(57)【要約】【課題】ノロウイルスに由来する免疫原性組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、第１のノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメインと第２のノロウイルス株のＶＰ１のＰ−ドメインの少なくとも一部を含有するＰ−ドメインとを含有するキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質に関する。本発明は、キメラＶＰ１タンパク質をコードする核酸、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を含有するウイルス様粒子、および免疫原性組成物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年７月６日に出願された米国仮出願第６１／３６１，５８１号（この完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルス（以前はＮｏｒｗａｌｋ様ウイルス、ＮＶＬ、またはＮｏｒｗａｌｋウイルスとして公知であった）は、成人および小児における急性ウイルス性胃腸炎の主要な病原因子（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）である。ノロウイルスは感染性が高く、牡蠣および水などの汚染された食物の摂取により広がる。ノロウイルスはまた、半閉鎖社会的集団、例えば、病院、学校、養護施設、および巡航客船における糞口経路を通じた人から人への伝播によっても急速に広がる。これらの特性により、ノロウイルスが主要な公共の健康上の懸念になっている。例えば、米国だけで、ウイルス性胃腸炎の大発生の９５％超、および推定で１年当たり２，３００万件の胃腸炎の症例がノロウイルスにより引き起こされている（非特許文献１；ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ．  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐ．（２０００年）４９巻：２０７〜２１１頁）。
【０００３】
ノロウイルス感染症の症状としては、下痢および嘔吐ならびに発熱、頭痛、悪寒および胃痛が挙げられる。そのような症状の原因は、ノロウイルスが腸上皮細胞の炭水化物受容体に結合し、それによってイオンの移動が不均衡になることに関連し得る（非特許文献２；非特許文献３）。接触感染性のノロウイルスは、わずか１０ビリオンの感染により疾患を引き起こし得る。他の点では健康であるがノロウイルスに感染した人は２〜４日以内に回復し得るが、彼らは症状が発症した後２週間に至るまで依然としてウイルスを放つ可能性がある。感染した人のおよそ３０〜４０％は無症状のままであるが、感染に対する感受性がより高い可能性がある他者にウイルスが放たれることにより感染が広がる（非特許文献４）。
【０００４】
ノロウイルスは、一本鎖のポジティブセンスＲＮＡを含有する、直径２７〜４０ｎｍの小さなエンベロープを有さない二十面体のウイルスであるＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。系統学的な研究により、ノロウイルス属は、配列類似性に基づいてＧＩ〜ＧＶの５つの遺伝子群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）にカテゴリー分類される少なくとも４０種の多様なウイルス株で構成されることが示されている。これらの５つの遺伝子群の中で、ＧＩおよびＧＩＩがヒトの感染に関して最も重要な遺伝子群である。各遺伝子群は、遺伝子型にさらに分けられる。現在、ＧＩは、８種の別個の遺伝子型を含み、ＧＩＩは少なくとも１７種の異なる遺伝子型を有する。ゲノムレベルでは、１つの遺伝子群内の株は、５１〜５６％のヌクレオチド配列同一性を有し、１つの遺伝子型内の株は、６９〜７０％のヌクレオチド配列類似性を有する（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０年２月２日［ｅ−ｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。
【０００５】
ノロウイルスＲＮＡは、ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ノロウイルスの主要な構造タンパク質はウイルスタンパク質１（ＶＰ１）である。ＶＰ１は、ノロウイルスＲＮＡのＯＲＦ２により独占的にコードされ、ノロウイルスのカプシド構造を形成する。ノロウイルスのカプシドは、１８０コピーのＶＰ１単量体で構成される。ＶＰ１を組換えによって発現させると、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の、ウイルスのゲノムを欠く二十面体のカプシド構造に自己集合し得る。
【０００６】
Ｘ線結晶構造解析研究により、カプシドタンパク質であるＶＰ１はそれぞれ、２つの別個のドメイン、殻（Ｓ）ドメインおよび突出（Ｐ）ドメインで構成されることが明らかになった。これらの２つのドメインは、短い可撓性のリンカーまたはヒンジによって一緒に繋がれている。ＶＰ１単量体のＳ−ドメインは、全体としてノロウイルスＶＬＰのコアを形成し、Ｐ−ドメインは、ＶＬＰの表面上に放射状に広がっており、ノロウイルスの公知の抗原エピトープの大部分を含む。Ｐドメイン（アミノ酸２２６〜５３０、Ｎｏｒｗａｌｋ株番号付け）は、２つのサブドメイン、Ｐ１およびＰ２に分けられる。Ｐ２ドメインは、ビリオン（またはＶＬＰ）の最外側の表面に放射状に位置し、配列が超可変であると考えられる。（例えば、Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻：６４６９〜６４７９頁を参照されたい。）Ｐ２ドメインは、ノロウイルス株の間で保存されている最小のＶＰ１の領域であり、受容体との結合および免疫応答性において重要な役割を果たすと考えられている。（Ｋｉｔａｍｏｔｏら（２００２年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４０巻：２４５９〜２４６５頁；Ｐｒａｓａｄら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６巻：２８７〜２９０頁；Ｔａｎら（２００３年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７巻：１２５６２〜１２５７１頁；Ｗｈｉｔｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０巻：６５８９〜６５９７頁；Ｖａｎｃｅら（２００５年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ．  ８６巻：２７９９〜２８０６頁）。構造研究により、異なるノロウイルスのＰ２サブドメインの形状およびサイズの多様性が示され、これは観察されたＰ２サブドメインの配列の変動性と一致する。Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８巻（１２号）：６４６９〜６４７９頁。
【０００７】
ＮｏｒｗａｌｋウイルスＶＬＰの発現および自己集合は、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞の発現系を用いて最初に実証され（Ｊｉａｎｇら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：６５２７〜６５３２頁）、次いで、ベネズエラウマ脳炎ベクターで感染させた哺乳動物細胞の発現系を用いて実証された（Ｂａｒｉｃら（２００２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６巻：３０２５〜３０３０頁）。真核生物の発現系において高レベルで発現させると、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、および特定の他のノロウイルスのＶＰ１単量体は、ネイティブなノロウイルスのビリオンと構造的によく似たＶＬＰに自己集合する。ＶＬＰはウイルスのカプシドタンパク質の真正のコンフォメーションを保持するが、ノロウイルスの遺伝物質を欠く。動物に注射すると、ノロウイルスＶＬＰは適切な宿主免疫応答を引き出し得る。
【０００８】
ノロウイルスの抗原性の性質について公知であることにかかわらず、ノロウイルスに対する有効なワクチンの開発は遅々としており、困難である。異なる遺伝子群および遺伝子型由来の野外（ｆｉｅｌｄ）分離株を含めた広範囲のノロウイルス株に対して有効なノロウイルスワクチンの開発が難題であることにはいくつかの理由がある。１つの理由は、異なるノロウイルス株の間に存在する複雑な抗原性の多様性である。遺伝子型の変動の結果として、新しいリガンド結合特性および抗原性の性質がもたらされ得る（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１０年２月２日［ｅ−ｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。第２の理由は、優性の循環ノロウイルス株が逐次的に入れ替わることである（Ｓｉｅｂｅｎｇａら（２００７年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８１巻：９９３２〜９９４１頁）。第３の理由は、ヒトノロウイルスについての細胞培養モデルがなく、中和アッセイの開発が妨げられていることである。第４の理由は、ヒトノロウイルスについての動物モデルがなく、ワクチンの効力の前臨床試験が制限され、ノロウイルスの病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｓ）および免疫を理解するための研究が妨げられていることである（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８巻：２３１〜２４１頁）。
【０００９】
免疫優性ノロウイルスエピトープをワクチンとして提供するために、以前、ただ１種のノロウイルス株由来の１種類のＶＰ１タンパク質（一価ＶＬＰとしても公知である）または２種以上のノロウイルス株由来の非キメラＶＰ１タンパク質の混合物（多価ＶＬＰとしても公知である）のいずれかを含有するＶＬＰが調製された。例えば、特許文献１を参照されたい。一価ＶＬＰは、広範囲のノロウイルス株に対する有効性が多価ＶＬＰよりも低い可能性がある。現在の多価ＶＬＰは、株間のＶＰ１−ＶＰ１相互作用表面が異なるので、共集合し得る異なる株由来のＶＰ１の範囲内に制約される可能性がある。これらの問題が原因で、上記のワクチン系はいずれも、ウイルスが進化することによって出現する新しいノロウイルスに対する迅速なカスタマイズに適さない。
【００１０】
ノロウイルスは、抗原型において進行性の変化を受け、新しい抗原変異体により古い抗原変異体が置き換えられる。したがって、現在季節性インフルエンザワクチンについて行われているのと同様に、ノロウイルスワクチンの株の組成を定期的に変更することが必要になる可能性がある。異なるノロウイルス株のＶＰ１からＶＬＰへの集合は、異なる効率レベルで生じ、生じるＶＬＰの収量および安定性のレベルは異なる。この株間の変動性により、ノロウイルスワクチン組成物において必要な株の変更のスピード、信頼度、および容易さが阻害される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３９２２９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．（２００２年）１８６巻：１〜７頁
【非特許文献２】Ｍａｒｉｏｎｎｅａｕら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００２年）１２２巻：１９６７〜１９７７頁
【非特許文献３】Ｈｕｔｓｏｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（２００３年）７７巻：４０５〜４１５頁
【非特許文献４】Ｈｕｔｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４年）１２巻（６号）：２７９〜２８７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、新しい野外分離株および／または臨床分離株を含めた任意の所望のノロウイルス株由来の、効率的に調製され、安定であり、適正に提供されたノロウイルス免疫原性材料からつくられる株組成物を迅速に変更することを可能にする改善されたノロウイルスワクチン開発手法の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、一部分において、ノロウイルス抗原を含む免疫原性組成物ならびにそのような組成物を迅速に開発するために使用することができる材料および方法を提供する。本発明のノロウイルス抗原は、Ｐ−ドメインの全部または一部を、異なるノロウイルス株由来のＰ−ドメインの全部または一部で置き換えたキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を含む。
【００１５】
一態様では、本発明は、第１のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインおよび第２のノロウイルス株由来のＶＰ１のＰ−ドメインの少なくとも一部、および必要に応じて、Ｓ−ドメインおよびＰ−ドメインと作動可能に連結したリンカーペプチドを含有するキメラノロウイルスウイルスタンパク質１（ＶＰ１）に関する。存在する場合、リンカーペプチドは、第１のノロウイルス株由来、第２のノロウイルス株由来、または第３のノロウイルス株由来のＶＰ１のリンカーペプチドなどの任意の適切なリンカーであってよい。キメラＶＰ１は、式（Ｉ）：Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｂ  （Ｉ）による構造を有してよい。
【００１６】
式（Ｉ）において、ＡおよびＢは、それぞれ独立して、存在しないまたは任意の所望のアミノ酸配列であり；Ｓは第１のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインであり；Ｌは、存在しないまたはリンカーペプチドであり；Ｐは、ノロウイルスＶＰ１のＰ−ドメインであり；Ｐ−ドメインの少なくとも一部は第２のノロウイルス株由来である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｐは第２のノロウイルス株由来のＰ−ドメインである。他の実施形態では、Ｐは、第１のノロウイルス株由来のＰ１−サブドメインまたはその一部と第２のノロウイルス株由来のＰ２−サブドメインとを含む。
【００１８】
キメラＶＰ１タンパク質は、表１に列挙されているノロウイルス株などの任意の所望のノロウイルス株由来の部分、例えば、Ｓ−ドメイン、Ｐ−ドメインを含有してよい。いくつかの実施形態では、Ｓ−ドメインはＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来である。これらの実施形態では、Ｐ−ドメインまたはその一部（例えば、Ｐ２サブドメイン）は、表１に列挙されているノロウイルス株などの任意の他のノロウイルス株由来であってよい。特定の実施形態では、Ｓ−ドメインはＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来であり、Ｐ−ドメインまたはその一部（例えば、Ｐ２サブドメイン）は、遺伝子群ＧＩＩの異なるノロウイルス株、遺伝子群ＧＩのノロウイルス株または遺伝子群ＧＩＶのノロウイルス株由来である。より詳細な実施形態では、Ｓ−ドメインはＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来であり、Ｐ−ドメインまたはその一部（例えば、Ｐ２サブドメイン）は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧＩＩ．４．２００６ａ、またはＮｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ由来である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。ＶＬＰは一価であっても多価であってもよい。多価ＶＬＰは、本明細書に記載の２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質を含んでよい。多価ＶＬＰは、本明細書に記載のキメラＶＰ１タンパク質と天然に存在するノロウイルスのＶＰ１タンパク質とを含んでよい。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載のキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸にも関する。組換え核酸は、例えば、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、所望に応じて、ベクターを含んでよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、自己複製するＲＮＡなど、自己複製するものである。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質、本明細書に記載のＶＬＰまたはそれらの組み合わせを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、本明細書に記載のキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸を含む免疫原性組成物にも関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、酵母細胞、テトラヒメナの細胞およびそれらの組み合わせであってよい。
【００２３】
本発明は、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰを生成する方法であって、本明細書に記載の組換え宿主細胞を、組換え核酸が発現され、キメラＶＰ１タンパク質が生成される条件下で培養するステップを含む方法にも関する。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞をＶＬＰの形成に適した条件下で維持する。いくつかの実施形態では、方法は、培養培地および／または組換え宿主細胞からキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰを単離するステップをさらに含む。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
第１のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインと第２のノロウイルス株由来のＶＰ１のＰ−ドメインの少なくとも一部とを含むキメラノロウイルスウイルスタンパク質１（ＶＰ１）。
（項目２）
上記Ｓ−ドメインと上記Ｐ−ドメインとを作動可能に連結するリンカーペプチドをさらに含む、項目１に記載のキメラノロウイルスＶＰ１。
（項目３）
上記リンカーペプチドが、上記第１のノロウイルス株由来、上記第２のノロウイルス株由来、または第３のノロウイルス株由来のＶＰ１のリンカーペプチドである、項目２に記載のキメラノロウイルスＶＰ１。
（項目４）
式：Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｂ
（式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しないまたは任意の所望のアミノ酸配列であり；
Ｓは第１のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインであり；
Ｌは、存在しないまたはリンカーペプチドであり；
ＰはノロウイルスＶＰ１のＰ−ドメインであり；ここで、該Ｐ−ドメインの少なくとも一部は第２のノロウイルス株由来である）
を有する、項目１に記載のキメラノロウイルスＶＰ１。
（項目５）
Ｌが、上記第１のノロウイルス株由来、上記第２のノロウイルス株由来、または第３のノロウイルス株由来のＶＰ１のリンカーペプチドである、項目４に記載のキメラＶＰ１。
（項目６）
Ｐが、第２のノロウイルス株由来のＰ−ドメイン全体である、項目４または項目５に記載のキメラＶＰ１。
（項目７）
Ｐが、上記第１のノロウイルス株由来のＰ１−サブドメインまたはその一部と第２のノロウイルス株由来のＰ２−サブドメインとを含む、項目４または項目５に記載のキメラＶＰ１。
（項目８）
上記第１のノロウイルス株が表１に列挙されているノロウイルス株からなる群から選択される、項目１から７までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目９）
上記第１のノロウイルス株がＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株である、項目１から８までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目１０）
上記第２のノロウイルス株が表１に列挙されているノロウイルス株からなる群から選択される、項目１から９までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目１１）
上記第２のノロウイルス株が、遺伝子群ＧＩＩ、遺伝子群ＧＩのノロウイルス株および遺伝子群ＧＩＶのノロウイルス株からなる群から選択される株である、項目９に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目１２）
上記第２のノロウイルス株が、遺伝子群ＧＩＩのノロウイルス株、および遺伝子群ＧＩのノロウイルス株からなる群から選択される、項目９に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目１３）
上記第２のノロウイルス株が、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧＩＩ．４．２００６ａ、またはＮｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓである、項目１２に記載のキメラＶＰ１タンパク質。
（項目１４）
項目１から１３のいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１５）
項目１から１３までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質を含む一価のノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１６）
項目１から１３までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質を含む多価のノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１７）
２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質を含む、項目１６に記載の多価ＶＬＰ。
（項目１８）
項目１から１３までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質を含む免疫原性組成物。
（項目１９）
項目１４から１７までのいずれか一項に記載のＶＬＰを含む免疫原性組成物。
（項目２０）
項目１５に記載の一価ＶＬＰを含む免疫原性組成物。
（項目２１）
項目１６または項目１７に記載の多価ＶＬＰを含む免疫原性組成物。
（項目２２）
項目１５に記載の２種以上の異なる一価ＶＬＰを含む免疫原性組成物。
（項目２３）
項目１から１３までのいずれか一項に記載のキメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸。
（項目２４）
ベクターを含む、項目２３に記載の組換え核酸。
（項目２５）
自己複製する、項目２３に記載の組換え核酸。
（項目２６）
項目２３から２５までのいずれか一項に記載の組換え核酸を含む免疫原性組成物。
（項目２７）
項目２３から２５までのいずれか一項に記載の組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
（項目２８）
昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、酵母細胞、テトラヒメナの細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２７に記載の組換え宿主細胞。
（項目２９）
キメラノロウイルスのＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰを生成する方法であって、項目２８に記載の組換え宿主細胞を、組換え核酸が発現され、キメラＶＰ１タンパク質が生成される条件下で培養するステップを含む方法。
（項目３０）
上記組換え宿主細胞をＶＬＰの形成に適した条件下で維持する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
培養培地および／または上記組換え宿主細胞から上記キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰを単離するステップをさらに含む、項目２９または項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ＶＬＰを単離する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
スクロースクッションまたはスクロース勾配を用いてＶＬＰを単離する、項目３２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明のキメラＶＰ１オリゴヌクレオチドをサブクローニングし、増幅させるために適したベクターｐＭＡＤＣ５の図を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてキメラＶＰ１タンパク質およびＶＬＰを発現させるために適したベクターｐＢＳ２４．１の図を示す。
【図３】図３は、３種の異なるノロウイルス株、Ｎｏｒｗａｌｋ（ｎｏｒｗ）遺伝子型Ｇ１．１（配列番号１１）、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ（ｓｎｏｗ）遺伝子型ＧＩＩ．２（配列番号１２）、および２００６ａ（ｇ２．４）ＧＩＩ．４（配列番号１３）由来のＶＰ１タンパク質のアミノ酸アラインメントである。示されている通り、殻ドメイン（Ｓ−ドメイン）は残基１〜２２１であり、リンカーペプチドは残基２２２〜２３０であり、突出ドメイン（Ｐ−ドメイン）は残基２３１〜５３０である。
【図４】図４Ａは、ノロウイルス株Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎにおける、その株のＶＰ１タンパク質をコードするＯＲＦ２のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。図４Ｂは、Ｓｎｏｗ  ＭｏｕｎｔａｉｎのＯＲＦ２にコードされるＶＰ１タンパク質の翻訳されるアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図５】図５は、Ｓ−ドメインがＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株に由来し、Ｐ−ドメインがＮｏｒｗａｌｋ株に由来するキメラＶＰ１タンパク質をコードする核酸（配列番号１５）を示す。
【図６】図６は、Ｓ−ドメインがＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株に由来し、Ｐ−ドメインがＧＩＩ．４  ２００６ａ株に由来するキメラＶＰ１タンパク質をコードする核酸（配列番号１６）を示す。
