(57)【要約】      （修正有）【課題】炎症性メディエータ誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置のための組成物および方法、ならびに該方法における使用のための組み換えベクターおよび組み換えタンパク質の提供。【解決手段】ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜の新血管形成に関与する加齢性黄斑変性症の処置における使用のための、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、アデノ隨伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性の送達によって、送達される脈絡膜新血管形成の処置のためにＩＬ−１８を発現するための、組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜の新血管形成に関与する加齢性黄斑変性症の処置における使用のための、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項２】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は組み換えＩＬ−１８（ｒＩＬ−１８）である、請求項１に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項３】
前記加齢性黄斑変性症は、滲出型加齢性黄斑変性症である、請求項１または２に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項４】
滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症のリスクがある患者における脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）の調節および／または抑制における使用のための、請求項１〜３のいずれか1項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項５】
ＶＥＧＦの産生を妨げ、かつ脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）発症に対して防御効果を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項６】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、全身的に、および／またはウイルス媒介性の送達によって送達される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項７】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、注射によって送達される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項８】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、静脈内注射によって送達される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項９】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、局所的に送達される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１０】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が眼内注射により送達される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１１】
前記インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、網膜下、硝子体内注射、眼球後方、結膜下および／またはテノン嚢下の注射を介して送達される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１２】
眼への送達のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１３】
網膜への送達のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１４】
脈絡膜への送達のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１５】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、新生血管疾患の発症前、または初期段階の新生血管疾患において、被験体に投与される方法における使用のための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１６】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、網膜へ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性の送達によって送達される、請求項４に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１７】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、網膜へ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性の送達によって送達され、ここで、誘導性のＩＬ−１８を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が網膜に送達される、請求項４に記載の使用のためのインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）。
【請求項１８】
脈絡膜新血管形成の処置のためにＩＬ−１８を発現するための、組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
【請求項１９】
滲出型のＡＭＤを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のための形態の、請求項１８に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、眼内注射によって眼に送達するためのベクターである、請求項１８または１９に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
【請求項２１】
前記ベクターが、網膜下、硝子体内、眼球後方、結膜下および／またはテノン嚢下注射を介して眼に送達するためのベクターである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達ベクターである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性性の網膜状態の処置のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
具体的には、本発明は、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置のための組成物および方法に、ならびにドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態、例としては、病理的誘導性のＣＮＶの処置または予防のために適切な、炎症性メディエータ、ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質を含む、選択された遺伝子産物の発現に関する遺伝子送達ベクターの使用に関する。好ましくは、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態とは、加齢性黄斑変性症である。
【０００３】
先進国では、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高齢者における法律上の盲目の最も高頻度の原因である。ＡＭＤは、進行性の疾患であり、眼の検査でドルーゼンとして認識される、黄斑における網膜色素上皮（ＲＰＥ）下のブルッフ膜への限局性の細胞外沈着の蓄積によって特徴づけられる。ドルーゼンの蓄積は、委縮型および滲出型のＡＭＤの両方に共通の主な病理学的特質である。黄斑におけるドルーゼンの存在、沈着の密度およびこの材料によって覆われる領域は、ＡＭＤ疾患の早期段階に相当する。ドルーゼンを有する個体は、ＡＭＤの終末期の盲目型に進行するリスクがあると考えられる。ＡＭＤの委縮（ａｔｒｏｐｈｉｃ）「委縮（ｄｒｙ）」型の終末期である地図状委縮（ＧＡ）は、網膜中心窩の下のＲＰＥの局所変性に続いて視覚の喪失で終わる。ＲＰＥなしでは、中心窩錐体光受容体は変性して、網膜中心の失明を生じる。脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）は、浸出性（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ）「滲出（ｗｅｔ）」型のＡＭＤの終末期を特徴付け、ここでは新しい血管がブルッフ膜／ＲＰＥを突き破って出血して、ＲＰＥと中心窩光受容体との間で血餅が形成されて直ちに失明することになる。
【０００４】
疾患、ＡＭＤは、古典的に多因子性であって、環境要因および遺伝子要因の両方が関与する。疾患の感受性に関連する配列の改変体は現在、ますます増大する免疫調節遺伝子で特徴付けられている。眼の表面上の補体の活性化は、ドルーゼン沈着を生じる早期疾患プロセスで主要な役割を果たすと考えられる。しかし、ＡＭＤ被験体の眼で観察された炎症性応答の開始に関与する機序はまだ解決されていない。
【０００５】
ドルーゼン沈着は、微粒子状のタンパク質の凝集物で、実際は細胞外で、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有プロテイン３（ＮＬＲＰ３）によって媒介される無菌性の炎症性応答の公知の活性化因子の特徴である。ＮＬＲＰ３は、「危険な」信号、例えば、ＡＴＰ、尿酸結晶、アミロイド様構造およびミトコンドリア機能不全の受容体として機能し、これは、インフラマソーム（ＮＬＲＰ３、カスパーゼ−補充ドメイン（ＡＳＣ）を含むアポトーシス関連Ｓｐｅｃｋ様ドメインおよびプロカスパーゼ−１を含み、ｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびｐｒｏ−ＩＬ−１８をそれらの成熟炎症促進性型に切断する）を活性化する。さらに過剰なドルーゼン蓄積は、隣接するＲＰＥ細胞を破壊し得、この細胞はその後、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化することが現在公知の細胞の過程である壊死によって死ぬ。
【０００６】
現在の抗体ベースの治療は、ＶＥＧＦの生物活性を阻害することによってＡＭＤの進行型を標的としている。しかし、これらのモノクローナル抗体（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標））の直接かつ規則的な眼内注射には、網膜の剥離、出血および感染のリスクがある。ＦＤＡの認可した処置で、委縮型黄斑変性症に適用できるものはないが、現在少数の例が臨床治験中である。従って、新規なＡＭＤ治療の生成は商業上重要である。
【０００７】
臨床的な展望から、炎症過程は長らく、ＡＭＤの病理および疾患の発症と関連付けられてきたが、著者らは、滲出型ＡＭＤの場合に網膜の炎症の全体的な阻害が、理にかなった治療ではないことを示唆する。著者らの観察を強化するように、滲出型ＡＭＤを有する個体におけるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））の近年の臨床治験の結果では、これらの被験者のうち５０％超で、症状が徐々に悪化したことが示された。
【０００８】
ＩＬ−１８は、広範な種々の機能を有する分子であり、これらの多くは、ＩＬ−１８が放出される環境に依存してお互い反対に二分される。これは、血管形成または血管増殖を調節する際の、ＩＬ−１８の役割に関してもあてはまる。例えば、ＩＬ−１８は、関節リウマチのモデルで血管形成促進性の効果を有することが示された（Ｐａｒｋら、２００１，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ＩＬ−１８  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＩＬ−１８が新規な血管形成性メディエータである証拠）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６７：１６４４〜１６５３）が、一方で、ヘルペス間質性角膜炎では血管新生阻害性であることが示された（Ｋｉｍ  Ｂら、２００６，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇＩＬ−１８  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｔｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ（ＩＬ−１８をコードするプラスミドＤＮＡの適用は、血管新生阻害効果によりヘルペス間質性角膜炎の発症を減じる）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７５：５０９〜５１６）。血管形成剤としてのＩＬ−１８の役割と、血管新生抑制剤としてのＩＬ−１８の役割との間の矛盾についての理由は、まだ不明確であるが、部分的には、関与する特定の血管床によって決定される。
