(57)【要約】【課題】逆相クロマトグラフィーにおいて、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（ＨＭＢ）の含有量を正確に決定することができる３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】  逆相クロマトグラフィーを用いた３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法であって、移動相のｐＨが５．５以下であることを特徴とする、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相クロマトグラフィーを用いた３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法であって、移動相のｐＨが５．５以下であることを特徴とする、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項２】
前記移動相のｐＨが、５．０以下であることを特徴とする、請求項１に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項３】
前記移動相のｐＨが、４．５以下であることを特徴とする、請求項２に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項４】
前記移動相のｐＨが、４．０以下であることを特徴とする、請求項３に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項５】
前記移動相のｐＨが、３．５以下であることを特徴とする、請求項４に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項６】
前記移動相が、酸を含む溶液、又は、酸を含む溶液及び水性溶媒の混合溶液からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項７】
前記水性溶媒が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、請求項６に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項８】
前記移動相における前記水性溶媒の含有量が、１０体積％以下であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項９】
前記酸が、有機酸を含有することを特徴とする、請求項６に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１０】
前記有機酸が、ギ酸又は酢酸を含有することを特徴とする、請求項９に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１１】
前記酸が、リン酸を含有することを特徴とする、請求項６に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１２】
前記移動相が、緩衝作用を有する物質を含有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１３】
逆相クロマトグラフィーの固定相が、表面にオクタデシル基を有するシリカゲルを含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１４】
示差屈折計を検出器として用いることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１５】
紫外吸収光度計を検出器として用いることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１６】
前記３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸が、カルシウム塩であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１７】
前記３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸が、食品中に含まれることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１８】
前記食品が、ゼリー、飲料、錠剤、粉剤、カプセル剤であることを特徴とする、請求項１７に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【請求項１９】
前記食品が、ゼリー、飲料、錠剤であることを特徴とする、請求項１８に記載の３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の測定方法に関する。さらに詳しくは、食品等に含まれる３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の含有量を逆相クロマトグラフィーにより高精度に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（以下、「ＨＭＢ」という。）とは、必須アミノ酸であるロイシンの代謝産物であり、運動時の筋組織ダメージの軽減、筋肉・筋力の増加、筋組織ダメージの回復向上、筋肉の合成と分解のバランスを改善、筋肉維持、体脂肪減少、ひきしめ、基礎代謝向上等の機能を有する物質である。ロイシンからの代謝生成量はわずか５％程度であることから、ＨＭＢ又はその塩を健康食品、特定保健用食品、機能性表示食品等に配合して、スポーツサプリメント、ロコモティブシンドローム予防サプリメント、サルコペニア予防サプリメント、メタボリックシンドローム予防サプリメント、ダイエット補助サプリメントとして摂取することが知られている。例えば、特許文献１には、約０．１重量％から約１０重量％のＨＭＢを含有する栄養粉末が開示されている。
【０００３】
