(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ロイシンリッチリピート含有Ｇ蛋白質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）モノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含む医薬組成物、さらに医薬、色素及び／又は造影剤を含む薬物送達システムの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるエピトープに結合する抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体。重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の各々の特定のアミノ酸配列及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の各々の特定のアミノ配列列であるモノクローナル抗体。キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることが好ましい、モノクローナル抗体。前記モノクローナル抗体を含む医薬組成物又は薬物送システム。更に医薬色素及び／又は造影剤を含み、好ましくはモノクローナル抗体と結合している、薬物送達システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する、抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖の、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４であり、軽鎖の、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号８である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、薬物送達システム。
【請求項６】
さらに、医薬、色素及び／又は造影剤を含む、請求項５に記載の薬物送達システム。
【請求項７】
医薬、色素及び／又は造影剤がモノクローナル抗体と結合している、請求項６に記載の薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列からなるエピトープに結合する、抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６（ＬＧＲ６））は、９６７アミノ酸からなる膜タンパク質であり、７回膜貫通型の領域とＮ末端の長い細胞外領域からなる構造を有している。また、ＬＧＲ６遺伝子は、正常組織と比較して胃癌患者において発現が上昇する遺伝子の一つであることが知られている。
【０００３】
Ｇタンパク質共役型受容体は、一般に、細胞外の神経伝達物質やホルモンを受容してそのシグナルを細胞内に伝える機能を有している。しかし、ＬＧＲ６のシグナル伝達の作用及び機能は、十分には解明されていなかった。
【０００４】
ＬＧＲ６に対する抗体としては、複数のメーカーからポリクローナル抗体が供給されている。例えば、ＬＧＲ６のＮ末端部分を抗原として作製された、ＬＳ−Ａ６２１（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＡＢＩＮ１２２２０７（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＮＢＰ１−４９６９６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）である。その他、ＬＧＲ６の４４５−５０４アミノ酸残基を抗原としたＨ０００５９３５２−Ａ０１（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、４５６−５４８を抗原とした抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｈ社）、５１６−５２８アミノ酸残基を抗原としたＬ４１６９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）が知られている。
【０００５】
ＬＧＲ６に結合するモノクローナル抗体としては、ウサギモノクローナル抗体としてＥＰＲ６８７４（ＧｅｎＴａｘ社）が知られているが、抗原は、細胞内ドメインであった。
【０００６】
さらに最近、ＬＧＲ６の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体が開発されたが、ＬＧＲ６の発現組織を同定し、その検出を意図したものであり、ＬＧＲ６の作用及び機能に着目したものでは無かった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／１９２９７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、膜タンパク質としてのＬＧＲ６の作用及び機能を解明し、それに寄与する物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、抗体がＬＧＲ６の特定の領域に結合すると、そのコンジュゲートが核内に移行することを、初めて見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］配列番号１１のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する、抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体、
［２］重鎖の、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４であり、軽鎖の、ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号８である、［１］に記載のモノクローナル抗体、
［３］モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体、
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物、
［５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、薬物送達システム、
［６］さらに、医薬、色素及び／又は造影剤を含む、［５］に記載の薬物送達システム、
［７］医薬、色素及び／又は造影剤がモノクローナル抗体と結合している、［６］に記載の薬物送達システム。
【００１０】
本発明において抗体とは、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を伴う抗体組成物、多特異性抗体（例、二重特異性抗体、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体フラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ））をいう。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に用いられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗体は、膜タンパク質に結合し、核内に移行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＬＧＲ６抗体であるｍ１６４が生細胞の状態で細胞内の核に移行をしていることを示す図である。ヒト大腸癌由来の培養細胞であるＨＣＴ１１６細胞をガラスボトムディッシュ上で１日培養した後に、ディッシュを氷上に１０分間静置後、ｍ１６４抗体を培地に添加し、１時間氷上で静置した。培地を吸い取り、ＰＢＳ（−）による洗浄後、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体含有培地を加え、３０分間氷上で静置した。培地を吸い取り、ＰＢＳ（−）による洗浄後、培地を加え、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で培養をし、２４時間に、培地を吸い取り、パラホルムアルデヒドによる固定とＴｒｉｔｏｎ−Ｘによる透過処理をおこなった後に、ＤＡＰＩを加えて、核を染色した。このガラスボトムディッシュに対して蛍光顕微鏡で明視野とＤＡＰＩによる蛍光とＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８の蛍光を観察した。その結果、明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）と２蛍光の画像を重ね合わせた画像(Ｍｅｒｇｅ)から、ｍ１６４由来のシグナルであるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光のシグナルは、ＤＡＰＩで染色された核の領域内に局在することが明らかとなった。
