(57)【要約】【課題】試料のハイパースペクトル画像から信頼性の高い代表ラマンスペクトルを取得することができる光学装置を提供する。【解決手段】本発明に係る光学装置は、特定のラマンスペクトル帯域を基準信号として指定する指定入力を受け取り、その基準信号の強度が基準強度以上である測定点について、ラマンスペクトルを抽出する。【選択図】図５
2018077059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に対して光を照射する光源、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られる信号を用いて前記試料の画像を取得する画像取得部、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られるラマン散乱光の特定のラマンスペクトル帯域を基準信号として指定する指定入力を受け取る入力インターフェース、
前記画像の測定点のなかから前記基準信号が基準強度以上の強度を有する測定点を選択する選択部、
前記測定点における前記試料からのラマン散乱光のラマンスペクトルを抽出するスペクトル解析部、
を備えることを特徴とする光学装置。
【請求項２】
前記スペクトル解析部は、既知の測定済試料に対して光を照射することにより得られたラマン散乱光のラマンスペクトルを記述した測定済データを取得し、
前記スペクトル解析部は、前記抽出したラマンスペクトルと、前記測定済データが記述しているラマンスペクトルとを比較することにより、前記測定済データが記述している物理的特性に基づき前記試料の物理的特性を特定する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項３】
前記入力インターフェースは、前記基準信号として、ＣＨ伸縮振動に由来するラマンスペクトル帯域を指定する前記指定入力を受け取り、
前記選択部は、前記指定入力が指定するラマンスペクトル帯域におけるラマンスペクトルが前記基準強度以上の強度を有する測定点を選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項４】
前記入力インターフェースは、前記基準信号として、特定の組織に固有の物質に由来するラマンスペクトルを指定する前記指定入力を受け取り、
前記選択部は、前記指定入力が指定するラマンスペクトルが前記基準強度以上の強度を有する測定点を選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項５】
前記入力インターフェースは、前記基準信号として、ラマン散乱光の指紋領域のラマンスペクトル帯域を指定する前記指定入力を受け取り、
前記選択部は、前記指定入力が指定するラマンスペクトル帯域におけるラマンスペクトルが前記基準強度以上の強度を有する測定点を選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項６】
前記選択部は、前記基準信号が基準強度以上の強度を有する測定点を、前記基準信号の強度の降順に複数選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項７】
前記選択部は、各前記測定点におけるラマンスペクトル間の類似性に基づき各前記測定点をクラスタリングすることにより、各前記測定点を１以上のクラスタに分類し、
前記選択部は、各前記クラスタに属する各前記測定点における前記基準信号の平均強度を求め、
前記選択部は、前記平均強度が前記基準強度以上である前記クラスタに属する前記測定点を選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項８】
前記選択部は、前記基準信号の空間平均強度が前記基準強度以上である空間領域における前記測定点を選択する
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項９】
前記スペクトル解析部は、
前記測定済データと前記抽出したラマンスペクトルに対して主成分分析を実施することにより前記試料の物理的特性を特定し、
または、
前記測定済データを用いてあらかじめ構築したニューラルネットワークに対して前記抽出したラマンスペクトルを入力することにより前記試料の物理的特性を特定する
ことを特徴とする請求項２記載の光学装置。
【請求項１０】
前記入力インターフェースは、前記光学装置のユーザが前記指定入力を入力するためのユーザインターフェースとして構成されている
ことを特徴とする請求項１記載の光学装置。
【請求項１１】
試料に対して光を照射する光源、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られる信号を用いて前記試料の画像を取得する画像取得部、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られるラマン散乱光のラマンシフトまたはその範囲を基準信号として指定する指定入力を受け取る入力インターフェース、
前記画像の測定点のなかから前記基準信号が基準強度以上の強度を有する測定点を選択する選択部、
前記測定点における前記試料からのラマン散乱光のラマンスペクトルを抽出するスペクトル解析部、
前記スペクトル解析部による処理結果を出力する出力部、
を備えることを特徴とする光学装置。
【請求項１２】
前記スペクトル解析部は、既知の測定済試料に対して光を照射することにより得られたラマン散乱光のラマンスペクトルを記述した測定済データを取得し、
前記スペクトル解析部は、前記抽出したラマンスペクトルと、前記測定済データが記述しているラマンスペクトルとを比較することにより、前記測定済データが記述している物理的特性に基づき前記試料の物理的特性を特定し、
前記出力部は、前記スペクトル解析部が特定した前記試料の物理的特性を記述した前記処理結果を出力する
ことを特徴とする請求項１１記載の光学装置。
【請求項１３】
前記測定済データは、前記測定済試料として、細胞腫ごとのラマンスペクトルを記述しており、
前記スペクトル解析部は、前記測定済データが記述している物理的特性に基づき、前記試料の物理的特性として、前記試料の細胞腫を特定し、
