(57)【要約】【課題】タンパク質のアロステリックモジュレーターを検出するための方法の提供。【解決手段】本発明はとりわけ、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、これにより、その構造的コンフォメーションを変化させる薬剤を同定する目的で、標的タンパク質を、第二高調波発生または和周波発生による検出のためのＳＨＧ活性プローブで標識するための方法を開示する。特定の実施形態では、本発明によれば、第二高調波発生技術を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１１日に出願された米国特許出願第１３／７９４，２７７号の一部継続出願である。米国特許出願第１３／７９４，２７７号は、２０１２年４月２５日に出願した米国特許出願第６１／６３８，１３１号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。この出願はまた、２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６３２８６号への優先権を主張する。ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６３２８６号はまた、２０１２年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６３８，０２６号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。上記の出願は、全ての目的のために本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は特に分子検出およびタンパク質検出の分野に関する。具体的には、本明細書では、第二高調波発生技術を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がん生物学における潜在的な治療標的の数は、最近２０年間において、指数関数的に増大し、がんゲノミクスの理解の深化をもたらしている。しかし、同時に、承認された療法であって、最も多量に活性化するがん関連遺伝子をターゲティングする療法の数は、ごくわずかしか増大していない。生物学的視点からは魅力的な多くのがん標的が、化学的見地からは扱いにくい（「アンドラッガブル」）と考えられている。これらのタンパク質標的は典型的に、他のタンパク質と相互作用する（すなわち、タンパク質間相互作用または「ＰＰＩ」）ときに、比較的大きな接触面積を保有するために、またはタンパク質の活性部位に極めて強固に結合するリガンドを保有するという事実に起因して、従来の薬物発見法には適さないことが理解されつつある。後者の場合の例は、そのリガンドであるＧＴＰにピコモル単位のアフィニティーで結合し、潜在的な薬物との競合を困難にしている、Ｒａｓなどのタンパク質に関して見出される。全ての既存の標的のうちの７５〜８０％は、古典的な低分子クラスまたは生物学的物質（タンパク質）クラスの治療剤であって、一般に、タンパク質の活性部位に競合的に結合することによりタンパク質の機能を阻害し、それらの中には、がんに対する妥当性の高いいくつかの標的が含まれる治療剤の範囲を越えていることが推定される。
【０００４】
このような「アンドラッガブル」標的に対するアロステリックモジュレーターは、魅力的な治療の解決法をもたらす。定義により、アロステリック分子は、タンパク質の活性部位以外の部位に結合し、これにより、タンパク質のコンフォメーションを変化させ、共時的な機能的効果（例えば、受容体の阻害、活性化など）を及ぼす。加えて、他の利点（１）には、標的タンパク質のアロステリックモジュレーションが、意図されない臨床的副作用を結果としてもたらしうる、天然リガンドの、タンパク質への結合の阻害またはこれとの競合に依拠する必要がないというさらなる利益を有する。しかし、現在利用可能な従来の技法を使用して、アロステリックモジュレーターを同定することは困難であった。例えば、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ法から得られる構造的情報は、ロースループット、感度、非生理学的条件、技法に適するタンパク質のサイズ、および他の多くの因子に起因して、薬物発見の目的では限定されたものである。したがって、必要とされているのは、標的タンパク質の構造をアロステリックにモジュレートすることが可能な薬剤（agent）を、迅速に、かつ、ハイスループット様式で同定する技法である。
【０００５】
本明細書では、標的タンパク質にアロステリックに結合し、これにより、そのコンフォメーション構造を変化させることが可能な薬剤を同定するための方法を開示することにより、このような技法を提供する。
【０００６】
本明細書を通して、多様な特許、特許出願、および他の種類の刊行物（例えば、雑誌論文）を参照する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりそれらの全体において、全ての目的で本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の簡単な概要
本明細書で提供される本発明はとりわけ、第二高調波発生技術を使用することにより、標的タンパク質のコンフォメーション状態のアロステリックモジュレーターを同定および検出するための方法を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、いくつかの態様では、本明細書において、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Ｂを同定するための方法であって、（ａ）標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Ａと接触させるステップと、（ｂ）標的タンパク質を、薬剤Ｂと接触させるステップであって、標的タンパク質を、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分（標識など）で標識し、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤Ｂが標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｃ）標的タンパク質を薬剤Ｂと接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、標的タンパク質の表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、標的タンパク質の表面上の１または複数のアミン基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質を、表面に結合させながら、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて標識する。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質の領域内に配置されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの１または複数である。いくつかの実施形態では、リガンドは、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴＰＥＧ分子または脂質は、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤Ａおよび／または薬剤Ｂは、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。
【０００９】
いくつかの態様では、本明細書において、薬剤に結合するとき、コンフォメーション変化を受ける標的タンパク質の構造内の特異的部位を同定するための方法であって、（ａ）標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質を、第１のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分（標識など）で標識し、表面選択技術を使用して、第１の検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、第１の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｂ）標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第２のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分（標識など）で標識されており、第２のアミノ酸残基は、第１のアミノ酸残基の位置とは異なる標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第２の検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、第２の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｃ）第１の検出可能なシグナルを、第２の検出可能なシグナルと比較するステップであって、第１のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が標的タンパク質に結合し、第１のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、第２のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第２のアミノ酸残基の部位において標的タンパク質に結合し、第２のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップとを含む方法が提供される。別の態様では、本明細書において、薬剤がタンパク質に結合した後のタンパク質の構造の部位特異的なコンフォメーション変化を同定するための方法であって、（ａ）標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第１のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、第１の検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられ、第１の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｂ）標的タンパク質を、薬剤と接触させるステップであって、標的タンパク質は、第２のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、第２のアミノ酸残基は、第１のアミノ酸残基の位置とは異なる標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第２の検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられ、第２の検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｃ）第１の検出可能なシグナルを、第２の検出可能なシグナルと比較するステップであって、第１のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第１のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、第２のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、薬剤が第２のアミノ酸残基の部位においてタンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤と接触させる最初のステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すステップをさらに含み、標的タンパク質内の１または複数の異なる部位に位置する１または複数のさらなるアミノ酸残基を、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分（標識など）で標識し、表面選択技術を使用して、１または複数のさらなる検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、１または複数のさらなる検出可能なシグナルが、薬剤が標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、方法は、薬剤が、標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合するのか、または非特異的に結合するのかを決定するステップをさらに含み、薬剤が、１つの第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導するが、１または複数の他の第二高調波部分で標識されたアミノ酸の部位では標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しない場合は、薬剤が標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合し、薬剤が全ての第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位において標的タンパク質の構造の同一のコンフォメーション変化を誘導する場合は、薬剤が標的タンパク質上のアロステリック部位に非特異的に結合する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）からなる群から選択される。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、標的タンパク質の表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、標的タンパク質の表面上の１または複数のアミン基により、標的タンパク質へと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質を、表面に結合させながら、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて標識する。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質の領域内に配置されている。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの１または複数である。いくつかの実施形態では、リガンドは、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴＰＥＧ分子または脂質は、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質の構造のコンフォ���ーション変化を、リアルタイムで検出する。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤は、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。
【００１０】
いくつかの態様では、本明細書において、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、（ａ）ＧＰＣＲを、天然リガンドと接触させるステップであって、天然リガンドを、第二高調波活性部分（標識など）で標識し、標識が、ＧＰＣＲに結合するときに、界面において正味の配向性を有するステップと、（ｂ）ＧＰＣＲを、薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤がＧＰＣＲ上のアロステリック部位に結合するときにもたらされるＧＰＣＲの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｃ）標的タンパク質を薬剤と接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、生体細胞、リポソーム、または合成生体膜の表面上に配置されている。他の態様では、本明細書において、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、（ａ）ＧＰＣＲを既知のリガンドと接触させるステップであって、既知のリガンドが、ＧＰＣＲに結合することが既知であり、既知のリガンドは、第二高調波活性部分で標識されており、標識されたリガンドが、ＧＰＣＲに結合するときに、界面において正味の配向性を有するステップと、（ｂ）ＧＰＣＲを薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性標識に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤がＧＰＣＲ上の部位に結合するときにもたらされるＧＰＣＲの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｃ）標的タンパク質を薬剤と接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、生体細胞は、ＧＰＣＲを生得的に（naturally）発現する。いくつかの実施形態では、生体細胞は、ＧＰＣＲをコードする異種核酸を含む。本明細書で記載されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、アルファ１アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）、ウロテンシン（ＵＴ）受容体、５−ＨＴ２セロトニン受容体および５−ＨＴ６セロトニン受容体、ヒポクレチン（オレキシン）受容体、ヒスタミンＨＩ受容体、ブラジキニンＢ１受容体およびブラジキニンＢ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体、アセチルコリン受容体（acetycholine  receptors）、ｍＧｌｕＲ５グルタミン酸受容体、バソプレッシンＶ２受容体およびバソプレッシンＶＩ受容体、アンジオテンシンＡＧＴＲ１受容体、コレシストキニンＣＣＫＡＲ受容体およびコレシストキニンＣＣＫＢＲ受容体、エンドセリンＥＮＤＲＡ受容体、グレリンＧＨＳＲｌａ受容体、メラトニンＭＴＮＲｌＡ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、血小板活性化因子ＰＴＡＦＲ受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体ＰＲＬＨＲ受容体、Ｇ共役５−ＨＴ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ６、および５−ＨＴ７セロトニン受容体、Ｇｉ共役ＧＡＢＡ−Ｂ受容体、ヒスタミンＨ３受容体、およびｍＧｌｕＲ２／４グルタ��ン酸受容体からなる群から選択される。
【００１１】
他の態様では、本明細書において、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Ｂを同定するための方法であって、（ａ）標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Ａと接触させるステップであって、薬剤Ａを、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分（標識など）で標識し、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルを、第二高調波活性部分（標識など）に発生させ、検出可能なシグナルが、薬剤Ｂが標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、（ｂ）標的タンパク質を、薬剤Ｂと接触させるステップと、（ｃ）標的タンパク質を薬剤Ｂと接触させた後で、検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップとを含む方法が提供される。いくつかの態様では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、薬剤Ａの表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、薬剤Ａへと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、天然スルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のスルフヒドリル基は、工学的に作製されたスルフヒドリル基である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が、薬剤Ａの表面上の１または複数のアミン基により、薬剤Ａへと結合されている。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、天然アミン基である。いくつかの実施形態では、前記１または複数のアミン基は、工学的に作製されたアミン基である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、非天然アミノ酸である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アラダンである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、界面は、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、表面を、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化する。いくつかの実施形態では、オリゴＰＥＧ分子または脂質は、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である。いくつかの実施形態では、表面は、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アフィニティータグを含む。本明細書で提示されるいずれかの実施形態のうちのいくつかの実施形態では、薬剤Ａまたは薬剤Ｂは低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである。
【００１２】
本発明は、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定する方法であって、（ａ）標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、候補結合パートナーと接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第１の検出可能なシグナルを検出するステップと、（ｂ）標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、候補結合パートナーと接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第２の検出可能なシグナルを検出するステップとを含む方法をさらに提供する。第１の検出可能なシグナルと、第２の検出可能なシグナルとの差異（例えば、ノイズレベルを１％、２％、３％、４％、５％上回る）は、標的生体分子と、候補結合パートナーとの特異的結合相互作用を指し示す。必要に応じて、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられる。必要に応じて、表面選択技術は、第二高調波発生または和周波発生である。
【００１３】
本発明は、標的生体分子をターゲティングする薬物候補のライブラリーをスクリーニングする方法であって、（ａ）標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第１の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第１の検出可能なシグナルを検出するステップと、（ｂ）標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第１の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第２の検出可能なシグナルを検出するステップと、（ｃ）第１の検出可能なシグナルと、第２の検出可能なシグナルとの第１の差異をもたらすステップと、（ｄ）標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第２の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第３の検出可能なシグナルを検出するステップと、（ｅ）標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、標的生体分子を、第２の薬物候補と接触させ、標的生体分子と候補結合パートナーとが結合した後の第４の検出可能なシグナルを検出するステップと、（ｆ）第３の検出可能なシグナルと、第４の検出可能なシグナルとの第２の差異をもたらすステップと、（ｇ）第１の差異および第２の差異に基づき、薬物を選択するステップとを含む方法をさらに提供する。必要に応じて、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、第二高調波活性部分により発生させられる。必要に応じて、表面選択技術は、第二高調波発生または和周波発生である。必要に応じて、方法は、選択された薬物を、動物においてスクリーニングするステップをさらに含む。
【００１４】
検出可能なシグナルは、標準化された第二高調波発生の強度の変化でありうる。標的生体分子は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴ糖でありうる。必要に応じて、候補結合パートナーは、アロステリックモジュレーターである。
【００１５】
本発明は、標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定する方法であって、（ａ）標的タンパク質を、タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと共にプレインキュベートするステップと、（ｂ）標的タンパク質を、候補アロステリック結合パートナーと接触させるステップと、（ｃ）表面選択技術を使用して、標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定するステップとを含む方法をさらに提供する。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合パートナーと直接的な構造的接触をなす部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合パートナーと間接的な構造的接触をなす部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、結合分子の結合に非構造的に影響を及ぼし、かつ／またはこれをモジュレートする部位である。必要に応じて、機能的に関連する部位は、第二高調波活性部分で標識される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Ｂを同定するための方法であって、
ａ．前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Ａと接触させるか、または薬剤Ａが、単離されたときに前記標的タンパク質の前記活性部位に生得的に結合しているステップと、
ｂ．前記標的タンパク質を、前記薬剤Ｂと接触させるステップであって、前記標的タンパク質が、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、前記薬剤Ｂが前記標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
ｃ．前記標的タンパク質を前記薬剤Ｂと接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の１または複数のアミン基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記１または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記１または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記１または複数のアミン基が、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記標的タンパク質を、表面に結合させながら、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて標識する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記非天然アミノ酸が、１または複数のリガンドに接触することが既知である前記標的タンパク質の領域内に配置されている、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目５に記載の方法。
（項目１７）
前記リガンドが、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの１または複数である、項目６に記載の方法。
（項目１８）
前記リガンドが、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記標的タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記表面を、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記オリゴＰＥＧ分子または脂質が、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記標的タンパク質の構造の前記コンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記薬剤Ａが、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記薬剤Ｂが、前記標的タンパク質の活性部位に特異的に結合する、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
