(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫を惹起することなく、効果的な抗腫瘍免疫および殺菌免疫を得るための実行可能な治療戦略に用いることが出来る抗体の提供。【解決手段】制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を阻害するまたはその安定性を低下させることによって対象における癌または感染症を治療するために用いられる、制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害する抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を阻害するまたはその安定性を低下させることによって対象における癌または感染症を治療するために用いられる、制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害する抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記対象における免疫ホメオスタシスを維持しつつ前記制御性Ｔ細胞の機能を阻害するまたはその安定性を低下させる、請求項１記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
制御性Ｔ細胞の機能を阻害するまたはその安定性を低下させることによって対象におけるワクチンの効果を高めるために用いられる、制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害する抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
免疫ホメオスタシスを維持しつつ対象における前記ワクチンの効果が高められる、請求項３に記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ワクチンが、癌または感染症の治療または予防のためのものであり、前記抗体またはフラグメントが前記ワクチンが投与される前または前記ワクチンとともに前記対象に投与される、請求項３または４に記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害し、かつＴｒｅｇ生存性および／または安定性を低下することができる、抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体が、インビボにおいて免疫ホメオスタシスを変化させない、請求項７記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記セマフォリンが、セマフォリンを発現している細胞上の膜貫通型セマフォリンであり、任意選択でクラスＩＶ膜貫通型セマフォリンまたはセマフォリン−４ａである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン−１：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）相互作用に影響しない、請求項１〜９のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン−１：クラスＩＩＩセマフォリン相互作用に影響を与えない、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記セマフォリンが、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）により発現される、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体が、モノクロナール抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象に投与した時ニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害するのに有効な量で含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべてについてその全体を本明細書に援用する２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８４，６０７号明細書、２０１２年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／７１２，６７９号明細書、および２０１２年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６１／７１１，１９３号明細書の利益を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
米国政府は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からのＧｒａｎｔ  Ｎｏｓ．ＡＩ０９１９７７、ＡＩ０３９４８０およびＡＩ０９８３８３、ならびにＮＣＩ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ＣＯＲＥ助成金ＣＡ２１７６５から準備された資金に基づき、本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ニューロピリン１：セマフォリン軸（Neuropilin-1:Semaphorin axis）を介して制御性Ｔ細胞の安定性および機能に影響を与えることによる、癌、感染症ならびに様々な炎症状態および自己免疫状態の処置を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己免疫の予防、免疫病変の抑制および免疫ホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしている１。一方で、Ｔｒｅｇは慢性ウイルス感染に対する効果的な抗腫瘍免疫および殺菌免疫（sterilizing immunity）の大きな障害にもなる。このことから、広範囲に及ぶ免疫反応を形成および制御するＴｒｅｇの能力が浮き彫りになる。Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの発生、維持および安定性に必要なマスター転写制御因子である２，３。非機能的Ｆｏｘｐ３を有するマウスおよびヒトでは、Ｔｒｅｇが欠如して、マウスのＳｃｕｒｆｙと呼ばれる致死性全身性自己免疫状態、およびヒトのＩＰＥＸが発症することから、免疫ホメオスタシスの維持におけるＴｒｅｇの重要性が明らかになる２，３。さらに、５つの転写因子（transcription factor quintet）は、Ｔｒｅｇの転写シグニチャーを「ロックインし（lock-in）」、その安定性を強化する冗長性遺伝子スイッチ(redundant genetic switch)を形成する４。一部の外的因子、たとえばトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）が、Ｆｏｘｐ３の安定性および機能を維持および／または強化することが示されているが５、別の細胞外因性経路または因子が存在するかどうかは、不明である。
【０００４】
組織常在性Ｔｒｅｇは、感染または炎症反応に応答し、それにより免疫性病変を抑制する最初のリンパ系細胞の一部である６，７。一部の環境、たとえば腫瘍および慢性感染症は、高度炎症性である場合があり、したがって意図されない炎症または自己免疫疾患を限定することを目的として、Ｔｒｅｇの安定性および機能を強化するための追加のメカニズムまたは遺伝的プログラムを必要とすることがある。その結果、多くの免疫性疾患はＴｒｅｇ機能の悪化あるいは限定を特徴とし、診療所では種々の疾患の処置のためＴｒｅｇの養子移入が積極的に進められているので、Ｔｒｅｇの安定性および機能を制御する分子経路の特定には大きな関心が払われている。
【０００５】
Ｔｒｅｇの安定性と可塑性は、最近かなり議論の的になっている。一部の研究では、系譜特異的転写因子、たとえばＴ−ｂｅｔ、ＩＲＦ４およびＳＴＡＴ３により誘導される特定タイプのＴ細胞応答の制御において同転写因子の決定的な役割が定義されてきた８−１０。一方、他の研究では、実証可能な割合のＴｒｅｇが炎症部位において「ｅｘ−Ｔｒｅｇ」に分化し、エフェクター機能を獲得することが示唆されてきた１１。Ｔｒｅｇがその転写プロファイルを変化させて、その安定性を維持し、炎症部位の免疫を調節し、その別の細胞運命を制御する細胞外因性因子および分子機構は、依然として不明である。
【０００６】
ニューロピリン１（Ｎｒｐ１；たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００８７３７（マウス）およびＮＧ＿０３０３２８（ヒト）のほか、様々なアイソフォームを参照されたい）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびクラスＩＩＩセマフォリンＳｅｍａ３ａの両方に対してチロシンキナーゼ受容体の膜結合型共受容体である。Ｎｒｐ１は、軸索ガイダンス、血管新生、細胞生存、遊走および浸潤において多岐にわたる役割を果たす１５。Ｎｒｐ１は、軸索成長円錐の崩壊を誘導し、特権を有する組織への浸潤を防ぐものであり、マウスでその遺伝子を欠損させると、胚性致死が引き起こされる１６。Ｎｒｐ１は、血小板由来増殖因子β（ＰＤＧＦβ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）と相互作用することも示されている１７，１８。Ｎｒｐ１は、Ｔｒｅｇに高発現することが示されている１９−２１。Ｔ細胞におけるＮｒｐ１の役割は示唆されてきたが２２、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１の役割は特定されておらず、Ｎｒｐ１はヒトＴｒｅｇに発現しないことが示唆されてきた２５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
背景技術のセクションに記載したように、当該技術分野において、Ｔｒｅｇの安定性および機能を制御する分子経路を特定し、その知識を癌、感染症および様々な炎症状態および自己免疫状態を処置するための新規な治療剤の開発に使用することが強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により捕捉された(Treg-restricted)ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）が、（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）上、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）上および／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上の）細胞表面リガンドセマフォリン−４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）と相互作用してＴｒｅｇ機能を増強し、炎症部位でのその生存を強化することを立証することにより、こうした必要性および他の必要性を満たすものである。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を阻害するまたはその安定性を低下させる方法であって、前記Ｔｒｅｇにおいて前記Ｔｒｅｇをニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の阻害剤に曝露することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリンなど、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）を発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のそうした膜貫通型セマフォリンと、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を阻害する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない。一実施形態では、前記Ｔｒｅｇは被検体（たとえば、ヒト）内にあり、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤を被検体に投与する。一実施形態では、被検体は癌（たとえば、メラノーマまたは膠芽細胞腫）を有する。もう１つの実施形態では、被検体は、Ｔｒｅｇが殺菌免疫を阻止する感染症（たとえば、慢性感染症）を有する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体（たとえば、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない抗体）である。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、セマフォリン分子（たとえば、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質［たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ］またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログ［たとえば、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインなど様々な融合分子を含む］であり、前記可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に高い親和性および特異性で、前記ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく結合することができる）。なおもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、Ｎｒｐ１タンパク質の前記可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）に高い親和性および特異性で結合し、それにより前記膜貫通型セマフォリンが前記ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強するのを防止することができる。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する（たとえば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである）。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡ（Ｃ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフ）を含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインとＰＴＥＮタンパク質との間のシグナル伝達経路を阻害する。こうした阻害剤は、たとえば、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡを含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインの全部または一部を含むＮｒｐ１タンパク質のペプチドもしくは小分子もしくはフラグメントまたはその誘導体もしくはアナログであってもよい。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を強化するまたはその安定性を増加させる方法であって、前記Ｔｒｅｇにおいて前記Ｔｒｅｇをニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸のアゴニストに曝露することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）を発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のそうした膜貫通型セマフォリンとＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を強化する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストはインビトロでＴｒｅｇに投与される。一実施形態では、Ｔｒｅｇは被検体（たとえば、ヒト）から抽出され、Ｎｒｐ１−セマフォリン相互作用のアゴニストの存在下、エキソビボで増幅され、次いで（ｉ）被検体に再導入されるか、あるいは（ｉｉ）別の被検体に投与される。一実施形態では、増幅したＴｒｅｇを投与される被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する。もう１つの実施形態では、Ｔｒｅｇは被検体（たとえば、ヒト）内にあり、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストを被検体に投与する。一実施形態では、被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、セマフォリン分子（たとえば、多量体セマフォリン分子および／または表面またはビーズ上に固定化されたセマフォリン分子）である。一実施形態では、セマフォリン分子は、クラスＩＶセマフォリン（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログである。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは抗体である。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは小分子である。なおもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、Ｔｒｅｇ内のＮｒｐ１発現を高める。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、Ｎｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を高める。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする被検体（たとえば、ヒト）の疾患を処置する方法であって、被検体の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においてニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸を阻害すること含む方法を提供する。一実施形態では、本方法は、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）を発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のそうした膜貫通型セマフォリンと、被検体のＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を阻害することを含む。一実施形態では、疾患は癌（たとえば、メラノーマまたは膠芽細胞腫）である。もう１つの実施形態では、疾患はＴｒｅｇが殺菌免疫を阻止する感染症（たとえば、慢性感染症）である。一実施形態では、本方法は、被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の治療有効量の阻害剤を被検体に投与することを含む。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体（たとえば、被検体のＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない抗体）である。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、セマフォリン分子である（たとえば、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質［たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ］またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログ［たとえば、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインなど様々な融合分子を含む］であり、前記可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく、高い親和性および特異性で結合することができる）。なおもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、Ｎｒｐ１タンパク質の前記可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）に高い親和性および特異性で結合し、それにより前記膜貫通型セマフォリンが被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強するのを防止することができる。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する（たとえば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである）。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡ（Ｃ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフ）を含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインとＰＴＥＮタンパク質との間のシグナル伝達経路を阻害する。こうした阻害剤は、たとえば、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡを含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインの全部または一部を含むＮｒｐ１タンパク質のペプチドもしくは小分子もしくはフラグメントまたはその誘導体もしくはアナログであってもよい。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である。もう１つの実施形態では、本方法は、追加の免疫調節治療薬（たとえば、治療ワクチン、チェックポイント阻害剤またはアクチベーター）を被検体に投与することをさらに含む。なおもう１つの実施形態では、本方法は被検体に化学療法または放射線療法（癌の処置のため）を行うこと、または抗生物質（感染症の処置のため）を投与することをさらに含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする被検体（たとえば、ヒト）の疾患を処置する方法であって、被検体の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においてニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸を活性化することを含む方法を提供する。一実施形態では、本方法は、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）を発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のそうした膜貫通型セマフォリンと、被検体のＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を高めることを含む。一実施形態では、被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する。一実施形態では、本方法は、被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の治療有効量のアゴニストを被検体に投与することを含む。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、セマフォリン分子（たとえば、多量体セマフォリン分子および／または表面またはビーズ上に固定化されたセマフォリン分子）である。一実施形態では、セマフォリン分子は、クラスＩＶセマフォリン（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログである。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは抗体である。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは小分子である。なおもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、被検体のＴｒｅｇ内のＮｒｐ１発現を高める。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、Ｎｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を高める。もう１つの実施形態では、本方法は、Ｔｒｅｇを強化するまたは炎症を阻止する別の治療を被検体に行うことをさらに含む。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、被検体（たとえば、ヒト）におけるワクチン（たとえば、癌または感染症の処置用または予防用のワクチン）の有効性を高める方法であって、被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の有効量の阻害剤を被検体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体（たとえば、被検体のＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない抗体）である。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、セマフォリン分子である（たとえば、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質［たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ］またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログ［たとえば、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインなど様々な融合分子を含む］であり、前記可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく、高い親和性および特異性で結合することができる）。なおもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、Ｎｒｐ１タンパク質の前記可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）に高い親和性および特異性で結合し、それにより前記膜貫通型セマフォリンが被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強するのを防止することができる。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する（たとえば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである）。さらなる実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡ（Ｃ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフ）を含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインとＰＴＥＮタンパク質との間のシグナル伝達経路を阻害する。こうした阻害剤は、たとえば、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡを含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインの全部または一部を含むＮｒｐ１タンパク質のペプチドもしくは小分子もしくはフラグメントまたはその誘導体もしくはアナログであってもよい。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である。本方法の一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤を、ワクチンを被検体に投与する前に被検体に投与する。本方法のもう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤をワクチンと一緒に被検体に投与する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上のニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン（たとえば、クラスＩＶセマフォリン、たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）相互作用を阻害する単離された抗体を提供する。
【００１５】
本発明の前述および他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲および図面において当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｅから、セマフォリン４ａが制御性Ｔ細胞の機能を増強することが立証される。図１Ａは、上部ウェルにおいて表記の細胞型の存在下で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激したとき、下部ウェルにおいて抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズで刺激したＴｃｏｎｖのトランスウェル抑制アッセイ（Transwell suppression assay）を示す。一部の条件では、Ｔｒｅｇ刺激の前に共培養細胞集団を固定した。図１Ｂは、セマフォリン−４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）に対する中和抗体を加えたトランスウェル抑制アッセイを示す。図１Ｃは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔｃｏｎｖに、スクランブルドｓｉＲＮＡもしくはＳｅｍａ４ａ  ｓｉＲＮＡをモックトランスフェクトまたはトランスフェクトし、次いでトランスウェル抑制アッセイにおいてブースト能力を評価した。図１Ｄは、上部ウェルにおいてＴｒｅｇの単独培養物を、マウスＩｇＧ１またはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇでコートしたビーズで刺激したトランスウェル抑制アッセイを示す。図１Ｅは、エキソビボで直接選別した固定した樹状細胞のほか、セマフォリン−４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）に対する中和抗体を加えたトランスウェル抑制アッセイを示す。結果は、５回［Ａ、Ｄ］または３回［Ｂ、Ｃ、Ｅ］の実験の平均を表す。対応のないｔ検定により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｉから、Ｎｒｐ１がＴｒｅｇ上でセマフォリン−４ａのリガンドとして作用することが立証される。図２Ａは、Ｔｃｏｎｖ：Ｔｒｅｇ共培養物を中和抗Ｎｒｐ１抗体またはそのアイソタイプコントロールの存在下で刺激したトランスウェル抑制アッセイを示す。図２Ｂは、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを用いたトランスウェル抑制アッセイを示す。図２Ｃは、上部ウェルのＷＴ、ＩＬ−１０−／−またはＥｂｉ３−／−Ｔｒｅｇを、下部ウェルのＳｅｍａ４ａ−ＩｇビーズおよびＷＴまたはｄｎＴＧＦｂＲＩＩ  Ｔｃｏｎｖと共培養して用いたトランスウェル抑制アッセイを示す。図２Ｄは、ＩＬ−１０およびＩＬ−３５に対する中和抗体の存在下または非存在下でＳｅｍａ４ａ−Ｉｇビーズと培養したＴｒｅｇを用いたトランスウェル抑制アッセイを示す。図２Ｅは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コートビーズ、ＩＬ−２、およびアイソタイプ(Iso)あるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇコートビーズで刺激してから４８時間後のＴｒｅｇにおける、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色のフローサイトメトリー解析を集計したものである。図２Ｆは、臍帯血から選別し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ−２と表記の期間培養したヒトＴｃｏｎｖまたはＴｒｅｇ細胞上のＮＲＰ−１発現を示す。図２Ｇは、８日間増幅したヒトＴｒｅｇを、ＮＲＰ１に対する遮断抗体の存在下または非存在下、ＩｇＧもしくはｈＳｅｍａ４ａ−Ｉｇコートビーズ、あるいは固定した自家ヒトＴｅｆｆと培養したトランスウェル抑制アッセイを示す。結果は、３回［Ａ、Ｄ〜Ｆ、Ｈ、Ｉ］または５回［Ｂ、Ｃ、Ｇ］の実験の平均を表す。対応のないｔ検定により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図２−２】図２−１の続き。図２Ｈは、組換えｍＮｒｐ１でコートしたプレートを、アイソタイプコントロール、抗Ｎｒｐ１または抗Ｓｅｍａ４ａの存在下、Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはマウスＩｇＧ１とインキュベートした、ＥＬＩＳＡを用いた結合アッセイを示す。Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはマウスＩｇＧ１は、抗アイソタイプ抗体を用いて検出した。図２Ｉは、中和抗Ｎｒｐ１抗体またはそのアイソタイプコントロールの存在下、Ｔｃｏｎｖ：Ｔｒｅｇ共培養物を刺激したトランスウェル抑制アッセイを示す。結果は、３回［Ａ、Ｄ〜Ｆ、Ｈ、Ｉ］または５回［Ｂ、Ｃ、Ｇ］の実験の平均を表す。対応のないｔ検定により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図３】図３Ａ〜３Ｃから、Ｎｒｐ１欠乏ＴｒｅｇがＦｏｘｐ３欠乏動物の自己免疫疾患を予防することが立証される。図３Ａは、注射を投与しない、あるいは１×１０６Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを１〜２日齢で投与したＦｏｘｐ３−雄マウスの生存曲線を示す。図３Ｂは、Ａと同様に処置したマウスの５週目の臨床スコアを示す。図３Ｃは、Ａと同様に処置したマウス由来の肝臓、肺および耳介（合算）の組織学的スコアを示す。