(57)【要約】【課題】幹細胞を競走馬または競技馬に投与する方法、および幹細胞を競走馬または競技馬に投与することによる競走馬または競技馬の症状改善方法を提供する。【解決手段】幹細胞投与方法は、動物（ドナー動物）から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬（ドナー競走馬）または競技馬（ドナー競技馬）に注入する投与工程を含み、競走馬または競技馬の症状改善方法は、上記幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬（ドナー競走馬）または競技馬（ドナー競技馬）に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする幹細胞投与方法。
【請求項２】
前記投与工程において、前記注射針で前記競走馬または前記競技馬に前記幹細胞含有液を注入する手段が静脈内注射である請求項１に記載の幹細胞投与方法。
【請求項３】
前記注射針が、内径０．６ｍｍ以上である請求項１または２に記載の幹細胞投与方法。
【請求項４】
前記幹細胞含有液に含有される前記幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項５】
前記幹細胞含有液が、前記注射針に連結された注射用容器に収容されており、
前記投与工程の途中または前記投与工程の終了後に、前記注射用容器に前記競走馬に注入可能な洗浄液を充填し、前記注射用容器の内壁に付着した前記幹細胞を前記洗浄液で洗浄するとともに前記競走馬に注入する洗浄工程を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項６】
前記投与工程を、前記幹細胞含有液が調製されたときから７２時間未満に実施する請求項１から５のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項７】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞を含む請求項１から６のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項８】
前記動物がウマ科の動物である請求項１から７のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項９】
前記ウマ科の動物が競走馬または競技馬である請求項８に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１０】
前記幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と前記幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であるか、または
前記幹細胞を採取される競技馬であるドナー競技馬と前記幹細胞を投与される被投与競技馬とが同一血統または兄弟である請求項９に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、前記競走馬または前記競技馬から採取された脂肪から採取された間葉系幹細胞である請求項９または１０に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする競走馬または競技馬の症状改善方法。
【請求項１３】
前記非正常状態を示す症状が、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である請求項１２に記載の競走馬の症状改善方法、
第１の症状が、屈腱炎の症状である、
第２の症状が、骨折である、
第３の症状が、管骨骨膜炎、
第４の症状が、歩様の非正常化である、
第５の症状が、腰麻痺の症状である、
第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である、
第７の症状が、呼吸器疾患である。
【請求項１４】
前記幹細胞投与方法における投与工程を１回、または複数日に分けて複数回実施することによって、生細胞数を合計１０００万個以上、前記競走馬または前記競技馬に投与する請求項１２または１３に記載の症状改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、競走馬または競技馬に幹細胞を投与するための幹細胞投与方法、および競走馬または競技馬の症状改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、種々の幹細胞を動物に投与する技術が提案されている。
たとえば特許文献１には、ヒト間葉系幹細胞を有効性成分として含んでなるアトピー性皮膚炎治療剤の発明が開示されている。
【０００３】
また特許文献２には、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞を培地で培養し、培養された細胞を回収する工程を含み、所定の特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法の発明が開示されている。同文献の明細書の実施例には、上記羊水由来多分化能幹細胞の、軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞への分化能を確認する試験を実施したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２４２２６５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５４１３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、競走馬は、競走馬特有の怪我や疾病（以下、怪我等ともいう）が生じることが知られている。たとえば屈腱炎は、発症数の高い競走馬特有の疾病である。屈腱炎とは、骨と筋肉を結ぶ腱組織のうち肢を屈曲させる筋肉（屈筋）に続く屈腱に生じた炎症を意味する。屈腱炎の症状が確認された競走馬は、患部を冷され、また休養させられるといった対処がとられることが一般的である。これらの対処法以外の屈腱炎に対する有効な治療方法や予防方法は未だ確立されていない。また、骨折も競走馬にとって重大な怪我の一つである。骨折は、競走馬に特有の怪我とまではいえないものの、騎手を乗せた状態で全力疾走をすることを余技なくされる競走馬は、他の動物よりも骨折の発生が著しく多い。
【０００６】
以上に述べた、屈腱炎および骨折は、競走馬に生じ得る怪我等の例示であり、これらに限らず、競走馬において怪我等の発生を防止し、また発生した怪我等を充分に治療することについて強い要望がある。これに対し、競走馬に幹細胞を投与することにより、上記要望の少なくとも一部を満たすことが期待されるものの、これまで具体的な研究は何らなされていない。
【０００７】
たとえば特許文献２には、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法の発明が開示されており、競走馬などの骨、腱、および筋肉の損傷および欠失疾患の治療に有用であるとの記載があるものの、競走馬に対する具体的な投与方法については何ら検討がなされていなかった。
【０００８】
上述する競走馬に関する特有の課題は、競技馬に関しても同様のことがいえる。
本発明は上記課題に鑑みてなされたものである。即ち、本発明は、幹細胞を競走馬または競技馬に投与する方法、および幹細胞を競走馬または競技馬に投与することによる競走馬の症状改善方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の幹細胞投与方法は、動物から採取された幹細胞または上記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
また本発明の競走馬または競技馬の症状改善方法は、本発明の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬または競技馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の幹細胞投与方法によれば、競走馬または競技馬に幹細胞を投与し、有意に当該幹細胞の投与による効果を競走馬または競技馬に供与することができる。