薬剤がタンパク質に結合した後の前記タンパク質の構造の部位特異的なコンフォメーション変化を同定するための方法であって、
ａ．前記標的タンパク質を、前記薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、第１のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、第１の検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記第１の検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
ｂ．前記標的タンパク質を、前記薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、第２のアミノ酸残基において、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、前記第２のアミノ酸残基は、前記第１のアミノ酸残基の位置とは異なる前記標的タンパク質の領域内に配置されており、表面選択技術を使用して、第２の検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記第２の検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
ｃ．前記第１の検出可能なシグナルを、前記第２の検出可能なシグナルと比較するステップであって、前記第１のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、前記薬剤が前記第１のアミノ酸残基の前記部位において前記タンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示し、前記第２のアミノ酸残基の部位のみにおけるコンフォメーション変化が、前記薬剤が前記第２のアミノ酸残基の前記部位において前記タンパク質の構造にコンフォメーション変化を誘導することを指し示すステップと
を含む方法。
（項目２９）
前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の前記活性部位に結合する薬剤と接触させる最初のステップを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すステップをさらに含み、前記標的タンパク質内の１または複数の異なる部位に位置する１または複数のさらなるアミノ酸残基は、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、１または複数のさらなる検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記１または複数のさらなる検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記標的タンパク質上の部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記薬剤が、前記標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合するのか、または非特異的に結合するのかを決定するステップをさらに含み、前記薬剤が、１つの第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導するが、１または複数の他の第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位では前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しない場合は、前記薬剤が前記標的タンパク質上のアロステリック部位に特異的に結合し、前記薬剤が全ての第二高調波活性部分で標識されたアミノ酸の部位において前記標的タンパク質の構造の同一のコンフォメーション変化を誘導する場合は、前記薬剤が前記標的タンパク質上のアロステリック部位に非特異的に結合する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステル、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記第二高調波活性部分が、前記標的タンパク質の表面上の１または複数のアミン基により、前記標的タンパク質へと結合されている、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
前記１または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記１または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記１または複数のアミン基が、１または複数のリガンドに接触することが既知である標的タンパク質のアミノ酸残基上に配置されている、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記標的タンパク質が、表面に結合しながら、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて標識されている、項目２８に記載の方法。
（項目４４）
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目２８に記載の方法。
（項目４５）
前記非天然アミノ酸が、１または複数のリガンドに接触することが既知である前記標的タンパク質の領域内に配置されている、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記リガンドが、タンパク質、核酸、リン脂質、炭水化物、または補因子のうちの１または複数である、項目３６に記載の方法。
（項目４８）
前記リガンドが、キナーゼシグナル伝達カスケードのタンパク質メンバーである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記標的タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記表面を、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記オリゴＰＥＧ分子または脂質が、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記標的タンパク質の構造の前記コンフォメーション変化を、リアルタイムで検出する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記薬剤Ａが、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法であって、
ａ．前記ＧＰＣＲを既知のリガンドと接触させるステップであって、前記既知のリガンドが、前記ＧＰＣＲに結合することが既知であり、前記既知のリガンドが、第二高調波活性部分で標識されており、前記標識されたリガンドが、前記ＧＰＣＲに結合した後に界面において正味の配向性を有するステップと、
ｂ．前記ＧＰＣＲを前記薬剤と接触させるステップであって、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性標識により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、前記薬剤が前記ＧＰＣＲ上の部位に結合するときにもたらされる前記ＧＰＣＲの構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
ｃ．前記標的タンパク質を前記薬剤と接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
（項目５８）
前記ＧＰＣＲが、生体細胞、リポソーム、または合成生体膜の表面上に配置されている、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記生体細胞が、前記ＧＰＣＲを生得的に発現する、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記生体細胞が、前記ＧＰＣＲをコードする異種核酸を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
前記ＧＰＣＲが、アルファ１アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）、ウロテンシン（ＵＴ）受容体、５−ＨＴ２セロトニン受容体および５−ＨＴ６セロトニン受容体、ヒポクレチン（オレキシン）受容体、ヒスタミンＨＩ受容体、ブラジキニンＢ１受容体およびブラジキニンＢ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体、アセチルコリン受容体、ｍＧｌｕＲ５グルタミン酸受容体、バソプレッシンＶ２受容体およびバソプレッシンＶＩ受容体、アンジオテンシンＡＧＴＲ１受容体、コレシストキニンＣＣＫＡＲ受容体およびコレシストキニンＣＣＫＢＲ受容体、エンドセリンＥＮＤＲＡ受容体、グレリンＧＨＳＲｌａ受容体、メラトニンＭＴＮＲｌＡ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、血小板活性化因子ＰＴＡＦＲ受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体ＰＲＬＨＲ受容体、Ｇ共役５−ＨＴ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ６、および５−ＨＴ７セロトニン受容体、Ｇｉ共役ＧＡＢＡ−Ｂ受容体、ヒスタミンＨ３受容体、およびｍＧｌｕＲ２／４グルタミン酸受容体からなる群から選択される、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤Ｂを同定するための方法であって、
ａ．前記標的タンパク質を、前記標的タンパク質の活性部位に結合する薬剤Ａと接触させるステップであって、前記薬剤Ａが、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性部分で標識されており、表面選択技術を使用して、検出可能なシグナルが、前記第二高調波活性部分により発生させられ、前記検出可能なシグナルが、薬剤Ｂが前記標的タンパク質上のアロステリック部位に結合するときにもたらされる前記標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示すステップと、
ｂ．前記標的タンパク質を、前記薬剤Ｂと接触させるステップと、
ｃ．前記標的タンパク質を前記薬剤Ｂと接触させた後で、前記検出可能なシグナルの存在または非存在を測定するステップと
を含む方法。
（項目６３）
前記第二高調波活性部分が、前記薬剤Ａの表面上の１または複数のスルフヒドリル基により、前記薬剤Ａへと結合されている、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、天然スルフヒドリル基である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記１または複数のスルフヒドリル基が、工学的に作製されたスルフヒドリル基である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）である、項目６２に記載の方法。
（項目６７）
前記第二高調波活性部分が、前記薬剤Ａの表面上の１または複数のアミン基により、前記薬剤Ａへと結合されている、項目６２に記載の方法。
（項目６８）
前記１または複数のアミン基が、天然アミン基である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記１または複数のアミン基が、工学的に作製されたアミン基である、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記第二高調波活性部分が、ＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルである、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記第二高調波活性部分が、非天然アミノ酸である、項目６２に記載の方法。
（項目７２）
前記非天然アミノ酸が、アラダンである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記標的タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、ステロイドホルモン受容体、またはチロシンキナーゼ受容体である、項目６２に記載の方法。
（項目７４）
前記界面が、ガラス表面、ポリエチレングリコール表面、支持脂質二重層表面、脂質類似体二重層表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリエチレン表面からなる群から選択される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記表面が、オリゴＰＥＧ分子または脂質で誘導体化されている、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記オリゴＰＥＧ分子または脂質が、Ｎｉ−ＮＴＡを保有するオリゴＰＥＧ分子またはＮｉ−ＮＴＡを保有する脂質である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記表面が、支持脂質二重層または脂質類似体二重層である、項目６２に記載の方法。
（項目７８）
前記標的タンパク質が、アフィニティータグを含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記薬剤Ａまたは前記薬剤Ｂが低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸、またはこれらの任意の組合せである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
ａ．標的タンパク質にコンジュゲートするための１もしくは複数のＳＨＧ活性標識もしくはＳＦＧ活性標識；
ｂ．タンパク質をＳＨＧ活性標識もしくはＳＦＧ活性標識で標識するための１もしくは複数の試薬；
ｃ．標的タンパク質を結合させるための１もしくは複数の表面；
ｄ．標的タンパク質−アロステリックモジュレーター相互作用を検出するための装置と共に使用するための１もしくは複数のシグナル周辺機器；
ｅ．標的タンパク質の機能性に必要な１もしくは複数の補因子；
ｆ．１もしくは複数の標的タンパク質に結合することが既知である１もしくは複数のペプチドおよび／もしくはタンパク質；
ｇ．１もしくは複数の標的タンパク質に結合することが既知である１もしくは複数の抗体；ならびに
ｈ．ＳＨＧ活性非天然アミノ酸（ＵＡＡ）標識もしくはＳＦＧ活性非天然アミノ酸（ＵＡＡ）標識をタンパク質へと導入するための１もしくは複数の成分
のうちの１または複数を含むキット。
（項目８１）
前記１または複数のＳＨＧ活性標識またはＳＦＧ活性標識が、マレイミド標識、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、オキサゾール標識、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、ＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびクマリンベースの色素からなる群から選択される、項目８０に記載のキット。
（項目８２）
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、ガラス、プラスチック、金属、ラテックス、ゴム、セラミック、およびポリマーからなる群から選択される、項目８０に記載のキット。
（項目８３）
前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、またはポリエチレンである、項目８１に記載のキット。
（項目８４）
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、少なくとも１つのあらかじめ形成された表面特徴を含む、項目８０に記載のキット。
（項目８５）
前記少なくとも１つのあらかじめ形成された表面特徴が、トレンチ、ｖ字溝、メサ構造、および／またはウェルである、項目８４に記載のキット。
（項目８６）
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、標的タンパク質への付着に適する表面化学特性をもたらす１または複数の分子であらかじめコーティングされている、項目８０に記載のキット。
（項目８７）
前記１または複数の分子が、アルデヒドシラン、ＢＳＡ−ＮＨＳ、またはオリゴポリエチレングリコールである、項目８６に記載のキット。
（項目８８）
前記オリゴポリエチレングリコールが、ニッケル−オリゴポリエチレングリコールである、項目８７に記載のキット。
（項目８９）
標的タンパク質を結合させるための前記表面が、支持脂質二重層または支持脂質類似体二重層であらかじめコーティングされている、項目８０に記載のキット。
（項目９０）
標的タンパク質−アロステリックモジュレーター相互作用を検出するための装置と共に使用するための前記シグナル周辺機器が、パスフィルター、カラーフィルター、干渉フィルター、偏光素子、またはビームを方向付け、その焦点を絞るための１もしくは複数の鏡またはレンズである、項目８０に記載のキット。
（項目９１）
標的タンパク質の機能性に必要な前記補因子が、チアミンピロリン酸、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ピリドキサールリン酸、リポアミド、メチルコバラミン、コバラミン、ビオチン、コエンザイムＡ、テトラヒドロ葉酸、メナキノン、アスコルビン酸、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、コエンザイムＦ４２０、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、Ｓ−アデノシルメチオニン、コエンザイムＢ、コエンザイムＭ、コエンザイムＱ、シチジン三リン酸、グルタチオン、ヘム、ヌクレオチド糖、ピロロキノリン、キノン、またはテトラヒドロビオプテリンである、項目８０に記載のキット。
（項目９２）
第二高調波発生（ＳＨＧ）および／または和周波発生（ＳＦＧ）を使用して、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、かつ／またはこれをモジュレートする薬剤についてスクリーニングし、これらを同定するためのシステムであって、
ａ．ＳＦＧ活性部分またはＳＨＧ活性部分で標識された標的タンパク質と、
ｂ．標的タンパク質−薬剤相互作用を検出するための装置であって、ｉ）基本波光源；ｉｉ）ＳＦＧ活性部分またはＳＨＧ活性部分で標識された前記標的タンパク質を含む基質；およびｉｉｉ）第二高調波ビーム、または他の非線形光学ビームの強度を測定するための検出器を含む装置と
を含み、
前記薬剤の、タンパク質上のアロステリック部位への結合を、前記装置により検出し、前記検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録するシステム。
（項目９３）
標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定する方法であって、
ａ．前記標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記候補結合パートナーと接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第１の検出可能なシグナルを検出するステップと、
ｂ．前記標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記候補結合パートナーと接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第２の検出可能なシグナルを検出するステップと
を含み、
表面選択技術を使用して、前記検出可能なシグナルを、前記第二高調波活性部分により発生させ、
前記第１の検出可能なシグナルと、前記第２の検出可能なシグナルとの差異が、前記標的生体分子と、前記候補結合パートナーとの特異的結合相互作用を指し示す方法。
（項目９４）
前記差異が、ノイズレベルを２％上回る、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記差異が、ノイズレベルを５％上回る、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
標的生体分子をターゲティングする薬物候補のライブラリーをスクリーニングする方法であって、
ａ．前記標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、第１の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第１の検出可能なシグナルを検出するステップと、
ｂ．前記標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記第１の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第２の検出可能なシグナルを検出するステップと、
ｃ．前記第１の検出可能なシグナルと、前記第２の検出可能なシグナルとの第１の差異をもたらすステップと、
ｄ．前記標的生体分子を、第１の部位において、第１の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、第２の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第３の検出可能なシグナルを検出するステップと、
ｅ．前記標的生体分子を、第２の部位において、第２の第二高調波活性部分で標識し、前記標的生体分子を、前記第２の薬物候補と接触させ、前記標的生体分子と前記候補結合パートナーとが結合した後の第４の検出可能なシグナルを検出するステップと、
ｆ．前記第３の検出可能なシグナルと、前記第４の検出可能なシグナルとの第２の差異をもたらすステップと、
ｇ．前記第１の差異および前記第２の差異に基づき、薬物を選択するステップと
を含み、
表面選択技術を使用して、前記検出可能なシグナルを、前記第二高調波活性部分により発生させる方法。
（項目９７）
前記選択された薬物を、動物においてスクリーニングするステップをさらに含む、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
前記検出可能なシグナルが、標準化された第二高調波発生の強度の変化である、項目９３または項目９４に記載の方法。
（項目９９）
前記表面選択技術が、第二高調波発生または和周波発生である、項目９３または項目９４に記載の方法。
（項目１００）
前記標的生体分子が、タンパク質である、項目９３または項目９４に記載の方法。
（項目１０１）
前記標的生体分子が、ＤＮＡである、項目９３または項目９４に記載の方法。
（項目１０２）
前記候補結合パートナーが、アロステリックモジュレーターである、項目９３または項目９４に記載の方法。
（項目１０３）
標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定する方法であって、
ａ．前記標的タンパク質を、前記タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと共にプレインキュベートするステップと、
ｂ．前記標的タンパク質を、候補アロステリック結合パートナーと接触させるステップと、
ｃ．表面選択技術を使用して、前記標的タンパク質内の機能的に関連する部位におけるコンフォメーション変化を測定するステップと
を含む方法。
（項目１０４）
前記機能的に関連する部位が、結合パートナーと直接的な構造的接触をなす部位である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
前記機能的に関連する部位が、結合パートナーと間接的な構造的接触をなす部位である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０６）
前記機能的に関連する部位が、結合分子の結合に非構造的に影響を及ぼし、かつ／または結合分子をモジュレートする部位である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０７）
前記機能的に関連する部位を、第二高調波活性部分で標識する、項目１０１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、タンパク質内のコンフォメーション変化を検出するための検出工程の概略を描示する。赤色の入射光は、表面に衝突し、全内部反射により、表面の平面に対して垂直に偏光し、表面から短い距離だけ進むエバネセント波を作り出す（左）。表面に結合させた、標識されたタンパク質であり、この法線に照らした色素の位置に依存するベースラインシグナルを伴うタンパク質である（中）。標識を、エバネセント波の法線へと引き寄せるコンフォメーション変化は、シグナルの増大を結果としてもたらす（左）。
【図２】図２は、ＳＨＧ技術を活用して、既知のアロステリック結合剤であるＧＮＦ２と相互作用するときに、野生型のＡｂｌキナーゼおよびＫ４１９Ｃ突然変異体のＡｂｌキナーゼにおいて誘導されるコンフォメーション変化を測定する実験の結果を描示する。
【図３】図３は、標識されたＲａｓタンパク質を、支持脂質二重層（ＳＬＢ）上のＳＨＧにより検出しうることを示すＳＨＧデータを描示する。
【図４Ａ】図４は、Ａ）標準化されたＳＨＧ強度を示す図、およびＢ）シフトパーセントを描示する図により、３つの化合物の、アミンにおいて標識された（溶液による標識）Ｒａｓ標的タンパク質への結合についてのＳＨＧデータを描示する。ベースラインのＳＨＧの測定値は、各化合物を、手作業により２０μＭの２倍濃度で注射する前に約５秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約６０秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
【図４Ｂ】図４は、Ａ）標準化されたＳＨＧ強度を示す図、およびＢ）シフトパーセントを描示する図により、３つの化合物の、アミンにおいて標識された（溶液による標識）Ｒａｓ標的タンパク質への結合についてのＳＨＧデータを描示する。ベースラインのＳＨＧの測定値は、各化合物を、手作業により２０μＭの２倍濃度で注射する前に約５秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約６０秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
【図５Ａ】図５は、Ａ）標準化されたＳＨＧ強度を示す図、およびＢ）シフトパーセントを描示する図により、３つの化合物の、システインにおいて標識されたＲａｓ標的タンパク質への結合についてのＳＨＧデータを描示する。ベースラインのＳＨＧの測定値は、各化合物を、手作業により２０μＭの２倍濃度で注射する前に約５秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約６０秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
【図５Ｂ】図５は、Ａ）標準化されたＳＨＧ強度を示す図、およびＢ）シフトパーセントを描示する図により、３つの化合物の、システインにおいて標識されたＲａｓ標的タンパク質への結合についてのＳＨＧデータを描示する。ベースラインのＳＨＧの測定値は、各化合物を、手作業により２０μＭの２倍濃度で注射する前に約５秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約６０秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はとりわけ、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、これにより、その構造的コンフォメーションを変化させる薬剤を同定する目的で、標的タンパク質を、第二高調波発生または和周波発生による検出のためのＳＨＧ活性部分、標識、またはプローブで標識するための方法を開示する。
【００１８】
構造ベースの薬物スクリーニングおよび生体分子の機構についての基礎研究の目的は、生体分子がリガンド、薬物、または他の結合パートナーに結合するときの、生体分子の構造および構造的変化を測定しうるツールを要求する。構造的変化を決定するための現在の技法は、ＮＭＲ（核磁気共鳴）およびＸ線結晶構造解析に主に限られている。これらの技法のうちのいずれも、構造的変化をリアルタイムで測定するのに適さない。さらに、それらは、時間集約的、かつ、労働集約的であり、薬物スクリーニングにおけるワイドスケールの使用に適さない。さらに、結晶化することが困難であり、したがって、それらの構造が決定されていないタンパク質（例えば、膜タンパク質）が多く存在する。
【００１９】
