(57)【要約】      （修正有）【課題】抗プリオン蛋白質抗体および抗体断片、並びにウイルス感染症の治療または予防薬およびそのスクリーニング方法の提供。【解決手段】プリオン蛋白質に結合し、特定のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、モノクローナル抗体又は抗体断片。ウイルス感染症の治療又は予防のための、プリオン蛋白質調節物質を含む医薬組成物、及び、ウイルス感染症の治療又は予防のための薬剤をスクリーニングする方法であって、プリオン蛋白質調節物質の候補物質の効果を調べることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオン蛋白質に結合し、配列番号９のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、モノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項２】
ＣＤＲ１として配列番号１の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
ＣＤＲ１として配列番号１の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項４記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
配列番号７のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
配列番号７のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１記載の抗体または抗体断片。
【請求項８】
重鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含み、軽鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項９記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、モノクローナル抗体または抗体断片。
【請求項１２】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１１記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片を発現可能なポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
【請求項１５】
ウイルス感染症の治療または予防のための、プリオン蛋白質調節物質を含む医薬組成物。
【請求項１６】
プリオン蛋白質調節物質が、抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片である、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
抗プリオン蛋白質抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片が、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ウイルス感染症の治療または予防のための薬剤をスクリーニングする方法であって、プリオン蛋白質調節物質の候補物質の効果を調べることを含む方法。
【請求項２２】
ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症である、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗プリオン蛋白質抗体および抗体断片に関する。本発明はまた、ウイルス感染症の治療または予防薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病は、脳、特に神経細胞に多く発現する正常プリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）が、正常プリオン蛋白質とアミノ酸配列は同じだが立体構造が異なる異常プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）に変化し、蓄積することで生じる。プリオン蛋白質に対する抗体は、プリオン病に対する治療効果を有する可能性が示唆されている（特許文献１）。しかしながら、正常プリオン蛋白質の機能や異常プリオン蛋白質の産生メカニズムは現在も解明されておらず、抗プリオン蛋白質抗体の生体に対する作用も明らかでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９４８４６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、抗プリオン蛋白質抗体および抗体断片を提供することを目的とする。本発明はまた、ウイルス感染症の治療または予防薬およびそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、プリオン蛋白質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、抗プリオン蛋白質抗体がウイルス感染症に対して治療および予防効果を有することを明らかにすることにより、プリオン蛋白質がウイルス感染症の治療および予防の標的となることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下を提供する。
１．プリオン蛋白質に結合し、配列番号９のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、モノクローナル抗体または抗体断片。
２．ＣＤＲ１として配列番号１の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列と９５％以上の配列同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１記載の抗体または抗体断片。
３．ＣＤＲ１として配列番号１の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１記載の抗体または抗体断片。
４．ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１〜３のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
５．ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記４記載の抗体または抗体断片。
６．配列番号７のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１記載の抗体または抗体断片。
７．配列番号７のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１記載の抗体または抗体断片。
８．重鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含み、軽鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む、前記６または７に記載の抗体または抗体断片。
９．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記６〜８のいずれかに記載の抗体または抗体断片。
１０．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記９記載の抗体または抗体断片。
１１．ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および
ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、モノクローナル抗体または抗体断片。
１２．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、前記１１記載の抗体または抗体断片。
１３．前記１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１４．前記１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片を発現可能なポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
１５．ウイルス感染症の治療または予防のための、プリオン蛋白質調節物質を含む医薬組成物。
１６．プリオン蛋白質調節物質が、抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片である、前記１５記載の医薬組成物。
