(57)【要約】      （修正有）【課題】血清アルブミンに特異的に結合し、それによってインビボの半減期を延長する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）の提供。【解決手段】本発明のＦａｂは、ＣＨ１ドメインおよびＣκＬドメインにおける鎖間ジスルフィド結合の原因であるシステイン残基を有しない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アルブミンに対する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）；および
（ｂ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）
を含み、
Ｆａｂは、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する、
前記Ｆａｂ。
【請求項２】
血清アルブミン（ＳＡ）に対して結合する、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であって、
（ａ）ＶＨドメインのＣＤＲを決定する配列番号１３（ＣＤＲ１）、１４（ＣＤＲ２）および１５（ＣＤＲ１５）のアミノ酸配列；および
（ｂ）ＶＬドメインのＣＤＲを決定する配列番号１６（ＣＤＲ１）、１７（ＣＤＲ２）および１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列
を含む、前記Ｆａｂ。
【請求項３】
ＶＨドメインが重鎖定常１ドメイン（ＣＨ１ドメイン）に結合され、およびＶＬドメインが軽鎖定常ドメイン（ＣκＬドメイン）に結合されている、請求項２に記載のＦａｂ。
【請求項４】
ＶＨドメインが配列番号６のアミノ酸配列を有し、およびＶＬドメインが配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のＦａｂ。
【請求項５】
ＣＨ１ドメインおよびＣκＬドメインのシステインのアミノ酸が欠失しているか、またはセリンを含み、システインを除く、任意の他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＦａｂ。
【請求項６】
ＣＨ１ドメインのシステインのアミノ酸が、ＣＨ１ドメインのＮ末端から数えて２３３番のアミノ酸であり、およびＣκＬドメインのシステインがＣκＬドメインのＮ末端から数えて２１４番のアミノ酸である、請求項５に記載のＦａｂ。
【請求項７】
ＣＨ１ドメインのシステインのアミノ酸およびＦａｂのＣκＬドメインのシステインのアミノ酸は欠失しているか、またはセリンを含み、システインを除く任意の他のアミノ酸残基で置換され；および生理活性エフェクター部分がタンパク質または（ポリ）ペプチドであり；およびＦａｂと生理活性エフェクター部分とが遺伝子的融合によって共有結合されている、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）と生理活性エフェクター部分との融合コンストラクト。
【請求項８】
生理活性エフェクター部分がタンパク質または（ポリ）ペプチドであり；およびＦａｂと生理活性エフェクター部分とが遺伝子的融合によって共有結合されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）と生理活性エフェクター部分との融合コンストラクト。
【請求項９】
Ｆａｂと生理活性エフェクター部分とが、０〜２０アミノ酸のペプチドリンカーを使用して遺伝子的融合によって共有結合されている、請求項７または８に記載の融合コンストラクト。
【請求項１０】
生理活性エフェクター部分が、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、およびレセプターからなる群から選択される１つである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の融合コンストラクト。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の融合コンストラクトであって、生理活性エフェクター部分が、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロンレセプター、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質結合レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギーインヒビター、細胞ネクローシス糖タンパク質、イムノトキシン、リンフォトキシン、腫瘍ネクローシス因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１抗トリプシン、アルブミン、アルファ−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリトロポエチン、高グリコシル化エリトロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビンレセプター活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、レセプター、レセプターアンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される１つである、前記融合コンストラクト。
【請求項１２】
生理活性エフェクター部分が、ｈＧＨ、ＧＣＳＦ、またはＩＦＮである、請求項１１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１３】
生理活性（ポリ）ペプチド（またはタンパク質）のＦａｂに対するモル比が、１：１と１０：１との間、好ましくは１：１と４：１との間である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の融合コンストラクト。
【請求項１４】
（ａ）プロモーター；（ｂ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＦａｂをコードする第一の核酸配列；および（ｃ）生理活性（ポリ）ペプチドまたはタンパク質および任意にリンカーをコードする第二の核酸配列を含む、発現ベクターであって、プロモーター、第一の核酸配列および第二の核酸配列が作動可能に連結されている、前記発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
宿主細胞が大腸菌である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞がＳＵＰＥＸ５（ＫＣＴＣ １２６５７ＢＰ）である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌のペリプラズムにおける生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドの可溶性発現を増加させる方法であって、大腸菌中に発現ベクターを導入することを含み；ここで、発現ベクターが、（ａ）プロモーター、（ｂ）抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）をコードする第一の核酸配列、および（ｃ）リンカーおよび生理活性（ポリ）ペプチドまたはタンパク質をコードする第二の核酸配列を含み；プロモーター、第一の核酸配列および第二の核酸配列が、作動可能に連結され；ならびにＦａｂのＣＨ１ドメインおよびＣκＬドメインのシステインのアミノ酸が、欠失しているか、またはセリン残基で置換されている、前記方法。
【請求項１９】
大腸菌がＳＵＰＥＸ５（ＫＣＴＣ １２６５７ＢＰ）である、請求項１８に記載の大腸菌のペリプラズムにおいて生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドの可溶性発現を増加させる方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の発現ベクターを大腸菌中に導入することを含む、大腸菌のペリプラズムにおいて生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドの可溶性発現を増加させる方法。
【請求項２１】
大腸菌がＳＵＰＥＸ５（ＫＣＴＣ １２６５７ＢＰ）である、請求項２０に記載の大腸菌のペリプラズムにおいて生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドの可溶性発現を増加させる方法。
【請求項２２】
生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、およびレセプターからなる群から選択される１つである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法であって、生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロンレセプター、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質結合レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギーインヒビター、細胞ネクローシス糖タンパク質、イムノトキシン、リンフォトキシン、腫瘍ネクローシス因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１抗トリプシン、アルブミン、アルファ−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポエチン、高グリコシル化エリトロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビンレセプター活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、レセプター、レセプターアンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される１つである、前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＦａｂに対して生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドを遺伝子的融合によって連結させることを含む、生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドのインビボの半減期を増加させる方法。
【請求項２５】
Ｆａｂに対して生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドが０〜２０アミノ酸のペプチドリンカーによって連結されている、請求項２４に記載の生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドのインビボの半減期を増加させる方法。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の方法であって、生理活性タンパク質または（ポリ）ペプチドが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロンレセプター、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質結合レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギーインヒビター、細胞ネクローシス糖タンパク質、イムノトキシン、リンフォトキシン、腫瘍ネクローシス因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１抗トリプシン、アルブミン、アルファ−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリトロポエチン、高グリコシル化エリトロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビンレセプター活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓（ポリ）ペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、レセプター、レセプターアンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される１つである、前記方法。
【請求項２７】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の融合コンストラクト、および薬学的に許容された賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）およびそれを含むＦａｂエフェクター融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）製剤は、最も成功したモノクローナル抗体治療剤の１つである。例えば、アブシキシマブ（ReoPro（登録商標））、ラニビズマブ（Lucentis（登録商標））、およびセルトリズマブペゴル（Cimzia（登録商標））などは、多くの国で医薬としてすでに承認されている。さらに、アブシキシマブ（ReoPro（登録商標））、ラニビズマブ（Lucentis（登録商標））およびセルトリズマブペゴル（Clmzia（登録商標））を含むポリクローナルＦａｂ製剤がＥＵにおいて市販されている。
【０００３】
外因性エフェクタードメインの結合は、それらがＦａｂエフェクター融合フォーマットを形成するとき、Ｆａｂフラグメントに対して治療効果を与え得る。したがって、実際に、臨床開発状況にある多くの抗体フラグメントは、外因性機能的部分に結合している。かかるＦａｂ融合タンパク質コンストラクト（またはＦａｂエフェクター部分コンストラクト）において、抗原結合フラグメントは、標的特異的な送達を提供し得、融合タンパク質または（ポリ）ペプチド（エフェクタードメイン）は、治療効果を提供し得る。原核生物起源に起源する融合ドメインは、例えば、deBouganin（脱免疫化植物トキシン）（Entwistle et al., (2012) Cancer Biother Radiopharm. 27, 582-92を参照）、ブドウ球菌のエンテロトキシン（ＳＥ）（Ilack et al., (2003) Toxicology. 185, 161-174を参照）またはPseudomonasのエキソトキシンの変異体形態（Choe et al., (1994) Cancer Res. 54, 3460-3467を参照；Kreitman et al., (1994) Int. J. Cancer 57, 856-864を参照）などのサイトトキシンを含み得る。さらに、ｓｃＦｖ（Lu et al., (2002) J Immunolog Meth. 267, 213-226を参照）またはサイトカイン（Holzer et al., (1996) Cytokine. 8, 214-221を参照；Sjogaard et al., (1999) Int J Oncol. 15, 873-882を参照）などの、真核生物からのポリペプチドを含む融合ドメインは、治療として機能し得る。放射性同位体は、一般的なＦａｂまたは（Ｆａｂ’）２フラグメントに化学的に結合されるが、サイトトキシン、サイトカインまたは酵素は、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２に遺伝子的に融合される。
【０００４】
Ｆａｂ分子は、ｓｃＦｖ、ＦｖまたはｄｓＦｖと異なり、大腸菌（Humphreys et al., J. Immunol. Methods. 209, 193-202；Carter et al., Biotechnology (N Y). 10, 163167；Venturi et al., J Mol Biol. 315, 1-8；Donzeau et al., Methods Mol Biol. 378, 14-31を参照）、またはさらにPseudomonas fluorescens（Retallack et al., Prot Exp Purif. 81, 157-165を参照）のペリプラズムにおいて可溶性形態として１〜２ｇ／Ｌまで簡便に産生することができることが知られている。現在、ｒｈＧＨ、インシュリンまたは様々な種類のサイトカインなどの多くの市販の生物学的剤は、大腸菌において産生されている（Graumann and Premstaller, (2006) Biotechnol J. 1, 164-186；Chadd and Chamow, (2001) Curr Opin Biotechnol. 12, 188-194を参照）。この点について、Ｆａｂフラグメントおよび他の治療剤に対する治療ドメインの遺伝子的連結は、新規な生物学的薬剤の開発、および現在の生物学的医薬の有効性の改善に大きな利点を有する。さらに、Ｆａｂ分子は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖまたはｄＡｂなどの他の抗体フラグメントに融合され、二重特異性または三重特異性抗体分子を製造し得る(Lu et al., (2002) J Immunolog Meth. 267, 213-226を参照)。しかしながら、エフェクタードメインが大腸菌における不適切なフォールディングまたはグリコシル化プロセスの欠如のため生物学的に機能的であり得ないことから、エフェクターが真核生物起源であるＦａｂエフェクター融合タンパク質の大腸菌における発現は妨げられる。さらに、大腸菌ペリプラズムにおいてＦａｂエフェクター融合タンパク質を産生するための最適な融合フォーマットは、まだ充分に研究されていない。サイトカインおよび成長因子などの、５０ｋＤａと６０ｋＤａとの間未満の分子量を有する大半の血清タンパク質は、腎クリアランスのため、インビボでは例えば数分〜数時間の短い半減期を有する。
【０００５】
したがって、治療ポリペプチドまたはタンパク質の血清半減期を延長することは、生物薬学的研究において最も盛んに研究される分野の１つである（Kontermann, (2012) Wiley, ISBN: 978-3-527-32849-9を参照）。このため、ペグ化、ポリシアル化（polysialylation）、ＨＥＳ化（HESylation）、グリコシル化、または柔軟かつ親水性のアミノ酸鎖（５００〜６００アミノ酸）に融合した組み換えＰＥＧアナログを含む様々な方法が開発されている（Chapman, 2002；Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545；Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283；Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876；Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246を参照）。さらに、治療タンパク質のインビボの半減期を延長するために、ＦｃＲｎ媒介リサイクル機構を直接的にまたは間接的に用いる。血清タンパク質間で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および免疫グロブリン（特に、ＩｇＧ）は、ＦｃＲｎ媒介リサイクル機構を通じて例外的に長い半減期を有することが知られている。ヒト体内では、ＩｇＧのサブクラスに依存して、アルブミンの血清半減期は１９日であり、ＩｇＧ分子のそれは１週とほぼ４週との間である。したがって、これらの２つの分子は、融合パートナーとして使用され、治療タンパク質および／または（ポリ）ペプチドの半減期を延長する。
【０００６】
大腸菌の細胞質またはペリプラズムにおいて製造される組み換えｈＧＨ（約１９ｋＤａ）は、幼児および成人において、インビトロのフォールディングプロセス後の成長ホルモンの欠如によって引き起こされる疾患を処置するために診療所で使用されている（Blethen et al., (1997) J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 418-420を参照）。ｒｈＧＨ投薬の１つの主要な不都合は、短期間の半減期（＜３０分）のための日常的な注射である。ｈＧＨの血清半減期を延長するために、ポリエチレングリコールの化学的結合（Clark et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 21969-21977；Pradhananga et al., 2002 J Mol Endocrinol. 29, 1114；Cho et al., 2011； Sondergaard et al., (2011) J Clin Endocrinol Metabol. 96, 681-688を参照）、および、ヒト化ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ ＩｇＧのＦａｂのアームに対する、改変されたｈＧＨの化学的結合（Palanki et al., (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 402-406を参照）が試みられてきた。さらに、血清におけるｈＧＨの半減期の延長は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Albutropin（登録商標））の融合または何百のＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＰＡＳ）残基を含むポリペプチド配列遺伝子の融合（ＰＡＳ化（PASylation））によって首尾よく達成されている(Osborn et al., 2002 Eur J Pharmacol. 456, 149-158；Anderson et al., (2011) J Biol Chem. 286, 5234-5241；Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta. 1830, 5526-5534；Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. 26, 489-501を参照)。
