(57)【要約】      （修正有）【課題】転移性前立腺がんをはじめとするがん患者のための、より効果的で手頃な価格のワクチン／薬剤を提供する。【解決手段】シプロフロキサシン等から選択される化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物。本発明の薬剤組成物は、抗原、および／またはアジュバントをさらに含んでなってもよい。ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４シグナル伝達経路を活性化するヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）８に対するリガンドを含んでなる医薬組成物を使用して、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性の免疫抑制を阻害する方法、またはより一般的には、免疫応答を増大させる方法もまた提供される。本発明は、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、およびＦｏｘＰ３を発現して、ＩＬ−１０を分泌し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制できる、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を使用して、Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式により与えられる化合物１の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
2018162262.tif 000007
哺乳類の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性の免疫抑制を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
抗原をさらに含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記哺乳類がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、
前記医薬組成物は、がん特異的抗原を含んでなる免疫原性量のがんワクチンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上皮内新生物、子宮頸部異形成、日光角化症、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、カポジ肉腫、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及び、Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される新生物疾患の治療のために用いられる、
請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
１μＭの量で化合物１が用いられる請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学に関し、具体的には宿主の免疫応答を強化する方法、より具体的には、Ｔ−ｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する能力を逆転させる方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１，０２４号明細書の優先権を主張する。その開示は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
免疫系を利用して、感染性因子や悪性細胞などを根絶することは、有望な治療的アプローチである。しかし最近まで、がん治療におけるその応用からは、散発的な臨床的成功しか得られていない（Ｄｉ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１１）。最近、ＦＤＡによって、免疫療法に基づくワクチン／薬剤シプロイセルＴ（プロベンジ（登録商標））およびイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））が認可されたことは、免疫療法分野の画期的出来事に相当する（Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｋａｎｔｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。さらに、黒色腫のためのｇｐ１００ペプチドの第ＩＩＩ相臨床試験からも、非常に有望な臨床結果が得られている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。それでもなお、これらの薬剤について報告された臨床上の便益は、完全寛解および恒久的治癒にはほど遠い。シプロイセルＴの場合、客観的な腫瘍退縮または実質的なＰＳＡレベル変化のない、わずか４．１ヶ月の延命効果が報告されている一方で、これらの輸液のコストは９３，０００米ドルである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、転移性前立腺がんをはじめとするがん患者のための、より効果的で手頃な価格のワクチン／薬剤に対する大きな必要性が、なおもある。
【０００５】
ペプチドベースのワクチン、そしてＦＤＡ認可ワクチン療法（Ｂｕｏｎｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）の比較的低い臨床的有効性の一因たり得る多数の要素の中でも、腫瘍微小環境内の制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇまたはＴｒｅｇ）細胞媒介性免疫抑制をはじめとする強力な負の調節機構は、がんワクチンおよび薬剤の治療効果の改善にとって大きな障害である（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２００７；Ｚｏｕ，２００６）。例えば、腫瘍部位にある既存のＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害してもよく、したがって効果的ながん免疫療法の大きな障害となっている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，２００５）。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞媒介性の免疫抑制は、動物腫瘍モデルおよびがん患者で十分に立証されており（Ｂｅｒｅｎｄｔ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈ，１９８０；Ｍｕｋｈｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞比の増大が、肺、乳房、および卵巣腫瘍をはじめとする、異なる種類のがんがある個人で検出されている（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。本発明者らによる研究は、腫瘍部位の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の存在をさらに実証し、これらは、腫瘍部位で抗原特異的および局所免疫寛容を誘発する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、免疫抑制を克服することが、より効果的ながんワクチンおよび薬剤開発を成功裏に開発する鍵であってもよい。幾人かの研究者らが、抗ＣＤ２５＋抗体によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させることを試みている一方で（Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒｅｃｈ  ａｎｄ  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，２００９）、他の研究者らは、シクロホスファミドを使用してＴｒｅｇ細胞を枯渇させている（Ａｕｄｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。しかしＣＤ２５は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇおよび新たに活性化されたエフェクターＴ細胞の双方の上で発現するので、抗ＣＤ２５抗体（オンタックおよびダクリズマブ）およびシクロホスファミドは、Ｔｒｅｇ細胞枯渇に対して特異的ではない。
【０００６】
Ｔｒｅｇ細胞は、表現型、サイトカインプロファイルまたは抑制機構に基づいて、異なるサブセットに分類され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の小規模な母集団に相当する天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、抗原刺激なしに胸線から誘導され、細胞接触依存性機序を通じて免疫応答を抑制し得る（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，２００４；Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２）。対照的に、Ｔｒ１およびＴｈ３などの抗原誘発性Ｔｒｅｇ細胞は、抗原による刺激後に末梢で誘発され、一般に、抑制性サイトカインＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βを通じて免疫応答を抑制する。（Ｌｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２；ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，２００５）。本発明者らの以前の研究は、抗原（ＬＡＧＥ１またはＡＲＴＣ１）特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞により共有される細胞接触依存性機序を通じて、免疫応答を抑制することを実証する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞およびＬＡＧＥ１特異的Ｔｒｅｇ細胞の双方の抑制機能は、ＤＣ不在下で、ポリグアノシンオリゴヌクレオチド（ＰｏｌｙＧ−ＯＮＤ）などのＴＬＲ８リガンドによって、直接、逆転され得る（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は腫瘍部位に豊富にあるので、本発明者らは、これらのＴｒｅｇ細胞の別のサブセットが、がん患者からの腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）中に存在するのではないかと仮定した。この予想を試験する研究は、その免疫抑制機能が、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−β（またはその双方）以外の可溶性要素によって媒介される、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の新規サブセットを同定した。
【０００７】
ＰｏｌｙＧ−ＯＮＤによる治療は、Ｔｒｅｇ細胞の機能逆転をもたらしたが（Ｋｉｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＰｏｌｙＧ−ＯＮＤが、ヒトおよびマウスＴｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転させ得るかどうかは、明らかでない。
【０００８】
Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制性能力を操作するのに利用し得る、方法および治療薬に対する強い必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載されるのは、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−β非依存性の可溶性因子媒介機構を介して免疫応答を抑制する、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の新規サブセットの作成および特性解析である。枯渇ストラテジーに伴う、免疫抑制および可能な問題を克服する試みにおいて、本発明者らは、新たに同定されたＴｒｅｇ細胞を使用するスクリーニングシステムを開発し、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を遮断できる化合物を同定した。これらの新たに同定された化合物による、異なる処理時間でのＴｒｅｇ細胞の処理からは、Ｔｒｅｇ細胞の非抑制状態を維持する異なる時間窓がもたらされた。マウスＴＬＲ８は機能性でないので、ヒトＴＬＲ８遺伝子組換えマウスが作成され、Ｔｒｅｇ細胞を阻害する本発明の化合物による処理が、抗腫瘍免疫を増強することが示された。
【００１０】
Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤は、宿主の免疫応答を増強でき、がんまたは感染症など、患者の免疫系の増強が所望される疾患または病状を治療するのに使用されてもよい。
【００１１】
表１から表３に列挙される化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５によって表わされる化合物をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性を阻害または増強する化合物、そして化合物を含んでなる医薬組成物が、開示される。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、表１から表３に記載される化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択される化合物の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は抗原をさらに含んでなってもよく、それは、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原であってもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、アジュバントをさらに含んでなってもよい。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする哺乳類において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性の免疫抑制を阻害する方法、またはより一般的には、免疫応答を増強する方法を提供し、方法は、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４シグナル伝達経路を活性化するヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）８に対するリガンドを含んでなる医薬組成物の薬理有効量を、哺乳類に投与するステップを含んでなる。リガンドは、ｓｓＲＮＡ４０、ｓｓＲＮＡ３３、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０、レシキモド、ロキソリビン、フラジェリン、ＬＰＳ、およびＰａｍ３ＣＳＫ４からなる群から選択され；または化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択される。
【００１４】
一実施形態では、哺乳類はヒトである。哺乳類は、がんに罹患していてもよく、またはがんを発症するリスクがあってもよい。哺乳類に、がん特異的抗原を含んでなるがんワクチンの免疫原性量をさらに投与してもよい。別の実施形態では、哺乳類にアジュバントがさらに投与される。アジュバントは、抗原と共に投与されてもよく、または抗原と共役していてもよい。
【００１５】
別の実施形態では、哺乳類に、化学療法剤の有効量もまた投与してもよい。
【００１６】
哺乳類はまた、感染症を患っていてもよく、または発症するリスクがあってもよい。
【００１７】
本発明は、１）候補化合物を提供するステップと、２）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を提供するステップと、３）候補化合物の存在または不在下で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と共に培養するステップと、４）候補化合物の存在または不在下で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度を測定するステップと、５）候補化合物存在下の増殖速度と、候補化合物不在下の増殖速度とを比較するステップとを含んでなり、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度が、その存在下でその不在下よりも高い候補化合物が、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害を逆転させると判定されて阻害剤として選択される、Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、およびＦｏｘＰ３を発現して；ＩＬ−１０を分泌し、宿主の免疫応答を阻害できる。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、抗原に特異的であってもよい。一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、特異的抗原を提示するＤＣなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養するステップを含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の［３Ｈ］−チミジン取り込み速度によって、判定されてもよい。
【００１８】
本発明の化合物または医薬組成物を単独で、または抗原製剤またはワクチンなどのその他の治療薬と組み合わせて使用して、それを必要とする患者（例えばがん患者、または感染症に罹患している患者）を治療する方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】腫瘍反応性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞系またはクローンの作成および特性解析を示す。（Ａ）未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞またはがん患者からのＴＩＬ１０８細胞中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。（Ｂ）ＴＩＬ１０８に由来するＴ細胞クローンの抗原特異性分析。Ｔ細胞クローンは、標的腫瘍、およびＨＬＡ−ＤＲ１、ＤＲ４またはＤＲ７分子を発現する２９３個の細胞のパネルに対して試験された。５８６ｍｅｌ、１３６３ｍｅｌ、１５５８ｍｅｌ、および１６４ｍｅｌがＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現した一方で、１０８ｍｅｌおよび１３５９ｍｅｌは、それぞれＨＬＡ−ＤＲ７および−ＤＲ４について陽性であった。Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ放出は、ＥＬＩＳＡによって判定された。
【図２】ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルおよびＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ）Ｔ細胞クローンのサイトカインプロファイル。（Ｂ）Ｔ細胞クローンのＦＡＣＳ分析。Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＧＩＴＲ分子に対する、フィコエリトリン（ＰＥ）−またはＦＩＴＣ−標識ｍＡｂで染色された。アイソタイプ対照抗体は、陰性対照の役割を果たした。（Ｃ）リアルタイムＰＣＲによる、ＴＩＬ１０８Ｔ細胞クローン中のＦｏｘｐ３発現レベルの判定。ＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞は、対照の役割を果たした。ＨＰＲＴは、内部対照の役割を果たした。
【図３】ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性の機能特性解析を示す。（Ａ）ＴＩＬ１０８  ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞クローンの抑制活性。全てのＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンが、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を抑制した一方で、ＣＤ４＋エフェクター１３６３−Ｔｈ細胞は、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖活性を増強した。（Ｂ）細胞接触機序は、抑制に必須でない。未感作ＣＤ４＋Ｔ（応答）細胞およびＴｒｅｇ細胞クローンが、トランスウェルシステム内で隔離された。外側ウェル内の未感作Ｔ細胞増殖の抑制は、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンを内側ウェルで培養した場合でさえも、観察された。（Ｃ）抗ＩＬ−１０および抗ＴＧＦ−β抗体は、未感作Ｔ細胞の増殖を回復できなかった。（Ｄ）未感作Ｔ細胞増殖の抑制は、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの培養物上清によって媒介された。Ｔｒｅｇ細胞クローンからの１０μＬの培養物上清は、未感作Ｔ細胞の増殖を抑制するのに十分であった。（Ｅ）未感作Ｔ細胞増殖の抑制に必要な培養物上清の用量設定。
【図４】ＴＩＬ１０８上清による、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖およびＩＬ−２分泌の阻害を示す。（Ａ）ＴＯＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の培養物上清による、ＣＤ８＋エフェクター細胞増殖の抑制。ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンから収集された上清が、ＣＤ８＋エフェクター細胞の増殖を阻害した一方で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴＩＬ１３５９細胞のどちらの上清も、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制できなかった。示されるような異なる量の上清が使用された。（Ｂ）ＴＩＬ１０８上清による、ＣＤ４＋エフェクター細胞のＩＬ−２分泌の阻害。ＯＫＴ３抗体処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの上清は、ＴＩＬ１３６３  ＣＤ４＋エフェクター細胞によるＩＬ−２産生を阻害した。対照的に、未処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞またはＯＫＴ３抗体処理ＴＩＬ１５５８−Ｔｈ細胞のどちらの上清も、ＴＩＬ１３６３  ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞によるＩＬ−２分泌を抑制できなかった。（Ｃ）ＯＫＴ３抗体処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞は、それらの上清よりも強力に、ＴＩＬ１３６３  ＣＤ４＋エフェクター細胞からのＩＬ−２分泌を阻害した。ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞は、ＯＫＴ３または対照抗体で１２時間にわたって前処理され、次にＴ細胞アッセイ培地で洗浄された。ＴＩＬ１５５８−Ｔｈ細胞は、対照の役割を果たした。これらのＴ細胞は、ＴＩＬ１３６３  ＣＤ４＋Ｔ細胞および対応する１３６３ｍｅｌ標的細胞と、個別に混合された。