前記出力部は、前記スペクトル解析部が特定した前記試料の細胞腫を記述した前記処理結果を出力する
ことを特徴とする請求項１２記載の光学装置。
【請求項１４】
試料に対して光を照射するステップ、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られる信号を用いて前記試料の画像を取得する画像取得ステップ、
前記試料に対して前記光を照射することにより得られるラマン散乱光のラマンシフトまたはその範囲を基準信号として指定する指定入力を受け取る入力ステップ、
前記画像の測定点のなかから前記基準信号が基準強度以上の強度を有する測定点を選択する選択ステップ、
前記測定点における前記試料からのラマン散乱光のラマンスペクトルを抽出するスペクトル解析ステップ、
を有することを特徴とする光学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン散乱を利用する光学装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野や生物分野において、観察対象の定性的な情報を非侵襲かつ非接触に取得することができるラマン顕微鏡が注目されている。これらの分野においては、観察対象である生体組織を染色し蛍光顕微鏡などを用いて観察する方法が一般的である。しかしながら、染色による影響により、同一の生体組織を継続的に観察することが困難であり、非侵襲な観察方法が求められてきた。
【０００３】
ラマン顕微鏡は、観察対象に対して励起レーザ光を照射することにより発生する散乱光のうち、励起光に対し周波数シフトを示すラマン散乱光を観測する。ラマン散乱光の示す周波数シフトはラマンシフトと呼ばれ、その強度はレーザ照射箇所に分布する化学結合の振動準位間のエネルギー差に依存する。したがって、レーザ照射箇所を変化させ、観察対象の複数箇所においてラマンスペクトルを得ることにより、観察対象の分子種およびその分布に関する情報を非侵襲かつ非接触に得ることができる。レーザ照射箇所毎に得たスペクトルの集合データをハイパースペクトル画像と呼ぶ。
【０００４】
自発ラマン散乱と呼ばれる通常のラマン散乱においては、ラマン散乱光は非常に弱く測定に時間を要するので、時間変化が大きい生体組織に対してラマン顕微鏡を用いることは困難であった。
【０００５】
近年の高性能な短パルスレーザの出現により、非線形光学効果を用いた顕微鏡の技術が発展した。ラマン顕微鏡においても、非線形光学効果を用い信号強度を増大させたＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）やＳＲＳ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）などが開発されてきた。これら非線形ラマン顕微鏡の開発により測定時間が短縮され、ラマンによる生体組織の観察が可能となってきている。
【０００６】
ラマン顕微鏡を用いた生体組織の評価においては、各観察対象に対し、その対象の性質を代表する１つのスペクトル（以下、代表ラマンスペクトルとする）を抽出し、これに対してスペクトル解析を実施することにより、生体組織を評価する場合がある。このような場合において従来は、明視野像から生体組織の形状を認識し、測定箇所またはハイパースペクトル画像におけるピクセルを選択し、その箇所におけるラマンスペクトルを代表ラマンスペクトルとして用いている（下記非特許文献１、２）。
【０００７】
下記特許文献１は、所望のラマンスペクトル帯域の信号強度を調整するため、励起光のパワー強度比と合波状態を調整することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１６／１４３０８４Ａ１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】X. Huang, et al.,“Spontaneous and coherent anti-Stokes Raman spectroscopy of human gastrocnemius muscle biopsies in CH-stretching region for discrimination of peripheral artery disease,” OSA Vol.6 No.8 2766-2777 (2015)
【非特許文献２】T. Ichimura, et al.,“Visualizing the appearance and disappearance of the attractor of differentiation using Raman spectral imaging,” Scientific report 5 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生体組織は複数の細胞小器官や水が複雑に混在しており、また単一の細胞小器官内であってもタンパク質などは物質分布を有する。したがって、明視野像から生体組織の構造を完全に把握することは困難である。さらには、ラマンスペクトルは測定箇所の物質分布に依存するので、細胞小器官ごとにスペクトル形状は変化する。また生体由来のラマン散乱光を有しない水が主成分となる箇所においては、信号強度は小さくなる。したがって上記非特許文献記載のように、測定点を主観的に選択してその測定点におけるラマンスペクトルを代表ラマンスペクトルとして抽出する手法は、生体組織の特徴を充分に反映していない形状や信号強度を有する代表ラマンスペクトルを抽出する可能性がある。すなわち従来手法は、生体組織を信頼性高く評価することが困難である可能性がある。
【００１１】
特許文献１記載の手法は、ラマンスペクトルの信号強度を調整する手法を記載しているが、同文献は適切な代表ラマンスペクトルを抽出する方法については言及されていない。したがって上記非特許文献と同様の課題を有している可能性がある。
【００１２】
