(57)【要約】      （修正有）【課題】動物の胃腸管において酸素感受性のある細菌の増殖又は維持。【解決手段】動物の胃腸管においてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを選択的に刺激するための食品組成物、医薬組成物、食品又は健康補助食品の製造のためのリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩の使用の提供。また、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩、及びシステインとともに調合された生きた有益なブチレート生成嫌気性細菌を含むシンバイオティクス組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の胃腸管におけるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の増殖を選択的に刺激するのに有効な量で、前記動物にリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩を投与することを含む、動物の胃腸管におけるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイを選択的に刺激するための方法における使用のためのリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩。
【請求項２】
前記動物は、ヒト、ペット又は家畜である、
ことを特徴とする請求項１に記載のリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩。
【請求項３】
胃腸管におけるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイの増殖を維持、支援又は刺激するのに有効な量で、必要とするヒト対象にリボフラビンが投与することを含む、炎症性の胃腸障害に関連する症状を予防、治療又は低減するための方法における使用のためのリボフラビン。
【請求項４】
前記炎症性の胃腸障害は、炎症性の胃腸疾患である、
ことを特徴とする請求項３に記載のリボフラビン。
【請求項５】
前記炎症性の胃腸疾患は、クローン病及び潰瘍性結腸炎である、
ことを特徴とする請求項４に記載のリボフラビン。
【請求項６】
リボフラビンは、体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり１日１〜１００ｍｇの用量で投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩。
【請求項７】
リボフラビンは、少なくとも３日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物、好ましくは哺乳類の胃腸管において酸素感受性のある細菌の増殖又は維持を支援する方法及び組成物に関する。特に、本発明は、例えばフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイといった有益なブチレート生成嫌気性細菌の増殖を選択的に促進する手段及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有益な細菌とも称されるプロバイオティクスは、宿主に、例えば、正常な宿主の胃腸の微生物叢の維持及び病原菌に対する抵抗力の向上といった有益な効果もたらし得る。長年にわたってプロバイオティクス製剤は健康補助食品として使用されてきた。今までのところ、多くの異なるプロバイオティクス株及びその組み合わせが存在するが、それらのほぼ全ては比較的酸素耐性のある株、例えばビフィズス菌種、乳酸菌種及びサッカロミセス種を利用したものである。近年の腸内微生物学の研究では、例えば抗炎症治療及びクローン病の治療といったプロバイオティクスの応用に関する新しい領域が調査されており、病原菌に対するコロニー形成抵抗性を向上させ得る。そのような細菌は、典型的には様々な炭水化物を利用し、主要な発酵性の最終生成物としてブチレートを生成する。ブチレートは、腸の健康の促進及び維持におけるその役割でよく知られている。例えば、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイは、部分的には分泌代謝物がＮＦ−ｋＢ活性及びＩＬ−８生成の阻害を可能にすることが原因で、細胞及びＴＮＢＳ結腸炎モデルにおいて抗炎症効果を示すことが明らかとなった。Ｆ．プラウスニッツィイは、最も多いヒト結腸細菌のひとつであり、個数は、健常個体の便における全微生物叢の５〜２０％の範囲を占める。Ｆ．プラウスニッツィイの減少は、回腸クローン病の手術後の再発リスクがより高いことと関連することが見出されている（非特許文献１）。現在は、Ｆ．プラウスニッツィイによる腸内毒素症の相殺は、増悪の再発を予防することによるＣＤ治療における有望な戦略であると考えられている。
【０００３】
