(57)【要約】【課題】多能性細胞または微小血管組織を含む新規組成物であって、細胞または組織が滅菌されており、かつ／またはウイルスを不活化する処置がなされている組成物、および同種異系の対象における組織傷害または疾患を処置または予防するためにこれらの組成物を使用する関連する方法を提供すること。【解決手段】処理された微小血管組織を含む組成物であって、前記処理された微小血管組織が、単離された多能性細胞、または多能性細胞もしくは前記微小血管組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含み、前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、前記組成物が滅菌されており、かつ／または前記組成物内のウイルスが不活化されている、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年９月１９日に出願された米国仮出願第６１／７０３，２０３号の利益を主張する。この出願の開示は、本明細書中に明示的に参考として援用される。
【０００２】
背景
分野
本発明のいくつかの実施形態は、滅菌されており、かつ／またはあらゆるウイルスを不活化する処置がなされている多能性細胞および／または微小血管組織を含む新規組成物、ならびに、それらの調製および関節炎などの組織傷害および疾患の処置または予防における同種異系または異種の使用のための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
筋肉、腱、靭帯、および関節包などの軟部組織の傷害はかなり頻繁に生じる。そのような傷害により、一般には、疼痛、炎症および内部組織ストレスを特徴とする組織の機能障害が生じ、最終的に機能的な能力障害が生じる。例えば、腱の捻挫は自然に治癒するが、腱の完全断裂は多くの場合、外科的に処置しなければ能力障害に至る。外科的修復を行ってさえも、アキレス腱の約１５％および２つの回旋腱板の４０％の修復は、その後機能しなくなる。さらに、修復された腱が傷害前の強度および機能レベルに戻ることはめったにない。
【０００４】
組織修復は、一般に、最初の炎症反応、それに続く細胞増殖および組織リモデリングを含めたいくつかの段階を含む。組織修復の基本的なプロセスは、線維増殖と血管新生の両方を含む。炎症性メディエーターによって活性化された線維芽細胞は創傷内に遊走し、増殖し、コラーゲンリッチ細胞外マトリックスを築き、一方、損傷を受けた組織内の毛細血管は修復帯に向かって成長して血流を再建する。リモデリングプロセスの間に、瘢痕組織は再吸収され、密度の高い、向き付けられたコラーゲンと置き換えられて、元の組織の特性の一部を有する組織が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
概要
組織修復を補助するための種々の異なる治療方法が開発されてきた。これらとしては、組織の内部成長のための足場をもたらすための物理的構造、例えば、よりよい縫合糸、骨アンカー、およびパッチまたはインプラントなどが挙げられる。さらに、種々の増殖因子が、組織の成長および創傷部位への遊走を改善するため、ならびに血管新生を促進するために使用されてきた。例えば、前臨床モデルにおける、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびｂＦＧＦなどの増殖因子を使用した腱の治癒の改善に関する報告がなされている。
【０００６】
つい最近、幹細胞を使用して創傷治癒および組織再生を促進する試みが行われた。幹細胞は、炎症過程の調節；損傷を受けた組織への遊走、および組織の成長に必要な内皮前駆細胞などの他の細胞の動員；修復細胞の増殖の刺激；瘢痕形成にわたる組織リモデリングの支持；アポトーシスの阻害；ならびに骨、軟骨、腱、または靭帯組織への分化を含めた種々の異なる機構のいずれかによって創傷治癒を媒介すると考えられている。多くの異なる組織を処置するまたは生じさせるための幹細胞の使用を記載したいくつもの報告がなされている。この研究の大半は、脂肪由来の幹細胞および他の多能性細胞が容易に多数得られることに起因して、これらの使用に集中してきた。しかし、移植された同種異系の細胞または組織により、免疫応答、および最終的には拒絶反応が引き起こされる、または有害なウイルスもしくは他の病原体が移入する可能性があるという懸念があるので、この研究は、自己細胞の使用に焦点を合わせている。しかし、残念ながら、自己幹細胞の使用は都合が悪い。これには、疼痛、費用および病的状態を伴う２回の別個の外科手技が必要であり、また、組織を処理のために実験室に送付すること、および傷害を受けた患者の処置を遅延させることに伴うリスクも存在する。
【０００７】
明白に、当技術分野において、望ましくない免疫応答を引き起こすことなく組織傷害を処置および修復するために有用な、同種異系の幹細胞および他の多能性細胞の新しい治療用組成物が必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、他の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、いくつかの実施形態では、組織の修復および／または再生などにおいて有用な新規の組成物、方法、キット、および細胞集団が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、単離された多能性細胞、または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含む組成物であって、血管新生活性または抗炎症活性を有し、滅菌されており、かつ／またはその中のウイルスが不活化されている組成物が提供される。特定の実施形態では、細胞または組成物は培養されていない。特定の実施形態では、組成物中に存在する細胞の５０％以下または１０％以下が生存可能である。特定の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の実質的に全てが生存不可能である。ある特定の実施形態では、前記細胞の少なくとも１％がトリパンブルーを排除する。特定の実施形態では、組成物は乾燥、凍結乾燥または凍結保存されている。関連する実施形態では、滅菌、乾燥、凍結乾燥、または凍結保存された組成物を含めた組成物は、室温付近で少なくとも１カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。ある特定の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組成物は、植え込み型足場またはマトリックスをさらに含み、これは、例えば、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ（putty  comprising  tissue  product）、または縫合糸であってよい。具体的には、細胞、組織または細胞膜は、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱、または皮膚接面に存在する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。しかし、追加的な実施形態では、直接投与（組織表面への投与または直接注射による投与のいずれか）、動脈内投与、全身投与などを含めた他の投与経路を使用することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、細胞または組織は、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである。一実施形態では、ドナーは、細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった。ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、単離された多能性細胞を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、ドナー哺乳動物から得た組織試料を解離させて、その中の複数の多能性細胞を放出させるステップと、複数の放出された多能性細胞を１つまたは複数の他の組織成分から分離して、単離された多能性細胞を含む組成物を作製するステップと、場合により、滅菌の前または後に組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、組成物を場合によって乾燥、凍結乾燥、または凍結保存する前またはその後に、組成物を滅菌し、かつ／または組成物中に存在するウイルスを不活化するステップとを含み、滅菌された組成物が、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞または組成物は培養しない。ある特定の実施形態では、当該方法は、場合により、放出された細胞または組成物を濾過するステップをさらに含み、例えば、これは、滅菌または乾燥、凍結乾燥、もしくは凍結保存の前であってよい。ある特定の実施形態では、解離は、組織試料を１つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼは、コラゲナーゼを含まない。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼは、１型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか；またはＭＭＰ２、ＭＭＰ１４、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれかを含む、またはそれからなる。これらのプロテアーゼ（または他の機能的等価物）の組合せを使用することができる。追加的な実施形態では、解離または分離は、超音波撹拌、濾過、または密度勾配の使用を含む。一実施形態では、組織は脂肪由来組織であり、超音波撹拌、濾過または密度勾配の使用により、前記放出された多能性細胞が脂肪細胞から分離される。
【００１４】
追加的な実施形態では、処理された微小血管組織を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、ドナー哺乳動物から得た微小血管組織試料を解離させて、解離した微小血管組織を含む組成物を作製するステップと、解離した微小血管組織を含む組成物から１つまたは複数の組織成分を除去するステップと、場合により、滅菌の前または後に組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、場合によって乾燥、凍結乾燥、または凍結保存する前またはその後に、組成物を滅菌し、かつ／または組成物中に存在するウイルスを不活化するステップとを含み、滅菌された組成物が、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法が提供される。特定の実施形態では、細胞または組成物は培養しない。特定の実施形態では、当該方法は、組成物を濾過するステップをさらに含む。特定の実施形態では、解離は、組織試料を１つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼは、コラゲナーゼを含まない。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼは、１型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか；またはＭＭＰ２、ＭＭＰ１４、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれかを含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、解離または除去は、超音波撹拌、濾過、または密度勾配の使用を含む。特定の実施形態では、微小血管組織は脂肪由来組織であり、前記超音波撹拌、濾過または密度勾配の使用により、脂肪細胞が組成物から除去される。
【００１５】
追加的な実施形態では、本発明は、滅菌、乾燥した組成物を含む、水分不透過性の容器であって、前記組成物が、単離された多能性細胞または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織を含むもしくは前記細胞もしくは組織から得た細胞膜を含み、前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、前記組成物が滅菌されており、かつ／または前記組成物内のウイルスが不活化されており、前記組成物が室温付近で少なくとも１カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する容器を提供する。ある特定の実施形態では、細胞または組成物は培養されていない。特定の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の５０％以下または１０％以下が生存可能である。ある特定の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の実質的に全てが生存不可能である。特定の実施形態では、前記細胞の少なくとも１％がトリパンブルーを排除する。特定の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。
【００１６】
水分不透過性の容器の特定の実施形態では、組成物は、植え込み型足場またはマトリックスをさらに含む。特定の実施形態では、植え込み型足場またはマトリックスは、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である。ある特定の実施形態では、細胞、組織または細胞膜は、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱または皮膚接面に存在する。
【００１７】
水分不透過性の容器の一実施形態では、組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。
【００１８】
本発明の水分不透過性の容器の特定の実施形態では、細胞または組織は、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである。特定の実施形態では、ドナーは、細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった。ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞を含む。ある特定の実施形態では、容器は、気密シールを含むバイアルである。種々の実施形態では、容器は内部が滅菌された密封包装中に存在する。
【００１９】
別の関連する実施形態では、本発明は、哺乳動物において傷害または疾患を処置または予防する、または組織再生を促進する方法であって、前記哺乳動物に、本発明の組成物または本発明の方法に従って調製した組成物を提供することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、組成物を、哺乳動物に外科的に植え込む。ある特定の実施形態では、組成物を、前記哺乳動物における傷害または疾患の部位内またはその近くに植え込む。関連する実施形態では、組成物は、前記哺乳動物の静脈内に提供される。ある特定の実施形態では、傷害は軟部組織内に存在する。特定の実施形態では、傷害は、腱、靭帯、皮膚、骨、軟骨、椎間板、または微小血管組織に存在する。特定の実施形態では、傷害または疾患は、虚血傷害、再灌流傷害、微小血管傷害、または炎症である。ある特定の実施形態では、疾患は、例えば、変形性関節症または関節リウマチなどの関節炎である。
【００２０】
追加的な実施形態では、多能性細胞および１つまたは複数の血管壁および／または細胞外マトリックス成分を含む組成物が提供される。別の実施形態では、本発明は、多能性細胞を含む滅菌された組成物を含む。さらなる実施形態では、本発明は、トリパンブルーを排除するが増殖はしない多能性細胞を含む組成物を含む。さらなる実施形態では、本発明は、多能性細胞、および１つまたは複数の血管壁細胞外マトリックス成分を含む組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、多能性細胞を含む滅菌された組成物を含む。さらなる実施形態では、本発明は、トリパンブルーを排除するが増殖はしない多能性細胞を含む組成物を含む。関連する実施形態では、本発明は、トリパンブルーを排除するが増殖はしない滅菌された多能性細胞を含む組成物を含む。本発明の組成物のある特定の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも５０％または少なくとも９０％が、トリパンブルーを排除するが増殖はしない。ある特定の実施形態では、組成物は、多能性細胞を含む。一実施形態では、組成物中に存在する多能性細胞の少なくとも５０％または少なくとも９０％が、トリパンブルーを排除するが増殖はしない。特定の実施形態では、組成物中に存在する総細胞の５０％以下または１０％以下が生存可能である。特定の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の実質的に全てが生存不可能である。本発明の組成物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、前記細胞の少なくとも１％または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも９０％がトリパンブルーを排除する。
【００２１】
追加的な実施形態では、本発明は、多能性細胞の２種以上の成分を含む滅菌された組成物を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、多能性細胞の５種以上または１０種以上の成分を含む。別の関連する実施形態では、本発明は、多能性細胞由来の細胞膜およびタンパク質を含む組成物を含む。特定の実施形態では、組成物は、生存細胞を全く含まない、または、インタクトな細胞を全く含まない。
【００２２】
さらに、本発明は、本発明の組成物のいずれかが、本明細書に記載されている傷害または状態のいずれかを含めた、対象における傷害または疾患の処置または予防において使用することができることを提供し、前記多能性細胞は前記対象の自己細胞ではない。
【００２３】
上で要約され、下でさらに詳細に記載されている方法は、実践者が行った特定の行為に関して記載されているが、これらには、別の人による行為に関する指示も含まれ得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、「微小血管組織を投与する」などの行為は、「微小血管組織の投与を指示する」ことも含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
処理された微小血管組織を含む組成物であって、
前記処理された微小血管組織が、単離された多能性細胞、または多能性細胞もしくは前記微小血管組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含み、
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、
前記組成物が滅菌されており、かつ／または前記組成物内のウイルスが不活化されている、
組成物。
（項目２）
前記細胞または組織が培養されていない、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物中に存在する前記細胞の５０％以下が生存可能である、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物中に存在する前記細胞の１０％以下が生存可能である、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物中に存在する前記細胞の実質的に全てが生存不可能である、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記細胞の少なくとも１％がトリパンブルーを排除する、項目１１に記載の組成物。
（項目７）
乾燥、凍結乾燥または凍結保存されている、項目１から６までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
室温付近で少なくとも１カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する、項目７に記載の組成物。
（項目９）
賦形剤を含む、項目１から８までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
植え込み型足場またはマトリックスをさらに含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記植え込み型足場またはマトリックスが、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
細胞、組織または細胞膜が、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱、または皮膚接面に存在する、項目１０または項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
静脈内投与用に製剤化されている、項目１から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
前記細胞または組織が、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである、項目１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記ドナーが、前記細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞を含む、項目１から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
放射線照射に曝露することによって滅菌されている、項目１から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
単離された多能性細胞を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、
ａ．ドナー哺乳動物から得た組織試料を解離させて、その中の複数の多能性細胞を放出させるステップと、
ｂ．複数の前記放出された多能性細胞を１つまたは複数の他の組織成分から分離して、単離された多能性細胞を含む組成物を作製するステップと、
ｃ．場合により、（ｂ）または（ｄ）に従って作製された前記組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、
ｄ．（ｂ）もしくは（ｃ）から生じた前記組成物を滅菌し、かつ／または（ｂ）もしくは（ｃ）から生じた組成物中に存在するウイルスを不活化するステップと
を含み、（ｄ）から生じた前記組成物が測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法。
（項目１９）
前記細胞または組織を培養しない、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
（ｃ）の前に、前記放出された細胞または組成物を濾過するステップをさらに含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記（ａ）の解離が、前記組織試料を１つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む、項目１８から２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記１つまたは複数のプロテアーゼが、コラゲナーゼを含まない、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記１つまたは複数のプロテアーゼが、
１型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか；または
ＭＭＰ２、ＭＭＰ１４、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか
を含む、またはそれからなる、項目２１または項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記（ａ）の解離または（ｂ）の分離が、超音波撹拌、遠心分離、濾過、または密度勾配の使用を含む、項目１８から２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記組織が、脂肪由来組織、骨髄、骨、筋肉組織、臍帯組織、または羊水組織であり、前記超音波撹拌、濾過、遠心分離、または密度勾配の使用により、前記放出された多能性細胞が脂肪細胞またはもう１つの他の細胞もしくは組織成分から分離され、場合により、前記組織が脂肪由来組織であり、前記放出された多能性細胞が脂肪細胞から分離される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
処理された微小血管組織を含み、血管新生活性または抗炎症活性を有する組成物を調製する方法であって、
ａ．ドナー哺乳動物から得た微小血管組織試料を解離させて、解離した微小血管組織を含む組成物を作製するステップと、
ｂ．（ａ）に従って作製された前記組成物から１つまたは複数の組織成分を除去するステップと、
ｃ．場合により、（ｂ）または（ｄ）の後に前記組成物を乾燥、凍結乾燥、または凍結保存するステップと、
ｄ．（ｂ）もしくは（ｃ）の後に前記組成物を滅菌し、かつ／または（ｂ）もしくは（ｃ）の後に前記組成物中に存在するウイルスを不活化するステップと
を含み、
（ｃ）または（ｄ）から生じた前記組成物が測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する方法。
（項目２７）
前記細胞または組織を培養しない、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物を濾過するステップをさらに含む、項目２６または項目２７に記載の方法。（項目２９）
前記（ａ）の解離が、前記組織試料を１つまたは複数のプロテアーゼと接触させることを含む、項目２６から２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記１つまたは複数のプロテアーゼが、コラゲナーゼを含まない、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記１つまたは複数のプロテアーゼが、
１型コラゲナーゼ、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか；または
ＭＭＰ２、ＭＭＰ１４、およびディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか
を含む、またはそれからなる、項目２９または項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記（ａ）の解離または（ｂ）の除去が、超音波撹拌、遠心分離、濾過、または密度勾配の使用を含む、項目２６から３１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記微小血管組織が脂肪由来組織であり、前記超音波撹拌、遠心分離、濾過または密度勾配の使用により、脂肪細胞が（ａ）に従って作製された前記組成物から除去される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
滅菌の乾燥した組成物を含む、水分不透過性の容器であって、前記組成物が、単離された多能性細胞、または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織から得たもしくはそれに由来する細胞膜を含み、前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有し、前記組成物が滅菌されており、かつ／または前記組成物内のウイルスが不活化されており、前記組成物が室温付近で少なくとも１カ月保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持している容器。
（項目３５）
前記細胞または組織が培養されていない、項目３４に記載の水分不透過性の容器。
（項目３６）
前記組成物中に存在する前記細胞の５０％以下が生存可能である、項目３４または項目３５に記載の水分不透過性の容器。
（項目３７）
前記組成物中に存在する前記細胞の１０％以下が生存可能である、項目３６に記載の水分不透過性の容器。
（項目３８）
前記組成物中に存在する前記細胞の実質的に全てが生存不可能である、項目３３７に記載の水分不透過性の容器。
（項目３９）
前記細胞の少なくとも１％がトリパンブルーを排除する、項目３４から３７までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４０）
前記組成物が賦形剤を含む、項目３４から３８までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４１）
前記組成物が、植え込み型足場またはマトリックスをさらに含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４２）
前記植え込み型足場またはマトリックスが骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である、項目４１に記載の水分不透過性の容器。
（項目４３）
細胞、組織または細胞膜が、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱または皮膚接面に存在する、項目４１または項目４２に記載の水分不透過性の容器。
（項目４４）
前記組成物が静脈内投与用に製剤化されている、項目３４から４３までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４５）
前記細胞または組織が、哺乳動物ドナー、場合によってヒトから得たものである、項目３４から４４までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４６）
前記ドナーが、前記細胞または組織を得た時点で健康な哺乳動物であった、項目４５に記載の水分不透過性の容器。
（項目４７）
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞を含む、項目３４から４５までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４８）
気密シールを含むバイアルである、項目３４から４７までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目４９）
滅菌の内部を含む密封包装内に存在する、項目３４から４８までのいずれか一項に記載の水分不透過性の容器。
（項目５０）
哺乳動物において傷害もしくは疾患を処置もしくは予防する、または組織再生を促進する方法であって、前記哺乳動物に、項目１から１６までのいずれか一項に記載の組成物または項目１８から３３までのいずれか一項に記載の方法によって調製された組成物を提供することを含む方法。
（項目５１）
前記組成物を前記哺乳動物に外科的に植え込む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記組成物を、前記哺乳動物における傷害または疾患の部位内またはその近くに植え込む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記組成物が前記哺乳動物の静脈内に提供される、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記傷害が軟部組織の傷害である、項目５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記傷害が腱、靭帯、皮膚、骨、軟骨、椎間板、または微小血管組織に存在する、項目５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記傷害または疾患が、虚血傷害、再灌流傷害、微小血管傷害、または炎症である、項目５０から５３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記疾患が関節炎である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
多能性細胞、および１つまたは複数の血管壁細胞外マトリックス成分を含む組成物。
（項目５９）
多能性細胞を含む滅菌された組成物。
（項目６０）
多能性細胞の２種以上の成分を含む滅菌された組成物。
（項目６１）
多能性細胞の１０種以上の成分を含む、項目５９に記載の滅菌された組成物。
（項目６２）
多能性細胞由来の細胞膜およびタンパク質を含む組成物。
（項目６３）
生存細胞を全く含まない、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
インタクトな細胞を全く含まない、項目６２に記載の組成物。
（項目６５）
トリパンブルーを排除するが増殖はしない多能性細胞を含む組成物。
（項目６６）
トリパンブルーを排除するが増殖はしない滅菌された多能性細胞を含む組成物。
（項目６７）
前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも５０％または少なくとも９０％が、トリパンブルーを排除するが増殖はしない、項目６５または項目６６に記載の組成物。
（項目６８）
前記多能性細胞が前記対象に対して自己細胞ではない、対象における傷害または疾患の処置または予防において使用するための項目５８から６７までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目６９）
対象の腱の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目７０）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目６９に記載の使用。（項目７１）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目６９から７０までのいずれか一項に記載の使用。
（項目７２）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目７０から７１までのいずれか一項に記載の使用。
（項目７３）
対象の靭帯の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目７４）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目７３に記載の使用。（項目７５）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目７３から７４までのいずれか一項に記載の使用。
（項目７６）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目７４から７５までのいずれか一項に記載の使用。
（項目７７）
対象の皮膚の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目７８）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目７７に記載の使用。（項目７９）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目７７から７８までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８０）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目７８から７９までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８１）
対象の骨の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目８２）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目８１に記載の使用。（項目８３）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目８１から８２までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８４）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目８２から８３までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８５）
対象の軟骨の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目８６）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目８５に記載の使用。（項目８７）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目８５から８６までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８８）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目８６から８７までのいずれか一項に記載の使用。
（項目８９）
対象の椎間板の傷害を修復するための、乾燥および滅菌された微小血管組織の使用。
（項目９０）
前記乾燥および滅菌された微小血管組織が多能性細胞を含む、項目８９に記載の使用。
（項目９１）
前記組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有する、項目８９から９０までのいずれか一項に記載の使用。
（項目９２）
多能性細胞が前記対象に対して同種異系である、項目９０から９１までのいずれか一項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、実施例１に記載の研究の概略図を提供する。
【図２】図２は、６視野における拡大率１００倍の細胞当たりの推定細胞数を示すグラフである。放射線照射の後および前（対照）の緩衝液１＆２中のＢＭＡ細胞およびＢＭＢ細胞を使用して、ＣＭ−ＤｉＩ標識したＨＵＶＥＣ細胞を誘引した。６つの画像（視野）を拡大率１００倍で視覚的に計数することによって細胞数を推定した。数を平均し、示されている通りプロットした。点線は、陰性培地対照についての平均を示す。細胞数がその線を超えることにより、ＢＭＡ材料試料またはＢＭＢ材料試料に起因した遊走が増加したことが示される。上から下に示されている標識は、各時点について左から右に示されている棒に対応する。
【図３】図３は、１２時間、２４時間および４８時間の移動の時間経過にわたる緩衝液１中ＢＭＡの存在下の標識したヒト内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図４】図４は、１２時間、２４時間および４８時間の移動の時間経過にわたる緩衝液１中ＢＭＢの存在下の標識したヒト内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図５】図５は、１２時間、２４時間および４８時間の移動の時間経過にわたる緩衝液２中ＢＭＡの存在下の標識したヒト内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図６】図６は、１２時間、２４時間および４８時間の移動の時間経過にわたる緩衝液２中ＢＭＢの存在下の標識したヒト内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図７】図７は、標識したヒト内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。左側の試料は希釈していないＥＺ−ＣＰＺ（商標）であり、これは、細胞を保存した緩衝液１＆２を表す。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）は凍結保存培地（Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）である。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）は、Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．により、細胞懸濁液と１：１（ｖ：ｖ）で穏やかに混合する、すぐに使える無血清無タンパク質の凍結保存培地であると説明されている。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）により、初代細胞培養物、リンパ球、ハイブリドーマ、ＣＨＯ、結腸、ＩＢＨＫおよびがん細胞株を含めた種々の細胞型の高い生存能力および蘇生が支持される。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）は、臨床グレードの成分、ガラス化剤および凍結保存剤の独自の配合を含有し、最終濃度が５％ＤＭＳＯである。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）により、ヒトおよび他の哺乳動物の細胞に対する凍結保護がもたらされる。右側は、ＥＺ−ＣＰＺとＭ３Ｄ（商標）限定培地（Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）の５０：５０混合物であり、これは、処理された微小血管組織の組成物材料を保存する緩衝液を表す。Ｍ３Ｄ（商標）は、Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．により、塩、アミノ酸、および糖を含有するが、増殖因子または血清もしくは抽出物などの未定義の成分は含有しない限定培地であると説明されている。移動の時間経過を１２時間および４８時間の時点で画像処理した。
【図８】図８は、蛍光顕微鏡画像を示す。ＳＶＦ細胞を４８ウェルプレートにプレーティングし、およそ５０％集密まで成長させた。ＢＭＡ材料をＣＭＤｉＩで染色し、すすいだ。ＢＭＡ材料５０μｌを成長しているＳＶＦ細胞の単一のウェルに入れた。ＣＭＤｉＩ染色した材料がＳＶＦ細胞によって取り込まれ、それら自体の膜に組み入れられると蛍光が観察される。緩衝液１中のＢＭＡ材料が上の段に示されており、緩衝液２中のＢＭＡ材料が下の段に示されている。左側の材料は放射線照射したものであり、右側の材料（対照）は放射線照射していないものである。
【図９】図９は、蛍光顕微鏡画像を示す。ＳＶＦ細胞を４８ウェルプレートにプレーティングし、およそ５０％集密まで成長させた。ＢＭＢ材料をＣＭＤｉＩで染色し、すすいだ。ＢＭＡ材料５０μｌを成長しているＳＶＦ細胞の単一のウェルに入れた。ＣＭＤｉＩ染色した材料がＳＶＦ細胞によって取り込まれ、それら自体の膜に組み入れられると蛍光が観察される。緩衝液１中のＢＭＢ材料が上の段に示されており、緩衝液２中のＢＭＢ材料が下の段に示されている。左側の材料は放射線照射したものであり、右側の材料（対照）は放射線照射していないものである。
【図１０】図１０は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞の微小血管組織への曝露に応答した遊走に関連するデータを示す。トランスウェルプレートの膜を通過するＨＵＶＥＣの数を４８時間の時点で計数し、培養培地＋ＥＧＦ対照と比較した。
【図１１】図１１は、大腿動脈切断後、０日目、ならびに凍結乾燥した微小血管組織または滅菌した微小血管組織のいずれかを投与した後７日目および１４日目のマウスの後肢への血流の回復に関連するデータを示す。
【図１２】図１２は、マトリゲルを単独で、または凍結乾燥した微小血管組織もしくは滅菌した微小血管組織のいずれかと組み合わせて注射した後のＳＣＩＤマウスにおける新しい血管の生成に関連するデータを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｃは、微小血管組織を植え込んだ後の骨の再生に関する。図１３Ａは、微小血管組織を伴う足場または微小血管組織を伴わない足場を投与した後の強度、弾性率、および靱性（対照である反対側の骨と比較して）に関連するデータを示す。図１３Ｂは、足場を単独で投与した後の骨再生に関する組織学的データを示す。図１３Ｃは、足場を微小血管組織と組み合わせて投与した後の骨再生に関する組織学的データを示す。
【図１３Ｂ−Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃは、微小血管組織を植え込んだ後の骨の再生に関する。図１３Ａは、微小血管組織を伴う足場または微小血管組織を伴わない足場を投与した後の強度、弾性率、および靱性（対照である反対側の骨と比較して）に関連するデータを示す。図１３Ｂは、足場を単独で投与した後の骨再生に関する組織学的データを示す。図１３Ｃは、足場を微小血管組織と組み合わせて投与した後の骨再生に関する組織学的データを示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｈは、微小血管組織を植え込んだ後の軟骨の再生に関する。図１４Ａは、足場単独で処置した軟骨の肉眼で見える画像を示し、一方、図１４Ｂ、図１４Ｃ、および図１４Ｄは、足場単独で処置した軟骨における、誘導された軟骨欠損の充填、プロテオグリカンの保持およびマトリックス染色に関連する画像（それぞれ）を示す。図１４Ｅは、微小血管組織を補充した足場で処置した軟骨の肉眼で見える画像を示し、一方、図１４Ｆ、図１４Ｇ、および図１４Ｈは、微小血管組織を補充した足場で処置した軟骨における誘導された軟骨欠損の充填、プロテオグリカンの保持およびマトリックス染色に関連する画像（それぞれ）を示す。
【図１５Ａ−Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｆは、微小血管組織を使用した、すり減った腱の修復に関する。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、すり減った無処置の腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、それぞれ、足場単独で処置したすり減った腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。図１５Ｅおよび図１５Ｆは、それぞれ、微小血管組織を補充した足場で処置したすり減った腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。
【図１５Ｅ−Ｆ】図１５Ａ〜１５Ｆは、微小血管組織を使用した、すり減った腱の修復に関する。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、すり減った無処置の腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、それぞれ、足場単独で処置したすり減った腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。図１５Ｅおよび図１５Ｆは、それぞれ、微小血管組織を補充した足場で処置したすり減った腱のマッソントリクローム染色またはテネイシン免疫組織化学的検査について示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、微小血管組織を処理して単離された多能性細胞または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織で構成される細胞膜を含む組成物を作製するための新規の方法の開発に一部基づく。種々の実施形態では、細胞または組織はこれらの手順の間に培養しない。組成物が血管新生活性または抗炎症活性を有することが有利である。いくつかの実施形態では、手順の間に組成物を滅菌し、かつ／または前記組成物内のウイルスを不活化するが、それでも組成物は予想外の治療的有効性を示す。
【００２６】
