(57)【要約】      （修正有）【課題】クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株における遺伝子組み換えマーカーとして使える、新規の遺伝子マーカー、効率的な遺伝子破壊方法、及びかかる方法を利用した相同組換えの頻度の増大方法の提供。【解決手段】特定の配列からなる塩基配列、又はその塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるマーカー遺伝子。好ましくは、マーカー遺伝子は、特定の配列からなる塩基配列、又はその塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列、又は配列番号１で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列、又は配列番号２で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のマーカー遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の機能解析などのために、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法に関し、さらには、かかる方法により発見された新規のマーカー遺伝子、かかる方法を特定の遺伝子の破壊に適用することにより得られた、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術の発展により、原核生物や真核生物を宿主として利用して産業上有用なタンパク質を大量に生産することが可能になった。原核生物の宿主としては、大腸菌などの細菌が一般的に使用されており、真核生物の宿主としては、サッカロミセス属やピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）などの酵母が一般的に使用されている。
【０００３】
酵母は、一般的に細菌と比べて増殖速度が速いため、細菌よりも高い細胞密度で培養することができる。また、酵母は、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であるため、生産されたタンパク質の抽出精製工程を簡単にすることができる。このため、酵母は、遺伝子組換え技術による有用タンパク質の生産宿主として使用されることが多くなっている。
【０００４】
かかる酵母の有用性に鑑み、出願人らは、種々の酵母の中から、αアミラーゼ、酸性キシラナーゼ、クチナーゼなどのタンパク質を大量に生産して細胞外に分泌する特性を有するクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｓ−２株（担子菌酵母の一種であり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として平成７年９月５日に国際寄託済）を選抜した（非特許文献１参照）。
【０００５】
また、出願人らは、この菌株の細胞外タンパク質の生産性の高さを利用して、酵母が本来生産するタンパク質以外の異種タンパク質を大量生産することを提案し、さらに、外来遺伝子を導入された形質転換体の選抜を一層効率的にするため、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の自然変異により、ウラシル要求性株（Ｕ５株）を取得し、この菌株と、マーカー遺伝子としてのＵＲＡ５遺伝子を組合せて用いることによって、形質転換体を選抜する方法を提案した（非特許文献２参照）。
【０００６】
Ｕ５株を用いることによる異種タンパク質の発現について、様々な菌株からラッカーゼ遺伝子を取得し、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を宿主として組換え発現効率を検討したところ、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びガエウマノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）由来のラッカーゼ遺伝子を組換え発現させた場合、ピキア・パストリスを宿主として用いた場合より大幅に高い生産性を示すことが記載されている（非特許文献３参照）。
【０００７】
また、特許文献１には、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼについて、特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼについて、コドンユーセージをクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株に合わせて最適化し、さらに分泌シグナル配列をクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株由来の配列に置換することによって、効率的に酵素を発現させることが可能になることが記載されている。
【０００８】
上記のように、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は、異種タンパク質を効率的に発現させるための宿主として、ますます有用になってきている。
【０００９】
一方、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株における遺伝子組換えマーカー遺伝子としては、ウラシル要求性遺伝子マーカーであるＵＲＡ５遺伝子が報告されているのみである。ＵＲＡ５遺伝子は、ｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードしており、本遺伝子を遺伝子マーカーとして用いて、ウラシル要求性株であるＵ５株に形質転換を行うことにより、ウラシル要求性の有無を指標として形質転換体を選抜することが可能である。
【００１０】
また、５−ＦＯＡ（５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）は、ｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを合成する酵母細胞に対してのみ致死作用を示すため、５−ＦＯＡの存在下で培養を行うことにより、ウラシル要求性株のポジティブスクリーニングを行うことが可能である（非特許文献４参照）。
【００１１】
この５−ＦＯＡの性質を利用して、ピキア・パストリスにおけるＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ遺伝子破壊法が報告されている（非特許文献５参照）。この方法では、まず、ウラシル要求性マーカー遺伝子とターゲット塩基配列を連結して宿主ゲノム中に導入する。次に、導入したターゲット塩基配列と、宿主の染色体上に存在する塩基配列との間で相同組換えを起こさせ、ウラシル要求性マーカー遺伝子とともにターゲット配列を除去する。この方法によれば、ウラシル要求性マーカー遺伝子をリサイクルすることが可能になるため、遺伝子の多重破壊が可能になる。
【００１２】
しかし、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株に外来遺伝子、若しくは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来の塩基配列を導入した場合、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の染色体上にランダムに遺伝子が導入されることが非特許文献２に示されており、ターゲットとする位置に外来遺伝子を導入することは非常に困難である。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株において相同組換え効率が低い原因は、外来遺伝子の導入時に、非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ  Ｊｏｉｕｎｉｎｇ）が起こっているためであると考えられ、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株には非相同組換え機構が備わっていると考えられる。
