(57)【要約】【課題】オートファジーの制御因子を新たに特定し、当該因子を利用した一連の技術を提供する。【解決手段】ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質、或いは、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬が提供される。ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカー、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬が提供される。被検物質が有する、（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法が提供される。【選択図】図１７
2018172285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬。
【請求項２】
ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬。
【請求項３】
オートファジーが基底型オートファジーであることを特徴とする請求項２に記載の治療薬。
【請求項４】
細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の治療薬。
【請求項５】
ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質又はＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質が、核酸であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の治療薬。
【請求項６】
核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸アプタマー、又はアンチセンス核酸であることを特徴とする請求項５に記載の治療薬。
【請求項７】
ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカー。
【請求項８】
細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項７に記載のバイオマーカー。
【請求項９】
ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬。
【請求項１０】
ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質が、抗ＥＲｄｊ８抗体であることを特徴とする請求項９に記載の診断薬。
【請求項１１】
細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の診断薬。
【請求項１２】
被検物質が有する、
（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、
（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、
を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１３】
細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮型側索硬化症、又はクローン病であることを特徴とする請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬、バイオマーカー、診断薬、並びに、スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、細胞が持つ細胞内の不良なタンパク質やオルガネラを分解するシステムである。この分解によって、細胞内の恒常性維持や飢餓時のアミノ酸供給が行われていると考えられている。
【０００３】
オートファジーは、「マクロオートファジー」、「ミクロオートファジー」、「シャペロン介在性オートファジー」の３種類に大きく分類される。マクロオートファジーでは、隔離膜と呼ばれる膜が小胞体膜で伸張し、不良タンパク質やオルガネラを包み込み、２重膜構造のオートファゴソームを形成する。このオートファゴソームがリソソームと融合することでオートリソソームとなり、タンパク質を分解する。一般に、オートファジーと表記する場合は、マクロオートファジーを示す。一方、ミクロオートファジーは、不良タンパク質を直接リソソームに取り込むことで分解する。また、シャペロン介在性オートファジーは、分子シャペロンによって不良タンパク質をリソソームに取り込むことで分解する。
【０００４】
オートファジーによる分解プロセスは、「隔離膜の形成」、「隔離膜の伸張とオートファゴソームの形成」、「オートファゴソームとリソソームの融合」の３つに大きく分けられる。そして、オートファジーに関わる様々なオートファジー関連因子（Ａｔｇ因子）によって、これらが制御されている。
【０００５】
またオートファジーは、「誘導型オートファジー」と「基底型オートファジー」に分類することができる。誘導型オートファジーは、飢餓誘導時などに生じ、一過的な栄養供給を行なうためのものである。一方、基底型オートファジーは、細胞内の異常タンパク質やオルガネラの定常的なクリアランスを行なうために、常に生じているオートファジーである。
【０００６】
このうち、基底型オートファジーは寿命の長い神経細胞などでは特に重要である。これまでの報告で、神経系においてオートファジーが抑制されたマウスでは、神経細胞内に構造異常タンパク質の蓄積が生じ、結果的に神経細胞死が観察されている（非特許文献１）。このことから、神経細胞において、基底型オートファジーによって不良タンパク質や異常な細胞内小器官などが分解除去されることで、それらの蓄積により生じる神経細胞死が防がれていることが予想される。
【０００７】
ところで、アルツハイマー病等の認知症を伴う神経変性疾患は、根本的な治療法が確立しておらず、病気の進行を遅らせる対処療法しかないのが現状である。このような神経変性疾患の治療や予防を目的とした医薬品開発は急務である。
【０００８】
上記のように、神経変性疾患の原因となる細胞内タンパク質凝集体は、オートファジーによる分解遅延によって蓄積することが明らかになっている（非特許文献１）。すなわち、神経細胞内におけるオートファジー活性が低下することにより、タンパク質分解が遅延し、細胞内タンパク質凝集体の蓄積が起こる。このことから、神経細胞内におけるオートファジー活性を制御する（高める）ことができれば、細胞内タンパク質凝集体を減少させ、また細胞内タンパク質凝集体の蓄積を防止することができ、神経変性疾患の根本的治療法の開発につながることが期待される。例えば、オートファジー活性を調節する因子を特定し、当該因子を制御することにより、オートファジー活性を上昇させることが考えられる。
【０００９】
さらにオートファジー活性の低下が、クローン病（非特許文献２）、萎縮型加齢黄斑変性症、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症（非特許文献３）、１型および２型糖尿病（非特許文献４）、肝炎（非特許文献５）の発症または増悪に関与することが示唆されている。
【００１０】
なお、細胞におけるオートファジーを誘発又は阻害する方法として、例えば、特許文献１，２に記載のものがある。
【００１１】
また近年、オートファジー分解に必要な膜成分が小胞体とミトコンドリアのコンタクトサイト（ＭＡＭ）から生じることが報告されている（非特許文献６）。このように、ＭＡＭがオートファジーにおいて重要な役割を持つことが明らかになってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０１３−５０６６８６号公報
【特許文献２】特表２０１３−５０６６８７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hara,T et al., Nature, 441, 885-889 2006
【非特許文献２】Adolph T et al., Nature, 503, 272-276, 2013
【非特許文献３】Fujiwara Y et al., Autophagy 9:3, 403-409, 2013
