(57)【要約】【課題】臨床診断薬用途を始めとするα―アミラーゼ、特に膵臓アミラーゼの測定において、異なる測定用基質間でも反応性を同じくする精度管理用物質を提供する。【解決手段】α−アミラーゼのアイソザイムを２種以上混合したα−アミラーゼ活性測定のキャリブレーションまたは精度管理用物質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト膵臓アミラーゼのＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムとを含み、その混合比がモル比で１〜８：１である、α−アミラーゼ活性測定の精度管理用物質。
【請求項２】
ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムの混合比がモル比で３〜６：１である、請求項１に記載の精度管理用物質。
【請求項３】
ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムの少なくとも一方が組換発現により得られたものである請求項１または請求項２に記載の精度管理用物質。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の精度管理用物質を用いてキャリブレーションを行い、α−アミラーゼ活性を測定する方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の精度管理用物質を用いて、α−アミラーゼ活性測定の精度管理を行う方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の精度管理用物質を含む、α−アミラーゼ活性測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−アミラーゼ活性測定用試薬およびα−アミラーゼ活性測定方法に関する。更に詳しくはα−アミラーゼ活性測定用試薬に用いるキャリブレーションまたは精度管理用物質、およびキャリブレーションまたは精度管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血清や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性を測定することにより各種疾患の診断が行われている。α−アミラーゼには、唾液アミラーゼ（ＡＭＹ１）と膵臓アミラーゼ（ＡＭＹ２）とがあり、それらを判別して測定することで、ヒト体内での障害部位をより詳しく推定することが可能である。また膵臓アミラーゼには更にＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ｂという２種類のアイソザイムが存在し、それぞれ基質特異性が異なることが知られている。ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２ＢはそれぞれＨＰＡ、ＨＸＡと呼ばれることもある。
【０００３】
臨床検査としてα−アミラーゼの活性を測定する場合、キャリブレーションあるいは精度管理用試料として、精製したα−アミラーゼが用いられているが、このうち膵臓アミラーゼに関しては、生体から分離精製した天然型膵臓アミラーゼと、ヒトＡＭＹ２を組換え発現して精製した組換型膵臓アミラーゼとがそれぞれ販売され、両者とも一般的に使用されている。とりわけ組換型膵臓アミラーゼは、天然型と比較してロット間差が少なく、また安定的に供給が可能なことから、好適に利用されている。
【０００４】
一方、アミラーゼ活性測定には、マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体を検出物質（アグリコン）として結合させた誘導体を基質とする方法が用いられている。このような基質として、例えば４，６−エチリデン−４−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（エチリデン−Ｇ７−ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド（Ｇ３−ＣＮＰ）、β−２−クロロ−４−ニトロフェニル−ガラクトピラノシルマルトテトラオシド（ＧａｌＧ４−ＣＮＰ）、α−２−クロロ−４−ニトロフェニル−ガラクトピラノシルマルトシド（ＧａｌＧ２−ＣＮＰ）などを用いた方法がある。測定試薬中での基質が自然分解し、ブランク値が上昇するなどの安定性の問題を避けるため、上記の中でも特にマルトオリゴ糖誘導体の非還元性末端のグルコースの４位および／または６位のヒドロキシル基を何らかの手段で修飾した誘導体が、測定試薬中で非常に安定であり、有用性が高いとされる。
【０００５】