【００１３】
真核生物において、二本鎖ＤＮＡの切断が修復される過程で働く非相同末端結合機構は、Ｋｕ７０―Ｋｕ８０ヘテロダイマー、ＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｘｒｃｃ４複合体を介して進行することが報告されており（非特許文献５参照）、Ｋｕ遺伝子変異体において、ターゲッティング頻度が向上することが、アカパンカビＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（非特許文献７、特許文献３参照）、コウジカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ（非特許文献８、特許文献４参照）などの真核生物において報告されている。
【００１４】
さらに、非特許文献９には、担子菌酵母の一種であるクリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）において、遺伝子の相同組換え効率が非常に低いことが示されており、Ｋｕ遺伝子の破壊により、遺伝子の相同組換え効率が飛躍的に向上したことが示されている。
【００１５】
上述するように、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は、異種タンパク質発現の宿主として非常に有用な微生物であり、この菌株の特性のさらなる改良を目的とした育種のために、遺伝子の機能解析は重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１３−４６６１０号公報
【特許文献２】特開２０１３−１３５６６３号公報
【特許文献３】特開２００５−２３７３１６号公報
【特許文献４】特開２００６−１５８２６９号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（１２），２２６１−２２６２，１９９４
【非特許文献２】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｎｏｖ  １５．（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ  ｙｅａｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  Ｓ−２  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｕｔｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｅｎｚｙｍｅ．）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１５：３９４−３９９．２０１３（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｃａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｓ−２．）
【非特許文献４】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，１６４−１７５  １９８７
【非特許文献５】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１  ３０６−３１２，２００１
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，６０７−６１４，２００１
【非特許文献７】ＰＮＡＳ  １０１，１２２４８−１２２５２  ２００４
【非特許文献８】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２７５，４６０−４７０  ２００６
【非特許文献９】Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂｉｏｌ．４３，５３１−４４  ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、クリプトコッカス・ネオホルマンスが有性世代を持つのに対し、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株はこれまでのところ有性世代が確認されていない。そのために、菌株間の交配等の手段によって、新たな変異株を作製することができず、遺伝学的研究が困難であり、産業的に極めて有用な菌であるにも関わらず、遺伝的解析は遅れていた。
【００１９】
このような有性世代を有さない生物の遺伝子の機能解析には、遺伝子ターゲッティングによる遺伝子破壊あるいは遺伝子置換が特に重要な技術となるが、そのために必要な遺伝子マーカーは、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株についてはウラシル要求性マーカーが取得されているのみであった。さらに、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の相同組換え頻度は非常に低いものであるため、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株を用いて遺伝子破壊株を取得すること、あるいは任意の位置での相同組換え株を取得することは極めて困難であった。
【００２０】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的はクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の新規の遺伝子マーカー、効率的な遺伝子破壊方法、及びかかる方法を利用した相同組換えの頻度の増大方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記目的を達成するために、他の酵母における遺伝子破壊法のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株への応用について鋭意検討した結果、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株においても、ピキア・パストリスと同様に、ウラシル要求性マーカー遺伝子を用いたＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ法により、効率的に遺伝子を破壊することができることを見出した。また、かかる方法を用いて、形質転換体の選抜に有用な新たな遺伝子マーカーを取得することができること、さらには、かかる方法を用いて、非相同末端結合機構に関与するＫｕ遺伝子を破壊することにより、相同組換えの頻度を増大させることができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００２２】
即ち、本発明は、以下の［１］〜［７］の構成を有するものである。
［１］以下の工程を含むことを特徴とする、クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法：
