(57)【要約】【課題】ＮＡＥ阻害物質に対する応答のバイオマーカーを提供すること。【解決手段】本明細書により、その変異状態が、ＮＡＥ阻害物質での治療に対する感受性と関連するマーカーが開示される。変異状態は、当該マーカー遺伝子と関連するマーカーの特性を測定することにより決定される。ＮＡＥ阻害治療に対する応答を予測するためのマーカー遺伝子のマーカーを分析するための組成物および方法が、提示される。患者試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特性を測定するための試薬を含有するキットであって、ここで、少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する前記少なくとも１つのマーカーは、カリンリングリガーゼの活性との関連性を有する腫瘍抑制物質である、キットもまた提供される。【選択図】図１
2018050634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１０月２８日に出願された、米国仮特許出願第６１／５５２，６８６号の優先権を主張する。前述の出願は、参照により、その内容全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願には、電子的に読み取り可能な形式で本明細書と共に提出される配列表が含有される。当該配列表ファイルは、２０１２年１０月２６日に作成され、「sequencelisting.txt」という名称で、サイズは１４９ｋｂ（１５３，０８８バイト）である。sequencelisting.txtファイル中にある配列表の内容全体が、参照により、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
細胞は、正常な組織環境の制約に支配されない、制御不能の増殖が起こるように、それらの細胞の遺伝子型または表現型が変化したとき、癌性細胞となる。１つ以上の遺伝子が、変異される、増幅される、欠損となる、過剰発現される、または低発現となる。染色体の部分が、失われ、またはある位置から他の位置へと移動しうる。一部の癌には、遺伝子型または表現型の変化の特徴的なパターンがある。
【０００４】
多くの遺伝子は、癌と関連する変異を有している。いくつかの遺伝子は、変異が発生する部位を複数、有している。多くの癌は、２つ以上の遺伝子の発現の変異および／または誤発現を有している。遺伝子変異により、腫瘍の進行、腫瘍の増殖率、または腫瘍の転移が促進される。いくつかの変異は、腫瘍細胞が治療に応答するか否かに影響しうる。
【０００５】
様々な薬剤により癌が治療される。血液および骨髄の癌は、多くの場合、ステロイド／グルココルチコイド、免疫調節薬、プロテアソーム阻害剤およびアルキル化剤で治療される。他の組織の癌は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、微小管阻害剤、血管新生阻害剤または他の剤により治療されることが多い。一部の患者は、１つの治療に対し、他の治療よりも良く反応する。このことから、ある患者にとっては、複合的な治療剤投与を受け、効果的な治療へとたどり着ける可能性がある。患者の治療プログラム初期の貴重な時間が、その患者にとって有効ではないと最終的には判明する治療を行うために、失われてしまうことがある。多くの患者にとって、治療内容選択の試行錯誤を行う時間の余裕はない。適切で、正確な治療内容の決定が、疾患の効果的な管理につながる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、本明細書に提供されるマーカーの量、存在または変化を測定することによる、腫瘍の予後診断および腫瘍の治療計画策定に関する。本マーカーは、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害剤による治療の後、好適な結果（たとえば、好適な治療応答、長期の無増悪期間および／または長期生存率等）が得られるかどうかを予測する。腫瘍細胞を含有する試料を、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験して、遺伝的マーカーの存在、量または変化（たとえば、少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態等）を測定することにより、たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質での治療で好適な結果が得られると期待される、および、標準的な、または積極的ではない治療によって疾患状態が管理されうる特定患者の特定、ならびに、治療により好ましくない結果となることが予期され、好適な結果および／または有効な疾患管理を得ることができるように、代替的な治療法や治療の組み合わせ、および／または、ＮＡＥ阻害物質でのより積極的な治療を必要とする特定患者を特定する。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、マーカーの特性（たとえば、量、存在または変化）の測定に有用なキットを提供する。他の態様において、本発明は、予後診断および治療または疾患管理戦略の決定方法を提供する。これらの態様において、たとえば、腫瘍細胞を含有する試料中のマーカーのサイズ、配列、組成または量等の特性が測定される。１つの実施形態において、腫瘍は液体（たとえば、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群または多発性骨髄腫等の血液系腫瘍）である。他の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍（たとえば、メラノーマ、非小細胞性肺癌、食道癌、膀胱癌、神経芽細胞腫、中皮腫、膵臓がん等）である。
【０００８】
様々な実施形態において、たとえば、ＤＮＡのサイズ、配列、組成もしくは量、および／または、ＲＮＡのサイズ、配列、組成もしくは量、および／または、１つ以上の変異（たとえば、本明細書に記述される体細胞変異）を伴うマーカー遺伝子に対応するタンパク質のサイズ、配列、組成もしくは量が、測定される。アッセイにより、たとえば、遺伝子が変異しているかどうか、変異の実体、および／または、変異遺伝子（複数含む）のＲＮＡもしくはタンパク質の量から過剰発現または発現減少が示唆されるかどうか等の、マーカー遺伝子に関する情報が明らかにされる場合、予後診断または治療または疾患管理戦略につながる有用な情報が得られる。１つの実施形態において、戦略は、Ｅ１酵素阻害（たとえば、ＭＬＮ４９２４等のＮＡＥ阻害療法）に対して決定される。
【０００９】
予後診断または治療または疾患管理戦略策定の検証に有用なマーカー遺伝子は、ニューロフィブロミン２（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍｉｎ  ２，ＮＦ２）、ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ４（ＳＭＡＤ４）、リシン特異的デメチラーゼ６Ａ（ｌｙｓｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ６Ａ、ＫＤＭ６Ａ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ５３、ＴＰ５３）、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質２Ａ  ｐ１４変異体（ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４）、一部の例においては、Ｆ−ｂｏｘ  ａｎｄ  ＷＤ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ７  （ＦＢＸＷ７）および、一部の例においては、腺腫様多発結腸ポリープ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ、ＡＰＣ）からなる群から選択される。各マーカー遺伝子は、そのＤＮＡにおける存在、または、マーカーＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の特性（たとえば、量、サイズ、配列もしくは組成）へのその影響によって、予後診断または治療または治療管理の策定に対する情報を提供できるような変異または変化を含む。いくつかの実施形態において、マーカーとして有用な遺伝子またはそれらの変異体または改変体は、正常なＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質とは異なるＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の特性（たとえば、腫瘍細胞を含有する試料中のサイズ、配列、組成または量）を有している。本明細書において、これら「マーカー遺伝子」と呼称される遺伝子の改変の例を記載し、その変異または量は、前記情報を提供することができる。
【００１０】
本発明のマーカーの変異により、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質での治療後の結果に関する情報が提供される。たとえば、腫瘍中の１つ以上の特定マーカーの特性（サイズ、配列、組成または量等）を検証することにより、どの治療剤、薬剤の組み合わせ、投薬および／または投与レジメンが、治療で好ましい結果を得られると期待できるかを決定することが可能となる。また、たとえば、癌中の特定マーカーもしくはマーカーセットの１つ以上の特性（サイズ、配列、組成または量等）を検証することにより、どの治療剤、治療剤の組み合わせ、投薬および／または投与レジメンが、治療で好ましい結果を得る可能性が少ないかを決定することもできる。たとえば、特定マーカーの１つ以上の特性（サイズ、配列、組成または量）を検証することによって、効果の無い、もしくは不適切な治療剤または投与レジメンを排除することができる。重要なことは、これらの決定は、患者ごとに行うことができるということである。ゆえに、特定の治療レジメンが、特定の患者もしくは患者のタイプに有益でありそうかどうか、および／または、特定の投与レジメンを開始すべきか、もしくは回避すべきか、継続するべきか、中断するべきか変更するべきかを決定することができる。
【００１１】
本発明は、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩治療等のＮＡＥ阻害物質を含む治療レジメンを受けることで好ましい結果を示すことが期待される癌患者を特定および／または選択する方法を目的とするものである。さらに、そのような治療レジメンを受けることで好ましくない結果となることが予期される患者を特定する方法も提供される。典型的には、これらの方法には、患者腫瘍（たとえば、血液がん細胞または固形腫瘍細胞等の患者の癌細胞）中の１つ以上のマーカーの特性（たとえば、サイズ、配列、組成もしくは量）、またはマーカー遺伝子（複数含む）の変異についての情報を計測、決定、受信、記憶または転送することが含まれ、任意選択的に、その特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）を基準マーカーのそれと比較することが含まれ、および、さらなる実施形態においては、試料から得た結果が、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質治療レジメンの好ましい結果に相当するかどうかを特定またはアドバイスすることが含まれる。
【００１２】
さらに、提供される方法は、マーカー遺伝子中の変異の存在または、患者のマーカー（複数含む）の特性（サイズ、配列、組成または量）が、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質治療レジメン等の治療で、その患者は好ましい結果を示すと期待されることが示唆されている場合に、治療に着手、継続または開始するステップをさらに含む治療法を含む。当該方法は、マーカー遺伝子中の変異の存在または、患者マーカーの特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）が、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法等の治療で、同様の治療レジメンを受けて良好な結果になると特定されている患者と比較し、その患者が好ましくない結果を示すと予期されることが示唆されている場合に、治療を中止、中断、変更または休止するステップをさらに含む治療法を含む。他の態様において、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法等の療法でまだ治療されていない患者の分析方法、および、本明細書に記述されるマーカー遺伝子の変異、または患者のマーカーの１つ以上の特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）に基づき、治療結果を特定および予測する方法が提供される。そのような方法には、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法で治療されないこと、ＮＡＥ阻害物質等の療法で治療されること、または、１つ以上の追加の療法との組み合わせで、１−置換メチルスルファミン酸塩療法で治療されること、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質に対する代替療法で治療されること、または、たとえば１−置換メチルスルファミン酸等の標準的なＮＡＥ阻害物質療法で好ましい結果が得られると特定されている患者の投薬および／もしくは投与レジメンと比較して、たとえばＮＡＥ阻害物質等のＥ１酵素阻害剤の療法で、より積極的な投薬および／または投与レジメンで治療されること、を含めることができる。ゆえに、本発明で提供される方法により、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法等の療法の不適切な、または効果の無い使用を排除することができる。
【００１３】
さらなる方法として、剤の活性、剤の有効性を測定する方法、または、新しい治療剤もしくは組み合わせを特定する方法が挙げられる。そのような方法として、たとえば血液のがん（たとえば、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫等）、固形腫瘍癌（たとえば、メラノーマ、食道がん、膀胱癌）等の癌を治療することを目的として、本発明のマーカー遺伝子の変異の存在、またはマーカー（複数含む）の特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）に影響を与えうるその活性に基づき、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質として有用な剤を特定する方法を含むことができる。例えば、癌を有する患者に良い結果をもたらすことを示す様式で提供される、マーカー遺伝子の変異の存在、もしくはマーカー（複数含む）の特性（サイズ、配列、組成または量等）を減少または増加させる阻害物質は、その癌に対する薬剤候補となるであろう。あるいは、好ましくない結果を示唆するマーカーを含有する腫瘍細胞の活性を減少させることが出来る剤も、癌に対する薬剤候補となるであろう。
【００１４】
本発明はまた、たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩のＮＡＥ阻害物質治療レジメン等の治療レジメン（たとえば、単独で、または化療法剤等の追加の剤（たとえば、グルココルチコイド剤、プロテアソーム阻害剤、アルキル化剤、キナーゼ阻害剤、またはトポイソメラーゼ阻害剤）との組み合わせ）で癌患者を治療する方法を目的とするものであり、当該方法には、マーカー特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）が、治療レジメンで良い結果がもたらされると期待される患者であることを示す患者を治療するための選択ステップ、および、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩のＮＡＥ阻害物質療法等の療法で患者を治療するステップが含まれる。いくつかの実施形態において、当該方法には、マーカー特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量（複数含む））が、好ましい結果を得ると期待される患者であることを示唆する患者を選択するステップ、および、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法と同様の期待生存期間を示す、ＮＡＥ阻害物質療法以外の療法を投与すること、を含めることができる。
【００１５】
癌患者を治療するさらなる方法には、癌療法（たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法等）での治療で好ましい結果を得られそうにない患者を選択することが含まれる。そのような方法にはさらに、標準療法で好ましい結果を得ると特定された患者の投与量または投薬スケジュールと比較して、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質等の療法を、投薬量を増加させたスケジュールで、または高用量で投与すること；１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法以外の癌療法を投与すること；追加の剤との組み合わせで、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩剤等のＮＡＥ阻害物質を投与すること、のうちの１つ以上を含めることができる。さらに、より急速に進行および死亡すると予期される進行性疾患を有する患者の選択方法が提供される。
【００１６】
さらなる方法には、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質治療レジメン等の癌治療に対する結果の指標に対する患者のマーカー（複数含む）の量を考察することにより、血液系の癌（たとえは、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫等）、固形腫瘍癌（たとえば、メラノーマ、食道癌、膀胱癌）等の癌を治療するか、それとも治療に対する支払を行うかどうかを評価すること、および支払をするべきかどうかについて決定またはアドバイスをすることを含めることができる。
【００１７】
本明細書において言及される全ての公表文献、特許出願、特許および他の参照文献の内容全体が、参照により援用される。
【００１８】
本発明の他の特性および利点が、以下の詳細な記述、図面および請求項から明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
患者を、ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害物質で治療するかどうかを決定する方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含有する患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子と関連する、少なくとも１つのマーカーの、少なくとも１つの特性を計測すること、
ｂ）ステップａ）で計測された少なくとも１つの特性が、ＮＡＥ阻害物質を用いる治療での結果に対し有益であるかどうかを特定すること、および、
ｃ）もし有益な特性が、ＮＡＥ阻害物質療法に対する好ましい結果を示唆する変異状態を有するマーカー遺伝子を少なくとも１つ、腫瘍細胞が含有すると示唆する場合、ＮＡＥ阻害物質で患者を治療することを決定すること、
を含む方法であって、ここで、少なくとも１つのマーカー遺伝子が、カリンリングリガーゼの活性との関連性を有する腫瘍抑制物質である、方法。
（項目２）
前記特性の少なくとも１つは、サイズ、配列、組成および量からなる群から選択される、項目１の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態は、変異である、項目１の方法。
（項目４）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態が、野生型である、項目１の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子は、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記マーカー遺伝子における変異は、不活化変異である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記マーカー遺伝子は、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つのマーカーが、前記マーカー遺伝子に対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記患者試料が、血液系腫瘍細胞を含有する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記患者試料が、固形腫瘍細胞を含有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つのマーカーが、少なくとも２つのマーカーである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、少なくとも２つのマーカー遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、ＣＤＫＮ２ＡまたはＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４である、項目３に記載の方法。
（項目１４）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子がＴＰ５３である、項目４に記載の方法。
（項目１５）
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子がＴＰ５３およびＡＰＣである、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも１つの特性が、少なくとも１つのマーカーの配列である、項目２に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つのマーカーが、核酸である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡまたは任意の前記のものの任意の部分からなる群から選択され、ここで、前記部分は、少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部分に対応する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ＮＡＥ阻害物質が、（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−４−｛４−［（１Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イルアミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−ヒドロキシシクロペンチル）メチルスルファミン酸塩である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
患者に癌のＮＡＥ阻害物質療法を継続するか否かを決定する方法であって、
ａ）患者由来の腫瘍細胞を含有する第一の生物試料、および患者由来の腫瘍細胞を含有する第二の生物試料を得ることであって、ここで、第一の試料は、第二の試料の前に得て、患者は第二の試料採取の前にＮＡＥ阻害物質で治療される、得ること、
ｂ）前記２つの試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特性を測定すること、
ｃ）ｂ）での測定結果を比較すること、および、
ｄ）前記比較により、第二の試料中の前記腫瘍細胞が、好ましい結果を示す変異状態を有するマーカー遺伝子を少なくとも１つ含有すると示される場合、ＮＡＥ阻害物質での治療を継続することを決定すること、
を含み、ここで、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、カリンリングリガーゼの活性との関連性を有する腫瘍抑制物質である、方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つの特性が、サイズ、配列、組成および量からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態が、変異である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態が、野生型である、項目２０の方法。
（項目２４）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子は、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つのマーカー遺伝子と対応する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記患者試料が、血液系腫瘍細胞を含有する、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記患者試料が、固形腫瘍細胞を含有する、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記少なくとも１つのマーカーが、少なくとも２つのマーカーである、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、少なくとも２つのマーカー遺伝子である、項目２０に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの特性が、少なくとも１つのマーカーの配列である、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つのマーカーが、核酸である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡまたは任意の前記のものの任意の部分からなる群から選択され、ここで、前記部分は、少なくとも１つのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異部分に対応する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＮＡＥ阻害物質が、（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−４−｛４−［（１Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イルアミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−ヒドロキシシクロペンチル）メチルスルファミン酸塩である、項目２０に記載の方法。
（項目３４）
患者試料中の少なくとも１つのマーカーの少なくとも１つの特性を測定するための試薬を含有するキットであって、ここで、少なくとも１つのマーカー遺伝子に対応する前記少なくとも１つのマーカーは、カリンリングリガーゼの活性との関連性を有する腫瘍抑制物質である、キット。
（項目３５）
前記少なくとも１つの特性が、サイズ、配列、組成および量からなる群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
前記少なくとも１つのマーカーが、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子と関連する核酸およびタンパク質からなる群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３７）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３８）
前記試料に添加する安定化剤をさらに含有する、項目３４に記載のキット。
（項目３９）
前記少なくとも１つのマーカーが、核酸であり、前記試薬が、少なくとも１つのプライマーである、項目３６に記載のキット。
（項目４０）
前記少なくとも１つのプライマーが、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５または染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９の配列、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０、および、前述の任意のものの相補物からなる群から選択される核酸配列とハイブリダイズする、項目３９に記載のキット。
（項目４１）
第二のプライマーをさらに含有する、項目３９に記載のキット。
（項目４２）
プローブをさらに含有する、項目３９に記載のキット。
（項目４３）
血液系腫瘍細胞を含有する前記患者試料が、血液である、項目９に記載の方法。
（項目４４）
前記患者試料の腫瘍細胞を富化することをさらに含有する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ＮＡＥ阻害物質として化合物を特定する方法であって、
ａ）少なくとも１つのマーカー遺伝子を含有する細胞を、検証化合物と接触させること、ｂ）前記細胞の増殖または生存能力への検証化合物の効果を測定すること、
を含み、
ここで、前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、その変異状態がＮＡＥ阻害物質での治療の結果と関連し、カリンリングリガーゼの活性と関連性を有する腫瘍抑制物質であり、および、
ここで、前記細胞の増殖または生存能力が減少する場合、前記検証化合物が、ＮＡＥ阻害物質である、方法。
（項目４６）
前記マーカー遺伝子の前記変異状態が、変異である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記マーカー遺伝子の変異状態が、野生型である、項目４５の方法。
（項目４８）
ＮＡＥ阻害物質での癌治療に対し支払を行うための方法であって、
ａ）腫瘍細胞を含有する患者試料中の少なくとも１つのマーカー遺伝子の変異状態を記録すること、および、
ｂ）前記変異状態より、好ましい結果が示唆される場合、前記ＮＡＥ阻害物質治療の支払いを許可すること、
を含む、方法。
（項目４９）
前記マーカー遺伝子の前記変異状態が、変異である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記マーカー遺伝子の変異状態が、野生型である、項目４８の方法。
（項目５１）
前記少なくとも１つのマーカー遺伝子が、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】１−置換メチルスルファミン酸塩の概略構造である。Ｇ１は、−Ｏ−または、−ＣＨ２−であり、Ｇ２は、−Ｈまたは−ＯＨであり、Ｇ３は、−Ｈまたは−ＯＨであり、Ｇ４は、−ＮＨ−、−Ｏ−または共有結合であり、Ｇ５は、置換ヘテロアリールである。
【図２】タンパク質基質のカリン−リング（ｃｕｌｌｉｎ−ｒｉｎｇ）リガーゼ（ＣＲＬ）ユビキチン化およびＮＥＤＤ化の一般的な経路である。ＣＲＬでは、カリンサブユニットは、ユビキチン様タンパク質ＮＥＤＤ８により保存リジン上で改変され、ホロ酵素活性を活性化させる。ＮＥＤＤ８活性およびカリンタンパク質への結合は、ＮＥＤＤ８のＥ１（ＮＡＥ）およびＥ２（Ｕｂｃ１２）を含むユビキチン化と相同である酵素カスケードを介して触媒される。カリンからＮＥＤＤ８の除去は、ＣＯＰ９シグナロソームにより触媒される。脱ＮＥＤＤ化により、ＣＲＬ構成要素の解離が促進される。カリン−リングコアは、新たなＣＲＬを形成するために動員されるまで、ＣＡＮＤ１への結合により不活性状態で隔離される。
【図３】ＭＬＮ４９２４に対する細胞株パネル２の応答である。各点は、１つの細胞株を表している。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、細胞株パネルのＭＬＮ４９２４への応答の比較を示す。Ａ．ＥＣ５０による細胞株パネル２の順序付け。黒い線は、パネル１の細胞株を表す。両パネルには、同一の名称の細胞株が１１４ある。Ｂ．両パネルに存在する細胞株に対する、対照の生存率のパーセント比較（ＰＯＣ）である。重複細胞株の結果は、０．７２（ｐ値＜２．２ｅ−１６）のスピアマンの順位相関を有している。
【図５】ＴＰ５３変異を伴う抵抗性の組織関連性。ＴＰ５３変異大腸癌細胞株は、ＴＰ５３野生型細胞株よりも、ＭＬＮ４９２４処置に対してより抵抗性である（対照生存率がより高いパーセント）。
【図６−１】図６Ａ〜Ｄは、複数時点での、異なる投与量のＭＬＮ４９２４での治療後の癌細胞株の生存率に対するＴＰ５３喪失の効果。対ＨＣＴ−１１６大腸癌細胞株のＭＬＮ４９２４に対する感度における、ＴＰ５３ノックアウトの効果を、ＭＬＮ４９２４の様々な濃度および時点にわたって、ＡＴＰｌｉｔｅにより測定した。データを、平均±標準誤差、Ｎ＝３で表す。点線はｐ５３ノックアウトであり、実線は、ｐ５３野生型である。
【図６−２】図６Ａ〜Ｄは、複数時点での、異なる投与量のＭＬＮ４９２４での治療後の癌細胞株の生存率に対するＴＰ５３喪失の効果。対ＨＣＴ−１１６大腸癌細胞株のＭＬＮ４９２４に対する感度における、ＴＰ５３ノックアウトの効果を、ＭＬＮ４９２４の様々な濃度および時点にわたって、ＡＴＰｌｉｔｅにより測定した。データを、平均±標準誤差、Ｎ＝３で表す。点線はｐ５３ノックアウトであり、実線は、ｐ５３野生型である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
