(57)【要約】【課題】抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制できるフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物、そのフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有する医療用バイオフィルム形成抑制剤、および、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法を提供すること。【解決手段】フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制するための、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物が、アビエチン酸を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満、かつ、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上の割合で含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制するための、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物であって、
アビエチン酸を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満、かつ、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上の割合で含有する
ことを特徴とする、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有することを特徴とする、医療用バイオフィルム形成抑制剤。
【請求項３】
フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制するフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法であって、
フェカーリス菌に対する、アビエチン酸の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定する工程、および、
アビエチン酸を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満、かつ、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上の割合で使用する工程
を備えることを特徴とする、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物、医療用バイオフィルム形成抑制剤およびフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法に関し、詳しくは、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物、そのフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有する医療用バイオフィルム形成抑制剤、および、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、細菌により形成される膜状の生物集団であって、口腔病、感染症などに関する医療分野、例えば、給水処理、排水処理などに関する水処理分野など、各種産業分野で問題となっている。
【０００３】
医療分野では、例えば、腸球菌などのグラム陽性球菌が、歯の表面などにバイオフィルムを形成する場合があり、また、そのバイオフィルムが、う蝕（虫歯）や歯肉炎などの口腔病を惹起する場合がある。
【０００４】
そのため、腸球菌によるバイオフィルムの形成を抑制することが要求されており、例えば、水、グリセリンなどの担体と、その担体に分散されたテルペノイドを含む口腔組成物が、提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
また、医療分野では、例えば、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性球菌が、医療用具の表面にバイオフィルムを形成する場合があり、また、そのバイオフィルムが、各種感染症を惹起する場合がある。
【０００６】
そのため、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの形成を抑制することが要求されており、例えば、ジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成抑制剤が提案されている。一方、このようなバイオフィルム形成抑制剤によって、医療用具を抗菌処理すると、薬剤耐性菌の発生を促進する場合があり、また、有益な常在菌を除去してしまう場合がある。そのため、バイオフィルム形成抑制剤には、ジテルペノイド化合物を抗菌性を示さない濃度で含有させることが、提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５２１８８０号公報
【特許文献２】国際公開パンフレットＷＯ２０１０／１１９６３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方、腸球菌には、フェカーリス菌とフェシウム菌とが含まれるが、場合により、とりわけ、フェカーリス菌によるバイオフィルムの形成を抑制し、また薬剤耐性菌の発生を抑制することが要求される。
【０００９】
しかし、引用文献１に記載されているテルペノイド（デヒドロアビエチン酸など）を、引用文献２に記載されるように抗菌性を示さない濃度で用いると、テルペノイドの種類および濃度によっては、フェカーリス菌によるバイオフィルムの形成を抑制できない場合がある。
【００１０】