【非特許文献４】Zhang S et al., FASEB J (12):5083-96, 2014
【非特許文献５】Rautou P et al., Journal of Hepatology, 53, 6, 1123-1134, 2010
【非特許文献６】Hamasaki M et al., Nature, 495, 389-93, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、オートファジーの制御因子を新たに特定し、当該因子を利用した一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、新規のオートファジーの制御因子を探索し、小胞体膜局在ＤｎａＪタンパク質であるＤＮＡＪＣ１６（DnaJ homolog subfamily C member 16）をクローニングした。そして、当該タンパク質が小胞体内腔にＪドメインを有することを確認したことから、新たにＥＲｄｊ８と命名した。そして、ＥＲｄｊ８について研究を進めた結果、ＥＲｄｊ８がオートファジー活性、特に基底型オートファジーを強力に負に制御する機能を有することを見出した。
【００１６】
上記した知見に基づいて提供される本発明の１つの様相は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬である。
【００１７】
本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬である。
【００１８】
好ましくは、オートファジーが基底型オートファジーである。
【００１９】
好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
【００２０】
好ましくは、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質又はＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質が、核酸である。
【００２１】
好ましくは、核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸アプタマー、又はアンチセンス核酸である。
【００２２】
本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカーである。
【００２３】
好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
【００２４】
本発明の他の様相は、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬である。
【００２５】
好ましくは、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質が、抗ＥＲｄｊ８抗体である。
【００２６】
好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
【００２７】
本発明の他の様相は、被検物質が有する、
（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、
（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、
を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法である。
【００２８】
好ましくは、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患が、神経変性疾患、１型糖尿病、２型糖尿病、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、又はクローン病である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患やオートファジーの異常が関与する疾患の、治療や診断に有用である。また本発明によれば、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質を効率的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞における、ＬＣ３の発現を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図２】ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞における、細胞内のＬＣ３の蓄積を表す写真である。
【図３】ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞における、細胞内のＬＣ３の蓄積を表す写真である。
【図４】図３で観察された全細胞のうち、オートリソソームを含む細胞が占める割合を表すグラフである。
【図５】ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入したＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積量を調べたドットブロットとＬＣ３の蓄積量を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図６】ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入したＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、細胞内のＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の蓄積を表す写真である。
【図７】図６で観察された細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。
【図８】ＥＲｄｊ８を過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積量を調べたドットブロットとＬＣ３の蓄積量を調べたウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図９】ＥＲｄｊ８を過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の蓄積を表す写真である。
【図１０】図９で観察された細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。
【図１１】ＥＲｄｊ８の過剰発現させたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞における、内在性のユビキチンタンパク質の蓄積を表す写真である。
【図１２】ＥＲｄｊ８の過剰発現させたＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体とリソソームの共局在を表す写真である。
【図１３】図１２で観察された細胞における、リソソームと共局在しているＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の割合を表すグラフである。
【図１４】ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、ＧＦＰ：：ＬＧＧ１の蓄積を表す写真である。
【図１５】図１４の線虫における、ＬＧＧ１のドットの数を表すグラフである。
【図１６】ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、ＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数を表すグラフである。
【図１７】ｄｎｊ８をノックダウンした神経変性疾患モデル線虫における、運動機能の回復を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
まず、ＥＲｄｊ８について説明する。ＥＲｄｊ８は、小胞体膜局在ＤｎａＪタンパク質であるＤＮＡＪＣ１６（DnaJ homolog subfamily C member 16）と同一のタンパク質である。ＥＲｄｊ８をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１６５〜２５１０番の領域がＥＲｄｊ８をコードしている部分である。当該領域のヌクレオチド配列とそれ対応するアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