１７．抗プリオン蛋白質抗体が、モノクローナル抗体である、前記１６記載の医薬組成物。
１８．抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片が、前記１〜１２のいずれかに記載の抗体または抗体断片である、前記１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
１９．ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症である、前記１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
２０．ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症である、前記１９記載の医薬組成物。
２１．ウイルス感染症の治療または予防のための薬剤をスクリーニングする方法であって、プリオン蛋白質調節物質の候補物質の効果を調べることを含む方法。
２２．ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症である、前記２１記載の方法。
２３．ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症である、前記２２記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、新規な抗プリオン蛋白質抗体および抗体断片、並びにウイルス感染症の治療または予防薬およびそのスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、プリオン蛋白質が肺組織で発現していることを示す。
【図２】図２は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスがインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］に高い感受性を有することを示す。
【図３】図３は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスがインフルエンザウイルスA型［strain A/WSN/33(H1N1)］に高い感受性を有することを示す。
【図４】図４は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスがインフルエンザウイルスA型［strain A/Aichi/2/68 (H3N2)］に高い感受性を有することを示す。
【図５】図５は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスにおいてインフルエンザ肺炎が重症化していることを示す。
【図６】図６は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスではIL-6の肺内産生量が高いことを示す。
【図７】図７は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスではIFN-γの肺内産生量が高いことを示す。
【図８】図８は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスではTNF-αの肺内産生量が高いことを示す。
【図９】図９は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスでは肺内でのウイルス産生が高いことを示す。
【図１０】図１０は、抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体がインフルエンザウイルス感染に対する予防効果を有することを示す。
【図１１】図１１は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］の感染に対して予防効果を有することを示す。
【図１２】図１２は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスA型［strain A/Aichi/2/68 (H3N2)］の感染に対して予防効果を有することを示す。
【図１３】図１３は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がウイルス産生を抑制することを示す。
【図１４】図１４は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］の感染による炎症性サイトカインの肺内産生を抑制することを示す。
【図１５】図１５は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体のインフルエンザウイルス感染防御に抗体とプリオン蛋白質との結合が必須であることを示す。
【図１６】図１６は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がインフルエンザの治療に有効であることを示す。
【図１７】図１７は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスが日本脳炎ウイルス (JEV, JaOArS982株 )に高い感受性を有することを示す。
【図１８】図１８は、抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体が日本脳炎ウイルス (JEV, JaOArS982株 )の感染を予防する傾向があることを示す。
【図１９】図１９は、マウスプリオン蛋白質のアミノ酸配列を示す。38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体のエピトープは41-45番目のアミノ酸（QGSPG）（配列番号９）である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．抗体および抗体断片
本明明細書における「抗体」には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。抗体の種は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト由来の抗体が挙げられる。モノクローナル抗体には、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【０００９】
本明明細書における「抗体断片」は、目的の抗原に結合する抗体の断片を意味する。抗体断片としては、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（VHおよびVL）、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、Fd、disulphide-linked FV (sdFv) 、Single-Chain FV (scFV) およびこれらの重合体が挙げられる(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd)。
【００１０】
本発明における抗体および抗体断片のイムノグロブリンクラスは、特に限定はされない。好ましくは、抗体および抗体断片のイムノグロブリンクラスは、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）である。
【００１１】
本明細書における「抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片」とは、プリオン蛋白質に結合する抗体または抗体断片を意味する。プリオン蛋白質の種は特に限定されず、ヒト、マウス、ウシ、ヒツジ等のプリオン蛋白質が挙げられる。
【００１２】
抗プリオン蛋白質抗体は、プリオン蛋白質のアミノ酸配列の一部からなるペプチドを免疫原として用いることにより、一般的な方法により取得することができる。ペプチドの長さは特に限定されないが、５−３０アミノ酸、好ましくは５−２０アミノ酸、より好ましくは８−１５アミノ酸である。かかるペプチドは、プリオン蛋白質をコードする遺伝子の配列またはプリオン蛋白質のアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。好ましい態様において、抗プリオン蛋白質抗体は、プリオン蛋白質のアミノ酸配列の一部からなり、かつ配列番号９のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として用いて作製された抗体である。
【００１３】
ポリクローナル抗体は、「Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989」などに記載の一般的な方法により作製することができる。具体的には、プリオン蛋白質のアミノ酸配列の一部からなるペプチドにより、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の哺乳動物を免役することで、作製することができる。
