(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞培養のための環境を定量化し、細胞培養環境の判定を行うことで、適切な細胞培養環境の探索が可能な細胞培養環境判定方法の提供。【解決手段】外気が導入されるチャンバー内に細胞を配し、チャンバーを第１の環境に設置して前記チャンバー内の細胞を培養するステップと、第１の環境に設置したチャンバー内で培養した細胞における遺伝子発現量を解析Ｓ２０１し、得られた第１環境遺伝子発現量と、チャンバーを第１の環境と異なる第２の環境に設置してチャンバー内の細胞を培養するステップと、第２の環境で培養した細胞における遺伝子発現量を解析Ｓ２０２し、得られた第２環境遺伝子発現量と、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比を算出Ｓ２０４し、算出された比に基づいて、第１の環境の細胞培養環境としての特性と、第２の環境の細胞培養環境としての特性を判定するステップＳ２０６と、を有する細胞培養環境判定方法。【選択図】図３
2018050509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外気が導入されるチャンバー内に細胞を配し、チャンバーを第１の環境に設置して前記チャンバー内の細胞を培養するステップと、
第１の環境に設置したチャンバー内で培養した細胞における遺伝子発現量を解析し、第１環境遺伝子発現量を取得するステップと、
外気が導入されるチャンバー内に細胞を配し、チャンバーを第１の環境と異なる第２の環境に設置してチャンバー内の細胞を培養するステップと、
第２の環境に設置したチャンバー内で培養した細胞における遺伝子発現量を解析し、第２環境遺伝子発現量を取得するステップと、
第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比を算出するステップと、
算出された比に基づいて、第１の環境の細胞培養環境としての特性と、第２の環境の細胞培養環境としての特性を判定するステップと、
を有することを特長とする細胞培養環境判定方法。
【請求項２】
第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比に基づいて、細胞影響指数を算出するステップを有することを特長とする請求項１に記載の細胞培養環境判定方法。
【請求項３】
細胞影響指数を算出するステップでは、
複数の遺伝子に基づいて、細胞影響指数を算出することを特長とする請求項２に記載の細胞培養環境判定方法。
【請求項４】
細胞影響指数を算出するステップでは、
快適な環境で増加する遺伝子、快適な環境で低減する遺伝子、不快な環境で増加する遺伝子、不快な環境で低減する遺伝子に分類して、細胞影響指数を算出することを特長とする請求項３に記載の細胞培養環境判定方法。
【請求項５】
細胞影響指数を算出するステップでは、
第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比、及び、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比の逆数から、細胞影響指数を算出することを特長とする請求項４に記載の細胞培養環境判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適な細胞培養環境を探索するために、細胞培養を行う環境を定量化し、細胞培養環境の判定を行う細胞培養環境判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くは輸血によって知られるように、採取された細胞を用い、けがや病気並びに事故等で失われた組織や臓器を再生させる再生医療の研究開発は盛んに行われてきた。近年の再生医療が目指す具体的なプロセスは、未分化な状態の細胞である幹細胞を採取し、これを体外で培養し、場合によっては分化させたのち、患部へ移植して再生を促すというものである。
【０００３】
このような細胞培養に関する技術が提案されており、例えば、特許文献１（特開２０１５−１７１３８２号公報）には、（ｉ）培養基材を血清で被覆する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得た血清で被覆された培養基材上に、細胞を、該細胞がコンフルエントに達する密度またはそれ以上の密度で播種してシート状の細胞培養物を形成する工程、および（ｉｉｉ）形成されたシート状細胞培養物を培養基材から単離する工程を含む、シート状細胞培養物の製造方法が開示されている。
