(57)【要約】【課題】外部抗原への免疫応答を維持できる、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤を提供すること。【解決手段】ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を有効成分として含有する、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を有効成分として含有する、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【請求項２】
前記発現抑制物質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する核酸である、請求項１に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【請求項３】
前記核酸が、ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【請求項４】
前記ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
5'-GGACAGCAGUCCUCCAUUAAUU-3'  （配列番号１）
5'-GGUUCGCACAGACAGUUUAAUU-3'  （配列番号２）
5'-GGCGAACCCUGACUAUCAAAUU-3'  （配列番号３）
【請求項５】
前記機能抑制物質が、ＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する核酸である、請求項１に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【請求項６】
前記核酸が、ＮＲ４Ａ２タンパクに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【請求項７】
前記自己抗体依存性自己免疫疾患が、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、バセドウ病、慢性甲状腺炎、Ａ型胃炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン過敏性腸症、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球瘍、特発性血小板減少性紫斑病、拡張性心筋症、慢性心筋炎、自己免疫性不妊症、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己抗体依存性自己免疫疾患は、自己組織を抗原として認識し、その自己組織に対する抗体（自己抗体）が産生されることにより、発症する自己免疫疾患である。産生された自己抗体は、自己の組織に対して免疫応答を誘発し、当該組織を破壊する。
【０００３】
中枢神経系組織に対する自己抗体依存性自己免疫疾患には、視神経脊髄炎等の病原性抗体が既に同定された疾患だけでなく、自己免疫性脳炎等の病原性抗体が未知であるか、又は自己抗原が未同定である疾患も包含される。自己抗体依存性自己免疫疾患は、膠原病を合併する頻度が高い。
【０００４】
自己抗体依存性自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫寛容が破綻して発症すると考えられている。自己抗体の一種である抗核抗体は、主にＩｇＧ型抗体であり、ＩｇＧ抗体の産生にはＢ細胞がその成熟過程でクラススイッチを起こす必要があり、また抗核抗体の産生には、体細胞超変異（somatic hypermutation：免疫グロブリンの相補性決定領域における変異）による親和性成熟（affinity maturation）が確認されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｅｎ  Ｊ．Ｅ．  Ｒａｖｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１５，６：８４３７，１−１１．
【非特許文献２】Ｊａｓｏｎ  Ａ．  Ｂｕｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００９，１０６，１５１８−１５２３．
【非特許文献３】Ｄｅｅｐａｋ  Ａ．  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５４２，１１０−１１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療に対する有効な治療方法は確立されておらず、一般的にステロイド又は免疫抑制剤の投与により免疫応答自体を抑制し、自己組織の損傷を防ぐ方法が採用されている。
【０００７】
しかし、ステロイド又は免疫抑制剤は、自己抗体に起因する免疫応答の抑制だけでなく、外部抗原に対する通常の免疫応答も抑制する。そのため、投与された患者は易感染性状態となり、自己免疫疾患の治療中に、他の外部抗原による日和見感染を起こす等の問題が生じる場合がある。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、外部抗原への免疫応答を維持できる、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ＢｘＳＢ−Ｙａａマウスに対して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞特異的にＮＲ４Ａ２遺伝子をノックアウトしたマウスが、外部抗原への免疫応答を維持しながら、自己抗体の産生が抑制され、糸球体腎炎の症状も抑制されるという知見を得て、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］を提供する。
［１］ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を有効成分として含有する、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［２］前記発現抑制物質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する核酸である、［１］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［３］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［２］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［４］前記ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む、［３］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は進行抑制剤。
5'-GGACAGCAGUCCUCCAUUAAUU-3'  （配列番号１）
5'-GGUUCGCACAGACAGUUUAAUU-3'  （配列番号２）
5'-GGCGAACCCUGACUAUCAAAUU-3'  （配列番号３）
