(57)【要約】【課題】内部標準試料を用いてゲル化された分析対象試料の質量分析を行なう場合に、分析結果の再現性を向上させる。【解決手段】試料の調製方法は、分析対象試料の分析データを補正するために前記分析対象試料に混合される標準試料を、電気泳動を用いない容器内でのゲル化方法によりゲル化する標準試料ゲル化ステップと、前記標準試料ゲル化ステップでゲル化された標準試料をゲル化した分析対象試料と混合する混合ステップと、を含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計により分析を行なう試料の調製方法であって、
分析対象試料の分析データを補正するために前記分析対象試料に混合される標準試料を、電気泳動を用いない容器内でのゲル化方法によりゲル化する標準試料ゲル化ステップと、
前記標準試料ゲル化ステップでゲル化された標準試料をゲル化した分析対象試料と混合する混合ステップと、を含む調製方法。
【請求項２】
前記分析対象試料及び標準試料はタンパク質であり、
前記混合ステップの後、前記混合ステップにおいて混合された分析対象試料と標準試料からなる試料にタンパク質分解酵素を添加して試料を分解する酵素消化ステップをさらに含む請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記分析対象試料及び標準試料は核酸であり、
前記混合ステップの後、前記混合ステップにおいて混合された分析対象試料と標準試料からなる試料に核酸分解酵素を添加して試料を分解する酵素消化ステップをさらに含む請求項１に記載の調製方法。
【請求項４】
前記混合ステップの前に、前記分析対象試料を電気泳動を用いてゲル化する電気泳動ステップを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ゲル化方法は、
容器内に標準試料を含む溶液を注入するステップと、
前記容器内の標準試料溶液にゲル化用試薬を添加するステップと、
前記容器内の標準試料溶液が固化するまで放置するステップと、を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記ゲル化方法は、前記標準試料溶液にゲル化試薬を添加するステップの前に、ゲル化された前記標準試料のゲル組成がゲル化された前記分析対象試料のゲル組成に対応したものとなるように、前記ゲル化試薬を選択するステップをさらに含む請求項５に記載の調整方法。
【請求項７】
請求項１から６の調製方法により調製された試料を質量分析計に導入して質量分析を行なう質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体高分子の分析において、分析データの補正などデータ処理の精度を高めるための技術に関し、特にゲル化したタンパク質などの生体高分子を質量分析計で分析するための試料調製方法と、その調製方法を用いて調製した試料を質量分析計により分析する質量分析方法に関するものである。かかる技術は、質量分析や液体クロマトグラフ（ＬＣ）分析などの分野において定量分析やバイオマーカー探索などに応用することができる。
【背景技術】
【０００２】
試料の分析では同一試料を同一条件で分析したとしても、分析装置のばらつき、操作のばらつき、環境条件のばらつきなど、様々な要因によって分析値が変動する。特に、分析対象試料が生体試料などである場合、分析データの変動を小さくする方法の一つとして、分析対象試料と一緒に規格化された試料（標準試料）も同一条件で分析し、標準試料の分析データを用いて試料の分析データを補正する方法が挙げられる。
【０００３】
そのような補正方法として、主に、分析対象試料と標準試料をそれぞれ個別に分析して分析対象試料の分析データを標準試料の分析データを用いて補正する方法と、分析対象試料に標準試料を添加し、分析対象試料と標準試料（内部標準試料）を同時に分析することにより分析対象試料の分析データを補正する方法の２つがある。一般的に、後者の内部標準試料によるデータの補正方法のほうが分析データの精度が高くなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Molecular & Cellular Proteomics. 2005 Dec;4(12):1948-58.  Xiaoning Lu, Haining Zhu
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、タンパク質を質量分析計により分析を行なう場合、前処理としてタンパク質の酵素消化が行なわれる。タンパク質の酵素消化では、溶液に溶解したタンパク質を消化する方法に加えて、ゲルを用いた、いわゆるゲル電気泳動で分離したタンパク質をゲルのまま切り出し、ゲル状態のままタンパク質の酵素消化を行なう方法がある（in-gel digestion法；ゲル内消化法）。
【０００６】
電気泳動を用いた方法によって精製された分析対象試料に標準試料を添加する場合、分析対象試料と標準試料とで別々に酵素消化などの前処理を行なうと、前処理工程でのばらつきが再現性に影響を与えるため、分析対象試料に標準試料を添加するタイミングは前処理の行なわれる前であることが望ましい。
