(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために用いられる、治療用組成物の提供。【解決手段】少なくとも１つの抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−ＷＥｎｖリガンドと、少なくとも１つの一酸化窒素ラジカル阻害剤と、を備え、前記抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−ＷＥｎｖリガンドは、特定の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のそれぞれを含む抗体であり、前記一酸化窒素ラジカル阻害剤は、Ｎｇ―ニトロ―Ｌ―アルギニン―メチルエステル、Ｓ−メチルイソチオ尿素、フマル酸及びフマル酸ジメチルから選択される、医薬組成物。ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープ蛋白質（ＥＮＶ）の発現に関連する疾患における再ミエリン化遮断の予防及び／治療に用いる医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドと、少なくとも１つの一酸化窒素ラジカル阻害剤と、を備え、
前記抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に記載された相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のそれぞれを含む抗体であり、
前記一酸化窒素ラジカル阻害剤は、Ｎｇ―ニトロ―Ｌ―アルギニン―メチルエステル（Ng-nitro-L-arginine-methylester (L-NAME)）、Ｓ−メチルイソチオ尿素（S-methyl-isothiourea (SMT)）、フマル酸及びフマル酸ジメチル（dimethyl fumarate (DMF)）からなる群から選択される
ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（envelope protein (ENV)）の発現に関連する疾患における再ミエリン化遮断の予防及び／又は治療のために用いられる
ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（envelope protein (ENV)）のＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患における再ミエリン化遮断の予防及び／又は治療のために用いられる
ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
多発性硬化症（Multiple Sclerosis (MS)）、再発寛解型多発性硬化症（Remitting-Relapsing Multiple Screlosis (RRMS)）、二次性進行型多発性硬化症（Secondary Progressive Multiple Screlosis (SPMS)）又は一次性進行型多発性硬化症（Primary Progressive Multiple Screlosis (PPMS)）のような進行型多発性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy (CIDP)）、統合失調症又は双極性障害のような精神病における再ミエリン化遮断の予防及び／又は治療のために用いられる
ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願はＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（envelope protein (ENV)）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において成人神経系（nervous system (NS)）の内在性ミエリン修復能力を遮断する、新たに発見された有害なメカニズムを予防し、及び／又は治療するための革新的化合物および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
この新規な治療法では、オリゴデンドロサイト前駆体細胞（oligodendrocyte precursor cells (OPCs)）に対してＥｎｖが与える上流側病原性効果の阻害と、ＯＰＣ分化（ＮＯラジカル）に対してＥｎｖ病原体がもたらす最終の下流側エフェクターの阻害と、を組み合わせる。それらは、神経系に影響を及ぼすＨＥＲＶ−Ｗ関連疾患の再ミエリン化を遮断するものとして今では知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、（ｉ）少なくとも一つの抗ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドと、（ｉｉ）ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために用いられる、少なくとも一つの一酸化窒素フリーラジカル（ＮＯ）阻害剤（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｙｄｅ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ）と、を有する治療用組成物に関する。
【０００４】
この組成物は、リガンドとＮＯ阻害剤とを併用する場合には、ＮＳ病変において再ミエリン化遮断をもたらす、この新たに解明されたプロセスにおいて、下流側ＮＯエフェクターのみならず上流側Ｅｎｖインデューサーをも標的とする。
【０００５】
また、（それぞれＥｎｖおよびＮＯを標的とする）これら二種類の化合物の相乗作用は、（特にＭＳ細胞１からウイルス粒子として単離された、ＭＳＲＶサブタイプに関連する場合において）ＨＥＲＶ−Ｗの活性化により誘導される非再ミエリン化病変を患う患者に対する治療をより迅速に、そしてより有効に行う助けとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の詳細な説明
ある態様では、本発明は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために用いられる、抗ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドに関する。
【０００７】
本発明において、「分化遮断」、「再ミエリン化遮断」あるいは「再ミエリン化妨害」というとき、これらの用語は、（ｉ）ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質、特にそのＭＳＲＶサブタイプにより誘導されるオリゴデンドロサイト前駆体細胞（ＯＰＣｓ）の阻害と、（ｉｉ）それに伴うＯＰＣｓからのＮＯの生成と、（ｉｉｉ）それに伴うＯＰＣｓによるミエリン生成の阻害と、を含む（実施例１を参照のこと）新たに発見された現象を要約するために用いられる。
【０００８】
ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患を、神経系に影響を及ぼす「ＨＥＲＶ−Ｗ関連疾患」と定義する。具体的には、ＨＥＲＶ−Ｗ関連疾患としては、多発性硬化症（Multiple Sclerosis (MS)）特に再発寛解型多発性硬化症（Remitting-Relapsing Multiple Screlosis (RRMS)）、二次性進行型多発性硬化症（Secondary Progressive Multiple Screlosis (SPMS)）や一次性進行型多発性硬化症（Primary Progressive Multiple Screlosis (PPMS)）のような進行性多発性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy (CIDP2)）、統合失調症や双極性障害のような各種精神病（ミエリン障害にも言及される３―５）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０００９】
従来、多発性硬化症（ＭＳ）病変は、軸索損傷に伴ってオリゴデンドロサイトやミエリン鞘が免疫介在的に失われることに原因があるとされている。神経系（ＮＳ）炎症性病変に関連して、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーの内在性レトロウイルスに由来する、多発性硬化症関連レトロウイルス（Multiple Screlosis associated retrovirus (MSRV)）エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）により介在される免疫細胞に及ぼされる影響については、既に報告されている。しかしながら、オリゴデンドロサイト前駆体細胞（ＯＰＣ）によるＭＳプラーク再ミエリン化の遮断を伴う、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖがグリア細胞に及ぼす直接の病原性については、まだ知られていなかったし、誰も報告していなかった。
【００１０】
本発明のある態様によれば、オリゴデンドロサイト前駆体細胞（ＯＰＣ）に対してＥｎｖが及ぼす上流側病原性効果は、抗ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドを用いることにより阻害され得る。本発明による抗ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドは、そのＥｎｖタンパク質に対する結合能力により規定される。
【００１１】
ここでリガンドの「結合」あるいはその「結合性」とは、エピトープを含有するその断片を含む標的抗原（たとえばＥＮＶ）に対して、少なくとも一時的に相互作用すること、または会合することを指す。
【００１２】
本発明によれば、ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶとは、ＨＥＲＶ−Ｗファミリーに属するいずれかのメンバー（ＭＳに由来するレトロウイルス粒子のＲＮＡにおいて同定された塩基配列から抽出規定されたＭＳＲＶサブグループを含む１４、２３）が有するｅｎｖ遺伝子によりエンコードされたタンパク質を意味する。
【００１３】
また本発明によるリガンドは、組換えｓｃＦＶタンパク質、Ｆａｂ断片および抗体に含まれると規定され得る。前記抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体、オリゴクローン抗体、キメラ化抗体、遺伝子操作された抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。本発明のある特定の態様においては、リガンドを含む抗体は、ヒト化ＩｇＧまたはヒトＩｇＧであり、具体的には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【００１４】
さらに具体的には、本発明によるリガンドは、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を有する相補性決定領域（complementary-determining regions (CDRs)）の少なくとも一つ、より好ましくはそれぞれを含む。
【００１５】
前記リガンドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０によりエンコードされる相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも一つ、より好ましくはそれぞれを含む。
【００１６】
上に述べたように、再ミエリン化が遮断されると、ＯＰＣｓからＮＯが生成される結果となる。したがって、別の態様によれば、本発明は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために用いられる、一酸化窒素ラジカル阻害剤にも関する。
【００１７】
ＨＥＲＶＷ  ＥＮＶの発現に関連する疾患は、上に述べたとおりである。
【００１８】
本発明のより具体的な態様において、一酸化窒素フリーラジカル（Nitric Oxyde (NO)
）阻害剤、一酸化窒素ラジカル阻害剤、あるいはＮＯ阻害剤とは、ＮＯ分子（ＮＯラジカルとも称する）が有する生物学的効果を阻害し得る何らかの薬剤である。ＮＯ阻害剤は、Ｎｇ―ニトロ―Ｌ―アルギニン―メチルエステル（Ng-nitro-L-arginine-methylester (L-NAME)）、Ｓ−メチルイソチオ尿素（S-methyl-isothiourea (SMT)）、フマル酸またはフマル酸ジメチル（dimethyl fumarate (DMF)）からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様において、本発明は、上に規定した少なくとも一つの抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドと、上に規定した少なくとも一つの一酸化窒素ラジカル阻害剤を組み合わせた医薬組成物に関する。この組成物は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する各種疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために用いられる。それらの疾患については、上に述べたとおりである。
【００２０】
上に規定した抗ＨＥＲＶ−Ｗリガンドを含有する前記医薬製品と、上に規定した一酸化窒素ラジカル阻害剤とは、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する各種疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するために同時に、分割して、または時間的に分散させて投与される、組み合わせ製品と見なされる。
【００２１】
Ｅｎｖにより誘導された実験的アレルギー性脳脊髄炎（experimental allergic encephalomyelitis (EAE)）のマウスモデルについて得られた結果（後述）においては、抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドと、これらのＮＯ阻害分子の少なくとも一つとの組み合わせにより得られる相乗効果は、これらの治療薬のいずれか一つを単独で用いた場合と比較して示した。たとえ単独で用いたとしても、一酸化窒素ラジカル阻害剤あるいは抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドは、ＥＡＥにおけるミエリン病変と関連するものとして知られている臨床的障害からの回復について、一定の治療的効力を有する８。とはいうものの、（ｉ）一酸化窒素ラジカル阻害剤あるいは抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドのいずれかを単独で用いる場合と、（ｉｉ）少なくとも一つの一酸化窒素ラジカル阻害剤および少なくとも一つの抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドを組み合わせて用いる場合と、を比較すれば、この組み合わせを治療の過程で用いることにより得られる顕著な効果の証左が得られるであろう。
【００２２】
したがって、炎症性浸潤及び／又は炎症活性を伴う病変（たとえばＭＳの不活性プラークなど）が見られないからといって、Ｅｎｖにより病気の患者に誘導される再ミエリン化遮断を治療する必要性が排除されるわけではない。このことは、炎症活性を伴わない多数の病変を有するものとして知られている、進行型ＭＳ（一次または二次性進行型の形を取り得る）を患っている患者には特に関連性が高いことである。進行型ＭＳにおいては、各種脳障害および脊髄障害の場合、磁気共鳴断層画像信号のガドリニウム増強はもはや見られないからである。
【００２３】
また、本発明は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するための方法にも関する。この方法は、少なくとも一つの抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖリガンドをヒトに投与することを含む。
【００２４】
ある具体的な態様では、この方法は、少なくとも一つの一酸化窒素ラジカル阻害剤を投与することを含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にそのＭＳＲＶサブタイプの発現に関連する疾患において再ミエリン化遮断を予防し、及び／又は治療するための方法にも関する。この方法は、少なくとも一つの一酸化窒素ラジカル阻害剤をヒトに投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＭＳ組織におけるＥｎｖタンパク質とＴＬＲ４受容体の発現検出；  （Ａ，Ｂ）抗Ｅｎｖ免疫組織化学により、Ｅｎｖタンパク質がＮＡＷＭにおいて慢性活動性病変付近に存在する（Ｂ）が、健康な脳白質には存在しない（Ａ）ことが示された（矢印）。（Ｃ）慢性活動性病変の周縁におけるＥｎｖ陽性ミクログリヤ細胞にごく近接するＯｌｉｇ２陽性ＯＰＣ。（Ｄ〜Ｄ’’’）ＴＬＲ４の共発現を特徴とするＰＤＧＦＲα陽性ＯＰＣを有する健康な対照脳組織（矢印）。（Ｅ〜Ｅ’’’）ＴＬＲ４およびＰＤＧＦＲαの両方を発現しているＭＳ患者の活動性病変付近のＮＡＷＭにおけるＯＰＣ（矢印）。目盛は５０μｍ。
【図２】ＯＰＣ分化中のＴＬＲ４発現調節；  （Ａ）９日間にわたる培養液中でのラットの自発的ＯＰＣ分化中における、ＴＬＲ４発現の段階的下向き調節を示す定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＧＡＰＤＨ発現が参照遺伝子として用いられた。データは３回にわたって個別に行われた実験により得られた平均値＋／−標準偏差として示される。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Β，Β’）抗ＴＬＲ４免疫染色の結果、ＴＬＲ４を小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ (small-hairpin RNA)）を媒介として抑制したところ、遺伝子導入されたＯＰＣには、抗体の特異性を保証するＴＬＲ４発現が見られないことが証明された（矢印）。図示されるＯＰＣは遺伝子導入後３日間固定され、遺伝子導入された細胞はｅＧＦＰの発現により標識づけられた。なお隣接する遺伝子導入されなかった細胞はＴＬＲ４陽性であった。（Ｃ〜Ｄ’）培養液中で３日間自発的分化させた後のガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）／ＴＬＲ４二重陽性ＯＰＣの代表例（Ｃ，Ｃ’）、および培養液中で６日間自発的分化させた後のミエリン塩基性タンパク質（myelin basic protein (MBP)）／ＴＬＲ４二重陽性ＯＰＣの代表例（Ｄ，Ｄ’）。（Ｄ）における矢印は、より低減されたＴＬＲ４発現レベルのみを特徴とする、さらに高度に分化したＯＰＣを示しており、（Ａ）における遺伝子発現データを反映している。矢印は強度に発現する成熟度のより低い細胞を示す。
