(57)【要約】【課題】細胞内移行性を向上させたプローブ分子を提供すること、および細胞などのミクロ環境の酸素濃度を発光スペクトル変化から高感度リアルタイムで定量するための発光試薬を提供すること。【解決手段】少なくとも１つのリンカーと、少なくとも１つの蛍光団と、少なくとも１つの酸素濃度応答性りん光団とを含み、該蛍光団と該酸素濃度応答性りん光団とが該リンカーを介して連結され、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする、化合物。【選択図】図６
2018065768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのリンカーと、少なくとも１つの蛍光団と、少なくとも１つの酸素濃度応答性りん光団とを含み、該蛍光団と該酸素濃度応答性りん光団とが該リンカーを介して連結され、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする、化合物。
【請求項２】
リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合した蛍光団とを含む化合物であって、該リンカーがアルギニンを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカーの第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
酸素濃度応答性りん光団がイリジウム錯体又は白金錯体を含む基である、請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８】
イリジウム錯体が下記（１）〜（７）の何れかの構造を有する、請求項７に記載の化合物。    
【化１】
2018065768.tif 000037
【化２】
2018065768.tif 000038
【請求項９】
蛍光団が下記いずれかの基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【化３】
2018065768.tif 000039
【化４】
2018065768.tif 000040
【化５】
2018065768.tif 000041
【請求項１０】
リンカーが下記で示されるオリゴアルギニンを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化６】
2018065768.tif 000042
ｎは４〜２０の整数である。
【請求項１１】
式（Ａ）で表される化合物である、請求項２に記載の化合物。
【化７】
2018065768.tif 000043
（Ａ）
式（Ａ）中、ｎは４〜２０の整数である。
【請求項１２】
リンカーがさらにプロリンを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
リンカーがプロリンとオリゴアルギニンから構成される、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
リンカーが下記で示されるプロリンとオリゴアルギニンから構成される、請求項１３に記載の化合物。
【化８】
2018065768.tif 000044
ｎは４〜２０の整数である。
【請求項１５】
式（Ｂ）で表される化合物である、請求項１４に記載の化合物。
【化９】
2018065768.tif 000045
（Ｂ）
式（Ｂ）中、ｎは４〜２０の整数である。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物を含む酸素濃度測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レシオ法を用いた細胞内酸素濃度測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や組織内の酸素濃度を計測する技術の開発は、細胞生物学の基礎研究のみならず、がん、脳卒中、心筋梗塞など低酸素状態が関与する病態の診断や治療において重要である。
細胞のようなミクロな構造体の特定の部位の酸素濃度を非侵襲的かつ高感度に計測する方法として、発光プローブ法は非常に有効である。一般に発光プローブを用いた酸素濃度計測法は、プローブ分子の発光が酸素分子との衝突によって消光を受けること、すなわち、発光プローブの発光強度が酸素濃度に依存して変化することを利用する。発光強度の変化から酸素濃度を求める方法は、プローブ分子の濃度と励起光強度分布が均一な場合には正確な値を与えるが、細胞内酸素濃度計測のように、プローブ分子の濃度分布が均一でない場合には、濃度の影響を受けてしまい、解析が困難になる。そこで、濃度の影響を受けない方法として、発光寿命の変化を利用する方法が考えられている、しかし、一般に発光寿命の測定にはパルスレーザーのような高価な光源と高度な光計測技術が必要なため、装置が大掛かりになってしまうという欠点を有する。
【０００３】
本発明者らは、酸素濃度に大きく依存して発光強度や発光寿命が変化するりん光団の特性と、酸素濃度の影響をほとんど受けない蛍光団の特性の両方を利用し、一つの分子内にりん光団と蛍光団をリンカーで結合させた化合物を作製し、発光スペクトルを測定したりん光強度と蛍光強度の比から、細胞内の酸素濃度を定量的に計測できる発光分子プローブを開発してきた。本発明者らは、これまでに、酸素濃度測定試薬（C343-Pro4-BTP）を開
発し、溶液中および脂質膜中における酸素濃度定量を行った（特許文献１参照。）。C343-Pro4-BTPを用いて培養細胞内の酸素濃度計測を試みたところ、C343-Pro4-BTPは、脂溶性が高すぎるため細胞への移行性が低く、定性的な評価に止まることが分かった。そこで、本発明者らはC343-Pro4-BTPの細胞内移行性を向上させるため、カチオン性イリジウム錯
体を用いた新規化合物C343-Pro4-BTQphen、C343-Pro8-BTQphenを開発した（特許文献２参照）。
【０００４】
【化１】
2018065768.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５５００５９４号公報
【特許文献２】特開２０１５−１０１５７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
C343-Pro8-BTQphenは、C343-Pro4-BTPに比べて細胞内移行性が向上し、市販の蛍光プレートリーダーを用いて細胞内からの発光を測定することができた。しかしながら、顕微鏡下の観察において凝集体が見られるなど、定量的に酸素濃度計測を行うためには、さらなる細胞内移行性の向上が必要である。
上記に鑑み、本発明は、細胞内移行性を向上させたプローブ分子を提供することを主たる課題とする。また、細胞などのミクロ環境の酸素濃度を発光スペクトル変化から高感度リアルタイムで定量するための発光試薬を提供することをさらなる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、少なくとも１つのリンカーと、少なくとも１つの蛍光団と、少なくとも１つの酸素濃度応答性りん光団とを含むことを特徴とする化合物において、該蛍光団と該酸素濃度応答性りん光団とが該リンカーを介して連結され、該リンカーとしてアルギニンを含むことで、細胞内移行性を向上させ、定量的に細胞内酸素濃度を測定できることを見出し、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  少なくとも１つのリンカーと、少なくとも１つの蛍光団と、少なくとも１つの酸素濃度応答性りん光団とを含み、該蛍光団と該酸素濃度応答性りん光団とが該リンカーを介して連結され、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする、化合物。
[２]  リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合した蛍光団とを含む化合物であって、該リンカーがアルギニンを含む、[１]記載の化合物。
