(57)【要約】      （修正有）【課題】真菌感染又は病原体に対して哺乳動物対象を免疫する方法（method）であって、前記対象に免疫原性量の化合物又はそれを含有する組成物を投与するステップを含む方法の提供。【解決手段】式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数であり、ＲはＨ又はアシル基である）により各々独立して表される１又は２以上の多糖部分を含む化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数であり、ＲはＨ又はアシル基である）により各々独立して表される１又は２以上の多糖部分を含む化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
近年、侵襲性の真菌性疾患の発生率が劇的に上昇していること、同様に薬剤抵抗性で以前には稀であった真菌種が出現してきたことから、広く有効で新しい治療上及び予防上の抗真菌治療戦略の必要性が強調されてきた（Cutler JE, Deepe GS, Jr., Klein BS. 2007. Advances in combating fungal diseases: vaccines on the threshold. Nat Rev Microbiol 5: 13-28、Ostrosky-Zeichner L, Casadevall A, Galgiani JN, Odds FC, Rex JH. 2010. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov 9: 719-27、Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 20: 133-63）。侵襲性真菌感染の発生率の増加は、疾患に関連した後天性免疫不全症の患者、集中治療室の患者、外科又は免疫抑制治療を受けている患者、及び器官又は細胞の移植療法を受けた患者の数が多くなっているせいで、免疫無防備状態の患者集団が増加していることに部分的に起因しうる。重要なことに、個体を侵襲性の真菌性疾患にかかりやすくさせるリスク因子により、有効な免疫応答を装備する可能性及び免疫療法に有利に応答する可能性が除外されないことから（Casadevall A, Pirofski LA. 2007. Antibody-mediated protection through cross-reactivity introduces a fungal heresy into immunological dogma. Infect Immun 75: 5074-8、Spellberg B. 2007. Prospects for and barriers to a fungal vaccine. Expert Opin Biol Ther 7: 1785-8）、有効なワクチン又は免疫療法ベースのアプローチを開発する見込みが与えられて、この行き届いていない医学的な必要性が満たされる。
【０００２】
ヒトに影響をおよぼす２つの最も流行性の病原性真菌であるアスペルギルス及びカンジダ種は、医療（health care）を必要とする全ての感染症のうち推定で８〜１０％を占め、死亡率の３０〜４０％に起因しうる（Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 20: 133-63、Cassone A, Torosantucci A. 2006. Opportunistic fungi and fungal infections: the challenge of a single, general antifungal vaccine. Expert Rev Vaccines 5: 859-67）。カンジダ種は米国における院内の敗血症ケースの第４の主要原因であり、全ての病原性真菌からの侵襲性の真菌性疾患の発生率の上昇は、世界の有意な医療負担を代表している。院内感染での真菌感染の入院及び治療が長くなることによる過剰な医療コストは、米国単独で毎年１０億米ドルに及ぶ。さらに、安全及び有効な抗真菌薬において進歩があるにもかかわらず、全てのクラスの現在利用可能な抗真菌剤が耐性株の出現にさらされていることを臨床単離体の包括的な抗真菌感受性試験は明らかとした（Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 20: 133-63）。クリプトコッカス髄膜炎（クリプトコッカス症としても知られている、真菌クリプトコッカスでの感染症）は、進行したＨＩＶ／ＡＩＤＳを伴う人々の間の非常に深刻な日和見感染症である。クリプトコッカス症は伝染性ではなく、このことは人から人に伝播できないことを意味している。クリプトコッカス髄膜炎は、特にクリプトコッカスが肺から脳に伝播した後に生じる。グローバルな問題として、世界的に約百万の新しいケースのクリプトコッカス髄膜炎が毎年生じており、６２５，０００の死亡例がもたらされている。大部分のケースは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを伴う人々の間で生じる日和見感染症である。先進国において抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ，antiretroviral therapy）の利用が広範囲で可能であることにより、これらの地域におけるクリプトコッカス感染の減少化が援助されてきたにもかかわらず、医療へのアクセスが制限される発展途上国においては依然として主要な問題である。サハラ以南のアフリカのいたるところで、例えばクリプトコッカスが、現在成人の髄膜炎の最も一般的な原因である。クリプトコッカス髄膜炎は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の死亡の主要原因であり、サハラ以南のアフリカにおいては、各年結核と同程度に多くの人々を死に至らしめ得る（Antinori S,  2013.  New Insights into HIV/AIDS-Associated Cryptococcosis. ISRN AIDS 471363）。
【０００３】
これらの真菌性疾患を治す重大な課題により、抗真菌兵器の価値ある成分として高度に有効な汎真菌ワクチン（pan-fungal vaccine）についての必要性が極めて高いことが示されている。現在まで、２つの真菌細胞壁炭水化物成分であるβ−マンナン及びβ−グルカンは、抗真菌ワクチン接種の標的として探索されてきた。直鎖β−（１→３）−グルカン又はβ−（１→２）−マンノトリオースから構成されるコンジュゲートワクチンは、能動及び受身免疫の双方における有効性を伴う、真菌性疾患に対する保護を付与することが示されている（Torosantucci A, Bromuro C, Chiani P, De Bernardis F, Berti F, Galli C, Norelli F, Bellucci C, Polonelli L, Costantino P, Rappuoli R, Cassone A. 2005. A novel glyco-conjugate vaccine against fungal pathogens. J Exp Med 202: 597-606、Xin H, Dziadek S, Bundle DR, Cutler JE. 2008. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13526-31、Han Y, Cutler JE. 1995. Antibody response that protects against disseminated candidiasis. Infect Immun 63: 2714-9）。真菌性疾患の動物モデルでは、Ｃ．アルビカンス、Ａ．フミガーツス、及びＣ．ネオフォルマンスに対してβ−グルカンワクチンが有効であることが証明されており、複数の不同性の真菌病原体に対するワクチン接種が成功する可能性が検証された（Torosantucci A, Bromuro C, Chiani P, De Bernardis F, Berti F, Galli C, Norelli F, Bellucci C, Polonelli L, Costantino P, Rappuoli R, Cassone A. 2005. A novel glyco-conjugate vaccine against fungal pathogens. J Exp Med 202: 597-606、Rachini A, Pietrella D, Lupo P, Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, Proietti C, Bistoni F, Cassone A, Vecchiarelli A. 2007. An anti-beta-glucan monoclonal antibody inhibits growth and capsule formation of Cryptococcus neoformans in vitro and exerts therapeutic, anticryptococcal activity in vivo. Infect Immun 75: 5085-94）。このような状況ではあるが、真菌病原体による免疫回避の一機構が非保護性又は阻害性の抗体応答を誘導する免疫優性エピトープの発現であるとの証拠がますます増えて存在していることから、有効なワクチン応答の産生には、標的抗原の微細構造を慎重に考慮することが要求されている。これらのデコイエピトープにより、保護性エピトープに向かう応答の有効性が失われる。例えば、直鎖β−（１→３）−グルカンエピトープから構成されるワクチンは保護性応答を産生する一方で、β−（１→３）−グルカンとβ−（１→６）−グルカン分枝から構成されるワクチンは双方の構造に対する抗体を産生するが、しかし、真菌性疾患に対して保護を付与することはない（Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, De Bernardis F, Palma AS, Liu Y, Mignogna G, Maras B, Colone M, Stringaro A, Zamboni S, Feizi T, Cassone A. 2009. Protection by anti-beta-glucan antibodies is associated with restricted beta-1,3 glucan binding specificity and inhibition of fungal growth and adherence. PLoS One 4: e5392、Bromuro C, Torosantucci A, Chiani P, Conti S, Polonelli L, Cassone A. 2002. Interplay between protective and inhibitory antibodies dictates the outcome of experimentally disseminated Candidiasis in recipients of a Candida albicans vaccine. Infect Immun 70: 5462-70）。
【０００４】
さらに、ワクチンの基礎的な有用性は、標的抗原の普遍性に依存している。例えば、β−（１→２）−マンノトリオースエピトープは全てのカンジダ種に出現するわけではない、また、このエピトープを用いるワクチン抗原は保護性ペプチドエピトープに依存して、その有用性が拡大される（Xin H, Dziadek S, Bundle DR, Cutler JE. 2008. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13526-31）。いくつかの細胞壁炭水化物エピトープの分布が限定的であることや細胞壁成分に対する増殖性の免疫応答を回避するため真菌病原体により用いられる機構の観点から考慮すると、普遍的に有効な真菌ワクチンについての必要性が存在する。本発明は、汎真菌ワクチンを提供するために、高度に保存された真菌細胞壁炭水化物エピトープを標的とするように設計された。
【０００５】
キチンは抗真菌性ワクチンの標的として検査されてきていないが、その理由の多くはキチンが高度に不溶性の性質であることに関連している。キチンを可溶性の断片に分解するための当技術分野において利用可能な方法は、化学量論的に制御されないため、脱重合の度合をモジュレートすることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cutler JE, Deepe GS, Jr., Klein BS. 2007. Advances in combating fungal diseases: vaccines on the threshold. Nat Rev Microbiol 5: 13-28
【非特許文献２】Ostrosky-Zeichner L, Casadevall A, Galgiani JN, Odds FC, Rex JH. 2010. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov 9: 719-27
【非特許文献３】Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 20: 133-63