【図３】培養されたラットＯＰＣに組換えＥｎｖが与える炎症誘発効果；  （Ａ，Ｂ，Ｃ）ＯＰＣを溶液中における組換えＥｎｖにより刺激し（Ａ、Ｅｎｖ可溶性）、表面結合組換えＥｎｖにより刺激し（Ｂ，Ｅｎｖ固体）、膜結合組換えＥｎｖにより刺激した（Ｃ）ところ、ｐＶ１４  Ｅｎｖ遺伝子導入されたＵ３４３上に膠芽腫細胞が発現した（Ｄ−Ｄ’）。これらのすべては、ｐＶ１４  対照遺伝子導入されたＵ３４３膠芽腫細胞の存在下に成長したＯＰＣまたは各種対照緩衝液と比較して、８時間の刺激の後にｉＮＯＳの発現を強く誘導した（Ε−Ε’）。組換えＥｎｖにおいて、調製エンドトキシンのレベルは、ＬＡＬテストにより測定したところ、５  ＥＵ／ｍＬ未満であった。（Ｄ−Ｅ’）Ｅｎｖ表面発現を示すｐＶ１４  ＥｎｖおよびｐＶ１４  対照遺伝子導入されたＵ３４３細胞の抗Ｅｎｖ免疫染色。（Ｆ−Ｇ’）Ｏ４免疫染色により評価したオリゴデンドログリアの形態は、１日培養後（Ｆ，Ｆ’）でも、５日間（Ｇ，Ｇ’）培養後でも、表面結合組換えＥｎｖによる刺激には影響されないままである。（Ｈ）ＮＯの分解生成物である亜硝酸を測定する、細胞培養液上清の間接的分光分析の結果、可溶性組換えＥｎｖによって２４時間刺激したＯＰＣ試料において、ＮＯの投与量依存レベルの著しい増加が見られた。（Ｉ−Ｋ）  ＴＮＦα，ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のような炎症性サイトカインは、表面結合組換えＥｎｖによる刺激により、上向き調節を施される。ＧＡＰＤＨが参照遺伝子として用いられた。データは平均値＋／−標準偏差として示され、それぞれ６回（Ａ）、８回（Ｂ）、３回（Ｃ）、３回（Ｈ）および８回（Ｉ〜Ｋ）にわたって個別に行われた実験の一つを表す。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。目盛は５０μｍ。
【図４】未成熟のラットＯＰＣ  （生後１日＝ＯＰＣ）と成熟したラットＯＰＣ（生後７日、「成熟したＯＰＣ」またはオリゴデンドロサイト＝ＯＬ；）とにおけるＨＥＲＶ−Ｗ感応性の比較；  両細胞型ともに１００ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えＥｎｖによる刺激を与えた。緩衝液対照ｉＮＯＳおよびサイトカインと比較すれば有意ではあったが、ＯＬでＥｎｖ刺激を与えた後の上向き調節は、ＯＰＣの場合ほど明白ではない。ＧＡＰＤＨ発現が参照遺伝子として用いられた。データは平均値＋／−標準偏差として示され、３回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５）。
【図５】ヒトＯＰＣのＥｎｖ依存性反応；  （Ａ）培養されたヒトＯＰＣを表面結合組換えＥｎｖ（固体）および可溶性組換えＥｎｖ（可溶性）で刺激すると、緩衝液で処理された細胞と比較して、２４時間の刺激の後にｉＮＯＳの発現が強く誘導される。ＧＡＰＤＨ発現が参照遺伝子として用いられた。データは平均値＋／−標準偏差として示され、３回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ，Ｂ’）培養されたＧａｌＣ陽性ヒトＯＰＣの免疫蛍光染色によれば、ＴＬＲ４に対する強度の高い信号（３日間の培養で現れる）が得られる。目盛は５０μｍ。
【図６】Ｅｎｖ経路中和実験；  （Ａ）組換えＥｎｖを熱により不活性化すると、８時間ＯＰＣを刺激した自然組換えＥｎｖと比べて抑制されたｉＮＯＳ遺伝子の発現がもたらされる。自然Ｅｎｖおよび変性Ｅｎｖ（Ｅｎｖ  ｈｅａｔ）の両標本ともに、濃度１０００ｎｇ／ｍｌで投与した。（Ｂ，Ｃ）それぞれＩＲＡＫ１／４およびＴＲＩＦにより薬理的に阻害した場合のＯＰＣにおけるｉＮＯＳ発現の低下。３２００ｎＭのＩＲＡＫ１／４を用いた２時間のプレインキュベーション工程に続いて、１または５０μＭのＴＲＩＦ阻害性ペプチドＯＰＣを表面結合（固体）組換えＥｎｖで８時間刺激し、その後溶解させた。（Ｄ）Ｅｎｖ受容体ＴＬＲ４の抗体を媒介とした分化に続くＯＰＣにおけるｉＮＯＳ発現の低下。濃度１５μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ４抗体を３７度で用いた２時間のプレインキュベーション工程に続いて、ＯＰＣを固体ｒＥｎｖで８時間刺激し、その後溶解させた。ＧＡＰＤＨ発現が参照遺伝子として用いられた。データは平均値＋／−標準偏差として示され、３回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１）。（Ｅ）ＯＰＣを表面結合（固体）組換えＥｎｖで８時間刺激した後に続いて起こる、ＮＫκＢ核局在の増加。データは平均値＋／−標準偏差として示され、３回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｆ〜Ｇ’）緩衝液（対照）およびＥｎｖで刺激したＯＰＣの代表的ＮＦκＢ免疫染色。目盛は５０μｍ。
【図７】３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）陽性ＯＰＣの生成；  （Ａ）免疫蛍光染色の結果、２４時間Ｅｎｖ（表面結合組換えＥｎｖ）で刺激した後では、緩衝液で処理した細胞に比べて著しく多数のＯＰＣがＮＯ依存性ニトロソ化ストレスマーカー３−ＮＴを発現することが分かった。陽性対照Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)）としては、強力なＮＯドナーを用いた。しかしながら、ｉＮＯＳ阻害性分子であるＬ−ＮＡＭＥを濃度１００μＭ、３７度で３０分間Ｅｎｖ刺激の前に用いてＯＰＣをインキュベートしたところ、３−ＮＴ陽性度は対照レベルにまで低減された。不活性エナンチオマーであるＤ−ＮＡＭＥは、Ｅｎｖ依存性３−ＮＴの誘導を消滅させることができなかった。データは平均値＋／−標準偏差として示され、３回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ〜Ｆ’）それぞれ対照細胞（Ｂ，Ｂ’）、Ｅｎｖ刺激したＯＰＣ（Ｃ，Ｃ）、Ｌ−ＮＡＭＥでプレインキュベートしたＯＰＣ（Ｄ，Ｄ’）、Ｄ−ＮＡＭＥでプレインキュベートしたＯＰＣ（Ｅ，Ｅ’）およびＳＮＡＰに曝したＯＰＣ（Ｆ，Ｆ’）の代表的抗３−ＮＴ免疫染色。目盛は５０μｍ。（Ｇ−Ｇ’’’）ＭＳ患者のＮＡＷＭ細胞切片を免疫組織蛍光染色したところ、（その前駆体マーカーＰＤＧＦＲα（矢印）の発現により標識される）常在性ＯＰＣは、その３−ＮＴ陽性度により示されるニトロソ化ストレスに耐えられることが証明された。
【図８】ＯＰＣ分化のＥｎｖ依存性阻害；  （Ａ，Ｂ）免疫蛍光解析の結果、表面結合組換えＥｎｖでそれぞれ１日および３日間刺激したところ、対照細胞に比べて著しく減少した数のＯＰＣが後期ミエリンマーカーＭＢＰとともに早期ミエリンマーカーＣＮＰａｓｅをも発現することが証明された。データは平均値＋／−標準偏差として示され、４回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ〜Ｃ’’’）および（Ｄ〜Ｄ’’’）はそれぞれ、対照およびＥｎｖ刺激されたＯＰＣの、代表的な抗ＣＮＰａｓｅおよび抗ＭＢＰ免疫染色を示す。（Ｅ）１００μＭのＬ−ＮＡＭＥと、表面結合組換えＥｎｖとを組み合わせて用いてＯＰＣを３日間インキュベートすると、抗ＭＢＰ免疫染色により示される、Ｅｎｖを媒介としたＯＰＣ分化ブロックの消滅がもたらされる。Ｄ−ＮＡＭＥを投与してもミエリンの発現をレスキューすることはできなかった。データは平均値＋／−標準偏差として示され、４回にわたって個別に行われた実験の代表例から得られた。ｔ−検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１。ここでｎ．ｓ．はnot significant（有意でない）を意味する）。（Ｆ〜Ｈ’）はそれぞれ、Ｅｎｖのみ、ＥｎｖとＬ−ＮＡＭＥとの組み合わせ、およびＥｎｖとＤ−ＮＡＭＥとの組み合わせで刺激したＯＰＣの代表的ＭＢＰ免疫染色。目盛は５０μｍ。
【図９】ＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングされたｌａｂｔｅｋにおいて２４時間および７２時間刺激した後の、ＯＰＣ成熟マーカーの発現；  コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（＋Ｅｎｖ−Ｔ）は、その希釈緩衝液（緩衝液）に比べて、２４時間の刺激の後ＣＮＰａｓｅ陽性ＯＰＣの百分率の低下を誘発し（Ａ）、７２時間の刺激の後ＭＢＰ陽性ＯＰＣの百分率の低下を誘発した（Ｂ）。データは１回の実験を１０回評価すること（one experiment assessed in decaplicates）により得られた平均値±ＳＥＭとして示される（（Ａ）各グループにつきカウント細胞数４１０〜５６３；＊ｐ＜０，０５  ｔ−検定、（Ｂ）各グループにつきカウント細胞数３６４〜４９１；＊ｐ＜０，００１  マン・ホイットニーの順位和検定(Mann-Whitney Rank Sum Test)）。
【図１０】ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１で２４時間刺激した後の、ヒトＯＰＣにおけるＣＮＰａｓｅの発現；  （Ａ）コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、２４時間の刺激の後、ＣＮＰａｓｅ陽性ＯＰＣの百分率の低下を誘発する。５０ｎＭまたは２００ｎＭのＧＮｂＡＣ１は、テストされた両方のＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−ＡまたはＧＮｂＡＣ１−Ｂ）において、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ効果を完全に阻害する。データは、２〜８回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数７０５〜３８７８）。（Ｂ）ＧＮｂＡＣ１（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）のみでコーティングされた場合においても、あるいはＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）とともにコーティングされた場合においても、テストされた両方のＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−ＡまたはＧＮｂＡＣ１−Ｂ）において、ＣＮＰａｓｅ陽性ＯＰＣの百分率に影響は無い。データは１回の実験を１０回評価すること（one experiment assessed in decaplicates）により得られた平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数３９９〜５１２；ｐ＞０，０５；一元配置分散分析(One-way ANOVA)）。
【図１１】培地に添加されたＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１で２４時間刺激した後の、ヒトＯＰＣ培養液におけるＣＮＰａｓｅの発現；  細胞培地において希釈されたＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（３ｎＭ）は、２４時間の処理の後のＣＮＰａｓｅ発現を著しく減少させる。ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）はこの効果を完全に阻害するが、単体で用いた場合には何の効果も示さない。データは、２〜４回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数９２７〜１９１３；＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液；一元配置分散分析後にフィッシャー最小有意差事後分析 (Fischer LSD post-hoc analysis) を実施）。
【図１２】ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１で７２時間刺激した後の、ヒトＯＰＣ培養液におけるＭＢＰの発現；  （Ａ）コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（Ｅｎｖ−Ｔ）は、７２時間の刺激の後、ＭＢＰ陽性ＯＰＣの百分率の低下を誘発する。テストされた両方のＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−ＡまたはＧＮｂＡＣ１−Ｂ）において、５０ｎＭのＧＮｂＡＣ１はＭＳＲＶ−Ｅｎｖ効果を部分的に阻害し、この阻害は２００ｎＭで完成される。（Ｂ）細胞培地において添加されたＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（３ｎＭ）は、７２時間の処理の後のＭＢＰ発現を著しく減少させる。ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）はこの効果を完全に阻害する（Ｂ）。（Ａ）データは、２〜８回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数９２４〜４１５６）。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液、Ψｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ；一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施。（Ｂ）データは、２〜４回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数１０１３〜１８３４）。＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液、Ψｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施。
【図１３】コーティングされたＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１で２４時間および７２時間刺激した後のＯＰＣ成熟マーカーの発現；  コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、（Ａ）２４時間の刺激の後、ＣＮＰａｓｅ陽性ヒトＯＰＣの百分率の低下を誘発し、（Ｂ）７２時間の刺激の後、ＭＢＰ陽性ヒトＯＰＣの百分率の低下を誘発する。（Ａ）テストされた両方のＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−ＡまたはＧＮｂＡＣ１−Ｂ）において、ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）はＭＳＲＶ−Ｅｎｖ効果を部分的に阻害する。（Ａ）データは、６回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数２８０５〜３０３９）。＊ｐ＜０，０５  対  緩衝液、Ψｐ＜０，０５  対  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析 (Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks) の後にスチューデント・ニューマン・クールズ事後分析 (Student Newman Keuls post-hoc analysis) を実施。（Ｂ）データは、５〜６回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつきカウント細胞数１６７１〜２０６６）。＊ｐ＜０，０５  対  緩衝液、Ψｐ＜０，０５  対  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施。
【図１４】ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘導されるヒトＯＰＣ成熟の阻害はＧＮｂＡＣ１により完全に逆転される；  コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、（Ａ）２４時間の刺激の後、ＣＮＰａｓｅ陽性ヒトＯＰＣの百分率の低下を誘発し、（Ｂ）７２時間の刺激の後、ＭＢＰ陽性ヒトＯＰＣの百分率の低下を誘発する。テストされた両方のＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（＋ＧＮｂＡＣ１−Ａまたは＋ＧＮｂＡＣ１−Ｂ）において、ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）はＭＳＲＶ−Ｅｎｖ効果を部分的に阻害する。結果は（Ａ）ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率、または（Ｂ）ＭＢＰ陽性細胞の百分率として表され、８〜１４回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭとして示される（各グループにつき（Ａ）カウント細胞数３６００〜６８００、（Ｂ）カウント細胞数２７００〜５８００の細胞）。＊ｐ＜０，０５  対  対照、Ψｐ＜０，０５  対  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施。