[３]  第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含む、[１]記載の化合物。
[４]  第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含む、[１]記載の化合物。
[５]  第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む、[１]記載の化合物。
[６]  第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカー第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む、[１]記載の化合物。
[７]  酸素濃度応答性りん光団がイリジウム錯体又は白金錯体を含む基である、[１]〜[
６]の何れかに記載の化合物。
[８]  イリジウム錯体が下記（１）〜（７）の何れかの構造を有する、[７]に記載の化合物。
【化２】
2018065768.tif 000004
【化３】
2018065768.tif 000005
[９]  蛍光団が下記いずれかの基を含む、[１]〜[８]のいずれかに記載の化合物。
【化４】
2018065768.tif 000006
【化５】
2018065768.tif 000007
【化６】
2018065768.tif 000008
[１０]  リンカーが下記で示されるオリゴアルギニンを含む、[１]〜[９]のいずれかに記載の化合物。
【化７】
2018065768.tif 000009
ｎは４〜２０の整数である。
[１１]  式（Ａ）で表される化合物である、[２]に記載の化合物。
【化８】
2018065768.tif 000010
（Ａ）
式（Ａ）中、ｎは４〜２０の整数である。
[１２]  リンカーがさらにプロリンを含む、[１]〜[１０]のいずれかに記載の化合物。
[１３]  リンカーがプロリンとオリゴアルギニンから構成される、[１２]に記載の化合物。
[１４]  リンカーが下記で示されるプロリンとオリゴアルギニンから構成される、[１３]に記載の化合物。
【化９】
2018065768.tif 000011
ｎは４〜２０の整数である。
[１５]  式（Ｂ）で表される化合物である、[１４]に記載の化合物。
【化１０】
2018065768.tif 000012
（Ｂ）
式（Ｂ）中、ｎは４〜２０の整数である。
[１６]  [１]〜[１５]のいずれかに記載の化合物を含む酸素濃度測定試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細胞内移行性を向上させたプローブ分子を提供できる。また、細胞などのミクロ環境の酸素濃度を発光スペクトル変化から高感度リアルタイムで定量するための発光試薬を提供することができる。
本発明の試薬により、蛍光とりん光のレシオを計測することで細胞内の酸素濃度を簡便に測定できる。本発明の試薬を細胞培地に添加し、蛍光顕微鏡で発光画像を取得することで酸素濃度イメージング画像が得られる。また、マイクロプレートリーダーを用いることで、リアルタイムで酸素濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明の一態様に係る酸素濃度測定試薬の概念図である。
【図２】図２は本発明の一態様に係る酸素濃度測定試薬の概念図である。
【図３】図３は本発明の一態様に係る酸素濃度測定試薬の概念図である。
【図４】図４は酸素応答性発光プローブにおける、蛍光団とりん光団の励起状態緩和過程における好ましいエネルギー関係を示す図である。
【図５】図５は（Ａ）7DEAC-Arg8-BTQphen、（Ｂ）7DEAC-Arg8-OH、（Ｃ）BTQphenのアセトニトリル中における吸収、発光スペクトルをそれぞれ示す図である。
【図６】図６はアセトニトリル中の7DEAC-Arg8-BTQphenについて、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す図である。
【図７】図７はアセトニトリル中の7DEAC-Arg8-BTQphenについて、４７０ｎｍでモニターした蛍光強度（If）と６５３ｎｍでモニターしたりん光強度（Iｐ）のレシオ（りん光強度/蛍光強度）（RI=Ip/If）の比（RI0/RI）を酸素分圧（pO2）に対してプロットした結果を示す図である。
【図８】図８は、HeLa細胞において、C343-Pro8-BTQphen、7DEAC-Arg8-BTQphen溶液を添加し、２時間培養した後に、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：４００−４１０ｎｍ、観測波長：＞４５５ｎｍ）を示す（図面代用写真）。
【図９】図９は、蛍光プレートリーダーを用いて、C343-Pro8-BTQphen、7DEAC-Arg8-BTQphen溶液をＨｅＬａ細胞に添加し、２１％および２．５％酸素分圧下で２時間培養した後に測定した発光強度を示す図である。
【図１０】図１０は、HeLa細胞において、C343-Pro8-BTQphen、C343-Arg8-BTQphen溶液を添加し、６時間培養した後に、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：４００−４１０ｎｍ、観測波長：＞４５５ｎｍ）を示す（図面代用写真）。
【図１１】図１１は、MCF-7細胞に7DEAC-Arg8-BTQphenを添加し、溶存酸素分圧を変えて測定した発光スペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、MCF-7細胞において、7DEAC-Arg8-BTQphenを添加し２時間培養した後に、ＦＣＣＰ又はアンチマイシンＡをそれぞれ添加して４７０ｎｍでモニターした蛍光強度と６６０ｎｍでモニターしたりん光強度のレシオ（６６０ｎｍ／４７０ｎｍ）の時間に対するプロットを示す図である。
【図１３】図１３は化合物（NBD-ProArg7-BTQphen）の空気飽和下（実線）又は窒素置換下（破線）のアセトニトリル中における吸収、発光スペクトルを示す図である。
【図１４】図１４はHeLa細胞において、NBD-ProArg7-BTQphen溶液を添加し、２時間培養した後に、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：400-440nm、観測波長：＞475nm）を示す（図面代用写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。すなわち、本明細書に記載された各実施形態は、その趣旨を逸脱しない範囲内で、様々に変形することができ、かつ、実施可能な範囲内で、他の実施形態により説明された特徴と組み合わせることができる。
【００１２】
本発明の一態様は、少なくとも１つのリンカーと、少なくとも１つの蛍光団と、少なくとも１つのりん光団とを含み、該蛍光団と該りん光団とが該リンカーを介して連結され、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする化合物である。
【００１３】
本発明の一態様は、リンカーと、該リンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該リンカーの第２の端に結合した蛍光団とを含む化合物であって、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする化合物である。すなわち、本発明の一態様である化合物は、図１に示されるように、酸素濃度応答性りん光団と蛍光団とが、それぞれリンカーの第１及び第２の端に結合して連結されたものである。
【００１４】
