(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルの厚さが厚い場合であっても球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルの三次元像を高速に構築する。【解決手段】顕微鏡システム１は顕微鏡装置１０と切断装置３０と処理装置２０を備える。顕微鏡装置１０は、対物レンズ１１０と補正環１１１と補正環制御装置２０５を有し、サンプルＳの画像データを取得する。切断装置３０は対物レンズ１１０の光軸と直交する面に沿ってサンプルＳを切断し複数の領域に区画する。処理装置２０は、補正環制御装置２０５に補正環１１１の設定を対物レンズ１１０の焦点面の深さに応じた設定に変更させる補正制御部と、焦点面の深さに応じた設定が補正環１１１に適用された状態で取得された複数の第１の画像データに基づいて三次元像を構築する画像処理部を有する。複数の第１の画像データは、複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、球面収差を補正する補正装置と、前記補正装置を制御する補正制御装置と、を有する顕微鏡装置であって、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、
前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置と、
前記補正制御装置に前記補正装置の設定を前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定に変更させる補正制御部と、複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する画像処理部と、を有する処理装置であって、前記複数の第１の画像データの各々は前記焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記顕微鏡装置により取得された画像データであり、前記複数の第１の画像データは前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む、処理装置と、を備える
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記切断装置は、前記光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記顕微鏡装置でイメージング済みの領域を除去し、
前記複数の第１の画像データの各々は前記切断装置によって除去される前に前記顕微鏡装置によりイメージングされた画像データである
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記切断装置は、前記光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記顕微鏡装置でイメージング済みの領域を所定の厚さの領域を残して除去し、
前記複数の第１の画像データの各々は前記切断装置によって除去される前に前記顕微鏡装置によりイメージングされた画像データである
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項４】
請求項３に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、さらに、
前記焦点面の深さを変更する深さ変更装置と、
前記深さ変更装置を制御する深さ制御装置と、を備え、
前記処理装置は、さらに、前記切断装置が前記サンプルを切断する度に、前記深さ制御装置に前記焦点面の深さが前記所定の厚さに対応する所定の深さになるように前記深さ変更装置を制御させる深さ制御部を備える
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記処理装置は、さらに、前記焦点面の深さと前記補正装置で補正すべき球面収差量との対応関係を記憶する記憶装置を備え、
前記補正制御部は、前記記憶装置に記憶されている前記対応関係に基づいて、前記補正装置が行うべき設定を表す設定情報を前記補正制御装置に送出し、
前記補正制御装置は、前記補正制御部が送出した前記設定情報に従って、前記補正装置を制御する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項６】
請求項５に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記処理装置は、さらに、前記記憶装置に記憶されている前記対応関係を、前記切断装置が前記サンプルを切断する度に更新する更新部を備える
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項７】
請求項６に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記更新部は、前記切断装置が前記サンプルを切断する度に前記顕微鏡装置で取得された複数の第２の画像データに基づいて、前記記憶装置に記憶されている前記対応関係を更新し、
前記複数の第２の画像データは、前記補正装置の設定が異なる複数の状態で前記サンプルの同一断面をイメージングした複数の画像データである
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項８】
請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、２光子励起顕微鏡装置である
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記補正装置は、前記対物レンズに設けられた電動補正環である
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１０】
請求項３に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記補正装置は、前記対物レンズに設けられた電動補正環であり、
前記深さ制御部は、前記電動補正環の設定が変更される度に、前記深さ制御装置に前記電動補正環の設定変更に起因する前記焦点面の変動を補償するように前記深さ変更装置を制御させる
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１１】
対物レンズを有し、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、
前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置であって、前記顕微鏡装置でイメージング済みの領域を除去する切断装置と、
複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する画像処理部を有する処理装置であって、前記複数の第１の画像データの各々は前記切断装置によって除去される前に前記顕微鏡装置によりイメージングされた画像データであり、前記複数の第１の画像データは前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む、処理装置と、を備える
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記切断装置は、前記光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記顕微鏡装置でイメージング済みの領域を所定の厚さの領域を残して除去する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、さらに、
前記対物レンズの焦点面の深さを変更する深さ変更装置と、
前記深さ変更装置を制御する深さ制御装置と、を備え、
前記処理装置は、さらに、前記切断装置が前記サンプルを切断する度に、前記深さ制御装置に前記焦点面の深さが前記所定の厚さに対応する所定の深さになるように前記深さ変更装置を制御させる深さ制御部を備える
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１４】
対物レンズと、球面収差を補正する補正装置と、前記補正装置を制御する補正制御装置と、を有する顕微鏡装置であって、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、
前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置と、
メモリと前記メモリにつながるプロセッサとを有する処理装置であって、プロセッサが、前記補正制御装置に前記補正装置の設定を前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定に変更させる処理と、複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する処理と、行うように構成される処理装置と、を備え、