【特許文献１】特開２０１５−１７１３８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のような細胞培養において、最適な培養環境の整備は研究の精度を上げ、再生治療をより早く安全に患者に提供するために必要不可欠である。
【０００５】
しかしながら、いまだ最適な細胞培養環境については明確になっておらず、研究段階である。細胞培養環境を構築する一つに空気環境がある。空気環境の影響に関して、これまで酸素が幹細胞の分化や増殖能に影響を及ぼすことが知られている。その他の培養環境の影響については、二酸化炭素や温度、振動等の研究報告がなされているが、細胞への影響を総合的に評価する方法は確立されていない。すなわち、これまで、細胞培養環境の定量的評価を行う手法が確立されておらず、問題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明は、上記課題を解決するものであって、本発明に係る細胞培養環境判定方法は、外気が導入されるチャンバー内に細胞を配し、チャンバーを第１の環境に設置して前記チャンバー内の細胞を培養するステップと、第１の環境に設置したチャンバー内で培養した細胞における遺伝子発現量を解析し、第１環境遺伝子発現量を取得するステップと、外気が導入されるチャンバー内に細胞を配し、チャンバーを第１の環境と異なる第２の環境に設置してチャンバー内の細胞を培養するステップと、第２の環境に設置したチャンバー内で培養した細胞における遺伝子発現量を解析し、第２環境遺伝子発現量を取得するステップと、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比を算出するステップと、算出された比に基づいて、第１の環境の細胞培養環境としての特性と、第２の環境の細胞培養環境としての特性を判定するステップと、を有することを特長とする。
【０００７】
また、本発明に係る細胞培養環境判定方法は、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比に基づいて、細胞影響指数を算出するステップを有することを特長とする。
【０００８】
また、本発明に係る細胞培養環境判定方法は、細胞影響指数を算出するステップでは、複数の遺伝子に基づいて、細胞影響指数を算出することを特長とする。
【０００９】
また、本発明に係る細胞培養環境判定方法は、細胞影響指数を算出するステップでは、快適な環境で増加する遺伝子、快適な環境で低減する遺伝子、不快な環境で増加する遺伝子、不快な環境で低減する遺伝子に分類して、細胞影響指数を算出することを特長とする。
【００１０】
また、本発明に係る細胞培養環境判定方法は、細胞影響指数を算出するステップでは、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比、及び、第１環境遺伝子発現量と第２環境遺伝子発現量の比の逆数から、細胞影響指数を算出することを特長とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る細胞培養環境判定方法によれば、細胞培養のための環境を定量化して、細胞培養環境の判定を行うことが可能となるので、より適切な細胞培養環境を探索することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養環境判定方法に用いる細胞を培養する細胞培養チャンバーの概略構成の模式図である。
【図２】遺伝子の発現量を取得するための各工程を説明する流れ図である。
【図３】本発明の実施形態に係る細胞培養環境判定方法における細胞影響指数算出処理のフローチャートを示す図である。
【図４】各属性を有する遺伝子の比を説明するテーブルである。
【図５】実施例のデータ取得方法を説明する図である。
【図６】実施例に基づく解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
【００１４】
本発明に係る細胞培養環境判定方法においては、細胞培養を行う環境に、細胞培養チャンバー１０を設置して、当該細胞培養チャンバー１０内に細胞培養環境から空気を導入しつつ、細胞を培養する。そして、細胞培養チャンバー１０内で培養した細胞を定量的に評価することで、細胞培養環境の判定を行うようにする。また、本発明に係る細胞培養環境判定方法においては、少なくとも２つの細胞培養環境に細胞培養チャンバー１０を設置して、細胞培養を行い、比較を行うことで、それぞれの細胞培養環境の判定を行う。
【００１５】
そこで、まず、細胞培養環境に設置して細胞培養を行う細胞培養チャンバー１０について説明する。図１は本発明の実施形態に係る細胞培養環境判定方法に用いる細胞を培養する細胞培養チャンバー１０の概略構成の模式図である。
【００１６】