また、本発明の他の一態様は、第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含むことを特徴とする化合物である。すなわち、図２に示されるように、蛍光団を末端に有し、第１のリンカーと第２のリンカーが酸素濃度応答性りん光団を介して連結されている化合物である。なお、第１のリンカーと第２のリンカーはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。第１の蛍光団と第２の蛍光団はそれぞれ同一であっても異なっていてもよいが、合成容易の観点から、同一であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の他の一態様は、第１のリンカーと、第２のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、かつ、該第２のリンカーの第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー及び該第２のリンカーがアルギニンを含む化合物である。すなわち、酸素濃度応答性りん光団を末端に有し、第１のリンカーと第２のリンカーが蛍光団を介して連結されている化合物である。なお、第１のリンカーと第２のリンカーはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。第１の酸素濃度応答性りん光団と第２の酸素濃度応答性りん光団はそれぞれ同一であっても異なっていてもよいが、合成容易の観点から、同一であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の他の一態様は、第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカー
と、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の蛍光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカーの第１の端に結合した酸素濃度応答性りん光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の蛍光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の蛍光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む化合物である。すなわち、図３に示されるように、蛍光団を末端に有し、第１のリンカーと第２のリンカーと第３のリンカーが酸素濃度応答性りん光団を介して連結されている化合物である。なお、第１のリンカー、第２のリンカー及び第３のリンカーはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。第１の蛍光団、第２の蛍光団及び第３の蛍光団はそれぞれ同一であっても異なっていてもよいが、合成容易の観点から、同一であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の他の一態様は、第１のリンカーと、第２のリンカーと、第３のリンカーと、該第１のリンカーの第１の端に結合した第１の酸素濃度応答性りん光団と、該第１のリンカーの第２の端に結合し、該第２のリンカーの第１の端に結合し、該第３のリンカーの第１の端に結合した蛍光団と、該第２のリンカーの第２の端に結合した第２の酸素濃度応答性りん光団と、該第３のリンカーの第２の端に結合した第３の酸素濃度応答性りん光団とを含む化合物であって、該第１のリンカー、該第２のリンカー及び該第３のリンカーがアルギニンを含む化合物である。すなわち、酸素濃度応答性りん光団を末端に有し、第１のリンカーと第２のリンカーと第３のリンカーが蛍光団を介して連結されている化合物である。なお、第１のリンカー、第２のリンカー及び第３のリンカーはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。第１の酸素濃度応答性りん光団、第２の酸素濃度応答性りん光団及び第３の酸素濃度応答性りん光団はそれぞれ同一であっても異なっていてもよいが、合成容易の観点から、同一であることが好ましい。
【００１８】
本発明の一態様である化合物は、一つの分子内に短寿命（ナノ秒オーダー）の蛍光を発する蛍光団と長寿命（マイクロ秒オーダー）のりん光を発するりん光団を有する。蛍光は寿命が短いために溶存酸素の影響をほとんど受けない。一方、りん光は、寿命が長いため、励起寿命内に酸素分子と衝突し顕著な消光を受ける。従って、例えば、蛍光団に緑色の発光を与える分子を、りん光団に赤色の発光を与える分子を用いれば、酸素が存在しないときには、両発光団の発光が混ざり合うために黄色の発光を与え、酸素が存在すると、赤色りん光が消光するため緑色の発光を与えるインテリジェントな発光プローブとなる。さらにこのプローブを用いて発光スペクトルを測定すれば、蛍光強度とりん光強度の比を取るレシオ法によって簡便に酸素濃度を定量することができる。
【００１９】
蛍光団の三重項準位がりん光団の三重項準位よりも低いとりん光団から蛍光団にエネルギー移動が起こり、りん光強度の著しい低下をきたすことがあるので、酸素濃度に依存して発光色が変化する発光プローブを設計するには、図４に示すように、蛍光団の励起三重項（Ｔ１）準位が、りん光団の励起三重項（Ｔ１’）準位よりも高くなるように発光団を組み合わせることが好ましい。
【００２０】
酸素濃度応答性りん光団としては、酸素濃度に依存したりん光を発する基であり、具体的にはイリジウム錯体を含む基、白金錯体を含む基、である。
【００２１】
イリジウム錯体としては、カチオン性イリジウム錯体や中性イリジウム錯体が挙げられる。カチオン性イリジウム錯体は、Ｉｒ（ＩＩＩ）を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体であってカチオン性のものを意味し、中性イリジウム錯体はＩｒ（ＩＩＩ）を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体であって中性のものを意味するが、例えば、下記の（１）〜（７）のイリジウム錯体が挙げられる。本発明では、リンカーとしてアルギニンを含むことで、カチオン性部位が増加し、培養液中での凝集が抑制され細胞内移行性が大幅に増加すると考えられる。ここで、アルギニンリンカーは、例え
ば、オクタアルギニンでは電荷は＋８になり、カチオン性イリジウム錯体が付くと＋９、中性では＋８のままである。つまり、アルギニンの数が多いときは、カチオン性でも中性でもさほど電荷の数は変化しないため、カチオン性イリジウム錯体だけでなく、中性イリジウム錯体を用いることができる。
配位子は、例えば、置換基を有していてもよい、フェナントロリン、ビピリジン、フェニルピリジン、ベンゾキノリン、ジアゾールなどを含む芳香族系分子が挙げられる。
なお、カチオン性イリジウム錯体は、陰イオンとの間で塩を形成していてもよい。陰イオンとしては、ヘキサフルオロリン酸イオン（ＰＦ６−）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、トリフルオロ酢酸イオン（ＣＦ３ＣＯＯ−）などが挙げられる。
【００２２】
【化１１】
2018065768.tif 000013
【００２３】
【化１２】
2018065768.tif 000014
なお、これらりん光団の励起三重項（Ｔ１’）準位はそれぞれ、（１）が１８１．５ｋＪ／ｍｏｌ、（２）が１７５．１ｋＪ／ｍｏ１、（３）が１６７．８ｋＪ／ｍｏｌ、（４）が１７６．２ｋＪ／ｍｏ１、（５）が２０１．４ｋＪ／ｍｏ１、（６）が１６８．５ｋＪ／ｍｏ１、（７）が１８４．０ｋＪ／ｍｏ１である。
上記のイリジウム錯体の合成方法は、特開２０１５−１０１５７０号公報、J. Photochem. Photobiol. A: Chem, 299, 172, 2015.、Inorg. Chem. 49, 6077, 2010.の記載を参
照することができる。
【００２４】