上述した膵臓アミラーゼの２種類のアイソザイム（ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ｂ）は、基質特異性が異なるため、上記のような種々の活性測定用基質に対してもそれぞれ反応効率は異なる。ヒト生体内におけるＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂの存在比は概ね５．４〜４．１：１程度とされている。キャリブレーションまたは精度管理用物質として生体から分離精製した天然型膵臓アミラーゼを用いた場合は、生体由来の検体とのアイソザイムの存在比の差が少ないので前記の各種活性測定用基質に対する各アイソザイムの反応効率の差は実用上問題とならないが、市販の組換型膵臓アミラーゼにはＡＭＹ２Ａのみが用いられているため生体由来の検体とのアイソザイムの存在比の差が大きく、これをキャリブレーションまたは精度管理用物質として用いた場合は、用いる基質によって得られる測定値が異なる問題点が議論されている。このことから、組換型膵臓アミラーゼをキャリブレーションまたは精度管理用物質として用いる場合に、より正確な測定を行うためには、基質の種類毎に異なる設定値を用いる必要性があると考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平５−５９７００号公報
【特許文献２】特開平９−１３５６８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】澱粉化学  第３８号  第２号  ｐ．１９３−１９６  （１９９１）
【非特許文献２】Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１２，  ３０３−３０５  （１９９２）
【非特許文献３】Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１５  Ｊｕｎ  １５；２４（１２）：３４７２−８０．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｖ０９８．  Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｍａｒ  １８．
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １２０３  （１９９３）  ２２４−２２９
【非特許文献５】Ｇｅｎｅ，  ５０  （１９８６）  ３７１−３７２
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ，  ８９  （１９９０）  ２５３−２５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、臨床診断薬用途を始めとするα―アミラーゼ、特に膵臓アミラーゼの測定において、異なる測定用基質間でも反応性を同じくするキャリブレーションまたは精度管理用物質、およびキャリブレーションまたは精度管理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、膵臓アミラーゼの２種のアイソザイム、すなわちＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂを適切な割合で混合したものをキャリブレーションまたは精度管理用物質として用いることにより、様々な測定用基質間で生体由来の膵臓アミラーゼとの反応効率の差がなくなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
項１．ヒト膵臓アミラーゼのＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムとを含み、その混合比がモル比で１〜８：１である、α−アミラーゼ活性測定の精度管理用物質。
項２．ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムの混合比がモル比で３〜６：１である、項１に記載の精度管理用物質。
項３．ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムの少なくとも一方が組換発現により得られたものである項１または項２に記載の精度管理用物質。
項４．項１〜項３のいずれかに記載の精度管理用物質を用いてキャリブレーションを行い、α−アミラーゼ活性を測定する方法。
項５．項１〜項３のいずれかに記載の精度管理用物質を用いて、α−アミラーゼ活性測定の精度管理を行う方法。
項６．項１〜項３のいずれかに記載の精度管理用物質を含む、α−アミラーゼ活性測定キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により臨床診断薬用途を始めとするα―アミラーゼ、特に膵臓アミラーゼの測定において、異なる測定用基質間でも反応性を同じくするキャリブレーションまたは精度管理用物質、およびキャリブレーションまたは精度管理方法が提供され、有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）
本発明の実施形態の１つは、ヒト膵臓アミラーゼのＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムとを含み、その混合比がモル比で１〜８：１である、α−アミラーゼ活性測定の精度管理用物質である。
【００１３】
本明細書において精度管理の目的は特に限定されない。例えば、キャリブレーション、製造時における工程管理、製品の品質管理、ロット間の管理などを含む。また、本明細書において精度管理用物質の態様は特に限定されない。例えば、キャリブレータや管理血清などが挙げられる。好ましくは管理血清である。
【００１４】