チャンバー本体１１内には、細胞の培地５５を収めた培養容器５０が置かれる。チャンバー本体１１には、細胞培養チャンバー１０が設置されている細胞培養環境からの空気を導入するための給気管１３が設けられている。
【００１７】
給気管１３の管路中においては、細胞培養環境からチャンバー本体１１内に導入される空気の温度及び湿度を制御するための温湿度制御装置３５と、チャンバー本体１１内の二酸化炭素濃度を所定値に保つためのＣＯ2供給装置３７が設けられている。
【００１８】
また、チャンバー本体１１内から空気を排気するための排気管１５が設けられており、排気管１５の管路中には、一定の風量で、チャンバー本体１１内から空気を排気するためのポンプ１７が設けられている。図中の矢印は、空気の流れを示している。
【００１９】
主制御部２０は、演算部、計時部、記憶部、通信部（いずれも不図示）などを備える汎用のマイクロコンピューターである。また、チャンバー本体１１内には、温度を検知する温度センサ２５、湿度を検知する湿度センサ２６、二酸化炭素濃度を検知するＣＯ2濃度センサ２７が設けられている。
【００２０】
温度センサ２５で検知される温度データ、及び、湿度センサ２６で検知される湿度データ、及び、ＣＯ2濃度センサ２７で検知された二酸化炭素濃度データは、主制御部２０に転送される。主制御部２０は転送される各データに基づいて、給気管１３の管路中の温度と湿度を調整・制御する温湿度制御装置３５、及び、給気管１３の管路中に二酸化炭素を供給するＣＯ2供給装置３７を制御する。
【００２１】
本発明に係る細胞培養環境判定方法においては、以上のように構成される細胞培養チャンバー１０を、第１の細胞培養環境と、この第１の細胞培養環境とは異なる第２の細胞培養とに設置して、それぞれ細胞を培養して、培養した細胞の遺伝子発現量を取得する。
【００２２】
次に、培養細胞の遺伝子発現量の取得のための工程を説明する。図２は遺伝子の発現量を取得するための各工程を説明する流れ図である。図２に示す各工程は、細胞培養チャンバー１０を第１の細胞培養環境に設置した場合と、細胞培養チャンバー１０を第２の細胞培養環境に設置した場合と、の双方で実行する。
【００２３】
図２において、ステップＳ１００で工程が開始されると、ステップＳ１０１では、培養する細胞に汚染がないことを確認する。細胞由来種はヒト、動物、植物の細胞を用いることができる。ステップＳ１０１では、これらの細胞に、事前にマイコプラズマ汚染、エンドトキシン試験、ウイルス試験等を行い、汚染の無いことを確認する。
【００２４】
ステップＳ１０２では、所定環境（例えば、第１の環境）に設置される細胞培養チャンバー１０のチャンバー本体１１内に、汚染が無いことが確認された細胞の培地５５を収めた培養容器５０が置かれる。
【００２５】
ステップＳ１０３では、細胞培養チャンバー１０のチャンバー本体１１内で細胞を培養する。このとき、チャンバー本体１１内には、ポンプ１７が駆動されることで一定量の空気が取り込まれる。また、チャンバー本体１１内に取り込まれる空気は、給気管１３に設けられている温湿度制御装置３５、及び、ＣＯ2供給装置３７が制御され、チャンバー本体１１内の温度、湿度、二酸化炭素濃度が一定となるように
ステップＳ１０４では、細胞培養チャンバー１０で培養された細胞を取り出して、培養細胞からＲＮＡを抽出し、続いて、ステップＳ１０５で、抽出したＲＮＡから補完的ＤＮＡを合成し、ステップＳ１０６で、合成された補完的ＤＮＡを用いて、遺伝子発現解析（リアルタイムＰＣＲ；Polymerase Chain Reaction）を行うことで、各遺伝子の発現量を取得する。
【００２６】
なお、本実施形態は、遺伝子発現解析をリアルタイムＰＣＲにより行ったが、次世代シーケンサーを用いて遺伝子発現解析を行うようにしてもよい。
【００２７】
上記のような各工程を２つの環境で実施することで、第１の細胞培養環境で培養した細胞の遺伝子発現量、第２の細胞培養環境で培養した細胞の遺伝子発現量を得ることとなる。続いて、取得された遺伝子発現量に基づいて、細胞培養環境を評価するための「細胞影響指数」を算出するための処理について説明する。このような算出処理のためには、パーソナルコンピューターなどの汎用の計算機が用いられる。
【００２８】
図３は本発明の実施形態に係る細胞培養環境判定方法における細胞影響指数算出処理のフローチャートを示す図である。
【００２９】
ステップＳ２００で、細胞影響指数算出処理が開始されると、続いて、ステップＳ２０１で、第１の環境で培養された細胞の第１環境遺伝子発現量を取得し、ステップＳ２０２で、第２の環境で培養された細胞の第２環境遺伝子発現量を取得する。
【００３０】