また本発明の競走馬または競技馬の症状改善方法によれば、競走馬または競技馬の種々の怪我等の症状を改善し、または怪我等の発生を未然に防ぎ、重大な怪我等が発生することを予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】競走馬の第４世代までの血統を示す説明図である。
【図２】実施例１における幹細胞投与前の被投与競走馬１における前足の腱の横断面を映したエコー画像であり、屈腱炎が発症していることを示す。
【図３】実施例１における幹細胞投与後の被投与競走馬１における前足の腱の横断面を映したエコー画像であり、屈腱炎の症状が改善されたことを示す。
【図４】実施例３における幹細胞投与前の被投与競走馬３における管骨のレントゲン写真であり、骨瘤付近に骨折の症状があることを示す。
【図５】実施例３における幹細胞投与後の被投与競走馬３における管骨のレントゲン写真であり、骨折の症状が改善していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。説明には適宜、図面を用いる。以下に述べる本発明の実施形態は、競走馬を例に説明するが、当該説明は競走馬に限定されるものではなく、適宜、競技馬に関する本発明の説明として参照され、また適宜、競走馬を競技馬と読み替えることができる。本発明に関し、本発明の幹細胞投与方法によって幹細胞を投与される競走馬（以下、「被投与競走馬」と称呼する場合がある）は、競走馬用の馬を意味し、競走馬として登録された馬だけでなく、競走馬として登録可能な育成中の馬も含む。
【００１４】
本発明に関し、「競技馬」とは、競技を行うために大会に出場することが可能な馬を指す。競技馬には、血統を有し、血統情報を付して登録されている競技馬、および血統情報を有さずに登録された競技馬を含む。たとえば、オリンピックや国体、国際試合へ参加できる競技馬の年齢は１０歳以上と規定されており、種々の症状を改善し、また健康状態を良好に維持するために、競技馬に本発明を適用することは非常に有効である。
ここで競技とは、乗馬競技、馬術競技、牛追い、ロデオ、ポロ、ホルター等を含み、複数の競技馬が参加して、種々の観点で優劣を競うことを趣旨とする。
【００１５】
＜第一実施形態＞
以下に本発明の第一実施形態として、本発明の幹細胞投与方法について説明する。
本実施形態における幹細胞投与方法は、動物から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬に注入する投与工程を含む。
【００１６】
本実施形態によれば、被投与競走馬に対し、切開して体内に埋設する手技ではなく、注射針を用い注射という簡易な手技で幹細胞を投与することができる。これにより、低侵襲で、幹細胞投与の効果を有効に競走馬に供与することができる。ここで注射とは、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射など、一般的に注射として知られる手技を広く含む。
上記幹細胞投与方法によれば、幹細胞投与の手技による競走馬への負担を回避し得る。そのため、疾病または怪我などの治療や予防といった観点で幹細胞を投与するだけでなく、競走馬の体力や健康を増強するために日常的に幹細胞を競走馬に投与するといったことも可能になる。上記幹細胞投与方法は低侵襲であるため、幹細胞投与を投与した競走馬を、連闘、または中１週もしくは中２週程度の比較的短い間隔でレースに出走させ得る。
以下に本実施形態の幹細胞投与方法の詳細について説明する。
【００１７】
（投与工程）
本実施形態における幹細胞投与方法は、幹細胞含有液を、注射針で競走馬に注入する投与工程を含む。以下に、投与工程の詳細について説明する。
投与工程は、その投与を行う者、投与場所などを特に限定するものではない。投与工程は、切開などの手技を行う必要がなく、注射という簡易な方法で幹細胞を投与するため、たとえば馬房などの衛生的に充分な施設ではない任意の場所でも投与工程を行うことができる。
【００１８】
本実施形態において、幹細胞が採取される動物は、哺乳類全般を含む。以下の説明において、幹細胞を採取される動物を、適宜「ドナー動物」と称呼する場合がある。従来は、自己の幹細胞を投与するという手法が一般的であったが、近年は、一の動物から採取された幹細胞を他の動物に投与する、所謂、固体間投与が可能となっている。そのため、競走馬に対し、当該競走馬自身の幹細胞を投与するのではなく、哺乳類一般をドナー動物とするものである。
【００１９】
たとえば、動物（ドナー動物）の好ましい例として、ウマ科の動物を挙げることができる。被投与競走馬に投与することを前提に調製される幹細胞含有液は、ウマ科の動物から採取された幹細胞を含有することで、被投与競走馬に対する生体適合性または親和性が良好であることが期待される。上述するウマ科の動物としては、たとえばウマ、ロバ、シマウマ、およびノロバなどを挙げることができる。
【００２０】
特に上記ウマ科の動物（ドナー動物）が競走馬であることは、本実施形態において好ましい態様といえる。以下の説明において、ドナー動物である競走馬を適宜「ドナー競走馬」と称呼する場合がある。ドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬に投与することによって、競走馬ではない動物の幹細胞が被投与競走馬に混入することを回避し、被投与競走馬の血統の維持に疑念が生じることを回避する。ドナー競走馬と被投与競走馬とは異なる競走馬であってもよいし、同一の競走馬であってもよい。
【００２１】
本実施形態において、ドナー競走馬は、幹細胞を採取される競走馬を意味し、現役の競走馬だけではなく、デビュー前の競走馬用の馬、および競馬を引退した馬を含む。被投与競走馬の血統の維持という観点からは、用いられる幹細胞は、ドナー競走馬の血統が明らかであるであることが重要であって、当該ドナー競走馬が、現役の競走馬であるか否かは問題ではないためである。
【００２２】
本実施系形態において、幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と、幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であることが好ましい。
【００２３】
従来の競走馬の研究において、競走馬は、血統により引き継がれる性質を有する傾向にあることが知られており、一世代前（即ち、父母）の性質は３割強程度、引き継がれるとされている。競走馬において血統は重要な要素である。したがって被投与競走馬に対し、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を提供することは、被投与競走馬の血統の維持という観点で望ましい影響を与え得る。従来、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬に対し提供することで血統を維持するという技術的思想は何ら報告されておらず、本発明において初めてその有効性の示唆とともに実現可能な提供方法を示す。
【００２４】
被投与競走馬Ｘの血統を表す図１を示す。図１は、被投与競走馬Ｘの１代先祖から４代先祖までの血統を示す図であり、４代血統表である。本実施形態において同一血統とは、ドナー競走馬が被投与競走馬Ｘの先祖であるか、ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとが同一の競走馬である場合をいう。本実施形態では、ドナー競走馬が、被投与競走馬Ｘの第９世代以下の範囲で同一血統であることが好ましく、第５世代以下の範囲で同一血統であることがより好ましい。たとえば、ドナー競走馬が図１における馬名ＡＢである場合には、当該ドナー競走馬は、被投与競走馬Ｘの父の父の父であり、３代先祖であって被投与競走馬Ｘと同一血統である。
本実施形態において競走馬に関し兄弟とは、両親が同じである全兄弟、父または母のいずれか一方が同じである半兄弟を含む。また兄弟は、姉妹、姉弟、兄妹、および双子を含む。