【図５】ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞処理後のＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞上清の抑制活性の逆転を示す。（Ａ）Ｐｏｌｙ−Ｇ１０オリゴヌクレオチドによる、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の逆転。（Ｂ）Ｐｏｌｙ−Ｇ１０−処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの上清は、未感作Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を喪失した。未処理Ｔｒｅｇ細胞からの上清は、対照の役割を果たした。（Ｃ）特異的ｓｉＲＮＡによる、Ｔｒｅｇ細胞中のＴＬＲ８、ＭｙＤ８８、およびＩＲＡＫ４のノックダウンは、Ｔｒｅｇ細胞が未感作Ｔ細胞の増殖を抑制する可逆性を遮断した。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９ｓｉＲＮＡは、対照の役割を果たした。（Ｄ）ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能は、ヒトＴＬＲ８に対する合成および天然リガンドによって逆転されたが、その他のＴＬＲに対するリガンドよっては逆転されなかった。（Ｅ）ヒトＴＬＲ８に対する合成および天然リガンドで処理されたＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の上清は、未感作Ｔ細胞の増殖を回復させたが、その他のＴＬＲに対するリガンドは、増殖を回復させなかった。
【図６】マウスＴｒｅｇ細胞の存在下で、未感作Ｔ細胞の増殖を回復できるＴＬＲリガンドの同定を示す。（Ａ）天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を単離して、抗ＣＤ４および抗ＣＤ２５抗体による染色後、ＦＡＣＳ選別によって精製した。異なる数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下で、応答細胞として未感作Ｔ細胞を使用する機能アッセイによって、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を判定した。０．５ｍｇの抗ＣＤ３抗体を含有する培地中で、精製ＡＰＣ（１ｘ１０４）を添加した未感作Ｔ細胞（１×１０５）をＴｒｅｇ細胞と混合した。５６時間の培養後、１ｍＣｉ／ウェルの最終濃度で［３Ｈ］チミジンを添加し、さらに１６時間の培養がそれに続いた。液体シンチレーションカウンターによって、［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。実験は、三重反復試験で実施した。Ｔｒｅｇ細胞またはＡＰＣは単独では、抗ＣＤ３抗体に応答しなかった。（Ｂ）ＴＬＲリガンドありまたはなしで、１：０．５の未感作Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の比率で、未感作Ｔ細胞／ＡＰＣの増殖アッセイを実施した。アッセイ条件は、パネルＡのものと同様であった。Ｐａｍ３ＣＳＫ４はＴＬＲ２に対するリガンドであり、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＴＬＲ３に対するリガンドであり、ＬＰＳはＴＬＲ４に対するリガンドであり、フラジェリンはＴＬＲ５に対するリガンドであり、ロキソリビンおよびレシキモドはＴＬＲ７に対する合成リガンドであり、ｐｏｌｙ−Ｇ１０はヒトＴＬＲ８のみに対するリガンドであり、ＣｐＧはＴＬＲ９に対するリガンドである。製造会社の説明書および本発明者らの独自の用量設定実験に従って、各リガンドの作業濃度を使用した。
【図７】遺伝子組換えマウス中のヒトＴＬＲ８の発現、機能、および抗腫瘍免疫を示す。（Ａ）ＣＤ４−ｈＴＬＲ８遺伝子組換えマウス中のヒトＴＬＲ８遺伝子の発現。各組織および細胞型から全ＲＮＡを単離して、ｈＴＬＲ８発現のＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用した。（Ｂ）Ｐｏｌｙ−Ｇ３ＯＮＤ処理に応えた、ヒトＴＬＲ８−発現Ｔｒｅｇ細胞の機能評価。
【図８】Ｐｏｌｙ−Ｇ３によるＴｒｅｇ細胞機能の遮断が、抗腫瘍免疫を増強することを示す。ＣＤ４−ｈＴＬＲ８  ＴｇマウスをＰｏｌｙ−Ｇ３またはＰｏｌｙ−Ｔ１０（対照）ＯＮＤ（１．０μｇ／マウス）によって、−２および−１日目に処理し、４つの異なる種類の腫瘍細胞を０日目に皮下注射した。腫瘍成長を２日毎にモニターした。
【図９】Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を遮断する、小分子化合物を同定するための２つのクリーニングストラテジーを示す。
【図１０】Ｔｒｅｇ細胞の機能を阻害する小分子化合物の同定を示す。これらの小分子化合物は、キノロン構造を含有する。ＣＤ４＋未感作Ｔ細胞増殖に対する顕著な効果（ＣＰＭ＞６０Ｋ、未感作Ｔ細胞単独との比較で５０％の回復）があるものは、さらなる薬物開発のための優れた候補と見なされる。いかなる化合物もなしの、未感作Ｔ細胞単独、またはＴｒｅｇ細胞添加ＣＤ４＋未感作細胞が、対照の役割を果たした。
【図１１】３種の異なる化合物と処理時間による処理後における、Ｔｒｅｇ細胞機能逆転の永続性を示す。Ｔｒｅｇ細胞は、１、３、および８日間にわたり３種の薬剤で前処理されて、それらの抑制機能の試験で使用されるまで、薬剤非含有培地中で培養された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
自己組織および腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を抑制することで、ＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が自己免疫寛容を誘発する強力な能力は十分に認識されているが、Ｔｒｅｇ細胞の異なるサブセットが利用する抑制機構については、ほとんど理解されていない。本発明者は、本明細書において、特有の免疫抑制機序がある、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の新規サブセットを開示する。この抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の新規サブセットは、それらのＣＤ２５、ＧＩＴＲ、およびＦｏｘＰ３マーカーの発現と、それらのＩＬ−１０分泌について、その他のＴｒｅｇ細胞と類似するが、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β以外の可溶性因子を通じて、免疫応答を阻害する。抑制活性は、ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４経路を活性化するヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）８に対するリガンドにより、Ｔｒｅｇ細胞を処理することで逆転させ得ることが分かり、ＴＬＲ８−ＭｙＤ８８シグナル伝達が、免疫抑制に関与する可溶性分子を調節する、新規機序が示唆された。
【００２１】
したがって本発明は、ＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が、宿主の免疫応答を免疫抑制する効果を逆転させる方法を提供する。本発明はまた、免疫賦活性組み合わせと、本発明の免疫賦活性組み合わせを対象に投与するステップを含む、治療的および／または予防的方法とを提供する。本発明はまた、ＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が、宿主の免疫応答を免疫抑制する効果を阻害する分子をスクリーニングする方法も提供する。本発明の方法および組成物は、免疫応答増大を提供して、特にがん特異的抗原ベースのワクチンによるがんの予防または治療における、特定の免疫学的治療の効力を改善し得る。
【００２２】
薬剤としての応用本発明のＴｒｅｇ細胞阻害剤は、様々な炎症性疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性疾患（アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性好酸球性胃腸炎など）、腎炎、腎障害、肝炎、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬、鼻炎、結膜炎、虚血再灌流傷害、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、急性呼吸窮迫症候群、細菌感染症に伴うショック、糖尿病、自己免疫疾患、移植拒絶反応、免疫抑制、がん転移、後天性免疫不全症候群などを予防および／または治療する薬剤として有用である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、抗原をさらに含んでもよい。存在する場合、抗原は、組み合わせの別の成分との併用で、抗原に対する免疫応答を生じるのに有効な量で投与してもよい。免疫応答を生じるのに有効な量を構成する抗原の特定の量は、当業者によって容易に判定され得る。
【００２４】
抗原は、医薬組成物のいずれかの成分と共に、同時にまたは順次投与してもよい。したがって、抗原は、単独で、または（例えば本発明のＴｒｅｇ抑制因子をはじめとする）全身免疫応答の刺激物質である、１つまたは複数のアジュバントとの混合物中で、投与してもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、１つのアジュバントに関して同時に（例えば混合物中で）投与してもよいが、１つまたは複数の追加的なアジュバントに関して順次投与してもよい。
【００２５】
抗原と医薬組成物のその他の成分との逐次同時投与は、抗原とその他の成分が同時投与されないにもかかわらず、それぞれが治療部位に同時に存在するように、その中で抗原とその他の医薬組成物の少なくとも１つの成分とが、投与される場合を含み得る。抗原と免疫賦活性組み合わせのその他の成分との逐次同時投与は、その中で抗原または医薬組成物の少なくとも１つのその他の成分が治療部位から除去されるが、除去される抗原またはその他の成分の少なくとも１つの細胞効果（例えばサイトカイン産生、特定細胞集団の活性化など）が、医薬組成物の少なくとも１つまたは複数の追加的成分が治療部位に投与されるまで、治療部位で持続する場合もまた含み得る。
【００２６】
抗原は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＮＫ  Ｔ細胞応答、γ／σ  Ｔ細胞応答、またはＴＨ１抗体応答の１つまたは複数をはじめとする、ＴＨ１免疫応答を生じる能力がある、いずれかの物質であり得る。適切な抗原としては、ペプチド；ポリペプチド；脂質；糖脂質；多糖類；炭水化物；ポリヌクレオチド；プリオン；生きたまたは不活性化細菌、ウイルスまたは真菌；および細菌、ウイルス、真菌、原生動物、腫瘍由来または生物由来の抗原、毒素または類毒素が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、特定の現在の実験的抗原、特に、強力な免疫応答を生じさせない、組換えタンパク質、糖タンパク質、およびペプチドなどの物質を、本発明のＴｒｅｇ細胞抑制因子化合物に関連して使用し得ることも検討される。例示的な実験的サブユニット抗原としては、アデノウイルス、ＡＩＤＳ、水痘、サイトメガロウイルス、デング、ネコ白血病、家禽ペスト、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、豚コレラ、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、日本脳炎、はしか、パラインフルエンザ、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、疣贅、および黄熱病などのウイルス性疾患に関連するものが挙げられる。特定の実施形態では、抗原は、がん抗原または腫瘍抗原であってもよい。がん抗原および腫瘍抗原という用語は同義的に使用されて、がん細胞によって差次的に発現される抗原を指す。
