(57)【要約】      （修正有）【課題】非侵襲的、簡便かつ安価であり、すべての種類の悪性腫瘍を検査できる方法を提供する。【解決手段】ヒト被験者の体表又は呼気から放出された一酸化炭素（ＣＯ）を含む気体サンプルを採取する工程、前記気体サンプル中のＣＯ濃度を決定する工程を含む、悪性腫瘍の検査方法。採取する気体が呼気である、検査方法。採取する気体が、体表から経皮的に放出された成分を含む気体である、検査方法。ヒト被験者が非喫煙者である、検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者の体表又は呼気から放出された一酸化炭素（ＣＯ）を含む気体サンプルを採取する工程、前記気体サンプル中のＣＯ濃度を決定する工程を含む、悪性腫瘍の検査方法。
【請求項２】
採取する気体が呼気である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
採取する気体が、体表から経皮的に放出された成分を含む気体である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
ヒト被験者が非喫煙者である、請求項１に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国の悪性腫瘍による死亡者数は、2015年には37万人を超え（厚生労働省、人口動態統計）、現在死亡原因の第一位である。したがって悪性腫瘍を早期に発見し、死亡者を減らすことは医療における最大の課題の一つである。しかし PET-CT のような画像診断を除けば、多くの腫瘍検査は各腫瘍個別の検査であり、悪性腫瘍全般を検出するような普遍的な検査はまだない。このようなスクリーニング検査が開発され、健康診断などで人々が受け、陽性と判定された人が精密な検査を受けるようにすれば、悪性腫瘍の患者を効率的に明らかにできると考えられる。そのような検査は、非侵襲的、簡便かつ安価であり、すべての種類の悪性腫瘍を検査できることが望ましい。
【０００３】
呼気を用いた悪性腫瘍検査は、そのようなスクリーニング検査を可能にすると考えられる。2006年には、訓練した犬が嗅覚によって肺癌、乳癌患者の呼気と健常人の呼気をかぎ分けたという報告がある(非特許文献１：Michael McCulloch et al.，Integrative cancer therapies, 2006, 5, 30)。すなわち、悪性腫瘍患者の呼気には悪性腫瘍特有のにおい成分が含まれていると考えられる。したがって、呼気を用いた悪性腫瘍検査を行うためには、呼気中に含まれる悪性腫瘍特有のにおい成分を特定することが必要である。そのようなにおい成分は揮発性有機化合物 (VOCs) であると考えられ、種々の化合物が候補として同定されている(非特許文献２：Kamila Schmidt and Ian Podmore，Jounal of biomarker, 2015, 2015, 981458)。世界中の研究者がそのような化合物を明らかにすべく研究しているはずであるが、現在に至るまでそのような化合物のうち、悪性腫瘍の検査に利用できるものは報告されていない。悪性腫瘍患者の呼気と健常人の呼気を犬が区別できたことから、悪性腫瘍特有のにおい成分が存在することは確かであろう。したがって、そのようなにおい成分を明らかにすることが悪性腫瘍患者のスクリーニング検査に必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Michael McCulloch et al.，Integrative cancer therapies, 2006, 5, 30
【非特許文献２】Kamila Schmidt and Ian Podmore，Jounal of biomarker, 2015, 2015, 981458
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、非侵襲的、簡便かつ安価であり、すべての種類の悪性腫瘍を検査できる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、一酸化炭素(ＣＯ)により悪性腫瘍のスクリーニング検査が可能になることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の悪性腫瘍の検査方法を提供するものである。
項１．  ヒト被験者の体表又は呼気から放出された一酸化炭素（ＣＯ）を含む気体サンプルを採取する工程、前記気体サンプル中のＣＯ濃度を決定する工程を含む、悪性腫瘍の検査方法。
