(57)【要約】【課題】妊娠母体から採取された末梢血から抗体を用いて胎児細胞を単離する新規な方法を提供する。【解決手段】抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を血液細胞集団に接触させて少なくとも２種の抗体で細胞をマーキングする工程と、血液細胞集団から、少なくとも２種の抗体でマーキングされた細胞を単離する工程と、を有する胎児細胞の単離方法；少なくとも２種の抗体を含む抗体セット；及びその応用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離する方法であって、
抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を血液細胞集団に接触させて前記少なくとも２種の抗体で細胞をマーキングする工程と、
前記血液細胞集団から、前記少なくとも２種の抗体でマーキングされた細胞を単離する工程と、
を有する、胎児細胞の単離方法。
【請求項２】
前記少なくとも２種の抗体が、抗ＨＢＧ抗体を含む、請求項１に記載の胎児細胞の単離方法。
【請求項３】
さらに、前記末梢血を密度勾配遠心分離に供して有核赤血球を含む画分を得る工程を有し、
前記有核赤血球を含む画分が前記血液細胞集団である、
請求項１又は請求項２に記載の胎児細胞の単離方法。
【請求項４】
さらに、
抗ＣＤ４５抗体を前記血液細胞集団に接触させて前記抗ＣＤ４５抗体で細胞をマーキングする工程と、
前記血液細胞集団から、前記抗ＣＤ４５抗体でマーキングされていない細胞を単離する工程と、
を有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の胎児細胞の単離方法。
【請求項５】
さらに、
核染色色素を前記血液細胞集団に接触させて細胞核を染色する工程と、
前記血液細胞集団から、前記核染色色素によって核が染色された有核細胞を単離する工程と、
を有する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の胎児細胞の単離方法。
【請求項６】
前記血液細胞集団から細胞を単離することがフローサイトメトリーによって行われる、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の胎児細胞の単離方法。
【請求項７】
抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を含む、胎児細胞の単離に用いるための抗体セット。
【請求項８】
前記少なくとも２種の抗体が、抗ＨＢＧ抗体を含む、請求項７に記載の抗体セット。
【請求項９】
前記少なくとも２種の抗体の一部又は全部がそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、及び磁気ビーズから選ばれる少なくとも１種で標識された抗体である、請求項７又は請求項８に記載の抗体セット。
【請求項１０】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の胎児細胞の単離方法により、妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離し、単離された前記胎児細胞から染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離する方法、抗体セット、及び出生前遺伝学的検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前遺伝学的検査として、従来、羊水穿刺により採取した羊水から胎児細胞を単離し、胎児細胞中の染色体を調べる羊水染色体検査が行われてきた。しかし、羊水穿刺には流産を引き起こす可能性がある。
【０００３】
一方、妊娠母体の血液中に存在する胎児由来の無細胞ＤＮＡ、又は、妊娠母体の血液中に存在する胎児細胞の染色体ＤＮＡを解析して、胎児染色体の異常を検出する検査が、非侵襲な出生前遺伝学的検査として知られている。
【０００４】
非侵襲な出生前遺伝学的検査の中でも、胎児由来の無細胞ＤＮＡを解析する検査は、既に実用化されている。一方、胎児細胞の染色体ＤＮＡを解析する検査は、いまだ実用に至っていない。その理由として、胎児細胞（例えば、胎児の有核赤血球）が母体血数ｍＬ中に１個程度しか存在しない希少細胞であることが挙げられる。しかし、胎児細胞の染色体ＤＮＡを解析できれば、より検査精度に優れた非侵襲な出生前遺伝学的検査が期待できる。
【０００５】
ところで、細胞を抗体を用いて免疫学的に識別し単離する方法は、細胞特異性の高い単離方法であり、臨床に普及している。こうした背景のもとに、妊娠母体の末梢血に含まれる胎児細胞を単離する方法として、胎児細胞に特有のタンパク質に結合する抗体を用いて胎児細胞を識別し単離する方法が、例えば特許文献１〜４に開示されている。胎児の赤血球に発現しているヘモグロビンのほとんどは、２個のサブユニットαと２個のサブユニットγとからなるヘモグロビンＦ（fetal hemoglobin）であるが、生後はサブユニットγよりもサブユニットβの発現が優位になり、成人の赤血球に発現しているヘモグロビンのほとんどは、２個のサブユニットαと２個のサブユニットβとからなるヘモグロビンＡ（adult hemoglobin）である。この現象を利用して、特許文献１〜４は、サブユニットγに対する抗体を用いて胎児の赤血球を識別し単離することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−０３９４３３号公報
【特許文献２】特表２００１−５０２８０５号公報
【特許文献３】特開２０１４−２２３０８２号公報
【特許文献４】特表２０１４−５３３５０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
出生前遺伝学的検査の精度を挙げるために、妊娠母体の末梢血から胎児細胞を確実に単離する免疫学的方法が求められている。
【０００８】
本開示の実施形態は、上記状況のもとになされた。
本開示の課題は、妊娠母体から採取された末梢血から抗体を用いて胎児細胞を単離する新規な方法を提供することである。
また、本開示の課題は、胎児細胞を単離するために用いる新規な抗体セットを提供することである。
また、本開示の課題は、単離された胎児細胞から染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
［１］  妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離する方法であって、抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を血液細胞集団に接触させて少なくとも２種の抗体で細胞をマーキングする工程と、血液細胞集団から、少なくとも２種の抗体でマーキングされた細胞を単離する工程と、を有する、胎児細胞の単離方法。
［２］  少なくとも２種の抗体が、抗ＨＢＧ抗体を含む、［１］に記載の胎児細胞の単離方法。
［３］  さらに、末梢血を密度勾配遠心分離に供して有核赤血球を含む画分を得る工程を有し、有核赤血球を含む画分が血液細胞集団である、［１］又は［２］に記載の胎児細胞の単離方法。