【００１４】
モノクローナル抗体は、抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法や、遺伝子工学的手法を用いて抗体遺伝子を含む発現ベクターを作製して細胞で発現させる方法など、公知の方法により取得することができる。
【００１５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、Kohler et al., Nature 256:495, 1975に記載の方法に準じて作製することができる。まず、免疫原を、抗原性を高めるための適当な物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミン等）、および必要に応じて免疫賦活剤（フロイントの完全若しくは不完全アジュバント等）とともに混合し、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。免疫動物は、３〜１０日間隔で複数回免疫される。免疫原であるペプチドは、一般に１〜１００μｇが投与される。次いで、複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞（免疫動物において抗体産生能を有する細胞）を回収し、自己抗体産生能のないミエローマ細胞（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞）とを、細胞融合させる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法、電気融合法などが用いられる。さらに、融合細胞が有する選択マーカーに基づき細胞融合に成功した細胞を選択し、選択された細胞が産生する抗体の免疫源に対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などにより確認することにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマをインビトロで培養した培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等のインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
【００１６】
モノクローナル抗体は、また、得られたハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングし、後述するように、適当な発現ベクターに組み込んで宿主細胞で発現させることにより、得ることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、 P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的とする抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することもできる。
【００１７】
得られたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製することができる。
【００１８】
キメラ抗体は、互いに由来の異なる可変領域（Ｖ領域とも記載する）と定常領域（Ｃ領域とも記載する）を連結した抗体である。好ましくは、キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の可変領域と、ヒト抗体由来の定常領域から構成される。キメラ抗体は、例えば、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドとヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドを連結し、これを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることによって、取得することができる。
【００１９】
抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（framework region）（ＦＲとも記載する）にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity determining region）（ＣＤＲとも記載する）で構成される。ＣＤＲは、実質的に抗体の結合特異性を決定する領域であり、そのアミノ酸配列は多様性に富む。一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも高い相同性を示す。そのため、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を他の抗体に移植することができる。
【００２０】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲと、ヒト抗体由来のＦＲおよびヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲをヒト抗体に移植することにより得ることができる。ヒト化抗体を得る方法としては、Overlap Extension PCRが例示される。具体的には、ヒト以外の動物由来の抗体（例えばマウス抗体）のＣＤＲとヒト抗体のＦＲとの末端にオーバーラップする部分を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲとヒト抗体のＦＲとが連結されたポリヌクレオチドを合成する。次いで、得られたポリヌクレオチドをヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結し、発現ベクターに組み込んで、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることにより、ヒト化抗体を取得することができる（欧州特許出願公開第２３９４００号明細書；国際公開第９６／０２５７６号）。
【００２１】
ヒト抗体は、例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原で感作し、次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞融合させることによって取得することができる（特公平1-59878号公報）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。また、ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することによっても取得することができる（国際公開第９３／１２２２７号、国際公開第９２／０３９１８号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９４／２５５８５号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている（国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９３／０６２１３号、国際公開第９３／１１２３６号、国際公開第９３／１９１７２号、国際公開第９５／０１４３８号、国際公開第９５／１５３８８号）。例えば、ヒト抗体のＶ領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択し、選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。次いで、このＶ領域配列をヒト抗体Ｃ領域の配列とインフレームで連結し、適当な発現ベクターに挿入して、この発現ベクターを宿主に導入して発現させることにより、ヒト抗体を取得することができる。
【００２２】
抗体断片は、例えば、パパイン、ペプシン等のプロテアーゼにより抗体を消化することにより得ることができる。あるいは、抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し発現させることで得ることができる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００２３】
前述のように、抗体および抗体断片は、これらをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入して発現させることにより、得ることができる。具体的には、抗体または抗体断片をコードする配列がエンハンサーやプロモーターなどの発現制御領域のもとで発現するよう発現ベクターを構築し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、抗体または抗体断片を発現させる。
【００２４】
宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの真核細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、CHO、COS、NIH3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞）、または昆虫細胞（例えば、Sf9、Sf21、Tn5）が挙げられる。真菌細胞としては、酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））などが挙げられる。また、大腸菌（E. coli）（例えば、JM109、DH5α、HB101等）、枯草菌などの原核細胞を宿主細胞として用いることもできる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法により行うことができる。
【００２５】
すなわち、本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本発明の抗体または抗体断片を発現可能なポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を提供する。
【００２６】
抗体および抗体断片がプリオン蛋白質に結合するか否かは、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などにより確認することができる。
【００２７】
ある態様において、本発明の抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片は、プリオン蛋白質に結合し、アミノ酸配列QGSPG（配列番号９）をエピトープとして認識する、モノクローナル抗体または抗体断片である。この配列は、ほとんど全ての哺乳動物（例えば、ヒト、ゴリラ、チンパンジー、マウス、ハムスター、ラット、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ）のプリオン蛋白質に存在する。かかるモノクローナル抗体または抗体断片は、プリオン蛋白質のアミノ酸配列の一部からなり、かつ配列番号９のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として用いることにより、得ることができる。抗体または抗体断片が配列番号９のアミノ酸配列をエピトープとして認識するか否かは、例えば、その抗体または抗体断片が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗プリオン蛋白質抗体と、配列番号９のアミノ酸配列への結合において競合するか否かを、ＦＡＣＳまたは交叉ブロッキングアッセイなどで調べることにより、確認することができる。
【００２８】
ある態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、
ＣＤＲ１として配列番号１の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列、
を含む軽鎖可変領域、
を含む。
【００２９】
「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上である。
【００３０】
ある態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、
ＣＤＲ１として配列番号１の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号２の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号３の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む重鎖可変領域、および／または
ＣＤＲ１として配列番号４の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
ＣＤＲ２として配列番号５の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、および
ＣＤＲ３として配列番号６の配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加された配列、
を含む軽鎖可変領域、
を含む。
【００３１】
アミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの公知の方法により行うことができる。このように、ＣＤＲの配列を改変し、抗原に対する親和性が維持または改善された抗体を得る手法は、当業界にて周知である。
【００３２】
ある好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および／または、ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、を含む。さらに好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および、ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、を含む。
【００３３】
ある態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および／または、配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、を含む。ある態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または、配列番号８のアミノ酸配列において０〜２個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。これらの態様には、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のＣＤＲに改変が生じていない抗体、具体的には、重鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む抗体；軽鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む抗体；および重鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含み、軽鎖可変領域がＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む抗体が含まれる。
【００３４】
ある好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
本発明はまた、ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、および、ＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域、を含む、モノクローナル抗体または抗体断片を提供する。本発明はさらに、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または抗体断片を提供する。
【００３６】
２．ウイルス感染症の治療または予防のための医薬組成物
本発明の医薬組成物は、プリオン蛋白質調節物質を含み、ウイルス感染症の治療または予防に用いられる。実施例において、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスはウイスル感染に対する感受性が高いこと、また、抗プリオン蛋白質抗体はウイスル感染に対して治療および予防効果を有することが示された。これらの結果は、プリオン蛋白質がウイルス感染症の治療および予防の標的となることを示す。プリオン蛋白質はウイルス感染に対する防御因子として機能することが示唆されることから、プリオン蛋白質調節物質は、プリオン蛋白質を活性化することにより治療または予防効果を発揮すると考えられる。
【００３７】
プリオン蛋白質調節物質には、低分子化合物、タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体および抗体断片が含まれる。好ましい態様において、プリオン蛋白質調節物質は、抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片である。
【００３８】
ウイルス感染症としては、インフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症が例示される。本発明の医薬組成物は、インフルエンザウイルス感染症に特に好適に用いられる。
【００３９】
ウイルス感染症の「治療」には、その症状の改善および寛解、並びに進行の遅延および抑制が含まれる。ウイルス感染症の「予防」には、感染および発症の抑制および遅延、並びに症状の軽減が含まれる。
【００４０】
