(57)【要約】【課題】本発明は、実用化に適したヒスチジンの測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を用いる、被検試料中のヒスチジンの測定方法、ヒスチジン測定用キット、ヒスチジン測定用検出系を提供する。本発明はさらに、前記方法を利用した潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法を提供する。本発明によれば、ヒスチジンを正確に、短時間で、簡便に、かつ安価に測定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を用いる、被検試料中のヒスチジンの測定方法。
【請求項２】
被検試料にヒスチジン脱炭酸酵素を作用させ、続いて４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を作用させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素が、ヒスタミン脱水素酵素およびヒスタミン酸化酵素からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒスチジン脱炭酸酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選ばれる１または２以上のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【請求項５】
ヒスチジン脱炭酸酵素がフォトバクテリウム属細菌に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フォトバクテリウム属細菌がフォトバクテリウム・フォスフォリウムである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒスチジン脱炭酸酵素が形質転換体により産生される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
形質転換体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である、請求項７に記載の方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の縮重変異体を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
ヒスタミン酸化酵素が、以下の（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選ばれる１または２以上のタンパク質である、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
（Ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
ヒスタミン酸化酵素がアルスロバクター属細菌に由来する、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アルスロバクター属細菌がアルスロバクター・クリスタロポエテスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒスタミン酸化酵素が形質転換体により産生される、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
形質転換体は、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である、請求項１２に記載の方法。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列の縮重変異体を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を作用させた後の被検試料中の４−イミダゾリルアセトアルデヒド、還元型電子供与体、アンモニアおよび過酸化水素からなる群より選ばれる少なくとも１つを測定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスチジン測定用キット。
【請求項１６】
反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
デバイス、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスチジン測定用検出系。
【請求項１８】
反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、請求項１７に記載の検出系。
【請求項１９】
検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスチジン測定用酵素センサー。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により測定された被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎または心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスチジンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は生体の構成要素として非常に重要であり、幾つかのアミノ酸が健康状態の指標となり得ることが知られている。例えばヒスチジンは、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん、生活習慣病のバイオマーカーであることが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜５）。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＭＳなどの機器を用いた方法、蛍光分析法（例えば、特許文献２）、ガラクトースオキシダーゼを用いる方法（例えば、非特許文献６）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０５６６３１号
【特許文献２】特開２００１−２４２１７４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｅｖｙ  Ｈ（２００４）"Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ"Ｏｒｐｈａｎｅｔ
【非特許文献２】Ｋａｗａｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｉａ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ"  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１１６，３４０‐３４６，２００５
【非特許文献３】櫻林郁之介、熊坂一成監修（２００８）最新臨床検査項目辞典  医歯薬出版株式会社，ｐｐ．２０５
【非特許文献４】Ｈｉｓａｍａｔｓｕ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（１）
【非特許文献５】Ｍｉｙａｇｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４１４３
【非特許文献６】Ｈａｓｅｂｅ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ６６  （２０００）  １２−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の方法では大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。ガラクトースオキシダーゼを用いる方法（非特許文献６）によれば簡単にヒスチジンを測定できるとされているが、生体試料中のガラクトースの影響を受けることやヒスタミンに対しても反応を示すことから生体試料中のヒスチジンを特異的に測定する点においては不適である。
【０００６】
本発明は、実用化に適したヒスチジンの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を提供する。
〔１〕ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を用いる、被検試料中のヒスチジンの測定方法。
〔２〕被検試料にヒスチジン脱炭酸酵素を作用させ、続いて４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を作用させる、〔１〕に記載の方法。
〔３〕４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素が、ヒスタミン脱水素酵素およびヒスタミン酸化酵素からなる群より選ばれる少なくとも１つである、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕ヒスチジン脱炭酸酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選ばれる１または２以上のタンパク質である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