項２．  採取する気体が呼気である、項１に記載の検査方法。
項３．  採取する気体が、体表から経皮的に放出された成分を含む気体である、項１に記載の検査方法。
項４．  ヒト被験者が非喫煙者である、項１に記載の検査方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、非侵襲的、簡便かつ安価に悪性腫瘍の有無を検査することができる。本発明で悪性腫瘍の部位が特定できない場合、別の検査で腫瘍部位を特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の動物実験の手順を示す。
【図２】実施例１の呼気中のＣＯ濃度を示す。
【図３】実施例２の、担癌マウスの皮膚からの気体におけるＣＯ濃度を示す。
【図４】実施例２の、担癌マウスの腫瘍部位におけるＣＯ産生酵素 (HO-1) の検出を示す。
【図５】実施例３の、ヒトの各種悪性腫瘍におけるＣＯ産生酵素 (HO-1) の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、ＣＯ濃度を検出するための気体サンプルは、被験者の呼気または体表から経皮的に放出された成分を含む気体（空気）を容器に集めたものを使用することができる。容器としては、体表から放出されるＣＯを含む成分を採取できるのであれば特に限定されないが、円筒状、角筒状、円錐状、角錐状、半球状、箱状などの形状の容器が挙げられ、具体的には、注射筒、ビーカー、コップ（紙製、樹脂製など）、シャーレ、樹脂製で可撓性の袋などが挙げられる。これらの容器は密閉系であってもよいが、小さい孔が開いていて、その孔から注射器などにより内部の気体を採取できるものであってもよい。容器が紙製や薄いフィルムなどで構成される場合、注射針を刺すことで内部の気体を採取することができる。容器を体表（皮膚など）に当てて体表からの成分を捕集する時間としては、１〜６０分程度、好ましくは３〜３０分程度が挙げられる。
【００１１】
呼気を集める場合には、樹脂製の袋、マウスピース、などの従来使用されているものを使用することができる。
【００１２】
呼気は全身の悪性腫瘍の検出に有効であり、経皮的な検出も各種の悪性腫瘍が対象に挙げられるが、皮膚がんあるいは皮膚もしくは粘膜に近い位置に発生した悪性腫瘍の検出に特に有効である。
【００１３】
気体サンプル中のＣＯ濃度の検出は、ガスクロマトグラフィー、一酸化炭素用ガス検知器、赤外線ガス分析計、定電位電解装置、接触燃焼装置、膜型表面応力センサーなどにより行うことができる。
【００１４】
悪性腫瘍としては、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳腫瘍、黒色腫、リンパ腫、白血病、皮膚癌などが挙げられる。
【００１５】
悪性腫瘍が疑われるときの気体サンプル中のＣＯ濃度（カットオフ値）としては、非喫煙者の場合には、例えば０．３ｐｐｍ以上、０．４ｐｐｍ以上、０．５ｐｐｍ以上、０．６ｐｐｍ以上、０．７ｐｐｍ以上、０．８ｐｐｍ以上、０．９ｐｐｍ以上、１ｐｐｍ以上、１．２ｐｐｍ以上、１．５ｐｐｍ以上、１．８ｐｐｍ以上、２ｐｐｍ以上、２．２ｐｐｍ以上、２．５ｐｐｍ以上、２．８ｐｐｍ以上、３ｐｐｍ以上、３．２ｐｐｍ以上、３．５ｐｐｍ以上、３．８ｐｐｍ以上、４ｐｐｍ以上、４．２ｐｐｍ以上、４．５ｐｐｍ以上、４．８ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、５．２ｐｐｍ以上、５．５ｐｐｍ以上、５．８ｐｐｍ以上、６ｐｐｍ以上が挙げられ、喫煙者の場合には、例えば０．５ｐｐｍ以上、１ｐｐｍ以上、１．５ｐｐｍ以上、２ｐｐｍ以上、２．５ｐｐｍ以上、３ｐｐｍ以上、３．５ｐｐｍ以上、４ｐｐｍ以上、４．５ｐｐｍ以上、５ｐｐｍ以上、５．５ｐｐｍ以上、６ｐｐｍ以上、６．５ｐｐｍ以上、７ｐｐｍ以上、７．５ｐｐｍ以上、８ｐｐｍ以上、８．５ｐｐｍ以上、９ｐｐｍ以上、９．５ｐｐｍ以上、１０ｐｐｍ以上、１２ｐｐｍ以上、１５ｐｐｍ以上、１８ｐｐｍ以上、２０ｐｐｍ以上、２５ｐｐｍ以上、３０ｐｐｍ以上、３５ｐｐｍ以上、４０ｐｐｍ以上、４５ｐｐｍ以上、５０ｐｐｍ以上が挙げられる。喫煙者の場合、検査を受ける８時間前、好ましくは１２時間前、より好ましくは２４時間前から禁煙しておくことが好ましい。禁煙の期間によりカットオフのＣＯ濃度は変化する。
【００１６】
