(57)【要約】【課題】抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法または診断薬を提供することである。【解決手段】（１）滲出型加齢黄斑変性の患者から採取された血液、血漿または血清中の、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカータンパク質の濃度を測定すること、および、（２）（１）で測定された濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けること、を含む、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法、および、そのための診断薬を提供する。【選択図】図１
2018091846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法であって、
（１）滲出性加齢黄斑変性の患者から採取された血液、血漿または血清中の、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカータンパク質の濃度を測定すること、および、
（２）（１）で測定された濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けること、
を含む方法。
【請求項２】
工程（２）における、測定された濃度と抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けることが、測定された濃度と当該マーカータンパク質の濃度のカットオフ値との比較により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定されたＴＧＦ−βの濃度がカットオフ値よりも高い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
測定されたＢＭＰ９の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
測定されたＴＧＦ−βの濃度がカットオフ値よりも高く、かつ、測定されたＢＭＰ９の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
測定されたアンジオポエチン−１の濃度がカットオフ値よりも高い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
測定されたアンジオポエチン−２の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
測定されたアンジオポエチン−１の濃度がカットオフ値よりも高く、かつ、測定されたアンジオポエチン−２の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
患者が抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置を受けたことがない、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
患者が抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置を受けているか、または、過去に受けたことがある、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体を含む、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、米国仮出願第６２／４２８８２３号に優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法、または、当該方法に使用し得る診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ：Age-related Macular Degeneration）は、高齢者の社会的失明の主原因の一つである。加齢黄斑変性は、地図状萎縮（網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管の萎縮）を伴う萎縮型加齢黄斑変性と、網膜下または網膜色素上皮下の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ：Choroidal Neovascularization）を特徴とする滲出型加齢黄斑変性に分類される。滲出型加齢黄斑変性の主要な病態であるＣＮＶ形成には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Vascular Endothelial Growth Factor）が重要な役割を果たすことが明らかになっており、現在、複数の抗ＶＥＧＦ薬が滲出型加齢黄斑変性治療薬として承認されている。
【０００３】
抗ＶＥＧＦ薬は高い臨床評価を得ているが、高価であり、硝子体注射により投与されるため、患者の精神的および身体的な負担が大きい。一方で、抗ＶＥＧＦ薬に対して治療抵抗性を示す患者が存在する。例えば、非特許文献１には、抗ＶＥＧＦ薬治療により、滲出型加齢黄斑変性患者の４０％において視力が改善し、３５％において視力が維持されたが、２５％では視力が悪化したことが記載されている。現在のところ、患者がそのような治療抵抗性を示すか否かを判定する方法は存在しない。
【０００４】
抗ＶＥＧＦ薬は、がんの治療薬としても使用されており、抗ＶＥＧＦ薬抵抗性のがんの治療において、他の血管新生を制御する分子に対する阻害剤を使用できる可能性が示唆されている（非特許文献２および３）。しかしながら、抗ＶＥＧＦ薬抵抗性の獲得における血管新生を制御する分子の役割は解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2014;252(4):647-55.
【非特許文献２】Curr Oncol Rep. 2014;16(2):365.
