(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ＡＧＥに対して高い感度を有し、かつ簡便に使用できることが可能なＡＧＥの分離方法、および該分離方法を利用した分析方法、濃縮方法、および製造方法を提供することである。【解決手段】本発明により、終末糖化産物（ＡＧＥ）を抗原とする抗原結合性ポリペプチド配列；およびグルカン認識ドメイン配列またはキチン認識ドメイン配列から選択される多糖認識ドメイン配列を含むポリペプチドを用いてＡＧＥを分離する工程を含む、ＡＧＥの濃縮方法が提供される。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
終末糖化産物（ＡＧＥ）を抗原とする抗原結合性ポリペプチド配列；および
グルカン認識ドメイン配列またはキチン認識ドメイン配列から選択される多糖認識ドメイン配列
を含むポリペプチドを用いてＡＧＥを分離する工程を含む、ＡＧＥの濃縮方法。
【請求項２】
前記多糖認識ドメイン配列が、グルカン認識タンパク質（ＧＲＰ）のグルカン認識ドメイン配列である、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが多糖から構成される担体に固定化されている、請求項１または２に記載の濃縮方法。
【請求項４】
担体が固体カードランである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項５】
前記抗原結合性ポリペプチドが一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項６】
ｓｃＦｖが、配列番号４〜６から選択される配列を有するｓｃＦｖか、これらの1つと交差競合するｓｃＦｖである、請求項５に記載の濃縮方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドにおいて、Ｎ末端より抗原結合性ポリペプチド配列、多糖認識ドメイン配列の順番である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドの配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を用いて、前記ポリペプチドを調製する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項９】
ＡＧＥが、Ｎε−カルボキシメチルリシン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、アルグピリミジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン、グルコスパンから選択されるアミノ酸、または当該アミノ酸のいずれかを配列に含むタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項１０】
ＡＧＥが、Ｎε−カルボキシメチルリシン、およびＧＡ−ピリジンから選択されるアミノ酸、または当該アミノ酸のいずれかを配列に含むタンパク質である、請求項９に記載の濃縮方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）の濃縮方法、分離方法、分析方法、および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（ＡＧＥ）は、生体内でアミノ酸、主にリシンのアミノ基が還元糖によって非酵素的に修飾された後、酸化・脱水・縮合等の複雑な反応を経て生成する物質の総称である。加齢や高血糖状態で生成するＡＧＥは糖尿病合併症や動脈硬化等の生活習慣病と関連しており、診断、予防において有用なバイオマーカーとして期待されている。病態の時に、ＡＧＥ、およびＡＧＥを含むタンパク質（「ＡＧＥ修飾タンパク質」ともいう）の具体的な種類と病態との関連性について解明することが求められており、その手段として質量分析法があげられる。
【０００３】
質量分析により生体試料に含まれるＡＧＥの分析を行う場合には、抗ＡＧＥ抗体を用いた免疫沈降により試料を前処理することが行われている。しかしながら、既存のＡＧＥ抗体を用いる分析では特異性および汎用性の点で、網羅的解析に用いるには問題がある。抗体を用いた免疫沈降では、一般的に、プロテインＧビーズやプロテインＡビーズが用いられるが、血清中の低発現量のタンパク質を免疫沈降により解析するためには、予め大量に存在するＩｇＧ抗体やアルブミンを除去する操作を行う必要がある。また、この操作を行っても血清中に含まれる様々な抗体を除去することは困難であり、免疫沈降の際にプロテインＧビーズやプロテインＡビーズは血清由来の抗体も結合するので、モノクローン性を保証することはできない。
【０００４】
さらに、ＡＧＥを含むタンパク質を処理する場合に、既存の抗ＡＧＥ抗体ではＡＧＥ構造体だけでなく、その周辺のペプチド配列も認識するため、検出できるタンパク質が限られている。また、既存の抗ＡＧＥモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞を用いて生産されており、純化が不十分である場合には、目的外の抗体が混入するといった問題が生じる。そのため、そのようなモノクローナル抗体を用いた場合には、目的とする分子だけではなく、目的以外の分子も一緒に観測されることになる。