白金錯体としては、カチオン性白金錯体や中性白金錯体が挙げられる。カチオン性白金錯体は、Ｐｔ（ＩＩ）を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体であってカチオン性のものを意味し、中性白金錯体はＰｔ（ＩＩ）を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体であって中性のものを意味するが、例えば、下記の白金錯体が挙げられる。
配位子は、例えば、置換基を有していてもよい、フェナントロリン、ビピリジン、フェニルピリジン、ベンゾキノリン、ジアゾールなどを含む芳香族系分子が挙げられる。
なお、カチオン性白金錯体は、陰イオンとの間で塩を形成していてもよい。陰イオンとしては、ヘキサフルオロリン酸イオン（ＰＦ６−）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、臭化物イオン（Ｂｒ−）、トリフルオロ酢酸イオン（ＣＦ３ＣＯＯ−）などが挙げられる。
【化１３−１】
2018065768.tif 000015
2018065768.tif 000016
2018065768.tif 000017
2018065768.tif 000018
【化１３−２】
2018065768.tif 000019
2018065768.tif 000020
2018065768.tif 000021
【００２５】
蛍光団は上記りん光団に応じて適宜選択することができ、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール（ＤＢＤ）、ジメチルアミノスルホニルベンゾチアジアゾール（ＤＢＴｈＤ）、ジメチルアミノスルホニルベンゾセレナジアゾール（ＤＢＳｅＤ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、またはクマリン系色素、ローダミン類、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、シアニン系色素などが例示される。蛍光団の発光波長の観点から、下記のＮＢＤ、ＦＩＴＣ、Ｃ３４３、７−ジエチルアミノクマリン（７ＤＥＡＣ）、ＤＢＤ、ＤＢＴｈＤ、ＤＢＳｅＤ，ローダミンＢ（ＲｈＢ）が好ましい。中でも、蛍光団の三重項エネルギーの観点から、７ＤＥＡＣ及びＮＢＤが好ましい。また、細胞の自家蛍光や細胞へのダメージ抑制の観点から、長波長で励起可能であるＮＢＤが好ましい。ＮＢＤは緑色蛍光を示す。これら蛍光団は市販のものを用いることができる。
【００２６】
【化１４】
2018065768.tif 000022
【００２７】
【化１５】
2018065768.tif 000023
【００２８】
【化１６】
2018065768.tif 000024
【００２９】
なお、これら蛍光団の励起三重項（Ｔ１）準位はそれぞれＮＢＤが１８１ｋＪ／ｍｏｌ、ＦＩＴＣが１９７ｋＪ／ｍｏｌ、Ｃ３４３が２０６、ｋＪ／ｍｏｌ、７ＤＥＡＣが２１０ｋＪ／ｍｏｌ、ＤＢＤが１７３ｋＪ／ｍｏｌ、ＤＢＴｈＤが１７９ｋＪ／ｍｏｌ、ＤＢＳｅＤが１４４ｋＪ／ｍｏｌ、ＲｈＢが１７３ｋＪ／ｍｏｌである。
【００３０】
蛍光団とりん光団を連結するリンカーは両者を化学的に結合するものであり、本発明の一態様に係る化合物は、該リンカーがアルギニンを含むことを特徴とする。
蛍光団とりん光団との近接を避けるため、蛍光団とりん光団を連結するリンカーは、できるだけ剛直であることが望ましい。また、その長さは２０Å以上であることが好ましい。長さの上限は特に制限はないが、３０Å以下であることが好ましい。
リンカーを構成するアルギニンのアミノ酸残基数は細胞膜透過性の観点から好ましくは４〜２０、より好ましくは６〜１５、さらに好ましくは７〜１２である。
また、本発明の一態様に係る化合物は、該リンカーがさらにプロリンを含むことが好ましい。リンカーを構成するプロリンのアミノ酸残基数は細胞膜透過性の観点から好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜４である。プロリンとアルギニンの合計として、４〜２０、より好ましくは６〜１５、さらに好ましくは７〜１２である。この場合、アルギニンとプロリンの配列はブロックとして存在してもよく、交互に存在していてもよいし、ランダムに存在していてもよい。
リンカー部分の分子量としては、細胞膜透過性の観点から５００以上５０００以下が好ましい。
【００３１】
本発明の一態様に係る化合物は、リンカーが下記で示されるオリゴアルギニンであることが好ましい。
【００３２】
【化１７】
2018065768.tif 000025
ここで、ｎは４〜２０の整数である。好ましくは、ｎは６〜１５の整数であり、より好ましくは７〜１２の整数である。
【００３３】
本発明の一態様である化合物は、リンカーとしてアルギニンを含むことにより、従来のプローブ分子より細胞内移行性の大幅な向上を達成するものである。後述する実施例に示されるとおり、Ｃ３４３−Ｐｒｏ８−ＢＴＱｐｈｅｎと７ＤＥＡＣ-Ａｒｇ8-ＢＴＱを添
加した細胞培養液の発光強度の比較から、７ＤＥＡＣ-Ａｒｇ8-ＢＴＱの発光強度は、リ
ンカーがプロリンのみから構成されるＣ３４３−Ｐｒｏ８−ＢＴＱｐｈｅｎよりも１２倍程度増加した。つまり、測定感度が１０倍以上向上することが示された。
【００３４】
本発明の一態様である化合物においては、本発明の効果を損なわない範囲で、リンカーとしてアルギニン以外の基を含んでいてもよい。
アルギニン以外の基は１種を含んでもよいし、２種以上を含んでもよい。また、リンカー中、アルギニンとアルギニン以外の基はブロックであってもよく、交互に存在していてもよいし、ランダムに存在していてもよい。リンカーがオリゴアルギニンを含む場合、オリゴアルギニン以外の基は、オリゴアルギニンの末端に結合していてもよい。すなわち、オリゴアルギニン以外の基は、オリゴアルギニンと蛍光団及びりん光団のいずれかとの間に存在してもよいし、オリゴアルギニンと蛍光団との間に存在し、かつオリゴアルギニンとりん光団との間に存在していてもよい。また、オリゴアルギニン以外の基はオリゴアルギニンとオリゴアルギニンとの間に存在してもよいし、アルギニンとオリゴアルギニンとの間に存在してもよい。さらに、これらの組み合わせであってもよく、オリゴアルギニンとアルギニン以外の基が交互に存在していてもよいし、ランダムに存在していてもよい。
一般に、ステロイド、ポリペプチドは比較的容易に発光団と結合させることができるため、リンカーとして好適に使用しうる。アルギニン以外の基として、例えば、ポリプロリンが例示される。また、ペプチド残基としてアスパラギン酸、リシンのような水溶性アミ
ノ酸を含むペプチドを用いれば、化合物に水溶性を持たせることもできる。
リンカーに含まれるポリペプチド全体としては、好ましくはアミノ酸残基数４〜２０、より好ましくはアミノ酸残基数６〜１５、さらに好ましくはアミノ酸残基数７〜１２である。
オリゴアルギニン以外のペプチドとしては合成容易性の観点からプロリンが好ましい。また、化合物に水溶性を持たせられるため、アスパラギン酸、リシンも好ましい。本発明の一態様である化合物においては、リンカーがプロリンとオリゴアルギニンから構成されることも好ましい。この場合、アミノ酸残基数が、プロリンとオリゴアルギニンの合計で４〜２０であればよく、プロリンとオリゴアルギニンは交互に結合していてもよいし、ランダムに結合していてもよい。プロリンがオリゴプロリンであってもよい。
【００３５】
本発明の一態様である化合物においては、リンカーが下記で示されるプロリンとオリゴアルギニンから構成されることも好ましい。
【００３６】
【化１８】
2018065768.tif 000026
ここで、ｎは４〜２０の整数である。好ましくは、ｎは６〜１５の整数であり、より好ましくは７〜１２の整数である。
【００３７】
本発明の一態様である化合物として、より具体的には、下記の化合物が挙げられる。ただし、本発明の一態様である化合物はリンカーとしてオリゴアルギニンを含み酸素濃度に依存した発色を示すものである限り、下記化合物に限定されるものではない。
【００３８】
【化１９】