【非特許文献３】J Clin Oncol 2010;28(15):suppl; abstract 4630.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願は、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法、または、当該方法に使用し得る診断薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねていたところ、滲出型加齢黄斑変性の患者の血清中のＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の濃度が、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性と相関することを見いだした。
【０００８】
従って、ある態様では、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法であって、
（１）滲出型加齢黄斑変性の患者から採取された血液、血漿または血清中の、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカータンパク質の濃度を測定すること、および、
（２）（１）で測定された濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けること、
を含む方法が提供される。
【０００９】
ある態様では、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体を含む、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための診断薬が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本願の開示に従い、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測できる。このような予測は、滲出型加齢黄斑変性の患者を抗ＶＥＧＦ薬により処置するか否か、あるいは、抗ＶＥＧＦ薬により処置されている患者において処置を継続するか否かの判定に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、対照（control）群、無処置群(naive）、治療応答群（well response）および治療抵抗群（refractory）の患者の血清におけるＴＧＦ−βの濃度を示す（**ｐ＜０．０１）。
【図２】図２は、対照群、無処置群、治療応答群および治療抵抗群の患者の血清におけるＢＭＰ９の濃度を示す（**ｐ＜０．０１）。
【図３】図３は、対照群、無処置群、治療応答群および治療抵抗群の患者の血清におけるアンジオポエチン−１の濃度を示す（*ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、対照群、無処置群、治療応答群および治療抵抗群の患者の血清におけるアンジオポエチン−２の濃度を示す（*ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１３】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１４】
本開示に関して、「抗ＶＥＧＦ薬」は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の機能を阻害する薬剤を意味し、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、ＶＥＧＦの発現を阻害する核酸を含む。抗ＶＥＧＦ薬の例には、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ペガプタニブ等が含まれる。
【００１５】
本開示に関して、「抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性」とは、当該処置による滲出型加齢黄斑変性の寛解の程度を意味する。滲出型加齢黄斑変性の寛解の程度は、ＣＮＶからの出血や血液成分の漏出、さらにはこれによる網膜下液または網膜内液の貯留(網膜浮腫、網膜色素上皮剥離)、変視、視力低下、中心暗点、色覚異常、視野欠損などの滲出型加齢黄斑変性の症状を評価することにより判定できる。ある実施態様では、有効性は、網膜下液または網膜内液、または、視力低下を評価することにより判定される。
【００１６】
本開示に関して、「抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置が有効である」とは、滲出型加齢黄斑変性が寛解することを意味し、例えば、抗ＶＥＧＦ薬による処置の開始から１２ヶ月以内、好ましくは６ヵ月以内、より好ましくは３ヵ月以内に、滲出型加齢黄斑変性が寛解することを意味する。
【００１７】
本開示に関して、「寛解する」または「寛解」は、部分的または完全に、滲出型加齢黄斑変性の原因が軽減または除去されること、滲出型加齢黄斑変性の進行が遅延または停止すること、および／または、滲出型加齢黄斑変性の症状が軽減、緩和、改善または除去されることを意味する。
【００１８】
本開示に関して、「患者」は、滲出型加齢黄斑変性に罹患しているいかなる動物であってもよい。動物は、ヒトであっても、ヒト以外の動物であってもよい。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ウマ等が例示され、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が例示される。ある実施態様では、患者はヒトである。
【００１９】
本開示に関して、「マーカータンパク質」とは、患者から採取された血液、血漿または血清中に検出されるタンパク質であって、その濃度により、当該患者における抗ＶＥＧＦ薬の効果を判定することのできる指標となるタンパク質を意味する。本開示に関して使用されるマーカータンパク質は、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１および／またはアンジオポエチン−２である。
【００２０】
ＴＧＦ−βは、血管新生を抑制するサイトカインとして知られている（Int J Cancer. 2004;108(2):251-7.）。ヒトのＴＧＦ−βの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１１３７として登録されている（配列番号１）。ＢＭＰ９は、血管新生を促進するサイトカインとして知られている（PLoS One. 2012;7(1):e30075.; J Cell Sci. 2010;123(Pt 10):1684-92.）。ヒトのＢＭＰ９の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＵＫ０５として登録されている（配列番号２）。ＴＧＦ−βとＢＭＰ９は拮抗作用を示すことが知られている。
【００２１】
アンジオポエチン−１は、血管新生を抑制する成長因子として知られている（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(4):2191-9.）。ヒトのアンジオポエチン−１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１５３８９として登録されている（配列番号３）。アンジオポエチン−２は、血管新生を促進する成長因子として知られている（J Clin Invest. 2012;122(6):1991-2005.）。ヒトのアンジオポエチン−２の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ１５１２３として登録されている（配列番号４）。アンジオポエチン−１とアンジオポエチン−２は拮抗作用を示すことが知られている。
