００９０】
一実施形態では、整形外科用インプラントを導入する方法は、全関節再置換物を取り付ける過程を包含することが意図される。最初の関節置換物に感染、特にブドウ球菌感染が生じた場合、唯一実施可能な治療法は全関節再置換術である。この実施形態では、最初に、感染した人工関節を取り除いてから、患者の根本的な感染症を治療する。感染症の治療は長期間（すなわち、６か月間）にわたって実施し、この間、患者は動けない状態（またはごくわずかに動ける状態）であり、根本的な感染症を治療するための高用量の抗生物質および任意選択で１種以上の本発明のモノクローナル抗体もしくは結合部分または医薬組成物が投与される。根本的な感染症を治療した後、新たな人工関節を取り付ける。新たな人工関節を取り付ける直前（すなわち、新たな人工関節を取り付けるまでの２週間）および任意選択で取り付けた後、１種以上の本発明のモノクローナル抗体もしくは結合部分または医薬組成物を患者に投与する。取り付け後の期間に、この治療法を１回以上繰り返すことができる。抗生物質治療薬を１種以上の本発明のモノクローナル抗体もしくは結合部分または医薬組成物と併用して、または同時に投与し得る。ここに挙げた治療法は、全関節再置換術時の感染または再感染を予防するのに効果的である。
【００９１】
本発明の治療方法は、これを必要とする任意の患者を治療するのに用いることができるが、この方法は、免疫無防備状態のあらゆる年齢の患者および５０歳を超えた患者に特に有用である。
【００９２】
本発明の別の態様は、個人の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能を評価する方法に関するものであり、この方法は、個人由来の血清の存在下で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）をＧｍｄの基質に曝露することと、前記曝露後に基質に対するＧｍｄの活性を評価することとを含む。この方法は、治療処置または予防処置のために本発明の抗体またはフラグメントを患者に投与する必要性を評価するのに特に有用である。
【００９３】
一実施形態では、上記のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＧｍｄを用いて、この方法を実施する。
【００９４】
Ｇｍｄの基質は、この酵素の任意の適切な基質であり得る。基質のひとつの例は、Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）細胞壁調製物である。本明細書で使用される「細胞壁」という用語は、細菌の細胞外膜を形成して細菌の統合性を保つあらゆる成分を表す。細菌細胞壁を精製する方法は当該技術分野で周知であり、特に限定されないが、天然の細胞壁およびＳＤＳ細胞壁の調製がこれに含まれる。遠心分離により沈殿させた対数期の培養物から天然の細胞壁を調製する。次いで、細菌を緩衝液に再懸濁させ、超音波振動によって破壊する。低速の遠心分離により未破壊細菌の除去を行った後、細胞壁を含有する上清を収集する（ＦｅｉｎおよびＲｏｇｅｒｓ，"Ａｕｔｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８，"Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７（１３）：１４２７−１４４２（１９７６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
ＳＤＳ処理した細胞壁は、ＦｅｉｎおよびＲｏｇｅｒｓ（"Ａｕｔｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８，"Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７（１３）：１４２７−１４４２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通りに、凍結乾燥させた細胞または対数期まで増殖させた細胞から調製することができる。
【００９６】
本発明のこの態様では、細菌細胞壁懸濁液を個人由来の血清の存在下および非存在下の両方でＧｍｄに曝露した後、分光光度計を用いてその吸光度を測定し、次いで血清がＧｍｄの細胞壁溶解活性を阻害する能力を分析することによって、前記個人の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫能の測定を実施することができる。血清を当該技術分野で許容される塩溶液で希釈し、マイクロタイタープレート中、約１ｍｇ／ｍｌの精製Ｇｍｄと３７℃で６０分間接触させ得る。次いで、分光光度計で４９０ｎｍにおける試料の吸光度を読み取り得る。方程式：阻害率（％）＝１００（１−（血清の存在下で測定した６０分後の吸光度の変化／血清の非存在下で測定した６０分後の吸光度の変化））によって、個人のこの免疫状態を決定することができる。この解析では、細菌懸濁液の光散乱の減少が細菌細胞壁を溶解する機能を示す溶解酵素（すなわち、Ｇｍｄ）の量と相関し、血清がＧｍｄによる細胞壁溶解を阻害する能力によって、Ｇｍｄに対する免疫能の存在が反映される。
【００９７】
個人由来の血清は、新たに分離した血清であっても、凍結血清を解凍したものであってもよい。いずれの場合にも、血清をアッセイに使用する前に、必要に応じて血清を約１：１０〜約１：１０００に希釈することができる。個人の血液から血清を分離するには、当該技術分野で周知の方法を用いることができる。
【００９８】