本発明の目的は、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制できるフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物、そのフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有する医療用バイオフィルム形成抑制剤、および、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明［１］は、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制するための、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物であって、アビエチン酸を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満、かつ、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上の割合で含有する、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含んでいる。
【００１２】
本発明［２］は、上記［１］に記載のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有する、医療用バイオフィルム形成抑制剤を含んでいる。
【００１３】
本発明［３］は、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制するフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法であって、フェカーリス菌に対する、アビエチン酸の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定する工程、および、アビエチン酸を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満、かつ、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上の割合で使用する工程を備える、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法を含んでいる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物、医療用バイオフィルム形成抑制剤およびフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法は、アビエチン酸を上記の特定濃度で含有するため、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、フェカーリス菌由来のバイオフィルム形成率を示すグラフである。
【図２】図２は、フェシウム菌由来のバイオフィルム形成率を示すグラフである。
【図３】図３は、フェカーリス菌の成長速度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、腸球菌の中でもフェカーリス菌に対して特異的に作用する組成物であって、アビエチン酸を特定濃度で含有している。
【００１７】
アビエチン酸は、下記式（１）で示されるテルペノイド化合物であって、アビエチン酸誘導体（例えば、ネオアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸など）および樹脂酸組成物（ロジンなど）とは区別される（異なる）。
【００１８】
【化１】
2018172318.tif 000002
【００１９】
アビエチン酸は、ロジンを構成する有機酸（樹脂酸）であり、天然物から常法により抽出することができる。
【００２０】
アビエチン酸を含む天然物としては、例えば、松脂などが挙げられる。
【００２１】
アビエチン酸を含む天然物からアビエチン酸を抽出する方法としては、特に制限されず、公知の方法および条件を採用することができる。
【００２２】
アビエチン酸を抽出する方法として、より具体的には、例えば、抽出溶剤に天然物を浸漬させる方法（浸漬抽出法）などが挙げられる。
【００２３】
抽出溶剤としては、特に制限されず、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、単独使用または２種類以上併用することができる。抽出溶剤として、好ましくは、水、メタノール、アセトンおよびそれらの混合溶媒が挙げられる。
【００２４】
抽出条件は、特に制限されず、抽出溶剤の種類などに応じて、適宜設定される。
【００２５】
また、必要により、抽出したアビエチン酸を精製する。精製方法としては、特に制限されず、例えば、蒸留法、晶析法、カラム精製法など、公知の方法が挙げられる。
【００２６】
なお、アビエチン酸は、市販品として入手することもできる。
【００２７】
そして、アビエチン酸を、溶剤に溶解および／または分散させることによって、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を得ることができる。
【００２８】
溶剤としては、上記した抽出溶剤と同様の溶剤が挙げられ、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。これらは、単独使用または２種類以上併用することができる。
【００２９】
フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物において、アビエチン酸の濃度は、フェカーリス菌の最少発育阻止濃度（Minimum Inhibitory Concentration:ＭＩＣ）未満となるように、調整される。
【００３０】
すなわち、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制する方法（フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制方法）では、まず、フェカーリス菌に対する、アビエチン酸の最少発育阻止濃度を測定し、その後、アビエチン酸を、後述の割合で使用する。
【００３１】
より具体的には、アビエチン酸の濃度は、薬剤耐性菌の発生を抑制する観点から、フェカーリス菌に対する最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）未満であり、好ましくは、最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／２以下、好ましくは、最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／４以下である。また、バイオフィルムの形成を十分に抑制する観点から、フェカーリス菌の最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１／８以上である。
【００３２】
