(57)【要約】【課題】ＨＭＢＣａのもつ筋肉増強効果や筋肉疲労回復効果を向上させた経口組成物を提供すること。【解決手段】３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウムと、ビタミンＤと、グルコースとを含有する経口組成物である。【選択図】図１
2018172301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウムと、ビタミンＤと、グルコースとを含有することを特徴とする経口組成物。
【請求項２】
筋肉の増強に用いられる筋肉増強用であることを特徴とする請求項１記載の経口組成物。
【請求項３】
筋肉の疲労回復に用いられる筋肉疲労回復用であることを特徴とする請求項１又は２記載の経口組成物。
【請求項４】
チュアブルタブレットであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（ＨＭＢＣａ）を含む経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（ＨＭＢ）は、必須アミノ酸であるロイシンの代謝生成物であり、筋肉の合成促進や分解抑制にかかわっていることが知られている。しかしながら、体内でのＨＭＢ生成量は非常に少ないため、このＨＭＢをサプリメント等として摂取する試みがなされている。
【０００３】
このようなサプリメントに関し、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（ＨＭＢＣａ）及び結晶セルロースを含有する錠剤が提案されている（特許文献１参照）。この特許文献１では、結晶セルロースを用いることにより打錠性を改善し、表面に凹凸のない錠剤を得ている。
【０００４】
また、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（ＨＭＢＣａ）の味及び臭いを改善するために、アミノ糖を用いることが提案されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５‐２１８１５８号公報
【特許文献２】特開２０１６‐８８８４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、ＨＭＢＣａに関する種々の検討はなされているが、筋肉増強や筋肉疲労回復といったＨＭＢＣａのもつ効果そのもののさらなる向上については、あまり検討されていない。
【０００７】
本発明の課題は、ＨＭＢＣａのもつ筋肉増強効果や筋肉疲労回復効果を向上させた経口組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＭＢＣａと共に、ビタミンＤ及びグルコースを用いることにより、ＨＭＢＣａのもつ筋肉増強効果や筋肉疲労回復効果を向上させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウムと、ビタミンＤと、グルコースとを含有することを特徴とする経口組成物。
［２］筋肉の増強に用いられる筋肉増強用であることを特徴とする［１］記載の経口組成物。
［３］筋肉の疲労回復に用いられる筋肉疲労回復用であることを特徴とする［１］又は［２］記載の経口組成物。
［４］チュアブルタブレットであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか記載の経口組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、筋肉増強効果及び／又は筋肉疲労回復効果（筋肉疲労改善効果）が非常に高い経口組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の組成物を適用した場合のＭｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子（ｍｙｏｇ）のｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す図である。
【図２】本発明の組成物を適用した場合の筋管細胞の賦活作用の評価結果を示す図である。
【図３】本発明の組成物を適用した場合のダメージを与えた筋芽細胞の細胞生存率の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の経口組成物は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（ＨＭＢＣａ）と、ビタミンＤと、グルコースとを含有することを特徴とする。
【００１３】
ＨＭＢＣａと共に、ビタミンＤ及びグルコースを用いることにより、ＨＭＢＣａのもつ効果を向上させることができる。すなわち、本発明の経口組成物は、ＨＭＢＣａのもつ筋肉増強効果や筋肉疲労回復効果を向上させることができ、シェイプアップや、スポーツ選手の筋肉増強、病後の筋力回復、高齢者の寝たきり防止、運動時の筋肉ダメージの抑制、運動後の筋肉疲労回復、基礎代謝の向上等に用いることができる。
【００１４】
［３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（ＨＭＢＣａ）］
本発明の経口組成物におけるＨＭＢＣａは、公知の方法により合成したものや、市販品を用いることができる。市販品としては、食品に適用可能なものであれば限定されない。
【００１５】
［ビタミンＤ］