【非特許文献４】Casadevall A, Pirofski LA. 2007. Antibody-mediated protection through cross-reactivity introduces a fungal heresy into immunological dogma. Infect Immun 75: 5074-8
【非特許文献５】Spellberg B. 2007. Prospects for and barriers to a fungal vaccine. Expert Opin Biol Ther 7: 1785-8
【非特許文献６】Cassone A, Torosantucci A. 2006. Opportunistic fungi and fungal infections: the challenge of a single, general antifungal vaccine. Expert Rev Vaccines 5: 859-67
【非特許文献７】Antinori S,  2013.  New Insights into HIV/AIDS-Associated Cryptococcosis. ISRN AIDS 471363
【非特許文献８】Torosantucci A, Bromuro C, Chiani P, De Bernardis F, Berti F, Galli C, Norelli F, Bellucci C, Polonelli L, Costantino P, Rappuoli R, Cassone A. 2005. A novel glyco-conjugate vaccine against fungal pathogens. J Exp Med 202: 597-606
【非特許文献９】Xin H, Dziadek S, Bundle DR, Cutler JE. 2008. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13526-31
【非特許文献１０】Han Y, Cutler JE. 1995. Antibody response that protects against disseminated candidiasis. Infect Immun 63: 2714-9
【非特許文献１１】Rachini A, Pietrella D, Lupo P, Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, Proietti C, Bistoni F, Cassone A, Vecchiarelli A. 2007. An anti-beta-glucan monoclonal antibody inhibits growth and capsule formation of Cryptococcus neoformans in vitro and exerts therapeutic, anticryptococcal activity in vivo. Infect Immun 75: 5085-94
【非特許文献１２】Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, De Bernardis F, Palma AS, Liu Y, Mignogna G, Maras B, Colone M, Stringaro A, Zamboni S, Feizi T, Cassone A. 2009. Protection by anti-beta-glucan antibodies is associated with restricted beta-1,3 glucan binding specificity and inhibition of fungal growth and adherence. PLoS One 4: e5392
【非特許文献１３】Bromuro C, Torosantucci A, Chiani P, Conti S, Polonelli L, Cassone A. 2002. Interplay between protective and inhibitory antibodies dictates the outcome of experimentally disseminated Candidiasis in recipients of a Candida albicans vaccine. Infect Immun 70: 5462-70
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数であり、ＲはＨ又はアシル基である）により各々独立して表される１又は２以上の多糖部分を含む化合物を提供する。
【０００８】
本発明はまた、式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数である）により表される化合物を製造するための方法（process）であって、
（ａ）キトサンを、前記キトサンを部分的にＮ−アシル化するため十分な量のアシル化剤と反応させて、修飾キチン／キトサン混合ポリマーを得るステップ；
（ｂ）前記修飾キチン／キトサン混合ポリマーを、前記混合ポリマーを非アシル化キトサン部分で切断するための脱アミノ剤と反応させて、式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノースの化合物を得るステップ
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、真菌感染又は病原体に対して哺乳動物対象を免疫する方法（method）であって、前記対象に免疫原性量の化合物又はそれを含有する組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明は、真菌病原体に対して哺乳動物対象における免疫応答を刺激する方法であって、前記対象に免疫原性量の化合物又はそれを含有する組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、上記の化合物に特異的な抗体を提供する。また、本発明は、真菌感染又は病原体に対して哺乳動物対象を保護する方法であって、前記抗体を前記対象に、前記真菌感染に対して前記対象を保護するために有効な量で投与するステップを含む方法を提供する。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数であり、ＲはＨ又はアシル基である）により各々独立して表される１又は２以上の多糖部分を含む化合物。
（２）ｎが３〜１００の正の整数である、上記（１）に記載の化合物。
（３）ｎが６〜５０の正の整数である、上記（２）に記載の化合物。
（４）アシル基Ｒがアセチル基である、上記（１）に記載の化合物。
（５）化合物におけるアシル基のうちの少なくとも３０％がアセチルである、上記（１）に記載の化合物。
（６）１又は２以上の多糖部分に共有結合している担体タンパク質をさらに含む、上記（１）に記載の化合物。
（７）担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、及び真菌タンパク質ビルレンス因子からなる群から選択される、上記（６）に記載の化合物。
（８）担体タンパク質が、多糖部分の各々のアンヒドロマンノース基において１又は２以上の多糖部分に直接的に共有結合している、上記（６）に記載の化合物。
（９）担体タンパク質が、１又は２以上の免疫原性骨格部分を介して１又は２以上の多糖部分に共有結合している、上記（６）に記載の化合物。
（１０）骨格部分の各々が、多糖、ペプチドグリカン、ポリペプチド、及びポリグリセリンからなる群から選択される、上記（９）に記載の化合物。
（１１）骨格が直鎖である、上記（９）に記載の化合物。
（１２）骨格がデンドリマーである、上記（９）に記載の化合物。
（１３）担体タンパク質又は骨格に共有結合している１又は２以上の直鎖β−マンナン又はグルカンエピトープをさらに含む、上記（６）又は（１２）に記載の化合物。
（１４）β−マンナンがβ−１，２−マンノース四糖である、上記（１３）に記載の化合物。
（１５）１又は２以上のグルカンエピトープが直鎖α−１，３−グルカンエピトープである、上記（１３）に記載の化合物。
（１６）１又は２以上のグルカンエピトープが直鎖β−１，３−グルカンエピトープである、上記（１３）に記載の化合物。
（１７）組成物中の化合物の分子のうちの少なくとも８０％について、ｎが６〜５０の値を有する、上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の化合物を含む組成物。
（１８）ｎの平均値が１０〜５０である、上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の化合物を含む組成物。
（１９）式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数である）により表される化合物を製造するための方法であって、
（ａ）キトサンを、前記キトサンを部分的にＮ−アシル化するため十分な量のアシル化剤と反応させて、修飾キチン／キトサン混合ポリマーを得るステップ；
（ｂ）前記修飾キチン／キトサン混合ポリマーを、前記混合ポリマーを非アシル化キトサン部分で切断するための脱アミノ剤と反応させて、式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノースの化合物を得るステップ
を含む、前記方法。
（２０）アシル化剤がアセチル化剤である、上記（１９）に記載の方法。
（２１）アセチル化剤が無水酢酸又は塩化アセチルである、上記（２０）に記載の方法。
（２２）アシル化剤がプロピオニル化剤である、上記（１９）に記載の方法。
（２３）プロピオニル化剤がＮ−プロピオン酸無水物又はプロピオン酸クロリドである、上記（２２）に記載の方法。
（２４）脱アミノ剤が亜硝酸ナトリウムである、上記（１９）に記載の方法。
（２５）真菌病原体に対して哺乳動物対象を免疫する方法であって、前記対象に上記（１）〜（１８）のいずれかに記載の免疫原性量の化合物又は組成物を投与するステップを含む、前記方法。
（２６）対象がヒト対象である、上記（２５）に記載の方法。
（２７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物に特異的な抗体。
（２８）真菌感染に対して哺乳動物対象を保護する方法であって、前記対象に、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物、又は上記（１７）若しくは１８に記載の組成物に特異的な抗体を、前記真菌感染に対して前記対象を保護するために有効な量で投与するステップを含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】修飾キチン断片の調製に関する反応スキームである。キトサンからの修飾キチン断片のワンポット調製に関する反応スキームである。
【図２】破傷風トキソイドにコンジュゲーションされる修飾キチンの分析の図である。修飾キチン断片の破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質へのコンジュゲーションを示しているクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。
【図３】修飾キチン−ＴＴコンジュゲートの用量及び免疫化スケジュールの図である。修飾キチン−ＴＴコンジュゲートワクチンをＢａｌｂ／Ｃマウスに投与するための用量及び免疫化スケジュールを示す図である。
【図４】Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける修飾キチン−ＴＴコンジュゲートワクチンの免疫原性の図である。Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートの免疫原性を示すラインプロット図である。スクリーニング抗原は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，human serum albumin）に架橋された修飾キチンである。
【図５Ａ】修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける免疫応答の特異性の図である。修飾キチン−ＨＳＡスクリーニング抗原に結合するワクチン血清の阻害を比較するラインプロット図である。
【図５Ｂ】修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける免疫応答の特異性の図である。複数のＧｌｃＮＡｃを含有しているグリコンジュゲート（glyconjugates）に向けたワクチン血清の交差反応性の欠如を示す棒グラフである。
【図５Ｃ】修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける免疫応答の特異性の図である。キチン／キトサン多糖に向けたワクチン血清の反応性を示す棒グラフである。左のグラフは、修飾キチンに反応する抗体を粒子性のキチン又はキトサンの吸着により枯渇させることができることを示す。加えて、キチン又はキトサンからの可溶性抽出物は、ワクチン血清の修飾キチン−ＨＳＡへの結合を阻害する。右のグラフは、無関係な抗体（抗ＨＡ）のそのエピトープへの結合が、同じ治療により影響されないことを示す。
【図６】カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）真菌全体への修飾キチン−ＴＴコンジュゲートワクチン誘導性抗体の結合の図である。モック（ＰＢＳ）及び修飾キチン−ＴＴ免疫化Ｂａｌｂ／Ｃマウスからの血清抗体が、Ｃ．アルビカンス全体に結合することを示す棒グラフである。反応性は、修飾キチン断片と特異的に競合する。