ＥＲｄｊ８は７８２アミノ酸からなる膜タンパク質であり、ＤｎａＪドメイン、チオレドキシン様ドメイン、及び膜貫通ドメインを有する。
【００３２】
本発明は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬を包含する。また本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬を包含する。
【００３３】
「ＥＲｄｊ８の発現」には、転写レベルの発現（ｍＲＮＡ量）と翻訳レベルの発現（タンパク量）の両方が含まれる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子の転写産物の量と翻訳産物の量の両方が、ＥＲｄｊ８の発現量となり得る。
【００３４】
１つの実施形態では、「ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質」又は「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」が核酸である。すなわち、本発明の治療薬は核酸医薬であり得る。
【００３５】
ＥＲｄｊ８の発現を抑える物質、オートファジー活性抑制機能を抑制する物質の例として、ＥＲｄｊ８特異的なｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡが挙げられる。具体例としては、後述の実施例で使用した、配列番号４又は配列番号５で示す配列をＥＲｄｊ８特異的配列として含むｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００３６】
上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ（塩基数）は、同じでもよいし、異なってもよい。当該塩基数は、通常は３０塩基以下、好ましくは１９〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基、さらに好ましくは２１塩基である。
【００３７】
また、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の末端形状は、平滑末端でもよいし、３’側がオーバーハングした突出末端であってもよい。突出末端の場合、突出部分の塩基数は、通常は１〜１０塩基、好ましくは１〜４塩基、より好ましくは１〜２塩基である。なお、センス鎖とアンチセンス鎖の突出部分の長さは、同じでもよいし、異なってもよい。また、突出部分のヌクレオチドは、ＤＮＡに変換されていてもよい。さらに、突出部分のヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基を有することが好ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、相補的でない塩基を有するものであってもよい。
【００３８】
上記ｓｉＲＮＡが有するＥＲｄｊ８特異的配列は、標的配列と同じであることが好ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、完全同一でなくてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡのＥＲｄｊ８特異的配列（アンチセンス配列）と標的配列とがハイブリダイズ可能であれば、数個程度の塩基のミスマッチは許容される。すなわち上記ｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１〜数個（例えば２〜４個程度）の塩基が置換、付加、若しくは欠失したものであって、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。さらに上記ｓｉＲＮＡには、標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。
【００３９】
さらに上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、ＲＮＡとＤＮＡとが混合したタイプであってもよい。例えば、センス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＲＮＡ鎖、他方がＤＮＡ鎖であるハイブリッド型ｓｉＲＮＡであってもよい。また、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたキメラ型ｓｉＲＮＡであってもよい。
【００４０】
上記ハイブリッド型ｓｉＲＮＡは、センス鎖がＤＮＡ、アンチセンス鎖がＲＮＡであるものが好ましい。
【００４１】
上記キメラ型ｓｉＲＮＡとしては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。具体例としては、センス鎖の３’末端側とアンチセンス鎖の５’末端側の両方のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。また、センス鎖の３’末端側とアンチセンス鎖の５’末端側のいずれか一方のヌクレオチドがＤＮＡに変換されたものが挙げられる。なお、ＤＮＡに変換されるヌクレオチドの長さは、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチド数以下であることが好ましい。ＤＮＡに変換する領域は、例えば、末端から１〜１３ヌクレオチド、好ましくは１〜１０ヌクレオチドの範囲から選択することができる。
【００４２】
キメラ型ｓｉＲＮＡの一例として、各鎖のヌクレオチド長が１９〜２１であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハング部分を除いた１〜１０個程度のヌクレオチドの一部または全部が連続してＤＮＡに変換され、かつ、アンチセンス鎖の５’末端側から１〜１０個程度のヌクレオチドの一部または全部が連続してＤＮＡに変換されたものが挙げられる。この例においてＤＮＡへの変換の対象となる領域は、センス鎖の３’末端側では、通常は末端から１〜１０個程度であり、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個である。アンチセンス鎖の５’末端側では、通常は末端から１〜１０個程度であり、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個である。この例において、センス鎖（オーバーハング部分を除く）とアンチセンス鎖におけるＤＮＡの数は、同じであることが好ましい。このｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安定性、生体への安全性、などの点で特に好ましいと考えられる。
【００４３】
また、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、上記ｓｉＲＮＡを構成するヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分や塩基部分、あるいはヌクレオチド間の結合部分が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。
塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等の５位修飾ウリジン又はシチジン；８−ブロモグノシン等の８位修飾アデノシン又はグアノシン；７−デアザ−アデノシン等のデアザヌクレオチド；Ｎ６−メチルアデノシン等のＯ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、などが挙げられる。
糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、リボヌクレオチドの２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2、又はＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾体や、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾体が挙げられる。
