(57)【要約】【課題】チロシンキナーゼ阻害剤投与中止時、あるいは投与中止から数ヶ月以内の早い段階で適用可能な、がんの再発の予測を補助する方法を提供することを課題とする。【解決手段】がん患者から採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程と、測定結果に基づいて、eTreg細胞数に関する値を取得する工程と、得られたeTreg細胞数に関する値に基づいて、前記患者を再発低リスク群に分類する工程とを含み、前記がん患者はチロシンキナーゼ阻害剤の投与履歴を有し、前記血液はチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液である、がんの再発の予測を補助する方法によって上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者から採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程と、
測定結果に基づいて、eTreg細胞数に関する値を取得する工程と、
得られたeTreg細胞数に関する値に基づいて、前記患者を再発低リスク群に分類する工程と
を含み、
前記がん患者はチロシンキナーゼ阻害剤の投与履歴を有し、
前記血液はチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液である、がんの再発の予測を補助する方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程をさらに含み、
前記eTreg細胞数に関する値は、eTreg細胞数の増加率または前記増加率の逆数であり、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記eTreg細胞数の増加率の逆数は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分類工程において、前記eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上である場合、前記患者が再発低リスク群に分類され、または
前記分類工程において、前記eTreg細胞数の増加率の逆数が所定の閾値未満である場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含み、
前記取得工程において、前記eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択されるいずれか１つのパラメータ、または
CD8+T細胞数／eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／eTreg細胞数、CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数及びPD-1+CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数からなる群より選択されるいずれか１つの逆数パラメータが取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分類工程において、前記パラメータが所定の閾値以上である場合、または前記逆数パラメータが所定の閾値未満である場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、以下の第1パラメータおよび第2パラメータが取得され：
第1パラメータ：前記eTreg細胞数の増加率；および
第2パラメータ：eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択される１の値、
前記分類工程において、前記第1パラメータが所定の閾値以上または前記第2パラメータが所定の閾値以上の場合、前記がん患者が再発低リスク群に分類される、請求項２記載の方法。
【請求項７】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、以下の第1逆数パラメータおよび第2逆数パラメータが取得され：
第1逆数パラメータ：前記eTreg細胞数の増加率の逆数；および
第2逆数パラメータ：CD8+T細胞数／eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／eTreg細胞数、CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数及びPD-1+CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される１の値、
前記分類工程において、前記第1逆数パラメータが所定の閾値未満または前記第2逆数パラメータが所定の閾値未満の場合、前記がん患者が再発低リスク群に分類される、請求項２記載の方法。
【請求項８】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、以下の第1パラメータ、第2パラメータおよび第3パラメータが取得され：
第1パラメータ：前記eTreg細胞数の増加率；および
第2パラメータおよび第3パラメータ：eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択されるいずれか２の値、
前記分類工程において、前記第1パラメータが所定の閾値以上、前記第2パラメータが所定の閾値以上または前記第3パラメータが所定の閾値以上の場合、前記がん患者が再発低リスク群に分類される、請求項２記載の方法。
【請求項９】
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、以下の第1逆数パラメータ、第2逆数パラメータおよび第3逆数パラメータが取得され：
第1逆数パラメータ：前記eTreg細胞数の増加率の逆数；および
第2逆数パラメータおよび第3逆数パラメータ：eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択されるいずれか２の値、
前記分類工程において、前記第1逆数パラメータが所定の閾値未満、前記第2逆数パラメータが所定の閾値未満または前記第3逆数パラメータが所定の閾値未満の場合、前記がん患者が再発低リスク群に分類される、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数／CD8+T細胞数及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、eTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上またはeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率及びeTreg細胞数／CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上またはeTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上またはeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数／CD8+T細胞数及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記分類工程において、eTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上またはeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数／CD8+T細胞数及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上、またはeTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率及びeTreg細胞数／CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数／CD8+T細胞数及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記分類工程において、eTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記がん患者から採取された血液中のCD8+T細胞数を測定する工程と、
前記がん患者から採取された血液中のPD-1+CD8+T細胞数を測定する工程と、
チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程とをさらに含み、
前記取得工程において、eTreg細胞数に関する値として、eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数／CD8+T細胞数及びeTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が取得され、
前記eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表され、
前記分類工程において、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、eTreg細胞数／CD8+T細胞数が所定の閾値以上、かつ、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、前記患者が再発低リスク群に分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液が、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２５〜４２日後に採取された血液である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液が、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１５〜４４日前に採取された血液である、請求項２〜５、１０〜１２、１４〜１６、１８及び１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、イマチニブである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、慢性骨髄性白血病である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記がん患者は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与を３年以上継続して受けており、分子遺伝学的完全寛解を２年以上継続して示している患者である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの再発の予測を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病(Chronic Myeloid Leukemia；CML)は、異常染色体であるフィラデルフィア染色体によるBCR-ABL1チロシンキナーゼの制御不能な活性化に起因する。CMLの治療薬として、イマチニブが知られている。イマチニブは、チロシンキナーゼ阻害剤(Tyrosine kinase inhibitor；TKI)の一種である。日本における前向き観察研究「TARGET」によれば、639人のCML患者を対象とした7.5年時点の全生存率は95.1％と極めて良好であった。CMLはかつて不治の病と考えられていたが、イマチニブの登場により、CML患者の予後を劇的に改善することが可能となっている。