【００２７】
本発明の薬剤組成物は、細胞媒介性の免疫応答によって治療可能な病状を治療的に処置するのに利用し得る。このような組み合わせは、少なくとも治療有効量のＴｒｅｇ細胞抑制因子を含有し得て、治療有効量の抗原をさらに含んでもよい。
【００２８】
医薬組成物は、治療計画において単剤として、または抗ウイルス剤や抗生物質などの別の治療薬との組み合わせで、投与し得る。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、それらが免疫応答を増強する能力のために、（ａ）アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、またはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡またはワクシニア、または伝染性軟属腫などのオルソポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルスまたは腸内ウイルス）、オルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、性器疣贅、尋常性肬贅、または足底疣贅を引き起こすものなどの乳頭腫ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスまたはデングウイルス）、またはレトロウイルス（例えばＨＩＶなどのレンチウイルス）による感染に起因する疾患などのウイルス性疾患；（ｂ）例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）などの細菌による感染に起因する疾患などの細菌疾患；（ｃ）クラミジア；カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス髄膜炎をはじめとするが、これに限定されるものではない真菌疾患；またはマラリア、ニューモシスチスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、およびトリパノソーマ感染症をはじめとするが、これに限定されるものではない寄生性疾患などのその他の伝染性疾患；（ｄ）上皮内新生物、子宮頸部異形成、日光角化症、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、カポジ肉腫、黒色腫、腎細胞がん、骨髄性白血病や慢性リンパ球性白血病をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、および有毛細胞白血病、およびその他のがん（例えば上で同定されたがん）などの新生物疾患；および（ｅ）アトピー性皮膚炎または湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、全身性エリテマトーデス、本態性血小板血症、多発性硬化症、オーメン症候群、円板状ループス、円形脱毛症などのＴＨ２媒介性、アトピー性、および自己免疫疾患；ケロイド生成阻害およびその他の各種瘢痕阻害；および慢性創傷をはじめとする創傷の治癒促進などであるが、これに限定されるものではない、病状の治療に特に有用であり得る。
【００３０】
本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態は、例えば、ＢＣＧ、コレラ、腺ペスト、腸チフス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、パラインフルエンザ、ポリオ、狂犬病、はしか、おたふく風邪、風疹、黄熱病、破傷風、ジフテリア、ヘモフィルスインフルエンザｂ、結核、髄膜炎菌性および肺炎球菌のワクチン、アデノウイルス、ＨＩＶ、水痘、サイトメガロウイルス、デング、ネコ白血病、家禽ペスト、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、豚コレラ、日本脳炎、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、乳頭腫ウイルス、黄熱病、およびアルツハイマー病と関連して使用するための、生きたウイルス、細菌、または寄生虫抗原；不活性化ウイルス、腫瘍由来、原生動物、生物由来、真菌、または細菌抗原、類毒素、毒素；自己抗原；多糖類；タンパク質；糖タンパク質；ペプチド；細胞ワクチン；ＤＮＡワクチン；組換えタンパク質；糖タンパク質；ペプチドなどの体液性および／または細胞媒介性の免疫応答のどちらかを生じさせるいずれかの物質と併用して使用するための、ワクチンアジュバントとして有用であってもよい。本発明の免疫賦活性組み合わせはまた、免疫機能損傷を有する個人において、特に役立ってもよい。例えばそれは、例えば移植患者、がん患者、およびＨＩＶ患者などにおける、細胞媒介性免疫抑制後に発生する、日和見感染症および腫瘍を治療するために使用してもよい。
【００３１】
上の目的で、本発明の阻害剤は、任意選択的にその他の薬剤との併用で、通常は経口または非経口投与によって、通常は全身または局所投与されてもよい。投与される用量は、例えば、年齢、体重、症状、所望の治療効果、投与経路、および治療持続期間に応じて決定される。ヒト成人では、１人あたりの用量は、一般に、数日間に１回、３日に１回、２日に１回、毎日１回、または最大で毎日数回、経口投与で１ｎｇ〜１０００ｍｇ；数日間に１回、３日に１回、２日に１回、毎日１回、または最大で毎日数回、非経口投与（好ましくは静脈内投与）で１ｎｇ〜１００ｍｇ；または毎日１〜２４時間の連続静脈内投与である。上述したように、様々な病状または臨床状態のために、用量が変更されてもよい。したがって、上で規定される範囲よりも低いまたはそれを上回る用量を使用してもよい場合がある。本発明の阻害剤は、任意選択的にその他の薬剤との併用で、経口投与のための固体形態、経口投与のための液体形態、または例えば注射剤、外用薬、坐薬、点眼剤、吸入剤などの非経口投与のための形態などの、様々な形態で投与されてもよい。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、１）候補化合物または被検物質を提供するステップと、２）免疫応答を抑制するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を提供するステップと；３）任意選択的にＤＣなどの抗原提示細胞の存在下で、免疫応答を抑制するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と共に、候補化合物の存在または不在下で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養するステップと、４）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度（例えば［３Ｈ］−チミジンの取り込み）を測定して、候補化合物存在下の増殖速度を候補化合物不在下の速度と比較するステップとを含んでなり、候補化合物存在下の増殖速度の増大が、化合物がＴｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤であることを示唆する、Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−β非依存性の可溶性因子媒介機序を通じて、宿主の免疫応答を抑制する。
【００３３】
薬剤に曝露されていない培養物（例えば、培地単独または別の対照）との比較で、［３Ｈ］チミジン取り込みの少なくとも約２０％の増大などの顕著な抑制効果を示す薬剤または試験化合物は、Ｔｒｅｇ細胞活性の抑制因子として適する。上述の方法を使用して、コンビナトリアルケミストリーに基づくもの、または天然起源化合物およびそれらの誘導体の収集物などの化合物ライブラリーをスクリーニングし得る。一実施例は、数千から数百万個の系統的に分類された化合物収集物の活性に関する情報を与えるようにデザインされた、混合物ベースの位置スキャニングライブラリーである。位置スキャニング技術は、新規酵素阻害剤、受容体作動薬および拮抗薬、抗菌、抗真菌、および抗ウイルス化合物を同定するために、成功裏に使用されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３７４３−３７７８，１９９９；Ｐｉｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１１８−１２２，２００３）。さらに、この技術は、いくつかの研究グループによって独立して検証されている。およそ５０の研究所によって実施された、１００を超える別個の研究からの文献は（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３７４３−３７７８，１９９９）、位置スキャニングライブラリーなどの系統的に分類された化合物の収集物をスクリーニングすることの、広範な効用を反映する。
【００３４】
以下の実施例は例示のみを目的として提供され、様々な修正や変更が、それに照らして当業者に提言され、これらは本出願の精神と範囲、および添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【実施例】
【００３５】
材料と方法
Ｔ細胞系およびクローン。ＣＤ４＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ１０８）は、黒色腫患者から外科的に除去された腫瘍サンプルから培養された。全てのＴＩＬおよびＴ細胞クローンは、１０％ヒトＡＢ血清および組換えＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養された。Ｔ細胞クローンは、以前記載されたような限界希釈法（０．３細胞／ウェル）によって、ＴＩＬ１０８から作成された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。最適増幅を得るために、本発明者らは、以前記載されたようなＯＫＴ３増殖法を使用した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＴＩＬ１３６３−ＴｈおよびＴＩＬ１５５８−Ｔｈは、それぞれＴＩＬ１３６３およびＴＩＬ１５５８から確立されたＣＤ４＋細胞クローンであり、以前記載されたクローンと同一であり、またはそれに類似していた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。それらの名称は、それらをその他のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞から際立たせる特性、すなわち、抗ＣＤ３抗体に応答した、それらのＴｈ１サイトカイン分泌と、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を亢進させるそれらの能力を反映することが意図される。Ｔ細胞からのサイトカイン放出は、以前記載されたようにして判定された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００３６】
