(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｐ２Ｘ７に対する生物学的材料に、及び、さらに特にポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドを調製するための方法、ポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞、及び予防的、治療的、又は診断的な目的のためのポリペプチドを含む組成物に及び特に医薬的組成物の提供。【解決手段】５０nM未満のＫｄでＰ２Ｘ７に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも１つ含む、Ｐ２Ｘ７関連疾患の処置における使用のためのポリペプチドであって、ここで、該Ｐ２Ｘ７への該免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、Ｐ２Ｘ７の活性を阻害するポリペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０nM未満のＫｄでＰ２Ｘ７に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも１つ含む、Ｐ２Ｘ７関連疾患の処置における使用のためのポリペプチドであって、ここで、該Ｐ２Ｘ７への該免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、Ｐ２Ｘ７の活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２】
Ｐ２Ｘ７関連疾患が、ＭＳ、ＩＢＤ、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌からなる群より選択される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｐ２Ｘ７がヒトＰ２Ｘ７である、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３に結合する、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）であり；そして
−  ここで、ＣＤＲ１は：
−  配列番号３４〜４７、
−  配列番号３４〜４７と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号３４〜４７と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ２は：
−  配列番号６２〜７５、
−  配列番号６２〜７５と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号６２〜７５と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群よりら選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ３は：
−  配列番号９０〜１０３、
−  配列番号９０〜１０３と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号９０〜１０３と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる；
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号６〜１９のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する、請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項５又は６記載のポリペプチドであって、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群：
−  ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号６２であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９０である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９１である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号６８であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９６である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号６４であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９２である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３７であり、ＣＤＲ２は配列番号６５であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９３である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３８であり、ＣＤＲ２は配列番号６６であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９４である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３９であり、ＣＤＲ２は配列番号６７であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９５である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４１であり、ＣＤＲ２は配列番号６９であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９７である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４２であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９８である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４３であり、ＣＤＲ２は配列番号７１であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９９である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４４であり、ＣＤＲ２は配列番号７２であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１００である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＣＤＲ２は配列番号７３であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０１である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４６であり、ＣＤＲ２は配列番号７４であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０２である；及び
−  ＣＤＲ１は配列番号４７であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０３である；
より選ばれる、ポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項５〜７のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号６〜１９と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項５〜７のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｐ２Ｘ７に結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドであって、少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが式１；
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）であり；そして
−  ここで、ＣＤＲ１は：
−  配列番号３４〜４７、
−  配列番号３４〜４７と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号３４〜４７と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ２は：
−  配列番号６２〜７５、
−  配列番号６２〜７５と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号６２〜７５と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ３は：
−  配列番号９０〜１０３、
−  配列番号９０〜１０３と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号９０〜１０３と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる；
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号６〜１９のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載のポリペプチドであって、ここで、少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群：
−  ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号６２であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９０である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９１である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号６８であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９６である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号６４であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９２である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３７であり、ＣＤＲ２は配列番号６５であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９３である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３８であり、ＣＤＲ２は配列番号６６であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９４である；
−  ＣＤＲ１は配列番号３９であり、ＣＤＲ２は配列番号６７であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９５である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４１であり、ＣＤＲ２は配列番号６９であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９７である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４２であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９８である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４３であり、ＣＤＲ２は配列番号７１であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号９９である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４４であり、ＣＤＲ２は配列番号７２であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１００である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＣＤＲ２は配列番号７３であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０１である；
−  ＣＤＲ１は配列番号４６であり、ＣＤＲ２は配列番号７４であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０２である；及び
−  ＣＤＲ１は配列番号４７であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり、及び、ＣＤＲ３は配列番号１０３である；
より選ばれる、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号６〜１９と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項１６】
Ｐ２Ｘ７に結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１０〜１５のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、Ｐ２Ｘ７に結合することができる前記の少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、同じでありうる又は異なりうるポリペプチド。
【請求項１７】
結合Ａｌｂ８（配列番号１２６）又はＡｌｂ１１（配列番号１２５）などのヒト血清アルブミンに結合している免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドが、配列番号１１８〜１２４と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号１１８〜１２４と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが、配列番号１１８〜１２４からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｐ２Ｘ７に対して向けられた少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで
ａ）少なくとも１つの第１免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｐ２Ｘ７の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられ；及び、ここで、
ｂ）少なくとも１つの第２免疫グロブリン単一可変ドメインが、第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とはそれぞれ異なる、前記Ｐ２Ｘ７の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられるポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項記載のポリペプチドであって、ここで、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために適しているアミノ酸配列、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列からなるポリペプチド。
【請求項２３】
アルファスクリーンアッセイにおけるＩＣ５０が３０nM以下である、請求項１〜２２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
アルファスクリーンアッセイにおけるＩＣ５０が３nM以下である、請求項１〜２３のいずれかに従ったポリペプチド。
【請求項２５】
医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに従ったポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項記載のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、以下の工程：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、請求項１〜２５のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製すること
を少なくとも含む、方法。
【請求項２７】
少なくとも以下の工程：
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；及び
ｂ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについて、免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること
を含む、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法。
【請求項２８】
５０nM未満のＫｄでＰ２Ｘ７に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、Ｐ２Ｘ７への免疫グロブリン単一可変ドメインの結合によって、Ｐ２Ｘ７の活性が阻害される、免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、Ｐ２Ｘ７受容体に関連する生物学的材料に、及び、さらに特にポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸に；そのようなポリペプチドを調製するための方法に；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に；予防的、治療的、又は診断的な目的のために、そのようなポリペプチドを含む組成物に及び特に医薬的組成物に関する。
【０００２】
背景
プリンヌクレオチドは、細胞外シグナル伝達分子として十分に確立されている。Ｐ２Ｘ受容体は、例えば、脳及び脊髄の多様な領域において、速い興奮性伝達を媒介するＡＴＰ依存的カチオンチャネルである。Ｐ２Ｘ７サブタイプは、ＡＴＰへの長時間曝露の間にそのイオン選択性を変化させる珍しい特性を有し、それは、チャンネル孔の進行性拡張及び９００Ｄａという大きな分子の透過性の発生をもたらす。Ｐ２Ｘ７受容体は、本来は、造血起源の細胞（マクロファージ、ミクログリア、及び特定のリンパ球を含む）において記載されたが、Ｃａ２＋及びＮａ＋イオンの流入、ならびに炎症性サイトカインの放出を媒介する。Ｐ２Ｘ７受容体は、インターロイキン１β（神経変性、慢性炎症、及び慢性疼痛の主要メディエーター）のプロセシング及び放出を調節するそれらの能力を通じて、神経細胞死に影響しうる。Ｐ２Ｘ７受容体の活性化は、炎症性刺激を提供し、Ｐ２Ｘ７受容体欠損マウスは、実質的に減弱した炎症応答を有し、神経障害性及び慢性炎症性疼痛のモデルを含む。さらに、Ｐ２Ｘ７受容体活性は、炎症性サイトカインの放出を調節することにより、鬱病の病態生理学において関与している。Ｐ２Ｘ７受容体は、このように、神経系と免疫系の間での決定的なコミュニケーションリンクを表しうる（Skaper et al. 2010 FASEB J. 24: 337-345）。免疫系の主要細胞へのＰ２Ｘ７受容体の局在化は、これらの細胞から重要な炎症メディエーターを放出するその能力と共役し、治療的な活用のための標的を提供しながら、広範囲の疾患（疼痛及び神経変性障害を含む）の処置におけるＰ２Ｘ７受容体アンタゴニストの潜在的な役割を示唆する。
【０００３】
アポトーシス細胞死が疾患の重要な機構である癌において、Ｐ２Ｘ７が、アポトーシスにおいてその直接的な効果を伴い、重要な役割を果たし、それが、正常組織と比較し、皮膚癌及び子宮上皮癌において示された通りである。恐らくは、Ｐ２Ｘ７は、癌の子宮上皮組織から正常組織を区別するためのバイオマーカーとして、将来有用であろう。
【０００４】
齧歯類モデルにおける糖尿病における網膜での初期アポトーシス細胞死が、眼のその部分におけるＰ２Ｘ７活性化に関連付けられており、糖尿病性微小血管障害への可能な関連を示唆する。
【０００５】
Ｐ２Ｘ７受容体遺伝子多型は、家族ベースの定量的な遺伝的関連試験において、高血圧に関連付けられることが報告されており、Ｐ２Ｘ７の第１イントロン中の単一ヌクレオチド多型ｒｓ５９１８７４と夜間拡張期血圧の強い関連性を伴う。Ｐ２Ｘ７受容体は、心臓血管系の細胞中で発現され、このシグナル伝達系に影響する薬物は、高血圧における新たな治療及び血栓事象の防止を提供しうる。
【０００６】
健康な腎臓におけるＰ２Ｘ７受容体の発現は、仮にある場合でも、非常に少ない。対照的に、Ｐ２Ｘ７の発現は、罹患腎組織で増加し、腎臓疾患の２つの齧歯類モデルの糸球体の免疫組織化学は、優勢な発現が、有足細胞、内皮細胞、及びメサンギウム細胞中であることを示している。Ｐ２Ｘ７受容体の潜在的な役割が、多発性嚢胞腎疾患及び腎線維症について記載されている。
【０００７】
ＡＴＰが、神経伝達及び神経調節において主要な役割を果たしているため、プリン受容体サブファミリー（Ｐ２Ｘ７含む）が、種々の病理学的状態に関与してきた。中枢神経系（ＣＮＳ）障害のこの病態生理学は、脳外傷、虚血、神経変性、及び神経精神疾患を含む。損傷が起こる場合、大量のＡＴＰが細胞外環境中に放出され、それは、外傷への細胞応答を誘発するために重要である。この状況において、Ｐ２Ｘ４及びＰ２Ｘ７の発現レベルが変化し、それは、損傷部位への休止ミクログリアの遊走及び走化性を刺激しうる。Ｐ２Ｘ７は、ミクログリアの増殖及び死を制御する際に重要な役割を果たす。
【０００８】
脳虚血は、脳卒中を含む、ＣＮＳへの問題を作り、悪化させうる。ミクログリア上で発現されるＰ２Ｘ７受容体は、グルコース／酸素欠乏の結果としての皮質損傷に関与している可能性がある。
【０００９】
神経炎症は、多数の神経変性疾患（例えばアルツハイマー疾患及びパーキンソン疾患など）の病因において主な役割を果たす。正確な機構は不明瞭であるが、ミクログリアにおけるシグナル伝達経路の調節異常は、炎症を増強し、シナプス機能障害、及び、究極的には、神経細胞死に導きうる。Ｐ２Ｘ７受容体の発現及び機能は、アルツハイマー疾患の患者及び種々の神経変性疾患の動物モデルの死後脳において有意に亢進されている。これは、神経変性の進行におけるＰ２Ｘ７Ｒ経路の役割を支持する。ブリリアントブルーＧを使用してＰ２Ｘ７Ｒを遮断し、血液脳関門を通過することができるＰ２Ｘ７Ｒアンタゴニストは、種々の動物モデルにおいて神経病理の寛解をもたらすことが示されている。シナプス変化及び神経細胞死への増加した感受性は、ハンチントン疾患（ＨＤ）の総体症状への公知の寄与因子である。減少した代謝が、長く、ＨＤに関連付けられてきた。最近の知見では、ＡＴＰ産生を減弱させる薬物による、ＨＤのシノラブディス・エレガンス及びショウジョウバエモデルにおける低下した神経細胞アポトーシスが実証されている。細胞外ＡＴＰは、Ｐ２Ｘ７受容体の刺激を通じて神経細胞死を惹起することが報告されている。故に、Ｐ２Ｘ７媒介性カルシウム透過性における変化は、ＨＤシナプス機能障害及び増加した神経細胞アポトーシスに寄与しうる。ＨＤのマウス及び細胞モデルを使用し、ＨＤ神経細胞の細胞体及び末端における増加したＰ２Ｘ７受容体レベル及び変化したＰ２Ｘ７媒介性カルシウム透過性が実証されており、ＨＤマウスへのＰ２Ｘ７アンタゴニストブリリアントブルーＧ（ＢＢＧ）のインビボ投与によって、神経細胞アポトーシスが防止され、体重喪失及び運動協調欠損が減弱された。
【００１０】
まとめると、これらの結果は、種々の神経変性疾患（ＡＤ及びＨＤを含む）を処置するための治療的標的としてのＰ２Ｘ７Ｒシグナル伝達経路についての可能性を高める。
【００１１】
多発性硬化症（ＭＳ）は、免疫原性、再発性、慢性炎症性疾患である。ＭＳのための治療薬としての生物製剤について巨大な潜在力がある。第一世代のサイトカイン（ＩＦＮ−γ−１Ａ、ＩＦＮ−γ−１ｂ）及び抗体（ＣＤ５２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ２０に対する）は、クリニックにおいて有望と失望の両方の結果をもたらしたが、しかし、依然として、新たな作用機構を介してリンパ球を標的とすることにより炎症を軽減する、又は活性化ミクログリア及びマクロファージを慢性的に標的とする治療薬についての高い医学的必要性があることは明らかである。
【００１２】
十分に検証されているが、イオンチャネルは、ＭＳの処置のための十分に活用されていない標的クラスを表す。イオンチャネルに対する薬物の開発が妨げられてきた。なぜなら、低分子阻害剤は、一般的に、特異性を欠き、標的の類縁体及び無関係のタンパク質にさえ影響するからである。
【００１３】
Ｐ２Ｘ７受容体は、骨髄性細胞上ならびにＣＮＳグリア細胞上で発現され、Ｐ２Ｘ７活性化は、グリア及びＴ細胞の両方の活性化を増加することが示されている。これらの特性は、自己免疫疾患（ＭＳを含む）の発生における役割を示唆する。ＭＳの動物モデルにおけるＰ２Ｘ７欠損、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が、代償的変化をもたらし、増加したＴ細胞サイトカイン産生に導くことが示され、活性化Ｔ細胞が、臨床的徴候を伴わないＰ２Ｘ７ヌルマウスの脳において検出された。大きく低下した疾患の発生率は、開始事象がこれらのマウスにおいて存在せず、ＥＡＥ疾患の発生におけるアストログリアＰ２Ｘ７についての役割を指示することを示唆した。
【００１４】
Matute et al.（J. Neuroscience 2007: 27(35): 9525-9533）は、インビトロ及びインビボでの増強されたＡＴＰシグナル伝達が、Ｐ２Ｘ７受容体媒介性Ｃａ２＋毒性を介してオリゴデンドロサイトの死に導き、Ｐ２Ｘ７受容体が、ＭＳの十分に確立されたモデルに関連付けられる神経学的欠損の根底にある組織損傷を媒介することを示している。順に、病変がＭＳにおいて形成される前での、軸索管におけるＰ２Ｘ７受容体の増加した発現は、この特色が、この疾患において新たに形成する病変に関連付けられるリスク因子を構成することを示唆する。ＡＴＰ  Ｐ２Ｘ７受容体の遮断は、従って、強力な神経保護特性を有し、この機構を活用し、ＭＳにおける組織損傷の進行を停止することができうることを示唆する。
【００１５】
Ｐ２Ｘ７特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が記載されている（Adriouch et al., 2005 "Probing the expression and function of the P2X7 purinoceptor with antibodies raised by genetic immunization" Cell Immunol 236: 72-77;Seman et al.2003. NAD-induced T cell death: ADP-ribosylation of cell surface proteins by ART2 activates the cytolytic P2X7 purinoceptor. Immunity 19:571-582）。これらの抗体は、Ｐ２Ｘ７の構造及び機能のさらなる特徴付けのための有用なツールであることが示された。米国特許出願第２０１０／０１７３７９９号には、Ｐ２Ｘ７に結合するナノボディが記載されている。
【００１６】
発明の概要
本発明は、従来技術のアミノ酸配列及び抗体と比較し、他の有利な特性（例えば、調製の改善された容易さ、良い安定性、及び／又は低下した商品のコスト）に加えて、改善された予防的、治療的、及び／又は薬理学的特性を伴うポリペプチドを提供する。
【００１７】
広範なスクリーニング、特徴付け、及びコンビナトリアル戦略に基づき、本発明者らは、驚くべきことに、類似のエピトープを認識する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドが、異なる交差反応性及び調節活性を有することを観察した。また、本発明は、先行技術において記載されるＰ２Ｘ７中和分子と比較し、Ｐ２Ｘ７活性を調節するための改善された特性を示す２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ポリペプチドを提供する。本発明者らは、驚くべきことに、２つのＰ２Ｘ７結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二価ポリペプチドが、それらの一価Ｐ２Ｘ７結合構築ブロック単独又は先行技術のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｌ４のＰ２Ｘ７調節能力と比較し、Ｐ２Ｘ７調節効力における有意な増加を示すことを観察した。さらに、二価の二重特異性Ｐ２Ｘ７結合構築ブロックは、改善された検出感度を示した。この目的のために、本発明は、加えて、また、Ｐ２Ｘ７に特異的に結合し、及び／又はＰ２Ｘ７を有意に調節、阻害、又は中和することが可能である多数の高度に有利な免疫グロブリン単一可変ドメインを利用可能にする。全く予想外に、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７受容体活性のアゴニストを同定した。これらのＰ２Ｘ７結合免疫グロブリン単一可変ドメイン及びこれらを含むポリペプチドが、本発明のさらなる局面を形成する。
【００１８】
さらに、本発明のポリペプチドは、インビボモデルにおいて、炎症の有意な低下を実証した。実験的腎炎の齧歯類モデルにおいて、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７アンタゴニストを用いた抗体媒介性糸球体腎炎の成功裏の処置を明らかに実証した（実施例３を参照のこと）。本明細書においてさらに記載する通り、好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（「ＩＳＶ」）である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下のアミノ酸配列である：
−  免疫グロブリンフォールドを含む、又は適した条件（例えば生理学的条件など）下で、免疫グロブリンフォールド（即ち、フォールディングにより）を形成する、即ち、免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨＨドメインなど）を形成することが可能である；及び
−  機能的な抗原結合活性を含む免疫グロブリン可変ドメインを形成する（又は、そのような適した条件下で形成することが可能である）（機能的な抗原結合部位を形成するために、別の免疫グロブリン可変ドメインとの相互作用（例えばＶＨ−ＶＬ相互作用など）を要求しないという意味において）。
【００１９】
ＩＳＶのものである、本発明のアミノ酸配列は、また、本明細書において「本発明のＩＳＶ」として言及される。本発明における使用のために適した免疫グロブリン単一可変ドメインの一部の好ましい例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろうが、例えば、ＶＨＨ及び／又は（他の）ナノボディ（好ましくは）、例えばヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ヒトＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨ、ｄＡｂ及び（単一）ドメイン抗体などを含む。
【００２０】
そのようなものとして、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、及び組成物が、本発明の疾患及び障害（本明細書において、また、「本発明の疾患及び障害」）の診断、防止、及び処置のために使用することができ、しかし、限定されないが、疾患、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、変形性関節症、癌、糖尿病、腎炎、神経因性疼痛、てんかん、神経変性疾患（例えばＡＤ及びＨＤなど）、ＭＳ及び心血管疾患（脳卒中及び高血圧を含む）、虚血、ならびに本明細書において記載する他の障害及び疾患を含む。特に、本発明のポリペプチド及び組成物は、Ｐ２Ｘ７媒介性障害（アポトーシスを含め）を含む疾患の診断、防止、及び処置のために使用することができる。
【００２１】
一般的に、前記「本発明の疾患及び障害」は、それを必要とする被験者（即ち、疾患もしくは障害又はその少なくとも１つの症状を有する及び／又は疾患もしくは障害を誘引又は発生するリスクのある）に、本発明のポリペプチド又は組成物のいずれかの（及び特にその医薬的に活性な量の）ならびに／あるいはＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）及びそのアイソフォーム又はＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームが含まれる生物学的経路又は機構に対して活性である公知の活性成分の（及び特にその医薬的に活性な量の）適した投与により、それぞれ、診断、防止、及び／又は処置することができる疾患及び障害として定義することができる。
【００２２】
特に、本発明のＩＳＶ及びポリペプチドを、本発明の疾患及び障害の診断、防止、及び処置のために使用することができ、それらは、ＡＴＰにより媒介される、過剰な及び／又は不要なＰ２Ｘ７ならびに特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）あるいはそのアイソフォームゲーティングにより特徴付けられる。本発明のそのような疾患及び障害の例は、再び、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかであろう。
【００２３】
このように、それに限定されることを伴わず、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドを、例えば、使用し、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォーム媒介性ゲーティング（例えば上に引用する疾患及び先行技術において言及されるものなど）を調節することができる活性成分を用いて、現在、診断、防止、又は処置されている全ての疾患及び障害を診断、防止、及び／又は処置することができる。また、本発明のポリペプチドを使用し、全ての疾患及び障害（それらのために、そのような活性成分を用いた処置が、現在、開発されている、提案されてきた、又は、将来、提案もしくは開発されるであろう）を診断、防止、及び／又は処置することができることが想定される。また、本明細書においてさらに記載する通りのそれらの有利な特性のため、本発明のポリペプチドが、これらの公知の活性成分が使用されている又は提案もしくは開発されるであろうもの以外の他の疾患及び障害の診断、防止、及び処置のために使用されうること；及び／又は、本発明のポリペプチドが、本明細書において記載する疾患及び障害を処置するための新たな方法及びレジメンを提供しうることが想定される。
【００２４】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドの他の適用及び使用は、本明細書におけるさらなる開示から、当業者に明らかになるであろう。
【００２５】
一般的に、本発明の疾患及び／又は障害の診断、防止、及び／又は処置において使用することができる、薬理学的に活性な薬剤、ならびに同を含む組成物を提供すること；そのような薬剤及び組成物の投与及び／又は使用を含む、そのような疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２６】
特に、当技術分野において現在使用されている及び／又は公知である薬剤、組成物、及び／又は方法と比較し、特定の利点を有するそのような薬理学的に活性な薬剤、組成物、及び／又は方法を提供することが本発明の目的である。これらの利点は、下のさらなる記載から明らかになるであろう。
【００２７】
さらに特に、本発明の疾患及び／又は障害の、ならびに本明細書において言及するさらなる疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための薬理学的に活性な薬剤、ならびにこれらを含む組成物として使用することができる治療的タンパク質を提供すること；ならびに、そのような治療的タンパク質及び組成物の投与及び／又は使用を含むそのような疾患及び障害の診断、防止、及び／又は処置のための方法を提供することが本発明の目的である。
【００２８】
したがって、Ｐ２Ｘ７に対して、特に、温血動物からのＰ２Ｘ７に対して、さらに特に哺乳動物（例えばマウスなど）からのＰ２Ｘ７に対して、例えば、特に、ヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられている免疫グロブリン単一可変ドメインを提供すること；ならびに、少なくとも１つのそのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれから本質的になるタンパク質及びポリペプチドを提供することが本発明の特定の目的である。
【００２９】
特に、温血動物及び特に哺乳動物、及び、さらに特にヒトにおける予防的、治療的、及び／又は診断的使用のために適しているそのような免疫グロブリン単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００３０】
さらに特に、Ｐ２Ｘ７に関連する及び／又はＰ２Ｘ７により媒介される１つ以上の疾患、障害、又は状態（例えば、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態など）の防止、処置、軽減、及び／又は診断のために、温血動物において、特に哺乳動物において、及び、さらに特にヒトにおいて使用することができるそのような免疫グロブリン単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００３１】
また、Ｐ２Ｘ７に関連する及び／又は媒介される１つ以上の疾患、障害、又は状態（例えば、本明細書において言及する疾患、障害、及び状態など）の防止及び／又は処置のために、温血動物において、特に哺乳動物において、及び、さらに特にヒトにおいて医薬的又は獣医学的組成物の調製物中で使用することができるそのような免疫グロブリン単一可変ドメインならびにそのようなタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することが、本発明の特定の目的である。
【００３２】
本発明において、一般的に、これらの目的は、本明細書において記載する、免疫グロブリン単一可変ドメイン、タンパク質、ポリペプチド、及び組成物の使用により達成される。
【００３３】
一般的に、本発明は、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられる（本明細書において定義する通り）及び／又はそれに特異的に結合することができる（本明細書において定義する通り）免疫グロブリン単一可変ドメイン；ならびに、少なくとも１つのそのようなアミノ酸配列又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、化合物及びコンストラクト、ならびに、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
【００３４】
さらに特に、本発明は、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに、本明細書において定義する通りである親和性（ＫＤ値（実際の又は見かけ上の）、ＫＡ値（実際の又は見かけ上の）、Ｋｏｎ速度及び／又はＫｏｆｆ速度として、あるいはＩＣ５０値として適切に測定される及び／又は表され、本明細書においてさらに記載する通り）を用いて結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド；ならびに、少なくとも１つのそのようなアミノ酸配列又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、化合物及びコンストラクト、ならびに、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
【００３５】
また、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、生物学的効力により特徴付けられ、ＩＣ５０値、本明細書においてさらに記載及び定義する通りである（例えば、Alphascreen（登録商標）による、など）；ならびに、少なくとも１つのそのようなアミノ酸配列又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、化合物及びコンストラクト、ならびに特にタンパク質及びポリペプチドとして適切に測定及び／又は発現されうる。
【００３６】
特定の局面において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、それらが、ヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに、Alphascreenアッセイにおける、１００nM又はそれ以下（例えば５０nM又はそれ以下など）、より好ましくは３０nM又はそれ以下、さらにより好ましくは２０nM又はそれ以下、最も好ましくは１０nM又はそれ以下（例えば５nMなど）のＩＣ５０を伴い結合するようにする。
【００３７】
（ヒト）Ｐ２Ｘ７への本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの結合は、本明細書において記載する通り、Ｐ２Ｘ７上での細胞外ＡＴＰの活性を阻害すること、又は（ヒト）Ｐ２Ｘ７からＡＴＰを置換することをもたらしうることが認められるであろう。（ヒト）Ｐ２Ｘ７への本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの結合が、本明細書において記載する通り、ゲーティングの阻害をもたらしうることが、さらに理解されるであろう。
【００３８】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドの、ならびにこれらを含む組成物の有効性を、含まれる特定の疾患又は障害に依存して、任意の適したインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、及び／又はそれ自体が公知の動物モデル、あるいは、それらの任意の組み合わせを使用してテストすることができる。適したアッセイ及び動物モデルが、当業者に明らかであろうが、例えば、下の実験部分において及び本明細書において引用する先行技術において使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。
【００３９】
Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームへの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの結合、置換、移動、あるいは他のインビボ及び／又はインビトロでの効力についての一部の好ましい技術的値は、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。
【００４０】
Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームへの結合のために、本発明のアミノ酸配列は、通常、そのアミノ酸配列内に、１つ以上のアミノ酸残基あるいはアミノ酸残基の１つ以上のストレッチ（即ち、互いに隣接している又は互いに近接近している、即ち、アミノ酸配列の一次又は三次構造において、２つ又はアミノ酸残基を含む各々の「ストレッチ」を伴う）を含み、それを介して、本発明のアミノ酸配列は、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに結合することができ、そのアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、このように、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに結合するための「部位」を形成する（また、本明細書において、「抗原結合部位」として言及する）。
【００４１】
一般的に、本発明のアミノ酸配列（又は、これらを含む化合物、コンストラクト、又はポリペプチド）が、被験者への投与のために（例えば、本明細書において記載する通りの、治療的及び／又は診断的目的のために）意図される場合、それは、好ましくは、前記被験者において自然発生しないアミノ酸配列；又は、それが前記被験者において自然発生する場合、本質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）のいずれかである。
【００４２】
また、医薬的な使用のために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン（ならびにこれらを含む化合物、コンストラクト、及びポリペプチド）が、好ましくは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられているのに対し；獣医的な目的のために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、好ましくは、処置すべき種からのＰ２Ｘ７に対して向けられている、又は、処置すべき種からのＰ２Ｘ７と少なくとも交差反応性であることが、当業者に明らかであろう。
【００４３】
また、本発明に従い、温血動物の第１種のＰ２Ｘ７に対して向けられている免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、温血動物の１つ以上の他の種からのＰ２Ｘ７と交差反応性を示しうる又は示さないであろう。例えば、ヒトＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、霊長類（例えば、限定を伴わず、マカク属からのサル（例えば、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及び／又はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）など）ならびにヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）など）の１つ以上の種のＰ２Ｘ７と、及び／又は、疾患についての動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、又はイヌ）において、特に、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームと関連する疾患及び障害についての動物モデル（例えば、本明細書において言及する種及び動物モデルなど）においてしばしば使用される動物の１つ以上の種のＰ２Ｘ７と交差反応性を示しうる又は示さないであろう。この点において、そのような交差反応性が、存在する場合、薬物開発の観点から利点を有しうることが当業者に明らかであろう。なぜなら、それは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドを、そのような疾患モデルにおいてテストすることを許すからである。
【００４４】
より一般的には、哺乳動物の複数の種のＰ２Ｘ７と交差反応性である本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、通常、獣医学的な適用における使用のために有利でありうる。なぜなら、それは、同じアミノ酸配列又はポリペプチドが、複数の種にわたり使用されることを許すからである。このように、動物の１つの種のＰ２Ｘ７に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチド（例えばヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォーム）に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドなど）を、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの使用が、処置される種において所望の効果を提供する限り、動物の別の種の処置において使用することができることが、また、本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
本発明は、その最も広い意味において、また、特に限定されないが、又は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが向けられるＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームの特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（適用可能な場合）により定義される。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、ＡＴＰ／Ｐ２Ｘ７相互作用部位に対して向けられうる又は向けられないであろうが、本明細書においてさらに定義する通りである。
【００４６】
