(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリペプチド又は融合タンパク質を含む医薬組成物と、がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患等の疾患における免疫系にそのモジュレート効果を生じる、一次配列がヒトＴＧＦβの配列と高い相同性を有する、ＴＧＦβ分子の突然変異したポリペプチドの提供。【解決手段】天然ＴＧＦβリガンドの配列との９０％を超える相同性によって特徴づけられる、ＡＬＫ５受容体によって媒介されるＴＧＦβ天然リガンドの活性をアンタゴナイズするポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ＴＧＦβリガンドの配列との９０％を超える相同性によって特徴づけられる、ＡＬＫ５受容体によって媒介されるＴＧＦβ天然リガンドの活性をアンタゴナイズするポリペプチド。
【請求項２】
Ｗ３０、Ｗ３２、Ｌ１０１、Ｉ５１、Ｌ５１、Ｑ６７及びＹ６からなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１種において、少なくとも１個の突然変異を含むことによって特徴づけられる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
本来の残基が、
ポジション３０に対して、Ｎ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｅ、
ポジション３２に対して、Ａ、
ポジション１０１に対して、Ａ、Ｅ、
ポジション５１に対して、Ｑ、Ｗ、Ｙ、Ａ、
ポジション６７に対して、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ及び
ポジション６に対して、Ａ
を含む群から選択されるアミノ酸残基のうち１種によって突然変異している、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＴＧＦβＲＩＩ及び／又はＴＧＦβＲＩＩＩ受容体との相互作用界面における突然変異が、それに対する親和性を増加させるために加えられている、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
その分泌に影響を与えることなく、ＬＡＰを欠く成熟ドメインを産生するための突然変異を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｃγ２ドメインに突然変異ａｌａ２３４及びａｌａ２３５を含むヒトＩｇＧ１の断片にカップリングされた、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
５０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの間の範囲内の、請求項３に記載の少なくとも１種のポリペプチドと、
薬学的に適したベヒクルと
を含む、がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項８】
治療有効量の請求項３に記載のポリペプチドの混合物と、
薬学的に適したベヒクルと
を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、担体タンパク質に共有結合により連結されている、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記担体タンパク質が、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域であることによって特徴づけられる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患の処置において有用な医薬の製造のための、請求項１から６までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答の増強に有用な医薬の製造のための、請求項１から６までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
増強のための前記ワクチンが、がんのための治療用ワクチンである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び医薬の分野に関する。本発明は、特に、その天然の対応物のシグナル伝達アンタゴニストである、ＴＧＦβ分子の突然変異バリアントの使用と、このようなバリアントの治療適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦβサイトカインは、細胞コロニー形成を刺激するその能力によって見出された（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＡＢら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：５３３９〜４３、１９８１）；このプロセスは、細胞の形質転換の古典的マーカーであるため、この分子は、トランスフォーミング増殖因子ベータと呼ばれた。今日、ＴＧＦβリガンド（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）は、多機能性増殖因子の原型として認識されている。身体の殆どあらゆる種類の細胞は、これらを産生し、その受容体複合体を発現する。これらの分子は、上皮、内皮及び造血細胞の増殖の強力な阻害因子であり（Ｒａｖｉｔｚ、ＭＪら、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７１：１６５〜２０７、１９９７）、細胞外マトリックス産生及び沈着（Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．、Ｔｈｅ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：５９７〜６４１、１９９０）並びに組織修復カスケード（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＡＢ．他、２７５〜３０８  Ｐｌｅｎｕｍ、１９９６）の最も強力な調節因子の１種である。これらは、細胞分化、遊走及び血管新生等、胚発生における様々な機序も調節する（Ｔａｙａ、Ｙ．ら（at al）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：３８６９〜７９、１９９９；Ｌｉｄｒａｌ、Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６３：５５７〜６８、１９９８）。
【０００３】
