(57)【要約】      （修正有）【課題】インビボでインスリンを発現及び分泌するベータ細胞を産生するような、糖尿病の治療法の提供。【解決手段】インビトロ又はインビボでほ乳類細胞へ投与されるための、（ｉ）Ｒ１４４０、ＲＯ０２８１６７５、ＲＯ４３８９６２０（ピラグリアチン）、ＬＹ２１２１２６０、ＰＳＮ−ＧＫ１、又は、ＧＫＡ−５０のうちから選択されたグルコキナーゼ活性化剤である第一の薬剤と、（ｉｉ）チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤である第二の薬剤と、（ｉｉｉ）膵臓細胞において機能的Ｐｄｘ−１タンパク質を発現するように構成されているＰｄｘ−１発現カセットである第三の薬剤と、を組み合わせてなる、ベータ細胞形成誘導用医薬組成物。【選択図】図１
2018172430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ又はインビボでほ乳類細胞へ投与されるための、
（ｉ）Ｒ１４４０、ＲＯ０２８１６７５、ＲＯ４３８９６２０（ピラグリアチン）、ＬＹ２１２１２６０、ＰＳＮ−ＧＫ１、又は、ＧＫＡ−５０のうちから選択されたグルコキナーゼ活性化剤である第一の薬剤と、
（ｉｉ）チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤である第二の薬剤と、
（ｉｉｉ）膵臓細胞において機能的Ｐｄｘ−１タンパク質を発現するように構成されているＰｄｘ−１発現カセットである第三の薬剤と、
を組み合わせてなる、ベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項２】
前記ほ乳類細胞が、膵臓細胞、肝臓細胞、腸管のＫ細胞、神経細胞又は幹細胞である、請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項３】
前記ほ乳類細胞は、治療すべき対象から分離されたものである、請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用組成物。
【請求項４】
前記ほ乳類細胞が、前記治療すべき対象に対して異種である、請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｐｄｘ−１発現カセットが、更にウイルスベクターに含まれている、請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、前記コード配列の３'にウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に有する、請求項５又は６記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項８】
前記第一、第二及び第二の薬剤が単一の組成物である請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【請求項９】
前記第一、第二及び第二の薬剤が膵管を通して提供される請求項１に記載のベータ細胞形成誘導用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１２年７月３１日に出願された米国仮出願第６１／６７８，０７７号の利益を主張する非仮出願であり、その内容全体は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表への言及
米国特許規則１．８２１−１．８２５に要求される配列表を、本出願と共に電子的に提出する。この配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの医薬療法は、１つの細胞病態生理学的状態に対して１分子という還元主義的アプローチを利用してきた。還元主義的アプローチは単一遺伝子疾患に対しては成功することが証明されてきたが、複雑な疾患では成功していなかった。医師は、１型又は２型糖尿病のような複雑な疾患を治療するには、アプローチの組み合わせが必要であると認識してきた。糖尿病の１つの治療法はインスリンの注射の投与であり、これは１９２２年に遡る。しかし、インスリン注射は、多くのタイプの１型及び２型糖尿病患者において糖尿病性合併症（例えば、網膜症、神経障害、腎症、循環器疾患及び脳卒中）の発症を防ぐことはできない。糖尿病性合併症の治療費は膨大であり、糖尿病患者における医療費が上昇することの大きな原因となっている。
【０００４】
生物医学研究において進歩はあったが、科学者や臨床医は、現在でも糖尿病の効果的な治療法を模索している。特定の種類の糖尿病では、ベータ細胞が損傷し、不足し、又は激減する。糖尿病の潜在的な治療法としては、薬剤をベースとする治療法及び細胞をベースとする治療法が挙げられ、両者ともに限界がある。薬剤をベースとする治療法は、通常は症状を治療するのみであり、患者は慢性的に薬剤に依存するようになる。細胞をベースとする治療法は、細胞及びその供給源の不足、免疫拒絶、並びに高価な製造費用及び配送費用のために妨げられている。
【０００５】
細胞をベースとする治療法は、糖尿病、及び膵臓ベータ細胞数の減少、又はベータ細胞機能の低下が原因であるか、それらが一因である他の病状の治療のための１つのアプローチである（Ｄ’Ａｍｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：１３９２−１４０１，２００６；Ｋｒｏｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２６：４４３−４５２，２００８）。多成分混合物は、ベータ細胞の胚性前駆体を再生するための１つの方法であり、例えば、転写因子の混合物が、幹細胞研究において使用されており（Ｅｍｉｎｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：９６８−９７６，２００９）、ウイルスベクター混合物がより最近になってマウスで使用されている（Ｚｈｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６２７−６３２，２００８）。一般に、これらの細胞は、グルコースに対する反応について十分に開発されておらず、細胞はインスリンを含むか発現しているが、グルコースの存在下、又はグルコース濃度の変化に反応してインスリンを分泌することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄ’Ａｍｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：１３９２−１４０１，２００６
【非特許文献２】Ｋｒｏｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２６：４４３−４５２，２００８
【非特許文献３】Ｅｍｉｎｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：９６８−９７６，２００９）、
【非特許文献４】Ｚｈｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６２７−６３２，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、対象内においてインビボでインスリンを発現及び分泌するベータ細胞を産生するような、糖尿病の治療法が依然必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に開示される方法には、インビトロ又はインビボでの膵臓細胞形成の誘導が含まれる。特定の態様においては、上記方法は、胚性経路を再現するために細胞を脱分化することなく、成体対象における膵臓ベータ細胞の形成を誘導する。更なる態様においては、上記方法は、分化のさまざまな段階の細胞内で膵臓ベータ細胞形成を誘導する。他の態様においては、上記方法は、インビトロでベータ細胞形成を誘導するために使用することができる。本明細書に開示されるアプローチの特定の実施態様は、具体的には、膵臓の胚産生過程（胚産生過程は、複数の膵臓内分泌細胞型の産生を起こす）を再現することなく、膵臓ベータ細胞形成の後胚誘導を標的とする。成体対象において、インビボで新しいベータ細胞を産生する能力は、１型及び２型糖尿病の患者を治療する新規な治療的アプローチを提供し得る。成体対象において膵臓ベータ細胞の数を増加する能力は、糖尿病に関しては治療的、予防的及び／又は治癒的であり得る。
【０００９】
特定の実施態様は、ベータ細胞の３種の生理機能、すなわち（ｉ）グルコース代謝、（ｉｉ）膜受容体機能、及び（ｉｉｉ）転写因子のレベルを調節及び統合する組成物及び方法に関する。特定の態様においては、本明細書に開示される上記方法は、膵臓ベータ細胞形成の後胚誘導過程を標的とする。胚性過程は複数の内分泌細胞型を引き起こすので、本明細書に開示される後胚法は、主として、ベータ細胞の産生を、又はベータ細胞の産生のみを誘導するように設計されている。特定の態様においては、ベータ細胞は、膵臓のような器官又は組織においてインビボで産生され、他の内分泌細胞型（例えば、グルカゴンを分泌するアルファ細胞、又はソマトスタチンを分泌するデルタ細胞）を検出できるレベルで産生することなく、インビトロで産生される。本発明者らは、他の膵臓内分泌細胞型を誘導することなく、成体対象においてインビボで膵臓ベータ細胞形成を誘導するという報告については認識していない。成体対象においてインビボでベータ細胞を産生する能力は、１型及び２型糖尿病、並びに他のタイプの糖尿病の新規な治療アプローチを提供する。
【００１０】
特定の実施態様では、膵臓ベータ細胞形成のための細胞内標的を調節するために遺伝子導入アプローチを使用する。他の実施態様では、遺伝子導入法により調節される細胞過程を模倣する治療薬を使用する。更なる他の実施態様では、遺伝子導入及び治療薬を併用して使用する。
【００１１】
特定の態様においては、グルコキナーゼ（ＧＫ）（その内容全体が本出願日に引用により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３４４２２．２（ＧＩ：３１９８２７９８）又はＮＰ＿０００１５３．１（ＧＩ：４５０３９５１）、それらの機能的断片若しくは変異体、又はＧＫ活性化剤が、グルコース代謝率を上昇させるために提供される。ＧＫ遺伝子から転写された他のＧＫ核酸（本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００８８４７．１を参照）の使用も意図される。特定の実施態様においては、ＧＫ酵素活性を維持しているＧＫの変異体も使用することができる。更なる態様においては、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ１Ｂ）の阻害剤（例えば、阻害的ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、小分子阻害剤）が、チロシンキナーゼ受容体又はチロシンキナーゼ関連受容体の活性を増大させるために提供される。更なる態様においては、Ｐｄｘ−１（本出願日に引用により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００２００（ＧＩ：４５５７６７３））、それらの機能的断片若しくは変異体、又はＰｄｘ−１活性の活性化剤が、ベータ細胞形成に関与する遺伝子を標的にするために提供される。特定の態様においては、Ｐｄｘ−１の転写活性化能力を維持しているＰｄｘ−１の変異体も使用することができる。Ｐｄｘ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００８１８３を参照）から転写された他のＰｄｘ−１核酸の使用も意図される。特定の態様においては、目的のタンパク質をコードする核酸が投与される。更なる態様においては、各タンパク質又は阻害剤が、個々の、又は別個の発現カセット又は発現ベクター中に含まれる。他の態様においては、１個の発現カセット又は発現ベクター中に２種以上のタンパク質がコードされる。
【００１２】
特定の態様においては、ベータ細胞誘導剤は膵臓に直接投与される。特定の態様においてはベータ細胞誘導化合物は膵管を介して投与される。更なる態様においては、ベータ細胞誘導剤は経口投与又は血管内投与される。
【００１３】
更なる態様においては、ベータ細胞誘導剤は、インビトロで細胞に投与される。特定の態様においては、インビトロで処理される細胞は、治療すべき対象に対して異種又は自家の細胞である。一態様においては、自家細胞は、誘発剤を投与された患者から分離され、その後、インビトロで処理された細胞を患者に移植する。他の態様においては、異種細胞を得、誘発剤を投与し、その後、インビトロで処理された細胞を患者に移植する。
【００１４】
特定の態様においては、器官、組織又は細胞標的は、グルコース濃度を関知し、インスリンを分泌することのできるものである。特定の態様においては、標的細胞又は組織は、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）及び／又はグルコキナーゼの発現、プロインスリンの発現、並びにプロインスリンを切断するためのタンパク質転換酵素の発現を誘導又は遺伝子工学で操作する能力を示す。細胞は、ベータ細胞の少なくとも２種の特徴を有し、人体に存在する。腸管のＫ細胞はこのような細胞の一例である。腸管のＫ細胞は、Ｇｌｕｔ２、グルコキナーゼ及びタンパク質変換酵素を発現し、その結果、インスリン発現の誘発が必要である。他の例においては、肝細胞もＧｌｕｔ２及びグルコキナーゼを発現する。
【００１５】
特定の実施態様は、インビボで後胚性膵臓細胞からベータ細胞形成を誘導する方法に関する。特定の態様においては、上記方法は、（ｉ）グルコキナーゼ（ＧＫ）濃度又は活性を上昇させる第一の薬剤、（ｉｉ）チロシン受容体キナーゼ活性を上昇させる第二の薬剤、並びに（ｉｉｉ）Ｐｄｘ−１介在性転写を増大する第三の薬剤の組み合わせをインビボで膵臓に提供することを含む。
【００１６】
特定の態様においては第一の薬剤はグルコキナーゼをコードする核酸である。グルコキナーゼをコードする核酸はウイルスベクター内に導入することができる。特定の態様においては、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、又は他の核酸送達ベクター若しくは粒子である。上記核酸はコード配列の３’に転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節エレメントを含むことができる。特定の実施態様においては、タンパク質形質導入ドメインを含むポリペプチドを細胞又は対象に投与することができる。特定の態様においては、グルコキナーゼは、タンパク質形質導入ドメインを含む組み換え型融合タンパク質として提供される。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤｓ、細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）、又は膜輸送配列（ＭＴＳ）は、古典的なエンドサイトーシスと無関係に、細胞内に大きな分子を輸送することのできる低分子ペプチドである。多くの公知のＰＴＤｓは、内在化の前に同じ表面分子（ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＨＳＰＧ）に結合し、内在化は、これらの分子に依存している。更なる態様においては、第一の薬剤は、低分子のグルコキナーゼの活性化剤であってもよい。グルコキナーゼの活性剤としては、Ｒ１４４０、ＲＯ０２８１６７５、ＲＯ４３８９６２０（ピラグリアチン）、ＬＹ２１２１２６０、ＰＳＮ−ＧＫ１、又はＧＫＡ−５０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
特定の態様においては、第二の薬剤はタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤である。タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂの阻害剤は、タンパク質チロシンキナーゼホスファターゼのｓｈＲＮＡ阻害剤であってもよい。特定の態様においては、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ阻害剤は、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，３２Ｄ、アンチセンスＩＳＩＳ−ＰＴＰ１ＢＲＸ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｓｏｘａｚｏｌｅ（商標）；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰＴＰ１Ｂの発現を下方制御するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド；Ｍｅｒｃｋ  Ｆｒｏｓｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＴＰ１Ｂ化合物の選択的阻害剤１及び３；Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，（Ｓ）−イソチアゾリジノン（（Ｓ）−ＩＺＤ）  複素環ホスホチロシン；又はＡｆｆｙｍａｘ，Ｉｎｃ．，トリアリールスルホンアミドをベースとするＰＴＰ１Ｂ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
更なる態様においては、第三の薬剤はベータ細胞選択的転写活性化剤である。特定の態様においては、転写活性化剤はＰｄｘ−１をコードする核酸である。特定の態様においては、転写活性化剤は、タンパク質形質導入ドメインを有する組み換え型融合タンパク質として細胞又は対象に投与される。特定の態様においては、他の転写活性化剤が単独で使用され、又はＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ６．１、及び／若しくはＰａｘ４と併用して使用することができる。更なる実施態様においては、化合物トログリタゾンを、Ｐｄｘ−１転写活性化剤に置き換え、又は併用して提供することができる。
【００１９】
特定の態様においては、第一、第二及び第三の薬剤は単一の組成物で提供される。他の態様においては、第一、第二及び第三の薬剤が別個に提供される。薬剤は、ほとんど同時に、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０分、又は１時間の投与間隔で投与することができる。特定の実施態様においては、第一、第二及び第三の薬剤は連続して提供される。他の実施態様においては、第一、第二及び第三の薬剤は同時に提供される。特定の実施態様においては、第一及び第二の薬剤、第一及び第三の薬剤、又は第二及び第三の薬剤は同じ薬剤である。