結果は、３回の独立した実験を表す。１元配置分散分析により＊＊はｐ＜０．０１［Ａ］、対応のないｔ検定により＊＊はｐ＜０．００１［Ｂ〜Ｃ］、ｎｓは有意差なし、ｐ＞０．０５である。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｊから、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇが抗腫瘍反応または高度炎症性大腸炎を抑制できないことが立証される。図４Ａは、１．２５×１０５ＭＣ３８メラノーマ細胞をｓ．ｃ．投与したＦｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスの腫瘍増殖曲線（上）および生存率プロット（下）を示す。図４Ｂは、マウスに１．２５×１０５ＥＬ４胸腺腫をｉ．ｄ．投与した以外は図４Ａと同様である。図４Ｃは、マウスに１．２５×１０５Ｂ１６メラノーマをｉ．ｄ．投与した以外は図４Ａと同様である。図４Ｄは、１７〜２０日前に２．５〜１０×１０５Ｂ１６細胞をｉ．ｖ．注射したＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスの肺転移数を示す。図４Ｅは、１８日前にＢ１６をｉ．ｄ．注射したＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウス由来の腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリー解析を表にしたものである。図４Ｆは、１．２５×１０５Ｂ１６メラノーマをｉ．ｄ．投与したＣ５７／ＢＬ６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。腫瘍が触知可能になったとき（５日目、矢印で示す）、マウスに抗Ｎｒｐ１またはそのアイソタイプコントロールの注射の投与を開始した（初回量４００μｇ、３日ごとに２００μｇ）。図４Ｇは、大腸炎を誘導するため４×１０５ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ＋ＣＤ２５−細胞を投与しあるいは投与せず、次いで大腸炎の検出後ＰＢＳ、またはＦｏｘｐ３ＣｒｅもしくはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウス由来の１×１０６Ｔｒｅｇを投与したＲａｇ２−／−マウスの大腸の組織像を示す。結果は、５回（Ａ〜Ｃ、Ｉ〜Ｊ  ｎ＝マウス１０〜２５匹）、３回（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ  ｎ＝マウス８〜１７匹）または４回（Ｇ）の実験の平均を表す。１元配置分散分析（Ａ〜Ｃ、Ｉ〜Ｊ）または対応のないｔ検定（Ｄ〜Ｆ、Ｈ）により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図４−２】図４−１の続き。図４Ｈは、ｎｄＬＮ、ｄＬＮまたはＴＩＬにおける様々な免疫細胞のＳｅｍａ４ａ発現を示す。図４Ｉは、週２回アイソタイプコントロール、抗Ｓｅｍａ４ａまたは抗Ｎｒｐ１（１００μｇ）の注射と同時に１．２５×１０５Ｂ１６メラノーマをｉ．ｄ．投与したＣ５７／ＢＬ６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。図４Ｊは、マウスにＳｅｍａ４ａ−Ｉｇを週２回投与した以外はｇと同様の腫瘍増殖曲線を示す。結果は、５回（Ａ〜Ｃ、Ｉ〜Ｊ  ｎ＝マウス１０〜２５匹）、３回（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ  ｎ＝マウス８〜１７匹）または４回（Ｇ）の実験の平均を表す。１元配置分散分析（Ａ〜Ｃ、Ｉ〜Ｊ）または対応のないｔ検定（Ｄ〜Ｆ、Ｈ）により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図５】図５Ａ〜５Ｄから、Ｓｅｍａ４ａによるＮｒｐ１のライゲーションが、Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル伝達の調節を介してＴｒｅｇの安定性を促進することが立証される。図５Ａは、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇにおけるＡｋｔシグナル伝達のフローサイトメトリー解析を示す。フローサイトメトリーにより精製されたＴｒｅｇを休止状態で放置するか、またはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇもしくはアイソタイプコントロールでコートしたビーズの存在下、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで一晩刺激した。図５Ｂは、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇの抗ＴＣＲの存在下または非存在下、抗体でコートした脂質二重層で２０分刺激したＴｒｅｇの免疫シナプス（ＩＳ）におけるＡｋｔ活性化のＴＩＲＦ顕微解析を示す。図５Ｃは、ＰＭＡおよびイオノマイシンで３日間増幅し、続いて５００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２中で５〜７日間増幅し、３時間血清飢餓状態にし、次いでＩＰの前に表記の通り３時間刺激したＴｒｅｇを用いたＮｒｐ１の免疫沈降解析を示す。図５Ｄは、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＰｔｅｎｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを用いたトランスウェル抑制アッセイを示す。結果は、３回（Ａ、Ｂ、Ｄ）の実験の平均であるか、または少なくとも３回の実験（Ｃ）の代表例である。対応のないｔ検定により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図６】図６Ａ〜６Ｄから、ニューロピリンがＰＴＥＮを介してＩＳにおけるＡｋｔ活性化を制限することが立証される。図６Ａは、図５ＢのＩＳにおけるｐＡｋｔの発現(occurrence)を集計したものである。図６Ｂは、フローサイトメトリーにより精製し、次いで抗ＴＣＲおよびＩｇＧあるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇを含む脂質二重層で刺激したＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇにおけるＩＳのＡｋｔおよびｐＴｙｒの活性化のＴＩＲＦ顕微鏡観察を示す。図６Ｃは、フローサイトメトリーにより精製し、次いで抗ＴＣＲおよびＩｇＧあるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇを含む脂質二重層で２０分間刺激したＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＰｔｅｎｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇにおけるニューロピリンのＩＳへのリクルートメントおよびＡｋｔの活性化のＴＩＲＦ顕微鏡観察を示す。図６Ｄは、図６ＣのＩＳにおけるｐＡｋｔの発現を集計したものである。結果は、３回［Ａ〜Ｂ］または２回［Ｃ〜Ｄ］の独立した実験の代表例である。１元配置分散分析により＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｉから、腫瘍浸潤ＴｒｅｇがＳｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１ライゲーションと同様のシグニチャーを有することが立証される。図７Ａは、腫瘍浸潤ＴｒｅｇのＡｋｔ活性化を示す。腫瘍を有するＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスを１２日目に屠殺し、ｎｄＬＮおよびＴＩＬを回収した。グラジエント遠心分離後、細胞を直ちに固定し、活性化Ａｋｔを染色した。網掛けのヒストグラムはアイソタイプコントロールを示す。結果は、以下にまとめてアイソタイプコントロール染色に対して補正した。腫瘍を有するＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウス由来のｎｄＬＮ、ｄＬＮまたはＴＩＬのＨｅｌｉｏｓ染色（Ｂ）、ＩＲＦ４／ＲＯＲγｔ染色（Ｃ）を示す。結果は、３回の独立した実験の平均を表す。対応のあるｔ検定［Ａ、ｎ＝７］または対応のないｔ検定［Ｂ−Ｉ、ｎ＝８〜２５］により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図７−２】図７−１の続き。Ｋｉ６７／ＢｒｄＵ染色（Ｄ）、切断型カスパーゼ−３染色（Ｅ）、Ｂｃｌ２染色（Ｆ）を示す。Ｋｉ６７／ＢｒｄＵ解析では、回収する前に動物にＢｒｄＵを１４時間注射した。結果は、３回の独立した実験の平均を表す。対応のあるｔ検定［Ａ、ｎ＝７］または対応のないｔ検定［Ｂ−Ｉ、ｎ＝８〜２５］により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図７−３】図７−２の続き。ＩＬ−１０染色（Ｇ）、ＣＤ７３染色（Ｈ）およびＬＡＧ−３染色（Ｉ）を示す。ＩＬ−１０では、タンパク質輸送阻害剤の存在下、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１６時間再刺激した。結果は、３回の独立した実験の平均を表す。対応のあるｔ検定［Ａ、ｎ＝７］または対応のないｔ検定［Ｂ−Ｉ、ｎ＝８〜２５］により＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図８】図８は、ニューロピリンがどのようにＴｒｅｇの安定性を維持するかを模式的に示す。ナイーブＴｒｅｇは低Ａｋｔの活性化を維持し、これが、ＦｏｘｏおよびＫＬＦ２のような因子の活性を介してその静止状態を促進する（左）。活性化時、Ｓｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１の非存在下で刺激されたＴｒｅｇは、高活性化のＡｋｔを有し、これがＦｏｘｏの核排出を促進し、Ｔｒｅｇの安定性の消失を引き起こす（中央）。Ｓｅｍａ４ａによるＮｒｐ１ライゲーションは、ＰＴＥＮのリクルートメントを介してＡｋｔ活性化を制限し、Ｆｏｘｏの核排出を阻害する（右）。これが、安定性およびＴｒｅｇ機能の向上と関連する遺伝的プログラムを促進する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、マウスおよびヒトの通常型Ｔ細胞上の免疫細胞表面リガンドセマフォリン−４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）と、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により捕捉された受容体ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）とが相互作用して、Ｔｒｅｇ機能を増強し、その生存を強化するという予想外の観察結果に基づく。Ｔｒｅｇにより捕捉されるＮｒｐ１を欠失したマウスは、腫瘍誘導性寛容(tumor-induced tolerance)が限定され、したがって特定の腫瘍にかなりの耐性を示すが、任意の自己免疫または炎症症候を発症しない。下記の実施例の欄に記載したように、Ｎｒｐ１の遮断はさらに、既存の腫瘍に対して治療効果を有する。Ｎｒｐ１は、免疫学的シナプス（ＩＳ）にリクルートされ、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）を介してＡｋｔ活性を抑制し、これがＦｏｘｏの核トランスロケーションを促進する。これにより、系譜特異的転写因子の誘導を抑制しながら、Ｔｒｅｇの安定性、生存および機能を促進する転写プログラムが誘導される。よって、Ｎｒｐ１ライゲーションは、高度炎症部位においてＴｒｅｇの安定性および機能を強化するが、免疫ホメオスタシスの維持には必要でないことから、癌および感染症における免疫療法の標的としてＮｒｐ１−セマフォリン軸の阻害が注目される一方、自己免疫および炎症の処置における標的としてＮｒｐ１−セマフォリン軸の増強も注目される。Ｎｒｐ１−セマフォリン相互作用をブロックすると、他の部位ではできないが腫瘍においては、Ｔｒｅｇ機能が限定され、有害な副作用を回避しながら抗腫瘍活性を強化し得る。これは、腫瘍発生のごく初期および転移を含む後期の両方において効果的な癌の処置および予防になり得る。同様のアプローチは、Ｔｒｅｇが障害となる他の任意の疾患（たとえば、Ｔｒｅｇが殺菌免疫を阻止する慢性感染症、たとえば、ＨＣＶ感染症、ＨＢＶ感染症、ＨＩＶ感染症等）に有効であり得、ワクチン接種を増強するかもしれない。一方、Ｎｒｐ１−セマフォリン相互作用を強化すると、Ｔｒｅｇが機能しない疾患（たとえば、自己免疫および炎症状態）においてＴｒｅｇ機能が増加すると考えられる。Ｔｒｅｇ機能を増加するためのＮｒｐ１−セマフォリン相互作用の強化に関連して、Ｎｒｐ１−セマフォリン相互作用のアゴニストの存在下で患者のＴｒｅｇをエキソビボ増幅し、次いで同じ患者に再導入する、または別の患者に投与する養子療法アプローチも本明細書に開示される。
【００１８】
定義
「Ｔｒｅｇ」または「制御性Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および／またはエフェクター機能を抑制する、またはその他の方法で免疫反応を抑制的に調節するＣＤ４＋Ｔ細胞をいう。とりわけ、Ｔｒｅｇは、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞のほか、他の免疫細胞により媒介される免疫反応をダウンレギュレートすることができる。好ましい実施形態では、本発明のＴｒｅｇはＦｏｘｐ３＋である。
【００１９】
「制御性Ｔ細胞機能」または「Ｔｒｅｇの機能」という用語は同義で使われ、ＣＤ４＋ＣＤ２５−またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の低下またはエフェクターＴ細胞を介した免疫反応の低下を引き起こすＴｒｅｇの任意の生物学的機能をいう。Ｔｒｅｇ機能は、当該技術分野において確立された技術により測定することができる。Ｔｒｅｇ機能の測定に有用なインビトロアッセイの非限定的な例として、下記の実施例の欄に記載したトランスウェル抑制アッセイのほか、より一般的には、ヒト末梢血または臍帯血（またはマウスの脾臓もしくはリンパ節）から精製された標的の通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）およびＴｒｅｇを、任意選択的に抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８コートビーズ（または抗原提示細胞（ＡＰＣ）、たとえば、照射脾細胞または精製樹状細胞（ＤＣ）または照射ＰＢＭＣ）により活性化し、続いて通常型Ｔ細胞の増殖をインビトロ検出する（たとえば、放射性ヌクレオチド（たとえば、［３Ｈ］−チミジン）または蛍光ヌクレオチドの取り込みの測定により、またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにより、またはフローサイトメトリーによる緑色蛍光色素エステルＣＦＳＥまたはＳｅｍｉｎａｐｈｔｈａｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ（ＳＮＡＲＦ−１）色素の希釈のモニタリングにより）インビトロアッセイが挙げられる。他の一般的なアッセイは、Ｔ細胞のサイトカイン応答を測定する。有用なＴｒｅｇ機能のインビボアッセイとしては、Ｔｒｅｇが重要な役割を果たす疾患の動物モデル、たとえば、（１）ホメオスタシスモデル（主としてＴｒｅｇにより抑制される標的細胞として恒常的に増幅するナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる）、（２）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）回復モデル（主としてＴｒｅｇにより抑制される標的細胞としてＴｈ１  Ｔ細胞（Ｔｈ１７）を用いる）、（３）実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル（主としてＴｒｅｇにより抑制される標的細胞としてＴｈ１７およびＴｈ１  Ｔ細胞を用いる）、（４）Ｂ１６メラノーマモデル（抗腫瘍免疫の抑制）（主としてＴｒｅｇにより抑制される標的細胞としてＣＤ８＋Ｔ細胞を用いる）、（５）ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＴｃｏｎｖ細胞をＲａｇ１−／−マウスに移入した養子移入大腸炎における結腸炎症の抑制、および（６）Ｆｏｘｐ３−レスキューモデル（主としてＴｒｅｇにより抑制される標的細胞としてリンパ球を用いる）を用いたアッセイが挙げられる。一プロトコルによれば、すべてのモデルがドナーＴ細胞集団用のマウスのほか、レシピエント用のＲａｇ１−／−マウスまたはＦｏｘｐ３−マウスを必要とする。様々な有用なアッセイのさらなる詳細については、たとえば、Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｓｔｏｎ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１１，７０７：２１−３７；Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｔｒｅｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｓｉｏｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｓｔｏｎ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１１，１１９−１５６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１０：１９６９−１９８０；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８８：２８７−２９６；Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００９，１８２：６１２１−６１２８；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８８：２８７−２９６；Ａｓｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１９０：９９５−１００４；Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，１９３：１３０３−１３１０；Ｂｅｌｋａｉｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，７：８７５−８８８；Ｔａｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，９：２３９−２４４；Ｂｅｔｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００９，２１：６１２−６１８；Ｄａｎｎｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００５，１１５（１２）：３６２３−３３；Ｔｓａｋｎａｒｉｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．，２００３，７４：２９６−３０８を参照されたい。
【００２０】
「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸」という用語は、本明細書で使用する場合、セマフォリン（たとえば、通常型Ｔ細胞など細胞に発現するセマフォリンまたは組換えセマフォリン）、Ｎｒｐ１のライゲーション、およびその後の下流のシグナル伝達により開始されるシグナル伝達経路をいう。
【００２１】
ＴｒｅｇのＮｒｐ１：セマフォリン軸と併用される「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、本明細書において同義で使われ、（ｉ）セマフォリン：Ｎｒｐ１の生産的ライゲーションおよび／または架橋を妨害する、または（ｉｉ）ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１のすぐ下流のシグナル伝達の結果を阻害することができる任意の作用物質をいう。Ｔｒｅｇに対するＮｒｐ１：セマフォリン相互作用の阻害は、下記の実施例の欄に記載したトランスウェル抑制アッセイを含む当該技術分野において公知の方法のいずれかにより評価することができる。
【００２２】
ＴｒｅｇのＮｒｐ１：セマフォリン軸と併用される「アゴニスト」または「増強薬」という用語は、本明細書において同義で使われ、（ｉ）Ｎｒｐ１：セマフォリンの相互作用を強化する、あるいは（ｉｉ）Ｔｒｅｇへのセマフォリン刺激およびＮｒｐ１シグナル伝達を人工的に模倣する、または（ｉｉｉ）ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１のすぐ下流のシグナル伝達の結果を活性化することができる任意の作用物質をいう。Ｔｒｅｇに対するＮｒｐ１：セマフォリン相互作用の強化は、下記の実施例の欄に記載したトランスウェル抑制アッセイを含む当該技術分野において公知の方法のいずれかにより評価することができる。
【００２３】
治療への応用については、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは医薬組成物として使用することができ、任意選択的に本発明の他のアゴニスト／アンタゴニストまたは他の治療分子と組み合わせてもよい。
【００２４】
ＴｒｅｇのＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストと併用される「セマフォリン分子」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１との相互作用に関与する膜貫通型セマフォリン分子（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）、様々な表面固定型およびビーズ固定型のそうした分子のほか、Ｔｒｅｇの機能の強化または安定性の増加に使用することができるそうした分子の多量体、誘導体、ミュータント、アナログおよびフラグメントを包含する。こうしたアゴニストセマフォリン分子の非限定的な例については下記により詳細に考察され、たとえば、Ｎｒｐ１を可溶性に架橋し、補体を結合できない多量体複合体を構築するＩｇＭ由来セマフォリン融合タンパク質が挙げられる。
【００２５】
ＴｒｅｇのＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤と併用される「セマフォリン分子」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１との相互作用に関与する可溶型の膜貫通型セマフォリン分子（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）のほか、機能の阻害またはＴｒｅｇの安定性の低下に使用することができるそうした分子の様々な誘導体、ミュータント、アナログおよびフラグメント（様々な融合分子を含む）を包含する。そうした阻害性セマフォリン分子の非限定的な例については、下記により詳細に考察され、たとえば、Ｎｒｐ１結合において内在性Ｓｅｍａ４ａとの競合に勝つＳｅｍａ４ａの様々な可溶性フラグメント、およびその誘導体またはアナログが挙げられる。１つの特定の実施形態では、阻害性セマフォリン分子は、Ｓｅｍａ４ａ細胞外ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３８６８６のＭｅｔ１−Ｈｉｓ６８３フラグメント）とヒトまたはマウスＩｇＧ１のＦｃ領域との融合体（Ｃ末端で）であるＳｅｍａ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質である。
【００２６】
「アナログ」という用語は、同一ではないが、類似の機能的特徴または構造的特徴を有する分子をいう。たとえば、ポリペプチドアナログは、天然に存在するポリペプチドと比較してアナログの機能を強化する特定の生化学的修飾を有するものの、天然に存在するポリペプチドの対応する生物活性を保持する。こうした生化学的修飾は、たとえば、リガンド結合を変化させることなくアナログのプロテアーゼ抵抗性、膜透過性を高める、あるいは半減期を延長することができる。アナログは、非天然型アミノ酸を含んでもよい。
【００２７】
「炎症」という用語は、本明細書で使用する場合、任意の過剰なまたは望ましくない免疫反応をいう。「炎症性疾患」という用語は、本明細書で使用する場合、過剰なまたは望ましくない免疫反応を伴う任意の病変をいう。
【００２８】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、当業者により判定された特定の値が許容誤差範囲内にあることを意味し、許容誤差範囲は、その値がどのように測定または判定されるか、すなわち、測定系の限界によってある程度異なる。たとえば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野の慣習により許容標準偏差内にあることを意味してもよい。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所定の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、一層好ましくは最大±５％、なお一層好ましくは最大±１％の範囲を意味してもよい。あるいは、特に生体システムまたはプロセスに関し、この用語は、ある値の１０倍以内、好ましくは２倍以内にあることを意味する。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、他に記載がない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は黙示的であり、この文脈において特定の値が許容誤差範囲内にあることを意味する。
【００２９】
本発明の文脈では、本発明が本明細書に記載する疾患の状態のいずれかに関する限り、「処置する」、「処置」および同種のものという用語は、そうした状態に伴う少なくとも１つの症状を軽減または緩和する、あるいはそうした状態の進行を遅延または抑制することを意味する。本発明の意味において、「処置する」はさらに、疾患を阻止する、その発現（すなわち、疾患の臨床的発現前の期間）遅延させる、および／またはその発症もしくは悪化のリスクを低下することも意味する。たとえば、癌に関連して「処置する」という用語は、患者の腫瘍量をゼロにする、または転移等を予防、遅延または阻害することを意味することがある。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用量または量に使用される「治療上有効な」という用語は、化合物または医薬組成物の量が投与を必要とする被検体への投与時に所望の活性を得るのに十分であることをいう。本発明の文脈では、「治療上有効な」という用語は、化合物（たとえば、ＴｒｅｇのＮｒｐ１：セマフォリン軸のアンタゴニストまたはアゴニスト）、またはそうした化合物を含む医薬組成物の量が、本発明の方法により処置される障害の発現を遅延させる、その進行を阻止する、その少なくとも１つの症状を軽減または緩和するのに十分であることをいう。活性成分の組み合わせを投与する際、その組み合わせの有効量は、個別に投与する場合に効果的であると考えられる各成分の量を含んでも、あるいは含まなくてもよい点に留意されたい。
【００３１】
「薬学的に許容される」という語句は、本発明の組成物と併用して使用される場合、哺乳動物（たとえば、ヒト）への投与の際に、そうした組成物の分子的実体および他の成分が生理学的に許容され、典型的には有害反応を引き起こさないことを意味する。好ましくは、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、より詳細にはヒトへの使用について連邦政府または州政府の規制当局により承認されている、あるいは米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「被検体」という用語は任意の哺乳動物をいう。好ましい実施形態では、被検体はヒトである。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数のものを含む。
【００３４】
本発明によれば、当該技術分野の技術における従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を利用してもよい。こうした技術は、文献に十分に説明されている。たとえば、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ｈｅｒｅｉｎ「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４》；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６》；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６》；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００３５】
本発明の方法
一実施形態では、本発明は、Ｔｒｅｇの機能を阻害するまたは安定性を低下させる方法であって、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤に前記Ｔｒｅｇを曝露することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のこうした阻害剤は、通常型Ｔ細胞上の膜貫通型セマフォリン（たとえばクラスＩＶセマフォリン、たとえばＳｅｍａ４ａ）とＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を阻害する。１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない。Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、被検体（たとえばヒト）に、たとえば癌または感染症に罹患している被検体に直接投与してもよい。関連する実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする被検体（たとえば、ヒト）の疾患（たとえば、癌または感染症）を処置する方法であって、被検体のＴｒｅｇ内のＮｒｐ１：セマフォリン軸を選択的に阻害する方法を提供する。
【００３６】
一実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体である。１つの特定の実施形態では、こうした抗体は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用またはＮｒｐ１−セマフォリンクラスＩＩＩ相互作用に影響を与えない。
【００３７】
もう１つの実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、セマフォリン分子（たとえば、可溶型のｓｅｍａ４ａタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログ）である。
【００３８】
なおもう１つの実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である。
【００３９】
本発明は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１発現を阻害する、または膜貫通型セマフォリンを発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のそうした膜貫通型セマフォリン発現を局所的に（たとえば、腫瘍において）阻害する、またはＮｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する、Ｔｒｅｇ内のＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤をさらに包含する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、Ｔｒｅｇの機能を強化するまたはその安定性を増加させる方法であって、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストを前記Ｔｒｅｇに曝露することを含む方法を提供する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のこうしたアゴニストは、通常型Ｔ細胞上の膜貫通型セマフォリン（たとえばクラスＩＶセマフォリン、たとえばＳｅｍａ４ａ）とＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を強化する。一実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、インビトロでＴｒｅｇに投与される（たとえば、Ｔｒｅｇは被検体（たとえば、自己免疫性疾患または炎症性疾患に罹患しているヒト）から抽出し、Ｎｒｐ１−セマフォリン相互作用のアゴニストの存在下でエキソビボ増幅し、次いで同じ被検体に再導入しても、あるいは別の被検体に投与してもよい）。もう１つの実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、被検体（たとえばヒト）に、たとえば、自己免疫性疾患または炎症性疾患に罹患している被検体に直接投与してもよい。関連する実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする被検体（たとえば、ヒト）の疾患（たとえば、自己免疫性疾患または炎症性疾患）を処置する方法であって、被検体のＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸を選択的に活性化することを含む方法を提供する。
【００４１】
一実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、セマフォリン分子（たとえば、Ｓｅｍａ４ａタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログ）である。こうしたセマフォリン分子は、たとえば、表面またはビーズ上で多量体化および／または固定化されていてもよい。
【００４２】
もう１つの実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは抗体である。
【００４３】
なおもう１つの実施形態では、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは小分子である。
【００４４】