【０００３】
近年では、CML治療を中止しても再発しない症例が報告されている。フランスにおける前向きSTIM試験(STop IMatinib)では、分子遺伝学的完全寛解が2年以上維持されている慢性期CML患者100症例を対象として、39％が分子遺伝学的再発を起こすことなく、イマチニブの投与を長期間中止できたことが報告されている。この結果は、オーストラリアにおけるTWISTER試験によって追試されており、CML患者の一部では、イマチニブ治療を中止できることが明らかとなっている。
【０００４】
経済的負担、副作用の存在、若い女性の場合には妊娠の希望などを理由として、イマチニブを含むTKIの投与中止を希望する患者も存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Imagawa J.ら,“Discontinuation of dasatinib in patients with chronic myeloid leukemia who have maintained deep molecular response for longer than 1 year (DADI trial): a multicenter phase 2 trial” The Lancet Haematology, Volume 2, Issue 12, December 2015, Pages e528-e535
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような背景から、イマチニブ治療を中止できる患者とそうでない患者を見極めることは重要である。非特許文献１には、慢性骨髄性白血病治療におけるダサチニブ(TKIの一種)の投与中止試験の結果が報告されている。同文献には、ダサチニブ投与中止の１年後にTreg細胞(制御性T細胞)の数が少ない患者群で予後が良好であったことが記載されている。しかしながら、同文献は、医師がイマチニブ投与中止の可否を実際に判断しようとする際に、あるいは投与中止から数ヶ月以内の早い段階で、CML患者の予後に関する情報を提供できる方法を記載するものではない。
【０００７】
よって、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与中止から数ヶ月以内の早い段階で適用可能な、がんの再発の予測を補助する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、イマチニブの投与中止から約１ヶ月後の血中eTreg細胞(エフェクター制御性T細胞)の数と、がん患者の予後との間に相関があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、がん患者から採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程と、測定結果に基づいて、eTreg細胞数に関する値を取得する工程と、得られたeTreg細胞数に関する値に基づいて、前記患者を再発低リスク群に分類する工程とを含み、前記がん患者はチロシンキナーゼ阻害剤の投与履歴を有し、前記血液はチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液である、がんの再発の予測を補助する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、チロシンキナーゼ阻害剤の投与中止から約１ヶ月の早い段階で適用可能な、がんの再発の予測補助方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】本実施形態の試薬キットの外観の一例である。
【図１Ｂ】本実施形態の試薬キットの外観の一例である。
【図２】予測補助装置の一例を示した概略図である。
【図３】図２の予測補助装置の機能構成を示すブロック図である。
【図４】図２に示された予測補助装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図５】図２に示された予測補助装置を用いた、がんの再発の予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。
【図６】eTreg細胞数の増加率に基づく分類結果を示す図である。
【図７】eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図８】eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図９】PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１０】PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１１】CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１２】CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１３】LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１４】LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１５】Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１６】Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１７】TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１８】TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図１９】ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【図２０】ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本実施形態のがんの再発の予測補助方法(以下、単に「方法」ともいう)は、がん患者から採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程を含む。がん患者は、がんに罹患していると診断され、チロシンキナーゼ阻害剤の投与履歴を有する患者であり、好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤の投与を３年以上継続して受けており、分子遺伝学的完全寛解を２年以上継続して示している患者である。
【００１３】
「チロシンキナーゼ阻害剤の投与履歴を有する」とは、患者がチロシンキナーゼ阻害剤を投与された経験が１回以上あることを意味する。「分子遺伝学的完全寛解」とは、高感度のRQ-PCR (Real-time Quantitative PCR)法又はnested PCR法によって、がんの原因遺伝子、たとえばBCR-ABL遺伝子が２回連続して検出されないことを意味する。
【００１４】
がんは、チロシンキナーゼの異常に起因するがんであれば特に限定されず、白血病、具体的には慢性骨髄性白血病(CML)、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病(Ph+ALL)および慢性リンパ性白血病、消化管間質腫瘍(GIST)、非小細胞肺がん、腎細胞がん、膵神経内分泌腫瘍、悪性軟部腫瘍(軟部肉腫)、悪性黒色腫、HER2過剰発現乳がん、特発性肺線維症、小リンパ球性リンパ腫などが挙げられるが、好ましくは慢性骨髄性白血病である。
【００１５】
がん患者から採取された血液は、全血、血清または血漿を含む。血液は、採取が簡便なものがとりわけ好ましく、例えば末梢血およびそれから取得される血清および血漿などが挙げられる。
血液は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後、好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２５〜４２日後に採取された血液である。
【００１６】
チロシンキナーゼ阻害剤は特に限定されず、イマチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ボスチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、レンバチニブ、ラパチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、イブルチニブなどが挙げられるが、好ましくはイマチニブである。
【００１７】
eTreg細胞とは、最終分化段階にあり、強い免疫抑制活性を示す制御性T細胞である。eTreg細胞は、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。ここで、本明細書において、細胞表面マーカーについての「発現する」、「＋」などの表現は、当該細胞表面マーカーを後述の標識化抗体によって標識した際に、シグナルが所定の閾値以上となることを意味する。たとえば、CD3+細胞は、抗CD3標識抗体で標識した際に所定の閾値以上の蛍光強度を示す細胞である。本明細書において、細胞表面マーカーについての「発現しない」、「−」などの表現は、当該細胞表面マーカーを後述の標識化抗体によって標識した際に、シグナルが所定の閾値未満となることを意味する。たとえば、CD45RA-細胞は、抗CD45RA標識抗体で標識した際に所定の閾値未満の蛍光強度を示す細胞である。
【００１８】
CD3 (Cluster of Differentiation 3)は、T細胞受容体と複合体形成することで知られる膜貫通タンパク質である。CD4 (Cluster of Differentiation 4)は、ヘルパーT細胞表面に発現する補助受容体である。FOXP3 (Forkhead box P3)は、Tregのマスター転写因子をコードする遺伝子である。CD45RA (Cluster of Differentiation 45 RA)は、ナイーブT細胞マーカーの１つである。eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。eTreg細胞数の測定は、たとえば、Nishikawaら(Current Opinion in Immunology, 2014, 27:1-7)などの記載に従って、測定することができる。
【００１９】
本実施形態の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前、好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１５〜４４日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する工程をさらに含んでいてもよい。
【００２０】