本明細書においてさらに記載する通り、本発明のポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられている本発明の２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。一般的には、そのようなポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに、本発明の単一アミノ酸配列と比較し、増加した結合力を伴い結合しうる。そのようなポリペプチドは、例えば、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォーム（それは、相互作用部位でありうる又はないであろう）の同じ抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（該当する場合）に対して向けられた本発明の２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる；あるいは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォーム（それは、相互作用部位でありうる又はないであろう）の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（該当する場合）に対して向けられた本発明の少なくとも１つの「第１」アミノ酸配列；第１（それは、再び、相互作用部位でありうる又はないであろう）とは異なる第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（該当する場合）に対して向けられた本発明の少なくとも１つの「第２」アミノ酸配列を含みうる。好ましくは、本発明のそのような「バイパラトープ」ポリペプチドにおいて、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列が、相互作用部位（本明細書において定義する通り）に対して向けられているが、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、バイパラトープの方法において、フォーマット化してもよく、実験部分において特徴付けする通り、異なるエピトープに対して向けられた一価構築ブロックを組み合わせる。
【００４７】
また、標的が結合対（例えば、受容体−リガンド結合対）の部分である場合、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、それらが、同族の結合パートナー、例えば、Ｐ２Ｘ７への結合についてのＡＴＰと競合するようにする、ならびに／あるいは、それらが、標的への結合パートナーの結合を（完全に又は部分的に）中和するようにする。
【００４８】
また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、一般的に、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームの全ての自然発生する又は合成の類似体、バリアント、変異体、アレル、部分、及びフラグメントに；あるいは、少なくとも、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに結合する抗原決定基又はエピトープと本質的に同じである１つ以上の抗原決定基又はエピトープを含む、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームのそれらの類似体、バリアント、変異体、アレル、部分、及びフラグメントに結合することが予測される。再び、そのような場合において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、そのような類似体、バリアント、変異体、アレル、部分、及びフラグメントに、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが（野生型）Ｐ２Ｘ７に結合する親和性及び特異性と同じである、あるいは、それとは異なる（即ち、より高い又はより低い）親和性及び／又は特異性を伴い結合しうる。
【００４９】
Ｐ２Ｘ７受容体は、恐らくは、多量体形態（例えば、三量体）及び特にホモ三量体形態として機能するため、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドが、ｉ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームだけに、単量体形態において結合し、ｉｉ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームだけに、多量体／三量体形態において結合し、又はｉｉｉ）単量体及び多量体形態の両方に結合することは、本発明の範囲内である。本発明の好ましい局面において、本発明のポリペプチドは、（ホモ）三量体ヒトＰ２Ｘ７結合体の形成を遮断する。
【００５０】
また、当業者に明らかであろう通り、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォーム、例えば、本発明の「バイパラトープ」ポリペプチドに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに、対応する単量体アミノ酸配列よりも高い結合力を伴い結合しうる。例えば、限定を伴わず、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームの異なるエピトープに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体の各々よりも高い結合力を伴い（通常は）結合しうる、ならびに、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドは、また、よりも高い結合力を伴い、Ｐ２Ｘ７の多量体（例えば、（ホモ）三量体）及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームの多量体（例えば、ホモ三量体）に（通常は）結合しうる。
【００５１】
一般的に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドは、少なくとも、生物学的及び／又は治療的な観点から最も関連しているＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームのそれらの形態（単量体、多量体、会合した及び異なる立体構造形態を含む）に結合しうるが、当業者に明かであろう通りである。
【００５２】
また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドの部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体を使用すること、ならびに／あるいは、そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体の１つ以上を含む又は本質的にそれらからなるタンパク質又はポリペプチドを使用することは、これらが、本明細書において想定される使用のために適している限り、本発明の範囲内である。そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体は、通常、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームに対する結合のための機能的な抗原結合部位（の少なくとも部分）を含みうる；より好ましくは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームへの特異的な結合が可能であり、さらにより好ましくは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）又はそのアイソフォームへ、ＥＣ５０値、平均Ｋｉ、結合、ゲーティング、切断放出に関するＩＣ５０値、及び／又は本明細書においてさらに記載する通りの他の測定値を伴い（本明細書において（例えば、実験部分において）定義する通り）、結合することが可能であろうが、ならびに、そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、及び／又は誘導体が、より強力で、より安定で、より可溶性でありうる、及び、同じエピトープを有しうる。そのような部分、フラグメント、類似体、変異体、バリアント、アレル、誘導体、タンパク質、及び／又はポリペプチドの一部の非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。本発明の追加のフラグメント又はポリペプチドは、また、本明細書において記載する通りの１つ以上の（より小さな）部分又はフラグメントを適切に組み合わせることにより（即ち、連結又は遺伝子融合により）提供されうる。
【００５３】
本発明の好ましいマルチパラトープ（例えばバイパラトープなど）ポリペプチドは、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又は本質的にそれからなり、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つにおいて、ＣＤＲ配列は、少なくとも配列番号６〜１９の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ配列と７０%アミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０%アミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０%アミノ酸同一性、例えば９５%アミノ酸同一性又はそれ以上など、あるいは、さらに本質的に１００%アミノ酸配列同一性をを有する（表Ｂ−３）。
【００５４】
好ましい局面において、本発明のマルチパラトープ（例えばバイパラトープなど）ポリペプチドは、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又は本質的にそれからなり、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つが、配列番号６〜１９を伴う免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＰ２Ｘ７の結合を交差遮断し、及び／又は配列番号６〜１９を伴う免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つによるＰ２Ｘ７への結合から交差遮断される。
【００５５】
本発明の好ましい局面において、本発明のマルチパラトープ（例えばバイパラトープなど）ポリペプチドは、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又は本質的にそれからなり、ここで、第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号６〜１９より選ばれ、及び、第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号６〜１９より選ばれ、ここで、第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第２の免疫グロブリン単一可変ドメインが、同じでありうる又は異なりうる。
【００５６】
好ましい局面において、、本発明のマルチパラトープ（例えばバイパラトープなど）ポリペプチドの２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインの各々が、Ｐ２Ｘ７に対して向けられ、異なるエピトープビン又はファミリーに属する。したがって、本発明は、Ｐ２Ｘ７に対して向けられた２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又は本質的にそれからなるポリペプチドに関し、ここで、Ｐ２Ｘ７に対して向けられる２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインの各々が、異なるエピトープビンに属する。異なるエピトープビンに属する免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは、標的Ｐ２Ｘ７結合について、互いに交差競合しない。したがって、本発明は、Ｐ２Ｘ７に対する２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれから本質的になるポリペプチドに関し、ここで、第１の免疫グロブリン単一可変ドメインが、第２の免疫グロブリン単一可変ドメインのＰ２Ｘ７への結合を交差遮断せず、及び／又は、ここで、第１の免疫グロブリン単一可変が、第２の免疫グロブリン単一可変ドメインよるＰ２Ｘ７への結合から交差遮断されない。
【００５７】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１１８〜１２４のいずれかより選択される。
【００５８】
本発明の多価（例えばマルチパラトープなど）ポリペプチドを、一般的に、２つ又はそれ以上の（一価）免疫グロブリン単一可変ドメインを適切に（場合により、適したリンカーを介して）連結する又は組み合わせことにより（又は、そのような（一価）免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を適切に連結し又は組み合わせ、所望の多価コンストラクトをコードする核酸を提供し、次に、前記多価コンストラクトを適切に発現させることにより）提供することができる。このように、本発明によって、本明細書において記載する多価、好ましくはマルチパラトープポリペプチドを利用可能にするだけでなく、しかし、また、本明細書において記載する一価ポリペプチドを利用可能にすることにより、当業者に、広範な異なる多価、好ましくはマルチパラトープ（及び特にバイパラトープ）ポリペプチド（それは、異なる結合親和性、結合力、特異性、効力、及び／又は効力を有しうる）を、本明細書において記載する通りの適した「構築ブロック」の使用を通じて提供するための「構築ブロック」として使用することができる広範な異なる「結合ドメイン」又は「結合単位」を提供することが明らかである。
【００５９】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、当技術分野において公知の通り、Ｆｃテールを介してカップリングしてもよい（例えば、実施例１．３において詳述する通り）。例えば、ＩＳＶのコード配列を、ＩｇＧ１−Ｆｃ（「Ｎｂ−Ｆｃ」）のコード配列とインフレームで融合させ、発現ベクター中にクローン化し、発現させてもよい（例えば、Scheuplein et al. 2010 "A recombinant heavy chain antibody approach blocks ART2 mediated deletion of an iNKT cell population that upon activation inhibits autoimmune diabetes" J. Autoimmun 34: 145-54を参照のこと）。個々のＮｂ−Ｆｃを混合し、ホモ二量体及び／又はヘテロ二量体を形成してもよい。あるいは、２つの個々のＮｂ−Ｆｃ、好ましくは、２つの異なるＮｂ−Ｆｃを、１つの発現ベクター中にクローン化し、発現させてもよい。
【００６０】
本発明の種々の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は一価ポリペプチド（及び／又は、同をコードするヌクレオチド配列及び／又は核酸）ならびに、多価及び／又はマルチパラトープポリペプチド（又は、同をコードするヌクレオチド配列及び／又は核酸）の調製における又はそのための「構築ブロック」としてそれらの使用が、本発明の局面を形成する。
【００６１】
本発明の一価ポリペプチドは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）より、及び重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になりうる。本発明の一価ポリペプチドは、従来の４本鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列より、及び重鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になりうる。本発明の一価ポリペプチドは、ドメイン抗体（又は、ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸）、単一ドメイン抗体（又は、単一ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとしての使用のために適しているアミノ酸）、又はナノボディ（しかし、限定しないが、ＶＨＨを含む）より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になりうる。好ましい局面において、本発明の一価ポリペプチドは、部分的又は完全ヒト化ナノボディ（例えば部分的又は完全ヒト化ＶＨＨなど）から本質的になる。
【００６２】
上に記載する通り、本発明は、また、本発明の多価、好ましくはマルチパラトープポリペプチドの調製における、本明細書に記載する通りの一価ポリペプチドの使用に関する。したがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドの調製における、結合ドメイン又は結合単位としての本発明の一価ポリペプチドの使用に関する。
【００６３】
本発明は、さらに、本発明の１つ以上の一価ポリペプチドあるいは１つ以上の多価、好ましくはマルチパラトープポリペプチドを含む又は本質的にそれからなり、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位を、場合により、さらに含むポリペプチド（また、本明細書において、「本発明のポリペプチド」として言及する）に関する。本明細書におけるさらなる開示から当業者に明らかになるであろう通り、そのようなさらなる基、残基、部分、結合単位、又はアミノ酸配列は、さらなる機能性を、本発明の一価又は多価、好ましくはマルチパラトープのポリペプチドに提供しうる又は提供しないであろう、及び、本発明の一価又は多価ポリペプチドの特性を修飾しうる又は修飾しないであろう。
【００６４】
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列に関する。そのような核酸は、また、本明細書において「本発明の核酸」として言及され、例えば、遺伝子コンストラクトの形態でありうる（本明細書においてさらに記載する通り）。したがって、本発明は、また、遺伝子コンストラクトの形態である核酸又はヌクレオチド配列に関する。
【００６５】
本発明の一価ポリペプチドをコードする核酸を連結し、本発明の多価、好ましくはマルチパラトープポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。したがって、本発明は、また、本発明の多価、好ましくはマルチパラトープのポリペプチドをコードする遺伝子コンストラクトの調製のための、本発明の一価ポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列の使用に関する。
【００６６】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを発現する（又は、適した状況下で、発現することが可能である）；及び／又は、本発明の核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。そのような宿主又は宿主細胞の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００６７】
本発明は、さらに、本発明の少なくとも１つのポリペプチド及び／又は本発明の少なくとも１つの核酸を含む又は含む組成物、及び、場合により、それ自体が公知の、即ち、組成物の意図される使用に依存し、そのような組成物の１つ以上のさらなる成分に関する。そのような組成物は、例えば、医薬的組成物（本明細書において記載する通り）又は獣医学的組成物でありうる。そのような組成物の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００６８】
本発明は、さらに、本明細書において記載するポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び組成物を調製するための方法に関する。
【００６９】
特に、本発明は、以下に関する：
（Ｉ）Ｐ２Ｘ７、好ましくはヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に、５０nM未満のＫｄで結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメイン。
（ＩＩ）（Ｉ）に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）のアミノ酸配列を含む；ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）であり；及び
−  ここで、ＣＤＲ１は：
−  配列番号３４〜４７、
−  配列番号３４〜４７と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号３４〜４７と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ２は：
−  配列番号６２〜７５、
−  配列番号６２〜７５と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号６２〜７５と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれ、そして
−  ここで、ＣＤＲ３は：
−  配列番号９０〜１０３、
−  配列番号９０〜１０３の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、そして
−  配列番号９０〜１０３と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド
からなる群より選ばれる。
（ＩＩＩ）（ＩＩ）に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号６〜１９のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する。
（ＩＶ）（Ｉ）に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）
のアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；ここで、ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ここで、ＣＤＲ２は配列番号６２であり；及び、ここで、ＣＤＲ３は配列番号９０である。
（Ｖ）（Ｉ）に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）
のアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；ここで、ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ここで、ＣＤＲ２は配列番号６３であり；及び、ここで、ＣＤＲ３は配列番号９１である。
（ＶＩ）（Ｉ）に従った免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）
のアミノ酸配列を含む；
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域であり；ここで、ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ここで、ＣＤＲ２は配列番号６８であり；そして、ここで、ＣＤＲ３は配列番号９６である。
（ＶＩＩ）（Ｉ）−（ＶＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド。
（ＶＩＩＩ）（ＶＩＩ）に従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
（ＩＸ）（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）に従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
（Ｘ）さらにヒト血清アルブミン、例えばＡｌｂ８（配列番号１２６）又はＡｌｂ１１（配列番号１２５）などを結合している免疫グログリン単一可変ドメインを含む、（ＶＩＩ）−（ＩＸ）のいずれかに従ったポリペプチド。
（ＸＩ）（Ｉ）−（ＶＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン又は（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、アルファスクリーン（Alphascreen）アッセイにおけるＩＣ５０が３０nM以下である。
（ＸＩＩ）（Ｉ）−（ＶＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン又は（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、アルファスクリーンアッセイにおけるＩＣ５０が３nM以下である。
（ＸＩＩＩ）ｉ）（Ｉ）−（ＶＩ）、（ＸＩ）、もしくは（ＸＩＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はｉｉ）（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチドをコードする核酸配列。
（ＸＩＶ）ｉ）（Ｉ）−（ＶＩ）、（ＸＩ）、もしくは（ＸＩＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はｉｉ）（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチド；及び、場合により、医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬的組成物。
（ＸＶ）Ｐ２Ｘ７関連疾患（しかし、限定しないが、ＭＳ、ＩＢＤ、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌を含む）の処置における使用のための、（Ｉ）−（ＶＩ）、（ＸＩ）、もしくは（ＸＩＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチド。
（ＸＶＩ）（Ｉ）−（ＶＩ）、（ＸＩ）、もしくは（ＸＩＩ）のいずれかに従った免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は（ＶＩＩ）−（Ｘ）のいずれかに従ったポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、以下の工程を少なくとも含む：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、（ＸＩＩＩ）に従った核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
（ＸＶＩＩ）：Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法であって、少なくとも以下の工程を含む：
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；及び
ｂ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについての免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること。
（ＸＶＩＩＩ）５０nM未満のＫｄでＰ２Ｘ７に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、前記Ｐ２Ｘ７への前記免疫グロブリン単一可変ドメインの結合によって、Ｐ２Ｘ７の活性が阻害される。
【００７０】
本発明の他の局面、実施態様、利点、及び適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。いくつかの文書が、本明細書の本文を通して引用される。本明細書において引用する文書（全ての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、説明書などを含む）の各々が、上記又は下記を問わず、本明細書により、参照により、それらの全体において組み入れられる。本明細書におけるいずれも、本発明が、先行発明のために、そのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】ラマ４０５及び４１８についての免疫計画及びサンプル調製。（Ａ、Ｂ）免疫計画の概略図及びＰ２Ｘ７  ｃＤＮＡ発現ベクター。ラマを、ＤＮＡプライム＞タンパク質追加免疫戦略を用いて免疫した（Koch-Nolte et al., 2007 FASEB J. 21, 3490-3498）。４弾道ＤＮＡ免疫後、動物を、ｍＰ２Ｘ７及びｈＰ２Ｘ７を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞及びビーズ上に吸着したｍＰ２Ｘ７で追加免疫した。ｍＰ２Ｘ７及びｈＰ２Ｘ７のｃＤＮＡコンストラクトのカクテルを、１μm金粒子上に吸着させた。ラマは、１免疫当たり１μgのＤＮＡ／mg金を各々用いた１２ショット、ｍＰ２Ｘ７を安定的に発現するＨＥＫ細胞（２×１０７個、１mM  ＡＴＰを用いた１５分間にわたる前処理）又はｈＰ２Ｘ７を安定的に発現するＨＥＫ細胞（３×１０７個）を用いた追加免疫、ならびにＡｍｉｎｏＬｉｎｋアガロースビーズ（Pierce）上に固定化されたＨＡＮＯ４３及びＨＡＮＯ４４（５μg／５０μlビーズ）を用いて免疫沈降したマウスＰ２Ｘ７を用いた最終追加免疫を受けた。ファージライブラリーを、免疫の各々の段階（ＰＢＬ１−６）の終了時に収集された血液サンプルから生成した。
【図１Ｂ】ラマ４０５及び４１８についての免疫計画及びサンプル調製。（Ａ、Ｂ）免疫計画の概略図及びＰ２Ｘ７  ｃＤＮＡ発現ベクター。ラマを、ＤＮＡプライム＞タンパク質追加免疫戦略を用いて免疫化した（Koch-Nolte et al., 2007 FASEB J. 21, 3490-3498）。４弾道ＤＮＡ免疫後、動物を、ｍＰ２Ｘ７及びｈＰ２Ｘ７を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞及びビーズ上に吸着したｍＰ２Ｘ７で追加免疫した。ｍＰ２Ｘ７及びｈＰ２Ｘ７についてのｃＤＮＡコンストラクトのカクテルを、１μm金粒子上に吸着させた。ラマは、１免疫当たり１μgのＤＮＡ／mg金を各々用いた１２ショット、ｍＰ２Ｘ７を安定的に発現するＨＥＫ細胞（２×１０７個、１mM  ＡＴＰを用いた１５分間にわたる前処理）又はｈＰ２Ｘ７を安定的に発現するＨＥＫ細胞（３×１０７個）を用いた追加免疫、ならびにＡｍｉｎｏＬｉｎｋアガロースビーズ（Pierce）上に固定化されたＨＡＮＯ４３及びＨＡＮＯ４４（５μg／５０μlビーズ）を用いて免疫沈降したマウスＰ２Ｘ７を用いた最終追加免疫を受けた。ファージライブラリーを、免疫の各々の段階（ＰＢＬ１−６）の終了時に収集された血液サンプルから生成した。
【図１Ｃ】ラマ４０５及び４１８についての免疫化計画及びサンプル調製。（Ｃ）Ａｌｅｘａ６４７結合ｍＡｂｓ  ＨＡＮＯ４４（抗ｍＰ２Ｘ７）（Moller et al.2007 Purinergic Signalling DOI 10.1007/s11302-007-9084-9）及びＬ４（抗ｈＰ２Ｘ７）（Buell et al.1998 Blood, 92 pp 3521-3528）による免疫のために使用した安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞上でのＰ２Ｘ７発現レベルのＦＡＣＳ分析。同じ抗体を用いて染色した非トランスフェクト細胞を、コントロールとして使用した（灰色ヒストグラム）。
【図１Ｄ】ラマ４０５及び４１８についての免疫化計画及びサンプル調製。（Ｄ）免疫のために使用されるビーズに結合した組換えｍＰ２Ｘ７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ＩＰ、レーン４）。ｍＰ２Ｘ７（８０kd、赤色矢印）を、アガロースビーズ（アミノ連結、Pierce）上に固定化したｍＡｂ  ＨＡＮＯ４４を使用し、ｍＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞のライセート（ライセート、レーン１）から免疫沈降した（マトリクス、レーン５、ビーズだけを用いたコントロールＩＰ）。
【図２Ａ】Ｐ２Ｘ７結合についての選択されたＮｂのＦＡＣＳ分析。第１（Ａ）及び第２（Ｂ）選択からのＮｂを用いた粗ペリプラズマ（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ）ライセートを、ＦＩＴＣ結合抗ｍｙｃ抗体とプレインキュベートし、非トランスフェクトＨＥＫ細胞及びＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞の混合物に加えた。細胞を洗浄し、データをフローサイトメトリー（FACS Calibur）により収集した。陽性クローンが二峰性染色を示すのに対し（ｗｔ細胞からのＰ２Ｘ７陽性細胞の描写）、陰性クローンは単一ピークを示す。灰色ヒストグラムは、非染色コントロール細胞を示す。
【図２Ｂ】Ｐ２Ｘ７結合についての選択されたＮｂのＦＡＣＳ分析。第１（Ａ）及び第２（Ｂ）選択からのＮｂを用いた粗ペリプラズマ（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ）ライセートを、ＦＩＴＣ結合抗ｍｙｃ抗体を用いてプレインキュベートし、非トランスフェクトＨＥＫ細胞及びＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞の混合物に加えた。細胞を洗浄し、データをフローサイトメトリー（FACS Calibur）により収集した。陽性クローンが二峰性染色を示すのに対し（ｗｔ細胞からのＰ２Ｘ７陽性細胞の描写）、陰性クローンは単一ピークを示す。灰色ヒストグラムは、非染色コントロール細胞を示す。
【図３】抗ｈＰ２Ｘ７  Ｎｂの特異性のＦＡＣＳ分析。ＨＥＫ細胞を、ＧＦＰ及びｍＰ２Ｘ７、ｒＰ２Ｘ７、又はｈＰ２Ｘ７のいずれかについての発現コンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を、穏やかなトリプシン処理により回収し、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質又はｍＡｂ  Ｌ４とインキュベートした（上部に示す通り）。結合抗体を、Ａｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧを用いて検出した。コントロールのために、非トランスフェクトＨＥＫ細胞（ｗｔ）を、同じ染色手順に供した。
【図４】抗ｈＰ２Ｘ７  Ｎｂの交差遮断分析。ｈＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトした５×１０５個のＨＥＫ細胞を、３μｇのそれぞれの非結合抗体を用いて、９５μｌの完全ＤＭＥＭ中で、１５分間にわたり室温でインキュベートした。洗浄を伴わず、１μl（〜２５０ng）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合１ｃ１１３−Ｆｃ、３ｃ２３−Ｆｃ又はｍＡｂ  Ｌ４を加え、インキュベーションを４℃で２０分間にわたり継続した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（FACS Calibur、ＢＤ）により分析した。ＭＦＩ、平均蛍光強度。染色のために使用したＮｂ−Ｆｃ又はｍＡｂのＡｌｅｘａ  ６４７結合体を、パネルの下に示し、遮断のために使用したＮｂ−Ｆｃ又はｍＡｂを、右上に示す。（賦形剤＝遮断Ａｂを伴わない培地）。
【図５Ａ】ｈＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃの組み合わせを用いた、初代白血球上のＰ２Ｘ７の改善された染色。（Ａ）単一ドナーからの１００μlの血液の一定分量を、１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃの各々３μｇの組み合わせとプレインキュベートした（「遮断」）。並列した一定分量を、３μgの１０６７−Ｆｃだけとインキュベートした（「非遮断」）。室温での３０分間のインキュベーション後、結合抗体のマスターミックスを加えた：１ｃ１１３−Ｆｃ  Ａｌｅｘａ６４７（〜２５０ng）；３ｃ２３−Ｆｃ  Ａｌｅｘａ６４７（〜２５０ng）；及び抗CD4 Pacific Blue。細胞を、氷上で３０分間にわたり、抗体染色のためにインキュベートした。赤血球を、２mlの１×ＢＤ溶解溶液を用いた１０分間の室温でのインキュベートにより溶解した。細胞を、１回、３mlの完全ＲＰＭＩ  ５%  ＦＣＳを用いて洗浄し、フローサイトメトリー（FACS CantoII、BD）により分析した。リンパ球を、低前方散乱（ＦＳＣ）対側方散乱（ＳＳＣ）に基づいてゲートした（矢印）。黒色の数字は、それぞれの象限における細胞のパーセンテージを示す。左右のＭＦＩ値は、それぞれ、ＣＤ４−及びＣＤ４＋リンパ球の平均蛍光強度を示す。
【図５Ｂ】ｈＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃの組み合わせを用いた、初代白血球上のＰ２Ｘ７の改善された染色。（Ｂ）３人の異なるドナーからのＰＢＬのＦＡＣＳ分析を、追加の抗ＣＤ８  Ａｌｅｘａ４８８染色ｍＡｂを用いて、（Ａ）における通りに実施した。顆粒球、単球、及びリンパ球のゲーティングは、ＦＳＣ及びＳＳＣに基づいた（示す通り）。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４−／ＣＤ８−リンパ球のゲーティングは、ＣＤ４及びＣＤ８の細胞表面染色に基づいた。Ｐ２Ｘ７の発現を連結表現で示す。非染色遮断及び非遮断Ｎｂ−Ｆｃを用いたプレインキュベーションは、パネルの下に、それぞれ（＋）及び（−）により示す。
【図６Ａ】１ｃ８１及び３ｃ２３のＮｂは、トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出を遮断する。（Ａ）ＨＥＫ細胞を、ＣＤ６２ＬだけについてのｃＤＮＡコンストラクトを用いてトランスフェクトし、又はＣＤ６２Ｌ及びｈＰ２Ｘ７についてのコンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ６２Ｌの切断放出を、細胞を、６０分間にわたり、４mM  ＡＴＰを用いて、完全ＤＭＥＭ培地中で、３７℃でインキュベートすることにより誘導した。
【図６Ｂ】１ｃ８１及び３ｃ２３のＮｂは、トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出を遮断する。（Ｂ）ＡＴＰ用量応答アッセイにおいて、Ｐ２Ｘ７及びＣＤ６２Ｌ同時トランスフェクト細胞を、０．２５、１、２、又は４mM  ＡＴＰを用いて、６０分間にわたり、３７℃でインキュベートした。一定分量の細胞を、２μgのＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質１ｃ８１−Ｆｃもしくは３ｃ２３−Ｆｃを用いて、又はコントロールＮｂ−Ｆｃ（抗ｈＣＤ３８  １０６７−Ｆｃ）を用いて、１５分間にわたり、室温で、２mM又は４mM  ＡＴＰを用いた６０分間のインキュベーションに先立ち、プレインキュベートした。細胞を、１５０μlの完全培地を用いて１回洗浄し、３０分間にわたり４℃で染色し、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４  ＰＥ）及びＰ２Ｘ７（Ｌ４  ＡＦ６４７）発現を検出した。さらなる洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（FACS Calibur、ＢＤ）により分析した。
【図７】３ｃ２３及び１ｃ８１のＮｂは、トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出を遮断する。ＨＥＫ細胞を、ＧＦＰ、ＣＤ６２Ｌ、及びｈＰ２Ｘ７についてのｃＤＮＡコンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、１５分間にわたり室温で、１：３希釈工程において滴定した、示したＮｂを伴う８０μlのＤＭＥＭ培地中でプレインキュベートした。最高及び最低Ｎｂ濃度は、２．８μg/ml及び４ng/mlであった。ＡＴＰを最終濃度４mMまで加えた。細胞を６０分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に、フローサイトメトリー前にＣＤ６２Ｌについて染色した。ＣＤ６２Ｌ細胞表面染色についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＧＦＰ＋細胞上でのゲーティング後に算出した。ＩＣ５０値を、半最大のＣＤ６２Ｌ  ＭＦＩで算出した（赤色点線でマーク）（表３を参照のこと）。
【図８Ａ】ナノボディ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ＲＰＭＩ８２２６細胞によるホスファチジルセリンのＡＴＰ誘導性外在化を防止する。（Ａ）ＲＰＭＩ８２２６細胞上でのＰ２Ｘ７発現を、Ａｌｅｘａ６４７結合１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃのカクテルを用いて２×１０５個細胞を染色することにより検出した（図５中の通り）。灰色ヒストグラム＝過剰の非結合１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃを用いてプレインキュベートした細胞、オープンヒストグラム＝過剰のコントロール１０６７−Ｆｃを用いてプレインキュベートした細胞。
【図８Ｂ】ナノボディ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ＲＰＭＩ８２２６細胞によるホスファチジルセリンのＡＴＰ誘導性外在化を防止する。（Ｂ）細胞を、ＡＰＣ結合アネキシンＶを用いたＰＳについての染色前に、示された濃度のＡＴＰを用いて、６０分間にわたり３７℃でインキュベートした。
【図８Ｃ】ナノボディ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ＲＰＭＩ８２２６細胞によるホスファチジルセリンのＡＴＰ誘導性外在化を防止する。（Ｃ）ＲＰＭＩ  ８２２６細胞を、０．５μgの１０６７−Ｆｃ、１ｃ１１３−Ｆｃ、１ｃ８１−Ｆｃ、３ｃ２３−Ｆｃ、又はｍＡｂ  Ｌ４を用いて、１５分間にわたり、室温で、最終濃度０（コントロール）又は４mMまでのＡＴＰの添加前に、プレインキュベートした。細胞を、３７℃で６０分間にわたり、さらにインキュベートし、ＡＰＣ結合アネキシンＶを用いた染色に先立ち、アネキシンＶ染色緩衝液を用いて１回洗浄した。細胞を、フローサイトメトリー（FACS Canto II、ＢＤ）により分析した。
【図９】Ｎｂ  １ｃ８１及び３ｃ２３は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死を防止する。ＲＰＭＩ８２２６細胞（１５０μｌ培地中の５×１０５個の細胞）を、９００ngのそれぞれのＦｃ融合タンパク質又はｍＡｂ  Ｌ４を用いて、１０分間にわたり室温でプレインキュベートした。１５０μl  ＡＴＰの４mMストックを、また、最終ＡＴＰ濃度２mM（１：２希釈）及び最終抗体濃度３μg/mlまで加えた。細胞を、３７℃で６０分間又は２４時間にわたりインキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色緩衝液中で１回洗浄し、ＡＰＣ結合Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖを用いたホスファチジルセリンの提示及びヨウ化プロピジウムを用いた細胞死について染色した。データ収集は、フローサイトメトリー（FACS CantoII、ＢＤ）により行った。
【図１０】ＮＢＳ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ＰＳのＡＴＰ誘導性外在化及びヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断する。３人のドナーからの全血液の１００μlの一定分量を、０．５μgの１０６７−Ｆｃ、１ｃ１１３−Ｆｃ、１ｃ８１−Ｆｃ、３ｃ２３−Ｆｃ又は１μgのｍＡｂ  Ｌ４を用いて、３０分間にわたり、室温で、１００μl培地（非処理コントロール）又は完全培地中の８mM  ＡＴＰストック溶液の添加前に、プレインキュベートした。細胞を、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートし、１回、アネキシンＶ染色緩衝液を用いて洗浄し、抗ＣＤ６２Ｌ  ＦＩＴＣ、アネキシンＶ−ＡＰＣ、抗ＣＤ４  ＡＰＣ／Ｃｙ７、及び抗ＣＤ８  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅのマスターミックスを用いて、６０分間にわたり、室温で染色した。赤血球を、２mlの１×ＢＤ溶解溶液中での１０分間のインキュベーションにより溶解した。細胞を、１．５mlのアネキシンＶ染色緩衝液を用いて１回洗浄し、フローサイトメトリー（FACS CantoII、ＢＤ）により分析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、図５における通りに、低ＦＳＣ及びＳＳＣ、ならびにＣＤ４及びＣＤ８についての染色に基づき、順次、ゲートした。血液サンプルは、図５において分析されたドナーと同じドナーからであった。
【図１１Ａ】全身的に注射されたＨＬＥ−ＮｂによるＰ２Ｘ７のインビボ遮断／増強の動態分析。（Ａ）脾細胞及び肝臓細胞を、半減期延長Ｎｂ（Ｐ２Ｘ７及びアルブミンについて二種特異的）１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８（２０μg）、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８（１００μg）、コントロールＮｂ（１００μg）の静脈内注射後２時間及び２４時間に調製した。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＮＫ１．１に対する抗体を用いて同時染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ４＋細胞のパーセンテージ）の及びｉＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋細胞のパーセンテージ）の頻度を、FlowJoソフトウェアを用いて算出した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側スチューデントｔ検定）。
【図１１Ｂ】全身的に注射されたＨＬＥ−ＮｂによるＰ２Ｘ７のインビボ遮断／増強の動態分析。（Ｂ）ＣＤ２７の切断放出を、２５μM  ＮＡＤ＋、又は溶媒（ｓｏｌ）を用いたエクスビボの細胞の処理に続く、抗ＣＤ２７を用いた共染色によりモニターした（脾臓：ＣＤ４＋細胞上でゲート；肝臓：ＣＤ３＋細胞上でゲート）。
【図１１Ｃ】全身的に注射されたＨＬＥ−ＮｂによるＰ２Ｘ７のインビボ遮断／増強の動態分析。（Ｃ）細胞を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８、コントロールＮｂ（２００μg静脈内投与）の注射後２時間目に調製し、（ａ、ｂ）における通りに染色した。ホスファチジルセリンの外在化を、２５０μM  ＡＴＰ、２５μM  ＮＡＤ＋、又は溶媒（ｓｏｌ）を用いたエクスビボの細胞の処理に続く、アネキシンＶを用いた共染色によりモニターした（脾臓：ＣＤ４＋細胞上でゲート；肝臓：ＣＤ３＋細胞上でゲート）。
【図１２Ａ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ａ）尿中アルブミンをＥＬＩＳＡにより定量化し、クレアチニンレベルを自動測定により決定した。
【図１２Ｂ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ｂ）屠殺の日、血液尿素窒素、血清トリグリセリド、及び血清コレステロールレベルを自動測定により決定した；血清中ＩＬ−６及び尿中ＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡにより定量化した。有意性は、マンホイットニーＵ検定を用いて評価した。
【図１２Ｃ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ｃ）脾細胞を、ＮＡＤ＋の非存在（ＰＢＳ）又は存在において、３０分間にわたりインキュベートし、次に、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ２７について、ＦＡＣＳ分析前に染色した。ゲーティングを、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ上で実施した。Ｐ２Ｘ７アゴニストＮｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスからのＴｒｅｇは、より低い割合のＣＤ２７＋Ｔ細胞を含んだが、その全てが、ＣＤ２７のＮＡＤ＋誘導性喪失に感受性であった；Ｐ２Ｘ７アンタゴニストＮｂ１３Ａ７を用いて処置されたマウスからのＴｒｅｇは、ＣＤ２７のＮＡＤ＋誘導性切断放出に耐性であった。
【図１２Ｄ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ｄ）腎臓切片を、ＰＡＳを用いて染色した（上部）。尿細管性タンパク質キャストを、アスタリスクによりマークする。
【図１２Ｅ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ｅ）腎臓切片を、ＤＮＡ染色色素ｄｒａｑ５、Ｔ細胞マーカーＣＤ３に対する蛍光色素結合ｍＡｂ、及びネフリン（腎臓濾過障壁での有足細胞膜タンパク質）に対する蛍光色素結合ｍＡｂを用いて染色した（下）。有足細胞核を、アスタリスクによりマークする。Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスからの腎臓切片は、Ｎｂ１３Ａ７又はコントロールＮｂを用いて処置されたマウスよりも、ＣＤ３＋Ｔ細胞のより強力な糸球体浸潤及びネフリンについての破壊染色を示す。