本発明の好ましいヒト被験者は非喫煙者であり、検査実施の数時間前から喫煙をしていなければ、検査の対象となる。非喫煙者の過去の喫煙期間は、１０年以下、好ましくは５年以下、より好ましくは３年以下、特に好ましくは１年以下、最も好ましくは６カ月以下である。また、検査実施時の禁煙期間は、長い方が良く、好ましくは６か月以上、より好ましくは１年以上、さらに好ましくは３年以上、特に好ましくは５年以上、最も好ましくは１０年以上である。喫煙経験のない被験者が最も好ましい。
【００１７】
気体サンプル中のＣＯ濃度が高いほど、悪性腫瘍に罹患している確率が高くなる。
【００１８】
本発明の検査方法は、非侵襲的かつ低コストであり、容易に悪性腫瘍の有無の判定が可能であるので、健康診断のような健常者を多く含む集団に対し好ましく実施可能である。
【００１９】
本発明の検査方法の対象は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
【実施例】
【００２０】
本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
【００２１】
実施例１：T細胞性悪性リンパ腫細胞移植マウスの呼気からの一酸化炭素 (CO) 検出
１  実験方法
(1) 動物
6週齢のマウスscid/scid（日本クレア）を18匹用いた。それらのマウスを6匹ずつ，コントロール群，EL4-TK群，EL4-TK＋ZnPP群に分けた。コントロール群にはPBS (Phosphate Buffered Saline，SIGMA)を，EL4-TK群にはEL4-TK細胞（T細胞性悪性リンパ腫細胞，東北大学加齢医学研究所由来）を，EL4-TK＋ZnPP群にはEL4-TK細胞に加えてヘム酸化酵素 (HO-1) の阻害剤であるZnPPを投与した。実験手順は図1に示した。培養したEL4-TK細胞を室温で3分間遠心(1000 rpm) し，PBSで洗浄した後に1.0 × 107 cells /0.1 mlになるようにPBSを加え，懸濁した。マウスに移植するまで氷冷した。細胞をマウスの尾静脈から0.1 ml導入した。なお，コントロールにはPBSを0.1 ml導入した。阻害剤にはZnPPを用い，粉末を溶かした後にpH 7.4に調節し，その後5 mg/kgになるように調製し，濾過滅菌した。ZnPPは，EL4-TK＋ZnPP群に対し，細胞移植の翌日と８日目に腹腔内投与した。体重は当初は一日おきに，その後毎日測定した。マウスからの呼気採取は次のように行った。マウスを100 mlのポリプロピレンボトル（サンプラテック）に入れて蓋をした。蓋には注射針が通る穴を空けておき，注射針を入れるとき以外はテープで蓋をした。10分後，容器内の空気を50 ml注射筒を用いて，蓋をしたまま穴から注射針を差し込み14 ml採取した。2 ml のシリンジバイアル（日電理化硝子）の蓋をビンの口からずらし,その隙間から針を差し込んでその空気を押しだし，素早く蓋を閉めた。呼気採取を行うときには，実験を行った実験室の空気も採取した。
【００２２】
(2) 成分解析
バイアルからガラス製シリンジで空気を1 ml取り，トライライザー mBA-3000（タイヨウ）に注入して濃度を測定した。
【００２３】
(3) 統計処理
それぞれの成分の値から実験室内の空気の値を引いた値を用いた。統計処理はMann-WhitneyのU検定を行った後にBonferroni法によって補正した。EXCEL VBA MACRO FOR WINDOWS ノンパラメトリック統計2012に付属のソフトを利用した。
【００２４】
２．研究成果
(1) マウスの体重変化と容体
scidマウスの呼気を採取し，翌日尾静脈からT細胞性悪性リンパ腫細胞株EL4-TK細胞を1.0 × 107 個導入した。EL4-TK細胞がCOを産生するHO-1（ヘム酸化酵素）を発現していることは確認してある。HO-1は，ヘムを酸化的に分解してCO，鉄，ビリベルジンをつくる酵素である。EL4-TK群では，9日目にマウスが動かない状態になり，10日目にマウスの平均体重が増えなくなった。そこで10日目に呼気を採取した。翌日には体重は落ちた。コントロール群，EL4-TK＋ZnPP群のマウスは10日目でも元気であった。
【００２５】
(2) 呼気COの濃度変化
呼気のCO濃度を測定した結果，EL4-TK群のCO濃度は有意に増加していた（図2）。0日目と10日目を比べると，コントロール群のCO濃度は減少傾向にあったが，EL4-TK群では有意に増えていた。そして，10日目で比較するとコントロール群では0.19 ppm，細胞移植群では0.70 ppmであり，3.7倍で有意に高かった。これらから，EL4-TK 細胞導入によりマウスの呼気中のCO濃度が上昇したことがわかった。またEL4-TK＋ZnPP群は10日目にほぼ0 ppmであり，EL4-TK群と比較すると有意に低かった。