【００２０】
特定の態様においては、第一、第二及び第三の薬剤は注射又は点滴により、膵臓、又は他の標的器官若しくは組織に提供される。更なる態様においては、膵臓への注射又は点滴は、膵管を通して実施される。
【００２１】
他の実施態様には、インビボで膵臓又は他の器官若しくは組織に、上記薬剤を含む治療用組成物を与えることを含む、糖尿病の治療方法が含まれる。特定の態様においては、治療用組成物は、ｉ）機能的グルコキナーゼタンパク質を発現するように構成されているグルコキナーゼ発現カセット、（ｉｉ）チロシンホスファターゼ１Ｂ阻害剤、及び（ｉｉｉ）機能的Ｐｄｘ−１タンパク質を発現するように構成されているＰｄｘ−１発現カセットを含む治療用組成物であって、膵臓内で膵臓ベータ細胞が誘導される組成物である。更なる実施態様においては、化合物トログリタゾンは、Ｐｄｘ−１と併用して与えることができる。
【００２２】
特定の実施態様には、患者に対して異種の標的細胞を得、若しくは患者から自家標的細胞を分離し、インビボで上記薬剤を含む治療用組成物を細胞に与えることを含む、糖尿病の治療方法が含まれる。特定の態様においては、治療用組成物は、（ｉ）機能的グルコキナーゼタンパク質を発現するように構成されているグルコキナーゼ発現カセット、（ｉｉ）チロシンホスファターゼ１Ｂ阻害剤、及び（ｉｉｉ）機能的Ｐｄｘ−１タンパク質を発現するように構成されているＰｄｘ−１発現カセットを含む治療用組成物であって、膵臓内で膵臓ベータ細胞が誘導される組成物である。更なる実施態様においては、化合物トログリタゾンは、Ｐｄｘ−１と併用して与えることができる。上記方法は、処理された標的細胞を患者に移植することを更に含む。
【００２３】
特定の態様においては、１種、２種又はそれ以上の核酸（すなわち、遺伝子）を使用することができる。特定の態様においては、３種の核酸が使用される。更なる態様においては、１種、2種又は３種の核酸を、１種以上の化学剤と併用することができる。更に他の態様においては、標的経路を積極的又は消極的に調節する化学剤を、核酸なしで使用することができる。
【００２４】
特定の実施態様においては、化学剤の併用としては、ＧＫの化学剤活性化剤とＰＴＢ１Ｂの化学剤阻害剤及び／又はＰｄｘ−１の化学剤活性化剤との併用：又はＰｄｘ−１の化学剤活性化剤とＰＴＢ１Ｂの化学剤阻害剤との併用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
特定の実施態様においては、核酸は化学剤と併用して使用することができる。特定の態様においては、１種以上のＧＫ遺伝子、ＰＴＢ１Ｂ阻害核酸、及び／又はＰｄｘ−１活性化核酸は、１種以上の化学剤、ＰＴＢ１Ｂ阻害剤、化学剤ＧＫ活性化剤、及び／又は化学剤Ｐｄｘ−１活性剤と併用して使用することができる。本明細書で用いられる場合、遺伝子は、ＧＫ酵素をコードするＧＫ遺伝子、阻害核酸をコードするＰＴＢ１Ｂ遺伝子、又はＰｄｘ−１経路の活性化剤をコードするＰｄｘ−１等の治療用核酸をコードする核酸を意味する。
【００２６】
薬剤の種々の組み合わせとしては、化学剤ＧＫ活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤ＧＫ活性化剤、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤ＧＫ活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；化学剤ＧＫ活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及びＰｄｘ−１遺伝子；ＧＫ遺伝子化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及びＰｄｘ−１遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ−１遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤ＰＴＰ１Ｂ遺伝子化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、及びＰｄｘ−１遺伝子；化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ−１遺伝子；化学剤ＧＫ活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；化学剤ＧＫ活性化剤、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；化学剤ＧＫ活性化剤、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ−１遺伝子；Ｐｄｘ−１遺伝子及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；Ｐｄｘ−１遺伝子及びＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；化学剤ＧＫ活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子お及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤及び化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤；化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及びＧＫ遺伝子；化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＧＫ遺伝子；化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、化学剤ＧＫ活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；化学剤ＧＫ活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、化学Ｐｄｘ−１活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及びＰＴＰ１Ｂ遺伝子；ＧＫ遺伝子、化学剤ＧＫ活性化剤、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；ＧＫ遺伝子、Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；Ｐｄｘ−１遺伝子、化学剤Ｐｄｘ−１活性化剤、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子及び化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤；又はＰｄｘ−１遺伝子、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＧＫ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
特定の実施態様においては１種の薬剤は、（ｉ）グルコキナーゼ活性を積極的に調節し、チロシンキナーゼ受容体活性及び／又はチロシンキナーゼ関連受容体活性を積極的に調節し；（ｉｉ）グルコキナーゼ活性を積極的に調節し、ベータ細胞特異的転写を積極的に調節し；又は（ｉｉｉ）チロシンキナーゼ受容体活性及び／又はチロシンキナーゼ関連受容体活性を積極的に調節し（例えば、ＰＴＢ１Ｂを阻害）、ベータ細胞特異的転写を積極的に調節し得る。
【００２８】
特定の態様においては、化学剤ＧＫ活性化剤は、２つの段階でグルコース代謝速度を上昇させ、Ｐｄｘ−１介在性遺伝子発現を増大させるよう作用し得る。化学剤ＰＴＢ１Ｂ阻害剤を化学剤ＧＫ活性化剤と併用することにより、本明細書に開示する３種の経路のそれぞれを標的とすることができる。
【００２９】
特定の態様においては、２型糖尿病のような病状においては、化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、インスリンの存在下、チロシンキナーゼ受容体レベル及びＧＫレベルの両方に作用し得る。特定の態様においては、ＧＫ活性化剤は、グルコース代謝及びＰｄｘ−１介在性転写活性化を上昇させ得る。例えば、ロシグリタゾンは、ＧＫ及びＰｄｘ−１が介在する効果を増大させる。化学剤ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、インスリン分泌能力と併用すると、グルコース代謝が増大し、チロシンキナーゼ受容体活性が上昇する。更に、ロシグリタゾンのようなＰＰＡＲ−ガンマ活性化剤のファミリーは、ＧＫの発現及びＰｄｘ−１の発現を増加させる。したがって、複数の標的経路を調節するために１種の薬剤を投与することができる。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「標的細胞」及び「標的細胞（複数）」は、ベータ細胞又はベータ細胞様細胞を誘導し産生し得る、前駆体細胞、分離細胞、幹細胞、膵臓、他の器官又は組織の細胞を意味する。上記細胞は、誘導前はベータ細胞であっても非ベータ細胞であってもよい。前駆体細胞は、完全に分化していない細胞である。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、発現は、ｍＲＮＡレベル（核酸の発現）及び／又はタンパク質レベル（タンパク質の発現）を意味する。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡを検出するのに好適なオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で所定の方法を用いて設計することができる。又は、あるいはそれに加え、タンパク質の発現は、当該技術分野で認められている任意の方法（例えば、任意の抗体をベースとする検出法）を用いて評価することができる。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「治療」という用語は、疾患又は障害を治療するための治療方法との関連で使用される場合、疾患又は障害の１以上の症状を改善し、そうでなければ有益に変えるあらゆる方法を意味する。本明細書で用いられる場合、特定の疾患又は障害の症状の改善は、持続的であろうと一時的であろうと、本発明の組成物及び方法による治療に起因し、又は関連する持続的又は一時的な、あらゆる軽減を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「有効量」及び「治療に有効」という用語は、意図する効果又は生理的な結果を起こすための投与に関連して有効である期間（インビボにおける短期又は長期投与、並びに定期的又は連続的投与を含む）に利用される、本明細書に開示される１種以上の化合物又は医薬組成物の量又は濃度を意味する。
【００３４】
本発明において使用される１種以上の化合物又は医薬組成物の有効量は、ベータ細胞形成又は成熟を促進する量、例えばグルコース依存インスリン分泌細胞を増加し、又はグルコースに依存する細胞からのインスリンの分泌の増加する量を含む。
【００３５】
「対象」という用語は、本発明の方法による治療が提供される、動物、ヒト又は非ヒトを記述するために明細書を通じて使用される。特定の態様においては、対象はヒトである。
【００３６】
「提供する」という用語は、「使用のために供給し、又は与える」ことを通常に意味する。いくつかの実施態様においては、タンパク質は、タンパク質を直接投与することにより提供されるが、他の実施態様においては、タンパク質は、タンパク質をコードする核酸を投与することにより提供される。他の実施態様においては、ｓｈＲＮＡ等の阻害剤は、細胞内のタンパク質濃度を低下させるために提供することができる。特定の態様においては、本発明は、治療用核酸、ペプチド及び／又は小分子の種々の組み合わせを含む組成物を意図する。
【００３７】
本発明の他の実施態様を、本明細書を通して議論する。本発明の一態様に関して議論するあらゆる実施態様は、本発明の他の態様に適用され、逆もまた同様である。本明細書に開示される各実施態様は本発明の全ての態様に適用可能な、本発明の実施態様であると理解される。本明細書で議論されるあらゆる実施態様は本発明のあらゆる方法又は組成物に実施することができることが意図され、逆もまた同様である。更に、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を実施するために使用することができる。
【００３８】
「ａ」又は「ａｎ」という用語の使用は、請求項及び／又は明細書中の「含む」という用語と併せて、「１」を意味するが、「１以上」、「少なくとも１」及び「１又は１以上」の意味とも一致する。
【００３９】
本明細書を通し、「約」という用語は、値がその値を決定するために使用される装置又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示す。
【００４０】
請求項中の「又は」という用語の使用は、二者択一のみを意味するか、又は選択肢が互いに排他的であることを意味することを明確に示さない限り、「及び／または」を意味するために使用されるが、本開示は、二者択一のみ及び「及び／又は」を意味するという定義を支持する。
【００４１】
明細書及び請求項で使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含んでいる」の任意の形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「有している（ｈａｖｉｎｇ）」の任意の形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の任意の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）又は「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の任意の形態、例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、非排他的若しくは非制限的であり、詳説されない別のエレメント若しくは方法工程を排除するものではない。
【００４２】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の特定の実施態様を示すが、本発明の精神及び範囲内の種々の変形及び修飾は、本明細書の詳細な説明から当業者に明らかになるであろうことから、詳細な説明及び具体例は、説明のためにのみ与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
以下の図面は本明細書の一部をなすものであり、本発明の特定の態様を更に説明するために含められる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せて、そうした図面の１つ以上を参照することにより、さらに良く理解され得る。
【００４４】
【図１】図１は、成熟膵臓においてインビボで膵臓ベータ細胞の産生を誘導するための３種の分子を含む誘導混合物を用いるアプローチの例を示す。
【図２】図２は、レンチウイルスの構築物を示し、（Ａ）グルコキナーゼ、（Ｂ）Ｐｄｘ−１及び（ｃ）ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂの設計及び検証を示す。
【図３】図３は、インビボにおける、ＣＮＩＰ混合物（Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫ＋Ｌｅｎｔｉ−Ｐｄｘ−１及びＬｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂ）によるＰＤＸ−１及びＧＫの過剰発現、並びにＰＴＰ１Ｂ発現抑制を示す
【図４】図４は、プラセボ混合物を注射した対照群と比較した、ベータ細胞形成混合物を注射したマウスにおける、成熟膵臓組織における１個のベータ細胞を染色した量の計測結果を示す。
【図５】図５は、プラセボを注射した対照の成体マウス群と比較した、成体マウスの膵臓において増殖を誘導する、３種の分子（ＧＫ、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ‐１）を含むベータ細胞形成混合物の例を示す。
【図６】プラセボを注射した対照の成体マウス群と比較した、ベータ細胞形成混合物（ＧＫ、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ‐１）を注射した成体マウスにおいて、膵臓ベータ細胞の質量は著しく増大した。インスリン染色の免疫蛍光画像は共焦点顕微鏡を用いて捕獲した。ベータ細胞及び全膵臓の面積はＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）を用いて測定した。全ベータ細胞の質量は全ベータ細胞として計算し、膵臓の全面積の割合として表した。
【図７】図７は、プラセボを注射した対照の成体マウス群と比較した、ベータ細胞形成混合物を注射した成体マウス群における膵臓内のベータ細胞クラスターの数（クラスターの密度）を示す。クラスターの密度は、膵臓の全面積で割ったベータ細胞クラスターの数として測定した。
【図８】図８は、プラセボを注射した対照の成体マウス群と比較した、ベータ細胞形成混合物（ＧＫ、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰｄｘ‐１）を注射した成体マウス群における、空腹時の血漿インスリン濃度を示す。
【図９】図９は、混合物（Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫ＋Ｌｅｎｔｉ−Ｐｄｘ−１＋Ｌｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂ）、又は２種の分子、又は各分子別個に投与して４週後の膵島及び外分泌腺中の増殖のＢｒｄＵマーカーを示す。図は、２００μｍに分離した、動物あたり１０個の切片で調べた膵臓の領域の代表である（各群についてｎ＝３〜４）。結果は、対照と比較した、ＢｒｄＵ標識された細胞数の増加倍率として表される。分析のために共焦点レーザー顕微鏡を使用した。Ｌｅｎｔｉ＝レンチウイルス；ＧＣＫ＝グルコキナーゼ；ＰＴＰ１Ｂ＝タンパク質−チロシンホスファターゼ１Ｂ。データは平均±ＳＥとして表わす。＊＝ｐ＜０．００１  ＣＮＩＰ混合物対対照；＝ｐ＜０．０５  ＣＮＩＰ混合物対［ＧＫ＋ＰＴＰ１Ｂ］；＃＝ｐ＜０．０１［ＧＫ＋ＰＴＰ１Ｂ］対対照
