(57)【要約】【課題】異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供する。【解決手段】反応液が移動する流路を含み、前記流路は、第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、前記第１領域には、逆転写酵素およびプライマーが配置され、前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、逆転写酵素およびプライマーが配置され、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１領域に、ｄＮＴＰが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記第１領域に、バッファーが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記第２領域に、プローブが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記第２領域に、プライマーおよびｄＮＴＰが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記逆転写酵素、前記プライマー、および前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記逆転写酵素、前記プライマー、および前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通する、核酸増幅反応容器。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う、核酸増幅反応容器。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項において、
前記流路は、
前記第１領域と、前記第１領域および前記第２領域と離間した第３領域と、を有する第１流路と、
前記第１流路の前記第１領域および前記第３領域以外の部分であって、前記第１領域と前記第３領域との間の前記部分から延出し、前記第２領域を有する第２流路と、
を有する、核酸増幅反応容器。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記反応液を、前記第２領域と前記第３領域との間で往復させて核酸増幅反応を行う、核酸増幅反応容器。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度、および前記第１温度よりも高い第３温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第３温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記第３領域を、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１４】
請求項１２または１３において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１５】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度に加熱された前記第１領域に配置して逆転写反応を行う工程と、
前記逆転写反応を行う工程の後に、前記反応液を、第２温度に加熱された前記第２領域と、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱された前記第１領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程と、
を含む、核酸増幅反応方法。
【請求項１６】
請求項１０または１１に記載の核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度に加熱された前記第１領域に配置して逆転写反応を行う工程と、
前記逆転写反応を行う工程の後に、前記反応液を、第２温度に加熱された前記第２領域と、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱された前記第３領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程と、
を含む、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
核酸には、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）およびＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の大きく２種類が存在する。標的核酸を含む鋳型核酸がＲＮＡの場合、ＰＣＲ（核酸増幅反応）の前に、逆転写反応（ＲＴ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することが知られている。
【０００５】
例えば非特許文献１には、ＲＴおよびＰＣＲを別々のチューブで行うＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴおよびＰＣＲをそれぞれ最適な条件下で行うことができるため、効率よく正確な増幅が確実になると記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｃｈａｐｅｒ  ５  一般的なＲＴ−ＰＣＲ法”、１２８頁、［online］、［平成２８年９月２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://roche-biochem.jp/pdf/prima/molecular_biology/pcr/PCR_manual_J/third_edition/PCR_manual_chapter5_J.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のようなＲＴ−ＰＣＲは、例えば、逆転写反応を行った反応液を、ピペット操作により容器から取り出し、別の容器に移し替えて別の容器で核酸増幅反応を行う必要があり、反応液を別の容器に移し変える際に、反応液に異物が混入することが懸念される。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を含む核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸増幅反応容器は、
反応液が移動する流路を含み、
前記流路は、
第１領域と、前記第１領域と離間した第２領域と、を有し、
前記第１領域には、逆転写酵素およびプライマーが配置され、
前記第２領域には、ポリメラーゼが配置されている。
【００１０】
このような核酸増幅反応容器では、逆転写反応を行った後、反応液を別の容器に移し替えて、別の容器で核酸増幅反応を行う必要がない。したがって、このような核酸増幅反応容器では、反応液に異物が混入することを抑制することができる。
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に、ｄＮＴＰが配置されていてもよい。
【００１２】
このような核酸増幅反応容器では、逆転写反応において、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域に、バッファーが配置されていてもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応容器では、反応液のｐＨを調整することができる。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域に、プローブが配置されていてもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応容器では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域に、プライマーおよびｄＮＴＰが配置されていてもよい。
【００１８】
このような核酸増幅反応容器では、第１領域に配置されるプライマーおよびｄＮＴＰの量を、逆転写反応に必要な量だけとすることができる。これにより、このような核酸増幅反応容器では、逆転写反応において、プライマーおよびｄＮＴＰの量が多すぎて、逆転写反応に影響を及ぼすことを抑制することができ、逆転写反応をより最適な条件下で行うことができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記逆転写酵素、前記プライマー、および前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２０】