【図７】図７は、２４種の、本発明の例示的なキメラＶＰ１タンパク質の一次構造の概略図を示す。変数であるＡ、Ｓ、Ｌ、Ｐ１−１、Ｐ２、Ｐ１−２、およびＢは本明細書に記載の通りである。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｅは、いくつかのノロウイルス株のＶＰ１配列の多数のアミノ酸アラインメントを示す。Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁を参照されたい。これらの図面では以下の領域が示されている：Ｎ末端領域（線）；Ｓ−ドメイン（黒四角）、Ｐ１−１−サブドメイン（白四角）；Ｐ２−サブドメイン（ＸＸＸ）；Ｐ１−２−サブドメイン（白四角）およびＣ末端領域（線）。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す。示されている配列は以下のノロウイルス株由来である：＃８（配列番号１７）（ＡＢ０５８５４７、ＧＩ／１１株）；ＳｅＶ（配列番号１８）（ＡＢ０３１０１３、ＧＩ／１株）；２５８（配列番号１９）（ＡＢ０７８３３５、ＧＩ／２株）；６４５（配列番号２０）（ＢＤ０１１８７１、ＧＩ／３株）；ＣＶ（配列番号２１）（ＡＢ０４２８０８、ＧＩ／４株）；ＷＵＧ１（配列番号２２）（ＡＢ０８１７２３、ＧＩ／８株）；ＨＶ（配列番号２３）（Ｕ０７６１１、ＧＩＩ／１株）；４８５（配列番号２４）（ＤＱ０９３０６５、ＧＩＩ／１株）；Ｉｎａ（配列番号２５）（ＡＢ１９５２２５、ＧＩＩ／２株）；８０９（配列番号２６）（ＢＤ０１１８７６、ＧＩＩ／３株）；Ｓｈ５（配列番号２７）（ＡＢ１９５２２６、ＧＩＩ／３株）；１８−３（配列番号２８）（ＤＱ０９３０６２、ＧＩＩ／３株）；３３６（配列番号２９）（ＤＱ０９３０６３、ＧＩＩ／３株）；１１５２（配列番号３０）（ＤＱ０９３０）；１０４（配列番号３１）（ＡＢ０７８３３６、ＧＩＩ／４株）；７５４（配列番号３２）（ＢＤ０１１８７７、ＧＩＩ／５株）；７ｋ（配列番号３３）（ＡＢ０７８３３７、ＧＩＩ／６株）；４４５（配列番号３４）（ＤＱ０９３０６４、ＧＩＩ／６株）；１０−２５（配列番号３５）（９ＢＤ０１１８８１、ＧＩＩ／７株）；Ｕ２５（配列番号３６）（ＡＢ０３９７８０、ＧＩＩ／８株）；０２６（配列番号３７）（ＡＦ５０４６７１、ＧＩＩ／１０株）；ＣＨＶ（配列番号３８）（ＡＢ０３２７５８、ＧＩＩ／１２株）；４７（配列番号３９）（ＡＢ０７８３３４、ＧＩＩ／１４株）；Ｈｉｒｏ（配列番号４０）（ＡＢ０４４３６６、ＧＩＩ／１２株）；Ａｌｐｈ２３（配列番号４１）（ＤＱ０９３０６７、ＧＩＩ／１７株）。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｅは、いくつかのノロウイルス株のＶＰ１配列の多数のアミノ酸アラインメントを示す。Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁を参照されたい。これらの図面では以下の領域が示されている：Ｎ末端領域（線）；Ｓ−ドメイン（黒四角）、Ｐ１−１−サブドメイン（白四角）；Ｐ２−サブドメイン（ＸＸＸ）；Ｐ１−２−サブドメイン（白四角）およびＣ末端領域（線）。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す。示されている配列は以下のノロウイルス株由来である：＃８（配列番号１７）（ＡＢ０５８５４７、ＧＩ／１１株）；ＳｅＶ（配列番号１８）（ＡＢ０３１０１３、ＧＩ／１株）；２５８（配列番号１９）（ＡＢ０７８３３５、ＧＩ／２株）；６４５（配列番号２０）（ＢＤ０１１８７１、ＧＩ／３株）；ＣＶ（配列番号２１）（ＡＢ０４２８０８、ＧＩ／４株）；ＷＵＧ１（配列番号２２）（ＡＢ０８１７２３、ＧＩ／８株）；ＨＶ（配列番号２３）（Ｕ０７６１１、ＧＩＩ／１株）；４８５（配列番号２４）（ＤＱ０９３０６５、ＧＩＩ／１株）；Ｉｎａ（配列番号２５）（ＡＢ１９５２２５、ＧＩＩ／２株）；８０９（配列番号２６）（ＢＤ０１１８７６、ＧＩＩ／３株）；Ｓｈ５（配列番号２７）（ＡＢ１９５２２６、ＧＩＩ／３株）；１８−３（配列番号２８）（ＤＱ０９３０６２、ＧＩＩ／３株）；３３６（配列番号２９）（ＤＱ０９３０６３、ＧＩＩ／３株）；１１５２（配列番号３０）（ＤＱ０９３０）；１０４（配列番号３１）（ＡＢ０７８３３６、ＧＩＩ／４株）；７５４（配列番号３２）（ＢＤ０１１８７７、ＧＩＩ／５株）；７ｋ（配列番号３３）（ＡＢ０７８３３７、ＧＩＩ／６株）；４４５（配列番号３４）（ＤＱ０９３０６４、ＧＩＩ／６株）；１０−２５（配列番号３５）（９ＢＤ０１１８８１、ＧＩＩ／７株）；Ｕ２５（配列番号３６）（ＡＢ０３９７８０、ＧＩＩ／８株）；０２６（配列番号３７）（ＡＦ５０４６７１、ＧＩＩ／１０株）；ＣＨＶ（配列番号３８）（ＡＢ０３２７５８、ＧＩＩ／１２株）；４７（配列番号３９）（ＡＢ０７８３３４、ＧＩＩ／１４株）；Ｈｉｒｏ（配列番号４０）（ＡＢ０４４３６６、ＧＩＩ／１２株）；Ａｌｐｈ２３（配列番号４１）（ＤＱ０９３０６７、ＧＩＩ／１７株）。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｅは、いくつかのノロウイルス株のＶＰ１配列の多数のアミノ酸アラインメントを示す。Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁を参照されたい。これらの図面では以下の領域が示されている：Ｎ末端領域（線）；Ｓ−ドメイン（黒四角）、Ｐ１−１−サブドメイン（白四角）；Ｐ２−サブドメイン（ＸＸＸ）；Ｐ１−２−サブドメイン（白四角）およびＣ末端領域（線）。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す。示されている配列は以下のノロウイルス株由来である：＃８（配列番号１７）（ＡＢ０５８５４７、ＧＩ／１１株）；ＳｅＶ（配列番号１８）（ＡＢ０３１０１３、ＧＩ／１株）；２５８（配列番号１９）（ＡＢ０７８３３５、ＧＩ／２株）；６４５（配列番号２０）（ＢＤ０１１８７１、ＧＩ／３株）；ＣＶ（配列番号２１）（ＡＢ０４２８０８、ＧＩ／４株）；ＷＵＧ１（配列番号２２）（ＡＢ０８１７２３、ＧＩ／８株）；ＨＶ（配列番号２３）（Ｕ０７６１１、ＧＩＩ／１株）；４８５（配列番号２４）（ＤＱ０９３０６５、ＧＩＩ／１株）；Ｉｎａ（配列番号２５）（ＡＢ１９５２２５、ＧＩＩ／２株）；８０９（配列番号２６）（ＢＤ０１１８７６、ＧＩＩ／３株）；Ｓｈ５（配列番号２７）（ＡＢ１９５２２６、ＧＩＩ／３株）；１８−３（配列番号２８）（ＤＱ０９３０６２、ＧＩＩ／３株）；３３６（配列番号２９）（ＤＱ０９３０６３、ＧＩＩ／３株）；１１５２（配列番号３０）（ＤＱ０９３０）；１０４（配列番号３１）（ＡＢ０７８３３６、ＧＩＩ／４株）；７５４（配列番号３２）（ＢＤ０１１８７７、ＧＩＩ／５株）；７ｋ（配列番号３３）（ＡＢ０７８３３７、ＧＩＩ／６株）；４４５（配列番号３４）（ＤＱ０９３０６４、ＧＩＩ／６株）；１０−２５（配列番号３５）（９ＢＤ０１１８８１、ＧＩＩ／７株）；Ｕ２５（配列番号３６）（ＡＢ０３９７８０、ＧＩＩ／８株）；０２６（配列番号３７）（ＡＦ５０４６７１、ＧＩＩ／１０株）；ＣＨＶ（配列番号３８）（ＡＢ０３２７５８、ＧＩＩ／１２株）；４７（配列番号３９）（ＡＢ０７８３３４、ＧＩＩ／１４株）；Ｈｉｒｏ（配列番号４０）（ＡＢ０４４３６６、ＧＩＩ／１２株）；Ａｌｐｈ２３（配列番号４１）（ＤＱ０９３０６７、ＧＩＩ／１７株）。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｅは、いくつかのノロウイルス株のＶＰ１配列の多数のアミノ酸アラインメントを示す。Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁を参照されたい。これらの図面では以下の領域が示されている：Ｎ末端領域（線）；Ｓ−ドメイン（黒四角）、Ｐ１−１−サブドメイン（白四角）；Ｐ２−サブドメイン（ＸＸＸ）；Ｐ１−２−サブドメイン（白四角）およびＣ末端領域（線）。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す。示されている配列は以下のノロウイルス株由来である：＃８（配列番号１７）（ＡＢ０５８５４７、ＧＩ／１１株）；ＳｅＶ（配列番号１８）（ＡＢ０３１０１３、ＧＩ／１株）；２５８（配列番号１９）（ＡＢ０７８３３５、ＧＩ／２株）；６４５（配列番号２０）（ＢＤ０１１８７１、ＧＩ／３株）；ＣＶ（配列番号２１）（ＡＢ０４２８０８、ＧＩ／４株）；ＷＵＧ１（配列番号２２）（ＡＢ０８１７２３、ＧＩ／８株）；ＨＶ（配列番号２３）（Ｕ０７６１１、ＧＩＩ／１株）；４８５（配列番号２４）（ＤＱ０９３０６５、ＧＩＩ／１株）；Ｉｎａ（配列番号２５）（ＡＢ１９５２２５、ＧＩＩ／２株）；８０９（配列番号２６）（ＢＤ０１１８７６、ＧＩＩ／３株）；Ｓｈ５（配列番号２７）（ＡＢ１９５２２６、ＧＩＩ／３株）；１８−３（配列番号２８）（ＤＱ０９３０６２、ＧＩＩ／３株）；３３６（配列番号２９）（ＤＱ０９３０６３、ＧＩＩ／３株）；１１５２（配列番号３０）（ＤＱ０９３０）；１０４（配列番号３１）（ＡＢ０７８３３６、ＧＩＩ／４株）；７５４（配列番号３２）（ＢＤ０１１８７７、ＧＩＩ／５株）；７ｋ（配列番号３３）（ＡＢ０７８３３７、ＧＩＩ／６株）；４４５（配列番号３４）（ＤＱ０９３０６４、ＧＩＩ／６株）；１０−２５（配列番号３５）（９ＢＤ０１１８８１、ＧＩＩ／７株）；Ｕ２５（配列番号３６）（ＡＢ０３９７８０、ＧＩＩ／８株）；０２６（配列番号３７）（ＡＦ５０４６７１、ＧＩＩ／１０株）；ＣＨＶ（配列番号３８）（ＡＢ０３２７５８、ＧＩＩ／１２株）；４７（配列番号３９）（ＡＢ０７８３３４、ＧＩＩ／１４株）；Ｈｉｒｏ（配列番号４０）（ＡＢ０４４３６６、ＧＩＩ／１２株）；Ａｌｐｈ２３（配列番号４１）（ＤＱ０９３０６７、ＧＩＩ／１７株）。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｅは、いくつかのノロウイルス株のＶＰ１配列の多数のアミノ酸アラインメントを示す。Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁を参照されたい。これらの図面では以下の領域が示されている：Ｎ末端領域（線）；Ｓ−ドメイン（黒四角）、Ｐ１−１−サブドメイン（白四角）；Ｐ２−サブドメイン（ＸＸＸ）；Ｐ１−２−サブドメイン（白四角）およびＣ末端領域（線）。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す。示されている配列は以下のノロウイルス株由来である：＃８（配列番号１７）（ＡＢ０５８５４７、ＧＩ／１１株）；ＳｅＶ（配列番号１８）（ＡＢ０３１０１３、ＧＩ／１株）；２５８（配列番号１９）（ＡＢ０７８３３５、ＧＩ／２株）；６４５（配列番号２０）（ＢＤ０１１８７１、ＧＩ／３株）；ＣＶ（配列番号２１）（ＡＢ０４２８０８、ＧＩ／４株）；ＷＵＧ１（配列番号２２）（ＡＢ０８１７２３、ＧＩ／８株）；ＨＶ（配列番号２３）（Ｕ０７６１１、ＧＩＩ／１株）；４８５（配列番号２４）（ＤＱ０９３０６５、ＧＩＩ／１株）；Ｉｎａ（配列番号２５）（ＡＢ１９５２２５、ＧＩＩ／２株）；８０９（配列番号２６）（ＢＤ０１１８７６、ＧＩＩ／３株）；Ｓｈ５（配列番号２７）（ＡＢ１９５２２６、ＧＩＩ／３株）；１８−３（配列番号２８）（ＤＱ０９３０６２、ＧＩＩ／３株）；３３６（配列番号２９）（ＤＱ０９３０６３、ＧＩＩ／３株）；１１５２（配列番号３０）（ＤＱ０９３０）；１０４（配列番号３１）（ＡＢ０７８３３６、ＧＩＩ／４株）；７５４（配列番号３２）（ＢＤ０１１８７７、ＧＩＩ／５株）；７ｋ（配列番号３３）（ＡＢ０７８３３７、ＧＩＩ／６株）；４４５（配列番号３４）（ＤＱ０９３０６４、ＧＩＩ／６株）；１０−２５（配列番号３５）（９ＢＤ０１１８８１、ＧＩＩ／７株）；Ｕ２５（配列番号３６）（ＡＢ０３９７８０、ＧＩＩ／８株）；０２６（配列番号３７）（ＡＦ５０４６７１、ＧＩＩ／１０株）；ＣＨＶ（配列番号３８）（ＡＢ０３２７５８、ＧＩＩ／１２株）；４７（配列番号３９）（ＡＢ０７８３３４、ＧＩＩ／１４株）；Ｈｉｒｏ（配列番号４０）（ＡＢ０４４３６６、ＧＩＩ／１２株）；Ａｌｐｈ２３（配列番号４１）（ＤＱ０９３０６７、ＧＩＩ／１７株）。
【図９】図９は、Ｃｈａｋａｖａｒｔｙら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９巻（１号）：５５４〜５６８頁により同定された、異なる公知のおよび示唆された抗原性ノロウイルスの株およびクラスを区別するＳおよびＰドメイン由来のアミノ酸残基を示す表である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、濃い灰色のＳ−ドメイン（内部）および薄い灰色のＰ−ドメイン（外部）を有するＮｏｒｗａｌｋウイルス様粒子のＸ線構造である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの場合と同様に色づけされた単一の単量体の図である。
【図１１】図１１Ａは、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ＶＬＰの精製されたタンパク質を示す画像である。図１１Ｂは、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図１２】図１２Ａは、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／Ｎｏｒｗａｌｋ  ＶＬＰキメラの精製されたタンパク質を示す画像である。図１２Ｂは、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／Ｎｏｒｗａｌｋ  キメラＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を生成し、使用するための組成物および方法を提供する。本発明は、さらに、Ｓ−ドメインが第１のノロウイルス株に由来し、Ｐ−ドメインの全部または一部分が第２のノロウイルス株に由来する前記キメラＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２６】
本発明の他の態様は、核酸およびポリペプチド、ならびにそのような核酸およびポリペプチドを調製し、精製するための方法を包含する。本発明のこれらの態様は、本発明のＶＬＰならびに免疫原性組成物におけるそれらの使用ならびにノロウイルスの処置または予防におけるそのような組成物の使用方法と共に、以下により詳細に記載する。
【００２７】
Ｉ．  定義
本出願において使用される科学用語および技術用語は全て、別段の指定がない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願において使用される場合、以下の単語または句は指定された意味を有する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り、単数および複数の言及を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「ａ（１つの）ポリヌクレオチド」への言及は、そのようなポリヌクレオチド２つ以上などの混合物を包含する。
【００２９】
数値ｘに関して、用語「約」は、例えば、ｘ＋１０％を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「ノロウイルス」および「Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス」は、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡの、エンベロープを持たないウイルスであるＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科のノロウイルス属のメンバーをいう（Ｇｒｅｅｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １巻、８４１〜８７４頁（ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ、編集主幹、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００１年））。用語ノロウイルスは、そのウイルスの全ての遺伝子群の株を包含する。現在、ノロウイルス株は、５つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＶ）に分けられ、それらは少なくとも２０の遺伝クラスターまたは遺伝子型に細分される。具体的には、用語ノロウイルスは、これらに限定されないが、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＮＶ）種、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス（ＬＶ）種、Ｍｅｘｉｃｏウイルス（ＭＶ）種、Ｈａｗａｉｉウイルス（ＨＶ）種、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス（ＳＭＶ）種、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｓｈｉｅｌｄウイルス（ＤＳＶ）種、およびＳｏｕｔｈｈａｍｐｔｏｎウイルス（ＳＶ）種を包含する。多数のノロウイルス分離株が部分的に、または完全に配列決定されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＴａｘｏｎｏｍｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）またはＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅに関するＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐａｔｒｉｃ．ｖｂｉ．ｖｔ．ｅｄｕ）を参照されたい。用語ノロウイルスは、出願時に特徴付けられていない分離株も包含する。
【００３１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生成物の最小の長さに限定されない。よって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義の範囲内に含まれる。全長のタンパク質およびそのフラグメントの両方がこの定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後（ｐｏｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りは、天然の配列に対して修飾、例えば、欠失、付加および置換など（一般に天然に保存された）を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるものなど、意図的なものであってよい、または、タンパク質を生成する宿主の変異によるものまたはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどの偶発的なものであってよい。
【００３２】
「実質的に精製された」とは、一般に、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）が、その物質が、それが存在する試料における百分率の大部分を構成するように単離することをいう。典型的に、試料において、実質的に精製された成分は、その試料の５０％、好ましくは８０％〜８５％、より好ましくは９０〜９５％を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降が挙げられる。
【００３３】
「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、その分子が天然に見いだされる、生物全体から分離されており、別個である、または、同じ種類の他の生物学的な高分子の実質的な不在下で存在することを意味する。用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに関しては、天然では通常それに関連している配列の全体またはその一部分を欠く核酸分子；または、天然に存在するのと同様だが、それと結びついた異種配列を有する配列；または染色体から切り離された分子である。
【００３４】
「組換え」とは、本明細書において核酸分子を説明するために使用される場合、その起源または操作によって、それが天然では関連しているポリヌクレオチドの全部または一部と結びついていない、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドを発現させることによって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、下でさらに記載するように、目的の遺伝子をクローニングし、次いで、形質転換した生物において発現させる。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を生成する。
【００３５】
用語「形質転換」とは、挿入するために用いる方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することをいう。例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、形質導入またはｆ−接合が含まれる。外因性のポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持することができる、あるいは、宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００３６】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および他のそのような単細胞の実体として培養された微生物またはそれよりも高等の真核細胞株を示す用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして用いることができる、または用いられてきた細胞をいい、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代を包含する。
【００３７】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれると、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳されて（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定することができる。コード配列としては、これに限定されないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置してよい。
【００３８】
典型的な「制御エレメント」としては、これらに限定されないが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化するための配列（コード配列の５’側に位置する）、および翻訳終結配列が挙げられる。
【００３９】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、また、それらの類似体、例えば、修飾された骨格を含有するものなど（例えば、ホスホロチオエートなど）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）なども包含する。本発明は、上記のものと相補的な配列を含む核酸を包含する（例えば、アンチセンスまたはプローブする（ｐｒｏｂｉｎｇ）目的で）。
【００４０】
用語「自己複製する」は、ポリメラーゼをコードし、ポリメラーゼにより核酸分子が複製されることを可能にするヌクレオチド配列エレメントを含有し、好ましくは、キメラノロウイルスＶＰ１などの所望のポリペプチドもコードする核酸分子をいう。自己複製核酸は、自己複製するＲＮＡ分子であることが好ましい。例えば、自己複製するＲＮＡ分子は、アルファウイルスのゲノムに基づいてよく、ＲＮＡ分子の複製を導き得る非構造タンパク質をコードし、ＲＮＡ分子の複製を可能にするために十分な複製認識配列を含有し、かつ、キメラノロウイルスＶＰ１などの所望の標的ポリペプチドもコードする。必要に応じて、１または複数の構造ウイルス遺伝子（例えば、カプシドおよび／またはエンベロープの糖タンパク質）が自己複製するＲＮＡ分子から欠失しているまたは除かれている。自己複製するＲＮＡ分子を生成するために使用することができる適切なアルファウイルスとしては、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどが挙げられる（自己複製するＲＮＡ分子に関しては、例えば、ＥＰ１７５１２８９Ｂ１；Ｙｉｎｇら（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５巻（７号）：８２３〜８２７頁；Ｒａｃａｎｅｌｌｉら（２００４年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０巻（１号）：４７〜５８頁を参照されたい）。
【００４１】
「作動可能に連結した」とは、そう記載されている成分がそれらの通常の機能を果たすように構成されている、エレメントの配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）をいう。よって、コード配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を導くように機能する限りは、コード配列と隣接している必要はない。よって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写された配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在してよく、それでも、プロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結した」とみなされ得る。
【００４２】
「にコードされる」とは、ポリペプチド配列またはその一部が、少なくとも３アミノ酸のアミノ酸配列を含有するポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。
【００４３】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を導くことができる集合体をいう。発現カセットは、一般に、上記の通り、制御エレメント、例えば、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）に作動可能に連結している（それらの転写を導くために）プロモーターなどを含み、多くの場合、その上ポリアデニル化配列も含む。本発明のある特定の実施形態の範囲内では、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含有されてよい。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は、１または複数の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つの多重クローニング部位、および「哺乳動物の」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）も含んでよい。
【００４４】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、本質的に遊離している、例えば、ポリヌクレオチドが天然に関連しているタンパク質を約５０％未満、好ましくは約７０％未満、およびより好ましくは少なくとも約９０％未満含有する目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞を、カオトロピック作用剤を用いて破壊すること、およびポリヌクレオチド（複数可）およびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降によって分離することが挙げられる。
【００４５】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入することができる（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリア、およびリポソーム）。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」とは、目的の核酸の発現を導くことができる任意の核酸構築物を意味し、これは、核酸配列を標的細胞に移入することができる。よって、これらの用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、一般に、Ｔ細胞受容体および／または抗体によって認識される抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質抗原に由来する、またはその一部分の短いペプチドであり得る。エピトープの三次元構造は、その機能にとって重要である場合も重要でない場合もある。しかし、この用語は、グリコペプチドおよび炭水化物エピトープを有するペプチドも包含することが意図される。いくつかの異なるエピトープが単一の抗原性分子に保有され得る。用語「エピトープ」は、生物全体を認識する応答を刺激する、アミノ酸または炭水化物の修飾された配列も包含する。選択されたエピトープが、感染症を引き起こす感染性因子のエピトープであれば有利である。
【００４７】
種々のノロウイルスのカプシドエピトープに関する記載については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｄｙら、米国特許出願公開第２００５／０１５２９１１号を参照されたい。具体的には、Ｈａｒｄｙらは、以下の配列：ＷＴＲＧＳＨＮＬ、（配列番号１）、ＷＴＲＧＧＨＧＬ、（配列番号２）、ＷＴＲＧＱＨＱＬ（配列番号３）、またはＷＬＰＡＰＩＤＫＬ（配列番号４）を含む、Ｎｏｒｗａｌｋウイルスのカプシドタンパク質の残基１３３〜１３７におけるエピトープ、およびＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルスのカプシドタンパク質の残基３１９〜３２７におけるエピトープを同定した。そのようなカプシドエピトープおよびそれらをコードする核酸を含む免疫原性ポリペプチドを、本発明の実施において使用することができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」は、一般に、Ｔ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいい、「Ｂ細胞エピトープ」は、一般に、Ｂ細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいう。
【００４９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成物内に存在する抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔ−リンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（「ＣＴＬ」）による抗原に特異的な応答を伴う。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）にコードされるタンパク質と結びついて提示され、細胞の表面上で発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の破壊の誘導および促進、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原に特異的な応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上にＭＨＣ分子と結びついたペプチド抗原を提示している細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激すること、およびその活性の焦点を合わせることを助けるように作用する。「細胞性免疫応答」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含めた、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって生成される、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の生成もいう。
【００５０】
細胞性免疫応答を惹起する免疫原性組成物またはワクチンは、脊椎動物の被験体を、細胞表面において抗原をＭＨＣ分子と結びつけて提示させることによって感作するために役立ち得る。細胞媒介性免疫応答は、それらの表面に抗原を提示している細胞、またはその近傍に向けられる。さらに、抗原に特異的なＴ−リンパ球を生じさせて、免疫された宿主の将来の防御を可能にすることができる。
【００５１】
特定の抗原の、細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、いくつものアッセイ、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または、感作された被験体において抗原に特異的なＴ−リンパ球をアッセイすることによって決定することができる。そのようなアッセイは当技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）１５１巻：４１８９〜４１９９頁；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４年）２４巻：２３６９〜２３７６頁を参照されたい。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内のサイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカインの分泌を測定することを含む、または、エピトープに特異的なＴ細胞を測定することによる（例えば、四量体技法によって）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，  Ａ．  Ｊ．、およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，  Ｃ．  Ａ．、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８７巻（９号）１３６７〜１３７１頁、１９９８年；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｍ．  Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １５０巻：５〜２１頁、１９９６年；Ｌａｌｖａｎ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６巻：８５９〜８６５頁、１９９７年により概説されている）。
【００５２】
よって、免疫学的応答とは、本明細書で使用される場合、抗体の生成（例えば、細菌毒素、および細胞に進入して複製するウイルスなどの病原体を、毒素および病原体に結合することによって遮断し、典型的に、細胞を感染および破壊から保護する中和性抗体）を刺激するものであってよい。目的の抗原は、ＣＴＬの生成も惹起することができる。よって、免疫学的応答としては、以下の効果の１または複数を挙げることができる：Ｂ細胞による抗体の生成；ならびに／または、目的の組成物またはワクチンに存在する１または複数の抗原を特異的に向けさせるサプレッサーＴ細胞および／または記憶／エフェクターＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和するため、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に防御をもたらすために役立ち得る。そのような応答は、標準的な免疫測定法を使用して決定することができる。哺乳動物の先天性免疫系は、病原性生物の分子上の特徴も、免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体および同様の受容体分子を活性化することによって認識し、それに応答する。先天性免疫系が活性化されると、種々の非適応性の免疫応答細胞が活性化されて、例えば、種々のサイトカイン、リンフォカインおよびケモカインが生成される。先天性免疫応答によって活性化される細胞としては、単球（ｍｏｎｃｙｔｅ）および形質細胞様（ｐｌａｍａｓａｃｙｔｏｉｄ）系列（ＭＤＣ、ＰＤＣ）の未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞、ならびにガンマ、デルタ、アルファおよびベータＴ細胞およびＢ細胞などが挙げられる。よって、本発明は、先天性応答と適応応答の両方を伴う免疫応答も意図している。
【００５３】
「免疫原性組成物」は、組成物を被験体に投与することにより被験体において目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が発生する場合の、抗原性分子を含む組成物である。
【００５４】
用語「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、上記の通り免疫学的応答を惹起するアミノ酸配列をいう。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で使用される場合、前駆体および成熟形態、その類似体、またはその免疫原性フラグメントを含めた、問題のタンパク質の全長の天然配列または組換え配列を包含する。