健康食品等の食品では、有効成分を添加した場合には、その有効成分の含有量の範囲を品質保証規格として設定することが求められる。品質保証規格では、有効成分の原料の配合量から算出した値を有効成分の含有量として保証する場合もあるが、一般的には製品中の有効成分の含有量を測定して、その結果を品質保証値として提示している。また、健康食品等の食品では、種々の食品材料と混合して使用することから、他の素材との相性等によって有効成分の安定性が低下する場合もある。そのため、保存試験において、製品中の有効成分の含有量を測定する必要もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１４−５０９８４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＭＢ等の有効成分の含有量を測定する方法として、逆相クロマトグラフィーを用いる方法が考えられるが、逆相クロマトグラフィーで利用される一般的な条件でただ単純に分析を行っても、十分な保持時間が得られず、他の成分との高度な分離を実現することが困難であった。そのため、種々の成分を含有する健康食品等の食品において、ＨＭＢのピークを安定的に検出することが困難であり、ＨＭＢの含有量を正確に決定できない問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、逆相クロマトグラフィーにおいて、ＨＭＢの含有量を正確に決定することができるＨＭＢの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記問題点を解決すべく検討した結果、逆相クロマトグラフィーの移動相のｐＨを５．５以下に設定することによって、ＨＭＢの逆相クロマトグラフィーのカラムへの保持時間が高まり、他の成分との高度な分離を実現できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は、以下のＨＭＢの測定方法を提供する。
【０００８】
［本願第１発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１発明は、逆相クロマトグラフィーを用いたＨＭＢの測定方法であって、移動相のｐＨが５．５以下であることを特徴とするＨＭＢの測定方法である。
［本願第２発明の構成］
上記課題を解決するための本願第２発明は、前記移動相のｐＨが５．０以下であることを特徴とする本願第１発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第３発明の構成］
上記課題を解決するための本願第３発明は、前記移動相のｐＨが４．５以下であることを特徴とする本願第２発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第４発明の構成］
上記課題を解決するための本願第４発明は、前記移動相のｐＨが４．０以下であることを特徴とする本願第３発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第５発明の構成］
上記課題を解決するための本願第５発明は、前記移動相のｐＨが、３．５以下であることを特徴とする本願第４発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第６発明の構成］
上記課題を解決するための本願第６発明は、前記移動相が、酸を含む溶液、又は、酸を含む溶液及び水性溶媒の混合溶液からなることを特徴とする本願第１〜５発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第７発明の構成］
上記課題を解決するための本願第７発明は、前記水性溶媒が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする本願第６発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第８発明の構成］
上記課題を解決するための本願第８発明は、前記移動相における前記水性溶媒の含有量が、１０体積％以下であることを特徴とする本願第６発明又は本願第７発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第９発明の構成］
上記課題を解決するための本願第９発明は、前記酸が、有機酸を含有することを特徴とする本願第６発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１０発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１０発明は、前記有機酸が、ギ酸又は酢酸を含有することを特徴とする本願第９発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１１発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１１発明は、前記酸が、リン酸を含有することを特徴とする本願第６発明に記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１２発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１２発明は、前記移動相が、緩衝作用を有する物質を含有することを特徴とする本願第１〜１１発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１３発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１３発明は、逆相クロマトグラフィーの固定相が、表面にオクタデシル基を有するシリカゲルを含むことを特徴とする本願第１〜１２発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１４発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１４発明は、示差屈折計を検出器として用いることを特徴とする本願第１〜１３発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１５発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１５発明は、紫外吸収光度計を検出器として用いることを特徴とする本願第１〜１４発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１６発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１６発明は、前記ＨＭＢが、カルシウム塩であることを特徴とする本願第１〜１５発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１７発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１７発明は、前記ＨＭＢが、食品中に含まれることを特徴とする本願第１〜１６発明のいずれかに記載のＨＭＢの測定方法である。