本実施形態の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のCD8+T細胞数、PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含んでいてもよい。以下の実施例で示すように、PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3、TIGIT又はICOSを更に発現しているeTreg細胞数をCD8+T細胞数又はPD-1+CD8+T細胞数で除することによって得られるパラメータを用いた場合には良好な分類結果が得られた。
【００２１】
CD8 (Cluster of Differentiation 8)は、細胞傷害性T細胞表面に発現する補助受容体である。CD8+T細胞は、CD3及びCD8(CD8a)を発現することによって特徴付けられる細胞(CD3+CD8+T細胞又はCD3+CD8a+T細胞)である。したがって、CD8+T細胞数は、当業者に公知の方法によって、このようなCD3+CD8+T細胞(あるいはCD3+CD8a+T細胞)の数を計測することにより測定することができる。CD8+T細胞数は、たとえば、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体、標識化抗FoxP3抗体及び標識化抗CD45RA抗体に代えて、標識化抗CD3抗体及び標識化抗CD8抗体(あるいは標識化抗CD8a抗体)を用いることを除いては、eTreg細胞数の計測に関して述べたことと同様にして計測することができる。なお、CD8は、CD8aなどを含むCD8ファミリーを形成するが、本発明で測定するのはCD8aである。以下、CD8aを単に「CD8」ということがある。
【００２２】
PD-1+CD8+T細胞数は、CD3、CD8(CD8a)及びPD-1を発現することによって特徴付けられる細胞(PD-1+CD3+CD8+T細胞又はPD-1+CD3+CD8a+T細胞)である。PD-1 (Programmed cell death 1)は、PD-L1又はPD-L2リガンドとの相互作用によってT細胞の活性化を抑制することで知られる免疫チェックポイントタンパク質である。PD-1+CD8+T細胞数は、当業者に公知の方法によって、PD-1+CD3+CD8+T細胞(あるいはPD-1+CD3+CD8a+T細胞)の数を計測することにより測定することができる。PD-1+CD8+T細胞数は、たとえば、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体、標識化抗FoxP3抗体及び標識化抗CD45RA抗体に代えて、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD8抗体(あるいは標識化抗CD8a抗体)及び標識化抗PD-1抗体を用いることを除いては、eTreg細胞数の計測に関して述べたことと同様にして計測することができる。
【００２３】
本実施形態の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のPD-1+eTreg細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数、LAG-3+eTreg細胞数、Tim-3+eTreg細胞数、TIGIT+eTreg細胞数及びICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される少なくとも１つを測定する工程をさらに含んでいてもよい。以下の実施例で示すように、PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim-3、TIGIT又はICOSを更に発現しているeTreg細胞数を用いた場合には良好な分類結果が得られた。
【００２４】
PD-1+eTreg細胞は、PD-1、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(PD-1+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。PD-1+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、PD-1+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。PD-1+eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗PD-1抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗PD-1抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００２５】
CTLA-4+ eTreg細胞は、CTLA-4、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(CTLA-4+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)は、T細胞の免疫応答の抑制に関与することで知られる免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子である。CTLA-4+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、CTLA-4+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。CTLA-4+eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗CTLA-4抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗CTLA-4抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００２６】
LAG-3+ eTreg細胞は、LAG-3、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(LAG-3+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。LAG-3 (lymphocyte activation gene-3)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質をコードする遺伝子である。LAG-3+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、LAG-3+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。LAG-3+eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗LAG-3抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗LAG-3抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００２７】
Tim-3+ eTreg細胞は、Tim-3、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(Tim-3+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。Tim-3 (T-cell immunoglobulin and mucin containing protein-3)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質をコードする遺伝子である。Tim-3+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、Tim-3+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。Tim-3+ eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗Tim-3抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗Tim-3抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００２８】
TIGIT+ eTreg細胞は、TIGIT、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(TIGIT+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質をコードする遺伝子である。TIGIT+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、TIGIT+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。TIGIT+ eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗TIGIT抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗TIGIT抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００２９】
ICOS+ eTreg細胞は、ICOS、CD3、CD4及びFOXP3を発現し、CD45RAを発現しないことによって特徴付けられる細胞(ICOS+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞)である。ICOS (Inducible T cell costimulator)は、Treg細胞の分化誘導に関与する共刺激分子をコードする遺伝子である。ICOS+eTreg細胞数は、当業者に公知の方法によって、ICOS+ CD3+ CD4+ FOXP3+ CD45RA-細胞の数を計測することにより測定することができる。ICOS+ eTreg細胞数は、たとえば、以下のようにして測定することができる：血液から採取した細胞と、標識化抗ICOS抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗CD45RA抗体とを混合し、細胞表面に発現する抗原に抗体を結合させ、細胞を洗浄し、標識化抗FoxP3抗体を用いて核内染色し、細胞を洗浄し、その後フローサイトメトリを用いて、標識化抗ICOS抗体、標識化抗CD3抗体、標識化抗CD4抗体及び標識化抗FoxP3抗体に由来するシグナルの全てを発し、標識化抗CD45RA抗体に由来するシグナルを発しない細胞の数を計測する。
【００３０】
標識化抗体とは、標識物質で標識された抗体を意味する。標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよいが、シグナル発生物質であることが好ましい。このようなシグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。酵素の基質は、選択する酵素の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。標識物質は、蛍光物質であることが特に好ましい。
【００３１】
本明細書において、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が蛍光物質である場合、それにより発せられる蛍光シグナルを、フローサイトメータなどの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