本発明の方法によって作製される新規組成物により、対象における傷害、例えば、軟部組織傷害の処置または予防に関連する利点を含めた、以前の処理された微小血管組織および多能性細胞の組成物を超える利点がもたらされる。これらの利点としては、以下が挙げられる（しかし、これだけに限定されない）：（１）対象の同種異系または異種処置のために本発明の組成物を使用することができること；（２）本発明の組成物により、免疫応答の低下および拒絶反応の可能性の低下が生じること；（３）本発明の組成物は抗炎症活性を有すること；（４）本発明の組成物は血管新生活性を有すること；（５）本発明の組成物は滅菌されており、かつ／または有害なウイルスにより汚染されていないこと；および（６）本発明の組成物は使用する前に安定に保管することができ、かつ／または即時使用の準備ができていること。要するに、これらの組成物により、従来の生存可能な幹細胞または多能性細胞の調製物に固有の作用機構の、組織への分化以外の全てが都合よくもたらされる。以下の説明では、本発明の種々の実施形態の詳細な理解をもたらすために、ある特定の具体的細目が記載されている。しかし、これらの細目を伴わずに本発明を実施することができることが当業者には理解されよう。
【００２７】
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語を下で定義する。
【００２８】
「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」という単語は、特に記載がなければ１つまたは複数を示す。
【００２９】
「約」とは、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さが、参照される数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さから３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％程度変動することを意味する。「約」という用語と併せて使用される数値に関して考察されているいずれの実施形態でも、約という用語を省略することができることが明確に意図されている。
【００３０】
文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびにその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、制限のない、包括的な意味で、すなわち「含むがこれだけに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきである。
【００３１】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句に続くいかなるものも包含し、かつ、それに限定されるものとする。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在してはならないことを示す。
【００３２】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その句の後に列挙されている要素をいずれも含み、かつ、列挙されている要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されるものとする。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在する場合もあり、存在しない場合もあることを示す。
【００３３】
本明細書全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して各所に現れる「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で１つまたは複数の実施形態に組み合わせることができる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能的な」という用語などは、生物学的機能、酵素的機能、または治療的機能を指す。
【００３５】
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」または「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍以上（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）（全ての整数および中間の１を超える小数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４などを含める）である増加を含み得る。
【００３６】
「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」または「より少ない（ｌｅｓｓｅｒ）」量とは、一般には、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、または５０分の１以下（例えば、１００分の１、５００分の１、１０００分の１）（全ての整数および中間の１を超える小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含める）である減少を含み得る。
【００３７】
「から得た（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）」とは、試料、例えば、細胞または組織などが、特定の供給源、例えば、所望の生物体または所望の生物体内の特定の組織などから単離されたまたはそれに由来するものであることを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、例えば、多能性細胞に関しては、その天然の環境から取り出されたことを意味する。例えば、細胞は、その天然の環境において一緒に存在する材料の一部または全部から分離されている場合、単離されたものである。
【００３９】
「処理された微小血管組織」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の通り解離された微小血管組織を指す。
【００４０】
「凍結保存する」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば低温で凍結させた、多能性細胞組成物または処理された微小血管組織の組成物を指す。処理された微小血管組織の組成物ならびに凍結保存された多能性細胞の組成物および微小血管組織組成物は、抗炎症活性および血管新生活性を含めた種々の生物学的性質を有する。
【００４１】
「多能性細胞」とは、２種以上の異なる特殊化した細胞型に分化する能力を維持する細胞を指す。「多能性細胞」とは、幹細胞および多能性前駆細胞を包含する。本明細書で使用される場合、「多能性細胞」という用語は、細胞の、本明細書に記載の方法に従って滅菌または保存する前の、２種以上の異なる特殊化した細胞型に分化する元々の能力を指す。多能性細胞の例としては、これだけに限定されないが、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、内皮前駆細胞、脂肪由来の幹細胞、および臍帯幹細胞が挙げられる。本明細書に記載の方法に従って滅菌または保存した後、多能性細胞は成長または分化するその能力を失う可能性があることが理解される。
【００４２】
「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」としては、これだけに限定することなく、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により、ヒトまたは家畜動物において使用するために許容されるものとして認可された任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、調味剤、界面活性物質、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張化剤、溶媒または乳化剤が挙げられる。
【００４３】
「医薬組成物」とは、本発明の組成物と、治療剤を哺乳動物、例えば、ヒトに送達するために当技術分野において一般に認められている媒体との製剤を指す。したがって、そのような媒体としては、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および同様の単語、例えば、「処置した（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を示す。処置には、場合により、傷害、疾患もしくは状態の症状の低下もしくは好転、または傷害、疾患もしくは状態の進行の遅延が伴い得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を投与することにより、そのような症状の１つまたは複数が処置され得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語、例えば、「予防した（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などは、傷害、疾患または状態の発症または再発を予防する、阻害するまたはその可能性を減少させるための手法を示す。これは、傷害、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の出現もしくは再発を予防する、阻害するもしくはその可能性を減少させること、または場合により、傷害、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させるため、もしくは傷害、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の出現もしくは再発を遅延させるための手法も指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および同様の単語は、傷害、疾患または状態の強度、影響、症状および／または負荷量を低下させることも包含する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、組成物の「有効量」または「治療有効量」は、例えば有益な臨床結果などの所望の生物学的効果に影響を及ぼすために十分な量である。
【００４７】
「自己移入」、「自家移植」などの用語は、組織ドナーが、組織から作製された組成物のレシピエントでもある処置を指す。
【００４８】
「同種異系移入」、「同種移植」などの用語は、組織ドナーが、組織から作製された組成物のレシピエントと同じ種であるが同じ個体ではない処置を指す。
【００４９】
「異種移入」、「異種移植」などの用語は、組織ドナーが、組織から作製された組成物のレシピエントとは異なる種のものである処置を指す。
【００５０】
幹細胞組成物および微小血管組織組成物を作製する方法
本発明の複数の態様は、血管の組織、例えば、微小血管の組織を処理して多能性細胞またはその断片を含む組成物を作製する新規の方法に関する。特定の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の追加的な組織成分をさらに含む。したがって、「処理された微小血管組織の組成物」という用語は、インタクトな多能性細胞を含んでもよく含まなくてもよい本発明の組成物を指す。特定の実施形態では、本発明の微小血管組織組成物は、インタクトな多能性細胞を全く含まない、または多能性生細胞を全く含まない、または生細胞を全く含まない。ある特定の実施形態では、本発明の微小血管組織組成物は、多能性細胞の断片または細胞膜を含む。本発明の「多能性細胞を含む組成物」または「多能性細胞組成物」は、多能性生細胞および／または多能性死細胞を含んでよい。
【００５１】
いくつかの実施形態は、種々の傷害、疾患または病態、例えば、軟部組織傷害の処置および予防において有用なものを含めた多能性細胞組成物および微小血管組織組成物を作製するための新規の方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、単離された多能性細胞の組成物、または微小血管組織組成物を滅菌すること、および／または前記細胞または組織内のウイルスを不活化することを含む。そのような滅菌された多能性細胞の組成物および微小血管組織組成物が、傷害、疾患および他の病態の処置または予防において有用な性質を含めた望ましい生物学的性質を保持することは驚くべき予想外の知見である。
【００５２】
本発明の多能性細胞組成物および微小血管組織組成物は、任意の哺乳動物の組織、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、またはウマなどの哺乳動物から得た組織から調製することができる。本発明の組成物は、自己の、同種異系のまたは異種の対象を処置するために使用することができる。したがって、組織は、処置される対象から得ることもでき、処置される対象と同じ種であっても異なる種であってもよい異なるドナー動物から得ることもできる。特定の実施形態では、組織は、処置される対象と同じ種の同種異系ドナー、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物ドナーから得る。特定の実施形態では、ドナー動物は健康なドナーである。
【００５３】
種々の実施形態では、多能性細胞組成物または微小血管組織組成物は、いくつかの異なる組織のいずれかから調製される。特定の実施形態では、組織は非胚組織である。例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物を調製するために使用する組織は、血管組織または微小血管組織、例えば、脂肪組織、皮膚、骨、腱組織、産後組織（例えば、臍帯組織または胎盤組織）、骨髄、または筋肉組織などである。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、組織試料を解離させて細胞および／もしくは他の組織成分を放出させるステップと、放出された細胞および／もしくは組織成分の少なくとも一部分を１つもしくは複数の他の組織成分から分離するステップと、分離した細胞および／もしくは組織成分を滅菌し、かつ／または分離した細胞および／もしくは組織成分中のウイルスを不活化する処置を行うステップとを含む方法によって調製することができる。ある特定の実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を滅菌またはウイルスを不活化する処置の前、その間、またはその後に乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存する。特定の実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存した後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。関連する実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、凍結保護物質、例えば、細胞を滅菌用放射線から保護する凍結保護物質と接触させた後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。凍結保護物質により、細胞成分を、タンパク質の安定化、フリーラジカルのクエンチ、および酸化への抵抗によって保護することができる。放射線照射中に組成物を冷却すること、組成物から酸素を除去すること（例えば、組成物を乾燥することおよび／または真空もしくは不活性雰囲気中で放射線照射すること）により、損傷をさらに最小限にすることができる。
【００５５】
関連する実施形態では、本発明の方法は、ドナー哺乳動物から得た組織試料を解離させて、その中の複数の多能性細胞を放出させるステップと、複数の放出された多能性細胞を１つまたは複数の他の組織成分から分離して、単離された多能性細胞を含む組成物を作製するステップと、単離された多能性細胞を含む組成物を滅菌し、かつ／または単離された多能性細胞を含む組成物中に存在するウイルスを不活化するステップとを含む。特定の実施形態では、多能性細胞を含む組成物を、滅菌またはウイルスを不活化する処置の前、その間、またはその後に、乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存する。特定の実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存した後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。関連する実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、凍結保護物質、例えば、細胞を滅菌用放射線から保護する凍結保護物質と接触させた後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。
【００５６】
別の関連する実施形態では、本発明の方法は、ドナー哺乳動物から得た組織試料を解離させてその中の複数の組織成分を放出させるステップと、複数の放出された組織成分を分離して、１つまたは複数の組織成分を含む組成物を作製するステップと、組成物を滅菌し、かつ／または組成物中に存在するウイルスを不活化するステップとを含む。特定の実施形態では、組成物を、滅菌またはウイルスを不活化する処置の前、その間、またはその後に、乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存する。特定の実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、乾燥、凍結乾燥、凍結、または凍結保存した後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。関連する実施形態では、分離した細胞および／または組織成分を、凍結保護物質、例えば、細胞を滅菌用放射線から保護する凍結保護物質と接触させた後に、滅菌するかまたはウイルスを不活化する処置を行う。
【００５７】
ある特定の実施形態では、組織成分は、１つまたは複数の多能性細胞、分化細胞、細胞外マトリックスの成分、増殖因子、血管新生作用物質、抗炎症作用物質、サイトカイン、ケモカイン、および／または分化作用物質を含む。細胞外マトリックス成分としては、これだけに限定されないが、種々のコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジンなどの細胞外マトリックスタンパク質、ならびに本明細書に記載のその他のものが挙げられる。
【００５８】
組織試料は、対象またはドナーから、外科手術、脂肪吸引（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、生検または針生検を含めた種々の異なる方法によって得ることができる。ドナーは生きていても死んでいてもよく、例えば、最近死亡したものであってよい。
【００５９】
組織は、機械的処理および／または酵素的処理の両方を含めた種々の方法によって解離させることができる。例えば、組織は、機械力（細かく切る力またはせん断力）、単一のもしくは組み合わせたタンパク質分解酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼおよび／もしくは中性プロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、ヒアルロニダーゼ、および／もしくはペプシンなどを用いた酵素的消化、または機械的方法と酵素的方法の組合せによって解離させることができる。特定の実施形態では、本発明の方法ではコラゲナーゼの使用を用いない。
【００６０】
ある特定の実施形態では、酵素的消化方法では、酵素の組合せ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せなどを使用する。特定の実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはコラゲナーゼであってよく、中性プロテアーゼはサーモリシンまたはディスパーゼであってよい。コラゲナーゼは、１型、２型、３型、または４型（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１８）であってよい。特定の実施形態では、酵素的消化方法では、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、およびヒアルロン酸を消化するための粘液溶解酵素の組合せ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびヒアルロニダーゼの組合せ、またはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）およびヒアルロニダーゼの組合せなどを使用する。細胞を解離させるための当技術分野で公知の他の酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼなどが挙げられ、これは、それ自体で使用することも、マトリックスメタロプロテアーゼ、粘液溶解酵素、および中性プロテアーゼなどの他の酵素と組み合わせて使用することもできる。ある特定の実施形態では、酵素の組合せは、１型コラゲナーゼと、ディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか、Ｌｉｂｅｒａｓｅ、および／またはＶｉｔａｃｙｔｅを含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、酵素の組合せは、１型コラゲナーゼと、ディスパーゼもしくはサーモリシンのいずれか、Ｌｉｂｅｒａｓｅ、および／またはＣｉｚｙｍｅを含む、またはそれからなる。特定の実施形態では、コラゲナーゼは、単独でも１つまたは複数の追加的な酵素との組合せでも使用しない。ある特定の実施形態では、ＭＭＰ１の代わりにＭＭＰ２および／またはＭＭＰ１４を使用する（単独でまたは本明細書に記載の組合せで）。
【００６１】
解離を実現するために組織または細胞をプロテアーゼと接触させる温度および時間は公知であり、当業者が容易に決定することができる。細胞の解離が増加または減少するように酵素的消化プロセスを調整することができる。例えば、より完全な細胞の解離が望まれる場合には、２種以上の酵素を含めることもでき、消化時間を増大させることもできる。細胞の生存能力は維持される必要はないが、一部の実施形態では、一般に、酵素的消化の間にいくらかの細胞溶解が起こったとしても、付着およびシグナル伝達分子を含有する膜が保存されるように、細胞膜が大体インタクトなままであることが望ましい。したがって、本発明の一実施形態によると、そのようなプロセスにおけるリピダーゼ（ｌｉｐｉｄａｓｅ）などの酵素の使用は有用ではない場合がある。
【００６２】
酵素処置の代わりに、またはそれに加えて、非酵素的方法を使用して組織を解離させることができる。例えば、キレート化剤、超音波撹拌、超音波（例えば、脂肪細胞を溶解もしくは除去するため）、または機械的な細胞の解離の使用を含めた、物理的手段または化学的手段を使用して組織を解離させることができる。
【００６３】
組織が骨である特定の実施形態では、細胞からコラーゲンマトリックスをなくすために、酵素的な（または他の）処理の前に骨を脱灰処理する。特定の実施形態では、ＥＤＴＡを使用して骨を脱灰処理する（組織を脱脂するための溶媒、その後の骨塩を除去するための酸とは対照的に）。ある特定の実施形態では、組織、例えば骨を処理する方法は、以下の１つまたは複数を含まない：脂肪および／または細胞の溶媒抽出、粒子サイズを低下させるための凍結粉砕、および／または酸による脱灰処理。
【００６４】
組織を解離させた後、解離した組織をさらに処置して所望の組織成分、例えば、多能性細胞（および／または他の所望の細胞性組織成分または非細胞性組織成分）を望ましくない組織成分から単離または分離することができる。これらの方法を使用して、例えば、赤血球、脂肪細胞、他の分化細胞、または脂質などの望ましくない細胞または分子を除去することができる。濾過（例えば、孔径２０ミクロンのフィルターは多能性細胞を通すが多くの脂肪細胞または筋肉細胞は保持する）、遠心分離（脂肪細胞および脂質は浮遊するが、多能性細胞はペレット化される）、または密度勾配（赤血球をペレット化させるため、および多能性細胞を望ましくない細胞とは異なるレベルで懸濁させるために勾配を使用することができる）などの種々の方法を使用して多能性細胞および他の所望の組織成分を望ましくない細胞または組織成分から分離することができる。使用する特定の方法は、一部において、処理される組織の供給源に左右される。例えば、組織供給源が脂肪組織である場合、脂質、脂肪細胞、およびいくつかの前脂肪細胞を微小血管組織の他の成分から分離するために、解離した組織を場合によって比較的低い力で遠心分離し、一方、多能性細胞を骨髄から単離する場合には、密度勾配を場合によって使用する。他の実施形態では、密度勾配遠心分離の使用などの筋肉細胞単離プロトコールを使用して酵素的消化の後に筋肉組織をさらに処置して、筋肉細胞を除去し、所望の細胞を濃縮することができる。