本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、試料のハイパースペクトル画像から信頼性の高い代表ラマンスペクトルを取得することができる光学装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る光学装置は、特定のラマンスペクトル帯域を基準信号として指定する指定入力を受け取り、その基準信号の強度が基準強度以上である測定点について、ラマンスペクトルを抽出する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る光学装置によれば、生体組織のラマン測定において、信頼性の高い代表ラマンスペクトルを取得し、生体組織の状態評価の信頼性を向上させることができる。上記した以外の、課題、構成、および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】自発ラマン散乱におけるストークス散乱のエネルギー準位図である。
【図２】ＣＡＲＳにおけるエネルギー準位図である。
【図３】実施形態１に係る光学装置の構成例である。
【図４】コントローラ３０１が提供するユーザインターフェースの画面例である。
【図５】コントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。
【図６】実施形態１に係る光学装置を透過型多色ＣＡＲＳ顕微鏡として構成した場合におけるエネルギー準位図である。
【図７】生体組織のＣＡＲＳスペクトルの例である。
【図８】解析部３１０が代表ラマンスペクトルを解析する手順を説明するフローチャートである。
【図９】解析部３１０が代表ラマンスペクトルを解析する別手順を説明するフローチャートである。
【図１０】実施形態１により得られたラマンスペクトルの例である。
【図１１】同種細胞間におけるアミドＩの信号強度の変動係数を示すグラフである。
【図１２】図８で説明した主成分分析を用いた解析によって細胞種を識別した結果を示すグラフである。
【図１３】適合率と感度の例を説明する表である。
【図１４】図９で説明したニューラルネットワークを用いた解析によって細胞種を識別した結果を示すグラフである。
【図１５】実施形態２においてコントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。
【図１６】実施形態３においてコントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜ラマン散乱とＣＡＲＳについて＞
以下では本発明の理解を容易にするため、まず自発ラマン散乱と非線形ラマンの１例としてのＣＡＲＳについて説明する。その後に本発明に係る光学装置の実施形態の詳細について説明する。
【００１７】
図１は、自発ラマン散乱におけるストークス散乱のエネルギー準位図である。ラマン散乱には、励起光よりも周波数が減少するストークス散乱と、増加するアンチストークス散乱とがある。図１においてはストークス散乱のみを示した。
【００１８】
ストークス散乱において、分子は始状態として基底状態１０１を取り、周波数ωpの励起光により中間状態１０３への励起を経て、振動励起準位１０２に緩和する。分子のエネルギー順位が中間状態１０３から振動励起準位１０２へ緩和する際、分子は周波数ωsの光を散乱光として放出する。アンチストークス散乱において、分子は始状態として振動励起準位１０２を取り、中間状態１０３を経て基底状態１０１に緩和する。ラマンシフト周波数ΩはΩ＝ωP−ωSで表される。分子の振動励起準位は内在する化学結合に由来して複数存在し、また同種結合であっても分子種によって振動励起準位やその準位への遷移確率が異なる。したがって、分子種に特有のラマンスペクトルが形成される。
【００１９】
上記の自発ラマン散乱にて得られる散乱光の強度は弱く測定に時間を要するが、非線形光学効果を用いるＣＡＲＳは散乱光強度を増大し、ビデオレートで測定を実施することができる。ＣＡＲＳは励起光として、ポンプ光、ストークス光、プローブ光という３種類のレーザを用いる３次の非線形光学効果である。一般的には光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。
【００２０】
ＣＡＲＳが高強度を示す要因は２点ある。１点目は励起光強度への非線形依存性である。２点目は、コヒーレントな分子励起である。以下これらの要因について説明する。
【００２１】
ＣＡＲＳ光の強度は、ＰＡＳ（ωＡＳ）∝｜χ（３）ＥＰ２（ωＰ）Ｅ＊Ｓ（ωＳ）｜２で表される。χ（３）は３次の電気感受率、ＥＰはポンプ光およびプローブ光の電場、ＥＳはストークス光の電場である。上式中でＥＳの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。以上より、ＣＡＲＳ光の強度はポンプ光の強度の２乗およびストークス光の強度の１乗に比例する。自発ラマン散乱では出力１０ｍＷ程度のＣＷレーザを一般的に用いるが、非線形ラマンであるＣＡＲＳにおいてはピークパワーの出力が１０ＭＷ程度のパルスレーザを用いており、非線形効果により信号強度は大きくなる。
【００２２】
図２は、ＣＡＲＳにおけるエネルギー準位図である。周波数ωＰのポンプ光と周波数ωＳのストークス光を同時に照射することにより、分子は中間状態１０３への励起を経て、振動励起準位１０２に緩和する。この緩和は、ストークス光による分子の強制振動によって起こる誘導放出である。分子はその後、周波数ωＰのプローブ光による中間状態１０４への励起を経て、周波数ωＡＳのＣＡＲＳ光を放出し、基底状態１０１に緩和する。以上のようにＣＡＲＳは誘導放出をともなっており、複数の分子をコヒーレントに励起し、散乱光を増強することができる。ＣＡＲＳ光強度に寄与する３次の電気感受率χ（３）は自発ラマン散乱に寄与する１次の電気感受率χ（１）より数桁小さいが、以上２点の要因によりＣＡＲＳは自発ラマン散乱と比較して１０５倍程度の強い散乱光を示す。
【００２３】
＜実施の形態１：装置構成＞
図３は、本発明の実施形態１に係る光学装置の構成例である。光学装置は、コントローラ３０１、ラマン光学系（短パルスレーザ光源３０２〜ダイクロイックミラー３０６）、解析部３１０を備える。コントローラ３０１は、光学装置の全体動作を制御する。ラマン光学系については以下説明する。解析部３１０は、観察対象３０８の光学画像を取得し、これに対してラマンスペクトル解析を実施する。解析部３１０の具体的な処理については後述する。コントローラ３０１と解析部３１０は単一の装置として構成してもよい。コントローラ３０１は、観察対象３０８の画像を取得する画像取得部として動作するとともに、ハイパースペクトル画像のピクセルを選択する選択部として動作する。