癌患者治療で継続している問題のうちの１つは、治療応答における個人差である。成功裏に癌治療開発が発展する一方で、一部の患者のみが、任意の特定の療法に対し応答する。治療係数が低く、多くの利用可能な癌治療には潜在的な毒性があるため、そのような個人差により、患者に、不必要で効果の無い、あまつさえ有害である可能性のある治療レジメンを受けさせている可能性がある。個々人の患者を治療するためにデザイン療法を最適化することができれば、そのような状況は減少され、または無くすことができる可能性がある。さらに、標的を定めて設計された療法により、より焦点を当てた、全体として思い通りの患者の治療を提供しうる。ゆえに、特定の癌療法を投与された際に好ましい結果を得られると期待される特定の癌患者、ならびに、より積極的な癌療法および／または代替的な癌療法（たとえば、その患者に投与されていた従前の癌療法に代わるもの）により好ましい結果を得る可能性のある特定のがん患者を特定する必要性がある。それゆえ、特定の癌阻害療法で利益を得る、ならびに、より積極的な癌阻害療法および／または代替的な癌阻害療法（たとえば、その患者が受けていた癌療法または治療に代わるもの）により利益を得る癌患者（たとえば、血液のがん患者（多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫等）、固形腫瘍癌（たとえば、メラノーマ、食道癌または膀胱癌））の診断、病期分類、予後診断およびモニターを提供することは有益であり、適切な予防手段をもたらすこととなる。
【００２１】
本発明は、部分的には、変異遺伝子を含有する細胞のＮＡＥ阻害物質（たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩））に対する感受性と、マーカー遺伝子の変異が関連しうるという認識に基づいている。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子はカリンリングリガーゼ（ＣＲＬ）経路に関与しており、たとえば、それがコードしているタンパク質は、ＣＲＬもしくはＣＲＬ関連タンパク質と相互作用するか、ＣＲＬの基質である。マーカー遺伝子にコードされるタンパク質は、腫瘍抑制物質としての野生型の機能を有しうる。マーカー遺伝子の例としては、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４および／またはＫＤＭ６Ａが挙げられる。他のマーカー遺伝子の例としては、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａおよび／またはＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４が挙げられる。マーカー遺伝子は、体細胞変異等の変異を示し、その存在によりコードされる遺伝子産物の発現または活性が影響され得る。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子中に２つ以上の変異、または腫瘍細胞もしくは腫瘍に変異を有する２つ以上のマーカー遺伝子があっても良い。さらなる実施形態において、腫瘍形成をもたらすことができる変異を含む、追加の遺伝子変異を有する細胞に、マーカーの遺伝子変異があっても良いが、追加の変異遺伝子は、本明細書においてマーカー遺伝子とみなされるものではなくとも良い。いくつかの実施形態において、変異は、不活性化変異である。他の実施形態において、変異は、マーカー遺伝子の発現に影響を及ぼす。他の実施形態において、変異は、コード遺伝子産物と細胞での結合パートナーの相互作用の変化をもたらしうる。マーカー遺伝子中の変異の特定および／または測定を用いて、腫瘍の治療（たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質での治療）により好ましい結果が期待できるかどうか、または、代替的な治療および／もしくはより積極的な治療（たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩阻害物質等のＮＡＥ阻害物質での治療）により、予測生存期間の延長が期待されるかどうかを、決定することができる。たとえば、本明細書に提供される組成物および方法を用いて、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩療法剤等のＮＡＥ阻害物質、または１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質の投薬もしくは投与レジメン等で、好ましい結果が得られると期待される患者であるかどうかを、決定することができる。概して、本明細書に記述される腫瘍抑制マーカー遺伝子中の変異は、ＮＡＥ阻害物質での治療に対する感度、またはその好ましい結果と関連している。カリンリングリガーゼに関連した経路で腫瘍抑制物質として機能し、その変異がＮＡＥ阻害物質に対する感度と関連しているマーカー遺伝子の例としては、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＣＤＫＮ２Ａおよび／またはＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４が挙げられる。しかしながら、ＴＰ５３およびＡＰＣもまた、腫瘍抑制マーカー遺伝子である。特に、ＴＰ５３経路の遺伝子は、ＮＡＥ阻害物質の効果と関連している。本明細書に記述されるように、多くの腫瘍型に対するいくつかの実施形態において、ＴＰ５３の変異、およびいくつかの例においてはＡＰＣの変異は、ＮＡＥ阻害物質に対する抵抗性をもたらす。ゆえに、ＴＰ５３およびＡＰＣからなる群由来の野生型マーカー遺伝子は、ＮＡＥの感度と関連し得る。いくつかの実施形態において、ＴＰ５３およびＡＰＣからなる群から選択されるマーカー遺伝子の変異は、ＮＡＥ阻害物質に対する抵抗性と関連する。
【００２２】
これらの特定事項に基づき、本発明は、１）たとえば１−置換メチルスルファミン酸治療レジメン等のＮＡＥ阻害物質により好ましい結果が得られるような効果があるかどうか、および／または癌を管理できるほどの効果があるかどうかを決定するための方法および組成物、２）たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法（単剤または併剤）、およびその腫瘍治療のために用いられる投薬および投与の有効性をモニターするための方法および組成物、３）たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩阻害療法レジメン等のＮＡＥ阻害物質を含有する、腫瘍の治療のための方法および組成物、４）特定の治療剤および治療剤の組み合わせを特定するための方法および組成物、ならびに、特定の患者における腫瘍の治療に効果的な投薬および投与レジメン、ならびに、５）疾患管理戦略を特定するための方法および組成物、を提供するが、これらに限定されない。
【００２３】
ユビキチンおよび他のユビキチン様分子（Ｕｂｌ）は、ｕｂｌのＣ末端グリシンとのアシル−アデニレート中間体の形成を触媒する特定の酵素（Ｅ１酵素）により活性化される。活性化されたｕｂｌは、次いで、チオエステル結合中間体の形成を介して、Ｅ１酵素内の触媒システイン残基へと移送される。Ｅ１−ｕｂｌ中間体およびＥ２が会合し、チオエステル交換がもたらされ、ｕｂｌがＥ２の活性化システイン部位に移送される。次いで、ｕｂｌは、直接、またはＥ３リガーゼと連動して、標的タンパク質中のリジン側鎖のアミノ基とのイソペプチド結合形成を介し、標的タンパク質に結合される。Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ８（ＮＥＤＤ８）と名付けられたｕｂｌは、ヘテロ二量体ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ、ＡＰＰＢＰ１−ＵＢＡ３、ＵＢＥ１Ｃ（ユビキチン活性化酵素Ｅ１Ｃ）としてもまた知られる）により活性化され、２つのＥ２結合酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２（ＵＢＣ１２）およびＵＢＣ１７）のうちの１つに移送され、最終的に、ユビキチンリガーゼのカリン−リングサブタイプにより、カリンタンパク質へのＮＥＤＤ８のライゲーションがもたらされる（図２を参照のこと）。ＮＥＤＤ化の機能は、多くの細胞周期および細胞シグナル伝達タンパク質（ｐ２７およびＩ−κＢを含む）の代謝に関与するカリンベースのユビキチンリガーゼの活性化である。Pan  et  al.,  Oncogene  23:1985−97  (2004)を参照のこと。ＮＡＥの阻害により、カリン−リングリガーゼが介在するタンパク質の代謝が撹乱され、細胞（たとえば、腫瘍細胞または寄生体等の病原体の細胞）にアポトーシス死をもたらすことができる。Soucy  et  al.  (2010)  Genes  &  Cancer  1:708-716を参照のこと。
【００２４】
本明細書において、「Ｅ１」、「Ｅ１酵素」または「Ｅ１活性化酵素」という用語は、標的分子へのユビキチンまたはユビキチン様（集合的に、「ｕｂｌ」）の結合の活性化または促進に関与する関連ＡＴＰ依存性活性化酵素のファミリーの任意の１つを指す。Ｅ１活性化酵素は、トランスチオレート化反応を介して各Ｅ２結合酵素へと適切なｕｂｌを移送するアデニル化／チオエステル中間体形成を介して、機能する。得られた活性化ｕｂｌ−Ｅ２により、標的タンパク質へのｕｂｌの最終的な結合が促進される。細胞シグナル伝達、細胞周期、およびタンパク質代謝において機能する様々な細胞タンパク質は、Ｅ１活性化酵素（たとえば、ＮＡＥ、ＵＡＥ、ＳＡＥ）を介して制御されるｕｂｌ結合の基質である。文脈で別様に示されない限り、「Ｅ１酵素」という用語は、任意のＥ１活性化酵素タンパク質（ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ（ＡＰＰＢＰ１／Ｕｂａ３））、ユビキチン活性化酵素（ＵＡＥ（Ｕｂａ１））、ｓｕｍｏ活性化酵素（ＳＡＥ（Ａｏｓ１／Ｕｂａ２））、ＵＢＡ４、ＵＢＡ５、ＵＢＡ６、ＡＴＧ７またはＩＳＧ１５活性化酵素（Ｕｂｅ１Ｌ）を含むがこれらに限定されない）を指すものと意図される。
【００２５】
「Ｅ１酵素阻害物質」または「Ｅ１酵素の阻害物質」という用語は、Ｅ１酵素と相互作用し、その酵素活性を阻害することができる、本明細書に定義される構造を有する化合物を示すために用いられる。Ｅ１酵素活性の阻害とは、基質ペプチドまたはタンパク質へのユビキチン様（ｕｂｌ）結合を活性化するＥ１酵素の能力（たとえば、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、ＳＵＭＯ化）を減少させることを意味する。いくつかの実施形態において、Ｅ１酵素阻害物質は、２つ以上のＥ１酵素を阻害することができる。他の実施形態においては、Ｅ１酵素阻害物質は、特定のＥ１酵素に特異的である。様々な実施形態において、そのようなＥ１酵素活性の減少は、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％である。様々な実施形態において、Ｅ１酵素活性を減少させるために必要なＥ１酵素阻害物質の濃度は、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満である。
【００２６】
本明細書において、「ＮＡＥ阻害物質」という用語は、ＮＡＥヘテロ二量体の阻害物質を指す。ＮＡＥ阻害物質の例としては、ＭＬＮ４９２４を含む１−置換メチルスルファミン酸塩（図１を参照のこと）が挙げられる。Langston  S.らによる米国特許出願第１１／７００，６１４号（その国際出願は、ＷＯ０７／０９２２１３、ＷＯ０６０８４２８１およびＷＯ２００８／０１９１２４として公開され、前述の公開特許出願のそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に援用される）に、Ｅ１活性化酵素（たとえば、ＮＡＥ）の効果的な阻害物質である化合物が公開されている。いくつかの実施形態において、ＮＡＥ阻害物質は、他の（ＮＡＥではない）Ｅ１酵素を阻害しないか、またはほとんど阻害しない。当該化合物は、Ｅ１活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するのに有用であり、細胞増殖性疾患（たとえば、癌）およびＥ１活性に関連した他の疾患（たとえば、病原性感染症および神経変性疾患）の治療に有用である。Langstonらに開示された化合物の１種は、４−置換（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−{７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン−７−イル}シクロペンチル）メチルスルファミン酸塩類である。
【００２７】
ＭＬＮ４９２４（（（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−４−｛４−［（１Ｓ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イルアミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−ヒドロキシシクロペンチル）メチルスルファミン酸塩）は、ＮＡＥ特異的Ｅ１阻害物質であり、細胞タンパク質のホメオスタシスを摂動することにより、ヒト腫瘍細胞でアポトーシス死を誘導するカリン−リングリガーゼ介在性タンパク質代謝を撹乱する（Soucy  et  al.  (2009)  Nature  458:732-736）。細胞および腫瘍異種移植片研究におけるＭＬＮ４９２４の評価により、２つの明確に異なる機序が明らかとなっている。１つ目は、ＭＬＮ４９２４介在性ＣＲＬ１ＳＫＰ２およびＣＲＬ４ＤＤＢ１基質Ｃｄｔ−１の異常調節を介したＤＮＡ再複製、ＤＮＡ損傷および細胞死の誘導である（Milhollen  et  al.  (2011)  Cancer  Res.  71:3042-3051）。ｐ５３の状態は、ＤＮＡ再複製の誘導に影響を与えないが、適切な遺伝的背景に基づき、細胞をよりアポトーシスまたは老化に陥りやすくさせ得る（Milhollen  et  al.  (2011)  supra,  Lin  et  al.  (2010)  Nature  464:374-379および、Lin  et  al.  (2010)  Cancer  Res.70:10310-20）。２つ目の機序は、主にリン酸化ＩκＢαのＣＲＬ１βＴＲＣＰ介在性代謝の異常調節を介したＮＦ−κＢ依存性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫におけるＮＦ−κＢ経路活性化の阻害である（Milhollen  et  al.  (2010)  Blood  116:1515-1523）。さらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の前臨床モデルは、細胞株および患者の一次芽球の両方で、Ｃｄｔ−１異常調節、ＮＦ−κＢ阻害および活性酸素種の誘導に関連した機序を介し、ＭＬＮ４９２４阻害に対して感受性である（Swords  et  al.  (2010)  Blood  115:3796-3800）。
【００２８】
たとえばＮＦ２（Ahronowitz  et  al.  (2007)  Human  Mutation  28:1-2に概略がある）、ＫＤＭ６Ａ（van  Haaften  et  al.  (2009)  Nat.  Genet.  41:521-523に概略がある）、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４等の遺伝子は、多くの癌種で変異している。ＳＭＡＤ４は、多くの癌で変異しているが、ＳＭＡＤ４変異の多くは、腸管、膵臓（Miyaki  and  Kuroki  (2003)  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  306:799-804に概略がある）または甲状腺の癌で見いだされている。
【００２９】
本明細書において、「ＮＦ２」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０００２５９（配列番号３）をコードしているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００２６８（配列番号１、オープンリーディングフレームは、配列番号２、配列番号１の４４４〜２２３１ヌクレオチド）に関連した遺伝子のより長いアイソフォームを指す。ＮＦ２に対する他の名称としては、ＡＣＮ、ＢＡＮＦ、ＳＣＨおよびｍｅｒｌｉｎ（ｍｏｅｓｉｎ−ｅｚｒｉｎ−ｒａｄｉｘｉｎ様タンパク質）が挙げられる。ＮＦ２は、腫瘍抑制遺伝子として機能し、第２２染色体上で見いだされる。ＮＦ２は、細胞骨格、細胞表面タンパク質と相互作用し、細胞骨格の動力学およびイオン輸送の調節に関与している可能性がある。ＮＡＥ阻害（たとえば、ＭＬＮ４９２４）に対する感受性に関与するＮＦ２の機能には、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣＲＬ４ＤＣＡＦIを阻害する能力が挙げられる（Li  et  al.  (2010)  Cell  140:477-490）。ＮＦ２における変異は、その阻害活性を撹乱し、ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１基質の制御不能なユビキチン化およびその変異遺伝子を有する細胞の増殖をもたらす。
【００３０】
本明細書において、「ＳＭＡＤ４」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００５３５０（配列番号６）をコードしている、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５３５９（配列番号４、オープンリーディングフレームは配列番号５、配列番号４の５３９〜２１９７ヌクレオチド）に関連した遺伝子を指す。ＳＭＡＤ４に対する他の名称としては、ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｏｃｕｓ  ４（ＤＰＣ４）、ＪＩＰまたは、ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ，  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ，  ４（ＭＡＤ４）が挙げられる。ＳＭＡＤ４は、芽球分化成長因子（ＴＧＦ）βシグナル伝達に関与しているシグナル伝達タンパク質である。ＳＭＡＤ４は、腫瘍抑制物質として振る舞うことができ、Ｓｋｐ−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ｂｏｘタンパク質（ＳＣＦ）複合体によるユビキチン化での分解の標的となりうる。
【００３１】
本明細書において、「ＫＤＭ６Ａ」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０６６９６３（配列番号１０または配列番号１１（１７３位でＬの代わりにＶ、５８４位でＬの代わりにＲ、６０１位でＳの代わりにＮ、および／または６２９位でＥの代わりにＫとなっている配列番号１０である。））をコードしているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１１４０（配列番号７、オープンリーディングフレームは配列番号８、配列番号７の３７６〜４５８１ヌクレオチド、または配列番号９）に関連した遺伝子を指す。ＫＤＭ６Ａに対する他の名称としては、ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄもしくはｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ＴＰＲ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＵＴＸ）またはｂＡ２８６Ｎ１４．２が挙げられる。ＫＤＭ６Ａは、ヒストンデメチラーゼであり、腫瘍抑制物質として機能することができる。
【００３２】
本明細書いおいて、「ＦＢＸＷ７」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿３６１０１４（配列番号１４）をコードしている、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３６３２（配列番号１２、オープンリーディングフレームは配列番号１３、配列番号１２の１５０〜２２７３ヌクレオチド）に関連した遺伝子を指す。ＦＢＸＷ７に対する他の名称としては、ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｃ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｓｅｌ−１０（ＳＥＬ１０）、ａｒｃｈｉｐｅｌａｇｏ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＧＯ）、Ｆ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＢＸ３０  （ＦＢＸＯ３０）、またはｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＣＤＣ４）が挙げられる。ＦＢＸＷ７は、ユビキチンタンパク質リガーゼ複合体に加わり、細胞周期および細胞の生存に関与するタンパク質を含む、タンパク質のリン酸化依存性ユビキチン化に関与することができる。ＦＢＸＷ７は、腫瘍抑制物質として振る舞うことができる。マーカー遺伝子としてのＦＢＸＷ７の使用は、組織特異的であり得、すなわち、一部の組織に生じる腫瘍に感受性のあるマーカーであるが、他の組織に生じた腫瘍には感受性が無いということがありうる。たとえば、ＦＢＸＷ７は、子宮、子宮頸管、または肝臓の腫瘍に感受性のあるマーカーであり得るが、消化管の腫瘍には感受性の無いマーカーであり、そこでは他の遺伝子の変異が優位であり得、これらの腫瘍由来の細胞のＭＬＮ４９２４に対する非感受性または抵抗性をもたらす。
【００３３】
本明細書において、「ＴＰ５３」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０００５３７（配列番号１７、または、７２位のアミノ酸残基がプロリン、Ｐの代わりにアルギニン、Ｒである、変異体）をコードしているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５４６（配列番号１５、オープンリーディングフレームは配列番号１６、配列番号１５の２０３〜１３８４ヌクレオチド、または４１７位のヌクレオチドがシトシンの代わりにグアニンである、変異体）に関連した遺伝子を指す。ＴＰ５３に対する他の名称としては、ＢＣＣ７、ＬＦＳ１およびｐ５３が挙げられる。ＴＰ５３はＤＮＡに結合し、転写因子を活性化させ、腫瘍抑制物質として機能することができる。
【００３４】
本明細書において、「ＣＤＫＮ２Ａ」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００００６８（配列番号２０）をコードしているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７７（配列番号１８、オープンリーディングフレームは配列番号１９、配列番号１８の３０７〜７７７ヌクレオチド）に関連する遺伝子を指す。ＣＤＫＮ２Ａに対する他の名称としては、ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＡＲＦ）、ｐ１６、ｐ１６ＡＲＦ、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ４（ＩＮＫ４）およびｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ−１（ＭＴＳ１）が挙げられる。ＣＤＫＮ２Ａの変異体は、最初のエクソンが異なる。変異体の１つは、「ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４」または「ＣＤＫＮ２Ａ．ｐ１４」であり、ｐ１４ＡＲＦとしてもまた知られ、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿４７８１０２（配列番号２３、または配列番号２３のアミノ酸残基４２で始まる変異体）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８１９５（配列番号２１、オープンリーディングフレームは配列番号配列番号２２、配列番号２１の３８〜５５９ヌクレオチド）に関連している。ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４は、ｐ１６ＡＲＦ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＣＤＫＮ２Ａ）とは異なるリーディングフレームの翻訳から得られる。ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４は、サイクリン依存性キナーゼ４を阻害し、ｐ５３を安定化させ、細胞周期Ｇ１の進行を制御することができる。ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４は、腫瘍抑制物質として振る舞うことができる。
【００３５】
本明細書において、「ＡＰＣ」は、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００００２９（配列番号２６）をコードしているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００３８（配列番号２４、オープンリーディングフレームは配列番号２５、または１４５８ヌクレオチドでシトシンの代わりにチミンである変異体）に関連した遺伝子である、ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉを指す。ＡＰＣに対する他の名称としては、ＢＴＳＰ２およびＤＰ２が挙げられる。ＡＰＣは微小管に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、腫瘍抑制物質として機能することができる。
【００３６】
癌に関連した公共的な変異分類作製に注目が集まっている。癌に関連した変異に関する情報を含む公共的なデータベースの例としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）により維持されているＤａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ（ｄｂＧａＰ）および、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）に維持されているＣａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースがある。
【００３７】
変異状態を測定するための方法および組成物、たとえば、血液系腫瘍（たとえば、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫等）または固形腫瘍（たとえば、メラノーマ、食道がん、肺癌、または膀胱癌）のマーカー遺伝子の変異を特定し、治療に対する応答性、無増悪期間、および治療での生存率を予測するための方法および組成物が開示される。また、本明細書に開示される方法および組成物により、たとえば大腸癌、乳癌、頭頸部癌または中枢神経系の癌等の固形腫瘍におけるマーカー遺伝子中の変異を特定することもできる。
【００３８】
マーカーは、ＭＬＮ４９２４に対する治療に感受性を示す腫瘍細胞の遺伝子プロファイルに基づき特定された。ＴＰ５３マーカーはまた、ＴＰ５３遺伝子の欠損において異なっている同系細胞株の振る舞いに基づき同定された。２つ以上の方法により検証された腫瘍細胞の間で、感受性の結果は一致している。
【００３９】
他で定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書に記述される細胞および組織培養、分子生物学ならびにタンパク質およびオリゴ化学またはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションの技術、ならびにそれらに関連して用いられる専門用語は概して、当分野で公知であるものである。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号またはＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号および、有用な核酸配列およびペプチド配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により維持されるウェブサイトで見出すことができる。本出願を全体で引用されているすべてのデータベースアクセッション記録（たとえば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ１３３アノテーションファイル、Ｅｎｔｒｅｚ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、ＣＯＳＭＩＣ由来のもの）の内容（表を含む）は、参照により、本明細書に援用される。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、タンパク質精製、組織培養ならびに形質転換およびトランスフェクション（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクション等）には、標準的な技法が用いられる。酵素反応は、メーカーの仕様書に従い実施されるか、または当分野で一般に行われているように実施されるか、または本明細書に記述されるように実施される。前述の技法および手順は通常、たとえば、本明細書全体で引用および論じられる様々な総説および、より具体的な参照文献に記述されるように、当分野に公知の方法に従い、実施される。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）またはＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。本明細書に記述される分析化学、有機合成化学ならびに、医化学および薬化学の技術ならびに実験手順、ならびにそれらに関連して用いられる専門用語は、当分野に公知である。化学合成、化学分析、医薬品、処方および送達、ならびに患者の治療に対し、標準的な技術が用いられる。さらに、文脈上、他で要求されない限り、単数形は、複数形を含み、複数形は、単数形を含むものとする。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含んで、優先される。
【００４０】
「１つ（ａ、ａｎ）」および「少なくとも１つ」という冠詞は、本明細書において、文法上の冠詞の対象の１つ以上を指すために用いられる。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、少なくとも１つの要素である、１つ以上の要素を意味する。矛盾がある場合には、本明細書が、定義を含み、優先される。
【００４１】
本明細書において、「好ましい」結果または予後とは、長期の生存期間、長期の無増悪期間（ＴＴＰ）、および／または良好な応答を指す。逆に、「好ましくない」予後とは、短期の生存期間、短期の無増悪期間（ＴＴＰ）、および／または良好ではない応答を指す。
【００４２】
本明細書において「マーカー」とは、患者の腫瘍細胞で変異を有するとして同定されているマーカー遺伝子と関連のある物質を含み、さらに、その変異は、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質による治療などで好ましい結果または好ましくない結果となる患者の指標となる。マーカーの例としては、たとえば染色体遺伝子座、遺伝子に対するＤＮＡ、遺伝子に対するＲＮＡまたは遺伝子に対するタンパク質等の物質が挙げられる。たとえば、マーカーとしては、たとえばサイズ、配列、組成または量等の患者の短期間生存の指標となる特性を示す、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれ、あるいは、マーカーとしては、たとえばサイズ、配列、組成または量等の患者の長期間生存の指標となる特性または変異を示す、染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれる。他の例において、マーカーとしては、治療に対して良好な応答を示さない患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体の遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれ、あるいは、マーカーとしては、良い応答性を示す患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれる。さらなる例において、マーカーとしては、治療により短期無増悪期間（ＴＴＰ）となる疾患を有する患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体遺伝座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれ、あるいは、長期ＴＴＰとなる疾患を有する患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれる。よりさらなる例において、マーカーとしては、治療により短期間生存となる疾患を有する患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれる。あるいは、マーカーとしては、長期間生存となる疾患を有する患者の指標である、サイズ、配列、組成もしくは量等の特性または変異を有する染色体遺伝子座、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質等のマーカー遺伝子物質が含まれる。ゆえに、本明細書において、マーカーとは、これらの可能性のそれぞれおよびすべてを含むことが意図され、さらに、個々のマーカーとして各々単一であるマーカーを含むことができ、あるいは、「マーカー（複数）」または「マーカーセット」と集合的に参照された場合には、すべての特性または１つ以上の特性を含むことができる。
【００４３】