【０００９】
Ｑｉａｏら（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒａｉｚａｔｉｏｎ（インターロイキン−１８は、病理学的な眼内の新血管形成を調節する）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  ８１，Ａｐｒｉｌ  ２００７，１０１２〜１０２１）は、眼内の新血管形成の発達を誘発する、未熟児網膜症の酸素誘発性モデルを用いる。眼内の新血管形成は、内網膜にある血管の新血管形成に関与する。Ｑｉａｏらは、組み換えＩＬ−１８を、酸素誘発性網膜症の発症の間にＣ５７ＢＬ／６マウスに投与したところ、新血管形成の阻害は見出さなかった。Ｑｉａｏらは、ＩＬ−１８が、眼内網膜新血管形成を、その発症を阻害するのではなくその退縮を促進することによって、調節すると結論付けた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜新血管形成ならびに／または病理学的に誘発性のＣＮＶ、好ましくはＡＭＤに、より好ましくは滲出型ＡＭＤに関連する脈絡膜新血管形成に関与する変性性の網膜状態のための新規でかつ改良された治療に関する。
【００１１】
脈絡膜は、眼の外側であり、かつ網膜とは完全に別である、血管床である。網膜眼内血管系と同じ方式で作用するのではない。脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）とは、眼の脈絡膜の新しい血管の創出である。これは、変性性の黄斑変性症である滲出型ＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）の一般的な症状であり、Ｑｉａｏらの網膜新血管形成（眼内）とは別個である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書では、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）という用語は理想的には、網膜新血管形成（眼内）は含まない。眼内新血管形成は、内網膜にある血管の新血管形成に関与する。これは、眼の外であって網膜とは完全に別である血管床である脈絡膜に関与する脈絡膜新血管形成とは別である。理想的には、本明細書では、眼内新血管形成のためのＩＬ−１８の使用は除外される。
【００１３】
本明細書では、「ＮＬＲＰ３インフラマソーム、構成要素または基質」という用語は、ＮＡＬＰ３、ＡＳＣおよびｐｒｏ−カスパーゼ−１およびｐｒｏ−ＩＬ−１８およびＩＬ−１８を包含することが理解される。ＮＬＲＰ３、ＡＳＣおよびｐｒｏ−カスパーゼ−１がオリゴマー形成する場合、それらは、活性なカスパーゼ−１を生じ、これが次にｐｒｏ−ＩＬ１８を切断して、Ｉｌ−１８を成熟させる。従って、ｐｒｏ−ＩＬ１８は、カスパーゼ１の基質であるという事実のおかげで、インフラマソームの構成要素である。ＩＬ−１８の２４ＫＤａの不活性な前駆体は、「ｐｒｏ−ＩＬ−１８」と呼ばれ、そして１８ＫＤａの成熟ＩＬ−１８は、「ＩＬ−１８」または「炎症促進性ＩＬ−１８」と呼ばれる。ＮＬＲＰ３およびＮＡＬＰ３は、本明細書では交換可能に用いられて、同じインフラマソーム構成要素を指す。好ましい実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム、構成要素または基質は、成熟Ｉｌ−１８であって「Ｉｌ−１８」と呼ばれる。またＩＬ−１８についての言及は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１５６２．３で規定されるヌクレオチド配列、およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１５５３．１で規定されるタンパク質配列も意味することが理解される。また、ＩＬ−１８の送達に対する言及は、例えば、眼内注射を介して局所的な、または静脈内注射を介して全身性の、組み換えＩＬ−１８（ｒＩＬ−１８）の送達をカバーすることも理解される。
【００１４】
本発明者らは、ドナーのＡＭＤの眼から単離されたドルーゼンが、ＮＬＲＰ３−インフラマソームを活性化し、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の分泌を生じることを示した。さらに、また、ドルーゼン構成要素Ｃ１ＱはＮＬＲＰ３−インフラマソームを活性化もする。さらに、ＡＭＤのバイオマーカーである、酸化的ストレス関連タンパク質−修飾カルボキシエチル−ピロール（ＣＥＰ）は、インフラマソームをプライミングする。著者らは、委縮型ＡＭＤ様の病理をモデリングするＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスの網膜における活性化マクロファージにおいて、カスパーゼ−１およびＮＬＲＰ３を切断したことを見出した。本発明者らは、滲出型ＡＭＤの許容された動物モデルである、レーザー誘発性の脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）が、Ｎｌｒｐ３−／−マウスでは増悪されるが、Ｉｌ１ｒ１−／−マウスでは増悪されないということを示し、このことは直接的にＣＮＶの発達を調節する際のＩＬ−１８を意味している。これらの知見は、ＡＭＤの進行におけるＮＬＲＰ３およびＩＬ−１８の防御的な役割の指標である。
【００１５】
ＮＬＲＰ３およびその構成要素は、ＡＭＤの主要な疾患に対する防御因子として直接結びつけられるというのが本発明者らの見解である。従って、眼に対してＩＬ−１８を生じるかまたは送達することを目的とした戦略によって、特に滲出型ＡＭＤの状況では、ＣＮＶの進行を予防するのに有益性が証明され得る。
【００１６】
本発明の第一の一般的な態様によれば、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための、炎症性メディエータ、好ましくはＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質が提供される。
【００１７】
本発明の網膜（眼内）新血管形成および脈絡膜（外眼）新血管形成は、血管系の別個の状態である。本発明者らは、ＩＬ−１８が脈絡膜の新血管形成の促進を抑制することを見出した。
【００１８】
理想的には、ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質は、ＩＬ−１８であり、これには組み換えＩＬ−１８を含む。
【００１９】
理想的には、網膜の状態としては、病理学的に誘発性のＣＮＶ、例えば、ＡＭＤ、好ましくは委縮型および／または滲出型ＡＭＤ、より好ましくは滲出型ＡＭＤに関連する脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）が挙げられる。
【００２０】
本発明の一般的な態様によれば、炎症性メディエータ、構成要素または基質は、加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体におけるインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）発現を制御、維持または刺激するのに用いられ得、そして特に滲出型ＡＭＤの状況では、ＣＮＶの進行を抑制する。
【００２１】
インフラマソームの上流の構成要素も用いられ得ることが理解される。これらの構成要素としては、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣまたはｐｒｏ−カスパーゼ−１、ｐｒｏ−ＩＬ−１８などが挙げられる。しかし、ＩＬ−１８または組み換えＩＬ−１８の送達は好ましい。
【００２２】
理想的には、炎症性メディエータ、構成要素または基質、例としては、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、新生血管疾患の発症の前に投与されるか、または初期段階の新生血管疾患において投与される。
【００２３】
ドルーゼンによるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化によって、平衡が存在し得ることが示唆され、それによってドルーゼンの特定の局所レベルが、ＩＬ−１８（これは今度は抗血管新生エフェクターとして機能し得る）を誘導する能力に起因して耐容され、これは脈絡膜の恒常性を炎症性微小環境で維持する。一旦、危機的なレベルのドルーゼンが蓄積されれば、その防御の役割は、周囲の組織に対する過剰な損傷によって無効にされる可能性が高い。重要なことに、本発明者らは、ドルーゼン−誘導性の炎症性メディエータは、ＣＮＶ発達に対して防御的であること、およびＶＥＧＦの下流生成を妨げるＩＬ−１８のＮＬＲＰ３媒介性の上昇が生じることを実証した。さらに、ＩＬ−１８は、もっと通常の炎症のモデルである、実験的なブドウ膜炎の発症においては役割を果たさないことが示された。
【００２４】
一実施形態によれば、変性性の網膜の状態は、加齢性黄斑変性症である。全体を通じて呼ばれる加齢性黄斑変性症とは、滲出型加齢性黄斑変性症であっても、または萎縮型加齢性黄斑変性症であってもよいことが理解される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクのある患者において、脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）を制御する際の使用のためのインターロイキン−１８（Ｉｌ−１８）または組み換えＩＬ−１８が提供される。ＩＬ−１８の結果として得られたＮＬＲＰ３媒介性の上昇は、ＶＥＧＦの下流の生成を妨げ、これに本発明者らは、ＣＮＶ発達に対する防御性を見出した。
【００２６】
また、本明細書におけるＩＬ−１８に対する全ての言及は、組み換えＩＬ−１８（ｒＩＬ−１８）を指すことも理解されるべきである。
【００２７】
本発明の一般的な態様によれば、ＩＬ−１８または組み換えＩＬ−１８を投与して、局所的な効果または全身性の効果を生じて、もたらしてもよい。
【００２８】
ＩＬ−１８または組み換えＩＬ−１８タンパク質は、それ自体で投与されてもよい。また、ＩＬ−１８または組み換えＩＬ−１８は、薬学的組成物の形態で投与されてもよい。必要に応じて、ＩＬ−１８は、薬学的に許容されるアジュバントとともに投与されてもよい。このようなアジュバントは、担体、希釈剤および賦形剤、例えば、無菌水およびオイルを含んでもよい。さらなるアジュバント、賦形剤および補助物質は下に列挙する。
【００２９】
投与は、種々の経路を介して行われてもよいことが理解される。これらの経路は、必要に応じて局所効果または全身効果を提供するためにデザインされる。これらの経路としては、限定するものではないが、経口、局所、肺、直腸、皮下、皮内、経鼻、頭蓋内、筋肉内、眼内、または関節内の注射、などが挙げられる。投与の最も典型的な経路は、静脈内、続いて、皮下であるが、他の経路が等しく有効であり得る。また、筋肉内注射は、腕の筋肉で行っても、または足の筋肉で行ってもよい。
【００３０】
いくつかの方法では、ＩＬ−１８は、特定の組織に直接注射されてもよい。他の実施形態では、投与は、徐放性の組成物の一部であってもよい。
【００３１】
非経口投与に関して、ＩＬ−１８は、水、オイル、生理食塩水、グリセロールまたはエタノールのような無菌液であり得る薬学的な担体とともに、薬学的に許容される希釈剤中でその物質の溶液または懸濁液の注射剤形として投与され得る。さらに、補助物質、例えば、保湿剤または乳化剤、サーファクタント、ｐＨ緩衝物質などが、組成物中に存在してもよい。薬学的組成物の他の構成要素は、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、および鉱油である。一般には、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが特に注射溶液用の適切な液体担体である。
【００３２】
また、ＩＬ−１８は、デポ注射またはインプラント調製物の形態で投与されてもよく、これは、タンパク質ＩＬ−１８の徐放性を可能にするような方式で処方することができる。
【００３３】
典型的には、組成物は、注入物質として、液体溶液または懸濁剤としていずれで調製されてもよい；注射前の液体ビヒクル中の溶液中に適切な固体型、またはその中の懸濁物もまた調製され得る。この調製物はまた、送達を強化するためのポリラクチド、ポリグリコリドまたはコポリマーのようなリポソームまたはマイクロ粒子中に乳化されてもよいし、またはカプセル化されてもよい。
【００３４】
経口の処方物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとってもよい。局所適用は、経皮送達または皮内送達を生じてもよい。あるいは、経皮送達は、皮膚パッチを用いて達成されてもよい。