【０００５】
ＡＧＥの検出方法として、ＡＧＥ受容体またはそのホモログを利用する方法（特許文献１）、ガレクチンまたはその炭化水素認識領域を利用する方法（特許文献２）、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥを認識するＤＮＡアプタマーを利用する方法（特許文献３）が報告されている。
【０００６】
また、ＧＲＰ配列と固体カードランを用いたアフィニティーシステムについての報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５４３９７号公報
【特許文献２】特開２０１２−２２５７６２号公報
【特許文献３】特開２０１４−９０６６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Protein Eng Des Sel. 2012, 25:405-413.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＡＧＥに対して高い感度を有し、かつ簡便に使用できることが可能なＡＧＥの分離方法、および該分離方法を利用した分析方法、濃縮方法、および製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、既知の多糖認識ドメイン配列、例えば、グルカン認識タンパク質（ＧＲＰ）のグルカン認識ドメイン配列またはキチン認識ドメイン配列の配列と多糖から構成される担体（例えば、固体カードラン、キチンビーズ）の安価なアフィニティーシステムを利用し、さらにＡＧＥに特異的なｓｃＦｖを用いることにより、生体試料中のＡＧＥまたはＡＧＥ修飾タンパク質を分離・濃縮できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明により、以下の方法が提供される。
［１］終末糖化産物（ＡＧＥ）を抗原とする抗原結合性ポリペプチド配列；および
グルカン認識ドメイン配列またはキチン認識ドメイン配列から選択される多糖認識ドメイン配列
を含むポリペプチドを用いてＡＧＥを分離する工程を含む、ＡＧＥの濃縮方法。
［２］前記多糖認識ドメイン配列が、グルカン認識タンパク質（ＧＲＰ）のグルカン認識ドメイン配列である、［１］に記載の濃縮方法。
［３］前記ポリペプチドが多糖から構成される担体に固定化されている、［１］または［２］に記載の濃縮方法。
［４］担体が固体カードランである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の濃縮方法。
［５］前記抗原結合性ポリペプチドが一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、［１］〜［４］のいずれかに記載の濃縮方法。
［６］ｓｃＦｖが、配列番号４〜６から選択される配列を有するｓｃＦｖか、これらの1つと交差競合するｓｃＦｖである、［５］に記載の濃縮方法。
［７］前記ポリペプチドにおいて、Ｎ末端より抗原結合性ポリペプチド配列、多糖認識ドメイン配列の順番である、［１］〜［６］のいずれかに記載の濃縮方法。
［８］前記ポリペプチドの配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を用いて、前記ポリペプチドを調製する工程をさらに含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の濃縮方法。
［９］ＡＧＥが、Ｎε−カルボキシメチルリシン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、アルグピリミジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン、グルコスパンから選択されるアミノ酸、または当該アミノ酸のいずれかを配列に含むタンパク質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の濃縮方法。
［１０］ＡＧＥが、Ｎε−カルボキシメチルリシン、およびＧＡ−ピリジンから選択されるアミノ酸、または当該アミノ酸のいずれかを配列に含むタンパク質である、［９］に記載の濃縮方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＡＧＥ、特にＡＧＥにより修飾されたタンパク質の効率的な分離方法、濃縮方法、分析方法、および製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】73MuL9scFv-GRPのドメイン構造およびアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１−２】73MuH19scFv-GRPのドメイン構造およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図１−３】6D12scFv-GRPのドメイン構造およびアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図２】pET-73MuL9scFv-GRP、pET-73MuH19scFv-GRP、およびpET-6D12scFv-GRPのプラスミドを示す図である。
