(57)【要約】【課題】ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含め、多くのがん細胞を捕捉できるがん細胞捕捉方法を提供する。【解決手段】体液中に含まれるがん細胞捕捉方法であって、採取した体液のたんぱく質濃度を減少させた後、親水性ポリマー層にがん細胞を捕捉させるがん細胞捕捉方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中に含まれるがん細胞捕捉方法であって、
採取した体液のたんぱく質濃度を減少させた後、親水性ポリマー層にがん細胞を捕捉させるがん細胞捕捉方法。
【請求項２】
親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されている請求項１記載のがん細胞捕捉方法。
【化１】
2018050548.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【請求項３】
親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されている請求項１記載のがん細胞捕捉方法。
【化２】
2018050548.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【請求項４】
たんぱく質濃度を減少させる方法が、採取した体液を希釈するものである請求項１〜３のいずれか記載のがん細胞捕捉方法。
【請求項５】
希釈が緩衝溶液又は液体培地を用いて行われる請求項４記載のがん細胞捕捉方法。
【請求項６】
たんぱく質濃度を減少させる方法が、採取した体液に遠心分離を施して上澄みを除去するものである請求項１〜３のいずれか記載のがん細胞捕捉方法。
【請求項７】
体液が血液である請求項１〜６のいずれか記載のがん細胞捕捉方法。
【請求項８】
親水性ポリマー層の厚みが２〜２００ｎｍである請求項１〜７のいずれか記載のがん細胞捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液（血液等）中のがん細胞を捕捉するがん細胞捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞が発生するとやがて、血液・体液中に出て来ることが知られており、血液中に出て来たがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれている。そして、この血中循環腫瘍細胞を調べることによるがんの治療効果の確認、予後寿命、投与前の抗がん剤の効果予測、がん細胞の遺伝子解析を用いた治療方法の検討、等が期待されている。
【０００３】
しかしながら、血中循環腫瘍細胞は非常に数が少なく（数個〜数百個／血液１ｍＬ）、がん細胞を捕捉することが難しいという問題がある。
【０００４】
例えば、血中循環腫瘍細胞の捕捉技術として、Ｃｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈシステムと呼ばれるものが知られているが、これは、抗原抗体反応（ＥｐＣＡＭ抗体で捕捉）を用いる技術であるため、ＥｐＣＡＭを発現しているがん細胞しか捕捉できず、補足可能ながん細胞の種類に制限がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５２３９８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記課題を解決し、ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含め、多くのがん細胞を捕捉できるがん細胞捕捉方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、体液中に含まれるがん細胞捕捉方法であって、採取した体液のたんぱく質濃度を減少させた後、親水性ポリマー層にがん細胞を捕捉させるがん細胞捕捉方法に関する。
【０００８】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性ポリマーで形成されていることが好ましい。
【化１】
2018050548.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【０００９】
前記親水性ポリマー層は、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体で形成されていることが好ましい。
【化２】
2018050548.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【００１０】
前記たんぱく質濃度を減少させる方法は、採取した体液を希釈するものであることが好ましい。ここで、前記希釈は、緩衝溶液又は液体培地を用いて行われることが好ましい。
前記たんぱく質濃度を減少させる方法は、採取した体液に遠心分離を施して上澄みを除去するものであることが好ましい。
【００１１】
前記体液は、血液であることが好ましい。
前記親水性ポリマー層の厚みは、２〜２００ｎｍであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、体液中に含まれるがん細胞捕捉方法であって、採取した体液のたんぱく質濃度を減少させた後、親水性ポリマー層にがん細胞を捕捉させるがん細胞捕捉方法であるため、ＥｐＣＡＭを発現していないがん細胞も含め、多くのがん細胞を捕捉できる。そのため、例えば、体液中からがん細胞を充分に捕捉でき、また、同時に他のタンパク質や細胞の粘着・接着も抑制できる。従って、がん細胞等を選択的に捕捉することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】親水性ポリマー層が形成されたウェルを有するマルチウェルプレート（医療用検査装置）の模式図の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、体液中に含まれるがん細胞捕捉方法であって、採取した体液のたんぱく質濃度を減少させた後、親水性ポリマー層にがん細胞を捕捉させるがん細胞捕捉方法である。
【００１５】