【００５５】
上で定義されたノロウイルスのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、ノロウイルスに由来する分子であり、それぞれ、これらに限定することなく、ノロウイルスの種々の分離株の任意のものを含む。分子は、問題の特定の分離株に物理的に由来する必要はないが、合成的にまたは組換えによって生成することができる。
【００５６】
具体的には、ノロウイルス株のゲノムは、３つのオープンリーディングフレーム：ポリタンパク質に転写されるＯＲＦ１；主要なカプシドタンパク質であるＶＰ１に転写されるＯＲＦ２；副次的な構造タンパク質であるＶＰ２に転写されるＯＲＦ３を含有する。ノロウイルスのＮｏｒｗａｌｋ株では、ＶＰ１タンパク質内のポリペプチドドメインの境界は以下の通りである：アミノ酸残基１〜２２１によって形成される殻（Ｓ）ドメイン、アミノ酸残基２２２〜２３０の可撓性ヒンジ領域、およびアミノ酸残基（ａｍｉｎｏ  ｒｅｓｉｄｕｅ）２３１〜５３０によって形成される突出（Ｐ）ドメイン。Ｐ−ドメインは、さらに、Ｐ１、およびカプシド殻から最も遠く広がり、推定上の受容体結合部位を含有する超可変Ｐ２の２つのサブドメインに分類される（Ｃｈｏｉら（２００８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａａｃｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５巻：９１７５〜９１８０頁、Ｐｒａｓａｄら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６巻：２８７〜２９０頁）。前記の番号付けは、Ｎｏｒｗａｌｋ株のポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号１１）に対するものであるが、ノロウイルスの他の遺伝子型および分離株から得た配列内の対応するアミノ酸位も本発明に包含されることが意図されていると理解されるべきである。例えば、図３を参照されたい。全長のＶＰ１またはＶＰ２をコードするポリペプチド、ならびにその変異体、その免疫原性フラグメント、およびそのようなポリペプチド、変異体または免疫原性フラグメントをコードする核酸のうちの任意の１つを本発明の実施において使用することができる。
【００５７】
いくつものノロウイルス分離株の核酸配列およびタンパク質配列が公知である。代表的なノロウイルスのＶＰ１およびＶＰ２の配列は図４Ａ〜４Ｂおよび５Ａ〜５Ｂに示されている。ノロウイルス分離株由来のＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、およびそれらがコードするポリペプチドの配列を含めた追加的な代表的な配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースに列挙されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋエントリーを参照されたい：ノロウイルス遺伝子群１株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１６；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｂｒａｄｄｏｃｋ  Ｈｅｉｇｈｔｓ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１５；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｙｅｔｔｅ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１４；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１３；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｓａｎｄｕｓｋｙ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１２；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｃａｎｔｏｎ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１１；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｉｆｆｉｎ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１０；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｅ１／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００；ノロウイルス遺伝子群１株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００８；ノロウイルス遺伝子群１株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−８４１／２００１／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００７；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｈｉｒａｍ／２０００／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００６；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｔｏｎｔｏｇａｎｙ／１９９９／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２００５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ−００１９５９；ノロウイルスＨｕ／ＧＩ／Ｏｔｏｆｕｋｅ／１９７９／ＪＰ  ゲノムＲＮＡ、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１８７５１４；ノロウイルスＨｕ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１３３／２００３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ２１２３０６；ノロウイルスＳｙｄｎｅｙ２２１２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８１３２；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株ＳＮ２０００ＪＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９０４５７；Ｌｏｒｄｓｄａｌｅウイルス  完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６５５７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、Ｇｉｆｕ’９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４５６０３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株Ｖｉｅｔｎａｍ０２６、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５０４６７１；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ．４／２００４／Ｎ／Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８８３０９６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｈｏｋｕｓｈｉｎ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受��番号ＡＢ１９５２２７；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｋａｍｏ／０３／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２８；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｓｉｎｓｉｒｏ／９７／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２６；ノロウイルスＨｕ／ＧＩＩ／Ｉｎａ／０２／ＪＰ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１９５２２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｎｅｕｓｔｒｅｌｉｔｚ２６０／２０００／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７７２７３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／ｐＵＳ−ＮｏｒＩＩ／１９９７／ＧＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ７４１８１１；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ２Ｓ１６／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８７９８９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ４Ｓ７／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８７９８７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｗｉｔｎｅｙ／Ｂ７Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０３０；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｂａｎｂｕｒｙ／Ｂ９Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２９；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／ＣｈｉｐｐｉｎｇＮｏｒｔｏｎ／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２８；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｄｉｄｃｏｔ／Ｂ９Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２７；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ８Ｓ５／２００２／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２６；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ４／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２５；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ５／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２４；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ５Ｓ２３／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２３；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ２／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２２；ノロウイルスＨｕ／ＮＬＶ／Ｏｘｆｏｒｄ／Ｂ６Ｓ６／２００３／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５８８０２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス分離株Ｂｏ／Ｔｈｉｒｓｋ１０／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４６８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス分離株Ｂｏ／Ｐｅｎｒｉｔｈ５５／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス分離株Ｂｏ／Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ２４／００／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス分離株Ｂｏ／Ｄｕｍｆｒｉｅｓ／９４／ＵＫ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１２６４７４；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ２０３６／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６７５５５５；ノロウイルスＮＬＶ／ＩＦ１９９８／２００３／Ｉｒａｑ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６７５５５４；ノロウイルスＮＬＶ／ＢＵＤＳ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６６０５６８；ノロウイルスＮＬＶ／Ｐａｒｉｓ  Ｉｓｌａｎｄ／２００３／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６５２９７９；Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１３４７４８；Ｎｏ���ｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ／５６０／１９９８／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２６；Ｈｕ／ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ／ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／１９９９／ＪＰ（９９１２−０２Ｆ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４４３６６；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株１１ＭＳＵ−ＭＷ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７４８２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株Ｂ−１ＳＶＤ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７４８１９；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｈｉｌｌｓ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２３；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ４／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２２；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ２／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２１；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｇ１２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０２０；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ａｎｃｈｏｒａｇｅ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１９；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／ＣＳ−Ｄ１／２００２／ＣＡＮ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１８；ノロウイルス遺伝子群２株Ｈｕ／ＮｏＶ／Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ／２００２／ＵＳＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５０２０１７；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／ＧＩＩ／Ｌａｎｇｅｎ１０６１／２００２／ＤＥ、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ４８５６４２；マウスノロウイルス１ポリタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２２８２３５；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５３６；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｍｅｘ７０７６／１９９９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５４２０９０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｎ  ４５５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３９４４０；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｈｅｒｚｂｅｒｇ  ３８５／０１／ＤＥ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３９４３９；ヒトカリシウイルスＮＬＶ／Ｂｏｘｅｒ／２００１／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５３８６７９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０８１７２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全なゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ２０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全なゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ１８、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスゲノムＲＮＡ、完全なゲノム、分離株：Ｓａｉｔａｍａ  Ｕ２５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３９７８０；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２５ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５４３；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス株：Ｕ２０１  ＧＩＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６７５４２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株４１６／９７００３１５６／１９９６／ＬＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８０５５９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルス株４０８／９７００３０１２／１９９６／ＦＬ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８０５５８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｂｕｒｗａｓｈ  Ｌａｎｄｉｎｇ／３３１／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２５；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ  Ｂｅａｃｈ／３２６／１９９５／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２４；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｈｉｔｅ  Ｒｉｖｅｒ／２９０／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２３；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ／３０６／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２２；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｐｏｒｔ  Ｃａｎａｖｅｒａｌ／３０１／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２１；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｈｏｎｏｌｕｌｕ／３１４／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４２０；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｒｉｃｈｍｏｎｄ／２８３／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１９；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｗｅｓｔｏｖｅｒ／３０２／１９９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１８；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／ＵＫ３−１７／１２７００／１９９２／ＧＢ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１７；Ｎｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｍｉａｍｉ／８１／１９８６／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４１６；Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７００５９；Ｄｅｓｅｒｔ  ＳｈｉｅｌｄウイルスＤＳＶ３９５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０４４６９；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、完全なゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０９３７９７；Ｈａｗａｉｉカリシウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０７６１１；Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７４１８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ−ＫＹ−８９／８９／Ｊ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２３８２８；Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＳＲＳＶ−ＳＭＡ／７６／ＵＳ）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２３８３１；Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４６５００；ヒトカリシウイルス株Ｍｅｌｋｓｈａｍ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８１８７９；ヒトカリシウイルス株ＭＸ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２２４９８；Ｍｉｎｉｒｅｏｖｉｒｕｓ  ＴＶ２４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０２０３０；およびＮｏｒｗａｌｋ様ウイルスＮＬＶ／Ｇｗｙｎｅｄｄ／２７３／１９
９４／ＵＳ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１４４０９；これらの配列は全て（本出願の出願日で記録される）は、参照により本明細書に組み込まれる。追加的なノロウイルス配列は、以下の特許公報に開示されている：ＷＯ０５／０３０８０６、ＷＯ００／７９２８０、ＪＰ２００２０２０３９９、ＵＳ２００３１２９５８８、米国特許第６，５７２，８６２号、ＷＯ９４／０５７００、およびＷＯ０５／０３２４５７、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の比較およびノロウイルスの遺伝的な多様性および系統発生解析に関する考察については、Ｇｒｅｅｎら（２０００年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８１巻（増補２）：Ｓ３２２〜Ｓ３３０頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８巻：５９８２〜５９９０頁；Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻：６４６９〜６４７９頁；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９巻：５５４〜５６８頁；Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７８巻：１５７１〜１５７８頁も参照されたい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「主要なカプシドタンパク質」または「主要なカプシドポリペプチド」または「ＶＰ１」は、ノロウイルスに関しては、ノロウイルスのＯＲＦ２にコードされるポリペプチドに対して相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それには、ノロウイルスのＯＲＦ２にコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性を示す配列であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、それに対して７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を含む配列が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「副次的な構造タンパク質」または「副次的な構造ポリペプチド」または「ＶＰ２」または「小さな塩基性タンパク質」は、ノロウイルスに関しては、ノロウイルスのＯＲＦ３にコードされるポリペプチドに対して相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それには、ノロウイルスのＯＲＦ３にコードされるポリペプチドに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性を示す配列であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、それに対して７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を含む配列が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルスカプシドを含有するが、ウイルスのゲノムの全部または一部分、具体的には、ウイルスのゲノムの複製性でかつ感染性の成分を欠く非複製的な、非感染性のウイルスの殻をいう。ＶＬＰは、一般に、１または複数のウイルスタンパク質、例えば、これらに限定されないが、カプシド、外被、殻、表面、構造タンパク質と称されるタンパク質など（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２）で構成される。ノロウイルス・ＶＬＰは、適切な発現系においてＶＰ１を組換え発現させると、自発的に形成され得る。特定のＶＬＰを生成するための方法は当技術分野で公知であり、以下により詳細に考察されている。ウイルスタンパク質を組換え発現させた後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の従来の技法、例えば、電子顕微鏡法、生物物理学的な特徴付けなどを使用して検出することができる。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離することができ、かつ／または、特徴的な密度バンド形成（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｂａｎｄｉｎｇ）によって同定することができる。あるいは、問題のＶＬＰ調製物のガラス化した水性試料において低温電子顕微鏡法を実施し、適切な曝露条件下で画像を記録することができる。ノロウイルスまたはノロウイルスＶＬＰの試料に対して、高電子密度の陰性造影剤（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）、例えば、酢酸ウラニル、ギ酸ウラニル（ｕｒａｎｕｙｌ  ｆｏｒｍａｔｅ）、またはリンタングステン酸でコーティングした後にネガティブ染色電子顕微鏡検査を実施することができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、これらに限定されないが、例えば、血液、血漿、血清、排泄物（ｆｅｃａｌ  ｍａｔｔｅｒ）、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚、呼吸器、腸、および泌尿生殖器の外分泌物、涙、唾液、乳、血球、器官、生検材料を含めた、被験体から単離された組織または流体の試料、ならびに、これらに限定されないが、細胞および組織、例えば組換え細胞、および細胞成分を培地中で成長させることによって生じる馴化培地を含めた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物の構成成分の試料をいう。具体的には、ノロウイルスは、生物学的試料、例えば、ウイルスに感染した個体由来の嘔吐物または下痢などから得ることができる。
【００６２】