【００３５】
理想的には、上記の投与方式は、眼への、好ましくは網膜への、さらに好ましくは脈絡膜層へのＩＬ−１８の送達を生じる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、局所送達手段としては、ＩＬ−１８、ｒＩＬ−１８またはＩＬ−１８／ｒＩＬ−１８を含む薬学的組成物の眼への直接注射、例えば、眼内注射が挙げられる。注射は、網膜下であっても、眼の硝子体（硝子体内）であっても、眼の後ろ（眼球後方）であっても、結膜の下（結膜下）またはテノン嚢下（テノン下）に行われてもよい。
【００３７】
別の好ましい実施形態によれば、炎症促進性インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ｒＩＬ−１８またはＩＬ−１８／ｒＩＬ−１８を含む薬学的組成物を、被験体に対して全身的に送達してもよい。全身的な送達手段としては、非経口的または腸内の送達手段が挙げられ、本質的に、全ての非局所的な送達手段を包含し得る。理想的には、全身的な送達手段としては、注射、直接注射、および／またはウイルス媒介性の送達が挙げられる。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、全身的な注射技術としては、静脈内注射による静脈内送達が挙げられる。静脈内注射は、被験体の末梢静脈に対するものであってもよい。この投与経路に関しては、ＩＬ−１８、ｒＩＬ−１８またはＩＬ−１８／ｒＩＬ−１８を含んでいる薬学的組成物は、被験体の血流に直接的に投与／注射される。
【００３９】
好ましくは、ＩＬ−１８は、網膜に対して全身的に、直接の注射によって、例えば、静脈内注射および／またはウイルス媒介性の送達によって送達される。
【００４０】
ウイルス媒介性の送達技術としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達ベクターが挙げられる。必要に応じて、ウイルス媒介性の送達技術、例としては、ＡＡＶ療法を、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣまたはｐｒｏ−カスパーゼ−１を導入することによってインフラマソーム構成要素の上流に適用してもよい。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、脈絡膜、新血管形成の処置のために適切な形態で、ｐｒｏ−ＩＬ−１８またはＩＬ−１８の発現を指向する組み換えウイルス遺伝子送達ベクターが提供される。
【００４２】
組み換えウイルス遺伝子送達ベクターは、全身的投与の形態で、例えば、静脈内投与によってもよい。
【００４３】
また、組み換えウイルス遺伝子送達ベクターは、ＡＭＤ、好ましくは滲出型ＡＭＤを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のための形態であってもよい。
【００４４】
例えば、ベクターは、網膜下または硝子体内の注射を含めて、眼内注射を介した眼への送達に適切な形態であってもよい。
【００４５】
ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であっても、アデノウイルスであっても、またはレンチウイルス遺伝子送達ベクターであってもよい。理想的には、遺伝子送達ベクターの送達は、網膜下注射を介し、ここでは、例えば、少量の液体を網膜の下部に注射する。これは、単回投与後の長期間の疾患の管理に利点を有する。また、このベクターは、被験体での硝子体内投与にも最適化されてもよい。
【００４６】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態、好ましくは滲出型ＡＭＤのための新規な遺伝子治療であって、被験体に対するウイルス、好ましくはＡＡＶ媒介性のＩＬ−１８の送達の使用を含めて、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクのある被験体において、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）発現を制御、維持または刺激する遺伝子治療が提供される。
【００４７】
この好ましい実施形態によれば、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子送達ベクターであって、ＡＭＤ、好ましくは滲出型ＡＭＤを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のために適切なＩＬ−１８の発現を指向するベクターが提供される。
【００４８】
ＡＡＶベクターは、Ｉｌ−１８遺伝子をコードするヌクレオチドを含む。ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１〜１１、好ましくは血清型２、８または９のうちのいずれか１つであってもよい。理想的には、ＩＬ−１８遺伝子は、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接される。
【００４９】
多くの異なるプロモーターを用いてもよい。これらは理想的には細胞特異的プロモーターである。これらとしては、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）特異的プロモーター、例えば、ＣＲＡＬＢＰまたはＲＰＥ６５、内皮細胞特異的プロモーター、例えば、Ｔｉｅ−２もしくはクローディン−５、またはロドプシンを含む光受容体特異的プロモーターを挙げることができる。
【００５０】
ＡＡＶは、それが網膜細胞を誘導するのに極めて効果的であるので、眼の疾患に用いられる主なウイルスベクターである。またこれは、非免疫原性であって、このことは、臨床の観点から極めて重要である。ＡＡＶの技術は、宿主組織、特に網膜のような中枢神経系の組織に対して遺伝子を送達する極めて安全な手段として出現した。宿主ゲノムへ組み込むことができるアデノウイルスとは対照的に、ＡＡＶは、細胞に感染し、引き続き、それらの遺伝子材料がエピソームＤＮＡとして核中に残留する。この因子は、それらの優れた安全性プロフィールおよび低い免疫原性に重要である可能性が高い。相まって、ＡＡＶ技術は、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋ジストロフィーのためのある範囲の臨床試験で現在用いられており、この提案に関しては、ＡＡＶは、現在、網膜の用途に十分達成されており、多数の臨床試験が、Ｌｅｂｅｒ’ｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ（ＬＣＡ）と呼ばれる劣性型の網膜色素変性症の処置について進行中である。
【００５１】
今まで、１１のＡＡＶ血清型が、文献中で記載されており、それらの血清型の重要な相違は、それらが感染できる標的細胞に関する。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−８およびＡＡＶ−９は、ＲＰＥ細胞を効果的に誘導することが見出された。従って、本発明は好ましくは、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−８および／またはＡＡＶ−９の使用を包含し得る。
【００５２】
１つの好ましい実施形態によれば、本発明は、５’および３’ＵＴＲを含んでいるＩＬ１８をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を、左右のＡＡＶ逆方向末端反復（Ｌ−ＩＴＲおよびＲ−ＩＴＲ）を組み込むよう、ベクター中に導入することによって、ベクター（例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ血清型−２、−８および−９）を構築することを包含する。
【００５３】
本発明の第二の態様によれば、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態を処置する方法であって、炎症性メディエータ、ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質を、その必要な被験体に投与することを包含する、方法が提供される。
【００５４】
好ましい実施形態によれば、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置する方法であって、加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体に対してインターロイキン−１８（Ｉｌ−１８）を投与することを包含する方法が提供される。ＩＬ−１８は、局所効果を得るために投与されても、または全身効果を得るために投与されてもよい。
【００５５】
好ましい実施形態によれば、局所送達手段としては、直接の眼内注射が挙げられる。注射は、網膜下であってもよく、眼の硝子体であっても（硝子体内）、眼の後ろ（眼球後方）であっても、結膜の下（結膜下）またはテノン嚢下（テノン下）に行われてもよい。
【００５６】
別の好ましい実施形態によれば、炎症促進性インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、被験体に対して全身的に送達され得る。全身性の送達手段としては、非経口的または腸内の送達手段が挙げられ、本質的に、全ての非局所的な送達手段を包含し得る。理想的には、全身的な送達手段としては、注射、直接注射、および／またはウイルス媒介性の送達が挙げられる。最も好ましい実施形態によれば、全身的な注射技術としては、静脈内注射による静脈内送達が挙げられる。静脈内注射は、被験体の末梢静脈に対するものであってもよい。この投与経路に関しては、組み換えＩＬ−１８が、被験体の血流に直接的に投与／注射される。
【００５７】
本発明の第三の態様によれば、ＮＬＲＰ３−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性ＩＬ−１８（Ｉｌ−１８）の使用であって、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜新血管形成に関与する疾患、例えば、滲出型または萎縮型加齢性黄斑変性症を発症するリスクを示すバイオマーカーとしての使用が提供される。
【００５８】
本発明の第四の態様によれば、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜新血管形成に関与する疾患、例えば、滲出型または萎縮型加齢性黄斑変性症の発症のリスクを決定するかまたはその進行をモニタリングするための方法であって、被験体において、インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性ＩＬ−１８（ＩＬ−１８）を、バイオマーカーとして用い：
被験体において循環中のＩＬ−１８および／またはＩＬ−１８結合タンパク質レベルを得ることと；
ＩＬ−１８のレベルおよび／またはＩＬ−１８結合タンパク質レベルを参照に対して比較することであって、ここで疾患ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成の発症または進行という被験体のリスクが、参照に比較した、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１８結合タンパク質のレベルに基づく比較と、
を包含する方法が提供される。
【００５９】
ＩＬ−１８およびその結合タンパク質（ＩＬ−１８結合タンパク質）の比は、慣習的に、正常な参照からの変動の指標として用いられるが、ＩＬ−１８レベルは単独で用いられ得ることが理解される。
【００６０】
本発明を、以下の非限定的な図面および実施例に関連してここに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ドルーゼンはＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化する：（ａ）非喫煙、無病、委縮型および滲出型ＡＭＤ罹患個体の眼底写真。（ｂ）ちょうど５００μｍ未満から超顕微鏡的サイズの粒子までの範囲のドルーゼン断片。（ｃ）ブルッフ膜（ＢＭ）／ドルーゼン調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ｄ）黄色蛍光タンパク質標識−ＡＳＣ（ＹＦＰ−ＡＳＣ）を安定に発現する免疫されたＢＬ６  ＢＭＤＭの生細胞画像化。細胞を、ＬＰＳで３時間プライミングし、続いて２５０ｎｇ  ｍｌ−１のドルーゼンでさらに２時間処理して、Ｐｏｌｙ（ｄＡｄＴ）を、陽性コントロールとして用いた。ＡＳＣ−ＹＦＰの重合化は、スペック形成によって、もとの倍率×６０で観察した。（ｅ，ｆ）ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生は、１００ｎｇ  ｍｌ−１のＬＰＳを用いて一晩プライミングしたヒトＰＢＭＣにおけるＥＬＩＳＡによって測定し、引き続き、漸増用量のドルーゼン調製物（２５０  ｎｇ  ｍｌ−１および５００  ｎｇ  ｍｌ−１）を用いて７時間処理した（＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。（ｇ）ドルーゼンを用いるＴＨＰ−１細胞の処理後のカスパーゼ−１の切断生成のウエスタンブロット。（ｈ）漸増用量のドルーゼンを用いて処理した後の野性型（ＷＴ）（青のバー）およびＮＬＲＰ３−欠損（Ｎｌｒｐ３−／−）（赤のバー）の骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤＭ）においてＥＬＩＳＡで測定したＩＬ−１β（左側パネル）およびＩＬ−６（右側パネル）の産生（＊＊＊Ｐ≦０．０００１）（ｉ）漸増用量のドルーゼンを用いて処理した後のＷＴ（青のバー）およびＮｌｒｐ３−／−）（赤のバー）の骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）においてＥＬＩＳＡで測定したＩＬ−１β（左側パネル）およびＴＮＦ−α（右側パネル）の産生（＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。全てのＥＬＩＳＡデータは、３連で行われた３つの別々の実験の最小の代表である。
