(57)【要約】【課題】非特異的な増幅が生じることを抑制することができる核酸増幅反応容器を提供する。【解決手段】反応液が移動する流路を含み、前記流路は、第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、前記第１領域には、プライマーが配置され、前記第２領域には、逆転写酵素が配置されている、核酸増幅反応容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、プライマーが配置され、
前記第２領域には、逆転写酵素が配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記第１領域に、プローブが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記第１領域に、ｄＮＴＰが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記第１領域に、バッファーが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記プライマーおよび前記逆転写酵素は、乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記プライマーおよび前記逆転写酵素は、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通する、核酸増幅反応容器。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う、核酸増幅反応容器。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記流路は、
前記第１領域および前記第２領域と離間した第３領域と、
前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域と離間した第４領域と、
を有し、
前記第２領域および前記第３領域は、前記第１領域と前記第４領域との間の前記流路に位置し、
前記第２領域および前記第３領域は、屈曲した形状を有する、核酸増幅反応容器。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記第３領域は、前記流路において、前記第２領域よりも前記第４領域側に位置し、
前記反応液を、前記第３領域と前記第４領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う、核酸増幅反応容器。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記第３領域を、前記第２温度よりも高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記第４領域を、前記第３温度よりも低い第４温度に加熱する第４加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、前記第３領域、および前記第４領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１４】
請求項１２または１３において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１５】
鋳型核酸およびプライマーを含む反応液を、第１温度で加熱して変性する変性工程と、
前記変性工程の後に、逆転写酵素を前記反応液に添加し、前記反応液を第１温度よりも低い第２温度で加熱して、逆転写反応を行う逆転写反応工程と、
前記逆転写反応工程の後に、前記反応液に熱サイクルを付与して、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応工程と、
を含む、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
核酸には、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）およびＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の大きく２種類が存在する。標的核酸を含む鋳型核酸がＲＮＡの場合、ＰＣＲ（核酸増幅反応）の前に、逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することが知られている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−３６３０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、ＰＣＲに用いられるプライマーは、温度が低いと、鋳型核酸に非特異的にアニーリング（標的配列以外の配列にアニーリング）しやすい。そのため、例えば、低温（例えば室温）から温度を上げて逆転写反応を行うと、プライマーが非特異的にアニーリングし、核酸増幅反応において非特異的な増幅（標的配列以外の配列が増幅すること）が生じる場合がある。
【０００７】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる核酸増幅反応容器を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を含む核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る核酸増幅反応容器は、
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、プライマーが配置され、
前記第２領域には、逆転写酵素が配置されている。
【０００９】
このような核酸増幅反応容器では、例えば、第１領域においてプライマーを変性させた後に、第２領域において逆転写反応を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器では、逆転写反応において、プライマーの鋳型核酸への非特異的なアニーリングや、プライマー同士の結合であるプライマーダイマーを抑制することができる。よって、このような核酸増幅反応容器では、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００１０】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されていてもよい。
【００１１】
このような核酸増幅反応容器は、第１領域および第２領域を所定の温度まで加熱する前の状態（低温（例えば室温）の状態）でポリメラーゼとプライマーとが共存する（接触する）ことがなく、所定の温度まで加熱した後にポリメラーゼとプライマーと接触させることができる。これにより、このような核酸増幅反応容器では、例えば低温の状態でプライマーが非特異的にアニーリングし伸長反応が起こって非特異的な増幅が生じることを、より確実に抑制することができる。
【００１２】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に、プローブが配置されていてもよい。
【００１３】
このような核酸増幅反応容器では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００１４】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に、ｄＮＴＰが配置されていてもよい。
【００１５】
このような核酸増幅反応容器では、核酸増幅反応において、ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。また、逆転写反応において、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００１６】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に、バッファーが配置されていてもよい。
【００１７】
このような核酸増幅反応容器では、反応液のｐＨを調整することができる。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記プライマーおよび前記逆転写酵素は、乾燥状態で配置されていてもよい。
【００１９】
このよう核酸増幅反応容器では、プライマーおよび逆転写酵素が液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーと逆転写酵素とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記プライマーおよび前記逆転写酵素は、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２１】
このよう核酸増幅反応容器では、プライマーおよび逆転写酵素が液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーと逆転写酵素とを、さらにより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２２】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通してもよい。
【００２３】
このような核酸増幅反応容器では、標的核酸を導入口から第１領域へ導入することができる。
【００２４】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行ってもよい。
【００２５】
このような核酸増幅反応容器では、反応液を第１領域と第２領域との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００２６】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記流路は、
前記第１領域および前記第２領域と離間した第３領域と、
前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域と離間した第４領域と、
を有し、
前記第２領域および前記第３領域は、前記第１領域と前記第４領域との間の前記流路に位置し、
前記第２領域および前記第３領域は、屈曲した形状を有してもよい。
【００２７】
このような核酸増幅反応容器では、逆転写反応のための温度と、プライマーのアニーリングおよび伸長反応の温度と、を別々に設定することができ、効率よく逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【００２８】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第３領域は、前記流路において、前記第２領域よりも前記第４領域側に位置し、
