(57)【要約】      （修正有）【課題】早期診断によって、アルツハイマー病に罹患している何百万の人々の生活の質とその家族の生活の質を改善するための前記アルツハイマー病の診断の改良方法の提供。【解決手段】神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することとを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、
対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することと
を含む、方法。
【請求項２】
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと；
対象が神経変性状態を有するか否かを決定することと
をさらに含み、
少なくとも１種の刺激による対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、対象が神経変性状態を有することを示す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種の刺激がタンパク質混合物、多糖混合物、プロテインキナーゼＣ活性化因子、Ａβオリゴマー、薬剤、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質混合物、多糖混合物、またはそれらの組み合わせが細胞外基質調製物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせがラミニン、コラーゲン、エンタクチン、ヘパリンサルフェートプロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、増殖因子、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせが少なくとも１種の基底膜タンパク質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
細胞外基質調製物が腫瘍または癌細胞から調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍細胞がＥＨＳマウス肉腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせが可溶化された形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
細胞試料が末梢細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
末梢細胞が皮膚細胞、血液細胞、口腔内粘膜細胞および脳脊髄液由来の細胞から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
皮膚細胞が繊維芽細胞または上皮細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が減少である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加および減少の組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
変化がマイクロアレイによって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
マイクロアレイが細胞試料および対照細胞を含むアレイである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
マイクロアレイが細胞試料および対照細胞に由来の核酸を含むアレイである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸がｃＤＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
変化がポリメラーゼ連鎖反応によって測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
神経変性状態がアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症および老化から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
アルツハイマー病が孤発性アルツハイマー病、初期段階アルツハイマー病および若年発症アルツハイマー病から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
神経変性状態の診断が１種以上のさらなる診断法を使用して確認される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１種の刺激が２種以上の刺激を含み、２種以上の刺激が細胞試料と同時にまたは経時的に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、
対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現と対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現を検出することと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと；
対象が神経変性状態を有するか否かを決定することと
を含み、
少なくとも１種の刺激による対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、対象が神経変性状態を有することを示す、方法。
【請求項３０】
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加、減少、またはそれらの組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対照細胞が神経変性状態のない個体由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
対照細胞が、年齢が一致する対照細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１種の刺激がタンパク質混合物、多糖混合物、プロテインキナーゼＣ活性化因子、Ａβオリゴマー、薬剤、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の刺激が２種以上の刺激を含み、２種以上の刺激が細胞試料と同時にまたは経時的に接触される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
神経変性状態を治療または予防するための１種以上の候補薬物の開発に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
化合物を、細胞外基質調製物を含む培地中で培養した神経変性状態細胞試料と接触させることと；
神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することと；
神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を、化合物と接触させることなく細胞外基質調製物を含む培地中で培養した対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと
を含み；
対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、化合物が神経変性状態を治療または予防するための１種以上の候補薬物の開発に有用であることを示す、方法。
【請求項３７】
対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加、減少、またはそれらの組み合わせである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞外基質調製物、および神経変性状態のない少なくとも１つの個体由来の対照細胞を含む、神経変性状態を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本願は、合衆国法典第３５巻第１１９条の下、２０１１年１０月５日に出願された米国仮出願第６１／５４３，４１６号の優先権の利益を主張するものであり、その出願の内容は、参照によりその全体が本願に援用されるものとする。
【０００２】
本出願の開示は、刺激誘発性遺伝子発現プロファイルを使用する、神経変性状態、たとえばアルツハイマー病などの診断方法に関する。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶と認知機能の進行性減退によって特徴づけられる神経変性障害である。５００万人以上のアメリカ人がこの進行性の不治の病にかかって生活していると推定されている。アルツハイマー病は脳細胞を破壊し、記憶喪失や、生活の質を低下させる、思考および行動に関する問題を引き起こす。ＡＤには既知の完治する方法はないが、症状に対して治療を行うことにより、ＡＤに罹患している何百万の人々の生活の質とその家族の生活の質を改善することができる。ＡＤの早期診断によって、患者は生活の質を最大化する選択を行ない、かつ将来に対する計画を立てる時間が与えられ、未知の問題についての心配が和らげられ、患者が治療から恩恵を受けるよりよい機会が得られる。
【０００４】
ＡＤの複雑性は、早期のスクリーニングに大きな課題を提起する。症状の診断前にＡＤを予測するか、ＡＤを早期に高い信頼性で診断する生物学的マーカーは、ＡＤを検査し治療する上で大きな影響を与え得る。また長期の前駆症状段階、アルツハイマー病以外の他の認知症（非ＡＤＤ）との共存症およびＡＤの多因子的性質は、正確な診断に対してより一層の課題を提起している。
