(57)【要約】【課題】ネオコタラノールを精度よく、かつ、簡便に定量することができる分析法を提供する。【解決手段】本発明は、マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物を内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法を提供する。また、本発明は、試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としての前記群より選択される化合物の使用を提供する。【選択図】図２
2018091742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物を内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法。
【請求項２】
液体クロマトグラフィーにおけるカラムとして陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーにおける移動相として水酸化ナトリウムを用いる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としてのマルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネオコタラノールの定量分析方法、及びその定量分析用内部標準物質としてのマルトース等の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオ糖スルホニウム塩化合物は、糖尿病、腎症等に対する治療効果を有することが知られている（特許文献１及び２参照）。中でも、チオ糖スルホニウム塩化合物の一種であるネオコタラノールは、治療効果が高いため、近年注目を浴びている。
【０００３】
現状、ネオコタラノールを含むチオ糖スルホニウム塩化合物を定量する分析方法としては、LC-MSを用いた絶対検量線法（特許文献３参照）及びキャピラリー電気泳動法（非特許文献１参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２０５１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１３３３９０号
【特許文献３】特開２００９−９２５９７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Anal Chem. 2010, 82, 5323-5330
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
LC-MSは高感度ではあるが、HPLC等と比較して定量精度が低いことや煩雑性（機種毎のスペックによって異なるイオン化効率を考慮する必要がある、マトリックス効果の排除に適切な希釈率や前処理法の設定が必要である等）といった課題があることに加えて、高額機器でもあり、容易に利用できる方法ではない。
キャピラリー電気泳動を用いた方法については、食品を用いた定量が報告されているが、各対象物質を完全分離ピークとして検出されておらず、その定量精度に課題がある。
【０００７】
よって、本発明が解決しようとする課題は、ネオコタラノールを精度よく、かつ、簡便に定量することができる分析法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００９】
（１）マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物を内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法である。
【００１０】
（２）液体クロマトグラフィーにおけるカラムとして陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いる、（１）記載の方法である。
【００１１】
（３）液体クロマトグラフィーにおける移動相として水酸化ナトリウムを用いる、（１）又は（２）記載の方法である。
【００１２】
（４）試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としてのマルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物の使用である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料溶液中のネオコタラノールを精度よく、かつ、簡便に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】標準物質のピーク面積（Ax）と内部標準物質のピーク面積（As）の比を縦軸、標準物質の濃度（Mx）と内部標準物質の濃度（Ms）の比を横軸にプロットした検量線を示す図である。
【図２】本発明の方法を用いた、HPAEC-PADクロマトグラムの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、具体的には、以下の構成を有する。
マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物、好ましくはマルトースを内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法。
【００１６】
液体クロマトグラフィーにおけるカラムには陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いることが好ましい。陰イオン交換樹脂の官能基としては、４級アルキルアミン、４級アルカノールアミン、４級アンモニウム塩、４級アルカノールアンモニウム塩等が挙げられる。
【００１７】