【００２２】
本開示に関して、上記４種のマーカータンパク質は、当該タンパク質の機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列（例えば、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列）において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでいてもよい。なお、「数個」とは、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個、最も好ましくは２〜３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。
【００２３】
また、上記４種のマーカータンパク質は、当該タンパク質の機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列（配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列）と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２４】
上記の方法では、滲出性加齢黄斑変性の患者から採取された血液、血漿または血清を使用する。血液は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から、採取され得る。血漿または血清は、当業者に周知の方法により血液を適宜処理することにより調製し得る。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあり得る。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。また、採取された血液、血漿または血清を、使用に先立ち、その調製中または調製後に低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。また、採取された血液、血漿または血清を、必要に応じて適宜希釈して使用し得る。
【００２５】
各マーカータンパク質濃度の測定は、各マーカータンパク質に特異的に結合する抗体を用いる免疫学的手法により実施できる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色などを例示できる。
【００２６】
本開示に関して、抗体は、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドを意味し、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。抗体は、各マーカータンパク質または当該タンパク質の抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生し得る。あるいは、市販の抗体を使用してもよい。
【００２７】
抗体は、各マーカータンパク質と選択的に相互作用できるものであれば、その断片および誘導体であってもよい。抗体の断片および誘導体には、例えば、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂ断片；２個の可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖ断片；可動性ペプチドリンカーにより連結された２個のＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；ラクダ科の重鎖二量体および単一可変領域、および、テンジクザメの新規抗原受容体などの単一ドメイン骨格および、可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）が含まれる。
【００２８】
抗体は、標識されていてもよい。標識は、当業者が適宜選択し得る。標識の非限定的な例には、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団の染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）、粒子（例えば、金などの金属粒子）、蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット）が含まれる。各種標識を、当業者に周知の様々な化学反応、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用して、所望の抗体に結合させることができる。アミンおよびチオール以外の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンも使用できる。あるいは、抗体は、標識されていなくてもよい。この場合は、各マーカータンパク質の抗体を認識する、標識された二次抗体をさらに使用し得る。
【００２９】
抗体は、適切な支持体に結合させて抗体アレイとして提供されてもよい。支持体としては、抗体を固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などの支持体を例示できる。
【００３０】
各マーカータンパク質の濃度を測定した後に、測定した各マーカータンパク質の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付ける。例えば、測定した各マーカータンパク質の濃度を、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効であった滲出性加齢黄斑変性患者の血液、血漿または血清における当該各マーカータンパク質の濃度、および／または、抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効であった滲出性加齢黄斑変性患者の血液、血漿または血清における当該各マーカータンパク質の濃度と比較する。あるいは、測定した各マーカータンパク質の濃度を、あらかじめ求めておいた評価基準と比較してもよい。かかる評価基準として、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効であった滲出性加齢黄斑変性患者の血液、血漿または血清における当該各マーカータンパク質の濃度の平均値を例示できる。また、別の評価基準として、抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効であった滲出性加齢黄斑変性患者の血液、血漿または血清における当該各マーカータンパク質の濃度の平均値を例示できる。あるいは、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効／無効であった多数の滲出性加齢黄斑変性患者の血液、血漿または血清における当該各マーカータンパク質の濃度の分布図などと比較することにより、測定した各マーカータンパク質の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けることができる。マーカータンパク質濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００３１】