【００２５】
尚、本実施形態において馬名とは、競走馬として競馬に出走するにあたり登録された当該競走馬の正式名称を意味する。競走馬は馬名登録義務があり、たとえば日本では、所定の団体（平成２７年４月現在、公益財団法人ジャパン・スタッドブック・インターナショナル）による馬名審査を通過した名前が正式な馬名として登録される。ドナー競走馬と被競走馬とが同一血統であるか否かを確認可能とするために、投与工程に用いられる幹細胞含有液は、これに含まれる幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名が確認可能であることが好ましい。
【００２６】
幹細胞含有液に関し、ドナー競走馬の馬名を確認可能とするために、たとえば、幹細胞含有液がドナー競走馬の馬名情報が記された容器に収容されるか、または幹細胞含有液を収容する容器に、馬名情報が記された付帯物が添付されていることが好ましい。ここで馬名情報とは、幹細胞含有液を使用する者がドナー競走馬の馬名を知るための情報であって、たとえば、馬名自体、または別途作成された馬名データベースと照合可能な番号などを挙げることができる。
【００２７】
次に、幹細胞含有液に含有される幹細胞について説明する。
本実施形態において用いられる幹細胞は、動物から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞である。
幹細胞は、自己複製能および多分化能（種々の細胞に分化する能力）を有する細胞である。本実施形態に用いられる幹細胞は、動物のいずれの組織から採取されたかは、特に限定されない。たとえば、上記幹細胞は、脂肪由来の幹細胞（脂肪幹細胞）、臍帯、臍帯血または胎盤（以下、臍帯等ともいう）由来の幹細胞（臍帯幹細胞）、骨髄由来の幹細胞（骨髄幹細胞）などを挙げることができるが、これに限定されない。
幹細胞は、その分化能から、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞などが知られる。本実施形態において用いられる幹細胞は、これらのいずれか一種または二種以上を混合して用いてもよい。
【００２８】
たとえば本実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞を含むと良い。間葉系幹細胞は、骨、血管、筋または腱等の生体内の多くの組織の再構築に関与可能であり、競走馬に対し投与することで、種々の効果が期待されるからである。具体的には、間葉系幹細胞の投与により、競走馬の怪我や疾病などの症状の改善、良好な体調の維持、また腱や内臓の強化などの効果が期待される。
【００２９】
間葉系幹細胞は、間葉系組織のある組織に存在し、たとえば、骨髄から採取される間葉系幹細胞である骨髄間葉系幹細胞、脂肪から採取される間葉系幹細胞である脂肪間葉系幹細胞、臍帯等から採取される間葉系幹細胞である臍帯間葉系幹細胞などが存在する。
【００３０】
本実施形態における幹細胞含有液は、間葉系幹細胞を含むことが好ましく、実質的に幹細胞含有液に含まれる幹細胞は間葉系幹細胞であることがより好ましい。
【００３１】
本実施形態におけるより望ましい態様としては、幹細胞は、ドナー競走馬から採取された間葉系幹細胞を含む。
たとえば、本実施形態における幹細胞は、競走馬（ドナー競走馬）から採取された脂肪から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または臍帯等から採取された臍帯等由来の間葉系幹細胞を含むことが好ましい。
競走馬は一般的に脂肪率が数パーセントと非常に低く、他の動物に比べて脂肪を採取することが容易ではない。しかし、本発明者の研究によれば、ドナー競走馬の脂肪から分画された間葉系幹細胞を含む幹細胞は、その後の継代培養において良好な増殖率を示し、また競走馬に投与した際の患部への定着率も高いことが確認された。そのため、被投与競走馬に投与するための幹細胞としてドナー競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞を選択することは、幹細胞の確保および投与の効果の両面から望ましい。
【００３２】
本実施形態における幹細胞の他の好ましい例としては臍帯等から採取された臍帯幹細胞を挙げることができる。骨髄幹細胞または脂肪幹細胞等を採取する場合には、適宜の医療行為が必要となり、ドナー動物に対し、体力的なダメージを与える虞がある。これに対し、臍帯等は、ドナー動物の出産において特段の外科的行為を必要とせずに入手することができる。したがって、ドナー動物に対し幹細胞を採取するために体力的なダメージを与える虞がない。特にドナー競走馬は脂肪率が数％程度と非常に低いことが一般的であるため、ドナー競走馬の臀部などを切開して脂肪を採取した後、切開部の治癒に数週間を要する。
尚、臍帯は母馬と子馬とを繋ぐものであるところ、本実施形態において、臍帯血または臍帯から採取された幹細胞は、母馬側の幹細胞であると定義する。したがって本発明において、臍帯等から採取された幹細胞のドナー競走馬は、当該母馬である。
【００３３】
動物から幹細胞を採取する方法は、特に限定されず、動物における任意の組織から幹細胞のみを採取する方法、または幹細胞以外の任意の他の生体成分とともに幹細胞を採取する方法を含み、公知の採取方法を適宜採用することができる。ここで生体成分とは、細胞、ホルモンまたは血液成分などの上記動物の生体物質または生体物質から構成される物質を意味し、幹細胞以外の任意の他の生体成分とは、幹細胞を除く生体成分を意味する。生体物質とは、生体を構成する生体高分子（多糖、核酸、またはタンパク質など）や、当該生体高分子を構成する各種の糖、脂質、ビタミン、ホルモンなどを意味する。幹細胞含有液には、動物由来の成分として実質的に幹細胞のみを含有していてもよいし、幹細胞と任意の他の生体成分を含んでいてもよい。
【００３４】
幹細胞の継代培養方法は特に限定されず、幹細胞の培養方法として知られる公知の方法から適宜選択して実施することができる。継代培養における培地は、細胞培養に適した培地から適宜選択して用いることができる。たとえば細胞用の培地として一般的に知られる血清培地または無血清培地を用いることもできる。上記培地は、市販品または公知の培地組成に倣って調製されたものであってもよいし、あるいは幹細胞を継代培養するために新たに好適化された培地組成を適宜、調製して作成されたものであってもよい。無血清培地を用いた継代培養により得られた継代幹細胞は、幹細胞のドナーである動物と、被投与動物とが、異なる個体である場合（即ち、個体間投与を行う場合）に好ましい。継代培養は、動物から採取された幹細胞を播種して行ってもよいし、凍結保存し解凍した後の幹細胞を播種してもよい。
【００３５】
動物から採取された幹細胞は、速やかに幹細胞含有液の調製に用いられ被投与競走馬に投与されてもよいし、一度、凍結保存され、使用の前に解凍して幹細胞含有液の調製に用いられてもよい。凍結保存方法は、保存される幹細胞の生存率を良好に維持可能な方法で凍結保存できる方法であればよく特に限定されない。たとえば、幹細胞に対し、細胞の凍結保存剤として公知のジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）、グリセロールなどの凍結保存液のいずれか一種または組み合わせを加えて、凍結保存することができる。
幹細胞の凍結保存における凍結温度は特に限定されないが、たとえば保存期間が比較的短期間である場合には、設定温度が−２０℃前後であるフリーザ、または設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることができる。幹細胞の保存期間が数年以上となることが予想される場合には、設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることが好ましく、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）がより好ましい。凍結保存される幹細胞の形態にもよるが、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）を行う場合には、幹細胞を、まず−８０℃のディープフリーザにて２４時間程度保存して凍結し、次いで液体窒素タンクに移すことが好ましい。凍結保存された幹細胞を解凍する際には、適度な温度が維持されたウォーターバス（たとえば３７℃前後）などを用い、凍結時に幹細胞の多数が死滅しないよう考慮する。
