(57)【要約】【課題】ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤、がん治療薬及び素クリーニング方法を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）【化１】2018158900.tif 000010（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）で表される化合物又はその塩を有効成分とする、ＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）のＳ−ニトロシル化阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2018158900.tif 000008
（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）
で表される化合物又はその塩を有効成分とする、ＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）のＳ−ニトロシル化阻害剤。
【請求項２】
ＤＮＭＴ３のＳ−ニトロシル化を特異的に阻害する、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
下記式（Ｉ）
【化２】
2018158900.tif 000009
（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）
で表される化合物を有効成分とするがん治療薬。
【請求項４】
一酸化窒素発生剤及び候補物質の存在下でＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）を含む細胞を培養し、Ｓ−ニトロシル化されたＤＮＭＴを検出する工程を含む、がん治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤、がん治療薬及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAメチル基転移酵素（DNMT）は共通のメチル供与体であるS-アデノシルメチオニンからDNA分子の特定の部位にメチル基を転移させる。いくつかの生物機能はDNAにおけるメチル化塩基によるものとされている。ＤＮＡのメチル化異常はがん化に深く関係していることが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】京府医大誌  118(8)、515-521、2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な作用メカニズムを有するがん治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の課題に鑑み検討を重ねた結果、DNMTはシステイン残基のチオール基がNO によって酸化されて，酵素活性が抑制されること、細胞のNO処理によって，DNAの脱メチル化が亢進し，がん化を促進する遺伝子の発現が上昇することを見出し、ＤＮＭＴの活性を維持しつつＳ−ニトロシル化を選択的に阻害する阻害剤を見出し、この阻害剤ががん化を抑制することを見出した。
【０００６】
本発明は、以下のＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤、がん治療薬及びそのスクリーニング方法を提供するものである。
項１.  下記式（Ｉ）
【化１】
2018158900.tif 000002
（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）
で表される化合物又はその塩を有効成分とする、ＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）のＳ−ニトロシル化阻害剤。
項２.  ＤＮＭＴ３のＳ−ニトロシル化を特異的に阻害する、項１に記載の阻害剤。
項３.  下記式（Ｉ）
【化２】
2018158900.tif 000003
（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）
で表される化合物を有効成分とするがん治療薬。
項４．  一酸化窒素発生剤及び候補物質の存在下でＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）を含む細胞を培養し、Ｓ−ニトロシル化されたＤＮＭＴを検出する工程を含む、がん治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）の活性中心にあるシステイン残基は、ＮＯによりＳ−ニトロシル化され、酵素活性が低下する。ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化を抑制する物質は、活性中心のシステイン残基と相互作用するため、ＤＮＭＴの酵素活性を低下させることが予測される。ＤＮＭＴの酵素活性を低下させる物質は、ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化を抑制したとしてもがん治療薬としては使用できない。
【０００８】
本発明のＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤は、ＤＮＭＴの酵素活性を維持しつつＳ−ニトロシル化を抑制できるので、がん治療薬として有用である。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明のＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤は、ＤＮＭＴ３のＳ−ニトロシル化を特異的に阻害することができる。ＤＮＭＴはがん化以外にも多様な生理活性に関与しており、ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化を非特異的に阻害すると毒性を発現することが予測されるが、ＤＮＭＴ３のＳ−ニトロシル化を特異的に阻害することで、毒性を抑えつつがん化を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Maintenance DNA methylation by DNMT1