【図１２Ｆ】Ｎｂ  １３Ａ７の全身投与は、抗体誘導糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、Ｎｂ  １４Ｄ５のそれは、強化する。抗体誘導腎炎のモデルにおける処置の時間経過。６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）を、半減期延長Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８、又はコントロールＮｂ（５０μg）を、抗有足細胞（ＡＰ）又は免疫前（ＰＩ）血清の注射前２時間目に静脈内注射した。マウスは、Ｎｂ（２５μｇ）の追加注射を３日毎に受けた。最終Ｎｂ注射後３日目に、マウスを屠殺し、腎臓及び血清を、さらなる分析に供した。（Ｆ）腎臓切片を、免疫蛍光顕微鏡法の前に、ネフリンに対するｄｒａｑ５及び蛍光色素結合ｍＡｂ、補体因子３（Ｃ３）、ならびにＩｇＧを用いて染色した。ＡＰ血清を用いて処置されたマウスからの（しかし、ＰＩ血清を用いて処置されたマウスからではない）切片は、ＩｇＧ及び３の糸球体沈着物を示す。ＩｇＧ沈着物のパターンは、Ｎｂ１３Ａ７を用いて処置されたマウスにおいて規則的であるが、しかし、コントロールＮｂを用いて処置されたマウスにおいて部分的に破壊され、Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスにおいて強く破壊される。
【図１３Ａ】Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５のＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、リンパ節、脾臓、及び肝臓からのリンパ球上のＰ２Ｘ７を検出する。野生型及びＰ２Ｘ７−／−マウスのリンパ節、脾臓、又は肝臓からのリンパ球を、蛍光色素結合マウスＰ２Ｘ７特異的１３Ａ７−Ｆｃ、１４Ｄ５−Ｆｃ又はヒトＰ２Ｘ７特異的３ｃ２３−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を用いて、ならびに、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＮＫ１．１に対する抗体を用いて、フローサイトメトリーの前に共染色した。
【図１３Ｂ】Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５のＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質によって、リンパ節、脾臓、及び肝臓からのリンパ球上のＰ２Ｘ７を検出する。野生型及びＰ２Ｘ７−／−マウスのリンパ節、脾臓、又は肝臓からのリンパ球を、蛍光色素結合マウスＰ２Ｘ７特異的１３Ａ７−Ｆｃ、１４Ｄ５−Ｆｃ又はヒトＰ２Ｘ７特異的３ｃ２３−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を用いて、ならびに、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＮＫ１．１に対する抗体を用いて、フローサイトメトリーの前に共染色した。
【図１３Ｃ】Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５のＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質によって、リンパ節、脾臓、及び肝臓からのリンパ球上のＰ２Ｘ７を検出する。野生型及びＰ２Ｘ７−／−マウスのリンパ節、脾臓、又は肝臓からのリンパ球を、蛍光色素結合マウスＰ２Ｘ７特異的１３Ａ７−Ｆｃ、１４Ｄ５−Ｆｃ又はヒトＰ２Ｘ７特異的３ｃ２３−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を用いて、ならびに、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＮＫ１．１に対する抗体を用いて、フローサイトメトリーの前に共染色した。
【図１４】Ｎｂ  ３ｃ２３は、ヒトＲＰＭＩ８２２６リンパ腫細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断する。ＲＰＭＩ８２２６細胞に、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した（BD FACS Canto）。細胞を洗浄し、ヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  ３ｃ２３−３ｃ２３又はマウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７（ネガティブコントロール）の非存在（溶媒）又は存在において、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を用いて添加したＰＢＳ（Invitrogen）中に再懸濁し、フローサイトメトリー（BD FACS Canto）により分析した。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。１００秒間にわたる平衡化後、ＡＴＰを、最終濃度２mMまで加え、インキュベーションを、最終濃度５μmまでのイオノマイシンの添加前に、１００秒間にわたり継続した。
【図１５】Ｎｂ  ３ｃ２３は、ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断する。４人のドナーからのヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度５ｍＭまでのＡＴＰの添加及び１時間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、Ｎｂ３ｃ２３−３ｃ２３の非存在又は存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いてインキュベートした。血漿を、サンプルの遠心分離により調製し、血漿中のＩＬ−１βレベルを、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により決定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図１６】ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断するＮｂ  ３ｃ２３の用量応答分析。ヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度２mMまでのＡＴＰの添加及び１時間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、示した濃度のＮｂ  ３ｃ２３、３ｃ２３−３ｃ２３、及び３ｃ２３Ｆｃの非存在又は存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いてインキュベートした。血漿を、細胞の遠心分離により調製し、血漿中のＩＬ−１βレベルを、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により決定した。マウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ１３Ａ７を、ネガティブコントロールとして使用した。
【図１７】Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。濃度１μg/ml  ＮｂでのマウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  １４Ｄ５−１４Ｄ５、Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７又はヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  ３ｃ２３−３ｃ２３（ネガティブコントロール）の存在におけるＣａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷したマウスＰ２Ｘ７トランスフェクトＨＥＫ細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。６０秒間にわたる平衡化後、細胞を、最終濃度２５０μm又は１mMまで細胞外ＡＴＰに曝露し、２分後、濃度５μmでＣａ２＋イオノフォアイオノマイシンに曝露した。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。
【図１８】Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ媒介性カルシウム流入を逆転し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを誘導及び強化する。Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷したマウスＰ２Ｘ７トランスフェクトＨＥＫ細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。６０秒間にわたる平衡化後、細胞を、最終濃度２μg/ml  ＮｂまでのマウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  １４Ｄ５−１４Ｄ５、Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７又はヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  ３ｃ２３−３ｃ２３を用いた処理前２分間にわたり、示した濃度のＡＴＰを用いてインキュベートした。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。
【図１９】Ｎｂ１３Ａ７は、マウス腹腔マクロファージにおけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入をし、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。マウス腹腔マクロファージを、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した（BD FACS Canto）。細胞を洗浄し、Ｐ２Ｘ７強化Ｎｂ  １４Ｄ５又はＰ２Ｘ７拮抗的Ｎｂ  １３Ａ７（１μg／５００μl）の非存在（溶媒）又は存在において、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋添加のＰＢＳ（Invitrogen）中に再懸濁した。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。１２０秒間にわたる平衡化後、細胞を、示した濃度の細胞外ＡＴＰに曝露し、２分後、最終濃度１μmまでＣａ２＋イオノフォアイオノマイシンへ曝露した。
【図２０ａ】Ｎｂ１３Ａ７は、腹腔マクロファージによるＩＬ−１βのプロセシング及び分泌を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。野生型又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのヘパリン化血液を、一価Ｎｂ（１μg／２００μl）  １４Ｄ５、１３Ａ７、又は溶媒の存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いて、示した最終濃度までのＡＴＰの添加及び３０分間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、インキュベートした。ａ）サンプルを遠心分離し、血漿中のＩＬ−１βレベルをＥＬＩＳＡ（Biolegend）により分析した。
【図２０ｂ】Ｎｂ１３Ａ７は、腹腔マクロファージによるＩＬ−１βのプロセシング及び分泌を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。野生型又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのヘパリン化血液を、一価Ｎｂ（１μg／２００μl）  １４Ｄ５、１３Ａ７、又は溶媒の存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いて、示した最終濃度までのＡＴＰの添加及び３０分間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、インキュベートした。ｂ）赤血球を溶解し、血液白血球を、２つの工程において、最初に、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ−６Ｃ、及びＬｙ−６Ｇについての蛍光標識結合ｍＡｂを用いて染色した。細胞を、次に、プロＩＬ−１β（e-Bioscience）についてのさらなる染色前に、固定（２%  ＰＦＡ）及び透過処理（０．３%サポニン及び０．１%ＢＳＡを含むＰＢＳ）した。フローサイトメトリー分析を実施し（BD FACS Canto）、ゲーティングをＣＤ１１ｂ＋  ＬＹ−６Ｃｈｉ単球上で実施した。
【図２１ａ】Ｎｂ  １３Ａ７は、細胞外ＡＴＰ又はＮＡＤ＋に応答して、Ｙａｃ−１マウスリンパ腫細胞によるＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。マウスＹａｃ−１リンパ腫細胞上でのＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を、１３Ａ７（ａ）、１４Ｄ５（ｂ）、又はコントロールＮｂの存在における、ＡＴＰ又はＮＡＤ＋を用いた、３７℃で２０分間にわたる細胞の処理に続く、フローサイトメトリーによりモニターした。使用したＡＴＰ及びＮＡＤ＋の濃度は、これらの細胞におけるＰ２Ｘ７の活性化のための閾値上の（ａ）及び下の（ｂ）であった（それぞれ、（ａ）における１００μM及び２０μMならびに（ｂ）における３０μM及び１．５μM）。
【図２１ｂ】Ｎｂ  １３Ａ７は、細胞外ＡＴＰ又はＮＡＤ＋に応答して、Ｙａｃ−１マウスリンパ腫細胞によるＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。マウスＹａｃ−１リンパ腫細胞上でのＣＤ６２Ｌの細胞表面発現を、１３Ａ７（ａ）、１４Ｄ５（ｂ）、又はコントロールＮｂの存在における、ＡＴＰ又はＮＡＤ＋を用いた、３７℃で２０分間にわたる細胞の処理に続く、フローサイトメトリーによりモニターした。使用したＡＴＰ及びＮＡＤ＋の濃度は、これらの細胞におけるＰ２Ｘ７の活性化のための閾値上の（ａ）及び下の（ｂ）であった（それぞれ、（ａ）における１００μM及び２０μMならびに（ｂ）における３０μM及び１．５μM）。
【図２２】Ｎｂ  １３Ａ７は、細胞外ＡＴＰ又はＮＡＤ＋に応答して、マウスＴ細胞によるＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。ＣＤ３及びＣＤ６２Ｌについての染色前に、１４Ｄ５、１３Ａ７、又はコントロールＮｂの存在において、２００μM  ＡＴＰ又は５０μM  ＮＡＤ＋を用いた、３７℃で２０分間にわたり処理した脾細胞のフローサイトメトリー分析。コントロール細胞を、ＡＴＰ又はＮＡＤの非存在において、溶媒（ｓｏｌ）中で、４℃で、インキュベートした。
【００７２】
詳細な説明
免疫グロブリン配列、例えば抗体及びそれらに由来する抗原結合フラグメント（例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、研究及び治療的適用においてそれらのそれぞれの抗原を特異的に標的にするために用いられる。免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、例えば、ＶＨＨなど）の生成は、実験動物（例えばラマなど）の免疫、免疫組織からのファージライブラリーの構築、抗原結合免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージの選択、ならびに所望の特異性についての前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングを含みうる（ＷＯ９４／０４６７８）。あるいは、同様の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、例えば、ｄＡｂなど）を、天然又は合成ライブラリーから直接的に抗原結合免疫グロブリン単一可変ドメインをディスプレイするファージを選択すること、ならびに、その後の、所望の特異性について前記ドメイン及びそれらの操作コンストラクトのスクリーニングにより生成することができる（Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-6; Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490;ならびに、例えば、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願）。残念なことに、モノクローナル及び／又は重く操作された抗体の使用は、また、高い製造コストを要し、他の戦略と比較し、最適以下の腫瘍浸潤をもたらしうる。
【００７３】
本発明は、特定のポリペプチドに関し、また、以下を含む、又は、より好ましくは、本質的にそれらからなる、「本発明のポリペプチド」又は「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「本発明のＩＳＶ」として言及される：（ｉ）１つの免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる第１構築ブロック（ここで、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７に対して向けられる）；（ｉｉ）場合により、免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる又はそれを含む第２構築ブロック（ここで、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７に対して向けられる）；及び（ｉｉｉ）場合により、免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれから本質的になる第３構築ブロック（ここで、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、血清アルブミン及び特にヒト血清アルブミンに対して向けられる（及び、さらにより好ましくは、ここで、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ａｌｂ８又はＡｌｂ１１（本明細書において定義する通り）である））。さらに、本発明は、また、そのようなポリペプチドをコードする核酸に；そのようなポリペプチドを調製するための方法に；そのようなポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に；そのようなポリペプチド、核酸、及び／又は宿主細胞を含む組成物に及び特に医薬的組成物に；ならびに、予防的、治療的、又は診断的な目的のための、そのようなポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び／又は組成物の使用に関する。本発明の他の局面、実施態様、利点、及び適用は、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
【００７４】
この試験において、種々の抗Ｐ２Ｘ７ナノボディが開発され、炎症性疾患（腎炎を含む）の診断及び治療におけるそれらの潜在能について特徴付けた。
【００７５】
定義
他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは、当業者に明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 2nd Ed.)Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、F. Ausubel et al.（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987）、Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985）、Old et al.（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981);Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001）、Roitt et al.（Roitt's Essential Immunology (10th Ed.)Blackwell Publishing, UK, 2001）、及びJaneway et al.（Immunobiology (6th Ed.)Garland Science Publishing/ChurChill Livingstone, New York, 2005）、ならびに本明細書において引用する一般的な背景技術が参照される。
【００７６】
他に示さない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及びマニピュレーションを実施することができ、それ自体が公知の様式において実施されており、当業者に明かであろう通りである。例えば、再び、標準的なハンドブック及び本明細書において言及される一般的な背景技術に、ならびに、本明細書において引用するさらなる参考文献に；ならびに、例えば、以下のレビュー、Presta（Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006）、Levin and Weiss （Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006）、Irving et al.（J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001）、Schmitz et al.（Placenta 21 Suppl.A: S106-12, 2000）、Gonzales et al.（Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005）が参照され、それらは、タンパク質工学のための技術、例えば親和性成熟ならびにタンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術などを記載する。
【００７７】
用語「配列」は、本明細書において使用する通り（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、「ポリペプチド配列」、又は「タンパク質配列」などの用語において）、一般的に、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、関連するアミノ酸配列ならびに同をコードする核酸又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解すべきである。
【００７８】
アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードに従って示されうる。ＷＯ０８／０２００７９の４８ページの表Ａ−２が参照される。
【００７９】
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応培地又は培養培地と比較し、それが、それが、通常、前記の供給源又は培地中で関連付けられる少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの混入物質、不純物、もしくは微量成分から分離されている場合、「（本質的に）単離された（形態）（における）」であると考えられる。特に、核酸又はアミノ酸は、それが、少なくとも２倍、詳細には、少なくとも１０倍、さらに詳細には、少なくとも１００倍、及び１０００倍まで又はそれ以上で精製されている場合、「（本質的に）単離された」を考える。「（本質的に）単離された形態において」である核酸又はアミノ酸は、好ましくは、本質的に均質であり、適した技術、例えば適したクロマトグラフィー技術など、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などを使用して決定される通りである。
【００８０】
ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を、別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」、又は別のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列「から本質的になる」と言う場合、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、最初に言及したヌクレオチド又はアミノ酸配列にそれぞれ組み入れられていることを意味するが、しかし、通常は、これは、一般的に、最初に言及したヌクレオチド又はアミノ酸配列が、その配列内に、最初に言及した配列が、実際に、どのように生成された又は得られたかとは無関係に、同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ後者の配列として有する、ヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチをそれぞれ含むことを意味する。非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言う場合、これは、前記の免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み入れられていることを意味しうるが、しかし、より通常は、これは、一般的に、本発明のポリペプチドが、その配列内に、前記の本発明のポリペプチドがどのように生成された又は得られたかとは無関係に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸又はヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言う場合、最初に言及した核酸又はヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例えば、ポリペプチド）中に発現される場合、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、前記の発現産物の部分を形成するようにする（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及した、より大きな核酸又はヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム中にある）。
【００８１】
「から本質的になる」は、本発明の方法において使用する免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドと厳密に同じある、又は、限定された数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基、例えば、１〜１０アミノ酸残基及び、好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、又は６アミノ酸残基（免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端に、カルボキシル末端に、又はアミノ末端及びカルボキシル末端の両方に加えられた）を有するポリペプチドに対応することを意味する。
【００８２】
２つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを、［第２ヌクレオチド配列中の対応する位置でのヌクレオチドと同一である第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を、［第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、ここで、第２ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１ヌクレオチド配列と比較し）は、単一ヌクレオチド残基（位置）での違いとして考えられる。あるいは、２つ又はそれ以上のヌクレオチド配列の間での配列同一性の程度は、配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズム（例えばNCBI Blast v2.0など）を使用し、標準的な設定を使用して算出してもよい。配列同一性の程度を決定するための一部の他の技術、コンピューターアルゴリズム、及び設定は、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＥＰ０９６７２８４、ＥＰ１０８５０８９、ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ９８／４９１８５、及びＧＢ２３５７７６８において記載されている。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のヌクレオチドを伴うヌクレオチド配列を、「第１」ヌクレオチド配列として取りうるが、他方のヌクレオチド配列は、「第２」ヌクレオチド配列として取りうる。
【００８３】
２つ又はそれ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」（また、本明細書において「アミノ酸同一性」として言及される）のパーセンテージを、［第２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸残基と同一である第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、ここで、第２アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１アミノ酸配列と比較し）は、単一アミノ酸残基（位置）での違いとして、即ち、本明細書において定義する通りの「アミノ酸の違い」として考えられる。あるいは、２つのアミノ酸配列の間での配列同一性の程度を、公知のコンピューターアルゴリズム（例えば、ヌクレオチド配列についての配列同一性の程度を決定するための、上に言及するものなど）を使用し、再び、標準的な設定を使用し、算出してもよい。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を伴うアミノ酸配列を、「第１」アミノ酸配列として取りうるが、他方のアミノ酸配列は、「第２」アミノ酸配列として取りうる。
【００８４】
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れうるが、それは、一般的に、アミノ酸残基が、同様の化学的構造の別のアミノ酸残基を用いて置換されており、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対する影響がほとんどない又は本質的にない、アミノ酸置換として記載することができる。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野において、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＧＢ３３５７６８、ＷＯ９８／４９１８５、ＷＯ００／４６３８３、及びＷＯ０１／０９３００から周知であり；ならびに、そのような置換の（好ましい）型及び／又は組み合わせは、ＷＯ０４／０３７９９９ならびにＷＯ９８／４９１８５からの及び本明細書において引用するさらなる参考文献からの関連のある教示に基づいて選択されうる。
【００８５】
そのような保存的置換は、好ましくは、ここで、以下の群（ａ）−（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸により置換されている置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｂ）極性、負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｃ）極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎに又はＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに、又はＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに、又はＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに、又はＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；ならびに／あるいはＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに、又はＬｅｕに。
【００８６】
本明細書において記載するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、また、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーションの頻度の分析に、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978により開発された潜在能を形成する構造の分析に、ならびにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984;Kyte & Doolittle;J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986により開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づきうる（全てが、本明細書において、それらの全体において、参照により組み入れられる）。ナノボディの一次、二次、及び三次構造に関する情報は、本明細書における記載において及び上に引用する一般的な背景技術において与える。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; 及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)により与えられる。従来のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬ接触面及び潜在的なラクダ化置換をこれらの位置で形成するアミノ酸残基の一部に関するさらなる情報を、上に引用する先行技術において見出すことができる。
【００８７】
アミノ酸配列及び核酸配列は、それらが、それらの全長にわたり１００%配列同一性（本明細書において定義する通り）を有する場合、「厳密に同じ」であると言う。
【００８８】
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の違い」は、第２配列と比較した、第１配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１、２、又はそれ以上のそのようなアミノ酸の違いを含みうることが理解されている。さらに詳細には、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸の違い」は、それぞれａ）、ｄ）、又はｇ）のＣＤＲ配列と比較し、ｃ）、ｆ）、又はｉ）において指定するＣＤＲ配列の位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指し；ｃ）、ｆ）、及びｉ）のＣＤＲ配列が、それぞれａ）、ｄ）、又はｇ）のＣＤＲ配列（上記）と比較し、１、２、又は最大３つのそのようなアミノ酸の違いを含みうる。
【００８９】
「アミノ酸の違い」は、１、２、又は最大３つの置換、欠失、もしくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせでありうるが、それは、本発明のポリペプチドの特性を改善する、あるいは、本発明のポリペプチドの所望の特性から又は所望の特性のバランスもしくは組み合わせを少なくとも過剰に損なわない。この点において、本発明の結果として得られるポリペプチドは、１つ以上のＣＤＲ配列を含むが、１、２、又は最大３つの置換、欠失、もしくは挿入を伴わないポリペプチドと比較し、同じ、ほとんど同じ、又はより高い親和性を伴い、Ｐ２Ｘ７に少なくとも結合すべきであり、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される通りである。
【００９０】
この点において、ｃ）、ｆ）、及び／又はｉ）に従ったアミノ酸配列は、それ自体が公知の（上記の）親和性成熟の１つ以上の技術を使用した親和性成熟を用いて、それぞれａ）、ｄ）、及び／又はｇ）に従ったアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列でありうる。
【００９１】
例えば、また、そのような欠失及び／又は置換は、本発明のポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に依存し、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば１つ以上のグリコシル化部位など）を除去するように設計されうるが、当業者の能力内であろう通りである。
【００９２】
用語「エピトープ」及び「抗原決定基」は、それらは互換的に使用することができ、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又はポリペプチドなど）により、さらに詳細には、前記分子の抗原結合部位により認識される、マクロ分子（例えばポリペプチド又はタンパク質など）の部分を指す。エピトープは、免疫グロブリンのための最小結合部位を定義し、このように、免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
【００９３】
エピトープを認識する抗原結合分子の部分（例えば本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又はポリペプチドなど）は、「パラトープ」と呼ばれる。
【００９４】
特定のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は、その少なくとも１つの部分、フラグメント、又はエピトープについて）「に結合する」又は「に特異的に結合する」ことができる、「について親和性を有する」及び／又は「について特異性を有する」ポリペプチド（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は、一般的に、抗原結合分子もしくはそのフラグメントなど）は、前記エピトープ、抗原、又はタンパク質「に対する」又は「に対して向けられた」と言い、あるいは、そのようなエピトープ、抗原、又はタンパク質に関して「結合」分子である、あるいは「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例えば、「抗」Ｐ２Ｘ７）であると言う。
【００９５】
用語「特異性」は、ＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページのパラグラフｎ）において、それに与えられる意味を有する；及び、本明細書において言及する通り、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）分子が結合することができる異なる型の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、ＷＯ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）の５３〜５６ページに記載される通り、親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができ、それは、また、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）と関連抗原の間の結合を測定するための一部の好ましい技術を記載する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）は、それらの抗原に、１０−５〜１０−１２モル／リットル又はそれ以下、及び、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル又はそれ以下、及び、好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（即ち、１０５〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、及び、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル又はそれ以上、及び、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）結合しうる。１０４モル／リットル（又は１０４Ｍ−１より低い任意のＫＡ値）リットル／モルより大きい任意のＫＤ値は、一般的に、非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、所望の抗原に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば、１０と５nMの間又はそれ以下などで結合する。抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的な結合は、それ自体が公知の任意の適した様式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイなど）及び当技術分野においてそれ自体が公知のその異なるバリアント；ならびに本明細書において言及する他の技術において決定することができる。当業者に明かであろう通り、及びＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページに記載される通り、解離定数は、実際の又は見かけ上の解離定数でありうる。解離定数を決定するための方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６ページに言及される技術を含む。
【００９６】
免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、第１抗原に、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２標的又は抗原に結合する親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍、及び、１００００倍まで又はそれ以上良い親和性（上に記載する通りで、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度、及び／又はＫｏｎ速度として適切に表現される）を用いて結合する場合、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原について「特異的」であると言う。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２標的又は抗原に結合するＫＤよりも、少なくとも１０倍少ない、例えば少なくとも１００倍少ない、及び、好ましくは、少なくとも１０００倍少ない、例えば１０．０００倍少ない又はそれよりさらに少ないＫＤ値で第１標的又は抗原に結合しうる。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドが、第２標的又は抗原と比較し、第１標的又は抗原に「特異的」である場合、それは、前記の第２標的又は抗原に対してではなく、前記の第１標的又は抗原に対して向けられる（本明細書において定義する通り）。
【００９７】
用語「（交差）遮断する」、「（交差）遮断した」、「（交差）遮断している」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合している」、及び「（交差）競合」を本明細書において互換的に使用し、所与の標的への他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤の結合を妨げる、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、標的への別のものの結合と干渉することができる範囲は、従って、それが、本発明に従って交差遮断すると言うことができるか否かを問わず、競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの特に適した定量的な交差遮断アッセイでは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の範囲を測定することができるBIAcore機器を使用する。別の適した定量的な交差遮断アッセイでは、標的へのそれらの結合という点で、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の間での競合を測定するためのＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
【００９８】
以下では、一般的に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従って交差遮断する又は交差遮断することが可能であるかを決定するための適したBIAcoreアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが認められるであろう。BIAcore機器（例えば、BIAcore 3000）は、製造者の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイにおいて、標的タンパク質（例えば、Ｐ２Ｘ７）は、ＣＭ５  BIAcoreチップに、標準的なアミンカップリング化学を使用して結合され、標的によってコートされている表面が生成される。典型的には、標的の２００〜８００共鳴単位によってチップに結合させうる（簡単に測定可能な結合レベルであるが、しかし、使用されているテスト試薬の濃度により容易に飽和可能である量）。互いに交差遮断するそれらの能力について評価すべき２つのテスト結合薬剤（Ａ＊及びＢ＊と名付ける）を、適した緩衝液中での結合部位の１対１モル比で混合し、テスト混合物を作製する。結合部位ベースで濃度を算出する場合、結合薬剤の分子量は、その結合薬剤上の標的結合部位の数により割った結合薬剤の全分子量であると仮定される。テストミックス中の各々の結合薬剤の濃度は、BIAcoreチップ上に捕捉された標的分子上のその結合薬剤についての結合部位を容易に飽和させるために十分に高いはずである。混合物中の結合薬剤は同じモル濃度（結合ベースで）であり、その濃度は、典型的には、１．００と１．５マイクロモル（結合部位ベースで）の間でありうる。Ａ＊単独及びＢ＊単独を含む別々の溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、同じ緩衝液中で、テストミックス中と同じ濃度であるべきである。テスト混合物を、標的コートBIAcoreチップの上に通し、結合の全量を記録する。チップを、次に、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤を除去するような方法において処理する。典型的には、これは、チップを、３０mM  ＨＣｌを用いて、６０秒間にわたり処理することにより行う。Ａ＊単独の溶液を、次に、標的コート表面の上に通し、結合の量を記録する。チップを再び処理し、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤の全てを除去する。Ｂ＊単独の溶液を、次に、標的コート表面の上に通し、結合の量を記録する。Ａ＊及びＢ＊の混合物の最大理論的結合を次に算出し、標的表面単独の上を通した場合での各々の結合薬剤の結合の合計である。混合物での実際の記録された結合が、この理論的最大値未満である場合、次に、２つの結合薬剤は、それぞれ交差遮断すると言う。このように、一般的に、本発明に従った、交差遮断する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、上のBIAcore交差遮断アッセイにおいて標的に結合するであろうものであり、アッセイの間に、及び第２免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の存在において、記録された結合が、２つの免疫グロブリンの最大理論的結合の８０%〜０．１%（例えば、���０%〜４%）の間、特に、最大理論的結合の７５%〜０．１%（例えば、７５%〜４%）の間、より特に、最大理論的結合（ちょうど上に定義する通り）の７０%〜０．１%（例えば、７０%〜４%）の間であるようにする。上に記載するBIAcoreアッセイは、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従い、互いに交差遮断するか否かを決定するために使用される一次アッセイである。稀な場合では、特定の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、アミン化学を介して、ＣＭ５  BIAcoreチップに結合させた標的に結合しないであろう（これは、通常、標的上の関連する結合部位が、チップへの結合によりマスク又は破壊される場合に生じる）。そのような場合において、交差遮断は、標的のタグ付きバージョン、例えば、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きバージョンを使用して決定することができる。この特定のフォーマットにおいて、抗Ｈｉｓ抗体は、BIAcoreチップに結合されうるが、次に、Ｈｉｓタグ付き標的は、チップの表面の上を通し、抗Ｈｉｓ抗体により捕捉されうる。交差遮断分析は、本質的に上に記載する通りに行いうる（各々のチップ再生サイクル後、新たなＨｉｓタグ付き標的を、抗Ｈｉｓ抗体コート表面上に戻し充填しうることを除く）。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付き標的を使用して与えられた例に加えて、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き標的を代わりに使用することができる。さらに、当技術分野において公知である種々の他のタグ及びタグ結合タンパク質の組み合わせを、そのような交差遮断分析のために使用することができる（例えば、抗ＨＡ抗体を伴うＨＡタグ；抗ＦＬＡＧ抗体を伴うＦＡＬＧタグ；ストレプトアビジンを伴うビオチンタグ）。
【００９９】