このような核酸増幅反応容器では、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、逆転写酵素およびプライマーと、ポリメラーゼとを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記逆転写酵素、前記プライマー、および前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２２】
このような核酸増幅反応容器では、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、逆転写酵素およびプライマーと、ポリメラーゼとを、さらにより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１領域は、標的核酸を導入する導入口と連通してもよい。
【００２４】
このような核酸増幅反応容器では、標的核酸を導入口から第１領域へ導入することができる。
【００２５】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記反応液を、前記第１領域と前記第２領域との間で往復させて核酸増幅反応を行ってもよい。
【００２６】
このような核酸増幅反応容器では、反応液を第１領域と第２領域との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００２７】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記流路は、
前記第１領域と、前記第１領域および前記第２領域と離間した第３領域と、を有する第１流路と、
前記第１流路の前記第１領域および前記第３領域以外の部分であって、前記第１領域と前記第３領域との間の前記部分から延出し、前記第２領域を有する第２流路と、
を有してもよい。
【００２８】
このような核酸増幅反応容器では、例えば第１領域の温度を変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【００２９】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記反応液を、前記第２領域と前記第３領域との間で往復させて核酸増幅反応を行ってもよい。
【００３０】
このような核酸増幅反応容器では、反応液を第２領域と第３領域との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００３１】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度、および前記第１温度よりも高い第３温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、前記第３温度よりも低い第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域および前記第２領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００３２】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を含むため、異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００３３】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記第３領域を、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記第３領域を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００３４】
このような核酸増幅反応装置では、例えば第１領域の温度を変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【００３５】
本発明に係る核酸増幅反応装置において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含んでもよい。
【００３６】
このような核酸増幅反応装置では、反応液からの蛍光を検出することができる。
【００３７】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度に加熱された前記第１領域に配置して逆転写反応を行う工程と、
前記逆転写反応を行う工程の後に、前記反応液を、第２温度に加熱された前記第２領域と、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱された前記第１領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程と、
を含む。
【００３８】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を用いるため、異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００３９】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、第１温度に加熱された前記第１領域に配置して逆転写反応を行う工程と、
前記逆転写反応を行う工程の後に、前記反応液を、第２温度に加熱された前記第２領域と、前記第１温度および前記第２温度よりも高い第３温度に加熱された前記第３領域と、の間で往復させて核酸増幅反応を行う工程と、
を含む。
【００４０】
このような核酸増幅反応装置では、例えば第１領域の温度を変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図２】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図３】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図４】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図５】第１実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。
【図６】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図７】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図８】第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図９】第１実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図１０】第２実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図１１】第２実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図１２】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図１３】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１４】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１５】第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００４３】
１．  第１実施形態
１．１．  核酸増幅反応容器
まず、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１は、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す断面図である。図２は、第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【００４４】
核酸増幅反応容器１００は、図１および図２に示すように、容器本体１０を含む。容器本体１０の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。核酸増幅反応容器１００は、容器本体１０によって形成された流路２０を含む。流路２０には、第１試薬２および第２試薬４が設けられている。
【００４５】
１．１．１．  流路
流路２０は、反応液６が移動することができる流路である。なお、図１では、流路２０に反応液６が配置される前の状態を示し、図２では、流路２０に反応液６が配置された状態を示している。
【００４６】
反応液６は、標的核酸（標的配列を含む核酸）を含む鋳型核酸溶液と、容器本体１０内に配置された第１試薬２と、が接触することによって調整（生成）される。したがって、反応液６は、鋳型核酸および第１試薬２を（鋳型核酸の成分および第１試薬２の成分を）含むこととなり、核酸増幅反応を進行させる場となる。さらに、反応液６は、第２試薬４と接触し、第２試薬４を（第２試薬４の成分を）含む。鋳型核酸は、ＲＮＡであり、インフルエンザウイルスやＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスから得ることができる。