第二高調波発生（ＳＨＧ）は、タンパク質へと付着させたＳＨＧ活性色素プローブの構造的シフトに対して高感度である。対象のタンパク質を、アミン部位またはスルフヒドリル部位（例えば、リシン残基またはシステイン残基）において、ＳＨＧ活性色素プローブで、共有結合的に標識する。ＳＨＧ活性色素プローブは、蛍光プローブであることが多く、鍵となる構成要素は、双極子モーメントの差異が大きく、非中心対称性の構造であるという要件である。ＳＨＧの測定は、標識されたタンパク質を、表面に結合させ、それを、超高速レーザーに由来する赤色のパルス光へと曝露することにより行う。照射下において、色素プローブは、赤色の入射光の小部分を、青色の光へと転換するが、これが、「第二高調波」シグナルである。光の吸収を伴わず、反射と類似の機構に依拠するこの現象は、標識の正味の平均配向性が存在する場合に限り生じるものであり、溶液中でランダムに配向させた標識分子は、第二高調波光をもたらさない（図１）。理論的には、同じ軸に照らし、標識のうちの半分が表面を向き、他の半分は表面とは逆を向くタンパク質の集団であれば、第二高調波光をもたらさないであろう。実際は、正味の平均配向性が常に存在する。リガンドの結合および共時的なコンフォメーション変化に起因して標識の平均配向性がシフトする場合、第二高調波光の強度は変化し、これが、コンフォメーション変化を検出するＳＨＧの能力の基盤となる。
【００２０】
本発明では、第二高調波発生法を使用して、標的タンパク質のアロステリックモジュレーターについてスクリーニングし、これを同定する。本発明者らはとりわけ、標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合することが既知の薬剤もしくはリガンドと共にプレインキュベートするか、または候補アロステリックモジュレーターのＳＨＧスクリーニングの前に天然リガンドをその活性部位に結合させたタンパク質を単離することにより、ＳＨＧにより検出される標的タンパク質のコンフォメーション変化が、標的タンパク質上の、活性部位ではなく、アロステリック部位における候補モジュレーターの相互作用に起因する可能性が増大することを発見した。したがって、本出願の方法は、本明細書で記載される方法を使用する、タンパク質のコンフォメーションおよび挙動についてのアロステリックモジュレーターの同定が、結果を得るのに長時間を要求することが多く、リガンドに結合した後のタンパク質のコンフォメーショナルダイナミクスのスナップショットをもたらすに過ぎないことがせいぜいである従来の方法とは対照的に、ハイスループットアッセイとして、かつ、リアルタイムで実施しうるという点で、当技術分野で既に実施された方法に対する改善を表す。
【００２１】
Ｉ．一般的な技法
本発明の実施は、別段に指し示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、非線形光学による検出および測定、ならびに免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、２版（Sambrookら、１９８９年）；「Oligonucleotide  Synthesis」（M.  J.  Gait編、１９８４年）；「Animal  Cell  Culture」（R.  I.  Freshney編、１９８７年）；「Methods  in  Enzymology」（Academic  Press,  Inc.）；「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」（F.  M.  Ausubelら編、１９８７年、および定期的な改訂版）；「PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction」（Mullisら編、１９９４年）といった文献において十分に説明されている。Singletonら、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology、２版、J.  Wiley  &  Sons（New  York、N.Y.、１９９４年）；March、「Advanced  Organic  Chemistry  Reactions,  Mechanisms  and  Structure」４版、John  Wiley  &  Sons（New  York、N.Y.、１９９２年）；「Bioconjugate  Techniques」、Elsevier（G  .T.  Hermanson、２００８年）、「Second-order  nonlinear  optical  effects  at  surfaces  and  interfaces」、Nonlinear  Surface  Electromagnetic  Phenomena、Elsevier（H.  PonathおよびG.I.  Stegeman編、１９９１年）；ならびに「Neuronal  Calcium  Sensor  Proteins」、NOVA  Publishers（PhilippovおよびKoch編、２００６年）は、当業者に、本出願において使用される用語のうちの多くに対する一般的な指針を提供している。
【００２２】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される「第二高調波」とは、周波数が光の基本波ビーム（fundamental  beam）の２倍の周波数の光を指す。
【００２３】
本明細書で使用される通り、全ての原子の反転（ｘ，ｙ，ｚ）→（−ｘ，−ｙ，−ｚ）であって、分子または物質を変化させずにおく反転がなされる空間内の点（「中心」または「反転中心」）が存在する場合、分子相または物質相は「中心対称性」である。非中心対称性の分子または物質は、この反転の中心を欠く。例えば、分子が均一の組成であり、球または立方体の形状である場合、それは中心対称性である。中心対称性の分子または物質は、第二高調波発生、和周波発生、および差周波発生に必要な非線形感受率または超偏光度を有さない。
【００２４】
本明細書で使用される「表面選択性」とは、当技術分野で公知の第二高調波発生もしくは和／差周波発生、または他の表面特異的技法などの非線形光学法を指す。
【００２５】
本明細書で使用される「和周波発生」（ＳＦＧ）とは、１つの周波数における光（Ω１）を、別の周波数における光（Ω２）と混合して、和周波数（Ω１＋Ω２）における応答をもたらす非線形光学法である（Shen、１９８４年、１９８９年）。例えば、ＳＦＧは、分子を、表面において、それらの特徴的な振動遷移を介して検出するのに特に有用であり、この場合は本質的に、可視光周波数および赤外周波数におけるΩ１およびΩ２による表面選択性の赤外線分光法である。「ＳＨＧ」または「第二高調波発生」という用語を本明細書で使用する場合、ＳＦＧおよび「和周波発生」は、当業者に周知の方法によるＳＨＧに置きかえることができ、ＳＨＧの代わりに使用しうることが理解される。
【００２６】
本明細書で使用される「非線形活性部分」とは、超偏光度を保有する物質である。
【００２７】
本明細書で使用される「第二高調波活性部分」または「第二高調波活性部分」とは、それをより非線形光学活性とするために、分子（例えば、酵素などのタンパク質）、粒子、または相（例えば、脂質二重層）へと付着（共有結合的に、または非共有結合的に）させうる、非線形活性部分、粒子、または分子を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「アロステリック」、「アロステリックモジュレーター」、または「アロステリック候補」とは、活性部位以外の部位に主に結合し、ＳＨＧまたはＳＦＧにより決定されるコンフォメーション変化を引き起こし、したがって、アロステリック作用機構を介してそれらの効果を及ぼす分子、部分、または物質を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「活性部位」または「活性結合部位」とは、その形状および帯電電位の結果として、多様な共有結合的結合力および／または非共有結合的結合力を介して、別の薬剤（限定せずに述べると、リガンド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む核酸、分子、化合物、抗生剤もしくは薬物、分子、部分、基質、生成物、類似体、または阻害剤を含む）と好適に相互作用または会合し、触媒作用、シグナル伝達、および／またはエフェクターの活性化などであるがこれらに限定されないタンパク質の機能が果たされる標的タンパク質の領域を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる「超偏光度」または「非線形感受率」とは、非線形光の発生を可能とする、分子、粒子、界面、または相の特性を指す。「超偏光度」、「二次非線形偏光度」、および「非線形感受率」という用語は場合によって、互換的に使用される。
【００３１】
本明細書で言及される通り、本明細書で定義される「機能的に関連する」結合パートナーイベントに関与する部位は、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、またはＳＨＧなどの構造的技法により決定される、結合パートナー（例えば、エフェクター分子）との直接的または間接的な構造的接触をなす任意の部位を含む。直接的な構造的接触とは、その一部が、結合パートナー分子の一部から２ｎｍ以内にある任意の残基と定義される。間接的な構造的接触とは、その一部が、Ｘ線、ＮＭＲ、またはＳＨＧなどの構造的技法により見られる通り、結合パートナー（例えば、エフェクター分子）、または結合パートナーの模倣体もしくは類似体が結合するときに、その配向性、コンフォメーション、または相対的な座標を、結合パートナー、模倣体、または類似体の非存在下におけるその配向性、コンフォメーション、または相対的な座標と比べて変化させる任意の残基と定義される。「機能的に関連する」という用語はまた、結合分子の結合またはモジュレーション（例えば、活性化、阻害、調節など）に重要であることが、非構造的手段（例えば、突然変異誘発または特定の残基が結合パートナーの結合またはモジュレーションに重要であることを示す生化学的データ）により既知である残基も含む。
【００３２】
本明細書で定義される「リガンド」という用語は、別のタンパク質に結合する１つのタンパク質、タンパク質に結合する炭水化物、またはタンパク質に結合する低分子などであるがこれらに限定されない、別の分子に結合する任意の分子を含む。
【００３３】
本明細書で使用される「非線形」とは、入射光ビーム（別称、基本波）の周波数を変換することが可能な光学法を指す。非線形ビームとは、このような変換から生じる高次周波数ビーム、例えば、第二高調波である。第二高調波発生、和周波発生、または差周波発生では、非線形ビームをコヒーレントに発生させる。第二高調波発生（ＳＨＧ）では、基本波ビームの２つのフォトンが、界面により事実上散乱され、第二高調波の１つのフォトンをもたらす。本明細書ではまた、「非線形」を、「非線形光学」または「表面選択性非線形」とも称する。
【００３４】
本明細書で用いられる「非線形活性」または「非線形的に活性」という用語はまた、１または複数の入射放射ビームにより駆動されると、非線形光学放射を発生させる、分子、粒子、界面、または相の能力の一般的な特性も指す。
【００３５】
本明細書で非線形光学法に言及する場合、「検出」または「〜を検出すること」とは、表面選択性非線形光学放射の特性を使用して、プローブ−標的間相互作用（タンパク質と候補モジュレーター化合物との相互作用など）の特性または相互作用の効果を検出するか、測定するか、または非線形光の特性（例えば、強度、波長、偏光、または電磁放射に一般的な他の特性）と相関させうる技法を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「コンフォメーション変化」という用語は、生物学的分子種（例えば、酵素などのタンパク質）の構造的コンフォメーションの変化を指す。
【００３７】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。
【００３８】
本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、ＳＨＧにより検出されるタンパク質のコンフォメーションを変化させる任意の物質（例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質など）を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「界面」とは、非線形光学シグナルを発生させる領域、または正味の配向性を保有する第二高調波活性部分で標識された標的が存在する表面近傍の領域である。界面はまた、２つの表面、異なる媒体（例えば、水溶液と接触したガラス表面、緩衝液と接触した細胞表面）と接触した表面、または物理的特性または化学的特性の異なる２つの媒体の間の接触部近傍の領域からもなりうる。
【００４０】
本明細書では、別段に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００４１】
本明細書で使用される「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」という単数形の用語は、文脈により別段に明確に指し示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００４２】
本明細書を通して与えられるあらゆる最大の数値的限界は、あらゆる低値の数値的限界を、このような低値の数値的限界が本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むことが意図される。本明細書を通して与えられるあらゆる最小の数値的限界は、あらゆる高値の数値的限界を、このような高値の数値的限界が本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むであろう。本明細書を通して与えられるあらゆる数値的範囲は、このような広範な数値的範囲内に収まるあらゆる狭小な数値的範囲を、このような狭小な数値的範囲がすべて本明細書に明示的に書き込まれた場合と同様に含むであろう。
【００４３】
ＩＩＩ．組成物
Ａ．開示される方法における使用のための標的タンパク質
本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、ウイルス、微生物（細菌、真菌、藻類、および原虫を含む）、非脊椎動物（昆虫および蠕虫を含む）、動物、脊椎動物（哺乳動物、鳥類または魚類、および、哺乳動物の中では、例えば、ヒト、類人猿、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ラマ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ネコ、およびイヌなど）の正常細胞もしくは病理学的細胞、または植物の正常細胞もしくは病理学的細胞を含む、任意の天然の供給源に由来する自然発生物質またはそのサブユニットもしくはドメインでありうる。標的タンパク質はあるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて作り出されるかもしくは突然変異などにより修飾された非自然発生タンパク質、キメラタンパク質、または人工タンパク質でありうる。標的タンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、または金属タンパク質でありうる。標的タンパク質は、核タンパク質、細胞質タンパク質、膜会合タンパク質、または分泌タンパク質でありうる。標的タンパク質は、単一の高分子である必要がない。例えば、標的タンパク質は、高分子のホモ多量体（二量体、三量体、または四量体などであるがこれらに限定されない）の場合もあり、ヘテロ多量体（二量体、三量体、または四量体などであるがこれらに限定されない）の場合もある。加えて、標的タンパク質は、他のタンパク質、オリゴペプチドもしくはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、あるいは有機低分子もしくは無機低分子または有機イオンもしくは無機イオンなど、生理学的機能を果たすための１または複数のリガンドも要求しうる。さらなる例は、補因子、リボソーム、ポリソーム、およびクロマチンを含む。
【００４４】
本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質の生物学的活性は、受容体活性または酵素活性などの特異的な活性に限定されない。標的タンパク質の非限定的な例は、核受容体、オーファン核受容体、チロシンキナーゼ受容体、エンドセリン、エリスロポエチン受容体、ＦＡＳリガンド受容体、プロテインキナーゼ（例えば、プロテインキナーゼＣ、チロシンキナーゼ、セリンキナーゼ、トレオニンキナーゼ、ヌクレオチドキナーゼ、またはポリヌクレオチドキナーゼ）、タンパク質ホスファターゼ（セリン／トレオニンホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、またはピロホスファターゼ）、細胞周期調節因子（サイクリンｃｄｋ２、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５、Ｐ５３、ＲＢ）、ＧＴＰアーゼ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ｒａｓ、エンドプロテアーゼ、エクソプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、イオンチャネル、シャペロニン（すなわち、熱ショックタンパク質）、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ（すなわち、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ）、テロメラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ（ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リボシルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、またはメチルトランスフェラーゼ）、ヒドロラーゼ、カルボキシラーゼ、イソメラーゼ、グリコシダーゼ、デアミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、セルラーゼ、リアーゼ、レダクターゼ、リガーゼ、または細胞内ユビキチン化経路のプロセシング酵素（Ｅ１、Ｅ２、もしくはＥ３酵素、またはデユビキチナーゼなど）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物タンパク質、動物タンパク質、およびヒトタンパク質の中から選択される構造的タンパク質および非構造的タンパク質でありうる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、トリインフルエンザウイルス、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ハンタウイルス、または東部ウマ脳炎ウイルスなどであるがこれらに限定されないウイルスタンパク質でありうる。
【００４５】
本明細書で提供される方法のうちのいずれかについてのいくつかの態様では、標的タンパク質は、受容体である。「受容体」という用語は、表面受容体および細胞内受容体の両方を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、核受容体である。核受容体とは、リガンドにより活性化される転写活性化因子のファミリーである。これらの受容体は、リガンドへの結合、二量体化、トランス活性化、およびＤＮＡへの結合のための別個のドメインへと組織化される。ステロイド受容体ファミリーとは、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、アンドロゲン、プロゲスチン、およびエストロゲンに対する受容体からなる大きなファミリーである。受容体の活性化は、リガンドへの結合時に生じ、これにより、受容体の二量体化および共活性化タンパク質の結合を可能とするコンフォメーション変化が誘導される。これらの共活性化因子は、受容体のＤＮＡへの結合、および後続の標的遺伝子の転写活性化を容易とする。共活性化タンパク質の動員に加えて、リガンドの結合はまた、受容体を、受容体機能の共抑制因子として用いられるタンパク質の結合を置きかえるかまたは阻止するコンフォメーションに置くとも考えられる。リガンドが、薬理学的アゴニストである場合、新たなコンフォメーションは、生物学的シグナル伝達経路の他の構成要素、例えば、転写因子と相互作用して、標的組織内の生物学的応答を誘発するコンフォメーションである。リガンドが、薬理学的アンタゴニストである場合、新たなコンフォメーションは、受容体が、そうでなければその受容体を活性化しうる１または複数のアゴニストによって活性化されえないコンフォメーションである。ＮＲの非網羅的なリストは、この開示が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願公開第２００６／０４６１３４号（１４および１５頁、ならびに図１を参照されたい）において記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のためのＮＲは、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、レチノイン酸受容体アルファ（ＲＡＲＧ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体アルファ（ＬＸＲＧ）、またはプロゲステロン受容体の中から選択することができる。
【００４６】
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおける使用のための標的タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（また、７回膜貫通ドメイン受容体としても公知）である。「Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）」とは、Ｇタンパク質とカップリングすることによりシグナル伝達を媒介する受容体のスーパーファミリーの任意のメンバーを指す。ＧＰＣＲは、細胞外環境に存在する分子に結合し、細胞内のシグナル伝達カスケードを誘発し、最終的には、細胞応答を誘発することが可能な膜貫通受容体タンパク質の大ファミリー（ヒトの全ゲノムのうちの約５％を表す）を含む。ＧＰＣＲは、酵母、襟鞭毛虫、および動物を含む真核生物だけに見出される。これらの受容体に結合し、これらを活性化させる分子は、感光性化合物、香気物質、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含むがこれらに限定されず、低分子からペプチドおよび大型のタンパク質へとサイズも様々である。細胞質ゾルのカルシウムレベルに影響を及ぼすＧＰＣＲのクラスの１つの例は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路を活性化させ、その結果として、ホスホイノシチドの加水分解をもたらして、異なる第２のメッセンジャーの２つのクラス、すなわち、ジアシルグリセロールおよびイノシトールリン酸を発生させる、Ｇタンパク質のＧｑ型を介して作動する。ジアシルグリセロールは、ある種のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化させるが、イノシトールリン酸（ＩＰ３などであるがこれらに限定されない）は、小胞体、筋小胞体（筋細胞の場合）、および／またはミトコンドリアなどの細胞内貯蔵庫からのカルシウムの移動を刺激する。ＧＰＣＲは、酵母、襟鞭毛虫、および動物を含む真核生物だけに見出される。これらの受容体に結合し、これらを活性化させる分子は、感光性化合物、香気物質、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含むがこれらに限定されず、低分子からペプチドおよび大型のタンパク質へとサイズも様々である。
【００４７】
本明細書で開示される方法における使用のためのＧＰＣＲは、Ｇｑタンパク質またはＧｑ／１１、アルファ１アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）、ウロテンシン（ＵＴ）受容体、５−ＨＴ２セロトニン受容体および５−ＨＴ６セロトニン受容体、ヒポクレチン（オレキシン）受容体、ヒスタミンＨＩ受容体、ブラジキニンＢ１受容体およびブラジキニンＢ２受容体、ボンベシンＢＢ２受容体、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体、アセチルコリン受容体（例えば、Ｍ１、Ｍ３、およびＭ５）、ｍＧｌｕＲ５グルタミン酸受容体、バソプレッシンＶ２受容体およびバソプレッシンＶＩ受容体、アンジオテンシンＡＧＴＲ１受容体、コレシストキニンＣＣＫＡＲ受容体およびコレシストキニンＣＣＫＢＲ受容体、エンドセリンＥＮＤＲＡ受容体、グレリンＧＨＳＲｌａ受容体、メラトニンＭＴＮＲ１Ａ受容体、ニューロテンシンＮＴＳＲ１受容体、血小板活性化因子ＰＴＡＦＲ受容体、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、濾胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨＲ）、およびプロラクチン放出ペプチド受容体ＰＲＬＨＲ受容体を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、カルシウムセンサータンパク質を発現させる細胞内で内因的に発現させる。他の実施形態では、ＧＰＣＲは、カルシウムセンサータンパク質を発現させる細胞内で異種発現させる。
【００４８】
他の態様では、本発明の方法における使用のための標的タンパク質は、キナーゼでありうる。キナーゼとは、リン酸化と称する過程である、リン酸基を、ＡＴＰなど、高エネルギーのドナー分子から、特異的な基質へと転移させる種類の酵素である。キナーゼの最大のグループのうちの１つは、特異的なタンパク質に作用し、その活性を修飾するプロテインキナーゼである。キナーゼは、シグナルを伝送し、細胞内の複雑な過程を制御するのに広範に使用される。ヒトでは、５００を超える異なるキナーゼが同定されている。それらの大きな多様性、ならびにシグナル伝達におけるそれらの役割のために、それらは、特に、キナーゼ発現またはキナーゼ調節の異常を特徴とする疾患状態に関する研究の対象となっている。
【００４９】
プロテインキナーゼは、そのコンフォメーションが、キナーゼ活性を調節すると考えられている、活性化ループまたはＡループと称する、大型の可撓性のループを含有する。多くのキナーゼでは、Ａループのコンフォメーションは、この領域内の特異的な残基のリン酸化により制御される（Johnson、１９９６年）。活性化ループは一般に、保存的なＡｓｐＰｈｅＧｌｙ配列で始まり、保存的なＡｌａＰｒｏＧｌｕで終わる。不活性キナーゼの構造では、このループは、基質またはＡＴＰの結合性部位を遮断することが多い（Hubbard、１９９４年；Mohammadi、１９９６年；およびMcTigue、１９９９年）。チロシンキナーゼは通常、ループ内に１つまたは２つのチロシンを有し、ＭＡＰＫキナーゼは、ＴおよびＹのいずれにおいてもリン酸化された、Ｔ［ＤＥ］Ｙモチーフを有するが、他の大半のキナーゼは、ループ内にトレオニンを有する。
【００５０】
本発明の方法における使用のための標的タンパク質は、任意のプロテインキナーゼに広く適用可能である。これらは、タンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質セリンキナーゼを含みうる。タンパク質チロシンキナーゼの非限定的な例は、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ、ｐ５６ｌｃｋ、ＺＡＰキナーゼ、血小板由来成長因子受容体チロシンキナーゼ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）受容体チロシンキナーゼ、および上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ、および上皮成長因子受容体様チロシンキナーゼである。本発明における使用のために適用可能なセリンプロテインキナーゼの非限定的な例は、ＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ、Ａｋｔ、およびＣＤＫ（サイクリン依存性プロテインキナーゼ）を含む。哺乳動物生物学において、ｒａｓ遺伝子の突然変異および成長因子受容体の調節異常と関連する様々な増殖性細胞疾患（例えば、がんなど）では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーに属するプロテインキナーゼが不適切に活性化される（Magnusonら、「Seminars  in  Cancer  Biology」、５巻：２４７〜２５２頁（１９９４年））。ＭＡＰキナーゼは、当技術分野で公知であり、このようなキナーゼの部分的な非限定的リストは、ａｂｌ、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、Ａｕｒｏｒａ−Ｂ、Ａｕｒｏｒａ−Ｃ、ＡＴＫ、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｌｋ、Ｂｒｋ、Ｂｔｋ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｓｒｃ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃＲａｆｌ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＲＫ、Ｆａｋ、ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、Ｆｇｒ、ＦＬＫ−４、Ｆｌｔ−１、Ｆｍｓ、Ｆｐｓ、Ｆｒｋ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＮＳ−Ｒ、Ｊａｋ、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ、ＰＫＣ、ＰＹＫ２、Ｒｏｓ、Ｔｉｅｌ、Ｔｉｅ２、Ｔｒｋ、Ｙｅｓ、およびＺａｐ７０を含む。本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態では、キナーゼは、ａｂｌキナーゼである。
【００５１】
