(57)【要約】【課題】改善されたリポソーム形成技術を提供する。【解決手段】第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記内管を前記外管の内部に固定する固定具であって、前記外管を保持する外管保持部材と、前記内管を保持する内管保持部材と、前記外管保持部材と前記内管保持部材とを連結する連結部材と、を備え、前記連結部材は、前記外管保持部材で前記外管を保持し、前記内管保持部材で前記内管を保持し、前記内管を前記外管の内部に配置した状態で、前記外管保持部材と前記内管保持部材との前記送液方向の距離を調節可能に連結する、固定具。【選択図】図１
2018086630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記内管を前記外管の内部に固定する固定具であって、
前記外管を保持する外管保持部材と、
前記内管を保持する内管保持部材と、
前記外管保持部材と前記内管保持部材とを連結する連結部材と、を備え、
前記連結部材は、前記外管保持部材で前記外管を保持し、前記内管保持部材で前記内管を保持し、前記内管を前記外管の内部に配置した状態で、前記外管保持部材と前記内管保持部材との前記送液方向の距離を調節可能に連結する、
固定具。
【請求項２】
金属製である、請求項１に記載の固定具。
【請求項３】
第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、
前記液滴はリポソームであり、前記第１の液滴材料がリポソームの膜を構成する脂質を含み、前記第２の液滴材料が親水性高分子を含む、
液滴の製造方法。
【請求項４】
前記親水性高分子が多糖又はポリエーテルである、請求項３に記載の液滴の製造方法。
【請求項５】
第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、
前記送液を前記デバイスを遠心することにより行い、前記デバイスに印加する遠心力を調整することにより、製造する液滴の粒径を調整する、
液滴の粒径を調整する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定具及びその使用に関する。より詳細には、固定具、液滴の製造方法及び液滴の粒径を調整する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは脂質二重膜で構成され、人工的に作製可能な閉鎖小胞である。細胞と同じ構成を持つことができるため、生体に投与しても安全性が高い。このため、試薬を内包したリポソームを医薬や化粧品として用いる技術が実現化されている。また、リポソーム内部にタンパク質等を高密度に入れ、細胞を模したリポソームを作製し、細胞の機能を研究する用途にも用いられている。
【０００３】
実験室等にある簡便な器具を用いてリポソームに試薬を内包させる方法としては、水和法やエクストルーダー法がある。しかしながら、これらの方法では、試薬のリポソームへの内包効率が低く、また、試薬を大量に必要とするため、高価な試薬や希少な試薬を内包させたい場合には非常に非効率的である。
【０００４】
これに対し、特許文献１や非特許文献１には、水和法やエクストルーダー法よりも効率的にリポソームに試薬を内包できる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１３７３８０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yamada, A. et al, Spontaneous Transfer of Phospholipid-Coated Oil-in-Oil and Water-in-Oil Micro-Droplets through an Oil/Water Interface, Langmuir, 22 (24), 9824-9828, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１の方法では、作製できるリポソームの数が少ない傾向にある。また、試薬の種類によってはリポソームに内包させることが困難な場合がある。また、非特許文献１に記載された方法では、得られるリポソームの大きさが不均一である。また、撹拌してエマルジョンを調製する工程があるため、内包させる試薬が油層に対して不安定な場合には、変性してしまう場合がある。このような背景のもと、本発明は、改善されたリポソーム形成技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記内管を前記外管の内部に固定する固定具であって、前記外管を保持する外管保持部材と、前記内管を保持する内管保持部材と、前記外管保持部材と前記内管保持部材とを連結する連結部材と、を備え、前記連結部材は、前記外管保持部材で前記外管を保持し、前記内管保持部材で前記内管を保持し、前記内管を前記外管の内部に配置した状態で、前記外管保持部材と前記内管保持部材との前記送液方向の距離を調節可能に連結する、固定具。
［２］金属製である、[１］に記載の固定具。