特定の成分は、有益な方法で胃腸の微生物群を改変するように有益な細菌の増殖又は維持を支援することが知られている。そのような成分は、「プレバイオティクス」と称される。公知のプレバイオティクスの典型的な例は、オリゴ糖、例えば、フラクトオリゴ糖及びイヌリンである。シンバイオティクスとはプロバイオティクスとプレバイオティクスを相乗作用形式で組み合わせた栄養補助食品を示す。腸において有益な酸素耐性のある細菌のレベルを維持又は刺激するための数多くのプレバイオティクス及びシンバイオティクス製剤が先行技術で公知である。その一方、おそらく酸素感受性のある細菌を生存させておくことは技術的に困難であるため、これらの細菌を刺激することについて論じた研究はほとんどない。例えば、前述した抗炎症効果のために必要な細菌は、非常に酸素感受性が高く数分を超えて周囲空気に曝露されると生存することができない。その結果、治療への応用が有望であるにもかかわらず、今まではＦ．プラウスニッツィイを含有するプロバイオティクス組成物は開示されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ソコル（ｓｏｋｏｌ）他著、ＰＮＡＳ、第１０５巻、第４３号、２００８年、ｐ１６７３１〜１６７３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
有益な嫌気性細菌の治療への可能性を認めた上で、本発明者らは、胃腸管においてブチレート生成嫌気性細菌の個体数を増加させる新しい手段及び方法の特定を試みた。特に、ブチレート生成嫌気性細菌、好ましくはＦ．プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を選択的に刺激する新規プレバイオティクス及びシンバイオティクス製剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚いたことに、ビタミンＢ２としても知られる経口投与リボフラビンは、ヒト志願者においてＦ．プラウスニッツィイの絶対的及び相対的な集団の個数を上昇させ得ることが見出された。ブチレート生成も同様に促進された。さらに、シンバイオティクス製剤は、Ｆ．プラウスニッツィイを好気条件下で安定させるために開発されたため、この高度酸素感受性の有機体をプロバイオティクスとして使用することを可能とする。
【０００７】
従って、一実施形態では、本発明は、動物の胃腸管においてＦ．  プラウスニッツィイを選択的に刺激するための食品組成物、医薬組成物、食品又は健康補助食品の製造のための、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩の使用を提供し、リボフラビンは、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０１〜２ｍｇの量が使用される使用される。
【０００８】
ビタミンＢ２としても知られるリボフラビンは、ヒト及び他の哺乳類の健康維持において重要な働きをする微量栄養素である。補助因子ＦＡＤ及びＦＭＮの中心成分であるため、全フラビンタンパク質に必要である。リボフラビン自体は、非常に様々な細胞プロセスに必要である。エネルギー代謝、及び、脂肪、ケトン体、炭水化物及びタンパク質の代謝にて重要な働きをする。リボフラビンは、アスパラガス、ポップコーン、バナナ、柿、オクラ、チャード、カッテージチーズ、乳、ヨーグルト、肉、卵、魚及びサヤインゲンにおいて、自然下に存在している。他の供給源は、特定のチーズ、緑色葉野菜、レバー、腎臓、マメ科植物、トマト、イースト、マッシュルーム及びアーモンドである。
【０００９】
リボフラビンは、幾つかの臨床及び治療状況で使用されてきた。３０年以上に渡ってリボフラビンのサプリメントは、新生児黄疸の光療法治療の一部として使用されてきた。乳児への照射に使われる光は、黄疸を引き起こす毒素であるビリルビンだけでなく乳児の血液中に自然に発生するリボフラビンも分解するため、追加の補給が必要となる。高用量のリボフラビンは、単独又はベータブロッカーとの併用で、偏頭痛の予防に有用であるように思われる。特に１日５００ｍｇのクエン酸マグネシウムの補給及び、一部の例では、コエンザイムＱ１０の補給と併用して、１日４００ｍｇの投与が、偏頭痛の予防に有効に使用されてきた。リボフラビンとＵＶ光との併用は、血液製剤にみられる病気を引き起こす有害な病原菌の能力の低下に有効であることが示されてきた。近年、リボフラビンは角膜の円錐角膜障害の進行を遅らせる又は止める新規治療に使用されてきた。本発明前は、有益な腸内細菌に対するプレバイオティクスとしてのリボフラビンの役割は開示されてきていない。
【００１０】
リボフラビンはそのままで使用され得、又は経口摂取に適した任意の好ましい製剤に組み入れられ得る。製剤は液体又は固体であり得る。食料製品、医薬組成物、食品又は健康補助食品であることが好ましい。例えば、食料製品は乳又はヨーグルト飲料である。好ましい態様では、リボフラビンが被覆カプセル内に含まれているため、結腸にリボフラビンを送達することが可能となる。いくつかの実施形態では、例えば、液体製品へのリボフラビンの取り込みを促進するために、より溶けやすい形態であるリボフラビン−５’−リン酸塩（Ｅ１０１ａ）又はリボフラビンの５’−モノリン酸エステルのモノナトリウム塩（Ｅ１０６）が使用され得る。
【００１１】
リボフラビンによるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の選択的な刺激は、十分なリボフラビンが大腸／結腸に到達し全てが小腸で吸収されないことを確実にするため、体重１ｋｇ当たり１日少なくとも０．０１〜２ｍｇの量を使用することで達成し得ることが見出された。本発明の目的に対して有効なリボフラビンの用量は、推奨される１日摂取量（成人男性で１．５ｍｇ／日）より約５０倍高く、リボフラビン欠乏症の治療の６〜１０ｍｇ／日より少なくとも１０倍高いことが見出された。しかし、リボフラビン補給の用量、頻度及び期間は、例えば個体の健康状態及び体重といった様々な要因に左右される。当業者は、通常の知識と経験に基づきそれらを決定することができる。一実施形態では、１日当たり、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜１００ｍｇの量のリボフラビンが使用される。リボフラビンは、好ましくは少なくとも３日間連続、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間使用する。ヒト個体における非常に優れた結果は、１４日間以上、１日当たりリボフラビンを少なくとも５０ｍｇ、好ましくは少なくとも１００ｍｇ、１回経口投与した後に得られた。但し、頻度、用量及び／又は全治療期間が下回ることも又は上回ることも同様に想定される。リボフラビンは１日１回の投与が好ましい。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、Ｆ．プラウスニッツィイのプレバイオティクスとしての、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩の使用に関する。このプレバイオティクス使用は、重要な治療用途を備える。本開示内で使用するプレバイオティクス使用とは、好ましくは腸においてＦ．プラウスニッツィイの個数及び相対的割合を選択的に増加させることにより、消化器系においてＦ．プラウスニッツィイの増殖及び／又は活性を刺激するためにリボフラビンを使用することを示す。細菌は内因性及び／又は外因性（例えば、本発明にかかるシンバイオティクス組成物の摂取による）であり得る。胃腸管の多数のＦ．プラウスニッツィイ（及び多数の他の細菌）は、特に、例えばＦＩＳＨ分析、定量リアルタイムＰＣＲ又はハイスループットの１６ＳｒＲＮＡシークエンシングといった分子技術を使用する先行技術でよく知られている方法を使用して、便サンプルを分析することにより容易に定量できる。Ｆ．プラウスニッツィイの活性は、有益な発酵生成物、好ましくはブチレートを測定することで定量することができる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、Ｆ．プラウスニッツィイを、それを必要とする動物、例えば哺乳類の胃腸管において選択的に刺激する方法であって、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩を、胃腸管においてＦ．プラウスニッツィイの増殖を選択的に刺激するのに有効な量でその動物に投与することを含む方法を提供する。動物は、ヒト、ペット又は家畜であり得る。このため、本発明の獣医学的な使用も同様に包含される。例えば、本発明は、ペット又は家畜においてＦ．プラウスニッツィイの個数を増加させる方法も同様に提供する。ある特定の態様では、家畜は家禽、例えば鶏である。例えば、本発明は、トリの砂嚢においてＦ．プラウスニッツィイの増殖を維持、支援又は刺激する方法を提供する。砂肝（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｕｓ）、胃咀嚼器（ｇａｓｔｒｉｃｍｉｌｌ）及び砂ずり（ｇｉｇｅｒｉｕｍ）とも称される砂嚢は、鳥類、は虫類、ミミズ、一部の腹足類及び一部の魚類を含む一部の動物の消化管に見られる器官である。
【００１４】
動物は、ヒト対象であることが好ましい。一実施形態では、ヒト対象は、炎症性の胃腸疾患、特にクローン病又は関連する大腸炎に罹患している。従って、同様に、胃腸管におけるＦ．プラウスニッツィイの増殖の維持、支援又は刺激に有効な量のリボフラビンを必要とする対象に投与することを含む、炎症性の胃腸障害に関連する症状を予防、治療又は低減する方法も同様に提供する。典型的な炎症性の胃腸障害を持ち、リボフラビンによる胃腸管のＦ．プラウスニッツィイの個数の増加の利益を受け得る個体には、クローン病、炎症性大腸炎及び潰瘍性結腸炎の患者が含まれる。同様に、患者が胃腸管のＦ．プラウスニッツィイの個数の回復又は増加の利益を受ける他の疾患、症状又は障害の治療も包含される。
【００１５】
本発明の他の態様は、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩、及びシステインと混合された生きたブチレート生成嫌気性細菌を含むシンバイオティクス組成物に関する。この混合物は、製造、貯蔵及び／又は消費中、これらの細菌を周囲空気への曝露から驚くほどよく保護することが見出された。例えば、周囲空気への曝露に少なくとも２４時間耐えることができ、模擬胃腸液中での安定性は少なくとも２時間であることが観察され得る。同様に、本発明に準じるシンバイオティクス製剤は、食料製品、例えば乳又はヨーグルト飲料と混合された場合、少なくとも２時間安定し得る。リボフラビンが使用されることが好ましい。これにより、本発明は、酸素に曝露しても安定している、安定した及びコスト効率のよいシンバイオティクス製剤を提供する。システインを他の抗酸化剤、例えばクエルセチン又はアスコルビン酸に置き換えると望ましい結果は得られなかったことから、システインの寄与は驚くほど特有であることが示唆される。
【００１６】
本発明に準じたシンバイオティクスの組み合わせは、動物の腸管における、有益な（すなわち、食品グレードで非病原性の）ブチレート生成嫌気性細菌の再導入又は個数の増加のための食料補助食品として有益である。一般に、細菌は、治療上有効な用量及び／又は予防上有効な用量が投与され得る。細菌が生存可能な形態で存在する場合、これらの細菌は腸にコロニーを形成し増殖することができるという事実を考慮するとどのような濃度であっても理論上は有効である。