〔５〕ヒスチジン脱炭酸酵素がフォトバクテリウム属細菌に由来する、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕フォトバクテリウム属細菌がフォトバクテリウム・フォスフォリウムである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕ヒスチジン脱炭酸酵素を産生する形質転換体を用いる、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕形質転換体は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である、〔７〕に記載の方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の縮重変異体を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔９〕宿主がエシェリヒア属細菌である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕宿主がエシェリヒア・コリである、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕ヒスタミン酸化酵素が、以下の（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選ばれる１または２以上のタンパク質である、〔３〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
（Ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質。
〔１２〕ヒスタミン酸化酵素がアルスロバクター属細菌に由来する、〔３〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕アルスロバクター属細菌がアルスロバクター・クリスタロポエテスである、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕ヒスタミン酸化酵素が形質転換体により産生される、〔３〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕形質転換体は、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群より選ばれる１または２以上のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である、〔１４〕に記載の方法。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列の縮重変異体を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１６〕宿主がエシェリヒア属細菌である、〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕宿主がエシェリヒア・コリである、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を作用させた後の被検試料中の４−イミダゾリルアセトアルデヒド、還元型電子供与体、アンモニアおよび過酸化水素からなる群より選ばれる少なくとも１つを測定する、〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１９〕ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスチジン測定用キット。
〔２０〕反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕デバイス、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスチジン測定用検出系。
〔２２〕反応用緩衝液または緩衝塩、４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および還元型電子供与体検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、〔２１〕に記載の検出系。
〔２３〕検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む、ヒスタミン測定用酵素センサー  。
〔２４〕〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の方法により測定された被検試料中のヒスタミンの量が基準量よりも低ければ被験者は潰瘍性大腸炎または心臓悪液質、生活習慣病またはがんに罹患していると判定し、被検試料中のヒスタミンの量が基準量よりも高ければ被検者はヒスタミン血症に罹患していると判定する、潰瘍性大腸炎、心臓悪液質、生活習慣病、がんまたはヒスチジン血症の判定方法。
〔２５〕〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の方法により測定された潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者の被検試料中のヒスタミンの量が基準量よりも低ければ被験者は炎症性腸疾患の再燃リスクが高いと判定し、被検試料中のヒスタミンの量が基準量よりも高ければ被検者は再燃リスクが低いと判定する、潰瘍性大腸炎の判定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒスチジンを正確に、短時間で、簡便に、かつ安価に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒスチジン脱炭酸酵素（ＨｉｓＤＣ）とヒスチジンを反応させた後にヒスタミン酸化酵素（ＨＯＸ）を加えた際の各濃度のヒスチジンに対する検量線である。
【図２】図２は、ＨｉｓＤＣとヒスチジンおよびヒスタミン脱水素酵素を同時に加えた際の各濃度のヒスチジンに対する検量線である。
【図３】図３は、ヒスチジン測定時の吸光度の値を１００とした際の各アミノ酸に対する比活性を示すグラフである。
【図４】図４は、ＨｉｓＤＣ及びＨＯＸを用いて求めたヒト血漿中のヒスチジン定量値と他機器の定量値をそれぞれ示すグラフである。
【図５】図５は、ＨｉｓＤＣとヒスチジンを反応させた後にＨＯＸを加えた際の各濃度のヒスチジンに対する検量線である。
【図６】図６は、ＨｉｓＤＣ及びＨＯＸを用いて求めたヒト血漿中のヒスチジン定量値と他機器の定量値をそれぞれ示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明においては、被検試料中のヒスチジンの測定にあたり、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾールアセトアルデヒド生成酵素を用いる。通常は、被検試料にヒスチジン脱炭酸酵素を作用させ、続いて４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を作用させる。
【００１１】
ヒスチジン脱炭酸酵素（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＨｉｓＤＣ；ＥＣ  ４．１．１．２２）は、ヒスチジンをヒスタミンに転換する酵素である。ヒスチジン脱炭酸酵素は、ヒスチジンに特異的に作用することが好ましく、また、中性付近で活性を示すことが好ましい。さらに、補助タンパク質を必要としないことが好ましい。
【００１２】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とは、ヒスタミンから４−イミダゾリルアセトアルデヒドを生成する酵素であり、例えば、ヒスタミン脱水素酵素およびヒスタミン酸化酵素が挙げられる。ヒスタミン脱水素酵素（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＨｉｓＤＨ；ＥＣ  １．４．９９）は、ヒスタミンから４−イミダゾリルアセトアルデヒドを生じる酵素であり、好ましくは、ヒスタミンを受容体の存在下酸化的脱アミノ反応により４−イミダゾリルアセトアルデヒドに転換する酵素である。ヒスタミン酸化酵素（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｏｘｙｄａｓｅ；ＥＣ  １．４．３．２２）は、ヒスタミンと水と酸素から４−イミダゾリルアセトアルデヒドを生成する酵素である。ヒスタミン脱水素酵素としては、ヒスタミンに特異的に作用する（例えば、カダベリン、プトレッシンなど他のアミンに実質的に作用しない）ヒスタミン脱水素酵素が好ましい。ヒスタミン酸化酵素はヒスタミンに特異的に作用する（例えば、トリプトファン、アルギニン、プロリンなど他のアミノ酸に実質的に作用しない）ヒスタミン酸化酵素が好ましい。
【００１３】