【００３６】
次に幹細胞含有液について  説明する。本実施形態における幹細胞含有液は、上述にて説明する幹細胞を含有し、注射針を通じて被投与競走馬に注入可能な剤である。幹細胞含有液は、たとえば幹細胞、または幹細胞を含有する細胞液に対し、リンゲル液または生理食塩水などの輸液製剤を混合して適度な粘度に調整することによって作成することができる。上記細胞液とは、幹細胞を含有する液状物であればよく、たとえばドナー動物から採取された幹細胞を継代培養して得られた培養液の一部、幹細胞を含有する解凍後の凍結保存液などを挙げることができるが、これらに限定されない。
幹細胞含有液は、注射器から被投与動物に注入可能な程度に粘度が低く調製されていることが好ましい。
【００３７】
本実施形態における幹細胞含有液は、生体由来の物質として実質的に幹細胞のみを含んでいてもよく、また幹細胞に加えて任意の他の生体成分を含んでいてもよい。
上記他の生体成分としては、たとえば、サイトカインを挙げることができる。本実施形態における幹細胞含有液は、幹細胞とともにサイトカインを含有していてもよい。
サイトカインは、細胞から産生される生理活性タンパク質であり、一般的には分子量８万以下、より多くは３万以下の低分子のものが多く知られる。生理活性とは、生体内において、化学物質が特定の生理的な調節機能に対して作用する性質を意味する。被投与動物に対し幹細胞とともにサイトカインが投与されることで、被投与動物の体内における幹細胞の自己複製能または多分化能の発現に対し、当該サイトカインが好適に関与し得る。
上記サイトカインは、幹細胞含有液に含まれる幹細胞から産生されたものであってもよいし、異なる細胞から産生されたものであってもよい。
【００３８】
たとえばサイトカインとしては、ケモカイン、細胞増殖因子、インターロイキン、若しくはインターフェロン、またはこれらの誘導体を例示することができるが、これに限定されない。上記ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインに大別される８ｋＤａから約１４ｋＤａ程度の低分子量のタンパク質である。ケモカインは、ケモカイン受容体を介して作用する。
幹細胞含有液に含まれるサイトカインの好ましい例として、ＣＸＣＬ１２またはその誘導体を挙げることができる。ＣＸＣＬ１２またはその誘導体は、被投与動物の体内において幹細胞の自己複製能または多分化能の発現を良好に促進し得る。
【００３９】
またＣＸＣＬ１２またはその誘導体を含む幹細胞含有液には、ＣＸＣＬ１２の受容体であるＣＸＣＲ４またはその誘導体が含まれることが好ましい。幹細胞と共に投与されたＣＸＣＬ１２を有効に作用させるためである。また、被投与動物に投与された幹細胞は、直接に、または肺、脾臓、肝臓などの臓器を経て順次、炎症などを起こしている患部に到達するホーミング効果があることが知られている。ここでＣＸＣＬ１２とその受容体であるＣＸＣＲ４を幹細胞とともに投与することによって、当該ホーミング効果を向上させ得る。
【００４０】
次に本実施形態における注射針について説明する。本実施形態において用いられる注射針は、被投与競走馬の体表面から体内に向けて刺し、当該注射針の内部に形成された流通路を通じて幹細胞含有液を被投与競走馬に投与可能な部材である。たとえば注射針は、先端が先細りであるとともに横断面が環状に形成され、長手方向の内部に幹細胞含有液が流通可能な流通路が延在する細径の筒状体である。注射針は長手方向の両端が開口し、一方の開口から他方の開口まで幹細胞含有液を流通可能な流通路を有する。
注射針は、投与時に被投与競走馬に刺すタイプ、または予め被投与競走馬の任意の箇所に刺しておく留置針のいずれであってもよい。
また注射針は、注射筒（所謂、シリンジ）と連結可能な部材であってもよいし、点滴用チューブを介して点滴容器に連結可能な部材であってもよい。上記点滴容器には、点滴バック、および点滴ボトルを含む。即ち、本実施形態の投与工程は、注射筒と注射針を有する注射器を用いて実施することもできるし、点滴容器と点滴用チューブと留置針とを有する点滴装置を用いて実施することもできる。
【００４１】
本実施形態において、注射針は、内径０．６ｍｍ以上であることが好ましい。かかる範囲の内径を有する注射針を用いることによって、注射針の内部を通過する幹細胞が注入圧によって損傷することを良好に回避し得る。また注入時に幹細胞を損傷しないという観点では、競走馬に対する幹細胞の注入速度を充分に遅くすることも肝要である。ここで内径０．６ｍｍ以上の注射針を用いることで、単位時間当たりの幹細胞の注入量を増やすことができるため、注入速度を遅くしても、注入にかかる時間を短くすることができ、被投与競走馬に対する負担を軽減することができる。
【００４２】
注射針の太さは、一般的に「ゲージ」で示される。これは注射針の外径が１インチの何分の１であるかを示すものであって、たとえば２３ゲージは１／２３インチである。本実施形態における注射針の外径は特に限定されない。一般的に、外径に応じて内径も定められること、および内径は上述するとおり適度に太いことが好ましいという観点からは、本実施形態における注射針は、２３ゲージ以上であることが好ましく、２０ゲージ以上であることがより好ましく、１９ゲージ以上であることがさらに好ましい。
【００４３】
本実施形態に用いられる注射針は、特定の注射の態様に限定されず、公知の注射という手技に用いられる注射針から適宜選択することができる。換言すると、本実施形態の幹細胞投与方法は、注射針を用い、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など、注射として知られる手段から適宜選択して実施することができる。
【００４４】
たとえば本実施形態における投与工程において、注射針で競走馬（被投与競走馬）に幹細胞含有液を注入する手段は静脈内注射であることが好ましい。
患部（たとえば腱）に直接に注射すると患部を傷つける虞があるため注射を行う手技者の手腕に頼る必要がある。これに対し、静脈内注射であれば、静脈血とともに一旦、幹細胞含有液を心臓に送り、その後に、幹細胞等のホーミング効果により炎症部まで幹細胞を到達させることによって、手技者の手腕に依存することなく、投与工程を望ましく実施することができる。
【００４５】
また静脈内注射により幹細胞含有液を注射した場合、脾臓を含む臓器を幹細胞含有液が循環するため、副次的な効果が期待される。本実施形態の幹細胞投与方法は、競走馬に対し幹細胞含有液を静脈内注射で投与することで、単に競走馬に対し低侵襲であるといった効果を超えた、優れた効果を与え得る。
即ち、競走馬に対し、静脈内注射で幹細胞含有液を投与した場合、幹細胞含有液に含まれる幹細胞は、肺、脾臓、肝臓などの臓器を通過してその何割かが消費され、残余が炎症などを発生した患部に到達し得る。
上記臓器の中で脾臓は、一般的にはリンパ器官として知られるが、運動時などに循環血流に放出するための大量の血液を貯蔵する機能も有している。特に競走馬は、競馬の試合中に大量に消費される血液を脾臓に貯蔵しているため、体重に対する脾臓重量が他の動物（たとえば牛）などよりも大きい傾向にある。競走馬の脾臓に貯蔵された血液は、試合中に大量に放出され消費されるため、試合後の競走馬の脾臓は顕著に疲労しており、また次の試合に向けて、速やかに大量の血液を貯蔵することが求められる。また、試合後の競走馬は、腱や筋肉の炎症を起こし易い。即ち、競走馬は、脾臓の疲労と腱などの炎症が同じタイミングで発生するという他の動物には見られない体調変化が生じる。これに対し、注射用幹細胞含有液を競走馬に注射することによって、これに含まれる幹細胞を脾臓および腱などの炎症部分のいずれにも好適に作用させ得る。
【００４６】
以上に説明する投与工程を実施するタイミングは特に限定されていないが、たとえば投与工程を、幹細胞含有液が調製されたときから７２時間未満に実施することが好ましく、５０時間以内であることがより好ましい。
