(57)【要約】【課題】再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、慢性腎障害を治療するための細胞製剤を提供する。本発明の細胞製剤は、上記疾患の対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を静脈投与することにより、腎障害部位に選択に集積させ、その組織内でＭｕｓｅ細胞が腎臓を構成する細胞に分化するという腎組織再生メカニズムに基づく。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、慢性腎障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
【請求項２】
外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
慢性腎障害が、慢性糸球体腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、急速進行性糸球体腎炎、悪性高血圧症、ＳＬＥ腎炎、アミロイド腎、腎・尿路腫瘍、骨髄腫、閉塞性尿路生涯、痛風腎、腎形成不全、及び腎・尿路結核からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項７】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、腎障害部位に集積する能力を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が、足細胞、メサンギウム細胞、糸球体内皮細胞、傍糸球体細胞、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、血管内皮細胞、ヘンレわな、及び／又は集合管の細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、腎不全により損傷を受けた腎臓組織の修復及び再生に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の透析移行患者の増加は、ＱＯＬや国民医療費の面で問題となっている。慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症及び多発性嚢胞腎をはじめとする多くの慢性腎疾患は、その障害過程が進行性であり、治療が奏功しなければ最終的には腎機能の廃絶をきたし腎不全により透析移行に至る。現在、腎障害（腎不全）治療のための透析医療費は１兆円を超え、全医療費の約３%を占め、腎障害患者数は年々増加している。現在、わが国では人工透析患者数は約３０〜４０万人であり、患者一人についてみれば、１ヶ月の透析治療の医療費は、外来血液透析では約４０万円、腹膜透析（ＣＡＰＤ）では３５〜７０万円必要といわれている。
【０００３】
腎障害の中で、糸球体上皮が様々な原因により機能的又は構造的な障害を受けるものを糸球体上皮障害という。ここで、糸球体上皮細胞は、足細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）と呼ばれ、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の外面に並ぶ、高度に分化した細胞である。足細胞は、濾過関門の確定的な成分であり、そして、ネフリン、ポドシン及びα−アクチニン−４などの、それらの遺伝子における突然変異が腎疾患蛋白尿の原因となることが見出されている（非特許文献１及び２）。また、足細胞は、糸球体毛細血管の圧力の変化に反応し、灌流圧の変化に対して糸球体濾過量を調節する（非特許文献２〜４）。このように、足細胞を含む糸球体上皮は、腎臓における老廃物の濾過機能に重要な役割を担っているため、腎硬化症への進行を阻止することは、透析患者を増加させないためにも急務な課題である。
【０００４】
一方、腎障害には、糸球体の障害に限らず、尿細管における疾患も含まれる。尿細管は近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿細管及び集合管から形成され、尿細管において、糸球体濾液（原尿）から必要な栄養物質の再吸収と不要物質の分泌が行なわれる。何らかの原因で尿細管の働きに異常が起こると、全身の様々な疾患を発症することもある。近位尿細管の疾患としては、ファンコニ症候群、アミノ酸尿症、腎性糖尿などが挙げられ、遠位尿細管疾患としては、典型的には遠位尿細管性アシドーシスが知られている。
【０００５】
慢性腎障害が進行すると、正常な腎臓が有する機能が廃絶するために、体内の各臓器に影響が及び、典型的には尿毒症となる。具体的には、中枢神経障害、末梢神経障害、心・循環器障害、消化器障害、視力・眼障害、血液・凝固障害、免疫障害、内分泌障害、皮膚障害、骨・関節障害、電解質障害、酸塩基平衡障害が起こる。ここで、慢性腎障害の治療としては、尿毒症を予防するために人工透析が不可欠であり、完治には腎臓移植が唯一の根治療法である。しかしながら、ドナー不足のために全ての慢性腎障害患者に移植を施すことは不可能である。１９２０年代に腎障害患者に透析療法が行われて以来、患者に負担が少ない治療法が開発されていないのが現状である。
【０００６】