【０００７】
このカテゴリーにおいて最もよく研究された１つは、１ヶ月の投与計画を可能にする、Ｎ末端およびＣ末端にＸＴＥＮアミノ酸配列が遺伝子的に連結されたｒＧＨであるＶＲＳ−３１７である（Schellenberger et al., (2007) Nat Biotech. 27, 1186-1190；Cleland et al., (2012) J Pharm Sci. 101, 2744-2754；Yuen et al., (2013) J Clin Endocrinol Metab. 98, 2595-2603を参照）。また、ｈＧＨは、血管疾患（Thomas J Merimee et. al., (1973), Diabetes, 22, 813-819を参照）およびクロイツフェルト・ヤコブ病（John Powell-Jackson et al., 1985, Lancet, 2, 244-246を参照）に関連している。さらに、ＩＦＮ−γは、移植片対宿主疾患（Bruce R.Blazar et.al., 2003, The Journal of Immunology, 171, 1272-1277を参照）を加速させ、ＩＦＮ−αは、自己免疫疾患に関する（A Imagawa et al., 1995, The Journal of clinical endocrinology & metabolism, 80, 922-926を参照）。また、ＧＳＣＦは、自己免疫疾患に関し（Anke Franzke et al., 2003, Blood, 102, 734-739を参照)、ＨＣＶは、肝臓疾患に関連する（Van Thiel DH et al., 1995, Hepato-gastroenterology, 42, 907-912を参照)。
【０００８】
Ｆａｂ融合タンパク質（またはポリペプチド）は、特に、とりわけＦａｂ融合タンパク質が低コストで微生物発現系において産生できるとき、大きい用量の医薬を長期間の時間必要とする慢性疾患を処置するための治療剤として大きな可能性を有する。しかしながら、Ｆａｂを用いるかかる可能性のある強力な利点にもかかわらず、延長されたインビボの半減期を有するタンパク質または（ポリ）ペプチド医薬の開発において抗血清アルブミン（ＳＡ）Ｆａｂ抗体を適用する試みはなされていない。本明細書において、発明者らは、新規な抗血清アルブミン（ＳＡ）Ｆａｂエフェクタータンパク質（または（ポリ）ペプチド）融合コンストラクトを構築し、大腸菌のペリプラズムにおける機能的な融合コンストラクトの高収量の産生を確認することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００９】
発明の開示
技術的な課題
本発明によって解決される技術的な課題は、延長されたインビボの血清半減期を有する新規な抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提供することである。
本発明によって解決される別の技術的な課題は、宿主細胞のペリプラズムにおける最適な産生を可能にするＦａｂエフェクター部分融合コンストラクトを提供することである。
本発明によって解決されるなお別の技術的な課題は、高収量で可溶性形態のＦａｂエフェクターコンストラクトを産生する発現ベクターおよび宿主細胞を提供することである。
本発明によって解決されるなお別の技術的な課題は、上記の融合コンストラクトを含む医薬組成物を提供することである。
【００１０】
技術的解決策
上記の課題を解決するために、本発明は、大腸菌におけるペリプラズム発現のために最適なＦａｂエフェクター融合コンストラクト（またはフォーマット）を提供し、ここでＦａｂは、重鎖定常１ドメイン（ＣＨ１）に結合している重鎖可変ドメインを有し、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に結合している軽鎖可変ドメインを有する。
本発明の一態様において、小ペプチドまたはドメイン抗体（ｄＡｂ）などのアルブミンまたはアルブミン結合部分に対する様々な治療タンパク質の融合が、ＦｃＲｎ媒介リサイクル機構を通じて治療タンパク質の半減期を延長することが示されていることを考慮して（Dennis et al., (2002) Biochimica et Biophysica Acta. 1830, 5526-5534；Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta. 1830, 5526-5534；Nguyen et al., (2006) Protein Eng Des Sel. 19, 291-297；Kontermann, (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876を参照）、ヒト抗ＳＡ Ｆａｂを抗体フラグメントとして選択した。先行研究によると、Ｆａｂフラグメントは、静脈内投薬後のヒトにおいて１６〜２０ｈの排出半減期を有し（Ujhelyi and Robert, (1995) Clin Pharmacokinet. 28, 483493を参照）、静脈内投薬後のラットにおいて約３ｈの排出半減期を有する（Nguyen et al., 2006 Protein Eng Des Sel. 19, 291-297を参照）。
【００１１】
驚くべきことに、本発明におけるＦａｂ（ＳＬ３３５）の半減期は、ラットにおいて３７ｈであり、これは従来のヒトＦａｂよりもおよそ１２倍長く、したがって、ＳＬ３３５は、ヒトにおいて少なくとも１６０〜２００ｈ（６〜８日）の半減期を有し得ると考えるのが妥当である。一方、ＲＳＡに対してそれぞれ１３ｎＭおよび１ｍＭの結合親和性を有するｄＡｂｒ３およびｄＡｂｒ１６の２つのＶｋドメインは、ラットにおいて５３ｈ（ｄＡｂｒ３）および４３ｈ（ｄＡｂｒ１６）のｔ１／２値を有することが知れられていた（Holt et al., (2008) Protein Eng Des Sel. 21, 283-288を参照）。さらに、ＲＳＡに対して９２ｎＭの親和性を有するＡｂ  Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈのｔ１／２ｂは、２６．９ｈであった（Nguyen et al., 2006を参照）。したがって、ＳＬ３３５のインビボの機能性は、従来報告されていたＳＡに特異的なｄＡｂおよびペプチドのそれに匹敵することが示唆される。ＳＬ３３５のＶＨおよびＶＬは、従来報告されたアルブミン特異的ｄＡｂ（データは示されない）を用いると、全配列レベルでたった６５〜６７％、相補性決定領域（ＣＤＲ）レベルで約５０％のアミノ酸相同性を共有するに過ぎなかったことは注目に値する。
【００１２】
具体的には、本発明の態様において、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的なＦａｂは、配列番号１（ＳＡ１３８  ＶＨ：ＱＶＱＬＬＱＳＧＡＥ  ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ  ＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＶＧＷ  ＩＮＴＹＳＧＧＴＫＹＡ  ＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴ  ＲＤＴＳＩＳＴＶＹＭ  ＥＬＳＧＬＫＳＤＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬ  ＤＴＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ）、配列番号２（ＳＡ１３９  ＶＨ：ＥＶＱＬＬＱＳＧＡＥ  ＶＫＥＰＧＡＳＶＫＶ  ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ  ＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＱＧＬＥＷＶＧＲ  ＩＮＴＹＮＧＮＴＧＹＡ  ＱＲＬＱＧＲＶＴＭＴ  ＴＤＴＳＴＳＩＡＹＭ  ＥＶＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬ  ＤＴＷＧＱＧＴＭＶＴ  ＶＳＳ）、配列番号３（ＳＡ１４０  ＶＨ：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧ  ＶＶＱＴＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲ  ＮＹＧＩＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳ  ＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡ  ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳ  ＲＤＮＳＲＮＴＶＨＶ  ＱＭＤＳＬＲＧＧＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＤＶＨＹＹＧＳＧＳＹＹＮＡＦ  ＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ）、配列番号４（ＳＡ１４１  ＶＨ：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧ  ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＬＳＶ  ＩＳＨＤＧＧＦＱＹＹＡ  ＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳ  ＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬ  ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＡＧＷＬＲＱＹＧＭ  ＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ）、配列番号５（ＳＬ１８  ＶＨ：ＥＶＱＬＶＱＳＧＴＥ  ＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩ  ＳＣＫＩＳＧＹＳＦＴ  ＡＹＷＩＡＷＶＲＱＭ  ＰＧＫＧＬＥＷＭＧＭ  ＩＷＰＰＤＡＤＡＲＹＳ  ＰＳＦＱＧＱＶＴＦＳ  ＶＤＫＳＩＳＴＡＹＬ  ＱＷＨＳＬＫＴＳＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＬＹＳＧＳＹ  ＳＰＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ）および配列番号６（ＳＬ３０１、ＳＬ３１０およびＳＬ３３５  ＶＨ：ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧ  ＰＶＫＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＭＦＲ  ＡＹＳＭＮＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ  ＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡ  ＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳ  ＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬ  ＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹ  ＹＣＡＲＥＴＶＭＡＧＫＡＬ  ＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴ  ＶＳＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン；および
【００１３】
配列番号７（ＳＡ１３０：ＥＬＶＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ  ＲＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ  ＡＳＲＬＥＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＤＳＶＰＶＴＦＧＱ  ＧＴＲＬＥＩＫＲ）、配列番号８（ＳＡ１３９  ＶＬ：ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ  ＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ  ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＹＳＴＰＰＹＴＦＧＱ  ＧＴＫＬＥＩＫＲ）、配列番号９（ＳＬ１８  ＶＬ：ＥＬＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＩＦ  ＮＹＶＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤ  ＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰ  ＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱ  ＲＳＫＷＰＰＴＷＴＦＧＱ  ＧＴＲＶＤＩＫＲ）、配列番号１０（ＳＬ３０１  ＶＬ：ＥＬＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＥＴＶＳＳ  ＲＱＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧ  ＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰ  ＥＤＳＡＶＦＹＣＱＱ  ＹＧＳＳＰＲＴＦＧＧ  ＧＴＫＬＥＩＫＲ）、配列番号１１（ＳＬ３１０  ＶＬ：ＥＬＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳ  ＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧ  ＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＡＡＴＹＹＣＱＫ  ＹＳＳＹＰＬＴＦＧＱ  ＧＴＫＬＥＩＫＲ）および配列番号１２（ＳＬ３３５  ＶＬ：ＥＬＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＴＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧ  ＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰ  ＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧ  ＡＳＴＧＡＴＧＶＰＡ  ＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＴＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＹＹＳＦＬＡＫＴＦＧＱ  ＧＴＱＬＥＩＫＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、を含む。
【００１４】
上記のＦａｂのＶＨドメインは、重鎖定常１ドメイン（ＣＨ１ドメイン）に結合され、ＦａｂのＶＬドメインは、軽鎖定常ドメイン（ＣκＬドメイン）に結合される。さらに、本発明の血清アルブミン（ＳＡ）に特異的なＦａｂは、ＳＬ３３５のＶＨ領域における配列番号１３（ＣＤＲ１）（ＡＹＳＭＮ）、配列番号１４（ＣＤＲ２）（ＳＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡＤＳＶＫＧ）および配列番号１５（ＣＤＲ３）（ＥＴＶＭＡＧＫＡＬＤＹ）ならびにＳＬ３３５のＶＬ領域における配列番号１６（ＣＤＲ１）（ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ）、配列番号１７（ＣＤＲ２）（ＧＡＳＴＧＡＴ）および配列番号１８（ＣＤＲ３）（ＱＱＹＹＳＦＬＡＫＴ）で表されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
一態様において、ＦａｂのＣＨ１ドメインおよびＣκＬドメインのシステインのアミノ酸は欠失してもよく、またはセリン残基で置換してもよい。特に、上記のＳＬ３３５については、ＣＨ１ドメインのシステインのアミノ酸は、ＣＨ１ドメインのＮ末端から数えて２３３番目のアミノ酸であり、ＣκＬドメインのシステインは、ＣκＬドメインのＮ末端から数えて２１４番目のアミノ酸であり、それらはセリン残基で置換される。混乱を避けるために、Ｆａｂを構成するＨ鎖およびＬ鎖は、以下のとおり称した：１）Ｈｃｙｓ：２３３番目の位置でシステインを有するＨ鎖、２）Ｌｃｙｓ：２１４番目の位置でシステインを有するＬ鎖、３）Ｈｓｅｒ：２３３番目の位置でセリンを有するＨ鎖、および４）Ｌｓｅｒ：２１４番目の位置でセリンを有するＬ鎖。
本発明の別の態様において、Ｆａｂエフェクター融合は、遺伝子的融合を通じてエフェクタードメインをＦｄまたはＦａｂ分子の軽鎖のいずれかのＮまたはＣ末端に連結することによって構築される。大腸菌のペリプラズム環境における組み換えタンパク質のフォールディングおよびヘテロ二量化機構は、かなり複雑であり、ほとんど未知であることから、いずれのＦａｂエフェクター融合フォーマットが機能的発現に最適であるかは予測不可能である。
【００１６】
さらに、別の態様において、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）およびエフェクタードメイン（生理活性エフェクター部分）の融合コンストラクトが提供され、ここで、ＦａｂののＣＨ１ドメインのシステインのアミノ酸およびＣκＬドメインのシステインのアミノ酸は、欠失するか、またはセリン残基で置換され；およびここで生理活性エフェクター部分は、タンパク質であるか、または（ポリ）ペプチドであり；およびここでＦａｂおよび生理活性エフェクター部分は、遺伝子的融合によって共有結合されている。Ｆａｂおよび生理活性エフェクター部分は、０〜２０アミノ酸のペプチドリンカーを使用する遺伝子的融合によって共有結合されてもよい。本発明のｈＧＨを含む６つのＦａｂエフェクター融合フォーマット（またはコンストラクト）間で、結果は、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒが大腸菌において最も高い発現収量を示すことを明確に実証した。すなわち、この態様に従って、欠失または他のアミノ酸残基との置換のいずれかによる、ＣＨ１ドメインにおけるＣｙｓ２３３およびＣＬｋにおけるＣｙｓ２１４の両方の除去は、培養上清におけるＳＬ３３５融合エフェクターコンストラクトの可溶性発現を改善する。
【００１７】
これは、３つの重要な問題に対処する。第一に、エフェクター部分の融合、例えばｈＧＨのＣＨ１のＣ末端に対するものは、ＣＬｋのＣ末端に対するものが好ましい。従来、Luらは、抗ＫＤＲ ＦａｂのＣＨ１のＣ末端に対する抗Ｆｌｔ−１ ｓｃＦｖの遺伝子的連結が、ＣＬドメインのＣ末端に対する連結よりも５倍高い収量を産生したことを報告していた（Lu et al., (2002) J Immunolog Meth. 267, 213-226を参照）。データは含まれていなかったが、我々発明者の全大腸菌ライセートを使用するウェスタンブロット分析によって、ＬｃｙｓＧ／ＨｃｙｓおよびＬｓｅｒＧ／ＨｃｙｓのＦｄフラグメントがほぼ完全に分解され、大腸菌上清において融合タンパク質の可溶性形態の非検出をもたらすことが明らかにされた。ＶＨドメインは大腸菌において凝集する傾向があるため（Dudgeon et al., (2009) Protein Eng Des Sel. 22, 217-220）、ＣＬのＣ末端におけるエフェクタードメインの存在によってＶＨドメインのＶＬドメインに対する相互作用およびＣＨ１ドメインのＣＬドメインに対する相互作用を抑制し、急速な凝集およびＦｄフラグメントの分解をもたらし得ることが推測できる。ＬｓｅｒＧ／ＨｃｙｓとＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒとの間で可溶性発現収量を比較すると、ＣＨ１ドメインにおけるＣｙｓ２３３の存在が、おそらく異常なジスルフィド結合形成によって、このプロセスを加速させるものと考えられた。ＣＨ１ドメインにおいてＣｙｓ２３３を除去した後、ＣＨ１の末端におけるエフェクタードメインの存在は、ＶＨ−ＶＬ対合前にＶＨドメイン上の疎水性表面の部分的な遮断によってＶＨドメイン凝集を低減することに有益な効果を有し得る。