［５］前記機能抑制物質が、ＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する核酸である、［１］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［６］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２タンパクに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［５］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［７］前記自己抗体依存性自己免疫疾患が、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、バセドウ病、慢性甲状腺炎（橋本病）、Ａ型胃炎（場合により、悪性貧血を含む）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック・スプール（グルテン過敏性腸症）、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球瘍、特発性血小板減少性紫斑病、拡張性心筋症、慢性心筋炎、自己免疫性不妊症、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変である、［１］〜［６］のいずれかに記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤又は病態の進行抑制剤。
［８］ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を対象に投与することを含む、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［９］前記発現抑制物質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する核酸である、［８］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［１０］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［９］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［１１］前記ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む、［１０］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
5'-GGACAGCAGUCCUCCAUUAAUU-3'  （配列番号１）
5'-GGUUCGCACAGACAGUUUAAUU-3'  （配列番号２）
5'-GGCGAACCCUGACUAUCAAAUU-3'  （配列番号３）
［１２］前記機能抑制物質が、ＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する核酸である、［８］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［１３］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２タンパクに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１２］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［１４］前記自己抗体依存性自己免疫疾患が、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、バセドウ病、慢性甲状腺炎（橋本病）、Ａ型胃炎（場合により、悪性貧血を含む）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック・スプール（グルテン過敏性腸症）、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球瘍、特発性血小板減少性紫斑病、拡張性心筋症、慢性心筋炎、自己免疫性不妊症、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変である、［８］〜［１３］のいずれかに記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法。
［１５］ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を対象に投与することを含む、自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
［１６］前記発現抑制物質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する核酸である、［１５］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
［１７］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１６］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
［１８］前記ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを含む、［１７］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
5'-GGACAGCAGUCCUCCAUUAAUU-3'  （配列番号１）
5'-GGUUCGCACAGACAGUUUAAUU-3'  （配列番号２）
5'-GGCGAACCCUGACUAUCAAAUU-3'  （配列番号３）
［１９］前記機能抑制物質が、ＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する核酸である、［１５］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
［２０］前記核酸が、ＮＲ４Ａ２タンパクに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１９］に記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
［２１］前記自己抗体依存性自己免疫疾患が、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、バセドウ病、慢性甲状腺炎（橋本病）、Ａ型胃炎（場合により、悪性貧血を含む）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック・スプール（グルテン過敏性腸症）、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球瘍、特発性血小板減少性紫斑病、拡張性心筋症、慢性心筋炎、自己免疫性不妊症、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群）、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性肝炎、又は原発性胆汁性肝硬変である、［１５］〜［２０］のいずれかに記載の自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、外部抗原への免疫応答を維持できる、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの脾臓の写真である。図１Ｂは、両マウスを性別で区別して脾臓の重量をプロットしたグラフである。
【図２】１つの脾臓あたりの白血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示すグラフである。
【図３】ＣＸＣＲ５及びＰＤ１の発現量に基づくヒストグラムである。