【００３２】
本実施形態では、シグナルの検出結果から、eTreg細胞などの細胞数を測定する。例えば、シグナルの検出回数の値などを、細胞数として用いることができる。細胞数としては、例えば、シグナル検出回数の値から陰性対照試料のシグナル検出回数の値又はバックグラウンドの値を差し引いた値が挙げられる。陰性対照試料は適宜選択できるが、例えば、健常者から得た血液などが挙げられる。
【００３３】
本実施形態の方法は、上記の測定結果に基づいて、eTreg細胞数に関する値を取得する工程を含む。
eTreg細胞数に関する値は、がん患者から採取された血液中におけるeTreg細胞数の増加の度合いや血液中に存在する他の細胞、たとえばCD8+T細胞の数との比などのパラメータ、あるいはそれらの組合せなどであり得る。
【００３４】
１つの実施形態では、eTreg細胞数に関する値は、eTreg細胞数の増加率またはeTreg細胞数の増加率の逆数であってもよい。
ここで、eTreg細胞数の増加率は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表される。
【００３５】
eTreg細胞数の増加率の逆数は、以下の式：
(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数)／(チロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中におけるeTreg細胞数)
によって表される。
【００３６】
Treg細胞は、本来、免疫機能を抑制する作用を有するため、eTreg細胞が増加すると免疫機能が低下し、がん患者の予後は悪くなると考えられる。しかしながら、本発明者らは、このような技術常識に反して、イマチニブの投与中止から約１ヶ月後の血中eTreg細胞数が増加している場合、がん患者の予後が良好であることを見出した。
【００３７】
別の実施形態では、以下の群から選択される１以上のパラメータ：
eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数；又は
以下の群から選択される１以上の逆数パラメータ：
CD8+T細胞数／eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／eTreg細胞数、CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数及びPD-1+CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数；
であってもよい。
【００３８】
通常、担がん生体における持続的で継続的なeTreg細胞数の増加は、がん免疫を抑制する方向に働くと考えられている。本発明では、長期間にわたるイマチニブ投与により、患者体内においてeTreg細胞が低下し、抑制が解除されていた免疫状態となる。イマチニブ投与を中止することで、一過性(中止から１ヵ月後)にeTreg細胞がリバウンドした状態をとらえたものである。eTreg細胞の活性化は最初にイマチニブ中止から１ヵ月後の段階で起こり、その後、eTreg細胞のリバウンドが落ち着く。一方で、CD8+T細胞の活性化は、eTreg細胞の低下中に十分な活性化が誘導されていたかを捉えたものである。つまり、イマチニブ投与中に十分にeTreg細胞の低下があり、腫瘍によるeTreg細胞を介した免疫抑制が解除されていると、体内のCD8+T細胞が十分に活性化する。このイマチニブによるeTreg細胞の十分な低下とCD8+T細胞の活性化との両者を捉えた指標が「eTreg細胞数／CD8+T細胞数」である。本実施形態では、投与中止１ヵ月後のeTreg細胞数／CD8+T細胞数の値が高いほど、その後の免疫状態の回復及び正常化につながり、結果として非再発の指標となると考えられる。eTreg細胞は、CD8+T細胞をはじめとするエフェクター細胞の機能を抑制し、一方でCD8+T細胞は、細胞障害作用を有するエフェクターT細胞である。これらの細胞数の比をとることで、免疫状態が相対的に抑制的なのか又は活性化されているのかの指標を得られると考えられる。
【００３９】
別の実施形態では、eTreg細胞数に関する値は、上記のeTreg細胞数の増加率や、パラメータ、逆数パラメータの組合せであってもよい。複数のパラメータを組み合わせて解析に用いることにより、分類工程の精度を高めることができるようになる。
【００４０】
より具体的には、eTreg細胞数に関する値は、たとえば上記の群から選択される２つのパラメータ、すなわち以下の第1パラメータおよび以下の第2パラメータの組合せ又は２つの逆数パラメータ、すなわち以下の第1逆数パラメータおよび以下の第2逆数パラメータの組合せであってもよい：
第1パラメータは、eTreg細胞数の増加率であり；
第1逆数パラメータは、eTreg細胞数の増加率の逆数であり；
第2パラメータは、eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択される１の値であり；
第2逆数パラメータは、CD8+T細胞数／eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／eTreg細胞数、CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／PD-1+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／CTLA-4+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／LAG-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／Tim-3+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、PD-1+CD8+T細胞数／TIGIT+eTreg細胞数、CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数及びPD-1+CD8+T細胞数／ICOS+eTreg細胞数からなる群より選択される１の値である。
【００４１】
あるいは、eTreg細胞数に関する値は上記の群から選択される３つのパラメータ、すなわち上記の第1パラメータ、上記の第2パラメータおよび以下の第3パラメータの組合せ又は３つの逆数パラメータ、すなわち上記の第1逆数パラメータ、上記の第2逆数パラメータおよび以下の第3逆数パラメータの組合せであってもよい：
第3パラメータは、eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択される、第2パラメータとは異なるパラメータであり；
第3逆数パラメータは、eTreg細胞数／CD8+T細胞数、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数からなる群より選択される、第2逆数パラメータとは異なる逆数パラメータである。
【００４２】
好ましい実施形態では、eTreg細胞数に関する値は、以下の第1パラメータ、以下の第2パラメータおよび以下の第3パラメータの組合せである：
第1パラメータは、eTreg細胞数の増加率であり；
第2パラメータは、eTreg細胞数／CD8+T細胞数であり；
第3パラメータは、eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数である。
【００４３】
本実施形態の方法は、上記のようにして得られたeTreg細胞数に関する値に基づいて、患者を再発低リスク群に分類する工程を含む。
分類は、たとえば、パラメータと所定の閾値との比較によって行われてもよい。
所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。たとえば、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、複数のがん患者から採取された血液中のeTreg細胞数を測定する。また、それらのがん患者からチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中におけるeTreg細胞数を測定する。その後、測定したeTreg細胞数のデータから、eTreg細胞数の増加率を算出する。そして、得られたeTreg細胞数の増加率を、再発履歴がある患者群のデータと、再発履歴がない患者群のデータとに分類する。なお、「再発履歴がある」とは、がん患者が過去に再発を起こしたことがあることを意味する。そして、再発履歴がある患者群から採取された血液中のeTreg細胞数の増加率と、再発履歴がない患者群から採取された血液中のeTreg細胞数の増加率とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を所定の閾値として設定する。所定の閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。
【００４４】
より具体的な実施形態では、たとえば、eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上である場合、分類工程において患者は再発低リスク群に分類される。また、eTreg細胞数の増加率の逆数が所定の閾値未満である場合、分類工程において患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、表１に支持される。
別の実施形態では、たとえば、１つのパラメータが所定の閾値以上である場合、または１つの逆数パラメータが所定の閾値未満である場合、分類工程において患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、表２〜１５に支持される。
【００４５】
eTreg細胞数に関する値が複数のパラメータを含む場合、分類は、たとえば、各パラメータ又は逆数パラメータと、各パラメータ又は逆数パラメータに対応する所定の閾値とを個々に比較し、全てのパラメータ又は逆数パラメータが所定の閾値以上であるか否か、いずれか１つのパラメータ又は逆数パラメータが所定の閾値以上であるか否かなどの基準に従って行われてもよい。
【００４６】
より具体的な実施形態では、たとえば、第1パラメータが所定の閾値以上または第2パラメータが所定の閾値以上の場合、分類工程においてがん患者は再発低リスク群に分類される。また、第1逆数パラメータが所定の閾値未満または第2逆数パラメータが所定の閾値未満の場合、分類工程においてがん患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、実施例１６の(16-1)、(16-3)、(16-5)に支持される。
【００４７】
別の実施形態では、たとえば、第1パラメータが所定の閾値以上、第2パラメータが所定の閾値以上または第3パラメータが所定の閾値以上の場合、分類工程においてがん患者は再発低リスク群に分類される。また、第1逆数パラメータが所定の閾値未満、第2逆数パラメータが所定の閾値未満または第3逆数パラメータが所定の閾値未満の場合、分類工程においてがん患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、実施例１６の(16-7)に支持される。
【００４８】
