(57)【要約】【課題】Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物及び前記微生物を用いて高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。【解決手段】クエン酸シンターゼタンパク質の内在的活性が低下又は不活性化された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸シンターゼ（citrate synthase）タンパク質の内在的活性が低下又は不活性化された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物。
【請求項２】
前記クエン酸シンターゼ（citrate synthase）タンパク質の内在的活性が低下した微生物が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記微生物が、さらにシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）、又は双方の活性が内在的活性に比べて低下又は不活性化された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記微生物が、さらにホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性が導入又は強化されるか、内在性ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼがホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するように変異した、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項５】
前記微生物が、さらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の活性が導入又は強化された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項６】
前記微生物が大腸菌（E.coli）である、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項７】
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記微生物の培養過程で生成されたＯ−アセチルホモセリンを得るステップとを含む、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（escherichia）属微生物及び前記微生物を用いて高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）は、生体内の必須アミノ酸の一種であるメチオニンの前駆体として作用する。メチオニンは、生体内の必須アミノ酸の一種であり、飼料や食品添加剤だけでなく、輸液剤、医薬品の合成原料としても広く用いられている。
【０００３】
メチオニンは生物学的合成や化学合成により生産される。近年、発酵により生産したＬ−メチオニン前駆体から酵素変換反応によりＬ−メチオニンを生産する二段階工法（特許文献１）も公知となっている。
【０００４】
前記二段階工法においては、メチオニン前駆体としてＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）やＯ−アセチルホモセリンを用いることができ、メチオニンの経済的な大量生産のためにＯ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１３４３２号
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１１−００２３７０３号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第２２９００５１号明細書
【特許文献４】韓国公開特許第１０−２０１２−００７０５３１号公報
【特許文献５】国際公開第２０１２／０８７０３９号
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０９０５３８１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176
【非特許文献２】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington DC 1981
【非特許文献３】PNAS (2000) vol97: P6640-6645
【非特許文献４】Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2001;66(3a):333-6
【非特許文献５】The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278, 35435-35443
【非特許文献６】Methods Mol Biol. 2012;815:307-19. doi: 10.1007/978-1-61779-424-7_23.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、Ｏ−アセチルホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、クエン酸シンターゼタンパク質の発現又は活性を減少させると、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能を大幅に向上させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上したＯ−アセチルホモセリンを生産する微生物を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記微生物を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるＯ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物を用いると、Ｏ−アセチルホモセリンを化学的合成に比べて、環境にやさしく、かつより高い収率で生産することができる。また、生産されたＯ−アセチルホモセリンは、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼによりメチオニンと酢酸の合成の前駆体として用いることで、高効率でＬ−メチオニンを生物変換することができ、変換された前記Ｌ−メチオニンは動物飼料や動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品又は食品添加剤の生産に広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】クエン酸シンターゼ活性低下菌株の作製のための発現カセットのデザインを示す図である。
【図２】ｐＢＡＤ２４−クエン酸シンターゼアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）ベクターの開裂地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一態様は、クエン酸シンターゼ（citrate synthase）タンパク質の内在的活性が低下又は不活性化された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物を提供する。
【００１３】
本発明における用語「Ｏ−アセチルホモセリン」とは、微生物のメチオニン生合成経路上の特異的中間体物質であり、Ｌ−ホモセリンのアセチル誘導体を意味する。前記Ｏ−アセチルホモセリンは、ホモセリンとアセチルＣｏＡを基質としてアセチルＣｏＡのアセチル基をホモセリンに転移する酵素活性により生成される。
【００１４】
本発明における用語「Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物」とは、Ｏ−アセチルホモセリンを生物体内で生産できる原核又は真核微生物菌株であり、Ｏ−アセチルホモセリン生産能のない母菌株にＯ−アセチルホモセリンの生産能が付与された微生物や、内在的にＯ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物が含まれる。Ｏ−アセチルホモセリン生産能力は、品種改良により付与又は増進させることができる。前記Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物には、エシェリキア属（Escherichia sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、セラチア属（Serratia sp.）、プロビデンシア属（Providencia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacteria sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、レプトスピラ属（Leptospira）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ヒフォモナス属（Hyphomonas sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium sp.）、ノカルディア属（Nocardia sp.）、又は菌類（fungi）もしくは酵母類（yeast）に属する微生物菌株が含まれる。具体的には、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。より具体的には、エシェリキア属の微生物菌株であり、その具体的な例として大腸菌（Escherichia coli）が挙げられる。前記Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物は、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンもしくはＬ−メチオニンを生産する菌株又はそれに由来するものであるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明における用語「クエン酸シンターゼ（citrate synthase, E.C. 2.3.3.1）」とは、ＴＣＡサイクルの最初の段階の酵素であり、オキサロ酢酸（oxaloacetate）とアセチルＣｏＡの反応を触媒する。具体的には、アセチルＣｏＡの２個の炭素を有する酢酸残基と、４個の炭素を有するオキサロ酢酸との縮合反応を触媒することにより、６個の炭素を有するクエン酸塩を生成する。大腸菌（Escherichia coli）における前記クエン酸シンターゼをＧｌｔＡと命名したが、本発明においてＧｌｔＡと前記クエン酸シンターゼは混用される。
