(57)【要約】【課題】異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供する。【解決手段】反応液が移動する第１流路と、前記第１流路と屈曲部を介してつながり、前記反応液が移動する第２流路と、を含み、前記第１流路は、第１プライマーおよびポリメラーゼが配置されている第１領域を有し、前記第２流路は、第２プライマーが配置されている第２領域を有する、核酸増幅反応容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液が移動する第１流路と、
前記第１流路と屈曲部を介してつながり、前記反応液が移動する第２流路と、
を含み、
前記第１流路は、第１プライマーおよびポリメラーゼが配置されている第１領域を有し、
前記第２流路は、第２プライマーが配置されている第２領域を有する、核酸増幅反応容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１プライマーおよび前記第２プライマーが前記反応液に含まれた場合に、前記反応液に含まれる前記第２プライマーの濃度は、前記反応液に含まれる前記第１プライマーの濃度より高い、核酸増幅反応容器。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記第２プライマーのＴｍ値は、前記第１プライマーのＴｍ値より高い、核酸増幅反応容器。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記第２領域に、プローブが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記第２領域に、ｄＮＴＰが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記第２領域に、ポリメラーゼが配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記第１プライマー、前記第２プライマー、および前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記第１プライマー、前記第２プライマー、および前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている、核酸増幅反応容器。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記屈曲部を、前記第１温度および前記第２温度より高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記屈曲部を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１０】
請求項９において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含む、核酸増幅反応装置。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、前記第１領域と前記屈曲部と、の間で往復させて、核酸増幅反応を行う第１核酸増幅反応工程と、
前記第１核酸増幅工程の後に、前記反応液を、前記屈曲部と前記第２領域との間で往復させて、核酸増幅反応を行う第２核酸増幅反応工程と、
を含み、
前記第１領域は、前記第１核酸増幅反応工程において、第１温度に加熱され、
前記第２領域は、前記第２核酸増幅反応工程において、第２温度に加熱され、
前記屈曲部は、前記第１核酸増幅工程および前記第２核酸増幅反応工程において、前記第１温度および前記第２温度より高い第３温度に加熱される、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応容器、核酸増幅反応装置、および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応溶液に施す処理である。
【０００４】
上記のようなＰＣＲでは、プライマーのテンプレート（鋳型核酸）に対する類似配列によって、ミスアニーリング（標的配列以外の配列にプライマーがアニーリングすること）が起こり、標的配列の増幅とともに非特異的な増幅（標的配列以外の配列が増幅すること）が起こることがある。
【０００５】
上記のような非特異的な増幅を抑えるために、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲが検討されている（例えば非特許文献１参照）。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは、テンプレートの増幅領域に対して、外側のプライマーと内側のプライマーとを使って、基本的には２段階のＰＣＲを行う方法である。具体的には、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは、最初の（外側の）プライマーによる第１のＰＣＲ（１回目のＰＣＲ）で増えた増幅産物を新たな鋳型として、Ｎｅｓｔｅｄ（内側の）プライマーで第２のＰＣＲ（２回目のＰＣＲ）を行う。第１のＰＣＲで増えた増幅産物は、内側のプライマーに類似した配列が存在する確率が低くなるため、非特異的な増幅を抑えることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】高橋輝行、外３名、「結核性髄膜炎の遺伝子診断：ＰＣＲ法による診断の進歩と今後の展開」、臨床神経学、第５３巻、第１１号（２０１３）、ｐ．１１８７−１１８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記のようなＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲでは、例えば、ピペット操作により、１回目のＰＣＲを行った反応液を容器から取り出し、別の容器に移し替えて２回目のＰＣＲを行う必要があり、反応液に異物が混入することが懸念される。
【０００８】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、異物が混入する可能性を低くすることができる核酸増幅反応容器を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を含む核酸増幅反応装置を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る核酸増幅反応容器は、
反応液が移動する第１流路と、
前記第１流路と屈曲部を介してつながり、前記反応液が移動する第２流路と、
を含み、
前記第１流路は、第１プライマーおよびポリメラーゼが配置されている第１領域を有し、
前記第２流路は、第２プライマーが配置されている第２領域を有する。
【００１０】
このような核酸増幅反応容器では、第１流路において第１核酸増幅反応（１回目のＰＣＲ）の最中に、反応液が第２プライマーと接触することを抑制することができる。これにより、核酸増幅反応容器では、第１流路において反応液に対して第１核酸増幅反応を行った後に、反応液を容器から取り出し別の容器に移し替えることをせずに、第２流路において反応液に第２核酸増幅反応（２回目のＰＣＲ）を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器では、反応液に異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００１１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１プライマーおよび前記第２プライマーが前記反応液に含まれた場合に、前記反応液に含まれる前記第２プライマーの濃度は、前記反応液に含まれる前記第１プライマーの濃度より高くてもよい。
