(57)【要約】      （修正有）【課題】被験者において正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法の提供。【解決手段】被験者の血液試料中のα−シヌクレインの生体外免疫磁気的低下（ＩＭＲ）シグナルを検出し、そのうち、（ａ）前記ＩＭＲシグナルが、α−シヌクレインに対する抗体を含む磁気ナノ粒子と結合したα−シヌクレインにより生成される工程と、（ｂ）工程（ａ）で検出されたα−シヌクレインのＩＭＲシグナルをロジスティック関数（Ｉ）に当てはめ、血液試料中のα−シヌクレインの濃度を計算し、（ｃ）工程（ｂ）で取得されたα−シヌクレインの濃度と所定の閾値範囲を比較し、所定の閾値範囲より高い場合はパーキンソン病認知症、所定の閾値範囲の間である場合は正常な認知力のパーキンソン病、所定の閾値範囲より低い場合は健康であることを示す工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法であって、
（a）被験者の血液試料中のα−シヌクレインの生体外免疫磁気的低下（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ＩＭＲ）シグナルを検出し、そのうち、前記ＩＭＲシグナルが、α−シヌクレインに対する抗体を含む磁気ナノ粒子と結合したα−シヌクレインにより生成される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で検出されたα−シヌクレインのＩＭＲシグナルをロジスティック関数（I）に当てはめ、血液試料中のα−シヌクレインの濃度を計算し、
2018091735.tif 000007
（I）
そのうち、ＩＭＲ（％）はα−シヌクレインのＩＭＲシグナルであり、φα−synはα−シヌクレインの濃度であり、フィッティングパラメータＡはバックグラウンド値であり、Ｂは最大値であり、φoはＩＭＲシグナルが（（Ａ+Ｂ）/２）に等しいときのα−シヌクレインの濃度であり、γはφα−synをｘ軸、ＩＭＲ（％）をｙ軸としたときの曲線のデータポイントφoでの傾斜である工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で取得されたα−シヌクレインの濃度と、所定の閾値範囲を比較し、そのうち、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より高い場合、パーキンソン病認知症であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲の間である場合、正常な認知力のパーキンソン病であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より低い場合、健康であることを示す工程と、
を含むことを特徴とする、正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法。
【請求項２】
前記磁気ナノ粒子の材料が、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４で構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法。
【請求項３】
前記磁気ナノ粒子の材料がＦｅ３Ｏ４であることを特徴とする、請求項１に記載の正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法。
【請求項４】
前記血液試料が血漿であることを特徴とする、請求項１に記載の正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパーキンソン病認知症をパーキンソン病から特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）はアルツハイマー病に次いで、２番目に多い神経変性病である。６６歳以上の高齢者の１％超がＰＤを患っている。世界で約１０００万人がＰＤを抱えて暮らしている。ＰＤ患者一人当たりの直接的または間接的医療コストは年間約１０万米ドルと見積もられている。特に米国、カナダ、欧州、オーストラリアなど、多くの国が維持不可能な医療費の増加を心配している。ＰＤの診断、治療、ワクチンの開発に多くのリソースと努力が注がれている。
【０００３】