予後診断または治療または疾患管理戦略の決定のための測定に有益な染色体遺伝子座マーカーは、たとえば、染色体２２ｑ１２．２の塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９（ＮＦ２）、たとえば、染色体１８ｑ２１．１−２１．２の塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２（ＳＭＡＤ４）、たとえば、染色体Ｘｐ１１．２の塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７（ＫＤＭ６Ａ）、たとえば、染色体４ｑ３１．３の塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２（ＦＢＸＷ７）、たとえば染色体１７ｐ１３．１の塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８（ＴＰ５３）、および、たとえば、９ｐ２１の塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０（ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４）からなる群から選択される。染色体遺伝子座の番号は、ＮＣＢＩＧｅｎｅデータベースのヒトゲノムＢｕｉｌｄ３７．３（２０１１年１０月５日現在で最新）の参照に基づいている。マーカーＤＮＡ、マーカーＲＮＡ、またはマーカータンパク質は、染色体遺伝子座マーカー上の塩基対と対応することができる。たとえば、マーカーＤＮＡは、染色体遺伝子座マーカー由来のゲノムＤＮＡを含むことができ、マーカーＲＮＡは遺伝子座マーカーから転写されたポリヌクレオチドを含むことができ、および、マーカータンパク質は、試料（たとえば、腫瘍細胞を含む）中の染色体遺伝子座マーカーでの発現からもたらされたポリペプチドを含むことができる。
【００４４】
「マーカー核酸」は、本発明のマーカー遺伝子によりコードされる、または本発明のマーカー遺伝子に対応する核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。そのようなマーカー核酸としては、ＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖（その中に生じる任意のイントロンを含む））が挙げられ、たとえば、任意のマーカー遺伝子またはそのような配列の相補体のオープンリーディングフレームまで、およびそれを含む、ゲノムＤＮＡのエクソンの１つ以上等の全体配列または部分配列をその中に含む。マーカー核酸はまた、任意のマーカーの完全配列もしくは部分配列、またはそのような配列の相補鎖を含有するＲＮＡを含み、ここで、すべてのチミジン残基はウリジン残基と置き換えられ、ならびに、ゲノムＤＮＡの転写により生成されたＲＮＡ（すなわち、スプライシング前）、ゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡのスプライシングにより生成されたＲＮＡ、およびスプライシングされたＲＮＡの翻訳により生成されたタンパク質（すなわち、たとえば膜貫通シグナル配列等の通常の開裂部位の開裂前および開裂後の両方のタンパク質を含む）も含む。本明細書において、「マーカー核酸」はまた、ゲノムＤＮＡ（スプライシングされたＲＮＡを含む）の転写により生成されたＲＮＡの逆転写により作製されたｃＤＮＡを含んでもよい。マーカー核酸には、遺伝子コードの縮重により、本発明のマーカー（たとえば、変異マーカー）に対応するタンパク質をコードしている核酸のヌクレオチド配列とは異なり、ゆえに、同じタンパク質ではあるが、たとえば変異タンパク質をコードしている配列もまた含まれる。本明細書において、「対立遺伝子多型」という表現は、所与の遺伝子座で、またはヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して発生するヌクレオチド配列を指す。そのような天然に発生する対立遺伝子多型は、通常、所与の遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の変異をもたらす。代替的な対立遺伝子は、別の多くの個体（たとえば癌を有していない個体の細胞（たとえば、生殖細胞系細胞））にある対象の遺伝子の配列解析を行うことにより特定することができる。これは、様々な個体の同じ遺伝子座を特定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いて、容易に実施することができる。そのようなヌクレオチド変異のすべてまたは一部、および、野生型のマーカー遺伝子の機能活性を変化させず、天然発生の対立遺伝子多型の結果であるアミノ酸多形または変異を検出することは、本明細書に記述されるマーカーの野生型バージョンの範囲内にあると解される。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカー（たとえば、変異核酸）によりコードされる、または本発明のマーカーに対応するタンパク質である。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、互換可能に用いられる。マーカーのタンパク質は、その名称またはアミノ酸配列により具体的に参照されるが、当業者であれば、変異、欠損および／または翻訳後修飾により、タンパク質構造、出現、細胞局在および／または振る舞いが影響を受けることが理解される。他で示唆されない限り、そのような差異は、本明細書において区別されず、本明細書に記述されるマーカーはそのような変異のすべてまたは一部を含むものと解される。
【００４５】
本明細書において、「マーカー遺伝子」とは、そのＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質が、治療による予後に関する情報を提供する（すなわち、「有益」である）、サイズ、配列、組成または量（複数含む）等の特性を有するような変異を有することができる遺伝子を指す。たとえば１−置換メチルスルファミン酸（たとえば、ＭＬＮ４９２４）等のＮＡＥ阻害物質治療の後の結果に結び付けられるような、本明細書に記述されるマーカー遺伝子のは、上述の染色体遺伝子座マーカー内の遺伝子の例であり、表１に記述される。マーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡ、オープンリーディングフレーム、およびタンパク質の配列もまた、表１に列挙される。表１に列挙されるマーカー遺伝子は、いたるところで発現されているか、または発現が制限されているアイソフォームを有することができる。ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４アイソフォームの別個の列挙を除き、表１のＤＮＡ配列番号は、主要で最も長いアイソフォームをコードするｍＲＮＡを指し、タンパク質配列番号は、そのようなアイソフォームの少なくとも前駆体を表し、必ずしも成熟タンパク質を表してはいない。これらの配列は、そのアイソフォームまたは前駆体に、マーカー遺伝子の実体を制限するとはみなされない。さらなるアイソフォームおよび成熟タンパク質は、表１に列挙されているＩＤにより特定されるＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤにより維持されるデータベース）で提供される情報を考察することにより、当業者が容易に取り出し、理解することができる。
【表１】
2018050634.tif 000003
【００４６】
本明細書において、「有益（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）」な特性（たとえば、マーカーのサイズ、配列、組成または量）とは、その値または差異が、予後または結果に相関しているサイズ、配列、組成または量等の特性を指す。たとえばマーカーのサイズ、配列、組成または量等の有益な特性とは、核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはマーカー遺伝子に対応するタンパク質のいずれかを分析することにより得ることができる。たとえば、マーカー（たとえば、染色体遺伝子座マーカーまたは患者由来の試料中のマーカー）の特性、例えばサイズ（長さまたは分子量等）、配列（たとえば、核酸配列またはタンパク質配列等）、組成（たとえば、塩基組成またはアミノ酸組成またはペプチド消化または遺伝子断片パターン）、または量（たとえば、コピー数および／または発現レベル）等は、もし、それが分析材料の野生型または対立遺伝子多型とは異なるものであった場合、「有益」でありうる。いくつかの実施形態において、マーカーの特性は、もしそれが、マーカー遺伝子が野生型であることを示唆する場合、有益である。マーカーの量が測定される実施形態において、量は、それが、発現を評価するために用いられた分析の標準誤差を超えるほどに、基準量よりも大きいか、または小さい場合、「有益」である。マーカーの有益な発現レベルは、測定された発現レベルおよびその結果（たとえば、良好な応答、不良な応答、長期の無増悪期間、短期の無増悪期間、短期の生存期間または長期の生存期間等）の統計的相関で決定することができる。統計分析の結果により、本明細書に記述される方法において用いるためのマーカーを選択するための閾値を設定することができる。あるいは、マーカー（たとえば、染色体遺伝子座マーカー）またはマーカー遺伝子（サイズ、配列、組成または量等の異なる特性を有するマーカー遺伝子）は、通常、結果を予測する量の範囲を有する。たとえばサイズ、配列、組成または量等の有益な特性は、結果に対して決められたサイズ、配列、組成または量等の特性の範囲内に収まる特徴（たとえば、サイズ、配列、組成または量等）がある。さらに、マーカーのセットは、それらの特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量等）の組み合わせが、本明細書に提供される方法により決定されたものとして設定されたマーカー（たとえば、染色体遺伝子座マーカーまたはマーカー遺伝子）に対し、事前に決定されたスコアと合致、または上回るかもしくは下回るかのいずれかであれば、共に「有益」でありうる。マーカーの配列または組成を変えることができる点変異に加えて、遺伝子転座、転写スプライス変異、欠損および切断は、マーカーのサイズ、配列または組成を変化させることが出来る事象の例である。たった１つの特性（たとえば、マーカー、マーカー遺伝子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）の特性）を測定することにより、予後予測（すなわち、示唆される結果）を提供することができる。２つ以上の特性（たとえば、マーカー、マーカー遺伝子の特性）を測定し、２つの特性の有益な量が互いに一致する（すなわち、結果の生物特性が矛盾しない）場合、予後予測を提供することができる。マーカー遺伝子の複合的な特性の測定から得られる結果が一致する例としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡにおけるナンセンス変異または欠損、および低量もしくは低分子量のコードされたタンパク質、または、タンパク質の結合ポケットもしくは活性部位をコードする領域における変異、およびコードされたタンパク質の低活性の特定がある。その活性レベルに基づき合成を制御するフィードバックループを伴う経路にタンパク質がある場合には、異なる例が発生する。この場合においては、タンパク質の低量または低活性は、マーカー遺伝子変異により、組織として変異したｍＲＮＡが大量にあることと関連しており、ゆえに、タンパク質活性が枯渇し、タンパク質産生のシグナルが繰り返して出される。
【００４７】
本明細書において、「遺伝子欠損」とは、２未満のＤＮＡコピー数の量を指し、「増幅」とは、２より多いＤＮＡコピー数の量を指す。「二倍体」の量とは、２と等しいコピー数を指す。「２倍体、または増幅」という用語は、遺伝子コピーが「欠損していない」こととして解釈することができる。選択的な有益の量が遺伝子欠損であるマーカーにおいて、増幅は通常見られない。逆に「二倍体または欠損」という用語は、コピー数が「増幅しない」こととして解釈することができる。選択的な有益の量が増幅であるマーカーにおいて、遺伝子欠損は通常みられない。明確に述べると、配列欠損は、マーカー遺伝子の変異の結果として遺伝子内に発生することができ、転写されたタンパク質の欠損をもたらすか、または短縮化されたｍＲＮＡもしくはタンパク質をもたらす。そのような欠損は、コピー数に影響を与えなくとも良い。
【００４８】
「長期の生存期間」および「短期の生存期間」という用語は、治療の最初の投与を受けた後の、癌患者が生存すると予測される期間の長さを指す。「長期間生存者」とは、短期間生存者として特定された患者よりも、腫瘍による死が遅くなるか、または進行の程度が遅くなると予測される患者を指す。「生存上昇」または「死亡率の低下」は、たとえば、群の７０％、８０％、９０％またはそれ以上が治療の最初の投与を受けた後に、十分な期間生存するような参照標準と比較し、特性（たとえば、本明細書に記述される１つ以上のマーカーのサイズ、配列、組成または量）に基づき推定された生存期間の決定である。「死亡率の早期化」または「生存期間の短期化」は、たとえば、群の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれ未満が、治療の最初の投与を受けた後に、十分な期間生存しないような参照標準と比較し、本明細書に記述される１つ以上のマーカーの特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）に基づき推定された生存期間の決定を指す。いくつかの実施形態において、十分な期間は、癌治療を受けた最初の日から数えて少なくとも６、１２、１８、２４または３０か月である。
【００４９】
癌は、治療剤と接触しない場合のその増殖と比較して、治療剤と接触した結果、その増殖率が阻害される場合、治療剤に対し「応答性」があるか、または治療に対し「良好な応答」がある。癌の増殖は、様々な方法で測定することができ、たとえば、腫瘍のサイズ、腫瘍型に適した腫瘍マーカーの発現等の特性を測定してもよい。たとえば、骨髄腫に関連したマーカーの特定、およびたとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法へのその応答性を支援するために用いられる応答の定義である、Blade  et  al.  (1998)  Br  J  Haematol.  102:1115-23に記述されるＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  （ＳＷＯＧ）の基準を用いることができる。これらの基準は、骨髄腫で測定される応答の型を定義し、または、治療剤に対する腫瘍の感受性のもう１つの重要な評価基準である疾患進行に対する時間の特徴付けを定義している。固形腫瘍に対しては、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  （ＲＥＣＩＳＴ）  ガイドライン  (Eisenhauer  et  al.  (2009)  E.  J.  Canc.  45:228-247)を用いて、固形腫瘍に関連するマーカー、およびＮＡＥ阻害物質に対する固形腫瘍の応答の特定を支援することができる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓが定期的に開催され、様々なタイプの癌に対する応答の基準が設定、更新、そして公開されている。そのような公開レポートに従い、対象腫瘍のマーカーおよびそれらのＮＡＥ阻害物質に対する応答の特定をサポートすることができる。例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、Cheson  et  al.  (2003)  J.Clin.  Oncol.  21:4642-4649）およびリンパ腫（たとえば非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫（Cheson  et  al.  (2007)  J.Clin.  Oncol.  25:579-596））に対する基準である。基準は、たとえば測定可能な変化した代謝活性を伴う部位（たとえば、腫瘍部位）の特定もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍内への特定のマーカーのトレースのためにたとえば陽電子放出コンピューター断層撮影（ＰＥＴ）等の分析法を、特定の腫瘍マーカーに対する抗体の結合を検出することによる腫瘍細胞の特定のためにたとえば免疫組織化学法を、ならびに、異なるマーカーおよび蛍光染色による細胞型の特徴付けの等ためにフローサイトメトリー法を、さらに、細胞組成（たとえば、血液スメアもしくは骨髄生検中の芽球カウント、有糸分裂像の存在および数等）または組織構造（たとえば不規則な組織構造または細胞の基底膜浸潤）を特定するために組織学的な従来法を、考慮に入れている。たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質療法に対し応答性であることの質は変化するものであり得、異なる癌は、異なる条件下で、与えられた治療剤に対する異なるレベルの「応答性」を示す。さらに、応答性の評価基準は、患者の生活の質、転移の程度等を含む、腫瘍サイズの増加を超えた追加の基準を用いて分析することができる。さらに、臨床的な予後マーカーおよび変量（たとえば、骨髄腫のＭタンパク質、前立腺癌のＰＳＡレベル等）を、適用可能な状況で分析することができる。
【００５０】
治療剤との接触が無い場合の増殖と比較して、治療剤と接触した結果としてのその増殖率が阻害されない、またはごくわずかしか阻害されない場合、治療に対して、癌は、治療剤に対して「不応性」であるか、もしくは「不良な応答性」を有するか、または不良な応答性となる。上述のように、癌の増殖は様々な方法で測定することができ、たとえば、腫瘍サイズまたは腫瘍型に適した腫瘍マーカーの発現が測定されてもよい。たとえば、治療剤に対して不応性の腫瘍に関連したマーカーの特定を支援するために用いられる応答の定義として、たとえば上述のガイドラインを用いることができる。治療剤に対して不応性であることの質は、とても変わりやすいものであり、異なる癌は、異なる条件下で、与えられた治療剤に対して異なるレベルの「不応性」を示す。さらに、不応性の評価基準は、患者の生活の質、転移の程度等の腫瘍サイズの増加を超えた追加の基準を用いて分析することができる。くわえて、臨床的な予後診断マーカーおよび変量（たとえば、骨髄腫のＭプロテイン、前立腺癌のＰＳＡレベル）を、適切な状況下で分析することもできる。
【００５１】
本明細書において、「長期の無増悪期間」、「長期ＴＴＰ」および「短期の無増悪期間」、「短期ＴＴＰ」とは、治療により安定した疾患が活性化疾患の状態に変化するまでの時間の長さを指す。時折、治療は、良好な応答でも不良な応答でもない安定した疾患状態をもたらすことがあり、たとえば、ただ単に悪くならない疾患であるＭＲが、一時期、進行性の疾患となる。この期間は、少なくとも４〜８週間、少なくとも３〜６か月、または６か月超であってもよい。
【００５２】
「治療」は、さらなる腫瘍増殖を阻害または防ぐため、ならびに、腫瘍の縮小をもたらすため、および長期生存をもたらすために治療を用いることを意味する。治療はまた、腫瘍の転移を防ぐことを含むこともまた意図される。もし癌または腫瘍の少なくとも１つの臨床症状（応答性／不応性、無増悪期間、または当分野に公知の指標および本明細書に記述の指標により決定される）が軽減、終了、遅延、最小化、または防止された場合、腫瘍は、「阻害される」または「治療される」。本明細書にさらに記述されるように、治療レジメン（たとえば、１−置換メチルスルファミン酸塩等のＮＡＥ阻害物質レジメン）を用いた治療に従う腫瘍の任意の症状（物理的なもの、またはその他のもの）の任意の軽減は、本発明の範囲内である。
【００５３】
本明細書において、「剤」という用語は、腫瘍細胞を含む癌細胞が治療プロトコールで曝されうる任意のものとして広く定義される。本発明との関連で、そのような剤として、たとえば１−置換メチルスルファミン酸塩剤等のＮＡＥ阻害物質、ならびに当分野に公知および本明細書に詳述される化学療法剤が挙げられるが、これに限定されない。
【００５４】
「プローブ」という用語は、たとえば本発明のマーカー等の特定の目的標的分子に選択的に結合することができる、単離分子等の任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成されるか、または適切な生物学的材料から由来してもよい。標的分子検出の目的のために、プローブは本明細書に記述されるように標識されるよう具体的に設計されても良い。プローブとして用いることができる分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機モノマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
マーカーのたとえばサイズ、配列、組成または量等の「正常な」特性とは、「基準試料」中の、たとえばサイズ、配列、組成または量等の特性を指しても良い。基準試料は、たとえば体細胞変異等を伴う腫瘍が生じている同じ患者由来の正常な、たとえば胚細胞系の適合試料であってもよい。基準試料は、マーカー関連疾患を有していない健常な対象由来の試料であってもよく、またはたとえば平均特性等の基準特性（たとえば、数人の健常な対象中の野生型マーカーのサイズ、配列、組成または量）であってもよい。基準試料特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）は、参照データベース由来の１つ以上のマーカーのサイズ、配列、組成または量等の特性から構成されてもよい。あるいは、マーカーのサイズ、配列、組成または発現レベル等の「正常な」特性は、腫瘍が生じた同じ患者から同様の環境または応答状況での非腫瘍細胞中のマーカー遺伝子等のマーカーのサイズ、配列、組成または量等の特性である。正常なＤＮＡコピー数は２または２倍体であり、例外は、男性のＸ関連遺伝子であり、そこでは正常なＤＮＡコピー数は１である。
【００５６】
マーカー遺伝子の「過剰発現」および「低発現」とは、患者のマーカー遺伝子の発現が、それぞれマーカー遺伝子の正常発現レベルよりも、高いレベルまたは低いレベルにある（たとえば、２分の３倍超、少なくとも２倍、少なくとも３倍より高いレベルかより低いレベル等）ことを指し、たとえば、検証試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質で測定して、発現を分析するために行った分析の標準誤差よりも大きいことを指す。「有意な」発現レベルとは、本明細書に提供される方法により決定されたように設定されたマーカー遺伝子に対して前もって決定されたスコアと合致するか、上回るか、または下回るレベルを指してもよい。
【００５７】
「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広い概念を指す。１番目の核酸領域のアデニン残基は、その１番目の領域と逆行する２番目の核酸領域の残基と、もしその残基がチミンまたはウラシルである場合には、特異的な水素結合（塩基対）を形成することが出来ることが知られている。同様に、１番目の核酸鎖のシトシン残基は、その１番目の鎖と逆行する２番目の核酸鎖の残基と、もしその残基がグアニンである場合には、塩基対を形成できることが知られている。核酸の１番目の領域は、同じ、または異なる核酸の２番目の領域に対して、もし、その２つの領域が逆行する様式で配置される際、１番目の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基と２番目の領域の残基が塩基対を形成できる場合には、相補的である。ひとつの実施形態において、１番目の領域は、１番目の部分を含有し、２番目の領域は２番目の部分を含有し、ここで、１番目と２番目の部分が逆行する様式で配置される際、１番目の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％またはすべてが、２番目の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。
【００５８】
本明細書において「相同」とは、同じ核酸鎖の２つの領域の間の、または２つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列の類似性を指す。両領域のヌクレオチド残基配置が同じヌクレオチド残基で占められる場合、その領域はその位置で相同である。もし各領域の少なくとも１つの位置のヌクレオチド残基が同じ残基で占められる場合、１番目の領域は２番目の領域に対して相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基で占められている２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される（すなわち、同一性パーセントにより）。例として、ヌクレオチド配列５´−ＡＴＴＧＣＣ−３´を有する領域と、ヌクレオチド配列５´−ＴＡＴＧＧＣ−３´を有する領域は、５０％同一の相同性を共有する。１つの実施形態において、１番目の領域は１番目の部分を含有し、２番目の領域は２番目の部分を含有し、ここで、各部分のヌクレオチド残基配置の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基に占められる。１００％同一の１つの実施形態においては、各部分のすべて位置のヌクレオチド残基は、同じヌクレオチド残基で占められる。
【００５９】
本明細書中に他で特定されない限り、「抗体」（複数含む）という用語は、自然発生する抗体の形態（たとえば、ポリクローナル抗体（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）およびモノクローナル抗体および組換え抗体（たとえば、単鎖抗体、二鎖タンパク質および複鎖タンパク質、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体および多特異的抗体ならびに前述すべての断片および誘導体であり、当該断片（たとえば、ｄＡｂｓ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）´２、Ｆａｂ´）および当該誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する））を広く含有する。抗体誘導体は、抗体に連結されたタンパク質またはキメラ部分を含有しても良い。「抗体」という用語はまた、合成変異体および遺伝子操作変異体を含む。
【００６０】
「キット」は、本発明のマーカーまたはマーカーセットを特異的に検出するための試薬（たとえば、プローブ）を少なくとも１つ含有する任意の製造品（たとえば、パッケージまたは容器）である。当該製造品は、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、本発明の方法を実施する（たとえば、患者から得られた試料での実施）ためのユニットとして販売するために、販売促進、流通、販売または売り出されてもよい。そのようなキットに含まれる試薬は、少なくとも１つの核酸プローブと、任意選択的に、マーカー特性（たとえば、サイズ、配列、組成または（たとえば発現の）量等）を検出するために用いるための１つ以上のプライマーおよび／または抗体を含んでも良い。さらに、本発明のキットは、適切な検出アッセイを記述している説明書を含有してもよい。そのようなキットは、癌の症状を示している患者、特に、ＮＡＥ阻害療法で治療することができる癌（たとえば、血液のがん、（たとえば、多発性骨髄腫等の骨髄腫、非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、急性骨髄性白血病等の白血病）および固形腫瘍（たとえば、皮膚腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、卵巣腫瘍等））である可能性を示している患者の診断、評価または治療を可能にするために、記録、保存、転送または受信される情報（たとえば１つ以上のマーカーの発現レベル、特性（たとえば、サイズ、配列、組成））を作り出すために、臨床で、または罹患検査セットで、簡便に用いることができる。
【００６１】
本発明の方法および組成物は、癌に罹患している患者に対する診断および治療に用いることを目的とする。癌または腫瘍は、本発明の方法に従い、治療または診断される。「癌」または「腫瘍」は、患者内での任意の腫瘍性増殖を含むことが意図され、原発腫瘍および任意の転移腫瘍が含まれる。癌は、血液系腫瘍型または固形腫瘍型であっても良い。血液系腫瘍には、血液が原発である腫瘍が含まれ、たとえば、骨髄腫（たとえば、多発性骨髄腫）、白血病（ワルデンシュトローム症候群、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、他の白血病）、リンパ腫（たとえば、Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）および骨髄異形成症候群が含まれる。固形腫瘍は、器官に起源があってもよく、たとえば皮膚、肺、脳、乳房、前立腺、卵巣、大腸、腎臓、膵臓、肝臓、食道、胃、小腸、膀胱、子宮、子宮頚、頭頚、中枢神経系、骨、精巣、副腎等における癌を含んでも良い。癌は、マーカー遺伝子が変異している細胞を含有しても良い。本明細書において、癌細胞（腫瘍細胞を含む）は、異常な（増加した）速度で分裂する細胞を指すか、またはその増殖および生存の制御が、癌細胞が発生または生存している同じ組織の細胞に対するものとは異なっている細胞を指す。癌細胞としては、たとえば、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支癌、メラノーマ、腎細胞癌、ヘパトーマ−肝細胞癌、胆管癌、胆管癌、乳頭癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、乳癌、胃腸癌、大腸癌、膀胱癌、前立腺癌および頭頸部の扁平上皮癌等の癌；たとえば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、腱肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫および中皮肉腫等の肉腫；骨髄腫、白血病（たとえば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ球性白血病）、およびリンパ腫（たとえば、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網肉腫、またはホジキン疾患）等の血液の癌；および、グリオーマ、髄膜腫、髄芽腫、神経鞘腫または上衣腫を含む神経系の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書において、「非侵襲」という用語は、対象に最小限の損傷を与える手順を指す。臨床応用のケースにおいて、非侵襲の試料採取手順は、通常、麻酔および／または外科的器具または縫合を行うことなく、たとえば予約なしの飛び入りで、素早く行われることができる。非侵襲の試料採取の例としては、血液、血清、唾液、尿、頬スワブ、咽頭培養、糞便試料および頸部スメアが挙げられる。非侵襲診断分析としては、Ｘ線、磁気共鳴画像、陽電子放出コンピューター断層撮影等が挙げられる。
【００６３】
本明細書において、ファーマコゲノミクスマーカーの量の測定を介した、腫瘍の治療予後評価が示される。また、非侵襲、簡便または低コストな方法（たとえば、血液試料由来）による予後評価が示される。血液系腫瘍（たとえばリンパ腫、白血病（たとえば急性骨髄性白血病）、骨髄腫（たとえば多発性骨髄腫））の癌の程度または予後を決定するための典型的な方法として、骨髄生検を実施し、遺伝子型または表現型（たとえば組織学的分析）のための組織を採取することができる。本発明は、患者の腫瘍治療または疾患管理のための適切な治療レジメンを決定、評価、アドバイスまたは提供するための方法を提供する。本明細書に提供されるキットおよび方法を用いた治療のモニタリングは、好ましくない予後の可能性を特定、およびそれらを防止することができ、ゆえに、罹患率、死亡率をおさえ、治療レジメンの調節、治療中断、または代替療法の使用を介して、治療コストを抑えることができる。
【００６４】
「生物学的試料」という用語は、たとえば組織、細胞、生物学的液体およびそれらから単離されたもの、対象から単離されたもの、ならびに、対象内に存在する組織、細胞および液体等の患者試料を含むことが意図され、患者または健常な対象から得ることができる。骨髄の血液系腫瘍（たとえば、骨髄腫瘍）において、腫瘍の一次解析は、骨髄試料で実施することができる。しかしながら、いくつか種類の腫瘍細胞（たとえば、クローン形質の腫瘍細胞、循環内皮細胞等）は、全血の細胞群に一定の割合でいる。これらの細胞はまた、たとえば白血病、リンパ腫および骨髄腫等の血液腫瘍に対する標準療法である骨髄移植の準備段階で、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で患者を処置する間に、血液中に動員することができる。多発性骨髄腫の循環腫瘍細胞の例は、たとえば、Pilarski  et  al.  (2000)  Blood  95:1056-65、および、Rigolin  et  al.  (2006)  Blood  107:2531-5により研究されている。ゆえに、たとえば、治療結果を決定するためのマーカーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定のための非侵襲試料は、末梢血試料を含むことができる。従って、末梢血中の細胞を、マーカー量のために試験することができる。血液系腫瘍を有する患者に対し、正常な特性（たとえばサイズ、配列、組成または量）の対照である、基準試料は、患者の皮膚または頬スワブから得ることができる。固形腫瘍に対しては、典型的な腫瘍試料は腫瘍生検であり、固形腫瘍細胞が含有されている。あるいは、たとえば血液、唾、乳頭吸引液、尿、糞便、頸スメア等中で、脱落腫瘍細胞または腫瘍部位から擦り取った腫瘍細胞を非侵襲的に試料採取することができる。固形腫瘍に対しては、正常特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量）に対する対照である、基準試料は、患者の血液から得ることができる。