ヌクレオチド間の結合部分が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチド間のホスホエステル基がホスホチオエート基で置換されたものが挙げられる。
【００４４】
上記ｓｉＲＮＡに類似して、本発明における核酸は、一本の鎖がステムループ構造をとることにより形成された二本鎖ＲＮＡ、すなわちｓｈＲＮＡであってもよい。例えば、当該核酸は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。また当該核酸は、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。さらに当該核酸は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端、並びに、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両方に、２〜４ヌクレオチドからなるループが形成されたｓｈＲＮＡであってもよい。
ｓｈＲＮＡについても、ハイブリッド型やキメラ型の構成を採用することができる。さらに、ｓｈＲＮＡを構成するヌクレオチドは、その糖部分や塩基部分、あるいはヌクレオチド間の結合部分が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。
【００４５】
ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ以外の核酸としては、アンチセンス核酸が挙げられる。すなわち、ＥＲｄｊ８のｍＲＮＡに相補的な配列を有するアンチセンス核酸を設計し、ＥＲｄｊ８の発現を抑える核酸医薬として用いることができる。
【００４６】
その他の例としては、核酸アプタマーが挙げられる。例えば、ＥＲｄｊ８に特異的に結合および作用する核酸アプタマーを設計し、ＥＲｄｊ８のオートファジー活性抑制機能を抑える核酸医薬として用いることができる。
【００４７】
本発明の治療薬の使用方法については、有効成分の種類や剤形等によって適宜選択される。
【００４８】
本発明の治療薬は、全身投与と局所投与のいずれによっても使用され得る。細胞内の異常物質蓄積が局所的に起こっている場合は、注射等により当該箇所に直接投与することができる（局所投与）。一方、細胞内の異常物質蓄積が複数箇所にわたる場合や場所を特定できない場合には、静脈注射等による全身投与が好ましく採用される。
【００４９】
本発明の治療薬の投与経路としては、経口投与と非経口投与の両方が適用できる。非経口投与の例としては、静脈内、皮下、筋肉、局所、腹腔内、経皮、経鼻、経肺、等の各投与方法が挙げられる。
【００５０】
本発明の治療薬の投与量については、有効成分の種類、投与経路、疾患の進行度や重篤度、投与対象者の年齢や体重、等により適宜設定することができる。
【００５１】
本発明の治療薬は、有効成分である「ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質」又は「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であり得る。当該担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、滑剤、懸濁剤、分散剤、希釈剤、等が挙げられる。これらの担体は、公知のものがそのまま適用できる。また本発明の治療薬は、液体、半固体、固体のいずれの剤形でもよい。
【００５２】
本発明の治療薬が核酸医薬である場合、非ウイルスベクター又はウイルスベクターの形態で投与することができる。
【００５３】
非ウイルスベクターの形態で投与する場合には、例えば、リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法等の、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法；マイクロインジェクション法；遺伝子銃でキャリアとともに核酸分子を細胞に移入する方法、などを用いることができる。
【００５４】
ウイルスベクターを用いてｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを投与する場合には、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを利用することができる。例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入する。そして、細胞又は組織にこの組換えウイルスを感染させる。これにより、細胞又は組織内で導入遺伝子が発現し、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを作用させることができる。
【００５５】
１つの実施形態では、「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質」は、低分子化合物、ペプチド又は抗体である。
【００５６】
当該ペプチドとしては、ＥＲｄｊ８と結合可能なペプチドや、ＥＲｄｊ８の部分ペプチド及び／又はアナログペプチドであってオートファジー活性抑制機能がＥＲｄｊ８よりも低いペプチド（ＥＲｄｊ８のドミナントネガティブ作用を持つペプチド）、が挙げられる。
【００５７】
当該抗体としては、ＥＲｄｊ８に対する抗体が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子の他、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。さらに当該抗体は、ヒト型キメラ抗体又はヒト化抗体であることが好ましい。
【００５８】
上記ペプチド及び抗体は、いずれも公知の方法により製造することができる。本発明の医薬組成物の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤又は輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下又は局所に投与することができる。
【００５９】
本発明は、ＥＲｄｊ８からなる、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患検出用のバイオマーカーを包含する。例えば、ＥＲｄｊ８からなるバイオマーカーを指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患を検出することができる。例えば、生体の局所において当該バイオマーカーの発現量が多い場合には、オートファジーが抑制されており、細胞内の異常物質蓄積が起こっていると判定することができる。
【００６０】
本発明は、ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質を含む、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の検出に用いるための診断薬を包含する。ＥＲｄｊ８に対して特異的に結合する物質の例としては、抗ＥＲｄｊ８抗体が挙げられる。例えば、抗ＥＲｄｊ８抗体を用いて組織中や体液中のＥＲｄｊ８の発現量を測定し、オートファジーの異常に起因する細胞内の異常物質蓄積の有無を検出することができる。
【００６１】
本発明は、被検物質が有する、（ａ）ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する活性、又は、（ｂ）ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性、を指標として、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法を包含する。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法の１つの態様は、被験物質が有する「ＥＲｄｊ８の発現量を抑制する活性」を指標とするものである。すなわち当該活性を有する物質は、オートファジーを促進する作用、あるいは抑制されたオートファジーを回復させる（抑制を解除する）作用を有することが期待され、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質となり得る。
【００６３】
