(57)【要約】      （修正有）【課題】アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの提供。【解決手段】（ａ）特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）特定の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；（ｃ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｄ）特定のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｅ）特定のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いてアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５に記載のタンパク質を含む植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
【請求項１０】
前記植物がバラである、請求項９に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
【請求項１１】
切花である、請求項９又は１０に記載の植物の部分。
【請求項１２】
請求項１１に記載の切花の加工品。
【請求項１３】
以下の工程：
請求項７に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させる工程、及び
該非ヒト宿主からアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を採取する工程、
を含む、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
改変された花色を有する植物を製造するための方法であって、
宿主植物に請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６に記載のベクターを導入する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
花産業は新規かつ種々の品種を開発することに努力している。新規品種育成のための有効な方法の一つとして花の色を変えることがあり、古典的な育種方法を用いて、ほとんどの商業的品種について様々な花色を呈する品種が作出されている。しかしながら、従来の育種による方法では種ごとに遺伝子プールが制限されていることから、単一の種が広範囲にわたる花色品種を有することは稀である。
【０００３】
花の色は主として２つのタイプの色素、すなわちフラボノイド及びカロチノイドに由来する。フラボノイドは黄色から赤ないしは青色の広範囲の花色に主に寄与し、一方カロチノイドはオレンジ又は黄色の色調に主に寄与する。フラボノイドの中でも花色に主たる寄与をするのは、アントシアニンと総称される一群の化合物である。アントシアニンの発色団は、アントシアニジンであり、主要なアントシアニジンとしてペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンが知られている。植物には多様なアントシアニンが存在することが知られており、その多様性が花の色の多様性の一因となっている。数百種のアントシアニンの構造がすでに決定されており、ほとんどのアントシアニンの3位の水酸基は糖により修飾されている（特許文献１−４）。
【０００４】
アントシアニンの生合成経路は３位の配糖化物の生合成までは、ほとんどの顕花植物で共通であり、その後、種及び品種特異的に配糖化、アシル化、メチル化など様々な修飾を受ける。このような品種における修飾形態の違いがアントシアニンの多様性すなわち多彩な花色の一因となっている。一般的にアントシアニンを修飾する芳香族アシル基が多いほどアントシアニンは安定化し、青色化する（特許文献１）。
【０００５】
アントシアニジンを含むフラボノイドの生合成は詳細に研究されている。アントシアニンの合成に関与する酵素の遺伝子はすべてクローニングされ、これらの転写因子の遺伝子も得られている。したがってこれらの遺伝子の発現を人為的に改変することにより花で蓄積するフラボノイドの構造と量を改変し、花色を変えることができる。分子生物学的手法と植物への遺伝子導入により、アントシアニンの構造を改変し、花の色を変えた例が報告されている（特許文献３，４）。
【０００６】
花の色を青くする方法の１つとしてアントシアニンのβ環の水酸基数を増加させることが考えられる。アントシアニンの3′位を水酸化する反応を触媒する酵素（フラボノイド３′−水酸化酵素：Ｆ３′Ｈ）とアントシアニンの３′位と５′位を水酸化する反応を触媒する酵素（フラボノイド３′，５′−水酸化酵素：Ｆ３′５′Ｈ）は、花色を変える上で重要である。概してペラルゴニジン（β環の水酸基が１個）はオレンジから赤、シアニジン（β環の水酸基が２個）は赤から紅色、デルフィニジン（β環の水酸基が３個）は紫から青の花に含まれることが多い。紫から青の品種のない植物種はデルフィニジンを作る能力を欠く場合が多く、その代表例として、バラ、キク、カーネーションが挙げられる。
【０００７】
これらの植物について、紫から青の品種をバイオテクノロジーにより作出することは以前から注目されている。実際にデルフィニジンを生産するために必須のＦ３′５′Ｈ遺伝子を発現させることにより、花色を青紫色にしたカーネーションが作製され、花弁でデルフィニジンを生産することは可能となったが、未だ花の色は十分な青色とはなっていない。すなわち、花の色を真に青くするためには、Ｆ３′５′Ｈ遺伝子を導入するだけでは不十分であり、さらに工夫をする必要があると考えられる。
