(57)【要約】      （修正有）【課題】副作用の低減されたグリコサミノグリカンの提供。【解決手段】１０ＩＵ／ｍｇ未満の抗凝固因子ＩＩａ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満の抗凝固因子Ｘａ活性、４．６ｋＤａ±１０％〜６．９ｋＤａ±１０％の重量平均分子量（Ｍｗ）及び下式の多糖鎖を高頻度で有し、化学的にインタクトな非硫酸化型イズロン酸およびグルクロン酸が、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで検出不能である化学的に改変されたグリコサミノグリカン。2018111825.tif 000015【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群より選択される、化学的に改変されたグリコサミノグリカンであって、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子ＩＩａ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子Ｘａ活性、および４．６ｋＤａ±１０％〜６．９ｋＤａ±１０％の重量平均分子量（Ｍｗ）を有し、
該化学的に改変されたグリコサミノグリカンにおいて、
−含まれる多糖鎖が、２〜２０個の二糖単位（分子量：１．２ｋＤａ〜１２ｋＤａ）を有し；
−該多糖鎖中、化学的にインタクトな非硫酸化型イズロン酸およびグルクロン酸が、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで検出不能であり、かつ
−該多糖鎖のうち、（式Ｉ）で示される多糖鎖が最も高頻度に存在し：
【化１】
2018111825.tif 000012
（式中、
【化２】
2018111825.tif 000013
であり、
ｎは、２〜２０の整数である。）；
−該多糖鎖の分子量の分布が以下の表の累積重量％として表される、
【表１】
2018111825.tif 000014
化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項２】
前記多糖鎖のうち、６〜１２個の二糖単位（分子量：３．６〜７．２ｋＤａ）を有する多糖鎖が最も高頻度に存在する、請求項１に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項３】
改変されたグルコサミンが、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中で５．９５ｐｐｍおよび６．１５ｐｐｍのシグナルを生じる、請求項１または２に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項４】
化学的にインタクトな非硫酸化型イズロン酸およびグルクロン酸が、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで検出不能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項５】
前記化学的に改変されたグリコサミノグリカンが、ヘパリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項６】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸からなる群より選択される、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子ＩＩａ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子Ｘａ活性、および４．６ｋＤａ±１０％〜６．９ｋＤａ±１０％の重量平均分子量（Ｍｗ）を有している化学的に改変されたグリコサミノグリカンを調製する方法であって、以下の順序の工程、
（ａ）該グリコサミノグリカンの多糖鎖に含まれるグルクロン酸およびイズロン酸を過ヨウ素酸塩を用いた処理により酸化する工程と、
（ｃ）アルカリ条件下での該多糖鎖の脱重合と、
（ｄ）還元剤との反応を通じた該多糖鎖の末端のアルデヒド基の還元および安定化と、を包含し、さらに、
（ｂ）工程ａ）の終わりと、工程ｄ）の開始との間を確実に６時間±１０％以内で行うことによって、前記過ヨウ素酸塩の酸化効果を排除または最小化する工程を含む、方法。
【請求項７】
前記過ヨウ素酸塩酸化が、１０℃を超える温度で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記過ヨウ素酸塩酸化が、（１０±１０％）（ｗ／ｖ）％〜（２０±１０％）（ｗ／ｖ）％という初期グリコサミノグリカン濃度を有する溶液で行われる、請求項６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化過程が、少なくとも１５時間行われる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記過ヨウ素酸塩酸化が、１３℃±１０％〜１７℃±１０％の温度で、（１５±１０％）％のグリコサミノグリカン濃度で、およびｐＨ５±１０％で、１８時間±１０％〜２４時間±１０％行われる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脱重合化が、２０℃±１０％を超える温度で行われる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
グリコサミノグリカン誘導体において、１．２ｋＤａ±１０％〜１２ｋＤａ±１０％の分子量を有する多糖鎖を豊富にする、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学的に改変された硫酸化グリコサミノグリカンの治療上有効な量、ならびに治療上許容される担体を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項１５】
難産の処置のための方法に使用され、該方法において患者に対して治療上有効な量で投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項１６】
敗血症の処置のための方法に使用され、該方法において患者に対して治療上有効な量で投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【請求項１７】
非還元性末端不飽和グルコサミンが、ヘパリンの５．４２ｐｐｍのシグナルに対して４％未満の強度（％比）を有する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの５．０〜６．５の間のシグナルとして存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学的に改変されたグリコサミノグリカン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低い抗凝固活性を有する新規な改変されたグリコサミノグリカンおよびそれらの生成法に関する。生成法は、例えば、非経口注射後の高いバイオアベイラビリティおよび高い構造安定性（都合のよい保管性および取扱い性を生じる）を有する改変されたヘパリンおよびヘパリン硫酸を生成するように特に適合されている。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、多分散性の、血栓症が生じる過程である凝固を阻害する天然に存在する多糖体である。ヘパリンは、種々の長さおよび分子量の未分岐の多糖鎖からなる。５０００から４０，０００ダルトンを超える分子量の鎖が、製薬等級のヘパリンを形成する。
【０００３】
天然の供給源（主にブタの腸またはウシの肺組織）由来のヘパリンは、血栓症の予防および処置のために治療的に投与され得る。しかし、未分画のヘパリンの効果は、予想が困難であり得る。未分画のヘパリンでの血栓症の処置の間、凝固パラメーターは、過剰な抗凝固または過小な抗凝固を防ぐために極めて密にモニターされなければならない。
【０００４】
多数のブランドのヘパリンおよび低分子量のヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えば、ダルテパリンおよびエノキサパリンは、それらの抗凝固活性に依存する処置のために利用可能である。多数のインビトロおよび動物実験的検討、ならびに臨床試験でも、ヘパリンおよびその誘導体は、その抗凝固効果に関連する特性以外の有益な特性を有することが示されている。しかし、既存のヘパリンおよびＬＭＷＨは、抗凝固効果に伴う出血リスクのせいで、他の医学的状態を処置するために適当ではない。ＬＭＷＨは、ヘパリンに比較してかなりの臨床的利点を示すが、このクラスの物質は、そもそも、潜在的に生命に脅威となる副作用を生じ得る高い抗凝固活性を保持したままである。
【０００５】
皮下に投与されてもよく、ＡＰＴＴモニタリングを必要としないので、ＬＭＷＨは、未分画のヘパリン投与のために以前ならば入院を要した、深部静脈血栓症または肺塞栓症のような状態の通院治療を可能にする。
【０００６】
