(57)【要約】【課題】  有機ゲルマニウム化合物を含有する酸化ストレスによる細胞のダメージ、具体的には細胞死を抑制することのできる剤、該細胞死抑制剤を含有する皮膚外用剤及び加工食品を提供する。【解決手段】  本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤は、式（１）  Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とすることを特徴とする。式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物は、水中では式（１−１）（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）で表される構造をとっている、【選択図】  図１
2018158905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とすることを特徴とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤。
【請求項２】
式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする請求項１に記載の酸化ストレスによる細胞死抑制剤。
【請求項３】
式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有する請求項３に記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有することを特徴とする加工食品。
【請求項６】
式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有する請求項５に記載の加工食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスによる細胞のダメージ、具体的には細胞死を抑制することのできる剤、該細胞死抑制剤を含有する皮膚外用剤及び加工食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は様々なストレスに晒されており、特に活性酸素による酸化ストレスからのＤＮＡの傷害が細胞ダメージを引き起こし、細胞死や細胞の癌化などが生じることが知られている。細胞のダメージは様々な環境要因により引き起こされるが、この活性酸素による部分は大きく、このようなダメージからの防御を目指して抗酸化物質を付加することが最も多用されている。中でも、皮膚は太陽光の紫外線に晒される機会が多く、紫外線による活性酸素の発生は皮膚組織の炎症を引き起こすことでも組織のダメージが進行し、皮膚組織の重要な構成因子であるコラーゲンやケラチンといった構造タンパク質を切断することで皮膚のたるみを生じる等の皮膚老化の原因となることもあるため、美容の観点からも予防が望まれる状況にある。
【０００３】
これら皮膚細胞の防御としては、化粧品の分野では紫外線カットをすることで紫外線が傷害する前段階で防御する素材、抗酸化物質により紫外線によって発生した活性酸素を消去して紫外線による傷害を防御する素材などが主として用いられ、これら両者の組み合わせの混合製品などが効果を訴求している。
【０００４】
しかしながら、前者の紫外線カット素材は性質上皮膚への害を持つ化学物質なども多く、時折該当するような化粧品による皮膚の健康被害などが報じられる状況にある。このため、皮膚への害がなく、又、上記した２種類の手段に依らない第三の細胞ダメージ抑制手段が潜在的に求められている。
【０００５】
細胞保護や酸化ストレス消去に関する特許は数多く存在し、例えば特許文献１には化粧料又は皮膚外用剤が、特許文献２には活性酸素消去酵素活性化剤が、特許文献３には活性酸素消去剤、皮膚外用剤、口腔用組成物及び食品が開示されているが、いずれも活性酸素消去が中心的な素材に関するものであり、細胞自体に働きかける物質は見当たらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−２２２６１２号公報
【特許文献２】特開２０１６−０９４３４９号公報
【特許文献３】特開２０１３−２２４３１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、紫外線をはじめとする活性酸素の発生に関連する傷害源には直接作用せず、細胞がダメージを受けた際に当該細胞の持っている酸化ストレスに対抗する力を誘導することにより細胞の防御能力を引き出し、細胞組織の健全性を維持することのできる細胞死抑制剤及びそれを含有する皮膚外用剤を提供することを主たる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は以下の〔１〕〜〔６〕の態様を提供する。
【０００９】
〔１〕  式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とすることを特徴とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤。