各酵素は、上記活性を発揮し得る酵素であれば特に限定されない。ヒスチジン脱炭酸酵素としては例えば、フォトバクテリウム属細菌（例えば、フォトバクテリウム・フォスフォリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ））、モルガネラ属細菌（例えば、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、クレブシエラ属細菌（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、ストレプトコッカス属細菌（例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ラクトバチルス属細菌（例えば、ラクトバチルス３０ａ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ３０ａ）、ラクトバチルス・サエリムネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバチルス・ブチネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ））、オエノコッカス属細菌（例えば、オエノコッカス・オエニ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ））、テトラゲノコッカス属細菌（例えば、テトラゲノコッカス・ムリアティクス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｒｉａｔｉｃｕｓ）、テトラゲノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）等）、クロストリジウム属細菌（例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等）、マイクロコッカス属細菌（例えば、マイクロコッカス・エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）等）、スタフィロコッカス属細菌（例えば、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）等）、ラオウルテラ属細菌（例えば、ラオウルテラ・プランティコラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）等）、エンテロバクター属細菌（例えば、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））等の細菌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）７９（４），８６１−８７１、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  １０４（１）：１９４−２０３）に由来するヒスチジン脱炭酸酵素が挙げられる。前記細菌のうち、フォトバクテリウム属細菌が好ましく、フォトバクテリウム・フォスフォリウムがより好ましい。
【００１４】
ヒスタミン脱水素酵素としては、例えば、特許第３７８２６２１号公報に記載のヒスタミン脱水素酵素；キッコーマンバイオケミファ株式会社製臨床診断薬用酵素「ヒスタミンデヒドロゲナーゼ」；ノカルディオイデス属細菌（例えば、ノカルディオイデス・シンプレックス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）等）、アルスロバクター属細菌（例えば、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）等）など細菌由来のヒスタミン脱水素酵素（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８９（２０００）１８３−１８７）；アミンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．２）のうちヒスタミンに作用するものが挙げられる。アミンデヒドロゲナーゼとしては例えば、シュードモナス属細菌（例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シトロバクター属細菌（例えば、シトロバクター・フレウンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、アルカリゲネス属細菌（例えば、アルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ））が挙げられる。
【００１５】
ヒスタミン酸化酵素としては、例えば、アルスロバクター属細菌（例えば、アルスロバクター・クリスタロポイデス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ：Ｔａｌａｎｔａ  ７７（２００９）１１８５−１１９０）、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ：Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．９７（２００４）：１０４−１０）等）、アスペルギルス属細菌（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ  ｎｉｇｅｒ：Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．９７（２００４）：１０４−１０）等）、アルカリゲネス・キシロソキシダンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ：特開２００３−６１６５０号公報等）等の細菌由来のヒスタミン酸化酵素が挙げられる。
【００１６】
各酵素は、各酵素活性を有するタンパク質であればよい。以下、ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質及びヒスタミン酸化酵素を例にとって順に説明する。
【００１７】
［ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質］
ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質の例としては、以下の（Ａ）のタンパク質が挙げられる：（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ａ）のタンパク質は、フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素である。
【００１８】
ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質の他の例としては、（Ａ）のタンパク質に相同のタンパク質が挙げられ、以下の（Ｂ）のタンパク質が好ましい：
（Ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００１９】
アミノ酸配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。  
【００２０】
上述したアミノ酸配列および後述する塩基配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００２１】
ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質のさらに他の例としては、（Ａ）のタンパク質の改変タンパク質が挙げられ、以下の（Ｃ）のタンパク質が好ましい：
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
【００２２】
上記タンパク質では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００２３】
置換、欠失、挿入、付加等の変異の対象であるアミノ酸残基は、通常は天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
【００２４】
配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列番号３のアミノ酸配列において、変異導入後のアミノ酸配列のヒスチジン脱炭酸酵素活性等を向上させるような、１以上のアミノ酸残基の変異が導入されるアミノ酸配列を決定することができる。
【００２５】
配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。本明細書において用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２６】
（Ｂ）および（Ｃ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（Ａ）のタンパク質のヒスチジン脱炭酸酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
【００２７】
ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質は、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００２８】
ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質はまた、当該タンパク質の産生が所望される宿主細胞の種類に応じて、翻訳後修飾（例、グリコシル化）タンパク質、または翻訳後非修飾（例、非グリコシル化）タンパク質であってもよい。原核生物では、タンパク質が翻訳後修飾されないこと、ならびに動物細胞、植物細胞、昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）、および下等真核生物（例、酵母）では、タンパク質の翻訳後修飾が大きく異なることが一般に知られている〔例、Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９），３０（１９），３−２００を参照〕。したがって、天然で植物細胞に由来するタンパク質を、このような異種宿主細胞で産生させた場合、天然では生じ得ない、翻訳後非修飾タンパク質、または異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を入手し得ると考えられる。
【００２９】
上述したようなヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質としては、例えば、フォトバクテリウム・フォスフォリウムに由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。  
【００３０】
［ヒスタミン酸化酵素のタンパク質］
ヒスタミン酸化酵素のタンパク質の例としては、以下の（Ｄ）のタンパク質が挙げられる：（Ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ｄ）のタンパク質は、アルスロバクター・クリスタロポイデス由来のヒスタミン酸化酵素である。
【００３１】
ヒスタミン酸化酵素のタンパク質の他の例としては、（Ｄ）のタンパク質に相同のタンパク質が挙げられ、以下の（Ｅ）のタンパク質が好ましい：
（Ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質。
アミノ酸配列との同一性％、配列の相同性の決定方法の各例及び好ましい例は、ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質について既に述べたものと同様である。
【００３２】
ヒスタミン酸化酵素のタンパク質のさらに他の例としては、（Ｄ）のタンパク質の改変タンパク質が挙げられ、以下の（Ｆ）のタンパク質が好ましい：
（Ｆ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質。
変異（欠失、置換、付加及び挿入）の個数、導入部位、変異の対象であるアミノ酸残基の種類、導入位置の選定、の各例及び好ましい例は、ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質の説明について既に述べたものと同様である。
【００３３】
（Ｅ）および（Ｆ）のタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（Ｄ）のタンパク質のヒスタミン酸化酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
【００３４】
ヒスタミン酸化酵素のタンパク質は、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよいし、当該タンパク質の産生が所望される宿主細胞の種類に応じて、翻訳後修飾（例、グリコシル化）タンパク質、または翻訳後非修飾（例、非グリコシル化）タンパク質であってもよい。異種部分の例は、ヒスチジン脱炭酸酵素のタンパク質の説明について既に述べたものと同様である。
【００３５】
上述したようなヒスタミン酸化酵素のタンパク質としては、例えば、アルスロバクター・クリスタロポイデスに由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
【００３６】
本発明において、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素としては、それぞれ天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または各酵素を産生する形質転換体から得ることができる。また、本発明において、各酵素自体を用いてもよいが、ヒスチジン脱炭酸酵素を産生する形質転換体、または４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を産生する形質転換体を用いてもよい。
【００３７】
ヒスチジン脱炭酸酵素を産生する形質転換体は、ヒスチジン脱炭酸酵素を産生できる、またはヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを発現してヒスチジン脱炭酸酵素を産生できる宿主細胞であり、例えば、ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を産生する形質転換体は、斯かる酵素を産生できる、または斯かる酵素をコードするポリヌクレオチドを発現して斯かる酵素を産生できる宿主細胞であり、例えば、４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。以下、形質転換体についてヒスチジン脱炭酸酵素及びヒスタミン酸化酵素を例にとって順に説明する。
【００３８】
［ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチド］
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドとしては例えば、上記した（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられ、以下に述べるポリヌクレオチドが好ましい。
【００３９】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドの例としては、（ａ）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする。配列番号１の塩基配列は、ｃＤＮＡに対応する。なぜならば、（ａ）のポリヌクレオチドは、原核生物であるフォトバクテリウム・フォスフォリウムに由来するためである。したがって、（ａ）のポリヌクレオチド、ならびに後述する（ｂ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、天然に生じるポリヌクレオチドではない。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、用語「開始コドン」とは、タンパク質の合成開始を指定するコドンをいう。開始コドンとしては、例えば、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）、バリン残基をコードするコドン（例、ＧＵＧ）、イソロイシン残基をコードするコドン（例、ＡＵＡ）、およびロイシン残基をコードするコドン（例、ＵＵＧ）が挙げられるが、メチオニン残基をコードするコドン（例、ＡＵＧ）が好ましい。本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明のポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。  
【００４１】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドのさらにまた他の例としては、縮重ポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｂ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの縮重変異体を含むポリヌクレオチド。  
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。  
【００４３】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。  
【００４４】
【表１】
2018046814.tif 000002
【００４５】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明の縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
【００４６】
縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜５００個、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。  