上記の通り、曝露段階および評価段階は陰性対照（すなわち、血清を含有しない緩衝溶液）と並行して実施することができる。あるいは、これらの段階を、本発明のモノクローナル抗体または結合フラグメントを１種以上含有する溶液（少なくとも５０％のＧｍｄ活性阻害率が得られる濃度であることが好ましい）などの陽性対照と並行して実施することができる。さらなる実施形態では、陽性対照と陰性対照の両方を個人の血清と並行して用いる。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗Ｇｍｄ抗体は４Ａ１２、１Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２もしくは３Ａ８またはその結合フラグメントである。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。ここに挙げる実施例は、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１００】
インプラントによる骨髄炎のマウス下腿モデル
整形外科用インプラントによるＯＭは髄内装置（すなわち、人工関節）および経皮質インプラント（すなわち、外部固定装置、図１Ａ）の両方に生じる。固定装置の感染率は人工関節全体の２．５倍、発生率は人工関節全体の８倍を上回るが、固定装置の再置換術は、はるかに単純であるため、このことは深刻に捉えられていない（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。感染した経皮質インプラントがみられる症例のほとんどが、１回の手術でピンの位置を移動させ、独立して膿瘍を処置することにより解消できるが、感染した人工装具の大部分は再置換術を２回必要とする（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。１回目の再置換術は感染症を治療するために必要とされ、２回目の再置換術は人工装具を取り替えるために必要とされるものである。したがって、臨床的意義の観点から、この分野では主として、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＵＡＭＳ−１（ＡＴＣＣ４９２３０）株のある髄内装置に関するインプラントによるＯＭのモデルに焦点が絞られている（Ｄａｕｍら，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ，Ｓｅｐｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８（６）：８０４−１３（１９９０）；Ｒｉｓｓｉｎｇら，"Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：５８１−６（１９８５）；Ｐａｓｓｌら，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ，"Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ２４（４）：３２３−６（１９８４）；Ｗｏｒｌｏｃｋら，"Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．６９（２）：２３５−４４（１９８８）；Ｖａｒｓｈｎｅｙら，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ，"Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２７（９）：８１６−９（１９８９）；Ｋａａｒｓｅｍａｋｅｒら，"Ｎｅｗ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．３３９：２４６−５２（１９９７）；上記文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。残念ながら、この方法には大きな制約があり、その最たるものが、再現性のある（時���的にも空間的にも）病変が得られないことである。この制約を克服するため、既に記載されている通りに（Ｚｈａｎｇら，"Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  Ｌｉｎｅａｇｅ  ａｎｄ  ｉｓ  Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｒｅｐａｉｒ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１１）：１４０５−１５（２００２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、アインホルン装置を用いて、１×１０６ＣＦＵを含有する髄内ピンの挿入直後に脛骨を骨折させることによって、感染の位置を骨幹部に誘導した。マウスにおいて、感染した経皮質ピンの移植では常に病変がピンに隣接して発生し、脛骨の他の領域に慢性ＯＭが生じることも、血行性に播種することもないことがわかった（図１Ａ〜１Ｃ）。
【０１０１】
骨溶解を定量化するため、感染脛骨をμＣＴにより分析する経時的研究を実施した（図１Ｂ〜１Ｃ）。この結果は、反応性の骨膜による骨形成を伴って感染インプラント周辺に破骨細胞による骨吸収がみられる腐骨片形成と一致するものであった。
【０１０２】
マウスにおけるＯＭの存在を組織学的に確認した。図２Ａ〜２Ｈは、脛骨の経皮質ピンモデルが、腐骨片および骨柩の形成、破骨細胞による皮質骨吸収ならびにインプラント周囲の壊死骨に存在するグラム染色された細胞外細菌および生物膜を含む慢性ＯＭの顕著な特徴をすべて含んでいることを示している。熱殺菌した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む陰性対照では、上に挙げた特徴を示すものはみられなかった。
【実施例２】
【０１０３】
