(57)【要約】      （修正有）【課題】デスレセプター５（ＤＲ５）を標的とする抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする別の抗原結合部位とを組み合わせる二重特異性抗体の提供。【解決手段】ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体、ＤＲ５に特異的な抗体、これらの産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びこれらの使用方法。抗体がヒトであるか又はヒト化されている二重特異性抗体。ＦｃドメインとＤＲ５に特異的な抗原結合部を含む１個以上のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的結合部位を１個以上のＦａｂ断片と、を含む二重特異性抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の群から選択される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、並びに
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０及び配列番号３４の群から選択される重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１及び配列番号３５の群から選択される重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２及び配列番号３６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３及び配列番号３７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４及び配列番号３８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体。
【請求項２】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含み、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、配列番号１５及び配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１６及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含み、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
抗体がヒトである、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
抗体がヒト化されている、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
Ｆａｂ断片の少なくとも１個が、軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに接続しており、少なくとも１個のＦａｂ断片が、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに接続している、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と
を含む、請求項７又は８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と
を含む、請求項７又は８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項１から７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片とを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
二重特異性抗体がＤＲ５及びＦＡＰの両方に対して二価である、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
ＤＲ５に対して二価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片を更に含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
ＤＲ５に対して三価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
ＤＲ５に対して一価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片（１個又は複数個）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項１１から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
Ｆａｂ断片の少なくとも１個がペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している、請求項７から２０の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む、請求項７から２１の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
前記１個又は複数個のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される１個又は複数個の位置にある、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含み、このことにより、第１の抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化が可能となる、請求項７から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
ノブ・イントゥ・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む、請求項２５に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の群から選択される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体。
【請求項２８】
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項２７から２９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
がんの治療のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
医薬としての使用のための、請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
医薬の製造における、請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
医薬ががんの治療用である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
医薬が膵がん又は結腸直腸癌の治療用である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体の重鎖又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、核酸配列。
【請求項３８】
請求項１から２６の何れか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖又は請求項２７から３０の何れか一項に記載の抗体の軽鎖をコードする配列を含む、核酸配列。
【請求項３９】
請求項３７及び／又は請求項３８に記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３９に記載のベクターを含む、原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項４１】
抗体が産生されるように請求項４０に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項４２】
特に上記実施例に関連して、本明細書に記載されている発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な第１の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体、ＤＲ５に特異的な抗体、これらの産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、がんの治療での強力な治療剤である。なぜならば、モノクローナル抗体は、がん細胞上で特異的に発現される抗原を選択的に標的とするからである。アゴニストモノクローナル抗体による、がん細胞上のＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシスを誘導するリガンド）デスレセプターの標的化は、標的とする細胞のアポトーシスを直接的に誘導することができることから、モノクローナル抗体療法の新たな創出を意味する。
【０００３】
ＴＲＡＩＬの結合時には、ＤＲ４及びＤＲ５等のＴＮＦＲ−ＳＦファミリのデスレセプターは三量体化される。三量体化は、外因性アポトーシス経路、及びカスパーゼ活性化等の事象の複合カスケードを誘導し、このことにより、最終的に標的細胞が死滅する。アポトーシスの誘導は、ＤＲ５の高クラスター化（即ち、多数の三量体のクラスター化）が起こる場合に更に高められる。デスレセプターは様々な細胞タイプ上で広く発現されるが、外因性経路を介したアポトーシスの誘導は腫瘍細胞に限定される。抗体に結合するアゴニストＤＲ４又はＤＲ５はデスレセプターに交差結合し、そのためアポトーシスを誘導することができることから、これらの受容体は、がん治療での標的として興味深い。少なくとも８種のデスレセプター標的分子が臨床開発に入っており、結腸直腸がん又は肺がんのような進行性の固形腫瘍等の様々な症状の治療になる可能性に関して臨床試験で評価されている。さらに、リンパ腫及び／又は多発性骨肉腫等のその他の症状を治療しようと試みられている。
【０００４】
米国２００７／００３１４１４Ａ１号及び国際公開第２００６／０８３９７１号に記載の完全ヒトＤＲ５アゴニスト抗体であるドロジツマブは、高濃度で交差結合することなく、ある程度のインビトロアポトーシス活性を示す。しかしながら、インビボでのデータから、下記の異なる作用機序が明らかとなった：ＦｃγＲ変異マウスにおいては（又はＦｃγＲ結合の阻害で抗体変異体が使用された場合に）、ドロジツマブは、この分子のインビボ活性がＦｃγＲ媒介性の交差結合に主に依存することを示す不活性であった。この分子を第二相臨床まで試験しており、安全であると思われた（ＭＴＤは２０ｍｇ／ｋｇを超えていた）が、有意な有効性を全く示さなかった。
【０００５】
コナツムマブ（欧州１９２２３３７Ａ号に記載されている）は、別の完全ヒトＤＲ５アゴニスト抗体である。コナツムマブの活性は、Ｆｃ受容体による交差結合に厳密に依存している。ドロジツマブとは対照的に、この抗体は非リガンド阻害である。この分子はまた、臨床試験において非常に限られた有効性を示すのみであった。
【０００６】
キメラＤＲ５抗体であるＬＢＹ−１３５は、交差結合依存性の活性及び非リガンド阻害特性に関してコナツムマブと同様の特性を示しており、単剤療法では有意な有効性を全く示さなかった。さらに、ＬＢＹ−１３５は、第一相治験の登録患者の一部において免疫原性の兆候を示した。
【０００７】
ＤＲ４及びＤＲ５の組み換えにより産生された天然型リガンド（ＴＲＡＩＬ）であるデュラネルミンは、臨床治験において限られた目的の反応を示すのみであった。天然型リガンドの使用には、下記の何らかの不都合がある：ＴＲＡＩＬはデスレセプター受容体及びおとり受容体の両方等の多数の受容体を標的とし、従って選択性が重要である。さらに、ＴＲＡＩＬの、用量及びスケジュールパラメータに影響を及ぼす因子である血液半減期は、モノクローナル抗ＤＲ抗体と比べてはるかに短い。ＴＲＡＩＬの血液半減期が非常に短いことから、モノクローナル抗ＤＲ抗体と比べて多量の及び頻繁な投与が必要である。さらに、組み換えＴＲＡＩＬの産生は非常に難しくて退屈なものである。
【０００８】
上記に記載の３種全てのＤＲ５アゴニスト抗体及びリガンドの開発は中断された。
【０００９】
２種の更なる完全ヒト抗体であるマパツムマブ（抗ＤＲ４）及びレクサツムマブ（抗ＤＲ５）は依然として開発されているが、これらの抗体も単剤療法では有望な有効性を示さなかった。
【００１０】
ティガツズマブは、言うまでも無く全身性の毒性問題のリスクを持つ二次交差結合の非存在下において、（既に低濃度で）インビトロで活性であるといわれているヒト化ＤＲ５アゴニスト抗体である。しかしながら、全てのその他の記載したアゴニストＤＲ５抗体のように、この分子もこれまでＰｈＩ／ＰｈＩＩの研究において説得力のある有効性を示しておらず、最大限に許容される用量であるＭＴＤは８ｍｇ／ｋｇ以下を示すのみであった。
【００１１】
デスレセプターを標的化することによりアポトーシスを誘導するための様々な手法が、四量体ＤＲ５結合ナノボディである分子ＴＡＳ２６６により続行されている（国際公開第２０１１０９８５２０Ａ１号）。ＤＲ５結合部分の四価構造に起因して、ＤＲ５の交差結合は標準的な二価抗体と比べて増加すると考えられ、このことにより、活性が高まる可能性がある。しかしながら、分子ＴＡＳ２６６の小さいサイズに起因して、この分子は、（抗体と比べて）予想以上に短い半減期という欠点を有する。さらに、全身性の毒性のリスクが高くなる。なぜならば、この四量体分子は腫瘍を標的としないからである。
【００１２】
ＤＲ５抗体ドロジツマブと腫瘍抗原結合部分又は二重特異性抗体プラットフォームにおける腫瘍を囲む間質に存在する抗原との結合は、下記の２つの効果を達成するための新規の手法として本出願の発明者らにより説明されている。第１に、ＤＲ５結合抗体は、（特に交差結合に非依存的な活性を示すＤＲ５抗体を使用する場合に）潜在的な全身性の毒性問題を避けることができる腫瘍部位を標的とすることができる。第２に、その結果、この腫瘍又は腫瘍間質を標的とする部分は、ＤＲ５過剰クラスター化を誘導し、その後に腫瘍部位特異的アポトーシスを誘導する交差結合単位としても作用する。様々な腫瘍タイプを標的とするドロジツマブ＿ｓｃＦｖ融合分子を使用する基本概念が証明されている（国際公開第２０１１／０３９１２６号を参照されたい）。
【００１３】
ここで特に興味深いのは、ＤＲ５及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１６６８）に結合する二重特異性抗体であった。ヒトＦＡＰは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９を使用する線維芽細胞の培養において最初に同定された（国際公開第９３／０５８０４号に記載されている、ＡＴＣＣ番号ＨＢ  ８２６９）。このタンパク質の相同物がマウス等のいくつかの種で発見された（Niedermeyer等, Int J Cancer 71, 383-389 (1997), Niedermeyer等, Eur J Biochem 254, 650-654 (1998)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ１９１９０）。ＦＡＰは下記の独特な組織分布を有する：ＦＡＰの発現は、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌及び乳癌等の全ての原発性の及び転移性の上皮腫瘍の９０％超の反応性間質線維芽細胞で高度に上方制御されることが発見されたが、正常な成体組織では一般的に見られない（Rettig等, Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988)；Garin-Chesa等, Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)）。その後の報告から、ＦＡＰは間質線維芽細胞中で発現されるだけでなく上皮起源のいくつかのタイプの悪性細胞中でも発現されており、ＦＡＰ発現は悪性の表現型と直接関連があることが分かった（Jin等, Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003)）。驚くことに、発明者らは、間質中においてＦＡＰを標的とし腫瘍細胞上でＤＲ５を標的とする二重特異性抗体が、標的が様々な細胞上に位置しているにも関わらずアポトーシスを実際に誘導することを発見した。
【００１４】
更なる研究により、本出願の発明者らは、国際公開第２０１１／０３９１２６号に記載のｓｃＦｖ含有二重特異性分子全てが、生産性、安定性及び準最適な非特異的活性の原因となる凝集体形成に関して同じ固有の問題を有することを発見した。
【００１５】
本出願では、ＦＡＰ及びＤＲ５を標的とする新規の二重特異性抗体が提供される。本出願の発明者らは、交差結合後にのみ活性である新規のＤＲ５結合部分を開発した。従って、腫瘍細胞アポトーシスの誘導は、ＦＡＰによるＤＲ５過剰交差結合に依存しており、Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用に非依存的である。よって、本明細書では、ＦＡＰ及びＤＲ５に特異的な二重特異性抗体に加えて、ＤＲ５に結合する新規な抗体も提供される。
【００１６】
対照的に、上記に記載した従来のＤＲ５標的分子の活性は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性の過剰クラスター化に依存しており、腫瘍中での免疫性の湿潤及び活性化状態による影響を受ける（Li及びRavetch, PNAS 2012；Wilson, Cancer Cell 2011；国際公開第２０１１０９８５２０Ａ１号）。Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用を生理的なヒトＩｇＧレベルまで低下させることができる。そのため、従来のＤＲ５標的分子の活性は、わずかな湿潤性細胞に制限されることが多い（Moessner, Blood 2010）。ＤＲ５及びＦＡＰの両方を標的とする二重特異性抗体を使用することによって、ＦＡＰによる過剰交差結合により敏感な腫瘍細胞の割合を著しく増加させることができ、ＤＲ５アゴニストに対する固有の耐性のリスクを低下させる。新規のＤＲ５結合部分はＦＡＰとの交差結合後にのみ活性であり、これにより、ＤＲ５バインダーであるアポマブ及びティガツズマブと比較して安全性及び毒性プロファイルが改善される可能性がある。これまで試験されているＤＲ５アゴニストは臨床において安全であったが、この臨床プログラムは、ＤＲ５標的分子の低い有効性により妨げられている。
【００１７】
さらに、好ましい新規のＤＲ５結合部分は、ドロジツマブと異なるエピトープに結合する。
【００１８】
重要なことは、新規のＤＲ５結合部分を、新規の及び確立された二重特異性フォーマットの両方を含む多くの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ標的抗体フォーマットで採用することができることである。対照的に、ドロジツマブへの任意のＮ末端融合により不活性分子が生じることから、ＦＡＰ結合部分のＣ末端融合のみが、ドロジツマブをベースとする二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ標的抗体フォーマットで可能である。そのため、新たなＤＲ５結合部分の提供により、様々な二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ標的抗体フォーマットにおけるＤＲ５標的部分の採用の可能性が大きく広がる。このことは、いくつかの二重特異性フォーマットが生産性及び活性に関して優れた特性を有することから特に重要である。
【００１９】
本明細書で提供されるのは、新規のＤＲ５結合部分と親和性成熟ＦＡＰ結合部分とを含む新規の二重特異性抗体である。
【００２０】
本発明の二重特異性抗体は、１個又は複数個のクロスオーバーＦａｂ断片がＩｇＧ分子に融合している二重特異性抗体フォーマットで提供される。クロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されているＦａｂ断片である。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば国際公開第２００９０８０２５２号、国際公開第２００９０８０２５３号、国際公開第２００９０８０２５１号、国際公開第２００９０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に記載されている。
【００２１】
これまで、ｓｃＦｖ含有フォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体のみが説明されている（国際公開第２０１１／０３９１２６号）。本明細書に開示する新規のＤＲ５バインダーの有利な特性に加えて、クロスオーバーＦａｂベースの二重特異性フォーマットの使用により、収率が改善され、凝集体及び生産中の副産物が減少する。さらに、ｓｃＦｖベースの及びｓｃＦａｂベースのＤＲ５−ＦＡＰ標的二重特異性抗体は凝集体を形成する傾向を示し、従って、ＦＡＰの非存在下でさえも非特異的な交差結合ＤＲ５へのより高いリスクを有する。従って、これらのフォーマットは、非標的細胞（即ち健康な細胞）においてアポトーシスを誘導する可能性があるという欠点を有する。
【００２２】
本明細書で提供される新規の二重特異性抗体のＤＲ５結合部分及びＦＡＰ結合部分は、従来のＤＲ５抗体と比較して優れたインビボ有効性を示す。本発明の好ましい二重特異性抗体は、腫瘍間質上のＦＡＰに高親和性で結合し、腫瘍細胞上のＤＲ５に低親和性で結合する。さらに、本明細書で提供される、ＤＲ５及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体は、密接に関係するタンパク質ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２（ＤＲ５に密接に関係する）及びＤＤＰＩＶ（ＦＡＰに密接に関係する）と交差反応しない。さらに、各結合特異性の価数の数に関して限定されない様々な二重特異性フォーマットでＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を提供することが初めて可能である。
【００２３】
まとめると、本明細書で提供される新規の二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は非常に特異的及び強力であり、この新規の二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰ依存的な腫瘍細胞中におけるＤＲ５過剰クラスター化により、アポトーシスを選択的に誘導し、正常な細胞への結合は低い。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）を標的とする抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする別の抗原結合部位とを組み合わせる二重特異性抗体に関する。これにより、デスレセプターは交差結合するようになり、標的とした腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される。この二重特異性デスレセプターアゴニスト抗体の従来のデスレセプター標的抗体に対する利点は、ＦＡＰが発現される部位のみでのアポトーシスの誘導の特異性であり、更にＤＲ５の過剰クラスター化の誘導に起因するこの二重特異性抗体のより高い力価である。さらに、ＤＲ５に結合する新規の抗体が提供される。上記で概説したように、本発明の発明者らは、新規の及び有利なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体に組み込まれる既知のＤＲ５バインダーと比較して優れた特性を有する新規のＤＲ５結合部位を開発した。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、並びに
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９及び配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０及び配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４及び配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重異性抗体を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む二重特異性抗体を提供する。
【００２７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５；のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む可変重鎖並びに配列番号１６及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【００２８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【００２９】
好ましくは、前記二重特異性抗体はヒトである、又はヒト化されている。
【００３０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含む。
【００３１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個は、軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続しており、少なくとも１個のＦａｂ断片は、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続している。
【００３２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、
Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【００３３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、
Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【００３４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００３５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００３６】
一実施形態では、前記二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰの両方に関して二価である。
【００３７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００３８】
一実施形態では、前記二重特異性抗体はＤＲ５に関して二価でありＦＡＰに関して一価である。
【００３９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００４０】
一実施形態では、前記二重特異性抗体はＤＲ５に関して三価でありＦＡＰに関して一価である。
【００４１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００４２】
一実施形態では、前記二重特異性抗体はＤＲ５に関して一価でありＦＡＰに関して一価である。
【００４３】
一実施形態では、前記二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片（１個又は複数個）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【００４４】
一実施形態では、前記Ｆａｂ断片の少なくとも１個が、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。
【００４５】
一実施形態では、前記二重特異性抗体はＦｃドメインを含み、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、前記１個又は複数個のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される１箇所又は複数箇所である。一実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を消失させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。
【００４６】
一実施形態では、第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含み、このことにより、抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化が可能となる。一実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む。
【００４７】
更なる実施形態では、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の群から選択される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体が提供される。
【００４８】
更なる実施形態では、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体が提供される。
【００４９】
更なる実施形態では、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽視を含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体が提供される。
【００５０】
更なる実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体が提供される。
【００５１】
第２の目的では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に特異的に結合する抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００５２】
第３の目的では、本発明は、がんの治療用の、本発明のＤＲ５及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗体又はＤＲ５に特異的に結合する抗体に関する。好ましい一実施形態では、前記がんは、膵がん又は結腸直腸癌である。別の実施形態では、二重特異性抗体又はＤＲ５に特異的に結合する抗体の医薬としての使用が提供される。好ましくは、前記使用は、がんの治療用であり、好ましくは膵癌又は結腸直腸癌の治療用である。
【００５３】
更なる目的では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞に関する。さらに、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の発現量に関する、２種の異なる細胞株（ＳＷ８７２及びＧＭ０５３８９）のＦＡＣＳ結合解析を示すグラフである（Ａ）。様々な濃度の抗ＦＡＰ抗体で測定した蛍光強度を、３種の大きさ（黒色のバー、灰色のバー及び斜線のバー）の範囲で示す。二次抗体及び細胞のみとしてのネガティブコントロール反応をそれぞれ、点を付したバー及び白色のバーとして示す。上記背景であった全ての試験した抗体濃度でＧＭ０５３８９細胞はＦＡＰの発現を示すが、使用した最高の抗体濃度（１０μｇ／ｍｌ）でＳＷ８７２細胞のＦＡＰ発現のみを検出することができ、このことは、これらの細胞が、ＦＡＰに基づく結合／アポトーシス誘導実験に適していないことを示す。加えて、この細胞株がドロジツマブ媒介性アポトーシスをほとんど受けないことを示す（Ｂ）。ドロジツマブ単独では又は別の市販の抗ＤＲ５抗体では、関連するＤＮＡ断片化は誘導されなかった。ドロジツマブが抗ヒトＦｃ抗体と交差結合する場合にのみ、検出可能な低レベルのアポトーシス誘導を観測することができる。
【図２】ドロジツマブとのＦＡＣＳ結合による２種の異なるヒト腫瘍細胞株（乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び腎癌細胞株ＡＣＨＮ）でのＤＲ５発現の検出、並びにその後の標識抗Ｆｃ抗体による検出を示すグラフである。両方の細胞株とも、ヒトＤＲ５の同程度の低い発現レベルを示す。
【図３】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。ＡＣＨＮ（Ａ）又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂ）標的細胞を、単独で又は同数のＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９線維芽細胞の存在下で培養した。ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（ｓｃＦｖが融合している）をそれぞれ０．１μｇ／ｍｌ（Ａ）及び０．７ｎＭ（Ｂ）の濃度で添加し、細胞を２４時間にわたりインキュベートした後にＤＮＡ断片化を検出した。ドロジツマブの交差結合の場合には、０．１μｇ／ｍｌの二次抗Ｆｃ抗体を使用した。
【図４】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。ＦＡＰ発現線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）の存在下又は非存在下での二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ｓｃＦａｂが融合したドロジツマブ）によるＡＣＨＮ細胞上でのアポトーシスの誘導。様々なＦＡＰ結合部分を有する二重特異性分子の活性を、二次抗Ｆｃ抗体により交差結合している又は交差結合していないドロジツマブと比較する。２種の異なる濃度（１．０μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌ）で抗体を使用した。この設定では、４Ｇ８  ｓｃＦａｂ融合を含む二重特異性分子（Ｂ）は、ＤＮＡ断片化アッセイにおいて、３Ｆ２  ｓｃＦａｂ含有分子（Ａ）と比較して優れたアポトーシス誘導活性を示した。
【図５】標準的な（Ｇ４Ｓ）４リンカーにより抗ＦＡＰクロスＦａｂ部分がドロジツマブＩｇＧのＣ末端に融合している２種の異なる二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子の概略を表す図である。示すように、（Ａ）の場合にはＶＨＣＬクロスＦａｂがドロジツマブＩｇＧに融合しているが、（Ｂ）ではＶＬＣＨ１鎖がＩｇＧに接続している。これら２種の分子は、二重特異性分子を含有する新たに単離されたＤＲ５バインダーの場合にも使用されたＩｇＧ−クロスＦａｂ組み合わせを使用する可能なフォーマットのほんの一例である。その他の可能性として、分子のＩｇＧ部分での交差、クロスＦａｂを安定化させるための塩架橋及び残基の荷電の実施、又は異なるリンカーの長さ及び配列の使用が挙げられる。
【図６】様々な二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体フォーマットの精製中における凝集体含有量の比較を示すグラフである。全てのフォーマットは、ＦＡＰ結合ドメイン（クローン４Ｇ８）がＣ末端に融合しているドロジツマブＩｇＧからなる。ＦＡＰ結合部分は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（Ａ）、ｓｃＦａｂ（Ｂ）又はクロスＦａｂ（Ｃ）の何れかからなる。調製用サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムは、３種のコンストラクトの間に明確な差異を示した。ｓｃＦｖ分子及びクロスＦａｂ分子の産生は同程度であったが、ｓｃＦａｂ含有コンストラクトは、より低い収率及びより高い凝集体含有量を示した。この比較から、クロスＦａｂ含有分子が最も有望に見えた。
【図７】組み換えヒトＦＡＰ発現ＨＥＫ２９３細胞でのＦＡＣＳ結合の分析を示すグラフである。新規のクロスＦａｂフォーマットでのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子を、ｓｃＦａｂ分子、親４Ｇ８  ＩｇＧ、及び未処理のネガティブコントールであるドロジツマブと比較した。２種のクロスＦａｂ分子が少なくともＩｇＧコントロールと同じ範囲でＦＡＰに結合することが示された。
【図８】二重特異性ドロジツマブ−ＦＡＰ分子（クロスＦａｂ）の組み換えヒトＤＲ５及びＦＡＰへの同時結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）分析を示すグラフである。リガンドとしてのビオチン化ヒトＤＲ５−Ｆｃをストレプトアビジンチップ上に固定化し、続いて第１の被分析物（二重特異性クロスＦａｂ分子）を注入した。ＤＲ５−Ｆｃへの結合（９０秒結合）及び短い解離期間（１０秒）後に、様々な濃度（１００ｎＭ、５００ｎＭ）の組み換え可溶型ＦＡＰ（ヒト又はマウス）を第２の被分析物として添加し、更なる反応を測定した。ドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ａ（Ａ及びＢ）の結合をドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ｂ（Ｃ及びＤ）と比較した。各コンストラクトを、ＤＲ５及びヒトＦＡＰ（Ａ，Ｃ）又はマウスＦＡＰ（Ｂ，Ｄ）への結合に関して測定した。全ての試験した分子に関するこの分析により、ＤＲ５及びヒト／マウスＦＡＰへの同時結合を証明することができた。
【図９】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。２種の細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＧＭ０５３８９）共培養アッセイにおいて２種のクロスＦａｂ分子（ドロジツマブ−Ｘ−Ｆａｂ−Ａ及びドロジツマブ−Ｘ−Ｆａｂ−Ｂ）をドロジツマブ及び過剰交差結合ドロジツマブと比較したアポトーシス誘導実験の結果。（Ａ）細胞死検出ＥＬＩＳＡを使用して、２４時間後にアポトーシスの誘導を検出した。試験した全てのコンストラクトを、７ｎＭ及び０．７ｎＭの濃度で使用した。標的細胞及びエフェクター細胞のアポトーシス誘導を、標的細胞のみのアポトーシスと比較する。（Ｂ）ドロジツマブ（＋／−Ｆｃ交差結合）とドロジツマブ重鎖のＣ末端に融合したＦＡＰクロスＦａｂからなる二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子とによる細胞死検出ＥＬＩＳＡ（ＤＮＡ断片化）における共培養バイスタンダーアポトーシス誘導の比較。親和性成熟ＦＡＰ結合部分（２８Ｈ１）を含む分子は、より低い親和性ＦＡＰバインダーを含む分子と比べて優れた活性を示す。
【図１０】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。二重特異性ドロジツマブ−ＦＡＰクロスＦａｂ分子によるアポトーシスの誘導は、ＦＡＰによる交差結合に依存する。図１０は、ＥＬＩＳＡプレートに塗布した組み換えヒトＦＡＰにより交差結合したクロスＦａｂ分子によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのアポトーシス誘導の結果を示す。コントロール分子（抗Ｆｃ抗体により交差結合したドロジツマブ）は、ＦＡＰの塗布及び無関係のコントロールタンパク質に依存することなく同様のアポトーシス誘導を示すが、二重特異性コンストラクトのみが、ＦＡＰが塗布された場合に著しいアポトーシス活性を示した。コントロールプラスミドのみの塗布により、おそらくＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の基礎ＦＡＰ発現に起因して、最高のコンストラクト濃度（７ｎＭ）のアポトーシスを検出することができた。アポトーシス活性は試験した両方のクロスＦａｂ分子で同様であり、過剰交差結合ドロジツマブで観測したのと同じ範囲内であった。
【図１１】ＦＡＰ発現ヒト線維芽細胞ＧＭ０５３８９との共培養実験における、様々なヒト腫瘍細胞株でのアポトーシス誘導（ＤＮＡ断片化）の比較を示すグラフである。ドロジツマブ及び過剰交差結合したドロジツマブを、二重特異性ドロジツマブ−４Ｇ８クロスＦａｂ分子（全て７．０ｎＭ及び０．７ｎＭ）と比較する。使用した腫瘍細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳がん）、Ｕ−８７ＭＧ（膠芽腫）、ＦａＤｕ（扁平上皮癌）又はＡ５４９（肺癌）であった。７ｎＭの濃度でのアポトーシス誘導は４種全ての細胞株で同様であったが、０．７ｎＭでは細胞株間でのより明白な差異を観察した。
【図１２】新規のＤＲ５バインダーの単離、スクリーニング及び特徴付けのために使用したヒトＤＲ５抗原コンストラクトの概略を示す図である。全てのコンストラクトに関して、ノブ・イントゥ・ホール技法を使用して、同じＤＲ５ドメイン（細胞外ドメイン、ＥＣＤ；ａａ５６−２０７）を単独で（Ａ）、ダイマーＦｃ融合として（Ｂ）、又はモノマーＦｃ融合として（Ｃ）使用した。全ての抗原を一時的にトランスフェクトさせてＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞中で産生した。
【図１３ａ−ｃ】二次抗Ｆｃ抗体との過剰交差結合後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのアポトーシスの誘導（ＤＮＡ断片化アッセイ）に関する４６種の独特なＤＲ５バインダー（ファージ提示により単離されている）のスクリーニングを示すグラフである。抗体を、７ｎＭの濃度（黒色のバー）で及び０．７ｎＭの濃度（斜線のバー）で使用した。ＤＲ５バインダーの大部分（４２／４６）は、過剰交差結合後にＤＮＡ断片を様々な程度まで誘導することができた。
【図１３ｄ】二次抗Ｆｃ抗体との過剰交差結合後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのアポトーシスの誘導（ＤＮＡ断片化アッセイ）に関する４６種の独特なＤＲ５バインダー（ファージ提示により単離されている）のスクリーニングを示すグラフである。抗体を、７ｎＭの濃度（黒色のバー）で及び０．７ｎＭの濃度（斜線のバー）で使用した。ＤＲ５バインダーの大部分（４２／４６）は、過剰交差結合後にＤＮＡ断片を様々な程度まで誘導することができた。
【図１４ａ】新規のＤＲ５抗体が二次交差結合することなくアポトーシス活性を示すかどうかを評価するための、二次交差結合する抗Ｆｃ抗体の存在下で又は非存在下で、選択した一連の新規のＤＲ５バインダーによるＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるアポトーシス誘導を示すグラフである。新規のＤＲ５バインダーを、交差結合することなくある程度まで活性であることが知られている抗体であるドロジツマブと比較した。
【図１４ｂ−ｃ】新規のＤＲ５抗体が二次交差結合することなくアポトーシス活性を示すかどうかを評価するための、二次交差結合する抗Ｆｃ抗体の存在下で又は非存在下で、選択した一連の新規のＤＲ５バインダーによるＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるアポトーシス誘導を示すグラフである。新規のＤＲ５バインダーを、交差結合することなくある程度まで活性であることが知られている抗体であるドロジツマブと比較した。
【図１５】７ｎＭの濃度の様々な交差結合したＤＲ５抗体による処理時の３種の異なるヒト腫瘍細胞（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞増殖の阻害の分析（Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ  Ａｓｓａｙ）を示すグラフである。
【図１６】７ｎＭの濃度の交差結合したＤＲ５抗体による処理後に３種のヒト腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）においてカスパーゼ８活性化により測定したアポトーシス誘導の評価を示すグラフである。
【図１７】表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるエピトープビニング実験の結果を示す表である。第１の抗体のヒトＤＲ５への結合後に、試験する追加の抗体の更なる結合を分析した。ドロジツマブエピトープと重複する可能性があるクローン４２２を除いて、試験した新規のＤＲ５バインダーはいずれも、ドロジツマブエピトープと重複するＤＲ５上の領域に結合するように見えず、これらは互いに、少なくとも重複するエピトープを共有する可能性がある。
【図１８】リガンド阻害抗体とリガンド非阻害抗体とを判定するためのＴＲＡＩＬ競合アッセイを示すグラフである。ヒトＴＲＡＩＬをＣＭ５チップ上に固定化した。次いで、ヒトＤＲ５−ＦｃとＤＲ５抗体とからなる複合体を被分析物として使用し、固定化されているＴＲＡＩＬへの複合体の結合を分析した。ファージ提示からの新規のバインダーのほとんどがＴＲＡＩＬ阻害分子であったが、ウサギ免疫化からの多くのＤＲ５抗体は非阻害種であった。
【図１９】様々なＤＲ５アゴニスト抗体による処理時のＤＬＤ−１標的細胞の増殖の抑制でのヒトＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。様々な濃度のヒトＴＲＡＩＬの非存在下（実線）で又は存在下（点線）で、ＤＬＤ−１標的細胞を、交差結合したＤＲ５抗体と共にインキュベートした。ＤＲ５抗体により認識されたエピトープに応じて、ＴＲＡＩＬの添加により細胞増殖の抑制が増加した（非リガンド阻害）又はＴＲＡＩＬの添加により細胞増殖の阻害が増加しなかった（リガンド阻害）。ＴＲＡＩＬ単独及びＴＲＡＩＬを阻害しないことが知られている抗体をコントロールとして含めた。
【図２０ａ】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。９６ウェルプレート上に塗布した組み換えヒトＦＡＰの存在下での又は非存在下での標的細胞株としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１での様々なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（ＦＡＰクローン２８Ｈ１）のアポトーシス誘導活性。この設定では、塗布したＦＡＰは、腫瘍間質中で発現されたＦＡＰを模倣するだろう。２種の濃度（７．０ｎＭ及び０．７ｎＭ）で二重特異性抗体を試験した。新規のＤＲ５バインダーを含む二重特異性分子の場合、ＦＡＰの存在下でのみアポトーシスの濃度依存性誘導を検出したが、ドロジツマブを含むコントロール分子はＦＡＰの非存在下で同じ活性も示し、このことは、新規のＤＲ５抗体の活性は交差結合に厳密に依存することを裏付ける。
【図２０ｂ】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。９６ウェルプレート上に塗布した組み換えヒトＦＡＰの存在下での又は非存在下での標的細胞株としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１での様々なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（ＦＡＰクローン２８Ｈ１）のアポトーシス誘導活性。この設定では、塗布したＦＡＰは、腫瘍間質中で発現されたＦＡＰを模倣するだろう。２種の濃度（７．０ｎＭ及び０．７ｎＭ）で二重特異性抗体を試験した。新規のＤＲ５バインダーを含む二重特異性分子の場合、ＦＡＰの存在下でのみアポトーシスの濃度依存性誘導を検出したが、ドロジツマブを含むコントロール分子はＦＡＰの非存在下で同じ活性も示し、このことは、新規のＤＲ５抗体の活性は交差結合に厳密に依存することを裏付ける。
【図２１】ＤＲ５発現標的細胞としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び交差結合用のＧＭ０５３８９（ＦＡＰ＋線維芽細胞）を使用する共培養アッセイにおける二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子（２＋２クロスＦａｂフォーマット）のバイスタンダーアポトーシス誘導活性を示すグラフである。様々な新規の単離されたＤＲ５バインダーを含む分子を、３種の濃度（７．０ｎＭ、０．７ｎＭ及び０．０７ｎＭ）でドロジツマブ含有コンストラクトと比較した。この条件下では、試験した全ての二重特異性コンストラクトは、抗Ｆｃ  ｍＡｂによる又は組み換えＦＡＰによる交差結合と比較して同じ活性を示さなかった。このことは、交差結合後にアポトーシスを主に誘導することができる全ての抗体が、より天然の条件下（抗原−ＤＲ５及びＦＡＰ−が様々な細胞タイプで発現される）でもこのことを行うであろうというわけではないことを示す。
【図２２】全ての抗Ｆｃ抗体との交差結合後に、ドロジツマブと比較した、ヒトＦｃのＣ末端に融合している新規のＤＲ５結合Ｆａｂで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞による細胞死検出ＥＬＩＳＡ（ＤＮＡ断片化）を示すグラフである。試験した全てのＦｃ融合分子は、交差結合したドロジツマブと同じ範囲内で、標的細胞にアポトーシス誘導を付与することができ、このことは、これらの結合能力及び活性能力は、Ｎ末端へのＦｃの配置によって阻害されないことを示す。Ａ：ファージ提示に由来するＤＲ５バインダー、Ｂ：免疫化に由来するヒト化ＤＲ５バインダー。
【図２３】ＧＭ０５３８９線維芽細胞を使用する共培養アッセイ（アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイ）における標的細胞株としてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１へのアポトーシス誘導に関する二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（Ｃ末端２８Ｈ１クロスＦａｂ融合を有する新規のＤＲ５バインダー）の比較を示すグラフ。
【図２４】細胞死検出ＥＬＩＳＡにおいてＤＮ断片化により決定したように、バイスタンダーアッセイにおいて二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体がＧ４０１細胞のアポトーシスを誘導することを示すグラフ。
【図２５】生産性及び品質に関して評価した、更なる二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰクロスＦａｂフォーマットの概略を表す図である。これら４種の分子は、ＤＲ５及びＦＡＰの結合部分の位置及び価数が異なり、２種の２＋１分子、１種の３＋１コンストラクト及び１種の１＋１コンストラクトを評価した。１方の２＋１分子は、ＤＲ５（５Ｅ１１）重鎖のＣ末端に融合した１個のＦＡＰ（２８Ｈ１）クロスＦａｂを含む（Ａ）が、別の２＋１フォーマットは、２８Ｈ１クロスＭａｂカウンターパートによりＦｃのＮ末端に融合した２個のＤＲ５（５Ｅ１１）Ｆａｂからなる（Ｂ）。第３の分子（Ｃ）は、３個のＤＲ５を標的とするＦａｂと重鎖のＣ末端で融合した１個の２８Ｈ１クロスＦａｂとを含む。１＋１フォーマット（Ｄ）では、ＤＲ５バインダー番号１７４は、クロスＦａｂ配置におけＦＡＰ結合部分４Ｂ９と結合している。全てのコンストラクトは、ノブ・イントゥ・ホール技法を使用するヘテロ二量体化に依存する。
【図２６】ＧＭ０５４８９線維芽細胞と共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてＤＮＡ断片化に関して細胞死検出ＥＬＩＳＡにより測定した、様々なフォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子（Ａ：５Ｅ１１−２８Ｈ１、Ｂ：１８Ｆ１１−２８Ｈ１）のアポトーシス活性を示すグラフである。標準的な２＋２フォーマットのドロジツマブ−２８Ｈ１を、３種の異なる濃度で２＋２フォーマット、２＋１フォーマット及び３＋１フォーマットの５Ｅ１１−２８Ｈ１分子及び１８Ｆ１１−２８Ｈ１分子と比較した。
【図２７】下記の３種の更なる二重特異性フォーマット：２＋１、新規の２＋１（ヘッド・トゥ・テイル融合）及び３＋１と比較した５Ｅ１１−２８Ｈ１分子（２＋２フォーマット）のバイスタンダーアポトーシス誘導を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を標的細胞として使用し、ＧＭ０５３８９線維芽細胞をＦＡＰ依存性の交差結合のために共培養し、二重特異性抗体を７００−０．００７ｎＭの濃度で評価した。
【図２８】生産性、副生物プロファイル及び活性の評価のための新たな二重特異性５Ｅ１１−２８Ｈ１フォーマット（２＋２）を示す図である。分子は交差の位置及び種類が異なる。Ａ：２８Ｈ１（ＣＨ１ＣＬ）のＣ末端交差、Ｂ：Ｎ末端５Ｅ１１  Ｆａｂ全体の交差、Ｃ：５Ｅ１１のＮ末端ＶＨＶＬ交差、Ｄ：５Ｅ１１のＮ末端ＣＨ１ＣＬ交差、Ｅ：Ｃ末端２８Ｈ１  ＦＡｂの完全な交差、Ｆ：Ｃ末端２８Ｈ１  Ｆａｂ（ＶＨＶＬ）の交差。
【図２９】０．００３７から６０ｎＭの範囲の濃度にわたるＭＤＡ−ＭＢ−２３１での３種の異なるフォーマットの５Ｅ１１−２８Ｈ１クロスＦａｂによるＦＡＣＳ結合結果を示すグラフである。ＰＥがコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃ（Ｆａｂ）２を検出のために使用した。
【図３０ａ−ｂ】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。ＤＮＡ断片化により検出した、共培養（Ａ）設定での及び単培養（Ｂ、Ｃ）設定での４種の異なるクロスＭａｂ変異体のアポトーシスの誘導。４種の異なる変異体全てが、共培養設定で同程度の用量依存的に腫瘍細胞でアポトーシスを誘導する。単培養設定では、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞株又はＧＭ０５３８９線維芽細胞株の何れにおいてもアポトーシスは誘導されず、このことから、４種全ての変異体のアポトーシス誘導の特異性及びＦＡＰ依存性が指摘される。
【図３０ｃ】アポトーシスを検出するためのＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイを示すグラフである。ＤＮＡ断片化により検出した、共培養（Ａ）設定での及び単培養（Ｂ、Ｃ）設定での４種の異なるクロスＭａｂ変異体のアポトーシスの誘導。４種の異なる変異体全てが、共培養設定で同程度の用量依存的に腫瘍細胞でアポトーシスを誘導する。単培養設定では、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞株又はＧＭ０５３８９線維芽細胞株の何れにおいてもアポトーシスは誘導されず、このことから、４種全ての変異体のアポトーシス誘導の特異性及びＦＡＰ依存性が指摘される。
【図３１】ＤＬＤ−１（Ａ；ヌードマウス）細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂ；ＳＣＩＤ−ベージュマウス）細胞を、３Ｔ３線維芽細胞を発現するｍｕ  ＦＡＰと共注入して腫瘍間質中でのＦＡＰ発現を確実にしている、マウス異種移植腫瘍モデルにおけるインビボ有効性を示すグラフである。腫瘍の移植後に、二重特異性ドロジツマブ−２８Ｈ１分子（三角）又はドロジツマブのみ（四角）又はビヒクルコントロール（菱形）の静脈内注射により１０ｍｇ／ｋｇで処理を実施した。ビヒクルコントロールと比較した腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）により有効性を決定した。
【図３２】二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子のアポトーシス誘導活性に関するインビボ有効性実験のために産生した二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子の評価を示すグラフである。ＤＬＤ−１細胞のＤＮＡ断片化に関する細胞死検出ＥＬＩＳＡにおいて４種の異なる分子を試験した。３Ｔ３細胞又はマウスのＦＡＰを発現する組み換え３Ｔ３細胞を、交差結合に関する共培養アッセイで使用した。未処理の細胞と比較したアポトーシスの増加倍数を示す。
【図３３】３Ｔ３細胞又はマウスのＦＡＰを発現する３Ｔ３細胞（Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ）との共培養アッセイ後のＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体による処理後のＤＬＤ−１細胞の生存率を示すグラフである。未処理のコントロールと比較した生存率の割合を示す。
【図３４】様々な２＋２フォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子（１０ｍｇ／ｋｇ）をビヒクルコントロールと比較したマウス異種移植モデルを示すグラフである。全てのコンストラクトには、下記の様々なＤＲ５バインダー：５Ｅ１１、１７４及び４２２に融合した２８Ｈ１  ＦＡＰクロスＦａｂが含まれていた。さらに、あらゆるＦｃγＲ相互作用（ＰＧＬＡＬＡ）を抑制するための変異をＦｃが有する１種の分子（５Ｅ１１−２８Ｈ１）が含まれていた。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）として有効性を決定した。
【図３５】ＤＮＡ断片化アッセイを示すグラフである。抗ＤＲ５抗体は、用量依存的な受容体の過剰クラスター化時に細胞死を誘導する。生成したウサギ抗ＤＲ５抗体は様々な力価でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のアポトーシスを誘導することができたが、常に用量依存的であり、ＤＲ５分子のＦｃに媒介された交差結合後のみであった（上方のパネル）。抗ウサギＦｃ特異的二次抗体の非存在下では、有意な細胞死を検出しなかった（下方のパネル）。
【図３６】用量依存的な受容体の過剰クラスター化時に抗ＤＲ５抗体により細胞生存率が低下することを示すグラフである。生成したウサギ抗ＤＲ５抗体は様々な力価でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の生存率を高めることができたが、常に用量依存的であり、ＤＲ５分子のＦｃに媒介された交差結合後のみであった（上方のパネル）。抗ウサギＦｃ特異的二次抗体の非存在下では、細胞生存率は、あらゆる抗体濃度で影響を受けなかった（下方のパネル）。
【図３７】７ｎＭの濃度での様々な交差結合ＤＲ５抗体による処理時の３種の異なるヒト腫瘍細胞（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞増殖の抑制の分析（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒｇｌｏ  Ａｓｓａｙ）を示すグラフである。
【図３８】７ｎＭの濃度での交差結合ＤＲ５抗体による処理後の３種のヒト腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中においてカスパーゼ８活性化により測定したアポトーシス誘導の評価を示すグラフである。
【図３９】ストレスを加えたＤＲ５抗体試料の相対活性濃度：例示的反応曲線を示すグラフである。
【図４０】免疫化に由来する、元のＤＲ５抗体及びストレスを加えたＤＲ５抗体の相対活性濃度を示すグラフである。
【図４１】ファージ提示に由来する、元のＤＲ５抗体及びストレスを加えたＤＲ５抗体の相対活性濃度を示すグラフである。
【図４２】様々なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体の両方の組み換え標的への同時結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）分析を示すグラフである。最初の反応では二重特異性抗体の組み換えヒトＤＲ５−Ｆｃへの結合を測定し、続いて、組み換えヒトの（上方のパネル）又はマウスの（下方のパネル）のＦＡＰへの結合を分析した。
【図４３】ＤＮＡ断片化により検出した共培養アッセイにおける２＋２二重特異性コンストラクトによるＤＬＤ−１腫瘍細胞株及びＨ４６０腫瘍細胞株でのアポトーシスの誘導を示すグラフである。ＤＲ５結合成分としてドロジツマブを含む二重特異性コンストラクトは、ＦＡＰの非存在下でアポトーシスを既に誘導するが、免疫化により得られる新規のＤＲ５バインダーを含む全てのコンストラクトは、ＦＡＰの存在下のみでアポトーシスを誘導する。新たに開発したＤＲ５バインダー、例えば００１１−２８Ｈ１及び００１６−２８Ｈ１を有するコンストラクトは、ドロジツマブ含有二重特異性コンストラクトと比較して特に低濃度でより高い程度にアポトーシスを誘導することができる。
【図４４】フローサイトメトリー分析により測定した、抗ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性２＋２コンストラクトのＤＲ５発現腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１への結合を示すグラフである。
【図４５Ａ】ＤＮＡ断片化（細胞死検出ＥＬＩＳＡ）により検出した交差結合後のヒト化変異体のアポトーシスの誘導を示すグラフであり、ＤＲ５ＴＡＡ−００１１（ＤＲ５ＴＡＡ−００６６−ＤＲ５ＴＡＡ−００７５、黒色の線）のヒト化変異体は、用量依存的な二次抗体との交差結合時にアポトーシスを誘導する。いくつかのヒト化変異体、例えばＤＲ５ＴＡＡ−００６７、ＤＲ５ＴＡＡ−００７１、ＤＲ５ＴＡＡ−００７４及びＤＲ５ＴＡＡ−００７５は、キメラ変異体（ＤＲ５ＴＡＡ−００５２、灰色の線）と比較して、最大の誘導及び用量依存性に関して同様の様式でアポトーシスを誘導することができる。