【図１５】ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘導されるヒトＯＰＣ成熟の阻害はＧＮｂＡＣ１により完全に逆転される（規格化されたデータ）；  ＭＳＲＶ−ＥｎｖはＯＰＣに接種する前に培養チャンバースライド上でコーティングされた。ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）は、コーティングされる前にＭＳＲＶ−Ｅｎｖと混合される（ＧＮｂＡＣ１−Ａ）か、またはＭＳＲＶ−Ｅｎｖでコーティングされた培養チャンバー上でインキュベートされた（ＧＮｂＡＣ１−Ｂ）。データは（Ａ）ＣＮＰａｓｅ陽性細胞または（Ｂ）ＭＢＰ陽性細胞の百分率として定量化され、対照条件（ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液）に対する変化の百分率として表される。結果は８〜１４回個別に行われた実験の平均値±ＳＥＭを表す（各グループにつき（Ａ）カウント細胞数３６００〜６８００、（Ｂ）カウント細胞数２７００〜５８００）。＊ｐ＜０，０５  対  対照、Ψｐ＜０，０５  対  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施。
【図１６】グループＡ，Ｂ，ＣおよびＦについてのＥＡＥ臨床スコアの推移(clinical score kinetics)；  Ａ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｂ：２００μｇのＧＮｂＡｃ１でＥＡＥを治療した場合、Ｃ：Ｌ−ＮＡＭＥでＥＡＥを治療した場合、Ｆ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＬ−ＮＡＭＥでＥＡＥを治療した場合。
【図１７】グループＡ，Ｂ，ＤおよびＧについてのＥＡＥ臨床スコアの推移；  Ａ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｂ：２００μｇのＧＮｂＡｃ１でＥＡＥを治療した場合、Ｄ：ＳＭＴでＥＡＥを治療した場合、Ｇ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＳＭＴでＥＡＥを治療した場合。
【図１８】グループＡ，Ｂ，ＥおよびＨについてのＥＡＥ臨床スコアの推移；  Ａ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｂ：２００μｇのＧＮｂＡｃ１でＥＡＥを治療した場合、Ｅ：ＤＭＦでＥＡＥを治療した場合、Ｈ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＤＭＦでＥＡＥを治療した場合。
【図１９】２３ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：Ｅｎｖを「一回注射した」グループＡおよび「二回注射した」グループＢ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＤおよびＧ、Ｄ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＨ。
【図２０】２６ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：Ｅｎｖを「一回注射した」グループＡおよび「二回注射した」グループＢ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＤおよびＧ、Ｄ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＨ。
【図２１】２９ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：Ｅｎｖを「一回注射した」グループＡおよび「二回注射した」グループＢ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＤおよびＧ、Ｄ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＨ。
【図２２】グループＡ，Ｂ，ＣおよびＤについてのＥＡＥ臨床スコアの推移；  Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｃ：２００μｇのＧＮｂＡｃでＥＡＥを治療した場合、Ｄ：５００μｇのＧＮｂＡｃでＥＡＥを治療した場合。
【図２３】グループＡ，Ｂ，ＥおよびＦについてのＥＡＥ臨床スコアの推移；  Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｄ：ＳＭＴでＥＡＥを治療した場合、Ｇ：５００μｇのＧＮｂＡｃおよびＳＭＴでＥＡＥを治療した場合。
【図２４】グループＡ，Ｂ，ＧおよびＨについてのＥＡＥ臨床スコアの推移；  Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｅ：ＤＭＦでＥＡＥを治療した場合、Ｈ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＤＭＦでＥＡＥを治療した場合。
【図２５】実験期間を通じた体重増加の推移（免疫原を最初に注射した日に対する相対的体重増加）；  グループＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｃ：２００μｇのＧＮｂＡｃでＥＡＥを治療した場合、Ｄ：５００μｇのＧＮｂＡｃでＥＡＥを治療した場合。）
【図２６】実験期間を通じた体重増加の推移（免疫原を最初に注射した日に対する相対的体重増加）；  グループＡ、Ｂ、ＥおよびＦ（Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｄ：ＳＭＴでＥＡＥを治療した場合、Ｇ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＳＭＴでＥＡＥを治療した場合。）
【図２７】実験期間を通じた体重増加の推移（免疫原を最初に注射した日に対する相対的体重増加）；  グループＡ、Ｂ、ＧおよびＨ（Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：未治療のＥＡＥ陽性対照、Ｅ：ＤＭＦでＥＡＥを治療した場合、Ｈ：２００μｇのＧＮｂＡｃおよびＤＭＦでＥＡＥを治療した場合。）
【図２８】１６ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＧおよびＨ。
【図２９】２６ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＧおよびＨ。
【図３０】２９ｒｐｍのロータロッド上での時間の推移；  Ｘ軸：プロトコルに従って値を測定した日、Ｙ軸：７日目に対して相対的な、ロータロッド上における時間利得または損失、Ａ：グループＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、Ｂ：グループＡ、Ｂ、ＥおよびＦ、Ｃ：グループＡ、Ｂ、ＧおよびＨ。
【図３１】実験期間を通じた全グループのＥＡＥ臨床スコアの推移；  （Ａ：モックＥＡＥ陰性対照、Ｂ：モックのアイソタイプ抗体により治療されたＥＡＥ陽性対照、Ｃ：５００μｇのＧＮｂＡｃでＥＡＥを治療した場合、Ｄ：フマル酸ナトリウムでＥＡＥを治療した場合、Ｅ：５００μｇのＧＮｂＡｃとフマル酸ナトリウムでＥＡＥを治療した場合。）
【００２７】
【表１Ａ】
2018065814.tif 000002
【００２８】
【表１Ｂ】
2018065814.tif 000003
【００２９】
【表１Ｃ】
2018065814.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下の実施例は説明的なものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３１】
［実施例１：ＨＥＲＶ−Ｗファミリーエンベロープタンパク質により誘導され、（神経系の脱髄病変におけるオリゴデンドログリア前駆体細胞の分化を阻害する）再エミリン化遮断］
１．１  物質および方法
１．１．１  オリゴデンドロサイト前駆体細胞の培養
ラットのオリゴデンドロサイト前駆体細胞（ＯＰＣｓ）を、前述の通り２２浄化した。ＯＰＣｓを増殖用培地（１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子と１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト血小板由来成長因子−ＡＡとを補充したＳａｔｏ培地；R & D Systems,
Wiesbaden-Nordenstadt, Germany）に保存した一方で、０，５％ウシ胎児血清を補充し
たＳａｔｏ培地によって分化を開始した。ヒト胎児オリゴデンドロサイト前駆体細胞（ｈＯＰＣ）および各培地を3H Biomedical, Uppsala, Swedenから購入した。組換えＥｎｖを、タンパク質バッチを供給するGeNeuro（Geneva, Switzerland）の品質管理規格に従ってPX-Therapeutics（Grenoble, France）により生成し浄化した。エンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出成分（limulus amebocyte lysate (LAL)）試験で測定したところ、５ＥＵ／ｍＬ未満であった。Ｅｎｖ刺激を、３つの異なった手法でそれぞれ行った：ｉ）分化培地において１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌで希釈された組換え完全長Ｅｎｖタンパク質を用いた手法と、ｉｉ）表面濃度が１７，５３ｎｇ／ｃｍ２である細胞培養皿上でコーティングされた組換えＥｎｖタンパク質を用いた手法と、ｉｉｉ）Ｅｎｖを過剰発現し遺伝子導入されたＵ３４３膠芽腫細胞上にＯＰＣｓを接種する手法。組換えＥｎｖ緩衝液プレパラート（２０ｍＭヒスチジン、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ６．０)を同等の希釈度で用いて、対照刺激実験を行った。比色分析一酸化窒素評価キット（Merck-Millipore/Calbiochem, Darmstadt, Germany）を用いてＯＰＣの上清におけるＮＯ濃度測定を行い、Ａｎｔｈｏｓプレートリーダー２００１（Anthos labtec instruments, Salzburg, Austria）を用いて５４０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞径とプロセス分岐の度合いとを考慮し、抗Ｏ４抗体（Merck-Millipore/Chemicon, Darmstadt, Germany)を用いて、ＯＰＣ形態評価を行った。ＩＲＡＫ−１／４阻害剤Ｉ（１−（２−（４−モルフォリニル）エチル）−２−（３−ニトロベンゾイルアミノ）ベンズイミダゾール、Ｎ−（２−モルフォリニルエチル）−２−（３−ニトロベンゾイルアミノ）−ベンズ−イミダゾール；Sigma Aldrich, Hamburg, Germany）実験を、２４００ｎＭの濃度で行った。ＴＲＩＦ阻害性ペプチド (Invivogen, San Diego, USA)実験を、製造業者のプロトコルに従って５０μΜの濃度で行った。組換えＥｎｖを１２３°Ｃの温度に１時間曝すことによって、Ｅｎｖ不活性化を行った。ＴＬＲ４−抗体受容体遮断実験を、１５μｇ／ｍｌの抗体濃度で行った。Ｌ−ＮＡＭＥ／Ｄ−ＮＡＭＥ遮断実験をそれぞれ１００μΜの濃度で行った；Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ (S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine)）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【００３２】
１．１．２  オリゴデンドロサイト前駆体およびＵ３４３膠芽腫細胞の形質移入
ＯＰＣｓを増殖用培地において２４時間成長させた。また、抗ＴＬＲ４抗体特異性を証明するためにＨｕＳＨ２９ ｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳベクター (OriGene, Rockville, Maryland, USA)に基づいてＴＬＲ４抑制ベクターをコード化するｓｈＲＮＡを使用したＮａｎｏ Ｊｕｉｃｅ試薬（Merck-Millipore, Darmstadt, Germany）を用いて、形質移入を行った。Ｕ３４３膠芽腫細胞において膜結合Ｅｎｖを発現させるために、遺伝子導入された細胞を可視化するためのレモン色の発現ベクター９とＥｎｖ過剰発現物（ＨＥＲＶ−Ｗ  ＭＳＲＶ型エンベロープ遺伝子コード配列のｎｔ１からｎｔ１６２９を持ったｐＶ１４ベクターである、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３３１５００．１（Geneuro SA, Switzerlandにより供給）)とを1:5の比率で組み合わせた。対応する空ベクターは対照として用いた。Ｕ３４３膠芽腫細胞の形質移入は、リポフェクタミン (Life Technologies, Darmstadt, Germany)を用いて行われた。
【００３３】
１．１．３  多発性硬化症組織の染色
Ｏｌｉｇ２／Ｅｎｖ二重染色を行うために、ホルマリン固定パラフィン封入ヒトＭＳ組織を切断し、５μＭ切片を、キシレンにおいて脱パラフィンし、等級付けアルコールを介して蒸留水に再水和した。メタノールに溶解させた０．３％過酸化水素中でスライドをインキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性を消滅させた。そして、スライドを、蒸留水ですすぎ、１０ｍＭトリスおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９）溶液に転移させ、熱誘導抗原回収を行った。その後、スライドを、室温に冷却し、リン酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline (PBS))ですすぎ、抗Ｏｌｉｇ２(1:300; Merck-Millipore)および抗Ｅｎｖ抗体３Ｂ２Ｈ４(1:500, GeNeuro, Geneva, Switzerland)の両方とも用いて一晩４°Ｃでインキュベートした。次に、切片をＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ (1:400; Life Technologies/Molecular Probes, Darmstadt, Germany)と共にインキュベートし、Ｏｌｉｇ２及びＡｌｅｘａ５５５標識ヤギ抗マウスを検出し、Ｅｎｖを可視化した。ＴＬＲ４／ＰＧＲＦＲα二重染色を行うために、急速凍結した組織を切断し、５μＭ切片を、抗ＴＬＲ４ (1:100; Merck-Millipore)および抗ＰＤＧＦα抗体(1:50; eBiosciences, San Diego, California, USA)を用いて一晩４°Ｃでインキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウス (1:400; Life Technologies/Molecular Probes)と、ビオチン化ウサギ抗ラットを含むＰＤＧＦＲα (1:500; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)と、Ａｌｅｘａ６４７標識ストレプトアビジン (1:400; Life Technologies/Molecular Probes)とをそれぞれ用いて、ＴＬＲ４を検出した。核染色を行うために、切片をヘキスト染色液(1:100; Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany)を用いて1分間インキュベートし、ベクタシールド (Vector Laboratories)で覆った。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ共焦点レーザー走査顕微鏡 (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany)を用いて、顕微鏡分析を行った。
【００３４】
１．１．４  培養細胞の染色
パラホルムアルデヒド固定培養細胞の染色を、前述の通り２２行った。一次抗体を以下の様に希釈した：抗ＴＬＲ４抗体 (1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)、抗Ｅｎｖ抗体３Ｂ２Ｈ４ (1/500; GeNeuro, Geneva, Switzerland)、抗２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）抗体(1/1000; Covance, Princeton, New Jersey, USA)、単クローン抗ミエリン塩基性タンパク質 (MBP; 1/1000; Convance, Princeton, New Jersey, USA)、多クローン抗ミエリン塩基性タンパク質抗体 (1:1000; Millipore, Schwalbach, Germany)、抗ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）抗体および抗Ｏ４抗体 (共に1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)、抗３−ＮＴ抗体 (1/1000; Abeam, Cambridge, MA, USA)、ならびに抗ＮＦＫＢ抗体 (1/1000; Abeam, Cambridge, MA, USA)。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合した抗体とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４を結合した抗体と (共に1:500,)を、シグナル可視化のために用いた。核を、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール (DAPI; Roche, Basel, Switzerland)を用いて染色した。
【００３５】