【図２】図２：ＣＥＰ、ドルーゼンの構成要素は、ＮＬＲＰ３インフラマソームをプライミングし得る：（ａ）ＬＰＳ、ＣＥＰ−付加アルブミン（ＣＥＰ−ＨＳＡ）またはＨＳＡを、漸増用量（５０および１００μｇ  ｍｌ−１）で用いてプライミングし、続いて５ｍＭのＡＴＰで処理したヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１βの産生。（ｂ）ＣＥＰ−ＨＳＡを用いてプライミングし、次いでＡＴＰまたはポリ（ｄＡｄＴ）のいずれかで活性化したＷＴおよびＮｌｒｐ３−／−のＢＭＤＭにおけるＩＬ−１βの産生。（ｃ，ｄ）ＨＳＡまたはＣＥＰ−ＨＳＡを用いてプライミングし、ＡＴＰで活性化するかまたは左の未処理としたＷＴまたはＴｌｒ２−／−のＢＭＤＭにおけるＩＬ−１βおよびＩＬ−６の産生。（ｅ，ｆ）ＩＬ−１βおよびＴＮＦα産生は、ＬＰＳまたはＣＥＰのいずれかでプライミングして、ＡＴＰで活性化した、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ  ＢＭＤＭ（ＷＴ）またはＣ３Ｈ／ＨｅＪ  ＢＭＤＭ（これは、変異体ＴＬＲ４を含む）で測定した。（ｇ）ＹＦＰ−ＡＳＣを安定に発現する不死化したＢＬ６  ＢＭＤＭの生細胞画像化。細胞をＣＥＰ−ＨＳＡ（上のパネル）またはＨＳＡ（下のパネル）を用いて３時間プライミングし、続いて、２５０ｎｇ／ｍｌのドルーゼンを用いてさらに２時間処理した。ＡＳＣ−ＹＦＰのオリゴマー形成は、スペック形成によって、もとの倍率×６０によって観察した。全てのＥＬＩＳＡデータは、３連で行った３つの別々の実験の最小の代表である。
【図３】補体因子Ｃ１Ｑ、ドルーゼンの構成要素は、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化する：（ａ）ＣＥＰを用いて３時間プライミングされ、Ｃ１ｑを用いて６時間漸増容量で活性化されたＢＭＤＭにおけるＩＬ−１β（左側パネル）およびＴＮＦα（右側パネル）の産生。（ｂ）ＬＰＳでプライミングされ、漸増用量のＣ１Ｑで処理されたＴＨＰ１細胞中のカスパーゼ−１切断産物のウエスタンブロット。（ｃ）ＹＦＰ−ＡＳＣを安定に発現する不死化されたＢＬ６  ＢＭＤＭの生細胞画像化。細胞を、ＬＰＳ（上部パネル）またはＣＥＰ−ＨＳＡのいずれかで３時間プライミングし、続いて、１０μｇ  ｍｌ−／−のＣ１Ｑ（右側パネル）を用いてさらに２時間処理した。ＡＳＣ−ＹＦＰのオリゴマー形成は、スペック形成によって、もとの倍率×６０によって観察した。（ｄ）ＬＰＳ（３時間）でプライミングし、Ｃ１Ｑ（１６時間）を漸増用量（２．５、５および１０μｇ  ｍｌ−／−Ｃ１Ｑ）で用いて活性化した、ＷＴおよびＮｌｒｐ３−／−  ＢＭＤＣにおけるＩＬ−１β（左側パネル）およびＴＮＦ−α（右側パネル）の産生。（ｅ）１００ｎｇ  ｍｌ−／−のＬＰＳを用いて一晩プライミングして、５μｇ  ｍｌ−／−のＣ１Ｑを用いて６時間活性化し、さらに、Ｃ１Ｑの１時間前に、漸増用量（１０倍）のＺＶＡＤ（カスパーゼ−１インヒビター）の処理をしたヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１β、ＩＬ−１８およびＩＬ−６の産生。全てのＥＬＩＳＡデータは、３連で行った３つの別々の実験の最小の代表である。
【図４】切断カスパーゼ−１  ｐ１０は、ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスにおいて活性化マクロファージと同時局在化する：（ａ〜ｃ）ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫したマウスの網膜の凍結切片の免疫染色であって、脈絡膜からブルッフ膜へ延びる脈絡膜（ｂ）の領域に対するＦ４／８０陽性マクロファージ（ａ）の局在化を示し、かつ（ｃ）網膜の外側セグメント（ＯＳ）および外核層（ＯＮＬ）においてＲＰＥの上に示す。頂部パネル（ｃ）左側パネル、微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）画像、（ａ，ｂ）底部パネル（ｃ）右側パネル、蛍光画像（Ｆ４／８０−赤、ＤＡＰＩ−青）。（ｄ、ｅ）カスパーゼ−１  ｐ１０（赤色）およびＦ４／８０（緑色）を用いたＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスの網膜凍結切片の同時標識であって、（ｄ）脈絡膜／ブルッフ膜内におよびそれを超えて存在するマクロファージ、ならびに（ｅ）網膜のＯＳ中のマクロファージ突出における同時局在化を示している。（ｆ）ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫したマウスの網膜凍結切片の同時標識は、ＮＬＲＰ３（赤色）およびＦ４／８０（緑色）の同時局在化を示す。（ｇ）高倍率のＮＬＲＰ３およびＦ４／８０染色。
【図５】ＮＬＲＰ３は、ＩＬ−１β依存性の方式でレーザー誘発性のＣＮＶ病変形成に対して防御性である：（ａ）ＷＴ（頂部左側パネル）、Ｎｌｒｐ３−／−（頂部中央パネル）およびＩｌ１ｒ１−／−（頂部右側パネル）のマウスにおけるレーザー誘発性ＣＮＶであって、レーザー火傷６日後のＣＮＶ発達を示している。ＷＴ（最下部左側パネル）、Ｎｌｒｐ３−／−（最下部中央パネル）およびＩｌ１ｒ１−／−（最下部右側パネル）からの共焦点Ｚスタックの３−Ｄ再構築画像。ＣＮＶ容積レンダリング（棒グラフ）。（ｂ）Ｎｌｒｐ３−／−およびＩｌ１ｒ１−／−マウスの桿体視細胞および錐体視細胞機能の網膜電図検査（ＥＲＧ）分析。（ｃ）Ｎｌｒｐ３−／−マウスにおけるレーザー誘導性損傷の部位に対する活性化マクロファージ（Ｆ４／８０−緑色）の局在化を示している免疫染色。（ｄ）切断カスパーゼ１（赤色）に関して、損傷３時間後のＷＴ（左側パネル）またはＮｌｒｐ３−／−（右側パネル）網膜凍結切片の免疫染色。
【図６】ＮＬＲＰ３は、ＩＬ−１８産生におけるその役割を通じてＣＮＶ病変形成に対する防御を付与し、これが次にＶＥＧＦレベルを調節する：（ａ）Ｉｌ１８−／−マウスの桿体視細胞および錐体視細胞の機能の網膜電図検査（ＥＲＧ）分析。（ｂ）Ｉｌ１８−／−マウスにおけるレーザー誘発性ＣＮＶであって、レーザー火傷６日後のＣＮＶ発達を示している（左側パネル）。共焦点Ｚスタックの３−Ｄ再構築画像（右側パネル）。ＣＮＶ容積レンダリング（棒グラフ）。（ｃ）ＣＮＶ容積は、ＷＴマウスに比べて有意に増大された（図５）（＊Ｐ＝０．０２９２）。ＶＥＧＦの産生は、ＥＬＩＳＡによって、（ｄ）ＡＲＰＥ−１９細胞および（ｅ）マウス脳微小血管内皮細胞（Ｂ．ｅｎｄ３）（漸増用量のＩＬ−１８で２４時間処理、または左側の未処理）で分析した。ＥＬＩＳＡデータは、３連で行った３つの別々の実験の最小の代表である。
【図７】（ａ）ＡＲＰＥ−１９細胞（左側）およびＴＨＰ１細胞（右側）におけるＮＬＲＰ３発現のウエスタンブロット、当量のタンパク質をＢＣＡアッセイで決定したとおりロードした。（ｂ）ＡＲＰＥ−１９細胞を、種々のＴＬＲリガンドでプライミングした；１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、または２μｇ／ｍｌのＰａｍ３Ｃｙｓ、または２５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、または１μｇ／ｍｌのＲ８４８、もしくは５μｇ／ｍｌのＣｐＧ−ＯＤＮおよび左側の未処理、またはＡＴＰでさらに１時間活性化のいずれか。次いで、ＩＬ−１β産生を測定した。
【図８】ａ）ＲＰＥスープを、光学顕微鏡下で観察したところ、ドルーゼンの単離後に生成された網膜／ＲＰＥ材料を含んでいた。ｂ）この材料（１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌ）を、ＬＰＳでプライミングしたＰＢＭＣに添加したが、ＩＬ−１βレベルの増大も、ｃ）ＩＬ−１８レベルの増大も生じなかった。ｄ）ＩＬ−６発現は、漸増用量のＲＰＥスープでは未変化であった。ｅ）ＲＰＥスープは、ＷＴまたはＮｌｒｐ３─／─のマウスのＢＭＤＣでＩＬ−１βレベルに変化を誘発しなかった。ｆ）実験群の間のＩＬ−６発現に有意な変化はなかった。
【図９】ドルーゼンでのＴＨＰ１細胞の処置後のカスパーゼ−１  Ｐ１０のウエスタンブロットの濃度測定分析。
【図１０】ａ）ＬＰＳでプライミングしたＷＴおよびＴｌｒ２─／─のＢＭＤＭ（ＡＴＰで活性化）においてＩＬ−１βのレベルは有意に増大したｂ）ＩＬ−６レベルは有意に異なることはなかった。
【図１１】漸増用量のＣ１Ｑを用いるＴＨＰ１細胞の処理後のカスパーゼ−１  Ｐ１０ウエスタンブロットの濃度測定分析。
【図１２】溶液中のＣ１Ｑのゼータ電位測定で、１１．８ｍＶというゼータ平均が示される。
【図１３】１００ｎｇ  ｍｌのＬＰＳを用いて一晩プライミングして、５μｇ  ｍｌのＣ１Ｑを用いて６時間活性化し、さらに、Ｃ１Ｑ処理の１時間前に、漸増用量（１０倍）の（ａ）ＤＰＩ（ＲＯＳインヒビター）、（ｂ）バフィロマイシン（リソソームの酸性化を阻害する）、（ｃ）ＣＡ−０７４Ｍｅ（カテプシンＢインヒビター）の処理をしたヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１β、ＩＬ−１８およびＩＬ−６の産生。
【図１４】ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウス網膜におけるＣＤ６８染色（赤色）は強膜および網膜の外側部（ＯＳ）において陽性の細胞を示した。
【図１５】ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスの網膜凍結切片を、ＮＬＲＰ３について染色して、（ａ）網膜の外側部分、（ｂ）網膜色素上皮（ＲＰＥ）、（ｃ）強膜内の細胞、および（ｄ）脈絡膜内の細胞において陽性の免疫反応性を観察した。
【図１６】ＷＴマウスでのレーザー誘発性ＣＮＶ（右側パネル）の部位に同時局在化した、Ｆ４／８０（左側パネル、赤色）およびカスパーゼ−１  ｐ１０（中央パネル，緑色）。
【図１７】ＩＬ−１８は、傷害２４時間後にＷＴマウスのレーザー誘発性傷害の部位で観察した（左側パネル−赤色染色）。この染色は、Ｎｌｒｐ３─／─マウスにおける損傷の部位では明らかではなかった（右側パネル−赤色染色）。
【図１８】図１８（ａ）レーザー誘発性ＣＮＶ後に注射された中和ＩＬ−１８（１μｇ）抗体は、落射蛍光顕微鏡で測定して、ＷＴマウスでＣＮＶの大きさを有意に増大した。（ｂ）共焦点、Ｚ−スタック  ３−Ｄは、ＣＮＶの画像を表示した。（ｃ）有意に増大されたＣＮＶが、ニセの注射をしたマウスと比較して、レーザー損傷後に１μｇのＩＬ−１８中和抗体を注射されたＷＴマウスで観察された（＊Ｐ＝０．０３６８）。
【図１９】ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂについて染色した（ａ）ＢＭＤＣおよび（ｂ）ＢＭＤＭのフローサイトメトリー分析。
【図２０】図２０（ａ）ＲＰＥは、光受容体の外側部に隣接して存在する。図２０（ｂ）標的された網膜／ＲＰＥ／ブルッフ膜／脈絡膜複合体の熱破壊であって、５３２ｎｍのレーザーが５０μｍ径の損傷を生じている（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ａｌｅｘａ−５６８（赤色）およびＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ−４８８（緑色））。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
実施例
材料および方法
ドルーゼン単離
ドルーゼンおよび少量のブルッフ膜を、以前に記載されたように（８）、６つのＡＭＤドナーの眼（８８Ｍ、９１Ｆ、９７Ｍ、８５Ｆ、８５Ｍおよび８０Ｍ）から、これらの実験における使用のために単離した。
【００６３】
ＣＥＰ−アルブミン産生
ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に、以前に記載のように（５４）ＣＥＰを付加した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ分析