免疫系において、ＴＧＦβシグナル伝達は、非常に重要な調節ノードである。その最も重要な機能の１つは、リンパ球減少性環境における自己抗原によって誘導されるナイーブＴ細胞の増殖の阻害により、リンパ球恒常性及び免疫寛容を維持することである（Ｂｅｖａｎ、Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、１３（７）：６６７〜７３、２０１２）。この分子は、また、ナチュラルキラー細胞（Ｌａｏｕａｒ、Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：６００〜６０７、２００５）、樹状細胞（Ｌｕｏ、Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：２８２１〜２８２６、２００７；Ｂｅｋｅｒｅｄｊｉａｎ  Ｄｉｎｇ、Ｉ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２８：４３９〜４５０、２００９）、マクロファージ（Ｓｉｃａ、Ａ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １８、３４９〜３５５、２００８、Ｔｏｒｒｏｅｌｌａ．Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４８００〜０９、２００９）、好中球（Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ、ＺＧら、Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １６：１８３〜１９４、２００９）並びにエフェクター及びメモリーＴ細胞（Ｇｏｒｅｌｉｋ、Ｌ．＆Ｆｌａｖｅｌｌ、ＲＡ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ、７：１１１８〜１１２２、２００１；Ｆｌａｖｅｌｌ、ＲＡ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１：１３１〜４４、２００９）の活性化、成熟化及び分化を抑制又は変更する。ＴＧＦβは、天然及び誘導性調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）並びにＴＣＤ４＋ＩＬ１７＋（ＴＨ１７）エフェクターＴ細胞の誘導、分化及び維持において不可欠な役割を果たす（Ｋｒｙｃｚｅｋ、Ｉ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６７３０〜３３、２００７；Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ、ＴＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：１２〜２１、２００９；Ｆａｎｔｉｎｉ、ＭＣら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：５１４９〜５３、２００４；Ｆｌａｖｅｌｌ、Ｒ．Ａ．、Ｃｅｌｌ  １３４：３９２〜４０４、２００８）。
【０００４】
成熟ＴＧＦβリガンドは、１１２アミノ酸残基のホモ二量体である。これらは、Ｎ末端に位置する潜在関連プロペプチド（ＬＡＰ）及びＣ末端極に向かう活性ドメインによって形成される前駆体分子に由来する。両ドメインは、タンパク質分解によって細胞内で分離され、リガンドは、活性ドメインに可逆的に結合したプロドメインによって形成される不活性前駆体として分泌され、これにより、細胞受容体へのアクセスを調節する（Ｇｅｏｆｆｒｅｙ  Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｊｏａｎｎｅ  Ｅ．  Ｍｕｒｐｈｙ−Ｕｌｌｒｉｃｈ．  ＪＢＣ  ２７９巻、３６号：３８０３２〜３９、２００４）。潜在型に関連するプロペプチドも、成熟ドメインの分泌に重要であると仮定された（Ｇｒａｙ  Ａ．  ａｎｄ  Ａ  Ｍａｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３２８〜３０、１９９０）。
【０００５】
全３種のアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）は、原形質膜において、受容体ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩと相互作用する。ベータグリカンとしても公知の後者は、あらゆる細胞型において発現されるとは限らず、これは、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３リガンドによって媒介されるシグナル伝達に不必要であるが、ＴβＲＩＩが飽和した場合、これらのリガンドの貯蔵所を構成する（Ｗａｎｇ  ＸＦら、Ｃｅｌｌ  ６７：７９７〜８０５、１９９１；Ｌｅｂｒｉｎ  Ｆ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ  ６５：５９９〜６０８、２００５）。ＴβＲＩＩＩは、ＴβＲＩ及びＴβＲＩＩ受容体と複合体を形成し、これらにリガンドを提示する。これらの受容体は、ＴβＲＩＩに第一に結合し、ＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ複合体は、ＴβＲＩ受容体を協同的且つ高親和性で補充及び活性化し、シグナル伝達ヘテロ三量体複合体の形成をもたらす。ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３は、高親和性で（５〜３０ｐｍ）ＴβＲＩＩに結合することができ、一方、ＴＧＦ−β２は、ＴβＲＩＩＩの存在下のみで同じ仕方でこれを行うことができる（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：２６０１３〜１８、２００４；Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２８：１１７３〜１１８３、２００３；Ｇｒｏｐｐｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２９、１５７〜１６８、２００８）。
【０００６】
これまで、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３ファミリーのリガンドが、ＴβＲＩＩが属する同じタンパク質ファミリーの一部である他のＩＩ型受容体に結合する能力を有することは報告されていない（Ｈｕａｎｇ  Ｆ  ａｎｄ  ＹＧ  Ｃｈｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃ  Ｍａｒ  １５、２：９、２０１２）。しかし、これらは、数種類のＩ型受容体と結合することができる。ＡＬＫ５は、そのリガンドサブファミリーの参照ＴβＲＩ受容体として記載されている。これをＴβＲＩＩ／ＴＧＦ−β複合体に補充した後に、ＳＭＡＤ２／３タンパク質のリン酸化が誘導される（Ｈｕａｎｇ  Ｆ  ａｎｄ  ＹＧ  Ｃｈｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃ；Ｍａｒ  １５；２：９、２０１２）。