本発明の経口組成物におけるビタミンＤは、脂溶性ビタミンの１種であり、植物由来であっても、動物由来であっても、合成品であってもよい。ビタミンＤとしては、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、これらの誘導体が挙げられ、ビタミンＤ３が特に好ましい。一般的に、ビタミンＤ２は植物（植物性食品）に多く含まれ、ビタミンＤ３は動物（動物性食品）に多く含まれる。
【００１６】
［グルコース］
本発明の経口組成物におけるグルコースは、Ｌ−グルコースでも、Ｄ−グルコースでもよいが、Ｄ−グルコース（ブドウ糖）が好ましい。ブドウ糖としては、無水結晶ブドウ糖、含水結晶ブドウ糖、精製ブドウ糖、液状ブドウ糖が挙げられ、デンプンを原料とした酸糖化法や酵素糖化法などによって得ることができる。本発明においては、市販のグルコースを用いることができる。
【００１７】
［その他の成分］
本発明の経口組成物は、必要に応じて、経口用として許容される上記成分以外の他の成分を含有してもよい。このような他の成分としては、例えば、水溶性ビタミン（ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１５、Ｂ１７、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ＰＡＢＡ、ビタミンＣ、ビタミンＰ）、油溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ）等のビタミン類；カルシウム、マグネシウム、リン、鉄等のミネラル類；タウリン、ニンニク等に含まれる含硫化合物；ヘスペリジン、ケルセチン等のフラバノイド或いはフラボノイド類；コラーゲン等のタンパク質；ペプチド；アミノ酸；動物性油脂；植物性油脂；動物・植物の粉砕物又は抽出物等を挙げることができる。
【００１８】
本発明の経口組成物は、例えば、一般的な食品や、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の所定機関より効能の表示が認められた機能性食品などのいわゆる健康食品や、医薬品（医薬部外品を含む）等として用いることができる。
【００１９】
本発明の経口組成物は、筋肉増強及び／又は筋肉疲労回復に用いることができる。かかる筋肉増強用経口組成物や筋肉疲労回復用経口組成物は、ＨＭＢＣａ、ビタミンＤ、及びグルコースを含有し、筋肉増強及び／又は筋肉疲労回復に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができる物であれば特に制限されるものではない。例えば、本発明に係る製品の本体、包装、説明書、宣伝物のいずれかに筋肉増強効果及び／又は筋肉疲労回復効果がある旨を表示したものが本発明の権利範囲に含まれる。例えば、「筋肉増強」「シェイプアップ」「筋肉疲労回復」「筋肉疲労改善」「寝たきり予防」「寝たきり防止」等の筋肉増強及び／又は筋肉疲労回復効果を有する旨を表示したものを例示することができる。
【００２０】
なお、本発明の筋肉増強用経口組成物や筋肉疲労回復用経口組成物は、製品の包装等に、本発明における組合せの成分（ＨＭＢＣａ、ビタミンＤ、及びグルコース）が、筋肉増強及び／又は筋肉疲労回復の有効成分として表示されているものに限られない。例えば、有効成分を特定していないものであってもよい。また、ＨＭＢＣａのみを有効成分として表示したものであってもよい。
【００２１】
本発明の経口組成物は、賦形剤等の添加剤を必要に応じて添加して、公知の方法によって製造することができる。
【００２２】
本発明の経口組成物の形態としては、例えば、錠状、固形状、丸状、チュアブル状等を挙げることができる。
【００２３】
本発明の経口組成物は、摂取し易いチュアブル状の形態が好ましい。これは、運動前後、運動中などに水などがなくとも手軽に飲用することができる。
【００２４】
本発明の経口組成物におけるＨＭＢＣａ、ビタミンＤ、及びグルコース（本発明の成分）の含有量としては、その効果の奏する範囲で適宜含有させればよい。
【００２５】
一般的には、本発明の経口組成物が錠状、チュアブル状等のサプリメントや医薬品の場合には、本発明の成分が乾燥質量換算で全体の３０〜９０質量％含まれていることが好ましく、４０〜８５質量％含まれていることがより好ましく、５０〜８０質量％含まれていることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明の経口組成物におけるＨＭＢＣａと、ビタミンＤとの配合質量比としては、乾燥質量換算で、１：０．０００１〜１：０．３の範囲であることが好ましく、１：０．００１〜１：０．２の範囲であることがより好ましく、１：０．０１〜１：０．１の範囲であることがさらに好ましい。
【００２７】
本発明の経口組成物におけるＨＭＢＣａと、グルコースとの配合質量比としては、乾燥質量換算で、１：０．５〜１：５．０の範囲であることが好ましく、１：１．５〜１：４．５の範囲であることがより好ましく、１：２．０〜１：３．０の範囲であることがさらに好ましい。
【００２８】
本発明の経口組成物の摂取量としては特に制限はないが、本発明の効果をより顕著に発揮させる観点から、成人の１日当たり、ＨＭＢＣａ摂取量が、５００ｍｇ／日以上となるように摂取することが好ましく、１０００ｍｇ／日以上となるように摂取することがより好ましく、１５００ｍｇ／日以上となるように摂取することがさらに好ましい。その上限は、例えば、５０００ｍｇ／日であり、好ましくは３０００ｍｇ／日である。本発明の経口組成物を摂取する対象としては、筋肉の増強や疲労回復を必要とする人であれば特に限定されないが、シェイプアップを目的とする人や、スポーツ選手や、足腰の弱った高齢者等を好ましく例示することができる。