前記複数の第１の画像データの各々は、前記焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記顕微鏡装置により取得された画像データであり、
前記複数の第１の画像データは、前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１５】
対物レンズの光軸と直交する面に沿ってサンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画し、
前記対物レンズと球面収差を補正する補正装置とを有する顕微鏡装置で、前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記サンプルをイメージングして、前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の第１の画像データを含む複数の画像データを取得し、
前記複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する
ことを特徴とする三次元像構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、顕微鏡システム、及び、三次元像構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２光子励起顕微鏡法は、低光毒性を有しサンプルの比較的深部まで観察可能であることから、生命科学の研究分野において、非常に有望な顕微鏡法である。しかしながら、２光子励起顕微鏡法によって観察可能な深さには限界があるため、例えばマウスの脳など大きなサンプル全体を観察することは難しい。
【０００３】
特許文献１には、２光子励起顕微鏡法で観察可能な深さの制約を克服する技術として、２光子励起顕微鏡とミクロトームとを備えたシステムが記載されている。特許文献１に記載のシステムは、２光子励起顕微鏡によるイメージングとミクロトームによるサンプルの最上部の除去とを繰り返すことで、サンプル全体をイメージングする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２０８１８４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、ミクロトームでサンプルを切断すると、カット面付近でサンプルが歪んでしまう。このため、切断によって歪んでしまうサンプル中の領域については切断前にイメージングすることが望ましく、従って、次に切断が予定されている面よりも深い領域までイメージングすることが望ましい。しかしながら、イメージングする領域の深さが深くなるほど、サンプルとサンプルに接する媒質（例えば、空気、浸液など）との屈折率差に起因して大きな球面収差が発生し、取得する画像の画質が劣化し得る。
【０００６】
また、ミクロトームによるサンプルの切断には比較的長い時間がかかることが知られている。このため、高速に三次元像を構築するためには、ミクロトームにより除去される切断片の厚さ（以降、カット厚さとも記す）を厚くし、サンプルの切断回数を少なくすることが望ましい。しかしながら、カット厚さを厚くするほど、切断前により深い領域までイメージングすることになるため、画質がさらに劣化し得る。
【０００７】
以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面に係る目的は、サンプルの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルの三次元像を高速に構築することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様に係る顕微鏡システムは、対物レンズと、球面収差を補正する補正装置と、前記補正装置を制御する補正制御装置と、を有する顕微鏡装置であって、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置と、前記補正制御装置に前記補正装置の設定を前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定に変更させる補正制御部と、複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する画像処理部と、を有する処理装置であって、前記複数の第１の画像データの各々は前記焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記顕微鏡装置により取得された画像データであり、前記複数の第１の画像データは前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む、処理装置と、を備える。
【０００９】
本発明の別の態様に係る顕微鏡システムは、対物レンズを有し、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置であって、前記顕微鏡装置でイメージング済みの領域を除去する切断装置と、複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する画像処理部を有する処理装置であって、前記複数の第１の画像データの各々は前記切断装置によって除去される前に前記顕微鏡装置によりイメージングされた画像データであり、前記複数の第１の画像データは前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む、処理装置と、を備える。
【００１０】
本発明の更に別の態様に係る顕微鏡システムは、対物レンズと、球面収差を補正する補正装置と、前記補正装置を制御する補正制御装置と、を有する顕微鏡装置であって、サンプルをイメージングして画像データを取得する顕微鏡装置と、前記対物レンズの光軸と直交する面に沿って前記サンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画する切断装置と、メモリと前記メモリにつながるプロセッサとを有する処理装置であって、プロセッサが、前記補正制御装置に前記補正装置の設定を前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定に変更させる処理と、複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する処理と、行うように構成される処理装置と、を備え、前記複数の第１の画像データの各々は、前記焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記顕微鏡装置により取得された画像データであり、前記複数の第１の画像データは、前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含む。
【００１１】
本発明の一態様に係る三次元像構築方法は、対物レンズの光軸と直交する面に沿ってサンプルを切断し、前記サンプルを複数の領域に区画し、前記対物レンズと球面収差を補正する補正装置とを有する顕微鏡装置で、前記対物レンズの焦点面の深さに応じた設定が前記補正装置に適用された状態で前記サンプルをイメージングして、前記複数の領域のうちの少なくとも２つの領域の第１の画像データを含む複数の画像データを取得し、前記複数の第１の画像データに基づいて前記サンプルの三次元像を構築する。
【発明の効果】
【００１２】
上述の態様によれば、サンプルの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルの三次元像を高速に構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】一実施形態に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図２】図１に例示される処理装置の物理構成の一例を示した図である。
【図３】図１に例示される処理装置の機能構成の一例を示した図である。
【図４】図１に例示される顕微鏡の構成を例示した図である。
【図５】三次元像構築処理のフローチャートである。
【図６】カット厚さと歪み厚さとイメージング深さの関係を示した図である。
【図７】目標値算出処理のフローチャートである。
【図８】目標値算出処理において最初に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。
【図９】目標値算出処理において２回目に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。
【図１０】別の目標値算出処理のフローチャートである。
【図１１】図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。