キナーゼに関しては、複数種類の化合物が、キナーゼの機能をモジュレートすることが公知である。例えば、Ｉ型キナーゼ阻害剤は、キナーゼの活性コンフォメーションを認識する。Ｉ型キナーゼ阻害剤は、ＡＴＰにより通常形成される水素結合を模倣する１つ〜３つの水素結合を提示することにより、ＡＴＰ結合性部位に結合する。理論に束縛されずに述べると、Ｉ型キナーゼ阻害剤とは対照的に、ＩＩ型キナーゼ阻害剤は、キナーゼの不活性コンフォメーションを認識し、ＡＴＰ結合性部位に直に隣接する疎水性ポケットを占有することにより、ＡＴＰと間接的に競合しうると考えられる。この疎水性ポケットは、活性化ループの固有なＤＦＧ−ｏｕｔコンフォメーションにより作り出される。これは、機能性に必要でないが、いくつかのＩＩ型阻害剤は、ＡＴＰ結合性部位へと直接に水素結合を形成することが可能である（GotinkおよびVerheul、Angiogenesis、２０１０年、１３巻（１号）：１〜１４頁）。これに対し、ＩＩＩ型キナーゼ阻害剤とは、活性化ループ以外の部位に結合することにより（すなわち、キナーゼ上のアロステリック部位に結合することにより）キナーゼ活性をモジュレートする、非ＡＴＰ競合キナーゼ阻害剤である。ＩＩＩ型化合物は、キナーゼ上のそれほど保存的でない部位に結合するという事実に起因して、高度に選択性であり、研究および薬物発見コミュニティーの関心を増大させつつある。
【００５２】
本発明の方法の範囲内における使用にはまた、標的タンパク質の突然変異形態も想定されている。本明細書で使用される「突然変異」は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列など、規定されたアミノ酸一次配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基についての、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、および／またはアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸「置換」とは、規定されたアミノ酸一次配列の少なくとも１つのアミノ酸構成要素を、別のアミノ酸（例えば、システイン残基またはリシン残基）で置きかえることを意味する。当技術分野では、標準的な技法により、突然変異または置換を、標的タンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製するための方法が周知である。本明細書で記載される方法における使用のための標的タンパク質は、保存的置換を含みうる。保存的置換を、下記の「好ましい置換」の表題の下の「アミノ酸置換表」に示す。置換が生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合は、下記の表中の「例示的な置換」と命名されるか、またはアミノ酸のクラスに言及しながら下記でさらに記載される、より実質的な変化を導入することができる。
【表２−１】
2018091866.tif 000002
【表２−２】
2018091866.tif 000003
【００５３】
標的タンパク質の生物学的特性の実質的な修飾は、それらの（ａ）置換の領域内のポリペプチド骨格の、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する効果が著明に異なる置換を選択することにより達成する。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスのメンバーへの交換を伴うであろう。
【００５４】
さらなる実施形態では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のための突然変異体の標的タンパク質は、１または複数の非自然発生のアミノ酸または修飾アミノ酸を含みうる。「非自然発生のアミノ酸残基」とは、上記で列挙した自然発生のアミノ酸残基以外の残基であって、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基（複数可）に共有結合的に結合することが可能な残基を指す。非天然アミノ酸は、ホモリシン、ホモアルギニン、ホモセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸（aminoisbutyric  acid）、２−アミノピメリン酸、三級ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン（naphthalanine）、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンを含むがこれらに限定されない。修飾アミノ酸は、例えば、Ｎ−メチル化されたＤアミノ酸およびＬアミノ酸、別の官能基へと化学的修飾された側鎖官能基など、可逆的もしくは不可逆的に化学的に保護されているか、またはそれらのＮ末端アミノ基もしくはそれらの側鎖基において修飾されている天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。例えば、修飾アミノ酸は、メチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アスパラギン酸−（ベータ−メチルエステル）、アスパラギン酸の修飾アミノ酸；Ｎ−エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸；またはアラニンカルボキサミドおよびアラニンの修飾アミノ酸を含む。当技術分野では、さらなる非天然アミノ酸および修飾アミノ酸、ならびにそれらをタンパク質およびペプチドへと組み込む方法が公知である。（例えば、Sandbergら（１９９８年）、J.  Med.  Chem.、４１巻：２４８１〜９１頁；XieおよびSchultz（２００５年）、Curr.  Opin.  Chem.  Biol.、９巻：５４８〜５５４頁；HodgsonおよびSanderson（２００４年）、Chem.  Soc.  Rev.、３３巻：４２２〜４３０頁を参照されたい）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、標準的なタンパク質精製法を使用する適切な精製スキームにより、細胞（がん細胞など）から単離することができる。別の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、組換えＤＮＡ法により作製される。組換え発現に対する代替法としては、本明細書で記載される方法における使用のための突然変異体の標的タンパク質は、標準的なペプチド合成法を使用して化学合成することができる。
【００５６】
Ｂ．標的タンパク質のアロステリックモジュレーターを同定する方法における使用のための薬剤
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、標的タンパク質の未知の候補アロステリックモジュレーターでありうる。本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、低分子化合物、抗体、非抗体ポリペプチド、炭水化物、阻害性核酸のうちのいずれか、またはこれらの任意の組合せでありうる。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体（ヒト化抗体など）またはその断片である。あるいは、薬剤は、低分子化合物でありうる。他の実施形態では、薬剤は、非抗体ポリペプチド（単離非抗体ポリペプチドなど）でありうる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド（例えば、単離ペプチド）である。
【００５７】
１．非抗体結合性ポリペプチド
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、非抗体結合性ポリペプチドである。結合性ポリペプチドは、本明細書で記載される標的タンパク質のうちのいずれかなどの標的タンパク質に好ましくは特異的に結合するポリペプチドである。結合性ポリペプチドは、公知のポリペプチド合成法を使用して化学合成することもでき、組換え技術を使用して調製および精製することもできる。結合性ポリペプチドは通常、少なくとも約５アミノ酸の長さ、あるいは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸以上の長さであり、ここで、このような結合性ポリペプチドは、好ましくは特異的に野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合することが可能である。結合性ポリペプチドは、過度の実験なしに、周知の技法を使用して同定することができる。この点で、当技術分野では、ポリペプチド標的に結合することが可能な結合性ポリペプチドについてのポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることが注意される（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号および同第ＷＯ８４／０３５６４号；Geysenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、８１巻：３９９８〜４００２頁（１９８４年）；Geysenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、８２巻：１７８〜１８２頁（１９８５年）；Geysenら、Synthetic  Peptides  as  Antigens、１３０〜１４９頁（１９８６年）；Geysenら、J.  Immunol.  Meth.、１０２巻：２５９〜２７４頁（１９８７年）；Schoofsら、J.  Immunol.、１４０巻：６１１〜６１６頁（１９８８年）、Cwirla,  S.  E.ら（１９９０年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：６３７８頁；Lowman,  H.B.ら（１９９１年）、Biochemistry、３０巻：１０８３２頁；Clackon,  T.ら（１９９１年）、Nature、３５２巻：６２４頁；Marks,  J.  D.ら（１９９１年）、J.  Mol.  Biol.、２２２巻：５８１頁；Kang,  A.S.ら（１９９１年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：８３６３頁；およびSmith,  G.  P.（１９９１年）、Current  Opin.  Biotechnol.、２巻：６６８頁を参照されたい）。
【００５８】
バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイとは、大規模なポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、本明細書で開示される方法における使用のための野生型または突然変異体の標的タンパク質などの標的ポリペプチドに結合することが可能なライブラリーのメンバー（複数可）を同定することを可能とする１つの周知の技法である。ファージディスプレイは、変異体のポリペプチドを、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示する技法である（Scott,  J.K.およびSmith,  G.  P.（１９９０年）、Science、２４９巻：３８６頁）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質の変異体（またはランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大規模なライブラリーは、標的分子に結合する配列について、迅速かつ効率的に、高アフィニティーで分取しうるという事実にある。ファージ上のペプチドライブラリー（Cwirla,  S.  E.ら（１９９０年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：６３７８頁）またはタンパク質ライブラリー（Lowman,  H.B.ら（１９９１年）、Biochemistry、３０巻：１０８３２頁；Clackson,  T.ら（１９９１年）、Nature、３５２巻：６２４頁；Marks,  J.  D.ら（１９９１年）、J.  Mol.  Biol.、２２２巻、５８１頁；Kang,  A.S.ら（１９９１年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：８３６３頁）のディスプレイが、何百万ものポリペプチドまたはオリゴペプチドを、特異的結合特性を伴うポリペプチドまたはオリゴペプチド（Smith,  G.  P.（１９９１年）、Current  Opin.  Biotechnol.、２巻：６６８頁）についてスクリーニングするのに使用されている。ランダムな突然変異体のファージライブラリーの分取は、多数の変異体を構築し、繁殖させるための戦略、標的受容体を使用するアフィニティー精製のための手順、および結合強化の結果を評定する手段を要求する。米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、および同第５，６６３，１４３号を参照されたい。
【００５９】
大半のファージディスプレイ方法では、繊維状ファージを使用しているが、ラムドイドファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Renら、Gene、２１５巻：４３９頁（１９９８年）；Zhuら、Cancer  Research、５８巻（１５号）：３２０９〜３２１４頁（１９９８年）；Jiangら、Infection  &  Immunity、６５巻（１１号）：４７７０〜４７７７頁（１９９７年）；Renら、Gene、１９５巻（２号）：３０３〜３１１頁（１９９７年）；Ren、Protein  Sci.、５巻：１８３３頁（１９９６年）；Efimovら、Virus  Genes、１０巻：１７３頁（１９９５年））、およびＴ７ファージディスプレイシステム（SmithおよびScott、Methods  in  Enzymology、２１７巻：２２８〜２５７頁（１９９３年）；Ｕ．Ｓ．５，７６６，９０５）もまた公知である。
【００６０】
さらなる改善は、ペプチドライブラリーを選択された標的分子への結合についてスクリーニングし、これらのタンパク質を所望の特性についてスクリーニングする潜在的可能性を伴う機能的なタンパク質を提示するディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発されており（ＷＯ９８／１４２７７）、二分子間相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）およびコンストレインドへリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を解析および制御するのにファージディスプレイライブラリーが使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、アフィニティーリガンドを単離する方法であって、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液、およびアフィニティーリガンドが、標的分子に結合せずに、結合性リガンドを選択的に単離する第２の溶液と接触させる方法について記載している。ＷＯ９７／４６２５１は、ランダムなファージディスプレイライブラリーを、アフィニティー精製された抗体でバイオパニングし、次いで、結合性ファージを単離した後で、マイクロプレートウェルを使用するマイクロパニング工程を施して、高アフィニティー結合性ファージを単離する方法について記載している。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのアフィニティータグとしての使用もまた報告されている（Liら（１９９８年）、Mol  Biotech.、９巻：１８７頁）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでありうるコンビナトリアルライブラリーを使用して酵素の特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用について記載している。洗浄剤を使用するファージディスプレイにおける使用に適する酵素を選択するための方法は、ＷＯ９７／０９４４６において記載されている。特異的結合性タンパク質を選択するさらなる方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、同第５，４３２，０１８号、およびＷＯ９８／１５８３３において記載されている。
【００６１】
米国特許第５，７２３，２８６号、同第５，４３２，０１８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，４９８，５３０号、同第５，７７０，４３４号、同第５，７３４，０１８号、同第５，６９８，４２６号、同第５，７６３，１９２号、および同第５，７２３，３２３号ではまた、ペプチドライブラリーを作り出し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法についても開示されている。
【００６２】
結合性ポリペプチドは、それらの阻害性効果（例えば、アフィニティーの増強、半減期、安定性、およびクリアランス速度、毒性の低減などの薬物動態特性の改善を含む）を増強するように修飾することができる。このような修飾は、例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、非自然発生であるが機能的に同等なアミノ酸による置換、連結基などを含む。
【００６３】
２．低分子
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、低分子化合物である。低分子は、好ましくは、本明細書で定義される結合性ポリペプチドまたは非抗体有機分子であって、好ましくは特異的に、野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合する有機分子である。有機低分子は、公知の方法（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）を使用して同定および化学合成することができる。有機低分子は、通常約２０００ドルトン未満のサイズ、あるいは、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ドルトン未満のサイズであり、好ましくは特異的に野生型または突然変異体の標的タンパク質に結合することが可能なこのような有機低分子は、過度の実験なしに、周知の技法を使用して同定することができる。この点で、当技術分野では、ポリペプチド標的に結合することが可能な分子についての有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることが注意される（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換されたヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、炭酸、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、スルホン酸アリール、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物などでありうる。
【００６４】
いくつかの態様では、低分子化合物は、コンビナトリアル化学ライブラリーの構成要素である。コンビナトリアル化学ライブラリーとは、小型のサブユニットまたは単量体を含む複数の分子種の化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーは、数百〜数十万の異なる分子種の化合物の範囲の様々なサイズに収まる。炭水化物、オリゴヌクレオチド、および有機低分子などの化合物を含む、オリゴマーライブラリーおよびポリマーライブラリーを含む、様々なライブラリーの種類もまた存在する。このようなライブラリーは、固定化およびクロマトグラフィーによる化合物の分離、ならびにアクセプター分子（ｃ−ｍｅｔタンパク質など）に結合するか、または対象の生物学的活性（細胞内増殖の阻害などであるがこれらに限定されない）を媒介することが可能なリガンドを同定し、特徴づけるための使用など、様々な使用がなされる。
【００６５】
当技術分野では、固相支持体上で化合物のライブラリーを合成するための多様な技法が公知である。固相支持体は、サブユニットまたは単量体と結合して、ライブラリーの化合物を形成するように官能化された表面を伴うポリマー対象であることが典型的である。１つのライブラリーの合成は、多数の固相支持体を伴うことが典型的である。コンビナトリアルライブラリーを作製するには、固相支持体を、化合物の１または複数のサブユニットと反応させ、注意深く制御された所定の化学反応の連鎖において、１またはより多数の試薬と反応させる。言い換えれば、ライブラリーのサブユニットを、固相支持体上で「成長させる」。ライブラリーが大規模になるほど、要求される反応の数が増大することから、ライブラリーを構成する化合物の複数の分子種の化学組成を追跡する作業が複雑化する。いくつかの実施形態では、低分子は、約２０００ドルトン未満のサイズ、あるいは、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ドルトン未満のサイズである。
【００６６】
本明細書における態様のうちのいずれかにおいて記載されている低分子薬剤は、固体支持体上で実行しうる任意の種類の化学反応に由来しうる。このような化学反応は、ブタジエンのトラッピングを含む［２＋２］付加環化；イソキサゾリン、フラン、および修飾ペプチドの合成を含む［２＋３］付加環化；ジオール、アルデヒド、およびケトンの固定化を含むアセタール形成；アルデヒドの誘導体化、プロパンジオールの合成を含むアルドール縮合；アルデヒドの誘導体化を含むベンゾイン縮合；ベンゾジアゼピンおよびヒダントイン、チアゾリジン、ターン模倣体、ポルフィリン、フタロシアニンを含む環化縮合；ジエステルの環化を含むディークマン環化；アクリル酸の誘導体化を含むディールス−アルダー反応；アルコールのアルケンへの付加を含む求電子付加；アルデヒドの誘導体化を含むグリニャール反応；二置換アルケンの合成を含むヘック反応；ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるニトリルオキシドの合成（［２＋３］付加環化を参照されたい）を含むヘンリー反応；フェロモンおよびペプチドの合成を含む接触水素化（アルケンの水素化）；スルファニルケトン、ビシクロ［２．２．２］オクタンの合成を含むマイケル反応；アリールエーテル、ペプチジルホスホネート、およびチオエーテルの合成を含む光延反応；キノロンの合成を含む求核芳香族置換；アルデヒドおよびケトンの合成を含む酸化；ペンチノールを伴うノルボルナジエンの環化を含むポーソン−カンド付加環化；ヘリセンの合成を含む光化学環化；アルデヒドおよびアシルクロリドの誘導体化を含む、有機金属化合物を伴う反応；カルボニル、カルボン酸、エステル、およびニトロ基の還元を含む、錯体ヒドリドおよびスズ化合物を伴う還元；カルボキシル基の還元を含むそ合（Ｓｏａｉ）反応；ビフェニル誘導体の合成を含むスティル反応；置換シクロヘキサノンの合成を含むストーク反応；キノロンの合成を含む還元アミノ化；フェニル酢酸誘導体の合成を含む鈴木反応；ならびにアルデヒド、フェロモン、およびスルファニルケトンによる反応を含むウィティッヒ−ホルナー反応を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
化学ライブラリーの合成ならびに個々の固相支持体上のそれらのライブラリーの個々の化合物のデコンボリューションについて開示する参考文献は、米国特許出願第２００９／００３２５９２号；Needelsら（１９９３年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９０巻：１０７００〜１０７０４頁；およびＷＯ９７／１５３９０において見出すことができる。
【００６８】
３．抗体
いくつかの態様では、本明細書で記載される方法における使用のための薬剤は、抗体である。抗体とは、標的タンパク質に好ましくは特異的に結合するタンパク質である。抗体の変異体は、抗体の活性に実質的に影響を及ぼさずに、当技術分野で公知の情報に基づき作製することができる。例えば、抗体の変異体は、異なる残基により置きかえられた、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基を有しうる。抗体では、置換突然変異誘発のために最大の関心の対象となる部位は一般に、超可変領域を含むが、フレームワーク領域（ＦＲ）の変化もまた想定される。
【００６９】
抗体では、置換変異体の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１または複数の超可変領域の残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、結果として得られる変異体（複数可）は、それらがそこから作製される親抗体と比べて生物学的特性が改善されているであろう。このような置換変異体を作り出すための簡便な方途は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、複数の超可変領域部位（例えば、６つ〜７つの部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を発生させる。このようにして作り出される抗体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から提示される。次いで、ファージにより提示された変異体を、本明細書で開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発を実施して、抗原の結合に著明に寄与する超可変領域の残基を同定することができる。あるいはまたは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することが有益でありうる。このような接触残基および近傍の残基は、本明細書で精緻化される技法による置換のための候補である。このような変異体を発生させたら、変異体のパネルを、本明細書で記載されるスクリーニングにかけ、１または複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を伴う抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【００７０】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製する。これらの方法は、天然供給源（自然発生のアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、または既に調製された抗体の変異体または抗体の非変異形に対する、オリゴヌクレオチドを媒介する（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に、１カ所または複数カ所のアミノ酸修飾を導入し、これにより、Ｆｃ領域変異体を作り出すことが所望でありうる。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸修飾を含む、１または複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
【００７２】
一実施形態では、Ｆｃ領域変異体は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の結合アフィニティーの改変を提示しうる。このような変異体のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９、または４４７のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。ＦｃＲｎへの結合が低減されたＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９、または４４７のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。あるいは、上述のＦｃ領域変異体は、ＦｃＲｎへの結合の増大を提示し、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。
【００７３】
ＦｃＲへの結合が低減されたＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。
【００７４】
例えば、Ｆｃ領域変異体は、ＦｃＲＩの結合の低減を提示し、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７、または３２９のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。
【００７５】
Ｆｃ領域変異体は、ＦｃＲＩＩの結合の低減を提示し、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８、または４３９のうちの任意の１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。
【００７６】
対象のＦｃ領域変異体は、ＦｃＲＩＩＩの結合の低減を提示し、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、または４３７のうちの１または複数におけるアミノ酸修飾を含むことが可能であり、ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによる番号付けである。
【００７７】
Ｃｌｑへの結合および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を改変（すなわち、改善または減殺）したＦｃ領域変異体は、国際特許出願第ＷＯ９９／５１６４２号において記載されている。このような変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３３、または３３４のうちの１または複数におけるアミノ酸置換を含みうる。また、Ｆｃ領域変異体に関するDuncanおよびWinter  Nature、３２２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際特許出願第ＷＯ９４／２９３５１号も参照されたい。