［４］  さらに、抗ＣＤ４５抗体を血液細胞集団に接触させて抗ＣＤ４５抗体で細胞をマーキングする工程と、血液細胞集団から、抗ＣＤ４５抗体でマーキングされていない細胞を単離する工程と、を有する、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の胎児細胞の単離方法。
［５］  さらに、核染色色素を血液細胞集団に接触させて細胞核を染色する工程と、血液細胞集団から、核染色色素によって核が染色された有核細胞を単離する工程と、を有する、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の胎児細胞の単離方法。
［６］  血液細胞集団から細胞を単離することがフローサイトメトリーによって行われる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の胎児細胞の単離方法。
［７］  抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を含む、胎児細胞の単離に用いるための抗体セット。
［８］  少なくとも２種の抗体が、抗ＨＢＧ抗体を含む、［７］に記載の抗体セット。
［９］  少なくとも２種の抗体の一部又は全部がそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、及び磁気ビーズから選ばれる少なくとも１種で標識された抗体である、［７］又は［８］に記載の抗体セット。
［１０］  ［１］〜［６］のいずれか１つに記載の胎児細胞の単離方法により、妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離し、単離された胎児細胞から染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査方法。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、妊娠母体から採取された末梢血から抗体を用いて胎児細胞を単離する新規な方法が提供される。
また、本開示によれば、胎児細胞を単離するために用いる新規な抗体セットが提供される。
また、本開示によれば、単離された胎児細胞から染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】有核赤血球画分の全細胞に占める抗体陽性細胞の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、実施形態の範囲を制限するものではない。
【００１３】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１４】
本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中の各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
【００１５】
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１６】
＜胎児細胞の単離方法＞
本開示の単離方法は、妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離する方法である。本開示において血液には、血液そのもの、及び、生理食塩水で希釈した血液；血液にグルコース、抗血液凝固剤等の添加剤を加えた保存血液；これらの分画物；などの血液試料が含まれる。本開示において血液細胞集団とは、血液を構成する細胞の集団を指す。
【００１７】
本開示の単離方法は、妊娠母体から採取された末梢血から、胎児細胞、望ましくは胎児の有核細胞を単離する。有核細胞には染色体が存在するため、胎児の有核細胞を単離することで、胎児染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。妊娠母体の末梢血に含まれる胎児の有核細胞としては、有核赤血球が挙げられる。
【００１８】
胎児の有核赤血球は、胎盤を通過して母体の血液中に移行する。胎児の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。したがって、本開示の単離方法に供する血液は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体から採取した末梢血、又は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体から採取した末梢血から調製した血液試料であることが好ましい。
【００１９】
母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。胎児の有核赤血球は、妊娠母体血中の細胞の約１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、妊娠母体の抹消血中においては、非常に存在確率が低い。妊娠母体の末梢血には、胎児の有核赤血球のほかに、母親の白血球（好酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球）；母親の、核のない成熟した赤血球；母親の有核赤血球；等の血液細胞が含まれる。
【００２０】
上記の様々な細胞を含む血液細胞集団から、胎児細胞、望ましくは胎児の有核赤血球を効率よく単離するために、本開示の単離方法は、抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を用いて細胞を選別する。上記１２種の抗体が結合するヒトタンパク質の詳細を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2018050559.tif 000002
【００２２】
ヒトのヘモグロビンサブユニットγ（hemoglobin subunit gamma；ＨＢＧ）の遺伝子は２つあり、それぞれＨＢＧ１（hemoglobin subunit gamma 1）とＨＢＧ２（hemoglobin subunit gamma 2）とを発現する。本開示において、ＨＢＧは、ＨＢＧ１とＨＢＧ２とを含む用語であり、抗ＨＢＧ抗体とは、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２の少なくとも一方に結合する抗体を意味する。
【００２３】
本開示において、抗体は、免疫グロブリン分子そのもの（intact immunoglobulin）のみならず、その断片であって抗原への結合能を有する断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'）をも包含する用語である。
【００２４】
本発明者の解析によって、ＨＢＧ、ＡＬＡＳ２、ＨＥＭＧＮ、Ｃ９ｏｒｆ５、ＧＹＰＢ、ＳＬＣ１Ａ５、ＥＩＦ１ＡＹ、Ｃ４ｏｒｆ３、ＩＧＦ２、ＧＹＰＥ、ＣＬＩＣ６、及びＤＤＸ３Ｙは、ヒト成人骨髄血に比べヒト臍帯血において高発現していることが確認された。これらヒトタンパク質に結合する抗体を少なくとも２種用いることによって、血液細胞集団から胎児細胞を効率的に単離することができる。
【００２５】