【０００５】
したがって、当技術分野においてアルツハイマー病を診断する改良方法が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ＡＤに罹患している対象由来の繊維芽細胞（左側の棒）と年齢を平均した対照対象（「ＡＣ」）由来の繊維芽細胞（右側の棒）をＢＤマトリゲル（BD Matrigel）（商標）で４８時間刺激した後の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１９（ＴＮＦＲＳＦ−１９）遺伝子の発現レベル（マイクロアレイデータ）を示す。
【図２】図２は、４８時間ＢＤマトリゲル（商標）によって刺激した場合と、ＢＤマトリゲル（商標）による刺激を実施しなかった場合の、ＡＤおよびＡＣ対象におけるＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の発現レベル（ＰＣＲ分析による）を示す。
【図３】図３は、４８時間ＢＤマトリゲル（商標）によって刺激した、ＡＤおよびＡＣ対象におけるＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の発現レベル（ＰＣＲ分析による）を示す。
【図４】図４は、正常および癌細胞でのＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の組織特異的発現を示す。
【０００７】
［説明］
本発明の開示は、神経変性状態、たとえばアルツハイマー病の診断方法であって、対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激、たとえばタンパク質および／または多糖混合物、プロテインキナーゼＣ活性化因子、Ａβオリゴマー（ＡＳＰＤ）、薬剤、ならびにそれらの組み合わせと接触させることと；細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することとを含む、方法を対象とする。方法は、細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと；対象が神経変性状態（アルツハイマー病）を有するか否かを決定することとをさらに含んでいてもよく、対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、対象が神経変性状態（アルツハイマー病）を有することを示す。
【０００８】
本開示の特定の側面を以下により詳しく記載する。本出願で使用され、ここで明確化されている用語および定義は、本発明の開示内の意味を表わすものとする。ここで言及されている特許および科学文献は、参照によってここに援用されるものとする。ここで提供されている用語および定義は、参照によって援用されている用語および／または定義と矛盾する場合、前者が優先する。
【０００９】
単数形の「a」「an」および「the」は、文脈が指示しない限り、複数への言及を含んでいる。
【００１０】
用語「神経変性状態」とは、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性喪失をもたらす状態を意味する。状態としては、限定されるものではないが、進行性認知症症候群、たとえば、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、筋萎縮；姿勢運動系障害症候群、たとえば、パーキンソン病、多発症状萎縮、トゥレット症候群；進行性失調症症候群、たとえば、大脳皮質運動失調；筋無力症または萎縮がゆっくりと進行する症候群、たとえば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；および老化が挙げられる。
【００１１】
用語「アルツハイマー病」または「ＡＤ」とは、Ａβおよび／または神経原線維変化が中枢神経系の細胞に最終的に蓄積する任意の状態を意味し、その蓄積は、他の疾患または状態、たとえばＣＡＡに起因し得ないものである。ＡＤは、家族性発現の遺伝性であってもよいし、孤発性のものであってもよい。ここで用いる場合、ＡＤは、家族性、孤発性、ならびに、表現型の発現に基づくそれらの中間およびサブグループを含む。さらに、この用語は、ダウン症候群の対象におけるＡβの発生を含む。
【００１２】
用語「孤発性ＡＤ」とは、生涯の後期に、通常約６５歳以降に発症し、ＡＤの家族歴、またはＡＤの危険因子であると同定された遺伝子における変異を伴わないＡＤを意味する。
【００１３】
用語「若年発症」とは、約６５歳以下の人に発症するＡＤを意味する。若年発症としては、限定されるものではないが、家族性ＡＤが挙げられる。
【００１４】
「家族性ＡＤ」とは、プレセニリン−ｌ遺伝子（ＰＳＥＮ−ｌ）、プレセニリン−２遺伝子（ＰＳＥＮ−２）；アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードしている遺伝子、および／またはアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）をコードしている遺伝子における遺伝性突然変異を伴うＡＤを意味する。
【００１５】
「初期段階ＡＤ」とは、中程度の認知低下の症状、たとえば、記憶喪失または混乱を伴うＡＤの段階を意味する。記憶喪失または他の認知低下は顕著であるが、まだ人はそれを補うことができ、自立して機能し続けることができる。この段階は、機能評価別病期（Functional Assessment Staging）（ＦＡＳＴ）分類の第４段階と相関するか、ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎより刊行）、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ、またはＭＭＳＥで定義されている判定基準による軽度ＡＤと相関する。
【００１６】
「軽度認知障害（ＭＣＩ）」は、正常な加齢による認知変化とＡＤの間の移行段階を意味する。ＭＣＩを有する対象には、対象の年齢および教育から予測される認知障害を上回る障害があるが、対象の日常的活動を著しく妨げることはない。ＭＣＩの人は、記憶、言語、または他の精神機能の機能障害をもっていてもよい。ＭＣＩの対象全員がＡＤを発症するとは限らない。ここで用いる場合、ＭＣＩの対象は、ＡＤを発症するリスクがあると考えられる。
【００１７】
ＡＤに関する別の危険因子は、加齢、ＰＳＥＮ−ｌ、ＰＳＥＮ−２、ＡＰＰおよびＡＰＯＥにおける突然変異である。
【００１８】
ここで使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物を意味する。一態様では、対象はヒトである。
【００１９】
ここで使用する「健常対象」は、神経変性状態、たとえばＡＤに相対的なものである。
すなわち、この健常対象はＡＤを発症しておらず、特定の疾患に罹患していると診断されておらず、疾患が進行するリスクはない。
【００２０】
「末梢組織」とは、神経外胚葉に由来しない組織を意味し、具体的に、身体の嗅上皮、舌、皮膚（真皮および／または表皮を含む）、ならびに粘膜層が挙げられる。ここで使用する用語「差次的に発現した」または「差次的発現」とは、２つの試料、対照試料と試験試料における細胞成分の変化の測定を意味する。細胞成分は、対照に比較して実験でアップレギュレートされ得るか、対照試料に比較して実験でダウンレギュレートされ得るかのいずれかである。
【００２１】
ここで使用する場合、「発現レベルの検出」という語句は、発現レベルを定量する方法、ならびに、目的の遺伝子が少しでも発現しているか否かを測定する方法を含む。検出は、定性的であっても定量的であってもよい。一態様では、差次的発現は統計学的に有意である。
【００２２】
ここで使用する場合、「アップレギュレートする」または「アップレギュレーション」とは、任意の機序、たとえば限定されるものではないが、転写、翻訳の増加および／または転写物もしくはタンパク質産物の安定性の増加などを介した、ベースラインまたは対照の状態と比較した遺伝子または遺伝子産物の量または活性の上昇を検出することを意味する。検査細胞における発現の増加は、対照細胞における対応する遺伝子が刺激によって変化しないか、刺激に応答してダウンレギュレートされるかのいずれかの状況を含む。
【００２３】
ここで使用する場合、「ダウンレギュレートする」または「ダウンレギュレーション」とは、任意の機序、たとえば限定されるものではないが、転写、翻訳の減少および／または転写物もしくはタンパク質産物の安定性の低下などを介した、ベースラインまたは対照の状態と比較した遺伝子または遺伝子産物の量または活性の低下を検出することを意味する。検査細胞における発現の低下は、対照細胞における対応する遺伝子が刺激によって変化しないか、刺激に応答してアップレギュレートされるかのいずれかの状況を含む。
【００２４】
「遺伝子発現における変化」とは、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの検出を意味する。
【００２５】