ＬＭＷＨのダルテパリンは、深部静脈血栓症の予防を受けた女性の遷延分娩を低減することが示された。その機構は、子宮頸部熟化を促進する都合の良い炎症性反応を生じるインターロイキンのダルテパリン誘導性のレベル増大を含むと考えられる。さらに、ダルテパリンは、子宮の収縮性を増大することが示された（非特許文献１）。
【０００７】
しかし、ヘパリンおよびＬＭＷＨは、多数の理由のせいでこのような疾患を予防または処置するために適当ではない。まず、ヘパリンおよびＬＭＷＨは、かなりの周知の抗凝固効果を有しており、これによって、妊娠後期および分娩の際のそれらの使用は、出血リスクのせいで、予防的使用および救急使用の両方について、制限される。例えば、ダルテパリンの使用は、出生の際に施される場合が多い手段である、硬膜外麻酔が施される場合は、厳密に禁忌とされる。第二に、ヘパリンは、ヘパリンに曝された何れの患者でも生じ得る重度の免疫媒介性の薬物反応である、ヘパリン起因性血小板減少症にづけられている。これは、ある患者が、ヘパリンを５日以上投与された後か、またはその患者が以前にヘパリン暴露されていた場合のいずれかに発症する、ヘパリン依存性の抗体によって生じる潜在的に破滅的なプロトロンビン疾患である。ヘパリンでの長期処置の別の厄介な潜在的影響とは、骨の脱灰を誘導して骨粗しょう症を生じ得るということである。
【０００８】
ヘパリンに関連する面倒な影響（大部分は出血）の危険性を有することなく、抗凝固活性以外のヘパリン鎖の潜在的な臨床効果の利点を得る目的で、低抗凝固性ヘパリン（ＬＡＨ）を得るために、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの抗凝固活性を根絶または低減する多くの試みがあった。しかし、この種のヘパリンの臨床的な経験は限られており、今までのところ、このような生成物は臨床使用が許されていない。
【０００９】
特許文献１は、９〜１３ｋＤａの平均分子量を有している、低い抗凝固効果を有する生成物を生じる、酵素的に分解されるかまたは酸化されたヘパリンを開示しており、これは、神経変性疾患の治療容易提案されている。
【００１０】
特許文献２は、抗凝固効果を担う五糖残基の残基を切断するために天然のヘパリンを処理し、その後に、５．８〜７．０ｋＤａの平均分子量を有する、低抗凝固、低分子量のヘパリンを生じる脱重合を行うという一方法を実証する。特許文献２では、約１５時間の透析のような、時間のかかる方法を用いて、酸化過程をおわらせる。このような過程は、最終生成物の分子量分布に影響し得る。多糖鎖の分子量および長さを制御することは、その化合物の所望の生物学的影響を得るために重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１０５９３０４号明細書
【特許文献２】米国特許第４，９９０，５０２号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】アクタ・オブステトリシア・エ・ギネコロジカ・スカンジナビカ（Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica），２０１０年，第８９巻，１４７〜１５０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
皮下投与後の長鎖ヘパリンのバイオアベイラビリティは、低く、かつヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）誘発の可能性はまた、鎖の長さと正に相関する。これらの臨床上望ましくない特性を低減するために、ヘパリン誘導体は、全長であるべきではない。特定の分子量のヘパリン鎖は、標準的なヘパリンの分画によって獲得できる。しかし、ゲルろ過、アルコール沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーのような分画方法による、中程度のまたは低い分子量のヘパリン誘導体の生成は、高分子量のヘパリンがそのように廃棄されるので、原料のかなりの無駄を伴う。
【００１４】
本発明は、以下のセクションに概説されるように、多糖鎖が短縮され、適当な平均分子量分布が達成されてその臨床使用を利し、原料の損失を最小にしながら最大の多糖鎖と関連するリスクを低減する新規な過程を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸から選択される、化学的に改変されたグリコサミノグリカンであって、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子ＩＩ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子Ｘａ活性、および約４．６〜６．９ｋＤａの平均分子量（重量平均、Ｍｗ）を有しており、ここで、
その多糖鎖が、１．２ｋＤａ〜１２ｋＤａの分子量に相当する２〜２０個（式Ｉにおけるｎ）のポリマー二糖単位を有し、
主に存在する二糖類が（式Ｉ）
【００１６】
【化１】
2018111825.tif 000002
【００１７】
であって、
ここで、
【００１８】
【化２】
2018111825.tif 000003
【００１９】
であり、
ｎは、２〜２０の整数である、
化学的に改変されたグリコサミノグリカンに関する。
【００２０】
本発明はさらに、その使用およびその生成のための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による低抗凝固性ヘパリン合成のスキームを示す。
【図２】薬物の安定性研究の結果を示す。
【図３】薬物の安定性研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一般的な用語では、本発明は、多糖鎖の治療効果を保持するように、ならびに多糖鎖の最適サイズ分布を生じて、高いバイオアベイラビリティおよび安定性を保証しながらまた一方では、低い抗凝固効果を有し、それによって出血のリスクを本質的に排除するように、選択的に調製される、化学的に改変されたヘパリンおよびヘパラン硫酸に関する。
【００２３】
本発明はまた、製品のコストが好ましく、市販品を生成するために大規模化できる高収率の過程を保証する。製造のコストおよび原料の利用可能性は両方とも、薬剤製品を獲得するのに重要な要因となる。好ましい鎖長の分布を有する薬学的に許容される誘導体へ未分画のヘパリンを改変する能力によって、高いバイオアベイラビリティをともなう非経口投与が可能になる。さらに、これは、自己治療のような臨床処置を可能にし、これには、社会経済学的な視点から利点がある。
【００２４】
いくつかの用語および定義を、一般的なおよび詳細なまたは実験の文脈で、本発明を記載する以下の文脈で用いている。
【００２５】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形である「１つの、ある（ａ、ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の指示物を包含することが注意されるべきである。
【００２６】
また、「約、およそ、ほぼ（ａｂｏｕｔ）」という用語は、所与の値の±２％、好ましくは、適宜、その数値の±５％、そして最も好ましくは±１０％の偏差を示すために用いられる。
【００２７】
ヘパリンは、天然に存在するグリコサミノグリカンであって、これは、ヒトおよび動物のいわゆる肥満細胞において細胞内で合成されて貯蔵される。ほぼブタの腸粘膜から工業的に調製されるヘパリンは、強力な抗凝固剤であり、血栓塞栓性障害の予防および処置のために好ましい薬物として、６０年を超えて臨床的に用いられている。ヘパリン処置の主な潜在的な有害作用は、その抗凝固特性によって生じる出血性の合併症である。ヘパリンは、極めて多分散性であり、５〜４０ｋＤａ（平均は約１５〜１８ｋＤａである）におよぶ分子量を有する多糖類の不均一な集団から構成される。
【００２８】
欧州薬局方による低分子量／質量のヘパリン（ＬＭＷＨ）は、８ｋＤａ未満の質量平均分子量を有する硫酸化ＧＡＧの塩として定義され、総質量のうち少なくとも６０％が８ｋＤａ未満の分子量を有する。それらは、多糖鎖の還元性または非還元性末端で異なる化学構造を示す。力価は、乾燥物質を参照として算出して１ミリグラムあたり７０ＩＵ以上の抗凝固因子Ｘａ活性である。抗凝固因子ＩＩａ活性に対する抗凝固因子Ｘａ活性の比は、１．５以上である。臨床的に用いられるＬＭＷＨは、約４〜７ｋＤａの平均である３〜１５ｋＤａにおよぶ分子量を有する。ヘパリンの制御された脱重合によって生成されたＬＭＷＨは、未分画のヘパリンに比較して、皮下注射後の出血を誘発する傾向の低さ、バイオアベイラビリティの増大、および長期の半減期を含めて、より好ましい薬理学的および薬物動態学的な特性を呈する。
【００２９】
ヘパラン硫酸は、ヘパリンよりも全体的な硫酸化の少ない直鎖の多糖体であって、ブタの腸粘膜から、またはウシの肺から、Ｆｒａｎｓｓｏｎら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅｓ（ヘパラン硫酸の構造的研究）」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６巻，５９〜６９ページ（１９８０年）に記載のように、塩化セチルピリジニウム分画および連続する塩抽出を用いるヘパリン副画分から調製できる。ヘパラン硫酸は、交互するグルコサミンおよびウロン酸残基から構成され、得られる二糖単位は、Ｎ−アセチル化、Ｎ−硫酸化または（低程度に）Ｎ−非置換のいずれかであり、主にドメイン的に配置されている。一部のヘパラン硫酸は、特定の抗凝固五糖の存在に依存して（ただしヘパリンよりはかなり少ない）抗凝固活性を保有する。