ＦＡＣＳ分析。ＧＩＴＲの発現は、抗ＧＩＴＲ抗体（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、それに続くＦＩＴＣに共役結合する二次的ヤギ抗マウスｍＡｂによる、Ｔ細胞の染色後に判定された。Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ分析前に、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有する培地中に、少なくとも２週間維持された。ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＧＩＴＲの発現を判定するために、本発明者らは、ＰＥまたはＦＩＴＣのどちらかに共役結合するそれぞれの抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、Ｔ細胞を染色した。洗浄後、細胞はＦＡＣＳスキャンによって分析された。
【００３７】
増殖アッセイ。抗ＣＤ３ｍＡｂ被覆（２μｇ／ｍｌ）９６ウェルプレート内で、未感作ＣＤ４Ｔ細胞（１×１０５）が、制御性Ｔ細胞と共に、異なる比率（１：０．２、１：０．１、および１：０．０５）で培養された。代案としては、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞またはその他のエフェクター細胞（ＴＩＬ１３６３−ＴｈおよびＴＩＬ１５５８−Ｔｈ）のどちらかからの上清が、新鮮アッセイ培地に添加されて、増殖アッセイのための総容積が２００μｌにされた。５６時間の培養後、最後の１６時間の培養中に、増殖未感作またはエフェクターＴ細胞が、１μＣｉ／ウェルの最終濃度の［３Ｈ］チミジンによって標識された。［３Ｈ］チミジン取り込みは、液体シンチレーションカウンターで測定された。場合によっては、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞は、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０、ＯＫＴ３抗体または異なるＴＬＲリガンドで１２時間処理され、次にＰＢＳまたはＴ細胞アッセイ培地で洗浄された。新鮮培地中で２４〜３６時間の培養後、それらの抑制活性を測定するために、これらのＴ細胞からの上清が収集された。以下のリガンドは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された：ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ａ（３μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ−Ｂ（３μｇ／ｍｌ）、イミキモド（１０μｇ／ｍｌ）、ロキソリビン（５００μＭ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（２５μｇ／ｍｌ）、ｓｓＲＮＡ４０／ＬｙｏＶｅｃ（３μｇ／ｍｌ）、ｓｓＲＮＡ３３／ＬｙｏＶｅｃ（３μｇ／ｍｌ）、ｐａｍ３ＣＳＫ４（２００ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリン（１０μｇ／ｍｌ）、またはＰｏｌｙ−Ｇ３（３μｇ／ｍｌ）。以前記載されたようにして、トランスウェル実験が実施された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００３８】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって、１×１０７個のＴ細胞から全ＲＮＡが抽出された。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が、逆転写のために使用された。逆転写混合物（２０μｌ）は２μｇの全ＲＮＡを含有し、４２°Ｃで１時間培養された。ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が使用され、リアルタイムＰＣＲによって、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡレベルが定量化された。プライマー、およびＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入されたＦｏｘｐ３またはＨＰＲＴに特異的な内部蛍光性ＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＰＣＲ反応が実施された。以前記載されたようにして、各サンプル中のＴＬＲ７、８、および９、ＭｙＤ８８、およびＩＲＡＫ４の発現レベルがリアルタイムＰＣＲによって判定され、ＨＰＲＴの相対量について正規化された（Ｐｅｎｇｅｔａｌ．，２００５）。
【００３９】
レンチウイルスベースのｓｉＲＮＡの構築およびウイルス形質導入。コンピュータ支援プログラムが使用されて、各遺伝子について数個のｓｉＲＮＡ配列（１９ヌクレオチド）が選択された。ｓｉＲＮＡ配列、８ヌクレオチドスペーサー、およびｐｏｌｙＴターミネーター配列を含有するオリゴヌクレオチドがアニールされ、次にＧＦＰ発現ｐＬｅｎｔｉｌｏｘ３．７ベクターのＨａｐＩおよびＸｈｏＩ部位にクローンされた（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＲＡＫ４、ＭｙＤ８８、およびＴＬＲ７、８、および９、およびウイルス形質導入のためのｓｉＲＮＡについては、以前記載されている（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。形質導入の３または４日後に形質導入効率が分析され、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ選別装置によって、細胞がＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞に選別された。次に機能的増殖アッセイにおいて、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０によるそれらの可逆性を判定するために、選別されたＴｒｅｇ細胞が使用された。
【００４０】
結果と考察
抑制活性があるＣＤ４＋ＴＩＬ系の同定
腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞系を作成するために、本発明者らは、最初に、がん患者から外科的に除去された新鮮腫瘍サンプルから、腫瘍浸潤性リンパ球を確立した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇後、腫瘍細胞系のパネルとの対比で、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞系が試験された。ＴＩＬ１０８は、腫瘍反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞系であり、さらなる分析のために選択された。ＦＡＣＳ分析は、ＴＩＬ１０８が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞母集団中に、１７％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有した一方で、正常なＰＢＭＣ誘導ＣＤ４＋Ｔ細胞母集団は、約６％のＣＤ２５＋Ｔ細胞を保有したことを明らかにした（図１（Ａ））。これらの細胞の機能特性を判定するために、本発明者らは、ＴＩＬ１０８細胞が、抗ＣＤ３抗体刺激に対する、精製未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を抑制できた一方で（図１（Ａ））、対照未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞は、増殖応答を阻害できなかったことを示し、ＣＤ４＋ＴＩＬ１０８細胞系が、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞クローンの豊富な供給源であることが示唆された。
【００４１】
次に本発明者らは、限界希釈法によって、ＴＩＬ１０８系からＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを作成した。３５個の腫瘍反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの内、１２個が成功裏に増殖され、さらなる分析のために、多数のＴ細胞が得られた。図１（Ｂ）に示されるように、全ての１２個のＴＩＬ１０８クローンはＭＨＣクラスＩＩ適合性１０８ｍｅｌ細胞を明確に認識し、その内３個は同種異系１５５８ｍｅｌ細胞を認識した一方で、それらのいずれもＭＨＣクラスＩＩ適合性ＥＢＶおよび２９３誘導細胞系には反応しなかった。
【００４２】
ＩＬ−１０分泌ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞クローンの表現型分析
各Ｔ細胞クローンのサイトカインプロファイルを判定するために、本発明者らは、全ての１２個のＴ細胞クローンが、大量のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０を分泌したが、その他のサイトカインの分泌はわずかまたは皆無であったことを見出した（図２（Ａ））。ＦＡＣＳ分析によって、本発明者らは、全てのＩＬ−１０産生Ｔ細胞クローンが、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＧＩＴＲマーカーを発現したことを示した。４つのクローンの典型的なデータは、図２（Ｂ）に示される。リアルタイムＰＣＲ分析は、これらのＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン中のフォークヘッド転写因子（Ｆｏｘｐ３）の発現が、ＣＤ４＋ＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞中の発現よりも高かったことを明らかにした（図２（Ｃ））。総合すると、これらのデータは、ＴＩＬ１０８Ｔ細胞クローンが、典型的にＣＤ４＋制御性Ｔ細胞に伴う、マーカーおよびサイトカインを発現することを示唆する。
【００４３】
Ｔｒｅｇ細胞によって分泌される可溶性因子はＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫抑制を媒介する
ＴＩＬ１３６３−Ｔｈエフェクター細胞が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害せずむしろ増強したのとは対照的に、全てのＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンは、上の表現型特性に一致して、応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘発性増殖を用量依存様式で強力に抑制した（図３（Ａ））。これらのＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞が、未感作Ｔ細胞増殖をどのように阻害するかを判定するために、本発明者らはトランスウェル実験を実施した。図３（Ｂ）に示されるように、内側ウェル内のＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンは、内側ウェル内のＴ細胞抑制による影響を受けない外側ウェル内の未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を依然として抑制できた。したがって、細胞と細胞の接触は、Ｔｒｅｇ細胞クローンの抑制機能に必須でない。
【００４４】
次に本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞クローンによって豊富に産生されるＩＬ−１０が、免疫抑制に関与するかどうかを調べた。アッセイ培地中への抗１０、抗１０Ｒ、またはその双方（各１０μｇ）の包含は、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖活性を回復できなかった（図３（Ｃ））。より多量（３０μｇ）の抗体の添加、または抗体被覆プレートの使用でも、同様の結果が得られた（データ示さず）。第３の抗体である抗ＴＧＦ−βもまた、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖活性に対するいかなる効果も欠いていた（データ示さず）。これらの結果は、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンによって媒介される未感作Ｔ細胞増殖の抑制における、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの関与を除外する。