【図６Ｂ】カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）真菌全体への修飾キチン−ＴＴコンジュゲートワクチン誘導性抗体の結合の図である。抗原アフィニティー精製したキチン反応性抗体が、Ｃ．アルビカンス全体に結合することを示す棒グラフである。
【図７Ａ】様々な条件下で成長させたカンジダ・アルビカンス酵母細胞の形態の図である。３０℃でＹＰＤ培地中ｏ／ｎで成長させた酵母細胞。
【図７Ｂ】様々な条件下で成長させたカンジダ・アルビカンス酵母細胞の形態の図である。３７℃でＹＰＤ培地及び血清中１５０分間成長させた中間フィラメント細胞。
【図７Ｃ】様々な条件下で成長させたカンジダ・アルビカンス酵母細胞の形態の図である。３７℃でＹＰＤ培地及び血清中３００分間でフィラメントは菌糸体に成長する。
【図８Ａ】フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンス全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。酵母細胞に結合する抗体についてのアッセイ対照。
【図８Ｂ】フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンス全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。酵母細胞に結合する破傷風トキソイド抗体対照。
【図８Ｃ】フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンス全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。３０℃でＹＰＤ培地中ｏ／ｎで成長させた酵母細胞に結合するラミナリン抗体（上段）及び修飾キチン抗体（下段）。
【図８Ｄ】フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンス全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。３７℃でＹＰＤ培地及び血清中１５０分間成長させた酵母細胞に結合するラミナリン抗体。
【図８Ｅ】フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンス全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。３７℃でＹＰＤ培地及び血清中３００分間成長させた場合に酵母細胞（菌糸体）に結合する修飾キチン抗体。
【図９Ａ】修飾キチン−ＴＴワクチンがＣ．アルビカンスの致死的チャレンジからの保護を媒介することを示す図である。マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）は、修飾キチン−ＴＴワクチンで免疫され、引き続いて生きたＣ．アルビカンスの致死量でチャレンジされた。生存を、真菌チャレンジ後３６日間モニターした。
【図９Ｂ】修飾キチン−ＴＴワクチンがＣ．アルビカンスの致死的チャレンジからの保護を媒介することを示す図である。マウス（ＣＤ１）は、修飾キチン−ＴＴ及びラミナリン−ＴＴコンジュゲートワクチンで免疫され、引き続いて生きたＣ．アルビカンスの致死量でチャレンジされた。生存を、真菌チャレンジ後２８日間モニターした。
【図１０Ａ】キチン、修飾キチン及びラミナリンでの正常ヒト血清のＥＬＩＳＡによる免疫反応性を示す図である。修飾キチン−ＨＳＡ被覆プレートにおける正常ヒト血清（ＩｇＧガンマ）の反応性。全ての血清は、有意に修飾キチンと反応することから、真菌又は外来抗原を含有している他のキチンへのいずれかの曝露を通して、ヒトにおいて自然獲得されたキチン特異的な抗体が存在することを示唆している。
【図１０Ｂ】キチン、修飾キチン及びラミナリンでの正常ヒト血清（ＮＨＳ，normal human sera）のＥＬＩＳＡによる免疫反応性を示す図である。様々なインヒビターでの競合阻害による、高力価ＮＨＳの修飾キチンＨＳＡ被覆プレートへの結合の抗体特異性。修飾キチンに向けたＮＨＳの特異性が、最高であり、小キチンオリゴ糖インヒビター（ＤＰ５及びＤＰ３）が続く。
【図１０Ｃ】キチン、修飾キチン及びラミナリンでの正常ヒト血清のＥＬＩＳＡによる免疫反応性を示す図である。ＤＰが増加するキチンオリゴ糖での競合阻害による、高力価ＮＨＳのキトヘキサオース−ＨＳＡ被覆プレートへの結合の抗体特異性。ＤＰ２〜ＤＰ６のキチンオリゴ糖のサイズの増加に伴う阻害の増加が存在することから、これらのヒト抗体が、六糖の最小サイズを有するキチンの構造エピトープを認識することが示唆される。
【図１０Ｄ】キチン、修飾キチン及びラミナリンでの正常ヒト血清のＥＬＩＳＡによる免疫反応性を示す図である。ラミナリンＨＳＡ被覆プレートにおける正常ヒト血清（ＩｇＧガンマ）の反応性。修飾キチンと同じ度合ではないが、ＮＨＳはラミナリン（ベータグルカン）抗原を認識する。
【図１１】フローサイトメトリーによるクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）Ａ型（Ｈ９９）全体への修飾キチン及びラミナリンワクチン誘導性抗体の結合の図である。酵母細胞への抗体結合についてのアッセイ対照。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、式β（１→４）−［ＧｌｃＮＨ−Ｒ］ｎ−２，５−アンヒドロマンノース（式中、ｎは３〜５００の正の整数であり、ＲはＨ又はアシル基である）により各々独立して表される１又は２以上の多糖部分を含む化合物を提供する。本発明のより具体的な実施形態では、ｎは３〜１００、又は６〜５０の正の整数である。ある実施形態では、アシル基Ｒはアセチルである。別の実施形態では、化合物におけるアシル基のうちの少なくとも３０％は、アセチルである。
【００１２】
技術分野は、予防、治療、及び真菌感染の検出である。具体的には、真菌細胞壁の炭水化物成分を標的にするワクチン又は免疫療法により、播種性又は局所的に侵襲性の真菌感染のための治療を提供することができる。疾患の適応症は、カンジダ、アスペルギルス、及びクリプトコッカス種のヒトの病原性形態によって引き起こされるものを含むが、限定されない、多数のものである。加えて、これらの病原性真菌の保存された炭水化物成分に対して抗体応答を生じる能力により、患者の生物学的サンプル（例えば、血漿、血清、又は他の体液、並びに組織切片、など）における、これらの真菌因子の検出のための診断試薬の開発が導かれるであろう。最終的に、キチンに対するＴｈ２タイプ炎症応答がアレルギー喘息及び他のアレルギー状態に関連付けられているので（Lee CG. 2009. Chitin, chitinases and chitinase-like proteins in allergic inflammation and tissue remodeling. Yonsei Med J 50: 22-30）、Ｔｈ１タイプ免疫応答に向かうシフトをもたらすキチンベースのワクチンはアレルゲン誘導性炎症の症状を寛解させ得る。
【００１３】
所望の別の重要な細胞壁炭水化物は、表面α−１，３−グルカンである。真菌病原体による感染の成功は、ベータグルカンなどの保存された細胞壁成分を検出する宿主免疫機構を転覆させることに依存する。稀な多糖α−（１，３）−グルカンは、大部分の真菌性呼吸器病原体の細胞壁構成成分であり、病原性と相関する又は直接的にビルレンスと連結している。しかしながら、α−（１，３）−グルカンが真菌ビルレンスを促進する正確な機構は、未知である。α−（１，３）−グルカンは、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）酵母細胞壁の最外層に存在し、免疫賦活性のベータグルカンが宿主の食作用性細胞による検出から隠匿されることによる病因に寄与する。食細胞による炎症誘発性ＴＮＦアルファの産生は、酵母細胞におけるα−（１，３）−グルカン層の存在又は宿主ベータグルカン受容体デクチン−１のＲＮＡ干渉ベースの枯渇化によって抑制される。Rappleye et al.は、ヒストプラスマ症の初期の宿主−病原体相互作用に影響する鍵分子の成分を機能上定義し、Ｈ．カプスラーツムが宿主免疫系を邪魔をする重要な機構を明らかにした。さらに、彼らは、この回避の度合が二形性の真菌病原体と日和見性の真菌の間の病原性ポテンシャルにおける差に寄与することを提唱している（Rappleye CA, Eissenberg LG, Goldman WE . 2007. Histoplasma capsulatum alpha-(1,3)-glucan blocks innate immune recognition by the beta-glucan receptor. PNAS. 104(4):1366-70）。別の研究は、真菌感染に対する細胞壁α−１，３−グルカンの関連性を示唆した。多くの真菌種が同じ又は類似するステルス感染戦略を潜在的に利用するであろうとの理由から、例えば、α−１，３−グルカナーゼ活性を作物植物に付与することによって、又は真菌性α−１，３−グルカンシンターゼのインヒビターを適用することによって、真菌性α−１，３−グルカンを標的とすることは、重要な作物における多種多様な真菌性疾患の予防についての多様な戦略を提供するであろう。詳細な機構はいまだ解決されていないが、表面α−１，３−グルカンの除去が菌侵入前に真菌病原体に対抗する宿主植物の防御応答を急速に活性化し、病原体感染の阻害がもたらされるということは事実である（Fujikawa T. et al. 2012. Surface alpha 1,3-Glucan Facilitates Fungal Stealth Infection by Interfering with Innate Immunity in Plants PLOS Pathogens  8:| e1002882）。酵母細胞壁は、細胞の統合性の維持、特にチャレンジに直面して、例えば、哺乳動物宿主における成長に極めて重要である。病原性真菌クリプトコッカス・ネオフォルマンスは、その多糖カプセルを細胞表面に、壁におけるα（１−３）グルカンを介して、付加的にアンカーする。アルファグルカンシンターゼ遺伝子が破壊されたクリプトコッカス細胞は、温度を含むストレスに感受性であり、また分裂の困難性を示した。これらの細胞は表面カプセルを欠いているにもかかわらず、カプセル物質をその環境に出し続けた。細胞壁の外側部分に通常局在するアルファグルカンが存在しないこと、壁の外側領域が高度に無秩序化されたこと、及び内側領域が肥厚性（hypertrophic）であったことが、電子顕微鏡法により示された。細胞壁組成の分析により、キチン／キトサンの代償性の増加を付随するアルファグルカンの完全な欠損及び細胞壁フラクション間のベータグルカンの再分��が実証された。変異体は感染のマウスモデルにおいて成長できなかったが、線形動物には死を引き起こした。これらの研究は、クリプトコッカス細胞壁におけるアルファグルカンの役割の形態学的及び生化学的な調査を統合している（Reese, A. J.et al. 2007. Loss of cell wall alpha (1-3) glucan affects Cryptococcus neoformans from ultrastructure to virulence. Mol. Microbiol. 63, 1385-1398）。
【００１４】
したがって、キチン／キトサン及び１又は２以上のグルカン抗原、例えば、α−１，３リンケージャー（linkager）、β−１，３リンケージ又は双方のホモポリマーを含有しているグルカン抗原を含むワクチンは、高度に保存された真菌細胞壁エピトープを標的とし、汎真菌ワクチンを提供する。
【００１５】
本発明は、病原性真菌の複数の門にわたる共通の構造上のエレメントである、保存された炭水化物細胞壁成分を標的とする抗真菌コンジュゲートワクチンを提供する。これらのワクチンの組成物は、キチン単独、又はβ−マンナン又はグルカンエピトープと組み合わせたキチンに由来するオリゴ糖又は多糖からなる１又は２以上のエピトープを含むことができる。炭水化物成分は、適切な免疫原性タンパク質担体、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、又は真菌細胞表面に存在する特異的なタンパク質ビルレンス因子にコンジュゲートされてもよい。本発明のある実施形態では、担体タンパク質は、多糖部分の各々のアンヒドロマンノース基において１又は２以上の多糖部分に直接的に共有結合している。ある実施形態では、担体タンパク質は、１又は２以上の免疫原性骨格部分を介して１又は２以上の多糖部分に共有結合している。従来の骨格部分を使用することができ、その例には、多糖、ペプチドグリカン、ポリペプチド、及びポリグリセリンが含まれる。骨格は、直鎖又はデンドリマーであり得る。想定される多成分性ワクチンは、キチン、β−マンナン及び／又はグルカンエピトープ（直鎖α−１，３−及び／又はβ−１，３−グルカン）の単純な混合物又は選り抜きの担体タンパク質又は免疫原性骨格に個々にコンジュゲートされる誘導体を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１６】