【図４５Ｂ】ＤＮＡ断片化（細胞死検出ＥＬＩＳＡ）により検出した、更なる交差結合がないヒト化変異体のアポトーシスの誘導の欠如を示すグラフであり、ＤＲ５ＴＡＡ−００１１（ＤＲ５ＴＡＡ−００６６−ＤＲ５ＴＡＡ−００７５）のヒト化変異体は、二次抗体による交差結合がない場合にはアポトーシスを誘導しない。
【図４６】１＋１フォーマットの及び２＋２フォーマットの二重特異性抗ＤＲ５−ＦＡＰ抗体による共培養系での細胞死の同程度の誘導を示すグラフである。
【図４７】腫瘍細胞及び線維芽細胞の両方の存在下でのみの細胞死の誘導での二重特異性抗ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の高い特異性を示すグラフである。
【図４８】ＤＬＤ−１  ＣＲＣ共注入細胞株をベースとする異種移植モデルにおける二重特異性抗ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）の有効性を示すグラフである。
【図４９】Ｃｏ５８９６ＣＲＣ断片をベースとする患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ）における、二重特異性抗ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）の有効性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークのことである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含むことができる、又は該アクセプターヒトフレームワークはアミノ酸配列の変更を含むことができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変更の数は１０個以下である、９個以下である、８個以下である、７個以下である、６個以下である、５個以下である、４個以下である、３個以下である、又は個２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して配列が同一である。
【００５６】
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を意味する。別途指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのパートナーＹに対する該分子Ｘの親和性を一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。本明細書に記載の方法等の当該技術分野で既知の一般的な方法によって、親和性を測定することができる。結合親和性の測定の具体的な説明であって例示的な実施形態を下記に記載する。
【００５７】
「親和性成熟」抗体は、１個又は複数個の超可変領域（ＨＶＲ）における１個又は複数個の改変がない親抗体と比較して、そのような改変を有する抗体を意味しており、そのような改変により、抗原に対する抗体の親和性が改善される。
【００５８】
用語「デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体」は、ＤＲ５及びＦＡＰを発現する細胞を標的とする診断薬及び／又は治療薬として抗体が有用であるのに十分な親和性でＤＲ５及びＦＡＰに結合することができる二重特異性抗体を意味する。具体的には、「デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体」は、腫瘍細胞上のＤＲ５及び前記腫瘍を囲む間質中のＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を意味する。一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体の無関係の非ＦＡＰタンパク質又は非ＤＲ５タンパク質への結合の程度は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えばＢｉａｃｏｒｅ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合に抗体のＤＲ５又はＦＡＰへの結合の約１０％未満である。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、≦１μＭの、≦１００ｎＭの、≦１０ｎＭの、≦１ｎＭの、≦０．１ｎＭの、≦０．０１ｎＭの又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、様々な種由来のＤＲ５又はＦＡＰで保存されているＤＲ５又はＦＡＰのエピトープに結合する。好ましくは、前記二重特異性抗体は、ヒトの及びカニクイザルのＤＲ５と、ヒトの、カニクイザルの及びマウスのＦＡＰとに結合する。
【００５９】
用語「デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体」は、ＤＲ５を発現する細胞を標的とする診断薬及び／又は治療薬として抗体が有用であるのに十分な親和性でＤＲ５に結合することができる抗体を意味する。一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体の無関係の非ＤＲ５タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合に抗体のＤＲ５への結合の約１０％未満である。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合Ｄする抗体は、≦１μＭの、≦１００ｎＭの、≦１０ｎＭの、≦１ｎＭの、≦０．１ｎＭの、≦０．０１ｎＭの又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体は、様々な種由来のＤＲ５で保存されているＤＲ５のエピトープに結合する。好ましくは、前記抗体は、ヒトの及びカニクイザルのＤＲ５に結合する。用語「デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体」は、ＤＲ５及び別の抗原に結合することができる二重特異性抗体も包含する。
【００６０】
用語「抗体」は本明細書において最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含しており、該抗体構造として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６１】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体、クロス−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６）に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する単鎖ポリペプチド、即ちＶＬドメインと共に集合して機能性抗原結合部位となり、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらすことができる単鎖ポリペプチド、又はＶＬドメインの特性を有する単鎖ポリペプチド、即ちＶＨドメインと共に集合して機能性抗原結合部位となり、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらすことができる単鎖ポリペプチドを含む。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を意味する。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている少なくとも１個のＦａｂ断片を含む。可変領域又は定常領域のどちらかの交換により、前記Ｆａｂ断片は「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。クロスオーバーＦａｂ分子の下記の２種の異なる鎖組成物が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂの重鎖の可変領域と軽鎖のＦａｂ軽鎖の可変領域とが交換されている、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されているペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されているペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。他方では、Ｆａｂの重鎖の定常領域と軽鎖の定常領域とが交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称される。
【００６３】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で下記の順の内の１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ、ここで、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドであり、好ましくは３２から５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合により安定化されている。さらに、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けによる、可変重鎖における４４位及び可変軽鎖における１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化される場合がある。用語「Ｎ末端」はＮ末端の最後のアミノ酸を表す。用語「Ｃ末端」はＣ末端の最後のアミノ酸を表す。
【００６４】
「融合」又は「接続」が意味するのは、成分（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合により直接的に又は１個若しくは複数個のペプチドリンカーを介して結合することである。
【００６５】
用語「リンカー」は本明細書で使用する場合、ペプチドリンカーを意味しており、好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸の長さ、好ましくは５から１００個の長さ、より好ましくは１０から５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシンであり、Ｓ＝セリンであり、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５及びｍ＝０、１、２若しくは３）であり、好ましくはｘ＝４であり、ｎ＝２又は３であり、より好ましくはｘ＝４であり、ｎ＝２である。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
【００６６】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を意味する。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２本の軽鎖と２本の重鎖とから構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖を、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプ内の１つに割り当てることができ、これらの内のいくつかをサブタイプに、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に更に分割することができる。免疫グロブリンの軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの内の一方に割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合している２個のＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的に成る。
【００６７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上阻害する抗体を意味しており、逆に言うと、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を参照抗体が５０％以上阻害する。例示的な競合アッセイを本明細書に記載する。
【００６８】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し該一部又は全てに対して相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、この部分はエピトープと呼ばれている。抗原結合ドメインは、例えば１個又は複数個の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされ得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【００６９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが、通常は組み換えＤＮＡ技法により調製される異なる供給源又は種に由来する抗体を意味する。ウサギ可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」のその他の好ましい形態は、本発明に係る特性を生じさせるために、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明に係る特性を生じさせるために、定常領域が元の抗体の定常領域から修飾されている又は変更されている形態である。そのようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で公知である従来の組み換えＤＮＡ技法及び遺伝子トランスフェクション技法を含む。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許５２０２２３８号及び米国特許５２０４２４４号を参照されたい。
【００７０】
用語「細胞傷害性薬剤」は本明細書で使用する場合、細胞の機能を阻害する若しくは阻止する及び／又は細胞の死滅若しくは破壊を引き起こす物質を意味する。細胞傷害性薬剤として、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又はその他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びこの断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素又は細菌起源、真菌起源、植物起源若しくは動物起源の酵素活性毒素（この断片及び／又は変異体を含む）；並びに下記に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味する。抗体のエフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性で細胞媒介性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性の細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込み；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」は、天然に存在する又は組み替えのポリペプチド又はこの断片の、ペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと見なす。操作として、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾が挙げられ、これらの手法の組み合わせも更に挙げられる。
【００７３】
用語「アミノ酸変異」は本明細書で使用する場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせにより最終的なコンストラクトに到達することができるが、但し、最終的なコンストラクトは、所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合性の低下又は別のペプチドとの結合の増加を有する。アミノ酸配列の欠失及び挿入として、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失並びにアミノ酸の挿入が挙げられる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち１個のアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換として、２０種の標準的なアミノ酸の天然に存在しないアミノ酸又は天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリシン）による置き換えが挙げられる。アミノ酸変異を、当該技術分野で公知の遺伝学的方法又は化学的方法を使用して生じさせることができる。遺伝学的方法として、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を挙げることができる。遺伝子操作以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を改変する方法、例えば化学的修飾も有用であることができることが意図される。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位でのプロリンからグリシンへの置換を３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
【００７４】
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに必要な投薬量及び期間での有効な量を意味する。
【００７５】
本明細書では、用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」を、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域の境界は若干異なる可能性があるが、ヒトＩｇＧの重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸びていると定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）が存在していてもよいし存在していなくてもよい。本明細書では別途明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。Ｆｃドメインの「サブユニット」は本明細書で使用する場合、ダイマーＦｃドメインを形成する２個のポリペプチドの内の一方、即ち、安定した自己結合が可能な、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００７６】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの結合を促進する修飾」とは、ホモダイマーを形成するために、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの結合を減少させる又は阻止するペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾のことである。本明細書で使用する場合、結合を促進する修飾として、結合が所望される２種のＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）それぞれに対して行われる別々の修飾が特に挙げられ、これらの修飾は、２種のＦｃドメインサブユニットの結合を促進するように互いに相補的である。例えば、結合を促進する修飾により、その結合を立体的に又は静電気的にそれぞれ有利にするようにＦｃドメインサブユニットの内の一方又は両方の構造又は電荷が変更され得る。そのため、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で生じており、これらのポリペプチドは、各サブユニットに融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同じではないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施形態では、結合を促進する修飾はＦｃドメイン中にアミノ酸変異を含み、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２種のサブユニットそれぞれにおいて別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【００７７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは一般的に、下記の４種のＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中に下記の配列で現われる： ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００７８】
本明細書では、用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」を、天然型抗体の構造と実質的に同じ構造を有する抗体又は本明細書で定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味するために互換的に使用する。
【００７９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を意味しており、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞として「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらには、最初の形質転換細胞と、継代の数に関係なく該形質転換細胞に由来する子孫とが含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全に同一ではない可能性があるが突然変異を含むことができる。これには、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が含まれる。
【００８０】
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体のレパートリー若しくはその他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体のことである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。本発明に係るキメラ抗体及びヒト化抗体に関して述べてもいるように、用語「ヒト抗体」は本明細書で使用する場合、例えば「クラススイッチング（ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」、即ちＦｃ部分の変更又は突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４へ及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、本発明に係る特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する本発明に係る特性を生じさせるために定常領域において修飾されているそのような抗体も含む。
【００８１】
用語「組み換えヒト抗体」は本明細書で使用する場合、組み換え手段により調製されている、発現されている、作成されている又は単離されている全てのヒト抗体、例えばＮＳ０細胞若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、再配置された形で可変領域及び定常領域を有する。本発明に係る組み換えヒト抗体はインビボでの体細胞超変異に曝されている。そのため、組み換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来する及び関連するがインビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。
【００８２】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのＶＬフレームワーク配列又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークのことである。一般的に、ヒト免疫グロブリンのＶＬ配列及びＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般的に、配列のサブグループは、
Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ．１−３でのサブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、サブグループはＫａｂａｔ等（上記参照）でのサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、サブグループはＫａｂａｔ等（上記参照）でのサブグループＩＩＩである。
【００８３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を意味する。ある実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１個の、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を任意選択的に含むことができる。抗体の「ヒト化型」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化されている抗体を意味する。本発明に包含される「ヒト化抗体」のその他の形態は、本発明に係る特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する本発明に係る特性を生じさせるために、定常領域が更に修飾されている又は元の抗体の定常領域から変更されている形態である。
【００８４】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は本明細書で使用する場合、配列が超可変である及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般的に、天然型４鎖抗体は６個のＨＶＲ、即ちＶＨ中に３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中に３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般的に、超可変ループ及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは最高の配列可変性である、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−６５及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２で生じる。（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称されており、本明細書ではこれらの用語を、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して互換的に使用する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により説明されており、定義には、互いを比較した場合にアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はこの変異体のＣＤＲを意味する何れかの定義の適用は、本明細書において定義される及び使用される用語の範囲内であることを意図している。上記の各引用文献によって定義されているＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として下記の表Ａに記載する。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を付与する特定のＣＤＲを含む残基を常套的に決定することができる。
2018046823.tif 000002
1表Aでの全てのCDR定義の番号付けは、Kabat等に記載されている番号付けの慣例に従う(下記を参照されたい)。
2表Aで使用する小文字「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されるCDRを意味する。
【００８５】
Ｋａｂａｔ等は、あらゆる抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体以外のあらゆる実験データに頼ることなく、あらゆる可変領域配列に、「カバット番号付け」であるこのシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）に記載されている番号付けシステムを意味する。別途明記しない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及はカバット番号付けシステムに従っている。
【００８６】
ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮−ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−５８及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２で生じる。（Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい）。別途指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及びその他の残基（例えばＦＲ残基）は本明細書において、Ｋａｂａｔ等（上記参照）に従って番号付けされている。
【００８７】
「イムノコンジュゲート」とは１個又は複数個の異種分子にコンジュゲートした抗体のことであり、イムノコンジュゲートとして細胞傷害性薬剤が挙げられるがこれに限定されない。
【００８８】
「個体」又は「被検体」とは哺乳動物のことである。哺乳動物として、家畜（例えば雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）ウサギ並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態では、個体又は被検体はヒトである。
【００８９】
「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から分離されている抗体のことである。いくかの実施形態では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ）により測定した場合に９５％超の又は９９％超の純度に精製されている。抗体純度の評価の方法に関する概説として、例えばＦｌａｔｍａｎ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００９０】
「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から分離されている拡散分子を意味する。単離された核酸として、通常は核酸分子を含む細胞に含まれている核酸分子が挙げられるが、この核酸分子は、染色体外に又は該核酸分子の天然の染色体上の位置とは異なる染色体の位置に存在する。
【００９１】
「ＤＲ５及びＦＡＰ抗体に特異的に結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はこれらの断片）をコードする１種又は複数種の核酸分子を意味しており、この核酸分子として、単一のベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子（１種又は複数種）、及び宿主細胞中の１つ又は複数の位置で存在するそのような核酸分子（１種又は複数種）が挙げられる。
【００９２】
用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味しており、即ち、例えば天然に存在する変異を含む又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能な変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般的に少量で存在している。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。そのため、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体を様々な技法によって作成することができ、この技法として、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ提示法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられるがこれらに限定されず、そのような方法及びモノクローナル抗体を作成するためのその他の例示的な方法を本明細書に記載する。
【００９３】
「裸の抗体」は、異種部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を意味する。裸の抗体は薬学的製剤中に存在することができる。
【００９４】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、続いて３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの内の一方に割り当てることができる。
【００９５】
用語「添付文書」を、指示、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌に関する情報及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる使用説明書を意味するために使用する。
【００９６】
「実質的に交差反応がない」とは、分子（例えば抗体）が、特に標的抗原と比較した場合に、該分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原に密接に関連する抗原）を認識しない又は該抗原に特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に約１０％未満から約５％未満で結合することができる、又は実際の標的抗原とは異なる抗原の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満又は約０．１％未満からなる、好ましくは約２％未満、約１％未満又は約０．５％未満からなる、最も好ましくは約０．２％未満又は約０．１％未満からなる量で、実際の標的抗原とは異なる前記抗原に結合することができる。
【００９７】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」を、配列を位置合わせし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義し、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部であると考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための位置合わせを、当該技術分野の技術内である様々な手段で実現することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大の位置合わせを実現するのに必要なあらゆるアルゴリズム等の、配列の位置合わせに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により書かれており、ソースコードがユーザー文書と共に米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９に提出されており、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコから公的に入手可能である、又はソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄ等のＵＮＩＸオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００９８】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を利用する状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対していくつかの％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）を下記のように算出する。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列位置合わせプログラムＡＬＩＧＮ−２によるＡ及びＢの位置合わせの場合に、該プログラムにより同一性の一致として記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中におけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性がＡに対するＢの％のアミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるだろう。別途明確に述べない限り、本明細書で使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落で記載したように得られる。
【００９９】
用語「薬学的製剤」は、含まれる有効成分の生物活性が有効となるような形態であり、この製剤が投与される被検体に対して許容しがたいほどの毒性である追加の成分を含まない調製物を意味する。
【０１００】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中における有効成分以外の、被検体に対して無毒の成分を意味する。薬学的に許容される担体として、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０１】
別途指示がない限り、用語「デスレセプター５（ＤＲ５）」は本明細書で使用する場合、霊長類（例えばヒト）並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる天然型ＤＲ５を意味する。この用語は、「完全長で」未処理のＤＲ５を包含し、細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＤＲ５を更に包含する。この用語は、ＤＲ５の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトＤＲ５のアミノ酸配列を配列番号１５５に示す。
【０１０２】
別途指示がない限り、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は本明細書で使用する場合、霊長類（例えばヒト）並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる天然型ＦＡＰを意味する。この用語は、「完全長で」未処理のＦＡＰを包含し、細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＦＡＰを更に包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的なヒトの、マウスの及びカニクイザルのＦＡＰ外部ドメインのアミノ酸配列（Ｃ末端がポリリジン及び６×Ｈｉｓタグを有する）をそれぞれ、配列番号１５６、配列番号１５７及び配列番号１５８に示す。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「治療(ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びこの文法上の変形、例えば「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療する個体の自然経過を変更しようと試みる臨床的介入を意味しており、予防のために又は臨床病理学の経過中のどちらかで実施することができる。治療の望ましい効果として、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的な又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行速度を遅らせること、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させる、又は疾患の進行を遅らせる。
【０１０４】
用語「がん」は本明細書で使用する場合、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｏａｌｖｉｏｌａｒ）細胞肺がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚の又は眼内のメラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管のカルシノーマ、子宮内膜のカルシノーマ、子宮頸部のカルシノーマ、膣のカルシノーマ、外陰部のカルシノーマ、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂のカルシノーマ、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、骨髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａｓ）、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａｓ）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、上記がんの内の何れかの難治性バージョン又は上記がんの内の１種若しくは複数種の組み合わせを意味する。
【０１０５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。天然型抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、各ドメインが４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３個の超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似の構造を一般的に有する。（例えばKindt等, Kuby Immunology, 6th ed., W. H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照されたい）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であることができる。さらに、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体由来のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して、特定の抗原に結合する抗体を単離することができる。例えばＰｏｒｔｏｌａｎｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【０１０６】
用語「抗体の抗原結合部位」は本明細書で使用する場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」、即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域、即ち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。従って、抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する及び抗体の特性を定義する領域である。ＣＤＲ領域及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準定義に従って決定される、及び／又は「超可変ループ」由来の残基である。
【０１０７】
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。例えば、天然型抗体は単一特異的である。本発明に係る「二重特異性抗体」とは、２種の異なる抗原結合特異性を有する抗体のことである。本発明の抗体は２種の異なる抗原、即ち第１の抗原としてのＤＲ５及び第２の抗原としてのＦＡＰに対して特異的である。
【０１０８】
用語「単一特異性」抗体は本明細書で使用する場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１個又は複数個の結合部位を有する抗体を表す。
【０１０９】
用語「二重特異性」抗体は本明細書で使用する場合、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原にそれぞれ結合する少なくとも２個の結合部位を有する抗体を表す。
【０１１０】
本明細書で提供する抗体は多重特異性抗体であり、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本明細書では、ＦＡＰ及びＤＲ５に対する結合特異性を有する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、二重特異性抗体はＤＲ５の２種の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を使用して、ＤＲ５を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局所化することもできる。二重特異性抗体を、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１１１】
多重特異性抗体を製作するための技法として、異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein及びCuello, Nature 305:537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655 (1991)を参照されたい）並びに「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば米国特許第５７３１１６８号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。抗体Ｆｃ−ヘテロダイマー分子を製作するために静電ステアリング効果を操作することにより（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２個以上の抗体又は断片を架橋することにより（例えば米国特許第４６７６９８０号及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい）、二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用することにより（例えばKostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照されたい）、二重特異性抗体断片を製作するために「ダイアボディ」技法を使用することにより（例えばHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照されたい）、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用することにより（例えばGruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい）、及び例えばＴｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように三重特異性抗体を調製することにより、多重特異性抗体を製作することもできる。
【０１１２】
「オクトパス抗体」等の、３個以上の機能性抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照されたい）。
【０１１３】
抗体又は断片は本明細書において、ＦＡＰ又はＤＲ５に結合し、別の異なる抗原にも更に結合する少なくとも１個の抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照されたい）。
【０１１４】
用語「価」は本出願内で使用する場合、抗体分子中における特定の数の結合部位の存在を表す。従って、用語「二価」、「四価」及び「六価」はそれぞれ、抗体分子中における２個の結合部位の存在、４個の結合部位の存在及び６個の結合部位の存在を表す。本発明に係る二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば「四価」若しくは「六価」）であることができる。
【０１１５】
本発明の抗体は１個又は複数個の結合部位を有しており、二重特異性である。即ち、２個を超える結合部位が存在する（即ち抗体が三価又は多価である）場合、この抗体は二重特異性であることができる。本発明の二重特異性抗体として、多価の単鎖抗体、二特異性抗体及び三特異性抗体が挙げられ、１個又は複数個のペプチドリンカーを介して更なる抗原結合部位（例えば単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／若しくはＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が結合している完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が更に挙げられる。抗体は、単一種由来の完全長であることができる、又は抗体をキメラ化若しくはヒト化することができる。
【０１１６】
用語「ベクター」は本明細書で使用する場合、該ベクターが結合している別の核酸を伝播することができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターを含み、ベクターが導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターを更に含む。ある種のベクターは、該ベクターが作動可能に結合している核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。
【０１１７】
用語「アミノ酸」は本出願内で使用する場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を表す。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、語句「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」を互換的に使用し、そのような指定は全て子孫も含む。そのため、単語「トランスフェクタント」及び「トランスフェクトされた細胞」は、最初の被検体細胞とトランスファーの数に関係なくそれに由来する培養物とを含む。意図的な又は不慮の突然変異に起因して、全ての子孫のＤＮＡの内容が厳密に同一でなくてもよいことも理解されるだろう。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【０１１９】
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を意味する。別途指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのパートナーＹに対する該分子Ｘの親和性を一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。本明細書に記載の方法等の当該技術分野で既知の一般的な方法によって、親和性を測定することができる。結合親和性の測定の具体的な説明であって例示的な実施形態を下記に記載する。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「結合する」又は「特異的に結合する」は、インビトロアッセイにおける、好ましくは表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）における、抗原のエピトープに対する抗体の結合を意味する。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。結合する又は特異的に結合するは、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
【０１２１】
デスレセプターへの抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）により調べることができる。この結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の結合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。
【０１２２】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の分子の化学的に活性な表面のグループ分けを含み、ある実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、特に接頭辞「グリコ」を有する用語「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」並びに「グリコシル化操作」は、天然に存在する又は組み替えのポリペプチド又はこの断片のグリコシル化パターンのあらゆる操作を含むと見なす。グリコシル化操作として、細胞で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝的操作等の、細胞のグリコシル化装置の代謝的操作が挙げられる。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化での突然変異及び細胞環境の作用が含まれる。一実施形態では、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変更である。特定の実施形態では、この操作により、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性が変更される。
【０１２４】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ＴＲＡＩＬデスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な第１の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体に基づく。別の実施形態では、ＤＲ５を標的とする新規の抗体が提供される。本発明の抗体は、例えばがんの治療又は診断に有用である。
【０１２５】
Ａ．ＤＲ５及びＦＡＰに結合する例示的な二重特異性抗体
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する、単離された二重特異性抗体を提供する。ＦＡＰ結合部分は国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、その全体が出典明示により援用される。ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で使用しようとする特定の対象のＦＡＰ結合部分を、下記の実施形態で概説する。
【０１２６】
ある実施形態では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体はデスレセプターを特異的に架橋し、標的細胞のアポトーシスが誘導される。この二重特異性のデスレセプターアゴニスト抗体の、従来のデスレセプターを標的とする抗体に対する利点は、ＦＡＰが発現される部位のみでのアポトーシスの誘導の特異性である。上記で概説したように、本発明の発明者らは、新規で有利なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体に組み込まれ得る既知のＤＲ５バインダーと比較して優れた特性を有する新規のＤＲ５結合部分を開発した。
【０１２７】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、並びに
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９及び配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０及び配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１及び配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４及び配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重異性抗体を提供する。
【０１２８】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１２９】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３０】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３１】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３２】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３３】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３４】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３５】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３６】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３７】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３８】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１３９】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号７５の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号８４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４１】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号７５の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号８４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４２】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９６の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４３】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９６の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４４】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４５】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４６】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４７】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４８】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４９】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１５０】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１５１】
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号３３の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体を提供する。
【０１５２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
配列番号１５及び配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖並びに配列番号１６及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１５９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１６９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１７９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号９５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１８０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号９５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０１８１】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１８２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０１８４】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、Ｃ末端のリジンが除去されている。
