(57)【要約】【課題】メラニン合成に重要な役割を果たすことが知られているＭＩＴＦ−Ｍを活性化する、安全且つ安価な活性促進剤を提供する。【解決手段】  メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤であって、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤であって、
アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤。
【請求項２】
メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性促進剤であって、
アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイト（色素形成細胞）の細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ）、ＥＤＮＲＢ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｂ）、及びＳＣＦＲ（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、別名：ｃ−Ｋｉｔ，ＣＤ１１７）の活性促進剤に関する。また、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｍ）の活性促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
白髪の発生は代表的な老徴であり、外見の印象に与える影響が大きい。若々しくいたいと願う生活者の多くは、染毛剤や染毛料を用いて染色することにより白髪化に対応している。しかし、これらの染毛方法は手間がかかること、髪や頭皮に悪影響を及ぼす可能性があること、さらに自然な色に染まり難いこと等の様々な問題があった。このため、染毛剤や染毛料に頼らない抗白髪方法（例えば、白髪化の予防方法やその改善方法）の開発が求められている。
【０００３】
毛髪の色を決定するメラニン色素はメラノサイトで産生される色素成分である。メラノサイトは毛母細胞と隣り合う形で毛球部に存在しており、毛母細胞が細胞分裂して髪が作り出される際に、メラノサイトからメラニン色素が受け渡され、髪の内部に取りこまれる。したがって、メラノサイトにおけるメラニン合成が正常に行われない場合は、髪がメラニンを取り込むことができず、白髪が発生することとなる。
【０００４】
メラノサイトにおけるメラニン合成は、ＭＩＴＦ−Ｍが重要な役割を果たしている（非特許文献１）。ＭＩＴＦ−Ｍは、メラノサイト合成に関わる酵素であるチロシナーゼや、その関連タンパク質であるＴＲＰ−１（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＴＲＰ−２（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の転写制御を行うことが知られている。また、ＭＩＴＦ−Ｍは前記のタンパク質の転写制御以外にも、メラノサイトの分化誘導、遊走、抗アポトーシスに関連することが知られている。
【０００５】
上述の通り、白髪化のメカニズムをターゲットとした研究は盛んに行われている。しかしながら、これらの知見は抗白髪の抜本的解決方法の発見には繋がっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｍｉ  Ｋ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３０７、Ｉｓｓｕｅ５７１０、２００５年２月４日、ｐ．７２０−７２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、メラニン合成に重要な役割を果たすことが知られているＭＩＴＦ−Ｍを活性化する、安全且つ安価な活性促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の様な事情に鑑み、本発明者は白髪化のメカニズムに着目して鋭意研究を重ねた結果、特定の成分がメラノサイトの特定の細胞膜受容体の活性を促進させること、及びＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させることを見出して本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤であって、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤を提供する。
【００１０】
また、本発明は、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性促進剤であって、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とする活性促進剤についても提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進し、さらに安全且つ安価な活性促進剤を提供することができる。したがって、前記の活性促進剤は、メラノサイトにおけるメラニン合成を促進させることができ、例えば白髪化の予防やその改善に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アセンヤク抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ
【図２】ヘマチン液によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ
【図３】サンショウ果皮抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ
【図４】ホップ花抽出物によるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲ遺伝子の発現量を示すグラフ
【図５】アセンヤク抽出物、ヘマチン液、サンショウ果皮抽出物、及びホップ花抽出物によるＭＩＴＦ−Ｍ遺伝子の発現量を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性促進剤に関する。また、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性促進剤に関する。なお、これらの活性促進剤を「本発明の活性促進剤」と称する場合がある。
【００１４】
本発明の活性促進剤は、アセンヤク抽出物及び／又はヘマチンを有効成分とし、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性を促進することを特徴とする。また、これらの細胞質受容体を活性化させることにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する。つまり、本発明の活性促進剤は、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲを活性化することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進し、その結果、メラニン合成をはじめとする各種の生理作用を発揮する。この生理作用の一つとして、例えば、抗白髪作用（白髪化の予防やその改善）が挙げられる。
【００１５】