本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（特許文献５；非特許文献５〜８）。しかしながら、慢性腎障害の予防及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１４，ｐ．２９５８−２９６６（２００３）
【非特許文献２】Ｍｕｎｄｅｌ  Ｐ．＆  Ｓｈａｎｋｌａｎｄ  Ｓ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３，ｐ．３００５−３０１５（２００２）
【非特許文献３】Ｍｏｒｔｏｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．２９８１−２９８７（２００４）
【非特許文献４】Ｐａｖｅｎｓｔａｄｔ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．８３，ｐ．２５３−３０７（２００３）
【非特許文献５】Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐ．６００−６０７（２００５）
【非特許文献６】Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．８６３９−８６４３（２０１０）
【非特許文献７】Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５−９８８０（２０１１）
【非特許文献８】Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．１３９１−１４１５（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、慢性腎障害の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、慢性腎障害マウスに対して、Ｍｕｓｅ細胞を血管内投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が腎組織に集積し、障害した糸球体及び尿細管を再建及び修復し、腎機能の改善又は回復をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、慢性腎障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
［２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が、濃縮された細胞画分を含む、上記［１］に記載の細胞製剤。
［３］慢性腎障害が、慢性糸球体腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、急速進行性糸球体腎炎、悪性高血圧症、ＳＬＥ腎炎、アミロイド腎、腎・尿路腫瘍、骨髄腫、閉塞性尿路生涯、痛風腎、腎形成不全、及び腎・尿路結核からなる群から選択される、上記［１］及び［２］に記載の細胞製剤。
［４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［１］〜［３］に記載の細胞製剤。
［５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］〜［４］に記載の細胞製剤。
［６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［１］〜［５］に記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］〜［６］に記載の細胞製剤。
［８］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］〜［７］に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［９］前記多能性幹細胞が、腎障害部位に集積する能力を有する、上記［１］〜［８］に記載の細胞製剤。
［１０］前記多能性幹細胞が、足細胞、メサンギウム細胞、糸球体内皮細胞、傍糸球体細胞、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、血管内皮細胞、ヘンレわな、及び／又は集合管の細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、上記［１］〜［９］に記載の細胞製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、慢性腎障害を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を血管等から投与することにより、障害腎組織に選択に集積させ、その組織内でＭｕｓｅ細胞が腎組織を構成する細胞に分化するという腎組織再生メカニズムによって、慢性腎障害の進展を抑制し、腎機能を改善させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＭｕｓｅ細胞移植の６週後の慢性腎障害マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）モデルの腎機能を評価した結果を示す。左図はクレアチニンクリアランス（μｌ／分）、右図は血清クレアチニン（ｍｇ／ｄｌ）についての結果である。クレアチニンクリアランスの測定では、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群と比較して、Ｍｕｓｅ細胞を投与した場合、腎臓において血清中のクレアチニンを排泄する機能が有意に回復していた。血清クレアチニンの測定では、Ｍｕｓｅ細胞の投与群の血清クレアチニン濃度は、生理食塩水の投与群と比較して低く、統計的有意差を示した。一方、非Ｍｕｓｅ細胞の投与群は、生理食塩水の投与群と比較して統計的有意差を示さなかった。