１．１．５  ＲＮＡ調製、ｃＤＮＡ合成、および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
培養された細胞からのＲＮＡ精製を、ＲＮｅａｓｙ法 (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて行った。単離されたＲＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット (Life Technologies/Applied Biosystems)を用いて逆転写した。パワーサイバーグリーンユニバーサルミックス (Life Technologies/Applied Biosystems)を用いて７９００ＨＴ配列検出システム (Life Technologies/Applied Biosystems)上で、遺伝子発現レベルの定量的測定を行った。プライマー配列を、プライマーエクスプレス２．０ソフトウェア (Life Technologies/Applied Biosystems)を用いて特定し、特異的アンプリコンの生成について試験した：
TLR4_fwd: CTGGGTTTCTGCTGTGGACA (SEQ ID No. 7)
TLR4_rev: AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC (SEQ ID No. 8)
riNOS_fwd: CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG (SEQ ID No. 9)
riNOS_rev: TGCACCCAAACACCAAGGT (SEQ ID No. 10)
huiNOS_fwd: TGAGGAGCAGGTCGAGGACT (SEQ ID No. 11)
huiNOS_rev: TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG (SEQ ID No. 12)
huGAPDH_fwd: TGGACCTGACCTGCCGTCTA (SEQ ID No. 13)
huGAPDH_rev: AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG (SEQ ID No. 14)
TNFα_fwd: AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA (SEQ ID No. 15)
TNFα_rev: CCGGACTCCGTGATGTCTAAG (SEQ ID No. 16)
IL1β_fwd: GAAACAGCAATGGTCGGGAC (SEQ ID No. 17)
IL1β_rev: AAGACACGGGTTCCATGGTG (SEQ ID No. 18)
IL6_fwd: GTTGTGCAATGGCAATTCTGA (SEQ ID No. 19)
IL6_rev: TCTGACAGTGCATCATCGCTG (SEQ ID No. 20)
GAPDH_fwd: GAACGGGAAGCTCACTGGC (SEQ ID No. 21)
GAPDH_rev: GCATGTCAGATCCACAACGG (SEQ ID No. 22)
ODC_fwd: GGTTCCAGAGGCCAAACATC (SEQ ID No. 23)
ODC_rev: GTTGCCACATTGACCGTGAC (SEQ ID No. 24)
ＧＡＰＤＨおよびＯＤＣを基準遺伝子として利用し、相対的遺伝子発現レベルをΔΔＣｔ法(Life Technologies/Applied Biosystems)に従って測定した。各サンプルを四通りで測定した。データは平均値±標準偏差で表す。ｔ−検定を用いて統計的有意性を決定した。
【００３６】
１．２  結果
１．２．１  慢性活動性ＭＳ病変の近くにあり常在性ＯＰＣｓの近傍にあるＥｎｖタンパク質の局在性
免疫組織学的分析を用いて、ヒト脳組織サンプルにおけるＥｎｖタンパク質局在性についての研究を行った。これにより、Ｏｌｉｇ２陽性ＯＰＣｓ（図１Ｃ）のすぐ近傍の慢性活動性ＭＳ病変 (chronic active MS lesions (CAL)) の周縁のみならず、ＣＡＬの近くのＮＡＷＭ（図１Ｂ）においても、非常に大量のＥｎｖタンパク質が存在することが明らかになった。病変までさらに距離があるＮＡＷＭは、識別可能なＥｎｖ免疫反応性（図１Ａ）を示さなかった。常在性ＯＰＣｓへのＥｎｖタンパク質の潜在的な影響、ひいてはそれに関連するミエリン修復への潜在的な影響のさらなる証拠を得るため、ＴＬＲ４および血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲα）二重陽性ＯＰＣｓをさらに探した。これらは、健常な脳（図１Ｄ−Ｄ’”）およびＭＳ患者のＮＡＷＭ（図１Ｅ−Ｅ’”）において検出することができた。これにより、ＭＳ脳では、ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖ発現細胞または対応する分泌タンパク質の近傍において、ＴＬＲ４陽性ＯＰＣｓを検出し得ることが明瞭に証明された。その結果、ＴＬＲ４陽性ＯＰＣｓは、前述の通り１０、ＴＬＲ−４病原性アゴニストの感染しやすい標的になっている。しかし、このことは、予想外の発見を成し、まだ見ぬ応用可能性を切り開くものである。なぜならば、ＴＬＲ４がＯＰＣｓにおいてそのような条件で発現することが従来は知られていなかったからである。またそれにも増して、これも明らかになったように、ＭＳＲＶ−ＥｎｖのようなＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質が、分化における正にこの段階において、ミエリン形成の可能性に対する最終的で劇的な効果を伴ってＯＰＣｓと直接相互作用するとは予測することができなかったからである。
【００３７】
１．２．２  培養したラット及びヒトＯＰＣｓによるＴＬＲ４発現
これまでの研究により、単球および樹状細胞に対するＴＬＲ４依存炎症誘発効果が本質的には立証されてきた１０。抗ＴＬＲ４免疫標識により、ラットおよびヒト両方のオリゴデンドログリア前駆体細胞の表面における当該受容体の発現が確認された（図２Ｃ、Ｃ’、および５Ｂ）。さらに、ラットＯＰＣｓにおけるＴＬＲ４の特異的ｓｈＲＮＡ介在性ノックダウンにより、前述の免疫標識の特異性が実証された（図２Ｂ、Ｂ’）。若年ＯＰＣｓから成熟ＯＰＣｓへのＴＬＲ４受容体発現の推移を評価するために、さらに成熟したＯＰＣｓのためのマーカーである抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体のみならず、抗ガラクトセレブロシド（galactocerebroside (GalC)）抗体をも用いて、培養液中、３日間および６日間の分化を行った後（図２Ｃ−Ｄ’）に、共染色を行った。興味深いことに、時間の経過に伴うＴＬＲ４受容体遺伝子発現が、細胞分化の過程の間、下方制御されることがわかった（図２Ａ）一方で、特異的ＴＬＲ４タンパク質検出の結果、若いほうの細胞に比べて形態的に成熟したラットＯＰＣｓにおいては、後期の時点で弱い信号が生じただけであった。
【００３８】
１．２．３  ＥｎｖのＯＰＣ刺激による、炎症性サイトカインの発現および誘導型ＮＯ合成酵素の誘導
培地（Ｅｎｖ可溶性；１００ｎｇ／ｍｌ；図３Ａ）に溶解されているか、細胞培養皿（Ｅｎｖ固形；図３Ｂ）上でコーティングされているか、または遺伝子導入されたＵ３４３膠芽腫細胞（ｐＶ１４Ｅｎｖ；図３Ｃ−Ｅ’）の表面で過剰発現している組換えＥｎｖタンパク質によってラットＯＰＣｓを刺激すると、(緩衝液または空ベクターで処理した)対照条件の場合と比べて、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６（図２Ｉ−Ｋ）のような炎症性サイトカインの誘導が引き起こされるだけでなく、誘導型一酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxide synthase (iNOS)）の強力な転写増加も引き起こされた。そして次に、増強されたｉＮＯＳ発現が、細胞上清におけるニトロソ化ストレスにより誘導された生成物である一酸化窒素（nitric oxide (NO)）のＥｎｖ濃度依存上昇を引き起こす（図３Ｈ）。興味深いことに、ラットＯＰＣ形態は、１日間および５日間のＥｎｖ曝露の後行ったオリゴデンドログリアのＯ４染色によって示されるとおり、Ｅｎｖ刺激の間、変化しないままであった（図３Ｆ−Ｇ’）。ヒトＧａｌＣ陽性ＯＰＣｓがＴＲＬ４を発現することがわかり（図５Ｂ，Ｂ’）、また、（皿表面上でコーティングされているだけでなく、溶液中にもある）組換えＥｎｖによる刺激も同様にｉＮＯＳ転写を誘導した（図５Ａ）。さらに、Ｅｎｖ刺激は、ＯＰＣ生存に影響せず（ＴＵＮＥＬ法により、また総細胞数の定量化により明らかな通り；データ未提示）、また、老化ＯＰＣ表現型を誘導しない（β−ガラクトシダーゼ染色によって確かめられた；データ未提示）ということがわかった。成熟したラットＯＰＣｓ（ｍａｔＯＰＣｓ；分化培地に６日間保存）へのＥｎｖ刺激によって、炎症反応が引き起こされる（図４）。この炎症反応は、ｉＮＯＳ、ＴＮＦα、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６の転写レベルにより決まり、未成熟ＯＰＣｓの効果に比べるとかなり弱い。この観察結果は、成熟ＯＰＣｓにおいてみられた下位ＴＬＲ４発現レベルと符合しており（図２）、未成熟細胞のＥｎｖ平行ＴＬＲ−４発現レベルに対する優れた感応性を示唆している。
【００３９】
１．２．４  ＴＬＲ４を介したＥｎｖ効果の伝達およびＩＲＡＫ−１／４，ＴＲＩＦおよびＮＦＫＢを伴う炎症応答
ＴＬＲ４に対するＥｎｖの特異性を証明し、かつ下流側シグナル伝達をさらに解明するために、我々はいくつかの対照実験を行った（図６）。ＯＰＣ刺激前の組換えＥｎｖの熱失活により、ｉＮＯＳ誘導が対照と比べて非常に著しく減少する（図６Ａ）。ｉＮＯＳ転写も同様に著しく低下することが、ＴＬＲ４の抗体介在遮断を用いて観測することができた。これにより、この受容体に対するＥｎｖの特異性および、観測された下流側の炎症誘発効果（図６Ｄ）に対するその関連性を確認した。ＥｎｖによるＴＬＲ４活性化直後の細胞内経路に解明の光を投じるために、我々はＴＬＲ４活性化後の２つの公知の下流側経路の役割について調べた。すなわち、ＩＲＡＫ−１／４（interleukin-1 receptor-associated-kinase-1/4（インターロイキン１受容体関連キナーゼ１／４））を伴うＭｙＤ８８依存経路、および、ＴＲＩＦ（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β（ＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ））を伴うＭｙＤ８８非依存経路について調べた。ＩＲＡＫ−１／４阻害剤ＩまたはＴＲＩＦ阻害性ペプチドを利用すると、Ｅｎｖの存在下でｉＮＯＳ発現レベルが著しく減少する結果となった（図６Ｂ，Ｃ）。このことから、Ｅｎｖを介してＴＬＲ４を活性化することにより、ＭｙＤ８８非依存シグナル伝達経路だけでなくＭｙＤ８８依存シグナル伝達経路もまた活性化されることが証明された。両経路ともに、ＮＦＫＢ (nuclear factor K-light-chain-enhancer of activated B cells （活性化B細胞の核内因子Ｋ-軽鎖エンハンサ）)核移行に収束し得る。核ＮＦＫＢ局在性を持ったＯＰＣｓがＥｎｖ刺激により著しく増加することが、抗ＮＦＫＢ抗体を用いて確認された（図６Ｅ−Ｇ’）。これにより、炎症性サイトカインの転写の上方制御が観測されたことの説明がついた。
【００４０】
１．２．５  ニトロソ化ストレスマーカーニトロチロシンのＥｎｖ介在性誘導
ＮＯは、Ｅｎｖ刺激後著しく増加した（図３Ｈ参照）が、活性窒素種(reactive nitrogen species (RNS))である。ＮＯは、タンパク質、核酸、および脂質を含む多数の細胞内分子と反応し得る。これにより、３−ニトロチロシン残留物（3-nitrotyrosine residues(3-NT)）が形成される。ラットＯＰＣｓを組換えＥｎｖタンパクに曝露すると、緩衝液対照（図７Ｂ，Ｂ’およびＣ，Ｃ’）と比べると３−ＮＴ陽性細胞が著しく増加し、ＮＯ介在性ニトロソ化ストレス誘導を示すことがわかった。しかし、ｉＮＯＳ阻害分子であるＬ−ＮＡＭＥ（L-NG-nitroarginine methyl ester（Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニンメチルエステル））と共にプレインキュベーションすると、３−ＮＴ陽性ＯＰＣｓの形成が激減したのと同様に（図７Ｄ，Ｄ’）、ＮＯ生産も著しく減少する（データ未提示）ことがわかった。Ｌ−ＮＡＭＥの不活性エナンチオマーであるＤ−ＮＡＭＥを負の対照として用いても、Ｅｎｖを介した３−ＮＴ形成に影響はなかった（図７Ｅ，Ｅ’）。他方、強力なＮＯドナーであるＳＮＡＰ（S-nitroso-N-acetylpenicillamine（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセ
チルペニシラミン））を用いると、正の対照として作用し、ほぼ全てのＯＰＣｓがニトロチロシニル化された（図７Ｆ，Ｆ’）。重要なことに、前駆体マーカーであるＰＤＧＦＲαの発現によって明らかにされた３−ニトロチロシン陽性ＯＰＣｓが、ＭＳ患者の脳のＮＡＷＭにおいて検出された（図７Ｇ−Ｇ’”）。これは、このストレスメカニズムがＭＳにおいて病理学的関連性を持っているということを示している。
【００４１】
１．２．６  ＯＰＣｓのミエリン発現へのＥｎｖによる影響
これらの観察の後、Ｅｎｖタンパク質が、ミエリン修復活性に必要であると示されたオリゴデンドログリア分化プロセスに影響し得るかどうかを調べた。この目的のために、Ｅｎｖ刺激をしたラットＯＰＣｓを、Ｅｎｖ刺激から３日後のミエリンタンパク質ＣＮＰａｓｅ（2’, 3’-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase（２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ））およびＥｎｖ刺激から６日後のＭＢＰ（myelin basic protein（ミエリン塩基性タンパク質））の発現について、それぞれ評価した。その結果、前駆体マーカーＯ４の発現が変わらなかったこと（図３Ｆ−Ｇ’）とは対照的に、ＥｎｖによりＣＮＰａｓｅ陽性細胞の数およびＭＢＰ陽性細胞の数が著しく低下する（図８Ａ−Ｄ’”）ことが明らかになった。これにより、Ｅｎｖタンパク質の存在下で細胞分化反応が著しく損なわれることが明らかになった。しかし、Ｅｎｖ刺激と並行してＤ−ＮＡＭＥではなくＬ−ＮＡＭＥを添加することによって、ＭＢＰ発現をレスキューすることができた（図８Ｅ−Ｈ’）。これにより、ニトロソ化ストレスを介した３−ＮＴ形成と低下したＯＰＣ分化能力との直接的な関連の証拠が得られた。
【００４２】
１．３  結果分析
ＭＳのような神経性炎症脱髄疾患における非効率的なＮＳ再エミリン化は、脱髄軸索を適切に分化し再ミエリン化する常在性ＯＰＣｓの能力が低下することにより主に引き起こされると考えられている１１-１３。しかし、この再エミリン化遮断を引き起こす、主要
な上流側病原性分子は知られていなかった。対応するレトロウイルス粒子１４から得られる場合は“多発性硬化症関連レトロウイルス性要素”(Multiple Sclerosis associated retroviral element (MSRV))とも称されるＨＥＲＶ−Ｗのエンベロープタンパク質Ｅｎｖが、自然免疫系に炎症誘発効果を及ぼすことが、これまでの研究によりすでに明らかになっている。この自然免疫系は単核性細胞を活性化し、この単核性細胞が今度は主要炎症性サイトカインを生成する１０。しかし、Ｅｎｖと低下したＯＰＣ分化能力との直接的な関連は、これまでのところ想起されたことはなかったし、想起され得なかった。ここで、我々は、ＭＳに冒されたＮＳ組織においてこのＥｎｖタンパク質が検出され得ることを証明する。また、我々は、これまで知られていなかったＥｎｖ受容体であるＴＬＲ４の存在を介して、ある分化段階にあるＯＰＣｓにおけるＯＰＣ分化にＥｎｖが干渉し得ることを証明する。この有害な効果は、ｉＮＯＳを介して引き起こされる。このストレス反応により、ニトロチロシンが形成され、ミエリンタンパク質の発現に直接的な影響が及ぶ。興味深いことに、Ｅｎｖ刺激はＯＰＣ細胞生存率に影響せず、細胞形態は変化しないままであった。このことは、Ｅｎｖ介在性シグナルが細胞骨格要素を標的にしていないことを示唆している。注目すべきこと、また、ここに示す思いもよらない発見の新規性を裏付けることとしては、ヒトの脳におけるオリゴデンドログリア細胞においてＴＬＲ４は存在しないと、これまでの研究では主張されてきたことがある１５。しかし、この分野におけるこのような従来の認識とは対照的に、ＴＬＲ４が、培養された一次ＯＰＣｓ（ラットおよびヒト起源両方）において発現するだけでなく、ＭＳ組織におけるＰＤＧＦＲα陽性常在性ヒトＯＰＣｓにおいても発現することも、はっきりと証明することができた。このような違いは、Lehnhardtおよびその同僚たちがオリゴデンドログリア細胞を検出するためのより一般的なマーカーであるＯ４を用いたのに対し、我々は、それに代えて新たに受け入れられた前駆体マーカーであるＰＤＧＦＲ-αに依拠したという事実に由来する可能性はある。とはいうものの、（そのようなパターンが存在するとはまだ思われていなかったときに）我々は、ＯＰＣｓにおいてこの特有のＴＬＲ４発現パターンが存在することの根拠をこのようにして初めて示したのである。また我々は、ＯＰＣ成熟の間、ＴＬＲ４の強い下向き調節を観測した。これは、受容体発現が、そして結果的にはＥｎｖへの感受性が、未成熟細胞に限定されていることを示唆している。とはいいながら、それにより、これらの細胞が、ＭＳ病変において発現し遊離すると明らかにされているＥｎｖタンパク質と直接相互作用できるようになるということであるから、この発見には病理学的関連性がある。これらの発見に照らすと、ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖタンパク質は、ＭＳの免疫病理学的成分であるというだけでなく、内在性ミエリン修復活性に対して著しく悪い影響を及ぼすものでもあると結論付けられる。したがって、疾病経過中に多くのＭＳ患者において観測される修復能力の低下は、ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗ要素の活性化によるものであると結論付けられる２。