先ず、採取した体液に、希釈、遠心分離等の処理を施すことで、採取した体液に比べ、たんぱく質濃度が減少した試料を作製した後、作製された試料を親水性ポリマー層に接触させ、試料中のがん細胞を捕捉する方法である。よって、アルブミン等のたんぱく質による細胞接着抑止効果が減じ、親水性ポリマーに対するがん細胞の本来の接着能力が発揮されるので、がん細胞の捕捉性が大きく向上すると共に、血小板等の捕捉性が低下し、たんぱく質が多い状態では到底発揮し得ないがん細胞の選択的な捕捉効果を奏する。
【００１６】
具体的に説明すると、血中循環腫瘍細胞（数個〜数百個／血液１ｍＬ）等の体液中にでてきた腫瘍細胞（がん細胞等）は、非常に数が少なく、検査に供するには、採取した体液中に存在する腫瘍細胞をできる限り多く捕捉することが重要であり、腫瘍細胞の接着を抑制するたんぱく質の数を減じることが必要と考えられる。本発明は、予め、採取した体液に比べ、たんぱく質濃度が減少した試料を作製した後、該試料を親水性ポリマー層に接触させる方法であるので、体液中の腫瘍細胞が親水性ポリマー層に、より多く吸着・接着される。そして、吸着された腫瘍細胞の数を測定することで、体液中の腫瘍細胞数が判り、がん治療効果の確認等を期待できる。また、捕捉した腫瘍細胞を培養し、その培養した細胞で抗がん剤等の効き目を確認することで、抗がん剤等の投与前に、体の外で、抗がん剤等の効き目を確認できると同時に、抗がん剤等の選定にも役立つ。
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施形態の一例を、図を用いて説明する。
本発明のがん細胞捕捉方法は、例えば、図１の医療用検査装置１（マルチウェルプレート１）を用いて実施できる。
【００１８】
図１の医療用検査装置１（マルチウェルプレート１）は、がん細胞を捕捉する目的で使用される装置で、いわゆるマトリクス状にウェル１１が配置されたマルチウェルプレート１である。マルチウェルプレート１は、円形に開口された複数のウェル１１を有している。ウェル１１は、血液等の体液中のたんぱく質濃度を減少させた試料を注入する凹部であり、注入した試料を検査に供することにより、採取した体液をそのまま検査に供するより、がん細胞を効率的に捕捉することが可能となる。従って、体液中のがん細胞の有無の確認、がん細胞数の計測、がん細胞の培養、薬の効き目の確認・選定を実施できる。
【００１９】
体液中のたんぱく質濃度を減少させる方法は、公知の手法を使用でき、例えば、採取した体液を希釈する方法が挙げられる。ここで、希釈方法としては、ヒト血液のｐＨ（約７．４）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液や、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）等の液体培地、を用いる方法があり、具体的には、採取した体液に緩衝溶液を加えて希釈することや、液体培地に採取した体液を加えて希釈することで、採取した体液に比べて、たんぱく質濃度を減少させた試料を作製できる。
【００２０】
体液中のたんぱく質濃度を減少させる方法としては、採取した体液に遠心分離を施して上澄みを除去する方法も挙げられる。具体的には、採取した体液を遠心分離し、作製されたたんぱく質を含む上澄みを取り除くことにより、採取した体液に比べて、たんぱく質濃度を減少させた試料を作製できる。
【００２１】
図１では、一例として、４行６列の２４個のウェル１１を有する２４ウェルプレートを示しているが、マルチウェルプレート１は、ウェル１１を少なくとも２つ以上有していれば良く、ウェル１１の個数は任意である。２４ウェルプレートの他には、ウェル１１が、６個、９６個、３８４個等の汎用マルチウェルプレートでも良い。
【００２２】
マルチウェルプレート１の構成材料としては、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等のアクリル樹脂（ポリアクリル樹脂）、シクロオレフィン樹脂（ポリシクロオレフィン）、カーボネート樹脂（ポリカーボネート）、スチレン樹脂（ポリスチレン）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂、ポリジメチルシロキサン等が挙げられる。
【００２３】
ウェル１１は非貫通孔であり、マルチウェルプレート１の表面に開口されている。ウェル１１には、開口から、体液中のたんぱく質濃度を減少させた試料が注入される。また、がん細胞の存在を確認した場合、がん細胞を培養するための培養液を注入することも可能である。
【００２４】
ウェル１１の開口の直径Ｒ、深さＤは、特に限定されず、通常のマルチウェルプレート１のＲ、Ｄを採用できる。図１では、マルチウェルプレート１の表面及び裏面に対して、ウェル１１の内側面が略垂直であるが、ウェル１１は、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて窄まる形状でも良い。また、内側面が傾斜し、開口から底面にかけて拡がる形状でも良い。
【００２５】
図１では、ウェル１１は円形に開口しているが、ウェル１１の開口形状は任意であり、四角形等、任意の形状に開口したものでもよい。
【００２６】
マルチウェルプレート１は、複数のウェル１１が分離可能なものを好適に使用できる。複数のウェルを有する場合、がん細胞数計測用ウェルと、がん細胞培養用ウェルとに分離使用でき、例えば、計測用ウェルでがん細胞の存在の有無を確認した上で、存在が確認された場合に培養用ウェルでがん細胞を培養し、その細胞で薬の効き目を確認できる。
【００２７】
マルチウェルプレート１（医療用検査装置１）において、ウェル１１の内側面は、少なくとも一部に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。図１は、ウェルの底面及び側面の一部に親水性ポリマー層２１が形成されている例を示している。
【００２８】
ウェル１１内に、体液中のたんぱく質濃度を減少させた試料を導入すると、これらに含まれるがん細胞が親水性ポリマー層２１に吸着されると共に、血小板、赤血球等の吸着が抑制される。そのため、試料の導入後に所定時間保持し、次いで、洗浄することで、がん細胞を親水性ポリマー層２１に吸着できる。そして、吸着されたがん細胞の数を測定することで、体液中のがん細胞数が判り、がん治療効果の確認等が期待される。