後述する実施例に示すように、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効な滲出性加齢黄斑変性患者においては、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１の濃度が、当該処置が無効な滲出性加齢黄斑変性患者と比較して高かった。従って、血液、血漿または血清におけるＴＧＦ−βまたはアンジオポエチン−１の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による処置の有効性との間の正の相関に基づき、抗ＶＥＧＦ薬による処置の有効性を予測できる。例えば、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の濃度が相対的に高いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。
【００３２】
後述する実施例に示すように、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効な滲出性加齢黄斑変性患者においては、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２の濃度が、当該処置が無効な滲出性加齢黄斑変性患者と比較して低かった。従って、血液、血漿または血清におけるＢＭＰ９またはアンジオポエチン−２の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による処置の有効性との間の負の相関に基づき、抗ＶＥＧＦ薬による処置の有効性を予測できる。例えば、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の濃度が相対的に低いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。
【００３３】
さらに、これらのタンパク質のうちの複数、例えば２種、３種または４種の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けることにより、より高い精度で、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性を予測できる。例えば、ＴＧＦ−βの濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９の濃度が相対的に低いと評価された場合、ＴＧＦ−βの濃度が相対的に高いと評価され、かつ、アンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合、アンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、アンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合、アンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９の濃度が相対的に低いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。別の例では、ＴＧＦ−βの濃度が相対的に高いと評価され、かつ、アンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価された場合、または、ＢＭＰ９の濃度が相対的に低いと評価され、かつ、アンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。また別の例では、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９の濃度が相対的に低いと評価された場合、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、アンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合、ＴＧＦ−βの濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合、または、アンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。さらなる例では、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１の濃度が相対的に高いと評価され、かつ、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２の濃度が相対的に低いと評価された場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。
【００３４】
また、血液、血漿または血清中の各マーカータンパク質の濃度のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定した各マーカータンパク質の濃度と、このカットオフ値とを比較してもよい。例えば、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の濃度が前記カットオフ値以上である場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。あるいは、例えば、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカータンパク質の濃度が前記カットオフ値以下である場合には、当該滲出性加齢黄斑変性患者は抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である可能性が高いと判定できる。
【００３５】
「カットオフ値」とは、閾値ともいい、その値を基準として処置の有効性の判定をし得る値をいう。好ましくは、カットオフ値は、高い診断感度および高い診断特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効である滲出性加齢黄斑変性患者で高い陽性率を示し、かつ、抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効である滲出性加齢黄斑変性患者で高い陰性率を示す、血液、血漿または血清中の各マーカータンパク質の濃度をカットオフ値として設定し得る。１つのマーカーについて、複数のカットオフ値を設定することもできる。
【００３６】
カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、自体公知の方法により実施できる。一般的には、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群から採取された血液、血漿または血清中のマーカータンパク質の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群から採取した血液、血漿または血清中のマーカータンパク質の濃度を、統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。カットオフ値の設定には、例えばSAS Ver. 9.4等の統計解析用ソフトウェアを使用し得る。
【００３７】
例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver opera ting characteristic analysis）により、カットオフ値の設定を行うことができる。ＲＯＣ解析では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Sensitivity）を縦軸に、ＦＰＦ（False Positive Fraction、偽陽性率：１−特異度（Specificity））を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線では、全く診断能のない検査は、対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、対角線が左上方に弧を描くような曲線となり、診断能１００％の検査は、左辺−上辺上を通る曲線となる。カットオフ値の設定としては、例えば、感度と特異度の優れた独立変数のＲＯＣ曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法がある。また、ＲＯＣ曲線における曲線下面積（area under the curve、ＡＵＣと略称される）が０．５００となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法、つまり、（感度＋特異度−１）を計算して、その最大値となるポイントであるヨーデン指標（Youden index）をカットオフ値に設定することもできる。