【図１２】別の三次元像構築処理のフローチャートである。
【図１３】図１に例示される処理装置の機能構成の別の例を示した図である。
【図１４】補正関数処理のフローチャートである。
【図１５】補正関数の算出方法を説明するための図である。
【図１６】別の補正関数処理のフローチャートである。
【図１７】更に別の三次元像構築処理のフローチャートである。
【図１８】図１に例示される処理装置の機能構成の更に別の例を示した図である。
【図１９】更に別の三次元像構築処理のフローチャートである。
【図２０】切断前後に重複して画像データを取得する領域について説明するための図である。
【図２１】補正環１１１の設定に起因する焦点面の変動を抑える方法について説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［第１の実施形態］
図１は、本実施例に係る顕微鏡システム１の構成を例示した図である。図２は、図１に例示される処理装置２０の物理構成の一例を示した図である。図３は、処理装置２０の機能構成の一例を示した図である。図４は、図１に例示される顕微鏡１００の構成を例示した図である。
【００１５】
図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡装置１０、処理装置２０と、切断装置３０と、表示装置４０と、処理装置２０へ指示を入力するための複数の入力装置（キーボード５０、補正環操作装置６０、Ｚ操作装置７０）を備える。
【００１６】
顕微鏡装置１０は、サンプルＳをイメージングして画像データを取得する２光子励起顕微鏡装置であり、対物レンズ１１０と補正環１１１を有する顕微鏡１００と、補正環１１１を制御する補正環制御装置２０５を有する顕微鏡制御装置２００とを備える。顕微鏡１００の詳細な構成については、図４を参照しながら後述する。
【００１７】
顕微鏡制御装置２００は、処理装置２０からの指示に従って顕微鏡１００を制御する装置である。顕微鏡制御装置２００は、顕微鏡１００からの入力信号に基づいて画像データを生成し取得する画像取得部２０１と、顕微鏡１００の各種電動部を制御する制御信号を生成する複数の制御装置（光源制御装置２０２、ズーム制御装置２０３、Ｚ制御装置２０４、補正環制御装置２０５、ＸＹ制御装置２０６）を備える。
【００１８】
光源制御装置２０２は、顕微鏡１００が有するレーザー１０１（図４参照）を制御して、レーザー１０１からの出力を調整する装置である。ズーム制御装置２０３は、顕微鏡１００が有する走査ユニット１０２（図４参照）を制御して、顕微鏡１００のズーム倍率を調整する装置である。
【００１９】
Ｚ制御装置２０４は、顕微鏡１００が有するＺ駆動装置１０９を制御して、対物レンズ１１０の焦点面の深さを変更する装置である。補正環制御装置２０５は、顕微鏡１００が有する補正環１１１を制御して、補正環１１１の設定値を変更する装置である。なお、補正環１１１の設定値とは、例えば、基準位置に対する補正環１１１の回転角度のことである。ＸＹ制御装置２０６は、ＸＹステージ１１６を制御して、対物レンズ１１０の光軸に対してサンプルＳの位置を変更する装置である。
【００２０】
切断装置３０は、対物レンズ１１０の光軸と直交する面に沿ってサンプルＳを切断し、サンプルＳを複数の領域（例えば、図１に示す領域Ｓｒ１から領域Ｓｒ４）に区画する装置であり、例えば、ミクロトームである。切断装置３０は、処理装置２０からの指示に従って、カッター制御装置３４がカッターステージ３１に固定されたカッター３３を超音波振動子３２で振動させることで、サンプルＳを切断する超音波カッター装置である。切断装置３０は、サンプルＳを切断し、顕微鏡装置１０でイメージング済みの領域を除去するように構成される。
【００２１】
処理装置２０は、例えば、標準的なコンピュータであり、図２に示すように、プロセッサ２１、メモリ２２、入出力インターフェース２３、ストレージ２４、及び、可搬記録媒体２６が挿入される可搬記録媒体駆動装置２５を備え、これらがバス２７によって相互に接続されている。なお、図２は、処理装置２０のハードウェア構成の一例であり、処理装置２０はこの構成に限定されるものではない。
【００２２】
プロセッサ２１は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＭＰＵ（Micro Processing Unit）、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理、例えば、後述する三次元像構築処理を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、ストレージ２４または可搬記録媒体２６に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。
【００２３】
入出力インターフェース２３は、処理装置２０以外の装置（例えば、顕微鏡装置１０、切断装置３０、表示装置４０、キーボード５０、補正環操作装置６０、Ｚ操作装置７０など）と信号をやり取りする回路である。ストレージ２４は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２５は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２６を収容するものである。可搬記録媒体２６は、ストレージ２４を補助する役割を有する。
【００２４】
プロセッサ２１は、ストレージ２４または可搬記録媒体２６に記憶されているプログラムをプロセッサ２１につながっているメモリ２２にロードして実行することで、図３に示す構成（画像処理部９１、深さ制御部９２、目標値算出部９３、補正制御部９４）を有する。
【００２５】
画像処理部９１は、顕微鏡装置１０で取得された複数の画像データに基づいてサンプルＳの三次元像を構築する。構築した三次元像は、例えば、表示装置４０により表示される。なお、三次元像構築に用いられる複数の画像データ（以降、複数の第１の画像データと記す）の各々は、対物レンズ１１０焦点面の深さに応じた設定が補正環１１１に適用された状態で顕微鏡装置１０により取得された画像データであり、切断装置３０により除去される前に顕微鏡装置１０でイメージングされた画像データである。また、複数の第１の画像データは、切断装置３０により区画されたサンプルＳの複数の領域（例えば、図１に示す領域Ｓｒ１から領域Ｓｒ４）のうちの少なくとも２つの領域の画像データを含んでいる。
【００２６】
深さ制御部９２は、対物レンズ１１０の焦点面の深さの変更をＺ制御装置２０４に指示する。Ｚ制御装置２０４が深さ制御部９２からの指示に従ってＺ駆動装置１０９を制御することで、対物レンズ１１０の焦点面の深さがＺ駆動装置１０９により変更される。即ち、顕微鏡システム１では、Ｚ駆動装置１０９は、焦点面の深さを変更する深さ変更装置であり、Ｚ制御装置２０４は、深さ制御装置であるＺ駆動装置１０９を制御する深さ制御装置である。
【００２７】
なお、焦点面の深さとは、サンプルＳの表面を基準とした深さであり、表面から焦点面までの光軸方向の距離のことである。また、焦点面の深さの基準となるサンプルＳの表面は、ＸＹステージ１１６に配置されたサンプルＳの上面のことである。切断装置３０によりサンプルＳが切断される度に表面は更新され、最新のカット面がサンプルの新たな表面となる。
【００２８】
目標値算出部９３は、深さ制御部９２がＺ制御装置２０４に焦点面の深さの変更を指示すると、目標値を算出する。目標値とは、球面収差が補正される補正環１１１の設定値のことであり、対物レンズ１１０の焦点面の深さに応じて異なる。
【００２９】
補正制御部９４は、深さ制御部９２がＺ制御装置２０４に焦点面の深さの変更を指示すると、補正環制御装置２０５に補正環１１１の設定を対物レンズ１１０の焦点面の深さに応じた設定に変更させる。具体的には、補正制御部９４は、目標値算出部９３が算出した目標値を含む設定情報を補正環制御装置２０５に送出する。補正制御部９４が送出した設定情報に従って補正環制御装置２０５が補正環１１１を制御することで、補正環１１１に焦点面の深さに応じた目標値が設定され、顕微鏡１００で生じる球面収差が補正される。なお、以降では、焦点面の深さに応じた目標値が補正環１１１に設定された状態を、焦点面の深さに応じた設定が補正装置に適用された状態と記す。
【００３０】
表示装置４０は、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、ＣＲＴディスプレイなどである。なお、表示装置４０は、タッチパネルセンサを備えてもよく、その場合、入力装置としても機能する。
【００３１】
キーボード５０は、処理装置２０に情報を入力する入力装置である。キーボード５０は、利用者による操作に従って、各種情報を処理装置２０に入力する。例えば、利用者の操作に従って、対物レンズ１１０と焦点面の間の媒質の情報（屈折率、光軸方向の厚さ）などが処理装置２０へ入力される。
【００３２】