［３］第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、前記液滴はリポソームであり、前記第１の液滴材料がリポソームの膜を構成する脂質を含み、前記第２の液滴材料が親水性高分子を含む、液滴の製造方法。
［４］前記親水性高分子が多糖又はポリエーテルである、［３］に記載の液滴の製造方法。
［５］第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、前記送液を前記デバイスを遠心することにより行い、前記デバイスに印加する遠心力を調整することにより、製造する液滴の粒径を調整する、液滴の粒径を調整する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、改善されたリポソーム形成技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】固定具の一例と、当該固定具を使用して組み立てた液滴製造デバイスの構造を説明する模式図である。
【図２】（ａ）は、内管保持部材の正面図、側面図及び平面図である。（ｂ）は、外管保持部材の正面図、側面図、平面図及び底面図である。
【図３】従来型の固定具の一例の構造を説明する模式図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、従来型の固定具を用いて外管と内管とを同心円状に配置する手順の一例を説明する模式図である。
【図５】液滴の製造方法を説明する模式図である。
【図６】試薬を内包したリポソームが製造される様子を示す模式図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１で作製したリポソームの顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２で作製したリポソームの顕微鏡写真である。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３で作製したリポソームの粒径及び存在率の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１２】
［固定具］
１実施形態において、本発明は、第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記内管を前記外管の内部に固定する固定具であって、前記外管を保持する外管保持部材と、前記内管を保持する内管保持部材と、前記外管保持部材と前記内管保持部材とを連結する連結部材と、を備え、前記連結部材は、前記外管保持部材で前記外管を保持し、前記内管保持部材で前記内管を保持し、前記内管を前記外管の内部に配置した状態で、前記外管保持部材と前記内管保持部材との前記送液方向の距離を調節可能に連結する、固定具を提供する。
【００１３】
図１は、本実施形態の固定具の一例と、当該固定具を使用して組み立てた液滴製造デバイスの構造を説明する模式図である。正面図及び平面図を示す。
【００１４】
液滴製造デバイス１００は、外管１０と内管２０とを備えている。また、外管１０と内管２０との間には間隙が存在している。また、内管２０の送液方向下流側の先端部２２は、外管１０の送液方向下流側の先端部１２よりも送液方向上流側に位置している。
【００１５】
また、液滴製造デバイス１００では、外管１０の内部に内管２０を配置した状態で、外管１０及び内管２０を固定具４０で固定している。固定具４０は、外管保持部材１１と、内管保持部材２１と、連結部材３０とを備えている。連結部材３０は、外管保持部材１１で外管１０を保持し、内管保持部材２１で内管２０を保持し、内管２０を外管１０の内部に配置した状態で、外管保持部材１１と内管保持部材２１とをこれらの送液方向の距離を調節可能に連結している。連結部材３０は、ピン３１、固定用ネジ３２及び固定用ネジ３３を備えている。
【００１６】
図２（ａ）は、内管保持部材２１の正面図、側面図及び平面図である。また、図２（ｂ）は、外管保持部材１１の正面図、側面図、平面図及び底面図である。
【００１７】
連結部材３０で連結した外管保持部材１１及び内管保持部材２１は、それぞれピン３１に沿って任意の位置に移動可能である。また、固定用ネジ３２を締めることにより、内管保持部材２１をピン３１上に固定することができる。また、固定用ネジ３３を締めることにより、外管保持部材１１をピン３１上に固定することができる。
【００１８】
ここで、従来型の固定具について説明する。図３は、特許文献１に記載された、従来型の固定具の一例の構造を説明する模式図である。従来型の固定具４０’は、液滴製造デバイスを構成する内管２０を、外管１０の内部に配置するために用いられる固定具であって、外管１０を保持する外管保持部材１１と、内管２０を保持する内管保持部材２１とを備える。
【００１９】
外管保持部材１１及び内管保持部材２１は中央部に孔を有する板状の部材であり、外管保持部材１１及び内管保持部材２１は連結部材３０’により連結されている。連結部材３０’は、外管保持部材１１と内管保持部材２１とを回転自在に連結するネジである。固定具４０’は、外管１０及び内管２０を支えてより効果的に同心円状の配置を保つため、中央部に孔を有する板状の部材である支持体１１’及び２１’を更に備えている。