【００１２】
このような核酸増幅反応容器では、非特異的な増幅産物の量を減らすために、第１核酸増幅反応の熱サイクル数を、第２核酸増幅反応の熱サイクル数より少なくした場合に、第１プライマーが無駄となることを抑制することができる。
【００１３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２プライマーのＴｍ値は、前記第１プライマーのＴｍ値より高くてもよい。
【００１４】
このような核酸増幅反応容器では、第２核酸増幅反応工程において、第１プライマーと第２プライマーとが共存した場合に、第１プライマーよりも第２プライマーをアニーリングさせ易くすることができる。
【００１５】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域に、プローブが配置されていてもよい。
【００１６】
このような核酸増幅反応容器では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域に、ｄＮＴＰが配置されていてもよい。
【００１８】
このような核酸増幅反応容器では、第１核酸増幅反応および第２核酸増幅反応の両反応で使用する分のｄＮＴＰを第１領域に配置させなくてよいので、第１核酸増幅反応において、十分に核酸を増幅させることができる。
【００１９】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第２領域に、ポリメラーゼが配置されていてもよい。
【００２０】
このような核酸増幅反応容器では、第１核酸増幅反応および第２核酸増幅反応の両反応で使用する分のポリメラーゼを第１領域に配置させなくてよいので、第１核酸増幅反応において、十分に核酸を増幅させることができる。
【００２１】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１プライマー、前記第２プライマー、および前記ポリメラーゼは、乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２２】
このような核酸増幅反応容器では、第１プライマーおよびポリメラーゼと、第２プライマーと、をより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２３】
本発明に係る核酸増幅反応容器において、
前記第１プライマー、前記第２プライマー、および前記ポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されていてもよい。
【００２４】
このような核酸増幅反応容器では、第１プライマーおよびポリメラーゼと、第２プライマーと、をさらにより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。
【００２５】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、
本発明に係る核酸増幅反応容器と、
前記第１領域を、第１温度に加熱する第１加熱部と、
前記第２領域を、第２温度に加熱する第２加熱部と、
前記屈曲部を、前記第１温度および前記第２温度より高い第３温度に加熱する第３加熱部と、
前記反応液が、前記第１領域、前記第２領域、および前記屈曲部を移動するように、前記核酸増幅反応容器を動かす駆動機構と、
を含む。
【００２６】
このような核酸増幅反応装置では、本発明に係る核酸増幅反応容器を含むため、異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００２７】
本発明に係る核酸増幅反応装置において、
前記反応液からの蛍光を検出する検出機構を含んでもよい。
【００２８】
このような核酸増幅反応装置では、反応液からの蛍光を検出することができる。
【００２９】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応容器を用いた核酸増幅反応方法であって、
前記反応液を、前記第１領域と前記屈曲部と、の間で往復させて、核酸増幅反応を行う第１核酸増幅反応工程と、
前記第１核酸増幅工程の後に、前記反応液を、前記屈曲部と前記第２領域との間で往復させて、核酸増幅反応を行う第２核酸増幅反応工程と、
を含み、
前記第１領域は、前記第１核酸増幅反応工程において、第１温度に加熱され、
前記第２領域は、前記第２核酸増幅反応工程において、第２温度に加熱され、
前記屈曲部は、前記第１核酸増幅工程および前記第２核酸増幅反応工程において、前記第１温度および前記第２温度より高い第３温度に加熱される。
【００３０】
このような核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応容器を用いるため、異物が混入する可能性を低くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図２】本実施形態に係る核酸増幅反応容器を模式的に示す断面図。
【図３】Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを説明するための図。
【図４】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図５】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図６】本実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。
【図７】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図８】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図９】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１０】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図。
【図１１】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３３】
１．  核酸増幅反応容器
まず、本実施形態に係る核酸増幅反応容器について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す断面図である。図２は、本実施形態に係る核酸増幅反応容器１００を模式的に示す図１のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【００３４】
核酸増幅反応容器１００は、図１および図２に示すように、容器本体１０を含む。容器本体１０の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。核酸増幅反応容器１００は、容器本体１０によって形成された流路２０を含む。流路２０には、第１試薬２および第２試薬４が設けられている。
【００３５】
１．１．  流路
流路２０は、反応液６が移動することができる流路である。なお、図１では、流路２０に反応液６が配置される前の状態を示し、図２では、流路２０に反応液６が配置された状態を示している。
【００３６】
反応液６は、標的核酸（鋳型核酸、検体）を含む鋳型核酸溶液と、容器本体１０内に配置された第１試薬２と、が接触することによって調整（生成）される。したがって、反応液６は、鋳型核酸および第１試薬２を（鋳型核酸の成分および第１試薬２の成分を）含むこととなり、核酸増幅反応を進行させる場となる。さらに、反応液６は、第２試薬４と接触し、第２試薬４を（第２試薬４の成分を）含む。鋳型核酸は、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であってもよい。鋳型核酸としては、例えば、マイコプラズマ菌、ノロウイルス、サイトメガロウイルス、エンテロウイルスなどから得られる。
