(57)【要約】【課題】  従来技術では製造することのできなかった形状の脂質二重膜構造体とその製造方法を提供することである。【解決手段】  脂質二重膜構造体は、トーラス体形状の第１の脂質二重膜構造体１００または円筒形状の第２の脂質二重膜構造体２００の２つの形態をとりうる。脂質二重膜構造体の製造方法は、リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する懸濁液準備工程と、基材の上に懸濁液を供給する懸濁液供給工程と、基材の上で懸濁液を静置することにより基材の上にリン脂質の脂質二重膜を支持させる脂質二重膜支持工程と、脂質二重膜に過酸化水素を供給する過酸化水素供給工程と、を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する懸濁液準備工程と、
基材の上に前記懸濁液を供給する懸濁液供給工程と、
前記基材の上に前記リン脂質の脂質二重膜を支持させる脂質二重膜支持工程と、
前記脂質二重膜に過酸化水素を供給する過酸化水素供給工程と、
を有すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の脂質二重膜構造体の製造方法において、
前記過酸化水素供給工程では、
前記リン脂質をトーラス体形状もしくは円筒形状の脂質二重膜構造体とすること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の脂質二重膜構造体の製造方法において、
第２の水に大気圧プラズマを照射してプラズマ照射水を作製するプラズマ照射水作製工程を有し、
前記過酸化水素供給工程では、
前記懸濁液に前記プラズマ照射水を添加すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の脂質二重膜構造体の製造方法において、
前記過酸化水素供給工程では、
前記懸濁液に大気圧プラズマを直接照射すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。
【請求項５】
脂質二重膜が３次元的構造を備える脂質二重膜構造体において、
前記脂質二重膜がトーラス体形状もしくは円筒形状を保持していること
を特徴とする脂質二重膜構造体。
【請求項６】
請求項５に記載の脂質二重膜構造体において、
内径が５ｎｍ以上３５ｎｍ以下であること
を特徴とする脂質二重膜構造体。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の脂質二重膜構造体において、
外径が３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下であること
を特徴とする脂質二重膜構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の技術分野は、脂質二重膜構造体とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は、脂質とタンパク質と糖質とから構成されている。脂質は、親水部分と疎水部分とを有する。そのため、脂質は、ミセルまたは脂質二重膜といった構造をとる。脂質二重膜は、生体膜を構成する主要な構造体である。そのため、脂質二重膜は、創薬、バイオチップ、バイオセンサー、といった技術分野での利用が期待されている。
【０００３】
脂質二重膜は、脂質が水中で取り得る最も安定な形状である。このような脂質二重膜のうち球形のリポソームと、平面状の脂質二重膜と、が知られている。例えば、特許文献１には、平面脂質二重膜を形成する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１６７６０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、球形のリポソームと平面状の脂質二重膜と以外の形状を保持している脂質二重膜構造体はほとんど知られていない。
【０００６】
本明細書の技術は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。その課題とは、従来技術では製造することのできなかった形状の脂質二重膜構造体とその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様における脂質二重膜構造体の製造方法は、リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する懸濁液準備工程と、基材の上に懸濁液を供給する懸濁液供給工程と、基材の上にリン脂質の脂質二重膜を支持させる脂質二重膜支持工程と、脂質二重膜に過酸化水素を供給する過酸化水素供給工程と、を有する。
【０００８】
この脂質二重膜構造体の製造方法においては、基材に支持されている脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより、従来にはみられなかった３次元的形状を備える脂質二重膜構造体が得られる。脂質二重膜構造体の形状は、トーラス体形状もしくは円筒形状である。
【０００９】
第２の態様における脂質二重膜構造体においては、脂質二重膜が３次元的構造を備えている。つまり、脂質二重膜がトーラス体形状もしくは円筒形状を保持している。
【００１０】
この脂質二重膜構造体は、例えば、その内部に高分子化合物を収容することができる。これにより、その高分子化合物を輸送する輸送体としての応用が期待される。最近では、リポソームが薬剤を輸送する輸送体として期待されているが、それとともにこの脂質二重膜構造体を輸送体とすることも可能である。
【発明の効果】
【００１１】
本明細書では、従来技術では製造することのできなかった形状の脂質二重膜構造体とその製造方法が提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１の脂質二重膜構造体の形状を示す平面図である。
【図２】第１の脂質二重膜構造体の形状を示す側面図である。
【図３】第１の脂質二重膜構造体の断面を示す概念図である。
【図４】第２の脂質二重膜構造体の形状を示す平面図である。
