(57)【要約】      （修正有）【課題】リフォールディングが不必要であり、なおかつ生産性と熱安定性が高い改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａ、ならびにその製造方法の提供。【解決手段】ヒトＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ３１９９４の４３番目から２１５番目まで）のアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該アミノ酸残基において、８２番目、９４番目、９８番目、１０４番目、１０５番目および１３９番目に相当する位置のアミノ酸置換が少なくとも１つ以上生じた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ。ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１２３１８−１の３４番目から２０６番目まで）のアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該アミノ酸残基において、７３番目、８５番目、８９番目、９５番目、９６番目および１３０番目に相当する位置のアミノ酸置換が少なくとも１つ以上生じた改良型組換えＦｃγＲＩＩａ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される何れかの改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（６）に記載のアミノ酸置換のうちいずれか１つ以上を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（２）配列番号１の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
（３）配列番号１の８４番目のセリンのトレオニンへの置換
（４）配列番号１の９０番目のアスパラギンのトレオニンへの置換
（５）配列番号１の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
（６）配列番号１の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
（ｉｉ）配列番号８８で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（７）から（１２）に記載のアミノ酸置換のうちいずれか１つ以上を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（７）配列番号８８の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（８）配列番号８８の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
（９）配列番号８８の８４番目のセリンのトレオニンへの置換
（１０）配列番号８８の９０番目のアスパラギンのトレオニンへの置換
（１１）配列番号８８の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
（１２）配列番号８８の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
（ｉｉｉ）上記（ｉ）または（ｉｉ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）〜（１２）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
【請求項２】
以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択される何れかの改良型組換えＦｃγＲＩＩである、請求項１に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）に記載のアミノ酸置換を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（ｖ）配列番号８８で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（７）に記載のアミノ酸置換を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（７）配列番号８８の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（ｖｉ）上記（ｉｖ）または（ｖ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）または（７）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
【請求項３】
以下の（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）から選択される何れかである、請求項１に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｖｉｉ）配列番号２から配列番号１１のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（ｖｉｉｉ）  ）配列番号８９で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（ｉｘ）上記（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）〜（１２）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した、改良型組換えＦｃγＲＩＩを生産可能な形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養することにより改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産する工程、得られた培養物から生産された改良型組換えＦｃγＲＩＩを回収する工程、の２つの工程を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩの製造方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
【請求項１０】
抗体を含む溶液を請求項９に記載の吸着剤を充填したカラムに添加し当該吸着剤に前記抗体を吸着させる工程、吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる工程、の２つの工程を含む、抗体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対し結合親和性を有するヒトＦｃγレセプター（以下、ＦｃγＲという）ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）およびＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に由来し、生産性および熱安定性を高めた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよび改良型組換えＦｃγＲＩＩａに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＦｃγＲは、抗原とＩｇＧとの結合物であるＩｇＧ免疫複合体に結合して細胞内にシグナル伝達を行なうレセプター群である（非特許文献１）。ヒトのＦｃγＲは、サブタイプに分類することができ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）が報告されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
ＩｇＧ免疫複合体とＦｃγＲの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域にＦｃγＲが結合することで起こる。個々のＦｃγＲ分子種は、ＩｇＧのＦｃ領域認識ドメインを有し、単一種の、または同じサブタイプに属するＩｇＧを認識する。これによって個々の免疫応答において、どのアクセサリー細胞が動員されるかが決定される（非特許文献１〜３）。ＦｃγＲの中でもＦｃγＲＩＩｂは細胞の活性化を抑制するシグナル伝達を行ない、細胞の活性化のシグナル伝達を行なう他のサブタイプのＦｃγＲとは異なる（非特許文献１〜３）。ＦｃγＲＩＩａは活性化型ＦｃγＲのうちの一つであり、マクロファージ、血小板、好中球、単球や樹状細胞などで発現される。ＦｃγＲＩＩｃは活性化型ＦｃγＲのうちの一つであり、ナチュラルキラー細胞などで発現される。
【０００４】
成熟したＦｃγＲのタンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域と結合する細胞外領域、細胞膜貫通領域、およびシグナル伝達に関わる細胞内領域から構成される。ＦｃγＲＩＩｂとＦｃγＲＩＩｃの細胞外領域のアミノ酸配列は同一である。また、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩｂの細胞外領域のアミノ酸配列は非常に相同性が高い。
【０００５】
ヒトＦｃγＲＩＩｂ由来の組換えタンパク質（以下、組換えＦｃγＲＩＩｂという）は、診断、医療、結晶構造解析、さらには抗体の分離や濃縮に使用するためのクロマトグラフィー材料などへの応用の可能性がある（特許文献１から４）。大腸菌宿主を用いた組換えＦｃγＲＩＩｂの調製に関して、これまでにいくつかの研究が行なわれているが、特許文献１から４では、大腸菌宿主で封入体（不溶性）として発現させた組換えＦｃγＲＩＩｂを、再生（リフォールディング）させる調製方法が報告されている。
【０００６】
ヒトＦｃγＲＩＩａ由来の組換えタンパク質（以下、組換えＦｃγＲＩＩａという）は、診断、医療、結晶構造解析、さらには抗体の分離や濃縮に使用するためのクロマトグラフィー材料などへの応用の可能性がある。大腸菌宿主を用いた組換えＦｃγＲＩＩａの調製に関して、これまでにいくつかの研究が行なわれており、非特許文献４および５では、大腸菌宿主で封入体（不溶性）として発現させた組換えＦｃγＲＩＩａを、再生（リフォールディング）させる調製方法が報告されている。
【０００７】
しかしながら、リフォールディングは一般的に複雑な操作が必要、操作に時間がかかる、効率が低いなどの課題がある（非特許文献６）。
【０００８】
また、組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａを産業応用するためには、使用や保存などの観点から組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａは各種条件（熱、酸性、アルカリ性など）に対して安定性が高いことが好ましい。しかしながら、これまでに組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａの安定性向上は行なわれていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特表２００５−５１５９８１号公報
【特許文献３】特開２０１１−１０５７１６号公報
【特許文献４】特開２０１２−１８８４５６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】高井俊行，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５
【非特許文献２】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７−４９２，１９９１
【非特許文献３】Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ，ＢＬＯＯＤ，１１９，５６４０−５６４９，２０１２
【非特許文献４】Ｐ．Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９，７３７−７４９，２００１
【非特許文献５】Ｓ．Ｔ．Ｊｕｎｇ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７，２１−３０，２０１０
【非特許文献６】Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ＆  Ｍ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４，２３５−２５１，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、リフォールディングが不必要であり、なおかつ生産性と熱安定性が高い改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａ、ならびにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討を行なった結果、組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａを構成するアミノ酸のうちの特定のアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換し、大腸菌宿主により可溶性として発現させることで、リフォールディングが不必要であり、なおかつ生産性と熱安定性が高い改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａを提供し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される何れかの改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（６）に記載のアミノ酸置換のうちいずれか１つ以上を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（２）配列番号１の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
（３）配列番号１の８４番目のセリンのトレオニンへの置換
（４）配列番号１の９０番目のアスパラギンのトレオニンへの置換
（５）配列番号１の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
（６）配列番号１の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
（ｉｉ）配列番号８８で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（７）から（１２）に記載のアミノ酸置換のうちいずれか１つ以上を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（７）配列番号８８の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（８）配列番号８８の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
（９）配列番号８８の８４番目のセリンのトレオニンへの置換
（１０）配列番号８８の９０番目のアスパラギンのトレオニンへの置換
（１１）配列番号８８の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
（１２）配列番号８８の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
（ｉｉｉ）上記（ｉ）または（ｉｉ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）〜（１２）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
［２］
以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択される何れかの改良型組換えＦｃγＲＩＩである、［１］に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）に記載のアミノ酸置換を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（１）配列番号１の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（ｖ）配列番号８８で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（７）に記載のアミノ酸置換を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（７）配列番号８８の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（ｖｉ）上記（ｉｖ）または（ｖ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）または（７）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
［３］
以下の（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）から選択される何れかである、［１］に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩ。