【００１０】
〔２〕  式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする〔１〕に記載の酸化ストレスによる細胞死抑制剤。
【００１１】
〔３〕  式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【００１２】
〔４〕  式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有する〔３〕に記載の皮膚外用剤。
【００１３】
〔５〕  式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有することを特徴とする加工食品。
【００１４】
〔６〕  式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする酸化ストレスによる細胞死抑制剤を含有する〔５〕に記載の加工食品。
【００１５】
即ち、発明者らは有機ゲルマニウム製剤が組織の性状を健常に保つことを数多く目撃し、ある種の構造を有する有機ゲルマニウム化合物が致死的細胞ダメージを回避し保全しうるという知見を得、この細胞保護に関する知見を詳細に検討し、本発明を完成するに至ったのである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、上記式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物を適用すると、酸化ストレスを与えても細胞死が有意に抑制されるという効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】NHDFへの酸化ストレス負荷における本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤の添加による細胞ダメージの軽減効果を示すグラフである。
【図２】HuH-7への酸化ストレス負荷における本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤の添加による細胞ダメージの軽減効果を示すグラフである。
【図３】NHDFへの酸化ストレス負荷におけるIL-6に対する本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤の添加の影響を示すグラフである。
【図４】NHDFへの酸化ストレス負荷におけるNr4a2に対する本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤の添加の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の酸化ストレスによる細胞死抑制剤（以下、単に細胞死抑制剤ということもある。）の有効成分である有機ゲルマニウム化合物は、以下の式（１）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３      （１）
で表されるものであり、この有機ゲルマニウム化合物は公知である。
【００２０】
尚、上記有機ゲルマニウム化合物は、以下の式（１’）
[（Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２Ｏ３]ｎ      （１’）
で表される化合物、或いは、以下の式（１’’）
Ｇｅ−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）２ｎＯ３ｎ      （１’’）
で表される化合物と同一であり、上記の式はいずれも結晶状態での構造に対応するもので、水溶液中では以下の式（１−１）
（ＯＨ）３Ｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ      （１−１）
で表される構造を有し、結晶化に際して脱水反応により重合されて上記式（１）、式（１’）や式（１’’）で表される構造をとるものである。換言すれば、上記有機ゲルマニウム化合物は、式（１−１）で表されるものを除き、重合度ｎを用いて表した場合は、重合度ｎ＝２〜∞のオリゴマーからポリマーということができる。
【００２１】
本発明の細胞死抑制剤は、上記構造の有機ゲルマニウム化合物を有効成分とするものであるが、使用する際には、必要に応じ、その効果を失うことがない範囲で、他の成分を添加することもできる。
【００２２】
又、本発明の細胞死抑制剤の使用量としては、細胞の状態に応じて適宜に決定、変更すればよいが、例を挙げれば、有効成分である有機ゲルマニウム化合物として
０．５〜１００ｍｇ／Kｇ体重／日、具体的には２０ｍｇ／Kｇ体重／日での経口摂取
という範囲を挙げることができる。
【００２３】