前記反応液を、前記第３領域と前記第４領域との間で往復させて核酸増幅反応を行ってもよい。
【００２９】
このような核酸増幅反応容器では、反応液を第３領域と第４領域との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００３０】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００３１】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を含むため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００３２】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第１温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記第３領域を、前記第２温度よりも高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記第４領域を、前記第３温度よりも低い第４温度に加熱する第４加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、前記第３領域、および前記第４領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００３３】
このような核酸増幅反応装置では、逆転写反応のための温度と、プライマーのアニーリングおよび伸長反応の温度と、を別々に設定することができ、効率よく逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【００３４】
本発明に係る核酸増幅反応装置において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含んでもよい。
【００３５】
このような核酸増幅反応装置では、反応液からの蛍光を検出することができる。
【００３６】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
鋳型核酸およびプライマーを含む反応液を、第１温度で加熱して変性する変性工程と、
前記変性工程の後に、逆転写酵素を前記反応液に添加し、前記反応液を第１温度よりも低い第２温度で加熱して、逆転写反応を行う逆転写反応工程と、
前記逆転写反応工程の後に、前記反応液に熱サイクルを付与して、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応工程と、
を含む。
【００３７】
このような核酸増幅反応方法では、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図２】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図３】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図４】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図５】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。
【図６】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図７】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図８】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図９】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図１０】第２実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図１１】第２実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図１２】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図１３】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１４】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１５】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１６】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１７】実験方法を説明するための図。
【図１８】逆転写反応前の加熱を行った場合の温度プロファイル。
【図１９】逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の温度プロファイル。
【図２０】逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の熱サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図２１】逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の電気泳動の結果。
【図２２】逆転写反応前の加熱を行った場合の熱サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図２３】逆転写反応前の加熱を行った場合の電気泳動の結果。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００４０】
１．  第１実施形態
１．１．  核酸増幅反応容器
まず、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１は、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す断面図である。図２は、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【００４１】
核酸増幅反応容器１００は、図１および図２に示すように、容器本体１０を含む。容器本体１０の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。核酸増幅反応容器１００は、容器本体１０によって形成された流路２０を含む。流路２０には、第１試薬２および第２試薬４が設けられている。
【００４２】
１．１．１．  流路
流路２０は、反応液６が移動することができる流路である。なお、図１では、流路２０に反応液６が配置される前の状態を示し、図２では、流路２０に反応液６が配置された状態を示している。
【００４３】
反応液６は、標的核酸（標的配列を含む核酸）を含む鋳型核酸溶液と、容器本体１０内に配置された第１試薬２と、が接触することによって調整（生成）される。したがって、反応液６は、鋳型核酸および第１試薬２を（鋳型核酸の成分および第１試薬２の成分を）含むこととなり、核酸増幅反応を進行させる場となる。さらに、反応液６は、第２試薬４と接触し、第２試薬４を（第２試薬４の成分を）含む。鋳型核酸は、ＲＮＡであり、インフルエンザウイルスやＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスから得ることができる。
【００４４】
流路２０には、液体（図示せず）が収容されている。液体は、反応液６とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体は、反応液６と異なる比重を有している。具体的には、液体の比重は、反応液６の比重よりも小さい。液体は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。液体は、容器本体１０の内壁を覆っており、流路２０に反応液６が配置された際に反応液６の表面を覆う。液体は、流路２０に充填されていない。これにより、核酸増幅反応容器１００では、液体が流路２０を充填する場合に比べて、反応液６を速く移動させることができる。
【００４５】
流路２０は、例えば、直線状の流路である。流路２０の形状は、例えば、直方体である。流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有している。
【００４６】
第１領域３０は、例えば、流路２０の一方側の端部である。第１領域３０は、第１温度に加熱される領域である。第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第１温度に加熱される。第１温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性）に適した温度であり、例えば、８０℃以上１０５℃以下である。第１領域３０は、例えば、流路２０の、第１加熱部４０（図３参照）に設けられた開口部４０ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第１領域３０の形状は、長方形である。
【００４７】
第１領域３０は、図２に示すように、標的核酸を含む鋳型核酸溶液を導入する導入口３１と連通する。図示の例では、導入口３１は、蓋１２によって塞がれている。核酸増幅反応容器１００では、蓋１２を開けて鋳型核酸溶液を流路２０に導入することができる。容器本体１０および蓋１２によって、流路２０は、密封されている。
【００４８】
第２領域３２は、例えば、流路２０の他方側の端部（第１領域３０とは反対側の端部）である。第２領域３２は、第１温度よりも低い第２温度に加熱される領域である。第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第２温度に加熱される。第２温度は、例えば、逆転写反応に適した温度であり、４５℃以上７５℃以下である。第２温度は、逆転写反応に適した温度であり、かつ、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であってもよい。第２領域３２は、例えば、流路２０の、第２加熱部４２（図３参照）に設けられた開口部４２ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第２領域３２の形状は、長方形である。
【００４９】