骨髄炎のリアルタイムＰＣＲによる定量化
ＯＭを定量化する方法は知られていない。感染した骨から生きた細菌を効率的に抽出し、古典的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）細菌量を決定することは不可能なため、その代替となる細菌量の結果判定法として、チーズ（Ｈｅｉｎら，"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｆｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｅｓｅ，"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（７）：３１２２−６（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）および血液（Ｐａｌｏｍａｒｅｓら，"Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ＰＣＲ，"Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５（３）：１８３−９（２００３）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の汚染試験で実施されるように、ＤＮＡ試料中の回収可能なｎｕｃ遺伝子の数を定量化するリアルタイムＰＣＲ法を開発した。
【０１０４】
既に記載されている２６９ｂｐ産物を増幅するプライマー
2018162288.tif 000007
を用いて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）特異的ｎｕｃ遺伝子のＲＴＱ−ＰＣＲを実施することができる（Ｈｅｉｎら，"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｆｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｅｓｅ，"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（７）：３１２２−６（２００１）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。０．３  μＭのプライマー、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および精製脛骨ＤＮＡ鋳型２μｌからなる最終体積２０μｌ中で反応を実施することができる。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ＲＧ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、ＡＵ）を用いて試料をアッセイすることができる。
【０１０５】
このほか、試料間のＤＮＡ鋳型の統合性を制御するため、プライマー
2018162288.tif 000008
を用いて、１２４ｂｐの産物を検出するマウスβ−アクチン遺伝子のＲＴＱ−ＰＣＲを実施することができる。マウスβ−アクチン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｎｕｃ、およびｒＲＮＡゲノムＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、これらのＰＣＲの特異性および予測産物を増幅する能力が示された（Ｌｉら，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。次いで、ｎｕｃ遺伝子、すなわち黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡを含む精製プラスミドＤＮＡを用いて用量反応実験を実施し、このＲＴＱ−ＰＣＲの検出限界が約１００コピーであることが明らかになった（Ｌｉら，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このアッセイは、感染および受動免疫処置の有効性の二次的な結果判定法として、ｉｎ  ｖｉｖｏ細菌量を定量化するのに用いられている。
【実施例３】
【０１０６】
骨髄炎確立時の感染および液性免疫の動態
骨髄炎確立時の微生物による病理発生および宿主免疫を定量化するため、感染した経皮質ピンをマウスの脛骨に移植する経時的研究を実施し、細菌量および宿主の液性応答をそれぞれ、ｎｕｃ／β−アクチンのＲＴＱ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットにより経時的に判定した（図３Ａ〜３Ｃ）。結果は、感染と液性免疫との間に明らかな逆相関関係があることを示す。ここに挙げた結果は、古典的な微生物による病理発生および細胞外細菌に対する後天性免疫にみられる通り、細菌が迅速に自らを確立して対数増殖期に入り、１１日後に中和液性応答によって消失することを示すものである。細菌量のピークと特定の細菌タンパク質に対する高親和性のＩｇＧ抗体の生成が一致することに基づけば、この「免疫優性」抗原が、ＯＭの確立に対して診断にも防御にも機能的な免疫応答を誘発することは明らかである。
【実施例４】
【０１０７】
ＯＭ確立時に特異的なＩｇＧ２ｂ応答を誘発する５６ｋＤａの免疫優性抗原としての黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）自己溶菌酵素のグルコサミニダーゼサブユニットの特定およびクローン化