【００４７】
流路２０には、液体（図示せず）が収容されている。液体は、反応液６とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体は、反応液６と異なる比重を有している。具体的には、液体の比重は、反応液６の比重よりも小さい。液体は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。液体は、容器本体１０の内壁を覆っており、流路２０に反応液６が配置された際に反応液６の表面を覆う。液体は、流路２０に充填されていない。これにより、核酸増幅反応容器１００では、液体が流路２０を充填する場合に比べて、反応液６を速く移動させることができる。
【００４８】
流路２０は、例えば、直線状の流路である。流路２０の形状は、例えば、直方体である。流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有している。
【００４９】
第１領域３０は、例えば、流路２０の一方側の端部である。第１領域３０は、例えば、流路２０の、第１加熱部４０（図３参照）に設けられた開口部４０ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第１領域３０の形状は、長方形である。
【００５０】
第１領域３０は、逆転写反応工程において、第１温度に加熱される領域である。逆転写反応工程において、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第１温度に加熱される。第１温度は、逆転写反応に適した温度であり、例えば、４５℃以上７５℃以下である。
【００５１】
第１領域３０は、核酸増幅反応工程において、第１温度よりも高い第３温度に加熱される領域である。核酸増幅反応工程において、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第３温度に加熱される。第３温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性）に適した温度であり、例えば、８５℃以上１０５℃以下である。
【００５２】
第１領域３０は、図２に示すように、標的核酸を含む鋳型核酸溶液を導入する導入口３１と連通する。図示の例では、導入口３１は、蓋１２によって塞がれている。核酸増幅反応容器１００では、蓋１２を開けて鋳型核酸溶液を流路２０に導入することができる。容器本体１０および蓋１２によって、流路２０は、密封されている。
【００５３】
第２領域３２は、例えば、流路２０の他方側の端部（第１領域３０とは反対側の端部）である。第２領域３２は、例えば、流路２０の、第２加熱部４２（図３参照）に設けられた開口部４２ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第２領域３２の形状は、長方形である。
【００５４】
第２領域３２は、核酸増幅反応工程において、第３温度よりも低い第２温度に加熱される領域である。第２領域３２は、逆転写反応工程においても、第２温度に加熱されていてもよい。第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第２温度に加熱される。第２温度は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であり、例えば、４５℃以上７５℃以下である。第２温度は、第１温度と同じで温度であってもよいし、異なる温度であってもよい。
【００５５】
流路２０は、図２に示すように、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれている。第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂは、容器本体１０の内壁である。内壁１０ａ，１０ｂによって、流路２０は形成されている。第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。具体的には、距離Ｄは、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下である。距離Ｄを０．５ｍｍ以上とすることにより、核酸増幅反応容器１００の製造が困難になることを抑制することができる。距離Ｄを３ｍｍ以下とすることにより、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００５６】
核酸増幅反応容器１００は、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行うための容器である。
【００５７】
１．１．２．  第１試薬
第１試薬２は、図１に示すように、第１領域３０に配置されている。第１試薬２は、第２試薬４と離間した状態で配置されている。第１試薬２は、導入口３１から第１領域３０に導入されてもよい。導入口３１は、第１試薬２が導入された後、蓋１２によって塞がれてもよい。第１試薬２は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第１試薬２は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第１試薬２は、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００５８】
第１試薬２は、逆転写反応を行うための試薬である。第１試薬２は、例えば、プライマーと、ｄＮＴＰと、逆転写酵素と、バッファーと、を含む。
【００５９】
プライマーは、鋳型核酸にアニーリングするよう設計されている。第１試薬２は、フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）およびリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）のうちのいずれか一方のプライマーを含む。第１試薬２に含まれているプライマーは、一本鎖構造の鋳型核酸（ＲＮＡ）にアニーリングする。
【００６０】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。また、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成する（逆転写反応）。
【００６１】
逆転写酵素は、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてｃＤＮＡを合成する酵素である。逆転写反応は、逆転写酵素により、ＲＮＡの塩基配列を鋳型としてｃＤＮＡを合成する反応のことである。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に逆転写酵素の量は、例えば、５ユニット以上６０ユニット以下であり、好ましくは３０ユニット以上６０ユニット以下である。
【００６２】
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、反応液６のｐＨを調整することができる。バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれる２価の陽イオンの濃度は、例えば、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００６３】
第１試薬２が凍結乾燥されている場合、第１試薬２は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、特にトレハロースは、凍結保護剤としての機能が高く、強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、第１試薬２の各成分を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。
【００６４】
１．１．３．  第２試薬
第２試薬４は、第２領域３２に配置されている。第２試薬４は、第２領域３２と連通する導入口（図示せず）から第２領域３２に導入されてもよい。該導入口は、第２試薬４が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第２試薬４は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第２試薬４は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第２試薬４は、第２領域３２を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００６５】
第２試薬４は、例えば、逆転写反応を行うための試薬である。第２試薬４は、例えば、プライマーと、ポリメラーゼと、プローブと、を含む。
【００６６】