【図２】NOによるDNMT3B活性調節機構
【図３】タンパク質Cys残基を介した酸化ストレス／レドックスシグナル伝達
【図４】S-nitrosylation of DNMTs (1)。「input」は、含量コントロール（各サンプルに同じくらい当該タンパク質がある）を意味する。
【図５】S-nitrosylation of DNMTs (2)
【図６】DNMT3B特異的抗体の作出
【図７】DNMT活性評価方法
【図８】Inhibitory effect of NO on DNMT activity
【図９】DNMT3Bのホモロジーモデリング
【図１０】SNO-DNMT形成へのDBICの影響
【図１１】SNO化を抑制する濃度では酵素活性に影響はない。（ａ）ＤＢＩＣによるＳ−ニトロシル化の程度。○はDNMT3B、●はDNMT3A、△はDNMT1である。（ｂ）ｈＤＮＭＴ３Ｂの酵素活性の測定結果。
【図１２】NOによる細胞増殖効果はDBIC処理で解除される。（ａ）ＣＣＮＤ２もしくはＡＣＴＢの発現量、（ｂ）細胞数
【図１３】スフェアアッセイ
【図１４】NOによるスフェア形成能に対するDBICの抑制効果（１）
【図１５】NOによるスフェア形成能に対するDBICの抑制効果（２）
【図１６】炎症性発がんモデル
【図１７】抗体アレイを用いた新規NO結合タンパク質の網羅的スクリーニング法の概略
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）として、DNMT1(図１)、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B(図2)、DNMT3Lが知られている。DNMT1は複製依存性DNAメチラーゼ、DNMT2はRNAメチラーゼ、DNMT3A, DNMT3BはDe novo DNAメチラーゼである。
【００１２】
本発明の好ましいＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤は、DNMT3(DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)を特異的に阻害するものであり、より好ましくはDNMT3A、DNMT3Bを特異的に阻害するものであり、特にDNMT3Bを特異的に阻害するものである。DNMT3／DNMT3B特異的阻害剤は、DNMT1、DNMT2を阻害しないので、副作用を低減することができる。
【００１３】
ヒトのDNMT3AとDNMT3Bのアミノ酸配列のアラインメントは図９に示され、これらは非常に相同性が高い。本発明の好ましい阻害剤は、意外にもDNMT3BのＳ−ニトロシル化を特異的に阻害するものであり、このような結果は、到底予測できないものである。
【００１４】
図３に示すように、タンパク質のシステイン残基のＳＨ基は、Ｓ−酸化、Ｓ−ニトロシル化又はＳ−スルフヒドリル化されることが知られている。ＤＮＭＴ、特にＤＮＭＴ３ＢがＳ−ニトロシル化されるとメチル基転位活性が低下してシトシン残基の脱メチル化が生じ、ＣＣＮＤ２などのがん化を促進する遺伝子発現が増大する(図２)。一方、ＤＮＭＴ、特にＤＮＭＴ３ＢのＳ−ニトロシル化が抑制されると、メチル基転位活性が維持され、シトシン残基のメチル化が促進され、ＣＣＮＤ２などのがん化を促進する遺伝子発現は抑制される(図２)。したがって、本発明のＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤は、がん治療薬として有用である。
【００１５】
本発明において、ＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化阻害剤及びがん治療薬として有用な化合物は、一般式（Ｉ）で表される。
【００１６】
【化３】
2018158900.tif 000004
【００１７】
（Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Ｙ１は、２価の連結基を示す。）
本発明の１つの好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２の一方が置換されていてもよいアリール基であり、他方が置換されていてもよいヘテロアリール基である。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２の両方が置換されていてもよいアリール基である（Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なっていてもよい）。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２の両方が置換されていてもよいヘテロアリール基である（Ｒ１とＲ２は、同一であっても異なっていてもよい）。
【００２０】
アリール基としては、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
【００２１】
ヘテロアリール基としては、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよい。具体例としては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ［ｂ］チエニル及びベンズイミダゾリルが挙げられる。
【００２２】
置換基としては、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＮＯ，ＮＯ２、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、低級アルキル基、アリール基、低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級アルキルチオ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、低級アルコキシカルボニル基、シクロアルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、モノ低級アルキル置換カルバモイル基、ジ低級アルキル置換カルバモイル基、低級アルコキシカルボニルアミノ基などが挙げられ、置換基の数は、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個である。
