(57)【要約】【課題】抗原の活性が変化しにくい抗原含有水溶液の製造方法及び試料中の抗原を正確かつ再現性高く定量することができる免疫測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含む水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で熟成する工程（Ｉ）を含み、工程（Ｉ）において熟成温度Ｔ（℃）と熟成時間Ｓ（日）とが下記数式（１）の関係を満たす抗原含有水溶液の製造方法。１≦Ｓ≦−９．５７×Ｔ＋５０８．６  （１）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含む水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で熟成する工程（Ｉ）を含み、工程（Ｉ）において熟成温度Ｔ（℃）と熟成時間Ｓ（日）とが下記数式（１）の関係を満たす抗原含有水溶液の製造方法。
１≦Ｓ≦−９．５７×Ｔ＋５０８．６  （１）
【請求項２】
抗原（Ａ）が、サイトケラチン１９フラグメントである請求項１に記載の抗原含有水溶液の製造方法。
【請求項３】
キレート剤（Ｂ）が、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の抗原含有水溶液の製造方法。
【請求項４】
水溶液（Ｘ）のｐＨが５．５〜８．５である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原含有水溶液の製造方法。
【請求項５】
水溶液（Ｘ）の体積を基準として、抗原（Ａ）の濃度が１〜１０００μｇ／Ｌであり、キレート剤（Ｂ）の濃度が０．１〜１００ｇ／Ｌである請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原含有水溶液の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法により得られた抗原含有水溶液を既知量の被検体として用いて検量線を作成する工程を含む免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原含有水溶液の製造方法及び免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原（特にサイトケラチン１９フラグメント）は、肺非小細胞癌、特に扁平上皮癌に特異性の高い腫瘍マーカーとして病気の診断や治療のモニタリングにしばしば利用される。患者の試料中の抗原（特にサイトケラチン１９フラグメント）を定量するためには、参照標準として較正物質が必要になる。しかしながら、この較正物質中に含まれる抗原は希薄であるため、溶液中で長期間に渡り安定保存することは困難である。そこで、凍結乾燥により水分を除去した形態で保存し、使用時に水を加えて溶解する方法や、５０重量％グリセロール存在下−２０℃で液状保管して凍結変性を防ぐ方法、更に牛血清アルブミンや動物血清等のタンパク質を添加して水溶液を凍結し、安定性を確保する方法が知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
しかしながら、凍結乾燥する方法では、使用前に緩衝液等で必要な濃度に溶解させる必要があり、溶解させる液量等に誤差が生じやすく、患者の試料の定量における正確性に影響を与える問題がある。また、５０重量％グリセロール存在下−２０℃で液状保管する方法では、粘度が高くサンプリング精度が低いため較正物質としてそのまま免疫測定に用いることができない問題がある。更に、牛血清アルブミンや動物血清等のタンパク質を添加して水溶液を凍結する方法では、抗原（特にサイトケラチン１９フラグメント）の凍結融解による失活の影響により、正確性を担保できない問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】佐々木實、免疫化学的同定法（第３版）、東京化学同人、１９９３年
【非特許文献２】水岡慶二、免疫血清検査マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９８６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、抗原の活性が変化しにくい抗原含有水溶液の製造方法及び試料中の抗原を正確かつ再現性高く定量することができる免疫測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含む水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で熟成する工程（Ｉ）を含み、工程（Ｉ）において熟成温度Ｔ（℃）と熟成時間Ｓ（日）とが下記数式（１）の関係を満たす抗原含有水溶液の製造方法；この製造方法により得られた抗原含有水溶液を既知量の被検体として用いて検量線を作成する工程を含む免疫測定方法である。