ステップＳ２０３では、各遺伝子の種類毎に第２環境遺伝子発現量／第１環境遺伝子発現量（比）の算出を行い、ステップＳ２０４では、各遺伝子の属性毎（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ毎）に当該比を記憶しておく。ここで、各遺伝子の属性について説明する。ここで、各遺伝子の属性を、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４通りに区分している。それぞれがどのような属性であるかは下記の通りである。
Ａ：ある基準環境で細胞が発現する遺伝子に比べて快適な環境で増加する遺伝子
Ｂ：ある基準環境で細胞が発現する遺伝子に比べて快適な環境で低減する遺伝子
Ｃ：ある基準環境で細胞が発現する遺伝子に比べて不快な環境で増加する遺伝子
Ｄ：ある基準環境で細胞が発現する遺伝子に比べて不快な環境で低減する遺伝子
本発明に係る細胞培養環境判定方法においては、複数の遺伝子の発現量を測定し、基準となる環境で培養した細胞が発現する遺伝子量に比較して対象となる環境で培養した細胞が発現する遺伝子量の数値を用いて評価する。
【００３１】
そこで、本発明に係る細胞培養環境判定方法においては、上記のようなＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４通りの属性の遺伝子の発現量の比を細胞培養環境ごとで算出し、さらにこれに基づいて「細胞影響指数」を算出し、それぞれの細胞培養環境の定量化を図るようにしている。
【００３２】
さて、ステップＳ２０５では、全ての種類の遺伝子について、比の算出と、算出した比の記憶が終了したか否かが判定される。ステップＳ２０５の判定結果がＮＯであるときには、ステップＳ２０６に進み、次の遺伝子に着目して、ステップＳ２０１に戻りループする。
【００３３】
一方、ステップＳ２０５の判定結果がＹＥＳであるときには、ステップＳ２０７に進み、細胞影響指数を（細胞影響指数）＝ΣＡ＋Σ１／Ｂ−（ΣＣ＋Σ１／Ｄ）によって算出する。
【００３４】
ここで、ΣＡは、Ａの属性を有する遺伝子の前記の比の総和である。Σ１／Ｂは、Ｂの属性を有する遺伝子の前記の比の逆数の総和である。また、ΣＣは、Ｃの属性を有する遺伝子の前記の比の総和である。また、Σ１／Ｄは、Ｄの属性を有する遺伝子の前記の比の逆数の総和である。
【００３５】
図４は各属性を有する遺伝子の比を説明するテーブルである。  図４（Ａ）はＡの属性を有する遺伝子とその比を、図４（Ｂ）はＢの属性を有する遺伝子とその比を、図４（Ｃ）はＣの属性を有する遺伝子とその比を、図４（Ｄ）はＤの属性を有する遺伝子とその比を、それぞれ示している。
【００３６】
図４のようなテーブルを例に取ると、細胞影響指数は、
（細胞影響指数）＝ΣＡ＋Σ１／Ｂ−（ΣＣ＋Σ１／Ｄ）
=A(1.5+2.4+1.2+1.1)+B(1/0.5+1/0.4+1/0.8+1/1)-[C(1.0+2.0+1.2+1.1)+D(1/0.2+1/0.4+1/0.3+1/1)=6.2+18.5-(5.3+10.5)=8.9
となる。この細胞影響指数は、０以上であれば、ある基準環境に比べて、細胞を培養するのにより適した環境である、ということが言える。
【００３７】
ステップＳ２０８では、細胞影響指数算出処理を終了する。
【００３８】
以上のように、本発明に係る細胞培養環境判定方法によれば、細胞培養のための環境を定量化して、細胞培養環境の判定を行うことが可能となるので、より適切な細胞培養環境を探索することができるようになる。
（実施例）
次に、本発明の実施例について説明する。図５は実施例のデータ取得方法を説明する図である。図５（Ａ）は新規培養環境（第１の環境）を模擬する給気管１３の管路中にケミカルフィルター３３が設けられた細胞培養チャンバー１０を示している。また、図５（Ｂ）は通常培養環境（第２の環境）を模擬する給気管１３の管路中にケミカルフィルター３３が設けられていない細胞培養チャンバー１０を示している。本実施例では、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）の２態様で細胞を培養し、細胞培養環境の評価を行った。
細胞培養
培養に使用した細胞はマイコプラズマ汚染試験済みの細胞HUV-EC-C（臍帯由来血管内皮細胞）、TIG-1-20（繊維芽細胞：胎児肺由来）をJCRB細胞バンク（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所）より入手した。HUV-EC-Cは培地５５（内皮細胞増殖培地（C22110:タカラバイオ社））を用いて培養し、培地５５の交換は2〜3日間隔で実施した。
【００３９】
培養容器５０としてはT-75フラスコを用いて、細胞培養チャンバー１０で2〜3継代した細胞を使用した。TIG-1-20は最少必須培地（11095-080:gibco社）にFBSを10%添加した培地を用いて培養し、培地交換は2〜3日間隔で実施した。T-75フラスコを用いて2〜3代培養した後、一度凍結保存を行った。実験開始前に解凍し、播種した後2〜3代継代した細胞を使用した。