【００４７】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できるが、例えば、異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞の種類に適合するように作製されてもよい。異種タンパク質の発酵生産に汎用される宿主細胞としては、例えば、後述する任意の微生物が挙げられるが、細菌および酵母が好ましい。このような細菌および酵母としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ならびにサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が挙げられる。したがって、このような微生物（例、細菌、酵母）における低頻度コドンの非低頻度コドンへの変更、およびゲノムＧＣ含量適合性等の要素の考慮が好ましい。
（ｂ）のポリヌクレオチドとしては、配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の縮重変異体であり、配列番号１におけるコドンが大腸菌での発現を考慮して改変された塩基配列である。
【００４８】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドの他の例としては、配列番号１で表されるポリヌクレオチドまたはその縮重変異体の相同ポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｃ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体（好ましくは配列番号２で表される塩基配列）と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４９】
塩基配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００５０】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドのさらに他の例としては、配列番号１で表されるポリヌクレオチドまたはその縮重変異体のアナログポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｄ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列またはその縮重変異体（好ましくは配列番号２で表される塩基配列）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５１】
本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。  
【００５２】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位とは、当該ポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする単位をいう。ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞が挙げられる。
【００５３】
発現ベクターは、ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明のヒスチジン脱炭酸酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
【００５４】
発現ベクターは、ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。発現ベクターは、ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、ヒスチジン脱炭酸酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、ヒスチジン脱炭酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、ヒスチジン脱炭酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。これにより、ヒスチジン脱炭酸酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断がタンパク質発現後に可能となる。
【００５５】
ヒスチジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞は、ヒスチジン脱炭酸酵素を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびこれをコードするポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞はまた、上記プロモーターに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００５６】
遺伝子が組込まれた発現ベクターの宿主への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００５７】
［ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチド］
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドとしては例えば、上記した（Ｄ）〜（Ｆ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられ、以下に述べるポリヌクレオチドが好ましい。
【００５８】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの例としては、（ｅ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号６の塩基配列は、配列番号８のアミノ酸配列をコードする。配列番号６の塩基配列は、ｃＤＮＡに対応する。なぜならば、（ｅ）のポリヌクレオチドは、原核生物であるアルスロバクター・クリスタロポエテスに由来するためである。したがって、（ｅ）のポリヌクレオチド、ならびに後述する（ｆ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドは、天然に生じるポリヌクレオチドではない。
【００５９】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドのさらにまた他の例としては、縮重ポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｆ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｆ）（ｅ）のポリヌクレオチドの縮重変異体を含むポリヌクレオチド。
（ｆ）のポリヌクレオチドとしては、配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号７で表される塩基配列は、配列番号６で表される塩基配列の縮重変異体であり、配列番号６におけるコドンが大腸菌での発現を考慮して改変された塩基配列である。
【００６０】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの他の例としては、配列番号６で表されるポリヌクレオチドまたはその縮重変異体の相同ポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｇ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体（好ましくは配列番号７で表される塩基配列）と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつヒスチジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
塩基配列との同一性％の例および好ましい例は、ヒスチジン脱炭酸酵素について既に述べたものと同様である。
【００６１】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドのさらに他の例としては、配列番号６で表されるポリヌクレオチドまたはその縮重変異体のアナログポリヌクレオチドが挙げられ、以下の（ｈ）のポリヌクレオチドが好ましい：
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列またはその縮重変異体（好ましくは配列番号７で表される塩基配列）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヒスタミン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００６２】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位とは、当該ポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする単位をいう。ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞が挙げられる。
【００６３】
発現ベクターは、ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターの例および好ましい例は、ヒスチジン脱炭酸酵素について既に述べたものと同様である。