【００４５】
細胞培養物上清が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制できるかどうかを直接試験するために、本発明者らは、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンからのわずか１０μｌの細胞培養物上清の機能アッセイ培地への添加が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に９０％を超える阻害をもたらした一方で、ＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞またはいずれかの未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞からの同一量の培養物上清の添加が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害せずむしろ増強したことを見出した（図３（Ｄ））。用量設定実験は、上清の量の増大と共に、抑制活性が増大したことを示した（図３（Ｅ））。これらの結果は、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞によって分泌される可溶性因子が、それらの抑制機能に、直接関与することを実証する。したがって、ＴＩＬ１０８系／クローンは、天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞によって、またはＴｒ１／Ｔｈ３細胞によって用いられるものとは異なる機序を通じて免疫抑制を媒介する、Ｔｒｅｇ細胞の新規サブセットに相当してもよい（Ｌｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，２００４；Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２）。Ｔｒｅｇ細胞の追加的なサブセットは、がん患者からの追加的な臨床サンプルが評価される際に、同定される可能性が高い。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに加えて、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫＴ、およびγδ  ＴＣＲ  Ｔ細胞をはじめとするＴｒｅｇ細胞のサブセットもまた、異なる疾患状況（自己免疫疾患およびがん）において宿主免疫応答を調節する上で、重要な役割を果たしてもよく（Ｃｏｒｔｅｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈａｙｄａｙ  ａｎｄ  Ｔｉｇｅｌａａｒ，２００３；Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，２００４）、特有の抑制機構または表現型があるＴｒｅｇ細胞サブセットのスペクトルの存在が示唆される。
【００４６】
ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞によるエフェクターＴ細胞機能の阻害
次に、Ｔｒｅｇ細胞上清に、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞増殖を抑制する能力があるかどうかを試験した。図４（Ａ）に示されるように、上清もまた、ＣＤ８＋ＴＩＬ１３５９Ｔ細胞の増殖を強力に阻害した。ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞クローンによって分泌される可溶性因子が、ＴＩＬ１３６３−Ｔｈエフェクター細胞のＩＬ−２分泌能力を阻害できるかどうかを判定するために、本発明者らは、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体による刺激ありまたはなしで、ＴＩＬ１０８  Ｔ細胞クローンからの５０μｌの細胞上清を添加した１５０μｌの新鮮培養液中で、１３６３ｍｅｌ（刺激因子）細胞と共にＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞を培養した。ＯＫＴ３刺激ＴＩＬ１５５８−Ｔｈエフェクター細胞培養物からの上清、またはＯＫＴ３刺激なしで培養されたＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの上清には、いかなる活性も欠如していたのは対照的に、ＯＫＴ３刺激ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞培養物からの上清は、ＴＩＬ１３６３−Ｃ１細胞によるＩＬ−２分泌を阻害した（図４（Ｂ））。ＴＩＬ１３６３−Ｔｈおよび１３６３ｍｅｌ細胞と、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞との共培養が、ＩＬ−２のより良い阻害をもたらすかどうかをさらに試験するために、本発明者らは、ＯＫＴ３刺激ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞が、ＯＫＴ３刺激のないＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞とは対照的に、ＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞によるＩＬ−２分泌のより強力な阻害を示すことを見出した（図４（Ｃ））。ＯＫＴ３抗体刺激ＴＩＬ１５５８−Ｔｈ細胞は、ＴＩＬ１３６３−Ｔｈ細胞によるＩＬ−２産生を阻害しなかった。これらのデータは、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞によるＩＬ−２産生の阻害に、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の活性化が必須であることを示唆する。
【００４７】
ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の逆転
次に本発明者らは、Ｐｏｌｙ−Ｇオリゴヌクレオチドが、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転させ得るかどうかを試験した。Ｐｏｌｙ−Ｇ１０によるＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の前処理が、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の逆転をもたらし、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を回復させた一方で、未処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞は、抑制性であり続けた（図５（Ａ））。より重要なことには、未処理親ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの上清が、それらの抑制特性を維持したのとは対照的に、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞から収集された上清は、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増強し（図５（Ｂ））、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞によって分泌される可溶性因子の抑制活性が、Ｐｏｌｙ−Ｇ媒介シグナル伝達経路によって、直接調節されることが示唆された。
【００４８】
次に本発明者らは、ＴＬＲ８シグナル伝達経路が、Ｐｏｌｙ−ＧオリゴヌクレオチドによるＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の機能逆転に、必要かどうかの判定を試みた。このようにして、本発明者らは、ＧＦＰ発現レンチウイルスベースのｓｉＲＮＡコンストラクトを使用して、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞中で、ＴＬＲ８、ＭｙＤ８８、およびＩＲＡＫ４などの、ＴＬＲ８シグナル伝達経路のいくつかの重要な分子をノックダウンして、それらの対応する遺伝子の発現が阻害されることを実証した（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。標的遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡウイルス粒子を感染させたＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇが、ＧＦＰ＋（形質導入）およびＧＦＰ−（非形質導入）細胞に選別され、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０オリゴヌクレオチドに応答するそれらの能力について試験された。図５（Ｃ）に示されるように、ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ８、ＭｙＤ８８、およびＩＲＡＫ４の特異的ノックダウンは、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０オリゴヌクレオチドが、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を逆転させる能力を消滅させた。対照的に、ＴＬＲ７および９に対して特異的なｓｉＲＮＡウイルスをＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞に形質導入した場合は、抑制活性またはその可逆性のいずれも影響を受けなかった。選別されたＧＦＰ−ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞は、非形質導入親細胞と同じ可逆的抑制機能を保有した（図５（Ｃ））。この結果に一致して、ヒトＴＬＲ８に対する２つの天然リガンド（ｓｓＲＮＡ４０およびｓｓＲＮＡ３３）もまた、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転させた一方で、その他のＴＬＲに対するリガンドは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を回復できなかった（図５（Ｄ））。Ｐｏｌｙ−Ｇ２およびｓｓＲＮＡ４０処理ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞からの上清について同様の結果が得られたが、ｓｓＲＮＡ３３リガンドは有効性が劣った（図５（Ｄ））。
【００４９】
天然起源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞ならびにＬＡＧＥ１特異的ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と同様に、ＴＩＬ１０８  Ｔｒｅｇ細胞によって分泌される可溶性因子の抑制活性もまた、ＴＬＲ８シグナル伝達によって直接制御されるので、本発明者らは、ＴＬＲ８−ＭｙＤ８８シグナル伝達経路が、抑制の特定の機構にかかわりなく、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能に関与する分子の機能を特異的に制御すると推測する。どうしてその他のＴＬＲシグナル伝達経路でなく、ＴＬＲ８がＴｒｅｇ細胞の抑制活性を抑制するのかは明らかでないが、Ｔｒｅｇ細胞中のＴＬＲ発現パターンが、ＴＬＲ８シグナル伝達経路のこのユニークな特性をある程度説明してもよい。代案としては、Ｔｒｅｇ細胞中のＴＬＲ８−ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４複合体が、Ｔｒｅｇ細胞機能の抑制に必要なＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４下流のユニークなシグナル伝達経路を動員するのかもしれない。