１≦Ｓ≦−９．５７×Ｔ＋５０８．６  （１）
【発明の効果】
【０００６】
本発明の抗原含有水溶液の製造方法は、抗原の活性が変化しにくい抗原含有水溶液を得られる。
また、本発明の免疫測定方法は、試料中の抗原を正確かつ再現性高く定量することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の抗原含有水溶液の製造方法は、本発明は、抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含む水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で熟成する工程（Ｉ）を含み、工程（Ｉ）において熟成温度Ｔ（℃）と熟成時間Ｓ（日）とが下記数式（１）の関係を満たす抗原含有水溶液の製造方法である。
１≦Ｓ≦−９．５７×Ｔ＋５０８．６  （１）
本発明の製造方法によれば、抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含む水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で上記熟成時間、熟成させることにより、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる。従って、本発明の製造方法により得られた抗原含有水溶液を、例えば、免疫測定における較正物質（検量線を作成する際に用いる既知量の被検体）として用いれば、患者の試料中の抗原を正確かつ再現性高く定量することができる。尚、本発明の製造方法は、上記工程（Ｉ）を含んでいればよく、得られた抗原含有水溶液は冷蔵（４〜１０℃）や室温（１０〜３５℃）で更に保管してもよい。
【０００８】
本発明において、抗原（Ａ）としては、サイトケラチン１９フラグメントが含まれる。
サイトケラチン１９フラグメントは、上皮細胞の中間径フィラメントの構成タンパクであるサイトケラチンの一つであるサイトケラチン１９の可溶性フラグメントであり、分子量が約４０ｋＤ程度の酸性タンパクである。
本発明に使用するサイトケラチン１９フラグメントの由来には特に限定が無く、組織から抽出された天然物以外にも、遺伝子組み換え物や化学合成物を使用することができる。これらの抗原は、Ｒｏｃｈｅ社やＢｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社等より市販されている。
【０００９】
本発明において、水溶液（Ｘ）中の抗原（Ａ）の含有量は、任意の濃度で使用することができるが、患者の血液中の抗原（特にサイトケラチン１９フラグメント）を定量する際に必要な濃度域の観点及び抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる観点から、水溶液（Ｘ）の体積を基準として、１〜１０００μｇ／Ｌが好ましく、更に好ましくは２〜１００μｇ／Ｌ、次に更に好ましくは３〜１０μｇ／Ｌである。
【００１０】
本発明において、キレート剤（Ｂ）としては、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を少なくとも合計２個有する化合物が含まれ、例えば、アミノカルボン酸型キレート剤及びヒドロキシ酸型キレート剤が含まれる。
アミノカルボン酸型キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」ともいう）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（以下、「ＡＤＡ」ともいう）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸及び３−ヒドロキシ−２，２’−イミノジコハク酸４ナトリウム並びにこれらの塩等が挙げられる。
ヒドロキシ酸型キレート剤としては、α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸及びクエン酸等）、β−ヒドロキシ酸（例えば、サリチル酸等）並びにこれらの塩等が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩及びカルシウム塩等）等が挙げられる。
本発明におけるキレート剤（Ｂ）は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００１１】
キレート剤（Ｂ）としては、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる観点から、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００１２】
本発明におけるキレート剤（Ｂ）は、安定性を向上させる添加剤として含有する他に、緩衝剤等その他の目的としても併用し含有させることもできる。