【図２】ヒトＭｕｓｅ細胞移植の６週後の慢性腎障害マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）モデルの腎機能を評価した結果を示す。左図は血中尿素窒素（ＢＵＮ）（ｍｇ／ｄｌ）、右図は尿タンパク／クレアチニン比についての結果である。Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、非Ｍｕｓｅ細胞の投与群及び生理食塩水の投与群と比較して、血中の尿素窒素濃度が低下した。さらに、排泄尿中の尿タンパク／クレアチニン比を測定すると、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、他の群と比較して該比が低く、腎機能が改善されていることを示唆した。
【図３】慢性腎障害に伴う糸球体硬化に対するヒトＭｕｓｅ細胞の糸球体修復効果を検討した結果を示す（６週後）。上段の画像は、ＰＡＳ染色された腎組織切片を示し、左からＭｕｓｅ細胞投与群、非Ｍｕｓｅ細胞投与群、及び生理食塩水群を示す。Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、糸球体基底膜が非常に明確であった。一方、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群では、糸球体硬化が進行し、糸球体基底膜の輪郭が不鮮明であった。さらに、各群の１個体あたり連続する２０個の糸球体を観察し、糸球体硬化の面積比を画像解析ソフトＮＩＳｅｌｅｍｅｎｔ（登録商標）（Ｎｉｃｏｎ社）を用いて、１糸球体におけるＰＡＳ陽性面積を解析した（下段）。Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、他の投与群と比較して、糸球体硬化の面積比が小さかった。これにより、Ｍｕｓｅ細胞は、糸球体硬化の進行を防ぎ、さらに糸球体の再建及び修復を促すことが示唆された。
【図４】尾静脈投与されたヒトＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の腎組織への生着について検討した結果を示す（６週後）。Ｍｕｓｅ細胞は、腎組織に生着しているのに対して、非Ｍｕｓｅ細胞はほとんど生着しなかった。
【図５】１糸球体及びその周辺を含む領域における蛍光画像を示す（６週後）。上段下段共に、ヒトＭｕｓｅ細胞投与群である。左パネルは、抗ヒトゴルジ複合体抗体を用いて、マウス腎臓に生着したヒトＭｕｓｅ及び非Ｍｕｓｅ細胞を検出したものである。中央パネルは、腎組織の自家蛍光（ａｕｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す。右パネルは、左パネルの蛍光から中央パネルの蛍光を差し引いた蛍光画像である。矢頭で指示されるように、Ｍｕｓｅ細胞は、糸球体、尿細管、間質部等に広く分布して生着している。
【図６】マウス腎組織に生着したヒトＭｕｓｅ細胞の分化を検討した結果を示す。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が導入されたＧＦＰ陽性のヒトＭｕｓｅ細胞を用いた。また、遠位尿細管の上皮細胞において特異的に発現しているカルビンジンに対する抗体を用いて蛍光染色した。中央パネルは、遠位尿細管に生着したＭｕｓｅ細胞（ＧＦＰ陽性）を示す。右パネルは、カルビンジンに対する抗体によって特定された上皮細胞を示す。これらの画像を重ね合わせた画像を左パネルに示す。特に蛍光が強い領域を拡大すると、ＧＦＰ蛍光とカルビンジン蛍光が同一細胞群において観察されたことから、Ｍｕｓｅ細胞は、遠位尿細管に集積及び生着し、遠位尿細管に分化していることが示唆された。
【図７】マウス腎組織に生着したヒトＭｕｓｅ細胞の分化を検討した結果を示す。図６と同様に、ＧＦＰ陽性のヒトＭｕｓｅ細胞を用いた（中央パネル）。また、近位尿細管の上皮細胞において特異的に発現しているアクアポリン（ＡＱＰ１）に対する抗体を用いて蛍光染色した（右パネル）。これらの画像を重ね合わせた画像を左パネルに示す。この結果から、ＧＦＰ蛍光とＡＱＰ１蛍光が同一細胞群において観察されたことから、ヒトＭｕｓｅ細胞は、近位尿細管に集積及び生着し、上皮細胞に分化していることが示唆された。なお、陰性対照としてＧＦＰ及びＡＱＰ１に対する１次抗体で染色をしていないものを用いた（下段）。
【図８】ヒトＭｕｓｅ細胞の遊走能を検討した結果を示す。遊走能の評価には、ボイデンチャンバー法を用いた。陰性対照として用いたヒトＭｕｓｅ細胞＋疾患モデルマウス血清不含、又は非ヒトＭｕｓｅ＋疾患モデルマウス血清不含の系では、インサートを通過する細胞はほとんど観察されなかった。これに対して、疾患モデルマウス血清が添加された系では、Ｍｕｓｅ細胞は非常な遊走性を示し、これは、非Ｍｕｓｅ細胞＋疾患モデルマウス血清の件と比較しても顕著であった。このことから、疾患モデルマウス血清には、Ｍｕｓｅ細胞を遊走させるための何らかの因子を含むことが示唆された。