【０００７】
その場合、前処理中に各試料が受ける変動要因の影響は各試料の形態によって異なるため、標準試料の形態は分析対象試料と同一であることが望ましい。すなわち、分析対象試料がゲル状態である場合は添加する標準試料もゲル状態であることが好ましい。内部標準試料ゲルの調製方法としては、分析対象試料と同様に、標準試料を電気泳動し、試料を含むゲル片を切り出して調製することになる。
【０００８】
本発明は、内部標準試料を用いてゲル化された分析対象試料の質量分析を行なう場合に、分析結果の再現性を向上させることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る試料の調製方法は、分析対象試料の分析データを補正するために前記分析対象試料に混合される標準試料を、電気泳動を用いない容器内でのゲル化方法によりゲル化する標準試料ゲル化ステップと、前記標準試料ゲル化ステップでゲル化された標準試料をゲル化した分析対象試料と混合する混合ステップと、を含むものである。
【００１０】
既述のように、標準試料をゲル化する場合には、分析対象試料と同様に、標準試料を電気泳動してゲル片を切り出すという方法が一般的である。しかし、本発明者は、ゲル電気泳動を用いた標準試料のゲル化では、電気泳動用ゲルの品質のばらつきや電気泳動によるタンパク質分離のばらつき、ゲルの切り出しサイズのばらつきなど、多くの変動要因が存在し、調製した内部標準試料ゲル自体にばらつきが生じ、そのようなばらつきが生じている内部標準試料ゲルの分析データを用いて分析対象試料のデータの補正処理を行なうと、処理したデータの再現性が低下するという知見を得た。
【００１１】
非特許文献１には、溶液状態では酵素消化が難しい膜タンパク質などの酵素消化を改善するために、試料に電気泳動ゲルの作製に必要な試薬を混合し、それらの溶液を内径１〜２ｍｍのガラスチューブ内に吸引し、ガラスチューブ内でゲル化する方法が報告されている。本発明では、このような方法を用いて標準試料をゲル化することで、標準試料のゲル化を電気泳動以外の方法を用いて行なう。
【００１２】
なお、非特許文献１に開示されている方法は、あくまで溶液状態では酵素消化の困難な分析対象試料の酵素消化を改善することを目的として提案されたものであり、電気泳動を用いて分析対象試料の精製を行なうような場合には、電気泳動後のゲルの切り出しによって分析対象試料がゲル化されるため、非特許文献１に開示された方法が用いられることはあり得ない。そして、分析対象試料のゲル化が電気泳動を用いて行なわれる場合に、標準試料のゲル化を電気泳動以外の方法を用いて行なうということは、電気泳動を用いたゲル化による上述の問題点が明らかになっていない従来の技術常識からすればあり得ないことである。
【００１３】
ここで、本発明において「ゲル化」とは、試料（分析対象試料又は標準試料）自体がゲル状態になるということを意味するのではなく、分析に必要な試料部分がゲルに含まれている状態にすることを意味する。
【００１４】
前記分析対象試料及び標準試料としては、例えばタンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸が挙げられる。タンパク質の場合、前記混合ステップの後、前記混合ステップにおいて混合された分析対象試料と標準試料からなる試料にタンパク質分解酵素を添加して試料を分解する酵素消化ステップをさらに含む。核酸の場合も同様であり、前記混合ステップの後、前記混合ステップにおいて混合された分析対象試料と標準試料からなる試料にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡの分解酵素）やリボヌクレアーゼ（ＲＮＡの分解酵素）等の核酸分解酵素を添加して試料を分解する酵素消化ステップをさらに含む。
【００１５】
すなわち、酵素消化を行なう前に、ゲル化した分析対象試料にゲル化した標準試料を添加し、分析対象試料と標準試料の酵素消化を一緒に行なう。これにより、分析対象試料と標準試料の酵素消化がまったく同一の条件で行なわれるため、分析対象試料と標準試料の酵素消化が別々になされる場合の変動要因をなくすことができ、分析の再現性が向上する。
【００１６】
本発明に係る分析対象試料は、必ずしも電気泳動を用いてゲル化されたものに限られないが、電気泳動を用いてゲル化されたものであってもよい。その場合、本発明に係る調製方法は、前記混合ステップの前に、前記分析対象試料をゲル電気泳動を用いてゲル化する電気泳動ステップを含んでいる。ゲル電気泳動としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）、等電点電気泳動、アフィニティ電気泳動（親和電気泳動）などが挙げられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳとポリアクリスアミドゲルを利用してタンパク質を分子量の違いによって分離する電気泳動法である。等電点電気泳動は、タンパク質の等電点の違いを利用して分離する電気泳動法である。アフィニティ電気泳動は、直流電場で生体高分子が親和性をもつ物質と相互作用して移動速度を変化させる現象を利用して生体高分子を分離する電気泳動法である。