ＯＭ確立時の液性応答の特徴をさらに明らかにするため、感染後最初の２週間にわたって、マウス血清中のＩｇアイソタイプの出現率をＥＬＩＳＡにより決定した（Ｌｉら，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。結果は、マウスが第１週目に古典的なＩｇＭ応答を開始し、第２週目には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原に対して強力なオプソニン作用および防御作用を示すことが近年明らかにされた特異的ＩｇＧ２ｂ応答（Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎら，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｏｐｓｏｎｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  ｏｒ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｏｌｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｂｅｔａ−（１−６）−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３（１０）：６７５２−６２（２００５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に転換することを示すものであった。
【０１０８】
図３Ｃで確認された免疫優性抗原の分子的属性を明らかにするため、２Ｄ−ＰＡＧＥによって分離する全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抽出物の差引きウエスタンブロットを実施した（図４Ａ〜４Ｃ）。この分析により、免疫前の血清によっては検出されないが、免疫１４日後の血清と強い反応性を示すポリペプチドの存在が明らかになった。このタンパク質を分離用クーマシーブルー染色ゲルから分離し、トリプシンで消化し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）によって分析したところ、７０個の個々のペプチドピークがみられた。いずれのペプチドのアミノ酸配列も、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｌｔのＧｍｄサブユニットの既知の配列と１００％一致した。ほかにも、ＡｔｌがＭＲＳＡ  ＯＭのウサギ脛骨モデルの免疫優性抗原であることが近年明らかにされているのは興味深い（Ｂｒａｄｙら，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４（６）：３４１５−２６（２００６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
図４Ｃの２Ｄ−ＰＡＧＥゲルから取り出したスポットが免疫優性抗原によるものであることを裏付けるため、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）自己溶菌酵素の５３ｋＤａグルコサミニダーゼサブユニットの１，４６５ｂｐコード領域を、ＩＰＴＧ誘導用のｌａｃ  Ｉプロモーターを含むｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化することによって、組換え６−Ｈｉｓで標識された融合タンパク質を作製した。ＤＮＡの配列決定後、プラスミドを用いてＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、これを用いて組換えＨｉｓ−グルコサミニダーゼ（Ｈｉｓ−Ｇｍｄ）を作製した。次いで、この組換えタンパク質を用いて免疫前の血清および免疫血清の反応性を評価した。結果は、ＩＰＴＧに誘導された５７ｋＤａ組換えタンパク質が免疫血清によってのみ認識されることを示し、したがって、Ｇｍｄが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫優性抗原であることを裏付けるものであった。Ｘｅｎ２９に感染したマウス由来の抗血清を用いてこの実験を再び実施したところ、Ｃ５７Ｂｌ／６もこの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生物発光株に対してＧｍｄ特異的抗体を産生することが裏付けられた。
【実施例５】
【０１１０】
ＯＭおよび細菌増殖の経時的結果判定法としてのｌｕｘ形質転換黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージング
マウスモデルのＯＭを定量化するＲＴＱ−ＰＣＲ法はきわめて有用なものであるが、この方法には主な制約が３つある。１つ目は、分析にマウスを屠殺してＤＮＡを回収する必要があるため、この方法は経時的ではない点である。２つ目は、この方法は多大な労力を要し、ＤＮＡ単離、ＰＣＲ、およびデータ分析に細心の注意が必要である点である。３つ目は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ（ｎｕｃ遺伝子）を検出しても、活発な増殖相にある細菌と生物膜内に密集した休眠状態の細菌とを区別することができない点である。したがって、ＲＴＱ−ＰＣＲを用いてｉｎ  ｖｉｖｏの細菌増殖に対するｍＡｂの効果を容易に評価することはできない。
【０１１１】