【００２４】
短パルスレーザ光源３０２から出射した光は、ビームスプリッタ３０３により２分岐される。分岐された光の一方は、フォトニック結晶ファイバ３０４などの光ファイバに導入され、その内部で広帯域な光（スーパーコンティニューム光と言う）が発生する。スーパーコンティニューム光は、ファイバから出射した後、所望の波長成分のみがロングパスフィルタ３０５により抽出され、これがストークス光として用いられる。もう一方の励起光とストークス光はダイクロイックミラー３０６などにより合波され、観察対象３０８に対して集光照射されてＣＡＲＳ光が発生する。分光器３０９はそのＣＡＲＳ光を検出し、解析部３１０はそのハイパースペクトル画像とラマンスペクトルを取得する。ピエゾステージ３０７は、観察対象３０８に対する集光箇所を微調整する。
【００２５】
図４は、コントローラ３０１が提供するユーザインターフェースの画面例である。ユーザインターフェースは、解析部３１０が観察対象３０８のラマンスペクトルを解析する際の条件をユーザが指定するためのインターフェースである。ここでは画面インターフェースを用いて解析条件を指定する例を示したが、その他適当なインターフェースを用いて指定することもできる。例えば解析条件を記述したデータを解析部３１０に対して入力するためのデータＩ／Ｏを用いるなどが考えられる。インターフェースが指定する各項目については後述のフローチャートで改めて説明する。
【００２６】
＜実施の形態１：装置動作＞
図５は、コントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。以下図５の各ステップについて説明する。
【００２７】
（図５：ステップＳ５０１）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「測定領域及びステップ」「露光時間」「測定帯域」欄に入力された指定入力に基づき、測定条件を設定する。
【００２８】
（図５：ステップＳ５０２）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「スペクトル処理」欄に入力された指定入力に基づき、ハイパースペクトル画像に対して実施するスペクトル処理方法を設定する。スペクトル処理の例としては、レーザ未照射状態でも検出される信号（暗電流と言う）の除去、正規化、などが挙げられる。
【００２９】
（図５：ステップＳ５０３）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「基準信号」欄に入力された指定入力に基づき、代表ラマンスペクトルを抽出する際に使用する基準信号を設定する。ここでいう基準信号としては、ラマンスペクトル内に含まれる各帯域の信号のうち、顕著な特徴を有すると想定されるものを指定する。基準信号として適しているラマンスペクトル帯域の例については後述する。基準信号を指定する際には、ユーザが任意のラマンシフト値（またはその範囲、以下同様）を入力するか、あるいはコントローラ３０１があらかじめ保持しているラマンスペクトル帯域の選択肢のなかからユーザにいずれかを選択させることができる。
【００３０】
（図５：ステップＳ５０４）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「ピクセル選択手法」欄に入力された指定入力に基づき、観察対象３０８の画像のピクセルを選択する手法を設定する。選択された手法に基づきステップＳ５１１においてピクセルを選択する。ピクセル選択手法を指定する際には、コントローラ３０１があらかじめ保持している選択肢のなかからいずれかをユーザに選択させるか、あるいはユーザ独自の関数を入力させることができる。
【００３１】
（図５：ステップＳ５０５）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「抽出スペクトル領域」欄に入力された指定入力に基づき、代表ラマンスペクトルとして抽出するスペクトル帯域を設定する。選択されたスペクトル領域をステップＳ５１２において抽出する。
【００３２】
（図５：ステップＳ５０６）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「解析手法」欄に入力された指定入力に基づき、解析手法を設定する。解析部３１０は、指定された解析手法を用いて代表ラマンスペクトルを解析する。解析手法を指定する際には、コントローラ３０１があらかじめ保持している選択肢のなかからいずれかをユーザに選択させるか、あるいはユーザが独自に開発した解析プログラムを指定させることができる。
【００３３】
（図５：ステップＳ５０７）
コントローラ３０１は、図４に示すインターフェースの「評価対象」欄に入力された指定入力に基づき、評価対象を設定する。
【００３４】
（図５：ステップＳ５０８）
コントローラ３０１は、ステップＳ５０１〜Ｓ５０７において指定した各測定条件に問題がないか否かを判定する。問題がある場合はステップＳ５０１に戻って改めて測定条件を指定させる。問題がない場合はステップＳ５０９へ進む。具体的には、ステップＳ５０１において指定した測定帯域内に、ステップＳ５０３において指定した基準信号やステップＳ５０５において指定した代表ラマンスペクトルのスペクトル帯域が含まれているか否か、などに基づき、測定条件の適否を判断することができる。
【００３５】
（図５：ステップＳ５０９）
コントローラ３０１は、測定光を観察対象３０８に対して走査することにより、観察対象３０８のハイパースペクトル画像を取得する。ハイパースペクトル画像のピクセル値を測定する際に、各ピクセルに対応する測定点ごとに、観察対象３０８からのラマン散乱光に基づくラマンスペクトル（図７に例示するような帯域範囲にわたるスペクトル）を得ることができる。コントローラ３０１は、各ピクセルの座標とその座標におけるラマンスペクトルを対応付けて、保存しておく。
【００３６】
（図５：ステップＳ５１０）