ＰＤ診断の臨床基準は動作緩慢、歯車様硬直、休止時振戦、姿勢の不安定など運動障害の観察である。これらの臨床的特徴は一般的に使用されているが、ＰＤの診断にはいくつかの重大な問題がある。例えば、他の運動障害（例：多系統萎縮症、大脳皮質基底核変性症、または進行性核上まひ）もＰＤの臨床症状と重なり、ＰＤ診断の精度が低下することがある。さらに、臨床症状は大脳基底核、特に黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの５０％超の変性後に現れることが報告されている。臨床的な運動障害の観察を使用した早期段階でのＰＤ診断は非常に難しい。遺伝子配列の分析は早期段階でのＰＤ診断においてより優れた方法であるかもしれない。それでも、ＰＤ患者のうち遺伝性は１０％のみである。ＰＤ患者の９０％は散発性である。
【０００４】
パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）と呼ばれる認知機能障害と認知症の発症は、ＰＤにおいて一般的である。ＰＤにおける認知症進行の予測は難しく、当該分野において大きな影響がある。研究者らは現在ＰＤとＰＤＤを区別する生体分子診断の達成に取り組んでいる。α−シヌクレインはＰＤまたはＰＤＤの最も認知度の高いバイオマーカーである。α−シヌクレイン分子はリン酸化した、リン−α−シヌクレイン分子で、相互に容易に凝集してドーパミン作動性ニューロン内でレビー小体を形成する。 レビー小体を有するドーパミン作動性ニューロンは変性し、ドーパミンを発現する能力を失う。脳の運動皮質中の神経系細胞がドーパミン不足のため損傷し、運動障害が促進される。
【０００５】
数多くの発見において、ＰＤまたはＰＤＤ患者では健康な被験者と比較して、レビー小体の形成により脳脊髄液（ＣＳＦ）中のα−シヌクレインの濃度が低下することが示されている。しかしながら、血中α−シヌクレイン濃度におけるばらつきに付いて報告されている結果は一貫性がない。血漿α−シヌクレインについての分析結果に一貫性がない主な理由は、この分析法の低濃度検出限界が優れないためである。これらの報告によると、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）がＣＳＦまたは血漿中のα−シヌクレインの分析に使用されている。α−シヌクレインは脳と脊髄で発現され、これらの部位では豊富であるが、末梢血系では量が非常に少ない。ＥＬＩＳＡは血漿中のα−シヌクレインのように、超低濃度のタンパク質を正確に検出することができない。このため、ＥＬＩＳＡを使用したＰＤまたはＰＤＤの生体分子診断におけるα−シヌクレインの分析には血漿の代わりとしてＣＳＦのほうが適している。
【０００６】
ＣＳＦは通常腰椎穿刺によって採取されるが、これはリスクが高く、不快感を与える。ＣＳＦ中のα−シヌクレイン分析による早期診断は一般人口に広く受け入れられてはいない。代わりに、血液は医療機関でずっと簡単に採取することができる。したがって、血漿中の超低α−シヌクレインの分析を実現するために、高感度の検出技術が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、被験者における正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の被験者における正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法は、（ａ）被験者の血液試料中のα−シヌクレインの生体外免疫磁気的低下（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ＩＭＲ）シグナルを検出し、そのうち、前記ＩＭＲシグナルが、α−シヌクレインに対する抗体を含む磁気ナノ粒子と結合したα−シヌクレインにより生成される工程と、（ｂ）工程（ａ）で検出されたα−シヌクレインのＩＭＲシグナルをロジスティック関数（Ｉ）に当てはめ、血液試料中のα−シヌクレインの濃度を計算し、
2018091735.tif 000002
（Ｉ）