１２種の抗体（抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体。以下、同じ。）から少なくとも２種選択する組合せとしては、抗ＨＢＧ抗体と、それ以外の１１種の抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体との組合せが挙げられる。抗ＨＢＧ抗体を用いることにより、血液細胞集団から単離される細胞が、胎児の赤血球である確率が高まる。好ましい組合せとしては、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体との組合せが挙げられ、より好ましい組合せとしては、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、及び抗ＣＬＩＣ６抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体との組合せが挙げられ、更に好ましい組合せとしては、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、及び抗ＳＬＣ１Ａ５抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体との組合せが挙げられる。
【００２６】
１２種の抗体はそれぞれ、抗原を免疫された非ヒト動物の血液から精製する方法；抗原を免疫された非ヒト動物のＢ細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を得る方法；等の方法で製造可能である。１２種の抗体は、市販品でもよい。
【００２７】
１２種の抗体の一部又は全部はそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、及び磁気ビーズから選ばれる少なくとも１種で標識された標識化抗体でもよい。
【００２８】
抗体を標識する蛍光色素としては、例えば、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647等が挙げられる。抗体を標識する蛍光タンパク質としては、例えば、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、フィコエリスロシアニン等が挙げられる。抗体を標識する酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。
【００２９】
１２種の抗体から少なくとも２種の抗体を選択して組み合せることによって、血液細胞集団から胎児細胞を単離するために用いる抗体セットが提供される。本抗体セットの一つの実施形態例は、少なくとも抗ＨＢＧ抗体を含み、抗ＨＢＧ抗体と、それ以外の１１種の抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体とを含む。本抗体セットの好ましい実施形態例は、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体とを含む。本抗体セットのより好ましい実施形態例は、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、及び抗ＣＬＩＣ６抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体とを含む。本抗体セットの更に好ましい実施形態例は、抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、及び抗ＳＬＣ１Ａ５抗体から選ばれる少なくとも１種の抗体とを含む。
本抗体セットに含まれる少なくとも２種の抗体の一部又は全部はそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、及び磁気ビーズから選ばれる少なくとも１種で標識された標識化抗体でもよい。
【００３０】
以下、本開示の単離方法を、工程を説明することによって、詳細に説明する。
【００３１】
［胎児細胞マーキング工程、胎児細胞単離工程］
本開示の単離方法は、
抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を血液細胞集団に接触させて少なくとも２種の抗体で細胞をマーキングする工程（「胎児細胞マーキング工程」という。）と、
血液細胞集団から、少なくとも２種の抗体でマーキングされた細胞を単離する工程（「胎児細胞単離工程」という。）と、を有する。
【００３２】
ＨＢＧ、ＡＬＡＳ２、ＨＥＭＧＮ、Ｃ９ｏｒｆ５、ＧＹＰＢ、ＳＬＣ１Ａ５、ＥＩＦ１ＡＹ、Ｃ４ｏｒｆ３、ＩＧＦ２、ＧＹＰＥ、ＣＬＩＣ６、及びＤＤＸ３Ｙは、ヒト成人骨髄血に比べヒト臍帯血において高発現していることから、１２種の抗体の少なくとも２種の陽性細胞は、胎児細胞である確率が高い。したがって、胎児細胞マーキング工程及び胎児細胞単離工程によって、妊娠母体から採取された末梢血に由来する血液細胞集団から、高確率で胎児細胞が単離される。
【００３３】
胎児細胞マーキング工程は、１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体を血液細胞集団に接触させて少なくとも２種の抗体で細胞をマーキングする工程であり、抗体を血液細胞集団に接触させる方法は制限されない。抗体と血液細胞集団との接触は、例えば、血液細胞集団の細胞懸濁液に抗体を添加し、又は、抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に血液細胞集団を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体は、血液細胞集団に、同時に接触させてもよく、順次接触させてもよい。１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体の一部又は全部が、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、磁気ビーズ等で標識されていない場合には、これら抗体に対する標識化二次抗体を、血液細胞集団にさらに接触させてもよい。二次抗体の標識としては、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、磁気ビーズ等が挙げられる。
【００３４】
胎児細胞マーキング工程において抗体を接触させる血液細胞集団は、抗体が細胞膜を通過して細胞質に至ることを可能にする目的で、細胞膜透過処理を施された血液細胞集団であることが好ましい。細胞膜透過処理は、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００等の界面活性剤を含有するリン酸緩衝液又は生理食塩水と、血液細胞集団とを混合し、４℃〜室温で１分間〜３０分間インキュベートすることによって行われる。血液細胞集団に細胞膜透過処理を施す場合、血液細胞集団は、細胞内からタンパク質が失われることを抑制する目的で、細胞膜透過処理の前に固定化処理を施された血液細胞集団であることが好ましい。細胞の固定化処理は、例えば、グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液又は生理食塩水と、血液細胞集団とを混合し、４℃〜室温で１分間〜３０分間インキュベートすることによって行われる。
【００３５】
胎児細胞単離工程は、少なくとも２種の抗体でマーキングされた細胞を単離する工程であり、単離する方法は制限されない。