一実施形態では、β−マンナンは、β−１，２−マンノース四糖であり得る。β−１，２マンノース四糖／骨格複合体の最も単純な実施形態では、オリゴ糖は、修飾キチン多糖と反応して、多価分子を産生できる。β−１，２マンノース四糖は、化学的に合成することができる（Nitz M, Bundle D.R.  2001.  J. Synthesis of Di- to Hexasaccharide 1,2-Linked -Mannopyranan Oligomers, a Terminal S-Linked Tetrasaccharide Congener and the Corresponding BSA Glycoconjugates J Org Chem  66: 8411-23）。オリゴ糖の縮合は、オリゴ糖の還元末端の間と修飾キチンの遊離アミノ基との反応又はスクアレート基を備えたスペーサーアームを介する反応に関する、当技術分野において利用可能な任意の多数の方法によって成し遂げることができる（Nitz M, Bundle D.R.  2001.  J. Synthesis of Di- to Hexasaccharide 1,2-Linked -Mannopyranan Oligomers, a Terminal S-Linked Tetrasaccharide Congener and the Corresponding BSA Glycoconjugates J Org Chem  66: 8411-23）。加えて、本発明は、骨格とされるオリゴ糖／多糖を適切な担体タンパク質にコンジュゲートする、さらなるステップを想定する。このコンジュゲーションは、当技術分野における熟練した従事者に利用可能な、いくつかの手段によって達成されうる。例えば、骨格複合体は、還元的なアミノ化によって直接的に、又は炭水化物構成物と担体タンパク質の間の立体障害を取り除く適切なスペーサー長を含有している適切な架橋剤を用いることによって間接的にコンジュゲートされ得る。本発明のさらなる別の実施形態では、デンドリマー多糖骨格は、骨格成分を多機能性の架橋試薬、例えば、トリス−スクシンイミジル−アミノトリアセタート（ＴＳＡＴ，Tris-succinimidyl-aminotriacetate）と最初に反応させることによって調製することができる。この反応により、β−１，２マンノースオリゴ糖成分の引き続く縮合について、デンドリマー様パターンで多価アレイの利用可能な骨格が得られるであろう。
【００１７】
或いは、異なる炭水化物成分を、直接的又は間接的のいずれかで化学的に架橋することができる。例えば、炭水化物は、それらを共通の骨格マトリックス、例えば、デンドリマー基質と一緒に連結させることによって、又はタンパク質担体との共コンジュゲーションによって接合させることができる。さらなる別の実施形態では、炭水化物成分の間に化学的な架橋を作出すること、引き続いて骨格とした多糖マトリックスを免疫原性タンパク質又はペプチド担体とコンジュゲートすることによって、成分を一緒に直接的に骨格とする。これらの化学的な架橋は、還元的なアミノ化又はヘテロ二官能性若しくはホモ二官能性の化学的な架橋試薬の使用を含むが、これらに限定されない、当技術分野における熟練した従事者に利用可能な任意の数の手段によって達成することができる。
【００１８】
本発明は、組成物中の化合物の分子のうちの少なくとも８０％について、ｎが６〜５０の値を有する、上記の化合物を含む組成物を提供する。代替の実施形態では、本発明は、ｎの平均値が１０〜５０である、上記の化合物の分子を含む組成物を提供する。
【００１９】
抗真菌ワクチンに使用するためのキチン又はキトサン由来断片を産生する方法を試験した。文献（米国特許第５７０５６３４号明細書（Bredehorst R, Pomato N, Scheel O, Thiem J. 1998.）、米国特許第５３１２９０８号明細書（Nakao E. 1994.）、米国特許第４８０４７５０号明細書（Nishimura T, Eto E, Yamad T. 1989.）、米国特許出願公開第２００９０２８１０５８号明細書（Gislason J, Einarsson JM, How NC, Bahrke S. 2009.））中の利用可能な方法に部分的に基づく様々な条件下で、多数の戦略を試験した。アプローチには、キチンの部分的な酸加水分解などのキチンオリゴ糖を直接的に得る方法が含まれていた。試験した変数には、反応の時間、温度、及びスケールが含まれていた。全ての試験した方法において、溶解性が主要な問題であり、所望のサイズのオリゴ糖の収量は１％以下の失望的な範囲であり、公開された収量とは一致しているが、ワクチン抗原の効率的な産生のためには望ましくはない。公開された方法に基づく様々な条件も試験して、キトサンオリゴ糖又は多糖の限定的な亜硝酸脱アミノ（nitrous deamination）を達成し、これにより脱アミノ化された残基でのグリコシド結合の切断（ポリマー断片化）を伴って遊離アミノ基が脱アミノ化された。亜硝酸脱アミノについて試験した変数には、亜硝酸のモル分率を変動させること並びにアセチル化のサイズ及び度合を変動させたキトサンで開始することが含まれていた。これらのケースの全てで、亜硝酸処理により、キトサン懸濁物が溶解された、しかし、反応を制御することは困難であり、再度、所望のサイズのオリゴ糖の収量は低かった。最終的に、亜硝酸脱アミノ反応のための出発原料として部分的に脱−Ｎ−アセチル化されたキチンを産生する試みでは、キチンをＮａＯＨで処理して、亜硝酸脱アミノ前の限定的な脱−Ｎ−アセチル化を実行した。この処理は、非常に低分子量のキチンオリゴ糖のみを産生した。
【００２０】
当技術分野による現存の方法で容認可能な収量で所望のサイズのキチン由来断片を得ることに失敗したことから、所望の産物を得るための別の戦略を考案し、この戦略は限定数の遊離アミノ基を含有しているグルコサミン残基を有するキチン／キトサン混合ポリマーを産生するため、キトサンを部分的に再−Ｎ−アシル化する（例えば、再−Ｎ−アセチル化する）ことであった。引き続く亜硝酸脱アミノ反応は、遊離アミノ基を含有しているグルコサミン残基のみで生じることが理由で、Ｎ−アシルグルコサミン（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン）残基は、切断に対して耐性であろう。アシル化（例えば、アセチル化）反応は、自然において触媒性ではないので、反応が、反応中に存在するアセチル化試薬のモル分率を調整することによって制御できるかどうかを試験した。アシル化（例えば、アセチル化）試薬の量を調整することによって、引き続く亜硝酸脱アミノ反応においてキチン由来断片のサイズを直接的に制御できることが見出された。さらに、キトサンから修飾キチン断片へ導く２つの反応を、固相アシル化（例えば、アセチル化）反応、続いて酸性化及び亜硝酸脱アミノして修飾キチン断片を得ることからなる、ワンポット反応として行うことができた。任意の従来のアシル化剤を使用することができ、例えば、双方がアセチル化剤である無水酢酸若しくは塩化アセチル、又はプロピオニル化剤であるＮ−プロピオン酸無水物若しくはプロピオン酸クロリドを使用することができる。
【００２１】
キチンをワクチン製剤において用いるための主要な障害は、その高度に不溶性の性質である。キチンを可溶性の断片に分解するための当技術分野において利用可能な方法は、化学量論的に制御されないため、脱重合の度合をモジュレートすることは困難である。目的は、真菌細胞壁における天然性（native）キチンポリマーに対するワクチン応答を誘導し、十分なサイズのキチン由来断片を効率的に生産し、一方、断片が、それらが注射可能ワクチンとして製剤化されるために適切に可溶性であるか又は十分に均一であるとの潜在的に競合する判定基準をも満たすことであった。どのようにして、これらの判定基準をワンポット反応で満たすことにおいて成功が達成されたかを、以下の非限定的な例が実証する。化学量論的に限定的な反応におけるキトサンの部分的な再−Ｎ−アセチル化の最初のステップを用いることにより、引き続いて修飾ポリマーを亜硝酸脱アミノによって制御された様式で断片化することが可能であった（実施例１及び図１）。
【００２２】
本発明は、真菌感染に対して哺乳動物対象を免疫する方法であって、前記対象に上記の免疫原性量の化合物又は組成物を投与するステップを含む方法を提供する。対象は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。
【００２３】
炭水化物抗原の免疫原性を改善するため及びＴ細胞依存的な記憶応答を促進するため、修飾キチン断片を破傷風トキソイドにコンジュゲートした。破傷風トキソイドは、それを炭水化物コンジュゲートワクチンのためのタンパク質担体としての使用に適切とする複数のＴヘルパーエピトープを含有する免疫原性タンパク質の非限定的な例である。実施例２及び図２は、アルデヒド含有キチン断片を破傷風トキソイドに還元的なアミノ化を介してコンジュゲーションするための方法の非限定的な例を実証する。実施例３及び図３は、試験動物にワクチン応答を誘導する免疫化戦略の典型的な例を提供する。
【００２４】
ここで概説されるように、修飾キチンワクチンで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける抗体応答の評価により、そのワクチンが、免疫抗原（実施例４及び図４）及びＣ．アルビカンス真菌全体（実施例６及び図６）の双方に向けた頑強及び特異的な免疫応答を産生することが実証される。モック（ＰＢＳ）免疫した動物は、前の真菌曝露と一致する、Ｃ．アルビカンス全体への結合の基礎レベルを呈する（実施例６Ａ及び図６Ａ）。修飾キチンワクチンでの免疫化により、Ｃ．アルビカンスを認識する血清抗体の力価が著明に上昇し、真菌への適応応答の増強を示している。Ｃ．アルビカンスの結合が修飾キチン断片で実質的に阻害されたことは、血清抗体の有意な部分がキチンを認識すること、重要なことに、抗体が天然性真菌におけるキチンを認識することを実証している。抗原阻害実験により、免疫抗原に向けたワクチン応答の特異性が立証された（実施例及び図５Ａ）。さらに、誘導性抗体は、哺乳動物に存在する複数のＧｌｃＮＡｃ含有グリココンジュゲートと検出可能な交差反応性を示さなかった（実施例５Ｂ及び図５Ｂ）。これらの陰性の特異性対照には、Ｏ−連結型ＧｌｃＮＡｃ−セリン、主要な細胞内グリカン；両方共に多くの異なるＮ−及びＯ−連結型炭水化物抗原を含有する、卵白アルブミン及びフェチュイン（fetuin）；細胞外マトリックスの主要な成分であるヒアルロン酸（ＨＡ）；並びに多数の糖タンパク質を含有する粗製血清が含まれていた。ワクチン血清がキチン又はキトサン粒子の懸濁液に前吸着された又は可溶性のキチン／キトサンとインキュベートされた場合に、修飾キチン抗原への結合は劇的に阻害され（実施例５Ｃ及び図５Ｃ）、さらにワクチン応答の特異性を実証している。ワクチンの抗原アフィニティー精製により、血清抗体が誘導されたことから、キチン特異的なフラクションはＣ．アルビカンス全体に結合することが可能であることが示される。これらのデータは、全ての既知の病原性真菌に存在する、真菌細胞壁の保存された必須な成分、すなわちキチンに向けたワクチンの具体的な例を提供する。
【００２５】
フローサイトメトリーによる修飾キチンワクチン誘導性抗体のＣ．アルビカンス酵母細胞への結合の分析は、修飾キチン抗体が、１：１０希釈で結合する約２５％の生きた集団でカンジダ細胞を陽性に染色したことを指し示し（実施例６Ｃ及び図８Ｃ下段パネル）、さらに実施例６の詳細な結合データを支持する。ラミナリン−ＴＴコンジュゲートで生成された高力価ラミナリン（β−グルカン）抗体はまた、Ｃ．アルビカンスを陽性に染色した（図８Ｃ上段パネル）。これらのデータは、両方の炭水化物が真菌の表面で曝露されることを示唆する。
【００２６】
培養におけるカンジダの成長の様々なステージでの修飾キチン抗体並びにベータグルカン抗体の結合も、フローサイトメトリーにより検査した。酵母細胞（３０℃で一晩インキュベーション後）及び菌糸体（フィラメント）形態（３７℃で、それぞれ１５０分間及び３００分間でインキュベーション後）は、血清を含有しているＹＰＤ培地における培養により得た（図７Ａ−Ｃ）。
【００２７】
フローサイトメトリー染色の結果は、ワクチン誘導性ラミナリン抗体のカンジダ細胞への結合が酵母細胞において最大であるが、真菌のより病原性のフィラメント形態に細胞が分化するにつれて減少するが（図８Ｄ）、修飾キチン誘導性抗体の結合が、真菌の分化ステージにより影響されないことを指し示しており、これは侵襲プロセスを通じて、それらの一致した抗原発現を指し示している（図８Ｅ）。これらの結果は、有効な汎真菌ワクチン製剤の開発のために重要であり、真菌の侵襲性プロセスを通じて有効性が最適であるため、１を超える細胞壁炭水化物成分をワクチン製剤に導入することの必要性を強調する。
【００２８】
フローサイトメトリーによる修飾キチンワクチン誘導性抗体のクリプトコッカス・ネオフォルマンスＡ型（Ｈ９９）酵母細胞への結合の分析は、修飾キチン抗体が、それぞれ２５％、７５％及び８５％修飾キチン−ＴＴコンジュゲート抗体の１：１０希釈で結合する約３１％、４７％及び６０％の生きた集団でクリプトコッカス細胞を陽性に染色したことを指し示し（実施例６及び図１１下段パネル）、さらに実施例６の詳細な結合データを支持する。ラミナリン−ＴＴコンジュゲートで生成された高力価ラミナリン（β−グルカン）抗体はまた、クリプトコッカス・ネオフォルマンスを陽性に染色した（図１１上段パネル）。カンジダ・アルビカンスについてのように、これらのデータは、両方の炭水化物がクリプトコッカス真菌の表面で曝露されることを示唆する。
【００２９】