【図５】第２の脂質二重膜構造体の形状を示す側面図である。
【図６】懸濁液中においてリン脂質のベシクルが基材の上に沈殿するとともに基材の上に展開する様子を示す概念図である。
【図７】実験において高速ＡＦＭ装置で測定するための試料台の構成図である。
【図８】実験で用いた高速ＡＦＭ装置の構成を示す図である。
【図９】基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その１）である。
【図１０】基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その２）である。
【図１１】トーラス体形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。
【図１２】トーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径をプロットしたグラフである。
【図１３】トーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径をプロットしたグラフである。
【図１４】トーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅をプロットしたグラフである。
【図１５】円筒形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。
【図１６】脂質二重膜の時間的変化を示すＡＦＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、具体的な実施形態について、脂質二重膜構造体とその製造方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。
【００１４】
（第１の実施形態）
１．脂質二重膜構造体
第１の実施形態の脂質二重膜構造体は、所定の３次元的構造を備えている。後述するように、この脂質二重膜構造体は、脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより所定の３次元的形状を保持するようになったものである。これらの形状のうち第１の形状はトーラス体形状である。第２の形状は円筒形状である。本実施形態の脂質二重膜構造体は、トーラス体形状と円筒形状とのいずれかの形状を保持している。
【００１５】
１−１．第１の脂質二重膜構造体（トーラス体形状）
図１は、第１の脂質二重膜構造体１００の形状を示す平面図である。図２は、第１の脂質二重膜構造体１００の形状を示す側面図である。第１の脂質二重膜構造体１００は、トーラス体形状を保持している。第１の脂質二重膜構造体１００の外径Ｒｏ１は、３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下である。第１の脂質二重膜構造体１００の内径Ｒｉ１は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第１の脂質二重膜構造体１００の幅Ｗ１は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。これらの数値範囲は、例示である。そのため、外径Ｒｏ１等は、これらの数値範囲以外の数値であってもよい。
【００１６】
図３は、第１の脂質二重膜構造体１００の断面を示す概念図である。図３に示すように、第１の脂質二重膜構造体１００は、内側に疎水基を有するとともに外側に親水基を有する。第１の脂質二重膜構造体１００は、水中で安定に存在する。第１の脂質二重膜構造体１００の外側に親水基を有するためである。
【００１７】
１−２．第２の脂質二重膜構造体（円筒形状）
図４は、第２の脂質二重膜構造体２００の形状を示す平面図である。図５は、第２の脂質二重膜構造体２００の形状を示す側面図である。第２の脂質二重膜構造体２００は、円筒形状を保持している。第２の脂質二重膜構造体２００の外径Ｒｏ２は、３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の内径Ｒｉ２は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の幅Ｗ２は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の高さＨ２は、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。これらの数値範囲は、例示である。そのため、外径Ｒｏ２等は、これらの数値範囲以外の数値であってもよい。
【００１８】
また、第２の脂質二重膜構造体２００の断面も図３のようになっている。そのため、第２の脂質二重膜構造体２００は、内側に疎水基を有するとともに外側に親水基を有する。第２の脂質二重膜構造体２００は、水中で安定に存在する。第２の脂質二重膜構造体２００の外側に親水基を有するためである。
【００１９】
２．脂質二重膜構造体の製造方法
２−１．懸濁液準備工程
ここで、リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する。
【００２０】
２−１−１．脂質準備工程
まず単離したリン脂質を準備する。リン脂質は、クロロホルム溶液の内部で保存されていることが多い。そのため、クロロホルム溶液とリン脂質との混合物からクロロホルムを蒸発させる。これにより、リン脂質が得られる。リン脂質として例えば、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを用いる。
【００２１】
２−１−２．混合分散工程
次に、リン脂質と第１の水とを混合する。これにより、リン脂質と第１の水との混合物が作製される。ここで、第１の水は、純水である。次に、混合物を撹拌する。そして、リン脂質を第１の水の内部に十分に拡散させる。これにより、リン脂質が第１の水の内部に十分に分散している懸濁液が作製される。この段階で、懸濁液中にリン脂質のベシクルが生成されると考えられる。
【００２２】
２−２．懸濁液供給工程