【００３７】
流路２０には、液体（図示せず）が収容されている。液体は、反応液６とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体は、反応液６と異なる比重を有していてもよい。具体的には、液体の比重は、反応液６の比重よりも小さくてもよい。液体は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。液体は、容器本体の内壁を覆っており、流路に反応液６が配置された際に反応液６の表面を覆う。液体は、流路に充填されていない。これにより、核酸増幅反応容器では、液体が流路を充填する場合に比べて、反応液６を速く移動させることができる。
【００３８】
流路２０は、図１に示すように、第１流路２２と、第２流路２４と、屈曲部２６と、を有している。
【００３９】
第１流路２２は、例えば、直線状の流路である。第１流路２２の形状は、例えば、直方体である。第１流路２２は、第１領域３０を有している。第１領域３０は、例えば、第１流路２２の一方側の端部である。第１領域３０は、第１温度に加熱される領域である。第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第１温度に加熱される。第１温度は、第１プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。第１領域３０は、例えば、流路２０の、第１加熱部４０（図４参照）に設けられた開口部４０ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第１領域３０の形状は、長方形である。
【００４０】
第２流路２４は、例えば、直線状の流路である。第２流路２４の形状は、例えば、直方体である。第２流路２４は、第２領域３２を有している。第１領域３０は、例えば、第１流路２２の一方側の端部である。第２領域３２は、第２温度に加熱される領域である。第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第２温度に加熱される。第２温度は、第２プライマーのアニーリングおよび伸長反応に適した温度であり、例えば、５５℃以上７５℃以下である。第２温度は、第１温度と同じであってもよいし、第１温度と異なっていてもよい。第２領域３２は、例えば、流路２０の、第２加熱部４２（図４参照）に設けられた開口部４２ａ内に位置する部分である。図１に示す例では、第２領域３２の形状は、長方形である。
【００４１】
屈曲部２６は、屈曲した形状を有している。屈曲部２６は、第１流路２２と第２流路２４とを接続している。すなわち、第２流路２４は、第１流路２２と屈曲部２６を介してつながっている。屈曲部２６は、例えば、第１流路２２の他方側の端部（第１領域３０とは反対側の端部）と、第２流路２４の他方側の端部（第２領域３２とは反対側の端部）と、に接続されている。
【００４２】
屈曲部２６は、第１流路２２の延出方向（長手方向）と第２流路２４の延出方向（長手方向）とが互い平行にならないように、流路２２，２４を接続している。図示の例では、第１流路２２の延出方向と第２流路２４の延出方向とは、直交しており、流路２０は、Ｌ字状（略Ｌ字状）の形状を有している。第１流路２２の延出方向と第２流路２４の延出方向とのなす角度θは、７０°以上１１０°以下であってもよい。図示はしないが、流路２０は、Ｖ字状（略Ｖ字状）の形状を有していてもよい。図示の例では、屈曲部２６は、角部を有する形状であるが、円弧状の形状を有していてもよい。
【００４３】
屈曲部２６は、第１温度および第２温度より高い第３温度に加熱される領域である。屈曲部２６に反応液６が位置した場合、反応液６は、例えば、第３温度に加熱される。第３温度は、二本鎖ＤＮＡの解離（変性）に適した温度であり、例えば、８０℃以上１０５℃以下である。第３領域３４は、例えば、流路２０の、第３加熱部４４（図４参照）に設けられた開口部４４ａ内に位置する部分である。
【００４４】
屈曲部２６は、図２に示すように、標的核酸（鋳型核酸）を含む鋳型核酸溶液を導入する導入口２８と連通してもよい。図示の例では、導入口２８は、蓋１２によって塞がれている。核酸増幅反応容器１００では、例えば、蓋１２を開けて鋳型核酸溶液を流路２０に導入することができる。容器本体１０および蓋１２によって、流路２０は、密封されていてもよい。
【００４５】
流路２０は、図２に示すように、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれている。第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂは、容器本体１０の内壁である。内壁１０ａ，１０ｂによって、流路２０は形成されている。第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。具体的には、距離Ｄは、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下である。距離Ｄを０．５ｍｍ以上とすることにより、核酸増幅反応容器１００の製造が困難になることを抑制することができる。距離Ｄを３ｍｍ以下とすることにより、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００４６】
核酸増幅反応容器１００は、第１試薬２を含む反応液６を、第１領域３０と屈曲部２６との間で往復させて第１核酸増幅反応を行い、第１核酸増幅反応を行った後に、第２試薬４を含む反応液６を、屈曲部２６と第２領域３２との間で往復させて第２核酸増幅反応を行うための容器である。
【００４７】
１．２．  第１試薬
第１試薬２は、図１に示すように、第１領域３０に配置されている。第１試薬２は、第２試薬４と離間した状態で配置されている。第１試薬２は、第１領域３０と連通する導入口（図示せず）から第１領域３０に導入されてもよい。該導入口は、第１試薬２が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第１試薬２は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第１試薬２は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第１試薬２は、第１領域３０を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００４８】
第１試薬２は、核酸を増幅させるための試薬であり、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおいて、１回目の第１核酸増幅反応を行うための試薬である。第１試薬２は、例えば、第１プライマーと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００４９】
第１プライマーは、鋳型核酸にアニーリングするよう設計されている。アニーリングとは、プライマーがＤＮＡと結合することをいう。第１試薬２は、第１プライマーとして、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングする第１フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングする第１リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。ここで、図３は、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを説明するための図である。図３に示すように、第１プライマー１０１は、鋳型核酸１１０にアニーリングして、第１増幅産物１１１を生成するためのプライマーである。