胎児細胞マーキング工程に用いる抗体（１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体、又は、これら抗体に対する二次抗体）が、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、磁気ビーズ等で標識された標識化抗体である場合には、その標識に応じた光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって胎児細胞単離工程が行われる。胎児細胞単離工程は、効率の観点から、フローサイトメトリーによって行うことが好ましく、したがって、胎児細胞マーキング工程に用いる抗体（１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体、又は、これら抗体に対する二次抗体）は、蛍光色素、蛍光タンパク質、又はビオチンで標識された抗体であることが好ましい。
【００３６】
［有核赤血球濃縮工程］
胎児細胞マーキング工程において抗体を接触させる血液細胞集団は、妊娠母体から採取された末梢血から、有核赤血球を多く含む集団に濃縮された細胞集団であることが好ましい。したがって、本開示の単離方法は、さらに、末梢血を密度勾配遠心分離に供して有核赤血球を含む画分を得る工程（「有核赤血球濃縮工程」という。）を有し、この有核赤血球を含む画分が、胎児細胞マーキング工程における血液細胞集団であることが好ましい。
【００３７】
有核赤血球は、密度勾配遠心分離により、血液中に存在する血漿成分やその他の血液細胞と分離され得る。有核赤血球を分離するための密度勾配遠心分離は、公知の方法を適用してよい。例えば、密度の異なる２種類の媒体を遠沈管に重層した不連続密度勾配の上に、生理食塩水で希釈した血液を重層して遠心を行うことにより、有核赤血球を分画し濃縮できる。
【００３８】
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、胎児の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児の有核赤血球の密度は、1.065ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ程度、母親の血球の密度は、赤血球が1.070ｇ／ｍＬ〜1.120ｇ／ｍＬ程度、好酸球が1.090ｇ／ｍＬ〜1.110ｇ／ｍＬ程度、好中球が1.075ｇ／ｍＬ〜1.100ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が1.070ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が1.060ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ程度、単球が1.060ｇ／ｍＬ〜1.070ｇ／ｍＬ程度である。
【００３９】
密度1.065ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ程度の胎児の有核赤血球を、ほかの血液細胞と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。胎児の有核赤血球の中心の密度は1.080ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度をはさむ２つの異なる密度の媒体を隣接して重層することで、その界面に胎児の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、下層の媒体の密度を1.08ｇ／ｍＬ〜1.10ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.080ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ）、上層の媒体の密度を1.06ｇ／ｍＬ〜1.08ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.065ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ）とする。本開示の単離方法においては、下層の媒体と上層の媒体は同じ種類でも異なる種類でもよく、同じ種類の媒体を用いることが好ましい。
【００４０】
媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５ｎｍ〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll-Paque（登録商標）、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含むHistopaque（登録商標）等が挙げられる。本開示の単離方法においては、Percoll及び／又はHistopaqueを使用することが好ましい。Percollは、密度1.130ｇ／ｍＬの製品が市販されており、水で希釈することで密度勾配を調製することが可能である。Histopaqueは、市販されている密度1.077ｇ／ｍＬの媒体及び密度1.119ｇ／ｍＬの媒体と水とを用いて密度勾配を調製することが可能である。
【００４１】
２層の不連続密度勾配は、例えば以下のようにして遠沈管に形成する。まず、凝固点以上かつ１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度状態にある下層の媒体を遠沈管の底部に収容する、又は、下層の媒体を遠沈管の底部に収容したのち１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度下で保存して冷却する。次に、下層の媒体の上に上層の媒体を重層する。
【００４２】
［白血球マーキング工程、白血球除外工程］
本開示の単離方法は、赤血球の単離効率を向上させる観点から、さらに、
抗ＣＤ４５抗体を血液細胞集団に接触させて抗ＣＤ４５抗体で細胞をマーキングする工程（「白血球マーキング工程」という。）と、
血液細胞集団から、抗ＣＤ４５抗体でマーキングされていない細胞を単離する工程（「白血球除外工程」という。）と、を有することが好ましい。
【００４３】
白血球共通抗原であるＣＤ４５は、白血球全般、即ち、好酸球、好中球、好塩基球、単球、及びリンパ球に発現していることから、血液細胞集団に含まれるＣＤ４５陰性細胞は、赤血球である確率が高い。したがって、白血球マーキング工程及び白血球除外工程によって、妊娠母体から採取された末梢血に由来する血液細胞集団から、高確率で赤血球が単離される。
【００４４】
白血球マーキング工程は、抗ＣＤ４５抗体を血液細胞集団に接触させて抗ＣＤ４５抗体で細胞をマーキングする工程であり、抗ＣＤ４５抗体を血液細胞集団に接触させる方法は制限されない。抗ＣＤ４５抗体と血液細胞集団との接触は、例えば、血液細胞集団の細胞懸濁液に抗ＣＤ４５抗体を添加し、又は、抗ＣＤ４５抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に血液細胞集団を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。白血球マーキング工程は、胎児細胞マーキング工程と同時に行ってもよく、胎児細胞マーキング工程の前又は後に行ってもよい。胎児細胞マーキング工程と白血球マーキング工程との同時実施は、例えば、血液細胞集団の細胞懸濁液に、１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体及び抗ＣＤ４５抗体を添加する、又は、１２種の抗体から選ばれる少なくとも２種の抗体及び抗ＣＤ４５抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に、血液細胞集団を添加することによって行われる。