流路２０は、図２に示すように、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれている。第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂは、容器本体１０の内壁である。内壁１０ａ，１０ｂによって、流路２０は形成されている。第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。具体的には、距離Ｄは、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下である。距離Ｄを０．５ｍｍ以上とすることにより、核酸増幅反応容器１００の製造が困難になることを抑制することができる。距離Ｄを３ｍｍ以下とすることにより、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００５０】
核酸増幅反応容器１００は、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行うための容器である。
【００５１】
１．１．２．  第１試薬
第１試薬２は、図１に示すように、第１領域３０に配置されている。第１試薬２は、第２試薬４と離間した状態で配置されている。第１試薬２は、導入口３１から第１領域３０に導入されてもよい。導入口３１は、第１試薬２が導入された後、蓋１２によって塞がれてもよい。第１試薬２は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第１試薬２は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第１試薬２は、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００５２】
第１試薬２は、例えば、プライマーと、ｄＮＴＰと、プローブと、バッファーと、を含む。
【００５３】
プライマーは、核酸にアニーリングするよう設計されている。第１試薬２は、プライマーとして、二本鎖構造の核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。
【００５４】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。また、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（逆転写反応）。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００５５】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有しているポリメラーゼを用いる。
【００５６】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼを用いる。５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤポリメラーゼがあるが、この酵素は、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００５７】
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、反応液６のｐＨを調整することができる。バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれる２価の陽イオンの濃度は、例えば、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００５８】
第１試薬２は、キレート剤を含んでいてもよい。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。キレート剤は、第１領域３０が第１温度に加熱された場合に、ＲＮＡである鋳型核酸が熱によって分解されることを抑制することができる。
【００５９】
第１試薬２は、ダミーＤＮＡを含んでいてもよい。ダミーＤＮＡは、鋳型核酸と異なる配列を有し、逆転写反応に影響を及ぼさない配列を有していることが好ましい。鋳型核酸であるＲＮＡは、末端に長いアデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）の繰り返しでできている。したがって、ダミーＤＮＡは、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の連続配列を有していないことが好ましい。ダミーＤＮＡは、第１領域３０が第１温度に加熱された場合に、ＲＮＡである鋳型核酸が熱によって分解されることを抑制することができる。これは、熱による分解にかかわる化学種が、鋳型核酸を分解する代わりに、ダミーＤＮＡを分解するためのである。
【００６０】
第１試薬２が凍結乾燥されている場合、第１試薬２は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、特にトレハロースは、凍結保護剤としての機能が高く、強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、第１試薬２の各成分を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００６１】
１．１．３．  第２試薬
第２試薬４は、第２領域３２に配置されている。第２試薬４は、第２領域３２と連通する導入口（図示せず）から第２領域３２に導入されてもよい。該導入口は、第２試薬４が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第２試薬４は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第２試薬４は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第２試薬４は、第２領域３２を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００６２】
第２試薬４は、例えば、ポリメラーゼと、逆転写酵素と、を含む。
【００６３】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、一本鎖ＤＮＡの塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型などを用いる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００６４】
ポリメラーゼは、ホットスタート型であってもよいし、非ホットスタート型であってもよい。ホットスタート型とは、ホットスタートＰＣＲを行うためのホットスタート処置が行われたポリメラーゼのことであり、所定の温度より高い温度で一定時間晒されることにより、活性を有する。ホットスタート処理としては、例えば、抗体をポリメラーゼと反応させて複合体を形成する処理（抗体形成処理）、化学物質をポリメラーゼのアミノ酸と共有結合させる処理（化学修飾処理）、ワックスをポリメラーゼに付着させる処理、金属イオンをポリメラーゼと反応させる処理などがある。非ホットスタート型とは、ホットスタート処置が行われていないポリメラーゼのことである。非ホットスタート型は、例えば、ホットスタート型に比べて安価である。
【００６５】
逆転写酵素は、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてｃＤＮＡを合成する酵素である。逆転写反応は、逆転写酵素により、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてｃＤＮＡを合成する反応のことである。逆転写反応では、ＰＣＲで用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの一方をＲＮＡにアニーリングさせて、ｃＤＮＡを合成することができる。
【００６６】
逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に逆転写酵素の量は、例えば、５ユニット以上６０ユニット以下であり、好ましくは３０ユニット以上６０ユニット以下である。
【００６７】
なお、第２試薬４は、第１試薬２と同様に、ｄＮＴＰを含んでいてもよい。また、第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第２試薬４は、第１試薬２と同様に、糖を含んでもよい。
【００６８】
核酸増幅反応容器１００は、例えば、以下の特徴を有する。
【００６９】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有し、第１領域３０には、プライマーが配置され、第２領域３２には、逆転写酵素が配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、例えば、第１温度に加熱された第１領域３０においてプライマーを変性させた後に、第２温度に加熱された第２領域３２において逆転写反応を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器１００では、低温（例えば室温）から温度を上げて逆転写反応を行わないので、逆転写反応において、プライマーの鋳型核酸への非特異的なアニーリングや、プライマー同士の結合であるプライマーダイマーを抑制することができる。よって、核酸増幅反応容器１００では、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【００７０】
特に、逆転写反応の反応温度は、核酸増幅反応の反応温度よりも低い場合があり、逆転写反応では、鋳型核酸が二本鎖構造をとり易く、またプライマー同時の結合によるプライマーダイマーなどが起こり易い。しかし、核酸増幅反応容器１００では、プライマーを変性させた後に逆転写反応を行うことができるため、上記のような問題を解消することができる。
【００７１】
さらに、核酸増幅反応容器１００では、逆転写酵素は、第２領域３２に配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、耐熱性の低い逆転転写酵素を、第１温度に加熱させずに、逆転写反応を行うことができる。
【００７２】
さらに、核酸増幅反応容器１００では、逆転写反応および核酸増幅反応を、１つの核酸増幅反応容器１００で行うことができる。そのため、逆転写反応を行った反応液を、ピペット操作により容器から取り出し、別の容器に移し替えて別の容器で核酸増幅反応を行う場合に比べて、反応液６に異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００７３】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２には、ポリメラーゼが配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０および第２領域３２を所定の温度まで加熱する前の状態（低温（例えば室温）の状態）でポリメラーゼとプライマーとが共存する（接触する）ことがなく、第１温度まで加熱した後にポリメラーゼとプライマーと接触させることができる。これにより、核酸増幅反応容器１００では、例えば低温の状態でプライマーが非特異的にアニーリングし伸長反応が起こって非特異的な増幅が生じることを、より確実に抑制することができる。
