(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚バリア機能を増強することができる皮膚バリア増強剤、及び皮膚バリア増強剤を含有する医薬組成物又は薬用化粧品の提供。【解決手段】単糖及び糖アルコールの少なくとも一方を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である皮膚バリア増強剤、及び皮膚バリア増強剤を含有する医薬組成物又は薬用化粧品。該単糖としては、グルコースであることが好ましく、該糖アルコールとしては、マンニトールであることが好ましい。該薬用化粧品の形態としては、液体状、ゲル状、又はシート状であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である皮膚バリア増強剤。
【請求項２】
前記単糖としてグルコースを含有する請求項１に記載の皮膚バリア増強剤。
【請求項３】
前記糖アルコールとしてマンニトールを含有する請求項１に記載の皮膚バリア増強剤。
【請求項４】
前記ｐＨが５．０以上７．０以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の皮膚バリア増強剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である薬用化粧品。
【請求項７】
液体状、ゲル状、又はシート状である請求項６に記載の薬用化粧品。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の薬用化粧品を、皮膚又は粘膜に塗布するステップを含む美容方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア増強剤、医薬組成物、薬用化粧品、及び美容方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、体内の水分の蒸発を防ぎ、皮膚の水分量を保持する機能とともに、ダニ、ほこり、花粉、及び微生物等の侵入を防ぐバリア機能を有している。
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、及び接触性皮膚炎等にみられる炎症症状においては、皮膚からの水分の消失が顕著に認められている。かかる水分の消失には皮膚内における水分を保持する機能、及びバリアとしての機能を担うタンパク質分子の減少、即ち皮膚バリア機能の低下が関与している。
【０００３】
皮膚バリア機能の低下に伴い、皮膚を介したアレルゲン、及び細菌等による感作が増加し、アレルギー反応、及び皮膚炎症等が惹起されることが報告されている。特に、高齢者においては、皮膚バリア機能が低下していること、及び皮膚バリア機能の回復が充分に起こらないことから、皮膚炎、及び褥瘡等の症状が悪化しやすい。このようなことから、皮膚バリア機能の増強を促進することができる皮膚バリア増強剤等の薬剤の開発が期待されている。
かかる状況のもと、特許文献１は、グルコースがＨＭＧＢ１の産生を促進し、ＨＭＧＢ１の細胞外への放出を誘導し、正常細胞の増殖や遊走を高め、組織の修復を促進することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１４７４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、皮膚バリア機能をより一層増強できる皮膚バリア増強剤が求められている。
そこで、本発明は、皮膚バリア機能を増強することができる皮膚バリア増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｆｉｌａｇｇｒｉｎは表皮の顆粒層を形成する細胞内に存在するタンパク質であり、皮膚の水分量を保ち、保湿をする機能に寄与するタンパク質である。Ｃｌａｕｄｉｎ−１は、表皮の細胞どうしをつなぐｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎを構成する膜タンパク質である。Ｃｌａｕｄｉｎ−１は、アレルゲン、微生物等の細胞内への侵入を防ぐタンパク質であるとともに、体表の水分蒸発を防ぐ機能に寄与している。
本発明者らは、皮膚組織の修復を促進する皮膚バリア増強剤について鋭意検討した結果、酸性領域にｐＨを有する単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有する溶液が、皮膚バリア関連タンパク質であるＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生を促進する作用を有することを見出した。かかる皮膚バリア関連タンパク質の産生が促進されれば、皮膚バリア機能を増強することができると考え、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、以下の［１］〜［６］の態様を有する。
［１］  単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である皮膚バリア増強剤。
［２］  前記単糖としてグルコースを含有する［１］に記載の皮膚バリア増強剤。
［３］  前記糖アルコールとしてマンニトールを含有する［１］に記載の皮膚バリア増強剤。
［４］  前記ｐＨが５．０以上７．０以下である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の皮膚バリア増強剤。
［５］  ［１］〜［４］のいずれか１項に記載の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である医薬組成物。
［６］  ［１］〜［４］のいずれか１項に記載の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である薬用化粧品。