【図４】図３のヒストグラムの各領域のＴ細胞数を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、ＦＡＳ及びＧＬ７に基づくヒストグラムである。図５Ｂは、雌雄で区別した場合のＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞の数、ＦＡＳ＋ＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞の数を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、ＭＺ  Ｂ細胞の数及び、脾臓１つあたりのＭＺ  Ｂ細胞の割合を示すグラフである。図６Ｂは、Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞の数を示すグラフである。
【図７】Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスとＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスにおける、血清中の総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又は抗核抗体（ＡＮＡ）の濃度を示すグラフである。
【図８】電気泳動後のゲルの写真である。
【図９】Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス由来の腎臓の組織化学的顕微鏡写真である。
【図１０】ＮＰ４又はＮＰ３１に対するＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ１の相対量を示すグラフである。
【図１１】ＰＤ１及びＣＸＣＲ５遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１２】ＩｇＧ及びＡＮＡの発現量に関する結果を示すグラフである。
【図１３】Ｔ細胞における遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＩＬ−２１の発現量を蛍光強度に基づき比較したヒストグラムであり、図１４Ｂは、ＩＬ−２１の発現量を蛍光強度に基づき比較したグラフである。
【図１５】ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂの発現量の変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔定義〕
本明細書において、「自己抗体依存性自己免疫疾患」とは、自己組織又はその一部、自己組織から分泌されるメディエーターを抗原として認識し、当該自己組織に対する抗体（自己抗体）を産生することにより、その免疫反応により組織が損傷されて発症する自己免疫疾患を意味する。また、自己抗体依存性自己免疫疾患は、臓器特異的自己免疫疾患と全身性自己免疫疾患に分類される。
【００１４】
臓器特異的自己免疫疾患の原因となる抗原としては、例えば、平滑筋（例えば、アクチン）、アシアロ糖蛋白レセプター、肝腎ミクロソーム−１（例えば、チトクロームＰ４５０  ２Ｄ６）、肝可溶性抗原（ＳＬＡ）、好中球細胞質（例えば、ＨＭＧ１、ＨＭＧ２）、ミトコンドリアＭ２、表皮細胞間質（例えば、デスモグレイン３、デスモグレイン１）、表皮基底膜（例えば、ＢＰ１８０）、甲状腺刺激ホルモン受容体、サイログロブリン（Ｔｇ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、胃壁細胞、内因子、大腸、ＡＳＣＡ（Anti-saccharomyces cerevisiae antibodies）、グリアディン、膵臓ランゲルハンス島細胞、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、副腎皮質、糸球体基底膜（ＧＢＭ）、Ｐ−ＡＮＣＡ（例えば、ミエロペルオキダーゼ）、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）、ＧＱ１ｂ、アセチルコリン受容体、赤血球、血小板（例えば、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ、Ｉｂ／ＩＸ）、心筋、精子、透明帯が挙げられる。
【００１５】
臓器特異的自己免疫疾患としては、例えば、自己免疫性脳炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、バセドウ病、慢性甲状腺炎（橋本病）、Ａ型胃炎（場合により、悪性貧血を含む）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック・スプール（グルテン過敏性腸症）、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球瘍、特発性血小板減少性紫斑病、拡張性心筋症、慢性心筋炎、自己免疫性不妊症が挙げられる。
【００１６】
全身性自己免疫疾患の原因となる抗原としては、例えば、ＤＮＡ、ヒストン、ＥＮＡ（可溶性核抗原：Extractable Nuclear Antigen）、セントロメア、核小体、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原：Proliferating Cell Nuclear Antigen）、細胞質、ミトコンドリア、平滑筋、ｄｓＤＮＡ、Ｓｍ（Smith）、ＲＮＰ、ＳＳ−Ａ／Ｒｏ、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、Ｓｃｌ−７０（トポイソメラーゼＩ）、Ｊｏ−１、ＣＥＮＰ−Ｂ（セントロメア蛋白Ｂ）、免疫グロブリンＧ、ＭＭＰ−３、フィラグリン、ｓｓＤＮＡ、ＣＣＰ（シトルリン化ペプチド）、ヌクレオソーム、カルジオリピン、リボソームＰ、ミトコンドリアＭ２、プロトロンビン、ループスアンチコアグラント、好中球ＰＲ３（好中球プロテイナーゼ３）、好中球ＭＰＯ（好中球ミエロペルオキシダーゼ）が挙げられる。
【００１７】
全身性自己免疫疾患としては、例えば、薬剤誘発性ループス、ＣＲＥＳＴ症候群、ＳＳｃ（強皮症）、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、ＲＡ（関節リウマチ）、ＭＣＴＤ（混合性結合組織病）、ＳＳ（シェーグレン症候群）、ＰＭ／ＤＭ（多発性筋炎／皮膚筋炎）、ＭＰＡ（顕微鏡的多発血管炎）、ＷＧ（ウェゲナー肉芽腫症）、ＡＧＡ（アレルギー性肉芽腫性血管炎（Churg-Strauss症候群））、ＡＰＳ（抗リン脂質抗体症候群）、ＡＩＨ（自己免疫性肝炎）、ＰＢＣ（原発性胆汁性肝硬変）が挙げられる。
【００１８】
ＮＲ４Ａ２遺伝子は、Ｎｕｒｒ１遺伝子、ＮＯＴ遺伝子、又はＲＮＲ１遺伝子とも呼ばれ、オーファン核内受容体の１種である。ＮＲ４Ａ２遺伝子の主な発現部位は、中枢神経系であり、特に中脳腹側、脳幹、脊髄に強く発現している。また、ＮＲ４Ａ２は，プロスタグランジン、増殖因子、炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体架橋に応答して発現が誘導され、リガンド依存性又はリガンド非依存性にＤＮＡと直接結合して転写を制御する。ヒトＮＲ４Ａ２遺伝子の転写産物のNCBI Reference Sequenceのアクセッション番号は、ＮＭ＿００６１８６．３である。
【００１９】
〔自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤〕
本発明の第一実施形態にかかる自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤は、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を有効成分として含有する。当該治療剤は、自己抗体依存性自己免疫疾患の病態の進行抑制剤としても使用することができる。
【００２０】
ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質としては、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制するできる物質であればよく、核酸であっても低分子化合物であってもよい。核酸は、例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、又はｓｉＤＮＡとｓｉＲＮＡのキメラ分子であってもよい。
【００２１】
ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、例えば、特許第５０９８０３３号公報に記載のｓｉＲＮＡであってもよい。具体的には、5'-GGACAGCAGUCCUCCAUUAAUU-3'（配列番号１）、5'-GGUUCGCACAGACAGUUUAAUU-3'（配列番号２）、又は5'-GGCGAACCCUGACUAUCAAAUU-3'（配列番号３）、あるいは、それらの塩基配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチド等は、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制し得る。配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列は、5'-UUAAUGGAGGACUGCUGUCCUU-3'（配列番号４）である。配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列は、5'-UUAAACUGUCUGUGCGAACCUU-3'（配列番号５）である。配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列は、5'-UUUGAUAGUCAGGGUUCGCCUU-3'（配列番号６）である。なお、本発明において、これらのオリゴヌクレオチドに、糖鎖、核酸塩基、またはバックボーンが修飾されたリボヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドを含む）であってもよい。
【００２２】
糖鎖が修飾されたリボヌクレオチドとしては、例えば、各塩基のリボースにおいて、２位の水酸基（ＯＨ）が、Ｈ、ＯＲ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基（但し、Ｒは、Ｃ１−６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。）で置き換えられたリボヌクレオチドが挙げられる。核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチドとしては、例えば、ウリジン又はシチジンが、５位で置換されたウリジン又はシチジン（例えば、５−（２−アミノ）−プロピルウリジン、５−ブロモウリジンなど）であるリボヌクレオチド、アデノシン又はグアノシンが、８位で置換されたアデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグアノシンなど）、デアザヌクレオチド（例えば、７−デアザアデノシンなど）、Ｏ−又はＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなど）等を挙げることができる。また、バックボーンが修飾されたリボヌクレオチドとしては、例えば、リン酸基がチオリン酸基などの修飾基に置き換えられたリボヌクレオチドを挙げることができる。
【００２３】
上述のオリゴヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応、酵素合成法、固相合成法等の常法により合成することができる。
【００２４】
また、発現抑制物質は、上記核酸を発現する組換えベクターであってもよい。上記核酸を発現する組換えベクターとしては、例えば、ｓｉＲＮＡが非修飾ＲＮＡである場合、その核酸をコードするＤＮＡを組み込んだウイルスベクターまたはプラスミドなどの発現ベクターウイルスなどを挙げることができる。
【００２５】
なお、上記ＤＮＡをウイルスベクターに組み込んだ発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させた細胞株、その細胞株から産生されるウイルス等もＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する物質として有用である。ウイルスを薬剤や医薬組成物として用いる場合には、毒性や副作用が生じないようにするために、ウイルスを遺伝子操作等の公知の方法により、増殖しないように変異させておくことが好ましい。例えば、感染はするが、複製しないように改変されたレトロウイルスやアデノウイルスに、上記核酸を発現することができる発現ベクターに組み込んだものを用いればよい。上記ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージベクターなどである。
【００２６】
また、上記核酸を封入したリポソームもＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する物質として有用である。この場合、Trans IT In Vivo Gene Delivery System（商品名、TaKaRa社製）やIn Vivo Transfection Kit AteloGene（商品名、高研社製）などを用いることにより、生体内標的部位にこれらのオリゴヌクレオチドを導入することができる。
【００２７】
さらに、上記核酸を内包した高分子ミセルも、薬物キャリアとして優れた特性を有し、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する物質として有用である。
【００２８】
また、上記核酸を細胞に発現させるためのプラスミドと、高分子キャリアとの複合体も、標的組織にプラスミドを運び、そこで上記核酸を発現させることが可能であることから、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する物質として有用である。なお、高分子キャリアとしては、前記プラスミドを細胞内に導入することが可能な物質であればどのようなものを用いてもよく、例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポロタミン、キトサン、合成ペプチド、又はデンドリマーなどを用いることができる。
【００２９】
第一の実施形態に係る自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤における上記有効成分（ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤全量を基準として、０．００１〜１００質量％であってよい。
【００３０】
第一の実施形態に係る自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００３１】
第一の実施形態に係る自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００３２】