未凍結の状態で細胞を取り扱う場合には、細胞に適した温度環境（例えば０℃を超えて１０℃以下）を維持することが一般的である。本発明者の検討によれば、調製された幹細胞含有液を実質的に０℃を超えて１０℃以下の温度環境で取り扱った場合でも、当該幹細胞含有液に含有される幹細胞は、経時的に死滅していくことがわかった。幹細胞含有液に含まれる幹細胞の総数に対する、生きた幹細胞の数の比率を生存率としたとき、当該生存率は、概ね、２４時間後では８０％、４８時間後では７０％、７２時間後では、５０％から６０％程度であった。したがって７２時間未満であれば、５０％を超えた生存率である幹細胞含有液を、被投与競走馬に投与できること、および、死滅した幹細胞を多量に被投与競走馬に投与することを防止することができる。また幹細胞含有液が調製されたときから５０時間以内の投与であれば、幹細胞含有液に含有される幹細胞の総数に対し、有意に半数を超える生きた幹細胞を投与することができ好ましい。
【００４７】
（生細胞数確認工程）
本実施形態における幹細胞投与方法は、上述する投与工程に加えて、幹細胞含有液に含有される幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含んでもよい。生細胞数確認工程を実施することによって、被投与競走馬に対し投与される生きた幹細胞の数を把握することができ、幹細胞投与方法の信頼性を向上させることができる。
【００４８】
生細胞数確認工程の実施のタイミングは特に限定されないが、上述する投与工程の実施の前に行うことが好ましい。投与工程の前に、生細胞数確認工程を実施して幹細胞含有液に含まれる幹細胞の生細胞数を確認することによって、当該幹細胞含有液が正常であることを確認でき投与工程の信頼性が向上する。
【００４９】
生細胞数確認工程を実施する方法は、幹細胞含有液に含まれる生細胞数を確認できる方法であればよく、特に限定されない。ここで、生細胞数を確認する、とは、幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数を把握することを意味する。上記生細胞数の確認には、幹細胞含有液を用いて、これに含まれる生細胞数を測定する態様、および幹細胞含有液と同一の組成の他のサンプルを用いて生細胞数を測定し、その測定結果から、幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数を推定する態様を含む。
【００５０】
幹細胞含有液またはこれと同一の組成のサンプルを用いて生きた幹細胞の数を測定する方法は、特に限定されない。一般的には、幹細胞含有液またはこれと同一の組成のサンプルを必要に応じて希釈するとともにトリパンブルーなどの染色液で細胞を染色する。たとえばトリパンブルーで幹細胞を染色すると、死んだ細胞が青く染色されるため、色の違いを確認することで生細胞を確認（測定）することができる。この原理を用いて血球計算盤やマイクロプレートリーダーなどの公知の細胞数測定具を用い、生細胞数を測定することができる。
【００５１】
ここで、幹細胞含有液と同一の組成のサンプルとは、当該幹細胞含有液に含まれる幹細胞の濃度、輸液等が実質的に同一であるサンプルを意味する。たとえば、幹細胞含有液として用いた液の一部を、幹細胞含有液が収容される容器とは異なる容器に収容することによって当該サンプルを得ることができる。当該サンプルを用いて生きた幹細胞を測定し、測定結果より幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数を把握することによれば、幹細胞含有液を汚染する虞なく、当該幹細胞含有液に含まれる生細胞数を把握することができる。
【００５２】
尚、競走馬は、病気などで動物病院に連れてこられるペット動物や、病院または研究室で使用されるマウスなどと異なり、大型の動物であるため、移動させることが容易ではない。幹細胞投与のために、所定期間内に１回または複数回、馬房と幹細胞を調製する施設（以下、調製施設ともいう）とを往復させることによって、競走馬に精神的な疲労を与える虞もある。そのため、競走馬の健康維持や怪我の防止、治療などを日常の居所である馬房または馬房に近い病院などの施設（以下、馬房等ともいう）で行いたいという要望がある。特に、競走馬を、連闘、または中１週もしくは中２週程度の比較的短い間隔でレースに出走させる場合には、馬房等と調製施設との往復を避け、馬房等にて適切な処置を受けさせたいという潜在的な要望があった。当該要望を満たすために、調製施設にて調製された幹細胞含有液を、一般の輸送機関などを利用して馬房等に輸送することが有用である。ただし、輸送時におけるトラブルによって、予定していた輸送時間を超過し、また輸送時の温度管理が不徹底になる等して、幹細胞含有液に含まれる幹細胞が予定した以上に死滅してしまう場合も起こり得る。これに対し、投与工程前に上述する生細胞数確認工程を実施することで、生きた幹細胞を予定していた数だけ投与できるのか否かを、投与前に把握することができ、本実施形態の幹細胞投与方法の信頼性を向上させることができる。
【００５３】
（洗浄工程）
また本実施形態における幹細胞投与方法は、幹細胞含有液が、注射針に連結された注射用容器に収容されている場合に、さらに洗浄工程を有していてもよい。
ここで洗浄工程は、投与工程の途中または投与工程の終了後に、注射用容器に競走馬（被投与競走馬）に注入可能な洗浄液を充填し、注射用容器の内壁に付着した幹細胞を当該洗浄液で洗浄するとともに競走馬（被投与競走馬）に注入する工程である。
【００５４】
幹細胞は、容器壁面に付着する性質があることが知られているところ、洗浄工程を有する本実施形態の投与方法によれば、注射用容器に付着した幹細胞を効率よく被投与競走馬に投与することができ、幹細胞の投与数のロスを減らすことができる。
【００５５】
上記注射用容器としては、注射針に連結可能な容器（たとえば、注射筒）、および、注射針に間接的に連結可能な容器（たとえば点滴容器など）をいずれも含む。
【００５６】
上記洗浄液とは、被投与競走馬に注入可能な溶液であればよく、たとえばリンゲル液や生理食塩水などの輸液を、上記洗浄液として用いることができる。
【００５７】
＜第二実施形態＞
次に、本発明の第二実施形態として本発明の競走馬の症状改善方法（以下、本症状改善方法ともいう）について説明する。
本実施形態の競走馬の症状改善方法は、上述する本発明の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする。本実施形態における幹細胞投与方法は、上述する第一実施形態の説明を適宜参照することができる。尚、本実施形態において症状の改善とは、非正常状態を正常状態にし、または正常状態に近づけることをいう。
【００５８】
本症状改善方法によれば、正常状態とは異なる症状を示す競走馬（即ち、非正常状態である競走馬）に幹細胞を投与することによって、当該症状を改善することが可能である。より具体的には、本症状改善方法によれば、たとえば競走馬の怪我等の症状の改善を行い、または怪我等の発生を予防することが可能である。
本症状改善方法の実施による非正常状態の改善のメカニズムは明らかでないが、注射により競走馬に投与された幹細胞含有液（またはこれに含まれる幹細胞）は、競走馬の炎症部分などの非正常な局部に到達し、当該局部を正常な状態に戻すための有意な作用を発揮するものと推測される。
【００５９】
本実施形態において、非正常状態とは、正常な状態とは異なる症状を有する状態をいう。具体的には、一の競走馬において、疾病、怪我、またはレースもしくはトレーニング後の疲労などのない状態を正常状態とし、当該正常状態では確認されなかった不良な状態を非正常状態という。即ち、非正常状態は、レースやトレーニング後の疲労状態、および疾病等が観察される状態を含む。
【００６０】
非正常状態である疲労状態は、例えば、正常状態と相対的に比較される乳酸値の上昇、体表面において観察される局所的な熱感、または正常状態と異なる歩様の観察などで、確認することができる。このような疲労を残したまま、レースに出走し、またはトレーニングすることによって、怪我等を誘引する虞がある。また、疲労状態にある競走馬において、怪我等の誘引を虞、充分に休養させることによって、レース間隔が長くなり、またトレーニング不足になる虞がある。