【００６５】
ある特定の実施形態では、例えば凝集塊を除去するために、本発明の組成物の濾過も行う。例えば、毛細血管が詰まることを回避するために、大きな凝集塊を除去するための、例えば孔径２０〜５０ミクロンのフィルターを用いた濾過を静脈内注射用の組成物の調製の間に実施することができる。特定の実施形態では、解離後かつ使用前、例えば、解離後かつ凍結乾燥または滅菌前に濾過を実施する。
【００６６】
実施形態に応じて、多能性細胞組成物および微小血管組織組成物を、場合により、保管または保存のために凍結または乾燥させる、例えば、乾燥する（例えば、フリーズドライまたは噴霧乾燥する）、凍結保存する、または凍結させる。本発明の組成物を保存する際、糖（例えば、トレハロース、マンニトール、スクロース）、多価アルコール（例えば、ポリエチレングリコール）、アルデヒド、タンパク質（例えば、アルブミン）、アミノ酸（例えば、グリシン）、界面活性物質（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）、ＤＭＳＯ、および／または過マンガン酸塩を含めた任意の適切な賦形剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、賦形剤は使用しない。
【００６７】
細胞およびそれらの活性成分を、一部において、電離放射線による損傷からいくつかの方法によって保護することができる。抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーが非常に有効であり得る。凍結乾燥において使用する糖などの巨大分子を固定する作用剤、および乾燥プロセス自体により、破壊された鎖が再結合してそれらの元の化学構造になる可能性が増す。水、空気および他の酸素の供給源を除去することにより、タンパク質または他の生物活性種の酸化が減少する。放射線照射の間組成物を凍結させることによっても、切断された分子が不適切に再結合する可能性が低下する。最後に、細胞内で細胞または活性な分子よりも賦形剤の濃度がはるかに高いことは、単に質量作用の影響で活性化合物の切断がより少なくなることを意味する。
【００６８】
フリーズドライ（例えば、凍結乾燥）には、一般には、４つのステップ：前処置、凍結、一次乾燥、および二次乾燥が伴う。前処置は、濃度調整または１つまたは複数の賦形剤の添加を含んでよい。前処置後、多能性細胞組成物または微小血管組織組成物を凍結させる。凍結ステップは、一般には、慎重に制御した様式で（例えば、毎分約−０．５℃から毎分約−５０℃の間の冷却速度で）行って、細胞構造を保存するが、細胞の生存能力は保存される必要はない。一部の実施形態では、多能性細胞組成物または微小血管組織組成物を毎分約−１０℃の冷却速度で凍結させる。冷却速度は、特定の細胞または組織および使用する賦形剤に基づいて調整することができる。多能性細胞組成物または微小血管組織組成物は、機械的な冷凍を使用することおよび／または組成物を含有する容器をフリーズドライに適した温度に到達するまでドライアイスまたは液体窒素に曝露させることを含めた任意の適切な手段を使用して凍結させることができる。一次乾燥ステップの間、温度および圧力を調整して、多能性細胞または微小血管組織からの水の昇華が引き起こされるために適した条件にする。使用する賦形剤および／または細胞または微小血管組織の濃度を適応させるために特定の温度および圧力を調整することができる。二次乾燥ステップの間、温度および圧力をさらに調整して、凍っていない水の多能性細胞または微小血管組織からの除去を容易にする。二次乾燥ステップ後の最終的な含水量は、約１重量％から約４重量％までの間（約１％〜約２％、約２％〜約３％、約３％〜約４％、約４％〜約５％、およびその重複している範囲を含む）であることが好ましいが、貯蔵寿命または生物活性を最大にするために調整することができる。
【００６９】
一部の実施形態では、多能性細胞組成物または微小血管組織組成物を噴霧乾燥する。噴霧乾燥の前に、多能性細胞組成物または微小血管組織組成物を、必要に応じてフリーズドライではなく噴霧乾燥のために選択された賦形剤を用いて、フリーズドライされる多能性細胞組成物または微小血管組織組成物と同様に前処置することができる。噴霧乾燥の間、多能性細胞または微小血管組織を微粒化して液滴にし、乾燥チャンバー内で熱風に曝露させる。一実施形態では、賦形剤は、利用する温度で融解しない糖である。特定の実施形態では、賦形剤は、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、および没食子酸プロピルなどの抗酸化剤である。
【００７０】
一部の実施形態では、多能性細胞組成物および微小血管組織組成物は、乾燥によっては処理せず、その代わりに、凍結保存する。細胞および組織を凍結保存するための方法は公知である。例えば、細胞組成物または微小血管組織組成物は、１つまたは複数の賦形剤または凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、アルブミン、または糖）と混合し、慎重に制御した様式で冷却することができる。一部の実施形態では、冷却は２つ以上の段階で行い、第１段階は制御した様式で（例えば、温度を毎分１℃ずつ下げて）中間の温度（例えば、−３０℃）まで行い、第２段階で中間の温度にある細胞または組織をより低い保管温度（例えば、−１９６℃）に移行させる。
【００７１】
凍結保存された多能性細胞の組成物および血管組織組成物は、凍結保存状態を維持するために適した温度（例えば、約−３０℃〜−１９６℃）で保管することができる。フリーズドライまたは噴霧乾燥した処理された細胞または微小血管組織は、凍結保存した細胞、生細胞、または新鮮な組織よりも幅広い条件で保管することができる。処理された細胞または微小血管組織を保管するために適した温度としては、約−１００℃〜約４５℃の温度が挙げられる。一部の実施形態では、フリーズドライまたは噴霧乾燥した処理された細胞または微小血管組織は、室温で保管することができる。
【００７２】
種々の実施形態では、提供される処理された細胞または微小血管組織の貯蔵寿命は、１つまたは複数の生物活性を維持しながら、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約６カ月、またはそれ以上である。特定の実施形態では、組成物は、およそ４℃で少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、または少なくとも１年にわたって保管した場合、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。本明細書に記載のキットおよび組成物の特定の実施形態では、組成物は、およそ−２０℃で少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、または少なくとも約１年にわたって保管した場合、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。特定の実施形態では、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかを含めたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合、保管前の活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。
【００７３】
生じた組成物を含めた、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、場合により、例えば、細菌、ウイルス、および真菌などの微生物、またはプリオンによる汚染を減少させるまたは排除するために滅菌する。特定の実施形態では、多能性細胞を含む組成物および／または他の組織成分を、放射線照射を使用して滅菌する。電子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、または紫外線放射などの放射線を使用する滅菌方法がある。特定の実施形態では、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、約０．５〜約５．０Ｍｒａｄ、または約１．０〜約３．０Ｍｒａｄの範囲、または約１．０Ｍｒａｄ、または約１．５Ｍｒａｄ、または約２．０Ｍｒａｄ、または約２．５Ｍｒａｄ、または約３．０Ｍｒａｄ、または約３．５Ｍｒａｄ、または約４．０Ｍｒａｄ、または約４．５Ｍｒａｄ、または約５．０Ｍｒａｄ（またはこれらの値の間の任意のガンマ線照射量）の線量のガンマ線照射に曝露させることによって滅菌を実施する。特定の実施形態では、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、約０．５〜約５．０Ｍｒａｄ、または約１．０〜約３．０Ｍｒａｄの範囲、または約１．０Ｍｒａｄ、または約１．５Ｍｒａｄ、または約２．０Ｍｒａｄ、または約２．５Ｍｒａｄ、または約３．０Ｍｒａｄ、または約３．５Ｍｒａｄ、または約４．０Ｍｒａｄ、または約４．５Ｍｒａｄ、または約５．０Ｍｒａｄ（またはこれらの値の間の任意のガンマ線照射量）の線量の電子ビーム照射に曝露させることによって滅菌を実施する。多くの場合、組成物を曝露させる放射線の量を測定することはより容易である。特定の実施形態では、滅菌用のＥビームまたはガンマ線のレベルは、約９〜約３０ｋＧｙ、または約２０〜約３０ｋＧｙ、または約９〜約１７ｋＧｙ（またはこれらの値の間の任意の放射線の量）である。さらに、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、ウイルスを不活化するために処置することができる。ウイルスを不活化する方法は、上記の通り滅菌用の放射線照射の使用を含め、当技術分野で公知である。酸または塩基による処置、漂白、アルデヒドまたはエチレンオキシド溶液、または熱を含めた、ウイルスを不活化する他の方法を使用することができる。組成物の凍結乾燥または凍結に使用する凍結保護物質および他の賦形剤によっても放射線から保護することができることが理解される。例えば、低温と併せた糖およびアルブミン（または他の安定化タンパク質）により、細胞に対する放射線障害からの保護がもたらされる。したがって、特定の実施形態では、滅菌またはウイルス不活化を凍結乾燥後に実施する。
【００７４】
さらに、処理または凍結保存された多能性細胞または微小血管組織の組成物の治療的使用のための適合性に生存能力は必要ないので、保存プロセスおよび保管を生存能力が維持されるように調整する必要はない。処理、滅菌、または凍結保存前の、提供される多能性細胞組成物または微小血管組織組成物中の生存細胞の百分率は１００％に至り得る。これは、処理、滅菌、または凍結保存後には、約５０％未満、例えば、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約１％未満であり得る。一部の実施形態では、提供される処理された多能性細胞の組成物または微小血管組織組成物は、処理、滅菌、または凍結保存後に生存細胞を含有しない。いくつかの実施形態では、処理または凍結保存された多能性細胞または微小血管組織の組成物は、例えば軟部組織の治療的修復および／または再生において使用される。追加的な実施形態では、処理または凍結保存された多能性細胞または微小血管組織の組成物は硬組織の治療的修復および／または再生において使用される。
【００７５】
さらに、微生物汚染の可能性を減少させるために、組織を調達または処理する前に、ドナーを微生物の所定の一覧（例えば、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＴＢなど）についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して微生物の核酸の存在を検出すること、または特定の微生物に関連する分子の存在をＥＬＩＳＡによって検出することによるものなどの公知の技法を使用して行うことができる。本発明の一部の実施形態によると、微生物により汚染された微小血管組織を使用からから排除することができる。さらに、処理または凍結保存された組織は、無菌的または滅菌技法を使用して作製することができる。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、解離した細胞または微小血管組織を培養することを含まない。
【００７７】
単離された幹細胞組成物および微小血管組織組成物
本発明の方法により、独特の多能性細胞組成物および微小血管組織組成物が作製される。本発明で提供される多能性細胞組成物および微小血管組織組成物は、いくつかの実施形態では、微小血管組織（例えば、脂肪組織、腱組織、または筋肉組織）の解離（例えば、酵素的消化による）により生じた幹細胞および／または前駆細胞の混合物を含み得る、最小限の処理がなされた培養されていない細胞または培養されていない微小血管組織（またはその成分）を含む。処理された多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、追加的な分子（例えば、細胞外マトリックス分子または増殖因子の全体または断片化されたもの）を含んでよい。さらに、処理された多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、実施形態に応じて、多能性細胞の断片または膜を含んでよい。さらに、処理された微小血管組織は、インタクトな多能性細胞を含んでも含まなくてもよい。
【００７８】
上記の通り、本発明の方法を使用して、多能性細胞または処理された微小血管組織を含む組成物を単独で、または１つもしくは複数の追加的な細胞型および／もしくは他の成分と組み合わせて調製することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、追加的な細胞型は、これだけに限定されないが、線維芽細胞、濾胞外毛根鞘細胞を含めたケラチノサイト、内皮細胞、周皮細胞、赤血球、単球、形質細胞を含めたリンパ球、好中球、血小板、肥満細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、肝細胞、神経および神経膠細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含めた間質細胞、上皮細胞、または血液由来細胞である。
【００８０】
特定の実施形態では、追加的な組織成分は、細胞外マトリックスの成分である。細胞外マトリックスは、糖タンパク質、プロテオグリカン、複合炭水化物、および他の分子などの多様な構成物を含む。細胞外マトリックスは、種々のコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、テネイシン（サイトアクチン（ｃｙｔｏａｃｔｉｎ））、エンタクチン（ニドゲン）、オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ）、アンカリンＣＩＩ（ａｎｃｈｏｒｉｎ  ＣＩＩ）、コンドロネクチン、リンクタンパク質、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、エピネクチン（ｅｐｉｎｅｃｔｉｎ）、ヒアルロネクチン（ｈｙａｌｕｒｏｎｅｃｔｉｎ）、アミロイドＰ成分、フィブリリン、メロシン、ｓ−ラミニン、ウンドゥリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン（ｅｐｉｌｌｉｇｒｉｎ）、カリニン、フィブリン、フィブリノーゲン、およびＨＳＰを含めたいくつかの異なるタンパク質のいずれかを含んでよい。
【００８１】
関連する実施形態では、追加的な組織成分は、増殖因子、血管新生作用物質、抗炎症作用物質、サイトカイン、または分化作用物質を含む。例えば、増殖因子または血管新生作用物質は、塩基性線維芽細胞増殖因子、他の線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子β１および／またはβ３、血管内皮細胞増殖因子から選択することができる。使用することができる追加的な増殖因子および増殖因子のクラスまたはファミリーとしては、ある特定の増殖因子についての代表的な生物活性も含む表１５に列挙されているもののいずれかが挙げられる。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、脂肪組織、骨塩、筋肉細胞、および／または血液細胞を全く含有しない、または実質的に含有せず、例えば、これらの細胞型または骨塩の１つまたは複数は処理の間に組成物から除去されている。これにより、組成物中の微小血管系に関連する細胞の濃度を上昇させることができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＤＮＡまたは実質的な量のＤＮＡを含み、例えば、ＤＮＡは処理の間に組成物から除去されておらず、例えば、組織は脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅ）されておらずＤＮＡも洗い流されていない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、細胞および／または組織成分の水溶性懸濁液である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、単独では、皮膚グラフトまたは腱グラフトなどの構造的な足場またはマトリックスを含まない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、皮膚、臍帯、または骨などの微小血管組織を使用して作製することができ、それらは、細胞からマトリックスがなくなるように処置される。
【００８３】
特定の実施形態では、本発明の組成物は１つまたは複数の生物活性を有する。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は抗炎症活性または血管新生活性を有する。ある特定の関連する実施形態では、組成物により、血管形成または組織治癒が促進される。いくつかの実施形態では、これらの効果の組合せが実現される。
【００８４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は抗炎症活性を有する。特定の実施形態では、本発明の組成物に曝露または接触させた傷害または疾患のある組織（例えば、炎症反応が起こっている傷害または疾患のある組織）では、傷害または疾患のある組織を同様に処置するが、本発明の組成物には曝露または接触させない場合と比較して炎症の軽減が示される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物に曝露または接触させた組織における炎症の量は、傷害または疾患のある組織を本発明の組成物に曝露または接触させない場合の炎症の量と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少する。炎症は、例えば、組織学的に観察した場合に患部組織において観察されるリンパ球の数を含めた、当技術分野において利用可能な手段によって測定することができる。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定することができる抗炎症活性を有する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定される炎症の量は、本発明の組成物の不在下または対照組成物の存在下で同じアッセイで測定される炎症の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％少ない。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、混合リンパ球反応である。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は血管新生活性を有する。特定の実施形態では、本発明の組成物に曝露または接触させた傷害または疾患のある組織（例えば、炎症反応が起こっている傷害または疾患のある組織）では、傷害または疾患のある組織を同様に処置するが、本発明の組成物には曝露または接触させない場合と比較して、血管新生の増加が示される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物に曝露または接触させた組織における血管新生の量は、傷害または疾患のある組織を本発明の組成物に曝露または接触させない場合の血管新生の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％増加する。血管新生は、例えば、本明細書に記載の後肢虚血モデルを含めた、当技術分野において利用可能な手段によって測定することができる。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定することができる血管新生活性を有する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイで測定される活性の量は、本発明の組成物の不在下または対照組成物の存在下で同じアッセイで測定される活性の量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％多い。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは実施例４に記載のマトリゲルアッセイである。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは本明細書に記載の内皮細胞遊走アッセイである。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物により、傷害または疾患のある組織の治癒が促進される；すなわち、本発明の組成物は組織治癒活性を有する。本明細書で使用される場合、組成物の「組織治癒活性」とは、組成物に曝露させた傷害または疾患のある組織（例えば、硬組織または軟部組織）の治癒（例えば、修復または再生）の、同様に処置したが組成物への曝露は伴わない類似組織と比較した改善を容易にする組成物の能力である。治癒の改善は、完全に治癒するまでの時間、生じた新しい組織の量、もたらされる治癒した組織の強度、またはもたらされる治癒した組織の機能性などの任意の適切な手段を使用して測定する。
【００８９】
滅菌またはウイルス不活化された、同種異系多能性細胞の組成物、異種多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、自己由来の幹細胞を用いた新しい軟部組織の作製が難しいこと、同種異系幹細胞および異種幹細胞は拒絶されると認識されていること、および滅菌またはウイルス不活化された細胞の生存能力は低下しており、したがって生物活性または治療的活性が低下していると以前は考えられていたことが原因で、以前は靭帯および腱などの軟部組織の修復を容易にするために使用されていなかった。しかし、本明細書に記載のプロセスおよび組成物は、精製された幹細胞または細胞の生存能力に依拠するとは限らない。それどころか、提供されるプロセスは、生存不可能な細胞、間葉系幹細胞および前駆細胞、ならびにそのような細胞から分泌される他の分子（例えば、サイトカイン、増殖因子、走化性分子など）を含めた細胞の混合物を含有する組成物を作製するために使用される。一部の実施形態では、組成物は、生存可能な細胞と生存不可能な細胞の混合物を含有する。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明の組成物中に存在する細胞の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満が生存可能である。いくつかの実施形態では、細胞の実質的に全てが生存不可能である。本明細書で使用される場合、「生存可能な」という用語にはその通常の意味が与えられるものとし、また、適切な条件下、例えば、同じ細胞または細胞型が、例えば、本明細書に記載の通り処理しなければ増殖すると予測される条件で培養した場合に増殖することができる細胞も指すものとする。他の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の約２％未満または約１％未満が生存可能である。特定の実施形態では、組成物中に存在する細胞の全てまたは実質的に全てが生存不可能である。したがって、「生存不可能」という用語は、細胞が、適切な条件下、例えば、同じ細胞が、例えば本明細書に記載の通り処理しなければ増殖すると予測される条件で培養した場合に増殖することができないことを意味する。