本態様においても、「ＥＲｄｊ８の発現量」には、転写レベルの発現量（ｍＲＮＡ量）と翻訳レベルの発現量（タンパク量）の両方が含まれる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子又はその代替遺伝子（レポーター遺伝子等）の転写産物の量と翻訳産物の量の両方が、ＥＲｄｊ８の発現量となり得る。
【００６４】
ｍＲＮＡ量の測定方法としては、対応する遺伝子のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、等を用いて行うことができる。
【００６５】
タンパク量の測定方法としては、対応する遺伝子がコードするタンパク質を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法、ウエスタンブロット法、等を用いて行うことができる。
【００６６】
ＥＲｄｊ８の発現量を指標とする場合は、レポーター遺伝子を使用することができる。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子の発現量をもって、ＥＲｄｊ８の発現量を把握することができる。
【００６７】
ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターとは、細胞内においてＥＲｄｊ８遺伝子の発現を調節しているＤＮＡ上の領域であって、転写因子が結合することにより、ＥＲｄｊ８遺伝子の発現が誘導される領域をいう。
【００６８】
「機能的に連結」とは、プロモーターの下流に連結された遺伝子が当該プロモーターの制御下で発現可能である連結様式をいう。すなわち、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子は、当該プロモーターの制御下で転写され、その後、翻訳される。
【００６９】
レポーター遺伝子としては、生命工学の分野で一般的に用いられているものを採用することができる。例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、をコードする遺伝子を採用することができる。
【００７０】
好ましい実施形態として、下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞又は当該細胞の抽出液に、被験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で被験物質を接触させた細胞又は当該細胞の抽出液における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
を包含する上記スクリーニング方法が挙げられる。
【００７１】
本実施形態における、工程（ｉ）の具体例としては、ＥＲｄｊ８遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を機能的に連結し、これを適宜のベクターに組み込み、さらに適宜の細胞に導入する。そして、この細胞（組換え細胞）に被験物質を接触させる。細胞に被験物質を接触させる方法としては、被験物質を含有する培地で細胞を培養することが挙げられる。その他の例としては、細胞懸濁液や細胞抽出液に被験物質を添加することが挙げられる。
【００７２】
工程（ｉｉ）では、レポーター遺伝子の発現量を測定する。例えばレポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であれば、発現産物であるルシフェラーゼの活性を、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子であれば、発現産物であるＧＦＰを、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＵＳ遺伝子であれば、発現産物であるＧＵＳの活性を、グルクロン等の発色をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子であれば、発現産物であるＣＡＴの活性を、クロラムフェニコールのアセチル化をもって検出することができる。
【００７３】
別途、工程（ｉ）で細胞等に被験物質を接触させないコントロールを設定し、その場合の発現量を基準値として設定する。そして、被験物質を細胞等に接触させた場合の測定値と、当該基準値とを比較する。
【００７４】
ＥＲｄｊ８のプロモーターの下流に連結する遺伝子は、ＥＲｄｊ８遺伝子の一部又は全長とレポーター遺伝子との融合遺伝子であってもよい。
【００７５】
レポーター遺伝子を使わずに、ＥＲｄｊ８遺伝子をそのまま使うことも可能である。すなわち、前記プロモーターの下流に連結されたＥＲｄｊ８遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ量）又は翻訳産物（ＥＲｄｊ８タンパク）の量を測定することにより、ＥＲｄｊ８の発現量を把握することができる。
また、この場合のＥＲｄｊ８遺伝子は、ＥＲｄｊ８の全長をコードする遺伝子に加えて、ＥＲｄｊ８の機能的断片をコードする遺伝子であってもよい。ＥＲｄｊ８の機能的断片については後述する。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法の別の態様は、被験物質が有する「ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する」を指標とするものである。すなわち当該活性を有する物質は、抑制されたオートファジーを回復させる（抑制を解除する）作用を有することが期待され、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬の候補物質となり得る。
【００７７】
例えば、単離されたＥＲｄｊ８に被験物質を接触させた際の、当該ＥＲｄｊ８の活性を測定することにより、本発明のスクリーニング方法を実施することができる。「ＥＲｄｊ８の活性」は、例えばオートファジー活性抑制機能である。当該オートファジー活性抑制機能を代替するものとしては、オートファゴソームの小胞体膜からの解離を阻害する活性が可能性として挙げられる。
【００７８】
単離されたＥＲｄｊ８は、例えば、配列番号２に示すＥＲｄｊ８遺伝子を用いて調製することができる。
【００７９】
単離されたＥＲｄｊ８には、ＥＲｄｊ８の全長に加えて、ＥＲｄｊ８の機能的断片が含まれる。ここで「ＥＲｄｊ８の機能的断片」とは、ＥＲｄｊ８の部分配列を有するポリペプチドであって、ＥＲｄｊ８としての活性（例えば、オートファジー活性抑制機能）を保持しているものを指す。
【００８０】
また、単離されたＥＲｄｊ８には、天然のＥＲｄｊ８と実質的に同等とみなせるＥＲｄｊ８の変異体、改変体が含まれる。
例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ（ヒトＥＲｄｊ８のｃＤＮＡ）と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質が、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、「０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、１％ＳＤＳ、６５℃、２４時間」の条件をいう。
別の例として、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ヒトＥＲｄｊ８）において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質も、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。
さらに別の例として、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ヒトＥＲｄｊ８）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつＥＲｄｊ８としての活性を有するタンパク質も、本実施形態における単離されたＥＲｄｊ８に含まれる。
【００８１】
細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の例としては、神経変性疾患が挙げられる。具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症、脊髄小脳変性症、などが挙げられる。細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の他の例としては、１型糖尿病、２型糖尿病が挙げられる。その他の例としては、加齢黄斑変性症、肝炎、筋強直性ジストロフィー、筋委縮側索硬化症、クローン病などが挙げられる。