【００２９】
本発明の経口組成物は、１日の摂取量が前記摂取量となるように、１つの容器に、又は例えば２〜３の複数の容器に分けて、１日分として収容することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づき説明する。
［実施例１］
試験１：筋芽細胞を用いた筋分化促進作用の評価
【００３１】
（１）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、７５ｃｍ２フラスコを用いて、マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて培養した。
（２）トリプシン処理により浮遊させた細胞を、７５ｃｍ２フラスコからコラーゲンコートした９６ウェルプレートの各ウェルに１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。以下、ＤＭＥＭはグルコース濃度１０００ｍｇ／Ｌのものを用いた。
（３）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間前培養した。
【００３２】
（４）１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで所定濃度（下記表１）に調整したサンプルを２００μＬずつ添加し、２４時間培養した。
（５）２４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
（６）得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子（Ｍｙｏｇ）に対するプライマー（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）により定量リアルタイムＰＣＲを行い、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨプライマー（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を測定した。
【００３３】
各サンプルは、以下に示す方法で調製した。
ビタミンＤ３は、エタノールに溶解後、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈して、エタノール終濃度が０．１％（Ｖ／Ｖ）となるように調製し、フィルター滅菌した。その他の被験物質は、０．１％（Ｖ／Ｖ）エタノール及び１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに溶解後、フィルター滅菌した。
これらの各被験物質を含む溶液を０．１％（Ｖ／Ｖ）エタノール及び１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて各被験物質が下記表１に示す濃度となるように調製した。なお、コントロールには、０．１％（Ｖ／Ｖ）エタノール及び１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加した。
【００３４】
【表１】
2018172301.tif 000003
【００３５】
図１に、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す。Ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子は、筋芽細胞が骨格筋に分化する際に働く遺伝子であり、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、骨格筋の分化の指標となる。数値は、高いほどＭｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が高いことを示す。
【００３６】
図１に示すように、ＨＭＢＣａにビタミンＤ３及びグルコースを添加した場合（実施例１及び２）、ビタミンＤ３のみの添加（比較例１）やビタミンＤ３及びスクロース添加（比較例２）の場合に比べて、高いＭｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示した。また、実施例２及び比較例２に示すように、グルコースに代えてスクロースを用いても効果は低く、本発明の特定の組合せの場合に、特に優れた効果を発揮することがわかる。これらの結果より、本発明の組成物は、骨格筋分化を効果的に促進させ、骨格筋をより有効に増強することができると考えられる。
【００３７】
試験２：筋管細胞を用いた細胞賦活作用の評価
（１）マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）（理化学研究所バイオリソースセンター製）を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地により培養を行った。
（２）コラーゲンコート（東洋紡製）した９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに１２０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種し２４時間前培養した。