ある態様において、本発明の医薬組成物は、プリオン蛋白質に結合し、アミノ酸配列QGSPG（配列番号９）をエピトープとして認識する、モノクローナル抗体または抗体断片を含む。好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、ＣＤＲ１として配列番号１、ＣＤＲ２として配列番号２、およびＣＤＲ３として配列番号３の配列を含む重鎖可変領域、およびＣＤＲ１として配列番号４、ＣＤＲ２として配列番号５、およびＣＤＲ３として配列番号６の配列を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または抗体断片、または、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体または抗体断片、を含む。
【００４１】
本発明の医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、本発明の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、または皮下投与により投与することができるが、静脈内投与によることが好ましい。本発明の医薬組成物の投与量もまた、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日当たり、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを投与することができるが、これに限定されない。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、常法により製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、プリオン蛋白質調節物質に加えて、滅菌水、生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤などを含むことができる。
【００４３】
本発明はまた、プリオン蛋白質調節物質、好ましくは抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片を対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防方法、および、ウイルス感染症の治療または予防のための医薬の製造における、プリオン蛋白質調節物質、好ましくは抗プリオン蛋白質抗体または抗体断片の使用、を提供する。
【００４４】
３．ウイルス感染症の治療または予防のための薬剤のスクリーニング方法
プリオン蛋白質がウイルス感染症の治療および予防の標的となることから、プリオン蛋白質調節物質の候補物質の効果を調べることにより、ウイルス感染症の治療または予防のための薬剤をスクリーニングすることができる。
【００４５】
プリオン蛋白質調節物質の候補物質は、例えば、プリオン蛋白質に結合性を有する物質である。候補物質は、低分子化合物、タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体または抗体断片でありうる。プリオン蛋白質に対する結合性に基づき選択された候補物質を、実施例に記載のようにウイルス感染症のモデル動物に投与し、ウイルス感染症に対する効果を調べることにより、ウイルス感染症の治療または予防のための薬剤をスクリーニングすることができる。ウイルス感染症は、例えばインフルエンザウイルス感染症または日本脳炎ウイルス感染症であり、好ましくは、インフルエンザウイルス感染症である。
【００４６】
本発明をさらに下記の実施例で説明するが、これら実施例は如何なる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
抗体の作製
１．ポリクローナル抗体の作製
（１）大腸菌発現ベクターの作製
マウスプリオン蛋白質 (GenBank accession No. M13685)（配列番号１０）のアミノ酸23−231に相当するDNA断片を、gcggatccaaaaagcggccaaagcctggag（配列番号１１）（下線部はBamH Iサイト）とccaagcttctatcagctggatcttctcccgtcgta（配列番号１２）（下線部はHind IIIサイト）のプライマーを用いてPCRを行い増幅した。このDNA断片の塩基配列を確認した後、BamH IとHind IIIで処理し、pQE30発現ベクター (Qiagen)に挿入した。pQE30発現ベクターは、挿入した遺伝子の5'に6×Hisタグのための塩基配列を有している。従って、このベクターから産生されるマウスプリオン蛋白質は、N末側で6×Hisタグに標識される。
【００４８】
（２）マウスレコンビナントプリオン蛋白質の精製
作製した発現ベクターを大腸菌E. coli (M15)に導入し、1 mM イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)を含むLB培地で培養し、プリオン蛋白質を発現させた。遠心分離により大腸菌を回収した後、デオキシリボヌクレアーゼ Iを含むCelLytic B Bacterial Cell Lysis/Extraction Reagent (Sigma-Aldrich Co.)に懸濁し、大腸菌を溶解した。溶解液を25,000×gで10分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物は0.2 mg/ml リゾチームを含むCelLytic B Bacterial Cell Lysis/Extraction Reagentに溶解し、時折混和しながら室温で15分間処理した。その後、9倍量のCelLytic B Bacterial Cell Lysis/Extraction Reagentを加え、25,000×gで10分間遠心した。沈殿物を10分の1に希釈したCelLytic B Bacterial Cell Lysis/Extraction Reagentで3回洗浄し、溶液(8 M 尿素, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Na2HPO4, pH 8.0)にて溶解した。溶解液をNi-NTAカラム (Qiagen)に添加し、マニュアルに従い、マウスレコンビナントプリオン蛋白質を精製した。
【００４９】
（３）免疫
精製したマウスレコンビナントプリオン蛋白質をPBSで透析し、100μgをプリオン蛋白質欠損マウスの腹腔内に免疫した。初回の免疫のアジュバントとして完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories)を使用した。さらに2週間おきに、同量のマウスレコンビナントプリオン蛋白質を免疫した。2回目以降の免疫には、アジュバントとして不完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories)を使用した。合計で5回免疫した。
【００５０】
（４）抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体の精製
最後の免疫から１週間後に血液を採取し、室温で凝血させた後、遠心分離により血清を回収した。抗体の精製は、MAbTrap Kit (GE Healthcare)を用いてマニュアル通りに行なった。血清を結合バッファーで希釈し、2,000 rpmで2分間遠心した。上清をMAbTrapカラムに通し、抗体をカラムに吸着させた。その後、結合バッファーでカラムを洗浄し、溶出バッファーで吸着していた抗体を回収した。回収した溶液はすぐに中和バッファーにて中和した。抗体の濃度を測定し、生理食塩水で0.5 mg/mlに調整した。
【００５１】
２．モノクローナル抗体の作製
（１）免疫
精製したマウスレコンビナントプリオン蛋白質をPBSで透析し、50μgをプリオン蛋白質欠損マウスの腹腔内に免疫した。初回免疫のアジュバントとして完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories)を使用した。さらに1週間おきに、同量のマウスレコンビナントプリオン蛋白質を免疫した。2回目以降の免疫には、アジュバントとして不完全フロイントアジュバント (Difco Laboratories)を使用した。合計で6回免疫した。
【００５２】
（２）ハイブリドーマの作製
最終免疫3−4日後に、脾臓を採取し、脾細胞を回収した。回収した脾細胞をミエローマ細胞（P3U1）と、ミエローマ細胞：脾細胞=1〜10:1となるように混和し、1,400 rpmで5分間遠心した。RPMI1640培地 (Sigma)で等量に希釈した50%ポリエチレングリコールをペレットに加え、細胞融合を行った。融合した細胞をRPMI1640培地で洗浄後、15％ FBS、HTサプリメント (Gibco)、およびアミノプテリン溶液 (Sigma)を添加したRPMI1640培地にて懸濁し、96穴プレートに播種し、38−2ハイブリドーマ細胞を得た。