【００７８】
Ｃ．第二高調波活性部分（標識など）
本明細書で提供される方法のうちのいずれかについてのいくつかの態様では、野生型または突然変異体の標的タンパク質を、第二高調波活性部分または第二高調波活性標識（別称：ＳＨＧ部分またはＳＨＧ標識）で標識する。第二高調波活性部分（標識など）は、結果として得られる標的タンパク質を、第二高調波発生に対して感受性とし、表面選択技術を使用する、界面における研究に適切とするために、標的タンパク質に共有結合的または非共有結合的に結合しうる。次いで、標識された標的タンパク質は、第二高調波発生または和周波発生などの表面選択技術により研究することができる。外因性部分（標識など）は、標的タンパク質へとあらかじめ付着させることができ、任意の非結合標識または未反応標識は、測定を行う前に標識された実体から分離する。一実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的タンパク質へと付着させる。標的タンパク質の第二高調波活性部分（標識など）による標識は、結合反応（標的タンパク質を、活性コンフォメーションまたは不活性コンフォメーションへと安定化させることが可能な薬剤の結合など）が、標識の配向性またはコンフォメーションの変化を結果としてもたらす場合に、標的タンパク質のコンフォメーション変化を、表面選択性非線形光学法を使用して検出する直接的な光学手段を可能とする。蛍光標識による検出とは異なり、ＳＨＧ標識は、界面において標識され、正味の配向性を伴う標的タンパク質だけが、第二高調波シグナルに寄与し；表面に付着しない、標識された標的タンパク質は、シグナルに寄与しないという重要な利点を有する。したがって、薬剤に結合した後のＳＨＧで標識された標的タンパク質分子内のコンフォメーション変化を検出するためのシグナル対ノイズ比は、変わらず常に高い。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、ＳＨＧ活性部分（標識など）で標識する（すなわち、表面へと付着させた後において）。他の実施形態では、支持脂質二重層表面または支持脂質類似体二重層表面へと付着させた後において、標的タンパク質を、ＳＨＧ活性部分（標識など）で標識する。
【００７９】
本発明の代替的な態様では、少なくとも２つの識別可能な第二高調波活性部分（標識など）を使用することができる。その場合は、付着された２つ以上の識別可能な標識の配向性を、発散するコヒーレントの非線形光ビームの方向を十分に規定することが容易となるように選ぶことになろう。２つ以上の識別可能な標識は、試料に照らして１または複数の偏光方向で入射する、１または複数の周波数における複数の基本波光ビームを使用し、少なくとも２つの非線形光ビームの発散を結果としてもたらすアッセイで使用することができる。一実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、第二高調波活性部分（標識など）の全体的な非線形感受率を増大させるように、各々が非線形感受率を有し、互いに対して一定でかつ明確な配向性で併せて結合する複数の個々の第二高調波活性部分（標識など）を含む。
【００８０】
１．第二高調波活性色素
本明細書で記載される方法のうちのいくつかの態様では、第二高調波活性部分（標識など）は、色素である。標的タンパク質は、特異的な標識または非特異的な標識を介して、色素により標識することができる。
【００８１】
第二高調波活性部分は、特異的な標識を介して、例えば、共有結合または水素結合を介して、標的タンパク質へと付着させることができる。例えば、第二高調波活性部分（標識など）は、検出される標的タンパク質のアミノ酸一次配列内のアミン基、リシン基、またはスルフヒドリル基へと、共有結合的に付着させることもでき、非共有結合的に付着させることもできる。いくつかの実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）は、アミン反応性スクシンイミジルエステル、チオール反応性マレイミド、またはアルデヒド反応性ヒドラジドおよび／もしくはケトン反応性ヒドラジド、ならびにヒドロキシルアミンを保有する。いくつかの実施形態では、ＳＦＧ色素標識またはＳＨＧ活性色素標識は、アジドへとカップリングするための「クリック化学反応」を介してコンジュゲートすることができる。コンジュゲート形成における使用のためのクリック化学反応の詳細は、「Synthesis  and  Functionalization  of  Biomolecules  via  Click  Chemistry」、C.  Schillingら、１５章、３５５〜３７８頁、「Click  Chemistry  for  Biotechnology  and  Materials  Science」、J.  Lahann（編）、Wiley（２００９年）において記載されている。
【００８２】
本明細書で開示される方法における第二高調波または和周波活性部分（標識など）としての使用に適切な色素の例は、限定せずに述べると、マレイミド標識（システイン残基上のタンパク質を特異的に標識する、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）など）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ（リシン残基を特異的に標識する）、オキサゾール標識（アミンを特異的に標識するＰｙＭＰＯ−スクシンイミジルエステルなど）、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）を含む。他の実施形態では、標識は、ケトクマリンおよび３，３’−カルボニルビス（７−ジエチルアミノクマリン）などであるがこれらに限定されない、クマリンベースの色素でありうる。他の実施形態では、標識は、ＰｙＭＰＯ−ＳＥ（商標）（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）でありうる。
【００８３】
本明細書で開示される方法のうちのいくつかの態様では、標的タンパク質のアミノ酸一次配列内の天然のアミノ酸残基は、突然変異させることもでき、第二高調波活性色素に結合することが可能な別のアミノ酸で置換することもできる。本明細書で使用される「突然変異」は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列など、規定されたアミノ酸一次配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基についての、アミノ酸残基の欠失、アミノ酸残基の挿入、および／またはアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸「置換」とは、規定されたアミノ酸一次配列の少なくとも１つのアミノ酸構成要素を、別のアミノ酸（例えば、システイン残基またはリシン残基）で置きかえることを意味する。アミノ酸一次配列内の１または複数のアミノ酸残基の突然変異または置換（保存的突然変異または置換など）は、その標的タンパク質のリガンドに結合するとき、または標的タンパク質にアロステリックに結合することが可能な未知の候補薬剤に結合するときに、そのアミノ酸配列によりコードされる標的タンパク質がコンフォメーション変化を受ける感受率の実質的な変化を結果としてもたらさないことが所望される。
【００８４】
当技術分野では、標準的な技法により、突然変異または置換を、標的タンパク質などのタンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製するための方法が周知である。本明細書で記載される標的タンパク質は、保存的置換を含みうる。保存的置換を、上記の「アミノ酸置換表」の、「好ましい置換」の表題の下に示す。
【００８５】
２．非天然アミノ酸
他の態様では、第二高調波活性部分（標識など）は、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）でありうる。従来の標識とは対照的に、ＵＡＡは、包埋部位および露出部位のいずれにおいてもタンパク質を標識する手段をもたらす。加えて、タンパク質の固有の成分として、それらは、アミノ酸官能基（システインおよびアミンなど）へと付着させた標識（色素など）より大きな感度および忠実度で構造的変化を報告しうる。ＵＡＡは、第二高調波発生などの非線形法を使用してタンパク質を検出するための超偏光度を保有する。したがって、これらの特異的な非天然アミノ酸はまた、ＳＨＡＡ（「第二高調波アミノ酸」）とも称されている。タンパク質の構造的コンフォメーションの変化を検出するためのプローブとしてＵＡＡを使用することの別の利点は、検出を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（すなわち、生細胞内で）実行しうることである。例えば、本明細書で記載される方法を使用して、候補薬剤の結合に応答して、生細胞内の標的タンパク質により呈示されるコンフォメーション変化を検出することができる。標的タンパク質の、表面に照らして配向させたタンパク質集団を使用することにより、リアルスペースおよびリアルタイムにおける構造またはコンフォメーション変化の高精度のマップを、ＵＡＡをそのアミノ酸配列の一部として含有する標的タンパク質を使用して構築することができる。アミノ酸一次配列内の１または複数のアミノ酸残基の、ＵＡＡによる置換は、ＧＤＰもしくはＧＴＰに結合するとき、またはＧＴＰが加水分解するとき、または標的タンパク質に結合することが可能な未知の候補薬剤に結合して、それを不活性コンフォメーションもしくは活性コンフォメーションへと安定化させるときに、そのアミノ酸配列によりコードされる標的タンパク質がコンフォメーション変化を受ける感受率の実質的な変化を結果としてもたらさないことが所望される。
【００８６】
任意の超偏光性ＵＡＡは、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて、候補薬剤に結合した後の標的タンパク質の構造内のコンフォメーション変化を測定するための第二高調波活性部分（標識など）として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＵＡＡが、アラダンである（それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれている、Cohenら、２００２年、Science、２９６巻：１７００頁；Abbyadら、２００７年、J.  Phys.  Chem.、１１１巻：８２６９頁）。他の実施形態では、ＵＡＡは、ダンシルアラニンである（Summererら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.、２００６年、１０３巻（２６号）：９７８５〜９７８９頁）。一実施形態では、非天然アミノ酸は、和周波発生活性（ＳＦＧ活性）である。本明細書で使用される「和周波発生活性」とは、超偏光度を保有し、ＳＦＧにより検出可能なＳＨ活性の標識を指す。他の実施形態では、ＵＡＡは、超偏光性ではないが、それが、上記で記載した色素のうちのいずれかなどの第二高調波活性標識色素に結合することを可能とする、適切な１または複数の化学官能基を保有する。他の実施形態では、ＵＡＡは、タンパク質内の不連続の部位に工学的に作製して、ＳＦＧにより部位特異的コンフォメーション変化を同定するように振動特性が調整されたプローブを含みうる。いくつかの実施形態では、ＵＡＡへと組み入れるためのプローブ部分は、それらが天然のタンパク質構造を攪乱しないように、十分に小型であることが所望され、ＮＯ、ＣＮ、ＳＣＮ、またはＮ３を含みうるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブ部分は、内因性のタンパク質振動からは十分に隔てられた、約１，９００〜２，３００ｃｍ−１の間のスペクトル範囲内で固有の振動シグネチャーを提示する。別の実施形態では、第二高調波活性部分（標識など）が表面に対して正味の配向性を保有するように、ＵＡＡを使用して、標的タンパク質を表面へと付着させることができる。
【００８７】
したがって、いくつかの態様では、標的タンパク質のコンフォメーションの構造的変化は、標的タンパク質の異なる突然変異体内のアミノ酸配列に工学的に作製された非天然アミノ酸標識またはこのような標識のシリーズの傾斜角または絶対傾斜角を測定することにより、リアルタイムおよびリアルスペースで決定することができる。プローブは、標的タンパク質内の任意の部位に組み込むこともでき、その末端に組み込むこともでき、その任意のドメイン内に組み込むこともできる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＵＡＡと共有結合的に反応するように化学的に装備された第二高調波活性標識を含みうる。例えば、タンパク質へと組み込まれたＵＡＡが、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）であれば、第二高調波活性色素は、ｐＡｃＦに共有結合的に結合するのに適切な化学反応をその上で生じさせるであろう。別の実施形態では、第２のＵＡＡ（これは一般に第二高調波活性ではない）に加えてＳＨＡＡを組み込むことにより、第２のＵＡＡとの反応に適切な化学反応で誘導体化された表面に照らして配向させた形での、タンパク質の、化学的に直交する共有結合的カップリングが可能となる。ＳＨ活性である、高度に配向させた標的タンパク質試料（２つのＵＡＡを使用して）により、ベースラインのＳＨＧシグナルおよび対比ＳＨＧシグナル（コンフォメーション変化によるシグナルの変化）のいずれも、ＳＨＧシグナルをもたらすのにＵＡＡを使用しない標的タンパク質と比較して大きくすることができる。
【００８８】
他の態様では、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける、標的タンパク質のアミノ酸配列内の１または複数のＵＡＡを使用することにより、標的タンパク質内の１または複数の部位における、１または複数の標識の傾斜角を時間の関数として決定することを介して、候補アロステリックモジュレーターに結合するときに、標的タンパク質が受ける実際のコンフォメーション変化を決定することが可能となる。標的タンパク質の三次元構造は、各々が異なる位置に配置されたＳＨＡＡプローブを含有する、タンパク質の１または複数の突然変異体を作製することにより決定することができる（すなわち、各突然変異体内の、表面に照らしたプローブの配向性を、各突然変異体内のプローブについて決定することができ、したがって、側鎖の配向性を、各突然変異体内のプローブについて決定することができ、この情報を使用して、全体的な三次元タンパク質構造のモデルを構築することができる）。測定されたプローブ傾斜角を踏まえ、当業者に公知の立体障害法、統計学的方法分子的動力学、ラマチャンドランプロット、またはエネルギー最小化法からの情報を使用して、構造をさらに決定する一助とすることができる。プローブの傾斜角の時間分解された測定により、リアルタイムで生じるタンパク質のコンフォメーション変化の動画がもたらされる。ＳＨＧ（およびＳＦＧ）の事実上瞬間的な応答および感度のために、特定のプローブ（例えば、表面に照らした傾斜角または絶対傾斜角）の空間的配向性は、対象のほぼ任意の時間スケールにおいて、リアルタイムで測定することができる。
【００８９】
ＳＨＧ法におけるＵＡＡの使用と関連するさらなる情報は、その開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１０／００６８１４４号において見出すことができる。
【００９０】
Ｄ．界面
本明細書で開示される方法のうちのいくつかの態様では、標的タンパク質は、固体表面に結合させるか、または標的タンパク質に結合させた第二高調波活性標識が正味の配向性を有するように、界面に対して配向させる。ＧＴＰまたはＧＤＰに結合するとき、標的タンパク質の活性部位内でＧＴＰが加水分解するとき、または薬剤が標識された標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導すると仮定する場合、突然変異体もしくは野生型の標的タンパク質の構造を不活性コンフォメーションもしくは活性コンフォメーションへと安定化させることが可能な候補薬剤が結合するときに変化しうるのは、この正味の配向性である。いくつかの実施形態では、界面は、シリカ、ガラス、ケイ素、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、金属、半導体、もしくは絶縁体の表面、または生物学的成分を吸着もしくは付着させうる任意の表面から作製することができる。異なる実施形態では、界面は、蒸気−液体界面、液体間界面、液体−固体界面、または固体間界面でありうる。一実施形態では、蒸気−液体界面は、空気−水界面である。一実施形態では、液体間界面は、油−水界面である。異なる実施形態では、液体−固体界面は、水−ガラス界面またはベンゼン−ＳｉＯ２界面である。
【００９１】
いくつかの態様では、界面はまた、生体細胞表面およびリポソーム表面も含みうる。付着または固定化は、当技術分野で周知の様々な技法を介して施すことができる。例えば、タンパク質に対して、表面は、生体分子の表面上のアミンへとカップリングするために、アルデヒドシランで誘導体化することができる（MacBeathおよびSchreiber、２０００年（その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている））。また、まずＢＳＡの分子層を表面へと付着させ、次いで、それをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化することにより、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）表面も使用することができる。ＢＳＡ上の活性化したリシン残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン酸残基は、タンパク質上の表面アミンと反応する。
【００９２】
また、支持リン脂質二重層も、例えば、Salafskyら、Biochemistry、１９９６年（その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている）、その関連する部分が参照により本明細書に組み込まれている、「Biomembranes」、Gennis、Springer-Verlag、Kalbら、１９９２年；およびBrianら、１９８４年などにおける、膜タンパク質または他の膜会合成分を伴うかまたはこれを伴わずに使用することができる。当技術分野では、支持リン脂質二重層が周知であり、会合膜タンパク質を伴うかまたは伴わずにそれらを作製するのに、多数の技法が利用可能である。これらの支持二重層は、水溶液中に浸して、それらが空気へと曝露されるときのそれらの破壊を防止しなければならないことが典型的である。いくつかの実施形態では、表面は、脂質類似体二重層表面である。
【００９３】
固体表面（例えば、平面状基質、ビーズなど）を使用する場合、固体表面もまた、その正味の表面電荷密度を低減または増強する多様な化学反応を介して誘導体化して、標的タンパク質−候補アロステリックモジュレーター間相互作用の検出を最適化することができる。他の実施形態では、固体表面は、ガラス表面、プラスチック表面、金属表面、ラテックス表面、ゴム表面、セラミック表面、ポリマー表面、ポリプロピレン表面、ポリビニリデンジフルオリド表面、ポリスチレン表面、またはポリエチレン表面（ポリエチレングリコール表面など）でありうる。その上に標的タンパク質を固定化させる支持体は、生物学的材料、非生物学的材料、有機材料、無機材料、または粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、もしくはスライドとして存在する材料のうちのいずれかの組合せなどであるがこれらに限定されない、広範囲にわたる材料からなりうる。表面は、ディスク、方形、球、または円形などであるがこれらに限定されない、任意の簡便な形状をとりうる。表面は、好ましくは平坦でありうるが、また、様々な代替的な表面の立体形状もとりうる。例えば、表面は、試料（タンパク質など）が配置される隆起領域または陥没領域を含有しうる。表面は、その上に試料を形成しうる硬質の支持体を形成することが好ましい。表面はまた、適切な光吸収特徴をもたらすようにも選ぶ。例えば、表面は、限定せずに述べると、多量体化されたラングミュア−ブロジェットフィルム、官能化されたガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾ケイ素、または（ポリ）テトラクロロエチレン（(poly)tetrafhioroefhylene）、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリ炭酸、もしくはこれらの組合せなど、多種多様なゲルまたはポリマーのうちのいずれか１つでありうる。当業者には、他の表面材料もたやすく明らかであろう。一実施形態では、基質は、平坦なガラスまたはシリカである。
【００９４】
いくつかの態様では、表面は、周知の技法を使用してエッチングして、所望の表面特徴をもたらすことができる。例えば、トレンチ、ｖ字溝、メサ構造などの形態により、標的タンパク質（タンパク質の合成領域など）を、衝突光の焦点内により緊密に配置することができる。表面はまた、それにより集光される発光を最大化するための反射「鏡」構造も装備しうる。別の例として述べると、表面は、エッチングして、ウェルを形成することもできる。
【００９５】
本発明の別の態様では、アフィニティータグ付けされた標的タンパク質を、ＳＨＧまたはＳＦＧを検出するための表面へと固定化するのに、オリゴポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子も使用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＳＡＴ（ＰＥＧ４）（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチレングリコール）でありうる。ＳＨＧシグナルを検出するのに適するＰＥＧ化された界面は、上記で記載した表面のうちのいずれかなどの適切な表面を、オリゴＰＥＧ溶液でコーティングすることにより調製することができる。一実施形態では、表面は、ガラスでありうる。別の実施形態では、表面は、アミノ末端シラン誘導体化ガラスでありうる。当技術分野では、アフィニティータグは一般的であり、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグなど）、マルトース結合性タンパク質タグ、ＨＡタグ、ビオチンタグ、チオールタグ、またはＧＳＴタグでありうる。いくつかの実施形態では、アフィニティータグは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のヒスチジン残基のうちのいずれかを有するヒスチジンである。一実施形態では、オリゴＰＥＧ分子を、標的タンパク質上で発現させるアフィニティータグに結合する薬剤で修飾する。薬剤は、ヒスチジンタグの場合、ニッケルであることが可能であり、糖（マルトースなど）、抗体、またはアフィニティータグに結合することが可能である当技術分野で公知の他の任意の分子でもありうる。
【００９６】
ＩＶ．本発明の方法
Ａ．第二高調波発生
第二高調波発生（ＳＨＧ）とは、非線形物質と相互作用するフォトンが効果的に「組み合わされて」、２倍のエネルギーを伴い、したがって、最初のフォトンの２倍の周波数および半分の波長を伴う新たなフォトンを形成する、非線形光学工程である。ＳＨＧは、和周波発生（ＳＦＧ）の特殊な場合である。ＳＨＧなどの表面選択性非線形光学（ＳＳＮＬＯ）法は、バルク分子種の存在下における、界面分子または界面粒子の検出を可能とする。強いレーザービーム（基本波）を、いくつかの試料の界面へと方向付け、界面が非中心対称性である場合、試料は、非線形光、すなわち、基本波高調波を発生させることが可能である。基本波ビームまたは第二高調波ビームは、ストークスシフトによる分離がより狭小な励起光および放出光を伴う、蛍光法における典型的な場合とは異なり、互いから容易に分離することができる。個々の分子または粒子は、それらが、１）非線形的に活性である（超偏光度を保有する）場合、および２）表面に近接し、その影響を介して（化学的力または電気的力を介して）ランダムでなく配向する場合に検出することができる。分子種のこの正味の配向性および内因的ＳＨＧ活性が、界面においてＳＨＧにより可能となる効果の一因となる。
【００９７】
ＳＨＧは、ＳＨ活性プローブを使用して生体分子のコンフォメーション変化を検出および研究する高感度の技法として出現した（Salafsky,  J.  S.  Journal  of  Chemical  Physics、２００６年、１２５巻、０７４７０１頁；Salafsky,  J.  S.  Physical  Chemistry  Chemical  Physics、２００７年、９巻、５７０４頁）。表面上に吸着させるかまたは共有結合的に固定化させた標識されたタンパク質は、表平面に照らした、ＳＨＧ標識の非線形偏光度の平均の正味の配向性に起因して、ＳＨＧシグナルをもたらす。具体的には、ＳＨ強度は、ＩＳＨ＝Ｇ（χｓ（２））２Ｉ２［式中、ＩＳＨは、第二高調波強度であり、Ｇは、実験形状および波長に依存する定数であり、Ｉは、基本波ビームの強度である］として与えられる。非線形感受率であるχｓ（２）は、式：
【数１】
2018091866.tif 000004
［式中、Ｎｓは、分子の表面密度であり、カッコは、配向の平均を描示し、α（２）は、基本波ビームの２つの入射フォトンから第二高調波フォトンをもたらす可能性を決定する量子力学的特性である、それらの非線形偏光度である］を介して、表面上のＳＨ活性分子の詳細を保有する。χｓ（２）を測定することにより、表面上の分子の配向性についての情報がもたらされる。例えば、α（２）で、分子的軸ζに沿った単一のエレメントζζζ（２）が優勢となり、表面の平面内で分子の方位角分布がランダムである場合、χｓ（２）のエレメントであって、消去されない唯一のエレメントは、
【数２】
2018091866.tif 000005
［式中、θは、ζと面法線との間の極角であり、添え字である
【数３】
2018091866.tif 000006
は、それぞれ、表面に対して垂直な方向および平行な方向を指す］である（Heinz,  T.  F.ら、Physical  Review  A、１９８３年、２８巻、１９８３頁）。
【００９８】
ＳＨ光は、コヒーレントでかつ指向性であるので、ＳＨビームの集光および単離は単純化され、基本波高調波と第二高調波とは、スペクトル的に十分に隔てられているため、ＳＨＧには、蛍光測定を困難にしうるクロストークが存在しない。プローブの光崩壊は、２つのフォトンにより誘導される吸収を介して比較的緩慢に生じることから、比較的長い時間スケールにわたる測定が可能となる。ＳＨＧによる得失代償は、シグナル強度である（蛍光より何桁か弱い）。しかし、表面近傍でランダムに拡散する分子は、シグナルをもたらさず、式１によるそれらの配向平均はゼロであるので、第二高調波光に寄与するのは、表面上に固定化させたＳＨ活性分子だけである。したがって、ＳＨＧは、表面結合分子と遊離分子とを弁別するように内因的に装備されている。ＳＨシグナルは、プローブの配向平均について報告し、したがって、コンフォメーション変化に起因する変化について報告する。
【００９９】
標的タンパク質−アロステリックモジュレーター間相互作用、および標的タンパク質のコンフォメーション構造に対するそれらの効果を検出するための装置は、様々な立体形状を前提としうる。その最も単純な形態では、装置は、以下：ｉ）基本波光源；ｉｉ）表面付着プローブを伴う基質（ＳＨＧで標識された標的タンパク質など）；およびｉｉｉ）第二高調波ビーム、または他の非線形光学ビームの強度を測定するための検出器を含むであろう。装置のより精緻な変化形は、例えば、モノクロメーター（波長を選択するための）、パスフィルター、カラーフィルター、干渉もしくは他のスペクトルフィルター（波長を選択するため、または基本波（複数可）をより高次の高調波から分離するための）、１もしくは複数の偏光素子、ビームを方向付け、その焦点を絞るための１もしくは複数の鏡もしくはレンズ、コンピュータによる制御、またはソフトウェアを使用するであろう。
【０１００】
非線形光を送達するかまたは発生させる方式（例えば、ＳＨＧ）は、以下の手段：ＴＩＲ（全内部反射）、光ファイバー（ビーズを付着させるかまたは付着させない）、透過（試料内の基本波の通過）、反射（基本波は、試料から反射される）、走査造影（試料を走査することを可能とする）、共焦点造影または走査、複合空洞共振器（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃａｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐｏｗｅｒ  ｂｕｉｌｄ−ｕｐ）、多重経路セットアップのうちの１または複数に基づきうる。
【０１０１】
測定された情報は、以下のパラメータ：光の強度（ＰＭＴまたはフォトダイオードにより光起電力へと転換されることが典型的）、光の波長（モノクロメーターおよび／またはフィルターにより決定される）、時間、または位置のうちの１または複数を含みうるベクターの形態を取りうる。装置の２つの一般的な構成は、画像走査装置（基質の造影：ｘ，ｙ座標の関数としての強度、波長など）および分光光度装置（いくつかの平面状表面についての、または細胞、リポソーム、もしくは他の粒子の懸濁液についての強度、波長などの測定）である。
【０１０２】
基本波ビームは、試料へと、様々な様式で送達することができる（例えば、その開示が参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００２／００９４５２８号を参照されたい）。和周波構成または差周波構成では、基本波ビームは、２つ以上のビームを含み、界面において、差周波ビームまたは和周波ビームを発生させることが理解される。
【０１０３】