【００２０】
続いて、図４（ａ）〜（ｃ）を参照しながら、従来型の固定具４０’を用いて外管１０と内管２０とを同心円状に配置する手順の一例を説明する。図４（ａ）に示す固定具４０’では、外管保持部材１１、支持体１１’、内管保持部材２１及び支持体２１’の有する孔１１ａ、１１’ａ、２１ａ及び２１’ａが同心円状に配置されている。
【００２１】
まず、図４（ｂ）に示すように、内管保持部材２１及び支持体２１’を回転させ、外管保持部材１１及び支持体１１’の有する各孔の中心と、内管保持部材２１及び支持体２１’の有する各孔の中心とをずらし、外管保持部材１１及び支持体１１’の有する各孔に外管１０を挿入する。
【００２２】
ここで、外管１０は、流体の送液方向上流側ほど外径が大きいため、外管１０を外管保持部材１１に設けられた孔１１ａに通すことで、外管１０が嵌め込まれ、外管１０が保持される。
【００２３】
次いで、図４（ｃ）に示すように、内管保持部材２１及び支持体２１’を回転させ、外管保持部材１１及び支持体１１’の有する各孔の中心と、内管保持部材２１及び支持体２１’の有する各孔の中心とを一致させ、内管保持部材２１及び支持体２１’の有する各孔に内管２０を挿入する。
【００２４】
ここで、内管２０は、流体の送液方向上流側ほど外径が大きいため、内管２０を内管保持部材２１に設けられた孔２１ａに通すことで内管２０が嵌め込まれ、内管２０が保持される。このようにして、外管１０及び内管２０を同心円状に配置することができる。
【００２５】
従来型の固定具４０’では、外管保持部材１１、支持体１１’、内管保持部材２１及び支持体２１’が、ネジである連結部材３０’によって連結されている。このため、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を、連結部材３０’のネジ山とネジ山の間の距離の倍数でしか調整することができなかった。また、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を調整した後に、外管１０及び内管２０を配置する必要があるため、顕微鏡下で観察しながら外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を調整することはできなかった。
【００２６】
これに対し、本実施形態の固定具４０によれば、液滴製造デバイス１００の内管２０を外管１０の内部に暫定的に固定した後、内管２０の先端部２２及び外管１０の先端部１２を顕微鏡下で観察しながら、外管保持部材１１と内管保持部材２１との送液方向の距離を調整することができる。また、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離は無段階に調整することができる。
【００２７】
このため、実施例において後述するように、液滴製造デバイス１００の内管２０を外管１０の内部の最適な位置に配置して固定することができ、液滴の製造効率を飛躍的に高めることができる。
【００２８】
本実施形態の固定具は、樹脂製であってもよく、金属製であってもよい。中でも、金属製であることが好ましい。本実施形態の固定具が金属製であるとは、固定具の少なくとも一部が金属製であることであってもよく、全部が金属製であることであってもよいが、全部が金属製であることが好ましい。
【００２９】
金属としては、例えばアルミ、ステンレス、チタン等が挙げられる。金属は微細加工を精度よく行うことが容易であるため、材料を金属とすることにより、精度の高い固定具を製造することが容易になる。また、金属は、温度や圧力に対する変動が樹脂よりも小さい傾向にあるため、外管及び内管を正しい位置に常に固定することが容易である。
【００３０】
また、液滴製造デバイスにおいて、液滴材料の送液を遠心により行う場合には、固定具が遠心力に耐える必要がある。これに対し、材料を金属とすることにより、遠心力に耐えることができる固定具を容易に製造することができる。
【００３１】
続いて、本実施形態の固定具４０を用いて、外管１０と内管２０とを同心円状に配置する手順の一例を説明する。図１に示す固定具４０では、外管保持部材１１が有する孔と、内管保持部材２１が有する孔が同心円状に配置されている。
【００３２】
まず、内管保持部材２１を回転させ、外管保持部材１１の有する孔の中心と、内管保持部材２１の有する孔の中心とをずらし、外管保持部材１１の有する孔に外管１０を挿入する。
【００３３】
ここで、外管１０は、流体の送液方向上流側ほど外径が大きいため、外管保持部材１１に設けられた孔に通すことで外管１０が嵌め込まれ、外管１０が保持される。
【００３４】
次いで、内管保持部材２１を回転させ、外管保持部材１１が有する孔の中心と、内管保持部材２１が有する孔の中心とを一致させ、内管固定部材２１が有する孔に内管２０を挿入する。
【００３５】
このとき、中心を確実に揃えるために、固定具４０を覆うような、中心位置合わせ用のホルダーにセットして以降の作業を行うと作業性が向上する。
【００３６】
ここで、内管２０は、流体の送液方向上流側ほど外径が大きいため、内管２０を内管保持部材２１が有する孔に通すことで内管２０が嵌め込まれ、内管２０が保持される。このようにして、外管１０及び内管２０を同心円状に配置することができる。
