(57)【要約】【課題】  本発明は、生体材料及びその製造方法を提供する。【解決手段】  生体材料の製造方法は、ベースを提供し；気相堆積プロセスを行い、前記ベース上にパリレン薄膜を形成し；及び、蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液に浸し、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成するステップを含む。【選択図】  図１
2018158080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料であって、
パリレン薄膜；及び
前記パリレン薄膜の表面に吸着されている第一蛋白質を含む、生体材料。
【請求項２】
請求項1に記載の生体材料であって、
前記生体材料は、前記第一蛋白質とは異なる第二蛋白質をさらに含み、前記第二蛋白質は、前記パリレン薄膜の表面に吸着されている、生体材料。
【請求項３】
請求項2に記載の生体材料であって、
前記第一蛋白質又は前記第二蛋白質は、骨形成蛋白質-2、フィブロネクチン又は多血小板血漿を含む、生体材料。
【請求項４】
生体材料の製造方法であって、
ベースを提供し；
気相堆積プロセスを行い、前記ベース上にパリレン薄膜を形成し；及び
蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液に浸し、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成するステップを含む、製造方法。
【請求項５】
請求項4に記載の製造方法であって、
前記パリレン薄膜上に前記表面物質を形成した後に、前記表面物質を洗うステップをさらに含む、製造方法。
【請求項６】
請求項4に記載の製造方法であって、
前記表面物質は、生物学的機能を有する、製造方法。
【請求項７】
請求項6に記載の製造方法であって、
前記生物学的機能は、細胞増殖及び／又は骨形成作用を含む、製造方法。
【請求項８】
請求項4に記載の製造方法であって、
前記蛋白質溶液は、骨形成蛋白質-2、フィブロネクチン及び／又は多血小板血漿を含む、製造方法。
【請求項９】
請求項8に記載の製造方法であって、
前記蛋白質溶液は、所定の混合比を有する２種類以上の蛋白質を含む、製造方法。
【請求項１０】
請求項9に記載の製造方法であって、
前記表面物質の組成比は、前記所定の混合比と同じである、製造方法。
【請求項１１】
請求項5に記載の製造方法であって、
前記表面物質を洗うステップは、
Tween  20を含有するリン酸塩緩衝液により３回洗い；
Tween  20を含有しないリン酸塩緩衝液により１回洗い；及び
脱イオン水により１回洗うことを含む、製造方法。
【請求項１２】
請求項5に記載の製造方法であって、
前記表面物質の吸着は、不可逆である、製造方法。
【請求項１３】
請求項1に記載の生体材料の用途であって、
前記生体材料は、細胞培養のために用いられる、用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料の分野に関し、特に、改質パリレン薄膜（parylene  film）及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
商業上では、パリレン-C(parylene-C)と称されるパリレンは、FDA（アメリカ食品医薬品局）の承認により、生物医学応用の塗層となっている。これらの類型の塗層は、細胞外液に長期露出するという不利環境下で、その下の表面又は装置を腐食又は酸化から有効に保護することができる。パリレン-Cは、多くの利点、例えば、化学及び生物の不活性、酸素及び水蒸気の遮断能力、滑らかな表面テクスチャ、並びに優れた電気絶縁性を有する。その不活性及び他の材料を保護し得るという主な特徴により、パリレン-Cは、複雑な生物環境中で使用する材料界面への厳しい要件を満足することができる。生体相容性は、先進生物材料表面設計中での疑問の余地がない要件であり、また、生物材料は、応用時に、通常、特定の生物学的機能を有することを要し、且つその設計は、このような機能に応じて行うことができ、例えば、細胞外マトリックスの多機能界面をシミュレーションすることにより、幹細胞の分化及び増殖を促進することができる。しかし、改質パリレン-Cによりこのような性質を示すことは、挑戦的である。幾つかの改質、例えば、化学移植は、偶に、生物学的効果を誘導するようにパリレン-C表面に応用することができるが、その改質過程では、潜在的な有害溶剤及び化学物質が含まれている。