【０１８５】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、Ｃ末端のリジンが除去されている。
【０１８６】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位を含む第１の抗体であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖、並びに配列番号１５１又は配列番号１５２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、並びに配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む前記第１の抗体と、上記実施形態の内の何れかで定義した１種又は複数種のアミノ酸配列を含む、ＦＡＰに特異的な第２の抗体とを含む。一実施形態では、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列のＣ末端のリジンが除去されている。
【０１８７】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位を含む第１の抗体であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖、並びに配列番号１５１又は配列番号１５２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、並びに配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む前記第１の抗体と、配列番号１５の可変重鎖及び配列番号１６の可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な第２の抗体とを含む。
【０１８８】
一実施形態では、配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１２４を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１８９】
一実施形態では、配列番号１３３、配列番号１３２及び配列番号１２４を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９０】
好ましい一実施形態では、配列番号１３４、配列番号１３２及び配列番号１２４を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９１】
一実施形態では、配列番号２６２、配列番号２６３及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９２】
一実施形態では、配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９３】
一実施形態では、配列番号１３８、配列番号１３９及び配列番号１３７を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９４】
一実施形態では、配列番号２７４、配列番号２７５及び配列番号１３７を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９５】
一実施形態では、配列番号２７６、配列番号２７７及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９６】
一実施形態では、配列番号２７８、配列番号２７９及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９７】
一実施形態では、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１２４及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９８】
一実施形態では、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１２４及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９９】
一実施形態では、配列番号１４４、配列番号１４３、配列番号１２４及び配列番号１３２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０２００】
一実施形態では、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１及び配列番号１６２を含む二重特異性抗体が提供される。
【０２０１】
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５の可変重鎖及び配列番号１６の可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０２０２】
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＦＡＰ及びＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号７において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号７でのＶＨ配列を含み、該ＶＨ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０３】
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５の可変重鎖及び配列番号１６の可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
【０２０４】
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号８において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号８でのＶＬ配列を含み、該ＶＬ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０５】
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、配列番号８の可変軽鎖及び配列番号７の可変重鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＦＡＰ及びＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号１５において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号１５でのＶＨ配列を含み、該ＶＨ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０６】
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、配列番号８の可変軽鎖及び配列番号７の可変重鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号１６において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号１６でのＶＬ配列を含み、該ＶＬ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０７】
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、上記実施形態の内の何れかでのＶＨと、上記実施形態の内の何れかでのＶＬとを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、この抗体は、配列番号７及び配列番号８並びに配列番号１５及び配列番号１６それぞれでのＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、該ＶＨ配列及びＶＬ配列はこれらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２０８】
本発明の更なる態様では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、モノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体としてキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が挙げられる。一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、ヒト抗体である。
【０２０９】
Ｂ．ＤＲ５に結合する例示的な抗体
一態様では、本発明は、ＤＲ５に結合する、単離された抗体及び抗体断片を提供する。これらのデスレセプターアゴニスト抗体は、ＤＲ５及び別の抗原を標的とする新規で有利な二重特異性抗体に組み込まれ得る既知のＤＲ５バインダーと比較して優れた特性を有する。
【０２１０】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、並びに
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１１】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１２】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１３】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１４】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１５】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１６】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１９の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１７】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号７５の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号８４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１８】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９６の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２１９】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０４の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２２０】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２２１】
一態様では、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号９８の重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む抗体を提供する。
【０２２２】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む。
【０２２３】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２４】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２５】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２６】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２７】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２８】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２２９】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３０】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３１】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３２】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号８５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３３】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３４】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３５】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３６】
一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号９５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
【０２３７】
別の態様では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。
【０２３８】
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５に結合する抗体は、ＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号７において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５に結合する抗体は配列番号７でのＶＨ配列を含み、該ＶＨ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２３９】
別の態様では、デスレセプター５（ＤＲ５）に結合する抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。
【０２４０】
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５に結合する抗体は、ＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号８において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５に結合する抗体は配列番号８でのＶＬ配列を含み、該ＶＬ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
【０２４１】
別の態様では、ＤＲ５及び別の抗原に結合する二重特異性抗体であって、上記実施形態の内の何れかでのＶＨと、上記実施形態の内の何れかでのＶＬとを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、この抗体は、配列番号７及び配列番号８それぞれでのＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、該ＶＨ配列及びＶＬ配列はこれらの配列の翻訳後修飾を含む。一実施形態では、ＤＲ５及び別の抗原に結合する二重特異性抗体であって、上記実施形態の内の何れかでのＶＨと、上記実施形態の内の何れかでのＶＬとを含み、下記のセクションＣにおいてＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体に関して概説されているフォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。別の実施形態では、ＤＲ５及び別の抗原に結合する前記二重特異性抗体であって、上記実施形態の内の何れかでのＶＨと、上記実施形態の内の何れかでのＶＬとを含み、下記のセクションＤ及びＥにおいてＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体に関して概説されている１種又は複数種のＦｃドメイン修飾を含む二重特異性抗体が提供される。
【０２４２】
本発明の更なる態様では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５に結合する抗体は、モノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体としてキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が挙げられる。一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５に結合する前記抗体は、ヒト抗体である。
【０２４３】
Ｃ．ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の例示的なフォーマット
一実施形態では、ＤＡ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、抗体断片、例えばＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ断片、ｘＦａｂ断片、ｓｃＦａｂ断片、ダイアボディ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を含む。別の実施形態では、この抗体は、完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書で定義するその他の抗体クラス若しくはアイソタイプを含む。
【０２４４】
本発明に係る二重特異性抗体は少なくとも二価であり、三価又は多価であることができ、例えば四価又は六価であることができる。
【０２４５】
本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０２４６】
別の実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続しており、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続している。
【０２４７】
実施形態の内の何れかでは、Ｆａｂ断片を、直接的に又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに又は互いに融合させることができ、該ペプチドリンカーは１個又は複数個のアミノ酸を含み、典型的には約２−２０個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー、（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は一般的には１と１０との間の数であり、典型的には２と４との間の数である。第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とを互いに融合させるのに特に好適なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖とを接続させるのに好適な例示的ペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３１８）である。さらに、リンカーは免疫グロブリンのヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、抗原結合部分がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、抗原結合部分を、更なるペプチドリンカーの有無に関わらず免疫グロブリンのヒンジ領域又はこの一部を介して融合させることができる。
【０２４８】
好ましい前記二重特異性抗体は、２個の結合部位それぞれがＦＡＰ及びＤＲ５それぞれを標的とする四価である（２＋２フォーマット）。別の実施形態では、前記二重特異性抗体は、３個の結合部位がＤＲ５用であり１個の結合部位がＦＡＰ用である四価である（３＋１フォーマット）。例えば、ＦＡＰを標的とする１個のＦａｂ断片とＤＲ５を標的とする１個のＦａｂ断片とを、２個のＤＲ５結合部位を有するＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に融合させることにより、３＋１フォーマットを実現することができる。このことを、下記でより詳細に概説する。
【０２４９】
別の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、２個の結合部位それぞれがＤＲ５を標的とし、１個の結合部位がＦＡＰを標的とする三価（２＋１フォーマット）である。例えば、ＦＡＰを標的とするＦａｂ断片を、２個のＤＲ５結合部位を有するＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に融合させることにより、２＋１フォーマットを実現することができ、第１の抗体のＦｃ部分は、下記に概説するノブ・イントゥ・ホール戦略に従って修飾されている。
【０２５０】
別の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は二価（１＋１フォーマット）であり、即ち、ＤＲ５及びＦＡＰそれぞれに対して一価である。本発明の二価抗体は、ＤＲ５を標的とする１個の結合部位と、ＦＡＰを標的とする１個の結合部位とを有する。例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１１；１０８：１１１８７−９２に記載されており、下記で概説するクロスｍａｂ技法により、１＋１フォーマットを実現することができる。
【０２５１】
本発明の二重特異性抗体の例示的なフォーマットを図２５及び図２８に示す。
【０２５２】
本明細書では、上記実施形態の内の何れかに係る配列の内の何れかを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する様々な二重特異性抗体のフォーマットが提供される。
【０２５３】
１．２＋２フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０２５４】
上記二重特異性抗体はＦＡＰ及びＤＲ５の両方に対して二価であり、２個の結合部位それぞれがＦＡＰ用及びＦＲ５用であることから、このフォーマットは「２＋２」フォーマットとも称される。２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的な構造を図２８に示す。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
【０２５５】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２５６】
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２５７】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２５８】
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２５９】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片はそれぞれ、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。これらのクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖をそれぞれ含む。
【０２６０】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２６１】
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２６２】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。これらのクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０２６３】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しており２個のＦａｂ断片がＣ末端に融合しているＦｃドメインを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０２６４】
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に接続している。そのような一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む前記Ｆａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３鎖）のＣ末端に接続している。
【０２６５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（即ち、ＤＲ５に特異的な２個のＦａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２６６】
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片と
を含む。
【０２６７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２６８】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２６９】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２７０】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。
【０２７１】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０２７２】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２７３】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０２７４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２７５】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０２７６】
更に好ましい実施形態では、ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
【０２７７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２７８】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。
【０２７９】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０２８０】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２８１】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。
【０２８２】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。
【０２８３】
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０２８４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続しており、少なくとも１個のＦａｂ断片が重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続している。
【０２８５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに融合しており、少なくとも１個のＦａｂ断片が重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続している。
【０２８６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【０２８７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）に定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【０２８８】
一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む前記２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合している。具体的な実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０２８９】
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。
【０２９０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＮ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【０２９１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に定常軽鎖（ＣＬ）のＮ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
【０２９２】
一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む前記２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合している。具体的な実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０２９３】
２＋２フォーマットを有する例示的抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含むＦａｂ断片と
を含み、
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している。
【０２９４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含むＦａｂ断片と
を含み、
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している。
【０２９５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２９６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０２９７】
別の実施形態では、本発明の前記二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
【０２９８】
一実施形態では、２本の配列番号１３１のＶＨ（ＤＲ５）−Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１３２のＶＬ（ＤＲ５）−カッパ軽鎖と、２本の配列番号１２４のＶＬＣＨ１（ＦＡＰ）鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。
【０２９９】
一実施形態では、２本の配列番号１３３のＶＨ（ＤＲ５）Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１３２のＶＬ（ＤＲ５）−カッパ軽鎖と、２本の配列番号１２４のＶＬＣＨ１（ＦＡＰ）鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマット有する二重特異性抗体が提供される。
【０３００】
一実施形態では、２本の配列番号１３４のＶＨ（ＤＲ５）Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１３２のＶＬ（ＤＲ５）−カッパ軽鎖と、２本の配列番号１２４のＶＬＣＨ１（ＦＡＰ）鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマット有する二重特異性抗体が提供される。
【０３０１】
一実施形態では、２本の配列番号１３５のＶＬ（ＤＲ５）−ＣＨ１−Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＨ１鎖と、２本の配列番号１３６のＶＨ（ＤＲ５）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１３７のＶＬ（ＦＡＰ）−カッパ軽鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。
【０３０２】
一実施形態では、２本の配列番号１３８のＶＨ（ＤＲ５）ＣＬ−Ｆｃ−ペプチドリンカー−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＨ１鎖と、２本の配列番号１３９のＶＬ（ＤＲ５）−ＣＨ１鎖と、２本の配列番号１３７のＶＬ（ＦＡＰ）−カッパ軽鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。
【０３０３】
２．２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０３０４】
上記二重特異性抗体は三価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり２個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「２＋１」フォーマットとも称される。従って、このセクションで提供される二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して二価でありＦＡＰに対して一価である。
【０３０５】
２＋１フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的な構造を図２５ａ）及び図２５ｂ）に示す。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
【０３０６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３０７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３０８】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖を含む。
【０３０９】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３１０】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０３１１】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しているＦｃドメインを含む。
【０３１２】
一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０３１３】
ＦＡＰバインダーがＣ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。そのような一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む前記Ｆａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３鎖）のＣ末端に融合している。ＦＡＰバインダーがＣ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の例示的な構造を図２５ａ）に示す。
【０３１４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３１５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３１６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３１７】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３１８】
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３１９】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３２０】
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３２１】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３２２】
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３２３】
ＦＡＰバインダーがＮ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
別の実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む別のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して、ＩｇＧ分子のＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片のＮ末端に融合している。ＦＡＰバインダーがＮ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の例示的な構造を図２５ｂ）に示す。
【０３２４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３２５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３２６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３２７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
【０３２８】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
【０３２９】
一実施形態では、ｂ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ａ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合している。
【０３３０】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
【０３３１】
一実施形態では、ｂ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ａ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合している。
【０３３２】
更に好ましい実施形態では、ＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
【０３３３】
別の実施形態では、前記本発明の二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
【０３３４】
３．３＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０３３５】
上記二重特異性抗体は四価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり３個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「３＋１」フォーマットとも称される。従って、このセクションに記載の二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して三価でありＦＡＰに対して一価である。
【０３３６】
３＋１フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的な構造を図２５ｃ）に示す。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
【０３３７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３３８】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３３９】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖を含む。
【０３４０】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３４１】
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とをそれぞれ含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０３４２】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しており２個のＦａｂ断片がＣ末端に融合しているＦｃドメインを含み、ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０３４３】
一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０３４４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３４５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３４６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３４７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。
【０３４８】
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３４９】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。
【０３５０】
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３５１】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに融合している。
【０３５２】
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
【０３５３】
更に好ましい実施形態では、このセクションに記載の実施形態の内の何れかのｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
【０３５４】
別の実施形態では、本発明の前記二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
【０３５５】
４．１＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０３５６】
上記二重特異性抗体は二価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり１個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「１＋１」フォーマットとも称される。従って、このセクションに記載の二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して一価でありＦＡＰに対して一価である。１＋１フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的な構造を図２５ｄ）に示す。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。１＋１フォーマットでのＩｇＧ分子は、クロスｍａｂフォーマットとも称される（Schaefer等, Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-92を参照されたい）。
【０３５７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含む。
【０３５８】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３５９】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３６０】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３６１】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しているＦｃドメインを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
【０３６２】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
【０３６３】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている。この抗体フォーマットはクロスＭａｂ（ＶＨＶＬ）とも称される。
【０３６４】
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている。
【０３６５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている。この抗体フォーマットはクロスＭａｂ（ＣＨ１ＣＬ）とも称される。
【０３６６】
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている。
【０３６７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の完全なＶＨ−ＣＨ１ドメイン及びＶＬ−ＣＬドメインが交換されている。このことは、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合していることを意味する。一実施形態では、その他のＦａｂ断片が、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。
【０３６８】
この抗体フォーマットはクロスＭａｂＦａｂとも称される。一実施形態では、両方のＦａｂ断片が、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。
【０３６９】
Ｄ．Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、Ｆｃ部分が修飾されている免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含む。修飾されたＦｃ部分は、野生型のＦｃ部分と比較してＦｃγ受容体に対する結合親和性が低下している。
【０３７０】
本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む１対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、該ダイマーの各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３のＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２個のサブユニットは、互いに安定して結合することができる。
【０３７１】
本発明に係る一実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）でのアミノ酸置換を含む、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換により、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換が減少する（Stubenrauch等, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照されたい）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の例示的な配列を配列番号１５１に示す。
【０３７２】
Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期等の好ましい薬物動態学的特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかしながら、同時期に、好ましい抗原保有細胞よりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞への本発明の二重特異性抗体の所望されない標的化が引き起こされ得る。従って、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施形態では、Ｆｃドメイン（若しくは前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）は、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（若しくは天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）と比較して、Ｆｃ受容体に対する５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示す、及び／又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（若しくは天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）と比較して、５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を実質的に誘導しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の内の１種又は複数種である。特定の実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した場合、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）が天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を、具体的には約８０％超を、より具体的には約９０％超を示す場合に実現される。
【０３７３】
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下している及び／又はエフェクター機能が低下しているように操作されている。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、同一の１個又は複数個のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２個のサブユニットそれぞれに存在する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施形態では、アミノ酸突縁変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を２倍以上、５倍以上又は１０倍以上低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数個のアミノ酸突然変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組み合わせにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を１０倍以上、２０倍以上又は更に５０倍以上低下させることができる。一実施形態では、操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、非操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体を比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満を示し、具体的には１０％未満を示し、より具体的には５％未満を示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具外的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体それぞれに対する結合が低下している。いくつかの実施形態では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も減少している。一実施形態では、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下していない。ＦｃＲｎの実質的に同様の結合、即ちＦｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）が、非操作型のＦｃドメイン（又は前記非操作型のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示す場合に実現される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、そのような親和性の約８０％超を示すことができ、更に約９０％超を示すことができる。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較した場合にエフェクター機能が低下しているように操作されている。エフェクター機能の低下として、下記の内の１種又は複数種を挙げることができるがこれらに限定されない：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性の細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイ���分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、直接的シグナル伝達を誘導するアポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。一実施形態では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の内の１種又は複数種である。特定の実施形態では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。一実施形態では、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０３７４】
一実施形態では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置でのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ２３９の位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇであり、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、ＦｃドメインはＰ３２９位でのアミノ酸置換と、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２３９及びＰ３３１から選択される位置での更なるアミノ酸置換とを含む。より具体な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位、Ｌ２３４位及びＬ２３５位でのアミノ酸置換を含む。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。出典明示により全体が本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号に記載されているように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせにより、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合がほとんど完全に消失する。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号には、そのような変異型Ｆｃドメインを調製する方法、及び該変異型Ｆｃドメインの特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を測定する方法も記載されている。
【０３７５】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。従って、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインはＬ２３５位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインはＰ３２９位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。そのようなＩｇＧ４のＦｃドメイン変異及びこのＦｃγ受容体結合特性は、出典明示により全体が本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号に記載されている。
【０３７６】
特定の実施形態では、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。
【０３７７】
ある実施形態では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化が除かれている。そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位でのアミノ酸突然変異を含み、特に、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギンをアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む。
【０３７８】
上記及びＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下しているＦｃドメインとして、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の内の１個又は複数個の置換を有するＦｃドメインも挙げられる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体として、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体等の、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の内の２個又はそれ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０３７９】
当該技術分野で公知の遺伝学的方法又は化学的方法を使用するアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により、変異型Ｆｃドメインを調製することができる。遺伝学的方法として、ＤＮＡ配列のコーディング、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的突然変異誘発を挙げることができる。正しいヌクレオチド変化を例えば配列決定により検証することができる。
【０３８０】
例えばＥＬＩＳＡにより、又は標準的な器具、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、Ｆｃ受容体への結合を容易に測定することができ、そのようなＦｃ受容体を組み換え発現により得ることができる。そのような好適な結合アッセイが本明細書に記載されている。あるいは、Ｆｃドメインの結合親和性又はＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性を、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価することができる。
【０３８１】