（１）前記特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、前記特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含み、さらに、前記特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び／又は前記ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と前記特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部の間に、前記特定の遺伝子の５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が挿入されている遺伝子コンストラクトを作製する工程；
（２）前記ウラシル要求性の菌株を前記遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、前記菌株のゲノム中の前記特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって前記遺伝子コンストラクトが挿入された第１の形質転換体を選抜する工程；及び
（３）５−ＦＯＡを含有する培地で前記第１の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第２の形質転換体を選抜する工程。
［２］クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］配列番号１で示される塩基配列、又は配列番号１で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
［４］配列番号２で示される塩基配列、又は配列番号２で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列をプロモーターとしてさらに含むことを特徴とする、［３］に記載のマーカー遺伝子。
［５］相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法であって、［１］又は［２］に記載の方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のＫｕ遺伝子を破壊する工程を含むことを特徴とする方法。
［６］クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株であり、Ｋｕ遺伝子が、配列番号３で示される塩基配列、又は配列番号３で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつＫｕ遺伝子活性を有する塩基配列からなることを特徴とする、［５］に記載の方法。
［７］相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株であって、［５］又は［６］に記載の方法により得られることを特徴とする菌株。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、機能解析や改変の対象となる標的遺伝子の破壊や相同組換え、及び形質転換体の選択を効率的に行うことができるため、クリプトコッカス属の菌株における遺伝子の多重破壊や遺伝子組換えの効率を飛躍的に向上させることができる。従って、本発明は、クリプトコッカス属の菌株の遺伝子の機能解析やそれに基づく育種のために極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクターの構造を示す。
【図２】図２は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ―ｉｎ株の確認結果を示す。
【図３】図３は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ―ｉｎ株の栄養要求性の確認結果を示す。
【図４】図４は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ−ｏｕｔの原理を示す。
【図５】図５は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ−ｏｕｔ株の確認結果を示す。
【図６】図６は、ａｄｅ１  Ｐｏｐ−ｏｕｔ株の栄養要求性の確認結果を示す。
【図７】図７は、ａｄｅ１  相補コンストラクトを示す。
【図８】図８は、Ｋｕ７０のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクターの構築手順を示す。
【図９】図９は、Ｋｕ７０のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔの確認結果を示す。
【図１０】図１０は、ａｄｅ１  遺伝子座へのターゲティング率の確認結果を示す。
【図１１】図１１は、ｘｙｌ１  破壊ベクターの構造を示す。
【図１２】図１２は、ｘｙｌ１  遺伝子座へのターゲティング率の確認結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の遺伝子破壊方法、かかる方法によって得られるマーカー遺伝子、かかる方法を特定の遺伝子の破壊に適用することにより得られる、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法、及びかかる取得方法により得られる菌株について説明する。
【００２６】
本発明は、遺伝子の機能解析などのためにクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株のゲノム中の特定の遺伝子を破壊する方法を提供するものである。この方法は、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製する工程（１）、このコンストラクトを用いてＰｏｐ−ｉｎを行い、特定の遺伝子を破壊する工程（２）、及びＰｏｐ−ｏｕｔを行い、ウラシル要求性マーカー遺伝子を除去する工程（３）を含むものである。
【００２７】
工程（１）では、特定の遺伝子コンストラクト（Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクト）を作製するが、この遺伝子コンストラクトは、特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と、ウラシル要求性マーカー遺伝子配列と、特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部とをこの順序で含むことが必要であり、さらに、特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部とウラシル要求性マーカー遺伝子配列の間及び／又はウラシル要求性マーカー遺伝子配列と特定の遺伝子の３′側配列の少なくとも一部の間に、特定の遺伝子の５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が挿入されていることが必要である。
【００２８】
工程（１）によって作製されるＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの一例は、図１の下側に示される三つのコンストラクト（ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ）である。図１からわかるように、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトは、破壊対象の特定の遺伝子のＯＲＦの代わりにウラシル要求性マーカー遺伝子のＯＲＦが、この特定の遺伝子の５′側配列の少なくとも一部と３′側配列の少なくとも一部の間に挟まれた構造を有する。これは、工程（２）において、相同組換えによって特定の遺伝子を破壊するためである。また、本来存在する５′側又は３′側配列（の少なくとも一部）に加えて、５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部が、本来存在する５′側又は３′側配列（の少なくとも一部）とウラシル要求性マーカー遺伝子のＯＲＦとの間に挿入されている。これは、工程（３）において、５′側又は３′側配列の少なくとも一部と、５′側又は３′側配列の別の少なくとも一部との間で、相同配列の染色体内部での相同組換えを生じさせて、ウラシル要求性マーカー遺伝子をゲノム中から除去するためである。