［７］  液体状、ゲル状、又はシート状である［６］に記載の薬用化粧品。
［８］  ［６］又は［７］に記載の薬用化粧品を、皮膚又は粘膜に塗布するステップを含む美容方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、皮膚バリア関連タンパク質であるＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生を促進し、皮膚バリア機能を増強できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１〜６、比較例１〜４のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。
【図２】実施例２，４，６、比較例２，４のＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡの発現量の評価結果を示すグラフである。
【図３】実施例２，４，６、比較例２，４のＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量の評価結果を示すグラフである。
【図４】実施例７、比較例７のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。
【図５】実施例１〜６、比較例１〜４の細胞傷害率の評価結果を示すグラフである。
【図６】アトピー性皮膚炎マウスモデルによる評価を行ったマウスの耳介部の外観を示す写真である。
【図７】アトピー性皮膚炎マウスモデルによる評価を行ったマウスの耳介部の切片の組織を染色した結果を示す写真である。
【図８】参考試験１のＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量の評価結果を示すグラフである。
【図９】参考試験２のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。
【図１０】参考試験３のＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（皮膚バリア増強剤）
本発明の皮膚バリア増強剤は、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である。皮膚バリア増強剤の形態としては、ｐＨを測定可能な形態であれば特に制限されない。具体例として液体状、ゲル状、シート状、ゾル、クリーム、及び乳液等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本発明の皮膚バリア増強剤は、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有する。単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有することによって、細胞のＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生を促進し、皮膚バリア機能を増強できる。皮膚バリア増強剤は、皮膚の水分量を保ち、保湿をする機能、微生物等の細胞内への侵入を防ぐ機能等の皮膚が本来有する皮膚バリア機能の増強または回復を図るものである。
【００１１】
皮膚バリア増強剤中の単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量は、１〜５０００ｍＭであることが好ましく、６〜３０００ｍＭであることがより好ましく、６〜１０００ｍＭであることがさらに好ましく、６〜１６５ｍＭであることが特に好ましい。単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量が上記下限値以上であれば、皮膚バリア増強剤によって、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が促進され、皮膚バリア機能が増強または回復されやすい。単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量が上記上限値以下であれば、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方が皮膚バリア増強剤中に均一に分散して、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復されやすい。
【００１２】
＜単糖＞
単糖としては、グルコース、フルクトース、マンノース、アラビノース、グロース、キシロース、リキソース、エリトロース、トレオース、ガラクトース、及びソルボース等の公知の単糖が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも皮膚バリア増強剤は、単糖としてグルコースを含有することが好ましい。
【００１３】
＜糖アルコール＞
糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、ラクチトール等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも皮膚バリア増強剤は、糖アルコールとしてマンニトールを含有することが好ましい。
【００１４】
＜皮膚バリア増強剤のｐＨ＞
本発明の皮膚バリア増強剤は、ｐＨが４．０以上７．０以下であり、５．０以上７．０以下であることが好ましい。ｐＨが上記下限値以上であれば、皮膚バリア増強剤による皮膚組織、及び細胞の障害が低減され、かつ、ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの転写、及び発現が促進され、皮膚バリア機能が増強または回復されやすい。ｐＨが上記上限値以下であれば、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ‐１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復される。