上に挙げた短所を克服するため、本発明は、生物発光イメージングを用いて病原体をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターするきわめて革新的な方法に関する（Ｃｏｎｔａｇら，"Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｈｏｓｔｓ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（４）：５９３−６０３（１９９５）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。より最近、この目的のためにＰ．Ｒ．Ｃｏｎｔａｇらが生物発光黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｘｅｎ  ２９；ＡＴＣＣ  １２６００）を作製している（Ｆｒａｎｃｉｓら，"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３５９４−６００（２０００）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。図５Ａ、５Ｂは、この方法がどのように本発明のＯＭモデルに適用されるかを示している。Ｘｅｎ２９を用いた経時的研究では、無菌のピンを移植したマウスにも、非経口ゲンタマイシンで処置した感染マウスにも、バックグラウンドシグナルのみが検出された。これに対して、感染した未処置の脛骨のＢＬＩは、第４日にベースラインの４倍という急激な増加を示し、その後、第１１日までにバックグラウンドレベルまで減少した。
【実施例６】
【０１１２】
組換えＧｍｄワクチンがインプラントによるＯＭからマウスを防御する
ＯＭに対する抗自己溶菌酵素による受動免疫処置の可能性を評価するため、活性組換えＧｍｄワクチンによる初期試験を実施し、この試験ではマウス（ｎ＝２０）を次のように免疫処置した：グループ１（ＰＢＳとアジュバントの混合物（陰性対照））；グループ２（等体積のアジュバントを用いて１：１で乳化した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｘｅｎ２９全プロテオーム抽出物２０μｇ（陽性対照））；グループ３（Ｈｉｓ−グルコサミニダーゼ２０μｇとアジュバントの混合物）。抗原投与２８日前、各ワクチンのエマルション１５０μｌを筋肉内注射（ｉ．ｍ．）した。抗原投与１４日前、追加免疫処置（ｉ．ｍ．；タンパク質２０μｇとフロイント不完全アジュバントの混合物）を実施した。
【０１１３】
マウスでのワクチンの有効性を評価するため、抗ＧｍｄによるＥＬＩＳＡを実施し（図６Ａ）、最初の免疫処置の前、追加免疫処置の前および細菌投与の前の血清抗体価の定量化に用いた（図６Ｂ）。注目すべきことに、結果は、組換えワクチンのみが高い力価の免疫応答を誘発したことを示すものであった。このワクチンの有効性を評価するため、上の実施例の通りに、Ｘｅｎ２９に感染させた下腿ピンにより免疫処置マウスに抗原を投与し（図５Ａ〜５Ｃを参照されたい）、第３日にＢＬＩを実施し、第１１日にｎｕｃ  ＲＴＱ−ＰＣＲ用にマウスを安楽死させた。注目すべきことに、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）全プロテオームで免疫処置したマウス２０匹のうち１８匹が抗原投与後４８時間以内に死亡したため、そのグループの有効性データは用いることができない。この観察結果には推測による説明しかできないが（すなわち、他の抗原に対する高度免疫）、他のいずれのグループにも死亡例がみられず、グループ２のマウス５匹からなる４コホートに死亡例が再びみられたという事実は、結果が正しいことを示すものである。このような理由から、この免疫処置プロトコルをその後の研究の陽性対照として使用するべきではない。このことはほかにも、活性ワクチンの安全性に対する懸念を浮き彫りにするとともに、精製したｍＡｂまたはその結合フラグメントで受動免疫処置を実施する根拠を裏付けるものである。
【０１１４】
グループ１および３のＢＬＩおよびｎｕｃ  ＲＴＱ−ＰＣＲのデータを図７Ａ〜７Ｃに示す。結果は、Ｈｉｓ−Ｇｍｄ免疫処置マウスに検出されたＢＬＩの有意な減少を明らかに示しており（図７Ａ、７Ｂ）、これは細菌の浮遊増殖の減少を示すものである。この結果と一致して、このモデルでは細菌量のピーク時にｎｕｃ遺伝子の数に有意な減少がみられないことが観察された（第１１日）。したがって、ここに挙げたデータは、このモデルでは組換えＧｍｄワクチンによりマウスをＯＭから防御することが可能であることを示すものである。
【実施例７】
【０１１５】
マウス抗Ｇｍｄモノクローナル抗体の作製およびスクリーニング
実施例６に記載したＨｉｓ−Ｇｍｄ免疫処置が成功したことから、このプロトコルを用いてマウス抗Ｇｍｄ  ｍＡｂを作製した。ｍＡｂの作製には標準的な方法を用いた。調製したハイブリドーマの初期プールから、抗Ｇｍｄ活性に関するＥＬＩＳＡによるスクリーニングを実施して第一のサブセットを選択し、ウエスタンドットブロットアッセイを実施して、高親和性を有する第二のサブセットを選択した。
【０１１６】
ＧｍｄおよびＧｍｄのＲ３ドメイン内にみられるこれらの領域の推定エピトープに対する見かけの高親和性（≦１０−９Ｍ）に基づいて、ハイブリドーマ細胞系を５つ選択した。Ｒ３ドメインはＧｍｄタンパク質の触媒ドメインではないため、上記モノクローナル抗体が有意な抗Ｇｍｄ阻害活性を有することは予想外であった。選択した５つのハイブリドーマは１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６であった。これらは、いずれもマウスＩｇＧ１抗体を分泌した。
【０１１７】
ハイブリドーマ１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１４０１１４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）の配列決定および試験を実施した後、ほかにも、下に記載するハイブリドーマ４Ａ１２を配列決定および試験に供した。