【００５０】
第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれる第１フォワードプライマーおよび第１リバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。第１フォワードプライマーのＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値および第１リバースプライマーのＴｍ値は、それぞれ、例えば、６０℃以上８０℃以下である。
【００５１】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上である。
【００５２】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する（伸長反応）。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０６ｍＭ以上０．７５ｍＭ以下であり、好ましくは０．１２５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下である。
【００５３】
バッファーは、例えば、塩を含む緩衝剤である。バッファーに含まれる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。これらの塩により、反応液６のｐＨを調整することができる。バッファーは、２価の陽イオンを含む。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｍｎ、Ｃｏ，Ｍｇが挙げられる。第２試薬４が混合された反応液６に含まれる２価の陽イオンの濃度は、例えば、２ｍＭ以上７．５ｍＭ以下である。
【００５４】
鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、第１試薬２は、さらに、逆転写酵素を含む。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００５５】
第１試薬２が凍結乾燥されている場合、第１試薬２は、糖を含む。糖としては、例えば、二糖類および三糖類のうち、非還元糖であるスクロース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース等が挙げられる。二糖類および三糖類の中でも、特にトレハロースは、凍結保護剤としての機能が高く、強力な水和力により、凍結乾燥試薬が水分子と接触することを防止し、凍結乾燥試薬の保存安定性を向上させることができる。凍結乾燥試薬は、第１試薬２の各成分を含む混合試薬溶液を凍結乾燥することにより調整することができる。凍結乾燥の際の温度は、例えば、−８０℃程度である。なお、第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第２試薬４も糖を含んでもよい。
【００５６】
１．３．  第２試薬
第２試薬４は、第２領域３２に配置されている。第２試薬４は、第２領域３２と連通する導入口（図示せず）から第２領域３２に導入されてもよい。該導入口は、第２試薬４が導入された後、蓋（図示せず）によって塞がれてもよい。第２試薬４は、例えば、乾燥状態（乾燥された状態）で配置されている。より具体的には、第２試薬４は、凍結乾燥状態（凍結乾燥された状態）で配置されている。これにより、第２試薬４は、第２領域３２を規定する容器本体１０の内壁に貼り付くことができる。
【００５７】
第２試薬４は、核酸の増幅量を定量するための試薬であり、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおいて、２回目の第２核酸増幅反応を行うための試薬である。第２試薬４は、例えば、例えば、第２プライマーと、プローブと、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、バッファーと、を含む。
【００５８】
第２プライマーは、第１核酸増幅反応において増幅された核酸（増幅産物）にアニーリングするよう設計されている。第２試薬４は、第２プライマーとして、第２フォワードプライマーと、第２リバースプライマーと、を含む。図３に示すように、第２プライマー１０２は、第１増幅産物１１１にアニーリングして、第２増幅産物１１２を生成するためのプライマーである。
【００５９】
第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれる第２フォワードプライマーおよび第２リバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上１２．８μＭ以下であり、好ましくは１．６μＭ以上９．６μＭ以下である。第２フォワードプライマーのＴｍ値および第２リバースプライマーのＴｍ値は、それぞれ、例えば、６０℃以上８０℃以下である。
【００６０】
第１試薬２に含まれる第１プライマー、および第２試薬４に含まれる第２プライマーが反応液６に含まれた場合（第１試薬２および第２試薬４が反応液６に混合された場合）、反応液６に含まれる第２プライマーの濃度（第２フォワードプライマーおよび第２リバースプライマーの濃度）は、反応液６に含まれる第１プライマーの濃度（第１フォワードプライマーおよび第１リバースプライマーの濃度）よりも高い。第２プライマーの濃度と第１プライマーの濃度との差は、例えば、０．５μＭ以上５μＭ以下である。
【００６１】
第２プライマーのＴｍ値（第２フォワードプライマーのＴｍ値および第２リバースプライマーのＴｍ値）は、第１プライマーのＴｍ値（第１フォワードプライマーのＴｍ値および第１リバースプライマーのＴｍ値）よりも高い。第２プライマーのＴｍ値と第１プライマーのＴｍ値との差は、例えば、１℃以上１０℃以下である。
【００６２】
プローブは、核酸の増幅量を定量するために用いられる蛍光標識プローブである。容器本体１０の、少なくとも第２領域３２を規定する部分は、プローブが混合された反応液６からの蛍光、および蛍光を得るための励起光を透過することができる材料で構成されている。第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６に含まれるプローブの濃度は、０．５μＭ以上７．２μＭ以下であり、好ましくは０．９μＭ以上３．６μＭ以下である。
【００６３】
プローブは、レポーター色素およびクエンチャー色素を含む加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであってもよい。加水分解プローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素は、該レポーター色素に近接しているクエンチャー色素によって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素は、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。ハイブリダイゼーションとは、プローブがＤＮＡに結合することをいう。プローブとして加水分解プローブを用いる場合は、ポリメラーゼとして５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有しているポリメラーゼを用いる。
【００６４】
