(57)【要約】【課題】大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用な環状テトラペプチド化合物を提供する。【解決手段】大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用な環状テトラペプチド化合物を単離した。この化合物は、炎症性疾患、例えば、喘息やアトピー性皮膚炎等の皮膚の機能を改善するための飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用することができる可能性がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列のアミノ末端のアミノ基とカルボキシル末端のカルボキシル基がペプチド結合で連結された環状テトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
配列番号１：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
配列番号２：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
【請求項２】
式Ｉを有する環状テトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
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【請求項３】
請求項１に記載の化合物を含む飲食品、サプリメント、または医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焼酎製造において副成する焼酎蒸溜残液から得られる、生物学的に活性な新規な環状テトラペプチド化合物に関する。本発明において環状テトラペプチドとは、４アミノ酸残基がペプチド結合によって環状に連結した化合物をいう。
【背景技術】
【０００２】
焼酎を製造する際に副成する焼酎蒸溜残液については、大麦焼酎蒸溜残液から精製した特定の画分が有する脂肪肝抑制効果（特許文献１）、抗酸化作用（特許文献２）、血圧降下作用（特許文献３）等の種々の生理活性作用を有する画分が報告されている。また、黒糖焼酎蒸留残液からは、特定の精製画分のチロシナーゼ阻害活性（特許文献４）が報告されている。
【０００３】
また、生理活性を有する環状テトラペプチドとしては、免疫抑制活性（特許文献５）を有するものや、抗有糸分裂抑制活性（特許文献６）、タンパク質チロシンキナーゼ阻害活性（特許文献７）を有する環状テトラペプチドが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１４５４７２号公報
【特許文献２】特許第４６９４０９９号明細書
【特許文献３】特許第４５８４６１１号明細書
【特許文献４】特開２００４−２４８５９２号公報
【特許文献５】特許第５９０１５４３号明細書
【特許文献６】特許第４００６４６６号明細書
【特許文献７】特開２０１２−１８０３１５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１１）Ｖｏｌ．１８６，Ｎｏ．８，ｐ．４７６２−４７７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、有用な生理活性を有する画分が複数得られている大麦焼酎蒸溜残液から、今まで知られていない新規で有用な化合物を単離精製し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、大麦焼酎蒸溜残液からの既知の有用な画分や、新たな精製工程による画分を種々作成して研究を行った結果、大麦焼酎蒸溜残液に含まれる新規環状テトラペプチド化合物を同定し、この化合物が活性酸素発生遺伝子（ＤＵＯＸ１）の発現抑制効果を有する物質であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は,以下の技術的事項から構成される。
（１）配列番号１または２のいずれかで表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列のアミノ末端のアミノ基とカルボキシル末端のカルボキシル基がペプチド結合で連結された環状テトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
配列番号１：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
配列番号２：Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
（２）式Ｉを有する環状テトラペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
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（３）（１）に記載の式Ｉの化合物を含む飲食品、サプリメント、または医薬品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規な環状テトラペプチド化合物を提供することができる。本発明の環状テトラペプチド化合物は、アトピー性皮膚炎や喘息等の炎症性疾患との関連があることが知られている活性酸素制御機構のうちの活性酸素発生遺伝子（ＤＵＯＸ１）の発現抑制活性を有する。大麦焼酎蒸溜残液という発酵食品由来であるため毒性もなく、炎症性疾患の緩和、例えばアトピー性皮膚炎の症状の緩和や抗皮膚炎活性による美肌効果等が期待でき、食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】サイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子発現レベルの環状テトラペプチドによる抑制効果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、環状テトラペプチド化合物には、本発明の環状テトラペプチド化合物が有するＤＵＯＸ１発現抑制活性を失わない範囲で、その薬学的に許容される塩、または誘導体も含まれる。薬学的に許容される塩としては、ナトリム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、硫酸塩、硝酸塩などの有機酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩が例示される。誘導体としては、エステル化、アミド化、アシル化、カルボキシル化、ホルミル化、ホスホリル化、リン酸化、グリコシル化が例示される。