【０００８】
実際に青い花に含まれるアントシアニンは糖を介して芳香族アシル基で修飾されていることが多い（特許文献１）。そこで、花の色をより青くする方法のひとつとして、カフェオイル基、クマロイル基、シナポイル基などの芳香族アシル基によりアントシアニンを修飾することが考えられる（特許文献１、２）。
【０００９】
一般に、アントシアニンは配糖化によってやや赤くなり、糖を介した芳香族アシル基の付加によってアントシアニンの色は青くなる（特許文献１）。また、アントシアニンは中性溶液中では不安定な化合物であるが、糖やアシル基によって修飾されることで安定性が向上する（特許文献１）。アサガオ（Pharbitis nil）由来のアントシアンを用いた実験により、アシル化されたアントシアニンのうち、グルコースを介して芳香族アシル基、例えばクマル酸やカフェ酸が結合したアントシアニンはその吸収極大が長波長側に移動することが観察された（特許文献１）。
【００１０】
芳香族アシル基の結合したアントシアニンにはツユクサ（Commelina communis）由来のアオバニンを始め、自然界からの数多くの分離例が報告されている（特許文献1）。例えば、青い花のアントシアニンはシネラリン(サイネリア由来)、ゲンチオデルフィン(リンドウ由来)、ヘブンリーブルーアントシアニン(アサガオ由来)、テルナチン(チョウマメ由来)、ロベリニン(ロベリア由来)等に代表されるように、複数の芳香族アシル基を有している。
【００１１】
シネラリア（Senecio cruentus）由来のシネラリンは１個の脂肪族アシル基と３個の芳香族アシル基を有するが、これら芳香族アシル基が中性水溶液中での色素の安定化に寄与していることが報告されている（特許文献１）。また、リンドウ花弁の主要色素であるゲンチオデルフィン（ＤＥＬ  ３Ｇ−５ＣａｆＧ−３′ＣａｆＧ）は、デルフィニジン３位配糖化物を基本骨格とし、５位と３′位の水酸基にグルコース１分子とカフェ酸１分子からなる側鎖を有する。これら５位ならびに３′位の糖−アシル基側鎖により、サンドイッチ型の分子内スタッキングが起こり、水溶液中で色素が安定化されることが報告されている（特許文献２）。さらに、２つの糖−芳香族アシル基側鎖のうち、５位よりも３′位の糖−芳香族アシル基が色素の安定化、青色化に大きく寄与していることが確かめられた（特許文献２）。
【００１２】
芳香族アシル基転移反応は１９８０年にナデシコ科のマンテマ属（Silene）植物（特許文献１）で初めて示され、アラセイトウ属（Matthiola）植物の可溶化酵素画分にも同様の芳香族アシル基転移酵素活性が見い出された（特許文献１）。その後、リンドウからアントシアニンの５位の糖にカフェ酸やクマル酸などの芳香族アシル基を転移するアントシアニン５位芳香族アシル基転移酵素（５ＡＴ）が単離され、精製された酵素の内部アミノ酸配列の情報をもとに、リンドウの５ＡＴをコードするｃＤＮＡが単離された（特許文献１）。
【００１３】
３位、５位などのＡ環のアシル化だけでは充分な効果がなく、３′位のアシル化がアントシアニンの青色化、安定化のために必要であること、さらに望ましくは３′位を含む複数の位置のアシル化が必要であることが知られている。これについて、特許文献１及び２には、リンドウの５位芳香族アシル基転移酵素が、３′アシル基転移活性をもコードしており、単一の酵素でありながら、アントシアニンの５位と３′位の２箇所の糖にそれぞれ芳香族アシル基転移反応を触媒することが開示されている（特許文献２）。しかしながら、当該遺伝子は異種の植物では十分に発現しないため、異種の植物でも機能する芳香族アシル基転移酵素又はその遺伝子の取得が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３９５０９８６号公報
【特許文献２】特許第５５９８８３０号公報
【特許文献３】特許第４６９０１９７号公報
【特許文献４】特許第５６９７０４１号公報
【特許文献５】特許第４９８２７８２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】J Struct Funct Genomics (2014) 15:153-164
【非特許文献２】Science Translational Medicine (2013) 5: pp. 181ra52
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
アントシアニンの安定化と青色化には、アントシアニンの芳香族アシル基が寄与し、特に５位の糖−アシル基側鎖よりも３′位の糖−アシル基側鎖の寄与が大きい。さらに３′位を含めた複数位置の糖−アシル基側鎖よってアントシアニンはより青く安定になると考えられる。したがって、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有する酵素あるいは当該酵素をコードする遺伝子を用いて、人為的にアントシアニンを修飾し、アントシアニンをより安定な化合物へと改変し、またそのアントシアニンに一層の青味を付加することにより、新たな花色を有する植物品種を開発できることが期待される。現在、青いバラとして知られるバラ品種（アプローズ）に存在する主要アントシアニンはデルフィニジン３，５−ジグルコシドであるため、リンドウの５，３′−アシル基転移酵素（Ｇ５，３′ＡＴ）遺伝子を導入することによって、花色をさらに青くする研究が行われていたが、Ｇ５，３′ＡＴ遺伝子を導入しても、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基が付加されたアントシアニンを検出することはできなかった。また、当該遺伝子をペチュニアに導入した場合でも５，３′−ジアシルアントシアニンは検出されなかった。したがって、本発明が解決すべき課題は、バラなどの異種植物へ導入した際に安定に発現するアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