［本願第１８発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１８発明は、前記食品が、ゼリー、飲料、錠剤、粉剤、カプセル剤であることを特徴とする本願第１７に記載のＨＭＢの測定方法。
［本願第１９発明の構成］
上記課題を解決するための本願第１９発明は、前記食品が、ゼリー、飲料、錠剤であることを特徴とする本願第１８に記載のＨＭＢの測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本願第１〜１８発明によれば、逆相クロマトグラフィーにおいて、他の成分と分離した保持時間に安定的にＨＭＢを検出でき、ＨＭＢの含有量を正確に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図２】比較例１の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図３】実施例２の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図４】実施例３の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図５】実施例４の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図６】実施例４の参考として、実施例４の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図７】実施例５の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図８】実施例５の参考として、実施例５の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図９】比較例２の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図１０】比較例２の参考として、比較例２の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図１１】実施例６の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図１２】実施例６の参考として、実施例６の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図１３】実施例７の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図１４】実施例７の参考として、実施例７の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図１５】実施例８の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図１６】実施例８の参考として、実施例８の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【図１７】実施例９の逆相クロマトグラフィーの測定結果（クロマトグラム）である。
【図１８】実施例９の参考として、実施例９の試料からＨＭＢＣａ除いた成分について、逆相クロマトグラフィーを測定した結果（クロマトグラム）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施形態について詳細に述べる。
［ＨＭＢの測定方法］
本発明のＨＭＢの測定方法は、逆相クロマトグラフィーを用いたＨＭＢの測定方法である。逆相クロマトグラフィーを用いる方法であれば、特に制限されず、例えば、移動相を重力により送液するオープンカラムクロマトグラフィーや、移動相を高圧ポンプで送液する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定することができる。高度な分離を実現することができることから、ＨＰＬＣを用いて測定することが好ましい。
【００１２】
固定相（カラムに充填される充填剤）は、基材の表面に疎水性基を備えたものが用いられる。基材としては、特に制限されないが、疎水性基を修飾しやすいという観点から、シリカゲル粒子が好適に利用される。また、疎水性基としては、通常、炭化水素基が利用され、炭化水素基の種類としては、オクタデシル基、オクチル基、ブチル基、フェニル基、フェニルエチル基、ナフチルエチル基、ピレニルエチル基等が挙げられる。特に、表面にオクタデシル基を有するシリカゲル（ＯＤＳ）が好ましい。
【００１３】
固定相の設定温度（カラム温度）は、特に制限されないが、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃である。また、カラム温度は、カラム恒温槽を用いて一定に保つことが好ましい。カラム温度を一定に調節することにより、カラム分離を安定化することができる。
【００１４】
本発明のＨＭＢの測定方法において移動相のｐＨは５．５以下である。移動相のｐＨが５．５を超える場合、ＨＭＢの保持時間が短くなり分離性能が低下する。移動相のｐＨは、好ましくは５．０以下であり、より好ましくは４．５以下であり、さらに好ましくは４．０以下であり、特に好ましくは３．５以下である。移動相のｐＨの下限は、特に制限されないが、通常２．０以上である。