【００３０】
ヘパリンは、その抗凝固活性を主に、セリンプロテイナーゼインヒビターである、アンチトロンビン（ＡＴ）に対する高い親和性の結合およびその活性化を通じて発揮する。ＡＴ（血液凝固の重要な生理的阻害剤）は、活性化された凝固因子を、これらの因子との安定な複合体を形成することによって、中和する。ヘパリンの多糖鎖内の特定の五糖の結合は、凝固因子の阻害の率を劇的に増強するＡＴの構造的変化を生じ、それによって血液凝固および凝血の形成を軽減する。
【００３１】
ヘパリンポリマー内に無作為に分布された、固有の特定の五糖配列は、ＡＴに対する結合に必須である。この配列のいくつかの構造的な特徴は、ＡＴとヘパリンとの相互作用に重要であると示された。とりわけ、この五糖配列中に存在するイズロン酸残基は、Ｃ−２位置で一貫して硫酸化され、一方でグルクロン酸のＣ−２およびＣ−３の両方のヒドロキシル基は非置換である（式ＩＩ）。
【００３２】
【化３】
2018111825.tif 000004
【００３３】
抗凝固活性と適合するいくつかの構造的異形としては、非還元性の末端側のＧｌｃＮ単位のＮ−硫酸ではなくＮ−アセチル置換、および他の２つのＧｌｃＮ残基での６−Ｏ−硫酸化ではなく非置換Ｃ６−ヒドロキシル基が挙げられる。
【００３４】
本明細書における開示された過程を適用することによって、ＡＴとの相互作用は不可能になり、従って、抗凝固活性は本質的にとり除かれる。
【００３５】
本発明においては、グリコサミノグリカンの抗凝固活性は、ＡＴによる凝固因子ＸａおよびＩＩａ（トロンビン）の阻害増強という臨床機能に関する。一実施形態では、本発明による化学的に改変されたグリコサミノグリカンの抗凝固活性は本質的に存在しない。
【００３６】
低抗凝固性のヘパリンを調製する過程では、非特異的な脱重合（すなわち脱重合工程そのもの、アルカリβ脱離からの加水分解から得られる予測可能な結果に起因しない脱重合効果）を回避、または中和することが重要である。非特異的な脱重合によって、分子量の予測不能な損失、変色した生成物（不安定な吸光度値）、他の安定性の問題、ならびに正体不明の残基およびヘパリンまたは低分子量ヘパリンの処置から生ずるとは予測されない残基の出現が生じ得る。
【００３７】
本発明の１つの重要な態様は、最適の鎖分布および好適な安定性の特徴を有する生成物を得るために脱重合を制御することである。１つの態様では、脱重合は、過ヨウ素酸塩、およびまた生ずるヨウ素酸塩もヘパリンに対する酸化的な攻撃を発揮することを可能にする条件を制御することによって制御される。本発明による方法は、鎖分布および安定性にネガティブに影響する非特異的な脱重合を最小化するために最適化された。
【００３８】
他の用語は、以下の説明において関連する文脈において定義される。
【００３９】
一態様では、本発明は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸から選択される、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子ＩＩａ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子Ｘａ活性、および約４．６〜約６．９ｋＤａの平均分子量（重量平均、Ｍｗ）を有している改変されたグリコサミノグリカンを調製する方法に関する。この方法は通常、水溶液中に存在する未分画のヘパリンまたはヘパラン硫酸を、非硫酸化型ウロン酸を酸化できる酸化剤にさらすことによって選択的に酸化する工程、および得られた酸化された単糖を還元することを包含する。この方法はまた、通常は、塩基性加水分解によってヘパリン鎖を脱重合化することを包含する。
【００４０】
一態様では、この方法は以下の工程を包含する。
●過ヨウ素酸塩での処理によるグルクロン酸およびイズロン酸の酸化、
●ヨード含有化合物を酸化する効果を排除または最小化する工程、
●アルカリ条件下での多糖鎖の脱重合（β脱離過程）、および
●ＮａＢＨ４のような還元剤との反応を通じた末端のアルデヒド基の還元および安定化。
【００４１】
さらなる態様では、本発明はまた、以下の工程のうちの１つ以上を包含する。
●ホウ酸塩（酸化されたＮａＢＨ４）を除去する手段によるこの生成物の最終精製、小さいグリコサミノグリカン断片の除去、対イオンの付加および固体状の生成物の単離、
●生成物の長期保管を可能にするための、減圧および加熱下、または凍結乾燥過程としての生成物の乾燥、
●リン酸緩衝水溶液（６〜８へのｐＨの調節）中への生成物の溶解および調製。張度調節を目的とした添加剤の添加、
●バイアルまたはシリンジへの生成物の無菌的な充填またはそれらの中での凍結乾燥。
【００４２】
一態様では、この方法は、酸化、加水分解による脱重合化、および還元の順序で行い、さらに具体的には以下の工程を含む。
ａ）過ヨウ素酸塩での処理によるグルクロン酸およびイズロン酸の酸化、
ｂ）ヨード含有化合物を酸化する効果の排除または最小化、
ｃ）アルカリ条件下での多糖鎖の脱重合（β脱離過程）、および
ｄ）ＮａＢＨ４のような還元剤との反応を通じた末端のアルデヒド基の還元および安定化。
【００４３】
さらなる態様では、この方法はまた、以下の工程のうちの１つ以上を含む。
ｅ）生成物の最終精製であって、ホウ酸塩（酸化されたＮａＢＨ４）の除去、小さいグリコサミノグリカン断片の除去、対イオンの添加および固体状の生成物の単離、
ｆ）生成物の長期保管を可能にするための、減圧および加熱下での、または凍結乾燥過程としての生成物の乾燥、
ｇ）リン酸緩衝水溶液（６〜８へのｐＨの調節）中への生成物の溶解および調製。張度調節を目的とした添加剤の添加、
ｈ）バイアルまたはシリンジへの生成物の無菌的な充填またはそれらの中での凍結乾燥。
【００４４】
この方法の好ましい態様では、化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、未分画のヘパリンであり、かつ非硫酸化イズロン酸および／または非硫酸化グルクロン酸は、選択的に酸化され、それによって、ＡＴＩＩＩと特異的な五糖との間の相互作用によって媒介される抗凝固効果を阻害する。この酸化は、２つの近接する遊離のヒドロキシルを有する非硫酸化ウロン酸を、ＡＴ結合を担う五糖のＣ２およびＣ３で切断する。非限定的な例として、未分画のヘパリンの組成物を、メタ過ヨウ素酸塩のような過ヨウ素酸塩で処理する（例えば、適切な割合の、脱イオン水に溶解された未分画のヘパリンおよびメタ過ヨウ素酸ナトリウム）。他の酸化剤は、それらが、最終生成物の他の構造または安定性に影響することなく、酸化効率に対して、および非硫酸化型残基に対して同じ化学的な影響を有する場合、有用である。
【００４５】
異なる態様によれば、本発明による化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、化学的構造（式ＩＩＩ）を有するグリコールで切断された残基を含む。
【００４６】
【化４】
2018111825.tif 000005
【００４７】
グリコールで切断された残基は、この方法および特異的な加水分解工程に関して先に考察されたとおり、酸化および還元の過程の結果として、化学的に改変されたヘパリンの多糖鎖に出現する。描写されたグリコール分割残基は、非硫酸化イズロン酸およびグルクロン酸の酸化および還元から得られる。
【００４８】
完全な酸化を得るために、酸化工程は好ましくは、１０℃を超える温度で、好ましくは約１５±２℃で、少なくとも１５時間、および好ましくは約１８〜２４時間行う。
【００４９】
この実施形態では、過ヨウ素酸塩酸化は、約１０〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは約１５（ｗ／ｖ）％の初期グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）濃度の溶液中で行う。この原料の高濃度によって、好適なプロセス経済性がもたらされる。なぜならこの過程で引き続いて行われる沈殿工程は、溶媒の体積／生成物の体積に基づくからである。
【００５０】
特定の実施形態では、この酸化工程は、メタ過ヨウ素酸塩の添加によって、約１５±２℃の温度で、約１５％のグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリンまたはヘパラン硫酸）濃度で、約５のｐＨで、約１８〜２４時間行う。
【００５１】
この過程の未分画のヘパリンの使用は、本発明に一般に有利とみなされる。なぜなら、これは、材料の無駄を減らし、費用効率を増大することに寄与して、中程度の多糖鎖の長さおよび好適なバイオアベイラビリティを有する生成組成物の供給を助けるからである。
【００５２】
過ヨウ素酸塩酸化の後、本発明による方法はさらに、酸化を終了させる工程、および残留の酸化剤を排除する工程のうちの少なくとも１つの工程を含んでもよい。少なくとも１つの排除工程は、還元型の酸化剤を除去する工程を包含する。この場合、還元型は、還元型に変換された酸化剤を意味し、本発明のグリコサミノグリカン中の標的単糖残基の酸化に寄与する。また、この場合、この還元工程は、酸化されたグリコサミノグリカンを還元することとは別に、残りの酸化剤を消費する（減少させる）ために寄与する還元剤の添加を包含してもよい。