【００５０】
別個のＴＬＲリガンドを通じたマウスＴｒｅｇ細胞機能の調節
ＴＬＲ８は、マウス中で機能性ではないので（Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、マウス中のＴｒｅｇ細胞抑制の逆転は、ヒトとは異なることが予想される。Ｐｏｌｙ−Ｇオリゴヌクレオチドが、マウスＴＬＲ８によるＴｒｅｇ細胞の機能逆転を起こさせ得るかどうかを試験するために、本発明者らは、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を単離して精製し、ＴＬＲリガンドに応答するそれらの能力を評価した。マウスＴｒｅｇ細胞が、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制できた一方で、Ｔｒｅｇ細胞またはＡＰＣ単独では、抗ＣＤ３抗体に応答して増殖しなかった（図６（Ａ））。しかしＰｏｌｙ−Ｇオリゴヌクレオチドは、マウスＴｒｅｇ細胞の抑制活性の逆転に影響を及ぼさなかった（図６（Ｂ））。
【００５１】
興味深いことに、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９に対するＴＬＲリガンドは、マウスＴｒｅｇ細胞による未感作Ｔ細胞増殖の抑制を逆転させ得なかった（図６（Ｂ））。ＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳは、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能の逆転に対する軽微な効果を有した一方で、ＴＬＲ３およびＴＬＲ５に対するリガンドは、それらの抑制機能に対するいかなる効果も欠いていた。これらのデータは、マウスＴｒｅｇ細胞の存在下で未感作Ｔ細胞の増殖を抑制する、特定のＴＬＲ経路を同定し、ＣＤ４＋ＴｒｅｇとＴヘルパー細胞間の平衡を変化させることで、抗腫瘍免疫を増強することの理論的根拠を提供する。
【００５２】
ヒトＴＬＲ８遺伝子組換えモデルの開発
マウスＴＬＲ８は機能性でないので、本発明者らは、最近、遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスを作成した。ヒトＴＬＲ８は、脾臓、胸線、リンパ節、およびＣＤ４＋Ｔ細胞内で発現されたが、Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその他の分析された組織（図７（Ａ））中では発現されなかった。したがって、ＣＤ４−ｈＴＬＲ８ＴｇマウスにおけるマウスＣＤ４＋Ｔ細胞中のｈＴＬＲ８の忠実な発現および機能は、生体内でＴｒｅｇ細胞機能を操作する、本発明者らの能力を大幅に促進するであろう。ｈＴＬＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞のＰｏｌｙ−Ｇ３による処理は、それらの抑制機能を逆転させたが、Ｐｏｌｙ−Ｔ１０（対照）による処理は逆転させなかった（図７（Ｂ））。これらの研究は、Ｐｏｌｙ−Ｇ３によって、ＴＬＲ８−発現マウスＴｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転させ得ることを示唆する。
【００５３】
Ｔｒｅｇ細胞機能の遮断による抗腫瘍免疫の増強
Ｐｏｌｙ−Ｇ３処理が、Ｔｒｅｇ細胞機能を遮断することにより、生体内で抗腫瘍免疫を増強するかどうかを試験するために、本発明者らは、−２および−１日目における、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（対照）およびＣＤ４−ｈＴＬＲ８Ｔｇマウスへの、Ｐｏｌｙ−Ｇ３、Ｐｏｌｙ−Ｔ１０、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドの静脈内注射によって作成された保護腫瘍モデルを開発した。処置したマウスを０日目のＢ１６腫瘍細胞（１×１０５細胞／マウス）の皮下注射によって攻撃投与して、腫瘍成長を２日毎にモニターした。本発明者らは、Ｐｏｌｙ−Ｇ３処理が、ＣＤ４−ｈＴＬＲ８  Ｔｇマウス中で、Ｂ１６細胞に対する抗腫瘍免疫を増強するが、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中では、増強しなかったことを見出した（図８）。Ｐｏｌｙ−Ｔ１０およびＣｐＧ処理は、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＤ４−ｈＴＬＲ８Ｔｇマウスのどちらにおいても、腫瘍成長を阻害できず、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴＬＲ８発現が、Ｐｏｌｙ−Ｇ３−誘発抗腫瘍免疫に必須であることが示唆された。重要なことに、本発明者らは、Ｐｏｌｙ−Ｇ３処理が、ＣＤ４−ｈＴＬＲ８Ｔｇマウスにおいて、前立腺ＲＭ１腫瘍細胞の増殖を阻害したことを実証した（図８）。同様の結果は、リンパ腫、ＭＣＡ２８肉腫、およびＲＭ１前立腺がん腫瘍細胞をはじめとする、いくつかのその他の各種がんでも得られた。
【００５４】
ヒトＴｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転させる能力がある新規化合物の同定
ＴＬＲ８シグナル伝達経路に関する本発明者らの知識は、現在のところ限定的であるので、代案のアプローチは、小分子化合物をスクリーニングすることであろう。このアプローチの実現可能性を実証するために、本発明者らは、Ｔｉｍｔｅｃ，Ｉｎｃ．から数百種類の小分子化合物を入手して、図９に記載されるものと類似した実験で、それらをスクリーニングした。
【００５５】
具体的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が添加された可溶性抗ＣＤ３抗体を使用して、機能スクリーニングアッセイを実施した。ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｖｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。７日間にわたり、ＩＬ−４（５００ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＰＢＭＣ誘導単球からＤＣが生成された。様々な小分子化合物（１μＭ）の不在または存在下で、２×１０４のＤＣおよび抗ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する２００μｌの培地中において、１：０．２、１：０．１、および１：０．０５の異なる比率で、１×１０５個の未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞と共に培養した。５６時間の培養後、１μＣｉ／ウェルの最終濃度で［３Ｈ］チミジンを添加し、さらに１６時間の培養がそれに続いた。液体シンチレーションカウンターによって、［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。全ての実験は、三重反復試験で実施された。さらに、ＡＰＣなしで被覆された抗ＣＤ３抗体を使用して、スクリーニングアッセイを実施した。様々な小分子化合物（１μＭ）の不在または存在下で、抗ＣＤ３ｍＡｂ被覆（２μｇ／ｍｌ）９６ウェルプレート内において、１：０．２、１：０．１、および１：０．０５の異なる比率で、１×１０５個の未感作ＣＤ４Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞と共に培養した。５６時間の培養後、１μＣｉ／ウェルの最終濃度で［３Ｈ］チミジンを添加し、さらに１６時間の培養がそれに続いた。液体シンチレーションカウンターによって、［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
【００５６】
本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を強力に逆転させる、１１個の化合物を同定した（図１０および表１から表３）。これらの結果は、小分子化合物がヒトＴｒｅｇ細胞の抑制機能を逆転できることを示唆する。
【００５７】
Ｔｒｅｇ細胞抑制機能の薬剤誘発性遮断の永続性は処理時間に依存する
Ｔｒｅｇ細胞抑制機能の薬剤誘発性逆転の永続性を判定するために、本発明者らは、それぞれ１、３、および５日間にわたり、（低濃度の）薬剤の存在下で、Ｔｒｅｇ細胞（各５×１０６）を培養した。薬剤なしで培養されたＴｒｅｇ細胞が、対照の役割を果たした。１、３および８日目にＴｒｅｇ細胞を収集して、ＰＢＳで３回洗浄して、内在する薬剤を除去した。これらの細胞（０．５〜１×１０６）の一部が、機能アッセイで使用された一方で、残りのＴ細胞は、ＩＬ−２を含有するＴ細胞培地中で培養され、３週間にわたり４日毎の機能アッセイで使用された。図１１に示されるように、薬剤化合物＃１、＃４、および＃７によるＴｒｅｇ細胞の１日間の処理、次に洗浄後、試験のための使用時までの薬剤非含有培地中での培養。前処理Ｔｒｅｇ細胞は抑制機能を喪失し、５〜６日間にわたり非抑制状態のままであった。Ｔｒｅｇ細胞の３日間の薬剤処理では、これらは３〜４週間にわたり非抑制性のままであり、次に再度抑制性になった。同様に、８日間前処理されたＴｒｅｇ細胞は抑制機能を喪失し、次に異なる種類の化合物次第で抑制性になった（図１１）。したがって、未感作Ｔ細胞増殖の少なくとも５０％の回復（すなわちＴｒｅｇ細胞の抑制活性の５０％の遮断）に必要な最小薬物濃度と、エフェクターＴ細胞免疫の誘発を可能にするのに十分な時間にわたり非抑制状態を維持する能力とによる判定で、最も有望な化合物は、さらなる実験のために有用である。Ｔｒｅｇ細胞抑制機能逆転の永続性は、処理時間に左右されるので、本発明者らは、時間窓を調節して、最小の自己免疫応答リスクで、最大の抗腫瘍免疫を誘発できた。本発明者らはまた、Ｔｒｅｇ細胞の抑制機能を増強し得る小分子化合物を同定することを期待する。全体的に、本発明者らの研究は、異なる化合物／薬剤によってＴｒｅｇ細胞の抑制機能を調節し得ることを示唆し、これは多くの種類の疾患の治療にとって重要であってもよい。
【００５８】
【表１】
2018162262.tif 000002
【表２】
2018162262.tif 000003
【表３】
2018162262.tif 000004
【００５９】
本特許で言及される全ての文献、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に援用する。いずれかの実施形態からの１つまたは複数の特性は、本開示の範囲を逸脱することなく、いずれかのその他の実施形態の１つまたは複数の特性と組み合わされてもよい。上の説明は、例証的であって制限的でない。本開示を検討することにより、本発明の多数のバリエーションが、当業者に明らかになるであろう。したがって本発明の範囲は、上の説明を参照して判定されるべきでなく、特許請求の範囲、そしてそれらの完全な範囲または同等物を参照して判定されるべきである。本発明の実施形態の例を項目として以下に示す。
［項目１］
化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択される化合物の薬理有効量と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であり、上記化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５は下記化学式によりそれぞれ与えられる、
2018162262.tif 000005
医薬組成物。
［項目２］
抗原をさらに含んでなる、項目１に記載の医薬組成物。
［項目３］
アジュバントをさらに含んでなる、項目１又は２に記載の医薬組成物。