【００３７】
固定具４０では、外管保持部材１１、内管保持部材２１は連結部材３０のピン３１により接続されている。そのため、ホルダーにはめたまま、各部材をずらし、部材同士の距離を調節することができる。顕微鏡等で、内管２０の先端部１２の位置、外管１０の内径等を観察しながら位置調節することで、外管１０と内管２０の重なる位置を適切に調整することができる。
【００３８】
外管１０及び内管２０の位置を、最適な位置に調整した後は、固定用ネジ３２及び３３を締めて各部材の位置を固定しておく必要がある。また、固定用ネジ３２又は固定用ネジ３３の一方は、常に締めて固定していてもよく、接着剤等で固定していてもよい。
【００３９】
［液滴の製造方法］
１実施形態において、本発明は、第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、前記液滴はリポソームであり、前記第１の液滴材料がリポソームの膜を構成する脂質を含み、前記第２の液滴材料が親水性高分子を含む、液滴の製造方法を提供する。
【００４０】
本実施形態の液滴の製造方法を説明する。図５は、本実施形態の液滴の製造方法を説明する模式図である。図５では、１．５ｍＬチューブの内部に、上述した液滴製造デバイス１００が収容されている。液滴製造デバイス１００の外管１０及び内管２０は、上述した固定具４０で固定されていることが好ましい。
【００４１】
１．５ｍＬチューブの内部には、後述する送液操作により形成された、脂質膜一層の液滴が通過する脂質膜Ｍ１が用意されている。具体的には、１．５ｍＬチューブの内部には、水相Ｗ１と、油相Ｏ１と、水相Ｗ１及び油相Ｏ１の界面に形成された脂質膜Ｍ１が形成されている。油層Ｏ１の液面と外管１０の先端部１２とは離れている。油層Ｏ１の液面と外管１０の先端部１２との間の距離は、例えば１〜２０ｍｍであってもよく、１〜１０ｍｍであってもよい。
【００４２】
ここで、油相Ｏ１の組成は、後述する第１の液滴材料１０Ｆの組成と同一であってもよく、異なっていてもよい。また、水相Ｗ１の組成としては、水、等張液又は緩衝液等が挙げられる。
【００４３】
液滴製造デバイス１００においては、外管１０及び内管２０は同心円状に配置されている。外管１０及び内管２０の断面形状は真円である。図５に示すように、内管２０は外管１０の内部に配置され、外管１０と内管２０との間には間隙が形成されている。
【００４４】
外管１０の内部（間隙）には第１の液滴材料１０Ｆが充填されている。また、内管２０の内部には第２の液滴材料２０Ｆが充填されている。第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆは、外管１０及び内管２０の軸方向に送液される。第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆの送液方向は互いに同一であり、図５における矢印の方向である。  内管２０の送液方向下流側の先端部２２は、外管１０の送液方向下流側の先端部１２よりも送液方向上流側に位置している。
【００４５】
第１の液滴材料１０Ｆとしては、リポソームを構成する両親媒性物質が挙げられる。両親媒性物質は、水に溶解しにくい有機溶媒に溶解されていることが好ましい。
【００４６】
両親媒性物質としては脂質、界面活性剤等を挙げることができる。脂質としては、人工（合成）脂質、天然物由来の脂質、細胞から抽出した脂質等が挙げられ、具体的には、ジオレオイルフォスファチヂルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルフォスファチヂルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール、スフィンゴミエリン、糖脂質ガングリオシド、レシチン等が挙げられる。界面活性剤としては、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。両親媒性物質は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４７】
有機溶媒としては、ミネラルオイル、オリーブオイル等の植物油、シリコンオイル、デカン、ヘキサン、クロロホルム等が挙げられる。
【００４８】
第２の液滴材料２０Ｆは親水性高分子を含む。第２の液滴材料２０Ｆは、リポソームに内包させる対象物質を更に含んでいてもよい。ここで、リポソームに内包させる対象物質自体が親水性高分子であってもよい。実施例において後述するように、本実施形態の液滴の製造方法によれば、前記第２の液滴材料が親水性高分子を含むことにより、所望の物質を内包したリポソームの作製効率を向上させることができる。
【００４９】
第２の液滴材料２０Ｆにおいて、対象物質及び親水性高分子は、水に溶解又は分散されていることが好ましい。リポソームに内包させる物質としては、特に制限されず、タンパク質、核酸、ウイルス、細菌、細胞抽出物、多糖、低分子化合物、粒子等が挙げられる。粒子としては、磁性体ビーズ、樹脂ビーズ等が挙げられる。
【００５０】