以下は、一般的に、標的（例えば、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本明細書において定義する通り、交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを記載する。このアッセイは、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかについて使用することができることが認められるであろう。アッセイの一般的な原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートされた標的に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤を有することである。第２の、潜在的に交差遮断する、抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドの過剰量を、溶液中に加える（即ち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していない）。限定された量の標的を、次に、ウェルに加える。コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド及び溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドは、限定された数の標的分子の結合について競合する。プレートを洗浄し、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドにより結合されていない過剰な標的を除去し、また、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドならびに第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドと標的の間に形成された任意の結合体を除去する。結合した標的の量を、次に、標的を検出するために適切である試薬を使用して測定する。コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドを交差遮断することができる溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドが結合することができる標的分子の数を、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドが、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドの非存在において結合することができる標的分子の数と比べ、減少させることができる。第１免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド（例えば、Ａｂ−Ｘ）が、固定化された免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドとして選定され、それは、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコートされる。その後、プレートを、適したブロッキング溶液を用いてブロックし、その後に加えられた試薬の非特異的結合を最小限にする。１ウェル当たりのＡｂ−Ｙ標的結合部位のモルが、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングの間に１ウェル当たりに使用されたＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも１０倍高いように、第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド（例えば、Ａｂ−Ｙ）の過剰量を、次に、ＥＬＩＳＡプレートに加える。する。次に、標的を、加え、１ウェル当たりの標的のモルが、各々のウェルをコートするために使用されたＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも２５倍低いようにする。適したインキュベーション期間に続き、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出するための試薬を加え、コートされた抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）により特異的に結合された標的の量を測定する。アッセイについてのバックグラウンドシグナルは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｙ）、標的緩衝液だけ（即ち、標的を伴わない）、及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。アッセイについての陽性コントロールシグナルは、コートされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチド（この場合においてＡｂ−Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド緩衝液だけ（即ち、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドを伴わない）、標的及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性コントロールシグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍であるように、実行してもよい。コーティングする免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドとして使用するための及び第２の（コンペティター）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドとして使用するための免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドの選択から結果として得られる任意のアーチファクト（例えば、標的についてのＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙの間の有意に異なる親和性）を回避するために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットにおいて実行しうる：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドであり、Ａｂ−Ｙが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドである場合であり、及び、２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドであり、Ａｂ−Ｘが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドである場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１において又はフォーマット２において、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドが、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドの非存在（即ち、陽性コントロールウェル）において得られた標的検出シグナルと比較し、標的検出シグナル（即ち、コートされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はポリペプチドにより結合された標的の量）の６０%〜１００%の間、特に７０%〜１００%の間、より特に８０%〜１００%の間の低下を起こすことができる場合、交差遮断するとして定義される。
【０１００】
「エピトープビニング」は、免疫グロブリンの対、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤を同定するための競合結合アッセイ又は交差遮断アッセイの使用を指し、それらは、標的（例えば、Ｐ２Ｘ７）に同時に結合することが可能である、又は可能ではなく、それにより、同じ又は重複するエピトープに結合する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤を、標的上で同定する。
【０１０１】
「エピトープビン」は、本明細書において使用する通り、従って、同じ又は重複する結合特異性を有する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のファミリーである。上に記載する通り、エピトープビン中への免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の選別は、抗原結合についての、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の交差競合（交差遮断）に基づく。交差競合（交差遮断）アッセイによって、抗原への免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の同時結合（対合）を分析し、類似の対合プロファイルを伴う免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤を一緒にグループ化する。類似のプロファイルを伴う（即ち、同じエピトープビンに属する）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、同じ、密接に関連した、及び／又は重複エピトープに結合しうる。
【０１０２】
アミノ酸配列は、２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミン、例えば異なる哺乳動物からのＰ２Ｘ７など）について、それが、これらの異なる抗原又は抗原決定基の両方について特異的（本明細書において定義する通り）である場合、「交差反応性」であると言う（）。
【０１０３】
本明細書において使用する通り、「に特異的に結合することができる」及び「に特異的に結合する」を同義で使用し、それぞれの示した実体に特異的に結合するための能力を指す。
【０１０４】
用語「Ｐ２Ｘ７」は、本明細書において使用する通り、（ホモ）三量体細胞外ＡＴＰゲートカチオンチャネル「Ｐ２Ｘ７受容体」、特に、配列番号１〜５により表されるタンパク質、ならびに、そのアイソフォームの全て、特に配列番号１〜３及びそのアイソフォームを形成するタンパク質を指す。（ヒト）アイソフォームは、全てのスプライスバリアント（例えば、Ｐ２Ｘ７（ｂ）−Ｐ２Ｘ７（ｋ））、ならびに、ヒトＰ２Ｘ７受容体において同定された全ての単一ヌクレオチド多型を含み、代替Ｎ末端及び膜貫通ドメイン１（全て、当技術分野において公知、例えば、Cheewatrakoolpong et al.(2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 17-27及びFeng et al.(2006) J. Biol. Chem.281, 17228-17237を参照のこと）を含む。Ｐ２Ｘ７受容体のゲーティングは、インフラマソームの及び細胞表面メタロプロテアーゼの活性化を誘導する。
【０１０５】
本発明のポリペプチドの用語「効力」は、本明細書において使用する通り、その特定の効果が生じるために要求される、所定量の本発明のポリペプチドの機能である。それは、そのポリペプチドについてのＩＣ５０の逆として単純に測定される。それは、Ｐ２Ｘ７活性を中和するための、本発明の前記ポリペプチドの能力を指す；Ｐ２Ｘ７活性を調節、阻害、及び／又は防止し、Ｐ２Ｘ７活性により誘導される組織損傷の誘発を調節、阻害、及び／又は防止するようにする。
【０１０６】
効力は、当技術分野において公知の又は本明細書において記載する、任意の適したアッセイにより測定されうる（例えば、実施例のセクションにおいて記載される通り、など）。
【０１０７】
対照的に、本発明のポリペプチドの「有効性」は、効果自体の最高強度を、飽和ポリペプチド濃度で測定する。効力は、本発明のポリペプチドから達成可能な最高応答を示す。それは、所望の（治療的）効果を産生するためのポリペプチドの能力を指す。
【０１０８】
本発明の文脈において、「調節している」又は「調節すること」は、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）ならびにそのアイソフォームの活性を増加、促進、又は増強することを意味し、適したインビトロ、細胞、又はインビボアッセイ（例えば、本明細書において言及するものなど）を使用して測定される通りである。特に、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）の活性を、同じ条件下の同じアッセイ（しかし、本発明のポリペプチドの存在を伴わない）におけるＰ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）の活性と比較し、少なくとも１%、好ましくは少なくとも５%、例えば、少なくとも１０%又は少なくとも２５%だけ、例えば、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、あるいは９０%又はそれ以上だけ低下又は阻害することは、適したインビトロ、細胞、又はインビボアッセイ（例えば、本明細書において言及するものなど）を使用して測定される通りである。
【０１０９】
調節は、例えば、Ｐ２Ｘ７受容体への細胞外ＡＴＰの結合を低下又は阻害すること、あるいは、Ｐ２Ｘ７受容体のＡｒｇ  １２５でのＮＡＤ依存的ＡＤＰリボシル化を阻害することを含みうる。調節は、例えば、Ｐ２Ｘ７受容体によるゲーティングを低下又は阻害することを含みうる。Ｐ２Ｘ７受容体のゲーティングは、インフラマソームの活性化、細胞表面メタロプロテイナーゼの活性化、ＴＡＣＥによるエクトドメイン切断放出、ホスファチジルセリンの外在化、及び／又はアポトーシスを誘導する。
【０１１０】
あるいは、調節は、Ｐ２Ｘ７受容体によるゲーティングを増加、強化、又は増強することを含みうる。
【０１１１】
本発明のポリペプチドの半減期は、一般的に、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ上のパラグラフｏ）において記載される通りに定義することができ、本明細書において言及する通り、ポリペプチドの血清濃度が、、インビボで、例えば、自然の機構による、ポリペプチドの分解及び／又はポリペプチドのクリアランスもしくは隔離に起因して５０%低下するために要する時間を指す。本発明のポリペプチドのインビボでの半減期を、それ自体が公知の任意の様式において、例えば薬物動態分析により決定することができる。適した技術が当業者に明らかであろうが、例えば、一般的には、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ上のパラグラフｏ）において記載される通りでありうる。また、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ上のパラグラフｏ）において言及される通り、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などを使用して表すことができる。例えば、標準的なハンドブック、例えばKenneth et al.（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986）及びM Gibaldi and D Perron（"Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982）などが参照できる。用語「半減期の増加」又は「増加した半減期」は、また、ＷＯ０８／０２００７９の５７ページ上のパラグラフｏ）において定義される通りであり、特に、ｔ１／２ベータにおける増加（ｔ１／２アルファ及び／又はＡＵＣあるいは両方における増加を伴う又は伴わない）を指す。
【０１１２】
他に示さない限り、用語「免疫グロブリン」は、本明細書において重鎖抗体に又は従来の４鎖抗体に言及するために使用されるかにかかわらず、一般的な用語として使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（しかし、限定しないが、抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなど）の両方を含む。
【０１１３】
用語「ドメイン」（ポリペプチド又はタンパク質の）は、本明細書において使用する通り、その三次元構造を、タンパク質の残りに非依存的に保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性に関与し、多くの場合において、他のタンパク質に、タンパク質の及び／又はドメインの残部の機能の喪失を伴わず、加えられたり、除去されたり、又は移されたりしてもよい。
【０１１４】
用語「免疫グロブリンドメイン」は、本明細書において使用する通り、抗体鎖（例えば、従来の４鎖抗体の又は重鎖抗体の鎖など）の球状領域、又はそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持する点において特徴付けられ、それは、２つのベータ−シート中に配置された約７つの逆平行ベータ−ストランドの２層サンドイッチからなり、場合により、保存されたジスルフィド結合により安定化される。
【０１１５】
用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書において使用する通り、４つのフレームワーク領域から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは、当技術分野において、本明細書において下に、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及される。それらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断され、  それらは、当技術分野において、及び、本明細書において下に、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及される。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下の通りに示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原結合部位を持つことにより、抗原についての特異性を、抗体に、与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【０１１６】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、「単一可変ドメイン」と互換可能に使用され、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、及びそれにより形成される分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメントから離れて設定し、ここで、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインは、相互作用し、抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、相互作用し、抗原結合部位を形成する。この場合において、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合部位に寄与しうる。即ち、合計６つのＣＤＲが、抗原結合部位形成に含まれうる。
【０１１７】
上の定義の観点において、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当技術分野において公知である）又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド連結したＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はそのような従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（全てが当技術分野において公知である）の抗原結合ドメインは、正常には、免疫グロブリン単一可変ドメインとして見なされないであろう。なぜなら、これらの場合において、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、正常には、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインにより生じないであろうが、しかし、（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽及び重鎖可変ドメインなどの対により、即ち、免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ対（それは、それぞれの抗原のエピトープに合同で結合する）により生じうるからである。
【０１１８】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することを伴わず、抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ、ＶＨＨ、又はＶＬドメインにより形成される。故に、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３を上回らないＣＤＲにより形成される。
【０１１９】
そのようなものとして、単一の可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその適したフラグメント；又は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適したフラグメントでありうる；それが、単一の抗原結合単位（即ち、単一の可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位で、単一の抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用し、機能的な抗原結合単位を形成する必要がないようにする）を形成することが可能である限り。
【０１２０】
本発明の一実施態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列でありうる。
【０１２１】
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は、（単一）ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又は、ｄＡｂとしての使用のために適しているアミノ酸）又はナノボディ（本明細書において定義する通りで、しかし、限定しないが、ＶＨＨを含む）；他の単一可変ドメイン、又はそれらの任意の１つの任意の適したフラグメントでありうる。
【０１２２】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（登録商標）（本明細書において定義する通り）又はその適したフラグメントでありうる。［注意：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）、及びナノクローン（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．の登録商標である］ナノボディの一般的な記載について、参照が、下のさらなる記載に、ならびに本明細書において引用する、例えば、例えば、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）において記載される先行技術に作られる。
【０１２３】
「ＶＨＨドメイン」は、また、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体として公知であり、本来は、「重鎖抗体」の（即ち、「軽鎖の欠けた抗体」の；Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。用語「ＶＨＨドメイン」が、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（それらは、本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」として言及される）から、及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（それらは、本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」として言及される）から区別するために選ばれている。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる記載については、Muyldermansによるレビュー文献（Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001におけるレビュー）に、ならびに以下の特許出願が参照され、それらは、一般的な背景技術として言及される：Vrije Universiteit BrusselのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、及びＷＯ９６／３４１０３；UnileverのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１、及びＷＯ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、及びＷＯ０３／０５５５２７；Algonomics N.V.及びAblynx N.VのＷＯ０３／０５０５３１；National Research Council of CanadaによるＷＯ０１／９０１９０；Institute of AntibodiesによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；ならびに、Ablynx N.V.によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、及びＷＯ０６／１２２８２５ならびにAblynx N.V.によるさらなる公開特許出願。また、これらの出願において言及されるさらなる先行技術に、特に、国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１〜４３ページ上に言及される参考文献のリストが参照され、そのリスト及び参考文献は、本明細書において、参照により組み入れられる。これらの参考文献において記載される通り、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。ナノボディ（ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化を含む）ならびに他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価コンストラクト（リンカー配列の一部の非限定的な例を含む）及びナノボディ及びそれらの調製物の半減期を増加させるための異なる修飾のさらなる記載が、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４において見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な記載について、本明細書において引用する、例えば、例えば、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）において記載される先行技術が参照される。
【０１２４】
「ドメイン抗体」は、また、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」、及び「ｄＡｂ」（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」は、商標として、企業のGlaxoSmithKlineグループにより使用されている）として公知であり、例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ward et al.（Nature 341: 544-546, 1989）、Holt et al.（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）及びＷＯ０３／００２６０９ならびに、例えば、ＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びDomantis Ltdの他の公開特許出願において記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ哺乳動物、特に、ヒト４鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合ドメインとして（即ち、ＶＬ又はＶＨドメインとそれぞれ対合することなく）エピトープに結合するために、そのような抗原結合特性についての特定の選択（例えば、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる）が要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、完全ヒト配列に由来する場合、約１３〜約１６kDaの分子量を有し、例えば、ヒトにおける治療的使用のためのヒト化を要求しない。
【０１２５】
それらが哺乳動物由来ではないため、本発明の文脈においてあまり好ましくないが、単一の可変ドメインが、サメの特定の種に由来しうることにも注意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、ＷＯ０５／１８６２９を参照のこと）。
【０１２６】
このように、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一の可変ドメイン」は、非ヒト供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載された通りに、ヒト化してもよい。さらに、この用語は、非ラクダ供給源、例えば、マウス又はヒトに由来するポリペプチドを含み、それは「ラクダ化」されており、例えば、Davies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）及びRiechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）において記載されている通りである。
【０１２７】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基に、Kabat et al.（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）により与えられたＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従い番号を付け、ラクダからのＶＨＨドメインに適用された通りであり、例えば、Riechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）の図２において示されている通りである。ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための代替方法は、その方法が、また、類似の様式において、ＶＨＨドメインに適用することができ、当技術分野において公知である。しかし、本明細書の記載、特許請求の範囲、及び図において、他に示さない限り、上に記載された通りにＶＨＨドメインに適用された、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングに従うであろう。
【０１２８】
ＶＨドメインについて及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知である通り、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動しうるが、Ｋａｂａｔナンバリングにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しないであろう（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングに従った１つ以上の位置が、実際の配列において占められないであろう、又は実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングにより許される数よりも多いアミノ酸残基を含みうる）ことに注意すべきである。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに従ったナンバリングが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応しうる又はしないであろうことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０の範囲中、しばしば、１１２と１１５の間にありうる。しかし、より小さい及びより長い配列が、また、本明細書において記載する目的のために適しうることに注意すべきである。
【０１２９】
ＣＤＲ領域の決定は、また、異なる方法に従って行ってもよい。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２が位置３６〜４９にアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２が位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３が位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３が位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、及びＶＨＨのＦＲ４が位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【０１３０】
ＣＤＲ配列は、Kontermann and Dubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp.33-51, 2010）に従って決定されうる。この方法に従い、ＦＲ１は、位置１〜２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、位置２６〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は、位置５０〜５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、位置５９〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、及びＦＲ４は、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【０１３１】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、ヒト化に供することができる。特に、ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、以前のパラグラフにおいて、そのために一般的に定義される免疫グロブリン単一可変ドメインでありうるが、しかし、ここで、少なくとも１つのアミノ酸残基が（及び特にフレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在し、それは、ヒト化置換（本明細書において定義する通り）である及び／又はそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、自然発生するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ以上（又はその組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知の任意の様式において）導入することができ、結果として得られるＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、及び／又は他の所望の特性についてテストすることができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適したヒト化置換（又はその適した組み合わせ）が、当業者により、本明細書における開示に基づき、決定されることができる。また、前述のものに基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
【０１３２】
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディなど（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）は、また、１つ以上の変化を、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列中に導入することにより、親和性成熟に供することができ、それらの変化は、それぞれの親分子と比較し、そのそれぞれの抗原についての結果として得られる免疫グロブリン単一可変ドメインの改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、当技術分野において公知の方法により、例えば、Marks et al.（Biotechnology 10: 779-783, 1992）、Barbas et al.（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shier et al.（Gene 169: 147-155, 1995）、Yelton et al.（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jackson et al.（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkins et al.（J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson and Hawkins（Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）により記載される通りに、調製されうる。
【０１３３】
ポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体又はナノボディなどから開始し、また、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマット化する」として言及される；及び、ポリペプチドの作られた部分である免疫グロブリン単一可変ドメインが、「フォーマット化」される又は前記ポリペプチド「のフォーマット中」にあると言う。免疫グロブリン単一可変ドメインをフォーマット化することができる方法の例及びそのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づき、当業者に明らかであろう；及び、そのようなフォーマット化された免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる局面を形成する。
【０１３４】
例えば及び限定を伴わず、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを、ポリペプチドの調製のための「結合単位」「結合ドメイン」、又は「結合ブロック」（これらの用語は互換可能に使用される）として使用してもよく、それらは、場合により、結合単位（即ち、Ｐ２Ｘ７上の同じもしくは別のエピトープに対する及び／又はＰ２Ｘ７以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質、もしくは標的に対する）として役立ちうる１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。
【０１３５】
一価ポリペプチドは、１つだけの結合単位（例えば、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含む又はそれから本質的になる。１つ以上の結合単位（例えば、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、本明細書において、「多価」ポリペプチドとして言及されうるが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位／免疫グロブリン単一可変ドメインは、また、本明細書において、「多価」フォーマット中にあるとして言及されうる。例えば、「二価」ポリペプチドは、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（場合により、リンカー配列を介して連結されている）を含みうるのに対し、「三価」ポリペプチドは、３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（場合により、２つのリンカー配列を介して連結されている）を含みうる；など。
【０１３６】
多価ポリペプチドにおいて、２つ又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じもしくは異なりうるが、同じ抗原もしくは抗原決定基に対して（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対して、又は異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられうる、あるいは、代わりに、異なる抗原もしくは抗原決定基；又はそれらの任意の適した組み合わせに対して向けられうる。少なくとも１つの結合単位が第１抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられており、少なくとも結合単位が第２抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられている少なくとも２つの結合単位（例えば、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、また、「多特異的」ポリペプチドとして言及されうるが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位（例えば、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）は、また、本明細書において、「多特異的フォーマット」中にあるとして言及されうる。このように、例えば、本発明の「二重特異的」ポリペプチドは、第１抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第２抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三重特異的」ポリペプチドは、第１抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、第２抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第３抗原（例えば、Ｐ２Ｘ７及び第２抗原の両方とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドである。
【０１３７】
「マルチパラトープポリペプチド」、例えば「バイパラトープポリペプチド」又は「トリパラトープポリペプチド」などは、異なるパラトープを各々有する２つ又はそれ以上の結合単位を含む又はそれから本質的になる（本明細書においてさらに記載する通り；本発明の多価ポリペプチドに関するチャプターを参照のこと）。
【０１３８】
Ｐ２Ｘ７
本発明のＩＳＶ及びポリペプチドは、一般的に、Ｐ２Ｘ７へのＡＴＰの結合又は、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７の細胞外ＡＴＰ媒介性活性化を調節ならびに、特に阻害及び／又は防止し（表Ｂ−２を参照のこと）、このように、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）によるゲーティングを調節及び特に阻害もしくは防止する、及び／又は、そのようなゲーティング（Ｐ２Ｘ７構築ブロック）に関連する生物学的機構、応答、及び効果を調節するために使用することができる。好ましくは、本発明のＩＳＶは、１ｃ８１様配列、３ｃ２３様配列、１ｃ１１３様配列、１３ａ７様配列、１４ｄ５様配列からなる群より選ばれる。
【０１３９】
本発明により提供されるアミノ酸配列は、好ましくは、本質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）、又は本発明のタンパク質又はポリペプチドの形態部分（本明細書において定義する通り）中にあり、それは、本発明の１つ以上のアミノ酸配列を含みうる又はそれから本質的になりうるが、それは、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全てが、場合により、１つ以上の適したリンカーを介して連結される）をさらに含みうる。例えば、限定を伴わず、本発明の１つ以上のアミノ酸配列を、そのようなタンパク質又はポリペプチド中の結合単位として使用してもよく、それは、場合により、結合単位（即ち、Ｐ２Ｘ７以外の１つ以上の他の標的に対する）として役立ちうる１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含みうるが、本発明の一価、多価、又は多特異的ポリペプチドをそれぞれ提供するようにし、全てが、本明細書において記載する通りである。そのようなタンパク質又はポリペプチドは、また、本質的に単離された形態でありうる（本明細書において定義する通り）。
【０１４０】
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、そのようなものとして、好ましくは、ジスルフィド架橋を介して、任意の他のアミノ酸配列又は鎖に連結されていない（しかし、１つ以上の分子内ジスルフィド架橋を含みうる又は含まないであろう）単一のアミノ酸鎖から本質的になる。例えば、ナノボディ（本明細書において記載する通り）は、時折、ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２の間にジスルフィド架橋を含みうることが公知である。しかし、本発明の１つ以上のアミノ酸配列が、互いに及び／又は他のアミノ酸配列に（例えば、ジスルフィド架橋を介して）連結され、また、本発明において有用でありうるペプチドコンストラクト（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＳｃＦｖコンストラクト、「ダイアボディ」、及び他の多特異的コンストラクト）を提供しうることに注意すべきである。例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23(9): 1126-36によるレビューを参照できる。
【０１４１】
一般的に、本発明のアミノ酸配列（又は、同を含む化合物、コンストラクト、もしくはポリペプチド）が、被験者への投与のために（例えば、本明細書において記載する通りの、治療的及び／又は診断的目的のために）意図される場合、それは、好ましくは、前記被験者において自然発生しないアミノ酸配列；又は、それが前記被験者において自然発生する場合、本質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）のいずれかである。
【０１４２】
さらに、本発明のアミノ酸配列は、場合により、Ｐ２Ｘ７に対する結合のための少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質、又は標的に対する結合のための１つ以上のさらなる結合部位を含む。
【０１４３】
本記載及び請求項において、以下の用語を、以下の通りに定義する：
Ａ）１Ｃ８１様配列：本明細書において定義する通り、「１Ｃ８１様配列」、「１Ｃ８１様ＩＳＶ」、又は「１Ｃ８１様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義される：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（当技術分野において公知の通り）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１４４】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の抑制により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１４５】
好ましくは、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイを用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１４６】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の抑制により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１４７】
例えば、そのような１Ｃ８１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。特に、１Ｃ８１様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１４８】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１４９】
具体的に好ましい局面において、「１Ｃ８１様配列」、「１Ｃ８１様ＩＳＶ」、又は「１Ｃ８１様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１５０】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１５１】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれ、ｄ）、ｅ）、及びｆ）の下で定義される。再び、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１５２】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１５３】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った１Ｃ８１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、１Ｃ８１様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１５４】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮断により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１５５】