【００６４】
ヒスタミン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞は、ヒスタミン酸化酵素を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞は、ヒスタミン酸化酵素およびこれをコードするポリヌクレオチドに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞はまた、上記プロモーターに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。宿主細胞、形質転換体、発現ベクターの宿主への導入（形質転換）の例および好ましい例は、ヒスチジン脱炭酸酵素の説明について既に述べたものと同様である。
【００６５】
本発明において、被検試料は、ヒスチジンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）、食品（例、栄養ドリンク、アミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のヒスチジンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。
【００６６】
被検試料が生体由来試料の場合、被検試料が採集される被検者は特に限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等のヒスチジンがバイオマーカーとなり得る疾患に罹患しているかの確認を要望する被検者であることが好ましい。これにより、罹患しているか否か、罹患リスクを正確に、短時間で、簡便に、かつ安価に分析することができる。疾患が潰瘍性大腸炎の場合、潰瘍性大腸炎の寛解期にある被検者であることが好ましい。これにより、潰瘍性大腸炎の再燃リスクを評価することができる。
【００６７】
ヒスチジンの測定における検出対象は、被検試料中のヒスチジンを測定できる限り特に限定されず、生成する４−イミダゾリルアセトアルデヒド、還元型電子供与体、およびアンモニア、過酸化水素等の副生物のいずれでもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。
【００６８】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン脱水素酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。  
【００６９】
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
【００７０】
ヒスタミン脱水素酵素により触媒される反応
ヒスタミン＋酸化型電子供与体→４−イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ2＋還元型電子供与体１−ＰＭＳＨ2
【００７１】
共役反応
還元型電子供与体＋テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）→酸化型電子供与体＋ＷＳＴ−８（赤色）
【００７２】
電子供与体としては、１−メトキシフェナジンメトスルフェート（１−メトキシＰＭＳ）〔酸化型〕／１−ＰＭＳＨ2〔還元型〕が挙げられる。
【００７３】
上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン脱水素酵素に加えて、電子供与体およびテトラゾリウム塩を用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、電子供与体およびテトラゾリウム塩、ならびにヒスタミン脱水素酵素を混合して酵素反応に供し、最後に、生成したＷＳＴ−８（赤色）の吸光度（約４７０ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。  
【００７４】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、ヒスチジン測定の際の反応および共役反応としては、例えば、以下の反応が挙げられる。
【００７５】
ヒスチジン脱炭酸酵素により触媒される反応
ヒスチジン→ヒスタミン＋ＣＯ2
【００７６】
ヒスタミン酸化酵素により触媒される反応
ヒスタミン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→４−イミダゾリルアセトアルデヒド＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
【００７７】
共役反応（ペルオキシダーゼにより触媒される反応）
２Ｈ2Ｏ2＋４−アミノアンチピリン＋フェノール→キノンイミン色素＋４Ｈ2Ｏ
【００７８】
上記共役反応を利用する場合、ヒスチジンの測定は、ヒスチジン脱炭酸酵素およびヒスタミン酸化酵素に加えて、４−アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料をヒスチジン脱炭酸酵素との酵素反応に供し、続いて、４−アミノアンチピリン（４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合して得られる混合試料を酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ  ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、ヒスチジンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。  
【００７９】
また、ヒスタミン酸化酵素は過酸化水素電極に用いることができる。斯かる過酸化水素電極を用いることで、被検試料中のヒスタミンの量を特異的に評価することができる。  
【００８０】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、ヒスタミン測定用キットに含めることができる。ヒスタミン測定キットは、他の試薬、例えば反応用緩衝液、緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つをさらに含むことができる。  
【００８１】
反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために利用できる。
【００８２】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素がヒスタミン酸化酵素である場合、過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に利用できる。斯かる試薬としては例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４―アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。
【００８３】
アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。
【００８４】
４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬としては、例えば１−メトキシＰＭＳ等の電子供与体が挙げられる。
【００８５】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、デバイスと共に、ヒスチジン測定用検出系の構成要素とすることができる。各酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、各酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。各酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。  
【００８６】
ヒスチジン測定用検出系は、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては例えば、反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬および４−イミダゾリルアセトアルデヒド検出試薬の少なくとも一つが挙げられる。ヒスチジン測定用検出系では、上記他の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、上記他の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
【００８７】
デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素と接触させて、ヒスチジンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素とヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素とを混合して、両酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要に応じて両酵素と）の混合を可能にする流路、および両酸化酵素によりヒスチジンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のヒスタミンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。