別の実施形態では、たとえば、第1パラメータが所定の閾値以上かつ第2パラメータが所定の閾値以上、第1パラメータが所定の閾値以上かつ第3パラメータが所定の閾値以上、または第2パラメータが所定の閾値以上かつ第3パラメータが所定の閾値以上の場合、患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、実施例１６の(16-2)、(16-4)、(16-6)に支持される。
【００４９】
別の実施形態では、たとえば、第1パラメータが所定の閾値以上、第2パラメータが所定の閾値以上、かつ、第3パラメータが所定の閾値以上の場合、患者は再発低リスク群に分類される。このような分類は、たとえば、実施例１６の(16-8)に支持される。
【００５０】
本発明の範囲には、がんの治療方法も含まれる。一実施形態によると、がんの治療方法は、上記の測定工程、取得工程および判定工程を含み、さらに治療工程を含む。本実施形態による治療方法においては、判定工程において、患者は、再発低リスク群と、その他の群とに分類される。治療工程において、その他の群に分類された患者に対して、TKI投与を再開する。再発低リスク群に分類された患者に対しては、薬剤投与再開(薬剤再投与)を行わず、経過観察などの措置がとられ得る。
【００５１】
本発明の範囲には、上記のがんの再発の予測補助方法に用いられる試薬キットも含まれる。
第１の実施形態において、試薬キットは、eTreg細胞検出用試薬キットである。第１の実施形態の試薬キットは、抗CD3抗体(第１抗体)、抗CD4抗体(第２抗体)、抗FoxP3抗体(第３抗体)、抗CD45RA抗体(第４抗体)、及び４種類の標識物質を含む。標識物質が酵素である場合、本実施形態の試薬キットは、該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
第２の実施形態において、試薬キットは、CD8+T細胞検出用試薬キットである。第２の実施形態の試薬キットは、抗CD3抗体(第１抗体)、抗CD8抗体(第５抗体)、及び２種類の標識物質を含む。標識物質が酵素である場合、本実施形態の試薬キットは、該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
第１抗体、第２抗体、第３抗体、第４抗体、第５抗体、標識物質及び基質の形態は特に限定されず、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。本実施形態では、第１抗体、第２抗体、第３抗体、第４抗体、第５抗体、標識物質及び基質は、それぞれ別の容器に保存されているか又は個別に包装されていることが好ましい。なお、血液試料、第１抗体、第２抗体、第３抗体、第４抗体、第５抗体、標識物質及び基質についての詳細は、上記の予測補助方法の説明で述べたことと同様である。
【００５４】
試薬キットは、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim-3抗体、抗TIGIT抗体及び抗ICOS抗体からなる群より選択される１以上の抗体をさらに含んでいてもよい。この場合、試薬キットは、選択された抗体を標識化するための標識物質をさらに含む。選択された抗体を標識化するための標識物質は、上記の第１〜第５抗体を標識化するために用いられる標識物質とは異なる種類のものである。選択された抗体を標識化するための標識物質が酵素である場合、試薬キットは、該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。
【００５５】
試薬キットは、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供されてもよい。この箱には、試薬キットの添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、試薬キットの構成、血液試料中のバイオマーカー濃度の測定プロトコールなどが記載されることが好ましい。
また、試薬キットは、上述の各種試薬の他、洗浄液、キャリブレーターなどを適宜含んでいてもよい。
【００５６】
図１Ａに、第１の実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、５１０は、試薬キットを示し、５１１は、第１標識物質で標識化された第１抗体を収容した第１容器を示し、５１２は、第２標識物質で標識化された第２抗体を収容した第２容器を示し、５１３は、第３標識物質で標識化された第３抗体を収容した第３容器を示し、５１４は、第４標識物質で標識化された第４抗体を収容した第４容器を示し、５１５は、添付文書を示し、５１６は、梱包箱を示す。
【００５７】
図１Ｂに、第２の実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、５２０は、試薬キットを示し、５２１は、第１標識物質で標識化された第１抗体を収容した第１容器を示し、５２２は、第５標識物質で標識化された第５抗体を収容した第２容器を示し、５２３は、添付文書を示し、５２４は、梱包箱を示す。
【００５８】
本発明の範囲には、上記の試薬を、がんの再発の予測用試薬キットの製造のために使用することも含まれる。すなわち、本発明は、がんの再発の予測用試薬キットの製造のための抗体及び標識物質の使用にも関する。
【００５９】
本発明には、がんの再発の予測を補助するデータの取得に適する装置が含まれる。また、本発明には、がんの再発の予測を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。なお、該コンピュータプログラム製品が備える媒体は、コンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つ、コンピュータが読取可能な媒体であってもよい。
【００６０】
以下に、上記の本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの例に示される形態のみに限定されない。図２は、がんの再発の予測を補助するデータを取得するための、予測補助装置の概略図である。図２に示された予測補助装置１１は、測定装置２２と、該測定装置２２と接続された判定装置３３とを含んでいる。
【００６１】
本実施形態において、測定装置の種類は特に限定されず、細胞数の測定方法に応じて適宜選択できる。図２に示される例では、測定装置２２は、フローサイトメータである。フローサイトメータは、標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。以下に説明する例では、シグナルは、化学発光シグナルや蛍光シグナルなどの光学的情報である。
【００６２】
抗原抗体反応を行った細胞サンプルを測定装置２２にセットすると、測定装置２２は、標識化抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報を判定装置３３に送信する。
【００６３】
判定装置３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力部３３ｂと、検体情報や判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。判定装置３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、判定装置３３のプロセッサは、光学的情報に基づいて、がんの再発の予測を補助するデータを取得するプログラムを実行する。
【００６４】
図３は、予測補助装置１１のコンピュータ本体３３ａのソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図３に示されるように、判定装置３３は、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。受信部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。
【００６５】
受信部３０１は、測定装置２２から送信された情報を受信する。記憶部３０２は、判定に必要な所定の閾値や細胞数を算出するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、細胞数を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出された細胞数が、記憶部３０２に記憶された所定の閾値以上であるか又はそれ未満であるかを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、がんの再発の予測を補助するデータとして出力する。
【００６６】
図４は、図３に示すコンピュータ本体３３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図４に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６及び画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００６７】
ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、図３に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３３が、がんの再発の予測を補助するデータを取得するための装置として機能する。
【００６８】
ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００６９】
ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１及びハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
【００７０】
ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(がんの再発の予測を補助するデータを取得するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００７１】
読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００７２】
入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力部３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３３ｂにより、コンピュータ本体３３ａに各種の指令やデータを入力することが可能である。
【００７３】
通信インターフェイス３３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３３ａは、通信インターフェイス３３６により、プリンタなどへの印刷データの送信が可能である。測定装置２２は、通信インターフェイス３３６により、判定装置３３への測定データ(光学的情報)の送信が可能である。
【００７４】
画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００７５】
次に、予測補助装置１１による、がんの再発の予測を補助するデータ取得の処理手順を説明する。図５は、がんの再発の予測データ取得のフローチャートの一例である。ここでは、標識化抗体に基づく光学的情報などからeTreg細胞数の増加率を算出し、それに基づいて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００７６】