【０００３】
癒着（楔入）生体材料の表面改質に関し、過去の多くの研究は、共有結合方式で安定且つ専一的な生物分子と接続することが望ましい。しかし、生物分子と安定な化学結合を生成することは、比較的長い化学反応時間が必要であることを意味し、これは、実際の医療や手術を行う時の分秒が争うニーズを満足することができない。よって、迅速且つ有効な表面改質を達成することは、物理吸着の化学共有結合に対しての最大の優勢になる。
【０００４】
多くの研究は、既に蛋白質と表面との間の相互作用に詳しく述べており、また、新しい生物材料の設計の面においても指導及び方針を提供している。しかし、蛋白質吸着の詳細なメカニズムについてのコンセンサスがまだ得られておらず、材料界面上の蛋白質分子を操作する方法も確立されていない。分子の材料表面上での吸着作用は、一つの基本的且つ理解されやすい現象であるが、蛋白質吸着を制御するメカニズムは、複雑である。従来技術は、幾つかの問題について解決案を与えている。蛋白質の非特異的吸着をさらに防止し得る生物的環境を作ることは、一般的に無垢表面の形成と称される。蛋白質吸着作用が通常新生物材料設計中の予防ステップに制限されることを考慮して、生体相容性の改善は、蛋白質吸着作用がその効果を発揮し得る唯一の点であるかもしれない。
【０００５】
しかし、物理吸着を有効に制御できなければ、多くの生物分子を選択的に吸着し、また、多くの他の生物学的作用への干渉を引き起こすことがある。近年、生物分子の非専一的な物理吸着現象について、如何に避けるかを主としており、例えば、抗粘着、抗結垢などの技術がある。生物分子吸着は、悪いことでなく、生体材料表面に特定の生物分子を吸着させるように有効且つ正確に制御できれば、表面を短時間内で吸着分子の生物学的機能と改質させることができる。蛋白質／界面性質を制御する能力は、臨床応用及び工業製品の生物材料の加工に有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新しい生体材料の製造方法を提供し、これにより、簡単且つ直観的な吸着過程を利用して異なる機能材料をパリレン-Cの表面に導入することができ、前記機能材料は、骨形成蛋白質-2(BMP-2)、フィブロネクチン（fibronectin）及び多血小板血漿(platelet  rich  plasma、PRP)を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面では、生体材料が提供され、それは、パリレン薄膜及び前記パリレン薄膜の表面に吸着されている第一蛋白質を含む。本発明の一実施例によれば、前記生体材料は、さらに、前記第一蛋白質と異なる第二蛋白質を含み、前記第二蛋白質は、パリレン薄膜の表面に吸着されている。本発明の一実施例によれば、第一蛋白質又は第二蛋白質は、骨形成蛋白質-2、フィブロネクチン又は多血小板血漿を含む。
【０００８】
本発明の他の側面では、生体材料の製造方法が提供され、それは、ベースを提供し；気相堆積プロセスを行って、前記ベース上にパリレン薄膜を形成し；及び、蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液中に浸し、これにより、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成するステップを含む。本発明の一実施例によれば、前記パリレン薄膜上に前記表面物質を形成した後に、前記表面物質を洗うステップをさらに含む。本発明の一実施例によれば、前記表面物質は、生物学的機能を有し、そのうち、前記生物学的機能は、細胞増殖及び／又は骨形成作用を含む。本発明の一実施例によれば、前記蛋白質溶液は、２種類以上の蛋白質を含み、且つ所定の混合比を有し、そのうち、前記表面物質の組成比と、前記蛋白質溶液の前記所定の混合比とは、同じである。本発明の一実施例によれば、前記表面物質を洗うステップは、Tween  20を含有するリン酸塩緩衝液を用いて３回洗い；Tween  20を含有しないリン酸塩緩衝液を用いて１回洗い；及び、脱イオン水を用いて１回洗うことを含む。本発明の一実施例によれば、前記表面物質の吸着は、不可逆である。
【０００９】
また、本発明の他の側面では、生体材料の用途を提供し、そのうち、前記生体材料は、細胞培養のために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明による生体材料の製造方法のステップを示す図である。