本実施形態の液滴の製造方法において、上記の親水性高分子としては、多糖、ポリエーテル等が挙げられる。
【００５１】
多糖としては、デキストラン、デキストリン、ペクチン等が挙げられる。多糖の分子量は１０００〜３０００００であることが好ましい。
【００５２】
ポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。ポリエーテルの分子量は１０００〜３０００００であることが好ましい。
【００５３】
本実施形態の液滴の製造方法において、第２の液滴材料は、第２の液滴材料の比重を上げるための添加物を更に含有することが好ましい。これにより、リポソームに対象物質を内包させる効率を更に上昇させることが容易になる。
【００５４】
添加物としては比重を上げる物質であれば特に制限されないが、リポソーム膜を不安定にさせる両親媒性物質等は使用しないことが好ましい。また、作製した試薬内包リポソームを細胞実験に用いる場合には、細胞毒性がない物質であることが好ましい。
【００５５】
第２の液滴材料の比重は、１．０１〜１．５に調整することが好ましい。比重を上げるための添加物としては、例えば低分子糖類、高分子密度媒体（例えばイオジキサノール）等が挙げられる。低分子糖類としては、分子量１０００以下の糖類が挙げられ、例えばスクロース、グルコース、マルトース等が挙げられる。
【００５６】
内管２０の送液方向下流側の先端部２２の内径は、０．１μｍ〜５００μｍであることが好ましく、１μｍ〜１００μｍであることがより好ましく、５μｍ〜３０μｍであることが更に好ましい。
【００５７】
内管２０の先端部２２の内径が上記範囲にあると、製造される液滴がマイクロ流体力学の法則にしたがうため、単分散性に優れる液滴をより容易に製造することができる。
【００５８】
液滴製造デバイス１００においては、内管２０の先端部２２が位置する外管１０の内径が、作製するリポソームの粒径に影響を与える。このため、外管１０と内管２０中心軸、及び外管１０の内部における内管２０の位置を厳密に調整することが好ましい。内管２０の先端部２２が位置する外管１０の内径が１００〜１４０μｍであると、リポソームの収量が多くなる傾向にある。
【００５９】
外管１０及び内管２０の構成材料は特に制限されず、例えば、樹脂、金属、ガラス等の材料を使用することができる。なかでも、外管１０及び内管２０の構成材料としてガラスが好ましい。ガラス管は、熱して引き延ばすことで微細な内径の管を作製することが容易である。このため、所望の内径を有する部分でガラス管を切断すれば、容易に所望の内径有する外管１０及び内管２０を得ることができる。
【００６０】
図６は、上述した液滴製造デバイス１００を用いて、試薬を内包したリポソームが製造される様子を示す模式図である。上述したように、液滴製造デバイス１００では、外管１０の送液方向下流側の先端部１２付近において、外管１０と内管２０との間に形成された間隙に第１の液滴材料１０Ｆが、内管２０の内部に第２の液滴材料２０Ｆがそれぞれ導入された状態にある。第２の液滴材料２０Ｆはリポソームに内包させる物質を含む。
【００６１】
ここで、図６中の矢印で示される方向に、第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆを送液すると、同心円状の外管１０及び内管２０の位置関係を維持したまま、第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆが送液され、第１の液滴材料１０Ｆが外層であり、第２の液滴材料２０Ｆが内層である層流が形成される。
【００６２】
送液は、例えばシリンジポンプで行ってもよく、例えば遠心分離機の遠心力により行ってもよいが、遠心分離機はシリンジポンプよりも並列処理数が大きい観点で好ましい。
【００６３】
第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆの送液が更に進むと、内層である第２の液滴材料２０Ｆの流れが不連続になり、流れの先端（下流側）から第２の液滴材料２０Ｆの液滴Ｄ１が形成される。
【００６４】
第２の液滴材料２０Ｆの流れが不連続となるのは、第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆの流れがレイリー・プラトー不安定性により不安定となることや、流れの推進力の大きさによっては乱流になるためと考えられる。
【００６５】
液滴Ｄ１は脂質の一重膜を有している。液滴Ｄ１は送液方向を更に直進し、油相Ｏ１と水相Ｗ１の界面に形成された脂質一重膜Ｍ１に接触し、脂質一重膜Ｍ１に包まれつつ水相Ｗ１内へと到達する。この時、液滴Ｄ１は脂質二重膜を有している。このようにして、細胞と同様の脂質二重膜を有する試薬内包リポソームＤ２を得ることができる。
【００６６】
ここで、第２の液滴材料２０Ｆに、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体分子等を含有させておくことにより、機能的にも細胞に類似した人工細胞を作製することができる。
【００６７】