（ｖｉｉ）配列番号２から配列番号１１のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
（ｖｉｉｉ）  配列番号８９で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
（ｉｘ）上記（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩのアミノ酸配列において、前記（１）〜（１２）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩ
［４］  ［１］から［３］のいずれかに記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩをコードするＤＮＡ。
［５］  ［４］に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
［６］  ［５］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した、改良型組換えＦｃγＲＩＩを生産可能な形質転換体。
［７］  宿主が大腸菌である、［６］に記載の形質転換体。
［８］  ［６］または［７］に記載の形質転換体を培養することにより改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産する工程、得られた培養物から生産された改良型組換えＦｃγＲＩＩを回収する工程、の２つの工程を含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩの製造方法。
［９］  ［１］から［３］のいずれかに記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
［１０］  抗体を含む溶液を［９］に記載の吸着剤を充填したカラムに添加し当該吸着剤に前記抗体を吸着させる工程、吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる工程、の２つの工程を含む、抗体の分離方法。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
１．本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ
本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂについて以下に述べる。
【００１６】
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂは、（ａ）：配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記の置換（１）から置換（６）のうちいずれか１つ以上の置換を含む、または（ｂ）：上述の（ａ）のアミノ酸配列において置換（１）〜（６）により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるものである。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列について説明する。配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトＦｃγＲＩＩｂ（配列番号１２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ３１９９４）の細胞外領域に由来した組換えタンパク質（組換えＦｃγＲＩＩｂ）のアミノ酸配列である。配列番号１のＮ末端側１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列（ＭａｌＥシグナル配列）であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列はヒトＦｃγＲＩＩｂ（配列番号１２）の細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号１２に示すアミノ酸配列のＮ末端側４３番目のトレオニンから２１５番目のグルタミン）に由来する配列であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。
【００１８】
前記の置換（１）から置換（６）は、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの製造において、形質転換体による生産性（発現量）を高める効果がある。そのため、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性より高い。形質転換体による本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性をより高めるためには、前記の置換（１）から置換（６）の置換を複数有することが好ましく、すべてを有することがより好ましい。
【００１９】
さらに、前記の置換（１）から置換（６）は、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性を高める効果もある。そのため、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性より高い。本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性をより高めるためには、前記の置換（１）から置換（６）の置換を複数有することが好ましく、すべてを有することがより好ましい
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの好ましい例として、本願第２発明の改良型ＦｃγＲＩＩｂ、すなわち（ａ’）：配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記（１）の置換を少なくとも含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ、または（ｂ’）：上述（ａ’）の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列において、前記（１）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ、を挙げることができる。
【００２０】
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの他の好ましい例として、本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ、すなわち（ｃ）：
配列番号２（置換（３）を含む）、
配列番号３（置換（６）を含む）、
配列番号４（置換（１）を含む）、
配列番号５（置換（１）、置換（３）および置換（６）を含む）、
配列番号６（置換（１）、置換（３）、置換（５）および置換（６）を含む）、
配列番号７（置換（１）、置換（３）、置換（４）および置換（６）を含む）、
配列番号８（置換（１）、置換（２）、置換（３）および置換（６）を含む）、
配列番号９（置換（１）、置換（２）、置換（３）、置換（５）および置換（６）を含む）、
配列番号１０（置換（１）、置換（３）、置換（４）、置換（５）および置換（６）を含む）、ならびに
配列番号１１（置換（１）、置換（２）、置換（３）、置換（４）、置換（５）および置換（６）を含む）
のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ、または（ｄ）：上述（ｃ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列において、前記（１）〜（６）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ、を挙げることができる。
【００２１】
本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂは、そのＮ末端側に発現用宿主での可溶性発現を促すシグナル配列を有することが好ましい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列を有することが好ましい。大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列は、ＭａｌＥシグナル配列などの文献等（例えば、Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏｎ等，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，２３−２９，２０１０）で公知のものを使用すればよい。ただし、前記の置換（１）から置換（６）による熱安定性を高める効果のみを望む場合は、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂが、そのＮ末端側に発現用宿主での可溶性発現を促すシグナル配列を有することは必須ではない。
【００２２】
本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂは、そのＩｇＧ結合性が維持される限り、前記の置換（１）から置換（６）により置換された位置以外の領域に（言い換えれば、前記の置換（１）から置換（６）の置換を保持しつつ、更に加えて）、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列における大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列（場合によって隣接のリンカー配列も含む）に相当する部分をＰｅｌＢ、ＤｓｂＡまたはＴｏｒＴなどの他のシグナル配列（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏｎ等，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，２３−２９，２０１０）に置換してもよいし、当該ＭａｌＥシグナル配列に相当する部分を欠失させてもよい。また、例えば、配列番号１のアミノ酸配列におけるポリヒスチジン配列（場合によって隣接のリンカー配列も含む）に相当する部分を他の配列（例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、配列番号８６の２００番目のアルギニンから２０５番目のグリシンまでのアミノ酸残基からなるシステインタグなどのオリゴペプチド）に置換してもよいし、当該ポリヒスチジン配列に相当する部分を欠失させてもよい。さらに、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂにグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質などの他の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列を付加して融合タンパク質としてもよい。なお、配列番号１のアミノ酸配列における２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基に相当する部分の、前記の欠失、置換または付加されていてもよいアミノ酸残基数は、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。アミノ酸の欠失、置換または付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行なうことができる。
【００２３】
本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ等のＩｇＧ結合性は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法（例えば、下記のＥＬＩＳＡ方法１）や表面プラズモン共鳴法（Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１１３，３７１６−３７２５，２００９）などにより評価することができる。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ方法１について説明する。ＥＬＩＳＡ方法１ではＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ＩｇＧを固定化する（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌと２．６８ｍＭのＫＣｌと０．５％（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を各ウェルに添加し、ブロッキングを行なう（３０℃で２時）。洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で各ウェルを洗浄後、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを含有するサンプル溶液をウェルに添加し、固定化ＩｇＧと反応させる（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させる。反応後、洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２５】
以下、本願第４発明から本願第８発明について説明する。本願第４発明のＤＮＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用しヒトＦｃγＲＩＩｂまたは他のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩａやＦｃγＲＩＩｃなど）のｃＤＮＡ等をもとに改変して作製する方法、ヒトＦｃγＲＩＩｂまたは他のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩａやＦｃγＲＩＩｃなど）のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して作製する方法、そして例えば配列番号２から配列番号１１に記載のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、大腸菌を宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないいわゆるレアコドンであるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。ちなみに、コドンの使用頻度の解析は、例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１６年６月２１日）を利用することにより可能である。
【００２６】
ＤＮＡ増幅法を用いて本願第４発明のＤＮＡを作製する際は、エラープローンＰＣＲ法を用いた変異導入法を利用することができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＤＮＡに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ、好ましくは０．１から１ｍＭの濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことができる。
【００２７】
本願第４発明のＤＮＡとして、具体的に、
配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１３の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６および１７の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１８の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１９の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の塩基配列からなるＤＮＡ、
および配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列からなるＤＮＡ
を例示することができる。
【００２８】
本願第４発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換するには、本発明のＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドなどを基にしたベクター中の適切な位置に本願第４発明のＤＮＡを挿入して本願第５発明の組換えベクターとし、それを用いて形質転換したほうが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、組換えベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに本願第４発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。
【００２９】
本願第５発明において使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクターおよびｐＢＢＲベクター等が例示できる。また本願発明において使用するプロモータとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。