なお、本明細書において、ｐＨとは、ｐＨ計測器（堀場製作所製「Ｆ−５３」）を用いて、２５℃で測定される値である。
【００１５】
皮膚バリア増強剤のｐＨは、公知の緩衝液によって調節することができる。
緩衝液は、皮膚バリア増強剤のｐＨを４．０以上７．０以下に維持するものであれば、公知の緩衝液であってよく、特に限定されない。緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、メタリン酸緩衝液、ソルビン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、ＭＥＳ緩衝液（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液）、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液）、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、等の緩衝液；グリシン−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、及びグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液等のアミノ酸系緩衝液；トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液等のホウ酸系緩衝液；イミダゾール緩衝液等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの中でも、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びメタリン酸緩衝液好ましい。緩衝液のｐＨ調整は、塩酸、及び酢酸等の酸性物質、又は水酸化ナトリウム、アンモニア等の塩基性物質を用いて適宜調整することができる。
なお、上述の緩衝液を皮膚バリア増強剤に添加せずに、リン酸、酢酸、アミノ酸等の公知の酸性物質を皮膚バリア増強剤に添加することによって、皮膚バリア増強剤のｐＨを４．０以上７．０以下に調整してもよい。
【００１６】
緩衝液によって皮膚バリア増強剤のｐＨが調節される場合、皮膚バリア増強剤中の緩衝液の濃度は、６〜１６５ｍＭであることが好ましい。緩衝液の濃度が前記下限値以上であれば、皮膚バリア増強剤のｐＨを調節しやすくなる。緩衝液の濃度が前記上限値以下であれば、皮膚バリア増強剤によって、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復されやすい。
【００１７】
＜任意成分＞
皮膚バリア増強剤は、本発明の効果を阻害しない範囲で、必要に応じて、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方以外の任意成分を含有できる。
任意成分としては、賦形剤、増粘剤、担体、香料、色素等が挙げられる。これらの任意成分は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。上記の任意成分については、後述の「（医薬品組成物）」の項で具体的に説明する。
【００１８】
（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、本発明の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である。
医薬組成物中の単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量は、医薬組成物（皮膚バリア増強剤）の用途、用法等を勘案して決定できる。例えば、医薬組成物を用いた経皮吸収剤であれば、１００〜５０００ｍＭが好ましく、１０００〜３０００ｍＭがより好ましい。医薬組成物を用いた注射剤であれば、１〜１０００ｍＭが好ましく、６〜１６５ｍＭがより好ましい。単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量が上記下限値以上であれば、医薬品組成物によって、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が促進され、皮膚バリア機能が増強または回復されやすい。単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の含有量が上記上限値以下であれば、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方が医薬品組成物中に均一に分散して、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復されやすい。
【００１９】
医薬組成物のｐＨは、４．０以上７．０以下であり、５．０以上７．０以下であることが好ましい。ｐＨが上記下限値以上であれば、ＦｉｌａｇｇｒｉｎをコードするｍＲＮＡ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１をコードするｍＲＮＡの発現が促進され、皮膚バリア機能が増強または回復されやすい。ｐＨが上記上限値以下であれば、医薬組成物の投与による皮膚組織の障害が起こりにくく、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復されやすい。
【００２０】
医薬組成物の用途としては、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、関節リウマチ、及び膠原病等の自己免疫疾患の治療薬；ネフローゼ症候群、潰瘍性大腸炎、肝炎、膵炎、甲状腺炎、感冒、口内炎、歯肉炎、及び歯周炎等の臓器炎症等の疾患の抗炎症薬；やけど、傷、褥瘡、にきび、あせも、及びしもやけ等の創傷の創傷治療薬等；色素性乾皮症、及び魚鱗癬等の遺伝性疾患の治療薬等が挙げられる。これらの中でも特に抗炎症薬、創傷治療薬に本発明の医薬組成物を適用すると、本発明の効果が顕著である。