第一の実施形態に係る自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの自己抗体依存性自己免疫疾患の治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ／日／人である。
【００３３】
上記第一の実施形態は、それを必要とするヒト対象にＮＲ４Ａ２遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、又はＮＲ４Ａ２タンパクの機能を抑制する機能抑制物質を投与するステップを含む、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
１．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの作製
（１）ＢｘＳＢ−Ｙａａマウス
ＢｘＳＢ−Ｙａａマウスは、抗核抗体を含む多様な抗体が産生され、脾腫、リンパ節腫大、糸球体腎炎等の膠原病様病態を自然発症する。また、ＢｘＳＢ−Ｙａａマウスは、主に雄マウスにおいて、上記病態を発症する。一方、雌のＢｘＳＢ−Ｙａａマウスは、高週齢期になって病態を発症することがある。
【００３６】
（２）動物
使用したマウスはすべて、特定病原体不在条件（ＳＰＦ）下で飼育した。ｌｏｘｐ配列でＮＲ４Ａ２遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスを樹立した。すなわち、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＮＲ４Ａ２導入遺伝子をＣ５７ＢＬ／６胚性幹細胞にマイクロインジェクションにより導入した。樹立系統をＣ５７ＢＬ／６  ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを作製した。得られたマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４−Ｃｒｅマウス（タコニック社）と交配させることにより、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウス）を樹立した。
次に、得られたマウスをＢｘＳＢ−Ｙａａマウス（日本エスエルシー株式会社より購入）と１０代に渡って交配させる（戻し交配）ことにより、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  ＢｘＳＢマウス（以下、「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス」ともいう。）、及びＣｒｅ−ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  ＢｘＳＢマウス（以下、「ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス」ともいう。）を樹立した。得られたＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスは、同腹のＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスと一緒に飼育されていたＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ  ＢｘＳＢマウスとともにＳＰＦ条件で飼育された。
【００３７】
２．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの解析
（１）脾臓の観察
８、１６、又は２０週齢のＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスを安楽死させ、二次リンパ組織（脾臓）を取り出し、得られた組織をタオルで乾燥した。得られた脾臓を撮影した後、重量を測定した。
【００３８】
脾臓の外観及び重量に関する結果を図１に示す。図１Ａは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの脾臓の写真である。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの脾臓は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスの脾臓に比べて小さかった。図１Ｂは、両マウスを性別で区別して脾臓の重量をプロットしたグラフである。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスにおいては、１６及び２０週齢の雄マウスから採取した脾臓は、８週齢の雄マウス及び雌マウスから採取した脾臓よりも顕著に重かった。一方、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスにおいては、各群において、脾臓の重量に顕著な違いはなかった。
【００３９】
（２）細胞の単離
１６週齢のマウスから採取した脾臓中の各細胞数を、フローサイトメトリーを用いて測定した。具体的には、組織（脾臓）を３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したRPMI 1640培地（Invitrogen社製）において更に分散させた。得られた組織のホモジネートを７０μｍセルストレイナー（BD Bioscience社製）に通して単細胞に分解し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。
得られた白血球細胞中の白血球細胞（ＣＤ４５＋細胞）の総数、Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ＋ＣＤ１９−細胞）の数、Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ−ＣＤ１９＋細胞）の数、単球細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ−ＣＤ１９−ＮＫ１．１−細胞）の数、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋細胞）の数を、FACSCanto II又はFACS ARIA II（BDCytometry Systems社製）で測定し、Flow-Joソフトウェアで解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４５抗体（BD Bioscience社製またはBiolegend社製）、抗ＴｃＲβ抗体（BDBioscience社製、Biolegend社製またはeBioscience社製）、抗ＣＤ１９抗体（Biolegend社製）、抗ＮＫ１．１抗体（BD Bioscience社製）、及び抗ＣＤ４抗体（Biolegend社製）である。
【００４０】
脾臓中の白血球細胞数に関する結果を図２に示す。図２Ａ〜Ｅはそれぞれ、１つの脾臓あたりの白血球細胞の数、Ｔ細胞の数、Ｂ細胞の数、単球細胞の数、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示すグラフである。雄のＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスに比べて、各細胞の数が減少した。
【００４１】
（３）ＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞表面抗原発現