ＡＬＫ１は、内皮細胞におけるＴＧＦ／ＴβＲＩＩ複合体の形成に応答して活性化され、ＳＭＡＤ１及びＳＭＡＤ５によってシグナル伝達する（Ｇｏｕｍａｎｓ  ＭＪら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １２（４）：８１７〜２８、２００３）。一部の上皮細胞において、ＳＭＡＤ１／５シグナル伝達は、受容体ＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６によって誘導される（Ｄａｌｙ  ＡＣら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２８：６８８９〜６９０２、２００８）。ＡＬＫ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏ心血管系発生に関するプロセスにも関連する（Ｏｌｉｖｅｙ  ＨＥら、Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２３５（１）：５０〜９、２００６）。ＴβＲＩＩ及びＡＬＫ５の両方が、リガンドのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３ファミリーに特有である一方、ＡＬＫ１／２／６／３は、より乱雑であり、アクチビン及び骨形成タンパク質によっても共有されることを強調するべきである（Ｓｅｂａｌｄ  Ｗ．ら、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、３８５（８）：６９７〜７１０、２００４）。
【０００７】
ＡＬＫ５媒介性シグナル伝達は、特定の疾患における様々な発症機序に関連する。例えば、がんにおいて、その役割は複雑であり、免疫応答の抑制及び腫瘍進行の促進に関連する。免疫応答の抑制は、主に腫瘍発生初期に起こる。一方、腫瘍進行者としてのその役割は、転移性浸潤性表現型の誘導及び抗腫瘍免疫応答の抑制により、発癌の進行期に起こる（Ｍｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １０：４１５〜２４、２０１０；Ｍｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  １０１（２）：３０６〜１２、２０１０；Ｈａｗｉｎｋｅｌｓ  ＬＪ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２９（４）：１４０〜５２、２０１１）。ＴＧＦβの活性が同様に有害である別の疾病は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、マイコバクテリア及びクルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）寄生虫等、病原体が原因の慢性感染症である。ＴＧＦβは、防御免疫応答にマイナスの影響を及ぼし、これらの細胞内病原体を成長及び生存させる（Ｒｅｅｄ  ＧＳ．、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １：１３１３〜１３２５、１９９９）。多くの疾患において、ＴＧＦβの過剰産生は、損傷した臓器の正常機能を損なう、線維性組織の病的過剰に寄与する。線維性組織の病的過剰の数例として、とりわけ、肺線維症、サルコイドーシス、心臓線維症（cardiac fibrosis）、心筋症、肝硬変、全身性硬化症、糸球体硬化症及び原発性胆汁性肝硬変が挙げられる（Ｋｏｐｐ  ＪＢら、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、１：１３４９〜１３６５、１９９９）。
【０００８】
ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するために複数の戦略が設計された。大部分の阻害因子は、前臨床モデルにおいて評価されてきたが、そのうちの一部は、臨床治験における様々な種類のがん及び線維症において検査され始めている（Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（８）：５５４〜６７、２０１０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＥＣら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ８（７）：９６４〜７８、２０１２；Ｈａｗｉｎｋｅｌｓ  ＬＪ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２９（４）：１４０〜５２、２０１１）。最新技術において、次の阻害戦略を見出すことができる。
【０００９】
１  −  その受容体の細胞外ドメインの可溶型（ＵＳ２００２／０００４０３７及びＵＳ２００７／０２４４０４２）、抗ＴＧＦβ抗体（ＵＳ２００２／０７６８５８、ＵＳ２００５／０２７６８０２）又はサイトカイン遺伝子の形質導入を遮断するオリゴヌクレオチド（ＵＳ２００４／０００６０３６、ＵＳ２００７／０１５５６８５）を用いたリガンドの中和。
【００１０】
２  −  ＴβＲＩ／ＡＬＫ５のキナーゼドメインに結合する小分子を用いたシグナル伝達の遮断（ＵＳ２００６／００５７１４５、ＵＳ２００５／０１３６０４３、ＵＳ２００６／０２３４９１１）。
【００１１】
３  −  その細胞外ドメインを認識する抗体による受容体ＩＩ遮断（ＵＳ２０１０／０１１９５１６、ＵＳ２００９／７５７９１８６）。
【００１２】
これまでのところ、シグナル伝達アンタゴニストとしてリガンドＴＧＦβのムテインを用いた阻害戦略は、報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＴＧＦβファミリー（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３）の突然変異バリアントが、その天然の対応物の機能を阻害し得るという科学的知見に関係する。本発明者らは初めて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、ＴＧＦβの突然変異バリアントが、天然バリアントによって誘導されるシグナル伝達を実質的に阻害することができ、よって、その生物学的効果を中和することができることを見出した。この知見は、このようなリガンドが有害活性を有するがん、線維症又は慢性感染症等の疾患におけるＴＧＦβシグナル伝達をモジュレートするための新たな戦略の基盤を提供する。
【００１４】
本発明は、ＡＬＫ５  １型受容体を介してシグナル伝達するその能力を実質的に排除又は減少させるために天然アミノ酸を突然変異させたいくつかのポジションを除き、ヒトＴＧＦβと一次配列のレベルにおいて高い相同性を有するポリペプチドに関する。このようなＴＧＦβの突然変異バリアントは、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩ受容体に高親和性で結合するその能力を維持するが、ＡＬＫ５  Ｉ型受容体と相互作用しないため、シグナル伝達することができず、高親和性ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩ受容体への結合に関して天然バリアントと競合することにより、天然バリアントのシグナル伝達を負にモジュレートする。本発明は、また、単独での、或いはＴＧＦβの作用が疾患の経過に影響を与えるがん、線維症又は慢性感染症等の疾患の処置のためのワクチン又は他の治療様式と組み合わせた、これらの突然変異バリアントの治療適用を含む。