【図２Ａ】本発明の第一実施例に基づいて形成された生体材料の赤外反射吸収分光法(IRRAS)によるスペクトル図である。
【図２Ｂ】本発明の第一実施例に基づいて形成された生体材料の赤外反射吸収分光法(IRRAS)によるスペクトル図である。
【図３】本発明の第一実施例に基づいて形成された生体材料の水晶振動子マイクロバランス(QCM)による分析図である。
【図４】本発明の第一実施例に基づいて形成された生体材料の水晶振動子マイクロバランス(QCM)による分析図である。
【図５】本発明の第二実施例によるQCM分析図である。
【図６Ａ】本発明の第三実施例による特異性抗体の結合親和力のQCM分析図である。
【図６Ｂ】本発明の第三実施例による特異性抗体の結合親和力のQCM分析図である。
【図７Ａ】本発明の第五実施例に基づいて行われた24時間細胞培養後の光学顕微鏡による画像である。
【図７Ｂ】本発明の第五実施例に基づいて行われた72時間細胞培養後の光学顕微鏡による画像である。
【図８Ａ】本発明の第六実施例に基づいて行われた10日細胞培養後のALPを示すである。
【図８Ｂ】本発明の第六実施例に基づいて行われた21日細胞培養天後のカルシウム沈着の光学顕微鏡による画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付した図面を参照しながら本発明を実施するための形態を詳細に説明する。
【００１２】
第1図は、本発明による生体材料の製造方法のステップを示す図である。第1図に示すように、該方法は、次のようなステップを含む。
【００１３】
ステップ400：ベース（基材）を提供し；
【００１４】
ステップ402：気相堆積プロセスを行って、前記ベース上にパリレン薄膜を形成し；
【００１５】
ステップ404：蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液中に浸し、これにより、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成し；
【００１６】
ステップ406：前記表面物質を洗うステップを行う。
【００１７】
以下、各ステップについて詳しく説明する。
【００１８】
まず、ベースを提供する(ステップ400)。一実施例では、ベースは、例えば、ステンレス、チタン、金、及び組織培養ポリスチレン(tissue  culture  polystyrene、TCPS)であっても良い。周知のように、TCPSは、細胞培養実験に用いられる良好な培養培地材である。
【００１９】
次に、気相堆積プロセスを行うことにより、前記ベース上にパリレン薄膜を形成する(ステップ402)。パリレン(PPX-C)薄膜は、所定の化学気相堆積(CVD)システムにより形成され、前記所定のシステムは、昇華（sublimation）領域、乾留炉及び堆積室からなる。CVD重合プロセスでは、Dichloro-(2,2)-Paracyclophane(二元重合体)は、まず、約150℃の時に蒸発され、そして、乾留炉に輸送される。このような二元重合体は、乾留炉の中で670℃の時に単体遊離基に解離される。その後、遊離基は、堆積室に進入し、15℃に保つ回転保持器上で重合され、これにより、均一のPPX-C薄膜を形成することができる。残留物堆積の抑制のために、堆積室の壁の温度は、90℃に維持される。流量が25（ml／min）のアルゴン気流は、キャリアガスとして使用される。CVD重合の全過程では、操作圧力が75(mTorr)に調節され、堆積レートが約0.5（Angstrom／s）に保たれる。本発明により形成されたPPX-C薄膜の化学式は、
【化１】
2018158080.tif 000003
であり、そのうち、nは、1乃至750,000の整数である。
【００２０】
次に、蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液中に浸し、これにより、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成する(ステップ404)。蛋白質溶液は、機能性蛋白質を含む任意の溶液であっても良い。一実施例では、蛋白質溶液は、骨形成蛋白質-2(BMP-2)、フィブロネクチン及び／又は多血小板血漿(PRP)を含むが、これに限定されない。4℃下で、PPX-C薄膜が塗布されたベースを蛋白質溶液に10分浸し、蛋白質溶液中の機能性蛋白質がPPX-C薄膜の表面に吸着されるようにさせ、これにより、表面物質を形成する。本発明では、10分間の吸着時間の使用は、バランスを達成するためであり、BMP-2、フィブロネクチン又はPRPについてこのような蛋白質吸着を行う重要な要件でない。一実施例では、蛋白質溶液は、２種類の機能性蛋白質を含む混合溶液であっても良く、且つ所定の混合比を有する。なお、所定の混合比は、質量濃度に基づいて変更することができ、また、前記表面物質の組成比は、蛋白質溶液の所定の混合比と同じである。