【００３０】
本願第６発明または本願第７発明の形質転換体は、本願第５発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。
【００３１】
本願第６発明において使用する宿主に特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（本願第７発明の態様）が好ましい。また本願第５発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよく、例えば、宿主として大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。なお、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体から適当な抽出方法または市販のキットなどを用いることで、本願第５発明の組換えベクターを抽出することができる。例えば宿主が大腸菌の場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いることができる。
【００３２】
本願第８発明は、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体を用いて本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを製造する方法であり、形質転換体を培養することで本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを生産する工程（以下、第１工程という）、得られた培養物から本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収する工程（以下、第２工程という）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
【００３３】
本願第８発明における第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合（すなわち本願第７発明の態様）では、必要な栄養源を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を使用することが好ましい。本願第５発明の組換えベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該組換えベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが好ましい。
【００３４】
培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加するが、さらに、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促すためにグリシンなどの試薬を添加してもよい。宿主が大腸菌である（本願第７発明の形質転換体を用いる）場合、添加するグリシン濃度はその増殖に影響を与えない範囲であればよく、好ましくは培地に対して１０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）である。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主が大腸菌である（本願第７発明の形質転換体を用いる）場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、製造しようとする本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすればよく、例えば宿主が大腸菌である（本願第７発明の形質転換体を用いる）場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であり、製造しようとする本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。
【００３５】
本願第５発明の組換えベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本願第１から本願第３発明が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。
【００３６】
本願第８発明における第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によって本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収する。例えば本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂが培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加するなどにより細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すればよい。
【００３７】
以上説明したように、本願第８発明により、宿主の培養物から本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを回収することができる。回収された本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂについて、更に高純度化する場合は、一般的に知られた精製方法を用いればよい。例えば、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製を挙げることができるが、その際にはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを複数種組み合わせて精製を行なうことがより好ましい。
【００３８】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩｂを不溶性担体に結合させることで、本願第９発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００３９】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩｂを不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。
【００４０】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００４１】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００４２】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００４３】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００４４】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩｂを不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００４５】
本願第９発明の吸着剤を用いて抗体を分離（本願第１０発明を実施）するには、例えば、本願第９発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本願第９発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ６から９である。本願第８発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本願第８発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本願第８発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【００４６】
２．本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ
本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａについて以下に述べる。
【００４７】
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａは、（ａ）：配列番号８８に示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記の置換（７）から置換（１２）のうちいずれか１つ以上の置換を含む、または（ｂ）：上述の（ａ）のアミノ酸配列において置換（７）〜（１２）により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる、ものである。
【００４８】
配列番号８８のアミノ酸配列について説明する。配列番号８８のアミノ酸配列は、ヒトＦｃγＲＩＩａ（配列番号９０、ＵｎｉＰｌｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１２３１８−１）の細胞外領域に由来した組換えタンパク質（組換えＦｃγＲＩＩａ）のアミノ酸配列である。配列番号８８のＮ末端側１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列（ＭａｌＥシグナル配列）であり、２７番目のメチオニンから２８番目のグリシンまでアミノ酸配列はリンカー配列であり、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列はヒトＦｃγＲＩＩａ（配列番号９０）の細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号９０に示すアミノ酸配列のＮ末端側３４番目のグルタミンから２０６番目のグルタミン）に由来する配列であり、２０２番目のグリシンから２０３番目のグリシンまでのアミノ酸配列はリンカー配列であり、２０４番目のヒスチジンから２０９番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。
【００４９】
なお、配列番号８８のアミノ酸配列の２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列と、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列の相同性は高く、わずか１２アミノ酸残基のみが相違する。具体的な相違箇所は図４に示す。ヒトＦｃγＲＩＩａとヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列の保存性は高い。
【００５０】
前記の置換（７）から置換（１２）は、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの製造において、形質転換体による生産性（発現量）を高める効果がある。そのため、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの生産性は、配列番号８８に示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩａの生産性より高い。形質転換体による本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの生産性をより高めるためには、前記の置換（７）から置換（１２）の置換を複数有することが好ましく、すべてを有することがより好ましい。
【００５１】
さらに、前記の置換（７）から置換（１２）は、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの熱安定性を高める効果もある。そのため、本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの熱安定性は、配列番号８８に示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩａの熱安定性より高い。本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの熱安定性をより高めるためには、前記の置換（７）から置換（１２）の置換を複数有することが好ましく、すべてを有することがより好ましい。
【００５２】
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの好ましい例として、本願第２発明の改良型ＦｃγＲＩＩａ、すなわち（ｖ）：配列番号８８で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記（７）に記載のアミノ酸置換を少なくとも含む、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ、または（ｖｉ）：上述（ｖ）の改良型組換えＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列において、前記（７）の置換により置換された位置以外の領域に１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧ結合性を有する改良型組換えＦｃγＲＩＩａ、を挙げることができる。
【００５３】
本願第１発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの他の好ましい例として、本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ、すなわち置換（７）、置換（８）、置換（９）、置換（１０）、置換（１１）および置換（１２）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩａである、配列番号８９で示されるアミノ酸配列のうち２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基を少なくとも含む改良型組換えＦｃγＲＩＩａ、を挙げることができる。
【００５４】
本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａは、そのＮ末端側に発現用宿主での可溶性発現を促すシグナル配列を有することが好ましい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列を有することが好ましい。大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナル配列は、ＭａｌＥシグナル配列などの文献等（例えば、Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏｎ等，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，２３−２９，２０１０）で公知のものを使用すればよい。ただし、前記の置換（７）から置換（１２）による熱安定性を高める効果のみを望む場合は、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａが、そのＮ末端側に発現用宿主での可溶性発現を促すシグナル配列を有することは必須ではない。
【００５５】
本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａは、そのＩｇＧ結合性が維持される限り、前記の置換（７）から置換（１２）により置換された位置以外の領域に（言い換えれば、前記の置換（７）から置換（１２）の置換を保持しつつ、更に加えて）、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。例えば、配列番号８８のアミノ酸配列における大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列（場合によって隣接のリンカー配列も含む）に相当する部分をＰｅｌＢ、ＤｓｂＡまたはＴｏｒＴなどの他のシグナル配列（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏｎ等，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，２３−２９，２０１０）に置換してもよいし、当該ＭａｌＥシグナル配列に相当する部分を欠失させてもよい。また、例えば、配列番号８８のアミノ酸配列におけるポリヒスチジン配列（場合によって隣接のリンカー配列も含む）に相当する部分を他の配列（例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、配列番号１７５の２００番目のアルギニンから２０５番目のグリシンまでのアミノ酸残基からなるシステインタグ、などのオリゴペプチドなど）に置換してもよいし、当該ポリヒスチジン配列に相当する部分を欠失させてもよい。さらに、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａにグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質などの他の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列を付加して融合タンパク質としてもよい。なお、配列番号８８のアミノ酸配列における２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基に相当する部分の、前記の欠失、置換または付加されていてもよいアミノ酸残基数は、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。アミノ酸の欠失、置換または付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行なうことができる。