また、第２の液滴材料２０Ｆに添加する対象物質の濃度を規定することにより、リポソームＤ１の内部における対象物質の濃度を制御することができる。細胞内及び細胞外で通常生じる種々の代謝の反応を、リポソームＤ２の内部で生じさせることもできる。
【００６８】
また、第１の液滴材料１０Ｆが含有している脂質と、油相Ｏ１が含有している脂質を異なる種類のものにすることで、脂質二重膜の外層と内層を非対称にすることができる。
【００６９】
本実施形態の液滴の製造方法において、推進力（例えば遠心力）の大きさによっては、粒径が揃った高品質な試薬内包リポソームを作製することができる。例えば、直径０．１μｍ〜５００μｍ程度の試薬内包リポソームを多量に製造することができる。
【００７０】
また、製造した試薬内包リポソームを、第２の液滴材料２０Ｆとして再度内管２０に導入して送液することにより、試薬内包リポソームの脂質膜の外側に更に脂質膜を形成し、脂質膜を多層化することができる。このとき、同じ組成の脂質膜を多層化することもできるし、異なる組成の脂質膜を多層化することもできる。例えば、第１の液滴材料１０Ｆ及び第２の液滴材料２０Ｆの組成を任意に変更することにより、リポソームの脂質膜の外側に、当該脂質膜とは異なる組成の脂質膜を形成することができる。
【００７１】
［液滴の粒径を調整する方法］
１実施形態において、本発明は、第１の液滴材料を送液する外管と、前記外管の内部に配置され、第２の液滴材料を送液する内管とを備え、前記外管と前記内管との間には間隙が存在し、前記第１の液滴材料と前記第２の液滴材料の送液方向は同じであり、前記内管の前記送液方向下流側の先端部が、前記外管の前記送液方向下流側の先端部よりも前記送液方向上流側に位置する液滴製造デバイスの、前記外管に前記第１の液滴材料を送液し、前記内管に前記第２の液滴材料を送液する工程を含み、前記送液を前記デバイスを遠心することにより行い、前記デバイスに印加する遠心力を調整することにより、製造する液滴の粒径を調整する、液滴の粒径を調整する方法を提供する。
【００７２】
本実施形態の方法に用いる液滴製造デバイスとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。液滴製造デバイスの外管及び内管は、上述した固定具４０で固定されていることが好ましい。
【００７３】
実施例において後述するように、液滴製造デバイスに印加する遠心力を調整することにより、製造する液滴の粒径を調整することができる。液滴は、リポソームであってもよい。
【００７４】
液滴製造デバイスに印加する遠心力の大きさは、リポソームを作製できれば何れの値でもよいが、レイリー・プラトー不安定性による液滴が形成される場合には、内管の先端部の内径と同じ粒径の液滴が得られる。また、液滴製造デバイスに印加する遠心力を、レイリー・プラトー不安定性による液滴が形成される遠心力を超える大きさにすると、内管の先端部の内径と異なる粒径の液滴が得られる。このように、遠心力を制御することにより、液滴の粒径を調整することができる。
【実施例】
【００７５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７６】
［実験例１］
第２の液滴材料（内管に導入する液滴材料）に水溶性高分子を添加して、磁性体ビーズを内包したリポソームを作製した。水溶性高分子としては、ローダミンデキストランを使用した。
【００７７】
（液滴製造デバイス）
本実験例では、図１、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示したものと同様の構造を有する固定具４０を使用して、液滴製造デバイス１００と同様の構造を有する液滴製造デバイスを組み立てて使用した。
【００７８】
（外管及び内管の作製）
プーラー（製造元：ナリシゲ、型番：ＰＣ−１０）を使用して、市販のガラス管（型式「Ｇ−１」、ナリシゲ社製；型式「１Ｂ２００−６」、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を引き伸ばし、外管及び内管を作製した。外管先端部の内径は８０μｍであった。また、内管先端部の内径は１０μｍであった。
【００７９】
（液滴材料の導入）
外管１０の内部に、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を５ｍＭ含有するミネラルオイルを１５μＬ封入した。また、内管１０の先端部を、磁性体ビーズ１ｍｇ／ｍＬ、ローダミンデキストラン５（ｗ／ｖ）％及びスクロース１Ｍを含む水溶液（試験区）に浸し、毛細管現象により内管１０の内部に０．１μＬの水溶液を吸い上げた。なお、「ｗ／ｖ」は質量と体積の比であり、「（ｗ／ｖ）％」は質量と体積の比の百分率である。ここでは、「ｗ」はローダミンデキストランの質量であり、「ｖ」は１Ｍスクロース水溶液の体積である。
【００８０】
また、対照として、ローダミンデキストランを含有しない水溶液（磁性体ビーズ１ｍｇ／ｍＬ及びスクロース１Ｍを含む水溶液）を０．１μＬ吸い上げた内管１０を用意した。
【００８１】
（内管及び外管の固定）