【００１８】
第二に、ＣＬｋのＣｙｓ２１４の存在は、ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合タンパク質の可溶性産生を、追加の様式でさらに悪化させる。ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの収量よりも低いＨｓｅｒＧ／Ｌｃｙｓの収量は、Bence Jonesタンパク質として知られる、Ｌ鎖がホモ二量体を形成する傾向によって説明できるであろう（Kirsh et al., (2005) J Immunol Methods. 301, 173-185を参照）、ここで、ＣＬｋのＣｙｓ２１４は、ホモ二量体の安定化に作用し得、または融合タンパク質における他のシステイン残基との異常なジスルフィド結合（単数または複数形）を形成することに関与する。ＦａｂにおけるＣＨ１のＣ末端とＣＬのＣ末端との間のジスルフィド結合が、かなりの柔軟度で高度に可動的であることもまた知られている（Rothlisberger et al., (2005) J. Mol. Biol. 347, 773-789；Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel. 20, 227-234を参照）。この点について、本発明は、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）のＣｙｓ２３３および軽鎖定常ドメイン（ＣＬｋ）のＣｙｓ２１４を有さない抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提供する。同様に、ＨｅｒＧＦ／ＬｓｅｒおよびＨｓｅｒＩＦＮｂ／Ｌｓｅｒは、大腸菌において最も高い発現収量を示した。本発明の融合コンストラクトにおいて、生理活性ポリペプチド（またはタンパク質）のＦａｂに対するモル比は、１：１と１０：１との間、好ましくは１：１と４：１との間である。
【００１９】
第三に、発現収量だけでなく、抗ｈＧＨ抗体のｈＧＨドメインに対する接近性もまた、ＳＬ３３５におけるこれらの２つのＣ末端システイン残基の存在によってある程度抑制される。これは、エフェクタードメインとそのリガンドとの間の相互作用もまた干渉される場合、Ｆａｂエフェクター融合におけるエフェクタードメインの治療機能に重要であり得るであろう。我々発明者は、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ｂなどの他のエフェクターが同一の結論をもたらしたことから、ＦａｂΔｄｓの融合パートナーとしての利用が、ｈＧＨについてのみ有益であるのではないことを実証した。
【００２０】
本発明の別の側面において、発現ベクターおよび宿主細胞として変異体大腸菌ＳＵＰＥＸ５株（ＫＣＴＣ １２６５７ＢＰ）が、技術的な課題を解決するために提供される。この株は、ＭＣ１０６１大腸菌株のランダムな化学的変異誘発によって作製され、ＭＣ１０６１大腸菌株は市販バイオ医薬品の製造のための主要な宿主株の１つである大腸菌Ｋ１２株に由来することから選択された。親ＭＣ１０６１株と比較すると、発現宿主として変異体ＳＵＰＥＸ５大腸菌株を利用することによって、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの産生に有益な効果がさらにもたらされた。ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合だけでなく、ＦａｂｄｓとＳＵＰＥＸ５大腸菌株との組み合わせもまたＦａｂエフェクター融合タンパク質一般の可溶性発現において有利であり、これは、ＳＬ３３５−ＧＣＳＦ融合（ＳＬ３３５ｗｔ−ＧＣＳＦ対ＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦ）、ＳＬ３３５−ＩＦＮβ融合（ＳＬ３３５ｗｔ−ＩＦＮｂ対ＳＬ３３５Δｄｓ−ＩＦＮβ）、ＥＧＬ４−ｈＧＨ融合（ＥＧＬ４ｗｔ−ｈＧＨ対ＥＧＬ４Δｄｓ−ｈＧＨ）、および１β２８−ｈＧＨ融合（１β２８ｗｔ−ｈＧＨ対１β２８Δｄｓ−ｈＧＨ）から得られた結果によって明確に実証された。
【００２１】
したがって、前記結果は、ＣＨ１のＣｙｓ２３３およびＣＬＫのＣｙｓ２１４を有さないＦａｂの変異体形態であるＦａｂΔｄｓの利用が、Ｆａｂエフェクター融合タンパク質の可溶性発現における従来のＦａｂよりも有益であり、少なくともＳＵＰＥＸ５大腸菌株における従来のＦａｂよりも有益であることを強く支持する。これらの融合は、大腸菌における可溶性Ｆａｂフラグメントのペリプラズムの産生収量を増加させることが知られていることから（Schlapschy et al., (2006) Escherichia coli. Protein Eng Des Sel. 19, 385-390を参照)、シャペロンタンパク質またはジスルフィドイソメラーゼ（ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ、Ｓｋｐ、Ｓｅｃ Ａ、Ｓｅｃ Ｂ、ＤｓｂＡまたはＤｓｂ Ｃ）の共発現は、ＳＬ３３５ｗｔ−ＧＣＳＦまたはＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦさえの可溶性および機能的発現を改善するであろう。我々発明者は、とりわけ、小胞体におけるジスルフィド形成のためのシャペロンおよび触媒機構が、宿主細胞におけるＦａｂエフェクター融合タンパク質の高発現のために過剰負荷であるとき、Ｆａｂｄｓの利用が有益であり得ると信じている。
【００２２】
本発明の一態様において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを、培養フラスコを使用しておよそ１０ｍｇ／Ｌの濃度で産生した。これは、本発明における分子の大きさの４倍の増加にもかかわらず、従来の報告よりも高収量である。先行報告によると、大腸菌のペリプラズムにおけるｒｈＧＨの可溶性発現における研究によって、収量がｐｅｌＢ−ｈＧＨについて０．６４〜２．５７ｍｇ／Ｌであり、ｏｍｐＡ−ｈＧＨについて０．３２〜２．２９ｍｇ／Ｌであったことが示され（Sockolosky and Szoka, (2013) Protein Exp Purif. 87, 129-135を参照）、一方、ｒｈＧＨの収量は、使用されたプロモーターおよび宿主大腸菌株に大きく依存的であった（Soares et al., (2003) Protein Engineering. 16, 1131-1138を参照）。単純な培地の最適化を通じて、我々発明者は、ＯＤ６００ｎｍ＝約１０〜１１の細胞密度を可能にする培養フラスコを使用して、培養上清中に約５０ｍｇ／Ｌの収量を日常的に得た（原稿準備中）。これは、培地組成物およびフェドバッチ培養系の精練された調節を通じて工業規模のためにさらに充分に改善することができる。
【００２３】
本発明の別の側面において、ＳＬ３３５ｄｓエフェクタータンパク質は、ＨＳＡに対する増加した親和性を示す。一態様において、ＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨは、親ＳＬ３３５のものと比較して、ｐＨ条件に依存してＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）に対する応答において５〜９倍の増加、およびＲＳＡ（ラット血清アルブミン）に対する応答において１．３〜４倍の減少を示した。抗体フラグメントとエフェクタードメインとの遺伝子的連結は、抗体フラグメントの抗原結合親和性に影響を与えるであろうし、親和性における変化は、抗体フラグメントの性質、エフェクタードメインおよびこれら２つの機能的部分をいかに連結するかに依存して、大きな程度で変わり得る。親和性におけるこれらの違いが、鎖間ジスルフィド結合の非存在またはｈＧＨ融合ドメインの存在からもたらされるものかどうかは明らかになっていない。それにもかかわらず、抗原に対するＳＬ３３５Δｄｓの結合親和性におけるｈＧＨ融合の効果は、ＩＦＮ−ａ２ｂ−ＤＯＭ７ ｈ−１４のそれと比較して無視できるものと考えられ、ヒト、マウスおよびラットＳＡに対するその親和性は、親ＤＯＭ７ ｈ−１４に対して７．７、２２．３および１５．８倍減少した（Walker et al., (2010) Protein Eng Des Sel. 23, 271-278を参照）。したがって、ＣＨ１およびＣＬドメインは、それぞれのリガンドに対して結合する抗原結合領域とエフェクタードメインとの間の立体障害を低減するための空間を提供するため、Ｆａｂは、親和性およびエフェクターフォールディングの維持においてドメインＡｂよりも利点を有し得るだろう。
【００２４】
本発明の別の態様において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、血清半減期を大きく延長し、そのｔ１／２（静脈内投薬において１６．６ｈ）は、ＰＥＧ５−ｈＧＨ（２５０ｋＤａ）のそれと同様であった（Clark et al., 1996を参照）。興味深いことに、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのｔ１／２は、Albutropin（登録商標）（ｔ１／２＝２．９６ｈ）のそれよりも５．６倍長く、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨとAlbutropin（登録商標）との間のｔ１／２における違いは、Ｓ．Ｃ．（皮下）投薬において１６倍（９７．２ｈ対５．９３ｈ）までさらに延長したが（Osborn et al., 2002を参照)、これらの比較は、実験が同じ設定の下で実施されない限り状況によるものである。同様に、ＩＦＮ−ａ２ｂ−ＤＯＭ７ ｈ−１４のｔ１／２は、ＨＳＡ−ＩＦＮ−ａ２ｂのそれよりもおよそ１．５倍長いものでもあった（Walker et al., 2010を参照）。したがって、アルブミン結合体（albumin binder）の融合は、アルブミンとの融合よりも長い半減期を提供する可能性が高いと考えられ、根本的な機構はまだ決定されていない。Ｉ．Ｖ．投薬におけるＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの血清ｔ１／２は、ＶＲＳ−３１７（ｔ１／２＝１５ｈ）のそれと同様であったことは注目に値する（Cleland et al., (2012) J Pharm Sci. 101, 27442754）。これは、週１回の投与またはさらに月１回の投与よりも長い投与が、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ（SAFAtropin（登録商標）と称される）について可能であり得ることを示唆し得る。
【００２５】
本発明の別の態様において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの薬力学的な効果は、Albutropin（登録商標）のものよりもはるかに優れ、週１回の投与計画を考慮すると、モルに基づいてGrowtropin（登録商標）よりも７倍超の効力があると考えられる。不幸なことに、下垂体切除ラットのいくつか、とりわけ賦形剤のみの群に属するものが早く死んだため、我々は、２週間の薬力学的な研究を１１日目で中断せざるを得なかった。動物は、外科手術後の日本から韓国への８月中の長距離輸送によって深刻にストレスを受けた可能性が高いと考えられ、これは、賦形剤のみの群に属する動物の５％の重量損失および我々の予想よりも大きい標準偏差値によって明らかにされた。それにもかかわらず、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨが、長時間作用するｈＧＨとして開発される極めて大きい可能性を有することは明らかであると考えられ、したがって、我々は今後、それをSAFAtropin（登録商標）と称する。
【００２６】
本発明の別の態様において、上記のＦａｂに融合した生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、およびレセプターからなる群から選択される任意のものである。
【００２７】
本発明のなお別の態様において、生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロンレセプター、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質結合レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギーインヒビター、細胞ネクローシス糖タンパク質、イムノトキシン、リンフォトキシン、腫瘍ネクローシス因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１抗トリプシン、アルブミン、アルファ−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリトロポエチン、高グリコシル化エリトロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビンレセプター活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラズミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、レセプター、レセプターアンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される任意のものである。
【００２８】
本発明の別の側面において、医薬組成物が提供され、ここで組成物は、本発明のＦａｂエフェクター部分融合コンストラクトおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含み、インビボの持続可能性を増加させる。本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、または筋肉内の投薬を含む様々な方法を通じて体内に投薬することができ、より好ましくは注射型製剤として投薬することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、当業者によく知られた方法を使用して処方し、その投薬後の活性成分の急速な、持続した、または遅延した放出を提供できる。製剤は、タブレット、ピル、粉末、小袋、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟および硬ゼラチンカプセル、滅菌注射可能溶液、滅菌包装粉末などの形態であってもよい。好適な担体、賦形剤、および希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギナート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルである。さらに、製剤は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、フレーバー剤、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００２９】
実際に投薬する融合タンパク質またはポリペプチドの量は、処置される条件、選択された投薬の経路、個々の患者の年齢、性別および体重、ならびに患者症状の重症度を含む様々な関連因子；ならびに活性成分の生理活性ポリペプチドの種類に鑑みて決定されるべきであることが理解されるべきである。本発明の融合タンパク質は、血中で極めて優れた持続可能性を有することから、本発明の融合タンパク質を含むペプチド製剤の投薬の数および頻度を顕著に低減することができる。
【００３０】
本明細書で使用されるとおり、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、「などの（such as）」またはそのバリアントが、本願明細書および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される程度に、かかる用語は、用語「含む（comprising）」と同様な様式で限定的ではなく包括的であることが意図される。
本発明において、「生理活性ポリペプチドまたはタンパク質」は、それがヒトを含む哺乳動物に投薬されるときに有用な生物学的活性を表す（ポリ）ペプチドまたはタンパク質である。
【００３１】
本発明において、「Ｆａｂエフェクター部分（単数または複数）融合コンストラクト（またはフォーマット）」は、生理活性（ポリ）ペプチドまたはタンパク質がＦａｂに共有結合したコンストラクトである。さらに、「Ｆａｂエフェクター部分（単数または複数）融合コンストラクト（またはフォーマット）」は、Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ融合（ポリ）ペプチド、融合コンストラクト、および融合フォーマットを含むと理解される。
この点について、本発明は、例において詳細に記載されている。前述の開示において記載されるとおり、例の記載が本発明の範囲を限定しないことに留意すべきである。
【００３２】
発明の有利な効果
本発明において、抗血清アルブミンＦａｂΔｄｓ関連（ＳＡＦＡ）技術は、長時間作用するバイオ治療を開発するための新規なプラットフォーム技術として提供される。この点について、本発明は、インビボでの長時間の作用、エフェクタードメインの立体構造の維持、結合親和性、ならびに低コストで単純な産生および手順の観点において、ＰＥＧ化、Ｆｃ融合、ＡｌｂｕｄＡｂ技術およびアルブミン融合を含む他の従来の技術よりも利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、抗−ＳＡ Ｆａｂファージ抗体の結合特異性を決定するためのモノクローナルファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２−１】図２Ａは、ＥＬＩＳＡによるヒトＦａｂクローンの抗原結合特異性の決定を示す。
【図２−２】図２Ｂは、ＥＬＩＳＡによるヒトＦａｂクローンの抗原結合特異性の決定を示す。
【図３】図３は、ＳＬ３３５のインビボの薬物動態を表す。
【図４】図４は、本研究において構築された６つのＳＬ３３５−ｈＧＨ融合フォーマットを示す図解である。
【図５−１】図５Ａおよび図５Ｂは、大腸菌培養上清における可溶性ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合の収量および結合反応性を決定するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。結合シグナルは、ＴＭＢ基質を使用して可視化し、４５０ｎｍにおける吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤを表す。
【図５−２】図５Ｃおよび図５Ｄは、大腸菌培養上清における可溶性ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合の結合反応性を決定するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。結合シグナルは、ＴＭＢ基質を使用して可視化し、４５０ｎｍにおける吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤを表す。
【図６】図６は、ＳＬ３３５およびＳＬ３３５−ｈＧＨバリアント（２０℃、Ａ；２５℃、Ｂ；または３０℃、Ｃ）の宿主大腸菌および温度に依存的な発現を決定するためのＥＬＩＳＡを表す。
【図７】図７は、大腸菌培養上清における可溶性ＳＬ３３５−ＧＣＳＦおよびＳＬ３３５−ＩＦＮβ融合コンストラクトの収量を決定するためのＥＬＩＳＡを表す。
【００３４】
【図８】図８は、大腸菌培養上清における可溶性ＥＧＬ４−ｈＧＨ（Ａ）の収量、および１β２８−ｈＧＨ融合（Ｂ）を決定するためのＥＬＩＳＡを表す。
【図９】図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによるＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨの分析を表す。
【図１０】図１０は、チップベースのキャピラリー電気泳動によるＨｃｙｃＧ／ＬｃｙｓおよびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの分析を表す。
【図１１】図１１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるＨｃｙｃＧ／ＬｃｙｓおよびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの分析を表す。
【図１２】図１２は、ＦＰＬＣを使用するゲルろ過を介するＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの精製を表す。
【図１３】図１３は、Ｎｂ２−１１細胞増殖アッセイによるＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨのインビトロｈＧＨ生理活性の決定を示す。
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡおよびインビトロＮｂ２−１１細胞増殖アッセイによるＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨの血清安定性の決定を示す。
【図１５】図１５は、ラットにおけるGrowtropinまたはＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨの薬物動態学的な分析である。
【００３５】