【図１０】図１０は、混合物ＣＮＩＰ（Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫ＋Ｌｅｎｔｉ−Ｐｄｘ−１＋Ｌｅｎｔｉ−ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂ）、２種の分子、又は各分子を個々に注射して４週後、混合物対照及び互いに比較したベータ細胞の質量を示す（各群についてｎ＝３〜４）。各切片の全膵臓細胞及びインスリン陽性染色領域は、Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ）を用いて測定した。ベータ細胞の質量は、全切片の全膵臓細胞領域に対する全インスリン陽性領域の割合に膵臓組織の質重量をかけて計算した。図面は、２００μｍに区切った、動物１匹あたりの１０個の切片で調べた膵臓の領域の代表である。分析には共焦点レーザー顕微鏡を使用した。Ｌｅｎｔｉ＝レンチウイルス；ＧＣＫ＝グルコキナーゼ；ＰＴＰ１Ｂ＝タンパク質−チロシンホスファターゼ１Ｂ。＊＝ｐ＜０．００１＝ＣＮＩＰ混合物対対照；ｐ＜０．００１  ＣＮＩＰ混合物対［ＧＫ＋Ｐｄｘ−１］；ｐ＜０．００１  ＣＮＩＰ混合物対［ＰＴＰ１Ｂ＋Ｐｄｘ−１］；■＝ｐ＜０．０５  ＣＮＩＰ混合物対［ＧＫ＋ＰＴＰ１Ｂ］。＃＝ｐ＜０．０５［ＧＫ＋ＰＴＰＩＢ］対［ＰＴＰ１Ｂ＋Ｐｄｘ−１）；ｐ＜０．０５［ＧＫ＋ＰＴＰ１Ｂ］対対照。データは、平均±標準誤差として表す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書に開示される特定の方法は、１細胞調節過程に対して１分子という科学的主義を否定する概念を示す。特定の態様においては、上記方法は、細胞生理機能の３つの段階、すなわち、代謝、膜受容体機能、及び遺伝子転写段階の統合を含む。複数の細胞生理機能の段階の統合は、ベータ細胞形成の相乗効果をもたらす。相乗効果は、複数の分子が一緒に機能し、それぞれの効果の合計よりも大きい効果をもたらすことを必要とする。本明細書に開示される相乗作用アプローチを用い、本発明者らは、成体の膵臓内での膵臓ベータ細胞形成を誘導することに成功した。成体動物及びヒトにおいてインビボでベータ細胞を産生する能力は、１型及び２型糖尿病の対象を治療するための新規な治療アプローチをもたらす。
【００４６】
Ｉ.糖尿病の治療方法
本発明者らは、「細胞ネットワーク統合及び処理（ＣＮＩＰ）を利用し、成体対象内においてインビボで膵臓ベータ細胞形成が増大し得ることを証明した。ＣＮＩＰアプローチに従って、本発明者らは、細胞処理における３つの主要な段階で、すなわち（１）第一に、細胞内における炭水化物代謝段階で、（２）第二に、膜受容体機能の段階で、（３）第三に、遺伝子発現段階で、介入する。３つの全ての段階を標的とすることにより、ベータ細胞形成を誘導する相乗的相互作用を起こすことができる。本発明者らは、この方法の一例を、Ｓｙｎｅｒがギリシャ名ｓｙｎｅｒｇｏｓからの接頭辞であり、ＩＩＩはローマ数字の３であることから、「Ｓｙｎｅｒ−ＩＩＩ」と呼ぶ。
【００４７】
ＣＮＩＰアプローチは成体対象内におけるベータ細胞の産生を模倣するように設計されており、胚発生段階では細胞を再プログラミングしない。本発明者らは、幹細胞の研究、又はマウスモデルにおいて最近使用されるウイルスベクターの混合物において使用される転写因子の混合物（Ｚｈｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６２７−３２，２００８）は、発生の胚形成期を再現することによりベータ細胞を産生するために使用されることに気付いた。それに対し、ＣＮＩＰアプローチは、成熟した段階で作用するように設計されており、ベータ細胞形成を誘導するよう、細胞制御の３つの段階を統合するメカニズムを利用する。
【００４８】
本明細書に開示される方法は、胚性経路をやり直すような細胞の脱分化をすることなく、成体対象においてインビボで膵臓ベータ細胞形成を誘導する。このＣＮＩＰアプローチは、膵臓の胚形成過程（胚形成過程では複数の型の膵臓内分泌細胞の生成をもたらすことになる）を再現することなく、後杯期に膵臓ベータ細胞形成を誘導することを標的とする。成体対象におけるインビボで新たなベータ細胞を産生する能力は、１型及び２型糖尿病、並びに他の型の糖尿病の治療のための新規な治療アプローチを提供し得る。成体対象において膵臓ベータ細胞数を増大させることができれば、糖尿病を、治療、予防及び／又は治癒することが可能となる。
【００４９】
特定の実施態様においては、本明細書に開示される組成物及び方法は、膵臓以外の組織に適用することができる。特定の態様においては、本明細書に開示される組成物は、腸管Ｋ細胞内に到達することができ、血中グルコースの上昇に反応してインスリンを分泌するインスリン様β細胞を形成することが可能である。更なる態様においては、本明細書に開示される組成物は、肝臓に到達してグルコースに応答するベータ細胞の形成を誘導することが可能である。更なる他の態様においては、本明細書に開示される組成物は、ベータ細胞を産生する幹細胞の分化及び／又は脱分化の最後の段階に適用することができる。特定の態様においては、本明細書に開示される組成物は、ベータ細胞を産生する体内の種々の細胞及び／又は組織に送達され、そしてそれ故、当該組成物の適用対象は本明細書に開示される特定の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
特定の実施態様においては、標的細胞はインビトロで処理される。標的細胞は、ベータ細胞を形成する能力を有するか、又はベータ細胞を形成する能力を誘導することのできる、細胞である。このような細胞を産生し、又は得る方法は当該技術分野で公知であり、標的細胞を含む組織を提供し、当該技術分野で公知の方法で、例えば細胞表面特異的抗体を用い、ＦＡＣＳ（細胞分別機）を用いて標的細胞を分離すること、又は標的細胞の増殖を可能にする特定条件下で細胞を培養することを含む。特定の態様においては、適切な標的細胞系がある（Ｌｉｅｂｅｒら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １５（５）：７４１−４７，１９７５）。
【００５１】
膵臓ベータ細胞に分化し得る細胞であれば、本発明の方法の標的細胞として使用することができる。これには、ヒト又は動物（例えば、哺乳類）の組織由来の前駆体細胞が含まれる。特定の実施態様においては、標的細胞は自家標的細胞である。すなわち、標的細胞は、治療される対象の細胞として、同じ遺伝情報を含んでいる。特定の態様においては、標的細胞は治療薬が投与される前に遺伝子改変されていない。特定の態様においては、標的細胞は、膵臓前駆体細胞、小腸前駆体細胞、肝臓前駆体細胞、膵管細胞の集団由来の前駆体、神経内分泌細胞前駆体、及び膵臓幹細胞からなる群から選択される。これには、ヒト又は動物の組織由来の全ての体細胞分化細胞が含まれる。特定の態様においては、標的細胞は、体細胞分化細胞、肝臓、腸内分泌細胞、膵管細胞、外分泌及び内分泌膵臓細胞、並びに神経内分泌細胞からなる群から選択される。
【００５２】
得られた標的細胞はインビトロの細胞培養システム（組織培養皿、及び６穴、２４穴又は９６穴プレートのような標準的な細胞培養システムが含まれる）で増殖、操作することができ。培養条件は標的細胞に依存し、当業者であればそれら標的細胞の培養方法を理解しているであろう。
【００５３】
Ａ. グルコース代謝
グルコース代謝は、成熟膵臓、又は他の器官若しくは組織におけるベータ細胞形成を誘導するためのＣＮＩＰアプローチにおける第一の局面である。グルコースは哺乳類細胞によって利用される主要なエネルギー源であり、グルコースの代謝により、細胞機能及び増殖のためのエネルギーが供給される（Ｂｏｈｎｓａｃｋ及びＨｉｒｓｃｈｉ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．２４：４３３−４５３，２００４）。解糖の阻害により細胞周期進行が停止し、増殖を誘導するにはグルコースが必要であることが立証された（Ｎｅｗｃｏｍｂら，  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｃｅｌｌ．２：１４３−１４９，２００３）。インビボにおける膵臓ベータ細胞形成を誘導する要因には、グルコース代謝の増加が含まれる（Ｂｅｒｎａｒｄら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：１１９５−１２０５，１９９９；Ａｌｏｎｓｏら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６：１７９２−１８０１，２００７）。成体ラットに２４時間グルコースを点滴するだけで、ベータ細胞数が約５０％増加した（Ｂｅｒｎａｒｄら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：１１９５−１２０５，１９９９）。更に、グルコースは、インビトロにおける構成的アポトーシスプログラムを制御することにより、ベータ細胞の生存を促進する（Ｈｏｏｒｅｎｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１５６８−１５７４，１９９６）。グルコース代謝は、膵臓ベータ細胞形成の誘導のための膵臓を準備する。
【００５４】
特定の態様においては、グルコース代謝速度は、グルコースキナーゼをコードする核酸を供給することにより、又はグルコースキナーゼ、他の酵素若しくは調整剤の活性を上昇させることにより、増大する。特定の実施態様においては、本明細書に開示される核酸に帰する機能は、グルコース代謝を増大させる種々の化合物又は小分子を投与することによりもたらされ得る。グルコキナーゼ活性化化合物としては、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．、化合物Ｒ１４４０；Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．、化合物ＲＯ０２８１６７５；Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．、化合物ＲＯ４３８９６２０（ピラグリアチン）；Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｉｎｃ．ピラグリアチン  ＬＹ２１２１２６０；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ピラグリアチンＰＳＮ−ＧＫ１；Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ，Ｉｎｃ．ピラグリアチンＧＫＡ−５０；Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．国際特許出願公開第ＷＯ／２００７１２２４８２号に開示されているグルコキナーゼ活性化剤；Ｍｅｒｃｋ−Ｂａｎｙｕ  Ｉｎｃ．、国際特許出願公開第ＷＯ／２００３０８０５８５号に開示されているグルコキナーゼ活性化剤；Ｔａｋｅｄａ  Ｉｎｃ．、国際特許出願公開第ＷＯ／２００７１０４３４号に開示されているグルコキナーゼ活性化剤；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｉｎｃ．、国際特許出願公開第ＷＯ／２００７０７５８４７号に開示されているグルコキナーゼ活性化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
Ｂ．受容体チロシンキナーゼ及びチロシンキナーゼ関連受容体
膜受容体チロシンキナーゼ及び／又はチロシンキナーゼ関連受容体は、成体対象において膵臓ベータ細胞形成を誘導するＣＮＩＰアプローチの第二の構成要素である。生理的刺激に続く膵臓ベータ細胞の産生における第二の局面は、膜受容体を通してメッセージを受け取るための細胞に関するものである。膵臓ベータ細胞群の刺激に関与している膜受容体は、受容体のチロシンキナーゼファミリー及び受容体のチロシンキナーゼ関連ファミリー由来のものである。妊娠中は、インスリ抵抗性の発生、及び胎児／胎盤エネルギー需要の上昇に反応して膵臓ベータ細胞の質量が増大し、この効果は、プロラクチン、エストロゲン、及び胎盤性ラクトゲンの分泌の上昇を齎す（Ｈｅｉｔら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：３１１−３３８，２００６）。ベータ細胞のインスリン分泌の増大による補填が失敗すると、妊娠性糖尿病が引き起こされる。膵島の増大及び細胞過形成が、解剖された妊娠したヒトで観察されている（Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  ８５：８１８−８２０，１９７８）。膵臓ベータ細胞の質量を増大させる、妊娠中のホルモン刺激（プロラクチン、エストロゲン、及び胎盤ラクトゲン）は、チロシンキナーゼ関連受容体を通して作用する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２５−Ｓ２９，２００１）。ベータ細胞の質量を増加させる他のホルモンは、受容体のチロシンキナーゼファミリーを通して作用し、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子, 成長ホルモン、インスリン、ＩＧＦ−１、ＥＧＦを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０（Ｓｕｐｐｌ．  １）：  Ｓ２５−Ｓ２９，  ２００１）。注目すべきことに、ベータ細胞質量についてのこれらのホルモンの効果も、グルコース代謝に依存している。グルコースの非存在下で、膵臓ベータ細胞の質量を増大させるという、チロシンキナーゼファミリーを介したホルモンの作用は消失している（Ｃｏｕｓｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４４：６４９−６５８，１９９９）。すなわち、ＣＮＩＰアプローチは、成熟した膵臓におけるベータ細胞形成を誘導するための、グルコース代謝、膜チロシンキナーゼ、及び／又はチロシンキナーゼ関連受容体の効果を兼ね備えている。
【００５６】
特定の実施態様においては、本明細書に開示される核酸に帰する機能は、成体膵臓でのベータ細胞形成のために、チロシンキナーゼ受容体、及び／又はチロシンキナーゼ関連受容体活性を上昇させる種々の化合物又は小分子を投与することにより、もたらされ得る。ある態様においては、アンチセンスＤＮＡ又は阻害ＲＮＡ分子等の阻害核酸を使用することができる。このような化合物としては、Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，３２Ｄ；アンチセンスＩＳＩＳ−ＰＴＰ１ＢＲＸ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，イソキサゾール；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰＴＰ１Ｂの発現を下方制御するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド；Ｍｅｒｃｋ  Ｆｒｏｓｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＰＴＰ１Ｂ化合物の選択的阻害剤１及び３；Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，（Ｓ）−イソチアゾリジノン（（Ｓ）−ＩＺＤ）複素環ホスホチロシン；Ａｆｆｙｍａｘ，Ｉｎｃ．，トリアリールスルホンアミドをベースとするＰＴＰ１Ｂ阻害剤等のＰＴＰ１Ｂ阻害剤化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
他のｓｈＲＮＡ標的チロシンフォスファターゼファミリータンパク質は単独で使用することができ、又はｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂと併用して使用することができる。ＰＴＰ１Ｂは、成熟膵臓での膵臓ベータ細胞機能に関与する受容体の大多数のチロシンキナーゼファミリーにおいて作用する。しかし、細胞内タンパク質ホスファターゼの２種の他のメンバーである、Ｔ細胞タンパク質チロシンホスファターゼ（ＴＣＰＴＰ）及びＳＨＰ−２は、受容体チロシンキナーゼが関与するインスリンシグナル伝達を標的とすることがわかってきた（Ｔｏｎｋｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：８３３−４６，２００６）。ＳＨＰ−２（ＳＨ２−ドメイン含有ホスファターゼ−２）は、２−アミノ末端Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含む、普遍的に発現する細胞内タンパク質チロシンホスファターゼである。ＳＨ２−２は、チロシン−リン酸化インスリン受容体及びＩＲＳ−１の両方に結合する。ＴＣＰＴＰは、２種の形態、すなわち小胞体を標的とする４８ｋＤａ型（ＴＣ４８）及び核を標的とする４５ｋＤａ型（ＴＣ４５）で存在する。ＴＣ−ＰＴＰは、インスリンシグナル伝達を負に制御することが証明されている（Ａｏｋｉ及びＭａｔｓｕｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３９７１８−２６，２０００；Ｔｏｎｋｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：８３３−４６，２００６）。したがって、ｓｈＲＮＡ−ＳＨＰ−２及びｓｈＲＮＡ−ＴＣ−ＰＴＰを発現する核酸は、本明細書に開示される方法及び組成物において使用することができる。
【００５８】
Ｃ.ベータ細胞特異的転写