【００２９】
「ウラシル要求性マーカー遺伝子」は、ウラシルの合成に関与する遺伝子であり、例えばｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードする遺伝子が挙げられる。その具体的な例としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＵＲＡ５遺伝子を挙げることができる。この遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ４７０５２６．１に公開されている。
【００３０】
ＵＲＡ５遺伝子がコードするｏｒｏｔａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによって、５−ＦＯＡ（フルオロオロチン酸）は分解される。その結果、ｏｒｏｔａｔｅの代わりにウラシル合成経路に取り込まれ、最終的に正常なＲＮＡの合成を阻害し、細胞の成育を抑制する。一方、ＵＲＡ５遺伝子が抑制または除去された菌株は５−ＦＯＡを分解しないため、５−ＦＯＡの存在下でも生育することができる。従って、５−ＦＯＡを用いることで、ウラシル要求性マーカーが抑制または除去された菌株を選抜することが可能である。
【００３１】
工程（２）では、ウラシル要求性の菌株を遺伝子コンストラクトで形質転換し、ウラシル非含有培地で培養して、菌株のゲノム中の特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって遺伝子コンストラクトが挿入された第１の形質転換体を選抜する。これは、一般的な形質転換工程と同様である。
【００３２】
工程（１）で作製された遺伝子コンストラクトは、ウラシル要求性マーカー遺伝子を含む。従って、工程（２）で、形質転換処理後の菌体をウラシル非含有培地で培養すると、菌株のゲノム中の特定の遺伝子が存在する部位に二重相同組換えによって遺伝子コンストラクトが挿入された形質転換体のみが生育することができ、目的とする形質転換体（第１の形質転換体）を選抜することができる。
【００３３】
工程（３）では、５−ＦＯＡを含有する培地で第１の形質転換体を培養し、相同配列の染色体内部での相同組換えによりウラシル要求性マーカー遺伝子がゲノム中から除去された第２の形質転換体を選抜する。
【００３４】
工程（２）で菌株のゲノム中に遺伝子コンストラクトが挿入されたが、この遺伝子コンストラクトは、５′側配列及び３′側配列の少なくとも一方を少なくとも部分的に重複して含むため、必ずしも安定ではない。従って、図４に示されるように、形質転換後の培養中に、これらの相同配列の間で染色体内部での相同組換えが一定頻度で生じ、それによりウラシル要求性マーカー遺伝子が除去された形質転換体が一定頻度で出現する。これがＰｏｐ−ｏｕｔと称される現象である。一方、上述の通り、５−ＦＯＡの存在下では、ウラシル要求性マーカー遺伝子を有さない菌株のみが生育することができる。従って、工程（２）の後の形質転換体を工程（３）において５−ＦＯＡを含む培地中で培養することにより、染色体内部での相同組換えが生じてウラシル要求性マーカー遺伝子が除去された形質転換体（第２の形質転換体）を選抜することができる。この形質転換体は、特定の遺伝子が破壊されており、しかもウラシル要求性マーカー遺伝子が除去されているため、遺伝子の多重破壊が可能であり、遺伝子の機能解析や育種のために極めて有用である。
【００３５】
クリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株は、特に限定されないが、例えばクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２，クリプトコッカス・リクエファシエンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ），クリプトコッカス・フラヴス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ），クリプトコッカス・カルバツス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）などから自然変異により取得されるものを使用することができる。これらの菌は、市販品として、または、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの公的寄託機関から入手することができる。特に好ましいクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託されているクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株である。
【００３６】
また、本発明は、配列番号１で示される塩基配列からなることを特徴とするマーカー遺伝子を提供する。
【００３７】
配列番号１で示される塩基配列は、Ａｄｅ１遺伝子に相当する。この遺伝子は、アデニンの合成に関与するホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子である。この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、既に知られているクリプトコッカス・ネオホルマンスのＡｄｅ１遺伝子に対して７７％の同一性を有する。
【００３８】
本発明では、マーカー遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列のものに限定されず、配列番号１で示される塩基配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキシアミド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）も包含する。かかる均等の範囲の配列は、配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列又はその一部のプローブとして、ストリンジェントな条件（例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件）下でハイブリダイゼーションを行い、得られた塩基配列を遺伝子発現させてその機能を確認することにより、容易に得ることができる。なお、塩基配列間の同一性は、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、Ｂｌａｓｔを用いて決定することができる。
【００３９】
配列番号１は、Ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦのみの配列であるため、配列番号１又はその均等の範囲の配列を実際にマーカー遺伝子として機能させるためには、その５′側に適切なプロモーター配列を配置することが望ましい。かかるプロモーター配列としては、従来公知のいかなるものも使用することができるが、特に配列番号２で示される塩基配列、又は配列番号２で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）を使用することが、マーカー遺伝子の全長を最小限に抑えながらもマーカー遺伝子としての機能を奏させるために好ましい。なお、均等の範囲の配列の取得方法は、配列番号１の場合と同様である。配列番号２は、「ＴＥＦ１プロモーター」と称されるものであり、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａをコードする遺伝子の５′側の塩基配列である。
【００４０】