【００９１】
しかし、特定の実施形態では、本発明の組成物中の細胞の少なくともいくつかがトリパンブルーを排除する。特定の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％がトリパンブルーを排除する。
【００９２】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、トリパンブルーを排除するが生存不可能である細胞を含む。ある特定の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約５０％がトリパンブルーを排除するが生存不可能である。
【００９３】
本発明に従って、本明細書に記載の組成物中の細胞は生存不可能であってよく、対象に移植された後に長く持続しなくてよいが、それにもかかわらず、当該組成物により、対象において、治癒の改善、炎症の軽減、または血管新生の増加がもたらされる応答のカスケードが誘発されることが理解される。本明細書に記載の多能性細胞の組成物および処理された微小血管組織の組成物は、例えば軟部組織などの傷害または疾患のある組織の治癒を促進または誘導するために生存可能な幹細胞または幹細胞全体を含む必要はない。さらに、本発明の組成物は、組成物を調製するために使用する組織試料中に存在するまたはそれに付随する、解離した組織、多能性細胞（例えば、幹細胞）などの細胞、細胞膜、細胞外マトリックス成分、および種々の増殖因子、血管新生因子、抗炎症作用物質、サイトカイン、分化作用物質などを含めた、処理された組織および種々のその成分を含んでよい。
【００９４】
本発明の組成物を、それを必要とする対象に投与するために、組成物を医薬組成物として製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の組成物、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤を含む。本発明の組成物は、医薬組成物中に、それを必要とする対象における傷害、疾患または障害の処置または予防をもたらすのに十分な量で、すなわち、治療有効量で存在する。
【００９５】
薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤は当業者にはよく知られている。組成物を液体溶液として製剤化するための許容される担体および／または希釈剤としては、生理食塩水および滅菌水が挙げられ、また、場合により、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および他の一般的な添加剤を含み得る。本発明の医薬組成物は、本発明の組成物を適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることによって調製することができ、また、固体、半固体、液体または気体形態の調製物、例えば、散剤、顆粒剤、溶液、注射、吸入剤、ミクロスフェアおよびエアロゾルなどに製剤化することができる。これらの組成物は、分散剤および表面活性剤、結合剤および滑沢剤も含有してよい。当業者は、本発明の組成物を適切な様式で、Remington’s  Pharmaceutical  Sciences、Gennaro編、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA  １９９０年に開示されているものなどの許容される慣習に従ってさらに製剤化することができる。
【００９６】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、限定することなく、局所、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、経口、鼻、移植、植え込み、注射、カテーテルを介した送達、局所、経皮、吸入、非経口、および鼻腔内が挙げられる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内への注射または注入の技法を包含する。さらに、本発明の組成物は、外科的に植え込むこと、注射すること、送達すること（例えば、カテーテルまたはシリンジを介して）、または他の方法で、直接または間接的に、修復または増強が必要な部位に投与することができる。例えば、本発明の組成物は、対象における傷害または疾患の部位またはその近くに外科的に導入することができる。一部の実施形態では、投与は静脈内投与である。医薬組成物は、特定の投与経路用に製剤化することができる。特定の実施形態では、当該方法は、組織修復のためには外科的であり、虚血を治療するためには静脈内のものであり、疼痛および炎症を処置するためには関節腔への注射であり、創傷への注射であり、末梢血管疾患を処置するためには筋肉への注射である。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。ある特定の実施形態では、静脈内投与用に製剤化された組成物を濾過して、毛細血管または他の血管を詰まらせる可能性がある大きな粒子または凝集塊を減少させる。特定の実施形態では、静脈内投与用に製剤化された組成物は、場合により等張性であり、ｐＨが約５．０〜約９．０（例えば、約７．３）の範囲であり、容量オスモル濃度が約５０から約６００の間であり、かつ／または重量オスモル濃度が約６００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、例えば、約２９０ｍＯｓｍ／Ｌである。
【００９８】
インプラント、マトリックスおよび足場
ある特定の実施形態では、本発明の組成物をインプラント、マトリックスまたは足場と組み合わせる。マトリックスとしては、生体適合性の足場、格子、自己組織化構造などを挙げることができる。そのようなマトリックスは細胞に基づく療法、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の技術分野で公知である。マトリックスは、本発明の組成物を用いて前処置する（例えば、本発明の組成物を播種する、接種する、それと接触させる）ことができる。本発明のいくつかの態様では、組成物中に存在する細胞および／または組織成分はマトリックスに接着している。一部の実施形態では、細胞は、マトリックスの間隙内に含有される、またはそれに架橋している。特定の実施形態では、細胞および／または他の組織成分はマトリックスと密接に付随しており、治療的に使用する場合、それにより対象の細胞の内部成長および／または血管新生が誘導または支持される。
【００９９】
本発明の組成物に付随したまたは本発明の組成物を含むマトリックスは、対象の体に、これだけに限定されないが、植え込み、注射、外科的取り付け、他の組織の移植などを含めた当技術分野で公知のいかなる形でも導入することができる。本発明の組成物は、対象に提供するまたは対象内に植え込む前にインプラント、マトリックスまたは足場と組み合わせることもでき、本発明の組成物は、対象内にすでに存在するインプラント、マトリックスまたは足場と組み合わせることもできる。インプラント、マトリックスまたは足場により、組成物を対象またはその中の組織中の所望の場所に保持し、対象の中にある組成物を保護し、かつ／または組成物が所望の速度で、もしくは所望の期間にわたって放出されることを可能にする物理的構造がもたらされ得る。
【０１００】
いくつかの実施形態で使用されるマトリックスは、ｉｎ  ｖｉｖｏの組織または臓器の形状および／またはサイズに形づくることができる。本発明の足場は、本明細書に記載の通り、平らであっても管状であってもよく、または、その切片を含んでもよい。本発明の足場は多層であってよい。
【０１０１】
特定の実施形態では、インプラント、マトリックスまたは足場は、生体適合性のインプラント、マトリックス、または足場である。インプラント、マトリックスまたは足場は、固体または液体を含んでよい。インプラント、マトリックス、または足場は生分解性であってよい。特定の実施形態では、インプラント、マトリックスまたは足場は、ミクロビーズもしくは粒子、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場（例えば、ＢｉｏＦｉｂｅｒ（商標）Ｓｃａｆｆｏｌｄ）、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸もしくは植え込み型の医療機器を含む。インプラント、マトリックスまたは足場は、例えば：コラーゲンマトリックスまたは生体適合性ファブリック；整形外科用インプラント；多孔質の柔軟な植え込み型足場；外科用インプラント；多孔質のコーティングされたインプラント；ポリマー溶液；ＤＭＳＯ、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびアルコールなどの溶媒；ヒドロゲル；ヒアルロン酸または他のグリコサミノグリカンまたはプロテオグリカン；コラーゲン；フィブリン；トロンビン；血餅；血小板；血小板が豊富な血漿；脱灰処理された骨基質；自己細胞；および／または海綿骨であってよい。
【０１０２】
本発明の組成物は、例えば、注射用にヒドロゲル溶液に懸濁させることができる。適切なヒドロゲルの例としては、ＲＡＤ１６などの自己組織化ペプチドが挙げられる。あるいは、植え込む前に、細胞を含有するヒドロゲル溶液を硬化させて細胞が分散したマトリックスを形成することができる。ヒドロゲルは、水分子を閉じ込めてゲルを形成する三次元の開いた格子構造が創出されるように共有結合、イオン結合、または水素結合によって架橋した有機ポリマー（天然または合成）であってよい。ヒドロゲルを形成するために使用することができる材料の例としては、イオンにより架橋結合した多糖、例えば、アルギン酸およびその塩、ペプチド、ポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ）、およびポリアクリレートなど、または、それぞれ温度またはｐＨによって架橋結合したブロックポリマー、例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体などが挙げられる。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明の組成物を、生物学的適合性のインプラント、マトリックスまたは足場に付随させる、その中に含有させる、それに塗布する、またはそれをコーティングする。特定の実施形態では、本発明の組成物を使用して、柔軟な生体適合性の足場（例えば、織布シートまたは不織布シートまたは糸）などの材料をコーティングする。ミクロビーズもしくは粒子を含む材料をコーティングするためには、噴霧乾燥した処理された組成物が特によく適し、これは、コーティングを噴霧乾燥プロセスの間に行うことができるのでコーティングする前に再構成する必要がない。ある特定の実施形態では、組成物をマトリックス、例えば、多孔質かつ／またはコラーゲンを含有するマトリックスに包埋させるまたはそれをコーティングする。ある特定の実施形態では、マトリックスは、Ｃｏｎｅｘａ（商標）ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｒｉｘ、ＢｉｏＦｉｂｅｒ（商標）Ｓｃａｆｆｏｌｄ、またはＢｉｏＦｉｂｅｒ（商標）−ＣＭ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｔｏｒｎｉｅｒ；Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）であってよい。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、三次元の足場に付随させてｉｎ  ｖｉｖｏに植え込むことができ、その場合、組成物により、骨組みの上またはその中で細胞増殖が誘導され、ｉｎ  ｖｉｖｏで代替組織が形成される。骨組みの上またはその中で増殖する細胞は、組成物中の細胞および／または足場を植え込む対象の細胞を含んでよい。そのような３次元の骨組みを使用して、胃腸管および泌尿生殖器路、ならびに血管のような管状構造；ヘルニア修復のための組織；腱および靭帯を形成することができる。関連する実施形態では、本発明の組成物を三次元の骨組みに付随させる。骨組みは、所望の矯正構造の形状に形づくることができる。
【０１０５】
本発明において使用することができる足場の例としては、これだけに限定されないが、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６０，２７６号に記載の通り、不織マット、多孔質発泡体、または自己組織化ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸および乳酸の合成吸収性共重合体（ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ；Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）またはポリ−４−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＡ、Ｔｅｐｈａ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）で構成される繊維を使用して形成することができる。例えば、米国特許第６，３５５，６９９号において考察されているフリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって形成されるポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）共重合体で構成される発泡体も使用することができる。一実施形態では、骨組みは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＨＡ、ＰＣＬ共重合体もしくは混和物、またはヒアルロン酸製のマルチフィラメント糸で構成されてよいフェルトである。
【０１０６】
キット
本発明は、本発明の組成物、例えば、医薬組成物を含むキットをさらに含む。組成物は、単独で、例えばバイアル中に、または、処理もしくは凍結保存された微小血管組織との組合せに適したものなどの他の製品と組み合わせて包装することができる。別の材料と一緒に包装する場合、処理または凍結保存された微小血管組織は、他の材料と別々に包装することもでき、他の材料と予備混合することまたはそれに付随させることもできる。一部の実施形態では、処理された微小血管組織を生体適合性材料へのコーティングとして、またはインプラント、マトリックスもしくは足場に付随させて包装する。
【０１０７】
特定の実施形態では、本発明のキットは、本明細書に記載の組成物を含む水分不透過性の容器を含む。例えば、一実施形態では、本発明のキットは、滅菌、乾燥された（例えば、凍結乾燥された）組成物を含む水分不透過性の容器を含み、前記組成物は、単離された多能性細胞または処理された微小血管組織、または前記細胞もしくは組織で構成される細胞膜を含み、前記細胞または組織は培養されておらず、前記組成物は血管新生活性または抗炎症活性を有し、前記組成物は滅菌されており、かつ／または前記組成物内のウイルスが不活化されている。
【０１０８】
本明細書に記載のキットおよび組成物の特定の実施形態では、組成物は、室温付近で少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、または少なくとも１年保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。本明細書に記載のキットおよび組成物の特定の実施形態では、組成物は、室温付近で少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、または少なくとも１年保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。本明細書で使用される場合、「室温」とは、約２０℃〜約２５℃または約２１℃の温度である。本明細書に記載のキットおよび組成物の特定の実施形態では、組成物は、およそ４℃で少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、または少なくとも約１年保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。本明細書に記載のキットおよび組成物の特定の実施形態では、組成物は、およそ−２０℃で少なくとも約１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約６カ月、または少なくとも約１年保管した場合に、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性を保持する。特定の実施形態では、測定可能な血管新生活性または抗炎症活性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかを含めたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合、保管前の活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。
【０１０９】
本発明のキットおよび組成物の特定の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下が生存可能である、前記組成物中に存在する細胞の２％以下が生存可能である、または前記組成物中に存在する細胞の実質的に全てが生存不可能である。関連する実施形態では、前記細胞の少なくとも１％がトリパンブルーを排除する。他の実施形態では、前記細胞の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％がトリパンブルーを排除する。ある特定の実施形態では、前記細胞の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％がトリパンブルーを排除するが生存不可能である。
【０１１０】
種々の実施形態によると、本発明のキットは、本発明の組成物および賦形剤を含む医薬組成物を含んでよい。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化されている。他の実施形態では、本発明のキットは、これだけに限定されないが、本明細書に記載されている任意のものを含めた、本発明の組成物およびインプラント、足場またはマトリックスを含んでよい。特定の実施形態では、植え込み型足場またはマトリックスは、骨由来のインプラント、バイオ繊維足場、多孔質吸収性ポリマー、ヒドロゲル、組織製品を含むパテ、または縫合糸である。ある特定の実施形態では、前記組成物の細胞、組織または細胞膜は、前記植え込み型足場またはマトリックスの骨、腱または皮膚接面に存在する。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本発明のキットは、密封容器中に本発明の滅菌および乾燥（例えば、凍結乾燥）された組成物を含む。密封容器は、防湿性のものまたは水分不透過性のものであってよく、容器の内部へのアクセスが可能になる密封された開口部を含有してよい。ある特定の実施形態では、容器は、気密シールを含むバイアルである。ある特定の実施形態では、容器は、ブリスター包装であり、ホイルシールを含んでよい。特定の実施形態では、密封容器の内部は滅菌されている。したがって、使用する前に、使用者は容器の内部にアクセスし、乾燥した組成物に液体を加えてその組成物を溶解または再構成し、次いで、再構成された組成物を対象に提供するまたは投与することができる。ある特定の実施形態では、液体は、滅菌水、または生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの滅菌溶液である。
【０１１２】
組成物ならびにインプラント、マトリックス、および足場の使用
本発明の組成物、ならびに前記組成物を含むインプラント、マトリックス、および／または足場は、それを必要とする対象における傷害または疾患を処置または予防するために使用することができる。種々の実施形態では、組成物を、それを必要とする組織またはそれを必要とする組織の近く、例えば、それを必要とする組織の周囲の組織に直接提供するまたは適用することができる。それを必要とする対象としては、本発明の組成物を用いた処置が有効であり得る傷害もしくは疾患を有する対象、または傷害もしくは疾患のリスクがある対象が挙げられる。特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、またはウマなどである。ある特定の実施形態では、対象は、治癒能力が低下している、例えば、糖尿病の対象および化学療法を受けている対象などである。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物を、これだけに限定されないが、軟部組織の傷害または疾患、硬組織の傷害または疾患、骨の傷害または疾患、関節の傷害または疾患、心臓組織の傷害または疾患、脂肪組織の傷害または疾患、軟骨の傷害または疾患、および椎間板の傷害または疾患を含めた、対象におけるさまざまな組織または臓器の傷害または疾患を処置または予防するために使用する。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物を、軟部組織傷害を処置または予防するために使用する。軟部組織とは、本明細書で使用される場合、一般に、全身に見いだされる骨外構造を指し、これだけに限定されないが、軟骨組織、半月板組織、靭帯組織、腱組織、椎間板組織、歯周組織、皮膚組織、血管組織、筋肉組織、筋膜組織、骨膜組織、眼組織、心膜組織、肺組織、滑液組織、神経組織、脳組織、腎組織、骨髄、泌尿生殖器組織、腸組織、肝組織、膵臓組織、脾臓組織、脂肪組織、およびこれらの組合せを含む。軟部組織傷害としては、全身に生じ得る、筋肉、靭帯、腱、皮膚、線維組織、脂肪、滑膜、神経、血管、および筋膜などの任意の軟部組織に対する損傷または傷害が挙げられる。提供される処理された微小血管組織の軟部組織治癒活性が有効であり得る軟部組織傷害としては、限定することなく、腱および／または靭帯の断裂などの傷害ならびに虚血性事象から生じる傷害が挙げられる。一般的な軟部組織傷害は、捻挫、筋挫傷、挫傷を生じる傷害、または特定の軟部組織の使いすぎに起因し得る。軟部組織傷害には、開放性軟部組織傷害と非開放性軟部組織傷害のどちらも含まれる。
【０１１５】
本発明の方法に従って処置または予防することができる軟部組織の傷害、疾患および状態としては、これだけに限定されないが、血管組織、皮膚組織、または筋骨格組織の傷害が挙げられる。軟部組織の状態としては、例えば、皮膚の状態（例えば、瘢痕修正または外傷性創傷、重度の熱傷、皮膚潰瘍（例えば、褥瘡（圧力）潰瘍、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍）の処置、ならびに皮膚がんの切除に伴うものなどの手術創）；血管の状態（例えば、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、および静脈疾患などの血管疾患；血管傷害；不適切な血管発生）；声帯に影響を及ぼす状態；美容の状態（例えば、修復、増強、または美化を伴うもの）；筋疾患（例えば、先天性ミオパチー；重症筋無力症；炎症性筋疾患、神経原性筋疾患、および筋原性筋疾患；ならびに筋ジストロフィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、およびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーなど）；これだけに限定されないが、歯根膜および前十字靭帯を含めた腱および靭帯などの結合組織の状態；ならびに臓器および／または筋膜（例えば、膀胱、腸、骨盤底）の状態が挙げられる。かなり一般的な軟部組織傷害の１つの例は、骨盤底に対する損傷である。これは、分娩の間にまたは膀胱のヘルニア形成である膀胱瘤などの膀胱膣筋膜に対する損傷に至る可能性があるその合併症から起こり得る潜在的に重篤な医学的状態である。同様の医学的状態として、直腸瘤（直腸のヘルニア形成）、腸瘤（直腸膣窩または膀胱膣窩を通る腸の突出）、および腸膀胱ヘルニア（膀胱および腸の両方が突出している２重ヘルニア）が挙げられる。