プローブは、加水分解プローブ以外の非加水分解プローブであってもよい。具体的には、プローブは、蛍光消光現象を利用したＱ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）プローブであってもよい。具体的には、プローブは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉであってもよい。Ｑプローブは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションしていない状態で発光し、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーションすると消光する。この発光強度の差により、核酸の増幅量を定量することができる。プローブとしてＱプローブを用いる場合は、５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有していないポリメラーゼを用いる。例えばＫＯＤポリメラーゼがあるが、この酵素は、一般的に用いられるＴａｑポリメラーゼよりも伸長反応の速度が大きく、熱サイクルの高速化を図ることができる。
【００６５】
第２試薬４に含まれるポリメラーゼは、第１試薬２に含まれるポリメラーゼと同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。第２試薬４に含まれるポリメラーゼの濃度は、第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６において、第１試薬２に含まれるポリメラーゼの濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００６６】
第２試薬４に含まれるｄＮＴＰの濃度は、第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６において、第１試薬２に含まれるｄＮＴＰの濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００６７】
第２試薬４に含まれるバッファーは、例えば、第１試薬２に含まれるバッファーと同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。第２試薬４に含まれるバッファーの濃度は、第１試薬２および第２試薬４が混合された反応液６において、第１試薬２に含まれるバッファーの濃度と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００６８】
第２試薬４が凍結乾燥されている場合、第１試薬２と同様に、第２試薬４は、糖を含んでもよい。
【００６９】
核酸増幅反応容器１００は、例えば、以下の特徴を有する。
【００７０】
核酸増幅反応容器１００では、反応液６が移動する第１流路２２と、第１流路２２と屈曲部２６を介してつながり、反応液６が移動する第２流路２４と、を含み、第１流路２２は、第１プライマーおよびポリメラーゼが配置されている第１領域３０を有し、第２流路２４は、第２プライマーが配置されている第２領域３２を有する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１流路２２において第１核酸増幅反応（１回目のＰＣＲ）の最中に、反応液が第２プライマーと接触することを抑制することができる。これにより、核酸増幅反応容器１００では、第１流路２２において反応液６に対して第１核酸増幅反応を行った後に、反応液６を容器から取り出し別の容器に移し替えることをせずに、第２流路２４において反応液６に第２核酸増幅反応（２回目のＰＣＲ）を行うことができる。したがって、核酸増幅反応容器１００では、反応液６に異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００７１】
さらに、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を別の容器に移し替える必要がないので、ウイルスを含む反応液６が人体等に接触することを抑制することができ、安全性を高めることができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、反応液６を別の容器に移し替える手間を省くことができ、作業を簡便にすることができる。
【００７２】
核酸増幅反応容器１００では、第１プライマーおよび第２プライマーが反応液６に含まれた場合に、反応液６に含まれる第２プライマーの濃度は、反応液６に含まれる第１プライマーの濃度より高い。ここで、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおいて、第１核酸増幅反応の熱サイクル数を、第２核酸増幅反応の熱サイクル数より少なくすることで、非特異的な増幅産物の量を減らすことができる。この場合に、第１プライマーの濃度を第２プライマーの濃度より低くすることで、第１プライマーが無駄となることを抑制することができる。
【００７３】
核酸増幅反応容器１００では、第２プライマーのＴｍ値は、第１プライマーのＴｍ値よりも高い。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第２核酸増幅反応工程において、第１プライマーと第２プライマーとが共存した場合に、第１プライマーよりも第２プライマーをアニーリングさせ易くすることができる。
【００７４】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２に、プローブが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、核酸の増幅量を定量することができる。
【００７５】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２に、ｄＮＴＰが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、第１核酸増幅反応において、十分に核酸を増幅させることができる。例えば、第１試薬２に、第１核酸増幅反応および第２核酸増幅反応の両反応で使用する分のｄＮＴＰを含有させておくと、第１核酸増幅反応において、ｄＮＴＰの量が多すぎて十分に核酸が増幅されない場合がある。
【００７６】
核酸増幅反応容器１００では、第２領域３２に、ポリメラーゼが配置されている。これにより、核酸増幅反応容器１００では、第１核酸増幅反応において、十分に核酸を増幅させることができる。例えば、第１試薬２に、第１核酸増幅反応および第２核酸増幅反応の両反応で使用する分のポリメラーゼを含有させておくと、第１核酸増幅反応において、ポリメラーゼの量が多すぎて十分に核酸が増幅されない場合がある。
【００７７】
核酸増幅反応容器１００では、第１プライマー、第２プライマー、およびポリメラーゼは、乾燥状態で配置されている。具体的には、第１プライマー、第２プライマー、およびポリメラーゼは、凍結乾燥状態で配置されている。そのため、核酸増幅反応容器１００では、第１プライマー、第２プライマー、およびポリメラーゼが液体の状態で配置されている場合に比べて、第１プライマーおよびポリメラーゼと、第２プライマーと、をより確実に互いに離間させた状態で配置させておくことができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、第１核酸増幅反応を行っている最中に、第２プライマーが第１流路２２に進入することを抑制することができる。さらに、核酸増幅反応容器１００では、第１プライマー、第２プライマー、およびポリメラーゼの保存安定性を高めることができる。
【００７８】