一方、本発明の皮膚外用剤は、上記式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物を含有するものであるが、これを製造するには、ｐＨが中性領域になるように苛性ソーダもしくは重曹などのアルカリ性分子を適宜混合して10質量％（以下％で示す）以上の高濃度となるようにし、これを皮膚外用剤の成分として望ましくは最終の製品濃度として当該有機ゲルマニウム化合物を0.01％から６％で含むよう調整すればよく、外用剤としての他の基材としては、特に限定されない。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤の適用量としては、皮膚の状態に応じて適宜に決定、変更すればよいが、例を挙げれば、有効成分である有機ゲルマニウム化合物として
当該有機ゲルマニウム化合物含有皮膚外用剤０．１ｇ〜５ｇ、具体的には皮膚塗布１ｍｇ／日
という範囲を挙げることができる。
【００２５】
更に、本発明の細胞死抑制剤を他成分と混合し、これをカプセル，タブレット，顆粒，ペースト及び溶液状に加工して、加工食品、いわゆるサプリメントとして経口により摂取可能なように適宜処理を行うことや、或いは、加工することなく、例えば粉末として摂取することもできる。口腔内から消化管内部を経て肛門にかけての体外最表面部の粘膜組織細胞に対する適応を想定する場合、特に胃部までの上部消化管を対象とする目的ではカプセル状の加工を避け、口腔内での本発明の細胞死抑制剤の溶解を容易にする形状が最適である。これら各形状における本発明の細胞死抑制剤すなわち有機ゲルマニウム化合物の含有量は0.001％から100％とし、標的組織の細胞に実施例で掲げる濃度領域で本発明の細胞死抑制剤が存在しうる量を配合することが望ましい。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は例示する実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
（正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する作用）
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblast：NHDF）をFCS（ウシ胎児血清）含有（0.2ml/ml）血清培地で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をFCS含有血清培地を用い、96穴（well）細胞培養プレートに1.5×104となるように播種し、200μlの培地で培養した。一昼夜培養を行い、培地を廃棄し、新鮮な培地に交換して20μlのキサンチンオキシダーゼ（100U/l）と60μlの1mMヒポキサンチンを活性酸素源として過酸化水素を発生させ、1.5hr、37℃で酸化ストレスを負荷した。式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物を1〜1000μg/mlの培地中濃度となるように各wellに添加し（この時点では、式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物は加水分解されて式（１−１）で表される構造をとっている。）、各被験濃度につき8wellで評価した。培養終了後、培地を廃棄し、MTSアッセイを用いて生細胞数を測定することにより細胞ダメージへの保護効果を検討した。市販のMTSを培地に1/10容添加し、1hr培養を行った後、ホルマザン産生による490nmの吸収を吸光値として測定した。
【００２８】
図１に結果を示した。酸化ストレスを負荷せず、有機ゲルマニウム化合物（図中ではＧｅ化合物と略記した。以下の図において同じである。）も添加しなかった陰性対照群における生細胞数は13,168cells/mlだったが、酸化ストレスの負荷により5,251cells/mlに生細胞数が減少した。即ち、約60%が死滅し、39.9％が生細胞として生存した。有機ゲルマニウム化合物の添加により生き残った細胞は0，1，10，100及び1000μg/mlにおいて39.9, 44.0, 47.3, 60.7 及び 61.1 %であり、濃度依存的に効果が増す事が示唆され、細胞死を抑制できることが認められた。この作用は、本発明の細胞死抑制剤或いはこれを含有する皮膚外用剤の使用によって、皮膚において期待できるものということができる。
【００２９】
実施例２
（ヒト肝臓癌由来細胞株HuH-7に対する作用）
ヒト肝臓ガン由来細胞株HuH-7を10％FBS（ウシ胎児血清）含有MEM培地で培養した後、96穴（well）細胞培養プレートに1.5×104となるように播種し、200μlの培地で培養した。一昼夜培養を行い、培地を廃棄し、新鮮な培地に交換して過酸化水素を活性酸素源として培地中最終濃度を０．２mMとし、1.5hr、37℃で酸化ストレスを負荷した。式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物を1〜1000μg/mlの培地中濃度となるように各wellに添加し（この時点では、式（１）で表される有機ゲルマニウム化合物は加水分解されて式（１−１）で表される構造をとっている。）、各被験濃度につき8wellで評価した。培養終了後、培地を廃棄し、MTSアッセイを用いて生細胞数を測定することにより細胞ダメージへの保護効果を検討した。市販のMTSを培地に1/10容添加し、1hr培養を行った後、ホルマザン産生による490nmの吸収を吸光値として測定した。