液体クロマトグラフィーにおける移動相としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いることができる。これらの中でも水酸化ナトリウムを用いることが好ましい。また、移動相は、上記塩基性物質以外に公知の各種添加剤を含有していてもよい。
【００１８】
更に、本発明は、試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としてのマルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物、好ましくはマルトースの使用に関する。
【実施例】
【００１９】
以下、具体的態様を参照して、本発明を説明する。部、％は、他に断りのない限り、質量部、質量％を表す。本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではない。
【００２０】
例１．内部標準物質としてマルトースを用いたネオコタラノールの定量分析結果
１．使用試薬及び装置
１−１．試薬
以下の試薬を用いた。
・標準物質：ネオコタラノール（純度96.3％）
・内部標準物質：マルトース一水和物（99.9+%HPLC、生化学用, 和光純薬工業株式会社製)
・超純水（0.22 μmフィルターろ過した比抵抗値18MΩ以上のもの）
・1 M塩酸（容量分析用、和光純薬工業株式会社製）
・50%NaOH水溶液（d=1.525、精密分析用、和光純薬工業株式会社製）
・陽イオン交換カラム担体：TOYOPEARL（登録商標） SP-650M （東ソー株式会社製）
・Heガス（移動相内への炭酸ガス混入防止）
【００２１】
１−２．装置
使用した装置は、以下のとおりである。
・電子天秤AB204-S（メトラー・トレド株式会社製）
・圧力調整器（Heガス用）
・ボルテックスミキサー
・遠心分離機：KUBOTA 7780II（久保田商事株式会社製）
・分析装置  ：Dionex（商標） ICS-3000（Thermo Scientific社製）
分析カラム      ：Dionex（商標） CarboPac（商標） PA1（4.0×250mm）
（Thermo Scientific社製）
ガードカラム    ：Dionex（商標） CarboPac（商標） PA1G（4.0×50mm）
（Thermo Scientific社製）
カラム恒温槽    ：TC
ポンプ          ：シングルポンプモジュールSP-グラジエント
オートサンプラー：Dionex（商標） AS-AP（Thermo Scientific社製）
検出器          ：電気化学検出器（作用電極;Au、参照電極;AgCl）
【００２２】
２．前処理法
２−１．前処理用試料調製
試料として、ネオコタラノール含有食品（0.239 mg/g）を用いた。
（１）スパチュラを用いて、15 mL容遠沈管に食品200 mg を電子天秤にて量りとった。
（２）超純水（8 mL）を添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌・分散させ、均一溶液とした。
（３）均一溶液を遠心分離（15,000 rpm/5分間/20℃）後、予め準備した15 mL容遠沈管に上清を回収した。
上記操作にて得られた上清を「前処理用試料」とした。
【００２３】
２−２．前処理カラム調整
２−２−１．カラム担体微粒子除去
（１）担体（TOYOPEARL（登録商標） SP-650M（東ソー株式会社製）、250 mL、使用時までは20％エタノールにて保存）に超純水を適宜加えながら撹拌し2 L容ビーカーに全て移した。
（２）全体が2 Lになるまで加水した後、撹拌均一化した。
（３）90分程度静置後、上澄み（微粒子を含む部分）を除去した。
（４）操作（２）〜（３）を3回繰り返した。
上記操作にて得られた担体を以下の処理に使用した。
【００２４】
２−２−２．カラム充填
（１）エコノカラム（商標）（バイオラッド社製、1×10cm）を設置した。
（２）カラムに超純水（3 mL）を添加した。
（３）２−２−１の担体に超純水を適量加え、均一に分散した後、パスツールピペットを用いてカラムに添加した。
（４）高さ2cmになるよう充填した。
【００２５】
２−２−３．洗浄
２−２−２で得られたカラムに超純水（20 mL）を通液し、移動相を水に置換した。
【００２６】
２−２−４．平衡化
（１）10 mL容メスシリンダーを用いて、1 M塩酸（5 mL）及び超純水（5 mL）を50 mL容ビーカーに分注した。均一に撹拌し、0.5M塩酸を調製した。
（２）２−２−３後のカラムに0.5M 塩酸（8 mL）を通液した。
（３）次いで、超純水（8 mL）を通液し、移動相を水に置換した。
上記操作を実施したものを「前処理カラム」として使用した。
【００２７】
２−３．前処理操作
（１）「前処理カラム」に「前処理用試料」全量を供した。
（２）全量通液後、超純水（8 mL）通液により不要部分を溶出させた。
（３）1 M塩酸（3.5 mL）及び超純水（46.5 mL）を100 mL容ビーカーに分注した。均一に撹拌し、0.07M 塩酸を調製した。
（４）その後、0.07M 塩酸（8 mL）を通液し、ネオコタラノールを回収した。この時、10 mL容メスフラスコに回収した。
（５）加水し、10 mL溶液とした後、よく撹拌して均一溶液とした。
（６）これを0.20 μmフィルター処理し、ろ液を得た。
上記操作にて得られたろ液を「試験溶液」として用いた。
【００２８】
３．分析前準備
３−１．標準溶液の調製
（１）ネオコタラノール（10 mg）を10 mL容メスフラスコに正確に量りとった。
（２）超純水を用い10 mLまでメスアップした後、均一に撹拌し、1,000 μg/mL標準溶液を作製した。
（３）1,000 μg/mL標準溶液を基準液とし、希釈系列（1、2、5、10及び20 μg/mL）を作製した。
上記操作にて得られた溶液（1、2、5、10及び20 μg/mL）を「標準溶液」として用いた。
【００２９】
３−２．内部標準溶液の調製