なお、第１試薬２と第２試薬４とを、互いに離間させた状態で配置させておくことができれば、第１試薬２および第２試薬４の少なくとも一方は、液体の状態で配置されていてもよい。特に、第２試薬４が液体の状態で配置されていると、第１核酸増幅反応での増幅産物を希釈することができるので、非特異的な配列が第２核酸増幅反応で増幅されることを抑制することができる。
【００７９】
核酸増幅反応容器１００では、屈曲部２６は、例えば、標的核酸を導入する導入口２８と連通する。そのため、核酸増幅反応容器１００では、例えば、屈曲部２６を第３温度に加熱した後に、屈曲部２６において、検体を含む鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させることができ、ホットスタートＰＣＲを行うことができる。
【００８０】
核酸増幅反応容器１００では、流路２０は、第１内壁１０ａと、第１内壁１０ａに対向する第２内壁１０ｂと、に挟まれ、第１内壁１０ａと第２内壁１０ｂとの間の距離Ｄは、流路２０に反応液６が導入された場合に、反応液６が第１内壁１０ａおよび第２内壁１０ｂに接触する長さである。そのため、核酸増幅反応容器１００では、加熱部の熱を反応液６に十分に伝えることができる。
【００８１】
２．  核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図４は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す断面図である。図５は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図４のＶ−Ｖ線断面図である。図６は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置２００の機能ブロック図である。
【００８２】
本発明に係る核酸増幅反応装置は、本発明に係る核酸増幅反応容器を含む。以下では、本発明に係る核酸増幅反応容器として核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置２００について説明する。
【００８３】
核酸増幅反応装置２００は、図４〜図６に示すように、第１加熱部４０と、第２加熱部４２と、第３加熱部４４と、駆動機構５０と、検出機構６０と、処理部７０と、操作部７２と、表示部７４と、記憶部７６と、核酸増幅反応容器１００と、を含む。
【００８４】
なお、便宜上、図４および図５では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図６では、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２，４４の図示を省略している。
【００８５】
第１加熱部４０、第２加熱部４２、および第３加熱部４４は、核酸増幅反応容器１００に接して設けられている。加熱部４０，４２，４４は、例えば、図示しないヒーターから発生した熱を、核酸増幅反応容器１００に伝えるアルミニウム製のヒートブロックである。加熱部４０，４２，４４の温度は、図示せぬ温度センサーおよび処理部７０によって制御されていてもよい。
【００８６】
第１加熱部４０は、流路２０の第１領域３０を第１温度に加熱する。第１加熱部４０は、例えば、第１領域３０に反応液６が位置した場合、反応液６を第１温度に加熱する。第１加熱部４０には、開口部４０ａが設けられている。図示の例では、開口部４０ａは、有底の穴である。第１領域３０は、開口部４０ａに挿入された領域である。開口部４０ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。
【００８７】
第２加熱部４２は、流路２０の第２領域３２を第２温度に加熱する。第２加熱部４２は、例えば、第２領域３２に反応液６が位置した場合、反応液６を第２温度に加熱する。第２加熱部４２には、開口部４２ａが設けられている。図示の例では、開口部４２ａは、有底の穴である。第２領域３２は、開口部４２ａに挿入された領域である。開口部４２ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。第２加熱部４２には、開口部４２ｂが設けられている。開口部４２ｂは、開口部４２ａと連通している。開口部４２ｂは、後述する検出機構６０からの励起光を第２領域３２に導き、かつ、プローブが混合された反応液６からの蛍光を検出機構６０に導くための開口部である。
【００８８】
第３加熱部４４は、流路２０の屈曲部２６を、第１温度および第２温度より高い第３温度に加熱する。第３加熱部４４は、例えば、屈曲部２６に反応液６が位置した場合、反応液６を第３温度に加熱する。第３加熱部４４には、開口部４４ａが設けられている。図示の例では、開口部４４ａは、屈曲部２６を貫通する貫通孔であり、屈曲した形状を有している。屈曲部２６は、開口部４４ａに挿入された領域である。開口部４４ａは、核酸増幅反応容器１００を装着可能な装着部である。
【００８９】
駆動機構５０は、反応液６が、第１領域３０、第２領域３２、および屈曲部２６に移動するように、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２，４４を動かす機構である。駆動機構５０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２，４４を動かす。駆動機構５０は、図示はしないが、核酸増幅反応容器１００および加熱部４０，４２，４４を支持する支持部と、該支持部を動かすモーターと、を有していてもよい。
【００９０】
検出機構６０は、プローブが混合された反応液６からの蛍光を検出する機構である。検出機構６０は、例えば、処理部７０からの入力信号に基づいて、試薬２，４が混合された反応液６に励起光を照射し、反応液６からの蛍光を検出する。検出機構６０としては、蛍光を検出することができれば特に限定されず、例えば、公知の蛍光測定器を用いる。
【００９１】
処理部７０は、例えば記憶部７６に記憶されているプログラムに従って、駆動機構５０および検出機構６０を制御するための処理を行う。処理部７０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。
【００９２】
操作部７２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部７０に送る処理を行う。操作部７２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。
【００９３】
表示部７４は、処理部７０によって生成された画像を表示する。表示部７４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ  Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）等により実現される。
【００９４】
記憶部７６は、処理部７０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部７６は、処理部７０の作業領域として用いられ、処理部７０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部７６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。
【００９５】
核酸増幅反応装置２００では、核酸増幅反応容器１００を含むため、反応液６に異物が混入する可能性を低くすることができる。
【００９６】
なお、上記では、第１領域３０が第１温度に加熱され、屈曲部２６が第３温度に加熱される例について説明したが、第１領域３０が第３温度に加熱され、屈曲部２６が第１温度に加熱されてもよい。ただし、この場合は、第２核酸増幅反応工程において、反応液６を、第１領域３０と第２領域３２との間で往復させなければならず、処理部７０の処理が複雑になるため、第１領域３０が第１温度に加熱され、屈曲部２６が第３温度に加熱されることが好ましい。