そのうち、ＩＭＲ（％）はα−シヌクレインのＩＭＲシグナルであり、φα−synはα−シヌクレインの濃度であり、フィッティングパラメータＡはバックグラウンド値であり、Ｂは最大値であり、φoはＩＭＲシグナルが（（Ａ+Ｂ）/２）に等しいときのα−シヌクレインの濃度であり、γはφα−synをｘ軸、ＩＭＲ（％）をｙ軸としたときの曲線のデータポイントφoでの傾斜である工程と、（ｃ）工程（ｂ）で取得されたα−シヌクレインの濃度と、所定の閾値範囲を比較し、そのうち、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より高い場合、パーキンソン病認知症であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲の間である場合、正常な認知力のパーキンソン病であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より低い場合、健康であることを示す工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】免疫磁気的低下を使用して磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子上に固定化された抗に対する生物活性試験を示すグラフである。
【図２】４５０ｎｍ、Ｏ.Ｄ.４５０ｎｍでのα−シヌクレイン濃度依存的なＩＭＲシグナル（実線）と吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（破線）を示すグラフである。
【図３】α−シヌクレイン測定用のダイナミックレンジ分析のためのＰＢＳ溶液中の変換されたα−シヌクレイン濃度φα−syn,ＩＭＲ対スパイクしたα−シヌクレイン濃度φα−synを示すグラフである。
【図４】健康な被験者、ＰＤ患者、ＰＤＤ患者についてＩＭＲを使用して検出された血漿α−シヌクレイン濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明者らは、例えば１〜１０ｐｇ／ｍｌ以下などの超低濃度で生体分子を量的に検出するための免疫磁気的低下（ＩＭＲ）と呼ばれる免疫測定技術を開発した。ＩＭＲの超高感度に主に寄与しているのは、抗体機能性磁気ナノ粒子の利用である。これらの磁気ナノ粒子は試薬中によく分散され、試験試料中のあらゆる場所の標的生体分子を捕捉することができる。そのほか、粒子がナノレベルのサイズであるため、合計の結合免責が極めて大きい。したがって、磁気ナノ粒子の表面上に固定化された抗体は非常に効率的に標的生体分子に結合することができ、ＩＭＲを使用した超高感度の免疫測定が確立された。ＩＭＲはヒトの血漿中の超低濃度のβ−アミロイドおよびタウ蛋白の分析に適用できることが示されている。健康な被験者と、アルツハイマー病による軽度認知障害患者間の明確な区別が血漿β−アミロイドとタウ蛋白の分析によって明らかにされた。これらの結果によって、ヒト血漿中の超低濃度α−シヌクレインを分析し、ＰＤまたはＰＤＤの生体分子診断を達成する、または血漿α−シヌクレイン濃度によってＰＤとＰＤＤを区別することの実行可能性を調査する動機付けを得た。この作業においては、ＩＭＲを利用したα−シヌクレイン分析用の試薬を調製する。試薬及びα−シヌクレイン分析の特性を調べる。さらに比較のため、ＥＬＩＳＡを使用したα−シヌクレインに関する分析特性を調べる。最後に、血漿α−シヌクレインの分析によるＰＤ患者、ＰＤＤ患者、健康な被験者の区別についての初期的な結果を報告する。この作業において行われる横断的研究はＰＤにおけるＰＤＤの進行予測に対応することはできないが、結果はＰＤＤとＰＤの区別におけるこの血漿α−シヌクレイン測定方法の使用可能性を示唆している可能性がある。
【００１１】
本発明の被験者における正常な認知力のパーキンソン病またはパーキンソン病認知症を特定する方法は、（a）被験者の血液試料中のα−シヌクレインの生体外免疫磁気的低下（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ＩＭＲ）シグナルを検出し、そのうち、前記ＩＭＲシグナルが、α−シヌクレインに対する抗体を含む磁気ナノ粒子と結合したα−シヌクレインにより生成される工程と、（b）工程（a）で検出されたα−シヌクレインのＩＭＲシグナルをロジスティック関数（Ｉ）に当てはめ、血液試料中のα−シヌクレインの濃度を計算し、
2018091735.tif 000003
（Ｉ）
そのうち、ＩＭＲ（％）はα−シヌクレインのＩＭＲシグナルであり、φα−synはα−シヌクレインの濃度であり、フィッティングパラメータＡはバックグラウンド値であり、Ｂは最大値であり、φoはＩＭＲシグナルが（（Ａ+Ｂ）/２）に等しいときのα−シヌクレインの濃度であり、γはφα−synをｘ軸、ＩＭＲ（％）をｙ軸としたときの曲線のデータポイントφoでの傾斜である工程と、（c）工程（b）で取得されたα−シヌクレインの濃度と、所定の閾値範囲を比較し、そのうち、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より高い場合、パーキンソン病認知症であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲の間である場合、正常な認知力のパーキンソン病であることを示し、α−シヌクレインの濃度が所定の閾値範囲より低い場合、健康であることを示す工程と、を含む。