【００１６】
アセチルＣｏＡ＋オキサロ酢酸＋Ｈ２Ｏ→クエン酸塩＋ＣｏＡ−ＳＨ
具体的には、前記クエン酸シンターゼはエシェリキア属微生物に由来するものであってもよく、より具体的な例として、大腸菌由来ＧｌｔＡであってもよい。前記クエン酸シンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、相同性を有する配列であって、実質的に配列番号４のアミノ酸配列と同一又は相当するクエン酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮重（genetic code degeneracy）により同一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及びその変異体も本発明に含まれる。
【００１７】
本発明における用語「内在的」活性とは、本来微生物が天然の状態又は当該タンパク質の改変前に有しているタンパク質の活性を意味する。
【００１８】
前記「タンパク質の活性が内在的活性に比べて低下又は不活性化されたもの」とは、本来微生物が天然の状態で有しているタンパク質の活性と比較して、その活性が天然の状態に比べて減少したり、なくなったものを意味する。前記低下とは、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異などによりタンパク質自体の活性が本来微生物が有しているタンパク質の活性に比べて低場合と、それをコードする遺伝子の発現阻害又は翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なタンパク質発現の程度が天然菌株に比べて低下する場合と、それらの組み合わせとを含む概念であるが、これらに限定されるものではない。前記不活性化には、タンパク質をコードする遺伝子が天然菌株に比べて全く発現されない場合、及び発現されたとしてもその活性がない場合が含まれる。
【００１９】
このようなタンパク質活性の低下又は不活性化は、当該分野で周知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性を除去する場合をはじめとして、前記酵素の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が低い配列や活性のない配列に置換する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合することにより前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、及び当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、これらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に特に限定されるものではない。
【００２０】
具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部を欠失させる方法は、微生物内の染色体導入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のポリヌクレオチド配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われる。例えば、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。また、前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なり、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、さらに具体的には１〜５０個であるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２１】
また、発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的置換もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
また、染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、前記タンパク質の活性がさらに低下するように、遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された遺伝子配列又は活性を有さないように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
具体的には、前記クエン酸シンターゼタンパク質の活性を低下させるために、クエン酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列のうち一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する方法を用いることができる。より具体的には、クエン酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列のうち１４５番目のアミノ酸又は１６７番目のアミノ酸をチロシン（Ｙ）又はリシン（Ｋ）から他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するクエン酸シンターゼを用いてもよい。さらに具体的には、クエン酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列が１４５番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）からアラニン（Ａ）に、１６７番目のアミノ酸であるリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）に置換された変異ポリペプチドをコードする遺伝子配列に改変されたものであってもよい。ここで、前記アミノ酸残基の番号は、開始コドンによりコードされるメチオニンの次に位置するアミノ酸を１番として番号を付けたものである。前記ポリペプチドは、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列を有する。また、クエン酸シンターゼ活性が野生型より低下したものであれば、前述した配列番号のアミノ酸配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列も含まれる。このような相同性を有する配列であって、実質的に配列番号１又は２のタンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２４】
本発明における用語「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させて、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列させることにより決定することができる。前記コンピュータプログラムは、ＢＬＡＳＴ（NCBI）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（CLC bio）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（DNASTAR Inc）などであってもよい。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間に安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、その後単鎖特異的なヌクレアーゼで分解し、分解したフラグメントのサイズを決定することにより決定することができる。
【００２５】
本発明における用語「相同」とは、全ての文法形態やスペリングの変異形態であるスーパーファミリー由来のタンパク質及び異種由来の相同タンパク質を含み、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係を意味する。それらのタンパク質（及びそれらのコード遺伝子）は、高度の配列類似性により反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用及び本発明における「相同」とは、「非常に高い」などの形容詞で修飾されると、共通の進化起源を意味するのではなく、配列類似性を意味する。
【００２６】
本発明の具体的な態様として、前記微生物は、さらにシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase, EC 2.5.1.48）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase, EC 2.7.1.39）、又は双方の活性が内在的活性に比べて低下又は不活性化されたものであってもよい。
【００２７】
本発明における用語「シスタチオニンγ−シンターゼ」とは、Ｏ−スクシニルホモセリン及びＬ−システインを基質として下記化学反応によりシスタチオニンを合成する酵素である。本発明において、大腸菌由来のシスタチオニンγ−シンターゼをＭｅｔＢと命名した。
【００２８】
Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン＋Ｌ−システイン→Ｌ−シスタチオニン＋コハク酸塩（succinate）
具体的には、前記大腸菌由来のシスタチオニンγ−シンターゼは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号９のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、相同性を有する配列であって、実質的に配列番号９のアミノ酸配列と同一又は相当するシスタチオニンγ−シンターゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮重により同一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及びその変異体も本発明に含まれる。
【００２９】
このようなシスタチオニンγ−シンターゼ活性の低下及び不活性化は、前述した方法により行われる。
【００３０】