【００２１】
本発明の一実施例によれば、フローインジェクション分析（FIA）装置及び連続周波数変化記録装置付きのADS-QCM計器を用いて、水晶振動子マイクロバランス(QCM)分析を行う。FIA装置に接続される蠕動ポンプを使って流速を制御する。前記計器のセンシング素子は、9MHzの共振周波数及び0.1cm2の総センシング面積を有するAT切断圧電石英プレートである。石英結晶センサは、前述のCVD重合方法によりPPX-Cが塗布される。安定な周波数のリターンを得た後に、選択された蛋白質溶液をFIA装置により分析室に注射し、そして、周波数の時間依存性変化を連続して監視測定する。すべての実験は、25℃下で行われる。なお、本発明での「吸着」とは、QCMを用いて蛋白質吸着量を定量分析し、分析結果により、周波数変化範囲が18(Hz)から350(Hz)までの間にあることを示せば、蛋白質が成功裏に目標表面に吸着されていることを指す。
【００２２】
最後に、前記表面物質を洗うステップを行うことで、前記表面物質を洗う(ステップ406)。このステップは、Tween  20を含有するリン酸塩緩衝液(PBS)を用いて３回洗い；Tween  20を含有しないPBSを用いて１回洗い；及び脱イオン水を用いて１回洗うことを含む。これにより、このステップを行うことで、しっかり吸着されていない蛋白質を除去することができる。
【００２３】
上述の生体材料は、細胞培養のために用いることができる。PPX-C薄膜の表面に、機能性蛋白質を含む表面物質を吸着させることにより、細胞の生物学的機能、例えば、細胞増殖又は骨形成作用を誘導することができ、そのうち、前記細胞培養は、体内又は体外に用いることができる。本発明は、吸着されているフィブロネクチン、BMP-2及びPRPを特徴とする多機能表面モデルシステムを以て、フィブロネクチン、BMP-2又はPRPにより独立誘導された細胞増殖及び骨形成作用を示している。
【００２４】
以下、本発明の各実施例について詳細に説明する。
【実施例１】
【００２５】
本実施例は、単一種類の蛋白質溶液を用いて、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液中に浸し、これにより、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成する。単一種類の蛋白質溶液を使用するので、前記表面物質の組成も、一種類の機能性蛋白質を有する。第2A図及び第2B図は、BMP-2、フィブロネクチン及びPRPが吸着されているPPX-C薄膜の赤外反射吸収分光法(IRRAS)によるスペクトル図である。サンプルを、窒素ガスで掃いたキャビティにセットする。各スペクトルは、4cm-1のレゾリューションで、500cm-1から4000cm-1まで128回スキャンして採集することにより得られたものである。第2A図及び第2B図に示すように、純PPX-C薄膜のスペクトルに比べ、BMP-2、フィブロネクチン及びPRPがそれぞれ吸着されているPPX-C薄膜のスペクトルは、すべて、3300-3500cm-1のところでのN-H帯（領域）及び1000-1250cm-1のところでのC-N帯（領域）が検出されており、これは、前記複数の機能性蛋白質をPPX-C薄膜の表面に成功裏に吸着させていることを証明している。
【００２６】
第3図及び第4図は、PPX-C薄膜の表面に吸着されているBMP-2、フィブロネクチン又はPRPの水晶振動子マイクロバランス(QCM)による分析図である。そのうち、横軸は、時間(分)を表し、縦軸は、周波数変化(ヘルツ)を表す。Polyethylene  Glycol(PEG)により修飾された表面は、蛋白質抵抗性を有し、また、蛋白質の非特異的吸着を防止することができるため、本実施例において、蛋白質低吸着の対照表面とされる。第3図に示すように、PPX-C薄膜表面上でのフィブロネクチンの周波数変化は、130.4±11.9Hzであり、BMP-2の周波数変化は、19.6±1.2Hzである。これらの結果は、PPX-C薄膜表面への吸着に対応させると、約64.7±5.9ng/cm2のフィブロネクチン及び9.7±0.6ng/cm2のBMP-2に相当する。PEG修飾の表面に比べ、低いフィブロネクチン(1.5±0.5ng/cm2)及びBMP-2(3.4±1.1ng/cm2)の吸着が観察された。PPX-C薄膜の表面上でのPRP吸着の分析は、第4図に示すようであり、PPX-C薄膜表面上でのPRPの周波数変化は、340±11.9Hzであり、この結果は、PPX-C薄膜表面への吸着を対応させると、約168.9±5.9ng/cm2のPRPに相当する。上述の結果により、これらの蛋白質がPPX-C薄膜の表面に成功裏に吸着されていることは証明されている。