【００１２】
好ましい実施態様において、前記磁気ナノ粒子の材料は、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４で構成される群より選択される。
【００１３】
別の好ましい実施態様において、前記磁気ナノ粒子の材料はＦｅ３Ｏ４で構成される群より選択される。
【００１４】
更に好ましい実施態様において、前記血液試料は血漿である。
【実施例】
【００１５】
以下の実施例は本発明のさまざまな要素と特徴を説明するためだけのものであり、本発明を限定しない。
【００１６】
方法
【００１７】
α−シヌクレイン分析用試薬は磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（ＭＦ-ＤＥＸ-００６０、ＭａｇＱｕ）α−シヌクレインに対する機能性モノクローナル抗体（ｓｃ−１２７６７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｓｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ.）を含む。磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子への抗体固定に関する詳細なプロセスはＨｏｒｎｇ  ｅｔ  ａｌ.（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ａｐｐｌ  Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄ.２００５；１５：６６８〜６７１）及びＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.（Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｍａｇｎ  Ｍａｔｅｒ.２００８；３２０：２６８８〜２６９１）で説明されている。抗体機能性磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子はｐＨ−７.２リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に分散される。粒径分布が動的レーザー光散乱法（Ｎａｎｏｔｒａｃ−１５０、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ）により分析される。試薬の磁気濃度は振動試料磁力計（ＨｙｓｔｅｒＭａｇ、ＭａｇＱｕ）を使用して測定される。磁気ナノ粒子上の抗体の生物活性がＩＭＲ分析器（ＸａｃＰｒｏ−Ｓ、ＭａｇＱｕ）を使用して測定される。ＩＭＲ分析器は磁気センサーとして高温超伝導量子干渉計（Ｈｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ）磁力計を装備したＡＣ磁気磁化率計である。ＡＣ磁気磁化率計の詳細についてはＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ａｐｐｌ  Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄ.２０１３；２３：１６００６０４〜１６００６０７）及びＣｈｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ.（Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓ  ２００８、 １０３：０１４７０３-１-６）で説明されている。ＩＭＲシグナルとα−シヌクレインの濃度間の関係を確立するため、ＰＢＳ溶液でスパイクされたα−シヌクレイン（ａｂ５１１８９、Ａｂｃａｍ）が用意された。ＩＭＲシグナルの各測定について、８０μｌの試薬が４０μｌのα−シヌクレイン溶液と混合され、続いてＩＭＲ分析器（ＸａｃＰｒｏ−Ｓ、ＭａｇＱｕ）を使用してＩＭＲシグナルが検出された。α−シヌクレイン溶液の各濃度でＩＭＲシグナルに対して同じ測定が行われた。ＩＭＲシグナルの測定に加え、α−シヌクレイン濃度依存的吸光度単位（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）を見つけるために市販のＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ００６１、Ｎｏｖｅｘ）ｇａ使用された。