当該技術分野で既知の方法により、Ｆｃドメインのエフェクター機能又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能を測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイのその他の例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、マウンテンビュー）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィンスコシン州、マディソン）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は加えて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されている動物モデル等の動物モデルにおいて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで評価することができる。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの補体成分への結合、具体的にはＣ１ｑへの結合が低下している。従って、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが操作されているいくつかの実施形態では、前記エフェクター機能の低下としてＣＤＣの低下が挙げられる。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、そのためＣＤＣ活性を有するかどうかを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003)並びにCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
【０３８３】
下記のセクションには、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の二重特異性抗体の好ましい実施形態が記載されている。
【０３８４】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインが、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３８５】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３８６】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、前記１個又は複数個のアミノ酸置換が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位の内の１個又は複数個である、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３８７】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３８８】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３８９】
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９０】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９１】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９２】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体及び阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９３】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９４】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９５】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９６】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
【０３９８】
Ｅ．ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内の一方又は他方に融合している異なる抗原結合部分を含み、そのため、Ｆｃドメインの２個のサブユニットは典型的には、２個の同一でないペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え共発現及びその後の二量体化により、２種のポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組み換えによる産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインに所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することが有利となるだろう。
【０３９９】
従って、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの結合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２個のサブユニット間の最も広範囲のタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。そのため、一実施形態では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。
【０４００】
具体的な実施形態では、前記修飾はいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内の一方で「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内のもう一方で「ホール」修飾を含む。
【０４０１】
ノブ・イントゥ・ホール技法は、例えば米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面で突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの接触面に、対応する空洞（「ホール」）を導入し、その結果、ヘテロダイマー形成を促進してホモダイマー形成を妨げるように突起が空洞中に位置することができることを含む。第１のポリペプチドの接触面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより、突起を構築することができる。大きなアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、突起と同一の又は同様のサイズの代償的空洞を第２のポリペプチドの接触面に生じさせる
【０４０２】
従って、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞中に位置することができる突起が作られており、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第１のサブユニット内の突起が位置することができる空洞が作られている。
【０４０３】
突起及び空洞を、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的突然変異誘発によって変更することにより又はペプチド合成により作ることができる。
【０４０４】
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位でのロイシン残基がアラニン残基に置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
【０４０５】
更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基に置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２個のシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２個のサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、ダイマーが更に安定化される（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４０６】
代替実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公報国際公開第２００９／０８９００４号に記載の、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２個のＦｃドメインのサブユニットの接触面の１個又は複数個のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基に置き換え、その結果、ホモダイマー形成が静電気的に好ましくないがヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなることを含む。
【０４０７】
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含み、このことにより、ＩｇＧ分子の２本の重鎖のヘテロ二量体化が可能となる。
【０４０８】
更に好ましい実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む（Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)を参照されたい）。
【０４０９】
Ｆ．核酸配列、ベクター及び方法
本発明は、上記に記載の二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体又はこれらの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを更に提供する。本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを、完全な二重特異性抗原結合分子若しくはＤＲ５に結合する完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される多数の（例えば２個又はそれ以上の）ポリヌクレオチドとして発現させることができる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又はその他の手段により結合して、機能的な二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を形成することができる。例えば、Ｆａｂ断片の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意選択的な別のＦａｂ断片（の一部）を含む二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部とは別のポリヌクレオチドにより、Ｆａｂ断片の軽鎖部分をコードすることができる。共発現される場合、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合してＦａｂ断片を形成することができる。別の実施形態では、２個のＦｃドメインサブユニットの内の一方及び任意選択的な１個又は複数個のＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部を、２個のＦｃドメインサブユニットの内の他方及び任意選択的なＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部とは別のポリヌクレオチドによりコードすることができる可能性がある。共発現される場合、Ｆｃドメインサブユニットは結合してＦｃドメインを形成するこができる。
【０４１０】
一実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１６７、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９１、配列番号１９９、配列番号２０７及び配列番号２０９に示す可変重鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１１】
一実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１７１、配列番号１７９、配列番号１８７、配列番号１９５、配列番号２０３、配列番号２０８及び配列番号２１０に示す可変軽鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１２】
別の実施形態では、本発明は、二重特異性抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２２２、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２５９、２６０、２６１、２６４及び２６５に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１３】
一実施形態では、本発明は、本発明のＤＲ５に結合する抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１６７、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９１及び配列番号１９９に示す可変重鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１４】
一実施形態では、本発明は、本発明のＤＲ５に結合する抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１７１、配列番号１７９、配列番号１８７、配列番号１９５及び配列番号２０３に示す可変軽鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１６７、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９１、配列番号１９９、配列番号２０７又は配列番号２０９のアミノ酸配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上同一である可変重鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗体又はこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１７１、配列番号１７９、配列番号１８７、配列番号１９５、配列番号２０３、配列番号２０８又は配列番号２１０のアミノ酸配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上同一である可変軽鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１７】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＤＲ５に結合する抗体及びこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１６７、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９１又は配列番号１９９のアミノ酸配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％％以上同一である可変重鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＤＲ５に結合する抗体及びこの断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１７１、配列番号１７９、配列番号１８７、配列番号１９５又は配列番号２０３のアミノ酸配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％％以上同一である可変軽鎖配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。
【０４１９】
ある実施形態では、このポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＡＮ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖であることができる、又は二本鎖であることができる。
【０４２０】
本発明の更なる目的では、本発明は、本発明の核酸配列を含む発現ベクターと、本発明のベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞とに関する。加えて、抗体が産生されるようにこの宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法も提供される。
【０４２１】
Ｇ．抗体変異体
ある実施形態では、上記に記載したものに加えて、本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のアミノ酸変異体が意図される。例えば、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性を改善することが望まれる場合がある。二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。そのような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトに到達するように欠失、挿入及び置換のあらゆる組み合わせを行うことができるが、但し、最終コンストラクトは所望の特性、例えば抗原結合を保持する。
【０４２２】
１．置換変異体、挿入変異体及び欠失変異体
ある実施形態では、１個又は複数個のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象の部位として、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換を、「保存的置換」という表題で表Ｂに示す。より実質的な変更を、「例示的な置換」という表題で表Ｂ記載し、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記で更に説明する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、産物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善に関してスクリーニングすることができる。
2018046823.tif 000003
【０４２３】
下記の共通の側鎖の特性に従ってアミノ酸を分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０４２４】
非保存的置換は、これらのクラスの内の１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うことができる。
【０４２５】
置換変異体の一種として、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１個又は複数個の超可変領域の残基を置換することが挙げられる。一般的には、更なる研究のために選択される、生じた変異体（１種若しくは複数種）は、親抗体と比較して、いくつかの生物学的特性の改変（例えば改善）（例えば親和性の増加、免疫原性の低下）を有することができる、及び／又は親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持することができる。例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、該親和性成熟抗体を、例えば、ファージ提示に基づく親和性成熟技法を使用して、例えば本明細書に記載した親和性成熟技法を使用して簡便に生成することができる。簡潔に言うと、１個又は複数個のＨＶＲ残基を突然変異させて変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。
【０４２６】
ＨＶＲ中で改変（例えば置換）を行って、例えば抗体の親和性を改善することができる。そのような改変を、ＨＶＲの「ホットスポット」、即ち体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照されたい）及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、生じた変異体のＶＨ若しくはＶＬを結合親和性に関して試験する。二次ライブラリから構築して再選択することによる親和性成熟が、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（O’Brien等編、Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟に関するいくつかの実施形態では、成熟のために選択した可変遺伝子に、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）の内のいずれかにより多様性を導入する。次いで、二次ライブラリを作成する。次いで、この二次ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法として、いくつかのＨＶＲ残基（例えば同時に４−６個の残基）が無作為化されているＨＶＲ特異的手法を伴う。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、抗原結合に関与するＨＶＲ残基を具体的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が標的となることが多い。
【０４２７】
ある実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１個又は複数子のＨＶＲ内で起こることができる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば本明細書に記載の保存的置換）をＨＶＲ中で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であることができる。上記に記載の変異体のＶＨ配列及びＶＬ配列に関するある実施形態では、各ＨＶＲは未改変である、又は１個以下の、２個以下の若しくは３個以下のアミノ酸置換を含むことができる。
【０４２８】
突然変異誘発のために標的化することができる抗体の残基又は領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５により説明される「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）を同定し、中性の又は多は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）に置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを確認する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置で更なる置換を導入することができる。あるいは又は加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を、置換の候補として標的化することができる、又は除去することができる。変異体をスクリーニングして、変異体が所望の特定を含むかどうかを確認することができる。
【０４２９】
アミノ酸配列の挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲であるアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合が挙げられ、単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入も更に挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体として、（例えばＡＤＥＰＴの場合は）酵素に対する抗体のＮ末端若しくはＣ末端への融合、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合が挙げられる。
【０４３０】
２．グリコシル化変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を改変して、抗体がグリコシル化される程度を増加させる又は減少させる。アミノ酸配列を改変し、それにより１個又は複数個のグリコシル化部位を作る又は除去することにより、抗体へのグリコシル化部位の追加又はグリコシル化部位の欠失を簡便に実現することができる。
【０４３１】
二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体がＦｃ領域を含む場合、該Ｆｃ領域に結合した炭化水素を改変することができる。哺乳動物細胞により産生される天然型抗体は典型的には、Ｎ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般的に結合する、分枝した二分枝オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔ等、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖として、様々な炭化水素、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸を挙げることができ、二分枝オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌＮＡｃに結合したフコースも更に挙げることができる。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体におけるオリゴ糖の改変を行って、いくつかの特性が改善されている抗体変異体を作成することができる。
【０４３２】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠く炭化水素構造を有す二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であることができる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７での糖鎖中でのフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中においておよそ２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を意味するが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の小さな配列変異に起因して、２９７位の約±３個のアミノ酸の上流又は下流、即ち２９４位と３００位との間に位置することもできる。そのようなフコシル化変異体ではＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照されたい。「非フコシル化」抗体変異体又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例として、ＵＳ  ２００３／０１５７１０８；ＷＯ  ２０００／６１７３９；ＷＯ  ２００１／２９２４６；ＵＳ  ２００３／０１１５６１４；ＵＳ  ２００２／０１６４３２８；ＵＳ  ２００４／００９３６２１；ＵＳ  ２００４／０１３２１４０；ＵＳ  ２００４／０１１０７０４；ＵＳ  ２００４／０１１０２８２；ＵＳ  ２００４／０１０９８６５；ＷＯ  ２００３／０８５１１９；ＷＯ  ２００３／０８４５７０；ＷＯ  ２００５／０３５５８６；ＷＯ  ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。非フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｅ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka等, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓ等、特に実施例１１）、並びにノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki等, Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y.等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が挙げられる。
【０４３３】
例えば二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体のＦｃ領域に結合している二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分されたオリゴ糖を有する二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体が更に提供される。そのような二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体では、フコシル化が低減されている及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ等）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａ等）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ等）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体ではＣＤＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ等）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０４３４】
３．システインにより操作された抗体変異体
ある実施形態では、システインにより操作された二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体、例えば二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の１個又は複数個の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、残基の置換は、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の接近可能な部位で生じる。この残基をシステインで置換することにより、抗体の接近可能な部位に反応性チオール基が位置し、この反応性チオール基を使用して抗体をその他の部分、例えば薬物部分又はリンカー薬物部分とコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作成することができる。ある実施形態では、下記の残基の内の何れか１個又は複数個をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインにより操作された抗体を、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成することができる。
【０４３５】
Ｈ．組み換え方法及び組み換え組成物
例えば固体状のペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組み換え産生により、本発明の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体を得ることができる。組み換え産生の場合、例えば上述したような、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体（又は断片）をコードする１種又は複数種のポリヌクレオチドを単離し、更なるクローニング及び／又は宿主細胞中での発現のために１種又は複数種のベクターに挿入する。そのようなポリヌクレオチドを、従来の手順を使用して容易に単離して配列決定することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド内の１種又は複数種を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に公知である方法を使用して、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）のコード配列を適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含む発現ベクターを構築することができる。この方法として、インビトロ組み換えＤＮＡ技法、合成技法及びインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載されている技法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスの一部であることができる、又は核酸断片であることができる。発現ベクターは、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（即ちコード領域）がプロモーター及び／又はその他の転写若しくは翻訳の制御要素と作動可能に共にクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分のことである。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部であると見なすことができる。しかしながら、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域等の隣接領域はいずれもコード領域の一部ではない。単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別々の（異なる）ベクター上に、２個又はそれ以上のコード領域が存在することができる。さらに、あらゆるベクターは単一のコード領域を含むことができ、又は２個若しくはそれ以上のコード領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは１種又は複数種のポリペプチドをコードすることができ、該ポリペプチドは、翻訳後に又は翻訳と同時に、タンパク質切断により最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）、これらの変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合している又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域として、特殊化した要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。作動可能な結合とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドの発現が調節配列（１種又は複数種）の影響下に又は制御下に置かれるように、遺伝子産物のコード領域が１種又は複数種の調節配列に結合している場合のことである。プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じ、２個のＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこのポリペプチドコード領域に結合したプロモーター）間の結合の性質が発現調節配列の遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない又はＤＮＡ鋳型の転写される能力に干渉しない場合、２個のＤＮＡ断片が「作動的に結合している」。従って、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を生じさせることができた場合、プロモーター領域は、この核酸と作動可能に結合しているだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーター以外のその他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終止シグナルをポリヌクレオチドに作動可能に結合させて細胞特異的転写を指示させることができる。適切なプロモーター及びその他の転写制御領域を本明細書で開示する。様々な転写制御領域が当業者に知られている。この転写制御領域として、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられるがこれに限定されず、この転写制御領域として、サイトメガロウイルス由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片（例えば、前初期プロモーター及びイントロンＡ）、シミアンウイルス４０由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片（例えば初期プロモーター）、並びにレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス等）由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片が挙げられるがこれらに限定されない。その他の転写制御領域として、脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ−グロビンが挙げられ、真核細胞における遺伝子発現を制御可能なその他の配列も更に挙げられる。更なる適切な転写制御領域として、組織特異的なプロモーター及びエンハンサーが挙げられ、誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）も更に挙げられる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。この翻訳制御要素として、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終止コドン、並びにウイルスシステムに由来する要素（特に内部リボソーム浸入部位、即ちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が挙げられるがこれらに限定されない。発現カセットは、複製起点及び／又は染色体の組み込み要素、例えばレトロウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復配列（ＩＴＲ）等のその他の特徴を含むこともできる。
【０４３６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域を、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができ、これらのペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する。例えば、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の分泌が望まし場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗体若しくは本発明のＤＲ５に結合する抗体又はこれらの断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、伸長しているタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド配列又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般的に、このポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有し、翻訳されたポリペプチドから該シグナルペプチドが切断されて、分泌された又は「成熟した」形態のポリペプチドが産生されることを認識している。ある実施形態では、天然型シグナルペプチド、例えば免疫グロブリンの重鎖シグナルペプチド若しくは軽鎖シグナルペプチドが使用される、又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するこの配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はこの機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒトの組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスのβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【０４３７】
その後の精製を容易にするために使用される可能性がある短いタンパク質配列（例えばヒスチジンタグ）又は二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体の標識化に役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド内に又は該ポリヌクレオチドの端部に含ませることができる。
【０４３８】
更なる実施形態では、本発明の１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある実施形態では、本発明の１種又は複数種のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関して本明細書に記載した特徴の内の何れかを単独で又は組み合わせて包含することができる。そのような一実施形態では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、該ベクターにより形質転換されている又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本発明の二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体又はこれらの断片を生成するように操作され得るあらゆる種類の細胞系を意味する。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を複製するのに適した宿主細胞及びこれらの抗体の発現を支持するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で公知である。そのような細胞を、特定の発現ベクターにより適切にトランスフェクトする又は形質導入することができ、大規模な発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させて、臨床応用に十分な量の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を得ることができる。適切な宿主細胞として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等の様々な真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化が必要でない場合には、細菌中でポリペプチドを産生することができる。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから単離して可溶画分を更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニング宿主又は発現宿主であり、この真核微生物として、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、それにより部分的な又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドが産生される真菌株及び酵母株が挙げられる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクション用に、昆虫細胞と共に使用することができる多数のバキュロウイスル株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号及び米国特許第第６４１７４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技法を説明している）を参照されたい。脊椎動物細胞を宿主として使用することもできる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞も有用であることができる。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、ＳＶ４０により形質転換されている��ル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えばGraham等, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されている２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されている）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）等のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにミエローマ細胞、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞の概説に関して、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞として、培養細胞、例えばほんの一部として哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物組織若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は真核細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。
【０４３９】
これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技法は、当該技術分野で公知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞を、その他の抗体鎖も発現するように操作し、その結果、発現産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であることができる。
【０４４０】
一実施形態では、本発明に係る二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の発現に適した条件下で、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（又は宿主細胞の培地）から二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を回収することを含む。
【０４４１】
二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の成分は、互いに遺伝子学的に融合する。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、その成分が互いに直接的に又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さを、当該技術分野で公知の方法に従って決定することができ、有効性に関して試験することができる。二重特異性抗体の様々な成分間のリンカー配列の例は、本明細書に記載の配列中に見出される。必要に応じて融合の個々の成分を分離すべく切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むために、更なる配列を含めることもできる。
【０４４２】
ある実施形態では、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部を形成するＦａｂ断片は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体又はこの断片の一部を形成し、これらに由来することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野で公知である（例えばHarlow及びLane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。非天然に存在する抗体を、固相−ペプチド合成を使用して構築することができる、組み換えにより産生することができる（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載されている）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照されたい）。
【０４４３】
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体で使用することができる。本発明において有用である非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス起源、霊長類起源又はヒト起源であることができる。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体がヒトでの使用を目的とする場合、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ形態の抗体を使用することができる。ヒト化形態又は完全ヒト形態の抗体を、当該技術分野で公知の方法に従って調製することもできる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照されたい）。ヒト化を様々な方法により実現することができ、この方法として、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば良好な抗原結合親和性若しくは抗体機能を保持するのに重であるフレームワーク残基）の有無に関わらず、非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲをヒト（例えばレシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ若しくはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが表面残基の置き換えによりヒト様断片でそれらを「覆う」ことが挙げられるがこれらに限定されない。ヒト化抗体及びこの作製方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３，１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、米国特許第７５２７７９１号、米国特許第６９８２３２１号及び米国特許第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）のグラフィティングを説明している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を説明している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を説明している）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを説明している）に更に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域を、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏ���  ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０、４５０−４５９（２００８）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により生成されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成し、これに由来することができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域を、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫源を投与することにより調製することもできる（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域を、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することもできる（例えばHoogenboom等. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554; Clackson 等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい）。ファージは典型的には、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のどちらかとして提示する。
【０４４４】
ある実施形態では、本発明において有用なＦａｂ断片を、例えば、内容全体が出典明示により援用される米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って結合親和性を高めるように操作する。本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の特定の抗原決定基に結合する能力を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られているその他の技法、例えば表面プラズモン共鳴技法（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システムで解析される）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）の何れかにより測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合に関して参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定することができる。ある実施形態では、そのような競合する抗体は、参照抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば直鎖エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする詳細で例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に記載されている。例示的な競合アッセイでは、固定化されている抗原を、抗原に結合する第１の標識された抗体と、抗原への結合に関して第１の抗体と競合する能力を試験する第２の未標識の抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在することができる。コントロールとして、固定化されている抗原を、第１の標識された抗体を含むが第２の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合の抗体を除去し、固定化されている抗原と結合した標識の量を測定する。固定化されている抗原と結合した標識の量が、コントロール試料と比べて試験試料中で実質的に減少している場合、このことは、抗原への結合に関して第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
【０４４５】
本明細書に記載されているように調製された二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、当該技術分野で既知の技法、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用する実際の条件は、正味の荷電、疎水性、親水性等の因子にある程度依存しており、当業者には明らかであるだろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合には、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合には、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスを使用することができる。逐次的なプロテインＡ又はプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的には実施例に記載されるように二重特異性抗体を単離することができる。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の純度を、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等の様々な公知の分析法の内の何れかにより測定することができる。
【０４４６】
I．アッセイ
本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体並びにＤＲ５に結合する抗体を、当該技術分野で既知の様々なアッセイにより、それらの物理的な／化学的な特性及び／又は生物学的活性に関して同定することができる、スクリーニングすることができる、又はこれらの特徴を明らかにすることができる。
【０４４７】
１．親和性アッセイ
本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のＤＲ５及び／ＦＡＰに対する親和性を、標準的な器具類、例えばＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施例に記載の方法に従って測定することができ、受容体又は標的タンパク質等を、組み換え発現により得ることができる。あるいは、本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のＤＲ５及び／又はＦＡＰへの結合を、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明であり例示的な実施形態を下記に及び下記の実施例に記載する。
【０４４８】
一実施形態によれば、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機械（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によりＫＤを測定する。
【０４４９】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付けた組み換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化されている抗Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により補足し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡潔に言うと、カルボキシルメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合タンパク質が約６５００反応単位（ＲＵ）になるように５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応の群を阻害する。続いて、Ｆｃ受容体を４ｎＭ又は１０ｎＭで６０秒にわたり補足する。動力学的測定のために、二重特異性コンストラクトの４倍段階希釈液（５００ｎＭから４０００ｎＭの範囲）を、１２０秒にわたり３０μｌ／分の流速、２５℃でＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で注入する。
【０４５０】
標的抗原に対する親和性を測定するために、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体に関して記載したように、二重特異性コンストラクトを、活性化ＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異性抗体ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により補足する。結合タンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトを３００ｎＭで９０秒にわたり補足する。標的抗原は、３０μｌ／分の流速、２５０から１０００ｎＭの範囲の濃度で１８０秒にわたりフローセルを通過する。解離を１８０秒にわたりモニタリングする。
【０４５１】
バルクの屈折率の差を、参照フローセルで得た応答を引くことにより補正する。定常状態の応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングにより解離定数ＫＤを導き出した。結合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時にフィットさせるにより単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を使用して、結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３、８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
【０４５２】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の既知の方法により抗原結合活性に関して試験する。
【０４５３】
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＦＡＰ又はＤＲ５それぞれへの結合に関して特定の抗ＦＡＰ抗体又は特定の抗ＤＲ５抗体と競合する抗体を同定することができる。ある実施形態では、そのような競合する抗体は、特定の抗ＦＡＰ抗体又は特定の抗ＤＲ５抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば直鎖エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする詳細で例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に記載されている。更なる方法が実施例セクションに記載されている。
【０４５４】