【００５６】
本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ等のＩｇＧ結合性は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法（例えば、下記のＥＬＩＳＡ方法１）や表面プラズモン共鳴法（Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１１３，３７１６−３７２５，２００９）などにより評価することができる。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ方法１について説明する。ＥＬＩＳＡ方法１ではＩｇＧ（化学及血清療法研究所製）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ＩｇＧを固定化する（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌと２．６８ｍＭのＫＣｌと０．５％（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を各ウェルに添加し、ブロッキングを行なう（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で各ウェルを洗浄後、改良型組換えＦｃγＲＩＩａを含有するサンプル溶液をウェルに添加し、固定化ＩｇＧと反応させる（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させる。反応後、洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００５８】
以下、本願第４発明から本願第８発明について説明する。本願第４発明のＤＮＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用しＦｃγＲＩＩａまたは他のＦｃγＲ（ヒトＦｃγＲＩＩｂやＦｃγＲＩＩｃなど）のｃＤＮＡ等をもとに改変して作製する方法、ヒトＦｃγＲＩＩａまたは他のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩｂやＦｃγＲＩＩｃなど）のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して作製する方法、そして例えば配列番号８９に記載のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａの生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、大腸菌を宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないいわゆるレアコドンであるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。ちなみに、コドンの使用頻度の解析は、例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１６年６月２１日）を利用することにより可能である。
【００５９】
ＤＮＡ増幅法を用いて本願第４発明のＤＮＡを作製する際は、エラープローンＰＣＲ法を用いた変異導入法を利用することができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＤＮＡに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ、好ましくは０．１から１ｍＭの濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことができる。
【００６０】
本願第４発明のＤＮＡとして、具体的に、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする配列番号９１の塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【００６１】
本願第４発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換するには、本発明のＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドなどを基にしたベクター中の適切な位置に本願第４発明のＤＮＡを挿入して本願第５発明の組換えベクターとし、それを用いて形質転換したほうが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、組換えベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに本願第４発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。
【００６２】
本願第５発明において使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクターおよびｐＢＢＲベクター等が例示できる。また本願発明において使用するプロモータとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。
【００６３】
本願第６発明または本願第７発明の形質転換体は、本願第５発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。
【００６４】
本願第６発明において使用する宿主に特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（本願第７発明の態様）が好ましい。また本願第４発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよく、例えば、宿主として大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。なお、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体から適当な抽出方法または市販のキットなどを用いることで、本願第５発明の組換えベクターを抽出することができる。例えば宿主が大腸菌の場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いることができる。
【００６５】
本願第８発明は、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体を用いて本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを製造する方法であり、形質転換体を培養することで本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを生産する工程（以下、第１工程という）、得られた培養物から本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを回収する工程（以下、第２工程という）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
【００６６】
本願第８発明における第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合（すなわち本願第７発明の態様）では、必要な栄養源を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を使用することが好ましい。本願第５発明の組換えベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該組換えベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが好ましい。
【００６７】
培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加するが、さらに、本願第６発明または本願第７発明の形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促すためにグリシンなどの試薬を添加してもよい。宿主が大腸菌である（本願第７発明の形質転換体を用いる）場合、添加するグリシン濃度はその増殖に影響を与えない範囲であればよく、好ましくは培地に対して１０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）である。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、製造しようとする本願第１発明から本願第３発明の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすればよく、例えば宿主が大腸菌である（本願第７発明の形質転換体を用いる）場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であり、製造しようとする本願第１発明から本願第３発明の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。
【００６８】
本願第５発明の組換えベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本願第１発明から本願第３発明が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。
【００６９】
本願第８発明における第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によって本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを回収する。例えば本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａが培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本願
第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞
集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加するなどにより細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すればよい。
【００７０】
以上説明したように、本願第８発明により、宿主の培養物から本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを回収することができる。回収された本願第１発明から本願第３発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａについて、更に高純度化する場合は、一般的に知られた精製方法を用いればよい。例えば、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製を挙げることができるが、その際にはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを複数種組み合わせて精製を行なうことがより好ましい。
【００７１】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩａを不溶性担体に結合させることで、本願第９発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００７２】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩａを不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。
【００７３】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。
【００７４】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］）シクロヘキサンー１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００７５】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００７６】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００７７】
本願第１発明から本願第３発明の改良型ＦｃγＲＩＩａを不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００７８】
本願第９発明の吸着剤を用いて抗体を分離（本願第１０発明を実施）するには、例えば、本願第９発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本願第９発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ６から９である。本願第９発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本願第９発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本願第９発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【発明の効果】
【００７９】
大腸菌宿主により可溶性として発現されることでリフォールディングが不必要であり、なおかつ生産性と熱安定性が高い改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよび改良型ＦｃγＲＩＩａ、ならびにそれらの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性を評価した図である。
【図２】本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを固定化したゲルを充填したカラムにより各抗体を分離した結果を示すクロマトグラムである。
【図３】本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩａを固定化したゲルを充填したカラムにより各抗体を分離した結果を示すクロマトグラム。
【図４】配列番号１のアミノ酸配列の２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列と、配列番号８８のアミノ酸配列の２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸配列との相違を示す図。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明の実施の形態について、実施例および比較例等を用いて詳細に説明するが、これら例は本発明の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００８２】
実施例１  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（３）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３（配列番号２のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１３）を含むＤＮＡを、下記（（１−１）から（１−３））に示すように、まずヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列から塩基配列へ変換し、次に該塩基配列を含むＤＮＡを作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法およびエラープローンＰＣＲ法の二段階）を利用し改変して作製した。
【００８３】
（１−１）ヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列から塩基配列への変換および該塩基配列を含むＤＮＡ作製
ヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列（配列番号１２）を基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３頁，２００２年）を用いてコドンを大腸菌型に変換し、配列番号２４に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計した。
【００８４】
配列番号２５から配列番号６６に示す４２種類のオリゴヌクレオチドを使用した二段階のＰＣＲにより、配列番号２４に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製した。