ＣＮＩＰアプローチにおける第三の局面は遺伝子発現段階に向けられており、転写活性化剤又は転写因子（これらは、グルコキナーゼにより生ずるグルコース代謝効果、代謝／分子効果を収束・集中させる誘因物質（誘因体）として利用される）、並びに成熟膵臓内でベータ細胞を産生するためのチロシンキナーゼ受容体及びチロシンキナーゼ関連受容体が含まれる。「転写」という用語は、遺伝子のＤＮＡ配列をＲＮＡ産物に複写する工程を意味し、通常、鋳型としてＤＮＡを用い、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより実施される。全てのシステムは、物理学のようにモジュラー誘因体を有している。カオス系においては、ネットワーク終点は誘因体の影響力に従う。単純な観察から、ある発射体の衝突目標は、推進力の初期力に空気抵抗及び発射体に対する重力の影響を組み合わせたものに依存する。初期影響力、空気抵抗及び重力は、発射体の最終的な目標を決定するための誘引体として相乗的に作用する。生存生物は、「カオス」状態に存在する非線形動的システムであるといえる。転写段階において、とある一組の遺伝子の発現量は一定のままであり、これらの遺伝子は「ハウスキーピング」遺伝子と呼ばれる。これらは、細胞の普遍的な機能を実行するが、他のクラスの遺伝子は、環境刺激に反応して発現する。生理的ストレスに対する膵臓ベータ細胞の適応において、遺伝子発現の上方制御は、膵臓ベータ細胞形成を誘導するために不可欠である（Ｂｏｕｗｅｎｓ及びＲｏｏｍａｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８５：１２５５−１２７０，２００５）。遺伝子発現段階での、この生理的ストレスに対する適応反応の重要なメディエータは、転写因子の形態におけるモジュラー誘因物質の活性化を必要とする（Ａｌｂｅｒｔ及びＢａｒａｂａｓｉ，Ｒｅｖ  Ｍｏｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ７４：４７−９７，２００２；Ａｌｂｅｒｔ及びＯｔｈｍｅｒ，Ｊ  Ｔｈｅｏｒ  Ｂｉｏｌ  ２２３，１−１８，２００３）。したがって、ＣＮＩＰアプローチには、生理的ストレスへ反応して成熟膵臓でベータ細胞を形成することに関与する（モジュラー誘因物質としての）転写因子が含まれることになる。
【００５９】
Ｐｄｘ−１の過剰発現は、膵臓ベータ細胞形成を誘導するＣＮＩＰ遺伝子発現パターンを導くために、他の転写因子（ＴＦ）の相乗的収束力を用いて単独で使用することができる。したがって、成熟膵臓ベータ細胞形成に関与し、インビボにおけるベータ細胞形成に対するＰｄｘ−１の効果を増大し得る他のＴＦは、本明細書に開示される方法において使用することができる。特定の態様においては、ベータ細胞形成に関与するＴＦを使用することができる。他の内分泌細胞形成に関与するＴＦは除外することができる。Ｐｄｘ−１に代えて併用して添加される、発育期の後において膵臓ベータ細胞形成に関与しているＴＦとしては、ＮｅｕｒｏＤ，Ｉｓｌ１，Ｎｋｘ６．１，及びＰａｘ４が挙げられる。抗糖尿病薬チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン）も、ベータ細胞形成を増大させるＴＦと併用して使用することができる。例えば、トログリタゾンは、Ｐｄｘ−１プロモータ内の機能的ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）応答エレメントを介してマウスの膵島でのＰｄｘ−１の発現を増大させる（Ｇｕｐｔａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３（４７）：３２４６２−７０，２００８）。Ｐｄｘ−１遺伝子のプロモータ中のＰＰＡＲγ応答エレメントの正調節（positive modulation）によるＰｄｘ−１の誘導も意図される。
【００６０】
Ｄ．治療用組成物
特定の態様においては、本明細書に開示された１、２、３種又はそれ以上の治療成分を、１つのあるいは複数の組成物内で混合させることができ、又は併用投与することもできる。一態様においては、１種以上の治療成分は、１、２、３種又はそれ以上の核酸送達ベクター、及び／又は治療剤、の混合物として提供される。このような混合物は、本明細書に開示されるように、経口投与、局所投与又は全身投与することができる。
【００６１】
更なる態様においては、２、３種又はそれ以上の治療成分を結合させて、二価、三価、又は四価組成物を作製することができる。このような組成物は、本明細書に開示されるように、経口投与、局所投与又は全身投与することができる。特定の態様においては、このような組成物は経口投与される。他の態様においては、組成物は局所的に注射又は点滴される。
【００６２】
更なる態様においては、１、２、３種又はそれ以上の治療成分を、化学的アダプタシステム（chemical adaptor system）を用いて１分子内に含めても良い。このような組成物は、本明細書に開示されるように、経口投与、局所投与又は全身投与することができる。
【００６３】
II.核酸組成物
「核酸ベクター」という用語は、核酸配列を複製、転写及び／又は翻訳（すなわち発現）し得る細胞内に導入するために、核酸配列を挿入することのできる、キャリア核酸分子を意味するために使用される。核酸配列は「外因性」（これはベクターが導入される細胞に対して異物であるか、配列自体は細胞に対して「内因性」であるが、配列の位置が宿主細胞内の通常ではありえない場所にあること意味する）であっても良い。特定の態様においては、外因性ベクターは、外因性核酸をコードしていても良い。核酸ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、及び他の発現ベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、人工染色体（例えば、ＹＡＣｓ）等が挙げられる。最近の開示を考慮すると、当業者であれば、標準的組み換え技術により、ベクターの構築設備は十分であろう（例えば、両者とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照されたい）。
【００６４】
「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能なＲＮＡをコードする核酸を含む、あらゆるタイプの遺伝的構築物を意味する。あるケースにおいては、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに転写される。他のケースにおいて、例えば、阻害ＲＮＡ、アンチセンス分子又はリボザイムの産生においては、これらの配列は転写されない。発現ベクターには、さまざまな「制御配列」、これは、特定の宿主細胞内でコード配列に作動可能に結合した、転写、及び場合によっては翻訳に必要な核酸配列を意味する、を含んでも良い。転写及び翻訳を制御する制御配列に加え、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を提供する本明細書に開示される核酸配列を含んでいてもよい。
【００６５】
特定の態様は、ベータ細胞誘導コンポーネントをコードする核酸の使用を含む。核酸の例としては、配列番号１及び配列番号４で提供されるＧＫ、配列番号２で提供されるＰＴＢ１Ｂ  ｓｈＲＮＡ、及び配列番号３で提供されるＰｄｘ−１、又は当業者に認識される等価物が挙げられる。特定の態様においては、核酸には、配列番号１、２、３、及び／又は４と８０、８５、９０、９５、９８又は１００％同一である核酸配列が含まれる。特定の実施態様においては、本発明の核酸は、配列番号５（ＧＫ）又は配列番号６（Ｐｄｘ−１）のタンパク質と８０、８５、９０、９５、９８又は１００％同一であるタンパク質をコードする。
【００６６】
同一のタンパク質又はポリペプチドをコードするなら、単一のアミノ酸をコードするいくつかの異なるコドンの能力を考慮して配列を修飾することができる。発現に使用する特定の生物を考慮して、コドン選択の最適化を試みることもできる。
【００６７】
Ａ.プロモータ及びエンハンサー
「プロモータ」とは、転写開始及び転写速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモータには、核酸配列の特定の転写を開始するための、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子のような調節タンパク質及び分子が結合することができる遺伝的エレメントを含んでも良い。「制御下」及び「転写制御下」に「動作可能に位置する」、「動作可能に連結する」という語句は、プロモータが、転写開始及び／又は該配列の発現を制御するための核酸配列に関し、正確な機能的位置及び／又は方向にあることを意味する。
【００６８】
プロモータは、通常、ＲＮＡ合成の開始部位を位置づけるよう機能する配列を含む。追加のプロモータエレメントは転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０〜１１０個上流に位置する、同様に多くのプロモータは、開始部位の下流に機能的エレメントを含んでいることも知られている。プロモータの「制御下に」コード配列を移動するために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択されるプロモータの「下流」（すなわち３’）に配置する。「上流」のプロモータは、ＤＮＡの転写を誘発し、ＲＮＡの発現を促進する。プロモータエレメント同士の間隔は、しばしばフレキシブルであり、エレメントが反転又は互いに相対的に移動した場合でもプロモータ機能が失われることはない。プロモータによっては、個々のエレメントが協調的又は無関係に転写を活性化するように機能し得る。プロモータは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を意味するエンハンサーと一緒に使用してもしなくてもよい。
【００６９】
プロモータは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード領域を分離することにより得られるように、核酸配列と本来的に関連するものであってもよい。このようなプロモータは「内因性］又は「同種」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、上記配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列と本来的に関連するものであってもよい。また、組み換え型、外因性又は異種プロモータの制御下に核酸を位置することにより、一定の利点が得られ、これは、自然環境における核酸配列と通常は関連しないプロモータを意味する。また、組み換え型又は異種エンハンサーは、自然環境における核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを意味する。このようなプロモータ又はエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモータ又はエンハンサー、他のウイルス、原核細胞若しくは真核細胞から分離したプロモータ又はエンハンサー、並びに「自然には存在しない」、すなわち種々の転写調節領域の種々のエレメントを含むプロモータ又はエンハンサー、及び／又は発現を変えた変異体が挙げられる。
【００７０】
当然ながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞、組織期間又は生物において、ＤＮＡ断片の発現に効率的に向けられたプロモータ及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、通常は、タンパク質発現のためのプロモータ、エンハンサー、細胞型の組み合わせに精通している（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｖｏｌ．Ｉ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい）。使用されるプロモータは、導入されたＤＮＡ断片の高レベル発現に向けられた適切な条件下で構造的、組織特異的、誘導可能、及び／又は有用であってもよい。例えば、組み換え型タンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有利である。プロモータは、異種であっても内因性であってもよい。
【００７１】
更に、発現を推進するために、任意のプロモータ／エンハンサーの組み合わせ（例えば、真核性プロモータデータベースＥＰＤＢ、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／におけるワールドワイドウェブ）も使用することができる。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現システムの使用は、他の可能な実施態様である。送達複合体の一部として、又は追加の遺伝的発現構築物として、適切な細菌性ポリメラーゼが供給される場合には、真核細胞は、特定の細菌性プロモータからの細胞質転写を支援し得る。
【００７２】
特定の態様においては、本発明の核酸は、特に膵臓組織で発現する非誘導性又は誘導性プロモータを含むことができる。このような非誘導性プロモータとしては、インスリン遺伝子、グルカゴン遺伝子、アミラーゼ遺伝子等由来の組織特異的膵臓プロモータが挙げられる。このような誘導性プロモータとしては、グルコース応答エレメントの制御下における膵臓特異的プロモータ、化学的、ペプチド、リガンド又は代謝産物により誘導可能な応答エレメントの制御下における膵臓特異的プロモータが挙げられる。
【００７３】
Ｂ．開始シグナル
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルの提供が必要になる場合ある。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンが、全体の挿入物の翻訳を確実にするための所望のコード配列のリーディングフレームを有する「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然のものであっても、合成の物であってもいずれでもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含ませることによって高めることができる。
【００７４】
Ｃ．多重クローニング部位
ベクターには、多重制限酵素部位を含む核酸領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ）が含まれ、これらのいずれかは、ベクターを消化するための標準的組み換え技術と合わせて使用することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた、核酸分子の触媒的開裂を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。しばしば、ベクターは制限酵素を用いて線形化又は断片化され、ＭＣＳ内で外因性の配列をベクターに連結することができる。「連結」は、互いに隣接していてもいなくてもよい２個の核酸断片間にホスホジエステル結合を形成する工程の意味である。制限酵素及び連結反応を含む技術は、組み換え技術の分野の当業者に周知である。
【００７５】
Ｄ．終結シグナル
本発明のベクター又は構築物は、通常、少なくとも１個の終結シグナルを含んでいる。「終結シグナル」あるいは「ターミネータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特定の終結に関与するＤＮＡ配列を含む。したがって、特定の実施態様においては、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図する。ターミネータは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボにおいて必要とされる場合がある。
【００７６】
本発明において使用されることが意図されるターミネータとしては、ウシ成長ホルモンターミネータ、又はＳＶ４０ターミネータのようなウイルス終結配列等の、本明細書に開示される転写の任意の周知のターミネータ、又は当業者に公知のものが挙げられる。特定の実施態様においては、終結シグナルは、例えばトランケーション配列のために、転写可能又は翻訳可能な配列を欠如している場合がある。
【００７７】
Ｅ．転写後調節エレメント（ＰＲＥ）
転写後調節は、ＲＮＡ段階、すなわち、遺伝子の転写と翻訳の間での、遺伝子発現の調節である。特定の態様においては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が使用される。ＷＰＲＥは、核転写のレベルを上昇させ、ＲＮＡ核外遊出を促進する。ＷＰＲＥは、効率的に発現するように核内で正常に分解されるＲＮＡを導くＲＮＡプロセシングにおける他の工程を促進することができる。ＷＰＲＥは、新たに合成された転写物を、核内の分解から保護するＲＮＡ−タンパク質複合体の生成を促進するように機能することもできる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３：２８８６−２８９２，１９９９、及び米国特許第６２８４４６９号）。
【００７８】
Ｆ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物の発現においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功には重要でないと考えられ、任意のこのような配列を使用することができる。好ましい実施態様としては、種々の標的細胞において都合がよく、十分に機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大し、細胞質輸送を促進することができる。
【００７９】
Ｇ．複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始する特定の核酸配列である、複製起点部位（しばしば、「ｏｒｉ」と呼ぶ）を１個以上含んでいてもよい。その他、宿主細胞が酵母である場合には、自己複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【００８０】
Ｈ．選択可能かつスクリーニング可能なマーカー
本発明の特定の実施態様においては、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含ませることにより、インビトロ又はインビボで識別することができる。このようなマーカーは、識別可能な改変を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な識別を可能にする。一般に、選択マーカーは、選別を可能にする性質を付与するものである。陽性の選択マーカーは、マーカーの存在によって選抜されることを可能にするものであるが、陰性の選択可能マーカーは、存在することによって選抜から排除されるものである。陽性の選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
【００８１】