【図３】精製した73MuL9scFv-GRP、73MuH19scFv-GRP、6D12scFv-GRPのSDS-PAGEを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：73MuL9scFv-GRP、レーン３：73MuH19scFv-GRP、レーン４：6D12scFv-GRPをそれぞれ示す。
【図４】scFv-GRPとカードランビーズを用いたGA-BSA、ならびに、CML-BSAの濃縮を行った後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１：GA-BSA（１μｇ）、レーン２：GA-BSAを73MuL9scFv-GRPにより処理した後の試料、レーン３：CML-BSA（１μｇ）、レーン4：CML-BSAを6D12scFv-GRPにより処理した後の試料、をそれぞれ表す。
【図５】scFv-GRPとカードランビーズを用いたＡＧＥ修飾タンパク質の分離・濃縮を行った後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１：分子量マーカー、レーン２：精製後の73MuL9scFv-GRP（０．５μｇ）、レーン３：血清を73MuL9scFv-GRPにより処理した後の試料、レーン４：精製後の73MuH19scFv-GRP（０．５μｇ）、レーン５：血清を73MuH19scFv-GRPにより処理した後の試料、レーン６：精製後の6D12scFv-GRP（０．５μｇ）、およびレーン７：血清を6D12scFv-GRPにより処理した後の試料、をそれぞれ表す。
【図６】カードランビーズ、Ni-NTA アガロースビーズにヒト血清を加え、洗浄操作を行い、ビーズに非特異的に吸着した分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。カードランビーズのレーン１：分子量マーカー、レーン２：ヒト血清中の非特異的に吸着した分子、Ni-NTAビーズのレーン1：分子量マーカー、レーン３：ヒト血清中の非特異的に吸着した分子をそれぞれ表す。矢印は非特異的吸着と予想されるバンドを示す。
【図７】73MuL9scFv、73MuH19scFv、6D12scFvの配列（配列番号４〜６）を示す図である。
【図８】カードランビーズを乾燥させた後、走査型電子顕微鏡にて撮影した画像を示す図である。
【図９】血清中のトランスサイレチン（ＴＴＲ）がGA-ピリジン修飾されたタンパク質であることを確認するための、ウエスタンブロッティングの結果を示す図である。レーン１：GRPにより処理した後の試料、レーン２：73MuL9scFv-GRPにより処理した後の試料、およびレーン３：大腸菌発現系を用いて調製したトランスサイレチンをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法により濃縮されるＡＧＥは、リシンなどのアミノ酸残基が糖と反応して得られる化合物であれば特に限定されない。例としては、Ｎε−カルボキシメチルリシン、Ｎε−カルボキシエチルリシン、アルグピリミジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、Ｎω−カルボキシメチルアルギニン、グルコスパンから選択されるアミノ酸、または当該アミノ酸の誘導体、ペプチド、または当該アミノ酸のいずれかを配列に含むタンパク質などが挙げられる。具体的な例としては、ＧＡ−ピリジン、カルボキシルメチルリジン、およびそれらのいずれかを配列に含むペプチドまたはタンパク質などが挙げられる。
【００１５】
本明細書における「一本鎖抗体」は、全長抗体の重鎖由来のＦｖドメイン（ＶＨ）と軽鎖由来のＦｖドメイン（ＶＬ）をペプチドリンカーにより連結して得られる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を意味する。ここでペプチドリンカーは、一本鎖抗体が抗原結合性を有するのに適した配列であれば特に限定されず、例えば、１０個以上のアミノ酸、具体的には１０〜２７個のアミノ酸、より具体的には１５〜２０個のアミノ酸から構成される。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸は、天然アミノ酸であれば特に限定されない。当該アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどが挙げられ、具体的には、グリシン、アラニン、セリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられる。
【００１６】