特に好ましい１Ｃ８１様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）である。
【０１５６】
このセクションＡ）に記載する全ての１Ｃ８１様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、１Ｃ８１のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、１Ｃ８１の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として得られる１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１５７】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮断により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１５８】
１つの特定の局面において、１Ｃ８１様配列は、配列番号６と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%など、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った１Ｃ８１様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうるが、特に（しかし、限定を伴わず）ＲＴＦＳＦＳＴＳＴＭＧ（配列番号３４）（ＣＤＲ１）；ＡＩＤＷＳＤＦＮ（配列番号６２）（ＣＤＲ２）；及びＨＳＥＴＲＧＧＴＲＹＦＤＲＰＳＬＹＮＹ（配列番号９０）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような１Ｃ８１様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、結果として得られる１Ｃ８１様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１５９】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、１Ｃ８１様ＩＳＶは、２５０nM未満、より好ましくは、２００nM未満、１７５nMもしくはさらに少ない、例えば１５０nMもしくは１２５nM未満の、又は、さらにより好ましくは、１１０nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮断により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１６０】
１つの特別な局面において、任意の１Ｃ８１様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【０１６１】
Ｂ）３Ｃ２３様配列：「３Ｃ２３様配列」、「３Ｃ２３様ＩＳＶ」、又は「３Ｃ２３様構築ブロック」を、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義する：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（当技術分野において公知の通り）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１６２】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮断により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１６３】
好ましくは、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイを用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１６４】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１６５】
例えば、そのような３Ｃ２３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。特に、３Ｃ２３様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１６６】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１６７】
具体的に好ましい局面において、「３Ｃ２３様配列」、「３Ｃ２３様ＩＳＶ」、又は「３Ｃ２３様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１６８】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１６９】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれｄ）、ｅ）、及びｆ）の下に定義される通りである。再び、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１７０】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１７１】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った３Ｃ２３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、３Ｃ２３様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴであり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１７２】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１７３】
特に好ましい３Ｃ２３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）である。
【０１７４】
このセクションＢ）に記載する全ての３Ｃ２３様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、３Ｃ２３のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、３Ｃ２３の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として得られる３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１７５】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１７６】
１つの特定の局面において、３Ｃ２３様配列は、配列番号６と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%など、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った３Ｃ２３様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうるが、特に（しかし、限定を伴わず）、ＲＴＦＲＨＹＡＭＧ（配列番号４０）（ＣＤＲ１）；ＡＩＳＳＹＧＳＴ（配列番号６８）（ＣＤＲ２）；及びＤＥＴＬＧＡＶＰＮＦＲＬＨＥＫＹＥＹＥＹ（配列番号９６）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような３Ｃ２３様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、結果として得られる３Ｃ２３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１７７】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイ（例えば、実施例１．７又は１．８において記載する通り、など）におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される。好ましくは、３Ｃ２３様ＩＳＶは、１００nM未満、より好ましくは、５０nM未満、２５nMもしくはさらに少ない、例えば２０nMもしくは１５nM、１０nM、８nM未満の、又は、さらにより好ましくは、５nM未満のＩＣ５０を伴う調節活性を有する；あるいは、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される（例えば、実施例１．１１において記載する通り）；あるいは、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される（例えば、実施例１．１０において記載する通り）。
【０１７８】
１つの特別な局面において、任意の３Ｃ２３様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【０１７９】
Ｃ）１Ｃ１１３様配列：「１Ｃ１１３様配列」、「１Ｃ１１３様ＩＳＶ」、又は「１Ｃ１１３様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義される：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（当技術分野において公知の通り）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１８０】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の遮防止により決定される。
【０１８１】
好ましくは、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイを用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１８２】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される。
【０１８３】
例えば、そのような１Ｃ１１３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。特に、１Ｃ１１３様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１８４】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される。
【０１８５】
具体的に好ましい局面において、「１Ｃ１１３様配列」、「１Ｃ１１３様ＩＳＶ」、又は「１Ｃ１１３様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴとわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１８６】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される。
【０１８７】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれｄ）、ｅ）、及びｆ）の下に定義される通りである。再び、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１８８】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される。
【０１８９】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った１Ｃ１１３様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、１Ｃ１１３様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１９０】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の防止により決定される。
【０１９１】
特に好ましい１Ｃ１１３様配列において：ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＩＡＦＮＹＹＳＭＳであり、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）であり；及び、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）である。
【０１９２】
このセクションＣ）において記載する全ての１Ｃ１１３様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、１Ｃ１１３のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、１Ｃ１１３の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として得られる１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１９３】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の阻害により決定される。
【０１９４】
１つの特定の局面において、１Ｃ１１３様配列は、配列番号６と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%など、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った１Ｃ１１３様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうる、特に（しかし、限定を伴わず）、ＩＡＦＮＹＹＳＭＳ（配列番号３５）（ＣＤＲ１）；ＤＩＳＰＧＧＨＴ（配列番号６３）（ＣＤＲ２）；及びＲＬＲＦＥＶＳＳＮＹ（配列番号９１）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような１Ｃ１１３様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、結果として得られる１Ｃ１１３様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０１９５】
好ましくは、調節活性は、トランスフェクトＨＥＫ細胞ベースのアッセイにおけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるホスファチジルセリン（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性外在化により決定される；又は、ヒトＴ細胞によるＣＤ６２Ｌ（ＰＳ）のＡＴＰ誘導性切断放出により決定される；又は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死の阻害により決定される。
【０１９６】
１つの特別な局面において、任意の１Ｃ１１３様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【０１９７】
Ｄ）１３Ａ７様配列：「１３Ａ７様配列」、「１３Ａ７様ＩＳＶ」、又は「１３Ａ７様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義される：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（当技術分野において公知の通り）を用いて、細胞ベースのアッセイ（当技術分野において公知の通り）により、インビボアッセイにより決定することができる。
【０１９８】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０１９９】
好ましくは、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイを用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２００】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２０１】
例えば、そのような１３Ａ７様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。特に、１３Ａ７様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２０２】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２０３】
具体的に好ましい局面において、「１３Ａ７様配列」、「１３Ａ７様ＩＳＶ」、又は「１３Ａ７様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２０４】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２０５】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれ、ｄ）、ｅ）、及びｆ）の下で定義される通りである。再び、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２０６】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２０７】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った１３Ａ７様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、１３Ａ７様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような１３Ａ７様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２０８】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２０９】
特に好ましい１３Ａ７様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）である。
【０２１０】
このセクションＤ）に記載する全ての１３Ａ７様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、１３Ａ７のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、１３Ａ７の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として得られる１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２１１】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２１２】
１つの特定の局面において、１３Ａ７様配列は、配列番号６と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った１３Ａ７様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうる、特に（しかし、限定を伴わず）、ＹＹＤＩＧ（配列番号４７）（ＣＤＲ１）；ＣＲＦＴＮＤＧＳＴＡＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７５）（ＣＤＲ２）；及びＧＰＬＴＫＲＲＱＣＶＰＧＤＦＳＭＤＦ（配列番号１０３）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような１３Ａ７様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、結果として得られる１３Ａ７様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２１３】
好ましくは、調節活性を、１３Ａ７様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．３において記載する通り、など）。好ましくは、１３Ａ７様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２１４】
１つの特別な局面において、任意の１３Ａ７様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【０２１５】
Ｅ）１４Ｄ５様配列：「１４Ｄ５様配列」、「１４Ｄ５様ＩＳＶ」、又は「１４Ｄ５様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶ（本明細書において記載する通り）として定義される：
ａ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ１；及び／又は
ｂ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ２；及び／又は
ｃ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹとわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかを含む又はそれから本質的になるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（当技術分野において公知の通り）を用いて、細胞ベースのアッセイ（当技術分野において公知の通り）により、インビボアッセイにより決定することができる。
【０２１６】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２１７】
好ましくは、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれａ）及びｂ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りである。より好ましくは、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれａ）、ｂ）、及びｃ）の下に定義される通りである。再び、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイを用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２１８】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２１９】
例えば、そのような１４Ｄ５様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）（それぞれｂ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（それぞれａ）及びｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；特に、１４Ｄ５様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）（上のｃ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）（上の（ｂ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）を含みうる又はそれから本質的になりうる、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）（上のａ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）を含みうる又はそれから本質的になりうる。再び、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２２０】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２２１】
具体的に好ましい局面において、「１４Ｄ５様配列」、「１４Ｄ５様ＩＳＶ」、又は「１４Ｄ５様構築ブロック」は、以下を含むＩＳＶである：
ｄ）（ｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）とわずか３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ１；及び／又は
ｅ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ２；及び／又は
ｆ）（ｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、又は９５%を上回る配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）とわずか７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の違い（本明細書において定義する通り）を有するアミノ酸配列のいずれかであるＣＤＲ３；
ここで、そのようなＩＳＶ中に存在するフレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りであり、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２２２】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２２３】
好ましくは、この具体的に好ましい局面に従った１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであり；又は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｄ）及びｆ）の下で定義される通りであり；又は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ｅ）及びｆ）の下で定義される通りである。より好ましくは、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、全て、それぞれ、ｄ）、ｅ）、及びｆ）の下で定義される。再び、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２２４】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２２５】
例えば、この具体的に好ましい局面に従った１４Ｄ５様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）（それぞれｅ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）（それぞれｄ）及びｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）（それぞれｄ）及びｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１及びＣＤＲ２を伴う）である。特に、１４Ｄ５様配列がこの局面に従う場合：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）であり、及び、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）（上のｆ）の下に定義される通りであるＣＤＲ３を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）（上のｅ）の下に定義される通りであるＣＤＲ２を伴う）であり；及び／又は、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）であり、及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（上のｄ）の下に定義される通りであるＣＤＲ１を伴う）である。再び、そのような１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２２６】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２２７】
特に好ましい１４Ｄ５様配列において：ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）であり、ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）であり；及び、ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）である。
【０２２８】
このセクションＥ）において記載する全ての１４Ｄ５様配列において、フレームワーク配列は、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。好ましくは、フレームワーク配列は、フレームワーク配列が、１４Ｄ５のフレームワーク配列と少なくとも８０%、例えば少なくとも８５%など、例えば、少なくとも９０%、例えば少なくとも９５%などの配列同一性を有するようにする（それは、例えば、所与の配列と、１４Ｄ５の配列との配列同一性の全体の程度を決定することにより決定することができ、算出においてＣＤＲは無視する）。再び、所与の配列中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、好ましくは、結果として得られる１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２２９】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２３０】
１つの特定の局面において、１４Ｄ５様配列は、配列番号６と少なくとも７０%、例えば少なくとも８０%など、例えば、少なくとも８５%、例えば少なくとも９０%など、又は９５%を上回る配列同一性を有するＩＳＶである。例えば、この局面に従った１４Ｄ５様配列において、ＣＤＲは、上に記載する具体的に好ましい局面に従いうる、特に（しかし、限定を伴わず）、ＳＹＡＭＧ（配列番号４６）（ＣＤＲ１）；ＲＩＹＴＧＧＴＡＷＹＥＤＳＶＫＧ（配列番号７４）（ＣＤＲ２）；及びＲＶＲＹＤＹ（配列番号１０２）（ＣＤＲ３）でありうる。再び、好ましくは、そのような１４Ｄ５様ＩＳＶ中に存在するＣＤＲ及びフレームワークの組み合わせは、結果として得られる１４Ｄ５様ＩＳＶが調節活性を有するようにし、それは、当業者に公知の任意の適したアッセイにより、例えば、Alphascreenアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）を用いて、又は細胞ベースのアッセイ（例えば、本明細書において記載する通り、など）により決定することができる。
【０２３１】
好ましくは、調節活性を、１４Ｄ５様ＩＳＶを用いて注射したマウスからの脾臓細胞及び肝臓細胞中でのＣＤ２７のＡＴＰ誘導性切断放出又はＰＳ外在化の調節により決定する（例えば、実施例２．２において記載する通り、など）。好ましくは、１４Ｄ５様ＩＳＶは、抗有足細胞誘導性の腎炎モデルにおいて決定される調節活性を有する（実施例３において記載する通り）。
【０２３２】
１つの特別な局面において、任意の１４Ｄ５様配列は、本明細書においてさらに記載する通り、ヒト化及び／又は配列最適化されうる。
【０２３３】
実施例１．５において記載する通り、本発明のＩＳＶを、異なるエピトープビン又はファミリー中に、本明細書において詳述する通りの交差遮断分析を用いてグループ化することができる。グループＡのＩＳＶは、１ｃ８１様ＩＳＶ及び１ｃ１１３様ＩＳＶにより表され、グループＢのＩＳＶは、３ｃ２３様ＩＳＶにより表される。
【０２３４】
実施例１．４において記載する通り、本発明のＩＳＶを、交差反応性の存在又は非存在に基づいてグループ化することができる。「ヒト特異的」ＩＳＶは、３ｃ２３様ＩＳＶ及び１ｃ１１３様ＩＳＶにより表される；「ヒト／ラット／マウス特異的」ＩＳＶは、１ｃ８１様ＩＳＶにより表される；「マウス特異的」ＩＳＶは、１３Ａ７様ＩＳＶ及び１４Ｄ５様ＩＳＶにより表される。
【０２３５】
一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメイン（特に、ＶＨＨ配列及び配列最適化された免疫グロブリン単一可変ドメイン）は、特に、フレームワーク配列（再び、本明細書においてさらに記載する通り）の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」（本明細書において記載する通り）の存在により特徴付けることができる。
【０２３６】
このように、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（一般的な）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を伴うアミノ酸配列として定義することができ、
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここでＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指す。
【０２３７】
好ましい局面において、本発明は、（一般的な）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を伴うアミノ酸配列である少なくとも免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供し、
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここでＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、及び、ここで：
ｉ）Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸残基の少なくとも１つが、下の表Ａ−１において言及されるホールマーク残基より選ばれる；及び、ここで：
ｉｉ）前記アミノ酸配列が、ＷＯ２００９／１３８５１９に示す通りの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＷＯ２００９／１３８５１９における配列番号１〜１２５を参照のこと）の少なくとも１つと少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列中でＸを用いて示される）を無視し；及び、ここで：
ｉｉｉ）ＣＤＲ配列は、一般的に、本明細書においてさらに定義する通りであり（例えば、表（Ｂ−２）中に提供する通り、組み合わせにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って算出されることに注意すること）。
【０２３８】
【表１】
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【０２３９】
再び、そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、任意の適した様式において、及び、任意の適した供給源から由来しうるが、例えば、自然発生するＶＨＨ配列（即ち、ラクダの適した種、例えばラマから）又は合成もしくは半合成ＶＨもしくはＶＬ（例えば、ヒトから）でありうる。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、「ヒト化」又は、そうでなければ、「配列最適化された」ＶＨＨ、「ラクダ化」免疫グロブリン配列（及び特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列、即ち、ラクダ化ＶＨ）、ならびに、技術、例えば親和性成熟（例えば、合成、無作為、又は自然発生する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲ移植、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列から由来するフラグメントの組み合わせ、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリー、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術；又は、本明細書においてさらに記載する通りの前述のもののいずれかの任意の適した組み合わせなどにより変えられている、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ラクダＶＨＨを含みうる。
【０２４０】
本発明は、Ｐ２Ｘ７への結合のために特に適したアミノ酸残基（配列番号３４〜４７、配列番号６２〜７５、及び配列番号９０〜１０３；表Ｂ−１）のストレッチを提供する。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、特に、それらが、本発明のポリペプチドの抗原結合部位（の部分）を形成するような方法において、本発明のポリペプチド中に存在する、及び／又はその中に組み入れてもよい。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、重鎖抗体のＣＤＲ配列又はＰ２Ｘ７に対して産生されたＶＨＨ配列として生成されている。アミノ酸残基のこれらのストレッチは、また、本明細書において「本発明のＣＤＲ配列」として言及される（即ち、それぞれ「本発明のＣＤＲ１配列」、「本発明のＣＤＲ２配列」、及び「本発明のＣＤＲ３配列」）。
【０２４１】
しかし、本発明は、アミノ酸残基のこれらのストレッチによって、本発明のポリペプチドが、特定の親和性及び効力（本明細書において定義する通り）を用いてＰ２Ｘ７に結合することを許す限り、その最も広い意味において、アミノ酸残基のこれらのストレッチが、本発明のポリペプチド中に有しうる特定の構造的役割又は機能に限定されないことに注意すべきである。このように、一般的に、本発明は、その最も広い意味において、特定の指定された親和性、結合力、有効性、及び／又は効力を伴いＰ２Ｘ７に結合することが可能である、ならびに、本明細書において記載する通りの１つ以上のＣＤＲ配列、特に２つ又はそれ以上のそのようなＣＤＲ配列の適した組み合わせを含み、互いに、１つ以上のさらなるアミノ酸配列を介して適切に連結され、全ポリペプチドが、Ｐ２Ｘ７へ結合することが可能である結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するようにする、一価ポリペプチド（また、本明細書において、「本発明の一価ポリペプチド」として言及される）を提供する。しかし、本発明の一価ポリペプチド中でのわずか１つのそのようなＣＤＲ配列の存在は、それ自体が既に、本発明の一価ポリペプチドに、Ｐ２Ｘ７への結合の能力を提供するために十分でありうることに注意すべきである；参照が、例えば、再び、ＷＯ０３／０５０５３１に記載されている、いわゆる「促進（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ）フラグメント」に作られる。
【０２４２】
このように、特定の、しかし、非限定的な局面において、本発明の一価ポリペプチドは、以下からなる群より選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含みうる：ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号３４〜４７；
ｂ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｃ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及び／又はＣＤＲ２配列：
ｄ）配列番号６２〜７５；
ｅ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｆ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及び／又はＣＤＲ３配列：
ｇ）配列番号９０〜１０３；
ｈ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｉ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
【０２４３】
アミノ酸残基の上の指定されたストレッチの１つ以上を含む一価ポリペプチドは、改善された特性、例えば、改善された結合特徴（ＫＤ値（実際の又は見かけ上の）、ＫＡ値（実際の又は見かけ上の）、ｋｏｎ率及び／又はｋｏｆｆ率、あるいは、代わりに、ＩＣ５０値として適切に測定及び／又は表現され、本明細書においてさらに記載する通り）、Ｐ２Ｘ７についての改善された親和性及び／又は改善された結合力、ならびにＰ２Ｘ７を調節するための改善された有効性及び／又は効力などを示す。
【０２４４】
さらに特に、アミノ酸残基の上の指定されたストレッチの１つ以上を含む一価ポリペプチドは、親和性（ＫＤ値（実際の又は見かけ上の）、ＫＡ値（実際の又は見かけ上の）、ｋｏｎ率及び／又はｋｏｆｆ率、あるいは、代わりに、ＩＣ５０値として適切に測定及び／又は表現され、本明細書においてさらに記載する通り）を伴い、タンパク質Ｐ２Ｘ７に結合することができ、好ましくは、それらは：
−  １０００nM〜１nM又はそれ以下、好ましくは１００nM〜１nM又はそれ以下、より好ましくは１５nM〜１nM又はさらに１０nM〜１nM又はそれ以下の会合定数（ＫＤ）を伴い、Ｐ２Ｘ７に結合するようにし；
及び／又は、それらは：
−  １０４M-1s-1〜約１０７M-1s-1の間、好ましくは１０５M-1s-1と１０７M-1s-1の間、より好ましくは１０６M-1s-1又はそれ以上のｋｏｎ率を伴い、Ｐ２Ｘ７に結合するようにし；
及び／又は、それらは：
−  １０−２s-1（ｔ１／２＝０．６９ｓ）と１０−４s-1の間（複数の日のｔ１／２を伴う不可逆的に近い結合体を提供する）、好ましくは１０−３s-1と１０−４s-1又はそれ以下のｋｏｆｆ率を伴い、Ｐ２Ｘ７に結合するようにする。
【０２４５】
Ｐ２Ｘ７への本発明の一価ポリペプチドの結合のための一部の好ましいＩＣ５０値が、本明細書におけるさらなる記載及び実施例から明らかになるであろう。ＩＣ５０を決定するためのアッセイは、ＥＬＩＳＡにおける結合を含む。
【０２４６】
特に、本発明の一価ポリペプチドは、１つの抗原結合部位を含む一価ポリペプチドでありうるが、ここで、前記抗原結合部位は、上に記載する通りのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の適した組み合わせ）からなる群より選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つのストレッチを含む。好ましい局面において、しかし、本発明の一価ポリペプチドは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び／又は本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選ばれたアミノ酸残基の１つ以上、例えば２つ以上のストレッチを含む。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、それぞれ、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列、及び本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選ばれたアミノ酸残基の３つのストレッチを含む。本発明の一価ポリペプチドについて好ましいとして、本明細書において記述されるＣＤＲの組み合わせを、表Ｂ−１中に列挙する。
【０２４７】
本発明が、本発明の一価ポリペプチドの（又は、それを発現させるために使用された、本発明の核酸の）起源に関して、また、本発明の一価ポリペプチド又は核酸が生成又は入手される（されてきた）方法に関して、限定されないことに注意すべきである。このように、本発明の一価ポリペプチドは、自然発生する一価ポリペプチド（任意の適した種から）又は合成もしくは半合成一価ポリペプチドでありうる。
【０２４８】
さらに、また、上に記述するＣＤＲの１つ以上以上を、他の「スキャフォールド」（しかし、限定しないが、ヒトスキャフォールド又は非免疫グロブリンスキャフォールドを含む）上に「移植」することが可能であることが、当業者に明らかであろう。そのようなＣＤＲ移植のための適したスキャフォールド及び技術は、当業者に明かであり、当技術分野において周知であり、例えば、ＵＳ７，１８０，３７０、ＷＯ０１／２７１６０、ＥＰ０６０５５２２、ＥＰ０４６０１６７、ＵＳ７，０５４，２９７、Nicaise et al.（Protein Science 13: 1882-1891, 2004）、Ewert et al.（Methods 34: 184-199, 2004）、Kettleborough et al.（Protein Eng. 4: 773-783, 1991）、O'Brien and Jones（Methods Mol.Biol. 207: 81-100, 2003）、Skerra（J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000）、及びSaerens et al.（J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005）ならびに本明細書において引用するさらなる参考文献を参照のこと。例えば、マウス又はラットＣＤＲを、ヒトフレームワーク及びスキャフォールド上に移植するための、それ自体が公知の技術を、類似の様式において使用し、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書において定義するＣＤＲ配列の１つ以上及び１つ以上のヒトフレームワーク領域又は配列を含むキメラタンパク質を提供することができる。アミノ酸配列を提示するための適したスキャフォールドが、当業者に明らかでありうるが、例えば、限定を伴わず、免疫グロブリンに基づく又はそれに由来する結合スキャフォールド（即ち、本明細書において既に記載した免疫グロブリン配列以外）、プロテインＡドメインに由来するタンパク質スキャフォールド（例えばAffibodies（商標）など）、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計されたアンキリン反復、アビマー及びＰＤＺドメイン（Binz et al.Nat.Biotech., 23: 1257, 2005）、ならびにＤＮＡ又はＲＮＡに基づく結合部分（しかし、限定しないが、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーを含む）（Ulrich et al.Comb.Chem. High Throughput Screen 9: 619-32, 2006）を含む。
【０２４９】
本発明の前記の一価ポリペプチドにおいて、ＣＤＲを、さらなるアミノ酸配列に連結してもよく、及び／又は、互いに、アミノ酸配列を介して連結してもよく、ここで、前記アミノ酸配列は、好ましくは、フレームワーク配列である、又は、フレームワーク配列として作用する、もしくはＣＤＲを提示するためのスキャフォールドを一緒に形成するアミノ酸配列である。
【０２５０】
好ましいが、しかし、非限定的な実施態様に従い、本発明の一価ポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結された少なくとも３つのＣＤＲ配列を含み、ここで、好ましくは、３つのＣＤＲ配列の少なくとも１つが、ＣＤＲ３配列であり、他の２つのＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列であり、好ましくは、１つのＣＤＲ１配列及び１つのＣＤＲ２配列である。１つの具体的に好ましいが、しかし、非限定的な実施態様に従い、本発明の一価ポリペプチドは、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、本発明の一価ポリペプチドについて本明細書において定義する通りであり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４は、フレームワーク配列である。本発明のそのような一価ポリペプチドにおいて、フレームワーク配列は、任意の適したフレームワーク配列でありうるが、適したフレームワーク配列の例が、例えば、標準的なハンドブックならびに本明細書において言及するさらなる開示及び先行技術に基づき、当業者に明かであろう。
【０２５１】
したがって、本発明は、また、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になる、Ｐ２Ｘ７に対する一価ポリペプチドに関し、ここで：ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号３４〜４７；
ｂ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｃ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及び／又は
ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号６２〜７５；
ｅ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｆ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及び／又は
ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号９０〜１０３；
ｈ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｉ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
【０２５２】
特に、この好ましいが、しかし、非限定的な局面に従い、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなる、Ｐ２Ｘ７に対する一価ポリペプチドに関し、ここで：ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号３４〜４７；