【００１７】
本発明にかかる組成物は、一般に、本組成物の１日の用量がブチレート生成嫌気性細菌１０４〜１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）を含むことが好ましい。特に好適な１日の用量は１０６〜１０１０ｃｆｕである。本発明にかかる組成物は、本組成物の乾燥重量１グラム当たり１０２〜１０１０ｃｆｕのブチレート生成嫌気性細菌を含んでもよく、好ましくは１０６〜１０９コロニー形成単位、より好ましくは１０６〜１０８ｃｆｕの細菌を含む。
【００１８】
一実施形態では、ブチレート生成嫌気性細菌は、ファーミキューテス門、好ましくはクロストリジウムレプタム系統発生グループのメンバーである。好ましい態様では、シンバイオティクス組成物にＦ．プラウスニッツィイが含まれる。本発明にかかる組成物は、本組成物の乾燥重量１グラム当たり、１０２〜１０１０ｃｆｕのＦ．プラウスニッツィイを含んでもよく、好ましくは１０６〜１０９コロニー形成単位、より好ましくは１０６〜１０８ｃｆｕのＦ．プラウスニッツィイを含み得る。Ｆ．プラウスニッツィイ株ＶＰＩ  Ｃ１３−２０−Ａ、ＡＴＣＣナンバー２９７３９は、ＬＧＣ／ＡＴＣＣ米国菌培養収集所、ドイツヴェセルのＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社から入手可能である。Ｆ．プラウスニッツィイ株Ａ２−１６５、ＤＳＭナンバー１７６７７は、ドイツブラウンシュワイクのＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）から入手可能である。
【００１９】
例えばルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｉ）、ビフィズス菌及びラクノスピラ菌の群から選択される、ブチレートを生成する２以上の異なる細菌の混合物が存在し得る。一実施形態では、ロゼブリア又はアナエロスティペス属、又はユウバクテリウムハリイ種に属するものから追加のブチレート生成生物が選択される。
【００２０】
リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩は、本組成物の総乾燥重量に基づき、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％の量で存在する。例えば、本組成物の総乾燥重量に基づき、２〜１０％又は０．０５〜０．２５％のように、０．０５〜１０％、好ましくは１〜１０％含有され得る。システインは、本組成物の総乾燥重量に基づき、好ましくは少なくとも０．０５％の量で存在する。最大２％含有されるシステインは、適切に使用される。例えば、本組成物には、本組成物の総乾燥重量に基づき、０．１〜１．５％、０．５〜１％又は０．０５〜０．２％のシステインが含有され得る。
【００２１】
一般的には、システインとリボフラビンを有する製品は、小型で十分保護される。しかし、調剤は技術的に困難であり得る。充填剤（例えば、コーンスターチ又は小麦ふすま）を追加した場合、かさ容積が増加し、酸素の透過が容易となり、水分を引き寄せ得るだろう。製品の安定性を向上させるためには、充填剤の追加前に、イヌリンで細菌と抗酸化剤を含有する細粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）をコーティングすることが必須である。
【００２２】
このため、本組成物は、イヌリン又はイヌリンタイプのフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）を含むことが好ましい。イヌリンは主に果糖単位から構成されるポリマーであり、典型的には末端グルコースを備える。イヌリンの果糖単位はβ（２→１）グリコシド結合により連結している。一般に、植物性イヌリンは、２０〜数千の果糖単位を含む。イヌリンタイプのＦＯＳは、イヌリン、又は、末端α（１→２）結合Ｄ−グルコースとβ（２→１）結合で結合したＤ−フルクトース残基のポリマーであるポリフルクトースの分解により生成される。イヌリンの重合度は１０〜６０の範囲にある。イヌリンは、酵素的又は化学的に分解され、一般的な構造がＧｌｕ−（Ｆｒｕ）ｎ（ＧＦｎ）及びＦｒｕｍ（Ｆｍ）（ｎ及びｍは１〜７の範囲）であるオリゴ糖の混合物となり得る。イヌリンタイプのＦＯＳは、重量パーセントに基づき、約２％〜１０％使用されるのが適切である。
【００２３】
リボフラビンとシステインがイヌリンタイプのオリゴ糖、難消化性澱粉及び小麦ふすまとともに補充された場合、周囲空気に曝露された後の細菌の生存率は非常に優れていた。難消化性澱粉（ＲＳ）とは、健康な個体の小腸における分解を免れる澱粉及び澱粉分解生成物を示す。シンバイオティクス製剤は、難消化性澱粉を乾燥重量に基づいて４０％〜６５％含むことが好ましい。コーンスターチが好ましい。小麦ふすまは、我々の食事の一般的な繊維供給源であり、不溶性非澱粉性多糖類及びビタミン類の豊かな供給源であると考えられている。現在のシンバイオティクス製剤中に、小麦ふすまが乾燥重量に基づいて本組成物の２０％〜４０％を構成することが好ましい。小麦ふすまは、例えばセリアック病患者に使用するため、類似の特性を備えるグルテンを含有しない代替的なふすまであるソバふすまに置き換え得る。
【００２４】