【図９】腎障害部位へのヒトＭｕｓｅ細胞の移動性を検討した結果を示す。Ｈｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２染色されたＭｕｓｅ細胞を慢性腎障害マウスモデルに尾静脈投与し、投与の２４時間後、腎組織を固定し、蛍光顕微鏡下で観察した。核染色されたＭｕｓｅ細胞は強いシグナルのスポットとして特定される（矢印部分）。尾静脈に投与されたＭｕｓｅ細胞は、糸球体、尿細管、間質部等に広く分布していることが分かる。
【図１０】図９と同様に、非Ｍｕｓｅ細胞の移動性を検討した蛍光画像を示す。非Ｍｕｓｅ細胞は、尿細管及び間質部にのみ観察された。また、ヒトＭｕｓｅと非Ｍｕｓｅの移動性をグラフにしたものを表示する（それぞれ、ｎ＝４）。
【図１１】ヒトＭｕｓｅ細胞移植によるＳＣＩＤマウスの慢性腎障害モデルにおけるクレアチニンクリアランス（μｌ／分）の経時的変化を測定した結果を示す。Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群と比較して有意に高く、腎機能が顕著に回復していることが示唆された。
【図１２】ヒトＭｕｓｅ細胞を移植後の１糸球体及びその周辺を含む領域における蛍光画像を示す（塩酸ドキソルビシン投与から８週後）。左パネルは、抗ヒトゴルジ複合体抗体を用いて、マウス腎臓に生着したＭｕｓｅを検出したものである。中央パネルは、足細胞のマーカーであるＷＴ−１（転写因子）に対する抗体を用いて検出した足細胞を示す蛍光画像である。左パネルは、両蛍光画像を重ね合わせたものであり、ヒトゴルジ複合体とＷＴ−１の蛍光が同一細胞群において観察されたことから、投与されたＭｕｓｅ細胞は、糸球体に集積し、足細胞に分化していることが示唆された。
【図１３】血管内皮細胞の表面抗原マーカーであるＣＤ３１に対する抗体を用いて蛍光免疫染色すると、投与されたヒトＭｕｓｅ細胞は、糸球体において血管内皮細胞に分化していることが示唆された。右パネルは、抗ヒトゴルジ複合体抗体を用いて蛍光免疫染色されたヒトＭｕｓｅ細胞であり、中央パネルは、ＣＤ３１に対する抗体を用いて蛍光免疫染色された血管内皮細胞であり、両画像を重ね合わせたものを左パネルに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、慢性腎障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
【００１４】
１．適用疾患
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤を用いて、慢性腎障害の予防及び／又は治療を目指す。ここで、「慢性腎障害」とは、長期間（例えば、数週間、数ヶ月間、数年間、又は数十年間）にわたって発生し、腎尿細管細胞機能又は糸球体濾過率（ＧＦＲ）が持続的に低下し、この期間に発症する、あらゆる腎臓の病的な状態、機能不全又は障害を意味する。しかしながら、本発明は、適用疾患として、急性腎不全などのより短時間（例えば、数分間、数時間、又は数日間）に発症する腎疾患を排除することを意図しない。したがって、本発明によれば、糸球体及び尿細管等の組織における慢性若しくは急性障害を適用疾患としてもよい。慢性腎障害としては、限定されないが、慢性糸球体腎炎、腎硬化症、糖尿病性腎症、嚢胞腎、慢性腎盂腎炎、急速進行性糸球体腎炎、悪性高血圧症、ＳＬＥ腎炎、アミロイド腎、腎・尿路腫瘍、骨髄腫、閉塞性尿路生涯、痛風腎、腎形成不全、及び腎・尿路結核などが挙げられる。
【００１５】
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ  ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｊａｎ  １７，２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、慢性腎障害を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。
【００１６】
簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
【００１７】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００１８】
また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下： 
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００１９】
（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
【００２０】
また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
【００２１】