【００７４】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、プローブが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００７５】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、ｄＮＴＰが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸増幅反応において、ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。また、逆転写反応において、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００７６】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、バッファーが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、反応液６のｐＨを調整することができる。
【００７７】
核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよび逆転写酵素は、乾燥状態で配置されている。具体的には、プライマーおよびポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよび逆転写酵素が液体の状態で配置されている場合に比べて、プライマーと逆転写酵素とを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、プライマーおよび逆転写酵素の保存安定性を高めることができる。
【００７８】
なお、第１試薬２と第２試薬４とを、互いに離間させた状態で配置させておくことができれば、第１試薬２および第２試薬４の少なくとも一方は、液体の状態で配置されていてもよい。
【００７９】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０は、標的核酸を導入する導入口３１と連通する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、標的核酸を導入口３１から第１領域３０へ導入することができる。
【００８０】
核酸増幅反応容器１００では、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行う。これにより、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００８１】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれ、第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。そのため、核酸増幅反応容器１００では、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００８２】
１．２．  核酸増幅反応装置
次に、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図３は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す断面図である。図４は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。図５は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０の機能ブロック図である。
【００８３】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置１１０について説明する。
【００８４】
核酸増幅反応装置１１０は、図３〜図５に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、駆動機構５０と、検出機構６０と、処理部７０と、操作部７２と、表示部７４と、記憶部７６と、核酸増幅反応容器１００と、を含む。
【００８５】
なお、便宜上、図３および図４では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図５では、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２の図示を省略している。
【００８６】
第１加熱部４０および第２加熱部４２は、核酸増幅反応容器１００に接して設けられている。加熱部４０，４２は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器１００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【００８７】
第１加熱部４０は、流路２０の第１領域３０を第１温度に加熱する。第１加熱部４０は、例えば、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６を第１温度に加熱する。第１加熱部４０には、開口部４０ａが設けられている。図示の例では、開口部４０ａは、有底の穴である。第１領域３０は、開口部４０ａに挿入された領域である。開口部４０ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。
【００８８】
第２加熱部４２は、流路２０の第２領域３２を、第１温度よりも低い第２温度に加熱する。第２加熱部４２は、例えば、第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６を第２温度に加熱する。第２加熱部４２には、開口部４２ａが設けられている。図示の例では、開口部４２ａは、有底の穴である。第２領域３２は、開口部４２ａに挿入された領域である。開口部４２ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。第２加熱部４２には、開口部４２ｂが設けられている。開口部４２ｂは、開口部４２ａと連通している。開口部４２ｂは、後述する検出機構６０からの励起光を第２領域３２に導き、かつ、反応液６からの蛍光を検出機構６０に導くための開口部である。
【００８９】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０および第２領域３２に移動するように、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす機構である。駆動機構５０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす。駆動機構５０は、図示はしないが、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を支持する支持部と、該支持部を動かすモーターと、を有していてもよい。
【００９０】
検出機構６０は、反応液６からの蛍光を検出する機構である。検出機構６０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、反応液６に励起光を照射し、反応液６からの蛍光を検出する。検出機構６０としては、蛍光を検出することができれば特に限定されず、例えば、公知の蛍光測定器を用いる。
【００９１】
処理部７０は、例えば記憶部７６に記憶されているプログラムに従って、加熱部４０，４２、駆動機構５０、および検出機構６０を制御するための処理を行う。処理部７０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。
【００９２】
操作部７２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部７０に送る処理を行う。操作部７２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。
【００９３】
表示部７４は、処理部７０によって生成された画像を表示する。表示部７４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）等により実現される。
【００９４】
記憶部７６は、処理部７０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部７６は、処理部７０の作業領域として用いられ、処理部７０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部７６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。
【００９５】
核酸増幅反応装置１１０では、核酸増幅反応容器１００を含むため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができることができる。
【００９６】
１．３．  核酸増幅反応方法
次に、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図６は、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図７および図８は、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図７および図８では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図７および図８では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置１１０を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【００９７】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器１００が装着された核酸増幅反応装置１１０の加熱部４０，４２を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定する処理を行う（ステップＳ１）。本工程により、第１領域３０と第２領域３２との間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。本工程では、核酸増幅反応容器１００の配置は、第１配置である。第１配置では、図７に示すように、第１領域３０は、第２領域３２よりも重力作用方向において下方に位置する。図示の例では、流路２０の延出方向（長手方向）は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。処理部７０は、例えば、第１領域３０および第２領域３２がそれぞれ第１温度および第２温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【００９８】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認下の後に、核酸増幅反応容器１００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図７に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ２）。