【００２１】
医薬組成物の剤形は、ｐＨを測定することができる形態であれば特に限定されない。かかる剤形の具体例としては、液剤、乳剤、懸濁剤、及びシロップ剤等の経口剤；軟膏、ローション、クリーム、貼付剤、及びエアゾール剤等の経皮吸収剤；注射剤、点眼剤及び坐剤等の非経口剤が挙げられる。これらの中でも、軟膏等の経皮吸収剤において、本発明の効果が顕著に表れる。なお、注射剤は、安定性の観点から、液剤がバイアル等に充填された後、凍結乾燥処理により水分が除去され、使用直前に、凍結乾燥物が生理食塩水等に分散されて、液剤に調製されたものであってもよい。
【００２２】
医薬組成物の用法としては、例えば、疾患の種類等に応じて適宜決定される。例えば、疾患がアトピー性皮膚炎、切り傷や擦り傷等の皮膚の創傷等である場合、経皮吸収剤である医薬組成物を直接患部に塗布する方法等が挙げられる。
疾患が口腔内や胃腸である場合、医薬組成物を経口剤として経口投与する方法、医薬組成物を注射剤として患部組織に注入する方法等が挙げられる。もしくは、上部内視鏡下で患部を医薬組成物で洗浄し、患部に医薬組成物を塗布することにより、粘膜再生を促してもよい。これにより、健全な粘膜を形成でき、自然治癒を漸増させ、粘膜侵襲を防ぐことができる。さらに、医薬組成物を胃粘膜に塗布することで、胃粘膜の再生を促し、上皮組織のバリア機能を増強、又は回復できる。
疾患が花粉症等、鼻・眼粘膜部の疾患である場合、医薬組成物を患部に塗布する方法が挙げられる。医薬組成物を鼻・眼粘膜部に塗布すると、鼻・眼粘膜部は、修復され、かつ粘膜層に強固なバリアを形成する。このため、鼻・眼粘膜部にアレルゲンが多数付着してもアレルギー反応を押さえ、鼻詰まりが生じたり、鼻汁又は涙が多量に分泌されたりするのを解消できる。
疾患が風邪等のウィルスや細菌の感染による上気道粘膜の炎症（感冒）である場合、医薬組成物を点鼻したり吸入させたりする方法が挙げられる。これにより、上気道粘膜の炎症を抑え、上気道粘膜を修復して再生して感染進行を抑制でき、かつ自然免疫応答の賦活化を促進できる。
なお、医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の種類・程度、投与方法等に応じて適宜決定される。
【００２３】
医薬組成物は、本発明の効果を阻害しない範囲で、必要に応じて、本発明の皮膚バリア増強剤以外の任意成分（以下、「医薬品任意成分」とも記す。）を含有できる。
医薬品任意成分としては、薬理学的に許容される塩、賦形剤、増粘剤、担体、香料、色素等が挙げられる。これらの医薬品任意成分は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００２４】
薬理学的に許容される塩としては、慣用の無毒性の塩、即ち酸付加塩及び各種塩基との塩が挙げられ、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩、アラニン塩、ロイシン塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩；アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）及びアルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩等）等の無機塩基塩；トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。これらの塩は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。このような塩を含有すると、結晶化が容易なためである。
【００２５】
賦形剤は、医薬組成物の剤形に応じて適宜選択でき、例えば、蒸留水、イオン交換水、純水等の水、メタノール、エタノール等の炭素数１〜６の低級アルコール、グリセリン等の液体の賦形剤；乳糖、デンプン、デキストリン、白糖等の固体の賦形剤等が挙げられる。これらの賦形剤は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００２６】
増粘剤は、医薬組成物の剤形に応じて適宜選択でき、例えば、ゼラチン、キサンタンガム、カラギーナン等が挙げられる。これらの増粘剤は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００２７】
（薬用化粧品）
本発明の薬用化粧品は、本発明の皮膚バリア増強剤を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である。本発明の薬用化粧品は、例えば、ローション、クリーム、乳液、ファンデーション等であって、皮膚疾患の予防を目的とするものである。なお、薬用化粧品は、日本国の薬事法に定められた医薬部外品に分類されるものである。
【００２８】
薬用化粧品中の皮膚バリア増強剤の含有量は、薬用化粧品の用途、及び投与の形態等を勘案して決定でき、例えば、薬用化粧品中の単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方の濃度が、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは６〜１６５ｍＭとなる量とされる。上記範囲内であれば、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ‐１の産生が促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復され皮膚組織の修復がより一層促進される。
【００２９】