なお、これまでの研究��は、安定した挿入を伴うが、（ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子において、コード配列なしではそれ以降ＲＴ活性も粒子も生成することができない）欠陥コピーによってコード化された、ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖタンパク質の染色体７に対する実験的な効果が説明されてきた１６。このＥｎｖタンパク質は、唯一のコード化遺伝子であるＨＥＲＶ−Ｗ７ｑ要素（ｅｎｖまたはＥＲＶＷ−Ｅ１遺伝子座）によって発現され得る。このＥｎｖタンパク質は、明らかに特有の細胞経路を引き起こす表面ドメインのＣ末端部分において４つのアミノ酸を欠失している。そして、このＥｎｖタンパク質は、胎盤に限定されたタンパク質レベルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで発現することが知られている１７，１８。このタンパク質は、まさしく“飼い慣らされた”ＨＥＲＶタンパク質の例であり１７、合胞体栄養細胞組織の形成において生理学的な役割を果たしており、故に“Ｓｙｎｃｙｔｉｎ”と名付けられている１９。ＴＬＲ４結合ドメインだけでなく、ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖにおける対応する膜融合ドメインも、ＨＥＲＶ−Ｗサブタイプ（例えば、ＭＳＲＶ−ＥｎｖやＳｙｎｃｙｔｉｎ）の間に、多かれ少なかれ保存され得る。活性ドメインのコンフォメーション曝露を伴った表面または細胞外タンパク質としてのそれらの利用能は非常に制限されており、Ｓｙｎｃｙｔｉｎの生理学的な役割は、合胞体栄養細胞に埋没し、胎盤の存在に限定されたままとなっている。よって、関連する病原性は、例えば、ヒトにおける、ある環境的感染因子２０，２１による非生理学的活性化の顕著な特徴、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ条件における実験的遺伝子導入の顕著な特徴であると思われる。Ｓｙｎｃｙｔｉｎが、多発性硬化症（multiple sclerosis (MS)）を患った個体のＮＳアストログリアにおいて発見されたと報告された。しかし、別の場所で抗体を用いると、ＳｙｎｃｙｔｉｎではなくＨＥＲＶ−Ｗ  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖサブタイプが検出されるという報告があった22。Ｓｙｎｃｙｔｉｎ配列は、それでも、オリゴデンドロサイトに有害なサイトカインの遊離を引き起こすマウスアストロサイトにおいて遺伝子導入をすることによって発現され得たが１６、遺伝子導入されたマウスは生育不能であることが明らかになった(C. PowerのH. Perron宛て私信、Neurovirology symposium,  San Diego, 2007)。しかし、腺腫様多発結腸ポリープ(adomatosis polyposis coli(APC))陽性ミエリン形成オリゴデンドロサイトが、このような遺伝子導入されたマウスの脳に
おいてＳｙｎｃｙｔｉｎ介在性細胞毒性に対して脆弱であることを、Ａｎｔｏｎｙおよび同僚は発見した。一方で我々は、（成熟細胞はそうではないが）未成熟ＯＰＣｓのみが、Ｅｎｖ介在性炎症誘発のきっかけにとてもなりやすいということを実証することができた。したがって、この研究から得られた結果は、脳細胞における胎盤タンパク質の遺伝子導入による強制発現の条件と関連する人工的実験条件に基づく結果であるように思われる。人工的な条件から推論されるこれらの結果とは異なり、我々は、ＭＳ病理学それ自体ではなく、成人神経系(adult nervous system (NS))の内在性修復能力に作用する有害なメカニズムを明らかにした。そのメカニズムは、オリゴデンドロサイトの免疫介在性損失、および、軸索損傷を伴ったミエリン鞘の免疫介在性損失を顕著な特徴とする。実際、ＮＳ炎症性病変に関連する免疫細胞に対するＥｎｖ介在性効果については、現在多数の文献に記載されている７、１０、２３-２５。しかし、ＯＰＣｓによるＭＳプラークの再エミリン
化遮断への介入を伴った、ＨＥＲＶ−Ｗ  Ｅｎｖのグリア細胞に対するそのような直接的病原性は、我々以前の研究では誰も明らかにしていなかった。活性ＭＳプラークにおいて、またはより低い活性の病変の周縁において、広範囲なＥｎｖタンパク質発現を示すＭＳ脳免疫組織学に関連する今回の結果は、ＭＳ病変におけるＯＰＣによる再エミリン化に係る公知の欠陥に対して果たすこのような役割を裏付けている。
【００４３】
［実施例２： ＨＥＲＶ−Ｗファミリーエンベロープタンパク質によって誘導される再
ミエリン化遮断の抗Ｅｎｖ特異的抗体を用いた効率的治療］
ＨＥＲＶ−Ｗファミリーエンベロープ由来のエンベロープタンパク質（特に多発性硬化症関連レトロウイルスサブタイプ由来のＥｎｖであるＭＳＲＶ−Ｅｎｖ）は、ミエリン化しないＯＰＣがミエリンを生成する成熟したオリゴデンドロサイトに分化する能力（これは再ミエリン化プロセスにおいて非常に重要なステップとして現れる）の有力な抑制因子である。我々は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖタンパク質が、オリゴデンドロサイト分化を表す、異なる２種類のマーカーの発現に対して与える影響を調べた。
【００４４】
―  ＣＮＰａｓｅ（2',3'-Cyclic nucleotide-3'-phosphohydrolase（２’，３’−環
状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ））は、ミエリンタンパク質全体の４％に相当し、軸索中の緻密化していないオリゴデンドログリア髄鞘の細胞質に存在する。ＣＮＰａｓｅは、成長中のオリゴデンドロサイトによって合成される、ミエリンに特異的なタンパク質のなかで、最も以前から知られているタンパク質である。
【００４５】
―  ＭＢＰ（Myelin basic protein（ミエリン塩基性タンパク質））はミエリンタンパク質の３０％程度を構成しており、中枢神経系および末梢神経系におけるミエリンの緻密化に主要な役割を果たす。ＭＢＰは、in vivoとin vitroとの両方においてＣＮＰａｓｅ
の後に続いて現れ、成熟したオリゴデンドロサイトを表す特異的マーカーである。今回の研究の目的は、ＧＮｂＡＣ１などの特異的抗エンベロープ抗体（組換えヒト化抗Ｅｎｖ  ｌｇＧ４単クローン抗体）が、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘導されるＯＰＣの成熟阻害を遮断し得るかどうかを判定することであった。実際、ＧＮｂＡＣ１のこのような効果は、「細胞の再ミエリン化遮断に抗う」という当該抗体の特性を示すものと思われる。この仮説を検証するために、初代培養のヒトＯＰＣを、ＧＮｂＡＣ１と共にまたはＧＮｂＡＣ１なしで、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ組換えタンパク質を培養面にコーティングすることによって、または当該タンパク質を培地に添加することによって、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖと共にインキュベートした。早期成熟マーカーとしてのＣＮＰａｓｅの発現と、後期成熟マーカーとしてのＭＢＰの発現とを、それぞれ１日あるいは３日の刺激の後、免疫細胞化学的に評価した。
【００４６】
本実施例では、 ＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質の細胞内
ドメイン、経膜ドメイン、および細胞外ドメインを含有する完全長の組み換えＭＳＲＶ−Ｅｎｖタンパク質のことを指す。
【００４７】
ここに示す結果によると、ヒトＯＰＣは自身の原形質膜にＴＬＲ４を特異的に発現することが分かる。また、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ組換えタンパク質が、ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の数とＭＢＰ陽性細胞の数とを、特異的にかつ有意に減少させることを証明している。これらの観測結果は、ヒトとラットのＯＰＣに対する実施例１の観測結果と合致する。また、我々の実験は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖによって誘導されるヒトＯＰＣの成熟阻害（遮断）がＧＮｂＡＣ１を使用した治療によって完全に逆転されることを初めて示しており、これは、ＧＮｂＡＣ１の、従来では想到し得ない新規な治療上の特性を証明している。したがって、これは進行性の多発性硬化症の治療法に関するさらなる示唆を与えるものである。
【００４８】
２．１  物質および方法
２．１．１  物質
【００４９】
【表２】
2018065814.tif 000005
【００５０】
【表３】
2018065814.tif 000006
【００５１】
【表４】
2018065814.tif 000007
【００５２】
２．１．２．プロトコル
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ、 ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液、およびＧＮｂＡＣ１を用いたヒトＯＰＣのインキュベーション
完全長の組み換えＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（５４８  ａａ；  ６１，４４  ＫＤａ）（バッチ１１０７１９−１）はPX’Therapeuticsによって生成・浄化された。初期濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ（９，７６μΜ）であった。ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ−ＨＣＩ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、１．５％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）はPX’Therapeuticsによって提供された。この溶液を陰性対照として使用した。ＧＮｂＡＣ１（バッチＴ９６／ｂＡＣ１／Ｂ１；ＧＭＰ生産）はPolymun Scientific（Vienna, Austria）によって生成・浄化された。初期濃度は１０ｍｇ／ｍｌ（６８，０３μΜ）であ
った。
【００５３】
ヒトＯＰＣは、細胞接種前に溶液を細胞培養皿の表面にコーティングすることによって、または細胞接種後に溶液を細胞培地に添加することによって、異なる治療用組成物により刺激した。いずれの場合も、Ｌａｂｔｅｋ  ８ウェルチャンバースライド（Nunc製）を、３７℃で一晩、ポリ−Ｌ−リジン（Sigma-Aldrich製）で予めコーティングしておいた。
【００５４】
Ｌａｂｔｅｋ  ８ウェルチャンバースライドのコーティング
上記異なる治療用組成物を無菌ラミナーフローフード（Fischer Bioblock, France）内においてＰＢＳで希釈し、Ｌａｂｔｅｋ ８ウェルチャンバ―スライド（Nunc製；１ウェル２５０μｌ）を以下のようにコーティングした。
【００５５】
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ：（１μｇ／ｍｌ）３７℃、２時間コーティング
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液：（ＭＳＲＶ−Ｅｎｖと同希釈度）３７℃、２時間コーティング
― ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ａ１：ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）とＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）の混合物で３７℃、２時間コーティング
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ａ２：ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）とＧＮｂＡＣ１（２９，４μｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）の混合物で３７℃、２時間コーティング
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ｂ１：ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間のコーティング、ＰＢＳで洗浄、その後ＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）で３７℃、１時間コーティング
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ｂ２：ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間のコーティング、ＰＢＳで洗浄、その後ＧＮｂＡＣ１（２９，４μｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）で３７℃、１時間コーティング
―  ＧＮｂＡＣ１ Ａ１単独：ＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）で３７℃、２時間コーティング
―  ＧＮｂＡＣ１ Ａ２単独：ＧＮｂＡＣ１（２９，４μｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）で３７℃、２時間コーティング
―  ＧＮｂＡＣ１ Ｂ１単独：ＰＢＳで３７℃、２時間、その後ＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）で３７℃、１時間コーティング
―  ＧＮｂＡＣ１ Ｂ２単独：ＰＢＳで３７℃、２時間、その後ＧＮｂＡＣ１（２９，４μｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）で３７℃、１時間のコーティング
―  ＢＳＡ：（１μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間コーティング
―  ＢＳＡ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ａ１：ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）とＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）の混合物で３７℃、２時間コーティング
―  ＢＳＡ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ａ２：ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）とＧＮｂＡＣ１（２９，４μｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）の混合物で３７℃、２時間コーティング
―  ＢＳＡ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ｂ１：ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間のコーティング、ＰＢＳで洗浄、その後ＧＮｂＡＣ１（７，３５μｇ／ｍｌ＝５０ｎＭ）で３７℃、１時間コーティング
―  ＢＳＡ ＋ ＧＮｂＡＣ１ Ｂ２：ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間のコーティング、ＰＢＳで洗浄、その後ＧＮｂＡＣ１（２９，４ｇ／ｍｌ＝２００ｎＭ）で３７℃、１時間コーティング
ヒトオリゴデンドロサイト前駆体細胞の培養
ＯＰＣ（ヒトの脳組織から単離されたもの）をScienCell Research Laboratoriesから（3H Biomedical, Swedenを介して）購入した。各バイアルには、１ｍｌ、１×１０６個の細胞が収められている。製造業者（ScienCell）の推奨に従って、ＯＰＣ成長溶液（OPC growth solution (OPCGS)）とペニシリン／ストレプトマイシン（penicillin/streptomycin (P/S)）とをＯＰＣＭに添加することにより、完全なＯＰＣ培地（ＯＰＣＭ (OPC culture medium)）を再構成した。
【００５６】
ヒトＯＰＣが収められたバイアルを３７℃で水浴させ、内容物が完全に溶けるまで回転させながら緩やかに撹拌した。細胞を、１ｍｌのギルソン（Gilson）ピペットで穏やかに再懸濁させた。その後、当該細胞を完全なＯＰＣＭで希釈し、無菌ラミナーフローフード（Fischer Bioblock, France製）内で、予めポリ−Ｌ−リジン（０，０１％、Sigma製）と上記治療用組成物と（あるいは治療用組成物なし）（３．２．１．１参照）でコーティングされたＬａｂＴｅｋ８ウェル培養容器に接種した（細胞７０００個／ｃｍ2＝１ウェルにつき細胞１００００個）。培養物は、３７℃、５％ＣＯ２で、のちの免疫細胞化学実験が行われるまでインキュベートした。翌日、７２時間処理が施された培養物中の残留ＤＭＳＯと、くっついていない細胞とを取り除く目的で、増殖培地を取り換えた。
【００５７】
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖを含む培地を用いたインキュベーション
Ｌａｂｔｅｋ８ウェル培養容器において３時間ヒトＯＰＣを前培養（３．２．１．２参照）したのち、下記溶液を添加して、Ｌａｂｔｅｋ８ウェル（１ウェル２５０μｌ）において細胞を３７℃で２４時間または７２時間インキュベートした。
【００５８】
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液、陰性対照として使用、完全な細胞培地に添加
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖを３ｎＭ（０，１８４μｇ／ｍｌ）完全な細胞培地に添加