【０１１８】
ハイブリドーマ４Ａ１２（最もマッチする生殖細胞系列：Ｊ５５８．５９．１５５およびＪＨ４）は次のようなＶＨヌクレオチド配列（配列番号４）を有する：
2018162288.tif 000009
。
【０１１９】
４Ａ１２  ＶＬ（最もマッチする生殖細胞系列：ＲＦおよびＪＫ５）は次のようなヌクレオチド配列（配列番号５）を有する：
2018162288.tif 000010
。
【０１２０】
ハイブリドーマ４Ａ１２  ＶＨのアミノ酸配列（配列番号２）は次の通りである：
2018162288.tif 000011
。
【０１２１】
４Ａ１２  ＶＬは次のようなアミノ酸配列（配列番号３）を有する：
2018162288.tif 000012
。
【０１２２】
ｍＡｂｓ １Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５０３３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）のＶＬおよびＶＨドメインの配列と比較すると、４Ａ１２のＶＬおよびＶＨドメインは独特なものである。
【実施例８】
【０１２３】
ｍＡｂ  ４Ａ１２による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｇｍｄ酵素活性の阻害
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＵＡＭＳ−１をＬＢ培地１０ｍＬ中、２００ｒｐｍの回転台に載せて３７℃で１２時間、対数中期まで増殖させた。次いで、細菌をＬＢ培地で１０００ｃｆｕ／ｍＬまで希釈し、希釈した懸濁液１００μＬを、抗体および対照を添加するよう指定された平底マイクロタイター（カバー付）にウェルに加えた。抗Ｇｍｄ抗体および対照抗体をそれぞれＰＢＳ中約１ｍｇ／ｍＬのストックからＬＢに希釈し、０．２μフィルターで滅菌した。指定された４連ウェルに各抗体１００μＬを加えた。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーで４９０ｎｍにおける光散乱を１時間毎に（１２時間）測定した。図８に示されるように、１Ｃ１１と４Ａ１２は同程度の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害を示した。
【０１２４】
増殖阻害という結果が得られたため、このほか４Ａ１２が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の二分裂を阻害する能力について、既に黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の密集または凝集を促進することが示されている１Ｃ１１と比較した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｘｅｎ２９）を液体のルリアブロス（ＬＢ）培地中、無関係なＩｇＧ  ｍＡｂ（ＣＴＬ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡに対するｍＡｂ（抗Ｓｐａ）、または４Ａ１２および１Ｃ１１抗Ｇｍｄ  ｍＡｂの存在下で培養した。３７℃で１２時間培養した後、走査型電子顕微鏡用に懸濁培養のアリコートを採取した。次いで、走査型電子顕微鏡法による可視化のため、試料を無菌シリコンチップ上に播き、固定し、脱水し、金でコートした。娘細菌に輪郭が明確な細胞膜がみられる（白矢印）ことからＣＴＬおよび抗Ｓｐａ  ｍＡｂには二分裂に対する効果がないことを示す代表的な写真を掲載する（それぞれ図９Ａ、９Ｂ）。これに対して、娘細菌間に分裂板が伸長している（赤矢印）ことから明らかな通り、４Ａ１２（図９Ｃ）および１Ｃ１１（図９Ｄ）はともに二分裂を阻害する。図９Ｃには明確に見える分裂板が存在しないことから、４Ａ１２の方が１Ｃ１１よりも阻害能が高い証拠となる。
【実施例９】
【０１２５】
ヒト化抗体の作製および試験
Ｔｉｌｌｅｒら（"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−２）：１１２−２４（２００８）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって実施例７に記載されているヒト抗体発現ベクター内へのクローン化を可能にするプライマーを用いて、４Ａ１２抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を再増幅した。４Ａ１２の軽鎖および重鎖可変領域と、ヒトカッパおよびＩｇＧ１定常領域とを含むプラスミドを調製し、ＨＥＫ２９３細胞内に共トランスフェクトした。３日後、細胞から培地を取り出し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧの存在および固定化したＧｍｄタンパク質との結合についてアッセイした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン基質とを用いて結合抗体を検出した。
【０１２６】
次いで、ヒト：マウスキメラ４Ａ１２（ｈ４Ａ１２）がＧｍｄ酵素活性を阻害する能力を試験した。マウスＩｇＧ１  ４Ａ１２およびそのキメラ型のｈ４Ａ１２をＧｍｄ活性の基質である熱殺菌したＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の存在下、示される濃度でＧｍｄとともにインキュベートした。３７℃で６０分間インキュベートした後、４９０ｎｍにおける光散乱をｔ＝０のときの光散乱と比較することによって、細胞溶解の程度を測定した。阻害率パーセントを１００×（１−（阻害剤のΔ６０Ａ４９０／阻害剤なしの対照のΔ６０Ａ４９０））として計算した。マウス４Ａ１２モノクローナル抗体は約１００％のＧｍｄ活性阻害を達成することができる最小濃度に関してほぼ３倍の差を示したが、このデータは、いずれの型の抗体もＧｍｄを完全に阻害することができることを裏付けるものである。