本発明は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１発現を強化する、または膜貫通型セマフォリンを発現する細胞（たとえば、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ））上のセマフォリン発現を局所的に（たとえば、糖尿病の膵島において）強化する、またはＮｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を強化する、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストをさらに包含する。
【００４５】
Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸の別の阻害剤およびアゴニストについては、当該技術分野において公知の様々なスクリーニング方法を用いて同定することができる（たとえば、固定化した標的分子またはそのフラグメントを使用して）。
【００４６】
本発明の阻害剤またはアゴニストは、上述の治療法に使用してもよいし、あるいは前臨床データを得る目的で非ヒト哺乳動物に投与してもよい。処置対象の例示的非ヒト哺乳動物として、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物、および前臨床試験が行われる他の哺乳動物が挙げられる。こうした哺乳動物は、処置対象の疾患の確立した動物モデルであってもよいし、あるいは目的の阻害剤またはアゴニストの毒性の研究に使用してもよい。これらの各々の実施形態において、哺乳動物を対象に用量漸増試験を行ってもよい。
【００４７】
本発明の方法により処置可能な癌の非限定的な例として、たとえば、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫および白血病が挙げられる。非限定的な具体例としては、たとえば、乳癌、膵癌、肝癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、卵巣癌、原発性または転移性メラノーマ、扁平上皮癌、基底細胞癌、脳癌、血管肉腫、脈管肉腫、骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、胃腸癌、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、肺癌腫、上皮性癌、子宮頸癌、精巣腫瘍、神経膠腫、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、白血病、神経芽細胞腫、小細胞性肺癌、膀胱癌腫、リンパ腫、多発性骨髄腫、髄様癌、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、造血器新生物(hematopoietic neoplasias)、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌、腎細胞癌、ヘパトーマ等が挙げられる。
【００４８】
本発明の方法により処置可能な感染症としては、以下に限定されるものではないが、Ｔｒｅｇが殺菌免疫を阻止し、たとえば、細菌、寄生虫、ウイルス、真菌または原虫により引き起こされ得る任意の感染症（特に、慢性感染症）が挙げられる。
【００４９】
本発明の方法により処置可能な炎症性疾患および自己免疫疾患の非限定的な例として、たとえば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、糖尿病、多発性硬化症、たとえば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、グレーブス病、紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、乾癬、ベーチェット病、自閉症性腸炎(autistic enterocolitis)、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、横断性脊髄炎、自己免疫性心筋症、セリアック病、皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー、喘息、接触皮膚炎（人工化学物質に対する任意の反応を含む）、アテローム性動脈硬化症（または心臓もしくは血管系に影響を与える他の任意の炎症状態）等が挙げられる。
【００５０】
様々な疾患の処置に使用する際、本発明の阻害剤またはアゴニストは、同一または類似の疾患に好適な他の治療薬と組み合わせてもよいことを意図している。さらに、相加または相乗効果を得るため、本発明の２種以上の阻害剤またはアゴニストを併用投与してもよい。第２の治療薬と併用投与する場合、本発明の阻害剤またはアゴニストおよび第２の治療薬は、同時に投与しても、あるいは連続的に（任意の順序で）投与してもよい。各作用物質の好適な治療上有効な投与量は、相加作用または相乗作用に伴い下げてもよい。
【００５１】
本発明のＮｒｐ１：セマフォリン軸アゴニストは、Ｔｒｅｇ（たとえば、非マイトジェン抗ＣＤ３(non-mitogenic anti-CD3)）、インビボでのＴｒｅｇの移行を強化する他の療法、あるいは炎症を阻止する療法（たとえば、ＩＬ１、ＩＮＦα／β、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＬ１３、ＩＬ２３等の遮断による）と組み合わせてもよい。
【００５２】
一実施形態では、本明細書に開示されたＴｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、感染症または腫瘍に対するワクチンの有効性を強化するのに有用である。感染性因子の不活化細胞または単一もしくは複数の抗原を含む感染症に対するワクチンと同様に、腫瘍ワクチンは典型的には、患者の免疫系を刺激する不活化腫瘍細胞または腫瘍抗原を含む。免疫系は、この刺激に応答して感染症または新形成を標的とする免疫応答細胞を作る。Ｔｒｅｇはこうした免疫応答を抑制するように作用するので、その機能および安定性を本発明の方法により阻害すると、ワクチンに対する免疫応答が強化され得る。
【００５３】
本発明のＴｒｅｇ阻害剤は、免疫応答（たとえば、癌または感染症の処置のため）を惹起するように作用する試薬と同時に、あるいはその試薬が被検体に投与される前（たとえば、１〜１４日前）に被検体に投与してもよい。
【００５４】
本発明の阻害性化合物はさらに、抗腫瘍抗体または病因抗原に対する抗体と組み合わせて投与してもよい。
【００５５】
本発明の阻害性処置剤は、他の免疫調節処置剤、たとえば、治療ワクチン（以下に限定されるものではないが、ＧＶＡＸ、ＤＣを用いたワクチン等）、チェックポイント阻害剤（以下に限定されるものではないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３等を阻止する作用物質）またはアクチベーター（以下に限定されるものではないが、４１ＢＢ、ＯＸ４０等を強化する作用物質）と組み合わせてもよい。本発明の阻害性処置剤はさらに、Ｔｒｅｇの機能または安定性を阻害する能力を有する他の処置剤と組み合わせてもよい。こうした追加のＴｒｅｇ阻害剤の一部の非限定的な例として、ＯＮＴＡＫ、ＨｕＭａｘ−Ｔａｃ、ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）およびＭＤＸ−０１０が挙げられる。
【００５６】
本発明の治療方法は、別の免疫療法および療法と組み合わせてもよい。たとえば、癌の処置に使用する場合、本発明の阻害剤は、腫瘍の種類、患者の状態、他の健康問題および種々の因子に応じて従来の癌療法、たとえば、手術、放射線治療、化学療法またはこれらの組み合わせと組み合わせて使用してもよい。ある態様では、本発明の阻害剤との併用の癌療法に有用な他の治療薬として、血管新生阻害薬が挙げられる。多くの血管新生阻害薬が同定されており、当該技術分野において公知であり、たとえば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、可溶型ｂＦＧＦ受容体、トランスフォーミング増殖因子β、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤性プロリフェリン関連タンパク質のほか、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ（２０００）により記載されたものなどがある。一実施形態では、本発明の阻害剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、たとえば抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを阻止できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤およびこれらの任意の組み合わせ（たとえば、抗ｈＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブまたはラニビズマブ）と組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
本発明の併用処置に使用することができる化学療法化合物の非限定的な例として、たとえば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロナート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられる。
【００５８】
これらの化学療法化合物は、その作用機序により、たとえば、以下のグループに分類することができる：代謝拮抗薬／抗癌剤、たとえばピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリンアナログ、葉酸拮抗剤ならびに関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖薬／有糸分裂阻害薬、たとえば天然物、たとえばビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）、微小管破壊剤、たとえばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、たとえばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、それ自身アスパラギンを合成する能力を有さない細胞を排除するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、たとえばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア類（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼネス−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、たとえば葉酸アナログ（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他の阻害剤）；線維素溶解薬（たとえば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走薬(antimigratory agent)；分泌抑制薬（ブレフェルジン）；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（たとえば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および増殖因子阻害剤（たとえば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤およびカスパーゼアクチベーター；およびクロマチン破壊剤。
【００５９】
感染症の処置では、本発明の併用療法は、本発明のＴｒｅｇ阻害剤と抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、抗原生動物薬またはこれらの組み合わせとの併用投与を包含してもよい。
【００６０】
有用な抗生物質の非限定的な例として、リンコサミド（クリンダマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（たとえばテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）；アミノグリコシド（たとえばゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）；β−ラクタム（たとえばペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム）；バンコマイシン；バシトラシン；マクロライド（エリスロマイシン）、アムホテリシン；スルホンアミド（たとえばスルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェニド、ｐ−アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（たとえばナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗緑膿菌剤（たとえばカルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン）またはこれらの任意の塩もしくは変異体が挙げられる。さらにＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。こうした抗生物質は、たとえば、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ，Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．）、およびＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．）から市販品として入手することができる。使用する抗生物質は、細菌感染症の種類によって異なる。
【００６１】
有用な抗真菌剤の非限定的な例として、イミダゾール（たとえばグリセオフルビン、ミコナゾール、テルビナフィン、フルコナゾール、ケトコナゾール、ボリコナゾールおよびイトラコナゾール）；ポリエン（たとえばアムホテリシンＢおよびニスタチン）；フルシトシン；およびカンジシジンまたはこれらの任意の塩もしくは変異体が挙げられる。さらにＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
【００６２】
有用な抗ウイルス薬の非限定的な例として、インターフェロンα、βまたはγ、ジダノシン、ラミブジン、ザナミビル、ロピニビル、ネルフィナビル、エファビレンツ、インジナビル、バラシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リマンチジン、リバビリン、ガンシクロビル、ホスカルネットおよびアシクロビルまたはこれらの任意の塩もしくは変異体が挙げられる。さらにＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
【００６３】
有用な抗寄生虫剤の非限定的な例として、クロロキン、メフロキン、キニーネ、プリマキン、アトバコン、スルファドキシンおよびピリメタミンまたはこれらの任意の塩もしくは変異体が挙げられる。さらにＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
【００６４】
有用な抗原生動物薬の非限定的な例として、メトロニダゾール、ジロキサニド、ヨードキノール、トリメトプリム、スファメトキサゾール、ペンタミジン、クリンダマイシン、プリマキン、ピリメタミンおよびスルファジアジンまたはこれらの任意の塩もしくは変異体が挙げられる。さらにＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
【００６５】
本発明の抗体阻害剤およびアゴニスト
上記の方法に関連して、本発明は、Ｔｒｅｇに対するＮｒｐ１：セマフォリン相互作用を阻害または増大する単離された抗体を提供する。一実施形態では、セマフォリンはクラスＩＶセマフォリン（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）である。一実施形態では、抗体は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用またはＮｒｐ１−セマフォリンクラスＩＩＩ相互作用に影響を与えない。
【００６６】
本発明は、Ｔｒｅｇに対するＮｒｐ−１：セマフォリン相互作用を妨害する抗Ｎｒｐ１抗体および抗セマフォリン抗体の両方を包含する。有用な抗体の例として、たとえば、（ｉ）セマフォリン分子の「ｓｅｍａ」ドメインおよび「ＰＳＩ」ドメイン、すべてのセマフォリン分子上に進化的に保存された領域を特異的に標的とする抗体（たとえば、Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，３３（３）：１２７−１３５を参照されたい）、および（ｉｉ）Ｎｒｐ１上のセマフォリン結合ドメイン（ＶＥＧＦ結合ドメインではない）を標的とする抗体（たとえば、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，２８７（１４）：１１０８２−１１０８９を参照されたい）が挙げられる。
【００６７】
阻害抗体および増強抗体のどちらの場合も、本発明は、Ｎｒｐ１に加えてＴｒｅｇ特異的タンパク質も認識し、したがって抗体が特異的にＴｒｅｇを標的とする二重特異性抗体もさらに提供する。たとえば、こうした二重特異性抗体は、Ｎｒｐ１に加えてＴｒｅｇの表面タンパク質を標的とすることができ、表面タンパク質として、たとえば、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ６２Ｌ（セレクチン）、ＯＸ−４０リガンド（ＯＸ−４０Ｌ）、ＣＴＬＡ４、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＦＯＸＰ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１０３、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ガレクチン−１、ＴＮＦＲ２またはＴＧＦβＲ１が挙げられる。
【００６８】
本発明により使用される抗体は、必要に応じてモノクローナルでも、あるいはポリクローナルでもよい。さらに抗体フラグメントを使用してもよく、たとえば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦｖフラグメントが挙げられる。抗体は一本鎖抗体であってもよい。他の好適な改変体および／または作用物質も当業者には明らかになるであろう。キメラ抗体およびヒト化抗体も本発明の範囲内である。キメラ抗体およびヒト化抗体であれば、ヒト被験者において、対応する非キメラ抗体より免疫原性が低いであろうことが予想される。たとえば非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体を作製するための種々のアプローチが記載されている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１（１９８５）；Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２（１９８５），Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書、英国特許第２１７７０９６Ｂ号明細書を参照されたい。加えて、キメラ抗体はさらに、可変領域の一部、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域がヒト由来であり、超可変領域のみが非ヒト由来であるように「ヒト化」してもよい。こうした免疫グロブリン分子の改変は、当該技術分野において公知のいくつかの技術（たとえば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，７３０８−７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４，７２７９（１９８３）；Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２，３−１６（１９８２））のいずれかにより行うことができ、好ましくは国際公開第９２／０６１９３号パンフレットまたは欧州特許第０２３９４００号明細書の教示内容に従って行う。ヒト化抗体は、たとえば、Ｓｃｏｔｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２  Ｈｏｌｌｙ  Ｒｏａｄ，Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎにより商業的に生産してもよい。
【００６９】
ある種の実施形態では、さらに抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位に関連する抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、第２抗体の作製に使用する動物と同じ種、好ましくは同じ系統の動物を免疫することにより第２抗体に対して調製することができる。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号明細書を参照されたい。一実施形態では、抗体はＮｒｐ１もしくはセマフォリンまたはその一部に対して産生され、これらの抗体を使用して次いで抗イディオタイプ抗体を作製する。
【００７０】
本発明は、細胞内ターゲティングおよび細胞外ターゲティングの両方の抗体を提供する。細胞内ターゲティングは、イントラボディという細胞内発現抗体の使用により達成することができる。
【００７１】
目的の抗原（たとえば、Ｎｒｐ１またはＳｅｍａ４ａ）上の特定のエピトープに結合する追加の抗体をスクリーニングするには、たとえばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載された通常の交差ブロッキングアッセイを行ってもよい。あるいは、たとえばＣｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているようなエピトープマッピングを行って、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを判定してもよい。
【００７２】
本発明に有用な追加の抗体はまた、たとえば米国特許出願公開第２００８／０２１３２６８号明細書に記載されているようなファージディスプレイアプローチを用いて作製および選択してもよい。
【００７３】
本発明の抗体はさらに、親抗体よりも物理的特性、化学的特性およびまたは生物学的特性の改善した抗体ミュータントを作製するため修飾してもよい。使用するアッセイが生物活性アッセイである場合、抗体ミュータントは好ましくは、選択したアッセイ（たとえば、トランスウェル抑制アッセイによるＴｒｅｇの機能または安定性、およびＢｃｌ２またはＨｅｌｉｏｓのアップレギュレーションを測定する）において、そのアッセイにおける親抗体の生物活性より少なくとも約１０倍高い、好ましくは少なくとも約２０倍高い、一層好ましくは少なくとも約５０倍高い、場合によっては少なくとも約１００倍または２００倍高い生物活性を有する。
【００７４】
抗体ミュータントを作製するため、親抗体の超可変領域の１つまたは複数に１つまたは複数のアミノ酸変化（たとえば置換）を導入してもよい。あるいは、またはさらに、フレームワーク領域残基の１つまたは複数の変化（たとえば、置換）を親抗体に導入して、その結果第２の哺乳類種由来の抗原に対する抗体ミュータントの結合親和性を向上させてもよい。修飾するためのフレームワーク領域残基の例として、抗原に直接非共有結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲと相互作用する／ＣＤＲのコンフォメーションに影響を与えるもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨの界面に関与するもの（欧州特許第２３９４００Ｂ１号明細書）が挙げられる。ある種の実施形態では、こうしたフレームワーク領域残基の１つまたは複数の修飾の結果、第２の哺乳類種由来の抗原に対する抗体の結合親和性が増強される。たとえば、本発明のこの実施形態では、約１つから約５つのフレームワーク残基を変化させてもよい。超可変領域残基を変化させない場合でも、これで前臨床試験に使用するのに好適な抗体ミュータントを得るのに十分であることも珍しくない。しかしながら、通常、抗体ミュータントは、追加の超可変領域の変化を含む。変化される超可変領域残基は、無作為に変化させてもよく、特に、親抗体の初めの結合親和性により、こうした無作為に作られた抗体ミュータントを容易にスクリーニングできるような場合にそうである。
【００７５】
こうした抗体ミュータントを作製するための１つの有用な手順は、「アラニンスキャニング変異導入(alanine scanning mutagenesis)」と呼ばれている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。この場合、超可変領域残基の１つまたは複数をアラニンまたはポリアラニン残基で置換して、第２の哺乳類種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を与える。次いで、置換に対して機能的感受性を示すこれらの超可変領域残基を、置換の部位または置換用の部位にさらなるまたは他の突然変異を導入することにより精密化する。こうして作られたａｌａ−ミュータントについて、本明細書に記載するようなその生物活性をスクリーニングする。
【００７６】
本発明の抗体は、標準的手段により調製することができる。
【００７７】
免疫抗原の調製ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製については、たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，１７２，１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，」（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１）；Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）），Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８５））を参照されたい。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）により選択することができる。
【００７８】
本発明の抗体は、よく知られた技術を用いて組換え技術により作製してもよい。たとえば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい。所望の抗原をコードする核酸は、従来の手順を用いて単離あるいは合成し、さらにクローニングまたは発現のため複製可能なベクターに挿入してもよい。
【００７９】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内に産生させても、ペリプラズムに産生させても、あるいは直接培地に分泌させてもよく、公知の技術、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いてさらに単離および精製する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製してもよい（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）。マウスアイソタイプおよびヒトγ３には、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用してもよい（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５）。
【００８０】
異なる種、抗体に由来する部分を含む、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化（ＣＤＲグラフト）抗体、またはＣＤＲグラフト一本鎖抗体の様々な部分は、従来の技術により化学的に結合しても、あるいは遺伝子工学技術を用いて隣接するタンパク質として調製してもよい。たとえば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させて、連続したタンパク質を得てもよい。たとえば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４号Ｂ１明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号明細書；およびＷｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号明細書を参照されたい。さらに、霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）と、一本鎖抗体に関するＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８））とを参照されたい。ヒト化可変領域をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡ）配列は、ＰＣＲ変異誘発法を用いてヒト鎖またはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列、たとえば既にヒト化された可変領域由来のＤＮＡ鋳型を変化させて構築することができる（たとえば、Ｋａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９））；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；およびＬｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ  １０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）。これらまたは他の好適な方法を用いて、変異体も容易に作製することができる。一実施形態では、クローン化した可変領域に変位を誘発して、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択してもよい（たとえば、ファージライブラリーから；たとえば、Ｋｒｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５１４，５４８号明細書；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照されたい）。
【００８１】
さらに、キメラフラグメント、ヒト化フラグメント、霊長類化フラグメントまたは一本鎖抗体フラグメントなどの抗体の機能的フラグメントを作製してもよい。本抗体の機能的フラグメントは、それが由来する全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。有用な抗体フラグメントとして、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントがあるが、これに限定されるものではない。こうしたフラグメントは、酵素的切断または組換え技術により作製することができる。たとえば、パパイン切断またはペプシン切断では、それぞれＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。抗体はさらに、自然終結部位の上流に１つまたは複数の終止コドンを導入した抗体遺伝子を用いて種々の切断型で作製することもできる。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよび重鎖のヒンジ領域を含むように設計することができる。
【００８２】
たとえば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の完全なレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）の免疫化を利用する方法など、不可欠な特異性を有する抗体を作製または単離する他の好適な方法を使用してもよい。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号明細書；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，４５１，２１６Ｂ１号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４Ｅ１号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号明細書；およびＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第０，５１９，５９６号Ａ１明細書を参照されたい。さらに、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Ｈｕｓｔｏｎ，米国特許第５，４７６，７８６号明細書；およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）も参照されたい。
【００８３】
ある種の実施形態では、抗体または抗体の抗原結合フラグメントは標識しても、あるいは非標識でもよく、診断目的に使用される。典型的には、診断アッセイでは、抗体のその標的への結合に起因する複合体の形成を検出する必要がある。抗体は、たとえば、放射性核種、フルオロフォア、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、およびリガンド（たとえば、ビオチンまたはハプテン）で直接標識してもよい。多くの適切なイムノアッセイが当業者に公知である（たとえば、米国特許第３，８１７，８２７号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；および同第４，０９８，８７６号明細書を参照されたい）。
【００８４】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の生理学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用する投与量および濃度で被投与者に無毒であり、緩衝液、たとえばホスフェート、シトレートおよび他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（たとえばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、たとえばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；単糖類、二糖類およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の糖質；キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ；糖、たとえばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、たとえばナトリウム；金属錯体（たとえば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン界面活性剤、たとえばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００８５】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、処置対象の特定の適応症に対する必要に応じて１つまたは複数の追加の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない相補活性を有するものをさらに含んでもよい。所期の目的に有効な量で組み合わされて、様々な活性薬が存在してもよい。考えられる追加の活性化合物の非限定的な例として、たとえば、ＩＬ２およびＴＧＦβのほか、上記の併用処置の考察において記載された様々な作用物質が挙げられる。