従って、本発明は、ブチレート生成嫌気性細菌、好ましくはＦ．プラウスニッツィイを周囲空気への曝露による有害な影響から保護するための方法であって、細菌を、リボフラビン及びシステインを含み、好ましくはさらにイヌリン、難消化性澱粉及び（ソバ）小麦ふすまを含む組成物に調剤することを含む方法も同様に提供する。本開示で使用されている、「周囲空気への曝露による有害な影響から保護する」とは、２４時間の保管で、ＣＦＵの最初の個数の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％を維持することを示す。
【００２５】
本発明者らは、フィーカリバクテリウムがシステイン、リボフラビン及びイヌリンとともに調剤された場合、取り扱い困難な泡状物質が得られたことを観察した。そこで、コーンスターチと小麦ふすまの充填剤としての使用可能性を試験した。明らかに、これら２つの化合物には、これら化合物単独又はイヌリンとの併用のいずれの場合もフィーカリバクテリウムに対する保護効果はなかった（表１及びデータ非表示）。しかし、コーンスターチ及び小麦ふすまをイヌリン、リボフラビン及びシステインと併用した場合、フィーカリバクテリウムの最大生存率（６０％以下）に近い値が観察された。この混合物によると、非常に大きいかさ容積を備える固い小型の細粒が生じるため、この知見は重要である。このように、イヌリンが安定剤であるのに対してリボフラビンとシステインは保護効果を提供する。澱粉と小麦ふすまは、製剤の容易な製造を可能とする充填剤である。従って、同様に、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイを周囲空気への曝露による有害な影響から保護するための方法であって、当該方法は、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ細菌を（ｉ）リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩、（ｉｉ）システイン、（ｉｉｉ）イヌリン、（ｉｖ）コーンスターチ、及び、（ｖ）小麦ふすまを含む組成物中に調剤することを含み、前述した調剤は、細菌、リボフラビン及びシステインを含有する細顆を提供することと、コーンスターチ及び小麦ふすまを追加する前に前述した細顆をイヌリンでコーティングすることとを含む方法も提供される。
【００２６】
同様に、例えばトレハロースといったさらなる１以上の抗凍結剤の追加も対象となる。イヌリンとトレハロースの組み合わせが好ましい。
【００２７】
もちろん、本組成物は、さらなるプレバイオティクス及び／又はプロバイオティクスを含むさらなる有用な成分も含有し得る。有用なプロバイオティクス細菌は、乳酸菌、ビフィズス菌又はこれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。プロバイオティクス細菌は、確立されたプロバイオティクス特性を備える任意の乳酸菌又はビフィズス菌であり得る。例えば、ビフィズス菌の腸内微生物叢の発達を促進することもでき得る。適切な追加のプロバイオティクスは、ビフィズス菌、乳酸菌、連鎖球菌及びサッカロミセス又はこれらの混合物からなる群から選択され得、特に、ビフィドバクテリウム  ロンガム、ビフィドバクテリウム  ラクティス、ラクトバチルス  アシドフィラス、ラクトバチルス  ラムノサス、ラクトバチルス  パラカゼイ、ラクトバチルス  ジョンソニー、ラクトバチルス  プランタラム、ラクトバチルス  サリバリウス、エンテロコッカス  フェシウム、サッカロミセス  ボウラルディ及びラクトバチルス  レウテリ又はこれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、ラクトバチルス  ジョンソニー（ＮＣＣ５３３、ＣＮＣＭ１−１２２５）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（ＮＣＣ４９０、ＣＮＣＭ１−２１７０）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（ＮＣＣ２７０５、ＣＮＣＭ１−２６１８）、ビフィドバクテリウム  ラクティス（２８１８、ＣＮＣＭ１−３４４６）、ラクトバチルス  パラカゼイ（ＮＣＣ２４６１、ＣＮＣＭ１−２１１６）、ラクトバチルス  ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）、ラクトバチルス  ラムノサス（ＮＣＣ４００７、ＣＧＭＣＣ１．３７２４）、エンテロコッカス  フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）及びこれらの混合物からなる群から選択される。一実施形態では、さらなるプロバイオティクスは、抗炎症性分子の送達媒体として機能する食品グレードの非病原性組み換え細菌であり得る食品グレードの細菌を含む。例えば、ＷＯ２０１１／０８６１７２号明細書及び当該明細書で引用される参考文献を参照されたい。有用な増殖基質にはセロビオース及びラクツロースが含まれる。製剤は、例えばマルトデキストリン又はプルランといった賦形剤及び増量剤を含有し得る。
【００２８】