【００１５】
本発明の新規性とは、ＴＧＦβの機能が、天然の又はワクチン接種によって誘導される防御免疫応答を低下させる或いは過剰な組織修復及び線維症を誘導する疾患において、ＴＧＦβシグナル伝達をモジュレートし、これにより様々な腫瘍の浸潤性及び転移性能力並びに様々な免疫系及び結合組織細胞の活性をモジュレートするための新規治療アプローチを提供することである。上述の阻害戦略のいずれも、シグナル伝達アンタゴニストとしてＴＧＦβリガンドのムテインを用いていない。本発明のＴＧＦβ突然変異体は、実質的に自己タンパク質であり、従って免疫原性が低く、これに対する抗体応答のリスクを最小化する。ＴＧＦβ受容体系に対するその高い特異性は、予想外の毒性を低下させる（小型の阻害因子に基づく戦略に共通）。このようなＴＧＦβの突然変異バリアントは、少なくとも天然ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３と同様のＴβＲＩＩ受容体に対する結合親和性を維持する（６〜１０ｐＭ）。この親和性は、モノクローナル抗体又は他の薬物を用いた他の受容体又はリガンド阻害戦略では達成が困難である。驚くべきことに、本発明の著者らは、これらのＴＧＦβ突然変異バリアントが、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩ受容体と相互作用するその能力を維持することを見出したが、ムテインは、細胞表面に対する天然リガンドのあらゆる可能な結合部位を遮断するため、これは、ＴβＲＩＩ抗受容体抗体を上回る利点を構成する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＴＧＦβ天然リガンドの、ＡＬＫ５受容体によって媒介される活性をアンタゴナイズするポリペプチドに関する。このポリペプチドは、ＴＧＦβ天然リガンドのアミノ酸配列に対して９０％を超える相同性を保有する。本発明のポリペプチドは、Ｙ６、Ｗ３０、Ｗ３２、Ｉ５１、Ｌ５１、Ｑ６７及びＬ１０１からなる群から選択される残基のうち１種において、その一次アミノ酸配列における少なくとも１個の突然変異を有する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、本来のアミノ酸残基は、
ポジション６に対して：Ａ；
ポジション３０に対して：Ｎ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｅ；
ポジション３２に対して：Ａ；
ポジション５１に対して：Ｑ、Ｗ、Ｙ、Ａ；
ポジション６７に対して：Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ；及び
ポジション１０１に対して：Ａ、Ｅ；
を含む群から選択されるアミノ酸残基のうち１種によって突然変異している。
【００１８】
本発明の別の目的は、受容体ＴＧＦβＲＩＩ及び／又はＴＧＦβＲＩＩＩとの相互作用界面に、受容体との親和性を増加させる突然変異が加えられたポリペプチドである。
【００１９】
更に、本発明は、本発明に記載されているポリペプチドの１種又は混合物と、その投与のための薬学的に適したベヒクルとを含有する、がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患の処置に用いられる医薬組成物に関する。斯かるポリペプチドは、アルブミン又はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域となり得る担体タンパク質に、共有結合により連結することができる。本発明の別の一実施形態において、ポリペプチドは、ペグ化することができる。
【００２０】
最後に、本発明は、がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患の処置において有用な医薬組成物を製造すると共に、特に、強化のためのワクチンが、がん処置のための治療用ワクチンである場合、天然ＴＧＦβに換えてワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答を増強するための、記載のポリペプチドの使用に関する。
【００２１】
ＴＧＦβ突然変異体ポリペプチドの獲得
本発明は、１１２アミノ酸の長さを有するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、異なる天然ＴＧＦβ分子と高い配列同一性、９０％を超える同一性を維持する。その配列の区域において、ポリペプチドは、天然ＴＧＦβと比較して１〜６個の突然変異を含む。本来の残基に置き換わる残基は、本来のアミノ酸に対して大幅に異なる物理化学的特性を有するように選択され、残基の変化は、非極性から極性、荷電から無電荷、大型から小型、及び酸性から塩基性となる。
【００２２】
ＴＧＦβムテインと呼ぶこともできるこのようなポリペプチドは、その受容体ＴβＲＩＩ及びＡＬＫ５と複合体形成した天然ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３の三次元構造に基づき設計された（ＰＤＢデータベースに入力）。ＴβＲＩＩ受容体側ではなく、ＡＬＫ５受容体結合領域の一部を形成する、溶媒に有意に曝露されるアミノ酸に相当するＴＧＦβポジションのみに突然変異を導入した。これらの残基は、パブリックドメインのバイオインフォマティクスプログラムを用いたところ、ＡＬＫ５との相互作用において重要であると予測された。次表は、相互作用において重要であると予測される、ＡＬＫ５との結合界面由来の残基と、結合に影響する可能な突然変異を示す。これらの結果により、あらゆる可能な理論上のムテインのデータベースを作成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最高のアンタゴニスト効力を有するムテインを選択した。
【表１】
2018111703.tif 000002
【００２３】
本発明のポリペプチドは、タンパク質の化学合成を含む様々な手順によって得ることができる。ポリペプチドは、遺伝子工学技法によって得ることもでき、この技法の技術分野において反映されるいずれかのトランスフェクションプロトコールを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌又はＣＨＯ及びＨＥＫ２９３等の哺乳類細胞においてポリペプチドを封入体として発現させること等が挙げられる。特異的ポジションにおける突然変異は、ポリメラーゼ連鎖反応によって導かれる定方向突然変異誘発技法によって得ることもできる。
【００２４】