上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、慢性腎障害の治療において所望の効果（例えば、クレアチニンクリアレンの改善、血清クレアチニン量の低下、血中の尿素窒素量の低下、糸球体効果面積の減少など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。後述する実施例３〜７においては、塩酸ドキソルビシン投与によって作製した慢性腎障害モデルマウスに対して、Ｍｕｓｅ細胞移植による各種の効果を検討した。約２０〜３０
ｇのＢａｌｂ／ｃマウス又はＳＣＩＤマウスに対しては、ＳＳＥＡ３陽性細胞を２×１０４細胞／頭で投与することにより、非常に優れた効果が得られた。この結果から哺乳動物一個体あたり６．６〜１０×１０５細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与することで優れた効果が得られることが期待される。なお、対象とする個体はマウス、ヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり１×１０３細胞〜１×１０７細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞〜１×１０８細胞、１×１０４細胞〜５×１０７細胞、２×１０４細胞〜２×１０７細胞、５×１０４細胞〜５×１０６細胞、１×１０５細胞〜１×１０６細胞などが挙げられる。
【００２２】
３．マウス慢性腎障害モデルの作製とＭｕｓｅ細胞による治療効果
本明細書においては、本発明の細胞製剤による慢性腎障害の治療効果を検討するためにマウス慢性腎障害モデルを構築し、使用することができる。該モデルとして使用されるマウスには、限定されないが、一般的に、Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＳＣＩＤマウスが挙げられる。慢性腎障害モデルは、これらのマウスに抗ガン剤（例えば、塩酸ドキソルビシン）を静脈投与することによって作製され得る。塩酸ドキソルビシンは、アドリアマイシン（慣用名）としても知られ、過剰投与により腎障害（ヒトの単状糸球体硬化症に類似した慢性腎障害）を引き起こすことは広く知られている。本発明によれば、塩酸ドキソルビシンの投薬量は、好ましくは個体１ｇあたり１１．５μｇである。
【００２３】
本発明の細胞製剤はヒト由来のＭｕｓｅ細胞であるため、該製剤を投与されるマウスとは異種の関係にある。通常、モデル動物において異種の細胞等が投与される実験では、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与される。これまでに、本発明者らは、Ｍｕｓｅ細胞の母集団である間葉系細胞が元々強い免疫抑制を有し、Ｍｕｓｅ細胞も同様の作用を有することを見出している。したがって、本発明においては、免疫抑制剤を使用していないマウスモデルにおいて免疫抑制剤を使用しなくてもよい。実際に、免疫抑制剤を用いなくても、本発明の細胞製剤による顕著な腎機能の改善が見られた（実施例１〜６参照）。
【００２４】
本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤は、慢性腎障害患者の腎機能を改善又は正常（又は正常値）に回復することができる。本明細書において使用するとき、腎機能の「改善」とは、慢性腎障害に伴う各種の症状の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは、日常生活に差し支えない程度にまで症状を緩和することを意味する。また、腎機能を「正常に回復する」とは、慢性腎障害に起因した全ての症状が腎障害前の状態に戻ることを意味する。
【００２５】
本発明の細胞製剤を投与した後のマウスモデルの腎機能の評価は、一般的に知られ、簡易に測定可能な尿タンパク、クレアチニンクリアランス、血清クレアチニン、及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）、及び尿タンパク／クレアチニン比を指標として行うことができる。例えば、クレアチニンクリアランスの測定では、筋肉組織起源のクレアチニンが、腎機能の減少に伴って尿細管による分泌が増大することを指標としている。したがって、腎機能が改善又は正常に向かうことによって、クレアチニンクリアランスが増加し、一方、血清クレアチニン量が減少することになる。また、血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、タンパク質代謝の廃棄物であって、腎機能の低下に伴って血中のＢＵＮ量が増加する。血清クレアチニンと同様に、腎機能が改善又は正常に向かうことによって、ＢＵＮは減少する。なお、ヒトでは、血清クレアチニンについては、正常値が０．４〜１．２ｍｇ／ｄｌであり、ＢＵＮについては、正常値が８〜２０ｍｇ／ｄｌである。
【００２６】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：マウス慢性腎障害モデルの作製