次に、基材の上に懸濁液を供給する。この状態では、ベシクルが懸濁液中に分散している状態にある。ここで基材は、種々の基板である。基材として例えば、マイカ基板が挙げられる。または、基材は、固体であれば、その他の材質であってもよい。
【００２３】
２−３．脂質二重膜支持工程（静置工程）
次に、基材の上で懸濁液を静置する。これにより、図６に示すように、懸濁液中のベシクルが基材の上に沈殿する。そして、ベシクルは、基材の上に沈殿する際に展開すると考えられる。つまり、基材の上にリン脂質の脂質二重膜を支持させるのである。
【００２４】
２−４．過酸化水素供給工程
次に、基材の上の脂質二重膜に過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を供給する。具体的には、基材の上に静置した懸濁液に過酸化水素を添加する。これにより、基材の上に展開している脂質二重膜の一部が、基材から剥がれるとともに円環状にまとまりだす。そして、脂質二重膜の一部が、トーラス体形状の第１の脂質二重膜構造体１００または円筒形状の第２の脂質二重膜構造体２００になる。
【００２５】
トーラス体形状の第１の脂質二重膜構造体１００と円筒形状の第２の脂質二重膜構造体２００とのどちらが生成されるかについては、基材から剥がれる面積や形状に依存すると考えられる。
【００２６】
３．変形例
３−１．リン脂質の種類
本実施形態では、リン脂質として１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを用いている。しかし、これ以外のリン脂質を用いてもよい。例えば、ホスフィチジルコリン、ホスフィチジルセリン、ホスフィチジルエタノールアミン、ホスフィチジル酸、ホスフィチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
【００２７】
３−２．脂質二重膜支持工程
本実施形態では、基材に供給した懸濁液を静置することにより脂質二重膜を基材に支持させる。しかし、帯電させた脂質二重膜またはベシクルの中心部に帯電粒子を有するものを用いる場合には、懸濁液に電界をかけることにより、リン脂質を基材の上に支持させることもできる。また、ベシクルを１箇所に集中させることもできる。
【００２８】
３−３．基材の洗浄
脂質二重膜支持工程の後に、懸濁液の上澄みを緩衝液等で洗浄してもよい。
【００２９】
３−４．組み合わせ
これらの変形例等を自由に組み合わせてもよい。
【００３０】
４．本実施形態のまとめ
本実施形態の脂質二重膜構造体は、基材に支持されている脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより得られる。第１の脂質二重膜構造体１００の形状はトーラス体形状である。第２の脂質二重膜構造体２００の形状は円筒形状である。そのため、例えば、これらを何らかの高分子化合物の輸送体として用いることができる。
【００３１】
（第２の実施形態）
第２の実施形態について説明する。第２の実施形態では、過酸化水素供給工程が第１の実施形態と異なっている。そのため、その異なる点について説明する。
【００３２】
１．脂質二重膜構造体の製造方法
１−１．脂質二重膜支持工程まで
第１の実施形態の脂質二重膜支持工程までを実施する。
【００３３】
１−２．プラズマ照射水作製工程
第２の水に非平衡大気圧プラズマを照射することによりプラズマ照射水を作製する。第２の水は純水である。非平衡大気圧プラズマのプラズマガスは、例えばＡｒガスである。またはその他の希ガスであってもよい。プラズマガスは、希ガスの他にその他のガスを含んでいてもよい。大気圧プラズマは、大気中で窒素や酸素に由来する原子や分子、ラジカル等を発生させる。例えば、酸素に由来するラジカルが第２の水の内部に供給されることにより、第２の水の内部で過酸化水素が発生する。
【００３４】
１−３．過酸化水素供給工程
次に、基板の上の懸濁液を静置したものにプラズマ照射水を添加する。前述のように、このプラズマ照射水は過酸化水素を含んでいる。したがって、第１の実施形態と同様に第１の脂質二重膜構造体１００または第２の脂質二重膜構造体２００が作製される。
【００３５】
２．変形例
２−１．過酸化水素供給工程
懸濁液にプラズマ照射水を添加する代わりに、懸濁液に大気圧プラズマを直接照射してもよい。その場合であっても、懸濁液の内部に過酸化水素が発生するからである。
【実施例】
【００３６】
１．懸濁液の作製方法
まず、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを含んでいるクロロホルム溶液をガラスバイアルに入れた。次に、ガラスバイアルに窒素ブローした。これは、クロロホルムを蒸発させるためである。そして、ガラスバイアルの蓋を空けた状態でデシケーターに入れた。次にその状態でデシケーターを真空引きした。真空引きする時間は３０分であった。この真空引きによりクロロホルムはほとんど蒸発しきる。すなわち、純粋な１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが得られる。
【００３７】
次に、上記のガラスバイアルに超純水としてｍｉｌｌｉＱ水を入れた。これにより、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅと超純水との混合溶液が作製された。そして、チップソニケーターを用いて、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを超純水中に分散させた。これにより、白濁していた混合溶液が透明になった。透明な混合溶液（懸濁液）では、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが十分に超純水中に分散している。
【００３８】
次に、十分に分散している懸濁液を小分けにして冷凍保存した。そして、実験に用いる分量だけ冷凍状態の懸濁液を溶解した。その際に、０．１０ｍｇ／ｍｌになるよう３８．４ｍＭの塩化マグネシウム水溶液で希釈した。そして、チップソニケーターを用いて１分間だけ超音波処理した。このようにして分散の十分な懸濁液（ベシクル懸濁液）が作製された。なお、この段階では、懸濁液に過酸化水素は添加されていない。