【図１６】図１６は、Growtropin（登録商標）またはＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨで処置された下垂体切除ラットにおける用量依存的重量増加を示す。１つの処置群につきＮ＝３匹のラット、１匹のラットにつき１回の日常的な重量測定。
【図１７】図１７は、Growtropin（登録商標）またはＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨで処置された脛骨の長さの用量依存的増加を示す。１つの処置群につきＮ＝３〜４匹のラット、１匹のラットにつき１回の脛骨測定。
【図１８】図１８は、本発明のｐＨＥＫＡベクターを示す。
【図１９】図１９は、本発明のｐＨＥＫＡベクターの核酸配列を示す。
【図２０】図２０は、本発明の抗ＳＡ Ｆａｂクローンによって利用されたＶＨおよびＶＬ遺伝子の推定アミノ酸配列を示す。
【図２１−１】図２１ａは、本発明の抗ＳＡ Ｆａｂクローンによって利用されたＶＨ（Ａ）のＤＮＡ配列を示す。
【図２１−２】図２１ｂは、本発明の抗ＳＡ Ｆａｂクローンによって利用されたＶＨ（Ａ）のＤＮＡ配列を示す。
【図２１−３】図２１ｃは、本発明の抗ＳＡ Ｆａｂクローンによって利用されたＶＬ遺伝子（Ｂ）のＤＮＡ配列を示す。
【図２１−４】図２１ｄは、本発明の抗ＳＡ Ｆａｂクローンによって利用されたＶＬ遺伝子（Ｂ）のＤＮＡ配列を示す。
【図２２−１】図２２ａは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−２】図２２ｂは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−３】図２２ｃは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−４】図２２ｄは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−５】図２２ｅは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−６】図２２ｆは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−７】図２２ｇは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−８】図２２ｈは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−９】図２２ｉは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【図２２−１０】図２２ｊは、本発明のＦａｂエフェクター融合コンストラクトの配列情報を示す。リンカーおよびエフェクタードメインに下線を付し、ＣＤＲを太字で書いた。
【００３６】
本発明の態様
１．材料および分析
１−（１）クローニングおよび株
すべてのＤＮＡクローニング実験を、標準的な手順（Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manulal, 2nd ed., (New Youk, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照）にしたがって実施した。ＳＬ３３５エフェクター融合コンストラクトを構築するためのシーケンシング等級のオリゴヌクレオチドおよびコドン最適化遺伝子を、Bioneer, Daejeon, South Koreaによって合成した。ＰＣＲ増幅を、９４℃で１ｍｉｎ、５８℃で１ｍｉｎおよび７２℃で１ｍｉｎ、続いて、７２℃で１０ｍｉｎの２５サイクルの条件下で、特に明記しない限り、PyrobestまたはEx-Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Takara, tsu, Japan)を使用して実施した。制限エンドヌクレアーゼ、エビアルカリホスファターゼ（ＳＩＰ）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼもまたTakaraから購入した。大腸菌ＭＣ１０６１株[araD139 Del(araA-leu)7697 Del(lac)X74 galK16 galE15(GalS) lambda- e14- mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2]（ATCC, Manassas, USA）をクローニングに使用し、大腸菌ＳＵＰＥＸ５株を組み換えタンパク質発現に使用した。大腸菌ＴＧ１株{F' [traD36 proAB+lacIqlacZΔM15]supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5,(rK-mK-)}（Agilent Technologies, Palo Alto, USA）を組み換えファージ製剤に使用した。
【００３７】
１−（２）ＨｕＤＶＦａｂ−８Ｌ抗体ライブラリーのバイオパニング
標的抗原に対して結合した組み換えファージの濃縮を、従来記載されたとおり実施した（Joo et al., (2008) J. Immunol. Methods. 333, 24-37; Hur et al., (2010) Immunol Lett. 132, 24-30を参照）。簡潔には、ヒト、ラットまたはマウス血清アルブミン（それぞれＨＳＡ、ＲＳＡまたはＭＳＡ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）と結合したトシル化磁気ビーズを、HuDVFab-8L抗体ライブラリー（AprilBio, Chuncheon, South Korea）からの１０１０個のファージと４℃で４ｈ混合させ、０．０２％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。ビーズに結合されたファージ抗体を、溶出バッファー（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２）で溶出させた。対応する軽（Ｌ）（ＶＬ＋ＣＬｋ）鎖を有する新たなＴＧ１細胞を溶出されたファージで感染させ、２５μｇ／ｍｌのアンピシリン、１０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（２×ＹＴ／ＡＣＴ）を含有する２ＹＴ培地において増殖させた。その後のパニングのために組み換えファージを次いでEx-12ヘルパーファージ（AprilBio）を使用して増幅させた。最後のパニングの後、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施し、陽性クローンを識別した。陽性クローンからのＦｄ（ＶＨ＋ＣＨ１）遺伝子を、pHg3A-3ベクター（AprilBio, Chuncheon, South Korea）へサブクローニングし、Ｌ鎖最適化をpLf1T-3ファージミドベクター（AprilBio）における１．４×１０８のヒトナイーブのｋＬ鎖レパートリーを使用して実施した。
【００３８】
１−（３）−ＤＮＡシーケンシング分析
pHf1g3A-2（AprilBio）ファージミドおよびpLf1A-3プラスミド（AprilBio）をWizard Plasmid Miniprep Kit（Promega, Medison, WI, USA）を使用して抗ＳＡ Ｆａｂ分子を産生する大腸菌細胞から単離した。pHf1g3A-2またはpLT-2に対して相補的である２つの異なるシーケンシングプライマー（５’−ｇｔｇｃｃｇｔｔｃｔａｔａｇｃｃａｔａｇｃａｃ−３’（配列番号：１９）および５’−ｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｔｔｔｃｇｃｔａｃｃｇｔｇ−３’（配列番号：２０））を使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子をそれぞれ読んだ。ＤＮＡシーケンシングをSolGent, Daejeon, South Koreaによって実施した。
【００３９】
１−（４）ｐＨＥＫＡ発現ベクターの構築
Ｂｇｌ ＩＩ制限部位＋ｔｒｃプロモーター＋ｇ１０翻訳エンハンサーリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含有するＤＮＡフラグメント＃１を、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼおよび１組のＰＣＲプライマー＃１（５’−ｇｇｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｔｇａｇｃｔｇｔｔｇａｃａａｔｔａａｔｃａｔｃｃｇ−３’（配列番号：２１））および＃２（５’−ｃｃｔｃｔｔｔａａｔｔｔｔｔａａｔａａｔａａａｇｔｔａａｔｃｇａｔａａｔｔｃｃ−３’（配列番号：２２））を使用して、pTrcHis-Bベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）からのＰＣＲ増幅によって得た。ｇ１０翻訳エンハンサー＋ＲＢＳ＋ＢａｍＨ Ｉ＋マルチクローニング部位（ＭＣＳ）＋転写ターミネーターを含有するＤＮＡフラグメント＃２を、ＰＣＲプライマー＃３（５’−ｇｇａａｔｔａｔｃｇａｔｔａａｃｔｔｔａｔｔａｔｔａａａａａｔｔａａａｇａｇｇｔａｔａｔａｔｔａｇｇａｔｃｃｇａｇｃｔｃｇａｇｔｔｃｔｇｃａ−３’（配列番号：２３））および＃４（５’−ｇｇｇｃａｃｔａｃｇｔｇｃｇａａａｇｇｃｃｃａｇｔｃｔｔｔｃｇａｃｔ−３’（配列番号：２４））を使用して、上記と同じ鋳型からのＰＣＲ増幅によって得た。連結ＰＣＲを実施し、Ex-Taq ＤＮＡポリメラーゼならびに１組のＰＣＲ＃１および＃４プライマーを使用して、これらの２つのＤＮＡフラグメントを組み立てた。得られた約５２０ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動を通じて単離した。その後、連結ＰＣＲ産物およびpET28a（Invitrogen）プラスミドをＢｇｌ ＩＩおよびＤｒａ ＩＩＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＲＴで２ｈ共にライゲーションした。ＭＣ１０６１エレクトロコンピテント細胞を３ｍｌのライゲーション反応で形質転換した後、大腸菌形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Sigma-Aldrich）を含有する２ＹＴプレート上で選択した。
【００４０】
ｐＨＥＫＡベクターへＦａｂ遺伝子をサブクローニングするために、＃５（５’−ｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｔｇｔｔａａｔｔａａｇｇａｇｇａａｔｔｔａａａｇａａｔｔｃａｔｇａａａａａａｃｔｇｃｔｇｔｔｃｇｃｇａｔｔｃｃｇｃｔ−３’（配列番号：２５））および＃６（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔａｔｔａａｃａａｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｃａａｃｔｃｔｃｔｔｇｔｃｃ−３’（配列番号：２６））の１組のＰＣＲプライマーを使用して、Ｆｄ（ＶＨ＋ＣＨ１）鎖遺伝子をpHf1g3A-2ファージミドベクターからＰＣＲ増幅し、＃７（５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃａｔｇａａａａａｇａｃａｇｃｔａｔｃｇｃｇａｔｔｇｃａｇｔｇ−３’（配列番号：２７））および＃８（５’−ａｔｔｃｃｔｃｃｔｔａａｔｔａａｃａｇａｔｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇａｔｔａａｃａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃｔｔｔｇｔ−３’（配列番号：２８））の１組のＰＣＲプライマーを使用して、Ｌ鎖遺伝子をpLT-2プラスミドベクターからＰＣＲ増幅した。得られたＦｄおよびＬ鎖遺伝子フラグメントをＰＣＲ＃６および＃７プライマーをＰＣＲ＃６および＃７プライマーを使用して連結ＰＣＲを通じて組み立て、約１．４ｋｂｐの大きさの得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出した。その後、ＰＣＲ産物およびｐＨＥＫＡプラスミドをＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＲＴで２ｈ共にライゲーションし、大腸菌ＭＣ１０６１またはＳＵＰＥＸ５エレクトロコンピテント細胞へエレクトロポレーションした。ｐＨＥＫＡ発現ベクターの製造に使用したＰＣＲプライマーを下記表１に示す。図１８はｐＨＥＫＡ発現ベクターの図解を示す。
【００４１】
【表１】
2018172391.tif 000002
【００４２】
１−（５）変異体大腸菌ＳＵＰＥＸ５株の確立
化学的変異誘発を従来研究に記載のとおり本質的に行った。簡潔には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と融合した抗ヒト分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ２（ＢＣＫＤ−Ｅ２）ｓｃＦｖを発現する大腸菌ＭＣ１０６１細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリアブロス（ＬＢ）培地中で約０．３のＯＤ６００まで増殖させた。５ｍｌの培地中に含有された細胞を３，０００ｇで１０ｍｉｎの遠心分離によって集め、冷えた０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で２回洗浄した。次いで細胞を１．９ｍｌの同じバッファー中に再懸濁し、３７℃で１５、３０および４５ｍｉｎ、５０μｇ／ｍｌのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（Sigma-Adrich,St. Louis, MO, USA）で処置した。ＭＮＮＧ処置の後、細胞を混合し、２回洗浄し、２ｍｌのＬＢ培地中に再懸濁した。二膜系（two-membrane system）のコロニーリフトアッセイを記載のとおり次いで実施した。簡潔には、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートを、低タンパク質結合能力の第一のナイロン膜（０．４５ｍのNytran N Nylon blotting membrane）（GE Healthcare Life Science, Wauwatosa, WI, USA）で覆った。変異した細菌を１０６細胞／プレートの密度で膜上に広げ、３７℃で８ｈ増殖させた。一方、第二のニトロセルロース膜（Bio-Trace（商標）NT Nitrocellulose Transfer Membrane）（PALL, Port Washington, NY, USA）を５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１ｍＭイソプロピル−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Sigma-Aldrich）を含有する新たなＬＢ寒天プレート上に被せた。
【００４３】
第一のナイロン膜をＬＢ寒天プレートから除去し、第二の膜の上に配置し、続いて３７℃で５ｈインキュベーションした。インキュベーション後、（コロニーを有する）第一の膜を除去し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する新たなＬＢ寒天プレート上に配置し、細菌の後の回復のために４℃で保存した。第二の膜を０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を含有する新たなリン酸緩衝生理食塩水中で１０ｍｉｎ３回洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）基質（Duchefa, Haarelem, Netherlands）中に浸漬し、大腸菌コロニーのＡＰを可視化した。特有のＡＰ活性を示す大腸菌コロニーを対応する第一のフィルターから採取し、共にプールし、二回目の変異誘発およびコロニーリフトアッセイを実施した。二回目のコロニーリフトアッセイ後、一時的な陽性大腸菌クローンを選択し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する１０ｍｌの２ＹＴ培地中でＯＤ６００が０．５に達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度で培地中に加え、細胞を２７℃で一晩増殖させた。培養上清を次いで３，３００ｇで２０ｍｉｎの遠心分離によって採取した。ペリプラズム抽出物を製造するために、細胞ペレットをペリプラズム抽出バッファー（２ストック；２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、冷凍および解凍を３回行い、４℃で２０ｍｉｎ、１０，０００ｇで遠心分離した。可溶性抗ＢＣＫＤ−ＡＰ融合を含有するペリプラズム抽出物を上清を採取することによって最終的に得た。
【００４４】
培養上清のおよびペリプラズム抽出物の系列希釈を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma-Aldrich）を含有するＰＢＳを使用することによって製造し、５０ｍｌの培養上清またはペリプラズム抽出物試料を９６ウェルマイクロタイタープレート（SPL, South Korea）において１００ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）基質（Roche, South Sna Francisco, CA, USA）と混合した。５〜１０ｍｉｎ後、２５μｌの３ＭのＮａＯＨを各ウェルに加え、反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダー（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用して４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗ＢＣＫＤ−ＡＰ融合の増強した発現を示す４つの変異体大腸菌株（Ｍ＃５、Ｍ＃７、Ｍ＃５４およびＭ＃６９）を抗生物質を有さない２ＹＴ培地において３７℃で一晩増殖させた。細胞を次いで約１０３細胞／プレート密度でＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩増殖させた。得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するか、または有さないＬＢ寒天プレート上で複製した。抗生物質を有さないＬＢ寒天プレート中で増殖したが、抗生物質を有するＬＢ寒天プレート中では増殖しなかった大腸菌コロニーを選択し、抗生物質を有さない２ＹＴ培地中でＯＤ６００が約１．０に達するまで増殖させた。細胞ストックをグリセロール（２０％ｖ／ｖ）を加えることによって製造し、８０℃で保存した。クローニングに使用するために、エレクトロコンピテント細胞を標準的なプロトコルにしたがって変異体株から製造し、８０℃で保存した。Ｍ＃５、変異体大腸菌株の１つ、を、ＳＵＰＥＸ５（ＫＣＴＣ １２６５７ＢＰ）と称し、ＦａｂおよびＦａｂエフェクター融合タンパク質を発現させるために使用した。
【００４５】
１−（６）酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
モノクローナルファージＥＬＩＳＡのために、組み換えファージをファージレスキューによって陽性大腸菌クローンから得、約１０８ＣＦＵ／ウェルを５μｇ／ｍｌのＨＳＡ、ＲＳＡ、ＭＳＡまたはＢＳＡでコートされたMaxiSorb ELISAプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に加えた。ファージをｐＨ６またはｐＨ７．４のいずれかにおいて３７℃で１ｈ抗原に結合させた。ＨＲＰＯと結合したヤギ抗ヒトκＬ Ａｂ（Sigma-Aldrich）を二次抗体として使用した。結合シグナルをＴＭＢ基質（BD Science, San Jose, CA, USA）で可視化し、４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用して測定した。データは３つの実験の標準偏差の平均を表す。従来のＥＬＩＳＡのために、５μｇ／ｍｌの濃度における様々な抗原［ヒトＳＡ、ラットＳＡ、マウスＳＡ、サルＳＡ（Alpha diagnositic Intl., San Antonio, TX, USA）、イヌＳＡ（CUSABIO, Wuhan, Hubei, China）、ウサギＳＡ（Sigma-Aldrich）、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）（R&D systems, Minneapolis, MN, USA）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）（R&D systems）、ＩＬ−１５レセプターα（ＩＬ−１５Ｒα）（R&D systems）、ＩＬ−１β（eBioscience, San Diego, CA, USA）、ＣＤ１６ａ（R&D systems）、ｃ−ＭＥＴ（Sinobiological, Beijing, China）］をマイクロタイタープレート上に固定化し、Ｆａｂ分子抗原に結合させ、上記のとおり検出した。可溶性ＦａｂまたはＦａｂ−ｈＧＨ融合タンパク質の濃度を決定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを捕捉Ａｂとしてマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ ｍＡｂ（AprilBio）を、検出抗体としてＨＲＰＯ結合ヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂ（Sigma-Aldrich）を使用して実施した。