上記２．（２）と同様にして、各マウスの白血球細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋細胞）を、フローサイトメーターを用いて分離した。得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＸＣＲ５、及びＰＤ１の発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＸＣＲ５抗体（Biolegend社製）、抗ＩＣＯＳ抗体（Biolegend社製）、及び抗ＰＤ１抗体（Biolegend社製またはeBioscience社製）である。
【００４２】
結果を図３及び４に示す。図３は、ＣＸＣＲ５及びＰＤ１の発現量に基づくヒストグラムである。エラーバーは、各群あたり４匹のマウスの結果の標準誤差を意味する。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスに比べて、ＰＤ１の発現量が少ないことが判明した。図４は、図３のヒストグラムの各領域のＴ細胞数を示すグラフである。図４Ａは、細胞数を比較したグラフであり、図４Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞における各細胞の割合を比較したグラフである。図４中、「ＤＮ」はダブルネガティブ（ＰＤ１−ＣＸＣＲ５−細胞）、「ＳＰ」はシングルポジティブ（ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５−細胞、末梢性ヘルパーＴ細胞ともいう。）、「ＤＰ」はダブルポジティブ（ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞ともいう。）を意味する。末梢性ヘルパーＴ細胞（ＳＰ）は、濾胞外に存在することが知られている。濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＤＰ）は、その細胞表面にＣＸＣＲ５が発現しており、濾胞内及び濾胞外に存在することが知られている。
【００４３】
（４）胚中心Ｂ細胞における細胞表面抗原発現
上記２．（２）と同様にして、各マウスの白血球細胞からＢ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ−ＣＤ１９＋細胞）を、フローサイトメーターを用いて分離した。得られたＢ細胞における、ＦＡＳ及びＧＬ７の発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した。ＧＬ７は通常、マウス胚中心Ｂ細胞の活性化マーカーとして使用される。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ−１９抗体（Biolegend社製）、抗ＦＡＳ抗体（eBioscience社製）、及び抗ＧＬ７抗体（Biolegend社製）である。
【００４４】
結果を図５に示す。図５Ａは、ＦＡＳ及びＧＬ７に基づくヒストグラムである。図５Ｂは、雌雄で区別した場合のＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞の数、ＦＡＳ＋ＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞の数を示すグラフである。エラーバーは、各群４匹のマウスの標準誤差を意味する。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス（雄）とＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス（雄）との間で、ＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞が顕著に減少しており、特にＦＡＳ＋ＧＬ７＋胚中心Ｂ細胞は更に顕著に減少していた。雌マウスに関しては、両群間で顕著な差は見られなかった。
【００４５】
（５）辺縁帯Ｂ細胞における細胞表面抗原発現
上記２．（４）で得られたＢ細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ−ＣＤ１９＋細胞）から、ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ２１−ＣＤ２３＋Ｂ細胞（以下、「ＭＺ  Ｂ細胞」ともいう。）を、フローサイトメーターを用いて分離した。分離の際に使用した抗体は、抗Ｂ２２０抗体（Biolegend社製）、抗ＣＤ２１抗体（Biolegend社製）、及び抗ＣＤ２３抗体（Biolegend社製）である。
【００４６】
（６）その他の免疫細胞における細胞表面抗原発現
次に、上記２．（４）で得られたＴ細胞あるいはＢ細胞以外の細胞（ＣＤ４５＋ＴｃＲβ−ＣＤ１９＋細胞）から、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞（以下、「Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞」ともいう。）、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−ＣＤ１１ｃ＋細胞（樹状細胞）、及びＣＤ１１ｂ−ＮＫ１．１＋細胞（ＮＫ細胞）をそれぞれ、フローサイトメーターを用いて分離した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Biolegend社製またはeBioscience社製）、抗Ｌｙ６Ｇ抗体（Biolegend社製またはeBioscience社製）、抗Ｌｙ６Ｃ抗体（Biolegend社製）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend社製）、及び抗ＮＫ１．１抗体（BD Bioscience社製）である。
【００４７】
結果を図６に示す。図６Ａは、ＭＺ  Ｂ細胞の数及び、脾臓１つあたりのＭＺ  Ｂ細胞の割合を示すグラフである。エラーバーは、各群４匹のマウスの標準誤差を意味する。ＭＺ  Ｂ細胞の数は、各群において顕著な差はなかったが、１つの脾臓あたりの割合では、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスにおけるＭＺ  Ｂ細胞は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスよりも、増加していた。図６Ｂは、Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞、樹状細胞、及びＮＫ細胞の細胞数を比較したグラフである。雄マウスで比較すると、ＮＲ４Ａ２をノックアウトすることにより、Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞及び樹状細胞の数が顕著に減少した。
【００４８】
３．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの免疫応答
（１）血清中のＩｇＧ抗体の発現量
１６週齢のＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス及びＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスの後眼窩静脈叢から採血し、凝固させた後、遠心分離により血球細胞を除去して血清を得た。得られた血清は測定に使用するまで−８０℃で保管した。血清中のＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及び抗核抗体（ＡＮＡ）の濃度およびＩｇＧの性状を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