なお、最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、常法によって測定される。例えば、フェカーリス菌に対するアビエチン酸の最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、１６〜６４μｇ／ｍＬ、好ましくは、２０〜４０μｇ／ｍＬである。
【００３３】
例えば、フェカーリス菌に対するアビエチン酸の最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）が３２μｇ／ｍＬである場合、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物のアビエチン酸の濃度は、具体的には、３２μｇ／ｍＬ未満（すなわち、ＭＩＣ未満）、好ましくは、１６μｇ／ｍＬ以下（すなわち、ＭＩＣの１／２以下）、より好ましくは、８μｇ／ｍＬ（すなわち、ＭＩＣの１／４以下）であり、例えば、４μｇ／ｍＬ以上（すなわち、ＭＩＣの１／８以上）である。
【００３４】
フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物のアビエチン酸の濃度が上記範囲であれば、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【００３５】
また、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、必要により、添加剤を含有することができる。添加剤としては、例えば、研磨材、ゲル化剤、湿潤剤、抗う蝕性剤、調味剤、甘味剤、除痛剤、抗結石剤、美白剤、界面活性剤、結合剤、保存剤、不透明化剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、消毒剤などが挙げられる。これらは、単独使用または２種類以上併用することができる。また、添加剤の含有割合は、目的および用途に応じて、適宜設定される。
【００３６】
そして、このようなフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、アビエチン酸を上記の特定濃度で含有するため、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【００３７】
そのため、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムが問題となる分野、具体的には、医療分野、水関連分野（冷却水設備、浴槽設備、水処理設備など）、塗料分野（船底塗料など）、飲食品分野（食品製造設備、飲料製造設備など）、化粧品分野、洗浄剤分野、トイレタリー用品分野などの各種産業分野において用いられる。とりわけ、医療分野において、医療用バイオフィルム形成抑制剤として、好適に用いられる。
【００３８】
換言すれば、医療用バイオフィルム形成抑制剤は、上記のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を含有しており、例えば、口腔病の予防および／または治療、感染症の予防および／または治療など、各種医療分野において用いられる。
【００３９】
口腔病の予防および／または治療の分野では、医療用バイオフィルム抑制剤は、例えば、口腔組成物として調製される。
【００４０】
口腔組成物の形態は、特に制限されず、例えば、練り歯磨、ゲル、粉末、溶液（口腔洗浄剤、歯用リンス液）、懸濁液、乳液、トローチ（飴）、ビヒクル、錠剤、ガムなどが挙げられる。また、医療用バイオフィルム抑制剤を口腔組成物として調製する方法は、特に制限されず、口腔組成物の形態に応じて、公知の方法が採用される。
【００４１】
また、口腔組成物の使用方法は、特に制限されず、口腔組成物の形態に応じて、公知の方法が採用される。例えば、口腔組成物が練り歯磨である場合には、任意の頻度で、口腔組成物で口腔内（例えば、歯、義歯、歯肉、舌、口腔内粘膜など）を処理する。
【００４２】
処理形態としては、例えば、塗布、コーティング、浸透、洗浄などが挙げられ、口腔組成物の形態に応じて、適宜選択される。
【００４３】
このように、口腔内を、医療用バイオフィルム形成抑制剤で処理することにより、生体の常在細菌叢を乱すことを抑制し、また、薬剤耐性菌の発生を抑制することができ、効果的にフェカーリス菌由来のバイオフィルム形成を抑制することができる。
【００４４】
その結果、例えば、う蝕、歯肉炎、カンジタ病、口内炎などの口腔病を、予防および／または治療することができる。
【００４５】
また、感染症の予防および／または治療の分野では、医療用バイオフィルム抑制剤は、例えば、各種医療用具の表面処理剤として調製される。
【００４６】
表面処理剤の形態は、特に制限されず、例えば、溶液、懸濁液、乳液、フィルム、シートなどが挙げられる。また、医療用バイオフィルム抑制剤を表面処理剤として調製する方法は、特に制限されず、表面処理剤の形態に応じて、公知の方法が採用される。
【００４７】
また、表面処理剤の使用方法は、特に制限されず、表面処理剤の形態に応じて、公知の方法が採用される。
【００４８】
例えば、表面処理剤が溶液である場合には、任意の頻度で、表面処理剤を医療用具の表面を処理する。
【００４９】
医療用具としては、例えば、医療用デバイス、好ましくは、生体内に留置される医療法デバイスが挙げられる。より具体的には、例えば、インプラント（例えば、尿道カテーテル、腹腔カテーテル、中心静脈カテーテルなどのカテーテル、例えば、人工歯（デンタルインプラント）、骨固定ボルト、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、ボイスプロテーゼ、コンタクトレンズなど）などが挙げられる。
【００５０】
また、医療用具としては、上記の他、例えば、医療用ドレッシング材、医療用テープなど、生体内に留置されない医療用具も挙げられる。
【００５１】
また、処理形態としては、例えば、塗布、コーティング、浸透、洗浄などが挙げられ、表面処理剤の形態に応じて、適宜選択される。
【００５２】
このように、医療用具の表面を、医療用バイオフィルム形成抑制剤で処理することにより、生体の常在細菌叢を乱すことを抑制し、また、薬剤耐性菌の発生を抑制することができ、効果的にフェカーリス菌由来のバイオフィルム形成を抑制することができる。
【００５３】
その結果、例えば、手術部位感染、血流感染、呼吸器感染、尿路感染、さらには、心内膜炎、髄膜炎、敗血症などの各種感染症を、予防および／または治療することができる。
【００５４】
フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、医療用バイオフィルム形成抑制剤に限定されない。すなわち、フェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物は、口腔内および医療用具の他、例えば、一般家庭や事業所などにおける給水設備および排水設備、軟膏の基材、滑り止め剤、セッケンなどに用いることもできる。
【００５５】
そして、このような医療用バイオフィルム形成抑制剤は、アビエチン酸を上記の特定濃度で含有するため、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【実施例】
【００５６】
次に、本発明を、実施例および比較例に基づいて説明するが、本発明は、下記の実施例によって限定されるものではない。なお、「部」および「％」は、特に言及がない限り、質量基準である。また、以下の記載において用いられる配合割合（含有割合）、物性値、パラメータなどの具体的数値は、上記の「発明を実施するための形態」において記載されている、それらに対応する配合割合（含有割合）、物性値、パラメータなど該当記載の上限値（「以下」、「未満」として定義されている数値）または下限値（「以上」、「超過」として定義されている数値）に代替することができる。
【００５７】
＜スクリーニング試験＞
・ＭＣＩ測定
アビエチン酸（ＡＡ）、デヒドロアビエチン酸（ＤＡ）、ネオアビエチン酸（ＮＡ）およびロジン（樹脂酸混合物）について、フェカーリス菌（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ５１２９９株）およびフェシウム菌（Ｅ．  ｆａｅｃｉｕｍ  ＦＮ−１株）の最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）を、微量液体希釈法により測定した。目視により菌の育成を確認できない最小濃度をＭＩＣとした。
【００５８】
その結果を、表１に示す。
【００５９】
【表１】
2018172318.tif 000003
【００６０】
・培地試験
アビエチン酸（ＡＡ）、デヒドロアビエチン酸（ＤＡ）、ネオアビエチン酸（ＮＡ）およびロジンを、溶剤としてＤＭＳＯで適宜の濃度に希釈し、試料溶液を得た。
【００６１】
フェカーリス菌（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ５１２９９株）をＮ培地（１％グルコース添加）で１００倍に希釈した。また、フェシウム菌（Ｅ．  ｆａｅｃｉｕｍ  ＦＮ−１株）をＬＢ培地（１％グルコース添加）で１００倍に希釈した。その後、各希釈液を、９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。
【００６２】
そこに、アビエチン酸（ＡＡ）、デヒドロアビエチン酸（ＤＡ）、ネオアビエチン酸（ＮＡ）およびロジンのいずれか一種の試料溶液を加えた。このとき、各培地中における濃度が、表２に記載の数値となるよう、調整した。なお、コントロールは試料も溶媒も含まない培地とした。これらを３７℃で２４時間静置培養した。これにより、各培地にバイオフィルムを形成させた。
【００６３】
【表２】
2018172318.tif 000004
【００６４】
その後、形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色した。蒸留水を用いて各ウェルを洗浄した後、３０％酢酸２００μＬで溶出したクリスタルバイオレットについて、５７０ｎｍの吸光度を計測し、バイオフィルム形成率（ｖｓコントロール）を求めた。
【００６５】
フェカーリス菌由来のバイオフィルム形成率を図１に、フェシウム菌由来のバイオフィルム形成率を図２に示す。
【００６６】
・無抗菌性の確認
アビエチン酸（ＡＡ）をＭＩＣの１／８の濃度で用いた場合のフェカーリス菌の成長率と、アビエチン酸（ＡＡ）をＭＩＣの１／１６の濃度で用いた場合のフェカーリス菌の成長率と、アビエチン酸（ＡＡ）を用いなかった場合のフェカーリス菌の成長率とを、以下の方法で比較した。
【００６７】
すなわち、アビエチン酸（ＡＡ）を適宜の濃度になるように調整したＮ培地（１％グルコース添加）の濁度（６００ｎｍ）を、それぞれ１０分おきに測定し、その濁度から常法により成長率を求めた。
【００６８】
その結果を、図３に示す。
【００６９】
＜考察＞
図１および図２において、バイオフィルム形成率を、エラーバーの上端にて判断した。
【００７０】
フェカーリス菌およびフェシウム菌は、いずれも腸球菌の一種であるが、図２が参照されるように、アビエチン酸（ＡＡ）、デヒドロアビエチン酸（ＤＡ）、ネオアビエチン酸（ＮＡ）およびロジンのいずれを各種濃度で用いても、フェシウム菌由来のバイオフィルムの形成を抑制することはできなかった。
【００７１】
これに対して、図１が参照されるように、アビエチン酸（ＡＡ）をＭＩＣの１／８の濃度で用いた場合にのみ、フェカーリス菌由来のバイオフィルムの形成を抑制することができた。また、アビエチン酸（ＡＡ）の濃度が高いほど、バイオフィルム形成能が高いと推察されるため、ＭＩＣの１／８以上であれば、バイオフィルムの形成を抑制することが推察された。
【００７２】
一方、図２が参照されるように、アビエチン酸（ＡＡ）を用いる場合でも、その濃度がＭＩＣの１／１６以下であれば、フェカーリス菌由来のバイオフィルムの形成を抑制することができなかった。
【００７３】
また、デヒドロアビエチン酸（ＤＡ）、ネオアビエチン酸（ＮＡ）およびロジンのいずれをどのような濃度で用いても、フェカーリス菌由来のバイオフィルムの形成を抑制することはできなかった。
【００７４】
また、図３が参照されるように、フェカーリス菌の育成速度は、アビエチン酸（ＡＡ）をＭＩＣの１／８の濃度で用いた場合と、アビエチン酸（ＡＡ）を用いなかった場合とで、同程度であることが確認された。つまり、アビエチン酸（ＡＡ）の濃度がＭＩＣ未満であれば、抗菌性を発現しないことが確認された。
【００７５】
以上のことから、アビエチン酸（ＡＡ）の濃度がＭＩＣ未満、かつ、ＭＩＣの１／８以上であれば、抗菌性を発現することなく、フェカーリス菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができると確認された。
【００７６】
実施例１
アビエチン酸（ＡＡ）をＤＭＳＯに溶解させ、アビエチン酸濃度４μｇ／ｍＬ（ＭＩＣの１／８）のフェカーリス菌由来バイオフィルム形成抑制組成物を調製した。
【図１】
2018172318.tif 000005
【図２】
2018172318.tif 000006
【図３】
2018172318.tif 000007