用語「マイクロアレイ」または「核酸マイクロアレイ」とは、基板に結合した複数の核酸のコレクションであって、複数のそれぞれの結合核酸へのハイブリダイゼーションが別々に検出可能なものを意味する。基板は、固体または多孔質であってもよく、平面状または非平面状であってもよく、単一型（unitary）または分散型（distributed）であってもよい。マイクロアレイまたは核酸マイクロアレイは、Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ．），ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（ｓｕｐｐｌ．）：１−６０（１９９９）；Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ．），Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）においてそのように呼ばれるすべての装置を含む。これらのマイクロアレイは、とりわけ、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２０００；９７（４）：１６６５−１６７０で開示されている、複数の核酸が単一型の平面状基板上ではなく、複数のビーズ上に配置されている、基板に結合した複数の核酸のコレクションを含む。
【００２６】
用語「約」および「およそ」とは、一般に、測定の所定の特質または精度で測定された量に対して容認され得る程度の誤差を意味する。典型的には、誤差の程度の例としては、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、好ましくは１０％以内であり、さらに好ましくは５％以内である。あるいは、生物学的系では特に、用語「約」および「およそ」とは、所定の値の絶対値の桁の範囲内にある値を意味し、好ましくは５倍以内、さらに好ましくは２倍以内にある値を意味する。ここで示した数量は、特に言及しない限り、概算値であり、明確に記載されていない場合、用語「約」または「およそ」を意味し得る。
【００２７】
一態様において、本発明の開示は、神経変性状態（ＡＤ）の発症または罹患が疑われる対象由来の細胞（「細胞試料」）の少なくとも１種の刺激による応答での遺伝子発現レベルにおいて、同じ刺激で刺激した後の正常対照細胞（「対照細胞」）における同一遺伝子の発現と比較した差異を検出することによって神経変性状態、たとえばＡＤを診断する方法を提供する。一態様では、対照細胞は、年齢が一致する対照の対象に由来し、細胞試料と同じ刺激で刺激される。
【００２８】
本発明の別の態様では、刺激された細胞試料における、刺激された対照細胞と比較して増加した遺伝子発現（アップレギュレーション）は、神経変性状態（ＡＤ）の存在を示す。他の側面では、刺激された細胞試料における、刺激された対照細胞と比較して減少した遺伝子発現（ダウンレギュレーション）は、神経変性状態（ＡＤ）の存在を示す。第３の側面では、刺激された細胞試料における、刺激された対照細胞と比較して増加した遺伝子発現がないことは、神経変性状態（ＡＤ）の存在を示す。第４の側面では、刺激された細胞試料における、刺激された対照細胞と比較して減少した遺伝子発現がないことは、神経変性状態（ＡＤ）の存在を示す。
【００２９】
別の態様では、本発明の開示は、遺伝子発現における差次的変化を検出することによって初期段階ＡＤを診断する方法を提供する。特定の態様では、ここで記載した方法は、アルツハイマーの病態または認知症を、他の形態の認知症、たとえば、前頭側頭骨変性認知症（たとえば、ピック病、大脳皮質基底核神経節変性症、および前頭側頭骨認知症）、ハンチントン病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、脳血管疾患、頭部外傷、ならびに物質乱用に付随するものと区別するために用いることができる。
【００３０】
さらなる態様では、本発明の開示は、同一患者から別の機会に採取した２種以上の試料に本方法を適用することによって、疾患の進行を評価する方法を提供する。この態様は、第１の試料の採取後で次の試料の採取前に投与された任意のＡＤ治療の効果を評価するために用いることもできる。例としての評価可能なＡＤ治療としては、Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン）、Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドナパジル）およびＲａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）が挙げられる。
【００３１】
本発明の開示は、ここで開示した方法に従って、遺伝子の差次的発現に基づいて試験薬剤の効果を評価することによって、ＡＤの治療または予防のための治療用物質をスクリーニングする方法をさらに提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明の開示は、ここで開示した診断方法を実施するためのキットを提供する。表１は、対照細胞と比較してＡＤ細胞においてアップレギュレートされることが確認された遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を提供する。表２は、対照細胞と比較してＡＤ細胞においてダウンレギュレートされることが確認された遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を提供する。
【００３３】
たとえば、ＴＮＦＲＳＦ−１９またはＴＮＦα−１９受容体遺伝子は、ここでは、ＢＤマトリゲル（商標）による刺激の際にＡＤ細胞においてアップレギュレートされる。ＴＮＦＲＳＦ−１９（ＴＲＯＹ、ＴＡＪまたはＴＲＡＤＥとしても知られている）は、ニューロンで発現され、軸索成長に関与するＴＮＦファミリーのオーファン受容体である。これは、細胞外ドメインおよび伸長した細胞質ドメインを有する３４８アミノ酸の推定上の膜結合タンパク質である。ＴＮＦＲＳＦ１９の遺伝子記号情報を表４に記載する。
【００３４】
ＴＮＦＲＳＦ−１９は、ＪＮＫカスケード、アポトーシス、Ｉ−κＢキナーゼ／ＮＦ−κＢカスケード腫瘍壊死因子媒介性シグナル経路の制御に関連している。他のＴＮＦ受容体とは異なり、ＴＮＦＲＳＦ−１９は、免疫応答経路で機能を果たしているようには見えない。これまでのところ、ＡＤに関与する新しい細胞経路を同定するための刺激誘発性全ゲノム発現手法の可能性を示す、ＴＮＦＲＳＦ−１９アップレギュレーションとＡＤとの関係については文献で報告されていない。
【００３５】
別の態様では、ここで開示した診断方法は、表１および／または表２に示した少なくとも１種の遺伝子の対照試料と細胞試料における差次的発現を検出することを含む。
【００３６】
別の態様では、ここで開示した診断方法は、表１および／または表２に示した少なくとも２種の遺伝子の対照試料と細胞試料における差次的発現を検出することを含む。
【００３７】
別の態様では、ここで開示した診断方法は、表１および／または表２に示した少なくとも５種の遺伝子の対照試料と細胞試料における差次的発現を検出することを含む。
【００３８】
別の態様では、ここで開示した診断方法は、表１および／または表２に示した少なくとも１０種の遺伝子の対照試料と細胞試料における差次的発現を検出することを含む。
【００３９】
別の態様では、ここで開示した診断方法は、表１および／または表２に示した少なくとも１５種の遺伝子の対照試料と細胞試料における差次的発現を検出することを含む。
【００４０】
生物学的試料
本発明の開示は、神経変性状態の進行のリスクの疑いがある（たとえば、ＡＤまたはＡＤ罹患の疑いがある）対象由来の細胞を使用する神経変性状態、たとえば、アルツハイマー病を診断するための方法を提供する。ここで開示した方法では、対象から採取される細胞は、任意の生細胞を含む。一態様では、細胞は末梢組織由来であり、すなわち、非神経組織由来である。さらなる態様では、組織は皮膚、血液、粘膜、または脳脊髄液由来である。
【００４１】
別の態様では、細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、またはリンパ球を含む造血性細胞である。さらなる態様では、細胞は皮膚上皮細胞、皮膚線維芽細胞、血液細胞または頬粘膜細胞である。細胞は、新鮮細胞、培養細胞、または分析前に凍結した細胞であってもよい。一態様では、パンチ皮膚生検を用いて対象由来の皮膚線維芽細胞を得ることができる。皮膚繊維芽細胞試料はまた、外科用の刃を使用することによって対象から得てもよい。これらの線維芽細胞は、直接分析されるか、または細胞培養条件に導入される。別の態様では、細胞はレーザーキャプチャー顕微解剖を用いた切除片から単離され、同一タイプの細胞の均質群を取得する。
【００４２】
刺激
いくつかの態様では、ここで開示した少なくとも１種の刺激はタンパク質混合物、多糖混合物、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子、Ａβオリゴマー（ＡＳＰＤ）、薬剤、およびそれらの組み合わせから選択される。一態様では、少なくとも１種の刺激は２種以上の刺激を含み、２種以上の刺激は、細胞試料と同時にまたは経時的に接触される。
【００４３】
少なくとも１種の刺激は、タンパク質および／または多糖混合物、たとえば、ゼラチン状タンパク質および／または多糖混合物を含む。たとえば、刺激は、ＡＤに特異的な差次的遺伝子発現を誘導するタンパク質および／または多糖混合物中でＡＤ細胞、ＡＣ細胞または非ＡＤＤ細胞を培養することによって誘導することができる。
【００４４】
いくつかの態様では、タンパク質および／または多糖混合物は、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、ヘパリンサルフェートプロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、増殖因子、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、タンパク質および／または多糖混合物は少なくとも１種の基底膜タンパク質を含む。
【００４５】