【００９７】
３．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図７は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。図８〜図１０は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するための断面図である。なお、便宜上、図８〜図１０では、駆動機構５０、検出機構６０、処理部７０、操作部７２、表示部７４、および記憶部７６の図示を省略している。また、図８〜図１０では、重力が作用する方向（重力作用方向）を矢印ｇで示している。以下では、一例として、核酸増幅反応容器１００を含む核酸増幅反応装置２００を用いた核酸増幅反応方法について説明する。
【００９８】
まず、処理部７０は、操作部７２から処理を開始する旨の信号を受けると、核酸増幅反応容器１００が装着された核酸増幅反応装置２００の加熱部４０，４２，４４を制御して、第１領域３０を第１温度に設定し、第２領域３２を第２温度に設定し、屈曲部２６を第３温度に設定する処理を行う（ステップＳ１）。本工程により、第１領域３０と屈曲部２６との間には、第１温度と第３温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。さらに、第２領域３２と屈曲部２６との間には、第２温度と第３温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。処理部７０は、例えば、第１領域３０、第２領域３２、および屈曲部２６がそれぞれ第１温度、第２温度、および第３温度に達したら、表示部７４に鋳型核酸を導入する旨を表示させる処理を行う。
【００９９】
次に、例えば、表示部７４の表示を確認した後に、核酸増幅反応容器１００の蓋１２を開けて、流路２０の屈曲部２６に鋳型核酸溶液を導入する（ステップＳ２）。
【０１００】
次に、処理部７０は、例えば、操作部７２から鋳型核酸溶液を導入した旨の信号を受けると、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置に保持する処理を行う（ステップＳ３）。第１配置では、図８に示すように、第１領域３０は、第２領域３２および屈曲部２６よりも、重力作用方向において下方に位置する。これにより、第１領域３０において、鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させて反応液６を調整することができる。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１の時間（第１の期間）、第１配置に保持させる。第１の時間は、鋳型核酸溶液と第１試薬２とを接触させるための時間である。処理部７０は、タイマーを内蔵していてもよい。図示の例では、流路２２，２４の延出方向は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【０１０１】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ４）。第２配置では、図９に示すように、屈曲部２６は、第１領域３０および第２領域３２よりも、重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、第１領域３０から屈曲部２６に移動する。反応液６は、屈曲部２６において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第２の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。ホットスタートを行うことができるポリメラーゼを用いている場合は、本工程において、ポリメラーゼを賦活化させることができる（ホットスタート）。図示の例では、流路２２，２４の延出方向は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【０１０２】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う（ステップＳ５）。第１配置では、図８に示すように、反応液６は、屈曲部２６から第１領域３０に移動する。反応液６は、第１領域３０において第１温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置とした後に駆動機構５０の動作を第３の時間（第３の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第３の時間、第１配置に保持される。これにより、反応液６に対して、第１プライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第３の時間は、第１プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１０３】
次に、処理部７０は、第２配置から第１配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ５の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数（第１所定回数）に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ６）。処理部７０は、ステップＳ５の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている第１所定回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている第１所定回数は、特に限定されないが、例えば、５回以上３０回以下である。
【０１０４】
処理部７０は、ステップＳ６においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図７において「Ｙｅｓ」の場合）、ステップＳ７へ移行する。
【０１０５】
一方、処理部７０は、ステップＳ６においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図７において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ８に移行する。
【０１０６】
ステップＳ８では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う。反応液６は、第１領域３０から屈曲部２６に移動する。反応液６は、屈曲部２６において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間（第４の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第４の時間、第４配置に保持される。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。第４の時間は、変性のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。
【０１０７】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ５へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。