まず、ステップＳ１−１において、予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された式にしたがってチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止から２０〜５０日後に採取された血液中のeTreg細胞数及びチロシンキナーゼ阻害剤の投与停止の１０〜５０日前に採取された血液中のeTreg細胞数を測定する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、記憶部３０２に記憶された式にしたがってeTreg細胞数の増加率を算出する。
【００７７】
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、ステップＳ１−３で算出された増加率が、記憶部３０２に記憶された所定の閾値以上であるか、それともそれ未満であるかを判定する。ここで、増加率が所定の閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、がん患者が再発低リスク群に分類されることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、増加率が所定の閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−６に進行し、判定部３０４は、がん患者が再発低リスク群に分類されないことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００７８】
そして、ステップＳ１−７において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、予測補助装置１１は、がんの再発の予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
【００７９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００８０】
実施例１：eTreg細胞数の増加率に基づく分類
イマチニブ投与中止から２５〜４２日後に慢性骨髄性白血病患者(55人；うち再発例19人および非再発例36人)から採取された末梢血をRPMI1640 (ニプロ社製)で希釈し、Ficoll-Paque PLUS (GEヘルスケアジャパン社製)を用いた密度勾配遠心法によりＰＢＭＣ(末梢血単核球 Peripheral Blood Mononuclear Cells)層を回収し、細胞凍結保存液中に懸濁し、測定解析まで液体窒素下で凍結保存した。液体窒素凍結細胞バイアルを、37℃の恒温層中で温め、2%FCSを含むPBSまたはRPMI1640溶液中に懸濁し、遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞を、100μLの2％FCSを含むPBSに懸濁し、非特異結合をブロックするためにFc block (eBioscience社製)を加え、15分間反応させた。その後、死細胞除去のためにFVD (Fixable Viability Dye；eBioscience社製) および細胞表面の抗原染色のために抗ヒトCD3抗体、抗ヒトCD4抗体及び抗ヒトCD45RA抗体(それぞれeBioscience社製)を加え、抗体反応を20〜30分間行った。洗浄後、細胞内染色のためFoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience社製)を用いて細胞固定および膜透過処理を行い、抗FoxP3抗体(eBioscience社製)を用いて核内染色をおこなった。洗浄後、フローサイトメーター(BD社製)により測定解析を行い、eTreg細胞数を計測した。
また、イマチニブ投与中止の１５〜４４日前に慢性骨髄性白血病患者から採取された末梢血からＰＢＭＣを回収し、上記と同様にして、eTreg細胞数を計測した。
上記の計側結果から、eTreg細胞数の増加率を求め、再発リスク群分類を行った。
【００８１】
結果を図６及び表１に示す。図６に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。ここで、正解率とは、再発低リスク群に分類された患者が、分類結果のとおり再発しなかった確率を意味する。また、表中、偽陽性は、再発した患者であるにも拘らず再発低リスク群に分類されたことを意味し、真陽性は、再発しなかった患者が再発低リスク群に分類されたことを意味する。以下の表１の場合、再発例19人のうち再発低リスク群に分類された偽陽性の患者が1人存在し、非再発例36人のうち再発低リスク群に分類された真陽性の患者は10人であった。
【００８２】
【表１】
2018163019.tif 000002
【００８３】
実施例２：eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
イマチニブ投与中止から２５〜４２日後に慢性骨髄性白血病患者(55人；うち再発例19人および非再発例36人)から採取された末梢血をRPMI1640(ニプロ社製)で希釈し、Ficoll-Paque PLUS (GEヘルスケアジャパン社製)を用いた密度勾配遠心法によりPBMC(末梢血単核球：Peripheral Blood Mononuclear Cells)層を回収し、細胞凍結保存液中に懸濁し、測定解析まで液体窒素下で凍結保存した。液体窒素凍結細胞バイアルを、37℃の恒温層中で温め、2%FCSを含むPBSまたはRPMI1640溶液中に懸濁し、遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞を、100μLの2％FCSを含むPBSに懸濁し、非特異結合をブロックするためにFc block (eBioscience社製)を加え、15分間反応させた。その後、死細胞除去のためにFVD (Fixable Viability Dye；eBioscience社製)および細胞表面の抗原染色のために抗ヒトCD3抗体、抗ヒトCD4抗体、抗ヒトCD8a抗体及び抗ヒトCD45RA抗体(それぞれeBioscience社製)を加え、抗体反応を20〜30分間行った。洗浄後、細胞内染色のためFoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience社製)を用いて細胞固定および膜透過処理を行い、抗FoxP3抗体(eBioscience社製)を用いて核内染色をおこなった。洗浄後、フローサイトメーター(BD社製)により測定解析を行い、eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測した。そして、eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求め、再発リスク群分類を行った。
【００８４】
結果を図７及び表２に示す。図７に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表２に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【００８５】
【表２】
2018163019.tif 000003
【００８６】
実施例３：eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(55人；うち再発例19人および非再発例36人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトPD-1抗体(BioLegend社製)を更に用い、eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してeTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【００８７】
結果を図８及び表３に示す。図８に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表３に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【００８８】
【表３】
2018163019.tif 000004
【００８９】
実施例４：PD-1+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(57人；うち再発例20人および非再発例37人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトPD-1抗体(BioLegend社製)を更に用い、PD-1+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してPD-1+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【００９０】
結果を図９及び表４に示す。図９に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表４に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【００９１】
【表４】
2018163019.tif 000005
【００９２】
実施例５：PD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(57人；うち再発例20人および非再発例37人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトPD-1抗体(BioLegend社製)を更に用い、PD-1+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してPD-1+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【００９３】
結果を図１０及び表５に示す。図１０に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表５に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【００９４】
【表５】
2018163019.tif 000006
【００９５】
実施例６：CTLA-4+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(57人；うち再発例20人および非再発例37人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトCTLA-4抗体(BioLegend社製)を更に用い、CTLA-4+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してCTLA-4+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【００９６】
結果を図１１及び表６に示す。図１１に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表６に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【００９７】
【表６】
2018163019.tif 000007
【００９８】