【実施例１０】
【０１２７】
抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  ４Ａ１２を含有する受動ワクチンはマウスＯＭモデルにおいて整形外科移植後に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する
下腿ピンを用いたＯＭモデル（実施例１および６を参照されたい）が進行中であり、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する候補ｍＡｂ  ４Ａ１２の能力を評価するのに使用されるであろう。簡潔に述べると、手術３日前に、５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに対し生理食塩水（ｎ＝１０）または生理食塩水０．２５ｍｌに精製４Ａ１２抗Ｇｍｄ抗体１ｍｇを溶かしたもの（ｎ＝５）を腹腔内注射する。手術時、マウスにＸｅｎ２９黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を５００，０００ＣＦＵ含有する下腿インプラントを移植する。第０日、３日、５日、７日、１０日または１１日および１４日にマウスにイメージングを実施して生物発光を評価し、各群を代表する個体のＢＬＩヒートマップを含む画像を検討する。
【０１２８】
この実験がこれまでに成功したことに基づけば、ヒト化４Ａ１２抗体またはそのＩｇクラス変異体を単独で、または１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６のヒト化型抗体の１種以上と組み合わせて、一次全関節置換術を受ける高齢患者（６５歳超）を対象とする第Ｉ相臨床試験に用いることが可能であると予想される。
【実施例１１】
【０１２９】
整形外科感染症の患者における黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫のバイオマーカーとしての抗グルコサミニダーゼ抗体
感染症の存在を評価する優れた血清ベースの診断検査法（すなわち、Ｃ反応性タンパク質；ＣＲＰ）は存在するが、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する宿主免疫をアッセイする試験は存在しない。抗Ｇｍｄ抗体が防御免疫の血清バイオマーカーであるとする仮説を検証するため、感染マウスおよび非感染マウスならびに黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症を有する整形外科患者および同感染症を有さない整形外科患者の血清において物理学的力価および中和力価を定量化するアッセイを開発した。
【０１３０】
組換えＨｉｓ−Ｇｍｄタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で作製し、物理学的力価のための抗Ｇｍｄ  ＥＬＩＳＡの分析物として精製した。このＥＬＩＳＡは、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲にある抗Ｇｍｄ抗体を検出することが可能なものであった。抗原投与しないマウス（ｎ＝５）の血清と、Ｈｉｓ−Ｇｍｄタンパク質で免疫処置したマウス（ｎ＝１０）の血清における抗Ｇｍｄ抗体の力価を比較することによって、ＥＬＩＳＡの特異性を判定した。抗原投与しない全マウスの力価が検出限界１００を下回り、この検出限界の値は免疫処置マウスよりも有意に低いものであった（ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
抗ＧｍｄによるＨｉｓ−Ｇｍｄ活性の阻害をＯ．Ｄ．によって決定するＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）細胞壁消化アッセイにより、機能的力価を決定した（図１１Ａ）。四角で囲った部分は、抗Ｇｍｄの機能アッセイに使用したＨｉｓ−Ｇｍｄの有効濃度を示している。その感度は、精製１Ｃ１１  ｍＡｂの希釈物による３．５μｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｇｍｄの阻害率（％）として決定され、力価は変曲点に対応する（図１１Ｂの矢印）。上記の抗原を投与しないマウス、抗原を投与したマウス、および免疫処置マウスから得られた１：１０の血清希釈物により機能アッセイの特異性を判定した（図１１Ｃ；ｐ＝＊＊０．００４）。線形回帰分析では、図１１Ｄに示されるように、物理学的力価と機能的力価との間に有意な相関が認められることが明らかになった（ＰＢＳで１：１０に希釈した血清での阻害率（％）；ｐ値＜０．０００２、ピアソン相関係数）。