一本鎖抗体は、ＶＬドメインのＣ末端とＶＨドメインのＮ末端をペプチドリンカーで連結する構造、またはＶＨドメインのＣ末端とＶＬドメインのＮ末端をペプチドリンカーで連結する構造のいずれを有していてもよい。
【００１７】
ＡＧＥを抗原とするｓｃＦｖの配列は、本発明が属する技術分野の通常の技術を用いて決定することができる。例えば、ＡＧＥを抗原とする全長抗体を作成した後にその配列情報に基づいて作成することができる。また、その際に、公知の抗ＡＧＥ抗体の配列情報を利用することもできる。
【００１８】
本発明で用いるｓｃＦｖは、成書（例えば、Carl A. K. Borrebaeck 編集, (1995) Antibody Engineering (Second Edition), Oxford University Press, New York；John McCafferty, Hennie Hoogenboom, Dave Chiswell 編集, (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press, Oxfordなど）および文献（例えば、Biochim. Biophys. Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology 1385, 17-32 (1998)など）に記載の方法により製造することができる。
【００１９】
本発明で使用されるｓｃＦｖは、アミノ酸残基の糖化反応により構成された構造、またはタンパク質において当該構造の周辺構造も含む部分をエピトープとするものを使用することができる。エピトープへの抗体結合の親和性について、例えば、１０−６Ｍ未満、具体的には１０−７Ｍ未満、より具体的には１０−８Ｍ未満、さらに具体的には１０−９Ｍ未満の親和性（ＫＤ）を有することが望ましい。
【００２０】
本発明において、例えば、配列番号４〜６から選択される配列を有するｓｃＦｖか、これらの1つと交差競合するｓｃＦｖを使用することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ解析、ＥＬＩＳＡアッセイ法、またはフローサイトメトリーを使用して、上記配列を有するｓｃＦｖとの交差競合を実証することができる。一つの態様として、配列番号４〜６から選択される配列を有するｓｃＦｖと６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するｓｃＦｖを使用することができる。
【００２１】
本発明で使用される多糖認識ドメイン配列は、グルカン認識ドメイン（ＧＲＰ）配列またはキチン認識ドメイン配列から選択され、当該配列を含むポリペプチドに多糖への結合能を付与する機能を有するものであれば特に限定されない。グルカン認識ドメイン（グルカン結合ドメイン）配列としては、β−１，３−グルカン認識タンパク質（ＧＲＰ）の結合ドメインであって、β−１，３−グルカンに特異的に結合する機能を有するものの配列を使用することができ、例えば、カイコ、タバコスズメガ、ノシメマダラメイガなどに由来するＧＲＰの結合ドメイン配列を使用することができる。
【００２２】
また、グルカン認識ドメイン（グルカン結合ドメイン）配列として、ショウジョウバエ由来のグラム陰性菌結合タンパク質（ＧＮＢＰｓ）の結合ドメインを使用することができる。
【００２３】
キチン認識ドメイン配列としては、キチナーゼのキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）配列であって、キチンに特異的に結合する機能を有するものの配列を使用することができ、例えば、Bacillus circulans、Pyrococcus furiosusなどに由来するＣＢＤの配列を使用することができる。
【００２４】
ｓｃＦｖなどの抗原結合性ポリペプチド配列と多糖認識ドメイン配列は、ペプチドリンカーにより連結されていてもよい。ここで、ペプチドリンカーは、各配列が機能を発揮するのに適した配列であれば特に限定されず、例えば、５個以上のアミノ酸、具体的には５〜１５個のアミノ酸、より具体的には９〜１０個のアミノ酸から構成される。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸は、天然アミノ酸であれば特に限定されない。当該アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどが挙げられ、具体的には、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、アルギニンなどが挙げられる。
【００２５】
本発明においては、ポリペプチドが有する多糖認識ドメイン配列を固体の多糖を含む担体に固定化することによりアフィニティーシステムを構築して、生体試料中のＡＧＥまたはＡＧＥ修飾タンパク質を分離・濃縮することを特徴とする。担体としては、固体カードラン、固体キチンを使用することができる。担体の形状は特に限定されず、粒状物、ビーズ、ペレット、ゲル、シートなどであってもよい。
【００２６】