病原性真菌での致死的チャレンジに対する保護の予備的な例では、修飾キチン−破傷風トキソイドコンジュゲートを含む単一細胞壁成分ワクチンを受けたＢａｌｂ／Ｃ及びＣＤ１マウスは、１００％致死量の生きたＣ．アルビカンスに対する部分的な保護を示した（実施例７及び図９Ａ及び９Ｂ）。致死的チャレンジ実験の反復では、同じ修飾キチン−破傷風トキソイドコンジュゲートワクチンは、生きたＣ．アルビカンスに対する類似する部分的な保護を発揮し、ラミナリン（β−グルカン）−破傷風トキソイドコンジュゲート又はキトヘキサオース−破傷風トキソイドコンジュゲートの保護を超える（図９Ｂ）。これらの結果は拡大適用され、本発明のさらなる実施形態、例えば、複数の細胞壁成分を含むワクチン（実施例９及び図８）は、例えばＣ．アルビカンス、Ａ．フミガーツス、及びＣ．ネオフォルマンスを用いる類似するインビボ致死的チャレンジモデルにおける有効性に関して検査される。
【００３０】
ここで概説されるキチン、修飾キチン及びラミナリン抗体の存在に関する正常なヒト血清（ＮＨＳ）の分析は、これらの抗体が、自然獲得され、健常個体に存在することを実証する（図１０）。キチン抗体は有意なレベルで存在すると思われ（図１０Ａ）、これらのレベルはβ−グルカンに対するものよりも有意に高い（図１０Ｄ）。留意される興味深いことは、キチン抗体が、少なくともＤＰ６の糖で構成される構造エピトープに向けられることである（図１０Ｃ）。これらの結果はキチンベースのワクチンの設計に重要である、その理由は、それらが最適なコンジュゲートワクチンが少なくとも（a least）６ＧｌｃＮＡｃ残基のキチン断片を含有すべきであることを示唆するからである。
【００３１】
先行する明細書において概説されたように産生されたワクチンは、薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水又は他の適切な担体において製剤化することができる。加えて、ワクチンは、１又は２以上のアジュバントが至適に含まれて、免疫原性及び／又は有効性を増大させることができる。アジュバントを、ワクチン組成物に直接的に添加することができる又はワクチンの投与と別々に、同時に若しくは直後に投与することができる。制限なく、適切なアジュバントは、当技術分野において知られている多様なアジュバントを単独で又は組み合わせて含む。非限定的な例は、アルミニウム塩、例えば、アルミニウム水酸化物ゲル又はリン酸アルミニウム若しくはアラムであるが、カルシウム、マグネシウム、鉄若しくは亜鉛の塩でもあり得、又はアシル化チロシン、若しくはアシル化糖、カチオン性若しくはアニオン性誘導体化糖、若しくはポリホスファゼンの不溶性の懸濁物であってもよい。アジュバントは、例えば、種々の水中油型エマルジョン、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体４アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体７アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体８アゴニスト及びＴｏｌｌ様受容体９アゴニスト）、サポニン又はその組合せからも選択することができる。
【００３２】
増殖性の抗体応答を得るワクチン組成物が、複数の様式で使用されてもよい。例えば、ワクチンは、真菌感染のリスクのある患者の直接的な免疫化に使用されてもよい。或いは、本発明の化合物及び組成物は、本発明の化合物に対する抗体を単離する又は生成させるため使用されてもよい。単離された抗体は、当技術分野において利用可能な既知の方法を用いて、ポリクローナル又はモノクローナルの性質で調製され得る。例えば、本発明の化合物は、当技術分野における熟練した従事者に周知の方法により、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用されてもよい。別の例として、本明細書に記載される組成物は適切な宿主における抗体応答を誘発するために使用されてもよく、結果的に生じる抗体は当該技術分野において確立された既知の方法を用いて、ハイブリドーマ技術により不死化されてもよい。さらなる別の非限定的な実施例では、当該技術分野において既知の方法を用いて、本明細書に記載される化合物は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を用いて、ヒト抗体を直接的に産生するために使用されてもよい。このようにして産生された任意の抗体は、予防上又は治療上の使用に関して、受動的な保護を付与するため使用されてもよい。これらの単離された抗体の使用のための非限定的な例は、免疫療法、現存の抗真菌剤との併用療法、又は免疫複合体調製（例えば、抗真菌剤への直接的なコンジュゲーション）を介した真菌性疾患に対する直接的な保護を含み得る。さらに、これらの抗体は、患者サンプル中の真菌感染の検出のための診断上のプラットフォームを開発するため使用することができる。
【００３３】
記載の真菌細胞壁成分への特異的な応答を誘発するワクチン抗原の産生の達成の観点において、任意の先の抗体ベースの戦略は、抗体の１若しくは２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は抗体の１若しくは２以上の抗原結合断片を含むことができる、抗体断片若しくは操作された抗体誘導体に拡大適用できるであろう。用語「抗体（antibody）」及び「抗体（antibodies）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、など及び上記の任意のエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
真菌細胞壁に存在するキチンの部分がキチンデアセチラーゼによって改変されてキトサンを産生する、またキチン／キトサンポリマーの混合物が適切な細胞壁統合性及び機能に必要であるとの証拠が存在する（Lenardon MD, Munro CA, Gow NA. 2010. Chitin synthesis and fungal pathogenesis. Curr Opin Microbiol 13: 416-23、Baker LG, Specht CA, Donlin MJ, Lodge JK. 2007. Chitosan, the deacetylated form of chitin, is necessary for cell wall integrity in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell 6: 855-67）。修飾キチン断片におけるＮＭＲデータはいくらかの残留遊離アミノ基を示しており、ワクチンが純粋なキチン並びにキチン質の細胞壁におけるキトサン含有領域の両方を標的にできる可能性が浮上してきた。
【００３５】
キチン、β−マンナン及びβ−グルカンに加えて、ポリマーは、真菌細胞壁の基礎的な炭水化物構成成分を含む。特異的なβ−マンナン又はβ−グルカン炭水化物を標的とするワクチン誘導性抗体は、真菌性疾患に対する保護を付与することが示されており、ワクチンベースの有効性及び受動的な保護の両方を発揮する（Torosantucci A, Bromuro C, Chiani P, De Bernardis F, Berti F, Galli C, Norelli F, Bellucci C, Polonelli L, Costantino P, Rappuoli R, Cassone A. 2005. A novel glyco-conjugate vaccine against fungal pathogens. J Exp Med 202: 597-606、Xin H, Dziadek S, Bundle DR, Cutler JE. 2008. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13526-31、Han Y, Cutler JE. 1995. Antibody response that protects against disseminated candidiasis. Infect Immun 63: 2714-9）。現在まで、キチンは、抗真菌ワクチンの標的として検査されていない。インビボで、これらの３つの炭水化物成分は共有結合によって架橋されて、細胞壁格子（cell wall lattice）を形成する（Latge JP. 2007. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Mol Microbiol 66: 279-90、Levitz SM. 2010. Innate recognition of fungal cell walls. PLoS Pathog 6: e1000758）。修飾キチン単独、又は真菌細胞壁の２つ以上の保存された炭水化物エピトープの組合せからなるワクチン製剤が、広く保護的なワクチン応答を産生させるため意図される。このような組合せワクチンを、真菌細胞壁の表面組織分布を厳密に模倣する、共投与混合物として又は架橋された骨格として設計できるであろう。これらのワクチンは汎真菌性の免疫応答の誘導に有効性が高いことが予期される。
【００３６】
本発明は、本明細書に記載される本発明を説明するが、限定はせず、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
［実施例］
【実施例１】
【００３７】
修飾キチン断片を得るためのキトサンの部分的な再−Ｎ−アセチル化／脱アミノ化
−  ３ｇのキトサン（１６．８ｍｍｏｌのＧｌｃＮＨ２；Sigma社カタログ番号４１９４１９）を、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で１５０ｍＬのＨ２Ｏに懸濁し、撹拌プレート（stir plate）に配置した。
−  無水酢酸、７９５μＬ、０．５当量（アミノ基の数と比例）を、１５ｍＬのＥｔＯＨに添加した。
−  無水酢酸溶液を、付加漏斗（addition funnel）で３０分間にわたり滴下して、撹拌キトサン懸濁液に添加した。反応は非常に粘稠性となったが、反応混合物を撹拌することがなおも可能であった。
−  反応を、さらに３０分間室温で進行させた。
−  １８ｍＬの氷酢酸を反応混合物に添加して、約３のｐＨを与えた。
−  ６ｍＬの新たに調製したＮａＮＯ２の５％水溶液を、反応に添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。反応により、相当量のガスが解放され、反応の過程の間にかなり低粘稠性となった。
−  反応混合物を、１６．５ｍＬの１０Ｎ  ＮａＯＨで中和した。
−  サンプルを、７，０００分画分子量（molecular weight cut off）の透析膜中で４Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌに対して一晩透析した。サンプルを、４Ｌの水を４回交換して室温でさらに透析した。
−  反応混合物を、４，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離して不溶性の物質を除去し、次に０．４５ｕｍシリンジフィルターを通して濾過した。
−  サンプルを、ＨＰＬＣ及びＮＭＲ分析のため取り出した。
【実施例２】
【００３８】
還元的なアミノ化による修飾キチン−破傷風トキソイドワクチンコンジュゲートの調製
−  ５ｍｇの破傷風トキソイド（ＴＴ、生理食塩水中の３ｍｇ／ｍＬ溶液から３．３ｍＬ；Sreum Staten Institute）を、５０ｍｇの修飾キチン断片に添加した。
−  シッフ塩基反応を、６時間室温で進行させた。
−  再精製したシアノホウ化水素ナトリウム（sodium cyanoborohydride）１０ｍｇを、１０μＬ  Ｈ２Ｏの容量で反応混合物に添加した。反応を室温で進行させたままとし、１日及び３日後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。
−  反応後、キチン−ＴＴ混合物を、ＰＢＳで約２ｍＬに希釈し、４ＬのＰＢＳに対して透析した。透析したサンプルを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過した。最終的な透析液を、ＢＣＡアッセイにより定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣにより分析した。
【実施例３】
【００３９】
修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートでのＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫
４０匹の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスを受け取り、標準の昼／夜サイクル下で食物及び水を自由にさせて飼育した。動物を、最小一週施設に順化させ、次に無作為に４グループに分け、以下の通り免疫した：
１．フロイント完全アジュバント中のＰＢＳのエマルジョン（２００μＬ）を、腹腔内注射で１０匹のマウスに０日目に送達した。２８日目及び３８日目に、動物は、同じ様式で送達されるフロイント不完全アジュバント中のＰＢＳの注射を受けた。
２．修飾キチン−ＴＴコンジュゲート（２５μｇの抗原）を、フロイント完全アジュバント中のエマルジョン（２００μＬ）として、腹腔内注射で０日目に１０匹のマウスに注射した。２８日目及び３８日目に、動物は、一次免疫と同じ様式で送達されるフロイント不完全アジュバント中のキチン−ＴＴ（２５μｇ）の追加免疫注射を受けた。
３．動物は、修飾キチン−ＴＴ（５０μｇ）をグループ２のためのプロトコールのように注射された。
４．動物は、修飾キチン−ＴＴ（１００μｇ）をグループ２及びグループ３のように注射された。