ｂ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｃ）配列番号３４〜４７のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及び
ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
ｄ）配列番号６２〜７５；
ｅ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｆ）配列番号６２〜７５のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ；
及びＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
ｇ）配列番号９０〜１０３；
ｈ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のストレッチ；
ｉ）配列番号９０〜１０３のアミノ酸配列の少なくとも１つと３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列のストレッチ。
【０２５３】
本発明は、また、ＣＤＲ配列が、配列番号６〜１９のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも７０%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０%のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０%のアミノ酸同一性、例えば９５%のアミノ酸同一性又はそれ以上など、あるいはさらに（本質的に）１００%のアミノ酸同一性を有する、一価ポリペプチドに関する。
【０２５４】
１つの特定の、しかし、非限定的な局面において、本発明の一価ポリペプチドは、免疫グロブリンフォールドを含む一価ポリペプチド又は、適した条件（例えば生理学的条件など）下で、免疫グロブリンフォールドを形成する（即ち、フォールディングにより）ことが可能である一価ポリペプチドでありうる。とりわけ、Halaby et al.(J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999）によるレビューが参照される。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように、適当にフォールドされた場合、アミノ酸残基のストレッチは、Ｐ２Ｘ７に結合するための抗原結合部位を適当に形成することが可能でありうる。
【０２５５】
したがって、フレームワーク配列は、好ましくは、免疫グロブリンフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列に由来しているフレームワーク配列（の適した組み合わせ）である（例えば、配列最適化、例えばヒト化又はラクダ化などによる）。例えば、フレームワーク配列は、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ配列）などに及び／又は重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ配列）に由来するフレームワーク配列でありうる。１つの特に好ましい局面において、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列に由来しているフレームワーク配列（ここで、前記フレームワーク配列は、場合により、部分的に又は完全にヒト化しうる）である、又は、ラクダ化されている従来のＶＨ配列（本明細書において定義する通り）のいずれかである。
【０２５６】
フレームワーク配列が、好ましくは、本発明の一価ポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体（又は、ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列）などである；単一ドメイン抗体（又は、単一ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸）である；「ｄＡｂ」（又は、「ｄＡｂ」としての使用のために適しているアミノ酸）である；又はナノボディ（登録商標）（しかし、限定しないが、ＶＨＨを含む）であるようにしうる。再び、適したフレームワーク配列が、標準的なハンドブックならびに本明細書において言及するさらなる開示及び先行技術に基づき、当業者に明かであろう。
【０２５７】
特に、本発明の一価ポリペプチド中に存在するフレームワーク配列は、本発明の一価ポリペプチドがナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基（ＷＯ０８／０２００７９（表Ａ−３〜Ａ−８）中で定義される通り）を含みうる。そのようなフレームワーク配列（の適した組み合わせ）の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる開示から明らかになるであろう（例えば、表Ｂ−１を参照のこと）。一般的には、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化したナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる（例えば、ＷＯ０８／０２００７９、６１ページ、２４行から９８ページ、３行においてさらに記載される通り）。
【０２５８】
さらに特に、ナノボディは、（一般的な）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を伴う免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドでありうるが、
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、及び、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、及び、それらは：
ｉ）配列番号６〜１９（表Ｂ−３を参照のこと）のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視する。この点において、参照が、また、表Ｂ−１に作られ、それは、配列番号６〜１９（表Ｂ−３を参照のこと）の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号２０〜３３）、フレームワーク２配列（配列番号４８〜６１）、フレームワーク３配列（配列番号７６〜８９）、及びフレームワーク４配列（配列番号１０４〜１１７）を列挙する；又は
ｉｉ）表Ｂ−１中に描写する通りのフレームワーク配列の組み合わせ；
及び、ここで：
ｉｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔナンバリングに従った位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８でのアミノ酸残基の１つ以上が、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ−１から表Ａ−８中で言及するホールマーク残基より選ばれる。
【０２５９】
好ましい局面において、本発明は、配列番号６〜１９のいずれかより選択される免疫グロブリン単一可変ドメイン又は一価ポリペプチドを提供する。
【０２６０】
本発明は、また、配列番号６〜１９を伴う免疫グロブリン単一可変ドメインのいずれか１つと同じエピトープビンに属する一価ポリペプチドを提供する。したがって、本発明は、また、配列番号６〜１９を伴う免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つのＰ２Ｘ７への結合を交差遮断する、及び／又は、配列番号６〜１９を伴う免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つによるＰ２Ｘ７への結合を交差遮断する、Ｐ２Ｘ７に対して向けられた一価ポリペプチドに関する。
【０２６１】
再び、そのような一価ポリペプチドは、任意の適した様式において、任意の適した供給源から由来する免疫グロブリン単一可変ドメインでありうるが、自然発生するＶＨＨ配列（即ち、適した種のラクダのから）又は合成もしくは半合成アミノ酸配列（しかし、限定しないが、「ヒト化」（本明細書において定義する通り）ナノボディ又はＶＨＨ配列、「ラクダ化」（本明細書において定義する通り）免疫グロブリン配列（及び特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、ならびに、技術、例えば親和性成熟（例えば、合成、無作為、又は自然発生する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲ移植、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列から由来するフラグメントの組み合わせ、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリー、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術；又は、本明細書においてさらに記載する通りの前述のもののいずれかの任意の適した組み合わせなどにより得られたナノボディでありうる。また、免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨ配列を含む場合、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、適切にヒト化してもよく（本明細書においてさらに記載する通り）、本発明の１つ以上のさらなる（部分的又は完全）ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインを提供するようにする。同様に、免疫グロブリン単一可変ドメインが、合成又は半合成配列（例えば部分的にヒト化された配列など）を含む場合、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインは、場合により、さらに適切にヒト化してもよく（再び、本明細書において記載する通り）、再び、本発明の１つ以上のさらなる（部分的又は完全）ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインを提供するようにする。
【０２６２】
本発明のこれらの一価ポリペプチド、及び特に本発明のＣＤＲ配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインは、多価ポリペプチドの調製のための構築ブロック又は結合単位としての使用のために特に適する。
【０２６３】
したがって、Ｐ２Ｘ７に結合する本発明の一価ポリペプチドは、本質的に単離された形態（本明細書において定義する通り）でありうる、あるいは、それらは、タンパク質又はポリペプチドの部分を形成しうる、それは、Ｐ２Ｘ７に結合する１つ以上の一価ポリペプチドを含みうる又はそれから本質的になり、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全てが、場合により、１つ以上の適したリンカーにより連結される）をさらに含みうる。本発明は、また、本発明の１つ以上の一価ポリペプチド（又はその適したフラグメント）を含む又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドに関する。
【０２６４】
本発明の１つ以上の一価ポリペプチドは、このように、そのようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位又は構築ブロックとして使用され、それぞれ、本発明の一価、多価、又はマルチパラトープポリペプチドを提供するようにする（全てが、本明細書において記載する通り）。本発明は、このように、また、本発明の１つの一価ポリペプチドを含む又はそれから本質的になる一価コンストラクトであるポリペプチドに関する。本発明は、このように、また、本発明の２つ又はそれ以上の一価ポリペプチドを含む又はそれから本質的になる多価ポリペプチド、例えば二価又は三価ポリペプチドであるポリペプチドに関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多価及び多特異的ポリペプチドならびにそれらの調製については、また、Conrath et al., J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001、ならびに、例えば、ＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９９／２３２２１、及びＷＯ２０１０／１１５９９８が参照される）。
【０２６５】
上のさらなる記載から及び本明細書において明らかでありうる通り、本発明のアミノ酸配列（又はＩＳＶ）が、本発明のポリペプチドを形成するための「構築ブロック」として、即ち、それらを、互いに、１つ以上を、本発明の他のアミノ酸配列と、ならびに／あるいは１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位と適切に組み合わせることにより、本明細書において記載する通りの化合物又はコンストラクト（例えば、限定を伴わず、本明細書において記載する、本発明のバイパラトープ、二／多価、及び二／多特異的ポリペプチドなど）を形成するために使用することができ、それは、１つの分子内で、１つ以上の所望の特性又は生物学的機能を組み合わせる。
【０２６６】
本発明により提供される遮断ポリペプチド又はＩＳＶは、優先的に、炎症（例えばＭＳ又は腎炎など）を低下させる。
【０２６７】
したがって、本発明は、それらの各々が、Ｐ２Ｘ７、好ましくはヒトＰ２Ｘ７（本明細書において「Ｐ２Ｘ７」として言及される）に特異的に結合する、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又は本質的にそれからなるポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、また、本明細書において、「本発明の多価ポリペプチド」として言及される。２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、場合により、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されうる。
【０２６８】
好ましくは、多価ポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７に対して向けられる２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、ここで、Ｐ２Ｘ７に対して向けられる「第１の」免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＰ２Ｘ７に対して向けられる「第２の」免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じ又は異なるパラトープを有する。後者のポリペプチドは、また、本明細書において、「本発明のマルチパラトープポリペプチド」として言及される。したがって、本発明は、Ｐ２Ｘ７に対して向けられる２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれからなるポリペプチドに関し、ここで、Ｐ２Ｘ７に対して向けられる「第１の」免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＰ２Ｘ７に対して向けられる「第２の」免疫グロブリン単一可変ドメインは、異なるパラトープを有する。そのようなポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７上の異なるエピトープに対して向けられる２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれからなる。より具体的には、そのようなポリペプチドは、Ｐ２Ｘ７上の第１エピトープに対して向けられる少なくとも１つの「第１の」免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＰ２Ｘ７上の第１エピトープとは異なるＰ２Ｘ７上の第２エピトープに対して向けられる少なくとも１つの「第２の」免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。好ましくは、本発明のこれらのマルチパラトープポリペプチドは、バイパラトープ又はトリパラトープポリペプチド（また、本明細書において、「本発明のバイパラトープ」及び「本発明のトリパラトープ」として言及される）である（本明細書において定義する通り）。本発明に従い特に好ましいバイパラトープポリペプチドは、本明細書において記載する実施例及び表Ｂ−４において示すものである。
【０２６９】
少なくとも２つのナノボディを含む本発明のポリペプチド、ここで、少なくとも１つのナノボディは、第１抗原に対して（即ち、Ｐ２Ｘ７に対して）向けられ、少なくとも１つのナノボディは、第２抗原に対して（即ち、Ｐ２Ｘ７とは異なる）向けられ、また、本発明の「多特異的」ポリペプチドとして言及され、そのようなポリペプチド中に存在するナノボディは、また、本明細書において、「多特異的フォーマット」中にあるとして言及される。このように、例えば、本発明の「二特異的」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられた少なくとも１つのナノボディ及び第２抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三特異的」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７）に対して向けられた少なくとも１つのナノボディ、第２抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディ、及び第３抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディなどを含むポリペプチドである。
【０２７０】
したがって、その最も単純な形態において、本発明の二特異的ポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチド（本明細書において定義する通り）であり、Ｐ２Ｘ７に対して向けられた第１ナノボディ、及び第２抗原に対して向けられた第２ナノボディを含み、ここで、前記の第１及び第２ナノボディが、場合により、リンカー配列を介して連結されるのに対し（本明細書において定義する通り）；本発明の三特異的ポリペプチドは、その最も単純な形態において、本発明の三特異的ポリペプチドであり（本明細書において定義する通り）、Ｐ２Ｘ７に対して向けられた第１ナノボディ、第２抗原に対して向けられた第２ナノボディ、及び第３抗原に対して向けられた第３ナノボディを含み、ここで、前記の第１、第２、及び第３ナノボディは、場合により、１つ以上、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結されうる。
【０２７１】
Ｐ２Ｘ７に対して向けられた少なくとも２つのナノボディを含む本発明のポリペプチドは、ここで、少なくとも１つの「第１」ナノボディが、Ｐ２Ｘ７（例えば、ｈＰ２Ｘ７）の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられ；及び、ここで、少なくとも１つの「第２」ナノボディが、第１とは異なる、前記Ｐ２Ｘ７の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（例えば、ｈＰ２Ｘ７）に対して向けられ、そのようなポリペプチド中に存在するナノボディは、また、本明細書において、「マルチパラトープフォーマット」中にあるとして言及される。このように、例えば、本発明の「バイパラトープ」ポリペプチドは、抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７）の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた少なくとも１つのナノボディ及び第１とは違う前記抗原（即ち、同じＰ２Ｘ７）の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「トリパラトープ」は、抗原（即ち、Ｐ２Ｘ７）の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた少なくとも１つのナノボディ、第１とは異なる前記抗原（即ち、同じＰ２Ｘ７）の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディ、ならびに、しかし、前記抗原の前記第１及び前記第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とは異なる抗原（即ち、同じＰ２Ｘ７）の第３抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた少なくとも１つのさらなるナノボディなどを含むポリペプチドである。
【０２７２】
したがって、その最も単純な形態において、本発明のバイパラトープポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチド（本明細書において定義する通り）であり、Ｐ２Ｘ７の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた第１ナノボディ、及び、第１とは異なる前記Ｐ２Ｘ７の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた第２ナノボディを含み、ここで、前記第１及び前記第２ナノボディは、場合により、リンカー配列（本明細書において定義する通り）を介して連結されうるのに対し；本発明のトリパラトープポリペプチドは、その最も単純な形態において、本発明の三価ポリペプチド（本明細書において定義する通り）であり、Ｐ２Ｘ７の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた第１ナノボディ、及び、第１とは異なる、前記Ｐ２Ｘ７の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造（例えば、同じＰ２Ｘ７）に対して向けられた第２ナノボディ、しかし、前記第１及び前記第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とは異なる同じＰ２Ｘ７の第３抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられた第３ナノボディを含み、ここで、前記第１、第２、及び第３ナノボディは、場合により、１つ以上の、特に１つ及び複数の、特に２つのリンカー配列を介して連結されうる。
【０２７３】
しかし、本明細書における上の記載から明かな通り、本発明は、本発明の多特異的ポリペプチドが、Ｐ２Ｘ７に対する少なくとも１つのナノボディ、及びＰ２Ｘ７とは異なる１つ以上の抗原に対して向けられた任意の数のナノボディを含みうるという意味において、それに限定されない。
【０２７４】
さらに、本発明のポリペプチドにおける種々のナノボディの特定の順番又は配置が、本発明の最終的なポリペプチドの特性（しかし、限定しないが、Ｐ２Ｘ７についての、あるいは１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性、又は結合力を含む）に対して特定の影響を有しうることが、本発明の範囲内に包含されるが、前記順番又は配置は、通常、決定的ではなく、場合により、本明細書における開示に基づく一部の限定的なルーチン実験後、当業者により適切に選ばれうる。このように、参照が、本発明の特定の多価又は多特異的ポリペプチドに作られる場合、これが、他に明示しない限り、関連するナノボディの任意の順番又は配置を包含することに注意すべきである。
【０２７５】
最終的に、また、本発明のポリペプチドが、２つ又はそれ以上のナノボディ及び１つ以上のさらなるアミノ酸配列（本明細書において言及する通り）を含むことが、本発明の範囲内である。
【０２７６】
１つ以上のＶＨＨドメイン及びそれらの調製物を含む多価及び多特異的ポリペプチドについて、また、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；ならびに、例えば、ＷＯ９６／３４１０３及びＷＯ９９／２３２２１が参照される。本発明の一部の特定の多特異的及び／又は多価ポリペプチドの一部の他の例が、本明細書において参照されるAblynx N.V.による出願において見出すことができる。
【０２７７】
本発明の化合物又はポリペプチドは、一般的に、本発明の１つ以上のアミノ酸配列（又はＩＳＶ）を、１つ以上のさらなる基、残基、部分、又は結合単位に、場合により、１つ以上の適したリンカーを介して、適切に連結する少なくとも１つの工程を含む方法により調製することができ、本発明の化合物又はポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、また、一般的に、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、前記核酸を適した様式において発現させ、及び本発明の発現ポリペプチドを回収する工程を少なくとも含む方法により調製することができる。そのような方法は、それ自体が公知の様式において実施することができ、それは、当業者に明らかであろうが、例えば、本明細書においてさらに記載する方法及び技術に基づく。
【０２７８】
本明細書において「好ましい」（又は「より好ましい」、又は「さらにより好ましい」、など）として言及されるナノボディ（又はＩＳＶ）が、また、本明細書において記載するポリペプチド中での使用のために好ましい（又はより好ましい、又はさらにより好ましい、など）ことが当業者に明かであろう。このように、本発明の１つ以上の「好ましい」ナノボディ（又はＩＳＶ）を含む又はそれから本質的になるポリペプチドが、一般的に好ましく、本発明の１つ以上の「より好ましい」免疫グロブリン単一可変ドメインを含む又はそれから本質的になるポリペプチドが、一般的により好ましい、など。
【０２７９】
本発明の１つの特定の局面において、本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）又は本発明の少なくとも１つのナノボディ（又はＩＳＶ）を含む、本発明の化合物、コンストラクト、もしくはポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列と比較し、増加した半減期を有しうる。そのようなナノボディ（又はＩＳＶ）、化合物、及びポリペプチドの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者に明らかであろうが、例えば、その半減期を増加するために（例えば、ペグ化を用いて）化学的に修飾された本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）配列又はポリペプチド；血清タンパク質への結合のための少なくとも１つの追加の結合部位を含む本発明のアミノ酸配列（例えば血清アルブミンなど、例えば、ＥＰ０３６８６８４Ｂ１、４ページを参照のこと）；又は本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）の半減期を増加する少なくとも１つの部分（及び特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された本発明の少なくとも１つのナノボディ（又はＩＳＶ）を含む本発明のポリペプチドを含む。そのような半減期延長部分又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例が、本明細書におけるさらなる開示に基づき、当業者に明らかになるであろうが；例えば、限定を伴わず、本発明の１つ以上のナノボディ（又はＩＳＶ）を、１つ以上の血清タンパク質あるいはそのフラグメント（例えば血清アルブミン又はその適したフラグメントなど）に、あるいは血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合単位（例えば、血清タンパク質、例えば血清アルブミンなど、血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧなど、又はトランスフェリンに結合することができるナノボディ（又はＩＳＶ）又は（単一）ドメイン抗体など）に適切に連結するポリペプチド；本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）を、Ｆｃ部分（例えばヒトＦｃなど）あるいはその適した部分又はフラグメントに連結するポリペプチド；又は、本発明の１つ以上のナノボディ（又はＩＳＶ）を、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小タンパク質又はペプチド（例えば、限定を伴わず、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９において記載するタンパク質及びペプチドならびにAblynx N.V.の米国仮出願、２００６年１２月５日出願のAblynx N.V.の表題「Peptides capable of binding to serum proteins」（また、ＰＣＴ／ＥＰ／２００７／０６３３４８を参照のこと））に連結するポリペプチドを含む。
【０２８０】
再び、当業者に明かな通り、そのようなナノボディ（又はＩＳＶ）、化合物、コンストラクト、又はポリペプチドは、１つ又は追加の基、残基、部分、又は結合単位、例えば１つ以上のさらなるアミノ酸配列及び特に１つ以上のナノボディ（又はＩＳＶ）（即ち、Ｐ２Ｘ７に対して向けられない）を含んでもよく、多特異的ナノボディ（又はＩＳＶ）コンストラクトの三特異的ナノボディを提供するようにする。
【０２８１】
一般的に、増加した半減期を伴う本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）（又は化合物、コンストラクト、もしくはポリペプチド）は、本発明の対応するアミノ酸配列それ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍を上回る大きい半減期を有する。例えば、増加した半減期を伴う、本発明のナノボディ（又はＩＳＶ）、化合物、コンストラクト、又はポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列それ自体と比較し、１時間を上回る、好ましくは２時間を上回る、より好ましくは６時間を上回る、例えば１２時間を上回るなど、あるいはさらに２４、４８、又は７２時間を上回る増加した半減期を有しうる。
【０２８２】
好ましいが、しかし、非限定的な局面において、本発明のそのようなナノボディ（又はＩＳＶ）、化合物、コンストラクト、又はポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日など）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日など）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日又はそれ以上など）、又は１４日を上回る（例えば約１４〜１９日など）の半減期を有しうる。
【０２８３】
本発明の別の１つの局面において、本発明のポリペプチドは、結果として得られる本発明のポリペプチドが、血液脳関門を通過することを可能にする１つ以上の（例えば２つ及び、好ましくは、１つの、など）アミノ酸配列に連結された（場合により、１つ以上の適したリンカー配列を介して）本発明の１つ以上の（例えば２つ及び、好ましくは、１つの、など）ナノボディ（又はＩＳＶ）を含む。特に、結果として得られる本発明のポリペプチドが、血液脳関門を通過することを可能にする前記の１つ以上のアミノ酸配列は、１つ以上の（例えば２つ及び、好ましくは、１つの、など）ナノボディ（又はＩＳＶ）、例えば、ＷＯ０２／０５７４４５において記載されるナノボディ（又はＩＳＶ）などでありうるが、その内の、ＦＣ４４（ＷＯ０６／０４０１５３の配列番号１８９）及びＦＣ５（ＷＯ０６／０４０１５４の配列番号１８９）が好ましい例である。
【０２８４】
一般的に、医薬的使用のために、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバント、ならびに、場合により、１つ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、医薬的調製物又は組成物として製剤化されうる。非限定的な例を用いて、そのような製剤は、経口投与のため、非経口投与のために（例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射又は静脈内注入などによる）、局所投与のために、吸入による、皮膚パッチによる、インプラントによる、座剤などによる投与のために適した形態でありうるが、ここで、非経口投与が好ましい。そのような適した投与形態（それは、投与の様式に依存して、固形、半固形、又は液体でありうる）ならびに方法及びその調製物中での使用のための担体が、当業者に明らかであろうが、本明細書においてさらに記載する。そのような医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「医薬的組成物」として言及されるであろう。非ヒト生物における使用のための医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において、「獣医用組成物」として言及されるであろう。
【０２８５】
このように、さらなる局面において、本発明は、本発明の少なくとも１つのアミノ酸、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、又は本発明の少なくとも１つポリペプチド及び少なくとも１つの適した担体、希釈剤、又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適する）、及び、場合により、１つ以上のさらなる活性物質を含む医薬的組成物に関する。
【０２８６】
一般的に、本発明のポリペプチドは、それ自体が公知の任意の適した様式において製剤化及び投与することができる。例えば、上に引用する一般的な背景技術（ならびに特にＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６７、及びＷＯ０８／０２００７９に）ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005);又はthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５ページを参照のこと）が参照される。
【０２８７】
本発明のポリペプチドは、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）ならびに他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体が公知の任意の様式で製剤化及び投与されうる。これらを調製するためのそのような製剤及び方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、又はくも膜下腔内投与）のために又は局所（即ち、経皮又は皮内）投与のために適した調製物を含む。
【０２８８】
非経口投与のための調製物は、例えば、注入又は注射のために適している滅菌溶液、懸濁剤、分散剤、又は乳剤でありうる。そのような調製物のための適した担体又は希釈剤は、例えば、限定を伴わず、ＷＯ０８／０２００７９の１４３ページ上に言及されるものを含む。一実施態様において、調製物は水性溶液又は懸濁液である。
【０２８９】
本発明のポリペプチドは、遺伝子治療からの公知の送達の方法を使用し、投与することができ、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号
（その遺伝子治療の送達方法のために参考として組み入れられる）を参照。送達の遺伝子治療方法を使用し、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチドをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトした初代細胞を、追加で、組織特異的プロモーターを用いてトランスフェクトし、特定の器官、組織、移植片、腫瘍、又は細胞を標的とすることができ、加えて、細胞内での局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列を用いてトランスフェクトすることができる。
【０２９０】
このように、本発明のポリペプチドは、全身的に、例えば、医薬的に許容可能な培地（例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体など）との組み合わせにおいて経口的に投与してもよい。それらは、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセル中に封入してもよく、錠剤中に圧縮してもよく、又は患者の食事での食物と直接的に組み入れてもよい。経口的な治療的投与のために、本発明のポリペプチドは、１つ以上の賦形剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態において使用してもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１%の本発明のポリペプチドを含むべきである。組成物及び調製物中のそれらのパーセンテージは、もちろん、変動しうるが、便利には、所与の単位投与形態の重量の約２〜約６０%の間でありうる。そのような治療的に有用な組成物中での本発明のポリペプチドの量は、効果的な投与量レベルが得られるようにする。
【０２９１】
腫瘍切除の部位での局所投与のために、本発明のポリペプチドを、生物分解性ポリマー薬物送達系、徐放性ポリ（乳酸）−ｃｏ−グリコール酸製剤などにおいて使用してもよい（Hart et al., Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3): CD007294）。
【０２９２】
本発明のさらに好ましい局面において、本発明のポリペプチド、例えば、１つの一価抗ヒトＰ２Ｘ７免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つの一価抗ヒト血清アルブミン免疫グロブリン単一可変ドメインから本質的になる（ＧＳリンカーにより連結されている）ポリペプチドなどは、従来の抗体（例えばＩｇＧなど）と比較し、固形腫瘍において有益な分布及び動態プロファイルを有しうる。
【０２９３】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、また、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤及び甘味剤又は香味剤、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１４３〜１４４ページに言及されるものを含みうる。単位投与形態がカプセルである場合、それは、上の型の材料に加えて、液体担体（例えば植物油又はポリエチレングリコールなど）を含みうる。種々の他の材料が、コーティングとして存在しうる、又は、そうでなければ、固形の単位投与形態の物理的形態を修飾しうる。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック、又は糖などを用いてコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルは、本発明のポリペプチド、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び香料（例えばチェリー又はオレンジフレーバーなど）を含みうる。無論、任意の単位投与形態を調製する際に使用される任意の材料は、医薬的に許容可能であり、用いられる量において実質的に非毒性であるべきである。また、本発明のポリペプチドは、持続放出調製物及びデバイス中に組み入れてもよい。
【０２９４】
経口投与のための調製物及び製剤は、また、本発明のコンストラクトが、胃環境に耐性であり、腸中へ通過することを許しうる腸溶コーティングを伴い提供されうる。より一般的には、経口投与のための調製物及び製剤を、胃腸管の任意の所望の部分中への送達のために適切に製剤化してもよい。また、適した坐剤を、胃腸管中への送達のために使用してもよい。
【０２９５】
本発明のポリペプチドは、また、注入又は注射により、静脈内又は腹腔内に投与してもよい。特定の例は、ＷＯ０８／０２００７９の１４４及び１４５ページ及びＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２９７５（全文書）中にさらに記載されている通りである。
【０２９６】
局所投与のために、本発明のポリペプチドを、純粋な形態（即ち、それらが液体である場合）において適用してもよい。しかし、一般的に、それらを、皮膚に、組成物又は製剤として、皮膚科学的に許容可能な担体（それは、固体又は液体でありうる）との組み合わせにおいて投与することが望ましいであろう。特定の例が、ＷＯ０８／０２００７９の１４５ページにさらに記載されている通りである。
【０２９７】
一般的に、液体組成物（例えばローションなど）中での本発明のポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５wt-%から、好ましくは約０．５〜１０wt-%からでありうる。半固形又は固形組成物（例えばゲル又は粉末など）中での濃度は、約０．１〜５wt-%、好ましくは約０．５〜２．５wt-%でありうる。
【０２９８】
処置における使用のために要求される本発明のポリペプチドの量は、選択された特定のポリペプチドだけでなく、しかし、また、投与の経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢及び状態に伴い変動しうるが、究極的には、担当医又は臨床医の判断によるであろう。また、本発明のポリペプチドの投与量は、標的細胞、腫瘍、組織、移植片、又は器官に依存して変動する。
【０２９９】
所望の用量は、便利に、単一用量中で又は適切な間隔で投与される分割用量として（例えば、２、３、４又はそれ以上のサブ用量／日として）提示されうる。サブ用量自体は、さらに、例えば、多数の別々の緩く間隔を置いた投与中に分割されうる。
【０３００】
投与レジメンは、長期間の毎日の処置を含みうる。「長期間」により、少なくとも２週間及び好ましくは、いくつかの週、月、又は年の持続期間を意味する。この投与量の範囲における必要な改変が、当業者により、本明細書における与えられた教示のルーチン実験だけを使用して決定されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。投与量は、また、任意の合併症の事象において個々の医師により調整されることができる。
【０３０１】
別の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７に関連する少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３０２】
本発明の文脈において、用語「防止及び／又は処置」は、疾患を防止及び／又は処置することを含むだけでなく、しかし、また、一般的に、疾患の発症を防止すること、疾患の進行を遅らせる又は逆転させること、疾患に関連付けられる１つ以上の症状の発生を防止する又は遅らせること、疾患に関連付けられる１つ以上の症状を低下及び／又は軽減すること、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度及び／又は持続時間を低下させること、ならびに／あるいは、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度におけるさらなる増加を防止すること、疾患により起こされる任意の生理学的な傷害を防止、低下、又は逆転させること、ならびに、一般的に、処置されている患者に有益である任意の薬理学的な作用を含む。
【０３０３】
処置すべき被験者は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、及び、さらに特にヒトである。当業者に明らかであろう通り、処置すべき被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクがあるヒトであろう。
【０３０４】
本発明は、Ｐ２Ｘ７に関連する少なくとも１つの疾患もしくは障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、その生物学的もしくは薬理学的な活性を伴い、及び／又はＰ２Ｘ７が含まれる生物学的な経路もしくはシグナル伝達を伴い、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のアミノ酸配列の、本発明のポリペプチドの、及び／又はそれらを含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。実施態様において、本発明は、Ｐ２Ｘ７、その生物学的もしくは薬理学的な活性、及び／又はＰ２Ｘ７が含まれる生物学的な経路もしくはシグナル伝達を調節することにより処置することができる少なくとも１つの疾患もしくは障害の防止及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。実施態様において、前記の医薬的に効果的な量は、Ｐ２Ｘ７、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＰ２Ｘ７が含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節するために十分である量；及び／又は、Ｐ２Ｘ７、その生物学的もしくは薬理学的活性、及び／又はＰ２Ｘ７が含まれる生物学的経路もしくはシグナル伝達を調節するために十分である、循環中の本発明のポリペプチドのレベルを提供する量でありうる。
【０３０５】
実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又はこれらを含む医薬的組成物を、患者に投与することにより、遮断及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の遮断及び／又は処置のための方法に関する。実施態様において、方法は、本発明のポリペプチド、又はこれらをコードする本発明のヌクレオチドコンストラクトの、及び／又はこれらを含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【０３０６】
実施態様において、本発明は、Ｐ２Ｘ７へのＡＴＰの結合を、処置すべき被験者の特定の細胞において又は特定の組織において阻害することにより（及び特にＭＳ患者においてＰ２Ｘ７へのＡＴＰの結合を阻害することにより）遮断及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患もしくは障害の遮断及び／又は処置のための方法に関し、前記方法は、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【０３０７】
実施態様において、本発明は、本明細書において列挙する疾患及び障害からなる群より選ばれる少なくとも１つの疾患もしくは障害の遮断及び／又は処置のための方法であって、前記方法は、それを必要とする被験者に、本発明のポリペプチド、又はこれらをコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又はこれらを含む医薬的組成物を投与することを含む。
【０３０８】
実施態様において、本発明は、免疫療法のため、特に受動免疫療法のための方法に関し、その方法は、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ又はそのリスクがある被験者に、本発明のポリペプチド、又は同をコードする本発明のヌクレオチドコンストラクト、及び／又は同を含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０３０９】
上の方法において、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド及び／又は同を含む組成物を、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、任意の適した様式で投与することができる。このように、本発明のポリペプチド及び／又は同を含む組成物を、例えば、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、経口、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、又は胃腸管内を回避する他の任意の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所、坐剤を用いて、吸入により投与することができる。臨床医は、そのような投与において使用される適した投与経路及び適した医薬的製剤又は組成物を、遮断又は処置すべき疾患又は障害及び臨床医に周知である他の因子に依存して、選択することができるであろう。
【０３１０】
本発明のポリペプチド及び／又はこれらを含む組成物を、遮断又は処置すべき疾患又は障害を遮断及び／又は処置するために適している処置レジメンに従って投与する。臨床医は、一般的に、適した処置レジメンを、因子、例えば、遮断又は処置すべき疾患又は障害、処置すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用すべき本発明のポリペプチド、使用すべき特定の投与経路及び医薬的製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、ならびに臨床医に周知の同様の因子などに依存して、決定することができるであろう。
【０３１１】
一般的に、処置レジメンは、本発明の１つ以上のポリペプチドの、又はこれらを含む１つ以上の組成物の、１つ以上の医薬的に効果的な量又は用量における投与を含みうる。投与される特定の量又は用量は、臨床医により、再び、上に引用する因子に基づき、決定することができる。
【０３１２】