第２試薬４は、プライマーとして、二本鎖構造の核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマーと、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマーと、を含む。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。第２試薬４が含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方は、第１試薬２が含むプライマーと同じ種類であってもよい。すなわち、第１試薬２が含むプライマーは、第２試薬４が含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方であってもよい。この場合、第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるフォワードプライマー濃度とリバースプライマーの濃度とは、第１試薬２が含むプライマー分だけ異なってもよい。
【００６７】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、一本鎖ＤＮＡの塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型などを用いる。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００６８】
ポリメラーゼは、ホットスタート型であってもよいし、非ホットスタート型であってもよい。ホットスタート型とは、ホットスタートＰＣＲを行うためのホットスタート処置が行われたポリメラーゼのことであり、所定の温度より高い温度で一定時間晒されることにより、活性を有する。ホットスタート処理としては、例えば、抗体をポリメラーゼと反応させて複合体を形成する処理（抗体形成処理）、化学物質をポリメラーゼのアミノ酸と共有結合させる処理（化学修飾処理）、ワックスをポリメラーゼに付着させる処理、金属イオンをポリメラーゼと反応させる処理などがある。非ホットスタート型とは、ホットスタート処置が行われていないポリメラーゼのことである。非ホットスタート型は、例えば、ホットスタート型に比べて安価である。
【００６９】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有しているポリメラーゼを用いる。
【００７０】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、ポリメラーゼとしてポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼを用いる。５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤポリメラーゼがあるが、この酵素は、Ｔａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００７１】
第２試薬４は、ｄＮＴＰを含んでもよい。そのため、第１試薬２に含まれるｄＮＴＰの量を、逆転写反応に必要な量だけとすることができ、第１試薬２に核酸増幅反応に必要な量のｄＮＴＰを含めなくすることができる。これにより、逆転写反応において、ｄＮＴＰの量が多すぎて、逆転写反応に影響を及ぼすことを抑制することができ、逆転写反応をより最適な条件下で行うことができる。
【００７２】
第２試薬４は、バッファーを含んでいてもよい。第２試薬４に含まれるバッファーの種類は、第１試薬２に含まれるバッファーと同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。さらに、第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第２試薬４は、第１試薬２と同様に、糖を含んでもよい。
【００７３】
核酸増幅反応容器１００は、例えば、以下の特徴を有する。
【００７４】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０と離間した第２領域３２と、を有し、第１領域３０には、逆転写酵素およびプライマーが配置され、第２領域３２には、ポリメラーゼが配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１温度に加熱された第１領域３０において逆転写反応を行った後、反応液６を、第３温度に加熱された第１領域３０と、第２温度に加熱された第２領域３２と、の間を往復させて核酸増幅反応を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器１００では、逆転写反応を行った後、反応液６を別の容器に移し替えて、別の容器で核酸増幅反応を行う必要がない。したがって、核酸増幅反応容器１００では、反応液６に異物が混入することを抑制することができる。
【００７５】
さらに、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を別の容器に移し替える必要がないので、ウイルスを含む反応液６が人体等に接触することを抑制することができ、安全性を高めることができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を別の容器に移し替える手間を省くことができ、作業を簡便にすることができる。
【００７６】
さらに、核酸増幅反応容器１００では、逆転写反応を行うための第１試薬２と、逆転写反応を行うための第２試薬４とが、別々に配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、逆転写反応を行うための試薬と核酸増幅反応を行うための試薬とが１つの試薬として配置されている場合に比べて、逆転写反応が核酸増幅反応を行うための試薬成分によって影響を受けることを抑制することができ、逆転写反応をより最適な条件下で行うことができる。
【００７７】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、ｄＮＴＰが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、逆転写反応において、逆転写酵素は、アニーリングしたプライマーの末端に、新たなＤＮＡを形成することができる。
【００７８】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０に、バッファーが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、反応液６のｐＨを調整することができる。
【００７９】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２に、プローブが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００８０】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２に、プライマーおよびｄＮＴＰが配置されている。そのため、核酸増幅反応試薬１００では、第１試薬２に含まれるプライマーおよびｄＮＴＰの量を、逆転写反応に必要な量だけとすることができ、第１試薬２に核酸増幅反応に必要な量のプライマーおよびｄＮＴＰを含めなくすることができる。これにより、逆転写反応において、プライマーおよびｄＮＴＰの量が多すぎて、逆転写反応に影響を及ぼすことを抑制することができ、逆転写反応をより最適な条件下で行うことができる。
【００８１】
核酸増幅反応容器１００では、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている。具体的には、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、逆転写酵素およびプライマーと、ポリメラーゼとを、より確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、逆転写酵素、プライマー、およびポリメラーゼの保存安定性を高めることができる。
【００８２】
なお、第１試薬２と第２試薬４とを、互いに離間させた状態で配置させておくことができれば、第１試薬２および第２試薬４の少なくとも一方は、液体の状態で配置されていてもよい。
【００８３】
核酸増幅反応容器１００では、第１領域３０は、標的核酸を導入する導入口３１と連通する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、標的核酸を導入口３１から第１領域３０へ導入することができる。
【００８４】
核酸増幅反応容器１００では、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて核酸増幅反応を行う。これにより、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を第１領域３０と第２領域３２との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【００８５】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれ、第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。そのため、核酸増幅反応容器１００では、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００８６】