【図２】本発明の抗体と抗原の断片との結合性を示す図である。ＬＧＲ６の４４６位〜５６７位のアミノ酸配列からなるタンパク質を抗原として、ＬＧＲ６抗体ｍ１６４を得た。ＬＧＲ６の４４６位〜５６７位のアミノ酸配列を３つに分割（４４６〜４８５、４８６〜５２７、５２８〜５６７）し、ｐｅｔ３２ｂベクターを利用して、３種の組換えタンパク質を発現させ精製した。得られたタンパク質を用いたＡｇ−ＥＬＩＳＡを実施した。図の吸光度はブランク（抗原タンパク質なし）を引いた値を示す。図の結果より、ＬＧＲ６抗体ｍ１６４は４８６番目から５２７番目に結合することが示された。
【図３】本発明の抗体の細胞傷害活性を示す図である。９６ウエル培養プレートにヒト大腸癌由来の培養細胞であるＨＣＴ１１６細胞を１ウエルあたり２４００個播種し、一日３７℃、５％  ＣＯ２環境下で培養をした。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓａｐｏｒｉｎ（１５  ｎＭ）とビオチン標識ｍ１６４抗体（０．２  ｎＭから２００  ｎＭ）を混合し、４℃で１時間静置させた溶液を、一つの組み合わせにつき、３ウエルずつ加えた後に、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で３日間培養をした後に、生細胞数測定試薬であるＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８による吸光度測定を行うことで各ウエルの細胞の増殖の度合いを把握した。コントロールとしてＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓａｐｏｒｉｎを加えず、ビオチン標識ｍ１６４抗体のみ加えたウエルも上記の実験操作を行った。縦軸は４５０  ｎＭの吸光度、横軸はｍ１６４抗体の終濃度を示した。実線と白丸はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓａｐｏｒｉｎ（１５  ｎＭ）とビオチン標識ｍ１６４抗体の混合液を加えたもの、破線と白四角はコントロールとしてビオチン標識ｍ１６４抗体のみを加えたものを示す。同じ組み合わせの３ウエルの吸光度から標準偏差を算出し、図中にエラーバーとして図示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗原であるポリペプチドは、化学的か、又は大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法によって合成することができる。
【００１４】
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
【００１５】
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ＬＧＲ６遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
【００１６】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
【００１７】
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
【００１８】
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
【００１９】
上記のようにして得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
【００２０】
モノクローナル抗体の作製
本発明の抗原を単独か、又は担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から１〜３０日後、好ましくは２〜５日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
【００２１】
細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
【００２２】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０８〜５×１０８個の抗体産生細胞と２×１０７〜１０×１０７個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比１０：１〜１：１）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００２３】
ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば１０〜２０％のウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上０．３個／ウエルの密度で播種し、各ウエルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００２４】
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、９６ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に３７℃で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを３７℃で１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、ＬＧＲ６に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）としては、例えば、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６４」（以下「１６４」という）が挙げられる。ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
【００２６】
モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内にハイブリドーマを約５×１０６〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００２７】
本発明の抗ＬＧＲ６抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列表に示されるアミノ酸配列からなり、かつ／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列表に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
【００２８】
抗ＬＧＲ６抗体のエピトープ
本発明の抗ＬＧＲ６抗体のエピトープ（抗原決定基）は、配列表に記載のアミノ酸からなる領域からなる。
【００２９】
遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
【００３０】
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
【００３１】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特許第２８２８３４０号公報等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗ＬＧＲ６抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲのアミノ酸配列としては、配列表に記載のアミノ酸配列が好ましい。
【００３２】
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（Ｖ領域）の抗原結合部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
【００３３】
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
【００３４】
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
【００３５】
抗体断片の作製
本発明で使用されるＬＧＲ６に対する抗体の断片は、ＬＧＲ６に特異的に結合する。
【００３６】
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
【００３７】
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ′）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ′は、上記Ｆ（ａｂ′）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