―  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（３ｎＭ）＋ ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ；２９，４μｇ／ｍｌ）混合物を完全な細胞培地に添加
―  ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）を単独で完全な細胞培地に添加
in vitroでＯＰＣに発現するＴＬＲ４とミエリン形成マーカー
２４時間または７２時間のインキュベーションの後、細胞培地を取り除いて、上述の治療用組成物（３．２．１参照）によって刺激したヒトＯＰＣを、パラホルムアルデヒド溶液（ＰＢＳ中に４％のＰＦＡ、１チャンバ―につき２５０μｌ）に室温で１時間固定した。その後、それらをＰＢＳ（１チャンバ―につき３×２５０μｌ）で３回洗浄した。ＴｒｉｔｏｎＸ１００を０，１％含有するＰＢＳ溶液（１チャンバ―につき２５０μｌ）にウシ胎児血清（fetal bovine serum (FBS)）を１０％含有させたものを用いて、３７℃で１時間インキュベーションすることにより、非特異的結合部位を飽和させた。ＴＬＲ４を染色する場合には、ＰＢＳ（１チャンバ―につき２５０μｌ）のみにＦＢＳを１０％含有させたものを用いて細胞をインキュベートした。飽和後、一次抗体溶液を用いてＯＰＣ培養物を４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ溶液（１チャンバ―につき２００μｌ）にＦＢＳを１０％含有させたもので以下のように希釈した。
【００５９】
―  １／１０００のマウス抗ＴＬＲ４抗体（２４時間および７２時間の培養後）
―  １／２００のマウス抗ＣＮＰａｓｅ抗体（２４時間の刺激後）
―  １／１００のマウス抗ＭＢＰ抗体（７２時間の刺激後）
細胞をＰＢＳで３回洗浄し（１チャンバ―につき３×２５０μｌ）、二次抗体溶液を用いて３７℃で１時間、以下のようにインキュベートした（１チャンバ―につき２５０μｌ）。
【００６０】
―  ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体を１／２００
室温でＰＢＳで３回洗浄（１チャンバ―につき３×３００μｌ）した後、プラスチックチャンバ―をスライドから取り外した。その後、当該スライドを、ＤＡＰＩを含む封入剤Vectastain（Ｒ）（Vectashield）で封入した。Axioscope顕微鏡（Zeiss製）を用いた蛍光顕微鏡検査により、染色を視覚化した。
【００６１】
データ分析
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ−Ｔを２４時間刺激（または管理）した後、任意に選択した１チャンバ―につき１０視野内のＣＮＰａｓｅ免疫反応性細胞を数えた。ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率を以下のように計算した。
【００６２】
【数１】
2018065814.tif 000008
【００６３】
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ−Ｔを７２時間刺激（または管理）した後、任意に選択した１チャンバ―につき１０視野内のＭＢＰ免疫反応性細胞を数えた。ＭＢＰ陽性細胞の百分率を以下のように計算した。
【００６４】
【数２】
2018065814.tif 000009
【００６５】
データは、ＣＮＰａｓｅ陽性細胞またはＭＢＰ陽性細胞の百分率の平均値±ＳＥＭとして示した。グラフィックはWindows用GraphPadソフトウェア5.00版（San Diego California USA）を用いて作成した。ノン・パラメトリック統計的検定をSigma Stat（Chicago, IL, USA）を用いて実施した。
【００６６】
実験を独立して３系列行う過程で以下の結果を収集した。実験毎に、凍結状態の商用ＯＰＣ（ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０１、ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０２、およびＯＰＣ  ＩＣＣ  ０３）が収められた新しいバイアルを用いた。
【００６７】
２．２  結果
２．２．１  in vitroにおいてヒトＯＰＣにＴＬＲ４受容体が発現
ＴＬＲ４の発現を免疫蛍光顕微鏡検査によって評価した。いかなる界面活性剤も使用せずに飽和ステップを実施することによって、細胞の表面上においてのみＴＬＲ４を検出することができる。この実験によって、初代培養の２４時間後および７２時間後に、ヒトＯＰＣの細胞表面にＭＳＲＶ−Ｅｎｖの標的受容体が存在することが確認された（図示せず）。
【００６８】
２．２．２  in vitroにおいてヒトＯＰＣにＣＮＰａｓｅおよびＭＢＰが発現
in vitroでのヒトＯＰＣの形態を明視野顕微鏡観察によって視覚化した。ＯＰＣは一つの細胞体と通常二つの細胞拡張部とを有していた。ＣＮＰａｓｅおよびＭＢＰの発現が、それぞれ培養の２４時間後と７２時間後に免疫蛍光顕微鏡検査によって確認された（図示せず）。
【００６９】
２．２．３  ＧＮｂＡＣ１と共に用いた場合、あるいはＧＮｂＡＣ１と共に用いなかった場合のＭＳＲＶ  ＥＮＶがヒトＯＰＣ分化に与える影響
コーティングされたＭＳＲＶ−Ｅｎｖが初代培養のヒトＯＰＣ（ＯＰＣ ＩＣＣ  ０１
）における成熟マーカーの発現に与える影響
この第１セットの実験（ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０１）の目的は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖによるｌａｂｔｅｋチャンバースライドのプレコーティングや、ＣＮＰａｓｅおよびＭＢＰの免疫染色プロトコルを設定することに加えて、ヒトＯＰＣの初代培養条件を設定することであった。
【００７０】
ヒトＯＰＣの接種前に、Ｌａｂｔｅｋ培養容器を１ｇ／ｍｌのＭＳＲＶ−Ｅｎｖでコーティングした。陰性対照（緩衝液）として、当該培養容器をＭＳＲＶ−Ｅｎｖ緩衝液の
みを用いて同じ条件でインキュベートした。
【００７１】
ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率は、対照条件（緩衝液）における８５±４％から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋで２４時間刺激したヒトＯＰＣにおける６９±６％へと、有意に減少する（＊  ｐ＜０，０５；ｔ−ｔｅｓｔ）（図９Ａ）。
【００７２】
７２時間の培養後、ＭＢＰ陽性細胞の百分率は、対照条件（緩衝液）における７４±７％から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（＋Ｅｎｖ−Ｔ）でプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける２５±３％へと、有意に減少する（＊  ｐ＜０，００１  マン・ホイットニーの順位和検定）（図９Ｂ）。これらの結果から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、in vitroにおいてヒトＯＰＣがミエリン形成細胞へ成熟するのを阻害することが分かる。
【００７３】
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０２）により誘導されるＯＰＣの成熟阻害に与えるＧＮｂＡＣ１の影響
この第２セットの実験（ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０２）は、ＭＳＲＶ−ＥｎｖがヒトＯＰＣ分化に与える影響を確認することと、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖを細胞培地に直接添加した場合でも、当該ＭＳＲＶ−ＥｎｖがヒトＯＰＣの分化を阻害し得るかどうかを確認することと、を目的に行った。また、ＧＮｂＡＣ１が、このモデルにおいてＭＳＲＶ−Ｅｎｖの影響を阻害し得るかどうかも試験した。
【００７４】
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋ内でヒトＯＰＣを刺激した場合、ＧＮｂＡＣ１治療用組成物を二つの異なるプロトコルで評価した。一つ目のプロトコルでは、ｌａｂｔｅｋ培養スライドを、ＯＰＣ接種前に、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍＬ）とＧＮｂＡＣ１（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）との混合物を用いてプレインキュベートした（条件ＧＮｂＡＣ１−Ａ）。二つ目のプロトコルは、ＯＰＣ接種前に、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍＬ）でコーティングした後に、続いてＧＮｂＡＣ１（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）でコーティングをする（条件ＧＮｂＡＣ１−Ｂ）というものであった。
【００７５】
ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１がヒトＯＰＣにおけるＣＮＰａｓｅ発現に与える影響
２４時間の刺激後、ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率が、対照条件（緩衝液）における７５±２％から、１μｇ／ｍｌのＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける５５±２％へと、有意に減少することが観察される（＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）。また、１μｇ／ｍｌのＢＳＡでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける刺激は、ＣＮＰａｓｅ発現（７１±２％）に影響を与えない。このことから、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖを用いた場合に観察された影響は、対照タンパク質を用いた場合にはみられなかったので、特異的であることが分かる（図１０Ａ）。
【００７６】
ＧＮｂＡＣ１は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおいて誘導されるＣＮＰａｓｅ陽性細胞の減少を有意に阻害する（図１０Ａ）。ＧＮｂＡＣ１の影響は、５０ｎＭおよび２００ｎＭの場合にみられ、また、テストされた以下の二つの処理プロトコルにおいてみられる。すなわち、（ｉ）ＧＮｂＡＣ１−Ａ、５０ｎＭ（６９±４％）、２００ｎＭ（８０±２％）という条件と、（ｉｉ）ＧＮｂＡＣ１−Ｂ、５０ｎＭ（９６±３％）および２００ｎＭ（７６±４％）（Ψｐ＜０，００１、一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）という条件においてみられる。さらに、ＧＮｂＡＣ１の影響は濃度に依存するようである（図１０Ａ）。
【００７７】
さらなる対照実験を行ったところ、ＧＮｂＡＣ１単独（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）で、またはＧＮｂＡＣ１（５０ｎＭまたは２００ｎＭ）＋ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）の混合物でプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおいて２４時間刺激したヒトＯＰＣは、対照条件（緩衝液）（ｐ＞０，０５；一元配置分散分析）と比較して、ＣＮＰａｓｅ発現に影響を与えないことが分かった（図１０Ｂ）。これらの観察は、先に記述した二つのＧＮｂＡＣ１処理プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−Ａ  ５０ｎＭ、ならびにＧＮｂＡＣ１ Ａ  ２００ｎＭおよびＧＮｂＡＣ１−Ｂ  ５０ｎＭ）に従ってなされた。
【００７８】
この実験により証明されるのは、溶液中のＭＳＲＶ−Ｅｎｖが低濃度であったとしても、２４時間後のＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率の有意な減少を誘発することである。すなわち、対照条件（緩衝液）における７８±２％から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖグループにおける５７±２％へと有意に減少することである（＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）（図１１）。さらに、ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）を用いた治療は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖに誘導されるＣＮＰａｓｅ発現の低下に対して完全に拮抗する(７６±２％；Ψｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ。一元配置
分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）。興味深いのは、対照条件（緩衝液）と比較すると、２００ｎＭのＧＮｂＡＣ１単独（７４±２％）ではＣＮＰａｓｅの発現に影響を与えないことである（図１１）。
【００７９】
ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１がヒトＯＰＣにおけるＭＢＰ発現に与える影響
７２時間の刺激後、ＭＢＰ陽性細胞の百分率が、対照（緩衝液）における７６±２％から、１μｇ／ｍｌのＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける５７±１％へと、有意に減少することが観察される（＊＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）（図１２Ａ）。この実験では、ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）でプレコーティングしたｌａｂｔｅｋ内のＯＰＣ培養物は、対照（緩衝液）（６９±２％）とわずかに異なるＭＢＰ陽性細胞の百分率を示す。しかし、ＢＳＡの影響も、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖの影響とは有意に異なる（ｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）。従って、このＢＳＡの影響は、当該実験系列のみの単発的なものであり、他には影響を及ぼさないものであることを示している。なぜなら、それはその他の実験においても観察されていないし、あるいは、同じ系列の実験においてＣＮＰａｓｅを用いても観察されていないからである。
【００８０】
ＧＮｂＡＣ１は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖでプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおいて誘導されるＭＢＰ陽性細胞の減少を有意に阻害する（図１２Ａ）。ＧＮｂＡＣ１の影響は、５０ｎＭの場合に部分的にみられ、２００ｎＭの場合には完全な阻害が達成され、また、テストされた以下の治療プロトコルの双方においてみられる。すなわち、（ｉ）ＧＮｂＡＣ１−Ａを５０ｎＭ（６９±２％）および２００ｎＭ（７３±２％）で与える場合と、（ｉｉ）ＧＮｂＡＣ１−Ｂを５０ｎＭ（６８±２％）および２００ｎＭ（７４±２％）（Ψｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）を与える場合の両方においてみられる。さらに、ＧＮｂＡＣ１の影響は濃度に依存するようである（図１２Ａ）。
【００８１】
この実験は、ＭＢＰ陽性細胞の百分率が、対照条件（緩衝液）における７６±２％から、培地に添加されたＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（３ｎＭ）によって７２時間刺激された細胞における５５±２％へと、有意に減少することも証明する（＊ｐ＜０，００１  対  緩衝液。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）（図１２Ｂ）。さらに、ＧＮｂＡＣ１(ＧＮｂＡＣ１  ２００ｎＭ）用いた治療は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖによって誘導されるＭＢＰ発現の減少を完全に阻害する（７６±２％；Ψｐ＜０，００１  対  Ｅｎｖ−Ｔ。一元配置分散分析の後にフィッシャー最小有意差事後分析を実施）（図１２Ｂ）。
【００８２】
ＭＳＲＶ−Ｅｎｖに誘導されるＯＰＣの分化阻害に与えるＧＮｂＡＣ１の効果の確認
上記結果は、相当な量の収集データから導き出されたものであるが、この第３セットの実験（ＯＰＣ  ＩＣＣ  ０３）は、完全に独立した系列の実験によって、ＧＮｂＡＣ１の効果を完全複製することを目的に行われた。
【００８３】
ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１が、ヒトＯＰＣ培養物におけるＣＮＰａｓｅの発現およびＭＢＰの発現に与える影響
２４時間の刺激後、ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の百分率が、対照条件（緩衝液）における９０±１％から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）でプレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける７１±１％へと、有意に減少することが観察される（＊ｐ＜０，０５；クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にスチューデント・ニューマン・クールズ事後分析を実施）（図１３Ａ）。前述したように、テストされた二つのＧＮｂＡＣ１治療プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−Ａ：９０±２％とＧＮｂＡＣ１−Ｂ：９１±４％）においてＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘導されるＣＮＰａｓｅの発現阻害を完全に逆転する（Ψｐ＜０，０５  対  Ｅｎｖ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施）（図１３Ａ）。