【００１２】
本発明の環状テトラペプチド化合物は、大麦焼酎蒸溜残液から単離精製して製造することができる。また、麹菌の液体及び固体培養からも単離精製して製造することができ、さらに、公知の方法で化学合成することもでき、例えば固相合成法で鎖状ペプチドを合成した後、樹脂に固定したまま環化反応を行う方法や、鎖状ペプチドを切り離してから溶液中で環化反応を行う方法で製造できる。
【００１３】
大麦焼酎蒸溜残液を用いる場合には、大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得てから、該液体分を合成吸着剤に吸着させる。その吸着した成分のうち２０％エタノールで溶出後、４０％エタノール溶出液により溶出する画分から、本発明の環状テトラペプチド化合物をさらに単離精製することができる。
【００１４】
大麦焼酎蒸留残液は、代表的には歩留まり６０乃至７０％の精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の単式蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生する大麦焼酎の蒸留残液である。
【００１５】
大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ） が好ましい。泡盛製造で使用する黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）などのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００１６】
大麦焼酎蒸留残液から固液分離して液体分を得ることにより、原料大麦または大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等を除去して清澄液を得る。固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法により行うことができる。次いで、その液体分を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して吸着させる。合成吸着剤としては、芳香族系、芳香族系修飾型、あるいはメタクリル系の合成吸着剤を用いることができ、好適な例としては、ダウ・ケミカル社製のアンバーライトＦＰＸ６６、三菱化学社製のセパビーズＳＰ８５０、及び同三菱化学社製のダイヤイオンＨＰ２０等が挙げられる。
【００１７】
その後、その合成吸着剤吸着画分を２０容量％エタノールと４０容量％エタノール溶出液により順次溶出させて、得られた溶出画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかける。得られたＨＰＬＣクロマトグラフの分子量４８６の画分をさらに精製するために、凍結乾燥させてから水に溶解させ、遠心分離後再び水で洗浄してからアセトニトリル溶液に溶解させて、再びＨＰＬＣにかけて精製することにより、本発明の環状テトラペプチド化合物を単離精製することができる。
【００１８】
本発明の環状テトラペプチド化合物は、炎症性疾患の緩和や治療、例えばアトピー性皮膚炎の緩和や抗皮膚炎活性による美肌のための飲食品、サプリメント、医薬品として様々な形態で利用することができる。「飲食品」には、通常の飲食品の他、経腸栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが含まれる。また、「飲食品」および「医薬品」の対象はヒトに限定されるのもではなく、ペットや家畜のような哺乳動物用の医薬品および飼料も包含する。
【００１９】
本発明の環状テトラペプチド化合物は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることができる。種々の剤型の経口用組成物を製造するための各種成分および製造法は、サプリメント、医薬品等の製造分野で公知な成分から適宜選択することができる。本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するための各種の添加剤として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を添加することができる。
【００２０】
経口用以外にも注射剤、点滴剤、外用剤、座薬剤等の非経口用投与剤としての各種製剤形態で使用できる。また、製剤中の本発明の環状テトラペプチド化合物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき症状の程度、投与対象の状態（年齢、性別を含む）、剤型などによって異なる。環状テトラペプチド化合物の１日投与量が約１０〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。  
【００２１】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（７０％精白）を用いた。
［大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造］