（３）各ｗｅｌｌより培地を除去後、２％ＨＳ-ＤＭＥＭを２００μＬ添加し７２時間培養した。
（４）各ｗｅｌｌより培地を除去後、２％ＨＳ-ＤＭＥＭを２００μＬ添加しさらに４８時間培養した。これら一連の処理により、単核細胞である筋芽細胞は融合して、多核細胞である筋管細胞へと分化する。
【００３８】
（５）各ｗｅｌｌより培地を除去後、フィルターをしたＫｒｅｂｓ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＲＰ ｂｕｆｆｅｒ）２００μＬで１度各ｗｅｌｌを洗った。
（６）洗浄後、ＫＲＰ ｂｕｆｆｅｒで所定の濃度（下記表２）に調整したサンプルを２００μＬ添加し、１６時間培養した。各サンプルは、試験１と同様に調製した。コントロールについても、試験１と同様である。
（７）培養後Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ-８（同仁化学研究所製）を用いて筋管細胞の賦活活性を測定した。
【００３９】
【表２】
2018172301.tif 000004
【００４０】
図２に、筋管細胞の賦活作用の評価結果を示す。数値は、高いほど筋管細胞の賦活作用が高いことを示す。筋肉は、筋管細胞から、収縮能を持つ筋繊維を形成する段階を経て完成することから、筋管細胞を賦活することで骨格筋を増強することができると考えられる。
【００４１】
図２に示すように、ＨＭＢＣａにビタミンＤ３及びグルコースを添加した場合（実施例３及び４）、ビタミンＤ３のみの添加（比較例３）やビタミンＤ３及びスクロース添加（比較例４）の場合に比べて、高い賦活作用を示した。また、実施例４及び比較例４に示すように、グルコースに代えてスクロースを用いても効果は低く、本発明の特定の組合せの場合に、特に優れた効果を発揮することがわかる。これらの結果より、本発明の組成物は、筋管細胞を効果的に賦活させ、骨格筋をより有効に増強することができると考えられる。
【００４２】
試験１及び試験２の結果より、本発明の組成物は、筋芽細胞の分化を効果的に促進し、かつ、筋芽細胞から分化した筋管細胞を効果的に賦活することができることから、骨格筋を極めて有効に増強することができると考えられる。
【００４３】
試験３：筋芽細胞を用いた筋疲労（損傷）の防止・回復効果の評価
（１）マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）（理化学研究所バイオリソースセンター製）を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地により培養を行った。
（２）コラーゲンコート（東洋紡製）した９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに８０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで播種し２４時間前培養した。
（３）各ｗｅｌｌより培地を除去後、１０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭで所定濃度（下記表３）に調整したサンプルを１５０μＬ添加し２４時間培養した。各サンプルは、試験１と同様に調製した。コントロールについても、試験１と同様である。
（４）培養後、１０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭで１００μｇ／ｍｌに調製したニトロプルシドナトリウムを５０μＬ添加し、２４時間培養した。なお、この工程においては、ニトロプルシドナトリウムの添加により細胞死を誘発した。
（５）培養後Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて筋芽細胞の生存率を測定した。
【００４４】
【表３】
2018172301.tif 000005
【００４５】
図３に、ダメージを与えた筋芽細胞の細胞生存率の評価結果を示す。数値は、高いほど筋芽細胞の細胞生存率（保護作用）が高いことを示す。
【００４６】
図３に示すように、ＨＭＢＣａにビタミンＤ３及びグルコースを添加した場合（実施例５及び６）、ビタミンＤ３のみの添加（比較例５）やビタミンＤ３及びスクロース添加（比較例６）の場合に比べて、高い細胞生存率（保護作用）を示した。また、実施例６及び比較例６に示すように、グルコースに代えてスクロースを用いても効果は低く、本発明の特定の組合せの場合に、特に優れた効果を発揮する。これらの結果より、本発明の組成物は、筋芽細胞を効果的に保護し、筋肉疲労（損傷）を防止・回復することができると考えられる。
【００４７】
以上の結果より、本発明の組成物は、骨格筋を極めて有効に増強することができる（試験１及び試験２）と共に、筋芽細胞を効果的に保護し、筋肉疲労（損傷）を防止・回復することができる（試験３）と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の経口組成物は、高い筋肉増強効果及び／又は筋肉疲労回復効果を有することから、本発明の産業上の有用性は高い。
【図１】
2018172301.tif 000006
【図２】
2018172301.tif 000007
【図３】
2018172301.tif 000008