【００５３】
（３）腹水産生
マウスの腹腔にプリスタン (Sigma)を1匹につき500μL投与した。約2週間後に、38−2ハイブリドーマ細胞をPBSで懸濁し、1 ml（約1×106個）の細胞懸濁液を1匹のマウスの腹腔に摂取した。細胞投与後、腹水が産生されるのを待って、腹水を採取した。回収した腹水を3,000 rpmで遠心し、上清だけを回収した。
【００５４】
（４）38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体の精製
38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体の精製は、MAbTrap Kit (GE Healthcare)を用いてマニュアル通りに行なった。腹水を結合バッファーで希釈し、2,000 rpmで2分間遠心した。上清をMAbTrapカラムに通し、抗体をカラムに吸着させた。その後、結合バッファーでカラムを洗浄し、溶出バッファーで吸着していた抗体をはがし、回収した。回収した溶液はすぐに中和バッファーにて中和した。抗体の濃度を測定し、生理食塩水で0.5 mg/mlに調整した。
【００５５】
３．ＣＤＲの決定
（１）38−2ハイブリドーマ細胞からのトータルRNAの抽出
38−2ハイブリドーマ細胞（1.2×107）をPBSで洗浄し、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてトータルRNAを抽出した。Buffer RLT 600μlを添加し、QIAshredderスピンカラム (Qiagen)に添加し、15,000 rpm で2分間遠心し、細胞を破砕した。回収した細胞破砕液に同量の70%エタノールを添加し、ピペッティングにより混和した。混和液の700μlをRNeasyスピンカラム (Qiagen)にアプライし、15,000 rpmで15秒間遠心した。さらに、700μlのBuffer RW1を添加し、15,000 rpmで15秒間遠心し、洗浄を行なった。次に、500μlのBuffer RPEを添加し、15,000 rpmで15秒間遠心し、洗浄を行なった。もう一度、Buffer RPEを添加し同様に遠心し、洗浄を行なった。最後に、RNaseを含まない水40μlを添加し、15,000 rpmで1分間遠心しトータルRNAを回収した。
【００５６】
（２）38−2ハイブリドーマ細胞cDNAライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製は、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)を用いて行なった。約1μg (2.75μl)のトータルRNAに、5'−CDS Primer A 1μlを加え、72℃で3分間反応させ, 42℃で2分間冷やした。1μl SMARTer IIA オリゴ、2μl 5×First−Strand Buffer、1μl DTT、1μl dNTP Mix、0.25μl RNase Inhibitor、1μl SMARTScribe Reverse Transcriptase を加え、42℃で90分間反応させ、70℃10分間で反応を終了させた。
【００５７】
（３）重鎖および軽鎖cDNAの作製
作製した38−2ハイブリドーマcDNAライブラリーをTricine-EDTA Buffer 250μlで希釈し、2.5μlを重鎖および軽鎖cDNAの作製にそれぞれ使用した。2.5μl cDNAライブラリー、5μl 10×Universal Primer A Mix (UPM)、1μl 遺伝子特異的プライマー (重鎖, 5'−tcatttacccggagaccgggagatggtct-3'（配列番号１３）;軽鎖, 5'−gcctccaagaccttagaagggaagatagga-3'（配列番号１４）)、4μl dNTPs、10μl 5×Buffer、27μl 水、0.5μl Phusion Hot Strat DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific Inc.)を加え、PCR (98℃ 1分; 98℃ 10秒, 60℃ 30秒, 72℃ 3分, 35回；72℃ 10分)を行なった。
【００５８】
（４）重鎖および軽鎖CDRの決定
PCRで増幅したそれぞれのcDNAをpCR-Blunt II-TOPO vector (Invitrogen life technologies)にクローニングし、M13リバースプライマーとM13フォワードプライマー用いて塩基配列を決定した。アミノ酸配列を決定した後、Kabat numberingを決定するサイト（http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/）を用いてナンバリングし、Kabat numberingとCDRの対応表が記載されているサイト(http://www.bioinf.org.uk/abs/)を用いてそれぞれのCDRを決定した。
【００５９】
38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を以下に示す。重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（配列番号１〜３）および軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（配列番号４〜６）を下線で示す。
重鎖可変領域（配列番号７）
MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLIQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTFGMSWVKQALGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLEASASTAYLQINNLNNEDTATYFCSRYGSYAMDYWGQGTSVTVSS
ＣＤＲ１（配列番号１）: TFGMS
ＣＤＲ２（配列番号２）: WINTYSGVPTYADDFKG
ＣＤＲ３（配列番号３）: YGSYAMDY
軽鎖可変領域（配列番号８）
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITHDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEFPLTFGAGTKLELKR
ＣＤＲ１（配列番号４）: RSSKSLLYKDGKTYLN
ＣＤＲ２（配列番号５）: LMSTRAS
ＣＤＲ３（配列番号６）: QQLVEFPLT
【００６０】
４．エピトープの決定
38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体のエピトープ決定は、PepSpots法を用いて行なった (参考文献；Masujin et al, PLoS One 8: e58013, 2013)。マウスプリオン蛋白質の全長をカバーする13個のアミノ酸からなる122個のポリペプチド（それぞれのポリペプチドは2個のアミノ酸がオーバーラップしている）をスポットしたニトロセルロース膜に、0.5μgの38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を反応させ、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合抗マウスIgG抗体と化学発光基質を用いてシグナルを検出した。
【００６１】
図１９に示すように、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体は、マウスプリオン蛋白質の41-45番目のアミノ酸配列QGSPG（配列番号９）をエピトープとして認識した。
【００６２】
プリオン蛋白質の発現
脳（図１では、Bと表記）および肺（図１では、Lと表記）におけるプリオン蛋白質の発現をウェスタンブロッティング法により確認した。正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図１ではB6と表記）（以下、B6マウスとも記載する）、プリオン蛋白質を過剰発現するトランスジェニックマウス（図１ではTGと表記）（以下、TGマウスとも記載する）、およびプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図１ではKOと表記）（以下、KOマウスとも記載する）の雄および雌の脳と肺を摘出し、乳剤化した後、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を使用してウェスタンブロッティングを行った（図１）。その結果、B6マウスおよびTGマウスの脳において、プリオン蛋白質の強い発現が認められた。また肺において、発現は低いもののプリオン蛋白質が検出された。ウェスタンブロッティングのコントロールとして、βアクチンに対する抗体を用いた（図１では、Actbと表記）。