＊マウスは血を取られ、血清をキチン特異的な抗体応答を評価するため−４日目、３８日目及び５０日目に調製した。
【００４０】
動物は血を取られ、免疫前血清の抗体価を決定するため初期注射の４日前（試験日−４）に血清を調製した。マウスを、上記で概説された実験グループに従い研究０日目に免疫した。ＬＭＷキチン−ＴＴ抗原を、０．２５、０．５及び１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに懸濁し、フロイント完全アジュバントと１：１の比で混合し、２０分間ボルテックスして、エマルジョンを作出した。ＰＢＳ／フロイントの対照又は検査抗原（それぞれ、トータルで２５、５０、又は１００μｇタンパク質コンジュゲートについて、最終濃度０．１２５、０．２５又は０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有している２００μＬのエマルジョンを、上記のように、腹腔内注射により各マウスに０日目に投与した。２８日目及び３８日目の引き続く追加免疫のため、抗原を、フロイント不完全アジュバント中に同様に調製し、同じ様式で投与した。免疫した動物は血を取られ、血清を抗体応答を評価するため３８日目及び５０日目に調製した。
【実施例４】
【００４１】
修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスの抗体応答に関するアッセイ
−  ２つの異なる修飾キチンヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）コンジュゲートの２μｇ／ｍＬ溶液を、ＰＢＳ中に調製した。
−  １００μＬの各溶液により、９６ウェルのアッセイプレートのウェルの半分（各抗原について１／２プレート）を被覆し、一晩室温でインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次にＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  修飾キチンワクチンマウス血清を、プールし、ＰＢＳ中に１：２０に希釈した。
−  処置グループは、以下の通りである：
１．ＰＢＳ／フロイント
２．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；２５μｇ／マウス
３．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；５０μｇ／マウス
４．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；１００μｇ／マウス
−  各プールした血清サンプルの１０倍希釈物の２００μＬを、キチン−ＨＳＡ被覆マイクロプレートのウェルの最初のカラムにプレートした。
−  １：２００〜１：４０９，６００の範囲のトータルで１２の異なる血清濃度で、二倍希釈系列を作製した。
−  サンプルを、２時間室温でインキュベートした。
−  プレートを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  吸光度を、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【実施例５】
【００４２】
修飾キチン−ＴＴワクチンコンジュゲートで免疫されたＢａｌｂ／Ｃマウスの抗体応答の特異性に関するアッセイ
Ａ．抗原阻害
−  修飾キチンＨＳＡコンジュゲート（ロット♯２及び♯３）の２μｇ／ｍＬ溶液を、ＰＢＳ中に調製した。
−  １００μＬの各溶液により、９６ウェルのアッセイプレートのウェルの半分を被覆し、一晩室温でインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。
−  ウェルをＰＢＳＴで３×洗浄し、４℃で使用するまで乾燥保存した。
−  ＧｌｃＮＡｃ、ＨＡ及び修飾キチン断片の２ｍｇ／ｍＬ溶液をＰＢＳ中に調製し、２００μＬの各溶液をタイターチューブのセットに移した。
−  ２ｍｇ／ｍＬ〜１．９５μｇ／ｍＬの範囲のトータルで１１の異なる濃度の各インヒビター及び非阻害対照（１ｍｇ／ｍＬ〜９７６ｎｇ／ｍＬの最終的なインヒビター濃度）で、ＰＢＳ中の二倍希釈系列を作製した。
−  修飾キチン−ＴＴ／フロイント処置グループ（１００μｇ／マウス、５０日目の採血）からプールしたサンプルを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中に２０：０００倍に希釈した。
−  １００μＬの希釈した血清サンプルを、各タイターチューブ（最終４０：０００希釈）に移し、インヒビターで３０分間室温でインキュベートした。
−  １００μＬの各血清サンプル／インヒビターを、修飾キチン−ＨＳＡ被覆マイクロプレートに移し、２時間室温でインキュベートした。
−  プレートを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止し、吸光度をマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【００４３】
Ｂ．抗体反応性特異性対照（Antibody reactivity specificity controls）
−  ＰＢＳ中に１０％溶液（ｖ：ｖ）として調製されるＦＢＳを除き、試験化合物（セリン−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ、卵白アルブミン、フェチュイン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ウシ胎児血清）の２μｇ／ｍＬ溶液をＰＢＳ中に調製した。
−  １００μＬの各溶液により、９６ウェルのアッセイプレートのウェルを被覆した。試験抗原を、プレートにおいて一晩４℃でインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳで３×洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロックした。
−  ウェルをＰＢＳＴで３×洗浄し、４℃で使用するまで乾燥保存した。
−  修飾キチンワクチンマウス血清を、処置グループでプールし、ＰＢＳ中に１：２０に希釈した。処置グループは、以下の通りであった：
１．ＰＢＳ／フロイント
２．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；２５μｇ／マウス
３．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；５０μｇ／マウス
４．修飾キチン−ＴＴ／フロイント；１００μｇ／マウス
−  プールした血清サンプルを、最終的に１：２０，０００倍に１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中にさらに希釈した。
−  各グループからの１００μＬの希釈した血清サンプルを、アッセイプレートのウェルに三連で移し、１時間室温でインキュベートした。
−  プレートを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  吸光度を、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
−  グループ４に関する全ての反復に関するＥＬＩＳＡ応答が、直線範囲外であったことに留意されたい。これらのサンプルを、プレートリーダーの検出限界付近である３．０の値に自由裁量で割り当てた。これらの値は、おそらく過小評価を表す。
【００４４】
Ｃ．キチン／キトサン吸収及び阻害
−  試験化合物（修飾キチン−ＨＳＡ又はＬＭＷ  ＨＡ−ＨＳＡ）の２μｇ／ｍＬ溶液を、ＰＢＳ中に調製した。
−  １００μＬの各溶液により、９６ウェルのアッセイプレートのウェルを被覆し、一晩４℃でインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  その間に、プールした修飾キチンワクチンマウス血清を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：５０００の最終濃度に希釈した。
−  ＨＡ  ＭＡｂ♯２を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０００に希釈した。
−  ５ｍＬの希釈した血清サンプル又はＨＡ  ＭＡｂを、ローテータ上で１００ｍｇのキチン又はキトサン（双方を不溶性の懸濁物として作製）のいずれかと一晩４℃でインキュベートした。
−  希釈したキチンワクチン♯１血清又はＨＡ  ＭＡｂの一部を、４℃に置いて陽性対照として働かせ、阻害実験に関してキチン／キトサン抽出物と混合した。
−  これと並行して、キチン及びキトサンを、阻害試験（inhibition testing）に関して可溶性キチン／キトサンを抽出するため、同じ様式で５ｍＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳとインキュベートした。
−  サンプルを４５００で５分間遠心分離して、不溶性キチン及びキトサンをペレットとした。
−  上清フラクションを、新しいチューブに取り出し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に４倍（最終的に修飾キチンワクチンについて１：２０，０００及びＨＡ  ＭＡｂについて１：８，０００）に希釈した。
−  未処理の修飾キチンワクチン血清サンプル及び未処理のＨＡ  ＭＡｂを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１００μＬのＡｂ又は血清＋３００μＬのＢＳＡ／ＰＢＳ）中に均等な最終濃度に同様に希釈した。
−  阻害試験に関して、未処理の血清又はＡｂ溶液を、キチン又はキトサン抽出物のいずれかで均等な最終濃度（最終的に修飾キチンワクチンについて１：２０，０００及びＨＡ  ＭＡｂについて１：８，０００）に４倍希釈した。溶液を、ＥＬＩＳＡプレートに付加する前に３０分間室温でプレインキュベートした。
−  １００μＬの各サンプルを、三連で、必要に応じて、改変された修飾キチン−ＨＳＡ又はＬＭＷ  ＨＡ−ＨＳＡのいずれかで被覆されたＥＬＩＳＡストリップに添加した。
−  サンプルを、ストリップにおいて１時間室温でインキュベートした。
−  ストリップを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  ＨＡ  ＥＬＩＳＡサンプルが非常に急速に発色することから、反応を約１分間以内で停止した。同じく、修飾キチンワクチンサンプルにおける陽性対照が急速に発色することから、反応を２分後に終結させた。
−  吸光度を、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【実施例６】
【００４５】
Ｃ．アルビカンス細胞全体に向けた修飾キチン−ＴＴワクチン免疫化Ｂａｌｂ／Ｃマウスからの血清抗体の免疫反応性に関するアッセイ
Ａ．Ｃ．アルビカンス細胞に対する全血清の結合
−  Ｃ．アルビカンスの単一コロニーを、サブロー（Saboraud）デキストロース寒天板から取り上げ、２ｍＬのＹＰＤ成長培地に接種するため使用した。培養物を、２５０ＲＰＭで振盪して、一晩３０℃で成長させた。
−  １００μＬの５×１０６細胞／ｍＬ懸濁液を、アミン表面修飾ストリップウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。細胞を、１時間室温で定着させた。
−  グルタルアルデヒドの２％ＰＢＳ中溶液１００μＬを、各ウェルに添加した。
−  細胞を、一晩室温で架橋させた。
−  固定液を吸引除去し、ウェルをＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  ウェルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間室温でブロックした。
−  その間に、プールした修飾キチンワクチンマウス血清を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０，０００の濃度に希釈した。
−  修飾キチン又はＰＢＳの２ｍｇ／ｍＬ溶液の１００μＬを、三連で、タイターチューブに分配した。
−  阻害試験に関して、１００μＬの血清を、インヒビター（最終的に修飾キチンワクチン血清サンプルについて１：４０，０００及びインヒビターについて１ｍｇ／ｍＬ）を含有しているチューブに添加した。溶液を、ＥＬＩＳＡプレートに付加する前に３０分間室温でプレインキュベートした。
−  １００μＬの各サンプルを、Ｃ．アルビカンス被覆ストリップウェルプレートに添加した。サンプルを、１時間室温でインキュベートした。
−  ストリップを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μLで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で室温でインキュベートした。
−  反応を、２分後に１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  吸光度を、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【００４６】
Ｂ．Ｃ．アルビカンスに対するアフィニティー精製した修飾キチン反応性抗体の結合