いくつかの態様では、タンパク質および／または多糖混合物は調製物を含む。いくつかの態様では、調製物は可溶化される。少なくとも１つの態様では、調製物は、腫瘍または癌細胞、たとえば、エンジェルブレス−ホーム−スワーン（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出されており、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質が豊富である。このような調製物は、たとえば、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパランサルフェートプロテオグリカン、およびエンタクチン／ニドゲンの少なくとも１つを含んでいてもよい。本発明の開示に適した非限定的な例はＢＤマトリゲル（商標）であり、これはＥＨＳマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物に対する商品名（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。たとえば、ＢＤマトリゲル（商標）の成分を表３に示す。この混合物は多くの組織で見出される複合細胞外環境に類似しており、細胞培養用基質として使用してもよい。ＢＤマトリゲル（商標）は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパランサルフェートプロテオグリカン、およびエンタクチン１を含む。３７℃で、ＢＤマトリゲル（商標）は重合し、哺乳動物細胞の基底膜に類似する生物学的に活性なマトリックス材料を生成する。
【００４６】
本発明の開示のいくつかの態様では、調製物は、ＴＧＦ−β、上皮成長因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／または、腫瘍内に自然に発生していても、していなくてもよい他の増殖因子をさらに含む。いくつかの態様では、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／または他の増殖因子は、腫瘍、たとえば、ＥＨＳマウス肉腫腫瘍内に自然に発生する。ＢＤマトリゲル（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ）は、たとえば、より厳密に定義されたゲル基質の基底膜調製物を必要とする用途に適していてもよい。いくつかの態様では、少なくとも１種の刺激はＢＤマトリゲル（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄよりもより一層明確に定義されている基底膜調製物である。
【００４７】
調製物は、正常と形質転換の両方の足場依存性上皮および他の細胞型が付着および分化するための効果的なＥＣＭタンパク質調製物を含んでいてもよい。例としての細胞型としては、限定されるものではないが、ニューロン、肝細胞、セルトリ細胞、ニワトリレンズ、および血管内皮細胞が挙げられる。ＥＣＭタンパク質調製物は、成体ラット肝細胞における遺伝子発現ならびにマウスおよびヒト乳腺上皮細胞における三次元培養に影響を及ぼしていてもよい。調製物は、たとえば、腫瘍細胞浸潤アッセイ用の基質、インビボでの末梢神経再生における支持体として供給されてもよく、かつ／またはインビトロとインビボの両方での血管形成研究用の基質を提供してもよい。ＥＣＭタンパク質はまた、インビボでの免疫不全マウス（immunosupressed mice）におけるヒト腫瘍の増殖を支援していてもよい。
【００４８】
本発明の開示のいくつかの態様では、ある量の冷蔵されたＥＣＭタンパク質は組織培養実験器具上に分注される。ここで使用されている用語「冷蔵」とは、室温未満の温度、たとえば、約１５℃未満、約１０℃未満、約５℃未満、たとえば、約４℃の温度を意味する。高い温度でインキュベートした場合、ＥＣＭタンパク質は自己組織化して実験器具の表面を被覆する薄膜を生成してもよい。ここで使用されている用語「高い」とは、室温より高い温度、たとえば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃よりも高い温度、たとえば、約３７℃の温度であって、ヒトの体温のおよその平均温度であることを意味する。
【００４９】
いくつかの態様では、より多くの容量のＥＣＭタンパク質を用いて、細胞培養用の厚い三次元ゲルを生成する。たとえば、厚いゲルは、ゲルの表面から内部へ移動するように細胞を誘導するのに有用であってもよい。いくつかの態様では、この移動挙動は、腫瘍細胞の転移に関するモデルとして役立ち得る。いくつかの態様では、培養培地は、約１．０ｍｍ〜約２．０ｍｍの厚さ、たとえば、約１．５ｍｍまたは約１．８ｍｍの層を含む。培養培地の量はまた、関係式のＶ＝（πｒ2）ｈに従ってウェルプレート内容積（Ｖ）として表わすことができ、式中、ｈは層の厚さであり、ｒは半径である。いくつかの態様では、たとえば、培養培地の体積は、約４００μｌ〜約８００μｌの範囲であってもよく、たとえば、ｒ＝１１．０５ミリメートルで約７００μｌである。
【００５０】
いくつかの態様では、ここで開示した少なくとも１種の刺激はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子を含む。ＰＫＣ活性化因子は当技術分野で公知であり、たとえば、限定されるものではないが、ブラジキニン、ホルボールエステル、たとえば、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、ホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）、ホルボール１２，１３−ジデカノエート（ＰＤＤ）、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジンＦ２ｕおよびバソプレシンが挙げられる。他のＰＫＣ活性化因子としては、１，２−ｓｎ立体配置に様々な脂肪酸を有するジアシルグリセロールを含んでいる、天然および非天然のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む。
特定の態様では、ＤＡＧは不飽和脂肪酸を含む。一態様では、ＰＫＣ活性化因子は大環状ラクトンであり、限定されるものではないが、ブリオスタチン化合物のクラスおよびネリスタチン化合物のクラスのものが挙げられる。他の態様では、ＰＫＣ活性化因子はベンゾラクタムである。さらなる態様では、ＰＫＣ活性化因子はピロリジノンである。特定の態様では、大環状ラクトンはブリオスタチンである。さらなる特定の態様では、ブリオスタチンはブリオスタチン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、または−１８である。
【００５１】
いくつかの態様では、ここで開示した少なくとも１種の刺激は、ブリオスタチンの類似体を含む。ブリオスタチンの類似体は、一般にブリオログと称され、本発明の方法における使用に適する特定のあるクラスのＰＫＣ活性化因子である。ブリオログは構造的に類似しているが、ＰＫＣに対する親和性は大きく異なる（０．２５ｎＭ〜１０μＭ）。ブリオスタチン−１は、２つのピラン環と１つの６員環アセタールとを有するが、ほとんどのブリオログにおいては、ブリオスタチン−１のピランの１つは、第２の６員アセタール環で置き換えられている。この修飾によって、ブリオログの安定性はブリオスタチン−１と比べて、たとえば、強酸中または塩基中の両方で低下するが、生理学的ｐＨではそれほど顕著ではない。ブリオログはまた、ブリオスタチン−１（９８８）と比べて分子量が小さく（約６００〜７５５の範囲）、その特性によって血液脳関門を越える輸送が促進される。
様々なブリオログは、たとえば、米国特許出願公開第２００８−００５８３９６Ａ１号として公開されている、米国特許出願第１１／８０２７２３号に開示されている。
【００５２】
他のクラスのＰＫＣ活性化因子は多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）である。これらの化合物は神経系の必須成分であり、数多くの健康上の利点を有する。一般的に、ＰＵＦＡは、膜流動性を増加させ、酸化して高度の生理活性を有する産物となり、炎症やホルモンの様々な作用を生じ、急速に分解され代謝される。炎症性の作用と迅速な代謝は、おそらくそれらの活性のある炭素−炭素二重結合の結果であろう。これらの化合物は、おそらくはＰＳ部位の結合によるＰＫＣの強力な活性化因子であり得る。
【００５３】
一態様では、ＰＵＦＡはリノール酸（下記参照）から選択される。
【化１】
2018046826.tif 000003
【００５４】
別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ誘導体、特にシクロプロパン誘導体である。特定のシクロプロパン化ＰＵＦＡ、たとえば、ＤＣＰＬＡ（すなわち、両方の二重結合にシクロプロパンを有するリノール酸）は、ＰＫＣ−εを選択的に活性化し得る。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，２８４（５０）：３４５１４−３４５２１を参照されたい。さらに米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５Ａ１を参照されたい。その親分子と同様に、ＰＵＦＡ誘導体は、ＰＳ部位に結合することによりＰＫＣを活性化すると考えられる。
【００５５】
シクロプロパン化脂肪酸は低い毒性を示し、脳に容易に取り込まれ、そこで、それらは長い半減期（ｔ1/2）を示す。二重結合のシクロプロパン環への変換は、酸化と炎症性の副生成物への代謝を防止し、より大きなＰＫＣ活性化をもたらし得る剛性のより高いＵ字型３Ｄ構造を生成する。さらに、このＵ字型は、より大きなアイソフォーム特異性を生じ得る。たとえば、シクロプロパン化脂肪酸は、ＰＫＣ−εの強力かつ選択的な活性化を示し得る。
【００５６】
