(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚内部の線維構造の状態を正確に把握し、皮膚内部構造を正しく評価すること。【解決手段】皮膚組織透明化と免疫蛍光染色法を組み合わせることにより得られる皮膚内部構造の三次元画像を画像解析し、皮膚組織内のフィブリリン構造を数値化することを特徴とする皮膚内部構造評価方法。フィブリリン構造の長さ、径、直線性のいずれか１以上を数値化することを特徴とする皮膚内部構造評価方法。数値化された値を、皮膚線維の老化度の指標とすることを特徴とする皮膚内部構造評価方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚組織透明化と免疫蛍光染色法を組み合わせることにより得られる皮膚内部構造の三次元画像を画像解析し、皮膚組織内のフィブリリン構造を数値化することを特徴とする皮膚内部構造評価方法。
【請求項２】
前記フィブリリン構造の長さ、径、直線性のいずれか１以上を数値化することを特徴とする請求項１に記載の皮膚内部構造評価方法。
【請求項３】
前記数値化された値を、皮膚線維の老化度の指標とすることを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚内部構造評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚内部構造の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚内部の線維構造は、皮膚弾力性に大きく関わっている。皮膚内部の線維構造を評価する方法として、ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点レーザー顕微鏡で評価する方法、免疫染色した皮膚組織の切片を光学顕微鏡で評価する方法、電子顕微鏡で評価する方法が用いられている。しかし、これらの手法では、皮膚内部の線維構造を三次元的かつタンパク特異的に評価することは困難である。
【０００３】
特許文献１には、組織を透明化し、蛍光標識し、蛍光顕微鏡などで観察する方法が記載されている。特許文献１には、皮膚、皮下組織を対象臓器とすることは記載されているが、観察した結果を解析・評価する手法については何ら開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１１５２０６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、皮膚内部の線維構造の状態を正確に把握し、皮膚内部構造を正しく評価することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、蛍光標識し、透明化した皮膚組織により皮膚内部の線維構造を三次元的かつタンパク特異的に観察することができ、フィブリリン構造により皮膚内部構造を正確に評価できることを見出してなされたものである。
【０００７】
本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．皮膚組織透明化と免疫蛍光染色法を組み合わせることにより得られる皮膚内部構造の三次元画像を画像解析し、皮膚組織内のフィブリリン構造を数値化することを特徴とする皮膚内部構造評価方法。
２．前記フィブリリン構造の長さ、径、直線性のいずれか１以上を数値化することを特徴とする１．に記載の皮膚内部構造評価方法。
３．前記数値化された値を、皮膚線維の老化度の指標とすることを特徴とする１．または２．に記載の皮膚内部構造評価方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の皮膚内部構造評価方法は、皮膚組織透明化と免疫蛍光染色法を組み合わせることにより、皮膚内部の線維構造を三次元的かつタンパク特異的に観察することができる。皮膚真皮内部の線維構造としては、膠原線維、弾性線維が知られ、膠原線維は、Ｉ型コラーゲンを主成分とし、弾性線維は、骨格線維としてのマイクロフィブリル、フィブリリン、均質物質としてエラスチンから構成され、さらに細胞外基質として、フィブロネクチンなどの糖タンパクやプロテオグリカンを主成分とする基質が存在する。これらの中で、フィブリリン構造を画像処理、数値化して得られる変数により、皮膚内部構造を正しく評価することができる。フィブリリン構造は、長さ、径、直線性について、年齢による差異が認められるため、フィブリリン構造を老化度、肌年齢の指標とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】２０代女性から採取した検体の皮膚内部構造の三次元画像。
【図２】６０代女性から採取した検体の皮膚内部構造の三次元画像。
【図３】フィブリリン構造の解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、皮膚組織透明化と免疫蛍光染色法を組み合わせることにより得られる皮膚内部構造の三次元画像を画像解析し、皮膚組織内のフィブリリン構造を数値化し、この数値に基づいて皮膚内部構造を評価する方法に関する。
【００１１】