2018065768.tif 000027
ここで、ｎは４〜２０の整数である。
この化合物は上記のエネルギー関係Ｔ１＞Ｔ１’を満たしている。
【００３９】
【化２０】
2018065768.tif 000028
ここで、ｎは４〜２０の整数である。
この化合物は上記のエネルギー関係Ｔ１＞Ｔ１’を満たしている。
【００４０】
【化２１】
2018065768.tif 000029
ここで、ｎは４〜２０の整数である。
この化合物は上記のエネルギー関係Ｔ１＞Ｔ１’を満たしている。
【００４１】
本発明の一態様である化合物は、例えば、りん光団化合物と、蛍光団化合物を両端に反応性の基を有するリンカー化合物と反応させることによって得ることができ、具体的には、後述の実施例に記載の方法に従って合成することができる。
【００４２】
また、上記化合物において７ＤＥＡＣ及びＮＢＤに代えて他の蛍光団を用いることもできるし、イリジウム錯体を含む基に代えて白金錯体を含む基を用いることもできる。
【００４３】
本発明の一態様である化合物は、酸素濃度に応じてその発光色が変化するため、その発色に基づいて酸素濃度を測定するための酸素濃度測定試薬として用いることができる。例えば、化合物ＮＢＤ−ＰＲ７−ＢＴＱｐｈｅｎの場合、赤色のときは酸素濃度が低く、緑色のときは酸素濃度が高いというような判定ができる。また、化合物７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ８−ＢＴＱｐｈｅｎの場合、赤色のときは酸素濃度が低く、青色のときは酸素濃度が高いというような判定ができる。
【００４４】
また、あらかじめ酸素濃度と、りん光強度と蛍光強度の比（Ｉｐ／Ｉｆ）との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することも可能である。
【００４５】
【数１】
2018065768.tif 000030
【００４６】
本発明の一態様である酸素濃度測定試薬は、本発明の一態様である化合物を含む。
本発明の一態様である酸素濃度測定試薬を用いて試料中の酸素濃度を検出する場合、本発明の酸素濃度測定試薬を試料に添加してインキュベートした後、化合物を励起してりん光を観察できるような蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置、マイクロプレートリーダーなどを用いてりん光および蛍光を観察することができる。それにより、細胞内酸素濃度を定量またはイメージングできる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
＜合成例１：７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ８−ＢＴＱｐｈｅｎの合成＞
（７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］８−ＯＨの合成）
７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］８−ＯＨは全自動マイクロウェーブペプチド合成装置（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａ、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標））を用いてＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。樹脂はＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが導入されているクロロトリチルレジン（１．１ｇ、アミノ酸導入モル数：０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。縮合反応は、アミノ酸として０．５ＭのＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液、縮合剤として０．６ＭのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）のＤＭＦ溶液、添加剤として０．５Ｍの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）のＤＭＦ溶液、塩基として２．０ＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液を用い、それぞれアミノ酸導入モル数に対して３等量、３等量、３等量、６等量加え、室温にて１時間反応させた。Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２％ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液を用いて、アミノ酸導入モル数に対して３．５等量加え、室温にて５分反応させた。脱保護を完全に行うため、再度、同条件で１０分反応させた。ペプチドを７ＤＥＡＣで標識するために、ペプチドの樹脂が入ったバイアルに、７ＤＥＡＣ（１１０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）（１９０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３４ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液６ｍＬを加えて、室温にて２４時間反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し、未反応の７ＤＥＡＣおよび縮合剤を除去した。ペプチドを樹脂から切り出すために、ペプチドの樹脂が入ったバイアルに、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液１０ｍＬを加え、室温にて９０分反応させた。切り出したペプチドの溶液を減圧乾固させ、少量のアセトニトリルに再度溶解させた。その溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、水を除去し、再度水を加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、黄色固体を得た（５９０ｍｇ、粗生成物収率：４０％）。
【００４９】
【化２２】
2018065768.tif 000031
【００５０】
（７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］８−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬナス型フラスコに７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］８−ＯＨ（３５３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、（ｂｔｑ）２Ｉｒ（ｐｈｅｎ−ｐｉｐｅ）・ＰＦ６・ＣＦ３ＣＯＯ（１３６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）ＨＡＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、脱水ＤＭＦ２ｍＬに溶解させた。この溶液にＤＩＥＡを０．３４ｍＬ加え、窒素置換下、室温にて２４時間撹拌した。溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、水を除去し、再度水を加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、赤色固体を得た（４５５ｍｇ、粗生成物収率：９８％）。
【００５１】