【実施例２】
【００２７】
本実施例は、QCMによる動的分析を用いて、フィブロネクチン又はBMP-2層が吸着されている表面(第一蛋白質表面)の吸着安定性をさらに表す。結合親和力を動的に研究するために、本実施例は、相同蛋白質（Homologous  Protein）（BMP-2又はフィブロネクチン）又は異種蛋白質（Heterologous  Protein）（BSA、66kDa）を第一蛋白質表面に導入する。第5図は、BMP-2又はフィブロネクチン層が吸着されている表面の後続の吸着親和力のQCM分析図である。第5図に示すように、フィブロネクチン又はBMP-2層が既に吸着されている表面上でのBMP-2、フィブロネクチン又はBSAの導入は、すべて、低い吸着親和力を示しており、周波数変化に対応する吸着の量は、2.9±0.3ng/cm2乃至5.9±0.3ng/cm2の範囲にある。PRP層が既に吸着されている表面でのPRPの導入のQCM分析図については、第4図を参照し、周波数変化は、15.8±2.9Hzである。これらの結果から分かるように、（i）先に吸着されたBMP-2又はフィブロネクチンにより、吸着能力を飽和状態にさせ、これにより、後続の蛋白質分子の吸着作用を阻止し；（ii）最初に吸着されたBMP-2又はフィブロネクチンの表面について、安定界面の低汚垢性質を作り、且つその後の蛋白質吸着に対しての抵抗性が非特異的であり（相同及び異種蛋白質にもかかわらず）；（iii）前のBMP-2又はフィブロネクチンの吸着は、不可逆である。
【実施例３】
【００２８】
PPX-C薄膜に吸着されている表面物質は元の蛋白質の生物活性を保っているかどうかを研究するために、本実施例は、フィブロネクチン又はBMP-2層が吸着されている表面を、（ヒトの）BMP-2抗体及びフィブロネクチン抗体に露出させ、吸着されているBMP-2又はフィブロネクチンの、それ相応の抗体に対しての結合親和力を検出する。第6A図及び第6B図は、特異性抗体の結合親和力のQCM分析図である。第6A図に示すように、フィブロネクチン抗体の、フィブロネクチンが吸着されているPPX-C薄膜に対しての結合効率（21.0±1.4ng/cm2）は高く、BMP-2が吸着されているPPX-C薄膜に対しての結合効率は低い。また、第6B図に示すように、BMP-2抗体の、BMP-2が吸着されているPPX-C薄膜に対しての結合効率（35.1±2.3ng/cm2）は高く、フィブロネクチンが吸着されているPPX-C薄膜に対しての結合効率は低い。即ち、吸着されている蛋白質と、それ相応の抗体との間に高結合効率があることは、観察されている。これにより、吸着過程で一定程度の変質が発生しても、吸着されている蛋白質の重要な生物活性、例えば、それ相応の抗体に対しての特異性が依然として保たれていることを証明している。これに対して、フィブロネクチン又はBMP-2が吸着されていないPPX-C薄膜及びPEG修飾表面は、すべて、低い結合効率を呈している。
【実施例４】
【００２９】
本実施例は、異なる混合比（例えば、1:0、10:1、1:1、1:10及び0:1）のBMP-2及びフィブロネクチンを含む蛋白質溶液を用いて、同一PPX-C薄膜表面上でのBMP-2及びフィブロネクチンの組み合わせ及び競争的吸着を研究し、PPX-C薄膜表面に異なる混合比のBMP-2及びフィブロネクチンを吸着させることにより、特定抗体に対しての結合親和力を交差検査（検証）する。次に、PPX-C表面を、（ヒトの）BMP-2抗体及びフィブロネクチン抗体に露出させることにより、蛋白質混合物吸着表面の交差検査を行う。表1は、異なる混合比のBMP-2及びフィブロネクチンが吸着されているPPX-C薄膜表面上での特異性抗体との結合親和力のQCM分析結果を示す。表1に示すように、BMP-2の比の増加に伴い、BMP-2抗体の混合物表面に対しての結合効率は高く、且つフィブロネクチン抗体の結合効率も、フィブロネクチン含量の増加に伴って増加する。