「被験体」は、これらに限定することなく、チンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル種を含めたヒトおよび他の霊長類；農場動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなど；家庭内哺乳動物、例えば、イヌおよびネコなど；げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどを含めた実験動物；家禽、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥類、アヒル、ガチョウなどを含めた鳥類などを含めた、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。よって、成体個体および新生仔個体のどちらも包含されるものとする。
【００６３】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド部分間の％同一性をいう。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、その分子の定義された長さにわたって配列が少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される場合、実質的に相同とは、特定の配列に対して完全な同一性を示す配列もいう。
【００６４】
一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列のヌクレオチドとヌクレオチドの正確な対応、または２つのポリペプチド配列のアミノ酸とアミノ酸の正確な対応をそれぞれいう。％同一性は、上記配列をアラインメントし、２つのアラインメントされた配列間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さで割り、その結果に１００を掛けることにより、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。容易に利用可能なコンピュータプログラム、例えば、ペプチド分析についてのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２巻：４８２〜４８９頁の局所相同性アルゴリズムを適応させるＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ編、５巻、増補３：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．のＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．を使用して、解析を補助することができる。同様にＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依拠する、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．から入手可能である）内のヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムが利用可能である。これらのプログラムは、製造者によって推奨されており、上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する％同一性は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用し、デフォルトスコアリング表および６ヌクレオチド位（ｓｉｘ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）のギャップペナルティを用いて決定することができる。
【００６５】
本発明に関して％同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を持つ、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）により配給されるＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表についてデフォルトパラメータを使用して（例えば、ギャップ開始ペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが１、およびギャップが６）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる。データから、「配列同一性」を反映する「一致（Ｍａｔｃｈ）」する値が生じた。配列間の％同一性または％類似性を算出するための他の適切なプログラムは、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴである。例えば、以下のデフォルトパラメータを使用してＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを使用することができる：遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｃｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルタ（ｆｉｌｉｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；エクスペクト（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列（５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）；ソート（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非冗長性（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は容易に入手可能である。
【００６６】
あるいは、相同性は、ポリヌクレオチドを、相同な領域間に安定な二重鎖が形成される条件下でハイブリダイズし、その後、一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）により消化し、消化されたフラグメントのサイズを決定することによって決定することができる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムに対して定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当技術分野の技術の範囲内である。
【００６７】
アミノ酸置換がキメラＶＰ１タンパク質に存在する場合、それは、本質的に保存されていること、すなわち、第１のアミノ酸が、それらの側鎖に基づいて同様の性質を有する第２のアミノ酸で置き換えられている置換であることが好ましい。詳細には、アミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられ、ファミリーを用いた置換は、保存置換であるとみなされる。４つのファミリーは、（１）酸性アミノ酸−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電の極性アミノ酸−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時には芳香族アミノ酸に分類される。
【００６８】
「治療有効量」は、免疫原性組成物に関しては、抗体を生成させるため、またはノロウイルス感染または疾患を処置もしくは予防するためのいずれかの免疫学的応答を誘導するであろう免疫原（例えば、キメラＶＰ１タンパク質、ＶＬＰ、または抗原をコードする核酸）の量を意味する。そのような応答は、一般に、被験体において、組成物に対する抗体媒介性免疫応答および／または分泌性免疫応答もしくは細胞性免疫応答の発生をもたらすであろう。通常、そのような応答は、これらに限定されないが、以下の効果の１または複数を含む；免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭなどの任意の免疫学的クラス由来の抗体の生成；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫学的な細胞（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌ）に対する活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルをもたらすこと；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγσＴ細胞集団の増大。
【００６９】
本発明の目的のために、アジュバントの「有効量」は、共投与された（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）抗原または抗原をコードする核酸に対する免疫学的応答を増強する量となる。
【００７０】
本明細書で使用される「処置」は、（ｉ）感染または再感染または疾患の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的に（感染する前に）、または治療的に（感染した後に）実施することができる。
【００７１】
ＩＩ．発明を実施する形式
本明細書に記載された本発明は、それ自体が変動し得る、特に例示されている分子またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、単に本発明の特定の局面、特徴および実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではない。さらに、本発明の実施は、その全てが当技術分野の通常の技術の範囲内である、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技法および免疫学の従来の方法を用いるであろう。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版、２００１年（Ｂ．  Ｎ．  ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．  Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ａ．  Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．、現在の追加物）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）を参照されたい。本明細書に記載のものと同様または同等であるいくつもの方法および材料を本発明の実施において用いることができるが、本明細書には、好ましい材料および方法が記載されている。さらに、本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものであろうが下記のものであろうが、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。
【００７２】
本発明は、一部分において、第１のノロウイルス株のＶＰ１タンパク質のＰ−ドメインの全部または一部を第２のノロウイルス株のＰ−ドメインの全てまたは対応する一部で置き換えることができるという発見、および発現すると、そのようなキメラＶＰ１タンパク質はＶＬＰに自己集合し得るという発見に基づく。ＶＬＰは、組換え宿主細胞において十分に発現されず、したがってＶＬＰを容易に形成しないノロウイルス株のＶＰ１タンパク質由来のＰ−ドメインであっても、任意の所望のＶＰ１のＰ−ドメインを含有することが発見されている。これは、十分に発現され、したがって、ＶＬＰを容易に形成し得るノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメイン、および任意の他の所望のノロウイルス株のＶＰ１タンパク質のＰ−ドメインの全部または一部を含有するキメラＶＰ１タンパク質を調製することによって実現される。したがって、本発明は、任意の所望のＰ−ドメインの全部または一部を含有するキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質、およびノロウイルスＶＬＰを提供する。現在、新興のノロウイルス株由来のＰ−ドメインを含めた任意のＰ−ドメインの全部または一部を含有するキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質、およびノロウイルスＶＬＰを比較的容易かつ迅速に生成することができる。
【００７３】
したがって、本発明は、被験体における免疫応答を誘導するために使用することができる免疫原性組成物、好ましくは被験体をノロウイルス感染および／またはノロウイルス疾患から保護することができる免疫原性組成物を迅速に生成するための組成物および方法を提供する。本発明は、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を単量体の形態でまたはＶＬＰの形態で含む免疫原性組成物を提供する。キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は第１のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインと、第２のノロウイルス株由来のＶＰ１のＰ−ドメインの全部または一部とを含有する。
【００７４】
本発明のノロウイルスＶＬＰは一価であってよく、単一型のキメラＶＰ１タンパク質で構成されてよい。そのような一価ＶＬＰは、単一のノロウイルス株由来の単一のＶＰ１のＰ−ドメインの複数のコピーを含有する。所望に応じて、本発明のノロウイルスＶＬＰは多価であってよく、２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質で構成されてよい。２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質は、同じノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインを含有するが、異なるノロウイルス株由来のＶＰ１のＰ−ドメインを含有することが好ましい。
【００７５】
さらに、本発明の免疫原性組成物は１または複数のアジュバントまたはアジュバントをコードする核酸をさらに含んでよく、免疫原性ポリペプチドおよび／またはＶＬＰをアジュバントと混合する、または共発現させる。免疫原性組成物は、ノロウイルス抗原以外の追加的な抗原、例えば、下痢性疾患を引き起こす病原体に対する免疫において使用することができる抗原も含んでよい。
【００７６】
キメラノロウイルスＶＰ１をコードする核酸分子、例えば、ＲＮＡ分子または自己複製するＲＮＡ分子を含む免疫原性組成物も提供される。そのような組成物は、被験体に投与することができ、コードされるキメラノロウイルスＶＰ１を被験体において、好ましくはＶＬＰの形態で生成することができる。
【００７７】
核酸、ポリペプチドおよび／またはＶＬＰならびにそれらを調製し、精製し、ノロウイルス感染症の処置または予防において使用するための方法を含めた本発明の他の態様をさらに理解するために、より詳細な考察が以下に提供される。
【００７８】
Ａ．ポリペプチドおよびＶＬＰ
キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、第１のノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメインと、第２のノロウイルス株のＶＰ１のＰ−ドメインの少なくとも一部を含有するＰ−ドメインとを含有する。キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインおよびＰ−ドメインは、一般に、天然に存在するＶＰ１タンパク質においてと同様に、リンカーペプチドを通じて繋がれている。リンカーペプチドにより、キメラＶＰ１タンパク質が適正に折りたたまれ、したがって自己集合してＶＬＰを形成することが可能になり得る。リンカーペプチドは、任意の適切なアミノ酸配列、例えば、第１のノロウイルス株、第２のノロウイルス株または第３のノロウイルス株のＶＰ１タンパク質由来のリンカーペプチドであってよい。第１のノロウイルス株、第２のノロウイルス株および第３のノロウイルス株は、任意の所望のノロウイルス株、例えば、表１に列挙されている任意の株であってよい。例えば、第１のノロウイルス株はＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株であってよく、第２のノロウイルス株は、任意の他の株、例えば、Ｎｏｒｗａｌｋ株または２００６ａ株であってよい。
【００７９】
所望に応じて、キメラＶＰ１のＳドメイン、リンカーおよび／またはＰドメインのアミノ酸配列は、対応する天然に存在するアミノ酸配列と、１または複数のアミノ酸の交換、付加または欠失（例えば、変異、置換、挿入、欠失、切断など）により異なってよい。そのような配列の変化によってキメラＶＰ１タンパク質が適正に折りたたまれ、ＶＬＰに自己集合することが妨げられるべきではない。一般に、高度に保存されていない領域において天然に存在する配列からアミノ酸配列が変動する（１または複数のアミノ酸の付加または欠失によるものを含む）ことは許容される。例えば、図８Ａ〜８Ｂに示されているように、いくつかのノロウイルスのＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントにより、Ｓドメインは高度に保存されているが、Ｐドメイン、特にＰ２サブドメインは可変性がより高いことが示されている。したがって、所望に応じて、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域、およびＰドメインにアミノ酸配列の変動を導入することができる。Ｓドメインおよび／またはＰ１サブドメインにも、好ましくは図８Ａにおいてアスタリスクで印を付けていない、保存されていない位置に、いくらかのアミノ酸配列の変動を導入することができる。
【００８０】
いくつかのノロウイルス株のＶＰ１タンパク質は、酵母などの宿主細胞において組換え発現によって高収量で生成することが難しい。しかし、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質が、酵母細胞などの所望の宿主細胞において高発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）である株（例えば、発現が酵母細胞１リットル当たり＞４０ｍｇになり得るＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株など）由来のＳ−ドメインを含有する場合、Ｐ−ドメインが十分に発現されない株由来であっても、キメラタンパク質はその宿主細胞において高収量で生成され得る。例えば、ＮｏｒｗａｌｋのＰ−ドメインの分泌型可溶性発現を、Ｓｎｏｗ  ＭｏｕｎｔａｉｎのＳ−ドメインを用いて記載の通りキメラ構築物を生成することにより、５倍超増加させることができる。したがって、本発明のキメラＶＰ１タンパク質を使用して、宿主細胞において十分に発現されず、したがってＶＬＰを容易に形成しない株由来のＶＰ１のＰ−ドメインを含有するＶＬＰを作製することができる。したがって、一般に、Ｓ−ドメインは、酵母細胞などの所望の宿主細胞において十分に発現される株のＶＰ１タンパク質由来であることが好ましい。高発現体ノロウイルス株は、宿主細胞、好ましくは酵母において、組換えにより、ＶＰ１タンパク質を少なくとも細胞１リットル当たり約５ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約１０ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約１５ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約２０ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約２５ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約３０ｍｇ、少なくとも細胞１リットル当たり約３５ｍｇ、または少なくとも細胞１リットル当たり約４０ｍｇの量で生成することができる株であることが好ましい。
【００８１】
キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式Ｉによる構造を有してよい：
Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｂ  （Ｉ）
式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しないまたは任意の所望のアミノ酸配列であり；
Ｓは第１のノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメインであり；
Ｌは、リンカーペプチドであるまたは存在しない；および
Ｐは、ノロウイルスＶＰ１のＰ−ドメインであり、ここで、Ｐの少なくとも一部は第２のノロウイルス株のＰ−ドメイン由来である。
【００８２】
リンカーペプチド（Ｌ）は、キメラＶＰ１タンパク質が適正に折りたたまれ、自己集合してＶＬＰを形成することを可能にする任意のアミノ酸配列であってよい。適切なリンカーペプチドとしては、第１のノロウイルス株、第２のノロウイルス株または第３のノロウイルス株のＶＰ１タンパク質由来のリンカーペプチドが挙げられる。あるいは、リンカーペプチド（Ｌ）は、キメラタンパク質が適正に折りたたまれ、ＶＬＰに自己集合することを可能にする短いアミノ酸配列、例えば、２０アミノ酸以下（すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸）、好ましくは約９アミノ酸であってよい。適切なリンカーペプチド（Ｌ）の例としては、ポリグリシンリンカー（Ｇｌｙｎ、ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い（配列番号５））、および（ＧＧＧＳ）ｎ、ここで、ｎ＝１、２、３または４（配列番号６）、および高度に荷電したリンカー、例えば、（ＳＲＳＫ）ｎ、ｎ＝１、２、３または４（配列番号７）が挙げられる。Ｌは、第１のノロウイルス株、第２のノロウイルス株または第３のノロウイルス株のＶＰ１タンパク質由来のリンカーペプチドであることが好ましい。
【００８３】
ＡおよびＢは、存在する場合、独立して、任意の所望のアミノ酸配列、例えば、約１〜５００アミノ酸、約１〜２５０アミノ酸、約１〜１００アミノ酸、約１〜５０アミノ酸、約１〜４０アミノ酸、約１〜３０アミノ酸、約１〜２０アミノ酸、約１〜１０アミノ酸、または約１〜５アミノ酸の配列である。例えば、ＡおよびＢは、クローニングを容易にするために、またはクローニングの結果として、またはタンパク質の精製を容易にするためにキメラタンパク質に付加される１または複数のアミノ酸、例えば、エピトープタグまたはヒスチジンタグ（Ｈｉｓｎ、ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０（配列番号８））であってよい。エピトープタグは、強力なＴ細胞エピトープまたはタンパク質の免疫原性を改善するために設計された修飾されたエピトープからなってよい。これらの追加的な残基は、免疫調節物質の戦略の一部分として、修飾されたＴＬＲアゴニストを含んでよい。所望に応じて、Ａおよび／またはＢは、例えば、米国特許公開第２００６０２６４６０９号に開示されているものなどの熱ショックタンパク質またはフラグメント、または、米国特許第７，５２７，８０１号に開示されているものなどのウイルス性抗原および細菌性抗原を含めた免疫原性フラグメントを含んでよい。あるいは、Ａおよび／またはＢは、全長のタンパク質、例えば、ノロウイルスＶＰ１融合タンパク質上に提示される、またはノロウイルスＶＰ１またはその一部を提示するために用いられる組換えタンパク質を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡおよびＢはどちらも存在しない。
【００８４】
本明細書に記載の通り、ＶＰ１のＰ−ドメインは、Ｐ１サブドメインとＰ２サブドメインとを含む。したがって、本明細書に開示されている式において、Ｐは、Ｐ１−Ｐ２と表すことができ、ここで、Ｐ１はＰ１サブドメインであり、Ｐ２はＰ２サブドメインである。
【００８５】
Ｐ−ドメインの一次構造において、Ｐ２サブドメインのアミノ酸をＰ１サブドメインのアミノ酸の配列に挿入すると、一次構造は、式Ｐ１−１−Ｐ２−Ｐ１−２を有し、Ｐ１−１はＰ１サブドメインの配列のアミノ末端部分であり、Ｐ１−２はＰ１サブドメインの配列の残りであり、Ｐ２はＰ２サブドメインの配列である。
【００８６】
いくつかの例示的な実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式Ｉのものであってよく、式中、Ｓは第１のノロウイルス株由来であり、Ｐは第２のノロウイルス株由来である。そのような実施形態では、Ｌは、任意の適切なリンカー、例えば、第１のノロウイルス株または第２のノロウイルス株由来の天然のリンカーであってよい、または存在しなくてよい。
【００８７】
本明細書に記載の通り、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、Ｐ−ドメインの一部がＳドメインと同じ株由来であり、Ｐ−ドメインの一部が異なる株由来であるＰ−ドメインを含有してよい。異なる株（ｓｔａｉｎ）由来の部分は、Ｐ１ドメインまたはその一部、Ｐ２ドメインまたはその一部ならびにＰ１ドメインおよびＰ２ドメインの一部の任意の組み合わせであってよい。異なる株由来の部分はＰ２ドメインまたはその一部であることが好ましい。例えば、いくつかの実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる構造を有してよい。
【００８８】
Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｐ１−Ｐ２−Ｂ  （ＩＩ）
Ａ−Ｓ−Ｐ１−Ｐ２−Ｂ  （ＩＩＩ）
式ＩＩおよびＩＩＩにおいて、変数であるＡ、Ｓ、ＬおよびＢは式Ｉに記載の通りであり、Ｐ１はＶＰ１のＰ１ドメインであり、Ｐ２はＶＰ１のＰ２ドメインであり、Ｐ１およびＰ２の少なくとも１つはＳを提供する株とは異なるノロウイルス株（ｓｔａｉｎ）由来である。いくつかの実施形態では、ＳおよびＰ１は第１のノロウイルス株（ｓｔａｉｎ）由来であり、Ｐ２は第２のノロウイルス株由来である。他の実施形態では、ＳおよびＰ２は第１のノロウイルス株由来であり、Ｐ１は第２のノロウイルス株由来である。そのような実施形態では、リンカーＬが存在する場合、それは任意の適切なリンカー、例えば、第１のノロウイルス株または第２のノロウイルス株由来のリンカーであってよい。いくつかの実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は式ＩＩのものであり、式中、Ｓ、ＬおよびＰ１は第１のノロウイルス株由来であり、Ｐ２は第２のノロウイルス株由来である。式ＩＩおよびＩＩＩに包含される例示的な実施形態のこの記載は、Ｐドメインの一部がＳドメインと同じ株由来であり、Ｐドメインの一部が異なる株由来であるＰ−ドメインを含有するキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を例示するものである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式ＩＶおよびＸＶＩＩのいずれか１つによる構造を有する：
【００９０】
【化１】
2018086020.tif 000002
【００９１】
式中、Ｐは、Ｐ１サブドメインおよびＰ２サブドメインを含めたＰ−ドメインを表し、下付き文字は、Ｓ−ドメインまたはＰ−ドメインが以下の株：ＮＶ、Ｎｏｒｗａｌｋ株；ＳＭＶ、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株；ＤＳＶ、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｓｔｏｒｍ株由来であり；かつ、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶおよびＧＶは、それぞれ遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶおよびＧＶ由来の任意のノロウイルスであることを示す。
【００９２】
特定の実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株のＶＰ１由来のＳ−ドメイン、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株のＶＰ１由来のリンカーペプチド、および別のノロウイルス株のＶＰ１のＰ−ドメインの少なくとも一部を含有するＰ−ドメインを含む。より特定の実施形態では、Ｐ−ドメインまたはその一部は、Ｎｏｒｗａｌｋ株、２００６ａ株、またはＮｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ株のＶＰ１由来である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式ＸＶＩＩＩによる一次構造を有する：
Ａ−Ｓ第１−Ｌ−Ｐ１−１（第１）−Ｐ２（第２）−Ｐ１−２（第１）−Ｂ  （ＸＶＩＩＩ）
式ＸＶＩＩＩにおいて、下付き文字の第１および第２は、そのドメインが、それぞれ第１の株由来であることまたは第２の株由来であることを示す。特定の例では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質は、式ＸＩＸ〜ＸＬＶＩのいずれか１つによる一次構造を有する：
【００９４】
【化２】
2018086020.tif 000003
【００９５】
式中、下付き文字は、Ｓ−ドメインまたはＰ−サブドメインが、以下の株：ＮＶ、Ｎｏｒｗａｌｋ株；ＳＭＶ、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株；ＤＳＶ、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｓｔｏｒｍ株由来であり；かつ、ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶおよびＧＶは、それぞれ遺伝子群ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶおよびＧＶ由来の任意のノロウイルスであることを示す。
【００９６】
本発明の教義に従うことにより、標準の手順を用いた組換え手段によって莫大な数の異なるキメラＶＰ１タンパク質を生成することができる。ノロウイルスの異なる株由来のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＴａｘｏｎｏｍｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）またはＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅに関するＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐａｔｒｉｃ．ｖｂｉ．ｖｔ．ｅｄｕ）から入手することができる。
【００９７】
本発明のキメラＶＰ１タンパク質は、酵母細胞などの宿主細胞において発現させることによって生成させると、ＶＬＰに自己集合し得る。これは、特に、宿主細胞において十分に発現されるノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメイン、例えば、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株のＳ−ドメインなどを含有するキメラＶＰ１タンパク質の場合にそうである。したがって、本発明は、キメラＶＰ１を含有するＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは、一価であっても二価であっても多価であってもよい。一価ＶＬＰは、キメラＶＰ１タンパク質と、ただ１つのＰ−ドメインとを含有する。いくつかの実施形態では、一価ＶＬＰは、それぞれが同じＰ−ドメインを含有する、キメラＶＰ１と天然に存在するＶＰ１とを含有してよい。好ましい一価ＶＬＰは、単一のキメラＶＰ１タンパク質の複数のコピー（例えば、１８０コピー）で構成される。したがって、特定の実施形態では、本発明の一価ＶＬＰは、例えば、式Ｉ〜ＸＬＶＩのいずれか１つの単一のキメラＶＰ１の１８０コピーを含む。
【００９８】