なお、第１領域３０が第１温度および第２温度に加熱され、第２領域３２が高い第３温度に加熱されてもよいが、第２領域３２に配置されたポリメラーゼへの熱によるダメージを考慮すると、上記の例のように、第１領域３０が第１温度および第３温度に加熱され、第２領域３２が第２温度に加熱されることが好ましい。
【００８７】
１．２．  核酸増幅反応装置
次に、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図３は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す断面図である。図４は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。図５は、第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０の機能ブロック図である。
【００８８】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置１１０について説明する。
【００８９】
核酸増幅反応装置１１０は、図３〜図５に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、駆動機構５０と、検出機構６０と、処理部７０と、操作部７２と、表示部７４と、記憶部７６と、核酸増幅反応容器１００と、を含む。
【００９０】
なお、便宜上、図３および図４では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図５では、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２の図示を省略している。
【００９１】
第１加熱部４０および第２加熱部４２は、核酸増幅反応容器１００に接して設けられている。加熱部４０，４２は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器１００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【００９２】
第１加熱部４０は、逆転写反応工程において、第１領域３０を第１温度に加熱する。第１加熱部４０は、逆転写反応工程において、例えば、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６を第１温度に加熱する。さらに、第１加熱部４０は、核酸増幅反応工程において、第１領域３０を第１温度よりも高い第３温度に加熱する。第１加熱部４０は、核酸増幅反応工程において、例えば、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６を第３温度に加熱する。このように、第１加熱部４０は、第１領域３０を第１温度および第３温度に加熱する。第１加熱部４０には、開口部４０ａが設けられている。図示の例では、開口部４０ａは、有底の穴である。第１領域３０は、開口部４０ａに挿入された領域である。開口部４０ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。
【００９３】
第２加熱部４２は、核酸増幅反応工程において、第２領域３２を、第３温度よりも低い第２温度に加熱する。第２加熱部４２は、逆転写反応工程においても、第２領域３２を第２温度に加熱してもよい。第２加熱部４２は、例えば、第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６を第２温度に加熱する。第２加熱部４２には、開口部４２ａが設けられている。図示の例では、開口部４２ａは、有底の穴である。第２領域３２は、開口部４２ａに挿入された領域である。開口部４２ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。第２加熱部４２には、開口部４２ｂが設けられている。開口部４２ｂは、開口部４２ａと連通している。開口部４２ｂは、後述する検出機構６０からの励起光を第２領域３２に導き、かつ、反応液６からの蛍光を検出機構６０に導くための開口部である。
【００９４】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０および第２領域３２に移動するように、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす機構である。駆動機構５０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を動かす。駆動機構５０は、図示はしないが、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２を支持する支持部と、該支持部を動かすモーターと、を有していてもよい。
【００９５】
検出機構６０は、反応液６からの蛍光を検出する機構である。検出機構６０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、反応液６に励起光を照射し、反応液６からの蛍光を検出する。検出機構６０としては、蛍光を検出することができれば特に限定されず、例えば、公知の蛍光測定器を用いる。
【００９６】
処理部７０は、例えば記憶部７６に記憶されているプログラムに従って、加熱部４０，４２、駆動機構５０、および検出機構６０を制御するための処理を行う。処理部７０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。
【００９７】
操作部７２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部７０に送る処理を行う。操作部７２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。
【００９８】
表示部７４は、処理部７０によって生成された画像を表示する。表示部７４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）等により実現される。
【００９９】
記憶部７６は、処理部７０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部７６は、処理部７０の作業領域として用いられ、処理部７０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部７６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。
【０１００】
核酸増幅反応装置１１０では、核酸増幅反応容器１００を含むため、反応液６に異物が混入することを抑制することができる。
【０１０１】
１．３．  核酸増幅反応方法
次に、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図６は、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図７および図８は、第１実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図７および図８では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図７および図８では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置１１０を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【０１０２】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器１００が装着された核酸増幅反応装置１１０の加熱部４０，４２を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定する処理を行う（ステップＳ１）。本工程では、核酸増幅反応容器１００の配置は、第１配置である。第１配置では、図７に示すように、第１領域３０は、第２領域３２よりも重力作用方向において下方に位置する。図示の例では、流路２０の延出方向（長手方向）は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。処理部７０は、例えば、第１領域３０および第２領域３２がそれぞれ第１温度および第２温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【０１０３】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認下の後に、核酸増幅反応容器１００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図７に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ２）。