別の態様によれば、基質位置（ｘ，ｙ）の関数としての情報が所望される場合は、電荷結合検出器（ＣＣＤ）のアレイ検出器を使用することができる。ＣＣＤは、ピクセル（すなわち、フォトダイオード）のアレイを含み、その各々のピクセルは、その上への光の衝突を独立に測定しうる。所与の装置形状では、特定の基質位置（ｘ，ｙ）から生じる非線形光は、基質からある距離にあるＣＣＤ位置（Ｑ，Ｒ）における非線形光の衝突の強度（これは、蛍光発光の自発的で、確率的で、多方向的な性格と比較して、コヒーレントで平行な（そして一般に基本波と共に共伝搬する）非線形光学ビームのために決定することができる）を測定することにより決定することができる。ＣＣＤアレイにより、検出器内の１または複数のアレイエレメント（１０）が、基質表面の具体的な領域へとマップされることから、基質位置（ｘ，ｙ）の関数としての情報の容易な決定が可能となる。フォトダイオード検出器および光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード、フォトトランジスター、真空フォトダイオード、または入射光を電気的シグナル（すなわち、電流、電圧など）へと変換するための、当技術分野で公知の他の検出器もまた、光強度を検出するのに使用することができる。ＣＣＤ検出器では、ＣＣＤは、装置のコンピュータにインストールされたデータ収集ボードと連絡され、これにより制御される。データ収集ボードは、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｂｏａｒｄｓ  Ｉｎｃ．製のＣＩＯ−ＤＡＳ１６／Ｊｒなど、当技術分野で周知の種類でありうる。データ収集ボードおよびＣＣＤサブシステムは、例えば、以下の様式で作動しうる。データ収集ボードは、クロック信号をＣＣＤサブシステムへと送信することにより、ＣＣＤの積分時間を制御する。一実施形態では、ＣＣＤサブシステムは、ＣＣＤの積分時間を、４０９６クロック周期に設定する。クロック速度を変化させることにより、ＣＣＤがデータを組み入れる実際の時間を、操作することができる。積分時間において、各フォトダイオードは、それに到達する光の量に比例する電荷を蓄積する。積分時間が終わると、電荷は、ＣＣＤのシフトレジスターへと転送され、新たな積分時間が始まる。シフトレジスターは、ＣＣＤアレイに入射する光パターンを表す電圧として、電荷を保存する。次いで、クロック速度で電圧をデータ収集ボードへと伝送し、そこで、電圧をデジタル化し、コンピュータのメモリに保存する。このようにして、各積分時間において試料ストリップを造影する。その後、試料を完全に走査するまで、後続の行を組み入れる。
【０１０４】
一態様では、ＳＨ光の検出器は、単一フォトンカウンティング方式で作動する光電子増倍管でありうる。光電流パルスは、電圧に変換し、増幅し、Ｍｏｄｅｌ  ＳＲ４４５  Ｆａｓｔ  ＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒおよびＭｏｄｅｌ  ＳＲ  ４００  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により販売される）を使用して弁別にかけ、次いで、カウンターへと送信することができる。フォトンカウンターのゲーティングとＤＡＣ出力を介する検流計の制御とは、デジタル遅延／パルス発生器を使用して同期させることができる。ＰＣコンピュータとの連絡は、パラレルレジスター、ＣＡＭＡＣコントローラーカード、およびＰＣアダプターカードの使用を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の複数の方法により達成することができる。
【０１０５】
代替的な態様では、バンドパスフィルター、ノッチフィルター、またはカラーフィルターを、ビーム経路（例えば、基本波高調波、第二高調波など）のうちのいずれかまたは全てに配置して、例えば、スペクトルバンド幅の増大または光スループットの増大を可能とする。一実施形態では、干渉フィルター、ノッチパスフィルター、バンドパスフィルター、反射フィルター、または吸収フィルターを、図中のフィルターの代わりに使用して、基本波ビームまたは非線形光学ビームを通過させることもでき、遮断することもできる。
【０１０６】
本明細書で提供される方法のうちのいくつかの態様では、検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録することができる。例えば、データ保存媒体を読み取るためのシステムは、中央処理装置（「ＣＰＵ」）、例えば、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリ、マスストレージメモリ（１または複数のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブなど）でありうる作業用メモリ、１または複数のディスプレイデバイス（例えば、ブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、発光ダイオード（「ＬＥＤ」）ディスプレイ、液晶ディスプレイ（「ＬＣＤ」）、エレクトロルミネセントディスプレイ、真空蛍光ディスプレイ、電界放出ディスプレイ（「ＦＥＤ」）、プラズマディスプレイ、プロジェクションパネルなど）、１または複数のユーザー入力デバイス（例えば、キーボード、マイクロフォン、マウス、タッチスクリーンなど）、それらの全てが従来の双方向性システムバスにより相互接続された、１または複数の入力線、および１または複数の出力線を含むコンピュータを含みうる。システムは、単体のコンピュータの場合もあり、他のシステム（例えば、コンピュータ、ホスト、サーバーなど）へとネットワーク接続される（例えば、ローカルエリアネットワーク、ワイドエリアネットワーク、イントラネット、エクストラネット、またはインターネットを介して）場合もある。システムはまた、大衆消費電子製品および家庭用電気製品などのさらなるコンピュータ制御デバイスも含みうる。
【０１０７】
入力ハードウェアは、入力線によりコンピュータへとカップリングすることができ、様々な様式で実装することができる。本発明の機械可読データは、電話線または専用のデータ回線により接続された１または複数のモデムの使用を介して入力することができる。あるいは、または加えて、入力ハードウェアは、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブも含みうる。ディスプレイ末端と共に、キーボードもまた入力デバイスとして使用することができる。
【０１０８】
出力ハードウェアは、出力線によりコンピュータへとカップリングし、従来のデバイスにより同様に実装することができる。例として述べると、出力ハードウェアは、ＱＵＡＮＴＡなどのプログラムを使用して、本発明の活性部位の画像表示を表示するためのディスプレイデバイスを含みうる。出力ハードウェアはまた、ハードコピーの出力を作製しうるように、プリンターを含む場合もあろうし、後日の使用のためのシステム出力を保存するためのディスクドライブを含む場合もあろう。
【０１０９】
本発明において有用な機械可読の保存デバイスは、磁気デバイス、電気デバイス、光学デバイス、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。このようなデータ保存デバイスの例は、ハードディスクデバイス、ＣＤデバイス、デジタルビデオディスクデバイス、フロッピー（登録商標）ディスクデバイス、リムーバブルハードディスクデバイス、磁気光学ディスクデバイス、磁気テープデバイス、フラッシュメモリデバイス、バブルメモリデバイス、ホログラフィック保存デバイス、および他の任意のマスストレージ周辺デバイスを含むがこれらに限定されない。これらの保存デバイスは、データの保存を可能とするのに必要なハードウェア（例えば、ドライブ、コントローラー、電源など）ならびに任意の必要な媒体（例えば、ディスク、フラッシュカードなど）を含むことを理解されたい。
【０１１０】
当業者は、データを送受信または保存する他の任意の方法または技法もまた、候補モジュレーターに結合した後の標的タンパク質のコンフォメーション変化についてのリアルタイムのデータを、機械可読のフォーマットで提供するために想定されることを察知するであろう。
【０１１１】
Ｂ．ＳＨＧの検出および標識
Ｔｉ：Ｓフェムト秒レーザーからのビームを、当業者に公知の手順により、基本波として使用する。具体的には、パルスの持続時間を約１５０ｆｓとする８０ＭＨｚおよび０．５Ｗの平均電力で作動するアルゴンポンプ式のＴｉ：サファイアシステムを使用した（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）。ビームは、スライド−緩衝液間界面の地点へと優先的に焦点を当てる。表面が発生させる第二高調波光は、当業者に公知の手順により、集光し、基本波からフィルターで取り出し、光電子増倍管（ＰＭＴ）で検出する。光退色に起因して強度を減衰させたベースラインのシグナルを記録する。基本波ビームの偏光を変化させて、最大のシグナル出力をもたらした。第二高調波としてのシグナルは、基本波強度に対するその二次依存を決定し、その特徴的なスペクトル線形を測定することにより検証した。各データ点は、フォトンをカウントする１秒間の積分時間を使用することにより得た。
【０１１２】
いくつかの態様では、標的タンパク質は、上記で記載した標識のうちのいずれかなどの第二高調波（ＳＨ）活性標識で標識することができる。一実施形態では、標的タンパク質を、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１または複数の上の第二高調波活性部分（標識など）で標識し、ＳＨ活性の標識が、界面に対して正味の配向性を保有するように、本明細書で記載される表面または界面のうちのいずれかなどの表面へと付着させるかまたは界面において配向させる。標識されたアミノ酸は、システイン残基、リシン残基、またはアミンを含みうるがこれらに限定されない。他の実施形態では、標的タンパク質は、アラダンなどであるがこれらに限定されない非天然アミノ酸で標識する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質内の天然のアミノ酸残基を、第二高調波活性標識で標識する。他の実施形態では、標識されたアミノ酸残基は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製された、突然変異させるかまたは置換したアミノ酸残基（保存的に突然変異させるかまたは保存的に置換したアミノ酸残基など）でありうる。他の実施形態では、標的タンパク質は、表面（本明細書で記載される表面または界面のうちのいずれかなど）へと付着させ、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、ＳＨ活性の標識で標識する。
【０１１３】
Ｃ．標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法
本明細書では、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法が提供される。界面において正味の配向性を伴うＳＨ活性の標識に結合させた標的タンパク質を、標的タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと共にプレインキュベートし、ベースラインの第二高調波シグナルを確立する。あるいは、天然リガンドを活性部位にあらかじめ結合させた標的タンパク質を、細胞または組織から単離する。この後、標的タンパク質を、候補アロステリックモジュレーター（本明細書で記載される候補アロステリックモジュレーター剤のうちのいずれかなど）と共にインキュベートする。候補アロステリックモジュレーターの標的タンパク質への結合は、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す、検出可能なシグナルをもたらす。したがって、検出可能なＳＨＧシグナルの存在または非存在により、標的のアロステリックモジュレーターとしての候補薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の活性部位に結合することが既知の合成リガンドは、阻害剤または標的タンパク質の天然リガンドの合成類似体などの薬物である。
【０１１４】
いくつかの態様では、ＳＨ活性の標識を、１または複数の細胞内リガンドまたは細胞外リガンドに結合することが既知の、標的タンパク質上の特定のアミノ酸残基に結合させる。これらは、限定せずに述べると、別のタンパク質、ペプチド、核酸（阻害性核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなど）、リン脂質、炭水化物、または補因子（金属イオンまたはビタミンなどであるがこれらに限定されない）を含みうる。一実施形態では、ＳＨ活性の標識を、標的タンパク質と別のタンパク質との相互作用の界面帯域内に位置する（すなわち、タンパク質間相互作用の部位に配置された）ことが既知の、標的タンパク質内のアミノ酸に結合させる。
【０１１５】
いくつかの態様では、標的タンパク質上の標識されたアミノ酸残基は、システイン残基、リシン残基、またはアミンを含みうるがこれらに限定されない。他の実施形態では、標的タンパク質は、アラダンまたはダンシルアラニンなどであるがこれらに限定されない非天然アミノ酸で標識する。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、和周波発生活性（ＳＦＧ活性）である。いくつかの実施形態では、振動特性が調整された固有のプローブを含むＵＡＡを、不連続の部位（標的タンパク質と別のタンパク質との相互作用の界面帯域など）において標的タンパク質に工学的に作製して、ＳＦＧにより部位特異的コンフォメーション変化を同定することができる。プローブ部分は、ＮＯ、ＣＮ、ＳＣＮ、またはＮ３を含みうるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブ部分は、約１，９００〜２，３００ｃｍ−１の間のスペクトル範囲内で固有の振動シグネチャーを提示する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質内の天然のアミノ酸残基を、第二高調波活性標識で標識する。他の実施形態では、標識されたアミノ酸残基は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製された、突然変異させるかまたは置換したアミノ酸残基（保存的に突然変異させるかまたは保存的に置換したアミノ酸残基など）でありうる。
【０１１６】
他の態様では、標的タンパク質は、上記で記載した表面または界面のうちのいずれかなどの表面または界面に結合させることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、それを表面へと固定化するためのアフィニティータグ（ポリヒスチジンタグ、例えば、Ｈｉｓ６などであるがこれらに限定されない）を含む。別の実施形態では、表面を、Ｈｉｓ６タグ付けされたキナーゼを、ＳＨＧまたはＳＦＧを検出するための表面へと固定化するための、ニッケル−オリゴＰＥＧ分子でコーティングする。さらに別の実施形態では、表面は、支持脂質二重層表面または脂質類似体二重層表面である。
【０１１７】
いくつかの態様では、候補アロステリックモジュレーター剤の、ＳＨ活性標識標的タンパク質への結合は、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しうる。いくつかの実施形態では、このコンフォメーション変化は、ＳＨ活性の標識の正味の配向性を、界面に照らして変化させうる。いくつかの実施形態では、ＳＨ活性の標識の正味の配向性は、候補アロステリックモジュレーター剤に結合するときに、界面に照らして、約１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°以上のうちのいずれか変化する。一実施形態では、この変化を、リアルタイムで検出および記録する。
【０１１８】
Ｃ．薬剤へのアロステリック結合において、コンフォメーション変化を受ける標的タンパク質の構造内の特異的部位を同定するための方法
本明細書では、薬剤へのアロステリック結合において、コンフォメーション変化を受ける標的タンパク質の構造内の特異的部位を同定するための方法が提供される。いくつかの態様では、各標的タンパク質を、１つのＳＨ活性の標識に結合させるが、ＳＨ活性の標識の位置が、少なくとも２つ以上の標的タンパク質（すなわち、各々が単一のＳＨ活性の標識を、標的タンパク質の異なる領域内に配置した、標的タンパク質の少なくとも２つのコピー）の間で異なるように、単一の標的タンパク質を、２つ以上の異なる位置において、ＳＨ活性の標識で標識する。界面において正味の配向性を伴うＳＨ活性の標識に結合させた少なくとも２つの標的タンパク質は、標的タンパク質の活性部位に結合することが既知の天然リガンドまたは合成リガンドと、必要に応じてプレインキュベートし、ベースラインの第二高調波シグナルを確立することができる。次いで、少なくとも２つ以上の標識された標的タンパク質の各々を、候補アロステリックモジュレーター剤（本明細書で記載される候補アロステリックモジュレーター剤のうちのいずれかなど）と共にインキュベートする。候補アロステリックモジュレーターの標的タンパク質への結合は、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を指し示す、検出可能なシグナルをもたらす。標的上の第１の部位に配置されたＳＨ活性の標識で標識された標的タンパク質が、候補アロステリックモジュレーターに結合するときに、検出可能なシグナルをもたらすのに対し、同じ候補アロステリックモジュレーターを、標的上の第２の部位に配置されたＳＨ活性の標識で標識された標的タンパク質と共にインキュベートしても、検出可能なシグナルがもたらされない場合、これは、候補アロステリックモジュレーターが、標的タンパク質上の第１の部位において、標的タンパク質に特異的に結合し、コンフォメーション変化を誘導するが、第２の部位においてはそうではないことを指し示す。他方、候補アロステリックモジュレーターと共にインキュベートするときに、ＳＨ活性の標識を第１の部位に配置した標的タンパク質およびＳＨ活性の標識を第２の部位に配置した標的タンパク質の各々が、検出可能なシグナルをもたらす場合、これは、候補アロステリックモジュレーターが、両方の部位において、標的タンパク質に特異的に結合し、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しつつあるか、または候補アロステリックモジュレーターが、標的タンパク質に非特異的に結合しつつあることを指し示す。ＳＨ活性の標識が配置される標的タンパク質上の部位の数を増大させることにより、候補アロステリックモジュレーターが標的タンパク質に特異的に結合するのか、または非特異的に結合するのかを決定する能力を増大させることができる（すなわち、特異的な相互作用の可能性は、２つ、３つ、４つ、または５つなど、複数の標的タンパク質上の部位にわたりもたらされる検出可能なシグナルの数と共に小さくなる）。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０以上のうちのいずれかなど、標的タンパク質の複数の変化形であって、各々が、ＳＨ活性の標識を、標的タンパク質の異なる領域内に配置した変化形をもたらすことができる。
【０１１９】
「特異的結合」という用語は、標的生体分子（例えば、標的タンパク質）と結合パートナーとの、一般に特異的でかつ可逆的な相互作用であって、結合性部位における、生体分子の構造と結合パートナーの構造との空間的相補性を、結合性部位における、１または複数の種類の静電力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力とカップリングした組合せ効果を要求する相互作用について記載する。結合性部位における空間的相補性が大きく、他の力が強いほど、生体分子の、そのそれぞれの結合パートナーに対する結合特異性は大きくなるであろう。
【０１２０】
「非特異的結合」という用語は、標的生体分子と結合パートナーとの、非特異的な相互作用を介する、例えば、相互作用部位における静電力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力を介するが、アフィニティー（特異的な）結合などにおける非構造的力の効果を増強する構造的相補性を欠く相互作用を指す。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、標的生体分子を、第１の部位（例えば、第１のアミノ酸部位）において標識する場合に、候補結合パートナーが標的生体分子に結合した後の検出可能なシグナル（例えば、標準化されたＳＨＧ強度）の第１の変化を測定する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を、第２の部位（例えば、第２のアミノ酸部位）において標識する場合に、同じ候補結合パートナーが標的生体分子に結合した後の検出可能なシグナル（例えば、標準化されたＳＨＧ強度）の第２の変化を測定する。標準化されたＳＨＧ強度とは、候補結合パートナーが標的生体分子に結合するときに測定されるＳＨＧシグナルの、対照値（例えば、候補結合パートナーの非存在下において測定されるＳＨＧシグナル）に照らした比である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、第１の変化と第２の変化とのノイズレベルを上回る差異は、候補結合パートナーが、特異的結合剤であることを指し示す。いくつかの実施形態では、ノイズレベルは、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、または１０％である。いくつかの実施形態では、第１の変化と第２の変化との差異は、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、または５００％ノイズレベルを上回る。いくつかの実施形態では、特異的結合パートナーの、標的生体分子に対するアフィニティーは、遊離溶液中で１０−４〜１０−８Ｍ、１０−４〜１０−８Ｍ、１０−４〜１０−５Ｍ、１０−５〜１０−６Ｍ、１０−６〜１０−７Ｍ、１０−７〜１０−８Ｍ、１０−８〜１０−１２Ｍ、１０−８〜１０−９Ｍ、１０−９〜１０−１０Ｍ、１０−１０〜１０−１１Ｍ、１０−１１〜１０−１２Ｍの範囲にあるか、または１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、もしくは１０−１２Ｍを超える。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、第１の変化と第２の変化との、ノイズレベルを下回る差異は、候補結合パートナーが、非特異的結合剤であることを指し示す。いくつかの実施形態では、ノイズレベルは、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、または１０％である。いくつかの実施形態では、第１の変化と第２の変化との差異は、９５％、８５％、７５％、６５％、５５％、４５％、３５％、２５％、１５％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％ノイズレベルを下回る。いくつかの実施形態では、非特異的結合パートナーの、標的生体分子に対するアフィニティーは、遊離溶液中で、１０−１〜１０−２Ｍ、１０−２〜１０−３Ｍ、１０−３〜１０−４Ｍの範囲にあるか、または１０−４、１０−３、１０−２、１０−１Ｍ未満である。
【０１２４】
いくつかの態様では、ＳＨ活性の標識のうちの少なくとも１つは、標的タンパク質上の天然のアミノ酸残基に結合させず、標的タンパク質の特異的領域に工学的に作製されたアミノ酸（例えば、工学的に作製されたシステイン残基）に結合させる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質を、各天然のアミノ酸が、標的タンパク質の異なる領域内またはドメイン内に配置される、複数の天然のアミノ酸残基（システイン残基など）上のＳＨ活性の標識で標識する。別の実施形態では、標的タンパク質上のＳＨ活性の標識の全てを、標的タンパク質の２つ以上の領域内で工学的に作製された（すなわち、突然変異させるかまたは置換した）アミノ酸残基に結合させる。
【０１２５】
いくつかの態様では、標的タンパク質上の標識されたアミノ酸残基は、システイン残基、リシン残基、またはアミンを含みうるがこれらに限定されない。他の実施形態では、標的タンパク質は、アラダンまたはダンシルアラニンなどであるがこれらに限定されない非天然アミノ酸で標識する。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、和周波発生活性（ＳＦＧ活性）である。いくつかの実施形態では、振動特性が調整された固有のプローブを含むＵＡＡを、不連続の部位（標的タンパク質と別のタンパク質との相互作用の界面帯域など）において標的タンパク質に工学的に作製して、ＳＦＧにより部位特異的コンフォメーション変化を同定することができる。プローブ部分は、ＮＯ、ＣＮ、ＳＣＮ、またはＮ３を含みうるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブ部分は、約１，９００〜２，３００ｃｍ−１の間のスペクトル範囲内で固有の振動シグネチャーを提示する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質内の天然のアミノ酸残基を、第二高調波活性標識で標識する。他の実施形態では、標識されたアミノ酸残基は、標的タンパク質のアミノ酸一次配列に工学的に作製された、突然変異させるかまたは置換したアミノ酸残基（保存的に突然変異させるかまたは保存的に置換したアミノ酸残基など）でありうる。
【０１２６】
他の態様では、標的タンパク質は、上記で記載した表面または界面のうちのいずれかなどの表面または界面に結合させることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、それを表面へと固定化するためのアフィニティータグ（ポリヒスチジンタグ、例えば、Ｈｉｓ６などであるがこれらに限定されない）を含む。別の実施形態では、表面を、Ｈｉｓ６タグ付けされたタンパク質（キナーゼなど）を、ＳＨＧまたはＳＦＧを検出するための表面へと固定化するための、ニッケル−オリゴＰＥＧ分子でコーティングする。さらに別の実施形態では、表面は、支持脂質二重層表面または脂質類似体二重層表面である。
【０１２７】
いくつかの態様では、候補アロステリックモジュレーター剤の、ＳＨ活性標識標的タンパク質への結合は、標的タンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導しうる。いくつかの実施形態では、このコンフォメーション変化は、ＳＨ活性の標識の正味の配向性を、界面に照らして変化させうる。いくつかの実施形態では、ＳＨ活性の標識の正味の配向性は、候補アロステリックモジュレーター剤に結合するときに、界面に照らして、約１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°以上のうちのいずれか変化する。一実施形態では、この変化を、リアルタイムで検出および記録する。
【０１２８】
本明細書では、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定するための方法が提供される。いくつかの例では、標的生体分子を、第１の部位において、第二高調波活性部分など、非線形活性標識で標識する。次いで、標識されたタンパク質を、候補結合パートナーと接触させる。表面選択技術を使用して、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合と関連するシグナル（例えば、標準化された第二高調波発生の強度）を測定する。
【０１２９】
次いで、１または複数の部位について、同じ手順を繰り返す。例えば、標的生体分子は、それを同じ候補結合パートナーと接触させる前に、第２の部位において標識する（第１の部位における標識を伴わずに）ことができる。表面選択技術を使用して、標的生体分子と同じ候補結合パートナーとの結合と関連するシグナル（例えば、標準化された第二高調波発生の強度）を測定する。第１の部位において標識された標的を使用して発生させたシグナルを、第２の部位において標識された標的を使用して発生させたシグナルと比較する。ノイズレベルを上回る（例えば、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、または５００％ノイズレベルを上回る）差異は、標的生体分子と候補結合パートナーとの特異的結合を指し示す。ノイズレベルを下回る差異は、標的生体分子と候補結合パートナーとの非特異的結合を指し示す。
【０１３０】
本明細書で提供される方法を使用して、同じ標的生体分子をターゲティングする薬物候補のライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、上記で概括した手順を、ライブラリー内の各薬物について実行することができる。各薬物について、標的生体分子と薬物候補との結合と関連するシグナル（例えば、標準化された第二高調波発生の強度）を、標的生体分子を第１の標識部位上で標識する場合に１回測定し、標的生体分子を第２の標識部位上で標識する（第１の部位における標識を伴わずに）場合に１回測定する。これらの２つの測定の間の差異は、薬物候補の結合特異性、標的生体分子内のコンフォメーションを誘導するその能力、薬物動態、および有効性の指標である。これらの２つの測定の間の差異に基づくと、薬物候補を、さらなる後続のスクリーニング（例えば、動物実験または臨床試験）のために選択することができる。
【０１３１】
標的生体分子は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴ糖を含む任意の生体分子でありうる。
【０１３２】
標識部位は、複数の基準に基づき選択することができる。例えば、標識部位は、結合性部位からの距離に基づき選択することができる。いくつかの方法では、第１の標識部位は、結合性部位に対して、第２の標識部位より近位である。第１の標識部位および第２の標識部位はいずれも、結合界面内にありうる。標識部位の全てが結合界面内にあるわけではないことが好ましい。いくつかの方法では、標識部位のうちの少なくとも１つは、結合界面内にない。他の方法では、標識部位のうちの少なくとも１つは、結合界面内にある。いくつかの方法では、第１の標識部位は、結合界面内にあり、第２の部位は、結合界面外にある。いくつかの方法では、いずれの標識部位も結合界面外にある。