担体は多孔質であるものが好ましく、例えば０．０１〜１．５μｍ、好ましくは０．５〜１．２μｍ、より好ましくは０．１〜０．６μｍの孔径を有する。担体の孔径は走査型電子顕微鏡にて撮影した画像から測定することができる。担体として好ましくはビーズを用いることができ、例えば０．１〜１００μｍ、好ましくは１〜７０μｍ、より好ましくは５〜５０μｍの孔径を有する。
【００２７】
カードランはβ−１，３−グルカンであり、本発明において利用可能なカードランビーズは非特許文献１に記載の方法で作成することができる。キチンはポリ−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンであり、本発明においては購入により入手可能なキチンビーズ（キチンビーズ（Chitin Beads）、 S6651S、NewEngland BioLabs 社；キチンマグネットビーズ（Chitin Magnetic Beads）、 S6651S、NewEngland BioLabs 社など）や既知の方法により調製可能なキチンビーズを使用することができる。
【００２８】
本発明においては好ましくは固体カードランを使用することができる。カードランはβ−１，３−グルカンを原料とする安価な物質であり、購入により入手可能である（カードラン（β-1, 3-Glucan）、生化学用 032-09902、和光純薬工業株式会社など）。本発明に用いる固体カードランは非特許文献１に記載の方法により作成することもできる。固体カードランとグルカン認識ドメイン（グルカン結合ドメイン）配列の結合はＧＳＴやＨｉｓ−ｔａｇなどの他のアフィニティータグに比べて強固であるため、非特異吸着を防ぐためにより強力な洗浄操作を行うことが可能である。
【００２９】
本発明で用いる終末糖化産物（ＡＧＥ）を抗原とする抗原結合性ポリペプチド配列と多糖認識ドメインを含むポリペプチドは、本発明の属する技術分野において周知の方法により調製することができる。例えば、ｓｃＦｖ配列と多糖認識ドメイン配列を有するポリペプチドは、大腸菌、酵母、動物細胞（哺乳動物細胞など）、昆虫細胞などから選択される宿主を用いて、適切なプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔａｑ、ｌａｑなど）を使用して調製することができる。本発明で使用するポリペプチド鎖は、ハイブリドーマ細胞を用いず大腸菌により生産されるためモノクローン性が遺伝子レベルで保証される点において好ましい特性を有している。
【００３０】
本発明で用いるポリペプチド鎖は、抗原結合性ポリペプチド配列と多糖認識ドメイン配列を含むポリペプチドとして発現させることができる。抗原結合性ポリペプチド配列と多糖認識ドメイン配列を含有するポリペプチド鎖はインタクト抗体に比べて分子量が５分の１程度と小さく、分析の妨げとなる非特異吸着が起こりにくい点において好ましい特性を有している。
【００３１】
本発明にかかるＡＧＥの濃縮方法は以下の手法により実施することができる。抗原結合性ポリペプチド配列と多糖認識ドメイン配列を含むポリペプチドを固体である多糖に固定化させた後、生体試料を加えて反応させる。洗浄操作により、余剰のポリペプチドと生体試料中に含まれる夾雑物を除去する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液を加えて加熱操作を行い、ポリペプチド鎖を変性させることで生体試料中から分離・濃縮されたＡＧＥ修飾タンパク質を溶出させる。得られた溶出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析することで、ＡＧＥ修飾タンパク質を同定する。電気泳動後の検出法としてＣＢＢ染色、銀染色などが用いられる。
【００３２】
標品として用いられるＡＧＥおよびＡＧＥ修飾タンパク質は既知の方法により調製することができる。例えば、グリコールアルデヒドによりＢＳＡを修飾して得られるＧＡ−ＢＳＡは、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−（５−アミノ−５−カルボキシペンチル）ピリジニウムカチオン（ＧＡ―ピリジン）を含有する。またＮε−（カルボキシメチル）リシン（ＣＭＬ）を含有するＣＭＬ−ＢＳＡはＢＳＡをグリオキシル酸と反応させて還元することにより調製される（J. Biol. Chem. 277, 48905-48912 (2002)）。
【００３３】
本発明により分離したタンパク質を各々同定することで、バイオマーカー探索のみならず、ＡＧＥ関連疾患の発症メカニズム解明にも貢献し得る。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
本実施例ではｓｃＦｖとＧＲＰ配列をペプチドリンカーで連結させたポリペプチド鎖として大腸菌により発現させた。以下３種のプラスミドを用意した。
【００３５】
プラスミド pET-73MuL9scFv-GRP：図１−１に示す73MuL9scFv（配列番号４）とＧＲＰ配列をペプチドリンカーで連結したＤＮＡ断片を含むプラスミドであり、73MuL9scFv-GRPを発現させる。
【００３６】