その生物学的活性に従ったＴＧＦβ突然変異体ポリペプチドの選択；
本発明のポリペプチドは、次の特性を同時に保有するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験から選択される。
【００２５】
−  本発明においてムテインとも称されるＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、ＴβＲＩＩ受容体に結合するその能力を維持する。この結合能力は、ＴβＲＩＩ受容体鎖を検出するための市販のＥＬＩＳＡアッセイによって直接的に評価しても、受容体陽性細胞集団において間接的に評価してもよい。ＴβＲＩＩ受容体認識のレベルは、天然ＴＧＦβに匹敵するべきである。
【００２６】
−  このようなムテインは、ＴβＲＩＩ受容体へのＴＧＦβリガンド（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）の結合を遮断する。これは、ＴＧＦβリガンド（市販）のそれぞれでプレートを覆い、リガンドへのＴβＲＩＩ結合を阻害するムテインの能力を評価する、競合的ＥＬＩＳＡによって直接的に測定することができる。
【００２７】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、ＴβＲＩ受容体を介してシグナル伝達するその能力を失う（loose）又は実質的に低下させる。この特性は、ムテイン又は天然ＴＧＦβで処理した４Ｔ１マウス系統及びＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト系統の腫瘍細胞ライセートにおけるリン酸化Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のレベルを定量化する、ウエスタン免疫ブロッティングアッセイによって直接的に評価することができる。このようなムテインは、天然ＴＧＦβよりも少なくとも１００倍低いＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化を誘導するべきである。リン酸化（fosforilation）誘導特性は、ＣＴＬＬ−２細胞系におけるＩＬ−２によって誘導される増殖の阻害アッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することもできる。このような突然変異体は、天然ＴＧＦβよりも少なくとも１００倍低い阻害活性を有するべきである。
【００２８】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、各ＴＧＦβリガンド（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）によって誘導されるシグナル伝達を阻害することができる。この特性は、ムテイン又は天然ＴＧＦβで処理した４Ｔ１マウス系統及びＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト系統の腫瘍細胞ライセートにおけるリン酸化Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のレベルを定量化する、ウエスタン免疫ブロッティングアッセイによって直接的に評価することができる。５０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲において、ムテインは、市販のリガンドによって誘導されるシグナル伝達を少なくとも１００倍阻害する能力を提示するべきである。
【００２９】
−  このようなＴＧＦβ突然変異バリアントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を有する。これは、天然リガンドで処理した又はしない数種類の腫瘍細胞系の遊走を阻害することができる。斯かる系統の例として、４Ｔ１マウス系統及びＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト系統が挙げられる。細胞遊走アッセイにおいて、このようなムテインは、統計学的観点から、腫瘍細胞の遊走の有意な阻害が可能となるべきである。
【００３０】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、それぞれＩＬ−２又はＩＬ−６及びＩＬ−２３の存在下におけるナイーブＴ  ＣＤ４＋細胞からＴｒｅｇ  ｆｏｘｐ３＋又はＴＨ１７表現型への分化を誘導するその能力を失う（loose）又は実質的に低下させる。この特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞誘導アッセイにおいて直接的に評価することができる。このような突然変異体は、天然ＴＧＦβの場合よりも少なくとも１００倍低い誘導能力を有するべきである。
【００３１】
−  このようなＴＧＦβ突然変異バリアントは、その天然アナログによって誘導される、ナイーブＴ  ＣＤ４＋細胞からＴｒｅｇ  ｆｏｘｐ３＋又はＴＨ１７表現型への分化を阻害する能力を有する。この特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７細胞誘導アッセイにおいて直接的に評価することができる。５０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲において、このようなムテインは、市販のリガンドによって誘導されるシグナル伝達の少なくとも１００倍阻害する能力を提示するべきである。
【００３２】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有する。これは、移植可能腫瘍モデルにおいて数種類の腫瘍系統のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長及び転移性能力を阻害することができる。この特性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１乳房系統及びヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト腫瘍細胞系の原発性同所性腫瘍モデルを用いて評価することができる。このようなムテインは、ＰＢＳで処理した対照群と比較して、腫瘍サイズ及び肺転移数の統計学的に有意な低下を引き起こすべきである。
【００３３】
−  このような突然変異したＴＧＦβバリアントは、移植可能腫瘍モデルにおける天然の又はワクチン接種によって誘導された抗腫瘍免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させる能力を有する。
【００３４】
この特性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１乳房系統及び皮下ＣＴ２６結腸腫瘍系統の同所性原発性腫瘍モデルを用いて評価することができる。このようなムテインは、ナチュラルキラー細胞及びＴ  ＣＤ８＋リンパ球の細胞溶解活性及びサイトカイン分泌を増加させるべきである。これはまた、樹状細胞及びＴＨ１パターンＴ  ＣＤ４＋細胞の活性を増加させ、調節性Ｔ細胞及び骨髄系サプレッサー細胞の数並びにそれらの腫瘍促進活性（protumoral activity）を有意に低下させるべきである。