薬用化粧品のｐＨは、４．０以上７．０以下であり、５．０以上７．０以下であることが好ましい。ｐＨが上記下限値以上であれば、ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現が促進され、皮膚バリア機能が増強または回復されやすい。ｐＨが上記上限値以下であれば、医薬組成物の投与による皮膚組織の障害が起こりにくく、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生が十分に促進され、皮膚バリア機能が十分に増強または回復されやすい。
【００３０】
薬用化粧品の形態は、ｐＨを測定することができる形態であれば特に限定されない。具体例としては、液体状、ゲル状、及びシート状等の薬用化粧品が挙げられる。
薬用化粧品の使用方法としては、例えば、美容の目的等に応じて適宜決定される。例えば、皮膚の美容を目的とする薬用化粧品である場合、液体状、乳液状、ゲル状、及びシート状の薬用化粧品を直接皮膚に塗布する方法等が挙げられる。
口腔内の美容を目的とする場合、液体状、及びゲル状等の薬用化粧品を経口的に塗布する方法、液体状の薬用化粧品を注射剤として注入する方法等が挙げられる。
【００３１】
薬用化粧品は、本発明の効果を阻害しない範囲で、必要に応じて、本発明のバリア増強剤以外の任意成分（以下、「化粧品任意成分」とも記す。）を含有できる。
化粧品任意成分としては、例えば、流動パラフィン、セレシン、じろう、ラノリン、ワセリン、セタノール、スクワレン、ホホバ油、ステアリン酸、パルミチン酸、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ミツロウ、メチルポリシロキサン、ジメチルシクロポリシロキサン等の油剤；プロパノール、グリコール、プロピレングリコール、ヒアルロン酸、コラーゲン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、グリセリン、ソルビトール等の保湿剤；各種界面活性剤；乳化剤；賦形剤：増粘剤；ＰＨ調整剤；酸化防止剤；色素；香料；紫外線吸収剤等が挙げられる。これらの化粧品任意成分は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００３２】
（美容方法）
本発明の美容方法は、上述した薬用化粧品を皮膚又は粘膜に塗布する第１ステップを含む。薬用化粧品の塗布量は、患者の年齢、体重、皮膚の状態、塗布の方法等に応じて適宜決定される。
本発明の美容方法は、第１ステップのあとに、皮膚又は粘膜のｐＨを７．０より大きい塩基性領域に戻す第２ステップを含むことが好ましい。第１ステップを行ってから第２ステップを行うまでの時間は、１５〜３０分ほどであることが好ましい。第１ステップと、第２ステップの間の間隔が１５〜３０分ほどであれば、皮膚又は粘膜の本来のｐＨである塩基性領域に戻りやすい。ｐＨを塩基性領域に戻す方法としては、流水等で洗い流す方法、薬用化粧品をふき取ることで除去する方法、及び中和剤を含有するクリーム等を薬用化粧品の上から皮膚又は粘膜に塗布する方法等が挙げられる。これらの方法は、１種単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
本発明の美容方法は、上述した第１ステップと第２ステップを繰り返し行うことが好ましい。
【００３３】
（作用効果）
以上説明したように本発明の皮膚バリア増強剤は、単糖、及び糖アルコールの少なくとも一方を含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下であるから、細胞のＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生を促進することができ、ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの転写、及び発現を促進することができる。したがって、皮膚バリア増強剤によって皮膚バリア機能が十分に増強または回復される。
【００３４】
以上本発明の実施形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されない。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって限定されない。
【００３６】
（実施例１〜７、比較例１〜６）
ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ社製）に、表１の濃度となるようにＤ−グルコース（製品番号：Ｇ５７６７、ＳＩＧＭＡ社製）、又はＤ−マンニトール（製品番号：Ｍ９６４７、ＳＩＧＭＡ社製）と、培地のｐＨを調製するために塩酸（ＨＣｌ）（製品番号：０８０−０１０６、和光純薬社製）とを添加し、表１に示すｐＨに調製された皮膚バリア増強剤を含有する培地（以下、「試験用培地」とも記す。）を調製した。なお、ｐＨは、ｐＨ計測器（堀場製作所製「Ｆ−５３」）を用いて、２５℃で測定される値である。
各例の試験用培地を用いて、以下に記すＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析と、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質のｍＲＮＡ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質のｍＲＮＡの各発現量の解析を行い、その結果を図１〜３に示す。
【００３７】
＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析１＞