本発明における用語「ホモセリンキナーゼ」とは、ホモセリンのリン酸化をもたらす酵素であって、下記化学反応を行う酵素を意味する。本発明において、大腸菌由来のホモセリンキナーゼをＴｈｒＢと命名した。
【００３１】
ＡＴＰ＋Ｌ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ→ＡＤＰ＋Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ
具体的には、前記大腸菌由来のホモセリンキナーゼは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、相同性を有する配列であって、実質的に配列番号１１のアミノ酸配列と同一又は相当するホモセリンキナーゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮重により同一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及びその変異体も本発明に含まれる。
【００３２】
このようなホモセリンキナーゼ活性の低下及び不活性化は、前述した方法により行われる。
【００３３】
本発明の具体的な態様として、前記微生物は、さらにホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性が導入又は強化されるか、内在性ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼがＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するように変異したものであってもよい。
【００３４】
本発明における用語「ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.31）」とは、アセチルＣｏＡからアセチル基をホモセリンに転移させる活性を有する酵素を意味する。
【００３５】
具体的には、本発明による微生物には、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を導入することができる。前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、様々な微生物種に由来するものであってもよく、例えば、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属、デイノコッカス属、シュードモナス属、又はマイコバクテリウム属から選択される菌株に由来するタンパク質であってもよい。具体的には、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１３（レプトスピラ・メイエリ）、配列番号１４（コリネバクテリウム・グルタミカム）又は配列番号１５（デイノコッカス・ラディオデュランス）のアミノ酸配列を含むホモセリンＯ−アセチルトランスファーラゼであってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前述した配列番号のアミノ酸配列又はそれと７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、遺伝暗号の縮重により同一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及びその変異体も本発明に含まれる。
【００３６】
本発明に用いられるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの例は特許文献２又は３に開示されており、上記特許の明細書全体は本発明に参考資料として取り込まれる。
【００３７】
また、内在性ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.46）がホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するように変異したタンパク質とは、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドにおいてスクシニルＣｏＡからアセチルＣｏＡに基質特異性が変換された変異ポリペプチドを意味する。また、前記変異したタンパク質は、特にこれらに限定されるものではないが、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部を置換することにより、野生型とは異なり、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３８】
前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、エンテロバクター属、サルモネラ属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属微生物由来のポリペプチド、具体的にはエシェリキア属微生物由来のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、例えば、大腸菌（E. coli）由来のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。より具体的には、前記大腸菌由来のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。前記大腸菌由来のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをＭｅｔＡと命名した。
【００３９】
前記変異したホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号１６からなるポリペプチド又は前記ポリペプチド配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドの１１１番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、さらに１１２番目のアミノ酸がトレオニン又はヒスチジンに置換された変異型ポリペプチドであってもよい。具体的には、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１７〜１９のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。また、前述した配列番号のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、遺伝暗号の縮重により同一アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列及びその変異体も本発明に含まれる。前記変異したホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼに関する情報は特許文献４又は５から得ることができ、上記特許の明細書全体は本発明に参考資料として取り込まれる。
【００４０】
本発明における用語「活性を導入又は強化」するとは、特定のタンパク質活性のない微生物にそのタンパク質の活性を付与することや、そのタンパク質の活性を有する微生物において細胞内活性を増加させることなどであって、前記タンパク質の細胞内活性を内在的活性に比べて増加させることを意味する。
【００４１】
このような「タンパク質活性の導入又は強化」には、タンパク質自体の活性が増大して本来の機能以上の効果を導出することが含まれるだけでなく、内在性遺伝子の活性の増加、内部又は外部要因による内在性遺伝子の増幅、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子導入、発現調節配列の置換又は改変、及び突然変異による酵素活性の増加などによるその活性の増加が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
前記遺伝子コピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われたり、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞に導入されることにより行われたり、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞内に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の遺伝子のコピー数を増加する方法で行われる。
【００４３】
前記ベクターとは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物を意味し、前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００４４】
本発明において用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ1ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【００４５】
また、微生物内の染色体挿入用ベクターにより染色体内に内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体に導入されるので、前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換した細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いることができるが、これらに限定されるものではない。選択剤（selective agent）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換した細胞を容易に選択することができる。
【００４６】
本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換したポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらを全て含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含み、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００４７】