通常、薬剤選択マーカーを含ませることは形質転換細胞のクローニング及び識別に役立ち、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに耐性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。実施状況に基づき、形質転換細胞の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加え、その原理が比色分析であるＧＦＰ等のスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーも意図される。また、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなスクリーニング可能な酵素を使用することもできる。当業者は、場合によっては、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）及び／又は免疫組織科学的試験と一緒に免疫学的マーカーを使用する方法も知っているであろう。遺伝子産物をコードする核酸を同時に発現できる限りは、使用されるマーカーは重要ではないと考えられている。選択可能かつスクリーニング可能なマーカーの更なる例は当業者に周知である。
【００８２】
III．ポリペプチド組成物
ポリペプチドのアミノ酸組成への修飾及び／又は改変が可能であり、その結果、本発明はポリペプチド、及びポリペプチドをコードする核酸の配列中の多様性を意図し、ここで、それでもなお、それらは本発明の治療、予防及び治癒的態様に関するかなりの活性を保持できる。
【００８３】
生物学的機能的等価物には、固有の配列を含むが、同時に「野生型」又は標準的ペプチドをコードする能力を保持するように設計されたポリヌクレオチドが含まれる。これは、遺伝コードの縮重、すなわち、同じアミノ酸をコードする多重コドンの存在によって達成することができる。一例においては、当業者は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの能力を阻害せずにポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入したいと考えることもあろう。
【００８４】
他の例においては、ポリヌクレオチドは、より重要な改変を有する生物学的機能的等価物をコードする場合がある。特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子、受容体上の結合部位等の構造との相互結合能力が感知され得る程度に損失せずに、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換されていてもよい。いわゆる、「保存的」改変は、構造変化がその設計された機能を実施するタンパク質の能力に影響しないように、タンパク質の生物学的活性を阻害しない。したがって、本発明の目的を実現しながら、本明細書に開示される遺伝子及びタンパク質の配列にさまざまな改変がなされることが発明者らに意図される。
【００８５】
機能的等価物の観点から、行うことができる改変の数には制限があるという概念である「生物学的機能的等価物」は、タンパク質及び／又はポリヌクレオチドの定義に固有の、分子の決定された部分内に同等の生物学的活性の許容可能なレベルを有する分子を保持していることは、当業者によって理解されている。したがって、本明細書では、生物学的機能的等価物は、本明細書で、選択されたアミノ酸（又はヌクレオチド）が置換されたタンパク質（及びポリヌクレオチド）として定義される。特定の態様においては、ポリペプチドは、ポリペプチドの野生型と８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８又は１００％同一である。特定の態様においては、配列番号５又は６と８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８又は１００％同一のポリペプチドが使用され、核酸はそれらをコードする。
【００８６】
一般に、分子の長さが短くなると、機能を維持しながら分子内で実行できる改変は少なくなる。より長いドメインであれば中間程度の改変許容数を有する。全長タンパク質は、より大きい改変数に対する最大限の許容性を有する。しかし、タンパク質の構造が高度に依存している特定の分子又はドメインは、少しの修飾しか、又は修飾を全く許容しないことを理解しなければならない。ポリペプチドの機能は、関心のあるポリペプチドの活性を決定する種々のアッセイを用いて決定することができる。
【００８７】
アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。大きさ、形状及び／又はアミノ酸側鎖の置換基の分析によって、アルギニン、リシン、及び／又はヒスチジンは、全て正電荷を有する残基であり、アラニン、グリシン及び／又はセリンは全て類似の大きさであり、及び／又はフェニルアラニン、トリプトファン及び／又はチロシンは、全て一般的に類似の形状を有していること、が示される。したがって、これらの検討に基づき、アルギニン、リシン、及び／又はヒスチジン；アラニン、グリシン、及び／又はセリン；及び／又はフェニルアラニン、トリプトファン、及び／又はチロシンは、本明細書において生物学的機能的等価物であると定義される。
【００８８】
より量的に多くの改変を達成するため、アミノ酸の疎水性親水性指標を検討することができる。各アミノ酸は、それぞれの疎水性及び／又は電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が以下の用に割りあてられてる、すなわち、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及び／又はアルギニン（−４．５）である。
【００８９】
タンパク質への相互作用的生物学的機能の付与におけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。特定のアミノ酸を、類似の疎水性親水性指標及び／又はスコアを有し、及び／又は類似の生物学的活性を維持する他のアミノ酸と置換し得ることは公知である。疎水性親水性指標に基づいて変化させることにおいて、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが特により好ましい。
【００９０】
親水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換が効率的に実施できることも当該技術分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号に説明されているように、以下の親水性値が以下のアミノ酸残基に割りあてられている；アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させることにおいて、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものが特により好ましい。
【００９１】
特定の実施態様においては、本明細書に開示される組み換え型ポリペプチドはタンパク質形質導入ドメインを含む。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）は生体膜に対する膜透過性を有する。ＰＴＤｓは比較的短い（１〜３５アミノ酸）配列であり、この配列が連結、複合体化あるいは融合したタンパク質及びその他の高分子カーゴ（搬送体）に、この明白な膜透過性を付与する。例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：７））は小分子からタンパク質、ペプチド、薬剤ナノ粒子、造影剤の範囲にまで及ぶ様々な薬剤の細胞内送達のために広く使用されている。また、受容体介在性エンドサイトーシス活性も、細胞内薬剤送達のために使用することができる。例えば、トランスフェリン受容体介在性内在化経路は、薬剤及びタンパク質の部位特異的送達のために利用される効率的な細胞取り込み経路である。これは、トランスフェリンと治療薬又はタンパク質との結合によって化学的にも、治療用のペプチド・タンパク質のトランスフェリン構造内への取り込みよって遺伝子的にも、行うことが可能である。天然に存在するタンパク質（鉄結合タンパク質トランスフェリン等）は、これらのタンパク質が生分解性であり、毒性がなく、免疫原性がないので、薬剤標的の領域で非常に有用である。タンパク質形質導入ドメインとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）等のタンパク質由来のＰＴＤであるＴＡＴ（Ｒｕｂｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８，１９８９）、例えばＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ  ４８−５７、配列番号：８）；ヘルペスウイルステグメントタンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ及びＯ’Ｈａｒｅ  Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−３３，１９９７）；キイロショウジョウバエアンテナペディアタンパク質のホメオティックタンパク質（ペネトラチンＰＴＤ；Ｄｅｒｏｓｓｉら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８１８８−９３，１９９６）；プロテグリン１（ＰＧ−１）抗微生物ペプチドＳｙｎＢ（例えば、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、及びＳｙｎ  Ｂ４；Ｋｏｋｒｙａｋｏｖら．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２７：２３１−３６，１９９３）；及び塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｊａｎｓ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：８４１−４７，１９９４）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＴＤとしては、ポリアルギニンペプチド（Ｆｕｔａｋｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１６：２６０−６４，２００３；Ｓｕｚｕｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５８３６−４０，２００１）；トランスポータン（Ｐｏｏｇａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：６７−７７，１９８８；Ｐｏｏｇａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５：１４５１−５３，２００１）；ＭＡＰ（Ｏｅｈｌｋｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４１４：１２７−３９，１９９８）；ＫＡＬＡ（Ｗｙｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：３００８−１７，１９９７）；及び他のカチオン性ペプチド、例えば種々のβ−カチオン性ペプチド（Ａｋｋａｒａｗｏｎｇｓａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２（６）：２１２０−２９，２００８）等の合成ＰＴＤも挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
IV．送達ベクター
特定の態様においては、コンポーネントは、このようなコンポーネントをコードする又は発現する核酸を用いることにより、膵臓、又は他の器官若しくは組織に提供される。ウイルス性及び非ウイルス性送達ベクターを、本明細書に開示される方法において使用することができる（例えば、Ｓｙｎｅｒ−ＩＩＩ）。「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド分子」という用語は、別段の規定がない限り、本明細書において置き換え可能に用いられ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はリボ核酸（ＲＮＡ）の重合体を含む、デオキシ核酸の重合体を意味する。核酸は、細胞抽出物、ゲノム又はゲノム外ＤＮＡ、ウイルス核酸、又は人工的／化学的に合成した分子から得ることができる。この用語には、二重鎖又は一本鎖デオキシリボ核酸又はリボ核酸が含まれる。
【００９３】
Ａ．ウイルスの送達
受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に感染あるいは侵入し、ウイルスがコードする遺伝子を発現するという能力を有する特定のウイルスは、細胞（例えば哺乳類細胞）への外来核酸の導入のための魅力的な候補となる。したがって、グルコース代謝活性を増進するための薬剤をコードし、発現し、チロシンキナーゼ受容体活性を増大し、ベータ細胞に関連する遺伝子の転写を増大するウイルスを利用することができる。核酸を送達するために使用することのできるウイルスベクターの非限定的例を以下に説明する。
【００９４】
アデノウイルスベクター。核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。アデノウイルスは、ゲノムＤＮＡへの組み込みについての能力は低いが、この特徴は、これらのベクターにより提供される遺伝子導入の高い効率によって埋め合わされる。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングをサポートし、（ｂ）そこにクローニングされる組織又は細胞に特異的な構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。３６キロバイト、線形、二本鎖ＤＮＡウイルスについての遺伝子構成又はアデノウイルスの知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を７ｋｂ以下の外来性配列と置換可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ，Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．３，２３７−２５２，１９９２）。
【００９５】
ＡＡＶベクター。アデノ随伴ウイルストランスフェクションを用い、核酸を細胞に導入しても良い。アデノウイルスを連結したシステムを用い、細胞系へのトランスフェクション効率が上昇したことが報告されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組み換えの頻度が低く、非分裂細胞には感染することができないため、インビボで組織培養中の哺乳類細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは、感染性に関して広い宿主範囲を有する。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に開示されている。
【００９６】
レトロウイルスベクター。レトロウイルスベクターは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来の遺伝物質を導入し、特別な細胞系にパッケージされる、広いスペクトルの種及び細胞型に感染する能力を有する。レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列に置換して、核酸（例えば、関心のあるタンパク質をコードするもの）をウイルスゲノム内に挿入し、複製欠陥のウイルスを作製する。ウイルス粒子を作製するため、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲ及びパッケージング成分を含まない細胞系をパッケージする。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組み換え型プラスミドを特別の細胞系に導入する場合（例えば、リン酸カリウム沈殿により）、パッケージング配列により、組み換え型プラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子内にパッケージングされ、その後培地に分泌されることが可能になる。その後、組み換え型レトロウイルスを含む培地を集め、場合により濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い細胞型に感染することができる。
【００９７】
レンチウイルスは複合レトロウイルスであり、通常のレトロウイルス遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加え、制御的又は構造的機能を有する他の遺伝子を含んでいる。レンチウイルスベクターは当該技術分野において周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１３，５１６号、及び第５，９９４，１３６号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶビルレンス遺伝子を複数弱力化することにより、例えば、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子を除去してベクターを生物学的に安全にすることにより作製された。
【００９８】
組み換え型レンチウイルスベクターは非分裂細胞には感染することができず、インビボ及びエクスビボにおける遺伝子導入及び核酸配列の発現の両方に使用することができる。例えば、組み換え型レンチウイルスは、非分裂細胞には感染することができず、適切な宿主細胞は、パッケージング機能を有する２種以上のベクター、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に開示されるｒｅｖ及びｔａｔで形質転換される。
【００９９】
膜タンパク質を、特定の細胞型の受容体を標的とする抗体、又は特定のリガンドと結合することにより、組み換え型ウイルスを標的としても良い。関心のある配列（調節領域を含む）を、特定の標的細胞の受容体に対するリガンドをコードする他の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することにより、例えば、ベクターは現在は標的特異的である。このようなウイルスベクターは、膵臓細胞を標的としても良い。