【００８６】
活性成分は、たとえば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシラート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、あるいはマクロエマルジョンに封入してもよい。こうした技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００８７】
さらに、持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の好適な例として、マトリックスが形状製品、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルである、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、たとえばエチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸は１００日にわたり分子の放出を可能にする一方、ある種のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。封入された抗体が長時間体内にとどまると、３７℃の水分に曝されるため変性または凝集することがあり、生物活性を喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。安定化のため、関連するメカニズムに応じて合理的な戦術を考案することができる。たとえば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明した場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発により達成することができる。
【００８８】
疾患の処置では、本発明の抗体の適切な投与量は処置対象の疾患、疾患の重症度および経過、抗体の投与が予防目的かそれとも治療目的か、これまでの治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量によって異なる。抗体は、患者に１度に投与しても、あるいは一連の処置にわたり投与してもよい。本発明の治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターすることができる。
【００８９】
本発明の抗体の投与は、全身投与のほか、疾患の部位（たとえば、原発腫瘍または慢性感染部位）への直接投与を含む任意の好適な経路により行うことができる。
本発明のタンパク質／ペプチド阻害剤およびアゴニスト
上記に明記したように、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、様々なセマフォリン分子、たとえば、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質（たとえば、Ｓｅｍａ４ａ）のほか、その様々な阻害性フラグメント、誘導体およびアナログを含む。さらに、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の競合阻害剤として働き得るＮｒｐ１の可溶性細胞外ドメインのほか、その様々な阻害性フラグメント、誘導体およびアナログも本発明内に含まれる。１つの特定の実施形態では、阻害性セマフォリン分子は、Ｓｅｍａ４ａ細胞外ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３８６８６のＭｅｔ１−Ｈｉｓ６８３フラグメント）と、ヒトまたはマウスＩｇＧ１のＦｃ領域との融合体（Ｃ末端で）であるＳｅｍａ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質である。１つの特定の実施形態では、阻害性セマフォリン分子は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡを含むＮｒｐ１細胞質ドメインの全部または一部を含むＮｒｐ１タンパク質のフラグメント（またはその誘導体もしくはアナログ）であり、この分子はＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインとＰＴＥＮタンパク質との間のシグナル伝達経路を阻害する。
【００９０】
上記で詳細に論じたように、本発明の方法に有用なＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、全長セマフォリンタンパク質（たとえば、Ｓｅｍａ４ａタンパク質）のほか、そのアゴニストフラグメント、誘導体およびアナログを含む様々なセマフォリン分子を含む。こうしたアゴニストセマフォリン分子は、たとえば、多量体化しても（たとえば、ＩｇＭ融合タンパク質を用いて）および／または表面またはビーズ上に固定化してもよい。
【００９１】
可溶性阻害性形態の膜貫通型セマフォリンタンパク質は、たとえば、その完全な細胞外ドメイン（たとえば、Ｓｅｍａ４ａの全細胞外ドメイン）、またはＴｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく高い親和性および特異性でＮｒｐ１に結合できる、そうした細胞外ドメインのＮｒｐ１結合部分（たとえば、Ｆｃドメインに融合された）を含む。いくつかの実施形態では、こうした阻害性形態の膜貫通型セマフォリンタンパク質は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない。可溶性阻害性形態のＮｒｐ１の細胞外ドメインは、たとえば、Ｎｒｐ１の全細胞外ドメインまたはＴｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく高い親和性および特異性でＳｅｍａ４ａに結合できる、そうした細胞外ドメインのＳｅｍａ４ａ結合部分（たとえば、Ｆｃドメインに融合された）を含む。Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸を阻害するセマフォリン分子またはフラグメントまたは可溶性阻害性形態のＮｒｐ１の細胞外ドメインの有効性は、当該技術分野において公知のアッセイおよび実施例の欄に概説したアッセイ、特にトランスウェル抑制アッセイを用いて試験することができる。
【００９２】
セマフォリンタンパク質およびフラグメントは、当該技術分野において周知の様々な発現系を用いて、対応する核酸のフラグメントから組換え技術により作製することができ、作製には、細菌（たとえば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫（たとえば、Ｓｆ９）および哺乳動物細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７）など種々の宿主系が好適である。多くの発現ベクターが開発されており、これらの宿主ごとに入手可能である。ベクターとクローニングおよび発現の手順については、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８７））およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５に考察されている。本発明に有用な標準的な発現ベクターは当該技術分野において周知であり、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクターおよび酵母人工染色体が挙げられる（これに限定されるものではない）。ベクター配列は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖のための複製起点；ＳＶ４０複製起点；宿主細胞における選択のためのアンピシリン、ネオマイシンもしくはピューロマイシン耐性遺伝子；ならびに／または優性選択マーカーおよび目的の遺伝子を増幅する遺伝子（たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列をベクターにクローニングして融合タンパク質を作る。融合パートナーは、融合タンパク質の可視化または検出を可能にする働きをし得る。たとえば、融合パートナーは、抗体により認識されるエピトープ、ペプチドまたは核酸に結合するドメイン、またはより容易に検出できるペプチドを含んでもよい。融合パートナーとして、ＨＡ、ｍｙｃ、Ｈｉｓ６、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ、プロテインＡの２つの合成ＩｇＧ結合ドメイン（ＺＺ）、外膜タンパク質Ｆ、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ならびに様々なバクテリオファージλおよびバクテリオファージＴ７の製品があるが、これに限定されるものではない。本明細書に提供される教示内容から、融合パートナーとして他のタンパク質を使用してもよいことは明らかである。融合タンパク質からＧＮＡＬ配列の単離を容易にするため、化学的切断（たとえば、ＣＮＢｒ）または酵素的切断（たとえば、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン）を受けやすいアミノ酸を使用して、ＧＮＡＬタンパク質および融合パートナーを架橋してもよい。
【００９４】
好ましくは、本発明の発現ベクターはプロモーター配列を含む。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方を含む好適なプロモーターは一般に入手することができ、当該技術分野において周知である。細菌の発現に繁用されるプロモーターとして、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、Ｔ５ファージおよびＳＰ６ファージ、ならびにｔｒｐオペロン、ｌｐｐオペロンおよびｌａｃオペロン由来のプロモーターが挙げられる。さらにハイブリッドプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号明細書を参照されたい）、たとえばｔａｃおよびｔｒｃを使用してもよい。細菌の発現用のプラスミドとして、ｐＥＴ発現ベクターｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ  １１ａ、ｐＥＴ  １２ａ〜ｃおよびｐＥＴ  １５ｂ（米国特許第４，９５２，４９６号明細書を参照；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）が挙げられる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に有害なペプチドの効率的な過剰産生には、低コピー数のベクター（たとえば、ｐＰＤ１００）を使用してもよい（Ｄｅｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２３：１９，１９９４）。Ｔ７発現ベクターの細菌宿主は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）に見られるように、誘導性プロモーター（たとえば、ｌａｃＵＶプロモーター；米国特許第４，９５２，４９６号明細書を参照されたい）に作動可能に連結されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染色体コピーを含んでもよい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはさらに、Ｔ７発現ベクターと互換性があるプラスミド上に存在してもよい。ポリメラーゼは、λプロモーターおよびリプレッサーの制御下にあってもよい（たとえば、ｐＧＰ１−２；Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：１０７４，１９８５）。
【００９５】
発現の制御に使用できる他のプロモーターとして、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書および同第５，１６８，０６２号明細書）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８１，２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８０，２２：７８７−７９７）、疱疹チミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８１）７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８２；２９６：３９  ４２）；原核生物発現ベクター、たとえばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７８）７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８３；８０：２１−２５）があるが、これに限定されるものではない；さらに「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  １９８０；２４２：７４−９４を参照されたい。使用できるさらに他の有用なプロモーターとして、酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、たとえばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリンキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および造血組織特異的性を示す転写制御領域、特に、骨髄系細胞において活性があるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８６；４６：８９−９４）、造血幹細胞分化因子プロモーター、エリスロポエチン受容体プロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９１；１５：２５５７）等が挙げられる。
【００９６】
本発明の発現ベクターには、他の調節配列をさらに含めてもよい。こうした配列として、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起点、選択可能なマーカーおよび同種のものが挙げられる。調節配列は、転写およびその後の翻訳を可能にするように相互に作動可能に連結される。
【００９７】
特定の宿主において特定のコドンが存在すると、発現に有害作用を与えることがある。したがって、たとえば原核細胞または真核細胞など特定の宿主系に合わせて核酸配列を最適化してもよい。コドン使用頻度の問題を緩和するためヌクレオチド配列を変化させる方法は、当業者によく知られている（たとえば、Ｋａｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）６：４９４；Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９６）６０：５１２；および２４５ページから２５３ページにコドン使用頻度表を掲載するＢｒｏｗｎ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｔｄ．（１９９１）を参照されたい）。
【００９８】
可溶性型のタンパク質は、培養液を集める、あるいはたとえば、界面活性剤による処理、および必要に応じて音波処理または上記のような他の機械的プロセスで封入体を可溶化することにより得ることができる。可溶化または可溶型タンパク質は、様々な技術、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、二次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の違い、免疫沈降を用いて、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準的な技術により単離することができる。
【００９９】
あるいは、本発明のセマフォリンタンパク質またはフラグメントは、当該技術分野において公知の技術、たとえば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学を用いて化学的に合成してもよい。ペプチド合成の方法については、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３））およびＧｒａｎｔ（ｅｄ．），「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，」（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））も参照されたい。さらに、自動ペプチド合成機も市販されている（たとえば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。
【０１００】
ある種の実施形態では、本発明は、治療の効力または安定性（たとえば、エキソビボでの有効期間およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を強化するため、その構造の修飾によるセマフォリン分子の機能的変異体の作製も意図している。修飾ポリペプチドは、たとえば、アミノ酸置換、欠失または付加により作製することができる。たとえば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパルテートとグルタメート、トレオニンとセリンとの単独置換、またはあるアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸（たとえば、保存的突然変異）との同様の置換は、得られる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想するのが合理的である。保存的置換は、その側鎖に関連があるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。追加の方法については、たとえば、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８４（７３９５）：５２９−５３３を参照されたい。
【０１０１】
本開示は、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによりセマフォリンポリペプチドのコンビナトリアルミュータントのセットほか、切断ミュータントおよび機能的変異体配列を得る方法も意図している。縮重オリゴヌクレオチドの配列から潜在的なホモログのライブラリーを作成できる多くの方法がある。縮重遺伝子の配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、次いで合成遺伝子を発現のため適切な遺伝子にライゲートすればよい。縮重遺伝子のセットにより、所望の潜在的可溶性ポリペプチド配列のセットをコードする配列のすべてが、１回の混合で得られる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知である（たとえば、Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３（１９８３）；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，」（Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．Ａ  Ｇ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ  ２７３−２８９（１９８１））；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６（１９８４）；およびＩｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７（１９８３）を参照されたい。こうした技術は、他のタンパク質の定向進化に利用されてきた（たとえば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：２４２９−２４３３（１９９２）；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２（１９９０）；および米国特許第５，２２３，４０９号明細書、同第５，１９８，３４６号明細書および同第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。
【０１０２】
あるいは、コンビナトリアルライブラリーを作成するのに、アラニンスキャニング変異導入および同種のもの（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２（１９９４）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９（１９９４）；Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８（１９９３）；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１（１９９３）；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２（１９９３）；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））、リンカースキャニング変異導入（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０（１９９３）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２（１９９２）；およびＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６（１９８２））；飽和変異導入（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３（１９８６））；ＰＣＲ変異導入（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：１１−１９（１９８９））により；またはランダム変異導入、たとえば化学的変異導入（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；およびＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２−３４（１９９４））など変異誘発の他の形態を利用してもよい。特にコンビナトリアルな場合のリンカースキャニング変異導入は、切断（生理活性）型の本ポリペプチドを同定するのに好ましい方法である。
【０１０３】
点突然変異および切断により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、および特定の特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングには、広範囲に及ぶ技術が当該技術分野において公知である。こうした技術は、本セマフォリンポリペプチドのコンビナトリアル変異導入により作成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適している場合がある。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに最も繁用される技術は典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性を検出すると、検出された遺伝子産物の遺伝子をコードするベクターが比較的容易に単離しやすくなる条件下、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。本明細書に（たとえば、下記の実施例の欄に）記載の例示的アッセイの一部は、コンビナトリアル変異導入技術により作成された多くの縮重配列のスクリーニングに必要なハイスループット解析に適している。
【０１０４】
ある種の実施形態では、本発明の有用なセマフォリン分子は、ペプチドおよびペプチド模倣物などの小分子である。本明細書で使用する場合、「ペプチド模倣物」という用語は、化学修飾ペプチドと、非天然のアミノ酸、ペプトイドおよび同種のものを含むペプチド様分子とを含む。ペプチド模造物は、被検体への投与の際に高い安定性などペプチドに勝る様々な利点がある。ペプチド模倣物を同定する方法は、当該技術分野において周知であり、可能性のあるペプチド模造物のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングが挙げられる。たとえば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅには、既知の結晶構造を有する３００，０００を超える化合物のコレクションがある（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ  ３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造が入手できない場合、たとえば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤを用いて構造を作成することができる（Ｒｕｓｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）には、市販されており、さらに検索してセマフォリンポリペプチドの有望なペプチド模造物を同定することもできる約１００，０００の化合物がある。
【０１０５】
ある種の実施形態では、本発明の阻害性およびアゴニストセマフォリンポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含んでもよい。こうした修飾として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化があるが、これに限定されるものではない。このため、修飾された可溶性ポリペプチドは、非アミノ酸要素、たとえばポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびホスフェートを含んでもよい。こうした非アミノ酸要素のポリペプチドの官能性に対する作用は、本明細書に記載の機能アッセイを用いて試験することができる。
【０１０６】
ある態様では、本発明のセマフォリンポリペプチドの機能的変異体または修飾体は、セマフォリンポリペプチドの少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。こうした融合ドメインのよく知られた例として、以下に限定されるものではないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられ、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。
【０１０７】
アフィニティー精製においては、アフィニティークロマトグラフィーに適切なマトリックス、たとえばグルタチオン樹脂、アミラーゼ樹脂、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲート樹脂を使用することができる。当該技術分野において周知の別の融合ドメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。融合ドメインは、特異抗体が利用できる通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」をさらに含む。特定のモノクローナル抗体が容易に利用できるよく知られたエピトープタグとして、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タグおよびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位を有し、当該プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによりそこから組換えタンパク質を遊離させることができる。次いで遊離したタンパク質は、その後クロマトグラフ分離により融合ドメインから単離することができる。ある種の実施形態では、可溶性ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化することができる１つまたは複数の修飾を含む。たとえば、こうした修飾は、可溶性ポリペプチドのインビボでの（たとえば、血中）半減期を延長させる。
【０１０８】
一実施形態では、単離または精製されたセマフォリンタンパク質は、標準的技術、たとえば化学的架橋結合（たとえば、直接または１つもしくは複数のリンカー分子を介して）により、あるいは当該タンパク質または親和性タグに対して産生された抗体、または親和性タグのリガンドを介して好適なアフィニティーマトリックスまたは固体支持体に固定化してもよい。固体支持体は、任意の好適な固相またはマトリックス、たとえばビーズ、プレートの壁または他の好適な表面（たとえば、マイクロタイタープレートのウェル）、カラム微細孔性ガラス（ＣＰＧ）またはウェル内などの溶液に浸すことができるピンであってもよい。好都合には、支持体は、たとえばガラス、シリカ、ラテックス、プラスチックまたは任意の高分子材料で作られていてもよい。支持体はさらに、生分解性材料から作られていてもよい。支持体の表面は、疎水性でも、あるいは親水性でもよい。支持体は好適には機能性表面を有する。たとえば、米国特許第４，３３６，１７３号明細書；同第４，４５９，３７８号明細書；同第４，６５４，２６７号明細書を参照されたい。微粒子支持体（たとえばビーズまたは粒子）は、実質的に球状であってもよい。微粒子支持体の例には、単分散粒子、すなわち大きさが実質的に均一である粒子である（たとえば直径の標準偏差が５％未満の大きさ）。こうした粒子は、反応の再現性が非常によいという利点を有する。非磁性ポリマービーズも適用できる。こうしたビーズは、様々な製造業者、たとえばＤｙｎａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ＡＳ、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｓｅｒａｄｙｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、日本ペイント株式会社（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｐａｉｎｔ）、Ｃｈｅｍａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｒｏｌａｂｏ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｇｏｗａおよびＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である。好適な支持体の別の例には、磁性ビーズまたは粒子がある。磁性ビーズおよび粒子は好適には、常磁性でも、あるいは超常磁性でもよい。超常磁性ビーズおよび粒子は、たとえば欧州特許第０１０６８７３号明細書に記載されている。磁性ビーズおよび粒子は、いくつかの製造者、たとえばＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡから入手可能である。
【０１０９】
本発明のセマフォリン分子（たとえば、アゴニスト分子）はさらに、１つまたは複数の多量体化ドメイン、たとえば、ＩｇＧまたはストレプトアビジンに共有結合していても、あるいは非共有結合していてもよい。有用な有機分子ベースの多量体は、官能性環状構造、たとえばベンゼン環およびデキストランを含む。たとえば、米国特許第５，６３５，３６３号明細書、米国特許出願公開第２００４／２０９２９５号明細書、国際公開第０２／０７２６３１号パンフレットおよび国際公開第９９／４２５９７号パンフレットを参照されたい。多量体化ドメインへの結合は、たとえば、多量体化ドメインの反応基（たとえばデキストランポリマー上のビニルスルホン官能基）とセマフォリンタンパク質上の反応基（たとえばタンパク質表面上のアミノ基）との間の化学反応により、またはセマフォリンタンパク質の一部（たとえば、ビオチン化ペプチド成分）と多量体化ドメイン（たとえばストレプトアビジン４量体タンパク質上のビオチンの４つの結合部位）との間の非共有結合性相互作用により、共有結合を介しても、あるいは非共有結合を介してもよい。セマフォリンと多量体化ドメインとの共有結合に適切な化学反応は、求電子試薬の活性化による求核置換（たとえばアシル化、たとえばアミドの形成、ピラゾロンの形成、イソオキサゾロンの形成；アルキル化；ビニル化；ジスルフィドの形成）、炭素−ヘテロ多重結合への付加（たとえばアルデヒドまたはケトンとホスホネートの反応によるアルケンの形成；アリール化；アルキルボロネートまたはエノールエーテルとの反応によるアレーン／ヘタレーンのアルキル化）、求核試薬の活性化を用いた求核置換（たとえば縮合；エノールエーテルまたはエナミンによる脂肪族ハライドまたはトシレートのアルキル化）、および付加環化を含む。１つまたは複数の多量体化ドメインとセマフォリンタンパク質との間に非共有結合性相互作用を与えるのに適切な分子は、以下の分子ペアおよび分子：ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、抗体／抗原、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ／ＰＮＡ、ＬＮＡ／ＤＮＡ、ロイシンジッパー、たとえばＦｏｓ／Ｊｕｎ、ＩｇＧ２量体タンパク質、ＩｇＭ多価タンパク質、酸／塩基コイルドコイルヘリックス、キレート／金属イオン結合キレート、ストレプトアビジン（ＳＡ）およびアビジンならびにその誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体（モノクローナル、ポリクローナルおよび組換え体）、抗体フラグメントおよびその誘導体、ＡＰ−１のロイシンジッパードメイン（ｊｕｎおよびｆｏｓ）、ヘキサ−ｈｉｓ（金属キレート部分）、ヘキサ−ｈａｔ  ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、カルモジュリン−結合ペプチド（ＣＢＰ）、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、Ｓ−ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応エピトープ、エピトープタグ、Ｅ２Ｔａｇ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１およびＡＵ５エピトープ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳピトープ、Ｂｔａｇエピトープ、プロテインキナーゼ−Ｃエピトープ、ＶＳＶエピトープ、糖質、���質およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレクチン、たとえばＣｏｎ  Ａ（カナバリア・エンシフォルミス（Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ））またはＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素）、およびテトラネクチンまたはＰｒｏｔｅｉｎ  ＡもしくはＧ（抗体親和性）を含む。こうした結合物質の組み合わせも含まれる。特に、ＭＨＣ複合体をタグ化する場合、多量体化ドメインは、「抗タグ」であってもよい。「抗タグ」は、タグに結合している抗体およびこうしたタグに結合できる他の任意の分子を意味する。多量体技術については、さらにＭｅｋｈａｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１１，１：１２４も参照されたい。