【００２９】
親水性ポリマー層２１（親水性ポリマーにより形成される層）の膜厚（厚み）は、好ましくは２〜２００ｎｍ、より好ましくは２０〜１８０ｎｍである。上記範囲内に調整することで、良好なタンパク質や細胞に対する低吸着性、がん細胞に対する選択的吸着性・接着性が得られる。
【００３０】
親水性ポリマーは、親水性を有するものを適宜選択できる。例えば、１種又は２種以上の親水性モノマーの単独重合体及び共重合体、１種又は２種以上の親水性モノマーと他のモノマーとの共重合体等が挙げられる。前記単独重合体、共重合体としては、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等が挙げられる。
【００３１】
親水性モノマーは、親水性基を有する各種モノマーを使用できる。親水性基は、例えば、アミド基、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基、アミノ基、アミド基、オキシエチレン基等、公知の親水性基が挙げられる。
【００３２】
親水性モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリルアミド、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（（メタ）アクリロイルモルホリン等）、などが挙げられる。
【００３３】
他のモノマーは、親水性ポリマーの作用効果を阻害しない範囲内で適宜選択すれば良い。例えば、スチレン等の芳香族モノマー、酢酸ビニル、温度応答性を付与できるＮ−イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられる。
【００３４】
なかでも、親水性ポリマーとしては、下記式（Ｉ）で表されるポリマー及びポリ（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【化３】
2018050548.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基、Ｒ２はアルキル基を表す。ｍは１〜５、ｎは繰り返し数を表す。）
【００３５】
Ｒ２のアルキル基の炭素数は、１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。なかでも、Ｒ２は、メチル基又はエチル基が特に好ましい。ｍは、１〜３が好ましい。ｎ（繰り返し単位数）は、１５〜１０００が好ましく、３０〜５００がより好ましい。
【００３６】
また、親水性ポリマーとして、下記式（Ｉ−１）で表される化合物及び（メタ）アクリロイルモルホリンからなる群より選択される少なくとも１種の親水性モノマーと、他のモノマーとの共重合体も好適に使用できる。
【化４】
2018050548.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍは前記と同様。）
【００３７】
親水性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、がん細胞に対する選択的吸着性・接着性の観点から、好ましくは４０００〜１５００００、より好ましくは５０００〜１０００００、更に好ましくは８０００〜５００００である。なお、本明細書において、Ｍｗは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー（株）製ＧＰＣ−８０００シリーズ、検出器：示差屈折計、カラム：東ソー（株）製のＴＳＫＧＥＬ  ＳＵＰＥＲＭＡＬＴＰＯＲＥ  ＨＺ−Ｍ）による測定値を基に標準ポリスチレン換算により求めることができる。
【００３８】
医療用検査装置は、例えば、図１のウェル１１を備えたマルチウェルプレート１、更に必要に応じて他の部材（部品）を付加することにより、製造できる。
【００３９】
具体的には、親水性ポリマー層２１が形成されたマルチウェルプレート１の場合、（１）親水性ポリマーを各種溶剤に溶解・分散した親水性ポリマー溶液・分散液を、ウェル１１の内部に注入し、所定時間保持する方法、（２）該親水性ポリマー溶液・分散液をウェル１１の内面に塗工（噴霧）する方法、等、公知の手法により、ウェル１１の内面の全部又は一部に親水性ポリマー溶液・分散液をコーティングすることで、親水性ポリマーにより形成されるポリマー層が形成されたマルチウェルプレート１を製造できる。そして、得られたマルチウェルプレート１に、必要に応じて他の部品を追加することで、医療用検査装置を製造できる。
【００４０】
溶剤、注入方法、塗工（噴霧）方法などは、従来公知の材料及び方法を適用できる。
（１）、（２）の保持時間は、ウェル１１の大きさ、導入する液種、等により適宜設定すれば良いが、５分〜１０時間が好ましく、１０分〜５時間がより好ましく、１５分〜２時間が更に好ましい。保持後、適宜、余分な親水性ポリマー溶液・分散液を排出し、乾燥してもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４２】
〔医療用検査装置（マルチウェルプレート）の製造〕
ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を用いて、２−メトキシエチルアクリレートを８０℃で６時間熱重合し、ポリ２−メトキシエチルアクリレートを作製した（分子量Ｍｎ：約１５０００、Ｍｗ：約５００００）。そして、得られたポリ２−メトキシエチルアクリレートの２．５Ｗ／Ｖ％メタノール溶液を作製した。
市販ＰＭＭＡ製プレート内に、作製したポリ２−メトキシエチルアクリレート溶液（２．５Ｗ／Ｖ％）を注入し、３０分室温放置した後、液をピペットで吸出し、乾燥することで、図１の親水性ポリマー層が形成されたマルチウェルプレートを有する検査装置を作製した。
【００４３】
（実施例１）
ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を懸濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、ＰＢＳ溶液内の細胞濃度がある値Ａ１になるように更にＰＢＳ溶液を加えて、細胞濃度を調整した。次に、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。この場合、血液と等量のＰＢＳ溶液を加えたことになった。