【００２３】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００２４】
低級アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−６アルキル基が挙げられる。
【００２５】
アリール基としては、上記のものが挙げられる。
【００２６】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。
【００２７】
アリールオキシ基としては、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、フルオレニルオキシ、アントリルオキシ、ビフェニリルオキシ、テトラヒドロナフチルオキシ、クロマニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルオキシ、インダニルオキシ及びフェナントリルオキシが挙げられる。
【００２８】
低級アルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、tert−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ヘキシルチオなどの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−６アルキルチオ基が挙げられる。
【００２９】
モノ低級アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、tert−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ヘキシルアミノなどのＣ１−６アルキルでモノ置換されたアミノ基が挙げられる。
【００３０】
ジ低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジtert−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジヘキシルアミノなどのＣ１−６アルキルでジ置換されたアミノ基が挙げられる。
【００３１】
アシル基としては、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アリールカルボニル又はアリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルが挙げられる。
【００３２】
Ｃ１−６アルキルカルボニルとしては、メチルカルボニル、エチルカルボニル、ｎ−プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、tert−ブチルカルボニル、ｎ−ペンチルカルボニル、イソペンチルカルボニル、ヘキシルカルボニルが挙げられる。
アリールカルボニルとしては、フェニルカルボニル、ナフチルカルボニル、フルオレニルカルボニル、アントリルカルボニル、ビフェニリルカルボニル、テトラヒドロナフチルカルボニル、クロマニルカルボニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニル、インダニルカルボニル及びフェナントリルカルボニルが挙げられる。
【００３３】
アリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルとしては、ベンジルカルボニル、ナフチルメチルカルボニル、フルオレニルメチルカルボニル、アントリルメチルカルボニル、ビフェニリルメチルカルボニル、テトラヒドロナフチルメチルカルボニル、クロマニルメチルカルボニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルメチルカルボニル、インダニルメチルカルボニル及びフェナントリルメチルカルボニル、フェネチルカルボニル、ナフチルエチルカルボニル、フルオレニルエチルカルボニル、アントリルエチルカルボニル、ビフェニリルエチルカルボニル、テトラヒドロナフチルエチルカルボニル、クロマニルエチルカルボニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルエチルカルボニル、インダニルエチルカルボニル及びフェナントリルエチルカルボニルが挙げられる。
【００３４】
アシルオキシ基としては、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ又はアリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシが挙げられる。
【００３５】
Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシの具体例としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｎ−プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｎ−ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、tert−ブチルカルボニルオキシ、ｎ−ペンチルカルボニルオキシ、イソペンチルカルボニルオキシ、ヘキシルカルボニルオキシが挙げられる。
【００３６】
アリールカルボニルオキシの具体例としては、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ、アントリルカルボニルオキシ、ビフェニリルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルカルボニルオキシ、クロマニルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニルオキシ、インダニルカルボニルオキシ及びフェナントリルカルボニルオキシが挙げられる。
【００３７】
アリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシの具体例としては、ベンジルカルボニルオキシ、ナフチルメチルカルボニルオキシ、フルオレニルメチルカルボニルオキシ、アントリルメチルカルボニルオキシ、ビフェニリルメチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルカルボニルオキシ、クロマニルメチルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルメチルカルボニルオキシ、インダニルメチルカルボニルオキシ及びフェナントリルメチルカルボニルオキシ、フェネチルカルボニルオキシ、ナフチルエチルカルボニルオキシ、フルオレニルエチルカルボニルオキシ、アントリルエチルカルボニルオキシ、ビフェニリルエチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルカルボニルオキシ、クロマニルエチルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルエチルカルボニルオキシ、インダニルエチルカルボニルオキシ及びフェナントリルエチルカルボニルオキシが挙げられる。
【００３８】
アシルアミノ基としては、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ又はアリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノが挙げられる。
【００３９】
Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノの具体例としては、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ、ｎ−プロピルカルボニルアミノ、イソプロピルカルボニルアミノ、ｎ−ブチルカルボニルアミノ、イソブチルカルボニルアミノ、tert−ブチルカルボニルアミノ、ｎ−ペンチルカルボニルアミノ、イソペンチルカルボニルアミノ、ヘキシルカルボニルアミノが挙げられる。
【００４０】
アリールカルボニルアミノの具体例としては、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ、フルオレニルカルボニルアミノ、アントリルカルボニルアミノ、ビフェニリルカルボニルアミノ、テトラヒドロナフチルカルボニルアミノ、クロマニルカルボニルアミノ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニルアミノ、インダニルカルボニルアミノ及びフェナントリルカルボニルアミノが挙げられる。
【００４１】
アリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルアミノの具体例としては、ベンジルカルボニルアミノ、ナフチルメチルカルボニルアミノ、フルオレニルメチルカルボニルアミノ、アントリルメチルカルボニルアミノ、ビフェニリルメチルカルボニルアミノ、テトラヒドロナフチルメチルカルボニルアミノ、クロマニルメチルカルボニルアミノ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルメチルカルボニルアミノ、インダニルメチルカルボニルアミノ及びフェナントリルメチルカルボニルアミノ、フェネチルカルボニルアミノ、ナフチルエチルカルボニルアミノ、フルオレニルエチルカルボニルアミノ、アントリルエチルカルボニルアミノ、ビフェニリルエチルカルボニルアミノ、テトラヒドロナフチルエチルカルボニルアミノ、クロマニルエチルカルボニルアミノ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルエチルカルボニルアミノ、インダニルエチルカルボニルアミノ及びフェナントリルエチルカルボニルアミノが挙げられる。
【００４２】
低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｎ−プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、ｎ−ペンチルオキシカルボニル、イソペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルなどの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−６アルコキシカルボニル基が挙げられる。
【００４３】
シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。
【００４４】
低級アルケニル基としては、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、イソプロペニル、１−、２−若しくは３−ブテニル、２−、３−若しくは４−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−ヘキセニル、１−シクロペンテニル、１−シクロヘキセニル、３−メチル−３−ブテニルなどのＣ２−６アルケニル基が挙げられる。
【００４５】
低級アルキニル基としては、エチニル、１−若しくは２−プロピニル、１−、２−若しくは３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニルなどのＣ２−６アルキニル基が挙げられる。
【００４６】
モノ低級アルキル置換カルバモイル基としては、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ｎ−プロピルカルバモイル、イソプロピルカルバモイル、ｎ−ブチルカルバモイル、イソブチルカルバモイル、tert−ブチルカルバモイル、ｎ−ペンチルカルバモイル、イソペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイルなどのＣ１−６アルキルでモノ置換されたカルバモイル基が挙げられる。
【００４７】
ジ低級アルキル置換カルバモイル基としては、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、ジｎ−プロピルカルバモイル、ジイソプロピルカルバモイル、ジｎ−ブチルカルバモイル、ジイソブチルカルバモイル、ジtert−ブチルカルバモイル、ジｎ−ペンチルカルバモイル、ジイソペンチルカルバモイル、ジヘキシルカルバモイルなどのＣ１−６アルキルでジ置換されたカルバモイル基が挙げられる。
【００４８】