【０１００】
他のウイルスベクター。本発明の方法においては、他のウイルスベクターを使用しても良い。ワクチンウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ（編集），  Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７−４９２，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編集），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，Ｇｅｎｅ  ６８：１−１０，１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、及び単純ヘルペスウイルス等のウイルス由来のベクターを使用してもよい。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞にいくつかの魅力的な特徴を付与する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ（編集），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７−４９２，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編集），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１１７−１４８，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，Ｇｅｎｅ  ６８：１−１０，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６４２−６５０，１９９０）。
【０１０１】
修飾ウイルス。送達されるべき核酸は、発現するように設計され、又は特定の結合リガンドと連結している感染性ウイルス内に収納しても良い。したがって、ウイルス粒子は標的細胞の関連受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。ウイルスベクターの特定の標的を可能にするように設計する新規アプローチが、ウイルス、又はウイルスの表面タンパク質に対する化学的付加又は組み換え設計による、ウイルスの化学的又は遺伝的修飾に基づいて開発された。ラクトース部分を用いる、このような１つの修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特定の感染を可能にし得る。
【０１０２】
ウイルス表面タンパク質及び特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用する、組み換え型ウイルスを標的とする他のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによりビオチンを介して結合させても良い（Ｒｏｕｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９０７９−８３，１９８９）。主要な組織適合複合体のクラスＩ及びクラスＩＩ抗原に対する抗体を用い、それらはインビトロでの同種指向性ウイルスにこれらの表面抗原を有する種々のヒト細胞を感染させることを実証した（Ｒｏｕｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９０７９−８３，１９８９）。
【０１０３】
特定の態様においては、膵臓における形質導入を促進するために、アダプタシステム、すなわち送達ベクター及び標的となる膵臓細胞受容体の両方に結合する分子を使用することができる。更なる態様においては、天然のウイルスベクター受容体を、膵臓標的リガンドに誘導しても良い。更なる他の態様においては、標的の膵臓細胞に対する特異性を有する送達ベクターを得るために、２種の抗体が一緒に結合した二重特異性抗体を送達ベクターに結合させても良い。特定の態様においては、標的となる部分は化学的手段によって送達ベクターと結合させても良い。更なる態様においては、送達を増進するために、遺伝的に組み込まれた送達ベクターのＩｇ−結合ドメインに結合する抗体を使用することができる。更なる態様においては、小さい標的モチーフを、膵臓細胞が標的とするキャプシド、膜、ウイルス連結部、他のウイルス表面タンパク質に挿入しても良い。
【０１０４】
特定の態様においては、ウイルス構築物は、２種の異種タンパク質成分（例えば、ＧＫ及びＰｄｘ−１）をコードし、ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂを発現することができる。更なる態様においては、各成分は、個々の独立したウイルス内に含有させることができる。
【０１０５】
本明細書に開示される組成物は、内視鏡を用い、膵管を介して送達することができる。手短に言えば、患者は鎮静状態にされるか麻酔をかけられ、口を通してフレキシブル内視鏡を挿入し、食道を通って降り、胃に挿入され、幽門を通ってファーター膨大部（総胆管及び膵管の開口部）のある十二指腸に挿入される。オッディ括約筋は、膨大部の開口を調節する筋弁である。この領域は、手術を実施しながら、内視鏡カメラを用いて直接視覚化することができる。膵臓を標的とするために、プラスチックカテーテル又はカニューレを膨大部を通して挿入し、ベータ細胞誘導組成物（例えば、Ｓｙｎｅｒ−ＩＩＩ）を膵臓−胆管を通して導入する。ベータ細胞形成組成物は、膵臓標的部分をウイルスベクターと結合させることにより、例えば、ウイルスベクターの表面構造を膵臓組織のみを標的とするように修飾することにより静脈注射により送達することもできる。
【０１０６】
Ｂ．脂質介在性トランスフェクション
更なる実施態様においては、核酸は例えばリポソームのような脂質に取り込まれる。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内側の水性媒体を特徴とする小胞状構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有している。リン脂質が過剰の水溶液内に懸濁された場合にリポソームが自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造が形成され、水が取り込まれ、脂質二重層間に溶質が溶解する前に自己再配列を受ける（Ｇｈｏｓｈ及びＢａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｕら．（編集），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，８７−１０４，１９９１）。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）又はスーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸も考えられる。
【０１０７】
インビトロにおける、脂質が介在する核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は非常にうまくいっている（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７−１７６，１９８７）。培養した鶏胚、Ｈｅｌａ及び肝臓がん細胞における脂質が介在する送達及び外来ＤＮＡの実現可能性についても証明されている（Ｗｏｎｇら，Ｇｅｎｅ  １０：８７−９４  １９８０）。
【０１０８】
本発明の特定の実施態様においては、脂質粒子はセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成していてもよい。このことは、細胞膜との融合を促進し、脂質でカプセル化されたＤＮＡの細胞移入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５−３７８  １９８９）。他の実施態様においては、脂質粒子は、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体を形成していてもよく、又は一緒に使用してもよい（Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３６１−３３６４，１９９１）。更に他の実施態様においては、脂質粒子はＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合体を形成していてもよく、又は一緒に使用してもよい。他の実施態様においては、送達媒体は、リガンド及び脂質粒子を含んでいてもよい。
【０１０９】
特定の態様においては、ＰＴＰ１Ｂ  のｓｈＲＮＡとＰｄｘ−１及びグルコキナーゼをコードする核酸とを含む本明細書に開示される成分は、リポソームにより送達することができる。核酸を含むリポソームは、静脈注射により送達することができ、膵臓組織に到着すると遊離することができる。特定の態様においては、本発明の核酸は、リポソーム表面に存在する化学的に連結したリガンドを含むリポソームに包含される。該リガンドは、膵臓細胞を特異的に標的とする。この方法を用いることで、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモン及び毒素のような多種多様のリガンド又は受容体をリポソーム表面に固定することができ、各成分を含むベータ細胞を標的とすると共にベータ細胞が膵臓細胞に導入されるようにすることができる。
【０１１０】
Ｃ．受容体介在性トランスフェクション
更に、核酸は、受容体介在性送達媒体によって標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞内で起こる受容体介在性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々の受容体の細胞型特異的な分布の観点から、この送達方法は、本発明に更なる別の特異性を加える。
【０１１１】
特定の受容体介在性遺伝子標的化媒体は、細胞受容体特異的リガンド及び核酸結合剤を含む。他の受容体介在性遺伝子標的化媒体は、送達される核酸が動作可能に結合している細胞受容体特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドが受容体介在性遺伝子導入のために使用されており（Ｗｕ及びＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７；欧州特許第０２７３０８５号）、技術の操作を確立する。本発明の特定の態様においては、リガンドは、標的細胞集団において特異的に発現する受容体に対応して選択される。
【０１１２】
他の実施態様においては、細胞特異的核酸標的媒体の核酸送達媒体は、脂質粒子と組み合わせて特異的結合リガンドを含む。送達すべき核酸は脂質粒子内に収納されており、特異的結合リガンドは、脂質層内に機能的に組み込まれている。したがって、脂質粒子は標的細胞の受容体と特異的に結合し、中身を細胞に送達する。このようなシステムは、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）がＥＧＦ受容体の情報制御を示す細胞への核酸の受容体介在性送達に使用されるシステムのように、機能的に使用されるシステムであることが明らかになっている。
【０１１３】
更なる実施態様においては、標的送達媒体の核酸送達媒体は、好ましくは、細胞特異的結合に向けられた１種以上の脂質又は糖タンパク質を含む脂質粒子自体であってもよい。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドが脂質粒子内に組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みが上昇することが観察されている（Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７−１７６，１９８７）。本発明の組織特異的形質転換構築物は、本明細書に開示されるようにまたはそれと類似する機構で、標的細胞に特異的に送達されるものと考えられる。
【０１１４】
Ｄ．微粒子銃
微粒子銃技術は、核酸を、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織又は生物に導入するために使用することができる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；第５，６１０，０４２号；及びＰＣＴ出願公開第ＷＯ  ９４／０９６９９号）。この方法は、該ＤＮＡ被覆微粒子が細胞膜を貫通するように、ＤＮＡ被覆微粒子を加速して高速にし、細胞を死滅させずに細胞に侵入させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３，１９８７）。当該技術分野において公知の多種多様の微粒子銃技術があり、これらの多くは本発明に適用可能である。
【０１１５】
この微粒子銃においては、１個以上の粒子が少なくとも１個の核酸でコーティングされ、推進力によって細胞内に送達される。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。このような１つの装置は、電流を発生するための高電圧充電に依存し、その電流が原動力を提供する。使用される微粒子は、タングステン、金粒子又はビーズ等の生物学的に不活性な物質からなる。例示的な粒子としては、タングステン、白金及び金からなるものが挙げられる。ある例では、金属粒子表面上のＤＮＡの沈着は、微粒子銃を使用する受容細胞へのＤＮＡ送達に必ずしも必要なことではないと考えられる。しかし、粒子はＤＮＡでコーティングされているのではなくＤＮＡを中に含んでいても良い。ＤＮＡコーティング粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達レベルを上昇させるが、それ自体は必須ではない。
【０１１６】
裸のプラスミドＤＮＡは、エアピストルにより細胞内に導入することができる（遺伝子銃）。Ｓｙｎｅｒ−ＩＩＩプラスミドは、内視鏡により、遺伝子銃アプローチを用いて膵管を介して注入され、膵管を通って膵臓組織に到達する。プラスミドＤＮＡボンバードメントは、遺伝子銃を介して膜の細孔を開ける物理的圧力によって、及び／又は細胞膜を通る裸のプラスミドＤＮＡの拡散を容易にすることによって、細胞内に入る。
【０１１７】
Ｅ．ナノ粒子
本発明の核酸は、膵臓又は他の組織を標的とする、ナノ粒子の三次元多成分構造体に組み込んでも良い。使用し得るナノ粒子としては、リポソーム、重合体、タンパク質、ミセル、デンドリマー、量子ドット、ナノシェル、ナノ結晶、金ナノ粒子、常磁性ナノ粒子、及びカーボンナノチューブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
Ｆ．ハイドロダイナミック遺伝子導入法
裸のプラスミドＤＮＡは、ハイドロダイナミック遺伝子導入法を使用し、膵管を介して送達させても良い。膵管内ではバルーンカテーテルを配置しても良い。膵管内に配置されたバルーンカテーテルは、閉塞補助点滴のために膨張させる。
【０１１９】
Ｇ．エクレトロポレーション
特定の態様においては、一対の電極を膵臓又は他の組織の上又は中に配置すると共に、本発明の核酸を当該電極上に配置して、遺伝物質を組織内に導入するようしても良い。
【０１２０】
Ｈ．超音波による遺伝子導入
本発明の核酸は、静脈注射される微小気泡内に組み込んでも良い。微小気泡が膵臓又は他の組織に到達すると、それらは超音波の標的となる。微小気泡が膨張して破裂すると、微小気泡は膵臓内に核酸を放出する。局所的な衝撃波は、細胞膜の近くまで核酸を浸透させる。
【０１２１】
Ｉ．針による遺伝子導入
特定の態様においては、本発明の核酸は、針を用いて、膵臓又は他の組織に直接注入される。
【０１２２】
Ｖ．医薬組成物
当業者であれば、本明細書を考慮し、適切な治療レジメン（例えば、用量、投与回数、全身投与か局所投与か等）を決定することは十分可能である。投与について、本明細書に開示される成分を、薬学的に許容される媒体と共に単一の製剤（溶液、懸濁液、乳濁液等）に製剤化する。このような媒体は通常は無毒であり、非治療的である。このような媒体の例は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。固定油及びオレイン酸エチル等の非水性媒体も使用することができる。好ましい媒体は、５％（ｗ／ｗ）のヒトアルブミンの生理食塩溶液である。媒体は、少量の添加剤、例えば、等張性及び科学的安定性を向上させる物質、例えば緩衝液及び防腐剤を含んでいてもよい。
【０１２３】
本明細書に開示される治療用組成物、並びにその生物学的等価物は、単独で又は任意の適切な経路により投与することができる。非経口投与の例としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内等が挙げられる。本明細書に開示される投与経路は、単に例示であり、なんら限定されるものではない。
【０１２４】
本発明の実施態様により、動物、具体的にはヒトに投与される治療用組成物の用量は、合理的な期間にわたり、対象に所望の反応をもたらすのに十分な量とすべきである。治療用組成物の用量が、種々の要因、例えば、使用される具体的な治療用組成物の濃度、動物の年齢、種、健康状態又は病状及び体重に依存することは公知である。
【０１２５】
更に、用量及び投与計画は、主に宿主に対する生物学的損傷の種類、対象の種類、対象の病歴、及び投与される治療用組成物の種類に依存する。投与量は、投与経路、投与のタイミング及び投与回数、並びに特定の治療用組成物の投与に伴って起こるあらゆる有害な副作用の存在、性質及び程度、並びに所望の生理学的効果により決定されるであろう。種々の健康状態又は病状、特に慢性の健康状態又は病状が反復投与を含む長期間の治療を必要とする可能性があることも公知である。
【０１２６】
したがって、治療用組成物の量は、改善された治療指数を達成するのに有効でなければならない。反復投与が使用される場合、投与回数は、例えば対象の種類によるであろう。当業者は、所定の実験により、あらゆる特定のケースにおいて、最も効果的な、所与の対象における適切な投与経路及び投与回数を確認することができる。適切な用量及び投与計画は、従来公知の用量反応区域検出法により決定することができる。一般に、治療は、その化合物の最適用量よりも少ない少量の用量で開始する。その後、環境下で最適な効果が得られるまで、用量を少しずつ増加させる。
【０１２７】