【００１７】
本発明の調製方法における前記ゲル化方法としては、容器内に標準試料を含む溶液を注入するステップと、前記容器内の標準試料溶液にゲル化用試薬を添加するステップと、前記容器内の標準試料溶液がゲル化するまで放置するステップと、を含むものが挙げられる。ゲル化用試薬としては、モノマー、架橋剤、重合開始剤、重合促進剤のうち少なくとも一つを含む。かかる方法を用いることで、電気泳動を用いることなく標準試料のゲル化を行なうことができる。架橋剤の一例として、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（アクリルアミド）が挙げられる。重合開始剤の一例として、過硫酸アンモニウムが挙げられる。重合促進剤の一例として、ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン）が挙げられる。
【００１８】
ここで、標準試料ゲルのゲル組成は分析対象試料ゲルのゲル組成と同じであることが望ましい。ゲル組成によって酵素消化やペプチド抽出効率などが異なってくることが考えられるためである。したがって、上記した標準試料のゲル化方法は、前記標準試料溶液にゲル化試薬を添加するステップの前に、ゲル化された前記標準試料のゲル組成がゲル化された前記分析対象試料のゲル組成に対応したものとなるように、前記ゲル化試薬を選択するステップをさらに含むことが好ましい。
【００１９】
本発明に係る質量分析方法は、上述の調製方法により調製された試料を質量分析計に導入して質量分析を行なうものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による試料の調製方法は、電気泳動を用いた標準試料ゲルの調製における複数の変動要因を排除するために、電気泳動を行なわないで、マイクロチューブやガラスチューブのような容器内において標準試料をゲル化させたものを標準試料ゲルとして使用する。このようにして調製した標準試料ゲルと分析対象試料ゲルを用いて質量分析を行なうことで、電気泳動を用いた標準試料ゲルの調製で生じる変動要因を排除した分析を行なうことができ、分析結果の精度が向上する。
【００２１】
本発明に係る質量分析方法では、電気泳動を用いない方法によりゲル化された標準試料がゲル状態の分析対象試料に添加されたものを試料として質量分析計に導入して質量分析を行なうので、電気泳動を用いた標準試料ゲルの調製で生じる変動要因を排除した分析を行なうことができ、分析結果の精度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】試料調整方法及び質量分析方法の一実施例を示すフローチャートである。
【図２】電気泳動により得られたタンパク質ゲルのイメージ図である。
【図３】（Ａ）は同タンパク質ゲルのＡの範囲で切り出したときの質量分析計の検出信号の例であり、（Ｂ）は同タンパク質ゲルのＢの範囲で切り出したときの質量分析計の検出信号の例である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の試料調整方法及び質量分析方法は、ゲル化されたタンパク質などの生体高分子を分析対象試料とする場合に用いられるものである。試料を質量分析する場合、その試料を質量分析計に導入する前に試料の電気泳動を行なって試料を分子量あるいは鎖長ごとに分離し、分析したいスポット（分子量もしくは鎖長部分）を電気泳動用ゲルごと切り出す。切り出されたゲル片が質量分析の分析対象試料となる。タンパク質を電気泳動する一般的な方法として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アフィニティ電気泳動、などがある。
【００２４】
ただし、最初から精製された状態（不要な部分が含まれていない状態）の試料であれば、上記のような電気泳動による精製を行なう必要がない。そのような場合には、通常は分析対象試料が溶液状態のままで酵素消化のような前処理と質量分析を実施することもできるが、分析対象試料が例えば膜タンパク質など酵素消化が難しい試料であるときには、分析対象試料をゲル状態にしてから酵素消化などの前処理を実施することが考えられる。
【００２５】
そのような場合、分析対象試料をゲル化する方法としては、上述の電気泳動を用いた方法と、非特許文献１に開示されているような、マイクロチューブやガラスチューブのような容器内において分析対象試料をゲル化させる方法とが考えられる。すなわち、本発明が対象とする分析対象試料には、電気泳動を用いてゲル化されたものだけでなく、容器内におけるゲル化処理によってゲル化されたものも含まれる。
【００２６】
図１は、本発明に係る試料調整方法及び質量分析方法の一実施例を示すフローチャートである。
【００２７】
まず、分析対象試料のゲル化を行ない、分析対象試料ゲルを作成する。分析対象試料のゲル化方法としては、既述のように、電気泳動を用いて試料を分離し、分析対象試料部分のゲル片を切り出す方法のほか、容器内におけるゲル化処理によって分析対象試料をゲル化する方法が挙げられる。