【０１１０】
本発明の小分子阻害剤およびアゴニスト
本発明は、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１：セマフォリン軸の小分子阻害剤およびアゴニストをさらに包含する。小分子は、一般に低分子量（好ましくは約２０００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満、または約５００ダルトン未満）を有する様々なグループの合成物質および天然物質である。小分子は、以下に限定されるものではないが、たとえば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチド模造物、糖質、脂質または他の有機（炭素を含む）分子または無機分子であってもよく、合成でも、あるいは天然に存在しても、あるいは任意選択的に誘導体化されていてもよい。こうした小分子は、治療送達が可能な物質であってもよいし、あるいは送達または標的化しやいすいようにさらに誘導体化してもよい。こうした小分子は、天然の供給源（たとえば、植物、真菌、微生物および同種のもの）から単離しても、あるいは合成もしくは天然化合物のランダムまたはコンビナトリアル化学ライブラリーから単離しても、あるいは合成してもよい。Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ５（１）：３２−６を参照されたい。使用できる多くのランダムまたはコンビナトリアルライブラリーが、当該技術分野において公知である。現在、糖類、ペプチドおよび核酸を用いた化合物のランダム合成および指向性合成(directed synthesis)用に、多くの手段が使用されている。合成化合物のライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，Ｎ．Ｈ．）およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。希少な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、たとえばＰａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｎ．Ｃ．）から入手可能であるか、または容易に作製可能である。加えて、天然および人工的に作成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段により容易に修飾できる（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｔｉｂ  Ｔｅｃｈ  １４：６０）。
【０１１１】
分子のライブラリーを調製するための方法は当該技術分野において周知であり、多くのライブラリーが市販されている。本発明の対象となるライブラリーとして、ペプチドライブラリー、ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリー、合成有機コンビナトリアルライブラリーおよび同種のものが挙げられる。縮重ペプチドライブラリーは、溶液中で固定化した形態で細菌鞭毛ペプチドディスプレイライブラリーとしてまたはファージディスプレイライブラリーとして容易に調製することができる。ペプチドリガンドは、少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択することができる。ライブラリーは、ペプトイドおよび非ペプチド合成部分から合成してもよい。こうしたライブラリーをさらに合成してもよく、そうしたライブラリーは、その天然に存在する対応物と比較して酵素分解を受けにくい非ペプチド合成部分を含む。ライブラリーは、たとえば、以下に限定されるものではないが、ペプチドオンプラスミド（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｎ−ｐｌａｓｍｉｄ）ライブラリー、ポリソームライブラリー、アプタマーライブラリー、合成ペプチドライブラリー、合成小分子ライブラリーおよび化学ライブラリーを含むことを意図している。ライブラリーは、環状炭素もしくは複素環構造、および／または、上記の官能基の１つまたは複数で置換された芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでもよい。
【０１１２】
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２；１９９３年１０月１４日付けの国際公開第９３／２０２４２号パンフレット；およびＢｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３に記載されている。
【０１１３】
ファージディスプレイライブラリーの例は、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；および国際公開第９４／１８３１８号パンフレットに記載されている。
【０１１４】
ライブラリーのスクリーニングは、一般に知られた任意の様々な方法により達成することができる。たとえば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示している以下の参考文献を参照されたい：Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２；すべてＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，０９６，８１５号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；および同第５，１９８，３４６号明細書；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３；ならびに国際公開第９４／１８３１８号パンフレット。
【０１１５】
Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストおよびアンタゴニストの同定およびスクリーニングは、たとえば、Ｘ線結晶解析、中性子回折、核磁気共鳴分析および構造決定のための他の技術を用いて、関連するタンパク質の構造的特徴を決定することによりさらに行いやすくすることができる。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的設計または同定に対応する。
【０１１６】
ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１もしくはセマフォリンの発現または下流の分子イベントに影響を与える化合物
上記に記載したように、本発明は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１発現を阻害する、または通常型Ｔ細胞上のセマフォリン発現を局所的に（たとえば、腫瘍において）阻害する、またはＮｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止するＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤をさらに包含する。
【０１１７】
本発明は、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１発現を強化する、または通常型Ｔ細胞上のセマフォリン発現を局所的に（たとえば、糖尿病の膵島において）強化する、またはＮｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を強化する、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストをさらに包含する。
【０１１８】
有用な発現阻害剤の非限定的な例として、たとえば、干渉ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸が挙げられる。発現強化の非限定的な例として、たとえば、レトロウイルス遺伝子導入、レンチウイルス遺伝子導入、プラスミドおよびトランスフェクションを用いた過剰発現が挙げられる。
【０１１９】
アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡの分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡへの結合によりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止し、タンパク質翻訳を防止する働きをする。たとえば、従来のホスホジエステル技術により、たとえば、標的ＤＮＡ配列の特有の領域と相補的な少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Ｄａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１２（４）：ＲＡ６７−７４；Ｋａｌｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：１７３−９６；Ｌｕｔｚｅｌｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：２４３−５９）。
【０１２０】
ｓｉＲＮＡは、典型的には１５〜５０塩基対、好ましくは２１〜２５塩基対を含み、細胞内に発現した標的遺伝子またはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。アンチセンスポリヌクレオチドとして、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび同種のものがあるが、これに限定されるものではない。
【０１２１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ＤＮＡは、たとえばＵ６プロモーターなどのプロモーターを含む。こうしたＤＮＡは転写されて、ｓｉＲＮＡとして機能することができるスモールヘアピンＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡとして機能し得る線状ＲＮＡを細胞内に産生し得る。阻害剤はインビトロで重合されてもよく、組換えＲＮＡはキメラ配列またはこれら群の誘導体を含む。阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または標的ＲＮＡおよび／もしくは遺伝子が阻害されるような任意の好適な組み合わせを含んでもよい。さらに、これらの核酸の形態は、一本鎖でも、二本鎖でも、三本鎖でも、あるいは四本鎖でもよい。（たとえばＢａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８  ４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４  ４９８；および国際公開第００／４４８９５号パンフレット、国際公開第０１／３６６４６号パンフレット、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第００／０１８４６号パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、国際公開第９９／０７４０９号パンフレット、国際公開第００／４４９１４号パンフレットを参照）。
【０１２２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイム作用のメカニズムには、相補的な標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼ切断が関係する。ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的かつ効率的に触媒する操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子も、本発明の範囲内にある。標的分子について以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位を調査すると、任意の有望なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位が最初に特定される。特定されたなら、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列について、予想される構造的特徴、たとえばオリゴヌクレオチド配列を不適なものにし得る二次構造を評価すればよい。候補標的の適合性も、たとえば、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、その相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの利用可能性を試験することにより評価することができる。
【０１２３】
本発明の発現阻害剤は、既知の方法により調製することができる。これらの方法は、たとえば、固相ホスホロアミダイト化学合成による化学合成の技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写により作製することもできる。こうしたＤＮＡ配列は、好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、たとえばＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。たとえば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
【０１２４】
本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な修飾は、細胞内の安定性を高め、半減期を延長する手段として導入してもよい。考えられる修飾として、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用があるが、これに限定されるものではない。
【０１２５】
多種多様な標的分子に結合するアプタマー核酸配列は、容易に作製される。本発明のアプタマー核酸配列は、完全にもしくは部分的にＲＮＡからなっても、または完全にもしくは部分的にＤＮＡからなっても、および／または、他のヌクレオチドアナログからなってもよい。アプタマーは典型的には、ＳＥＬＥＸとして知られる公知のインビボまたはインビトロ（最も典型的には、インビトロ）選択技術を利用することにより、特定のリガンドに結合するように開発される（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）。アプタマーの作製方法は、たとえば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８、Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５，米国特許第５，５８２，９８１号明細書；国際公開第００／２００４０号パンフレット；米国特許第５，２７０，１６３号明細書；Ｌｏｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：９７３；Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：９７２６；Ｂｌｉｎｄ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３６０６−３６１０；Ｈｕｉｚｅｎｇａ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：６５６−６６５；国際公開第９９／５４５０６号パンフレット、国際公開第９９／２７１３３号パンフレットおよび国際公開第９７／４２３１７号パンフレット；ならびに米国特許第５，７５６，２９１号明細書に記載されている。
【０１２６】
１つの特定の実施形態では、Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡ（Ｃ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフ）を含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインとＰＴＥＮタンパク質との間のシグナル伝達経路を阻害する。こうした阻害剤は、たとえば、Ｃ末端アミノ酸配列ＳＥＡを含むＮｒｐ１タンパク質の細胞質ドメインの全部または一部を含むＮｒｐ１タンパク質のペプチドもしくは小分子もしくはフラグメントまたはその誘導体もしくはアナログであってもよい。
本発明の阻害剤またはアゴニスト組成物を投与するための方法
ある種の実施形態では、本発明の阻害剤およびアゴニストは、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と共に医薬組成物として製剤化される。本化合物は、ヒトまたは動物医学に使用するのに都合のよい任意の方法で投与されるように製剤化してもよい。本組成物中には、湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのほか、着色剤、放出剤(release agent)、コーティング剤、防腐剤および酸化防止剤がさらに存在してもよい。
【０１２７】
製剤は好都合には単位剤形で提供さてもよく、当該技術分野において周知の任意の方法により調製することができる。単一剤形を製造するのにキャリア材料と組み合わせてもよい活性成分の量は、処置対象の宿主および特定の投与モードによって異なる。単一剤形を製造するのにキャリア材料と組み合わせてもよい活性成分の量は、一般に治療効果を発揮する化合物の量である。
【０１２８】
一般に製剤は、液体キャリアもしくは微粉化した固体キャリア、またはその両方を用いて調製し、次いで必要に応じて製品に成形してもよい。
【０１２９】
経口投与用の製剤は、各々所定の量の１種または複数種の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤の形態であってもよいし、あるいは水性液体または非水性液体中の溶液剤もしくは懸濁剤または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンおよび同種のものとしてもよい。
【０１３０】
経口投与用の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤および同種のもの）では、１種または複数種の活性成分を１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア、たとえばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または、以下の（１）充填剤または増量剤、たとえばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）バインダー、たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）保湿剤、たとえばグリセロール；（４）崩壊剤、たとえば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延化剤、たとえばパラフィン；（６）吸収促進剤、たとえば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、たとえば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、たとえばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、たとえばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤のいずれかと混合してもよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤をさらに含む。同様の種類の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤のほか、高分子量ポリエチレングリコールおよび同種のものを用いて軟および硬ゼラチンカプセルの充填剤として利用してもよい。
【０１３１】
懸濁剤は、１種または複数種の活性成分に加えて、懸濁化剤、たとえばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天ならびにトラガントおよびこれらの混合物を含んでもよい。
【０１３２】
本発明の組成物はさらに、皮膚あるいは粘膜に局所投与することができる。これは、副作用を引き起こす可能性が最も低い直接送達の最大の機会を提供する。局所製剤は、皮膚または角質層の浸透促進剤として効果的であることが知られている多種多様の作用物質の１種または複数種をさらに含んでもよい。これらの例には、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドおよびアゾンがある。製剤を化粧品的に許容されるものにするため、別の作用物質をさらに含ませてもよい。これらの例には、脂肪、ワックス、油、色素、香料、防腐剤、安定剤および界面活性剤がある。さらに角質溶解薬、たとえば当該技術分野において公知のものを含めてもよい。例にはサリチル酸および硫黄がある。
【０１３３】
局所投与または経皮投与の剤形として、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤が挙げられる。本治療薬は、滅菌条件下で薬学的に許容されるキャリア、および必要とされる場合がある任意の防腐剤、緩衝液または噴霧剤と混合してもよい。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、当該ポリペプチド剤に加えて、賦形剤、たとえば動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物を含んでもよい。
【０１３４】
散剤およびスプレー剤は、１種または複数種の活性成分に加えて、賦形剤、たとえばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含んでもよい。スプレー剤はさらに、通常の噴霧剤、たとえばクロロフルオロヒドロカーボンおよび揮発性の非置換炭化水素、たとえばブタンおよびプロパンを含んでもよい。
【０１３５】
非経口投与に好適な医薬組成物は、１種または複数種の活性成分と組み合わせて、１種または複数種の薬学的に許容される等張な無菌の水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用直前に無菌の注射用溶液もしくは分散液に再溶解できる無菌の粉末を含んでもよく、これらは、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、製剤を予定のレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい。本開示の医薬組成物に利用してもよい好適な水性および非水性キャリアの例として、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび同種のもの）およびこれらの好適な混合物、植物油、たとえばオリーブ油、ならびに注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、たとえば、コーティング材料、たとえばレシチンの使用、分散液の場合、必要とされる粒度の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１３６】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をさらに含んでもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸および同種のものを含めることで確保することができる。さらに組成物に等張剤、たとえば糖、塩化ナトリウムおよび同種のものを含めると望ましい場合がある。さらに、注射用医薬品形態の吸収の持続化は、吸収を遅延させる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることで行うことができる。
【０１３７】
注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、たとえばポリラクチド−ポリグリコリドで１種または複数種の活性成分のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造することができる。活性成分とポリマーとの比および利用する特定のポリマーの性質に応じて、アンタゴニストの放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射用製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンにアンタゴニストを封入することによっても調製される。
【０１３８】
膣内または直腸投与用の製剤は、たとえば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチレートを含み、室温で固体だが、体温で液体であり、したがって直腸または膣腔で融解して活性化合物を放出する１種または複数種の好適な非刺激性賦形剤またはキャリアと、１種または複数種の活性成分を混合することにより調製することができる坐剤として提供してもよい。
【実施例】
【０１３９】
以下の例によって本発明をさらに記載および説明する。しかしながら、本明細書のどの箇所でそうした例および他の例を使用しても、単に例示のためのものであり、いかなる意味においても本発明または任意に例示した用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載する任意の特定の好ましい実施形態に限定されるものではない。実際に、本明細書を読むと本発明の多くの修正および変形が当業者に明らかになるかもしれないが、そうした変形は、本発明の精神または範囲を逸脱することなくなすことができる。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲の用語と共に、その特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ限定される。
【０１４０】
実施例１
材料および方法
マウス。Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびｄｎＴＧＦβＲＩＩマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。Ｆｏｘｐ３ＹＦＰ−ｉＣｒｅ、Ｆｏｘｐ３−マウスおよびＦｏｘｐ３ＤＴＲ−ｇｆｐマウスは、Ａ．Ｙ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ（ＨＨＭＩ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｒｕｂｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００８，２８：５４６−５５８；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，４（４）：３３０−３３６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００７，８（２）：１９１−１９７を参照されたい）から入手した。Ｉｌ１０−／−マウスは、Ｔ．Ｇｅｉｇｅｒ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ；Ｓｅｌｖａｒａｊ  ａｎｄ  Ｇｅｉｇｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１８０（５）：２８３０−２８３８を参照されたい）から入手した。Ｎｒｐ１ｆ／ｆマウスは、Ｄ．Ｃｈｅｒｅｓｈ（ＵＣＳＤ；Ａｃｅｖｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００８，１１１（５）：２６７４−２６８０を参照されたい）から入手した。Ｆｏｘｐ３−×ＣＤ４５．１マウスは、ヘテロ接合交雑から繁殖させた。動物実験は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＣｅｎｔｅｒのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ公認の特定病原体の感染していない（ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）施設で行った。動物プロトコルは、Ｓｔ  Ｊｕｄｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０１４１】
Ｎｒｐ１抗体およびセマフォリン抗体。マウスＳｅｍａ−３ａ、マウスＮｒｐ１およびヒトＳｅｍａ４ａ−Ｉｇは、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。実験には、以下の２つの異なるＮｒｐ１遮断抗体を使用した：（ｉ）Ｒ＆Ｄ  ＡＦ５６６は、抗Ｎｒｐ１マウス／ラットアフィニティー精製ポリクローナル抗体（ヤギＩｇＧ）であり、（ｉｉ）抗Ｎｒｐ１モノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供された（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃｌｏｎｅ  ７６１７０４，ＭＡＢ５９９４１）。セマフォリン−４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）に対する以下の抗体を使用した：ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのｃｌｏｎｅ  ５Ｅ３およびＲ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ７５７１２９）（たとえば、図１Ｅ、図２Ｈ、図４Ｉを参照されたい）。Ｓｅｍａ４ａ染色抗体は、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｃｌｏｎｅ  ５Ｅ３）から購入し、室内でビオチンまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７にコンジュゲートした。大部分のフローサイトメトリー抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。抗Ｆｏｘｐ３および抗ＥｏｍｅｓはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＫＬＦ２抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）抗体、ホスホ−Ｓ６Ｋ１（Ｔ４２１／Ｓ４２４）抗体、Ｆｏｘｏ３ａ抗体およびｐａｎ  Ａｋｔ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＰＴＥＮ−ＨＲＰ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【０１４２】
ＲＮＡ干渉。対照ｓｉＲＮＡ（カタログ＃４３９０８４３）およびＳｅｍａ４ａ（カタログ＃４３９０７７１、ｓｉＲＮＡ＃  ｓ７３５４７）ｓｉＲＮＡのプールは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、製造者の指示通りに再懸濁した。通常型のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ネガティブセレクションにより磁気的に選別し、Ａｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）により３００ｐＭｏｌのｓｉＲＮＡおよび２μｇのｐＭａｘＧＦＰ対照プラスミドをトランスフェクトし、Ａｍａｘａヌクレオフェクター培地で一晩放置した。次いでＧＦＰ、ＣＤ２５およびＣＤ４５ＲＢの発現に基づき細胞を選別し、トランスウェル抑制アッセイの上部ウェルでＴｒｅｇ細胞と共培養した。
【０１４３】
プラスミド。Ｎｒｐ１．ｍＣｈｅｒｒｙをＡｄｄｇｅｎｅから入手し、レトロウイルス過剰発現コンストラクトを作製する鋳型とした使用した。Ｎｒｐ１ＷＴをネイティブなシグナル配列を加えて作製し、ｐＭＩＣｈｅｒｒｙにクローニングした。Ｎｒｐ１ΔＳＥＡはＷＴコンストラクトから作製し、セリンコドンを終止コドンに変異させて末端のＳＥＡモチーフを欠失させた。ＡｋｔＷＴ、ＡｋｔＤＮ（Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１：７２７−７３６に記載されたドミナントネガティブキナーゼ死亡Ｋ１７９Ｍ（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ  Ｋ１７９Ｍ））、およびｐＢａｂｅ空ベクターは、Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ＪＰ，Ｌａｎｄ  Ｈ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（１２）：３５８７−９６に記載）から入手した。
【０１４４】
ヒトＴ細胞集団。ヒト臍帯サンプルは、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＢａｎｋのＢ．Ｔｒｉｐｌｅｔｔ、Ｍ．ＨｏｗａｒｄおよびＭ．ＭｃＫｅｎｎａから提供され、母親からインフォームドコンセントを得て経腟分娩の直後に臍静脈から採取手し、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により承認された。研究使用は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  ＩＲＢにより承認された。
【０１４５】