「ＴＥＦ１プロモーター」は、遺伝子の発現のために誘導剤を必要としないため、形質転換に用いるマーカー遺伝子（例えば、上述したＡｄｅ１遺伝子）や、異種タンパク質遺伝子（例えば、特許文献２に示されるアスペルギルス・オリゼ由来フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ））などの発現に好適である。
【００４１】
また、本発明は、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を取得する方法を提供する。この方法は、上述の遺伝子破壊方法によってクリプトコッカス属の菌株のゲノム中のＫｕ遺伝子を破壊する工程を含むものである。
【００４２】
Ｋｕ遺伝子は、真核生物において、二本鎖ＤＮＡの切断が修復される過程で働く非相同末端結合機構に関与する。従って、Ｋｕ遺伝子を本発明の方法により破壊することにより、非相同末端結合機構を抑制することができ、相同組換えの頻度を増大することができる。
【００４３】
Ｋｕ遺伝子としては、従来公知のいかなるものも使用することができるが、特に配列番号３で示される塩基配列、又は配列番号３で示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつＫｕ遺伝子活性を有する塩基配列（いわゆる均等の範囲の配列）を使用することが好ましい。なお、均等の範囲の配列の取得方法は、配列番号１の場合と同様である。
【００４４】
配列番号３のＫｕ遺伝子は、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株のＫｕ７０遺伝子に相当する。この遺伝子がコードするアミノ酸配列は、既に知られているクリプトコッカス・ネオホルマンスのＫｕ７０遺伝子に対して５９％の同一性を有する。このように、この遺伝子は既知の配列に対して同一性が低く、機能未知の配列であった。
【００４５】
また、本発明は、上述の方法により得られる、相同組換えの頻度が増大されたクリプトコッカス属のウラシル要求性の菌株を提供する。この菌株は、非相同組換え機構が抑制されているため、遺伝子ターゲッティング法又は標的遺伝子組換え法（細胞にＤＮＡを導入し、相同組換え体を選択することにより、標的とする特定遺伝子に突然変異を導入する方法）において非常に高いターゲッティング率が得られるものである。従って、かかる菌株は、遺伝子破壊（ノックアウト）株、遺伝子欠失株、遺伝子置換又は挿入株、又は染色体改変株等の、所望の各種目的株を容易に取得するために極めて有用である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（Ａ）Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製
クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子破壊株を作製するために、Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製した。Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製には、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐと、下流約２ｋｂｐを使用した。Ａｄｅ１遺伝子の上流配列を配列番号４に、Ａｄｅ１遺伝子の下流配列を配列番号５に示す。
【００４８】
まず、ａｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐとＡｄｅ１遺伝子のＯＲＦと、ａｄｅ１遺伝子の下流約２ｋｂｐを含む領域を、配列番号６（Ａｄｅ１Ｐ２ｋ＿Ｆ）のプライマーと、配列番号７（Ａｄｅ１Ｔ２ｋ＿Ｒ）のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター中にクローニングした。インサートが導入されたプラスミドを取得し、ｐＣＲ−ａｄｅ１と命名した。
【００４９】
次に、ｐＣＲ−ａｄｅ１ベクターから、配列番号８（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｆ）のプライマーと、配列番号９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ）のプライマーを用いてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行い、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ部分を除去したＰＣＲ産物を作製した。さらに、非特許文献２に記載のクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２組換えベクターであるｐＣｓＵＲＡ５から、配列番号１０（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｆ）のプライマーと配列番号１１（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｒ）のプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株由来のＵｒａ５遺伝子を増幅した。このようにして作製した２つのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて融合させ、ａｄｅ１遺伝子が破壊されたベクターであるｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５を作製した。
【００５０】
次に、ｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５ベクターから、以下の３通りのＰＣＲ及びｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。
すなわち、配列番号８（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｆ）のプライマーと配列番号９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１０（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｆ）と配列番号１１（ｕｒａ５−ａｄｅ１−Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａベクターを作製し、
配列番号１５（Ａｄｅ１−５００Ｆ）のプライマーと配列番号１２（Ｕｒａ５  ７０８−６８８Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１６（Ａｄｅ１−１４３６Ｆ）と配列番号１７（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ３）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａベクターを作製し、
配列番号１８（Ａｄｅ１−１０００Ｆ）のプライマーと配列番号１２（Ｕｒａ５  ７０８−６８８Ｒ）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物と、配列番号１３（Ａｄｅ１＋９３６Ｆ）と配列番号１９（ｐＣＲ−ａｄｅ１−ＰＴ−Ｒ４）のプライマーで増幅したＰＣＲ産物をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応させて、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂベクターを作製した。
【００５１】