同様に、本発明にかかるシンバイオティクス組成物を調製する方法も提供される。前述の化合物は、従来の湿式造粒法で混合され凍結乾燥により粉体形状にされ得る。本発明にかかる組成物は、水分活性０．２未満、例えば０．１９〜０．０５の範囲、好ましくは０．１５未満である粉体形状で提供され得る。本組成物は、常温保存可能な粉体であり得る。水分活性が低いため、このように常温保存可能であり、長期保管期間後であってもプロバイオティクス微生物が生存したままであることが確保される。水分活性すなわちＡｗは、系内の水のエネルギー状態の尺度である。水の蒸気圧を等しい温度における純水の蒸気圧で割った値で定義される。このため、純粋な蒸留水は正確に「１」の水分活性を備える。得られた粉体は、経口投与するため、圧縮してタブレットにしたり、カプセル又はテトラパック袋に注入され得る。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、食物補助食品、健康補助食品又は治療薬としての、シンバイオティック組成物の使用に関する。一実施形態では、随意に、Ｆ．プラウスニッツィイの増殖を選択的に刺激するためのプレバイオティクスとしての追加的なリボフラビンの使用と併用して、哺乳類の胃腸管においてＦ．プラウスニッツィイの個数を増加又は回復する方法に使用され得る。シンバイオティクス製剤は、１日当たりの投与量１００ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で経口投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】リボフラビン１００ｍｇ／日、２週間の介入試験中における志願者８名の便サンプル中のＦ．プラウスニッツィイ及び全細菌の個体数及び比率。（上のパネル）１グラム当たりのＦ．プラウスニッツィイの個体数。摂取前（２サンプルの平均）、摂取中（２サンプルの平均）及び摂取後（１サンプル）；（真ん中のパネル）全細菌；（下のパネル）全細菌に占めるＦ．プラウスニッツィイの割合。
【図２】リボフラビン１００ｍｇ／日、２週間の介入前、介入中及び介入後における志願者８名の便サンプル中のクロストリジウム群ＸＩＶａ細菌の個数。
【図３】リボフラビン１００ｍｇ／日、２週間の介入前、介入中及び介入後における志願者８名の便サンプル中の大腸菌様細菌とＦ．プラウスニッツィイ（細胞／ｇ）の個数の比較。この比較では、Ｆ．プラウスニッツィイの個数（右軸）は、大腸菌の個数（左軸）の前面にプロットしている。逆相関に注意されたい。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３１】
実施例１：リボフラビン介入試験
リボフラビンが腸のフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイの個数に与える影響を調査するため、ヒト介入試験を実施した。志願者８名の群（体重６０〜９０ｋｇ）は、リボフラビンのサプリメント１００ｍｇを１日１回、１４日間経口摂取するよう求められた。
【００３２】
摂取２週間前の期間に２つのサンプルをベースラインサンプルとして採取し、２つのサンプル（１週間につき１つ）を摂取中に、１つのサンプルを摂取１週間後に採取した。Ｆ．プラウスニッツィイ及び他の細菌群の個数は、前述したように特定のプローブを使ったＦＩＳＨ法で定量した（ハームセンら（Ｈａｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）著「アプリ  エンヴァイロン  ミクロビオール（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）」２００２年６月、第６８巻、第６号、ｐ．２９８２〜９０）。摂取前及び摂取中に採取したサンプルのフィーカリバクテリウムの個数を平均し、全サンプルについて図１にプロットした。その結果、試験を実施した全志願者で、個体７を除き、フィーカリバクテリウムの個数は、摂取中に増加し、摂取を終了すると再び減少した。
【００３３】
Ｆ．プラウスニッツィイの個数も同様に、便における他の細菌と比較して増加した。Ｆ．プラウスニッツィイの割合は、リボフラビンを摂取中の８サンプル中７サンプルで増加した。他の細菌群、例えばブチレート生成クロストリジウム群ＸＩＶａは増加しなかった（図２）。摂取前及び摂取中に算出したフィーカリバクテリウム／クロストリジウム群ＸＩＶａの割合は、全例で増加したことから、フィーカリバクテリウムが相対的に増加していることが示された。同様に、２つの潜在的な病原菌、例えば腸内細菌科、大腸菌様細菌（大腸菌は腸に最も多い）及び腸球菌の個数も計測した。最後の群は、介入中増加しなかった非常に少ない個数が検出されたのみであった。大腸菌の個数は、サンプル間で大きな変動が見られた（図３）。しかし、その個数は、リボフラビン摂取中、試験を実施した全個体において減少又は同じ値に留まった。さらに、フィーカリバクテリウムと大腸菌様細菌の個数の間には逆相関が検出された（図３、下方パネル）。大腸菌が多かった場合、フィーカリバクテリウムの個数は比較的少なかった。リボフラビンの投与で、この状況は改善、すなわちフィーカリバクテリウムの方に比率は移行した。
【００３４】
実施例２：周囲空気への曝露後におけるＦ．プラウスニッツィイのシンバイオティクス製剤の安定性
好気条件下で少なくとも２４時間安定である生きたフィーカリバクテリウムを備える製剤を生成するため、一連の実験を異なる成分の組み合わせで実施した。フィーカリバクテリウムは、ブロス培地中で一晩増殖させ、遠心分離し、ペレットを嫌気性リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄し再び遠心分離を行った。ペレットは、表１に示す成分を含有するＰＢＳと混合した。混合物は−２０℃で凍結し、次に凍結乾燥した。
【００３５】
凍結乾燥後、製剤を指定期間、空気に曝露した。調製物はリン酸緩衝液に再懸濁し、１０倍希釈系列を嫌気性増殖寒天培地に置いた。コロニー形成単位を計測し、曝露していないｔ＝０の時点と比較した。
【００３６】
表１：異なる製剤におけるＦ．プラウスニッツィイの生存率