シクロプロパン化のシモンズスミス反応は、二重結合をシクロプロパン基に変換する効率的な方法である。この反応は、カルベノイド中間体を介して作用し、親分子のシス立体構造を維持する。したがって、ＰＫＣ活性化特性が増強されるとともに、他の分子、たとえば生物反応性のエイコサノイド、トロンボキサン、またはプロスタグランジンへの代謝が防止される。
【００５７】
ＰＫＣ活性化脂肪酸の一つのクラスはオメガ−３ＰＵＦＡ誘導体である。一態様では、オメガ−３ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸、シクロプロパン化ルメレン酸、シクロプロパン化パリナリン酸、およびシクロプロパン化リノレン酸（ＣＰ３形態は下記参照）から選択される。
【化２】
2018046826.tif 000004
【００５８】
別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸はオメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。一態様では、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化リノール酸（「ＤＣＰＬＡ」、ＣＰ２形態は下記参照）、
【化３】
2018046826.tif 000005
【００５９】
シクロプロパン化アリキドン酸（arichidonic acid）、シクロプロパン化エイコサジエン酸、シクロプロパン化ジホモ−ガンマ−リノレン酸、シクロプロパン化ドコサジエン酸、シクロプロパン化アドレン酸、シクロプロパン化カレンド酸、シクロプロパン化ドコサペンタエン酸、シクロプロパン化ジャカル酸、シクロプロパン化ピノレン酸、シクロプロパン化ポドカルプ酸、シクロプロパン化テトラコサテトラエン酸（tetracosatetranoic acid）、およびシクロプロパン化テトラコサペンタエン酸から選択される。
【００６０】
ベルノール酸は天然に存在する化合物である。しかし、これはリノール酸のエポキシル誘導体であり、したがって、ここで使用される場合、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体とみなされる。ベルノール酸に加えて、シクロプロパン化ベルノール酸（下記参照）はオメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。
【化４】
2018046826.tif 000006
【００６１】
別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体である。一態様では、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化エイコセン酸、シクロプロパン化ミード酸、シクロプロパン化エルカ酸、およびシクロプロパン化ネルボン酸から選択される。
【００６２】
さらに別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸（「ＭＵＦＡ」）誘導体である。一態様では、ＭＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化オレイン酸（下記参照）
【化５】
2018046826.tif 000007
【００６３】
と、シクロプロパン化エライジン酸（下記参照）
【化６】
2018046826.tif 000008
【００６４】
から選択される。
【００６５】
ＰＫＣ活性化ＭＵＦＡ誘導体は、エポキシ化化合物、たとえば、トランス−９，１０−エポキシステアリン酸（下記参照）を含む。
【化７】
2018046826.tif 000009
【００６６】
別のクラスのＰＫＣ活性化脂肪酸はオメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体である。一態様では、オメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ルーメン酸、シクロプロパン化アルファエロステアリン酸（alphaelostearic acid）、シクロプロパン化カタルプ酸、シクロプロパン化プニカ酸から選択される。
【００６７】
別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、脂肪酸アルコールおよびその誘導体、たとえば、シクロプロパン化ＰＵＦＡとＭＵＦＡ脂肪アルコールである。これらのアルコールは、ＰＳ部位に結合することによってＰＫＣを活性化すると考えられる。これらのアルコールは、異なるクラスの脂肪酸から誘導することができる。
【００６８】
一実施態様では、ＰＫＣ活性化脂肪アルコールは、特に脂肪酸が上記で示されている、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、およびＭＵＦＡから誘導される。一態様では、脂肪アルコールは、シクロプロパン化リノレニルアルコール（ＣＰ３形態は下記参照）、
【化８】
2018046826.tif 000010
【００６９】
シクロプロパン化リノレイルアルコール（ＣＰ２形態は下記参照）、
【化９】
2018046826.tif 000011
【００７０】
シクロプロパン化エライジンアルコール（下記参照）、
【化１０】
2018046826.tif 000012
【００７１】
シクロプロパン化ＤＣＰＬＡアルコール、シクロプロパン化オレイルアルコールから選択される。
【００７２】
別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、脂肪酸エステルおよびその誘導体、たとえば、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪酸エステルである。一態様では、シクロプロパン化脂肪酸エステルは、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、オメガ−５ＰＵＦＡ、オメガ−７ＰＵＦＡから誘導される。これらの化合物は、ＰＳ部位での結合を介してＰＫＣを活性化すると考えられる。このようなエステルの利点の１つは、それらが、一般に、その遊離酸対応物よりも安定的であると考えられることである。
【００７３】
一態様では、オメガ−３ＰＵＦＡから誘導されるＰＫＣ活性化脂肪酸エステルは、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸メチルエステル（ＣＰ５形態は下記参照）
【化１１】
2018046826.tif 000013
【００７４】
およびシクロプロパン化リノレン酸メチルエステル（ＣＰ３形態は下記参照）
【化１２】
2018046826.tif 000014
【００７５】
から選択される。
【００７６】
別の態様では、オメガ−３ＰＵＦＡエステルは、ＤＨＡ−ＣＰ６と脂肪族および芳香族アルコールのエステルから選択される。一態様では、エステルはシクロプロパン化ドコサヘキサエン酸メチルエステル（ＣＰ６形態は下記参照）である。
【化１３】
2018046826.tif 000015
【００７７】
ＤＨＡ−ＣＰ６は、実際には、１０ｎＭの濃度で有効であることが示されていた。たとえば、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５号を参照されたい。
【００７８】
一態様では、オメガ−６ＰＵＦＡから誘導されるＰＫＣ活性化脂肪酸エステルは、シクロプロパン化アラキドン酸メチルエステル（ＣＰ４形態は下記参照）、
【化１４】
2018046826.tif 000016
【００７９】
シクロプロパン化ベルノール酸メチルエステル（ＣＰ１形態は下記参照）、
【化１５】
2018046826.tif 000017
【００８０】
およびベルノール酸メチルエステル（下記参照）
【化１６】
2018046826.tif 000018
【００８１】
から選択される。
【００８２】
特に興味深い１つのクラスのエステルはＤＣＰＬＡ（ＣＰ６−リノール酸）誘導体である。一態様では、ＤＣＰＬＡのエステルはアルキルエステルである。アルキル基は、一態様では、メチル、エチル、プロピル（たとえばイソプロピル）、およびブチル（たとえばｔｅｒｔ−ブチル）エステルから選択されていてもよい。メチルエステル形態のＤＣＰＬＡ（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）を下記に示す。
【化１７】
2018046826.tif 000019
【００８３】
別の態様では、ＤＣＰＬＡのエステルは、ベンジルアルコールから誘導される（下記に示す非置換ベンジルアルコールエステル）。さらに別の態様では、ＤＣＰＬＡのエステルは、芳香族アルコール、たとえば、天然酸化防止剤として用いられるフェノールおよび学習促進能力（pro-learning ability）を有する天然フェノールから誘導される。いくつかの特定の例としては、エストラジオール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レスベラトロール、ポリヒドロキシル化芳香族化合物、およびクルクミンが挙げられる。
【化１８】
2018046826.tif 000020
【００８４】
別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、シクロプロパン化ＭＵＦＡから誘導される脂肪酸エステルである。一態様では、シクロプロパン化ＭＵＦＡエステルは、シクロプロパン化エライジン酸メチルエステル（下記参照）
【化１９】
2018046826.tif 000021
【００８５】
およびシクロプロパン化オレイン酸メチルエステル（下記参照）
【化２０】
2018046826.tif 000022
【００８６】
から選択される。
【００８７】