【００１８】
本発明に参加した志願者には、主要な全身性疾患、手術、入院の医療チェックリストが与えられた。心不全、最近の心筋梗塞（過去６ヶ月間）、悪性腫瘍（過去２年間）、または管理不良の糖尿病（ＨｂＡ１Ｃ＞８.５）を含む、管理されていない疾患を報告した志願者は除外された。また、志願者には健康診断も実施された。本発明は大学病院の倫理委員会および治験審査委員会により承認された。
【００１９】
参加者には、１０ｍｌの非絶食静脈血（Ｋ３  ＥＤＴＡ、ラベンダーキャップ採血管）の提供が求められた。各試料にサンプリング順序に従って登録番号が割り当てられた。従って、試験室スタッフには被験者の臨床状態および人口学的データが知らされなかった。血液試料は採取の１時間以内に遠心分離され（２５００ｇ、１５分間）、血漿がクライオチューブに分割され、−８０℃で最長３ヶ月保管された後、ＩＭＲによる測定のため解凍された。ＩＭＲによるα−シヌクレイン濃度の測定用に、８０μｌの試薬が４０μｌの血漿と混合された。各血漿試料について同様の測定が行われた。
【００２０】
３８〜７３歳の健康な被験者からのヒト血漿試料が９つ、ＰＤ患者（３８〜８５歳）からのヒト血漿試料が９つ、ＰＤＤ患者（６０〜８１歳） からのヒト血漿試料１４が、ＩＭＲを使用したα−シヌクレイン分析に使用された。ＰＤ患者とＰＤＤ患者は臨床症状を使用して特定された。ＰＤ患者は認知的に正常であることに注意する。手順を行う前に、参加した患者全員にインフォームドコンセントが提供され、本発明は国立台湾大学病院研究倫理委員会により承認された。
【００２１】
抗体機能性磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の流体力学的径の平均値は５５.５ｎｍであり、粒子流体力学的径の標準偏差は１２.７ｎｍであった。走査型電子顕微鏡を使用して、抗体機能性磁気Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の径の平均値は〜４０ｎｍとして取得された。試薬は飽和磁化０.３ｅｍｕ／ｇの超常磁性である。以前に公開された文献（Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓ  ２０１３、１４４９０３-１-５）によると、０.３ｅｍｕ／ｇの試薬１ｍｌ中における抗体機能性ナノ粒子の数はおよそ１０１３である。試薬１ｍｌ中の抗体機能性磁気ナノ粒子の合計表面積は約１０００ｃｍ２である。実験では、８０μｌの試薬が使用される。各アッセイの試薬８０μｌ中の抗体機能性磁気ナノ粒子の合計表面積は約８０ｃｍ２である。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートと比較する場合、各ウェルの抗体と標的生体分子間の結合面積は０.４５ｃｍ２である。従って、ＩＭＲでの結合面積はＥＬＩＳＡのそれより１８０倍近く大きいということになる。
【００２２】
α−シヌクレインと磁気ナノ粒子上の抗体間の結合のためＩＭＲシグナルを測定することによって磁気ナノ粒子に固定化された抗体の生物活性が調べられる。図１に示すように、試薬と被験溶液を混合した後の試薬の時間依存的ａｃ磁化率χacが記録された。純ＰＢＳ溶液と、α−シヌクレイン溶液３.１ｆｇ／ｍｌの２つの被験試料が作製された。図１中の破線は、試薬とＰＢＳ溶液の混合物の時間依存的ａｃ磁化率χacを表す。明らかに、破線の経時的χacはほぼ変化のないままである。しかしながら、試薬とα−シヌクレイン３．１ｆｇ／ｍｌの混合溶液に対応する実線については、経時的χacが４５分間で低下して、より低いレベルに到達している。α−シヌクレインと磁気ナノ粒子上の抗体間の結合による試薬のａｃ磁化率χacにおける大幅な減少が観察される。
【００２３】
試薬のａｃ磁化率χacにおける減少を定量化するため、α−シヌクレインと磁気ナノ粒子上の抗体間の結合前／後の最初／最後のχacが図１に示す経時的χacに従って計算される。以前に公開された文献（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.２０１１；２：５００-５０５；Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓ  ２０１０、１０７：０７４９０３-１-５）で言及されていたように、試薬のａｃ磁化率χacにおける減少の判定のための信頼区間は、図１に示す時間依存的ａｃ磁化率χacの最初と最後の４０〜５０分以内である。本発明において、最初と最後の４５分以内試薬のａｃ磁化率χacのデータがχacの減少の判定に使用される。