【００１５】
移動相としては、酸を含む溶液（以下、「酸溶液」という。）、又は、酸溶液と水性溶媒の混合溶液が用いられる。好ましくは、酸溶液と水性溶媒の混合溶液である。なお、該混合溶液が用いられた場合には、本発明における移動相のｐＨとは、水性溶媒を混合する前の酸溶液のｐＨである。
【００１６】
移動相のｐＨを５．５以下にするための酸の種類は、特に制限されないが、リン酸、塩酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、酒石酸等の有機酸が挙げられる。有機酸を使用すると、ＨＭＢと他の成分との分離性能が向上する。好ましい有機酸としては、ギ酸、酢酸であり、より好ましい有機酸としては、酢酸である。酢酸を使用することにより、ＨＭＢのピークにおいて、理論段数、シンメトリー係数が高く優れたピークを得ることができる。
【００１７】
また、緩衝作用を有する物質を含有することが好ましい。緩衝作用を有する物質を使用することにより、ＨＭＢの分離を安定化することができる。緩衝作用を有する物質としては、例えば、リン酸の無機酸が挙げられ、具体的には、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。
【００１８】
水性溶媒とは、水に溶解する溶媒であり、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン等が挙げられる。好ましくは、アセトニトリル、メタノール、エタノールであり、特に、アセトニトリルが好ましい。このような溶媒を含むことによって、ＨＭＢの保持時間は短くなるが、シャープなピークを得ることができる。
【００１９】
移動相における水性溶媒の含有量は、好ましくは４０体積％以下、より好ましくは３０体積％以下、さらに好ましくは２０体積％以下、特に好ましく１０体積％以下であり、通常１体積％以上である。このような含有量であることによって、シャープなピークが得られる。また、分析時間を短縮することも可能である。
【００２０】
酸溶液と水性溶媒の混合物を移動相として使用する場合には、送液する前にあらかじめ混合した混合液を使用してもよいし、カラムの直前に設けたフローミキサーを用いて送液途中で混合した混合液を使用してもよい。また、逆相クロマトグラフィーを実施中に酸溶液と水性溶媒の混合比を変動してもよい。混合比の変動は、段階的に変動しても、連続的に変動（グラジェント溶離）してもよい。
なお、移動相は、すべて脱気したものを使用することが好ましい。移送相を脱気処理することにより、カラム分離を安定化することができる。
【００２１】
検出器としては、特に制限されないが、例えば、示差屈折計（ＲＩ）、紫外吸収光度計（ＵＶ）等が挙げられる。好ましくは、示差屈折計（ＲＩ）である。示差屈折計（ＲＩ）を用いることによって、ＨＭＢのピークをより際立たせて検出することができる。また、示差屈折計（ＲＩ）及び紫外吸収光度計（ＵＶ）の両方を用いて検出してもよい。
【００２２】
測定試料は、ＨＭＢを含有するものであればよく、例えば、健康食品、特定保健用食品、機能性表示食品等の食品、医薬品、医薬部外品等が挙げられる。食品は、一般的に様々な素材を含有するため、高度な分離を求められることから、本発明のＨＭＢの測定方法が好適に利用することができる。
【００２３】
具体的な食品の形態としては、特に制限されないが、例えば、錠剤（ラムネ菓子等を含む。）、粉剤（顆粒剤、粉末飲料等を含む。）、カプセル剤（ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤等を含む。）、飲料（清涼飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、乳酸飲料、茶飲料、乳飲料、牛乳等を含む。）、スープ、ゼリー、ヨーグルト、キャンデー、チョコレート、アイスクリーム等が挙げられる。これらの食品に対して、必要に応じて移動相等を加えて、溶解又は希釈し、さらにフィルターを通して不溶分を除去したものをクロマトグラフィーの試料とすればよい。また、油性成分が多く含むような形態の場合には、必要に応じて、レーゼ・ゴットリーブ法等の抽出操作を行い、油性成分を除去すればよい。
【００２４】
測定試料に含まれるＨＭＢは、塩の状態でもよい。塩としては、例えば、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。好ましくは、カルシウム塩である。
【実施例】
【００２５】
次に、実施例及び比較例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
【００２６】
１．ＨＭＢカルシウム（原末）の液体クロマトグラフィーの測定
＜実施例１（移動相のｐＨ：３．０）＞
３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸カルシウム（以下、「ＨＭＢＣａ」という。）の原末約０．１０ｇを精密に量り、移動相（下記試験条件参照）を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ＨＭＢＣａ標準品約０．１０ｇを精密に量り、移動相を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。標準溶液及び試料溶液各１０μＬについて、次の条件で液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図１に、ＨＭＢピークから得られた理論段数及びシンメトリー係数を表２に示す。図１及び理論段数等の結果から、良好な対称性を有するＨＭＢピークが、ブランクと明確に分離された保持時間に観測されることが明らかである。
また、標準溶液及び試料溶液のＨＭＢピークの面積を自動積分法により測定し、次式によって、ＨＭＢ含有量（質量％）を求めた。結果、ＨＭＢ含有量は８０質量％であることがわかった。
【００２７】
【数１】
2018091750.tif 000002
Ａｓｔｄ：標準溶液のＨＭＢのピーク面積
Ａｓｍｐ：試料溶液のＨＭＢのピーク面積
Ｗｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の秤取量（ｇ）