また、前記用語「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【００４８】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変することは、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的置換もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有するポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。また、前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよい。
【００４９】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００５０】
このようなタンパク質活性の導入及び亢進は、対応するタンパク質の活性又は濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株における活性又は濃度を基準として、一般に少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加したものであってもよい。
【００５１】
また、前記微生物は、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンを生合成する経路を遮断してＯ−アセチルホモセリンの生合成経路を強化するために、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性を内在的活性に比べて低下させるか、不活性化したものであってもよい。
【００５２】
ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性の低下及び不活性化は、前述した方法により行われる。
【００５３】
本発明の具体的な態様において、本発明によるＯ−アセチルホモセリン生産菌株は、Ｏ−アセチルホモセリン生合成の基質であるホモセリンの量をさらに増加させるために、ホスホエノールピルビン酸からホモセリンまでの生合成経路に関与する酵素の活性がさらに導入及び亢進されたものであってもよい。
【００５４】
具体的には、前記微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc, EC 4.1.1.31）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase, aspC, EC 2.6.1.1）、及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase, asd, EC 1.2.1.11）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の活性が導入又は強化されたものであってもよい。
【００５５】
例えば、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子、及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子を菌株に導入することができる。例えば、上記３種の酵素をコードする遺伝子の全てを宿主細胞の染色体内に２以上のコピー数で存在させることにより、これら酵素の活性を導入及び亢進させることができるが、これに限定されるものではない。前記活性の導入及び亢進は、前述した方法により行われる。
【００５６】
本発明の具体例においては、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する大腸菌菌株からクエン酸シンターゼ遺伝子を欠損させたり、クエン酸シンターゼタンパク質活性が野生型より低下した、変異したクエン酸シンターゼタンパク質をコードする遺伝子をクエン酸シンターゼ遺伝子位置に導入したり、クエン酸シンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを導入する様々な方法を用いて、クエン酸シンターゼタンパク質の活性を低下又は不活性化させた。その結果、作製した、クエン酸シンターゼタンパク質活性が低下又は不活性化されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株の全てにおいて、母菌株に比べてＯ−アセチルホモセリンの生産能が向上した（実施例１〜４）。
【００５７】
本発明の他の態様として、前記Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上したＯ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物を用いてＯ−アセチルホモセリンを製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、（ａ）前記微生物を培養するステップと、（ｂ）前記微生物の培養過程で生成されたＯ−アセチルホモセリンを得るステップとを含む、Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法を提供する。
【００５８】
本発明によるＯ−アセチルホモセリン生産能を有する大腸菌菌株の培養過程は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。特に、本発明の菌株の場合、ＴＣＡサイクルの最初の段階を触媒する酵素であるクエン酸シンターゼの活性が内在的活性に比べて低下又は不活性化された菌株であるので、ＴＣＡサイクルの流量低下を考慮して培地にグルタメートを含んでもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【００５９】
前記培養方法の例としては、回分、連続及び流加培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの様々な培養方法は、例えば非特許文献１に開示されている。
【００６０】
培養に用いられる培地は、特定の菌株の要件を満たさなければならない。具体的には、様々な微生物の培地の例が非特許文献２に開示されている。前記培地は、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地であってもよく、好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節して培養することができる。
【００６１】
炭素源としては、ブドウ糖（glucose）、ラクトース（lactose）、スクロース（sucrose）、乳糖、フルクトース（fructose）、マルトース（maltose）、デンプン（starch）及びセルロース（cellulose）などの炭水化物；大豆油（soybean oil）、ヒマワリ油（sunflower oil）、ヒマシ油、ベーバーオイル（castor oil）及びココナッツ油（coconut oil）などの脂肪；パルミチン酸（palmitic acid）、ステアリン酸（stearic acid）及びリノール酸（linoleic acid）などの脂肪酸、グリセリン（glycerol）及びエタノール（ethanol）などのアルコール；酢酸（acetic acid）などの有機酸（organic acid）が挙げられる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
窒素源としては、ペプトン（peptone）、酵母抽出物（yeast extract）、肉汁（gravy）、麦芽抽出物（malt extract）、トウモロコシ浸漬液（corn steep liquor, CSL）、黄粉（bean flour）などの有機窒素源及び尿素（urea）、硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）、塩化アンモニウム（ammonium chloride）、リン酸アンモニウム（ammonium phosphate）、炭酸アンモニウム（ammonium carbonate）並びに硝酸アンモニウム（ammonium nitrate）などの無機窒素源が挙げられる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。前記培地には、リン酸源としてリン酸二水素カリウム（potassium dihydrogen phosphate）、リン酸水素カリウム（dipotassium hydrogen phosphate）又はそれらに相当するナトリウム含有塩（sodium-containing salts）がさらに含まれてもよい。また、培地には、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate）、硫酸鉄（iron sulfate）などの金属が含まれてもよい。さらに、アミノ酸、ビタミン 及び好適な前駆体などが添加されてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができるが、上記例に限定されるものではない。
【００６３】
また、培養中に水酸化アンモニウム（ammonium hydroxide）、水酸化カリウム（potassium hydroxide）、アンモニア、リン酸及び硫酸などの化合物を好適な方法で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステル（polyglycol ester）などの消泡剤を添加することにより、培養中の気泡生成を抑制することができる。さらに、培養液の好気性（aerobic）条件を維持するために、培養液内に酸素又は酸素を含むガス（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、一般に２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、Ｏ−アセチルホモセリンの生産が所望のレベルに達するまで続けてもよく、具体的には１０〜１６０時間であるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明の前記Ｏ−アセチルホモセリンの生産方法は、前記培養された微生物又はその培養物からＯ−アセチルホモセリンを回収するステップをさらに含んでもよい。
【００６５】
前記Ｏ−アセチルホモセリンを回収するステップは、本発明の微生物の培養方法、例えば回分、連続又は流加培養方法などにより、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて、培養液から目的とするＯ−アセチルホモセリンを回収することができる。
【００６６】
前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
【００６７】
このように回収したＯ−アセチルホモセリンは、二段階工法（特許文献６）によりメチオニンを生産することができる。