一般的に、本明細書において言及する疾患及び障害の遮断及び／又は処置のために、処置すべき特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のポリペプチドの効力、特定の投与経路、及び使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、本発明のポリペプチドは、一般的に、１グラム〜０．０１マイクログラム／kg体重／日、好ましくは０．１グラム〜０．１マイクログラム／kg体重／日、例えば約１、１０、１００、又は１０００マイクログラム／kg体重／日の量で、連続的（例えば、注入による）、単一の１日用量として又は１日の間の複数の分割用量として投与されうる。臨床医は、一般的には、適した一日用量を、本明細書において言及する因子に依存して、決定することができるであろう。また、特定の場合において、臨床医は、これらの量から逸脱することを、例えば、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選んでもよいことが明らかであろう。一般的に、投与される量に関する一部のガイダンスは、しかし、親和性／結合力、有効性、生物分布、半減期、及び当業者に周知の同様の因子における違いを考慮に入れて、本質的に同じ経路を介して投与される、同じ標的に対する同等の従来の抗体又は抗体フラグメントについて通常投与される量から得ることができる。
【０３１３】
実施態様において、本発明の単一の隣接ポリペプチドを使用しうる。一実施態様において、本発明の２つ以上のポリペプチドを、組み合わせにおいて提供する。
【０３１４】
本発明のポリペプチドを、１つ以上のさらなる医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて、即ち、組み合わせ処置レジメンとして使用してもよく、それは、相乗効果に導きうる又は導かないであろう。再び、臨床医は、そのようなさらなる化合物又は成分、ならびに適した組み合わせの処置レジメンを、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、選択することができるであろう。
【０３１５】
特に、本発明のポリペプチドを、本明細書において引用する疾患及び障害の防止及び／又は処置のために使用する又は使用することができる他の医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られうる又は得られないであろう。そのような化合物及び成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例は、臨床医には明らかでありうる。
【０３１６】
本発明に従って使用される処置レジメンの有効性は、含まれる疾患又は障害についてそれ自体が公知である任意の様式で決定及び／又は追跡してもよく、臨床医に明らかであろう通りである。臨床医は、また、適切な場合、及び、ケースバイケースに基づき、特定の処置レジメンを変化又は修飾することができ、所望の治療的効果を達成し、不要な副作用を回避、限定、もしくは低下させ、及び／又は、一方で所望の治療的効果を達成すること、他方で不要な副作用を回避、限定、もしくは低下させることの間で適切なバランスを達成するようにする。
【０３１７】
一般的に、処置レジメンには、所望の治療的効果が達成されるまで及び／又は所望の治療的効果が維持されるべきである限り、従いうる。再び、これは、臨床医により決定されることができる。
【０３１８】
別の局面において、本発明は、Ｐ２Ｘ７に関連する疾患及び障害の少なくとも１つの防止及び／又は処置のため；及び／又は、本明細書において言及する処置の方法の１つ以上における使用のための医薬的組成物の調製における本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０３１９】
処置すべき被験者は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、及び、さらに特にヒトである。獣医学的な適用において、処置すべき被験者は、商業的な目的のために産生された又はペットとして保たれた任意の動物を含む。当業者に明らかであろう通り、処置すべき被験者は、特に、本明細書において言及する疾患及び障害に苦しむ、又はそのリスクがあるヒトであろう。
【０３２０】
本発明は、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチド、及び／又は同の医薬的組成物を、患者に投与することにより防止及び／又は処置することができる少なくとも１つの疾患又は障害の防止及び／又は処置のための医薬的組成物の調製における、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチドの使用に関する。
【０３２１】
さらに特に、本発明は、Ｐ２Ｘ７に関連する疾患及び障害の防止及び／又は処置のための、特に、本明細書において列挙する疾患及び障害の１つ以上の防止及び処置のための医薬的組成物の調製における、本発明のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチドの使用に関する。
【０３２２】
再び、そのような医薬的組成物において、本発明の１つ以上のポリペプチド、又は同をコードするヌクレオチド、及び／又は同の医薬的組成物を、また、１つ以上の他の活性成分（例えば本明細書において言及するものなど）と適切に組み合わせてもよい。
【０３２３】
本発明は、また、インビトロ（例えば、インビトロ又は細胞アッセイにおいて）又はインビボ（例えば、単一細胞又は多細胞生物において、特に、哺乳動物において、及び、さらに特にヒトにおいて、例えば、本発明の疾患又は障害のリスクがある又はそれに苦しむヒトにおいて）のいずれかでの使用のための組成物（例えば、限定を伴わず、本明細書においてさらに記載する通りの医薬的組成物又は調製物など）に関する。
【０３２４】
本発明のＩＳＶは、糸球体腎炎の関連する実験モデルにおいて、炎症の効果を寛解する。それらの作用様式に基づき、本発明のＩＳＶ及びコンストラクトは、他のＰ２Ｘ７関連疾患（しかし、限定しないが、ＭＳ、ＩＢＤ、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌を含む）の処置において有用でありうる。
【０３２５】
本発明のＩＳＶが、Ｐ２Ｘ７受容体機能を調節し、Ｐ２Ｘ７受容体でのＡＴＰの効果に拮抗することが可能であるため、これらの化合物は、また、Ｐ２Ｘ７関連疾患（神経変性疾患を含む）の処置において有用でありうることが考えられる。神経変性疾患は、認知症、特に変性認知症（例えば老人性認知症、レビー小体病を伴う認知症、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病及びクロイツフェルト・ヤコブ病、ＡＬＳ、又は運動ニューロン疾患；特にアルツハイマー病など）；血管性認知症（多発脳梗塞性認知症を含む）；ならびに頭蓋内空間を占める病変に関連する認知症；外傷；感染症及び関連症状（ＨＩＶ感染、髄膜炎、及び帯状疱疹を含む）；代謝；毒素；無酸素症及びビタミン欠乏症；及び軽度認知障害（例えば、加齢、特に加齢に関連する記憶障害）を含む。神経変性疾患（例えば、本発明のＩＳＶＳ又はコンストラクトにより処置されるべき）は、例えば、変性認知症（特にアルツハイマー病）、血管性認知症（特に多発梗塞性認知症）、又は軽度認知障害（ＭＣＩ）、例えば、加齢に関連するＭＣＩ、例えば年齢に関連する記憶障害などでありうる。
【０３２６】
本発明の組み合わせは、また、神経保護剤として、及び、外傷、例えば脳卒中、心停止、肺バイパス、外傷性脳傷害、脊髄傷害などに続く神経変性の処置において有用である。
【０３２７】
本発明のＩＳＶが、Ｐ２Ｘ７受容体機能を調節し、Ｐ２Ｘ７受容体でのＡＴＰの効果に拮抗することが可能であるため、これらの化合物は、疼痛（急性疼痛、慢性疼痛、慢性関節痛、筋骨格痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、内臓痛、癌に関連する疼痛、片頭痛に関連する疼痛、緊張性頭痛及び群発頭痛、機能性腸障害に関連する疼痛、腰痛及び頸部痛、捻挫及び筋挫傷に関連する疼痛、交感神経により維持される疼痛；筋炎、インフルエンザ又は他のウイルス感染に関連する疼痛、例えば一般的な風邪など、リウマチ熱に関連する疼痛、心筋虚血に関連する疼痛、術後疼痛、癌化学療法、頭痛、歯痛、及び月経困難症を含む）の処置において有用でありうることが考えられる。
【０３２８】
処置への参照は、他に明記されない限り、確立された症状の処置及び予防的処置の両方を含むことを理解すべきである。
【０３２９】
本発明のさらなる局面に従い、本発明者らは、従って、ヒト又は獣医学における使用のため及び／又は治療における使用のために、本明細書において定義するＩＳＶのコンストラクトを提供する。
【０３３０】
本発明の別の局面に従い、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７により媒介される状態の処置又は防止（例えば、処置）における使用のための、本明細書において定義する通りの組み合わせを提供する。組み合わせは、疼痛、炎症（例えば、ＭＳ、関節リウマチ、又は変形性関節症）、又は神経変性疾患の処置又は防止（例えば、処置）における使用のため、あるいは、特に、炎症性疼痛、神経因性疼痛、内臓痛、関節リウマチ、又は変形性関節症の処置における使用のために、例えば、哺乳動物、例えばヒトなどにおいて有用でありうる。
【０３３１】
本発明のさらなる局面に従い、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７により媒介される状態、例えば、本明細書において開示する状態又は疾患（特に、疼痛、炎症、ＭＳ、関節リウマチ、変形性関節症、又は神経変性疾患）に苦しんでいるヒト又は動物（例えば、齧歯類、例えば、ラット）被験者、例えばヒト被験者を処置する方法を提供し、本明細書において定義する通りの組み合わせの効果的な量を被験者に投与することを含む。
【０３３２】
本発明のさらなる局面に従い、本発明者らは、疼痛、炎症（例えば、ＭＳ、関節リウマチ、又は変形性関節症）、又は神経変性疾患（さらに特に、関節リウマチ又は変形性関節症、及び／又は疼痛、例えば炎症性疼痛、神経因性疼痛、又は内臓痛など）に苦しんでいるヒト又は動物（例えば、齧歯類、例えば、ラット）被験者、例えばヒト被験者を処置する方法を提供し、方法は、本明細書において定義する通りのコンストラクト又はＩＳＶの効果的な量を前記被験者に投与することを含む。
【０３３３】
本発明の別の局面に従い、本発明者らは、Ｐ２Ｘ７受容体の作用により媒介される状態、例えば、本明細書において開示する状態又は疾患の、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は齧歯類など、例えば、ヒト又はラット、例えば、ヒトにおける処置又は防止（例えば、処置）のための医薬品の製造のための、本明細書において定義する通りのコンストラクト又はＩＳＶの使用を提供する。本発明の別の局面に従い、本発明者らは、疼痛（例えば、炎症性疼痛、神経因性疼痛、又は内臓痛）、炎症（例えば、ＭＳ、関節リウマチ、又は変形性関節症）、又は神経変性疾患の、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト又は齧歯類など、例えば、ヒト又はラット、例えば、ヒトにおける処置又は防止（例えば、処置）のための医薬品の製造のための、本明細書において定義する通りの組み合わせの使用を提供する。
【０３３４】
ヒト及び他の哺乳動物の処置のための本明細書において定義する通りの組み合わせを使用するために、それを、場合により、医薬的実践に従って、医薬的組成物として製剤化することができる。従って、本発明の別の局面において、ヒト又は獣医学における使用のために適合された、本明細書において定義する通りの組み合わせを含む医薬組成物が提供される。
【０３３５】
治療における本明細書において定義する通りの組み合わせを使用するために、それらは、場合により、医薬的実践に従って、医薬組成物に製剤化することができる。本発明は、また、医薬的組成物（本明細書において定義する通りの組み合わせを含む）、又はその医薬的に許容可能な塩、及び、場合により、医薬的に許容可能な担体を提供する。本発明を、現在、以下の非限定的な好ましい局面、実施例えば、及び図を用いてさらに記載する。
【０３３６】
局面
Ａ１．５０nM未満のＫｄを伴いＰ２Ｘ７に結合することができる、Ｐ２Ｘ７関連疾患を処置する際での使用のための少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、前記Ｐ２Ｘ７への前記免疫グロブリン単一可変ドメインの結合が、Ｐ２Ｘ７の活性を阻害する。
【０３３７】
Ａ２．局面Ａ１に従ったポリペプチドであって、前記のＰ２Ｘ７関連疾患が、ＭＳ、ＩＢＤ、神経因性疼痛、てんかん、脳卒中、糖尿病、高血圧、及び癌からなる群より選択される。
【０３３８】
Ａ３．局面Ａ１又はＡ２に従ったポリペプチドであって、ここで、前記Ｐ２Ｘ７がヒトＰ２Ｘ７である。
【０３３９】
Ａ４．局面Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３に結合する。
【０３４０】
Ａ５．局面Ａ１〜Ａ４のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１のアミノ酸配列を含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）；ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）である；及び
−  ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号３４〜４７、
−  配列番号３４〜４７と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号３４〜４７と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド；及び
−  ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号６２〜７５；
−  配列番号６２〜７５と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び
−  配列番号６２〜７５と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド；及び
−  ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号９０〜１０３；
−  配列番号９０〜１０３と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び
−  配列番号９０〜１０３と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド。
【０３４１】
Ａ６．局面Ａ５に従ったポリペプチドであって、ここで、フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号６〜１９のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する。
【０３４２】
Ａ７．局面Ａ５又はＡ６に従ったポリペプチドであって、ここで、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群より選ばれ、ここで：
−  ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号６２であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９０；
−  ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９１；
−  ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号６８であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９６；
−  ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号６４であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９２；
−  ＣＤＲ１は配列番号３７であり、ＣＤＲ２は配列番号６５であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９３であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３８であり、ＣＤＲ２は配列番号６６であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９４であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３９であり、ＣＤＲ２は配列番号６７であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９５であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４１であり、ＣＤＲ２は配列番号６９であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９７であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４２であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９８であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４３であり、ＣＤＲ２は配列番号７１であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９９であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４４であり、ＣＤＲ２は配列番号７２であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１００であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＣＤＲ２は配列番号７３であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０１であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４６であり、ＣＤＲ２は配列番号７４であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０２であり；及び
−  ＣＤＲ１は配列番号４７であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０３である；
【０３４３】
Ａ８．局面Ａ５〜Ａ７のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される。
【０３４４】
Ａ９．局面Ａ５〜Ａ７のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号６〜１９と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される。
【０３４５】
Ａ１０．Ｐ２Ｘ７に結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、局面Ａ１〜Ａ９のいずれか１つに従ったポリペプチド。
【０３４６】
Ａ１１．局面Ａ１０に従ったポリペプチドであって、ここで、少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、式１のアミノ酸配列を含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （１）；ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４が、フレームワーク領域１〜４を指し、免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）である；及び
−  ここで、ＣＤＲ１は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号３４〜４７、
−  配列番号３４〜４７と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド、及び
−  配列番号３４〜４７と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド；及び
−  ここで、ＣＤＲ２は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号６２〜７５；
−  配列番号６２〜７５と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び
−  配列番号６２〜７５と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド；及び
−  ここで、ＣＤＲ３は、以下からなる群より選ばれる：
−  配列番号９０〜１０３；
−  配列番号９０〜１０３と少なくとも８０%アミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び
−  配列番号９０〜１０３と３、２、又は１アミノ酸の違いを有するポリペプチド。
【０３４７】
Ａ１２．局面Ａ１１に従ったポリペプチドであって、ここで、フレームワーク領域（ＦＲ）が、配列番号６〜１９のＦＲと８０%を上回る配列同一性を有する。
【０３４８】
Ａ１３．局面Ａ１１又はＡ１２に従ったポリペプチドであって、ここで、少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、免疫グロブリン単一可変ドメインの群より選ばれ、ここで：
−  ＣＤＲ１は配列番号３４であり、ＣＤＲ２は配列番号６２であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９０であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３５であり、ＣＤＲ２は配列番号６３であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９１であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４０であり、ＣＤＲ２は配列番号６８であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９６であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３６であり、ＣＤＲ２は配列番号６４であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９２であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３７であり、ＣＤＲ２は配列番号６５であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９３であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３８であり、ＣＤＲ２は配列番号６６であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９４であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号３９であり、ＣＤＲ２は配列番号６７であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９５であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４１であり、ＣＤＲ２は配列番号６９であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９７であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４２であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９８であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４３であり、ＣＤＲ２は配列番号７１であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号９９であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４４であり、ＣＤＲ２は配列番号７２であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１００であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＣＤＲ２は配列番号７３であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０１であり；
−  ＣＤＲ１は配列番号４６であり、ＣＤＲ２は配列番号７４であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０２であり；及び
−  ＣＤＲ１は配列番号４７であり、ＣＤＲ２は配列番号７５であり；及び、ＣＤＲ３は配列番号１０３である。
【０３４９】
Ａ１４．局面Ａ１０〜Ａ１３のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号６〜１９と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される。
【０３５０】
Ａ１５．局面Ａ１０〜Ａ１３のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号６〜１９と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を各々有する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される。
【０３５１】
Ａ１６．Ｐ２Ｘ７に結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、局面Ａ１０〜Ａ１５のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、Ｐ２Ｘ７に結合することができる前記の少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じでありうる又は異なりうる。
【０３５２】
Ａ１７．免疫グロブリン単一可変ドメイン結合ヒト血清アルブミン、例えばＡｌｂ８（配列番号１２６）又はＡｌｂ１１（配列番号１２５）などをさらに含む、局面Ａ１〜Ａ１６のいずれかに従ったポリペプチド。
【０３５３】
Ａ１８．局面Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドが、配列番号１１８〜１２４と８０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【０３５４】
Ａ１９．局面Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに従ったポリペプチドポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号１１８〜１２４と９０%を上回る配列同一性を伴うアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【０３５５】
Ａ２０．局面Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、ポリペプチドは、配列番号１１８〜１２４からなる群より選択される。
【０３５６】
Ａ２１．Ｐ２Ｘ７に対して向けられた少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであって、ここで
ａ）少なくとも１つの第１免疫グロブリン単一可変ドメインが、Ｐ２Ｘ７の第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられ；及び、ここで、
ｂ）少なくとも１つの第２免疫グロブリン単一可変ドメインが、第１抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造とはそれぞれ異なる、前記Ｐ２Ｘ７の第２抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット、又は立体構造に対して向けられる。
【０３５７】
Ａ２２．局面Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに従ったポリペプチドであって、ここで、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適しているアミノ酸配列、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために適しているアミノ酸配列、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、又はラクダ化ＶＨ配列からなるポリペプチド。
【０３５８】
Ａ２３．局面Ａ１〜Ａ２２のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、AlphascreenアッセイにおけるＩＣ５０が３０nM又はそれ以下である。
【０３５９】
Ａ２４．局面Ａ１〜Ａ２３のいずれかに従ったポリペプチドであって、ここで、AlphascreenアッセイにおけるＩＣ５０が３ｎＭ又はそれ以下である。
【０３６０】
Ａ２５．医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、局面Ａ１〜Ａ２４のいずれかに従ったポリペプチド。
【０３６１】
Ａ２６．局面Ａ１〜Ａ２５のいずれかに従ったポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、以下の工程を少なくとも含む：
ａ）適した宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適した発現系において、局面Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに従ったポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ）前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製すること。
【０３６２】
Ａ２７．少なくとも以下の工程を含む、Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に対して向けられた免疫グロブリン単一可変ドメインをスクリーニングするための方法：
ａ）免疫グロブリン単一可変ドメインのセット、コレクション、又はライブラリーを提供すること；及び
ｂ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインについて、免疫グロブリン単一可変ドメインの前記セット、コレクション、又はライブラリーをスクリーニングすること；及び
ｃ）Ｐ２Ｘ７及び特にヒトＰ２Ｘ７（配列番号１〜３）に結合することができる及び／又はそれについての親和性を有するアミノ酸配列を単離すること。
【０３６３】
Ａ２８．５０nM未満のＫｄを伴いＰ２Ｘ７に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインであって、ここで、前記Ｐ２Ｘ７への前記免疫グロブリン単一可変ドメインの結合によって、Ｐ２Ｘ７の活性が阻害される。
【０３６４】
本願を通じて引用する参考文献（文献・参考文献、発行された特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全ての全内容が、本明細書により、参照により、特に、本明細書において上に参照する教示について、明確に組み入れられる。
【０３６５】
【表２】
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【０３６６】
【表３】
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【０３６７】
【表４】
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【０３６８】
【表５】
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【０３６９】
【表６】
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【０３７０】
実施例
実施例１．１：ラマ４０５及び４１８の免疫化ならびにファージディスプレイライブラリーの構築
ラマを、ＤＮＡプライム＞タンパク質の追加免疫戦略により免疫化した（Koch-Nolte et al.2007 Faseb J 21: 3490-3499）。ラマを、遺伝子銃（Biorad）当たり、剃毛した左右の脇腹上に、金粒子上に吸着されたマウスＰ２Ｘ７（ｍＰ２Ｘ７）及びヒトＰ２Ｘ７（ｈＰ２Ｘ７）用のｃＤＮＡコンストラクトを用いて免疫化し（１μm、１μg  ＤＮＡ／mg金を用いた各々、１２ショット）、同を用いて、３回、２週間間隔で追加免疫した（図１）。最終的なＤＮＡ免疫化の３及び９日後、１００mlの末梢血液を、各々、収集した。全ＲＮＡを血液リンパ球から調製し、ＶＨＨレパートリーをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＡＸ５０ファージミド中にクローン化し、ファージライブラリーＰＢＬ１及びＰＢＬ２を生成した。ラマを、さらに、１回、ｍＰ２Ｘ７又はｈＰ２Ｘ７を安定的に発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を用いて追加免疫した（Adriouch et al., 2008 FASEB J. 22, 861-869）（２×１０７個のＨＥＫ＿ｍＰ２Ｘ７細胞及び３×１０７個のＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞、１５分間にわたり、１mM  ＡＴＰを用いて前処理し、次に、２%パラホルムアルデヒド中で１０分間にわたり氷上で固定）。４及び８日後、末梢血を収集し、ファージライブラリーＰＢＬ３及びＰＢＬ４を生成した。最終的な追加免疫を、ＨＥＫ＿ｍＰ２Ｘ７細胞ライセートからのアガロース共役ｍＡｂｓ  ＨＡＮＯ４３及びＨＡＮＯ４４（Adriouch et al. 2005, Moller et al.2007）を用いて免疫沈降した、精製ビーズ結合組換えｍＰ２Ｘ７（５μg／５０μlビーズ）を用いて実施した。４及び１０日後、ファージライブラリーＰＢＬ５及びＰＢＬ６を生成した。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＶＨＨレパートリーをＰＣＲにより増幅し、ｐＡＸ５０ファージミドベクター中にクローン化した。ファージをＴＧ１大腸菌中で増幅した。
【０３７１】
実施例１．２：ヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂの選択、シークエンシング、及び初期特徴付け
抗ｈＰ２Ｘ７ナノボディ（Ｎｂ）の選択を、組み合わせたファージライブラリーＰＢＬ５及びＰＢＬ６を用いて行った。２つの選択を行い、各々が、ｈＰ２Ｘ７発現細胞上での２ラウンドのパニングを含んだ。セクション１において、ファージライブラリーＰＢＬ５＋６（２００μl）を、ヒトＰ２Ｘ７を安定的に発現するためのトランスフェクトされたマウスＹａｃ−１リンパ腫細胞（２．５×１０７個の細胞）上にパニングした。細胞結合ファージを、トリプシン処理（１５分間、室温）により溶出し、上清を使用し、ＴＧ１大腸菌中での再感染当たりで、ファージを増幅させた。第１ラウンドの選択（２００μl）からのレスキューファージを、ｈＰ２Ｘ７を発現するように安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞上にさらにパニングした（２×１０７個の細胞）。各々のラマについて、クローンを、ラウンド２（Ｒ２）だけから選定した。ファージミドを各々のクローンから調製し、ｐＡＸ５０シークエンシングプライマーを用いて配列決定した。単一ドメイン抗体としてのＮｂの発現のために、ｐＡＸ５０ファージミドベクターを、ＨＢ２１５１大腸菌中に個々に形質転換した。一価Ｎｂを、可溶性Ｈｉｓ６ｘタグ付きタンパク質として発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりペリプラズム溶解物から精製した。
【０３７２】
シークエンシング結果によって、ラマ４０５のライブラリーＰＢＬ５＋６のＲ２選択からの３４の同一クローンが明らかになった（ファミリーａ）（表１）。４１クローンを、ラマ４１８のライブラリーＰＢＬ５＋６のＲ２選択から配列決定し、３つの異なるファミリーからなり（表１）、その内の３９は同一であった（ファミリーｂ、１ｃ１１３）。ＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞上でのテスト発現及び結合分析によって、１ｃ８１（ファミリーａ）及び１ｃ１１３（ファミリーｂ）がｈＰ２Ｘ７に特異的に結合するのに対し、２つの他の選択されたクローン（１ｃ１２１及び１ｃ１２６）は非結合剤であった（図２Ａ）。
【０３７３】
故に、同定されたクローンは、ラマ特異的であった。それにもかかわらず、２つの精緻化されたラウンドのパニング後でさえ、非結合剤が選択された。さらに、結果が、見かけ上のドミナントファージの存在により激しく歪められた。
【０３７４】
【表７】
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【０３７５】
選択されたクローンの数及び多様性を増加させるために、第２選択を、上の通りの同じ細胞を使用して行った：Ｒ１におけるＹａｃ−１＿ｈＰ２Ｘ７、及びＲ２におけるＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７。見かけ上のドミナントファージの再選択を防止するために、結合部位を、パニングに先立ち、過剰の精製１ｃ８１及び１ｃ１１３  Ｎｂ（０．７μg／２×１０７個の細胞）を用いた、Ｒ１におけるＹａｃ−１細胞のプレインキュベーションにより飽和させた。
【０３７６】
ドミナントファージを対比選択したが、第２選択手順によって、任意の他の中程度から強い結合剤は明らかにならなかった。特に、ラマ４１８ライブラリーのＲ２からの８クローンのシークエンシングによって、２つの異なるファミリーに属するクローンが明らかになり、各々が、同一の配列の４つのクローンを伴った。ＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞上でのテスト発現及び結合分析によって、ＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞への無の（３ｃ３４）又は非常に弱い結合だけ（３ｃ３９）が示された。
【０３７７】
ラマ４０５ライブラリーのＲ２からの１０クローンのシークエンシングによって、３つの異なるファミリーに属するクローンが明らかになった。１０クローン中５つが、わずかに異なるアミノ酸配列を伴うにもかかわらず、ファミリーａ、即ち、１ｃ８１と同じファミリーに属した。これらの４つは、同一のアミノ酸配列を有した。２つの別個の配列からなるさらなる３つのクローンが、新たなファミリーに属した（ファミリー  ｃ、３ｃ２３及び３ｃ２８）。ＨＥＫ＿ｈＰ２Ｘ７細胞上でのテスト発現及び結合分析によって、３ｃ２３（ファミリーｃ）がｈＰ２Ｘ７に特異的に結合したのに対し、１つの他の選択されたクローン（３ｃ３１）が非結合剤であったことが示された（図２Ｂ）。
【０３７８】
これらの結果によって、以前の治験、任意のＰ２Ｘ７結合剤の同定が、簡単ではないことが確証される。
【０３７９】
実施例１．３：二価分子中へのＮｂの再フォーマット化及び組換えタンパク質の産生
Ｎｂ１ｃ８１、１ｃ１１３、３ｃ２３のホモマー及びヘテロマー二量体をＰＣＲにより構築し、長い隣接プライマーを使用し、３５−ＧＳリンカー（ＳｆｉＩ−Ｎｂ１−２０ＧＳ−ＢａｍＨＩ−１５ＧＳ−Ｎｂ２−ＮｏｔＩ）を挿入するようにした。ＶＨＨドメインを、また、真核生物発現ベクターｐＭＥ（Scheuplein et al., 2010）中への、適した制限酵素部位（５’ＢａｍＨ１及び３’ＸｈｏＩ）により隣接されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、マウスＩｇＧ１のＦｃドメインへの融合タンパク質として再クローン化した。
【０３８０】
一価及び二価Ｎｂを、可溶性Ｈｉｓ６ｘタグ付きタンパク質としてＨＢ２１５１大腸菌中で発現させ、大腸菌ペリプラズマライセートから、固定化金属親和性クロマトグラフィーにより精製した。二価Ｎｂを、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付きＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質として、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞中で発現させた。トランスフェクションから５日後、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、細胞上清から、アガロースビーズ上に固定化されたＭ２−抗ＦＬＡＧ上での親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｎｂｓ及びＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ａｌｅｘａ６４７に、製造者の説明書（Pierce, Invitrogen）に従って結合させた。
【０３８１】
実施例１．４：トランスフェクトＨＥＫ細胞のＦＡＣＳ分析によって、Ｐ２Ｘ７  Ｎｂの特異性が確認される
選択したＮｂの特異性を検証し、Ｎｂが、また、マウスＰ２Ｘ７又はラットＰ２Ｘ７に結合しうるか否かを決定するために、ＨＥＫ細胞を、ＧＦＰ及びｈＰ２Ｘ７、ｍＰ２Ｘ７、又はｒＰ２Ｘ７のいずれかについての発現コンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質又はｍＡｂ  Ｌ４を用いて、ＦＡＣＳ分析前に染色した（図３）。結果は、Ｎｂ３ｃ２３（図中でＷＤ３ｃ２３Ｆｃとして命名される）及び１ｃ１１３（図中でＷＤ１ｃ１１３Ｆｃとして命名される）が、ｈＰ２Ｘ７を認識するが、しかし、ｒＰ２Ｘ７又はｍＰ２Ｘ７はしないのに対し、Ｎｂ１ｃ８１（図中でＷＤ１ｃ８１Ｆｃとして命名される）は、ｈＰ２Ｘ７、ｒＰ２Ｘ７、及びｍＰ２Ｘ７を用いてトランスフェクトされた細胞と特異的に反応する。比較により、以前に記載されたＮｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５（ＷＯ２０１０／０７０１４５）が、ｍＰ２Ｘ７を認識するが、しかし、ｈＰ２Ｘ７又はｒＰ２Ｘ７はせず、ｍＡｂ  Ｌ４は、ｈＰ２Ｘ７及びｒＰ２Ｘ７を認識するが、しかし、ｍＰ２Ｘ７はしない。
【０３８２】
予想外に、異なる種特異性及び交差反応性を伴うクローンが、同定及び選択されたが、マウス及びヒトＰ２Ｘ７  ＤＮＡならびにＰ２Ｘ７細胞を使用した同じ免疫化及び追加免疫戦略に由来した。
【０３８３】
実施例１．５：交差遮断結合分析によって、Ｎｂ  １ｃ８１（ファミリーａ）及び１ｃ１１３（ファミリーｂ）が、抗ｈＰ２Ｘ７  ｍＡｂ  Ｌ４と重複結合部位を共有することが示される
初代リンパ球は、低レベルのＰ２Ｘ７を発現する。異なるエピトープを認識する抗体を組み合わせること、又は立体構造に非依存的な抗体を使用することは、プリン受容体の可視化のための利点でありうる。選択したＮｂが重複エピトープを認識するか否かを検討するために、交差遮断分析を、非結合Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質ならびにＡｌｅｘａ６４７結合ｍＡｂ  Ｌ４及びＮｂ１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃを用いて実施した（図４）。高レベルのｈＰ２Ｘ７を安定的に発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を、飽和レベルの非結合ｍＡｂ  Ｌ４、Ｎｂ  １ｃ８１−Ｆｃ、Ｎｂ  １ｃ１１３−Ｆｃ、Ｎｂ  ３ｃ２３−Ｆｃ、コントロールＮｂ（１０６７−Ｆｃ、抗ｈＣＤ３８）、又は培地（賦形剤）のいずれかを用いてプレインキュベートした。洗浄を伴わず、細胞を、非結合抗体より１０倍少ない量で、示した結合抗体を用いて染色した。
【０３８４】
全ての場合において、コントロールＮｂ１０６７−Ｆｃは、Ａｌｅｘａ６４７結合Ｐ２Ｘ７  ｍＡｂ／Ｎｂによる染色に影響しなかった。Ａｌｅｘａ６４７結合１ｃ１１３−Ｆｃを用いた染色は、非標識１ｃ１１３−Ｆｃ、１ｃ８１−Ｆｃ、及びｍＡｂ  Ｌ４により完全に遮断されたが、しかし、３ｃ２３−Ｆｃによりされなかった。同時に、３ｃ２３−Ｆｃ  Ａｌｅｘａ６４７染色は、非結合３ｃ２３−Ｆｃにより完全に抑止されたが、しかし、他の抗体により影響されなかった。最終的に、ｍＡｂ  Ｌ４  ＡＦ６４７の結合が、３ｃ２３−Ｆｃにより影響されなかったのに対し、染色は、非結合Ｌ４及び１ｃ１１３−Ｆｃの存在において抑止された。１ｃ８１−Ｆｃは、また、不完全ではあるが、Ｌ４  ＡＦ６４７染色を遮断した。
【０３８５】
Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５のＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質の有用性をさらに評価するために、野生型及びＰ２Ｘ７−／−マウスのリンパ節、脾臓、又は肝臓からのリンパ球を、蛍光色素結合マウスＰ２Ｘ７特異的１３Ａ７−Ｆｃ、１４Ｄ５−Ｆｃ又はヒトＰ２Ｘ７特異的３ｃ２３−Ｆｃ（ネガティブコントロール）を用いて、ならびに、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＮＫ１．１に対する抗体を用いて、フローサイトメトリーの前に共染色した。図１３は、Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５のＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質によって、リンパ節、脾臓、及び肝臓からのリンパ球上でＰ２Ｘ７が検出されることを実証する。
【０３８６】
故に、これらのＮｂは、リンパ節、脾臓、及び肝臓からの初代細胞上でＰ２Ｘ７の発現をモニターするための有用なツールである。
【０３８７】
実施例１．６：エピトープ非依存的Ｎｂの組み合わせによって、ヒト末梢血リンパ球及び単球上でのＰ２Ｘ７の可視化が許される
初代リンパ球上でのＰ２Ｘ７の表面発現の検出は、適したツールの可用性及びリンパ球サブセット上でのプリン受容体の固有の低発現により限定される（Buell et al.1998）。３ｃ２３−Ｆｃが、１ｃ８１−Ｆｃ及び１ｃ１１３−Ｆｃに非依存的に結合することを示しているため、本発明者らは、蛍光色素標識Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質の組み合わせによって、ヒト末梢血中のリンパ球及び単球集団上でのＰ２Ｘ７の検出が改善されるか否かをテストした（図５）。この目的のために、単一ドナーからのＰＢＬの比較染色を、ｍＡｂ  Ｌ４対１ｃ１１３−Ｆｃ、３ｃ２３−Ｆｃ、又は後者の２つのＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質の組み合わせを用いて実施した。結果は、ｍＡｂ  Ｌ４単独を用いた染色と比較し、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質の組み合せによって、改善された検出感度がもたらされることを実証する（ＣＤ４＋細胞についてＭＦＩ２１対１１及びＣＤ４−細胞についてＭＦＩ１７対１０）（図５Ａ）。観察された染色の特異性を検証するために、遮断分析を、染色のために使用したのと同じ非標識Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質又はコントロールの組み合わせの１０倍過剰量を用いて実施した。
【０３８８】
異なるドナーにおけるＰ２Ｘ７の検出のために１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃを組み合わせることの有用性を検証するために、３人の別々のドナーからの全血の一定分量を、同じ手順により染色した（図５Ｂ）。単球、顆粒球、及びリンパ球を、ＦＳＣ対ＳＳＣによりゲートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４−／ＣＤ８-リンパ球（主にＢ細胞に対応する）を、ＣＤ４及びＣＤ８発現に基づいてゲートした。結果を連結表現で示す。特異的染色の範囲を、非遮断（−）対遮断（＋）染色のＭＦＩにおける増加倍率として算出した（表１．２）。結果は、単球及び全てのリンパ球サブセット中での（しかし、顆粒球中ではない）細胞表面Ｐ２Ｘ７の特異的染色を示す。Ｐ２Ｘ７発現のレベルは、単球＞ＣＤ４＞ＣＤ８＞ＣＤ４−／ＣＤ８-として定性的に順序付けることができる。
【０３８９】
表１．２．ヒト末梢血白血球上でのＰ２Ｘ７の発現についてのシグナル対バックグラウンド比率。平均蛍光強度を、図５に示す細胞の各々の集団について決定した。それぞれの非遮断（−）対遮断（＋）比率を、バックグラウンドを上回るシグナルの増加倍数として算出した。
【０３９０】
【表８】
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【０３９１】
実施例１．７：Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３は、トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出を遮断する