正常ヒト皮膚角化細胞（単一ドナー由来の初代培養の正常皮膚角化細胞、タカラバイオ株式会社製）をＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ｐＨ７．６、クラボウ社製）を用いて、６穴（６ｗｅｌｌ）マイクロプレートに１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように播種し、３７℃で２４時間培養した（前培養）。前培養後、培養液を吸引除去し、培地を実施例１〜６、及び比較例１〜４の試験培地と置換し、３７℃で３０分間培養した（本培養）。本培養後、培養上清を吸引除去し、培地をｐＨが７．６であるＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地と置換し、３７℃で３時間培養した（後培養）。後培養後、培地を除去し、培養した細胞からタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したのち、ニトロセルロース膜に転写し、マウス由来のＦｉｌａｇｇｒｉｎ抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法によって、培養細胞内のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を解析した。また、内在性コントロールとして、同一サンプルのβ−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量を解析した。検出されたそれぞれのタンパク質のバンドの濃度をデンシトメーターで測定し、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質、及びβ−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量を解析した。上記同一サンプルのβ−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量を１とし、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の相対値をもって、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を評価した。
【００３８】
＜ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量の解析＞
試験培地を実施例２，４，６、及び比較例２，４の試験培地に換えた以外は、「＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析１＞」と同様の手法にて前培養、本培養、及び後培養を行った。後培養後、培地を除去し、培養した細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、抽出したＲＮＡからＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡを増幅し、各ｍＲＮＡの発現量を解析した。比較例２の各ｍＲＮＡの発現量を１とし、実施例２，４，６、及び比較例４の各ｍＲＮＡの発現量の相対値をもって、ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量を評価した。
【００３９】
＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析２＞
実施例７、及び比較例７の試験用培地を用いた以外は、「＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析１＞」と同様の手法にて実施例７、及び比較例２のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析を行った。なお、比較例７のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を１とし、実施例７のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の相対値をもって、実施例７のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を評価した。結果を図４に示す。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
図１は、実施例１〜６、及び比較例１〜４のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を評価した結果を示すグラフである。
表１、及び図１に示すように、本発明を適用した実施例１〜６は、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の発現量が増加していた。特に、１１０ｍＭのＤ−グルコースを含有する実施例２，４，６で、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の発現量の増加が顕著であった。
【００４２】
図２，３は、実施例２，４，６，及び比較例２，４のＦｉｌａｇｇｌｉｎ（図２）、及びＣｌａｕｄｉｎ−１（図３）の各ｍＲＮＡの発現量を評価した結果をそれぞれ示すグラフである。
表１、及び図２，３に示すように、本発明を適用した実施例２，４，６は、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の各ｍＲＮＡの発現量が増加していた。なお、１１０ｍＭのＤ−グルコースを含有し、ｐＨが３．０である比較例４でも、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の各ｍＲＮＡの増加が認められた。
【００４３】
図４は、実施例７、及び比較例７のＦｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の発現量を評価した結果を示すグラフである。