低級アルコキシカルボニルアミノ基としては、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、イソプロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、イソブトキシカルボニルアミノ、tert−ブトキシカルボニルアミノ、ペンチルオキシカルボニルアミノ、イソペンチルオキシカルボニルアミノ及びヘキシルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。
【００４９】
Ｙ１で表される２価の連結基としては、単結合、−Ｒ４−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ３−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＲ３−、−ＯＲ４−、−ＳＲ４−、−ＮＲ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｏ−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｓ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＮＲ３−Ｒ４−、−Ｒ４−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＣＯＮＨ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＣＯＯ−、−ＣＯＯ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＣＯＯ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＯ−Ｒ４−、−Ｒ４−ＮＨＣＯＯ−Ｒ４−
（式中、Ｒ３は水素原子又は前記低級アルキル基を示し、Ｒ４は、同一又は異なって、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を示す。ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩを示す。）が挙げられる。
【００５０】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、公知化合物と新規化合物を含み、新規化合物は、例えば下記のように、化合物（Ｉ−１）に対しほぼ等モルの化合物（Ｉ−２）を必要に応じて溶媒、縮合剤、塩基からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下に室温から１００℃又は溶媒の沸騰する温度下に１〜２４時間程度反応させることにより有利に進行する。
【００５１】
溶媒としては、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、塩化メチレン、アセトニトリル等が挙げられる。
【００５２】
縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。縮合剤は、エステル又はアミド結合の形成のために用いることができる。
【００５３】
塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、ＮａＨ、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド等が挙げられる。
【００５４】
【化４】
2018158900.tif 000005
【００５５】
（Ｒ１、Ｙ１、Ｒ２は、前記に定義されるとおりである。）
Ｙ１ａ、Ｙ１ｂ、Ｙ１の組み合わせを以下に示す。
【００５６】
【表１】
2018158900.tif 000006
【００５７】
本発明の好ましい一般式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が置換されていてもよいフェニル基であり、Ｒ２が置換されていてもよい含窒素へテルアリール基である。
【００５８】
本発明のがん治療薬のスクリーニング方法は、一酸化窒素（ＮＯ）発生剤及び候補物質の存在下でＤＮＡメチル基転位酵素（ＤＮＭＴ）を含む細胞を培養し、Ｓ−ニトロシル化されたＤＮＭＴを検出する工程を含む。ＮＯ発生剤としては、ＮＯＣ−１８、ＳＮＯＣ（S-ニトロソシステイン）、GSNO（Sーニトロソグルタチオン）等が挙げられる。
【００５９】
ＮＯ発生剤の培養液中濃度としては、10-200μＭ程度である。
Ｓ−ニトロシル化されたＤＮＭＴの検出は、ビオチンスイッチ法後に抗体を用いたウェスタンブロット解析を行ってもよく、図１７に示す抗体アレイを用いた新規NO結合タンパク質の網羅的スクリーニング法に従い行ってもよい。図１７に示す方法は基本的にビオチンスイッチ法と同じであり，抗体アレイ上にDNMTの抗体が存在することが必要となる。ビオチンスイッチ法は、その開発と原理に関する論文（Jaffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH.  Nat Cell Biol. 2001 Feb;3(2):193-7.）、ビオチンスイッチ法に基づく抗体アレイを利用したＳ−ニトロシル化タンパク質の網羅的同定法に関する論文（Numajiri N, Takasawa K, Nishiya T, Tanaka H, Ohno K, Hayakawa W, Asada M, Matsuda H, Azumi K, Kamata H, Nakamura T, Hara H, Minami M, Lipton SA, Uehara T. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 21;108(25):10349-54. doi: 10.1073/pnas.1103503108.）の記載に従い行うことができる。
【実施例】
【００６０】
本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
なお、実施例において、「ｏｌｄ  ＳＮＯＣ」は、SNOC調製後，数日間経過してNOを放出しなくなったものである。
【００６１】
実施例１