【００３８】
具体的には、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群（反応例）、および抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群（無反応例）、から採取した血液、血漿または血清中の各マーカータンパク質の濃度を測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。また、例えば、検出された値における診断効率、即ち処置が有効であった患者を「有効」と正しく診断した症例と、処置が無効であった患者を「無効」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合、を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とし得る。
【００３９】
測定するマーカータンパク質の種類が複数である場合、複数のマーカータンパク質に関する総合的なカットオフ値を設定してもよい。例えば、複数のマーカータンパク質の濃度を用いてロジスティック回帰分析等を行うことにより、カットオフ値を設定し得る。
【００４０】
マーカータンパク質のカットオフ値は、適宜変更することができる。即ち、マーカータンパク質の組み合わせ、マーカータンパク質の定量方法および比較方法、臨床上の使用目的、所望の感度および特異度などの条件に応じて、カットオフ値を設定することができる。
【００４１】
別の態様では、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体を含む、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための診断薬が提供される。当該診断薬は、上記の方法に使用される。
【００４２】
測定対象の各マーカータンパク質に結合する抗体は、適切な支持体の上に結合して、抗体アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などを挙げることができる。
【００４３】
上記の診断薬に含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。
【００４４】
上記の診断薬は、マーカータンパク質の測定方法の実施に必要な他の成分や試薬をさらに含む診断用試薬キットとして提供され得る。例えば、上記の診断薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ＥＬＩＳＡプレート、ブロッティング膜などをさらに含む診断用試薬キットとして提供され得る。
【００４５】
ある態様では、患者における抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法であって、
（１）患者から血液、血漿または血清を採取すること、
（２）当該血液、血漿または血清中の、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカータンパク質の濃度を測定すること、および、
（３）測定された濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けること、
を含む方法が提供される。
【００４６】
ある態様では、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体の使用が提供される。
【００４７】
ある態様では、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための診断薬を製造するための、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体の使用が提供される。
【００４８】
また別の態様では、本願で開示される予測方法により抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定された患者に、有効量の抗ＶＥＧＦ薬を投与することを含む、滲出型加齢黄斑変性の処置方法が提供される。ここで、「処置」は、滲出型加齢黄斑変性の患者において、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、滲出型加齢黄斑変性の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。また、抗ＶＥＧＦ薬の有効量は、所望の薬効を奏するのに十分な量であれば特に制限されないが、例えば、１眼あたり０．０００１〜２０ｍｇが好ましく、１眼あたり０．００１〜１０ｍｇがより好ましく、１眼あたり０．０１〜５ｍｇがさらに好ましく、１眼あたり０．１〜２．５ｍｇが特に好ましい。
【００４９】
使用し得る抗ＶＥＧＦ薬の例には、ラニビズマブ、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ペガプタニブ等が含まれる。抗ＶＥＧＦ薬の適切な投与方法および投与量は、当業者に周知であり、例えば、各薬剤の添付文書等の記載に従って投与し得る。
【００５０】
ある態様では、本願で開示される予測方法により抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定された患者に投与するための、抗ＶＥＧＦ薬を含む滲出性加齢黄斑変性の処置剤が提供される。
ある態様では、本願で開示される予測方法により抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定された患者に投与するための滲出性加齢黄斑変性の処置剤を製造するための、抗ＶＥＧＦ薬の使用が提供される。
【００５１】
例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための方法であって、
（１）滲出性加齢黄斑変性の患者から採取された血液、血漿または血清中の、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカータンパク質の濃度を測定すること、および、
（２）（１）で測定された濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けること、
を含む方法。
［２］（１）において、マーカータンパク質に特異的な抗体を用いてマーカータンパク質の濃度を測定する、第１項に記載の方法。
［３］第１項に記載の工程（２）における、測定された濃度と抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性とを相関付けることが、測定された濃度と当該マーカータンパク質の濃度のカットオフ値との比較により行われる、第１項または第２項に記載の方法。