皮膚組織は、表面から順に表皮、真皮、皮下組織により構成される。真皮は、柔軟性と弾性に富んだ組織であり、場所によって異なるが１〜２ｍｍの厚さを有する。真皮は、主に細胞と細胞外マトリックス（線維と基質）とから構成される。細胞外マトリックスの主成分は膠原線維であり、その他に弾性線維、フィブロネクチンなどの糖タンパクやプロテオグリカンを主成分とする基質等が含まれる。
【００１２】
フィブリリンは、弾性繊維の骨格を形成するタンパク質であり、弾性繊維の構造を形成する。
本発明の皮膚内部構造評価方法は、フィブリリン構造を数値化して得られる変数により、皮膚内部構造を評価することを特徴とする。
【００１３】
＜タンパク特異的蛍光染色＞
皮膚組織内部の線維構造を特異的に可視化する手法として、皮膚弾力性線維を構成するタンパク質であるフィブリリンを抗原特異的に結合する１次抗体および１次抗体と結合し蛍光ラベル化された２次抗体を用い、抗原抗体反応による免疫蛍光染色法を用いる。
【００１４】
＜皮膚組織の透明化＞
通常、皮膚組織は、メラニンや血液中の赤色色素を代表とする色素や脂質による吸光や組織表面および内部での散乱が発生するため、光が深部まで透過せず、皮膚内部構造の三次元的蛍光画像を取得することは困難である。そこで、光を皮膚深部まで透過させるため、透明化試薬を用いて、これらの生体色素の脱色、脂質の除去、および屈折率の均一化を行うことにより光の透過性を向上させ、皮膚組織内部の線維構造の三次元画像を取得する。
【００１５】
＜蛍光染色された組織の評価方法＞
皮膚内部の三次元画像について、画像解析ソフトウェアを用いて、２値化及び細線化処理を行い、フィブリリン構造の長さ、径、直線性を数値化し、得られた変数により皮膚内部構造を評価する。
【実施例】
【００１６】
＜検体＞
２０代女性３名（２３、２４、２８歳）、６０代女性３名（６１、６１、６４歳）の腹部皮膚を採取し、検体とした。
検体のサイズは表皮面積がタテ約１０ｍｍ、ヨコ約１０ｍｍで、厚さは約１ｍｍである。
【００１７】
＜真皮内の蛍光染色＞
エラスチン抗体、フィブリリン−１抗体を含む水溶液に検体を浸漬して、タンパク特異的に標識した後、Ａｌｅｘａ４８８、５９４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２次抗体として蛍光標識した。さらに各種細胞の位置を認識するため、蛍光プローブＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、細胞核の染色を行った。
【００１８】
＜皮膚組織の透明化＞
組織抗体染色した後、Ｒａｐｉ  ｃｌｅａｒ  １．４９（ＳｕｎＪｉｎ  Ｌａｂ社）に検体を約３０分間浸漬して組織透明化を行った。
【００１９】
＜画像取得＞
線維構造を構成するタンパク質を蛍光染色し、皮膚組織の透明化をした検体を超解像型共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ−７００（ＺＥＩＳＳ社製）で観察して、三次元画像を取得した。観察方向は皮膚側面を対物レンズに垂直となるよう設置し、組織側面から、深さ７０μｍ深部まで撮像した。なお、撮像部位を統一するため、画像取得の範囲はタテ３００μｍ、ヨコ３００μｍとし、表皮の上部に約２０μｍの空白の画像取得領域を設けた。すなわち、表皮から真皮方向に向けて約２８０μｍの範囲が画像取得の範囲に含まれるようにした。
励起光は、４０５、４８８、５９４ｎｍのレーザー光を用い、それぞれ４２５〜４７５ｎｍ、５００〜５３０ｎｍ、６０５〜６４５ｎｍの蛍光を検出した。励起光４０５ｎｍ、検出光４２５〜４７５ｎｍで細胞核が検出できる。励起光４８８ｎｍ、検出光５００〜５３０ｎｍでエラスチンが検出できる。励起光５９４ｎｍ、検出光６０５〜６４５ｎｍでフィブリリン−１が検出できる。励起光５９４ｎｍ、検出光６０５〜６４５ｎｍでフィブリリン−１を検出した２３歳女性、６４歳女性の皮膚内部構造の三次元画像を、それぞれ図１、２に示す。
【００２０】
＜画像解析＞
得られた画像に対し、画像解析ソフトウェアＩｍａｒｉｓ（ＺＥＩＳＳ社製）を用いて２値化及び細線化処理を行い以下の解析変数を数値化した。
長さ
定義：１画像内における細線化した線維の長さの総和
径
定義：１画像内における線維の半径の平均値
直線性
定義：線維始点と線維末端との間の直線距離／細線化した線維の長さ
【００２１】
＜解析結果＞
フィブリリン構造の長さ、径、直線性に年代差が認められた。結果を図３に示す。２０代の皮膚組織のフィブリリン構造は、６０代と比べて、長く、細く、直線性が高かった。一方、フィブリリン構造の分岐の角度、体積、表面積、数、分岐の数についても画像解析ソフトウェアを用いて数値化したところ、これらについては、年代差は認められなかった。
【００２２】
＜まとめ＞
フィブリリン構造の長さ、径、直線性は、年齢による差異が認められ、これらの値が皮膚内部構造の評価に有用であることが確かめられた。フィブリリン構造の長さ、径、直線性を数値化して得られた値は、肌年齢、老化度等の指標とすることができる。また、皮膚内部構造を正確に評価することにより、個人ごとに適したスキンケアを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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