リンドウと同じくリンドウ科に属するトルコギキョウは、５，３′−アシル基転移酵素ではなく５−アシル基転移酵素を生産する。トルコギキョウの５−アシル基転移酵素（Ｅ５ＡＴ）とリンドウの５，３′−アシル基転移酵素（Ｇ５，３′ＡＴ）はアミノ酸配列の同一性が高く、また、Ｅ５ＡＴ遺伝子を導入したバラはアシル化アントシアニンを蓄積することから、本願発明者は、Ｇ５，３′ＡＴとＥ５ＡＴの立体構造に着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、Ｎ４１／Ｙ４１、Ｍ２３５／Ｌ２３４、Ｋ２４２／Ｇ２４１、Ｒ２４５／Ｑ２４４、Ｎ３８９／Ｋ３８９、Ｐ３９２／Ｌ３９２、Ｆ３９６／Ｌ３９６、Ｔ４００／Ｓ４００、Ｅ４２９／Ｇ４２９の９個のアミノ酸残基（前段がＧ５，３′ＡＴのアミノ酸残基、後段がＥ５ＡＴのアミノ酸残基を意味する）がアントシアニンの認識に関与し、これらのアミノ酸残基をリンドウ（Ｇ）型に改変することにより、アントシアニンの５位と３′位の両方の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有意に増大させるという驚くべき知見を得て、本発明を完成するにいたった。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
［２］  配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、１に記載のポリヌクレオチド。
［３］  配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、１に記載のポリヌクレオチド。
［４］  配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、１に記載のポリヌクレオチド。
［５］  １〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
［６］  １〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
［７］  ６に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
［８］  １〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する方法。
［９］  １〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は５に記載のタンパク質を含む植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［１０］  前記植物がバラである、９に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［１１］  切花である、９又は１０に記載の植物の部分。
［１２］  １１に記載の切花の加工品。
［１３］  以下の工程：
７に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主からアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
［１４］  改変された花色を有する植物を作製するための方法であって、
宿主植物に１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は６に記載のベクターを導入する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に安定して発現させることで、花色の改変に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＧＥＡＴ又はＥＧＡＴを基質と反応させた酵素反応液の高速液体クロマトグラムである。
【図２】Ｅ′ＡＴ又はＥ′ＧＡＴを基質と反応させた酵素反応液の高速液体クロマトグラムである。
【図３】Ｇ５，３′ＡＴ、ＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ又はＥ′ＧＡＴを含むコンストラクト（ｐＳＰＢ５５２３、ｐＳＰＢ６１０７、ｐＳＰＢ６１３３、ｐＳＰＢ６１３４）を表す。
【図４】組換えバラにおける導入遺伝子の発現解析結果を示す表である。
【図５】組換えバラでのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７、９又は１１のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８、１０又は１２のいずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。
【００２２】
本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
【００２４】
上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