−  ２０ｍｇの修飾キチン及び過ヨウ素酸酸化型ＨＡを、２ｍＬの２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５に溶解した。酸化型ＨＡは、溶解させるために室温で一晩を必要とする。
−  UltraLink Hydrazideゲル（４ｍＬのスラリー、２ｍＬの据付樹脂）を、５容積の２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５で洗浄した。
−  溶解した糖を、洗浄した樹脂に添加し、２４時間室温で反応させた。
−  非結合性の物質を排出し、樹脂を以下のもので洗浄した：
１．２０カラム容積の２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．５
２．５カラム容積の１０×ＰＢＳ。
３．１０カラム容積の１×ＰＢＳ。
−  プールした修飾キチンワクチンマウス血清（ＰＢＳ対照グループ及び１００μｇ修飾キチン−ＴＴ免疫化グループからの）を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：４０の初期濃度に希釈した。
−  １００μＬ（２００μＬのスラリー）の修飾キチン及び酸化型HA UltraLinkヒドラジドゲルを、ミクロスピンカラム中５００μＬのＰＢＳで洗浄した。
−  ２００μＬの各血清及びアフィニティー樹脂を混合し、１時間ＲＴでインキュベートした。
−  非結合性の物質を、３０秒間８５００ＲＰＭで遠心分離により除去した。
−  樹脂を、５００μＬのＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  ２００μＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．８を、各樹脂に添加し、約３分間相互作用させた。
−  溶出したタンパク質を、遠心分離により直接的に５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８を含有しているチューブに収集した。
−  Ｃ．アルビカンスの単一コロニーを、サブローデキストロース寒天板から取り上げ、２ｍＬのＹＰＤ成長培地に接種するため使用し、培養物を２５０ＲＰＭで振盪して一晩３０℃で成長させた。
−  １００μＬの１×１０７細胞／ｍＬ懸濁液を、アミン表面修飾ストリップウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。細胞を、２時間室温で定着させた。
−  グルタルアルデヒドの２％ＰＢＳ中溶液１００μＬを、各ウェルに添加した。
−  細胞を、１時間室温で架橋させた。
−  固定液を慎重に吸引除去し、ウェルをＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  ウェルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間室温でブロックした。
−  抗原アフィニティー精製した抗体を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：１，０００に希釈した。
−  二倍希釈系列を、タイターチューブ中に調製した。
−  １００μＬの抗体希釈を、三連で、Ｃ．アルビカンス被覆プレートに添加した。
−  サンプルを、１時間室温でインキュベートした。
−  プレートを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  吸光度を、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【００４７】
Ｃ．フローサイトメトリーによるカンジダ・アルビカンスへのワクチン誘導性抗体の結合：
カンジダ細胞：無菌ループを用いて、凍結ストックからＣ．アルビカンスをＳＤＡプレートにストリークし、３０℃でインキュベートした。ＳＤＡプレートから単一コロニーを、接種ループを用いて取り上げ、５０ｍｌのＹＰＤを含有している２５０ｍｌフラスコに接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で少なくとも１８時間インキュベートした。実験に関して、カンジダの菌糸体ステージ（mycelia stage）を使用した場合、細胞をＯ／Ｎインキュベーション後に３７℃で１５０分間及び血清を含有しているＹＰＤ中で３００分間インキュベートして、カンジダの菌糸体ステージへの分化を誘導及び助力した。Ｏ／Ｎ培養物を、５０ｍｌチューブに移し、１０００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットを２ｍｌのＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄した。ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、濃度を０．１  ＯＤ６００（４×１０６／ｍｌ）に調整した。
クリプトコッカス細胞：一晩ストック（stock overnight）から真菌の成長ストリーキング（growth-streaking）を無菌ループを用いて行い、クリプトコッカス−ネオフォルマンスＡ型株の凍結ストックをストリーキングしてＳＤＡプレート上で単離し、３０℃でインキュベートした。ＳＤＡプレートから単一コロニーを、接種ループを用いて取り上げ、５０ｍｌのＹＰＤを含有している２５０ｍｌフラスコに接種し、１５０ｒｐｍで振盪して３０℃で少なくとも１８時間インキュベートした。実験に関して、クリプトコッカスの菌糸体ステージを使用した場合、細胞をＯ／Ｎインキュベーション後に３７℃で１５０分間及び血清を含有しているＹＰＤ中で３００分間インキュベートして、カンジダの菌糸体ステージへの分化を誘導及び助力した。Ｏ／Ｎ培養物を、５０ｍｌチューブに移し、１０００ｇで２０分間遠心分離し、ペレットを２ｍｌのＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄した。ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、濃度を１．０  ＯＤ６００読み取り（４×１０７／ｍｌ）に調整した。
血清及び抗体：様々なワクチングループからのマウス血清を、ＰＢＳ中１：１０、１：５０及び１：１００に希釈し、１５μｌ容量／チューブで使用した。対照抗体を、マウスｍＡｂ対カンジダを１：５、１：１０及び１：２０希釈；ウサギｐＡｂ対カンジダを１：５０、１：１００及び１：２００希釈に希釈し、２０μｌ容量／チューブで使用した。ＦＩＴＣ−標識二次抗体を、ＰＢＳ中１：２５に希釈し、１５μｌ／チューブで使用した。ヨウ化プロピジウムを、ＰＢＳ中１：２で使用した（５μｌ／チューブ）。
フローサイトメトリー：約１００μｌの真菌細胞をチューブに移し、適切な血清及び抗体を添加し、氷上で６０分間インキュベートした。細胞を、次に１ｍｌ  ＰＢＳで（１０００ｇで１０分間、４０Ｃでスピンし、上清をデカントすることにより）２回洗浄し、続いて二次抗体で３０分間氷上で光から保護してインキュベーションした。
希釈したヨウ化プロピジウム（洗浄なし）を添加し、細胞を付加的に１０分間氷上でインキュベートし、続いて２ＰＢＳ洗浄し、最終的に２００μｌの１％パラホルムアルデヒド中で固定した。次に、データをFACS Calibur機器で獲得した。
【実施例７】
【００４８】
修飾キチン−ＴＴワクチンはＣ．アルビカンス病原性真菌の致死的チャレンジからの保護を付与する
Ａ．修飾キチン−ＴＴワクチンでのＢａｌｂ／Ｃマウスの免疫、及びキトヘアオース（Chitoheaose）−ＴＴ及びラミナリン−ＴＴコンジュゲートでのＣＤ１マウスの免疫。
−  ４０匹の雌性マウスを、受け取り、標準の昼／夜サイクル下で食物及び水を自由にさせて飼育した。動物を、最小一週間施設に順化させ、次に無作為に２グループに分け、以下の通り免疫した：
−  最初に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、２グループに分けた（ｎ＝２０マウス／グループ）：
１．ＰＢＳ／フロイント；２００μＬ／マウス；腹腔内注射
２．Ｍｏｄキチン−ＴＴ／フロイント；２００μＬ／マウス；ｉ．ｐ．；１００μｇ／マウス
−  モック免疫した対照動物に関して、完全フロイントアジュバントにおけるＰＢＳのエマルジョン（２００μＬ）を、腹腔内注射で２０匹のマウスに０日目に送達した。２８日目及び３８日目、動物は、一次免疫と同じ様式で送達される不完全フロイントアジュバント中のＰＢＳの注射を受けた。
−  ワクチン接種グループに関して、修飾キチン−ＴＴコンジュゲート（完全フロイントアジュバント中のエマルジョンとして、１００μｇの抗原）を、腹腔内注射で０日目に２０匹のマウス（２００μＬ）に送達した。２８日目及び３８日目、動物は、一次免疫と同じ様式で送達される不完全フロイントアジュバント中のキチン−ＴＴ（５０μｇ）の追加免疫注射を受けた。
−  マウスは血を取られ、血清を抗体応答の評価のため、−４、３８、５０、及び６２日目に調製した。
−  同じプロトコールを使用して、ＣＤ１マウスを修飾キチン−ＴＴ；ラミナリン−ＴＴ及びキトヘキサオース−ＴＴコンジュゲートで免疫した。
【００４９】
Ｂ．致死量のＣ．アルビカンスでのキチン−ＴＴワクチン免疫化Ｂａｌｂ／Ｃ及びＣＤ１マウスのチャレンジ。
上記、免疫グループの各々からの動物を、以下の通り、各免疫コホートについて１０匹の３グループに無作為に分け、Ｃ．アルビカンス細胞を接種した。
実験群：ｎ＝１０マウス／グループ、グループに無作為に分けた
グループ１及び２は、ＰＢＳ（モック）免疫した動物に由来する動物を含む
１．生理食塩水；２００μＬ／マウス；尾静脈注射
２．５×１０６  Ｃ．アルビカンス；２．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬから２００μＬ；尾静脈注射
グループ３及び４は、修飾キチン−ＴＴ免疫化動物に由来する動物を含む
３．生理食塩水；２００μＬ／マウス；尾静脈注射
４．５×１０６  Ｃ．アルビカンス；２．５×１０７  ＣＦＵ／ｍＬから２００μＬ；尾静脈注射
マウスモニタリング：
１．マウスを、死亡率及び次の窮迫性の徴候について毎日チェックした：
食物及び水消費の減少、重量減少、自主孤立／隠蔽（self-imposed isolation／hiding）、急速な呼吸、開口呼吸、運動の増加／減少、異常な姿勢／位置決め、脱水、単収縮、震え、及び振戦。
２．次のいずれかを付随する窮迫性の徴候を示しているマウスを瀕死と規定した：障害性の異所運動（食物及び水に到達できない）、筋収縮又は羸痩の徴候の証拠、嗜眠（傾眠、活動の嫌悪、物理的又は精神的な覚醒の欠如）、長期の摂食障害、呼吸困難、及び神経学的な障害。マウスが瀕死に見え、死が差し迫ったように見える場合に、マウスを安楽死させた。死亡日を、その次の日と記録した。
【実施例８】
【００５０】
ヒト正常血清におけるキチン及びβ−グルカン抗体の検出及び特徴付け
異なるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）コンジュゲート（修飾キチン、キトヘキサオース、及びラミナリン）の２μｇ／ｍＬ溶液を、ＰＢＳ中に調製した。
−  １００μＬの各溶液により、９６ウェルのアッセイプレートのウェルの半分（各抗原について１／２プレート）を被覆し、一晩室温でインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次にＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄した。
−  正常ヒト血清を、ＰＢＳ中１：２０に希釈した。
−  各プールした血清サンプルの１０倍希釈物の２００μＬを、様々なＨＳＡコンジュゲート被覆マイクロプレートのウェルの最初のカラムにプレートした。
−  １：２００〜１：４０９，６００の範囲のトータルで１２の異なる血清濃度で、二倍希釈系列を作製した。
−  サンプルを、２時間室温でインキュベートした。
−  プレートを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中１：２５００に希釈した１００μＬで１時間ＲＴでインキュベートした。
−  ウェルを、ＰＢＳＴで３×洗浄し、次に１００μＬのSureBlue Reserve TMBペルオキシダーゼ基質で５分間室温でインキュベートした。
−  反応を、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで停止した。
−  吸光度を、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【実施例９】
【００５１】
β１，３グルカン／キチンコンジュゲート破傷風トキソイドワクチンの調製。
以下は、真菌細胞壁の２つ以上の保存された成分を含む組合せ真菌ワクチンを調製するための、幾つかの想定される方法の１つの例である。この例では、ラミナリン（β−１，３グルカンの直鎖、非分枝ポリマー）は、還元され、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化され、引き続いて還元的なアミノ化によりキトサンに直接的にコンジュゲートされ、最終的に架橋された炭水化物は破傷風トキソイドにコンジュゲートされた。
−  ラミナリンを、標準的な方法により、水素化ホウ素ナトリウムで還元し、引き続いてメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化させた。
−  １００ｍｇの酸化型ラミナリンを、ＰＢＳに溶解（数分間３７℃で溶解）し、低分子量キトサンと１：５の比で混合した。キトサンは、不溶性の懸濁物として残留した。