【表１】
2018111711.tif 000002
【００３７】
表１は、シンバイオティクス製剤におけるＦ．プラウスニッツィイの安定性はいくつかの要因に左右されることを実証している。
・可逆性酸化還元反応を持つ、抗酸化剤のシステイン及びリボフラビンの存在。この保護効果は、クエルセチン又はアスコルビン酸のような他の抗酸化剤では観察されなかった。クエルセチンは不可逆的に酸化され、アスコルビン酸は水分が存在すると安定しないため、これらは保護効果を持たなかった。
・抗酸化性の酸化還元媒介剤により酸素透過から良好に保護するためには、細粒が小型であること又は例えばイヌリンといった凍結保存剤（ｃｒｙｏ−ｐｒｅｓｅｒｖａｎｔ）でコーティングすることが好ましい。イヌリンでコーティングされた場合にのみ、小麦ふすま又はコーンスターチの追加が有効である。また、イヌリンは小麦ふすま又はコーンスターチより水分を引き付けない。
【００３８】
実施例３：シンバイオティクス組成物の例
【００３９】
ステップ１
細菌の培養
Ｆ．プラウスニッツィイ株Ａ２−１６５（ＤＳＭ１７６７７）を、酵母エキス、カシトン、脂肪酸及びグルコース（ＹＣＦＡＧ）寒天培地上でサンプル１０μｌを培養することで、グリセロールストック（−８０℃）から戻した。培養物は、３７℃における、Ｈ２１０％、ＣＯ２１０％及びＮ２８０％（ｖ／ｖ）混合ガスを備える嫌気性のテント（ｔｅｎｔ）内の、ＹＣＦＡＧ培地上で、培養及び通常通りの維持がなされた。種培養液は、Ｆ．プラウスニッツィイ株の単一コロニーをＹＣＦＡＧ培養液５ｍｌに播種し、６００ｎｍ（Ａ６００）の光学密度（ＯＤ）が０．８以下となるまで１２時間〜１６時間培養して得た。種培養液１ｍｌを新鮮ＹＣＦＡＧ培地５０ｍｌに播種した（２％ｖ／ｖで播種）。培養物は、ＯＤＡ６００が０．８±０．２以下に到達するまで１２時間〜１６時間培養した。細胞は、１７℃１０分間、２７００ｇで遠心分離し、採取した。ペレットは、殺菌した嫌気性食塩水（０．８５％食塩と０．０５％システイン）で１度洗浄した。
【００４０】
ステップ２
製剤手順
【００４１】
組み合わせ１：イヌリンとシンバイオティクス繊維の混合物
ステップ１に準じて得られた細菌ペレット（５×１０８〜２×１０９の細菌を含有）を、イヌリン１０％（ｗ／ｖ）及びシステイン１６．５ｍＭを含有する溶液０．４ｍｌに懸濁した。ペレットを再懸濁した後、リボフラビンの貯蔵液０．２ｍｌ（１６．５ｍＭ）を追加した。完全に混合した後、小麦ふすま０．５ｇとコーンスターチ０．９ｇを追加し、その結果生じたスラリーを湿式造粒した。湿潤細粒は、少なくとも３時間、−２０℃で凍結した。凍結後、細粒を少なくとも３時間凍結乾燥した。
【００４２】
組み合わせ２：トレハロースとシンバイオティクス繊維の混合物
ステップ１に準じて得られた細菌ペレットを、トレハロース１０％及びシステイン１６．５ｍＭを含有する溶液０．４ｍｌに懸濁した。ペレットを再懸濁した後、リボフラビンの貯蔵液０．２ｍｌ（１６．５ｍＭ）を追加した。完全に混合した後、小麦ふすま０．５ｇとコーンスターチ０．９ｇを追加し、その結果生じたスラリーを湿式造粒した。湿潤細粒は、少なくとも３時間、−２０℃で凍結した。凍結後、細粒を少なくとも３時間凍結乾燥した。
【００４３】
組み合わせ３：イヌリン又はトレハロースとのシンバイオティクス混合物
ステップ１に準じて得られた細菌ペレットを、イヌリン又はトレハロース１０％及びシステイン１６．５ｍＭを含有する溶液１．６ｍｌに懸濁した。溶液は、システインの追加前にＮ２でパージした。ペレットを再懸濁した後、リボフラビンの貯蔵液０．２ｍｌ（１６．５ｍＭ）を追加した。完全に混合した後、その結果生じたスラリーを少なくとも３時間、−２０℃で凍結した。凍結後、細粒を少なくとも３時間凍結乾燥した。
【００４４】
組み合わせ４：プロバイオティクス混合物
ステップ１に準じて得られた細菌ペレットを、システイン１６．５ｍＭの溶液０．４ｍｌに懸濁した。ペレットを再懸濁した後、リボフラビンの貯蔵液０．２ｍｌ（１６．５ｍＭ）を追加した。完全に混合した後、その結果生じたスラリーを少なくとも３時間、−２０℃で凍結した。凍結後、細粒を少なくとも３時間凍結乾燥した。
【００４５】
組み合わせ５：イヌリン及び追加のリボフラビンとシンバイオティクス繊維の混合物
ステップ１に準じて得られた細菌ペレット（５×１０８〜２×１０９の細菌を含有）をイヌリン１０％（ｗ／ｖ）とシステイン１６．５ｍＭを含有する溶液０．４ｍｌに懸濁した。ペレットを再懸濁した後、リボフラビンの貯蔵液０．２ｍｌ（１００ｍＭ）を追加した。完全に混合した後、小麦ふすま０．５ｇとコーンスターチ０．９ｇを追加し、その結果生じたスラリーを湿式造粒した。湿潤細粒は、少なくとも３時間、−２０℃で凍結した。凍結後、細粒を少なくとも３時間凍結乾燥した。
【００４６】
ステップ３
安定性及び生存率試験の手順
ステップ２に準じて得られた凍結乾燥した細粒は、周囲の好気的条件の下、気密容器に貯蔵した。安定性及び生存率試験のため、細粒を規定の期間、最大２４時間、周囲空気に曝露した。好気への曝露後、細粒を嫌気性のテント（ｔｅｎｔ）下で嫌気的に処理した。細粒を希釈し、システイン０．０５％が補充された無酸素リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で水戻しし、１０倍希釈系列をＹＣＦＡＧ寒天培地に置いた。コロニー形成単位は、３７℃で２４時間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニーを計測することで定量した。