このようにして、Ａｄｅ１遺伝子の上流、ＯＲＦ、及び下流を含むｐＣＲ−ａｄｅ１ベクター、Ａｄｅ１の破壊ベクターであるｐＣＲ−ａｄｅ１−ｕｒａ５、並びにＡｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクターであるＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂをそれぞれ完成させた。これらのベクター（遺伝子コンストラクト）の詳細な構造を図１に示す。
【００５２】
（Ｂ）Ａｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ
組換え宿主としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を使用した。本菌株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６１として国際寄託されている。本菌株は、形質転換体の選択のために、ウラシル要求性となっており、ウラシルマーカーであるＵＲＡ５遺伝子を含むプラスミドを形質転換することにより、ウラシル要求性の有無を指標として形質転換体を選抜することが可能である。
【００５３】
形質転換は、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９２  Ｍａｒ；６０（３）：１１０１−８．（Ｖａｒｍａら）に記載の方法で実施した。具体的には、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．Ｕ５株を２０ｍｌＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。次に、この培養液を２００ｍｌ液体培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ポリペプトン０．５％、グルコース１．０％）に、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．１Ａｂｓになるように植菌して、培養液の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）が約１．０Ａｂｓになるまで２５℃で培養を行った。次に、この培養液を遠心分離して菌体を回収し、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｕｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）で菌体を２回洗浄し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）に吸光度ＯＤ６６０＝５０Ａｂｓとなるように懸濁して懸濁液を調製した。次に、上記（Ａ）で作製した三つのＡｄｅ１遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔベクター（Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ，Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ，及びＡｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ）を予めＫｐｎＩによって制限酵素処理して直鎖化したもの１０μｇ（〜５μｌ）を、懸濁液１００μｌに添加し、エレクトロポレーション用のキュベットに移した後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて通電した。通電条件は、Ｃ＝２５μＦ；Ｖ＝０．４７ｋＶに設定した。通電後の液中に、６００μｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２７０ｍＭシュークロース、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）を添加し、選択プレート上に塗り広げた。選択プレートとしては、ＹＮＢ−ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％  −ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％グルコース、１％寒天粉末）を用いた。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。
【００５４】
形質転換で得られた形質転換体については、配列番号６のＡｄｅ１−Ｐ２Ｋ及び配列番号７のＡｄｅ１−Ｔ２Ｋ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより、遺伝子コンストラクト（ベクター）の導入を確認した。その結果を図２に示す。
【００５５】
図２からわかるように、Ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ａ形質転換体については、５株中２株が（図２の１と５）、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ５００ａ形質転換体については、５株中１株が（図２の６）、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ１０００ｂ形質転換体については３株中１株が（図２の１２）、ａｄｅ１遺伝子座でＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを二重相同組換えにより導入されていた。
【００５６】
さらに、得られた形質転換体を、ＹＮＢ＋ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、  ５００ｍＭ  ウラシル、２％グルコース、１％寒天粉末）及びＹＮＢ＋ｕｒａ＋ａｄｅ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、５００ｍＭ  ウラシル、５００ｍＭ  アデニン、２％グルコース、１％寒天粉末）培地にそれぞれ植菌し、菌体の生育の有無により、各形質転換体の栄養要求性を確認した。その結果を図３に示す。
【００５７】
図３からわかるように、コロニーＰＣＲでａｄｅ１遺伝子座へのＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの二重相同組換えが確認された株（図３中の番号１，５，６，１２）では、アデニン非存在下で生育が確認されず、アデニンを添加した培地でのみ生育が確認された。本結果から、得られた形質転換体は、ａｄｅ１遺伝子が破壊され、アデニン要求性となっていることが確認された。
【００５８】
次に、本形質転換体に関して、Ｐｏｐ−ｏｕｔを行った。Ｐｏｐ−ｏｕｔとは、図４に示すように、各Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを導入した形質転換体の染色体において、相同配列の染色体内部での相同組換えが起こり、Ｕｒａ５マーカー遺伝子が除去された形質転換体が、ある一定の頻度で出現する現象のことである。Ｕｒａ５マーカー遺伝子が除去された形質転換体は、５−ＦＯＡ存在下で生育することができるようになるため、形質転換体の培養液を５−ＦＯＡを含む培地中で生育させ、生育コロニーを選抜することでＰｏｐ−ｏｕｔ株を選抜することが可能である。
【００５９】
Ｐｏｐ−ｏｕｔは、以下の手順で行った。形質転換体を５ｍｌＹＮＢ＋ＵＲＡ培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ  ウラシル、２％グルコース）で２５℃、４８時間培養した。得られた培養液０．１ｍｌを５−ＦＯＡ選択プレート（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ  ウラシル、０．２％  ５−ＦＯＡ、２％グルコース、１％寒天粉末）に植菌した。植菌したプレートを２５℃で１週間静置培養し、生育コロニーを選抜した。生育したコロニーについては、配列番号６のＡｄｅ１−Ｐ２Ｋ及び配列番号７のＡｄｅ１−Ｔ２Ｋ＿Ｒをプライマーとして用いてＫＯＤ−Ｆｘ（東洋紡社製）によるコロニーＰＣＲを行うことにより、遺伝子のＰｏｐ−ｏｕｔを確認した。その結果の一例を図５に示す。