【００２５】
本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
【００２６】
また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（バージョン9.5、Oxford Molecular Ltd., Oxford, England)のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
【００２８】
生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
【００２９】
また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。
【００３０】
実施例においては、アントシアンのアシル基転移反応において、アシル基の供与体としてカフェオイル−ＣｏＡ、ｐ−クマロイル−ＣｏＡ、フェルロイル−ＣｏＡ等のＣｏＡエステルが用いられているが、カフェオイル、ｐ−クマロイル、フェルロイル又はシナポイル−１−Ｏ−グルコースといったハイドロキシシンナモイル−１−Ｏ−グルコースも芳香族アシル基の供与体として利用できる（Glassgen and Seitz, Planta 186: 582, 1992）。
【００３１】
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された非ヒト宿主にも関する。
非ヒト宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Bacillus subtilis）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。
【００３２】
酵母としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Aspergillus）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ペニシリウム（Penicillium）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００３３】
また、本発明の発現ベクターは、それらを導入する宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。
【００３４】
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
【００３６】
前記発現ベクターによって形質転換された非ヒト宿主を培養、栽培又は生育させ、培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。
【００３７】
また、本発明は、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物に導入し、これを該植物内で発現させることにより得られる、植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織にも関する。当該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。本発明に係るアントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を付加したり、そのようなアシル化を抑制することができ、その結果として植物における花色を変更することができる。
【００３８】
現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
【００３９】
形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明は、上記切花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明により、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドを適切な非ヒト宿主細胞内で発現させることにより、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、アントシアニンの５及び３′位の糖に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。本発明によって改変された花色は、典型的には、青系花色である（好ましくは、Violet-Blueグループ／Blueグループ、及び／又は色相角：230°〜290°）。
【実施例】
【００４２】
［実施例１：ＧＥＡＴ遺伝子及びＥＧＡＴ遺伝子の作製と評価］
（１）ＧＥＡＴ遺伝子の作成
トルコギキョウ５ＡＴ（Ｅ５ＡＴ）ｃＤＮＡ（配列番号３）を含むプラスミドｐＳＦＬ６６７をＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化し、Ｅ５ＡＴのＣ末端側を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、リンドウ５，３′−ＡＴ（Ｇ５，３′ＡＴ）ｃＤＮＡ（配列番号１）を含むプラスミドｐＳＰＢ５５２０をＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化して得られるＤＮＡ断片と連結しｐＳＰＢ５９５５を得た。これをＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＥＴ３２ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ５９６１を得た。このプラスミドには、Ｎ末端側がＧ５，３′ＡＴ（配列番号２）由来の配列、及びＣ末端側がＥ５ＡＴ（配列番号４）由来の配列を有する融合タンパク質（配列番号６）をコードする遺伝子（配列番号５）が含まれる。このタンパク質をＧＥＡＴとする。