【０１０４】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から反応液６を調整した旨の信号を受けると、処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を、第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ３）。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。これにより、反応液６を、第１温度に加熱された第１領域３０に配置して逆転写反応を行うことができる（逆転写反応工程）。第１の時間は、逆転写反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上３０分以下である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。
【０１０５】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ４）。第２配置では、図８に示すように、第２領域３２は、第１領域３０よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて（第２試薬４を反応液６に添加し）、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、反応液６と第２試薬４とを接触させるための時間である。図示の例では、流路２０の延出方向（長手方向）は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【０１０６】
次に、処理部７０は、第１加熱部４０を制御して、第１領域３０を第３温度に設定する（ステップＳ５）。処理部７０は、例えば、ステップＳ４の処理を行ってから所定の時間経過後に、ステップＳ５の処理を行う。
【０１０７】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う（ステップＳ６）。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第３の時間、第１配置に保持される。これにより、反応液６を、第３温度で加熱して変性を行うことができる。第３の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上６０秒以下である。ホットスタートを行うことができるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。本工程において、反応液６を第３温度に加熱することにより、逆転写酵素を不活化することができ、逆転写酵素が核酸増幅反応に影響を及ぼすことを抑制することができる。
【０１０８】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ７）。反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第４の時間、第２配置に保持される。これにより、反応液６を、第２温度で加熱してプライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第４の時間は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１０９】
次に、処理部７０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ７の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ８）。処理部７０は、ステップＳ７の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている所定の回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。
【０１１０】
処理部７０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図６において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【０１１１】
一方、処理部７０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図６において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ９に移行する。
【０１１２】
ステップＳ９では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間（第５の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第５の時間、第１配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第５の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１１３】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ７へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。
【０１１４】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第２温度に加熱された第２領域３２と、第３温度に加熱された第１領域３０と、の間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与し、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、駆動機構５０を制御して核酸増幅反応容器１００をシーソー運動させ、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。
【０１１５】
処理部７０は、さらに、ステップＳ７において、例えば、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置１１０では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部７０は、ステップＳ７において、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置に保持するごとに検出機構６０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部７０は、検出機構６０の測定結果として検出機構６０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部７６に記憶する。処理部７０は、予め記憶部７６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部７０は、算出した核酸の増幅量を、表示部７４に表示させる処理を行ってもよい。
【０１１６】
ここで、図９は、核酸増幅反応装置１１０を模式的に示す図８のＩＸ−ＩＸ線断面図である。図９に示すように、第２配置では、第２領域３２は、検出機構６０と対向した位置にある。検出機構６０からの励起光は、開口部４２ｂを通って反応液６に至り、反応液６からの蛍光は、開口部４２ｂを通って検出機構６０に至る。
【０１１７】
核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器１００を用いるため、反応液６に異物が混入することを抑制することができる。
【０１１８】
２．  第２実施形態
２．１．  核酸増幅反応容器
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１０は、第２実施形態に係る核酸増幅反応容器２００を模式的に示す断面図である。以下、第２本実施形態に係る核酸増幅反応容器２００において、上述した第１実施形態に係る核酸増幅反応容器１００の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【０１１９】
核酸増幅反応容器２００では、図１０に示すように、第１領域３０および第２領域３２に加え、第３領域３４を有している点において、上述した核酸増幅反応容器１００と異なる。すなわち、核酸増幅反応容器２００では、流路２０は、第１領域３０と、第２領域３２と、第３領域３４と、を有している。
【０１２０】
核酸増幅反応容器２００では、流路２０は、第１流路２２と、第２流路２４と、を有する。
【０１２１】