二価ＶＬＰおよび多価ＶＬＰは、キメラＶＰ１タンパク質と、少なくとも２つの異なるＰ−ドメインとを含有する。例えば、いくつかの実施形態では、二価ＶＬＰは、第１のＰ−ドメインを含有するキメラＶＰ１と、第２のＰ−ドメインを含有する天然に存在するＶＰ１とを含有してよい。そのような実施形態では、キメラＶＰ１のＳ−ドメインと天然に存在するＶＰ１のＳ−ドメインは同じであることが好ましい。他の実施形態では、二価または多価ＶＬＰは、異なる株由来のＰ−ドメインを含有する２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質を含有する。２種以上のキメラＶＰ１タンパク質は同じＳ−ドメイン含有することが好ましい。
【００９９】
特定の他の実施形態では、本発明の二価または多価ＶＬＰは、例えば式Ｉ〜ＸＬＶＩによるキメラＶＰ１タンパク質からなる群から選択される２種以上のキメラＶＰ１タンパク質を含む。
【０１００】
所望に応じて、キメラＶＰ１のＳ−ドメインおよびＰ−ドメイン（Ｐ−サブドメインを含む）の一方または両方のアミノ酸配列を、例えば、該ドメインまたはサブドメインのアミノ酸配列が、該ドメインまたはサブドメインのアミノ酸配列の長さにわたって最大約２０％、最大約１％、最大約２％、最大約３％、最大約４％、最大約５％、最大約１０％、最大約１５％、または最大約２０％が、対応する天然に存在するアミノ酸配列と異なるようにする１または複数のアミノ酸の挿入、欠失、変異または置換を含むように（挿入、欠失、変異、置換によって）変更することができる。
【０１０１】
図８Ａ〜８Ｅに示されているように、天然に存在するＶＰ１のアミノ酸配列のアラインメントにより、Ｎ末端領域（アミノ酸１〜４９）、Ｓ−ドメイン（アミノ酸５０〜２２５）およびＰ１−１サブドメイン（アミノ酸２２６〜２７８）のアミノ酸配列が、Ｐ２サブドメイン（アミノ酸２７９〜４０５）、Ｐ１−２ドメイン（アミノ酸４０６〜５２０）およびＣ末端領域のアミノ酸配列よりも保存されている（アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示す）ことが実証されている（Ｈａｎｓｍａｎら（２００６年）Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７巻：９０９〜９１９頁）。保存されたアミノ酸残基は多くの場合、適切な折りたたみまたは機能にとって重要であるので、存在する任意のアミノ酸配列の変更は、保存された位置には導入しないことが好ましい。例えば、Ｓ−ドメインにおける保存されたアミノ酸は、適切な折りたたみおよびＶＬＰの形成にとって重要であり得る。したがって、本発明のキメラＶＰ１タンパク質では、保存されたアミノ酸残基は欠失しない、かつ置き換えられないことが好ましい。
【０１０２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインは、天然に存在するＳ−ドメインに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を含めたアミノ酸配列同一性を有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のキメラＶＰ１タンパク質のＰ１−１−サブドメインは、天然に存在するＰ１−１−サブドメインに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を含めたアミノ酸配列同一性を有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のキメラＶＰ１タンパク質のＰ２−サブドメインは、天然に存在するＰ２−サブドメインに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を含めたアミノ酸配列同一性を有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のキメラＶＰ１タンパク質のＰ１−２−サブドメインは、天然に存在するＰ１−２−サブドメインに対して少なくとも約７０〜１００％または約８０〜１００％のアミノ酸配列同一性であって、この範囲内の任意の％同一性、例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を含めたアミノ酸配列同一性を有してよい。
【０１０３】
本発明のＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインは、天然に存在するＳ−ドメインと比較して全長またはほぼ全長である。Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方における切断および内部の欠失は、ＶＬＰを形成する能力がＶＬＰの形成に好都合な条件下で保持されるのであれば、許容される。したがって、Ｓ−ドメインは、全長の配列、フラグメント、切断された配列および部分配列、ならびに参照Ｓ−ドメインまたはネイティブなＳ−ドメインの類似体形態および前駆体形態を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインは、そのＮ末端において、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸残基が切断されている。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインは、そのＣ末端において、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸残基が切断されていてよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＳ−ドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸残基長の内部の欠失を含有してよい。
【０１０４】
本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−１−サブドメインは、天然に存在するＰ１−１−サブドメインと比較して全長またはほぼ全長であり、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方における配列の切断および／または内部の欠失を伴う。したがって、Ｐ１−１−サブドメインは、全長の配列、フラグメント、切断された配列および部分配列、ならびに天然に存在するＰ１−１−ドメインの類似体形態および前駆体形態を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−１−サブドメインは、そのＮ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基が切断されている。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−１−サブドメインは、そのＣ末端において、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基が切断されていてよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−１−サブドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基長の内部の欠失を含有してよい。
【０１０５】
本発明のＶＰ１タンパク質のＰ２−サブドメインは、天然に存在するＰ２−サブドメインと比較して全長またはほぼ全長であり、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方における配列の切断および／または内部の欠失を伴う。したがって、Ｐ２−サブドメインは、全長の配列、フラグメント、切断された配列および部分配列、ならびに天然に存在するＰ２−ドメインの類似体形態および前駆体形態を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ２−サブドメインは、そのＮ末端において１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基が切断されている。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ２−サブドメインは、そのＣ末端において、１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基が切断されていてよい。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ２−サブドメインは、１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基の内部の欠失を含有してよい。
【０１０６】
本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−２−サブドメインは、ネイティブなＰ１−２−サブドメインまたは参照Ｐ１−２−サブドメインと比較して全長またはほぼ全長であり、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方における配列の切断および／または内部の欠失を伴う。したがって、Ｐ１−２−サブドメインは、全長の配列、フラグメント、切断された配列および部分配列、ならびに天然に存在するＰ１−２−ドメインの類似体形態および前駆体形態を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−２−サブドメインは、そのＮ末端において１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基が切断されている。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−２−サブドメインは、そのＣ末端において、１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基が切断されていてよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明のＶＰ１タンパク質のＰ１−２−サブドメインは、１〜約２６アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４または２６アミノ酸残基の内部の欠失を含有してよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のキメラＶＰ１タンパク質のＰ−ドメイン（Ｐ１−１、Ｐ２およびＰ１−２サブドメインを含む）は、キメラＶＰ１上に提示されるポリペプチドなどの、他のポリペプチドの一部であるアミノ酸配列の挿入または置き換えを含んでよい。例えば、Ｐ−ドメインを別のポリペプチドまたは別のポリペプチドの一部と融合することができる。例えば、式１において、Ｂは、キメラＶＰ１上に提示される別のポリペプチドのアミノ酸配列であってよい。そのような状況では、その他のポリペプチドは、キメラＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰの表面上に提示され得る。
【０１０８】
本発明のキメラＶＰ１タンパク質は、本明細書に記載のものを含めた任意の適切な方法を用いて酵母細胞などの適切な組換え宿主細胞において発現させることによって生成することができる。
【０１０９】
Ｂ．核酸
本発明は、さらに、本明細書に記載のキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸を提供する。これらの核酸は、第１のノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列、第２のノロウイルス株のＰ−ドメインの少なくとも一部を含有するＰ−ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列、ならびに必要に応じて、それぞれリンカーペプチド、アミノ酸配列Ａおよびアミノ酸配列Ｂをコードする第３、第４および第５のヌクレオチド配列を含有する。核酸配列は、核酸が転写および／または翻訳されて、ＶＬＰに自己集合するキメラＶＰ１タンパク質を生成できるように作動可能に連結する。所望のノロウイルス株由来のＶＰ１のＳ−ドメインおよびＰ−ドメインをコードする任意の適切な核酸配列を使用することができる。例えば、所望のノロウイルス株のゲノムにおけるＯＲＦ２内の対応する配列と同じヌクレオチド配列を有する核酸、または酵母細胞などの所望の宿主細胞において組換え発現させるために最適化された、コドン最適化したその変異体を使用することができる。
【０１１０】
Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来の代表的なノロウイルスＯＲＦ２配列は公知であり、図４Ａに示されている。多くの他のノロウイルス株のＯＲＦ２のヌクレオチド配列、例えば、ＮｏｒｗａｌｋウイルスのＯＲＦ２配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８７６６１、Ｈａｗａｉｉウイルス；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０７６１１、および以下の特許公報：ＷＯ０５／０３０８０６、ＷＯ００／７９２８０、ＪＰ２００２０２０３９９、ＵＳ２００３１２９５８８、米国特許第６，５７２，８６２号、ＷＯ９４／０５７００、およびＷＯ０５／０３２４５７に開示されている配列が当技術分野で公知である。異なるノロウイルス株の配列の比較については、Ｇｒｅｅｎら（２０００年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８１巻（増補２）：Ｓ３２２〜３３０頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８巻：５９８２〜５９９０頁；Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻：６４６９〜６４７９頁；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９巻：５５４〜５６８頁；Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７８巻：１５７１〜１５７８頁も参照されたい。ノロウイルスのヌクレオチド配列についてのさらなる情報は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＴａｘｏｎｏｍｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）またはＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅに関するＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｐａｔｒｉｃ．ｖｂｉ．ｖｔ．ｅｄｕ）から入手することができる。
【０１１１】
一部の態様では、組換え核酸は、本明細書に記載のキメラＶＰ１タンパク質、例えば、式ＩによるキメラＶＰ１タンパク質をコードする。例えば、組換え核酸は、式ＬＩＶによるコード配列を含んでよい
Ａ’−Ｓ’−Ｌ’−Ｐ’−Ｂ’  （ＸＬＶＩＩ）
式中、
Ａ’およびＢ’は、独立して、存在しないまたは任意の所望のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり；
Ｓ’は、第１のノロウイルス株のＶＰ１のＳ−ドメインをコードするヌクレオチド配列であり；
Ｌ’は存在しないまたはリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列であり；
Ｐ’は、ノロウイルスＶＰ１のＰ−ドメインをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、Ｐの少なくとも一部は第２のノロウイルス株のＰ−ドメイン由来である。
【０１１２】
Ｌ’にコードされるリンカーペプチド、およびＡ’、Ｓ’、Ｐ’およびＢ’にコードされるアミノ酸配列は、それぞれＬ、Ａ、Ｓ、Ｐ、およびＢについて本明細書において記載されている通りである。
【０１１３】
特定の実施形態では、組換え核酸は、式Ｉ〜ＸＬＶＩのいずれか１つによるキメラＶＰ１タンパク質をコードするコード配列を含有する。
【０１１４】
他の特定の実施形態では、組換え核酸は、図７に示されている任意の一次構造を有するキメラＶＰ１タンパク質をコードするコード配列を含有する。
【０１１５】
Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来のＳ−配列とＮｏｒｗａｌｋ株（ｓｔａｉｎ）由来のＰ−配列；またはＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ株由来のＳ−配列とＧＩＩ．４  ２００６ａ．ＯＰＴＩ．Ｐ株由来のＰ−配列を含有するキメラＶＰ１タンパク質をコードする代表的な組換え核酸がそれぞれ図５および６に示されている。Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ配列の場合では、Ｓ−ドメインは、残基１〜２１６を包含し、リンカーは、残基２１７〜２２６を含む。Ｎｏｒｗａｌｋについては、Ｐ−配列は残基２３１〜５３０を包含した。２００６ａ配列については、Ｐ−配列は残基２２７〜５４１を包含した。追加的な代表的なノロウイルス配列は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８７６６１、Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７００５９；Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎウイルス、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１３４７４８、Ｈａｗａｉｉウイルス；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０７６１１、および以下の特許公報：ＷＯ０５／０３０８０６、ＷＯ００／７９２８０、ＪＰ２００２０２０３９９、ＵＳ２００３１２９５８８、米国特許第６，５７２，８６２号、ＷＯ９４／０５７００、およびＷＯ０５／０３２４５７に開示されている配列である。異なるノロウイルス株の配列の比較については、Ｇｒｅｅｎら（２０００年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８１巻（増補２）：Ｓ３２２−３３０；Ｗａｎｇら（１９９４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８巻：５９８２〜５９９０頁；Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻：６４６９〜６４７９頁；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９巻：５５４〜５６８頁；Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７８巻：１５７１〜１５７８頁も参照されたい。
【０１１６】
キメラＶＰ１タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、任意の適切な方法を用いて構築することができ（例えば、化学合成によって、組換えＤＮＡ技術を用いて）、かつ種々の形態をとってよい（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど）。組換え構築物を生成するための多くの適切な方法が当技術分野において周知であり、慣習的である。例えば、組換え核酸は、キメラＶＰ１タンパク質の一部をコードする配列を含む２つ以上のオリゴヌクレオチドから、または標準の分子生物学技法を用いて、オリゴヌクレオチドをライゲーションして全長のキメラＶＰ１タンパク質についてのコード配列を形成することによって生成することができる。例えば、米国特許第６，６３２，６０１号および米国特許第６，６３０，２９８号を参照されたい。核酸は、実質的に純粋な（すなわち、実質的に他の宿主細胞や非宿主細胞の核酸を含まない）形態で調製することが好ましい。
【０１１７】
対象のＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、感染した個体由来の便試料または吐物試料中に存在するウイルスＲＮＡに由来するゲノムライブラリーから単離することができる。あるいは、ノロウイルス核酸は、例えば、Ｅｓｔｅｓら、米国特許第６，９４２，８６５号；Ｇｕｎｔａｐｏｎｇら（２００４年）Ｊｐｎ  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ５７巻：２７６〜２７８頁；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻：３０３５〜３０４５頁；Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １７８巻：１５７１〜１５７８頁；および、Ｄｏｌｉｎら（１９７１年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １２３巻：３０７〜３１２頁に記載の通り、感染したヒトまたは他の哺乳動物から、または感染した個体から収集した便試料または吐物試料から単離することができる。ブタウイルスは、ＬＬＣ−ＰＫ細胞において、胆汁酸を含有する腸液の存在下で成長させることができる（Ｃｈａｎｇら（２００４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１巻：８７３３〜８７３８頁）。したがって、ＰＣＲなどの増幅方法を使用して、ポリヌクレオチドを、ノロウイルスのゲノムＲＮＡまたはコードするｃＤＮＡのいずれかから増幅することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、化学的に合成することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列についての適切なコドンを用いて設計することができる。合成構築物は、キメラＶＰ１タンパク質を生成する意図された宿主細胞において発現させるために最適化されたコドンを含有することが好ましい。対象のポリヌクレオチドの完全な配列は、標準の方法によって調製した、重複しているオリゴヌクレオチドから組み立て、完全なコード配列に組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２巻：７５６頁；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３巻：１２９９頁；Ｊａｙら（１９８４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９巻：６３１１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５年）Ｇｅｎｅ  １６４巻：４９〜５３頁を参照されたい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであっても、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質および脂質などの他の成分を含まずに単離することが好ましい。
【０１１８】
あるいは、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから入手することができる、または、適切な場合には、当技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて完全にまたは部分的に合成することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい。具体的には、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、重複している合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、次に適切なＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ライゲーションされたヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅することによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：４０８４〜４０８８頁を参照されたい。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ５４巻：７５〜８２頁）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２７頁およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９巻：１５３４〜１５３６頁）、および間隙のある（ｇａｐｐｅｄ）オリゴヌクレオチドの、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素的穴埋め（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１００２９〜１００３３頁）を使用することができる。
【０１１９】
キメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え構築物は、従来の方法を用いて、発現ベクターなどの適切なベクターに調製することができる。発現ベクターなどの組換え構築物は、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸配列を含む。組換え構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態であってよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。例えば、構築物はプラスミドの形態であってよい。所望の宿主細胞において組換えタンパク質を発現させるためのいくつもの適切なベクターが当技術分野において周知であり、慣習的である。適切なベクターは、これらに限定されないが、以下：複製起点；選択マーカー遺伝子；１もしくは複数の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナル；選択された宿主細胞（例えば、哺乳動物起源の宿主細胞または異種哺乳動物または非哺乳動物種由来の宿主細胞）における分泌経路に対してターゲティングするためのシグナル配列またはリーダー配列、の１または複数を含めたいくつもの成分を含有してよい。例えば、昆虫細胞における発現のために、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適切なバキュロウイルス発現ベクターを使用して、組換えバキュロウイルス粒子を生成する。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させるために使用して、組換えタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞における発現のために、所望の哺乳動物の宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において構築物の発現を駆動するベクターを使用する。同様に、酵母における発現のために、所望の酵母宿主細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現を駆動するベクターを使用する。
【０１２０】
真核細胞において本発明のＶＬＰを生成するために、ウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類のポックスウイルスを含めたポックスウイルス科のウイルス（ｐｏｘ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ）に由来するウイルスベクターを使用することができる。さらに、Ｔｏｍｅｉら（１９９３年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７巻：４０１７〜４０２６頁およびＳｅｌｂｙら（１９９３年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４巻：１１０３〜１１１３頁に記載のワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系も、本発明での使用が見出される。この系では、細胞をまず、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体にｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させる。このポリメラーゼは、それが、Ｔ７プロモーターを担持する鋳型のみを転写するという点で、優れた特異性を示す。感染させた後、細胞に、Ｔ７プロモーターによって駆動される対象のＤＮＡをトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されたポリメラーゼにより、トランスフェクトされたＤＮＡがＲＮＡに転写され、次いでそれが宿主の翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。あるいは、「前駆体」系（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔｔ（１９８６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８９巻：１１３〜１３０頁）の場合と同様に、Ｔ７を精製タンパク質または酵素として加えることができる。この方法により、多量のＲＮＡおよびその翻訳産物（複数可）が細胞質内において高レベルで一過性に生成する。
【０１２１】
組換え核酸は、自己複製する核酸分子（例えば、ＲＮＡ）、アルファウイルス粒子、アルファウイルスレプリコンなどのようなベクター発現系の形態、またはそのようなベクター発現系の成分であってよい。
【０１２２】
所望に応じて、ベクターは、検出可能なマーカーを含んでよい。例えば、検出可能なマーカーは、１または複数の抗生物質に対する抵抗性を付与するポリペプチドであってよい。本発明のベクターに関する追加的な情報は、以下のセクションＣにおいて提供される。
【０１２３】
Ｃ．ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成およびそのための宿主細胞
本発明は、さらに、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸を含有する組換え宿主細胞、ならびにキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質およびキメラＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰを生成するための方法を提供する。キメラＶＰ１タンパク質は、任意の適切な方法を用いて生成することができる。一般に、キメラＶＰ１タンパク質は、キメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え構築物を、適切な組換え宿主細胞、例えば、昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類（例えば、ハムスター）、トリの細胞（例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナの細胞（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）またはそれらの組み合わせにおいて発現させることによって生成される。多くの適切な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当技術分野で周知である。適切な昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、シュナイダーＳ２細胞、およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（親のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローン分離株）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞、一般にはせん断された（ｓｈｅａｒｅｄ）アデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換される）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎仔肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディンダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディンダービーイヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（例えば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、および、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞などのベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などが挙げられる。適切なトリの細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒルの細胞（例えば、Ｖａｃｃｉｎ��  ２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）およびＷＯ２００５／０４２７２８に記載されているＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞系（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ））、およびＥＢ６６細胞などが挙げられる。