【００６０】
図５に示すように、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトがＰｏｐ−ｏｕｔされた場合、コロニーＰＣＲによって、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ａとａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−５００ａについては３７９７ｂｐ、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ｂについては２７９７ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ａ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では、１６株中１６株がＰｏｐ−ｏｕｔされており、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−５００ａ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では、１６株全てでＰｏｐ−ｏｕｔされていなかった。また、ａｄｅ１−Ｕｐｏｐ−１０００ｂ形質転換体のＰｏｐ−ｏｕｔ候補株では１６株中１５株がＰｏｐ−ｏｕｔされていた。以上のことから、Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトのＰｏｐ−ｏｕｔのためには、少なくとも１０００ｂｐの長さの相同配列が必要であることが判明した。
【００６１】
さらに、得られたＰｏｐ−ｏｕｔ株を、ＹＮＢ＋ｕｒａ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、５００ｍＭ  ウラシル、２％グルコース、１％寒天粉末）とＹＮＢ＋ａｄｅ寒天培地（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、５００ｍＭ  アデニン、２％グルコース、１％寒天粉末）培地、及び５−ＦＯＡ選択プレート（０．６７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  Ｗ／Ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．０７８％−ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５００ｍＭ  ウラシル、０．２％  ５−ＦＯＡ、２％グルコース、１％寒天粉末）にそれぞれ植菌し、菌体の生育を確認した。生育の結果を図６に示す。
【００６２】
図６に示すように、Ｐｏｐ−ｏｕｔ株では、アデニン要求性に加えて、ウラシル要求性になっていることが確認された。また、Ｐｏｐ−ｏｕｔ株は、５−ＦＯＡを含む培地でも生育した。このようにして得られたＰｏｐ−ｏｕｔ株をＡ１Ｕ５株と命名して、以下の検討に用いた。
【００６３】
（Ｃ）Ａｄｅ１遺伝子に基づくマーカー遺伝子の設計
Ａｄｅ１遺伝子を実際にマーカー遺伝子として機能させるためには、Ａｄｅ１遺伝子が発現されてＡｄｅ１タンパク質が生産されることが必要である。そこで、Ａｄｅ１遺伝子を発現するために好適なプロモーターの種類を検討した。
まず、上記（Ａ）で作製したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流約２ｋｂｐと、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域、及びＡｄｅ１遺伝子の下流約２ｋｂｐを含む、ｐＣＲ−ａｄｅ１を検討に用いた。配列番号２０（Ａｄｅ１Ｕ１ＫＦ）と配列番号２１（Ａｄｅ１ｔｅｒＲ）を用いてＰＣＲを行い、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のＡｄｅ１遺伝子の上流１ｋｐと、ａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域、Ａｄｅ１遺伝子の下流０．３ｋｂｐを含む領域を増幅した産物をＴａｒｇｅｔ−ｃｌｏｎｅ  ｐｌｕｓ（東洋紡製）にクローニングして、ｐＴＡｄｅ１＋１ｋ−０．３ｋを作製した。さらに、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２２（ＣｓＥＦ１ｐ＿Ｆ（Ｍｕｎ））と、配列番号２３（ＥＦ１ｐＡｄｅ１＿ｆＲ）のプライマーを用いて増幅したクリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２由来ＴＥＦ１プロモーター配列のＰＣＲ産物と、配列番号２４（ＥＦ１ｐＡｄｅ１＿ｆＦ）と配列番号２１（Ａｄｅ１ｔｅｒＲ）のプライマーを用いて増幅した、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のａｄｅ１遺伝子のＯＲＦ領域とａｄｅ１遺伝子の下流領域０．３ｋｂｐを含むＰＣＲ産物をＦｕｓｉｏｎ−ＰＣＲし、得られた産物をＴａｒｇｅｔ−ｃｌｏｎｅ  ｐｌｕｓ（東洋紡製）にクローニングして、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を作製した。上述のようにして作製したコンストラクト（プラスミド）の構造を図７に示す。
【００６４】
次に、作製したプラスミドを用いて、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２  Ａ１Ｕ５株に形質転換を行った。形質転換は、上記（Ｂ）に示す方法で行い、選択培地には、ＹＮＢ＋ｕｒａ培地を用いた。その結果、ｐＣＲ−ａｄｅ１及び、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を形質転換に用いた場合は、形質転換体を取得することができたが、ｐＴＡｄｅ１＋１ｋ−０．３ｋを形質転換に用いた場合は、形質転換体を得ることができなかった（結果は図示せず）。本結果から、ａｄｅ１遺伝子の発現には、５′ＵＴＲの長さが１ｋｂｐでは不十分であり、少なくとも２ｋｂｐ必要であることが明らかとなった。一方で、Ｔｅｆ１プロモーターを用いた場合は、１ｋｂｐの長さしかなくてもａｄｅ１遺伝子の発現には十分であることが明らかとなった。
【００６５】
（Ｄ）Ｋｕ７０遺伝子Ｐｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトの作製
非相同末端結合機構に関与するＫｕ７０遺伝子の破壊を行うため、非特許文献２に記載の、ｐＣｓＵＲＡ５ベクターをベースとして、Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔコンストラクトを作製した。
まず、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２５（Ｋｕ７０Ｕ２ｋＦ（ＳｂｆＩ））のプライマーと配列番号２６（Ｋｕ７０Ｕ２ｋＲ（ＳｂｆＩ））のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの上流約２ｋｂｐを増幅し、Ｓｂｆ１で制限酵素処理した後、同じくＳｂｆ１処理したｐＣｓＵＲＡ５に挿入して、ｐＣｓＵ−Ｋｕ７０Ｕ２Ｋを作製した。
【００６６】