トランスウェル抑制。ＦＡＣＳにより精製された１．２５×１０４Ｔｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＢｌｏＦｏｘｐ３ＹＦＰ−ｉＣｒｅ＋）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ９６の上部チャンバー（細孔サイズ０．４μｍ）において、選別したＴｃｏｎｖ（ＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ２５−ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋）またはＴｒｅｇの存在下１：４の比率で、Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはＩｇＧコンジュゲートラテックスビーズ（１：１の比率）の存在下、抗ＣＤ３（１４５．２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（３７．５１）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手）コンジュゲートラテックスビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）（１：１の比率）の存在下、および／または中和抗体の存在下で刺激した。一部の実験では、上部ウェルの共培養細胞を２％ＰＦＡで１５分間固定し、Ｔｒｅｇとの共培養の前に十分に洗浄した。精製した２．５×１０４Ｔｒｅｇを、下部ウェルにおいて１：１の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズにて刺激した。細胞を７２時間培養し、最後の８時間３［Ｈ］−チミジンでパルスした。下部チャンバーを回収し、βタカウンターで読み取った。
【０１４６】
ヒトの研究では、選別した臍帯血Ｔｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）を、３μｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３（ｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８（ｃｌｏｎｅ  ＣＤ２８．１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）で７〜９日間活性化した。回収および洗浄後、トランスウェルプレート(Transwell plate)の上部ウェルにおいてＴｒｅｇを、固定自家ＴｃｏｎｖまたはＩｇＧ／Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇコートラテックスビーズにて１：２００の比率で刺激した。下部ウェルでは２．５×１０４Ｔｃｏｎｖを、ＯＫＴ３／ＣＤ２８．１コートラテックスビーズにて１：１の比率で刺激した。細胞を５日間培養し、３［Ｈ］−チミジンで最後の８時間パルスした。下部チャンバーを回収し、βタカウンターで読み取った。
【０１４７】
実験全体を正規化するため「トランスウェル抑制率」は、１００−１００×［（特定のウェルのＣＰＭ）／（非抑制細胞の平均ＣＰＭ）］と定義する。
【０１４８】
融合タンパク質。Ｓｅｍａ４ａまたはＮｒｐ１の細胞外ドメインをコードする配列をｐＸ−Ｉｇにインフレームでクローニングして、Ｓｅｍａ４ａ−またはＮｒｐ１−マウスＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクト（Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはＮｒｐ１−Ｉｇ）を作製した。このコンストラクトをＪ５５８Ｌ  Ｂ細胞にエレクトロポレーションし、単一細胞ソーティングにより高産生クローンを選択した。高産生クローンをＳａｒｔｏｒｉｏｕｓバイオリアクターに播種し、プロテインＧ精製および濃縮のため回収した。スルフェートラテックス４μｍビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１ビーズあたり３ｐｇのタンパク質でアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１、ＭＯＰＣ２１、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇと一晩コンジュゲートし、１０％ＦＢＳでブロッキングし、培地で保存した。マウスＳｅｍａ−３ａ−Ｆｃ、Ｓｅｍａ４ａ−Ｆｃ、マウスＮｒｐ１、およびヒトＳｅｍａ４ａ−Ｆｃは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１４９】
結合アッセイ。高タンパク結合プレート(high protein binding plate)をＰＢＳ中、５００ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＮｒｐ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））で一晩コートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて室温で１〜２時間のブロッキング後、抗Ｓｅｍａ４ａ抗体、抗Ｎｒｐ１抗体またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で、コートプレートを様々な濃度のＳｅｍａ４ａ−ＩｇまたはマウスＩｇＧ１と２〜４時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０で１０回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのビオチン化抗マウスＩｇＧ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートして融合タンパク質（またはマウスＩｇＧ１対照）に結合した。７回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５００ｎｇ／ｍＬで加えてビオチン化抗体を検出した。さらに７回洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、１ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。
【０１５０】
ＶＥＧＦ結合でも、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇを使用しない以外は、同じプロトコルに従い、ＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中５０ｎｇ／ｍＬで使用し、５００ｎｇ／ｍＬの抗ＶＥＧＦ−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、続いてＳＡ−ＨＲＰで検出した。Ｓｅｍａファミリーメンバー全体の比較のため、プレートを様々な濃度のＳｅｍａ３ａ−Ｆｃ、Ｓｅｍａ４ｄ−Ｆｃ、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇまたはアイソタイプコントロールで一晩コートした。ビオチン化Ｎｒｐ１−Ｉｇを加え、３時間インキュベートし、検出のためＳＡ−ＨＲＰを使用した。
【０１５１】
ｍＲＮＡ解析。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解した細胞からＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。リアルタイムＰＣＲは、プライマーおよびプローブとＴａｑＭａｎマスターミックスまたはＳＹＢＲグリーン化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【０１５２】
Ｆｏｘｐ３欠乏自己免疫のレスキュー。ＣＤ４５．１×Ｆｏｘｐ３＋／−雌マウスをＣＤ４５．１雄マウスに定期繁殖(timed breeding)で交配した。出産時に雄の子孫についてＦｏｘｐ３−状況を調べた。フローサイトメトリーにより精製した１×１０６精製Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＣＤ４５．２＋Ｔｒｅｇを生後３日以内にＦｏｘｐ３−雄仔腹腔内に注射した。マウスについてｓｃｕｒｆｙ表現型（魚鱗癬、眼の炎症、ラント表現型および運動性の欠如）をモニターした。一部の実験では、耳介、肝臓および肺の組織学的解析のためすべてのマウスを５週で屠殺した。
【０１５３】
腫瘍モデル。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ、Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅ、またはＦｏｘｐ３ＤＴＲ．ｇｆｐマウスにＢ１６．Ｆ１０メラノーマ（１．２５×１０５細胞ｉ．ｄ．）、ＥＬ４胸腺腫（１．２５×１０５細胞ｉ．ｄ．）、またはＭＣ３８結腸癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（２．５×１０５  細胞ｓ．ｃ．）を注射した。腫瘍をデジタルカリパスで定期的に測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍およびリンパ節を解析のため回収した。ＴＩＬは、機械的破砕後、腫瘍サンプルからパーコールグラジエントを用いて調製した。転移研究では、Ｂ１６．Ｆ１０を様々な用量で静脈内注射した。１７〜２０日後、肺を回収し、Ｈ２Ｏ２で膨張させ、転移を数えた。Ｂ１６治療実験は、注射を１．２５×１０５Ｂ１６メラノーマ細胞をｉ．ｄ．注射し、腫瘍が触知可能になるまで待った（５日）。５日目に、マウスにラットＩｇＧ２ａあるいは抗Ｎｒｐ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃｌｏｎｅ  ７６１７０４）の腹腔内注射の投与を開始した（初回量４００μｇおよび３日ごとに２００μｇ）。
【０１５４】
実験的大腸炎。６〜８週齢のＲＡＧ２−／−マウスに４×１０５のコンジェニックマーカーで標識された(congenically marked)ＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ２５−Ｔｃｏｎｖ細胞を腹腔内注射した。２１〜２８日後（大部分のマウスの体重が５％減少し、大腸炎症状を有した）、１×１０６のＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを腹腔内に注射した。体重を１日１回測定し、Ｔｒｅｇレスキューから２８日後、切片を組織学的検査のため染色した。
【０１５５】
シグナル伝達解析。フローサイトメトリーでは、Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３ｅ／抗ＣＤ２８コートビーズ、および精製された通常型Ｔ細胞あるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇビーズで様々な回数刺激し、次いで１％ＰＦＡで３７℃にて１５分間固定した。次いで細胞を−２０℃で２０分間氷冷９０％ＭｅＯＨにて透過処理した。ＰＢＳで十分な洗浄後、細胞を、１０％正常マウス血清を含むＰＢＳでＲＴにて１０分間ブロッキングした。次いで細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の抗体（ｐＡｋｔ（Ｔ３０８）、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３））で暗所、ＲＴにて１時間染色した。最後に、細胞を適切な二次抗体で３０分間暗所、ＲＴにて染色し、次いで洗浄し、解析した。イムノブロット解析では、５００ＵのｒｈＩＬ−２と共に１ｎｇ／ｍＬのホルボール−１３−ミリストールアセテートおよび１０ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンでＴｒｅｇを３日間増幅し、次いで十分に培地で洗浄し、５００ＵのｒｈＩＬ−２を用いて１０倍量に増幅した。ＩＬ−２を用いずに一晩放置後、Ｔｒｅｇを、プレート結合抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８およびビーズ結合Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇで３時間刺激し、次いで氷上にて全細胞溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、ＴＷＥＥＮ−２０）で１５分間溶解した。一部の実験では、３×１０６のＴｒｅｇをより大量に溶解し、清澄なライセートをプロテインＧビーズと３時間インキュベートしてライセート「をプレクリアした」。Ｎｒｐ１を、ポリクローナル抗Ｎｒｐ１抗体（Ｒ＆Ｄ  ＡＦ５６６）を用いて一晩免疫沈降させ、続いてプロテインＧビーズと３時間インキュベートした。免疫ブロットに先立つ溶出および還元の前に、ビーズを溶解緩衝液で洗浄した。簡単に説明すると、沈殿物またはインプットライセートを２−メルカプト−エタノールおよび４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１００℃でインキュベートし、次いで４〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、２００Ｖで１時間泳動した。分離したゲルをＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）によりＰＶＤＦ膜に電気転写し、０．１％ＴＷＥＥＮ２０を追加した３％ＢＳＡを含むＴＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキングした膜をＨＲＰに直接コンジュゲートした抗ＰＴＥＮと一晩インキュベートし、ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮで３回洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ＥＣＬを用いて画像化した。
【０１５６】
レトロウイルスによる形質導入。２９３Ｔ細胞に、ｐＰＡＭ−ＥＱおよびｐＶＳＶ−Ｇパッケージングプラスミドを用いて様々なレトロウイルスコンストラクトをトランスフェクトして、ＧＰＥ８６レトロウイルスプロデューサー細胞を形質導入した。Ｔｒｅｇ細胞は、フローサイトメトリーにより精製した。Ｔｒｅｇを、９６ウェル平底プレートにおいて１００μＬ中、５×１０４／ウェルで２４時間５００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２の存在下、ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化し、細胞周期を進行させた(cycled)。ウイルス上清を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯの濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０倍濃縮し、周期が進行しているＴｒｅｇ細胞に５００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２および６μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下、等量で加え、２５００ｒｐｍ、３７℃で６０分遠心し、次いで２４時間インキュベートした。スピンダクション（spinduction）プロセスを２４時間おきに２回繰り返し、培養Ｔｒｅｇから１００μＬの上清を毎日除去して、培養液量を２００μＬ／ウェルに維持した。次いでＴｒｅｇ細胞を培地で洗浄し、蛍光タンパク質発現に基づき選別するか、または１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択し、ＩＬ−２でさらに増幅した。蛍光タンパク質または細胞内エピトープ染色（抗ＨＡ、Ｓｉｇｍａ）は、使用前に確認した。機能アッセイは、２４時間放置後にＩＬ−２を用いずに行った。
【０１５７】
顕微鏡観察。ＩＳ活性化のＴＩＲＦ照明は、以前に記載されているように行った５０。簡単に説明すると、抗ＴＣＲを含む脂質二重層、およびＳｅｍａ４ａ−Ｉｇまたはアイソタイプコントロールをロードした抗マウスＩｇＧ１捕捉抗体を調製した。Ｔｒｅｇ細胞を二重層上で２０分間刺激し、次いで固定し、透過処理し、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）、グローバルホスホチロシン（４Ｇ１０）またはＮｒｐ１に対して染色した。「ｐＡｋｔ＋ＴＣＲクラスターの割合」は、リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）陽性シナプスと、ＴＣＲクラスター形成による読み出しとして形成されたシナプスの総数との比率を表す。Ｆｏｘｏ３ａについては、培地で一晩未刺激のままであったか、あるいは固定化したＳｅｍａ４ａ−Ｉｇまたはそのアイソタイプコントロールの存在下または非存在下、固定化した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激した単離したばかりのＴｒｅｇ上で行った。細胞を回収し、１％ＰＦＡで固定し、０．１％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳで透過処理した。正常マウス血清でブロッキング後、細胞をトリス緩衝１％ＢＳＡ中、抗Ｆｏｘｏ３ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一晩染色した。数回の洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、次いで数回洗浄した。次いで顕微鏡観察前に細胞にＤＡＰＩおよびファロイジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６または４８８をロードした。スピニングディスクレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、１０〜３０細胞のランダムフィールドを可視化した。ファロイジンおよびＤＡＰＩ染色を用いて盲検マスク(blinded mask)を作製して、細胞質および核の体積をそれぞれ判定し、その後ようやくＦｏｘｏ３ａ染色を可視化した。２０〜３０スタックのＦｏｘｏ３ａ蛍光の核および細胞質の体積を、Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ（３ｉ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて任意蛍光単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）で計算し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで解析した。
【０１５８】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイおよび解析。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを、６〜８週齢マウスから９９．０％純度にフローサイトメトリーにより選別し、プレート結合抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２、およびアイソタイプあるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇコートラテックスビーズで４８時間刺激した。細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で溶解した。品質は、ＵＶ分光光度法およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）による解析により確認された。全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を処理し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ３’ＩＶＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓのプロトコルに従いＨａｒｔｗｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓで標識し、マウスハイスループット４３０  ＰＭ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ上にアレイ化した。シグナルデータはＲＭＡを用いてサマライズし、可視化し、品質は主成分分析（ＰＣＡ）（Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．６  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ，ＵＳＡ）により点検した。異なる日付にスキャンした、完全に反復された実験の差を補正する必要に応じて、バッチ補正（ｂａｔｃｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を適用した。Ｔｃｏｎｖ細胞を休止Ｔｒｅｇと比較するため、各プローブセットに不等分散ｔ検定を適用し、ｌｏｇ２比を計算した。この同じ解析を使用してＴｃｏｎｖ細胞を活性化Ｔｒｅｇ細胞と比較した。野生型Ｔｒｅｇ細胞におけるＳｅｍａ４ａ処理の作用をＮｒｐ１欠乏細胞におけるｓｅｍａ処理の作用と比較するため、各プローブセットに処理および遺伝子型の２要因ＡＮＯＶＡ交互作用（two factor ANOVA interaction）を適用し、Ｓｔｏｒｅｙのｑ値が多重比較を補正することが分かった。各プローブセットのカテゴリーの平均を確認し、Ｚスコアに変換し、階層的クラスタリングを行い、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ  ９．１（Ｔｉｂｃｏ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ  ＭＡ，ＵＳＡ）のヒートマップにより可視化した（図１Ａ）。図１１Ｂのヒートマップは、相互作用のｐ値が１０％のＦＤＲをパスし、１クラスの最小平均発現が６であり、かつ最小絶対値ｌｏｇ比の差が少なくとも０．５である上位に指定された遺伝子からなる。ボルケーノプロット（ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ）は、ＳＴＡＴＡ／ＳＥ  １１．１（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて作成した。すべてのボルケーノプロット（ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ）について、公式シンボル（ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｓｙｍｂｏｌ）または名称を有さない遺伝子を除外した。これらのプロットでは、スコアは、−ｌｏｇ１０変換されたｐ値をいう。相互作用ボルケーノプロット（ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ）の遺伝子では、原点からの距離の尺度（｜（スコア／１０＋｜ｌｏｇ比の差｜）／２｜＞０．５）を適用して、グラフを色分けした。統計的検定および多重比較の補正は、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．６（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて行った。Ｔｃｏｎｖ細胞と活性化Ｔｒｅｇ細胞との間の差が少���くとも３倍で、０．０１がｐ値であるプローブセットの配列を検索し、次いでこれらの配列をＳｉｇｎａｌＰ  ３．０ソフトウェアを用いて試験して膜貫通ドメインを同定した。
【０１５９】
結果
セマフォリン４ａは、Ｔｒｅｇ活性を刺激する、Ｔｃｏｎｖに発現するリガンドである
本発明者および共同研究者らは以前に、共培養した通常型ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の存在下または非存在下で刺激したＴｒｅｇの転写および機能的プロファイルが著しく異なることを示唆したことがある１２，１３。Ｔｒｅｇは、上部チャンバーに入れたＴｃｏｎｖと直接接触した場合のみ、透過性トランスウェル膜を通過するＴｃｏｎｖを抑制することができる（本明細書でトランスウェル抑制という）ことから、Ｔｒｅｇ機能を強化する接触依存性メカニズムが示唆される１２。本発明者らは、この特徴的なＴｒｅｇ活性および転写プロファイルを誘導するシグナルを決定しようとした。本発明者らは、Ｔｒｅｇが「自己ブーストする」ことができないことから、この活性を媒介するリガンドがＴｒｅｇではなくＴｃｏｎｖに発現し得るとの仮説を立てた。実際、単独、または追加の生もしくは固定したＦｏｘｐ３＋ＴｒｅｇもしくはＢ２２０＋Ｂ細胞との共培養で刺激したＴｒｅｇは、上部ウェルにて制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を刺激した際に下部ウェルにて抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズで刺激したＴｃｏｎｖのトランスウェル抑制アッセイにおいて、トランスウェル膜通過の抑制を媒介できなかった（図１Ａ）。一方、固定したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＴｒｅｇは、トランスウェル抑制を増強できたことから、リガンドが細胞表面に発現することが示唆された１２。Ｆｏｘｐ３．ＧＦＰマウスから選別し、抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下で照射ＡＰＣと共にまたは別にインキュベートしたＴｃｏｎｖ集団およびＴｒｅｇ集団のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析を用いて、休止および活性化Ｔｒｅｇ細胞とＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞との間の遺伝子発現を比較した（４８時間後、ＣＤ４およびＧＦＰ発現に基づき再選別した細胞抽出されたＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析に供した）。このリストは、Ｔｃｏｎｖに主に発現する細胞表面発現タンパク質をコードする遺伝子に着目して作成した。このリストから、さらに研究するため上位３種の遺伝子、Ｓｅｍａ４ａ（セマフォリン−４ａ）、Ｔｇｆｂｒ３（トランスフォーミング増殖因子、β受容体ＩＩＩ）およびＩｔｇｂ３（インテグリンβ３；ＣＤ６１）を、免疫調節におけるそれらの役割、およびｑＰＣＲによるＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞とＴｒｅｇおよびＢ２２０＋Ｂ細胞におけるそれらの差次的発現を結び付けるこれまでの研究に基づき、選択した。Ｓｅｍａ４ａおよびＴｇｆｂｒ３はＣＤ８＋Ｔ細胞でも強化されたが、Ｉｔｇｂ３は強化されなかった。次いで本発明者らは、これらの分子がＴｒｅｇ機能を増強する能力を評価するのに使用できる細胞株を同定しようとした。３Ｔ３線維芽細胞は、多量のＴｇｆｂｒ３およびＩｔｇｂ３を発現するが、Ｔｒｅｇのブーストを媒介できないことが明らかになった。一方、３Ｔ３細胞はＳｅｍａ４ａを発現しなかった。総合すると、これらのデータから、軸索活性および免疫制御を調節することが示されている１４Ｓｅｍａ４ａについて、さらに調査することが妥当であることが示唆された。
【０１６０】
Ｓｅｍａ４ａはＴｒｅｇ機能を増強するのに必要かつ十分であるかどうかを判定するため、４つのアプローチを使用した。
【０１６１】
第１に、トランスウェル抑制アッセイにおいてＴｃｏｎｖによるＴｒｅｇブーストの用量依存的阻害が、Ｓｅｍａ４ａ遮断ｍＡｂ（ｃｌｏｎｅ  ５Ｅ３、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で観察された（図１Ｂ）。第２に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｃｏｎｖ細胞におけるＳｅｍａ４ａ発現のｓｉＲＮＡノックダウンにより、Ｔｒｅｇ抑制をブーストするそれらの能力が限定された。これは、（ｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔｃｏｎｖに、スクランブルドｓｉＲＮＡまたはＳｅｍａ４ａ  ｓｉＲＮＡをモックトランスフェクトまたはトランスフェクトした後のトランスウェル抑制アッセイにおいて、および（ｉｉ）ネガティブ磁気分離(negative magnetic separation)を用いて濃縮し、２００ｐＭのスクランブルドｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）またはＳｅｍａ４ａ標的ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ＃４３９０７７１、ｓｉＲＮＡ＃  ｓ７３５４７）（ｓｉＳｅｍａ４ａ）のプールをヌクレオフェクトしたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を再選別し、２４時間抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のトランスフェクションから１６時間後に刺激し、続いてＲＮＡを抽出し、Ｓｅｍａ４ａ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲを行った後に（図１Ｃ）、判定された。
【０１６２】
第３に、３Ａ９  Ｔ細胞ハイブリドーマのＳｅｍａ４ａ喪失変異体は、トランスウェルアッセイにおいてＴｒｅｇ機能をブーストできなかったのに対し、Ｓｅｍａ４ａ喪失変異体のＳｅｍａ４ａ＋クローンまたはＳｅｍａ４ａトランスフェクタントは、Ｔｒｅｇ抑制を増強した（図４）。Ｓｅｍａ４ａ  ３Ｔ３−トランスフェクタント（Ｓｅｍａ４ａ過剰発現コンストラクトを発現するレトロウイルスを形質導入した）も、Ｔｒｅｇのトランスウェル抑制を増強したが、空ベクター対照細胞は、増強しなかった。
【０１６３】
第４に、ビーズにコートしたマウスのＳｅｍａ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔｃｏｎｖ細胞と同等程度に強力なトランスウェル抑制を誘導するのに十分であったが、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールは、十分でなかった（図１Ｄ）。
【０１６４】
さらに抗Ｓｅｍａ４ａ抗体も、Ｔｒｅｇ増強の用量依存的阻害を示した（図１Ｅ）。次いで他の免疫細胞がＳｅｍａ４ａを発現するかどうかを評価した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、低いものの実証可能なＳｅｍａ４ａ発現を示した一方、リンパ節ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）およびＤＸ５＋ナチュラルキラー細胞は、高レベルのＳｅｍａ４ａを発現するようであった（抗Ｓｅｍａ４ａで染色し、フローサイトメトリーで解析した末梢の脾臓／リンパ節調製物で判定された）。興味深いことに、リンパ節ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、Ｓｅｍａ４ａ依存性にＴｒｅｇ抑制を増強することができた（図１Ｅ）。
【０１６５】
次にＳｅｍａ４ａがＴｒｅｇ機能を増強するのに十分であるかどうかを判定した。Ｓｅｍａ４ａ  ３Ｔ３−トランスフェクタントは、Ｔｒｅｇトランスウェル抑制を増強できたが、空ベクター対照細胞はできなかった。重要な点として、ビーズにコートしたマウスのＳｅｍａ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔｃｏｎｖ細胞と同等程度にトランスウェル抑制を誘導するのに十分であったが、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールはそうではなかった（図１Ｄ）。
【０１６６】
全体として、これらのデータから、Ｓｅｍａ４ａはインビトロでＴｒｅｇ機能を増強するのに必要かつ十分であることが示唆される。
【０１６７】
Ｎｒｐ−１は、Ｔｒｅｇの機能および生存のブーストに必要なＳｅｍａ４ａ受容体である
ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）は、クラスＩＩＩセマフォリン、Ｓｅｍａ３ａの共受容体であり、軸索のガイダンスの制御に重要な役割を有する１５。Ｎｒｐ１は、軸索成長円錐の崩壊を誘導し、特権を有する組織への浸潤を防ぎ、マウスで遺伝子を欠損させると、胚性致死が引き起こされる１６。Ｎｒｐ１は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子β（ＰＤＧＦβ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）と相互作用することが示されている１７，１８。Ｎｒｐ１は、Ｔｒｅｇに高発現することが示されており、特に胸腺由来の「天然の」Ｔｒｅｇの有用なマーカーである（Ｆｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３およびニューロピリン発現のフローサイトメトリー解析により判定された）１９−２１。Ｔ細胞におけるＮｒｐ１の役割は示唆されてきたが２２、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１の役割は特定されていない。
【０１６８】
本発明者らは、Ｎｒｐ１が、Ｔｒｅｇ機能の増強を媒介するＳｅｍａ４ａの受容体であり得ると想定した。第１に、Ｎｒｐ１特異的ｍＡｂは、Ｔｒｅｇのブーストをインビトロで阻止することができた（図２Ａ）。Ｓｅｍａ４ａとＮｒｐ１との間の直接の相互作用は、精製された組換えＮｒｐ１およびＳｅｍａ４ａを用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて検証された（図２Ｈ）。重要な点として、Ｎｒｐ１：Ｓｅｍａ相互作用を破壊するが、Ｎｒｐ１：ＶＥＧＦ相互作用を破壊しないＮｒｐ１およびＳｅｍａ４ａのｍＡｂについて、用量依存的阻害が観察された（図２Ｈ）。第２に、Ｎｒｐ１ｆ／ｆおよびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＹＦＰマウスを交配して作製したＮｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇ（本明細書でＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅという）１７，２３は、細胞表面Ｎｒｐ１の発現がなく、Ｔｃｏｎｖ細胞またはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇコートビーズとの共培養後、トランスウェル抑制を媒介できなかった（図２Ｂ）。しかしながら、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇは、接触依存性抑制を媒介する能力を保持していた（野生型またはニューロピリン欠乏Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズの存在下、異なる濃度で共培養した古典的抑制アッセイにより判定された）。重要な点として、Ｓｅｍａ４ａとＮｒｐ１との間の直接の相互作用は、蛍光色素標識Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇを用いたＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇのフローサイトメトリー染色により検証され、蛍光色素標識Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇを用いたＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇでは検証されなかったが、精製された組換えＮｒｐ１およびその既知のリガンドＳｅｍａ３ａと同等と思われるＳｅｍａ４ａを用いたＥＬＩＳＡアッセイでは検証された。これらのデータから、Ｓｅｍａ４ａはＮｒｐ１に結合し、Ｔｒｅｇ機能をブーストできることが明らかに立証される一方、他のセマフォリンファミリーメンバーもこの機能を果たし得た可能性がある。第２に、Ｎｒｐ１特異的ｍＡｂは、インビトロでＴｒｅｇのトランスウェル抑制を阻止した（図２Ｉ）。