【００８５】
一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。なお、表１のＤＮＡ  ｍｉｘとは、配列番号２５から配列番号６６に示す４２種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００８６】
【表１】
2018050616.tif 000003
【００８７】
二段階目のＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。
【００８８】
【表２】
2018050616.tif 000004
【００８９】
二段階目のＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した（以下、同様の方法での精製をＤＮＡ断片精製と略記する）。精製したＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化し（ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社）、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターにライゲーションにより連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することでベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを調製した。
【００９０】
（１−２）ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法）を利用した改変
鋳型ＤＮＡとして前記のベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６７および配列番号６８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で５分の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分処理後に４℃に冷却することで実施した。得られたＰＣＲ産物をｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１と命名した。
【００９１】
【表３】
2018050616.tif 000005
【００９２】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製した。この制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ産物ｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクター（ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターはＨａｔａｙａｍａ＆Ｉｄｅが報告した方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１１１，１−８，２０１５）で作製）へライゲーションにより連結することで組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを作製し、これを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂと命名した。
【００９３】
形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを調製した。
【００９４】
組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂのうち、制限酵素ＸｂａＩ認識配列からＨｉｎｄＩＩＩ認識配列までのＤＮＡの塩基配列を配列番号６９に示す。配列番号６９の５’末端側から５０番目のアデニンから６７６番目のチミンは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂをコードする。
【００９５】
（１−３）ＤＮＡ増幅法（エラープローンＰＣＲ法）を利用した改変
エラープローンＰＣＲ法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡにランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。得られたＰＣＲ産物（改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡが含まれる）をＥＰと命名した。
【００９６】
【表４】
2018050616.tif 000006
【００９７】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。
【００９８】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
前記のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードするＤＮＡ（配列番号１３）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ａ４Ｆ３とする）を選抜し、取得した。すなわち、前記の形質転換体の各コロニー（約１８００）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。
【００９９】
培養後、２０μＬの培養液を６００μＬのＬＢ培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。培養後、遠心操作により得られる培養上清をサンプル溶液とした。
【０１００】
次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて５倍希釈した各サンプル溶液について、それに含まれる可溶性の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの量を前記のＥＬＩＳＡ方法１の測定値により評価した。このＥＬＩＳＡ方法１による評価結果から、形質転換体ａ４Ｆ３を選抜し、取得した。
【０１０１】
形質転換体ａ４Ｆ３からの組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３の抽出、ならびに改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は以下に記す組換えベクター抽出方法および配列解析方法をそれぞれ用いて行なった。
【０１０２】
組換えベクター抽出方法：形質転換体を培養し（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地、３７℃で一晩、好気的）、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて組換えベクターを抽出した。
【０１０３】
配列解析方法：組換えベクターのうち、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて塩基配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号７０または配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【０１０４】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の製造
形質転換体ａ４Ｆ３を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬに接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、０．０１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２０ｍＬに前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２０℃で２４時間、好気的に振とう培養し、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３を生産させた。
【０１０５】
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、培養液から遠心分離により集菌した菌体から改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３を含む可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の濃度測定は、以下に記すＥＬＩＳＡ方法２により行なった。可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の濃度を基に計算した結果、培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の生産性は１．０±０．１ｍｇ（ｎ＝２、可溶性タンパク質抽出液の回収および測定を２連で実施）であった。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡ方法２：抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体（Ａｎｔｉ−ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（１９０７１０））（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＢＡＭ１８７５１）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌと２．６８ｍＭのＫＣｌと０．５％（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎとを含む）を各ウェルに添加し、ブロッキングを行なった（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で各ウェルを洗浄後、調製した可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で段階希釈し、それらをウェルに添加して固定化抗ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ抗体と反応させた（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度の糖鎖付組換えＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ／ｃ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ  ＜ＦｃγＲＩＩＢ／Ｃ＞）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号１８７５−ＣＤ−０５０）の測定結果を基準として、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの濃度を決定した。
【０１０７】
実施例２  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２（配列番号３のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１４）を含むＤＮＡは、実施例１の（１）に記載の方法と同様の方法で作製した（ＰＣＲ産物ＥＰには改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２をコードする塩基配列を含むＤＮＡが含まれる）。
【０１０８】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
実施例１の（１−３）に記載のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２をコードするＤＮＡ（配列番号１４）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ａ２Ｅ２とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ａ２Ｅ２とする）を選抜し、取得した。この選抜の方法は、実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法で行なった。形質転換体ａ２Ｅ２からの組換えベクターｐＥＴ−ａ２Ｅ２の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１０９】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ａ２Ｅ２を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２の生産性は１．３±０．０ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１１０】
実施例３  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６（配列番号４のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１５）を含むＤＮＡは、実施例１の（１）に記載の方法と同様の方法で作製した（ＰＣＲ産物ＥＰには改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６をコードする塩基配列を含むＤＮＡが含まれる）。
【０１１１】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
実施例１の（１−３）に記載のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６をコードするＤＮＡ（配列番号１５）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ａ１５Ａ６とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ａ１５Ａ６とする）を選抜し、取得した。この選抜の方法は、実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法で行なった。形質転換体ａ１５Ａ６からの組換えベクターｐＥＴ−ａ１５Ａ６の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１１２】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ａ１５Ａ６を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６の生産性は１．７±０．０ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１１３】
実施例４  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（３）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３（配列番号５のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１６）を含むＤＮＡは、下記のように作製した。
【０１１４】
鋳型ＤＮＡとして実施例１の（１−２）に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ１と命名した。
【０１１５】
【表５】
2018050616.tif 000007
【０１１６】
鋳型ＤＮＡとして実施例１の（２）に記載の組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７３および配列番号７４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ２と命名した。
【０１１７】
鋳型ＤＮＡとして実施例１の（１−２）に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７５および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ３と命名した。
【０１１８】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３ｐ１、ｍ３ｐ２およびｍ３ｐ３を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ４と命名した。
【０１１９】
【表６】
2018050616.tif 000008
【０１２０】
【表７】
2018050616.tif 000009
【０１２１】
ＰＣＲ産物ｍ３ｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードする塩基配列（配列番号１６）を含むＤＮＡを得た。
【０１２２】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３とする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ３と命名した。
【０１２３】