本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、「国立大学法人東北大学動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、東北大学動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。より具体的には、マウス慢性腎障害モデルは、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＳＣＩＤマウス（雄性１１〜１３週齢）の尾静脈に塩酸ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）を１１．５μｇ／ｇマウスを投与することによって作製した。これらは、ヒト慢性腎不全の原因疾患の一つである単状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）様の病像を呈するモデルである。
【００２８】
実施例２：ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
ヒトＭｕｓｅ細胞の調製は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に従って行った。より具体的には、ヒト骨髄液から接着性を有する間葉系細胞を培養し、増殖を経て、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団をＳＳＥＡ−３陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。また、非Ｍｕｓｅ細胞は、上記間葉系細胞のうち、ＳＳＥＡ−３陰性の細胞群であり、対照として用いた。その後、リン酸緩衝生理食塩水又は培養液を用いて、所定濃度に調整し、以下の慢性腎障害マウスモデルにおけるＭｕｓｅ細胞による腎機能評価等に使用した。なお、骨髄間葉系細胞などの間葉系細胞を培養して得たものをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、ＳＳＥＡ−３陽性細胞は全て、ＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。
【００２９】
実施例３：Ｍｕｓｅ細胞移植によるＢａｌｂ／ｃマウスの慢性腎障害モデルにおける腎機能評価
実施例１で作製した慢性腎障害マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を３群に分け、塩酸ドキソルビシン投与の１週間後に各群のマウスにＭｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μｌ）、ヒト骨髄由来の非Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μｌ）、又は生理食塩水（２００μｌ）を尾静脈に投与した。その後、所定期間経過後に、各マウスについて、クレアチニンクリアランス、血清クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、及び尿タンパクを常法に従って測定し、慢性腎障害マウスに対するＭｕｓｅ細胞の治療効果を評価した。なお、投与に使用した細胞はいずれもヒト由来であるが、該細胞のマウスへの投与に際して、実験期間中、免疫抑制剤を用いていない。
【００３０】
（ａ）クレアチニンクリアランス及び血清クレアチニン
上記マウスモデル群のそれぞれについて、塩酸ドキソルビシン投与から６週間後のクレアチニンクリアランス（μｌ／分）の測定結果を図１右に示す。Ｍｕｓｅ細胞の投与群におけるクレアチニンクリアランスは、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群と比較して有意に高かった。Ｍｕｓｅ細胞の投与群と非Ｍｕｓｅ又は生理食塩水の投与群は、それぞれ有意差があった。これにより、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群と比較して、Ｍｕｓｅ細胞を投与された慢性腎障害マウスでは、腎臓において血清中のクレアチニンを排泄する機能が回復していることがわかる。さらに、上記のマウスモデルのそれぞれについて、血清クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄｌ）を測定した（図１左）。Ｍｕｓｅ細胞の投与群の血清クレアチニン濃度は、生理食塩水の投与群と比較して低く、統計的有意差を示した。一方、非Ｍｕｓｅ細胞の投与群は、生理食塩水の投与群と比較して統計的有意差を示さなかった。
【００３１】
（ｂ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）及び尿タンパク／クレアチニン比
腎臓による尿の排泄機能を調べるために、塩酸ドキソルビシン投与から６週間後の血中の尿素窒素（ＢＵＮ）濃度（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。図２左に示すように、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、非Ｍｕｓｅ細胞の投与群及び生理食塩水の投与群と比較して、血中の尿素窒素濃度が低下した。さらに、排泄尿中の尿タンパク／クレアチニン比を測定すると、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、他の群と比較して該比が低く、腎機能が改善されていることを示唆した（図２右）。
【００３２】
（ｃ）糸球体硬化