【０１６９】
本発明者および共同研究者らは以前に、Ｔｒｅｇが、ＴＧＦβではなくＩＬ−１０およびＩＬ−３５を介してトランスウェル抑制を媒介することを示したことがある１２。本明細書では、２つの実験アプローチを使用して、Ｔｃｏｎｖ細胞によりブースされるＴｒｅｇおよびＳｅｍａ４ａによりブースされるＴｒｅｇが使用する抑制のメカニズムが同じであるかどうかを判定した。第１に、トランスウェルプレートの上部チャンバーにおいてＳｅｍａ４ａ−Ｉｇコートビーズの存在下で刺激されたＴｒｅｇは、下部チャンバーにおいて野生型（ＷＴ）Ｔｃｏｎｖ細胞、およびＴＧＦβ２４に対して非感受性であるｄｎＴＧＦβＲＩＩ  Ｔｃｏｎｖ細胞を同様に抑制することができたことから、ＴＧＦβは必要でないことが示唆された（図２Ｃ）。一方、それぞれＩＬ−１０およびＩＬ−３５を分泌できないＩｌ１０−／−ＴｒｅｇおよびＥｂｉ３−／−Ｔｒｅｇは、トランスウェルを通過するＷＴ  Ｔｃｏｎｖを抑制できなかった（図２Ｃ）。第２に、ＩＬ−１０およびＩＬ−３５中和ｍＡｂは、ＷＴ  Ｔｒｅｇにより媒介されるトランスウェル抑制を妨げた（図２Ｄ）。Ｓｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１ライゲーションはＴｒｅｇ機能を強化するようであったが、本発明者らは、Ｓｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１ライゲーションがインビトロでＴｒｅｇの生存および／または安定性も強化し得ると推論した。実際、Ｓｅｍａ４ａ刺激により、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色により判定した細胞死の量がＮｒｐ１依存性に減少した（図２Ｅ）。アイソタイプまたはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇの存在下、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ−２を用いて７２時間培養した野生型およびＮｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇのその後のｑＰＣＲ解析、およびアイソタイプまたはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇの存在下、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ−２を用いて７２時間刺激した細胞のＩＬ−１０に対する細胞内サイトカイン染色（刺激の最後の８時間ブレフェルジンＡを加えた）から、ＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルはＳｅｍａ４ａ−Ｎｒｐ１ライゲーションにより増加せず、ＩＣＳによるＩＬ−１０＋Ｔｒｅｇの割合も増加しなかった。しかしながら、ＩＬ−１０のＥＬＩＳＡおよび細胞の上清由来のＩＬ−３５のＩＰ／ＩＢにより判定したところ、野生型Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＳｅｍａ４ａ−Ｉｇで刺激した場合、ＩＬ−１０およびＩＬ−３５の両方が培養物中で増加したが、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇでは増加しないことが明らかになった。これらを総合すると、これらのデータから、Ｓｅｍａ４ａによるＮｒｐ１ライゲーションは、ＩＬ−１０／ＩＬ−３５依存性抑制を増強し、インビトロでＴｒｅｇの生存および寿命を延長することが示唆される。
【０１７０】
ＮＲＰ１はヒトＴｒｅｇに発現しないと示唆されてきたが２５、このことは、活性化Ｔｒｅｇまたは機能抑制Ｔｒｅｇについて厳密に評価されたことがない。ヒトＴｒｅｇは、最大の抑制機能を得るため活性化を必要とし得るので１２，２６、本発明者らは、ＮＲＰ１が、機能抑制Ｔｒｅｇ上にのみ発現する可能性があると推論した。以前の研究２５と整合して、休止臍帯血ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞は、ＮＲＰ１を発現しなかった（図２Ｆ）。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ−２による活性化は、両方のＴ細胞集団において初期のＮＲＰ１発現を誘導したが、ＴｒｅｇはＮＲＰ１の長期的な安定発現を示さなかった。次いでＮＲＰ１−ＳＥＭＡ４Ａ軸がヒトＴｒｅｇ機能を増強できるかどうかを評価した。以前示されたように２６、Ｔｃｏｎｖは、透過性トランスウェル膜におけるヒトＴｒｅｇ抑制を増強することができる（図２Ｇ）。重要な点として、この抑制活性は、抗ＮＲＰ１  ｍＡｂによる阻止された一方、固定化したヒトＳＥＭＡ４Ａは、Ｔｃｏｎｖの非存在下でヒトＴｒｅｇ機能を増強するのに十分であった（図２Ｇ）。これらのデータから、マウスＴｒｅｇおよびヒトＴｒｅｇでは同じ経路が作用する可能性が裏付けられる。
【０１７１】
Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇは免疫ホメオスタシスを維持する
Ｎｒｐ１：Ｓｅｍａ４ａ軸を破壊すると、インビトロでＴｒｅｇ活性が減弱することを考慮して、本発明者らは、Ｔｒｅｇ機能がインビボで、特に高度炎症部位で低下し得ると仮定した。Ｆｏｘｐ３−欠損マウスは、ヒト疾患ＩＰＥＸを想起させる強い自己免疫状態を発症する。これは、広範囲な免疫浸潤および３〜６週で死に至る組織炎症を特徴とする２，２７。したがってインビボでのＴｒｅｇ機能の破壊は、炎症性疾患の発症につながる可能性がある。Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスとその年齢および性別の一致した同腹仔Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ対照とを１０ヶ月間観察し、Ｔｒｅｇ欠乏マウスで通常対象となるすべての器官の詳細な組織学的解析を行った。盲検解析から、Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスは、外観、および皮膚、肺、肝臓、腸、膵臓、腎臓、唾液腺および脾臓の組織学的解析を含むあらゆる点で正常範囲内にあることが立証された。フローサイトメトリー解析により判定したＴ細胞亜集団の大きさ、割合または表現型における変化は、観察されなかった。したがって、免疫ホメオスタシスにおける変化、炎症性疾患または自己免疫の発症は、Ｎｒｐ１の欠失がＴｒｅｇ上に限定された高齢マウスにおいて検出できなかった。
【０１７２】
Ｆｏｘｐ３欠乏マウスの自己免疫表現型は、２日齢のマウスへのＴｒｅｇの養子移入により実質的に遅延させることができ、これは、マウスが疾患で死亡する前の数ヶ月間持続することもある２，２７。疾患の発現、有病率、臨床スコアおよび組織学的スコア（肝臓、肺および耳介の）はすべて、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇレシピエントとＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇレシピエントとの間で同じであった（図３）。全体として、これらのデータから、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１の発現は、免疫ホメオスタシスの維持、および通常Ｔｒｅｇの非存在下で発症すると考えられる炎症性疾患および自己免疫疾患の予防にとって必要ないことが示される。
【０１７３】
Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇは、炎症環境において機能しない
Ｔｒｅｇは、多くの癌において効果的な抗腫瘍免疫の大きな障害となる２８，２９。抗ＣＤ２５処理またはＦｏｘｐ３ＤＴＲ−ｇｆｐマウス（Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇはジフテリア毒素受容体を発現し、ＤＴ投与によりその条件付き枯渇を行うことができる）の使用によるＴｒｅｇの枯渇は、抗腫瘍免疫を大きく強化することが示されている３０，３１。一方で、Ｔｒｅｇの枯渇は、Ｆｏｘｐ３欠乏マウスに見られるのと同様の広範囲なリンパ球増殖および自己免疫疾患も引き起こす３２。腫瘍は高度炎症環境であるので、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇが、腫瘍誘導性寛容を媒介し、効果的な抗腫瘍免疫を妨げる能力を評価した。３つの移植可能な腫瘍モデル：ＭＣ３８（免疫原性を有する結腸癌株）、ＥＬ４（中程度の免疫原性を有する胸腺腫）およびＢ１６（免疫原性に乏しいメラノーマ）を使用した３３，３４。腫瘍接種Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ−ｇｆｐマウスのＤＴ処理によるＴｒｅｇの完全な消失の結果、腫瘍は排除されたが、マウスは、ＤＴ処理から約３週間後に自己免疫により媒介される死亡に至る（図４Ａ〜Ｃ）。
【０１７４】
次いでＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅマウスおよびそのＦｏｘｐ３Ｃｒｅ同腹仔対照の腫瘍増殖を評価した。Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスでは、ＭＣ３８の腫瘍増殖の有意な遅延が観察されたが、完全寛解（ＣＲ）はまったくなかった（図４Ａ）。一方、ＥＬ４接種Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスの約４０％ではＣＲが観察され、ほぼすべてのマウスで腫瘍増殖が大きく低下した（図４Ｂ）。際だったのは、Ｂ１６接種Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスの３分の２でＣＲが観察され、残りのマウスでは腫瘍増殖が低下したことであった（図４Ｃ）。肺転移性Ｂ１６モデルを用いると、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ動物は、転移数が用量依存的に増加したのに対し、Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスは、高い腫瘍投与量でもほぼ完全な排除を示した（図４Ｄ）。皮膚のＢ１６腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の解析からは、Ｔｒｅｇ集団はどちらも腫瘍に浸潤できる一方、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇは、特に高い殺腫瘍性ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＩＬ−２＋サブセットにおいてエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびサイトカインの産生を抑制する能力が限定されることが示された（図４Ｅ）３５。よって、ＴｒｅｇにおけてＮｒｐ１シグナル伝達により引き起こされるプログラムは、抗腫瘍免疫の抑制に決定的に重要である。
【０１７５】
本発明者らはさらに、腫瘍微小環境においてどの細胞がＳｅｍａ４ａを発現するかを決定しようとした。驚いたことに、通常型ＤＣ（ｃＤＣ）、ＣＤ８＋Ｔｃｏｎｖ細胞、ＮＫ細胞、および程度が低いが、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＴＩＬにおいて流入領域および非流入領域リンパ節と比較してＳｅｍａ４ａ表面発現をダウンレギュレートする（図４Ｈ）。代わりに、Ｓｅｍａ４ａｈｉ腫瘍浸潤細胞の過半数（約５７％）は、ＰＤＣＡ１＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ＋形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）であった（図４Ｈ）。驚くべきことだが、この知見は以前の文献と整合したことから、ｐＤＣは免疫寛容を誘導することができ、ｐＤＣが枯渇すると抗腫瘍免疫が増加することが示唆された（Ｄｅｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ９３，３４３−３５２（２０１３）；Ｆａｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２，６１３０−６１４１（２０１２）；Ｓａｗａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８９，４２５８−４２６５，（２０１２））。実際、脾臓およびリンパ節調製物から選別し、ＣｐＧオリゴヌクレオチドで一晩活性化し、１％ＰＦＡで短時間固定し、続いて十分に洗浄したｐＤＣと共培養したＴｒｅｇを用いたトランスウェル抑制アッセイにおいて、ｐＤＣは、トランスウェル抑制アッセイにおいてＳｅｍａ４ａ依存性にＴｒｅｇ機能を増強することができた。
【０１７６】
これまでの研究から、セマフォリンに結合するＮｒｐ１ドメインは、ＶＥＧＦに結合するドメインと異なることが示されている４０。Ｔｒｅｇ誘導性の腫瘍寛容を媒介するＳｅｍａ４ａ−Ｎｒｐ１軸をさらに裏付けるため、本発明者らは、Ｎｒｐ１−Ｓｅｍａ４ａ相互作用を破壊するが、Ｎｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用を破壊しないＳｅｍａ４ａおよびＮｒｐ１特異的ｍＡｂを利用した。具体的には、（ｉ）５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１６５の存在下、抗Ｎｒｐ１またはマウスＩｇＧ１（抗ＶＥＧＦビオチンを用いて検出した）、あるいは（ｉｉ）アイソタイプコントロール、抗Ｎｒｐ１または抗Ｓｅｍａ４ａの存在下、Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはマウスＩｇＧ１、（Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはマウスＩｇＧ１は、抗アイソタイプ抗体を用いて検出した）とインキュベートした５００ｎｇ／ｍＬの組換えｍＮｒｐ１でコートしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡを用いた結合アッセイを行った。Ｂ１６メラノーマを接種し、Ｎｒｐ１遮断ｍＡｂまたはＳｅｍａ４ａ遮断ｍＡｂ（１００μｇ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃｌｏｎｅ  ７５７１２９）の注射を週２回投与した野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスは、アイソタイプコントロールのそれと比較して、腫瘍増殖の有意な低下を示した（図４Ｉ）。重要な点として、Ｎｒｐ１遮断ｍＡｂおよびＳｅｍａ４ａ遮断ｍＡｂの作用は、本質的に同一であった。さらに、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇを可溶性アンタゴニストとしてインビボで利用すると、やはり腫瘍増殖が有意に低下する（図４Ｊ）のに伴い、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤が同様に増加した。Ｎｒｐ１の遮断が治療上の有用性を有し得るかどうかを判定するため、Ｂ１６腫瘍を有するＣ５７／ＢＬ６マウスを、高用量（４００μｇの初回量、週２回２００μｇ）のＮｒｐ１遮断ｍＡｂで処置した。注目すべきは、この単独治療で腫瘍増殖が低下し、一部のマウスでＣＲが認められた（図４Ｆ）。
【０１７７】
Ｎｒｐ１依存性Ｔｒｅｇ機能はさらに、他の確立された高度炎症環境における応答の抑制でも広く重要であり得た。Ｒａｇ１−／−マウスにナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＴｃｏｎｖ細胞を養子移入すると、ヒト炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に類似した高度炎症性大腸炎が誘導されるが、これは、精製されたＴｒｅｇのその後の移入によりレスキューすることができる１３，３６。実際、Ｔｃｏｎｖ細胞をＲａｇ１−／−マウスに注射すると、著しい体重減少および免疫性病変が起こるが、これは、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇによりレスキューすることができた（図４Ｇ）。しかしながら、Ｎｒｐ１欠乏Ｔｒｅｇは、大腸炎を軽減できず、著しい体重減少および免疫性病変が起きた。よって、Ｎｒｐ１により媒介されるＴｒｅｇ機能は、確立された炎症性疾患、たとえば大腸炎の治癒に必要とされる。
【０１７８】
Ｎｒｐ１ライゲーションは、ＰＴＥＮを介してＡｋｔ−ｍＴＯＲを制限して、Ｆｏｘｏにより媒介されるＴｒｅｇ安定化を惹起する
ＶＥＧＦまたはクラスＩＩＩセマフォリンによるライゲーション後の、腫瘍系、ニューロンおよび内皮におけるＮｒｐ１の下流のシグナル伝達は、研究されてきたけれども１５，１７、ＴｒｅｇにおいてクラスＩＶセマフォリンにより誘導されるＮｒｐ１シグナル伝達経路は、知られていない。興味深いことに、Ｎｒｐ１は、一部の系でＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）活性を調節することが示されている３７，３８。Ａｋｔ−ｍＴＯＲ活性はＴｒｅｇ機能にとって有害であることが示されているので３９，４０、本発明者らは、Ｎｒｐ１ライゲーションがＡｋｔ活性化を阻害し得るとの仮説を立てた。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇをＳｅｍａ４ａ−ＩｇまたはＩｇＧコートビーズの存在下で刺激し、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ活性化をフローサイトメトリーにより評価した。Ｎｒｐ１ライゲーションは、Ａｋｔ  Ｓ４７３のリン酸化のほか、Ｔｒｅｇにおいてその活性化に必要とされるＳ６Ｋ１  Ｔ３８９のリン酸化を限定した（図５Ａ）。Ａｋｔリン酸化については、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を用いて免疫シナプス（ＩＳ）でも調べた。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇを、抗ＴＣＲｍＡｂおよびＳｅｍａ４ａ−ＩｇあるいはＩｇＧアイソタイプコントロールを含む脂質二重層で刺激した。ＩＳへのＮｒｐ１の強いリクルートメントはＳｅｍａ４ａが存在したときに観察され、これはＩＳでのグローバルホスホチロシン(global phosphotyrosine)染色が同じであるにもかかわらず、Ｎｒｐ１依存性のＡｋｔ活性の消失と同時に起こった（図５Ｂおよび６Ａ〜Ｂ）。
【０１７９】
Ａｋｔ不活性化がＴｒｅｇの増強に十分であったかどうかを判定するため、野生型（ＷＴ）Ａｋｔあるいはドミナントネガティブキナーゼ死亡（ＤＮ）ＡｋｔをコードするレトロウイルスをＴｒｅｇに形質導入した。ＤＮ  Ａｋｔを形質導入したＴｒｅｇは、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇにより誘導されるのと同程度にトランスウェル抑制を媒介できたが、ＷＴ  Ａｋｔではできなかったことから、Ｎｒｐ１の下流のＡｋｔ−ｍＴＯＲ活性の抑制は、Ｔｒｅｇの増強を誘導する主要経路であることが示唆される。
【０１８０】
Ｎｒｐ１は、Ｃ末端ＰＤＺドメイン結合モチーフ（アミノ酸配列：ＳＥＡ）を含む小さな細胞質ドメインを有する（Ｐｅｌｌｅｔ−Ｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４１１，２１１−２２６（２００８））。本発明者らは、ＩＳにおけるＳｅｍａ４ａ依存性のｐＡｋｔの消失に、このドメインが必要とされるとの仮説を立てた。ＷＴ  Ｎｒｐ１またはＰＤＺドメイン結合モチーフ欠乏Ｎｒｐ１ミュータントをコードするレトロウイルスを、ニューロピリン欠乏Ｔｒｅｇに形質導入した。興味深いことに、ＰＤＺドメイン結合モチーフが消失すると、Ｎｒｐ１がＳｅｍａ４ａライゲーション後にＩＳでＡｋｔ活性化を阻害する能力が完全に阻止された（図）ことから、このモチーフがＡｋｔシグナル伝達の分子阻害剤をリクルートすることが示唆された。
【０１８１】
ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、Ａｋｔ活性化を阻害することが示されている４１。ＰＴＥＮは、接触依存性のＴｒｅｇ抑制に必要でないようであるが４２、本発明者らは、ＰＴＥＮがＮｒｐ１により媒介されるＡｋｔの不活性化に寄与し得るとの仮説を立てた。休止および活性化Ｔｒｅｇにおいて、低レベルの構成型ＰＴＥＮとＮｒｐ１との結合が観察され、これはＳｅｍａ４ａライゲーションにより実質的に強化された（図５Ｃ）。さらに、ＰＴＥＮ欠乏Ｔｒｅｇは、ＴｃｏｎｖおよびＳｅｍａ４ａ−Ｉｇ誘導性のトランスウェル抑制を媒介できなかった（図５Ｄ）。最後に、ＰＴＥＮ欠乏Ｔｒｅｇは、Ｓｅｍａ４ａによる強いＮｒｐ１リクルートメントにもかかわらず、ＩＳでＡｋｔ活性化を阻害できなかった（フローサイトメトリーにより精製され、次いで抗ＴＣＲおよびＩｇＧあるいはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇを含む脂質二重層で２０分間刺激されたＦｏｘｐ３ＣｒｅまたはＰｔｅｎｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇにおけるＩＳでのニューロピリンのリクルートメント、およびＡｋｔの活性化のＴＩＲＦ顕微鏡観察により判定された；図６参照Ｃ〜Ｄ）。これらのデータから、ＰＴＥＮは、Ｎｒｐ１により媒介されるＩＳでのＡｋｔ活性化の抑制およびＴｒｅｇ機能の増強に必要とされることが示唆される。
【０１８２】
Ａｋｔ活性は、Ａｋｔにより媒介されるリン酸化が１４−３−３結合を介してＦｏｘｏ転写因子ファミリーメンバーの核排出を促進するように、１つにはそれらの核局在を制御することにより、Ｔｒｅｇ抑制プログラムを妨害することができる４３−４５。Ｆｏｘｏは、Ｆｏｘｐ３発現を調節し、一連のＴｒｅｇ関連遺伝子を促進し、Ｔ細胞系譜特異的転写因子およびエフェクター分子の発現を限定することにより、Ｔｒｅｇの発生および機能の制御に重要な役割を果たしている。予想通り、非刺激ＴｒｅｇはＦｏｘｏ核染色を示す一方、活性化Ｔｒｅｇは核からＦｏｘｏを排出する。これに対し、Ｓｅｍａ４ａ−Ｉｇを加えると、Ｆｏｘｏ核排出が阻害された。
【０１８３】
Ｎｒｐ１により媒介されるＴｒｅｇ増強を促進する転写プログラムを判定するため、Ｓｅｍａ４ａ−ＩｇまたはＩｇＧ１コートビーズの存在下、インビトロで刺激したＦｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇに関する遺伝子発現プロファイリングを行った。具体的には、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＣＤ４５ＲｂｌｏＦｏｘｐ３（ＹＦＰ）＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２、および固定化したＩｇＧ１またはＳｅｍａ４ａ−Ｉｇで４８時間刺激した。これらの細胞から抽出したＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子プロファイリング解析に供した。次いでマイクロアレイデータを、ＭＳｉｇＤＢを用いてＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）解析に供し、所定の遺伝子セットにエンリッチメントスコア（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ（ＥＳ））、ノーマライズドエンリッチメントスコア（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ（ＮＥＳ））およびフォルスディスカバリーレート（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ））を与えた。さらに、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇのＳｅｍａ４ａにより影響を受けたが、Ｎｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇでは影響を受けなかった遺伝子についてＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ＤＡＶＩＤ解析を行った。
【０１８４】
一般に、ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１ライゲーションと関連する転写の変化は、表現型の安定性の強化と整合する。Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）およびＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ＤＡＶＩＤ解析から、Ｔ細胞ホメオスタシスおよびＩＬ−７シグナル伝達などＳｅｍａ４ａライゲーションによりアップレギュレートされるいくつかの経路、ＩＬ−２によりダウンレギュレートされる遺伝子、ＣＤ２８反応性遺伝子、Ｔ細胞分化に関連する遺伝子、および疾患表現型と関連するいくつかの遺伝子セットが明らかになった（表１および３）。最もアップレギュレートされた遺伝子の統計解析から、ホメオスタシスと関連する遺伝子、特にＦｏｘｏ標的Ｋｌｆ２４６のほか、いくつかの転写因子、細胞表面分子および抗アポトーシスＢｃｌ２が明らかになった（表３）。さらに、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅマウスから新たに単離されたＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇ由来の遺伝子発現プロファイルの比較により、内部制御されたＴｒｅｇシグニチャーが得られたが、これは以前報告されたもの５と整合していた。Ｈｅｌｉｏｓ（Ｉｋｚｆ２）、Ｇｐｒ８３、Ｎｔ５ｅおよびＳｏｃｓ２を含むいくつかのＴｒｅｇシグニチャー遺伝子が、アップレギュレートされた。サブセットは、ｑＰＣＲ（Ｉｋｚｆ２、Ｓｏｃｓ２、Ｂｃｌ２、Ｎｔ５ｅ、Ｋｌｆ２、Ｇｐｒ８３）およびフローサイトメトリー（ＫＬＦ２、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｂｃｌ２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ７３）により確認された。
【０１８５】
興味深いことに、Ｎｒｐ１シグナル伝達は、いくつかのＴ細胞系譜特異的転写因子（Ｉｒｆ４、Ｒｏｒｇ、Ｅｏｍｅｓ）およびそれらの標的（Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ１７ａ）のダウンレギュレーションを誘導する（表３）。さらに、細胞シグナル伝達の一部のレギュレーター（Ｎｅｄｄ４、Ｒｇｓ１６、Ｓｅｒｐｉｎｅ２）およびチェックポイント阻害剤Ｌａｇ３もダウンレギュレートされた。Ｉｒｆ４、Ｉｒｆ８、ＲｏｒｃおよびＲｇｓ１６のダウンレギュレーションは、ｑＰＣＲにより確認された。全体として、Ｎｒｐ１シグナル伝達により誘導される転写プロファイルは、Ｔｒｅｇの最終分化を誘導または促進すると考えられるプログラムを阻害しながら、Ｔｒｅｇの安定性、静止状態および生存を促進し得る。Ｎｒｐ１およびＦｏｘｏにより媒介される転写プログラム間にかなり重複があるようであることもさらに注目される４５。
【０１８６】
Ｆｏｘｏタンパク質は、Ｓｅｍａ４ａ刺激によりやはりアップレギュレートされた、いくつかの遺伝子の転写を促進することができる（表３）４５，４７。特に興味のある遺伝子は、Ｎｒｐ１に反応してアップレギュレートされたＫｌｆ２であり、Ｋｌｆ２は、Ｔ細胞の生存、寿命および記憶と関連する遺伝子、たとえばＣＤ６２Ｌ（Ｓｅｌｌ）およびＣＤ１２７／ＩＬ−７Ｒα（Ｉｌ７ｒａ）の発現を促進する４７。実際、Ｓｅｍａ４ａの存在下でのＴｒｅｇ刺激は、それらの活性化により誘導されるダウンレギュレーションを限定することから、Ｎｒｐ１により刺激されたＴｒｅｇにおいてＦｏｘｏ／ＫＬＦ２軸が活性であることが示唆される。
【０１８７】
Ｎｒｐ１シグナル伝達はさらに、ＧＳＥＡにより決定されたいくつかの遺伝子サブセット、中でもたとえば、ＩＲＦ４標的、サイトカイン転写物（Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ１７ａ）、Ｆｏｘｐ３ダウンレギュレート遺伝子、およびＩＬ−２アップレギュレート遺伝子のダウンレギュレーションも誘導する（表２）。ｑＰＣＲまたはタンパク質解析により確認された標的遺伝子として、いくつかのＴ細胞系譜特異的転写因子（Ｉｒｆ４、Ｒｏｒｃ、Ｅｏｍｅｓ）、細胞シグナル伝達のレギュレーター（Ｒｇｓ１６）および阻害性受容体Ｌａｇ３が挙げられる。全体として、Ｎｒｐ１シグナル伝達により誘導される転写プロファイルは、Ｔｒｅｇの最終分化およびアポトーシスを誘導または促進すると考えられるプログラムを阻害しながら、Ｔｒｅｇの安定性、静止状態および生存を促進し得る。
【０１８８】
インビトロで観察されたシグナル伝達現象および転写現象が生理的に重要であるかどうかを判定するため、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇにおける主要な観察結果を評価した。しかしながら、Ｂ１６注射後に腫瘍を発症したのはＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスの一部のみであり、したがってサンプル採取した腫瘍は、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１消失の影響が大きいとは言えない腫瘍であると考えられる点に留意されたい。第１に、非流入領域リンパ節およびＴＩＬを、腫瘍を有するＦｏｘｐ３ＣｒｅおよびＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウス回収し、エキソビボでＡｋｔ活性化を評価した。非流入領域ＬＮは、Ｔｒｅｇにおいて相対的に高いＡｋｔ活性化を示したのに対し、腫瘍浸潤Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇは、より低いＡｋｔ活性化を示した（図７Ａ）。重要な点として、腫瘍微小環境におけるＡｋｔ活性の調節がＮｒｐ１ｆ／ｆＦｏｘｐ３ＣｒｅＴｒｅｇにおいて失われたことから、インビボでのＴｒｅｇの調節はＮｒｐ１により誘導されることが示唆される。第２に、ＴＩＬにおけるＮｒｐ１シグナル伝達のタンパク質標的を他のリンパ球コンパートメントと比較して調査し、Ｈｅｌｉｏｓが腫瘍内Ｔｒｅｇにおいてアップレギュレートされるが、ＩＲＦ４およびＲＯＲγｔはインビボでＮｒｐ１依存性にダウンレギュレートされることが見出された（図７Ｂ〜Ｃ）。第３に、アポトーシスが減少したが、Ｋｉ６７発現およびＢｒｄＵ取り込みにより（図７Ｅ）、および切断型カスパーゼ３染色の増加により（図７Ｄ〜Ｅ）評価したところ、このＮｒｐ１誘導性プログラムの結果、腫瘍内のＴｒｅｇ増殖が増加した。観察されたＮｒｐ１依存性Ｔｒｅｇ生存の強化は、抗アポトーシス因子Ｂｃｌ２の発現強化と相関した（図７Ｆ）。最後に、腫瘍内Ｔｒｅｇ抑制メカニズムに対するこれらの変化の影響を調査した。ＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルは変化しなかったものの、腫瘍内ＩＬ−１０＋ＴｒｅｇはＮｒｐ１依存性に強化された（図７Ｇ）。さらに、細胞外アデノシンを産生するＣＤ７３分子およびチェックポイント阻害剤ＬＡＧ−３もＮｒｐ１依存性に維持された（図７Ｈ）。よって、Ｎｒｐ１シグナル伝達は、炎症環境においてＴｒｅｇの安定性を強める重要なスイッチを与える。
【０１８９】
考察
本明細書に提供されたデータから、Ｔｒｅｇ機能の細胞接触依存性増強は、ＰＴＥＮ：Ａｋｔ：Ｆｏｘｏ軸を介したＳｅｍａ４ａ媒介性Ｎｒｐ１ライゲーションにより媒介されることが立証される（図８）。とりわけ、Ｎｒｐ１は、Ｔ細胞においてＡｋｔ活性を限定することが示唆されてきた限られた数の細胞表面受容体（たとえば、ＰＤ−１４８およびＣＴＬＡ−４４９）の１つのようである。Ｎｒｐ１は、特定の状況下でＡｋｔシグナル伝達を調節あるいはさらには活性化することもできる（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，３３４５−３３５１（２００８）；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８，８６６７−８６７２（２００８）；Ｆｕｋａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，１１７３−１１８０（２００７）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，５７２７−５７３５（２００６））一方、Ｎｒｐ１がＴｒｅｇにおいて機能する特定の状況（たとえば、ＩＳ、独特の細胞型、膜貫通と可溶性リガンドへのリクルートメント）では、ＰＴＥＮのリクルートメントおよびＡｋｔ活性の消失を促進する異なる環境が整えられる。この経路は、安定性を強め、生存を促進することにより間接的にＴｒｅｇ機能を強化するが、これは、炎症部位、たとえば腫瘍および大腸炎腸粘膜において最も明らかである。Ｔｒｅｇの安定性／可塑性の問題は非常に議論が分かれており、Ｔｒｅｇの安定性を維持する細胞外因性刺激およびメカニズムは、依然として分かっていない８−１１。ＦｏｘｏファミリーメンバーがＦｏｘｐ３機能を強化し、Ｔｒｅｇのホメオスタシスおよび機能を促進することを踏まえると４５、Ｎｒｐ１シグナル伝達がＦｏｘｏの核局在に対するＡｋｔのマイナスの影響を相殺することは、注目に値する。実際、Ｆｏｘｏシグナル伝達およびＮｒｐ１シグナル伝達により誘導される転写プロファイル間には、かなりの重複が存在する４５。さらに、Ｎｒｐ１シグナル伝達が、細胞静止状態に関与することが知られている、いくつかのＫＬＦ（Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ１）の発現を調節することも興味深い４６。５つの転写因子（transcription factor quintet）が、Ｔｒｅｇの転写シグニチャー「をロックインする（lock-in）」ことも最近示された４。興味深いことに、これらの転写因子の一部は、Ｎｒｐ１シグナル伝達により調節される（たとえば、Ｉｋｚｆ２、Ｉｒｆ４、Ｇａｔａ１）ことから、Ｓｅｍａ４ａにより媒介されるＮｒｐ１ライゲーションが、このプログラムの細胞外因性レギュレーターになり得ることが示唆される。全体として、本明細書に提供される観察結果から、Ｓｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１軸は、炎症部位でのＴｒｅｇの安定性を維持するのに必要とされる。さらに、Ｎｒｐ１：Ｓｅｍａ４ａ経路は特定の病理学的または遺伝的状況下で撹乱されることがあり、これがまた、種々の正常状態および病的状態におけるＴｒｅｇの安定性と可塑性という見たところ相反する認識の根拠ともなり得る可能性がある。メモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞がＮｒｐ１を発現することが示されていることを踏まえると、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ活性化の制限がメモリーＴ細胞表現型の維持を促進し得る可能性がある（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａ���．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０，３９−６８（２０１２））。