【０１２４】
バキュロウイルス系などの適切な昆虫細胞発現系は、当業者に公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １５５５巻（１９８７年）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから、キットの形態で市販されている。トリ細胞発現系も当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および、同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許公開第ＥＰ１５００６９９号；ＷＯ０３／０４３４１５；および、ＷＯ０３／０７６６０１に記載されている。同様に、酵母、細菌および哺乳動物細胞発現系も当技術分野で公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９年）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【０１２５】
一部の態様では、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質を生成するための方法は、キメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸で形質転換した宿主細胞を、核酸の発現に適した条件下で培養するステップを含み、それにより、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質が生成される。キメラＶＰ１タンパク質は、自己集合してＶＬＰを形成し得、宿主細胞をＶＬＰの形成に適した条件下で維持することが好ましい。ＶＬＰの形成に適した条件は周知であり、当業者により容易に決定される。例えば、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および昆虫細胞（ＳＦ９）におけるウイルス粒子の生成について記載されている米国特許第７，５２７，８０１号、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＬＰの生成について記載されているＴａｕｂｅ，  Ｓ．ら（２００５年）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５０巻：１４２５〜１４３１頁を参照されたい。所望に応じて、方法は、キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質、キメラＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰまたはそれらの組み合わせを培養培地または細胞から単離または精製するステップをさらに含んでよい。いくつかの好ましい実施形態では、キメラＶＰ１タンパク質および／またはキメラＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰを生成するために使用する宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、またはそれらの組み合わせである。
【０１２６】
本発明は、多価ＶＬＰを生成するための方法も提供する。多価ＶＬＰは、２つの異なるキメラＶＬＰをコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を維持することによって調製することができる。例えば、これは、酵母において発現させるためのｐＣＤＣ．７などのバイシストロン性の発現ベクターを使用して実現することができる。あるいは、２つ以上の一価ＶＬＰを調製し、必要に応じて、精製し、次いで、混合して多価のＶＬＰ処方物を生成することができる。
【０１２７】
ノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質、およびＶＬＰは、ノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸分子を、例えば、該組換え核酸を哺乳動物に投与した後、該哺乳動物の細胞により、ベクター発現系の形態でまたはベクター発現系の成分として発現させることによっても生成することができる。
【０１２８】
Ｄ．ＶＬＰの単離および精製
本発明はさらに、ノロウイルスＶＬＰを培養培地、宿主細胞またはそれらの組み合わせから単離または精製する方法を提供する。宿主細胞の培養培地、すなわち、馴化培養培地から直接ＶＬＰを単離または精製することが好ましい。しかし、所望に応じて、例えば遠心分離によって宿主細胞を回収することができ、任意の適切な方法を用いて宿主細胞のホモジネートまたは溶解物を形成することができ、ＶＬＰを単離することができる。ＶＬＰを実質的にインタクトな状態にしたまま細胞を溶解する適切な化学的手段、物理的手段または機械的手段は当技術分野で公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏｃｈ（Ｅ．  Ｌ．  Ｖ．  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．  Ａｎｇａｌ編、１９９０年）に記載されている。
【０１２９】
ＶＬＰは、培養培地または宿主細胞、例えば、細胞溶解物またはホモジネートから、任意の適切な方法を用いて単離することができる。ＶＬＰの完全性を維持する適切な方法、例えば、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレット形成など（例えば、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒら（１９９３年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７巻：６９２９〜６９３６頁を参照されたい）、ならびに、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含めた標準の精製技法を使用することができる。スクロースクッションまたはスクロース勾配での遠心分離は、ＶＬＰをＶＰ１単量体またはオリゴマーから単離するため、および他の細胞成分から単離するための都合のよい方法である。これらの方法は、単独で使用すること、継続的に使用すること、およびより大規模な精製スキームの中に組み込んで使用することができる。例えば、スクロースクッションまたは勾配で精製したＶＬＰは、その後に、所望に応じて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは任意の他の適切な方法を用いてさらに精製することができる。特定の実施例では、ノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ノロウイルスのＶＰ１タンパク質を発現している酵母細胞の培地から精製することができる。その培地を低速で回転させて（１５，０００×ｇ）、余分の細胞または細胞の破片を除去することができる。このステップの後、４０％スクロースクッションによる高速回転（１００，０００×ｇ）を実施して、ウイルス様粒子を遊離のタンパク質および他の材料から分離することができる。ＶＬＰを含有するペレットを緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁させ、イオン交換カラムにローディングすることができる。塩勾配を用いてカラムからＶＬＰを溶出させることができる。最後に、ＶＬＰを含有する溶出画分を濃縮し、緩衝液を低塩濃度の緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）と交換し、必要になるまで４℃で保管することができる。
【０１３０】
Ｅ．免疫原性組成物
上記の通り、本発明は、１または複数のキメラＶＰ１タンパク質を、好ましくはＶＬＰの形態で含む免疫原性組成物も提供する。２種以上の異なるキメラＶＰ１タンパク質、一価ＶＬＰ、または多価ＶＬＰを一緒に混合して、２種以上の異なるＶＰ１のＰ−ドメインを含有する多価の免疫原性組成物を生成することができる。
【０１３１】
免疫原性組成物は、キメラＶＰ１タンパク質、ＶＬＰおよび核酸の混合物を含み得、これは今度は、同一または異なるビヒクルを使用して送達され得る。抗原は、例えば、予防的な（すなわち、感染を予防するための）免疫原性組成物または治療的な（感染を処置するための）免疫原性組成物中で、個別に、または組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、所望の効果を実現するために、２回以上与えてよい（例えば、「初回刺激（ｐｒｉｍｅ）」投与、その後の１または複数の「追加刺激（ｂｏｏｓｔ）」）。同じ組成物を、１または複数の初回刺激ステップおよび１または複数の追加刺激ステップで投与してよい。あるいは、初回刺激および追加刺激のために異なる組成物を用いてよい。
【０１３２】
免疫原性組成物は、所望に応じて、ノロウイルス由来または別の病原体由来の１または複数の他の抗原をさらに含んでよい。例えば、組み合わせの免疫原性組成物は、キメラＶＰ１タンパク質および別の病原体、例えば、細菌性病原体、ウイルス性病原体または真菌性病原体由来の１または複数の抗原を含むノロウイルスＶＬＰを含有してよい。例えば、本発明の免疫原性組成物は、本明細書に記載のキメラＶＰ１タンパク質、および１または複数のロタウイルス抗原、例えば、弱毒生ロタウイルス（例えば、ＲＯＴＡＲＩＸ（ロタウイルスワクチン、生、経口用；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））、１または複数の生リアソータントロタウイルス（例えば、ＲＯＴＡＴＥＱ（ロタウイルスワクチン、生、経口用、五価；Ｍｅｒｃｋ）、ＲＯＴＡＳＨＩＥＬＤ（ロタウイルスワクチン、生、経口用、四価；Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ））、非ヒトロタウイルス（例えば、子ヒツジロタウイルス（Ｌａｎｚｈｏｕ）、ウシロタウイルス、アカゲザルロタウイルス）、リアソータントロタウイルス（例えば、ヒト−ウシリアソータントロタウイルス、ヒト−子ヒツジリアソータントロタウイルス、ヒト−アカゲザルリアソータントロタウイルス）、不活化ロタウイルス（例えば、熱失活させたロタウイルス）、ロタウイルスサブユニット（例えば、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、またはそれらの任意の組み合わせ）、ロタウイルスサブユニットＶＬＰまたはワクチンを含むノロウイルスＶＬＰを含んでよい。
【０１３３】
別の態様では、免疫原性組成物は、ノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む。所望に応じて、そのような免疫原性組成物は、適切な核酸送達系、例えば、リポソーム、リポプレックス、エマルション（ナノエマルション、マイクロエマルション）、粒子（ナノ粒子、微小粒子）、ベクター、例えばウイルス粒子、およびレプリコンなどを含有してよい。
【０１３４】
免疫原性組成物は、一般に、１または複数の「薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル」、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを、単独で、または組み合わせて含む。免疫原性組成物は、典型的に、上記の成分に加えて、１または複数の「薬学的に許容されるキャリア」を含む。これらとしては、それ自体は、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的に、大型の、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸共重合体、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソームなど）などである。そのようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、補助的な物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在してよい。薬学的に許容される成分の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【０１３５】
薬学的に許容される塩、例えば、無機塩類、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩など、ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩なども、本発明の免疫原性組成物において用いることができる。
【０１３６】
所望に応じて、抗原は、リポソームおよび粒子キャリア、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチドｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）の微小粒子またはナノ粒子などに吸着させる、その中に閉じ込める、またはその他の方法でそれと結びつけることができる。抗原は、免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化することができる。Ｒａｍｓａｙら（２００１年）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７巻（９２５１号）：１９５〜１９６頁；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ２巻：Ｓ２８〜３６頁；Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ（２０００年）Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４巻：１６３〜１６８頁；Ａｈｍａｄ  ＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １３巻：１１３〜１３３頁、ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８年）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７巻：５６３〜５６７頁；欧州特許第０４７７５０８号；米国特許第５，３０６，４９２；ＷＯ９８／４２７２１；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ  ３８０５５４９３２６、特に１０巻：４８〜１１４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘを参照されたい。
【０１３７】
本発明の免疫原性組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。例えば、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでよい。好ましいアジュバントとしては、これらに限定されないが、下記のアジュバントの以下の１または複数の型が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、投与する前にアジュバントと予め混合することもできる。
【０１３８】
ミョウバン
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバン誘導体、例えば、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合し、次いで、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて滴定し、沈殿させることによってｉｎ−ｓｉｔｕで形成されるミョウバン誘導体などである。
【０１３９】
レチノイン酸
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ビタミンＡの酸化形態であり、部分的なビタミンＡ機能のみを持つレチノイン酸である。
【０１４０】
ＭＦ５９Ｃ．１
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、クエン酸緩衝液中の水中油エマルジョン（スクアレン）であるＭＦ５９Ｃ．１である。ＭＦ５９Ｃ．１は、有効なアジュバントであり、パルボウイルスＢ１９に対する高い力価の中和性抗体の生成を増強することが示されている（Ｂａｌｌｏｕら、ＪＩＤ、１８７巻：６７５〜６７８頁（２００３年））。
【０１４１】
鉱質を含有する組成物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、鉱質を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などが挙げられる。適切な無機塩としては、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第８章および９章を参照されたい）、または、異なる鉱質化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバント（必要に応じて過剰なリン酸塩を含む）の混合物）が挙げられ、この化合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取り、塩（複数可）への吸着が好ましい。鉱質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１４２】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）で表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物から、赤外（ＩＲ）分光法により、特に１０７０ｃｍ−１での吸収バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーの存在により区別できる［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ…  （１９９５）  ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．  ＩＳＢＮ：  ０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍ．の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）により反映され、結晶性が乏しい粒子は、より小さい晶子サイズのために、より大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、より高いＷＨＨの値を有するアジュバントは、抗原吸着のための能力がより大きいことが観察されている。繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわちアジュバント自体は生理的ｐＨにて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１４３】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムである（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、通常、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．３〜１．２である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により厳密なＡｌＰＯ４から区別できる。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば２００℃に加熱時）でのＩＲスペクトルのバンドは、構造上のヒドロキシルの存在を示す［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ…  （１９９５）  ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．  ＩＳＢＮ：  ０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍ．の第９章］。
【０１４４】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、通常、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩について、一般的に、非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に、粒子状である（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような板状の形態）。この粒子の典型的な直径は、任意の抗原を吸着した後に０．５〜２０μｍ（例えば約５〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７〜１．５ｍｇタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１４５】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、通常、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【０１４６】
本発明の組成物を調製するために用いるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液）を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁物は、滅菌されており、発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭから２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭの間、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性ホスフェートイオンを含むことができる。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。
【０１４７】
一実施形態において、アジュバント成分としては、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が挙げられる。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化アルミニウムよりも多く、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在してよい。
【０１４８】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大≦０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１４９】
油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した油エマルジョン組成物としては、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン［Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第１０章］（マイクロフルダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も用いることができる。
【０１５０】
種々の適切な水中油エマルジョンが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的には、直径５μｍ未満であり、有利には、上記エマルジョンは、理想的にはサブミクロンの直径の油滴を有し、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて安定なエマルジョンを得ることにより達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。
【０１５１】
本発明は、動物（例えば魚類）または植物の供給源からのもののような油とともに使用することができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま種子油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって本発明の実施において用いてよい。動物の供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術において周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、５炭素イソプレンユニットで生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドとよばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有する。他の好ましい油は、トコフェロールである（下記参照のこと）。スクアレンを含む水中油エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を用いることができる。
【０１５２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性比）により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎとよばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのようなＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）を含む界面活性剤を用いることができる。エマルジョンに含むために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。上記したように、Ｔｗｅｅｎ８０のような洗浄剤は、以下の実施例にみられる熱安定性に寄与し得る。
【０１５３】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））の組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【０１５４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズのその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【０１５５】
本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むが、それらに限定されない：
・スクアレンとＴｗｅｅｎ８０とＳｐａｎ８５とのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの体積での組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量の点において、これらの比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５になる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、シトレートイオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【０１５６】
・スクアレンとαトコフェロールとポリソルベート８０とを含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ８０を有してよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するので、好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。スクアレンとＴｗｅｅｎ８０とは、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことにより作製できる。得られるエマルジョンは、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。
【０１５７】
・スクアレンとトコフェロールとＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とのエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照のこと）も含んでよい。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してよい。
【０１５８】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）とＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とトコフェロール（例えばα−トコフェロールスクシネート）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０の質量比で含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照のこと）も含んでよい。水相は、リン酸緩衝液を含有してよい。
【０１５９】
・スクワランとポリソルベート８０とポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）とのエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント中で用いられている（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクワラン、２．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバントにおけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる（５％スクワラン、１．２５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微小流動化が好ましい。
【０１６０】
・スクアレンと水性溶媒とポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）と疎水性非イオン性界面活性剤（例えばソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）とを含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または少なくとも９０％の油滴（体積による）が２００ｎｍ未満のサイズである。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１または複数も含んでよい。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。
【０１６１】