【００６３】
プリオン蛋白遺伝子欠損マウスのインフルエンザウイルスに対する感受性
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図２ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図２ではではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させた。図２は各マウスの生存曲線を示す（上段は雄、下段は雌のデータ）。ウイルスを感染させると、７０％くらいのB6マウスが生き残るのに比べて、KOマウスは１０％以下しか生き残らなかった。これらの結果は、KOマウスがインフルエンザウイルスに感受性が高いことを示し、プリオン蛋白質がインフルエンザウイルス感染から個体を防御するのに機能していることを示唆する。
【００６４】
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図３ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図３ではKOと表記）に、3000PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/WSN/33(H1N1)］を経鼻的に感染させた。図３は各マウスの生存曲線を示す（上段は雄、下段は雌のデータ）。ウイルスを感染させると、８０％くらいのB6マウスが生き残るのに比べて、KOマウスは全て死亡した。これらの結果は、KOマウスが別株のインフルエンザウイルスにも感受性が高いことを示している。
【００６５】
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図４ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図４ではKOと表記）に、500PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Aichi/2/68 (H3N2) ］を経鼻的に感染させた。図４は各マウスの生存曲線を示す（上段は雄、下段は雌のデータ）。ウイルスを感染させると、８０−９０％くらいのB6マウスが生き残るのに比べて、KOマウスは０−１０％以下しか生き残らなかった。これらの結果は、KOマウスがさらに別株のインフルエンザウイルスにも感受性が高いことを示している。
【００６６】
以上のように、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスは、３種類の異なる株のインフルエンザウイルスに高感受性であり、高い致死率を示した。これらの結果は、プリオン蛋白質がインフルエンザウイルスに対して防御因子として機能することを示す。
【００６７】
プリオン蛋白遺伝子欠損マウスにおける肺炎および炎症性サイトカインの産生
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図５ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図５ではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させ、感染後0日、3日、5日、および8日に肺を摘出し、ヘマトキシリンエオジン染色を行なった。肺炎の程度を評価するために、全肺切片に対する空気非含有領域の１００分率（％）を算出した（図５）。その結果、B6マウスでは、空気非含有領域が感染後5日から高くなり、感染後8日にはさらに上昇した。一方、KOマウスでは、いずれの時期においても、空気非含有領域がB6マウスと比べて有意に高かった。空気非含有領域の上昇は、肺炎の程度を表している。したがって、KOマウスでは、B6マウスと比べて、インフルエンザ肺炎が増悪していることが確認された。
【００６８】
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図６ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図６ではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させ、感染後0日、3日、5日、および8日に肺を摘出し、肺内のインターロイキン６(IL−6)の産生量をELISA法で測定した（図６）。KOマウスの肺内では、B6マウスと比べて、非常に高いIL−6の産生が確認された。
【００６９】
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図７ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図７ではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させ、感染後0日、3日、5日、および8日に肺を摘出し、肺内のインターフェロンγ(IFN-γ)の産生量をELISA法で測定した（図７）。KOマウスの肺内では、B6マウスと比べて、非常に高いIFN-γの産生が確認された。
【００７０】
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図８ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図８ではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させ、感染後0日、3日、5日、および8日に肺を摘出し、肺内のTumor necrosis factor−α (TNF−α)の産生量をELISA法で測定した（図８）。KOマウスの肺内では、B6マウスと比べて、非常に高いTNF−αの産生が確認された。
【００７１】
以上の結果は、プリオン蛋白遺伝子欠損マウスでは肺炎が重症化し、炎症性サイトカインが非常に高く産生され、いわゆるサイトカインストームが起こっていることを示す。
【００７２】
プリオン蛋白遺伝子欠損マウスの肺内のウイルス産生
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図９ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図９ではKOと表記）に、50PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を経鼻的に感染させ、感染後0日、3日、5日、および8日に肺を摘出し、乳剤化した後、3種類のインフルエンザウイルス由来蛋白質(NP, NS1, M2)に対する抗体でウェスタンブロッティングを行なった（図９）。その結果、B6マウスおよびKOマウスにおいて感染3日からウイルス蛋白質の産生が認められたが、KOマウスではB6マウスより高いウイルス蛋白質の産生が認められた。この結果は、KOマウスの肺内ではウイルス産生が高いことを示す。
【００７３】
抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体によるインフルエンザウイルス感染の予防
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図１０ではB6と表記）に、0.1 mgおよび0.5 mgの抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体（図１０ではSSと表記）を腹腔内に接種し、その翌日に100PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を鼻腔内に感染させた。コントロールとして、PBS（図１０ではSalineと表記）を腹腔内に接種した。図１０は各マウスの生存曲線を示す。PBSを接種されたマウスより、SS抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に多く生存した。また、その生存率は、抗体の投与量に依存していた。この結果は、SS抗プリオン蛋白質ポリクローナル抗体がインフルエンザウイルス感染の予防に機能したことを示す。
【００７４】
抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体によるインフルエンザウイルス感染の予防
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）に38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１１では38−2と表記）またはコントロール抗体(図１１ではIgGと表記）をそれぞれ1 mg、腹腔内に接種し、その翌日にインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］100PFUまたは200PFUを鼻腔内に感染させた。図１１は各マウスの生存曲線を示す（上段は100PFU、下段は200PFUのデータ）。コントロール抗体を接種されたマウスより、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に多く生存した。