【００１３】
水溶液（Ｘ）中のキレート剤（Ｂ）の含有量は、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる観点から、水溶液（Ｘ）の体積を基準として、０．１〜１００ｇ／Ｌが好ましく、更に好ましくは１〜５０ｇ／Ｌが好ましく、更に好ましくは１０〜３０ｇ／Ｌである。
【００１４】
本発明の製造方法において、熟成温度は１５℃〜５０℃であり、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる観点から、好ましくは２０℃〜４０℃であり、特に好ましくは２５℃〜３０℃である。
熟成温度が１５℃未満であると、十分な安定化効果が得られない。また、熟成温度が５０℃より高いと、抗原の活性が低下する。
【００１５】
本発明の製造方法の工程（Ｉ）において、熟成温度Ｔ（℃）と熟成時間Ｓ（日）とが下記数式（１）により表される関係を満たす。
１≦Ｓ≦−９．５７×Ｔ＋５０８．６  （１）
上記数式（１）は、工程（Ｉ）における熟成温度Ｔと熟成時間Ｓとの関係を表しており、熟成温度Ｔが高ければ高いほど、熟成時間Ｓが短くなることを意味し、上記数式（１）を満たすことで、キレート剤（Ｂ）による十分な安定化効果が得られ、抗原（Ａ）の活性が変化しにくい抗原含有水溶液を製造することができる。
【００１６】
本発明の水溶液（Ｘ）及び抗原含有水溶液のｐＨは、抗原含有水溶液中の抗原（Ａ）の保存安定性の観点から、５．５〜８．５が好ましく、更に好ましくは６．０〜７．８であり、特に好ましくは６．５〜７．０である。ｐＨが５．５以上又はｐＨが８．５以下であることで、抗原（Ａ）の保存安定性が高く、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなる。
【００１７】
本発明の製造方法において、水溶液（Ｘ）及び抗原含有水溶液には、上記抗原（Ａ）及びキレート剤（Ｂ）以外に、緩衝剤、防腐剤及びその他の安定化剤を含有してもよい。
緩衝剤としては、リン酸緩衝剤及びグッドバッファー等が挙げられる。
防腐剤としては、アジ化ナトリウム及びメチルイソチアゾリノン等が挙げられる。
その他の安定化剤としては、ウシ血清アルブミン、トレハロース及びアルギニン等が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法で得られる抗原含有水溶液は、抗原含有水溶液中の抗原（Ａ）の活性が変化しにくいので、例えば、既知量の被検体を用いて検量線を作成して測定値を較正する必要がある免疫測定方法における較正物質として用いることができる。
【００１９】
本発明の免疫測定方法は、上記製造方法により得られた抗原含有水溶液を既知量の被検体（以下、較正物質ともいう）として用いて検量線を作成する工程を含むものである。
【００２０】
本発明における免疫測定方法としては、上記工程を含むものであり、一般的にこの分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）等が挙げられる。
これらの測定法において、本発明の抗原含有水溶液は、較正物質としてそのまま使用されることが好ましい。
【００２１】
更に免疫測定方法が化学発光酵素免疫測定法である場合、固相担体としては、一般的にこの分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えばガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子、マイクロプレート及びラテックス等が代表的なものとして挙げられる。具体的には、例えば特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子が好ましい。
【００２２】
該化学発光酵素免疫測定法における磁性シリカ粒子としては、シリカのマトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物を分散されているものが含まれる。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることを意味する。
【００２３】
平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００２４】
磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、６０重量％が好ましく、更に好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％が好ましく、更に好ましくは８０重量％である。超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分であり、実際の用途面における分離操作が短時間で行え、９５重量％以下であると製造が容易である。
【００２５】