補正環操作装置６０は、補正環１１１の設定値を指示するための入力装置である。利用者が補正環操作装置６０で補正環１１１の設定値を指示すると、補正環制御装置２０５は、補正環１１１の設定値を指示された値に変更する。なお、補正環操作装置６０の代わりに、キーボード５０を用いて補正環１１１の設定値を指示するようにしてもよい。
【００３３】
Ｚ操作装置７０は、焦点面の深さの変更を指示するための入力装置である。利用者がＺ操作装置７０で焦点面の深さの変更を指示すると、Ｚ制御装置２０４は、Ｚ駆動装置１０９を光軸方向に移動させて焦点面の深さを変更する。
【００３４】
顕微鏡１００は、走査型顕微鏡の一種である２光子励起顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。サンプルＳは、透明化試薬によって透明化されていることが望ましい。
【００３５】
顕微鏡１００は、図４に示すように、照明光路上に、レーザー１０１と、走査ユニット１０２と、瞳投影光学系１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、対物レンズ１１０とを備えている。
【００３６】
レーザー１０１は、例えば、超短パルスレーザーであり、近赤外域のレーザー光を発振する。レーザー１０１の出力は、光源制御装置２０２によって調整される。即ち、光源制御装置２０２は、サンプルに照射するレーザー光のパワーを制御するレーザー制御装置である。
【００３７】
走査ユニット１０２は、例えば、ガルバノスキャナ、レゾナントスキャナなどのスキャナを含み、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査する。走査ユニット１０２の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット１０２の走査範囲は、ズーム制御装置２０３によって調整される。
【００３８】
瞳投影光学系１０３は、走査ユニット１０２を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。ダイクロイックミラー１０５は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離するスプリッタであり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。
【００３９】
対物レンズ１１０は、補正環１１１を備えた乾燥系又は液浸系の対物レンズであり、Ｚ駆動装置１０９に固定されている。Ｚ駆動装置１０９は、対物レンズ１１０を対物レンズ１１０の光軸方向に移動させる装置であり、対物レンズ１１０の焦点面の深さを変更する深さ変更装置である。Ｚ駆動装置１０９の移動量（即ち、対物レンズ１１０の移動）は、Ｚ制御装置２０４によって調整される。即ち、Ｚ制御装置２０４は、深さ変更装置であるＺ駆動装置１０９を制御する深さ変更制御装置である。
【００４０】
補正環１１１は、その設定値に応じた位置に対物レンズ１１０内のレンズを移動させて、球面収差を補正する補正装置であり、補正環制御装置２０５は、補正装置を制御する補正制御装置である。補正環１１１は、対物レンズ１１０に設けられた電動補正環であり、補正環制御装置２０５がステッピングモーター１１２の回転を制御することで補正環１１１の設定が変化する。なお、補正環１１１の設定値は、補正環１１１を手動で直接操作することで、変更することもできる。また、補正環制御装置２０５は、図１に示すベース部材１１５に取り付けられたリミットセンサー１１３によるフラグ部材１１４の検出結果に基づいて、補正環１１１を初期位置に調整する。
【００４１】
顕微鏡１００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー１０５の反射光路）上に、瞳投影光学系１０６と、光検出器１０７とを備えている。光検出器１０７から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０８に出力される。
【００４２】
瞳投影光学系１０６は、対物レンズ１１０の瞳を光検出器１０７に投影する光学系である。光検出器１０７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器１０８は、光検出器１０７からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、処理装置２０に出力する。
【００４３】
以上のように構成された顕微鏡システム１では、顕微鏡１００は、走査ユニット１０２を用いてレーザー光で対物レンズ１１０の光軸と直交する方向にサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器１０７で検出する。そして、処理装置２０の画像取得装置２０１が、光検出器１０７からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット１０２からの信号とに基づいて、サンプルＳの画像データを生成し、取得する。
【００４４】
図５は、三次元像構築処理のフローチャートである。図６は、カット厚さと歪み厚さとイメージング深さの関係を示した図である。図７は、目標値算出処理のフローチャートである。図８は、目標値算出処理において最初に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。図９は、目標値算出処理において２回目に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。以下、図５から図９を参照しながら、顕微鏡システム１で行われる三次元像構築処理の一例について、具体的に説明する。
【００４５】
顕微鏡システム１は、まず、撮影設定を読み込む（ステップＳ１０１）。ここでは、利用者が、例えばキーボード４０を用いて入力した、三次元像を構築するサンプルの領域、イメージング深さＤｉ、媒質情報などを、処理装置２０が読み込む。イメージング深さＤｉは、切断前にイメージングする領域を決定するための、焦点面の深さについての閾値である。媒質情報は、例えば、サンプルＳの屈折率、サンプルＳが屈折率の異なる屈折率を有する複数の層からなる場合には層毎の屈折率と厚さ、対物レンズ１１０が液浸系の対物レンズであれば浸液の屈折率などである。
【００４６】
処理装置２０は、読み込んだ撮影設定から、切断装置３０で除去する切断片の厚さであるカット厚さｔｃと、画像データを取得する深さ方向の間隔と、画像データを取得すべき複数の観察対象面の位置（以降、撮影位置とも記す）を決定する。
【００４７】
深さ方向の間隔は、例えば、顕微鏡１００の焦点深度などに基づいて決定される。撮影位置は、例えば、三次元像を構築するサンプルの領域と深さ方向の間隔とに基づいて決定される。
【００４８】
カット厚さｔｃは、例えば、図６に示すように、利用者が入力したイメージング深さＤｉと、予め顕微鏡システム１に設定されている歪み厚さｔｄに基づいて、下式（１）を満たすように決定される。なお、歪み厚さｔｄは、切断によりカット面Ｃ１近傍に生じる空間的に歪んでしまうサンプルＳ中の領域（以降、歪み領域と記す）Ｓｒｄの厚さをいう。この歪み厚さｔｄは、例えば、予め行われた実験に基づいてサンプルの種類毎に設定される。
Ｄｉ≧ｔｃ＋ｔｄ        （１）
【００４９】
カット厚さｔｃが厚いほど、切断の回数が少なくなり、三次元像構築に要する時間も短くなる。このため、カット厚さｔｃは式（１）を満たしながらできる限り大きな値に決定されることが望ましく、従って、Ｄｉ−ｔｄに近い値に決定することが望ましい。
【００５０】
次に、顕微鏡システム１は、サンプルＳの表面に焦点面を合わせ（ステップＳ１０２）、さらに、焦点面を初期位置へ移動する（ステップＳ１０３）。ここでは、処理装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置２０４がＺ駆動装置１０９を光軸方向に移動させて、焦点面の位置をステップＳ１０１で決定した複数の観察対象面の位置の一つである初期位置に変更する。
【００５１】
焦点面が移動すると、顕微鏡システム１は、焦点面の深さに応じた目標値を算出する（ステップＳ１０４）。ここでは、図７に示す目標値算出処理が行われる。
【００５２】
目標値算出処理では、顕微鏡システム１は、まず、推定される球面収差量に基づいて、補正環１１１の複数の設定値を決定する（ステップＳ２０１）。ここでは、顕微鏡装置１０でサンプルＳの画像データを取得する際の補正環１１１の設定値を処理装置２０が複数個決定する。具体的には、以下の手順により、複数の設定値が決定される。
【００５３】