【００４４】
（実施例２）
ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を懸濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、ＰＢＳ溶液内の細胞濃度がある値Ａ２になるように更にＰＢＳ溶液を加えて、細胞濃度を調整した。次に、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。この場合、血液と血液の２倍量のＰＢＳ溶液を加えたことになった。
【００４５】
（実施例３）
ＤＭＥＭ（液体培地）に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を懸濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、ＤＭＥＭ内の細胞濃度がある値Ａ１になるように更にＤＭＥＭを加えて、細胞濃度を調整した。次に、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。この場合、血液と等量のＤＭＥＭを加えたことになった。
【００４６】
（実施例４）
ＤＭＥＭ（液体培地）に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を懸濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、ＤＭＥＭ内の細胞濃度がある値Ａ２になるように更にＤＭＥＭを加えて、細胞濃度を調整した。次に、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。この場合、血液と血液の２倍量のＤＭＥＭを加えたことになった。
【００４７】
（実施例５）
線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を剥離液を用いて懸濁させ、一部をＰＢＳ溶液に混濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、この値を用いて、血液に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）の入った剥離液を混濁させた。このとき、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。次に、混濁させた血液に遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）を行い、上澄みを捨てて、残った血液を取り出した。
【００４８】
（実施例６）
線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を剥離液を用いて懸濁させ、一部をＰＢＳ溶液に混濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、この値を用いて、血液に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）の入った剥離液を混濁させた。このとき、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。次に、混濁させた血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行い、上澄みを捨てて、残った血液を取り出した。
【００４９】
（実施例７）
線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を剥離液を用いて懸濁させ、一部をＰＢＳ溶液に混濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、この値を用いて、血液に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）の入った剥離液を混濁させた。このとき、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。次に、混濁させた血液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分）を行い、上澄みを捨てて、残った血液を取り出した。
【００５０】
（比較例１）
線維肉腫（ＨＴ−１０８０）を剥離液を用いて懸濁させ、一部をＰＢＳ溶液に混濁させて、細胞数を血球計測管でカウントした後、この値を用いて、血液に線維肉腫（ＨＴ−１０８０）の入った剥離液を混濁させた。このとき、播種密度（濃度）が２８５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に計算上なるように血液を混濁させた。
【００５１】
実施例、比較例で作製した検査試料（採取した血液に比べ、たんぱく質濃度を減少させた試料）を図１の医療用検査装置に供し、以下の方法で評価した。
【００５２】
〔親水性ポリマー層（コーティング層）の膜厚〕
ウェル内面の親水性ポリマー層の膜厚は、ＴＥＭを使用し、加速電圧１５ｋＶ、１０００倍で測定（撮影）した。
【００５３】
〔がん細胞数の計測〕
各検査試料（がん細胞含有血液）をウェルに１ｍｌずつ注入し、３７℃で１時間接着させた。その後、ＰＢＳ溶液で未接着の細胞を洗浄した。次いで、免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で接着したがん細胞数をカウントトした。なお、比較例１の接着数を１．０として、相対値で比較した。
【００５４】
【表１】
2018050548.tif 000006
【００５５】
採取した血液をそのまま検査に供した比較例１に比べ、ＰＢＳ溶液や液体培地を用いて血液を希釈したり、血液に遠心分離処理を施して上澄みを除去することで、たんぱく質濃度を減少させた試料を供した実施例の方が、がん細胞接着量が大幅に増加することが明らかとなった。
【符号の説明】
【００５６】
１    医療用検査装置（マルチウェルプレート）
１１  ウェル
２１  親水性ポリマー層
【図１】
2018050548.tif 000009