コントローラ３０１は、取得したハイパースペクトル画像の各ピクセルについて、ラマンスペクトル内に含まれる基準信号の強度を取得する。本ステップにおける基準信号は、ステップＳ５０３において設定したラマンスペクトルに対応するものである。例えば基準信号として後述するＣＨ伸縮信号を指定した場合、２８５０ｃｍ−１（またはその近傍）のラマンシフトの信号強度を取得する。
【００３７】
（図５：ステップＳ５１１）
コントローラ３０１は、ステップＳ５１０において取得した基準信号強度と、ステップＳ５０４において設定したピクセル選択手法に基づき、ハイパースペクトル画像から１以上のピクセルを選択する。ピクセル選択手法としては、例えば基準信号強度が高い順に指定した個数のピクセルを選択する、などが考えられる。
【００３８】
（図５：ステップＳ５１２）
コントローラ３０１は、例えばステップＳ５１１において選択した１以上のピクセルそれぞれのラマンスペクトルを、全スペクトル帯域にわたって平均化することにより、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルを抽出する。その他適当な手法により代表ラマンスペクトルを導出してもよい。
【００３９】
（図５：ステップＳ５０１〜Ｓ５１２：補足）
代表ラマンスペクトルを抽出することそのものを目的とする場合は、後述する図８のフローチャート（図４の解析手法を実装した処理に相当）を実施する必要はない。図８のフローチャートを実施するか否かは、例えば図４の「解析」欄で指定することができる。
【００４０】
図６は、本実施形態１に係る光学装置を透過型多色ＣＡＲＳ顕微鏡として構成した場合におけるエネルギー準位図である。図６に示すように、励起光として広帯域光源を用い、発生するＣＡＲＳ光を分光検出するものを、多色ＣＡＲＳ顕微鏡と言う。図６においてはストークス光として広帯域光を用いている。多色ＣＡＲＳ顕微鏡は、ＣＡＲＳ光の分光スペクトルからラマンスペクトルを推定できる。したがって、ポンプ光とストークス光ともに単色光を用い波長掃引することによりＣＡＲＳスペクトルを取得する方式と比較し、短時間で測定箇所のスペクトルを得ることができる。
【００４１】
図７は、生体組織のＣＡＲＳスペクトルの例である。２８５０ｃｍ−１付近にＣＨ伸縮信号に由来する高強度な信号が見られる。ＣＨ伸縮信号は、脂質やたんぱく質などの生体組織を構成する分子において一般的に存在するものである。また、１２００〜１８００ｃｍ−１においてはたんぱく質に由来するアミドＩやアミドＩＩＩなどの低強度な信号が見られる。
【００４２】
ラマンによる生体組織評価においては、タンパク質の情報を多く含む指紋領域（約８００〜１８００ｃｍ−１）を用いることが有用と考えられている。換言すると、指紋領域のラマンスペクトルを基準信号として好適なピクセルを選択することにより、適切な代表ラマンスペクトルを抽出できると考えられる。しかし指紋領域の信号強度は低いので、組織評価のために用いることが難しい。
【００４３】
ＣＨ伸縮信号と指紋領域の信号はたんぱく質という共通の信号発生源を有するので、これらの信号強度には一定の相関があると考えられる。そこで１例として、信号強度の強いＣＨ伸縮信号を基準信号として用い、代表ラマンスペクトルとして指紋領域を抽出することが考えられる。ＣＨ伸縮信号が顕著であるピクセルを選択することにより、そのピクセルは指紋領域についても顕著な特徴を有していると推定されるので、好適な代表ラマンスペクトルを抽出できると考えられる。
【００４４】
ユーザは以上の原理を利用する場合、図４のインターフェースを介して、基準信号としてＣＨ伸縮信号を選択し、ピクセル選択手法として基準信号強度を降順に複数（個数を指定してもよい）選択することを指定する。代表ラマンスペクトルとして抽出するスペクトル領域は、必ずしも取得したラマン散乱光の全帯域でなくともよい。例えば、ステップＳ５１１において選択した各ピクセルのラマンスペクトルのうち、指紋領域に該当する８００〜１８００ｃｍ−１を代表ラマンスペクトルとして抽出するように、「抽出スペクトル帯域」欄に入力することができる。
【００４５】
図８は、解析部３１０が代表ラマンスペクトルを解析する手順を説明するフローチャートである。解析部３１０は、図５のフローチャートによって取得した観察対象３０８の代表ラマンスペクトルを、あらかじめ測定した試料から取得したラマンスペクトルと比較することにより、観察対象３０８の物理的特性を特定する。ここでは観察対象３０８が生体試料であると仮定し、物理的特性として観察対象３０８の細胞腫を特定する。以下図８の各ステップについて説明する。
【００４６】
（図８：ステップＳ８０１）
解析部３１０は、細胞腫が既に判明している生体試料をあらかじめ測定することにより取得したラマンスペクトルを記述したデータ（学習用データと呼ぶ）を取得する。学習用データは１つの細胞腫について複数準備しておいてもよい。
【００４７】
（図８：ステップＳ８０２）
解析部３１０は、図４の「解析手法」欄が指定する手法（ここでは主成分分析）を用いて、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルと学習用データを比較する。ラマンスペクトルはある帯域範囲にわたってラマンシフトの信号強度を表しているが、その帯域範囲のなかで当該ラマンスペクトルの特徴をよく表している成分を主成分として互いに比較することにより、ラマンスペクトル間の類似度を判定することができる。本ステップにおいては主成分分析のパラメータとして、累積寄与率（一般的には７０〜８０％）を設定する。例えば累積寄与率を８０％とした場合、ラマンスペクトルの特徴を最もよく表す成分から順に主成分として採用し、その累積寄与率が８０％になるまで、次に寄与率が高い成分を次の主成分として順次採用する。
【００４８】
（図８：ステップＳ８０３〜Ｓ８０４）
解析部３１０は、全ての学習用データについて主成分分析を実施することにより（Ｓ８０３）、各学習用データが記述しているラマンスペクトルの主成分と各主成分の主成分スコアを算出する（Ｓ８０４）。
【００４９】
（図８：ステップＳ８０５）
解析部３１０は、ステップＳ８０４において算出した各主成分スコアがそれぞれの主成分軸において正規分布にしたがうと仮定して、各主成分スコアの正規分布を算出する。得られた分布は多変量正規分布となる。
【００５０】
（図８：ステップＳ８０６〜Ｓ８０７）