【００３８】
ｓｃＦｖの場合は、抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
【００３９】
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
【００４０】
ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００４１】
本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、配列表に記載のＶＨ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を含み、及び／又は配列表に記載のＶＬ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列含む、抗体断片が挙げられる。
【００４２】
ＣＤＲを含む抗体断片（ペプチド）は、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含む抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００４３】
結合親和性
結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
【００４４】
結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍又は１０００〜１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、ＬＧＲ６の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
【００４５】
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１〜１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
【００４６】
結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。
【００４７】
本発明の医薬組成物及び／又は薬物送達システムは、抗ＬＧＲ６抗体を含む。本発明の抗体は、癌に発現しているＬＧＲ６に対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の医薬組成物及び／又は薬物送達システムは癌の診断又は治療のために使用することができる。
【００４８】
本発明における診断又は治療の対象となる癌としては、例えば大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してＬＧＲ６が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは大腸癌、乳癌である。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
【００５０】
また別の態様において、本発明は、癌の診断及び／又は治療用医薬組成物及び／又は薬物送達システムの製造のためのＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。また、本発明は、癌の診断及び／又は治療において使用するためのＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
【００５１】
癌の診断方法
本発明の癌の診断及び／又は治療方法は、本発明のＬＧＲ６に対する抗体（抗ＬＧＲ６抗体）又はその断片と、被験者から採取された生体試料（以下、単に「生体試料」ともいう）とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む方法である。この場合、ＬＧＲ６の検出結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
【００５２】
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
【００５３】
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
【００５４】
糞便を試料とする場合、特開２００５−４６０６５号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便から癌細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を１０  μｍ以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社）を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法など当業者が通常用いる細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
【００５５】
大腸癌や乳癌をはじめとする様々な癌において、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはいまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだ癌であっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、癌が進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのＬＧＲ６を発現する微量な細胞を検出および／または測定することができる。
【００５６】
「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば大腸癌、胃癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含まれる。
【００５７】
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウエルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
【００５８】
本発明において、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法などを利用できる。
【００５９】
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウエルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び／又は評価し、その検出、測定又は評価結果と癌の可能性等とを関連づけることができる。
【００６０】
本発明においては、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価結果に基づいて、被験者が癌に罹患している可能性の有無を診断することができる。
【００６１】
本発明の診断方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収した癌細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウエルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウエルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
【００６２】
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、癌に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
【００６３】
本発明において、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、免疫組織染色における染色度合（ＬＧＲ６の検出結果）を、強陽性（Ｓｔｒｏｎｇ）、陽性（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、弱陽性（Ｗｅａｋ）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）などに分類し、染色度合と癌の可能性とを関連付けることにより、癌を検出又は被験者
の癌の可能性（癌に罹患している可能性）の有無を診断することができる。
【００６４】
また、ＬＧＲ６の細胞外領域は、血液中に放出される場合が想定されるため、血液試料中のＬＧＲ６の発現量を測定することにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することも可能である。この場合、ＬＧＲ６の発現量の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するためには、生体試料中のＬＧＲ６の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）を定めることが望ましい。