【００６８】
二段階工程は、前記Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株により生産されたＯ−アセチルホモセリンとメチルメルカプタンを基質として用いて、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-acetyl homoserine sulfhydrylase）活性を有する酵素又は前記酵素を含む菌株を用いた酵素反応により、Ｌ−メチオニン及び有機酸を生産する工程を含む。
【００６９】
より具体的には、本発明は、上記方法で蓄積されたＯ−アセチルホモセリンを基質として用いて、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼなどの酵素反応により、Ｌ−メチオニンを生産する方法を提供する。
【００７０】
前記二段階工程において、Ｏ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニン前駆体として用いる場合、具体的にはレプトスピラ属（Leptospira sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium sp.）、ヒフォモナス属（Hyphomonas sp.）に属する微生物菌株、より具体的にはレプトスピラ・メイエリ（Leptospira meyeri）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ヒフォモナス・ネプツニウム（Hyphomonas neptunium）、クロモバクテリウム・ビオラセム（Chromobacterium violaceum）に属する微生物菌株由来のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを用いることができる。
【００７１】
上記反応は次の通りである。
【００７２】
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン⇔酢酸＋メチオニン
このようなさらなるメチオニン生産工程については特許文献６に開示されており、上記特許の明細書全体は本発明に参考資料として取り込まれる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７４】
参考例：Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の作製
＜１−１＞野生型大腸菌由来ｍｅｔＢ遺伝子の欠損（特許文献１）
Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株を作製するために、エシェリキア属微生物の代表的な微生物である大腸菌を用いた。このために、野生型大腸菌であるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）を米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection, ATCC）から入手して用いた。まず、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンのシスタチオニンへの生産経路を遮断するために、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子（配列番号１０）を欠損させた。具体的には、シスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子であるｍｅｔＢ遺伝子を欠損させるために、ＦＲＴ−ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＰＣＲ欠損方法を用いた（非特許文献３）。
【００７５】
具体的には、ｐＫＤ３ベクター（非特許文献３）を鋳型とし、配列番号３０及び３１のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応により欠損カセット（deletion cassette）を作製した。９４℃で３０秒間の変性（denaturation）ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリング（annealing）ステップ、７２℃で１分間の伸長（extension）ステップを３０回繰り返した。
【００７６】
結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル中で電気泳動し、その後１．２ｋｂｐの大きさのバンドからＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクター（非特許文献３）で予め形質転換したＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションした。
【００７７】
エレクトロポレーションのために、１００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）と５ｍＭアラビノース（l-arabinose）を含むＬＢ培地を用いて、ｐＫＤ４６で形質転換したＷ３１１０菌株を３０℃でＯＤ６００＝０．６まで培養し、その後滅菌蒸留水で２回、１０％グリセリン（glycerol）で１回洗浄して用いた。エレクトロポレーションは２５００Ｖで行った。２５μｇ／Ｌクロラムフェニコール（chloramphenicol）を含むＬＢ平板培地に回収した菌株を塗抹して３７℃で一晩培養し、その後耐性を示す菌株を選択した。
【００７８】
選択した菌株を鋳型とし、同一プライマーを用いて同一条件でＰＣＲし、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．２Ｋｂであると観察されたことを確認することにより、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。確認した菌株を再びｐＣＰ２０ベクター（非特許文献３）で形質転換してＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲを行うことにより、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１５０ｂｐに小さくなった最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製した菌株をＷ３−Ｂと命名した。
【００７９】
＜１−２＞ｔｈｒＢ遺伝子の欠損（特許文献１）
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子であるｔｈｒＢ遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。実施例１で作製したＷ３−Ｂ菌株からｔｈｒＢ遺伝子を欠損させるために、ｍｅｔＢ遺伝子を欠損させたときと同じＦＲＴ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰＣＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を用いた。
【００８０】
ｔｈｒＢ欠損カセットを作製するために、ｐＫＤ４ベクター（非特許文献３）を鋳型とし、配列番号３２及び３３のプライマーを用いて、９４℃で３０秒間の変性ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、７２℃で１分間の伸長ステップを３０回繰り返すＰＣＲ反応を行った。
【００８１】
結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル中で電気泳動し、その後１．６ｋｂｐの大きさのバンドからＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換したＷ３−Ｂ菌株にエレクトロポレーションした。５０μｇ／Ｌカナマイシン（kanamycin）を含むＬＢ平板培地に回収した菌株を塗抹して３７℃で一晩培養し、その後耐性を示す菌株を選択した。
【００８２】
選択した菌株は、菌株を直接鋳型とし、配列番号３２及び３３のプライマーを用いて同一条件でＰＣＲし、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．６Ｋｂであることが確認される菌株を選択することにより、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。確認した菌株を再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲを行うことにより、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１５０ｂｐに小さくなった最終ｔｈｒＢ遺伝子欠損菌株を作製し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。作製した菌株をＷ３−ＢＴ菌株と命名した。
【００８３】
＜１−３＞ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ｍｅｔＡ（特許文献５）
参考例＜１−２＞で得られた菌株のホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）活性を強化するために、強化された活性を有するホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｍｅｔＡ遺伝子（配列番号２４及び２６）を菌株に導入しようとした。
【００８４】
まず、活性が強化された変異型ｍｅｔＡ遺伝子を作製するために、野生型菌株であるＷ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３４及び３５のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ遺伝子を増幅した。
【００８５】