【０１１６】
種々の実施形態では、本発明の組成物を、これだけに限定されないが、望ましくない炎症反応または免疫応答に関連する疾患を含めた種々の疾患を処置または予防するために使用する。そのような疾患の例としては、関節リウマチ、変形性関節症、および自己免疫性の疾患および障害が挙げられる。さらに、本発明の組成物を、例えば傷害の部位における炎症を軽減するため、および／または免疫応答、例えば、傷害によって誘導される免疫応答を軽減するために使用することができる。同様に、本発明の組成物を、移植片拒絶反応を予防するまたはその可能性を減少させるために使用することができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明の組成物を、例えば、傷害または組織損傷の部位において血管新生または血管再生を促進または刺激するために使用する。特定の実施形態では、傷害は、組織に対する虚血、低酸素症、または再灌流傷害に関連するまたはそれを生じる。本発明に従って処置または予防することができる虚血、低酸素症、または再灌流傷害に関連するまたはそれを生じる傷害または疾患の例としては、脳卒中、心筋梗塞、および失血が挙げられる。血管新生または血管再生を促進または刺激するために本発明の組成物を用いて処置することができる傷害または組織損傷のさらなる例としては、移植または肢の再接合が挙げられる。
【０１１８】
本発明の組成物は、末梢神経損傷、勃起不全、肺高血圧症、多発性硬化症、および放射線熱傷を処置または予防するためにも使用することができる。さらに、本発明の組成物は、造血および／または創傷治癒を誘導するために使用することができる。
【０１１９】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、静脈内投与用に製剤化されている場合、急性心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、末梢血管疾患または慢性閉塞性肺疾患を処置または予防するために使用することができる。
【０１２０】
本発明の組成物は、傷害または疾患を処置または予防するために、単独で、または１つまたは複数の他の治療剤または手順と組み合わせて使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、損傷を受けた組織への血液供給を高めるため、および／または組織再生を促進するために、本発明の組成物を、血小板が豊富な血漿と組み合わせて使用することができる。１つまたは複数の他の治療剤または手順と組み合わせて使用する場合、本発明の組成物は、他の治療剤または手順を用いた処置の前に、同時に、または重複した期間の間に、またはその後に提供または使用することができる。
【０１２１】
別の治療剤と組み合わせて使用する場合、本発明の組成物は、他の作用剤と別々に提供されてもよく、他の治療剤も含有する医薬組成物、例えば、２種以上の治療剤を含み、そのうちの１種が本発明の組成物である共製剤（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中に存在してもよい。特定の実施形態では、本発明の組成物および追加的な治療剤の両方を同じインプラント、マトリックスまたは足場と組み合わせるまたはそれに付随させる。
【０１２２】
本発明の組成物は治療有効量で投与され、これは、使用される特定の組成物の活性；本発明の組成物を投与する対象の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；投与の様式および時間；対象における組成物の排出または分解の速度；ならびに処置する傷害、疾患または状態の種類または重症度を含めた種々の因子に応じて変動する。ある特定の実施形態では、治療有効用量は、１０４〜１０８個の多能性細胞およびそれらの関連するＥＣＭを処理することによって得られた材料からもたらされる。
【０１２３】
本発明の方法は、組成物を１つ、２つ、またはそれ以上の用量で投与することによって実施することができる。例えば、ある特定の実施形態では、組成物を単一用量、複数用量または反復用量である期間にわたって投与する。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１）
微小血管組織の調製および特徴付け
この研究では、微小血管組織を異なるプロセスによって調製し、次いで、アッセイする。簡単に述べると、少なくとも５〜１０ｌｂの皮下脂肪を臓器ドナーから得、以下の通り処理する：組織を細かく切る；それを酵素により解離させる；希釈し（クエンチなし）、回転させ、デカントし、次いで、細胞ペレットを洗浄する；凍結乾燥緩衝液中に再懸濁させる；そして、凍結乾燥する。処理に使用する基本条件は以下の通りである：脂肪組織を組織ドナーから外科的に回収する。はさみを用いて組織を細かく切り、０．２Ｕ／ｍｌのＣＩｚｙｍｅ  ＡＳ（Ｖｉｔａｃｙｔｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を伴うＰＢＳに、３７℃で６０分穏やかに撹拌しながら懸濁させ、次いで、３回洗浄し、Ｍ３Ｄ中に１ｍｌ当たり細胞２００万個で再懸濁させる。細胞懸濁液を凍結乾燥する直前まで室温で保持し、凍結乾燥する直前に、細胞をＥＺ−ＣＰＺ（商標）凍結保存培地（Ｉｎｃｅｌｌ
Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を用いて５０：５０に希釈し、バイアルに入れ、冷却するために凍結乾燥器トレーにローディングする。試料を、プロセスの間とプロセスの最後の両方でアッセイする。
【０１２５】
この研究では１０種の処理方法を実施する。これらを表１において「Ａ」〜「Ｊ」と称する。各処理方法を分析するために使用するアッセイ方法を表１に列挙し、１、２、３、４、５と称し、表２で詳述する。
【０１２６】
【表１】
2018065881.tif 000002
【０１２７】
【表２】
2018065881.tif 000003
【０１２８】
この研究のためにいくつかのタスクを実施する。これらをＡ〜Ｄと称し、さらなる詳細を以下に示し、図１において概説する。タスクで使用する特定の実験室アッセイ方法（Ｍ）をＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５と称する（表２）。
【０１２９】
タスクＡ．計画および設定
材料を注文し、調整し、設定し、試験する。
【０１３０】
タスクＢ．供給源の材料および一般的な手順
脂肪組織を臓器ドナーから得る。皮下脂肪を腹部、大腿および臀部から取得する。５〜１０ポンドの脂肪を収集し、ＺＴＭ（商標）ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）に入れる。
【０１３１】
組織を収集し、最初に、死亡してから１２時間以内に種々のステップおよび実験室的方法によって処理する（表１および２；図１）。室温で１２時間、２４時間および４８時間保管した後、基本条件を使用して１０ｇの一定分量を処理する。組織を細かく切るための肉挽き器法を使用して＞５＋ポンドを処理し、１０ｇの一定分量を、ＺＳｏｌＭ（商標）中４×Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  Ｉ（Ｖｉｔａｃｙｔｅ）酵素濃度を用いて、ならびに４×酵素濃度およびステップＥのＺＳｏｌＭ（商標）の消化体積の１／４を用いて消化する。試料の大部分を標準の酵素濃度および方法で消化する。
【０１３２】
消化後、試料をＺＳｏｌＦ（商標）中ですすぎ、遠心分離し、デカントし、次いで、さらに２回ＺＳｏｌＦ（商標）中で回転させて洗浄する。細胞を、凍結乾燥溶液バルク生成物としてＥＺ−ＣＰＺ（商標）中１：１細胞懸濁液に１ｍｌ当たり細胞１０６個で再懸濁し、１ｍＬの一定体積として凍結乾燥する（ステップＧ）。凍結乾燥したバイアルをガンマ線照射およびＥビーム照射に供する（ステップＨ、Ｉ、Ｊ）。最終生成物の全てを保管し、代表的な試料を試験し、選択したサブセットをその後の動物試験に使用する。
【０１３３】
タスクＣ．アッセイ
この研究において使用する様々な種類のアッセイ（Ｍ１〜Ｍ５）（表２）を以下に簡単に要約する。
【０１３４】
Ｍ１：脂肪組織を収集する前には行わなかった検査を含めた、感染症についてのドナーのスクリーニング。標準の評価に従ってドナーのスクリーニングおよび組織調達に関する同意を行って、いかなる感染症も最小限にするまたは排除する。実際の追加的な試験および付随するコストは個々の場合に応じて実施する。バイオバーデンアッセイを実施する。
【０１３５】
Ｍ２：細胞数および生存能力について、細胞計数を、血球計（光学顕微鏡）およびＤＡＰＩ核（蛍光顕微鏡）染色が伴うトリパンブルーを使用して実施する。細胞数を２連の読み取りとして記録する。
【０１３６】
Ｍ３：選択されたバイオマーカー：ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、およびＩＶ型コラーゲンについての免疫表現型検査。懸濁細胞の即時イムノアッセイを実施する。細胞をＬａｂＴｅｋｓから生じさせ、次いで染色し、代表的な写真を撮る。
【０１３７】
Ｍ４：袋Ｎ＝２中の受け取った組織の輸送溶液からの試料に対してバイオバーデンアッセイを行う（そして処理後｛最後の｝すすぎと比較する。ＥｎｄｏＳａｆｅ  ＰＴＳ  Ａｓｓａｙ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用して内毒素試験を実施する。標準のＵＳＰ培養物微生物学的試験を実施する。場合により、ＡＴＰ急速試験を実施する。
【０１３８】
Ｍ５：凍結乾燥後、および種々の処理および放射線照射プロトコール後の単離された細胞の試料に対して機能に関するバイオアッセイを行う。ＡＤＳＣ、内皮細胞、線維芽細胞について、トランスウェルを通過する細胞遊走アッセイを実施する。マトリゲルアッセイを実施して、種々の希釈度、処理および／または放射線照射の段階で、試料によって誘導される微小血管形成を評価する。
【０１３９】
タスクＤ．データ解析
観察に基づく読み取りおよびデータを解析のためにエクセルまたはプリズムに移行する。比較分析のために、各ＴＰＳおよび各細胞型についての試料反復の平均＋ＳＤ値を表にし、かつ／またはプロットする。
【０１４０】
実施した予備実験から得られた結果により、処理条件Ａ、ＢおよびＤの間に差異はほとんど示されず、３．５ｋｇの脂肪組織から凍結乾燥された生成物がバイアル当たり細胞１０６個でバイアル１５６０個生成された。
【０１４１】
（実施例２）
ラットにおけるアキレス腱傷害の処置
この研究により、本発明の微小血管組織調製物を使用して、アキレス腱傷害を修復することができることが実証される。
【０１４２】
雄のスプラーグドーリーラット（１日目に８週齢であり、１日目に約２５０ｇである）３２匹をＨａｒｌａｎから購入し、少なくとも３日間、馴化させる。ラットを表３の研究デザインに要約されている通り処置する。
【０１４３】
【表３】
2018065881.tif 000004
【０１４４】
研究はおよそ１０日間の動物の生涯にわたって行う。動物は−３日目に到着し、−３日目から１日目まで馴化させ、１日目に外科手術に供し、７日目に終了する予定である。
【０１４５】
試験物：
コラーゲンでコーティングしたバイオ繊維足場
処理された微小血管組織調製物ＡおよびＢを滅菌ＷＦＩで再構成し、足場に吸収させる。処理された微小血管組織の組成物Ａは滅菌せず、処理された微小血管組織の組成物ＢはＥビームで滅菌する。
【０１４６】
麻酔：１日目の外科手術の前に、動物を計量し、塩酸ケタミン１００ｍｇ／ｍＬ（４０〜９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン１００ｍｇ／ｍＬ（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して麻酔する。
【０１４７】
外科用調製物：試験開始の１日前に各動物の右後肢を剃毛する。１日目に、ベタジンおよびアルコールスクラブを用いて皮膚を外科的に調製し、無菌的外科的技法を使用して滅菌した布で包む。
【０１４８】
外科手技：１日目に、植え込む直前に試験物を調製する。グラフトにウィッキング作用によって細胞をローディングする。固定のために２つの５−０ポリプロピレン縫合糸をグラフトに取り付ける。グラフトを使用するまで生理食塩水が入ったペトリ皿の中に取りのけて、蓋をしておく。
【０１４９】
右後肢の尾側の（遠位の）脛骨から中脛骨のレベルまで真っ直ぐな外側の皮膚切開を生じさせる。この方法を使用して、皮膚を切り、後ろに引いてアキレス腱を踵骨からその筋腱移行部まで外側に露出させる。さらに切ることを用いてアキレス腱を露出させ、単離する。露出したアキレス腱を、有鉤ピンセットを用いてわずかにすり減らした後、グラフト試験物を取り付ける。グラフトを固定するために、踵骨を通って外側から内側への方向に単一の０．５ｍｍドリル穴を生じさせて縫合糸を継代させる。インプラント領域に生理食塩水を灌注していかなるデブリも除去し、ふき取り乾燥させた。
【０１５０】
グラフトを保持培地から取り出し、一端を踵骨に隣接させてアキレス腱の前側の表面に沿って挿入する。頭方グラフト固定用縫合糸を、改変Ｍａｓｏｎ−Ａｌｌｅｎ縫合パターンを使用して腓腹筋に筋腱移行部に対して頭方に取り付ける。次いで、尾側グラフト固定用縫合糸を踵骨のドリル穴に通し、足で中間位置に引っ張り、結ぶ。全ての固定用縫合糸について６つの縫合糸の結び目を結ぶ。適切な縫合材料を使用して切開を層状に閉じる。
【０１５１】
鎮痛：１日目に、麻酔から回復したら動物にブプレノルフィン（０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与する。疼痛に対して必要に応じて自由裁量で追加的なブプレノルフィンを投与することができる。
【０１５２】
体重測定：動物を、ランダム化時、１日目の外科手術の前、および研究終了まで週に１回、終結前を含め、計量する（約９つの時点）。
【０１５３】
健康の観察：研究期間中、１日１回動物をモニターする。（約７つの時点）
【０１５４】
切開部位領域の観察：切開部位の観察を２日目から７日目まで毎日記録する。
【０１５５】
温度／湿度の記録：毎日の室温および湿度の測定値を記録する。
【０１５６】
終結および組織採取：７日目に、動物を安楽死させ、植え込んだ試験物部位または対照物部位および周囲の腱組織を切除することにより各動物から採取する。採取した試料は全て、足場の中間の線に沿って半分に分割して腱の半分が各半分に含まれるようにする。採取した組織の半分は、常套的な病理組織学的評価および免疫組織化学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン中に保管する。残りの半分は、遺伝子発現解析のために、腱および過成長した軟部組織をメスの刃で取り除き、内部成長した組織を伴う足場を液体窒素中≦−７０℃でスナップ凍結する。
【０１５７】
ランダムに選択した２匹の動物／群の腱の切片（反対側のアキレスから取得したもの）、皮膚（毛の少ない領域から取得したもの）および肝臓も染色対照として採取し、免疫組織化学的評価のために１０％中性緩衝ホルマリン中に保管する。各対照組織の一部をＰＣＲ対照のために液体窒素中にスナップ凍結する。（３つの対照組織全てを一緒にホルマリン中に保管することができ、また凍結した部分も同様に一緒に保管することができる）。
【０１５８】
組織を組織学的分析（Ｈ＆Ｅ、マッソントリクローム）、免疫組織化学的分析（ＳＭＡＤ８およびテネイシン）、ならびにＰＣＲ分析（ＳＭＡＤ８、テネイシン、テノモジュリン（ｔｅｎｏｍｏｄｕｌｉｎ）、およびスクレラキシス）に供す。
【０１５９】
（実施例３）
マウスにおける虚血の処置
この研究により、虚血肢のマウスモデルにおける本発明の処理された微小血管組織の組成物の効果が実証される。虚血肢のマウスモデルを以前に記載されている通り創出し（Jang  Jら、Circulation  １９９９年；Huang  Nら、JOVE  ２００９年）、それを使用して、後肢虚血の誘導後の血管新生の促進における細胞調製物の効果を評価する。
【０１６０】
１４〜１６週齢のＳＣＩＤマウスに後肢虚血を外科的に誘導する。外科手術の直後に、以下の表４において詳述されている通り、処理された微小血管組織の組成物またはビヒクル対照を当該動物に投与する。簡単に述べると、後肢虚血の誘導後０日目に、３つの試験細胞物（それぞれ細胞０．５×１０６個）またはビヒクル対照を腓腹筋に筋肉内注射する。３つの試験物は、処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−Ｉ）、Ｅビームによって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−ＩＩ）、およびガンマ線によって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−ＩＩＩ）を含む。肢灌流の改善を３〜４日毎に合計１４日間にわたって評価する。１４日後に、動物を安楽死させる。虚血させた腓腹筋と反対側の腓腹筋の両方を外植し、組織学的分析に供す。
【０１６１】
【表４】
2018065881.tif 000005
【０１６２】
エンドポイント試験
血流を０日目、３日目、７日目、１１日目および１４日目にＬａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇによって評価する。
【０１６３】
外植研究のために１４日目に動物を屠殺し、後肢組織を収集し、処理し、保管する。
【０１６４】
（実施例４）
ＳＣＩＤマウスにおける血管形成
これらの研究では、本発明の微小血管組織調製物のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管構造を形成する能力を実証するためにマトリゲルプラグアッセイを利用する。マトリゲルプラグアッセイは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける真の血管形成の決定的なアッセイである。このアッセイは、マトリゲルを用いて治療用細胞を腹部領域の皮下に植え込むことを伴う。２週間の過程中、マトリゲル中の細胞は新生血管を形成するのに好都合な環境にあり、そのいくつかが宿主血管と吻合し得る。
【０１６５】
このアッセイでは、０．５×１０６個の細胞を、２００ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子を補充したマトリゲル０．５ｍｌに包埋し、次いで、ＳＣＩＤマウスに皮下注射する。各動物に２つのプラグを植え込む。２週間後、血管形成に関する組織学的分析のためにプラグを外植する。ヒト血管をネイティブなマウス血管と区別するために、内皮細胞（例えば、ＣＤ３１）を標的とするヒト特異的抗体を使用してヒト特異的血管を同定する。血液要素を用いて実施される管腔構造によって組織学的に実証された通り、ヒト特異的血管が存在することにより、内皮細胞が機能的であることが実証される。同様に、マウス特異的内皮細胞抗体を使用して、マウス特異的血管を同定することができる。傍分泌血管新生因子を分泌する治療用細胞の能力により、マウス血管形成の相対的な増強がもたらされる。
【０１６６】
以下の表５において詳述されている通り、１４〜１６週齢のＳＣＩＤマウスに、本発明の微小血管組織調製物またはビヒクル対照を含有するマトリゲルプラグを植え込む。
【０１６７】
【表５】
2018065881.tif 000006
【０１６８】
３つの試験物は、処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−Ｉ）、Ｅビームによって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−ＩＩ）、およびガンマ線によって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（試験細胞−ＩＩＩ）を含む。
【０１６９】
（実施例５）
ラットにおける関節リウマチの処置
この研究では、ラットにおける７日間で確立されたＩＩ型コラーゲン関節炎に付随する炎症、軟骨破壊および骨吸収の阻害における本発明の微小血管組織調製物の有効性が実証される。
【０１７０】
試験系
動物の数：４４
種／系統または品種：Ｌｅｗｉｓラット
ベンダー：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ
到着時の年齢／体重：１２５〜１５０ｇ
性別：雌
研究開始時の年齢範囲：最初の免疫時に少なくとも１２５グラム。
馴化：ＢＢＰに到着した後４〜８日間、馴化させる。
収容：ケージ当たり動物３〜５匹
【０１７１】
材料
試験物（処理された微小血管組織の組成物の調製物）および適切なビヒクル。トリアムシノロンおよび希釈用の滅菌生理食塩水（ＢＢＰ）、ウシＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）。
【０１７２】
一般的な研究デザイン
ラットをイソフルランで麻酔し、フロイント不完全アジュバント注射液ＩＤ／ＳＣ中ウシＩＩ型コラーゲン３００μｌを、背中の末端部に拡散させて、部位当たり１００μｌを０日目、および再度６日目に与える。
【０１７３】
両後足（膝の疾患は一般に重症度が足首と同様であるが、確実にカリパスで測定することが難しく、したがって、足首の測定値が、疾患の発症を決定するための膝の代理になる）における疾患が明白になる関節炎の１日目（研究１０日目）に各群へのランダム化を行う。これが関節炎の１日目になる。関節炎を有する動物を、各群についておおよその平均足首カリパス測定値を有する処置群にランダム化する。
【０１７４】
関節炎の１日目のみに処置（ＩＡ、両膝に両側性）を行う。足首は注射するには小さすぎるので、膝を処置する。処置の全身性の効果を足首のカリパス測定値によってモニターし、処置の局部的な効果を膝の病理組織検査によって決定する。足首のカリパス測定値は０日目（ベースライン）から７日目まで毎日取得する。ベースラインの足首のカリパス測定値を０日目に片方の足首を使用してインチの１０００分の１に丸めた値を用いて取得する。測定値を、様々な体重に基づくラットについての歴史的な値と比較することにより、臨床的に正常である（０．２６０〜０．２６４ｉｎ）ことを確認する。次いで、ベースラインの測定値を両足首に適用し、これらの値は、足首が全ての足首骨の良好な定義を伴って臨床的に正常であり、かつ炎症の証拠がない限りは、当該動物に残る。
【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
３つの試験物は、処理された微小血管組織の組成物（ＴＸ−Ｉ）、Ｅビームによって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（ＴＸ−ＩＩ）、およびガンマ線によって滅菌した処理された微小血管組織の組成物（ＴＸ−ＩＩＩ）を含む。
【０１７７】
疾患の誘導
馴化させた動物をイソフルランで麻酔し、コラーゲン注射する（Ｄ０）。６日目に、その動物を２回目のコラーゲン注射のために再度麻酔する。コラーゲンは、０．０１Ｎの酢酸中４ｍｇ／ｍｌ溶液を用意することによって調製する。等体積のコラーゲンとフロイント不完全アジュバントを、手で混合することにより、この材料のビーズの形態が水に入れた際に保持されるまで乳化させる。各動物に対して毎回３００μｌの混合物を背中の３箇所の皮下部位にわたって拡散させる（部位当たり１００μｌ）。
【０１７８】
材料
名称（ベンダー）：ＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）
意味：ウシＩＩ型コラーゲン
特性：可溶性、新生仔ウシ関節由来
保管条件：２〜８℃
純度：＞９９．６％
名称（ベンダー）：フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）
意味：不完全アジュバント
保管条件：２〜８℃
【０１７９】
試験物およびビヒクル
試験物ビヒクル：注射日に調製した幹細胞調製物、トリアムシノロン（Ｖｅｔａｌｏｇ、Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ）。