（７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ８−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬ遠沈管に７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］８−ＢＴＱｐｈｅｎ（２２４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を量りとり、ＴＦＡ：水：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を１ｍＬ加え、室温にて２時間反応させた。溶液に冷ジエチルエーテルを加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、ジエチルエーテルを除去し、再度ジエチルエーテルを加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内のジエチルエーテルを除去し、デシケータ内で乾燥させ赤色固体を得た（９３ｍｇ、粗生成物収率：５８％）。赤色固体を逆相ＨＰＬＣで精製して７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ８−ＢＴＱｐｈｅｎを得た。同定はＥＳＩ−ＭＳスペクトルを用いて行い、２価イオンピーク（ｍ／２Ｚ）を検出した。ｃａｌｃｄ．：１２３４．６  ［Ｍ−ＰＦ６−＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ：１２３４．５
【００５２】
【化２３】
2018065768.tif 000032
【００５３】
＜合成例２：７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ１２−ＢＴＱｐｈｅｎの合成＞
（７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］１２−ＯＨの合成）
７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］１２−ＯＨは全自動マイクロウェーブペプチド合成装置（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａ、Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いてＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。樹脂はＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが導入されているクロロトリチルレジン（１．０３ｇ、アミノ酸導入モル数：０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。縮合反応は、アミノ酸として０．６ＭのＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨのＤＭＦ溶液、縮合剤として０．５ＭのＨＢＴＵのＤＭＦ溶液、添加剤として０．５ＭのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液、塩基として２．０ＭのＤＩＥＡのＮＭＰ溶液を用い、それぞれアミノ酸導入モル数に対して３等量、３等量、３等量、６等量加え、室温にて１時間反応させた。Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２％ＤＢＵのＤＭＦ溶液を用いて、アミノ酸導入モル数に対して３．５等量加え、室温にて５分反応させた。脱保護を完全に行うため、再度、同条件で１０分反応させた。ペプチドを７ＤＥＡＣで標識するために、ペプチドの樹脂が入ったバイアルに、７ＤＥＡＣ（１０４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２３３ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．３４ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液６ｍＬを加えて、室温にて２４時間反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し、未反応の７ＤＥＡＣおよび縮合剤を除去した。ペプチドを樹脂から切り出すために、ペプチドの樹脂が入ったバイアルに、１％ＴＦＡのジクロロメタン溶液１０ｍＬを加え、室温にて９０分反応させた。切り出したペプチドの溶液を減圧乾固させ、少量のアセトニトリルに再度溶解させた。その溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、水を除去し、再度水を加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、黄色固体を得た（１．００ｇ、粗生成物収率：６３％）。
【００５４】
（７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］１２−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬナス型フラスコに７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］１２−ＯＨ（２７６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、（ｂｔｑ）２Ｉｒ（ｐｈｅｎ−ｐｉｐｅ）・ＰＦ６・ＣＦ３ＣＯＯ（５６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、脱水ＤＭＦ１ｍＬに溶解させた。この溶液にＤＩＥＡを０．１７ｍＬ加え、窒素置換下、室温にて２４時間撹拌した。溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、水を除去し、再度水を加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、赤色固体を得た（３３２ｍｇ、粗生成物収率：１０６％）。
【００５５】
（７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ１２−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬ遠沈管に７ＤＥＡＣ−［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］１２−ＢＴＱｐｈｅｎ（３０３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を量りとり、ＴＦＡ：水：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を１ｍＬ加え、室温にて２時間反応させた。溶液に冷ジエチルエーテルを加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、ジエチルエーテルを除去し、再度ジエチルエーテルを加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内のジエチルエーテルを除去し、デシケータ内で乾燥させ赤色固体を得た（１２１ｍｇ、粗生成物収率：８１％）。赤色固体を逆相ＨＰＬＣで精製して７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ１２−ＢＴＱｐｈｅｎを得た。同定はＥＳ５Ｉ−ＭＳスペクトルを用いて行い、３価イオンピーク（ｍ／３Ｚ）を検出した。ｃａｌｃｄ．：１０３２．２［Ｍ−ＰＦ６−＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ：１０３２．１
【００５６】
＜合成例３：ＮＢＤ−ＰｒｏＡｒｇ７−ＢＴＱｐｈｅｎの合成＞
（Ｈ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨの合成）