なお、本発明の活性促進剤がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する理由は、その有効成分が、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対して活性があることによるものであると推察される。つまり、本発明の活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進する活性促進剤といえる。また、本発明の活性促進剤は、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全ての活性を促進することにより、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進する活性促進剤といえる。
【００１６】
アセンヤク抽出物は、アセンヤクの各部位から抽出溶媒を用いて抽出することにより得られるものである。抽出方法は特に限定されず、公知の各種抽出方法を用いることができる。抽出原料としては、アセンヤクの葉、枝、材部、樹皮、根等の部位や、これらを乾燥したものが用いられる。抽出方法としては、常温で、又は加温して、抽出溶媒により抽出すること等が挙げられる。
【００１７】
抽出溶媒としては、通常の植物の抽出に用いられる溶媒であれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、水等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。この中でも、水及びエタノールからなる抽出溶媒、又は水及び１，３−ブチレングリコールからなる抽出溶媒が好ましい。
【００１８】
アセンヤク抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、アセンヤク抽出物をカラムクロマト法等により、分画、精製して用いることもできる。また、アセンヤク抽出物は、減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。なお、アセンヤク抽出物としては、例えば、「アセンヤク抽出液」、「アセンヤク抽出液ＢＧ」（以上、丸善製薬株式会社製）等の市販品を使用することができる。
【００１９】
ヘマチンは、動物（例えば牛や豚）の血液中に含まれるヘモグロビンを原料として得られる鉄を含むポルフィリン化合物である。ヘマチンの作製方法は特に限定されず、公知の各種作製方法を用いることができる。
【００２０】
ヘマチンはそのまま用いてもよいが、必要に応じてメタノール、エタノール、フェノキシエタノール等の一価アルコール、水等を含んだもの（ヘマチン液）を用いることができる。なお、ヘマチン（ヘマチン液）としては、例えば、「グロスフィリンＰ」（一丸ファルコス株式会社製）等の市販品を使用することができる。
【００２１】
本発明の活性促進剤は、頭皮に塗布されることにより経皮的に吸収されて毛根部位に達し、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進させる。本発明の活性促進剤はこれらの作用を有することにより、抗白髪剤として用いることができる。さらに、本発明の活性促進剤は抗白髪剤として、スカルプケア剤等の皮膚外用品や、シャンプー、トリートメント剤等の頭髪料に配合して用いることができる。
【００２２】
本発明の皮膚外用品及び頭髪料は、例えば、液状、ミスト状、霧状、乳液状、クリーム状、ジェル状、ワックス状、フォーム状等の各種剤形に調製して使用できる。また、本発明の所望の効果の発現が阻害されない範囲であれば、例えば、低級アルコール、多価アルコール、糖アルコール、紫外線吸収剤、香料、防腐剤、キレート剤、抗菌剤、酸化防止剤、保湿剤、清涼剤、ビタミン類、カチオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、両性ポリマー、アニオン性ポリマー、植物抽出液、噴射剤、ｐＨ調整剤、アミノ酸、抗炎症剤、収斂剤、色素、増粘剤等のその他の添加剤を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の活性促進剤を皮膚外用品又は頭髪料に使用する場合、アセンヤク抽出物の配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、製剤全体の０．０００２〜０．２質量％の範囲で配合することが好ましく、０．００１〜０．１質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００２〜０．０４質量％の範囲で配合することが更に好ましい。なお、アセンヤク抽出物の配合量は固形分換算を基準とする。
【００２４】
本発明の活性促進剤を皮膚外用品又は頭髪料に使用する場合、ヘマチンの配合量はその使用態様に応じて適宜調整されるが、製剤全体の０．０００１〜０．１質量％の範囲で配合することが好ましく、０．０００５〜０．０５質量％の範囲で配合することがより好ましく、０．００１〜０．０２質量％の範囲で配合することが更に好ましい。なお、ヘマチンの配合量は固形分換算を基準とする。
【００２５】
なお、本発明の活性促進剤は、抗白髪剤以外にも、皮膚の抗白斑治療剤、抗皮膚黒色化剤、美白剤といった皮膚化粧料としても好適に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２７】
［被験物質１（１．０体積％のアセンヤク抽出物を含む培地）の調製］
１５μＬのアセンヤク抽出液（２質量％のアセンヤクエキスを含むアセンヤク抽出物；丸善製薬株式会社製）を１４８５μＬのＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳを１．０体積％含む表皮メラニン細胞用増殖培地；以下、「Ｍｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）」と称する）に添加し、混和後にフィルター濾過処理を行うことにより１．０体積％のアセンヤク抽出物を含む培地を調製した。
【００２８】
［被験物質２（０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地を調製した。
【００２９】
［被験物質３（１．０体積％のヘマチン液を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにグロスフィリンＰ（１質量％のヘマチンを含むヘマチン液；一丸ファルコス株式会社製）を用い、ヘマチン液の終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のヘマチン液を含む培地を調製した。
【００３０】
［被験物質４（０．１体積％のヘマチン液を含む培地）の調製］
ヘマチン液の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質３の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のヘマチン液を含む培地を調製した。
【００３１】
［被験物質５（１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにサンショウ抽出液−Ｊ（０．１８質量％のサンショウ果皮エキスを含むサンショウ果皮抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地を調製した。
【００３２】