プラスミド pET-73MuH19scFv-GRP：図１−２に示す73MuH19scFv（配列番号５）とＧＲＰ配列をペプチドリンカーで連結したＤＮＡ断片を含むプラスミドであり、73MuH19scFv-GRPを発現させる。
【００３７】
プラスミド pET-6D12scFv-GRP：図１に示す6D12scFv（配列番号６）とＧＲＰ配列をペプチドリンカーで連結したＤＮＡ断片を含むプラスミドであり、6D12scFv-GRPを発現させる。
【００３８】
本実施例においては、ＡＧＥとしてＧＡ−ピリジンに特異的に結合する73MuL9scFv、73MuH19scFv、およびＣＭＬに特異的に結合する6D12scFvを用いた。
【００３９】
本実施例においては、固体カードランとしてカードランビーズを用いた。カードランビーズは既報記載の方法により調製した（非特許文献１）。
【００４０】
プラスミドpET-scFv-GRPで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換した。この大腸菌をアンピシリン含有LB寒天培地に広げ、終夜３７℃でインキュベートさせて形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを100μg/mlのアンピシリン含有LB培地（20ml）に植菌して３７℃で一晩前培養を行った。この前培養液を100μg/mlのアンピシリン含有LB培地（300ml）に、600nmの濁度が0.1になるように植菌した。600nmの濁度が0.6に到達した時点で終濃度1 mMイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを添加した後、３７℃で７時間培養した。培養液を6000 rpm、４℃で１０分遠心分離して集菌した。菌体をソニケーションバッファー（50 mM Tris-HCl（pH 8.0），100 mM NaCl）で懸濁させ、氷中において超音波破砕を行った。この溶液を6000 rpm、４℃、20分遠心分離して、不溶性画分を回収した。この不溶性画分を6Mグアニジン溶液で変性させた後、リフォールディングを行い、立体構造を保持したscFv-GRPを調製した。
【００４１】
［実施例２］
調製したscFv-GRP（２０〜５０μg）をカードランビーズ（２０％スラリー、１００μＬ）と室温で１時間、１．５ｍＬチューブ内で反応させた。その後、２％ＳＤＳと加熱操作により変性させた試料（ＧＡ−ＢＳＡ１００μｇ（ＧＡ−ピリジンを含有するタンパク質を含む）、ＣＭＬ−ＢＳＡ１００μｇ（ＣＭＬを含有するタンパク質を含む）、ヒト血清１ｍｇのいずれか）をバッファー(PBS+1%TritonX-100)で10倍希釈した後、scFv-GRPが結合したカードランビーズに加えて２時間反応させた。カードランビーズをバッファー（PBS-T、PBS＋0.05% Tween20））で３回洗浄した後、ＳＤＳを含む溶液を加えて９５℃、５分間で加熱した。溶出液を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、複数のバンドが確認され、ＡＧＥ修飾タンパク質が分離・濃縮されていることが確認された。73MuL9scFv-GRP、73MuH19scFv-GRPはＧＡ−ＢＳＡを、6D12scFv-GRPはＣＭＬ−ＢＳＡを濃縮していたことから、複数のバンドはＧＡ−ピリジンまたはＣＭＬ修飾されたタンパク質である。
【００４２】
［実施例３］
実施例で使用したものと同じ方法で作成したカードランビーズを乾燥させた後、走査型電子顕微鏡にて画像を撮影した（図８）。カードランビーズの平均的な球径は１０μm〜２０μｍであり、ビーズ表面の孔径は０．１３μｍ〜０．４６μｍであった。
【００４３】
［実施例４］
73MuL9scFv-GRPとカードランビーズを用いて、血清中のGA-ピリジン修飾されたタンパク質を分離・濃縮した後に得られた溶液をウエスタンブロッティングにて分析した。一次抗体は抗トランスサイレチン抗体（ウサギ由来）を、二次抗体はHRP標識抗ウサギIgG抗体を用いた。結果を図９に示す。ウエスタンブロッティングによって、血清中のトランスサイレチンがGA-ピリジン修飾されたタンパク質であることが確認された。ここで、レーン１：GRPにより処理した後の試料、レーン２：73MuL9scFv-GRPにより処理した後の試料、レーン３：大腸菌発現系を用いて調製したトランスサイレチンをそれぞれ示す。
【００４４】
［比較例１］
カードランビーズとNi-NTAアガロース（Qiagen）に対するヒト血清の非特異的吸着の比較を行った。カードランビーズ、Ni-NTA アガロースビーズに実施例２と同様に変性させたヒト血清1 mgを加え、反応、洗浄を行った。溶出液を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図６に示す。カードランビーズに比べて、Ni-NTAアガロースでは非特異的に結合しているバンドが多く見られ、カードランビーズの優位性が示された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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