【００７５】
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）に38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１２では38−2と表記）またはコントロール抗体(図１２ではIgGと表記）をそれぞれ1 mg、腹腔内に接種し、その翌日にインフルエンザウイルスA型［strain A/Aichi/2/68 (H3N2) ］600PFUを鼻腔内に感染させた。図１２は各マウスの生存曲線を示す。コントロール抗体を接種されたマウスより、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に多く生存した。
【００７６】
以上の結果は、38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体が、２種類の異なるインフルエンザウイルス株の感染を予防したことを示す。
【００７７】
抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体によるインフルエンザウイルスおよび炎症性サイトカインの産生の抑制
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）に抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１３では38−2と表記）またはコントロール抗体(図１３ではIgGと表記）をそれぞれ1 mg、腹腔内に接種し、その翌日にインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］200PFUを鼻腔内に感染させた。その後、経時的に肺を摘出し、乳剤化した後に、3種類のウイルス由来蛋白質(NP, NS1, M2)に対する抗体でウェスタンブロッティングを行なった（図１３）。コントロール抗体を接種されたマウスより、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に低いウイルス蛋白質の産生を示した。これらの結果は、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体が肺内のインフルエンザウイルスの産生を抑制することを示している。
【００７８】
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）に抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１４では38-2と表記）またはコントロール抗体(図１４ではIgGと表記）をそれぞれ1 mg、腹腔内に接種し、その翌日にインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］200PFUを鼻腔内に感染させた。その後、経時的に肺を摘出し、それぞれの炎症性サイトカインの肺内産生量をELISA法で測定した（図１４）。コントロール抗体を接種されたマウスより、38−2抗プリオン蛋白モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に低い炎症性サイトカインの産生量を示した。
【００７９】
以上の結果は、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体により、インフルエンザウイルスの産生が抑制され、炎症性サイトカインの産生が抑制されることを示す。
【００８０】
抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体によるインフルエンザウイルス感染防御における抗体とプリオン蛋白質との結合
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図１５ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図１５ではKOと表記）に、38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１５では38-2と表記）またはコントロール抗体(図１５ではIgGと表記）をそれぞれ1mg、腹腔内に摂取し、その翌日に100PFUのインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］を鼻腔内に感染させた。図１５は各マウスの生存曲線を示す。B6マウスでは、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種することで生存率の改善が認められた。一方、KOマウスでは、38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体の接種による生存率の改善は認められなかった。この結果は、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体のインフルエンザウイルス感染防御には、プリオン蛋白質の発現が必要であること、すなわち、プリオン蛋白質との結合が38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体のインフルエンザウイルス感染防御に必要であることを示す。
【００８１】
抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体によるインフルエンザの治療
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）にインフルエンザウイルスA型［strain A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)］200PFUを鼻腔内に感染させ、感染の3日後および5日後に、1 mgの38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１６では38−2と表記）を腹腔内に接種した。コントロール抗体（図１６ではIgGと表記）は、感染1日前に1 mg、腹腔内に接種した。図１６は各マウスの生存曲線を示す。コントロール抗体を接種されたマウスより、38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が有意に多く生存した。その生存率の改善は、抗体の接種時期が早いほうが高かった。これらの結果は、38-2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体がインフルエンザの治療にも有効であることを示す。
【００８２】
プリオン蛋白遺伝子欠損マウスの日本脳炎ウイルスに対する感受性
正常野生型マウス（C57BL/6マウス、図１７ではB6と表記）とプリオン蛋白遺伝子欠損マウス（図１７ではKOと表記）に、10,000PFUの日本脳炎ウイルス (JEV, JaOArS982株 )を皮下に感染させた。図１７は各マウスの生存曲線を示す。ウイルスを感染させると、約半数のB6マウスが生き残るのに比べて、KOマウスは１０％しか生き残らなかった。これらの結果は、KOマウスが日本脳炎ウイルスに感受性が高いことを示し、プリオン蛋白質が日本脳炎ウイルス感染から個体を防御するのに機能していることを示す。
【００８３】
抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体による日本脳炎ウイルス感染の予防
雄の正常野生型マウス（C57BL/6マウス）に抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体（図１８では38−2と表記）とコントロール抗体(図１８ではIgGと表記）をそれぞれ1 mg、腹腔内に接種し、その翌日に日本脳炎ウイルス (JEV, JaOArS982株 )10,000PFUを皮下に感染させた。図１８は各マウスの生存曲線を示す。コントロール抗体を接種されたマウスより、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体を接種されたマウスの方が、より遅く死亡する傾向が見られた。この結果は、38−2抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体が日本脳炎ウイルスの感染の予防に機能する可能性を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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