Ｈ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨは全自動マイクロウェーブペプチド合成装置（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａ、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標））を用いてＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。樹脂はＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨが導入されているクロロトリチルレジン（１．６７ｇ、アミノ酸導入モル数：０．３０ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。縮合反応は、アミノ酸として０．５ＭのＦｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨのＤＭＦ溶液、縮合剤として０．６ＭのＨＢＴＵのＤＭＦ溶液、添加剤として０．５ＭのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液、塩基として２．０ＭのＤＩＥＡのＮＭＰ溶液を用い、それぞれアミノ酸導入モル数に対して３等量、３等量、３等量、６等量加え、室温にて１時間反応させた。Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２％ＤＢＵのＤＭＦ溶液を用いて、アミノ酸導入モル数に対して３．５等量加え、室温にて５分反応させた。脱保護を完全に行うため、再度、同条件で１０分反応させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し、ペプチドを樹脂から切り出すために、ペプチドの樹脂が入ったバイアルに、１％ＴＦＡのジクロロメタン溶液１０ｍＬを加え、室温にて９０分反応させた。切り出したペプチドの溶液を減圧乾固させ、少量のアセトニトリルに再度溶解させた。その溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、白色固体を得た（１．１８ｇ、粗生成物収率：７９．５％）。
【００５７】
【化２４】
2018065768.tif 000033
【００５８】
（ＮＢＤ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨの合成）
１００ｍＬナス型フラスコにＨ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨ（９５６ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、ＮＢＤ−Ｃｌ（１９６ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル５０ｍＬに溶解させた。この溶液にＤＩＥＡを０．３４ｍＬ加え、窒素置換下、室温にて２４時間撹拌した。生成物をジオールカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９９：１）で精製し褐色固体を得た。精製が不十分であったため、さらに褐色固体をフラッシュ自動精製装置（Ｉｓｏｌｅｒａｓｐｅｃｔｒａ、Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて精製し、ＮＢＤ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨを得た（２４０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）。
【００５９】
（ＮＢＤ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬナス型フラスコにＮＢＤ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＯＨ（１６０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、（ｂｔｑ）２Ｉｒ（ｐｈｅｎ−ｐｉｐｅ）・ＰＦ６・ＣＦ３ＣＯＯ（６２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、脱水ＤＭＦ１ｍＬに溶解させた。この溶液にＤＩＥＡを０．１７ｍＬ加え、窒素置換下、室温にて２４時間撹拌した。溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、水を加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、水を除去し、再度水を加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内の水を凍結乾燥より除去し、赤色固体を得た（１８５ｍｇ、粗生成物収率：８５％）。
【００６０】
【化２５】
2018065768.tif 000034
【００６１】
（ＮＢＤ−ＰｒｏＡｒｇ７−ＢＴＱｐｈｅｎの合成）
５０ｍＬ遠沈管にＮＢＤ−Ｐｒｏ［Ａｒｇ（ｐｂｆ）］７−ＢＴＱｐｈｅｎ（１３５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を量りとり、ＴＦＡ：水：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を１ｍＬ加え、室温にて２時間反応させた。溶液に冷ジエチルエーテルを加えて固体を析出させた。得られた固体を遠心し（３５００ｒｐｍ、５分間）、ジエチルエーテルを除去し、再度ジエチルエーテルを加えて遠心した。この操作を２回繰り返した。バイアル内のジエチルエーテルを除去し、デシケータ内で乾燥させ赤色固体を得た（１２６ｍｇ、粗生
成物収率：１２０％）。赤色固体を逆相ＨＰＬＣで精製してＮＢＤ−ＰｒｏＡｒｇ７−ＢＴＱｐｈｅｎを得た。同定はＥＳ５Ｉ−ＭＳスペクトルを用いて行い、２価イオンピーク（ｍ／２Ｚ）を検出した。ｃａｌｃｄ．：１１６６．０  ［Ｍ−ＰＦ６−＋Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ：１１６５．８
【００６２】
【化２６】
2018065768.tif 000035
【００６３】
＜化合物の評価＞
合成例１により得られた化合物（7DEAC-Arg8-BTQphen）のアセトニトリル中における吸収、発光スペクトルを図５の（Ａ）にそれぞれ示す。7DEAC-Arg8-BTQphenは、蛍光団として青色蛍光を示す7-ジエチルアミノクマリン（7DEAC）、りん光団として赤色りん光を示
すカチオン性イリジウム錯体（BTQphen）、リンカーとしてオクタアルギニンから構成さ
れている。405nmを励起波長として発光スペクトルを測定したところ、7DEACに由来する蛍光およびBTQphenに由来するりん光が観測された。蛍光のピークは約470ｎｍであり、りん光のピークは約653ｎｍであった。（Ｂ）は蛍光団の参照化合物である7DEAC-Arg8-OHの吸収、発光スペクトルであり、（Ｃ）はりん光団の参照化合物であるBTQphenの吸収、発光
スペクトルである。
【００６４】
図６に7DEAC-Arg8-BTQphenの発光スペクトルの酸素分圧依存性を示す。発光スペクトルはアセトニトリル中、405nmを励起波長として溶存酸素分圧を変えて測定した。7DEACに由来する蛍光強度（If）は、酸素分圧変化に対して一定であるのに対して、BTQphenに由来
するりん光強度（Ip）は、酸素分圧の増加にともない減少した。
【００６５】
図７に酸素分圧（pO2）に対する、レシオ（RI=Ip/If）の比（RI0/RI）のプロットを示
す。このプロットを、式（１）を用いて解析した。  ここで、RI0（=Ip/If）は、酸素分
圧0mmHgのときのRI、KSVはStern-Volmer定数である。解析した結果、KSV値は0.12mmHgと
求められた。
【００６６】
【数２】