【００２４】
図１において、最初と最後の４５分の区間の間の磁化率χacのｐ値は、ＰＢＳ溶液の場合０.０４６であった。ＰＢＳと混合された試薬のａｃ磁化率χacでは若干の減少が観察される。３.１ｆｇ／ｍｌのα−シヌクレイン溶液の場合、最初と最後の４５分の区間の間の磁化率χacのｐ値は、０.００７であった。α−シヌクレイン溶液と混合された後の試薬の時間依存的ａｃ磁化率χacにおける明確な減少が証明された。
【００２５】
最初の４５分間内のχacの平均値である初期χacをχac,oとして表す。最後の４５分間内のχacの平均値である最終χacをχac,φとして表す。試薬のａｃ磁化率χacにおける減少、即ちＩＭＲシグナルは、次の式（１）により取得される。
ＩＭＲ（％） =（χac,o - χac,φ） / χac,o × １００ ％ （１）
【００２６】
式（１）により、図１の破線と実線についてのＩＭＲシグナルが計算され、それぞれ１.５６と２.１３％となる。図１に示す結果は、ＩＭＲアッセイのバックグラウンドレベルを示す。そのようなバックグラウンドレベルは主にアッセイシステムの電子ノイズに起因する。同様の測定によると、ＰＢＳ溶液のＩＭＲシグナルは１.５６と１.６５％である。従って、ＩＭＲシグナルのバックグラウンドレベルは１.６１％、標準偏差０.０６％である。
【００２７】
α−シヌクレインの濃度の関数としてのＩＭＲシグナル、即ち、ＩＭＲ（％）−φα−syn曲線を図２に示す。α−シヌクレインの濃度φα−synが３×１０−４ｐｇ／ｍｌ（＝０.３ｆｇ／ｍｌ）から増加するにつれ、ＩＭＲシグナルが増加する。φα−syn依存的ＩＭＲ（％）は、次の式（２）で表されるロジスティック関数にしたがっていることが分かった。
2018091735.tif 000004
（２）
そのうち、Ａ、Ｂ、φo、γはフィッティングパラメータである。図２中のデータポイントを式（２）にフィッティングすることで、フィッティングパラメータがＡ＝１.９４、Ｂ＝３.９５、φo＝４９.７、γ＝０.２６として取得される。フィッティングカーブが図２に実線で示されている。対応する決定係数Ｒ２は０.９９８である。Ｒ２が１に非常に近いということは、φα−syn依存的ＩＭＲ（％）がロジスティック関数に準じていることが示唆されている。
【００２８】
式（２）のパラメータＡはφα−synのゼロへの外挿時ＩＭＲ（％）の値である。通常、値Ａはバックグラウンドレベルよりも若干高い。例えば、Ａが１.９４％で、ここでのバックグラウンドレベルが１.６１％である。Ａとバックグラウンドレベル間の差は主にタンパク質分子と抗体機能性磁気ナノ粒子間の結合における動的平衡により引き起こされるノイズに起因する。しかしながら、Ａは検出下限値（ｌｏｗ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ）として使用されない。従来、検出下限値は、Ａよりも低濃度試験のＩＭＲシグナルの標準偏差の３倍高い（即ち３-σ基準）ＩＭＲシグナルを示す濃度として定義される。この実験において、低濃度試験の標準偏差は０.０２８％である。従って、低濃度限界はＩＭＲシグナルが２.０２％の濃度である。式（２）によって、α−シヌクレインアッセイの検出下限値が０.３ｆｇ／ｍｌであることが分かる。
【００２９】
ＥＬＩＳＡを使用した４５０ｎｍ、Ｏ.Ｄ.４５０ｎｍでのα−シヌクレイン濃度依存的吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が×印で図２に示されている。実験データが次のロジスティック関数にフィッティングされる。
2018091735.tif 000005
（３）
【００３０】