２種類の抗体の結合比を計算し、組み合わせ結果に対して数値標準化を行った後に得られたBMP-2の値は、1、0.97、0.51、0.16及び0であり、フィブロネクチンの値は、1、0.90、0.57、0.12及び0である。これらの比は、BMP-2又はフィブロネクチンの単独溶液濃度に比例し、且つ、1：0、10：1、1：1、1：10及び0：1のBMP-2及びフィブロネクチンの混合物の混合比と非常に相関する。これにより、本発明では、複数種の蛋白質を競争的に吸着させることにより、PPX-C薄膜表面上の蛋白質組成を制御し得ることを証明している。なお、得られる蛋白質の組成は、蛋白質溶液中の混合物の組成を調整することにより、予測及び制御することができる。
【００３０】
【表１】
2018158080.tif 000004
【００３１】
なお、表１では、aは、理論値を表し、bも理論値を表す。
【実施例５】
【００３２】
本発明による生体材料は、細胞培養のために用いることができ、且つ本発明の実施例４と組み合わせすることができる。そのうち、前記細胞培養は、体内又は体外に使用することができる。本発明の一実施例によれば、細胞培養プレート(12孔)の表面に対して、PPX-C塗層を用いて、前述の本発明の実施例４の蛋白質吸着過程と同様に修飾を行う。次に、修飾後の細胞培養プレートの表面上で、皮下脂肪組織から分離されたブタ脂肪幹細胞(pADSCs)を、1×104細胞／ｃｍ2の密度で接種する。細胞の培養は、増殖用基礎培地中で行われ、環境パラメターは、5％のCO2、37℃、及び100％の湿度であり、前記増殖用基礎培地は、営養混合物F-12を有するDulbecco改良のEagle培養培地を含み、F-12は、10％のウシ胎児血清、100kU/Lのペニシリン、100mg/Lのストレプトマイシン及び1.5mg/LのアムホテリシンBを含む。一実施例では、光学顕微鏡を用いて、100×拡大倍率で、24時間及び72時間培養の結果サンプルに対して観察及び撮影を行う。また、比較のために、本発明では、TCPS及び純PPX-C薄膜を細胞培養に用いて対照表面とする。第7A図及び第7B図は、本発明の実施例５に基づいて行われた24時間及び72時間細胞培養後の光学顕微鏡による画像である。第7A図に示すように、24時間後に、pADSCの、BMP-2及びフィブロネクチン（異なる比は、1:0、10:1、1:1、1:10及び0:1）が吸着されているPPX-C薄膜表面上での細胞の成長及び増殖を検査し、これにより、細胞の活力が増加する傾向があることを示している。pADSCの数量は、フィブロネクチン濃度の増加に伴って増加し、また、フィブロネクチンの、細胞増殖を誘導し得る生物学的機能にも対応する。第7B図に示すように、72時間後に、異なる混合比のBMP-2及びフィブロネクチンが吸着されているPPX-C薄膜表面上の培養細胞を検査し、細胞の持続的な成長及び増殖の状況をさらに検証し、これにより、吸着作用により調節された生物反応、及び吸着されているフィブロネクチンの持続的な有効性の証拠を提供している。
【実施例６】
【００３３】
本実施例は、pADSC細胞を前述の実施例１中の生体材料に培養し、これにより、吸着されているBMP-2、フィブロネクチン及び／又はPRPが骨形成作用を誘導し得るかどうかを研究し、且つ本発明の前述の各実施例と組み合わせすることができる。アルカリホスファターゼ(ALP)、カルシウム化(カルシウム沈着)及び骨形成マーカー遺伝子を検出することにより、骨形成作用をさらに研究する。そのうち、ALPは、形成作用の初期マーカーを表し、カルシウム沈着は、骨形成作用の成熟段階での特性である。第8A図は、本発明の実施例６に基づいて行われた10日細胞培養後のALPである。第8A図に示すように、純TCPS及びPPX-C薄膜表面(対照表面)上で培養されたpADSCに比べ、BMP-2及びPRPが吸着されているPPX-C薄膜表面上で培養されたpADSCは、著しく増加したALPを示している。第8B図は、本発明の実施例６に基づいて行われた21日細胞培養後のカルシウム沈着の光学顕微鏡による画像である。第8B図に示すように、純TCPS及びPPX-C薄膜表面(対照表面)上で培養されたpADSCに比べ、BMP-2が吸着されているPPX-C薄膜表面上で培養されたpADSCは、著しいカルシウム沈着を示している。上述の実験結果により、本発明では、PPX-C薄膜に骨形成作用の調節因子(BMP-2及びPRP)を吸着させることにより、細胞の骨形成作用を確実に誘導することができ、また、BMP-2及びPRPの、細胞の骨形成作用を誘導し得る生物学的機能にも対応していることが証明されている。