【０１８０】
試験物および製剤：生理学的ビヒクル中、膝関節当たり４０μｌを注射するために適した濃度の幹細胞調製物。トリアムシノロン２ｍｇ／ｍｌを生理食塩水中に希釈する。
【０１８１】
【表７】
2018065881.tif 000008
生存相の実行
関節炎の重症度による各群へのランダム化を関節炎１日目（研究１０日目）に行う。ランダム化後に処置（両側性ＩＡ、４０μｌ／関節）を開始する（１日目）。体重および足首のカリパス測定値／スコアを毎日取得する。
【０１８２】
人道的実施：２０％超の体重減少（１週間以内に）を含め、Ｂｏｌｄｅｒ  ＢｉｏＰＡＴＨ  ＩＡＣＵＣ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃａｒｅに従って病的状態の徴候を示す動物を研究から除き、ＣＯ２吸入によって人間的に屠殺する。
【０１８３】
【表８】
2018065881.tif 000009
【０１８４】
剖検
関節炎７日目に全採血によって動物を屠殺する。
【０１８５】
左右両後足の重量、ならびに肝臓、脾臓および胸腺の重量を含めた剖検データを収集する。
【０１８６】
採取する剖検試料は、一定分量の終末血清、および左右の後足および膝を含む。
【０１８７】
関節／病理組織学的スコア化の処理
固定液中に１〜２日、次いで脱灰器内に４〜５日置いた後、足首関節を縦方向に半分に切断し、膝を前頭面で半分に切断し、処理し、包埋し、切片作製し、トルイジンブルーで染色する。
【０１８８】
ＩＩ型コラーゲン関節炎のラット関節に関する病理組織学的スコア化方法
コラーゲン関節炎の足首および膝に、以下の基準に従って炎症、パンヌス形成および骨吸収に関して０〜５のスコアをつける：
膝および／または足首の炎症
０＝正常
０．５＝最小の限局性炎症
１＝滑膜／関節周囲の組織への炎症細胞の最小の浸潤
２＝軽度の浸潤
３＝中程度の浮腫が伴う中程度の浸潤
４＝顕著な浮腫が伴う顕著な浸潤
５＝重度の浮腫が伴う重度の浸潤
【０１８９】
ＩＩ型コラーゲン関節炎のマウスおよびラットにおける炎症性浸潤は、好中球およびマクロファージからなり、病変が急性〜亜急性相にある場合にはリンパ球はより少数である。組織浮腫および関節腔内への好中球の滲出が急性〜亜急性相では一般的である。炎症が慢性に進行するにつれ、滑膜および関節周囲の組織において、単核炎症細胞（単球、リンパ球）が優勢になり、また、線維芽細胞の増殖が多くの場合には異染色性マトリックスの沈着と共に起こる。関節腔内への滲出はあまり一般的でない。注釈部分に示されていなければ、炎症は急性〜亜急性型である。
【０１９０】
足首パンヌス
０＝正常
０．５＝軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯およびほんのわずかな関節のみが影響を受けている。
１＝軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯が主に影響を受けている。
２＝軽度の浸潤（辺縁帯において脛骨または足根骨の＜１／４）
３＝中程度の浸潤（辺縁帯において脛骨の１／４〜１／３またはわずかな足根骨が影響を受けている）
４＝顕著な浸潤（辺縁帯において脛骨または足根骨の１／２〜３／４が影響を受けている）
５＝重度の浸潤（辺縁帯において脛骨または足根骨の＞３／４が影響を受けている、構造全体の重度の歪み）
【０１９１】
膝パンヌス
０＝正常
０．５＝軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、辺縁帯およびほんのわずかな関節のみが影響を受けている。
１＝軟骨および軟骨下骨へのパンヌスの最小の浸潤、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ１〜１０％が影響を受けている。
２＝軽度の浸潤（脛骨または大腿骨の表面または軟骨下領域の１／４に至るまでにわたって進展している）、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ１１〜２５％が影響を受けている
３＝中程度の浸潤（脛骨または大腿骨の表面または軟骨下領域の＞１／４であるが＜１／２にわたって進展している）、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ２６〜５０％が影響を受けている
４＝顕著な浸潤（脛骨または大腿の表面の１／２〜３／４にわたって進展している）、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ５１〜７５％が影響を受けている
５＝重度の浸潤、軟骨表面または軟骨下骨のおよそ７６〜１００％が影響を受けている
【０１９２】
足首軟骨損傷（わずかな足根骨を重視）
０＝正常
０．５＝Ｔ  ｂｌｕｅ染色の最小の減少、辺縁帯のみが影響を受けており、ほんのわずかな関節が影響を受けている
１＝トルイジンブルー染色の最小〜軽度の減少、明白な軟骨細胞の減少またはコラーゲンの破壊は伴わない
２＝トルイジンブルー染色の軽度の減少、限局性の軽度（表在性）の軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊が伴う
３＝トルイジンブルー染色の中程度の減少、多巣性の中程度（中央の帯域までの深さ）の軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊が伴う、よりわずかな足根骨が１／２〜３／４の深さに影響を受けており、極めて少ない領域の全層の減少が伴う
４＝トルイジンブルー染色の顕著な減少、多巣性の顕著な（深部の帯域までの深さの）軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊が伴う、１または２のわずかな足根骨表面が軟骨の全層の減少を有する
５＝トルイジンブルー染色の重度の広範性の減少、多巣性の重度の（石灰化線までの深さの）軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊、２を超える軟骨表面が影響を受けている
【０１９３】
膝軟骨損傷
０＝正常
０．５＝Ｔ  ｂｌｕｅ染色の最小の減少、辺縁帯のみが影響を受けている
１＝トルイジンブルー染色の最小〜軽度の減少、明白な軟骨細胞の減少またはコラーゲンの破壊は伴わない
２＝トルイジンブルー染色の軽度の減少、限局性の軽度（表在性）の軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊が伴う、軟骨の５０％の深さが影響を受けているいくつかの小さな領域があり得る
３＝トルイジンブルー染色の中程度の減少、多巣性〜広範性の中程度（中央の帯域までの深さ）の軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊を伴う、１つの表面の全幅の１／４未満および全ての表面の全幅の２５％以下が全層の減少の影響を受けている１〜２の小さな領域があり得る
４＝トルイジンブルー染色の顕著な減少、多巣性〜広範性の顕著な（深部の帯域までの深さの）軟骨細胞の減少および／もしくはコラーゲンの破壊、または１つの表面がほぼ完全に減少しており、他の表面は部分的に減少しており、総合した全ての表面の幅の５０％未満が完全に全体的に減少している
５＝トルイジンブルー染色の重度の広範性の減少、大腿骨および／または脛骨の両方に多巣性の重度の（石灰化線までの深さの）軟骨細胞の減少および／またはコラーゲンの破壊、総合した全ての表面の幅の５０％超が完全に全体的に減少している
【０１９４】
足首の骨吸収
０＝正常
０．５＝最小の吸収、辺縁帯のみが影響を受けており、ほんのわずかな関節が影響を受けている
１＝小さな領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、極めて少ない破骨細胞
２＝軽度＝より多くの領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、より多くの破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の＜１／４が吸収されている
３＝中程度＝髄質骨梁骨および皮質骨の明白な吸収、皮質における全層欠損は伴わない、いくつかの髄質骨梁の減少、低い拡大率で明らかな病変、より多くの破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の１／４〜１／３が影響を受けている
４＝顕著＝皮質骨における全層欠損、多くの場合、残りの皮質表面のプロファイルの歪みが伴う、髄骨の顕著な減少、多数の破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の１／２〜３／４が影響を受けている
５＝重度＝皮質骨における全層欠損、多くの場合、残りの皮質表面のプロファイルの歪みが伴う、髄骨の顕著な減少、多数の破骨細胞、辺縁帯において脛骨または足根骨の＞３／４が影響を受けている、構造全体の重度の歪み
【０１９５】
膝の骨吸収
０＝正常
０．５＝最小の吸収、辺縁帯のみが影響を受けている
１＝最小＝小さな領域の吸収、低い拡大率では容易に明らかにならない、軟骨下骨の全関節幅のおよそ１〜１０％が影響を受けている
２＝軽度＝より多くの領域の吸収、軟骨下骨の明確な減少、軟骨下骨の全関節幅のおよそ１１〜２５％が影響を受けている
３＝中程度＝軟骨下骨の明白な吸収、軟骨下骨の全関節幅のおよそ２６〜５０％が影響を受けている
４＝顕著＝軟骨下骨の明白な吸収、軟骨下骨の全関節幅のおよそ５１〜７５％が影響を受けている
５＝重度＝破壊に起因する全関節の歪み、軟骨下骨の全関節幅のおよそ７６〜１００％が影響を受けている
【０１９６】
関節周囲のマトリックス沈着（任意の処置群において疾患対照と比較して増加が見られる場合にのみスコア化する）
０＝正常
１＝かすかな、多巣性の異染色性染色、関節周囲の組織の過剰な増大なし
２＝濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の過剰な増大なし
３＝濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の軽度の増大
４＝濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の中程度の増大
５＝濃い、広範性の異染色性染色、関節周囲の組織の重度の増大
【０１９７】
統計解析
臨床データ
スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニーのＵ検定（ノンパラメトリック）を使用してデータを解析する。該当する場合には、一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）またはクラスカル・ワリス検定（ノンパラメトリック）を適切な多重比較事後検定と一緒に使用して、群全てにわたってデータをさらに解析する。示されていなければ、統計解析は未加工の（変換していない）データのみに対して実施する。統計的検定により、データの正常性および分散の均一性に関するある特定の仮定がなされ、検定によりこれらの仮定に侵害が生じた場合にはさらなる解析が必要になり得る。全ての検定についての有意性をｐ≦０．０５に設定する。
【０１９８】
足の重量のパーセント阻害およびＡＵＣを、次式を使用して算出する：
％阻害＝Ａ−Ｂ／Ａ×１００
Ａ＝疾患対照の平均−正常の平均
Ｂ＝処置の平均−正常の平均
【０１９９】
（実施例６）
ヤギにおける骨の間隙、軟骨欠損および半月板病変の処置
この研究では、骨の間隙、軟骨欠損および半月板病変の処置における本発明の微小血管組織調製物の効果が実証される。この研究では、各動物について、右後膝関節を手術し、３つの異なる別々の外科的欠損を創出する。試験した各右大腿骨には、大腿骨外側上顆領域に直径８ｍｍ、深さ２０ｍｍまでの骨欠損を１つ生じさせ、滑車溝に４×７ｍｍの長方形、深さ２ｍｍまでの軟骨欠損を１つ創出し、内側半月の白色−白色域（ｗｈｉｔｅ−ｗｈｉｔｅ  ｚｏｎｅ）に長さ７ｍｍ、幅１〜２ｍｍまでの全層半月板欠損を１つ創出する。動物３匹の処置群の各欠損は微小血管組織調製物で処置し、一方、対照群の欠損には足場のみを充填する。８週間の時点でヤギを評価して、種々の欠損部位における修復された組織を評価し、特徴付ける。処置された欠損は全体の外観および組織学的外観が対照と比較して優れることが予想される。
【０２００】
ヤギを選択したのは、相対的な後膝関節のサイズが大きく、取扱いが容易であり、他の軟骨、半月板および骨の修復の研究において使用されており、応答がヒトにおいて見られる応答と類似しているからである。種々の種のヤギが、それらの関節サイズが大きいこと、半月板修復生理機能が類似していること、膝関節（後膝関節）の軟骨の厚さが１．５〜２ｍｍであり、ウマおよびヒトと類似していること、ならびにヒトと同様の海綿状骨および皮質骨を有する（二次骨単位）ことに起因して、軟骨研究のために使用されている。骨、軟骨および半月板修復プロセスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境では模倣することができない非常に複雑なプロセスである。関節、特に傷害を受けた関節の生理機能は非常に複雑であり、実験室では再現することができないので、動物モデルが必要である。この研究において使用する動物は表９に要約されている。
【０２０１】
【表９】
2018065881.tif 000010
【０２０２】
右大腿骨の外側上顆領域に単皮質上顆（ｕｎｉｃｏｒｔｉｃａｌ  ｅｐｉｃｏｎｄｙｌａｒ）の直径８ｍｍ、深さ２０ｍｍまでの欠損を１つ創出し、右大腿骨の外側滑車溝に４×７ｍｍ、深さおよそ２ｍｍまでの長方形の欠損を１つ創出し、右内側半月に長さおよそ７ｍｍ、１〜２ｍｍの幅の全層欠損を１つ創出する。各膝を、引き出し、可動域（角度計）、腫脹、温度、捻髪音、膝蓋骨トラッキング、および外反／内反について物理的に検査する。クロロヘキシジン、その後７０％アルコール、その後のベタジンの塗布を伴う標準の外科手術前洗浄を実施する。外科的手法は、右大腿骨の末端３分の１から脛骨プラトーのレベルまで曲線状の内側皮膚切開を行うことからなる。
【０２０３】
内側側副靭帯を同定し、焼灼を用いて骨−靭帯接合フットプリントの概略を作成する。フットプリントの中央に、２．８ｍｍのドリルビットおよびタップを使用して靭帯を再接合するためのねじ穴を創出する。振動鋸を使用して内側側副靭帯の接合フットプリントを切断し、それにより、それが脛骨に反映されることを可能にする。関節包を開き、膝を屈曲させ、外側に回転させて内側半月を露出させる。プラスチックの保護用つまみを内側半月の下に置き、特別に設計された卵形の穿孔器を使用して、半月板の白色−白色域に全層欠損を作出する。次いで、欠損を、足場または足場＋化合物のいずれかを用いて処置する。膝を真っ直ぐにし、ねじおよび座金を用いて内側側副靭帯を再接合させる。
【０２０４】
次いで、膝を屈曲させ、外側滑車溝の中間点を同定する。軟骨欠損のために穴を開ける点は、外側滑車溝の近位縁から２０ｍｍ遠位と定義される。直径６ｍｍの穿孔器を用いて軟骨にしるしをつけ、専門の計器を使用して直径６ｍｍ、深さおよそ２ｍｍまでの欠損を軟骨表面に作出する。次いで、この欠損を、足場または足場＋化合物のいずれかを用いて処置する。
【０２０５】
膝をさらに屈曲させ、カラー付きの直径３ｍｍのビットを使用して、外側大腿顆の上顆領域に２０ｍｍの深さまで予備的な穴を開ける。ドリルビットを関節の線に対して垂直かつ前側表面に対して並行になるように調整する。次いで、この予備的な穴を直径８ｍｍまで広げる。骨欠損を洗い流し、次いで、足場または足場＋化合物のいずれかを用いて処置する。
【０２０６】
深層および皮膚縫合用の１−０Ｖｉｃｒｙｌを使用して外科的切開を３層に閉じた後、改変トーマス副子を脚に適用して体重負荷および動きを制限する。ガラス繊維製ギプスおよび副子は最低でも手術後１４＋２日間つけたままにする。この期間中、動物を小さなパドック内で維持する。
【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
手術後８４＋２日目に、ステージＩＩＩ麻酔の下で塩化カリウムＩＶを用いて動物を安楽死させる。安楽死させた後、後膝関節を肉眼で評価し、滑液を色および粘性について肉眼で評価し、表１２に記載の通り試料を採取する。関節を開き、撮影し、軟骨部位の表面を表１３に示されている通りスコア化する。欠損部位の反対側の関節表面をあらゆる異常な関節表面について検査する。対照膝関節および手術した膝関節に対して肉眼での評価を実施する。膝窩リンパ節および滑膜をあらゆる炎症について検査する。
【０２０９】
【表１１】
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【０２１０】
反対側の膝をあらゆる異常な関節表面について検査する。右膝関節の肉眼での形態学的評価を行って、表３に列挙されている以前のスコア化基準に基づいて軟骨表面の修復を決定する。右大腿骨を切断して軟骨欠損を骨の間隙領域から分離し、１０倍の体積の１０パーセント中性緩衝ホルマリンを満たした適切に標識した容器に入れる。内側半月を肉眼で評価し、収集し、１０倍の体積の１０パーセント中性緩衝ホルマリンを満たした適切に標識した容器に入れる。
【０２１１】
【表１２】
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【０２１２】
滑液を採取し、体積、粘性（糸引き（ｓｔｒｉｎｇ））、透明性および色について評価する。必要に応じて、表１３に概説されている肉眼での滑液評価の半定量的スコア化を適用する。
【０２１３】
【表１３】
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【０２１４】
総滑液スコアは、色、透明性および糸引きスコアの合計である（０〜８点）。
【０２１５】
（実施例７）
処理されたラット微小血管組織を使用した細胞遊走アッセイ
処理された微小血管組織の組成物の細胞遊走に対する効果を実証するために、ヒト内皮細胞の遊走（処理された微小血管組織の組成物による化学誘引）および脂肪由来の間質血管画分（ＳＶＦ）細胞による標識した処理された微小血管組織の組成物の微小胞（ＭＶ）取り込みのアッセイを展開し、組成物の生物活性の尺度として使用した。
【０２１６】
これらの研究の選択についての理論的根拠は以下の通りであった：（１）処理された微小血管組織の組成物により血管修復の増大が誘導され得、したがって、内皮細胞の遊走が有効な測定基準になること；および（２）ＭＶの放出および取り込みは、組織修復モデルにおいて多数の細胞型で起こり得る重要な活性であり、したがって、血管修復のために重要な細胞型を有するＳＶＦ細胞集団を使用してＭＶの取り込みを試験した。
【０２１７】
一般的な研究デザイン
処理された微小血管組織の組成物の内皮細胞に対する化学誘引能力をアッセイするために、組成物の試料をトランスウェルプレートの下のチャンバーに入れ、オレンジ−赤色蛍光親油性色素（ＣＭ−ＤｉＩ）で標識した内皮細胞の遊走を１２〜４８時間、経時的にモニターした。アッセイは、既知組成の凍結保存培地ＥＺ−ＣＰＺ（商標）（Ｉｎｃｅｌｌ
Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を１００％で、およびベースライン対照としてＥＺ−ＣＰＺ（商標）とＭ３Ｄ（商標）（Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）培地の５０／５０混合物も含んだ。
【０２１８】
第２の研究を実施して、凍結乾燥した処理された微小血管組織の組成物のＳＶＦ細胞による取り込みを評価した。組成物をＣＭ−ＤｉＩと一緒にインキュベートして、色素を組成物試料のＭＶおよび細胞膜に組み入れさせた。標識した組成物試料をすすぎ、培地中に希釈し、次いで、ＳＶＦ細胞の単層培養物に付着させた。２４時間取り込みを行った後に、細胞をすすぎ、次いで、赤色蛍光色素の取り込みについて可視化した。
【０２１９】
材料および方法
Ｍ３Ｄ（商標）は、ＩＮＣＥＬＬにより製造された既知組成培養培地である。いくつかのアッセイでは、Ｍ３Ｄ（商標）に抗生物質（１×ＰＳＦ：Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ抗生物質／抗真菌薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）を補充した。Ｍ３Ｄ：１０培地（ＩＮＣＥＬＬ）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×ＰＳＦを補充したＭ３Ｄ（商標）であった。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）（Ｉｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）は、既知組成の細胞凍結保存培地である。ＥＺ−ＣＰＺ（商標）およびＥＺ−ＣＰＺ（商標）：Ｍ３Ｄ（商標）（１：１；ｖ／ｖ）を参照対照培地として使用した。
【０２２０】
培養培地用の水性製剤中のＣＭ−ＤｉＩは「Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）」蛍光色素である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。これは細胞膜およびＭＶなどの親油性材料と会合し、蛍光顕微鏡によって明るい赤色蛍光として可視化することができる。この研究のために、ＥＶＯＳ倒立顕微鏡を赤色フィルター：励起５３０ｎｍ、放出５９３ｎｍ）で使用した。
【０２２１】
継代１（ｐ１）のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＩＮＣＥＬＬ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから取得した。ＭＶ取り込みアッセイ用のヒトＳＶＦ  ｐ１細胞をＩＮＣＥＬＬ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから取得した。
【０２２２】
全ての細胞を、Ｍ３Ｄ：１０（商標）（Ｉｎｃｅｌｌ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）中で成長させた。内皮細胞を、ＣＭ−ＤｉＩと一緒に３７℃で３０分インキュベートし、次いで、１×ＰＳＦを伴うＭ３Ｄ（商標）ですすいだ。細胞を計数し、処理された微小血管組織の組成物試験材料を予めローディングした３ミクロン孔径のＰＥＴトランスウェルチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の上のチャンバーに３連のウェルでウェル当たり同数の細胞を適用した。
【０２２３】
吸着アッセイ用のＳＶＦ細胞を４８ウェルプレート中で対数期成長まで成長させた。
【０２２４】
処理された微小血管組織の組成物
２つの処理された微小血管組織の組成物、すなわち、ＢＭＡおよびＢＭＢを調製し、試験した。ＢＭＡ試料はラットＳＶＦ細胞であり、ＢＭＢはラット骨髄単核細胞であり、それぞれ１ｍｌ当たり細胞１０６個で凍結乾燥したものであった。ラットＳＶＦ細胞は、はさみを用いて精巣上体の脂肪パッドを直径１ｍｍよりも大きな小片がなくなるまで細かく切り、次いで洗浄し、ＰＢＳ中１Ｕ／ｍｌのＣＩｚｙｍｅ  ＡＳ（Ｖｉｔａｃｙｔｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）中、３７℃で６０分穏やかに撹拌しながらインキュベートすることによって調製した。細胞を２回洗浄し、凍結乾燥緩衝液中に１ｍｌ当たり１０６個で再懸濁した。ラット骨髄細胞は、大腿骨および脛骨にＡＣＤＡ／ＰＢＳ溶液を流し、２０ｇａの針を通して吸引および排出を繰り返すことによって解離させることによって得た。次いで、骨髄細胞をフィコール勾配で分離し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回洗浄し、緩衝液に再懸濁した。表１４に示されている通り、凍結乾燥した後、ＢＭＡ試料では検出限界を下回る（１０，０００を下回る）細胞数が示されたが、ＢＭＢ試料では６０万〜１００万の細胞数および１０〜５０％の生存能力（トリパンブルー）が示された。
【０２２５】
【表１４】
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【０２２６】
全ての試料を暗闇中で１年間冷凍保管し、試験試料を１１ｋＧｙのＥビーム照射で滅菌した。照射していない対照試料は滅菌しなかった。