【００６５】
血液採取容器に、血液の完全性を保つための添加剤（たとえばデキストロースまたはアルブミンまたはリン酸塩等の緩衝剤）とともに、抗凝固剤（たとえばヘパリンまたはエチレン−ジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸溶液）を含有することができる。マーカーの量が、試料中のそのＤＮＡレベルを測定することにより測定されるものである場合、ＤＮＡ安定化剤、たとえばＤＮＡｓｅを阻害する剤を、試料に添加することができる。マーカーの量が、試料中のそのＲＮＡレベルを測定することにより測定されるものである場合、ＲＮＡ安定化剤、たとえばＲＮＡｓｅを阻害する剤を試料に添加することができる。マーカーの量が、試料中のそのタンパク質レベルを測定することにより測定されるものである場合、タンパク質安定化剤、たとえばプロテアーゼを阻害する剤を試料に添加することができる。血液採取容器の例は、血液採取の際のＲＮＡ安定化に有用なＰＡＸＧＥＮＥ（登録商標）チューブ（ＰＲＥＡＮＡＬＹＴＩＸ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）がある。末梢血は、たとえば分画化、ソート、または濃縮（たとえば、腫瘍を富化させた試料、またはたとえば基準試料のために腫瘍が無い試料を得るため）等の改変をすることができる。改変試料の例としては、たとえば負の選択（たとえば赤血球からの白血球分離（たとえば、高密度糖またはポリマー溶液（たとえば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）またはＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）−１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＬＰ  ａｎｄ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ））を介した分画遠心分離））、および／または、直接単離を目的とした選択剤（たとえば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３３等の腫瘍細胞マーカーまたは骨髄前駆体マーカーへ結合する試薬）へのＢ細胞の結合による正の選択（たとえば、Ｂ細胞マーカーへ結合する磁気ビーズ（たとえば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡより入手）を含有する細胞の溶液への磁場の適用）、または蛍光活性化細胞ソーティングにより採取することができるクローン形質の骨髄腫細胞が含まれる。
【００６６】
あるいは、腫瘍細胞株（たとえば、ＯＣＩ−Ｌｙ３、ＯＣＩ−Ｌｙ１０細胞（Alizadeh  et  al.  (2000)  Nature  403:503-511）、ＲＰＭＩ  ６６６６細胞、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞、ＫＧ−１細胞、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、８ＥＳ細胞、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞、Ｋａｓｕｍｉ−３細胞、ＢＤＣＭ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｍｏ−Ｂ細胞、ＪＭ１細胞、ＧＡ−１０細胞、またはＢ細胞リンパ腫（たとえば、ＢＣ−３））または細胞株もしくは腫瘍細胞株のコレクション（たとえば、McDermott  et  al.  (2007)  PNAS  104:19936-19941または、ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）抗癌腫瘍細胞プロファイリングスクリーン（Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｂｏｔｈｅｌｌ，  ＷＡ）を参照のこと）を分析することができる。当業者であれば、本発明の方法に用いられる適切な細胞を、たとえば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より、容易に選択および得ることができる。もし当該組成物または方法が、治療プロトコールの有効性をモニターするため、または患者の治療予後を予測するために用いられるものである場合、治療される患者から得られた組織試料または血液試料が、分析のために用いることができる細胞源、またはマーカー遺伝子源、または遺伝子産物源となる。
【００６７】
たとえば、生検もしくは骨髄、血液もしくは改変血液（たとえば、腫瘍細胞を含有するもの）および／または基準（たとえば合致対照（たとえば、胚細胞系））試料を、当該試料中のマーカーの量を分析する前に、様々な公知の採取後調製技術および保存技術（たとえば、核酸および／またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外ろ過、濃縮、蒸発、遠心等）に供することができる。
【００６８】
１つの実施形態において、マーカー遺伝子の変異状態（たとえば、マーカー中の変異）を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸または、マーカー遺伝子に関連するタンパク質の配列解析を行うことにより特定することができる。核酸を配列解析するための方法は、当分野にいくつか知られている。核酸プライマーは、変異の可能性がある部位を含有する領域に結合するように設計することができ、または、野生型配列よりも変異配列に相補的であるように設計することができる。プライマー対は、マーカー遺伝子中の潜在的な変異を含有する領域を囲むように設計することがえきる。プライマーまたはプライマー対は、マーカー遺伝子に対応するＤＮＡの１つの鎖または両鎖を配列解析するために用いることができる。プライマーは、プローブ（たとえばハイブリダイゼーションプローブ等の核酸プローブ）と併せて用いて、配列解析の前に対象の領域を増幅させ、マーカー遺伝子中の変異の検出のための配列量を引き上げることができる。配列解析することができる領域の例としては、遺伝子全体、遺伝子の転写物、および遺伝子の断片または転写物（たとえば、１つ以上のエクソンまたは非翻訳領域）が挙げられる。プライマー選択の標的となる変異の例、および配列解析または組成分析の標的となる変異の例は、変異情報を収集している公共のデータベース（たとえば、ＣＯＳＭＩＣおよびｄｂＧａＰ等）中に見出すことができる。たとえばＮＦ２、ＳＭＡＤ、ＫＤＭ６ＡまたはＦＢＸＷ７等のマーカー遺伝子の一部の変異を、たとえば１−メチルスルファミン酸塩（たとえばＭＬＮ４９２４）の阻害によるＮＡＥ阻害に対する感受性と関連しうる変異の例示として、実施例の表８〜１１に列挙する。
【００６９】
配列解析法は、当業者に公知である。方法の例としては、サンガー法、ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）法、および次世代配列解析（ＮＧＳ）法が挙げられる。プライマー伸長標識ＤＮＡ断片を分離するための、たとえばキャピラリー電気泳動等の電気泳動法の使用を含むサンガー法は、ハイスループットアプリケーションで自動化することができる。プライマー伸長配列解析は、対象領域のＰＣＲ増幅の後で行うことができる。配列ベース呼び出しおよび変異特定には、ソフトウエアを役立てることができる。ＳＥＱＵＥＮＯＭ（商標）ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）配列分析（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、変異を特定するために、対象の特定断片の予測質量と実際の質量とを比較する質量分光分析法である。ＮＧＳ技術（または、「超並列配列解析」および「第二世代配列解析」とも呼ばれる）は、概して、従前の技術よりもより多くのスループットを提供し、様々なアプローチ（Zhang  et  al.  (2011)  J.  Genet.  Genomics  38:95-109  および、Shendure  and  Hanlee  (2008)  Nature  Biotech.  26:1135-1145に概略がある）を用いる。ＮＧＳ法は、試料のマーカー中の低頻度変異を特定することができる。いくつかのＮＧＳ法（たとえば、ＧＳ−ＦＬＸ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、Ｇｅｎｏｍｅ分析器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ＳＯＬＩＤ（商標）分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ．００７  （Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））は、フローセル中で空間的に分離されたＰＣＲ産物のクローン増幅の有無にかかわらず、サイクリックアレイ配列解析および様々なスキームを用いて、配列解析酵素（たとえば、ポリメラーゼまたはリガーゼ）により組み込まれた標識改変ヌクレオチドを検出する。１つのＮＧＳ法において、プライマー対を、ＰＣＲ反応に用いて、対象の領域を増幅することができる。増幅された領域は、連結された産物内へライゲーションすることができる。クローンライブラリーを、ＰＣＲ産物またはライゲーション産物からフローセル中で作製し、標識塩基の同一性に基づき、４つのチャンネルのうちの１つで画像化される、標識された、可逆終端塩基をポリメラーゼが付加しながら、シングルエンドの配列解析のためにさらに増幅（「ブリッジ」または「クラスター」ＰＣＲ）され、次いで、次のサイクルのために除去される。変異特定のために、ゲノム配列との比較において、ソフトウエアを役立てることができる。
【００７０】
タンパク質および核酸の組成は、当分野に公知の多くの方法により測定することができ、たとえば、開裂、分解または消化する方法でそれらを処理し、次いで、成分を分析する方法などがある。質量分光分析、電気泳動およびクロマトグラフィーにより分離し、比較のための成分を明らかにすることができる。欠損または挿入をもたらす変異は、これらの方法で、サイズまたは電荷の差異により特定することができる。タンパク質消化、または制限酵素核酸消化により、いくつかのの変異の後の、異なる断片パターンを明らかにすることができる。その構造的環境中の特定の変異アミノ酸を認識する抗体により、試料中のこれらの変異を検出および特定することができる（以下を参照のこと）。
【００７１】
１つの実施形態において、野生型または変異マーカーに対応する、たとえばゲノムＤＮＡ等のＤＮＡは、当分野公知の方法を用いて、生物学的試料中で、ｉｎ  ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の形式で分析することができる。ＤＮＡは、試料から直接、単離することができるか、または他の細胞成分（たとえばＲＮＡまたはタンパク質）の単離後、単離することができる。ＤＮＡ単離に対しては、キットが利用可能であり、たとえば、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）がある。ＤＮＡは、そのようなキットを用いても増幅することができる。
【００７２】
他の実施形態において、マーカーに対応するｍＲＮＡは、当分野に公知の方法を用いて、生物学的試料中でｉｎ  ｓｉｔｕおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の形式で分析することができる。発現レベルを測定するための方法の例を、実施例に含める。たとえば、核酸プローブを用いて、マーカーにハイブリダイズさせ、プローブがハイブリダイズした量を測定することができる。多くの発現検出法で、単離ＲＮＡが用いられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法においては、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、腫瘍細胞からのＲＮＡ精製に用いることができる（たとえば、Ausubel  et  al.,  ed.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  New  York  1987-1999を参照のこと）。さらに、多くの組織試料が、当業者に公知の方法を用いて容易に処理することができ、たとえば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ(1989,  U.S.  Patent  No.  4,843,155)の、シングルステップＲＮＡ単離法がある。ＲＮＡは、標準法（たとえば、Chomczynski  and  Sacchi  (1987)  Anal.  Biochem.162:156-159を参照のこと）、標準溶液（たとえば、ｔｒｉｚｏｌ、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ；米国特許第５，３４６，９９４号を参照のこと）、または標準キット（たとえば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｇｒｏｕｐ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）単離キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）または、ＬＥＵＫＯＬＯＣＫ（商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｂｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて単離することができる。
【００７３】
ＲＮＡ試料からＤＮＡを除去するために、さらなるステップを行っても良い。細胞溶解は、非イオン洗剤で行うことができ、次いで、微量遠心により核（つまりは、細胞ＤＮＡの大部分）を除去することができる。次いで、ＤＮＡを、ＤＮＡ分析のために核から単離することができる。１つの実施形態において、ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジウム溶解、次いで、ＣｓＣｌ遠心を行ってＤＮＡからＲＮＡを分離することにより、対象の様々なタイプの細胞から単離される（Chirgwin  et  al.  (1979)  Biochemistry  18:5294-99）。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏ−ｄＴセルロースでの選択により、選別される（Sambrook  et  al.  (1989)  Molecular  Cloning--A  Laboratory  Manual  (2nd  ed.),  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.を参照のこと）。あるいは、ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、有機抽出により行うことができ、たとえば、熱したフェノール、またはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで行うことができる。もし所望であれば、ＲＮＡｓｅ阻害剤を、溶解緩衝液に加えても良い。同様に、ある細胞タイプに対しては、タンパク質変性／消化ステップをプロトコールに加えることが望ましい。多くのアプリケーションにとって、たとえばトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の他の細胞ＲＮＡに対して、ｍＲＮＡを富化させることが望ましい。ほとんどのｍＲＮＡは、その３´末端にポリ（Ａ）テールを有している。これにより、たとえばセルロースやＳＥＰＨＡＤＥＸ．Ｒ（商標）メディウム等の固形支持体に連結させたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、ｍＲＮＡを富化させることができる（Ausubel  et  al.  (1994)  Current  Protocols  In  Molecular  Biology,  vol.  2,  Current  Protocols  Publishing,  New  Yorkを参照のこと）。結合した時点で、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳを用いて、アフィニティカラムから溶出される。
【００７４】
たとえば検証対象から生物学的試料（たとえば、骨髄試料、腫瘍生検または基準試料）を得た後の、生物学的試料中の本発明のマーカーの特性は、たとえば核酸（たとえば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等）の特性および／または翻訳されたタンパク質の特性を、広く公知の任意の測定法または検出法により評価されてもよい。そのような方法の非限定的な例としては、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能分析または活性分析、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。これらの方法としては、遺伝子アレイ／チップ技術、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、たとえばＧＬＰ認証実験条件下でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学法、免疫ブロッティング、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、ＦＡＣＳ分析、ノーザンブロット、サザンブロット、ＩＮＦＩＮＩＵＭ（登録商標）ＤＮＡ分析ＢｅａｄＣｈｉｐｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、定量的ＰＣＲ、細菌人工染色体アレイ、一塩基変異多型（ＳＮＰ）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）または細胞遺伝学的解析が挙げられる。本発明の検出法は、ゆえに、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的試料中のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために用いることができる。さらに、本発明のマーカーに対応する核酸またはポリペプチドの検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技術には、バイオマーカー（たとえば、バイオマーカーの転写物に相補的な核酸、または標識抗体、Ｆｃ受容体もしくはポリペプチド（たとえば、野生型または変異マーカー）に結合する抗原）を検出するための標識プローブを対象に導入することが含まれる。たとえば、抗体は、放射性同位体で標識することができ、その対象内の存在および位置を標準的な画像技術で検出することができる。これらの分析法は、様々な方法で実施することができる。当業者であれば、マーカー（複数含む）、組織試料および問題となっている変異の性状に基づき、これらの中から、または他の適切で利用可能な方法の中から選択することができる。いくつかのの方法を後述の項にてより詳細に記述する。異なるケース、または、たとえば腫瘍の異なる型もしくは異なる型の患者群においては、異なる方法または方法の組み合わせが適切な場合もある。
【００７５】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの技術としては、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、タンパク質アレイ、免疫沈降および免疫蛍光法が挙げられる。そのような例において、マーカーの発現は抗体（たとえば、放射線標識、クロモフォア標識、フルオロフォア標識または酵素標識抗体）、抗体誘導体（たとえば、基質が結合した抗体、またはタンパク質−リガンド対（たとえば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質もしくはリガンドが結合した抗体）または、抗体断片（たとえば、単鎖抗体、単離抗体超可変ドメイン等。マーカータンパク質またはその断片（その構造関係の中で変異した、または変異した配列もしくは変異した残基を含有する部分である領域を含有する断片またはタンパク質であり、その正常な翻訳後修飾のすべて、または一部を受けているマーカータンパク質を含む）と特異的に結合する）を用いて分析される。抗体は、配列番号３、６、１０、１１、１４、１７、２０および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を検出することができる。あるいは、抗体は、配列番号３、６、１０、１１、１４、１７、２０および２３の変異からなる群から選択される変異アミノ酸配列を有する変異タンパク質を検出することができる。たとえばｄｂＧａＰのＣＯＳＭＩＣ等の公共データベースで変異として列挙されている残基は、その変異残基を特異的に認識および結合する抗体の作製のための免疫原性の組成物で調製することができる。他の方法で抗体の対を使用することもでき、ここで、その対のうちの１つは、マーカータンパク質の上流、すなわち、変異予測領域（たとえば、ナンセンスまたは欠損）のＮ末端に結合し、対の他方は、タンパク質の下流に結合する。野生型タンパク質は、対の両方の抗体に結合するが、ナンセンスまたは欠損変異があるタンパク質は、対のうちＮ末端抗体のみしか結合しない。たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ分析法等の分析法により、腫瘍試料中の野生型タンパク質の失われた量を、たとえば基準試料との比較で検出してもよい。または標準的なＥＬＩＳＡ法により、抗体の結合レベルを比較し、腫瘍試料中に変異が存在するかを推測してもよいだろう。
【００７６】
タンパク質マーカーの量または機能性を検出するための間接的な方法としては、タンパク質の活性測定が挙げられる。たとえば、試料、または試料から単離されたタンパク質、または試料から単離、クローニング、増幅された核酸から発現されたタンパク質で、マーカータンパク質の活性を分析することができる。ＮＦ２活性を、結合パートナーに結びつくその能力により測定することができ、たとえば、セルフリーアッセイまたはセルベースのアッセイで測定することができる。１つの例においては、ＮＦ２の赤血球膜またはｐ５５／ＭＰＰ１に結合する能力を測定することができる（Seo  et  al.  (2009)  Exp.  Biol.  Med.  234:255-262）。他の例においては、ＳＭＡＤ４活性を、シグナル伝達におけるその活性により測定することができ、たとえば、セルフリーアッセイまたはセルベースのアッセイで測定することができる。１つの例において、ＳＭＡＤ４のリン酸化状態を測定することができ、ＳＭＡＤ４のＳｍａｄ−結合エレメントでのＤＮＡへの結合は、たとえば、ゲルシフトアッセイまたはレポーターアッセイで測定することができ（see,  e.g.,  Kuang  and  Chen  (2004)  Oncogene  23:1021-1029）、または核と細胞質の間のＳＭＡＤ４の移動は、細胞画像上で可視化し、定量化することができる。他の例においては、ＫＤＭ６Ａ活性を、たとえばヒストン等、タンパク質を脱メチル化するその活性により測定することができる。たとえば、アッセイにより、ヒストン３のリジン２７の脱メチル化レベルを測定することができる（Hong  et  al.  (2007)  PNAS  104:18439-18444）。他の例においては、ＦＢＸＷ７活性を、サイクリンＥに結合する活性、またはＳｋｐ−ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ｂｏｘユビキチンリガーゼ複合体の中に組み込まれる活性により測定することができる。他の例においては、ＴＰ５３の活性を、ＤＮＡに結合する活性または、四量体を形成する活性により測定することができる。
【００７７】
１つの実施形態において、マーカーの発現は、患者試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製し、そしてｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと、マーカー核酸と相補的かまたはその断片である参照ポリヌクレオチド（たとえば、ハイブリダイゼーションプローブ等の単離核酸プローブ）とをハイブリダイズすることにより、分析される。ｃＤＮＡは、任意選択的に、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、任意の様々なポリメラーゼ鎖反応法を用いて増幅されてもよい。同様に、１つ以上のマーカーの発現を、定量的ＰＣＲを用いて検出し、マーカー（複数含む）の発現レベルを評価してもよい。ｍＲＮＡレベル測定の使用例は、マーカー遺伝子中の不活性変異によって細胞中のｍＲＮＡレベルの変化をもたらしうることである。そのレベルは、機能性ではない、またはタンパク質が無いことでタンパク質産生のシグナル伝達のフィードバックが働き上方調節され、または、変化したｍＲＮＡ配列の不安定さにより下方調節される。あるいは、本発明のマーカーの変異または変異体（たとえば、上述の一塩基変異多型、欠損等）を検出するための多くの公知の方法のうち任意のものを用いて、患者のマーカー遺伝子中の変異発生を検出してもよい。
【００７８】
直接測定の例としては、転写物の定量がある。本明細書において、発現レベルまたは発現量とは、マーカーによりコードされるｍＲＮＡ発現の絶対量または、マーカーによりコードされるタンパク質発現の絶対量を指す。選択マーカーの絶対発現量に基づく測定実施に代わり、正規化された発現量に基づいて測定が行われても良い。発現量は、マーカーの絶対発現レベルを、マーカーではない対照マーカー（たとえば、恒常的に発現されているハウスキーピングの役割にあるもの）の発現量と比較することで補正することにより正規化されてもよい。正規化のための適切なマーカーとしてはまた、ハウスキーピング遺伝子（たとえば、アクチン遺伝子またはβ２マイクログロブリン等）が挙げられる。データ正規化の目的のための参照マーカーとしては、偏在的に発現されているマーカー、および／またはその発現が癌遺伝子により制御されていないマーカーが挙げられる。恒常的に発現されている遺伝子は当分野に公知であり、適切な組織および／または患者の状況、ならびに分析法に応じて、特定および選択することができる。そのような正規化により、１つの試料中の発現レベルと、他の試料中の発現レベルとを比較する（たとえば、異なる時間または異なる対象から得られた試料間で比較する）ことができる。さらに、発現レベルは、相対発現レベルとして提供されてもよい。ゲノムＤＮＡ試料のベースライン（たとえば、２倍体コピー数）は、腫瘍を有していない対象由来の細胞中の量、または患者の非腫瘍細胞中の量を測定することにより決定することができる。マーカーまたはマーカーセットの相対量測定については、問題となっている試料の発現レベル測定の前に、ベースラインを確立するために、少なくとも１、または２、３、４、５またはそれ以上の数の試料（たとえば、７、１０、１５、２０または５０以上の試料）に対して、マーカーまたはマーカーセットの量が測定される。ベースライン測定を確立するために、多量の試料で分析された各マーカーまたはマーカーセットの平均量または平均レベルを決定し、これを、問題となっているバイオマーカーまたはバイオマーカーセットに対するベースライン発現レベルとして用いる。検証試料に対して測定されたマーカーまたはマーカーセットの量（たとえば、発現の絶対レベル）は、次いで、そのマーカーまたはマーカーセットに対して得られたベースライン値により割られる。これにより相対値が得られ、マーカータンパク質活性の異常レベルの特定に役立たせることができる。
【００７９】
本発明の核酸分子配列に基づくプローブを用いて、本発明のマーカーの１つ以上に対応する転写物またはゲノム配列を検出することができる。プローブは、プローブに付着する標識群（たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子等）を含有することができる。そのようなプローブを、当該タンパク質を発現している細胞または組織を特定するための診断テストキットの一部として用いて、たとえば患者由来の細胞試料中の当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定することにより、たとえばｍＲＮＡレベルを測定、または当該タンパク質をコードする遺伝子が変異または欠損しているかどうかを判定することができる。
【００８０】
本明細書に記述されるデータベースの記録中に記述される核酸配列に加え、当業者であれば、群（たとえば、ヒトの群）の中に、アミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列の多形が存在していることを、理解することができる。そのような遺伝子的多形は、対立遺伝子変異が自然発生することにより、群の中で、個々の間に存在しうる。対立遺伝子は、所与の遺伝子座で代替的に発生する遺伝子群のうちの１つである。さらに、ＲＮＡの発現レベルに影響を与えるＤＮＡ多形は、その遺伝子の全体の発現レベルに影響を与えうる（たとえば、制御または分解に影響を与えることにより）ものとしてもまた存在することができることが理解される。
【００８１】
プライマーおよび核酸プローブは、特定のマーカーまたはその変異領域に相補的なヌクレオチド配列を含有し、マーカー遺伝子またはマーカー遺伝子に関連した核酸に選択的にハイブリダイズするのに十分な長さであり、たとえば、塩基配列特異的に核酸に結合することができ、そして洗浄の後も結合したままでいられる。プライマーとプローブは、マーカー核酸の単離および配列解析に役立つように用いることができる。１つの実施形態において、プライマーまたは核酸プローブ、たとえば、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、単離核酸は、たとえばストリンジェントな条件下で、約６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、２００、３５０、５００もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドのマーカー遺伝子、または、マーカー遺伝子もしくはその転写物もしくは相補物の変異を含有する領域へとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する領域を含有する。他の実施形態において、プライマーまたは核酸プローブは、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、または、染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０上の配列、または、任意の前述の相補物のうちの任意のものに規定される任意の配列のヌクレオチド配列を含有するマーカー核酸にハイブリダイズすることができる。たとえば、少なくとも約１０の連続的なヌクレオチド、少なくとも約１５の連続的なヌクレオチド、少なくとも約２５の連続的なヌクレオチド、少なくとも約３５の連続的なヌクレオチド、少なくとも約５０の連続的なヌクレオチドのヌクレオチド配列を含有するプライマーまたは核酸プローブが本発明により提供され、または、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、または、染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０上の配列、または、任意の前述の相補物の任意のものに規定される約１５〜約２０ヌクレオチドを有するプライマーまたは核酸プローブが、本発明により提供される。約２５、４０または５０ヌクレオチドを超える配列を有するプライマーまたは核酸プローブもまた本発明の範囲内にある。他の実施形態において、プライマーまたは核酸プローブは、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、または、染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０上の配列、または任意の前述の相補物のうちの任意のものに規定される任意の配列のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％もしくは８５％、または少なくとも９０％、９５％もしくは９７％の同一性の配列を有することができる。核酸類似体を、ハイブリダイゼーションの結合部位として用いることができる。適切な核酸類似体の例としては、ペプチド核酸（たとえば、Egholm  et  al.,  Nature  363:566  568  (1993)；米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）がある。
【００８２】
いくつかの実施形態において、核酸プローブは、野生型配列に結合するように設計することができ、その領域中に変異が存在すると、そのプローブによる結合またはハイブリダイゼーションの減少（たとえば測定可能な減少）がもたらされる。他の実施形態において、核酸プローブは、変異配列に結合するように設計することができ、その領域に変異が存在すると、そのプローブによる結合またはハイブリダイゼーションの増加がもたらされる。他の実施形態において、プローブおよびプライマーセットまたはプライマー対は、変異を有するマーカー中の領域を囲むように設計することができ、そのセットまたは対に基づく増幅により、変異を特定するための配列解析を行うことができる核酸を得ることができる。
【００８３】