【０１０８】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第１領域３０と屈曲部２６との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与することができ、核酸増幅反応を行うことができる（第１核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、核酸増幅反応容器１００をシーソー運動させて、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置と第２配置とに切換える処理を行う。
【０１０９】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ７）。これにより、反応液６を屈曲部２６に移動させることができる。反応液６は、屈曲部２６において第３温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を第４の時間停止させる。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。
【０１１０】
次に、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第３配置へ切換える処理を行う（ステップＳ９）。第３配置では、図１０に示すように、第２領域３２は、第１領域３０および屈曲部２６よりも、重力作用方向において下方に位置する。そのため、反応液６は、屈曲部２６から第２領域３２に移動する。これにより、第２領域３２において、反応液６と第２試薬４とを接触させて、第２試薬４を含む反応液６を調整することができる。反応液６は、第２領域３２において第２温度に加熱される。処理部７０は、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間（第５の期間）停止させる。そのため、核酸増幅反応容器１００の配置は、第５の時間、第３配置に保持される。これにより、反応液６に対して、第２プライマーのアニーリングおよび伸長反応を行うことができる。第５の時間は、第２プライマーのアニーリングおよび伸長反応のための加熱時間であり、例えば、０．５秒以上１０秒以下である。図示の例では、流路２２，２４の延出方向は、重力作用方向と平行ではなく、重力作用方向に対して傾いている。
【０１１１】
次に、処理部７０は、第２配置から第３配置へ切換えた回数（サイクル数、具体的にはステップＳ８の処理を行った回数）が、予め記憶部７６に記憶されている所定の回数（第２所定回数）に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ１０）。処理部７０は、ステップＳ９の処理を行うたびに、サイクル数を記憶部７６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部７６に記憶されている第２所定回数と、を比較する。予め記憶部７６に記憶されている第２所定回数は、特に限定されないが、例えば、２０回以上６０回以下である。
【０１１２】
処理部７０は、ステップＳ１０においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図７において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【０１１３】
一方、処理部７０は、ステップＳ１０においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図７において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１１に移行する。ステップＳ１１では、処理部７０は、駆動機構５０を制御して、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置から第２配置へ切換える処理を行う。これにより、反応液６は、第１領域３０から屈曲部２６に移動する。反応液６は、屈曲部２６において第３温度に加熱される。処理部７０は、例えば、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置とした後に駆動機構５０の動作を、第４の時間停止させる。これにより、反応液６に対して、変性を行うことができる。
【０１１４】
そして、処理部７０は、再び、ステップＳ９へ移行し、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置から第３配置へ切換える処理を行う。
【０１１５】
以上のように、処理部７０は、サイクル数が所定の回数となるまで、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置と第３配置とに切換える処理を行う。これにより、反応液６を、第２領域３２と屈曲部２６との間で往復させて、反応液６に熱サイクルを付与することができ、核酸増幅反応を行うことができる（第２核酸増幅反応工程）。処理部７０は、例えば、核酸増幅反応容器１００をシーソー運動させて、核酸増幅反応容器１００の配置を第２配置と第３配置とに切換える処理を行う。
【０１１６】
処理部７０は、さらに、ステップＳ９において、例えば、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置とした後に駆動機構５０の動作を第５の時間停止させる処理を行うと同時に、増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置２００では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部７０は、ステップＳ９において、核酸増幅反応容器１００の配置を第３配置に保持するごとに検出機構６０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部７０は、検出機構６０の測定結果として検出機構６０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部７６に記憶する。処理部７０は、予め記憶部７６に記憶させた増幅曲線を読み出し、該増幅曲線と取得した蛍光強度とにより、核酸の増幅量を算出する処理を行ってもよい。処理部７０は、算出した核酸の増幅量を、表示部７４に表示させる処理を行ってもよい。
【０１１７】
ここで、図１１は、核酸増幅反応装置２００を模式的に示す図１０のＸＩ−ＸＩ線断面図である。図１１に示すように、第３配置では、第２領域３２は、検出機構６０と対向した位置にある。検出機構６０からの励起光は、開口部４２ｂを通って反応液６に至り、反応液６からの蛍光は、開口部４２ｂを通って検出機構６０に至る。
【０１１８】
核酸増幅反応方法では、核酸増幅反応容器１００を用いるため、異物が混入する可能性を低くすることができる。
【０１１９】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１２０】
２…第１試薬、４…第２試薬、６…反応液、８…液体、１０…容器本体、１０ａ…第１内壁、１０ｂ…第２内壁、１２…蓋、２０…流路、２２…第１流路、２４…第２流路、２６…屈曲部、２８…導入口、３０…第１領域、３２…第２領域、４０…第１加熱部、４０ａ…開口部、４２…第２加熱部、４２ａ，４２ｂ…開口部、４４…第３加熱部、４４ａ…開口部、５０…駆動機構、６０…検出機構、７０…処理部、７２…操作部、７４…表示部、７６…記憶部、１００…核酸増幅反応容器、１０１…第１プライマー、１０２…第２プライマー、１１０…鋳型核酸、１１１…第１増幅産物、１１２…第２増幅産物、２００…核酸増幅反応装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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