−  反応物を、３７℃振盪培養器に２４時間配置した。
−  ２０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を添加し、反応をさらに２４時間３７℃で続けた。
−  反応懸濁物を、ディスポーザブルのプラスチックカラムに移し、不溶性の物質をＨ２Ｏで頻繁に洗浄して、任意の残留する未反応のラミナリンを除去した。
−  洗浄された不溶性の物質を、５ｍＬの１０％水性酢酸に再懸濁した。
−  １ｍＬの新たに調製した水性亜硝酸ナトリウムを添加し、反応を６０分間室温で進行させた。大部分の不溶性物質は、反応の過程の間に溶液に入り込んだ。
−  反応混合物を、４５００×Ｇで５分間遠心分離して、残留している不溶性の物質を除去した。可溶性フラクションを、以下の通りさらに処理した。
−  可溶性フラクションを１５ｍＬ、１Ｍ  ＮａＣｌの最終濃度に希釈し、４リットルのＨ２Ｏを４回交換して透析した。透析した物質を凍結乾燥して、柔らかい白色粉末を得た（全収率９０ｍｇ）。
−  多糖コンジュゲートをＳＥＣ  ＨＰＬＣにより分析し、産物中のキチン及びβ−グルカンの両方の存在を１Ｈ  ＮＭＲにより確認した。
−  １０ｍｇの破傷風トキソイド（ＴＴ、生理食塩水中の３ｍｇ／ｍＬ溶液から３．３ｍＬ）を、４０ｍｇのラミナリン−キチンコンジュゲートに添加した。
−  サンプルの２μＬアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、９８μＬの１×ＬＤＳサンプル緩衝剤＋５μＬの１Ｍ  ＤＴＴに添加した。
−  別の２μＬのサンプルを、ＨＰＬＣ分析のため、９８μＬの１×ＰＢＳに添加した。
−  溶液を、振盪培養器（３００ＲＰＭ）中３７℃で２４時間反応させた。
−  再精製したシアノホウ化水素ナトリウム４０ｍｇを、直接的に反応に添加した。反応を、振盪培養器（３００ＲＰＭ）中３７℃で２４時間進行させたままとした。
−  反応後、コンジュゲーション反応物を、１０，０００ＭＷＣＯ膜を有するＡｍｉｃｏｎ限外濾過デバイス中で約２．５ｍＬに濃縮した。サンプルを、４ＬのＰＢＳを３回交換して透析した。最終的な透析液を、ＢＣＡアッセイにより定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ  ＨＰＬＣにより分析した。サンプルを１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した後、それらを０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌濾過した。
【００５２】
（参考文献）
1. De Jonge R, van Esse HP, Kombrink A, Shinya T, Desaki Y, Bours R, van der Krol S, Shibuya N, Joosten MH, Thomma BP. 2010. Conserved fungal LysM effector Ecp6 prevents chitin-triggered immunity in plants. Science 329: 953-5
2. Lee CG. 2009. Chitin, chitinases and chitinase-like proteins in allergic inflammation and tissue remodeling. Yonsei Med J 50: 22-30
3. Cutler JE, Deepe GS, Jr., Klein BS. 2007. Advances in combating fungal diseases: vaccines on the threshold. Nat Rev Microbiol 5: 13-28
4. Ostrosky-Zeichner L, Casadevall A, Galgiani JN, Odds FC, Rex JH. 2010. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov 9: 719-27
5. Pfaller MA, Diekema DJ. 2007. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 20: 133-63
6. Casadevall A, Pirofski LA. 2007. Antibody-mediated protection through cross-reactivity introduces a fungal heresy into immunological dogma. Infect Immun 75: 5074-8
7. Spellberg B. 2007. Prospects for and barriers to a fungal vaccine. Expert Opin Biol Ther 7: 1785-8
8. Cassone A, Torosantucci A. 2006. Opportunistic fungi and fungal infections: the challenge of a single, general antifungal vaccine. Expert Rev Vaccines 5: 859-67
9. Torosantucci A, Bromuro C, Chiani P, De Bernardis F, Berti F, Galli C, Norelli F, Bellucci C, Polonelli L, Costantino P, Rappuoli R, Cassone A. 2005. A novel glyco-conjugate vaccine against fungal pathogens. J Exp Med 202: 597-606
10. Xin H, Dziadek S, Bundle DR, Cutler JE. 2008. Synthetic glycopeptide vaccines combining beta-mannan and peptide epitopes induce protection against candidiasis. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13526-31
11. Han Y, Cutler JE. 1995. Antibody response that protects against disseminated candidiasis. Infect Immun 63: 2714-9
12. Rachini A, Pietrella D, Lupo P, Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, Proietti C, Bistoni F, Cassone A, Vecchiarelli A. 2007. An anti-beta-glucan monoclonal antibody inhibits growth and capsule formation of Cryptococcus neoformans in vitro and exerts therapeutic, anticryptococcal activity in vivo. Infect Immun 75: 5085-94
13. Torosantucci A, Chiani P, Bromuro C, De Bernardis F, Palma AS, Liu Y, Mignogna G, Maras B, Colone M, Stringaro A, Zamboni S, Feizi T, Cassone A. 2009. Protection by anti-beta-glucan antibodies is associated with restricted beta-1,3 glucan binding specificity and inhibition of fungal growth and adherence. PLoS One 4: e5392
14. Bromuro C, Torosantucci A, Chiani P, Conti S, Polonelli L, Cassone A. 2002. Interplay between protective and inhibitory antibodies dictates the outcome of experimentally disseminated Candidiasis in recipients of a Candida albicans vaccine. Infect Immun 70: 5462-70
15. 米国特許第５７０５６３４号明細書（Bredehorst R, Pomato N, Scheel O, Thiem J. 1998.）
16. 米国特許第５３１２９０８号明細書（Nakao E. 1994.）
17. 米国特許第４８０４７５０号明細書（Nishimura T, Eto E, Yamad T. 1989.）
18. 米国特許出願公開第２００９０２８１０５８号明細書（Gislason J, Einarsson JM, How NC, Bahrke S. 2009.）
19. Lenardon MD, Munro CA, Gow NA. 2010. Chitin synthesis and fungal pathogenesis. Curr Opin Microbiol 13: 416-23
20. Baker LG, Specht CA, Donlin MJ, Lodge JK. 2007. Chitosan, the deacetylated form of chitin, is necessary for cell wall integrity in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell 6: 855-67
21. Latge JP. 2007. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Mol Microbiol 66: 279-90
22. Levitz SM. 2010. Innate recognition of fungal cell walls. PLoS Pathog 6: e1000758
23. Nitz M, Bundle D.R.  2001.  J. Synthesis of Di- to Hexasaccharide 1,2-Linked -Mannopyranan Oligomers, a Terminal S-Linked Tetrasaccharide Congener and the Corresponding BSA Glycoconjugates J Org Chem  66: 8411-23
24. Antinori S,  2013.  New Insights into HIV/AIDS-Associated Cryptococcosis. ISRN AIDS 471363
25. Rappleye CA, Eissenberg LG, Goldman WE . 2007. Histoplasma capsulatum alpha-(1,3)-glucan blocks innate immune recognition by the beta-glucan receptor. PNAS. 104(4):1366-70
26. Fujikawa T. et al. 2012. Surface alpha 1,3-Glucan Facilitates Fungal Stealth Infection by Interfering with Innate Immunity in Plants PLOS Pathogens  8:| e1002882
27. Reese, A. J.et al. 2007. Loss of cell wall alpha (1-3) glucan affects Cryptococcus neoformans from ultrastructure to virulence. Mol. Microbiol. 63, 1385-1398.
【図１】
2018172696.tif 000002
【図２】
2018172696.tif 000003
【図３】
2018172696.tif 000004
【図４】
2018172696.tif 000005
【図５Ａ−Ｂ】
2018172696.tif 000006
【図５Ｃ】
2018172696.tif 000007
【図６Ａ】
2018172696.tif 000008
【図６Ｂ】
2018172696.tif 000009
【図７】
2018172696.tif 000010
【図８Ａ】
2018172696.tif 000011
【図８Ｂ】
2018172696.tif 000012
【図８Ｃ】
2018172696.tif 000013
【図８Ｄ】
2018172696.tif 000014
【図８Ｅ】
2018172696.tif 000015
【図９Ａ】
2018172696.tif 000016
【図９Ｂ】
2018172696.tif 000017
【図１０Ａ】
2018172696.tif 000018
【図１０Ｂ】
2018172696.tif 000019
【図１０Ｃ】
2018172696.tif 000020
【図１０Ｄ】
2018172696.tif 000021
【図１１】
2018172696.tif 000022