【００３５】
本発明は、その分泌に影響を与えることなく、ＬＡＰを欠く成熟ドメインを産生することができる、ＴＧＦβムテインの追加的な修飾を包含する。これは、ＴβＲＩＩと相互作用できるように、ムテインをその活性型で得ることができるという結果を伴い、産生プロセスの単純化をもたらす。
【００３６】
別の一実施形態において、本発明は、その半減期を増加させる、ＴＧＦβムテインの追加的な修飾に関する。このような修飾は、とりわけ、ペグ化や、アルブミン又はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域となり得る担体タンパク質と上述の免疫調節性ポリペプチドのいずれかとの融合を含む。
【００３７】
より特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に融合された、ＴＧＦβの突然変異バリアント（特異的な突然変異は、表２に言及されている）に関し、これは、上に言及されている特性を呈するよう選択されたムテインをもたらす。カップリングのために選択されたＦｃ領域は、Ｃγ２ドメインに突然変異のセット（ａｌａ２３４、ａｌａ２３５）を有し、これが、新生児Ｆｃ受容体を除くＦｃガンマ受容体と相互作用することを妨げ、これにより、免疫エフェクター機序を誘導するその能力をサイレンシングする（Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｕｇ、２０（４）：４７９〜８５、２００８．Ｅｐｕｂ  ２００８年７月９日）。
【００３８】
このようなムテインは、ＡＬＫ５を介してシグナル伝達するその能力を有意に低下させる複数のアミノ酸置換を有する。しかし、これは、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩに結合するその能力を維持し、天然ＴＧＦβの活性を阻害する。
【００３９】
【表２】
2018111703.tif 000003
【００４０】
別の一実施形態において、本発明は、また、その阻害因子特徴に影響を与えることなく又は更にはそれを改善しつつ、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩに対するその親和性を増加させるため、或いは半減期の増加によりそのｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学を改善するために為される、ＴＧＦβムテインの追加的な修飾を包含する。斯かる追加的な突然変異は、バイオインフォマティクスツール又は異なる性質のコンビナトリアル分子ライブラリーの使用（ファージディスプレイライブラリー、酵母又は細菌における遺伝子発現ライブラリー）による合理的設計によって得ることができる。
【００４１】
ＴＧＦβ突然変異体ポリペプチドの治療適用
本発明は、また、活性成分として本発明により開示されているＴＧＦβムテイン及びそのアナログ又は融合タンパク質を含む医薬組成物と共に、ＴＧＦβの機能が、天然の若しくはワクチン接種によって誘導される防御免疫応答を低下させる又は過剰な組織修復及び線維症を誘導する疾患における、様々な腫瘍の浸潤性及び転移性能力並びに様々な免疫系及び結合組織細胞の活性のモジュレーションのためのその可能な治療適用を含む。
【００４２】
その治療用途のため、本発明のポリペプチドは、独立的に、或いはその治療作用を促進又は増強する他のポリペプチド又は他の物質と組み合わせて、疾患を有する対象に投与することができる。投与経路は、薬物の非経口的投与のための技法の技術分野に記載されている投与経路のいずれかとなり得る。ポリペプチドは、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下又は腫瘍内投与することができる。
【００４３】
本発明に記載されているポリペプチド又は融合タンパク質は、がん、線維症を伴う疾患及び慢性感染性疾患の治療法において有用な医薬組成物の一部として投与することもできる。好ましくは、本発明は、薬学的に許容されるベヒクルを含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【００４４】
組成物は、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体として、食塩水、滅菌水、リン酸緩衝食塩水その他が挙げられるがこれらに限定されない。患者への投与に適した他の緩衝剤、分散剤（dispersed agent）及び不活性無毒性物質が、本発明の組成物に含まれていてもよい。組成物は、投与に適切な溶液となることができ、無菌であり、望まれない粒子を含まない。
【００４５】
別の一実施形態において、本発明は、また、がん、線維症を伴う疾患又は慢性感染性疾患の対象への、本発明に記載されている治療有効量のポリペプチド、融合タンパク質又は組成物の投与を含む処置方法に関する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００４６】
本発明により記載されているポリペプチド又は融合タンパク質は、その効果の賦活因子として、伝統的腫瘍学的治療法（化学療法及び放射線照射）と組み合わせて投与することもできる。
【００４７】
所望の治療効果を得るため、本発明のポリペプチドは、リンパ節又は末梢部位におけるその濃度が、対象とする疾患に適切であることを保証するのに十分なほど高い用量で、即ち、ムテインが、天然ＴＧＦβの阻害効果を示す濃度範囲で投与するべきである。従って、用量は、試験している疾患種類及び投与経路に対し調整する必要がある。例えば、腫瘍治療法の場合、用量は、阻害効果を提示するのに十分なほど高い腫瘍及び／又は局所領域的リンパ節内部における突然変異体濃度を達成するよう調整するべきである。調査すべき用量範囲は、毎週又は隔週（biweekly）１．２５〜２０ｍｇ／ｋｇ／用量の間で変動し得る。
【００４８】
投与回数も、問題になっているムテインの体内分布に対し調整するべきである。一般に、上述の有効濃度は、連続２〜３０日間に及ぶ期間持続するべきである。ムテインが、担体タンパク質にカップリングされている場合、投与頻度は、それに従って調整するべきである。
【００４９】
本発明の化合物又は組成物が、別の抗がん剤と組み合わせて用いられる場合、本発明は、例えば、同時発生の、時間差の又は交互の処置選択肢を提供する。よって、本発明の化合物（単数又は複数）は、別々の医薬組成物において同時に投与することができる、即ち、本発明の化合物は、他の抗がん剤の前又は後に、例えば、数秒間、数分間、数時間、数日間又は数週間の差で投与することができる。
【００５０】
治療作用は、疾患の症状の完全又は部分寛解として定義される。がんにおいて、治療作用は、とりわけ、腫瘍体積の減少又は再発までの時間（relapse time）の増加として定義される。