本発明の実施態様において使用される治療用組成物は、通常、担体を含む。これらの担体は従来より使用されているものであり、投与経路、並びに溶解度、及び治療薬との反応性のような化学的及び物理的性質によってのみ制限される。更に、治療用組成物は高分子組成物、シクロデキストリン包接錯体、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロカプセルのような包接錯体として製剤化され、制限はない。
【０１２８】
本明細書に開示される薬学的に許容される賦形剤、例えば、媒体、アジュバント、担体、又は希釈剤は周知であり、容易に入手できる。薬学的に許容される担体は、治療用組成物に対して化学的に不活性なものであり、使用条件下で有害な副作用又は毒性のないものが好ましい。
【０１２９】
賦形剤の選択は、特定の治療用組成物によって、また組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度は決定される。したがって、本発明の実施態様において使用される、多種多様の適切な医薬組成物の製剤がある。例えば、非限定的製剤は、静脈用、皮下用、筋肉内用、腹腔内用等の注射製剤（これらに限定されない）、懸濁液及び乳濁液等の溶液、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、トローチ剤等の経口製剤（これらに限定されない）であってもよい。非経口投与に適切な非限定的製剤としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、界面活性剤等の非活性成分を含む水性及び非水性等張性無菌注射溶液が挙げられる。このような組成物における溶液としては、油、洗浄剤糖の脂肪酸等が挙げられ、他の周知で一般的な成分が制限なく挙げられる。
【０１３０】
ＶＩ．実施例
以下の実施例、並びに図面は、本発明の特定の実施態様を説明するために包含される。
実施例又は図面に開示される技術は、本発明者らにより発見された技術を示し、記載された方法の実施において十分に機能し、その結果、その実施のための形態を構成すると考えられると、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本明細書の開示を考慮し、開示され、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、同等又は類似の結果が今もなお得られる特定の実施態様において多くの変更をなし得ると認識している。
【実施例１】
【０１３１】
［成熟膵臓におけるベータ細胞形成］
Ａ．結果
説明の目的のために、治療用成分は、レンチウイルス−ＣＭＶ−グルコキナーゼ（ＧＫ）、レンチウイルス−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂ及びレンチウイルス−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を含む。対照組成物は、治療用組成物として同じ濃度で注射されるレンチウイルス−ＣＭＶ−ＧＦＰ及びレンチウイルス−Ｈ１−ｓｈＲＮＡスクランブルを含む。注射の４週間後、インビボにおいて、ＰＤＸ−１及びＧＫの過剰発現、及びＰＴＰ１Ｂ発現の抑制がマウスの膵臓内で検出された。グルコキナーゼの過剰発現は、膵島及び外分泌組織で検出された。膵臓組織は内分泌細胞でのみグルコキナーゼを発現するので、外分泌組織でのグルコキナーゼ発現により、治療用組成物によるグルコキナーゼの過剰発現が確認される。外分泌及び内分泌発現を区別するため、Ｐｄｘ−１の過剰発現は、Ｐｄｘ−１のｃＤＮＡに組み込まれたｃ−Ｍｙｃタグを使用することにより検出される。ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂと同時発現するＧＦＰも検出された。タンパク質発現はウェスタンブロットにより確認した。
【０１３２】
ＣＮＩＰアプローチの第一局面：ＣＮＩＰアプローチの１つの目的は、膵臓ベータ細胞形成を誘導するために、膵臓内でのグルコース代謝を増大させることである。グルコースが解糖経路に入るには、最初、膜グルコース輸送システムを通って細胞内腔に入る必要がある。グルコーストランスポーターの内、Ｇｌｕｔ  １及びＧｌｕｔ  ３は、外分泌及び内分泌ヒト膵臓組織に存在し、Ｇｌｕｔ  ２は膵臓ベータ細胞に存在する（Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２７：７４６−７５４，２０１１）。しかし、このグルコース輸送は、グルコースが解糖経路に入るための律速段階ではない（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２１４：２５４−２６２，２０１１）。解糖経路におけるグルコース代謝の最初の律速段階は、ヘキソキナーゼによるグルコースリン酸化反応の段階である。ヘキソキナーゼによるグルコースのリン酸化反応により、代謝産物グルコース６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）が生成する。膵臓ベータ細胞は、グルコキナーゼ（ＧＫ）という名前のヘキソキナーゼＩＶ型を含む。グルコキナーゼは、他のヘキソキナーゼとは異なり、細胞内Ｇ−６−Ｐが蓄積してもアロステリック阻害を受けない。したがって、グルコキナーゼについては、グルコキナーゼ酵素の量及び活性が、解糖系で処理されるグルコースの代謝流動速度を調節する。ヘキソキナーゼファミリーの他のメンバーについては、Ｇ−６−Ｐによる産生阻害が、酵素活性の重要な調節因子であり、それ故、グルコースの解糖経路に入ることについての重要な調節因子となる。グルコースがヘキソキナーゼによりリン酸化されない場合、グルコースは更なる代謝を受けることができず、遺伝子発現を誘導する転写装置に対する信号をなんら生成することができないこととなる（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１０２１３−１０２１６，１９９４及びＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５３２１−５３２４，１９９６）。したがって、特定の態様においては、膵臓ベータ細胞形成を誘導するために、グルコキナーゼをＣＮＩＰ混合物に含有させても良い。
【０１３３】
本発明者らは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの制御下にグルコキナーゼ遺伝子を発現するレンチウイルスベクター構築物を設計した（図２Ａ）。このレンチウイルスベクター構築物は、コード配列の３’非翻訳領域に、導入遺伝子の発現レベルを上昇させる、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後調節エレメントを含んでいた。ＷＰＲＥは核内において、核転写のレベルを増大させると共にＲＮＡの半減期を大幅に延長することにより、転写後の遺伝子発現プロセスを刺激するように機能する（Ｚｕｆｆｅｒｒｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８８６−２８９，１９９９）。マウスグルコキナーゼ（ＧＣＫ）遺伝子を、ｐＥｎｔＣＭＶ−ＷＰＲＥにサブクローニングし、挿入物をＤＮＡ配列により検証した。ｐＥＮＴ−ＧＣＫをＬＲクロナーゼＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ｐＬｅｎｔｉベクターに連結した。組み換え産物を大腸菌細胞に形質転換した。一晩培養した後、陽性のクローンを選択し、プラスミドＤＮＡを精製した。ｐＥｎｔ−ＧＣＫ及びｐＬｅｎｔｉ−ＧＣＫを２９３個の細胞に形質転換した。形質転換の４８時間後、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液で溶解し、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、ウェスタンブロッティングで分析した。ウェスタンブロットは、１：１０００に希釈した抗−ＧＣＫ抗体、それに続くＨＲＰ結合二次抗体を用いて実施した。ウェスタンブロット膜は、ＥＣＬ試薬を用いて発色させた。
【０１３４】
純粋で高い力価のレンチウイルスベクターを産生するためにｐＬｅｎｔｉ−ＧＣＫを使用する。Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫを、上述したように、成体マウスの膵臓に直接注入する。成体マウスＣ５７ＢＬ／６（８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ由来）が、膵臓をレンチウイルスベクター構築物の標的とするインビボ実験のために使用されるであろう。
【０１３５】
プラスミドベクターによるグルコキナーゼ発現が増大することにより、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）の蓄積量が増大することがわかっている（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１０２１３−１０２１６，１９９４）。グルコース６−リン酸は、複数の代謝経路（解糖、糖生成、ペントースリン酸経路、グリコーゲン生成及びグリコーゲン分解）の分岐点にある重要な中間体である。Ｄｏｉｒｏｎら（１９９６）によって、転写装置に対するグルコースシグナルは、ペントースリン酸経路により生成する代謝産物であるキシルロース５−リン酸が仲介していることが明らかにされた。Ｄｏｉｒｏｎにより明らかにされたように、キシルロース５−リン酸は、グルコース代謝による転写装置誘導の主因代謝産物である。ペントースリン酸経路を介して代謝流動を調節する重要な酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）である。Ｇ−６−Ｐは、酵素Ｇ６ＰＤの作用により、ペントースリン酸経路に入る。したがって、本発明者らのＣＮＩＰアプローチの発展型として、グルコース代謝による転写促進作用を仲介するキシルロース−５−リン酸産生を増大させるために、グルコース６−リン酸をペントースリン酸経路へ流すＬｅｎｔｉ−Ｇ６ＰＤを、Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫとの併用しても良い。キシルロース５−リン酸の産生における他の重要な酵素には、トランスケトラーゼ（ＴＫ）があり、ペントースリン酸経路の更に下流に位置する。したがって、遺伝子発現制御のグルコース代謝の効果を増大させるための別のアプローチとして、Ｌｅｎｔｉ−ＴＫをＬｅｎｔｉ−ＧＣＫと併用することが考えられる。グルコース代謝の制御下にある転写装置を活性化して、ベータ細胞形成を増大させるために、全ての分子（Ｌｅｎｔｉ−ＧＣＫ、Ｌｅｎｔｉ−Ｇ６ＰＤ及びＬｅｎｔｉ−ＴＫ）の相乗的な作用を用いても良い。
【０１３６】
ＣＮＩＰアプローチの第二の局面：ＣＮＩＰアプローチの第二の局面は、膜受容体チロシンキナーゼ活性、及びチロシンキナーゼ関連受容体活性を増大させることを含む。グルコース代謝は、成熟膵臓においてベータ細胞の産生に関与する主要なメカニズムである。ベータ細胞形成に関与する他のシステムは、チロシンキナーゼ受容体に対するリガンド結合である（Ｖａｓａｖａｄａら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：９３１−９５０，２００６）。プロラクチン受容体を介して作用する、成長ホルモン、プロラクチン及び胎盤性ラクトゲンの働きによって、生理的ストレス（すなわち、妊娠）に対する応答として膵臓ベータ細胞の質量が増大する。このプロラクチン受容体は、固有のチロシンキナーゼ活性を有していないが、チロシンキナーゼのヤヌスキナーゼファミリーのメンバーと相互作用する。プロラクチン受容体は、チロシンキナーゼ関連受容体のファミリーの一部である。チロシンキナーゼのヤヌスキナーゼファミリーは、妊娠中に起こるホルモン変化への応答としてのベータ細胞質量の増大に対して大きな役割を負っている（Ｖａｓａｖａｄａら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：９３１−９５０，２００６）。インスリン、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、及び上皮細胞増殖因子の作用も、膜結合チロシンキナーゼ受容体を活性化することにより、ベータ細胞の質量を増大させる（Ｖａｓａｖａｄａら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：９３１−９５０，２００６）。したがって、ラクトゲン（成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲンを含む）、インスリン、インスリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、及び、上皮細胞増殖因子受容体が、膵臓ベータ細胞の質量を増大させるためには、チロシンキナーゼの作用が必要である。
【０１３７】
タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）が、インスリン、インスリン増殖因子受容体、プロラクチン及び肝細胞増殖因子の、チロシンキナーゼを活性化する能力を阻害すること、が示されている（Ａｏｋｉ及びＭａｔｓｕｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３９７１８−３９７２６，２０００；Ｋａｋａｚｕら，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４９：２９２７−２９３５，２００８；Ｔｏｎｋｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：８３３−４６，２００６）。それ故、ＣＮＩＰ混合物中に含むことのできる１種の分子は、ＰＴＰ１Ｂを標的とする阻害剤又は阻害ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡによるＰＴＰ１Ｂタンパク質産生の抑制により、対応するホルモンの生理的濃度の結合に応じて、成熟膵臓におけるベータ細胞形成に関与する受容体チロシンキナーゼ活性が上昇するであろう。ｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂは、レンチ−ＧＣＫについて上述したのと同じ方法を用いて、Ｈ１ポリメラーゼプロモータの制御下にレンチウイルス構築物内に導入される（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５５：７１９−７２８，２０１２）（図２Ｃ）。ポリメラーゼＩＩＩのハウスキーピング機能のため、ポリメラーゼＩＩＩプロモータＨ１は、全ての細胞において普遍的に活性である。レンチ−ｓｈＲＮＡ−ＰＴＰ１Ｂを、上述のようにして膵臓に供給した。
【０１３８】
レンチウイルスｓｈＲＮＡ  ＰＴＰ１Ｂ。ｐＥＱＵ６ベクター内に小さいヘアピンＲＮＡｉを構築した。標的配列は２０塩基長である（ＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡ  配列番号：２）。ｓｈＲＮＡｉ配列はＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１３９】
共トランスフェクション実験を、標的遺伝子発現プラスミドｐＥｎｔ−ＰＴＰ１Ｂ及び１つのｐＥＱ−ＰＴＰ１Ｂ−ｓｈＲＮＡベクターを用いて実施した。以下の表１は、各反応の成分を示す。トランスフェクションの４８時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液内で細胞を溶解し、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動及びウェスタンブロット分析に供した。ウェスタンブロットは、１：１０００に希釈した抗−ＰＴＰ１Ｂ抗体を用いて実施した。膜を、ＥＣＬ試薬を用いて評価した。各６ウェルについて：
【表１】
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【０１４０】
ＣＮＩＰアプローチの第三の局面：本明細書に開示される方法に含むことのできる第三の局面には、膵臓におけるベータ細胞形成を誘導するために、グルコース代謝（局面１）とチロシンキナーゼ受容体ファミリー活性の刺激（局面２）の効果を統合するための転写因子を通じて遺伝子発現を増大させることが含まれる。
【０１４１】
標的ＤＮＡ配列に結合する転写因子の核内への促進核酸を説明するため、複数のモデルが提案されている。１つのモデルは、転写因子（ＴＦ）が促進拡散によりＤＮＡに結合することを提案している。第一に、ＴＦは、非特異的部位で不規則にＤＮＡと相互作用する。ＤＮＡ分子との最初のＴＦ相互作用の後、促進拡散によって、ＴＦはＤＮＡに沿って「滑っていくこと」により、当初の非特異的部位からその標的配列まで移動する。ＴＦがＤＮＡに沿って転がりながら進み、対応結合部位を見つけると、ＴＦは転写装置の活性化又は阻害を誘導する。ＴＦがどのようにしてＤＮＡ結合部位に達するかを説明するために提案されたモデルと関係なく、提案されたモデル及び実験のいずれにも、転写装置における活性化又は阻害の部位を見つけるためのＴＦのランダムな移動を伴う促進拡散が含まれる。転写装置に対するグルコース代謝シグナル伝達の１つの作用は、ＴＦがＤＮＡ分子と結合する可能性を増大することである（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５３２１−５３２４，１９９６）。実際、転写装置に対するグルコース代謝シグナル伝達は、ＴＦの発現を誘導し、細胞質から核へのＴＦの移動がグルコース誘導遺伝子を活性化する（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５３２１−５３２４，１９９６）。その結果として、ＴＦがグルコース誘発性遺伝子発現を増大させる生物物理学的メカニズムは、核内に存在するＴＦの量に依存する。実際に、核内のＴＦの量が増大すると、特定的結合部位をランダムに見つけるためのＤＮＡ分子と相互作用する機会が増大する（Ｍｉｔａｎｃｈｅｚら，Ｅｎｄｏ  Ｒｅｖ  １８：５２０−５４０，１９９７）。成熟した膵臓におけるベータ細胞形成に関与する遺伝子の発現の増大は、ベータ細胞形成経路を活性化するカギであるＴＦを過剰発現することにより、達成又は増進される。
【０１４２】