本発明の精度管理用物質は、ヒト由来ＡＭＹ２Ａとヒト由来ＡＭＹ２Ｂとを１：１〜８：１の混合比で含む。ここでいう混合比とは活性型酵素タンパク質のモル比であり、失活した酵素タンパク質は含まない。ＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂとがほぼ同じ分子量（両者とも５７．７ｋＤａ）であることから、酵素タンパク質がほぼ全て活性型である場合、モル比は重量比とも等しい。より好ましいモル比は３：１〜６：１である。さらに好ましいモル比は４：１〜５：１である。
【００１５】
本明細書において、「モル比」は以下の方法により定義される。
非特許文献２には、ＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂとで基質に対する反応性が違うことを利用した方法が開示されている。すなわち、人工基質ＦＧ５Ｐ（ｐ−ニトロフェニルＯ−α−６−デオキシ−６−｛（２−ピリジル）アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−トリス｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）｝−Ｄ−グルコピラノシド）を基質として用いた際、その反応産物であるＦＧ４（Ｏ−６−デオキシ−６−｛（２−ピリジル）アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−ビス｛Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）｝−Ｄ−グルコース）とＦＧ３（Ｏ−６−デオキシ−６−｛（２−ピリジル）アミノ｝−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）の量比が、ＡＭＹ２Ａの場合で１．１１、ＡＭＹ２Ｂの場合で１．８８と異なるため、両アイソザイムの混合物を反応に供した際のＦＧ４とＦＧ３と量比を測定することにより、アイソザイムの活性型酵素タンパク質のモル比を算出する方法である。ＦＧ４とＦＧ３の量比はＨＰＬＣにより測定することができる。
【００１６】
本発明の精度管理用物質に用いるＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムは、ヒト由来であれば特に限定されない。
例えば、市販のＡｂｎｏｖａ社製ＡＭＹ２Ａ／２Ｂ（Ｈｕｍａｎ）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、またはＭｙＢｉｏＳｏｕｒｓｅ社製Ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ２Ａ／２Ｂ  （ＡＭＹ２Ａ／２Ｂ），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、あるいはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製Ｈｕｍａｎ  ＡＭＹ２Ａ／２Ｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｈｉｓ  Ｔａｇ）などを用いればよい。
【００１７】
本発明の精度管理用物質に用いるＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムは、少なくとも一方が組換発現により取得されたものであってもよい。具体的には、細菌やカビ・酵母などを宿主とした組換発現などが好適に用いられる。ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列は公知（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）であり、当業者であれば標準技術を用いて容易に実施することができる。精製を容易にするため、６ｘＨｉｓタグやＧＳＴタグなどのタンパク質生成用タグを付加して発現させても良い。前記ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムのうち少なくとも一方が組換発現により取得されたものであれば、精製純度、ロット間差低減、製造コストの低減の観点から好ましい。前記ＡＭＹ２ＡアイソザイムとＡＭＹ２Ｂアイソザイムの両方が組換発現により取得されたものであれば、精製純度、ロット間差低減、製造コストの低減の観点からさらに好ましい。
【００１８】
（２）
本発明の別の実施形態は、前記の精度管理用物質を用いてキャリブレーションを行い、α−アミラーゼ活性を測定する方法である。
また、本発明の別の実施形態は、前記の精度管理用物質を用いて、α−アミラーゼ活性測定の精度管理を行う方法である。
【００１９】
本発明の方法において、α−アミラーゼ活性を測定する方法は特に限定されない。当業者は、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、様々な合成基質を用いて測定する方法が挙げられる。そのような合成基質としては、２−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ（Ｇａｌ−Ｇ２−ＣＮＰ）、２−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（Ｇａｌ−Ｇ４−ＣＮＰ）Ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ（Ｅｔ−Ｇ７−ｐＮＰ）などが挙げられる。