【００８２】
本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を有効成分として含有するオートファジー活性促進剤を包含する。例えば、真核細胞生物及び、それ由来の細胞におけるオートファジー活性を促進するために、本オートファジー活性促進剤を用いることができる。また、本オートファジー活性促進剤はヒトの治療以外の目的で使うこともできる。本オートファジー活性促進剤についても、上記した本発明の治療剤と同様の実施形態をとることができる。例えば、本オートファジー活性促進剤の有効成分は、低分子化合物、ペプチド又は抗体であり得る。
【００８３】
さらに本発明は、ＥＲｄｊ８又はＥＲｄｊ８をコードする核酸を有効成分として含有するオートファジー活性抑制剤を包含する。当該核酸を有効成分として含有するオートファジー活性抑制剤は、例えば、当該核酸が組み込まれたベクターであり得る。
【００８４】
本発明は、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質を投与する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療方法、を包含する。また本発明は、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質を投与する、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療方法、を包含する。
【００８５】
また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療に用いられる、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質、を包含する。また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療に用いられる、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質、を包含する。
【００８６】
また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬製造のための、ＥＲｄｊ８の発現を抑制する物質の使用、を包含する。また本発明は、細胞内の異常物質蓄積を伴う疾患の治療薬製造のための、ＥＲｄｊ８が有するオートファジー活性抑制機能を抑制する物質の使用、を包含する。
【００８７】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
（１）ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡの作製
Lifetechnologies社のStealth RNAiTM siRNAを利用して、２種のヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを作製した。ヒトＥＲｄｊ８特異的な配列（センス）として、GAUUGGUGCUUUAGCUGCAUUCAUA（配列番号４）とGAUUGGGAGUGAGAGUGACAAAUUU（配列番号５）を採用した。以下、配列番号４を採用したｓｉＲＮＡを「ｓｉＲＮＡ＃２」、配列番号５を採用したｓｉＲＮＡを「ｓｉＲＮＡ＃３」と称する。
【００８９】
（２）ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜１＞
LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen社)を用いて、ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃２又はｓｉＲＮＡ＃３）を導入した。７２時間培養した後に細胞を回収し、１％ＮＰ４０含有Lysis Bufferで可溶化した。４℃、１５０００ｒｐｍで遠心した後、可溶性画分にLaemmli Sample bufferを加えて可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、BlockingOne（ナカライテスク社）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。ＬＣ３タイプ１の検出には、抗ＬＣ３タイプ１抗体（ＭＢＬ社）を用いた。ＬＣ３タイプ２の検出には、抗ＬＣ３タイプ２抗体（ＭＢＬ社）を用いた。検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入したＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
【００９０】
結果を図１に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されＥＲｄｊ８の発現量が抑えられたＨｅＬａ細胞では、オートファゴソームマーカーであるＬＣ３の顕著な蓄積が観察された。
以上より、ＥＲｄｊ８の発現量を抑えることによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。また、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御する因子であることが強く示唆された。
【００９１】
（３）ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜２＞
上記（２）と同様にしてＨｅＬａ細胞にヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。５０μｇ／ｍＬジギトニンで膜透過処理を行い、BlockingOne（ナカライテスク社）を用いて室温で１時間ブロッキング後、抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社）を用いて細胞内のＬＣ３の染色を行った。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入したＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
【００９２】
結果を図２に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞では、細胞内にＬＣ３の顕著な蓄積が観察された。
以上より、ＥＲｄｊ８の発現量を抑えることによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。また、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御する因子であることが強く示唆された。
【００９３】
（４）ｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン
LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen社）を用いて、ｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃２を導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察はDeltaVision蛍光顕微鏡（ＧＥヘルスケア社）を用いた。取得した画像解析にはImage Jを用いた。
コントロールとして、ｓｉＲＮＡを導入しないｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
なお、ｔｆＬＣ３はｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰとをタンデムにＬＣ３に結合した融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ−ＬＣ３）である。ｔｆＬＣ３は、リソソームと融合していないオートファゴソーム内では赤色と緑色の蛍光を発し、一方、リソソームと融合した後のオートリソソーム内では赤色のみの蛍光を発する。