液滴材料を充填した外管１０と内管２０を、上述した固定具４０に順にはめて液滴製造デバイスを組み立てた。また、外管１０と内管２０との中心軸を厳密に合わせるために、固定具４０をホルダーに更に固定した状態で、顕微鏡下で外管１０の先端１２及び内管２０の先端２２の距離（すなわち、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離）を調節した。
【００８２】
内管２０先端２２が位置する外管１０の内径が１１５μｍとなる位置になるように内管保持部材２１を移動させた後、固定用ネジ３２及び固定用ネジ３３を締めてしっかり固定した。
【００８３】
（液滴回収の準備）
市販の１．５ｍＬチューブ（型式「ＭＰ−１５０ＨＣ」、日京テクノス（株）製）に３０μＬの１Ｍグルコース（水相）を注ぎ、上からＤＯＰＣ５ｍＭ含有ミネラルオイル１００μＬ添加した（油相）。脂質が一層に並ぶようにしばらく静置した後、外管１０及び内管２０を固定した固定具４０をチューブの内部に収納した。外管１０の先端１２と油相液面との間の距離が６ｍｍになるように、ミネラルオイルの量を微調整した。
【００８４】
（磁性体ビーズを内包したリポソームの作製）
上記のチューブを卓上小型遠心機（型式「ＡＴＴ−１０１」、（株）ハイテック製）にセットし、最大出力の遠心力で１０秒間遠心し、外液（ＤＯＰＣを５ｍＭ含有するミネラルオイル）及び内液（上述した試験区又は対照の水溶液）を同時に送液し、レイリー・プラトー不安定性により、磁性体ビーズを内包した液滴を作製した。作製された、磁性体ビーズを内包した液滴は、チューブ底に溜められたミネラルオイルと水の間の脂質膜を通過し、脂質二重膜のリポソームとなり、チューブ底の水中に放出された。
【００８５】
（磁性体ビーズを内包したリポソームの確認）
製造されたリポソームを回収し、蛍光顕微鏡で観察した。図７（ａ）〜（ｄ）は、リポソームの顕微鏡写真である。図７（ａ）は、対照のリポソームの明視野における顕微鏡写真である。また、図７（ｂ）は、図７（ａ）と同一の視野において、磁性体ビーズの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。その結果、図７（ａ）に示すように、対照のリポソームは、後述する試験区と比較して形成量が少なかった。また、図７（ａ）の丸で囲んだ領域にはリポソームの存在が確認されたが、この領域に対応する図７（ｂ）の丸で囲んだ領域には、磁性体ビーズの蛍光が観察されなかった。この結果から、水溶性高分子を含有しない第２の液滴材料を用いてリポソームを作製すると、リポソームの形成量が少なく、対象物質（磁性体ビーズ）をリポソームに内包させる効率も低いことが明らかとなった。
【００８６】
また、図７（ｃ）は、試験区のリポソームの明視野における顕微鏡写真である。また、図７（ｄ）は、図７（ｃ）と同一の視野において、磁性体ビーズの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。その結果、図７（ｃ）に示すように、試験区のリポソームは、対照と比較して形成量が多く、１視野中に約１００個のリポソームが確認された。また、図７（ｄ）に示すように、明視野のリポソームと、磁性体ビーズの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真における蛍光の位置が一致した。更に、顕微鏡下でネオジウム磁石を近づけると蛍光が移動した。以上の結果は、第２の液滴材料に水溶性高分子を添加することにより、磁性体ビーズが高効率で封入された大量のリポソームを作製できたことを示す。
【００８７】
［実験例２］
特許文献１に記載された、従来型の固定具を用いて内管及び外管を固定した液滴製造デバイスを組み立ててリポソームを作製し、実験例１の液滴製造デバイスと比較した。
【００８８】
従来型の固定具としては、図３に示した固定具４０’と同様のものを使用した。固定具４０’は、実験例１の固定具４０と同様に、外管保持部材１１と、内管保持部材２１とを備えており、実験例１の固定具４０における連結部材３０とは異なり、ネジである連結部材３０’を備えていた。このため、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を、連結部材３０’のネジ山とネジ山の間の距離の倍数でしか調整することができなかった。また、固定具４０’では、外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を調整した後に、外管１０及び内管２０を配置する必要があるため、顕微鏡下で観察しながら外管保持部材１１と内管保持部材２１との距離を調製することはできなかった。また、固定具４０’では、外管保持部材１１及び内管保持部材２１を固定することができず、内管２０と外管１０の中心を一致させることができなかった。
【００８９】
（リポソームの作製）
外管の内部に、ＤＯＰＣを５ｍＭ含有するミネラルオイルを１５μＬ封入した。また、内管の先端部を、ローダミンデキストラン５（ｗ／ｖ）％及びスクロース１Ｍを含む水溶液に浸し、毛細管現象により内管の内部に０．１μＬの水溶液を吸い上げた。
【００９０】
続いて、従来型の固定具又は実験例１と同様の固定具を用いて液滴製造デバイスをそれぞれ組み立てた。内管先端が位置する外管の内径は、いずれの液滴製造デバイスにおいても約１１０μｍとした。続いて、各液滴製造デバイスを用いて、実験例１と同様にしてリポソームを作製した。