【００３４】
本発明は、新しい生体材料の製造方法を提供し、簡単且つ直観的な吸着過程を利用して異なる機能材料をパリレン-C薄膜の表面に固定することができ、前記機能材料は、骨形成蛋白質-2(BMP-2)、フィブロネクチン（fibronectin）及び多血小板血漿(platelet  rich  plasma、PRP)を含む。なお、本発明による方法は、疎水性相互作用によって媒介されるので、改質過程で潜在的な有害物質を使用せず、これにより、PPX-C薄膜の応用を広げることができる。また、機能性蛋白質が有する生物学的機能は、PPX-C薄膜の表面に有効に導入することもできる。
【００３５】
以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はこの実施形態に限定されず、本発明の趣旨を離脱しない限り、本発明に対するあらゆる変更は本発明の技術的範囲に属する。
【図１】
2018158080.tif 000005
【図２Ａ】
2018158080.tif 000006
【図２Ｂ】
2018158080.tif 000007
【図３】
2018158080.tif 000008
【図４】
2018158080.tif 000009
【図５】
2018158080.tif 000010
【図６Ａ】
2018158080.tif 000011
【図６Ｂ】
2018158080.tif 000012
【図７Ａ】
2018158080.tif 000013
【図７Ｂ】
2018158080.tif 000014
【図８Ａ】
2018158080.tif 000015
【図８Ｂ】
2018158080.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月27日(2018.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料であって、
パリレン薄膜；及び
前記パリレン薄膜の表面に吸着されている第一蛋白質を含み、
前記生体材料は、前記第一蛋白質とは異なる第二蛋白質をさらに含み、前記第二蛋白質は、前記パリレン薄膜の表面に吸着されており、
前記第一蛋白質と前記第二蛋白質とは、所定の組成比を有する、生体材料。
【請求項２】
請求項１に記載の生体材料であって、
前記第一蛋白質又は前記第二蛋白質は、骨形成蛋白質-2、フィブロネクチン又は多血小板血漿を含む、生体材料。
【請求項３】
生体材料の製造方法であって、
ベースを提供し；
気相堆積プロセスを行い、前記ベース上にパリレン薄膜を形成し；及び
蛋白質溶液を提供し、前記パリレン薄膜を前記蛋白質溶液に浸し、前記パリレン薄膜上に表面物質を形成するステップを含み、
前記蛋白質溶液は、所定の混合比を有する２種類以上の蛋白質を含み、
前記表面物質の組成比は、前記所定の混合比と同じである、製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の製造方法であって、
前記パリレン薄膜上に前記表面物質を形成した後に、前記表面物質を洗うステップをさらに含む、製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の製造方法であって、
前記表面物質は、生物学的機能を有する、製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法であって、
前記生物学的機能は、細胞増殖及び／又は骨形成作用を含む、製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載の製造方法であって、
前記蛋白質溶液は、骨形成蛋白質-2、フィブロネクチン及び／又は多血小板血漿を含む、製造方法。
【請求項８】
請求項４に記載の製造方法であって、
前記表面物質を洗うステップは、
Tween  20を含有するリン酸塩緩衝液により３回洗い；
Tween  20を含有しないリン酸塩緩衝液により１回洗い；及び
脱イオン水により１回洗うことを含む、製造方法。
【請求項９】
請求項４に記載の製造方法であって、
前記表面物質の吸着は、不可逆である、製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の生体材料の用途であって、
前記生体材料は、細胞培養のために用いられる、用途。