解析部３１０は、学習用データ内に異常値が含まれているか否かを判定する（Ｓ８０６）。例えば、ステップＳ８０５において算出した多変量正規分布から大きく外れるデータ点は、異常値であるとみなすことができる。異常値がある場合は、その異常値を除去した上でステップＳ８０３に戻る（Ｓ８０７）。異常値がない場合は、ステップＳ８０８へ進む。
【００５１】
（図８：ステップＳ８０８）
解析部３１０は、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルを、ステップＳ８０４において算出した主成分軸に対して射影し、各主成分軸における主成分スコアを算出する。
【００５２】
（図８：ステップＳ８０９）
解析部３１０は、ステップＳ８０５において算出した多変量正規分布と、ステップＳ８０８において算出した観察対象３０８の主成分スコアとを比較することにより、観察対象３０８のラマンスペクトルが属する確率が最も高い分布を特定する。これにより、観察対象３０８の細胞種は、その特定した分布を有する学習用データに対応する細胞種であることを特定することができる。
【００５３】
図９は、解析部３１０が代表ラマンスペクトルを解析する別手順を説明するフローチャートである。解析部３１０は、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルと学習用データを比較することができるのであれば、任意の解析手法を用いることができる。ここではニューラルネットワークを用いる例を説明する。
【００５４】
（図９：ステップＳ９０１）
本ステップはステップＳ８０１と同様である。
【００５５】
（図９：ステップＳ９０２）
解析部３１０は、ニューラルネットワークの出力層の値を、各細胞種に対応してそれぞれ設定する。
【００５６】
（図９：ステップＳ９０３）
解析部３１０は、ニューラルネットワークの入力層に対して学習用データのラマンスペクトルを与えると、その学習用データに対応する細胞種を表す正しい値が出力層から出力されるように、ニューラルネットワークの層間重み値や各ニューロンのバイアス値を調整する。本ステップは、ニューラルネットワークの学習を実施することに相当する。ステップＳ９０２〜Ｓ９０３は、あらかじめ実施しておいてもよい。
【００５７】
（図９：ステップＳ９０４）
解析部３１０は、学習を実施したニューラルネットワークに対して、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルを入力し、出力値を得る。
【００５８】
（図９：ステップＳ９０５）
解析部３１０は、得られた出力値をステップＳ９０２において設定した細胞種ごとの出力値と比較し、あらかじめ設定した計算方法によって最も類似した細胞種の出力値を特定する。解析部３１０は、観察対象３０８の細胞種が、その特定した値に対応する細胞種であると判定することができる。
【００５９】
（図９：ステップ９０４：補足）
ニューラルネットワークの入力層に対して与えるデータとしては、観察対象３０８の代表ラマンスペクトルそのものでもよいし、適当な加工を施したものでもよい。例えば平均信号強度を差し引く、スケーリングを施す、などが考えられる。あるいは主成分分析や非負値行列因子分解など低次元、低ランク近似によって圧縮することにより得られるスコアや構成成分の重み係数を入力してもよい。そのようにすればスペクトルをそのまま入力する場合に比較して入力層のノードの数を小さくすることが可能となる。なお、層の数や隠れ層のノード数なども適宜調整することはもちろんである。これらは、学習の収束／計算時間／識別結果に対して影響を与えるので、事前にテストして最適な方法を選択するとよい。
【００６０】
図１０は、本実施形態１により得られたラマンスペクトルの例である。符号１００１は本実施形態１により抽出されたラマンスペクトルであり、符号１００２は従来の明視野像を用いて細胞中心付近から抽出したラマンスペクトルである。従来手法は、指紋領域内の信号が殆ど得られていない。これに対して本実施形態１によれば、指紋領域内のアミドＩＩＩ、ＣＨ変角、アミドＩなどの信号が得られていることが分かる。
【００６１】
図１１は、同種細胞間におけるアミドＩの信号強度の変動係数を示すグラフである。符号１１０１〜１１０３は、本実施形態１により抽出された代表ラマンスペクトルにおける変動係数である。符号１１０４〜１１０６は、従来の明視野像を用いて細胞中心付近から抽出した代表ラマンスペクトルにおける変動係数である。本実施形態１によれば、従来手法と比較して全細胞種に対し変動係数が小さくなっていることが分かる。これは、同種細胞間において安定した信号強度を得られていることを示している。
【００６２】
図１２は、図８で説明した主成分分析を用いた解析によって細胞種を識別した結果を示すグラフである。ここでは評価指数として、適合率と感度を用いた。適合率は、ある分類に属すると評価されたデータのうち、真にその分類に属するデータ件数の割合である。感度は、真にその分類に属するデータのうち、その分類に属すると評価されたデータ件数の割合である。適合率と感度の定義については図１３において改めて説明する。
【００６３】
符号１２０１〜１２０３と符号１２０７〜１２０９は、本実施形態１により得られた適合率と感度を示す。符号１２０４〜１２０６と符号１２１０〜１２１２は、従来手法により得られた適合率と感度を示す。本実施形態１によれば、従来手法と比較して、全細胞種に対し適合率と感度がともに向上していることが分かる。
【００６４】
図１３は、適合率と感度の例を説明する表である。細胞種Ａと分類された１２０個のデータのなかで、真に細胞種Ａであるものは８０個である。したがって適合率は、８０／１２０×１００＝６７％である。真に細胞種Ａであるデータは合計１００個あり、そのなかで細胞種Ａと分類されたものは８０個である。したがって感度は、８０／１００×１００＝８０％である。
【００６５】
図１４は、図９で説明したニューラルネットワークを用いた解析によって細胞種を識別した結果を示すグラフである。符号１４０１〜１４０３と符号１４０７〜１４０９はニューラルネットワークを用いた場合の適合率と感度であり、符号１４０４〜１４０６と符号１４１０〜１４１２は図１２で説明した主成分分析を用いた場合の適合率と感度である。図１４に示すように、解析手法に応じて適合率と感度を向上させることができる。
【００６６】