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有する、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体又はＤＲに結合する抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性として、例えばＤＮＡ断片化、アポトーシスの誘導及び標的細胞の溶解を挙げることができる。そのような生物活性をインビボで及び／又はインビトロで有する抗体も提供される。
【０４５５】
ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をそのような生物活性に関して試験する。（例えばＬＤＨ放出の測定による）細胞溶解を検出するためのアッセイ又は（例えばＴＵＮＥＬアッセイを使用する）アポトーシスを検出するためのアッセイは、当該技術分野で公知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイが国際公開第２００４／０６５５４０号（実施例１を参照されたい）にも記載されており、国際公開第２００４／０６５５４０号の内容全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０４５６】
Ｊ．薬学的製剤
本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の薬学的製剤を、所望の程度の純度を有するそのような二重特異性抗体又は抗体と、１種又は複数種の任意選択的な薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.編(1980)）とを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で調製する。薬学的に許容される担体は一般的に、採用する投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、該担体として下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニン等の抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個の残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリン等のその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体として、可溶型の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の間質性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０等のいくつかの例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１種又は複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと混合される。
【０４５７】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤として、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されたものが挙げられ、後者の製剤としてヒスチジン−酢酸塩バッファーが挙げられる。
【０４５８】
本明細書における製剤は、治療される特定の症状に必要な複数種の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する有効成分を含むこともできる。そのような有効成分は、意図する目的に有効である量での組み合わせで適切に存在する。
【０４５９】
有効成分を、例えばコアセルベーション技法により又は界面重合により調製されているマイクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルション中に封入することができる。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０４６０】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、この半透性マトリックスは、造形品の形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０４６１】
インビボ投与のために使用する製剤は一般的に無菌である。無菌状態を、例えば滅菌濾過膜に通す濾過により容易に実現することができる。
【０４６２】
Ｋ．治療方法及び治療用組成物
本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体並びにＤＲ５に結合する新規の抗体の内の何れかを治療方法で使用することができる。
【０４６３】
一態様では、医薬として使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療において使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、治療方法において使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合するための二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、本発明は、有効量の、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を提供する。そのような一実施形態では、この方法は、例えば下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」は、好ましくはヒトである。好ましい一実施形態では、前記がんは膵がん又は結腸直腸癌である。
【０４６４】
一態様では、医薬として使用するためのＤＲ５に結合する抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療において使用するためのＤＲ５に結合する抗体が提供される。ある実施形態では、治療方法において使用するためのＤＲ５に結合する抗体が提供される。ある実施形態では、本発明は、ＤＲ５に結合する有効量の抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するためのＤＲ５に結合する抗体を提供する。そのような一実施形態では、この方法は、例えば下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」は、好ましくはヒトである。好ましい一実施形態では、前記がんは膵がん又は結腸直腸癌である。
【０４６５】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の使用を提供する。別の態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるＤＲ５に結合する抗体の使用を提供する。一実施形態では、医薬はがんの治療用である。更なる実施形態では、医薬は、有効量の医薬を、がんを有する個体に投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためである。そのような一実施形態では、この方法は、例えば下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」はヒトであることができる。
【０４６６】
更なる態様では、本発明は、がんを治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、有効量の、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体を、がんを有する個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、この方法は、下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」はヒトであることができる。好ましい一実施形態では、前記がんは膵がん又は結腸直腸癌である。
【０４６７】
更なる態様では、本発明は、例えば上記治療方法の内の何れかにおいて使用するための、本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の内の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の内の何れかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の内の何れかと、例えば下記に記載する、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
【０４６８】
更なる態様では、本発明は、例えば上記治療方法の内の何れかにおいて使用するための、本明細書に記載のＤＲ５に結合する抗体の内の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５に結合する抗体の内の何れかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５に結合する抗体の内の何れかと、例えば下記に記載する、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
【０４６９】
本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体を、非経口投与、肺内投与及び鼻腔内投与、並びに局所的治療が望ましい場合には病巣内投与等のあらゆる適切な手段により投与することができる。非経口注入として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与が挙げられる。投与が短期間であるか又は慢性的であるかにある程度依存して、あらゆる適切な経路により、例えば静脈内注射又は皮下注射等の注射により投薬することができる。様々な時点での単回投与又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス点滴が挙げられるがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
【０４７０】
本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体は、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、投薬され、及び投与されるだろう。この状況で考慮される因子として、治療する個々の障害、治療する個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング及び医療施術者に既知のその他の因子が挙げられる。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体は、そうする必要はないが選択的に、問題となっている障害を予防する又は治療するために現在使用される１種又は複数種の薬剤と共に製剤化される。そのようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び上記で論じたその他の因子に依存する。その他の薬剤は一般的に、本明細書に記載したのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１から９９％で、又は任意の投与量で、又は適切であると実験的に／診療的に確認されている任意の経路により使用される。
【０４７１】
疾患の予防又は治療の場合、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、抗体のタイプ、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体を予防目的で投与するか又は治療目的で投与するかに関わらず疾患の重症度及び経過、過去の治療、患者の病歴及び二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するだろう。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体は、例えば１回若しくは複数回の投与によるか又は連続的注入によるかに関わらず、患者への投与のための最初の候補の投与量であることができる。１つの典型的な１日の投与量は、上述した因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲の可能性がある。数日又はより長い期間にわたる反復投与の場合、状態に応じて、治療は一般的に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで継続されるだろう。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であるだろう。そのため、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの内の１種又は複数種の投与量を患者に投与することができる。そのような用量を、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば、二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体を患者に約２回から約２０回投与するように、又は例えば二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体を約６回投与するように）投与することができる。最初により高い負荷の用量で、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与することができる。しかしながら、その他の投与レジメンも有用であることができる。この治療の経過は、従来の技法及びアッセイで容易にモニタリングされる。
【０４７２】
本発明のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する新規の抗体の代わりに又はこれらの抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して上記製剤又は治療法の内の何れかを実行することができることが理解される。
【０４７３】
Ｌ．製品
本発明の別の態様では、上記した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製品が提供される。製品は、容器と、該容器上の又は該容器に関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器として、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。ガラス又はプラスチック等の様々な材料で容器を形成することができる。容器は、単独で、又は疾患を治療する、予防する及び／若しくは診断するのに効果的な別の組成物と混合されている組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。しかしながら、製品は、（ａ）組成物が入っている第１の容器であって、該組成物が、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）組成物が入っている第２の容器であって、該組成物が、更なる細胞傷害性の又は治療用の薬剤を含む、第２の容器とを含むことができる。本発明の本実施形態における製品は、組成物を使用して特定の疾患を治療することができることを示す添付文書を更に含むことができる。あるいは又は加えて、製品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストローズ溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に含むことができる。その他のバッファー、希釈液、フィルタ、針及びシリンジ等の商業上又は使用者の観点から望ましいその他の物質を更に挙げることができる。
【０４７４】
上記製品の内の何れかは、本発明のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する新規の抗体の代わりに又はこれらの抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを含むことができることが理解される。
【実施例】
【０４７５】
ＩＩＩ．  実施例以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に示した一般的な説明を考慮に入れ、多様な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０４７６】
前述の発明は、理解の明確性の目的で一部の詳細において実例及び例として記載されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に引用されている全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明白に組み込まれている。
【０４７７】
実施例１：  ＤＲ５−ＦＡＰデスレセプターアゴニスト二重特異性抗体は、１種の細胞株のアポトーシスを、第２の細胞株による架橋結合を介して媒介することができる。
（腫瘍細胞によって発現される抗原を介した架橋結合とは別に）ＤＲ５としてのデスレセプターの架橋結合によるアポトーシスの誘導の１つの手法は、腫瘍を取り囲んでいる間質を標的とすることである。この場合には、標的化された抗原は、腫瘍細胞によって直接提示されるのではなく、第２の、異なる細胞型による。この種の抗原の一例は、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）であろう。このタンパク質は活性化された線維芽細胞上で発現されるが、これらの細胞は腫瘍間質内で見出される。
【０４７８】
ヒトＤＲ５及び腫瘍間質からの抗原を標的とする二重特異性デスレセプターアゴニスト抗体を使用した腫瘍標的化アポトーシス誘導の可能性を調査するために、ＤＲ５を認識するＩｇＧ１部分及び該抗体の重鎖のＣ末端に融合したＦＡＰ結合ｓｃＦｖからなる二重特異性分子を作製した。ＤＲ５を標的とするＩｇＧの配列は、ＵＳ２００７／００３１４１４Ａ１に記載のドロジツマブ配列から得られた。ＦＡＰ結合ｓｃＦｖ部分の可変の重鎖及び軽鎖の配列は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ１号に記載のファージディスプレイによって単離されたＦａｂ抗ＦＡＰ分子（３Ｆ２又は４Ｇ８）から得られた。これらのＦＡＰ  ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）２コネクターによって抗ＤＲ５  ＩｇＧの重鎖又は軽鎖のＣ末端に融合する。両方の抗ＦＡＰ抗体は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）上の異なるエピトープに結合し、且つヒト、マウス及びカニクイザルの抗原と交差反応性である。
2018046823.tif 000004
【０４７９】
この種の設定では、２種の異なる細胞株をインビトロ活性アッセイに使用しなければならない。１種の細胞株（標的細胞株）は、ヒトＤＲ５を発現しなければならず、アポトーシス能がなければならないが、ＦＡＰを発現する必要はない。第２の細胞株（エフェクター細胞株）は、（アポトーシス耐性によって又はＤＲ５を発現しないことによっての何れかで）アポトーシス陰性でなければならないが、表面上でＦＡＰを発現する必要がある。
【０４８０】
望ましい基準を満たす１種の可能なエフェクター細胞株は、ヒト線維芽細胞細胞株ＧＭ０５３８９である。図１ａに示されているように、この細胞株は、試験した最高の抗体濃度（１０μｇ／ｍｌ）でのみＦＡＰ発現が示された細胞株ＳＷ８７２と比較して著しいレベルのＦＡＰを発現するが、図１ｂに示されているように非架橋ドロジツマブによるアポトーシスを受けない。したがって、この細胞株は、第２の細胞株において発現される抗原を介した架橋結合によって標的細胞株のＤＮＡ断片化が誘導されるアポトーシスアッセイにおける可能性を秘めたエフェクター細胞株であるように見える。
【０４８１】
標的細胞株としてヒト腎腺癌細胞株ＡＣＨＮ又はヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が使用された。これらは、比較可能な、低レベルのＤＲ５を発現し（図２）、ＤＲ５に媒介されるアポトーシス誘導に感受性である。図３に、ＦＡＰを介したＤＲ５の腫瘍標的化架橋結合による、ＡＣＨＮ及びＧＭ０５３８９細胞株の組合せと比較した、ＡＣＨＮ細胞のＤＮＡ断片化の誘導の結果がまとめられている。コントロール抗体（ドロジツマブ）は、両方の細胞株において、Ｆｃ部分を標的とする二次抗体を介した架橋結合によりアポトーシスを誘導する（白棒）が、架橋結合なしでもいくらかの活性を示す。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子は、標的細胞株及びエフェクター細胞株の両方の存在下でアポトーシスの有意な誘導を示す（黒棒）。ＦＡＰ発現線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）なしでは、非架橋ドロジツマブと比較して僅かに増強されたアポトーシスがある（灰棒）。本発明者らは、ＡＣＨＮ細胞上のＤＲ５受容体が、線維芽細胞細胞株ＧＭ０５３８９によって発現されるＦＡＰ抗原に結合することにより、架橋されるという方法でこの結果を解釈している。全ての分子は、比較可能な最高のアポトーシス活性を示している。
【０４８２】
実施例２：  ドロジツマブに融合したｓｃＦａｂフォーマットの交差反応性ＦＡＰバインダーを有するＤＲ５二重特異性アゴニスト抗体は、共培養アッセイにおいてアポトーシス活性を示す
実施例１において実証したように、ｓｃＦｖフォーマットのＦＡＰ標的化部分がドロジツマブ重鎖又は軽鎖のＣ末端に融合した（２×２フォーマット）、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性アゴニスト抗体は、１種の細胞株がＦＡＰを発現する（エフェクター細胞）一方で第２の細胞株がＤＲ５受容体標的として役割を果たす、２種の細胞株の共培養の設定においてアポトーシスを誘導することができる。
【０４８３】
ｓｃＦｖ融合を含んでいるこれらの分子は、いくつかの不利な特性（少ない産生収量及び凝集体を形成する傾向）を示したので、表２に記載の４種の異なる分子の産生をもたらす、ドロジツマブの重鎖又は軽鎖の何れかのＣ末端に融合した、ＦＡＰ結合ユニットが単鎖Ｆａｂ単位（ｓｃＦａｂ）によって置換されたコンストラクトを作製した。これらの二重特異性分子のＩｇＧ部分へのｓｃＦａｂユニットの連結は、（Ｇ４Ｓ）４配列を介して生じるが、ｓｃＦａｂ内部リンカーは３２アミノ酸からなる。
【０４８４】
これらの分子は、標準的な組換え技術によって一過的に産生され、ＦＡＰ及びＤＲ５の結合の詳細な試験用に十分な量及び良好な質で精製される（ＦＡＣＳ；Ｂｉａｃｏｒｅ、示していない）。
2018046823.tif 000005
【０４８５】
第２の、ＦＡＰを発現している「エフェクター」細胞株（例えば、線維芽細胞株ＧＭ０５３８９）の存在及び非存在下における、ＤＲ５を発現している標的細胞株（例えば、腎癌細胞株ＡＣＨＮ）のアポトーシス誘導の分析を図４ａ及び４ｂに示している。アポトーシス誘導は、ＤＮＡ断片化アッセイで分析された。このアッセイにおいて１：１のエフェクター細胞に対する標的の比を使用し、ドロジツマブ、高架橋ドロジツマブ又は二重特異性コンストラクト（全てが１μｇ／ｍｌ及び０．１μｇ／ｍｌの濃度で使用される）の存在下における共培養の２４時間後のＤＮＡ断片化を分析した。
【０４８６】
試験した全てのコンストラクトについて、二重特異性分子は、ｓｃＦａｂがドロジツマブに融合しているので使用されるＦＡＰバインダー（３Ｆ２又は４Ｇ８の何れか）とは独立して、ＡＣＨＮ標的細胞において線維芽細胞エフェクター細胞株の存在下のみで増強されたアポトーシス誘導を示すことが実証され得た。しかし、高濃度の二重特異性分子では、ＦＡＰを発現している線維芽細胞の非存在下で低い程度のアポトーシス活性が認められ得た。全体的に、且つ使用されるＦＡＰバインダーとは独立して、重鎖のＣ末端にｓｃＦａｂ融合を有する分子は、ｓｃＦａｂが軽鎖のＣ末端に融合した分子と同様により活性であった。さらに、４Ｇ８を含んでいるコンストラクトは、３Ｆ２を含んでいる分子よりもより強力であるように見えた。しかし、ｓｃＦａｂに基づいたフォーマットの活性は、類似のｓｃＦｖに基づいたコンストラクトと比較してより低かった。
【０４８７】
抗Ｆｃ抗体によるさらなる架橋結合のないドロジツマブは、低いアポトーシス誘導を示した。しかし、抗Ｆｃ二次抗体のみを介して高架橋結合されたドロジツマブ−高度に人工的な状態−では、試験した分子の何れによっても到達され得なかった最も高いアポトーシス活性が認められた。
【０４８８】
実施例３：  ＣｒｏｓｓＦａｂフォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性アゴニスト抗体は、ｓｃＦａｂを含んでいる分子を超える優れた特性を示す
ｓｃＦａｂを含んでいる評価した二重特異性分子は、依然としていくつかの不利な特性（例えば、少ない発現収量、最適化可能なアポトーシス活性）を示したので、これらの負い目を克服するはずである新規フォーマットを分析した：ドロジツマブ重鎖のＣ末端へのＣｒｏｓｓＦａｂフォーマットのＦＡＰバインダー（４Ｇ８）の融合体。このフォーマットにおいてＦＡＰ結合部分は、表３に記載し図５に示しているようなＦａｂ断片内の可変領域の「クロスオーバー」交換において使用される。ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、２０ｍｅｒのコネクター（（Ｇ４Ｓ）４）を介してドロジツマブ重鎖に結合される。
2018046823.tif 000006
【０４８９】
両方のＣｒｏｓｓＦａｂ分子（これらのコンストラクトの構成については図５も参照されたい）を、（接着細胞又は浮遊細胞の何れかの）ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生させ、標準的な方法で精製した。表４に示しているように、ｓｃＦａｂ及びｓｃＦｖを含んでいる二重特異性コンストラクトと比較して、ＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、許容される少ない凝集体含有量で、約１０倍高い産物収量をもたらす有意に増強された発現量を示した。
【０４９０】
図６は、異なる二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子の産生中の凝集体含有量を示している。ドロジツマブ重鎖のＣ末端へのｓｃＦｖ（Ａ）、ｓｃＦａｂ（Ｂ）及びＣｒｏｓｓＦａｂ（Ｃ）の融合体について、精製中の調製用サイズ排除クロマトグラフィーからのクロマトグラムを示している。ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂの融合コンストラクトは、ＣｒｏｓｓＦａｂを含んでいる分子と比較して、有意により多い凝集体含有量を示す。これらの凝集体の精製中の除去は、精製後に得られる収量から簡単に知ることができる、材料の膨大な損失をもたらす。
【０４９１】
組換えＨＥＫ２９３細胞において発現される、ヒトＦＡＰに対するこれらの分子の結合を、ＦＡＣＳ分析によって検出した。図７は、類似のｓｃＦａｂコンストラクト（ハッチ付きの棒）又は対応しているＦＡＰ（４Ｇ８）ＩｇＧ分子（黒棒）と比較した、２種のドロジツマブ−ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（ドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ａ、ドット付きの棒及びドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ｂ、白棒）のＦＡＣＳ結合結果を示している。ＩｇＧコンストラクトにより、４Ｇ８  ＦＡＰ結合部分は、試験したＦＡＰバインダーに対するＮ末端阻害効果を有していないことが示されている通り、この融合部位（４Ｇ８  ＦＡＰ結合部分）がドロジツマブ重鎖のＣ末端に融合している３種の全ての二重特異性分子は、同様に又は同様の範囲で、組換えＨＥＫ細胞の膜において発現されるヒトＦＡＰに結合している。このアッセイにおいて使用される陰性コントロール分子（二次検出抗体及びドロジツマブ）は、ＦＡＰを発現しているＨＥＫ細胞に検出可能な様式で結合しない。
2018046823.tif 000007
【０４９２】
図８に、ＤＲ５及びＦＡＰへの二重特異性ＣｒｏｓｓＦａｂ分子の同時の結合を評価した、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）の結果を示している。このアッセイのために、抗原（Ｆｃ融合体としてのヒトのＤＲ５、配列番号３１６）をＢｉａｃｏｒｅチップにカップリングさせ、その後、第１の被分析物としてのＣｒｏｓｓＦａｂ分子の注入を行った。ＤＲ５へのｓｃＦａｂ分子の結合後、組換え可溶性ヒト又はマウスＦＡＰ（配列番号１５６及び１５７）を、第２の被分析物として使用した。第２の被分析物の注入に応じて得られる、第１の被分析物の注入後の全応答率の上昇によって示されるように、試験した全ての二重特異性分子について、ＤＲ５並びにヒト及びマウスのＦＡＰに対する濃度依存的な同時の結合が実証された。両方の四価二重特異性ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（２×２；ドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ａ及びドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ＿Ｂ）は、ＤＲ５並びにヒト及びマウスのＦＡＰに対する同様の結合を示した（図８；Ａ−Ｄ）。
【０４９３】
図９は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における、ＦＡＰを発現している線維芽細胞ＧＭ０５３８９の非存在下又は存在下における、２４時間のドロジツマブ対２種の異なる二重特異性ドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰ分子及び１つのＤｒｏｚｉｔｕｍａｂ＿４Ｇ８＿ｓｃＦａｂコンストラクトの後のＤＮＡ断片化アッセイによって決定されるようなアポトーシスの誘導を示す。適用された条件下で、高架橋ドロジツマブ及び二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子は、濃度依存的なアポトーシスの誘導を示す。これらの二重特異性コンストラクトは、低濃度では、いわゆるバイスタンダーアポトーシス（ＤＲ５及びＦＡＰを発現している細胞株の存在があるときのみのアポトーシス活性）に依存しているように見えたのに対して、これらは、高濃度では、単独でもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスを誘導した。高架橋ドロジツマブは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のみが存在したときに、低濃度でも高レベルのアポトーシスを誘導した。両方の二重特異性分子は、０．７ｎＭの濃度ですでに最高のアポトーシス誘導を示した。
【０４９４】
ＦＡＰを介する架橋結合に依存している二重特異性コンストラクトのアポトーシス誘導活性についてそれらの特異性を試験するために、異なるアッセイ設定を選択した（図１０）。この設定において、組換えヒトＦＡＰ又は関連のないコントロールタンパク質（白棒）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。これらのタンパク質を二重特異性分子又は適切なコントロールと共にインキュベートし、その後、標的細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を添加して、２４時間インキュベートした。図１０に示しているように、高架橋ドロジツマブ（灰棒）、二重特異性ｓｃＦａｂ分子（ハッチ付きの棒）及び二重特異性ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（黒棒）について、アポトーシス誘導を示す濃度依存的なＤＮＡ断片化を実証することができた。架橋ドロジツマブでのアポトーシス誘導は、（試験した全濃度範囲にわたり）常に、コーティングされたＦＡＰ又はコントロールタンパク質と同一の範囲であったのに対して、ＣｒｏｓｓＦａｂ分子のアポトーシス活性は、ＦＡＰをプレート上にコーティングしたときに、コントロールタンパク質と比較して、より高かった。０．７ｎＭ以下の濃度において、有意なアポトーシスは、コーティングされたＦＡＰの存在下においてのみ検出することができた。これは、標的ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上でのＤＲ５の特異的な架橋結合を示す。ドロジツマブ重鎖のＣ末端にＣｒｏｓｓＦａｂとして融合したＦＡＰ部分を含んでいる二重特異性ドロジツマブ−ＦＡＰコンストラクトは、図１１に示しているように、２４時間にわたる共培養アポトーシス試験（ＤＮＡ断片化アッセイ）において分析された異なる腫瘍細胞株について、試験した濃度でドロジツマブ単独を超える優れたアポトーシス誘導を示す。このアッセイでは、ＦＡＰを発現している線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）を、ドロジツマブ、抗Ｆｃ抗体で架橋されたドロジツマブ、又はドロジツマブ−Ｘ−ＦＡＰコンストラクトの何れかの存在下において（全て７ｎＭ及び０．７ｎＭの濃度で）、一連の異なる腫瘍細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、乳がん、黒棒；Ｕ−８７ＭＧ、膠芽細胞腫、灰棒；ＦａＤｕ、頭頸部、白棒及びＡ５４９、肺がん、ハッチ付きの棒）と共培養した。７ｎＭの濃度における架橋ドロジツマブのアポトーシス誘導を１００％に設定し、試験した他の分子の活性をそれに従って算出した。７ｎＭの濃度におけるドロジツマブ単独では、（試験した腫瘍細胞株に依存して）最高５０％の活性が示されたのに対して、ＣｒｏｓｓＦａｂ分子では、試験した全ての細胞株で高架橋ドロジツマブの７５−９０％の範囲内のアポトーシス誘導が示された。０．７ｎＭにおけるドロジツマブ単独では低い活性が示されたのに対して、二重特異性分子では有意なアポトーシス誘導活性（ＦａＤｕ細胞で最高１００％、試験した他の細胞株では６０及び９０％の間）が示された。
【０４９５】
実施例４：  新規ＤＲ５バインダーの作製のための抗原の調製及びスクリーニング手段
二重特異性フォーマットのドロジツマブには、最適状態に及ばないいくつかの特性（低産生能、架橋結合なしで活性がある、Ｎ末端融合体は抗体を不活性化させる）があるため、これらの負い目を解決する新しいＤＲ５抗体を単離した。新規ＤＲ５バインダーの単離において及びそれらのスクリーニング及び選択に使用される好適な抗原を作製するために、一連の融合タンパク質を構築した。（図１２に示しているような）以下のフォーマットを作製するために、各受容体遺伝子細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からコード領域をＰＣＲによって増幅して、一般的なタンパク質パートナーに融合させた：
１．細胞外ドメイン（ＥＣＤ）がＡｖｉタグ及びＨｅｘａｈｉｓタグにインフレームで融合しているフォーマット
２．ＥＣＤが、ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなるヒトＩｇＧ１のＦｃに融合し、その後ろにＡｖｉタグが融合していて、ＥＣＤとＦｃとの間にＡｃＴｅｖプロテアーゼ切断部位が挿入されたフォーマット（−−（結果としてダイマーの抗原になる）
３．ＥＣＤがノブ・イントゥ・ホール変異付きでＦｃに融合する以外は２と同様であり、モノマー抗原を得るために、この抗原−Ｆｃ融合体がＦｃ−ホール対応物と共発現されるフォーマット
【０４９６】
ヒトＤＲ５及びマウスＤＲ５の配列は、既知であり、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース内に注釈が付けられていたのに対して、カニクイザルホモログの配列は、そこに記載されていない。ヒト及びアカゲザルの間の相同性に基づいてＤＲ５遺伝子配列プライマーは設計されており、カニクイザルＰＢＭＣから調製されるＲＮＡからカニクイザル抗原を単離するために使用された。簡単に説明すると、新たに単離されたカニクイザル血液から、ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを使用してＲＮＡを単離した。ＤＮＡｓｅＩ消化及びＲＮＡの溶出の後に、ＱｉａｇｅｎからのＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ｃＤＮＡの合成及び増幅）（カタログ番号２１０２１２）を使用して、既知のアカゲザルＤＲ５配列によって設計された、プライマーとしてＧＡＢ−４０３９（ＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＣ、配列番号１６３）及びＧＡＢ４０４０（ＧＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧ；配列番号１６４）を用いてカニクイザルＤＲ５遺伝子を増幅した。シークエンシングのために、ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１  Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。配列の分析により、ヒトＤＲ５細胞外ドメインに対して８９％の相同性が明らかにされた。プライマーＧＡＢ−４１４５（ＧＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＡＣＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＧ；配列番号１６５）及びＧＡＢ−４１４６（ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＣ；配列番号１６６）を使用して、カニクイザルＤＲ５遺伝子の細胞外ドメインを、ヒトＦｃとの融合で、一般的発現ベクター内にクローニングした。
【０４９７】
ＭＰＳＶプロモーターの制御下で、望ましい遺伝子の発現が生じる。さらに、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）発現ＨＥＫ２９３細胞内でのプラスミドの安定な維持のために、３’ポリアデニル化部位及びｏｒｉＰ配列が含まれている。
【０４９８】
抗原の産生のために、関連した発現ベクターを、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトした（Ｃａ２ＰＯ４を介して又はＰＥＩ依存的トランスフェクションの何れか）。５−７日間の培養後、上清を回収し、プロテインＡ結合を介して（Ｆｃを含む抗原）又はＮＩ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって（Ｈｉｓタグを含む分子）及びその後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。必要に応じて、これらのタンパク質を、Ｃ末端Ａｖｉタグを介してビオチン化した。これは、ｂｉｒＡをコードしているプラスミドのコトランスフェクション／共発現によって、インビボで又はＡｖｉｄｉｔｙ  カタログ番号ＢＩＲＡからのビオチン化キットを使用して抗原の精製後にインビトロで行うこともできた。以下の抗原は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過性の遺伝子発現によって産生された。
2018046823.tif 000008
【０４９９】
組換えヒトＤＲ４−Ｆｃ（カタログ番号３４７−ＤＲ／ＣＦ）、ＤｃＲ１−Ｆｃ（カタログ番号６３０−ＴＲ／ＣＦ）、ＤｃＲ２−Ｆｃ／カタログ番号６３３−ＴＲ／ＣＦ）及びＯＰＧ−Ｆｃ（カタログ番号８０５−＝Ｓ／ＣＦ）については、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０５００】
実施例５：  一般的なＦａｂライブラリからの新規抗ＤＲ５バインダーの単離
ヒトＤＲ５に特異性のある抗体を、Ｆａｂフォーマットの一般的なファージディスプレイ抗体ライブラリ（ＤＰ４７−３）から選択した。このライブラリは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）内に無作為化配列スペースを含むＶ−ドメイン対形成Ｖｋ３＿２０（カッパ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築された。重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ：Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲによる３種のＰＣＲ増幅断片のアセンブリによってライブラリ作製を行った。断片１は、無作為化されたＬ３を含む抗体遺伝子の５’端を含み、断片２は、Ｌ３からＨ３にかかる中央の定常断片であるのに対して、断片３は、無作為化されたＨ３及び抗体遺伝子の３’部分を含む。以下のプライマーの組合せを使用して、ＤＰ４７−３ライブラリ用にこれらのライブラリ断片を作製した：それぞれ、断片１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、断片２（ＭＳ６３−ＭＳ６４）及び断片３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリ断片の産生のためのＰＣＲパラメータは、９４℃で５分の初期変性、９４℃１分、５８℃１分、７２℃１分の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の末端伸長であった。鋳型として等モル比の３種の断片を使用する、アセンブリＰＣＲでは、パラメータは、９４℃で３分の初期変性及び５サイクルの９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃２分であった。この段階において、外側のプライマーを添加してさらに２０サイクルを行い、その後、７２℃で１０分間の末端伸長を行った。十分な量の完全長の無作為化Ｆａｂコンストラクトのアセンブリ後、これらを、同様に処理されたアクセプターファージミドベクターと一緒にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化した。２２．８μｇのＦａｂライブラリを、１６．２μｇのファージミドベクターとライゲーションした。４．２×１０１０の最終ライブラリサイズを得るために、精製されたライゲーションを６８の形質転換に使用した。Ｆａｂライブラリを提示しているファージミド粒子を、レスキューして、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択のために使用した。
【０５０１】
ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分に融合ｓいたモノマー又はダイマーのヒトＤＲ５を発現したＨＥＫ２９３に対して、選択を行った。モノマー抗原の作製のために、２種の異なるＣＨ２−ＣＨ３鎖（このうちの１種のみがＮ末端融合としてヒトＤＲ５エクトドメインを有する）のヘテロ二量体化のためにＦｃノブ・イントゥ・ホールフォーマットを適用した。これらの抗原を、ａｖｉタグを介して酵素によってビオチン化した。パニングの段階を、溶液中で以下のパターンに従って行った：１．Ｆｃバインダーを回避するための、ＮＵＮＣマキシソーププレート上に１０μｇ／ｍｌでコーティングされたｈｕ  ＩｇＧ１を使用した〜１０１２ファージミド粒子のプレクリアリング、２．１ｍｌの総容量で０．５時間の１００ｎＭのビオチン化ヒトＤＲ５に対するプレクリアリング反応の上清からの非Ｆｃ結合ファージミド粒子の結合、３．ニュートラアビジンコーティング付きマイクロタイタープレート上で１０分間のインキュベーションによる、ビオチン化されたｈｕ  ＤＲ５及び付加された特異的に結合しているファージの捕捉、４．５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを使用したビーズの洗浄、５．１ｍｌの１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）の１０分間の添加によるファージ粒子の溶出及び５００μｌの１Ｍのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和、６．交差反応性バインダーを回避するための、ヒトＤｃＲ２上での溶出されたファージ粒子のポストクリアリングステップ並びに７．上清中のファージ粒子での対数増殖期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３での感染及びその後のファージミド粒子の、その後の選択段階において使用するための、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈澱。１００ｎＭの一定の抗原濃度を使用して、選択を３段階にわたって行った。２段階目に、抗原の捕捉：ファージ複合体は、ニュートラアビジンコーティング付きマイクロタイタープレート上での捕捉の代わりに、５．４×１０７個のストレプトアビジンコーティング付き磁気ビーズを１０分間添加することによって行った。以下のように、ＥＬＩＳＡによって特異的なバインダーを同定した：１ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭのビオチン化ヒトＤＲ５又はＤｃＲ２をニュートラアビジンプレート上にコーティングした。さらに、１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１を、ＮＵＮＣマキシソーププレート上にコーティングした。Ｆａｂを含んでいる細菌の上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用することにより、結合しているＦａｂをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。ヒトＤＲ５上でシグナルを示しているが、ヒトＤｃＲ２及びヒトＩｇＧ１上では何れも示していないクローンを、さらなる分析のための最終候補リストに入れた。
【０５０２】
選択されたＦａｂクローンの親和性（ＫＤ）を、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化された、ビオチン化された一価又は二価のＤＲ５抗原を用いて、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴によって２５℃で測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原を、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで、３０μｌ／分で異なる接触時間で注入して、垂直方向において２００、４００又は８００レスポンスユニット（ＲＵ）の固定化量を達成した。被分析物の注入：ワンショット動態測定では、注入方向を水平方向に変更して、精製されたＦａｂの２倍希釈系列（１００及び３．１２５ｎＭの間の範囲に及ぶ異なる濃度）を、５０、６０又は１００μｌ／分で、分離されたチャネル１−５に沿って１２０、１８０又は２００秒の結合時間、及び２００又は２４０秒の解離時間で同時に注入した。参照のために「ラインに入っている」ブランクを得るために、第６のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）を注入した。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアにおいて単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して結合及び解離のセンサーグラムに同時に適合させることによって算出した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。再生を、水平方向において５０ｍＭのＮａＯＨを使用して１００μｌ／分の流速で１８秒の接触時間で行った。
【０５０３】
実施例６：  選択されたＤＲ５バインダーは、架橋結合に応じてアポトーシスを誘導する能力がある
架橋結合のみに応じて選択された標的細胞のアポトーシスを誘導することができるＤＲ５バインダーを同定するために、Ｆａｂライブラリから単離された抗体を、対応するｈｕ  ＩｇＧ１フォーマットに変換した。簡単に説明すると、ファージディスプレイからの４６種の固有のＤＲ５バインダーの可変重鎖及び可変軽鎖を、標準的なＰＣＲ反応によって鋳型としてＦａｂクローンを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を精製して、それらが適切なヒト定常重鎖又はヒト定常軽鎖に融合した好適な発現ベクター内に（制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼに基づくクローニングによって又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＩｎＦｕｓｉｏｎキットを使用する「リコンビニーリング」によっての何れかで）挿入した。これらのベクター内の発現カセットは、キメラＭＰＳＶプロモーター及び合成ポリアデニル化部位からなる。さらに、これらのプラスミドは、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）を有するＨＥＫ２９３細胞内でのプラスミドの安定な維持のために、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＢａｒｒウイルスからのｏｒｉＰ領域を含んでいる。抗体は、記載のように、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において５０ｍｌの規模で一過的に産生された。高速且つ高処理能力の精製のために、上清を中和して、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−５１３８−０１））と共に１６時間インキュベートした。次いで、この上清／ビーズ混合物を、平衡化された空のＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−０４３５−０１）に重力流によって通過させた。残ったビーズを２回洗浄し、低ｐＨステップで抗体を溶出させた。最後に、溶出したタンパク質を中和し、その濃度を、２８０ｎｍでの吸光度及びモル吸光係数を使用して算出した。Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  カタログ番号ＰＳＭＯ８４５００６）を使用した分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって抗体試料の凝集体含有量を分析した。
【０５０４】
この精製操作の結果を表６にまとめている
2018046823.tif 000009
【０５０５】
この小規模のトランスフェクション及び産生、並びにその後のＰｒｏｔｅｉｎＡビーズを介した精製により、極めて少ない凝集体含有量で、合理的な量の純粋な抗体が得られた。図１３（ａ−ｅ）に、アポトーシスの検出用の標準的なＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイの結果をまとめている。各抗体を、２つの異なる濃度（１．０μｇ／ｍｌ：黒棒及び０．１μｇ／ｍｌ：ハッチ付きの棒）で（架橋結合のためにそれぞれ１．０及び０．１μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ抗体を用いて）試験した。得られたデータを、１００％に設定された（１．０μｇ／ｍｌにおける）架橋ドロジツマブの最高活性に対して標準化した。分析した抗体のうちの大多数は、架橋結合後にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において濃度依存的なアポトーシスの誘導を誘導することができた。４６種のバインダーのうちの７種（１５．２％）は、両方の濃度において、ドロジツマブよりも高い活性を明白に示した。１５種の抗体（３２．６％）は、ドロジツマブと同じ活性範囲内であり、試験した分子のうちの２０種（４３．５％）は、架橋結合に応じてアポトーシスを誘導したが、ドロジツマブと比較してかなり低い程度までであった。残りの４種のバインダー（「２０Ｅ３」、「１９Ｅ６」、１Ｂ１２」及び「１９Ｃ１２」、８．７％）は、抗Ｆｃ二次抗体を介した架橋結合後でさえも、不活性であってアポトーシスを誘導しなかった。
【０５０６】
実施例７：  新規ＤＲ５バインダーの特徴づけ
アポトーシス活性スクリーニングの結果に基づいて、評価された４６種のＤＲ５抗体のうちの１２種をさらなるより詳細な分析及び特徴づけから選択した。これらの抗体を、記載のように、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において再産生させ、標準的なプロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製し、その後、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。収量及びモノマー／凝集体含有量を決定した（表７）。精製された抗体を、標的特異性、種交差反応性及び親和性に関して特徴を明らかにした（表８）。さらに、熱安定性をＤＬＳによって分析し、架橋結合抗ヒトＦｃ二次抗体の存在下又は非存在下においてアポトーシス誘導活性を比較した。
2018046823.tif 000010
2018046823.tif 000011
【０５０７】
分析した全ての抗体は、ヒトＤＲ５を特異的に認識し、且つ、ＤＲ４、デコイ受容体（ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）及びオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）等のＴＮＦＲスーパーファミリーからの最も近いヒトホモログに結合しない。全てのＤＲ５抗体は、ヒト及びカニクイザルのＤＲ５と交差反応性であるが、マウスの対応物を認識しない（これは、約３０％のみの配列相同性により予想外ではない）。ヒトＤＲ５に対する親和性は、非常に広い範囲内（１６２ｎＭから７７３ｎＭまで）であったのに対して、測定された全ての結合活性は、低い（１桁）ナノモルの範囲内であった。試験した全てのＤＲ５バインダーは、動的光散乱（ＤＬＳ）実験によって測定されるように、６０℃を十分に超える凝集温度で高い熱安定性を示す。
【０５０８】
一連の選択されたＤＲ５バインダーの機能活性を決定するために、ＤＮＡ断片化を特異的に検出するＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒｏｃｈｅ；＃１１  ７７４  ４２５  ００１）を使用してアポトーシス誘導を分析した。抗体を、１．０及び０．１μｇ／ｍｌの濃度で、架橋結合のための同濃度の抗ヒトＦｃ二次抗体の存在下で使用した。比較のために、二次抗体の非存在下で抗体を１．０μｇ／ｍｌで使用して、選択されたＤＲ５バインダーの活性が架橋結合に依存しているかどうか、又はそれらがそれら自体ですでに活性であるかどうかを評価した。ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を標的細胞株として使用した。図１４に、異なるＤＲ５バインダーのアポトーシス誘導の結果をまとめている。新たに単離されたＤＲ５抗体の全てが、架橋結合後に、コントロール抗体ドロジツマブと同一の範囲内でアポトーシスを誘導する。しかし、架橋結合なしですでに有意なアポトーシス誘導活性を示すドロジツマブと異なり、新規ＤＲ５バインダーの活性は、二次抗体を介した架橋結合に厳密に依存している。これはヒトＤＲ５に対する最高及び最低の親和性を有する抗体の両方について同様であったので、このアポトーシス活性は、ＤＲ５バインダーの、その標的に対する親和性と相関していないようである。
【０５０９】
さらなる２つのアッセイを使用して、選択されたＤＲ５バインダーの活性を評価した。架橋抗体での処理による増殖の抑制を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃ＴＢ２８８）で測定した。さらに、カスパーゼ８の誘導を、Ｃａｓｐａｓｅ８−Ｇｌｏアッセイによって決定した（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ８２０２）。図１５は、抗Ｆｃ二次抗体を介して架橋されたＤＲ５バインダーの７ｎＭの濃度における３種の異なる腫瘍細胞株の増殖の最高の抑制を示している。ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＤＬＤ−１（黒棒）に対する効果を、大細胞肺がん系ＨＣＩ−Ｈ４６０（ハッチ付きの棒）及びヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（白棒）と比較した。３種の全ての細胞株について、増殖の有意な抑制を検出することができた。７ｎＭにおけるＤＬＤ−１の増殖の抑制はＤＲ５抗体の親和性と相関しているように見えるが、これは、ＮＣＩ−Ｈ４６０には当てはまらず、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ではある程度までのみである。
2018046823.tif 000012
【０５１０】
図１６は、Ｆｃ架橋ＤＲ５抗体での処理に応じたカスパーゼ８活性化の結果をまとめたものである。３種の異なる腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１、黒棒；ＮＣＩ−Ｈ４６０、ハッチ付きの棒；及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、白棒）における最高のカスパーゼ８活性化は、７ｎＭの濃度で示される。全ての抗体について、３種の全ての細胞株において、高レベルのカスパーゼ８活性化を検出することができた。カスパーゼ８の誘導は、異なる細胞株について同一の範囲内であったが、抗体の親和性とカスパーゼ８誘導レベルの相関は、増殖の抑制についてのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにおいて認められたほど顕著ではなかった。
2018046823.tif 000013
【０５１１】
実施例８：  エピトープ分析
新たに単離されたＤＲ５バインダーによって認識されるエピトープの種類及び相対的局在の特徴をさらに詳細に明らかにするために、精製されたＩｇＧを用いてウエスタン／ドットブロット分析及びＢｉａｃｏｒｅ測定を行った。ウエスタンブロット対ドットブロットの結果の比較は、抗体が直線的又は立体構造的なエピトープを認識するかどうかを示すはずであったのに対して、ビアコア競合実験は、異なる、同一の又は部分的に重複しているエピトープを暗示するはずであった。
【０５１２】
直線的又は立体構造的なエピトープを識別するために、ヒトＤＲ５を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ニトロセルロース膜上にブロットし、異なるＤＲ５バインダーと共にインキュベートして、抗ｈｕＦｃ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ０１７０）で検出した。並行して、ヒトＤＲ５を膜上にスポットし、ＤＲ５抗体を添加して同一の二次抗体で検出した。ドットブロット実験においてのみの抗原の結合は、立体構造的エピトープを暗示するはずであった。この設定では、抗原が、その天然の三次元立体構造で分析されるのに対して、ウエスタンブロット実験では、抗原は変性されていて、直線的エピトープのみがアクセス可能なはずであるからである。
2018046823.tif 000014
【０５１３】
これらの結果に基づいて、分析した抗体のうちの大多数は、ｈｕ  ＤＲ５上の立体構造的エピトープを認識するのに対して、２種の抗体（５Ｆ６、２４Ｂ７）のみが、ウエスタンブロット分析において変性された抗原に明白に結合し、直線的エピトープに対する結合を示していると結論づけることができた。ドットブロットにおいて強く結合し且つウエスタンブロットにおいて弱く結合することは、立体構造的エピトープを暗示もするが、これは、認識された直線的ストレッチを含む（１８Ｆ１１、１８Ｈ６）。
【０５１４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）による結合競合アッセイを、２つの異なる設定で行った。古典的なサンドイッチアッセイでは、第１のＤＲ５バインダーをチップ上に固定化し、その後、ｈｕ  ＤＲ５を添加して結合させる。次いで、第２のＤＲ５抗体を注入して、ＤＲ５に対するさらなる結合について分析する。タンデム型のアッセイでは、ｈｕ  ＤＲ５をチップ上に固定化し、その後、第１のＤＲ５バインダーを添加する。次いで、第２のＤＲ５バインダーを注入して、さらなる結合について分析する。図１７は、これらの結合競合アッセイ（４種の新しいＤＲ５抗体の、ドロジツマブとの比較）の結果をまとめたものである。これらの競合アッセイから、クローン５Ｅ１１、２２Ｅ９及び１７４（ＶＨ配列番号８８、ＶＬ配列番号８９、例えば、実施例２６を参照されたい）は、共通のエピトープを共有するであろうと結論づけることができた。これらのうちの１つが一度ＤＲ５に結合していると他の２種は何れも抗原に結合することができなかったからである。これらの３種の抗体は、明白に、ドロジツマブとは異なるエピトープを認識する。クローン４２２（ＶＨ配列番号８２、ＶＬ配列番号８５、例えば、実施例２６を参照されたい）の結合部位は、５Ｅ１１、２２Ｅ９及びドロジツマブのエピトープと重複している可能性があったが、クローン１７４からのものでは明らかにそうではなかった。認識されたエピトープの疑問に対する明白な答えは、共結晶化実験（ＤＲ５＋ｍＡｂ）及びその後の構造分析から得られる可能性があった。