形質転換体ｍ３からの組換えベクターｐＥＴ−ｍ３の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１２４】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｍ３を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の生産性は２．３±０．２ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１２５】
実施例５  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（３）、置換（５）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５（配列番号６のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１８）を含むＤＮＡは、下記（（１−１）と（１−２））に示すように改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードするＤＮＡを基にＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法およびエラープローンＰＣＲ法の二段階）を利用し改変して作製した。
【０１２６】
（１−１）ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法）を利用した改変
改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３のアミノ酸配列の一部（配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端側１０７番目セリンから１０９番目プロリンまで）をコードするＤＮＡ領域に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を設ける改変を行なった。
【０１２７】
鋳型ＤＮＡとして実施例４に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ１と命名した。
【０１２８】
鋳型ＤＮＡとして実施例４に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７７および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ２と命名した。
【０１２９】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３（Ｂ）ｐ１およびｍ３（Ｂ）ｐ２を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ３と命名した。
【０１３０】
ＰＣＲ産物ｍ３（Ｂ）ｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。
【０１３１】
得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を有し、かつ実施例４に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３と同一のアミノ酸配列をコードした塩基配列（配列番号１７）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）とする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ３（Ｂ）と命名した。
【０１３２】
形質転換体ｍ３（Ｂ）からの組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１３３】
（１−２）ＤＮＡ増幅法（エラープローンＰＣＲ法）を利用した改変
エラープローンＰＣＲ法を用いて、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１７）にランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。得られたＰＣＲ産物（改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５をコードする塩基配列を含むＤＮＡも含まれる）をＥＰｍ３（Ｂ）と命名した。
【０１３４】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰｍ３（Ｂ）を、制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。
【０１３５】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
前記のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５をコードするＤＮＡ（配列番号１８）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｄ１０Ｄ５とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ｄ１０Ｄ５とする）を選抜し、取得した。すなわち、前記の形質転換体の各コロニー（約１６００）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。培養後、２０μＬの培養液を６００μＬのＬＢ培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。培養後、遠心操作により得られる培養上清をサンプル溶液とした。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて５倍希釈した各サンプル溶液について、それに含まれる可溶性の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの量を前記のＥＬＩＳＡ方法１の測定値により評価した。このＥＬＩＳＡ方法１による評価結果から、形質転換体ｄ１０Ｄ５を選抜し、取得した。形質転換体ｄ１０Ｄ５からの組換えベクターｐＥＴ−ｄ１０Ｄ５の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１３６】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｄ１０Ｄ５を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５の生産性は２．５±０．１ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１３７】
実施例６  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（３）、置換（４）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７（配列番号７のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号１９）を含むＤＮＡは、実施例５の（１）に記載の方法と同様の方法で作製した（ＰＣＲ産物ＥＰｍ３（Ｂ）には改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７をコードする塩基配列を含むＤＮＡが含まれる）。
【０１３８】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
実施例５の（１−２）に記載のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７をコードするＤＮＡ（配列番号１９）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｄ１１Ｄ７とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ｄ１１Ｄ７とする）を選抜し、取得した。この選抜の方法は、実施例５の（２）に記載の方法と同様の方法で行なった。形質転換体ｄ１１Ｄ７からの組換えベクターｐＥＴ−ｄ１１Ｄ７の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１３９】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｄ１１Ｄ７を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７の生産性は３．０±０．３ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１４０】
実施例７  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（２）、置換（３）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２（配列番号８のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号２０）を含むＤＮＡは、実施例５の（１）に記載の方法と同様の方法で作製した（ＰＣＲ産物ＥＰｍ３（Ｂ）には改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２をコードする塩基配列を含むＤＮＡが含まれる）。
【０１４１】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有する形質転換体の取得
実施例５の（１−２）に記載のコロニー形成させた形質転換体から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２をコードするＤＮＡ（配列番号２０）を含む組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｄ６Ｅ２とする）により形質転換された形質転換体（以下、形質転換体ｄ６Ｅ２とする）を選抜し、取得した。この選抜の方法は、実施例５の（２）に記載の方法と同様の方法で行なった。形質転換体ｄ６Ｅ２からの組換えベクターｐＥＴ−ｄ６Ｅ２の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１４２】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２の製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｄ６Ｅ２を用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２の製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２の生産性は３．４±０．０ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１４３】
実施例８  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂの作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（２）、置換（３）、置換（５）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂ（配列番号９のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号２１）を含むＤＮＡは、下記のように作製した。
【０１４４】
鋳型ＤＮＡとして実施例５に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｄ１０Ｄ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐ１と命名した。
【０１４５】
鋳型ＤＮＡとして実施例５に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｄ１０Ｄ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７９および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐ２と命名した。
【０１４６】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ５ｂｐ１とｍ５ｂｐ２を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、当該反応液を表７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐ３と命名した。
【０１４７】
ＰＣＲ産物ｍ５ｂｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０１４８】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｂとする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｂを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ５ｂと命名した。
【０１４９】
形質転換体ｍ５ｂからの組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｂの抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂをコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１５０】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂの製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｍ５ｂを用いた改良型
組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂの製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂの生産性は３．０±０．９ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１５１】
実施例９  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃの作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（１）、置換（３）、置換（４）、置換（５）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃ（配列番号１０のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号２２）を含むＤＮＡは、下記のように作製した。
【０１５２】
鋳型ＤＮＡとして実施例５の（１−１）に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号８０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ１と命名した。
【０１５３】
鋳型ＤＮＡとして実施例５の（１−１）に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８１および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ２と命名した。
【０１５４】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ１とｍ５ｃｐ２を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ３と命名した。
【０１５５】
ＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０１５６】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｃとする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｃを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ５ｃと命名した。
【０１５７】
形質転換体ｍ５ｃからの組換えベクターｐＥＴ−ｍ５ｃの抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１５８】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃの製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｍ５ｃを用いた改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃの製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃの生産性は３．５±０．６ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１５９】