【００５３】
従って、本発明は通常は、未分画のグリコサミノグリカン、例えば、ヘパリンまたはヘパラン硫酸を、非硫酸化型単糖を酸化できる酸化剤にさらすことによって、選択的に酸化する工程、残留の酸化剤および還元型の酸化剤を排除する工程、ならびにアルカリ条件下でグリコサミノグリカン鎖を脱重合化する工程を有する方法に関する。これらの目的のために、排除工程は、水性アルコールのようなアルコールを；化学的に改変されたグリコサミノグリカンが沈殿する十分な量で添加する工程を包含してもよい。アルコールは、メタノール、プロパノール、エタノールまたは類似のアルコールであってもよく、化学的に改変されたグリコサミノグリカンを沈殿させるが、酸化剤およびその還元型はアルコールと一緒にで除去される。沈殿は１回行われても、または除去を最適化するために１もしくは数回繰り返して行われてもよい。しかし、１回だけ沈殿を行うことが有益である場合もある。なぜなら時間がかからず、残留ヨウ素含有化合物とグリコサミノグリカンとの間の暴露時間を減らすからである。
【００５４】
排除工程はまた、グリコサミノグリカンに対する酸化効果をさらに発揮する酸化剤を化学的に不活性化できるクエンチ剤の添加を包含し得る。２つの近接するヒドロキシル基を有する任意のクエンチャーを用いてもよい。適当なクエンチャーの非限定的な例は、エチレングリコールおよびグリセロールである。近接するジヒドロキシル基を含むクエンチャーを添加することによって、過ヨウ素酸塩は、酸化工程の終わりに直ちに有害性の低いヨウ素酸塩に変換される。
【００５５】
上記排除工程(単数または複数)は、グリコサミノグリカンの非特異的な脱重合（すなわち、アルカリ脱重合プロセスの予測可能な結果に属さない脱重合効果）を中和または最小化するために寄与すると、本発明者らによって一般に考えられる。上述のように、非特異的な脱重合では、分子量の予測不可能な減少、変色した生成物（保管によって吸光度の増大をともなう）、他の安定性の問題、およびヘパリンまたは低分子量ヘパリンのようなグリコサミノグリカンで生じるとは予測されない正体不明の残基の出現が生じ得る。
【００５６】
排除工程の導入によって、任意の非特異的な脱重合の制御の改善が可能になる。任意の前記の方法と適合する、非特異的な脱重合を制御する別の方法は、アルコールを添加した時、前の沈殿工程(単数または複数)の間の環境温度（室温）よりかなり低くまで温度を低下させることである。例えば、非特異的な脱重合を生じる望ましくない反応を防ぐために、約５℃まで温度を下げてもよい。
【００５７】
代替法として、工程段階ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、一連の順序で、好ましくは遅滞なく行われる。「一連の順序」とは、この場合、それらの工程が、なんら中間の沈殿工程なしに行われることを意味する。酸化工程の終わりから還元工程の開始までの時間経過を最小限にすることが特に重要である。
【００５８】
本発明の一態様では、工程段階ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、一連の順序で、好ましくは遅滞なく行われる。「一連の順序」とは、この場合は、それらの工程が、なんら中間の沈殿工程なしに行われることを意味する。この態様では、酸化性のヨウ素化合物の影響を排除または最小化する工程は、選択的な酸化工程の終わりと、還元工程の開始との間で多糖に対してなんらかの無制御の化学的影響を発揮する、残留の酸化性のヨウ素化合物の暴露時間を制御する工程を包含する。
【００５９】
従って、酸化工程の終わりから還元工程の開始まで、すなわち、脱重合の開始（塩基の添加）からホウ化水素の添加までの時間経過を最小限にすることが本発明の一態様である。一態様では、酸化工程の終わりからホウ化水素の添加までの時間経過は、約１時間〜約６時間である。別の態様では、酸化工程の終わりからホウ化水素の添加までの時間経過は、約５時間以下、好ましくは、約４時間以下、さらに好ましくは約３時間以下、そして最も好ましくは約２時間以下である。必要な最小時間は、反応のｐＨによって制御される脱重合の進行から決定される。一態様では、必要な最小時間は、約１時間である。例えば、実施例３に開示の低い方のｐＨでは、結果として必要な時間は最長になり、高い方のｐＨについて逆もまた成り立つ。この３工程は、同じ容器で有利に行うことができる。この代替過程は、過ヨウ素酸塩酸化の終わりからホウ化水素のヨード含有化合物に対するヘパリンまたはヘパラン硫酸の暴露時間を、還元工程で還元性のホウ化水素によってそれらが排除されるまで短縮するという利点を有する。ホウ化水素の添加によって残りの過ヨウ素酸塩は直ちにクエンチされて、これは生成物にとって有害性が低い他の不活性型、例えば、ヨウ化物およびヨウ素に変換される。ホウ化水素は残りの過ヨウ素酸塩をクエンチすること、末端のアルデヒド基を還元することの両方に有効な量で添加されなければならない。この方法でこの過程を短縮する明確な結果を表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
【００６０】
酸化工程の終了後、多糖鎖をアルカリ条件下で脱重合する。脱重合は好ましくは、所望の分子量を有する好適に分画された鎖を得るために、約５〜２５℃の温度で行われる。脱重合反応のｐＨは、硫酸化ウロン酸残基の２−Ｏ−硫酸基を保護し、増大するｐＨでの生成物の黄色着色の増大を防ぐために約１０〜１２である。着色は、生成物の質／安定性の指標であるので、生成物の保管期間に影響する。生成物の劣化の指標であるので、色を分析する必要性があてはまる。ｐＨは、好ましくは、２−Ｏ−硫酸化ウロン酸の脱硫酸化のおよびさらには生成物のさらなる着色のリスクのため、１３（０．１ＮのＮａＯＨまたはそれ以上）に達してはならない。反応時間は好ましくは、酸化された非硫酸化型ウロン酸の十分な切断に関して適切な反応を達成するために約１５〜９５分である。
【００６１】
酸化されたグリコサミノグリカンは、引き続いて、還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムで処理されて、末端のアルデヒド基を還元する。この過程は、アルデヒド含有末端を還元し、それらを第一級アルコールへ、アルデヒドが例えば１３Ｃ−ＮＭＲ分析によって検出できなくなる程度まで変換するように設計される。還元性の末端のこの程度の高い還元は、この生成物の高い安定性に寄与する。なぜならアルデヒドは、本質的に化学的に不安定であるからである。アルデヒドを排除する別の理由は、アルデヒドが潜在的に毒性であり得るということである。水素化ホウ素ナトリウムのように他の単糖類の硫酸基を不必要に改変も破壊もすることなく、酸化されたグルクロン酸／イズロン酸残基の同様に特定の還元工程を行うことができる場合、他の還元剤を考えることができる。そのように還元された鎖は、例えばアルコール沈殿によって単離され得る。
【００６２】
所望の鎖の選択を助けるために、またこの方法は、約３〜約１２ｋＤａの分子量を有する多糖鎖のヘパリンまたはヘパラン硫酸誘導体を富化する工程も包含し得る。この富化工程は一般には、生体高分子製造の業者に周知の従来の沈殿、クロマトグラフィー、濾過または分子ふるいの手順を包含する。
【００６３】
沈殿工程のパラメーター（生成物の濃度、有機溶媒の濃度、ｐＨおよび追加の対イオン）を、３ｋＤａより大きい多糖を保持するように最適化した。
【００６４】
本発明者らは、非特異的な脱重合が最小化されている高収率の新規な方法論を開発した。一態様では、酸化反応、ヨウ素化合物の除去、および改変されたヘパリンまたはヘパラン硫酸の沈殿の同時の終結が起こる。これは、ヨウ素化合物（水性エタノール溶液中で生成物が可溶性のままであるためには有害であり得る）が可溶性にとどまり、従って沈殿で除去されるので有利である。これは、以前の方法、例えば、米国特許第４，９９０，５０２号の方法とは対照的であり、そこでは、時間のかかる方法である透析またはイオン交換を用いている。透析は、めったに行われない面倒な技術である。装置の衛生管理は、微生物汚染を防ぐために大規模でなければならない。
【００６５】
本発明のある態様では、化学的に改変されたヘパリンの多糖鎖の４〜１５％は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有する。
【００６６】
本発明のある態様では、化学的に改変されたヘパリンの多糖鎖の１０〜２５％は、少なくとも８ｋＤａの分子量を有する。
【００６７】
本発明のある態様では、化学的に改変されたヘパリンの多糖鎖の２２〜４５％は、少なくとも６ｋＤａの分子量を有する。
【００６８】
本発明のある態様では、化学的に改変されたヘパリンの多糖鎖の少なくとも７０％は、少なくとも３ｋＤａの分子量を有する。
【００６９】
本発明による工程段階を行うことによって、表Ｉに開示される分布内におさまる多糖分子量仕様を有する低抗凝固性ヘパリン。
【００７０】
【表１】
2018111825.tif 000006
【００７１】
重量平均分子量Ｍｗの対応する値は４．６〜６．９ｋＤａの範囲内におさまる。
【００７２】
本発明の一態様では、化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、その製造の工程段階の結果として、化学的に改変されたグルコサミン残基の制御された低い含量を有する。