【０２２７】
標識した内皮細胞のトランスウェル遊走
凍結乾燥した材料を１×ＰＳＦを伴うＵＦＤＩ水１ｍｌ中に再構成した。この全試料のうち、３００μｌを３つのウェルのそれぞれの下部に入れ、２００μｌのＭ３Ｄを用いて最終的な体積を５００μｌにした。上部のチャンバーを試料ウェルにセットし、ＣＭ−ＤｉＩで標識したＨＵＶＥＣ  ｐ２細胞をそれぞれに同数入れた。プレートを３７℃でインキュベートし、１２時間、２４時間および４８時間の時点でウェルを画像化した。視野内の細胞を計数することによって画像を調査して結果を決定した。
【０２２８】
ＳＶＦ細胞による標識した微小胞の取り込み
凍結乾燥した材料の残りの１００μｌをＣＭ−ＤｉＩと一緒にインキュベートして、存在する細胞膜を標識した。材料を、Ｍ３Ｄ＋１×ＰＳＦを用いて遠心分離によって３回洗浄した。吸収アッセイのために４８ウェルプレートに播種したＳＶＦ細胞を５０％集密まで成長させ、ＣＭ−ＤｉＩで標識した凍結乾燥した材料５０μｌを上に層状に重ねた。２４時間の時点でウェルの半分をすすぎ、液体封入剤でコーティングし、乾燥させた；あとの半分は、すすぎ、固定し、３日後に封入した。画像を調査して結果を決定した。
【０２２９】
結果
標識した内皮細胞のトランスウェル遊走
ウェルの全てについて、１２時間の時点で下のチャンバーには最小数の細胞が存在した。図２および図３〜７の最初の段を参照すると、時間が進行するにつれ、細胞が下のチャンバーに遊走し始めた。試料の一部ははるかに急速に下のチャンバーに引き寄せられた。図２に見られる通り、ＢＭＡ試料ではＢＭＢよりも細胞が誘引される傾向があった。ＢＭＡ緩衝液２試験群では、試験試料の中で２４時間の時点では細胞数が最低であったが、４８時間の時点では細胞数が最高であった。全体的に、ＢＭＡ試料は緩衝液２を伴うＢＭＢ試料よりも良好な働きをし、緩衝液１よりも高い遊走速度を誘導する傾向が示された（しかし統計的には有意でない）。
【０２３０】
このアッセイの他の注目すべき効果は、２４時間および４８時間の時点でＢＭＡでは約２０％の遊走照射の減少が引き起こされる傾向があったが、ＢＭＢの効果はほとんどなく、基本的に同じレベルであった（差異は統計的には有意でなかった）ことである。
【０２３１】
ＥＺ−ＣＰＺ（商標）培地対照ではいくらかの移動があったが、これは時間経過の後半のみであり、また程度がＢＭＡ試料およびＢＭＢ試料よりも劣った。これらの結果により、組成物により血管新生活性を誘導するためには細胞が生存可能であるまたは自己細胞である必要はないことが劇的に実証される。
【０２３２】
ＳＶＦ細胞による標識した処理された微小血管組織の組成物の微小胞の取り込み
このアッセイを実施して、処理された微小血管組織の組成物のＭＶがＳＶＦ（間質血管画分）細胞内に輸送されるかどうかを決定した。各バイアル中の処理された微小血管組織の組成物材料の残りの１００μｌを、細胞自体が死んでいるとしても細胞膜に組み入れられるＣＭ−ＤｉＩを用いて標識付けることによってアッセイを実施した。ＳＶＦ細胞を、Ｍ３Ｄ：１０培地を伴う４８ウェルプレートにプレーティングし、接着させ、およそ５０％集密になるまで成長させた。標識した材料５０μｌをウェルに加え、６時間インキュベートした。ウェルをＭ３Ｄ（商標）で３回すすぎ、湿性封入剤を用いて固定した。図８および図９に見られる通り、画像により、色素がＳＶＦ細胞に移行しているので、細胞のいくつかが実際に材料を取り込んだことが示された。
【０２３３】
考察
このアッセイにおいて、放射線照射を伴うまたは伴わないＢＭＡ凍結乾燥材料およびＢＭＢ凍結乾燥材料は内皮細胞に対する化学誘引物質として作用した。材料に放射線照射した場合には細胞移動の軽度の減少が認められた。緩衝液１と緩衝液２の間の差異は無視できるものであった。
【０２３４】
ＢＭＡ材料およびＢＭＢ材料は、材料をすでに成長している培養物の上に置き、２４時間インキュベートすると、生ＳＶＦ細胞に取り込まれた。
【０２３５】
これらの実験で例示されるいくつかの重要な概念がある。ＳＶＦ試料では凍結乾燥した後に莫大な細胞の損失が見られ、生存能力が全く見られなかったが、生物活性は、細胞の損失が見られず、生存能力が１０〜５０％であった骨髄試料よりも保持されていた（ＳＶＦ細胞の損失は、消化ステップの間の過剰な酵素活性によって引き起こされた可能性がある）。どちらの細胞調製物も１年超にわたって安定であった。滅菌は内皮細胞を誘引するそれらの能力に実質的に影響を及ぼさなかった。
【０２３６】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【０２３７】
（実施例８）
微小血管組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果
上記の通り、種々の幹細胞調製物により、動物試験および臨床研究において種々の指標についての有益な効果が示された。多くの場合、投与された幹細胞の生存は比較的乏しい。したがって、本研究は、上記のいくつかの実施形態に関連して考察されている通り、幹細胞に付随する治療的利益のいくつか（または全て）を実現するために生存可能な幹細胞が必要かどうかに取り組むために設計した。本研究では、上に開示されている方法に従って処理された、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源である微小血管組織を使用した。
【０２３８】
簡単に述べると、微小血管組織をヒト死体脂肪組織から、組織を細かく切り、その後、細かく切った組織を酵素により消化することによって単離した。次いで、消化された組織を遠心分離して脂肪を除去し、微小血管組織をもたらした。微小血管組織を凍結保存緩衝液（Ｍ３：ＤＣとＥＺ−ＣＰＺ培地の１：１混合物、ＩＮＣＥＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）に再懸濁させ、バイアルに分配し、凍結乾燥または凍結乾燥と放射線による滅菌の両方を行った。
【０２３９】
生じた処理された微小血管組織を、血管新生および整形外科モデルにおいて細胞数、生存能力、表現型、ＣＦＵ−Ｆ、および生物活性についてアッセイした。
【０２４０】
結果
新鮮に単離し、凍結乾燥および凍結乾燥／滅菌した微小血管組織の細胞数および生存能力が表１６に示されている。各調製物の表現型が表１７に示されている。
【０２４１】
【表１６】
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【０２４２】
【表１７】
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【０２４３】
細胞数／細胞の生存能力のデータにより、微小血管組織の処理に基づいて細胞数に有意な変化はないことが明白に実証される（例えば、新鮮なものであろうと、乾燥したものであろうと、または乾燥および滅菌したものであろうと、細胞数はだいたい同じ、ＤＡＰＩ
ＤＮＡ染色の核取り込みに基づく）。しかし、微小血管組織を凍結乾燥することにより、微小血管組織中の細胞のトリパンブルーを排除する能力が有意に低下する。凍結乾燥により、生存細胞の百分率のおよそ７０％の低下が誘導される。放射線に曝露させることにより、生存能力がさらに低下し、したがって、微小血管組織中の細胞のおよそ２％のみが生存可能であった。さらに、機能的な間葉系幹細胞についてアッセイした場合（確立したコロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイを使用する）、凍結乾燥または凍結乾燥／滅菌した調製物において機能的な間葉系幹細胞は検出されなかった。
【０２４４】
興味深いことに、細胞数が変化せず、生存能力が低下するにもかかわらず、種々の処理方法により、細胞の表現型が変更された。表１７に示されているように、ＩＶ型コラーゲンが凍結乾燥／滅菌した微小血管組織において適度に増加した（新鮮な調製物に対して）。このデータにより、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織は、コラーゲンの密度が増加していることに少なくとも一部起因して、軟部組織の修復に十分に適し得ることが示唆される。コラーゲンに基づく材料は組織の工学的操作におけるそれらの使用について試験されているが、本明細書に開示されている微小血管組織は、材料が入手しやすく、また、「幹細胞性」が増強している（以下に考察する）ので、特に有利である。確立された造血幹細胞マーカーであるＣＤ３１（造血幹細胞）、ＣＤ３４（骨髄／造血幹細胞）、ＣＤ４４（がん幹様細胞）およびＣＤ４５（造血幹細胞）のそれぞれは、凍結乾燥および滅菌に応答して基本的に上方制御された。したがって、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織中の細胞の生存能力がほぼ完全に低下したにもかかわらず、残りのあらゆる細胞では幹細胞によって発現されることが公知のマーカーの発現が増強された。そのように、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織は、この幹細胞性の増強（および幹細胞性の増加により、例えば、修復、微小血管組織からの増殖因子の放出を増強する他の内在性細胞の傍分泌動員などが誘導されるという間接的な効果）に起因して、組織再生により適し得る。
【０２４５】
種々の微小血管組織を、他の細胞型を動員するそれらの能力について評価した。細胞の動員により、損傷または疾患のある組織の種々の機構による修復または再生が増強され得る。例えば、内皮細胞の動員により、血管形成が増強され得、それにより、新しい組織形成を容易にする血液供給が改善される。内在性幹細胞の動員により、新しい組織の成長および／または現存する損傷を受けた組織の修復を促進する事象のカスケードが開始され得る。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＤｉＩで標識し、下のウェルに種々の型の微小血管組織が入ったトランスウェルプレートの上に置いた。４８時間後に微小血管組織の各型についてウェル内の膜を横切ったＨＵＶＥＣの数を計数し、培養培地単独または上皮増殖因子（ＥＧＦ）を補充した培地を対照としてそれらと比較した。図１０に結果が示されている。培地単独に応答してＨＵＶＥＣ細胞のわずかな遊走が検出された。ＨＵＶＥＣ遊走の誘導因子として確立されたＥＧＦにより、培地単独よりも約１０倍多い遊走がもたらされる。新鮮に単離された微小血管組織（図１０の「消化したもの」）により、ＥＧＦよりもわずかに少ない遊走が誘導され、凍結乾燥したものにより、さらに少ない遊走が誘導された（しかし、それでも培地単独を超えるものであった）。予想外に、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織により、ＥＧＦと比較してほぼ２倍多い遊走、および培地単独よりもほぼ２０倍多い遊走が誘導された。したがって、微小血管組織を乾燥および滅菌することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞を動員するその能力が有意に増強される。いくつかの実施形態では、その能力の増強により、少なくとも一部において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける組織修復および／または再生の増強がもたらされる。
【０２４６】
そのｉｎ  ｖｉｖｏにおける修復の増強は、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織により、虚血となった組織へのよりロバストかつ急速な血流の回復が誘導されることを実証することにより確証された。ＳＣＩＤマウスを、虚血（重度の組織損傷に至る状態）を再現するために確立された方法に従って、大腿動脈の片側結紮および切断（transection）に供し
た。種々のやり方で処理した微小血管組織を虚血した肢に０日目、３日目、および７日目に導入し、０日目、７日目、および１４日目にマウスをレーザードップラーによって画像化した。図１１に示されている通り、生理食塩水を注射した対照の動物では、７日後または１４日後に血流の回復がほとんど示されない（虚血した肢は矢印で示されている）。対照的に、凍結乾燥した微小血管組織では、１４日目までに少なくとも部分的な血流の回復がもたらされた。しかし、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織では、７日目までに血流の有意な増加がもたらされ、１４日目の血流は反対側の対照肢と大きく区別できなかった。これらのデータにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遊走データが確証され、いくつかの実施形態では、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織により血流の回復を増強することができることが示される。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、血流の回復は、少なくとも一部において、小さな血管（例えば、微小血管系）、中程度の血管、および直径が大きな血管（例えば、組織への血液の主要な供給器である血管）を含めた新しい血管の形成に起因する。マトリゲル（０．５ｍＬ）を生理食塩水または微小血管組織（ヒト）と混合して、微小血管組織インプラントを生成し、それをＳＣＩＤマウスに皮下注射した。１４日後に、インプラントを取り出し、固定し、α−ＣＤ３１蛍光抗体を用いて染色した。インプラントが浸潤した血管を顕微鏡でサイズ分類し、計数した。標準偏差は平均計数／視野の１２〜３０％であった。各処理ステップ後に２用量の組織を試験した。ヒトＣＤ３１＋細胞は見いだされなかった。
【０２４８】
図１２には、細胞数が様々であり、異なる様式で処理された微小血管組織インプラントを植え込んだ後の種々の血管サイズの浸潤に関連するデータが要約されている。マトリゲルにより、視野当たり約３５の血管がもたらされ、その大多数が小さな血管であった。細胞約５０，０００個を伴う凍結乾燥した微小血管組織を植え込むことにより、浸潤の増加がもたらされ、中程度のサイズの血管のよりロバストな生成が伴った。細胞約５００，０００個を伴う凍結乾燥した微小血管組織を植え込むことにより、さらに別の血管生成が生じ、直径がより大きな血管の数が相当に増加した。細胞約５０，０００個を伴う凍結乾燥／滅菌した微小血管組織を植え込むことにより、血管数が対照と比較して増加し、大きな血管がいくらか生成された。細胞約５００，０００個を伴う凍結乾燥／滅菌した微小血管組織を植え込むことにより、有意な血管生成は、対照の２倍を超えた。興味深いことに、細胞５０，０００個の用量と比較して、より大きな細胞数により、生存能力がゼロに近いにもかかわらず、いくつかの直径が大きな血管がもたらされた。したがって、凍結乾燥したものであるかまたは凍結乾燥／滅菌したものであるかにかかわらず、処理された微小血管組織の投与により、直径がより大きな血管の形成が後押しされると思われる。これらのデータにより、組織の修復の重要な態様である血管の遊走および／または形成を増強する微小血管組織の能力がさらに裏付けられる。さらに、いくつかの実施形態では、種々のサイズの血管の生成により、循環系の主要な枝から標的組織（大きな直径）に血液を運搬する適切な能力があることだけでなく、血液が、標的組織全体を通して、内部までにも（中程度の血管および小さな血管）有効に分布し得ることも確実になる。
【０２４９】
総合すると、これらのデータにより、微小血管組織がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても血管新生を誘導する能力を有することが示される。そのように、微小血管組織は、血管新生を増強するその能力に基づいて、それにより組織の修復および／または再生が開始される高度に魅力的な機構であり、それにより、適切な血液供給および栄養分／酸素の流れが確実になることによって組織の修復および／または再生が容易になり、かつ／または維持される。
【０２５０】
さらに、微小血管組織を、骨および軟骨の修復を増強するその能力について評価した。骨に関して、成熟ヤギの遠位骨幹端に８ｍｍ×２ｃｍの臨界サイズの欠損の穴を開けた。組織足場（ＢＩＯＦＩＢＥＲ、Ｔｏｒｎｉｅｒ）をしっかりと巻き、欠損に単独で、または微小血管組織（体積１ｍｌ、細胞約１０６個）を含めて挿入した。細胞を、単に水１ｍｌをバイアルに加えることによってローディングし、簡単に旋回させ、次いで、内容物を足場上に滴下し、結合のために５分待った。１２週間の時点で、欠損を圧縮試験し、組織学的検査のために脱灰した。
【０２５１】
図１３Ａ〜１３Ｃには、骨欠損の修復に関連するデータが示されている。図１３Ａには、修復された骨の反対側の対照と比較した強度、弾性率、および靱性が示されている。足場を単独で使用することにより、損傷を受けた骨の強度および弾性率が対照骨のおよそ２０％になり、靱性が対照骨のおよそ５０％になった。足場に凍結乾燥／滅菌した微小血管組織を補充した場合、強度、弾性率、および靱性のそれぞれが足場単独と比較して増加した。したがって、これらのデータにより、微小血管組織を使用することにより、骨の損傷の修復が促進されることが示される。図１３Ｂおよび図１３Ｃには、足場を単独で用いて処置した骨および微小血管組織を補充した足場を用いて処置した骨の代表的な組織学的検査について示されている。図１３Ｂ（足場単独）では、欠損内に位置する骨と線維足場の接合部においていくらかの最初の骨棘形成が示されている。これにより、図１３Ａのデータによって証明される通り、線維足場によって少なくともいくらかの骨修復が開始されることが示唆される。図１３Ｃでは、組織学的検査により、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織を加えることにより、足場の周縁部において真の骨形成がもたらされたことが示唆される。したがって、同じ期間内で、微小血管組織により、骨の脱灰前駆体ではなく骨の形成が促進された。これにより、微小血管組織を足場と併せて使用することにより、治癒プロセスが加速し得ることが示唆される。
【０２５２】
軟骨修復に関して、成熟ヤギの内側滑車溝上の軟骨に４ｍｍ×７ｍｍの臨界サイズの欠損を穿孔した。欠損のおよその深さは軟骨よりもわずかに深い１ｍｍであった。組織足場（ＢＩＯＦＩＢＥＲ、Ｔｏｒｎｉｅｒ）を単独で、または凍結乾燥／滅菌した微小血管組織（細胞約１０６個）を補充して、欠損に適合させ、角のそれぞれに７−０ナイロン縫合糸を用いて定位置に保持した。３カ月後、欠損を組織学的に検査した。このデータは図１４Ａ〜図１４Ｈに示されている。図１４Ａ〜図１４Ｄには、足場単独のデータが示されており、図１４Ｅ〜図１４Ｈには、微小血管組織を補充した足場のデータが示されている。図１４Ａには、予め損傷させた軟骨の足場の肉眼で見た図が示されており、図１４Ｅには、微小血管組織を補充した足場についての同じ図が示されている。どちらの処置群でも修復の証拠が示された。図１４Ｂおよび図１４Ｆには、軟骨のヘマトキシリン・エオシン染色が示されている。微小血管組織を含む足場を使用することにより、足場を単独で使用することと比較して周縁部における充填の改善が示された。図１４Ｃおよび図１４Ｇには、サフラニンＯ染色が示されており、微小血管組織を用いて処置した欠損におけるより大きな程度のプロテオグリカンおよび保持が明らかにされている。図１４Ｄおよび図１４Ｈには、欠損のトルイジンブルー染色が示されており、微小血管組織を使用して欠損を処置した場合に、新しく生成した軟骨基質染色が成熟軟骨により似ていることが明らかにされている。これらのデータをまとめると、上記の骨の実験と同様に、微小血管組織により軟骨の修復が促進されることが確認された。
【０２５３】
微小血管組織の腱を修復する能力を評価するための実験も実施した。ラットアキレス腱を露出させ、有鉤ピンセットを用いてすり減らした。対照を同じ様式で手術した。ラットの１つの群を足場単独で処置し、別の群を、凍結乾燥／滅菌した微小血管組織を補充した足場で処置した。７日後に、ｑＰＣＲ、組織学的検査および免疫組織化学的検査のためにラットを屠殺した。足場群には、アキレスの前側表面に４ｍｍ×７ｍｍのＢＩＯＦＩＢＥＲ−ＣＭ足場を与えた。微小血管組織および処置群では、足場に微小血管細胞１０６個をローディングした。対照データは図１５Ａ（マッソントリクローム染色）および図１５Ｂ（テネイシンについての免疫組織化学的検査）に示されている。足場群についてのデータは図１５Ｃおよび図１５Ｄに示されている。マッソントリクローム染色（図１５Ｃ）により、足場の内部および周辺に最初の腱の修復を示す密集したコラーゲンの小さなポケットが明らかになった。同様に、テネイシンについての免疫組織化学的検査染色（図１５Ｄ）により、腱と植え込まれた足場の間の周縁部における発現の増加が明らかになり、これにより、最初の欠損の修復が再度示唆される。
【０２５４】
微小血管組織群についてのデータが図１５Ｅおよび図１５Ｆに示されている。マッソントリクローム染色（１５Ｅ）により、足場の内部および周辺における密集したコラーゲンの実質的な形成が明らかになり、これにより、欠損のかなりの修復が示される。同様に、テネイシンについての免疫組織化学的検査染色により、腱と植え込まれた足場の間の広範囲にわたる発現が明らかになった。これらのデータによっても欠損の有意な修復が示される。
【０２５５】
総合すると、これらの実験において提示されたデータにより、微小血管組織により、血管新生（標的組織への血液供給の確立および維持において重要な役割を果たす）させることができるだけでなく、骨、軟骨、および腱の修復を増強することもできることが確立される。いくつかの実施形態では、血管新生の増強は、少なくとも一部において、新しい組織の生成および維持をもたらす微小血管組織の能力において役割を果たす。
【０２５６】
本明細書において参照されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、本説明と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５７】
上に開示されている実施形態の特定の特徴および態様の種々の組合せまたは副組合せを行うことができ、それでも本発明の１つまたは複数の範囲内に入ることが意図されている。さらに、ある実施形態と関連した任意の特定の特徴、態様、方法、性質、特性、品質、特質、要素などに関する本明細書における開示は、本明細書に記載の他の実施形態の全てにおいて使用することができる。したがって、開示されている実施形態の様々な特徴および態様を、開示されている発明の種々の様式を形成するために互いと組み合わせるまたは互いと置き換えることができることが理解されるべきである。したがって、本明細書において開示されている本発明の範囲は、上記の特定の開示されている実施形態に限定されるべきでないことが意図されている。さらに、本発明の種々の改変、および代替形態が可能であるが、その特定の例が図に示されており、本明細書において詳細に記載されている。しかし、本発明は開示されている特定の形態または方法に限定されず、それとは反対に、本発明は、記載されている種々の実施形態の主旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に入る全ての改変、等価物、および代替を包含することが理解されるべきである。本明細書に開示されている方法はいずれも、列挙されている順序で実施される必要はない。本明細書に開示されている方法は、実践者が行うある特定の行為を含むが、これは、明白にも暗示によってのいずれでもこれらの行為の任意の第三者による指示も含み得る。例えば、「微小血管組織を投与すること」などの行為は「微小血管組織の投与を指示すること」を含む。本明細書に開示されている範囲は、任意のかつ全ての重複、部分範囲、およびこれらの組合せも包含する。例えば、「最大」、「少なくとも」、「超える」、「未満」、「間」などの言葉は、列挙されている数字を含む。「約」または「およそ」などの用語が先行する数字は、列挙されている数字を含む。例えば、「約３ｍｍ」は「３ｍｍ」を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｄ】
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【図１５Ｅ−Ｆ】
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【外国語明細書】
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