2018065768.tif 000036
【００６７】
図８にC343-Pro8-BTQphen、7DEAC-Arg8-BTQphen溶液をＨｅＬａ細胞の培養液に最終濃
度２μＭになるように添加し、２時間培養後洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：４００−４１０ｎｍ、観測波長：＞４５５ｎｍ）を示す。図８からわかるように、7DEAC-Arg8-BTQphenにおいてのみ明瞭な発光画像が得られた。
C343-Pro8-BTQphenは、蛍光団として青色蛍光を示すクマリン系蛍光団（C343）、りん
光団として赤色りん光を示すカチオン性イリジウム錯体（BTQphen）から構成されている
点において7DEAC-Arg8-BTQphenと共通するが、リンカーがオリゴプロリンから構成されている点において相違する。特許文献１に開示されているC343-Pro4-BTPphenは高い脂溶性
のため、培養液中で一部のプローブ分子が凝集し細胞内移行性が十分得られなかったことが問題であり、特許文献２に開示されているC343-Pro8-BTQphenはC343-Pro4-BTPに比べて細胞内移行性が向上し、市販の蛍光プレートリーダーを用いて細胞内からの発光を測定することができたが、顕微鏡下の観察において凝集体が見られるなど、定量的に酸素濃度計測を行うためには、さらなる細胞内移行性の向上が求められるものである。本発明では、リンカーとしてオリゴアルギニンを用いたことで、カチオン性部位が増加し、培養液中での凝集が抑制され細胞内移行性が大幅に増加したと考えられる。
【００６８】
また、細胞内移行性を定量化するために、蛍光プレートリーダーを用いて発光強度の比較を行った。
図９は、Ｃ３４３−Ｐｒｏ８−ＢＴＱｐｈｅｎ、７ＤＥＡＣ−Ａｒｇ８−ＢＴＱｐｈｅｎ溶液をＨｅＬａ細胞の培養液に最終濃度５μＭになるように添加し、２時間培養後洗浄し、蛍光プレートリーダーを用いて測定を行った結果である。測定においては、２１％、２．５％酸素濃度で実施した。それぞれの酸素濃度において、7DEAC-Arg8-BTQphenの発光強度は、C343-Pro8-BTQphenと比較して、12倍程度増加している。この結果は、測定感度が10倍以上向上したことを示している。
また、図１０に、C343-Pro8-BTQphen、C343-Arg8-BTQphen溶液をＨｅＬａ細胞の培養液に最終濃度５μＭになるように添加し、６時間培養後洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：４００−４１０ｎｍ、観測波長：＞４５５ｎｍ）を示す。以上の結果は、蛍光団を7DEACからC343に変えても同様の傾向を示していることから、オリゴアルギニ
ンをリンカーに用いることで細胞内移行性が大幅に増加することがわかる。合成の観点から考えると、蛍光団として7DEACを用いた方が容易である。
【００６９】
MCF-7細胞に7DEAC-Arg8-BTQphenを添加し、蛍光プレートリーダーを用いて細胞内に分
布している7DEAC-Arg8-BTQphenの発光スペクトルを測定したところ、図１１に示すように、7DEACに由来する蛍光とBTQphenに由来するりん光が観測された。また、培養酸素分圧（溶存酸素分圧）を２１、１０、２．５％と変えたところ、蛍光強度は一定であるのに対して、りん光強度は酸素分圧の減少に伴い増加した。よって、7DEAC-Arg8-BTQphenは、細胞内酸素濃度を定量するための校正曲線の作成が可能であることがわかった。
【００７０】
＜添加剤効果実験＞
また、細胞内酸素レベルを確認するために、添加剤効果実験を行った。添加剤としては、呼吸促進剤であるＦＣＣＰあるいは、呼吸阻害剤であるアンチマイシンＡを用いた。96ウェルプレートにMCF-7細胞を播種し（5.0×104個/ウェル）48時間培養した。その後、7DEAC-Arg8-BTQphen溶液を最終濃度2μＭになるように添加し2時間培養し、細胞に取り込まれなかった7DEAC-Arg8-BTQphenを洗浄により除去した。測定直前に、FCCP溶液あるいはアンチマイシンA溶液をそれぞれ最終濃度1μＭ、10μＭになるように添加し、測定を開始した。励起波長は405nm、7DEACの蛍光は470nm、BTQphenのりん光は660nmを観測波長とした。図１２に、時間に対するりん光強度のレシオ（660nm/470nm）のプロットを示す。FCCP添加においては、レシオは時間経過につれて増加し、約40分後から一定値となった。FCCPは呼吸促進剤であり、添加により細胞内酸素消費速度が増加したため、細胞内が低酸素状態になったことを示している。これに対して、アンチマイシンA添加では、レシオの増加は観測されなかった。これはアンチマイシンAが呼吸阻害剤であるため、細胞内酸素消費速度が減少するためである。以上の結果より、7DEAC-Arg8-BTQphenと蛍光プレートリーダーを用いることで細胞内酸素レベルのリアルタイム追跡が可能であることが明らかとなった。
【００７１】
図１３に、合成例３により得られたNBD-ProArg7-BTQphenのアセトニトリル中における
吸収、発光スペクトルを示す。実線は空気飽和下、破線は窒素置換下のスペクトルである。NBD-ProArg7-BTQphenは、４８０ｎｍ付近に吸収極大を示すため、7DEAC-Arg8-BTQphenと比較して、７０ｎｍ長波長の光を用いることができる。また、４８０ｎｍの光は、汎用性の高い色素として細胞生物学分野で使用されているフルオレセインや緑色蛍光たんぱく質であるＧＦＰの励起波長とほぼ同じである。また、NBD-ProArg7-BTQphenの蛍光強度は、酸素濃度に対して一定であるのに対して、りん光強度は酸素濃度が増加すると減少することから、レシオプローブ分子としての特徴を有する。
【００７２】
図１４にNBD-ProArg7-BTQphen溶液をＨｅＬａ細胞の培養液に最終濃度２μＭになるよ
うに添加し、２時間培養後洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した顕微画像（励起波長：４００−４４０ｎｍ、観測波長：＞４７５ｎｍ）を示す。細胞内から明瞭な発光が観察されているため、NBD-ProArg7-BTQphenは細胞内に移行していることがわかる。また、蛍光プレートリーダーを用いて細胞内に分布しているNBD-ProArg7-BTQphenの発光スペクトルを測定したところ、NBDに由来する蛍光とBTQphenに由来するりん光観測された。さらに、溶存酸素分圧を２１、１０、２．５％と変えたところ、蛍光強度は一定であるのに対して、りん光強度は酸素分圧の減少に伴い増加した。よって、7DEAC-ProArg7-BTQphenは、細胞内酸素濃度を定量するための校正曲線の作成が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の一態様である酸素濃度測定試薬は分析化学、生命科学、バイオイメージング分野、医療診断、細胞生物学、環境計測などの分野に用いることができる。具体的には、酸素濃度定量試薬、低酸素細胞画像化試薬、低酸素腫瘍診断試薬などとして用いることができる。
【図１】
2018065768.tif 000046
【図２】
2018065768.tif 000047
【図３】
2018065768.tif 000048
【図４】
2018065768.tif 000049
【図５】
2018065768.tif 000050
【図６】
2018065768.tif 000051
【図７】
2018065768.tif 000052
【図８】
2018065768.tif 000053
【図９】
2018065768.tif 000054
【図１０】
2018065768.tif 000055
【図１１】
2018065768.tif 000056
【図１２】
2018065768.tif 000057
【図１３】
2018065768.tif 000058
【図１４】
2018065768.tif 000059