【００４６】
既知の濃度のヒトＦａｂフラグメント（Bethyl, Montgomery, TX, USA）を使用して標準曲線を描いた。ｈＧＨドメインを検出するために、ｈＧＨのＣ末端に特異的なヤギｐＡｂであるT-20（Santacruz Biotechnology, Dallas, Tx, USA）および全長ｈＧＨに特異的なマウスｍＡｂであるNYThGH（Prospec, East Brunswick, NJ, USA）を使用し、続いてＨＲＰＯ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ ｐＡｂ（Sigma-Aldrich）またはＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ ｐＡｂ（Sigma-Aldrich）をそれぞれ二次抗体として使用した。ヤギ抗ヒトＧＣＳＦ ｐＡｂ（R&D systems）を使用してＧ−ＣＳＦドメインを検出し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−β ｐＡｂ（PEPROTECH, Rocky Hill, USA）を使用してＩＦＮ−βドメインを検出した。
【００４７】
１−（７）可溶性ＦａｂおよびＦａｂエフェクター融合タンパク質の製造
可溶性ＦａｂおよびＦａｂ−ｈＧＨ融合タンパク質を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１０ｍｌまたは１Ｌの２ＹＴ培地中で大腸菌ＳＵＰＥＸ５細胞をＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで３７℃で増殖させることによって産生し、続いて０．０５ｍＭのＩＰＴＧを加えた。２０℃における２０ｈの激しい振盪を伴うインキュベーション後、培養上清および細胞ペレットを３，３００ｇにおける２０ｍｉｎの遠心分離によって分離した。前述のとおりペリプラズム抽出物を得た。精製のために、培養上清および／またはペリプラズム抽出物を次いでＨＳＡ（AprilBio）で固定化されたセファロース４Ｂ樹脂に通過させた。大規模洗浄の後、樹脂に結合したＦａｂ分子を溶出バッファー（０．１Ｍグリシン、１０％グリセロール、ｐＨ３）で溶出し、続いて直ちにＴｒｉｓバッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０）で中和した。AKTA FPLC（GE Healthcare, Wauwatosa, WI, USA）を使用する親和性精製の後、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒのゲルろ過もまた実施した。簡潔には、Hiprep（商標）16/60 Sephacryl（商標）S-200HRP repacked Columnを平衡バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化し、５μｌのＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合）で充填した。溶出を、０．３５Ｍｐａのアラーム圧力および０．５μｌ／ｍｉｎの運転流速での平衡バッファーで実施した。フラクション番号１３、１６、１９および２３を、下記に記載のとおりＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００４８】
１−（８）バイオレイヤー干渉法による親和性測定
精製したＳＬ３３５と抗原（ヒトＳＡ、ラットＳＡまたはマウスＳＡ）との間でリアルタイム結合アッセイを、ＡＲ２Ｇ（アミン反応性第二生成）センサーを使用したことを除き、Octet RED system（ForteBio, Menlo park, CA, USA）によるバイオレイヤー干渉法を使用して、従来記載されたとおり実施した（Costin et al., (2013) J Virol. 87, 52-66）。簡潔には、既定の濃度のＳＬ３３５をカイネティクス等級のＡＲ２Ｇバイオセンサーへ結合させ、未結合のＦａｂフラグメントをカイネティクスバッファー（１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５）をインキュベートすることによってセンサーの表面から除去した。プローブを次いで、ヒトＳＡ、ラットＳＡまたはマウスＳＡに、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４条件下の既定の濃度（ｐＨ６およびｐＨ７．４でのヒトＳＡ濃度：２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭ；ｐＨ６でのラットＳＡ濃度：４ｍＭ、１ｍＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭおよび１２５ｎＭ；ｐＨ７．４でのラットＳＡ濃度：４ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、５００ｎＭおよび１２５ｎＭ；ｐＨ６およびｐＨ７．４でのマウスＳＡ濃度：２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭおよび１２．５ｍＭ）において、結合させ、続いて０．１％のＢＳＡを含有するｐＨ６またはｐＨ７．４のＰＢＳ中で解離させた。結合および解離カイネティクスを、観察された結合曲線を１：１結合モデルに対してフィッティングして会合速度定数を算出するOctet QK software packageを使用して算出した。会合および解離速度定数を少なくとも３つの異なる濃度のヒトＳＡ、ラットＳＡまたはマウスＳＡを使用して算出した。平衡解離定数を、カイネティック解離速度定数をカイネティック会合速度定数で除したものとして算出した。
【００４９】
１−（９）ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合コンストラクトの生成
ＳＬ３３５ｄｓを作製するために、Ｈｓｅｒと称される変異体Ｆｄ（Ｃｙｓ２３３ Ｓｅｒ２３３置換）を、１組のＰＣＲプライマー＃９（５’−ｇｇｇｇａａｔｔ  ｃａｔｇａａａｔａｔｃｔｇｃｔｇｃｃｔａｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａｃａａ−３’（配列番号：２９））および＃１０（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’配列番号：３０））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｆｄ鎖遺伝子からのＰＣＲ増幅によって得た。約７５０ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処置し、ｐＨＥＫＡとライゲーションした。Ｌｓｅｒと称される変異体Ｌ鎖（Ｃｙｓ２１４→Ｓｅｒ２１４置換）もまた、１組のＰＣＲプライマー＃１１（５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃａｔｇａａａａａａａｃｔｇｃｇａｔｔｇｃｇａｔｔｇｃｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｇｇｃｔｔｔｇ−３’（配列番号：３１））および＃１２（５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｔｔｔｃｇｃ  ｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔｇ−３’（配列番号：３２））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｌ鎖遺伝子からのＰＣＲ増幅によって得、ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉで切断し、Ｈｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓコンストラクトを生成するためのクローニング手順は以下のとおりとした：
【００５０】
Ｈｃｙｓと称されるＣｙｓ２３３を有する野生型Ｆｄを、１組のＰＣＲプライマー＃９および＃１３（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃａｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’（配列番号：３３））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化ＦｄからＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するｈＧＨもまた、１組のＰＣＲプライマー＃１４（５’−ｇｇｔｔｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｇａｔｃｔｔｔｔｃｃｇａｃｃａｔｔｃｃｇｃｔｇａｇｃｃｇ−３’（配列番号：３４））および＃１５（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇａａｇｃｃｇｃａｇｇａｇｃｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号：３５））を使用して、コドン最適化ｈＧＨ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＨｃｙｓおよびｈＧＨ遺伝子を共に連結し、１組のＰＣＲ＃９および＃１５プライマーを使用してアセンブリーＰＣＲによってＨｃｙｓＧを生成し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｌｃｙｓと称されるＳＬ３３５のＣｙｓ２１４を有する野生型Ｌ鎖を含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＬｃｙｓＧ／Ｈｃｙｓコンストラクトを生成するために、Ｌｃｙｓを、１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃１６（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃａｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：３６））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｌ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するｈＧＨもまた、１組のＰＣＲプライマー＃１４および＃１７（５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇａａｇｃｃｇｃａｇｇａｇｃｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号：３７））を使用して、コドン最適化ｈＧＨ遺伝子からＰＣＲ増幅した。
【００５１】
ＬｃｙｓおよびｈＧＨ遺伝子を連結し、１組のＰＣＲ＃１１および＃１７プライマーを使用してアセンブリーＰＣＲによってＬｃｙｓＧを生成し、ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉで切断し、野生型Ｆｄを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＨｓｅｒＧ／Ｌｃｙｓコンストラクトを作製するために、Ｈｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃９および＃１８（５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇａａｇｃｃｇｃａｇｇａｇｃｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号：３８））を使用して、コドン最適化野生型Ｆｄ鎖からＰＣＲ増幅した。リンカー配列を含有するｈＧＨのＰＣＲ増幅、アセンブリーＰＣＲおよびＨｓｅｒＧのクローニングを実施し、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓコンストラクトを作製した。ＬｓｅｒＧ／Ｈｃｙｓコンストラクトを生成するために、Ｌｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃１９（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’（配列番号：３９））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｌ鎖からＰＣＲ増幅した。リンカー配列を含有するｈＧＨのＰＣＲ増幅、アセンブリーＰＣＲおよびＬｓｅｒＧのクローニングを実施し、ＬｃｙｓＧ／Ｈｃｙｓコンストラクトを作製した。ＨｅｒＧ／Ｌｓｅｒコンストラクトを生成するために、ＨｓｅｒＧおよびｈＧＨのＰＣＲ増幅、およびアセンブリーＰＣＲを実施し、Ｌｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡをクローニングに使用することは除いて、ＨｓｅｒＧ／Ｌｃｙｓコンストラクトを作製した。Ｈｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡをクローニングに使用することを除き、ＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒもまた構築し、ＬｓｅｒＧ／Ｈｃｙｓコンストラクトを作製した。ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合コンストラクトおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合コンストラクトを製造するためのＰＣＲプライマーを以下の表２に示す。
【００５２】
【表２】
2018172391.tif 000003
【００５３】
１−（１０）ＳＬ３３５−ＧＣＳＦ融合コンストラクトの生成
ＨｃｙｓＧＦ／Ｌｃｙｓコンストラクトを生成するためにクローニング手順を以下のとおりとした；Ｈｃｙｓを、１組のＰＣＲプライマー＃９および＃２０（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔｇ−３’（配列番号：４０））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｈ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するＧ−ＣＳＦもまた、１組のＰＣＲプライマー＃２１（５’−ｇｇｔｔｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｇｃｃｔａｃｃｔａｔｃｇｃｇｃｇａｇｃａ−３’（配列番号：４１））および＃２２（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔａｔｔａａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇａｔｇｇｃｇｃａｇ−３’（配列番号：４２））を使用して、コドン最適化Ｇ−ＣＳＦ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＨｃｙｓおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃９および＃２２プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＳＬ３３５のＬ鎖を含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＬｃｙｓＧＦ／Ｈｃｙｓコンストラクトを生成するために、Ｌｃｙｓを、１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃２３（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃａｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：４３））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｌ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するＧ−ＣＳＦもまた、１組のＰＣＲプライマー＃２１および＃２４（５’−ｔａａｃａｇａｔｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇａｔｔａａｇｇｃｔｇｔｇｃｃａｇａｔｇｇｃｇｃａｇ−３’（配列番号：４４））を使用して、コドン最適化Ｇ−ＣＳＦ遺伝子からＰＣＲ増幅した。
【００５４】
１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃２５（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’（配列番号：４５））を使用して、アセンブリーＰＣＲによってＬｃｙｓおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子を連結し、ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉで切断し、ＳＬ３３５のＦｄを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＨｓｅｒＧＦ／Ｌｓｅｒコンストラクトを作製するために、Ｈｓｅｒを、１組のＰＣＲ＃９および＃２５プライマーを使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化ＦｄからＰＣＲ増幅した。ＨｓｅｒおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃９および＃２２プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｌｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＬｓｅｒＧＦ／Ｈｓｅｒコンストラクトを生成するために、Ｌｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃２６（５−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔｇ−３（配列番号：４６））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｌ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するＧ−ＣＳＦもまた、１組のＰＣＲ＃２１および＃２４プライマーを使用して、コドン最適化Ｇ−ＣＳＦ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＬｃｙｓおよびＧ−ＣＳＦ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃１１および＃２５プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって連結し、ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉで切断し、Ｈｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＳＬ３３５−ＧＣＳＨ融合コンストラクトおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦ融合コンストラクトを製造するためのＰＣＲプライマーを以下の表３に示す。
【００５５】
【表３】
2018172391.tif 000004
【００５６】
１−（１１）ＳＬ３３５−ＩＦＮ−ｂ融合コンストラクトの生成