【００８４】
７２時間の刺激後、ＭＢＰ陽性細胞の百分率が、対照条件（緩衝液）における７８±２％から、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ（１μｇ／ｍｌ）で７２時間プレコーティングしたｌａｂｔｅｋにおける５５±３％へと、有意に減少することが観察される（＊ｐ＜０，０５  対  緩衝液。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施）（図１３Ｂ）。前述したように、テストされた二つのＧＮｂＡＣ１治療プロトコル（ＧＮｂＡＣ１−Ａ：８０±２％とＧＮｂＡＣ１−Ｂ：７５±２％）においてＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘導されるＭＢＰの発現阻害を完全に逆転する（Ψｐ＜０，０５  対  Ｅｎｖ−Ｔ。クラスカル・ウォリスの順位による一元配置分散分析の後にダン事後分析を実施）（図１３Ｂ）。
【００８５】
実験ＯＰＣ ＩＣＣ ０２および実験ＯＰＣ ＩＣＣ ０３の蓄積データ
上記の異なる２系列の実験（ＯＰＣ ＩＣＣ ０２およびＯＰＣ ＩＣＣ ０３）で得られた結果を、同じ解析において蓄積した。したがって、図１４にグラフ化されたデータは、８〜１４回、ＣＮＰａｓｅについて行われた個別実験（図１４Ａ）およびＭＢＰについて行われた個別実験（図１４Ｂ）を示している。この分析により、ＭＳＲＶ−ＥｎｖおよびＧＮｂＡＣ１がヒトＯＰＣの分化に及ぼす効果には、高度な再現性と一貫性があることが分かる。
【００８６】
上記データの表現を規格化する目的で、対照条件（緩衝液）を基準として用い、１００％と見なした。要約すれば、これらの結果は、この系列の実験に使用したＭＳＲＶ−Ｅｎｖの濃度が、ＣＮＰａｓｅ陽性細胞の数を２４％抑制し（対照：１００±１％；Ｅｎｖ：７６±１％）、ＭＢＰ陽性細胞の数を２７％抑制する（対照：１００±２％；Ｅｎｖ：７３±２％）ことを示している。ＧＮｂＡＣ１（２００ｎＭ）は、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖは、ＣＮＰａｓｅの発現に及ぼす効果を完全に逆転させる（ＧＮｂＡＣ１−Ａ：１０２±１％；ＧＮｂＡＣ１−Ｂ：１０１±１％）（図１５Ａ）だけでなく、ＭＢＰの発現に及ぼす効果をも逆転させる（ＧＮｂＡＣ１−Ａ：１０１±２％；ＧＮｂＡＣ１−Ｂ９７±２％）（図１５Ｂ）。
【００８７】
２.３  結果分析
結果として、本実施例のデータから、ＭＳＲＶ  Ｅｎｖが、オリゴデンドロサイトの成熟を示す２種類の特異的マーカーの発現において、頑強性と高い再現性のある減少を誘導することが分かる。したがって、ＭＳＲＶ  Ｅｎｖは、ヒトのオリゴデンドロサイト前駆体がミエリン化細胞に分化することを阻害する。さらに、ここで明らかに証明できることは、ＧＮｂＡＣ１がこの有害なＭＳＲＶ  Ｅｎｖの効果を完全に逆転させ、このモデルにおいてＣＮＰａｓｅおよびＭＢＰの正常なレベルを回復するということである。これらの結果から、ＨＥＲＶ−Ｗ／ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより誘発されたＯＰＣの分化遮断が、ＧＮｂＡＣ１により治療されることが分かる。したがって、これらの結果は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質により誘導された脱髄性病変の治療剤としてのＧＮｂＡＣ１の革新的な効能を強力に裏付けるものである。このことは、特に、進行性の多発性硬化症にあてはまる。進行性の多発性硬化症においては、再ミエリン化が非常に重要であるが、実施例１で示したような持続的なＥｎｖ陽性細胞と分泌のせいで、再ミエリン化がＭＳ病変の周囲のＯＰＣからは発生しない。
【００８８】
［実施例３：ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)）およびＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質（envelope protein (Env)）により誘導された実験的アレルギー性脳脊髄炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE)）ネズミ科モデルに対する、ＧＮｂＡＣ１抗体、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＳＭＴ、ＤＭＦ、またはフマル酸ナトリウムの治療効果の研究］
３.Ａ  単一分子（単剤療法）と、ＯＰＣ遮断における抗Env抗体とEnv被誘導エフェクターを阻害する小分子との連携（併用療法）との比較
３.Ａ.１  材料
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Charles River社
ＭＯＧ  ３５−５５  EspiKem、Srl社（ポリペプチド製造業者）；参照番号  ＳＣ１２７２
ＧＮｂＡｃ１；バッチ  Ｔ９５０１１１−８  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４，ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に記載の相補性決定領域（complementary-determining regions (CDRs)）のそれぞれを有する抗ＭＳＲＶ／ＨＥＲＶ−Ｗヒト化ｌｇＧ４抗体
Ｌ−ＮＡＭＥ（ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステル(NG-Nitro-L-Arginine Methyl Ester)）、Sigma社；参照番号  Ｎ５７５１−５Ｇ、バッチ  ＢＣＢＦ４３７５Ｖ
ＳＭＴ（Ｓ）ヘミ硫酸メチルイソチオ尿素、Sigma社；参照番号  Ｍ８４４４５−１００Ｇ、バッチ  ＳＴＢＣ１００３Ｖ
フマル酸ジメチル（dimethyl fumarate (DMF)）、Sigma社；参照番号  ２４２９２６−１００Ｇ、バッチ  ２５０７ＶＢＣＢＨ
メトセルＭＣ、Ｓｉｇｍａ社；参照番号  ６４６０５−１００Ｇ、バッチ  ＢＣＢＤ９９８９Ｖ
ＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ）、Sigma社；参照番号  Ｆ５５０６−１０ＭＬ、バッチ  ０６１Ｍ８７２８
百日咳毒素（Pertussis Toxin (PTX)）、Calbiochem社；参照番号  ５１６５６１、バッチ  Ｄ００１２８８８１
リン酸緩衝食塩水（Phosphate buffer saline (PBS)、Lonza社；参照番号  ５１６５６１、バッチ  Ｄ００１２８８８１
Ｅｎｖ、PX’Therapeutics社；エンドトキシン・フリー（ＬＤＬ検定＜５ＵＩ／ｍｌ）および生理活性（Geneuro internal QC検定）で検証済の精製タンパク質の製造バッチ  ロータロッド装置（ＬＥ８２００）、Bioseb France社
３.Ａ.２  方法
Charles River Laboratoriesから、病原体を持たないＣ５７ＢＬ／６雌マウス（６〜８週齢）を購入し、免疫化の前に動物用設備にて１週間飼育した。免疫化の前日に、すべてのマウスの体重を測定し、ロータロッドテストを行って評価した。
【００８９】
ロータロッド
トレーニング期間：免疫化の９日および８日前。ホームケージの中に入れた状態のマウスを、待機室から実験室に移動した。マウスを１５分間実験室に慣れさせた。トレーニング期間中、各マウスを一定速度（４ｒｐｍ）のロータロッドに乗せた。落下しかけたマウスは、ロータロッドに戻った。ロータロッド上で安定していた場合には、マウスは１２０秒間走っていた。すべてのマウスをケージに戻してから、速度を１３ｒｐｍに上げ、マウスを再びロータロッドに１２０秒間乗せた。さらに、すべてのマウスをケージに戻してから、速度を１９ｒｐｍに上げ、マウスを再びロータロッドに１２０秒間乗せた。実験室の環境は、テストとテストの間、気温および光の強度を一定に保った。
【００９０】
テスト期間：各免疫化の前日に、マウスをホームケージに入れた状態で待機室から実験室に移動した。マウスを１５分間実験室に慣れさせた。その後、速度レベルを７〜４０ｒｐｍの１０段階に上げて、マウスを２回テストした。個々のマウスがロータロッドから落下するまでの時間（各速度レベルごとに２回のテスト）を６０秒まで記録した。このようにして、各マウスごとに、トレーニングとロータロッド装置上での能力を測定した。
【００９１】
上記ロータロッドテストの結果を、群ごとの個々のマウスのスコアの平均の推移(kinetics) として、棒線で示した標準誤差（ＳＥＭ）によって表す。当該の結果は、本実験の条件（１６〜２９ｒｐｍ）での神経運動障害の判別可能範囲内において、テスト日および速度ごとに表されている。
【００９２】
これらは、マウスの個体別に、ロータロッド上における相対的な（転落までの）時間利得または損失として、同一の速度でのテスト初日（Ｄ−７、当該群の疾患誘発の開始前）と比較して、各テスト日およびテスト速度ごとに計算した。この値は、「Ｘ日目におけるロータロッド上での時間」から「７日目、同一マウス、同一速度での時間」を除して計算される。図には、実験期間全体における各群の推移を、我々の条件下で発病したマウスと健康なマウスを区別できると検証できた場合の代表的な判別可能速度値（例えば、健康なマウスをすぐに落下させた高すぎる速度値、または、発病したマウスにゆっくりした動きを維持させた低すぎる速度値）について示す。
【００９３】
設定には、最初の体重と運動能力データとを参照として保存し、各マウスが自身の対照となるようにした。その後、グループごとの平均値と標準偏差とを計算した。各ケージには、各実験系列の前に提供された対応の情報に従って、異なる群のマウスを均等に収容した。
【００９４】
臨床評価
以下の基準に従って週に５日各マウスの体重を測定し、臨床的スコアを記録した：０＝「兆候なし」；１＝「尻尾の麻痺、または（片方または両方の）後脚の極度の反射、または片方の後脚の衰弱」；２＝「両方の後脚または両方の前脚の衰弱」；３＝「さらに、片方の麻痺または重大な欠損」；４＝「後脚または前脚の完全麻痺」；５＝「さらに反対側の脚の部分的麻痺または重大な欠損」；６＝「瀕死状態または死亡」。このモデルにおける脳病変および頸髄病変のより速い誘発を反映するために、これらの基準は標準基準から採用した。
【００９５】
実験の開始から終了まで、月曜、水曜、金曜の週３回、マウスの体重を測定した。
【００９６】
実施例３.Ａの実験系列においては、各群を以下のとおり定義した。
【００９７】
各グループは６匹のマウスからなり、すべてのマウスには、まず初日に首に、その後７日目および１４日目には背部側面に、１匹につきＭＯＧを２００μｇおよびＭＳＲＶ−ＥｎｖとＩＦＡとを合わせて６０μｇ注射した。
【００９８】
グループＡは、ＭＳＲＶ−Ｅｎｖにより実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発し、治療をまったく行わない陽性対照群とした。
【００９９】
グループＧおよびグループＨについては、ＧＮｂＡｃ１、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＳＭＴおよびＤＭＦを単独でか、または、ＧＮｂＡｃ１と併せて下記の投与量与えることにより、免疫化後１２日目に治療を開始した。１２日目の時点で、ＥＡＥの臨床的症状の進行がすでに観察されていた。ＧＮｂＡｃ１ヒト化抗体の投与は１度であったが、Ｌ−ＮＡＭＥまたはＳＭＴは研究が終了する２９日目まで４日ごとに投与した。グループＥおよびグループＨは、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）による治療を行う群であったため、各マウスの一日あたりの水の消費量を予め測定し、（我々の条件下では）各マウスは１日に約３.５ｍｌの水を飲むことが分かった。よって、この測定に基づき、マウス一匹当たり１ｇのＤＭＦと０.０８％のメトセルとを３.５ｍｌの飲用水に毎日添加した。
【０１００】
リンパ球の血液脳関門の遊走を促進するために、ＥＡＥプロトコルの常法に従い、すべての群について、各免疫原注射の後、同日に、１匹あたり３５０ｎｇの百日咳毒素（pertussis toxin (PTX)）を（腹腔内 (i.p.)）注射し、その２日後にこれを再現した。
【０１０１】
【表５】
2018065814.tif 000010
【０１０２】
３.Ａ.３  結果
臨床観察
上記のように、臨床的兆候を示すスコアと体重を定期的に評価した。実験期間を通してのＥＡＥスコアの推移を図１６〜図１８に示す。
【０１０３】
すべてのマウスについて、極度の反射、尻尾の麻痺、後脚と前脚の衰弱および部分的麻痺のようなＥＡＥ臨床スコアの定期的・継続的進展を記録できた。グループＡ（ＥＡＥ陽性対照）については、実験の終了時まで記録した。その他のグループＢ〜グループＨについては次のような治療を行った１２日目まで記録した。１２日目において、グループＢはＧＮｂＡｃ１ヒト化抗体で、グループＣ、グループＤおよびグループＥは抗遊離基を単剤で、グループＦ、グループＧおよびグループＨはＧＮｂＡｃ１と抗遊離基とを併用して、それぞれ治療した。
【０１０４】
治療後の観察
ＧＮｂＡｃ１により１回だけ治療したグループＢの臨床的兆候は２９日目までわずかに減少した。Ｌ−ＮＡＭＥ、ＳＭＴのみで治療したグループでは、ＥＡＥの進行の鈍化を伴う不規則な回復が観察された。なお、１６日目より後にはＳＭＴの注射を中断した。
【０１０５】
それぞれＧＮｂＡｃ１とＬ−ＮＡＭＥ、ＳＭＴ、ＤＭＦとの併用治療を行ったグループＦ、グループＧおよびグループＨでは、特にグループＧおよびグループＨによりいっそう著しい回復が見られた。この結果は、相乗効果によってＥＡＥ症状からの回復が著しく加速および増大することを示唆するものである。また、これらの物質による治療は、（別途テストした対照マウスも含め）いずれのマウス群にも何らの異常をも引き起こさなかったことも特筆すべきである。
【０１０６】
図１６、図１７および図１８に示す結果によれば、次のように要約できる。
【０１０７】
・治療を行わないマウス（グループＡ）が最も高い臨床スコア（疾患の最もひどい重篤化）が示すことは明白である。ＧＮｂＡＣ１のみで治療したマウス（グループＢ）は、（１２日目から開始した）ＧＮｂＡＣ１の注射後から回復する。
【０１０８】
・Ｌ−ＮＡＭＥまたはＳＭＴのみで治療したグループの回復スコアと推移は、グループＢのものより低かった。
【０１０９】
・ＤＭＦで治療したグループＥ、およびＧＮｂＡＣ１抗体（１投与２００μｇ）とＬ−ＮＡＭＥとの併用治療を受けたグループＦには、研究終了時に同等の回復が見られた。
【０１１０】
・ＧＮｂＡＣ１抗体とＳＭＴとの併用治療を受けたグループＧ、およびＧＮｂＡＣ１抗体とＤＭＦとの併用治療を受けたグループＨには、研究終了時に、他のすべての群に比べて著しく良い回復と、臨床的改善の著しく早期化された推移とが見られた。このことは、ＧＮｂＡＣ１とＳＭＴとの併用またはＧＮｂＡＣ１とＤＭＦとの併用による相乗効果が、治療結果を有意に向上させることを証明している。
【０１１１】
ロータロッドテスト
まず最初にはっきりさせておくべきだが、図１９中、「１ ｉｎｊ」および「２ ｉｎｊ」と示されたグループは、Ｅｎｖタンパク質とＭＯＧ抗原とを１回のみまたは２回注射した対照マウス群である。これに対し、その他のすべてのグループには、臨床的に顕著なＥＡＥを誘導するために必要な回数である３回のＥｎｖタンパク質とＭＯＧ抗原の注射を行った。「１ ｉｎｊ」および「２ ｉｎｊ」で示された群は、発病閾値よりも低く、臨床的疾患を誘導しないＥｎｖに曝されたマウスである。これらにより、急性かつ重症のＥＡＥ総体的症状と進展を惹起するように誘導された種々の治療法を用いてすべてのマウスをテストするには、この３回の注射パターンが必要であることが確認される。したがって、治療を受けたマウスにおいて観察される治療効果は、現在進行しつつある病状に対する治療の有効性に関連する。
【０１１２】
図１９に示す速度２３ｒｐｍにおけるロータロッド記録の結果から、次のことが分かる。
【０１１３】
・速度２３ｒｐｍでの運動で、マウスの主要感覚・運動機能障害を解明するのに十分な閾値に達した。治療を受けないグループＡの結果と推移が最も悪く、注射を１回のみまたは２回受けたマウス（「１ ｉｎｊ」または「２ ｉｎｊ」）は、大幅に緩和された症状と改善された進展を示す。治療を受けないグループＢの悪化（pejorative）および進行する臨床的欠乏により、３回のＥｎｖ注射が疾患とこれに対応するＮＳ病変を非常に活性化することが確認される。したがって、種々の治療を受けるその他のすべての群に、Ｅｎｖによる強力な疾患誘導を同様に行った。
【０１１４】
・ＥＡＥを発症し、２００μｇのＧＮｂＡＣ１注射を１回受けて治療されたグループＢは、実験期間の終了時には、Ｅｎｖへの曝露が低く疾患誘導されていない対照マウスと同様のスコアを回復した。  
・この条件下における最も注目すべき効果が、研究の終了時にはすべてのグループのなかで最も高いスコアを示し、推移曲線の驚くべき回復を示したと思われる、ＧＮｂＡＣ１抗体とＳＭＴとの併用治療を受けたグループＧに見られることは明白である。このことは、ＧＮｂＡＣ１とＳＭＴとの併用による相乗的効果により、治療効果が著しく向上することを証明している。
【０１１５】
・ＳＭＴのみで治療したグループＤの推移と結果も、より小幅ではあるが（実験期間の最終時点において）向上した。
【０１１６】
図２０に示す速度２６ｒｐｍにおけるロータロッド記録の結果から、次のことが分かる。
【０１１７】
・速度２６ｒｐｍでの運動により、この条件がマウスの主要感覚・運動機能障害を解明するための本実験において必要な閾値を上回ることが確認される。治療を受けないＡ群の結果と推移が最も悪く、注射を１回のみまたは２回受けたマウス（「１ ｉｎｊ」または「２ ｉｎｊ」）は、大幅に緩和された症状と改善された進展を示す（実験期間終了時の「１ ｉｎｊ」グループのスコアは大変良好である）。
【０１１８】