【００４５】
抗ＣＤ４５抗体は、白血球除外工程を光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって行う観点から、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、又は磁気ビーズ等で標識された標識化抗体であることが好ましく、白血球除外工程をフローサイトメトリーによって行う観点から、蛍光色素、蛍光タンパク質、又はビオチンで標識された抗体であることが好ましい。
【００４６】
白血球除外工程は、抗ＣＤ４５抗体の標識に応じた光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって行われる。白血球除外工程は、胎児細胞単離工程の前に行ってもよく、胎児細胞単離工程の後に行ってもよい。
【００４７】
［細胞核染色工程、有核細胞単離工程］
本開示の単離方法は、有核細胞の単離効率を向上させる観点から、さらに、
核染色色素を血液細胞集団に接触させて細胞核を染色する工程（「細胞核染色工程」という。）と、
血液細胞集団から、核染色色素によって核が染色された有核細胞を単離する工程（「有核細胞単離工程」という。）と、を有することが好ましい。
【００４８】
細胞核染色工程及び有核細胞単離工程によって、妊娠母体から採取された末梢血に由来する血液細胞集団から、高確率で有核細胞が単離される。
【００４９】
細胞核染色工程は、核染色色素を血液細胞集団に接触させて細胞核を染色する工程であり、核染色色素を血液細胞集団に接触させる方法は制限されない。核染色色素と血液細胞集団との接触は、例えば、血液細胞集団の細胞懸濁液に核染色色素を添加し、又は、核染色色素を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に血液細胞集団を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。細胞核染色工程は、胎児細胞マーキング工程の前に行ってもよく、胎児細胞マーキング工程の後かつ胎児細胞単離工程の前に行ってもよく、胎児細胞単離工程の後に行ってもよい。本開示の単離方法が白血球マーキング工程及び白血球除外工程を有する場合、細胞核染色工程は、白血球マーキング工程の前に行ってもよく、白血球マーキング工程の後かつ白血球除外工程の前に行ってもよく、白血球除外工程の後に行ってもよい。
【００５０】
核染色色素としては、クロマチン、核タンパク質、ＤＮＡ等を染色する色素のいずれでもよく、具体的には、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ヨウ化プロピジウム、７−ＡＡＤ（7-Amino-Actinomycin D）、ヘキスト３３３４２、ＤＲＡＱ５、メチレンブルー、ヘマトキシリン、チオニン等が挙げられる。
【００５１】
核染色色素が非蛍光色素の場合、有核細胞単離工程は、例えば、細胞集団を光学顕微鏡で観察し、核が染色された細胞を単離することにより行われる。
核染色色素が蛍光色素の場合、有核細胞単離工程は、例えば、フローサイトメトリーにより行われる。
【００５２】
有核細胞単離工程は、胎児細胞単離工程の前に行ってもよく、胎児細胞単離工程の後に行ってもよい。本開示の単離方法が白血球マーキング工程及び白血球除外工程を有する場合、有核細胞単離工程は、白血球除外工程の前に行ってもよく、白血球除外工程の後に行ってもよい。
【００５３】
本開示の単離方法の一例としては、胎児細胞マーキング工程、白血球マーキング工程、細胞核染色工程、胎児細胞単離工程、白血球除外工程、及び有核細胞単離工程を有し、胎児細胞マーキング工程及び白血球マーキング工程を行い（その順番は制限されない）、次いで細胞核染色工程を行い、次いで３つの単離工程をフローサイトメトリーによって順次行う（その順番は制限されない）実施形態が挙げられる。本実施形態例によれば、胎児の有核赤血球を効率よく単離することができる。
【００５４】
＜胎児の出生前遺伝学的検査方法＞
本開示の検査方法は、妊娠母体から採取された末梢血から胎児細胞を単離し、単離された胎児細胞から染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査の方法である。本開示の検査方法は、ヒト個体が生来的に保有する遺伝情報を明らかにする検査であり、例えば、染色体の異数性の有無の検出、遺伝子多型の検出、及び、遺伝子変異の検出の少なくともいずれかを行う検査である。本開示の検査方法は、例えば、１３番染色体、１８番染色体、及び２１番染色体のトリソミー；性染色体の過剰；等の染色体の異数性の有無の検出に適用される。
【００５５】
本開示の検査方法は、公知の遺伝子検査の方法、及び公知の遺伝子解析技術を適用して実施してよい。本開示の検査方法は、染色体ＤＮＡの解析を容易にする目的で、胎児細胞から全ゲノム増幅（whole genome amplification；ＷＧＡ）を行う工程を有することが好ましい。さらに、本開示の検査方法は、例えば、全ゲノム増幅の増幅産物を鋳型にして、染色体上の目的領域をポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction；ＰＣＲ）により増幅する増幅工程と、増幅した目的領域の塩基配列及び量を決定する配列解析工程と、を有することが好ましい。以下、上記の工程を説明することによって、本開示の検査方法の実施形態例を詳細に説明する。
【００５６】
［全ゲノム増幅］
全ゲノム増幅の方法は、特に制限されず、公知の方法で行ってよい。全ゲノム増幅は、例えば、界面活性剤とタンパク質分解酵素とを用いて細胞を溶解させる工程と、細胞から溶出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを増幅する工程と、を有する。
【００５７】
全ゲノム増幅は、市販の試薬を適用して行ってよい。ＰＣＲに基づく試薬としては、例えば、PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit（Sigma-Aldrich社）、国際公開第２０１２／１６６４２５号に開示のＭＡＬＢＡＣ法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）に係る試薬が挙げられる。鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬としては、例えば、GenomiPhi DNA Amplification Kit（ＧＥヘルスケア社、GenomiPhiは登録商標）、REPLI-g Single Cell Kit（QIAGEN社、REPLI-gは登録商標）が挙げられる。
【００５８】
全ゲノム増幅は、その終了後にアガロースゲル電気泳動を行って、増幅の有無を確認することが好ましい。全ゲノム増幅の増幅産物は、精製することが好ましい。精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社、QIAquickは登録商標）を用いて行う。増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（登録商標、Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００５９】