【００７３】
本発明の一態様では、化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、天然のヘパリンの５．４２ｐｐｍのシグナルに対して４％未満の強度（％比）を有する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの５．０〜６．５の間のシグナルとして存在するグルコサミンを含む。
【００７４】
一態様では、改変されたグルコサミンシグナルのこのようなシグナルは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは６．１５ｐｐｍおよび５．９５ｐｐｍに存在する。
【００７５】
本発明の一態様では、グリコサミノグリカンは、総グルコサミン含量のうち１％未満の改変されたグルコサミンを含む。このような改変されたグルコサミンは、多糖鎖の非還元性の末端に位置してもよく、残基構造には、Ｃ４−Ｃ５二重結合を含んでもよい。このような改変されたグルコサミンは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは５．９５ｐｐｍおよび６．１５ｐｐｍのシグナルを生じ得る。
【００７６】
化学的に改変されたグルコサミンは、生成方法の工程の間に改変を受けやすいグルコースアミン残基から生じ、非特異的な脱重合で考察された現象およびグリコサミノグリカン生成物の予測できない特徴に寄与し得る。
【００７７】
これは本発明のある態様であり、非特異的な脱重合および化学的に改変されたグルコサミンの出現の両方を、不安定なグルコサミンを改変するように寄与する工程段階における薬剤へのグリコサミノグリカンの暴露を制御することによって、最小化する方法が提供される。
【００７８】
従って、本発明の方法は、多糖鎖の不安定なグルコサミンの予想されないかまたは正体不明の残基への改変を最小化するために寄与する。従って、本方法は、ＥＤＱＭ（欧州医薬品品質管理理事会）、欧州理事会、２０１２年（Ｈ−ＮＭＲ許容判定基準）によって示されたヘパリンについての現行の許容判定基準に適合し得る、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンに好適に近い生成物を生成するように寄与する。
【００７９】
この目的のために、本発明の方法の一態様は、グリコサミノグリカンを選択的に酸化するために用いられる酸化剤の効果を排除または最小化する工程を包含する。酸化剤が、過ヨウ素酸塩化合物である場合、排除工程は、還元型の酸化剤（ヨウ素化合物）を除去する工程を包含する。一態様では、酸化性のヨウ素含有化合物の効果を排除または最小化する工程は、酸化工程の終わりから還元工程の開始までの任意の酸化剤に対する暴露時間を制御する工程を包含し得る。
【００８０】
上記方法は、最適サイズ分布を有する多糖鎖の全体的な富化を生じ、それによって、所望の薬理学的特性を有し、有害特性が最小であり、バイオアベイラビリティが高く、ならびに取扱いおよび保管が安定である生成物を保証する。この方法は、適宜、完全な酸化を保証する条件を包含し、また有利なサイズ分布を有する鎖を生成し、これによって望ましい治療有効性を支持し、他の記載の低抗凝固性ヘパリン（ＬＡＨ）と比較して治療指数を改善すると考えられる。本発明は、一般論として、言及される方法で調製されたグリコサミノグリカン誘導体にも及ぶ。
【００８１】
別の態様では、本発明は、化学的に改変されたヘパリンまたはヘパラン硫酸であって、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子ＩＩａ活性、１０ＩＵ／ｍｇ未満という抗凝固因子Ｘａ活性、および約４．６〜約６．９ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有している改変されたヘパリンまたはヘパラン硫酸に関する。このような誘導体は、本発明による方法で生成可能である。本発明による化学的に改変されたヘパリンまたはヘパラン硫酸はさらに以下の点で特徴付けられる。
多糖鎖が、１．２ｋＤａと１２ｋＤａとの間の分子量に相当する２〜２０個（式Ｉにおけるｎ）の二糖単位を有する；
主に存在する二糖は（式Ｉ）
【００８２】
【化５】
2018111825.tif 000007
【００８３】
であって、
ここで、
【００８４】
【化６】
2018111825.tif 000008
【００８５】
であり、
ｎは、２〜２０の整数である。
【００８６】
主な二糖は、約６００Ｄａの分子量を有する。「主に」という用語は、この状況では、「最も高頻度に存在する」多糖鎖という意味を有する。
【００８７】
さらに、上記で開示される方法によって改変されたグリコサミノグリカンでは、多糖鎖は、対応する天然のグリコサミノグリカンの硫酸基の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、それよりさらに好ましくは本質的に全てを保持する。多糖鎖は、対応する天然のグリコサミノグリカンの鎖に比較した場合、抗凝固効果を媒介する化学的にインタクトな五糖配列を本質的に欠くということが別の特徴的な特徴である。
【００８８】
さらに、本発明による改変されたグリコサミノグリカンでは、主なサイズは、３．６〜７．２ｋＤａの分子量に相当する６〜１２個の二糖単位である。「主に」という用語は、この状況では、「最も高頻度に存在する」多糖鎖という意味を有する。
【００８９】
本発明の一態様では、化学的に改変されたグリコサミノグリカンは本質的には、インタクトな非硫酸化型イズロン酸および／またはグルクロン酸を含まない。本質的に含まないとは、この場合、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで検出不能であることを意味する。典型的には、検出限界は、０．１％に設定される。
【００９０】
改変されたグリコサミノグリカンが、ヘパリンに由来すること、ならびに鎖が本質的に、非硫酸化型イズロン酸および／または非硫酸化型グルクロン酸、好ましくはＤ−グルクロン酸を含まず、結果として、対応する天然のヘパリンの鎖に比較した場合、抗凝固効果を媒介する化学的にインタクトな五糖を欠くことも好ましい。
【００９１】
化学的に改変されたグリコサミノグリカンが、図１に開示されるように、還元性の末端代替物Ｒ’を有する鎖を含むことがさらに好ましい。この非還元性の末端は、主にはＧｌｃＮ、硫酸化グルコサミンである。
【００９２】
化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、３ｋＤａを超える分子量を有する少なくとも７０％の多糖鎖を有することも好ましい。多糖鎖の５％未満、好ましくは３％未満およびさらに好ましくは１％未満が１５ｋＤａを超える分子量を有することも好適である。
【００９３】
好ましくは、本発明の化学的に改変された硫酸化ヘパリンは、５℃で、リン酸緩衝水溶液として、少なくとも３６カ月間、好ましくは少なくとも４８カ月間、およびさらに好ましくは少なくとも６０カ月間にわたって安定である分子量平均を有する。この分子量平均は、２５℃の温度で少なくとも５年間粉末として保管した場合に安定なままである。さらに、安定性の特徴のさらなる詳細は、実施例２に見出すことができる。
【００９４】
本発明はまた、上記で開示された方法で生成された、化学的に改変されたグリコサミノグリカンにも関する。
【００９５】
本発明はさらに、言及された合併症の処置および好ましい治療形態に有用な薬学的組成物であって、治療上有効な量の記載された化学的に改変されたグリコサミノグリカンおよび治療上許容される担体を含んでいる薬学的組成物に関する。このような組成物は、非経口投与によって、例えば、皮下注射または静脈内注射によって全身投与され得る。この薬学的組成物はまた、経口投与によって与えられてもよい。非経口投与に関しては、活性化合物は、溶液または懸濁液中に組み込まれてもよく、またこれは、１つ以上のアジュバント、例えば、無菌の希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液およびオスモル濃度を調節するための薬剤も含む。非経口製剤は、アンプル、バイアル、使い捨てシリンジ中に、または注入装置として、自己投与のためにも送達できる。
【００９６】
本発明による改変されたグリコサミノグリカンは、皮下投与と、従って、注入器のような適当な自己投与器具とよく適合している。なぜなら、それらは、皮下デポからの再吸収に好適な分子量分布を有し、その点では、市販の低分子量ヘパリンと似ているからである。
【００９７】
さらに、好適な分子量分布に起因して、本発明による改変されたグリコサミノグリカンは、限定するものではないが、膣、直腸、子宮内および経鼻投与などの粘膜の浸透を含む局所投与に十分適している。
【００９８】
本発明はまた、抗凝固効果に依存しない医療処置での使用のための上記されたような化学的に改変されたグリコサミノグリカンにも関する。
【００９９】
本発明はさらに、抗凝固効果に依存しない医療処置のための医薬の製造のための本発明による化学的に改変されたグリコサミノグリカンの使用に関する。
【０１００】