プライマーまたは核酸プローブは、結合エネルギー、塩基組成、配列複雑性、交差−ハイブリダイゼーション結合エネルギーおよび二次構造を考慮したアルゴリズムを用いて選択することができる（Friend  et  alらの国際特許出願公開ＷＯ０１／０５９３５（２００１年１月２５日公開）；Hughes  et  al.,  Nat.  Biotech.  19:342-7  (2001)を参照のこと）。本発明の有用なプライマーまたは核酸プローブは、各転写物にユニークな配列（たとえば、標的変異領域）に結合し、その特定の核酸（たとえば、転写物または変異転写物）のみを増幅、検出および配列解析するためのＰＣＲに用いることができる。マーカー遺伝子（たとえば、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６ＡおよびＦＢＸＷ７）のいくつかの変異の例が、実施例の表に見出される（表８〜１１）。他の変異は、本明細書に引用される参照文献および本明細書に記述される公共データベースに記載されている。当業者であれば、当分野公知の技術（たとえば、標準配列、変異または対立遺伝子変異に結合するプライマーまたは核酸プローブの可能性を、そのプライマーおよび核酸プローブ中のＧＣ含有量および縮重を操作することにより、調節すること）を用いて、本明細書に記述されるマーカーおよび同様の特性を有する関連マーカー（たとえば、染色体遺伝子座上のマーカー、または本明細書に記述されるものと同じマーカー遺伝子の異なる領域の変異）に対するプライマーおよび核酸プローブを設計することができる。当分野に公知のコンピュータープログラム（たとえば、Ｏｌｉｇｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ））を用いて、要求される特異性および最適な増幅特性を有するプライマーを設計することができる。完全に相補的な核酸プローブおよびプライマーを、本明細書に記述されるマーカーおよび変異、多形またはその対立遺伝子の検出に用いることが出来るが、完全相補性からの逸脱も企図する範囲内であり、そのような逸脱により、その分子が標的領域に特異的にハイブリダイズすることが妨げられることはない。たとえば、オリゴヌクレオチドプライマーは、その５´末端に非相補的な断片を有しても良く、そのプライマーの残りの部分は標的領域に相補的であってもよい。あるいは、得られたプライマーまたはプローブが標的領域に特異的にハイブリダイズすることが出来る限りは、非相補的なヌクレオチドがその核酸プローブまたはプライマー内に散在しても良い。
【００８４】
たとえば癌の体細胞変異により不活性化されうる腫瘍抑制物質である、カリンリング（ｃｕｌｌｉｎ  ｒｉｎｇ）リガーゼ経路に関与または相互作用するマーカー遺伝子等の、１マーカー、２マーカー、３マーカーもしくは４マーカーまたはそれ以上（たとえば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５マーカー）、またはその変異部分の量を調べることにより、治療結果の指標を分析することができる。マーカーは、他の治療結果評価基準と組み合わせて調べることができ、たとえば、生化学マーカー（たとえば、骨髄腫のＭタンパク質、蛋白尿等の腎臓の健康状態マーカー、ＮＳＣＬＣに対するＣ応答性タンパク質、またはサイトケラチン１９、サイトケラチン断片２１−１（ＣＹＦＲＡ２１−１）の血清レベル、膀胱癌に対するフィブリノーゲン／フィブリノーゲン分解産物の尿レベル、神経芽細胞腫に対するカテコールアミンの尿レベルもしくは血中レベル、膵臓がんに対する炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）の血清レベルもしくは代謝プロファイリング、中皮腫での可溶性メソテリン−関連ペプチド（ＳＭＲＰ））または組織学的評価（たとえば、芽球カウント、単位領域あたりの有糸分裂像の数、メラノーマ腫瘍、食道腫瘍または膀胱腫瘍の浸潤深度の測定）がある。
【００８５】
統計的手法により、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等のマーカー量の測定による治療予後の決定を支援することができる。１つのマーカーの量を、多様な時点で測定することができ、たとえば、剤（たとえばＮＡＥ阻害剤）での治療前、治療中、治療後で計測することができる。たとえば時間と共にベースラインからマーカー発現の変化が進行していることを決定するために、発現結果を、反復測定線形回帰モデル（Littell,  Miliken,  Stroup,  Wolfinger,  Schabenberger  (2006)  SAS  for  Mixed  Models,  2nd  edition.  SAS  Institute,  Inc.,  Cary,  NC)）により分析することができる：
【数１】
2018050634.tif 000004
ここで、Ｙｉｊｋは、ｉ番目の治療を受けたＪ番目の動物の、Ｋ日目でのｌｏｇ２変換された発現（ハウスキーピング遺伝子に対して正規化された）であり、Ｙｉｊ０は、ｉ番目の治療を受けたＪ番目の動物の、規定ベースラインｌｏｇ２転換発現（ハウスキーピング遺伝子に対して正規化された）であり、ｄａｙｋは、カテゴリー変数として扱われ、そしてεｉｊｋは、残余誤差項である。共分散行列（たとえば、１次自己回帰、化合物シンメトリー、空間パワー法則（ｓｐａｔｉａｌ  ｐｏｗｅｒ  ｌａｗ））は、時間とともに各動物で繰り返し測定されたモデルに対し指定することができる。さらに、各処置時点は、処置値がビヒクルとは有意に異なるかどうかを検証するために、ビヒクル群の同時点と戻り比較することができる。
【００８６】
データを分析するために、他の多くの方法を用いることができる。たとえば、相対発現値を、サイクル数の代わりに分析することができる。これらの値を、倍数変化、またはベースラインからの絶対差のいずれかとして検証してもよい。さらに、もし分散が全ての群および時点にわたり等しい場合には、反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いてもよい。最終（または他の）時点で観察されたベースラインからの変化は、小さなサンプルサイズのデータの有意差検定に対しては、対応ｔ検定、フィッシャー直接検定（ｐ値＝ΣＰ（Ｘ＝ｘ）、ｘ＝１から、ＮＡＥ阻害に感受性を示すと検証された状態（たとえば変異）の数値まで）を用いて分析してもよく、または、データが正規分布していない場合には、腫瘍患者が、正常な対象から有意差があるかどうかを比較するためにウィルコクソン符号順位検定を用いて、分析されてもよい。
【００８７】
１つの時点から次の時点までの量の差異、または腫瘍試料と正常試料の間の量の差異は、治療結果の予測を示しうる。ベースラインレベルは、治療の前（たとえば、ゼロ時点、治療の１日前、３日前、１週前および／または２週前かそれ以上）に、１、２、３、４またはそれ以上の回数、発現を測定することにより決定することができる。あるいは、ベースラインレベルを、多くの対象（たとえば同じ健康状態もしくは疾患状態にある正常対象または患者で、上述の治療をまだ受けていない、または受けない対象）から、決定することができる。あるいは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）プログラムに預託された発現値を用いることができる。たとえば、プロテアソーム阻害療法の前に試料採取された骨髄腫のｍＲＮＡ発現量のデータベースとしては、ＧＥＯアクセッション番号ＧＳＥ９７８２（Mulligan,  et  al.  (2006)  Blood  109:3177-88においてもまた分析されている）、およびＧＳＥ６４７７（Chng  et  al.  (2007)  Cancer  Res.  67:292-9でも分析されている）が挙げられる。腫瘍に対する治療効果を検証するために、マーカーの発現を、何らかの治療後の任意の時点または複数の時点（たとえば、治療の１日後、２日後、３日後、５日後、１週後、２週後、３週後、４週後、１か月後、２か月後、３か月後および／または６か月後かそれ以上）で測定してもよい。たとえば、マーカーの量は、何らかの治療後に一度、測定してもよく、または複数の間隔（たとえば、治療の間の、１週間隔、２週間隔、４週間隔または２か月間隔、３か月間隔、またはそれ以上）で測定しても良い。いくつかの実施形態において、治療の間のマーカー測定と、ベースライン時点での同一マーカー測定とを比較してもよい。他の実施形態において、治療の間のマーカー測定と、それより前の時点での同一マーカー測定とを比較してもよい。逆に、治療レジメン投与の中止後、進行性疾患の発症を測定するために、マーカーの量を任意の時点または複数の時点（たとえば、最後の治療の１日後、２日後、３日後、５日後、１週後、２週後、３週後、４週後、１か月後、２か月後、３か月後および／もしくは６か月後またはそれ以上）で測定してもよい。治療後のマーカー測定を、治療の終了時点での同一マーカー測定と比較してもよい。当業者であれば、様々な要因（たとえば、治療法の薬物動態学、治療継続期間、治療法の薬物力学、患者の年齢、疾患の性質または治療法の活性メカニズム等）に応じて、マーカーの量を分析する時点（複数含む）を決定するであろう。ベースラインもしくは予備測定されたＮＡＥ阻害療法に対する感度マーカーの標準発現に対して、負の傾向または相対量の減少（たとえば、表３に特定される感度マーカーの減少）は、たとえば抵抗性の増加等の、治療に対し腫瘍の応答性が減少していることを示唆する可能性がある。ベースラインまたは予備測定された治療結果マーカーの発現標準に対して、好ましい結果に向かう傾向にある場合、その治療レジメンの有効性または治療が継続して奏功していることを示唆する。抵抗性マーカーが増加する傾向にある場合��たとえば、表３に特定される抵抗性マーカーの増加等）、好ましくない結果を示唆する可能性がある。
【００８８】
任意のマーカー（たとえば、本発明のマーカー遺伝子等のマーカー遺伝子またはマーカーの組み合わせ、またはそれらの変異体、ならびに、たとえば本発明のマーカー遺伝子等のマーカーと組み合わせた任意の公知のマーカー）を、本発明の組成物、キットおよび方法に用いても良い。通常、可能な限りマーカー遺伝子の変異状態を評価する能力が良いマーカーを選択し、ＮＡＥ阻害物質での治療結果を予測する。たとえば、マーカー選択は、たとえば腫瘍細胞を含有する試料中のマーカーのサイズ、配列、組成または量等の特性と、対照細胞中の同一マーカーのサイズ、配列、組成または量等の特性の間の差異を、可能な限り最大化するものを選択する。この差異は、そのマーカーの量を分析する方法の検出限界と同じくらい小さいものであり得るが、他の実施形態においては、その差異は、少なくとも分析法の標準誤差より大きくあり得る。ＲＮＡまたはタンパク質の量の場合、差異は、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、１００、５００、１０００倍かそれ以上であっても良い。「低い」ＲＮＡまたはタンパク質の量は、腫瘍試料（たとえば、骨髄腫等の血液系腫瘍）全体の平均に対する発現が低いという可能性がある。たとえばコピー数等のＤＮＡの量の場合、量は、０、１、２、３、４、５、６かそれ以上のコピー数である。欠損により、コピー数が０または１となり、増幅により、コピー数が２より大きくなる。たとえば、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０２、Ｐ＜０．０１またはそれ以下のｐ値の信頼水準により、その差異が認定されてもよい。
【００８９】
２つ以上のマーカー（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは２５またはそれ以上のマーカーのセット）の測定により、発現プロファイルまたは、治療結果を暗示する傾向が提供されうる。いくつかの実施形態において、マーカーセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、または２５を超えないのマーカーを含有する。いくつかの実施形態において、マーカーセットには、複数の染色体遺伝子座、複数のマーカー遺伝子、または１つ以上のマーカー遺伝子（たとえば、核酸およびタンパク質、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ、または本明細書に記述されるマーカーの様々な組み合わせ）の複数のマーカーを含む。セット中のマーカーの量の分析を介した治療結果の分析は、セット中のマーカー量の治療結果の分類または傾向への貢献に影響を与えうる変数（たとえば、各マーカーのハイブリダイゼーション効率または測定の信号対ノイズ比）を説明する重み付き投票分析等の統計的手法に付随して行うことができる。マーカーセット（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは２５またはそれ以上のマーカーのセット）は、本明細書に記述されるマーカーＤＮＡまたはＲＮＡ（たとえば、染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４、または、前述の任意のものの相補物）の少なくとも１つを分析するためのプライマー（複数含む）またはプローブを含有しても良い。マーカーセット（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは２５またはそれ以上のマーカーのセット）は、少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つかそれ以上のマーカー、または、たとえばＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４および／またはＦＢＸＷ７等のマーカー上の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは２５またはそれ以上の変異を検出するためのプライマー（複数含む）またはプローブを含有してもよい。他の実施形態において、マーカーセットは、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４および／またはＫＤＭ６Ａの特性を分析するためのマーカーを含有してもよい。１つの実施形態において、子宮または子宮頚の癌に対するマーカーセットは、ＦＢＸＷ７の少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを少なくとも１つ含有する。１つの実施形態において、腸管、胸部、肺、頭頚、子宮頚または皮膚の癌に対するマーカーセットは、ＴＰ５３の少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを少なくとも１つ含有する。１つの実施形態において、腸管の癌に対するマーカーセットは、ＴＰ５３およびＡＰＣのそれぞれの少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを含有する。１つの実施形態において、皮膚または中枢神経系の癌に対するマーカーセットは、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４の少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを少なくとも１つ含有する。１つの実施形態において、頭頸部または皮膚の癌に対するマーカーセットは、ＣＤＫＮ２Ａの少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを少なくとも１つ含有する。１つの実施形態において、頭頸部の癌に対するマーカーセットは、ＳＭＡＤ４の少なくとも１つの特性を分析するためのマーカーを少なくとも１つ含有する。選択されたマーカーセットは、本明細書に提供されるマーカーから作られるか、または本明細書に提供される方法および当分野に公知の類似方法を用いたマーカーの間から選択されてもよい。本発明のアッセイに用いるための新しいマーカーを適格と認定するための方法は、マーカー（たとえば、マーカー遺伝子等）の発現の差異（たとえば、ベースラインからの倍数変化等）を有する腫瘍細胞を含有する試料中のＤＮＡコピー数の相互関係を示すことである。その関係性を評価する有用な方法は、ピアソンの積率相関係数である、ｒの値を求めた後、決定係数ｒ２を算出すること、および／または、標準的な統計法を用いて最小二乗プロットを作成することである。相関により、ＤＮＡコピー数対マーカー（たとえばマーカー遺伝子）の発現レベルを分析することができる。遺伝子産物は、相関（ｒ２、たとえば、本分析におけるデータの線形勾配）の結果が少なくとも０．１〜０．２、少なくとも０．３〜０．５、または少なくとも０．６〜０．８かそれ以上である場合、マーカーとして選択することができる。マーカーは、応答性、ＴＴＰまたは生存率に対する正の相関で変化することができる（すなわち、コピー数が減少する場合に減少する等、コピー数と同じ様式で発現レベルが変化する）。コピー数に対して負の相関で変化するマーカー（すなわち、コピー数が減少する場合に増加する等、コピー数と反対の様式で発現レベルが変化する）は、一貫しない結果決定を提供する。
【００９０】
アッセイに用いるための新しいマーカーを適格と認定する他の方法は、多くの対象における多くのマーカーの、検証剤での治療前後の発現を分析することである。発現結果から、治療前の試料と比較して、治療後に一定方向で大きな変化を示すマーカーを特定することができる。反復測定線形回帰モデルを確立し、統計的に有意な変化または差異を示す遺伝子を特定することができる。次いで、これらの有意な遺伝子をランク付けるために、たとえばベースライン対時間曲線等の変化の下の領域を算出することができる。これにより、統計的に最も大きな有意の変化を示す遺伝子のリストが作られる。次いで、いくつかのマーカーは、主成分分析、クラスタリング法（たとえば、階層的なｋ−ｍｅａｎｓ法）、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）または線形回帰法等の方法を用いて、セット中に共に組み合わせることができる。マーカーとしてそのような遺伝子（または遺伝子群）を用いるために、ベースラインから２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、７、１０倍かそれ以上の発現差異を示す遺伝子を、マーカーセット中に含めることとなる。発現プロファイル（たとえば、ベースラインまたは総マーカーセットの基準からの発現レベル差異の合成物）は、たとえば、マーカーの大部分（たとえば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％かそれ以上のマーカー）が特定の結果（たとえば、ベースラインまたは基準からの有意差）を示す場合；または、たとえば１０％超、２０％超、３０％超、４０％超のより多いマーカーが、他の方向ではなく１つの方向で有意な結果を示す場合、ある傾向にあることを示す。
【００９１】
本発明の組成物、キットおよび方法が、患者の治療結果の特性化のために用いられる実施形態の場合において、本発明のマーカーまたはマーカーのセットは、検証剤で治療を受けた患者の少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、６０％もしくは８０％、または実質的にすべてにおいて、有意な結果が得られるように選択される。本発明のマーカーまたはマーカーセットは、母集団の約１０％超に正の予測値（ＰＰＶ）が得られるように選択されてもよく、および、ＰＰＶが８０％超のアッセイ特異度と関連づけられた場合には、マーカーへのさらなる信頼度が推測される。
【００９２】
治療剤
本発明のマーカーおよびマーカーセットは、患者（たとえば癌患者（たとえば、血液のがん（たとえば多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫）または固形腫瘍癌（たとえば、メラノーマ等の皮膚癌、食道がん等の頭頸部癌、膀胱癌、小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）等の肺癌、肺の腺癌、たとえば脳内への肺癌転移や神経芽細胞腫等の中枢神経系の癌、膵臓がん、乳癌、中皮腫、子宮頸癌、たとえば大腸癌もしくは直腸の腺癌等の腸管の癌）を有する患者））における治療の好ましい結果の尤度（たとえば、治療剤に対する感受性）を、本発明のマーカー（複数含む）の組成または量等の特性に影響を与えるその能力に基づき、分析する。この予測を用いて、癌治療を評価し、各カテゴリーにおいて患者に対して最も適した治療レジメンを設計することができる。
【００９３】
特に、本方法を用いて、上述の項で記述されたように、ＮＡＥ阻害物質に対する患者の感受性を予測することができる。本発明の方法で検証される剤は、単剤または剤の組み合わせであってもよい。本発明の方法は、ＮＡＥ阻害療法と、プロテアソーム阻害療法および／または他の剤もしくは追加の剤（たとえば、化学療法剤からなる群から選択される）との組み合わせを含んでも良い。たとえば、本発明を用いて、化学療法剤の単剤（たとえば、ＭＬＮ４９２４等のＮＡＥ阻害物質）を用いて癌を治療できるかどうか、または１つ以上の剤をＮＡＥ阻害物質（ＭＬＮ４９２４等）と組み合わせて用いるべきかどうかを決定することができる。有用な組み合わせとしては、異なる作用メカニズムを有する剤が挙げられる（たとえば、ＮＡＥ阻害物質とアルキル化剤を組み合わせた抗有糸分裂剤の使用）。
【００９４】
本明細書において、「プロテアソーム阻害物質」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームの酵素活性を直接阻害する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害物質は、ボロン酸ペプチジルである。本発明の方法における使用に適したボロン酸ペプチジルプロテアソーム阻害物質の例は、Adamsらの米国特許第５，７８０，４５４号（１９９８）、第６，０６６，７３０
号（２０００）、第６，０８３，９０３号（２０００）、第６，２９７，２１７号（２００１）、第６，４６５，４３３号（２００２）、第６，５４８，６６８号（２００３）、第６，６１７，３１７号（２００３）、および第６，７４７，１５０号（２００４）に記載され、それらは各々、参照により、その中に記述される全ての化合物および処方を含む、その全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、ボロン酸ペプチジルプロテアソーム阻害物質は、Ｎ（４モルホリン）カルボニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；Ｎ（８キノリン）スルホニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；Ｎ（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸、およびＮ（４モルホリン）−カルボニル−［Ｏ−（２−ピリジルメチル）］−Ｌ−チロシン−Ｌ−ロイシンボロン酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、プロテアソーム阻害物質は、Ｎ（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（ボルテゾミブ；ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）；以前はＭＬＮ３４１またはＰＳ−３４１として知られていた）である。公表文献において、開示されたボロンエステルおよびボロン酸化合物の使用により筋タンパク質の分解率が減少すること、細胞のＮＦ−κＢ活性が減少すること、細胞のｐ５３タンパク質の分解率が減少すること、細胞のサイクリン分解を阻害すること、癌細胞の増殖を阻害すること、およびＮＦ−κＢ依存性細胞接着が阻害されることが記述されている。ボルテゾミブは、酵素の活性部位の１つにしっかりと結合する（Ｋｉ＝０．６ｎＭ）ことにより、プロテアソームを特異的に、および選択的に阻害する。ボルテゾミブは選択性の細胞毒性があり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、新規の細胞毒性パターンを有することが明らかになっている。Adams  J,  et  al.  Cancer  Res  59:2615-22.(1999)。
【００９５】
さらに、プロテアソーム阻害物質として、ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害物質（Steinらの米国特許第５，６９３，６１７号  （１９９７）；Simanらの国際特許公開ＷＯ９１／１３９０４；Iqbal  et  al.,  J.  Med.  Chem.  38:2276-2277  (1995)；およびIinumaらの国際特許公開ＷＯ０５／１０５８２６（それら各々は、その全体で参照により本明細書に援用される））、ペプチジルエポキシケトンプロテアソーム阻害物質（Crewsらの米国特許第６，８３１，０９９号；Smythらの国際特許公開ＷＯ０５／１１１００８；Bennettらの国際特許公開ＷＯ０６／０４５０６６；Spaltenstein  et  al.  Tetrahedron  Lett.  37:1343  (1996);  Meng,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  96:  10403  (1999)；および、Meng,  Cancer  Res.  59:  2798  (1999)）、α−ケトアミドプロテアソーム阻害物質（Chatterjee  and  Mallamoの米国特許第６，３１０，０５７号（２００１）および第６，０９６，７７８号（２０００）；ならびに、Wangらの米国特許第６，０７５，１５０号（２０００）および第６，７８１，０００号（２００４））、ペプチジルビニルエステルプロテアソーム阻害物質（Marastoni  et  al.,  J.  Med.  Chem.  48:5038  (2005）、ならびに、たとえばRydzewski  et  al.,  J.  Med.  Chem.  49:2953  (2006)および、Bogyo  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  94:6629  (1997)に開示されるペプチジルビニルスルホンおよび２−ケト−１，３，４−オキサジアゾールプロテアソーム阻害物質、アザペプトイド（Bouget  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  11:4881  (2003)；Baudy-Floc’hらの国際特許公開ＷＯ０５／０３０７０７；およびBonnemainsらの国際特許公開ＷＯ０３／０１８５５７）、および、エフラペプチンオリゴペプチド（Papathanassiuの国際特許公開ＷＯ０５／１１５４３１）、ラクタシスチンおよびサリノスポラミドならびにそれらのアナログ（Fenteanyらの米国特許第５，７５６，７６４号（１９９８）、第６，１４７，２２３号（２０００）、第６，３３５，３５８号（２００２）、および第６，６４５，９９９号（２００３）；Fenteany  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1994)  91:3358；Fenicalらの国際特許公開ＷＯ０５／００３１３７；  Palladinoらの国際特許公開ＷＯ０５／００２５７２；Stadlerらの国際特許公開ＷＯ０４／０７１３８２；Xiao  and  Patelの米国特許公開第２００５／０２３１６２号；およびCoreyの国際特許公開ＷＯ０５／０９９６８７）が挙げられる。
【００９６】
本発明の方法でＮＡＥ阻害物質（たとえば、ＭＬＮ４９２４）と組み合わせて用いるための追加の治療剤には、グルココルチコイドステロイドを含有する治療剤の既知の種類を含有することができる。グルココルチコイド療法は、通常、少なくとも１つのグルココルチコイド剤（たとえば、デキサメタゾン）を含有する。本発明のある応用形態において、本発明の方法で用いられる剤は、グルココルチコイド剤である。多発性骨髄腫患者の治療ならびに他の癌治療に利用されるグルココルチコイドの１つの例は、デキサメタゾンである。血液系腫瘍の治療および固形腫瘍の併用療法で利用される追加のグルココルチコイドとしては、ヒドロコルチゾン、プレジゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロンが挙げられる。
【００９７】
ＮＡＥ阻害療法と組み合わせて用いるための他の治療剤としては、化学療法剤が挙げられる。「化学療法剤」には、増殖細胞または組織の増殖（そのような細胞または組織の増殖は望ましいものではない）を阻害する化学試薬を含有することが意図される。たとえば抗代謝剤（たとえば、ＡｒａＡＣ、５−ＦＵおよびメトトレキサート）、抗有糸分裂剤（タキサン、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）、アルキル化剤（たとえばメルファンラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびナイトロジェンマスタード）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（たとえば、ＶＷ−２６、トポテカンおよびブレオマイシン）、鎖切断剤（たとえば、ドキソルビシンおよびミトキサントロン（ＤＨＡＤ））、架橋剤（たとえば、シスプラチンおよびカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ））等の化学療法剤、放射線および紫外線が当分野で公知であり（Gilman  A.G.,  et  al.,  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics,  8th  Ed.,  Sec  12:1202-1263  (1990)）、腫瘍性疾患の治療に一般に用いられている。化学療法に一般に用いられる化学療法剤の例を、以下の表２に列挙する。
【表２−１】
2018050634.tif 000005
【表２−２】
2018050634.tif 000006
【表２−３】
2018050634.tif 000007
【００９８】
本発明の方法で検証される剤は、単剤または併用剤であってもよい。たとえば、本発明の方法を用いて、単剤の化学療法剤（たとえばメトトレキサート）を癌の治療に用いることができるかどうか、または２つ以上の剤の併剤をＮＡＥ阻害物質（たとえばＭＬＮ４９２４）との組み合わせで用いることができるかどうかを、決定することができる。有用な組み合わせとしては、異なる作用メカニズムを有する剤を挙げることができる（たとえば、アルキル化剤およびＮＡＥ阻害物質と組み合わせた抗有糸分裂剤の使用等）。
【００９９】
本明細書に開示される剤は、任意の経路で投与してもよく、皮内、皮下、経口、動脈内、または静脈内の経路が含まれる。１つの実施形態において、投与は、静脈内投与によるものである。非経口投与は、ボーラス投与または点滴で提供することができる。
【０１００】
薬学的に受容可能な混合物中の開示化合物の濃度は、いくつかの要因（投与される化合物の投与量、用いる化合物（複数含む）の薬物動態特性、および投与経路を含む）に応じて変化する。剤は、単回投与または反復投与で投与されてもよい。治療は、多くの要因（患者の全体的な健康状態、ならびに処方および選択された化合物（複数含む）の投与経路を含む）に応じて、毎日、またはより頻繁に行われても良い。
【０１０１】
ＮＡＥ阻害物質のスクリーニング
本発明により、調節剤を特定する方法（または、本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも呼称される）が提供され、すなわち、ＮＡＥまたは他のＥ１酵素変異タンパク質に結合する候補物または検証化合物または剤（たとえば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物質、ペプトイド、小分子または他の薬物）は、たとえばＮＡＥもしくは他のＥ１酵素の発現または酵素活性を刺激または阻害する効果を有し、または、たとえばＮＡＥもしくは他のＥ１酵素基質もしくはＥ１酵素経路（たとえば、ＮＡＥ経路）のタンパク質の発現または活性を、たとえばカリンリングリガーゼの活性との関連で、刺激または阻害する効果を有する。ゆえに、特定される化合物を用いて、治療プロトコールにおいて標的遺伝子産物（たとえば、ＮＡＥまたは他のＥ１酵素遺伝子）の活性を調節し、または、標的遺伝子産物の生物学的機能を変化させ、または、ＮＡＥまたは他のＥ１酵素経路の相互作用を阻害する化合物を特定することができる。
【０１０２】
１つの実施形態において、本発明により、ＮＡＥ阻害物質としての化合物を特定する方法が提供され、たとえば、マーカー遺伝子の少なくとも１つに変異を少なくとも１つ含有する細胞と検証化合物とを最初に接触させ、次いで、細胞の生存率または細胞の増殖阻害を測定することにより、細胞の薬物抵抗性を調節する剤として化合物を特定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、表３に特定される抵抗性遺伝子を含有する。他の実施形態において、細胞は、表３に特定される感受性遺伝子を含有する。ＮＡＥ阻害物質の効果を、当該化合物に曝されていない対照細胞と比較することができる。いくつかの実施形態において、感受性マーカー遺伝子を含有する細胞への剤の効果を、抵抗性マーカー遺伝子を含有する細胞への剤の効果と比較することができる（たとえば、表３を参照のこと）。当該化合物は、細胞の生存率または細胞増殖が減少する場合には、ＮＡＥ阻害物質または薬物抵抗性調節物質として特定される。たとえば抵抗性を調節するＮＡＥ阻害物質として、前述の方法で特定された化合物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０３】
検出方法
予後予測アッセイの原理には、試料または反応混合物（マーカーを含んでも良い）、およびプローブを、適切な条件下で、当該マーカーとプローブが相互作用し結合するのに十分な時間をかけ、調製し、反応混合物中で除去および／または検出することができる複合体を形成することが含まれる。これらのアッセイは、様々な方法で実行することができる。
【０１０４】