【００９９】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から反応液６を調整した旨の信号を受けると、処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を、第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ３）。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。これにより、反応液６に対して、変性（鋳型核酸、プライマー、およびプローブの変性）を行うことができる。第１の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。
【０１００】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ４）。第２配置では、図８に示すように、第２領域３２は、第１領域３０よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて（第２試薬４を反応液６に添加し）、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。そして、反応液６を第２温度で加熱して、逆転写反応を行うことができる（逆転写反応工程）。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。第２の時間は、逆転写反応を行うための時間であり、例えば、１秒以上３０分以下である。図示の例では、流路２０の延出方向は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【０１０１】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う（ステップＳ５）。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第３の時間、第１配置に保持される。これにより、反応液６を、第１温度で加熱して変性（逆転写酵素の変性、標的核酸の変性）行うことができる。第３の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上６０秒以下である。ホットスタートを行うことができるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。本工程において、反応液６を第１温度に加熱することにより、逆転写酵素を不活化することができ、逆転写酵素が核酸増幅反応に影響を及ぼすことを抑制することができる。
【０１０２】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、第２領域３２の温度（第２温度）をプライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度に調整する（ステップＳ６）。処理部７０は、例えば、ステップＳ５の処理を行ってから所定の時間経過後に、ステップＳ６の処理を行う。なお、ステップＳ１において、第２温度を、逆転写反応に適した温度であり、かつ、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度に設定することができる場合は、本工程を省略することができる。
【０１０３】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ７）。反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第４の時間、第２配置に保持される。これにより、反応液６を、第２温度で加熱してプライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第４の時間は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１０４】
次に、処理部７０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ７の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ８）。処理部７０は、ステップＳ７の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている所定の回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。
【０１０５】
処理部７０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図６において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【０１０６】
一方、処理部７０は、ステップＳ７においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図６において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ９に移行する。
【０１０７】
ステップＳ８では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間（第５の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第５の時間、第１配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性（標的核酸の変性）を行うことができる。第５の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１０８】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ７へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う。
【０１０９】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与し、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、駆動機構５０を制御して核酸増幅反応容器１００をシーソー運動させ、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。
【０１１０】
処理部７０は、さらに、ステップＳ７において、例えば、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置１１０では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部７０は、ステップＳ６において、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置に保持するごとに検出機構６０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部７０は、検出機構６０の測定結果として検出機構６０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部７６に記憶する。処理部７０は、予め記憶部７６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部７０は、算出した核酸の増幅量を、表示部７４に表示させる処理を行ってもよい。
【０１１１】
ここで、図９は、核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す図８のＩＸ−ＩＸ線断面図である。図９に示すように、第２配置では、第２領域３２は、検出機構６０と対向した位置にある。検出機構６０からの励起光は、開口部４２ｂを通って反応液６に至り、反応液６からの蛍光は、開口部４２ｂを通って検出機構６０に至る。
【０１１２】
核酸増幅反応方法では、逆転写反応工程の前に、第１温度で加熱して変性する変性工程を含む。そのため、核酸増幅反応方法では、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる（詳細は後述する「３．  実験例」参照）。さらに、核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器１００を用いるため、非特異的な増幅が生じることを抑制することができる。
【０１１３】
２．  第２実施形態
２．１．  核酸増幅反応容器
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１０は、第２実施形態に係る核酸増幅反応容器２００を模式的に示す断面図である。以下、第２本実施形態に係る核酸増幅反応容器２００において、上述した第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【０１１４】
核酸増幅反応容器２００では、図１０に示すように、第１領域３０および第２領域３２に加え、第３領域３４および第４領域３６を有している点において、上述した核酸増幅反応容器１００と異なる。すなわち、核酸増幅反応容器２００では、流路２０は、第１領域３０と、第２領域３２と、第３領域３４と、第４領域３６と、を有している。
【０１１５】
第２領域３２および第３領域３４は、第１領域３０と第４領域３６との間の流路２０に位置している。第２領域３２は、流路２０において、第３領域３４よりも第１領域３０側に位置している。第３領域３４は、流路２０において、第２領域３２よりも第４領域３６側に位置している。すなわち、領域３０，３２，３４，３６は、流路２０に沿って、第１領域３０、第２領域３２、第３領域３４、第４領域３６の順で配置されている。
【０１１６】
第２領域３２は、屈曲した形状を有している。第２領域３２は、例えば、角度αで屈曲した形状を有している。角度αは、例えば、７０°以上１１０°以下であり、図示の例では、９０°である。図示はしないが、第２領域３２は、曲線（例えば円弧状）を有する形状であってもよい。第２領域３２は、第２温度に加熱される領域である。第２温度は、逆転写反応に適した温度である。