【０５１５】
ＤＲ５抗体が、ＤＲ５リガンド結合部位と類似又は重複するエピトープを認識するかどうかを評価するために、ＢｉａｃｏｒｅにおけるＴＲＡＩＬ競合アッセイを設定した。この目的のために、組換えｈｕ  ＴＲＡＩＬ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ  番号３１０−０４）を、ＣＭ５チップ上に固定化した。ヒトＤＲ５−Ｆｃ及びＤＲ５バインダーからなる予め形成された複合体を被分析物として使用し、固定化されているＴＲＡＩＬに対する結合を決定した。図１８に、ＴＲＡＩＬ競合実験の結果を示している。試験した複合体の何れもが、固定化されたｈｕＴＲＡＩＬに結合できないので（全ての実線）、クローン４２２（図１８ｂ中の点線）を除き、新たに単離された全てのＤＲ５バインダーは、ＤＲ５上のＴＲＡＩＬ結合部位と少なくとも重複するエピトープに結合するようである。それとは対照的に、ＤＲ５単独（破線）又はコントロール抗体とのＤＲ５の複合体（短破線）では、固定化されたリガンドに対する明らかな結合が示された。
【０５１６】
実施例９：  非リガンド競合性のＤＲ５抗体は、ＴＲＡＩＬの存在下において、リガンド競合性のバインダーと比較して増強されたインビトロのアポトーシス活性を示す
新しいＤＲ５バインダーの単離及びスクリーニング中に、ヒトＤＲ５上の異なるエピトープを認識する抗体が単離された。これらの抗体を分類する１つの可能な基準は、これらをリガンド阻害分子及びリガンド非阻害分子にグループ化することである。選択されたバインダーの中で、これらのグループのそれぞれについて１つの代表種が選択された：クローン５Ｅ１１は、ＤＲ５に結合するＴＲＡＩＬを阻害すると同定されたのに対し、クローン４２２は、リガンド非阻害抗体である（図１８）。
【０５１７】
少なくともＴＲＡＩＬ結合と重複するエピトープに対する結合の影響を評価するために、これらの２つの候補を、ヒトＴＲＡＩＬの存在下又は非存在下における抗Ｆｃ二次抗体での架橋結合後のＤＬＤ−１  ＣＲＣ標的細胞の増殖の阻害について分析した。１ウェルあたり４０００個のＤＬＤ−１標的細胞を、３７℃で一晩インキュベートし、その後、架橋抗体を添加した。ＴＲＡＩＬを阻害しない抗体５Ｅ１１、４２２及びコントロール抗体を、６つの異なる濃度（２．５倍の希釈段階において６．６７ｎＭから開始して最低０．０６８ｎＭまで）で使用した。等モル濃度の抗Ｆｃ二次抗体の添加によって架橋結合が達成された。ＴＲＡＩＬを、それぞれの抗体濃度まで１０、４、１．６、０．６４、０．２５６及び０．１０２ｎＭの濃度で添加した。４８時間のインキュベーション後、Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬を添加した。この増殖阻害アッセイの結果を図１９に示している。非リガンド阻害抗体であるクローン４２２は、ヒトＴＲＡＩＬの添加に応じて、ＴＲＡＩＬ結合部位に重なっているエピトープに結合するクローン５Ｅ１１と比較して有意に増強された抗増殖活性を示したことが実証された。架橋５Ｅ１１抗体の添加により、ＴＲＡＩＬ単独による増殖阻害に対する相加的な効果はなかった。対照的に、ヒトＴＲＡＩＬと組み合わせて架橋クローン４２２を使用することにより、活性に対する有意な相加効果が示された。
【０５１８】
ＤＲ５上に結合するＴＲＡＩＬを阻害しないことが知られている適切なコントロール抗体で同様の結果が認められた。インビトロアッセイにおいて認められたこの効果をインビボに転換することができるのであれば、評価されるべき設定が残されている。
【０５１９】
実施例１０：  二重特異性２＋２フォーマットにおける変換
ＤＲ５の高架橋結合による腫瘍細胞のアポトーシスの標的化された誘導のための二重特異性抗体の作製に新規ＤＲ５バインダーを使用することができるかどうかを評価するために、一組のＤＲ５抗体を四価二重特異性分子に変換した。これらの二重特異性抗体は、それぞれＤＲ５及びＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）のための、２つの結合部分を含んでいる。選択された異なるＤＲ５抗体をＦＡＰ抗体２８Ｈ１と組み合わせて、高い親和性のヒト／マウス／カニクイザル（ｈｕ／ｍｕ／ｃｙ）交差反応性ＦＡＰバインダーを単離し、ファージディスプレイによって親和性を熟成させた。使用した２＋２フォーマットでは、２８Ｈ１  ＣｒｏｓｓＦａｂドメイン（ＶＨＣＬ）は、（Ｇ４Ｓ）４コネクターを使用して抗ＤＲ５重鎖のＣ末端に融合した。２＋２フォーマットの概略構造を図２８に示している。以下は、２＋２フォーマットの二重特異性抗体の例示的な鎖である。
2018046823.tif 000015
2018046823.tif 000016
【０５２０】
全てのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子は、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において産生され、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製された。得られた産物収量は、合理的な範囲内にあった（約２０ｍｇ／Ｌ）。最終精製ステップ後のモノマー含有量は、全ての分子について９６％を超えた。
【０５２１】
図４２に示しているように、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による標的結合分析により、２＋２フォーマットの選択された全ての二重特異性抗体は、組換えＤＲ５及びＦＡＰ（ヒト及びマウス）に同時に結合できたことが明らかにされた。
【０５２２】
ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子がＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞株のアポトーシスを誘導することができるかを評価するために、続いて添加される二重特異性抗体を介しての標的細胞上でのＤＲ５の架橋結合のために９６ウェルプレートを組換えヒトＦＡＰでコーティングした。標的細胞（ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１）の添加及び２４時間のインキュベーションの後に、標準的なＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイによってアポトーシス誘導を決定した。図２０は、２つの異なる濃度（７．０ｎＭ及び０．７ｎＭ）において、ドロジツマブと比較した、新たに単離されたＤＲ５バインダー及びＣ末端に融合した２８Ｈ１  ＦＡＰ  ＣｒｏｓｓＦａｂを含んでいる７種類の二重特異性抗体のアポトーシス誘導の比較を示している。全ての分子を、ＦＡＰの存在下及び非存在下において試験した。予想通り、高濃度において、ドロジツマブに基づく二重特異性分子は、架橋結合ＦＡＰの非存在下ですでに有意な程度までアポトーシスを誘導した。対照的に、新しいＤＲ５バインダーを使用したＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子は、プレート上にコーティングされたＦＡＰの存在下においてのみアポトーシス誘導活性を示した。これは、この活性が組換えＦＡＰを介した架橋結合に依存していることを示している。
【０５２３】
二重特異性分子は、異なる細胞株上で発現されるＦＡＰを介してＤＲ５よりも効率良く架橋もされ得、それによってアポトーシスを誘導し得るかどうかを決定するために、いわゆるバイスタンダー共培養アッセイを設定した。図２１は、３つの異なる濃度（７．０、０．７及び０．０７ｎＭ）の二重特異性分子を用いた、腫瘍細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及びＦＡＰ発現線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）の共培養実験におけるアポトーシス誘導の結果を示している。それぞれ２８Ｈ１  ＦＡＰ  ＣｒｏｓｓＦａｂに融合した、５Ｅ１１、２２Ｅ９及び２０Ｆ２からのＤＲ５結合部分を含んでいる３種の二重特異性コンストラクトでは、対応する抗Ｆｃ架橋ＩｇＧ分子でも認められたように、比較可能な程度のアポトーシスの誘導が示される。これとは対照的に、ＤＲ５結合部分として６Ｈ４を含んでいる分子は、架橋ＩｇＧと比較して低下した活性を示した。試験した分子（１８Ｈ６−２８Ｈ１）のうちの１種は、（架橋ＩｇＧとは対照的に）全ての濃度で完全に不活性であった。これは、必ずしも全てのＤＲ５バインダーが、腫瘍細胞上のＤＲ５を高架橋結合するための二重特異性分子の作製に好適なわけではないことを示している。したがって、標的化されたアポトーシスの誘導の手法に正しいＤＲ５抗体を選択するために、エピトープ及び二重特異性活性の注意深い評価が必要である。この点に関して、ＤＲ５に対する比較的低い親和性及び２＋２二重特異性フォーマットにおける高い結合活性を示すＤＲ５バインダーは、特に有利である。ＤＲ５に対する低い親和性は、二重特異性抗体が通常の細胞に結合するのを防ぎ、したがって、腫瘍細胞においてＦＡＰ依存的な様式でアポトーシスを誘導するための選択性を増大させる。これらの特性を有する１種のバインダーは、例えば、ＤＲ５バインダー５Ｅ１１である。
【０５２４】
記載したように、ドロジツマブの不利な点のうちの１つは、二重特異性フォーマットにおけるその使用が制限されることであり、この抗体では第２の結合部分のＮ末端融合が可能にされないという事実である。この立体配置は、ＤＲ５に対する適切な結合を抑制し、それによってアポトーシスの誘導が妨げられる、ドロジツマブのＮ末端の阻害をもたらす。新たに単離されたＤＲ５抗体をこの種のフォーマットにおいて使用することができるかどうかを試験するために、選択されたＤＲ５バインダーのＦａｂが（Ｇ４Ｓ）４コネクターを介してヒトＦｃ領域にＣ末端で融合した、Ｆｃ−融合体分子を作製した。これらの分子を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生させて、ＰｒｏｔｅｉｎＡビーズを介して精製し、アポトーシス誘導アッセイにおいて試験した。図２２ａ）に、二次抗Ｆｃ  ＩｇＧでの架橋結合後にこれらのＦｃ−ＤＲ５融合分子を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＤＮＡ断片化アッセイの結果をまとめている。試験した全ての分子は、標的細胞株のアポトーシスを誘導することができ、これにより、選択されたＤＲ５バインダーはＮ末端で阻害されないことが示され、これらのバインダーと共に使用可能なフォーマットの範囲がより広くなる。
【０５２５】
実施例１１：  ファージディスプレイ由来のＤＲ５バインダーを含んでいる２＋２二重特異性フォーマットの熱安定性の特徴づけ
２＋２二重特異性フォーマットに変換されたファージディスプレイ由来のＤＲ５バインダーの熱安定性を、Ｏｐｔｉｍ１０００系（Ａｖａｃｔａ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｌｃ）を使用して、光散乱強度における変化として測定した。マイクロキュベットアレイ中で、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の１ｍｇ／ｍＬの濃度の９μＬの試料を、０．１℃／分の速度で２５℃から９０℃まで加熱した。光散乱強度（２６６ｎｍレーザー）を、０．４℃毎に記録し、ソフトウェアＩｇｏｒＰｒｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．２３（Ａｖａｃｔａ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｌｃ）で処理した。凝集発生温度は、光散乱強度が上昇し始める温度として定義される。
2018046823.tif 000017
【０５２６】
試験した全てのＤＲ５抗体は、２＋２二重特異性コンストラクト内にクローニングされたときにも、６０℃を十分に超える凝集温度で高い熱安定性を示した。
【０５２７】
実施例１２：  ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体は、異なる標的細胞上でアポトーシスを誘導することができる
ＦＡＰ  ２８Ｈ１  ＣｒｏｓｓＦａｂ部分に融合した、新たに単離されたＤＲ５バインダー（実施例２２から２５において示しているように、４種はファージディスプレイによって単離され、５種はウサギ免疫化由来）を含んでいる２＋２フォーマットの９種のＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を、ＧＭ０５３８９ヒトＦＡＰ＋線維芽細胞との共培養アッセイにおける２種の異なる細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＧ４０１）上でのアポトーシスの誘導についての並列実験において比較した。これらの二重特異性抗体を、０．０００７−７ｎＭの濃度範囲にわたって試験した。ＤＮＡ断片化アッセイの結果を、図２３（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び図２４（Ｇ４０１）にまとめている。試験した全ての二重特異性抗体は、両方の細胞系上で良好なアポトーシス誘導活性を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で得られた結果により、これらの抗体を２つの群に分けることができた。ウサギ免疫化から得られたものは０．７ｎＭの濃度で最高のアポトーシス誘導を示し、抗体濃度をさらに高めていくと活性は少し低下した。対照的に、二重特異性２＋２フォーマットのファージディスプレイ由来のバインダーは、高濃度で活性における低下を示さず、最大濃度まで一定に保たれた又はさらにより増強された。ＧＭ０５３８９線維芽細胞との共培養でＧ４０１細胞を用いた、両方の設定の二重特異性抗体についての実験において、０．０７ｎＭの濃度ですでに最高のアポトーシス誘導が達成され、その後一定に保たれた。この設定では、全ての分子が、アポトーシス誘導レベルに関して同様に機能した。
【０５２８】
実施例１３：  異なる二重特異性フォーマットの比較
２＋２  ＣｒｏｓｓＦａｂフォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子は、極めて良好な質で十分に産生され、且つ２種の細胞株の共培養の設定において濃度依存的な特異的なアポトーシスの誘導を媒介できることが実証された。これらの二重特異性分子のアポトーシス誘導の程度は、抗Ｆｃ二次抗体を介して高架橋結合された対応するＤＲ５バインダーで認められるのと同一の範囲内である。図２５に示しているように、ＤＲ５及びＦＡＰ結合単位が、異なるフォーマット及び異なる結合価で組み合わされている、さらなる異なるＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子を、それらのアポトーシス誘導能について評価するために、以下のコンストラクトを作製した。
2018046823.tif 000018
【０５２９】
全ての分子は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生され、標準的なプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーの手順によって精製された。副産物のプロファイル及び分子の質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ及びＣａｌｉｐｅｒ分析によって分析した。
2018046823.tif 000019
【０５３０】
表１５にまとめているように、これらのさらなるフォーマットは、２＋２フォーマットと比較して産生及び精製がより困難なようである。１種（Ｂ１６＿Ｅ１１Ａ＿００１）を除き、全てが、類似の２＋２分子よりも低い発現収量を示す。しかし、凝集体含有量は比較的低かった（＜２％）が、多くの場合に、より低い分子量の種も検出することができ、これは、分子の精製又は分解に起因した可能性があった。
【０５３１】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるアポトーシス誘導活性を、線維芽細胞共培養アッセイ（ＤＮＡ断片化）において異なる濃度（７．０；０．７及び０．０７ｎＭ）で試験した。図２６は、２＋２フォーマットの二重特異性ドロジツマブと比較した、３種の異なるフォーマット（２＋２；２＋１及び３＋１）のアポトーシス活性の結果を示している。この設定において、２＋２フォーマットの５Ｅ１１−２８Ｈ１二重特異性分子では、全体的に、ドロジツマブコントロールと比較して同様の活性が示された。最低濃度において、２＋２フォーマットの５Ｅ１１−２８Ｈ１二重特異性分子では、ドロジツマブコントロールと比較してさらにより高い活性が示された。対照的に、２＋１及び３＋１フォーマットでは、両方の２＋２フォーマット（ドロジツマブ及び５Ｅ１１）と比較して活性がより低いように見えた。別のＤＲ５バインダー（１８Ｆ１１）で同一のフォーマットを分析する場合には、３種の全ての分子において、ドロジツマブ二重特異性抗体と比較して低下したアポトーシス誘導活性が示される。しかし、１８Ｆ１１二重特異性分子では、より低い濃度（０．０７ｎＭ）で最高のアポトーシス誘導が生じたのに対して、ドロジツマブに基づく分子では、濃度の上昇と共により高い活性が示される。
【０５３２】
第２の分子設定において、２つのＤＲ５結合部分がＦｃ−ノブ部分にヘッド・トゥ・テールで融合する一方、ＦＡＰを標的としているＦａｂがＦｃ−ホール対応物と結合する、５Ｅ１１−２８Ｈ１二重特異性抗体について、さらなる２＋１フォーマットを評価した。４種の全てのフォーマットを、ＧＭ０５３８９線維芽細胞との共培養におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１のアポトーシス誘導についてのＤＮＡ断片化アッセイにおいて、（７．０から０．０００７ｎＭまでの範囲に及ぶ）広範囲の濃度にわたり比較した（図２７）。両方の２＋１分子は、０．７ｎＭの濃度で最高のアポトーシス活性を有していたのに対して、３＋１分子は、１０分の１の濃度ですでに最高のアポトーシスの誘導を示した。しかし、新しいフォーマットのうちの何れも、従来の２＋２フォーマットを超えて優れているようには見えなかった。
【０５３３】
実施例１４：  共培養アッセイ系における１＋１二重特異性フォーマットの機能活性の試験
実施例１２に記載の異なるフォーマット及び結合価変異体の他に、もう１つのコンストラクトを、交差されていないＦａｂ内のＤＲ５バインダー００１１（＝クローン１７４）及び交差されたＦａｂ内のＦＡＰバインダー４Ｂ９（配列番号２８０−２８２）を用いて（図２５Ｄに図示しているような）１＋１フォーマットで作製した。この１＋１フォーマットの機能活性を、二次架橋あり又はなしで、２＋２フォーマット（図２８Ａに図示しているように、ＤＲ５バインダーとして００１１を含み且つＦＡＰバインダーとして２８Ｈ１を含む；配列番号２８７−２８９）及び００１１のキメラＩｇＧ（配列番号９０−９３）と比較した。
【０５３４】
腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）からなる共培養系における架橋結合二次抗体の存在下又は非存在下における抗ＤＲ５及び抗ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体での細胞の処理に応じてのＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ７７４  ４２５  ００１）によってアポトーシス誘導を測定した。
【０５３５】
１日目：細胞の調製。接着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ヒト乳腺癌）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ）中で増殖させ、通常、１週間に２回、１：２０に分割した。ＧＭ０５３８９線維芽細胞を、１５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＮＥＡＳ（ＰＡＮ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＭＥＭ＋Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、通常、１週間に２回、１：３に分割した。
【０５３６】
共培養アッセイのために、線維芽細胞を、１日目に９６ウェルプレート中に１×１０４細胞／１００μｌ／ウェルの密度で播種し、５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。腫瘍細胞及び抗体を、２日目に添加した。
【０５３７】
単一培養アッセイのために、細胞株を、異なるプレート上に同一の密度で播種し、一晩インキュベートして、翌日、抗体で処理した。
【０５３８】
２日目：アポトーシスの誘導。培地を吸引して、抗体（抗ＤＲ５  ＩｇＧ又は抗ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体）を、単独で又は架橋結合抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ２１３６）と１：１の比で一緒に、１００μｌの培地中に異なる最終濃度で（図を参照されたい）細胞に添加した。
【０５３９】
共培養アッセイのために、線維芽細胞上に抗体の後に直ちに、腫瘍細胞を１００μｌの最終容量に達するまで添加した（１×１０４細胞／１００μｌ／ウェル）。
【０５４０】
培養物を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０５４１】
３日目：Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ：細胞死検出ＥＬＩＳＡ）。製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従い、それを少し変更して、このイムノアッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞を、１００μｌ／ウェルの２×溶解バッファーで室温で１５分間溶解させた。抗ヒストン抗体及び抗ＤＮＡ抗体からなるマスターミックスを、製造業者の説明書に従って調製して、９６ウェルのストレプトアビジンコーティング付き平底マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）上で１：４の希釈溶解液と混合した。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、ＡＢＴＳ基質を添加し、室温で光度分析に十分な発色まで（１０−３０分）インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍにおいて吸光度を読み取った。
【０５４２】
結果を図４６及び図４７に示している。
【０５４３】
単一特異性抗ＤＲ５抗体（キメラ００１１及びドロジツマブの両方）は、それらの自体によって有意なアポトーシスを誘導しなかったのに対して、細胞表面上での二次抗体とのＤＲ５分子の高クラスター形成は、約０．７ｍＭの濃度で細胞死を導いた。しかし、最良のアポトーシス誘導は、（フォーマット１＋１又は２＋２何れかの）抗ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を、線維芽細胞の表面上に存在するＦＡＰに結合する第２の部分を介して腫瘍細胞上にＤＲ５高クラスター形成を導く共培養物に添加したときに達成された（図４６）。
【０５４４】
単一特異性抗ＤＲ５抗体が架橋結合に応じてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスを誘導したのに対して、ＤＲ５及びＦＡＰに対する二重特異性分子は、ＤＲ５発現腫瘍細胞及びＦＡＰ発現腫瘍関連線維芽細胞の存在下でのみ機能的であった。さらに、何れの分子も、線維芽細胞の生存率にいかなる影響も示さなかった。（内部アッセイ陽性コントロールと比較した相対的なアポトーシス、図４７を参照されたい）。
【０５４５】
この活性データは、ＦＡＰ特異的アポトーシス誘導が、１＋１フォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体でも、２＋２フォーマットと同様に比較可能な有効性で各標的に対して結合価１で達成され得ることを実証している。
【０５４６】
実施例１５：  一般的な基盤技術としての２＋２二重特異性フォーマット
２８Ｈ１  ＶＨＣＬが５Ｅ１１重鎖のＣ末端に融合した２＋２フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、極めて良好なフォーマットであることが判明した。異なるＤＲ５バインダーについて、合理的な産物力価で産生可能であること、安定であること、少量のみの欠落又は間違った対の軽鎖を示すこと及び再現性良く良好な活性を示すことが実証された。それでもやはり、フォーマット基盤を拡大するために、交差する点の種類及び部位において異なるさらなる二重特異性５Ｅ１１−２８Ｈ１分子を作製した。評価した５種のさらなるフォーマット及び親分子を図２８に示している。５種のさらなる分子のうちの４種は、交差された２８Ｈ１  Ｆａｂをもはや含んでいないが、ＤＲ５（５Ｅ１１）重鎖（（Ｇ４Ｓ）４コネクターによって融合するＶＨＣＨ１又はＶＬＣＬの何れか）のＣ末端に融合した標準的なＦａｂドメインを含む。
2018046823.tif 000020
2018046823.tif 000021
【０５４７】
全ての分子を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において２００ｍｌの規模で一過的に産生させて、標準的なＰｒｏｔｅｉｎＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、最終的に、起源のフォーマット（５Ｅ１１重鎖に融合した２８Ｈ１のＣ末端ＣＨ１ＣＬ交差、（分子Ａ、図２８））と比較して分析し特徴を明らかにした。
【０５４８】
表１６にまとめているように、これらの５種の分子を２つの群に分けることができる：１つは、全体のＦａｂのものが交差されている２種のフォーマットを含む（Ｂ＋Ｅ）。これらの２種の分子は、極めて低い産物力価を示し、精製後も、これらは依然として多量の凝集体を含んでいた。したがって、これらの２種の分子はそれ以上評価されなかった。その他の３種（５Ｅ１１  ＶＨＶＬ又はＣＨ１ＣＬの交差及びＶＨＶＬとしてのＣ末端２８Ｈ１の交差）は、収量及び凝集体含有量に関してかなりより良好な産物の質を示した。図２９において示しているような分子Ａと比較して、分子Ｃ、及びＤも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上の標的結合についてＦＡＣＳによって試験した。さらに、分子Ｃ、Ｄ、及びＦのアポトーシス誘導に関する機能的な活性、同時及び独立した標的結合、安定性及び凝集傾向、並びに副産物のパターンをフォーマットＡと比較した（実施例２２から２５）
【０５４９】
実施例１６：  共培養アッセイ系における２＋２二重特異性フォーマット変異体の機能活性の試験
４種の異なる２＋２フォーマット変異体（図２８のフォーマットＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）を、腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び線維芽細胞（ＧＭ０５３８９）からなる共培養系における該コンストラクトでの細胞の処理に応じてのＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ７７４  ４２５  ００１）によって測定されるようなアポトーシスを誘導するこれらの機能活性について比較した。
【０５５０】
１日目：細胞の調製。接着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ヒト乳腺癌）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ）中で増殖させ、通常、１週間に２回、１：２０に分割した。ＧＭ０５３８９線維芽細胞を、１５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＮＥＡＳ（ＰＡＮ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＭＥＭ＋Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させ、通常、１週間に２回、１：３に分割した。
【０５５１】
共培養アッセイのために、線維芽細胞及び腫瘍細胞を、９６ウェルプレート中にそれぞれ１×１０４細胞／１００μｌ／ウェルの密度で同一の日に播種し、５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。単一培養アッセイのために、細胞株を、異なるプレート上に同一の密度で播種した。
【０５５２】
２日目：アポトーシスの誘導。培地を吸引して、二重特異性抗体を１００μｌの培地中に異なる最終濃度で（図を参照されたい）細胞に添加した。
【０５５３】
培養物を、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０５５４】
３日目：Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ：細胞死検出ＥＬＩＳＡ）。製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従い、それを少し変更して、このイムノアッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞を、１００μｌ／ウェルの２×溶解バッファーで室温で１５分間溶解させた。抗ヒストン抗体及び抗ＤＮＡ抗体からなるマスターミックスを、製造業者の説明書に従って調製して、９６ウェルのストレプトアビジンコーティング付き平底マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）上で１：４の希釈溶解液と混合した。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、ＡＢＴＳ基質を添加し、室温で光度分析に十分な発色まで（１０−３０分）インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍにおいて吸光度を読み取った。
【０５５５】
結果を図３０に示している。ＤＮＡ断片化によって検出されるような、共培養（ａ）及び単一培養（ｂ、ｃ）の設定における４種の異なるＣｒｏｓｓＭａｂ変異体のアポトーシスの誘導。４種の異なる変異体は全て、比較可能な用量依存的な様式で共培養設定において腫瘍細胞内でアポトーシスを誘導した。単一培養設定では、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞株においてもＧＭ０５３８９線維芽細胞細胞株においてもアポトーシスは誘導されず、４種の全ての変異体のアポトーシス誘導の特異性及びＦＡＰ依存性が指し示される。この機能活性データにより、二重特異性２＋２フォーマットを、交差の型及び部位に関して異なる立体配置で使用できることが示される。
【０５５６】
実施例１７：  ２＋２二重特異性フォーマット変異体の独立且つ同時の標的結合の試験
ＳＰＲアッセイにより、４種の異なる２＋２フォーマット変異体（図２８のフォーマットＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）を、両方の標的に独立且つ同時に結合するこれらの能力についてさらに比較した。
【０５５７】
異なるＣｒｏｓｓｍａｂ変異体への独立したＤＲ５結合及びＦＡＰ結合の評価
約３０００共鳴ユニット（ＲＵ）の捕捉系（５μｇ／ｍｌ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００８−３９）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングさせた。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルの温度を２５℃に、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉の前に、フローセルを、ランニングバッファーで２回プライムした。
【０５５８】
二重特異性抗体は、５μｇ／ｍｌ溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉された。順番に又は同時にの何れかで添加した（１０μｌ／分の流速）、各リガンドについての活性な結合能を決定することにより、二重特異性抗体への各リガンドの独立した結合を分析した：
１．５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＤＲ５の１８０秒間の注入（抗原の単独結合を同定する）。
２．５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＦＡＰの１８０秒間の注入（抗原の単独結合を同定する）。
３．５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＤＲ５及び５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＦＡＰの１８０秒間の注入（ＤＲ５の結合及びＦＡＰの結合を同時に同定する）。
【０５５９】
３ｍのＭｇＣｌ２溶液を用いて３０μｌ／分の流速で６０秒洗浄することによって表面を再生した。バルクの屈折率差を、抗ヒトＩｇＧ表面から得られたレスポンスを減算することによって補正した。
【０５６０】
結果として生じる手法３の最終シグナルが手法１及び２の個々の最終シグナルの合計に等しい場合、その二重特異性抗体は両方の抗原を互いに独立して結合することができる。
2018046823.tif 000022
４つの異なる全てのＣｒｏｓｓｍａｂ変異体は、ＤＲ５及びＦＡＰを互いに独立して結合することができる。
【０５６１】
Ｃｒｏｓｓｍａｂに対する同時のＤＲ５結合及びＦＡＰ結合の評価
第一に、約６００共鳴ユニット（ＲＵ）のＤＲ５（２０μｇ／ｍｌ）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングさせた。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、フローセルをランニングバッファーで２回プライムした。第二に、二重特異性抗体の１０μｇ／ｍｌ溶液を、３０μｌ／分の流速で３０秒間注入した。第三に、ｈＦＡＰ（１０μｇ／ｍｌ）を、３０μｌ／分の流速で３０秒間注入した。ｈＦＡＰの結合応答は、ｈＤＲ５に結合した二重特異性抗体の量に依存しており、且つ同時の結合を示す。グリシンｐＨ２溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００３−５５）を用いて３０μｌ／分の流速で７０秒洗浄することによって表面を再生した。ｈＦＡＰのさらなる特異的な結合シグナルによって従来のＤＲ５結合Ｃｒｏｓｓｍａｂに対する同時の結合が示されている。
【０５６２】
４種のＣｒｏｓｓｍａｂフォーマット（ＤＲ５ＴＡＡ−００５７、ＤＲ５ＴＡＡ−００７８、ＤＲ５ＴＡＡ−００７７及びＤＲ５ＴＡＡ−００８１）の同時のＤＲ５結合及びＦＡＰ結合の評価により、４種の異なる全てのＣｒｏｓｓｍａｂ変異体は同時にＦＡＰ及びＤＲ５を結合できることが示された。
【０５６３】
実施例１８：  ２＋２二重特異性フォーマット変異体の熱安定性及び凝集傾向の試験
４種の異なる２＋２フォーマット変異体（図２８のフォーマットＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）を、これらの熱安定性及び凝集体を形成するこれらの傾向についてさらに分析した。
【０５６４】
熱安定性
凝集発生温度：試料を、２０ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン塩化物、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製して、０．４μｍのフィルタープレートを通した遠心分離によって光学用の３８４ウェルプレートに移し入れ、パラフィン油で覆った。試料を０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃まで加熱しながら、動的光散乱により、流体力学的半径を繰り返し測定した。凝集発生温度は、流体力学的半径が増大し始める温度として定義される。
【０５６５】
凝集傾向
試料を、製剤バッファー（２０ｍＭ  Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、２４０ｍＭトレハロース、ｐＨ６．０）中で透析し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。０．２２μｍの遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した滅菌濾過後、試料を４０℃で２週間保存した。一方、コントロール試料は、−８０℃で維持した。凝集体形成は、ＴＳＫ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用してＳＥ−ＨＰＬＣによってモニターされ、４０℃及び−８０℃の試料間の差として報告された。
2018046823.tif 000023
【０５６６】
熱安定性は、親のフォーマットＡと比較して、フォーマットＣ、Ｄ及びＦにおいて少し低下したが、６１℃及び６０℃では、まだ良好な範囲内であった。
【０５６７】
凝集傾向は、フォーマットＡ、Ｃ及びＦについては極めて小さく、フォーマットＤについては少し増大された。
【０５６８】
実施例１９：  質量分析による、２＋２二重特異性フォーマット変異体の副産物プロファイルの評価
最後に、４種の異なる２＋２フォーマット変異体（図２８のフォーマットＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）を、これらの副産物プロファイルについて質量分析によってさらに分析した。
【０５６９】
異なるコンストラクトの脱グリコシル化された総質量を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を介して決定及び確認した。さらに、ＬＣ過剰提示等の潜在的な副産物を検出して相対的に定量化した。簡単に説明すると、最高３ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度の１００μｇの精製された抗体を、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７中の１４Ｕ  Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）で３７℃で２時間脱グリコシル化し、次いで、ＨＰＬＣを介してセファデックスＧ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で脱塩した。脱グリコシル化された総質量を、ＥＳＩ−ＭＳを介して、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ）源を備えたｍａＸｉｓ  ＵＨＲ−ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ）ＭＳ系上で決定した。
【０５７０】
産物の同一性及び完全性を評価するために、異なるＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体コンストラクトを、それらの脱グリコシル化された形態で質量分析によって分析した。同一性は、評価した全てのコンストラクトについて確認することができた。さらに、これらの異なるコンストラクトは、例えば、１種のＬＣ型の過剰提示又は１種若しくは２種のＬＣの損失を有する、数種類の副産物を示した。全てのコンストラクトは、質的及び量的に類似した副産物プロファイルを有していた。
【０５７１】
実施例１３及び３０−３３からの全ての結果により、二重特異性２＋２フォーマットは交差の型及び部位に関して異なる立体構造で使用され得ることが明確に示される。これにより、２＋２  ＣｒｏｓｓＦａｂフォーマットは広く適用可能な基盤技術となる。
【０５７２】
実施例２０：  ドロジツマブ−ＦＡＰ二重特異性分子は、非標的化ドロジツマブを超える優れたインビボ有効性を示す
インビトロ活性アッセイにおいて、二重特異性ドロジツマブ−ＦＡＰは、架橋されていないドロジツマブ単独と比較して、優れたアポトーシス誘導活性を示すことが実証された。関連したマウス腫瘍モデルにおけるインビボ有効性にもこれが転換されるかどうかを評価するために、異なる異種移植モデルを設定した。標準的なマウス腫瘍モデルの１つの問題は、ＦＡＰ発現が通常極めて低く、ヒトの状況を全く反映しないことである。ヒト腫瘍間質におけるＦＡＰ発現により近く類似しているモデルを確定するために、組換えによってマウスＦＡＰを発現する、操作されたマウス線維芽細胞（３Ｔ３細胞）を、それぞれの腫瘍細胞株（ヌードマウスにおける結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１及びＳＣＩＤマウスにおける乳がん系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と共注入した。この目的のために、３Ｔ３線維芽細胞を、ＭＰＳＶプロモーターの制御下で完全長マウスＦＡＰ遺伝子のための発現カセットを有するプラスミドで安定にトランスフェクトした。安定なクローンの選択のために、このベクターは、ピューロマイシンに対する耐性を与えるピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼのためのさらなる発現カセットをさらに有する。ＦＡＣＳ結合実験によって判断されるように、異なるレベルのマウスＦＡＰを発現している数種類のクローンを選択した。選択された１種のｍｕ  ＦＡＰ−３Ｔ３細胞株を、腫瘍細胞株ＤＬＤ−１と共注入し、ｍｕ  ＦＡＰ発現３Ｔ３細胞なしで注入したＤＬＤ−１細胞と比較して、有意に増強された腫瘍増殖がもたらされた。さらに、ヒト／マウス交差反応性抗ＦＡＰ抗体を使用したＩＨＣ分析により、予想通りに、両方の細胞株について、腫瘍を取り囲んでいる間質における高レベルのＦＡＰ発現が実証されている。したがって、この共移植された皮下異種移植モデルを使用して、元の非標的化ドロジツマブ抗体と比較して、二重特異性ドロジツマブ−ＦＡＰ分子のインビボでの有効性を評価した。２×１０６腫瘍細胞を、マウスＦＡＰを発現している２０％の３Ｔ３線維芽細胞と共移植した。腫瘍細胞移植の１２日後（ＤＬＤ−１）及び１０日後（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に、療法を開始した。これらの動物に、バッファー、ドロジツマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はドロジツマブ−ＦＡＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）の何れかを（静脈内）注入した。ドロジツマブ対二重特異性ドロジツマブの分子量の差（ドロジツマブは、二重特異性分子の分子質量の６０％のみ）について補正するために、後者を週２回投与した一方、ドロジツマブは週１回のみの投与であった。図３１に、ｍｍ３での平均腫瘍容量の経時的な増大をまとめている。図３１Ａは、ＤＬＤ−１／ｍｕ  ＦＡＰ−３Ｔ３共注入モデルにおける、ドロジツマブ及びバッファーコントロールと比較した、ドロジツマブ−ＦＡＰのインビボでの有効性を示している。ドロジツマブでは、コントロールと比較して結果として３６％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）になった、中程度の抗腫瘍有効性が示されただけであったのに対して、二重特異性分子では、試験の終了時（３３日目）に９９％の腫瘍増殖阻害が示された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｍｕＦＡＰ−３Ｔ３共注入モデルでは、この相違は、さらにより顕著である。このモデルでは、ドロジツマブ単独では、���ッファーコントロールよりも良好ないかなる有効性も示されなかったのに対して、ドロジツマブ−ＦＡＰ二重特異性抗体では、３２日目の試験の終了時に７７％の腫瘍増殖阻害が示されたからである（図３１Ｂ）。この結果により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、ＤＬＤ−１細胞株よりも、アポトーシス誘導に対してより抵抗性であることが示された可能性があった。
【０５７３】
実施例２１：  新たに単離されたＤＲ５バインダーを２８Ｈ１  ＦＡＰ  ＣｒｏｓｓＦａｂと組み合わせて使用したＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子の抗腫瘍活性の評価。
ＣｒｏｓｓＦａｂとして抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１に融合した二重特異性フォーマットにおける３種の異なるＤＲ５バインダー（５Ｅ１１、１７４及び４２２）のインビボでの有効性を、マウスＦＡＰを発現している３Ｔ３線維芽細胞とそれぞれ共注入されたＤＬＤ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおいて並列で比較した。Ｆｃγ受容体に対する結合を完全に消滅させる（がＦｃＲｎに対する親和性は変化していない）変異をＦｃ領域内に有する５Ｅ１１−２８Ｈ１  ＣｒｏｓｓＦａｂからなる第４の分子を含めた。この目的のために、大規模な一過的トランスフェクション及び産生を行い、ＨＥＫ細胞において十分な材料を産生させた。
2018046823.tif 000024
【０５７４】
全ての分子は、凝集体及びエンドトキシン含有量に関して優れた質で良好な収量で産生された。表２１にまとめているように、関連した抗原に対する結合を、異なる方法（ＳＰＲ及びＦＲＥＴ）によって分析した。
2018046823.tif 000025
【０５７５】
インビボ実験を開始する前に、最初にインビトロでのアポトーシス誘導活性について材料を試験した。図３２は、４種の異なるＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子を７．０、０．７及び０．０７ｎＭの濃度で比較したＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（細胞死検出ＥＬＩＳＡ）の結果をまとめたものである。アッセイは、ＤＬＤ−１細胞を標的細胞として使用し、３Ｔ３細胞又はマウスＦＡＰを発現している組換え３Ｔ３細胞が架橋結合のためのエフェクター細胞としての役割をする、共培養アッセイとして設定された。ＤＬＤ−１−３Ｔ３共培養実験において、ＤＬＤ−１細胞では、アポトーシスの誘導はほとんど少しも検出できなかったのに対して、ＦＡＰ発現３Ｔ３細胞との設定では、アポトーシス誘導において１０倍の増加が認められ、これにより、この活性が組換え３Ｔ３細胞の表面上でのＦＡＰを介した架橋結合によるものであることが示された。同一の二重特異性分子、標的及びエフェクター細胞を使用して、二重特異性アゴニストＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処理に応じて細胞生存率を決定する同様の実験を行った。この実験の結果を、図３３にまとめている。ここで、ＦＡＰ発現３Ｔ３細胞の存在下において、ＤＬＤ−１細胞のみに細胞生存率の有意な低下が認められたのに対して、（マウスＦＡＰを発現しない）未改変の３Ｔ３細胞とでは、生存率の低下は認められなかった。
【０５７６】
４種の全ての二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ分子を、両方が、２０％のマウスＦＡＰ発現３Ｔ３線維芽細胞と共注入される、２種の異なる腫瘍モデルにおけるインビボでの有効性の評価のために使用した。これらのインビボでの有効性実験の結果を、図３４に示している。腫瘍及び線維芽細胞の移植後に、週２回、静脈内（ｉ．ｖ．）に１０ｍｇ／ｋｇの投与で処置を開始した。ビヒクルコントロールと比較して有意な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）として示されたように、明確に、４種の全ての分子により、両方のモデルにおいて腫瘍の増殖を制御することができた。試験の終了時における、腫瘍増殖阻害の絶対的な百分率は、４種の全ての分子について同様の範囲内であった。ＤＬＤ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルについて、それぞれ以下の結果が得られた：５Ｅ１１＿２８Ｈ１（野生型Ｆｃ）：７５％／９５％；５Ｅ１１＿２８Ｈ１（ＰＧＬＡＬＡ）：８３％／９９％；クローン１７４：６６％／８７％及びクローン４２２：７３％／８９％。全ての分子は、ＤＬＤ−１実験におけるよりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいて少し強力であった。
2018046823.tif 000026
【０５７７】
実施例２２から２５：  免疫化による新しいＤＲ５結合部分の作製及び特徴づけ
（上記のような）ファージディスプレイライブラリからの改良された特性を有する新しいＤＲ５抗体の選択に加えて、ウサギの免疫化（実施例２２−２５）によっても新しいＤＲ５抗体を作製し、その後、集中的な特徴づけを行った（実施例２６−２８）。
【０５７８】
実施例２２：  ウサギの免疫化
１組のウサギを、０日目に、皮内適用によって、完全フロイントアジュバントで乳化した、４００μｇの組換えヒトＤＲ５（モノマーＦｃ融合体）で免疫化し、７、１４、３５、６３及び９１日目に、筋肉内適用及び皮下適用を交互に、完全フロイントアジュバントで乳化した、それぞれ２００μｇのＤＲ５−ｈｕＦｃで免疫化した。血液（推定される全血液容量の１０％）を２１、４１、６９及び９７日目に採取した。血清を調製し、これは、ＥＬＩＳＡによるタイター決定のために使用された（下記を参照されたい）。且つ末梢単核細胞を単離し、これは、Ｂ細胞クローニングのプロセスにおいて抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用された（実施例１７）。
【０５７９】
別の１組のウサギを、細胞内デスドメインを欠いたヒトＤＲ５をコードしているプラスミド発現ベクターを使用して、４００μｇのベクターＤＮＡの皮内適用及びその後のエレクトロポレーション（７５０Ｖ／ｃｍの５方形波、継続時間１０ミリ秒、間隔１秒）によって遺伝的に免疫化した。ウサギに６回の連続的な免疫化を、０、１４、２８、４９、７７及び１０５日目に行った。血液（推定される全血液容量の１０％）を、３５、５６、８４及び１１２日目に採取した。血清を調製し、これは、ＥＬＩＳＡによるタイター決定のために使用された（下記を参照されたい）。且つ末梢単核細胞を単離し、これは、Ｂ細胞クローニングのプロセスにおいて抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用された（実施例２３）。
【０５８０】
血清力価の決定
ヒトＤＲ５（モノマーＦｃ融合体）を、ＰＢＳ中に、０．３１２５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで、９６ウェルのＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定化し、その後、ＰＢＳ中に２％のＣｒｏｔｅｉｎ  Ｃ、２００μｌ／ウェルを用いたプレートのブロッキング；ＰＢＳ中に０．５％のＣｒｏｔｅｉｎ  Ｃ、１００μｌ／ウェルにおける、２重での、抗血清の連続希釈の適用；ＰＢＳ中に０．５％のＣｒｏｔｅｉｎ  Ｃ中に１：１６０００希釈された、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、１００μｌ／ウェルを用いた検出を行った。全てのステップについて、プレートを、３７℃で１時間インキュベートした。全てのステップの間で、プレートを、ＰＢＳ中に０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。シグナルを、ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μｌ／ウェルの添加によって発色させ；１ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェルの添加によって停止させた。吸光度を、参照としての６９０ｎｍに対して、４５０ｎｍで読み出した。力価は、最大半量のシグナルをもたらす抗血清の希釈率として定義された。
【０５８１】
実施例２３：  ウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
（実施例「ウサギの免疫化」に記載の）３組のウサギを血液の供給源として使用した。ＥＤＴＡを含んでいる全血を、１×ＰＢＳ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）で２倍に希釈し、その後、ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  ｍａｍｍａｌ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を製造業者の仕様書に従って使用して密度遠心分離した。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０５８２】
ＥＬ−４  Ｂ５培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１０％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、２ｍＭのグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で補った。
【０５８３】
マクロファージ／単球の枯渇
滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を、非特異的接着性を通してマクロファージ及び単球を枯渇させるために使用した。各ウェルを、最大４ｍｌの培地及び免疫化されたウサギからの最大６×１０６個のＰＢＭＣで満たして、インキュベーター中で３７℃で１時間、結合を可能にさせた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パニングステップのために使用した。
【０５８４】
プレートのコーティング
タンパク質におけるパニングのために、滅菌ストレプトアビジンコーティング付き６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのビオチン化組換えヒトＤＲ５（モノマーＦｃ融合体）で室温で３時間コーティングした。ヒト表面上におけるパニングのために、ＤＲ５陽性細胞Ｇ４０１細胞を、滅菌細胞培養６ウェルプレート中に播種して培養し、コンフルエントな細胞単層を生成させる。パニングの前に、これらの６ウェルプレートを、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
【０５８５】
ヒトＤＲ５タンパク質上のＢ細胞の濃縮
ヒトＤＲ５タンパク質でコーティングされた又はヒトＤＲ５陽性Ｇ４０１細胞で覆われた６ウェル組織培養プレートに、４ｍｌの培地あたり最大６×１０６個のＰＢＬを播種して、インキュベーター中で３７℃で１時間、結合を可能にさせた。ＤＲ５抗原の濃縮ステップ後に、１×ＰＢＳで１−２回ウェルを注意深く洗浄することによって非接着細胞を除去した。残りの粘着性の細胞を、インキュベーター中、３７℃でトリプシンによって１０分間分離した。ＥＬ−４  Ｂ５培地でトリプシン処理を停止させた。免疫蛍光染色まで細胞を氷上で維持した。
【０５８６】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
単細胞選別のために、抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮ステップからの細胞を、ＰＢＳ中で抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、遮光して４℃で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを、氷冷したＰＢＳで２倍洗浄した。最後に、氷冷したＰＢＳ中にＰＢＭＣを再懸濁し、直ちにＦＡＣＳ分析を行った。死細胞及び生細胞を識別するために、ＦＡＣＳ分析の前に、５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加した。コンピューター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＡｒｉａを、単細胞選別のために使用した。
【０５８７】
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Ｚｕｂｌｅｒ等（１９８５）によって記載されているのと同様の方法によって調製した。簡単に説明すると、単選別されたウサギＢ細胞を、９６ウェルプレート中で、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ  Ｃｅｌｌｓ（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を含む２００μｌ／ウェルのＥＬ−４  Ｂ５培地、５％のウサギ胸腺細胞上清（ｃｈａｒｇｅ  ＴＳＮ−Ｍ１３（１０２４２）、ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びガンマ線照射されたマウスＥＬ−４  Ｂ５胸腺腫細胞（２，５×１０４／ウェル）と共に、インキュベーター中の５％のＣＯ２雰囲気中で３７℃で７日間インキュベートした。スクリーニングのために、Ｂ細胞培養の上清を除去して、残った細胞を直ちに回収し、１００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で−８０℃で凍結させた。
【０５８８】
実施例２４：  Ｂ細胞ＰＣＲ及び組換え発現
リボ核酸（ＲＮＡ）の単離
ＲＮＡを単離する必要があった細胞を、最初に遠心分離によってペレット化した。この細胞ペレットを、１０μｌ／ｍｌのベータ−メルカプトエタノールを含む１００μｌのＲＬＴバッファーを添加することによって溶解させた。これらの細胞を、ピペットで複数回混合することによって再懸濁し、複数ウェルのプレートに移した。このプレートを、２００×ｇで短く遠心分離して、−２０℃で凍結させた。製造業者の説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）９６ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、ＲＮＡの単離を行った。
【０５８９】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写を行った。
【０５９０】
ポリメラーゼ連鎖反応
製造業者の説明書に従ってＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。軽鎖及び重鎖の可変領域を、別々の反応物中で増幅させた。抗体発現ベクターを標的とさせるために、２５ｂｐの重複で、ＰＣＲプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）９６Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）によって精製した。
【０５９１】
シークエンシング及びＳＬＩＣクローニング
重鎖及び軽鎖の可変領域のＤＮＡ配列を決定するためにＰＣＲ産物をシークエンスした。ＰＣＲ産物を、Ｈａｕｎ，Ｒ．Ｓ．等によるＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３（１９９２）ｐ５１５−５１８及びＬｉ，Ｍ．Ｚ．等によるＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（２００７）ｐ２５１−２５６に記載されている、いわゆるＳＬＩＣ−クローニング法によって、発現ベクター内にクローニングした。抗体発現のためのプラスミドを、制限酵素消化によって線状にした。線状にしたプラスミドを、調製用アガロース電気泳動によって精製し、ゲルから抽出した（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲ産物をクローニングするために、（２５ｂｐだけ）重複しているプライマーを使用して、精製したプラスミドをＰＣＲの手順に加えた。オーバーハングを生成させるために、ｄＮＴＰの非存在下において、ベクター及び挿入物の両方をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で処理し、次いで、組換えを促進するために、ベクター及び挿入物をＲｅｃＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）タンパク質及びＡＴＰと共にインキュベートした。産物を、大腸菌内に形質転換した。軽鎖及び重鎖のためのプラスミドＤＮＡを単離して、それぞれの対を一過的トランスフェクション用に組み合わせた。
【０５９２】
ＨＥＫ２９３細胞における抗体発現のための一過的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｆ１７−培地（Ｇｉｂｃｏ）中で１×１０ｅ６細胞／ｍｌまで培養した。２×１０ｅ６のＨＥＫ２９３細胞を、２９３−フリー（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）中に懸濁した１μｇのＨＣ＋ＬＣプラスミドでトランスフェクトした。７日のインキュベーション後、上清を回収して、プロテインＡを介して精製し、分析した。
【０５９３】
実施例２５：  免疫化に由来するＤＲ５抗体のスクリーニング