まず、処理装置２０は、現在の焦点面の位置とステップＳ１０１で取得した媒質情報から、対物レンズ１１０と焦点面との間の媒質の屈折率とその媒質の対物レンズ１１０の光軸方向の厚さを特定し、それらの情報に基づいて顕微鏡装置１０で発生する球面収差量を推定する。処理装置２０では、浸液（対物レンズ１１０が乾燥系の対物レンズであれば、空気）とサンプルＳの屈折率の差が大きいほど、焦点面の深さが深いほど、大きな球面収差量が推定される。そして、球面収差量が推定されると、処理装置２０は、予めストレージ２４に記憶されている、補正環１１１の設定値と補正環１１１が補正する球面収差量である補正量との関係を示す情報（以降、補正環情報と記す）に基づいて、推定された球面収差量に対応する補正環１１１の設定値（以降、推定設定値と記す）を算出する。推定設定値が算出されると、推定設定値を含む探索範囲を決定し、探索範囲を均等に分割する予め決められた数（ここでは１１）の設定値（補正環位置）を、複数の設定値として決定する。なお、図８では、θ０からθ１０までの１０個の設定値（補正環位置）が決定される例が示されている。
【００５４】
次に、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定を変更する（ステップＳ２０２）。ここでは、補正環制御装置２０５が処理装置２０からの指示に従って補正環１１１の設定値をステップＳ２０１で決定した複数の設定値のいずれかに変更する。例えば、補正環制御装置２０５は、補正環１１１の設定値をθ０に変更する。
【００５５】
補正環１１１の設定が変更されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの画像データを取得する（ステップＳ２０３）。ここでは、顕微鏡装置１０が処理装置２０からの指示に従って画像データを取得する。例えば、顕微鏡装置１０は、補正環１１１の設定値がθ０の状態で画像データを取得する。
【００５６】
その後、顕微鏡システム１は、ステップＳ２０１で決定したすべての設定値で画像データを取得したか否かを判定し（ステップＳ２０４）、すべての設定値で画像データを取得していない場合には、ステップＳ２０２からステップＳ２０４の処理を繰り返す。これにより、顕微鏡装置１０は、補正環１１１の設定値が異なる複数の状態で、サンプルＳの同一断面をイメージングした複数の画像データを取得する。なお、以降では、ステップＳ２０３で取得した複数の画像データを、三次元像の構築に用いられる第１の画像データと区別するため、第２の画像データと記す。
【００５７】
すべての設定値で第２の画像データが取得されると、顕微鏡システム１は、ステップＳ２０３で取得した複数の第２の画像データから複数の評価値を算出する（ステップＳ２０５）。ここでは、処理装置２０が、画素間の画素値（輝度値）の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、複数の画像データから、複数のコントラスト値を算出する。なお、一般に、球面収差が補正された画像ほど高いコントラストを有していることから、コントラスト値は、球面収差が補正されているかどうかを評価する評価値として好適である。
【００５８】
画像のコントラストを評価する評価式としては、例えば、ｘ方向にｎ画素分ずれた位置にある２つの画素の画素値の差分の２乗を、画像データ全体で積算してコントラスト値を算出する、下式が知られている。下式は、J.F.Brennerらによって提案された評価式であり、Brenner gradientと呼ばれている。
【数１】
2018063291.tif 000003
【００５９】
ここで、ＦＢｒｅｎｎｅｒはコントラスト値であり、ｘは画像データを構成する画素の列を特定する変数であり、ｙは画像データを構成する画素の行を特定する変数である。Ｗは画像データを構成する画素のｘ方向の画素数（即ち、列数）であり、Ｈは画像データを構成する画素のｙ方向の画素数（即ち、行数）である。ｆは画素値である。ｎはシフト量であり、画素値の差分が算出される画素間の間隔を示す整数（例えば、２など）である。
【００６０】
顕微鏡の分野では、Brenner gradientのシフト量を２に設定するのが通常である。従って、ステップＳ２０５では、例えば、シフト量２のBrenner gradientにより、ステップＳ２０３で取得した複数の第２の画像データの各々のコントラスト値を算出する。
【００６１】
複数の評価値が算出されると、顕微鏡システム１は、所定の条件を満たしているか否かを判定する（ステップＳ２０６）。所定の条件としては、例えば、ステップＳ２０２からステップＳ２０６までの処理の繰り返し回数が所定回数に達しているか否かであってもよく、複数の設定値の平均間隔が所定値以下であるか否かであってもよい。
【００６２】
ステップＳ２０６で所定の条件を満たしていない場合には、顕微鏡システム１は、改めて複数の設定値を決定し（ステップＳ２０７）、その後、ステップＳ２０２からステップＳ２０６の処理を繰り返す。
【００６３】
ステップＳ２０７では、処理装置２０は、以下の２つの条件を満たすように複数の設定値を決定する。第１の条件は、ステップＳ２０７で決定する複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔が、先の複数の設定値の分布範囲及び平均間隔と比較して、狭いことである。第２の条件は、ステップＳ２０７で決定する複数の設定値の分布範囲内に、ステップＳ２０５で算出された最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれることである。なお、本明細書において、評価値に対応する設定値とは、ある画像データから算出された評価値に対するその画像データが取得されたときの補正装置の設定値のことをいうものとする。また、設定値に対応する評価値とは、ある画像データが取得されたときの補正装置の設定値に対するその画像データから算出された評価値のことをいうものとする。
【００６４】
これにより、顕微鏡装置１０は、設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する処理を、複数の状態で設定される補正環１１１の複数の設定値の分布範囲と平均間隔とが繰り返し毎に狭まり、且つ、その分布範囲内に処理装置２０が算出した最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれるように、繰り返す。そして、処理装置２０は、繰り返し毎に、複数の画像データから複数の評価値を算出する。
【００６５】
図９は、ステップＳ２０７で決定した複数の設定値に基づいて取得した複数の第２の画像データのコントラスト値が示されている。図８と図９を比較すると、図９に示す複数の設定値（補正環位置）は、上記２つの条件を満たしていることが確認できる。なお、図８と図９では、いずれも１１個の設定値（補正環位置）が決定されている例が示されているが、設定値の数は、繰り返し毎に設定値の平均間隔が狭くなる限り、同一に限られず、増加しても減少してもよい。
【００６６】
ステップＳ２０６で所定の条件を満たしている場合には、顕微鏡システム１は、ステップＳ２０５で算出した複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて目標値を算出し（ステップＳ２０８）、目標値算出処理を終了する。ここでは、例えば、最後の繰り返しにおいてステップＳ２０５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。また、最後の繰り返しに限らずステップＳ２０５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。
【００６７】
顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、補正環１１１の設定を変更する（ステップＳ１０５）。ここでは、補正環制御装置２０５が補正環１１１の設定値をステップＳ１０４で算出された目標値に変更する。
【００６８】
さらに、顕微鏡システム１は、レーザー１０１の出力を設定する（ステップＳ１０６）。ここでは、光源制御装置２０２が、補正環１１１の設定値が目標値であるときに顕微鏡装置１０で取得された画像データに基づいて、サンプルＳに照射するレーザー光のパワーを制御する。例えば、ステップＳ１０５で補正環１１１の設定値を変更した後に改めて画像データを取得して、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよい。また、ステップＳ１０４で補正環１１１の設定値が目標値であるときの画像データが既に取得されている場合には、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよいし、光検出器１０７の感度（ゲイン）を調整してもよい。
【００６９】
レーザー１０１の出力の設定が完了すると、顕微鏡システム１は、画像データを取得する（ステップＳ１０７）。ここでは、焦点面の深さに応じた設定が補正環１１１に適用された状態で、顕微鏡装置１０が画像データを取得する。なお、以降では、ステップＳ１０７で取得した複数の画像データの各々を、目標値を算出するために用いられる第２の画像データと区別するため、第１の画像データと記す。