【００６５】
ＬＧＲ６の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、癌患者由来の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量を測定する。このとき対象となる患者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。また、２例以上の健常者由来の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量も測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方を含む全体から、ＬＧＲ６の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔｔｉｎｇ法を用いて、標準曲線を作成する。ＬＧＲ６を含まないサンプルのシグナル値を基準として、その数値の２倍をｃｕｔ−ｏｆｆ値と定めること等ができる。統計解析を行うための症例は、癌の種類（例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、白血病等）、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さらに、統計処理は、健常者のＬＧＲ６の発現量の測定値と、癌患者において癌の種類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときのＬＧＲ６の発現量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
【００６６】
本発明において、血液試料中のＬＧＲ６（細胞外領域）の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）は、血清中濃度で、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌであるが、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌである。
【００６７】
上記条件下でＬＧＲ６の発現量を測定した場合において、測定したＬＧＲ６の発現量が上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であるときに、癌が検出されたと判定でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断することができる。本発明においては、前記判定又は診断のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であって、かつ所定上限値以下（例えば、２００ｎｇ／ｍｌ以下、１９０ｎｇ／ｍｌ以下、１８０ｎｇ／ｍｌ以下、１７０ｎｇ／ｍｌ以下、１６０ｎｇ／ｍｌ以下、１５０ｎｇ／ｍｌ以下、１４５ｎｇ／ｍｌ以下、１４０ｎｇ／ｍｌ以下、１３５ｎｇ／ｍｌ以下、１３０ｎｇ／ｍｌ以下）であるときに、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
【００６８】
本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ（確率）は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９９％以上である。
【００６９】
さらに、本発明の別の態様において、一人の被験者（患者）のサンプルから測定されたＬＧＲ６の発現量を上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値と比較することで癌との関連性を診断及び／又は治療するほかに、複数の患者由来の生体試料を用いてＬＧＲ６の発現量を測定する場合がある。従って、上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団（１次母集団）においてＬＧＲ６の発現量を測定して統計解析処理し、これらの集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能である。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他の集団（２次母集団）における診断及び／又は治療の対象となる個々の被験者由来の試料におけるＬＧＲ６の発現量とを比較することができる。
【００７０】
あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んでＬＧＲ６の発現量を再度データ処理し、対象となる患者（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ＬＧＲ６の発現量の臨界値の精度を高め、これにより１人又は複数人の被験者における診断及び／又は治療精度を高めることができる。
【００７１】
本発明においては、（ｉ）被験者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量と、（ｉｉ）健常者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量との比較を行うことも可能である。
【００７２】
そして、前記（ｉ）の場合のＬＧＲ６の発現量が、前記（ｉｉ）の場合のＬＧＲ６の発現量と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量の約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上高い場合に、癌が検出されたと判断でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断できる。
【００７３】
上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
【００７４】
ＬＧＲ６の発現量は各種癌患者において発現するため、健康診断等においてＬＧＲ６の発現量が検出されてもどの癌であるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する（精密検査を行う）ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてＬＧＲ６が検出されたときは、癌種の主要資料（確定診断等）に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
【００７５】
本発明は、ＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の診断を補助する方法も提供する。
【００７６】
さらなる実施態様において、本発明は、上に記載する抗ＬＧＲ６抗体、医薬組成物、又は薬物送達システムのいずれかの治療的有効量を投与することを含む、癌を処置するための方法を提供する。
【００７７】
本発明における診断又は治療の対象となる癌としては、例えば大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してＬＧＲ６が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは大腸癌、乳癌である。
【００７８】
本発明の医薬組成物、又は薬物送達システムは、用いた投与量および濃度でそれに暴露された細胞または哺乳動物に対して非毒性である医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。生理学的に許容可能な担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることができる。生理学的に許容可能な担体の例は、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、および他の有機酸など；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量核酸（約１００塩基未満）、例えばＲＮＡ干渉用核酸の二重鎖又は単鎖；ＤＮＡ切断酵素、例えばＣＡＳ９タンパク質；治療・検出用の放射性同位体元素を含む化合物、例えば２１１Ａｔ含有化合物；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；および／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）である。
【００７９】