図１４の解析において用いたニューラルネットワークは、入力層／第１隠れ層／第２隠れ層／出力層から構成されるフィードフォワードネットワークである。入力層のノード数は４３２、第１隠れ層のノード数は６０、第２隠れ層のノード数は３５、出力層のノード数は３であった。第１および第２隠れ層の伝達関数はシグモイド関数とし、出力層の伝達関数はソフトマックス関数とした。出力層の３つのノードの値は、学習時には細胞種Ａ、Ｂ、Ｃに対して各々（１，０，０）、（０，１，０）、（０，０，１）とし、未知のスペクトルに対して出力される値の最大値を示す場所によって細胞種を判定した。例えば出力層の値が（０．０５，０．８，０．１５）であれば、２番目のノードが最大であるので、学習時に（０，１，０）を対応させた細胞種Ｂであると判定した。
【００６７】
＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係る光学装置は、ＣＨ伸縮信号を基準信号として用いることにより、生体組織を構成する物質が強く分布しているピクセルを選択し、高強度かつ形状および信号強度が安定した指紋領域を抽出することができる。これにより、解析精度を向上させることができる。
【００６８】
＜実施の形態２＞
実施形態１では、基準信号強度が高いピクセルを降順に複数選択した。本発明の実施形態２では、ハイパースペクトル画像のスペクトル類似性に基づくクラスタリングを実施するとともに、基準信号強度の平均値が大きいクラスタから代表ラマンスペクトルを抽出する。光学装置の構成は実施形態１と同様であるので、以下では主に差異点について説明する。なお、上記のクラスタリングにおけるスペクトル類似性は、全波数領域など基準信号の波数を含む波数領域で計算してもよいし、指紋領域など特定の波数領域で計算してもよい。例えば、信号強度の強いＣＨ伸縮信号を基準信号として用い、クラスタリングにおけるスペクトル類似性は指紋領域で計算することが考えられる。そうしてクラスタリングで得られたクラスタからＣＨ伸縮信号の強いクラスタを選択し、その平均スペクトルを代表スペクトルとすることができる。そのようにすれば、クラスタリングの際に信号強度の強いＣＨ伸縮信号の影響を受けずに信号強度の弱い指紋領域における類似性を元にクラスタリングがなされるので、良質の代表スペクトルを計算することができる。
【００６９】
図１５は、本実施形態２においてコントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。以下図１５の各ステップについて説明する。
【００７０】
（図１５：ステップＳ１５０１）
コントローラ３０１は、ステップＳ５０１〜Ｓ５０９と同様の処理を実施する。ただし本実施形態２においては、ステップＳ５０４のピクセル選択手法として、クラスタリングが指定されたものとする。クラスタリング手法、クラスタリングに使用するスペクトル帯域と類似度、クラスタ数についても併せて指定されるものとする。これらを指定する際には、コントローラ３０１があらかじめ保持している選択肢のなかからいずれかをユーザに選択させるか、あるいはユーザ独自の関数を指定させることができる。例えばクラスタリング手法としてｋ−平均クラスタリングを用い、類似度としてコサイン距離を用いることができる。
【００７１】
（図１５：ステップＳ１５０２）
コントローラ３０１は、観察対象３０８のハイパースペクトル画像に対して、ステップＳ５０５において指定したスペクトル帯域の単位ベクトル化を、各ピクセルについて実施する。コントローラ３０１は、単位ベクトル化したスペクトルを用いて、各ピクセル間のコサイン距離を導出し、ｋ−平均クラスタリングにより各ピクセルをクラスタリングする。
【００７２】
（図１５：ステップＳ１５０３〜Ｓ１５０４）
コントローラ３０１は、各クラスタの平均基準信号強度を算出する（Ｓ１５０３）。コントローラ３０１は、ステップＳ１５０３において算出した平均基準信号強度が最大であるクラスタを選択する（Ｓ１５０４）。
【００７３】
（図１５：ステップＳ１５０５）
コントローラ３０１は、ステップＳ１５０４において選択したクラスタの指定したスペクトル帯域の平均スペクトルを、代表ラマンスペクトルとして抽出する。
【００７４】
＜実施の形態２：まとめ＞
本実施形態２に係る光学装置は、スペクトル形状が類似するピクセルをクラスタリングすることにより、物質分布が似通っている箇所から代表ラマンスペクトルを抽出することができる。これにより、同じ状態の生体組織間における代表ラマンスペクトルのバラツキを抑制することができる。また類似スペクトルの加算平均により低強度な信号を増強することも期待されるので、信頼性の高い生体組織評価を実現できる。
【００７５】
＜実施の形態３＞
本発明の実施形態３では、ピクセル間の空間距離を考慮して、代表ラマンスペクトルを抽出するピクセルを選択する。光学装置の構成は実施形態１と同様であるので、以下では主に差異点について説明する。
【００７６】
図１６は、本実施形態３においてコントローラ３０１が観察対象３０８から代表ラマンスペクトルを抽出する処理を説明するフローチャートである。以下図１６の各ステップについて説明する。
【００７７】
（図１６：ステップＳ１６０１）
コントローラ３０１は、ステップＳ５０１〜Ｓ５１０と同様の処理を実施する。ただし本実施形態３においては、ステップＳ５０４のピクセル選択手法として、基準信号の空間平均強度の降順に複数のピクセルを選択することが指定されたものとする。また次のステップにおいて示すｋ（ｘ）とｎも併せて指定することとする。
【００７８】
（図１６：ステップＳ１６０２）
コントローラ３０１は、演算式「ＩＡＶ＝Σ（ｋ（ｘ）＊Ｉ）／ｎ」にしたがってラマンスペクトルの空間平均強度を各ピクセルについて算出する。ＩＡＶは空間平均強度である。ｋ（ｘ）は注目しているピクセルからの距離ｘの関数であり、ｘが大きいほど小さくなる。Ｉは個々のピクセルの基準信号強度である。ｎは加算するピクセル数である。本ステップは、周囲のピクセルにおける基準信号強度を重み付け平均することにより、ピクセルの空間的な広がりを加味して基準信号強度を求める意義がある。またｋ（ｘ）の関数形状にしたがって、基準信号の強度とピクセル間の空間距離のバランスを調整することができる。演算式は１例であるので、空間平均強度を算出できるその他演算式を用いることもできる。