【０１３２】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による整形外科感染症が確認された患者２７例および健常対照２０例から全関節置換術（ＴＪＲ）直前に血液を採取した。その血清から抗Ｇｍｄ抗体の物理学的力価および中和力価を決定しＣＲＰおよびＴＮＦレベルと比較して、その感染症のバイオマーカーとしての可能性を評価した。患者間に性別、年齢、ＢＭＩ、２型糖尿病、心疾患および自己免疫の有意差は認められなかった。感染患者の血清では、ＣＲＰ（１４８．５＋／−２３０．８と１７．８＋／−１７．２ｍｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０２）およびＴＮＦ（４３．０＋／−３７．５と２０．３＋／−１１．６ｐｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）レベルともに対照よりも有意に増加していた。感染患者と健常対照との間の物理学的力価（＊ｐ＜０．０２）および機能的力価（＊＊ｐ＜０．０００１）の有意差を図１２Ａおよび１２Ｂに示す。線形回帰分析では、物理学的力価と機能的力価との間に有意な相関が示された（図１２Ｃ；＊ｐ値＜０．０００１；ピアソン相関係数）。さらに、抗Ｇｍｄ抗体の受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の血清バイオマーカーとしての本試験の有意性を示すものであった（図１３）。このＲＯＣ曲線には、未感染対照（白丸）と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染患者（黒丸）の血清の物理学的力価を合わせて曲線下面積（ＡＵＣ）および有意性とともに示した。
【０１３３】
整形外科感染症、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）による整形外科感染症が依然として整形外科医の大きな課題となっている。この３０年間、整形外科感染症患者の治療に向けた大きな臨床的進歩がみられないことに加えて、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡの発生率が高くなっていることから、このような感染症を予防し治療する免疫処置戦略に研究者の焦点が絞られている。免疫プロテオーム仮説では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する効果的な液性免疫には細菌表面で発現する抗原に対する抗体群の開発が必要であるとされるが、このような抗体の性質および効果的な血清中濃度は未だ明らかにされていない。本実施例では、患者血清中の抗Ｇｍｄ抗体が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症のバイオマーカーである証拠が提供される。上記のデータに加えて、感染患者の臨床転帰を抗Ｇｍｄ力価と相関づけて、その免疫能のバイオマーカーとしての価値を評価する。
【０１３４】
本明細書に好ましい実施形態を図示および記載してきたが、当業者には、本発明の趣旨を逸脱することなく様々な修正、付加、置換などを実施することが可能であり、したがって、それらが以下の特許請求の範囲で定められる本発明の範囲内にあることが明らかであろう。
【図１】
2018162288.tif 000013
【図２】
2018162288.tif 000014
【図３】
2018162288.tif 000015
【図４】
2018162288.tif 000016
【図５】
2018162288.tif 000017
【図６】
2018162288.tif 000018
【図７】
2018162288.tif 000019
【図８】
2018162288.tif 000020
【図９】
2018162288.tif 000021
【図１０】
2018162288.tif 000022
【図１１】
2018162288.tif 000023
【図１２】
2018162288.tif 000024
【図１３】
2018162288.tif 000025
【配列表】
2018162288000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月24日(2018.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬドメインの一方または両方を含む、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月27日(2018.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌感染に対する、患者の受動免疫のための薬剤の製造における、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）グルコサミニダーゼと特異的に結合し、配列番号２のＶＨドメインおよび配列番号３のＶＬドメインの６個の相補性決定領域（CDR）の配列をすべて含み、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼの触媒ドメイン内のエピトープと完全にまたは部分的に結合する、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用。
【請求項２】
該抗体またはその抗原結合部分が、黄色ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ヒト化モノクローナル抗体が使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ヒト化モノクローナル抗体の抗原結合部分が使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
該抗原結合部分が、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメントまたは一本鎖抗体を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該薬剤が、第二の治療剤をさらに含み、前記第二の治療剤が抗生物質または免疫治療剤である、請求項１〜５のいずれか一項の使用。
【請求項７】
前記患者が、50歳を超えているかまたは免疫無防備状態である、請求項１〜６のいずれか一項の使用。