【００７０】
その後、顕微鏡システム１は、すべての撮影位置で第１の画像データを取得済みか否か判定する（ステップＳ１０８）。ここでは、処理装置２０が、ステップＳ１０１で決定した複数の撮影位置で第１の画像データを取得済みか否か判定する。
【００７１】
全ての撮影位置で第１の画像データを取得済みでない場合には、顕微鏡システム１は、さらに、焦点面の深さが閾値を超えているか否か判定する（ステップＳ１０９）。ここで、処理装置２０は、閾値としてイメージング深さＤｉを用いる。
【００７２】
焦点面の深さがイメージング深さＤｉを超えていない場合には、顕微鏡システム１は、焦点面をより深い位置である次の撮影位置に移動する（ステップＳ１１０）。ここでは、処理装置２０の指示に従って、Ｚ制御装置２０４がＺ駆動装置１０９を光軸方向に移動させて、焦点面の位置をステップＳ１０１で決定した複数の撮影位置のうちの未だ第１の画像データが取得されていない撮影位置に変更する。その後、顕微鏡システム１は、焦点面の深さが閾値（イメージング深さＤｉ）を超えるまで、ステップＳ１０４からステップＳ１１０の処理を繰り返し実行する。
【００７３】
焦点面の深さがイメージング深さＤｉを超えると、顕微鏡システム１は、サンプルＳを切断する（ステップＳ１１１）。ここでは、処理装置２０が切断装置３０を制御することで、切断装置３０が対物レンズ１１０の光軸と直交する面に沿ってサンプルＳを切断し、ステップＳ１０１で算出したカット厚さｔｃの切断片を除去する。
【００７４】
カット厚さｔｃは上述した式（１）の関係を満たしている。このため、ステップＳ１１１で除去されたカット厚さｔｃの切断片は、切断装置３０によって除去される前に顕微鏡装置１０でイメージング済みの領域である。また、サンプルＳの切断前にイメージング済みの領域は、所定の厚さの領域を残して切断装置３０により除去される。ここで、所定の厚さは、歪み厚さ以上の厚さである。即ち、切断装置３０は、イメージング済みの領域全体を除去するのではなく、イメージング済みの領域全体の一部を除去する。
【００７５】
サンプルＳが切断されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの新たな表面（カット面）に焦点面を合わせ（ステップＳ１１２）、さらに、焦点面を所定の深さ位置へ移動する（ステップＳ１１３）。ここでは、処理装置２０（深さ制御部９２）が、焦点面の深さが上述した所定の厚さに対応する所定の深さになるようにＺ制御装置２０４にＺ駆動装置１０９を制御させる。なお、所定の厚さは、切断後に残ったイメージング済みの領域の厚さである。所定の厚さに対応する所定の深さは、例えば、所定の厚さに、ステップＳ１０１で決定した画像データを取得する深さ方向の間隔を加えることで算出されてもよい。
【００７６】
その後、顕微鏡システム１は、すべての撮影位置で第１の画像データを取得するまで、ステップＳ１０４からステップＳ１１３の処理を繰り返し実行する。そして、すべての撮影位置で第１の画像データを取得すると、顕微鏡システム１は、三次元像を構築し（ステップＳ１１４）、三次元像構築処理を終了する。ここでは、処理装置２０（画像処理部９１）がステップＳ１０７で取得された複数の第１の画像データに基づいてサンプルＳの三次元像を構築し、表示装置４０に表示させる。
【００７７】
以上のように、顕微鏡システム１は、切断装置３０によるサンプルＳの切断と顕微鏡装置１０による画像データの取得とを繰り返す。これにより、サンプルＳの厚さが厚い場合であっても、サンプルＳ全体に亘って画像データを取得することができる。また、焦点面の深さに応じた設定が補正環１１１に適用された状態で画像データを取得することで、球面収差に起因する画質の劣化を抑制することができる。これにより、従来よりも焦点面をより深い位置まで移動させてイメージングすることが可能となるため、時間がかかる切断処理の回数を従来よりも少なくすることができる。従って、顕微鏡システム１によれば、サンプルＳの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルＳの三次元像を高速に構築することができる。
【００７８】
また、顕微鏡システム１では、三次元像構築に用いられる画像データの各々は、切断装置３０によって除去される前にイメージングされた画像データであり、顕微鏡装置１０は、次回の切断によりサンプルＳが歪んでしまうことが想定される領域を切断前にイメージングする。従って、顕微鏡システム１によれば、切断に起因する歪みが三次元像に生じることを回避することができる。
【００７９】
また、顕微鏡システム１は、切断によってサンプルＳが歪んでしまう領域の厚さを予め設定することで、焦点面の深さを制限する。これにより、カット面よりも過度に深い領域のイメージングを回避することができる。従って、顕微鏡システム１によれば、顕微鏡装置１０で発生する球面収差量を抑えることができるため、補正装置で補正しきれないような大きな球面収差が発生する状況を抑制することができる。
【００８０】
さらに、顕微鏡システム１は、既にイメージング済みの領域を重複してイメージングすることないように、切断する度に焦点面の深さを所定の深さに変更する。これにより無駄な画像データの取得を防止することができる。また、顕微鏡システム１は、目標値算出処理において、顕微鏡装置１０で発生する球面収差量を予め推定し、推定された球面収差量に基づいて補正環１１１の設定値が異なる複数の状態を決定する。これにより、補正環１１１の設定値の探索範囲を、図８に示すように、当初からある程度絞り込むことができるため、短時間で高精度に目標値を算出することができる。
【００８１】
図１０は、顕微鏡システム１で行われる別の目標値算出処理のフローチャートである。図１１は、図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。図１０及び図１１を参照しながら、図１０に示す目標値算出処理について説明する。なお、図１０に示す目標値算出処理のステップＳ３０１からステップＳ３０５までの処理は、図７に示す目標値算出処理のステップＳ２０１からステップＳ２０５までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。
【００８２】
顕微鏡システム１は、ステップＳ３０５で複数の評価値が算出されると、評価値と評価値に対応する設定値の複数の組み合わせに基づいて目標値を算出し（ステップＳ３０６）、目標値算出処理を終了する。
【００８３】
ステップＳ３０６では、処理装置２０は、まず、ステップＳ３０３で取得した複数の画像データから３つ以上の画像データを選択する。この３つ以上の画像データは、ステップＳ３０５で算出した複数の評価値のうちの最大値が算出された画像データが含まれるように、選択される。
【００８４】
その後、処理装置２０は、選択した３つ以上の画像データから得られる評価値とその評価値に対応する設定値の組み合わせに基づいて目標値を算出する。具体的には、３つ以上の評価値と設定値に基づいて、補間又は関数近似により関数を算出する。なお、この関数は、評価値と設定値に関する関数である。そして、算出した関数のピーク座標（評価値が最大となる座標）から得られる設定値が目標値として算出される。
【００８５】
図１１には、最大の評価値が算出される画像データとその前後（つまり、設定値が近い）の画像データからなる３つの画像データを選択し、それらの画像データから得られる３つの評価値と設定値の組み合わせからラグランジュ補間により二次関数を算出し、そのピーク座標から目標値を算出した例が示されている。なお、補間には、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。また、関数近似にも、最小二乗法などの任意の近似法が採用され得る。
【００８６】
顕微鏡システム１は、図７に示す目標値算出処理の代わりに、図１０に示す目標値算出処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。また、図１０に示す目標値算出処理を実行した場合には、図７に示す目標値算出処理よりもさらに少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することができる。従って、顕微鏡システム１は、より短時間で三次元像を構築することができる。
【００８７】
［第２の実施形態］
図１２は、別の三次元像構築処理のフローチャートである。図１３は、図１に例示される処理装置の機能構成の別の例を示した図である。図１４は、補正関数処理のフローチャートである。図１５は、補正関数の算出方法を説明するための図である。以下、図１２から図１５を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡システムで行われる三次元像構築処理の一例について、具体的に説明する。
【００８８】