また、本発明の医薬組成物、又は薬物送達システムは、本発明のモノクローナル抗体が核移行する性質を利用して、当該モノクローナル抗体に様々な物質を結合する（コンジュゲート形成する）ことにより、所望の物質を核内へ移行させることができる。本発明のモノクローナル抗体と結合させることのできる物質としては、例えば、医薬、色素、造影剤、タンパク質、ペプチド断片、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。医薬としては、以下に列挙する抗がん剤等が挙げられる。
【００８０】
本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体（その抗原結合断片を含む）は、少なくとも１種類の抗がん剤、トキシン、ラジオアイソトープ、または核酸、DNA切断酵素にコンジュゲートされる、このような抗がん剤、トキシン、ラジオアイソトープ、核酸、またはＤＮＡ切断酵素でコンジュゲートされた本発明のモノクローナル抗体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明のモノクローナル抗体および少なくとも１種類の抗がん剤、トキシン、またはラジオアイソトープを含む抗体コンジュゲート（以下、本発明の抗体コンジュゲートともいう）も、本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体と核酸またはタンパク質を含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体がＤＮＡ切断、ゲノムＤＮＡ編集、ＲＮＡ干渉法、タンパク質翻訳抑制に働く核酸とコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。また、核酸は例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、タンパク質は例えばＣＡＳ９タンパク質、ＴＡＬＥＮである。
【００８２】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体とラジオアイソトープを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が治療または検出可能なラジオアイソトープとコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。検出可能なラジオアイソトープは、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、２１１Ａｔまたは１５３Ｓｍである。
【００８３】
例えば、本発明の別の態様において、本発明のモノクローナル抗体と抗がん剤またはトキシンとを含む抗体コンジュゲートであって、本発明のモノクローナル抗体が抗がん剤またはトキシンとコンジュゲート形成している抗体コンジュゲートが提供される。前記抗がん剤は好ましくは化学療法剤である。また、トキシンは、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ）トキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エンドトキシンおよびエキソトキシン、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ、真菌（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスカミン、ヨウシュウヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ））、抗ウイルス性タンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦トキシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン等である。
【００８４】
作用機構には限定されず、「化学療法剤」は癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の種類には、限定するものではないが、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アンチメタボライ、紡錘体阻害剤植物アルカロイド、細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、抗体、光増感剤及びキナーゼ阻害薬が含まれる。化学療法剤は、「ターゲティング療法」と従来の化学療法とに用いられる化合物を含む。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５‐フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標），Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９，Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（シス−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペントアザ二環式［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキシアミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標），ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブト−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−エタンアミド，ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標），ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標），ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、Ａｋｔｉ−１／２、ＨＰＰＤ及びラパマイシンが含まれる。
【００８５】
化学療法剤の他の例には、ＤＭ１（Ｎ２’−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ４（Ｎ２’−Ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（４−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｏｘｏｐｅｎｔｙｌ）−ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標），ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，国際公開２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋインヒビター，ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋインヒビター，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ  ＴＭ，ＳＣＨ  ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＮ−３８、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ  ＴＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ  ＴＭ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ），パクリタキセルのアルブミン−変更ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ，ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ、及びシクロフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレ���ホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎｓ）（特にブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトセシン（合成類似体トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）及びバイゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭ１を含む）；エレトロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、チョロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ダイネミシンＡ（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎＡ）；クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）などのビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質発光団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗−代謝産物；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）のような葉酸類似体；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）のようなピリミジン類似体；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸リプレニッシャー（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）のようなメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）（Ｔ−２トキシン、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリデンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ  Ａ）及びアングイデン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）；イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体が含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、２つ以上の抗原結合部位有するバイスペシフィック抗体など多重特異性抗体でもよい。多重特異性抗体は異なる二つの抗体から抗原結合領域のクローニングとリンカーの組み合わせで作出することができる。ＬＧＲ６を一方の抗原結合部位とし、他の結合部位を、細胞内特に核において機能するタンパク質とした場合に、ｍ１６４抗体の性質を利用し、抗体が核に移行し、一方の抗原結合部位がタンパク質に結合することで、タンパク質の働きを阻害または促進することが期待され、既存の抗体では発揮できなかった細胞への作用を発揮することが期待される。
【００８６】
本発明の医薬組成物、又は薬物送達システムは、添付文書を含むことができる。添付文書は、適応、使用法、投与量、投与法、禁忌、パッケージされた産物と組み合わせる他の医薬、および／またはそのような医薬の使用に関する警告などに関する情報を含む、医薬の市販パッケージに通例含まれる適応に関する情報を含む、医薬の市販パッケージに通例含まれる使用説明書を指す。
【００８７】
本発明において薬物とは、癌の処置において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミドなど；アルキルスルホン酸、例えばブスルファンなど；アセトゲニン；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコールベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；ペメトレキセド；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エリュテロビン；パンクラチスタチン；ＴＬＫ−２８６；ＣＤＰ３２３、経口アルファ４インテグリン阻害剤；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード；ニトロソウレア；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質である。
【００８８】
また、この定義には、癌の増殖を促進することができるホルモンの効果を調節、低下遮断、または阻害するように作用する抗ホルモン薬剤が含まれ、しばしば、全身または体全体の処置の形態である。それらはホルモン自体でありうる。
【００８９】
投与経路は、従来公知の任意の方法を用いることができる。たとえば、適した様式での長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内経路による注射または注入、局所投与、吸入あるいは持続放出または延長放出の手段による。
【実施例】
【００９０】
実施例１  マウスの免疫と抗体のスクリーニング
（１）細胞の培養
マウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＤＳファーマ社）を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で８０％コンフルエントを越えないように３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。
【００９１】
（２）ＬＧＲ６遺伝子のクローニング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２  μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＬＧＲ６のアミノ酸第４４６番目から第５６７番目（配列番号１３）をコードする塩基配列である第１３３６番目から第１７０１番目を含むＤＮＡ（配列番号１９）をフォワードプライマー（配列番号１７）とリバースプライマー（配列番号１８）を用いて増幅した。  ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ）で切断し、ｐＥＴ３２ｂベクター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＬＧＲ６の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【００９２】
（３）ＬＧＲ６部分タンパク質の作製
上記（２）で作製したベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地［１％（ｗ／ｖ）トリプトン（ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）］で培養した。培地の濁度が６００  ｎｍの波長で０．６となった後、１  ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社製）を加え、４時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＬＧＲ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約１０  ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１  Ｍ  塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）、１０  ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応液を１  ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４  ｍＭ酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ−ＮＴＡレジン（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２００  ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製したＬＧＲ６のヒンジ領域部分タンパク質を得た。このタンパク質をヒンジ領域組換えタンパク質と称する。
【００９３】
（４）抗原−固相酵素免疫検定法（Ａｇ―ＥＬＩＳＡ）