【００３０】
図２に結果を示した。酸化ストレスを負荷せず、有機ゲルマニウム化合物も添加しなかった陰性対照群における生細胞数は17,194cells/mlだったが、酸化ストレスの負荷により5,413cells/mlに生細胞数が減少した。即ち、約68%が死滅し、31.5％が生細胞として生存した。有機ゲルマニウム化合物の添加により生き残った細胞は0，1，10，100及び1000μg/mlにおいて31.1, 31.8, 35.2, 40.9 及び 46.3 %であり、NHDFの場合と同様に濃度依存的に効果が増す事が示唆され、細胞死を抑制できることが認められた。本作用は、加工食品としてサプリメント製品などの形態により経口的に摂取した場合に各体内臓器における細胞で期待できる作用である。
【００３１】
実施例３
実施例１において、NHDFを培養し、キサンチンオキシダーゼとヒポキサンチンによって発生する過酸化水素による酸化ストレスを負荷した際に、有機ゲルマニウム化合物の添加（0(-),100及び1000μg/ml）による細胞死抑制効果が発現する原因を調査するため、網羅的遺伝子解析を実施し、細胞保護に関わる遺伝子発現の変化を検討した。即ち、酸化ストレス負荷の後、細胞をトリプシン処理によって剥離し、細胞からISOGEN法によってTotal RNAを抽出した。本RNAを用い、GeneChipによる遺伝子発現の網羅的解析及び定量RT-PCR法によりTHGP処理で変動する遺伝子発現を検討した。
【００３２】
網羅的遺伝子解析の結果、遺伝子発現の変化が大きかった遺伝子を以下の表1及び表２に示した。
【００３３】
【表１】
2018158905.tif 000003
【００３４】
【表２】
2018158905.tif 000004
【００３５】
酸化ストレスを負荷せず、有機ゲルマニウム化合物（表中ではＧｅ化合物と略記した。）も添加しなかった陰性対照群（ネガティブコントロール：NC）に比べ、酸化ストレス負荷群（ポジティブコントロール：PC）で発現が上昇した遺伝子の内、幾つかが有機ゲルマニウム化合物の添加によって減少した。特に炎症に関わるサイトカインであるIL-6（3.01⇒1.31及び1.09）及びケモカインであるCXCL2（5.85⇒2.48及び2.30）は抑制されていることが示された。又、Nr4a2やNr4a1は細胞死に関係する遺伝子であることがわかっているが、これも抑制が認められた（各々3.84⇒0.40及び0.46：Nr4a2、2.26⇒1.22及び1.08：Nr4a1）。Nr4a2は炎症性サイトカインIL-17産生が引き起こされることを抑制していることが知られている。このNr4a2発現抑制が結果として炎症に至らせず、IL-6の産生に至らないことが示された。
【００３６】
実施例４
定量RT-PCR法でGeneChip法により有機ゲルマニウム化合物の添加の効果が確認できた前記遺伝子の発現を分析した結果を図３及び図４に示した。GeneChip法により変動が確認されている当該遺伝子はいずれも同じ挙動（約3倍⇒1.1倍及び0.8倍：IL-6、約7倍⇒0.5倍前後：Nr4a2）を示している。又、酸化ストレスを負荷せずに有機ゲルマニウム化合物を添加した場合も、酸化ストレス負荷の場合よりも程度は小さいが、IL-6とNr4a2の発現抑制が認められており、酸化ストレスの有無にかかわらず抗炎症的に作用していることが示された。
【００３７】
図１乃至４及び表１の結果より、本発明の細胞死抑制剤は皮膚細胞及び肝臓細胞において、活性酸素である過酸化水素による細胞ダメージを、細胞内の防御機構を誘導することを介して軽減し、細胞死を抑制する効果を有することが明らかになった。
【００３８】
既存の酸化ストレスに対する細胞の保護作用は、従来技術の説明において示したように、物理的な保護と酸化ストレス源自体の消去が本体であるのに対し、本発明は細胞自体の防御機構の亢進による、全く新規のダメージ抑制機構によるものである。よって、本発明の細胞死抑制剤は単独で或いは既存の保護作用を示す手段との適切な組み合わせにより、細胞のダメージをより強く軽減することができる。又、体内における酸化ストレスによる細胞のダメージに対しても、経口摂取で適当量を到達させることにより対処できる点で、酸化ストレスにより発生しうる種々の疾患に対して予防/改善することができる。
【図１】
2018158905.tif 000005
【図２】
2018158905.tif 000006
【図３】
2018158905.tif 000007
【図４】
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