実施例１０  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂの作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製  前記の置換（１）、置換（２）、置換（３）、置換（４）、置換（５）および置換（６）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ（配列番号１１のアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号２３）を含むＤＮＡは、下記の方法で作製した。
【０１６０】
鋳型ＤＮＡとして実施例９の（１）に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７０および配列番号７８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ１と命名した。
【０１６１】
鋳型ＤＮＡとして実施例９の（１）に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃをコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７９および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ２と命名した。
【０１６２】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ６ｂｐ１とｍ６ｂｐ２を混合後、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ３と命名した。
【０１６３】
ＰＣＲ産物ｍ６ｂｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号７０および配列番号７１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０１６４】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂとする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ６ｂと命名した。
【０１６５】
形質転換体ｍ６ｂからの組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１の（２）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０１６６】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂの製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｍ６ｂを用いた改良型
組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂの製造を行なった。培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂの生産性は４．１±０．４ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１６７】
実施例１１  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのＩｇＧ結合性
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２および改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６のＩｇＧ結合性
実施例１に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３、実施例２に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２および実施例３に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６についてＩｇＧ結合性の評価を行なった。
【０１６８】
ＩｇＧ結合性の評価は、前記のＥＬＩＳＡ方法１を利用して行なった。具体的には、前記のＥＬＩＳＡ方法１どおりのＩｇＧ固定化ありの条件と、前記のＥＬＩＳＡ方法１からＩｇＧ固定化操作を行なわない変更をしたＩｇＧ固定化無しの条件の２条件で実験を行なった（各２連で実験を行なった）。実験では、実施例１から実施例３に記載の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈したものをサンプルとして用いた。
【０１６９】
対照として、ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターで大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を形質転換した形質転換体を用いて実施例１の（３）に記載の培養方法と可溶性タンパク質抽出液の調製方法により調製した可溶性タンパク質抽出液（以下、サンプルＭａｌＥ２１とする）と５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、サンプル緩衝液とする）を用いて同様の実験を行なった。
【０１７０】
各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのＩｇＧ結合性の評価結果を表８に示す。表８に示すように、各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのサンプルを用いて前記のＥＬＩＳＡ方法１（ＩｇＧ固定化ありの条件）の実験を行なった場合でのみ高い検出値が得られた。この結果から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２および改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６はＩｇＧ結合性を有することが確認された。
【０１７１】
【表８】
2018050616.tif 000010
【０１７２】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３のＩｇＧ結合性
実施例４に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３についてＩｇＧ結合性の評価を行なった。ＩｇＧ結合性の評価は、前記の方法と同様に行なった。ＩｇＧ結合性の評価では、実施例４に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３を含む可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈したものをサンプルとして用いた。対照として、前記のサンプル緩衝液を用いて同様の実験を行なった。
【０１７３】
ＩｇＧ結合性の評価結果を表９に示す。表９に示すように、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３のサンプルを用いて前記のＥＬＩＳＡ方法１（ＩｇＧ固定化ありの条件）を行なった場合でのみ高い検出値が得られた。この結果から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３はＩｇＧ結合性を有することが確認された。
【０１７４】
【表９】
2018050616.tif 000011
【０１７５】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７および改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２のＩｇＧ結合性
実施例５に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５、実施例６に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７および実施例７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２についてＩｇＧ結合性の評価を行なった。ＩｇＧ結合性の評価は、前記の方法と同様に行なった。ＩｇＧ結合性の評価では、実施例５から実施例７に記載の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈したものをサンプルとして用いた。対照として、前記のサンプル緩衝液を用いて同様の実験を行なった。
【０１７６】
ＩｇＧ結合性の評価結果を表１０に示す。表１０に示すように、各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのサンプルを用いて前記のＥＬＩＳＡ方法１（ＩｇＧ固定化ありの条件）を行なった場合でのみ高い検出値が得られた。この結果から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７および改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２はＩｇＧ結合性を有することが確認された。
【０１７７】
【表１０】
2018050616.tif 000012
【０１７８】
（４）改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂ、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃおよび改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂのＩｇＧ結合性
実施例８に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂ、実施例９に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃおよび実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂについてＩｇＧ結合性の評価を行なった。ＩｇＧ結合性の評価は、前記の方法と同様に行なった。ＩｇＧ結合性の評価では、実施例８から実施例１０に記載の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈したものをサンプルとして用いた。対照として、前記のサンプル緩衝液を用いて同様の実験を行なった。ＩｇＧ結合性の評価結果を表１１に示す。表１１に示すように、各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂのサンプルを用いて前記のＥＬＩＳＡ方法１（ＩｇＧ固定化ありの条件）を行なった場合でのみ高い検出値が得られた。この結果から、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂ、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃおよび改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂはＩｇＧ結合性を有することが確認された。
【０１７９】
【表１１】
2018050616.tif 000013
【０１８０】
実施例１２  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性
実施例１に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３、実施例２に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ２Ｅ２、実施例３に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ１５Ａ６、実施例４に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３、実施例５に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１０Ｄ５、実施例６に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ１１Ｄ７、実施例７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｄ６Ｅ２、実施例８に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｂ、実施例９に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ５ｃおよび実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂについて熱安定性の評価を行なった。
【０１８１】
熱安定性の評価では、実施例１から実施例１０に記載の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた。各サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００倍希釈し、４℃で３０分間の処理、５５℃で３０分間の熱処理、または６０℃で３０分間の熱処理を行なった。各処理後のサンプルの改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ濃度を実施例１の（３）に記載のＥＬＩＳＡ方法２により測定した。各サンプルについて、４℃で３０分間の処理の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ濃度を１００％として、５５℃で３０分間の熱処理と６０℃で３０分間の熱処理の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ濃度の割合をそれぞれ算出し、熱処理後の検出率（％）とした。実験は２連で行なった。
【０１８２】
各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性の評価結果を図１に示す。図１に示すように熱安定性（熱処理後の検出率）は、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂが最も高く、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂに存在する前記の置換（１）から置換（６）の数が多いほどその熱安定性が向上する傾向があることがわかる。
【０１８３】
比較例１  組換えＦｃγＲＩＩｂの作製
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの作製を行なった。
【０１８４】
（１）組換えＦｃγＲＩＩｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂおよび形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂの作製
実施例１の（１−１）と（１−２）に記載の方法により、組換えＦｃγＲＩＩｂ（配列番号１）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂおよび形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂを作製した。
【０１８５】
（２）組換えＦｃγＲＩＩｂの製造
実施例１の（３）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂを用いた組換えＦｃγＲＩＩの製造を行なった。培養液１Ｌあたりの組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性は０．８±０．０ｍｇ（ｎ＝２）であった。
【０１８６】
比較例１に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性および実施例１から実施例１０に記載の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの生産性を表１２にまとめて示す。表１２に示すように、実施例１から実施例１０の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂはいずれも組換えＦｃγＲＩＩｂ（比較例１）よりも生産性が高いことがわかる。また、表１２に示すように、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂに存在する前記の置換（１）から置換（６）の数が多いほどその生産性が向上する傾向があることがわかる。さらに、置換（１）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ（実施例４から実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ）は、比較例１の組換えＦｃγＲＩＩｂと比較して、いずれも生産性が２倍以上向上していることから、置換（１）は生産性の向上に特に有用であることがわかる。
【０１８７】
【表１２】
2018050616.tif 000014
【０１８８】
比較例２  組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性