【００２８】
分析対象試料を容器内においてゲル化する場合、分析対象試料の容器内におけるゲル化処理は、例えば以下のステップを含んでいる。ただし、以下に示す終濃度は一例に過ぎない。
（１）マイクロチューブ（容器）に分析対象試料の溶液を入れる。
（２）そのマイクロチューブ内の分析対象試料に以下の試薬を各終濃度になるように添加して撹拌する。
・ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：終濃度１％
・アクリルアミド／ビス混合液（２９：１）：終濃度１０％
・テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）：終濃度２．５％
（３）さらに過硫酸アンモニウム（終濃度０．０５％）を添加し、ゲルが固まるまで室温（例えば２０度）で放置する。
ゲルの基材としては、ポリアクリルアミド以外にアガロースなども利用可能である。
【００２９】
次に、標準試料を容器内においてゲル化する。ただし、標準試料のゲル化を分析対象試料のゲル化よりも前に行なってもよいし、分析対象試料と同時に行なってもよい。
【００３０】
標準試料の容器内におけるゲル化処理は、例えば以下のステップを含んでいる。ただし、以下に示す終濃度は一例に過ぎない。
（１）マイクロチューブ（容器）に標準試料の溶液を入れる。
（２）そのマイクロチューブ内の標準試料に以下の試薬を各終濃度になるように添加して撹拌する。
・ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：終濃度１％
・アクリルアミド／ビス混合液（２９：１）：終濃度１０％
・テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）：終濃度２．５％
（３）さらに過硫酸アンモニウム（終濃度０．０５％）を添加し、ゲルが固まるまで室温（例えば２０度）で放置する。
ゲルの基材としては、ポリアクリルアミド以外にアガロースなども利用可能である。
【００３１】
ここで、標準試料ゲルのゲル組成は分析対象試料ゲルのゲル組成と同じであることが望ましい。ゲル組成によって酵素消化やペプチド抽出効率などが異なってくることが考えられるためである。したがって、標準試料をゲル化するために使用する試薬としては、標準試料ゲルのゲル組成が分析対象試料のゲル組成と同じになるように選択されることが望ましい。
【００３２】
次に、上記の工程で得られた分析対象試料ゲルと標準試料ゲルを同じ容器に入れて混合し、酵素処理などの前処理を実施する。酵素処理では、分析対象試料ゲルと標準試料ゲルの入った容器に分解酵素を添加し、試料をペプチド断片に分解する。分解酵素として、試料がタンパク質である場合にはセリンプロテアーゼの一種であるトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いることができ、試料がＤＮＡやＲＮＡなどの核酸である場合には、デオキシリボヌクレアーゼやリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素を用いることができる。分析対象試料ゲルと標準試料ゲルの前処理を同じ容器内において同時に行なうことにより、前処理における分析結果の変動要因を排除することができる。
【００３３】
上記の前処理が終了した後、分析対象試料及び標準試料からなる試料を質量分析計に導入し、試料分析を行なって検出信号を得る。その後、質量分析計で得られた分析対象試料由来の検出信号を標準試料由来の検出信号に基づいて補正することになるが、この実施例の標準試料は電気泳動を用いることなくゲル化されているため、電気泳動を用いることによる検出信号の変動要因がなく、標準試料由来の検出信号の再現性が高い。したがって、再現性の高い標準試料由来の検出信号を用いて分析対象試料の補正を行なうため、分析結果の精度が向上することとなる。
【００３４】
ここで、図２にタンパク質の電気泳動イメージを示す。翻訳後修飾があるタンパク質は、この図に示されているようにタンパク質のバンドがブロードになり、このバンドをどの範囲で切り出すかによって検出データが異なる。図２のＡの範囲で切り出した場合は、図３（Ａ）のような検出結果が得られるのに対し、図２のＢの範囲で切り出した場合には、図３（Ｂ）に示されているように、Ａの範囲で切り出した場合よりも多くの糖鎖が付加した当ペプチドが検出される。このように、電気泳動後のゲルの切り出し範囲にばらつきが生じると、検出結果に影響を与えることになるが、ゲルの切り出し範囲を毎回再現良く均一に揃えることは困難である。
【００３５】
これに対し、以上において説明した実施例のように、標準試料のゲル化を電気泳動を用いずに容器内で実施することで、上記のような切り出し範囲のばらつきによる検出データの再現性の悪さを改善することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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