次に、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２７（Ｋｕ７０ｐｏｐＦ（ＥｃｏＲＩ））のプライマーと配列番号２８（Ｋｕ７０Ｄ２ｋＲ（ＥｃｏＲＩ））のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの上流約１ｋｂｐを増幅した産物と、配列番号２９（Ｋｕ７０ｐｏｐｆＦ）のプライマーと配列番号３０（Ｋｕ７０ｐｏｐｆＲ）のプライマーを用いてＫｕ７０遺伝子のＯＲＦの下流約２ｋｂｐを増幅した産物をＦｕｓｉｏｎ−ＰＣＲによって融合させ、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理した後、同じくＥｃｏＲＩで処理したｐＣｓＵ−Ｋｕ７０Ｕ２Ｋに挿入して、ｐＣｓＫｕ７０Ｕｐｏｐを作製した。ｐＣｓＫｕ７０Ｕｐｏｐのプラスミドマップを図８に示す。
【００６７】
（Ｅ）Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔ
Ｋｕ７０のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔを行う組換え宿主としては、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２．  Ｄ１１株を使用した。本菌株は、特許文献５に記載されており且つ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４８２として国際寄託された、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株の細胞外多糖類低生産変異体である。Ｄ１１株はＡ１Ｕ５株からＵＶ変異によって単離された変異体であり、ウラシル及びアデニン要求性株である。
【００６８】
ｐＣｓＫｕ７０ＵｐｏｐのＤ１１株への形質転換は上記（Ｂ）に示すとおりの方法で行い、選択培地には、ＹＮＢ−ｕｒａ培地を用いた。取得したＫｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ株からのＰｏｐ−ｏｕｔについても、上記（Ｂ）に示すとおりの方法で行い、Ｐｏｐ−ｏｕｔ候補株を得た。得られた候補株について、配列番号３１（ＣｓＫｕ７０ｃｏｌｏＰ＿Ｆ）と、配列番号３２（ＣｓＫｕ７０ｃｏｌｏＰ＿Ｒ）を用いてコロニーＰＣＲを行い、Ｋｕ７０遺伝子のＰｏｐ−ｉｎ／Ｐｏｐ−ｏｕｔを確認した。その結果を図９に示す。図９に示すように、Ｋｕ７０遺伝子がＰｏｐ−ｏｕｔされた株を取得し、ＤＫ１９１株と命名した。
【００６９】
（Ｆ）Ｋｕ７０破壊株のＡｄｅ１遺伝子座へのターゲッティング率（相同組換えの頻度）の検討
Ｋｕ７０遺伝子の破壊が、遺伝子座へのターゲッティング率に影響を与えるかを確認するため、Ｋｕ７０破壊株であるＤＫ１９１株にｐＣＲ−ａｄｅ１を形質転換し、ａｄｅ１遺伝子座への導入効率を検討した。対照として、Ｋｕ７０が破壊されていないＤ１１株へも同様に形質転換を行った。得られた形質転換体の確認は、配列番号６（Ａｄｅ１Ｐ２ｋ＿Ｆ）のプライマーと配列番号７（Ａｄｅ１Ｔ２ｋ＿Ｒ）のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行うことによって確認した。その結果を図１０に示す。
【００７０】
図１０から、Ｄ１１株を宿主とした場合は、３２株中９株でａｄｅ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は２８％であった。それに対して、ＤＫ１９１株を宿主とした場合は、３２株中２９株でａｄｅ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は、９１％であった。本結果から、Ｋｕ７０遺伝子の破壊により、ターゲティング率は３．４倍向上したことが明らかとなった。
【００７１】
（Ｇ）Ｋｕ７０破壊株のＸｙｌ１遺伝子座へのターゲッティング率（相同組換えの頻度）の検討
上記（Ｆ）では、遺伝子座の相同配列部分として上流２ｋｂｐと下流２ｋｂｐを使用したため、相同配列部分が長く、Ｋｕ７０遺伝子が機能しているＤ１１株でもターゲッティング率は２８％と比較的高い値となった。そこでＫｕ７０遺伝子破壊の効果をさらに厳格な条件下で確認するため、相同配列部分が短いコンストラクトを用いて、ターゲティング率の検証を行った。
【００７２】
ターゲティング率の検証には、Ｘｙｌａｎａｓｅ遺伝子をコードするＸｙｌ１遺伝子座を用いた。クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２株は酸性キシラナーゼを多量に分泌生産することが、非特許文献２において記載されている。
【００７３】
まず、クリプトコッカスｓｐ．Ｓ−２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３３（ＸｙｌＵ２ｋＦ）のプライマーと配列番号３４（ＸｙｌＤ１ｋＲ）のプライマーによりＰＣＲを行い、キシラナーゼ遺伝子の上流２ＫｂｐとＯＲＦ、及び下流１ｋｂｐを含む領域を増幅し、Ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｏｎｅ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇを行い、ｐＴ−ＸｙｌＵ２Ｋ−ＯＲＦ−Ｄ１Ｋを作製した。
【００７４】
次に、ｐＴ−ＸｙｌＵ２Ｋ−ＯＲＦ−Ｄ１Ｋを鋳型として、配列番号３５（ＸｙｌＵｐｐｅｒ１ｋｉＲ）のプライマーと配列番号３６（ＸｙｌｔｅｒｉＦ（ＳｂｆＭｕｎ））のプライマーを用いてインバースＰＣＲを行い、キシラナーゼ遺伝子の上流約１ｋｂｐとキシラナーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を除去したｐＴ−ＸｙｌＵｐ１Ｋ−Ｄ１Ｋを作製した。
【００７５】
次に、上記（Ｃ）に記載の、ｐＴＴｅｆ１ｐ−Ａｄｅ１を鋳型として、配列番号２２（ＣｓＥＦ１ｐ＿Ｆ（Ｍｕｎ））のプライマーと配列番号３７（Ａｄｅ１＿Ｒ（ＭｕｎＩ））のプライマーによりＰＣＲを行い、Ｔｅｆ１プロモーターとａｄｅ１のＯＲＦを含む領域を増幅し、制限酵素ＭｕｎＩで処理した。その後、同じくＭｕｎＩで処理したｐＴ−ＸｙｌＵｐ１Ｋ−Ｄ１Ｋに導入し、ｐＴＸｙｌｐｄｅｌＡを作製した。ｐＴＸｙｌｐｄｅｌＡのプラスミドマップを図１１に示す。
【００７６】
次に、上記（Ｆ）で示すように、Ｋｕ７０破壊株であるＤＫ１９１株及び対照としてのＤ１１株を用いて形質転換を行い、形質転換体のターゲティング率を算出した。形質転換体の確認は、配列番号３８（ＸｙｌＵｐｐｅｒＦ）のプライマーと配列番号３９（ｐＣｓＵＸ＿Ｒ）のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行うことによって行った。その結果を図１２に示す。
【００７７】
図１２からわかるように、Ｄ１１株を宿主とした場合は、３２株の全てでｘｙｌ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入された株は全く取得できなかった。それに対して、ＤＫ１９１株を宿主とした場合は、３２株中２２株でｘｙｌ１遺伝子座に二重相同組換えでＤＮＡが導入されたことが確認され、ターゲティング率は、６９％であった。本結果から、Ｋｕ７０遺伝子の破壊により、ターゲティング率は飛躍的に向上していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、機能解析や改変の対象となる標的遺伝子の破壊や相同組換え、及び形質転換体の選択を効率的に行うことができるため、クリプトコッカス属の菌株における遺伝子の多重破壊や遺伝子組換えの効率を飛躍的に向上させることができる。従って、本発明は、クリプトコッカス属の菌株の遺伝子の機能解析やそれに基づく育種のために極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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