ＰＣＲに用いたプライマーは米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH Gene Bank）に登録されているＮＣ＿０００９１３の大腸菌染色体ポリヌクレオチド配列に基づいて作製し、配列番号３４及び３５のプライマーはそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＶ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する。こうして得られたＰＣＲ産物及びＰｃｊ１が入ったｐＣＬ１９２０プラスミドをそれぞれＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理してクローニングした。クローニングしたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、その後スペクチノマイシン（spectinomycin）５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートで形質転換した大腸菌ＤＨ５αを選択してプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡと命名した。
【００８６】
次に、部位特異的突然変異誘発キット（site directed mutagenesis kit, Stratagene, 米国）を用いて、前述したように作製したｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡプラスミドを鋳型とし、配列番号３６及び３７のプライマーでＯ−スクシニルトランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置換した（Ｇ１１１Ｅ）。作製した変異Ｇ１１１Ｅ ｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＬ）と命名した。
【００８７】
また、前記Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼの１１１番目のアミノ酸をグリシンからグルタミン酸に置換し、さらに１１２番目のアミノ酸をロイシンからヒスチジンに置換するために、配列番号３８及び３９のプライマーを用いた。１１１番目のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に置換され、１１２番目のアミノ酸がロイシンからヒスチジンに置換されたｍｅｔＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＬ＿Ｐｃｊ１＿ｍｅｔＡ（ＥＨ）と命名した。
【００８８】
次に、ｍｅｔＡ（ＥＨ）による菌株内での置換のための置換カセットを作製するために、ｐＫＤ３ベクターを鋳型とし、配列番号４０及び４１のプライマーを用いて、９４℃で３０秒間の変性ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、７２℃で２分間の伸長ステップを３０回繰り返すＰＣＲ反応を行った。置換カセットのｍｅｔＡ（ＥＨ）部分は、ｐＣＬ−Ｐｃｊ１−ｍｅｔＡ（ＥＨ）を鋳型とし、配列番号４２及び４３のプライマーを用いてＰＣＲ産物を得た。ｍｅｔＡ野生型部分は、配列番号４４及び４５のプライマーを用いてＰＣＲ産物を得た。配列番号４２及び４５プライマーを用いてクロラムフェニコールマーカー部分を含むｍｅｔＡ（ＥＨ）置換カセットを作製し、ｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換した、参考例＜１−２＞で作製したＷ３−ＢＴ菌株に３つのＰＣＲ産物をエレクトロポレーションした。確認した菌株を再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、クロラムフェニコールマーカーが除去されてｍｅｔＡ遺伝子がｍｅｔＡ（ＥＨ）に置換された菌株をＷ３−ＢＴＡと命名した。
【００８９】
＜１−４＞ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ遺伝子２コピー（copy）菌株の作製（特許文献３）
参考例＜１−３＞で作製したＷ３−ＢＴＡ菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能を向上させるために、既出願の特許文献３を引用して生合成経路を強化した。上記特許の内容と同様に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子は配列番号４６、４７、４８及び４９のプライマー、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするａｓｐＣ遺伝子は配列番号５０及び５１のプライマー、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｓｄ遺伝子は配列番号５２、５３、５４及び５５のプライマーをそれぞれ用いて、各遺伝子を２コピーに増幅した菌株を作製した。ここで、Ｏ−アセチルホモセリンを生成すると共に生合成経路が強化された前記菌株をＷ３−ＢＴＡ２ＰＣＤ（「ＷＣＪＭ」ともいう）と命名した。
【００９０】
＜１−５＞フラスコ培養実験
参考例＜１−３＞及び＜１−４＞で作製した菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。
【００９１】
具体的には、ＬＢ培地にＷ３１１０、Ｗ３−ＢＴＡ及びＷＣＪＭ菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。下記表１に用いた培地の組成を示し、表２に確認したＯ−アセチルホモセリン生産量を示す。
【００９２】
【表１】
2018046875.tif 000003
【００９３】
【表２】
2018046875.tif 000004
【００９４】
その結果、野生型Ｗ３１１０においてはＯ−アセチルホモセリンが全く生成されなかったが、Ｗ３−ＢＴＡ菌株においてはＯ−アセチルホモセリンが０．９ｇ／Ｌ生成され、生合成経路が強化されたＷＣＪＭ菌株においては１．２ｇ／Ｌ生成された。
【００９５】
実施例１：クエン酸シンターゼ活性の欠失
＜１−１＞Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株におけるクエン酸シンターゼ（citrate synthase）遺伝子欠損菌株の作製
クエン酸シンターゼ（citrate synthase, GltA）は、ＴＣＡサイクルの最初の段階の酵素であり、オキサロ酢酸（oxaloacetate）とアセチルＣｏＡ（Acetyl-CoA）の反応で開始される。ＴＣＡサイクルの減少による生長阻害はよく知られているが（非特許文献４）、Ｏ−アセチルホモセリンの基質として用いられるアセチルＣｏＡの量を増加させるために、前記Ｗ３−ＢＴＡ菌株及びＷＣＪＭ菌株のクエン酸シンターゼ活性を優先的に欠損させた菌株の作製を試みた。
【００９６】
具体的には、前記Ｗ３−ＢＴＡ菌株及びＷＣＪＭ菌株のクエン酸シンターゼを欠損させるために、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号５６及び５７のプライマーを用いて、９４℃で３０秒間の変性ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、７２℃で２分間の伸長ステップを３０回繰り返した。結果として得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル中で遺伝子の大きさが１．６Ｋｂであると観察されたことを確認し、ＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換した前記Ｗ３−ＢＴＡ、ＷＣＪＭ菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、１００μｇ／Ｌアンピシリンと５ｍＭアラビノースを含むＬＢ培地を用いて、ｐＫＤ４６で形質転換したＷ３−ＢＴＡ、ＷＣＪＭ菌株を３０℃でＯＤ６００＝０．６まで培養し、その後滅菌蒸留水で２回、１０％グリセリンで１回洗浄して用いた。エレクトロポレーションは２５００Ｖで行った。５０μｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ平板培地に回収した菌株を塗抹して３７℃で一晩培養し、その後耐性を示す菌株を選択した。
【００９７】
選択した菌株を配列番号５８及び５９のプライマーを用いて同一条件でＰＣＲし、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが２．５Ｋｂであると観察されたことを確認することにより、染色体上のクエン酸シンターゼ遺伝子部分に欠損カセットが挿入されたことを確認した。確認した菌株を再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲを行うことにより、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．１Ｋｂに小さくなったクエン酸シンターゼ遺伝子欠損菌株を作製し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。ここで、作製した菌株をそれぞれＷ３−ＢＴＡ−ＡＤ、ＷＣＪＭ−ＡＤと命名した。
【００９８】
＜１−２＞Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株におけるクエン酸シンターゼ欠損菌株の評価
前記Ｗ３−ＢＴＡ−ＡＤ菌株とＷＣＪＭ−ＡＤ菌株は、クエン酸シンターゼ遺伝子が欠損しており、ＬＢ培地では生長が可能であるが、Ｏ−アセチルホモセリン培地条件では生長しなかった。Ｏ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、基本培地の組成にグルタメート（glutamate）３ｇ／Ｌを添加する条件（下記表３−基本培地にグルタメートを添加した培地の組成）で三角フラスコ培養を行った。
【００９９】
具体的には、ＬＢ培地にＷ３−ＢＴＡ−ＡＤ菌株とＷＣＪＭ−ＡＤ菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地（＋グルタメート添加）を含む２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。下記表４にＯ−アセチルホモセリン生産量を示す。
【０１００】
【表３】
2018046875.tif 000005
【０１０１】
【表４】
2018046875.tif 000006
【０１０２】
その結果、Ｗ３−ＢＴＡ菌株においてはＯ−アセチルホモセリンが０．９ｇ／Ｌ生成され、Ｗ３−ＢＴＡ−ＡＤ菌株においてはブドウ糖消費量が減少したが、Ｏ−アセチルホモセリンが１．４ｇ／Ｌと生産が５５．６％増加した。ＷＣＪＭ菌株においてもＯ−アセチルホモセリンが１．３ｇ／Ｌ生成され、ＷＣＪＭ−ＡＤ菌株においては２．１ｇ／Ｌ生産され、クエン酸シンターゼ遺伝子が欠損することによりＯ−アセチルホモセリン生産能が６１．５％向上することを確認した。
【０１０３】
実施例２：クエン酸シンターゼタンパク質活性の低下
＜２−１＞クエン酸シンターゼ遺伝子の変異の種類
実施例＜１−１＞で作製したＷＣＪＭ−ＡＤ菌株は培養速度が遅いため、多くの文献で周知のクエン酸シンターゼの様々な変異により、活性を低下させてアセチルＣｏＡ（Acetyl-CoA）に対する結合力を減少させた変異３種を選択した（非特許文献５）。選択した３種の変異に関する情報は下記表５の通りであり、１４５番目のアミノ酸がチロシン（Ｙ）からアラニン（Ａ）に、１６７番目のアミノ酸がリシン（Ｋ）からアラニン（Ａ）に、２０４番目のアミノ酸がトレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）に置換された変異遺伝子を示している。
【０１０４】
【表５】
2018046875.tif 000007
【０１０５】
＜２−２＞Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株におけるクエン酸シンターゼタンパク質活性が低下した菌株の作製
本発明者らは、実施例＜２−１＞で説明した、クエン酸シンターゼタンパク質活性が低下する変異をＯ−アセチルホモセリン生産菌株に導入して生産能を向上させようとした。
【０１０６】
前記ＷＣＪＭ−ＡＤ菌株にクエン酸シンターゼ遺伝子変異３種を導入するために、変異置換カセットを図１のようにデザインした。各変異はプライマーのヌクレオチドを置換して合成し、各カセットは３つのＰＣＲ産物により作製した。クエン酸シンターゼ遺伝子部分は、Ｗ３１１０菌株を鋳型とし、１４５番目のアミノ酸変異は配列番号６０及び６３のプライマーと配列番号６２及び６１のプライマーを用いて、各ＰＣＲ反応により５１４ｂｐ、１，１１２ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得た。上記方法と同様に、１６７番目のアミノ酸変異は配列番号６０及び６５のプライマーと配列番号６４及び６１のプライマーを用いて、５８０ｂｐ、１，０４６ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得て、２０４番目のアミノ酸変異は配列番号６０及び６７のプライマーと配列番号６６及び６１のプライマーを用いて、６８８ｂｐ、９３６ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得た。共通のカナマイシン部分は、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号６８及び６９のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ここで、クエン酸シンターゼ遺伝子位置に導入するために、配列番号６９にクエン酸シンターゼ遺伝子の後半部分のポリヌクレオチド配列を含むように作製し、電気泳動により１，５７１ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得た。
【０１０７】
変異により２つずつ回収した各ＤＮＡ断片と共通部分であるカナマイシンＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号６０及び６９のプライマーを用いてソーイングＰＣＲ（ｓｅｗｉｎｇ ＰＣＲ）反応を行った。９４℃で３０秒間の変性ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、７２℃で４分間の伸長ステップを３０回繰り返した。最終的に得られた各ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲル中で確認し、３，１１５ｂｐのサイズを有するクエン酸シンターゼ遺伝子変異カセット３種のＤＮＡ断片を得た。回収したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換した前記ＷＣＪＭ−ＡＤ菌株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションのために、１００μｇ／Ｌアンピシリンと５ｍＭアラビノースを含むＬＢ培地を用いて、ｐＫＤ４６で形質転換したＷＣＪＭ−ＡＤ菌株を３０℃でＯＤ６００＝０．６まで培養し、その後滅菌蒸留水で２回、１０％グリセリンで１回洗浄して用いた。エレクトロポレーションは２５００Ｖで行った。２５μｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ平板培地に回収した菌株を塗抹して３７℃で一晩培養し、その後耐性を示す菌株を選択した。
【０１０８】
選択した菌株を鋳型とし、同じ配列番号５８及び５９のプライマーを用いて同一条件でＰＣＲし、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが３．７Ｋｂであると観察されたことを確認することにより、クエン酸シンターゼ遺伝子のアミノ酸が置換された変異カセットが挿入されたことを確認した。確認した菌株を再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、再び同一条件のＰＣＲを行うことにより、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが２．５Ｋｂに小さくなったクエン酸シンターゼ活性変異菌株３種を作製し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。ここで、作製した各変異菌株をＷＣＪＭ−Ａ１４５、ＷＣＪＭ−Ａ１６７、ＷＣＪＭ−Ａ２０４と命名し、変異が導入されたクエン酸シンターゼ遺伝子の配列情報を配列番号１〜３（アミノ酸配列）及び５〜７（ヌクレオチド配列）でそれぞれ示した。
【０１０９】
＜２−３＞Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株におけるクエン酸シンターゼタンパク質活性が低下した菌株の評価
前記クエン酸シンターゼ遺伝子の活性が低下したＷＣＪＭ−Ａ１４５、ＷＣＪＭ−Ａ１６７、ＷＣＪＭ−Ａ２０４の３種の菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。ＬＢ培地にＷＣＪＭ、ＷＣＪＭ−Ａ１４５、ＷＣＪＭ−Ａ１６７、ＷＣＪＭ−Ａ２０４の４種の菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地を添加した２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果を下記表６に示す。
【０１１０】
【表６】
2018046875.tif 000008
【０１１１】
その結果、ＷＣＪＭ菌株においてはＯ−アセチルホモセリンが１．３ｇ／Ｌ生成され、ＷＣＪＭ−Ａ１４５、ＷＣＪＭ−Ａ１６７の２種の菌株においてはＯＤが減少すると共にブドウ糖消費量も減少したが、Ｏ−アセチルホモセリンが２．０／Ｌ及び１．９ｇ／Ｌ生産された。特異的には、グルタメートが１．３ｇ／Ｌから０ｇ／Ｌに減少したことから、クエン酸シンターゼ活性の低下によるＴＣＡサイクルの流量減少の結果であることを確認した。しかし、ＷＣＪＭ−Ａ２０４菌株においてはＯ−アセチルホモセリン生成量が０．２ｇ／Ｌ減少すると共にグルタメートがむしろ増加したことから、活性が強化された変異であることを確認した。
【０１１２】
実施例３：クエン酸シンターゼタンパク質の発現低下
＜３−１＞クエン酸シンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）発現ベクターの作製
本発明者らは、クエン酸シンターゼタンパク質の発現を低下させるために、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）発現法の適用を試みた。アンチセンスＲＮＡ発現法は、標的遺伝子であるクエン酸シンターゼｍＲＮＡと相補的結合部分を過剰発現させることにより、クエン酸シンターゼｍＲＮＡとリボソーム（Ribosome）の結合を相殺してタンパク質発現を減少させる方法である。クエン酸シンターゼ遺伝子のｍＲＮＡとの結合力を調節することにより抑制の程度を調節できるという利点があり、遺伝子発現を調節するアンチセンスＲＮＡにより従来の遺伝子欠失の過程を経ずに効果的に作製して遺伝子発現を減少させることができ、組換え微生物の製造に有用である。
【０１１３】
ベクターの作製のために、非特許文献６を参照して、過剰発現のためにインダクションが可能なｐＢＡＤ２４プラスミドにシンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡ部分を導入しようとした。図２にｐＢＡＤ２４−クエン酸シンターゼａｓＲＮＡベクター図を示す。
【０１１４】
クエン酸シンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡが発現した部分は、プロモーター部分５２ｂｐと、クエン酸シンターゼ開始コードから４８ｂｐの部分を含めて１００ｂｐのサイズであり、両側にはアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）の不安定性を減少させる３８ｂｐの反復配列（paired termini; PT）が連結されている。前記クエン酸シンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡ部分を得るために配列番号７０及び７１を用い、ベクターにクローニングするために制限酵素ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むようにした。
【０１１５】
こうして得られたＰＣＲ産物のサイズは１９４ｂｐであり、この産物をｐＢＡＤ２４プラスミドにそれぞれＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理してクローニングした。クローニングしたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、その後アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートで形質転換した大腸菌ＤＨ５αを選択してプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＢＡＤ２４−ｇｌｔＡ ａｓＲＮＡと命名した。
【０１１６】
＜３−２＞クエン酸シンターゼ遺伝子アンチセンスＲＮＡ発現ベクターのＯ−アセチルホモセリン生産菌株への導入及び評価
実施例＜３−１＞で作製したクエン酸シンターゼアンチセンスＲＮＡ発現ベクターであるｐＢＡＤ２４−ｇｌｔＡ−ａｓＲＮＡをＯ−アセチルホモセリン生産菌株であるＷＣＪＭ菌株に形質転換（transfomration）した。ここで、このように導入された菌株をＷＣＪＭ／Ａ−ａｓＲＮＡと命名した。
【０１１７】
ここで、クエン酸シンターゼアンチセンスＲＮＡの発現量を調節することにより、クエン酸シンターゼタンパク質の発現量を調節しようとした。ここで、アンチセンスＲＮＡの発現量はアラビノース（Arabinose）濃度により調節することができる。
【０１１８】
その結果、実施例２と同様に、クエン酸シンターゼ活性が低下したときにＯ−アセチルホモセリン生産量が増加することを確認した。
【０１１９】
また、クエン酸シンターゼタンパク質の発現量の減少に伴ってＯ−アセチルホモセリン生産量が増加するか否かを確認するために、三角フラスコ培養を行った。
【０１２０】
具体的には、ＬＢ培地にＷＣＪＭ菌株とＷＣＪＭ／Ａ−ａｓＲＮＡ菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地を添加した２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈した。ここで、クエン酸シンターゼアンチセンスＲＮＡの発現量を調節するために、アラビノースを０ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ添加して３３℃、２００ｒｐｍで１５、３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果を表７及び８に示す。
【０１２１】
【表７】
2018046875.tif 000009
【０１２２】
【表８】
2018046875.tif 000010
【０１２３】
その結果、１５時間の培養において、ＷＣＪＭ／Ａ−ａｓＲＮＡ菌株はアラビノース濃度によってＯＤが１程度減少することが確認されたが、Ｏ−アセチルホモセリン濃度は同程度であった。しかし、３０時間の培養において、コントロール菌株であるＷＣＪＭ菌株はアラビノース濃度が増加してもＯＤやＯ−アセチルホモセリン濃度が同じであったのに対して、クエン酸シンターゼアンチセンス発現ベクターが導入されたＷＣＪＭ／Ａ−ａｓＲＮＡ菌株はアラビノース濃度の増加によって明らかな結果が得られた。アラビノース濃度が０ｍＭではＯＤが９．２であったが、５ｍＭでは１．９減少した７．１であり、消費したブドウ糖量は少なかったが、Ｏ−アセチルホモセリン量は３０．８％増加した。これらの結果から、クエン酸シンターゼ活性の低下だけでなく、タンパク質発現の低下も同じ結果を示すことが分かった。
【０１２４】
実施例４：Ｏ−アセチルホモセリン高収率菌株におけるクエン酸シンターゼ活性の低下及び不活性化
＜４−１＞Ｏ−アセチルホモセリン高収率菌株におけるクエン酸シンターゼ活性が不活性化された菌株の作製及び評価
特許文献５には、野生型Ｗ３１１０由来である、ＮＴＧ突然変異によりトレオニンを生産する菌株からＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株を作製する方法が詳細に記述されている。ここで、作製した高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株は、韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１１４６Ｐとして寄託した。
【０１２５】
前記ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株は、フラスコ培養時にブドウ糖４０ｇ／Ｌを消費して約１５〜１６ｇ／ＬのＯ−アセチルホモセリンを生産するので、高収率のＯ−アセチルホモセリン生産能を有する。よって、クエン酸シンターゼ活性が欠失するとさらに多くのＯ−アセチルホモセリンを生産するか否かを確認するために、前記ＫＣＣＭ１１１４６Ｐに適用した。作製方法は実施例＜１−１＞と同一であり、この方法によりＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株のクエン酸シンターゼ活性が欠失した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＡＤと命名した。
【０１２６】
前記クエン酸シンターゼ遺伝子の活性が欠失したＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＡＤ菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。ＬＢ培地にＫＣＣＭ１１１４６Ｐ又はＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＡＤ菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地（＋グルタメート添加）を添加した２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果を下記表９に示す。
【０１２７】
【表９】
2018046875.tif 000011
【０１２８】
その結果、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株においてはＯ−アセチルホモセリンが１４．２ｇ／Ｌ生成され、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ＡＤ菌株においてはＯＤが減少したが、Ｏ−アセチルホモセリンが１６．７ｇ／Ｌと約１７．６％向上した。
【０１２９】
＜４−２＞Ｏ−アセチルホモセリン高収率菌株におけるクエン酸シンターゼ活性低下菌株の作製及び評価
前記Ｏ−アセチルホモセリン高収率菌株であるＫＣＣＭ１１１４６Ｐにおいてクエン酸シンターゼ活性を低下させるとさらに多くのＯ−アセチルホモセリンを生産するか否かを確認するために、実施例＜２−１＞で説明した、タンパク質活性を低下させる変異３種のうち最も高いＯ−アセチルホモセリン生産能を示す１４５番目のアミノ酸変異（チロシン（Ｙ）からアラニン（Ａ））と１６７番目のアミノ酸変異（リシン（Ｋ）からアラニン（Ａ））をＫＣＣＭ１１１４６Ｐに適用した。作製方法は実施例＜２−２＞と同一であり、この方法によりＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株のクエン酸シンターゼ活性が低下した菌株２種をそれぞれ作製し、各菌株をＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１４５、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１６７と命名した。
【０１３０】
前記クエン酸シンターゼ遺伝子の活性が低下したＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１４５、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１６７の２種の菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。
【０１３１】
ＬＢ培地にＫＣＣＭ１１１４６Ｐ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１４５、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１６７の３種の菌株を接種して３３℃で一晩培養し、その後単一コロニーを３ｍｌのＬＢ培地に接種して３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌのＯ−アセチルホモセリン生産培地を添加した２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍に希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果を下記表１０に示す。
【０１３２】
【表１０】
2018046875.tif 000012
【０１３３】
その結果、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株においてはＯ−アセチルホモセリンが１５．０ｇ／Ｌ生成され、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１４５、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１６７の２種の菌株においては実施例＜２−３＞と同様であった。２種の菌株のどちらもＯＤが減少したが、Ｏ−アセチルホモセリンが１７．５ｇ／Ｌ、１７．３ｇ／Ｌと約１６．７％向上した。Ｏ−アセチルホモセリン高生産菌株においてもクエン酸シンターゼ活性の低下によるＴＣＡサイクルの流量減少によりグルタメートが１．６ｇ／Ｌから０ｇ／Ｌに減少した。
【０１３４】
上記結果は、クエン酸シンターゼ活性低下変異を適用してＯ−アセチルホモセリンを生産できることを示すものであり、特許文献１に基づいて生産されたＯ−アセチルホモセリンを基質として用い、さらにシスタチオニンγ−シンターゼ（cystathionine gamma synthase）、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-succinylhomoserine sulfhydrylase）及びＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-acetylhomoserine sulfhydrylase）の活性を有する変換酵素を用いて変換反応を起こす場合より、低コストでＬ−メチオニンと酢酸を同時に生産できることを示すものでもある。
【０１３５】
本発明者らは、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株クエン酸シンターゼの１６７番目のアミノ酸変異株においてＯ−アセチルホモセリン生産が増加することを確認し、前記ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−Ａ１６７菌株を「ＣＡ０５−４００７」と命名し、その後これを２０１３年１１月２２日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４８３Ｐとして寄託した。
【０１３６】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【０１３７】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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