第１流路２２は、第１領域３０と、第１領域３０および第２領域３２と離間した第３領域３４と、を有する。第１流路２２は、一方の端部から他方の端部まで直線状に延出している。第１流路２２は、一方の端部において第１領域３０を有し、他方の端部において第３領域３４を有している。図示の例では、第３領域３４の形状は、長方形である。第１流路２２は、部分２２ａを有する。部分２２ａは、第１流路２２の第１領域３０および第３領域３４以外の部分であって、第１領域３０と第３領域３４との間の部分である。図示の例では、部分２２ａの形状は、長方形である。
【０１２２】
第２流路２４は、第２領域３２を有する。第２流路２４は、第１流路２２に接続されている。第２流路２４は、一方の端部から他方の端部まで直線状に延出している。第２流路２４は、一方の端部において第１流路２２に接続され、他方の端部において第２領域３２を有している。第２流路２４は、第１流路２２の部分２２ａから延出している。第１流路２２の延出方向（長手方向）と、第２流路２４の延出方向（長手方向）と、のなす角θは、例えば、７０°以上１１０°以下であり、図示の例では、９０°である。流路２０は、例えば、Ｔ字状（略Ｔ字状）の形状を有している。
【０１２３】
第３領域３４は、核酸増幅反応工程において、第１温度および第２温度よりも高い第３温度に加熱される領域である。第３領域３４は、逆転写反応工程においても、第３温度に加熱されていてもよい。第３温度は、上述のとおり、変性に適した温度である。
【０１２４】
核酸増幅反応容器２００では、第１領域３０は、核酸増幅反応容器１００とは異なり、第３温度に加熱されない。第１領域３０は、逆転写反応工程において、第１温度に加熱される領域である。第１領域３０は、核酸増幅反応工程においても、第１温度に加熱されていてもよい。第１温度は、上述のとおり、プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度である。
【０１２５】
核酸増幅反応容器２００は、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を、第３領域３４と第４領域３６との間で往復させて核酸増幅反応を行うための容器である。
【０１２６】
核酸増幅反応容器２００は、例えば、以下の特徴を有する。
【０１２７】
核酸増幅反応容器２００では、流路２０は、第１領域３０と、第１領域３０および第２領域３２と離間した第３領域３４と、を有する第１流路２２と、第１流路２２の第１領域３０および第３領域３４以外の部分２２ａであって、第１領域３０と第３領域３４との間の部分２２ａから延出し、第２領域３２を有する第２流路２４と、を有する。そのため、核酸増幅反応容器２００では、例えば核酸増幅反応容器１００を用いた核酸増幅反応方法のように第１領域３０の温度を第１温度および第３温度と変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１２８】
核酸増幅反応容器２００では、反応液６を、第２領域３２と第３領域３４との間で往復させて核酸増幅反応を行う。これにより、核酸増幅反応容器２００では、反応液６を第２領域３２と第３領域３４との間で往復させて、核酸を増幅させることができる。
【０１２９】
２．２．  核酸増幅反応装置
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図１１は、第２実施形態に係る核酸増幅反応装置２１０を模式的に示す断面図である。以下、第２本実施形態に係る核酸増幅反応装置２１０において、上述した第１実施形態に係る核酸増幅反応装置１１０の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
【０１３０】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器２００を装着可能な核酸増幅反応装置２１０について説明する。
【０１３１】
核酸増幅反応装置２１０は、図１１に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、第３加熱部４４と、核酸増幅反応容器２００と、を含む。なお、核酸増幅反応装置２１０は、図５に示すように、さらに、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６を含むが、便宜上、図１１では、これらの図示を省略している。
【０１３２】
加熱部４０，４２，４４は、核酸増幅反応容器２００に接して設けられている。加熱部４０，４２，４４は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器２００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２，４４の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【０１３３】
第３加熱部４４は、核酸増幅反応工程において、流路２０の第３領域３４を、第１温度および第２温度よりも高い第３温度に加熱する。第３加熱部４４は、逆転写反応工程においても、第３領域３４を第３温度に加熱してもよい。第３加熱部４４は、例えば、第３領域３４に反応液６が位置した場合、反応液６を第３温度に加熱する。第３加熱部４４には、開口部４４ａが設けられている。図示の例では、開口部４４ａは、有底の穴である。第３領域３４は、開口部４４ａに挿入された領域である。開口部４４ａは、核酸増幅反応容器２００を装着可能な装着部である。
【０１３４】
核酸増幅反応容器２００では、第１加熱部４０は、核酸増幅反応容器１００とは異なり、第１領域３０を第３温度に加熱しない。第１加熱部４０は、逆転写反応工程において、第１領域３０を、第１温度に加熱する。第１加熱部４０は、核酸増幅反応工程においても、第１領域３０を第１温度に加熱してもよい。
【０１３５】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０、第２領域３２、および第３領域３４に移動するように、核酸増幅反応容器２００および加熱部４０，４２，４４を動かす機構である。
【０１３６】
核酸増幅反応装置２１０では、核酸増幅反応容器２００を含むため、第１領域３０の温度を第１温度および第３温度と変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１３７】
２．３．  核酸増幅反応方法
次に、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１２は、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図１３〜図１５は、第２実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図１３〜図１５では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図１３〜図１５では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器２００を含む核酸増幅反応装置２１０を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【０１３８】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器２００が装着された核酸増幅反応装置２１０の加熱部４０，４２を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定する処理を行う（ステップＳ１１）。本工程では、核酸増幅反応容器２００の配置は、第１配置である。第１配置では、図１３に示すように、第１領域３０は、第２領域３２よりも重力作用方向において下方に位置する。処理部７０は、例えば、第１領域３０および第２領域３２がそれぞれ第１温度および第２温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【０１３９】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認下の後に、核酸増幅反応容器２００の蓋１２を開けて、流路２０の第１領域３０に鋳型核酸溶液を導入し、該鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて、図１３に示すように、反応液６を調製する（ステップＳ１２）。
【０１４０】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から反応液６を調整した旨の信号を受けると、処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を、第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ１３）。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。これにより、反応液６を、第１温度に加熱された第１領域３０に配置して逆転写反応を行うことができる（逆転写反応工程）。第１の時間は、逆転写反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上３０分以下である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。