【００４３】
（２）ＥＧＡＴ遺伝子の作成
Ｇ５，３′ＡＴｃＤＮＡ（配列番号１）を含むプラスミドｐＳＰＢ５５２０をＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化し、Ｇ５，３′ＡＴのＣ末端側を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ｐＳＦＬ６６７をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化して得られるＤＮＡ断片と、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化したＤＮＡ断片とを連結し、ｐＳＰＢ５９５７を得た。これをＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＥＴ３２ｃのＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ５９６４を得た。このプラスミドには、Ｎ末端側がＥ５ＡＴ、Ｃ末端側がＧ５，３′ＡＴ由来の配列を持つタンパク質（配列番号８）をコードする遺伝子（配列番号７）が含まれる。このタンパク質をＥＧＡＴとする。
【００４４】
（３）ＧＥＡＴとＥＧＡＴの酵素活性の測定
上記で作製した発現ベクターを用いて、大腸菌でＡＴタンパク質を発現させた。発現のプロトコールは、製造者の提供するプロトコールに依った。具体的には以下のように行った。
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、得られたコロニー１個を３ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地で３７℃一晩培養した。このうち０．１ｍｌを、１０ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地で３７℃３時間培養した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後、２７℃で一晩培養した。８０００回転１０分間の遠心分離で集菌し、１ｍｌの懸濁液（２−メルカプトエタノール、ＡＰＭＳＦを含む）中で超音波破砕を行った。これを１５０００回転１０分４℃の遠心分離に供した。上清をさらに５５０００回転３０分４℃で遠心分離し、上清をＡＴ反応のための粗酵素液とした。
酵素反応液は、５０μｌの粗酵素液、１０μｌのデルフィニジン３，５，３′−トリグルコシド溶液（１ｍｇ／ｌ）、１０μｌのカフェオイルＣｏＡ溶液（１ｍｇ／ｌ）、１０μｌの１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２０μｌの水を含む。３０℃で３０分反応後、９０μｌの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルと１０μｌのＴＦＡを加え、酵素反応を停止した。１５０００回転で１０分間遠心分離後、上清をＭｉｌｌｅｘ−ＬＨ（ポアサイズ０．４５μｍ）で濾過した。この濾過液に含まれるアントシアニンを特許文献1に記載の方法で分析した。
【００４５】
図１に示されるとおり、ＧＥＡＴを用いた場合には、基質の他には、デルフィニジン３−グルコシド５−（カフェオイル）グルコシド３′−グルコシド（保持時間１３．４５９分）のみが生じたのに対し、ＥＧＡＴを用いた場合には、当該化合物のピーク（保持時間１３．４３１分）の他にデルフィニジン３−グルコシド５−カフェオイルグルコシド３′−カフェオイルグルコシドのピークが観察された（保持時間１５．１４１分）。すなわち、ＧＥＡＴは５ＡＴ活性のみを有するのに対し、ＥＧＡＴは５，３′ＡＴ活性を有することが判明した。
【００４６】
［実施例２：Ｅ′ＡＴ遺伝子及びＥ′ＧＡＴ遺伝子の作製と評価］
（１）Ｇ５，３′ＡＴの立体構造解析
バラにおいて機能する５，３′−ＡＴ活性を持つタンパク質をデザインするために、Ｇ５，３′ＡＴの立体構造を解析した。立体構造の解析は、例えば、非特許文献１、非特許文献２に記載してある方法でおこなった。Ｇ５，３′ＡＴ（配列番号２）のタンパク質は、昆虫細胞／バキュロウイルス発現系を用いて発現した。またＣ末側を４残基短くし、基質との安定な複合体を形成させるために、活性中心と考えられる１７４番目のヒスチジン残基をアラニンへ変異させたタンパク質（Ｇ５，３′ＡＴ−Ｈ１７４Ａ）は、Ｎ末端にＳＵＭＯタグを融合し、大腸菌抽出液を用いた無細胞合成系により発現した。いずれのタンパク質もＮ末端にＨｉｓタグを付けたものとした。精製はＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製（Ｎｉキレートカラム使用）後、それぞれＴＥＶプロテアーゼまたはＳＵＭＯプロテアーゼでＨｉｓタグ／ＳＵＭＯタグを切断した。その後、陰イオン交換カラムで精製し、さらにゲルろ過を行った。結晶化はスクリーニングキットを用いて条件を探索したところ、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５，１．１〜１．４Ｍ  クエン酸ナトリウムの条件において結晶が得られた。その後、Ｄｍ３ＭａＴ３（Protein Data Bank ID: 2E1V）をモデル分子として分子置換法で構造を決定した(全長タンパク質)。