【００５１】
この新規治療戦略は、ＴＧＦβシグナル伝達をモジュレートするための他の提案を上回る多くの利点を有する。例えば、次の利点が挙げられる。
【００５２】
−  ＴＧＦβ突然変異体は、実質的に自己タンパク質であり（数個の突然変異を除き）、従って免疫原性が低い。この事実は、これに対する抗体応答のリスクを最小化する。
【００５３】
−  ＴＧＦβ受容体系によるその高い特異性は、予想外の毒性を低下させ、これは、小型の阻害因子に基づく戦略に共通する。
【００５４】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、少なくとも天然ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３と同様の、ＴβＲＩＩ受容体に対する結合親和性を維持する（６〜１０ｐＭ）。モノクローナル抗体又は他の薬物による受容体又はリガンド阻害戦略では、この親和性を打ち負かすことが困難である。
【００５５】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、モノクローナル抗体及びＦｃにカップリングした受容体よりも小型のサイズを有する。この特色は、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害する上述の他の薬物よりも優れた腫瘍への浸透を確実にする。
【００５６】
−  ＴＧＦβのこのような突然変異バリアントは、ＴβＲＩＩ／ＴβＲＩ（ＡＬＫ５）受容体系を介したいかなるリガンドのシグナル伝達も阻害する。パン（pan）リガンド抗体は、公知のＴＧＦβアイソフォームにしか向かわず、他のアイソフォームが存在する場合、この抗体はそれを阻害しない可能性があるため、これは、パンリガンド抗体を上回る理論上の利点である。
【００５７】
−  ＴＧＦβ突然変異バリアントは、ＴβＲＩＩＩ受容体と相互作用する能力を維持する。このようなムテインは、細胞表面への天然ＴＧＦβリガンドのあらゆる可能な結合部位を遮断するため、これは、ＴβＲＩＩ抗受容体抗体を上回る利点を構成する。
【００５８】
−  Ｆｃ断片への結合は、ムテインの半減期を増加させ、これにより用量及びその頻度が少なくなるであろうことから、ムテインに、小型の薬物に関する利点を付与する。
【００５９】
−  新生児Ｆｃ受容体を除くＦｃガンマ受容体と相互作用しないヒトＩｇＧ１のＦｃ断片への結合は、Ｆｃガンマ受容体と相互作用するその完全な能力を維持する抗受容体ＩＩ抗体と比較して、宿主の非腫瘍細胞における免疫エフェクター機序の誘発を回避し、予想外の毒性の可能性を低下させる。
【００６０】
次の実施例及び図面により、本発明を更に詳述する。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ムテインＧ＿Ｍ１及びＴＧＦβ１野生型Ｆｃ−融合タンパク質のウエスタンブロット解析を示す図である。これらのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元及び還元条件下で行い、抗ヒトＴＧＦβ１抗体による染色を行った。第１のレーンには、低分子量タンパク質標準がロードされ、第２のレーンには、ムテインＧＭ＿１＿Ｆｃがロードされ、第３のレーンにはＴＧＦβ１野生型＿Ｆｃ、第４のレーンには無関係な抗体ｈＲ３を用いた。
【図２】Ｇ＿Ｍ１＿ＦｃムテインによるＴβＲＩＩ受容体認識を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。陰性対照として、無関係な抗体ｈＲ３を用いた。Ｇ＿Ｍ１ムテインは、天然ＴＧＦβ１と同様の、ＴβＲＩＩ受容体への結合能力を保持する。
【図３】突然変異体又は天然ＴＧＦβによって誘導される、ＩＬ２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害を評価するためのアッセイを示す図である。ＣＴＬＬ−２細胞系増殖を阻害するムテインＧ＿Ｍ１の能力が、ヒト天然ＴＧＦβ１よりもはるかに低いことが示されている。データは、３回の独立的実験から得られる阻害の平均パーセンテージとして表されている。
【図４】天然ＴＧＦ  β１に起因するＩＬ２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害を中和するＧ＿Ｍ１ムテインの能力を評価するためのアッセイを示す図である。本図は、３回の独立的実験においてスコア化された細胞増殖の平均パーセンテージを示す。
【図５】Ｇ＿Ｍ１ムテインが、マウス４Ｔ１腫瘍細胞系の遊走をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することを示す図である。本図に示す通りの様々な時間間隔で創傷閉鎖の写真を撮った。本図は、創傷閉鎖の速度が、各時点において、細胞がムテインで処理された場合に有意により低いことを示す。
【図６】Ｇ＿Ｍ１ムテインが、天然ＴＧＦβによって誘導されるナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−ＧＩＴＲ−Ｔ細胞からＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞への分化／変換を阻害することを示す図である。ナイーブＴ細胞が、５００ｎｇ／ｍｌのムテインと共にインキュベートされた場合、Ｔ細胞培養物において回収される調節性Ｔ細胞のパーセンテージは、殆どゼロまで低下する。この濃度は、第一に変換を誘導するために用いた組換えヒトＴＧＦβ１の濃度よりも僅か３０倍高い濃度である。
【実施例】
【００６２】
（例１）
ＴＧＦβムテインの設計
バイオインフォマティクス技法を用いて、ＴＧＦβ突然変異体を計算により設計した。出発点として、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３とＴＧＦβ受容体の三元複合体の報告されている構造を用いた。公開されたバイオインフォマティクスプログラムを用いて、天然アイソフォーム及びあらゆる可能な突然変異バリアントの結合エネルギーを決定した。Ｃ末端ヒンジ領域並びにヒトＩｇＧ１のドメインＣγ２及びＣγ３並びにヒスチジンテイルを含むレンチウイルスベクターＰＬＷに基づく遺伝的構築物を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞においてＧ＿Ｍ１ムテインを発現させた。プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーによって、Ｇ＿Ｍ１を精製した。高純度（＞９５％）でこれを得た（図１）。
【００６３】
（例２）
ＥＬＩＳＡによるＴβＲＩＩへのムテインＧ＿Ｍ１の結合の評価
ＴβＲＩＩ（１ｕｇ／ｍｌ）でコーティングし、アルカリホスファターゼにカップリングした抗ヒトＦｃ抗体を用いて示すことにより、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。陰性対照として、無関係な抗体ｈＲ３を用いた。図２は、ムテインＧ＿Ｍ１が、天然ＴＧＦβ１と同様の、ＴβＲＩＩ受容体への結合能力を保持することを示す。