表１、及び図４に示すように、本発明を適用した実施例７は、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の発現量が、比較例７に比べて４．３倍に増加していた。
【００４４】
実施例１〜６、及び比較例１〜４の結果から、試験培地のグルコース濃度を６ｍＭ又は１１０ｍＭとし、ｐＨを４．０以上７．０以下に調整することにより、培養細胞によるＦｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の産生を促進できることが判った。
実施例１〜６、及び比較例２，４の結果から、試験培地のグルコース濃度を１１０ｍＭとし、ｐＨを３．０以上７．０以下に調整することにより、培養細胞内のＦｉｌａｇｇｌｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の各ｍＲＮＡの発現を促進できることが判った。
比較例３，４の結果から、グルコース濃度を１１０ｍＭとし、ｐＨを３．０に調整することにより、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質のｍＲＮＡの発現は促進されるものの、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質は、検出されないことが判った。
【００４５】
実施例７、及び比較例７の結果から、試験培地のマンニトールの濃度を１１０ｍＭとし、ｐＨを５．７に調整することにより、培養細胞によるＦｉｌａｇｇｌｉｎタンパク質の産生を促進できることが判った。
以上の結果から、本発明を適用することで、Ｆｉｌａｇｇｌｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の発現が促進され、皮膚バリア機能を増強できることが判った。
【００４６】
＜細胞障害試験＞
「＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析１＞」の項と同様にして、正常ヒト皮膚角化細胞を培養した。培養した細胞の障害の程度をＬＤＨ法によって解析した。各例の試験培地で培養した細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００で処理したときの細胞の障害の程度を１００％としたときの、各例で培養した細胞の障害率を評価した。
【００４７】
図５は、実施例１〜６、及び比較例１〜４の試験培地で培養した細胞の障害率を評価した結果を示すグラフである。
表１、及び図５に示すように、本発明を適用した実施例１〜６の細胞の障害率は、ｐＨが７．６である比較例１，２の細胞の障害率より低かった。一方、ｐＨが３．０である比較例３，４の細胞の障害率は、ｐＨが７．６である比較例１，２の細胞の障害率より高かった。
【００４８】
以上の結果から、ｐＨが３．０である比較例３，４では、細胞障害が起きていることが認められた。しかし、かかる細胞障害は、ｐＨが５．０以上の酸性領域にある試験培地で本発明を適用することによって、顕著に低減され、ｐＨが７．６である比較例１，２の試験培地で培養した細胞で認められる細胞障害より低い水準まで低減されることが判った。すなわち、ｐＨが５．０以上である試験培地で本発明を適用することによって、皮膚バリア機能が回復されて、細胞障害が低減されることが判った。
【００４９】
＜アトピー性皮膚炎マウスモデルによる評価＞
グルコース濃度を２０％に、ｐＨを６．０にそれぞれ調製したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の水溶液を作製し、本発明を適用した皮膚バリア増強剤とした。
馴化飼育後の８週令メスＮＣ／Ｎｇａマウスの右耳介部に、ダニ抗原を週２回の頻度でＤａｙ０からＤａｙ１４まで皮内投与した。これと並行して、本発明の皮膚バリア増強剤をＤａｙ０からＤａｙ２８まで１日１回、毎日塗布投与した。Ｍｏｃｋ群としてｐＨを７．６に調製したＰＢＳを、Ｄａｙ０からＤａｙ２８まで１日１回、毎日塗布投与した。
Ｄａｙ２８にＭｏｃｋ群、及び皮膚バリア増強剤を塗布した群の耳介部の写真を撮影し，イソフルラン麻酔下で放血、安楽死させたマウスから左右の耳介部を採取し、中性ホルマリン固定を行なった。パラフィン包埋後、組織切片を作製した。同切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）溶液で染色するとともに、マウス由来のＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１抗体を用いて免疫染色を行なった。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌには、８週令メスＮＣ／Ｎｇａマウスを無処置のままＤａｙ２８まで飼育したマウスの耳介切片を用いた。
【００５０】
図６は、アトピー性皮膚炎マウスモデルによる評価を行ったマウスの耳介部の外観を示す写真である。マウスの耳介部を肉眼で観察した結果、ダニ抗原で感作したマウス耳介部にｐＨが７．６のＰＢＳを塗布した群（Ｍｏｃｋ群）では、Ｄａｙ１５で軽度の潰瘍形成と出血が認められ、Ｄａｙ２８で高度の出血と潰瘍形成と認められた。一方、本発明の皮膚バリア増強剤を塗布した群では、Ｄａｙ２８にわずかな皮膚の腫脹が認められるものの、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ２８ともに耳介部における潰瘍の形成や出血は全く認められなかった。
【００５１】