【００４７】
（付記）
（付記１）
動物の胃腸管においてフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を選択的に刺激するための食品組成物、医薬組成物、食品又は健康補助食品の製造のためのリボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩の使用であって、
リボフラビンは、体重１ｋｇ当たり１日０．０１〜２ｍｇの量で使用される、使用。
【００４８】
（付記２）
前記動物は哺乳類であり、好ましくはヒト対象である、付記１に記載の使用。
【００４９】
（付記３）
前記ヒト対象は、炎症性の胃腸疾患、特にクローン病に罹患している、付記２に記載の使用。
【００５０】
（付記４）
リボフラビンは、体重１ｋｇ当たり１日０．１〜２ｍｇの量で使用される、付記１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【００５１】
（付記５）
リボフラビンは、少なくとも３日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間投与される、付記１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【００５２】
（付記６）
リボフラビンは、１日１回の用量として投与される、付記１〜５のいずれか１つに記載の使用。
【００５３】
（付記７）
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイのプレバイオティクスとしての、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩の使用。
【００５４】
（付記８）
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイを、それを必要とする動物の胃腸管において選択的に刺激する方法であって、
リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩を、前記胃腸管においてフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイの増殖を選択的に刺激するのに有効な量で、前記動物に投与することを含む、方法。
【００５５】
（付記９）
シンバイオティクス組成物であって、
（ｉ）生きている有益なブチレート生成嫌気性細菌、
（ｉｉ）前記組成物の総乾燥重量に基づき少なくとも０．０５％の量の、リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩、及び、
（ｉｉｉ）システイン、
を含む、シンバイオティクス組成物。
【００５６】
（付記１０）
リボフラビン、リン酸リボフラビン又はその塩は、前記組成物の総乾燥重量に基づき少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％の量で存在する、付記９に記載の組成物。
【００５７】
（付記１１）
システインは、前記組成物の総乾燥重量に基づき０．０５〜２％の量で存在する、付記９又は１０に記載の組成物。
【００５８】
（付記１２）
イヌリン又はイヌリンタイプのフラクトオリゴ糖を、好ましくは前記組成物の総乾燥重量に基づき２〜１０％の量で、さらに含む、付記９〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
【００５９】
（付記１３）
充填剤を、好ましくは前記組成物の総乾燥重量に基づき４０〜６５％量で、さらに含む、付記９〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【００６０】
（付記１４）
前記ブチレート生成嫌気性細菌は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門、好ましくはクロストリジウムレプタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ）系統発生グループのメンバーである、付記９〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
【００６１】
（付記１５）
前記ブチレート生成嫌気性細菌は、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイである、付記１４に記載の組成物。
【００６２】
（付記１６）
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ細菌を周囲空気への曝露による有害な影響から保護するための方法であって、当該方法は、
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ細菌を、
（ｉ）リボフラビン、リン酸リボフラビン又は生理学上許容されるその塩、
（ｉｉ）システイン、
（ｉｉｉ）イヌリン、
（ｉｖ）コーンスターチ、及び、
（ｖ）小麦ふすま又はソバふすま、
を含む組成物中に調剤することを含み、
前記調剤は、前記細菌、前記リボフラビン及び前記システインを含有する細粒を提供することと、前記コーンスターチ及びふすまを追加する前に前記細粒をイヌリンでコーティングすることとを含む、方法。
【図１】
2018111711.tif 000003
【図２】
2018111711.tif 000004
【図３】
2018111711.tif 000005