【０１３３】
Ｄ．Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法
本明細書では、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ；本明細書で記載されるＧＰＣＲのうちのいずれかなど）上のアロステリック部位に結合する薬剤を同定するための方法が提供される。ＧＰＣＲを、ＧＰＣＲに結合するときに、界面において正味の配向性を有する第二高調波活性標識で標識された天然リガンドと共にプレインキュベートし、ベースラインの第二高調波シグナルを確立する。この後、ＧＰＣＲを、候補アロステリックモジュレーター（本明細書で記載される候補アロステリックモジュレーター剤のうちのいずれかなど）と共にインキュベートする。候補アロステリックモジュレーターのＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲの構造のコンフォメーション変化を指し示す、検出可能なシグナルをもたらす。したがって、検出可能なＳＨＧシグナルの存在または非存在により、ＧＰＣＲのアロステリックモジュレーターとしての候補薬剤が同定される。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの活性部位に結合することが既知の天然リガンドは、ペプチドホルモンなどのホルモンである。
【０１３４】
いくつかの態様では、天然リガンド上の標識されたアミノ酸残基は、システイン残基、リシン残基、またはアミンを含みうるがこれらに限定されない。他の実施形態では、天然リガンドは、アラダンまたはダンシルアラニンなどであるがこれらに限定されない非天然アミノ酸で標識する。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、和周波発生活性（ＳＦＧ活性）である。いくつかの実施形態では、振動特性が調整された固有のプローブを含むＵＡＡを、不連続の部位において天然リガンドに工学的に作製することができる。プローブ部分は、ＮＯ、ＣＮ、ＳＣＮ、またはＮ３を含みうるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、プローブ部分は、約１，９００〜２，３００ｃｍ−１の間のスペクトル範囲内で固有の振動シグネチャーを提示する。いくつかの実施形態では、天然リガンド内の天然のアミノ酸残基を、第二高調波活性標識で標識する。他の実施形態では、標識されたアミノ酸残基は、天然リガンドのアミノ酸一次配列に工学的に作製された、突然変異させるかまたは置換したアミノ酸残基（保存的に突然変異させるかまたは保存的に置換したアミノ酸残基など）でありうる。
【０１３５】
他の態様では、ＧＰＣＲは、生体細胞の細胞膜上で発現させることもでき、リポソームの表面上などの合成生体膜上で発現させることもできる。さらに別の実施形態では、ＧＰＣＲを、支持脂質二重層表面または脂質類似体二重層表面などの表面内に埋め込む。いくつかの実施形態では、生体細胞は、その表面上において、ＧＰＣＲを生得的に発現する。他の実施形態では、生体細胞は、生体細胞の表面上で発現するＧＰＣＲをコードする核酸を異種発現させる。タンパク質（ＧＰＣＲなど）を、細胞の表面上で異種発現させるための方法は多数であり、当技術分野でも周知の技法である。
【０１３６】
いくつかの態様では、候補アロステリックモジュレーター剤のＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲの構造のコンフォメーション変化を誘導しうる。いくつかの実施形態では、このコンフォメーション変化は、ＳＨ活性標識天然リガンドの正味の配向性を、界面（例えば、細胞の細胞膜またはリポソームなどの合成生体膜）に照らして変化させうる。いくつかの実施形態では、ＳＨ活性の標識の正味の配向性は、候補アロステリックモジュレーター剤に結合するときに、界面に照らして、約１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°以上のうちのいずれか変化する。一実施形態では、この変化を、リアルタイムで検出および記録する。
【０１３７】
Ｖ．標識
標識は、タンパク質上の異なる種類の標識部位へと付着させることができる。例えば、１または複数の標識は、天然のタンパク質残基または突然変異体のタンパク質部位（例えば、非天然アミノ酸を組み込む部位）、またはこれらの組合せへと付着させることができる。標識部位は、タンパク質の表面上に配置することもでき、タンパク質内に包埋することもできる。標識部位は、タンパク質の表面上に配置することが好ましい。非天然アミノ酸へと付着させた標識は、タンパク質内に包埋された残基の標識を可能とする。
【０１３８】
標識は、任意の種類のアミノ酸残基へと付着させることができる。例えば、標識は、システイン残基またはリシン残基など、あらかじめ選択された部位へと付着させることができる。標識はまた、アミノ酸へと、タンパク質を通してランダムに（例えば、アミノ基を介して）付着させることもできる。標識は、異なる残基（例えば、システイン残基またはリシン残基）に、異なる速度または異なる占有度で結合させることができる。例えば、溶液中の標識は、１つの部位におけるアミン基に、別の部位におけるアミン基より速く結合しうる。結合速度はまた、標識反応条件にも依存する。例えば、ｐＨの変化は、１つの種類の残基が、所与の標識に優先的に結合することを意味しうる。さらに、標識（例えば、色素分子）の、標識されるタンパク質に対する比は、標識される部位の数に影響を及ぼしうる。標識される部位の数および／または位置を制御することは、例えば、結合相互作用の特異性をプローブするために重要でありうる。非天然アミノ酸では、標識手順を、選択された部位の標識に特異的に調整することができる。このような部位は、例えば、機能的に関連する部位の近傍など、戦略的に選択することができる。
【０１３９】
いくつかの例では、例えば、標識されるタンパク質を脂質二重層上に固定化する、したがって、脂質二重層に対面しないタンパク質の部分を露出させることにより、１または複数の標識部位の標識への利用可能性を増大させることができる。したがって、標識は、タンパク質上のあらかじめ選択された位置に対して、ランダムかつ／または特異的に実施することができる。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００以上の標識を、あらかじめ選択された位置（機能的に関連する部位など）の近傍または周囲に施すことができる。
【０１４０】
標識されたタンパク質は、多様なフォーマットを使用してアッセイすることができる。例えば、標識されたタンパク質は、マルチウェルプレートを使用してアッセイすることができる。ウェル内のタンパク質は、異なる形で（すなわち、異なる標識部位において）標識することができる。異なる形で標識されたタンパク質をアッセイすることにより、結合パートナーに結合した後のタンパク質のコンフォメーション変化のマップがもたらされうる。いくつかの方法では、標識部位は、部位が、タンパク質上またはタンパク質内に所定のパターンまたはグリッドを形成するように選択することができる。異なる標識部位において検出されるコンフォメーション変化は、結合パートナーの結合の特異性を指し示しうる。
【０１４１】
Ｖ．キット
他の態様では、本明細書で開示される方法の実施における使用のための組成物を含むキットが、本発明の別の特色を形成する。第二高調波発生（ＳＨＧ）を使用する、本明細書の方法、キット、および／またはシステム（例えば、本明細書で記載される標識および／または非天然アミノ酸のうちのいずれかを含む）についての任意の記載は、和周波発生（ＳＦＧ）または差周波発生（ＤＦＧ）を使用する方法、キットおよび／または、システムに適用することができる。
【０１４２】
一実施形態では、本明細書で記載されるＳＨＧ活性標識（色素標識など）、ＳＦＧ活性標識（色素標識など）、またはＤＦＧ活性標識（色素標識など）のうちのいずれかなど、標的タンパク質にコンジュゲートする１または複数のＳＨＧ活性部分（標識など）、ＳＦＧ活性部分（標識など）、またはＤＦＧ活性部分（標識など）を含むキットが提供される。これらは、マレイミド標識（ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）など）、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、オキサゾール標識、ＢＡＤＡＮ（商標）（６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン）、ＰｙＭＰＯ−ＳＥ（商標）（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）、およびＡＣＲＹＬＯＤＡＮ（商標）（６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン）などであるがこれらに限定されない、特異的な官能基に対して異なるカップリング化学反応を伴う色素標識を含みうる。他の実施形態では、色素は、ケトクマリンおよび３，３’−カルボニルビス（７−ジエチルアミノクマリン）などであるがこれらに限定されないクマリンベースの色素でありうる。
【０１４３】
キットへの組入れにはまた、本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける使用のために、タンパク質をＳＨＧ活性標識、ＳＦＧ活性標識、またはＤＦＧ活性標識で標識するための、ツールおよび試薬も想定される。これらは、限定せずに述べると、異なる標識条件を調べるための緩衝液パネル、標識反応を実施するための緩衝液、標識反応を実行するための試験管、標識されたタンパク質を、結合しなかった標識から精製するためのスピンカラムおよび／またはゲル濾過カラム、ならびに標識されたタンパク質を洗浄するための緩衝液を含みうる。
【０１４４】
別の実施形態では、キットは、本明細書で開示される表面のうちのいずれかなど、標的タンパク質を結合させるための１または複数の表面を含みうる。これらの表面は、再使用可能の場合もあり、消耗品（すなわち、１回または限定回数の使用が意図される）の場合もある。表面は、ガラス（スライドガラスなど）、プラスチック、金属、ラテックス、ゴム、セラミック、ポリマー（ポリプロピレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、またはポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール）などであるがこれらに限定されない）、または生体分子（タンパク質など）を吸着もしくは付着させうる任意の表面から作製することができる。いくつかの実施形態では、表面は平滑である。しかし、他の実施形態では、表面は、トレンチ、ｖ字溝、メサ構造、および／またはウェルなどであるがこれらに限定されない、あらかじめ形成された表面特徴を含みうる。加えて、表面は、本明細書で開示される方法のうちのいずれかによりあらかじめ清浄化することができる。表面があらかじめ形成された表面特徴を含まないさらなる実施形態では、キットは、表面上のウェルを鋳型成形するための粘着性ガスケットを含有しうる。
【０１４５】
一実施形態では、キット内に含まれる表面は、異なる励起形状であって、非線形光を送達するかまたは発生させる方式が、限定せずに述べると、ＴＩＲ（全内部反射）、透過、または反射のうちの１または複数に基づく形状に最適化することができる。
【０１４６】
さらなる実施形態では、本明細書で開示される、キット内に含まれる表面は、標的タンパク質への付着に適する表面化学特性をもたらす１または複数の分子であらかじめコーティングすることができる。これらの分子は、アルデヒドシラン、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、またはオリゴポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などであるがこれらに限定されない、本明細書で開示される分子のうちのいずれかを含みうる。一実施形態では、分子は、本明細書で開示されるアフィニティータグのうちのいずれかなどのアフィニティータグを含みうる。例えば、表面は、ヒスチジンタグ付けされたタンパク質を表面へと固定化するためのニッケル−オリゴＰＥＧ分子でコーティングすることができる。
【０１４７】
別の実施形態では、キット内に含まれる表面は、支持脂質（リン脂質などであるがこれらに限定されない）二重層または支持脂質類似体二重層であらかじめコーティングすることができる。キットのこの実施形態はまた、本明細書で開示される表面のうちのいずれかの上で支持脂質二重層または支持脂質類似体二重層を調製するための使用における脂質または脂質の混合物も含む。いくつかの実施形態では、脂質混合物は、ＤＯＰＣなどであるがこれらに限定されないホスホコリンを含みうる。いくつかの実施形態では、脂質混合物は、限定せずに述べると、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリール−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウム）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＰＥ（１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE  (1,2-sn-dioleoylphoshatidyethanolamine)））、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム）のうちの１または複数を含みうる。さらなる実施形態では、脂質または脂質混合物の脂質成分のうちのいずれかは、タンパク質への結合のためのアフィニティータグ（ニッケル化（nicklated）脂質、例えばＤＯＧＳ−Ｎｉ−ＮＴＡ脂質などであるがこれらに限定されない）を含みうる。
【０１４８】
本明細書で開示されるキットのうちの１または複数への組入れにはまた、標的タンパク質−アロステリックモジュレーター間相互作用および標的タンパク質のコンフォメーション構造に対する効果を検出するため、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定する、ならびに／またはＳＨＧ、ＳＦＧ、もしくはＤＦＧを使用する、コンフォメーション変化の任意の検出法および／もしくは測定法のための装置と共に使用されるシグナル周辺機器も想定される。これらは、限定せずに述べると、パスフィルター、カラーフィルター、干渉もしくは他のスペクトルフィルター（波長を選択するため、または基本波（複数可）をより高次の高調波から分離するための）、１もしくは複数の偏光素子、および／またはビームを方向付け、その焦点を絞るための１もしくは複数の鏡またはレンズを含みうる。定量的測定を行う目的のモーター型回転式載物台もまた、本明細書で開示されるキット内に含まれうる。
【０１４９】
別の実施形態では、タンパク質機能または酵素機能に必要な１または複数の補因子が、本明細書で開示されるキット内に含まれうる。これらは、無機補因子（銅イオン、鉄イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、または亜鉛イオンなどであるがこれらに限定されない）を含みうる。これらはまた、チアミンピロリン酸、ＮＡＤ＋（ＮＡＤＨ）、ＮＡＤＰ＋（ＮＡＤＰＨ）、ピリドキサールリン酸、リポアミド、メチルコバラミン、コバラミン、ビオチン、コエンザイムＡ、テトラヒドロ葉酸、メナキノン、アスコルビン酸、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、コエンザイムＦ４２０、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、Ｓ−アデノシルメチオニン、コエンザイムＢ、コエンザイムＭ、コエンザイムＱ、シチジン三リン酸、グルタチオン、ヘム、ヌクレオチド糖、ピロロキノリン、キノン、および／またはテトラヒドロビオプテリンなどであるがこれらに限定されない有機補因子も含みうる。本明細書で開示されるキットのうちのいずれかへの組入れにはまた、１もしくは複数の標的タンパク質（例えば、ユビキチンまたはＳＵＭＯ）に結合することが既知である１もしくは複数の標識された（ＳＦＧまたはＳＨＧで標識されたなど）ペプチドおよび／もしくはタンパク質、または１もしくは複数のＳＦＧもしくはＳＨＧで標識された抗体もしくはそれらの断片も想定される。
【０１５０】
さらに他の実施形態では、キットは、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ活性非天然アミノ酸（ＵＡＡ）標識をタンパク質へと導入するための１または複数の成分を含みうる。これらの成分は、限定せずに述べると、無細胞翻訳抽出物、特定の非天然アミノ酸標識（アラダンなど）を導入するためのｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対、ならびに／または反応緩衝液および洗浄緩衝液を含みうる。いくつかの例では、これらの成分は、標識を、例えば、本明細書で記載される特異性法に従い標識を配置するため、タンパク質の構造上もしくはタンパク質の構造内の機能的に関連する部位（例えば、タンパク質間相互作用の領域の近傍に配置される部位、任意の結合性部位の近傍に直接的には配置されないが、結合イベントなどによりコンフォメーション的に影響を受ける部位）、活性部位、結合性部位、または他の任意の部位の周囲の戦略的位置に標識を配置するためなど、標的タンパク質上の１または複数の位置において選択的に実施することを可能としうる。キットは、所定の位置における選択的標識を達成するためのツールを含みうる。
【０１５１】
別の実施形態では、キットは、生細胞を標識するための１または複数の成分を含みうる。これらは、限定せずに述べると、細胞を付着させるための表面、ＳＨＧ活性標識およびＳＦＧ活性標識、細胞標識反応における使用のための緩衝液、反応しなかった標識を除去するための洗浄緩衝液、ならびに細胞の成長培地を含みうる。
【０１５２】
さらに別の実施形態では、キットは、本明細書で記載される標識法に従い天然の残基を標識するための１または複数の成分も含みうる。このような成分は、生細胞を標識するための記載した成分、反応緩衝液および洗浄緩衝液、標識されるタンパク質に関して用いられる標識の成分（例えば、色素）、ならびに他の成分のうちのいずれかを含みうる。例えば、成分は、標識条件（例えば、標識濃度、物理的環境、および／または化学的環境）を、所望の標識の結果を達成するように変化させることを可能としうる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、キットのうちの１または複数は、アレイを標識するための成分、および／または複数の試料ウェルを標識するための成分を含有しうる。例えば、標識のために用いられる成分は、標識条件の正確な制御に基づき、異なるウェル領域および／またはアレイ領域において、異なる標識の結果を達成することを可能としうる。例えば、キットは、位置により標識条件を変化させるための成分を含みうる。
【０１５４】
さらに、キットは、対応する標識ツール（例えば、ＳＨＧ、ＳＦＧ、またはＤＦＧ活性非天然アミノ酸（ＵＡＡ）標識をタンパク質へと導入するための１または複数の成分）と併せて提供される１または複数の標識も含みうる。このような試薬は、キットの適用領域に従い、特注の濃度または量で組み入れることができる。
【０１５５】
ＶＩ．システム
他の態様では、本明細書において、第二高調波発生（ＳＨＧ）法、和周波発生（ＳＦＧ）法、および／または差周波（ＤＦＧ）法を使用して、標的タンパク質上のアロステリック部位に結合し、かつ／もしくはこれをモジュレートする薬剤についてスクリーニングし、これらを同定し、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を決定し、ならびに／またはコンフォメーション変化を検出および／または測定するためのシステムが提供される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、システムは、ＳＨＧ活性部分、ＳＦＧ活性部分、またはＤＦＧ活性部分（本明細書で提供される組成物、方法、またはキットのうちのいずれかにおいて開示されるＳＦＧ活性部分、ＳＨＧ活性部分、またはＤＦＧ活性部分、例えば、ＳＦＧ活性色素標識、ＳＨＧ活性色素標識、もしくはＤＦＧ活性色素標識、またはＳＦＧ活性非天然アミノ酸、ＳＨＧ活性非天然アミノ酸、もしくはＤＦＧ活性非天然アミノ酸などのうちのいずれか）で標識された標的タンパク質を含む。システムはまた、標的タンパク質−薬剤相互作用を検出するための装置であって、ｉ）基本波光源；ｉｉ）表面付着プローブを伴う基質（ＳＨＧで標識された標的タンパク質、ＳＦＧで標識された標的タンパク質、またはＤＦＧで標識された標的タンパク質など）；およびｉｉｉ）第二高調波ビーム、または他の非線形光学ビームの強度を測定するための検出器を含む装置も含む。システムのいくつかの実施形態では、薬剤のタンパク質上のアロステリック部位への結合を装置により検出し、検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録することができる。他の実施形態では、標的生体分子と候補結合パートナーとの結合相互作用の特異性を装置により検出し、検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録することができる。さらに他の実施形態では、任意の結合イベント時における１または複数のリアルタイムのコンフォメーション変化を検出およびモニタリングし（例えば、リアルタイムで）、検出器により記録されるデータを、固定式またはデータ保存媒体を読み取るためのシステムを介してアクセス可能な固定式またはデータ保存媒体上に記録することができる。
【０１５７】
他の実施形態では、システムは、モノクロメーター（波長を選択するための）、パスフィルター、カラーフィルター、干渉もしくは他のスペクトルフィルター（波長を選択するため、または基本波（複数可）をより高次の高調波から分離するための）、１もしくは複数の偏光素子、ビームを方向付け、その焦点を絞るための１もしくは複数の鏡もしくはレンズ、コンピュータによる制御、またはソフトウェアをさらに含む。他の実施形態では、非線形光を送達するかまたは発生させる方式（例えば、ＳＨＧ）は、以下の手段：ＴＩＲ（全内部反射）、光ファイバー（ビーズを付着させるかまたは付着させない）、透過（試料内の基本波の通過）、反射（基本波は、試料から反射される）、走査造影、共焦点造影または走査、複合空洞共振器、または多重経路セットアップのうちの１または複数に基づきうる。
【０１５８】
システムの別の実施形態では、測定された情報は、以下のパラメータ：光の強度（ＰＭＴまたはフォトダイオードにより光起電力へと転換されることが典型的）、光の波長（モノクロメーターおよび／またはフィルターにより決定される）、時間、または位置のうちの１または複数を含みうるベクターの形態を取りうる。装置の２つの一般的な構成は、画像走査装置（基質の造影：ｘ，ｙ座標の関数としての強度、波長など）および分光光度装置（いくつかの平面状表面についての、または細胞、リポソーム、もしくは他の粒子の懸濁液についての強度、波長などの測定）である。
【０１５９】
本発明は、例示を目的に提供されるものであり、限定的であることを意図するものではない、以下の実施例を参照することにより、さらに理解することができる。
【実施例】
【０１６０】
（実施例１）
合成リガンドをキナーゼ活性部位へと添加することを介する、キナーゼのアロステリックモジュレーターの同定
キナーゼとは、薬物標的の主要なクラスであり、少なくとも３０の別個のキナーゼ標的が、現在のところ臨床試験にかけられている。Ｉ型阻害剤として既知の大半のキナーゼ薬は、キナーゼのＡＴＰ結合性部位に結合し、ＡＴＰを模倣し、これと直接的に競合することにより、キナーゼ活性化ループを、活性コンフォメーションへと安定化させるように働く。これに対し、ＩＩ型阻害剤は、活性化ループならびにキナーゼ上の他の部位へと部分的に結合することにより、キナーゼの活性化ループを、不活性コンフォメーションへとシフトさせる。これに対し、ＩＩＩ型キナーゼ阻害剤とは、キナーゼ活性化ループ以外のキナーゼ上の部位に結合することにより、キナーゼ活性をアロステリックにモジュレートする。ＩＩＩ型阻害剤の同定は、候補阻害剤がキナーゼに結合する部位の決定が、弁別のためにＸ線結晶構造解析を要求することが典型的であるという事実に起因して困難である。本実施例では、第二高調波発生（ＳＨＧ）の検出を使用して、ｉ）キナーゼのコンフォメーションを１または複数の標識される部位において変化させる分子、およびｉｉ）キナーゼ活性部位に結合させた既知の合成リガンド（イマチニブ）の存在下においてキナーゼのコンフォメーションを１または複数の標識される部位において変化させ、これにより、定義上、活性部位以外の位置に結合するアロステリック分子の探索を偏向する分子を同定する。
【０１６１】
材料および方法
キナーゼの作製および標識
Ｎ末端６×Ｈｉｓタグを伴うＡｂｌキナーゼＫＤを、文献（５〜７）において記載されている通りに構築し、発現させ、精製する。次いで、タンパク質を、標識緩衝液（０．１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール）中で標準的な手順により透析する。標識のためのタンパク質の濃度は、２〜５ｍｇ／ｍＬとする。低濃度も許容可能であるが、これに応じて標識時間を調整する必要がありうる。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎを使用することによりタンパク質を濃縮することが、タンパク質をこの濃度レベルまで上げるために必要でありうる。
【０１６２】
濃縮されたタンパク質（２〜５ｍｇ／ｍＬ）を、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１：１２のモル比で混合する。マレイミドプローブは、システインに対する特異性が高い。標識反応物中のＤＭＳＯ濃度は、約３％以下に限定される。次いで、標識反応物を、撹拌翼を伴う清浄な円錐形のガラス製標識用バイアルへと移し、反応物を、撹拌プレート上のホイルラップ内に入れ、室温で１時間にわたり静かに撹拌する。標識されたタンパク質は、測定／ローディング緩衝液（０．１Ｍのトリス、緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ）のスタッキング緩衝液のアリコート中で、製造元により公表されているプロトコールを使用するＺｅｂａスピンカラムを使用してカラム精製する。この場合には、タンパク質：色素の化学量論比を、分光光度法により、約１：２と決定する。質量分析により、プローブで、キナーゼ内の２つのシステインを標識したことを確認した。
【０１６３】
ガラス器具および超音波装置による調製
開始前に、全てのガラス器具をＰｉｒａｎｈａ洗浄剤で清浄化する（２０分間）。使用上の注意：Ｐｉｒａｎｈａ洗浄剤は、発熱性が大きく、有機物と接触させた場合はとりわけ爆発しやすい。溶液は、ドラフト内の、Ｐｙｒｅｘ（登録商標）などの耐熱性のガラス器具内で、まず、Ｈ２Ｏ２を量り分け、次いで、酢酸を添加することにより調製する。真空ボトルを、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）ですすぐ。空気への曝露を可能な限り回避するように注意しながら、ＤＯＰＣ脂質の、ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）に対する所望のモル比を決定する。脂質ミックスを伴う真空ボトルを、Ｒｏｔｏｖａｐ蒸発器上に置く。乾燥するまで（約３０秒間）蒸発させ、次いで、Ｎ２ガスを、蒸発させた調製物上に１０分間にわたり吹きかけて、残留ＣＨＣｌ３を除去する。脂質混合物を２ｍＬのｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁させる。混濁した懸濁液形態となるまで（約５分間）激しくボルテックスする。懸濁液を、４ｍＬのポリスチレン製試験管へと移す。脂質混合物を、溶液が透明化するまで氷上で超音波処理する。これは、２５％の動力へと設定された超音波装置で約６０〜９０秒間を要求するはずである。
【０１６４】
超音波処理された脂質溶液を、マイクロ遠心管へと移し、４℃、１７，０００×Ｇで３０分間にわたり遠心分離する。上清を、清浄なマイクロ遠心管へと移し、完成した脂質調製物を４℃で保存するが、これは、約１カ月間にわたり安定である。
【０１６５】
スライドの調製およびタンパク質のローディング
ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を適用する直前に、顕微鏡用スライドを、Ｐｉｒａｎｈａ洗浄剤で、２０分間にわたり清浄化する。スライド染色容器内で、ｄｉＨ２Ｏにより３回にわたりすすぐ。スライドを圧縮窒素で乾燥させる。粘着性ガスケットを、Ｐｉｒａｎｈａで清浄化されたスライドへと付着させることにより、ＳＨＧウェルを組み立てる（すなわち、１０〜２０μｌの容量を含有するスライド１枚当たり１６ウェル）。アセンブリージグを使用して、ガスケットを整列させ、スライドをジグ内に注意深く入れ、しっかりと圧しつける。ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質調製物を、ＰＢＳ緩衝液またはＴＢＳ緩衝液で１：１に希釈する。スライドガラスの静水学的電荷を低減し、ＳＬＢの形成を可能とするのに、１００ｍＭのＮａＣｌが要求される。１０μＬの希釈されたＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を、スライドのウェルへとピペティングし、室温で５分間にわたりインキュベートする。いかなる場合もウェルへと空気を導入しないように注意しながら、スライドを緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）中に浸し、２００μＬのピペッターにより撹拌することにより、ウェルを洗浄する。液浴中の緩衝液の全容量を、新鮮な緩衝液と交換し、洗浄ステップをさらに２回にわたり繰り返す。１：１容量の１００ｍＭのＮｉＣｌ２溶液を全てのウェルへと添加し、室温で１０分間にわたりインキュベートする。スライドを緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）中に浸し、２００μＬのピペッターにより撹拌することにより、ウェルを洗浄する。液浴中の緩衝液の全容量を、新鮮な緩衝液と交換し、洗浄ステップをさらに２回にわたり繰り返す。必要な場合、ウェル内の緩衝液を、適切なタンパク質のローディング緩衝液へと交換し、対象の標的タンパク質をウェルへとロードする。室温で３０〜９０分間にわたりインキュベートした後、実験を開始する前に、ウェルを、アッセイ緩衝液で十分にすすぐ。