このような医学処置の非限定的な例は、長期の陣痛（難産）、および例えば、ゴーハム・スタウト症候群でのタンパク質漏出の予防および処置である。内皮層または上皮層からのタンパク質漏出はまた、敗血症およびタンパク質喪失性腸症などの障害でも生じる。本発明による化学的に改変されたグリコサミノグリカンは、患者に治療上有効な量で投与される。
【０１０１】
ＬＭＷＨならびに低抗凝固性ヘパリンは、オキシトシン誘導性の子宮筋収縮を、インビトロおよび臨月の女性でインビボの両方で増強する。膣送達でサンプリングされたヒト子宮頸部生検由来の子宮頸部細胞培養物に対する本発明によるＬＭＷＨまたは低抗凝固性ヘパリンの添加は、インターロイキン−６および８の合成を増大する。この知見は、ＬＭＷＨおよび低抗凝固性ヘパリンが子宮頸管熟化を誘導することを支持する。従って、ＬＭＷＨおよび低抗凝固性ヘパリンは、他の臓器において証明されたその抗炎症性効果とは反対に子宮頸部では炎症性作用を有する。従って、本発明による化学的に改変されたＧＡＧは、長期の陣痛の予防および処置に有用であり得る。
【０１０２】
患者に対する低抗凝固性ヘパリンの投与は、タンパク質が細胞バリアを通過する能力を低下させ、それによって、内皮層または上皮層からのタンパク質漏出を処置または予防すると仮定された。上記のような低抗凝固性ヘパリンは、サイトカインおよび増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）のような因子に結合し、それによってこれらの因子の活性を調節するというさらなる仮説が立てられた。このような別の因子、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ、アズロシジン）は、内皮漏出に関与し、早期の敗血症の主要なマーカーであることが最近示唆された。ＨＢＰが、例えば、ゴーハム・スタウト症候群の病的な血管新生過程および血管漏出（ＨＢＰ）を伴う状態の両方に関与すると思われるという事実、ならびにヘパラン硫酸の損失が腸上皮にまたがるタンパク質の漏出をもたらし得るという事実を考慮すれば、本発明による低抗凝固性ヘパリンを、さらなる従来の治療と組み合わせて与えることは、有益であるということ、およびヘパリンがこの過程を遅らせるという仮説が立てられる（Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，２０１１年，第１００巻，ｐｐ．１４４８〜１４５３ページ）。
【０１０３】
要するに、本発明による化学的に改変されたグリコサミノグリカンのインビボ効果は、適当な分子量分布および強力なポリアニオン特性の組み合わせに由来する。本発明の過程は、ＧＭＰに従って最適化され、大規模化されて行われ、生成物をヒトに投与することが可能になった。
【０１０４】
本発明はここで、以下の非限定的な実施例にさらに記載する。
【実施例】
【０１０５】
本発明による化学的に改変されたヘパリンの製造過程の詳細な説明
該物質は、ヘパリンナトリウムから調製される。調製は、ＡＴに結合する五糖配列中のグルクロン酸成分を含めて、ヘパリン中の非硫酸化ウロン酸残基を、過ヨウ素酸により選択的に酸化することを含む。この残基の構造の破壊は、ＡＴとの高い親和性の相互作用を壊滅し、結果として抗凝固効果（ａ−ＦＸａまたはａ−ＦＩＩａとして測定）が本質的にとり除かれる。その後のアルカリ処理、β脱離反応は、過ヨウ素酸塩によって酸化された非硫酸化型ウロン酸の部位でのポリマーの切断を生じる。まとめると、これらの操作は、ヘパリン鎖の十分な脱重合をともなう抗凝固活性の損失をもたらす。
【０１０６】
さらに、切断部位で得られた還元性末端は、ＮａＢＨ４で還元され、これは、末端のアルデヒドを、より安定な対応するジオールに変換する。その後、添加物、不純物および副生成物は、エタノール、濾過および遠心分離で沈殿を繰り返すことによって除去される。その後に、この物質を減圧および加熱での乾燥によって粉末状で得る。この薬物を、静脈内投与または皮下投与を意図した薬物を得るために滅菌水性緩衝液に溶解する。
【０１０７】
いままで記載された過程は一般には、酸化、ポリマー切断（アルカリ加水分解）および還元の工程を包含する。本発明による過程は、ヘパリン鎖の任意の種類の非特異的な脱重合を中和または排除するように開発される。この状況での非特異的な重合化は、一般には特定のアルカリβ脱離反応に関連しない脱重合を意味する。非特異的な脱重合は、精製された生成物の保管の間、さらなる脱重合および変色を生じ得る生成物の構造的な不安定性を生じる。さらに、ヘパリンでは通常は見出されない、ＮＭＲスペクトルに現れる非定型種の出現に寄与し得る。
【０１０８】
以下の項で記載され例示されるプロセスは、非特異的な脱重合を中和または排除する種々の態様を包含する。
【０１０９】
実施例１
非硫酸化型グルクロン酸およびイズロン酸（残基）の酸化、ＡＴ結合五糖および抗凝固活性の欠失
約３０００グラムの量のヘパリンを、精製水に溶解して１０〜２０（ｗ／ｖ）％溶液を得る。この溶液のｐＨを４．５〜５．５に調節する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を引き続き、処理溶液に添加する（ヘパリンの重量の１５〜２５％の量の過ヨウ素酸塩）。このｐＨを再度４．５〜５．５に調節する。反応を光から保護する。処理溶液は、１３〜１７℃の温度を維持し、一定の撹拌をしながら１８〜２４時間反応させ、温度は最後の２時間の間に５℃に低下させる。
【０１１０】
酸化反応の終わり、およびヨード含有化合物の除去
エタノール（９５〜９９．５％）を０．５〜１時間にわたって、注意深く撹拌しながら、５〜２５℃の温度で反応混合物に添加する。添加すべきエタノールの体積は、処理溶液の１体積あたり１〜２体積の範囲のエタノールである。次いで、酸化されたヘパリンを１５〜２０時間沈殿および沈降させ、その後に母液を傾瀉して捨てる。
【０１１１】
次に、この沈降物を精製水に溶解して、１５〜３０（ｗ／ｖ）％の処理溶液を得る。ＮａＣｌを添加して、処理溶液中で０．１５〜０．３０モル／リットルの濃度を得る。５〜２５℃の温度を維持しながらさらに０．５〜１時間撹拌を続ける。引き続き処理溶液の１容積あたり１．０〜２．０体積のエタノール（９５〜９９．５％）を、この溶液に、０．５〜１時間撹拌しながら添加する。これによって溶液から生成物を沈殿させる。
【０１１２】
アルカリβ脱離過程による多糖鎖の脱重合
母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、約７リットルの水の中で、完全に溶解するまで撹拌し、ここでこの溶液の濃度は１５〜３０％である。温度を５〜２５℃で維持しながら、４ＭのＮａＯＨ溶液を、ｐＨが１０．５〜１２になるまでゆっくり添加する。その反応を、開始して、１５〜９５分間進行する。この時点で、溶液のｐＨを記録して、４ＭのＨＣｌを、５．５〜７のｐＨになるまでゆっくり添加する。
【０１１３】
還元性末端の還元
温度を１３〜１７℃に維持したまま、その溶液のｐＨを５．５〜６．５に調節する。次いで、ｐＨを１０〜１１に増大しながら、１３０〜１５０グラムの量の水素化ホウ素ナトリウムをこの溶液に添加し、この反応を１４〜２０時間続ける。この反応の終了後、希酸をゆっくり添加して、ｐＨを４に調節し、これによって残りの水素化ホウ素ナトリウムを分解する。ｐＨ４を４５〜６０分間維持した後、溶液のｐＨを、希ＮａＯＨ溶液を用いて７に調節する。
【０１１４】
実施例５によって精製を続ける。
【０１１５】
実施例２
グルクロン酸およびイズロン酸（残基）の酸化、抗凝固活性の欠失
約３０００グラムの量のヘパリンを、精製水に溶解して、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の溶液を得る。この溶液のｐＨを、４．５〜５．５に調節する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を引き続き、処理溶液に添加する（ヘパリンの重量の１５〜２５％の量の過ヨウ素酸塩）。このｐＨを再度、４．５〜５．５に調節する。この反応は光から保護する。処理溶液は、一定に撹拌し、かつ１３〜１７℃の温度を維持しながら２２〜２６時間反応させ、ただし温度は、最後の２時間の間に５℃に下げる。反応時間の終わりのｐＨを測定して記録する。
【０１１６】
酸化反応の終わりおよびヨード含有化合物の除去
エタノール（９５〜９９．５％）を、この反応混合物に０．５〜１時間にわたって、注意深く撹拌しながら、および５〜２５℃の温度で添加する。添加すべきエタノールの体積は、処理溶液の１体積あたり１〜２体積の範囲のエタノールである。次いで、酸化されたヘパリンを、１５〜２０時間、沈殿および沈降させて、その後に母液を傾瀉して捨てる。
【０１１７】
アルカリβ脱離過程による多糖鎖の脱重合
その母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、約７リットルの水の中で、視覚的に完全に溶解されるように見えるまで撹拌する。２０〜２５℃の温度を維持しながら、４ＭのＮａＯＨを、１０．５〜１２のｐＨが得られるまでゆっくり添加して、それによって開始した反応を１５〜９５分間進行させる。この時点で、この溶液のｐＨを記録して、４ＭのＨＣｌを、５．５〜７のｐＨが得られるまでゆっくり添加する。
【０１１８】
還元性末端の還元