［ＰＣＲによる目的領域の増幅工程］
本増幅工程は、全ゲノム増幅で得た増幅産物を鋳型にして、目的領域をＰＣＲにより増幅する工程である。目的領域（増幅される領域）は、遺伝学的検査の目的に応じて選択される、染色体上の領域である。ＰＣＲに使用するプライマー対の塩基配列は、目的領域の塩基配列とシークエンサーの解析原理とに従って設計される。増幅工程は、染色体上の複数の領域を解析する目的で、複数のプライマー対を用いて複数の目的領域の多重増幅を行う多重ＰＣＲ（マルチプレックスＰＣＲ）としてもよい。増幅工程は、シークエンサーの解析原理に従って、ＰＣＲを１回行ってもよく２回以上行ってもよい。
【００６０】
ＰＣＲ試薬としては、例えば、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ社）、Multiplex PCR Assay Kit ver2（タカラバイオ社）、KAPA Library Amplification Kit（日本ジェネティクス社）、Platinum Multiplex PCR Master Mix Kit（ライフテクノロジーズ社、Platinumは登録商標）が挙げられる。マルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プライマー対ごとにアニーリングの至適温度が異なることがあるため、反応条件の検討をすることが好ましい。ＰＣＲのサイクル数は、リアルタイムＰＣＲによる検討を予め行って、その結果に基づき設定してよい。ＰＣＲは、その途中で、反応温度及び／又は反応時間を変更してもよい。
【００６１】
増幅工程で得た増幅産物は、精製することが好ましく、精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）、AMPure XP Kit（BECKMAN COULTER社）を用いて行う。増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）、KAPA Library Quantification Kits（日本ジェネティクス社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００６２】
［配列解析工程］
配列解析工程は、増幅された目的領域の塩基配列と量とを決定する工程である。配列解析工程は、各種のシークエンサーによって行われる。ＰＣＲによる増幅工程で得た増幅産物の全部又は一部が、配列解析工程でシークエンサーにかけられる物質であり、ＰＣＲによる増幅工程で得た増幅産物が、いわばシークエンス用ライブラリである。
【００６３】
配列解析工程は、解析の精度及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で、次世代シークエンサーによって行われることが好ましい。次世代シークエンサー（Next Generation Sequencer；ＮＧＳ）とは、サンガー法を利用したキャピラリーシークエンサー（第一世代シークエンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシークエンサーを意味する。次世代シークエンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシークエンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシークエンサーである。具体的には、MiSeq（Illumina社）、HiSeq2000（Illumina社、HiSeqは登録商標）、Roche454（Roche社）等が挙げられる。
【００６４】
シークエンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、SAMtools及びBEDtoolsが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び／又は染色体数を解析することが好ましい。
【００６５】
配列解析工程で解析した、増幅された目的領域の塩基配列と量とから、染色体の異数性の有無、遺伝子多型、及び／又は遺伝子変異が検出される。染色体の異数性の検出方法の一例を、以下に説明する。
【００６６】
胎児の有核赤血球から得た染色体について、増幅産物の量をシークエンサーで解析する。基準（あるいは参照）として、母親の細胞から得た染色体について、増幅産物の量をシークエンサーで解析する。胎児が染色体の異数性を有しなければ、母親由来の増幅産物の量と胎児由来の増幅産物の量とは、ほぼ１：１の量比になると予想される。増幅領域が位置する染色体が胎児においてトリソミーである場合には、母親由来の増幅産物の量と胎児由来の増幅産物の量とは、ほぼ１．０：１．５（あるいは２：３）の量比になると予想される。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例により発明の実施形態を詳細に説明するが、発明の実施形態は、これら実施例により限定されるものではない。
【００６８】
下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。また、物質濃度に関し、特に断りのない限り「％」は「ｖ／ｖ％」である。
【００６９】
下記において、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）を意味し、「ＢＳＡ」とは、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）を意味し、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝液（phosphate buffered saline）を意味、「ＰＥ」とは、フィコエリスリンを意味する。ＰＢＳは、特に断りのない限り、ｐＨ７．４である。
【００７０】
＜実施例１＞
胎児細胞において発現頻度が高い遺伝子を探索する目的で、トランスクリプトーム解析を行った。
【００７１】
［血液試料］
ＶＥＲＩＴＡＳ社から、ヒト臍帯血（商品番号Ｃ−ＣＢ１０１）を購入した。
【００７２】
抗凝固剤としてＥＤＴＡのナトリウム塩１０．５ｍｇ入りの７ｍＬ採血管に、妊婦ボランティア２名からそれぞれ末梢血７．０ｍＬを採取した。妊婦ボランティアからの採血は、インフォームドコンセントを得た上で行った。
【００７３】
血液はそれぞれ、生理食塩水を用いて２倍に希釈し、以下の工程に供した。
【００７４】
［全ＲＮＡ抽出］
各血液からTotal RNAをNucleoSpin RNA Blood kit（MACHEREY-NAGEL社）を用いて回収した。Total RNAの回収量は、臍帯血（１．２ｍＬ）から２３４０ｎｇ、母体末梢血Ａ（７．０ｍＬ）から５９８５ｎｇ、母体末梢血Ｂ（７．０ｍＬ）から５３５５ｎｇであった。ＲＮＡの分解度を示すＲＩＮ値（RNA Integrity Number）は、それぞれ９．５（臍帯血）、７．９（母体末梢血Ａ）、７．７（母体末梢血Ｂ）であり、顕著な分解がないことを確認した。
【００７５】
［ＲＮＡシークエンス解析］