・ＥＡＥを発症し、２００μｇのＧＮｂＡＣ１注射を１回受けたグループＢは、実験期間の終了時には、グループＤ、グループＧ、グループＣ、グループＥおよび「２ ｉｎｊ」対照グループと同様のスコアを回復した。
【０１１９】
・この条件下における最も注目すべき効果が、研究の終了時にはすべての群のなかで最も高いスコアを示し、良好な推移曲線の回復を示したと思われる、ＧＮｂＡＣ１抗体とＬ−ＮＡＭＥとの併用治療を受けたＦ群に見られることは明白である。Ｌ−ＮＡＭＥのみで治療したグループＣの推移と結果も、より小幅ではあるが向上した。このことは、ＧＮｂＡＣ１とＬ−ＮＡＭＥとの併用による相乗的効果により、治療効果が有意に向上することを証明している。
【０１２０】
図２１に示す速度２９ｒｐｍにおけるロータロッド記録の結果から、次のことが分かる。
【０１２１】
・速度２９ｒｐｍでの運動により、この条件がやはりマウスの主要感覚・運動機能障害を解明するために必要な閾値を上回ることが確認される。治療を受けないグループＡの結果と推移が最も悪く、注射を１回のみまたは２回受けたマウス（「１ ｉｎｊ」または「
２ ｉｎｊ」）の症状は、大幅に緩和された症状と改善された進展を示し、研究終了時のスコアは同様に良好である。
【０１２２】
・ＥＡＥを発症し、２００μｇのＧＮｂＡＣ１注射を１回受けたグループＢは、実験期間の終了時には、疾患誘発されておらずＥｎｖへの曝露が低い対照マウスと同様のスコアを回復した。
【０１２３】
・この条件下における最も注目すべき効果が、（研究の終了時には）すべてのグループのなかで最も高いスコアを示し、良好な推移曲線の回復を示した、ＧＮｂＡＣ１抗体とＬ−ＮＡＭＥとの併用治療を受けたＦ群に見られることは明白である。Ｌ−ＮＡＭＥのみで治療したグループＣの推移と結果も、より小幅ではあるが向上した。
【０１２４】
・もう１つ全般的に注目すべき結果は、ＧＮｂＡＣ１のみで治療したグループＢのマウスに定期的な改善が見られることである。グループＢは、すべての条件（１６〜２９ｒｐｍでのテスト）において、治療を受けなかったマウス（グループＡ）に比して、常に非常に安定な及び／又は向上したスコアを示した。
【０１２５】
とはいえ、ＧＮｂＡｃ１の明らかな有効性は、Ｌ−ＮＡＭＥまたはＳＭＴとの併用により大いに強調されたことが分かった。ＧＮｂＡｃ１の有効性はまた、ＤＭＦとの併用によっても向上したが、推移は遅くなった。いずれにせよ、このことは、最適化した投与量とより長期間の治療によるよりいっそうの向上を除外するものではない。
【０１２６】
すなわち、テストのすべての条件（臨床スコアも含む）において、ＳＭＴまたはＬ−ＮＡＭＥまたはＤＭＦとＧＮｂＡＣ１との併用が、いずれかの治療用分子の単独使用に比して、臨床的機能的回復に大いに有利であった。小分子の単独投与の効果は低く持続時間がきわめて短いように見える一方、ＧＮｂＡＣ１の効果の持続時間は長く、研究終了時には、これらの小分子薬剤のいずれよりも高い回復をもたらす。つまり、ＧＮｂＡＣ１の有効性の持続時間は長い。
【０１２７】
併用により大幅に改善した推移と最終的回復規模、すなわち、これらの治療剤を併用して機能回復に対する相乗的かつ標的特異的効果を得ることの有利性がｉｎ  ｖｉｖｏで確認される。このことは、ヒトの疾患におけるより早期かつより強力な臨床効果を示唆している。
【０１２８】
３．Ｂ．  単剤療法として単体で投与された場合もしくは、抗ＮＯ剤との併用により投与された場合の、抗Ｅｎｖ抗体の２種類の投与量の治療効力に関する比較
３．Ｂ．１  物質および方法
全ての物質及び比較方法は、指定のない場合は実施例３Ａに記載した通りであった。
【０１２９】
【表６】
2018065814.tif 000011
【０１３０】
全てのマウスに対して合計三回、すなわちＤ０において首に、Ｄ７とＤ１４において背部側面に皮下注射が行われた。この時、グループＡのマウスは一匹当たり２００μｇのＭＯＧおよびＩＦＡのみでＥｎｖを含まない注射を受けたことにより、本系統においてＥＡＥを発症しない陰性の対照グループ（ｃｔｒｌ−）を形成した。本系統においてＥＡＥの治療を受けていない陽性の対照グループは、グループＢと表される（ｃｔｒｌ＋）。他のグループのマウスは、１匹あたり２００μｇのＭＯＧとＩＦＡ，および６０μｇのＭＳＲＶ−ＥＮＶとを注射され、上記の要約表に示された治療を受けた。治療はグループ毎に、免疫処置後の１２日目から行われている。
【０１３１】
グループＣ、ＥおよびＧはＪ１２において２００μｇのＧｎｂＡｃ１の投与を受け、グループＤ、ＦおよびＨはＪ１２において５００μｇのＧｎｂＡｃ１の投与を受け、グループＢはＧＮｂＡｃ１の緩衝液のみの投与を受けた。
【０１３２】
グループＥおよびＦはＪ１２、Ｊ１４、Ｊ１９、Ｊ２１、Ｊ２６およびＪ２８において、マウス１匹あたり２００ｍｇのＳＭＴを１週間に二回腹腔内注射された。
【０１３３】
ＤＭＦの投与を受けるグループＧおよびＨに関して、我々はマウス１匹毎の１日の水の消費量を予め測定し、（我々の条件下では）各マウスは１日当たり約３．５ｍｌの飲用水を消費したことを既に証明した。そこで、この測定値を基に、マウス１匹あたりの１回の投与量として、２ミリグラムのＤＭＦと０．０８パーセントのメトセルとが、毎日の３．５ミリリットルの飲用水に加えられた。
【０１３４】
各ロータロッド試験の速度毎に、Ｅｎｖによって誘導されたＥＡＥを発症しており、治療を受けていないマウス（ＥＡＥの治療を受けていない陽性の対照であるグループＢ）に対応する曲線が、モック対照（Ｅｎｖタンパク質を有しないＩＦＡにより希釈されたＭＯＧにより免疫を与えられた、グループＡ）に比べて著しい欠乏を示している場合に、結果は有効とされた。このような基準を満たさない場合の結果は常に「解釈不能」とされた。それは「ＥＡＥ陽性グループ対ＥＡＥ陰性グループ」から得られる曲線があまりにも相違しているので、対応する技術や実験における条件が品質管理条件を満たしていなかったからである。
【０１３５】
２０日目の後、生理食塩水に含まれた２０μｇのＭＳＲＶ−Ｅｎｖが全てのマウスに静脈注射され、これらのマウスにＭＳＲＶ−Ｅｎｖタンパク質により系統的な急性の曝露を生じさせた。そのときには、ＥＡＥ発症マウスに対するほとんどの治療により、臨床上の有意な向上（寛解のような傾向）が見られていた。この試験は、グループＢ、Ｄ、ＦおよびＨのマウスに対しては２１日目に行われ、グループＡ、Ｃ、ＥおよびＧのマウスに対しては２２日目に行われた。この試験は、異なったグループが急性のＥｎｖ抗原血症へどう応答するかを研究し、各種の治療の防御効率の最終的な違いを評価するために行われた。
【０１３６】
３．Ｂ．２  結果：
臨床観察
臨床兆候のスコアや体重は、既に述べたように定期的に評価された。全実験期間を通じたＥＡＥ臨床スコアの推移は、図２２、２３および２４に表される。最初に免疫原を注射した日の前日と比較した相対的な体重増を示す体重曲線は、図２５、２６および２７に示される。
【０１３７】
ロータロッドテスト
ロータッド試験の結果は、速度別に（１６、２６および２９ｒｐｍ）図２８、２９および３０に表される。
【０１３８】
この実験系列は、単剤療法として治療用ＧＮｂＡＣ１抗体を中間的な量（２００μｇ）だけ投与した場合と、大量（５００μｇ）に投与した場合とにおける影響を対象としたものであり、同様の比較をＳＭＴおよびＤＭＦを併用した場合にも行った。
【０１３９】
全実験期間を通じた臨床スコア曲線の全体的な比較は有効とされている。それは（ｉ）治療されていない、Ｅｎｖによって誘導されたＥＡＥ（グループＢ）は一番悪化する (pejorative) 進展を示しており、（ｉｉ）ＥＡＥを発症しない、モック免疫状態となった対照（グループＡ）は、２０日目にＥｎｖの静脈注射された以前の期間を通じて、検出できる臨床兆候はないからである。
【０１４０】
２０日目の静脈注射まで、治療を受けたすべてのグループは、Ｅｎｖに誘導されたＥＡＥを持つ、治療されていないグループに比べて著しくかつ際立って異なっていた。２０日目において、全実験期間を通じて異なる疾病推移を有する、治療を受けたグループは、平均値が０．５未満の比較可能なスコアを示した。この数値は、治療を受けたすべてのグループにおける寛解期を示している。これは、全ての抗体の投与量の効能と、ＤＭＦもしくはＳＭＴとのテストされた組み合わせの効能とを確証していた。その後、２０日目の静脈注射によるＥｎｖタンパク質への曝露の結果、自然発症疾病が新たにかつ重篤に再発した場合の初期段階に見られるような、Ｅｎｖ発現のピークと、Ｅｎｖの血液への流出とが模擬的に生じた。図２２、２３および２４に示されるように、それぞれ異なる製品や投与量のもつ治療効力の大きな差異が解明された。
【０１４１】
１）ＧＮｂＡＣ１は投与量５００μｇ（グループＤ）において、このＥｎｖ抗原血症のピークに対して耐性を与えることに大変な効能をもたらすことが分かった。しかし投与量２００μｇ（グループＣ）では、一過性の臨床的障害がみられた。
【０１４２】
２）ＳＭＴと組み合わせた場合は、ＧＮｂＡＣ１両投与量（グループＥおよびＦ）において、有意でない臨床スコアの変動がみられた。このようにして、ＳＭＴは、最少のＧＮｂＡＣ１投与量（２００μｇ）で抗体のみで治療を受けたマウス（グループＣ）に比べ、同一最少投与量で治療されたマウスのＩＶ  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ曝露に対する耐性の増加をもたらした。
【０１４３】
３）ＤＭＦで治療を受けたマウスは、比較的高いＧＮｂＡＣ１投与量で治療を受けた場合（グループＨ）には、この抗原血症のピークに対する臨床的耐性を示したが、比較的低い投与量（グループＧ）では、臨床的な障害を防止できなかった。よってＤＭＦは、最少のＧＮｂＡＣ１投与量（２００μｇ）で治療されたマウスのＩＶ  ＭＳＲＶ−Ｅｎｖへの曝露に対しては耐性の増加をもたらさなかった。ＤＭＦと比較的高いＧＮｂＡＣ１投与量（グループＨの５００μｇ）とで治療を受けたマウスは、同投与量のＧＮｂＡＣ１のみで治療を受けたマウス（グループＤ）と同様の耐性を有していた。
【０１４４】
４）驚くべきことに、全実験期間を通じて体重増を示す曲線は、５００μｇのＧＮｂＡＣ１で治療を受けたグループＤが、最良のエンドポイントを有することを示している。
【０１４５】
５）ＧＮｂＡＣ１を２００μｇ与えた場合（グループＣ）、もしくはＤＭＦおよび比較的高い投与量のＧＮｂＡＣ１のみを与えた場合（グループＨ）、エンドポイントはモック対照と同等であった。
【０１４６】
これにより、臨床スコアの推移によって示される種々の治療の相対的な効能以上に以下のことが分かった：
−  単体で比較的多量に投与されたＧＮｂＡＣ１抗体（５００μｇ）が最良の臨床効率を示した。また、体重増の推移によって明らかとなったように、これはマウスの健康全般において好影響を与えた。
【０１４７】
−  比較的少投与量（２００μｇ）のＧＮｂＡＣ１と併用すると、ＳＭＴは、治療に対して著しく改善された効率をもたらし、最終ＭＳＲＶ−Ｅｎｖ  ＩＶ曝露に対しても完璧な耐性を示した。
【０１４８】
これにより、ＧＮｂＡＣ１が最も強力な治療薬であり、比較的高い投与量（５００μｇ）では最良の結果をもたらすが、比較的低い投与量（２００μｇ）でも、ＳＭＴとの組み合わせにより、その効能は大きく強化されることがわかる。ＳＭＴは、研究の最後の静脈注射により生成されるＥｎｖ抗原血症のピークの後に、症状が重篤化することを効果的に防止したからである。
【０１４９】
さらに、これらの結果は、比較的多量のＧＮｂＡＣ１投与が、単体でもＤＭＦの現在の投与量と組み合わせても、（体重増曲線に従えば）健康全般に対して治療効率の著しい増大をもたらすであろうことを示唆している。
【０１５０】
それにもかかわらず、ＳＭＴもしくはＤＭＦと、比較的多量に投与されたＧＮｂＡＣ１との組み合わせにより最終的に得られる相乗効果（があるとしてもそれ）は不明である。なぜなら、それはその抗体単体でも既に、ＥＡＥマウスの疾患誘導や疾患活性の現状に対する治療効率が最大化されるからである。
【０１５１】
またそれとともに、ロータロッド分析によれば、全ての関連速度（図２８Ａ、２９Ａおよび３０Ａ）において、Ｅｎｖ誘導ＥＡＥを発症し、治療を受けたマウスの神経障害の改善に際して、比較的多量に投与されるＧＮｂＡＣ１（１匹あたり５００μｇ）が（単体で与えられた時）とびぬけてもっとも効果的な製品であることであることが客観的に確かめられる。
【０１５２】
ロータロッドテストはさらに、ＳＭＴとＧＮｂＡＣ１との相乗効果も確証している一方で、ＳＭＴと併用して比較的少量投与されたＧＮｂＡＣ１で治療を受けたマウスに神経の改善がみられ、２６および２９ｒｐｍ（図２９Ｂおよび３０Ｂ）において著しい神経運動の改善が見られることも示している。１６ｒｐｍ（図２８Ｂ）においては、低速では、全実験期間を通じて、この臨床効果を証拠だてるのに十分な判別可能な効能を実現することができなかったようである。
【０１５３】
最後に、ロータロッドの結果によれば、ＤＭＦを投与された、Ｅｎｖ誘導ＥＡＥ発症マウスは、両ＧＮｂＡＣ１投与量で改善を示しているが、これは２９ｒｐｍ  （図３０Ｃ）のみにおいて明らかに顕著である。
【０１５４】
したがって、マウスの神経学的能力を評価する、この客観的かつ自動化された試験の結果を考慮すると、ＧＮｂＡＣ１は、実施例３．Ｂ．に示すように、目下のところ単剤療法ベースで投与された際には、堅固な治療薬であることが明らかであろう。ＳＭＴと組み合わせて比較的少量投与されるＧＮｂＡＣ１で見られるように、抗ＮＯ分子との相乗効果も、明白な証拠として示されており、強力な治療効果の増大を示している。  この効果はＧＮｂＡＣ１の種々の投与量で存在するに相違ないが、５００μｇのＧＮｂＡＣ１ですでに最大の効果を上げている現在の状況では不明かもしれない。
【０１５５】
３．Ｃ．  抗Ｅｎｖ抗体もしくはフマル酸ナトリウム単体（単剤療法）と、抗Ｅｎｖ抗体とフマル酸ナトリウムの組み合わせ（併用療法）との比較
３．Ｃ．１  物質および方法
物質
【０１５６】
【表７】
2018065814.tif 000012
【０１５７】
実験グループ
【０１５８】
【表８】
2018065814.tif 000013
【０１５９】
３．Ｃ．２  結果：
臨床観察
臨床兆候のスコアや体重は、既に述べたように定期的に評価された。全実験期間を通じたＥＡＥスコア推移は、図３１に表される。
【０１６０】
グループＡは、ＩＦＡ、Ｅｎｖタンパク質を含まないＭＯＧを注射され、かつ希釈剤緩衝液に存する抗体をプラシーボ注射された、陰性の対照グループであり、この実験期間中には著しい臨床症状は決して示さなかった。
【０１６１】
ＥＡＥ臨床スコアの展開は、１２日目まで、グループに分けて記録され得たが、これらのグループは１２日目にＧＮｂＡｄ１ヒト化された抗体で治療されたグループ（グループＣ）、もしくはフマル酸ナトリウム、ＤＭＦに関連した抗一酸化窒素遊離基（抗一酸化窒素）のみで治療されたグループＤ、もしくはこれと同時にＧＮｂＡｃ１でも治療されたグループＥである。
【０１６２】
ここで興味深いことに、多量のＧＮｂＡＣ１抗体を投与されたグループ（ＣおよびＥ）のみが、研究の終了時に臨床スコア曲線の有意な復帰と、著しく向上したエンドポイントとを示していた。フマル酸ナトリウムで治療されたグループＤは、効果のないアイソタイプ対照抗体（曲線上のエラーバーと重なる）で治療をされたグループＢに比べて、有意な臨床上の向上を見せなかっただけであった。ＥＡＥ臨床スコアの定期的・持続的展開は、アイソタイプ対照抗体で治療され、Ｅｎｖタンパク質に特異性を有しないグループＢ（Ｅｎｖによって誘導されたＥＡＥ）の実験の終了まで、全てのマウスに関して記録され得た。これが示しているのは、ＧＮｂＡＣ１に見られる治療上の効果はこの特定の抗体に固有のもので、ヒト化された抗体を同じアイソタイプで注射するかとは関連がない。例えば同じエピトープをターゲットとしない。
【０１６３】
最後の例は以下を示している：
−  Ｅｎｖタンパク質を注射されなかった対照グループＡは、抗体注射のモック（抗体の希釈剤）と同様に、Ｅｎｖによって誘導されたＥＡＥ（ＩＦＡおよびＭＯＧ）のモックに必要な、他の全ての成分を注射されたにも拘わらず、臨床兆候の見られない健康な対照として振る舞った。水溶性のフマル酸ナトリウムのモックな送達は通常の飲用水によって暗黙的に行われる。
【０１６４】
−  臨床スコアが最も上昇した（病気の進行が最悪だった）のは、無関係のアイソタイプ対照抗体（グループＢ）で治療を受けたマウスであることは明らかである。このように、Ｅｎｖタンパク質の存在下での、このモックアイソタイプ抗体注射は、典型的なＥＡＥ進展を見せた陽性ＥＡＥ対照を生じるとわかった。
【０１６５】
−  フマル酸ナトリウムで治療をされたグループＤは、効果のない対照抗体で治療をされたグループＢと同様に、研究の終了時に悪い結果となっただけであった。
【０１６６】
−  投与量の多いＧＮｂＡＣ１抗体を単体、もしくはフマル酸ナトリウムとの併用で治療を受けたグループＣおよびＥは、研究の終了時に同等の、そして著しく良好な回復をみせた。臨床的な改善は、治療が始まった１５日目から見られた。
【０１６７】
ここで、フマル酸ナトリウムは単体では効果はなく、グループＣおよびＥの曲線推移は同等とみられるので、これらの２グループに見られる臨床的効果は、フマル酸ナトリウム単体は効果がない一方で、ＧＮｂＡＣ１のみで十分にあらわれるに相違ない。
【０１６８】
３．Ｄ  実験３の総合的な結果の分析
結論として、ＧＮｂＡｃ１のような抗Ｅｎｖ特異性抗体や、ＤＭＦ、ＳＭＴ、もしくはＬ−Ｎａｍｅのような抗一酸化窒素遊離基（抗一酸化窒素）化合物での治療は、単体もしくは併用で有益である。それは、特に試験管内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＭＳＲＶ−ＥｎｖなどのＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質により誘導された再ミエリン化潜在活性の遮断を治療し予防するからである。
【０１６９】
現在の例で単剤療法として単体で与えられた時、ＧＮｂＡｃ１の多量の投与（体重約２０〜２５グラムのマウス１匹あたり５００μｇ）は、少量の投与（２００μｇ）に比べて特段の効率がみられた。
【０１７０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018065814.tif 000028
【図１６】
2018065814.tif 000029
【図１７】
2018065814.tif 000030
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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