その母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、精製水の添加によって、１５〜３０（ｗ／ｖ）％の処理溶液の濃度が得られるまで溶解する。温度を１３〜１７℃に維持しながら、この溶液のｐＨを５．５〜６．５に調節する。次いで、１３０〜１５０グラムの量の水素化ホウ素ナトリウムをこの溶液に添加して溶解し、ｐＨは直ちに１０〜１１のｐＨまで増大し、その反応を１４〜２０時間続ける。溶液のｐＨを、この反応時間の前後の両方で記録する。この反応時間後、希酸をゆっくり添加して、ｐＨを４の値に調節して、これによって、残りの水素化ホウ素ナトリウムを分解する。ｐＨ４を４５〜６０分間維持した後に、この溶液のｐＨを、希ＮａＯＨ溶液を用いて７に調節する。
【０１１９】
実施例５によって精製を続ける。
【０１２０】
実施例３
グルクロン酸およびイズロン酸（残基）の酸化、抗凝固活性の欠失
約３０００グラムの量のヘパリンを、精製水に溶解して、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の溶液を得る。この溶液のｐＨを、４．５〜５．５に調節する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を引き続き、処理溶液に添加する（ヘパリンの重量の１５〜２５％の量の過ヨウ素酸塩）。このｐＨを再度、４．５〜５．５に調節する。その反応器を光から保護する。処理溶液を、１３〜１７℃に温度を維持して一定に撹拌しながら１８〜２４時間反応させ、ただし温度は、最後の２時間の間に５℃までさげる。
【０１２１】
アルカリβ脱離過程による多糖鎖の脱重合
温度を５〜２５℃に維持したままで、４ＭのＮａＯＨ溶液を、１０．５〜１２のｐＨが得られるまでゆっくり添加する。この反応を開始して、１５〜９５分間進行させる。この時点で、この溶液のｐＨを記録して、４ＭのＨＣｌを、５．５〜７のｐＨが得られるまでゆっくり添加する。
【０１２２】
還元性末端の還元
温度を１３〜１７℃に維持したまま、この溶液のｐＨを５．５〜６．５に調節する。次いで、１３０〜２００グラムの量の水素化ホウ素ナトリウムをこの溶液に加え、一方でｐＨを１０〜１１まで上げて、その反応を１４〜２０時間続ける。この反応時間の後、希酸をゆっくり添加して、ｐＨを４の値まで調節し、これによって残りの水素化ホウ素ナトリウムを分解する。ｐＨ４を４５〜６０分間維持した後、この溶液のｐＨを、希ＮａＯＨ溶液を用いて７に調節する。
【０１２３】
還元された生成物の沈殿およびヨード含有化合物の初期の除去
エタノール（９５〜９９．５％）を、この反応混合物に、０．５〜１時間の期間にわたって、注意深く撹拌しながら、５〜２５℃の温度で添加する。添加すべきエタノールの体積は、処理溶液の１体積あたり１〜２体積の範囲のエタノールである。次いで酸化されたヘパリンを、１５〜２０時間沈殿させて沈降させ、その後に母液を傾瀉して捨てる。
【０１２４】
次に、その沈降物を、精製水に溶解して、１５〜３０（ｗ／ｖ）％の処理溶液を得る。ＮａＣｌを添加して、処理溶液中で０．１５〜０．３０モル／リットルの濃度を得る。
【０１２５】
実施例５によって精製を続ける。
【０１２６】
実施例４
グルクロン酸およびイズロン酸（残基）の酸化、抗凝固活性の欠失
約３０００グラムの量のヘパリンを精製水に溶解して、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の溶液を得る。この溶液のｐＨを、４．５〜５．５に調節する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を引き続き、処理溶液に添加する（ヘパリンの重量の１５〜２５％の過ヨウ素酸塩）。このｐＨを再度４．５〜５．５に調節する。その反応器を光から保護する。この処理溶液を、１３〜１７℃の温度を維持して一定に撹拌しながら１８〜２４時間反応させ、ただし温度は最後の２時間の間に５℃まで下げる。次に、グリセロールを添加してこの反応をクエンチし、すなわち、残留の過ヨウ素酸塩をヨウ素酸塩に変換し、１５０〜２００ｍｌの８５％グリセロール溶液を添加して、撹拌しながら３０〜６０分間反応させる。
【０１２７】
生成物の沈殿、ヨード含有化合物およびクエンチャー／反応生成物の除去
エタノール（９５〜９９．５％）を、この反応混合物に、０．５〜１時間にわたって、注意深く撹拌しながら、５〜２５℃の温度で添加する。添加すべきエタノールの容積は、１体積の処理溶液あたり１〜２体積の範囲のエタノールである。次いで、酸化されたヘパリンを、１５〜２０時間、沈殿および沈降させて、その後に、母液を傾瀉して捨てる。
【０１２８】
次に、その沈降物を、精製水に溶解して、１５〜３０（ｗ／ｖ）％の処理溶液を得る。ＮａＣｌを、添加して、０．１５〜０．３０モル／リットルの濃度を処理溶液中で得る。５〜２５℃の温度を維持したままで、さらに０．５〜１時間撹拌を続ける。引き続き、処理溶液の１体積あたり１．０〜２．０体積のエタノール（９５〜９９．５％）を、０．５〜１時間の間、撹拌しながらこの溶液に添加する。これによって、この溶液から生成物を沈殿させる。
【０１２９】
アルカリβ脱離過程による多糖鎖の脱重合
その母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、約７リットルの水の中で、視覚的に完全に溶解されるように見えるまで撹拌する。温度を５〜２５℃に維持したままで、４ＭのＮａＯＨを１０．５〜１２のｐＨが得られるまでゆっくり添加し、それによって開始した反応を６０〜９５分間進行させる。この時点で、この溶液のｐＨを、記録して、４ＭのＨＣｌを、５．５〜７のｐＨが得られるまでゆっくり添加する。
【０１３０】
還元性末端の還元
その母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、精製水の添加によって、１５〜３０（ｗ／ｖ）％の処理溶液の濃度が得られるまで溶解する。温度を１３〜１７℃に維持しながら、この溶液のｐＨを５．５〜６．５に調節する。次いで、１３０〜１５０グラムの量の水素化ホウ素ナトリウムをこの溶液に添加して、溶解し、ｐＨは直ちに、１０〜１１のｐＨまで増大し、その反応を１４〜２０時間続ける。溶液のｐＨを、この反応時間の前および後の両方で、記録する。この反応時間の後、希酸をゆっくり添加して、ｐＨを４の値に調節し、これによって残りの水素化ホウ素ナトリウムを分解する。ｐＨを４で４５〜６０分間維持した後、この溶液のｐＨを、希ＮａＯＨ溶液で７に調節する。
【０１３１】
実施例５によって精製を進める。
【０１３２】
実施例５
生成物の精製
処理添加物および不純物の除去、対イオンの添加、ならびに濾過
ホウ化水素によって末端を還元する最終の化学改変工程から生じる実施例１〜４による処理溶液を、下に概説する方法によって仕上げる。
【０１３３】
次いで、１体積の処理溶液を、１．５〜２．５体積のエタノール（９５〜９９．５％）に添加し、続いて＞２０００Ｇで、＜２０℃で、２０〜３０分間遠心分離し、その後に上清を傾瀉して捨てる。
【０１３４】
次いで、遠心分離によって得られた生成物ペーストを精製水に溶解して、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の生成物濃度を得る。次いで、ＮａＣｌを添加して、０．２０〜０．３５モル／リットルの濃度を得る。次に、１．５〜２．５体積のエタノール（９５〜９９．５％）を、処理溶液の１体積あたりに添加して、この溶液から生成物を沈殿させる。次に遠心分離を上記のとおり行う。次に、残りのペーストを精製水に加えて溶解する。生成物の濃度は、ここでは、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の範囲である。生成物溶液のｐＨは、ここで６．５〜７．５に調節する。次いで溶液を濾過して、粒子を除去する。次いで、処理溶液の１体積に、１．５〜２．５体積のエタノール（９５〜９９．５％）を添加する。遠心分離を、＞２０００Ｇで、＜２０℃で２０〜３０分間続けて、その後に上清を傾瀉して捨てる。
【０１３５】
沈殿物ペーストの脱水および粒径の低下
反応器に、体積約２リットルのエタノールを満たす。このエタノールを撹拌しながら、沈殿物ペーストを添加する。機械的撹拌によって、ペーストを固化し、存在する水をエタノールで置換して、均一な粒子懸濁液を得る。撹拌は１〜２時間後に中断して、その後に粒子を沈殿させる。過剰な液体の除去後に、粒子を、ふるいかミルにかけて、より小さくかつ均一な大きさの粒子を得る。
【０１３６】
生成物の乾燥
生成物をトレイの上に均一に広げて、真空キャビネットに入れる。真空をかけて、加熱を３５〜４０℃で行う。この時、窒素流を、乾燥機を通過させ、乾燥機では低圧を維持しておく。生成物が一定重量になったとき、すなわち、さらなる蒸発が見られなくなったとき、乾燥は完了とみなす。この生成物をパッキングして、湿気から保護する。
【０１３７】
実施例６
グルクロン酸およびイズロン酸（残基）の酸化、抗凝固活性の欠失
約３０００グラムの量のヘパリンを、精製水に溶解して、１０〜２０（ｗ／ｖ）％の溶液を得る。この溶液のｐＨを４．５〜５．５に調節する。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を引き続き、処理溶液に添加する（ヘパリンの重量の１５〜２５％の過ヨウ素酸塩）。このｐＨを再度、４．５〜５．５に調節する。この反応を光から保護する。この処理溶液を、１３〜１７℃の温度を維持しながら一定撹拌して１８〜２４時間反応させ、ただし、温度は、最後の２時間の間に５℃まで下げる。