［被験物質６（０．１体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地）の調製］
サンショウ果皮抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質５の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のサンショウ果皮抽出物を含む培地を調製した。
【００３３】
［被験物質７（１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地）の調製］
アセンヤク抽出液の代わりにホップ抽出液ＢＧ−ＪＮ（１．８質量％のホップ花エキスを含むホップ花抽出物；丸善製薬株式会社製）を用い、ホップ花抽出物の終濃度が１．０体積％となるように使用したこと以外は被験物質１の調製と同様の操作を行うことにより１．０体積％のホップ花抽出物を含む培地を調製した。
【００３４】
［被験物質８（０．１体積％のホップ花抽出物を含む培地）の調製］
ホップ花抽出物の配合量を０．１体積％としたこと以外は被験物質７の調製と同様の操作を行うことにより０．１体積％のホップ花抽出物を含む培地を調製した。
【００３５】
［陰性対照１の調製］
ブタンジオールを終濃度が１．０体積％となるようにＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）に添加し、陰性対照１を調製した。
【００３６】
［陰性対照２の調製］
ブタンジオールを終濃度が０．１体積％となるようにＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）に添加し、陰性対照２を調製した。
【００３７】
［メラノサイトの調製］
ヒトメラノサイトはＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を培養液とし、Ｔ７５フラスコを用いてＣＯ2インキュベーター（５体積％ＣＯ2、３７℃）内で必要細胞数に達するまで培養した。その後、Ｔ７５フラスコから培地を除き、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを添加、細胞を洗浄後に３ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、すぐに２ｍＬの添加したトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を除去、室温にて１〜２分静置し、細胞を剥離した。その後、１０ｍＬのＨＥＰＥＳを加え細胞を回収し、さらに１０ｍＬのトリプシン中和液を添加・混合し、その細胞溶液を１７０×ｇ、５分間遠心した。沈殿（細胞）にＭｅｄｉｕｍ２５４（ＨＭＧＳ含）を添加、懸濁後に細胞数を血球計算板にて測定することによりヒトメラノサイトを調製した。
【００３８】
［被験物質等の活性試験］
培養して得られたヒトメラノサイトを１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ウェルの２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内（５体積％ＣＯ2、３７℃）で、２４時間培養後、ウェルに被験物質１〜８、陰性対照１、２をそれぞれ０．５ｍＬずつ添加した。その後、２４時間培養し、細胞を回収した。
【００３９】
上記試験から得られた各細胞からトータルＲＮＡを回収した。ＲＮＡ抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＩＳＯＧＥＮ溶液によりサンプルの細胞を溶解した後、クロロホルムを加えて遠心分離し、水相に溶解しているＲＮＡを得た。その後、水相にイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿させＲＮＡを単離した。
【００４０】
ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて行った。具体的には、ＲＮＡが入ったチューブにｃＤＮＡ合成に必要な試薬（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、ＭｇＣｌ2、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ）を加えた後、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間の条件で順次反応させてｃＤＮＡを合成した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲチューブにサンプル（合成させたｃＤＮＡ）を調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＦＲ、ＭＩＴＦ−Ｍの遺伝子の発現量を定量した。ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。各遺伝子の発現量はΔΔＣｔ値として算出した。
【００４１】
増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ２遺伝子のＣｔ値を引いたＣｔ（目的遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ２）＝ΔＣｔ値である。さらにΔＣｔ値より溶媒対照区の平均ΔＣｔ値を引いたΔＣｔ（サンプル処理区）−ΔＣｔ（ブランク区）＝ΔΔＣｔ値とする。ΔΔＣｔ値を乗数項に代入した２−ΔΔＣｔ値が相対発現量となる。
【００４２】
以上の結果を図１〜５に纏めた。得られた結果から、被験物質１〜４（特に被験物質２の０．１体積％のアセンヤク抽出物を含む培地、及び被験物質３の１．０体積％のヘマチン液を含む培地）はＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの活性を促進させると共に、ＭＩＴＦ−Ｍの活性を促進することが示された。ここから、本発明の活性促進剤がＭＩＴＦ−Ｍの活性を強力に促進する理由は、その有効成分であるアセンヤク抽出物及びヘマチン液が、メラノサイトの細胞膜受容体であるＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの全てに対して活性があることによるものであると推察される。つまり、本発明の活性促進剤は、ＭＩＴＦ−Ｍの活性に由来する前記の３つの細胞膜受容体に作用し、その相乗効果により強力なＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用を発揮すると推察される。
【００４３】
その一方で、被験物質５〜８（サンショウ果皮抽出物を含む培地、及びホップ花抽出物を含む培地）では、ＭＩＴＦ−Ｍの活性促進作用がほとんど見られなかった。これは、サンショウ果皮抽出物及びホップ花抽出物が、ＴＧＦＢＲ２、ＥＤＮＲＢ、及びＳＣＦＲの細胞膜受容体のうち、２つ以下の細胞膜受容体しか活性を示さないことに起因すると推察される。つまり、サンショウ果皮抽出物及びホップ花抽出物はＭＩＴＦ−Ｍの活性に由来する前記の細胞膜受容体を活性化するものの、その２つ以下にしか活性を示さないため、結果的にＭＩＴＦ−Ｍ活性促進作用は低くなると推察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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