【００６４】
（例３）
ムテインＧ＿Ｍ１は、受容体ＴβＲＩ（ＡＬＫ５）を介してシグナル伝達する能力、従って、天然ＴＧＦβ生物学的活性を模倣する能力が低下している
本出願人らは、突然変異体又は天然ＴＧＦβによって誘導される、ＩＬ２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害を比較した。５０００個のＣＴＬＬ−２細胞／ウェルをｒＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で刺激し、表示濃度のＴＧＦβ１野生型又はムテインＧ＿Ｍ１の存在下で４８時間培養した。その後に、アラマーブルー試薬を培養物に添加し、５４０及び６３０ｎｍにおいてその還元を測定した。
【００６５】
Ｇ＿Ｍ１ムテインは、実験の陽性対照として用いた市販のＴＧＦβ１よりも２００倍多い濃度においてＣＴＬＬ−２系統の増殖を阻害することができなかった（図３）。ＣＴＬＬ−２細胞系増殖を阻害するムテインＧ＿Ｍ１の能力が、市販のＴＧＦβ１よりもはるかに低いことが示される。
【００６６】
（例４）
ムテインＧ＿Ｍ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβシグナル伝達アンタゴニストである
５０００個のＣＴＬＬ−２細胞／ウェルをｒＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）で刺激し、２ｐＭのＴＧＦβ１野生型及び表示濃度のＧ＿Ｍ１又はアイソタイプ対照ｈＲ３  ＭＡｂ；又は陽性対照としての抗ＴＧＦβ１抗体の存在下で培養した。４８時間後、アラマーブルー試薬を培養物に添加し、５４０及び６３０ｎｍにおいてその還元を測定した。
【００６７】
アイソタイプ対照ＭＡｂ  ｈＲ３ではなく、Ｇ＿Ｍ１ムテインは、天然ＴＧＦβ１に起因するＩＬ２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害を中和する（図４）。ムテインに起因する中和効果は、実験の陽性対照として用いた抗ＴＧＦβ１抗体により得られる中和効果と同様である。
【００６８】
（例５）
ムテインＧ＿Ｍ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗腫瘍効果を有する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイにおいて、マウス腫瘍細胞系４Ｔ１の遊走を阻害するムテインＧ＿Ｍ１の能力を評価した（ＣＣ  Ｌｉａｎｇら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．Ｔｗｏ（２）：３２９〜３３、２００７）。滅菌ピペットチップで細胞単層を掻き取ることにより、コンフルエントな細胞を傷つけた。Ｇ＿Ｍ１ムテイン又はＴＧＦβ１野生型（陰性対照として）をウェルに添加した。図５は、細胞をムテインで処理した場合、創傷閉鎖速度が有意により低い（ｐ＜０．０５、各時点におけるＤｕｎｎの事後検定を伴うクラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定）ことを示す。
【００６９】
（例６）
ムテインＧ＿Ｍ１は、天然ＴＧＦ  β１及びＩＬ２によって誘導されるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から調節性Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞への分化を阻害する
４匹のＣ５７／ＢＬ６マウスの脾臓から得られたＣＤ４＋ＣＤ２５−ＧＩＴＲ−ナイーブ集団を細胞選別により精製した。これらの細胞のうち５×１０４個を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２及び５ｎｇ／ｍｌの天然ヒトＴＧＦβ１の存在下で、３μｇ／ｍＬのプレート結合した抗ＣＤ３及び３μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８で刺激した。この培養条件において、３日後に回収された調節性Ｔ細胞のパーセンテージは、５５．６％であった。２５０及び５００ｎｇ／ｍＬの濃度において、この培養物におけるムテインの効果を評価した。ムテインの存在又は非存在下で回収されたＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。図６は、Ｔ細胞培養物における回収された調節性Ｔ細胞のパーセンテージが、Ｇ＿Ｍ１ムテインの存在下で殆どゼロまで低下する様子を示す。
【図１】
2018111703.tif 000004
【図２】
2018111703.tif 000005
【図３】
2018111703.tif 000006
【図４】
2018111703.tif 000007
【図５】
2018111703.tif 000008
【図６】
2018111703.tif 000009
【配列表】
2018111703000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月22日(2018.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＬＫ５受容体によって媒介されるＴＧＦβリガンド活性をアンタゴナイズする変異ＴＧＦβ３ポリペプチドであって、ヒトＴＧＦβ３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有し、変異Ｗ３０Ｅ、Ｌ１０１Ｅ及びＩ５１Ｑを含む、上記ポリペプチド。
【請求項２】
Ｃγ２ドメインに突然変異ａｌａ２３４及びａｌａ２３５を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ断片に融合された、請求項１に記載のポリペプチドを含む、カップリングポリペプチド。
【請求項３】
５０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの間の範囲内の、請求項１又は２に記載の少なくとも１種のポリペプチドと、
薬学的に適したベヒクルと
を含む、がん、線維症を伴う疾患又は慢性感染性疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の少なくとも１種のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
がん、線維症を伴う疾患又は慢性感染性疾患の処置に使用するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答を増強するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ワクチンが、がん治療用ワクチンである、請求項６に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2018111703000001.pdf