Ｂ細胞培養液上清を、３８４ウェルマイクロタイタープレートにおける複数並行のＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイによってスクリーニングした。ＤＲ５発現細胞Ｇ４０１並びにビオチン化組換えヒトＤＲ５（モノマーＦｃ融合体）及びカニクイザルＤＲ５（ダイマーＦｃ融合体）に結合しているが、ヒトＤＲ４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号３４７−ＤＲ−１００）及びヒトＩｇＧ１には結合しない、抗体を一次ヒットとして選択した。二次スクリーニングにおいて、組換えによってＨＥＫ細胞内で発現された、マイクロ精製された抗体を、ヒト及びカニクイザルのＤＲ５に対する結合について及びさらにヒトＤＲ４、ヒトＤｃＲ１（社内）、ヒトＤｃ  Ｒ２（社内）又はヒト  オステオプロテジェリン（ＯＰＧ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号８０５−０５−１００）に対する結合のないことについて再び試験した。さらに、抗体を、Ｇ４０１細胞での架橋結合抗ヒトＦｃ抗体の存在下又は非存在下における機能的なアポトーシスアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ：細胞死検出ＥＬＩＳＡ）において試験した。Ｆｃを介した架橋結合に応じてアポトーシスを誘導することができる（しかし、その非存在下では誘導できない）それらの抗体のみを、さらなる特徴づけ及び開発のために選択した。
【０５９４】
二次スクリーニングの後に選択されてＳＬＩＣクローニング法によって発現プラスミド中にクローニングされた抗体の配列を、可変軽鎖及び可変重鎖のサブクローニング及び再シークエンシングによって検証した。
【０５９５】
これらのサブクローニングされて配列を検証された発現プラスミドを、次いで、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の、より大きな規模の一過的トランスフェクションに使用し、その後、さらにより強力な特徴づけステップを可能にするプロテインＡ精製を行った。
【０５９６】
実施例２６：  免疫化に由来するＤＲ５抗体の結合特性の特徴づけ
ウサギ免疫化からの選択されたＤＲ５抗体を、それらの結合特性、種交差反応性並びに結合ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲ分析による特異性について特徴を明らかにした。
【０５９７】
ＴＲＡＩＬ結合受容体に対するモノクローナル抗体の結合（イムノアッセイ）
抗原結合イムノアッセイを、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０及び０．５％のＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で補ったＰＢＳバッファーを用いて、３８４ウェルのストレプトアビジンコーティング付きマイクロタイタープレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ）上で室温で行った。１２５ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＤＲ５（モノマーＦｃ融合体）タンパク質（社内）又は６３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｈＦｃカニクイザルＤＲ５タンパク質（社内）又は６３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＤｃＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）タンパク質（社内）を、１：３０００希釈された抗ウサギＦｃ−ＨＲＰコンジュゲート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１：５０希釈されたＢ細胞上清の混合物を含んでいるウェルに添加した。９０分のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴ（０．２％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で６回洗浄して、ＢＭ  ｂｌｕｅ（登録商標）ＨＲＰ基質溶液（ＢＭ  ｂｌｕｅ（登録商標）：３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で室温で３０分間発色させた。吸光度を３７０ｎｍで測定した。上清の添加なしでブランク値を定めた。
【０５９８】
免疫原のｈＦｃタグに対する負の選択のために、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（カタログ番号１０９−００６−００６）からのビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）、ヒトＩｇＧ１（社内）及び抗ウサギＦｃ−ＨＲＰコンジュゲートの混合物を用いたイムノアッセイを使用し、記載のように処理した。ヒトＤＲ４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号３４７−ＤＲ−１００）、ヒトオステオプロテジェリン（ＯＰＧ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号８０５−０５−１００）及びヒトＤｃＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号６３０−ＴＲ−１００）の様な関連するＴｒａｉｌ結合受容体への結合を試験するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｕｎｃ）上で抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００６−０９８）を用いて各タンパク質−ｈＦｃのキメラを捕捉することによってイムノアッセイを確立した。
2018046823.tif 000027
【０５９９】
ウサギ免疫化から選択されたＤＲ５抗体は、ＥＬＩＳＡにおいてヒト及びカニクイザルＤＲ５に対して良好且つ比較可能な結合特性を示すが、それらはマウスＤＲ５を認識しない。選択された全ての抗体は、結合ＥＬＩＳＡにおいてヒトＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びオステオプロテジェリンに対して有意なシグナルを示さなかったので、ＤＲ５に対する特異性が高い。
【０６００】
ＤＲ５動的親和性
約３０００−５０００共鳴ユニット（ＲＵ）の捕捉系（１０μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギ；注文コードＪＩＲ１１１−００５−０４６；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングさせた。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを、２５℃に設定して−サンプルブロックを１２℃に設定してー、ランニングバッファーで２回プライムした。
【０６０１】
ＤＲ５抗体は、１μｇ／ｍｌ溶液を１０μｌ／分の流速で３０秒間注入することによって捕捉された。溶液中の多様な濃度の組換えヒトＤＲ５（モノマーＨｉｓ−Ａｖｉ融合タンパク質、社内）を、１：３の希釈において１００ｎＭから開始して最低０．４１ｎＭまでで３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入することによって結合を測定した。解離状態を最長３００秒間までモニターし、試料溶液からランニングバッファーに切り換えることによってトリガーした。１００ｍＭのＨ３ＰＯ４（リン酸）溶液を用いて３０μｌ／分の流速で６０秒洗浄することによって表面を再生した。バルクの屈折率差を、ブランク表面から得られたレスポンスを減算することによって補正した。バッファー注入も減算される（＝２倍の参照）。ＫＤ及び他の動態パラメータの計算のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。
2018046823.tif 000028
【０６０２】
実施例２７：  免疫化に由来するＤＲ５抗体の機能的特徴づけ
ＤＮＡ断片化及び細胞生存率
架橋結合抗体の存在下又は非存在下における抗ＤＲ５抗体での処理に応じた、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ７７４  ４２５  ００１）及びＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７３）によってそれぞれ測定されるような、アポトーシス及び細胞生存率を評価することによって、ＤＲ５抗体を機能的に特徴を明らかにした。
【０６０３】
細胞の調製：接着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ヒト乳腺癌）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ）中で：増殖させ、通常、１週間に２回、１：１０に分割した。このアッセイのために、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ）でフラスコから分離させて、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に５０μｌ中に１×１０４細胞／ウェル（ＣＤＤＥ）又は０．２５×１０４細胞／ウェル（ＣＴＧ）の密度で播種し、５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。
【０６０４】
ウサギ抗ＤＲ５抗体によるアポトーシスの誘導：アポトーシスをもたらすＤＲ５受容体の架橋結合を誘導するために、試料（ウサギ抗ＤＲ５  ＩｇＧ、ＤＲ５−ＴＡＡ−＃）を、単独で又は架橋結合抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１の比で一緒に、ＰＢＳ中の５０μｌ中に異なる濃度で細胞に添加した。細胞を、３７℃で２４時間（ＣＤＤＥ）又は４８時間（ＣＴＧ）インキュベートした。
【０６０５】
Ａ）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ：細胞死検出ＥＬＩＳＡ）：製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従ってこのイムノアッセイを実施した。簡単に説明すると、上清を注意深く吸引し、細胞を２００μｌ／ウェルの溶解バッファーで室温で３０分間溶解させた。抗ヒストン抗体及び抗ＤＮＡ抗体からなるマスターミックスを、製造業者の説明書に従って調製して、９６ウェルのストレプトアビジンコーティング付き平底マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）上で１：４の希釈溶解液と混合した。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、ＡＢＴＳ基質を添加し、室温で光度分析に十分な発色まで（１０−３０分）インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍにおいて吸光度を読み取った。
【０６０６】
図３５は、この実験の結果を示している：作製されたウサギ抗ＤＲ５抗体は、異なる効力で、しかし常に用量依存的な様式で、且つＦｃを介したＤＲ５分子の架橋結合後のみに、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のアポトーシスを誘導することができた。抗ウサギＦｃ特異的二次抗体の非存在下では、有意な細胞死は検出されなかった。
【０６０７】
Ｂ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）：イムノアッセイを、製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実施した。簡単に説明すると、最初に、発光基質を含むバッファー中に細胞を溶解させた（１００μｌ）。シェーカー上で１０分のインキュベーション時間後、発光を、ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｌｕｓリーダーで測定した。
【０６０８】
図３６は、この実験の結果を示している：細胞生存率は、用量依存的な様式で、抗ＤＲ５抗体によって、受容体高クラスター形成に応じて低下した。作製されたウサギ抗ＤＲ５抗体は、変動する効力で、しかし常に用量依存的な様式で、且つＦｃを介したＤＲ５分子の架橋結合後のみに、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の生存率を低下させることができた。抗ウサギＦｃ特異的二次抗体の非存在下では、細胞生存率は、何れの抗体濃度においても影響を受けなかった。
【０６０９】
細胞生存率及びカスパーゼ８活性化
Ｃａｓｐａｓｅ８−Ｇｌｏカスパーゼ８活性化アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ＃Ｇ８２０２）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ＃ＴＢ２８８）を、製造業者の説明書に従って行った。
【０６１０】
カスパーゼ８活性化アッセイのために、１０，０００個のがん細胞を、１ウェルあたり７５μｌで不透明白色９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  カタログ＃ＢＤ３５３２９６）中に播種し、５％のＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。次いで、抗ＤＲ５抗体を、６回の連続希釈において抗ウサギＦｃ抗体と共に添加した（２５μｌ中の等しいモル濃度のＤＲ５抗体及びウサギＦｃ抗体）。抗体を、細胞上で５％のＣＯ２と共に３７℃で３時間インキュベートした。次いで、溶解バッファー中の１００μｌのカスパーゼ８基質を各ウェルに添加して十分に混合した。３７℃でさらに３０分のインキュベーション後、発光シグナルをＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５プレート中で読み取った。
【０６１１】
細胞生存率アッセイのために、１ウェルあたり４，０００個のがん細胞を黒色／透明底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  カタログ＃ＢＤ３５３２２０）中に播種し、５％のＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。次いで、抗ＤＲ５抗体を、６回の連続希釈において抗ウサギＦｃ抗体と共に添加した（２５μｌ中の等しいモル濃度のＤＲ５抗体及びウサギＦｃ抗体）。抗体を、細胞上で５％のＣＯ２と共に３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加して十分に混合した。室温でさらに１０分のインキュベーション後、発光シグナルをＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５プレートリーダーで読み取った。
【０６１２】
図３７は、７ｎＭの濃度の異なる架橋ＤＲ５抗体での処理に応じた、３種の異なるヒト腫瘍細胞（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞増殖の抑制の分析（Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ  Ａｓｓａｙ）を示している。図３８は、７ｎＭの濃度の架橋ＤＲ５抗体で処理後の３種のヒト腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１、ＮＣＩ  Ｈ４６０及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）におけるカスパーゼ８活性化によって測定されるアポトーシス誘導を示している。試験した全てのＤＲ５抗体は、試験した全ての腫瘍細胞株において、高いカスパーゼ８活性化を誘導する。ＤＲ５抗体は、変動する効力で、試験した全ての細胞株の生存率を低下させることができた。
【０６１３】
実施例２８：  ファージディスプレイ及び免疫化によって得られたＤＲ５抗体の化学安定性の評価
ストレスを受けたＤＲ５抗体試料の作製
ＤＲ５抗体の化学安定性を試験するために、ストレスを受けた試料を作製し、ＤＲ５結合に関して機能的に特徴を明らかにした。高ｐＨストレスでは−中でも−反応性Ａｓｎホットスポットの脱アミド化が誘導されるのに対して、ｐＨ６．０では、例えば、反応性のＡｓｎ及びＡｓｐ残基からのスクシンイミド形成が誘導され得る。高ｐＨストレスについては、試料を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ８．０に移し入れ、４０℃で５日間インキュベートした。低ｐＨストレスについては、試料を、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に移し入れ、４０℃で３週間インキュベートした。コントロール試料は、−８０℃で維持した。
【０６１４】
ストレスを受けたＤＲ５抗体試料の相対的な活性濃度の決定
約５０００共鳴ユニット（ＲＵ）の捕捉系（２０μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギ；注文コードＪＩＲ１１１−００５−０４６；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することによってｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上にカップリングさせた。サンプルバッファー及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルの温度を２５℃に、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉の前に、フローセルを、ランニングバッファーで２回プライムした。
【０６１５】
二重特異性抗体は、５０ｎＭ溶液を１０μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉された。溶液中のヒトＤＲ５を、２００ｎＭの濃度で３０μｌ／分の流速で９０秒間注入することによって結合を測定した。解離状態を最長９０秒間までモニターし、試料溶液からランニングバッファーに切り換えることによってトリガーした。０．８５％のＨ３ＰＯ４（リン酸）溶液を用いて３０μｌ／分の流速で６０秒洗浄することによって表面を再生した。バルクの屈折率差を、ブランク表面から得られたレスポンスを減算することによって補正した。
【０６１６】
ストレスを受けた抗体の相対的な活性濃度は、（ストレスを受けていない参照試料と比較して）捕捉量及び結合量から算出される比（ＲＵ捕捉で除算されたＲＵ結合）である。
【０６１７】
図３９は、ストレスを受けたＤＲ５抗体試料の相対的な活性濃度の決定に使用される例示的な応答曲線を示している。図４０及び図４１は、免疫化及びファージディスプレイに由来する、元の及びストレスを受けたＤＲ５抗体の相対的な活性濃度を示している。それぞれｐＨ６及びｐＨ８のストレス後に少し低下した相対的な活性濃度を示した抗体ＤＲ５ＴＡＡ−００１３及びＤＲ５ＴＡＡ−００１０以外、他の全てのＤＲ５抗体は、ｐＨストレス後に相対的な活性濃度のいかなる関連した低下も示さなかった。
【０６１８】
実施例２９：  共培養アッセイにおける、免疫化及びファージディスプレイによって得られた、２＋２二重特異性フォーマットのＤＲ５−バインダーの機能的特徴づけ
ＤＲ５の高架橋結合による腫瘍細胞のアポトーシスの標的化された誘導のための二重特異性抗体の作製に、免疫化によって得られた新規ＤＲ５バインダーを使用することができるかどうかを評価するために、一組のＤＲ５抗体を、ＦＡＰ抗体２８Ｈ１と組み合わせて（図１８Ａに図示しているような）２＋２二重特異性分子に変換した。二重特異性コンストラクトを、それらのアポトーシス誘導活性について共培養アッセイにおいて試験した。
【０６１９】
各処理について３重の試料を可能にするために１５０μｌの総容量中に、３Ｔ３細胞又はマウスＦＡＰを発現するようにトランスフェクトされた３Ｔ３細胞（２，５００細胞／ウェル）との共培養で、ＤＬＤ−１又はＨ４６０腫瘍細胞（１０，０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、５０μｌの抗体（４×濃度）で２４時間処理した（未処理コントロール：培地５０μｌ）。
【０６２０】
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ：（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号１１７７４  ４２５  ００１）：操作は、製造業者の手順に明記された通りに正確に従って行われた。Ｖｍａｘ値は、１分毎に１０分間、４０５ｎｍにおけるａｂｓの測定値から（４９０ｎｍにおける参照波長値を引いて）推定される。３重のバックグラウンド値（溶解バッファーのみ）の平均を全ての試料から減算する。データは、未処理の試料に対するアポトーシス後の増加倍数で表される。
【０６２１】
図４３は、ＤＮＡ断片化によって検出されるような、共培養アッセイにおける２＋２二重特異性コンストラクトによるＤＬＤ−１及びＨ４６０腫瘍細胞株におけるアポトーシスの誘導を示している。ＤＲ５結合構成要素としてドロジツマブを含んでいる二重特異性コンストラクトは、ＦＡＰの非存在下においてすでにアポトーシスを誘導するのに対して、免疫化によって得られた新しいＤＲ５バインダーを含んでいる全てのコンストラクトは、ＦＡＰの存在下でのみアポトーシスを誘導する。新たに開発されたＤＲ５バインダーを有するコンストラクト、例えば、００１１−２８Ｈ１及び００１６−２８Ｈ１等は、特に低濃度において、ドロジツマブを含んでいる二重特異性コンストラクトと比較して、より高い程度までアポトーシスを誘導することができる。
【０６２２】
実施例３０：  免疫化及びファージディスプレイによって得られた、２＋２二重特異性フォーマットのＤＲ５−バインダーの細胞結合の特徴づけ
細胞を、染色バッファー（ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ）中の２４μｇ／ｍｌの各ＤＲ５−ＦＡＰコンストラクト又はドロジツマブで氷上で１時間染色した（５ｘ１０４／５０μｌ）。２回洗浄した後、二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１１０１３）を１０μｇ／ｍｌで添加し、細胞を、直接光から保護して、再び氷上で１時間インキュベートした。さらに２回の洗浄ステップ後、細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏで測定した。
【０６２３】
試験した全てのコンストラクトは、異なる強さでＭＤＡ−ＭＢ−２３１への結合を示す（図４４を参照されたい）。
【０６２４】
実施例３１：  免疫化によって得られたＤＲ５抗体のＶＨ及びＶＬドメインのヒト化
ヒト生殖系列配列と同一のフレームワークを使用して、ウサギＤＲ５結合抗体ＤＲ５ＴＡＡ−００１１をヒト化した。ヒト生殖系列配列ｈＶＨ＿３＿６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９９６８２）及びｈＶＨ３＿１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１７６７）は、ＶＨヒト化変異体の２種のアクセプターであって、ヒト生殖系列配列ｈＶＫ１＿９３（アクセッション番号Ｐ０４４３１）及びｈＶＫ１＿５（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１６０２）は、ＶＬヒト化のアクセプターであった。配列番号２３及び２６から選択される重鎖可変領域コンストラクト、並びに配列番号２４、２９、３０、３１、及び３２から選択される軽鎖可変領域コンストラクトを含んでいる８種のヒト化ＤＲ５抗体が得られ、これらの特徴をさらに明らかにした（実施例２７から２９）。
2018046823.tif 000029
【０６２５】
実施例３２：  免疫化によって得られたヒト化ＤＲ５−バインダーの機能的特徴づけ
架橋結合抗体の存在下又は非存在下におけるヒト化抗ＤＲ５抗体での処理に応じてＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ７７４  ４２５  ００１）によって測定されるアポトーシスを評価することによって、ヒト化ＤＲ５抗体を機能的に特徴を明らかにした。
【０６２６】
細胞の調製：接着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（ヒト乳腺癌）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）で補ったＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ）中で増殖させ、通常、１週間に２回、１：１０に分割した。このアッセイのために、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ）でフラスコから分離させて、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に５０μｌ中に１×１０４細胞／ウェル（ＣＤＤＥ）の密度で播種し、５％のＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。
【０６２７】
ヒト化抗ＤＲ５抗体によるアポトーシスの誘導：アポトーシスをもたらすＤＲ５受容体の架橋結合を誘導するために、試料（ヒト化抗ＤＲ５  ＩｇＧ、ＤＲ５−ＴＡＡ−＃）を、単独で又は架橋結合抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ２１３６）と１：１の比で一緒に、ＰＢＳ中の５０μｌ中に異なる濃度で細胞に添加した。細胞を、３７℃で２４時間インキュベートした（ＣＤＤＥ）。
【０６２８】
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（ＣＤＤＥ：細胞死検出ＥＬＩＳＡ）：製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従ってこのイムノアッセイを実施した。簡単に説明すると、上清を注意深く吸引し、細胞を２００μｌ／ウェルの溶解バッファーで室温で３０分間溶解させた。抗ヒストン抗体及び抗ＤＮＡ抗体からなるマスターミックスを、製造業者の説明書に従って調製して、９６ウェルのストレプトアビジンコーティング付き平底マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）上で１：４の希釈溶解液と混合した。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、ＡＢＴＳ基質を添加し、室温で光度分析に十分な発色まで（１０−３０分）インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍにおいて吸光度を読み取った。アポトーシスシグナルを、２μｇ／ｍｌの濃度におけるキメラ抗ＤＲ５抗体のアポトーシスに標準化した。
【０６２９】
結果を図４５に示している：Ａ  ＤＲ５ＴＡＡ−００１１のヒト化変異体（ＤＲ５ＴＡＡ−００６６−ＤＲ５ＴＡＡ−００７５、黒線）は、二次抗体での架橋結合に応じて用量依存的な様式でアポトーシスを誘導する。数種類のヒト化変異体、例えば、ＤＲ５ＴＡＡ−００６７、ＤＲ５ＴＡＡ−００７１、ＤＲ５ＴＡＡ−００７４及びＤＲ５ＴＡＡ−００７５等は、キメラ変異体（ＤＲ５ＴＡＡ−００５２、灰線）と比較して、最大の誘導及び用量依存性に関して同様の様式でアポトーシスを誘導することができる。Ｂ  ＤＲ５ＴＡＡ−００１１のヒト化変異体（ＤＲ５ＴＡＡ−００６６−ＤＲ５ＴＡＡ−００７５）は、二次抗体によって架橋結合されていない場合には、アポトーシスを誘導しない。したがって、このヒト化変異体は、ＦＡＰの存在下でのみ特異的にアポトーシスを誘導するために二重特異性フォーマットにおいて使用するのに適している。
【０６３０】
選択されたヒト化変異体のＦａｂを、（Ｇ４Ｓ）４コネクターを介してヒトＦｃ領域にＣ末端で融合させた。これらの分子を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生させて、ＰｒｏｔｅｉｎＡビーズを介して精製し、アポトーシス誘導アッセイにおいて試験した。図２２ｂ）に、二次抗Ｆｃ  ＩｇＧでの架橋結合後にこれらのＦｃ−ＤＲ５融合分子を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＤＮＡ断片化アッセイの結果をまとめている。試験した全ての分子は、標的細胞株のアポトーシスを誘導することができ、これにより、選択されたＤＲ５バインダーはＮ末端で阻害されないことが示され、これらのバインダーと共に使用可能なフォーマットの範囲がより広くなる。
【０６３１】
実施例３３：  免疫化によって得られたヒト化ＤＲ５−バインダーの結合親和性の特徴づけ
ヒト化ＤＲ５−バインダーを、それらの結合親和性について、ＳＰＲ分析によって特徴を明らかにした。ＢＩＡｃｏｒｅ特徴分析：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＣＭ５センサーを用いて使用した。０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＮａＯＨ、１０ｍＭのＨＣｌ及び１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を１００μｌ／分で１分注入することによって、このセンサーを予め調整した。システムバッファーは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴＷＥＥＮ  ２０であった。サンプルバッファーは、１ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルデキストラン（Ｓｉｇｍａ）で補ったシステムバッファーであった。抗ヒト抗体捕捉系を、バイオセンサー表面上に確立した。製造業者の説明書に従い、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学作用を使用して、８０００の相対的なレスポンスユニットのヤギ抗ヒトＦｃγ断片特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を固定化した。１Ｍのエタノールアミンを使用して、センサーを非活性化した。
【０６３２】
２０ｎＭの各抗体試料を、１０μｌ／分の流速で１分間捕捉した。参照として、２０ｎＭのポリクローナルヒト標準ＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｄｅｎｔ．１１７１７５７０）を参照フローセル１上に捕捉し、減算シグナルをモニターした。
【０６３３】
一実施形態では、２３．３ｋＤａの被分析物ＤＲ５を、０ｎＭ、３．３ｎＭ、１１ｎＭ、２×３３ｎＭ、１００ｎＭ及び３００ｎＭの濃度系列において３０μｌ／分で３分の結合時間注入した。複合体解離を５分間モニターした。
【０６３４】
１０ｍＭのグリシンバッファー  ｐＨ１．５の１分の注入によって３０μｌ／分で系を再生し、次いで、１０ｍＭグリシンバッファー  ｐＨ１．７を２回連続して１分注入した。製造業者の説明書に従い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して動態パラメータを評価した。
【０６３５】
ラングミュアモデルによってＲＭＡＸグローバルを用いて、結合速度定数ｋａ（１／分）、解離速度定数ｋｄ（１／秒）及び解離定数ＫＤを算出した。
2018046823.tif 000030
【０６３６】
ヒト化変異体の動的結合特性は、キメラ変異体と比較して、ＫＤ及びｋｄについては約３の係数以内、ｋａについては約２の係数以内に維持された。
【０６３７】
実施例３４：  免疫化によって得られたヒト化ＤＲ５−バインダーの熱安定性及び化学安定性の特徴づけ
ヒト化ＤＲ５−バインダーを、それらの熱安定性及び化学安定性について特徴を明らかにした。試料を、２０ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン塩化物、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製して、０．４μｍのフィルタープレートを通した遠心分離によって光学用の３８４ウェルプレートに移し入れ、パラフィン油で覆った。試料を０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃まで加熱しながら、動的光散乱により、流体力学的半径を繰り返し測定した。凝集発生温度は、流体力学的半径が増大し始める温度として定義される。
2018046823.tif 000031
【０６３８】
ＤＲ５ＴＡＡ−００１１のヒト化変異体では、６８℃以上の凝集温度での高い熱安定性が明らかにされた。
【０６３９】
化学安定性
ストレスを受けたＤＲ５抗体試料の作製：ＤＲ５抗体の化学安定性を試験するために、ストレスを受けた試料を作製し、ＤＲ５結合に関して機能的に特徴を明らかにした。高ｐＨストレスでは−中でも−反応性Ａｓｎホットスポットの脱アミド化が誘導されるのに対して、ｐＨ６．０では、例えば、反応性のＡｓｎ及びＡｓｐ残基からのスクシンイミド形成が誘導され得る。高ｐＨストレスについては、試料を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ８．０に移し入れ、４０℃で５日間インキュベートした。低ｐＨストレスについては、試料を、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に移し入れ、４０℃で３週間インキュベートした。コントロール試料は、−８０℃で維持した。
【０６４０】
ストレスを受けたＤＲ５抗体試料の分析：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＣＭ５センサーを用いて使用した。０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＮａＯＨ、１０ｍＭのＨＣｌ及び１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を１００μｌ／分で１分注入することによって、このセンサーを予め調整した。システムバッファーは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴＷＥＥＮ  ２０であった。サンプルバッファーは、１ｍｇ／ｍＬのカルボキシメチルデキストラン（Ｓｉｇｍａ）で補ったシステムバッファーであった。抗ヒト抗体捕捉系を、バイオセンサー表面上に確立した。製造業者の説明書に従い、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学作用を使用して、８０００の相対的なレスポンスユニットのヤギ抗ヒトＦｃγ断片−特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を固定化した。１Ｍのエタノールアミンを使用して、センサーを非活性化した。
【０６４１】
２０ｎＭの各抗体試料を、１０μｌ／分の流速で１分間捕捉した。参照として、２０ｎＭのポリクローナルヒト標準ＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｄｅｎｔ．１１７１７５７０）を参照フローセル１上に捕捉し、減算シグナルをモニターした。
【０６４２】
別の実施形態では、被分析物を、０ｎＭ及び５００ｎＭにおいて１００μｌ／分で２分の結合時間注入した。複合体解離を５分間モニターした。
2018046823.tif 000032
【０６４３】
１０ｍＭのグリシンバッファー  ｐＨ１．５の１分の注入によって３０μｌ／分で系を再生し、次いで、１０ｍＭグリシンバッファー  ｐＨ１．７を２回連続して１分注入した。製造業者の説明書に従い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して動態パラメータを評価した。
【０６４４】
抗体／抗原複合体半減期を、式ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）によって分で算出した。モル比を算出した：ＭＷ（抗体）／ＭＷ（抗原）＊ＢＬ（抗原）／ＣＬ（抗体）。
【０６４５】
抗体注入終了の直前（抗体捕捉量、ＣＬ：Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｅｖｅｌ）及び被分析物注入の直前（後結合、ＢＬ：Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ）にデータ報告点が記録された。抗体結合能の特徴を明らかにするために、捕捉量（ＣＬ）及び後結合（ＢＬ）のレスポンスシグナルの高さを使用した。相対的な結合係数をＢＬ／ＣＬで算出した。ストレスの衝撃を受けていない抗体試料（相対的に活性な結合）に対する、抗体試料の相対的な結合の比率から指数が形成された。
【０６４６】
結果を表２７に示している。ＤＲ５ＴＡＡ−００１１のヒト化変異体にストレス試験を行った。非ストレス下の最初の材料と比較して、ヒト化変異体は何れも、ヒトＤＲ５への結合の減少を示さなかった。
【０６４７】
実施例３５：  材料及び方法
他に記載がない限り、上記に概説した実験において後述の材料及び方法を使用している。
【０６４８】
組換えＤＮＡ技術
全ての抗体及び抗原発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製された。分子生物学的試薬は、製造業者の推奨に従って使用された。遺伝子又は遺伝子断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅又はＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドから作製された。ＰＣＲ増幅又はサブクローニングされたＤＮＡ断片を、ＤＮＡシークエンシング（Ｓｙｎｅｒｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって確認した。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡを調製するために、標準的なＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを、適切な大腸菌宿主株中に形質転換して、その中で増幅させた。二重特異性分子の産生のために、標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づく方法を使用して、各遺伝子をコードしているプラスミドでＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトした。３種の発現ベクターの使用されたプラスミド比は、１：１：１であった。トランスフェクトされた細胞を７日間培養して、精製のために上清を回収した。
【０６４９】
トランスフェクションＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞
本明細書中で使用される全ての（二重特異性）抗体及び抗原は（商業的な供給源から得られたのではない場合）、後述のような、必要とされるベクターのための、ＰＥＩを介したトランスフェクション操作を使用して、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過的に産生された。
【０６５０】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ  ＣＨＯ培地中、無血清懸濁液で培養する。産生のために、トランスフェクションの２４時間前に、５００ｍｌの振盪フラスコ中に４億個のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を播種する。トランスフェクションのために、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を、予め温めた２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地に置換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地中に混合し、２００μｇのＤＮＡの最終量にする。５４０μｌのＰＥＩを添加した後、溶液を１５秒間ボルテックス処理し、次いで、室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％のＣＯ２雰囲気でインキュベーター中３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション時間後、１６０ｍｌのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１を添加する。７日後、培養上清を、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって精製のために回収し、その溶液を、フィルター滅菌（０．２２μｍフィルター）して、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを添加し、４℃で維持する。産生後、上清を回収して、抗体を含む上清を０．２２μｍの滅菌フィルターに通して濾過し、精製まで４℃で保存した。
【０６５１】
精製：標準的な＋ＰｒｏｔＡビーズ
タンパク質を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において一過性の発現によって産生させた。本明細書に記載の全ての二重特異性分子を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）等の、標準的な操作を使用して２段階で精製した。
【０６５２】
その上清を、（２Ｍのトリス  ｐＨ８．０を使用して）ｐＨ８．０に調整し、バッファーＡ（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化されたＴｒｉｃｏｒｎ（商標）５／５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カラム容量（ｃｖ）＝１ｍｌ）中に充填されたＭａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。少なくとも５カラム容量（ＣＶ）のバッファーＡで洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去した。直線的ｐＨ勾配０−１００％において１２ＣＶを超えるバッファーＢ（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌ）で目的のタンパク質を溶出させた。最後に、１０ＣＶのバッファーＢでの追加のステップを含め、その後、５ＣＶのバッファーＡの平衡化ステップを行った。目的のタンパク質を含んでいる画分をプールし、（２Ｍのトリス  ｐＨ８．０を使用して）ｐＨを徐々にｐＨ６．０に調整した。超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０．０００  ＭＷＣＯ  ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、試料を０．５−２ｍｌに濃縮し、次いで、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００調製用グレードカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。溶出された画分の凝集体含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、２５℃でｐＨ６．７で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ  分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。２％未満のオリゴマーを含む画分をプールし、超濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ  ３０．０００  ＭＷＣＯ  ＨＹ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、１−１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に濃縮した。精製されたタンパク質を液体Ｎ２で凍結し、−８０℃で保存した。
【０６５３】
高速且つ高処理能力の精製のために、上清を、２Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８の１／４０カラムを使用して中和し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−５１３８−０１））と共に、回転させながら４℃で１９時間インキュベートした。次いで、この上清／ビーズ混合物を、平衡化された空のＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号１７−０４３５−０１）に重力流によって通過させた。残ったビーズを結合バッファー（１０ｍＭ  トリス、５０ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）で２回洗浄し、低ｐＨステップ（１０ｍＭ  トリス、５０ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で抗体を溶出させた。最後に、溶出されたタンパク質を、１／４０容量の２Ｍのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０の添加によって中和した。精製された抗体のタンパク質濃度を、２８０ｎｍで測定された吸光度及びアミノ酸配列から算出したモル吸光係数から算出した。ランニングバッファー（２００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．０２％  アジ化ナトリウム  ｐＨ７．０）２５℃で平衡化されたＺｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  分析用サイズ排除カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  カタログ番号ＰＳＭＯ８４５００６）を使用して、抗体試料の凝集体含有量を分析した。
【０６５４】
ＦＡＣＳ結合分析
アポトーシスアッセイを実施する前に、使用する全ての標的細胞株を、腫瘍関連抗原及びＤＲ５デスレセプターの相対的な発現量について分析した。
【０６５５】
細胞の数及び生存率を決定した。このために、接着して増殖している細胞を、細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１３１５１−０１４）で分離した。細胞を遠心分離（４分、４００×ｇ）によって回収して、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ）で洗浄し、細胞数をＦＡＣＳバッファー中１．１１１×１０６細胞／ｍｌに調整した。この細胞懸濁液を、９６ウェル丸底プレートの１ウェルあたり１８０μｌ使用して、１ウェルあたり２×１０５細胞にした。これらの細胞を、適切な希釈率の一次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離（４分、４００×ｇ）によって回収して、上清を完全に除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。これらの細胞を、希釈した１２μｌの二次抗体（無標識の一次抗体を使用した場合）又はＦＡＣＳバッファー中に、遮光して４℃で３０分間再懸濁させた。ＦＡＣＳバッファーでの２回の洗浄ステップ後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、ＨＴＳ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ）で分析した。代替的に、細胞を、ＦＡＣＳバッファー中２％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）２００μｌで４℃で２０分間固定し、後に分析することもできた。全てのアッセイを３重で行った。
2018046823.tif 000033
【０６５６】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）
ＩｇＧとしての又は二重特異性フォーマットの多様な抗ＤＲ５バインダーの結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００上でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行った。
【０６５７】
ＤＲ５バインダーの種交差反応性の決定のために、マウス、ヒト及びカニクイザルからのビオチン化ＤＲ５を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルにそれぞれ約３００ＲＵの固定化量で直接にカップリングさせた。ＩｇＧとしての多様なＤＲ５バインダーを、５００、１００及び２５ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流速で６０秒間注入し、その後、９０秒間の解離段階を行った。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定化されていない参照フローセル上で得られたレスポンスを減算することによって補正した。
【０６５８】
第２の実験では、ｈｕＤＲ４Ｆｃ、ｈｕＤｃＲ１Ｆｃ、ｈｕＤｃＲ２Ｆｃ及びｒｈｕＯＰＧＦｃをアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップに固定化することによってＤＲ５バインダーの特異性を決定した。固定化量は、１００及び４００ＲＵの間であった。各バインダーを、５００、１００及び２５ｎＭの濃度で、異なるフローセルに３０μｌ／分の流速で６０秒間通過させ、解離状態を９０秒間モニターした。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定化されていない参照フローセル上で得られたレスポンスを減算することによって補正した。
【０６５９】
さらに、固定化されているヒト及びカニクイザルのＤＲ５  ＥＣＤ（固定化量は、約１００ＲＵであった）を含むＣＭ５チップ上で、ＩｇＧ及び２＋２フォーマットの結合活性を測定した。各コンストラクト又はＩｇＧを、１：２の希釈段階における５００−０．９７ｎＭの間の濃度で、異なるフローセルに３０μｌ／分で９０秒間通過させた。解離を１２０秒間分析した。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定化されていない参照フローセル上で得られたレスポンスを減算することによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して速度定数を算出し、動態分析又は定常分析の何れかとして数値積分法によって反応速度式を１：１ラングミュア結合に適合させた。
【０６６０】
標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抗ヒトＦａｂ又は抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）の何れかをｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接にカップリングさせた捕捉フォーマットを使用して、親和性を評価した。固定化量は、約８，０００−１００００ＲＵであった。ＩｇＧ又は２＋２のフォーマットのＤＲ５バインダーを、それぞれ５０又は３０ｎＭの濃度で、３０μｌ／分の流速で６０秒間捕捉させた。１：２の希釈段階における５００−０．９７５ｎＭ（カニクイザルＤＲ５）又は１０００−０．９７５ｎＭ（ｈｕＤＲ５）の範囲に及ぶ濃度での３０μｌ／分で１２０秒間のヒト又はカニクイザルのＤＲ５の注入を、２＋２フォーマットについて行った。ＩｇＧの親和性を、ｈｕＤＲ５のみについて、１：３の希釈段階において２０００−２０ｎＭの濃度で測定した。解離を１２０秒間にわたって評価した。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定化されていない参照フローセル上で得られたレスポンスを減算することによって補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して速度定数を算出し、動態分析又は定常分析の何れかとして数値積分法によって反応速度式を１：１ラングミュア結合に適合させた。
【０６６１】
古典的なサンドイッチアッセイ又はタンデム型の手法の何れかを用いて、２種の異なるフォーマットにおいてエピトープビニングを測定した。古典的なサンドイッチアッセイでは、各ＤＲ５バインダーをアミンカップリングによってＣＭ５チップ表面上の１つのフローセルに約５００ＲＵの標的固定化量で直接に固定化する。次いで、ｈｕＤＲ５を５００ｎＭの濃度で各フローセルに６０秒間通過させ（流速３０μｌ／分）、その後、もう１つのＤＲ５バインダーを３０ｎＭの濃度で６０秒間注入する（流速３０μｌ／分）。同じ流速で解離を６０秒間にわたってモニターした。同一のＤＲ５バインダーの注入に次いでその固定化されているものをコントロールとして使用する。固定化されているバインダーによって全てのＤＲ５が結合されていれば、これは、レスポンスを増加させないはずであるからである。
【０６６２】
タンデム型の手法では、ｈｕＤＲ５ＥＣＤを、ＣＭ５チップ上に２５０ＲＵの最終レスポンスで固定化した。次いで、第１のＤＲ５バインダーを２０ｎＭの濃度でフローセルに９０秒間通過させ、その後、第２のＤＲ５バインダーを９０秒間注入した。解離を９０秒間にわたってモニターした。流速は、全てのステップについて３０μｌ／分であった。２種のバインダーが異なるエピトープを認識する場合には、レスポンスユニットにおける増加が認められ得た。全てのＤＲ５分子が最初の注入によって飽和されて同一のエピトープへの追加の結合が生じ得ないことを確認するために、同一のＤＲ５バインダーの注入をコントロールとして使用した。
【０６６３】
これらのバインダーのうちの何れかがリガンド阻害性であるかどうかをさらに決定するために、ｒｈｕＴＲＡＩＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  カタログ番号３１０−０４）をアミンカップリングによってＣＭ５チップ上に２，０００ＲＵの固定化量で固定化した。ｈｕＤＲ５  Ｆｃ又はｈｕＤＲ５  ＥＣＤを、試験する各ＤＲ５バインダーと複合体形成させ（１００ｎＭのＤＲ５と５００ｎＭのＩｇＧ）、その複合体をフローセルに５０μｌ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を１２０秒間にわたって評価した。さらに、古典的なサンドイッチアッセイを用いた。そこでは、ｈｕＤＲ５Ｆｃ又はｈｕＤＲ５  ＥＣＤを最初に１００ｎＭで注入し、その後、各ＤＲ５バインダーを５００ｎＭで注入した。接触時間は、３０μｌ／分の流速で、ＤＲ５については６０秒、且つＩｇＧについては９０秒であった。解離ステップを９０秒間行った。ＤＲ５に加えて、ＴＲＡＩＬに結合し得たバインダーは非リガンド阻害性であるとみなされたのに対し、いかなる追加の結合も示さなかったバインダーはリガンド阻害性とみなされた。
【０６６４】
２＋２フォーマットの多様なＤＲ５バインダーの同時の結合を、固定化されているｈｕＤＲ５Ｆｃビオチン（固定化量約１０００ＲＵ）を含んでいるＳＡチップ上で確認した。第１のステップにおいて、２＋２コンストラクトを９０秒間注入し、その後、ヒト又はマウスのＦＡＰの何れかを５００又は１００ｎＭの濃度で、９０秒間注入した。解離を６０秒間モニターした。全てのステップについての流速は、３０μｌ／分であった。ヒト又はマウスのＦＡＰの注入によってレスポンスユニットにおけるさらなる増加が認められた場合に、同時の結合は本当であるとみなされた。
【０６６５】
古典的なサンドイッチアッセイ又はタンデム型の手法を用いての何れかの２種の異なるフォーマットにおいてエピトープビニングを測定した。古典的なサンドイッチアッセイでは、各ＤＲ５バインダーをアミンカップリングによってＣＭ５チップ表面上の１つのフローセルに約５００ＲＵの標的固定化量で直接に固定化する。次いで、ｈｕＤＲ５を５００ｎＭの濃度で各フローセルに６０秒間通過させ（流速３０μｌ／分）、その後、もう１つのＤＲ５バインダーを３０ｎＭの濃度で６０秒間注入する（流速３０μｌ／分）。同じ流速で解離を６０秒間にわたってモニターする。同一のＤＲ５バインダーの注入に次いでその固定化されているものをコントロールとして使用する。固定化されているバインダーによって全てのＤＲ５が結合されていれば、これは、レスポンスを増加させないはずであるからである。
【０６６６】
タンデム型の手法では、ｈｕＤＲ５ＥＣＤを、ＣＭ５チップ上に２５０ＲＵの最終レスポンスで固定化した。次いで、第１のＤＲ５バインダーを２０ｎＭの濃度でフローセルに９０秒間通過させ、その後、第２のＤＲ５バインダーを９０秒間注入する。解離を９０秒間にわたってモニターした。流速は、全てのステップについて３０μｌ／分であった。２種のバインダーが異なるエピトープを認識する場合には、レスポンスユニットにおける増加が認められ得た。全てのＤＲ５分子が最初の注入によって飽和されて同一のエピトープへの追加の結合が生じ得ないことを確認するために、同一のＤＲ５バインダーの注入をコントロールとして使用した。
【０６６７】
これらのバインダーのうちの何れかがリガンド阻害性であるかどうかをさらに決定するために、ｒｈｕＴＲＡＩＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  カタログ番号３１０−０４）をアミンカップリングによってＣＭ５チップ上に２，０００ＲＵの固定化量で固定化した。ｈｕＤＲ５  Ｆｃ又はｈｕＤＲ５  ＥＣＤを、試験する各ＤＲ５バインダーと複合体形成させ（１００ｎＭのＤＲ５と５００ｎＭのＩｇＧ）、その複合体をフローセルに５０μｌ／分の流速で９０秒間通過させた。解離を１２０秒間にわたって評価した。さらに、古典的なサンドイッチアッセイを用いた。そこでは、ｈｕＤＲ５Ｆｃ又はｈｕＤＲ５  ＥＣＤを最初に１００ｎＭで注入し、その後、各ＤＲ５バインダーを５００ｎＭで注入した。接触時間は、３０μｌ／分の流速で、ＤＲ５については６０秒、且つＩｇＧについては９０秒であった。解離ステップを９０秒間行った。ＤＲ５に加えてＴＲＡＩＬに結合し得たバインダーは非リガンド阻害性であるとみなされたのに対し、いかなる追加の結合も示さなかったバインダーはリガンド阻害性とみなされた。
【０６６８】
２＋２フォーマットの多様なＤＲ５バインダーの同時の結合を、固定化されているｈｕＤＲ５Ｆｃビオチン（固定化量約１０００ＲＵ）を含んでいるＳＡチップ上で確認した。第１のステップにおいて、２＋２コンストラクトを９０秒間注入し、その後、ヒト又はマウスのＦＡＰの何れかを５００又は１００ｎＭの濃度で、９０秒間注入した。解離を６０秒間モニターした。全てのステップについての流速は、３０μｌ／分であった。ヒト又はマウスのＦＡＰの注入によってレスポンスユニットにおけるさらなる増加が認められた場合に、同時の結合は本当であるとみなされた。
【０６６９】
ＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡ
誘導されたアポトーシスの決定のために、ＲｏｃｈｅからのＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＰＬＵＳキットを使用した。簡単には、（分離、並びに細胞数及び生存率の決定の後に）９６ウェルプレートの１ウェルあたり１０４個のＦＡＰ発現ＧＭ０５３８９細胞を、２００μｌの適切な培地中に播種し、５％のＣＯ２雰囲気中で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を、適切な濃度のアポトーシス誘導抗体、コントロール抗体及び他のコントロールを含む１００μｌの新鮮な培地で置換した：
【０６７０】
二重特異性抗体及びＩｇＧを、０．７及び７ｎＭ又は表示の通りの最終濃度で使用した。架橋結合抗体を、一次抗体と同一の容量モル濃度で使用した。抗体の添加後、１ウェルあたり１０４個のアポトーシス感受性腫瘍細胞を添加した。
【０６７１】
これらの細胞を、５％のＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートして、アポトーシスの誘導を可能にさせた。細胞を、遠心分離（１０分、２００×ｇ）によって回収し、２００μｌの（キットで供給された）溶解バッファー中で室温で１時間インキュベートした。完全なＤＮＡ及び溶解された細胞を、遠心分離（１０分、２００×ｇ）によって沈殿させ、断片化されたＤＮＡを含む２０μｌの上清を、製造業者の推奨に従ってアポトーシス誘導について分析した。
【０６７２】
増殖の阻害（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ）
細胞生存率アッセイのために、（７５μｌの容量中の）４，０００腫瘍細胞／ウェルを黒色の透明底９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  カタログ＃ＢＤ３５３２２０）中に播種し、加湿された５％のＣＯ２雰囲気中で３７℃で一晩インキュベートした。次いで、２．５×連続希釈の６つの濃度で２５μｌの４×ＤＲ５バインダー  プラス／マイナス  ウサギ−Ｆｃ（等しいナノモルのＤＲ５バインダー及びＦｃ）を添加した。５％のＣＯ２と共に３７℃で４８時間のインキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加して十分に混合した。室温でさらに１０分間のインキュベーション後、発光設定下でＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５プレートリーダーを用いて、結果の細胞生存率を決定した。