（１）マルトース1水和物（10 mg）を10 mL容メスフラスコに正確に量りとった。
（２）超純水を用い10 mLまでメスアップした後、均一に撹拌し、1,000 μg/mL内部標準溶液を作製した。
（３）1,000 μg/mL内部標準溶液を基準液とし、1及び10 μg/mLを作製した。
上記操作にて得られた溶液（1及び10 μg/mL）を「内部標準溶液」として用いた。
【００３０】
３−３．検量線作成用試料の調製
（１）2 mL容エッペンチューブに各標準溶液（1、2、5、10及び20 μg/mL）を0.5 mLずつ分注した。
（２）これに内部標準溶液（1 μg/mL）を0.5 mLずつ添加した。
（３）ボルテックスミキサーにて均一に撹拌した。
上記操作にて得られた5サンプルを「検量線作成用試料」として用いた。
【００３１】
３−４．分析試料の調製
（１）2 mL容エッペンチューブに２−３で調製した試験溶液（0.5 mL）を分注した。
（２）（１）で得た溶液に３−２で調製した10 μg/mL内部標準溶液（0.5 mL）を添加した。
（３）ボルテックスミキサーにて均一に撹拌した。
上記操作にて得られた均一溶液を「分析試料」として用いた。
【００３２】
３−５．移動相（120mM NaOH水溶液）の調製
（１）2 mL容メスピペット（PP製）を用い、50%NaOH水溶液（6.3 mL）を1 L容メスシリンダー（PFA製）に分注した。
（２）1,000 mLまで加水し、1L容ボトル（PFA製）に移した。
（３）撹拌混合し、均一溶液とした。
上記操作にて得られた均一溶液を「移動相」として用いた。
【００３３】
３−６．カラム接続及び平衡化
（１）パージを行い、ポンプ内を「移動相」で置換した。
（２）流速を0.3 mL/minに設定後、通液しながら分析カラム及びガードカラムを接続した。
（３）接続後、所定流速1 mL/minまでは、5分間かけて段階的に上げていった。具体的には、約2分後には0.6 mL/min、約5分後には1 mL/minのごとくである。
（４）所定流速に到達後、1時間以上の通液により平衡化させた。平衡化後、分析を開始した。
【００３４】
４．HPAEC-PAD定量分析（内部標準法）
４−１．分析条件
陰イオン交換樹脂を充填したカラムとパルスドアンペロメトリ検出器を組み合わせた方法（High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection：HPAEC-PAD法）により、表１の条件にて分析を実施した。
【表１】
2018091742.tif 000003
【００３５】
４−２．検量線作成
（１）３−３で調製した「検量線作成用試料」を分析した。
（２）標準物質のピーク面積（Ax）と内部標準物質のピーク面積（As）の比を縦軸、標準物質の濃度（Mx）と内部標準物質の濃度（Ms）の比を横軸にプロットし、図１に示す検量線を作成した。
【００３６】
４−３．分析及び分析対象物濃度（Mx）算出
（１）分析試料を分析した(各分析試料につき、5回分析実施)。
（２）分析結果（Ax, As: 測定値を入力、Ms：添加濃度）と検量線（図１：Y=1.0849X、R2=0.9999）から、分析試料中のネオコタラノール濃度（Mx）を算出した。
【００３７】
４−４．食品中におけるネオコタラノールの定量値算出
（１）４−３で求めた（Mx）を下式に代入し、定量値を算出した。5回分析により得られた平均値を「ネオコタラノールの定量値」とした。
【数１】
2018091742.tif 000004
（式中、A：標準物質の純度（％）、Mx：ネオコタラノール濃度である。）
【００３８】
４−５．食品中におけるネオコタラノールの定量値＜算出例＞
表２及び図２に、当該食品の分析例を示した。
図２に示すとおり、マルトースは、ネオコタラノールのピークのごく近傍に明確に区別されるピークを有し、内部標準物質として好適であることがわかる。
【表２】
2018091742.tif 000005
【００３９】
４−６．分析試料中のネオコタラノールの定量結果
４−６−１．各分析試料中のネオコタラノール濃度（Mx）
分析結果より、分析１〜５のネオコタラノール濃度（Mx）を算出した。結果を表３に示す。
【００４０】
検量線：  Y=1.0849X（Y=Ax/As, X=Mx/Ms）
Ax:ネオコタラノールのピーク面積
As: 内部標準物質（マルトース）のピーク面積
Mx: ネオコタラノール濃度（μg/mL）
Ms: 内部標準物質（マルトース）濃度（μg/mL）
【表３】
2018091742.tif 000006
【００４１】
４−６−２．分析試料中のネオコタラノール含量
得られた分析１〜５のネオコタラノール濃度（Mx）を４−４で示した式に代入し、定量値を算出し、平均定量値0.241 mg/gを得た。
【表４】
2018091742.tif 000007
【００４２】
例２．各種内部標準物質の検討
以下に示す８つの物質についての検討をした。
【００４３】
１．分析条件
以下の条件で分析を行った。
【表５】
2018091742.tif 000008
【００４４】
２．検討物質一覧
下表の８成分を用い検討を実施した（全て、1 μg/mL溶液を10 μL注入）。
【表６】
2018091742.tif 000009
【００４５】
３．結果
表７に分析結果を示した。
【表７】
2018091742.tif 000010
【００４６】
以上、具体的な態様を参照して本発明を説明したが、当業者であれば以上の開示により本発明を実施できよう。しかしながら、上記の具体的な一態様は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法は、ネオコタラノールを植物等から分離後若しくは合成後に精製する場合、又は、糖尿病、腎症等の治療等を目的としたネオコタラノールが配合される医薬品、食品等の分野において、有用に使用することができる。
【図１】
2018091742.tif 000011
【図２】
2018091742.tif 000012