また、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス（雄、１６週齢）、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス（雄、１６週齢）、及びＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス（雌、８週齢）の各群４匹の血清に含まれるＩｇＧに結合するタンパクを調査した。同マウスの肝臓から抽出したタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ニトロセルロース膜に転写後、採取した血清を用いてイムノブロッティングにより認識タンパク質を検出した。
【００４９】
結果を図７及び図８に示す。図７Ａ〜Ｃはそれぞれ、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスとＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスにおける、血清中の総ＩｇＧ、各種ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）、及び抗核抗体（ＡＮＡ）の濃度を示すグラフである。ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスに比べて、総ＩｇＧ、ＩｇＧ２ａ及びＡＮＡの量が顕著に減少した。一方、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスは、ＩｇＧ２ｂの量がわずかに減少し、ＩｇＧ１の量は変化しなかった。また、図８は、ＩｇＧ抗体に結合する肝臓由来のタンパクをイムノブロッティングにより検出したフィルムの写真である。写真のうち、レーン１〜４では、多様な抗核抗体のバンドが検出されたが、レーン５〜８及びレーン９〜１２では、タンパクが少なかった。すなわち、雄のＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスでは、複数種の肝臓由来のタンパクに対するＩｇＧが発現したことが理解できる。
【００５０】
（２）腎臓における組織学的変化
Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスとＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの腎臓を採取し、各種染色により組織の病理学的解析を行った。染色方法は、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、過ヨウ素酸・シッフ染色（ＰＡＳ染色）又はマッソントリクローム染色（ＭＴＣ染色）である。
【００５１】
結果を図９に示す。図９は、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスとＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの腎臓をそれぞれ、ＨＥ染色、ＰＡＳ染色又はＭＴＣ染色したときの電子顕微鏡写真である。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスでは、過剰に形成された自己抗原・抗体複合体の沈着に起因する腎臓障害（糸球体腎炎）の著しい増悪が観察されたが、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、腎臓障害が軽減されていた。すなわち、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでの結果は、自己抗体産生の減少が反映されたものと理解できる。
【００５２】
（３）外来抗原に対する免疫応答
Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスをそれぞれ、ＣＦＡ乳化ＮＰ−ＫＬＨで免疫した後、外来抗原（ＮＰ−４及びＮＰ−３１エピト−プ）に対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＣＦＡはＦｒｅｕｎｄ’s  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔを意味し、ＮＰ−ＫＬＨはＮＰハプテン結合キーホールリンペットヘモシアニンを意味する。
また、８週齢から２０週齢になるまでの間、ケージ内のマウス糞便サンプルを採取して、糞便サンプル中のＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５３】
結果を図１０に示す。図１０Ａ、１０Ｂは、ＮＰ４又はＮＰ３１に対するＩｇＧ２ａの相対量を示すグラフであり、図１０Ｃ、１０Ｄは、ＮＰ４又はＮＰ３１に対するＩｇＧ１の相対量を示すグラフである。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの間で、外来抗原に対する免疫応答に有意な差は見られなかった。図１０Ｅは、糞便サンプル中のＩｇＡ濃度を示すグラフである。外来抗原に対して自然産生される腸管内分泌ＩｇＡは、腸内細菌叢の分布制御に重要な役割を果たすが、この結果によれば、ＩｇＡ産生量に影響を与えなかったといえる。
【００５４】
（４）末梢血中のＴ細胞分布及び抗体の発現量の経時変化
８、１３、１６、２０及び２４週齢において、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスから採血し、それぞれフローサイトメーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＴｃＲβ＋Ｔ細胞）におけるＰＤ１及びＣＸＣＲ５タンパク質の発現量をフローサイトメーターで測定し、各種ＩｇＧ、及びＡＮＡの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５５】
ＰＤ１及びＣＸＣＲ５遺伝子の発現量に関する結果を図１１に示し、各種ＩｇＧ及びＡＮＡの発現量に関する結果を図１２に示す。図１１によれば、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス（雄）では、ＰＤ１−ＣＸＣＲ５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が徐々に減少していくところ、１３〜１６週齢において、一過性にＰＤ１＋ＣＸＣＲ５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加し、２０〜２４週齢において、ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加することがわかる。これに対し、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス（雄）では、同様の傾向が見られるが、その変化は顕著に小さかった。図１２Ａ〜Ｄはそれぞれ、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＡＮＡの発現量の経時変化を示すグラフである。図１２によれば、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス（雄）では、徐々にＩｇＧ２ａ、ＡＮＡの発現量が増加していくのに対し、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウス（雄）では、ＩｇＧ２ａ、ＡＮＡの発現量の増加が顕著に抑制されていた。また、ＩｇＧ１の発現量は、観察期間内に増加することはなく、また両群間で違いはなかった。
【００５６】
（５）細胞間における遺伝子の発現量の違い