【００３９】
２．高速ＡＦＭ装置による観察方法
次に、高速ＡＦＭ装置（株式会社生体分子計測研究所製）を用いて脂質二重膜構造体を観察した。そのために、図７に示すような試料台を作製した。まず、マイカ基板をガラス台に接着剤を用いて接着した。接着剤が乾燥した後に、マイカ基板を劈開した。そして、ガラス台を高速ＡＦＭ装置のピエゾステージに接着した。次に、０．１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液をマイカ基板の上に１．５μＬ滴下した。そして、常温で５分間だけ混合溶液を静置した。この段階で、リン脂質からなるベシクルがマイカ基板の上に展開したと考えられる。そして、緩衝液でマイカ基板の表面を洗浄した。ここで、緩衝液は、ＮａＯＨとＮａＣｌとを添加した５０ｍＭのＨＥＰＥＳであった。これにより、懸濁液の上澄みが除去された。この段階では、マイカ基板の上には脂質二重膜が残留していると考えられる。また、この段階では、脂質二重膜は平面形状であると考えられる。
【００４０】
次に、図８に示すような高速ＡＦＭ装置により脂質二重膜を観察した。観察溶液は、上記の緩衝液であった。そして、観察を開始するとともに観察溶液に過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を添加した。これにより、マイカ基板の上の脂質二重膜に過酸化水素が供給されると考えられる。そして、脂質二重膜は、トーラス体形状もしくは円筒形状に変形した。
【００４１】
３．観察結果
３−１．過酸化水素添加前（平面形状）
図９は、基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その１）である。図９の上段に、脂質二重膜の表面画像を示す。図９の下段に、上段の線に沿って測定された高さを示すグラフを示す。これ以降の図において、上段の表面画像と下段のグラフとの関係は、図９と同様である。図９に示すように、平面形状の脂質二重膜の膜厚は５ｎｍ程度である。
【００４２】
図１０は、基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その２）である。図１０の下段に示すように、脂質二重膜の表面は、非常に平坦である。
【００４３】
このように、観察溶液（緩衝液）を脂質二重膜に供給した段階では、脂質二重膜は平坦な形状のままである。つまり、緩衝液は脂質二重膜の形状変化に寄与しない。
【００４４】
３−２．過酸化水素添加後の脂質二重膜構造体（トーラス体形状）
図１１は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。図１１は、観察溶液に過酸化水素を添加した後の脂質二重膜を示している。図１１の上段および下段に示すように、脂質二重膜構造体がトーラス体形状であることが確認された。
【００４５】
図１２は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径をプロットしたグラフである。図１２の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径（ｎｍ）である。図１２の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１２に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径の平均値は４３．１ｎｍであった。
【００４６】
図１３は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径をプロットしたグラフである。図１３の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径（ｎｍ）である。図１３の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１３に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径の平均値は１３．８ｎｍであった。
【００４７】
図１４は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅をプロットしたグラフである。図１４の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅（ｎｍ）である。図１４の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１４に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅の平均値は１５．１ｎｍであった。
【００４８】
３−３．過酸化水素添加後の脂質二重膜構造体（円筒形状）
図１５は、円筒形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。図１５は、観察溶液に過酸化水素を添加した後の脂質二重膜を示している。円筒形状の脂質二重膜構造体の外径の平均値は４１．２ｎｍであった。図１５に示すように、円筒形状の脂質二重膜構造体の高さは、およそ２００ｎｍ程度であった。
【００４９】
３−４．脂質二重膜構造体の成長過程
図１６は、脂質二重膜の時間的変化を示すＡＦＭ画像である。測定の都合上、所定の時刻（観察の開始時刻）を０秒とした。図１６に示すように、０秒の段階では、画像中の中央付近と右下付近にトーラス体形状の脂質二重膜構造体が存在している。そして、時間の経過とともに、中央付近のトーラス体形状の脂質二重膜構造体の右隣の位置に新たなトーラス体形状の脂質二重膜構造体が成長している様子が観察された。図１６に示すように、数秒という短い時間でトーラス体形状の脂質二重膜構造体が形成された。
【符号の説明】
【００５０】
１００…第１の脂質二重膜構造体
２００…第２の脂質二重膜構造体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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