【００９１】
（リポソーム数の確認）
製造されたリポソームを回収し、蛍光顕微鏡で観察した。図８（ａ）は、従来型の固定具を用いて組み立てた液滴製造デバイスで作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真である。また、図８（ｂ）は、実験例１と同様の固定具を用いて組み立てた液滴製造デバイスで作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真である。図８（ａ）及び（ｂ）の双方において、ローダミンの蛍光を観察した。
【００９２】
その結果、従来型の固定具を用いて組み立てた液滴製造デバイスでは、水相１０μＬあたり平均７０個のリポソームが確認された。これに対し、実験例１と同様の固定具を用いて組み立てた液滴製造デバイスでは、水相１０μＬあたり平均５００個のリポソームが確認された。このように、実験例１と同様の固定具を使用することにより、リポソームの形成量を約７倍に増加させることができた。
【００９３】
［実験例３］
実験例１と同様の固定具を用いて組み立てた液滴製造デバイスを用い、遠心条件を変更してリポソームを作製した。
【００９４】
（リポソームの作製）
外管の内部に、ＤＯＰＣを５ｍＭ含有するミネラルオイルを１５μＬ封入した。また、内管の先端部を、ローダミンデキストラン５（ｗ／ｖ）％及びスクロース１Ｍを含む水溶液に浸し、毛細管現象により内管の内部に０．１μＬの水溶液を吸い上げた。
【００９５】
続いて、実験例１と同様の固定具を用いて液滴製造デバイスを組み立てた。内管先端が位置する外管の内径は、いずれの液滴製造デバイスにおいても約１１０μｍとした。続いて、市販の１．５ｍＬチューブ（型式「ＭＰ−１５０ＨＣ」、日京テクノス（株）製）に３０μＬの１Ｍグルコース（水相）を注ぎ、上からＤＯＰＣ５ｍＭ含有ミネラルオイル１００μＬ添加した（油相）。脂質が一層に並ぶようにしばらく静置した後、組み立てた液滴製造デバイスをチューブの内部に収納した。外管の先端と油相液面との間の距離が６ｍｍになるように、ミネラルオイルの量を微調整した。
【００９６】
続いて、上記のチューブを高速遠心分離機（クボタ社製）にセットし、遠心条件を５００×ｇ（ｇは重力加速度を意味する。）又は１０００×ｇに制御して１０秒間遠心し、リポソームを作製した。
【００９７】
（リポソーム数の確認）
製造されたリポソームを回収して蛍光顕微鏡で観察し、リポソームの粒径及び数を測定した。図９（ａ）は、５００×ｇの遠心条件で作製したリポソームの粒径及び存在率の測定結果を示すグラフである。同じ実験を２回行った。図９（ｂ）は、１０００×ｇの遠心条件で作製したリポソームの粒径及び存在率の測定結果を示すグラフである。同じ実験を２回行った。
【００９８】
その結果、レイリー・プラトー不安定性に基づく層流が発生する速度より小さい５００×ｇでは、内管サイズ（内管先端部の内径１０μｍ）と同様の粒径サイズのリポソームと、それよりも小さい粒径サイズのリポソームとがほぼ同じ存在率で作製された。
【００９９】
一方、レイリー・プラトー不安定性に基づく層流が発生する速度より大きい１０００×ｇでは、内管サイズ（内管先端部の内径１０μｍ）よりも小さい粒径サイズのリポソームの存在率がより多かった。
【０１００】
この結果は、同一サイズの内管を用いた液滴製造デバイスでも、遠心力を制御することにより、リポソームの粒径を制御できることを示す。すなわち、遠心力を制御することにより、大きい内径の内管からも小さい粒径のリポソームを作製することができる。
【０１０１】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換及びその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、改善されたリポソーム形成技術を提供することができる。本発明は、化学関連分野、生物関連分野等に幅広く利用可能であり、生化学合成、遺伝子解析等にも利用可能である。また、実施例において示されるとおり、本発明は、液滴内でのタンパク質合成や、人工細胞膜小胞（リポソーム）の製造にも利用可能であるので、特に生物学関連分野、医学関連分野において好適に利用可能である。特に、リポソームについては、マイクロドメイン、膜の内外層の非対称性、膜タンパク質の導入等、より人工細胞に近い構造を有したものを作製することが可能である。
【符号の説明】
【０１０３】
１０…外管、１１…外管保持部材、１１’，２１’…支持体、１１ａ，１１’ａ，２１ａ，２１’ａ…孔、１２，２２…先端部、２０…内管、２１…内管保持部材、３０，３０’…連結部材、３１…ピン、３２，３３…固定用ネジ、４０，４０’…固定具、１００…液滴製造デバイス、１０Ｆ…第１の液滴材料、２０Ｆ…第２の液滴材料、Ｄ１…液滴、Ｄ２…試薬内包リポソーム、Ｏ１…油相、Ｗ１…水相、Ｍ１…脂質膜。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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