上記２．（２）と同様にして、１６週齢のＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスの脾臓から、セルソーターを用いて、ＣＤ４＋ＰＤ１−ＣＸＣＲ５−細胞（ＤＮ細胞）、ＣＤ４＋ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５−細胞（ＳＰ細胞）、ＣＤ４＋ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋細胞（ＤＰ細胞）に分離した。２種類のマウスから得られた合計６群の各細胞について、Ｂｃｌ６、Ｂｌｉｍｐ１、Ｍａｆ、ＩＬ−２１、Ｉｃｏｓの各遺伝子の発現量をリアルタイム定量的ＰＣＲ法で測定した。
摘出した脾臓からフローサイトメーターを用いてそれぞれのＣＤ４＋Ｔ細胞をソーティングした後、遺伝子の転写産物を定量化するために、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いて、得られた細胞集団から総ＲＮＡを抽出した。次に、一本鎖ｃＤＮＡキット（Takara社製）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。Light Cycler96装置（Roche Diagnostics社製）を備えたPower SYBR Greenmaster mix（Applied Biosystems社製）を用いた定量リアルタイムＰＣＲを、市販のプライマー（Quantitechプライマー、Qiagen社製）を用いて実施し、遺伝子発現量をＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１又はβ２Ｍハウスキーピング遺伝子に基づき補正した。
【００５７】
結果を図１３に示す。Ｂｃｌ６遺伝子とＭａｆ遺伝子の発現は、ＤＰ細胞とＳＰ細胞で相対的に高く、Ｂｌｉｍｐ１遺伝子、Ｉｃｏｓ遺伝子、ＩＬ−２１遺伝子の発現は、ＤＰ細胞で高かった。ＤＮ細胞では、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯにより、Ｂｌｉｍｐ１、Ｍａｆ、ＩＬ−２１遺伝子の発現量が低下した。またＳＰ細胞では、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯにより、Ｂｃｌ６遺伝子のみが低下した。ＤＰ細胞では、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯにより、Ｂｌｉｍｐ１、ＭＡＦ、ＩＬ−２１、Ｉｃｏｓ遺伝子が低下した。
【００５８】
次に、各群の細胞をＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（BD Biosciences社製）の存在下、５ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ／ＰＭＡ及び５００ｎｇ／ｍＬ  イオノマイシンで５時間再刺激した後、eBioscience Foxp3染色キットで細胞表面の染色、並びに組織の固定を行った。ＩＬ−２１の検出は、ＩＬ−２１受容体ＩｇＧ−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａと二次抗体により細胞内染色し、その蛍光強度を測定した。１群につき、試験を３回実施した。分析に使用したＩＬ−２１検出試薬はＩＬ−２１受容体ＩｇＧ−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）であり、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch社製）である。
【００５９】
結果を図１４に示す。図１４ＡはＩＬ−２１の発現量を蛍光強度に基づき比較したヒストグラムであり、縦軸は細胞数、横軸は相対蛍光強度を示す。図１４Ｂは、ＩＬ−２１の平均蛍光強度を各群間で比較したグラフ、及びＩＬ−２１＋細胞の割合を示すグラフである。図１４ＡおよびＢによれば、ＤＰ細胞とＳＰ細胞の蛍光強度はともに高く、ＩＬ−２１を発現していること、一方、ＤＮ細胞は蛍光強度が低く、ＩＬ−２１の発現量が少ないことがわかる。さらにＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、ＤＰ細胞とＳＰ細胞のＩＬ−２１の発現が消失したことから、これらのＩＬ−２１の発現がＮＲ４Ａ２依存性であることが分かる。
【００６０】
（６）細胞間におけるＩｇＧの発現量の違い
上記２．（２）と同様にして、１６週齢のＣｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウス及びＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスから脾臓を取り出し、フローサイトメーターを用いて、ソーティングによりＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ＴｃＲβ−細胞）を分離した後、さらにＢ細胞を２サブセット（ＧＬ７＋細胞、ＧＬ７−細胞）に分離した。また同様にして、脾臓からＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９−ＴｃＲβ＋細胞）を分離した後、さらにＴ細胞を３サブセット（ＰＤ１−ＣＸＣＲ５−細胞、ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５−細胞、ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋細胞）に分離した。得られた２サブセットのＢ細胞及び３サブセットのＴ細胞をそれぞれ１：５の比率で刺激用抗ＣＤ３抗体の存在下で１１日間共培養し、培養上清中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの発現量をＥＬＩＳＡ法で測定した。Ｂ細胞がＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ＴｃＲβ−ＧＬ７−細胞である場合、共培養の際に抗ＣＤ４０抗体を共存させた。培養の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（クローン名２Ｃ−１１、ハイブリドーマ上清より自家精製）、及び抗ＣＤ４０抗体（BD Bioscience社製）である。
【００６１】
結果を図１５に示す。図１５Ａ〜Ｃはそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの発現量の変化を示したグラフである。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢｘＳＢマウスでは、ＧＬ７＋Ｂ細胞とＴ細胞を共培養すると、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの発現量が多かったが、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、両ＩｇＧの発現量は減少したＧＬ７−Ｂ細胞を抗ＣＤ４０抗体の存在下にＴ細胞と共培養すると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの発現量が増え、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ  ＢｘＳＢマウスでは、すべてのＩｇＧの発現量が減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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