たとえば、そのようなアッセイを実行するための１つの方法には、マーカーまたはプローブを固相支持体（基質もまた呼ばれる）上にしっかりと固定すること、固相上に固定された標的マーカー／プローブ複合体を反応の最後に検出することが含まれる。そのような方法の１つの実施形態において、マーカーの存在および／または濃度を分析される対象からの試料を、担体または固相支持体上に固定することができる。他の実施形態において、逆の状況が可能であり、その場合には、プローブが固相上に固定され、対象からの試料はアッセイの非固定成分として反応を行うことができる。そのような実施形態の１つの例として、試料の発現分析のための、固定された予測マーカーもしくはマーカーセットを含有するアレイまたはチップの使用が挙げられる。
【０１０５】
アッセイ成分を固相に固定する方法は多く確立されている。限定されないが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を介して固定されたマーカーまたはプローブ分子が挙げられる。そのようなビオチニル化アッセイ成分は、当分野に公知の技術（たとえば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、およびストレプトアビジンでコートした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に固定することができる。ある実施形態においては、固定化アッセイ成分を有する面を、前もって調製および保存することができる。
【０１０６】
そのようなアッセイに適した他の担体または固相支持体としては、マーカーまたはプローブが属する分子類に結合することができる任意の物質が挙げられる。良く知られている支持体または担体としては、限定されないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、はんれい岩および磁鉄鉱が挙げられる。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適した多くの他の担体を知っており、本発明での使用のために、そのような支持体を適合させることができるであろう。たとえば、細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で泳動し、たとえばニトロセルロース等の固相支持体上に固定することができる。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄し、検出可能な標識抗体で処理することができる。固相支持体を、次いで、再度緩衝液で洗浄し、非結合抗体を除去することができる。固相支持体上の結合標識の量を、次いで、標準的な手段で検出することができる。
【０１０７】
上述の方法でアッセイを実行するために、非固定化成分を固相に添加し、２番目の成分をその上に固定する。反応が完了した後、形成された任意の複合体が固相上に固定されたままでいられるような条件下で、複合体化されなかった成分を（たとえば、洗浄により）除去してもよい。固相に固定されたマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書に説明される多くの方法で行うことができる。
【０１０８】
１つの実施形態において、プローブは、未固定アッセイ成分である場合、当該プローブを、アッセイの検出および読み出しの目的のために、本明細書において論じられる検出可能な標識で、間接的または直接的のいずれかで標識することができ、このことは当業者に非常によく知られている。プローブ（たとえば核酸または抗体等）に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブに連結させる（すなわち、物理的に結び付ける）ことによるプローブの直接標識、ならびに、直接標識された他の試薬との反応性によるプローブの間接標識を包含することが意図される。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出が挙げられる。また、成分（マーカーまたはプローブ）のいずれかもさらに操作または標識することなく、マーカー／プローブの複合体形成を直接検出することが可能であり、たとえば、蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ、たとえば、Lakowiczらの米国特許第５，６３１，１６９号；Stavrianopoulosらの米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）の技術を使用することにより直接検出することが可能である。第一の「ドナー」分子上の蛍光体標識は、適切な波長の入射光での励起で、その発光蛍光エネルギーが第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識により吸収され、次に、その吸収されたエネルギーにより第二のアクセプターが蛍光を発することができるように、選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は単純に、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用しても良い。「アクセプター」分子標識が、「ドナー」のそれとは異なるように、異なる波長を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー転移効率は分子を隔てる距離と関連するため、分子間の空間的な関係を分析することができる。分子間で結合が発生する状況において、アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放出が最大となるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当分野に公知の標準的な蛍光分析検出法（たとえば、蛍光光度計を用いる）を介して簡便に測定することができる。
【０１０９】
他の実施形態において、マーカーを認識するプローブの能力測定は、アッセイ成分（プローブまたはマーカー）のいずれをも標識することなく、たとえばリアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＢＩＡ）等の技術を用いて実行することができる（たとえば、Sjolander,  S.  and  Urbaniczky,  C.  (1991)  Anal.  Chem.  63:2338-2345および、Szabo  et  al.  (1995)  Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  5:699-705を参照のこと）。本明細書において、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、いかなる反応体をも標識することなく、リアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である（たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））。結合表面での質量変化（結合事象の指標）により、対光近見表面の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）がもたらされ、これにより、生物分子間のリアルタイムな反応の指標として使用できる検出可能なシグナルが得られる。
【０１１０】
あるいは、他の実施形態において、類似した診断アッセイおよび予後予測アッセイを、液相中の溶質としてマーカーおよびプローブを使用して実施することができる。そのようなアッセイにおいては、複合体化されたマーカーとプローブは、標準的な多くの技術（限定されないが、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈降等）のうち任意のものを用いて、複合体化されなかった成分から分離させる。分画遠心法において、マーカー／プローブ複合体は、一連の遠心ステップを介して、異なるサイズおよび密度に基づく複合体の異なる沈降平衡により、複合体化されなかったアッセイ成分から分離されてもよい（たとえば、Rivas,  G.,  and  Minton,  A.P.  (1993)  Trends  Biochem  Sci.    18:284-7を参照のこと）。また、標準的なクロマトグラフィー技術を用いて、複合体化された分子を、複合体化されなかった分子から分離させることができる。たとえば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、カラムフォーマット中の適切なゲルろ過樹脂の利用を介して、サイズに基づき分子を分離し、たとえば、相対的に大きな複合体が、相対的に小さな非複合体化成分から分離されうる。同様に、非複合体化成分と比較して、マーカー／プローブ複合体は、相対的に異なる電荷特性を有しており、これにより複合体を、複合体化されなかった成分から、たとえばイオン交換クロマトグラフィー樹脂を利用して、分別する。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に公知である（Heegaard,  N.H.  (1998)  J.  Mol.  Recognit.  11:141-8；Hage,  D.S.,  and  Tweed,  S.A.  (1997)  J.  Chromatogr.  B.  Biomed.  Sci.  Appl.  699:499-525を参照のこと）。また、非結合成分から複合体化された成分を分離するために、ゲル電気泳動も行うことができる（たとえば、Ausubel  et  al.,  ed.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  New  York,  1987-1999を参照のこと）。この技術において、たとえばタンパク質または核酸の複合体は、サイズまたは電荷に基づき分離される。いくつかの実施形態において、電気泳動プロセス中の結合相互作用を維持するために、還元剤を用いない条件下、非変性ゲルマトリックス材料を用いる。特定のアッセイおよびその成分に対する適切な条件は、当業者に公知である。
【０１１１】
単離されたｍＲＮＡは、限定されないが、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ鎖反応およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）およびプローブアッセイを含むハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて用いることができる。ｍＲＮＡレベルを検出する、ある診断法には、単離されたｍＲＮＡと、検出される変異またはその遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（たとえばハイブリダイゼーションプローブ等のプローブ）とを接触させることが含まれる。いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子の変異を含有する核酸を、プローブまたはプライマーとして用いることができる。本発明の核酸プローブまたはプライマーは、一本鎖ＤＮＡ（たとえば、オリゴヌクレオチド）、二本鎖ＤＮＡ（たとえば、二本鎖オリゴヌクレオチド）またはＲＮＡであっても良い。本発明のプライマーは、対象の領域に隣接している核酸配列にハイブリダイズする核酸を指し、たとえば、プライマー伸長もしくは増幅反応において対象の領域全体にわたり伸長することができ、または、対象の領域（たとえば、マーカー遺伝子またはその変異を含有する核酸領域）をカバーする核酸配列にハイブリダイズする核酸を指す。核酸プローブは、たとえば、全長ｃＤＮＡまたはその一部であっても良く、たとえば、マーカー核酸配列またはその相補物の少なくとも７、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または５００かそれ以上の連続したヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下、本発明のマーカーまたはその相補物をコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに十分に特異性でハイブリダイズするものであってもよい。核酸プローブの正確な長さは、当業者により日常的に考慮され、実行される多くの要素に依る。本発明の核酸プローブは、当分野に公知の任意の適切な技法を用いた化学合成により調製されてもよく、組換え技術により製造されてもよく、またはたとえば制限酵素消化等により、生物学的試料から得ても良い。本発明の診断アッセイに用いるための他の適切なプローブが、本明細書に記述される。プローブは、それに付着される標識群（たとえば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、酵素補因子、ハプテン、シークエンスタグ、タンパク質または抗体等）を含有してもよい。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で、改変することができる。核酸標識の例では、ＳＵＰＥＲ（商標）  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｎｏｇｅｎ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、米国特許第７，０４５，６１０号を参照のこと）を用いて組み込まれる。発現レベルは、たとえば増幅されたＤＮＡレベルの測定の後で、全体的な核酸レベルとして測定することができ（たとえば、ＳＹＢＲグリーン色素（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）等のＤＮＡ挿入色素を用いて）、または、たとえば標識されたプローブを有する特定の核酸として、たとえば設計に基づくプローブを用いて測定することができる。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイフォーマットは、信��対雑音比および特異性を挙げるために、プローブベースの設計を用いることができる。
【０１１２】
そのようなプライマーまたはプローブは、たとえば対象由来の細胞試料中の転写核酸分子の量を測定することによりタンパク質を発現している細胞または組織を特定し、たとえばタンパク質をコードしている遺伝子が変異または欠損しているかどうかを決定するための、または転写物、ｍＲＮＡレベルの検出のための診断テストキットの一部として用いることができる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡと核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、問題となっているマーカーが発現されているものであることが示唆される。本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により、マーカータンパク質（たとえば、配列番号３、６、１０、１１、１４、１７、２０、２３または２６の配列を有するタンパク質）をコードする核酸のヌクレオチド配列から異なるが、同じタンパク質をコードする核酸分子を検出することを包含する。当業者であれば、アミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多形が、個体群（たとえば、ヒト個体群）中に存在しうることを認識するであろう。そのような遺伝的多形は、自然発生する対立遺伝子変異により個体群中の個々の間に存在しうる。対立遺伝子は、一定の遺伝子座で代替的に発生する遺伝子群の１つである。そのような自然発生の対立遺伝子変異は、一般的に、一定の遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の相違をもたらしうる。代替的な対立遺伝子は、多くの異なる個体（たとえば、個々由来の正常試料）における対象遺伝子の配列解析を行うことにより特定することができる。これは、様々な個体における同じ遺伝子座を特定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いることにより、容易に実施することができる。そのようなヌクレオチド変異の一部またはすべて、および、結果として生じる機能活性を変化させない自然発生の対立遺伝子変異の結果であるアミノ酸多形または変異を検出することが、本発明の範囲内にあることが意図される。さらに、ＲＮＡの発現レベルに影響を与えるＤＮＡ多形は、またその遺伝子の全体的な発現レベルに影響を与えうる（たとえば、制御や分解に影響を与えることにより）ものとして存在することが、理解されるであろう。
【０１１３】
本明細書において、「ハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に対し、互いに有意に同一または相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズしたままでいる状態を記述することが意図される。いくつかの実施形態において、その状態は、引き続く増幅および／または検出のために、互いに少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、９０％または９５％同一である配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような状態である。ストリンジェントな条件は、関与するヌクレオチド配列の長さにより変化するが、当業者に公知であり、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Ausubel  et  al.,  eds.,  John  Wiley  &  Sons,    Inc.  (1995)の２、４および６項にある技術に基づき見出す、または決定することができる。さらなるストリンジェントな条件およびそのような条件を決定するための方法は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Sambrook  et  al.,  Cold  Spring  Harbor  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1989)の７、９および１１項に見出すことができる。少なくとも１０塩基対の長さがある合成物に対するストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の非限定的な例としては、４Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約６５〜７０℃（または、４Ｘ  ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、約４２〜５０℃）でハイブリダイゼーション、次いで、１Ｘ  ＳＳＣ、約６５〜７０℃で１回以上の洗浄が挙げられる。そのような合成物に対する高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の非限定的な例としては、１Ｘ  ＳＳＣ、約６５〜７０℃（または、１Ｘ  ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、約４２〜５０℃）でハイブリダイゼーション、次いで、０．３Ｘ  ＳＳＣ、約６５〜７０℃で１回以上の洗浄が挙げられる。そのような合成物に対する低度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の非限定的な例としては、４Ｘ  ＳＳＣ、約５０〜６０℃（または、代替的に６Ｘ  ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、約４０〜４５℃）でハイブリダイゼーション、次いで、２Ｘ  ＳＳＣ、約５０〜６０℃で１回以上の洗浄が挙げられる。上記に列挙された値の中間の範囲、たとえば、６５〜７０℃、または４２〜５０℃もまた、本発明により包含されるものとみなされる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の他の例は、６Ｘ  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でハイブリダイゼーション、次いで、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０〜６５℃で１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液のさらなる例は、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５％サルコシン酸ナトリウム、および３０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションである。ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム）の代わりにすることができ、洗浄は、各ハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間、行われる。５０塩基対の長さ未満であると��測される合成物に対するハイブリダイゼーションの温度は、その合成物の融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、以下の式に従い決定される。１８塩基未満の長さの合成物に対しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対の長さの合成物に対しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮは、合成物中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣに対し、［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。また、当業者であれば、核酸分子が膜（たとえば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜糖）へ非特異的にハイブリダイズすることを減少させるために、追加の試薬（ブロッキング剤（たとえば、ＢＳＡまたはサケ精子担体ＤＮＡもしくはニシン精子担体ＤＮＡ）、洗剤（たとえば、ＳＤＳ）、キレート剤（たとえば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない）をハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加してもよいことが理解される。特に、ナイロン膜を用いる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の追加の非限定的な例は、約６５℃、０．２５−０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳでハイブリダイゼーション、次いで、６５℃、０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳで１回以上洗浄（または、代替として０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％のＳＤＳ）（たとえば、Church  and  Gilbert  (1984)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81:1991-1995を参照のこと）である。プライマーまたは核酸プローブは、検出法で単独で用いることができ、または、プライマーは、検出法で、少なくとも１つの他のプライマーまたは核酸プローブと共に用いることができる。プライマーはまた、少なくとも１つの核酸部分を増幅するために用いることができる。本発明の核酸プローブは、対象の領域にハイブリダイズする核酸を指し、さらには伸長されない。たとえば、核酸プローブは、バイオマーカーの変異領域に特異的にハイブリダイズする核酸であり、患者のＤＮＡにハイブリダイズするか、またはハイブリダイズしないかによって、または形成された合成物のタイプによって、バイオマーカーの変異の存在もしくは特定の指標、またはマーカー活性量の指標となりうる。
【０１１４】
１つの形式において、ＲＮＡは、たとえばアガロースゲル上で単離ＲＮＡを泳動し、ＲＮＡをゲルから膜（たとえばニトロセルロース）に移すことにより、固体表面上に固定され、プローブと接触する。別のフォーマットにおいては、核酸プローブ（複数含む）は、固体表面上に固定され、ＲＮＡは、たとえば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）遺伝子チップアレイまたはＳＮＰチップ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、または治療結果の指標となるマーカーの少なくとも１つを含有するマーカーセットを用いてカスタマイズされたアレイの中でプローブ（複数含む）と接触する。当業者であれば、公知のＲＮＡおよびＤＮＡ検出法を、本発明のマーカーの量の検出における使用のために容易に適合させることができる。たとえば、高密度マイクロアレイまたは分岐ＤＮＡアッセイに対しては、たとえば上述の項に記述されているように腫瘍細胞を単離するために改変された試料等の中の腫瘍細胞をより高濃度にすることが有効である。関連実施形態において、試料から得られた転写ポリヌクレオチドの混合物を、マーカー核酸の少なくとも一部（たとえば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００またはそれ以上のヌクレオチド残基）と相補的または相同であるポリヌクレオチドを固定させた基質と接触させる。もしマーカーと相補的または相同なポリヌクレオチドが基質上で特異的に検出されれば（たとえば、異なる発色団もしくはフルオロフォアを使用して、または異なる選択位置に固定されて、検出される）、複数のマーカーの発現レベルを、１つの基質（たとえば、選択された位置で固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を用いて同時に分析することができる。１つの核酸と他とのハイブリダイゼーションを含む、マーカーの発現分析法が用いられる実施形態において、そのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施することができる。
【０１１５】
試料中の本発明のマーカーに対応するＲＮＡの量を測定する別の方法には、核酸増幅（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ（実験態様は、Mullisの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記述されている）、リガーゼ鎖反応（Barany,  1991,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  88:189-193）、自家持続配列複製法（Guatelli  et  al.,  1990,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh  et  al.,  1989,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:1173-1177）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Lizardi  et  al.,  1988,  Bio/Technology  6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardiらの米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法）のプロセス、次いで、当分野に公知の技術を用いた増幅された分子の検出が含まれる。これらの検出スキームは、核酸分子の数が極端に少ない場合の核酸分子の検出に対し、特に有用である。本明細書おいて、増幅プライマーは、遺伝子の５´領域または３´領域（それぞれ＋鎖および−鎖、逆もまた然り）にアニールすることができる核酸分子の対であると定義され、その間に短い領域を含有する。概して、増幅プライマーは、約１０〜約３０ヌクレオチドの長さであり、約５０〜約２００ヌクレオチドの長さの領域に隣接する。適切な条件下、および適切な試薬を用いて、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含有する核酸分子が、そのプライマーにより増幅される。
【０１１６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ法については、検出の前にＲＮＡを細胞から単離する必要は無い。そのような方法においては、細胞試料または組織試料は、公知の組織学的方法を用いて調製／処理される。次いで、試料は支持体（典型的にはガラススライド）上に固定され、次いで、マーカーをコードするＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触する。
【０１１７】
本発明の他の実施形態において、マーカーに対応するポリペプチドが検出される。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを検出するための剤は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合することができる抗体である。関連実施形態において、抗体は、検出可能な標識を有している。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであっても良い。損なわれていない抗体、またはその断片（たとえば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２）を用いても良い。
【０１１８】
様々な形式を用いて、試料が特定の抗体に結合するタンパク質を含有するかどうかを測定することができる。そのような形式の例としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、Ｂ細胞が本発明のマーカーを発現しているかどうかの測定に用いるために、公知のタンパク質／抗体の検出法を容易に適合させることができる。
【０１１９】
マーカーに対応するポリペプチドのレベルを測定する他の方法は、質量分析法である。たとえば、損なわれていないタンパク質またはペプチド（たとえば、トリプシンペプチド）を、１つ以上のポリペプチドマーカーを含有する血液試料、リンパ液試料、または他の試料等の試料から分析することができる。その方法にはさらに、豊富なタンパク質（たとえば、血清アルブミン等）の量を少なくするよう試料を処理し、本方法の感度を高めることが含まれる。たとえば、液体クロマトグラフィーを用いて試料を分画化し、部分試料を質量分析法で別々に分析できるようにすることができる。そのステップは、別々系で実施することができるか、または液体クロマトグラフィー／質量分析を組み合わせた系（ＬＣ／ＭＳ、たとえば、Liao,  et  al.  (2004)  Arthritis  Rheum.  50:3792-3803を参照のこと）で実施することができる。質量分析系はまた、タンデム（ＭＳ／ＭＳ）モードであっても良い。タンパク質またはペプチド混合物の荷電状態分布を、１つまたは複合的なスキャンにより得て、統計的手法により分析することができ、たとえば、ＬＣ／ＭＳ系での保持時間および質量対電荷比（ｍ／ｚ）を用いて、ＮＡＥ阻害療法に応答性または非応答性である患者由来の試料中に、統計的に有意なレベルの差で発現しているタンパク質を特定する。使用することができる質量分析計の例としては、イオントラップ系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）または四重極飛行時間型質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）がある。当該方法にはさらに、たとえばマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法でのペプチド質量フィンガープリンティングのステップが含まれても良い。当該方法にはさらに、１つ以上のトリプシンペプチドを配列解析するステップが含まれても良い。本方法の結果を用いて、一次配列データベース（たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤまたは、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより維持されるデータベース）から、質量分析トリプシンペプチドのｍ／ｚベースピークに基づき、タンパク質を特定することができる。
【０１２０】
電子機器読み取り可能なアレイ
本発明方法と併せた使用のために、本発明の予測マーカーの少なくとも１つを含有する、読み取り可能なアレイを含む電子機器がまた企図される。本明細書において、「電子機器読み取り可能な媒体」とは、電子機器による直接的な読み取りおよびアクセスが可能なデータまたは情報の保存、維持または含有のための任意の適切な媒体を指す。本明細書において、「電子機器」という用語は、任意の適切なコンピューター機器もしくは処理装置または、データもしくは情報の保存のために設定または適合された他のデバイスを含むことが意図される。本発明での使用および記録された情報のモニタリングに適した電子機器の例としては、独立型のコンピューター機器；ネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネットおよびエキストラネットを含む）；たとえば携帯端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケベル等の電子装置；ならびにローカルおよび分散処理システムが含まれる。本明細書において、「記録された」とは、電子機器読み取り可能な媒体上に情報を保存またはエンコードするためのプロセスを指す。当業者であれば、本発明のマーカーを含有する製品を作製するために、公知の媒体上に情報を記録するための現時点で公知の任意の方法を容易に適合させることができる。
【０１２１】