・０．５〜５０％の油と、０．１〜１０％のリン脂質と、０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤とを含むエマルジョン。好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１６２】
・非代謝性油（例えば軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））と少なくとも１種の界面活性剤（例えばレシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性物質結合体（例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、ＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。
【０１６３】
・鉱油と、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン（ＷＯ２００６／１１３３７３を参照のこと）。
【０１６４】
・鉱油と、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）とを含むエマルジョン（ＷＯ２００６／１１３３７３を参照のこと）。
【０１６５】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えばコレステロール）とが、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン。
【０１６６】
組成物中の抗原（ＶＬＰ）およびアジュバントは、典型的に、患者に送達される時には、混和物中にあるであろう。エマルジョンは、抗原（ＶＬＰ）と、製造中に混合することができる、または、送達時に即席で混合することができる。よって、アジュバントおよび抗原（ＶＬＰ）は、使用時に最終的な処方物にすぐ準備できる、包装または分配されたワクチン中に別々に保持することができる。抗原（ＶＬＰ）は、一般に、最終的に２つの液体を混合することによってワクチンを調製するために、水性の形態であろう。混合するための２つの液体の体積比は、変動してよいが（例えば、５：１と１：５の間）、一般に約１：１である。
【０１６７】
サポニン処方物（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第２２章を参照されたい）
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見いだされるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に取得可能である。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製された処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。
【０１６８】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい。
【０１６９】
サポニンとコレステロールの組み合わせを使用して、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第２３章）。ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなども含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに用いることができる。ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１または複数を含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは、ＷＯ９６／３３７３９にさらに記載されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加的な洗浄剤を欠いてよい。
【０１７０】
ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、必要に応じてリン脂質と組み合わされる、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができる、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が挙げられる。
【０１７１】
細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性の誘導体など、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を包含する。
【０１７２】
ＬＰＳの無毒性の誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの「小粒子」形態は、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過するのに十分小さい（ＥＰ−Ａ−０６８９４５４）。他の無毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣体（ｍｉｍｉｃ）、例えば、ＲＣ−５２９などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体などが挙げられる。
【０１７３】
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４などが挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：２４８５〜２４９１頁およびＰａｊａｋら（２００３年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１巻：８３６〜８４２頁に記載されている。
【０１７４】
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。
【０１７５】
ＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾などを含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献であるＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１巻：２３９３〜２４００頁；ＷＯ０２／２６７５７、およびＷＯ９９／６２９２３は、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンとの交換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９巻：８３１〜８３５頁；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら（２００２年）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３２巻：１７９〜１８５頁；ＷＯ９８／４０１００；ＵＳ６，２０７，６４６；ＵＳ６，２３９，１１６；およびＵＳ６，４２９，１９９においてさらに考察されている。
【０１７６】
ＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフなど）は、ＴＬＲ９に向けられ得る（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３１巻（第３部）：６５４〜６５８頁）。ＣｐＧ配列は、例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよい、または、例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなどＢ細胞応答誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（２００３年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０巻：４０６１〜４０６８頁；Ｋｒｉｅｇ（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３巻：６４〜６５頁およびＷＯ０１／９５９３５において考察されている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０１７７】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために５’末端を利用できるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端に付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３１巻（第３部）：６５４〜６５８頁およびＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）ＢＢＲＣ  ３０６巻：９４８〜９５３頁；Ｂｈａｇａｔら（２００３年）ＢＢＲＣ  ３００巻：８５３〜８６１頁およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０１７８】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として公知である（Ｓｃｈｅｌｌａｃｋら（２００６年）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４巻：５４６１〜５４７２頁）。よって、本発明で用いるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと連結してジヌクレオチドを形成しているシトシン）を含めたオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）と（ｉｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（複数可）を含めたオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）などのポリカチオンポリマーの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号９）を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、１１−ｍｅｒのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号１０）を含むペプチドであってよい。
【０１７９】
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来することが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、ＷＯ９５／１７２１１に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は、ＷＯ９８／４２３７５に記載されている。毒素または類毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく；Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などであることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、Ｂｅｉｇｎｏｎら（２００２年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０巻：３０１２〜３０１９頁；Ｐｉｚｚａら（２００１年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら（２０００年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９０巻：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら（２０００年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８巻：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７巻：６２７０〜６２８０頁；Ｐａｒｔｉｄｏｓら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６７巻：２０９〜２１６頁；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら（２００３年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２巻：２８５〜２９３頁；Ｐｉｎｅら（２００２年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８５巻：２６３〜２７０頁およびＴｅｂｂｅｙら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８巻：２７２３〜３４頁に見いだすことができる。有用なＣＴ変異体はＣＴ−Ｅ２９Ｈである。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれるＤｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５巻：１１６５〜１１６７頁に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
【０１８０】
ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキンなど（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）（ＷＯ９９／４０９３６およびＷＯ９９／４４６３６）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節物質はＩＬ−１２である。
【０１８１】
生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら）（２００１年）Ｊ  Ｃｏｎｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０巻：２６７〜２７６頁）、または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体などが挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる（ＷＯ９９／２７９６０）。
【０１８２】
微小粒子
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて、生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、それを、負に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン洗浄剤を用いて）。
【０１８３】
リポソーム（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ、Ｐｌｅｎｕｍの第１３章および１４章）
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、ＵＳ６，０９０，４０６、ＵＳ５，９１６，５８８およびＥＰ  Ａ０６２６１６９に記載されている。
【０１８４】
ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（ＷＯ９９／５２５４９）を包含する。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）ならびに少なくとも１つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールなどと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１８５】
ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら（１９９８年）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９巻：１０９〜１１５頁およびＰａｙｎｅら（１９９８年）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ３１巻：１８５〜１９６頁に記載されている。
【０１８６】
ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１８７】
イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物（例えば、「レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）３Ｍ」）が挙げられ、Ｓｔａｎｌｅｙ（２００２年）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２７巻：５７１〜５７７頁およびＪｏｎｅｓ（２００３年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ４巻：２１４〜２１８頁においてさらに記載されている。
【０１８８】
ベンゾナフチリジン（Ｂｅｎｚｏｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）
本発明においてアジュバントとして使用するために適したベンゾナフチリジン化合物の例は、ＷＯ２００９／１１１３３７に記載されている。
【０１８９】
リポペプチド
リポペプチド（すなわち、１または複数の脂肪酸残基および２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物）は、免疫賦活特性を有することが公知である。グリセリルシステイン（ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）に基づくリポペプチドは、本発明においてアジュバントとして使用するために特に適している。そのようなペプチドの特定の例としては、次式の化合物が挙げられる：
【０１９０】
【化３】
2018086020.tif 000004
【０１９１】
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、必要に応じて酸素官能基で置換されていてもよい８個から３０個まで、好ましくは１１個から２１個までの炭素原子を有する飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、飽和混成脂環式−脂肪族炭化水素基、または不飽和混成脂環式−脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ３は、水素、またはＲ１が上記と同じ意味を有するＲ１−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−基を表し、Ｘは、ペプチド結合によって結合した、遊離のカルボキシ基、エステル化されたカルボキシ基またはアミド化されたカルボキシ基を有するアミノ酸、または末端のカルボキシ基が遊離であるか、エステル化した形態であるか、アミド化した形態である２〜１０アミノ酸のアミノ酸配列を表す。特定の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｄ−アミノ酸、例えば、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）またはＤ−ガンマ−カルボキシ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌａ）を含む。
【０１９２】
細菌のリポペプチドは、一般に、ＴＬＲ６が関与することを必要とせずにＴＬＲ２を認識する。（ＴＬＲは協同的に作動して、種々のトリガーの特異的な認識をもたらし、ＴＬＲ２とＴＬＲ６は一緒になってペプチドグリカンを認識するが、ＴＬＲ２はリポペプチドの認識にはＴＬＲ６を伴わない）。これらは、時には天然リポペプチドと合成リポペプチドとに分類される。合成リポペプチドは同様の挙動をする傾向があり、主にＴＬＲ２によって認識される。
【０１９３】
本発明においてアジュバントとして使用するために適したリポペプチドとしては、次式を有する化合物：
【０１９４】
【化４】
2018086020.tif 000005
【０１９５】
（式中、＊で標識されたキラル中心および＊＊＊で標識されたキラル中心はどちらもＲ立体配置にあり；
＊＊で標識されたキラル中心はＲ立体配置またはＳ立体配置のいずれかにあり；
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それぞれ独立して、酸素官能基によって置換されていてもよい７〜２１個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基または脂環式−脂肪族炭化水素基である、またはＲ１ａおよびＲ１ｂのうちの両方ではなく一方がＨであり；
Ｒ２は、酸素官能基によって置換されていてもよい１〜２１個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基または脂環式炭化水素基であり；
ｎは０または１であり；
Ａｓは−Ｏ−Ｋｗ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｋｗ−ＣＯ−のいずれかを示し、Ｋｗは１〜１２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であり；
Ａｓ１は、Ｄ−アルファアミノ酸またはＬ−アルファアミノ酸であり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、アミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−アルファアミノ酸またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨ基またはＮ末端基、またはＤ−アルファアミノカルボン酸およびＬ−アルファアミノカルボン酸から選択される最大６個のアミノ酸を有するペプチドおよびアミノ−低級アルキル−スルホン酸の、Ｄ−アルファアミノ酸またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨ基またはＮ末端基を示し；
Ｚ３はＨまたは−ＣＯ−Ｚ４であり、ここで、Ｚ４はアミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−アルファアミノ酸またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨ基またはＮ末端基、またはＤアルファアミノカルボン酸およびＬ−アルファアミノカルボン酸から選択される最大６個のアミノ酸を有するペプチドおよびアミノ−低級アルキル−スルホン酸の、Ｄ−アルファアミノ酸またはＬ−アルファアミノ酸の−ＯＨ基またはＮ末端基である）；またはそのような化合物のカルボン酸から形成されるエステルまたはアミドが挙げられる。適切なアミドとしては−ＮＨ２およびＮＨ（低級アルキル）が挙げられ、適切なエステルとしてはＣ１〜Ｃ４のアルキルエステルが挙げられる。（本明細書で使用される場合、低級アルキルまたは低級アルカンは、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖アルキルまたは分枝アルキルをいう）。
【０１９６】
そのような化合物は、ＵＳ４，６６６，８８６により詳細に記載されている。本発明においてアジュバントとして使用するために適したリポペプチド化合物の例は、次式を有するリポペプチドである：
リポペプチド種の別の例はＬＰ４０と称され、ＴＬＲ２のアゴニストである。Ａｋｄｉｓら（２００３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３３巻：２７１７〜２７２６頁。
【０１９７】
これらは、ムレインリポタンパク質と称されるＥ．ｃｏｌｉ由来のリポペプチドの公知のクラスと関連する。ムレインリポペプチドと称されるこれらのタンパク質の特定の部分的な分解生成物は、Ｈａｎｔｋｅら（１９７３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３４巻：２８４〜２９６頁に記載されている。これらは、Ｎ−アセチルムラミン酸と連結したペプチドを含み、したがって、ムラミルペプチドと関連する。これらは、Ｂａｓｃｈａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８９年）４５巻（２０号）：６３３１〜６３６０頁に記載されている。
【０１９８】
本発明は、上記のアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において用いることができる：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、同第０７３５８９８号および同第０７６１２３１号）；（６）サブミクロンのエマルジョンに微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅ）した、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１または複数の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例えば、３ｄＭＰＬなど）。
【０１９９】
免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ．．．（１９９５年）Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編  ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍの第７章に開示されている。水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に小児において有用であり、一般に、抗原はこれらの塩に吸着される。水中スクアレンエマルジョンも、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとミョウバンの組み合わせ、またはレシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とミョウバンの組み合わせなどが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬの組み合わせを用いてもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＶＰ１およびＶＰ２を含有するパルボウイルス・ＶＬＰ、およびＭＦ５９などのアジュバントを含有する免疫原性組成物である。ＶＬＰとアジュバント（例えば、ＭＦ５９）は、予め混合し、単一の組成物として提供することができる、または、投与する前に混合するための別々の成分として提供することができる。
【０２０１】
Ｅ．投与
本発明の組成物（例えば、ノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質、ＶＬＰ、およびノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質をコードする核酸を含む組成物）は、一般に、患者に直接投与されるであろう。直接的な送達は、非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｓｐａｃｅ）へ）、または粘膜を通じて、例えば、直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、噴霧）、膣への投与、局所投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与（例えば、ＷＯ９９／２７９６１を参照されたい）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４およびＷＯ０２／０６４１６２を参照されたい）、鼻腔内投与（例えば、ＷＯ０３／０２８７６０を参照されたい）、眼への投与、耳への投与、肺への投与または他の粘膜投与などによって実現することができる。経皮送達は、例えば、マイクロニードル（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ）を使用して達成され得る。免疫原性組成物も、皮膚の表面に直接移すことによって局所的に投与してもよい。局所投与は、いかなるデバイスも利用することなく、または包帯または包帯様デバイスを利用して裸の皮膚を免疫原性組成物と接触させることによって実現することができる（例えば、米国特許第６，３４８，４５０号を参照されたい）。
【０２０２】
投与形式は、非経口的な免疫、粘膜免疫、または粘膜免疫と非経口的な免疫の組み合わせであることが好ましい。投与形式は、１〜３週間離した合計１〜２回のワクチン接種での非経口的な免疫、粘膜免疫、または粘膜免疫と非経口的な免疫の組み合わせであることがさらに好ましい。投与経路は、これらに限定されないが、経口的な送達、筋肉内の送達および経口的な送達および筋肉内の送達の組み合わせを含むことが好ましい。
【０２０３】
粘膜病原体由来の抗原、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ抗原などに対する粘膜免疫応答および全身免疫応答は、粘膜に初回刺激し、その後全身的に追加刺激する免疫により増強し得ることがすでに実証されている（Ｖａｊｄｙら（２００３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０巻：８６〜９４頁）。いくつかの実施形態において、ノロウイルスによる感染を処置または予防するための方法は、それを必要とする被験体に、１または複数のノロウイルス抗原を含む第１の免疫原性組成物を、粘膜に投与し、次いで、１または複数のノロウイルス抗原を含む第２の免疫原性組成物を治療有効量で非経口的に投与することを含む。
【０２０４】
免疫原性組成物は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するため、好ましくは増強された全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。
【０２０５】
免疫応答は、血清ＩｇＧ免疫応答および／または腸のＩｇＡ免疫応答の誘導を特徴とすることが好ましい。
【０２０６】
上記の通り、初回刺激−追加刺激方法は、１または複数の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を「初回刺激」ステップで送達し、その後、１または複数の第２の遺伝子送達ベクターおよび／またはポリペプチド抗原を「追加刺激」ステップで送達する場合に用いることが好ましい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の１または複数の遺伝子送達ベクターまたはポリペプチド抗原を用いた初回刺激および追加刺激の後に、１または複数のポリペプチドを含有する組成物（例えば、ノロウイルス抗原を含むポリペプチド）をさらに追加刺激する。
【０２０７】
共投与を伴う任意の方法では、種々の組成物を任意の順序で送達することができる。よって、複数の異なる組成物または分子を送達することを含む複数の実施形態において、核酸の全てがポリペプチドの前に送達される必要はない。例えば、初回刺激ステップは、１または複数のポリペプチドを送達することを含んでよく、追加刺激は、１もしくは複数の核酸および／または１もしくは複数のポリペプチドを送達することを含む。複数のポリペプチドを投与した後に、複数の核酸の投与を行うことができる、またはポリペプチドおよび核酸の投与を任意の順序で実施することができる。よって、本明細書に記載の遺伝子送達ベクターの１または複数、および本明細書に記載のポリペプチドの１または複数を、任意の順序で任意の投与経路によって共投与することができる。よって、本明細書に記載のポリヌクレオチドとポリペプチドの任意の組み合わせを使用して、免疫反応を惹起することができる。
【０２０８】
（ｉ）投薬レジメン
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールに従ってもよい。多回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路、例えば非経口的な初回刺激および粘膜での追加刺激、粘膜での初回刺激および非経口的な追加刺激などにより与えてよい。