【００９４】
結果を図３、図４に示す。すなわち、ｓｉＲＮＡを導入したｔｆＬＣ３安定発現ＨｅＬａ細胞では、赤色のみの蛍光が多く観察された（図３の右側の写真）。これは、ＬＣ３がリソソーム内に多く集積していることを示しており、オートファジーが顕著に促進していると考えられた。
そして、観察された全細胞のうちオートリソソームを含む細胞が占める割合は、ｓｉＲＮＡを導入しないコントロールでは２４％であったが、ｓｉＲＮＡを導入した場合では８９％に達した（図４）。
以上より、ＥＲｄｊ８がオートファジーを負に制御していることが強く示唆された。
【００９５】
（５）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜１＞
LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に上記（１）で作製したヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃３を導入した。７２時間培養した後に細胞を回収し、Laemmli Sample bufferを直接加えサンプル化を行った。ＰＶＤＦ膜にドットブロットを行い、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積を抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社）により定量した。
【００９６】
また、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。ＬＣ３の検出には、抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ社）を用いた。tubulinの検出には、抗tubulin抗体（ミリポア社を用いた）。
ドットプロットとウエスタンブロットの検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社)）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
コントロールとして、ｓｉＲＮＡを導入しないＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
【００９７】
結果を図５に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では、オートファジーの基質として知られるＰｏｌｙＱタンパク質が著しく減少していた。以上のことから、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが亢進している可能性が強く示唆された。
【００９８】
（６）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８のノックダウン＜２＞
上記（５）と同様にして、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞にヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡ＃３を導入した。７２時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
コントロールとして、コントロールとして、Stealth RNAi siRNA negative control lo GC（ThermoFisher社）を導入し、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞を用いて同様の実験を行った。
【００９９】
結果を図６、図７に示す。すなわち、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では、オートファジーの基質として知られるＰｏｌｙＱタンパク質（白い点）が著しく減少していた（図６）。細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数は、コントロールでは０．１７個程度であったのに対し、ヒトＥＲｄｊ８特異的ｓｉＲＮＡを導入した細胞では０．０５個程度であった（図７）。以上のことから、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが亢進している可能性が強く示唆された。
【０１００】
（７）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現＜１＞
Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＲＦＰとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８−ＲＦＰ）を発現するためのプラスミド（origene社）を導入した。
２４時間培養した後に細胞を回収し、Laemmli Sample bufferを直接加えサンプル化を行った。酢酸セルロース膜にドットブロットを行い、ＰｏｌｙＱタンパク質の蓄積を抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ社）により定量した。
また、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロッティングを行った。ＥＲｄｊ８の検出には、抗ＤＮＡＪＣ１６抗体（コスモバイオ社）を用いた。tubulinの検出には、抗tubulin抗体（ミリポア社を用いた）。
ドットプロットとウエスタンブロットの検出試薬としてＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社)）用い、ＬＡＳ４０００（富士フィルム社）により検出を行った。
コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
【０１０１】
結果を図８に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８−ＲＦＰを発現するプラスミドを導入した細胞では、ＰｏｌｙＱタンパク質が著しく増加していた。
以上のことから、ＥＲｄｊ８の過剰発現により基底レベルのオートファジー活性が阻害されることが強く示唆された。
【０１０２】
（８）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現＜２＞
上記（７）と同様にして、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、ＥＲｄｊ８−ＲＦＰを発現するためのプラスミドを導入した。
２４時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＥＲｄｊ８とＰｏｌｙＱの蛍光を観察した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
【０１０３】
結果を図９、図１０に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８−ＲＦＰを発現するプラスミドを導入した細胞では、ＰｏｌｙＱ凝集体の蓄積が観察された（図９）。細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数は、コントロールでは０．２９個程度であったのに対し、ヒトＥＲｄｊ８過剰発現細胞では４１．４個程度であった（図１０）。
以上のことから、ＥＲｄｊ８の過剰発現により基底レベルのオートファジー活性が阻害されることが強く示唆された。
【０１０４】
（９）神経細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＥＲｄｊ８の過剰発現
Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＦｌａｇとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８−Ｆｌａｇ）を発現するためのプラスミド（かずさＤＮＡ研究所社）を導入した。
４８時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