たとえば、マイクロアレイシステムは良く知られており、たとえば分析により遺伝子が発現しているかどうか（たとえば、ＤＮＡ検出、ＲＮＡ検出、タンパク質検出）、代謝物が産生されているかどうか等の試料の分析のために当分野で用いられている。本発明による使用のためのマイクロアレイには、本明細書に記述される治療レジメンに対して応答性および／または非応答性の特性がある、本発明の予測マーカー（複数含む）のプローブが１つ以上、含まれる。１つの実施形態において、マイクロアレイは、短期間生存者において発現上昇していることが示されているマーカーからなる群から選択されるマーカーの１つ以上と対応するプローブの１つ以上、および患者のうち長期間生存者で発現上昇していることが示されている遺伝子に対応するプローブの１つ以上を含有する。多くの異なるマイクロアレイ構成およびその生産方法が当業者に公知であり、たとえば、米国特許第号、第５，２４２，９７４号、第５，３８４，２６１号、第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４２４，１８６号、第５，４２９，８０７号、第５，４３６，３２７号、第５，４４５，９３４号、第５，５５６，７５２号、第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４２４，１８６号、第５，４２９，８０７号、第５，４３６，３２７号、第５，４７２，６７２号、第５，５２７，６８１号、第５，５２９，７５６号、第５，５４５，５３１号、第５，５５４，５０１号、第５，５６１，０７１号、第５，５７１，６３９号、第５，５９３，８３９号、第５，６２４，７１１号、第５，７００，６３７号、第５，７４４，３０５号、第５，７７０，４５６号、第５，７７０，７２２号、第５，８３７，８３２号、第５，８５６，１０１号、第５，８７４，２１９号、第５，８８５，８３７号、第５，９１９，５２３号、第５９８１１８５号、第６，０２２，９６３号、第６，０７７，６７４号、第６，１５６，５０１号、第６２６１７７６号、第６３４６４１３号、第６４４０６７７号、第６４５１５３６号、第６５７６４２４号、第６６１０４８２号、第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８４８，６５９号、および第５，８７４，２１９号；Shena,  et  al.  (1998),  Tibtech  16:301;  Duggan  et  al.  (1999)  Nat.  Genet.  21:10;  Bowtell  et  al.  (1999)  Nat.  Genet.  21:25;  Lipshutz  et  al.  (1999)  Nature  Genet.  21:20-24,  1999;  Blanchard,  et  al.  (1996)  Biosensors  and  Bioelectronics,  11:687-90;  Maskos,  et  al.,  (1993)  Nucleic  Acids  Res.  21:4663-69;  Hughes,  et  al.  (2001)  Nat.  Biotechol.  19:342,  2001（これらは各々、参照により本明細書に援用される）において開示されている。組織マイクロアレイを、タンパク質特定のために用いることができる（Hans  et  al.  (2004)Blood  103:275-282を参照のこと）。ファージ−エピトープマイクロアレイを用いて、タンパク質（複数含む）が患者体内で自己抗体を誘導するか否かに基づき、試料中のタンパク質を１つ以上、特定することができる（Bradford  et  al.  (2006)  Urol.  Oncol.  24:237-242）。
【０１２２】
ゆえに、マイクロアレイには、本明細書に特定されるマーカー（たとえば、治療結果の指標となるもの。たとえば、野生型マーカー遺伝子、正常な対立遺伝子変異体、およびマーカー遺伝子の変異を特定するためのもの）の１つ以上に対応するプローブを１つ以上含有する。マイクロアレイは、たとえば、治療結果の指標となる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５、もしくは少なくとも１００のバイオマーカーおよび／またはその変異体に対応するプローブを含有することができる。マイクロアレイは、本明細書に記述されるマーカーの１つ以上に対応するプローブを含有することができる。さらには、マイクロアレイは、本明細書に記述されるマーカーセットの完全な一式を含有しても良く、それは、本明細書に記述される方法に従い、選択およびまとめられてもよい。マイクロアレイを用いて、アレイ中の予測マーカーの１つ以上、または予測マーカーセットの発現を分析することができる。１つの例において、アレイを用いて、アレイ中のマーカーの発現プロファイルを確認するために、試料中の予測マーカーの１つ以上または予測マーカーセットの発現を分析することができる。この方法において、約４４，０００マーカーまで同時に発現を分析することができる。これにより、１つ以上の試料中で特異的に発現された一連のマーカーを示すよう、発現プロファイルを開発させることが可能となる。さらに、これにより、治療結果を分析するために、発現プロファイルを発展させることが可能となる。
【０１２３】
アレイはまた、正常細胞および異常細胞（たとえば、腫瘍等の試料）の１つ以上のマーカーの異なる発現パターンを確認するのに有用である。これにより、患者の治療結果特定を容易にするためのツールとして役立つ一連のマーカーが提供される。さらに、アレイは、基準発現レベルのための基準マーカーの発現を確認するのに有用である。他の例において、アレイを用いて、アレイ中の１つ以上のマーカーの経時的な発現をモニターすることができる。
【０１２４】
そのような定性的な測定に加え、本発明により、マーカー発現を定量化することも可能である。ゆえに、予測マーカーは、マーカーセットまたは試料中のマーカー量による結果の表示に基づき、グループ化することができる。これは、たとえば、本明細書に提供される方法による量のスコアリングによって、試料の結果を確認するのに有用である。
【０１２５】
アレイはまた、同一細胞または異なる細胞中の他の予測マーカーの発現に対する、マーカー発現の影響を確認するのに有用である。これにより、たとえば、もし患者が好ましくない予後となると予測される場合に、治療介入のための別の分子標的の選択を提供することができる。
【０１２６】
試薬およびキット
本発明はまた、生物試料（たとえば、骨髄試料、腫瘍生検または基準試料）中の本発明のマーカーに対応する核酸またはポリペプチドの存在を検出するためのキットを包含する。そのようなキットを用いて、治療結果を分析する（たとえば、ＮＡＥ阻害物質治療の後で、患者が好ましい結果を有することができるかどうかを決定する）ためのマーカー遺伝子の少なくとも１つの変異状態を測定することができる。たとえば、生物試料中の本発明のマーカーまたはマーカー遺伝子の変異に対応するゲノムＤＮＡ部分、ポリペプチドまたは転写されたＲＮＡを検出することができる、標識された化合物もしくは剤、および、試料中のゲノムＤＮＡ部分、ポリペプチドまたはＲＮＡの量を測定するための手段を含有することができる。マーカータンパク質との結合に適した試薬としては、抗体、抗体誘導体、抗体断片等が挙げられる。マーカー核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシングされたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）との結合に適した試薬としては、相補的な核酸が挙げられる。標識は、マーカー結合剤（たとえば、プローブ、またはプローブもしくはプライマー等の核酸試薬、または、たとえば特異的結合剤もしくは抗体等のタンパク質試薬）、に直接付着させることができ、または、二次試薬が間接標識のための標識を含有することができる。キットはまた、対照試料もしくは基準試料、または、検証試料を分析および比較することができる一連の対照試料もしくは基準試料を含有することができる。たとえば、キットは、本明細書に記述されるマーカーもしくは変異、または基準マーカー（たとえば、腫瘍を有していない対象由来の、試料間、もしくは時点間、もしくは基準ゲノム間の分析結果を標準化するためのハウスキーピング遺伝子等）の１つ以上を含む陽性対照試料を、たとえばマーカーの基準発現レベルまたは２倍体コピー数のベースラインを確立するために、有しても良い。例として、キットは、相補的な核酸のアニーリング、または抗体と、抗体が特異的に結合するタンパク質との結合に適した液体（たとえば、緩衝液）、および、試料部分の１つ以上を含有してもよい。本発明のキットは、任意選択的に、本発明の方法の実施に有用な追加の構成要素（たとえばチューブ等の試料収集容器）を含有しても良く、および、たとえば試料採取時と分析時との間に、時間、または有害な保管および操作状況があり得る場合に、任意選択的に、検出されるマーカーの量を最適化するための手段を含有しても良い。たとえば、キットは、上述のように、試料中の腫瘍細胞の数を増加させるための手段、緩衝剤、防腐剤、安定化剤または本明細書に提供される方法で使用するための細胞材料またはプローブの調製のための追加の試薬；ならびに提供されるプローブ（複数含む）内に組み込まれるか、または結合されるか、または単独で検出可能な標識を含有することができる。１つの例示的な実施形態において、試料収集容器を含有するキットは、たとえば、抗凝固剤および／または安定化剤（たとえば、上述の、または当業者公知のＲＮＡ安定化剤）を含有するチューブ等を含有することができる。キットはさらに、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素（たとえば、酵素または基質）を含有することが出来る。マーカーセットに対しては、キットは、バイオマーカーの検出に用いるためのマーカーセットアレイまたはチップを含有することができる。キットはまた、キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書を含むことができる。キットは、１つ以上のバイオマーカー（たとえば、本明細書に記述される２、３、４、５またはそれ以上のバイオマーカー）の検出のための試薬を含有することができる。
【０１２７】
１つの実施形態において、キットは、少なくとも１つのバイオマーカー、（たとえばＮＡＥ阻害物質治療による）治療結果を示すマーカーを検出するためのプローブを含有する。１つの例となる実施形態において、キットは、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、または、染色体２２ｑの塩基対２９９９９５４５〜３００９４５８９、染色体１８ｑの塩基対４８５５６５８３〜４８６１１４１２、染色体Ｘｐの塩基対４４７３２４２３〜４４９７１８４７、染色体４ｑの塩基対１５３２４２４１０〜１５３４５６１７２、染色体１７ｐの塩基対７５７１７２０〜７５９０８６８、染色体９ｐの塩基対２１９６７７５１〜２１９９４４９０上の配列、または、任意の前述の相補物、または配列番号３、６、１０、１１、１４、１７、２０、２３および／もしくは２６からなる群から選択されるマーカー遺伝子を検出するための核酸プローブを含有する。いくつかの実施形態において、キットは、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択されるマーカーを検出するためのプローブを含有する。他の実施形態において、キットは、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群から選択されるマーカー遺伝子中の変異を検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４およびＡＰＣからなる群由来の２つ以上のマーカーを含有するマーカーセットを検出するためのプローブを含有する。他の実施形態において、キットは、子宮または子宮頚の癌におけるＦＢＸＷ７を検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、腸管、胸部、肺、頭頸部、子宮頚または皮膚の癌におけるＴＰ５３を検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、腸管の癌におけるＴＰＣおよびＡＰＣを検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、皮膚または中枢神経系の癌におけるＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４を検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、頭頸部または皮膚の癌におけるＣＤＫＮ２Ａを検出するためのプローブを含有する。１つの実施形態において、キットは、頭頸部の癌におけるＳＭＡＤ４を検出するためのプローブを含有する。関連実施形態において、キットは、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４および２５からなる群から選択される核酸配列を含む、または当該核酸配列から誘導された（たとえば、それらの（たとえば相同または相補的な）断片、変異または変異体）核酸プローブを含有する。核酸プローブを含有するキット（たとえば、オリゴヌクレオチドベースのキット）については、当該キットは、たとえば、本発明のマーカーに対応する核酸配列にハイブリダイズする（標識または非標識の）オリゴヌクレオチド（任意選択的に基質に固定されている）等の核酸試薬を１つ以上含有することができ、および、任意選択的にさらに、基質に結合しない標識オリゴヌクレオチド、プライマー、ＰＣＲプライマー対（たとえば、本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに用いることができる）、分子標識プローブ、本発明のマーカーに対応する核酸配列の少なくとも２つとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するマーカーセット等を含有することができる。当該キットは、ＲＮＡ安定化剤を含有することができる。
【０１２８】
タンパク質プローブを含有するキット（たとえば、リガンドまたは抗体ベースのキット））については、当該キットは、たとえば、（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する（たとえば固形支持体に付着する）一次抗体、そして任意選択的に、（２）一次抗体またはポリペプチドのいずれかに結合し、検出可能な標識が結合された、異なる２次抗体、を含有することができる。当該キットは、タンパク質安定化剤を含有することができる。当該キットは、バイオマーカーではない試料由来の物質が、プローブに非特異的に結合する量を減少させるための試薬を含有することができる。非特異結合を減少させるための試薬の例としては、非イオン洗剤、たとえばアルブミンまたはカゼインを含有する、非特異的タンパク質を含有する溶液、または当業者公知の他の物質が挙げられる。
【０１２９】
本発明の予測マーカーに対応する単離ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体を、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製の標準的な技術を用いた抗体作製のために、免疫原として用いることができる。たとえば、通常、ウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳類または脊椎動物等の適切な対象（すなわち、免疫応答可能な対象）を免疫することによる抗体の調製に、免疫原が用いられる。さらなる態様において、本発明により、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供され、それら抗体または断片は、本発明のアミノ酸配列、本発明のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、本発明のアミノ酸配列の少なくとも８、１０、１２、１５、２０または２５の連続したアミノ酸残基の断片、本発明のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列（ここで、同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティは１２、およびギャップペナルティは４で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＡＬＩＧＮプログラムを用いて決定されている）、および、本発明の核酸分子からなる核酸分子に、４５℃、６Ｘ  ＳＳＣのハイブリダイゼーションおよび６５℃、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄の条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるアミノ酸配列またはその相補物からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および／または非ヒト抗体であっても良い。適切な免疫原調製物は、たとえば、遺伝子組み換えで発現されたポリペプチドまたは化学合成されたポリペプチドを含有してもよい。当該調製物はさらに、フロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントまたは類似の免疫賦活化剤等のアジュバントを含有しても良い。
【０１３０】
ヒト抗体を作製する方法は当分野に公知である。ヒト抗体を作製する１つの方法は、たとえばトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物を使用することである。これらのトランスジェニック動物は、それら自身のゲノムに挿入された、ヒトの抗体を産生するゲノムのかなりの部分を含有し、そして、動物自身の内因性抗体の産生はできない状態となっている。そのようなトランスジェニック動物の作製方法は当分野で公知である。そのようなトランスジェニック動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を用いて作製することができ、または、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」法を用いて作製することができる。ＸＥＮＯＭＩＣＥ（商標）を作製する方法は、米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号および第６，０７５，１８１号に記述されており、それらは参照により本明細書に援用される。「ミニ遺伝子座」法を用いたトランスジェニック動物の作製方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号および第５，６２５，８２５号に記述されており、また、国際特許公開ＷＯ９３／１２２２７も参照できる（それら各々は、参照により本明細書に援用される）。
【０１３１】
抗体は、イムノグロブリン分子および、免疫学的に活性なイムノグロブリン分子の部分（すなわち、本発明のポリペプチド（たとえば、本発明のポリペプチドのエピトープ等）等の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を含有する。本発明の特定のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドには結合するが、試料（たとえば生物試料であり、自然にポリペプチドを含有する）中の他の分子には実質的に結合しない分子である。たとえば、抗原結合断片、ならびに、上述の抗体から得られる全長単量体ポリペプチド、全長二量体ポリペプチドまたは全長三量体ポリペプチドは、それら自身、有用なものである。このタイプの有用な抗体ホモログとしては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される一価の断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含有する二価の断片である、Ｆ（ａｂ´）２、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから構成される、ｄＡｂ断片（Ward  et  al.,    Nature  341:544-546  (1989)）、（ｖｉｉ）ＶＨＨドメイン（ナノボディとして知られる）から構成される、単一ドメイン機能性重鎖抗体（たとえば、Cortez-Retamozo,  et  al.,    Cancer  Res.  64:  2853-2857(2004)およびそれに引用される参照文献を参照のこと）、および、（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、たとえば抗原結合断片を提供するのに十分なフレームワークとともに単離された１つ以上のＣＤＲ等、が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別々の遺伝子によりコードされているが、遺伝子組換え法を用いて、ＶＬとＶＨ領域が一価分子を形成するように対になる単一タンパク質鎖として形成することができる合成リンカーにより、それらを連結させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。たとえば、Bird  et  al.    Science  242:423-426  (1988)および、Huston  et  al.    Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:5879-5883  (1988)を参照のこと）。そのような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語の中に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者公知の従来法を用いて得ることができ、そしてその断片は、無傷抗体と同じ方法で有用性をスクリーニングされる。たとえばＦｖ、Ｆ（ａｂ´）２およびＦａｂ等の抗体断片は、無傷タンパク質の開裂（たとえば、プロテアーゼによる開裂または化学的な開裂）により調製されてもよい。本発明により、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。前述の任意のものの合成変異体および遺伝子操作変異体（米国特許第６，３３１，４１５号を参照のこと）もまた、本発明から予期される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、従来的なマウスのモノクローナル抗体技術を含む、様々な技術により産生することができ、たとえば、Kohler  and  Milstein,  Nature  256:  495  (1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor  et  al.,  1983,  Immunol.  Today  4:72を参照のこと）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole  et  al.,  pp.  77-96（Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy,  Alan  R.  Liss,  Inc.,  1985）を参照のこと）、またはトリオーマ技術等がある。概要は、Harlow,  E.  and  Lane,  D.  (1988)  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY、および、Current  Protocols  in  Immunology,  Coligan  et  al.  ed.,  John  Wiley  &  Sons,  New  York,  1994を参照のこと。診断応用については、抗体は、たとえばマウス、ラットまたはウサギで作製されたモノクローナル抗体であってもよい。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用での使用については、本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、対象のポリペプチドに結合する抗体について、ハイブリドーマの培養上清を、たとえば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングすることにより検出される。
【０１３２】
もし所望であれば、抗体分子を対象から（たとえば、対象の血液または血清から）単離または採取することができ、さらに、たとえばプロテインＡクロマトグラフィー等の公知の技術により精製してＩｇＧ分画を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体を、たとえばアフィニティクロマトグラフィー等により精製または選択（たとえば部分的精製）し、実質的に精製された抗体、および精製抗体を得ることができる。実質的に精製された抗体組成物とは、本文中の関連においては、抗体試料に、本発明の所望のタンパク質またはポリペプチド以外のエピトープに指向する抗体を最大でもたった３０％（乾重量で）のみ混入しており、および、試料の最大で２０％、最大で１０％または最大で５％（乾重量で）が、混入抗体であることを意味している。精製抗体組成物とは、その組成物中の抗体の少なくとも９９％が、本発明の所望のタンパク質またはポリペプチドに指向するものであることを意味する。
【０１３３】
本発明のマーカーに対応するポリペプチドに指向する抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を用いて、そのマーカーの発現パターンおよび発現レベルを評価するために、マーカー（たとえば細胞試料中の）の検出を行うことができる。また、抗体を診断的に用いて、たとえば特定の治療レジメンの有効性を測定するための臨床の検査手順の一部として、組織または体液（たとえば、血液試料または尿の）タンパク質レベルをモニターすることができる。検出は、抗体と検出可能な物質を連結させることにより促進することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、ならびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１３４】
従って、１つの態様において、本発明により、実質的に精製された抗体またはその断片、および非ヒト抗体またはその断片が提供され、その抗体または断片は、本明細書に特定されるマーカーによりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する。本発明の実質的に精製された抗体またはその断片は、ヒト抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であっても良い。
【０１３５】
他の態様において、本発明により、非ヒト抗体またはその断片が提供され、その抗体または断片は、本発明の予測マーカーの核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する。そのような非ヒト抗体は、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギ、またはラットの抗体であっても良い。あるいは、本発明の非ヒト抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であっても良い。さらに、本発明の非ヒト抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であっても良い。
【０１３６】
実質的に精製された抗体またはその断片は、本発明のポリペプチドのシグナルペプチド、分泌配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインまたは細胞質ループに特異的に結合しても良い。本発明の、実質的に精製された抗体もしくはその断片、非ヒト抗体もしくはその断片、および／または、モノクローナル抗体もしくはその断片は、本発明のアミノ酸配列の細胞外ドメインまたは分泌配列に特異的に結合する。
【０１３７】
本発明はまた、検出可能な物質に結合された本発明の抗体、および使用説明書を含有するキットを提供する。本発明のさらに他の態様は、本発明のプローブおよび薬学的に受容可能な担体を含有する診断用組成物である。１つの実施形態において、診断用組成物には、検出可能な部分である本発明の抗体、および薬学的に受容可能な担体が含まれる。
【０１３８】
感受性アッセイ
癌試料が、患者から得られる。発現レベルは、本明細書に記述されるマーカーの少なくとも１つと対応するマーカーに対して、試料中で測定される。マーカーセットが、本明細書に記述され、特定され、および本明細書に記述される方法を用いてマーカーセット中に共に入れられるマーカーを含有して、利用することができる。そのような分析を用いて、患者の腫瘍の発現プロファイルを得る。次いで、発現プロファイルの評価を用いて、患者が、好ましい結果を有すると期待されるか否か、およびたとえばＮＡＥ阻害療法（たとえば、ＮＡＥ阻害物質（ＭＬＮ４９２４等）単独での治療、または追加の剤との組み合わせでの治療）で利益を得るかどうか、または別の剤で生存率に同様の効果がもたらされると期待されるかどうかを決定する。また、発現プロファイルの評価を用いて、患者が好ましくない結果となると予測されるかどうか、およびＮＡＥ阻害療法以外の癌療法から利益を得るかどうか、または変更したＮＡＥ阻害療法レジメンから利益を得るかどうかを決定することができる。評価には、たとえば、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ  Ｏｍｕｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ））に預託された発現値を用いて、任意の本発明方法または当分野公知の他の類似のスコアリング方法（たとえば、重み付き投票、閾値特性の組み合わせ（ＣＴＦ）、Ｃｏｘ比例ハザード分析、主要成分スコアリング、線形予測スコア、Ｋ−最近傍等）を用いて調製された１つのマーカーセットの使用を含むことができる。さらに、評価には、２つ以上の調製されたマーカーセットの使用を含むことができる。評価結果により好ましい結果が示される場合、癌の治療に適しているとしてＮＡＥ阻害療法が特定され、または、好ましくない結果が予期される患者に対しては、より積極的な治療レジメンが特定される。
【０１３９】
１つの態様において、本発明は、たとえば癌（血液のがん（多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫等）または固形腫瘍癌（メラノーマ、食道癌または膀胱癌））を有している患者を、治療結果について評価する方法を特徴とする。当該方法には、患者におけるマーカーのマーカーセット中のマーカーの発現評価を提供することが含まれ、ここで、当該マーカーセットには以下の特徴がある：多量の遺伝子が含まれ、それらは各々、特定された結果を有する患者と、罹患していない対象との間で区別できるように発現しており、対象のマーカーセット中の各マーカーの異なる量（たとえば、罹患していない基準試料でのレベルと比較して）が、約１５％、約１０％、約５％、約２．５％、または約１％を超えない偽陽性で治療結果を予測できるような十分な数の特異的発現マーカーを含有し（ここで、偽陽性とは、対象がそうではない場合に、患者を応答性または不応性として推定してしまうことを意味する）、そして、基準値を有する患者由来のセット中の各マーカーの量の比較を得て、それにより患者を評価する。
【０１４０】
ＮＡＥ阻害療法の過程で患者から採取した腫瘍試料中の特定のマーカーまたはマーカーセットの１つ以上の量を検証することにより、治療剤が継続して機能するかどうか、または癌が治療プロトコールに対して不応性（難治性）となるかどうかを決定することができる。たとえば、ＭＬＮ４９２４の治療を受けている患者は、腫瘍細胞が除去され、マーカーまたはマーカーセットの発現をモニターされる。たとえば、ＮＡＥ阻害物質等の剤により、さらに好ましい結果となることが本明細書に特定されるマーカーの１つ以上の量のプロファイルにより示されている場合、その治療は続行される。しかし、剤により好ましくない結果となることが本明細書に特定されるマーカーの１つ以上の量のプロファイルにより示されている場合、癌は、たとえばＮＡＥ阻害療法等の療法に対して抵抗性となる可能性があり、他の治療プロトコールを開始し、患者を治療しなければならない。たとえば、癌は、ＮＡＥ阻害に対する抵抗性に関連するマーカー遺伝子中に変異を含有しうる。
【０１４１】
重要なことは、これらの決定は、患者ごと、または剤（もしくは剤の組み合わせ）ごとに行われうるということである。ゆえに、特定のＮＡＥ阻害療法が特定の患者または患者群／患者型に利益をもたらす可能性があるかどうか、または特定の治療を継続するべきかどうかを決定することができる。
【０１４２】
情報の使用
１つの方法において、たとえば患者の腫瘍の変異状態（たとえば、本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットを評価した結果である、患者のマーカー（複数含む）の、サイズ、配列、組成または量等の特性）等に関する情報、または、患者が好ましい結果を得ると期待されるかどうかという情報が、病院、診療所、政府当局、補償団体または保険会社（生命保険会社等）等の第三者に、開示（たとえば、電子的に通信される等で伝達）される。たとえば、医療手順の選択、医療手順に対して支払を行うかどうか、補償団体による支払、またはサービスもしくは保険に対するコストなどが、情報の機能であってもよい。たとえば、第三者が情報を受信し、少なくとも情報の一部に基づき決定を行い、そして任意選択的に情報を伝え、または情報に基づき手順、支払、支払のレベル、範囲の選択を行う。当該方法において、表１から選択される、もしくは表１から導かれる、および／または本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットの有益な発現レベルが測定される。
【０１４３】