［項目４］
上記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、項目２に記載の医薬組成物。
［項目５］
ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４シグナル伝達経路を活性化するヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）８に対するリガンドを含んでなる医薬組成物の薬理有効量を、それを必要とする哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類において制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性の免疫抑制を阻害する、または免疫応答を増大させる方法。
［項目６］
上記リガンドが、ｓｓＲＮＡ４０、ｓｓＲＮＡ３３、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ−Ｇ１０、レシキモド、ロキソリビン、フラジェリン、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
［項目７］
上記リガンドが、下記化学式によりそれぞれ与えられる化合物１、２、３、４、５、６、７、１３、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択される、
2018162262.tif 000006
項目５又は６に記載の方法。
［項目８］
上記哺乳類がヒトである、項目５から７のいずれか一項に記載の方法。
［項目９］
上記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、がん特異的抗原を含んでなるがんワクチンの免疫原性量が、上記哺乳類にさらに投与される、項目５から８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１０］
アジュバントが、上記哺乳類にさらに投与される、項目９に記載の方法。
［項目１１］
上記アジュバントが、上記抗原と共に投与され、または上記抗原と共役している、項目１０に記載の方法。
［項目１２］
化学療法剤の有効量を投与するステップをさらに含んでなる、項目１１に記載の方法。
［項目１３］
上記哺乳類が、感染症を患っている、または発症するリスクがある、項目５から１２のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４］
１）候補化合物を提供するステップと、
２）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を提供するステップと、
３）上記候補化合物の存在または不在下で、未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞を上記ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞と共に培養するステップと、
４）上記候補化合物の存在または不在下で、上記未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度を測定するステップと、
５）上記候補化合物の存在下の増殖速度と、上記候補化合物の不在下の増殖速度とを比較するステップと
を含んでなり、上記増殖速度が、その存在下でその不在下よりも高い候補化合物が、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害を逆転させると判定されて、阻害剤として選択される、Ｔｒｅｇ細胞が宿主の免疫応答を抑制する活性の阻害剤をスクリーニングする方法。
［項目１５］
上記ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、およびＦｏｘＰ３を発現して、ＩＬ−１０を分泌し、宿主の免疫応答を阻害できる、項目１４に記載の方法。
［項目１６］
上記ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、抗原に特異的である、項目１４または１５に記載の方法。
［項目１７］
上記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下でさらに培養される、項目１６に記載の方法。
［項目１８］
上記ＡＰＣが、抗原を提示する、項目１７に記載の方法。
［項目１９］
上記ＡＰＣが、樹状細胞である、項目１８に記載の方法。
［項目２０］
上記増殖速度が、上記ＣＤ４＋Ｔ細胞への［３Ｈ］−チミジン取り込み速度によって判定される、項目１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
【００６０】
参考文献
Audia et al.. 2007. Clin. Exp. Immunol. 150:523-530. 
Berendt et al.. 1980. J. Exp. Med. 151:69-80.
Buonerba et al.. 2011. Expert Rev Anticancer Ther 11:25-28.
Cortesini et al.. 2001. Immunol. Rev. 182:201-206.
Curiel et al.. 2004. Nat. Med. 10:942-949.
Di Lorenzo et al.. 2011. Nat Rev Clin Oncol 8:551-561.
Ghiringhelli et al.. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:641-648.
Hayday et al.. 2003. Nat Rev Immunol 3:233-242.
Hodi et al.. 2010. N. Engl. J. Med. 363:711-723.
Jiang et al.. 2004. Adv. Immunol. 83:253-288.
Jurk et al.. 2002. Nat Immunol 3:499.
Kantoff et al.. 2010. The New England journal of medicine 363:411-422.
Kiniwa et al.. 2007. Clinical Cancer Res. 13:6947-6958.
Lesterhuis et al.. 2011. Nat Rev Drug Discov 10:591-600.
Levings et al..2002. Int. Arch. Allergy Immunol. 129:263-276.
Mahnke et al.. 2007. Int. J. Cancer 120:2723-2733.
Morse et al.. 2008. Blood 112:610-618.
Mukherji et al.. 1989. J. Exp. Med. 169:1961-1976.
Peng et al.. 2005. Science 309:1380-1384.
Peng et al.. 2007. Immunity 27:334-348.
Powell et al.. 2008. J. Immunother. 31:189-198.
Rech et al.. 2009. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1174:99-106.
Rosenberg, 2011. Nat Rev Clin Oncol 
Rubinson et al.. 2003. Nat. Genet. 33:401-406.
Sakaguchi, S. 2004. Annu. Rev. Immunol. 22:531-562.
Schwartzentruber et al.. 2011. The New England journal of medicine 364:2119-2127.
Shevach, E.M. 2002. Nat Rev Immunol 2:389-400.
von Boehmer, H. 2005. Nat Immunol 6:338-344.
Wang et al.. 2004. Immunity 20:107-118.
Wang et al.., 2005. J. Immunol. 174:2661-2670.
Wang et al.., 2007. Curr. Opin. Immunol. 19:217-223.
Wang et al.., 2002. J. Exp. Med. 195:1397-1406.
Woo et al.., 2001. Cancer Res. 61:4766-4772.
Wrzesinski et al.., Curr. Opin. Immunol. 17:195-201.
Zou, W. 2006. Nat Rev Immunol 6:295-307.
【図１】
2018162262.tif 000008
【図２】
2018162262.tif 000009
【図３】
2018162262.tif 000010
【図４】
2018162262.tif 000011
【図５】
2018162262.tif 000012
【図６】
2018162262.tif 000013
【図７】
2018162262.tif 000014
【図８】
2018162262.tif 000015
【図９】
2018162262.tif 000016
【図１０】
2018162262.tif 000017
【図１１】
2018162262.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月19日(2018.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式により与えられる化合物７、２、３、４、５、６、１３、２２、２３、２４、２５からなるグループから選択される化合物の薬理有効量と、
薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
【表１】
2018162262.tif 000019
哺乳類の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性の免疫抑制を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
抗原をさらに含んでなる、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アジュバントをさらに含んでなる、
請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗原が、ペプチド抗原、タンパク質抗原、ポリヌクレオチド抗原、または多糖類抗原である、
請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記哺乳類がヒトである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳類にがんがあり、またはがんを発症するリスクがあり、
前記医薬組成物は、がん特異的抗原を含んでなる免疫原性量のがんワクチンをさらに含む、
請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
上皮内新生物、子宮頸部異形成、日光角化症、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、カポジ肉腫、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及び、Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される新生物疾患の治療のために用いられる、
請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
１μＭの量で前記化合物が用いられる
請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。