Ｗｓｍｐ：ＨＭＢＣａ原末の秤取量（ｇ）
Ｌｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の乾燥減量（質量％）
Ｐ      ：ＨＭＢＣａ標準品（乾燥物換算）中のＨＭＢ純度＝０．８５４（*）
【数２】
2018091750.tif 000003
【００２８】
【表１】
2018091750.tif 000004
【００２９】
＜比較例１（移動相のｐＨ：５．８）＞
移動相を水とアセトニトリルの混合溶液（Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：５．８）に変更した以外、実施例１と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図２に、ＨＭＢピークから得られた理論段数及びシンメトリー係数を表２に示す。図２及び理論段数等の結果から、移動相のｐＨが５．８の場合には、ＨＭＢがカラムに保持されず、インジェクションの後に、すぐにピークが観測されている。さらに理論段数もシンメトリー係数も悪い。
【００３０】
＜実施例２（移動相のｐＨ：２．９）＞
移動相を５０ｍＭギ酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液（５０ｍＭ ＨＣＯＯＨａｑ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：２．９）に変更した以外、実施例１と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図３に、ＨＭＢピークから得られた理論段数及びシンメトリー係数を表２に示す。図３及び理論段数等の結果から、良好な対称性を有するＨＭＢピークが、ブランクと明確に分離された保持時間に観測されることが明らかである。
【００３１】
＜実施例３（移動相のｐＨ：３．５）＞
移動相を５０ｍＭ酢酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液（５０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨａｑ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：３．５）に変更した以外、実施例１と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図４に、ＨＭＢピークから得られた理論段数及びシンメトリー係数を表２に示す。図４及び理論段数等の結果から、良好な対称性を有するＨＭＢピークが、ブランクと明確に分離された保持時間に観測されることが明らかである。
【００３２】
【表２】
2018091750.tif 000005
【００３３】
２．ＨＭＢＣａ配合錠剤の液体クロマトグラフィーの測定
＜実施例４（移動相のｐＨ：３．０）＞
ＨＭＢＣａ、結晶セルロース、ステアリン酸カルシウム、微粒二酸化ケイ素、及びヒドロキシプロピルセルロースを含むＨＭＢＣａ配合錠剤を準備した。
このＨＭＢＣａ配合錠剤１粒を取り、移動相（下記試験条件参照）を加えて正確に５０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ＨＭＢＣａ標準品約０．１０ｇを精密に量り、移動相を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。標準溶液及び試料溶液各１０μＬにつき、次の条件で液体クロマトグラフィーにより試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図５に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図６に示す。図５の結果から、ＨＭＢＣａ以外の成分を含む錠剤について、ＨＭＢピークをその他の成分と十分に分離した保持時間に観測できることが明らかである。
また、標準溶液及び試料溶液のＨＭＢピークの面積を自動積分法により測定し、次式によって、このＨＭＢＣａ配合錠剤６粒中のＨＭＢ含有量を求めた。結果、ＨＭＢ含有量は１．２ｇであることがわかった。
【００３４】
【数３】
2018091750.tif 000006
Ａｓｔｄ：標準溶液のＨＭＢのピーク面積
Ａｓｍｐ：試料溶液のＨＭＢのピーク面積
Ｗｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の秤取量（ｇ）
Ｌｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の乾燥減量（質量％）
Ｐ      ：ＨＭＢＣａ標準品（乾燥物換算）中のＨＭＢ純度＝０．８５４（*）
【数４】
2018091750.tif 000007
【００３５】
【表３】
2018091750.tif 000008
【００３６】
３．ＨＭＢＣａ配合ゼリーの液体クロマトグラフィーの測定
＜実施例５（移動相のｐＨ：３．５）＞
ＨＭＢＣａ、果糖ぶどう糖液糖、マルトデキストリン、寒天、乳酸、甘味料（アセスルファムＫ、ステビア、スクラロース）、ゲル化剤（増粘多糖類）、香料、色素を含むＨＭＢＣａ配合ゼリーを準備した。
このＨＭＢＣａ配合ゼリー１５〜２１ｇを精密に量り、移動相（下記試験条件参照）約２００ｍＬを加えて十分に振り混ぜ、１時間放置し、５分間超音波を照射した後、移動相を加えて正確に３００ｍＬとした。この液をろ紙でろ過し、ろ液１０ｍＬを正確に量り、移動相を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ＨＭＢＣａ標準品約０．１０ｇを精密に量り、移動相を加えて正確に２０ｍＬとした。この液１０ｍＬを正確に量り、移動相を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。標準溶液及び試料溶液各１０μＬにつき、次の条件で液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図７に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図８に示す。