変異タンパク質Ｇ５，３′−Ｈ１７４Ａについてはさらにデルフィニジングルコシドとカフェオイル−ＣｏＡをソーキングすることで複合体として構造解析を試みたところ、カフェオイル−ＣｏＡの電子密度の確認ができた。ホモロジーモデリングと配列比較の結果を用いてトＥ５ＡＴ（配列番号４）の構造を予測し、Ｇ５，３′ＡＴの立体構造と比較した。
先の変異タンパク質と基質との複合体構造解析の結果から５ＡＴの基質認識ポケットは推定できる。そこで、この基質認識ポケット周辺でＧ５，３′ＡＴとＥ５ＡＴの構造を比較し両者の間で異なるアミノ酸を探索した。
【００４７】
リンドウ５，３′−ＡＴ（Ｇ５，３′ＡＴ）（配列番号２）とＥ５ＡＴ（配列番号４）の立体構造に基づき、アントシアニンの認識に関与すると考えられた、Ｎ４１／Ｙ４１、Ｍ２３５／Ｌ２３４、Ｋ２４２／Ｇ２４１、Ｒ２４５／Ｑ２４４、Ｎ３８９／Ｋ３８９、Ｐ３９２／Ｌ３９２、Ｆ３９６／Ｌ３９６、Ｔ４００／Ｓ４００及びＥ４２９／Ｇ４２９の９個のアミノ酸残基（前段がＧ５，３′ＡＴのアミノ酸残基、後段がＥ５ＡＴのアミノ酸残基を意味する）に注目し、Ｅ５ＡＴの上記９個のアミノ酸残基をリンドウ型に改変したタンパク質（配列番号１０）をコードする遺伝子（配列番号９）、ならびに、ＥＧＡＴのリンドウ部分にＮ４１／Ｙ４１及びＭ２３５／Ｌ２３４の２個の変異を導入したタンパク質（配列番号１２）をコードする遺伝子（Ｅ′ＧＡＴ）（配列番号１１）を作製した。具体的には以下のように行った。
【００４８】
（２）Ｅ′ＡＴ遺伝子の作製
オペロン社（現ユーロフィン社）に委託し、Ｅ５ＡＴ′−Ｎ（５′端からＸｂａＩまでのトルコギキョウＤＮＡ配列で、Ｙ４１Ｎ、Ｌ２３４Ｍの変異を入れたもの）とＥ５ＡＴ′−Ｃ（ＸｂａＩから３′端までで、トルコギキョウＤＮＡ配列にＧ２４１Ｋ、Ｑ２４４Ｒ、Ｋ３８９Ｎ、Ｌ３９２Ｐ、Ｌ３９６Ｆ、Ｓ４００Ｔ、Ｇ４２９Ｅの変異を入れたもの）の２種類の合成ＤＮＡを作成した。
上記Ｅ５ＡＴ′−Ｎを含むベクターｐＥＸＡをｐＳＰＢ６１１８とし、Ｅ５ＡＴ′−Ｃを含むベクターｐＥＸＡをｐＳＰＢ６１１９とした。ｐＳＰＢ６１１８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化して得られる断片と、ｐＳＰＢ６１１９を消化してＸｂａＩ−ＸｈｏＩで消化して得られる断片と、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ−とを連結してｐＳＰＢ６１２０を得た。これをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化することで、発現ベクターＰＳＰＢ６１２２に移し、ｐＳＰＢ６１２２を得た。このプラスミドには、９個のアミノ酸残基が改変されたトルコギキョウのＡＴ（Ｅ′ＡＴ：配列番号１０）をコードする配列（配列番号９）が含まれる。
【００４９】
（３）Ｅ′ＧＡＴ遺伝子の作製
上記ｐＳＰＢ６１１８をＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化して得られる断片と、上記ｐＳＰＢ５５２０をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ−とを連結してｐＳＰＢ６１２１を得た。これをＥｃｏＲＩで消化することで、発現ベクターＰＳＰＢ６１２２に移し、ｐＳＰＢ６１２３を得た。このプラスミドには、２個のアミノ酸残基が改変されたトルコギキョウのＡＴ配列をＮ末端側に、リンドウのＡＴ配列をＣ末端側に持つ合成ＡＴ（Ｅ′ＧＡＴ：配列番号１２）をコードする配列（配列番号１１）が含まれる。
【００５０】
（４）Ｅ′ＡＴとＥ′ＧＡＴの酵素活性の測定
実施例１に記載の方法にしたがい、Ｅ′ＡＴとＥ′ＧＡＴを大腸菌で発現させ、活性を測定した。図２に示されるとおり、Ｅ′ＡＴを基質と反応させた場合、デルフィニジン３−グルコシド５−カフェオイルグルコシド３′−カフェオイルグルコシド（保持時間１５．５８０分）に相当するピークが観察された。また、Ｅ′ＧＡＴを基質と反応させた場合も当該化合物のピークが観察された（保持時間１５．５８８分）。
【００５１】
これらの結果から、人工的なアミノ酸配列を有するＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ及びＥ′ＧＡＴの３種類のタンパク質が５，３′−ＡＴ活性を有することが確認された。
これらの３種類の酵素活性を比較したところ、Ｅ′ＧＡＴ＞Ｅ′ＡＴ＞ＥＧＡＴであることがわかった。
【００５２】
［実施例３：バラへの遺伝子導入と組換えバラにおける導入遺伝子の発現解析］
バラにＧ５，３′ＡＴおよびその変異遺伝子を導入するために、これらを含むバイナリーベクターを構築した。構築は、公知の方法（特許文献３）に記載の方法で、バイナリーベクターｐＢｉｎＰｌｕｓ上に導入する遺伝子の発現カセットを挿入した。バイナリーベクターｐＳＰＢ５５２３は、ｐＢｉｎＰｌｕｓ上のネオマイシンリン酸基転移酵素遺伝子に近い方から、パンジー由来フラボノイド３′，５′−水酸化酵素（Ｆ３′５′Ｈ）ｃＤＮＡ（特許文献３）、リンドウのアントシアニン３′−糖転移酵素（特許文献５）のホモログであるヤクシマリンドウ（Gentiana yakushimense）のアントシアニン３′−糖転移酵素（Ｇｙ３′ＧＴ、あるいは３′ＧＴ）ｃＤＮＡ（配列番号１３）、Ｇ５，３′ＡＴｃＤＮＡを含む。これら３つの遺伝子は、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Ｅ３５ＳＰｒｏ．）（特許文献３）とアラビドプシス由来の熱ショックタンパク質ターミネーター（ＨＳＰｔｅｒ，タカラバイオ株式会社から販売されている植物発現ベクターｐＲＩ２０１−ＡＮ由来）により制御されている。同様に、ｐＳＢＰ６１０７、ｐＳＰＢ６１３３、ｐＳＢＰ６１３４を構築した。これらは、Ｇ５，３′ＡＴの代わりに、それぞれＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ、Ｅ′ＧＡＴｃＤＮＡが含まれている（図３）。