【００４０】
細胞培養チャンバー１０においては、ＣＯ2供給装置３７により二酸化炭素濃度が５％となるように調整した。また、チャンバー本体１１内の温度は２７℃、湿度は６２％とされた。
遺伝子発現解析
培養細胞は6wellプレートに 10,000cell/mlの濃度で播種し（Ａ）ケミカルフィルターありの細胞培養チャンバー１０内、及び、（Ｂ）ケミカルフィルター無しの細胞培養チャンバー１０内で培養を行い、ケミカルフィルターによる化学物質を除去した清浄空気が与える細胞への影響を評価した。
RNA抽出、ステップＳ１０４
トータルRNAの抽出はRNeasy Mini Kit （Roche社）を使用した。培養済み細胞の入った6wellプレート各ウェルに70%エタノールを700μl添加し、セルスクレイパーを用いてウェル底面全体を軽くこする。700μlをRNeasy Mini Spin Columnに入れ2ml collection tubeにセットして蓋を閉じる。12000rpmで1分間、遠心分離器にかけてcollection tubeに溜まった液体を廃棄する。  Buffer RW1を700μl添加し、蓋を閉じる。12000rpmで1分間、遠心分離器にかけてcollection tubeに溜まった液体を廃棄する。Buffer RPEを700μl添加し、蓋を閉じる。12000rpmで1分間、遠心分離器にかけてcollection tubeに溜まった液体を廃棄する（2回行う）。RNeasy Mini Spin Columnを1.5ml  Collection tubeにセットし、RNeasy Mini Spin Column のメンブレンにRNase-free water を50μl添加し12000rpmで1分間、遠心分離器にかける。1.5mlCollection tubeに分離されたRNA液体を回収する。
cDNA合成、ステップＳ１０５
cDNA合成はTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche社）を使用した。1.5ml Sampling tubeにRNA抽出で回収したtotal RNAを10ml、Anchored-oligo(dT)18 primer(50pmol/μl)を1μl、random hexamer primer(600 pmol/μl)を2μl添加して、卓上遠心機にて遠心する。さらにTranscriptor Reverse Transcriptase reaction Buffer(5x conc.)を4μl、protector RNase Inhibitor(40U/μl)を0.5μl、Deoxynucleotide Mix(10mM each)を2μl、Transcriptor reverse transcriptase(20U/μl)を0.5μl添加し、最終容量を20μlとする。サーマルサイクラーにて25℃10分、55℃30分、85℃5分でインキュベートしcDNAを合成する。出来上がったcDNAは-20℃にて保管する。
遺伝子発現解析（リアルタイムPCR）、ステップＳ１０６
リアルタイムPCRはLightCycler480( Roche社)を用いた。解析はリアルタイムPCRプライマーアッセイセット[RT2 Profiler PCR Arrays(QIAGEN社)]を用いてOxidative Stress, Stress Responseについて解析を行った。
【００４１】
15ml遠沈管に上記で作製したcDNA20μlに2x RT2SYBR Green Mastermixを1350μl、RNase Free Waterを1330μl加えて軽く攪拌する。RT2 Profiler PCR Arraysプレートに25μlずつ分注し、付属の粘着テープでシールする。1000rpm／分で30秒間遠心分離機にかけた後、Light Cycler480にセットする。
Light Cycler 480 測定条件
Pre-incubation（1回）    95℃ 5分  4.4℃/秒
Amplification（45回）    95℃ 10秒 4.4℃/秒
60℃ 10秒 2.2℃/秒
72℃ 10秒 4.4℃/秒
Melting curve（1回）     95℃ 5秒  4.4℃/秒
65℃ 1分  2.2℃/秒
97℃       0.11℃/秒
Cooling（1回）      40℃ 30秒 2.2℃/秒
遺伝子発現解析結果
これまで説明したように、HUV-EC-C細胞を（Ａ）ケミカルフィルター３３あり、（Ｂ）なしの環境下で培養し、細胞が発現する遺伝子発現量リアルタイムＰＣＲ法による測定した結果を図６に示す。
【００４２】