大麦を４０％（ｗ／ｗ）吸水させ４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、大麦トンあたり１ｋｇの種麹（白麹菌）を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間保持することにより、大麦麹を製造した。１次仕込みでは、この大麦麹（大麦として３トン）に、水３．６ｋＬ及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４ｋＬと蒸麦（大麦として７トン）を加えて１１日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃ とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎１０ｋＬと大麦焼酎蒸留残液１５ｋＬを得た。該大麦焼酎蒸留残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた前記大麦焼酎蒸留残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分２．５Ｌを三菱化学社製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラム（樹脂容量１Ｌ）に接触させ、当該カラムに吸着する合成吸着剤吸着画分を得た。さらに。この合成吸着剤吸着画分を吸着したカラムに脱イオン水６．２５Ｌを接触させて得られた溶出液を除去後、該カラムに２０（ｖ／ｖ）％ｎエタノール溶液２．５Ｌ、４０(ｖ／ｖ)％のエタノール溶液２．５Ｌを順次接触させることにより、溶出液をそれぞれ２．５Ｌ分取した。
【００２３】
この溶出液を減圧濃縮して凍結乾燥させた。凍結乾燥物を０．１ｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４  μｍ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａカラム（２１．２×２５０ｍｍ）を用いるＨＰＬＣ（溶液Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液，溶液Ｂ：０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にかけた。分離条件は、Ｂ濃度１５％、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２８０ｎｍとした。得られたＨＰＬＣクロマトグラフの分子量４８６付近の画分を分取して、再び減圧濃縮して凍結乾燥させてから、０．１ｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に溶解させ、さらに遠心分離して得られた白色の沈殿物を脱イオン水で洗浄した。これを６２．５％のアセトニトリル溶液に溶解させて、上記と同じ条件でＨＰＬＣにかけて精製した。
【００２４】
精製物の構造解析を行うため、フーリエ変換型赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）、液体クロマトグラフ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）及びアミノ酸分析を行った。その結果、分子量が４８６であるＬ−チロシン１個、Ｌ−グルタミン酸１個及びＬ−プロリン２個の４アミノ酸からなる新規な環状テトラペプチド化合物であることが判明した。
溶解性は、ジメチルスルフォキシドに易溶、水、メタノールに難溶、５０％メタノールに可溶であり、分子式は、Ｃ２４Ｈ３０Ｎ４Ｏ７であった。
【００２５】
チロシン１個、グルタミン酸１個及びプロリン２個からなる環状テトラペプチド構造を推定するため、さらにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。その結果、隣接したチロシン及びグルタミン酸に由来すると推定されるプロダクトイオンｄ（ｍ／ｚ２７９）が検出されたことから、下記式Ｉまたは式ＩＩのいずれかであると推定された。その他のプロダクトイオンについては、いずれの構造と考えても矛盾はなかった。
どちらの構造かを決定するために、それぞれを想定し、各種二次元ＮＭＲスペクトによる帰属を行った。ＨＭＢＣスペクトルの結果を図１に示す。ＨＭＢＣにおける１Ｈと１３Ｃの遠隔相関は、通常２〜４結合にて検出される。下記に示したＮ−Ｈ間における遠隔相関に着目した場合、推定構造（１）のＮ−Ｈ間は２結合である一方で、推定構造（２）のＮ−Ｈ間は５結合となり、やや不自然な帰属となった。
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【００２６】
この化合物は上記構造解析結果によれば、下記式Ｉで示される環状テトラペプチドである可能性が極めて高いものの、下記式ＩＩで示される環状テトラペプチドである可能性もわずかにある。
【化１】
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【化２】
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【実施例２】
【００２７】
本発明の環状テトラペプチド化合物のサイトカイン処理した正常ヒト表皮角化細胞におけるＤＵＯＸ１遺伝子の発現抑制活性について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞のサイトカイン処理
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ：クラボウ）の培養には、１０ｍＬシャーレを用い、正常ヒト表皮角化細胞基礎培地（Ｈｕｍｅｄｉａ  ＫＢ−２：クラボウ）に１０μｇ／ｍＬインスリン、０．１ｎｇ／ｍＬヒト組換え型上皮成長因子(ｈＥＧＦ)、０．４％（ｖ／ｖ）ウシ脳下垂体抽出液、０．６７μｇ／ｍＬハイドロコーチゾン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシン Ｂを添加して調製した表皮角化細胞増殖用無血清培地 (ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２)を用いた。凍結保存細胞を。２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２、５日間培養した。その後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２４穴シャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間培養した。コンフルエントになったのを確認後、１．８ｍＭＣａ２＋を含有した正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間培養した。培地を除去した後、１００μｇ／ｍＬの本発明の環状テトラペプチド化合物（以下、「４８６」という。）を含む１．８ｍＭＣａ２＋含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、９６時間培養した。培地除去後、４８６及びサイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−１３を各５０ｎｇ／ｍＬ）を含む１．８ｍＭＣａ２＋含有正常ヒト表皮角化細胞基礎培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間培養した。
【００２８】
ＲＮＡ抽出
培養細胞からの全ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。操作手順は、メーカーのプロトコールに従った。抽出したＲＮＡは−８０℃で保存した。
逆転写反応
抽出したＲＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）にて逆転写反応を行った。ＲＮＡ鋳型０．１μｇにＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを添加して６μＬとした反応液を６５℃、５分で反応させ、その後、４℃で反応を停止した。次に、２μＬ４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを加え、３７℃、５分反応後、4℃で反応を停止した。最後に、２μＬ５×ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘＩＩを加え、３７℃  １５分、５０℃  ５分、９８℃  ５分で反応した。反応液は−２０℃で保存した。
【００２９】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
上記逆転写反応により作成したｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と各遺伝子に対する特異的なプライマー（表1）を用いて、Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏシステムにより解析を行った。遺伝子の発現量はＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ法にて比較定量し、ＧＡＰＤＨを内部標準として相対値として算出した。反応は、９５℃、１０分の反応後、９５℃、１０秒、６０℃、１０秒、７２℃、１５秒を４５回繰り返す増幅反応を行い、最後に９５℃、３０秒、６０℃、２０秒、９５℃、２０秒の反応を行った。この時、ＤＮＡに結合するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの蛍光をモニタリングすることによってｍＲＮＡ発現量の増幅を測定した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
結果
正常ヒト表皮角化細胞をＩＬ−４、ＩＬ−１３で処理した場合のＤＵＯＸ１遺伝子発現に対する本発明の環状テトラペプチド化合物（４８６）の効果を調べた（図1）。その結果、サイトカイン無処理群に比べ、サイトカイン添加区ではＤＵＯＸ１遺伝子発現は上昇したが、４８６を１００μｇ／ｍＬ添加した区では、ＤＭＳＯ添加区に比べて減少した。
以上の結果から、大麦焼酎蒸留残液に含まれる環状テトラペプチド化合物は、炎症によって高発現されるＤＵＯＸ１遺伝子の発現量を、添加しない場合に比べて約３／５に抑制することが分かった。
【００３２】
アトピー性皮膚炎患者の多くは、皮膚組織でインターロイキン４（ＩＬ−４）やインターロイキン１３（ＩＬ−１３）が過剰に生産され、表皮ケラチノサイトの角化異常や表皮バリア機能異常の一因になっていることが知られている。Ｈｉｒａｋａｗａらによると、ＩＬ−４／ＩＬ−１３で刺激したヒト表皮ケラチノサイトにおいて、活性酸素産生にかかわるＤＵＯＸ１の発現が誘導され、Ｈ２Ｏ２産生能が増加されることが報告されており（非特許文献１）、アトピー性皮膚炎と活性酸素制御機構との関連が示唆されている。
【００３３】
実施例２の試験によって、ＩＬ−４とＩＬ−１３で刺激した正常ヒト表皮角化細胞において、本発明の環状テトラペプチド化合物がＤＵＯＸ１遺伝子の発現を有意に抑制する効果が確認された。
この本発明の環状テトラペプチド化合物のＤＵＯＸ１発現抑制効果により、炎症性疾患の緩和や治療、例えばアトピー性皮膚炎や喘息の症状を緩和する可能性が示唆され、抗皮膚炎活性による美肌効果も期待できることから、食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品における活用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用な環状テトラペプチド化合物を単離、提供することができる。この化合物は、炎症性疾患、例えば、喘息やアトピー性皮膚炎等の皮膚の機能を改善するための飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用できる可能性がある。
【図１】
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【配列表】
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