なお、本実施形態に係る顕微鏡システム（以降、単に顕微鏡システムと記す）は、図５に示す三次元像構築処理の代わりに、図１２に示す三次元像構築処理を行う点が、第１の実施形態に係る顕微鏡システム１と異なる。顕微鏡システムの物理構成は、顕微鏡システム１と同様である。
【００８９】
また、本実施形態に係る顕微鏡システムが有する処理装置２０は、図１２に示す三次元像構築処理を行うことで、図１３に示す機能構成を有する。なお、処理装置２０は、図１３に示すように、焦点面の深さと補正環１１１で補正すべき球面収差量との対応関係を示す補正関数を算出する補正関数算出部９５を備える。補正関数算出部９５が算出した補正関数は、記憶装置であるメモリ２２が記憶する。
【００９０】
顕微鏡システムは、まず、撮影設定を読み込み（ステップＳ４０１）、サンプルＳの表面に焦点面を合わせ（ステップＳ４０２）、さらに、焦点面を初期位置へ移動する（ステップＳ４０３）。なお、ステップＳ４０１からステップＳ４０３までの処理は、図５に示すステップＳ１０１からステップＳ１０３までの処理と同様である。
【００９１】
焦点面が移動すると、顕微鏡システムは、補正関数を算出する（ステップＳ４０４）。ここでは、図１４に示す補正関数算出処理が行われる。
【００９２】
補正関数算出処理では、顕微鏡システムは、まず、目標値算出処理を行い、初期位置における目標値を算出する（ステップＳ５０１）。なお、ステップＳ５０１で行われる目標値算出処理は、図７に示す目標値算出処理であってもよく、図１０に示す目標値算出処理であってもよい。
【００９３】
初期位置における目標値が算出されると、顕微鏡システムは、推定関数を算出する（ステップＳ５０２）。ここでは、処理装置２０（補正関数算出部９５）が、ステップＳ４０１で取得した媒質情報とストレージ２４に記憶されている補正環情報から、顕微鏡装置１０で発生する球面収差量を焦点面の深さ毎に推定し、推定関数を算出する。なお、図１５には、サンプルＳが屈折率の異なる２層構造を有する場合の、推定関数Ｆ１が例示されている。
【００９４】
その後、顕微鏡システムは、補正関数を算出し（ステップＳ５０３）、補正関数算出処理を終了する。ここでは、処理装置２０（補正関数算出部９５）が、ステップＳ５０１で算出された目標値と、ステップＳ５０２で算出された推定関数に基づいて、焦点面の深さ毎の目標値を表わす補正関数を算出し、記憶装置であるメモリ２２に記憶させる。図１５には、ステップＳ５０２で算出された補正関数Ｆ１をステップＳ５０１で算出された目標値Ｐ１に基づいて変形することで算出された補正関数Ｆ２が例示されている。
【００９５】
補正関数が算出されると、顕微鏡システムは、補正関数に基づいて目標値を算出し、補正環１１１の設定を変更する（ステップＳ４０５）。ここでは、まず、処理装置２０（補正制御部９４）が、メモリ２２に記憶されている補正関数（焦点面の深さと補正環１１１で補正すべき球面収差量との対応関係）と現在の焦点面の深さに基づいて、現在の焦点面の深さに応じた目標値を算出する。さらに、その目標値を含む設定情報（即ち、補正環１１１が行うべき設定を表す設定情報）を補正環制御装置２０５に送出する。そして、補正環制御装置２０５が、処理装置２０からの設定情報に従って補正環１１１の設定値を現在の焦点面の深さに応じた目標値に変更する。
【００９６】
その後、顕微鏡システムは、レーザー１０１の出力を設定し（ステップＳ４０６）、焦点面の深さに応じた設定が補正環１１１に適用された状態で第１の画像データを取得する（ステップＳ４０７）。さらに、顕微鏡システムは、すべての撮影位置で第１の画像データを取得済みか否か判定し（ステップＳ４０８）、全ての撮影位置で第１の画像データを取得済みでない場合には、焦点面の深さが閾値を超えているか否か判定する（ステップＳ４０９）。焦点面の深さが閾値（イメージング深さＤｉ）を超えていない場合には、顕微鏡システムは、焦点面をより深い位置である次の撮影位置に移動する（ステップＳ４１０）。その後、顕微鏡システムは、焦点面の深さが閾値を超えるまで、ステップＳ４０５からステップＳ４１０の処理を繰り返し実行する。なお、ステップＳ４０７からステップＳ４１０の処理は、図５に示すステップＳ１０５からステップＳ１１０までの処理と同様である。
【００９７】
焦点面の深さが閾値を超えると、顕微鏡システムは、サンプルＳを切断し（ステップＳ４１１）、サンプルＳの新たな表面（カット面）に焦点面を合わせ（ステップＳ４１２）、さらに、焦点面を所定の深さ位置へ移動する（ステップＳ４１３）。その後、顕微鏡システムは、すべての撮影位置で第１の画像データを取得するまで、ステップＳ４０５からステップＳ４１３の処理を繰り返し実行する。そして、すべての撮影位置で第１の画像データを取得すると、顕微鏡システムは、三次元像を構築し（ステップＳ４１４）、三次元像構築処理を終了する。なお、ステップＳ４１１からステップＳ４１４の処理は、図５に示すステップＳ１１１からステップＳ１１４までの処理と同様である。
【００９８】
本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、顕微鏡システム１と同様に、サンプルＳの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルＳの三次元像を高速に構築することができる。さらに、補正関数を用いることで補正関数算出後は画像データを取得することなく目標値を算出することができる。従って、本実施形態に係る顕微鏡システムによれば、顕微鏡システム１よりも高速に三次元像を構築することができる。
【００９９】
図１６は、別の補正関数処理のフローチャートである。本実施形態に係る顕微鏡システムは、図１４に示す補正関数算出処理の代わりに、図１６に示す補正関数算出処理を行ってもよい。
【０１００】
図１６に示す補正関数算出処理では、顕微鏡システムは、焦点面の深さを変更しながら目標値算出処理を所定回数だけ繰り返す（ステップＳ６０１からステップＳ６０３）。顕微鏡システムは、異なる深さにおける所定数の目標値が算出されると、補正関数を算出し（ステップＳ６０４）、補正関数算出処理を終了する。ここでは、処理装置２０（補正関数算出部９５）が、目標値と深さの複数の組み合わせに基づいて補正関数を算出する。補正関数は、任意の補間法又は関数近似によって算出し得る。
【０１０１】
顕微鏡システムは、図１４に示す補正関数算出処理の代わりに、図１６に示す補正関数算出処理を実行した場合であっても、同様の効果を得ることができる。
【０１０２】
［第３の実施形態］
図１７は、更に別の三次元像構築処理のフローチャートである。図１８は、図１に例示される処理装置２０の機能構成の更に別の例を示した図である。以下、図１７及び図１８を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡システムで行われる三次元像構築処理の一例について、具体的に説明する。
【０１０３】
なお、本実施形態に係る顕微鏡システム（以降、単に顕微鏡システムと記す）は、図１２に示す三次元像構築処理の代わりに、図１７に示す三次元像構築処理を行う点が、第２の実施形態に係る顕微鏡システムと異なる。顕微鏡システムの物理構成は、第２の実施形態に係る顕微鏡システムと同様である。
【０１０４】
また、本実施形態に係る顕微鏡システムが有する処理装置２０は、図１７に示す三次元像構築処理を行うことで、図１８に示す機能構成を有する。なお、処理装置２０は、図１８に示すように、焦点面の深さと補正環１１１で補正すべき球面収差量との対応関係を示す補正関数を算出しメモリ２２に記憶させる補正関数算出部９５と、切断装置３０がサンプルＳを切断する度に、メモリ２２に記憶されている補正関数を更新する更新部９６を備える。
【０１０５】
図１７に示す三次元像構築処理は、サンプルＳを切断する度に、複数の第２の画像データを取得して補正関数を算出する補正関数算出処理を行い（ステップＳ７０４）、補正関数を更新する点が、図１２に示す三次元像構築処理とは異なっている。その他の点は同様であり、ステップＳ７０１からステップＳ７１４の処理は、図１２に示す三次元像構築処理のステップＳ４０１からステップＳ４１７に対応する。
【０１０６】
本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、第１の実施形態に係る顕微鏡システム１及び第２の実施形態に係る顕微鏡システムと同様に、サンプルＳの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルＳの三次元像を高速に構築することができる。さらに、補正関数を用いることで目標値算出のために行う画像データ取得回数を少なくすることができる。このため、本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、第２の実施形態に係る顕微鏡システムと同様に、顕微鏡システム１よりも高速に三次元像を構築することができる。さらに、本実施形態に係る顕微鏡システムでは、切断装置３０がサンプルを切断する度にサンプルＳの画像データを取得して補正関数を算出し直すことで、補正関数に基づいて精度の高い目標値を算出することができる。従って、本実施形態に係る顕微鏡システムによれば、第２の実施形態に係る顕微鏡システムよりも高画質な三次元像を構築し得る。