ＨｃｙｓＩＦＮｂ／Ｌｃｙｓコンストラクトを生成するためのクローニング手順は以下のとおりとした。Ｈｃｙｓを、１組のプライマー＃９および＃２７（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃａｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’（配列番号４７））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｈ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するＩＦＮ−ｂもまた、１組のＰＣＲプライマー＃２８（５’−ｇｇｔｔｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｇａｔｃｔｔｃａｔａｃａａｃｃｔｇｃｔｇｇｇｃｔｔｃｃｔｇ−３’（配列番号４８））および＃２９（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇｔｔｇｃｇｃａｇａｔａｇｃｃｇｇｔｃａｇ−３’（配列番号４９））を使用して、コドン最適化ＩＦＮ−ｂ１ａ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＨｃｙｓおよびＩＦＮ−ｂ１ａ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃９および＃２９プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｌｃｙｓを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＨｓｅｒＩＦＮ−ｂ／Ｌｓｅｒコンストラクトを作製するために、Ｈｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃９および＃３０（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｔｃｇｇｔｔｃｃａｃｇｃｇｔｔ−３’（配列番号５０））を使用して、ＳＬ３３５のコドン最適化Ｈ鎖からＰＣＲ増幅した。ＨｓｅｒおよびＩＦＮ−ｂ １ａ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃９および＃２９プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、Ｌｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＳＬ３３４−ＩＦＮｂ融合コンストラクトおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ＩＦＮｂ融合コンストラクトを製造するためのＰＣＲプライマーを以下の表４に示す。
【００５７】
【表４】
2018172391.tif 000005
【００５８】
１−（１２）ＥＧＬ４−ｈＧＨおよび１ｂ２８−ｈＧＨ融合コンストラクトの生成
ＥＧＬ４、ヒト抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ、および１ｂ２８、ヒト抗ＩＬ−１ｂ Ｆａｂ、をＨｕＤＶＦａｂ−８Ｌ抗体ライブラリーから単離した（未発表、AprilBio Co.）。ＥＧＬ４ｗｔおよびＥＧＬ４Δｄｓを作製するために、ＨｃｙｓおよびＨｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃５および＃６、＃５および＃３１（５’−ｇｇｇａａｇｃｔｔａｔｔａａｃｔａｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｃａａｃｔｃｔｃｔｔｇ−３’（配列番号５１））をそれぞれ使用して、ＥＧＬ４ ｃＤＮＡのＨ鎖遺伝子からＰＣＲ増幅した。約７５０ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理し、ｐＨＥＫＡでライゲーションし、続いてＭＣ１０６１コンピテント細胞を形質転換した。ＬｃｙｓおよびＬｓｅｒもまた、１組のＰＣＲプライマー＃１１および＃３２（５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃａｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔ−３’（配列番号５２））、＃１１および＃３３（５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｔｔｔｃｇｃｃｇｃｇｇｔｔａａａｇｃｔｃｔｔｔ−３’（配列番号５３））をそれぞれ使用して、ＥＧＬ４ ｃＤＮＡのＬ鎖遺伝子からＰＣＲ増幅した。それらをＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉで切断し、ＥＧＬ４のＨｃｙｓまたはＨｓｅｒをそれぞれ含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＥＧＬ４ｗｔ−ｈＧＨ融合コンストラクトを作製するために、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓコンストラクトを生成するためのクローニング手順を以下のとおりとした。
【００５９】
Ｈｃｙｓを、１組のＰＣＲプライマー＃５および＃３４（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃａｃａａｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｃａａｃｔｃｔｃｔｔｇｔｃ−３’（配列番号５４））を使用して、ＥＧＬ４ ｃＤＮＡのＨ鎖ＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するｈＧＨもまた、１組のＰＣＲ＃１４および＃１５プライマーを使用してコドン最適化ｈＧＨ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＨｃｙｓおよびｈＧＨ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃５および＃１５プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＥＧＬ４のＬｃｙｓを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。ＥＧＬ４Δｄｓ−ｈＧＨ融合コンストラクトを作製するために、Ｈｓｅｒを、１組のＰＣＲプライマー＃５および＃３５（５’−ａｇａｔｃｃａｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａａｃｃａｃｔａｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｃａａｃｔｃｔｃｔｔｇｔｃ−３’（配列番号５５））を使用して、ＥＧＬ４ ｃＤＮＡのＨ鎖からＰＣＲ増幅し、リンカー配列を含有するｈＧＨもまた、１組のＰＣＲ＃１４および＃１５プライマーを使用して、コドン最適化ＨＧＨ遺伝子からＰＣＲ増幅した。ＨｓｅｒおよびｈＧＨ遺伝子を、１組のＰＣＲ＃５および＃１５プライマーを使用して、アセンブリーＰＣＲによって共に連結し、ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＥＧＬ４ΔｄｓのＬｓｅｒを含有するｐＨＥＫＡへクローニングした。１ｂ２８ｗｔ、１ｂ２８Δｄｓ、１ｂ２８ｗｔ−ｈＧＨおよび１ｂ２８Δｄｓ−ｈＧＨを、１ｂ２８ ｃＤＮＡがＰＣＲ鋳型に供されることを除き、同じＰＣＲプライマーセットを使用して、ＥＧＬ４−ｈＧＨ融合として作製した。ＥＧＬ４−ｈＧＨおよび１ｂ２８−ｈＧＨ融合コンストラクトを製造するためのＰＣＲプライマーを以下の表５に示す。
【００６０】
【表５】
2018172391.tif 000006
【００６１】
１−（１３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、精製したＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨタンパク質を、NuPAGE（登録商標）Sample Reducing Agent（Invitrogen）を有するかまたは有しないNuPAGE（登録商標）LDS Sample Buffer（Invitrogen）中に再懸濁し、７μｇ／ウェル濃度でゲル上に充填した。タンパク質バンドをCoomassie Blue staining（Bio-Rad）を使用することによって可視化した。ウェスタンブロット分析のために、５００ｎｇの親和性精製したＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを上記の各ウェル上に充填し、ニトロセルロース膜へ移した。０．０１％のＴｗｅｅｎ（Sigma-Aldrich）を含有するＰＢＳ中の３％スキムミルク（Bio-Rad）で膜を遮断した後、AP（Bethyl）と結合したヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂでインキュベーションすることによって、タンパク質を検出した。ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）基質（Duchefa）を膜上に加え、結合シグナルを可視化した。
【００６２】
１−（１４）チップベースのキャピラリー電気泳動
チップベースのキャピラリー電気泳動をAgilent 2100 Bioanalyzer system（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）で行った。タンパク質試料を製造業者のプロトコルにしたがって製造し、５〜８０ｋＤａの間のタンパク質の分析に推奨されるProtein 80 kit上で分析した。簡潔には、還元または非還元の電気泳動のために、それぞれＤＴＴの存在下または非存在下で、試料を試料バッファーと混合した。試料を９５℃で変性し、蛍光色素およびゲル溶液を含む適切な試薬で満たしたチップ上に充填した。チップを次いでシステムに挿入し、Expert 2100 softwareを使用してシステムを運転した。結果をプロットし、タンパク質の大きさに対して蛍光強度単位を反映させた。
【００６３】
１−（１５）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、Autoflex III Smartbeam device（Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA）上で実施した。試料を同じ体積のＭＡＬＤＩマトリックス（１０ｍｇ／ｍＬのａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットした。外部校正をPeptide and Protein MALDI-MS Calibration Kit（Sigma-Aldrich）で実施した。１５０００１６００００および１００００７００００のｍ／ｚ範囲における質量スペクトルを、ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合について陽イオンモードにおいてそれぞれ得た。
【００６４】
１−（１６）インビトロｈＧＨ生理活性アッセイ
Ｎｂ２−１１ラットリンパ腫細胞（Sigma-Aldrich）を、３７℃で加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、５％ウマ血清（Sigma-Aldrich）および１％のPenicillinStreptomycin（Invitrogen）で補われた完全ＤＭＥＭ中で増殖させた（Tanaka et al., 1980）。細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、１，０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、５％（ｖ／ｖ）ウマ血清を含有するＤＭＥＭ中で８×１０４細胞／ｍｌで再懸濁した。５０μｇ分量の細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、一晩インキュベートした。次いで細胞を、５％ウマ血清を含有する５０ｍｌのＤＭＥＭ中で３７℃で４８ｈ、増加濃度（０〜２０ｎＭ）のGrowtropin（登録商標）（未改変ｒｈＧＨ；Dong-A Pharmaceuticals, Seoul, South Korea）またはＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨで処置した。インキュベーション後、１０μｌのＣＣＫ−８（Dojindo, Mashiki-machi, Japan）を各ウェルに加え、４ｈインキュベートした。吸光度を４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダー（Bio-Rad）上で記録した。
【００６５】
１−（１７）ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの血清安定性
ＳＬ３３５ｗｔおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ（１０μｇ／ｍｌの最終濃度）を０．０３％アジ化ナトリウムをを含有するウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）中に再懸濁し、３７℃で１６日間インキュベートした。小分量（５０ｍｌ）を毎日取り、使用前に−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡによってＨＳＡに対する結合反応性を決定し、インビトロｈＧＨ生理活性を上記のとおりＮｂ２−１１細胞（Sigma-Aldrich）を使用して測定した。
【００６６】
１−（１８）インビボの薬物動態アッセイ
ＰＫ研究を認定ＣＲＯ企業（ChemOn, Suwon, South Korea）で実施した。動物に齧歯動物ペレットの標準的な食物および水を任意に与え、制御された照明で一定の湿度および温度の部屋において保った（１２ｈ照明、続いて１２ｈ暗闇）。簡潔には、ＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂ（無関係なヒトＦａｂ）を、３匹のSprague Dawleyラットの群へ別々に１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）または皮下注射（Ｓ．Ｃ．）し、血清試料をいくつかの時点（Ｉ．Ｖ．について５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈおよび１４４ｈ、Ｓ．Ｃ．について５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、および９６ｈ）で得た。血清試料中のＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂの濃度を、ＨＲＰＯと結合したマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ ｍＡｂおよびヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂをキャプチャーとして使用し、抗体をそれぞれ検出するサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。既知の濃度のヒトＦａｂフラグメントもまたアッセイに含め、標準曲線を得た。血清濃度対時間の曲線を、WinNonlin software（ＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂ）を使用して非コンパートメントモデルにフィッティングさせ、Sigma Plot softwareを使用してプロットした。同様に、Growtropin（登録商標）およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを、３〜４匹のラットの群へ別々に静脈内注射または皮下注射した。Growtropin（登録商標）およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの投与は、それぞれ、Ｉ．Ｖ．投薬について０．３ｍｇ／ｋｇ、Ｓ．Ｃ．投薬について０．６ｍｇ／ｋｇであった。血清試料を、いくつかの時点（Growtropin（登録商標）について５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈおよび８ｈ、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨについて５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈおよび１４４ｈ）で得た。血清試料中のGrowtropin（登録商標）の量を、hGH ELISA detection kit（Genway, San Diego, CA, USA）を使用して測定し、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのそれを、上記のとおりサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。血清濃度対時間曲線を、Phoenix（商標）WinNonlin software（Version 6.2）を使用して、１つのコンパートメントモデルについてフィッティングさせた。
【００６７】
１−（１９）インビボの薬力学的なアッセイ
Growtropin（登録商標）の日常的な投与および重量増加を促すためのＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの週１回投与の能力を、ChemOnでＳ．Ｃ．投薬を使用することによって、従来記載されたとおり（Clark et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 21969-21977を参照）、下垂体切除ラットにおいて分析した。簡潔には、若齢の下垂体切除Sprague Dawleyラット（Harlan, Tokyo, Japan）を購入し、外科手術後の第一の１５日間、７ｇよりも大きく増したあらゆる動物を研究から除外した。動物を５つの処置群（賦形剤のみ、０．３ｍｇ／ｋｇのGrowtropin（登録商標）の日常的な注射および週１回の０．６ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇまたは２．４ｍｇ／ｋｇのＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの注射）について無作為に選んだ。投与計画の開始後、体重を日常的に記録した。脛骨の骨成長を骨カリパスで慎重に測定した。統計比較を分散の分析を使用して行い、続いてDunnetts Multiple Comparison 試験を行い、０．０５未満のｐ値を有意なものとした。
【００６８】
２．実験結果
２−（１）抗ＳＡ Ｆａｂクローンの単離
ＨｕＤＶＦａｂ−８Ｌ抗体ライブラリーを、ｐＨ６またはｐＨ７．４でヒトＳＡ、ラットＳＡまたはマウスＳＡと結合した磁気ビーズに対して選択した。３回のバイオパニングの後、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施し、抗原に特異的であるファージ抗体クローンを識別した。６０よりも多い陽性クローンをＥＬＩＳＡによって同定し（データは示されない）、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のＤＮＡシーケンシング分析によってそれぞれＳＡ１３８、ＳＡ１３９、ＳＡ１４０、ＳＡ１４１、ＳＬ１８、ＳＬ３０１、ＳＬ３１０およびＳＬ３３５と称される８つの別個のファージ抗体を同定した。これらのクローンのヒトＳＡ、ラットＳＡ、マウスＳＡまたはウシＳＡに対する結合反応性を、ｐＨ６またはｐＨ７．４条件（図１Ａ＆１Ｂ）下でモノクローナルファージＥＬＩＳＡによって確認した。３つのファージ抗体クローン、ＳＡ１３８、ＳＡ１３９およびＳＡ１４１は、ｐＨ条件に拘らずヒトＳＡに対してのみ反応性であった。ＳＡ１４０は、ｐＨ７．４においてのみヒトＳＡも認識したが、その結合反応性は、ｐＨ６において失われた。他方、ＳＬ１８、ＳＬ３１０およびＳＬ３３５は、両方のｐＨ条件下でわずかに異なる強度で、ヒトＳＡ、ラットＳＡおよびマウスＳＡに結合した。ＳＬ３０１は、両方ｐＨにおいてヒトＳＡおよびラットＳＡに対して顕著に反応性であり、マウスＳＡに対してはｐＨ７．４のみにおいて弱い反応性であった。８つのＦａｂクローンのいずれもウシＳＡに対して反応性ではなかった。ＳＬ１８、ＳＬ３０１、ＳＬ３１０およびＳＬ３３５を、少なくとも２つの異なる種からのＳＡに対するそれらの交差反応性のため、さらに特性決定した。４つのファージ抗体クローンのＦｄおよびＬ鎖遺伝子を大腸菌におけるペリプラズム発現のためのｐＨＥＫＡベクターへサブクローニングし、可溶性Ｆａｂフラグメントを培養上清またはペリプラズム抽出物から製造した。親和性精製の後、ＥＬＩＳＡを実施し、ｐＨ６（図２Ａ）およびｐＨ７．４条件（図２Ｂ）の下でヒトＳＡ、ラットＳＡまたはマウスＳＡに対するこれらのフラグメントの結合反応性を比較した。
【００６９】
マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて５μｇ／ｍｌの濃度でＨＳＡ、ＲＳＡ、ＭＳＡまたはＢＳＡを固定化し、４つの精製したＦａｂ分子（ＳＬ１８、ＳＬ３０１、ＳＬ３１０およびＳＬ３３５）をｐＨ６．０（図２Ａ）またはｐＨ７．４（図２Ｂ）で抗原に結合させた。ＨＲＰＯ結合ヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂを二次抗体として使用した。ＴＭＢ基質を使用して結合シグナルを可視化し、４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Bio-Rad）を使用して測定した。データは、３つの実験の平均標準偏差を表す。ヒトＳＡ結合において、結合シグナルの順番は、ｐＨ６およびｐＨ７．４の両方において、ＳＬ３３５＞ＳＬ３１０＞ＳＬ３０１＞ＳＬ１８であった。ラットＳＡ結合において、順番は、ｐＨ６においてＳＬ３３５＞ＳＬ３１０＞ＳＬ３０１＞ＳＬ１８、ｐＨ７．４においてＳＬ３３５＝ＳＬ３１０＞ＳＬ３０１＝ＳＬ１８であった。マウスＳＡ結合において、順番は、ｐＨ６においてＳＬ１８＞ＳＬ３３５＞ＳＬ３１０、ｐＨ７．４においてＳＬ３３５＞ＳＬ３１０＞ＳＬ１８であった。図２に従って、ＳＬ３０１は、ｐＨ６においてマウスＳＡに結合しなかったが、ｐＨ７．４においては極めて弱く結合した。ＳＬ３３５は、ヒトＳＡおよびラットＳＡの両方に対して、ｐＨ条件に拘らず、４つのＦａｂクローン間で最も良好な結合体であることがわかった。ＳＬ３３５は、ｐＨ６において、ｐＨ７．４においてよりも、ヒトＳＡに２倍強く結合し（２０ｎｇ／ｍｌ対４０ｎｇ／ｍｌの５０％結合シグナル）、同じｐＨ条件下でラットＳＡよりも２０倍強く結合し（２０ｎｇ／ｍｌ対４００ｎｇ／ｍｌの５０％結合シグナル）、ｐＨ７．４においてラットＳＡよりも４倍強く結合した（４０ｎｇ／ｍｌ対１６０ｎｇ／ｍｌの５０％結合シグナル）。