本発明者らは、以前に、Ｐ２Ｘ７及びＣＤ６２Ｌ（Ｌセレクチン）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ細胞のＡＴＰを用いた処置が、ＣＤ６２ＬのＰ２Ｘ７依存的切断放出（内因性メタロプロテイナーゼのＰ２Ｘ７依存的活性化を介して）をもたらすことを示している。選択したＮｂがＰ２Ｘ７機能を遮断しうるか否かを決定するために、ＣＤ６２Ｌ切断放出分析を、トランスフェクトＨＥＫ細胞を用いて行った（図６）。細胞を、ＣＤ６２ＬだけについてのｃＤＮＡ発現コンストラクトを用いてトランスフェクトした、又はＣＤ６２Ｌ及びｈＰ２Ｘ７についてのコンストラクト（Ｙ１５５＿Ｔ３４８）を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ６２Ｌの切断放出を、ＡＴＰを用いたインキュベートにより誘導した。
【０３９２】
ＣＤ６２Ｌだけを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ細胞において、４mMのＡＴＰを用いたインキュベーションは、ＣＤ６２Ｌの細胞表面レベルに対する効果を示さなかった（図６Ａ）。ＣＤ６２Ｌ及びｈＰ２Ｘ７を用いて同時トランスフェクトしたＨＥＫ細胞において、対照的に、ＡＴＰを用いた処理は、ＣＤ６２Ｌの切断放出を、用量依存的な様式において誘導した（ＥＣ−５０  １．５mM；図６Ｂ）。２mM又は４mMのＡＴＰを用いた処理に先立つ、Ｎｂｓ１ｃ８１又は３ｃ２３のＦｃ融合コンストラクトを用いた細胞のプレインキュベーションによって、ＣＤ６２Ｌの切断放出が抑止された。コントロールＦｃ融合タンパク質１０６７−Ｆｃ（抗ｈＣＤ３８）は、切断放出に影響しなかった（図６Ｂ）。
【０３９３】
実施例１．８：Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３は、トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断する
マウスｍＡｂ  Ｌ４が、ヒト単球上でのＰ２Ｘ７活性化を遮断することが報告されている（Buell et al.1998）。選択されたＮｂ、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質、及びｍＡｂ  Ｌ４の遮断効力を比較するために、比較用量応答アッセイを、トランスフェクトＨＥＫ細胞を用いて実施した（図７）。この目的のために、ＨＥＫ細胞を、ＧＦＰ、ＣＤ６２Ｌ、及びｈＰ２Ｘ７を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を、穏やかなトリプシン処理により回収し、１５分間にわたり室温で、示した量のＮｂ、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質、又はｍＡｂ  Ｌ４を用いてインキュベートした。細胞を、６０分間にわたり３７℃で、４mMのＡＴＰの非存在又は存在において、細胞表面ＣＤ６２Ｌについての染色及びＦＡＣＳ分析の前に、さらにインキュベートした。
【０３９４】
結果は、飽和用量のＮｂ１ｃ８１及び３ｃ２３によるＣＤ６２Ｌ切断放出の完全遮断、飽和用量のＮｂ１ｃ１１３及びｍＡｂ  Ｌ４による部分的遮断、ならびにコントロールＮｂ及びＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質による無遮断を示す。滴定分析によって、二価Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、それらの単一ドメイン対応物を上回る改善されたモル阻害効力を有すること：３ｃ２３−Ｆｃが、３ｃ２３を上回る４倍増加を示したのに対し、１ｃ８１−Ｆｃが、１ｃ８１よりも２０倍より強力であることが明らかになった。故に、ＣＤ６２ＬのＡＴＰ誘導性切断放出を遮断又は強化するための効力に基づき、抗ｈＰ２Ｘ７抗体を、効力の降順において、３ｃ２３−Ｆｃ＞３ｃ２３＞１ｃ８１−Ｆｃ＞１ｃ８１＞１ｃ１１３−Ｆｃ＞１ｃ１１３、ｍＡｂ  Ｌ４として順序付けることができた（表１．３）。
【０３９５】
表１．３．トランスフェクトＨＥＫ細胞におけるＬセレクチン切断放出の遮断における抗ｈＰ２Ｘ７抗体の算出されたＩＣ５０値。ＩＣ５０値を、図７中の曲線から、半最大遮断の点（赤色点線）としてマークした抗ＣＤ６２Ｌの７００蛍光単位を用いて算出した。ＩＣ５０値は、閾値を下回る最高阻害を伴う曲線について推定することができなかった。nMでのＩＣ５０値を、それぞれの平均分子量を考慮に入れて算出した。ｎ／ａ＝適用できない。
【０３９６】
【表９】
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【０３９７】
実施例１．９：Ｎｂ３ｃ２３及び１ｃ８１は、ＲＰＭＩ  ８２２６リンパ腫細胞によるホスファチジルセリンのＡＴＰ媒介性外在化及び細胞死を遮断する
ＲＰＭＩ  ８２２６は、Ｐ２Ｘ７を内因性に発現するＢ細胞ミエローマ細胞株である（図８Ａ）。この細胞株は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の外在化及び細胞死（ヨウ化プロピジウムの不可逆取り込み）を伴うＡＴＰ処理に応答する（Farrell et al. 2010 BioChimica et Biophysica Acta 1800 pp 1173-1182）。ＦＡＣＳ分析では、ＲＰＭＩ  ８２２６細胞によるＰＳのＡＴＰ用量依存的な外在化が確認された（ＥＣ５０  １．８mM）（図８Ｂ）。選択したＮｂが、内因性に発現されたＰ２Ｘ７のＡＴＰ誘導性活性化を遮断することができるか否かをテストするために、ＲＰＭＩ８２２６細胞によるＡＴＰ媒介性ＰＳ外在化を遮断するＮｂの能力を検討した（図８Ｃ）。この目的のために、ＲＰＭＩ  ８２２６細胞を、ｍＡｂ  Ｌ４、抗ｈＰ２Ｘ７  Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質１ｃ１１３−Ｆｃ、１ｃ８１−Ｆｃ、３ｃ２３−Ｆｃを用いて、又はコントロールＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質１０６７−Ｆｃを用いて、１５分間にわたり室温でプレインキュベートし、次に、６０分間にわたり３７℃で、４mMのＡＴＰを用いてさらにインキュベートした。Ｐ２Ｘ７活性化の範囲を、蛍光色素標識アネキシンＶを用いた外在化ホスファチジルセリンの可視化によりアッセイした（図８Ｃ）。結果が、１ｃ８１−Ｆｃ及び３ｃ２３−ＦｃによるＡＴＰ誘導性ＰＳ外在化の完全に近い遮断を示すのに対し、ｍＡｂ  Ｌ４及び１ｃ１１３−Ｆｃは、両方が、ＰＳ外在化、及びコントロールＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質１０６７−Ｆｃによる遮断の完全欠如を部分的にだけ遮断した。
【０３９８】
実施例１．１０：Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ＲＰＭＩ８２２６細胞のＰ２Ｘ７媒介性細胞死を遮断する
ＡＴＰによるＲＰＭＩ  ８２２６細胞上でのＰ２Ｘ７の長期活性化が、ヨウ化プロピジウムの不可逆的取り込みにより検出された通り、細胞死をもたらすことが以前に実証されている（Farrell et al.2010）。次に、Ｐ２Ｘ７特異的Ｎｂが細胞死を遮断しうるか否かを検討した。この目的のために、ＲＰＭＩ  ８２２６細胞を、それぞれの抗体を用いて、ＡＴＰを用いた処理に先立ち、６０分間又は２４時間にわたりプレインキュベートした。細胞を、次に、洗浄し、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムを用いて染色し、ホスファチジルセリンの外在化及び細胞死を評価した（図９）。
【０３９９】
２mMのＡＴＰを用いた６０分間のインキュベーションの間に、ｍＡｂ  Ｌ４及びＮｂ  １ｃ１１３−Ｆｃは、両方が、コントロールと比較し、ホスファチジルセリンの提示を部分的に遮断した（図９、上パネル）。この部分的な遮断は、ＡＴＰを用いた一晩インキュベーションの間に細胞死を遮断するために十分ではなかった（図９、下パネル）。対照的に、Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質１ｃ８１−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃは、両方が、ＡＴＰ処理の持続期間に無関係に、Ｐ２Ｘ７媒介性のホスファチジルセリンの提示及び細胞死を完全に遮断した（図９、上及び下パネル）。
【０４００】
実施例１．１１：Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ヒトＴ細胞によるＰＳのＡＴＰ誘導性外在化及びＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断する
Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３が、Ｐ２Ｘ７を内因的に発現するＲＰＭＩ８２２６リンパ腫細胞によるＰＳのＡＴＰ誘導性外在化を効果的に遮断することを実証しているため、本発明者らは、次に、これらのＮｂが、また、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＰＳのＡＴＰ誘導性外在化及びＣＤ６２Ｌの切断放出を遮断することができるか否かを検討した。この目的のために、一定分量の全血液を、３０分間にわたり室温で、それぞれのＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて又はｍＡｂ  Ｌ４を用いて、４mMのＡＴＰを用いた３０分間にわたる３７℃での処理に先立ち、プレインキュベートした。その後、細胞を、Ｐ２Ｘ７活性化についての読み出しの通り、ＣＤ６２Ｌ発現及びＰＳの外在化（アネキシンＶ）について染色した。
【０４０１】
３人のドナーからのＴ細胞が、ＣＤ６２Ｌ切断放出及びアネキシンＶ染色により、異なる程度でＡＴＰに応答した（図１０）。ドナー１及び２からのＴ細胞は、ＡＴＰへのより弱い応答を示したのに対し、ドナー３からの細胞は、Ｐ２Ｘ７活性化に強く応答した。Ｐ２Ｘ７感度の大きさにおいて、ドナーは、ドナー３＞ドナー２＞ドナー１として順序付けることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＡＴＰへの応答は、それぞれのドナーにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞と同等である。ｍＡｂ  Ｌ４及び１ｃ１１３−Ｆｃの両方が、ＣＤ６２Ｌ切断放出及びＰＳの提示の部分的な遮断を示した；コントロール抗体１０６７−Ｆｃは、Ｐ２Ｘ７のＡＴＰ媒介性活性化に影響しなかった。Ｎｂ−Ｆｃタンパク質１ｃ８１−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃは、Ｐ２Ｘ７のＡＴＰ媒介性活性化を完全に遮断した。
【０４０２】
実施例１．１２：Ｎｂ  ３ｃ２３は、ヒトＲＰＭＩ８２２６リンパ腫細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断する
ＲＰＭＩ８２２６細胞に、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した（BD FACS Canto）。細胞を洗浄し、ヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  ３ｃ２３−３ｃ２３又はマウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７（ネガティブコントロール）の非存在（溶媒）又は存在において、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を用いて添加したＰＢＳ（Invitrogen）中に再懸濁し、フローサイトメトリー（BD FACS Canto）により分析した。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。１００秒間にわたる平衡化後、ＡＴＰを、最終濃度２mMまで加え、インキュベーションを、最終濃度５μmまでのイオノマイシンの添加前に、１００秒間にわたり継続した。図１４は、Ｎｂ  ３ｃ２３が、ヒトＲＰＭＩ８２２６リンパ腫細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断することを実証する。
【０４０３】
実施例１．１３：Ｎｂ  ３ｃ２３は、ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断する
４人のドナーからのヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度５ｍＭまでのＡＴＰの添加及び１時間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、Ｎｂ３ｃ２３−３ｃ２３の非存在又は存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いてインキュベートした。血漿を、細胞の遠心分離により調製し、血漿中のＩＬ−１βレベルを、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により決定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡ）。図１５は、Ｎｂ  ３ｃ２３が、ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断することを実証する。
【０４０４】
実施例１．１４：ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断するＮｂ３ｃ２３の用量応答分析
ヘパリン化全血液の一定分量を、最終濃度２mMまでのＡＴＰの添加及び１時間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、示した濃度のＮｂ  ３ｃ２３、３ｃ２３−３ｃ２３、及び３ｃ２３Ｆｃの非存在又は存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いてインキュベートした。血漿を、細胞の遠心分離により調製し、血漿中のＩＬ−１βレベルを、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems）により決定した。マウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ１３Ａ７を、ネガティブコントロールとして使用した。図１６は、ヒト血液細胞からのＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出を遮断するＮｂ  ３ｃ２３の用量応答分析を描写する。
【０４０５】
実施例１．１５：マウスＮｂ１３Ａ７は、リンパ腫細胞株Ｙａｃ−１によるＣＤ６２ＬのＮＡＤ＋及びＡＴＰ誘導性切断放出を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する
マウス特異的Ｎｂの機能的な効果を、Ｐ２Ｘ７発現マウス細胞を使用して、さらに評価した。リンパ腫細胞株Ｙａｃ−１は、マウスＰ２Ｘ７及び毒素関連エクト−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＡＲＴ２．２を内因性に発現する。これらの細胞上で、Ｐ２Ｘ７は、細胞外ＡＴＰにより、ならびにＡＲＴ２．２により触媒されるＲ１２５のＮＡＤ＋依存的ＡＤＰリボシル化により活性化されうる（Adriouch et al., 2008）。Ｎｂ１３Ａ７は、これらの細胞によるＣＤ６２ＬのＮＡＤ＋誘導性及びＡＴＰ誘導性の両方の切断放出を遮断した；二価フォーマット中への変換によって、このＮｂの遮断効力が著しく増強された。対照的に、Ｎｂ１４Ｄ５は、Ｙａｃ−１細胞によるＣＤ６２ＬのＡＴＰ及びＮＡＤ＋誘導性切断放出を促進した。再び、二価フォーマット中への変換によって、このＮｂの効力が著しく増強された（図１０００ｂ）。Ｎｂ１４Ｄ５の結合は、それ自体で、マウスＰ２Ｘ７のゲーティングを誘導しないが、それは、ＡＴＰ及びＮＡＤ＋の両方についてのゲーティングの閾値を下げた（ＷＯ２０１０／０７０１４５）。同様に、Ｎｂ１３Ａ７は、初代Ｔ細胞からのＣＤ６２ＬのＮＡＤ＋及びＡＴＰ誘導性切断放出を効果的に遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを促進した（図２２）。Ｎｂ１３Ａ７は、また、腹腔マクロファージによるＡＴＰ誘導性Ｃａ２＋流入ならびにＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性プロセシング及び分泌を効果的に遮断した（下の実施例１．１８及び１．１９を参照のこと）。
【０４０６】
実施例１．１６：Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する
マウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  １４Ｄ５−１４Ｄ５、Ｎｂ  １３Ａ７−１３Ａ７又はヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ  ３ｃ２３−３ｃ２３（ネガティブコントロール）の存在におけるＣａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷したマウスＰ２Ｘ７トランスフェクトＨＥＫ細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。細胞を、最終濃度２５０μm又は１mMまで細胞外ＡＴＰに曝露し、２分後、濃度５μmでＣａ２＋イオノフォアイオノマイシンに曝露した。図１７において実証する通り、Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。
【０４０７】
実施例１．１７：Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ媒介性カルシウム流入を逆転し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを誘導及び強化する
Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷したマウスＰ２Ｘ７トランスフェクトＨＥＫ細胞のリアルタイムフローサイトメトリー分析。細胞を、示した濃度のＡＴＰを用いて、２分間にわたり、マウスＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ１４Ｄ５−１４Ｄ５、Ｎｂ１３Ａ７−１３Ａ７又はヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂ３ｃ２３−３ｃ２３を用いた処置の前にインキュベートした。図１８において実証する通り、Ｎｂ１３Ａ７は、マウスＰ２Ｘ７を用いて安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるＡＴＰ媒介性カルシウム流入を逆転し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを誘導及び強化する。
【０４０８】
実施例１．１８：Ｎｂ１３Ａ７は、マウス腹腔マクロファージにおけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する
マウス腹腔マクロファージを、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いて負荷した。リアルタイムフローサイトメトリー分析を実施した（BD FACS Canto）。細胞を洗浄し、Ｐ２Ｘ７強化Ｎｂ  １４Ｄ５又はＰ２Ｘ７拮抗的Ｎｂ  １３Ａ７（１μg／５００μl）の非存在（溶媒）又は存在において、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を用いて添加したＰＢＳ（Invitrogen）中に再懸濁した。赤外線ランプを使用し、３７℃の一定のサンプル温度を維持した。１２０秒間にわたる平衡化後、細胞を、示した濃度の細胞外ＡＴＰに曝露し、２分後、最終濃度１μmまでＣａ２＋イオノフォアイオノマイシンへ曝露した。図１９において示す通り、Ｎｂ１３Ａ７は、マウス腹腔マクロファージにおけるＡＴＰ誘導性カルシウム流入を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。
【０４０９】
実施例１．１９：Ｎｂ１３Ａ７は、腹腔マクロファージによるＩＬ−１βのプロセシング及び分泌を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する
野生型又はＰ２Ｘ７−／−マウスからのヘパリン化血液を、一価Ｎｂ（１μg／２００μl）  １４Ｄ５、１３Ａ７、又は溶媒の存在において、２時間にわたり、ＬＰＳ（１μg/ml）を用いて、示した最終濃度までのＡＴＰの添加及び３０分間にわたる３７℃でのさらなるインキュベーションの前に、インキュベートした。ａ）サンプルを遠心分離し、血漿中のＩＬ−１βレベルをＥＬＩＳＡ（Biolegend）により分析した。ｂ）赤血球を溶解し、血液白血球を、２つの工程において、最初に、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ−６Ｃ、及びＬｙ−６Ｇについての特異的な蛍光標識結合ｍＡｂを用いて染色した。細胞を、次に、プロＩＬ−１β（e-Bioscience）についての染色前に、固定（２%  ＰＦＡ）及び透過処理（０．３%サポニン及び０．１%ＢＳＡを含むＰＢＳ）した。フローサイトメトリー分析を実施し（BD FACS Canto）、ゲーティングをＣＤ１１ｂ＋  ＬＹ−６Ｃｈｉ単球上で実施した。図２０において実証する通り、Ｎｂ１３Ａ７は、腹腔マクロファージによるＩＬ−１βのプロセシング及び分泌を遮断し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを強化する。
【０４１０】
実施例１．２０：結論
Ｎｂの３つの異なるファミリーを、ヒトＰ２Ｘ７（ｈＰ２Ｘ７）を発現する細胞上でのパンニングにより、２頭のラマより選択し、ｈＰ２Ｘ７の特異性について確認した。ファミリーａ（１ｃ８１、ラマ４１８）及びｂ（１ｃ１１３、ラマ４０５）を、ｈＰ２Ｘ７トランスフェクトＹａｃ−１及びＨＥＫ細胞上で、順次、ファージライブラリーをパニングすることにより選択した。ファミリーｃ（３ｃ２３、ラマ４０５）を、精製Ｎｂを用いて１ｃ８１及び１ｃ１１３エピトープをマスクし、パニングを繰り返すことにより選択した。Ｎｂを、二価コンストラクト及びＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質に再フォーマット化した。一価及び二価Ｈｉｓタグ付きＮｂを、大腸菌において発現させ、ペリプラズマライセートから、固定化した金属アフィニィークロマトグラフィーにより精製した。ＦＬＡＧタグ付きＮｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ細胞において発現させ、ＨＥＫ細胞上清から、アフィニティークロマトグラフィーにより、固定化した抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ  Ｍ２上で精製した。Ｎｂの特異性を、ヒトＰ２Ｘ７、マウスＰ２Ｘ７、又はラットＰ２Ｘ７を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ細胞上で検証した。エピトープ特異性を、選択されたＮｂ及び抗ｈＰ２Ｘ７  ｍＡｂ  Ｌ４を用いた交差遮断分析によりテストした。Ｎｂ１ｃ８１及び１ｃ１１３は、Ｌ４と共有されるエピトープを認識した。Ｎｂ３ｃ２３は、別個の非重複エピトープを認識する。Ｎｂを異なるエピトープと組み合わせることによって、ヒト末梢血リンパ球及び単球上での細胞表面Ｐ２Ｘ７の改善された染色が許された。特に、Ｎｂ１ｃ１１３−Ｆｃ及び３ｃ２３−Ｆｃは、初代ヒト血液細胞上でのＰ２Ｘ７の発現をモニターするために有用である。Ｌセレクチン（ＣＤ６２Ｌ）のＰ２Ｘ７依存的なＡＴＰ誘導性切断放出及びホスファチジルセリン（ＰＳ）の外在化を遮断するためのＮｂの効力を、トランスフェクトＨＥＫ細胞、ヒトＲＰＭＩ−８２２６リンパ腫細胞、及び初代ヒト末梢血白血球上でテストした。Ｎｂ１ｃ８１及び３ｃ２３は、ｍＡｂ  Ｌ４よりも効率的に、Ｐ２Ｘ７のＡＴＰ誘導性活性化を遮断した。１ｃ８１及び３ｃ２３の再フォーマット化した二価Ｎｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、それらの一価対応物よりも５〜２０倍増強された、Ｐ２Ｘ７の活性化を遮断するための効力を示した。実施例１．１５〜１．１９は、ＡＴＰ誘導性カルシウム流入及びＩＬ−１βのＡＴＰ誘導性放出に対するマウス特異的Ｎｂの機能的な効果を示し、それは、ヒトＰ２Ｘ７特異的Ｎｂを用いた結果を写す（実施例１．１２〜１．１４）。実施例１．２０は、Ｎｂ１３Ａ７及び１４Ｄ５が、リンパ節、脾臓、及び肝臓からの初代細胞上でＰ２Ｘ７の発現をモニターするための有用なツールであることを示す。
【０４１１】
実施例２：抗マウスＰ２Ｘ７ナノボディのエクスビボ及びインビボ遮断及び活性化
インビボでの全身注射後にＰ２Ｘ７を調節するナノボディの能力を評価するために、Ｐ２Ｘ７のＮＡＤ＋及びＡＴＰ媒介性ゲーティングに高い感度を提示することが以前に示されている２つの調節Ｔ細胞サブセット：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ及びｉＮＫＴ細胞をさらに精緻化した（Hubert et al. 2010 J. Exp. Med. 207 pp 2561-2568;Scheuplein et al., 2010）。
【０４１２】
実施例２．１：方法論
ナノボディを、マウスの尾静脈により静脈内注射した。マウスを１．５時間及び２４時間後に屠殺し、Ｐ２Ｘ７活性化の遮断又は増強についてインビボ及びエクスビボの両方で分析した。
【０４１３】
プロトコール設定：野生型Ｃ５７ｂｌ／６を、それぞれの量のナノボディを用いて、静脈内により、尾静脈中に注射した。注射後（ｐ．ｉ．）１．５時間又は２４時間目に、マウスを屠殺し、脾細胞及び肝臓リンパ球を、以前の実験において記載する通りに調製した。２００μｌの脾細胞又は肝臓白血球懸濁液を、遠心分離によりペレット化した。ペレットを、１００μｌのＲＰＭＩだけ、ＲＰＭＩ中の２５μＭ  ＮＡＤ又は２５０μＭ  ＡＴＰ中に再懸濁し、３７℃で１５分間にわたりインキュベートし、Ｐ２Ｘ７活性化を誘導し、エクスビボのＰ２Ｘ７活性化を伴わない氷上（４℃）で保ったサンプルと比較した。インキュベーション後、細胞をアネキシンＶ結合緩衝液中で洗浄し、アネキシン結合緩衝液中で染色した。
【０４１４】
蛍光色素結合Ｎｂ１３Ａ７を用いた脾臓及び肝臓からの初代細胞の染色によって、Ｔｒｅｇｓ及びｉＮＫＴ細胞によるＰ２Ｘ７の顕著な発現が確認された（実施例１．５、図１３を参照のこと）。マウス中へのこれらのＮｂの静脈内注射は、リンパ節、脾臓、及び肝臓におけるこれらの調節Ｔ細胞の効果的な染色を、注射後３０分以内にもたらした（データ示さず）。
【０４１５】
実施例２．２：ＨＬＥナノボディ１４Ｄ５（１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８）を増強することによるＰ２Ｘ７のインビボ活性化
１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８  Ｎｂの注射は、顕著に、注射後２時間目、脾臓から回収したＴｒｅｇの分解における２倍低下及び肝臓から回収したｉＮＫＴ細胞のさらにより劇的な低下をもたらした（図１１ａ）。Ｔｒｅｇ数（ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとして）は、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８を用いて注射したマウスにおける４%（ｎ＝３）対１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８を用いて注射したマウスにおける９%（ｎ＝３）及びダミーＮｂを用いて注射したマウスにおける１２%（ｎ＝１）まで下がった。ｉＮＫＴ細胞数（ＣＤ３ポジティブ細胞のパーセンテージとして）は、１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８及び１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８を用いて処置したマウスにおける、それぞれ１０%対４５%まで、ダミーＮｂを用いて処置したマウスにおける５５%（ｎ＝１）まで下がった。注射後２４時間目、Ｔｒｅｇｓ及びｉＮＫＴ細胞の数は、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８を用いて注射したマウスにおいて部分的な回復を示したが、しかし、依然として、１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８又はＤｕｍ−Ａｌｂ８−Ｄｕｍ（ダミーＮｂ）を用いて注射したマウスのそれを下回っていた。別の実験において、８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８を用いて注射したマウスは、ダミーＮｂ注射マウスのそれと同程度のＴｒｅｇｓ及びｉＮＫＴ細胞の数を示した（図１１ｃ）。１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８注射マウスの脾臓から回収されたＴ細胞は、ダミーＮｂを用いて注射したマウスと比較し、外因性ＮＡＤを用いた３７℃での１５分間のインキュベーションに応答し、増強したＣＤ２７の切断放出を示した（図１１ｂ）。
【０４１６】
このように、１４Ｄ５−１４Ｄ５−Ａｌｂ８  Ｎｂは、マウスＰ２Ｘ７を強化する。
【０４１７】
実施例２．３：アンタゴニスト  ＨＬＥナノボディ８Ｇ１１及び１３Ａ７（それぞれ８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８及び１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８）によるＰ２Ｘ７のインビボ遮断
ＨＬＥ−Ｎｂｓの腹腔内注射後２時間目に調製された脾臓及び肝臓細胞上で実施した機能アッセイの結果によって、Ｐ２Ｘ７上での８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８及び１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８の両方の遮断効果が明らかになる（図１１ｃ）。
【０４１８】
１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８の注射は、エクスビボで加えられた外因性ＮＡＤに応答して、脾臓ＴｒｅｇによるＣＤ２７の切断放出を完全に遮断し、肝臓ｉＮＫＴ細胞によるＣＤ２７の切断放出を部分的に遮断した（図１１ｂ）。１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８の注射は、また、エクスビボで加えられた外因性ＮＡＤに応答して、脾臓Ｔｒｅｇ及び肝臓ｉＮＫＴ細胞によるホスファチジルセリンの外在化を効果的に遮断した（図１１ｃ）。Ｙａｃ−１リンパ腫細胞でのインビトロの結果と沿って（実施例１．１５を参照のこと）、１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８は、抗ｍｙｃを用いた８Ｇ１１についてよりも、１３Ａ７について見られたより低い染色レベルにもかかわらず、８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８よりも、Ｐ２Ｘ７を遮断する際により効果的であった。結果は、注射後２時間目に、最低用量の１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８（１５μｇ）が、依然として、最高用量の８Ｇ１１−８Ｇ１１−Ａｌｂ８（２００μｇ）よりも効果的であり、最高用量の１３Ａ７−１３Ａ７−Ａｌｂ８（２００  μｇ）よりも、わずかだけ効果的ではなかったことを示す。動態分析の結果は、注射後２時間目と比較し、注射後２４時間目での同様の遮断ＨＬＥ−Ｎｂの機能的効果を示す（図１１ｂ）。
【０４１９】
実施例３．炎症モデルにおける抗Ｐ２Ｘ７ナノボディの評価
実施例３．１：方法論
再フォーマット化Ｎｂを、治療的な潜在能について、実験的に誘導された炎症：抗有足細胞抗体誘導性の糸球体腎炎のマウスモデルにおいてテストした。以前の試験では、Ｐ２Ｘ７欠損マウスが、これらの疾患のより軽度の形態を発生することが示されており、野生型マウスにおけるＰ２Ｘ７の薬理学的阻害が、Ｐ２Ｘ７の遺伝子欠失の有益な効果を模倣しうるとの仮説に導く。逆に、Ｐ２Ｘ７の薬理学的活性化は、これらの炎症応答を強化しうる。
【０４２０】
実施例３．２：抗体誘導性腎炎
マウス有足細胞を用いて免疫化した動物からの血清の全身注射は、腎臓の遅く進行する炎症を起こす。尿中のアルブミン（アルブミン尿）の出現は、糸球体濾過装置への損傷の読み出しとして使用することができる。尿の容積は広く変動しうるため、主に水分摂取量に依存して、尿中のアルブミン濃度を、クレアチニンの濃度に対して、正常化することが一般的である。疾患進行は、ＣｏｎＡ誘導性肝炎のそれよりもずっと遅い。野生型マウスにおいて、アルブミン尿は、通常、血清注射後７−９日目から検出可能である。動物は、通常、疾患に屈し、血清注射後１４〜１５日目に屠殺しなければならない。
【０４２１】
腎炎モデルにおける抗Ｐ２Ｘ７  ＨＬＥ−Ｎｂの潜在的な治療的及び／又は炎症性効果を評価するために、６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの群（ｎ＝６）が、ＨＬＥ−Ｎｂの５つの注射を受けた（抗有足細胞血清（ＡＰＮ）の注射前２時間での初回用量５０μｇならびに３、６、９、及び１２日目での各々２５μｇ）。コントロールマウスは、免疫前血清（ＰＩ）の注射を受けた。５〜６匹のマウスの群が、ダミーＮｂ、１３Ａ７−１３Ａ７−ＡＬＢ８、又は１４Ｄ５−１４Ｄ５−ＡＬＢ８を用いた注射を受けた。２４時間尿を、３、６、９、１２、１５、及び２１日目に代謝ケージ中に収集した。動物を１５又は２１日目に屠殺し、腎臓及び血液サンプルを収集し、さらなる分析（血清コレステロール、トリグリセリド、及びクレアチニンの決定を含む）に供した。
【０４２２】
実施例３．３：Ｎｂ１４Ｄ５は、腎炎モデルにおいて疾患パラメーターを増強し、Ｎｂ１３Ｄ７は、それを減少する
尿中のアルブミンをＥＬＩＳＡにより定量化し、クレアチニンレベルを、自動化測定により決定した（図１２Ａ）。屠殺の日、血液尿素窒素、血清トリグリセリド、及び血清コレステロールレベルを自動測定により決定した；血清中ＩＬ−６及び尿中ＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡにより定量化した。有意性を、マンホイットニーＵ検定を用いて評価した（図１２Ｂ）。尿分析の結果は、抗有足細胞血清及びダミーＮＢを用いて処置した動物における検出可能なタンパク尿を示し、９日目に開始し、１５又は２１日の実験終了まで、着実に増加する尿アルブミンレベルを伴う（図１２Ａ）。Ｐ２Ｘ７アンタゴニスト１３Ａ７−１３Ａ７−ＡＬＢ８を用いて処置されたマウスは、ダミーＮｂを用いて処置されたマウスよりも、屠殺の時にずっと低い尿中アルブミンレベルを示した（図１２）。これらの差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。対照的に、Ｐ２Ｘ７増強１４Ｄ５−１４Ｄ５−ＡＬＢ８を用いて処置されたマウスは、血清注射後３日目に既に、検出可能なアルブミン尿を発生し、ダミーＮｂ又は１３Ａ７−１３Ａ７−ＡＬＢ８処置マウスよりも有意に高い尿中アルブミンを、実験の経過を通じて提示し続けた。増強１４Ｄ５−１４Ｄ５−ＡＬＢ８を受けるマウスにおけるより重度の腎炎症候群と一致して、これらのマウスは、また、血清トリグリセリド、コレステロール、及びクレアチニンの著しくより高いレベルを、１５及び２１日目に示し、１３Ａ７−１３Ａ７−ＡＬＢ８を用いて処置されたマウスは、これらの血清パラメーターの正常レベルを示した。
【０４２３】
実施例３．４：Ｎｂ１３Ａ７は、ＣＤ２７＋Ｔ細胞のＮＡＤ＋誘導性切断放出に抵抗し、Ｎｂ１４Ｄ５は、それを誘導及び強化する
屠殺の日（抗有足細胞抗体の注射後２１日目、ナノボディの最終注射後３日目）、脾細胞を、ＮＡＤ＋の非存在（ＰＢＳ）又は存在において、３０分間にわたりインキュベートし、次に、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＣＤ２７についてＦＡＣＳ分析前に染色した。ゲーティングは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ上で実施した。Ｐ２Ｘ７アゴニストＮｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスからのＴｒｅｇは、より低い割合のＣＤ２７＋Ｔ細胞を含んだが、その全てが、ＣＤ２７のＮＡＤ＋誘導性喪失に感受性であった；Ｐ２Ｘ７アンタゴニストＮｂ１３Ａ７を用いて処置されたマウスからのＴｒｅｇは、ＣＤ２７のＮＡＤ＋誘導性切断放出に耐性であった。これらの結果は、脾臓Ｔｒｅｇが、屠殺の日になおも、Ｐ２Ｘ７特異的Ｎｂで、コートされたことを示す。
【０４２４】
実施例３．５：：Ｎｂ１４Ｄ５は、炎症性腎臓損傷を増強し、Ｎｂ１３Ｄ７は、それを減少する
屠殺の日（抗有足細胞抗体の注射後２１日目）、腎臓切片を、過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）を用いて染色した（図１２Ｄ上部）。尿細管性タンパク質キャストを、アスタリスクによりマークする。腎臓切片を、ＤＮＡ染色色素ｄｒａｑ５、Ｔ細胞マーカーＣＤ３に対する蛍光色素結合ｍＡｂ、及びネフリン（腎臓濾過障壁での有足細胞膜タンパク質）に対する蛍光色素結合ｍＡｂを用いて染色した（図１２Ｅ、下）。有足細胞核を、アスタリスクによりマークする。Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスからの腎臓切片は、Ｎｂ１３Ａ７又はコントロールＮｂを用いて処置されたマウスよりも、ＣＤ３＋Ｔ細胞のより強力な糸球体浸潤及びネフリンについての破壊染色を示す。
【０４２５】
腎臓切片を、免疫蛍光顕微鏡法の前に、ネフリンに対するｄｒａｑ５及び蛍光色素結合ｍＡｂ、補体因子３（Ｃ３）、ならびにＩｇＧを用いて染色した（図１２Ｆ）。ＡＰ血清を用いて処置されたマウスからの（しかし、ＰＩ血清を用いて処置されたマウスからではない）切片は、ＩｇＧ及び３の糸球体沈着物を示す。ＩｇＧ沈着物のパターンは、Ｎｂ１３Ａ７を用いて処置されたマウスにおいて規則的であるが、しかし、コントロールＮｂを用いて処置されたマウスにおいて部分的に破壊され、Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置されたマウスにおいて強く破壊される。
【０４２６】
故に、Ｐ２Ｘ７遮断Ｎｂ  １３Ａ７を用いて処置された動物は、仮にあっても、少ない腎臓損傷の又は炎症の徴候を示したのに対し、Ｐ２Ｘ７強化Ｎｂ  １４Ｄ５を用いて処置された動物は、悪化した炎症及び腎臓損傷を示した；アルブミン尿は、Ｎｂ１４Ｄ５又はコントロールＮｂを用いて処置された動物において有意に増大されたが、しかし、Ｎｂ１３Ａ７を用いて処置された動物においては低いままであった。さらに、前者（しかし、後者ではない）は、ネフローゼ症候群と一致した腎臓損傷の明らかな組織病理学的徴候、即ち、尿細管性タンパク質キャスト、糸球体毛細血管閉塞、有足細胞の膨張、濾過バリアでの破壊されたネフリン染色、ならびに炎症性細胞の細管周囲及び糸球体周辺浸潤を示した。一貫して、コントロールＮｂを用いて又はＰ２Ｘ７強化Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置された動物は、血液尿素窒素、血清トリグリセリド、及びコレステロールの上昇濃度を示した。逆に、Ｐ２Ｘ７遮断Ｎｂ  １３Ａ７を用いて処置された動物は、Ｐ２Ｘ７強化Ｎｂ１４Ｄ５を用いて処置された動物よりも、血清中炎症性サイトカインＩＬ−６及び尿中ＭＣＰ−１のより低いレベルを示した。これらの結果は、Ｐ２Ｘ７遮断Ｎｂは炎症性腎臓損傷を寛解することができること、Ｐ２Ｘ７強化Ｎｂはそれを悪化することができることを示す。
【０４２７】
実施例３．４：考察及び結論
Ｙａｃ−１リンパ腫細胞株でのＰ２Ｘ７のヌクレオチド誘導性活性化のインビトロ分析での結果は、二価及びＨＬＥ−Ｎｂの同様の機能的な効力を明らかにした。２つのＰ２Ｘ７アンタゴニストＨＬＥ−Ｎｂ１３Ａ７及び８Ｇ１１は、両方が、ＡＴＰ誘導性活性化よりも、Ｐ２Ｘ７のＮＡＤ（ＡＤＰリボシル化）誘導性活性化のより効率的な遮断を示し、１３Ａ７は、一貫して、８Ｇ１１よりも良い遮断有効性を示した。Ｐ２Ｘ７増強１４Ｄ５  Ｎｂの場合において、価数を一価から二価へ増加させることは、著しく増強された効力を伴ったが、さらなる価数の増加は、効力において、わずかなさらなる増加だけを示した。
【０４２８】
高用量（１００μg/マウス、５mg/kgに対応する）でのＨＬＥ−Ｎｂの全身注射に続き、３つのＰ２Ｘ７特異的ＨＬＥ−Ｎｂが、脾臓及び肝臓におけるＴ細胞上でのＰ２Ｘ７機能に対する明らかに検出可能な効果を示し、リンパ腫細胞のインビトロ処置を用いて観察された効果、即ち、８Ｇ１１によるより、１３Ａ７による、より効率的な遮断及び１４Ｄ５によるＰ２Ｘ７機能の著しい増強を忠実に再現した。抗ｍｙｃ抗体を使用し、Ｎｂは、脾臓及び肝臓Ｔ細胞の表面上で検出することができ、脾臓において最高レベルのＰ２Ｘ７：Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）を発現することが公知である２つの亜集団の最も顕著な染色を伴った。
【０４２９】
脾臓において、１３Ａ７は、細胞調製の間に放出された低レベルのＮＡＤに応答した、ＣＤ２７のＰ２Ｘ７誘導性切断放出を、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方の亜集団（Ｔｒｅｇの高感度ＣＤ２５＋集団ならびにＣＤ２５ネガティブの天然ＣＤ４＋Ｔ細胞の感度のより低い亜集団）上で完全に遮断した（図１１）。１３Ａ７は、また、より高濃度の外因性ＮＡＤの添加への応答において、ＣＤ２７のＰ２Ｘ７誘導性切断放出に対して、両方の亜集団を完全に保護した。１３Ａ７は、さらに、高濃度の外因性ＮＡＤの添加への応答において、ＣＤ２７のＰ２Ｘ７誘導性切断放出に対して、天然Ｔ細胞を完全に保護したが、しかし、Ｔｒｅｇｓは部分的にだけ保護した。時間経過分析は、１３Ａ７の注射後２４時間対１．５時間で同様の遮断活性を示した。滴定分析では、用量を、２００μｇから１５μｇ／マウスに低下させた場合、仮にある場合でも、少ない１３Ａ７の遮断活性の低下が明らかになった。
【０４３０】
インビボ実験では、実験的に誘導された腎炎のマウスモデルにおいて、また、Ｐ２Ｘ７機能及び疾患進行に対するＰ２Ｘ７特異的ＨＬＥ−Ｎｂの検出可能な効果が明らかになった。効果は、この腎炎モデルにおいて明らかに明白であった。強力なＰ２Ｘ７アンタゴニスト１３Ａ７  ＨＬＥ−Ｎｂは、このモデルにおいて有益な効果を示し、統計的な有意性を達成した。Ｐ２Ｘ７増強１４Ｄ５  ＨＬＥ−Ｎｂは、腎炎モデルにおいて疾患進行を有意に促進した。腎炎モデルにおいて、強力なアンタゴニスト１３Ａ７  ＨＬＥ−Ｎｂを用いて処置されたマウスは、屠殺時に、ダミーＮｂを用いて処置されたマウスより、ずっと低いレベルの尿中アルブミンを示した（アルブミンが、糸球体濾過装置への損傷の指標として役立った）。これらの差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。著しく対照的に、Ｐ２Ｘ７増強１４Ｄ５  ＨＬＥ  Ｎｂを用いて処置されたマウスは、ダミーＮｂを用いて処置されたマウスよりも、ずっと高いレベルのアルブミン尿、及び、より高いレベルの血清コレステロール及びクレアチニンを有した（より重度の腎炎症候群と一致した）。これらの差は、また、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０４３１】
故に、アンタゴニストＩＳＶ（例えばＮｂ１３Ａ７など）の全身投与は、抗体誘導性の糸球体腎炎における疾患パラメーターを軽減し、アゴニストＩＳＶ（例えばＮｂ１４Ｄ５など）の全身投与は、それを強化する。
【０４３２】
実施例３．５：展望
まとめると、このプロジェクト拡張の結果は、Ｔ細胞上のＰ２Ｘ７イオンチャネルの機能をインビボで操作するためにＨＬＥ  Ｎｂを使用することの実行可能性を強調する。腎炎のマウスモデルを用いた実験は、Ｐ２Ｘ７遮断Ｎｂが、この及び他の疾患において過剰な炎症反応の勢いを弱める際に、治療的に有益な効果を有することを示す。
【０４３３】
Ｐ２Ｘ７増強１４Ｄ５  ＨＬＥ−Ｎｂが、腎炎モデルにおいて炎症応答を悪化させたとの知見は、Ｎｂを、例えば、細胞内寄生虫（例えばクラミジア及びトキソプラズマなど）を用いた慢性感染において、所望の炎症応答を増強するために使用することができ、ここで、Ｐ２Ｘ７の活性化は、有益な効果を有することが示されてきた。
【０４３４】
Ｎｂは、一般的に、小分子阻害剤を上回る多数の利点を提供し、これらは、また、Ｐ２Ｘ７イオンチャネルに対して向けられたＮｂに関係する：低い毒性、生分解性、より大きなタンパク質ファミリーの個々のメンバーについての高い特異性、及び種々の再フォーマット化オプション。
【０４３５】
実施例４：ＭＳモデルにおける抗Ｐ２Ｘ７ナノボディの評価
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド残基３５〜５５を使用した、ＭＳ、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の動物モデルを、野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいて誘導する。疾患マウスは、抗Ｐ２Ｘ７  Ｎｂ又はダミーＮｂを受ける。疾患進行を、臨床徴候の出現、脳炎症及び神経損傷を評価するための免疫細胞化学染色により、及びＴ細胞サイトカイン産生の測定によりモニターする。
【０４３６】
実施例４．１：ＥＡＥの誘導
ＥＡＥを、合成ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５〜５５（ＭＯＧ３５−５５）を使用し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて能動的に誘導する（記載されている通り）（Matute et al., 2007）。マウスを、５００μｇのマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含む１００μLのＣＦＡと混合した、１００μLのＰＢＳ中に溶解した３００μｇのＭＯＧ３５-５５の乳剤を用いて皮下注射（１つの後肢において隣接領域中に２つの１００μＬ注射）する。ＭＯＧ３５-５５注射直後、動物は、百日咳毒素（２００μＬのＰＢＳ中のＰＴの２００ng）の腹腔内注射を受ける。２日後、マウスは第２ＰＴ注射を受け、１週間後、ＭＯＧ３５−５５の追加免疫注射を受ける。臨床徴候を、５ポイントスケールでスコア化する：グレード０、無臨床徴候；１、尾の引きずり及び／又は損なわれた立ち直り；２；１つの後肢での不全麻痺；３；２つの後肢での不全麻痺；４；瀕死；５、死亡。スコアリングは、盲検化研究者により毎日同じ時間に行われる。
【０４３７】
実施例４．２：抗Ｐ２Ｘ７ナノボディの注射
ナノボディを、ＭＯＧ３５−５５免疫化プロトコールと同時に、尾静脈により静脈内注射する。５−６匹のマウスの群が、ダミーＮｂ、１３Ａ７−１３Ａ７−ＡＬＢ８、又は１４Ｄ５−１４Ｄ５−ＡＬＢ８を用いた注射を受ける（実施例２において記載する通り）。
【０４３８】
実施例４．３：Ｔ細胞の単離及びサイトカイン測定
脾細胞を、追加免疫ＭＯＧ注射／Ｎｂ注射後４日目又は２１日目に、ＭＯＧ３５−５５免疫化ＥＡＥマウスから単離する。赤血球細胞の溶解後、脾細胞を、２４ウェルプレート中に、１ウェル当たり２×１０５個細胞の密度で、４００μｌのＲＰＭＩ培地中にプレーティングし、免疫原（０又は２５μg/mlのＭＯＧ３５−５５ペプチド）を用いてインキュベートする。１日後、培地の一定分量を、ＩＬ−１７又はＩＦＮγのレベルについて、ＥＬＩＳＡにより、推奨手順に従ってアッセイする。各々のサンプルを、少なくとも３通りにおいてアッセイし、ng/mlサイトカインの算出を標準曲線から決定し、ＭＯＧペプチドの存在に起因する増加を決定する。活性化した脾細胞により産生された６４の炎症性分子の半定量分析を、マウスサイトカイン抗体アレイＩＩＩ（例えば、RayBiotech）を使用し、製造者のプロトコールに従って行う。
【０４３９】
実施例４．４：浸潤細胞についての分析
マウス脳を、生理食塩水を用いて灌流し、４%パラホルムアルデヒド中で一晩後固定した。脳半球の脱水、洗浄、乾燥、及び固化は、標準的なプロトコールに従う。組織を、８μm厚に切断する。矢状切片（８又は１０μm）は、正中線から始めて切断し、マウントする。切片のさらなる調製は、標準的なプロトコールに従っている。各々の動物からの４つの連続切片を、嗅球から背側第三脳室までの領域中に存在する浸潤細胞の数について分析する。全ての染色切片の白黒画像は、１０×対物レンズを用いた同じ露光時間を使用して得られる。小さな丸い好ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｏｐｈｙｌｌｉｃ）核を含む特定の視野を定義し、コントラストを調整し、より大きな丸い細胞、恐らくは、オリゴデンドロサイトをカウントしないようにする。データを、ｍｍ２当たりの細胞数として提示する。
【０４４０】
免疫組織化学を使用し、Ｔ細胞を検出する。このために、凍結切片を、抗ＣＤ８抗体を使用して染色する。切片を、ＰＢＳ＋抗体中の３%ＢＳＡ中で、一晩、４℃でインキュベートし、洗浄し、次に、ＦＩＴＣを用いて標識した二次抗体を用いて展開する。
【０４４１】
等価物
前述の文書による明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。本発明は、提供する実施例により、範囲において限定されない。なぜなら、実施例は、本発明の特定の局面及び実施態様の例証として意図されるからである。他の機能的に等価の実施態様が、本発明の範囲内にある。本発明の種々の改変が、本明細書において示し、記載するものに加えて、前述の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。本発明の利点及び目的は、本発明の各々の実施態様により必ずしも包含されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月13日(2018.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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