【０１６６】
Ｐｉｒａｎｈａで洗浄したＦｉｓｈｅｒスライド上にＳＵＶを適用して、ＳＬＢ表面を作製する。ＮｉＣｌ２を１０分間にわたり添加し、ウェルを標識緩衝液中で洗浄した。
【０１６７】
標識されたタンパク質を、上記で記載した通りに調製されたＳＬＢ表面上へと、３μＭで４５分間にわたりロードした後、洗浄する。図１は、標識されたタンパク質を、ＳＬＢ上のＳＨＧにより検出しうることを示す。イミダゾールを添加する場合、シグナルは、ベースラインのレベルまで降下することから、表面への付着は、タンパク質のＨｉｓタグを介して生じることが指し示される。
【０１６８】
結晶構造解析（６、８、９）により、Ａｂｌキナーゼの活性部位ポケットに結合することが既知のイマチニブを、ウェルへと、５μＭの濃度で添加し、１０分間にわたりインキュベートして、ＡＴＰポケット（活性部位）へと結合させる。次いで、候補アロステリックモジュレーター剤を、ウェルへと添加し、ＳＨＧシグナルを、標識部位においてコンフォメーションを変化させる候補の能力についてモニタリングする。陽性の「ヒット」を、それらを添加した後にベースラインのシグナルを変化させる候補アロステリックモジュレーターとして同定する。
【０１６９】
（実施例２）
パートナーの結合イベントに関与する標的タンパク質の領域内に配置される部位の標識
ＰＩ３Ｋエフェクターの結合に関与することが既知のＨ−Ｒａｓの領域内にシステインを挿入する多様な突然変異を施す。天然のシステイン残基であるＣ１１８は、必要に応じて、アラニンまたはセリンへと突然変異させることができる。突然変異体を、ＳＨＧプローブであるＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）により標識される能力について、質量分析および当業者に公知のプロトコールを使用して調べる。例えば、天然の残基であるチロシンＹ６４は、ＰＩ３Ｋの結合に関与することが既知である。したがって、二重の突然変異（Ｃ１１８Ａ、Ｙ６４Ｃ）を伴う、組換え６×Ｈｉｓタグ付けされた（Ｎ末端）Ｈ−Ｒａｓタンパク質を、標準的なプロトコール（１０）により調製する。Ｈ−Ｒａｓを、室温で１時間にわたり、０．１ＭのトリスｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール中の、システイン反応性ＳＨＧプローブであるＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）を使用し、かつ、１２：１の色素：タンパク質比を使用して標識する。反応しなかった色素は、ゲル濾過により精製して除去する。６４位におけるシステインの標識は、質量分析により確認する。タンパク質を、候補結合剤分子へと曝露して、部位Ｃ６４においてＲａｓのコンフォメーションを、当業者に公知の対照（例えば、ＤＭＳＯ緩衝液媒体）と比較して有意な形で変化させる候補結合剤分子だけを同定する。工学的に作製されたシステインを標識することができない場合は、本明細書で定義されるエフェクター結合イベントにおいて機能的に関連する部位を突然変異させ、標識される能力について調べる。他の部位についても、同様の手順を実行することができる。
【０１７０】
（実施例３）
少なくとも１つは天然残基の標識を伴わない２つ以上の異なる様式による標的の標識
オリゴ−ＰＥＧによる誘導体化を伴うスライドを、以下の通りに調製する。スライド染色容器を清浄化し、真空オーブン内、７５℃／２０インチＨｇで乾燥させ、次いで、室温まで冷ます。十分なＳＡＴ（ＰＥＧ４）（Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチル（チオテトラエチレングリコール；Ｐｉｅｒｃｅ）溶液を、染色容器へと添加して、全スライドを覆う（約５０ｍＬ）。Ｕｌｔｒａｓｔｉｃｋスライド（アミノ末端シラン誘導体化スライド；Ｔｈｅｒｍｏ）を染色ラックに置き、染色容器に浸す。スライドを、フード内、室温で、２〜３時間にわたり撹拌しながらインキュベートする。次いで、スライドを、ＳＡＴ（ＰＥＧ４）溶液から取り出し、無水クロロホルムを含有するスライド洗浄ディッシュへと移す。洗浄ディッシュを、その深さの２／３まで水道水中に浸漬することにより、スライドを１５分間にわたり超音波処理する。スライドを第２の洗浄ディッシュへと移し、各々をエタノールで、次いで、ｄｉＨ２Ｏですすぐ。最後に、清浄化されたＳＡＴ（ＰＥＧ４）スライドを、乾燥するまで（３０〜６０分間）３７℃／２０インチＨｇの真空オーブンに入れる。
【０１７１】
１ｍｇ／ｍｌのマレイミド−Ｃ３−ＮＴＡを含有するウェル１つ当たり１５μＬずつの脱アシル化溶液を添加する。ガラスカバー下、室温で２０分間にわたりインキュベートする。ｄｉＨ２Ｏで十分に洗浄した後、１００ｍＭのＮｉＣｌ２／トリス、ｐＨ７．２溶液を、ウェル１つ当たり１５μＬずつ添加する。室温で１０分間にわたりインキュベートする。具体的な実験で要求されるローディング緩衝液中に浸すことにより、ウェルを洗浄する。２００μＬのピペッターで撹拌する。（しかし、実験でＰＢＳが要求される場合は、ＮｉＣｌ２／トリス、ｐＨ７．２溶液を、まずＨ２Ｏでウェルから洗い流し、次いで、要求される緩衝液で洗浄する）。いかなる場合においても、適切な緩衝液で十分な水和を保つ。
【０１７２】
タンパク質であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の、Ｎ末端８×Ｈｉｓタグを伴う突然変異体を、当技術分野で公知の方法（１１〜１３）を使用して創出する。第１の場合、天然のシステインの両方を除去し（Ｃ８５ＡおよびＣ１５２Ａ）、単一の異なる残基をシステインへと突然変異させた突然変異体を作製する。突然変異のための部位を選択するため、タンパク質の表面上の多様な残基を、システインへと突然変異させて、ＳＨＧプローブにより標識される能力について調べる。第２の場合、野生型タンパク質を標識し、プローブのＣ１５２への付着を、質量分析により確認する。野生型タンパク質または組換えタンパク質を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌへと精製する。いずれのタンパク質も、以下のプロトコールにより、ＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）を使用して標識する。タンパク質を、２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰおよび約５０ｕＭの１０％グリセロール中、２０：１の色素：タンパク質の標識比でインキュベートする（最終ＤＭＳＯ濃度は５％である）。タンパク質を、４℃で一晩にわたり撹拌し、次いで、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰへとゲル精製する。タンパク質を、そのＨｉｓタグを介してＰＥＧ表面へと固定化させる。いずれのタンパク質も、候補結合剤分子へと曝露して、分子が、異なる（システイン）標識部位においてタンパク質のコンフォメーションを変化させるのかどうかをアッセイする。２つの異なる形で標識された突然変異体のＳＨＧ応答の比較を使用して、例えば、標的タンパク質上の所与の候補結合分子の部位特異的応答を決定することができる。例えば、異なる標識部位に由来するＳＨＧ応答が同一である場合なら、候補結合分子は、タンパク質へと非特異的に結合している可能性がある。
【０１７３】
（実施例４）
ＳＨＧ技術を介する、既知のアロステリックモジュレーターの、Ａｂｌキナーゼへの結合についての試験
本実施例では、第二高調波発生（ＳＨＧ）検出を使用して、Ｘ線結晶構造解析研究（Nagar  Bら、Cell、２００３年、１１２巻（６号）：８５９〜８７１頁）に基づき、Ａｂｌキナーゼにアロステリックに結合することが既知のＧＮＦ−２が、結合するときに、Ａｂｌキナーゼの構造のコンフォメーション変化を誘導するのかどうかについて探索する。ＧＮＦ−２の、Ａｂｌキナーゼの野生型およびＫ４１９Ｃ突然変異体の両方への結合について探索した。
【０１７４】
材料および方法
スライドの清浄化およびアセンブリー
スライドガラスを、Ｐｉｒａｎｈａ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７０％の硫酸／３０％の過酸化水素）中、１００℃で２０分間にわたり洗浄した。これらから熱を除去し、１０分間にわたり冷ました。次いで、スライドをＰｉｒａｎｈａ洗浄液から取り出し、過剰な溶液をスライドから滴下させた。
【０１７５】
スライドを新たな容器に入れ、ｄＨ２Ｏ（超精製水；１８メガオーム）中で３回にわたり洗浄して、いかなる残留Ｐｉｒａｎｈａ溶液も除去した。スライドを、ｄＨ２Ｏから取り出し、窒素ガスをスライド上に吹きかけることにより乾燥させた。
【０１７６】
１６ウェルを含有する粘着性ケイ素製のアイソレーターを、アセンブリージグ上に置き、乾燥したスライドを、アイソレーター上に置いた後、Ｋｉｍｗｉｐｅで圧しつけて、しっかりと接着させた。
【０１７７】
脂質二重層およびタンパク質のローディング
ＳＵＶ原液（ＤＯＰＣ脂質／ＤＧＳ−ＮＴＡ／ＤＨＰＥ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を、ＰＢＳ中に１：１で希釈することにより、小型単層小胞（ＳＵＶ）溶液を調製した。１０μＬのこの１：１のＳＵＶ／ＰＢＳ溶液を、スライドの各ウェルへと入れ、時計皿下、室温で５分間にわたりインキュベートした。次いで、全スライドを、５０ｍＬのＰＢＳを伴う容器内に浸すことにより、スライドを３回にわたり洗浄した。各ウェルを、ＰＢＳおよび２００μＬのチップによる２回にわたる交換を使用して洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳから取り出し、各ウェルを、２０μＬのｄＨ２Ｏで３回にわたり洗浄した。このステップは、次のステップで使用されるＮｉＣｌ２溶液が、溶液から析出することを防止するのに必要であった。
【０１７８】
１０μＬの０．１Ｍ  ＮｉＣｌ２原液を、各ウェルへと入れ、ウェル内に０．０５Ｍ  ＮｉＣｌ２の最終溶液をもたらした。これを、時計皿下、室温で１０分間にわたりインキュベートした。
【０１７９】
全スライドを５０ｍＬのＰＢＳの容器へと浸すことにより、スライドを１回洗浄した。各ウェルを、ＰＢＳおよび２００μＬのチップによる２回にわたる交換を使用して洗浄した。次いで、全スライドを、５０ｍＬのタンパク質特異的反応緩衝液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＣＥＰ）を伴う容器へと浸すことにより、スライドを３回にわたり洗浄した。各ウェルを、反応緩衝液および２００μＬのチップによる２回にわたる交換を使用して洗浄した。
【０１８０】
６×Ｈｉｓタグ付けされたＡｂｌ−ＫＤまたはＫＤ−Ｋ４１９Ｃのどちらか（Seeligerら、Structure、２００７年、１５巻：２９９〜３１１頁）を、８μＬの反応緩衝液を含有する各ウェル内に５μＭの最終濃度まで添加した。次いで、タンパク質を、時計皿下のウェル内、室温で４５分間にわたりインキュベートすることを可能とした。
【０１８１】
ＳＨＧアッセイ
ＧＮＦ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭの原液として調製した。実験のために、０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する反応緩衝液により、反応緩衝液中に２０μＭの原液を調製した。
【０１８２】
４５分後、ＢＫ−７整合流体を使用して、スライドを、Ａｒｔｅｍｉｓプラットフォーム内に置いて、沈めたプリズムに取り付けた。いかなる気泡も、スライド下から除去するように注意を払った。Ａｒｔｅｍｉｓプラットフォームを使用して、洗浄前のライン走査を実施して、各ウェル内のＳＨＧレベルを評価した。
【０１８３】
次いで、各ウェルを、２０μＬのアッセイ溶液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴＣＥＰ、０．２％のＤＭＳＯ）で、５回にわたり洗浄した。
【０１８４】
次いで、Ａｒｔｅｍｉｓプラットフォームを使用して、洗浄後のライン走査を実施して、各ウェル内のＳＨＧレベルを評価した。特注で書き込まれたソフトウェアを使用して、選択されたウェルへと段階を移行させた。収集を開始し、データを５〜７秒間にわたり記録して、緩衝液注射前のベースラインを決定した。
【０１８５】
１０μＬのアッセイ溶液を、ウェルへと注入し、混合した。ＳＨＧレベルの変化を、約３０秒間にわたり記録した。この後、レーザー出力を約５秒間にわたり遮断して、ＧＮＦ２注射前の時間をマークした。次いで、レーザーの遮断を解除し、ＳＨＧシグナルを、ベースラインのレベルに戻した。次いで、データを約５秒間にわたり記録した後、１０μＬの２０μＭのＧＮＦ２原液を、ウェルへと注射した。ウェル内のＧＮＦ２の最終濃度は、１０μＭであった。次いで、データを、注射後３０秒間にわたり記録し、レーザー出力を約６０秒間にわたり遮断し、次いで、さらに３０〜６０秒間にわたりデータを記録した。
【０１８６】
結果
ＳＨＧレベルの変化を、緩衝液注射およびＧＮＦ２注射の両方について決定した。変化は、注射の１５秒後におけるＳＨＧ強度を採集し、注射前におけるベースラインのＳＨＧ強度で除することにより決定した。
【０１８７】
これらの実験によるデータは、Ａｂｌキナーゼ特異的阻害剤であるＧＮＦ２による野生型Ａｂｌ−ＫＤまたはＫ４１９Ｃ突然変異体の処置が、ＳＨＧにより測定されるコンフォメーション変化を結果としてもたらさないことを指し示す。下記で列挙される、当業者による論評の対象となる刊行物において裏付けられている通り、これらのＡｂｌ−ＫＤ断片は、ＧＮＦ２の結合に必要なドメインを含有するが、これらの断片は、ＧＮＦ−２の結合に応答するコンフォメーション変化に要求される全長Ａｂｌキナーゼ内で見出されるＳＨ３−ＳＨ２ドメインを欠く。したがって、ＳＨＧデータは、先行のＸ線共結晶構造データから予測される、ＧＮＦ−２に結合した後のコンフォメーション変化は生じないことを示す。したがって、本実施例は、ＳＨＧの検出は、分子の標的タンパク質へのアロステリック結合を評価するための、強力で、かつ、比較的迅速な技法であることを指し示す。
【０１８８】
（実施例５）
天然アミン基および天然スルフヒドリル基の両方におけるタンパク質の標識ならびに支持脂質二重層へのカップリング
本実施例は、タンパク質を、天然アミン基および天然スルフヒドリル基のいずれにおいても標識し、ＳＨＧ技術を使用する検出のためのヒスチジンアフィニティータグを介して支持脂質二重層へとカップリングしうることを裏付ける。
【０１８９】
材料および方法
ガラス器具および超音波装置による調製：開始前に、全てのガラス器具をＰｉｒａｎｈａ洗浄剤で清浄化した（２０分間）。真空ボトルを、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）ですすいだ。次いで、ＤＯＰＣ脂質の、ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）に対する所望のモル比を決定した。本明細書で開示されるデータについて、支持二重層を造影するためのＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＤＨＰＥを添加した３％ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）、９６．５％を使用した。脂質ミックスを伴う真空ボトルを、Ｒｏｔｏｖａｐ蒸発器上に置き、乾燥するまで（約３０秒間）蒸発させた。Ｎ２ガスを、蒸発させた調製物上に１０分間にわたり吹きかけて、いかなる残留ＣＨＣｌ３も除去した。次いで、脂質混合物を２ｍＬのｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁させ、混濁した懸濁液形態となるまで（約５分間）激しくボルテックスした。懸濁液を、４ｍＬのポリスチレン製試験管へと移した。脂質混合物を、溶液が透明化するまで氷上で超音波処理した。次いで、超音波処理された脂質溶液を、マイクロ遠心管へと移し、４℃、１７，０００×Ｇで３０分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を、清浄なマイクロ遠心管へと移した。完成した脂質調製物を４℃で保存したが、これらは、約１カ月間にわたり安定である。
【０１９０】
タンパク質の標識（溶液中のシステインの標識）：組換えのＨｉｓタグ付けされた（Ｎ末端）Ｈ−Ｒａｓタンパク質を、標準的なプロトコール（６）により調製した。このプロトコールにより調製したＲａｓタンパク質を、ＧＤＰに結合させる。次いで、タンパク質を、室温で１時間にわたり、０．１ＭのトリスｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール中、１２：１の色素：タンパク質比のシステイン反応性色素であるＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）で標識した。反応しなかった色素は、ゲル濾過により精製して除去した。結果として得られる色素：タンパク質比は、０．７：１であり、分光光度法により決定した。ＲａｓのＸ線結晶構造内では、単一のシステイン（Ｃｙｓ１１８）が、溶媒に接近可能であり、この観察は、測定された色素：タンパク質比が１．０以下であることと符合する。次いで、システインにおいて標識されたＲａｓを、膜へと直接カップリングした。
【０１９１】
タンパク質の標識（溶液中のアミンのランダムな標識）：Ｒａｓタンパク質内のアミン基を、ｐＨ８．３の炭酸水素ナトリウム緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で、標準的なプロトコールを使用して標識し、ゲル濾過および透析により精製した。次いで、アミンにおいて標識されたＲａｓを、膜へと直接カップリングした。
【０１９２】
スライドの調製およびタンパク質のローディング：ＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を適用する直前に、顕微鏡用スライドを、Ｐｉｒａｎｈａ洗浄剤で、２０分間にわたり清浄化し、次いで、スライド染色容器内で、ｄｉＨ２Ｏにより３回にわたりすすいだ。スライドを圧縮窒素で乾燥させた。粘着性ガスケットを、Ｐｉｒａｎｈａで清浄化されたスライドへと付着させることにより、ＳＨＧウェルを組み立てた。ｄＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質調製物を、ＰＢＳ緩衝液またはＴＢＳ緩衝液で１：１に希釈した。スライドガラスの静水学的電荷を低減し、ＳＬＢの形成を可能とするのに、１００ｍＭのＮａＣｌが要求された。１０μＬの希釈されたＤＯＰＣ／ＤＧＳ  ＮＴＡ（Ｎｉ）脂質を、スライドのウェルへとピペティングした後、室温で５分間にわたりインキュベートした。スライドを緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）中に浸し、２００μＬのピペッターにより撹拌することにより、ウェルを２回にわたり洗浄した。いかなる場合もウェルへと空気を導入しないことを確実にするように注意した。１：１容量の１００ｍＭのＮｉＣｌ２溶液を全てのウェルへと添加し、室温で１０分間にわたりインキュベートした。スライドを緩衝液浴（ＰＢＳまたはＴＢＳ）中に浸し、２００μＬのピペッターにより撹拌することにより、ウェルを２回にわたり洗浄した。次いで、ウェル内の緩衝液を、適切なタンパク質のローディング緩衝液へと交換した。
【０１９３】
流体支持脂質二重層は、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＤＨＰＥを使用して表面を造影する落射蛍光により確認した。二重層の側方移動性は、当技術分野で公知の、光退色後における蛍光回復により確認した。次いで、対象の標的タンパク質をウェルへとロードし、室温で３０〜９０分間にわたりインキュベートした。実験を開始する前に、ウェルを、アッセイ緩衝液で十分にすすいだ。
【０１９４】
結果
標識されたＨ−Ｒａｓタンパク質（アミンまたはシステインを介して）を、支持脂質二重層（ＳＬＢ）表面上へと、３μＭで４５分間にわたりロードした後、洗浄した。図３は、標識されたタンパク質を、ＳＬＢ上のＳＨＧにより検出しうることを示す。イミダゾールを添加する場合、シグナルは、ベースラインのレベルまで降下することから、表面への付着は、タンパク質のＨｉｓタグを介して生じることが指し示される。
【０１９５】
本実施例は、Ｒａｓタンパク質を、天然アミン基および天然スルフヒドリル基のいずれにおいても標識し、ＳＨＧ技術を使用する検出のためのＮ末端ヒスチジンアフィニティータグを介して支持脂質二重層へとカップリングしうることを裏付ける。
【０１９６】
（実施例６）
薬剤結合の特異性およびタンパク質の結合性部位の機能性を研究するための、タンパク質内の２つの異なる部位におけるコンフォメーション変化の検出
本実施例は、タンパク質内の２つの異なる部位におけるコンフォメーション変化の検出により、いかにして結合剤の特異性についての情報がもたらされるのかを裏付ける。本実施例では、１つの部位は、Ｒａｓタンパク質の解決されたＸ線結晶構造（ＰＤＢコード：３Ｌ８Ｚ、５Ｐ２１など）において同定されている、Ｒａｓ内の溶媒に接近可能なシステイン（Ｃ１１８）である。他の部位は、遊離アミン（リシン）を伴う部位である。複数の化合物を、これらの２つの位置（システイン部位対アミン部位）においてコンフォメーションを変化させるそれらの能力について調べる。１つの化合物は、コンフォメーション変化を、アミン部位だけにおいてもたらし、システイン部位においてはもたらさないことから、この化合物は、Ｒａｓに特異的に結合することが指し示される。
【０１９７】
本実施例はまた、タンパク質内の機能的に関連する部位を標識し、研究することはいかにして可能であるのかも裏付ける：システイン１１８は、Ｒａｓの触媒性領域の近傍にある（システイン残基の硫黄原子であるＳＧと、３Ｌ８Ｚ構造内のヌクレオチドのリン酸原子であるＰＡとの距離は、１．６ｎｍであり、したがって、化合物が、触媒性領域内でコンフォメーションを特異的に変化させることが可能であるのかどうかについての情報をもたらす）。
【０１９８】
３つの低分子のパネルを、Ｎ末端６×ヒスチジンタグを介してＳＬＢ表面へとテザリングされた、ランダムに標識された（アミンにおいて標識された）野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質およびシステインにおいて標識された野生型Ｈ−Ｒａｓタンパク質上で調べた。
【０１９９】
材料および方法
２つのプロトコールのうちの１つを使用して、ＰｙＭＰＯ−ＳＥ（商標）（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）を、Ｈｉｓタグ付けされた野生型Ｈ−Ｒａｓ（Ｎｏｖｕｓ）へとカップリングした。
【０２００】
第１のプロトコールでは、タンパク質を、支持脂質二重層表面（ＳＵＶおよび当業者に公知の標準的なプロトコールを介して調製された、３％のＮｉ−ＮＴＡ  ＤＯＧＳを伴うＤＯＰＣ）にまず結合させ、その後、洗浄前に３０分間にわたり、１０μＭのＰｙＭＰＯ−ＳＥ（商標）（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）へと曝露した。
【０２０１】
あるいは、Ｒａｓを、第２の標準的なプロトコールを使用して、ｐＨ８．３の炭酸水素ナトリウム緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で標識し、ゲル濾過および透析により精製した。次いで、標識されたＲａｓを、膜へと直接カップリングした。第２のプロトコールでは、Ｈ−Ｒａｓを、システイン反応性ＳＨＧプローブであるＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）を使用して標識した。
【０２０２】
組換えのＨｉｓタグ付けされた（Ｎ末端）Ｈ−Ｒａｓタンパク質は、標準的なプロトコール（Hallら、２００２年、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.、U.S.A.、９９巻（１９号）：１２１３８〜４２頁）により調製した。このプロトコールにより調製したＲａｓタンパク質を、ＧＤＰに結合させる。次いで、タンパク質を、室温で１時間にわたり、０．１ＭのトリスｐＨ８．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール中、１２：１の色素：タンパク質比のシステイン反応性色素であるＰｙＭＰＯ−ＭＡＬＥＩＭＩＤＥ（商標）（１−（２−マレイミジルエチル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムメタンスルホネート）で標識した。反応しなかった色素は、ゲル濾過により精製して除去した。分光光度法により決定される通り、結果として得られる色素：タンパク質比は、０．７：１であった。
【０２０３】
３つの化合物：化合物１：１１７０２８、５−ブロモ−７−［（４−フェニルピペラジン−１−イル）メチル］キノリン−８−オール；化合物２：６４３０００、２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル）−４−（１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル）−１Ｈ−イミダゾール；および化合物３：６６２７９６、１Ｈ−ピリド［２，３−ｅ］［１，２，４］［トリアゼピン−１−オン、２，３−ジヒドロ−４−［（モルホリノアセチル）アミノ］を、標識されたＲａｓへと曝露した。
【０２０４】
固定化させたＲａｓ標的のコンフォメーション変化は、５μＬの化合物１〜３を、個別に３倍濃度（３０μＭ）で、ウェル上の１０μＬのアッセイ緩衝液へと添加することにより誘導した後、静かに混合した。各化合物の最終濃度は、１０μＭであった。アッセイ緩衝液は、２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１５％のＤＭＳＯであった。
【０２０５】
結果
結果を、表１にまとめる。化合物１が、アミンにおいて標識されたタンパク質およびシステインにおいて標識されたタンパク質の両方に対する活性を提示したのに対し、化合物２は、アミンにおいて標識されたタンパク質に対してだけ活性を提示した。化合物３は、標識の位置に関わらず、Ｒａｓタンパク質と反応しなかった。ブランクの二重層（タンパク質を伴わない）へと曝露された後、洗浄されたＰｙＭＰＯ−ＳＥ（商標）（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド）は、バックグラウンドを上回るシグナルをもたらさなかった。したがって、標識の後にタンパク質の存在下で検出されるシグナルは、膜上に固定化させたときのタンパク質自体の標識に起因する。化合物２の部位依存的活性は、タンパク質へのその特異的結合についてのさらなる裏付けをもたらす。化合物１は、機能的に関連するシステイン部位において活性を有するため、近傍の（ナノメートル離れた）触媒性領域に対して効果を及ぼす可能性が高い。図４は、アミンにおいて標識されたＨ−Ｒａｓ標的についてのデータを示す。図５は、システインにおいて標識されたＨ−Ｒａｓ標的についてのデータを示す。ベースラインのＳＨＧの測定値は、各化合物を、手作業により２０μＭの２倍濃度で注射する前に約５秒間にわたり収集した。コンフォメーション変化は、注射後約６０秒間にわたり、リアルタイムでモニタリングした。適用された化合物の示差的な活性は、アミン部位上またはシステイン部位上におけるプローブの配置に依存して観察された。
【０２０６】
【表１】
2018091866.tif 000007
【０２０７】
この実験は、ＳＨＧを使用して、支持脂質二重層へとテザリングされたＲａｓタンパク質の構造のコンフォメーション変化を誘導することが可能な低分子化合物を同定しうることを裏付ける。
【０２０８】
本発明について純粋に例示的であることを意図するものであり、したがって、いかなる形でも本発明を限定するとは考えられないものとする本実施例もまた、上記で論じた本発明の態様および実施形態について記載し詳述する。前出の実施例および詳細な記載は、例示として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、および特許は、各個別の刊行物、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指し示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で引用される全ての刊行物は、本発明との関連で使用されうる組成物および方法について記載および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。理解の明確さのための例示および例を目的として、先行の発明をある程度詳細に記載したが、本発明の教示に照らして、当業者には、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明に対する特定の変更および改変を施しうることがたやすく明らかとなろう。
【０２０９】
参考文献
【表３−１】
2018091866.tif 000008
【表３−２】
2018091866.tif 000009
【図１】
2018091866.tif 000010
【図２】
2018091866.tif 000011
【図３】
2018091866.tif 000012
【図４Ａ】
2018091866.tif 000013
【図４Ｂ】
2018091866.tif 000014
【図５Ａ】
2018091866.tif 000015
【図５Ｂ】
2018091866.tif 000016