前記合成基質は、試料中にα−アミラーゼが存在すると、それ単独かまたは共役酵素の働きを伴って、最終的に還元末端のＣＮＰやｐＮＰを遊離させる。これが４００ｎｍ付近に吸収を持つので、４００ｎｍ付近の吸光度変化を測定することによりα−アミラーゼ活性を測定することができる。このようなα−アミラーゼ活性測定方法は、既に当該技術分野（臨床検査の分野）において確立されている。
【００２０】
本発明の方法において、精度管理用物質を用いてキャリブレーションや精度管理を行う方法は、既に当該技術分野（臨床検査の分野）において確立されている。当業者は種々の公知の方法を用いることができる。
【００２１】
本発明の精度管理用物質はどのようなキャリブレーションや精度管理にも適用できるが、管理血清の形態で行う場合に異なる基質を用いたアミラーゼ活性の測定においても、同じ値を用いて精度管理を行える観点からより好ましい効果が得られる。
【００２２】
（３）
本発明の別の実施形態は、前記の精度管理用物質を含む、α−アミラーゼ活性測定キットである。本発明の精度管理用物質を用いてα−アミラーゼ活性を測定する限り、その態様は特に制限されない
本発明のα−アミラーゼ活性測定キットは、本発明の精度管理用物質を少なくとも１回の活性測定に十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の精度管理用物質に加えて、アミラーゼ活性測定用基質、α−グルコシダーゼなどの共役酵素（必要な場合）、活性測定に必要な緩衝液、ならびに使用の指針を含む。本発明の精度管理用物質は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］
生体から分離精製した天然型膵臓アミラーゼとして、ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  （Ｌｅｅ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）、組換型ＡＭＹ２Ａとして、Ｈｕｍａｎ  ＡＭＹ２Ａ  ／  Ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｈｉｓ  Ｔａｇ）  （Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、組換型ＡＭＹ２ＢとしてＨｕｍａｎ  ＡＭＹ２Ｂ  ／  Ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｈｉｓ  Ｔａｇ）  （Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）をそれぞれ用いた。異なる測定用基質を用いたアミラーゼ測定用試薬として、リキテックＡＭＹ  ＥＰＳ  （ロシュ・ダイアグノスティックス社製、Ｅｔ−Ｇ７−ｐＮＰ基質）、ダイヤカラー・リキッドＡＭＹ  （東洋紡社製、Ｇａｌ−Ｇ４−ＣＮＰ基質）、ダイヤカラー・ＡＭＹ−Ｌダイレクト  （東洋紡社製、Ｇａｌ−Ｇ２−ＣＮＰ基質）をそれぞれ用いた。２μＬの天然型膵臓アミラーゼ（表示活性：６３０Ｕ／ｍＬ）を１ｍＬの生理食塩水（０．２％牛血清アルブミン含有）に溶解し、１２５７Ｕ／Ｌのキャリブレータ液として供し、上述の３種類のアミラーゼ測定用試薬のキャリブレーションを行った。測定には自動分析機７１７０（日立ハイテクノロジーズ社製）を用い、測定条件はそれぞれの試薬の製造元から提供されている条件に従った。続いて組換型ＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂの測定を行った。０．２８ｍｇのＡＭＹ２Ａ（凍結乾燥粉末）、および０．３５ｍｇのＡＭＹ２Ｂをそれぞれ８００μＬの生理食塩水（０．２％牛血清アルブミン含有）に溶解し、測定用サンプルとして供し、３種類のアミラーゼ測定用試薬で測定を行った。その結果を表１に示した。
【００２４】
【表１】
2018050573.tif 000002
【００２５】
表１に示したように、同じキャリブレータ液を用いたにも関わらず、ＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂは３種類の測定試薬で大幅に異なる測定値を示した。
【００２６】
上記の結果より、３種類の測定試薬間で測定結果の差異が最も小さくなるＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂの混合比を５．３：１（元の粉末の重量比）と見積り、上記の溶解液をその比率で混合した液を調製し、再度測定を行った。その結果を表２に示した。
【００２７】
【表２】
2018050573.tif 000003
【００２８】
表２に示したように、ＡＭＹ２ＡとＡＭＹ２Ｂの２種類のアイソザイムを混合したサンプルは、３種類の測定試薬で極めて近い測定結果を示した。このことから、天然型膵臓アミラーゼと混合した組換型膵臓アミラーゼは、測定用基質の種類に関わらず、同様の反応効率を示すことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により臨床診断薬用途を始めとするα―アミラーゼ、特に膵臓アミラーゼの測定において、異なる測定用基質間でも反応性を同じくするキャリブレーションまたは精度管理用物質を提供することが可能である。また異なる測定用基質を用いた試薬に対しても、同一のキャリブレーションまたは精度管理用物質によるキャリブレーションまたは精度管理が可能である。