抗原（Ａ）を含む水溶液は、一般的には冷蔵（４℃〜１０℃程度）保存や室温（１０〜３５℃）での保存では次第に失活してしまうため冷凍保存されるが、凍結融解の繰り返しにより失活してしまう問題がある。一方、本発明においては、抗原（Ａ）とキレート剤（Ｂ）とを含有する水溶液（Ｘ）を１５〜５０℃で熟成させることにより、抗原（Ａ）の活性が変化しにくくなり、抗原（Ａ）の冷蔵又は室温での長期保存を可能とするものである。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
＜実施例１＞
［抗原含有水溶液の作製］
２５℃に温調した室内において、０．１重量％の牛血清アルブミン、０．８５重量％の塩化ナトリウム及び２０ｇ／ＬのＥＤＴＡを含有させた０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（２５℃）を調製した。
そこへサイトケラチン１９フラグメント抗原（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（株）製、「Ｃｙｆｒａ−２１−１  Ａｎｔｉｇｅｎ」）を５μｇ／Ｌとなるように添加した後、２５℃で１４日熟成して抗原含有水溶液１を得た。
【００２８】
＜実施例２〜５＞
実施例１において、「ＥＤＴＡ」に代えて表１に記載のキレート剤を用いる以外は同様にして、抗原含有水溶液２〜５を得た。
【００２９】
＜実施例６〜７＞
実施例１において、表１に記載の熟成条件を用いる以外は同様にして、抗原含有水溶液６〜７を得た。
【００３０】
＜実施例８〜９＞
実施例１において、表１に記載のｐＨに調製する以外は同様にして、抗原含有水溶液８〜９を得た。
【００３１】
＜実施例１０〜１１＞
実施例１において、表１に記載の抗原濃度に調製する以外は同様にして、抗原含有水溶液１０〜１１を得た。
【００３２】
＜実施例１２〜１３＞
実施例１において、表１に記載のキレート剤濃度に調製する以外は同様にして、抗原含有水溶液１２〜１３を得た。
【００３３】
＜比較例１＞
実施例１において、「ＥＤＴＡ」を用いない以外は同様にして、比較用の抗原含有水溶液１’を得た。
【００３４】
＜比較例２＞
実施例１において、サイトケラチン１９フラグメント抗原を５μｇ／Ｌとなるように添加した後、熟成していないものを比較用の抗原含有水溶液２’とした。尚、後述する「抗原含有水溶液の保存安定性評価」において、作製時のものとしては、抗原を添加してから５時間（２５℃）のものを用いた。
【００３５】
＜比較例３＞
比較例２において、「ＥＤＴＡ」を用いない以外は同様にして、比較用の抗原含有水溶液３’を得た。
【００３６】
＜比較例４＞
実施例１において、熟成温度を１０℃にした以外は同様にして、比較用の抗原含有水溶液１’を得た。
【００３７】
【表１】
2018163149.tif 000002
【００３８】
［抗原含有水溶液の保存安定性評価］
実施例１〜１３及び比較例１〜４で作製した抗原含有水溶液をそれぞれ４℃と３５℃で保存し、作製時、２週間目、１カ月目、２カ月目及び３カ月目のサイトケラチン１９フラグメント濃度をサイトケラチン１９フラグメント測定試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製、「エクルーシス試薬」）で測定し、作製時の濃度に対する比率（％）｛（測定により得られた濃度）／（作製時の濃度）×１００｝を算出した。結果を表１に示す。尚、作製時の濃度に対する比率が１００％に近いほど、抗原の活性が変化しにくいことを示す。
【００３９】
表１の結果から、実施例１〜１３で得た抗原含有水溶液は、保存温度が４℃の場合、作製時の濃度に対する比率が９５％〜１０５％の範囲内であり、保存温度が３５℃の場合も、作製時の濃度に対する比率が９３％〜１１５％の範囲内であり、抗原の活性が変化しにくく、温度による影響もうけにくいことがわかる。
一方、比較例１〜４で得た抗原含有水溶液は、保存温度が４℃の場合、作製時の濃度に対する比率が９３％〜１０９％であり、実施例と比較して、低温保存での活性変化が大きいことがわかる。また、保存温度が３５℃の場合は更に、１４４％〜２１４％であり、抗原の活性が変化しやすく、更に抗原の活性が温度の影響を受けて変化しやすいことがわかる。
従って、本発明の抗原含有水溶液は、保存温度によらず、抗原の活性が変化しにくいことがわかる。また、本発明の抗原含有水溶液を既知量の被検体として用いて検量線を作成すれば、正確性の高い検量線を作成することができるので、試料中の抗原を正確かつ再現性高く定量することができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の方法により作製した抗原含有水溶液は、溶液状態で長期間安定して保存することができる。よって、本発明の抗原含有水溶液を較正物質として使用することで正確性及び再現性の良好な免疫測定を可能にし、臨床検査の信頼性を高めることができる。