【０１４１】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１４）。第２配置では、図１４に示すように、第２領域３２は、第１領域３０および第３領域３４よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて（第２試薬４を反応液６に添加し）、第１試薬２および第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１１０の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、反応液６と第２試薬４とを接触させるための時間である。
【０１４２】
次に、処理部７０は、第３加熱部４４を制御して、第３領域３４を第３温度に設定する（ステップＳ１５）。処理部７０は、例えば、ステップＳ１４の処理を行ってから所定の時間経過後に、ステップＳ１５の処理を行う。
【０１４３】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置から第３配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１６）。第３配置では、図１５に示すように、第３領域３４は、第１領域３０および第２領域３２よりも重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第２領域３２から第３領域３４に移動する。反応液６は、第３領域３４において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第３の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６を、第３温度で加熱して変性を行うことができる。第３の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上６０秒以下である。ホットスタートを行うことができるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。本工程において、反応液６を第３温度に加熱することにより、逆転写酵素を不活化することができ、逆転写酵素が核酸増幅反応に影響を及ぼすことを抑制することができる。
【０１４４】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ１７）。反応液６は、第３領域３４から第２領域３２に移動する。反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第４の時間、第２配置に保持される。これにより、反応液６を、第２温度で加熱してプライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第４の時間は、プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１４５】
次に、処理部７０は、第３配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ１７の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ１８）。処理部７０は、ステップＳ１７の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている所定の回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。
【０１４６】
処理部７０は、ステップＳ１８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図１２において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【０１４７】
一方、処理部７０は、ステップＳ１８においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図１２において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１９に移行する。
【０１４８】
ステップＳ１９では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置から第３配置へ切換える処理を行う。反応液６は、第２領域３２から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間（第５の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器２００の配置は、第５の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第５の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１４９】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ１７へ移行し、核酸増幅反応容器２００の配置を第３配置から第２配置へ切換える処理を行う。
【０１５０】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置と第３配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第２温度に加熱された第２領域３２と、第３温度に加熱された第３領域３４と、の間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与し、核酸増幅反応を行うことができる（核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、駆動機構５０を制御して核酸増幅反応容器２００をシーソー運動させ、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置と第３配置とに切換える処理を行う。
【０１５１】
処理部７０は、さらに、ステップＳ１７において、例えば、核酸増幅反応容器２００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置２１０では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。処理部７０の増幅解析処理は、例えば、「１．３．  核酸増幅反応方法」で説明したとおりである。
【０１５２】
核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器２００を用いるため、第１領域３０の温度を第１温度および第３温度と変更することなく、逆転写反応および核酸増幅反応を行うことができる。
【０１５３】
核酸増幅反応方法では、処理部７０は、ステップＳ１１において、領域３０，３２をそれぞれ第１温度、第２温度に設定する処理を行い、ステップＳ１５において、第３領域３４を第３温度に設定する処理を行う。これにより、逆転写反応工程において、第３温度に加熱された第３領域３４の温度が、第１領域３０に影響を及ぼし、第１領域３０の温度が第１温度から変動することを抑制することができる。
【０１５４】
なお、処理部７０は、ステップＳ１１において、領域３０，３２，３４をそれぞれ第１温度、第２温度、第３温度に設定する処理を行ってもよい。これにより、処理部７０は、ステップＳ１５を省略することができ、処理の簡略化を図ることができる。
【０１５５】
本発明は、本願に記載の特徴や効果を有する範囲で一部の構成を省略したり、各実施形態や変形例を組み合わせたりしてもよい。
【０１５６】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１５７】
２…第１試薬、４…第２試薬、６…反応液、１０…容器本体、１０ａ…第１内壁、１０ｂ…第２内壁、１２…蓋、２０…流路、２２…第１流路、２４…第２流路、３０…第１領域、３１…導入口、３２…第２領域、３４…第３領域、４０…第１加熱部、４０ａ…開口部、４２…第２加熱部、４２ａ，４２ｂ…開口部、４４…第３加熱部、５０…駆動機構、６０…検出機構、７０…処理部、７２…操作部、７４…表示部、７６…記憶部、１００…核酸増幅反応容器、１１０…核酸増幅反応装置、２００…核酸増幅反応容器、２１０…核酸増幅反応装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018046763.tif 000015
【図１４】
2018046763.tif 000016
【図１５】
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