【０１１７】
第３領域３４は、領域３０，３２と離間している。第３領域３４は、屈曲した形状を有している。第３領域３４は、例えば、角度βで屈曲した形状を有している。角度βは、例えば、７０°以上１１０°以下であり、図示の例では、９０°である。図示はしないが、第３領域３４は、曲線（例えば円弧状）を有する形状であってもよい。
【０１１８】
第３領域３４は、第２温度よりも高い第３温度に加熱される領域である。第３領域３４に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第３温度に加熱される。第３温度は、変性に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。第３温度は、第１温度と同じ温度であってもよいし、異なる温度であってもよい。第３領域３４は、例えば、流路２０の、第３加熱部４４（図１１参照）に設けられた開口部４４ａ内に位置する部分である。
【０１１９】
第４領域３６は、領域３０，３２，３４と離間している。第４領域３６は、第３温度よりも低い第４温度に加熱される領域である。第４領域３６に位置する反応液６は、例えば、第４温度に加熱される。第３温度は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であり、例えば、４５℃以上７５℃以下である。第４温度は、第２温度と同じ温度であってもよいし、異なる温度であってもよい。第４領域３６は、例えば、流路２０の、第４加熱部４６（図１１参照）に設けられた開口部４６ａ内に位置する部分である。図示の例では、第４領域３６の形状は、長方形である。
【０１２０】
流路２０は、図１０に示すように、第１流路２２と、第２流路２４と、第３流路２６と、を有している。
【０１２１】
第１流路２２は、一方の端部から他方の端部まで直線状に延出している。第１流路２２は、一方の端部において第１領域３０を有し、他方の端部において第２領域３２を有している。
【０１２２】
第２流路２４は、一方の端部から他方の端部まで直線状に延出している。第２流路２４は、一方の端部において第１流路２２の他方の端部と接続し、他方の端部において第３領域３４を有している。第２流路２４の一方の端部は、図１０に示すように、第２領域３２の一部を構成していてもよい。第２流路２４の延出方向は、例えば、第１流路２２の延出方向に対して直交している。
【０１２３】
第３流路２６は、一方の端部から他方の端部まで直線状に延出している。第３流路２６は、一方の端部において第２流路２４の他方の端部と接続し、他方の端部において第４領域３６を有している。第３流路２６の一方の端部は、図１０に示すように、第３領域３４の一部を構成していてもよい。第３流路２６の延出方向は、例えば、第１流路２２の延出方向に対して平行である。流路２０は、例えば、コの字状（略コの字状）の形状を有している。
【０１２４】
核酸増幅反応容器２００は、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を、第３領域３４と第４領域３６との間で往復させて核酸増幅反応を行うための容器である。
【０１２５】
核酸増幅反応容器２００は、例えば、以下の特徴を有する。
【０１２６】
核酸増幅反応容器２００では、第２領域３２および第３領域３４は、第１領域３０と第４領域３６との間の流路２０に位置し、第２領域３２および第３領域３４は、屈曲した形状を有する。そのため、核酸増幅反応容器２００では、例えば、第２温度に加熱された第２領域において逆転写反応を行い、反応液６を、第３温度に加熱された第３領域３４と、第４温度に加熱された第４領域３６と、の間で往復させて核酸増幅反応を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器２００では、逆転写反応のための温度と、プライマーのアニーリングおよび伸長反応の温度と、を別々に設定することができ、効率よく逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１２７】
核酸増幅反応容器２００では、第３領域３４は、流路２０において、第２領域３２よりも第４領域３６側に位置し、反応液６を、第３領域３４と第４領域３６との間で往復させて核酸増幅反応を行う。これにより、核酸増幅反応容器２００では、反応液６を第３領域３４と第４領域３６との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【０１２８】
２．２．  核酸増幅反応装置
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図１１は、第２実施形態に係る核酸増幅反応装置２１０を模式的に示す断面図である。以下、第２本実施形態に係る核酸増幅反応装置２１０において、上述した第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【０１２９】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器２００を装着可能な核酸増幅反応装置２１０について説明する。
【０１３０】
核酸増幅反応装置２１０は、図１１に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、第３加熱部４４と、第４加熱部４６と、核酸増幅反応容器２００と、を含む。なお、核酸増幅反応装置２１０は、図５に示すように、さらに、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６を含むが、便宜上、図１１では、これらの図示を省略している。
【０１３１】
加熱部４０，４２，４４，４６は、核酸増幅反応容器２００に接して設けられている。加熱部４０，４２，４４，４６は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器２００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２，４４，４６の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【０１３２】
第２加熱部４２には、開口部４２ａが設けられている。図示の例では、開口部４２ａは、屈曲した形状の貫通孔である。なお、核酸増幅反応装置１１０と異なり、核酸増幅反応装置２１０では、第２加熱部４２に、開口部４２ｂは設けられていない。
【０１３３】
第３加熱部４４は、流路２０の第３領域３４を、第２温度よりも高い第３温度に加熱する。第３加熱部４４は、例えば、第３領域３４に反応液６が位置した場合、反応液６を第３温度に加熱する。第３加熱部４４には、開口部４４ａが設けられている。図示の例では、開口部４４ａは、屈曲した形状の貫通孔である。第３領域３４は、開口部４４ａに挿入された領域である。開口部４４ａは、核酸増幅反応容器２００を装着可能な装着部である。
【０１３４】
第４加熱部４６は、流路２０の第４領域３６を、第３温度よりも低い第４温度に加熱する。第４加熱部４６は、例えば、第４領域３６に反応液６が位置した場合、反応液６を第４温度に加熱する。第４加熱部４６には、開口部４６ａが設けられている。図示の例では、開口部４６ａは、有底の穴である。第４領域３６は、開口部４６ａに挿入された領域である。開口部４６ａは、核酸増幅反応容器２００を装着可能な装着部である。第４加熱部４６には、開口部４６ｂが設けられている。開口部４６ｂは、開口部４６ａと連通している。開口部４６ｂは、検出機構６０からの励起光を第４領域３６に導き、かつ、反応液６からの蛍光を検出機構６０に導くための開口部である。
【０１３５】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０、第２領域３２、第３領域３４、および第４領域３６に移動するように、核酸増幅反応容器２００および加熱部４０，４２，４４，４６を動かす機構である。
【０１３６】
核酸増幅反応装置２１０では、核酸増幅反応容器２００を含むため、効率よく逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１３７】
２．３．  核酸増幅反応方法
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１２は、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図１３〜図１６は、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図１３〜図１６では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図１３〜図１６では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器２００を含む核酸増幅反応装置２１０を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【０１３８】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器２００が装着された核酸増幅反応装置２１０の加熱部４０，４２，４４，４６を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定し、第３領域３４を第３温度に設定し、第４領域３６を第４温度に設定する処理を行う（ステップＳ１１）。本工程により、第１領域３０と第２領域３２との間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成され、第２領域３２と第３領域３４との間には、第２温度と第３温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成され、第３領域３４と第４領域３６との間には、第３温度と第４温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。本工程では、核酸増幅反応容器２００の配置は、第１配置である。第１配置では、図１３に示すように、第１領域３０は、第２領域３２，３４，３６よりも重力作用方向において下方に位置する。処理部７０は、例えば、第１領域３０および第２領域３２がそれぞれ第１温度および第２温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【０１３９】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認下の後に、核酸増幅反応容器２００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図７に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ１２）。