【０１０７】
［第４の実施形態］
図１９は、更に別の三次元像構築処理のフローチャートである。図２０は、切断前後に重複して画像データを取得する領域について説明するための図である。以下、図１９及び図２０を参照しながら、本実施形態に係る顕微鏡システムで行われる三次元像構築処理の一例について、具体的に説明する。
【０１０８】
なお、本実施形態に係る顕微鏡システム（以降、単に顕微鏡システムと記す）は、図５に示す三次元像構築処理の代わりに、図１９に示す三次元像構築処理を行う点が、第１の実施形態に係る顕微鏡システム１と異なる。顕微鏡システムの物理構成は、顕微鏡システム１と同様である。
【０１０９】
図１９に示す三次元像構築処理は、サンプルＳの１回目の切断までの処理は、図５に示す三次元像構築処理と同様である。即ち、ステップＳ８０１からステップＳ８１１までの処理は、図５に示すステップＳ１０１からステップＳ１１１までの処理と同様である。
【０１１０】
顕微鏡システム１は、サンプルＳの１回目の切断が終了すると、サンプル表面に焦点面を合わせる（ステップＳ８１２）。この処理は、図５に示すステップＳ１１２の処理と同様である。その後、顕微鏡システム１は、既に行われた切断の回数を判定する（ステップＳ８１３、ステップＳ８１４）。
【０１１１】
ステップＳ８１３で切断が１回目であると判定されると、ステップＳ８０４に戻って、ステップＳ８０４からステップＳ８１４の処理を繰り返す。つまり、１回目の切断後は、顕微鏡システム１は、サンプル表面（１回目の切断により形成されたカット面Ｃ１）から画像データの取得を開始する。これにより、図２０に示すように、１回目のカット面Ｃ１と２回面のカット面Ｃ２の間に１回目の切断前後に重複して画像データが取得される重複領域が生じる。なお、図２０に示す領域Ｒｉは、各回のカット前にイメージングされる領域を示している。
【０１１２】
ステップＳ８１４で切断が２回目であると判定されると、顕微鏡システム１は、取得済みの画像データに基づいて実際の歪み厚さｔｄ２を算出する（ステップＳ８１６）。ここでは、処理装置２０が、図２０に示す重複領域について１回目の切断前に取得した画像データと１回目の切断後に取得した画像データを比較して、切断により歪んだ領域を特定し、実際の歪み領域の厚さｔｄ２を算出する。なお、画像データを比較して歪んだ領域を特定する方法としては、例えば、パターンマッチングを使用した方法、相関係数を使用した方法など、任意の方法が採用し得る。
【０１１３】
実際の歪み厚さｔｄ２が算出されると、顕微鏡システム１は、切断装置３０が除去する切断片の厚さであるカット厚さを更新する（ステップＳ８１７）。ここでは、処理装置２０は、ステップＳ８０１で決定したイメージング厚さＤｉとステップＳ８１６で算出した実際の歪み厚さｔｄ２とに基づいて、下式（３）を満たすようにカット厚さｔｃ２を決定し、現在設定されているカット厚さｔｃをカット厚さｔｃ２に更新する。
Ｄｉ≧ｔｃ２＋ｔｄ２        （３）
【０１１４】
なお、カット厚さｔｃ２は式（３）を満たすできる限り大きな値に決定されることが望ましく、従って、Ｄｉ−ｔｄ２に近い値に決定することが望ましい。ステップＳ８１７では、カット厚さｔｃ２は、例えば、Ｄｉ−ｔｄ２に決定される。
【０１１５】
予め設定されている歪み厚さｔｄは、歪んでしまう領域を大きめに見積もって算出されることが多いため、実際の歪み厚さｔｄ２よりも大きな値を有するのが通常である。このため、実際の歪み厚さｔｄ２に基づいて算出したカット厚さｔｃ２は、カット厚さｔｃよりも大きくなることが多い。
【０１１６】
カット厚さを更新すると、顕微鏡システム１は、焦点面を所定の深さ位置へ移動し（ステップＳ８１５）、その後、ステップＳ８０４に戻る。ここでは、処理装置２０（深さ制御部９２）が、焦点面の深さが所定の深さになるようにＺ制御装置２０４にＺ駆動装置１０９を制御させる。所定の深さは、例えば、Ｄｉ−ｔｃ２で算出されるイメージング済みの領域の厚さに、ステップＳ８０１で決定した画像データを取得する深さ方向の間隔を加えることで算出されてもよい。
【０１１７】
ステップＳ８１４で切断が３回目以降であると判定された場合には、顕微鏡システム１は、焦点面を所定の深さ位置へ移動し（ステップＳ８１５）、すべての撮影位置で第１の画像データを取得するまで、ステップＳ８０４からステップＳ８１５の処理を繰り返し実行する。そして、すべての撮影位置で第１の画像データを取得すると、顕微鏡システム１は、三次元像を構築し（ステップＳ８１８）、三次元像構築処理を終了する。なお、ステップＳ８１８の処理は、図５のステップ１１４の処理と同様である。
【０１１８】
本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、顕微鏡システム１と同様に、サンプルＳの厚さが厚い場合であっても、球面収差に起因する画質の劣化が抑制されたサンプルＳの三次元像を高速に構築することができる。さらに、２回目の切断以降、実測した歪み厚さｔｄ２に基づいて決定したカット厚さｔｃ２でサンプルを切断する。従って、切断回数をさらに少なくできる可能性が高く、第１の実施形態に係る顕微鏡システム１に比べて、より高速な三次元像構築が可能となる。
【０１１９】
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。顕微鏡システム、及び、三次元像構築方法は、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【０１２０】
顕微鏡装置１０が２光子励起顕微鏡装置である例を示したが、顕微鏡システムを構成する顕微鏡装置は、２光子励起顕微鏡装置に限らず、例えば、対物レンズの光軸と直交する方向からサンプルＳを照明するライトシート顕微鏡装置であってもよい。
【０１２１】
補正環制御装置２０５がＺ駆動装置１０９を制御して焦点面の深さを変化させる構成を例示したが、補正環制御装置２０５は、顕微鏡のステージを光軸方向に移動させることにより焦点面の深さを変化させてもよい。
【０１２２】
補正環１１１の設定に応じて対物レンズ１１０の焦点面が変動することがある。そのような対物レンズ１１０が使用される場合には、図２１に示すように、処理装置２０（深さ制御部９２）は、補正環１１１の設定が変更される度に、Ｚ駆動装置１０９に補正環１１１の設定変更に起因する焦点面の変動を補償するようにＺ駆動装置１０９を制御させてもよい。
【０１２３】
焦点の深さに応じて変化する球面収差を補正する補正装置として補正環１１１を例示したが、補正装置は、光路上で生じる球面収差の量を変化させることができるものであればよい。補正装置は、例えば、ＬＣＯＳ（Liquid crystal on silicon、商標）、ＤＦＭ（Deformable Mirror）、液体レンズなどを用いたＡＯ（Adaptive Optics）デバイスであってもよい。また、発生する球面収差量が大きく単一の補正装置では十分に球面収差を補正しきれない場合には、補正する球面収差量を複数の補正装置で分担し、顕微鏡装置１０で生じる球面収差を補正してもよい。
【符号の説明】
【０１２４】
１・・・顕微鏡システム、１０・・・顕微鏡装置、２０・・・処理装置、２１・・・プロセッサ、２２・・・メモリ、２３・・・入出力インターフェース、２４・・・ストレージ、２５・・・可搬記録媒体駆動装置、２６・・・可搬記録媒体、２７・・・バス、３０・・・切断装置、３１・・・カッターステージ、３２・・・超音波振動子、３３・・・カッター、３４・・・カッター制御装置、４０・・・表示装置、５０・・・キーボード、６０・・・補正環操作装置、７０・・・Ｚ操作装置、９１・・・画像処理部、９２・・・深さ制御部、９３・・・目標値算出部、９４・・・補正制御部、９５・・・補正関数算出部、９６・・・更新部、１００・・・顕微鏡、１０１・・・レーザー、１０２・・・走査ユニット、１０３・・・瞳投影光学系、１０４・・・ミラー、１０５・・・ダイクロイックミラー、１０６・・・瞳投影光学系、１０７・・・光検出器、１０８・・・Ａ／Ｄ変換器、１０９・・・Ｚ駆動装置、１１０・・・対物レンズ、１１１・・・補正環、１１２・・・ステッピングモーター、１１３・・・リミットセンサー、１１４・・・フラグ部材、１１５・・・ベース部材、１１６・・・ＸＹステージ、２００・・・顕微鏡制御装置、２０１・・・画像取得装置、２０２・・・光源制御装置、２０３・・・ズーム制御装置、２０４・・・Ｚ制御装置、２０５・・・補正環制御装置、２０６・・・ＸＹ制御装置、Ｓ・・・サンプル、Ｃ１・・・カット面、Ｃ２・・・カット面、Ｓrd・・・歪み領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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