【０１９０】
Ｔｒｅｇは多くの癌において効果的な抗腫瘍免疫の大きな障害となるので２８，２９、臨床的に重要な一般的な問題は、炎症性または自己免疫性の有害事象を防止しながら、腫瘍においてＴｒｅｇ機能を限定することが可能であるかどうかである。さらに、本明細書に記載の腫瘍研究におけるＳｅｍａ４ａの主要な供給減が形質細胞様ＤＣであることも興味深い。今回、Ｎｒｐ１：Ｓｅｍａ４ａ軸が、周辺のホメオタシス維持のためではなく、腫瘍性炎症部位でのＴｒｅｇの安定性に必要とされる中心経路として認識されたことから、初めて抗体または可溶性アンタゴニストによるＳｅｍａ４ａ：Ｎｒｐ１の遮断が、自己免疫を惹起することなく腫瘍誘導性寛容を限定するための実行可能な治療戦略であり得ることが示唆される。
【０１９１】
参考文献
2018172436.tif 000002
【０１９２】
2018172436.tif 000003
【０１９３】
2018172436.tif 000004
【０１９４】
2018172436.tif 000005
【０１９５】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際、本明細書に記載の改変に加えて本発明の様々な改変が、明細書本文から当業者に明らかになるであろう。こうした改変は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることを意図している。
【０１９６】
本明細書に引用する特許、出願、刊行物、試験方法、文献および他の資料はすべて、本明細書に物理的に存在しているかのようにその全体を本明細書に援用する。
他の実施態様
１．制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を阻害するまたはその安定性を低下させる方法であって、前記Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の阻害剤に、前記Ｔｒｅｇを曝露することを含む方法。
２．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、膜貫通型セマフォリンを発現する細胞上の膜貫通型セマフォリンと、前記Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を阻害する、実施態様１記載の方法。
３．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様２記載の方法。
４．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様３記載の方法。
５．前記膜貫通型セマフォリンを発現する細胞は、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からなる群より選択される、実施態様２記載の方法。
６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない、実施態様１記載の方法。
７．前記Ｔｒｅｇは被検体内にあり、前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤が該被検体に投与される、実施態様１記載の方法。
８．前記被検体は癌を有する、実施態様７記載の方法。
９．前記癌はメラノーマまたは膠芽細胞腫である、実施態様８記載の方法。
１０．前記被検体は、Ｔｒｅｇが殺菌免疫（sterilizing immunity）を阻止する感染症を有する、実施態様７記載の方法。
１１．前記感染症は慢性感染症である、実施態様１０記載の方法。
１２．前記被検体はヒトである、実施態様７記載の方法。
１３．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体である、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
１４．前記抗体は、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない、実施態様１３記載の方法。
１５．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤はセマフォリン分子である、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
１６．前記セマフォリン分子は、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に高い親和性および特異性で結合することができる、実施態様１５記載の方法。
１７．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様１６記載の方法。
１８．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様１７記載の方法。
１９．前記セマフォリン分子は、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインを含む、実施態様１５記載の方法。
２０．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリンに高い親和性および特異性で結合し、それにより前記膜貫通型セマフォリンが前記ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強するのを防止することができる、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
２１．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様２０記載の方法。
２２．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様２１記載の方法。
２３．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
２４．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様２３記載の方法。
２５．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
２６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である、実施態様１〜１２いずれか１項記載の方法。
２７．制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を強化するまたはその安定性を増加させる方法であって、前記Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸のアゴニストに、前記Ｔｒｅｇを曝露することを含む方法。
２８．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、膜貫通型セマフォリンを発現する細胞上の膜貫通型セマフォリンと、前記Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を強化する、実施態様２７記載の方法。
２９．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様２８記載の方法。
３０．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様２９記載の方法。
３１．前記膜貫通型セマフォリンを発現する細胞は、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からなる群より選択される、実施態様２８記載の方法。
３２．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、インビトロで前記Ｔｒｅｇに投与される、実施態様２７記載の方法。
３３．前記Ｔｒｅｇは、被検体から抽出され、前記Ｎｒｐ１−セマフォリン軸のアゴニストの存在下、エキソビボで増幅され、次いで（ｉ）前記被検体に再導入されるか、あるいは（ｉｉ）別の被検体に投与される、実施態様３２記載の方法。  
３４．前記増幅されたＴｒｅｇを投与される被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する、実施態様３３記載の方法。
３５．前記被検体はヒトである、実施態様３３記載の方法。
３６．前記Ｔｒｅｇは被検体内にあり、前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは該被検体に投与される、実施態様２７記載の方法。
３７．前記被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する、実施態様３６記載の方法。
３８．前記被検体はヒトである、実施態様３６記載の方法。
３９．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストはセマフォリン分子である、実施態様２７〜３８いずれか１項記載の方法。
４０．前記セマフォリン分子は多量体セマフォリン分子である、実施態様３９記載の方法。
４１．前記セマフォリン分子は、表面またはビーズ上に固定化されている、実施態様３９記載の方法。
４２．前記セマフォリン分子は、クラスＩＶセマフォリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログである、実施態様３９記載の方法。
４３．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様４２記載の方法。
４４．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは抗体である、実施態様２７〜３８いずれか１項記載の方法。
４５．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは小分子である、実施態様２７〜３８いずれか１項記載の方法。
４６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、前記ＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１発現を高める、実施態様２７〜３８いずれか１項記載の方法。
４７．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、Ｎｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を高める、実施態様２７〜３８いずれか１項記載の方法。
４８．疾患の処置を必要とする被検体の疾患を処置する方法であって、前記被検体の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸を阻害すること含む方法。
４９．膜貫通型セマフォリンを発現する細胞上の膜貫通型セマフォリンと、前記被検体のＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を阻害することを含む、実施態様４８記載の方法。
５０．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様４９記載の方法。
５１．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様５０記載の方法。
５２．前記膜貫通型セマフォリンを発現する細胞は、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からなる群より選択される、実施態様４９記載の方法。
５３．前記疾患は癌である、実施態様４８記載の方法。
５４．前記癌は、メラノーマまたは膠芽細胞腫である、実施態様５３記載の方法。
５５．前記疾患は、Ｔｒｅｇが殺菌免疫を阻止する感染症である、実施態様４８記載の方法。
５６．前記感染症は慢性感染症である、実施態様５５記載の方法。
５７．前記被検体はヒトである、実施態様４８記載の方法。
５８．前記被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の阻害剤の治療有効量を、前記被検体に投与することを含む、実施態様４８〜５７いずれか１項記載の方法。
５９．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体である、実施態様５８記載の方法。
６０．前記抗体は、前記被検体のＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない、実施態様５９記載の方法。
６１．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤はセマフォリン分子である、実施態様５８記載の方法。
６２．前記セマフォリン分子は、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に高い親和性および特異性で結合することができる、実施態様６１記載の方法。
６３．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様６２記載の方法。
６４．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様６３記載の方法。
６５．前記セマフォリン分子は、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインを含む、実施態様６１記載の方法。
６６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリンに高い親和性および特異性で結合することができ、それにより前記膜貫通型セマフォリンが前記被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することを妨げる、実施態様５８記載の方法。
６７．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様６６記載の方法。
６８．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様６７記載の方法。
６９．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する、実施態様５８記載の方法。
７０．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様６９記載の方法。
７１．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する、実施態様５８記載の方法。
７２．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である、実施態様５８記載の方法。
７３．追加の免疫調節治療を前記被検体に行うことをさらに含む、実施態様５８記載の方法。
７４．前記追加の免疫調節治療は、治療ワクチン、チェックポイント阻害剤またはアクチベーターを投与することを含む、実施態様７３記載の方法。
７５．化学療法または放射線療法を前記被検体に行うことをさらに含む、実施態様５３記載の方法。
７６．抗生物質を前記被検体に投与することをさらに含む、実施態様５５記載の方法。
７７．疾患の処置を必要とする被検体の疾患を処置する方法であって、前記被検体の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においてニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸を活性化することを含む方法。
７８．膜貫通型セマフォリンを発現する細胞上の膜貫通型セマフォリンと、前記被検体のＴｒｅｇ上のＮｒｐ１との間の相互作用を強化することを含む、実施態様７７記載の方法。
７９．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様７８記載の方法。
８０．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様７９記載の方法。
８１．前記膜貫通型セマフォリンを発現する細胞は、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からなる群より選択される、実施態様７８記載の方法。
８２．前記被検体は、自己免疫性疾患または炎症性疾患を有する、実施態様７７記載の方法。
８３．前記被検体はヒトである、実施態様７７記載の方法。
８４．前記被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸のアゴニストの治療有効量を、前記被検体に投与することを含む、実施態様７７〜８３いずれか１項記載の方法。
８５．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストはセマフォリン分子である、実施態様８４記載の方法。
８６．前記セマフォリン分子は多量体セマフォリン分子である、実施態様８５記載の方法。
８７．前記セマフォリン分子は、表面またはビーズ上に固定化されている、実施態様８５記載の方法。
８８．前記セマフォリン分子は、クラスＩＶセマフォリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログである、実施態様８５記載の方法。
８９．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様８８記載の方法。
９０．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは抗体である、実施態様８４記載の方法。
９１．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは小分子である、実施態様８４記載の方法。
９２．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、前記被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１発現を高める、実施態様８４記載の方法。
９３．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸のアゴニストは、Ｎｒｐ１のその下流のシグナル伝達経路への関与を高める、実施態様８４記載の方法。
９４．Ｔｒｅｇを強化するまたは炎症を阻止する別の治療を前記被検体に行うことをさらに含む、実施態様８４記載の方法。
９５．被検体におけるワクチンの有効性を高めるための方法であって、前記被検体のＴｒｅｇにおけるニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン軸の阻害剤の有効量を前記被検体に投与することを含む方法。
９６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は抗体である、実施態様９５記載の方法。
９７．前記抗体は、前記被検体のＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１−ＶＥＧＦ相互作用に影響を与えない、実施態様９６記載の方法。
９８．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤はセマフォリン分子である、実施態様９５記載の方法。
９９．前記セマフォリン分子は、可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該可溶型の膜貫通型セマフォリンタンパク質、フラグメント、誘導体またはアナログは、前記ＴｒｅｇにおけるＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することなく、Ｔｒｅｇ上のＮｒｐ１に高い親和性および特異性で結合することができる、実施態様９８記載の方法。
１００．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様９９記載の方法。
１０１．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様１００記載の方法。
１０２．前記セマフォリン分子は、Ｃ末端でＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したＳｅｍａ４ａ細胞外ドメインを含む、実施態様９８記載の方法。
１０３．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログであり、該Ｎｒｐ１タンパク質の可溶性細胞外ドメイン、フラグメント、誘導体またはアナログは、膜貫通型セマフォリンに高い親和性および特異性で結合することができ、それにより前記膜貫通型セマフォリンが前記被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１：セマフォリン軸を増強することを妨げる、実施態様９５記載の方法。
１０４．前記膜貫通型セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様１０３記載の方法。
１０５．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様１０４記載の方法。
１０６．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記被検体のＴｒｅｇにおいてＮｒｐ１タンパク質の発現を阻害する、実施態様９５記載の方法。
１０７．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様１０６記載の方法。
１０８．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、Ｎｒｐ１がその下流のシグナル伝達経路に関与するのを防止する、実施態様９５記載の方法。
１０９．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は小分子である、実施態様９５記載の方法。
１１０．前記被検体はヒトである、実施態様９５記載の方法。
１１１．前記ワクチンは、癌または感染症の処置または予防用である、実施態様９５記載の方法。
１１２．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ワクチンが前記被検体に投与される前に前記被検体に投与される、実施態様９５記載の方法。
１１３．前記Ｎｒｐ１：セマフォリン軸の阻害剤は、前記ワクチンと一緒に前記被検体に投与される、実施態様９５記載の方法。
１１４．制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上のニューロピリン１（Ｎｒｐ１）：セマフォリン相互作用を阻害する単離抗体。
１１５．前記セマフォリンはクラスＩＶセマフォリンである、実施態様１１４記載の抗体。
１１６．前記クラスＩＶセマフォリンはＳｅｍａ４ａである、実施態様１１５記載の抗体。
【０１９７】
【表１−１】
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【０１９８】
【表１−２】
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【０１９９】
【表１−３】
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【０２００】
【表１−４】
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【０２０１】
【表１−５】
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【０２０２】
【表２−１】
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【０２０３】
【表２−２】
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【０２０４】
【表２−３】
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【０２０５】
【表２−４】
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【０２０６】
【表２−５】
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【０２０７】
【表２−６】
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【０２０８】
【表２−７】
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【０２０９】
【表２−８】
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【０２１０】
【表２−９】
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【０２１１】
【表２−１０】
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【０２１２】
【表２−１１】
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【０２１３】
【表２−１２】
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【０２１４】
【表２−１３】
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【０２１５】
【表２−１４】
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【０２１６】
【表２−１５】
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【０２１７】
【表２−１６】
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【０２１８】
【表２−１７】
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【０２１９】
【表２−１８】
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【０２２０】
【表２−１９】
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【０２２１】
【表２−２０】
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【０２２２】
【表２−２１】
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【０２２３】
【表２−２２】
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【０２２４】
【表２−２３】
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【０２２５】
【表２−２４】
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【０２２６】
【表２−２５】
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【０２２７】
【表２−２６】
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【０２２８】
【表２−２７】
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【０２２９】
【表２−２８】
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【０２３０】
【表２−２９】
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【０２３１】
【表２−３０】
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【０２３２】
【表２−３１】
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【０２３３】
【表２−３２】
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【０２３４】
【表２−３３】
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【０２３５】
【表２−３４】
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【０２３６】
【表２−３５】
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【０２３７】
【表２−３６】
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【０２３８】
【表２−３７】
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【０２３９】
【表３−１】
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【０２４０】
【表３−２】
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【０２４１】
【表３−３】
2018172436.tif 000050
【０２４２】
【表３−４】
2018172436.tif 000051
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月11日(2018.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を阻害するまたはその安定性を低下させることによって対象における癌または感染症を治療するために用いられる、制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害する抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記対象における免疫ホメオスタシスを維持しつつ前記制御性Ｔ細胞の機能を阻害するまたはその安定性を低下させる、請求項１記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
制御性Ｔ細胞の機能を阻害するまたはその安定性を低下させることによって対象におけるワクチンの効果を高めるために用いられる、制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害する抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
免疫ホメオスタシスを維持しつつ対象における前記ワクチンの効果が高められる、請求項３に記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ワクチンが、癌または感染症の治療または予防のためのものであり、前記抗体またはフラグメントが前記ワクチンが投与される前または前記ワクチンとともに前記対象に投与される、請求項３または４に記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記対象がヒトである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞上のニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害し、かつＴｒｅｇ生存性および／または安定性を低下することができる、抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体が、インビボにおいて免疫ホメオスタシスを変化させない、請求項７記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記セマフォリンが、セマフォリンを発現している細胞上の膜貫通型セマフォリンであり、任意選択でクラスＩＶ膜貫通型セマフォリンまたはセマフォリン−４ａである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン−１：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）相互作用に影響しない、請求項１〜９のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｔｒｅｇにおけるニューロピリン−１：クラスＩＩＩセマフォリン相互作用に影響を与えない、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記セマフォリンが、通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）により発現される、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体が、モノクロナール抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の抗ニューロピリン−１抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象に投与した時ニューロピリン−１とセマフォリンとの間の相互作用を阻害するのに有効な量で含む、医薬組成物。