実施例７：CTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(57人；うち再発例20人および非再発例37人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトCTLA-4抗体(BioLegend社製)を更に用い、CTLA-4+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してCTLA-4+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例６と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【００９９】
結果を図１２及び表７に示す。図１２に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表７に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１００】
【表７】
2018163019.tif 000008
【０１０１】
実施例８：LAG-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(20人；うち再発例6人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトLAG-3抗体(ENZO社製)を更に用い、LAG-3+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してLAG-3+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１０２】
結果を図１３及び表８に示す。図１３に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表８に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１０３】
【表８】
2018163019.tif 000009
【０１０４】
実施例９：LAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(20人；うち再発例6人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトLAG-3抗体(ENZO社製)を更に用い、LAG-3+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してLAG-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例８と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１０５】
結果を図１４及び表９に示す。図１４に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表９に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１０６】
【表９】
2018163019.tif 000010
【０１０７】
実施例１０：Tim-3+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(20人；うち再発例6人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトTim-3抗体(BioLegend社製)を更に用い、Tim-3+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してTim-3+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１０８】
結果を図１５及び表１０に示す。図１５に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１０に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１０９】
【表１０】
2018163019.tif 000011
【０１１０】
実施例１１：Tim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(20人；うち再発例6人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトTim-3抗体(BioLegend社製)を更に用い、Tim-3+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してTim-3+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例１０と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１１１】
結果を図１６及び表１１に示す。図１６に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１１に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１１２】
【表１１】
2018163019.tif 000012
【０１１３】
実施例１２：TIGIT+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(22人；うち再発例8人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトTIGIT抗体(eBioscience社製)を更に用い、TIGIT+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してTIGIT+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１１４】
結果を図１７及び表１２に示す。図１７に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１２に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１１５】
【表１２】
2018163019.tif 000013
【０１１６】
実施例１３：TIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(22人；うち再発例8人および非再発例14人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトTIGIT抗体(eBioscience社製)を更に用い、TIGIT+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してTIGIT+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例１２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１１７】
結果を図１８及び表１３に示す。図１８に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１３に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１１８】
【表１３】
2018163019.tif 000014
【０１１９】
実施例１４：ICOS+eTreg細胞数／CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(32人；うち再発例12人および非再発例20人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトICOS抗体(eBioscience社製)を更に用い、ICOS+eTreg細胞数及びCD8a+T細胞数を計測してICOS+eTreg細胞数／CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例２と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１２０】
結果を図１９及び表１４に示す。図１９に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１４に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１２１】
【表１４】
2018163019.tif 000015
【０１２２】
実施例１５：ICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8+T細胞数に基づく分類
慢性骨髄性白血病患者(32人；うち再発例12人および非再発例20人)から採取された末梢血を用い、細胞表面の抗原染色のために抗ヒトICOS抗体(eBioscience社製)を更に用い、ICOS+eTreg細胞数及びPD-1+CD8a+T細胞数を計測してICOS+eTreg細胞数／PD-1+CD8a+T細胞数を求めたこと以外は実施例１４と同様にして、再発リスク群分類を行った。
【０１２３】
結果を図２０及び表１５に示す。図２０に示されるように、非再発群(Non-Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体が多数現れた。一方で、再発群(Ret)では、パラメータが所定の閾値以上を示す検体は殆ど見られなかった。このことから、パラメータが所定の閾値以上を示す患者を再発低リスク群に分類できることが明らかとなった。また、以下の表１５に示されるように、上記の再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１２４】
【表１５】
2018163019.tif 000016
【０１２５】
実施例１６〜２２：複数パラメータの組合せ解析
実施例１〜１５で得られた１パラメータ測定の結果を用いて、実施例１６〜２２では、複数パラメータを組み合わせて解析に用いて、再発リスク群分類を行った。
【０１２６】
実施例１６：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１〜３で得られたパラメータ(対象患者数55人；うち再発例19人および非再発例36人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、分類は以下のとおりにして行った。
【０１２７】
(16-1)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-2)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、かつ、eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-3)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-4)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、かつ、eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
【０１２８】