【０１３８】
アルカリβ脱離過程による多糖鎖の脱重合
温度を５〜２５℃に維持しながら、４ＭのＮａＯＨを、１０．５〜１２のｐＨが得られるまでゆっくり添加し、それによって開始した反応を、１５〜９５分間進行させる。この時点で、この溶液のｐＨを記録して、４ＭのＨＣｌを、５．５〜７のｐＨが得られるまで、ゆっくり添加する。
【０１３９】
還元性末端の還元
その母液を傾瀉して捨てた後、その沈降物を、精製水の添加によって、処理溶液の１５〜３０（ｗ／ｖ）％の濃度が得られるまで溶解する。温度を１３〜１７℃に維持しながら、この溶液のｐＨを５．５〜６．５に調節する。次いで、１３０〜２００グラムの量の水素化ホウ素ナトリウムを、この溶液に添加して、溶解し、ｐＨは直ちに１０〜１１のｐＨまで上がり、その反応は、１４〜２０時間続ける。その溶液のｐＨを、この反応時間の前および後の両方で、記録する。この反応時間の後、希酸をゆっくり添加して、ｐＨを４の値に調節し、これによって、残りの水素化ホウ素ナトリウムを分解する。ｐＨ４を４５〜６０分間維持した後、この溶液のｐＨを、希ＮａＯＨ溶液を用いて７に調節する。精製水をここで、１５〜２０ｍＳ／ｃｍの伝導率が反応溶液から得られるまで溶液に添加する。
【０１４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーによる生成物の精製
直径５００ｍｍのカラムに媒体ＤＥＡＥセファロースまたはＱＡＥセファロースを、１０〜１５ｃｍの床高さに相当する２５〜３０リットルの容積まで詰める。クロマトグラフィーは、３〜４サイクルで行って全生成物を消費する。
【０１４１】
次の緩衝液を調製する。
平衡緩衝液（緩衝液Ａ）：１５ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ。
溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）：２ＭのＮａＣｌ溶液。
消毒緩衝液：０．５ＭのＮａＯＨ。
クロマトグラフィー工程は、１５〜２５℃で、≦２００ｃｍ／時間または約３５０リットル／時間の流速で行う。
【０１４２】
カラムを、溶出緩衝液が１５〜２０ｍＳ／ｃｍの伝導率になるまで平衡緩衝液で平衡化する。次に、酸化されたヘパリン溶液をカラム中にポンピングする。加えるべき粗生成物の量は、＜４０ｇ／クロマトグラフィー媒体リットルに相当する。
【０１４３】
次に定組成洗浄を平衡緩衝液で行い、ＵＶ２１０〜２５４ｎｍがベースラインに達した時に中断される。典型的には、ベースラインに達するには５倍床体積の緩衝液が必要である。過程に添加された化合物およびそれらから形成された生成物は除去される。
【０１４４】
次に、カラムに加えられる緩衝液のイオン強度は、勾配溶出を行うことによって直線的に増大される。緩衝液Ａは、１００％から０％まで低下し、５倍床体積をかけて１００％の緩衝液Ｂで置き換えられる。この生成物、溶出液は、ＵＶ吸光度が０．１ＡＵを超える場合に収集され、シグナルが０．１ＡＵ未満である時に停止される。次いで、カラムの消毒を行い、その後に、次のサイクルのクロマトグラフィーのために再度準備する。全てのサイクルからの溶出液をまとめて、１５〜２５℃で保管する。
【０１４５】
生成物の脱塩
以前の工程からのまとめた溶出液の１体積を３体積の９５〜９９．５％エタノール、１５〜２５℃に、一定に撹拌しながら追加する。これによって、生成物が溶液から沈殿する。この生成物は、３時間を超える間沈降させられる。次に、その沈降物を、１５〜２５％の濃度まで精製水に溶解する。この溶液をここで、冷エタノール（＜−５℃）９５〜９９．５％に添加し、典型的には、生成物溶液の１体積あたり５体積のエタノールが消費される。次に、＞２０００Ｇを超える連続方式での遠心分離を行い、その後に生成物ペーストを回収して、乾燥のために調製する。
【０１４６】
生成物の乾燥
生成物をトレイ上に均一に広げ、真空キャビネットに入れる。真空をかけて、加熱を３５〜４０℃で行う。この時、窒素流を、乾燥機を通過させ、乾燥機では低圧を維持しておく。生成物が一定重量になったとき、すなわち、さらなる蒸発が見られなくなったとき、乾燥は完了とみなす。この生成物を、粉砕して均一にし、その後にパッキングして、湿気から保護する。
【０１４７】
実施例８
実施例１および３によって生じる低抗凝固性ヘパリンを、１Ｈ−ＮＭＲ分析に供して、天然のヘパリンのスペクトルと比較した。
【０１４８】
表ＩＩは、非還元性の末端不飽和グルコサミンから生成された天然のヘパリンには存在しない５．００ｐｐｍ〜６．５０ｐｐｍの間のシグナルを示す。表ＩＩの結果、天然のヘパリンのスペクトルに存在すると予測されない化合物の存在を低レベルまで減らすことが可能であることが示される。比較して、ヘパリンの品質管理に適用可能な現行の限界（モノグラフ７、ＥＤＱＭ）は、５．７０〜８．００ｐｐｍの領域の任意のシグナルについて５．４２ｐｐｍのシグナルに比較して４％未満である。
【０１４９】
【表２】
2018111825.tif 000009
【０１５０】
さらに、非還元性の末端不飽和グルコサミンの存在はまた、組み合わせた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの評価（ＨＳＱＣ）によって定量して、総グルコサミンのモル％として示した（表ＩＩＩを参照のこと）。
【０１５１】
さらに、サンプルを、以前に記載のように（Ｇｕｅｒｒｉｎｉ  Ｍ．，Ｎａｇｇｉ  Ａ．，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ  Ｓ，Ｓａｎｔａｒｓｉｅｒｏ  Ｒ，Ｔｏｒｒｉ  Ｇ．，Ａｎａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５年，第３３７巻，３５〜４７ページを参照のこと）、プロトンおよび炭素ＮＭＲ分光法の組み合わせた使用（ＨＳＱＣ）を含むＮＭＲ二次元（２Ｄ）法によって分析した。
【０１５２】
表ＩＩＩは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける５．９５ｐｐｍおよび６．１５ｐｐｍのシグナルとして存在する低抗凝固性ヘパリンのグルコサミンの総量に比較した改変されたグルコサミンの画分（％）を示す。
【０１５３】
【表３】
2018111825.tif 000010
【０１５４】
実施例９
上記の実施例のうちの任意の１つによって製造された生成物は、１５０ｍｇ／ｍＬの活性生成物とＮａリン酸塩を１５ｍＭまで含んでいる溶液（ｐＨ６〜８）のような、従来の無菌的な過程による製剤として調製できる。そのようにして得られた製剤は、主に皮下投与を意図しているが、静脈内投与に適当である。
【０１５５】
得られた生成物は、４．６〜６．９ｋＤａという見積もられる平均分子量を有し、本質的には抗凝固活性を有さない、脱重合化型のヘパリンである。
【０１５６】
この生成物は、多糖体の多量体のサイズ分布を有し、１．２〜１５ｋＤａの分子量に相当する２〜２０のｎの範囲である。主なサイズは、３．６〜９．６ｋＤａの分子量に相当する６〜１６個の二糖単位である。
【０１５７】
分子量は、連続したＴＳＫ２０００およびＴＳＫ３０００ＳＷカラムで行われるＧＰＣ−ＨＰＬＣで決定された。屈折率を評価のために用いた。ＬＭＷＨの最初の国際較正物を用いた。
【０１５８】
以下は、分子量分布および総重量の累積パーセンテージの対応する部分を示す。
【０１５９】
【表４】
2018111825.tif 000011
【０１６０】
重量平均分子量Ｍｗの対応する値は、４．６〜６．９ｋＤａの範囲におさまる。
【０１６１】
実施例１０
本発明によって生成される化学的に改変されたＧＡＧの原体／（粉末）およびリン酸緩衝水溶液に溶解された製剤の安定性を研究した。結果を図２および図３に開示する。
【０１６２】
実施例１１
皮下投与
実施例１に開示の方法によって生成された、トリチウム標識した化学的に改変されたヘパリンを、スプラーグドーリーラットおよびイヌに投与した。
【０１６３】
結果：
ラットでは、１日あたり体重１ｋｇあたり２、８および２４ｍｇのヘパリン、そしてイヌでは１日あたり体重１ｋｇあたり３、１５および４５ｍｇのヘパリンの皮下投与後に、吸収は迅速であり、通常は、それぞれ、ラットおよびイヌにおいて０．５時間および１．５時間内に最大の血漿値に達した。皮下のバイオアベイラビリティは、ラットおよびイヌの両方で約９０％であった。興味深いことに、ヘパリンの各バイオアベイラビリティは約１０％である。
【０１６４】
本明細書では特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは、例示の目的で例として開示したに過ぎず、添付の特許請求の範囲の範囲に関して限定するものではない。具体的には、種々の置き換え、変更および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得ると発明者は考えている。
【図１】
2018111825.tif 000016
【図２】
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【図３】
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