【００２６】
一方，H2に関しては，いずれの群も10日には増加しており，EL4-TK 細胞に依存しないことがわかった。
【００２７】
(3) 呼気CO濃度についての考察
呼気中のCO濃度は，0日目に比べて10日目には2.1倍になっていた。EL4-TK細胞は血液中に存在し，その細胞にはHO-1が発現していたため，血液中のCO濃度が上昇すると考えられる。そして，血液の成分は肺から呼気に移行するものがある。COは気体であり呼気に移行することも知られているため，呼気中のCO濃度が増加したことは矛盾がない。
【００２８】
また10日目についても，CO濃度はEL4-TK群がコントロール群と比較して3.7倍と有意に増えていた。すなわち，マウスの成長と共に増えたのではないことがわかった。また，EL4-TK＋ZnPP群と比較しても有意に濃度が高かった。HO-1の阻害剤ZnPPをマウスの腹腔内に導入すると，血液を介して全身に作用すると考えられる。したがって，ZnPPが血液中のEL4-TK細胞のHO-1のみならず，内在性（マウス個体）のHO-1を抑制したためにほぼ0 ppmになったと考えられる。
【００２９】
さらに，同じ気体のH2に関してはEL4-TK群に特異的な増加はなかったため，悪性腫瘍とは関係ないことがわかった。つまり，CO産生が悪性腫瘍に特異的であると言える。
【００３０】
実施例２：担癌マウスの皮膚からの一酸化炭素 (CO) 検出
１  実験方法
(1) 細胞株
移植細胞には結腸がん細胞株Colon-26（東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより供与）を用いた。この細胞を10% FBS (BioSera)，100 units/ml Penicillin，100 μg/ml Streptomycin (Gibco) 含有RPMI 1640培地（ナカライテスク）を用いて，37℃，5% CO2環境下で培養し，LunaTM（エル・エム・エス）を用いて細胞数を計測した。
【００３１】
(2) 動物
8週齢のマウスBalb/c（日本クレア）8匹を用いた。これらのマウスを，PBSを導入するPBS群4匹，およびColon-26細胞を導入するColon-26群4匹に分けた。培養したColon-26細胞は室温で3分間遠心(1000 rpm) し，PBSで洗浄した後に5.0 × 106 cells /0.1 mlになるようにPBSを加え，懸濁した。マウスに移植するまで氷冷した。移植前に右背中の毛を刈った。麻酔したBalb/cマウスの右背部の皮下に懸濁した細胞を0.1 ml導入した。一方，PBS群に対してPBSを0.1 ml導入した。PBSおよび細胞を導入後一週間程度放置し，Colon-26群のColon-26細胞を導入した部分が膨らむのを待った。ふくらみはノギスで測定し，長径が約10 mmになった段階で経皮的な成分の回収を行った。成分を集める容器は，5 mlの注射筒（テルモ）を6の目盛のところで切断した，針をつけない側を用いた。その容量は約2 mlであった。それにパラフィルムを被せて，さらにテープでマウスの腫瘍部位に被せた。60分放置した後に，1 mlのプラスチック製注射器で気体を採取した。
【００３２】
(3) 成分解析
1 mlの注射器の針を外し，パラフィルムで針を外した部分を塞いだ。それらの注射筒を株式会社タイヨウに送付し，H2およびCOの濃度測定を依頼した。結果のそれぞれの濃度の値は，環境中（空気中）の濃度を引いたものである。統計処理はMann-Whitney U-testを用いた。p<0.05で有意差ありと判定した。
【００３３】
(4) 免疫組織化学染色
PBS群の右背部皮膚，およびColon-26群の腫瘍部位を摘出し，ホルマリン固定した後にパラフィン包埋を経て組織標本を作製した。免疫染色法としては，EnVision Detection System/HRP (DAKO)を利用した酵素抗体法を用いた。一次抗体には抗HO-1抗体 (Enzo Life Science) を500倍希釈して，二次抗体にはLabelled Polymer-HRP Anti-Rabbitを用いた。発色はDABによって，核染色はマイヤーのヘマトキシリンによって行った。
【００３４】
２．研究成果
(1) COの経皮的測定の結果
経皮的に集めた気体のCO濃度を測定した結果，Colon-26群の腫瘍部位のCO濃度はPBS群に比べて高かった（図３）。PBS群の右背中から集めた気体のCO濃度の平均は0.21 ppmであり，Colon-26群の腫瘍部位の右背中から集めた気体のCO濃度は0.86 ppmであった。2群のCO濃度は4倍の開きがあり，有意にColon-26群の方が高かった。一方，COの陰性コントロールであるH2は2群でほとんど同じであり，有意差は認められなかった。