この研究全体を通じて用いた種々の実験群から上清中でサイトカインを定量するにはＥＬＩＳＡを用いた。ＩＬ−１β（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１８（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＩＬ−６（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ−α（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＶＥＧＦ（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を詳細に分析した。全てのＥＬＩＳＡは、三連で最低３分行った。この研究の間に用いたインヒビターは、インフラマソーム活性化の１時間前に以下の最高濃度で添加した：１μｇ／ｍｌのカスパーゼ−１インヒビター  ＶＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５μＭのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ），１０μＭのＣＡ−０７４  Ｍｅ（カテプシンＢインヒビター）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、１０μＭのＤＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ）。
【００６５】
ウエスタンブロット分析
一般的には、カスパーゼ−１（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、β−アクチン（Ａｂｃａｍ）、ＮＬＲＰ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、ＴＬＲ−４（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に特異的な抗体を、膜の上で４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳで洗浄して、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を有するウサギに対する二次抗体（ＩｇＧ）（１：２５００）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、またはマウス（ＩｇＧ）（１：１０００），（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｅｌａｎｄ）とともに、室温で３時間インキュベートした。免疫複合体を、増感化学発光（ＥＣＬ）を用いて検出した。全てのウエスタンブロットは、最低三回繰り返した。
【００６６】
細胞培養
ＡＲＰＥ−１９細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ２３０２）は、ＬＧＣ  ｐｒｏｍｏｃｈｅｍから入手し、ＴＨＰ１細胞および初代単離ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、インビトロのインフラマソーム活性化アッセイに用いた。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２、９５％空気で、１：１の混合物のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハム（Ｈａｍ）のＦ１２培地であって、１．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、２．５ｍＭのＬ−グルタミン、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）とを含む混合物の培地中で培養した。また、ＢＭＤＣおよびＢＭＤＭは、ＷＴ、ＮＬＲＰ３−／−、ＴＬＲ−２−／−、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪのマウスから、類遺伝子性のＣ５７／Ｂｌ６バックグラウンド上でも単離した。ＢＭＤＣおよびＢＭＤＭを、抗−ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣおよび抗−ＣＤ１１ｂ−ＰｅＣｙ７を用いて染色した。細胞を、生きた単一の細胞上でゲートして、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂの発現を、フローサイトメトリーによって評価した（図１９）。マウスｂＥｎｄ．３微小血管内皮細胞は、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｒｅｌａｎｄ）コーティングした組織培養フラスコで、ＤＭＥＭ含有のＧｌｕｔａｍａｘおよび１０％のＦＣＳ中で増殖した。
【００６７】
ＡＳＣスペック形成分析．
黄色蛍光（ＹＦＰ）タンパク質標識したＡＳＣを発現している不死化したＢＭＤＭ（ボン大学のＥｉｃｋｅ  Ｌａｔｚ博士より贈呈）を、ＬＰＳ、ＨＳＡまたはＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングし、次いで、ドルーゼンまたはＣ１Ｑを用いて、それぞれ３時間または６時間活性化した。スペック形成の生細胞画像化は、温度およびＣＯ２を調節した共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＴＭ  ＦＶ１０００）を用いて撮った。
【００６８】
ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫化
本発明者らは、標準的なマウス免疫プロトコール（５５）を用いた。著者らは、ＰＢＳ中に含有されるケタミン−キシラジン（８０〜９０ｍｇ／ｋｇのケタミン、２〜１０ｍｇ／ｍｌのキシラジン）を用いてマウスを麻酔した。本発明者らは、２００μｇのＣＥＰ−ＭＳＡを含有するＣＦＡまたはＩＦＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓ）を、前に記載のとおり（１８）、最初および全ての追加用量に用いた。
【００６９】
脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）のマウスモデル
本研究の経過中に行った全ての動物実験は、視覚と眼科学研究協会会議（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）（ＡＲＶＯ）の基準を順守し、全ての関連の国および制度上の承認は、本研究の開始の前に得た。ＣＮＶ（血管床が網膜へと増殖し、新生血管ＡＭＤを模倣する）を、以前に記載された（２１）顕微鏡送達システムを組み込んでいる、緑色の５３２ｎｍのＩｒｉｄｅｘ  Ｉｒｉｓレーザー（５３２ｎｍ、１４０ｍＷ、１００ｍＳｅｃ、５０μｍのスポットサイズ、１つの眼あたり３スポット）を用いてマウスに導入した。この技術を用いて、Ｎｌｒｐ３−／−、Ｉｌ１ｒ１−／−、ＩＬ−１８−／−およびＷＴマウス中でＣＮＶを誘導し、各々の実験アッセイ動物では、性別をマッチさせた。相前後して、また本発明者らは、ＩＬ１８に対する中和抗体（Ａｂｃａｍ）をレーザー火傷の後、硝子体内に直接注射した。マウスを、実験の６日後に屠殺して、神経網膜を取り出した。次いで、眼杯を、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ−ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ−ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ａｌｅａｘ−５６８分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（１：３００）を用いて４℃で一晩インキュベートして、ＣＮＶを共焦点顕微鏡で評価した（図２０ａ，ｂ）。
【００７０】
網膜平坦封入（ｆｌａｔｍｏｕｎｔ）および網膜凍結切片の間接的な免疫染色
間接的な免疫染色を用いて、ＡＭＤの動物モデルにおける神経網膜に存在する、活性化されたマクロファージおよび切断されたカスパーゼ−１を分析した。活性化されたマクロファージ、およびカスパーゼ−１（Ｐ１０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＮＬＲＰ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈおよびＡｂｃａｍ）およびＩＬ１８（Ａｂｃａｍ）に関するＦ４／８０に対する抗体ＣＤ６８（Ａｂｃａｍ）を、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＴＭ  ＦＶ１０００）と組み合わせて用いた。
【００７１】
統計的分析
２つの個々の実験群を分析していた場合、０．０５以下というＰ値で示される有意差によって、スチューデントのＴ検定を用いて、統計的分析を行った。多重比較のために、ＥＬＩＳＡ分析の場合と同様、ＡＮＯＶＡを、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後テストとともに用いて、有意差は、０．０５以下のＰ値で示した。
【００７２】
結果
ＲＰＥは、外側網膜と脈絡膜との間に位置する立方形細胞の単層である。このメラニン化した神経上皮は、多数の機能を有し、この機能としては、ａ）散乱光および反射光の吸収、ｂ）外側血液−網膜障壁（ｏＢＲＢ）の形成、ならびに光受容体外側部の弱った先端部の食作用による除去が挙げられる（２２）。ドルーゼンのプロテオームおよび免疫組織化学な分析で、補体カスケードに関与する実質上あらゆるタンパク質、アミロイド沈着で見出されるタンパク質、ならびにストレスに反応して合成されるタンパク質である、多数のクリスタリンを特定した（２３、２４）。コレステロール結晶およびアミロイド沈着のような宿主由来の微粒子状物質（２５、２６）がＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し得るという近年の発見を考慮して、本発明者らは、ドルーゼンが、インフラマソームの活性化を開始もできるか否かを決定することに興味を持った。  
【００７３】
ドルーゼンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化する
委縮型または滲出型のいずれかのＡＭＤがある個体の写真と比較した罹患していない眼の眼底の写真（図１ａ）。眼底の画像における点状の光の出現は、委縮型および滲出型の両方のＡＭＤにおけるドルーゼン蓄積であって、網膜下ＣＮＶが、滲出型ＡＭＤの写真にみえる。単離されたドルーゼンを超音波処理して、サンプルを小さい粒子状物質に分けた（図１ｂ）。ドルーゼンサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、６０ｋＤａを超える高い分子量のタンパク質のコホートが示された（図１ｃ）。インフラマソームは、多量体タンパク質複合体である。カスパーゼ−１は、インフラマソーム複合体中で活性化されたシステインプロテアーゼであり、ｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびｐｒｏ−ＩＬ−１８をその成熟型に切断する。カスパーゼ−１の活性化には、多量体複合体のためのプラットフォームを創出するオリゴマーを形成するタンパク質ＡＳＣを必要とする。通常は、ＡＳＣは、細胞全体に均一に分布されるが、一旦、活性化されれば、ＡＳＣは、「スペック（ｓｐｅｃｋ）」として公知である、単一のポイントに凝集する。黄色蛍光タンパク質で標識されたＡＳＣ（ＹＦＰ−ＡＳＣ）を安定に発現するＢＭＤＭを、ＬＰＳでプライミングして、ドルーゼンで処理するか、またはポリ（ｄＡｄＴ）（陽性コントロール）でトランスフェクトした。ＡＳＣ−ＹＦＰは、ＬＰＳ単独で処理したマクロファージでは識別困難である（図１ｄ、左側パネル）が、ドルーゼンで活性化したＬＰＳでプライミングしたマクロファージでは、ＡＳＣオリゴマー形成の指標である、強烈な単一の蛍光スペックの形成が明らかに認められる
【００７４】
ＡＭＤに関連する炎症性の応答は、局所性および全身性の両方の構成要素を有することが考えられる。本発明者らは最初に、ＡＲＰＥ−１９細胞株を、ＮＬＲＰ３の存在について、およびそれらが、ＩＬ−１βを、ある範囲のＴＬＲリガンドおよびＡＴＰｒでの活性化に対する応答で産生する能力について試験した。本発明者らは、ＡＲＰＥ−１９細胞が、ＮＬＲＰ３を発現し、ＩＬ−１βのレベルは、アッセイ感度の下限であることを見出した（図７）。末梢の骨髄細胞は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の初代の供給源であり、それらがＡＭＤにおいて網膜にアクセスする能力を有し、本発明者らは、これらの細胞が、著者らのシステムで目的の重要な細胞であると仮定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、極めて低濃度でさえドルーゼンでの活性化に応答してＩＬ−１βおよびＩＬ−１８を生じた（図１ｅ，ｆ）。本発明者らは、ＡＭＤの眼からのドルーゼンの解離の間に生じたＲＰＥ材料を、これらの実験のためのコントロールとして用いた（図８）。ドルーゼンで処理した後のＴＨＰ−１細胞溶解物におけるカスパーゼ−１発現のイムノブロット分析によって、切断されたカスパーゼ−１  ｐ１０のレベルの増大が確認された（図１ｇおよび図９）。まとめると、これらの結果、ＡＭＤドナーの眼由来のドルーゼンは、カスパーゼ−１およびＡＳＣインフラマソーム複合体を活性化し得、これが次に、ＰＢＭＣにおいてＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生を生じることが示される。