【００７０】
２−（２）ＳＬ３３５の交差反応性および結合親和性
ＳＬ３３５は、４つの抗ヒトＳＡ Ｆａｂクローン間で最も良好な結合体であったことから、その交差反応性をＥＬＩＳＡによってさらに分析した。ヒトＳＡ、ラットＳＡおよびマウスＳＡに対する結合反応性を、図２に示すとおり再現した。ＳＬ３３５は、カニクイザルＳＡを極めて強く認識し、イヌＳＡには弱く結合することもわかった。しかしながら、ＳＬ３３５は、ウサギＳＡならびにＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＩＬ−１５Ｒａ、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ１６ａまたはｃ−ＭＥＴを含む他の無関係な抗原を認識しなかった。ＳＬ３３５のｐＨ６またはｐＨ７．４におけるヒトＳＡ、ラットＳＡおよびマウスＳＡに対する結合親和性を、異なる濃度の抗原をＳＬ３３５でコートされたバイオセンサー上を通過させることによって、バイオレイヤー干渉法を介してさらに測定した（以下の表６を参照）。結果は、ＳＬ３３５のＨＳＡに対する解離定数がそれぞれｐＨ６において９ｎＭ、ｐＨ７．４において１３ｎＭであった点において、図２におけるＥＬＩＳＡデータとよく相関し、ＲＳＡに対するそれらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４においてそれぞれ１２２ｎＭおよび６５ｎＭであった。ＭＳＡについてＳＬ３３５の結合親和性は、ｐＨ６においておよそ１０ｍＭ、ｐＨ７．４においておよそ１．６ｍＭであったが、これらのデータは、信頼性の欠如のために表６に含まれなかった。
【００７１】
【表６】
2018172391.tif 000007
【００７２】
２−（３）ＳＬ３３５のインビボの薬物動態
血漿タンパク質のすべてのうち、ＨＳＡは、ＦｃＲｎ媒介リサイクル機構を通じて例外的に長い半減期を有し、治療タンパク質の半減期を延長するための融合パートナーとして一般的に使用される。さらに、血清アルブミンに関連する抗体フラグメントは、延長された血清半減期を有することが知られている。そこで、薬物動態学的な分析を実施し、ＳＬ３３５もまた長い血清半減期を有するのかどうか確認した。未知の結合特異性を有するヒトＦａｂは、陰性対照（Ｎｅｇ Ｆａｂ）として含まれた。ＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂを、３匹のラットの群へ１ｍｇ／ｋｇで別々に静脈内注射または皮下注射し、いくつかの時点で（Ｉ．Ｖ．について５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈおよび１４４ｈ、Ｓ．Ｃ．について５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、および９６ｈ）血清試料を採取した。血清試料中のＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂの濃度を、マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ ｍＡｂおよびＨＲＰＯと結合したヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂをキャプチャーとして使用し、抗体をそれぞれ検出するサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。既知の濃度のヒトＦａｂフラグメントもアッセイに含め、標準曲線を得た。血清濃度対時間の曲線を、WinNonlin softwareを使用する１つのコンパートメントモデル（ＳＬ３３５およびＮｅｇ Ｆａｂ）およびSigma Plot softwareを使用する２コンパートメントモデルについてフィッティングさせた。静脈内投薬において、ＳＬ３３５の末端半減期（ｔ１／２）は３７ｈであり、その曲線下の面積（ＡＵＣ０→∞）は１８７ｈ ｍｇ／ｍｌであり、Ｎｅｇ Ｆａｂと比較して、ｔ１／２における１０倍の増加、ＡＵＣ０→∞における２６倍の増加を表した（それぞれ３．８ｈおよび７ｈ ｍｇ／ｍｌ）（図３Ａ）。ＳＬ３３５の皮下注射は、Ｎｅｇ Ｆａｂと比較して、ｔ１／２における９倍の増加（１２０ｈ対１３ｈ）およびＡＵＣ０→∞における４４倍の増加（８７対２ｈ ｍｇ／ｍｌ）を含む同様な測定をもたらした（図３Ｂ）。これらの結果は、明確に延長されたＳＬ３３５の血清半減期を示し、ＳＬ３３５がラットにおけるＲＳＡとＦｃＲｎとの間の相互作用に干渉しないであろうということを示唆した。
【００７３】
２−（４）ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合の産生
ＳＬ３３５を使用し、２つのＳＬ３３５−ｈＧＨ融合および４つのさらなるＳＬ３３５−ｈＧＨ融合を、組み換えｈＧＨ（２７〜１９１ａａ）をＦｄまたはＬ鎖のＮまたはＣ末端に短いペプチドリンカーを介して遺伝子的に融合することによって作製した。組み換えｈＧＨ ｃＤＮＡ（２７〜１９１ａａ）を古典的なＦａｂ形態で短いペプチドリンカーを介してＳＬ３３５ｗｔのＨまたはＬ鎖のＣ末端に融合し、２つの融合フォーマット（ＨｃｙｓＧ／ＬｃｙｓおよびＬｃｙｓＧ／Ｈｃｙｓ）の構築をもたらした。４つのさらなる融合フォーマット（ＨｓｅｒＧ／Ｌｃｙｓ、ＬｓｅｒＧ／Ｈｃｙｓ、ＨｓｅｒＧ／ＬｓｅｒおよびＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒ）もまた、Ｃ末端ＣＨ１におけるＣｙｓ２３３および／またはＣ末端ＣＬｋにおけるＣｙｓ２１４がＳｅｒで置き換わったヌル（null）形態（ＳＬ３３５ヌル）またはｄｓ Ｆａｂ形態（ＳＬ３３５Δｄｓ）のＳＬ３３５を使用することを除き、上記のとおり構築した。融合タンパク質のペリプラズム発現のために、ｏｍｐＡ（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号５６））リーダー配列をＬ鎖またはＬ−ｈＧＨ融合の上流において位置させ、ｐｅｌＢリーダー配列（ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号５７））をＨ鎖またはＨ−ｈＧＨ融合の上流において位置させた。これらの予備的な実験において、ｈＧＨのＦｄまたはＬ鎖のＮ末端に対する遺伝子的連結は、可溶性融合タンパク質の低発現かまたは無発現をもたらした。ｈＧＨのＦｄのＣ末端に対する融合は、低発現収量も示し、おそらくＳＬ３３５−ｈＧＨ融合における異常なジスルフィド結合（データは示されない）のためにｈＧＨドメインのフォールディングを妨げるものと考えられた。
【００７４】
従来、ＣＨ１およびＣＬｋにおけるＣ末端Ｃｙｓ残基（それぞれＣｙｓ２３３およびＣｙｓ２１４）を変異させることによるＦａｂの鎖間ジスルフィド結合の除去は、ペリプラズムの産生、抽出および精製の際の安定性、血清安定性または血清半減期のレベルに影響を与えないことが報告されている（Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest; Humphreys et al., (1997) J. Immunol. Methods. 209, 193202; Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel. 20, 227234.を参照）。我々は、ＣＨ１のＣｙｓ２３３およびＣＬｋのＣｙｓ２１４の両方をセリンで置き換えることによって（Ｃｙｓ２３３ Ｓｅｒ２３３およびＣｙｓ２１４ Ｓｅｒ２１４置換）、ＳＬ３３５におけるこれらのＣｙｓ残基が、ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合の可溶性発現および適切なフォールディングを調節するかどうか試験した。図４は、６つのＳＬ３３５−ｈＧＨ融合コンストラクトを例示する。ＳＬ３３５ｗｔおよびＳＬ３３５Δｄｓ以外に、ＳＬ３３５ヌルと称されるさらに１つのＳＬ３３５バリアントもまた、各システイン残基（Ｃｙｓ２３３またはＣｙｓ２１４）の効果を別々に明らかにするために、ＣＨ１のＣｙｓ２３３またはＣＬｋのＣｙｓ２１４のいずれかとＳｅｒとを置換することによって作製した。２つのＳＬ３３５ｗｔ融合誘導体は、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓ（ＬＣｙｓ２１４と対合したＨＣｙｓ２３３−ｈＧＨ融合）およびＬｃｙｓＧ／Ｈｃｙｓ（ＨＣｙｓ２３３と対合したＬＣｙｓ２１４−ｈＧＨ融合）であり、２つのＳＬ３３５ヌル融合誘導体は、ＨｓｅｒＧ／Ｌｃｙｓ（ＬＣｙｓ２１４と対合したＨＳｅｒ２３３−ｈＧＨ融合）およびＬｓｅｒＧ／Ｈｃｙｓ（ＨＣｙｓ２３３と対合したＬＳｅｒ２１４−ｈＧＨ融合）であった。最終的に、２つのＳＬ３３５Δｄｓ融合誘導体は、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（ＬＳｅｒ２１４と対合したＨＳｅｒ２３３−ｈＧＨ融合）およびＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒ（ＨＳｅｒ２３３と対合したＬＳｅｒ２１４−ｈＧＨ融合）であった。これらの６つのＳＬ３３５−ｈＧＨ融合コンストラクトを大腸菌ＳＵＰＥＸ５宿主細胞中で発現させ、培養上清中のこれらの６つのＳＬ３３５−ｈＧＨ融合タンパク質の収量およびＨＳＡ結合反応性をＥＬＩＳＡによって分析した。ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合タンパク質を発現する大腸菌クローンをＩＰＴＧの存在下で同一の条件下で増殖させ、培養上清を短時間の遠心分離によって採取した。可溶性ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合の濃度を、マウス抗ヒトＦｄ ｍＡｂを捕捉Ａｂとして使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、ＨＲＰＯと結合したヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂを検出抗体として使用した（図５Ａ）。
【００７５】
可溶性Ｆａｂ形態は、ＬｃｙｓＧ／ＨｃｙｓまたはＬｓｅｒＧ／Ｈｃｙｓから検出されなかった。データは示さないが、大腸菌細胞ライセートを使用するウェスタンブロットによって、ＦｄのＣｙｓ２３３は、おそらくタンパク質凝集のために重い分解（heavy degradation）およびＦｄフラグメントの無分泌の原因であることが明らかにされた。ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓの収量は０．５μｇ／ｍｌであり、ＨｓｅｒＧ／ＬｃｙｓおよびＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒのものはそれぞれおよそ１．８μｇ／ｍｌおよび１．４μｇ／ｍｌであった（図５Ａ）。興味深いことに、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの収量は、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓのそれよりも８倍高い約４μｇ／ｍｌであった。全収量は培養上清中に存在するものに対して約３０％に過ぎなかったが（データは示されない）、ペリプラズムの抽出物は同一の発現パターンを示した。繰り返しの実験において、ＨｃｙｓＧ／ＬｃｙｓとＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒとの間の収量における違いは、大腸菌クローンのクローン変異または増殖速度に非依存的であることが確認された。ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合のＨＳＡに対する結合反応性を、５μｇ／ｍｌのＨＳＡでコートされたマイクロタイタープレートを使用して比較し、ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合を含有する培養上清の系列希釈でインキュベートした。次いで、ＨＳＡに結合したＳＬ３３５−ｈＧＨ融合を、ＨＲＰＯと結合したヤギ抗ヒトκＬ鎖ｐＡｂを使用して検出した。予想したとおり、抗ヒトκＬ ｐＡｂでＨＳＡ結合したＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒの検出は、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓのそれよりも８倍強い結合シグナルを産生し、ＨｓｅｒＧ／ＬｃｙｓおよびＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒのそれぞれよりもおよそ４倍強い結合シグナルを産生した（図５Ｂ）。T-20、ｈＧＨのＣ末端に特異的なヤギｐＡｂを使用してＳＬ３３５−ｈＧＨ融合を検出したとき、同様な結合シグナルパターンもまた観察された（図５Ｃ）。しかしながら、NYThGHを用いた検出において、全長ｈＧＨに特異的なマウスｍＡｂ、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒは、ＨｓｅｒＧ／ＬｃｙｓおよびＬｓｅｒＧ／Ｈｓｅｒの両方のものよりも３０倍高い結合シグナルおよびＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓのそれよりも６０倍高い結合シグナル（図５Ｄ）をもたらし、NYThGHのＨｃｙｓＧ／ＬｃｙｓのｈＧＨドメインに対する結合がＳＬ３３５における鎖間ジスルフィド結合の存在によって干渉されたことを示唆した。ＨｃｙｓＧ／ＬｃｙｓおよびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒは、ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合を作製するためのＳＬ３３５ｗｔおよびＳＬ３３５Δｄｓの利用を表すことから、それらはそれぞれＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合と今後称した（図５）。
【００７６】
可溶性ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合の高収量がＳＬ３３５における鎖間ジスルフィド結合の除去に依存的であることを決定するために、宿主大腸菌株または誘導温度、ＳＬ３３５ｗｔ、ＳＬ３３５Δｄｓ、ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合を、２０℃（図６Ａ）、２５℃（図６Ｂ）または３０℃（図６Ｃ）で、親ＭＣ１０６１ならびに変異体ＳＵＰＥＸ５細胞中で発現させ、培養上清中のＦａｂ分子の量をＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＣ１０６１株中に発現したＳＬ３３５ｗｔの収量は、２０℃において１μｇ／ｍｌであり、２５℃および３０℃におけるそれよりも約３倍高かった。このことは、２５℃以下のＳＬ３３５ｗｔの誘導が、とりわけＭＣ１０６１を宿主株として使用するときに有利であることを示唆した。同様な結果が、ＳＵＰＥＸ５株を用いても得られた。ＳＬ３３５Δｄｓの場合において、収量は宿主大腸菌株および誘導温度に拘らず２０℃で約１．３μｇ／ｍｌであった。これらの結果は、Ｆａｂにおける鎖間ジスルフィド結合の存在または非存在が、大腸菌宿主株に拘らず、２０℃で可溶性Ｆａｂ産生の収量に顕著に影響を与えないことを示した。ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ融合の収量は、宿主大腸菌株および誘導温度に拘らず約０．３〜０．５μｇ／ｍｌであった。他方、ＭＣ１０６１株中に発現したＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合の収量は、２０℃および２５℃の両方で１．８μｇ／ｍｌであり、３０℃で１．５μｇ／ｍｌであり、マイナーな温度依存性を示した一方、ＳＵＰＥＸ５株中に発現したＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合の収量は、２０℃および２５℃の両方で４．０μｇ／ｍｌであり、３０℃で３．５μｇ／ｍｌであった。これらの結果は、ＳＬ３３５ｗｔ形態および大腸菌ＭＣ１０６１株の組み合わせと比較して、ＳＬ３３５Δｄｓ形態および大腸菌ＳＵＰＥＸ５株の利用によって、ＳＬ３３５−ｈＧＨ融合タンパク質の約１２倍高い収量を可能にすることを意味した。
【００７７】
２−（５）ＳＬ３３５−ＧＣＳＦ、ＳＬ３３５−ＩＦＮｂ、ＥＧＬ４−ｈＧＨおよび１ｂ２８−ｈＧＨ融合コンストラクトの生成
Ｆａｂ−エフェクター融合タンパク質の可溶性発現の改善におけるＦａｂΔｄｓ形態およびＳＵＰＥＸ５株の有益な効果を実証するために、種々のＦａｂエフェクター融合コンストラクトを生成した。第一に、２つのＳＬ３３５−ＧＣＳＦ融合バリアント（ＳＬ３３５ｗｔ−ＧＣＳＦと称されるＨｃｙｓＧＣＳＦ／Ｌｃｙｓ、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦと称されるＨｓｅｒＧＦ／Ｌｓｅｒ）および２つのＳＬ３３５−ＩＦＮｂ融合バリアント（ＳＬ３３５ｗｔ−ＩＦＮｂと称されるＨｃｙｓＩＦＮｂ／Ｌｃｙｓ、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＩＦＮｂと称されるＨｓｅｒＩＦＮｂ／Ｌｓｅｒ）をＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合の生成と同じ方法で作製し、エフェクタードメインの影響を決定した。誘導温度を最適な２０℃に設定し、大腸菌培養上清におけるこれらの融合タンパク質の発現収量をＥＬＩＳＡによって比較した。ＳＬ３３５ｗｔ−ＧＣＳＦの収量は、ＭＣ１０６１およびＳＵＰＥＸ５においてそれぞれ０．３および０．６ｍｇ／ｍｌであり、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦのものは、ＭＣ１０６１およびＳＵＰＥＸ５においてそれぞれ０．６および１．５ｍｇ／ｍｌであった（図７Ａ）。一方、ＳＬ３３５ｗｔ−ＩＦＮｂの収量は、ＭＣ１０６１およびＳＵＰＥＸ５の両方においておよそ０．１６ｍｇ／ｍｌであり、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＩＦＮｂのものは、ＭＣ１０６１およびＳＵＰＥＸ５においてそれぞれ０．２および０．５ｍｇ／ｍｌであった（図７Ｂ）。したがって、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＧＣＳＦ融合およびＳＵＰＥＸ５株の組み合わせは、ＳＬ３３５ｗｔ−ＧＣＳＦ融合およびＭＣ１０６１株の組み合わせと比較して、約５倍高い収量のＳＬ３３５−ＧＣＳＦ融合形態を産生し、ＳＬ３３５Δｄｓ−ＩＦＮｂ融合およびＳＵＰＥＸ５株の組み合わせは、ＳＬ３３５ｗｔ−ＩＦＮｂ融合およびＭＣ１０６１株の組み合わせと比較して、約３倍高い量のＳＬ３３５−ＩＦＮｂ融合形態を産生した。
【００７８】
第二に、我々は、ヒト抗ＥＦＧＲ ＦａｂであるＥＧＬ４、およびヒト抗ＩＬ−１ｂ Ｆａｂである１ｂ２８を使用して、Ｆａｂの影響を決定するために、２つのＦａｂ−ｈＧＨ融合コンストラクトも作製した。ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合の生成と同じ方法で、２つのＥＧＬ４−ｈＧＨ融合コンストラクトは、ＨｃｙｓＧ／ＬｃｙｓフォーマットにおけるＥＧＬ４ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＨｓｅｒＧ／ＬｓｅｒフォーマットにおけるＥＧＬ４Δｄｓ−ｈＧＨ融合であった。同様に、１ｂ２８４−ｈＧＨ融合コンストラクトは、ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓフォーマットにおける１ｂ２８ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒフォーマットにおける１ｂ２８Δｄｓ−ｈＧＨ融合であった。ＥＧＬ４ｗｔ−ｈＧＨ融合の収量は、ＭＣ１０６１およびＳＵＰＥＸ５株において８０９０ｎｇ／ｍｌであり、ＥＧＬ４Δｄｓ−ｈＧＨ融合の収量は、ＭＣ１０６１株において１４０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＵＰＥＸ５株において２２０ｎｇ／ｍｌであり（図８Ａ）、ＥＧＬ４Δｄｓ−ｈＧＨ融合およびＳＵＰＥＸ５宿主細胞の組み合わせが、ＥＧＬ４ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＭＣ１０６１宿主細胞の組み合わせと比較して、培養上清中に２．４倍高い量のＥＧＬ４−ｈＧＨ融合タンパク質を産生したことを示した。１ｂ２８−ｈＧＨ融合コンストラクトの場合において、１ｂ２８４ｗｔ−ｈＧＨ融合の収量は、それぞれＭＣ１０６１において５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＵＰＥＸ５株において１００ｎｇ／ｍｌであり、１ｂ２８Δｄｓ−ｈＧＨ融合の収量は、ＭＣ１０６１株において９００ｎｇ／ｍｌであり、ＳＵＰＥＸ５株において４ｍｇ／ｍｌであり（図８Ｂ）、１ｂ２８Δｄｓ−ｈＧＨ融合およびＳＵＰＥＸ５宿主細胞の組み合わせが、１ｂ２８ｗｔ−ｈＧＨ融合およびＭＣ１０６１宿主細胞の組み合わせと比較して、培養上清中に８００倍高い量の１ｂ２８−ｈＧＨ融合形態を産生したことを示した。