【０１４０】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から反応液６を調整した旨の信号を受けると、処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を、第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ１３）。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。これにより、反応液６に対して、変性（鋳型核酸、プライマー、およびプローブの変性）を行うことができる。第１の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。
【０１４１】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１４）。第２配置では、図１４に示すように、第２領域３２は、領域３０，３４，３６よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて（第２試薬４を反応液６に添加し）、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。そして、反応液６を第２温度で加熱して、逆転写反応を行うことができる（逆転写反応工程）。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。第２の時間は、逆転写反応を行うための時間であり、例えば、１秒以上３０分以下である。
【０１４２】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置から第３配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１５）。第３配置では、図１５に示すように、第３領域３４は、領域３０，３２，３６よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第２領域３２から第３領域３４に移動する。反応液６は、第３領域３４において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第３の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６を、第３温度で加熱して変性（逆転写酵素の変性、標的核酸の変性）を行うことができる。第３の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上６０秒以下である。ホットスタートを行うことができるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。本工程において、反応液６を第１温度に加熱することにより、逆転写酵素を不活化することができ、逆転写酵素が核酸増幅反応に影響を及ぼすことを抑制することができる。
【０１４３】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置から第４配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１６）。第４配置では、図１６に示すように、第４領域３６は、領域３０，３２，３４よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第３領域３４から第４領域３６に移動する。反応液６は、第４領域３６において第４温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第４配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第４の時間、第４配置に保持される。これにより、反応液６を、第４温度で加熱してプライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第４の時間は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１４４】
次に、処理部７０は、第３配置から第４配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ１６の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ１７）。処理部７０は、ステップＳ１６の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている所定の回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。
【０１４５】
処理部７０は、ステップＳ１７においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図１２において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【０１４６】
一方、処理部７０は、ステップＳ１７においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図１２において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１８に移行する。
【０１４７】
ステップＳ１８では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第４配置から第３配置へ切換える処理を行う。これにより、反応液６は、第４領域３６から第３領域３４に移動する。反応液６は、第３領域３４において第３温度に加熱される。これにより、反応液６を、第３温度で加熱して変性を行うことができる。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間（第５の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第５の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６を、第３温度で加熱して変性（標的核酸の変性）を行うことができる。第５の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１４８】
次に、処理部７０は、ステップＳ１６へ移行し、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置から第４配置へ切換える処理を行う。
【０１４９】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置と第４配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第３領域３４と第４領域３６との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与し、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、駆動機構５０を制御して核酸増幅反応容器２００をシーソー運動させ、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置と第４配置とに切換える処理を行う。
【０１５０】
処理部７０は、さらに、ステップＳ１６において、例えば、核酸増幅反応容器２００の配置を第４配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置２１０では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部７０は、ステップＳ１６において、核酸増幅反応容器２００の配置を第４配置に保持するごとに検出機構６０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部７０は、検出機構６０の測定結果として検出機構６０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部７６に記憶する。処理部７０は、予め記憶部７６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部７０は、算出した核酸の増幅量を、表示部７４に表示させる処理を行ってもよい。第４配置では、第４領域３６は、検出機構６０と対向した位置にある。
【０１５１】
核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器２００を用いるため、効率よく逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１５２】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【０１５３】
３．１．  実験条件
３．１．１．  溶液の調整
鋳型核酸（テンプレートＲＮＡ）を含む検体に、プライマーおよびプローブを添加して溶液を調製した。鋳型核酸として、Ａ型のインフルエンザウイルスを含む溶液（ＩｎｆＡ）と、Ａ型のインフルエンザウイルスおよびＢ型のインフルエンザウイルスを含む溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）と、の２種類を調整した。溶液（ＩｎｆＡ）および溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）の組成は、以下のとおりである。
【０１５４】
＜溶液（ＩｎｆＡ）の組成＞
ＩｎｆＡ検出用フォワードプライマー（２０μＭ）                  ０．８μＬ
ＩｎｆＡ検出用リバースプライマー（２０μＭ）                    ０．８μＬ
ＩｎｆＡ検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）                      ０．６μＬ
インフルエンザＲＮＡ（２００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）                ０．５μＬ
蒸留水                                                          ７．３μＬ
【０１５５】
＜溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）の組成＞
ＩｎｆＡ検出用フォワードプライマー（２０μＭ）                  ０．８μＬ