式（３）におけるＡ′、Ｂ′、φo′、γ′のフィッティングパラメータは、０.１８９、５.０７０、１３５６６.０８、１.４４である。式（３）のロジスティック関数は図２において破線で示されている。×印と破線間の決定係数Ｒ２は０.９９９である。３-σ基準を利用することにより、ＥＬＩＳＡを使用したα−シヌクレインアッセイの検出下限値は７９.０４ｐｇ／ｍｌである。α−シヌクレインのアッセイに関してＩＭＲがＥＬＩＳＡより２５０,０００倍高感度であることが明らかである。前述したように、反応表面を考慮に入れると、ＩＭＲの検出感度はＥＬＩＳＡよりも２００倍高い。追加の１２５０倍は超低ノイズ磁気センサー、即ち高温超伝導量子干渉計（Ｈｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ）磁力計による可能性がある。Ｈｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ磁力計ノイズレベル５０ｆＴ／Ｈｚ１/２を示しており、これは単一のナノ粒子により生成される磁気シグナルよりも３桁低い。これは、標的生体分子への結合による単一の磁気ナノ粒子に起因するａｃ磁気シグナルの低下が、Ｈｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ磁力計により検出可能であり得ることを示唆している。このため、超低ノイズＨｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ磁力計は試薬のａｃ磁気シグナルにおける低下に対して極めて感度が高く、生体分子のアッセイに極めて高い感度を示す。
【００３１】
検出下限値に加え、ＩＭＲを使用したα−シヌクレインアッセイのダイナミックレンジは重要な特性である。ダイナミックレンジを調べるために、図２に示す実験的ＩＭＲシグナルが式（２）によりα−シヌクレインの濃度に変換される。変換されたα−シヌクレインの濃度はφα−syn,ＩＭＲで表される。図３に示すように、φα−syn,ＩＭＲとφα−syn間の相関性が調べられる。図３において、φα−syn,ＩＭＲとφα−synの間で線形性を得ることができる。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により発布された規定によると、図３の線形の傾斜は０.９０〜１.１０である必要がある。図３において、０.３１ｆｇ／ｍｌ〜３１ｎｇ／ｍｌのα−シヌクレイン濃度φα−synに対するφα−syn,ＩＭＲが使用される場合、図３に点線で示されるように、φα−syn,ＩＭＲ-φα−syn曲線の傾斜は０.７７で、決定係数Ｒ２は０.９９１である。図３の点線の傾斜は米国ＦＤＡの要件を満たしていない。アッセイのダイナミックレンジを調べるためのα−シヌクレインの濃度範囲を狭くする必要がある。このため、図３における最高のφα−syn,ＩＭＲ、即ち３１ｎｇ／ｍｌのφα−synは無視される。０.３１〜３.１ｎｇ／ｍｌ範囲のφα−syn,ＩＭＲとφα−syn間の線形曲線が図３に破線で示されている。破線の傾斜は１.４８で、決定係数Ｒ２は０.９９９である。破線の傾斜は米国ＦＤＡの要件よりもずっと高い。図３において２番目に高いφα−syn,ＩＭＲも無視する必要がありそうである。０.３１ｆｇ／ｍｌ〜３１０ｐｇ／ｍｌ範囲のφα−syn,ＩＭＲとφα−syn間の線形曲線が図３に実線で示されている。実線の傾斜は０.９３で、決定係数Ｒ２は０.９９９である。注意すべきは、実線の傾斜は米国ＦＤＡの要件を満たしている点である。従って、ＩＭＲアッセイのα−シヌクレイン濃度のダイナミックレンジは０.３ｆｇ／ｍｌ〜３１０ｐｇ／ｍｌである。
【００３２】
図２に示したデータはＩＭＲアッセイが極めて高感度であり、ヒト血漿中のα−シヌクレインを検出できる可能性があることを証明している。ＩＭＲを使用した健康な被験者とＰＤ患者、及びＰＤＤ患者の区別に関する事前研究のために、９名の健康な被験者、９名のＰＤ患者及び１４名のＰＤＤ患者より提供された血漿試料が採取された。採取された３３名の被験者の人口学的情報を表１に示す。ヒト血漿中のα−シヌクレインの検出された濃度φα−syn,ＩＭＲを図４に示す。ＰＤＤ患者の血漿φα−syn,ＩＭＲは０.１〜１００ｐｇ／ｍｌの範囲で、一方健康な被験者の血漿φα−syn,ＩＭＲは０.１ｐｇ／ｍｌよりずっと低かった。ＰＤ患者の血漿φα−syn,ＩＭＲは、健康な被験者のものとＰＤＤ患者のものの間に分布していた。健康な被験者とＰＤ患者間の血漿φα−syn,ＩＭＲに関するｐ値は０.００５であり、ＰＤ患者は健康な被験者と比較してより高い血漿α−シヌクレイン濃度を示す事実が明らかになった。図４では、ＰＤ患者とＰＤＤ患者間の血漿φα−syn,ＩＭＲにおける明確な区別が観察された（p＜０.００１）。図４の結果によると、血漿α−シヌクレインの濃度は、健康な被験者がＰＤを罹患し、ＰＤＤへと進行するにつれ上昇し続ける。健康な被験者とＰＤ患者間（ｐ＞０.０５）、ＰＤ患者とＰＤＤ患者間（ｐ＞０.０５）で年齢を一致させたことを述べておく。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