発現した遺伝子量は比較ＣＴ法に評価した。ケミカルフィルター３３なしの細胞培養チャンバー１０で培養した細胞はケミカルフィルター３３ありの条件に比べてVIMP（VCP interacting membrane selenoprotein）の発現量が約3.11倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）、MPO（Myeloperoxidase）の発現量が約2.49倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）になっている事を確認した。一方、発現が低減したのはLPO（lactoperoxidase）でケミカルフィルター３３ありの条件で培養した細胞が発現する遺伝子量に比べて約0.31倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）、GCLC（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit）が約0.4倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）となっていた。ケミカルフィルター３３なしの条件で遺伝子発現量が増加していた遺伝子は44遺伝子、発現量が低減していた遺伝子は28遺伝子であった。
【００４３】
図６は、ケミカルフィルター３３ありの新規培養環境（点線）で培養した細胞が発現した遺伝子発現量を基準にして、ケミカルフィルター３３なしの通常培養環境（実線）で培養した細胞が発現した遺伝子発現量を示すものである。通常培養環境は新規培養環境に比べて遺伝子発現量が増加していることから、細胞に酸化ストレスを与えていることが分かった。したがって、新規培養環境は細胞に酸化ストレスを与えにくい環境であることが確認された。
【００４４】
一方、TIG-1-20細胞をケミカルフィルター３３あり、なしの環境下で培養し、細胞が発現する遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲ法による測定も行った。それぞれの条件で発現した遺伝子量は比較ＣＴ法により評価した。ケミカルフィルター３３ありの条件が発現する遺伝子発現量に比較してケミカルフィルター３３なしの条件ではDUSP1(dual specificity phosphatase 1)が約1.26倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）、SIRT2(sirtuin 2)が約1.16倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）に遺伝子発現量が増加していた。一方、発現が低減した遺伝子はDUOX1(dual oxidase 1)が約0.36倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）、GPX5(glutathione peroxidase 5)が約0.38倍（本発明に係る細胞培養環境判定方法における比）に低減していた。ケミカルフィルター３３なしの条件で遺伝子発現量が増加していた遺伝子は20遺伝子、発現量が低減していた遺伝子は64遺伝子であった。
【００４５】
HUV-EC-CとTIG-1-20の遺伝子発現解析の結果から、HUV-EC-Cではケミカルフィルター３３が酸化ストレス低減に効果があるが、TIG-1-20ではあまり影響がないことが確認された。
【００４６】
なお、本実施例では、細胞の培養環境が、細胞の酸化ストレスに与える影響のみを評価したものであるが、現在入手可能なキットによれば、アポトーシス、セルサイクル、癌炎症、ストレス応答、ＤＮＡ修復などに与える影響の評価も簡便に行うことができる。
【００４７】
さらに、本発明に係る細胞培養環境判定方法における細胞影響指数を用いるようにすれば、細胞培養を実施する各種環境が、細胞に与える影響を総合的に判断することができるようになる。
【符号の説明】
【００４８】
１０・・・細胞培養チャンバー
１１・・・チャンバー本体
１３・・・給気管
１５・・・排気管
１７・・・ポンプ
２０・・・主制御部
２５・・・温度センサ
２６・・・湿度センサ
２７・・・ＣＯ2濃度センサ
３３・・・ケミカルフィルター
３５・・・温湿度制御装置
３７・・・ＣＯ2供給装置
５０・・・培養容器
５５・・・培地
【図１】
2018050509.tif 000003
【図２】
2018050509.tif 000004
【図３】
2018050509.tif 000005
【図４】
2018050509.tif 000006
【図５】
2018050509.tif 000007
【図６】
2018050509.tif 000008