コントロールとして、挿入遺伝子を持たないプラスミドを導入したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いて同様の実験を行った。
【０１０５】
結果を図１１に示す。すなわち、ＥＲｄｊ８−Ｆｌａｇの発現プラスミドが導入されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、内在性のユビキチンタンパク質の蓄積が観察された。この結果は、細胞内で定常的に分解されているユビキチン化タンパク質がＥＲｄｊ８の過剰発現により顕著に蓄積したことを示しており、ＥＲｄｊ８が定常的にオートファジーを負に制御していることが強く示唆された。また、神経細胞では誘導型オートファジーは起こらないとされていることから、ＥＲｄｊ８は定常型オートファジーを負に制御することができると考えられた。
【０１０６】
（１０）ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞用いたＥＲｄｊ８の過剰発現時におけるリソソームとＰｏｌｙＱの局在
Lipofectamine2000（Invitrogen社）を用いて、ＥＹＦＰ蛍光タンパク質融合Ｐｏｌｙ１４３Ｑタンパク質安定発現ＨｅＬａ細胞に、播種と同時に、ヒトＥＲｄｊ８とＲＦＰとの融合タンパク質（ＥＲｄｊ８−ＲＦＰ）を発現するためのプラスミド（origene社）を導入した。
２４時間培養後、リソソーム内の分解酵素の阻害剤であるＥ６４ｄ及びPepstatinAでさらに２４時間処理した後、Lysotraker（Molecular probes社）を用いてリソソームを染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、マウント剤を用いて細胞を固化した。観察にはＬＳＭ７００共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス）を用いた。取得した画像の解析にはＺＥＩＳＳ顕微鏡ソフトウェアＺＥＮ（カールツァイス）を用いた。
コントロールとして、ＲＦＰのみを発現するプラスミドを用いて同様の実験を行った。
【０１０７】
結果を図１２、図１３に示す。すなわち、リソソーム内の分解酵素活性を阻害することにより生じたＰｏｌｙＱタンパク質凝集体が、ＥＲｄｊ８過剰発現細胞ではリソソームと共局在しなくなった（図１２）。リソソームと共局在しているＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の割合は、コントロールでは８５％程度であったが、ＥＲｄｊ８過剰発現細胞では１８％程度であった（図１３）。
以上より、ＥＲｄｊ８はオートファゴソームとリソソームとの融合を阻害していることが強く示唆された。
【０１０８】
（１１）ＧＦＰ：：ＬＧＧ１を安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン＜１＞
ＧＦＰ：：ＬＧＧ１（哺乳動物細胞におけるＬＣ３のホモログ）を生殖腺で安定発現する線虫に、ｄｎｊ８（ＥＲｄｊ８のホモログ）特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。その次世代における生殖腺内でのＧＦＰ：：ＬＧＧ１の変化を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察した。
コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
【０１０９】
結果を図１４、図１５に示す。すなわち、ｄｎｊ−８をノックダウンした線虫の個体内においてＬＧＧ１のドットが顕著に蓄積していた（図１４）。また、線虫１個体あたりのＬＧＧ１のドットの数は、コントロールの線虫では１５個程度であったが、ｄｎｊ−８をノックダウンした線虫では３０個程度であった（図１５）。
このように、動物個体内においても、培養細胞と同様にＥＲｄｊ８のノックダウンにより、オートファジーマーカーであるＬＧＧ１が顕著に蓄積したことから、オートファジーが促進していることが強く示唆された。
【０１１０】
（１２）ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ４０Ｑを安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン＜２＞
ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ４０Ｑを筋肉において安定発現する線虫（神経変性疾患モデル線虫）に、ｄｎｊ８特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。その次世代における筋肉でのＧＦＰ：：ＬＧＧ１の変化を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察した。
コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
【０１１１】
結果を図１６に示す。すなわち、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫の個体内においてＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数が有意に減少した。詳細には、細胞あたりのＰｏｌｙＱタンパク質凝集体の数について、コントロールの線虫では４２個程度であったが、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫では３１個程度であった。このことから、線虫個体において、ＥＲｄｊ８のノックダウンによりオートファジーが促進されることが強く示唆された。
【０１１２】
（１３）ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑを安定発現する線虫個体に対するｄｎｊ８のノックダウン
ＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑを筋肉において安定発現する線虫（神経変性疾患モデル線虫）に、ｄｎｊ８特異的ｓｉＲＮＡを発現する大腸菌を餌として与え、ｄｎｊ８のノックダウンを行った。成虫時におけるＧＦＰ：：ｐｏｌｙ７９Ｑ発現線虫の動きの回復を蛍光顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス社）で観察し、動きの変化の解析をMetaMorph（モレキュラーディバイス社）により解析した。具体的には、ｓｉＲＮＡを線虫に与えてから２４時間、４８時間、７２時間経過時における各線虫の６０秒間の移動距離を測定した。
コントロールとして、ｓｉＲＮＡを発現しない大腸菌を餌として与えた線虫を用いて同様の実験を行った。
【０１１３】
結果を図１７に示す。すなわち、コントロールの線虫では運動機能を喪失したままであったのに対して、ｄｎｊ８をノックダウンした線虫では運動機能が回復していた。運動機能の回復は、ｓｉＲＮＡを線虫に与えてから後７２時間経過時において特に顕著であった。
これは、ｄｎｊ８のノックダウンによりオートファジーが促進した結果、ＰｏｌｙＱタンパク質のオートファジーによる分解が促進され、線虫の運動機能が回復したものと考えられた。この結果は、ＰｏｌｙＱ発現線虫において発症している神経変性疾患の回復を意味する。
【図１】
2018172285.tif 000003
【図２】
2018172285.tif 000004
【図３】
2018172285.tif 000005
【図４】
2018172285.tif 000006
【図５】
2018172285.tif 000007
【図６】
2018172285.tif 000008
【図７】
2018172285.tif 000009
【図８】
2018172285.tif 000010
【図９】
2018172285.tif 000011
【図１０】
2018172285.tif 000012
【図１１】
2018172285.tif 000013
【図１２】
2018172285.tif 000014
【図１３】
2018172285.tif 000015
【図１４】
2018172285.tif 000016
【図１５】
2018172285.tif 000017
【図１６】
2018172285.tif 000018
【図１７】
2018172285.tif 000019
【配列表】
2018172285000001.app