シークエンス用ライブラリは、各血液から抽出したTotal RNA のうち１μｇを出発材料とし、TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2（Illumina社）を用いて調製した。調製したライブラリにおけるポリヌクレオチドの長さは３８２ｂｐ〜３８５ｂｐ（アダプター配列を含む）であった。シークエンス解析は次世代シークエンサーHiSeq2500（Illumina社）を用いて行い、リード長１０１ｂｐ、Paired-end、Multiplexにて配列情報を取得した。
【００７６】
［バイオインフォマティクス解析］
次世代シークエンサーにて得られた配列情報を、下記のフローに従い解析した。
【００７７】
フロー：（１）リードデータのクオリティチェック、（２）リードデータのクリーニング、（３）poly-A/T tailの除去、（４）リファレンス配列にマッピング、（５）ジャンクション構造予測、（６）アセンブリング及び発現レベル比較
【００７８】
各フローの詳細は、下記のとおりである。
（１）リードデータのクオリティチェック、（２）リードデータのクリーニング
cutadaptプログラムによって、以下の手順で行った。
・３’端の混入してしまったアダプター配列を除去。
・３’端のクオリティ値が５未満の塩基の除去。
・クオリティの低いリードの除去。
・クオリティ値が５未満の塩基が全塩基の１０％より多いリードの除去。
・Ｎが全塩基の１０％より多いリードの除去。
・１種類の塩基が、「リードの全塩基数−３」個以上を占めているリードの除去。
・３’端に頻出する６ｂｐのアダプター配列の除去。
・塩基長が２０ｂｐ未満になったリードの除去。
・Paired-endのリードのみを抽出。
【００７９】
（３）poly-A/T tailの除去
PRINSEQプログラムによって、以下の手順で行った。
・３’端又は５’端に１０塩基以上連続するＡ又はＴを除去。
・塩基長が２０ｂｐ未満になったリードの除去。
・Paired-endのリードのみを抽出。
【００８０】
（４）リファレンス配列へのマッピング、（５）ジャンクション構造予測
TopHatプログラムを、コマンド「tophat -o $SAMPLE -G ref_genes.gtf -p 2 --solexa1.3-quals bowtie-indexed-genome fastq1 fastq2」にて実行した。
【００８１】
（６）アセンブリング及び発現レベル比較
Cufflinksプログラムを以下の手順で実行した。
・cufflinks：サンプルごとに転写物をアセンブリングする。ミトコンドリア由来転写物及びリボソーマルＲＮＡを除去する。コマンド「cufflinks -o $SAMPLE -M mask.gtf -g ref_genes.gtf -b genome.fasta -u -p 2 $SAMPLE.bam」
・cuffmerge：全サンプルの転写物をマージして、コンセンサスな転写物を作成する。コマンド「cuffmerge -o merge_all -g ref_genes.gtf -s genome.fasta -p 8 gtflist」
・cuffcompare：サンプルごとの転写物とコンセンサス転写物とを比較する。コマンド「cuffcompare -o $SAMPLE -r merged.gtf $SAMPLE.transcripts.gtf」
・cuffquant：サンプルごとにコンセンサス転写物の発現レベルを算出する。コマンド「cuffquant -o $SAMPLE -b genome.fasta -u merged.gtf $SAMPLE.bam」
・cuffdiff：サンプル間で発現レベル及び構造を比較する。コマンド「cuffdiff merged.gtf $SAMPLE1.bam $SAMPLE2.bam -M mask.gtf -b genome.fasta -u -p 2 -o $GROUP1_$GROUP2 -L $GROUP1,$GROUP2」
・cummeRbund：cuffdiffの統計結果をグラフ化する。
【００８２】
［発現レベルの比較］
以上の解析の結果、臍帯血においては515,217種、母体末梢血Ａにおいては583,632種、母体末梢血Ｂにおいては579,043種の転写物がアセンブルされ、コンセンサス転写物は631,932種であった。発現レベルをサンプル間で比較する指標として、ＦＰＫＭ（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）を用いた。コンセンサス転写物のうち、臍帯血と母体末梢血Ａの間で15,157種の発現レベルを比較し、臍帯血と母体末梢血Ｂの間で14,436種の発現レベルを比較し、母体末梢血Ａと母体末梢血Ｂの間で20,508種の発現レベルを比較した。臍帯血において特異的に発現している遺伝子の抽出を以下の手順で実施した。
【００８３】
まず、下記の要件（ａ）と要件（ｂ）を設定し、要件（ａ）を満たす転写物と要件（ｂ）を満たす転写物を、臍帯血と母体末梢血Ａの間と、臍帯血と母体末梢血Ｂの間とからそれぞれ抽出した。
・要件（ａ）：ＦＰＫＭ値が、臍帯血で５以上且つ母体末梢血で０．１以下（臍帯血のみで発現が認められる）。
・要件（ｂ）：ＦＰＫＭ値が、臍帯血で２００以上且つ母体末梢血で５０以下（母体末梢血でも発現が認められるが、臍帯血で高発現している）。
【００８４】
次に、抽出された遺伝子のうち、２グループに共通な転写物を抽出した。その結果、要件（ａ）を満たす遺伝子が６８種、要件（ｂ）を満たす遺伝子が１２３種、合計１９１種抽出された。１９１種の遺伝子のなかから、臍帯血のＦＰＫＭ値が特に高く、且つ、遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体が市販されている１６種を選択した。この１６種について、遺伝子がコードするタンパク質名とＦＰＫＭ値とを表２に示す。
【００８５】
【表２】
2018050559.tif 000003
【００８６】
＜実施例２＞
実施例１において選択した１６種のタンパク質に対する抗体を用いて、ヒト臍帯血とヒト成人骨髄血とから胎児細胞の単離を試みた。１６種のタンパク質に対する抗体として、表３に示す抗体を用意した。
【００８７】
【表３】
2018050559.tif 000004
【００８８】
［血液試料］
ＶＥＲＩＴＡＳ社から、ヒト臍帯血（商品番号Ｃ−ＣＢ１０１）とヒト成人骨髄血（商品番号ＡＢＭ００１）を購入した。血液はそれぞれ、生理食塩水を用いて２倍に希釈し、以下の工程に供した。
【００８９】
［密度勾配遠心分離による有核赤血球の濃縮］
Percoll液（登録商標、シグマアルドリッチ社製）と水を使用して、密度1.070ｇ／ｍＬの液と、密度1.095ｇ／ｍＬの液を調製した。遠沈管に密度1.095ｇ／ｍＬの液２ｍＬを入れ、４℃下に３０分間置き冷却した。次いで、密度1.095ｇ／ｍＬの液の上に、密度1.070ｇ／ｍＬの液２ｍＬを、界面が乱れないようにゆっくり重層した。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液の上に、希釈した血液１１ｍＬをゆっくり重層し、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液と密度1.095ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。採取した画分を、洗浄液（２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）にて２回洗浄し、有核赤血球を含む画分を得た。