これらのバイナリーベクターを特許文献３に記載の方法で、クールウォーター（ＣＷ）、オーシャンソング（ＯＳ）、ノブレス（ＮＯＢ）、リタパヒューメラ（ＬＰ）のバラ４品種に導入した。
【００５３】
［実施例４：組換えバラでのＲＴ−ＰＣＲ解析］
カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化して得られた組換えバラの葉を用いて、Ｇ５，３′ＡＴ、ＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ、Ｅ′ＧＡＴ遺伝子の発現解析を行った。全ＲＮＡは、Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用い、製造者に推奨されているプロトコールに従い単離し、ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Invitrogen社）を用いて、全ＲＮＡを鋳型にして、製造者に推奨されているプロトコールに従って合成した。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、（タカラバイオ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、反応体積３０μｌで行った（９４℃で２分間保持し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間保持のサイクルを３０サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。Ｇ５，３′ＡＴの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマー（フォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧ、リバースプライマー：ＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣ）、ＥＧＡＴの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するプライマー（フォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧ、リバースプライマー：ＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣ）、Ｅ′ＡＴの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するプライマー（フォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧ、リバースプライマー：ＣＴＡＴＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣ）、Ｅ′ＧＡＴの完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するプライマー（フォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＧ、リバースプライマー：ＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣ）を設計して利用した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、それぞれの完全長ｃＤＮＡに相当する大きさのバンドが検出されたことから、バラにおいてＧ５，３′ＡＴ遺伝子（１，４１０ｂｐ）、ＥＧＡＴ遺伝子（１，４０７ｂｐ）、Ｅ′ＡＴ遺伝子（１，３９８ｂｐ）、Ｅ′ＧＡＴ遺伝子（１，４０７ｂｐ）が転写されていることが確認された（図４）。さらにＧ５，３′ＡＴ遺伝子が転写されていることを確認したＣＷ１１個体、ＥＧＡＴ遺伝子が転写されていることを確認したＣＷ７個体、Ｅ′ＡＴ遺伝子が転写されていることを確認したＣＷ１９個体、Ｅ′ＧＡＴ遺伝子が転写されていることを確認したＣＷ１６個体の発現解析結果から、Ｇ５，３′ＡＴ遺伝子よりも人工的なアミノ酸配列を有するＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ、Ｅ′ＧＡＴ遺伝子のバラにおける転写産物量が多いことを確認した（図４）。また、ＣＷ以外の品種ＯＳ、ＮＯＢ、ＬＰに導入したＥＧＡＴ、Ｅ′ＡＴ、Ｅ′ＧＡＴ遺伝子が、バラで十分な酵素活性を示すＧｙ３′ＧＴ遺伝子と同等の転写物量を合成していることを確認した（図５）。
以上から、本発明によってバラの植物体で転写物が安定に高発現するアントシアニン５，３′−ＡＴ活性を示す配列を得られることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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