別のクラスのＰＫＣ活性化因子は、ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、およびそれらの誘導体から誘導されるサルフェートおよびホスフェートである。一態様では、サルフェートはＤＣＰＬＡサルフェートおよびＤＨＡサルフェート（ＣＰ６形態は下記参照）から選択される。
【化２１】
2018046826.tif 000023
【００８８】
一態様では、ホスフェートはＤＣＰＬＡホスフェートおよびＤＨＡホスフェート（ＣＰ６形態は下記参照）から選択される。
【化２２】
2018046826.tif 000024
【００８９】
ＰＵＦＡとＭＵＦＡ誘導体のさらなる態様は米国特許第８１６３８００号に開示されており、これは参照によりここに援用するものとする。
【００９０】
いくつかの態様では、ここで開示されている少なくとも１種の刺激は、Ａβオリゴマー（アミロスフェロイド（amylosheriod）、ＡＳＰＤ）を含む。たとえば、Ａβオリゴマーは、＞１００ｋＤａの分子量を有することができる。これらのオリゴマーは非常に有毒であることが報告されており、ＡＤの脳において発見されたもの（Ｎｏｕｇｕｃｈｉら、２００９）との類似性を有していた。
【００９１】
いくつかの態様では、ここで開示されている少なくとも１種の刺激は薬剤を含む。薬剤としては、限定されるものではないが、ブラジキニン、インスリン、ホルボールエステル（phobol ester）、リゾホスファチジルコリン、リポ多糖、アントラサイクリンダウノルビシン（anthracycline dannorubicin）、およびバナジルサルフェートが挙げられる。
【００９２】
遺伝子発現プロファイリング
遺伝子発現は、ロースループット法、たとえば、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＶＱ−ＰＣＲ）とリアルタイムＰＣＲ、およびハイスループット法、たとえば、マイクロアレイおよび差次的遺伝子発現検出用のＳＡＧＥの両方によって測定することができる。一態様では、検出は、、自動的な、マイクロアレイ技術のようにハイスループット設定でコンピュータ化された機器を用いて行われる。
【００９３】
一態様では、本発明の開示の方法は、マイクロＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを含む、ｍＲＮＡのような遺伝子転写物を検出することを提供する。転写物は、遺伝子のコーディング領域と非コーディング領域の両方からのものとすることができる。転写物は、細胞内インサイチューで検出できるか、または、細胞から抽出された精製形態で検出できる。
特定の態様では、核酸は細胞から単離精製され、次いで、遺伝子発現アッセイにおいて使用される。
【００９４】
別の態様では、本発明の開示の方法は、遺伝子転写物から発現される、タンパク質産物またはそれらの一部を検出することを提供する。タンパク質に基づくアッセイとしては、ロースループット方法、たとえば、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ、ならびにハイスループットのタンパク質マイクロアレイが挙げられる。
【００９５】
さらなる態様では、本発明の開示の方法は、検出されたタンパク質産物の活性または活性化状態、たとえば、所定のタンパク質のリン酸化を検出することをさらに含む。
【００９６】
一態様では、２つの異なる細胞由来の遺伝子転写物（たとえば、ｃＤＮＡ）を、マイクロアレイ上の公知の遺伝子転写物の結合部位にハイブリダイズするが、その１つは少なくとも１種の刺激で刺激された検査細胞であり、もう１つは、少なくとも１種の刺激で、好ましくは同じ刺激で刺激された、好ましくは同一細胞型の対照細胞である。２つのそれぞれの細胞型に由来する核酸は別々に標識し、それらを区別できるようにする。差次的に発現される転写物を評価するためのマイクロアレイの使用はよく知られている。たとえば、米国特許第６，９７３，３８８号を参照されたい。この技術は、典型的には、公知のｃＤＮＡ転写物を含むマイクロアレイの調製または購入、検査細胞からのＲＮＡの抽出および標識化、試験ＲＮＡのアレイへのハイブリダイズ、シグナルの検出および可視化、結果に基づく統計学的分析の実施、ならびに、任意に、ロースループット技術を使用するマイクロアレイの結果の確認を含む。
【００９７】
予め作製されているｃＤＮＡマイクロアレイは、たとえば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｌｐｈａＧｅｎｅ（登録商標）（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から市販されている。これらは、全ゲノムアレイおよび公知の遺伝子の標的サブセットを含む。
【００９８】
別の態様では、遺伝子の差次的発現は、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）を用いて検出される。ＳＡＧＥは、特異的ｍＲＮＡ転写物のごく一部が発現される回数を定量的に検出する（タグ）。ＳＡＧＥのアウトプットは、短い配列タグのリストとそれが観察される回数である。マイクロアレイハイブリダイゼーションと遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）技術の間の主たる差異点は、後者が解析される配列を事前に知っておく必要がないということである。ＳＡＧＥは、配列決定に基づく遺伝子発現プロファイリング技術である。
【００９９】
一態様では、細胞試料は、１種以上の遺伝子の発現レベルにおける、対照細胞での同一遺伝子または遺伝子群の発現レベルと比較して確認可能な差異を示す。たとえば、差次的発現は定量的である。さらなる例では、検査細胞で検出された遺伝子発現レベルは、対照細胞と比較して約１倍、２倍、５倍、１０倍および１００倍アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている。
【０１００】
本発明の開示のいくつかの態様では、遺伝子の発現レベルは、培養後約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、または約７２時間、あるいはそれ以上で測定することができる。たとえば、図１は、ＢＤマトリゲル（商標）で刺激した４８時間後のＡＤに罹患している対象由来の線維芽細胞（左側の棒）と、年齢を平均した対照対象（「ＡＣ」）由来の線維芽細胞（右側の棒）における腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１９（ＴＮＦＲＳＦ−１９）遺伝子の発現レベル（マイクロアレイデータ）を示す。
【０１０１】
治療のためのスクリーニング方法
さらなる側面では、この開示は、ここで開示した診断試験を使用して神経変性状態（ＡＤ）を治療または予防するための治療用物質をスクリーニングする方法に関する。この態様によれば、ここで開示した遺伝子発現において確認された差異を逆転または改善する化合物は、神経変性状態（ＡＤ）の治療または予防に有用である可能性のある物質として同定および選択される。
【０１０２】
一態様では、スクリーニング方法は、ＡＤであると診断された対象由来の細胞を、一定時間、試験化合物と接触させるステップと、続いて、細胞をここで開示した少なくとも１種の刺激と接触させるステップと、試験化合物が、本発明の開示の方法によって同定された遺伝子の差次的発現を、正常な対象由来の対照細胞で確認されたレベルの方へ変化させたか否かを検出するステップとを含む。
【０１０３】
一態様では、試験化合物と接触させる細胞は、本発明の開示の方法に従って神経変性状態（ＡＤ）と診断された対象に由来する。
【０１０４】
キット
この開示はまた、ここで開示した診断方法を実施するのに有用な製品を含むキットに関する。キットはまた、１種以上の生検、たとえば、パンチ皮膚生検の実施に必要な器具、バッファーおよび保存容器を含んでいてもよい。キットは、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、アレイと一緒に使用するための試薬、シグナル検出およびアレイ処理器具、遺伝子発現データベースおよび解析およびデータベース管理ソフトウェアを含むことができる。
キットはまた、神経変性状態（ＡＤ）診断に用いられる差次的発現遺伝子の同定に関する説明書を含んでいてもよい。
【０１０５】
上述したように、キットは、単一の診断試験、またはここで開示した試験の任意の組み合わせを含んでいてもよい。ここで開示した対照細胞と神経変性状態（ＡＤ）細胞との間のすべての差異は、神経変性状態（ＡＤ）診断用の臨床試験および診断キットに関する基礎を築くとともに、ここで開示した神経変性状態（ＡＤ）を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法の基礎を築く。
【０１０６】
組み合わせ診断方法
ここで開示した診断方法は、任意の別の診断方法と組み合わせて使用してもよいと思われる。例示的な方法としては、物理的および神経学的評価；バイオマーカー検出；および構造的（ＭＲＩ、ＣＴ）および機能的脳画像（ＰＥＴ；ＦＤＧ−ＰＥＴ）が挙げられる。
【０１０７】