【００７５】
本発明者らは、ＮＬＲＰ３は、微粒子状物質によるインフラマソーム活性化が必要なので、ドルーゼン誘発性のインフラマソーム活性化のセンサーとして可能性が高いと結論付けた。本発明者らは、野性型（ＷＴ）およびＮＬＲＰ３−欠損（Ｎｌｒｐ３−／−）の両方のマウスから骨髄を単離して、骨髄由来のマクロファージおよび樹状細胞（ＢＭＤＭおよびＢＭＤＣ）を培養した。ＷＴのＢＭＤＭおよびＢＭＤＣの両方とも、ドルーゼンに応答して有意なレベルのＩＬ−１βを産生し、逆にＮｌｒｐ３−／−のＢＭＤＭおよびＢＭＤＣ（図１ｈ、図１ｉ、左側パネル）は、ドルーゼンに応答して成熟ＩＬ−１βの産生を促進することができなかった。ＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルは、ＩＬ−１β産生の特定の効果の指標である、ドルーゼンの存在によって変化されなかった（図１ｈ、図１ｉ、右側パネル）。これらの結果によって、ＡＭＤドルーゼンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化できることが示される。
【００７６】
ＣＥＰ−付加したヒト血清アルブミンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームをプライミングする
ドルーゼン中で特定されたタンパク質の最大６５％までが、ＡＭＤおよび正常なドナーの両方から単離されたドルーゼン中で見出された。しかし、酸化的タンパク質修飾もまた、カルボキシエチルピロールタンパク質付加物を含めて、ドルーゼン中で観察された。累積的な酸化的損傷は、加齢に寄与して、長期的には、ＡＭＤの発症機序に寄与すると推測された（２７、２８、２９）。カルボキシエチルピロール（ＣＥＰ）添加物は、ドコサヘキサエン酸塩（ＤＨＡ）−含有脂質の酸化から特異的に生じ、ＡＭＤ被験体のドルーゼンおよび血清に対して有意に豊富である（１９）。近年では、それらのＣＥＰの中でもカルボキシアルキルピロールは、内皮細胞上でトール様レセプター２（ＴＬＲ２）によって認識されることが示された（３０）。ＴＬＲ２活性化が、細胞をプライミングして、ｐｒｏ−ＩＬ−１β、ｐｒｏ−ＩＬ−１８およびＮＬＲＰ３を誘導することを考えれば、本発明者らは、ＣＥＰ付加したタンパク質がドルーゼン中で、およびブルッフ膜上で、新規なプライミング因子であり得ると仮定した。
【００７７】
これを試験するために、本発明者らは、ＰＢＭＣを、漸増濃度のＣＥＰ−付加したＨＳＡまたはＨＳＡ単独を用いてプライミングし、細胞をＡＴＰで活性化した。ＩＬ−１βレベルは、ＣＥＰ−ＨＳＡの濃度増大とともに増大したが、ＨＳＡ単独でプライミングした細胞中では変化は観察されなかった（図１ａ）。ＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングされ、ＡＴＰで活性化されたＷＴのＢＭＤＭはまた、ＩＬ−１βを産生し、Ｎｌｒｐ３−／−マウスでは効果は観察されなかった（図２ｂ）。ＣＥＰ−ＨＳＡが、ＴＬＲ２活性化を通じて細胞をプライミングしていたのかどうかを確認するために、本発明者らは、ＷＴおよびＴＬＲ２−／−のＢＭＤＭを、ＨＳＡまたはＣＥＰ−ＨＳＡを用いてプライミングし、ＡＴＰで活性化した。ＡＴＰ活性化は、ＩＬ−１β増大をＷＴでは誘発したが、ＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングしたＴＬＲ２−／−のＢＭＤＭでは誘発しなかった。さらに、活性化の前にＨＳＡでプライミングしたＢＭＤＭではＩＬ−１β誘導は観察されず、ここでも、ＴＬＲ２を活性化する能力を付与するＣＥＰ改変であることが確認される（図２ｃ）。ＩＬ−６レベルは、ＣＥＰ−ＨＳＡ処理したＷＴ細胞の間で等価であり、これによって、ＩＬ−１βに関する応答の特性が確認される（図２ｄ）。ＩＬ−１βレベルを、ＡＴＰによって活性化されたＬＰＳプライミングされたＷＴおよびＴＬＲ２−／−のＢＭＤＭにおいて測定して、ＴＬＲ２−／−のＢＭＤＭが最適に応答していることを確実にした（図１０）。本発明者らのＣＥＰ−ＨＳＡにＬＰＳ混入が無いことを確実にするために、本発明者らは、ＢＭＤＭを、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから単離した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、それらをＬＰＳに対して非応答性にするＴｌｒ４遺伝子の変異を担持している（３１）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ  ＢＭＤＭは、ＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングされた場合、ＡＴＰに対して応答してＩＬ−１βを生じたがＬＰＳでは生じず（図２ｅ）、このことは、本発明者らのＣＥＰ付加物が、ＬＰＳはなく、ＴＬＲ２連結を通じてインフラマソームをプライミングすることを示している。ＴＮＦ−αは、ＬＰＳでプライミングしたＷＴのＣ３Ｈ／ＨｅＮのＢＭＤＭで検出されたが、ＣＥＰでプライミングした細胞では検出されなかった（図２ｆ）。本発明者らはさらに、ＣＥＰがＮＬＲＰ３インフラマソームをプライミングする能力を、ＡＳＣ−ＹＦＰスペック形成を、ＣＥＰ−処理したＢＭＤＭにおいて測定することによって試験した。フォーカスされたＡＳＣ−ＹＦＰスペックは、ＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングされたＢＭＤＭで観察され、ドルーゼンで活性化された（図２ｇ、頂部パネル）。ドルーゼン単独は、ＡＳＣのオリゴマー形成を生じることができると思われ（図２ｇ、底部パネル）、このことは、ドルーゼンが単独で、インフラマソーム活性化のための多数のタンパク質プラットフォームの形成を開始し得ることを意味する。しかし、本発明者らは、ＰＢＭＣまたはＢＭＤＭ／ＢＭＤＣがドルーゼンだけで処理され、ＥＬＩＳＡでアッセイされた場合、ＩＬ−１β増大を一貫して検出できなかった。
【００７８】
ドルーゼン構成要素補体因子Ｃ１Ｑは、インフラマソームを活性化する
ドルーゼンは、ＧＡのように網膜を歪曲し最終的には損傷し得る（２９）が、ドルーゼンを示す全ての患者が失明を発症するわけではなく、従って、ＲＰＥに対する機械的損傷を生じるドルーゼンの粒子状の性質に加えて、ドルーゼンのいくつかの構成要素（単数または複数）は、インフラマソームの活性化に、さらに特異的な方式で関与し得る。本発明者らは、Ｃ１Ｑを研究するために、ドルーゼンで特定された（３２）、古典的な補体経路の最初の開始構成要素を選択した。Ｃ１Ｑは、宿主組織に対して過度な損傷である可能性を有する先天性の免疫系のエフェクターであるので、ドルーゼン中にそれが存在することは、炎症性の損傷が早期または継続中という指標である。本発明者らは、Ｃ１ＱがＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化する能力を直接向上させた。ＢＭＤＭへＣ１Ｑ単独を添加することは、ＩＬ−１βの産生を生じないが、Ｃ１Ｑの添加の前にＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングされた細胞は、有意なレベルのＩＬ−１βを産生した（図３ａ、左側パネル）。炎症促進性サイトカインＴＮＦαの分泌は、ＣＥＰ−ＨＳＡでプライミングされたＢＭＤＭに対するＣ１Ｑの添加の際に変化しないままであって（図３ａ、右側パネル）、このことは、Ｃ１Ｑがインフラマソームを特異的に活性化しており、一般には炎症促進性サイトカインの上方制御に関与しないことを示している。本発明者らは、Ｃ１Ｑで活性化されたＴＨＰ１ヒト単球細胞において切断されたカスパーゼ−１  ｐ１０を観察し（図３ｂ、図１１）、さらに、ＹＦＰ−ＡＳＣスペックが、ＬＰＳ（図３ｃ、上の右側のパネル）またはＣＥＰ（図３ｃ、最下部の右側のパネル）のいずれかでプライミングした後、Ｃ１Ｑで活性化された細胞内の濃縮された焦点でみることができるので、Ｃ１Ｑは、ＡＳＣオリゴマー形成を生じ得ることを証明した。
【００７９】
Ｃ１Ｑで処理されたＷＴのＢＭＤＣは、有意なレベルのＩＬ−１βは生じないが、Ｎｌｒｐ３−／−ＢＭＤＭは、Ｃ１Ｑ活性化に応答してＩＬ−１βを産生できず（図３ｄ、左）、ＴＮＦαのレベルは不変のままであった（図３ｄ、右側）。カスパーゼ−１の役割を確認するため、本発明者らは、カスパーゼ−１インヒビター、ＺＶＡＤを、Ｃ１Ｑ活性化の前にヒトＰＢＭＣに添加した。カスパーゼ−１阻害は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の両方の産生を用量依存性に低下した（図３ｅ）。これらの結果をまとめれば、Ｃ１Ｑは、ＮＬＲＰ３インフラマソームによって検知される危険な信号として機能し得ることが示される。ヒト血液から単離されたＣ１Ｑおよびドルーゼンで見出されるＣ１Ｑの全てが、凝集する傾向を有し、本発明者らは、これをＣ１Ｑの溶液のゼータ電位分析後に示し、本発明者らは、このことは、Ｃ１ＱがＮＬＲＰ３インフラマソームをどのように活性化し得るかの重要な要因であると考える（図１２）。
【００８０】
Ｃ１Ｑインフラマソーム活性化は、ファゴリソソームを包含する
Ｃ１Ｑの沈着は、他の補体因子とともに、アミロイド構造と、またはその構成要素と関連することが示された（３３、３４）。従って、Ｃ１Ｑは、これらの粒子状の沈着を食作用するように試みるので、ドルーゼンの構成要素として、その凝集を生じ、マクロファージを補助し得る可能性がある。ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化をもたらす機序は、依然として議論の的であり、刺激に依存し得る。機序の１つは、粒子状構造の食作用を包含し、これがリソソーム破裂およびリソソーム内容の放出をもたらす（３５）。別の提唱された機序は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を包含し、これがＲＯＳ感受性ＴＸＮＩＰタンパク質を介したＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化をもたらす（３６）。ＲＯＳのＣ１Ｑの誘導（３７、３８）がインフラマソーム活性化を担うか否かを決定するために、本発明者らは、Ｃ１Ｑ活性化の前にＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビターＤＰＩでＰＢＭＣを処理した。ＤＰＩによるＲＯＳの阻害は、Ｃ１Ｑ誘導性のＩＬ−１β放出に影響を有さなかった（図１３ａ）。提唱される別の機序は、リソソーム不安定性がリソソームエキソペプチダーゼ、カテプシンＢのサイトゾルへの漏出（これは、インフラマソームの構成要素によって検知され、そのアセンブリにつながる）をもたらすということである（３５）。Ｃ１Ｑによるインフラマソームの活性化におけるファゴリソソームの役割を決定するために、本発明者らは、リソソーム酸性化に必須の液胞のＨ＋ＡＴＰａｓｅ系をブロックするインヒビターであるバフィロマイシンＡ、およびカテプシンＢインヒビターであるＣＡ−０７４  Ｍｅを用いた。液胞Ｈ＋ＡＴＰａｓｅまたはカテプシンＢのいずれかの阻害は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８のＣ１Ｑ活性化産生を制限し、ＩＬ−６産生には影響はない（図１３ｂ、ｃ）。このことは、Ｃ１Ｑが、ファゴリソソームの過程を変更してＮＬＲＰ３活性化を誘発することを直接意味する。
【００８１】
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、ＣＥＰ−ＭＳＡで免疫されたマウスで活性である
本発明者らは、インフラマソームが、ＣＥＰ−ＭＳＡで免疫されたマウスモデルである、委縮型ＡＭＤの十分特徴付けされたモデルの病理に関係するか否かを決定しようとした。この動物は、ＣＥＰ−ＭＳＡでの免疫後にその網膜およびＲＰＥにおいてＡＭＤ様病変を発症する。本発明者らは、ＣＥＰ−ＭＳＡで免疫されたマウスの網膜切片を、活性化されたマクロファージ（Ｆ４／８０およびＣＤ６８染色）、カスパーゼ−１  ｐ１０およびＮＬＲＰ３の存在について分析した。活性化マクロファージは、脈絡膜およびブルッフ膜内に存在することを確認し（図４ａ、図４ｂ、図１４）、また、本発明者らは、網膜の外側部においてＲＰＥ上の浸潤性マクロファージも観察した（図４ｃ）。これらの部分の染色によって、Ｆ４／８０と切断されたカスパーゼ−１  ｐ１０（図４ｄ、図４ｅ）およびＮＬＲＰ３（図４ｆ、図４ｇ、図１５）との同時局在化が示された。
【００８２】
ＮＬＲＰ３は、増悪されたレーザー誘発性のＣＮＶ発達を防御する