ＩｎｆＡ検出用リバースプライマー（２０μＭ）                    ０．８μＬ
ＩｎｆＡ検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）                      ０．６μＬ
ＩｎｆＢ検出用フォワードプライマー（２０μＭ）                  ０．８μＬ
ＩｎｆＢ検出用リバースプライマー（２０μＭ）                    ０．８μＬ
インフルエンザＲＮＡ（２００ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）                ０．５μＬ
蒸留水                                                          ５．７μＬ
【０１５６】
なお、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製を用いた。蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。蒸留水は、Ｒｏｃｈｅ社製を用いた。
【０１５７】
プライマーおよびプローブの配列は、下記表１のとおりである。
【０１５８】
【表１】
2018046766.tif 000003
【０１５９】
３．１．２．  試薬の調整
凍結乾燥状態の試薬Ａおよび試薬Ｂを調整した。溶液の組成は、以下のとおりである。
【０１６０】
＜試薬Ａの組成＞
ＳｕｐｅｒＳＣｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素                          ０．５μＬ
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）        ０．６μＬ
バッファー                                                      ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                            ０．５μＬ
トレハロース（２００ｍｇ／ｍＬ）                                ２．０μＬ
蒸留水                                                          ４．４μＬ
【０１６１】
＜試薬Ｂの組成＞
ＰｒｏｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素                                ０．５μＬ
ＧｅｎｅＴａｑＮＴ−Ａｂポリメラーゼ                            ２．０μＬ
バッファー                                                      ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                            ０．５μＬ
トレハロース（２００ｍｇ／ｍＬ）                                ２．０μＬ
蒸留水                                                          ３．０μＬ
【０１６２】
なお、ＳｕｐｅｒＳＣｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製を用いた。ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製を用いた。ＰｒｏｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製を用いた。ＧｅｎｅＴａｑＮＴ−Ａｂポリメラーゼは、ＧｅｎｅＴａｑＮＴ−Ａｂポリメラーゼは、抗Ｔａｑ抗体でホットスタート処理（抗体形成処理）を行ったポリメラーゼであり、抗Ｔａｑ抗体は、タカラバイオ株式会社製、ＧｅｎｅＴａｑＮＴは、株式会社ニッポンジーン社製を用いた。バッファーは、ＭｇＣｌ２と、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）と、ＫＣｌと、を含む。
【０１６３】
上記の試薬Ａ，Ｂの各々１．６μＬをチューブに注入し、凍結乾燥処理した。その後、シリコーンオイル（具体的には２ＣＳオイル（信越化学工業株式会社製））を、チューブに充填した。
【０１６４】
３．１．３．  実験方法
上記の溶液（ＩｎｆＡ）および溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）の逆転写反応前の加熱による効果を調べた。具体的は、図１７に示すように、容器（ＩｎｆＡ），（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）をそれぞれチューブ８０に収容し、４℃の状態からヒーター８２によって温度を上げて９５℃で５分間加熱した。
【０１６５】
次に、長手方向の大きさが２ｍｍのチューブ８４に、容器（ＩｎｆＡ），（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）の各々１．６μＬを注入した。チューブ８４には、凍結乾燥された試薬Ａまたは試薬Ｂが配置されている。チューブ８４を、予め５５℃で加熱した。そして、チューブ８４を攪拌して試薬Ａ，Ｂを溶解し、反応液を得た。その後、チューブ８４に収容された反応液に対して、ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲとして行った。
【０１６６】
ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写反応として５０℃で６０秒間加熱し、ホットスタート処理として９５℃で１０秒間処理後、その後、ＰＣＲの熱サイクルとして、９５℃で４秒間加熱および６３℃で６秒間加熱を、５０サイクル繰り返した。なお、ＰＣＲの熱サイクルの１回目のサイクルは、ホットスタートとして、９５℃で１０秒間加熱および６３℃で６秒間加熱とした。図１８に、逆転写反応前の加熱を行った場合の温度プロファイルを示す。
【０１６７】
反応液としては、反応液（１），（２），（３），（４）の４種類を得た。各反応液の内容物は以下のとおりである。
【０１６８】
反応液（１）：溶液（ＩｎｆＡ）＋試薬Ａ
反応液（２）：溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）＋試薬Ａ
反応液（３）：溶液（ＩｎｆＡ）＋試薬Ｂ
反応液（４）：溶液（ＩｎｆＡ＋ＩｎｆＢ）＋試薬Ｂ
【０１６９】
さらに、逆転写反応前の加熱を行わないこと以外は、上記と同様の方法で、反応液（１），（２），（３），（４）を得て、ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。図１９に、逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の温度プロファイルを示す。
【０１７０】
３．２．  実験結果
図２０は、逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の熱サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。図２１は、逆転写反応前の加熱を行わなかった場合の電気泳動（アガロースゲル電気泳動）の結果である。図２２は、逆転写反応前の加熱を行った場合の熱サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。図２３は、逆転写反応前の加熱を行った場合の電気泳動の結果である。
【０１７１】
図２０に示すように、逆転写反応前の加熱を行わなかった場合は、反応液（２），（４）は、反応液（１），（３）よりも蛍光強度（蛍光輝度）が小さかった。これは、図２１に示すように、反応液（２），（４）では非特異バンド（図２１において破線で囲まれたバンド）が現れていることから、ＩｎｆＢのプライマーを含んでいると非特異増幅が起き、目的となる核酸の増幅が妨げられていることが原因であると考えられる。
【０１７２】
一方、図２２に示すように、反応液（２），（４）は、反応液（１），（３）と同程度の蛍光強度であった。また、図２３に示すように、反応液（２），（４）の非特異バンドは、図２１に比べて薄くなった。したがって、逆転写反応前の加熱を行うことで、非特異的な増幅が生じることを抑制できることがわかった。特に、逆転写反応を行う場合は、逆転写酵素は耐熱性が小さいため、逆転写酵素を含む反応液を高温にすることはできないが、反応液が逆転写酵素を含む前に反応液を加熱することにより、逆転写酵素へのダメージを抑えつつ、非特異的な増幅が生じることを抑制できることがわかった。
【０１７３】
本発明は、本願に記載の特徴や効果を有する範囲で一部の構成を省略したり、各実施形態や変形例を組み合わせたりしてもよい。
【０１７４】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１７５】
２…第１試薬、４…第２試薬、６…反応液、１０…容器本体、１０ａ…第１内壁、１０ｂ…第２内壁、１２…蓋、２０…流路、２２…第１流路、２４…第２流路、２６…第３流路、３０…第１領域、３１…導入口、３２…第２領域、３４…第３領域、３６…第４領域、４０…第１加熱部、４０ａ…開口部、４２…第２加熱部、４２ａ，４２ｂ…開口部、４４…第３加熱部、４４ａ…開口部、４６…第４加熱部、４６ａ，４６ｂ…開口部、５０…駆動機構、６０…検出機構、７０…処理部、７２…操作部、７４…表示部、７６…記憶部、８０…チューブ、８２…ヒーター、８４…チューブ、１００…核酸増幅反応容器、１１０…核酸増幅反応装置、２００…核酸増幅反応容器、２１０…核酸増幅反応装置
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号１は、ＩｎｆＡのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、ＩｎｆＡのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、ＩｎｆＡの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号４は、ＩｎｆＢのフォワードプライマーの配列である。
配列番号５は、ＩｎｆＢのリバースプライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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