塩酸ドキソルビシン投与から６週間後に、慢性腎障害に伴う糸球体硬化に対するＭｕｓｅ細胞の糸球体修復効果を検討した（図３）。各マウスを屠殺後、腎組織切片を作製し、ＰＡＳ染色を行った。この染色によって、糸球体基底膜の変化から、糸球体硬化の程度を観察した。図３の上段に、Ｍｕｓｅ細胞、非Ｍｕｓｅ細胞、及び生理食塩水の投与群における各マウスの腎組織（糸球体）切片を示す。Ｍｕｓｅ細胞の投与群（左）では、糸球体基底膜が非常に明確であることがわかる。一方、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群（中央及び右）では、糸球体硬化が進行し、糸球体基底膜の輪郭が不鮮明である。さらに、各モデル群の１個体あたり連続する２０個の糸球体を観察し、糸球体硬化の面積比を画像解析ソフトＮＩＳｅｌｅｍｅｎｔ（登録商標）（Ｎｉｃｏｎ社）を用いて、１糸球体におけるＰＡＳ陽性面積を解析した（下段）。Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、他の投与群と比較して、糸球体硬化の面積比が小さかった。これにより、Ｍｕｓｅ細胞は、糸球体硬化の進行を防ぎ、さらに糸球体の再建及び修復を促すことが示唆された。
【００３３】
実施例４：腎組織におけるＭｕｓｅ細胞の生着及び分化
（ａ）Ｍｕｓｅ細胞の腎組織における生着
尾静脈投与されたＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の挙動を調べるために、これらの細胞が腎組織に生着するかどうかを検討した。最初に、ＧＦＰ陽性のＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞を作製し、これらを投与８週後のマウスを用い、実施例３と同様に腎組織切片を調製し、蛍光顕微鏡下で観察した。単位面積あたりの移植細胞数をカウントして、Ｍｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の生着について検討した。図４に示されるように、投与されたＭｕｓｅ細胞は、腎組織に生着しているのに対して、非Ｍｕｓｅ細胞はほとんど生着しなかった。
【００３４】
次に、ＧＦＰ陽性で標識していないヒトＭｕｓｅ細胞及を投与し、８週後に、実施例３と同様に腎組織切片を作製後、抗体ヒトゴルジ複合体抗体を用いてヒトＭｕｓｅ細胞を染色した。図５は、１糸球体及びその周辺を含む領域における蛍光画像を示す。図５左は、該抗体で染色した場合の蛍光画像であるが、中央の画像の通り、腎組織は自家蛍光が強いため、抗体による蛍光から自家蛍光を差し引いた蛍光画像を右に示す。上段の蛍光画像は、Ｍｕｓｅ細胞の投与群の画像であり、矢頭で指示されるように、Ｍｕｓｅ細胞は、糸球体、尿細管、間質部等に広く分布して生着している。
【００３５】
（ｂ）Ｍｕｓｅ細胞の腎組織における分化
腎組織に生着したＭｕｓｅ細胞が分化するかどうかを検討した。本実験では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子が導入されたＧＦＰ陽性のＭｕｓｅ細胞を用いた。また、遠位尿細管の上皮細胞において特異的に発現しているカルビンジンに対する抗体を用いて、Ｍｕｓｅ細胞の上皮細胞への分化について検討した。図６中央は、遠位尿細管に生着したＭｕｓｅ細胞（ＧＦＰ陽性）を示す。一方、図６右は、カルビンジンに対する抗体染色による上皮細胞を示す。これらの画像を重ね合わせた画像を図６左に示す。特に蛍光が強い領域を拡大すると、ＧＦＰ蛍光とカルビンジン蛍光が同一細胞群において観察されたことから、Ｍｕｓｅ細胞は、遠位尿細管に集積し、遠位尿細管の細胞に分化していることが示唆された。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は、近位尿細管に生着し、近位尿細管の上皮細胞に分化するかどうかをアクアポリン（ＡＱＰ１）の発現に基づいて検討した。図７上段は、Ｍｕｓｅ細胞を投与した場合にＧＦＰ蛍光画像（中央）、ＡＱＰ１染色画像（右）、及び両者を重ね合わせた画像（左）を示す。重ね合わせた画像から分かるように、ＧＦＰ陽性のＭｕｓｅ細胞は、近位尿細管の上皮細胞の分子マーカーであるアクアポリンを発現していることから、投与されたＭｕｓｅ細胞は、近位尿細管に集積し、近位尿細管の細胞に分化していることが示唆された。なお、陰性対照としてＧＦＰ及びＡＱＰ１に対する１次抗体で染色していないものを用いた（図７下段）。
【００３６】
実施例５：Ｍｕｓｅ細胞の遊走能の検討
上記の通り、慢性腎障害マウスモデルの尾静脈に投与されたＭｕｓｅ細胞は、腎障害部位に集積し、糸球体、遠位尿細管、及び近位尿細管の再建及び修復に大いに寄与していることが示唆された。次に、Ｍｕｓｅ細胞の腎障害部位への集積に関して、インビトロにおいてボイデンチャンバー法により、Ｍｕｓｅ細胞の遊走能を検討した。具体的には、使用したボイデンチャンバーは、ＢＤマトリゲルインベージョンチャンバー（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ−Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ）であり、チャンバー内に８．０μｍのポアサイズを有するＢＤファルコンセルカルチャーインサートを含む。