［４］測定されたＴＧＦ−βの濃度がカットオフ値よりも高い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［５］測定されたＢＭＰ９の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［６］測定されたＴＧＦ−βの濃度がカットオフ値よりも高く、かつ、測定されたＢＭＰ９の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［７］測定されたアンジオポエチン−１の濃度がカットオフ値よりも高い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［８］測定されたアンジオポエチン−２の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［９］測定されたアンジオポエチン−１の濃度がカットオフ値よりも高く、かつ、測定されたアンジオポエチン−２の濃度がカットオフ値よりも低い場合に、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置が有効であると判定する、第３項に記載の方法。
［１０］カットオフ値が、抗ＶＥＧＦ薬による処置が有効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群から採取された血液、血漿または血清中のマーカータンパク質の濃度と、抗ＶＥＧＦ薬による処置が無効であった滲出性加齢黄斑変性患者の群から採取された血液、血漿または血清中のマーカータンパク質の濃度を、統計解析的に処理することにより設定されたものである、第３項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］患者が抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置を受けたことがない、第１項ないし第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］患者が抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置を受けているか、または、過去に受けたことがある、第１項ないし第１０項のいずれかに記載の方法。
［１３］第１項ないし第１２項のいずれかに記載の方法により抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置が有効であると判定された患者に、有効量の抗ＶＥＧＦ薬を投与することを含む、第１項ないし第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＢＭＰ９抗体、抗アンジオポエチン−１抗体および抗アンジオポエチン−２抗体からなる群から選択される少なくとも１種の抗体を含む、抗ＶＥＧＦ薬による滲出性加齢黄斑変性の処置の有効性を予測するための診断薬。
【００５２】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【実施例１】
【００５３】
以下の４群を対象として、血清におけるバイオマーカー候補物質の濃度と滲出型加齢黄斑変性の病態との関連性を検討した。
グループＡ：対照（control）群（１０例）
グループＢ：無処置群（naive）（１３例）
グループＣ：治療応答群（well response）（２０例）
グループＤ：治療抵抗群（refractory）（１４例）
【００５４】
各群の選択および除外基準は下表の通りである。
【表１】
2018091846.tif 000003
【００５５】
【表２】
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【００５６】
免疫アッセイのプロトコール
バイオマーカー候補物質として、血管新生への関与が示唆されている１６種類のタンパク質を選択した。各対象から採取した血液１０ｍＬから、血清を調製した。血清試料中のバイオマーカー候補物質の濃度を、Aushon multiplex immunoassay platform（Aushon BioSystems, Billerica, MA）を使用して測定した。アレイプレートに１６種類のバイオマーカー候補物質に特異的な捕捉抗体をスポットし、抗体アレイを作成した。抗体アレイ上で試料を２時間インキュベートし、プレートを４回洗浄した。ビオチン化検出抗体の混合物を各ウェルに添加し、３０分間〜９０分間インキュベートし、プレートを４回洗浄した。次いで、プレートをストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３０分間インキュベートした。すべてのインキュベーションは、２００ｒｐｍで振盪しながら室温で行った。プレートを再度洗浄し、化学発光物質を添加した。Aushon Cirascan CCD Imaging Systemを使用してプレートの画像をすぐに取得し、Aushon Cirasoft Softwareを使用してデータを分析した。
【００５７】
結果を下表および図１〜４に示す。試験した１６種類のバイオマーカー候補物質のうち、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２の濃度について、治療応答群と治療抵抗群との間に有意差が見られた。具体的には、治療応答群において、ＴＧＦ−βおよびアンジオポエチン−１の濃度が高く、ＢＭＰ９およびアンジオポエチン−２の濃度が低かった。
【００５８】
【表３】
2018091846.tif 000005
【００５９】
【表４】
2018091846.tif 000006
【００６０】
【表５】
2018091846.tif 000007
【００６１】
【表６】
2018091846.tif 000008
【００６２】
グループＣおよびＤの結果から、ソフトウェアSAS Ver. 9.4を使用して、カットオフ値を求めた。「診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値」、すなわち、感度１、特異度１からの距離を最小とする［√（（１−感度）２＋（１−特異度）２）］を基準として、各測定項目のカットオフ値を求めた。上記の症例数で算出されたＴＧＦ−β、ＢＭＰ９、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２のカットオフ値は、それぞれ１１２１６１．４ｐｇ／ｍＬ、１２．４ｐｇ／ｍＬ、９２９４．０ｐｇ／ｍＬおよび４０１．０ｐｇ／ｍＬであった。いずれのカットオフ値についても、症例数が増えれば、より信頼性の高い値が得られることが期待される。
【００６３】
これらのカットオフ値を適用した場合の結果は下表の通りである。
【表７】
2018091846.tif 000009
【００６４】
さらに、４項目を同時に考慮した多変量のロジスティック回帰分析により推定されたモデルは、
logit＝−３．３９８７＋（０．００００６３×ＴＧＦ−β濃度）−（０．０５９３×ＢＭＰ９濃度）＋（０．０００１７７×アンジオポエチン−１濃度）−（０．０１２３×アンジオポエチン−２濃度）
であった。そして、感度１、特異度１からの距離を最小とする基準によるｌｏｇｉｔ値のカットオフ値は、０．８６０７３であった（logitはｌｏｇ（（Ｒ）／（１−Ｒ））で、Ｒは治療応答群＝１、治療抵抗群＝０）。症例数が増えれば、より信頼性の高いカットオフ値が得られることが期待される。これらのカットオフ値を適用した場合、感度は８５．０％、特異度は９２．９％であった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本開示に従って、抗ＶＥＧＦ薬による滲出型加齢黄斑変性の処置の有効性を予測できる。その結果、例えば、当該処置の有効性が見込める患者に対しては、当該処置を適用または継続し、有効性が見込めない患者に対しては治療方針を変更するなど、治療方針の選択が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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