滲出型（ｗｅｔ）（浸出性（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ））ＡＭＤについてかなり用いられるモデルは、レーザー誘発性のＣＮＶであって、またこれは、無菌性炎症についての理想的なモデルでもあり（３９）、組織内の壊死性の微小環境の誘導に起因する可能性が高い。壊死性細胞は、ＮＬＲＰ３インフラマソームを通じて無菌性炎症応答を誘発することが公知である（１７）。本発明者らは、ＮＬＲＰ３インフラマソームが、局在化した組織損傷に応答してＣＮＶ発達に重要な役割を果たし得ると仮定した。本発明者らの仮説を検討するため、本発明者らは、限局性のレーザー火傷をＷＴのＮｌｒｐ３−／−およびＩｌ１ｒ１−／−のマウスの網膜に与えて、ＣＮＶ容積を評価した。驚くべきことに、本発明者らは、ＷＴおよびＩｌ１ｒ１−／−マウスと比較した場合、Ｎｌｒｐ３−／−マウスでは有意に多いＣＮＶ発達および網膜下出血を見出した（図５ａ）。ＣＮＶの３ＤのＺ−スタック共焦点容積レンダリングによって、損傷の６日後のＮｌｒｐ３−／−マウスのＣＮＶ容積の有意な増大が確認された（図５ｄ、ヒストグラム）。網膜電図検査（ＥＲＧ）分析によって、両方のノックアウトマウスが、機能的な桿体視細胞および錐体視細胞の応答を損傷前に有することが確認された（図５ｂ）。本発明者らは、活性化されたマクロファージ浸潤（正のＦ４／８０免疫反応性）を、Ｎｌｒｐ３−／−マウスの病変部位で観察した（図５ｃ）が、切断されたカスパーゼ−１およびＩＬ−１８は、ＷＴマウスの損傷部位でのみ明らかであって、特にＮｌｒｐ３−／−マウスにはなかった（図５ｄ、図１６、図１７）。これらの知見は、ＣＮＶのこの動物モデルで観察された無菌性炎症性応答におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの役割、およびＣＮＶ発達の調節因子としてのＩＬ−１８に向かうポイントを記載している。
【００８３】
ＮＬＲＰ３は、ＩＬ−１８を通じてＣＮＶ病変形成に対する防御を付与する
増悪したＣＮＶ発達に対するＮＬＲＰ３媒介性の防御におけるＩＬ−１８の役割を確認するために、本発明者らは、レーザー誘発性のＣＮＶをＩＬ１８−／−マウスに投与した。これらのマウスは、ＥＲＧ分析によって評価した場合、正常な網膜機能を有することが観察された（図６ａ）。損傷６日後のＩＬ１８−／−マウスにおけるブルッフ膜のレーザー誘発性の破壊およびＣＮＶ容積定量によって、ＷＴのＣＮＶ（図６ｃ）に比較して顕著な病変の増大が示された（図６ｂ）。レーザー誘発性ＣＮＶに続いて硝子体内に注射されたＩＬ−１８中和抗体はまた、ＣＮＶ発達の有意な増大を生じた（図１８）。
【００８４】
本発明者らは、ＩＬ−１８が、ＶＥＧＦ合成の調節を介してその防御を付与し得ると推論した。この仮説を検討するために、本発明者らは、ＡＲＰＥ１９細胞およびマウス脳微小血管内皮細胞株（ｂＥｎｄ．３）を、組み換えＩＬ−１８で処理して、引き続きＶＥＧＦレベルを増殖培地中で分析した。ＩＬ−１８は、ＡＲＰＥ−１９細胞およびｂＥｎｄ．３細胞の両方によって分泌されたＶＥＧＦのレベルを有意に減少させた（図６ｄ、図６ｅ）。これらの知見は直接、ＶＥＧＦ発現の調節におけるＩＬ−１８の役割を意味し、Ｎｌｒｐ３−／−およびＩＬ１８−／−マウスにおける増悪したＣＮＶを説明する可能性が高い。
【００８５】
結論
本発明者らの研究では、ＡＭＤドナーの眼から単離したドルーゼンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し得ることが示された。さらに、本発明者らは、一般的に修飾ドルーゼンタンパク質でみられる酸化的ストレス関連タンパク質修飾である、カルボキシエチル−ピロール（ＣＥＰ）が、インフラマソームをプライミングし得ることを示す。相前後して、本発明者らは、補体構成要素Ｃ１Ｑが、カスパーゼ−１およびファゴリソソーム依存性の方式でＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し得ることを示す。本発明者らは、委縮型ＡＭＤの許容されたモデルである、ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスと関連するドルーゼン様病変の周囲のマクロファージ中の活性化されたカスパーゼ−１およびＮＬＲＰ３を観察した。また、本発明者らは、委縮型ＡＭＤの通常用いられる動物モデルがＮＬＲＰ３活性化に依存するが、予期せぬことに、ＮＬＲＰ３の非存在下では、ＣＮＶの発達は増悪したことを見出した。本発明者らは、ＩＬ−１８を、病原性の新血管形成の重要な調節因子とみなし、ＡＭＤの発症におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの防御的な役割を示唆する。
【００８６】
本発明者らの観察では、ＡＭＤの予防に関して多くの意味がある。現在の抗体ベースの治療は、ＶＥＧＦの生物活性を阻害することによってＡＭＤの進行型を標的としている。しかし、これらのモノクローナル抗体（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）及びＡｖａｓｔｉｎ（登録商標））の直接かつ規則的な眼内注射には、網膜剥離、出血および感染のリスクがある。
【００８７】
本発明者らは、ＡＭＤドナーの眼から単離したドルーゼンが、ＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し得ることを示した。ＡＭＤドルーゼンは、タンパク質沈着の収集物から構成され、その多くは、ＣＥＰに付加される。その粒子状の性質に起因して、正常なドナーの眼由来のドルーゼンはまたインフラマソーム活性化も誘導し得ことが可能であるが、その網膜中でのレベルは定義によれば、ＡＭＤドルーゼンよりも低く、生化学的組成物は異なる。これらの相違は、ＡＭＤの進行について重要である可能性が高い。インフラマソーム活性化に関するコントロールおよびＡＤＭドルーゼンの比較は、しかし、まだ完全には解明されていない。
【００８８】
本発明者らは、ＣＥＰ−ＨＳＡが、ＴＬＲ２活性化を通じてインフラマソームをプライミングして、ＡＭＤの眼の中で、焦点で、高レベルで蓄積する天然に存在するプライミング因子をもたらしてくれることができることを示した。ＮＬＲＰ３の場合には、危険な信号は通常粒子状であって、通常は細胞外である。ドルーゼンの構成要素であるＣ１Ｑは、アミロイド様に凝集することが示された。Ｃ１Ｑは、ヒト血液から単離され、ＮＬＲＰ３インフラマソームを、リソソームの酸性化およびカテプシンＢに依存した方式で活性化することを本発明者らは示す。
【００８９】
ＡＭＤにおいて出現する無菌性炎症反応は、過剰なドルーゼン蓄積に対してほぼ隣接するＲＰＥ細胞中で生じる限局性壊死の結果である可能性が高い。ブルッフ膜におけるドルーゼン蓄積は、早期ＡＭＤ発症の顕著な特徴でありかつ診断指標であり、疾患の病理の中心であると考えられる。本発明者らは、ＣＥＰ−ＭＳＡ免疫マウスにおいてＡＭＤ様病変に関連するマクロファージのインフラマソーム活性化を観察したが、最初の本発明者らの観察では、ＣＮＶへの進行における炎症性過程、浸出型のＡＭＤについての防御的役割が直接示され、疾患予防における炎症性過程の抑制に関連する現在の定説とは直接反対する。実際、あるレベルの炎症「パラ（ｐａｒａ）−炎症」は、宿主に有益であり得ることが現在受け入れられている。臨床的展望からは、炎症性の過程は長期にわたってＡＭＤの病理および疾患発症に関連していたが、本発明者らは、滲出型ＡＭＤの場合、網膜の炎症の全体的な阻害は、妥当な治療ではないと示唆する。本発明者らの観察を強化するように、滲出型ＡＭＤを有する個体におけるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））の近年の臨床試験の結果、これらの被験体のうち５０％超で、症状が大きく増悪したことが示された。
【００９０】
またＮＬＲＰ３インフラマソームは近年、マウスでの実験的な大腸炎および結腸直腸癌に対して、ＩＬ−１８産生を通じて、防御を付与することが示された。
【００９１】
以前の研究によって、ＩＬ−１８は、網膜の血管発達に重要な役割を果たすことが示される。Ｉｌ−１８─／─マウスは、血管拡張症および血管漏出を示し、またＶＥＧＦおよびｂＦＧＦレベルはまた、Ｉｌ−１８─／─マウス網膜では上方制御された。ＩＬ−１８の抗血管形成性の役割はまた、虚血後傷害で、および腫瘍血管形成の阻害でも観察された。
【００９２】
ドルーゼンによるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化によって、平衡が存在し得ること、それによってドルーゼンの特定の限局性のレベルは、ＩＬ−１８を誘導するその能力のおかげで耐容され、ＩＬ−１８は次に抗血管形成エフェクターとして機能し得、炎症性の微小環境で脈絡膜恒常性を維持することが示唆される。一旦臨界レベルのドルーゼンが蓄積すれば、その防御的役割は、周囲の組織に対する過剰な損傷によって無効にされる可能性が高い。重要なことに、本発明者らは、ドルーゼン−誘導性の炎症性メディエータが、ＣＮＶ発症に対して防御的であること、およびＶＥＧＦの下流産生を妨げるＩＬ−１８のＮＬＲＰ３媒介性の上昇が得られることを示した。さらに、ＩＬ−１８は、もっと通常の炎症のモデルである、実験的なブドウ膜炎の発症においてある役割を果たすのではないことが示され、これは、本発明者らの知見に由来する治療の特徴的な形態について直接の意味を有する知見である。全体として、本発明者らの観察は、直接、ＮＬＲＰ３が、ＡＭＤの主要な疾患病理に対する防御因子であるとみなし、かつ眼でＩＬ−１８を産生するかまたは眼に対してＩＬ−１８を送達する目的のストラテジーは、滲出型ＡＭＤの状況ではＣＮＶの進行を予防するのに利点を示し得ることを示唆する。  
【００９３】
補足的な方法
臨床評価
ＡＭＤの被験体および罹患していない個体は、インフォームドコンセントに従って臨床の眼科医が評価した。最良矯正距離視力（ｂｅｓｔ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）を、Ｓｎｅｌｌｅｎ  Ｃｈａｒｔを用いて測定した。近見視力は、標準試験タイプを用いて評価した。眼の前部は、スリット−ランプ生体顕微鏡で検査した。眼内圧は、Ｇｏｌｄｍａｎｎ  Ｔｏｎｏｍｅｔｒｙで測定した。詳細な眼底検査およびカラーの眼底写真は、トロピカミド（１％）を用いて瞳孔散大後に行った。委縮型ＡＭＤは、ＡＭＤ関連の黄斑の変化（ドルーゼン、ＲＰＥの色素過剰、低色素沈着、または地図状委縮）に起因する視力のゆがみの存在によって診断した。滲出型ＡＭＤは、ＣＮＶを図示するためにフルオレセイン血管造影写真によって補足した臨床試験で診断した。
【００９４】
マウスのＥＲＧ分析
マウスを、一晩暗野に順応させて、薄暗い赤い光のもとでの網膜電図写真のために準備した。瞳孔散大を、１％の１％のクリオペンタレートおよび２．５％のフェニレフリンの滴下によって行った。動物を、ケタミン（体重１５ｇあたり２．０８ｍｇ）およびキシラジン（体重１５ｇあたり０．２１ｍｇ）の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射によって麻酔した。光の標準化されたフラッシュを、Ｇａｎｚｄｅｌｄボウルでマウスに与えて、網膜の均一な照射を確実にした。ＥＲＧ応答を、同時に両方の眼から、Ｖｉｄｉｓｉｃ（Ｄｒ  Ｍａｎｎ  Ｐｈａｒｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を導電材として用いて、金ワイヤ電極（Ｒｏｌａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｇｍｂｈ）によって記録して、角膜の水和を維持した。参照電極および接地電極を、それぞれ、側頭眼角および尾の前から約１ｍｍ皮下に配置した。身体の温度を、直腸温度プローブで制御した加熱デバイスを用いて３７℃で維持した。応答は、ＲｅｔｉＳｃａｎ  ＲｅｔｉＰｏｒｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｕｎｉｔ（Ｒｏｌａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｇｍｂｈ）を用いて分析した。プロトコールは、ヒトの網膜電図写真について国際臨床基準委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が承認したものに基づいた。錐体視細胞単離物の応答は、３０カンデラ／ｍ−２という桿体視細胞−抑制バックグラウンド光（ここで事前に暗野に順応させた動物を刺激の前に１０分間さらした）に対して示される３カンデラ／ｍ−２／ｓの強度の白色フラッシュを用いて記録した。０．５Ｈｚの頻度で示した、４８の個々のフラッシュに対する応答をコンピューターで平均した。標準的な慣習に従って、ａ−波を、ベースラインからａ−波トラフまで、およびｂ−波をａ−波トラフからｂ−波のピークまで測定した。
【００９５】
本発明は、本明細書に記載された実施形態（ｓ）に限定されないが、本発明の範囲から逸脱することなく補正されても、改変されてもよい。
【００９６】
本発明は、以下の実施形態の第一の設定によってここで記載される。
１．変性性の網膜状態に対して防御性である炎症性メディエータ
２．ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素である炎症性メディエータ
３．炎症促進性インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）であるＮＬＲＰ３インフラマソーム構成要素