これに対し、疲労状態が確認された競走馬に、本症状改善方法を実施することによって、通常よりも早く疲労を回復させ、非正常状態を改善することが可能である。
【００６１】
非正常状態である怪我等は、特に限定されず、競走馬において生じる種々の怪我または疾病を含む。たとえば、怪我等は、屈腱炎等の運動系の疾患、骨折、歩様の非正常化（所謂、コズミまたはスクミといった症状を含む）、管骨骨膜炎（所謂、ソエの症状を含む）、腰麻痺（所謂、腰フラの症状を含む）、蹄疾患（趾間フレグモーネ）、眼科系の疾患、生殖機能疾患、神経系の疾患、皮膚病、毛艶不良、心肺系疾患、循環器系疾患、泌尿器系疾患、消火器系疾患、骨折、喘鳴症などの呼吸器疾患、内分泌免疫疾患、鼻出血などを挙げることができるが、これに限定されない。
【００６２】
尚、歩様の非正常化は、疲労状態にある競走馬、および、怪我等の状態にある競走馬のいずれにも発生し得るが、歩様の非正常化の原因を特定せずとも、本症状改善方法を実施することによって、歩様が正常化され得る。かかる理由は明らかではないが、静脈注射等の注射で幹細胞含有液を投与することで、当該幹細胞含有液（またはこれに含まれる幹細胞）を血流に乗せ種々の臓器を巡らせるとともに、炎症などが生じている局部に到達させ得るためであると推測される。
【００６３】
たとえば本症状改善方法に関し、非正常状態を示す症状は、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である。
即ち、第１の症状が、屈腱炎の症状である。第２の症状が、骨折である。第３の症状が、管骨骨膜炎である。第４の症状が、歩様の非正常化である。第５の症状が、腰麻痺の症状である。第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である。第７の症状が、喘鳴症などの呼吸器疾患である。本症状改善方法を、これらの症状を有する競走馬に対し実施することで、当該症状を良好に改善し得る。
尚、本実施形態において症状とは、競走馬が怪我等を有する場合、または怪我等が発生し易い状態にある場合に認められる正常（健常）な状態からの変化を意味する。
以下に、第１の症状から第６の症状について、詳細に説明する。
【００６４】
上述のとおり第１の症状は、屈腱炎の症状である。
屈腱炎とは、骨と筋肉を結ぶ腱組織のうち肢を屈曲させる筋肉（屈筋）に続く屈腱に生じた炎症である。屈腱炎は、競走馬の前足の管骨（第三中手骨）の後面にある浅屈腱に生じることが多いが、深屈腱に生じた炎症、および後足の浅屈腱または深屈腱に生じた炎症も本発明においていう屈腱炎に含む。屈腱炎の症状は、競走馬の外部観察による腱の付近の腫れ、熱感、触診時に競走馬が痛がるなどの臨床症状の有無で確認することもできるが、軽度な屈腱炎の症状も確認可能とするために超音波で診断することが望ましい。超音波診断は、競走馬の屈腱に超音波診断装置のプローブをあてて、腱の横断面のエコー像を観察することで行う。正常（健常）な屈腱は、白黒のエコー画像において白っぽく観察される。屈腱炎を発症している場合には、屈腱において炎症部が黒く観察されるため、その症状を容易に確認することができる。屈腱炎の損傷度合は、上記エコー画像に映し出される屈腱の横断面積に対する炎症部（即ち、黒く映し出された部分）の面積の比率で算出することができる。
上述する臨床症状の低減、または上記エコー画像における黒く映し出された部分の減少を確認することで、屈腱炎の症状が改善されたことを把握することができる。
【００６５】
屈腱炎の発生した競走馬に対し、本症状改善方法を実施して注射で幹細胞含有液を投与することで、一般的な屈腱炎の治癒速度よりも有意に早く、屈腱炎の症状を改善することができる。
【００６６】
上述のとおり第２の症状は、骨折である。
本実施形態において骨折とは、骨の構造の連続性が絶たれた状態を広く含み、たとえば剪断骨折、圧迫骨折、捻転骨折、屈曲骨折、剥離骨折などを含む。また管骨瘤にみられる骨折を含む。骨折は臨床症状などでも一応の診断をつけ得るが、エコー画像またはレントゲンで観察し診察することが一般的である。骨折した場合に、患部は炎症が生じることが一般的である。
【００６７】
骨折した競走馬に対し、本症状改善方法を実施して注射で幹細胞含有液を投与することで、一般的な骨折の治癒速度よりも有意に早く、骨折の症状を改善することができる。
【００６８】
上述のとおり第３の症状は、管骨骨膜炎である。管骨骨膜炎は、ソエとも呼ばれる。
管骨骨膜炎とは、管骨（第３中手骨）の前面に生じた炎症を指す。一般的には、骨が完全に化骨していない若い競走馬に過度なトレーニングを行わせることで、管骨骨膜炎が生じる。炎症症状があるため、投与された幹細胞含有液またはこれに含まれる幹細胞が、当該炎症症状の生じた局部に到達し、その症状を改善するよう作用し得る。
【００６９】
上述のとおり、第４の症状は、歩様の非正常化である。歩様の非正常化は、多数の原因があると考えられており、所謂、コズミまたはスクミと呼ばれる症状を含む。
コズミとは、筋肉痛、筋肉疲労、または腱もしくは靭帯の痛みなどが原因で起こる競走馬の歩様の変化（非正常化）を意味する。かかる症状のある競走馬に対し、本改善方法を実施することで、当該競走馬のマッサージ等のメンテナンスや休養期間を抑制し得る。
スクミとは、一般的には麻痺性筋色素尿症と呼ばれ、休養明けの激しい運動などの直後に突然歩様が乱れるといった非正常状態を示す。スクミを起こした競走馬の筋肉組織を顕微鏡で観察すると、筋肉組織が溶けている場合がある。これに対し、スクミの症状を有する競走馬に対し本改善方法を実施することによって、幹細胞の作用により筋肉組織の再生を図ることが可能である。
【００７０】
上述する第５の症状は、腰麻痺の症状であり、通常、腰フラとも呼ばれる。
上記腰麻痺とは、腰部の運動麻痺を主たる特徴とする疾病である。全く前兆がなく、突然に沈鬱状態となり、反射が衰えるなどの神経障害を発症し、その後に運動障害を発生する。数日以内に治癒する急性症を除き、慢性症または再発などの場合には、後肢の運動機能不全など重傷化することが多い。腰麻痺の発症した競走馬に対し、注射という簡易な手技で幹細胞含有液を投与し、腰麻痺の症状を改善し得る。
【００７１】
上述する第６の症状は、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である。
第６の症状に関し、観察とは、定量的な観察と定性的な観察とを含む。第６の症状は、既に怪我等が発生している競走馬、および怪我等の発生の虞のある競走馬のいずれにおいても観察される症状である。
即ち、既に屈腱炎または骨折などの怪我等が発生している競走馬は、炎症を起こしている局部の付近が熱を帯びる傾向があるため、競走馬の体表面の観察により容易に非正常状態であることを把握することができる。
また、怪我等が発生していない競走馬であっても、レースやトレーニングなどによる疲労が蓄積している場合には、正常な状態に比べて乳酸値が上昇し、また体表面において局所的に熱感を発する場合がある。このような症状を放置して、短い間隔でレースに出走し、またはトレーニングを行うと怪我等を誘引する虞がある。
【００７２】
したがって、第６の症状を有する競走馬に対し、本症状改善方法を実施して、早い段階で、乳酸値を正常な値に近づけ、または局所的な熱感を解消することで、怪我等の重傷化を防止し、また怪我等を誘引することを防止することができる。
【００７３】
上述する第７の症状は、喘鳴症などの呼吸器疾患である。呼吸器疾患とは、呼吸器に関連する種々の疾患を広く含み、その多くは、競走馬または競技馬の平常時の呼吸の状態、呼吸の音、または鼻孔、側胸、もしくは腹部などの動きの異常として観察可能である。上述する外部観察以外にも内視鏡を使用し患部を観察することでより詳しい症状を確認することができる。本発明において、喘鳴症は、喉から「ゼェゼェ」「ヒューヒュー」「ゴロゴロ」といった異常音を発する症例一般を広く含み、気管支炎などの炎症由来の症状および神経疾患由来の症状を含む。