抗体に対しての結合を測定したい組換えタンパク質をＰＢＳ（−）で希釈し、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１ウエル当たり５０ｎｇとなるよう分注して、４℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳ−Ｔと記載する）３５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔを３００μＬずつ各ウエルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、測定対象の抗体を含む溶液（マウス血清もしくはハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体希釈液）を１００μＬずつ分注し、１時間、室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍希釈したものを各ウエル１００μＬずつ分注し、３０分間、室温で反応させた。最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルトフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｒｉｃｈ社製）を２０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）に希釈し、この溶液の２０００分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（Ｖｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定した。
【００９４】
（５）免疫
上記で作製したヒンジ領域組換えタンパク質をフロイント完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１００μＬ（約４０μｇ／マウス）投与した。約３週間後、同じくヒンジ領域組換えタンパク質をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を２週間おきに複数回繰り返し、その都度、マウス血清を回収した。血清を用い抗体価を測定し、力価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫として、約４０μｇのヒンジ領域組換えタンパク質を静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。
【００９５】
（６）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞と０．２５×１０８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３  Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に１ウエルあたり５〜１２個のコロニーが形成されたことを、位相差顕微鏡で観察した
【００９６】
（７）ハイブリドーマのスクリーニング  ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、上記（３−１）に記載した抗原ＥＬＩＳＡを用いてヒンジ領域組換えタンパク質に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。
さらにヒンジ領域組換えタンパク質を作製する際に付加したＴｒｘ−、Ｓ−、Ｈｉｓ−Ｔａｇに反応する抗体を除くために、ｐＥＴ３２ｂベクターのみを大腸菌に導入し、上記（３）記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をタグ組換えタンパク質と称する。
【００９７】
ヒンジ領域組換えタンパク質に反応し、タグ組換えタンパク質に反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、１２１種のクローンが取得された。これらのハイブリドーマ細胞の中から、ヒンジ領域組換えタンパク質に強く反応し、タグ組換えタンパク質に反応しない抗体を選択し、限界希釈により単クローニングを行い、ハイブリドーマ細胞を樹立した。これらのハイブリドーマの中から、産生する抗体がヒト大腸癌由来の培養細胞であるＨＣＴ１１６細胞に対して結合するかを抗体蛍光免疫細胞染色で選抜した結果、クローン番号１６４を選択した。以降では、このハイブリドーマクローン１６４が産生する抗体をｍ１６４抗体と称する。
【００９８】
クローン番号１６４のハイブリドーマ細胞を、それぞれ１０ｃｍ    ディッシュ１０枚に９０％コンフルエントとなるよう培養し、ＥＸ  ＣＥＬＬ  Ｓｐ２／０（ニチレイバイオサイエンス社製）培地で１０日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。培養上清１００ｍＬに対し、０．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１〜３ｍＬ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。次に１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ  ３．０））で抗体タンパク質を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０〜７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳ（−）に置換した。
【００９９】
実施例２．抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体の解析
（１）免疫蛍光細胞染色
ヒト大腸がん細胞であるＨＣＴ１１６細胞を８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社）でコートしたＧｌａｓｓ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈ  （ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社）上に、１×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。１日間培養後、１５分間氷上で静置した。培地を吸い取り、実施例１．（７）に記載したｍ１６４抗体を１０  μｇ／ｍＬとなるよう培地に希釈した溶液を細胞へ添加し、氷上で３０分間反応させた。１０％  ＦＢＳを含む培地で洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  社製）で氷上、３０分間反応させた。培地で１回洗浄した後、３７℃に温めておいた１０％  ＦＢＳを含む培地を加えて、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。細胞を固定するために、２００  μＬの４％パラホルムアルデヒドを添加し、室温で１５分間処理した。ＰＢＳ（−）２回で洗浄し、ＰＢＳ（−）−０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（界面活性剤）を添加し、室温で１０分間処理した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）を添加し、室温で５分間反応した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００、キーエンス社製）で観察した。
【０１００】
観察の結果、図１で示したように核を染色するＤＡＰＩの蛍光シグナルの領域内に、ｍ１６４由来であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の蛍光シグナルが含まれていたことから、ｍ１６４抗体は核内に局在していた。ｍ１６４抗体、二次抗体添加をし、細胞を２４時間培養した後までは、固定・浸透化処理を行っていないことから、ｍ１６４抗体と二次抗体は、生細胞の状態で核内まで移行することが明らかとなった。
【０１０１】
（２）抗体の可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
実施例１．（７）で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５００  ｎｇから、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ５’／３’  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を行ってｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＳｅｑＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。実施例１．（７）で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例として、ハイブリドーマ細胞クローン番号１６４が産生するｍ１６４抗体の可変領域のアミノ酸配列を、下記方法を用いて決定した。
【０１０２】
抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、１０×ＵＰＭとｍＩｇＧ１＿ＣＨ＿５’ＲＡＣＥ＿ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号１４）を用いてＰＣＲ反応により断片を得た。
【０１０３】