一例として、本発明の開示の方法は、家族性ＡＤに関与することが知られている遺伝子の突然変異の評価と組み合わせて使用することができる。ＡＤを診断するさらなる方法は、Ａｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，０８０，５８２号および同第６，３００，０８５号に開示されており、これらの方法は、ＡＤ患者の細胞中のカリウムイオンチャネルの欠如、ＡＤ患者の細胞中で欠如しているカリウムイオンチャネルに特異的なカリウムチャネルブロッカーへの応答における、ＡＤおよび非ＡＤ細胞中の細胞内カルシウムイオン濃縮の差異、ならびに、細胞内カルシウム放出活性化因子、たとえば、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）の活性化因子への応答における、ＡＤ細胞と非ＡＤ細胞の間の差異を検出する。さらなる診断方法はＡｌｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第２００７／０４７０２９号に開示されているが、これは、ＰＫＣ活性化因子で刺激した後の細胞中の特異的リン酸化されたＭＡＰキナーゼタンパク質（Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２）の割合における変化を検出することによって、対象におけるＡＤを診断することを目的とする。Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．  ２００２  Ｏｃｔ；１１（Ｉ）：１６６−８３を参照されたい。
【０１０８】
［実施例］
例１
３名のＡＤと３名の年齢が一致する対照（ＡＣ）の皮膚繊維芽細胞の試料をこの遺伝子発現試験で使用した。年齢が一致する対照由来の繊維芽細胞は非ＡＤ認知症患者由来の繊維芽細胞と同様に、４８時間後に小さくしかもかなりの数のコロニーを形成するが、ＡＤ患者由来の繊維芽細胞は大きく数の少ないコロニーを形成する。表１および２に示した多数の遺伝子は、ＢＤマトリゲル（商標）により刺激した際に、ＡＤ細胞でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることが判明した。図１は、ＢＤマトリゲル（商標）で刺激した４８時間後の、ＡＤに罹患している対象由来の繊維芽細胞（左側の棒）と、年齢を平均した対照対象（「ＡＣ」）由来の繊維芽細胞（右側の棒）における、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１９（ＴＮＦＲＳＦ−１９）遺伝子の発現レベル（マイクロアレイデータ）を示す。示したように、ＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子はＡＣの事例と比べて、ＡＤの事例において刺激されている。
【０１０９】
図２は、４８時間ＢＤマトリゲル（商標）により刺激したか、ＢＤマトリゲル（商標）による刺激を行わなかった、ＡＤおよびＡＣ対象におけるＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の発現レベル（ＰＣＲ分析による）を示す。データは、各群につき、３名の年齢が一致する対照によって標準化した。ＡＣ１からＡＣ６で示した棒とＡＤ１からＡＤ６で示した棒は、ＡＣ対象またはＡＤ対象由来の新たに採取したものではない細胞から得られたデータを表わす。００２５  Ｍ３９  ＡＣ、００１９  Ｍ３３  ＡＣ、００５５  Ｍ５５  ＡＣ、および００６５  Ｍ６９  ＡＤで示した棒は、新たに採取した生検繊維芽細胞から得られたデータを表わす。
【０１１０】
図３は、４８時間ＢＤマトリゲル（商標）により刺激した、ＡＤおよびＡＣ対象におけるＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の発現レベル（ＰＣＲ分析による）を示す。データはＰＣＲによる各ゲルによって標準化した。ＡＣ１からＡＣ６により示した棒と、ＡＤ１からＡＤ６で示した棒は、ＡＣ対象またはＡＤ対象由来の新たに採取したものでない細胞から得られたデータを表わす。００２５  Ｍ３９  ＡＣ、００１９  Ｍ３３  ＡＣ、００５５  Ｍ５５  ＡＣ、および００６５  Ｍ６９  ＡＤで示した棒は、新たに採取した生検繊維芽細胞から得られたデータを表わす。
【０１１１】
図４は、正常および癌細胞におけるＴＮＦＲＳＦ−１９遺伝子の組織特異的発現を示す。
【０１１２】
ＢＤマトリゲル（商標）基底膜の調製：ＢＤマトリゲル  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する３０分前に氷上で４℃にて溶かした。すべてのピペット、チップおよび１２ウェル培養プレートは、使用前に４℃まで予備冷却した。ＢＤマトリゲル（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄを、冷却ピペットを使用して均質に混合した。ゲルの固体状凝集物が混合物内に含まれていないようにすべきである。１２ウェル培養プレートを使用前に３０分間氷上に維持し、１ウェル当たり７００μＬのＢＤマトリゲル（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄを加えた。細胞培養プレート表面上のゲルの均質性を倒立顕微鏡下で確認された。いかなる泡も回避されるべきである。１２ウェルプレートを３０分間３７℃に置いた。皮膚繊維芽細胞の細胞懸濁液をＢＤマトリゲル（商標）Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄの最上部に加えた。細胞の密度は約５０細胞／ｍｍ３に調節した。
【０１１３】
ＢＤマトリゲル（商標）マトリックスからの細胞の回収：細胞凝集物は以下のようにして回収した。ＢＤセルリカバリーソリューション（BD Cell Recovery Solution）（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＢＤマトリゲル（商標）マトリックスから細胞を回収した。まず、細胞培養培地を除去し、冷却ＰＢＳでＢＤマトリゲル（商標）マトリックス上の細胞層を３回洗浄した。３５ｍｍ皿当たりリカバリーソリューション２ｍＬであった。細胞凝集物／ゲル層を、氷上に置いた氷冷の５０ｍｌコニカルチューブへこすり取った。すべての物質を皿から回収するため、ＢＤセルリカバリーソリューション２ｍＬで１回すすぎ、チューブに移した。ＢＤマトリゲル（商標）は、数回チューブを前後に振動させることにより完全に溶解させ、１時間、またはＢＤマトリゲル（商標）が完全溶解するまで氷上に維持した。氷上に約３０分置いた後、細胞はチューブの底に沈殿した。これはゲルが溶解されたことを示す。細胞凝集物は、４℃で５分間２００〜３００×Ｇで遠心分離にかけることによってチューブの底のペレットとして回収した。細胞ペレットは、氷冷ＰＢＳ中に穏やかに再懸濁し、同一条件で遠心分離にかけることによって洗浄した。
ＲＮＡを標準法に従って細胞凝集物から分離した。
【０１１４】
遺伝子発現プロファイリング：マイクロアレイ分析は、Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＯｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）ｖ５（Ｐｈａｌａｎｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を使用して行った。ＲＮＡの品質および保全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）と、Ａ２６０／Ａ２８０の吸光度を利用して測定した。ＲＩＮが＞７．０であり、Ａ２６０／２８０吸光度比が＞１．８である高品質ＲＮＡだけをさらなる実験操作に利用した。ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換し、アミノ−アリルＵＴＰが含まれているインビトロでの転写を使用して増幅させ、ａＲＮＡ産物をＣｙ５（商標）ＮＨＳエステル（ＧＥＨ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と引き続き結合させた。断片化ａＲＮＡは、５０℃で終夜、１×ＯｎｅＡｒｒａｙハイブリダイゼーションバッファー（Ｐｈａｌａｎｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．０１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を用いるＨｙｂＢａｇ混合系を使用して、０．０２５ｍｇ／ｍｌの標識ターゲット濃度でハイブリダイズさせた。
【０１１５】
ハイブリダイゼーション後、アレイはＯｎｅＡｒｒａｙプロトコルに従って洗浄した。
各マイクロアレイの未加工の強度シグナルは、ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ（商標）ソフトウェアを使用して測定される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（商標）Ａｘｏｎ  ４１００Ａスキャナーを使用して取り込み、ＧＰＲフォーマットに保存した。次いで、それぞれの組の実験におけるすべてのマイクロアレイから得たデータを分析用のＲｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ）に送った。試験は、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ専用のモデリング技術を使用し、技術的な反復測定を組み合わせ、統計分析を行うことにより実施した。
【０１１６】
結果：ＢＤマトリゲル（商標）マトリックスでのインキュベーション４８時間の凝集物形成後に差次的に発現されたすべての遺伝子を表１および２に示す。
【表１】
2018046826.tif 000025
【０１１７】
表１に示した＃遺伝子はＥｒｋと関係がある。
【表２】
2018046826.tif 000026
【０１１８】
＊  表１および２に示したＰ値は３つのＡＤおよび３つのＡＣの事例から計算される。
【表３−１】
2018046826.tif 000027
【表３−２】
2018046826.tif 000028
【表３−３】
2018046826.tif 000029
【表３−４】
2018046826.tif 000030
【表４】
2018046826.tif 000031
【０１１９】