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に全長のｈＤＮＭＴ１（Negishi M, Saraya A, Miyagi S, Nagao K, Inagaki Y, Nishikawa M, Tajima S, Koseki H, Tsuda H, Takasaki Y, Nakauchi H, Iwama A. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Feb 23;353(4):992-8）、ｈＤＮＭＴ３Ａ（Suetake I, Mishima Y, Kimura H, Lee YH, Goto Y, Takeshima H, Ikegami T, Tajima S. Biochem J. 2011 Jul 1;437(1):141-8. doi: 10.1042/BJ20110241.）、ｈＤＮＭＴ３Ｂ（Mizuno S, Chijiwa T, Okamura T, Akashi K, Fukumaki Y, Niho Y, Sasaki H. Blood. 2001 Mar 1;97(5):1172-9）でトランスフェクトし、各ＤＮＭＴを発現する細胞を得た。
得られた３種の細胞を、ｏｌｄ  ＳＮＯＣ又はＳＮＯＣ（０，５０、１００又は２００μＭ）の存在下に37℃で30分間培養し、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂのニトロシル化の程度を、ビオチンとアビジンを使用する図１７に示すビオチンスイッチ法に従い測定した。結果を図４，５に示す。
ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂは、ＮＯ発生剤であるＳＮＯＣにより濃度依存的にニトロシル化されることが明らかになった。
【００６２】
実施例２
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に代えて胃粘膜上皮癌由来のAGS細胞を用いた以外は実施例１と同様にしてＳ−ニトロシル化ＤＮＭＴ３Ｂを測定した。ＨＥＫ２９３Ｔについての内在性ＤＮＭＴ１のＳ−ニトロシル化の結果と合わせて図６に示す。
【００６３】
実施例３
組換えｈＤＮＭＴ１、ｈＤＮＭＴ３Ａ、ｈＤＮＭＴ３Ｂについて、ｏｌｄ  ＳＮＯＣ又はＳＮＯＣ（０，０．１、１又は１０μＭ）の存在下に37℃で2時間処理し、図７に示す方法で各ＤＮＭＴの酵素活性を測定した。結果を図８に示す。
図８に示すように、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ＢはＳ−ニトロシル化により酵素活性が低下することが明らかになった。
【００６４】
実施例４
組換えｈＤＮＭＴ１、ｈＤＮＭＴ３Ａ、ｈＤＮＭＴ３Ｂ、ｈＰＴＥＮを組み込んだHEK293細胞について、ｏｌｄ  ＳＮＯＣ又はＳＮＯＣ（100 μＭ）の存在下（＋）又は非存在下（−）、各濃度（０，１０，５０，７５，１００ｎＭまたは１μＭ）の化合物ＤＢＩＣ
【００６５】
【化５】
2018158900.tif 000007
【００６６】
の存在下に37℃で1時間処理し、Ｓ−ニトロシル化の程度を電気泳動により測定した。結果を図１０に示す。ＤＢＩＣは、濃度依存的にＤＮＭＴのＳ−ニトロシル化を抑制することが明らかになった。
【００６７】
実施例５
組換えｈＤＮＭＴ３Ｂを組み込んだHEK293細胞について、ＳＮＯＣ（100 μＭ）の存在下、各濃度（０ｎＭ（ＤＭＳＯのみ、コントロール），１０１ｎＭ，１０２ｎＭ，１０３ｎＭ，１０４ｎＭ）のＤＢＩＣによるＳ−ニトロシル化の程度を測定した。結果を図１１（ａ）に示す。
また、組換えｈＤＮＭＴ３Ｂを組み込んだHEK293細胞について、ＳＮＯＣ（100 μＭ）の存在下、各濃度（０μＭ（ＤＭＳＯのみ），１μＭ，１０μＭ、１００μＭ）のＤＢＩＣ又は阻害剤ＴＦ−３（10μＭ）の存在下に37℃で2時間処理し、ｈＤＮＭＴ３Ｂの酵素活性を測定した。結果を図１１（ｂ）に示す。
Ｓ−ニトロシル化を抑制する濃度ではｈＤＮＭＴ３Ｂの酵素活性にほとんど影響しないことが明らかになった。
【００６８】
実施例６
胃粘膜上皮癌由来のAGS細胞をｏｌｄ  ＳＮＯＣ（１００μＭ）、ＳＮＯＣ（１００μＭ）、ＤＢＩＣ（１００ｎＭ）、５−Ａｚａ（10 μＭ）、ＧＳＮＯ（10 μＭ）の存在下又は非存在下に37℃で72時間培養し、細胞数、ＣＣＮＤ２もしくはＡＣＴＢの発現量を評価した。結果を図１２に示す。
【００６９】
実施例７
図１３に示す方法に従い、in vitroでのがん化形質獲得の評価のために、９６ウェル低接着プレートを用い、スフェアアッセイを行い、播種後１，２，３，４，５，６，７日後のスフェア数を測定した。図１３中、
「化合物」は、ＤＢＩＣを意味する。
「カクテル」は、15% DMSO/17.5% CremophorEL/8.75% ethanol/8.75% HCO-40/50% PBSを意味する。
「ＮＯＣ１８」はＮＯ発生剤であり、126μMの濃度で使用した。
「ＮａＯＨ」は、1.26 mMの濃度で使用した。
「溶媒」は、水である。
「ＦＰＣＫ−１−１」は、培養ヒト大腸腺腫細胞を意味する。
「ＦＰＣＫｐＰ１−４」は、実験的にマウスに生じさせた慢性炎症下にＦＰＣＫ−１−１を置いた際に発生した大腸癌か ら樹立した培養大腸癌細胞株を意味する。
結果を図１４，図１５に示す。
ＤＢＩＣは、ＮＯによるスフェア形成を抑制することが明らかになった。
【００７０】
実施例８
ゼラチンスポンジ移植の前日より25 mg/kg DBIC in 15% DMSO/17.5% CremophorEL/8.75% ethanol/8.75% HCO-40/50% PBSを腹腔内投与した（これ以降，１日１回同様に投与）。つぎに，炎症反応を誘発するゼラチンスポンジ（10×5×3 mm）を皮下に形成した間隙内に移入，さらに，1 x 105個のQR32細胞を移入ゼラチンスポンジ内に接種した。腫瘍を形成したマウスの数ならびに腫瘍径を経時的に測定した。実験は２回繰り返した（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｉ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ＩＩ）。結果を図１６に示す。なお、QR32細胞は炎症反応に伴う活性酸素種や窒素種により癌化するだけでなく悪性化（転移の獲得）を進展することが知られている。ＤＢＩＣが炎症による発がんを抑制できることが明らかになった。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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