比較例１に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂについて熱安定性の評価を行なった。熱安定性の評価では、比較例１に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた。実験は実施例１２に記載の方法と同様の方法で行なった。
【０１８９】
組換えＦｃγＲＩＩｂの熱安定性の評価結果を図１に示す。図１に示すように、実施例１から実施例１０の各改良型組換えＦｃγＲＩＩｂはいずれも組換えＦｃγＲＩＩｂ（比較例２）よりも熱安定性（熱処理後の検出率）が高いことがわかる。
【０１９０】
実施例１３  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの酸安定性
実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂについて酸安定性の評価を行なった。実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂを含む可溶性タンパク質抽出液のサンプル溶液を３０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈したサンプル溶液１００μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）２００μＬとを混合し、３０℃でそれぞれ２４時間、４８時間、７２時間静置した。
【０１９１】
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を、実施例１の（３）に記載のＥＬＩＳＡ方法２によって測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【０１９２】
比較例３  組換えＦｃγＲＩＩｂの酸安定性
比較例１に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂについて酸安定性の評価を行なった。酸安定性の評価は、比較例１に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂを含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた他は、実施例１３に記載の方法と同様の方法で行なった。
【０１９３】
改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ（実施例１３）および組換えＦｃγＲＩＩｂ（比較例３）の熱安定性の評価結果を合わせて表１３に示す。表１３に示すように、実施例１０に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂは比較例３に記載の組換えＦｃγＲＩＩｂよりも酸安定性（酸処理後の残存活性）が高いことがわかる。以上のことより、前記改良型組換えＦｃγＲＩＩｂは前記組換えＦｃγＲＩＩｂと比較し、熱安定性が向上（実施例１２および比較例２）するとともに酸安定性も向上することがわかる。
【０１９４】
【表１３】
2018050616.tif 000015
【０１９５】
実施例１４  システインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓの作製
（１）実施例１０で作製した配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号２３に記載のポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号８２（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号８３（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＡＡＣＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【０１９６】
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【０１９７】
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓを得た。
【０１９８】
（４）ｐＴｒｃ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号８４（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号８５（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は、実施例１の（２）と同様の方法で行なった。
【０１９９】
発現ベクターｐＴｒｃ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓのアミノ酸配列を配列番号８６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８７にそれぞれ示す。なお配列番号８６に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでのアミノ酸残基がＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２３番目のメチオニンおよび２４番目のグリシンがリンカーであり、２５番目のトレオニンから１９７番目のグルタミンまでのアミノ酸残基が改良型ＦｃγＲＩＩｂ細胞内領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のトレオニンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基に相当）であり、１９８番目のグリシンおよび１９９番目のシステインがリンカーであり、２００番目のアルギニンから２０５番目のグリシンまでのアミノ酸残基がシステインタグである。また前記改良型ＦｃγＲＩＩｂ細胞内領域が有するアミノ酸置換のうち、配列番号１１の６８番目のバリン（置換（１））は配列番号８６では６４番目に、配列番号１１の８０番目のグルタミン（置換（２））は配列番号８６では７６番目に、配列番号１１の８４番目のトレオニン（置換（３））は配列番号８６では８０番目に、配列番号１１の９０番目のトレオニン（置換（４））は配列番号８６では８６番目に、配列番号１１の９１番目のセリン（置換（５））は配列番号８６では８７番目に、配列番号１１の１２５番目のアルギニン（置換（６））は配列番号８６では１２１番目に、それぞれ相当する。
【０２００】
実施例１５  システインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例１４で作製したシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【０２０１】
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
【０２０２】
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
【０２０３】
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【０２０４】
（５）回収した菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【０２０５】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
【０２０６】
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【０２０７】
前記精製により、高純度のシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。
【０２０８】
実施例１６  改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓ固定化ゲルの作製と分離性能評価
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例１５で調製したシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ＿Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ固定化ゲルを得た。
【０２０９】
（２）（１）で作製したＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂ固定化ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂカラムを作製した。
【０２１０】
（３）（２）で作製したＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ８．５）の平衡化緩衝液で平衡化した。
【０２１１】
（４）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン（全薬工業製）；ベバシズマブ；インフリキシマブ）およびポリクローナル抗体（ヒト免疫グロブリン）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎにて５μＬ添加した。
【０２１２】
（５）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で１０分洗浄後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（３０分で５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【０２１３】
結果（溶出パターン）を図２に示す。図２中、ａ）はリツキサンを、ｂ）はベバシズマブを、ｃ）はインフリキシマブを、ｄ）はヒト免疫グロブリンを、それぞれＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂカラムへアプライしたときの結果である。モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の種類が異なると、それぞれの抗体の構造（アミノ酸配列や付加している糖鎖構造）が異なるため、これらの構造の違いがＦｃ結合性タンパク質との相互作用に寄与し、それぞれの抗体ごとに異なるピークに分離されることがわかる。
【０２１４】
実施例１７  改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の作製
（１）改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードする塩基配列を含むＤＮＡの作製
前記の置換（７）、置換（８）、置換（９）、置換（１０）、置換（１１）および置換（１２）を含む改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６のアミノ酸配列（）をコードする塩基配列（配列番号９１）を含むＤＮＡは、下記のように作製した。
【０２１５】
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例２に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号９３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ１と命名した。
【０２１６】
【表１４】
2018050616.tif 000016
【０２１７】
【表１５】
2018050616.tif 000017
【０２１８】
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例２に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９４および配列番号９５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ２と命名した。
【０２１９】
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例２に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９６および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ３と命名した。
【０２２０】
ＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１、Ａｍ６ｐ２とＡｍ６ｐ３は、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した（以下、同様の方法での精製をＤＮＡ断片精製と略記する）。ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１、Ａｍ６ｐ２とＡｍ６ｐ３を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ４と命名した。
【０２２１】
【表１６】
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【０２２２】
【表１７】
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【０２２３】
ＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ５と命名した。
【０２２４】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号９８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ６と命名した。
【０２２５】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９９および配列番号１００に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ７と命名した。
【０２２６】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０１および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ８と命名した。
【０２２７】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ６、Ａｍ６ｐ７とＡｍ６ｐ８を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ９と命名した。
【０２２８】
ＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ９を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ１０と命名した。
【０２２９】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１０を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０２および配列番号１０３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ１１と命名した。
【０２３０】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１０を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０４および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ１２と命名した。
【０２３１】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１１とＡｍ６ｐ１２を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｍ６ｐ１３と命名した。
【０２３２】
ＰＣＲ産物Ａｍ６ｐ１３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１０２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０２３３】
（２）改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクター（ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターはＨａｔａｙａｍａ  ＆  Ｉｄｅが報告した方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１１１，１−８，２０１５）で作製）にライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−Ａｍ６とする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−Ａｍ６を用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体Ａｍ６と命名した。
【０２３４】
形質転換体Ａｍ６からの組換えベクターