(57)【要約】【課題】優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物を提供すること。【解決手段】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合又は発現されたものであり、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．０３μｇ〜１．０μｇであることを特徴とする乳酸菌含有組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合又は発現されたものであり、
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．０３μｇ〜１．０μｇであることを特徴とする乳酸菌含有組成物。
【請求項２】
乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉである請求項１に記載の乳酸菌含有組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物。
【請求項４】
子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用である請求項３に記載のＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はＤＮＡウイルスであって、現在まで１００種類以上の異なる型が報告されている。前記ＨＰＶは皮膚（例えば、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２）や粘膜表面（例えば、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１）に感染することで、数ヶ月から数年単位で存在する良性腫瘍（イボ）を形成する。
更に、前記ＨＰＶのうち１５型（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８など）は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こすことから高リスクＨＰＶと呼ばれている。
【０００３】
女性特有のがんとして乳がんに次いで罹患率が高い子宮頚がんについては、そのほぼ１００％が、前記ＨＰＶの生殖器への長期間感染により発症するものであり、世界で５３万人、日本でも１万５千人の新規患者が毎年報告されている。
子宮頚がんによる年間の死亡者数は、世界で２７万人、日本でも３，５００人に達する。
理論的には、前記ＨＰＶの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚がんは完全に根絶することができる。
【０００４】
前記ＨＰＶの感染は、前記子宮頚がん以外にも、外陰がん、肛門がん、口腔がん、腟がん、陰茎がん、咽頭がん、そして尖圭コンジローマ（性器イボ）にも関連していることが明らかになっており、これらのがん及び性感染症の予防のために、前記ＨＰＶの感染に対する予防ワクチンは有効であると考えられる。しかし、既存のＨＰＶ予防ワクチンは、高リスクＨＰＶのうち２つの型しか予防できない。
【０００５】
前記ＨＰＶの中でも、特にＨＰＶ１６とＨＰＶ１８が、日本人女性の前記子宮頚がんの発症原因の約６５％、特に２０代では子宮頚がんの発症原因の約９０％を占めている。
前記ＨＰＶ１６と前記ＨＰＶ１８は、前記外陰がんに先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の５０％弱を占め、更に前記腟がんに進行する可能性のある腟上皮内腫瘍の発症の８５％にも関連していることが知られている。
【０００６】
前記ＨＰＶ感染による前記子宮頚がんの前がん病変である子宮頚部上皮内腫瘍（Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ；ＣＩＮ）は、子宮腟部（子宮頚部の下半分、腟に突き出している部分）の粘膜上皮に発生する。ＨＰＶ感染症は、性行為による微細な傷によってＨＰＶが粘膜上皮（重層扁平上皮）の基底細胞に侵入し、扁平上皮内でウイルス増殖するウイルス感染症である。長期間持続的に上皮内でＨＰＶが増殖すると、上皮細胞が不死化、癌化を生じる。これが子宮頚がんの起源であると考えられている。
【０００７】
前記子宮頚がんの発生過程では、基底細胞への前記ＨＰＶの増殖が持続すると、その一部でウイルス遺伝子が上皮細胞の遺伝子に挿入され、低レベルであったＥ６タンパク質とＥ７タンパク質の発現が持続的に亢進されるという変化が生じると考えられる。
前記Ｅ６タンパク質と前記Ｅ７タンパク質の発現は、ウイルス感染像であるＣＩＮ１（軽度異形成）では非常に低いのに対して、腫瘍化を遂げたＣＩＮ２（中度異形成）とＣＩＮ３（高度異形成）では高発現が認められることから、前記Ｅ６タンパク質と前記Ｅ７タンパク質の発現の持続的な亢進は前記ＣＩＮ２以降で起こると考えられる。
前記ＨＰＶの前記Ｅ６タンパク質と前記Ｅ７タンパク質、その中でも特に前記Ｅ７タンパク質が、ＨＰＶ関連がんに対する治療用ワクチンの開発においてとても魅力的なターゲットであると考えられる。Ｅ７タンパク質はヒトでの抗原性が高いからである。
【０００８】
これまでに、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質を抗原とした前記治療用ワクチンが既にいくつか開発されている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）ものの、それらが患者子宮頚部の前がん病変（前記ＣＩＮ）や癌細胞を排除することまでは示されてはおらず、実際に治療効果をもったワクチンの開発が強く望まれている。
【０００９】
本発明者らは、前記ＨＰＶ１６の前記Ｅ７タンパク質において、前記Ｒｂタンパク質との結合に関与する第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕを全てＧｌｙに置換した変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉに発現させ、熱処理により死菌化したものを乾燥、粉末化したワクチン（ＬａｃＥ７）をマウスに経口投与することで、脾臓だけでなく、粘膜においてもＥ７特異的細胞性免疫応答を誘導できることを示した（非特許文献２参照）。
【００１０】
また、本発明者らは、ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物として、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬との組合せについての研究も進めている（特許文献２参照）。
【００１１】
これまでの本発明者らの研究によって、ある程度の臨床効果を奏するワクチンが開発されつつある。
しかしながら、前記治療ワクチンではＣＩＮ３（高度異形成）からＣＩＮ２（中等度異形成）までの退縮効果に留まり、正常化は難しい。子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの患者における臨床効果を更に高めて正常化を目指すために、より優れた粘膜免疫誘導能を有するＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０１２−５１４４６９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１９１２２５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈ．  Ｐｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００６，  ｖｏｌ．１１９，  ｐｐ．１７０２−１７０９
【非特許文献２】Ｋ．  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１０，  ｖｏｌ．２８，  ｐｐ．２８１０−２８１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．０３μｇ〜１．０μｇであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
＜２＞  前記＜１＞に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
＜３＞  前記＜１＞に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、製造例１におけるｐＱＥ３１：：ｃＡ＝Ｅ７Ｒｂの模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、製造例１のＦＡＣＳ分析の結果を示す図−１である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、製造例１のＦＡＣＳ分析の結果を示す図−２である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ウェスタンブロット法により、各種のタンパク質について確認した結果の一例を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、製造例２におけるｐＩＧＭ２：：Ｅ７Ｒｂ＝ｐｒｔＰ  ａｎｃｈｏｒの模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、製造例２のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例１のＦＡＣＳ分析（測定条件は、Ｖｏｌｔａｇｅ：５２５）の結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例１のＦＡＣＳ分析（測定条件は、Ｖｏｌｔａｇｅ：６００）の結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例２のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、試験例３のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（乳酸菌含有組成物）
本発明の乳酸菌含有組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００１９】
＜乳酸菌＞
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の乳酸菌が好ましく、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）細胞の誘導能が確認されている点で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉがより好ましい。前記乳酸菌は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２０】
前記乳酸菌含有組成物は、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有さない乳酸菌を含んでいてもよいが、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌の含有割合が、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００２１】
＜＜ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチド＞＞
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２２】
前記ＨＰＶの型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、がんに関しての高リスク群に属する、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ６３が好ましく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８がより好ましく、ＨＰＶ１６が特に好ましい。前記ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質は、子宮頸がんをはじめとするＨＰＶ関連がん（肛門がん、咽頭がん、陰茎がん、外陰がん、腟がん等）に恒常的に発現しているがん抗原である。
【００２３】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質の全長タンパク質であってもよいし、１から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたタンパク質であってもよい。
また、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、野生型のＥ７タンパク質に由来するものであってもよいし、変異型のＥ７タンパク質に由来するものであってもよい。
【００２４】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの中でも、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）における第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕに相当する、Ｅ７タンパク質のＲｂタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換した変異型Ｅ７タンパク質が好ましく、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）の第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕの全てをＧｌｙに置換した変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）がより好ましい。
【００２５】
−含有量−
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量としては、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．０３μｇ〜１．０μｇであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０３μｇ〜０．３μｇが好ましく、０．０６μｇ〜０．３μｇがより好ましく、０．０９μｇ〜０．３μｇが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より優れた薬理効果（粘膜免疫誘導能）を発揮することができる点で、有利である。
【００２６】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＰＶのＥ７タンパク質に特異的な抗体を用いたＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ）により測定する方法などが挙げられる。
前記ＦＡＣＳにより測定する方法では、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が既知の試料と同じ条件で測定することにより、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が未知の試料の含有量を測定することができる。
【００２７】
＜＜態様＞＞
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、乳酸菌の菌体表面に結合されたもの（以下、「Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌」と称することがある）であってもよいし、乳酸菌の菌体表面に発現されたもの（以下、「Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌」と称することがある）であってもよい。また、両者を組み合わせた態様であってもよい。
また、前記乳酸菌は、生菌であってもよいし、死菌であってもよい。
前記死菌とする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オートクレーブで８０℃、５分間加熱処理する方法などが挙げられる。
【００２８】
−Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌−
前記Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌は、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法や化学合成による方法などにより製造した前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを乳酸菌の菌体表面に結合することにより、製造することができる。
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、コストなどの点で、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法が好ましい。
【００２９】
前記遺伝子組換えによる方法の宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられる。
前記細菌における前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの発現に適した発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＱＥ３１などが挙げられる。
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００３０】
前記形質転換菌により生産された前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、公知の方法を適宜選択することにより、精製することができる。
【００３１】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを前記乳酸菌の菌体表面に結合する方法としては、特に制限はなく、共有結合、電気的に結合するなどの公知の方法を適宜選択することができるが、アンカータンパク質を介して前記乳酸菌の菌体表面に電気的に結合する方法が好ましい。
【００３２】
前記アンカータンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのペプチドグリカン加水分解酵素であるＡｃｍＡ由来の細胞壁結合タンパクであるｃＡなどが挙げられる。
【００３３】
前記アンカータンパク質を介して前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを前記乳酸菌の菌体表面に結合する場合は、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドは、前記アンカータンパク質との融合タンパク質とすることが好ましい。
前記融合タンパク質における、前記アンカータンパク質と、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドとの順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アンカータンパク質と、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドとがこの順に融合されている態様が好ましい。前記好ましい態様の具体例としては、配列番号３で表される配列が挙げられる。
【００３４】
前記電気的に結合（以下、「固定化」と称することがある）する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記乳酸菌に、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドを含む溶液を添加し、混和する方法などが挙げられる。
前記混和する時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１時間程度などが挙げられる。
【００３５】
前記電気的に結合する方法では、前処理を行ってもよい。
前記前処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加熱処理などが挙げられる。前記加熱処理により、前記乳酸菌が死菌化される。
前記加熱処理の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１００℃で３０分間加熱するなどが挙げられる。
前記加熱処理は、前記乳酸菌をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で懸濁した状態で行ってもよいし、前記乳酸菌をＰＢＳで懸濁した状態で行ってもよい。
【００３６】
−Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌−
前記Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌は、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された乳酸菌を培養することにより、製造することができる。
【００３７】
前記発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＩＧＭ２などが挙げられる。前記ｐＩＧＭ２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ１５５９のＳ−ｌａｙｅｒタンパク質のプロモーター配列の下流にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ１５５９のｐｒｔＰ遺伝子の分泌シグナルを有し、これらの下流にＬａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のアンカー遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌ． ｃａｓｅｉ）を有する。
【００３８】
前記発現ベクターのその他の例としては、ｒｅｐＥ変異遺伝子と、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター（Ｐａｌｄ）と、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡで構成された群から選択されるポリグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子とを含むベクター（特表２０１２−５１４４６８号公報、特表２０１２−５１４４６９号公報参照）などが挙げられる。
【００３９】
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４０】
前記Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌とする場合には、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸は、アンカー遺伝子と結合したものとすることが好ましい。
前記アンカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｌａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のアンカー遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌ． ｃａｓｅｉ）が好ましい。
【００４１】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸と、前記アンカー遺伝子との順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸と、前記アンカー遺伝子とがこの順に結合されている態様が好ましい。前記好ましい態様の具体例としては、配列番号４で表される配列が挙げられる。
【００４２】
前記Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌に用いる乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９３株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４株が好ましい。前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４株は、前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９３株の継代派生株であり、形質転換効率が高い変異株である。前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９３株、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＢＬ２３株の全ゲノム配列に相同性が最も高い。
【００４３】
前記Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌の培養方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００４４】
前記Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌における、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における発現量を調節する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液のｐＨを調整する方法などが挙げられる。
後述する製造例２で示されるように、炭酸水素ナトリウムの濃度を変更し、培養液のｐＨを調整した培養液を用いることにより、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における発現量を調節することができる。
前記培養液のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ７程度が好ましい。
【００４５】
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドが、前記アンカータンパク質との融合タンパク質である場合、前記融合タンパク質の菌体表面における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．１μｇ〜３．３μｇが好ましく、０．１μｇ〜１．０μｇがより好ましく、０．２μｇ〜１．０μｇが更に好ましく、０．３μｇ〜１．０μｇが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より優れた薬理効果（粘膜免疫誘導能）を発揮することができる点で、有利である。
【００４６】
＜その他の成分＞
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
（ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物）
本発明のＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４８】
＜乳酸菌含有組成物＞
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
＜その他の成分＞
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する漢方薬、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５０】
−滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する漢方薬−
前記滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５１】
−粘膜アジュバント−
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する漢方薬と協調して、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。
【００５２】
前記粘膜アジュバントの例としては、細菌毒素由来アジュバント、合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＳＰ−Ｃ（サーファクテン）、ＳＰ−Ｂ、ＩＦＮ−α（野生型又は変異型）、二本鎖ＲＮＡ、活性増幅型ＴＮＦ変異体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５３】
前記細菌毒素由来アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）に由来するポリペプチド、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）に由来するポリペプチド、ベロ毒素（ＶＴ）に由来するポリペプチド、ジフテリア毒素（ＤＴ）に由来するポリペプチド、百日咳毒素（ＰＴ）に由来するポリペプチドなどが挙げられる。
前記細菌毒素由来アジュバントは、野生型細菌毒素由来アジュバントであってもよいし、変異型細菌毒素由来アジュバントであってもよいが、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
【００５４】
−医薬的に許容され得る担体−
前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、剤形に応じて公知の担体を適宜選択することができる。
【００５５】
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
＜使用＞
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００５７】
＜剤形＞
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）などが挙げられる。これらの剤形の前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【００５８】
＜投与＞
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００６０】
前記投与対象としては、ヒトが好適に挙げられる。
【００６１】
前記ＨＰＶ関連腫瘍としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、子宮頸がん、外陰がん、肛門がん、口腔がん、腟がん、陰茎がん、咽頭がん、及びこれらの前がん病変などが挙げられる。
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用として、好適に利用可能である。
前記初期子宮頸がんには、微小浸潤がんの状態が含まれる。
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、ＨＰＶ感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。
【００６２】
（ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかを治療する方法）
前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、個体に経口投与することにより、個体におけるＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかを治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物を経口投与することを特徴とする、ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかを治療する方法にも関する。
【００６３】
（粘膜免疫誘導剤）
本発明の粘膜免疫誘導剤は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００６４】
＜乳酸菌含有組成物＞
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記粘膜免疫誘導剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
＜その他の成分＞
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記ＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物のその他の成分の項目に記載のものと同様とすることができる。
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６６】
＜使用＞
前記粘膜免疫誘導剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記粘膜免疫誘導剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【００６７】
＜剤形＞
前記粘膜免疫誘導剤の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）などが挙げられる。これらの剤形の前記粘膜免疫誘導剤は、常法に従い製造することができる。
【００６８】
＜投与＞
前記粘膜免疫誘導剤の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００７０】
前記投与対象としては、ヒトが好適に挙げられる。
【００７１】
前記粘膜免疫誘導剤は、粘膜におけるＨＰＶのＥ７タンパク質特異的細胞性免疫応答を誘導することができる。
【００７２】
（粘膜免疫を誘導する方法）
前記粘膜免疫誘導剤は、個体に経口投与することにより、個体における粘膜免疫を誘導することができる。したがって、本発明は、個体に前記粘膜免疫誘導剤を経口投与することを特徴とする、粘膜免疫を誘導する方法にも関する。
【実施例】
【００７３】
以下に本発明の製造例及び試験例を説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
【００７４】
（比較製造例１：公知のＬａｃＥ７製剤の製造）
公知の製剤であるＬａｃＥ７製剤を、Ｐｏｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．１，７０２−１，７０９に記載の方法に従って製造した。
簡単に述べると、ＨＰＶ１６由来の変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、野生型Ｅ７タンパク質のＲｂタンパク質との結合に関与する第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕを全てＧｌｙに置換したもの）を、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１細胞）の誘導能が確認されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体（ＬａｃＥ７）は、熱で死菌化した。培地から精製したＬａｃＥ７を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し（ＬａｃＥ７製剤）、使用するまで４℃で保存した。前記ＬａｃＥ７製剤は水性溶媒に不溶性であった。
【００７５】
（製造例１：変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌の製造）
ＨＰＶのＥ７タンパク質由来ポリペプチドである変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）が、乳酸菌の菌体表面に結合された変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
【００７６】
＜変異型Ｅ７タンパク質の作製＞
−ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合配列を挿入したタンパク質発現用プラスミドの構築−
前記ｃＡは、アンカータンパク質であり、前記変異型Ｅ７タンパク質を乳酸菌の菌体表面へ固定化するツールとして用いた。前記ｃＡは、電荷と特定のモチーフによりグラム陽性菌のペプチドグリカンへ固定化することができるものであり、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのペプチドグリカン加水分解酵素であるＡｃｍＡ由来の細胞壁結合タンパクである（Ｔｊｉｂｂｅ  Ｂｏｓｍａ，  Ｒｏｌｆ  Ｋａｎｎｉｎｇａ，  Ｊｏｌａｎｄａ  Ｎｅｅｆ，  Ｓａｎｄｒｉｎｅ  Ａ．  Ｌ．  Ａｕｄｏｕｙ，  Ｍａａｒｔｅｎ  Ｌ．  ｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ，  Ａｎｔｏｎ  Ｓｔｅｅｎ，  Ｇｉｒｂｅ  Ｂｕｉｓｔ，  Ｊａｎ  Ｋｏｋ，  Ｏｓｃａｒ  Ｐ．  Ｋｕｉｐｅｒｓ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ，  ａｎｄ  Ｋｅｅｓ  Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ  （２００６）  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｎｏｎ−Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ｐ．  ８８０−８８９）。
前記ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合配列（配列番号３参照）をベクタープラスミドであるｐＱＥ３１に常法により挿入した（以下、「ｐＱＥ３１：：ｃＡ＝Ｅ７Ｒｂ」と称することがある、図１Ａ参照）。
【００７７】
−形質転換−
前記ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合タンパク質を発現させる宿主として、ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）（Ｅ． ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ＤＥ３  ＬＰＳ改変株、Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いた。
まず、ｐＲＥＰ４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を導入するために、エレクトロポレーション法によりＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）の形質転換を行った。
次いで、得られた形質転換体に、ｐＱＥ３１：：ｃＡ＝Ｅ７Ｒｂを塩化カルシウム法により導入し、前記ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合タンパク質を発現させる大腸菌（以下、「ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）  ｐＱＥ３１：：ｃＡ＝Ｅ７Ｒｂ，  ｐＲＥＰ４」と称することがある）を得た。
【００７８】
−融合タンパク質の発現及び精製−
アンピシリン（終濃度  １００μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（終濃度  ２５μｇ／ｍＬ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に前記菌体を一白金耳接種し、３７℃で一晩振盪培養した。
前記培養物を集菌し、洗浄後、培養時と同量のＰＢＳでメスアップし、アンピシリン（終濃度  １００μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（終濃度  ２５μｇ／ｍＬ）を含む本培養用のＬＢ液体培地の１／２０量になるよう接種した。
本培養は３７℃で振盪培養し、Ｏ．Ｄ．６００が０．５に達したところで、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３７℃、４時間振盪培養し、前記融合タンパク質の発現誘導を行った。
前記誘導後の培養液を集菌し、菌体１ｇ当たり５ｍＬのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、ｐＨ８）を加え、室温にて１時間穏やかに撹拌した。４℃、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
回収した上清４ｍＬに対してＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにより平衡化したＴＡＬＯＮ（登録商標）  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ  １ｍＬ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を室温で４０分間穏やかに混和した。上清とレジンの混合液をＰｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡＧＥＮ）に移し上清を除去した。４ｍＬのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、ｐＨ６．３）により２回洗浄し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、１５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ５．９）及びＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、３００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ４．５）により、Ｈｉｓタグ融合タンパク質を溶出した。
回収したタンパク質溶液は、透析により脱塩し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）−１０ｋ（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外濾過により濃縮した。
濃縮後のタンパク質溶液は、Ｑｕｉｃｋ  ＳｔａｒｔＴＭ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により濃度を測定した後、使用時まで−８０℃で保存した。
【００７９】
−ウェスタンブロット法による融合タンパク質の確認−
前記−融合タンパク質の発現及び精製−における本培養において、ＩＰＴＧを添加し、３７℃、４時間振盪培養した後の培養液を１０，０００×ｇで３分間遠心を行い、集菌した。上清を捨て、ペレットを１００μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで懸濁した。前記懸濁した懸濁液を１００℃で５分間加熱した。
加熱後の懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＥＤＭ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。
前記転写後の膜を一次抗体溶液（１％  ＢＳＡ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−），  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ＩｇＧ（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂ、株式会社  医学生物学研究所）（１：２，０００））中で、室温で１時間インキュベートした。
その後、前記膜をＰＢＳＴで２回洗浄した。
次いで、二次抗体溶液（１％  ＢＳＡ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−），  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｄｕｌｅ）−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｇｏａｔ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）（１：１０，０００））中で、室温で１時間インキュベートした。
その後、前記膜をＰＢＳＴで２回洗浄した。
次いで、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｃｈｅｍｉ  ｄｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にてバンドを検出し、目的の融合タンパク質が発現していることを確認した。
【００８０】
＜乳酸菌の菌体表面への結合＞
前記ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合タンパク質の乳酸菌の菌体表面への結合（以下、「固定化」と称することもある）は、Ｔｊｉｂｂｅ  Ｂｏｓｍａ，  Ｒｏｌｆ  Ｋａｎｎｉｎｇａ，  Ｊｏｌａｎｄａ  Ｎｅｅｆ，  Ｓａｎｄｒｉｎｅ  Ａ．  Ｌ．  Ａｕｄｏｕｙ，  Ｍａａｒｔｅｎ  Ｌ．  ｖａｎ  Ｒｏｏｓｍａｌｅｎ，  Ａｎｔｏｎ  Ｓｔｅｅｎ，  Ｇｉｒｂｅ  Ｂｕｉｓｔ，  Ｊａｎ  Ｋｏｋ，  Ｏｓｃａｒ  Ｐ．  Ｋｕｉｐｅｒｓ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ，  ａｎｄ  Ｋｅｅｓ  Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ  （２００６）  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｎｏｎ−Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ｐ．  ８８０−８８９を参考にして、以下のように行った。
【００８１】
−乳酸菌の培養−
乳酸菌として、抗原運搬体としてアジュバント効果が既に確認されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９３（Ｋａｊｉｋａｗａ  Ａ，  Ｉｇｉｍｉ  Ｓ  （２０１０）  Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：３４０９−３４１５）を用いた。
前記乳酸菌をＭａｎｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）液体培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、３７℃で一晩静置培養した。培養液を集菌し、ＰＢＳにより２回洗浄した。
【００８２】
−固定化の前処理−
前記固定化の前処理として、「前記乳酸菌をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理したもの」（以下、「ＴＣＡ処理あり」と称することがある）、及び「前記乳酸菌をＰＢＳで処理したもの」（以下、「ＴＣＡ処理なし」と称することがある）の２種類を用意した。
前記ＴＣＡによる処理は、菌体を培養液の０．２倍量の１０％  ＴＣＡにより再懸濁し、１００℃で３０分間加熱後、ＰＢＳにて３回洗浄した。
前記ＰＢＳによる処理は、菌体を培養液の０．２倍量のＰＢＳにより再懸濁し、１００℃で３０分間加熱後、ＰＢＳにて３回洗浄した。
【００８３】
−固定化−
前記前処理後の乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記融合タンパク質を１．０μｇ、０．３μｇ、０．１μｇ、又は０．０３μｇ（それぞれ前記変異型Ｅ７タンパク質の量として、０．３μｇ、０．０９μｇ、０．０３μｇ、又は０．００９μｇに相当する）加え、前記融合タンパク質を含むＰＢＳ溶液中で１時間混和した。これにより、乳酸菌の表面に前記融合タンパク質を電気的に結合させた。
前記混和後、ＰＢＳにより３回洗浄し、−８０℃で保存した。
【００８４】
以上により、下記の変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌が得られた。
（１）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
（２）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
（３）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
（４）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．００９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
（５）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
（６）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
（７）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
（８）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．００９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
【００８５】
＜ＦＡＣＳ分析＞
前記（１）〜（８）の変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌について、ＨＰＶのＥ７タンパク質に特異的な抗体を用い、蛍光標識を行った後、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ、ＢＤ社製）により、固定化を確認した。
具体的には、前記変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌を、０．５ｍＬの一次抗体溶液（１％  ＢＳＡ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−），  ａｎｔｉ−ＨＰＶ１６  Ｅ７  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＨＰＶ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ［２８９−１７０１３（ＴＶＧ−７０１Ｙ）］、ＧｅｎｅＴｅｘ社）（１：１０００））中で転倒混和（室温、６０分間）した。その後、遠心（１５，０００×ｇ、３分間）した後、ＰＢＳ（−）にて洗浄を２回行った。次いで、０．５ｍＬの二次抗体溶液（１％  ＢＳＡ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ（−），  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）（１：５００））中で遮光しながら転倒混和（室温、６０分間）した。その後、遠心（１５，０００×ｇ、３分間）した後、ＰＢＳ（−）にて洗浄を２回行った。
その後、ＰＢＳ（−）にて０．６ｍＬにメスアップし、ＦＡＣＳにより蛍光を検出した。
なお、前記融合タンパク質を用いなかった以外は、同一の操作を行ったものをネガティブコントロールとして用いた。
結果を図１Ｂ及び図１Ｃに示す。
【００８６】
図１Ｂ中、「Ｎ」は、ネガティブコントロールの結果を示し、「（１）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）の結果を示し、「（２）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）の結果を示し、「（３）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）の結果を示し、「（４）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．００９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）の結果を示す。
【００８７】
図１Ｃ中、「Ｎ」は、ネガティブコントロールの結果を示し、「（５）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）の結果を示し、「（６）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）の結果を示し、「（７）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）の結果を示し、「（８）」は、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．００９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）の結果を示す。
【００８８】
図１Ｂ及び図１Ｃの結果から、変異型Ｅ７タンパク質の量の増加に伴い、蛍光強度が強くなることが示された。
なお、前記変異型Ｅ７タンパク質の量を乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、０．９μｇとした場合には、乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、０．３μｇの場合と同様の結果となり、乳酸菌の菌体表面に結合できる前記変異型Ｅ７タンパク質の量は、０．３μｇ程度で飽和することもわかった。
【００８９】
なお、図１Ｄに、ウェスタンブロット法により、以下のタンパク質について確認した一例を示す。
［タンパク質］
・  Ｈｉｓタグ付きの、ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合タンパク質（４８ｋＤａ）
・  Ｈｉｓタグ付きのｃＡ（３３ｋＤａ）
・  Ｈｉｓタグ付きの変異型Ｅ７タンパク質（１５ｋＤａ）
図１Ｄ中、「１」は「Ｈｉｓタグ付きの、ｃＡと変異型Ｅ７タンパク質との融合タンパク質」の結果を示し、「２」は「Ｈｉｓタグ付きのｃＡ」の結果を示し、「３」及び「５」は「Ｈｉｓタグ付きのｃＡの発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「４」及び「６」は「Ｈｉｓタグ付きのｃＡの発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「７」は「Ｈｉｓタグ付きの変異型Ｅ７タンパク質」の結果を示し、「８」及び「１０」は「Ｈｉｓタグ付きの変異型Ｅ７タンパク質の発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「９」及び「１１」は「Ｈｉｓタグ付きの変異型Ｅ７タンパク質の発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示す。
【００９０】
（製造例２：変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌の製造）
ＨＰＶのＥ７タンパク質由来ポリペプチドである変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）が、乳酸菌の菌体表面に発現された変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
【００９１】
ベクタープラスミドとして、ｐＩＧＭ２（Ｋａｊｉｋａｗａ  Ａｋｉｎｏｂｕ，  Ｅｉｋｏ  Ｉｃｈｉｋａｗａ，  ａｎｄ  Ｓｈｉｚｕｎｏｂｕ  Ｉｇｉｍｉ  （２０１０）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０（２），  ３７５−３８２）を用い、変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）をコードする配列とＬａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のアンカー遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌ． ｃａｓｅｉ）の配列とをこの順に結合した配列（配列番号４）を挿入したベクタープラスミド（以下、「ｐＩＧＭ２：：Ｅ７Ｒｂ＝ｐｒｔＰ  ａｎｃｈｏｒ」と称することがある）を作製した（図２Ａ参照）。
【００９２】
前記ベクタープラスミドのターミネーター配列を除去し、エレクトロポレーション法により、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４に導入した（以下、「Ｌ． ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４［ｐＥＫ７：：Ｅ７Ｒｂ］」と称することがある）。
また、ネガティブコントロールとして、変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）をコードする配列とＬａｃｏｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のアンカー遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌ． ｃａｓｅｉ）の配列とをこの順に結合した配列（配列番号４）を挿入しないベクタープラスミドを用いた以外は同様にして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４にベクタープラスミドを導入した株を作製した（以下、「Ｌ． ｃａｓｅｉ  ＩＧＭ３９４［ｐＬＰｅｍｐｔｙ］」と称することがある）。
【００９３】
前記乳酸菌を、Ｍａｎｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にＥｍ  ５μｇ／ｍＬを添加した液体培地（ＭＲＳＥ）に播き、３７℃で一晩（約１４時間）培養した。培養液を集菌（５，０００ｇ×１０分間）し、ＰＢＳにより１回洗浄（５，０００ｇ×１０分間）した。ＰＢＳを添加し、細胞懸濁液濃度を１×１０９ＣＦＵ／ｍＬに調整した。
【００９４】
１ＬのＭＲＳＥ（（ｉ）ＮａＨＣＯ３を無添加、ｐＨ６．４、（ｉｉ）１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加、ｐＨ６．８、又は（ｉｉｉ）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加、ｐＨ７．１）に、前記調整した細胞懸濁液を１０％播き（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）、３７℃で約５時間、穏やかに攪拌しながら、嫌気条件下（アネロパック使用）で培養した。
なお、ネガティブコントロールの乳酸菌は、（ｉ）ＮａＨＣＯ３を無添加のＭＲＳＥを用いて培養した。
【００９５】
培養液を集菌（５，０００ｇ×１０分間）し、ＰＢＳにより１回洗浄（５，０００ｇ×１０分間）した。ＰＢＳを３０ｍＬ添加し、細胞懸濁液濃度を終濃度７．５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（ＯＤ≒７．５）に調整した。なお、乳酸菌数は、血球計算盤を用いて数えた。
【００９６】
前記細胞懸濁液をオートクレーブで８０℃、５分間加熱処理し、死菌とした。
また、前記加熱処理を行わなかったものを生菌の試料とした。
【００９７】
以上により、下記の変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌が得られた。
（ｉ−１）ＮａＨＣＯ３を無添加のＭＲＳＥ（ｐＨ６．４）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
（ｉ−２）ＮａＨＣＯ３を無添加のＭＲＳＥ（ｐＨ６．４）で培養し、生菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
（ｉｉ−１）１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ６．８）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
（ｉｉ−２）１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ６．８）で培養し、生菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
（ｉｉｉ−１）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
（ｉｉｉ−２）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、生菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
【００９８】
＜ＦＡＣＳ分析＞
前記（ｉ−１）、（ｉｉ−１）、及び（ｉｉｉ−１）の変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌、並びにネガティブコントロールの乳酸菌について、前記製造例１と同様にしてＦＡＣＳ分析を行い、乳酸菌１．０×１０８菌体当たりの菌体表面の変異型Ｅ７タンパク質の発現の程度を確認した。結果を図２Ｂに示す。
【００９９】
図２Ｂ中、「Ｎ」は、ネガティブコントロール（死菌）の結果を示し、「（ｉ−１）」は、ＮａＨＣＯ３を無添加のＭＲＳＥ（ｐＨ６．４）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌の結果を示し、「（ｉｉ−１）」は、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ６．８）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌の結果を示し、「（ｉｉｉ−１）」は、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌の結果を示す。
【０１００】
図２Ｂの結果から、培養液のｐＨを調整することにより、菌体表面の変異型Ｅ７タンパク質の発現量を調節可能であることが示された。
【０１０１】
（試験例１：菌体表面の変異型Ｅ７タンパク質の量の比較）
以下の試料について、前記製造例１と同様にしてＦＡＣＳ分析を行い、乳酸菌１．０×１０８菌体当たりの菌体表面の変異型Ｅ７タンパク質の量を比較した。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
＜試料＞
（Ｉ）  ・・・  前記製造例２におけるネガティブコントロール（死菌）。
（ＩＩ）  ・・・  前記比較製造例１で製造したＬａｃＥ７製剤。
（ＩＩＩ）  ・・・  前記製造例１における（３）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
（ＩＶ）  ・・・  前記製造例２における（ｉｉｉ−１）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
【０１０２】
図３Ａ及び図３Ｂ中、「（Ｉ）」は、前記試料（Ｉ）の結果を示し、「（ＩＩ）」は、前記試料（ＩＩ）の結果を示し、「（ＩＩＩ）」は、前記試料（ＩＩＩ）の結果を示し、「（ＩＶ）」は、前記試料（ＩＶ）の結果を示す。
【０１０３】
図３Ａ（測定条件は、Ｖｏｌｔａｇｅ：５２５）の結果から、既存のＬａｃＥ７製剤では、菌体表面における変異型Ｅ７タンパク質の発現を発現している乳酸菌と、発現していない乳酸菌とのバラつきが多いことが示された。また、図３Ｂ（測定条件は、Ｖｏｌｔａｇｅ：６００）の結果から、既存のＬａｃＥ７製剤では、菌体表面における変異型Ｅ７タンパク質の発現量が低いことが示された。
一方、前記製造例２における（ｉｉｉ−１）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌では、乳酸菌１．０×１０８菌体当たりの変異型Ｅ７タンパク質の発現量が０．３μｇ程度と推測された。
【０１０４】
（試験例２：抗ＨＰＶ粘膜免疫誘導能試験−１）
比較製造例１で製造したＬａｃＥ７製剤を用い、以下のようにして抗ＨＰＶ粘膜免疫誘導能試験を行った。
【０１０５】
＜マウスの免疫＞
マウスのＬａｃＥ７製剤による経口免疫は、Ｋ．  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１０，  ｖｏｌ．２８，  ｐｐ．２８１０−２８１７に記載の方法に従って行った。
【０１０６】
＜＜マウスへのＬａｃＥ７製剤の経口投与＞＞
６週齢の雌ＳＰＦ  Ｃ６７ＢＬマウス（日本クレア株式会社）に対して、前記ＬａｃＥ７製剤を経口投与することで免疫した。
１匹当たり０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、又は１．０ｍｇの前記ＬａｃＥ７製剤を第１週、第２週、第４週、及び第６週の合計４クール投与した。全ての投与は、前記ＬａｃＥ７製剤を２００μＬのＰＢＳに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続５日間、１日１回３時間の絶食後に行った。
【０１０７】
＜腸の回収＞
前記ＬａｃＥ７製剤の最後の接種から１週間後（接種開始から７週目）に、前記ＬａｃＥ７製剤を接種した５匹のマウスを解剖し、腸を採取した。前記腸は、排泄物を除いた後、プロテアーゼ阻害剤を加えたＨＢＳＳ  １０ｍＬで腸管内部を洗浄した。
【０１０８】
＜マウスの粘膜リンパ球の調製＞
腸は縦方向に切開して１０質量％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＰＲＭＩ１６４０（１０質量％  非働化牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール含有）培地で３７℃、３０分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、ＢＤファルコン（商標）セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス株式会社，米国）で組織残屑を除き、次いで、７０質量％と４０質量％のＰｅｒｃｏｌｌ  ＰＬＵＳを重層した１５ｍＬチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約１０７個〜１０８個の細胞を上に重層し、６００×ｇ、室温で２０分間遠心することで、７０質量％と４０質量％のＰｅｒｃｏｌｌ  ＰＬＵＳの界面に粘膜リンパ球（生存率９５％）が集まった。約５×１０６個〜１０×１０６個の粘膜リンパ球が各マウスから得られた。
【０１０９】
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
腸粘膜リンパ球（５×１０６細胞／ｍＬ）の懸濁液５０μＬを、２４時間、３７℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。
マウスＩＦＮ−γ用ＥＬＩＳＰＯＴキット（マブテックＡＢ、スウェーデン）のメーカープロトコールに従い、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質（配列番号１）においてＣＴＬエピトープとして報告されている、Ｅ７タンパク質の第４９番から第５７番のアミノ酸配列からなる１０μＬの合成ペプチド（１μｇ／ｍＬ）、マイトジェン（ホルボールミリステートアセテート  ４０ｎｇ／ｍＬ＋イオノマイシン  ４μｇ／ｍＬ）、又は培地のみ（コントロール）を、抗マウスＩＦＮ−γ抗体でコートされた９６ウェルプレート（ＥＬＩＩＰプレート、ミリポア株式会社、ＵＳＡ）に滴下した。９６ウェルプレート上のＩＦＮ−γ陽性のスポット数を解析した。その際、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ（カールツァイスビジョン社、ドイツ）のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。
【０１１０】
＜統計解析＞
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ（各グループはマウス５匹）間で比較した。その際、両側ステューデントｔ−検定を行った。ｐ値が＜０．０５の場合有意とみなした。
【０１１１】
試験例２の結果を図４に示す。
図４から明らかなように、投与量に依存して、１０６細胞当たりのＩＦＮ−γ産生細胞数が増加していた。
また、図４から、ＬａｃＥ７製剤を０．５ｍｇ投与した場合の１０６細胞当たりのＩＦＮ−γ産生細胞数は、６５．８細胞と算出された（図４中の矢印部分）。
【０１１２】
（試験例３：抗ＨＰＶ粘膜免疫誘導能試験−２）
以下の試料を用い、試料の投与量を０．５ｍｇ／マウスとした以外は、試験例２と同様にして抗ＨＰＶ粘膜免疫誘導能試験を行った。
＜試料＞
・  試料−１  ：  製造例１における（１）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理あり）。
・  試料−２  ：  製造例１における（６）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．０９μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
・  試料−３  ：  製造例１における（５）乳酸菌１．０×１０８菌体当たり、前記変異型Ｅ７タンパク質を０．３μｇ結合させた変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌（ＴＣＡ処理なし）。
・  試料−４  ：製造例２における（ｉｉｉ−２）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、生菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
・  試料−５  ：製造例２における（ｉｉｉ−１）２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を添加したＭＲＳＥ（ｐＨ７．１）で培養し、死菌とした変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌。
【０１１３】
結果を図５に示す。図５中、横軸の１〜５は、前記試料の番号を示す。
また、図５では、前記試験例２の結果も併せて示した。図５中、Ａは試験例２におけるＬａｃＥ７製剤の投与量が０．１ｍｇ／マウスの結果を示し、Ｂは試験例２におけるＬａｃＥ７製剤の投与量が０．３ｍｇ／マウスの結果を示し、Ｃは試験例２におけるＬａｃＥ７製剤の投与量が１．０ｍｇ／マウスの結果を示す。
図５における矢印は、前記試験例２の結果から算出されたＬａｃＥ７製剤を０．５ｍｇ／マウスで投与した場合の１０６細胞当たりのＩＦＮ−γ産生細胞数を示す。
【０１１４】
図５の結果から、本発明の変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌又は変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌である試料−１〜５を用いた場合には、公知の製剤であるＬａｃＥ７製剤を同量投与した場合と比較して、優れた抗ＨＰＶ免疫誘導能を有することが示された。
中でも、試料−２〜５を用いた場合には、公知の製剤であるＬａｃＥ７製剤を同量投与した場合と比較して、約２倍程度の非常に優れた抗ＨＰＶ免疫誘導能を有することが示された。
本発明者らによる公知の製剤であるＬａｃＥ７製剤を用いたヒトのＣＩＮ３患者での臨床試験では、病気が治った群と、病気が治らなかった群とにおけるＩＦＮ−γ産生細胞数を比較すると、前者は、後者よりもＩＦＮ−γ産生細胞数が２倍程度多いことが示されている（Ｋ．  Ｋａｗａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ  Ｅ７  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｇｒａｄｅ  ３  （ＣＩＮ３）  ｅｌｉｃｉｔｓ  Ｅ７−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｘ  ｏｆ  ＣＩＮ３  ｐａｔｉｅｎｔｓ．”，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１４  Ｏｃｔ  ２９；３２（４７）：６２３３−９．）。
したがって、本発明の変異型Ｅ７タンパク質結合型乳酸菌又は変異型Ｅ７タンパク質発現型乳酸菌が、公知の製剤であるＬａｃＥ７製剤よりも、同じ投与量で、ＩＦＮ−γ産生細胞数が２倍程度多いことは、臨床効果（奏効率）が有意に上がることが予想される。
【０１１５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌１×１０８菌体当たり、０．０３μｇ〜１．０μｇであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
＜２＞  ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合されたものである前記＜１＞に記載の乳酸菌含有組成物である。
＜３＞  ＨＰＶのＥ７タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に発現されたものである前記＜１＞に記載の乳酸菌含有組成物である。
＜４＞  乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物である。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞ののいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
＜６＞  子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用である前記＜５＞に記載のＨＰＶ感染症及びＨＰＶ関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
＜７＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
【図１Ａ】
2018158954.tif 000002
【図１Ｂ】
2018158954.tif 000003
【図１Ｃ】
2018158954.tif 000004
【図１Ｄ】
2018158954.tif 000005
【図２Ａ】
2018158954.tif 000006
【図２Ｂ】
2018158954.tif 000007
【図３Ａ】
2018158954.tif 000008
【図３Ｂ】
2018158954.tif 000009
【図４】
2018158954.tif 000010
【図５】
2018158954.tif 000011
【配列表】
2018158954000001.app