【００７９】
２−（６）ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの分子特性決定
ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ融合を分子レベルでさらに特性決定した。培養上清中の融合タンパク質をＨＳＡでコートした樹脂を通過させることによって親和性精製し、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓ（レーン１）およびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（レーン２）を、ＨＳＡが固定化されたセファロースビーズで培養上清から親和性精製し、還元または非還元条件下で４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質バンドをCoomassie Blue stainingで可視化した（図９Ａ）。分離ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質を、ニトロセルロース膜へ移し、ＡＰと結合したヤギ抗ヒトκＬ Ａｂを使用してＬｃｙｓおよびＬｓｅｒを検出した（図９Ｂ）。結合シグナルをＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質で可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの両方は、還元条件下でそれぞれＦｄ−ｈＧＨ融合およびＬ鎖に対応する、４６ｋＤａおよび２３ｋＤａの大きさにおける２つの主要なタンパク質バンドを産生した。非還元条件下では、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、鎖間ジスルフィド結合の非存在のため、２つの同一のタンパク質バンドを予想どおり産生した。ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨの場合において、ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨの正しいヘテロ二量体形態に対応する主要な７０ｋＤａタンパク質バンドが見えた。しかし、未知の同一性の２４ｋＤａ〜４５ｋＤａにおよぶ４つの明らかなタンパク質バンドおよび１００ｋＤａおよび１３５ｋＤａの大きさに対応するいくらかの弱いタンパク質バンドを含む、多くの異なる大きさのＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ誘導体もまた見出された。１５ｋＤａおよび１２．５ｋＤａの大きさにおけるタンパク質もまた試料のすべてから見えた。ウェスタンブロット分析を、抗ヒトＦｄ ｍＡｂ、抗κＬ鎖ｐＡｂおよび抗ｈＧＨ ｐＡｂ、T-20を使用して次いで実施した。抗ヒトＦｄ ｍＡｂを用いたブロットは、非還元および還元の両方の条件下で４６ｋＤａの大きさのＨｃｙｓＧおよびＨｓｅｒＧのみ検出した（データは示されない）。他方、２４ｋＤａ〜４５ｋＤａにおよぶ４つのタンパク質バンドならびにＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ試料における７０ｋＤａよりも大きいものを非還元条件下で抗κＬ鎖ｐＡｂによってすべて検出した（図９Ｂ）。この結果は、少なくとも異常なジスルフィド結合形成を介した、Ｌ鎖のＣｙｓ２１４の種々の多量体Ｌ鎖の形成の原因であることを示した。T-20抗ｈＧＨ ｐＡｂを用いたブロットは、非還元条件下でＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨの７０ｋＤａヘテロ二量体形態およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの約４５ｋＤａ単量体ＨｅｒＧを正しく認識した（図９Ｃ）。１５ｋＤａおよび１２．５ｋＤａの大きさのタンパク質は、それらの抗体のいずれによっても検出されず、それらが融合からの分解された産物または大腸菌宿主タンパク質からの汚染物質のいずれかであることを示唆した。
【００８０】
チップベースのキャピラリー電気泳動によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を確認した。ＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓ（図１０Ａ）およびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（図１０Ｂ）を還元または非還元の電気泳動のためのＤＴＴの存在下または非存在下で試料バッファーを用いて製造し、チップベースのキャピラリー電気泳動を、製造業者のプロトコルにしたがって、Protein 80 kitを使用してAgilent 2100 Bioanalyzer systemを用いて行った。結果をプロットし、タンパク質の大きさに対して蛍光強度単位を反映させた。ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨは、非還元条件下で２７．１ｋＤａ〜５２．４ｋＤａの大きさにおよぶいくつかのＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ誘導体を産生し、ＤＴＴの存在下の還元条件下でそれらの多くは消失した（図１０Ａ）。ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、マイナーな分子量の変化を除き、非還元条件と還元条件との間でほぼ同一のタンパク質ピークを産生した（図１０Ｂ）。
【００８１】
ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用してさらに分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析をAutoflex III Smartbeam device（Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA）上で実施した。親和性精製したＨｃｙｓＧ／Ｌｃｙｓ（図１１Ａ）およびＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（図１１Ｂ）をＭＡＬＤＩマトリックスと混合し、スペクトルを陽イオンモードにおいて１００００〜１５００００Ｄａのｍ／ｚ範囲にかけて得た。１００００〜７００００のｍ／ｚ範囲における質量スペクトルをＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨについて得た。ＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨ試料が、図８Ａに示すとおり、７０ｋＤａよりも大きいタンパク質バンドを示したことから、１５０００〜１６００００のものをＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨについて得た。Ｌｃｙｓ、ＨｃｙｓＧおよびＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨの分子量を、それぞれ２３，２２６Ｄａ、４６２２６Ｄａおよび６９，８３７Ｄａと同定した（図１１Ａ）。正しいＳＬ３３５ｗｔ−ｈＧＨよりも大きい３つの別個のタンパク質の大きさは、９２，８２４Ｄａ、１１７，４５５Ｄａおよび１３９，３４７Ｄａであることがわかった。ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの場合において、ＬｓｅｒおよびＨｓｅｒＧの分子量をそれぞれ２３，３３４Ｄａおよび４６，６６７Ｄａと同定した（図１１Ｂ）。Ｌｓｅｒと比較してＨｓｅｒＧの低いピークは、より大きい分子のより低いイオン化効率、または試料中のＬｓｅｒよりも低いモル比のＨｓｅｒＧの存在を表し得る。
【００８２】
親和性精製したＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを、ＦＰＬＣを使用してSephacrylS-200HRカラムに通過させることによってさらに精製した。Sephacryl（商標）S-200HR Prepacked Column and AKTA FPLC（GE Healthcare, Wauwatosa, WI, USA）を使用した親和性精製の後、ＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒのゲルろ過を実施した。カラムを平衡バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）で平衡化し、親和性精製したＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒで充填した。溶出を０．５ｍｌ／ｍｉｎの運転流速で平衡バッファーを用いて実施した。矢印は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析について選択されたフラクションを示す（図１２Ａ）。２つの特有のピークから取得したフラクション＃１３、＃１６、＃１９および＃２３を、還元条件下で４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルによって分析した（図１２Ｂ）。タンパク質バンドをCoomassie Blue stainingで可視化した。およそ６６ｋＤａおよび２５ｋＤａに対応する２つのピークがフラクション＃１２〜＃２７から見えた（図９Ａ）。そこで、４つのフラクション（フラクション＃１３、＃１６、＃１９および＃２３）を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、フラクション中のタンパク質含有量を決定した（図９Ｂ）。結果は、６６ｋＤａピーク（フラクション＃１３、＃１６および＃１９）からのフラクションはヘテロ二量体ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを含有し、２５ｋＤａピーク（フラクション＃２３）からのフラクションは単量体Ｌｓｅｒを主に含有することを示した。
【００８３】
２−（７）ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのインビトロ機能的特性決定
ＳＬ３３５ｗｔにおける鎖間ジスルフィド結合の除去および融合が、ｈＧＨ ＨＳＡまたはＲＳＡに対する結合親和性に影響を与えるか決定するために、バイオレイヤー干渉法アッセイをｐＨ６およびｐＨ７．４条件下でＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨを使用して実施した（以下の表６を参照）。ＨＳＡに対するＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの解離定数は、ｐＨ６で１．７ｎＭ、ｐＨ７．４で１．５ｎＭであり、ＳＬ３３５のものと比較して、それぞれ５倍および８．７倍の親和性の増加を示した。ＲＳＡに対する解離定数は、ｐＨ６およびｐＨ７．４において４９９ｎＭおよび８３．６ｎＭであり、ＳＬ３３５のものと比較して、それぞれ４．２倍および１．３倍の親和性の減少を示した。
【００８４】
ＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨのインビトロのｈＧＨ活性もまた、ｈＧＨ処置に際して濃度依存的な様式で増殖するＮｂ２−１１ラットリンパ腫細胞を使用して測定した。Ｎｂ２−１１ラットリンパ腫細胞を、８×１０４細胞／ｍｌで５％（ｖ／ｖ）ウマ血清を含有するＤＭＥＭ中に再懸濁し、５０μｌの分量の細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルへ加え、続いて一晩インキュベーションした。細胞を次いで、３７℃で４８ｈ、５％ウマ血清を含有する５０ｍｌのＤＭＥＭ中で、増加濃度のGrowtropin（登録商標）またはＨｓｅｒＧ／Ｌｓｅｒ（０〜２０ｎＭ）で処置した。インキュベーションの後、１０μｌのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに加え、細胞を４ｈインキュベートした。吸光度をマイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍの波長で記録した。データは、３つの実験の平均ＳＤを表す。ＨＳＡの非存在下において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、５０ｐＭ（３．５ｎｇ／ｍｌ）の見かけのＥＣ５０を有するＮｂ２−１１の増殖を刺激することができた（図１３Ａ）。この値は、ｒｈＧＨ標準（７．５ｐＭ）であるGrowtropin（登録商標）のそれよりも６．７倍効力が弱い。１０ｍＭのＨＳＡの存在下において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、Growtropin（登録商標）のものと比較して、およそ５倍の効力の低減を表したが、Growtropin（登録商標）およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのそれぞれの効力はほとんど影響を受けなかった（図１３Ｂ）。陰性対照として使用したＳＬ３３５は、あらゆる増殖効果を示さなかった。これらの結果は、明確にＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの機能的ｈＧＨ生理活性を実証した。
【００８５】
次いで、血清安定性を、３７℃で１６日間ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨをインキュベートすることによって決定した。ヒト血清中のＨＳＡに対するＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨおよびＳＬ３３５の結合能力が、その後の実験を複雑にするであろうから、試料を再懸濁するためにＦＢＳをヒト血清の代わりに使用した。試料を１日１回採取し、ＨＳＡ結合反応性およびインビトロの生理活性をそれぞれＥＬＩＳＡ（図１４Ａ）およびＮｂ２−１１細胞増殖アッセイ（図１４Ｂ）によって測定した。ＳＬ３３５もまた対照として含まれた。ＳＬ３３５と同様に、ＨＳＡに対する結合反応性およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのＮｂ２−１１増殖活性は、３７℃で１６日間のインキュベーションの後も変化せず、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは鎖間ジスルフィド結合の非存在に拘らず、ＳＬ３３５と同様に安定であることを実証した。
【００８６】
２−（８）ラットにおける薬物動態および薬力学的な研究
ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨがｈＧＨに長時間作用するための有望な候補であることが示されたことから、インビボの有効性研究を実施した。第一に、Growtropin（登録商標）およびＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの薬物動態を、単一の静脈内注射または皮下注射の後に時間の関数として、ラットにおいて各アナログの血清レベルを測定することによって比較した。０．６ｍｇ／ｋｇのGrowtropinまたはSAFAtropinの単一のボーラス用量の皮下注射（図１５Ａ）、または０．３ｍｇ／ｋｇのGrowtropinまたはSAFAtropinの単一のボーラス用量の静脈内注射（図１５Ｂ）をラットの各群（１つの群に４匹）に与えた。血清試料をタンパク質に依存して１４４ｈに至る間隔にわたり採取した。血清試料を、上記のとおり、Growtropin（登録商標）またはSAFAtropin（登録商標）について示された時間においてＥＬＩＳＡによって分析した。薬物動態学的なパラメーターを表７に示す。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、投薬の経路とは無関係に、ｔ１／２の劇的な延長を示した。静脈内投薬において、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、Growtropin（１６．６ｈ対０．２ｈ）と比較してｔ１／２の８３倍の増加および皮下投薬（９７．２ｈ対１．４ｈ）において６９倍の増加を表した。
ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨは、Growtropin（登録商標）のものと比較して、投薬の経路に拘らず、ＡＵＣ０→∞の約１０倍の増加および１０倍超遅いクリアランス速度（Ｃｌ／ｆ）も示した。０．６ｍｇ／ｋｇのGrowtropinまたはSAFAtropinの単一のボーラス用量の皮下注射、または０．３ｍｇ／ｋｇのGrowtropinまたはSAFAtropinの単一のボーラス用量の静脈内注射を、ラットの各群（１つの群に４匹）に与えた。血清試料を、１４４ｈに至る間隔にわたりタンパク質に依存して採取した。血清試料を、上記のとおりＥＬＩＳＡによって、示された時間においてGrowtropin（登録商標）またはSAFAtropin（登録商標）について分析した。興味深いことに、ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨのＣｍａｘ値は、投薬の経路に依存して、Growtropin（登録商標）のものよりも６倍および３倍低かった。
【００８９】
次に、下垂体切除ラットの成長速度を、Growtropin（登録商標）もしくは賦形剤バッファー対照（賦形剤のみ）の日常的なＳ．Ｃ．投薬の後、または週１回のＳＬ３３５ｄｓ−ｈＧＨのＳ．Ｃ．投薬の後、１０日間にかけて比較した。下垂体切除ラットを、賦形剤のみまたは０．３ｍｇ／ｋｇのGrowtropin（登録商標）で日常的に処置するか、または増加用量のSAFAtropin（登録商標）で０日目および７日目に処置した（図１６）。実線は、体重の平均パーセンテージ変化を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。賦形剤で処置したラットは、およそ５％重量損失を示した。一方、Growtropin（登録商標）（０．３ｍｇ／ｋｇ）の日常的な注射を受けたものは、５％の重量増加を示し、賦形剤のみの群よりも全１０％の重量増加をもたらした。ＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの週１回の注射は、用量依存的な重量増加をもたらし、２．４ｍｇ／ｋｇ投与は１５％の重量増加をもたらし、０．６ｍｇ／ｋｇの投与は３．５％の重量増加をもたらした。等モルのＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨ（１．２ｍｇ／ｋｇ）投与計画は、５％の重量増加をもたらし、これはGrowtropin（登録商標）の日常的な注射によって得たものに匹敵した。
図１７は、０．６ｍｇ／ｋｇのＳＬ３３５Δｄｓ−ｈＧＨの週１回の投薬は、ラットにおいて、Growtropin（登録商標）の日常的な投薬によって達成されたものと同等の脛骨長の増加を達成したことを示す。実線バー（solid bar）は、測定された脛骨の骨の長さの平均を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【００９０】
産業上の利用可能性
本発明の融合コンストラクトは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、エリトロポエチン、コロニー刺激因子またはその誘導体を含む様々な種類のエフェクター部分、および抗体誘導体などを含むように製造することができるため、本発明は、生理活性タンパク質またはポリペプチド治療剤を開発するために使用されるであろう。
本明細書中に引用される全ての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参考によって援用される。
【００９１】
【表８】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【図２２−１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月2日(2018.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アルブミンに対する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）；および
（ｂ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）
を含み、
Ｆａｂは、血清アルブミン（ＳＡ）に特異的に結合する、
前記Ｆａｂ。
【外国語明細書】
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