【００８８】
ヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素は、ヒスチジン測定用酵素センサーとして利用することもできる。ヒスチジン測定用酵素センサーは例えば、検出用電極、および検出用電極に固定または配置されたヒスチジン脱炭酸酵素および４−イミダゾリルアセトアルデヒド生成酵素を含む。両酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。  
【００８９】
ヒスタミン酸化酵素の場合の検出用電極としては例えば、過酸化水素検出用電極が挙げられ、より具体的には例えば、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極が挙げられる。これにより、ヒスタミン酸化酵素活性によりヒスタミンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、被検物質中のヒスチジンの測定が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
【００９０】
本発明は、被検者のクローン病、潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、ヒスチジン血症、心臓悪液質、がん等の疾患への罹患の予測、診断に利用することができる。炎症性腸疾患、心臓悪液質、生活習慣病、がんの患者ではヒスチジン量が低下し、ヒスチジン血症の患者ではヒスチジン量が増大する。そのため、例えば、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を基準量（健常者の基準量など）と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも低ければ、被検者は炎症性腸疾患または心臓悪液質に罹患していると判定することができる。上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を基準量（健常者の基準量など）と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量よりも高ければ、被検者はヒスチジン血症に罹患していると判定することができる。
【００９１】
また、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にある場合には、潰瘍性大腸炎の再燃リスクの評価に利用することができる。例えば、被検者が潰瘍性大腸炎の寛解期にあることが明らかな場合、上記測定方法において測定された被検試料中のヒスチジンの量を基準量（潰瘍性大腸炎の寛解期にあり再燃を生じなかった被検者に基づく基準量、健常者の基準量など）と比較し、被検試料中のヒスチジンの量が基準量より少ない場合には潰瘍性大腸炎への再燃リスクが高く、多い場合にはリスクが低いという基準と比較することにより、被検者の潰瘍性大腸炎の再燃リスクを判定することができる。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９３】
〔実施例１〕ＨｉｓＤＣの発現と精製
大腸菌を用いたＨｉｓＤＣの組替え発現系を以下のようにして構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。フォトバクテリウム・フォスフォリウム由来のヒスチジン脱炭酸酵素（ＨｉｓＤＣ）を大腸菌で効率的に発現させるため、ＨｉｓＤＣのアミノ酸配列（配列番号３）からＧＥＭＥＴＸＹを用いて一般的なコドン頻度に基づきコドン最適化ＨｉｓＤＣ（配列番号２）を取得した。コドン最適化ＨｉｓＤＣ（配列番号２）をＤＮＡプライマー１（配列番号４：５’TATCGAAGGTCGTCATATGACCACCC３’）およびＤＮＡプライマー（配列番号５：５’TTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAGGC３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮＤＥＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＥＴ１６ｂ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物から、標準的な方法に従ってライゲーション産物を得て、大腸菌ＸＬ−１０  ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ−１０−ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。以降、目的遺伝子が挿入されたプラスミドをｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ−ＢＬ２１（ＤＥ３）と、それぞれ呼ぶ。
【００９４】
ＨｉｓＤＣの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ１６ｂ−ＨｉｓＤＣ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２Ｌに前培養液２０ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。２５℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、２５℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに集菌した。
【００９５】
破砕用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ  ＰＬＰ  ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ，久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ  ＰＬＰ，ｐＨ８．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．２μＭ  ＰＬＰ，ｐＨ８．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＨｉ  ｐｒｅｐ  ２６／１０  ｄｅｓａｌｔｉｎｇを用いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に溶液交換した。ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ６ｍＬを用いて陰イオン交換カラムによる精製を４℃にて実施した。平衡化には５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を用いて、溶出には５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０を用いて、ＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出した。
【００９６】
〔実施例２〕活性確認
実施例１で調製したＨｉｓＤＣの活性評価は下記手順にて行った。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１０μＬ、各濃度ヒスチジン溶液１０μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液を９６穴マイクロプレートに入れて波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ社）で測定した。図１は各濃度のヒスチジン溶液に対する検量線を示す。
【００９７】
また、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を７５μＬ、超純水１５μＬ、各濃度ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ溶液５μＬ、ヒスタミン脱水素酵素を２５μＬ、検出溶液２５μＬを加え混合した溶液を９６穴マイクロプレートに入れて波長４７０ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダーで測定した。図２は各濃度のヒスチジン溶液に対する検量線を示す。
【００９８】
〔実施例３〕ヒスタミン酸化酵素の発現と精製
大腸菌を用いたヒスタミン酸化酵素の組替え発現系を以下のようにして構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。アルスロバクター・クリスタロポエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）由来のヒスタミン酸化酵素（ＨＯＸ）を大腸菌で効率的に発現させるため、ＨＯＸのアミノ酸配列（配列番号８）からＧＥＭＥＴＸＹを用いて一般的なコドン頻度に基づきコドン最適化ＨＯＸ（配列番号７）を取得した。コドン最適化ＨＯＸ（配列番号７）をＤＮＡプライマー３（配列番号９：５’ATCGAGGGAAGGATTTCACATATGGCAGAATATCTGCTGCCTGGCAC３’）およびＤＮＡプライマー４（配列番号１０：５’ATTACCTGCAGGGAATTCGGATCCTTAATTCGGACAACGGC３’）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮＤＥＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＭＡＬ−ｃ５Ｘ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ株式会社）を制限酵素消化し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物から、標準的な方法に従ってライゲーション産物を得て、大腸菌ＸＬ−１０  ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ−１０−ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。以降、目的遺伝子が挿入されたプラスミドをｐＭＡＬ−ｃ５Ｘ−ＨＯＸ、ｐＭＡＬ−ｃ５Ｘ−ＨＯＸによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＭＡＬ−ｃ５Ｘ−ＨＯＸ−ＢＬ２１（ＤＥ３）と、それぞれ呼ぶ。
【００９９】
ヒスタミン酸化酵素の調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＭＡＬ−ｃ５Ｘ−ＨＯＸ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５０ｍｌを２５０ｍｌ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２Ｌに前培養液２０ｍｌを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに集菌した。
【０１００】
破砕用バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ，久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。洗浄バッファーは（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）、溶出バッファーは（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  マルトース  ｐＨ７．０）をそれぞれ使用した。溶出画分を回収し、最終濃度０．１ｍＭとなるように硫酸銅を添加して３０分間４℃でインキュベートした。ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＨｉ  ｐｒｅｐ  ２６／１０  ｄｅｓａｌｔｉｎｇを用いて５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０に溶液交換した。
【０１０１】
〔実施例４〕基質特異性
実施例１で調製したＨｉｓＤＣの基質特異性を下記手順にて行った。ＨｉｓＤＣを０．２ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、超純水１０μＬ、各濃度ヒスチジン溶液１０μＬを加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。この溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた溶液を９６穴マイクロプレートに入れて波長４７０ｎｍ、８００ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ社)で測定した。図３に各アミノ酸溶液に対する比活性を示す。
【０１０２】
〔実施例５〕血漿中Ｈｉｓの定量測定（１）
実施例１で調製したＨｉｓＤＣを用いてヒト血漿中のＨｉｓの定量測定を行った。ＨｉｓＤＣを０．６ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を２５μＬ、７．５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ５μＬ、超純水５μＬ、各濃度ヒスチジン溶液１０μＬもしくはヒト血漿を加え混合した溶液を２５℃、１５分間インキュベートした。９６穴マイクロプレートにこの溶液５０μＬに対してヒスタミン脱水素酵素（チェックカラーヒスタミン、キッコーマンバイオケミファ社）を５０μＬ、検出溶液５０μＬを加えた。ヒスタミン脱水素酵素を加え混合する前および混合後一定時間の４７０ｎｍおよび８００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ  ４７０ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ４７０ｎｍ（後）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ社）にて測定した。
【０１０３】
反応前後の各測定ポイントにおける吸光度の値を用いて、酵素液添加の前後における吸光度の変化量（ΔＡｂｓ）は、（Ａｂｓ  ４７０ｎｍ（後）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)−（Ａｂｓ  ４７０ｎｍ（前）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前））×１００／１５０として求めた。各値から未反応の溶液の吸光度をブランクとして差引した後、検体としてＨｉｓ水溶液を用いた際のΔＡｂｓとＨｉｓ濃度との関係から検量線を作成し、検体としてヒト血漿を用いた際のΔＡｂｓから、ヒト血漿中のＨｉｓ濃度を求めた。検量線は、各Ｈｉｓ濃度において３回実験を行った際の平均値を用いて作成し、同一ロットのヒト血漿を３回測定して、ＬＣ−ＭＳによる分析値（７３．５μＭ）と比較した。結果を図４として示す。
【０１０４】
〔実施例６〕血漿中Ｈｉｓの定量測定（２）
実施例１で調製したＨｉｓＤＣおよび実施例３で調製したＨＯＸを用いてヒト血漿中のＨｉｓの定量測定を行った。ＨｉｓＤＣを０．６ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、１５μＬのＨｉｓＤＣに対して０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．５を７５μＬ、超純水１０μＬ、各濃度ヒスチジン溶液５０μＬもしくはヒト血漿を加え混合した溶液を２５℃、６０分間インキュベートした。９６穴マイクロプレートにこの溶液４０μＬに対して、４．０ｍｇ／ｍｌとなるように調製したＨＯＸを２０μＬ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を２０μＬ、１００ｍＭ  ＴＯＯＳを２μＬ、０．１Ｍ  ４−アミノアンチピリンを２μＬ、１５００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼを２μＬ、超純水を１１４μＬ加えた。ＨＯＸを加え混合する前および混合後一定時間の５５５ｎｍおよび８００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（後）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前）、Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ社）にて測定した。
【０１０５】
反応前後の各測定ポイントにおける吸光度の値を用いて、酵素液添加の前後における吸光度の変化量（ΔＡｂｓ）は、（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（後）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（後）)−（Ａｂｓ  ５５５ｎｍ（前）−Ａｂｓ  ８００ｎｍ（前））として求めた。各値から未反応の溶液の吸光度をブランクとして差引した後、検体としてＨｉｓ水溶液を用いた際のΔＡｂｓとＨｉｓ濃度との関係から検量線を作成し、検体としてヒト血漿を用いた際のΔＡｂｓから、ヒト血漿中のＨｉｓ濃度を求めた。検量線は、各Ｈｉｓ濃度において３回実験を行った際の平均値を用いて作成し、同一ロットのヒト血漿を３回測定して、ＬＣ−ＭＳによる分析値（７４．９μＭ）と比較した。検量線を図５に、定量結果を図６として示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、ヒスチジンの迅速かつ高感度な測定に有用であり、またヒスチジンの特異的な測定に有用である。本発明は、例えば生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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