(16-5)eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-6)eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、かつ、eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-7)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-8)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、かつ、eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
【０１２９】
(16-9)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上かつeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-10)eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(16-11)eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はeTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上かつeTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
【０１３０】
結果を以下の表１６に示す。表１６に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【０１３１】
【表１６】
2018163019.tif 000017
【０１３２】
実施例１７：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、PD-1+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びPD-1+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、４及び５で得られたパラメータ(対象患者数55人；うち再発例19人および非再発例36人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、分類は以下のとおりにして行った。
【０１３３】
(17-1)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-2)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-3)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、かつ、PD-1+eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-4)eTreg細胞数の増加率が所定の閾値以上、かつ、PD-1+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
【０１３４】
(17-5)eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-6)eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-7)eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
(17-8)eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上、又はPD-1+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数が所定の閾値以上の場合、再発低リスク群に分類した。
【０１３５】
結果を以下の表１７に示す。表１７に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表１７】
2018163019.tif 000018
【０１３６】
実施例１８：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、CTLA-4+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びCTLA-4+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、６及び７で得られたパラメータ(対象患者数55人；うち再発例19人および非再発例36人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、実施例１７の(17-1)〜(17-8)において「PD-1+eTreg細胞数」を「CTLA-4+eTreg細胞数」と読み替えること以外は実施例１７と同様にして分類を行った。
【０１３７】
結果を以下の表１８に示す。表１８に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表１８】
2018163019.tif 000019
【０１３８】
実施例１９：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、LAG-3+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びLAG-3+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、８及び９で得られたパラメータ(対象患者数19人；うち再発例6人および非再発例13人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、実施例１７の(17-1)〜(17-8)において「PD-1+eTreg細胞数」を「LAG-3+eTreg細胞数」と読み替えること以外は実施例１７と同様にして分類を行った。
【０１３９】
結果を以下の表１９に示す。表１９に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表１９】
2018163019.tif 000020
【０１４０】
実施例２０：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、Tim-3+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びTim-3+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、１０及び１１で得られたパラメータ(対象患者数21人；うち再発例8人および非再発例13人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、実施例１７の(17-1)〜(17-8)において「PD-1+eTreg細胞数」を「Tim-3+eTreg細胞数」と読み替えること以外は実施例１７と同様にして分類を行った。
【０１４１】
結果を以下の表２０に示す。表２０に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表２０】
2018163019.tif 000021
【０１４２】
実施例２１：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、TIGIT+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びTIGIT+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、１２及び１３で得られたパラメータ(対象患者数21人；うち再発例8人および非再発例13人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、実施例１７の(17-1)〜(17-8)において「PD-1+eTreg細胞数」を「TIGIT+eTreg細胞数」と読み替えること以外は実施例１７と同様にして分類を行った。
【０１４３】
結果を以下の表２１に示す。表２１に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表２１】
2018163019.tif 000022
【０１４４】
実施例２２：eTreg細胞数の増加率、eTreg細胞数/CD8+T細胞数、ICOS+eTreg細胞数/CD8+T細胞数及びICOS+eTreg細胞数/PD-1+CD8+T細胞数の組合せ解析
実施例１、２、１４及び１５で得られたパラメータ(対象患者数31人；うち再発例11人および非再発例20人)を用いて、パラメータ毎に対応する所定の閾値との比較に基づき、再発リスク群分類を行った。より具体的には、実施例１７の(17-1)〜(17-8)において「PD-1+eTreg細胞数」を「ICOS+eTreg細胞数」と読み替えること以外は実施例１７と同様にして分類を行った。
【０１４５】
結果を以下の表２２に示す。表２２に示されるように、複数のパラメータのいずれの組合せパターンにおいても、再発低リスク群分類の正解率は非常に高かった。
【表２２】
2018163019.tif 000023
【符号の説明】
【０１４６】
１１      予測補助装置
２２      測定装置
３３      判定装置
３３ａ    コンピュータ本体
３３ｂ    入力部
３３ｃ    表示部
３０１    受信部
３０２    記憶部
３０３    算出部
３０４    判定部
３０５    出力部
３３０    ＣＰＵ
３３１    ＲＯＭ
３３２    ＲＡＭ
３３３    ハードディスク
３３４    入出力インターフェイス
３３５    読出装置
３３６    通信インターフェイス
３３７    画像出力インターフェイス
３３８    バス
３４０    記録媒体
５１０、５２０    試薬キット
５１１、５２１    第１容器
５１２、５２２    第２容器
５１３            第３容器
５１４            第４容器
５１５、５２３    添付文書
５１６、５２４    梱包箱
【図１Ａ】
2018163019.tif 000024
【図１Ｂ】
2018163019.tif 000025
【図２】
2018163019.tif 000026
【図３】
2018163019.tif 000027
【図４】
2018163019.tif 000028
【図５】
2018163019.tif 000029
【図６】
2018163019.tif 000030
【図７】
2018163019.tif 000031
【図８】
2018163019.tif 000032
【図９】
2018163019.tif 000033
【図１０】
2018163019.tif 000034
【図１１】
2018163019.tif 000035
【図１２】
2018163019.tif 000036
【図１３】
2018163019.tif 000037
【図１４】
2018163019.tif 000038
【図１５】
2018163019.tif 000039
【図１６】
2018163019.tif 000040
【図１７】
2018163019.tif 000041
【図１８】
2018163019.tif 000042
【図１９】
2018163019.tif 000043
【図２０】
2018163019.tif 000044