本発明の別の態様は、ここで開示した本発明の詳細および実施を考慮すれば当業者には明らかであろう。この詳細および例は単なる例示として考え、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されているものとする。
【図１】
2018046826.tif 000032
【図２】
2018046826.tif 000033
【図３】
2018046826.tif 000034
【図４】
2018046826.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月1日(2017.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、
対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
本発明の別の態様は、ここで開示した本発明の詳細および実施を考慮すれば当業者には明らかであろう。この詳細および例は単なる例示として考え、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されているものとする。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、
対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することと
を含む、方法。
［２］
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと；
対象が神経変性状態を有するか否かを決定することと
をさらに含み、
少なくとも１種の刺激による対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、対象が神経変性状態を有することを示す、
［１］に記載の方法。
［３］
少なくとも１種の刺激がタンパク質混合物、多糖混合物、プロテインキナーゼＣ活性化因子、Ａβオリゴマー、薬剤、およびそれらの組み合わせから選択される、［１］に記載の方法。
［４］
タンパク質混合物、多糖混合物、またはそれらの組み合わせが細胞外基質調製物を含む、［３］に記載の方法。
［５］
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせがラミニン、コラーゲン、エンタクチン、ヘパリンサルフェートプロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、増殖因子、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、［３］に記載の方法。
［６］
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせが少なくとも１種の基底膜タンパク質を含む、［３］に記載の方法。
［７］
細胞外基質調製物が腫瘍または癌細胞から調製される、［４］に記載の方法。
［８］
腫瘍細胞がＥＨＳマウス肉腫である、［７］に記載の方法。
［９］
タンパク質混合物、多糖混合物またはそれらの組み合わせが可溶化された形態である、［３］に記載の方法。
［１０］
細胞試料が末梢細胞である、［１］に記載の方法。
［１１］
末梢細胞が皮膚細胞、血液細胞、口腔内粘膜細胞および脳脊髄液由来の細胞から選択される、［１０］に記載の方法。
［１２］
皮膚細胞が繊維芽細胞または上皮細胞である、［１１］に記載の方法。
［１３］
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加である、［２］に記載の方法。
［１４］
少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択される、［１３］に記載の方法。
［１５］
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が減少である、［２］に記載の方法。
［１６］
少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、［１５］に記載の方法。
［１７］
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加および減少の組み合わせである、［２］に記載の方法。
［１８］
増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、［１７］に記載の方法。
［１９］
変化がマイクロアレイによって測定される、［２］に記載の方法。
［２０］
マイクロアレイが細胞試料および対照細胞を含むアレイである、［１９］に記載の方法。
［２１］
マイクロアレイが細胞試料および対照細胞に由来の核酸を含むアレイである、［２０］に記載の方法。
［２２］
核酸がｃＤＮＡである、［２１］に記載の方法。
［２３］
変化がポリメラーゼ連鎖反応によって測定される、［２］に記載の方法。
［２４］
ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である、［２３］に記載の方法。
［２５］
神経変性状態がアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症および老化から選択される、［１］に記載の方法。
［２６］
アルツハイマー病が孤発性アルツハイマー病、初期段階アルツハイマー病および若年発症アルツハイマー病から選択される、［２５］に記載の方法。
［２７］
神経変性状態の診断が１種以上のさらなる診断法を使用して確認される、［１］に記載の方法。
［２８］
少なくとも１種の刺激が２種以上の刺激を含み、２種以上の刺激が細胞試料と同時にまたは経時的に接触される、［１］に記載の方法。
［２９］
神経変性状態の診断が必要な対象における神経変性状態の診断方法であって、
対象由来の細胞試料を少なくとも１種の刺激と接触させることと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現と対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現を検出することと；
細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと；
対象が神経変性状態を有するか否かを決定することと
を含み、
少なくとも１種の刺激による対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、対象が神経変性状態を有することを示す、方法。
［３０］
対照細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加、減少、またはそれらの組み合わせである、［２９］に記載の方法。
［３１］
増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２］
対照細胞が神経変性状態のない個体由来である、［２９］に記載の方法。
［３３］
対照細胞が、年齢が一致する対照細胞である、［２９］に記載の方法。
［３４］
少なくとも１種の刺激がタンパク質混合物、多糖混合物、プロテインキナーゼＣ活性化因子、Ａβオリゴマー、薬剤、およびそれらの組み合わせから選択される、［２９］に記載の方法。
［３５］
少なくとも１種の刺激が２種以上の刺激を含み、２種以上の刺激が細胞試料と同時にまたは経時的に接触される、［２９］に記載の方法。
［３６］
神経変性状態を治療または予防するための１種以上の候補薬物の開発に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
化合物を、細胞外基質調製物を含む培地中で培養した神経変性状態細胞試料と接触させることと；
神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することと；
神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現を、化合物と接触させることなく細胞外基質調製物を含む培地中で培養した対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較することと
を含み；
対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が、化合物が神経変性状態を治療または予防するための１種以上の候補薬物の開発に有用であることを示す、方法。
［３７］
対照神経変性状態細胞での少なくとも１種の同一遺伝子の発現と比較した神経変性状態細胞試料での少なくとも１種の遺伝子の発現の変化が増加、減少、またはそれらの組み合わせである、［３６］に記載の方法。
［３８］
減少した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＦＥＭＰ１、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ１８、ＩＧＦＢＰ５、ＨＡＳ１、ＣＤＨ２、ＣＡＰＧ、ＭＭＰ１２、ＭＡＰＫ１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＰＰＡＰＤＣ１Ａ、ＤＵＳＰ２、ＣＲＩＰ２、ＰＰＰ１ＣＢおよびＥＤＮＲＢから選択され、増加した発現を示す少なくとも１種の遺伝子がＥＧＲ２、ＭＡＰ２、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＡＤＭ１、ＣＯＬ２３Ａ１、ＢＤＫＲＢ２、ＡＰＯＥおよびＮＲＧ３から選択される、［３７］に記載の方法。
［３９］
細胞外基質調製物、および神経変性状態のない少なくとも１つの個体由来の対照細胞を含む、神経変性状態を診断するためのキット。
【外国語明細書】
2018046826000001.pdf