【０６７３】
カスパーゼ８（カスパーゼＧｌｏ）の誘導
カスパーゼ８活性化アッセイのために、７５μｌ中の１０，０００癌細胞／ウェルを、不透明白色９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  カタログ＃ＢＤ３５３２９６）中に播種し、加湿されたインキュベーター中で５％のＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。次いで、２５μｌの４×ＤＲ５バインダー  プラス／マイナス  抗Ｆｃを、２．５×連続希釈の６つの濃度で添加した（等モル比のＤＲ５バインダー及びＦｃ）。５％のＣＯ２と共に３７℃で３時間のインキュベーション後、溶解バッファー中の１００μｌのカスパーゼ８基質を各ウェルに添加した。３７℃で３０分間のさらなるインキュベーション後、結果を、発光設定下でＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５プレートリーダーで読み取った。
【０６７４】
ＦＲＥＴアッセイ
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ（ＴａｇＬｉｔｅと呼ばれる）を使用して、細胞上での二重特異性分子の結合を決定した。Ｈｅｋ  ＥＢＮＡ細胞を６０−８０％コンフルエントまで増殖させ、ＳＮＡＰタグ及びＭａｌＥ  ＴＭに融合したＤＲ５  ＥＣＤをコードしているプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。簡単に説明すると、２μｇのＤＮＡを、４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地及び３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１１６６８−０１９）と混合した。この混合物を、室温で２０分間インキュベートした。その間に、Ｔ７５フラスコ中で増殖させた接着性Ｈｅｋ  ＥＢＮＡ細胞を５ｍｌのＤ−ＰＢＳで洗浄し、その後、トランスフェクション混合物及び培地（６ｍｌ）（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸）を添加した。次いで、これらの細胞を、加湿されたインキュベーター（５％のＣＯ２）中で３７℃で一晩インキュベートした。細胞を５ｍｌのＤ−ＰＢＳで洗浄し、その後、１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（Ｃｉｓｂｉｏ  カタログ番号）を含む５ｍｌのＴａｇＬｉｔｅバッファー（Ｃｉｓｂｉｏ  カタログ番号）の混合物を添加した。この結果、ＤＲ５に融合したＳＮＡＰタグに蛍光色素が付加された。３７℃で１時間のインキュベーション時間後、細胞をＴａｇＬｉｔｅバッファーで洗浄し、結合されていない色素を除去した。次いで、３８４ウェルフォーマット（Ｒｅａｄｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中の１０，０００個の細胞の蛍光シグナルを６２０ｎｍ（励起３４３ｎｍ）で測定することによって標識効率を確認した。次いで、１０％のＤＭＳＯで置換した培地中で細胞を凍結させ、−８０℃で保存した。
【０６７５】
結合アッセイを行うために、予め標識された細胞を解凍して、洗浄し、１ウェルあたり１０００細胞を、５０−０．０９７ｎＭの範囲に及ぶ最終濃度（１：２の希釈段階）の５μｌのコンストラクト及び標識された５μｌの抗ｈｕＦｃ−ｄ２（最終濃度１５０ｎＭ）と混合した。室温で０時間、１時間及び３時間のインキュベーション後、蛍光ドナー（テルビウム）については６２０ｎｍ、蛍光アクセプター色素については６６５ｎｍで蛍光シグナルを測定した。６６５／６２０＊１０００の比を算出し、参照（１５０ｎＭの抗ｈｕＦｃ−ｄ２を用いた細胞）を減算した。ＫＤ決定のために、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて１サイトフィット特異的結合を用いて結果を分析した。
【０６７６】
動的光散乱（ＤＬＳ）による熱安定性の決定
タンパク質の熱安定性を、動的光散乱（ＤＬＳ）によってモニターする。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する３０μｇの濾過タンパク質試料を、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＵＳＡ）に２重でアプライした。半径及び総光散乱強度をデータ収集しながら、温度を０．０５℃／分で２５℃から７５℃まで上昇させる。
2018046823.tif 000034
2018046823.tif 000035
2018046823.tif 000036
【０６７７】
実施例３６：  新たに単離されたＤＲ５バインダー５Ｅ１１を２８Ｈ１  ＦＡＰ  ＣｒｏｓｓＦａｂと組み合わせて含むＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体のインビボでの抗腫瘍有効性
二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８）のインビボでの抗腫瘍有効性が細胞内で実証され、多様な腫瘍源（例えば、ＣＲＣ及び膵がん）の、断片に基づく、患者由来（ＰＤＸ）モデルをヌードマウス上に移植した。例として、ＣＲＣ異種移植モデルＤＬＤ−１（細胞株に基づく、共注入モデル）及びＣｏ５８９６（断片に基づく）について、データを示している。
【０６７８】
試験用薬剤
二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）は、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。抗体バッファーには、ヒスチジンが含まれていた。抗体溶液は、注入前にストックからバッファー中に適切に希釈された。
【０６７９】
細胞株及び培養条件
ＤＬＤ−１ヒトＣＲＣ細胞は、元はＡＴＣＣから得られた。この腫瘍細胞株を、１０％のウシ胎仔血清、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳで補った、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ高グルコース培地中、５％のＣＯ２の水飽和雰囲気中で３７℃で通常通りに培養した。３日毎に分割して、トリプシン／ＥＤＴＡ  １×で培養継代を行った。さらに、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をＡＴＣＣから購入し、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＣＳ及び２．０ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース中で培養した。
【０６８０】
患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ）
ＣＲＣ腫瘍異種移植Ｃｏ５８９６を、元は患者から得て、安定な増殖パターンの確立まで約３回から５回継代した。その後のインビボでの研究のために、Ｃｏ５８９６腫瘍断片を、ヌードマウスにおいて連続継代中の異種移植片から得た。腫瘍を、ドナーマウスから除去した後に、断片（直径４−５ｍｍ）に切断し、皮下移植までＰＢＳ中に入れておいた。イソフルオラン麻酔下のマウスに、側腹部に片側の皮下腫瘍移植を行った。
【０６８１】
動物
ヌードマウスを、ブリーダー（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、約束されたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定病原体のない条件下で、１２時間照明／１２時間暗所の１日のサイクルで飼養した。実験用の試験手順は、地方行政機関によって確認され承認された。到着後、新しい環境に慣らすため及び観察のために、動物を、動物施設の検疫部門で１週間維持した。連続的な健康状態のモニタリングを定期的に行った。食餌（Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  ３３３７）及び（酸性化されたｐＨ２．５−３の）水は、自由に与えられた。
【０６８２】
モニタリング
臨床症状及び有害作用の検出について、動物を毎日管理した。モニタリングのために、実験の全体にわたって動物の体重を記録した。
【０６８３】
動物の処置
細胞又は断片の移植後、中央値腫瘍サイズが約１００−２００ｍｍ３であったときに、動物を無作為化した後に動物の処置を開始した。抗体を、モデルによって、静脈内に１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇで単剤として、週に１回又は２回で数週間投与した。これに相当するビヒクルを同一の日に投与した。
【０６８４】
抗体有効性
ＤＬＤ−１  ＣＲＣ共注入細胞株に基づく異種移植モデル
ＤＬＤ−１  ＣＲＣ異種移植を有しているマウスを、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で試験９日目から２０日目までに１０及び１．０ｍｇ／ｋｇの投与量で４回処置した。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置により、用量に関連した有意な抗腫瘍有効性が示され、皮下ＤＬＤ−１異種移植に対して強力な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を、それぞれ８９％（１０ｍｇ／ｋｇ）及び７９％（１．０ｍｇ／ｋｇ）で算出した。対照的に、ＤＲ５  Ｆｃ変異抗体ドロジツマブＰＧ、ＬＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回）での処置後には、抗腫瘍有効性は認められなかった（図４８を参照されたい）。高ＦＡＰ含有量（ＤＬＤ−１／ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を用いた共注入試験；比８０／２０、図４８）と、低ＦＡＰ含有量（ＤＬＤ−１／ＭＲＣ５線維芽細胞を用いた共注入試験；比３０／７０、データは示していない）とで同様の結果が得られた。
【０６８５】
Ｃｏ５８９６  ＣＲＣ断片に基づく患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ）
Ｃｏ５８９６  ＣＲＣ異種移植を有しているマウスを、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で試験１８日目から３４日目までに３０ｍｇ／ｋｇの用量で６回処置した。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置により、有意な抗腫瘍有効性が示され、皮下Ｃｏ５８９６患者由来異種移植に対して強力な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を、７６％で算出した（図４９を参照されたい）。他のＣＲＣ細胞モデルにおいて、同様の結果が得られた（データは示していない）。
【０６８６】
実施例３６：  ヒト腫瘍内でのＦＡＰ分布
二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の可能性のある臨床的使用についての理解を得るために、ヒト腫瘍内でのＦＡＰの分布をＩＨＣによって評価した。
【０６８７】
Ｖｉｔａｔｅｘからのラット抗ヒトセプラーゼ抗体（ＩｇＧ２ａ、クローンＤ８）（ＭＡＢＳ１００１）を使用して、多様な腫瘍徴候からの２，５μｍのＦＦＰＥＴ切片をＶｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ上で免疫染色した。切片に標準的なＣＣ１処理を行い、次いで、抗体を、Ｄａｋｏ抗体希釈液（Ｓ３０２２）中に５μｇ／ｍＬの濃度で３７℃で６０’間インキュベートし、Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ  ＤＡＢ検出系（Ｖｅｎｔａｎａ  ＃７６０−４４５６）を使用して陽性の染色を検出した。Ａｂｃａｍからの適合したアイソタイプ抗体（ａｂ１８４５０）を陰性コントロールとして使用した。
【０６８８】
二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（表３０）について潜在的に興味深い臨床徴候を示している、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵がん（ＰＡＣ）、胃がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び中皮腫を含むヒト腫瘍の異なる徴候において、ＦＡＰ＋間質浸潤が存在した。
2018046823.tif 000037
【０６８９】
2018046823.tif 000038
2018046823.tif 000039
【０６９０】
２．ファージディスプレイ由来の非機能的ＤＲ５バインダーのアミノ酸配列
（ＣＤＲＨ１＝配列番号１、ＣＤＲＨ２＝配列番号２、ＣＤＲＬ１＝配列番号４及びＣＤＲＬ２＝配列番号５）
2018046823.tif 000040
【０６９１】
2018046823.tif 000041
【０６９２】
2018046823.tif 000042
2018046823.tif 000043
2018046823.tif 000044
2018046823.tif 000045
2018046823.tif 000046
2018046823.tif 000047
【０６９３】
2018046823.tif 000048
2018046823.tif 000049
2018046823.tif 000050
2018046823.tif 000051
2018046823.tif 000052
2018046823.tif 000053
2018046823.tif 000054
2018046823.tif 000055
2018046823.tif 000056
2018046823.tif 000057
2018046823.tif 000058
【０６９４】
2018046823.tif 000059
【０６９５】
７．ウサギ免疫化に由来するＤＲ５バインダーのアミノ酸配列
クローンＤＲ５ＴＡＡ−０００５  （別名：クローン０３９）
重鎖
ＶＨ
ｑｓｌｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔａｓｇｆｓｌｓｓａｙｍｓｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｗｉｇｙｉｙｓｇｓｇｓｔｗｙａｓｗｖｋｇｒｆｔｉｓｋｔｓｔｔｖｄｌｋｉｔｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｇｙｓｔｍｇｄｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号４１）
ＣＨ１−３  ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｓａｙｍｓ  （配列番号４３）
ＣＤＲ２  ＝  ｙｉｙｓｇｓｇｓｔｗｙａｓｗｖｋｇ  （配列番号４４）
ＣＤＲ３  ＝  ｇｙｓｔｍｇｄｌ  （配列番号４５）
【０６９６】
軽鎖
ＶＬ
ｑｖｌｔｑｔｐｓｐｖｓａａｖｇｇｔｖｔｉｎｃｑａｓｑｓｖｙｎｎｒｌａｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｌｌｉｙｌａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｋｇｓｇｓｇｔｑｆｔｌｔｉｓｄｌｑｃｄｄａａｔｙｙｃａｇｇｙｓｇｎｉｎａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号４６）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｖｙｎｎｒｌａ  （配列番号４８）  
ＣＤＲ２  ＝  ｌａｓｔｌａｓ  （配列番号４９）
ＣＤＲ３  ＝  ａｇｇｙｓｇｎｉｎａ  （配列番号５０）
【０６９７】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−０００６  （別名：クローン０５８）
重鎖
ＶＨ
ｑｓｌｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔａｓｇｆｓｌｓｓｎｈｍｓｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｗｉｇｙｉｙａｇｓｇｓａｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｉｓｒｔｓｔｔｖｄｌｋｍｔｓｌｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｇｄａｇｓｓｙｗｅｆｎｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号５１）
ＣＨ１−３  ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｓｎｈｍｓ  （配列番号５２）
ＣＤＲ２  ＝  ｙｉｙａｇｓｇｓａｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号５３）
ＣＤＲ３  ＝  ｄａｇｓｓｙｗｅｆｎｌ  （配列番号５４）
【０６９８】
軽鎖
ＶＬ
ｌｖｍｔｑｔｐｓｓｔｓｅｐｖｇｇｔｖｔｉｋｃｑａｓｑｓｉｇｓｓｌｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｌｌｉｙｈａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｒｓｇｉｑｔｔｌｔｉｓｇｖｑｃｄｄａａｔｙｙｃｌｇｖａｄａｒｒｄｄｇｆａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号５５）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号５６）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｇｓｓｌｓ  （配列番号５７）
ＣＤＲ２  ＝  ｈａｓｔｌａｓ  （配列番号５８）
ＣＤＲ３  ＝  ｌｇｖａｄａｒｒｄｄｇｆａ  （配列番号５９）
【０６９９】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００１０  （別名：クローン４８１）
重鎖
ＶＨ
ｑｓｌｅｅｓｇｇｒｌｖｋｐｄｅｔｌｔｌｔｃｔｖｓｇｆｓｌｓｓｎａｉｓｗｖｒｑａｐｇｍｇｌｅｗｉｇｉｉｇｓｓｇｙｔｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｖｓｋｔｓｔｔｖｄｌｅｉａｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｇｙｓｇａｓｄｙｓｆｎｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号６０）
ＣＨ１−３
ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｓｎａｉｓ  （配列番号６１）
ＣＤＲ２  ＝  ｉｉｇｓｓｇｙｔｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号６２）
ＣＤＲ３  ＝  ｇｙｓｇａｓｄｙｓｆｎｌ  （配列番号６３）
【０７００】
軽鎖
ＶＬ
ａｙｄｍｔｑｔｐｄｓｖｅｖａｖｇｇｔｖｔｉｋｃｑａｓｑｔｉｇｄａｌａｗｙｑｑｋｐｇｑｒｐｎｌｌｉｙｒｔｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｈｆｔｌｔｉｓｇｖｅｃａｄａａｔｙｙｃｑｑｇａｔｙｎｎｖｌｎｔｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号６４）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｔｉｇｄａｌａ  （配列番号６５）
ＣＤＲ２  ＝  ｒｔｓｔｌａｓ  （配列番号６６）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｑｇａｔｙｎｎｖｌｎｔ  （配列番号６７）
【０７０１】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００１３  （別名：クローン２９８）
重鎖
ＶＨ
Ｑｓｌｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔａｓｇｆｔｉｓｓｙｈｍｓｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｗｉｇｙｉｙａｇｓａｓｔｗｙａｓｗｖｋｇｒｆｔｉｓｋｔｓｔｔｖｄｌｋｍｔｓｌｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｄａｇｓｓｙｗｅｆｎｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号６８）
ＣＨ１−３  ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｓｙｈｍｓ  （配列番号６９）
ＣＤＲ２  ＝  ｙｉｙａｇｓａｓｔｗｙａｓｗｖｋｇ  （配列番号７０）
ＣＤＲ３  ＝  ｄａｇｓｓｙｗｅｆｎｌ  （配列番号５４）
【０７０２】
軽鎖
ＶＬ
Ｌｖｍｔｑｔｐｓｓｔｓｅｐｖｇｇｔｖｔｉｋｃｑａｓｑｓｉｇｓｓｌｓｗｙｑｑｔｐｇｑｐｐｋｌｌｉｙｔａｓｓｌａｓｓｖｐｋｒｆｓｇｓｒｓｇｔｑｆｔｌｔｉｓｇｖｑｃａｄａａｔｙｙｃｌｇｉｄｄｖｒｒｄｄｇｆａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号７１）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｇｓｓｌｓ  （配列番号５７）
ＣＤＲ２  ＝  ｔａｓｓｌａｓ  （配列番号７２）
ＣＤＲ３  ＝  ｌｇｉｄｄｖｒｒｄｄｇｆａ  （配列番号７３）
【０７０３】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００１９  （別名：クローン４６１）
重鎖
ＶＨ
Ｑｓｖｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔｖｓｇｆｓｌｓｎｙａｍｓｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｗｉｇｉｉｓｓｓｇｔｔｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｉｓｋｔｓｔｔｖｄｌｋｖｔｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｅｔｙｙｇｙｓｙａａｇｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号７４）
ＣＨ１−３
ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｎｙａｍｓ  （配列番号７５）
ＣＤＲ２  ＝  ｉｉｓｓｓｇｔｔｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号７６）
ＣＤＲ３  ＝  ｅｔｙｙｇｙｓｙａａｇｌ  （配列番号７７）
【０７０４】
軽鎖
ＶＬ
Ａｌｖｍｔｑｔｐｓｓｖｓａａｖｇｇｔｖｔｉｎｃｑａｓｑｎｉｙｓｎｌａｗｆｑｑｋｐｇｑｐｐｋｌｌｉｙｅｔｓｋｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｅｆｔｌｔｉｓｄｌｅｃｄｄａａｔｙｙｃｑｓｓｗｈｓｉｓｔｄｃａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号７８）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｎｉｙｓｎｌａ  （配列番号７９）
ＣＤＲ２  ＝  ｅｔｓｋｌａｓ  （配列番号８０）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｓｓｗｈｓｉｓｔｄｃａ  （配列番号８１）
【０７０５】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００１６  （別名：クローン４２２）
重鎖
ＶＨ
Ｑｓｌｅｅｓｇｇｒｌｖｋｐｄｅｔｌｔｌｔｃｔｖｓｇｆｓｌｎｎｙａｍｓｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｗｉｇｍｉｎｋｙｇｔｋｙｙａｔｗｔｋｇｒａｔｉｓｋｔｓｔｔｌｄｌｅｉｔｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｖｒｙａｇｄｄｙａｅｗｌｄｖｗｇｑｇｉｌｖｔｖｓｓ  （配列番号８２）
ＣＨ１−３
ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｎｙａｍｓ  （配列番号７５）
ＣＤＲ２  ＝  ｍｉｎｋｙｇｔｋｙｙａｔｗｔｋｇ  （配列番号８３）
ＣＤＲ３  ＝  ｖｒｙａｇｄｄｙａｅｗｌｄｖ  （配列番号８４）
【０７０６】
軽鎖
ＶＬ
Ａｄｉｖｍｔｑｔａｓｐｖｓａａｖｇｇｔｖｔｉｎｃｑａｓｑｓｉｓｓｓｙｖｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｌｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｑｌｓｌｔｉｒｇｖｑｃｄｄａａｔｙｙｃｌｙｇｙｓｄｖｓｓｓｅｙｖｆｇｇｇｔｅｖｖｖｒ  （配列番号８５）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）  
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｓｓｓｙｖｓ  （配列番号８６）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｌｙｇｙｓｄｖｓｓｓｅｙｖ  （配列番号８７）
【０７０７】
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００１１  （別名：クローン１７４）
重鎖
ＶＨ
Ｑｓｖｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔｖｓｇｆｓｉｓｒｙａｍｉｗｖｒｑａｐｇｅｇｌｅｙｉｇｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｉｓｋｔｓｔｔｖｄｌｋｍｔｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｙｔｙｓｄｇｔｄｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号８８）
ＣＨ１−３
Ｇｑｐｋａｐｓｖｆｐｌａｐｃｃｇｄｔｐｓｓｔｖｔｌｇｃｌｖｋｇｙｌｐｅｐｖｔｖｔｗｎｓｇｔｌｔｎｇｖｒｔｆｐｓｖｒｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｓｖｔｓｓｓｑｐｖｔｃｎｖａｈｐａｔｎｔｋｖｄｋｔｖａｐｓｔｃｓｋｐｔｃｐｐｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｉｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｑｄｄｐｅｖｑｆｔｗｙｉｎｎｅｑｖｒｔａｒｐｐｌｒｅｑｑｆｎｓｔｉｒｖｖｓｔｌｐｉａｈｑｄｗｌｒｇｋｅｆｋｃｋｖｈｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｒｇｑｐｌｅｐｋｖｙｔｍｇｐｐｒｅｅｌｓｓｒｓｖｓｌｔｃｍｉｎｇｆｙｐｓｄｉｓｖｅｗｅｋｎｇｋａｅｄｎｙｋｔｔｐａｖｌｄｓｄｇｓｙｆｌｙｎｋｌｓｖｐｔｓｅｗｑｒｇｄｖｆｔｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｉｓｒｓｐｇｋ  （配列番号４２）
ＣＤＲ１  ＝  ｒｙａｍｉ  （配列番号１７）
ＣＤＲ２  ＝  ｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号２５）
ＣＤＲ３  ＝  ｙｔｙｓｄｇｔｄｌ  （配列番号１９）
【０７０８】
軽鎖
ＶＬ
Ａｄｉｖｍｔｑｔｐａｓｖｓｅｐｖｇｇｔｖｔｉｋｃｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｒｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｋｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｒｄｌｅｃａｄａａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号８９）
Ｃｋａｐｐａ
ｇｄｐｖａｐｔｖｌｉｆｐｐａａｄｑｖａｔｇｔｖｔｉｖｃｖａｎｋｙｆｐｄｖｔｖｔｗｅｖｄｇｔｔｑｔｔｇｉｅｎｓｋｔｐｑｎｓａｄｃｔｙｎｌｓｓｔｌｔｌｔｓｔｑｙｎｓｈｋｅｙｔｃｋｖｔｑｇｔｔｓｖｖｑｓｆｎｒｇｄｃ  （配列番号４７）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２７）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７０９】
８．ウサギＭａｂ  ＤＲ５ＴＡＡ−００１１のキメラ化変異体のアミノ酸配列
クローンＤＲ５ＴＡＡ−００５２  （キメラ変異体）
重鎖
ＶＨ
Ｑｓｖｅｅｓｇｇｒｌｖｔｐｇｔｐｌｔｌｔｃｔｖｓｇｆｓｉｓｒｙａｍｉｗｖｒｑａｐｇｅｇｌｅｙｉｇｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｉｓｋｔｓｔｔｖｄｌｋｍｔｓｐｔｔｅｄｔａｔｙｆｃａｒｙｔｙｓｄｇｔｄｌｗｇｐｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号９０）
ＣＨ１−３
Ａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｋｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅａａｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｇａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｄｅｌｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ  （配列番号９１）
ＣＤＲ１  ＝  ｒｙａｍｉ  （配列番号１７）
ＣＤＲ２  ＝  ｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号２５）
ＣＤＲ３  ＝  ｙｔｙｓｄｇｔｄｌ  （配列番号１９）
【０７１０】
軽鎖
ＶＨ
Ａｄｉｖｍｔｑｔｐａｓｖｓｅｐｖｇｇｔｖｔｉｋｃｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｒｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｋｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｒｄｌｅｓａｄａａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｅｖｖｖｋ  （配列番号９２）
Ｃｋａｐｐａ
Ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２７）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１１】
2018046823.tif 000060
【０７１２】
ヒト化変異体重鎖
ＶＨ７
ＶＨ
Ｅｖｑｌｖｅｔｇｇｇｌｉｑｐｇｇｓｌｒｌｓｃａａｓｇｆｔｖｓｒｙａｍｉｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｙｉｇｆｉｔｓｄｇｓｔｙｙａｄｓａｋｇｒｆｔｉｓｒｄｎｓｋｎｔｌｙｌｑｍｎｓｌｒａｅｄｔａｖｙｙｃａｒｙｔｙｓｄｇｔｄｌｗｇｒｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号２３）
ＣＨ１−３
ａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｋｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅａａｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｇａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｄｅｌｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｃｈａｉｎ  （配列番号９１）
ＣＤＲ１  ＝  ｒｙａｍｉ  （配列番号１７）
ＣＤＲ２  ＝  ｆｉｔｓｄｇｓｔｙｙａｄｓａｋｇ  （配列番号１８）
ＣＤＲ３  ＝  ｙｔｙｓｄｇｔｄｌ  （配列番号１９）
【０７１３】
ＶＨ１７
ＶＨ
ｑｖｑｌｖｅｓｇｇｇｌｖｑｐｇｇｓｌｒｌｓｃｓａｓｇｆｓｉｓｒｙａｍｉｗｖｒｑａｐｇｋｇｌｅｙｖｇｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇｒｆｔｉｓｒｄｎｓｋｎｔｌｙｌｑｍｎｓｌｒａｅｄｔａｖｙｙｃａｒｙｔｙｓｄｇｔｄｌｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ  （配列番号２６）
ＣＨ１−３
ａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｋｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅａａｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｇａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｄｅｌｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ  （配列番号９１）
ＣＤＲ１  ＝  ｒｙａｍｉ  （配列番号１７）
ＣＤＲ２  ＝  ｆｉｔｓｄｓｓａｙｙａｓｗａｋｇ  （配列番号２５）
ＣＤＲ３  ＝  ｙｔｙｓｄｇｔｄｌ  （配列番号１９）
【０７１４】
ヒト化変異体軽鎖
ＶＬ２
ＶＬ
Ｄｉｑｍｔｑｓｐｓｔｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｋａｐｋｒｌｉｙｋａｓｓｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｅｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｄｄａａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｋｖｅｉｋ  （配列番号３２）
Ｃｋａｐｐａ
Ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２０）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｓｌａｓ  （配列番号２１）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１５】
ＶＬ３
ＶＬ
Ｄｉｑｍｔｑｓｐｓｓｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｋａｐｋｒｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｅｄａａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｋｖｅｉｋ  （配列番号３０）
Ｃｋａｐｐａ
Ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２０）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１６】
ＶＬ１０
ＶＬ
ｄｉｑｍｔｑｓｐｓｓｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｒｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｅｄｆａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｋｖｅｉｋ  （配列番号３１）
Ｃｋａｐｐａ
ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２０）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１７】
ＶＬ１１
ＶＬ
ｄｉｑｍｔｑｓｐｓｓｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｑｐｐｋｒｌｉｙｋａｓｔｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｄｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｅｄｆａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｋｖｅｉｋ  （配列番号２９）
Ｃｋａｐｐａ
ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｑａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２７）
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｔｌａｓ  （配列番号２８）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１８】
ＶＬ１５
ＶＬ
Ａｄｉｑｍｔｑｓｐｓｔｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓｗｙｑｑｋｐｇｋａｐｋｒｌｉｙｋａｓｓｌａｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇｔｅｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｄｄａａｔｙｙｃｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａｆｇｇｇｔｋｖｅｉｋ  （配列番号２４）
Ｃｋａｐｐａ
Ｒｔｖａａｐｓｖｆｉｆｐｐｓｄｅｑｌｋｓｇｔａｓｖｖｃｌｌｎｎｆｙｐｒｅａｋｖｑｗｋｖｄｎａｌｑｓｇｎｓｑｅｓｖｔｅｑｄｓｋｄｓｔｙｓｌｓｓｔｌｔｌｓｋａｄｙｅｋｈｋｖｙａｃｅｖｔｈｑｇｌｓｓｐｖｔｋｓｆｎｒｇｅｃ  （配列番号９３）
ＣＤＲ１  ＝  ｒａｓｑｓｉｓｔｙｌｓ  （配列番号２０）  
ＣＤＲ２  ＝  ｋａｓｓｌａｓ  （配列番号２１）
ＣＤＲ３  ＝  ｑｐｎｓｇｉａｔｙｇａａ  （配列番号２２）
【０７１９】
１０．ウサギ由来のＤＲ５バインダーを含んでいるキメラ二重特異性コンストラクトのアミノ酸配列
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００６１  （４Ｂ９及びＤＲ５ＴＡＡ−００１１を含んでいる１＋１キメラＣｒｏｓｓｍａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000061
【０７２０】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000062
【０７２１】
ＨＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000063
【０７２２】
交差ＨＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000064
【０７２３】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００３２  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−０００５を含んでいる２＋２キメラＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000065
【０７２４】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000066
【０７２５】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000067
【０７２６】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００３３  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００１１を含んでいる２＋２キメラＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000068
【０７２７】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000069
【０７２８】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000070
【０７２９】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００３４  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００１３を含んでいる２＋２キメラＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000071
【０７３０】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000072
【０７３１】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000073
【０７３２】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００３５  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００１６を含んでいる２＋２キメラＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000074
【０７３３】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000075
【０７３４】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000076
【０７３５】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−００３６  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００１９を含んでいる２＋２キメラＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000077
【０７３６】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000078
【０７３７】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000079
【０７３８】
１１．ヒト化されたウサギ由来のＤＲ５バインダーを含んでいる二重特異性コンストラクトのアミノ酸配列
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−０１１７  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００６７を含んでいる２＋２ヒト化ＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000080
【０７３９】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000081
【０７４０】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000082
【０７４１】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−０１１８  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００７１を含んでいる２＋２ヒト化ＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000083
【０７４２】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000084
【０７４３】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000085
【０７４４】
コンストラクトＤＲ５ＴＡＡ−０１１９  （２８Ｈ１及びＤＲ５ＴＡＡ−００７５を含んでいる２＋２ヒト化ＣｒｏｓｓＭａｂ）
ＬＣ（ＤＲ５）
2018046823.tif 000086
【０７４５】
交差ＬＣ（ＦＡＰ）
2018046823.tif 000087
【０７４６】
ＨＣ（ＤＲ５−交差ＦＡＰ）
2018046823.tif 000088
【０７４７】
１２．ヒト化されたウサギ由来のＤＲ５バインダーのＣ末端融合体のアミノ酸配列
2018046823.tif 000089
【０７４８】
１３．ＤＲ５バインダー及びそれらを含んでいる二重特異性分子の核酸配列
2018046823.tif 000090
2018046823.tif 000091
2018046823.tif 000092
2018046823.tif 000093
2018046823.tif 000094
2018046823.tif 000095
2018046823.tif 000096
2018046823.tif 000097
2018046823.tif 000098
2018046823.tif 000099
2018046823.tif 000100
2018046823.tif 000101
2018046823.tif 000102
2018046823.tif 000103
2018046823.tif 000104
2018046823.tif 000105
2018046823.tif 000106
2018046823.tif 000107
2018046823.tif 000108
2018046823.tif 000109
2018046823.tif 000110
2018046823.tif 000111
2018046823.tif 000112
2018046823.tif 000113
2018046823.tif 000114
2018046823.tif 000115
2018046823.tif 000116
2018046823.tif 000117
2018046823.tif 000118
2018046823.tif 000119
2018046823.tif 000120
2018046823.tif 000121
2018046823.tif 000122
2018046823.tif 000123
2018046823.tif 000124
2018046823.tif 000125
2018046823.tif 000126
2018046823.tif 000127
【０７４９】
１４．ＤＲ５配列
2018046823.tif 000128
【０７５０】
１５．ＦＡＰ配列
2018046823.tif 000129
【０７５１】
本発明の現在好ましい実施形態を記載及び示しているが、本発明が、これに限定されるのではなく、これ以外の場合にも添付の特許請求の範囲の範囲内で多様に実施され（embodied／practiced）得ることは明確に理解されるべきである。
【図１】
2018046823.tif 000130
【図２】
2018046823.tif 000131
【図３】
2018046823.tif 000132
【図４】
2018046823.tif 000133
【図５】
2018046823.tif 000134
【図６】
2018046823.tif 000135
【図７】
2018046823.tif 000136
【図８】
2018046823.tif 000137
【図９】
2018046823.tif 000138
【図１０】
2018046823.tif 000139
【図１１】
2018046823.tif 000140
【図１２】
2018046823.tif 000141
【図１３ａ−ｃ】
2018046823.tif 000142
【図１３ｄ】
2018046823.tif 000143
【図１４ａ】
2018046823.tif 000144
【図１４ｂ−ｃ】
2018046823.tif 000145
【図１５】
2018046823.tif 000146
【図１６】
2018046823.tif 000147
【図１７】
2018046823.tif 000148
【図１８】
2018046823.tif 000149
【図１９】
2018046823.tif 000150
【図２０ａ】
2018046823.tif 000151
【図２０ｂ】
2018046823.tif 000152
【図２１】
2018046823.tif 000153
【図２２】
2018046823.tif 000154
【図２３】
2018046823.tif 000155
【図２４】
2018046823.tif 000156
【図２５】
2018046823.tif 000157
【図２６】
2018046823.tif 000158
【図２７】
2018046823.tif 000159
【図２８】
2018046823.tif 000160
【図２９】
2018046823.tif 000161
【図３０ａ−ｂ】
2018046823.tif 000162
【図３０ｃ】
2018046823.tif 000163
【図３１】
2018046823.tif 000164
【図３２】
2018046823.tif 000165
【図３３】
2018046823.tif 000166
【図３４】
2018046823.tif 000167
【図３５】
2018046823.tif 000168
【図３６】
2018046823.tif 000169
【図３７】
2018046823.tif 000170
【図３８】
2018046823.tif 000171
【図３９】
2018046823.tif 000172
【図４０】
2018046823.tif 000173
【図４１】
2018046823.tif 000174
【図４２】
2018046823.tif 000175
【図４３】
2018046823.tif 000176
【図４４】
2018046823.tif 000177
【図４５Ａ】
2018046823.tif 000178
【図４５Ｂ】
2018046823.tif 000179
【図４６】
2018046823.tif 000180
【図４７】
2018046823.tif 000181
【図４８】
2018046823.tif 000182
【図４９】
2018046823.tif 000183
【配列表】
2018046823000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月31日(2017.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の群から選択される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、並びに
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９及び配列番号３３の群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０及び配列番号３４の群から選択される重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１及び配列番号３５の群から選択される重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１２及び配列番号３６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１３及び配列番号３７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号１４及び配列番号３８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む二重特異性抗体。
【請求項２】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含み、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、配列番号１５及び配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１６及び配列番号４０の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
抗体がヒトである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
抗体がヒト化されている、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
Ｆａｂ断片の少なくとも１個が、軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに接続しており、少なくとも１個のＦａｂ断片が、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに接続している、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と
を含む、請求項５又は６に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットに定常軽鎖（ＣＬ）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と
を含む、請求項５又は６に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項１から５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片とを含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
二重特異性抗体がＤＲ５及びＦＡＰの両方に対して二価である、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
ＤＲ５に対して二価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片を更に含む、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
ＤＲ５に対して三価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片とを含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
ＤＲ５に対して一価でありＦＡＰに対して一価である、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片（１個又は複数個）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項９から１７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
Ｆａｂ断片の少なくとも１個がペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している、請求項５から１８の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む、請求項５から１９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
前記１個又は複数個のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される１個又は複数個の位置にある、請求項２０に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含み、このことにより、第１の抗体の２本の重鎖のヘテロ二量体化が可能となる、請求項５から２２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
ノブ・イントゥ・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
（ａ）配列番号１、配列番号１７及び配列番号７５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と、
（ｂ）配列番号２、配列番号１８、配列番号２５及び配列番号８３の群から選択される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と、
（ｃ）配列番号３、配列番号１９、配列番号８４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０４及び配列番号１０８の群から選択される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と、
（ｄ）配列番号４、配列番号２０、配列番号２７及び配列番号８６の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号５、配列番号２１及び配列番号２８の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号６、配列番号２２、配列番号８７、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号９７の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、ＤＲ５に特異的に結合する抗体。
【請求項２６】
配列番号７及び配列番号８；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２６及び配列番号２４；配列番号２３及び配列番号２９；配列番号２３及び配列番号３０；配列番号２６及び配列番号３１；配列番号２６及び配列番号３２；配列番号２６及び配列番号３０；配列番号２３及び配列番号３１；配列番号８２及び配列番号８５；配列番号１００及び配列番号１０１；配列番号１０２及び配列番号１０３；配列番号１０６及び配列番号１０７；配列番号９４及び配列番号９５の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、請求項２５又は２６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
がんの治療のための、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
医薬としての使用のための、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
医薬の製造における、請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３２】
医薬ががんの治療用である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
医薬が膵がん又は結腸直腸癌の治療用である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体を含む、がんの治療のための医薬。
【請求項３５】
請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の重鎖又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体の重鎖をコードする核酸配列を含む、核酸。
【請求項３６】
請求項１から２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖又は請求項２５から２７の何れか一項に記載の抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む、核酸。
【請求項３７】
請求項３５及び／又は請求項３６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載のベクターを含む、原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項３９】
抗体が産生されるように請求項３８に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【外国語明細書】
2018046823000001.pdf