全力で疾走し、または規定の競技を実施することがを求められる競走馬または競技馬が呼吸器疾患を患うと、著しく競走能力または競技能力が損なわれる虞があり問題である。
【００７４】
第７の症状を有する競走馬または競技馬に対し、本症状改善方法を実施することで、薬剤投与や外科手術を回避し、あるいは適度に抑制した上で、第７の症状を改善することが可能である。
【００７５】
本症状改善方法において実施される幹細胞投与方法で投与される幹細胞の生細胞数は特に限定されない。たとえば、当該幹細胞投与方法における投与工程を１回、または複数日に分けて複数回実施することによって、生細胞数を合計１０００万個以上、競走馬に投与することが好ましく、合計２０００万個以上を投与することがより好ましく、合計５０００万個以上であることがさらに好ましく、合計８０００万個以上であることが特に好ましい。上述する範囲の生きた幹細胞を、上述する第１の症状から第６の症状を含む非正常状態の競走馬に投与することで、有意に、症状を改善することが可能である。
【００７６】
幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数（生細胞数）を確実に確認するためには、第一実施形態において説明した生細胞数測定工程を実施することが好ましい。ただし生細胞数確認工程を実施せずとも、幹細胞含有液を調製する際に、投与を予定する生細胞数を充分に上回る生きた幹細胞を予め含有させておくことで、上述する範囲の生細胞数の合計個数を満たす投与工程を実施することが可能である。
【００７７】
上述する各実施態様は、競走馬を例に説明したが、いずれも競技馬の実施態様として参照することができる。
競走馬および競技馬は、競馬の試合または各種の大会に出場するにあたり厳密なドーピング検査を受ける必要があり、治療等において規制物質を除く限定的な薬剤等の使用が余儀なくされている。これに対し、規制物質として定義されていない幹細胞を用いて競走馬または競技馬の症状の改善を行う本発明は、投与のタイミングを気にせずに競走馬または競技馬の症状を改善し、または体調を良好に維持するために非常に有効である。また幹細胞が、将来的に規制物質として定義された場合であっても、本発明は、幹細胞の投与のタイミングを計ることで充分に競走馬または競技馬の症状改善を図ることが可能である。
【実施例】
【００７８】
以下に、本発明の実施例を示す。
まず、実施例の実施のために、馬から幹細胞を採取し、当該幹細胞を継代培養して継代幹細胞を入手した。上記継代幹細胞を、凍結保存し解凍した後、解凍後の継代幹細胞を用いて幹細胞幹細胞含有液を調製し、当該幹細胞含有液を投与施設に提供した。
【００７９】
（幹細胞の採取）
馬の臀部を切開し脂肪細胞を約５ｇ採取し幹細胞採取用の試料とした。上記試料を、１ｍｍ角程度に裁断した後、コラゲナーゼ溶液を用いて３７℃１時間処理し、次いで、処理後の当該試料を約１０分、４００×ｇの遠心力で遠心分離し、１００μｍのメッシュを備えたセルストレイナーで未消化の脂肪組織片を除去した後、脂肪由来の間葉系幹細胞を含む間質血管画分（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。
【００８０】
（幹細胞の継代培養）
市販の動物細胞用の無血清培地に抗生物質（ゲンタシン）を添加して調製した培地が収容されたフラスコを準備した。上記フラスコに上述で得た分画物を播種し、３７℃／５％ＣＯ２条件下で液体静置培養を行った。２日置きに培地の上澄みを全量収集してフレッシュな培地に交換し、位相差顕微鏡にてフラスコの底面の面積１００％に対し、約８０％以上９０％以下の範囲に細胞が付着したことが確認された段階で培養を終了し、プロテアーゼを含む剥離剤をフラスコに添加してフラスコの内側壁面（特に内側底面）に付着した細胞を回収した。回収された細胞の生細胞数を血球測定盤を用いて測定し、適当な細胞数となるまで上述と同様の方法で継代培養を繰り返した。ジメチルスルホキシドを含有する無血清細胞凍結保存液に上記細胞を混合し、凍結用試料を得た。
【００８１】
（幹細胞の凍結保存）
上述のとおり得た凍結用試料１ｍｌ（幹細胞を約２×１０７個含む）を凍結保存容器に収容し、−８０℃に調整されたディープフリーザにて凍結保存した。
【００８２】
（凍結保存された幹細胞の解凍）
凍結保存工程終了後、凍結保存容器をディープフリーザから取出し、３７℃に調整されたウォーターバスにて凍結用試料を解凍し、幹細胞を含む解凍済試料を得た。
【００８３】
（幹細胞含有液の調製）
上述のとおり解凍されて得た幹細胞（解凍済試料）を、リンゲル液で洗浄した。洗浄後の幹細胞の一部にトリパンブルーを添加して、死滅した幹細胞を染色した上、生細胞数を測定したところ、解凍済試料１ｍｌに、幹細胞が約１．４×１０７個が含まれていることを確認した。次いで、幹細胞を約１．４×１０７個を含む解凍済試料１ｍｌに対し、リンゲル液を１．５ｍｌ添加して混合し、これを幹細胞含有液とした。
【００８４】
上述のとおり調製された幹細胞含有液を、速やかに注射針が連結されていない注射筒に収容し、収容された幹細胞含有液が漏出しないよう、当該注射筒を封止した。
【００８５】
上述のとおり得た幹細胞含有液を収容した注射筒を、ヤマト運輸のクール便（温度管理条件：０℃〜１０℃）で投与施設に対し出荷した。出荷後、約２４時間後に、投与施設に当該注射筒が到着した。投与工程の実施は、幹細胞含有液が調製されたときから約４８時間と設定し、投与までの間、約４℃の温度環境で、幹細胞含有液を収容した注射筒を保管した。
【００８６】
（実施例１）
獣医により屈腱炎の症状が確認された競走馬（馬名：ネオヴィータローザ、３歳、牡）を被投与競走馬１とした。
具体的には、被投与競走馬１は、図２に示すとおり、エコー画像において、腱全体の横断面Ａ１の中心側部分に、黒い画像（低エコー像）として写し出される損傷部Ａ２が存在することが確認された。また屈腱炎が発生している付近の外部観察から、熱感があることが確認された。これによって、被投与競走馬１は、屈腱炎の症状を有していると診断された。また、図２に示すエコー画像から、横断面Ａ１の面積が１．７０ｃｍ２であり、損傷部Ａ２の面積が０．８７ｃｍ２であり、横断面Ａ１の面積に対する損傷部Ａ２の面積の割合から、損傷率は５１％であることが確認された。
【００８７】
屈腱炎と診断された被投与競走馬１の首部に予め、静脈内注射用の留置針を留置した。注射針は、１８ゲージ（内径０．９４μｍ）の寸法のものを用いた。そして、上述のとおり輸送され保管された注射筒を上記注射針に連結し、収容された幹細胞含有液を静脈内注射により被投与競走馬に投与した。尚、投与時の幹細胞含有液に含有される幹細胞の生細胞数は、約１０００万個であることを予め把握した。
同様の投与方法で、数日の間隔を空けて、３回投与した。投与の間隔は表１に示す。
【００８８】
３回目の投与工程を実施した日の８日後に、被投与競走馬１の屈腱炎の症状のあった箇所のエコー画像を撮影した。そのときのエコー画像を図３として示す。図３から明らかなとおり、幹細胞の投与工程を実施する前に確認された損傷部Ａ２（図２参照）が投与後のエコー写真ではほとんど観察されなかった。また投与前に観察された熱感も消失していた。これにより被投与競走馬１の屈腱炎の症状が改善されたことが確認された。
また一般的に、屈腱炎のエコー観察を行った場合、発症から１か月程度で、損傷部を示す低エコー像の面積が小さくなり、３、４か月程度で、当該低エコー像がエコー画像で観察されなくなることが知られる。これに対し、実施例１では、発症が確認された日から３回の幹細胞投与を経て２１日後に損傷部Ａ２がエコー写真においてほとんど消失したことから、屈腱炎の症状の改善における幹細胞の投与の効果が有意に発揮されたことが示された。
【００８９】
（実施例２）
獣医により軽度の屈腱炎の症状が確認された競走馬（馬名：ネオヴァンキッシュ、５歳、牡）を被投与競走馬２として実施例２を行った。尚、被投与競走馬２は、エコー画像により屈腱炎の損傷率が約５％であると診断された。
具体的には、表２に示す投与回数および投与間隔に変更したこと以外は、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。
【００９０】