また、標準溶液及び試料溶液のＨＭＢピークの面積を自動積分法により測定し、次式によって、このＨＭＢＣａ配合ゼリー２０ｇ中のＨＭＢ含有量を求めた。結果、ＨＭＢ含有量は１．２ｇであることがわかった。
【００３７】
【数５】
2018091750.tif 000009
Ａｓｔｄ：標準溶液のＨＭＢのピーク面積
Ａｓｍｐ：試料溶液のＨＭＢのピーク面積
Ｗｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の秤取量（ｇ）
Ｗｓｍｐ：ＨＭＢＣａ配合ゼリーの秤取量（ｇ）
Ｌｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の乾燥減量（質量％）
Ｐ      ：ＨＭＢＣａ標準品（乾燥物換算）中のＨＭＢ純度＝０．８５４（*）
【数６】
2018091750.tif 000010
【００３８】
【表４】
2018091750.tif 000011
【００３９】
＜比較例２（移動相のｐＨ：５．８）＞
移動相を水とアセトニトリルの混合溶液（Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：５．８）に変更した以外、実施例５と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図９に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図１０に示す。
【００４０】
＜実施例６（移動相のｐＨ：３．０）＞
液体クロマトグラフィーの検出器を示差屈折率計（ＲＩ）に変更した以外、実施例５と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図１１に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図１２に示す。示差屈折率計（ＲＩ）を使用することにより、他成分のピークが小さくなり、ＨＭＢのピークを際立たせるという効果が認められた。
【００４１】
＜実施例７（移動相のｐＨ：２．９）＞
移動相を５０ｍＭギ酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液（５０ｍＭ ＨＣＯＯＨａｑ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：２．９）に変更した以外、実施例５と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図１３に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図１４に示す。有機酸としてギ酸を使用することにより、ＨＭＢのピーク近傍のピークが消失して、ＨＭＢのピークを際立たせるという効果が認められた。
【００４２】
＜実施例８（移動相のｐＨ：３．５）＞
移動相を５０ｍＭ酢酸水溶液とアセトニトリルの混合溶液（５０ｍＭ ＨＣＯＯＨａｑ：ＣＨ3ＣＮの体積比：９５：５，ｐＨ：３．５）に変更した以外、実施例５と同様の方法により、試料溶液を調製し、液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図１５に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図１６に示す。有機酸として酢酸を使用することにより、ＨＭＢのピーク近傍のピークが消失して、ＨＭＢのピークを際立たせるという効果が認められた。
【００４３】
４．ＨＭＢＣａ配合飲料の液体クロマトグラフィーの測定
＜実施例９（移動相のｐＨ：３．０）＞
果糖ぶどう糖液糖、ＨＭＢＣａ、レモン濃縮果汁、ＤＬ−リンゴ酸、クエン酸、香料、甘味料（ステビア）を含むＨＭＢＣａ配合飲料を準備した。
このＨＭＢＣａ配合飲料７ｍＬを正確に量り、移動相（下記試験条件参照）を加えて正確に２０ｍＬとし、保留粒子径０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を試料溶液とした。別に、ＨＭＢＣａ標準品約０．１０ｇを精密に量り、移動相を加えて溶かし、移動相を加えて正確に２０ｍＬとし、０．４５μｍのフィルターでろ過し、ろ液を標準溶液とした。標準溶液及び試料溶液各１０μＬにつき、次の条件で液体クロマトグラフィー試験を行った。試料溶液のクロマトグラム（チャート）を図１７に、参考としてＨＭＢＣａを除いた成分を同様の方法により測定した場合のクロマトグラム（チャート）を図１８に示す。
標準溶液及び試料溶液のＨＭＢピークの面積を自動積分法により測定し、次式により本ＨＭＢ配合飲料１００ｍＬ中のＨＭＢ含有量を求めた。結果、ＨＭＢ含有量は１．２ｇであることがわかった。
【００４４】
【数７】
2018091750.tif 000012
Ａｓｔｄ：標準溶液のＨＭＢのピーク面積
Ａｓｍｐ：試料溶液のＨＭＢのピーク面積
Ｗｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の秤取量（ｇ）
Ｌｓｔｄ：ＨＭＢＣａ標準品の乾燥減量（質量％）
Ｐ      ：ＨＭＢＣａ標準品（乾燥物換算）中のＨＭＢ純度＝０．８５４（*）
【数８】
2018091750.tif 000013
【００４５】
【表５】
2018091750.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、他の成分と分離した保持時間に安定的にＨＭＢを検出することが可能であり、ＨＭＢの含有量を正確に決定できるＨＭＢの測定方法を提供することができる。これにより、特定保健用食品や機能性表示食品などのＨＭＢの含有量を正確に決定することができる。
【図１】
2018091750.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018091750.tif 000030
【図１７】
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【図１８】
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