先行研究において、α−シヌクレインは神経細胞から開口分泌によりＣＳＦと血漿を含む体液中に放出され、それが脳内におけるα−シヌクレインの病理学的変化の細胞から細胞への伝達に寄与することが示されている。数々の研究がＰＤ患者から採取した血漿試料中のトータルまたはオリゴマーのα−シヌクレインレベルをチェックし、健康な対照群と比較することに重点を置いているが、結果は矛盾している。リン酸化及び線維化α−シヌクレインはタンパク質の主要な病理学的変化形態であるため、最近の１つの研究では対照群と比較して認知症を伴わない早期のＰＤ試料においてリン酸化α−シヌクレインの血漿レベルがより高いことが観察された。これらの観察を通じて、α−シヌクレイン（トータル、またはオリゴマーあるいはリン酸化形態）の血漿レベルが、ＰＤ患者の脳内におけるα−シヌクレインの病理学的変化を一部反映している可能性があることの実行可能性および潜在性を示唆している。さらに、皮質性レビー小体／神経突起の病変が認知症を伴わないＰＤよりもＰＤＤでより広範囲であり、これは血漿中のα−シヌクレイン沈着がＰＤよりもＰＤＤでより重度であることを示唆している。我々の結果は、α−シヌクレインの血漿レベルは、正常な認知力のＰＤの場合健康な対照群よりも若干高いだけである一方で、ＰＤＤではずっと高いというこの仮説を支持した。アルツハイマー認知症の特徴的な病理であるアミロイドβプラークとタウの神経原線維濃縮体も観察され、ＰＤＤ患者における認知状態と相関しているため、ＰＤＤの病態生理をより理解するためには、ＰＤＤの血漿レベルにおけるリン酸化-α−シヌクレイン、アミロイドβタンパク質、トータル及びリン酸化タウの評価を取り入れた今後の研究が必要である。
【００３５】
血漿試料において、異好抗体は主要な交絡因子であり、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるアッセイ結果に干渉する。臨床検査標準委員会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のガイダンス（ＣＬＳＩ−ＥＰ−Ａ２：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（臨床科学の干渉試験））によると、異好抗体（ＨＡ）は免疫測定の一般的な干渉物質の１つとして定義されている。ＩＭＲ法は先行研究を通じてＥＬＩＳＡと比較したとき低干渉と高特異性の効果を示している。選択のメカニズムは試薬中の振動する磁気ナノ粒子が寄与する遠心力に基づいている。詳細は先行研究で説明されている。事実、選択のメカニズムにより、ＨＡだけでなく、血漿中に頻繁に使用される薬剤の自然に存在する生体分子も磁気ナノ粒子との結合が阻止される。これは、ＩＭＲをパーキンソン病の血漿バイオマーカーの臨床分析に対する高特異性の方法として特徴付ける。
【００３６】
臨床的に、患者は最初にＰＤと診断され、疾患のより後の段階で認知症を発症することがあり、それによりＰＤＤの診断がなされる。従って、ＰＤ患者におけるＰＤＤの予測または進行の早期段階での診断ができるバイオマーカーは、実に臨床的な意義がある。図４の結果によると、ＰＤＤ患者における血漿α−シヌクレインはＰＤ患者よりも明確に高いレベルを示す（ｐ＜０.００１）。これは、ＰＤ患者におけるＰＤＤへの進行を監視する臨床的パラメータとしての血漿α−シヌクレインの使用が有望であることを示唆している。
【００３７】
α−シヌクレインに対する抗体を磁気ナノ粒子に固定することにより、α−シヌクレインのアッセイ用試薬が開発される。Ｈｉｇｈ−Ｔｃ  ＳＱＵＩＤ磁力計の補助を利用した免疫磁気的低下（ＩＭＲ）を活用することで、α−シヌクレインアッセイのダイナミックレンジは０.３ｆｇ／ｍｌ〜３１０ｐｇ／ｍｌとなっている。超高感度ＳＱＵＩＤベースのＩＭＲがヒト血漿α−シヌクレインのアッセイに適用される。初歩的な結果は、健康な被験者、ＰＤ患者、ＰＤＤ患者の血漿α−シヌクレインの濃度に明確な差があることを示している。この方法は、血漿α−シヌクレインのアッセイによりＰＤとＰＤＤの診断にＩＭＲを適用することが有望であることを示している。
【符号の説明】
【００３８】
無
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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