抗体のＬ鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、１０×ＵＰＭとｍＩｇ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  Ｒ３プライマー（配列番号１５）を用いてＰＣＲ反応により断片を得た。
【０１０４】
精製したＰＣＲ増幅断片をＧｏＴａｑ  Ｆｌｅｘｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。その後、ＳＰ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１６）を用いて、シークエンス反応を行い、Ｈ鎖とＬ鎖の可変領域部の配列を決定した。
【０１０５】
ｍ１６４抗体のＨ鎖可変領域（以下「ＶＨ」とも称する）のアミノ酸配列を配列番号１で示し、Ｌ鎖可変領域（以下「ＶＬ」とも称する）のアミノ酸配列を配列番号５で示した。ＶＨの遺伝子配列をｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）に挿入し、Ｈ鎖のヒトマウスキメラ抗体用の発現コンストラクトを作製した。このコンストラクトから翻訳されるヒトマウスキメラ抗体のＨ鎖の可変領域と定常領域のアミノ酸配列を配列番号９で示した。ＶＬの遺伝子配列をｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）に挿入し、Ｌ鎖のヒトマウスキメラ抗体用の発現コンストラクトを作製した。このコンストラクトから翻訳されるヒトマウスキメラ抗体のＬ鎖の可変領域と定常領域のアミノ酸配列を配列番号１０で示した。また、ｍ１６４抗体の可変領域のアミノ酸配列のうち、既存の抗ＬＧＲ６抗体の可変領域のアミノ酸配列と比較して特に変化が大きい（相同性が低い）領域を、当該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）として同定した。
同定したｍ１６４抗体のＣＤＲ領域、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３を配列番号２、３及び４で示し、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を配列番号６、７及び８で示す。
【０１０６】
（３）エピトープの特定
ＬＧＲ６部分タンパク質のｐｅｔ３２ベクターへのクローニング
ハイブリドーマ細胞のスクリーニングの過程で、ｍ１６４がＬＧＲ６のヒンジ領域部分タンパク質に結合することが示されたが、さらに狭い結合範囲（エピトープ）を調べるため、４４６番目から４８５番目の領域、４８６番目から５２７番目の領域、５２８番目から５６７番目の領域、それぞれに対応するＤＮＡ配列を、ＬＧＲ６のヒンジ領域部分タンパク質をコードする二重鎖ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅した。それぞれの断片をｐｅｔ３２ｂ（−）ベクターに挿入した。これらのプラスミドを用いて、大腸菌であるＢＬ２１(ＤＥ３)を形質転換した。ＬＧＲ６の４４６番目から５２７番目の領域、タンパク質の発現は実施例１の（３）に従った。菌体からの組換えタンパク質の精製は次の方法で行った。Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．８，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。超音波発生機（ＵＤ−２０１、トミー精工社製）をもいて超音波破砕後、１００００ｘｇ、５分間、４℃で遠心分離を行い、可溶性画分を回収した。Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化済みのＮｉ−ＮＴＡ  レジン充填オープンカラムに、上清を添加し、上清がカラムを流れた後に、Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を行い、さらに、Ｎａｔｉｖｅ溶出用基本ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄した。次に、Ｎａｔｉｖｅ溶出用基本ｂｕｆｆｅｒ中のイミダゾールの終濃度を５０ｍＭから５００ｍＭまで段階的に上げた溶液をカラムに流し、溶出液をチューブに回収し、ＨＩＳタグ融合タンパク質を溶出した。どのフラクションに目的のタンパク質があるかはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色でバンドとして確認した。溶出液は、透析を用いて、ＰＢＳ（−）に置換した。
【０１０７】
Ａｇ−ＥＬＩＳＡの実施
実施例１（４）の方法に従った。それぞれの組換えタンパク質の９６ウエルプレートへの塗布量は５０  ｎｇ、ｍ１６４抗体の添加濃度は１  μｇ／ｍｌとした。ネガティブコントロールとしてｐｅｔ３２ｂベクターから発現・精製したタグ組換えタンパク質を用いた。図２よりＬＧＲ６抗体ｍ１６４は４８６番目から５２７番目に結合することが示された。
【０１０８】
ｍ１６４抗体が結合するＬＧＲ６部分タンパク質の配列解析
ｍ１６４抗体は図１から核内に移行したことを示したが、この機構を明らかにするため、ｍ１６４抗体が結合するＬＧＲ６部分タンパク質の配列を解析した。ｃＮＬＳ  ＭＡＰＰＥＲという核移行シグナルを配列から解析するデータベースを用いて、ＬＧＲ６のヒンジ領域部分を解析したところ、ＬＧＲ６の４８８番目から５１３番目であり、Ｓｃｏｒｅが５．５であった。このことからヒンジ領域部分の核移行シグナルが、ｍ１６４抗体とＬＧＲ６の核移行に関与する可能性がある。
【０１０９】
実施例３
（１）抗体薬物複合体を用いた細胞傷害活性
実施例２（１）の結果から、抗体に結合させるのを色素ではなく毒素や放射性物質などの細胞障害活性を持った物質にした場合には、本発明の抗体コンジュゲートは細胞障害活性を示すことが予想されたため、ｍ１６４抗体を用いた抗体薬物複合体を用いた細胞傷害活性を測定した。
ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン標識下ｍ１６４抗体（以下ビオチン標識ｍ１６４抗体）を用いた。ＨＣＴ１１６細胞を９６ウエルプレートに１ウエルあたり２４００個播種し、一晩３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ストレプトアビジン−サポリンであるＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ社製）とビオチン標識ｍ１６４抗体を混合した後、氷上で１時間反応させた。この混合液を各ウエルに添加した。添加後の終濃度は、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＺＡＰは１５  ｎＭで固定し、ｍ１６４抗体は様々な終濃度（０．２、０．４、０．８、１．６、３、６、１２、２５、５０、１００、２００ｎＭのいずれか）とした。３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養した。その後培地を吸い取り、細胞数を吸光度から把握できる試薬であるＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を培地で１０倍に希釈した溶液を１ウエルに１００μＬずつ加えた。６０分後に４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｖｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定することで、各ウエルの細胞の増殖を把握した。図３に結果を示す。縦軸は４５０ｎＭの吸光度、横軸はｍ１６４抗体の終濃度を示した。実線と白丸はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓａｐｏｒｉｎ（１５ｎＭ）とビオチン標識ｍ１６４抗体の混合液を加えたもの、破線と白四角はコントロールとしてビオチン標識ｍ１６４抗体のみを加えたものを示す。同じ組み合わせの３ウエルの吸光度から標準偏差を算出し、図中にエラーバーとして図示した。図より、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓａｐｏｒｉｎ（１５ｎＭ）とビオチン標識ｍ１６４抗体は細胞の増殖を抑制させることが明らかとなった。サポリンに限らず、他の薬物、もしくは放射性同位体元素を含む化合物をｍ１６４抗体に標識させることで薬効を示すことが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明のモノクローナル抗体は、膜タンパク質に結合し核内に移行し、医薬組成物及び／又は薬物送達担体として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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