被投与競走馬２に対し４回目の投与工程を実施した日から２日後に、被投与競走馬２の屈腱炎の症状のあった箇所のエコー画像を撮影した。その結果、損傷部を示す黒い画像（低エコー像）が消失していた。これにより、被投与競走馬２の屈腱炎が、幹細胞含有液の投与により改善されたことが確認された。
【００９１】
（実施例３）
管骨に熱および痛みを伴う骨瘤を有し、レントゲン写真において当該骨瘤付近に骨折線が観察された競走馬（馬名：ネオヴァルカス、２歳、牡）を被投与競走馬３として実施例３を行った。被投与競走馬３の管骨の骨瘤付近における骨折の状態を示すレントゲン写真を図４に示す。獣医の診断により、図４において、管骨の中間部に骨瘤（モヤモヤ影の部分）が映し出されており、この骨瘤付近に骨折線が確認された。かかる被投与競走馬３に対し、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、１回の投与量を２倍（２０００万個）にしたこと以外は、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。
【００９２】
被投与競走馬３に対し投与工程を実施した日から１１日後に、被投与競走馬３の骨折の確認された箇所を含む管骨のレントゲンを撮影した。このレントゲン写真を図５に示す。その結果、獣医の診断により、投与前に存在していた骨折線が消失していることが観察され、骨折症状の改善が確認された。また、幹細胞を投与した翌日に被投与競走馬３の患部を観察したところ、骨瘤が残っているものの、熱および痛みが改善されたことが観察された。
実施例３では、一度の幹細胞投与により短期間で、管骨の骨瘤における熱、痛み、および骨折の症状が改善され、幹細胞投与の効果がこれらの症状の改善に有意に作用したことが確認された。
尚、図４および図５は、レントゲン写真を白黒反転させたものである。
【００９３】
（実施例４）
喘鳴音が確認された競走馬（馬名：ネオヴァシュラン、３歳、牝）を被投与競走馬４として実施例４を行った。１回目の投与工程（６月３日）の２日前（６月１日）に、被投与競走馬４に対し咽頭部の内視鏡検査を行った。内視鏡検査により撮影された動画を確認したところ、上部気道にある正面視にて左右一対の披裂軟骨の動作が左右同調せず、一方側の披裂軟骨の完全な外転が維持されておらず、非正常状態であることが観察された。上記内視鏡検査から、被投与競走馬４の喘鳴音は、披裂軟骨の動作不良（喉頭片麻痺）によるものであり、かかる喘鳴音が神経疾患に由来するものであると診断された。
そこで、被投与競走馬４に対し、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、１回の投与量を５倍（５０００万個）にし、投与回数と投与間隔を表１に示す内容に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。尚、被投与競走馬４は、２回の投与工程期間を含む約１か月間、休養、運動制限、および他の治療を受けることなく通常通りの調教（トレーニング）を受けた。
【００９４】
被投与競走馬４に対し、２回目の投与工程（６月９日）を実施した日から約３週間後（７月１日）に、再度、咽頭部の内視鏡検査を行った。上記内視鏡検査により撮影された動画を確認したところ、投与前に動作不良が確認された披裂軟骨の動作が改善され、また被投与競走馬４の喘鳴音が小さくなったことが確認された。これにより、被投与競走馬４は、喘鳴症が改善したという診断を受けた。
実施例４の結果から、本発明が喘鳴症に対しても効果を発揮し得ることが確認された。本発明によれば、特に神経疾患由来の喘鳴症に対し、外科的手術を受けることなく症状を改善し得ることが確認された。
ところで馬において、咽頭部の各器官を動かす神経は、脳を出発して心臓に連続する大動脈を経由し咽頭部に至るため、その長さは２．５ｍ以上の長さであると言われている。そのような末端神経の疾患に対し症状の改善が確認された実施例４から、本発明が喘鳴症を超えて、他の神経疾患の改善にも良好に作用すること示唆された。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
上記実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
（１）動物から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする幹細胞投与方法。
（２）前記投与工程において、前記注射針で前記競走馬または前記競技馬に前記幹細胞含有液を注入する手段が静脈内注射である上記（１）に記載の幹細胞投与方法。
（３）前記注射針が、内径０．６ｍｍ以上である上記（１）または（２）に記載の幹細胞投与方法。
（４）前記幹細胞含有液に含有される前記幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含む上記（１）から（３）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（５）前記幹細胞含有液が、前記注射針に連結された注射用容器に収容されており、
前記投与工程の途中または前記投与工程の終了後に、前記注射用容器に前記競走馬に注入可能な洗浄液を充填し、前記注射用容器の内壁に付着した前記幹細胞を前記洗浄液で洗浄するとともに前記競走馬に注入する洗浄工程を含む上記（１）から（４）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（６）前記投与工程を、前記幹細胞含有液が調製されたときから７２時間未満に実施する上記（１）から（５）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（７）前記幹細胞が、間葉系幹細胞を含む上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（８）前記動物がウマ科の動物である上記（１）から（７）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（９）前記ウマ科の動物が競走馬または競技馬である上記（８）に記載の幹細胞投与方法。
（１０）前記幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と前記幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であるか、または前記幹細胞を採取される競技馬であるドナー競技馬と前記幹細胞を投与される被投与競技馬とが同一血統または兄弟である上記（９）に記載の幹細胞投与方法。
（１１）前記幹細胞が、前記競走馬または前記競技馬から採取された脂肪から採取された間葉系幹細胞である上記（９）または（１０）に記載の幹細胞投与方法。
（１２）上記（１）から（１１）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする競走馬または競技馬の症状改善方法。
（１３）前記非正常状態を示す症状が、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である上記（１２）に記載の競走馬の症状改善方法、
第１の症状が、屈腱炎の症状である、
第２の症状が、骨折である、
第３の症状が、管骨骨膜炎、
第４の症状が、歩様の非正常化である、
第５の症状が、腰麻痺の症状である、
第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である、
第７の症状が、呼吸器疾患である。
（１４）前記幹細胞投与方法における投与工程を１回、または複数日に分けて複数回実施することによって、生細胞数を合計１０００万個以上、前記競走馬または前記競技馬に投与する上記（１２）または（１３）に記載の症状改善方法。
【符号の説明】
【００９７】
被投与競走馬・・・Ｘ
横断面・・・Ａ１
損傷部・・・Ａ２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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