図７は、アトピー性皮膚炎マウスモデルによる評価を行ったマウスの耳介部の切片の組織を染色した結果を示す写真である。図７のＨＥ染色結果に示すように、Ｍｏｃｋ群では、真皮における炎症性細胞の浸潤が強くみられた。しかし、本発明の皮膚バリア増強剤を塗布した群ではかかる炎症性細胞の浸潤が減少し、角質層と表皮の形態も正常に保たれていた。図７の免疫染色の結果に示すように、Ｍｏｃｋ群ではＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の発現の連続性が失われるとともに、その発現量が低下していた。一方、本発明の皮膚バリア増強剤を塗布した群では、強く連続したＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の染色像が認められた。同様に、Ｍｏｃｋ群では、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現の低下と、連続性の喪失とがみられたが、本発明の皮膚バリア増強剤を塗布した群では、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質は連続的に、かつ顆粒層部分に幅広に発現していた。
【００５２】
＜参考試験１＞
正常ヒト皮膚角化細胞をＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ｐＨ７．６、クラボウ社製）を用いて、６穴（６ｗｅｌｌ）マイクロプレートに１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度となるように播種し、３７℃で２４時間培養した（前培養）。前培養後、培養液を吸引除去し、培地を比較例２の試験培地と置換し、３７℃で本培養した。本培養の時間を０，０．５，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０時間としたときの各培養液から、培地を除去し、培養した細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、各培養液から抽出したＲＮＡからＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡを増幅し、各ｍＲＮＡの発現量を本培養の時間が異なる各培養液について解析した。本培養の時間が０時間であるときの各ｍＲＮＡの発現量を１とし、各培養時間の細胞の各ｍＲＮＡの発現量の相対値をもって、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の各ｍＲＮＡの発現量を評価した。
【００５３】
図８は、参考試験１の各培養時間における比較例２のＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量の評価結果を示すグラフである。比較例２では、Ｃｌａｕｄｉｎ−１のｍＲＮＡの発現誘導のピークは、発現誘導を開始した後、０．５時間で認められ、ＦｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡの発現誘導のピークは、発現誘導を開始した後、２．０時間で認められた。
【００５４】
＜参考試験２＞
培地を比較例５の試験培地を用い、本培養の時間を０，２．０，４．０，６．０，２４．０時間としたこと以外は、「＜Ｆｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の解析１＞」の項と同様にして、各培養時間におけるＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量を評価した。
図９は、参考試験２のＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。発現誘導を開始してから２時間でＦｉｌａｇｇｒｉｎタンパク質の発現量の増加が認められた。かかる発現量の増加は、発現誘導を開始してから２４時間までの間認められた。
【００５５】
＜参考試験３＞
培地を比較例６の試験培地を用い、マウス由来のＣｌａｕｄｉｎ−１抗体を用いた以外は、「＜参考例２＞」の項と同様の手法によって、各培養時間におけるＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の発現量を評価した。
図１０は、参考試験３のＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の発現量の評価結果を示すグラフである。発現誘導を開始してから２時間でＣｌａｕｄｉｎ−１タンパク質の発現量の増加が認められた。かかる発現量の増加は、発現誘導を開始してから２４時間までの間認められた。
【００５６】
以上の各試験等の結果から、６ｍＭもしくは１１０ｍＭのグルコース、又は１１０ｍＭのマンニトールを含有し、ｐＨが４．０以上７．０以下である皮膚バリア増強剤によって、皮膚バリア関連タンパク質の遺伝子発現が誘導されることが示された。すなわち本発明の皮膚バリア増強剤は、皮膚バリア関連タンパク質の遺伝子発現を促進することによって、皮膚バリア関連タンパク質であるＦｉｌａｇｇｒｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎ−１の産生を促進し、皮膚バリア機能を増強できることが示された。
参考試験２，３の結果でも示したようにｐＨが７．６である比較例２，５，６でも、グルコースを５５〜１６５ｍＭ含有することにより、皮膚バリア関連タンパク質の発現量、及び産生量の増加が認められた（図８〜図１０）。しかし本発明の皮膚バリア増強剤は、ｐＨが４．０以上７．０以下であることにより、皮膚バリア関連タンパク質の発現をより一層増強することができる（図１，図４）。よって、本発明の皮膚バリア増強剤は、従来の皮膚バリア増強剤より効果的に皮膚バリア機能を増強することができる。したがって、本発明の皮膚バリア増強剤を、医薬品等に適用すれば、皮膚組織を一層効果的に修復することができる等の顕著な効果を期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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