４．ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための実施形態２〜３のいずいれかに記載のインフラマソーム構成要素
５．実施形態４に記載のインフラマソーム構成要素であって、ここで上記の変性性の網膜の状態が加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、例としては、滲出型および委縮型ＡＭＤである、インフラマソーム構成要素。
６．先行する実施形態のいずれかに記載のＮＬＲＰ３−インフラマソームであって、ここでＩＬ−１８の活性が維持されるか、および／または刺激されている、ＮＬＲＰ３−インフラマソーム。
７．ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）に関与する変性性の網膜状態の処置のための医薬の製造における、ＮＬＲＰ３インフラマソーム誘発性ＩＬ−１８、その改変体または一部の使用であって、ここで、この処置が、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化因子、例えば、ＩＬ−１８の骨髄もしくは骨髄由来の細胞もしくは組織への送達および／または眼の細胞もしくは組織への直接の送達を包含する、使用。
８．ＩＬ−１８のウイルス媒介性の送達を含む実施形態７による使用。
９．ＩＬ−１８の活性を維持または刺激することを包含する、変性性の網膜症の進行を遅延するための方法。
１０．ＮＬＲＰ３−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインＩＬ−１８の使用であって、ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成関連の疾患に関与する疾患、例えば、滲出型または委縮型のＡＭＤを発症するリスクを示すためのバイオマーカーとしての使用。
１１．ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成関連の疾患、例えば、滲出型または委縮型のＡＭＤの発症または進行のリスクを、被験体において、−インフラマソーム誘発性メディエータ、好ましくは炎症促進性サイトカインＩＬ−１８を、バイオマーカーとして用いて決定するための方法であって、この方法は；
−この被験体において循環中のＩＬ−１８のレベルのレベルを得ることと；
−参照に対してＩＬ−１８レベルのレベルを比較することであって、ここで疾患ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成の発症または進行の被験体のリスクが、参照に比較してＩＬ−１８レベルのレベルに基づくことと；
を包含する、方法。
【００９７】
本発明はここで、以下の第二セットの実施形態によって記載される。
１．ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態の処置における使用のための、炎症性メディエータ、好ましくはＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質。
２．上記網膜の状態が、加齢性黄斑変性症である、実施形態１に記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
３．上記加齢性黄斑変性症が滲出型加齢性黄斑変性症または萎縮型加齢性黄斑変性症である、実施形態２による使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
４．上記ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素が、ｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏＩＬ−１８）またはインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）である、先行の実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
５．ｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）またはインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が、新生血管疾患の発症の前に、または初期段階の新生血管疾患において被験体に投与される方法での使用のための、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
６．加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体においてインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）発現を制御、維持または刺激する際の先行する実施形態のいずれかに記載の使用のための炎症性メディエータ、構成要素または基質。
７．滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクのある被験体において脈絡膜−新血管形成（ＣＮＶ）を制御する際の使用のための先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＰｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
８．Ｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）が、網膜へ送達される、実施形態７に記載の使用のためのｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
９．Ｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）が、網膜へ全身的に、直接注射によって、および／またはウイルス媒介性の送達によって送達される、実施形態８に記載の使用のためのｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
１０．Ｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性の送達によって網膜へ送達される、実施形態８または９に記載の使用のためのｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
１１．誘導性のｐｒｏ−ＩＬ−１８を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、網膜へ送達される、実施形態１０に記載の使用のためのｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
１２．網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるおよびその周囲のカスパーゼ−１の発現が、ｐｒｏ−ＩＬ−１８のＩＬ−１８への進行を調節し、ＩＬ−１８が脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）発症に対して防御効果を有する、先行の実施形態のいずれかに記載の使用のためのｐｒｏ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）。
１３．眼、好ましくは脈絡膜、新血管形成の処置のために適切な形態のｐｒｏ−ＩＬ−１８の発現を指向する組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
１４．ＡＭＤ、好ましくは滲出型ＡＭＤを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与のための形態の実施形態１３による組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
１５．上記ベクターが、網膜下または硝子体内注射を介した眼への送達に適切な形態である、実施形態１３または１４に記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
１６．前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達ベクターである、実施形態１３〜１５のいずれかに記載の組み換えウイルス遺伝子送達ベクター。
１７．Ｐｒｏ−ＩＬ−１８の発現を指向し、かつＡＭＤ、好ましくは滲出型ＡＭＤを発症するリスクのある被験体の眼に対する投与に適切な、実施形態１６に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子送達ベクター。
１８．前記遺伝子送達ベクターが、ｐｒｏ−Ｉｌ−１８遺伝子をコードするヌクレオチドを含んでいるＡＡＶベクターである、実施形態１７に記載の組み換えＡＡＶベクター。
１９．前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１〜１１のいずれか１つ、好ましくは血清型２、８または９である、実施形態１７または１８に記載の組み換えＡＡＶベクター。
２０．前記ｐｒｏ−ＩＬ−１８遺伝子遺伝子が、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する、実施形態１６〜１９のいずれかに記載の組み換えＡＡＶベクター。
２１．ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜−新血管形成に関与する変性性の網膜状態を処置する方法であって、炎症性メディエータ、ＮＬＲＰ３−インフラマソームの構成要素または基質を処置の必要な被験体に投与することを包含する、方法。
２２．加齢性黄斑変性症を発症するリスクのある被験体に対してプロ−インターロイキン−１８（ｐｒｏ−Ｉｌ−１８）を投与することを包含する、滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための、実施形態２１に記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月5日(2017.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜の新血管形成に関与する変性性の網膜疾患の治療のための、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）を含む薬学的組成物。
【請求項２】
前記網膜疾患は、加齢性黄斑変性症であり、好ましくは滲出型加齢性黄斑変性症または委縮型加齢性黄斑変性症である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
全身的に送達される、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症のリスクがある患者における脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）の調節のための、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）を含む薬学的組成物。
【請求項５】
新生血管疾患の発症前、または初期段階の新生血管疾患において、被験体に投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
網膜へ送達される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
網膜に対して全身的に、注射によって送達される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）発症に対して防御効果を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ドルーゼンおよびアナフィラトキシン誘発性の脈絡膜の新血管形成に関与する変性性の網膜疾患の治療のための医薬の製造における、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の使用。
【請求項１０】
前記網膜疾患は、加齢性黄斑変性症であり、好ましくは滲出型加齢性黄斑変性症または委縮型加齢性黄斑変性症である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬は、全身的に送達される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症のリスクがある患者における脈絡膜の新血管形成（ＣＮＶ）の調節のための医薬の製造における、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の使用。
【請求項１３】
前記医薬は、新生血管疾患の発症前、または初期段階の新生血管疾患において、被験体に投与される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬は、網膜へ送達される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬は、網膜に対して全身的に、注射によって送達される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の使用。