該インサートの上面にはマトリゲルマトリックスが塗布されている。インサートの下部に疾患モデルマウス血清を添加し、インサート内にＭｕｓｅ細胞（３．５×１０４個／ウェル）又は非Ｍｕｓｅ細胞（３．５×１０４個／ウェル）を播種した。培養２０時間後、インサートを通過した細胞数を顕微鏡下で求めた。結果を図８に示す。縦軸は、顕微鏡下で拡大した観察した１視野あたりに存在する細胞数を表す。陰性対照として用いたＭｕｓｅ細胞＋疾患モデルマウス血清不含、又は非Ｍｕｓｅ＋疾患モデルマウス血清不含の系では、インサートを通過する細胞はほとんど観察されなかった。これに対して、疾患モデルマウス血清が添加された系では、Ｍｕｓｅ細胞は非常に高い遊走性を示し、これは、非Ｍｕｓｅ細胞＋疾患モデルマウス血清の件と比較しても顕著であった。このことから、疾患モデルマウス血清には、Ｍｕｓｅ細胞を遊走させるための何らかの因子を含むことが示唆された。
【００３７】
実施例６：インビボにおける細胞移動アッセイ
慢性腎障害マウスモデルにおける腎障害部位へのＭｕｓｅ細胞の移動性を検討した。Ｍｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞をそれぞれ培養ディッシュに接着させ、一晩培養後、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を用いて、これらの細胞核を染色した。続いて、トリプシン処理後、細胞数をカウントし、２×１０４個を慢性腎障害マウスモデルに尾静脈投与した。投与の２４時間後、常法に従って、腎組織を固定し、蛍光顕微鏡下で観察した。Ｍｕｓｅ細胞を投与した系の蛍光画像を図９に示し、非Ｍｕｓｅ細胞を投与した系の蛍光画像を図１０に示す。いずれの画像においても、各染色されたＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の核は強いシグナルのスポットとして特定される（矢印部分）。尾静脈に投与されたＭｕｓｅ細胞は、糸球体、尿細管、間質部等に広く分布していたが、非Ｍｕｓｅ細胞は、尿細管及び間質部にのみ観察された。このことから、Ｍｕｓｅ細胞は、非Ｍｕｓｅ細胞と比較して、疾患部位に対して高い遊走性及び生着能を有していると考えられる。
【００３８】
実施例７：ヒトＭｕｓｅ細胞移植によるＳＣＩＤマウスの慢性腎障害モデルにおける腎機能評価、腎組織におけるヒトＭｕｓｅ細胞の生着及び分化
ヒト細胞を拒絶しない免疫不全のＳＣＩＤマウスを用いて、腎機能評価の１つとしてクレアチニンクリアランスを経時的に測定した。実験手順は、実施例３と同様に、実施例１で作製した慢性腎障害マウス（ＳＣＩＤ）を３群に分け、塩酸ドキソルビシン投与の１週間後に各群のマウスにＭｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μｌ）、ヒト骨髄由来の非Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μｌ）、又は生理食塩水（２００μｌ）を尾静脈に投与した。その後、各マウスについて、クレアチニンクリアランスを経時的に測定し、結果を図１１に示す。ヒトＭｕｓｅ細胞の投与群におけるクレアチニンクリアランスは、測定開始から６週目まで減少するが、測定期間中、非Ｍｕｓｅ細胞及び生理食塩水の投与群と比較して、有意に高かった。また、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、Ｂａｌｂ／ｃ慢性腎障害モデルと同様に、腎機能が顕著に回復していることが示唆された。
【００３９】
さらに、ＳＣＩＤマウスに投与されたヒトＭｕｓｅ細胞の挙動を調べるために、Ｍｕｓｅ細胞が腎組織に生着し、分化するかどうかを検討した。Ｍｕｓｅ細胞を投与後の８週目において、実施例３と同様に腎組織切片を調製し、特に、本実施例においては糸球体にＭｕｓｅが生着するかどうかを蛍光染色により調べた。図１２に示すように、Ｍｕｓｅ細胞は、ヒトゴルジ複合体に対する抗体により赤色の蛍光は発し（右パネル）、さらに、足細胞のマーカーとして知られているＷＴ−１（転写因子）の発現をこれに対する抗体により検出すると、緑色の蛍光を発していた（中央パネル）。両パネルを重ね合わせた画像（左パネル）において、ヒトゴルジ複合体とＷＴ−１の蛍光が同一細胞群において観察されたことから、投与されたＭｕｓｅ細胞は、糸球体に集積し、足細胞に分化していることが示唆された。さらに、血管内皮細胞の表面抗原マーカーであるＣＤ３１に対する抗体を用いて蛍光免疫染色すると、投与されたＭｕｓｅ細胞は、糸球体において血管内皮細胞に分化していることが示唆された（図１３）。このように、投与されたＭｕｓｅ細胞は、慢性腎障害のＳＣＩＤマウスにおいても、障害部位に集積し、腎組織を構成する細胞に分化する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の細胞製剤は、慢性腎障害マウスモデルに投与することにより、腎障害部位において腎組織を再建及び修復し、腎機能を回復させることができ、慢性腎障害の治療に応用することができる。
【００４１】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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