【０２０９】
投薬レジメンにより、抗体応答のアビディティが増強され、中和特性を持つ抗体がもたらされることが好ましい。
【０２１０】
ある場合では、血清中の抗体レベルと、ノロウイルスによって引き起こされる疾患からの防御との間に相関がある。例えば、多数の攻撃試験において、血清中の抗体レベルは、高用量のＮｏｒｗａｌｋウイルスを用いて経口的な攻撃を繰り返した（２〜３回）後の防御と関連した（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １６１巻：１８〜２１頁）。別の試験では、抗体が先在していない乳児では２３人のうち１８人にヒトカリシウイルスによって引き起こされる胃腸炎が発生したが、抗体レベル先在している乳児では１８人のうち１５人が病気にならなかった（Ｒｙｄｅｒら（１９８５年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５１巻：９９〜１０５頁）。さらに別の研究では、Ｎｏｒｗａｌｋ感染による発症は、ベースラインのＮｏｒｗａｌｋ抗体力価が１：１００を超える人では１３％であったのと比較して、ベースラインのＮｏｒｗａｌｋ抗体力価が１：１００未満である人では４７％であった（ｐ＜０．００１）（Ｒｙｄｅｒら（１９８５年）Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １５１巻：９９〜１０５頁）。一部の個体は特定のノロウイルス株に対する受容体を生成せず、したがって、それらのノロウイルス株に対して本質的に抵抗性であるので、抗体の存在が、防御ではなく特定の株に対する感受性と相関するという異常な結果が認められ得る。Ｐａｒｒｉｎｏら（１９９７年）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ２９７巻：８６〜８９頁を参照されたい。
【０２１１】
上記のとおりキメラノロウイルスＶＰ１タンパク質およびＶＬＰを、哺乳動物、例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与して、ノロウイルスに特異的なＴ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化することができる。投与は、上記で考察されるように、遺伝子銃（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｇｕｎ）を用いた注射を含めた非経口注射、鼻腔内注射、筋肉内注射または皮下注射を含めた当技術分野で公知の任意の手段によるものでよい。
【０２１２】
キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質またはＶＬＰを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答および／または体液性応答）、好ましくは防御免疫応答を誘導するために有効な量で投与する。
【０２１３】
ノロウイルスに特異的なＴ細胞応答は、とりわけ、５１Ｃｒ放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって、またはＩＦＮ−γを細胞内染色することによって測定することができる。タンパク質は、ノロウイルスに感染していない哺乳動物に投与することができる、または、ノロウイルスに感染している哺乳動物に投与することができる。組成物中の融合タンパク質の詳細な投与量は、これらに限定されないが、組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、および全身状態、ならびに組成物の投与形式を含めた多くの因子に左右されるであろう。本発明の組成物の有効量は、常套的な実験のみを用いて容易に決定することができる。適切な用量を同定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを用いることができる。一般に、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、または１０ｍｇのノロウイルスポリペプチドまたはＶＬＰを、大型の哺乳動物、例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与するであろう。所望に応じて、共起刺激分子またはアジュバントも、組成物の前、その後、またはそれと一緒に提供することができる。
【０２１４】
本発明の組成物を送達することによって生じる、ノロウイルスに特異的なＴ細胞の活性化を含めた哺乳動物の免疫応答は、投与量、投与経路、または追加刺激レジメンを変動させることによって増強することができる。本発明の組成物は、単回投与スケジュール、または、好ましくは、ワクチン接種の一次過程が１〜１０の別個の用量を含み、その後、その後の免疫応答を維持し、かつ／または強化するために必要な時間間隔で他の用量を与え、例えば、１〜４カ月で第２の用量を与え、必要に応じて、その後、数か月後に１または複数の用量を与える多回用量スケジュールで与えてよい。
【０２１５】
Ｆ．免疫応答の効力を決定するための試験
治療的な処置の効力を調査する１つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を調査する別の方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する全身免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＧ１生成レベルおよびＩｇＧ２ａ生成レベルをモニターすることなど）および粘膜免疫応答をモニターすること（例えば、ＩｇＡ生成レベルをモニターすることなど）の両方を伴う。典型的に、血清特異的な抗体応答は、免疫した後、攻撃する前に決定されるが、一方、粘膜特異的な抗体応答は、免疫し、攻撃した後に決定される。
【０２１６】
本発明の免疫原性組成物の成分タンパク質の免疫原性の別の評価の仕方は、タンパク質を組換えによって発現させて、患者の血清または粘膜の分泌物を免疫ブロットによってスクリーニングすることである。タンパク質と患者血清との間の陽性反応は、患者において問題のタンパク質に対する免疫応答が以前開始されたことがある−すなわち、そのタンパク質が免疫原であることを示す。この方法は、免疫優性タンパク質および／またはエピトープを同定するためにも用いることができる。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ効力モデルとしてはヒト攻撃モデルが挙げられ、これは、ＮＩＨおよびＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によって支持される（例えば、Ｌｉｎｄｅｓｍｉｔｈら（２００３年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：５４８〜５５３頁およびＬｉｎｄｅｓｍｉｔｈら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９巻：２９００〜２９０９頁を参照されたい）。
【０２１８】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、改善された、または増強された、または変化した免疫応答であってよい。免疫応答は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、増強された全身応答および／または粘膜応答であることが好ましい。
【０２１９】
増強された全身免疫および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１免疫応答および／またはＴＨ２免疫応答に反映される。免疫応答の増強は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生成の増加を含むことが好ましい。粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答であることが好ましい。粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増加を含むことが好ましい。
【０２２０】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体生成を増強し、よって、細胞外の感染に対する応答において価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１または複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答により、将来の防御のためにＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞が生成され得る。
【０２２１】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０など）の１または複数の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の生成の増加のうち１または複数を含んでよい。増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１生成の増加を含むようになることが好ましい。
【０２２２】
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦβなど）の１または複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの生成の増加のうち１または複数を含んでよい。増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ生成の増加を含むようになることが好ましい。
【０２２３】
本発明の免疫原性組成物、具体的には、本発明の１または複数の抗原を含む免疫原性組成物は、単独で、または他の抗原と組み合わせて、必要に応じてＴｈ１応答および／またはＴｈ２応答を惹起することができる免疫調節剤と一緒に用いることができる。
【０２２４】
本発明は、１または複数の免疫調節剤、例えば、アルミニウム塩などの無機塩など、およびＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物も含む。免疫原性組成物は、アルミニウム塩とＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドの両方を含むことが最も好ましい。あるいは、免疫原性組成物は、ＡＤＰリボシル化毒素、例えば、解毒されたＡＤＰリボシル化毒素など、およびＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む。１または複数の免疫調節剤はアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、上でさらに説明されているＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１または複数から選択することができる。
【０２２５】
感染に有効に対処するために、本発明の免疫原性組成物により細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方が引き出されることが好ましい。この免疫応答により、長持ちする（例えば、中和）抗体および１または複数の感染性抗原に曝露させると直ちに応答し得る細胞媒介性免疫が誘導されることが好ましい。
【０２２６】
Ｇ．医薬品としての免疫原性組成物の使用
本発明は、医薬品として使用するための（特にワクチンを作製するための、またはワクチンとして使用するための）本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること（すなわち、免疫原性組成物である）が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。胃腸炎、好ましくは急性胃腸炎などの腸の感染症を予防および／または処置するためにワクチンを使用することが好ましい。胃腸炎は、水様下痢ならびに／または腸の蠕動（ｐｅｒｉｓｔａｌｉｓｉｓ）および／もしくは運動性の両方をもたらすイオンおよび／または水の移動の不均衡に起因し得る。胃腸炎は、嘔吐ももたらす場合がある。
【０２２７】
本発明は、上記の組成物を用いて免疫応答を誘導する、または増大させるための方法を提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および／または細胞媒介免疫を含んでよい（全身免疫および粘膜免疫を含む）。免疫応答は、追加刺激応答を含む。
【０２２８】
本発明は、有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および／または細胞媒介免疫を伴うことが好ましい。免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の一方または両方を含むことが好ましい。方法により、追加刺激応答が生じてよい。
【０２２９】
哺乳動物はヒトであることが好ましい。免疫原性組成物、好ましくはワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは、子（例えば、乳児または幼児、就学前の子、例えば、１歳以下の子、１歳から３歳までの子、または４歳の子、または５歳の子、または６歳の子、または７歳の子、または８歳の子、または９歳の子、または１０歳以上の子）、ティーンエイジャー、高齢者（例えば、約６０歳以上）または高リスク群の人、例えば、軍人、旅行者、医療従事者、保育（デイケア）提供者、および食品取扱者であることが好ましい。免疫原性組成物またはワクチンは、そのような個体に、治療的に使用するために投与することもできる。（例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために）小児用ワクチンを成人に投与することもできる。
【０２３０】
本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の他の標的グループとしては、移植および免疫無防備状態の個体；例えば、米国、カナダおよびヨーロッパにいる成人および小児であって、これらに限定されないが、食品取扱者；これらに限定されないが病院および養護施設の人員などの医療従事者；デイケア提供者；巡航客船旅行者を含めた旅行者；軍人；ならびに上記の小児集団および／または高齢者集団を含めた成人および小児が挙げられる。
【０２３１】
（ｉ）．ノロウイルス特異的Ｔ細胞
ノロウイルス特異的Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されるキメラＶＰ１タンパク質またはＶＬＰによって活性化され、好ましくはＶＰ１のＰ−ドメインのエピトープを認識する。ノロウイルス特異的Ｔ細胞はＣＤ８＋またはＣＤ４＋であり得る。
【０２３２】
ノロウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成するこれらのエピトープのいずれかを提示している、ノロウイルスに感染している細胞を死滅させ得る細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であり得る。ノロウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイによって検出することができる。５１Ｃｒ放出アッセイでは、ノロウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の、これらのエピトープのうちの１または複数を提示している標的細胞を溶解する能力を測定する。ＩＦＮ−γなどの抗ウイルス作用物質を発現するノロウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞も、本明細書において想定されており、同様に免疫学的方法によって、好ましくはＩＦＮ−γなどのサイトカインに対する細胞内染色によって、本明細書に記載のものなどのノロウイルスポリペプチドのうちの１または複数を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後に、検出することができる。
【０２３３】
ノロウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ球増殖アッセイによって検出することができる。リンパ球増殖アッセイでは、ノロウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の、例えば、ＶＰ１に反応して増殖する能力を測定する。
【０２３４】
（ｉｉ）ノロウイルス特異的Ｔ細胞を活性化する方法
キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質およびＶＬＰを使用して、ノロウイルス特異的Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで活性化することができる。ノロウイルス特異的Ｔ細胞の活性化は、とりわけ、ノロウイルスに対するＣＴＬ応答を最適化するためのモデル系をもたらすため、およびノロウイルス感染症に対する予防的処置または治療的処置をもたらすために使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化のために、タンパク質を、上記の通り、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターによってＴ細胞に供給することが好ましい。
【０２３５】
Ｔ細胞のポリクローナル集団は、ノロウイルスに感染している哺乳動物の血液に由来してよく、リンパ節、脾臓、または胸腺などの末梢リンパ器官由来であることが好ましい。好ましい哺乳動物としては、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが挙げられる。ノロウイルスに感染することは、哺乳動物における活性化されたノロウイルス特異的Ｔ細胞の数を増やすことに役立つ。次いで、哺乳動物に由来するノロウイルス特異的Ｔ細胞を、本発明によるノロウイルス免疫原性ポリペプチド、および／または融合タンパク質を加えることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激することができる。次いで、ノロウイルス特異的Ｔ細胞を、とりわけ、増殖、ＩＦＮ−γの生成、および、例えばＶＰ１ポリペプチドエピトープを提示している標的細胞を溶解する能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。
【０２３６】
Ｈ．キット
本発明は、本発明の免疫原性組成物の１または複数の容器を含むキットも提供する。組成物は、個々の抗原がそうであり得るように、液体の形態であってよい、または凍結乾燥されてよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい）。
【０２３７】
キットは、薬剤的に許容できる緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはブドウ糖溶液などを含む第２の容器をさらに含んでよい。これは、他の薬学的に許容される処方用溶液、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジまたは他の送達デバイスなどを含めた、最終使用者にとって有用な他の材料も含有してよい。キットは、アジュバントを含む第３の成分をさらに含んでよい。
【０２３８】
キットは、免疫誘導する方法のため、または感染を処置するための使用説明書を含有する添付文書も含んでよい。添付文書は、承認されていないドラフト添付文書であってよい、または食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認された添付文書であってよい。
【０２３９】
本発明は、本発明の免疫原性組成物を予め満たした送達デバイスも提供する。
【実施例】
【０２４０】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０２４１】
（実施例１）
Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／ＮｏｒｗａｌｋキメラＶＰ１タンパク質のための発現構築物
キメラノロウイルスＶＰ１タンパク質、およびキメラタンパク質を含有するＶＬＰを生成するための構築物であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３を、キメラＶＰ１タンパク質をコードする配列を酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１にクローニングすることによって作製した。ｐＢＳ２４．１ベクターは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、１９８９年７月１９日出願の共有に係る米国特許出願第３８２，８０５号に詳細に記載されている。ｐＢＳ２４．１ベクターは、酵母において自律複製するための２−ミクロン配列および酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよび選択マーカーとしてＵＲＡ３を含有する。β−ラクタマーゼ遺伝子および細菌におけるプラスミドの複製のために必要なＣｏｌＥ１複製起点もこの発現ベクター内に存在する。発現の調節は、ハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（米国特許第６，１８３，９８５号に記載されている）およびアルファ因子ターミネーターの制御下に置いた。
【０２４２】
図６に示されているポリヌクレオチド配列（配列番号１６）に含まれるＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ（ＳＭＶ０／Ｎｏｒｗａｌｋ  ＶＰ１タンパク質を発現させるために、構築物を作製し、利用した。これを行うために、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｃｃ６５１によって切り取った、予め生成したＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ遺伝子のＳ−ドメインに対応するフラグメントを、制限酵素Ａｌｗ２１１およびＳａｌ１を用いて生成したＮｏｒｗａｌｋ遺伝子のＰ−ドメインに対応するフラグメントにライゲーションした。この新しいキメラＤＮＡを、ｐＭＡＤＣ５サブクローニングベクター（図１）に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位においてライゲーションし、増幅させた。次に、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３においてＳＭＶ／ＮｏｒｗａｌｋキメラＶＰ１タンパク質を発現させるために、増幅させたフラグメント（図５に示されている）を、発現ベクターｐＢＳ２４．１（図２）に、ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ部位においてクローニングした。
【０２４３】
（実施例２）
Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／ＧＩＩ．４．２００６ａキメラのための発現構築物
本実施例では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３におけるＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ／ＧＩＩ．４．２００６ａ  ＶＬＰ（ＳＭＶ／ＧＩＩ．４．２００６ａ／キメラ）の生成において発現ベクターｐＢＳ２４．１を使用した。キメラＳＭＶ／ＧＩＩ．４．２００６ａ  ＶＰ１タンパク質を発現させるために利用したコード配列は図７に示されている。Ｓｎｏｗ  ＭｏｕｎｔａｉｎウイルスおよびＧＩＩ．４．２００６ａウイルスのＶＰ１のＳ−ドメインおよびＰ−ドメインのｃＤＮＡ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを用いてコード配列を生成した。
【０２４４】
本実施例では、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｃｃ６５１によって切り取った、予め生成したＳｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ遺伝子のＳ−ドメインに対応するフラグメントを、制限酵素Ｘｂａｌ−ＳａｌＩを用いて生成したＧＩＩ．４．２００６ａ遺伝子のＰ−ドメインに対応するフラグメントにライゲーションした。この新しいキメラＤＮＡを、ｐＭＡＤＣ５サブクローニングベクター（図１）に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位においてライゲーションし、増幅させた。次に、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３においてＳＭＶ／ＮｏｒｗａｌｋキメラＶＰ１タンパク質を発現させるために、増幅させたフラグメント（図６に示されている）を、発現ベクターｐＢＳ２４．１（図２）に、ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ部位においてクローニングした。
【０２４５】
（実施例３）
酵母におけるキメラＶＬＰの発現
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ１−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃ１−４０７、ｇａｌ２、［ｃｉｒ０］、：：ｐＤＭ１５（ｐＧＡＰ／ＡＤＲ１：：Ｇ４１８Ｒ）、：：Ｙｉｐ５ΔｌｅｕＡＤ）を上記の発現プラスミドで形質転換した。形質転換する前に、酵母細胞をＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトン（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）２％グルコース）プレート上に画線し、形質転換のためのコンピテント細胞を調製するために単一のコロニーを選択した。
【０２４６】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して酵母の形質転換を実施した。形質転換後、単一のコロニーを得るために、いくつかのＵｒａ−形質転換体をＵｒａ−８％グルコースプレート上に画線した。その後、単一のコロニーをＬｅｕ−８％グルコースプレートにパッチして、プラスミドのコピー数を増加させた。Ｌｅｕスターター培養物を３０℃で２４時間成長させ、次いで、ＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトン２％グルコース）またはＶｅｇｇｉｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｖｅｇｇｉｅ  ＰｅｐｔｏｎｅおよびＶｅｇｇｉｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）培地中に１：２０に希釈した。細胞を３０℃で４８〜７２時間にわたり成長させ、培地中のグルコースを枯渇させ、次いで採取した。培地からグルコースが枯渇すると誘導が起こった。この系により、外来遺伝子が誘導される前に高細胞量がもたらされた。
【０２４７】
（実施例４）
キメラＶＬＰの精製
ノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、ノロウイルスキメラＶＰ１タンパク質を発現している酵母細胞の培地から精製した。培地を低速回転（１５，０００×ｇ）させて余分の細胞または細胞の破片を除去した。このステップの後、上清を、４０％スクロースクッションによる４時間の高速回転（１００，０００×ｇ）に供して、遊離のタンパク質および他の材料からウイルス様粒子を分離した。ＶＬＰを含有するペレットを、緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁させ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑカラムにローディングし、高塩濃度を用いて溶出させた。ＶＬＰを、塩の勾配を増加させる過程でカラムから溶出させた。最後に、ＶＬＰを含有する溶出画分を濃縮し、緩衝液を低塩濃度の緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）に交換し、使用するまで４℃で保管した。
【０２４８】
【表１−１】
2018086020.tif 000006
【０２４９】
【表１−２】
2018086020.tif 000007
【０２５０】
【表１−３】
2018086020.tif 000008
【０２５１】
【表１−４】
2018086020.tif 000009
【０２５２】
【表１−５】
2018086020.tif 000010
【０２５３】
【表１−６】
2018086020.tif 000011
【０２５４】
【表１−７】
2018086020.tif 000012
【０２５５】
【表１−８】
2018086020.tif 000013
【０２５６】
【表１−９】
2018086020.tif 000014
【０２５７】
【表１−１０】
2018086020.tif 000015
【０２５８】
【表１−１１】
2018086020.tif 000016
【０２５９】
【表１−１２】
2018086020.tif 000017
【０２６０】
【表１−１３】
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【０２６１】
【表１−１４】
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【０２６２】
【表１−１５】
2018086020.tif 000020
【０２６３】
【表１−１６】
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【０２６４】
【表１−１７】
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【０２６５】
【表１−１８】
2018086020.tif 000023
【０２６６】
【表１−１９】
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【０２６７】
【表１−２０】
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【０２６８】
【表１−２１】
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【０２６９】
【表１−２２】
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【０２７０】
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【０３１８】
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【０３１９】
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【０３２０】
【表１−７３】
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【表１−７４】
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【表１−７５】
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【０３２３】
【表１−７６】
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【０３２４】
【表１−７７】
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【表１−７８】
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【０３２６】
【表１−７９】
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【０３２７】
【表１−８０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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