出生後のベータ細胞形成に関与する主要な転写因子の１つはＰｄｘ−１である（Ｄｏｉｒｏｎ及びＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．９：３５６−３５７，２０１１）。Ｐｄｘ−１は、膵臓において出生の前後で異なる効果を有する（Ｄｏｉｒｏｎ及びＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．９：３５６−３５７，２０１１）。胚性段階では、Ｐｄｘ−１は膵臓の発生に必須であり、内分泌及び外分泌組織内で発現する。しかし、出生後は、Ｐｄｘ−１は、膵臓ベータ細胞及びソマトスタチン細胞でのみ発現する。したがって、成熟膵臓においては、Ｐｄｘ−１は胚性膵臓の発生を誘導しないが、転写装置に対するグルコース代謝シグナル伝達に反応してインスリン遺伝子発現を誘導する作用によって、膵臓ベータ細胞形成を誘導する（Ｄｏｉｒｏｎ及びＤｅＦｒｏｎｚｏ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．９：３５６−３５７，２０１１；Ｍｉｔａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏ  Ｒｅｖ  １８：５２０−５４０，１９９７）。Ｐｄｘ−１は、発生段階後に、成体動物におけるベータ細胞形成を誘導することが証明されている（Ｂｏｕｗｅｎｓ及びＲｏｏｍａｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８５：１２５５−１２７０，２００５）。Ｐｄｘ−１は、ベータ細胞形成を増強するという胎生期以降の作用を目的としてＣＮＩＰアプローチで使用することができる。
【０１４３】
ＣＮＩＰアプローチは、膵臓発生の胚性経路を活性化することなく、成熟膵臓においてベータ細胞形成の後胚発生を誘導するように設計されている。これまでのＣＮＩＰアプローチでない各手法は、膵臓の胎生発生を再現するために胚性経路又は幹細胞を利用してきた。ベータ細胞形成を増大するために胚性経路を誘導することの不利益は、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方の耐糖能異常において重要な病因的役割を果たしていることが示されている、グルカゴン産生アルファ細胞を含む全てのタイプの内分泌細胞を誘導してしまうことである。ＣＮＩＰアプローチは、成熟膵臓において膵臓ベータ細胞形成を誘導するため、胚性経路及び幹細胞経路を回避する。
【０１４４】
Ｐｄｘ−１の発現、及び、細胞質から核への移行は、転写装置に対するグルコース代謝シグナル伝達により誘導される（Ｍｉｔａｎｃｈｅｚら，Ｅｎｄｏ  Ｒｅｖ  １８：５２０−５４０，１９９７）。既に記載したように、グルコース代謝はベータ細胞形成に必須である。細胞型を形成するには、細胞の遺伝的発現プロフィールを変更しなければならない。グルコース代謝による遺伝子誘導は、遺伝子発現プロフィールが血中のグルコース濃度により調節及び制御される、エピジェネティックな現象の例である（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５３２１−５３２４，１９９６；Ｍｉｔａｎｃｈｅｚら，Ｅｎｄｏ  Ｒｅｖ  １８：５２０−５４０，１９９７）。Ｐｄｘ−１遺伝子の発現、及び細胞質から核への移行はグルコース代謝により誘導される。しかし、グルコース代謝シグナル伝達の効果は、膵臓ベータ細胞形成に関与する転写装置に向けられるものである。Ｐｄｘ−１の過剰発現は、ＤＮＡ分子に不規則に結合してその特異的ＤＮＡ結合部位を見出すことのできるＰｄｘ−１の総量を増大させることにより、ベータ細胞形成を増進させる。このように、Ｐｄｘ−１の過剰発現は、ベータ細胞形成を刺激するＣＮＩＰ混合物における全てのシグナル伝達メカニズムを纏め上げることにおいて、中心的役割を果たす。膵臓におけるＰｄｘ−１の過剰発現は、ベータ細胞形成に関連していない転写装置でのグルコース代謝シグナル伝達の他の効果を活性化する前に、ベータ細胞を産生するためのＣＮＩＰ混合物における分子の集中をもたらす（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：５３２１−５３２４，１９９６；Ｍｉｔａｎｃｈｅｚら，Ｅｎｄｏ  Ｒｅｖ  １８：５２０−５４０，１９９７）。Ｐｄｘ−１  ｃＤＮＡは、ＣＭＶプロモータの制御下、レンチ−ＧＣＫについて上述したのと同じ方法を用い、レンチウイルス構築物に導入されている。このインビボにおける注入方法は、成体マウスの膵臓を標的とするためにレンチ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１と共に使用された。
【０１４５】
レンチウイルスＣＭＶ−Ｐｄｘ−１構築物（図２Ｂ）：マウスのＰＤＸ−１遺伝子をｐＥｎｔＣＭＶ−ＷＰＲＥベクターにサブクローニングし、挿入をＤＮＡ配列決定により検証した。ｐＥＮＴ−ＰＤＸ−１をＬＲクロナーゼＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ｐＬｅｎｔｉベクターに連結した。組み換え産物を大腸菌細胞に形質転換した。一晩培養した後、陽性クローンを選択し、プラスミドＤＮＡを精製した。
【０１４６】
ｐＥｎｔ−ＰＤＸ１及びｐＬｅｎｔｉ−ＰＤＸ１を２９３個の細胞に導入（トランスフェクション）した。トランスフェクション４８時間後、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液で溶解し、４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、ウェスタンブロッティングで分析した。ウェスタンブロットは、１：１０００に希釈した抗−Ｍｙｃ抗体（ＰＤＸ１構築物について）、それに続くＨＲＰ結合二次抗体を用いて実施した。抗体結合は、ＥＣＬ試薬を用いて検出された。
【０１４７】
外分泌組織内の１〜２個組のインスリン陽性細胞の数を、対照群に対して治療群を比較することでベータ細胞形成の指標として使用した（図４）。１〜２個組のインスリン陽性細胞の増加が、治療群についての外分泌組織において検出された。
【０１４８】
対照群と比較した治療群における１〜２個組のインスリン陽性細胞の増加は、ベータ細胞増殖（マーカーＢｒｄＵにより量を計測）と相関していた（図５）。ＢｒｄＵマーカーにより、膵島及び外分泌組織における増殖が証明された。
【０１４９】
増殖マーカーＢｒｄＵのインスリン陽性細胞との共局在化は、治療用組成物を注射した群での新たな膵臓ベータ細胞の形成を示している。膵臓ベータ（インスリン）細胞増殖のみが観察された。アルファ（グルカゴン）又はデルタ（ソマトスタチン）細胞の増殖は検出されなかった。組織学的定量化により、治療用組成物は膵臓ベータ細胞形成を誘導した。実際に、上記で説明したように、治療用組成物は、グルカゴン又はソマトスタチン細胞を齎すことなく、膵臓ベータ細胞の胚後産生を誘導するように設計された。
【０１５０】
ベータ細胞の質量を、治療群及び対照群において定量した（図６）。膵臓ベータ細胞の質量は、対照プラセボを注射した対照の成体マウス群と比較し、治療用組成物を注射した成体マウスにおいて著しく増加した。
【０１５１】
ベータ細胞のクラスター密度を、治療及び対照群において定量した。治療用組成物は、対照と比べて、ベータ細胞のクラスター密度を著しく増大させた（図７）。
【０１５２】
膵臓ベータ細胞増殖、ベータ細胞の質量、及び、ベータ細胞のクラスター密度の各増加は、治療用組成物を注射した成体マウスを対照プラセボ群と比較した際の、一晩絶食した後のインスリン産生の増加と、相関していた（図８）。
【０１５３】
Ｂ．方法
成熟膵臓に対して遺伝子送達を標的とするインビボにおける方法：成体動物におけるベータ細胞形成を調査するため、ウイルスベクターを用いてインビボにおいて成熟膵臓を標的とした。方法論は検証されており（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５５：７１９−７２８，２０１２）、インビボで膵臓ベータ細胞を産生するためにＣＮＩＰアプローチにおいて用いられた。
【０１５４】
レンチウイルスベクターの利点は、樹脂状細胞を著しく活性化しないことである。更に、レンチウイルスベクターは、（ｉ）分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染し、組み入れることができ、（ｉｉ）形質導入率が高く、インビボにおいて遺伝子発現を維持することができ、（ｉｉｉ）宿主の大幅な免疫反応を誘導せずに済み、（ｉｖ）うまく再投与することができる。重要なこととして、インビボで成体マウスの膵臓にウイルスベクターを注入する方法により、成体において発症した慢性疾患に対する、新規な治療法、及び／又は、治癒の見込みを、評価することが可能になり、胚発生段階で遺伝子が欠損した場合に起こる代償機構の発生が回避される。このアプローチは、ノックアウトモデルにおいて報告された相反する発見の一部、すなわち、インスリン受容体がノックアウトされたマウスにおける正常／正常に近い筋肉インスリン感受性（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６５：３１３−３２，２００３を参照されたい）と、ＧＬＵＴ４についてのホモ接合ヌル変異体（ＧＬＵＴ４  −／−）（Ｍｉｎｏｋｏｓｈｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（３６）：３３６０９−１２，２００３）と（これらは糖尿病の表現型を示していない）を不要にする。したがって、特定の実施態様においては、レンチウイルスベクターは、膵臓を直接標的とするために使用される。
【０１５５】
すなわち、レンチウイルス構築物は、以下のように、導管を介してマウスの膵臓に導入することができる：３２ゲージのカテーテル（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）を、胆嚢の小さい開口部を通して胆嚢管に挿入する。カテーテルが総胆管に送られ、胆管とカテーテルの周りに肝臓へのベクターの逆流を防ぐための０／０縫合のスリップノットにより所定の場所に固定される。ベクターの十二指腸への漏出を防ぐためのＯｄｄｉ括約筋の周りに配置されたマイクロクランプを用いて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する１００μＬのレンチウイルスベクターを１０8ＴＵ／ｍＬで、カテーテルを通して膵管にゆっくりと注入する。感染２週間後、組織学的検査のために全膵臓を摘出する。４８時間後、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に、ＧＦＰをコードするレンチウイルスの注入は、特に膵臓組織を標的とした（Ｄｏｉｒｏｎら，２０１２）。ＧＦＰ発現に基づく、レンチウイルスベクターによる膵臓への形質導入の定量的形態学的分析は、６０％の組織がＧＦＰを発現したことを示した。発現は、４週間後でも膵臓で検出された（図３）。緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスは、心臓、肝臓、脳、脚筋及び腎臓等の他のいずれの組織においても、組織検査及びＰＣＲによって検出されなかった（データは図示せず）。注入の２日目及び１４日目に、炎症（膵炎）の証拠を探すために、膵臓組織をＨ＆Ｅを用いて染色した。炎症の証拠は観察されなかった。ｓｈＲＮＡ  Ｇｒｂ１０又はｓｈＲＮＡスクランブルを含むレンチウイルスベクター注入の後、活動量、注入後１４日にわたる毎日の食糧摂取量（ｓｈＲＮＡ  Ｇｒｂ１０マウス、５．９±０．５グラム／日［ｎ＝６］に対しｓｈＲＮＡスクランブルマウス、５．４±０．３グラム／日［ｎ＝５］）、体重増加は、ｓｈＲＮＡ  Ｇｒｂ１０及びｓｈＲＮＡスクランブル群で同程度であった。レンチウイルス注入後に、対照又は実験群のいずれにおいても下痢は観察されず、膵臓酵素（リパーゼ）及び肝臓酵素（ＡＳＴ、ＡＬＴ）は上昇しなかった（Ｄｏｉｒｏｎら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５５：７１９−７２８，２０１２）。これらの結果により、レンチウイルスの注入技術が胃腸、膵臓又は肝臓に不都合な影響を及ぼさないことが証明された。
【０１５６】
本発明者らはまた、グルコキナーゼ（ＧＫ）、Ｐｄｘ−１転写因子、及びＰＴＰ１Ｂを標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを構築し、作製した。８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用し、全ての実験について水及び通常の固形飼料の食事を自由に摂取できる環境を維持した。ベータ細胞の増殖量を計測するため、レンチウイルスベクターの注入の１日目から、マウスに、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液を、５０μｇ／体重１ｇで、毎日腹腔内に１２日間注射した。レンチウイルスの注入の４週間後、組織学的検査のために、全膵臓を摘出した。
【０１５７】
タンパク質産生を促進あるいは抑制するために、インビボにおける成熟膵臓への直接投与を行っても良い。要約すると、本発明者らは、インビボにおいて成熟膵臓を標的とする方法論的プロトコルを開発した。この技術は、ベータ細胞形成を促進するＣＮＩＰアプローチの有効性を検証する研究において使用されるであろう。上述のレンチウイルス注入法は、成熟膵臓が直接的な標的となり得るという概念を実証するものである。膵臓ベータ細胞を標的とする、あるいは産生する、レンチウイルスアプローチを使用して得られた結果は、小分子及び非ウイルスを使用する治療法にも応用可能である。
【０１５８】
動物実験：８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用し、全ての実験について、水及び通常の固形飼料の食事を自由に摂取できる状態を維持した。レンチウイルスベクターの注入の１日目から、マウスに、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液を、５０μｇ／体重１ｇで、毎日腹腔内に１２日間注射した。レンチウイルスの注入の４週間後、組織学的検査のために、全膵臓を摘出した（以下を参照されたい）。
【０１５９】
免疫蛍光及び免疫組織化学分析：成体マウスの膵臓組織を、４％パラホルムアルデヒド−１％グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝液に４℃で一晩浸漬することにより固定し、その後クリオスタット切片作製のためにＴｉｓｓｕｅｓ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ化合物を用いて埋め込んだ。以下の一次抗体：すなわち、抗−ソマトスタチン（Ｇ−１０）、抗−Ｋｉ−６７（Ｍ−１９）、抗−グルカゴン（Ｋ７９ｂＢ１０）及び抗−インスリンＡ（Ｃ−１２）、抗体及び対照ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。増殖試験のために、膵臓組織を、Ｋｉ６７（Ｍ−１９）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はラットモノクローナルＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）のいずれかを用いて染色した。抗原賦活は、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵについて、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で１０分間、次いで室温で３０分間冷却することにより実施した。核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて対比染色した。使用される蛍光二次抗体としては、ロバ抗−ヤギフルオレセイン、ヤギ抗−マウスフルオレセイン、ヤギ抗−ウサギＴｅｘａｓ  ｒｅｄ、及びロバ抗ヤギＴｅｘａｓ  ｒｅｄ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。ベータ細胞の面積とは、インスリン免疫染色について陽性に染色された細胞の表面積を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ−１０００レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて走査した全膵臓の表面積で割ったものを意味する。インスリン陽性の表面積及び全膵臓の表面積は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて定量した。ベータ細胞の質量は、膵臓の湿重量を乗じたベータ細胞表面積として計算した。一条件あたり、少なくとも３匹のマウスを分析した。レンチウイルス注入の２日目及び１４日目に、炎症（膵炎）の証拠を探すために、膵臓組織をＨ＆Ｅを用いて染色した。
【０１６０】
ウェスタンブロット：ウェスタンブロットについては、等量のタンパク質を１０及び１５％  ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、膜を、５％脱脂乳の０．１％  ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０溶液でブロッキングし、Ｐｄｘ−１に対する特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰＴＰ１Ｂ（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、グルコキナーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及びＧＡＰＤＨ（Ｇ９５４５，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて精査した。次いで、膜をＨＲＰを結合した二次抗体（ＮＡ９３４）で培養し、化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて発色させた。
【０１６１】
統計分析：結果を平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表わす。統計比較は、適切な場合スチューデントの独立ｔ検定又は一元配置分散分析法により実施した。結果は、ｐ＜０．０５の場合に、統計的に有意であると判断した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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