【００３５】
(2) 腫瘍部位の免疫組織化学染色の結果
Colon-26群の腫瘍部位のCO濃度がPBS群に比べて高かったため，Colon-26群の腫瘍部位にHO-1（ヘム酸化酵素）が存在しているのかどうか確かめた。その結果，染まっている細胞を確認できた（図４）。一方，腫瘍のできてない皮膚細胞にはHO-1は存在しなかった（染まっている小さな細胞は組織球であり白血球の一種である）。
【００３６】
(3) COの経皮的測定および腫瘍部位の免疫組織化学染色の考察
腫瘍部位の体表から経皮的に採取された気体を測定すると，CO濃度が腫瘍のない体表からの気体に比べて有意に高かった。このことから腫瘍で産生されたCOは体表に向かって出てきていることがわかった。なお，この腫瘍部位にはCOを産生するHO-1（ヘム酸化酵素）が存在していることが確認できた。つまりCOはHO-1により産生された後，分子量が小さいため細胞膜を通過して四方八方へ拡散し，皮膚側に向かったものを検出したと考えられる。一方，同じ気体のH2は腫瘍部位と腫瘍でない部位の体表から同程度しか排出されていなかった。つまり，COが腫瘍特異的に排出されていると判断できる。したがって，腫瘍部位から出てくるCOを検出できれば悪性腫瘍の検出が行えることが明らかになった。そして，検出する場所によっておおよそどこの悪性腫瘍か判断できる可能性がある。
【００３７】
実施例３：ヒトの悪性腫瘍におけるHO-1（ヘム酸化酵素）の検出
１  実験方法
(1)  材料と方法
材料はテストスライドA701Ｖ-Various cancer tissues with corresponding normal ti
ssues (AccuMax)を使用した。このスライドにはパラフィン包埋切片として，ヒトの皮膚，甲状腺，食道，胃，肺，乳房，肝臓，膵臓，腎臓，大腸，卵巣，前立腺の腫瘍組織とその周囲の非腫瘍組織が載っている。肝臓，肺については正常臓器を用いた。
【００３８】
免疫染色法としては，EnVision Detection System/HRP (DAKO)を利用した酵素抗体法を用いた。一次抗体には抗HO-1抗体 (Enzo Life Science) を1000倍希釈して，二次抗体にはLabelled Polymer-HRP Anti-Rabbitを用いた。発色はDABによって，核染色はマイヤーのヘマトキシリンによって行った。
【００３９】
２．研究成果
(1) ヒトの各種悪性腫瘍におけるHO-1（CO産生酵素）の免疫組織化学染色の結果
ヒトの各種悪性腫瘍について，COを産生する酵素 HO-1 が発現していることがわかった（図５）。基本的に非腫瘍部位ではHO-1は発現していない。ただ，大腸，腎臓，胃，乳房のような腺組織を持つ臓器の腺においてはHO-1の発現が見られた。一方，悪性腫瘍組織においては発現の多少はあるものの，いずれの組織も非腫瘍組織よりも濃くなっていたため，HO-1発現の亢進が見られた。非腫瘍組織に発現が認められる腺組織においても，色が濃くなり発現がさらに強くなっていることがわかった。つまり悪性腫瘍ではHO-1がより強く発現するようになることがわかった。
【００４０】
(2) ヒトの各種悪性腫瘍におけるHO-1（CO産生酵素）の免疫組織化学染色の考察
調べたすべての悪性腫瘍において，程度の違いはあるがHO-1の発現が強くなっていることがわかった。つまり，悪性腫瘍になると発現が上昇したHO-1によってCOが産生されることになると考えられる。
【００４１】
(3) 実施例1から３までの結果の総括
実施例１および２から，マウスにおいて悪性腫瘍にはCO産生酵素であるHO-1が発現していた。そして，それらの細胞，組織から出てくるCOを呼気，または経皮的に検出することができた。一方，H2は悪性腫瘍と関連はなかった。つまり悪性腫瘍からはCOが特異的に排出されていると考えられる。このことは悪性腫瘍，HO-1，CO産生を一般的に関連付けることができると考えられる。そして，ヒトの悪性腫瘍にもHO-1の発現が見られた。つまり，ヒトにおいても悪性腫瘍からCOが産生されると考えられるため，ヒトからも呼気，および経皮的にCOの検出が可能になると予測できる。最終的に，悪性腫瘍の検査にCOを利用することができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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