１つの実施形態において、医療保険または生命保険等の保険料は、マーカーもしくはマーカーセット等の１つ以上のマーカーの発現レベル（たとえば、治療結果に関連する発現レベル（たとえば、有益な量））に関する情報の機能として、評価される。たとえば、もし本明細書に記述される患者のマーカー遺伝子またはマーカーセットが、保険対象（または保険補償を求める対象）と、基準値（たとえば、罹患していない人）または基準試料（たとえば合致対照）の間で異なる特性（たとえば、サイズ、配列、組成または量等）を有している場合、保険料は、増加され得る。保険料はまた、本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットを評価した結果に基づき見積もられ得る。たとえば、保険料は、たとえば、マーカー（たとえば、本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットの評価結果）に応じて、リスクを分散させるために評価されてもよい。他の例において、保険料は、既知の治療結果を有する患者から得られた保険数理データに応じて分析されてもよい。
【０１４４】
サイズ、配列、組成または量等のマーカー特性に関する情報（（たとえば、有益な量等）の本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットの評価結果）を、たとえば生命保険に関する引受業務プロセスの中で用いることができる。当該情報は、対象に関するプロファイルの中に組み込むことができる。プロファイル中の他の情報としては、たとえば、生年月日、性別、配偶者の有無、銀行預金情報、クレジットカード情報、子供等が挙げられる。保険契約は、プロファイル中の１つ以上の他の情報項目と共に、たとえば本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットの評価結果のたとえばサイズ、配列、組成または量等のマーカー特性に関する情報に応じたものとすることが推奨され得る。保険料またはリスク分析はまた、マーカーまたはマーカーセット情報に応じて評価することができる。１つの実施形態において、予測される治療結果に基づき、ポイントが割り当てられる。
【０１４５】
１つの実施形態において、サイズ、配列、組成または量等のマーカー特性に関する情報（たとえば、本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットの評価結果）は、対象に提供されるサービスまたは治療に対して支払を行うための資金の移転を許可するかどうか（または、本明細書に言及される他の決定を行うかどうか）を決定する機能により分析される。たとえば、本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットのサイズ、配列、組成または量等の特性の分析結果により、対象に好ましい結果が期待されることが示される可能性がある場合は、治療が必要であり、対象に提供されるサービスまたは治療に対する支払のための許可を示す、または許可を与える結果がもたらされる。１つの例において、表１から選択もしくは得られる、または本明細書に記述されるマーカーまたはマーカーセットのサイズ、配列、組成または量等の有益な特性が測定され、もしその有益な量により好ましい結果が確認される場合、支払が許可される。たとえば、事業体（病院、介護者、政府当局または保険会社、または医療費の支払もしく補償を行う他の事業体）は、本明細書に記述される方法の結果を用いて、対象患者以外の関係者が、その患者に提供されるサービス（たとえば、特定の治療）または治療に対して支払を行うかどうかを決定することができる。たとえば、一番目の事業体（たとえば、保険会社）は、本明細書に記述される方法の結果を用いて、患者に、または患者のために、金銭を支払うかどうか（たとえば、患者に提供されるサービスまたは治療に対して、商品もしくはサービスのベンダー、病院、医師または他の介護者等の第三者に補償を行うかどうか）を決定することができる。たとえば、一番目の事業体（たとえば、保険会社）は、本明細書に記述される方法の結果を用いて、保険プランまたはプログラム（たとえば、健康保険もしくは生命保険のプランまたはプログラム）にある個々人を、継続するか、中断するか、登録するかどうかを決定することができる。
【０１４６】
１つの態様において、本開示は、データの提供方法を特徴とする。本方法には、支払を行うかどうかを決定するために、本明細書に記述されるデータ（たとえば、本明細書に記述される方法により作製される）を提供し、記録（たとえば、本明細書に記述される記録）を提供することが含まれる。いくつかの実施形態において、データは、コンピューター、コンピューターディスク、電話、ファクシミリ、電子メール、または手紙により提供される。いくつかの実施形態において、データは、１番目の当事者から２番目の当事者へと提供される。いくつかの実施形態において、一番目の当事者は、患者、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、保険維持機構（ＨＭＯ）、病院、政府当局または薬剤を販売もしくは供給する者から選択される。いくつかの実施形態において、２番目の当事者は、第三者支払い当事者、保険会社、雇用者、雇用者が提供する健康保険のプラン、ＨＭＯまたは政府当局である。いくつかの実施形態において、１番目の当事者は、対象、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬剤を販売もしくは供給する事業体から選択され、２番目の当事者は政府当局である。いくつかの実施形態において、１番目の当事者は、対象、ヘルスケア提供者、治療を行う医師、ＨＭＯ、病院、保険会社、または薬剤を販売もしくは供給する者から選択され、２番目の当事者は保険会社である。
【０１４７】
他の態様において、本開示は、患者のマーカーもしくはマーカーセットに対するサイズ、配列、組成または量等の特性のリストおよび値を含む記録（コンピューターで読み取り可能な記録）を特徴とする。いくつかの実施形態において、当該記録には、各マーカーに対する２以上の値が含まれる。
【０１４８】
本発明は、以下の実施例により解説されるが、当該実施例は、何らかの本発明を限定する意図は無い。
【実施例】
【０１４９】
実施例１．細胞株パネルスクリーニング
臨床開発を支持し、腫瘍感受性または抵抗性のバイオマーカーの可能性があるものを特定するために、２つの大きな癌細胞株パネル（パネル１、Ｎ＝６５３（McDermott  et  al.  (2007)  PNAS  104:19936-19941）；パネル２、Ｎ＝２４０（O’Day  et  al.  (2010)  Fourth  AACR  International  Conference  on  Molecular  Diagnostics  in  Cancer  Therapeutic  Development））をＭＬＮ４９２４で処理して、細胞活性のデータ（ＩＣ５０、ＥＣ５０およびＰＯＣ−対照のパーセンテージ）を作製した。
【０１５０】
パネル１（上記のMcDermott  et  alら）。細胞株を、３つの濃度（２０ｎＭ、２００ｎＭ，および２μＭ）のＭＬＮ４９２４に、７２時間、曝した。活性、すなわち細胞数を、細胞浸透性核酸染色の蛍光を測定することにより定量化した。各試料の３重分の値の平均をとり、ＤＭＳＯ対照と比較して、対照パーセンテージを算出した。結果中、対照または活性無しの値は、約１の値が与えられ、感受性が示される値は１未満、全細胞群が死亡すると値は０、そして抵抗性が示される値は１より大きい値である。活性の連続的な値を各濃度に対して得て、一部の値を、最終的な感受性または抵抗性に対するカットオフとして選択した。たとえば、パネル中で記録されたすべてのＰＯＣのメジアン値よりも小さいメジアンＰＯＣ（＜０．３４）は、感受性を示唆し、０．３４〜０．７５は感受性の境界を示唆し、パネル中のすべてのＰＯＣの４分の３よりも大きい値（＞０．７５）は、非感受性または抵抗性を示唆する。概して、感受性細胞株では、用量反応関係が認められた。感受性、非感受性または抵抗性としての細胞株の最終判断は、２μＭでのその生存率により決定された。
【０１５１】
パネル２（Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．，  Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）。ＭＬＮ４９２４を、１０の濃度の１／２ｌｏｇ希釈で加え、７２時間、処理した。画像解析を含めた蛍光顕微鏡による高含有細胞スクリーニングを行い、いくつかのタイプのデータを作製した。結果には、ＥＣ５０値（細胞数測定の後、ＥＣ５０濃度は、ＭＬＮ４９２４濃度のｌｏｇに対する対照パーセント曲線（ＰＯＣ）の変曲点から算出された）、ＩＣ５０値（ＰＯＣ−ｌｏｇ  ＭＬＮ４９２４プロットから、ＩＣ５０は、５０％最大予想反応での濃度である）、アポトーシス（５倍超の誘導に対する濃度として決定された、ＭＬＮ４９２４濃度のｌｏｇに対してプロットされたカスパーゼ３の活性測定）および有糸分裂活性（ホスホ−ヒストン３の倍数増加測定により決定）が含まれた。ＥＣ５０とＩＣ５０の比較（図３）により、細胞株を、感受性、非感受性または抵抗性に割り当てることができた。感受性または抵抗性の細胞株の最終的な特定は、ＥＣ５０値に基づいた。感受性に対するカットオフは、パネルに記録されたすべてのＰＯＣのメジアン値よりも小さいメジアンＥＣ５０（＜０．３６）であり、境界感受性は、０．３６〜１．６７のメジアンＥＣ５０と関連しており、非感受性または抵抗性細胞株は、ＥＣ５０がパネル中のすべてのＰＯＣの４分の３よりも大きい（＞１．６７）ことで特定された。
【０１５２】
パネル１とパネル２で重複している細胞株（１１４が重複）は、増殖阻害効果の一致を示した（スピアマンの相関係数＝０．７２）。さらに、各細胞株パネル全体として（重複細胞株だけではない）の組織学的および変異分析もまた、２つのパネル間で一致した結果を示した（図４ＡおよびＢ）。
【０１５３】
対照値のメジアンパーセンテージを用いたフィッシャーの直接検定を、細胞株における個々の変異とＭＬＮ４９２４に対する感受性または抵抗性との関連を評価するために用いた。選択された遺伝子に対するｐ値の要約を表３にまとめる。フィッシャーの直接検定において、変異が感受性と関連していた遺伝子として、ＮＦ２、ＳＭＡＤ４、ＫＤＭ６Ａ、ＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａ＿ｐ１４が挙げられる。ＲＢ１とＴＰ５３は、非感受性と関連していた。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
※は、全ての細胞型で確証されていない、ＲＢ１関連の表現型を表す。いくつかの腫瘍型は、他よりも、より抵抗性と関連していた：脳腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍および肺腫瘍（ＮＳＣＬＣ）は、それぞれ、ｐ値が０．１０２、０．２０５、０．２２６、および０．２８１である。ＲＢ１が感受性マーカーではないという結果は、ＭＬＮ４９２４のメカニズムへの関与からＲＢ１を除外した、Jia  et  al.  ((2011)  Neoplasia  13:561-569)の結果と一致している。
【０１５６】
実施例２．変異の関連性の分析
細胞株における変異遺伝子を治療剤に対する感受性と相関させるにあたっての困難性の１つには、多くの細胞株が、２つ以上の変異遺伝子を有しているということである。たとえば、甲状腺癌由来の８５０５Ｃという名称の細胞株は、ＢＲＡＦ、ＴＰ５３、ＮＦ２およびＣＤＫＮ２Ａに変異を有している。特に、ＴＰ５３およびＣＤＫＮ２Ａ変異は、複数の細胞株において、他の変異と共に発生していた。どの変異が細胞株パネルにおいて感受性または抵抗性と関連しているのかを知るために、副解析（ｓｕｂ−ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。
【０１５７】
ＡＰＣ対ＴＰ５３  細胞株パネル１において、２３の細胞株がＡＰＣに変異を有している。これらのうち、１８の細胞株がＴＰ５３にも変異を有している。ＡＰＣがＭＬＮ４９２４に対する抵抗性を引き起こしているのか、または、単にＴＰ５３変異でよく見られるパッセンジャー変異（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）であるのかを決定することは困難であった。細胞株のさらなる分析を、ＴＰ５３を含む二重の変異を有する細胞株を差し引きすることにより行った（表４）。
【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
表４Ａに示されるように、細胞株パネルからのＴＰ５３変異の差し引きによって、ＭＬＮ４９２４での治療に対するＴＰ５３野生型細胞株の抵抗性と残りの変異との関連性を結論付けるには小さすぎるＮをもたらす。２３すべてのＡＰＣ変異を除去した後も、ＴＰ５３は抵抗性と関連があると思われる（表４Ｂ）。それにもかかわらず、ＡＰＣおよびＴＰ５３の両方の変異を有する細胞株は、抵抗性と強い関連性を示している（表４Ｃ）。さらに、ＡＰＣ＋ＴＰ５３変異の亜群の細胞株の大部分は、腸管癌腫瘍試料由来である（表５。この表にはまた、元のの差し引き分析には含まれていなかった６つのパネル１の細胞株と、パネル２由来のデータおよび細胞株が含まれている）。
【０１６０】
【表５−１】
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【表５−２】
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【０１６１】
組織構造との関連性 
一部のＴＰ５３変異は、一部の腫瘍型において、他のものよりも抵抗性と関連している可能性がある。ＴＰ５３変異細胞株を、マンホイットニー（ノンパラメトリック）検定により、組織型内で分析した。図５に示されるように、ＴＰ５３変異は、大腸癌細胞株で、ＭＬＮ４９２４に対する抵抗性と有意に相関した（ｐ値＝０．０４０２２）。
【０１６２】
他の組織における同様の関連性の分析により、ＴＰ５３は、乳癌および肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株においてＭＬＮ４９２４抵抗性と関連していることが示唆される。
【０１６３】
腫瘍の組織構造と、ＭＬＮ４９２４治療に対する抵抗性または感受性との関連性の可能性について、さらに変異を分析した。表６に、パネル１の分析結果を提供し、表７に、パネル２の分析結果を提供するが、それらのサイズはより小さいため、このタイプの分析が困難であることが判明した。組織との関連性のカットオフは、ｐ値が＜０．０５で選択された。
【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
ＴＰ５３が、ＭＬＮ４９２４に対する抵抗性と全体的に関連していることとは対照的に、頭頸部癌においては、ＴＰ５３変異は感受性と関連している。同様の対比は、皮膚および中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＣＤＫＮ２Ａ変異にも認められた。ＣＤＫＮ２Ａ変異は、全体的にはＭＬＮ４９２４治療に対する感受性と関連性を有しているにもかかわらず、皮膚およびＣＮＳ腫瘍細胞株においては、ＣＤＫＮ２ＡまたはＣＤＫＮ２Ａ．ｐ１４変異は、ＭＬＮ４９２４治療に対する抵抗性と関連していた。また、表６および７において、ＴＰ５３変異が、子宮頸癌および皮膚癌において、抵抗性と有意に相関していること；ＣＤＫＮ２Ａ変異が、頭頸部癌において感受性と有意に相関していること；ＳＭＡＤ４変異が、頭頸部癌において感受性と有意に相関していること、ＲＢ１変異が、肺癌において抵抗性と有意に相関していること；およびＲＢ１変異が骨癌において感受性と有意に相関していることを示す。
【０１６７】
実施例３  個々の細胞株スクリーニング結果
以下の表に、マーカーの変異によりＭＬＮ４９２４に対する感受性がもたらされたと結論付けられた個々の細胞株のスクリーニングの結果を示す。変異の注記および変異構文の説明は、ＣＯＳＭＩＣデータベースに見出すことができる。
【０１６８】
【表８−１】
2018050634.tif 000014
【表８−２】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表１０−１】
2018050634.tif 000019
【表１０−２】
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【表１１】
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【０１６９】
実施例４  ＴＰ５３欠損と抵抗性との関連性
ＭＬＮ４９２４に対する応答性におけるＴＰ５３の役割を決定するための他の方法は、ＴＰ５３遺伝子を欠損させる実験であった。早期の研究において、ＭＬＮ４９２４に対する再複製応答におけるｐ５３の重要性は、特定の遺伝子操作に依存しているよう思われ、ＣＤＴ１の過剰発現を良く反映していると予測された（Ｃｄｔ１は、２つの別のＣＲＬ複合体の基質であり、多くの細胞株においてＭＬＮ４９２４により安定化される）。ノックダウン実験において、ｐ５３は、早期ではＣＤＴ１ノックダウンと同じような振る舞いをすると思われたが、後期では、高濃度のＭＬＮ４９２４が使用されない限りは、そうではなかった。ウェスタンブロッティングより、ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌによってｐ５３タンパク質が効果的にノックダウンされたことが示唆されたが、ＲＮＡｉでは通常、タンパク質の完全な消失はもたらされない。したがって、特に、ＭＬＮ４９２４はｐ５３の安定性をもたらすため、残ったタンパク質によりＭＬＮ４９２４に対する応答性がまだ影響を受けている可能性がある（Liao  et  al.  (2011)  Mol.  Cell  Proteomics  10:10.1074/mcp.M111.009183）。ＭＬＮ４９２４の生存能力への効果を、遺伝子組み換えでｐ５３を欠損させたＨＣＴ−１１６細胞と、その元の対照細胞で分析した。
【０１７０】
ｐ５３発現が野生型（＋／＋）または欠損（−／−）のいずれかである、同系ＨＣＴ−１１６細胞株の対（それぞれ、ＨＤ  ＰＡＲ−０１８およびＨＤ  １０４−００１、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｔｄ）を、別々の３８４ウェルのプレートに播種し、次いで、翌日、三重でＭＬＮ４９２４の希釈で処理し、１６００、１２００、８００および４００細胞／ウェルの密度で播種した細胞と共に、それぞれ２４、３６、４８または７２時間インキュベートした。化合物のインキュベーションの後、ＨＣＴ−１１６細胞の生存率を、ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒイメージングシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、メーカーの説明書に従い分析した。
【０１７１】
ＨＣＴ−１１６ＴＰ５３＋／＋細胞（ＭＬＮ４９２４  ＬＣ５０＝２１±１ｎＭ）は、ＨＣＴ−１１６ＴＰ５３−／−細胞（ＭＬＮ４９２４  ＬＣ５０＝７４±５ｎＭ）よりも、７２時間で、ＭＬＮ４９２４に対し高い感受性を示した（図６Ａ〜Ｄ）。これらの結果より、ｐ５３欠損により、ＨＣＴ−１１６のＭＬＮ４９２４に対する感受性が減少することが示唆され、７２時間でのｐ５３の包括的な役割はアポトーシス促進であることが示唆される。ＴＰ５３−／−細胞は２４、３６および４８時間では高濃度の薬剤でも細胞がほとんど死ななかったことから、この解釈は早期の時点では強化される。ウェスタンブロットより、ＴＰ５３−／−ＨＣＴ−１１６細胞において、ＭＬＮ４９２４により、未だにｐ２１の発現が上方調節されていたことが示された。ＨＣＴ−１１６細胞におけるｐ２１の安定化は、ＣＲＬ４−Ｃｄｔ２阻害の直接的な効果によるものであろう（Nishitani  et  al.,  2008;  Abbas  et  al.,  2008;  Kim  et  al.,  2008）。
【０１７２】
この結果は、ＨＣＴ−１１６細胞−／−細胞ｐ５３ノックアウト細胞を用いた、Linら（(2010)  Cancer  Res.  70:10310-10320）における結果と逆になっている。その実験では、ＴＰ５３ノックアウト細胞は、ＭＬＮ４９２４による全体的な細胞死または増殖に対して、より感受性であったと結論付けられた。本実験とLinらの結果が異なった理由は、細胞をＭＬＮ４９２４でした時間の長さである。Linらは、細胞を８時間処理して、洗浄した。本実験および前の実施例の細胞株パネルにおいて、細胞は７２時間にわたり継続してＭＬＮ４９２４で処置された。洗浄時、ｐ５３レベルは安定化され、早期の経路よりも、当初は阻害され、それにより早期の感受性がもたらされた代替経路の活性化を利用している。
【０１７３】
実施例５  核酸の単離および核酸の配列解析方法
【０１７４】
ゲノム単離およびＤＮＡ配列解析
細胞および腫瘍からのＤＮＡ単離は、ＤＮＡＥＡＳＹ（登録商標）単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて行う。ＲＮＡ単離は、ＭｅｇａＭａｘ（Ａｍｂｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）を用いて行う。ゲノム単離は、メーカーが推奨するプロトコールに従い行う。
【０１７５】
ＳＡＮＧＥＲ配列解析法
ＰＣＲ増幅は、遺伝子エクソンごとに最適化されたサイクル条件で行う。プライマー伸長シークエンシングは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１を用いて行う。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒで反応させる。シークエンスベースコールは、ＫＢＴＭ  Ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。体細胞変異コールは、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）で測定され、Ｓｅｑｍａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて対応する参照配列と、配列データを並べることにより手動で確認する。
【０１７６】
ＳＥＱＵＥＮＯＭ配列法  Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）分析を、一塩基伸長で、ＴｙｐｅＰＬＥＸ（登録商標）化学法を用いて設計する。このプロセスは、３つのステップからなる。１）対象のＳＮＰまたは変異および隣接する配列を含有するテキストファイルを、mysequenom.comにアップロードし、そこでウェブベースのＰｒｏｘＳＮＰプログラムを介して実行する。２）ＰｒｏｘＳＮＰのアウトプットを、ＰｒｅＸＴＥＮＤを介して実行する。３）ＰｒｅＸＴＥＮＤのアウトプットを、マルチプレックス化された反応物中に見出される可能性のあるすべてのピーク間での分離を確実にするために、伸長産物の予測質量を決定するＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎを介して実行する。
【０１７７】
次いで、ＰＣＲプライマーを、分析設計ステップで特定された領域を囲むように設計する。対象の領域を、プライマ―を用いてＰＣＲ反応中で増幅する。増幅および伸長された産物１５ｎｌを、Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ  ＲＳ１０００を用いて、３８４ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩ上にスポットする。３点検量体を各チップに加え、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆコンパクト質量分析計の適正な実行を確実にする。
【０１７８】
ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩを、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦコンパクト質量分析計に配置する。質量分析計を、３８４ウェルのｓｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ上の各スポットに対し、最大で９つを取得できるよう作動するようにセットする。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（１０１４２−２）から入手したＴｙｐｅＰＬＥＸ  Ｇｏｌｄ  ｋｉｔ  ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ  ＩＩを、メーカーの推奨プロトコールに従って用いる。分析は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｔｙｐｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｖ４のＳｅｑｕｅｎｏｍ分析ソフトウエアを用いて実施する。
【０１７９】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いた標的化ＮＧＳを使用して、マーカー中の低頻度変異を確認および特定する。プライマー対は、コーディングエクソンを増幅するように設計する。ＰＣＲ産物は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて定量し、等モル比で各試料を混合する。精製産物を、ライゲーションにより末端修復および連結する。連結産物を、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリー調製に用いる。連結ＰＣＲ産物を分断し、マルチプレックス化プールごとにバーコードを付けた１２の試料からなる、バーコード化したＨｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリーを作製するために用いる。プールされたＨｉ−Ｓｅｑ  ２０００ライブラリーを、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００フローセルの８レーン上でのクラスター作製により、クローン増幅させ、Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２０００上での１×１００  シングルエンドシークエンシングを用いて配列解析する。ヒトゲノム、ビルドＨｇ１８に対するプライマリーシークエンシングリードのマッチング、ならびに、ＳＮＰ分析は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＣＡＳＡＶＡソフトウエア、バージョン１．７．１．を用いて行う。
【０１８０】
一般手順
定量ＲＴ−ＰＣＲ
ｃＤＮＡ合成および定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、試薬、およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて、以下のサイクル条件で行う。ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ活性化のため、２分間、５０℃で維持。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ活性化のために９５℃、１０分間、次いで、９５℃１５秒、６０℃１分の２パートサイクルを４０回行う。ｄＣｔは、対照遺伝子Ｂ２Ｍ（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）およびＲＰＬＰＯ（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）の平均Ｃｔを用いることにより算出する。相対ｍＲＮＡ発現の定量は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得られる。ｍＲＮＡ発現の倍数変化値は、正常試料および対応腫瘍試料から作製される。
【０１８１】
骨髄腫試料に対する試料取扱い
患者の骨髄吸引液が採取されると、急速な負の選択を介して骨髄腫細胞が富化される。富化手順には、赤血球  ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合する抗体と連結された細胞型特異的抗体のカクテルを用いる。抗体カクテルには、以下の特異性を有する抗体が含まれる：ＣＤ１４（単球）、ＣＤ２（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）、ＣＤ３３（骨髄前駆細胞および単球）、ＣＤ４１（血小板および巨核細胞）、ＣＤ４５ＲＡ（ナイーブＢ細胞およびＴ細胞）およびＣＤ６６ｂ（顆粒球）。抗体は、試料中の非骨髄腫細胞型を赤血球に架橋する。結合された細胞型を、改変フィコール密度勾配を用いて除去する。次いで、骨髄腫細胞を回収し凍結する。
【０１８２】
全ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｇｒｏｕｐ  ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）単離キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、分光光度法により定量化する。
【０１８３】
ＲＮＡ単離法で使用したカラムのフロースルー分画から、ＤＮＡを単離する。
【０１８４】
骨髄腫遺伝子発現のアレイ分析
標準Ｔ７ベースの増幅プロトコール（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）により、ＲＮＡをビオチニル化  ｃＲＮＡに転換する。０．５以上〜２．０μｇの試料の少量をまた標識し、６μｇのｃＲＮＡが産生されれば、次いで、ハイブリダイズを行う。自動化Ｔ７増幅手順のために、ｃＤＮＡおよびビオチン標識ｃＲＮＡを、ＡＭＰＵＲＥ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してメーカーのプロトコール（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）に従い精製する。ｃＲＮＡ産生量を分光光度法により分析し、１０μｇのｃＲＮＡを断片化し、さらに、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｏｍｅＨＧ−Ｕ１３３ＡおよびＨＧ−Ｕ１３３Ｂ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）アレイ上で３重でのハイブリダイゼーションで処理する。ｃＲＮＡ産生量が６μｇ〜１０μｇの範囲にある場合、全ｃＲＮＡ試料を断片化する。
【０１８５】
各試料に対するｃＲＮＡを、Ｕ１３３Ａ／Ｂアレイに３重でハイブリダイズする；オペレーター、チップロット、臨床現場およびスキャナー（ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）スキャナー３０００）は、期間中ずっと制御される。バックグラウンドの差し引き、スムージング調整、ノイズ補正およびシグナル算出は、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＭＡＳ５．０で実施する。品質管理の基準には、プレゼントコールパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）（＞２５）スケールファクター（＜１１）、βアクチン３´：５´比（＜１５）およびバックグランド（＜１２０）が含まれる。これらの基準から外れる試料は、次の分析から除外される。
【０１８６】
骨髄腫の純度スコアにより、文献において骨髄腫細胞（およびそれらの正常な血漿前駆細胞）で高度に発現していると知られている遺伝子の発現を、赤血球系細胞、好中球およびＴ細胞で高度に発現していると知られている遺伝子（以下のリストの１４のマーカーを参照のこと）の発現に対し、検証する。骨髄腫スコア＝骨髄腫マーカー（以下の＃１〜４）／赤血球（＃５〜７）＋好中球（＃８〜１１）＋Ｔ細胞（＃１２〜１４）：
１．  ２０５６９２＿ｓ＿ａｔ  ＣＤ３８  ＣＤ３８抗原（ｐ４５）  骨髄腫／血漿細胞２．  ２０１２８６＿ａｔ  ＳＤＣ１  ｓｙｎｄｅｃａｎ−１  骨髄腫／血漿細胞
３．  ２０１８９１＿ｓ＿ａｔ  Ｂ２Ｍ  ｂｅｔａ−２  マイクログロブリン  骨髄腫／血漿細胞
４．  ２１１５２８＿ｘ＿ａｔ  Ｂ２Ｍ  ｂｅｔａ−２  マイクログロブリン  骨髄腫／血漿細胞
５．  ３７９８６＿ａｔ  ＥｐｏＲ  エリスロポエチン受容体  赤血球系細胞
６．  ２０９９６２＿ａｔ  ＥｐｏＲ  エリスロポエチン受容体  赤血球系細胞
７．  ２０５８３８＿ａｔ  ＧＹＰＡ  グリコフォリンＡ  赤血球系細胞
８．  ２０３９４８＿ｓ＿ａｔ  ＭＰＯ  ミエロペルオキシダーゼ  好中球
９．  ２０３５９１＿ｓ＿ａｔ  ＣＳＦＲ３コロニー刺激因子３受容体（顆粒球）  好中球
１０．  ２０４０３９＿ａｔ  ＣＥＢＰＡＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、α好中球
１１．  ２１４５２３＿ａｔ  ＣＥＢＰＥＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、ε好中球
１２．  ２０９６０３＿ａｔ  ＧＡＴＡ３  ＧＡＴＡ結合タンパク質３  Ｔリンパ球
１３．  ２０９６０４＿ｓ＿ａｔ  ＧＡＴＡ４  ＧＡＴＡ結合タンパク質４  Ｔリンパ球１４．  ２０５４５６＿ａｔ  ＣＤ３ＥＣＤ３Ｅ抗原、εポリペプチド  Ｔリンパ球
１０未満の骨髄腫純度スコアの試料は、追加分析から除外される。
【０１８７】
均等物
特定の用語を用いて本発明の実施形態が記述されているが、そのような記述は例示説明を目的とするのみであり、本発明の範囲または主旨から離れることなく変更および変形がなされうることが理解される。当業者であれば、日常的な実験を超えることなく、本明細書に記述される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下のクレームに包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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