【００９０】
［免疫染色］
上記で得た画分の細胞数をセルカウンター（Bio-Rad Laboratories社、ＴＣ２０全自動セルカウンター）で計測し、細胞濃度が１×１０７個／ｍＬになるように０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した。この細胞懸濁液１ｍＬに、白血球を染色する目的でＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体（ホスト動物：マウス、BD biosciences社）を１０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、０．０２５％グルタルアルデヒド−ＰＢＳを１ｍＬ添加し、２５℃で１０分間転倒混和することで細胞を固定化した。次いで、固定化処理後の細胞を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００−ＰＢＳを１００μＬ添加し、２５℃で５分間静置することで細胞膜透過処理を行った。次いで、細胞膜透過処理後の細胞を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁し、１．５ｍＬチューブに１００μＬずつ分注した。各チューブに、表３に示す各抗体（一次抗体。抗ＨＢＧ抗体としては、ＦＩＴＣで標識された抗体を用いた。）を添付文書に記載される推奨量または希釈率となるように添加し、２５℃で６０分間インキュベートした。一次抗体処理後の細胞を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁した。一次抗体が直接蛍光標識されている場合（ＨＢＧ、Ｃ４ｏｒｆ３、ＧＹＰＥ、ＣＤ７１）は、後述する核染色の工程に進んだ。一次抗体が標識されていない場合は、蛍光標識された二次抗体を用いて標識反応を行った。一次抗体のホスト動物種に対応した二次抗体としてＰＥ標識抗ラビットＩｇＧ（Thermo Fisher Scientific）を用いた。抗体濃度が１０μｇ／ｍＬになるように希釈した二次抗体溶液を各チューブに２００μＬ添加し、２５℃で３０分間インキュベートすることで標識反応を行った。
【００９１】
［核染色］
抗体処理後の細胞を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、核染色剤としてＤＲＡＱ５（Cell Signaling Technology社）を５μＭ含む０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ  １ｍＬに置換して５分間静置し、細胞核を染色した。核染色後の細胞懸濁液を次工程に供した。
【００９２】
［有核赤血球の単離］
フローサイトメータ（ＳＯＮＹ（株）社製ＳＨ８００ＺＰ）を用いて、前方散乱光と側方散乱光にて、細胞懸濁液から細胞をゲーティングした。次いで、ゲーティングした細胞画分からＣＤ４５陰性細胞をゲーティングすることで白血球を除き、赤血球を主成分とするＣＤ４５陰性画分を得た。次いで、ＣＤ４５陰性画分からＤＲＡＱ５陽性細胞をゲーティングすることで、有核赤血球画分を得た。
【００９３】
［抗体陽性細胞の単離］
フローサイトメータ（ＳＯＮＹ（株）社製ＳＨ８００ＺＰ）を用いて、有核赤血球画分から抗体陽性細胞をゲーティングし、有核赤血球画分の全細胞に占める抗体陽性細胞の割合（％、個数基準）を求めた。その結果を、表４及び図１に示す。図１の横軸は、臍帯血を試料にした場合の、有核赤血球画分の全細胞に占める抗体陽性細胞の割合であり、図１の縦軸は、成人骨髄血を試料にした場合の、有核赤血球画分の全細胞に占める抗体陽性細胞の割合である。
【００９４】
【表４】
2018050559.tif 000005
【００９５】
臍帯血に含まれる赤血球のほとんどが、胎児の有核赤血球であり、成人骨髄血に含まれる赤血球のほとんどが、成熟した無核の赤血球であるところ、
抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体は、成人骨髄血に比べ臍帯血において、抗体陽性細胞の割合が多かった。
一方、抗ＣＤ７１抗体、抗ＳＮＣＡ抗体、抗ＡＨＳＰ抗体、及び抗ＨＭＢＳ抗体は、臍帯血と成人骨髄血とで抗体陽性細胞の割合に差はなかった。
【００９６】
＜実施例３＞
表３に示す抗体を２種組み合わせて、ヒト臍帯血とヒト成人骨髄血とから胎児細胞の単離を試みた。
【００９７】
実施例２と同様にして、ヒト臍帯血とヒト成人骨髄血とから、密度勾配遠心分離によって有核赤血球を含む画分を得た。次いで、有核赤血球を含む画分を、実施例２と同様にして、ＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体で処理した。次いで、一次抗体による処理を実施例２と同様にして、但し、表５に示す組合せの２種の抗体を用いて行った。この際、抗ＨＢＧ抗体としては、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体又は抗ＧＹＰＥ抗体と組み合せる場合には、ＲＰＥで標識された抗体を用い、上記以外の抗体と組み合せる場合には、ＦＩＴＣで標識された抗体を用いた。次いで、標識されていない一次抗体に対して、実施例２と同様にして、二次抗体としてＰＥ標識抗ラビットＩｇＧ（Thermo Fisher Scientific）を反応させた。次いで、実施例２と同様にして、ＤＲＡＱ５で細胞核の染色を行い、核染色後の細胞懸濁液を次工程に供した。
【００９８】
実施例２と同様にして、フローサイトメータ（ＳＯＮＹ（株）社製ＳＨ８００ＺＰ）を用いて、細胞懸濁液から細胞をゲーティングした。次いで、ゲーティングした細胞画分からＣＤ４５陰性細胞をゲーティングすることで白血球を除き、赤血球を主成分とするＣＤ４５陰性画分を得た。次いで、ＣＤ４５陰性画分からＤＲＡＱ５陽性細胞をゲーティングすることで、有核赤血球画分を得た。次いで、有核赤血球画分から抗体陽性細胞をゲーティングした。有核赤血球画分の全細胞に占める抗体（１）陽性かつ抗体（２）陽性の細胞の割合（％、個数基準）を計測した。その結果を、表５に示す。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
抗ＨＢＧ抗体と、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体のいずれか１つとで免疫染色した場合、成人骨髄血よりも臍帯血において、抗体（１）陽性かつ抗体（２）陽性である細胞の割合が多く、臍帯血／成人骨髄血が２．８〜３９．２であった。
一方、抗ＣＤ７１抗体と、抗ＳＮＣＡ抗体、抗ＡＨＳＰ抗体、及び抗ＨＭＢＳ抗体のいずれか１つとで免疫染色した場合、臍帯血と成人骨髄血とで、抗体（１）陽性かつ抗体（２）陽性である細胞の割合に差はなかった。
【０１０１】
実施例１〜３の結果は、抗ＨＢＧ抗体、抗ＡＬＡＳ２抗体、抗ＨＥＭＧＮ抗体、抗Ｃ９ｏｒｆ５抗体、抗ＧＹＰＢ抗体、抗ＳＬＣ１Ａ５抗体、抗ＥＩＦ１ＡＹ抗体、抗Ｃ４ｏｒｆ３抗体、抗ＩＧＦ２抗体、抗ＧＹＰＥ抗体、抗ＣＬＩＣ６抗体、及び抗ＤＤＸ３Ｙ抗体からなる群から選ばれる少なくとも２種の抗体を用いて細胞を免疫染色することによって、妊娠母体の末梢血から胎児細胞を単離することが可能であることを示している。
【図１】
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