【００７９】
（図１６：ステップＳ１６０３）
コントローラ３０１は、例えばステップＳ１６０２において求めた空間平均強度が大きい順に１以上のピクセルを選択する。
【００８０】
（図１６：ステップＳ１６０４）
コントローラ３０１は、ステップＳ１６０３において選択した１以上のピクセルそれぞれのラマンスペクトルを、ステップＳ１６０２と同様の計算式により重み付け平均することにより、代表ラマンスペクトルを抽出する。
【００８１】
＜実施の形態３：まとめ＞
本実施形態３に係る光学装置は、空間的に近くかつ基準信号強度が強いピクセルを選択する。したがって、単一の細胞内における小器官などのように空間的に局在した箇所から代表ラマンスペクトルを抽出する用途に適している。空間平均強度を用いる手法は、実施形態２において各クラスタの信号強度を算出する際に用いることもできる。
【００８２】
実施形態２ではクラスタリングを実施して、クラスタ毎に基準信号の強度を計算して最も基準信号の強いクラスタを選択する例について述べた。このクラスタ毎の基準信号の強さは、同一クラスタに属するスペクトルの基準信号の強さの強度平均で求めてもよいし、上述の空間平均強度の計算式を用いて選択してもよい。後者の場合には、同一クラスタに分類されたピクセルにおいて上記のＩＡＶによって空間平均強度を計算し、空間平均強度の最も高いクラスタを選択して、そのクラスタに分類されたスペクトル群から代表スペクトルを計算することができる。このように実施形態２と３を組み合わせれば、クラスタを構成するピクセルの空間的な集まり具合も加味されてクラスタが選択されるので、指定された波数範囲で類似したスペクトルを持ち、さらに空間的にも近いスペクトル群から代表スペクトルを計算することが可能となり、より信頼性の高い代表スペクトルを得ることが可能となる。
【００８３】
＜本発明の変形例について＞
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００８４】
以上の実施形態においては、透過型多色ＣＡＲＳ顕微鏡をラマン光学装置として用いているが、本発明は、ラマン散乱光を取得できる光学装置であればあらゆる装置について適用することができる。例えば、透過および反射を問わずＣＡＲＳ顕微鏡以外に自発ラマン散乱顕微鏡やＳＲＳ顕微鏡などにおいて本発明を適用することができる。また広帯域光を用いた多色型だけでなく、励起光の波長を変化させていく波長掃引型を使用しても構わない。
【００８５】
以上の実施形態においては、基準信号としてＣＨ伸縮信号を用いて指紋領域を抽出することを説明した。基準信号としてはＣＨ伸縮信号以外に、（ａ）細胞核など所望の組織に特徴的な物質に由来するラマンシフト、（ｂ）指紋領域内において所定強度以上を有するラマンシフト、などが想定される。（ａ）を用いることにより、特定の細胞内小器官から信号を取得できる可能性がある。（ｂ）を用いることにより、特定のたんぱく質が局在している箇所から信号を取得できる可能性がある。
【００８６】
以上の実施形態において、ピクセルを選択したあとにそのピクセルの指紋領域から代表ラマンスペクトルを抽出することを説明した。それ以外に抽出する領域として、ＣＨ伸縮信号などを指定することも考えられる。ＣＨ伸縮信号は脂肪異常を評価する際には最適とされている。この場合は単一信号のみを用いて解析を実施するので、信号のラマンシフトやピーク幅などを正確に取得する必要がある。したがって安定した代表ラマンスペクトルを取得する必要があるので、本発明を用いることが有用である。
【００８７】
以上の実施形態においては、学習済データを解析する処理と観察対象３０８から取得した代表ラマンスペクトルを解析する処理を同時に実施する例を示した。事前に学習済データの解析を終えておくことにより、解析時間を短縮しリアルタイムで観察対象３０８を評価することができる。薬効や細胞の代謝などのように経時変化を評価する際には、このようなリアルタイム評価が有効である。
【００８８】
以上の実施形態においては、観察対象３０８の物理的特性として細胞種を特定することを説明したが、その他物理的特性を特定する際にも本発明を適用することができる。例えば、（ａ）ある細胞がガンか否かを判別する、（ｂ）ガンの種類を識別する、（ｃ）ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が未分化状態であるか分化しているかを判別する、などの用途にも応用できる。
【００８９】
以上の実施形態において、コントローラ３０１と解析部３１０は、これらの機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアによって構成することもできるし、これらの機能を実装したソフトウェアをＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などの演算装置が実行することにより構成することもできる。
【符号の説明】
【００９０】
３０１：コントローラ
３０２：短パルスレーザ光源
３０３：ビームスプリッタ
３０４：フォトニック結晶ファイバ
３０５：ロングパスフィルタ
３０６：ダイクロイックミラー
３０７：ピエゾステージ
３０８：観察対象
３０９：分光器
３１０：解析部
【図１】
2018077059.tif 000003
【図２】
2018077059.tif 000004
【図３】
2018077059.tif 000005
【図４】
2018077059.tif 000006
【図５】
2018077059.tif 000007
【図６】
2018077059.tif 000008
【図７】
2018077059.tif 000009
【図８】
2018077059.tif 000010
【図９】
2018077059.tif 000011
【図１０】
2018077059.tif 000012
【図１１】
2018077059.tif 000013
【図１２】
2018077059.tif 000014
【図１３】
2018077059.tif 000015
【図１４】
2018077059.tif 000016
【図１５】
2018077059.tif 000017
【図１６】
2018077059.tif 000018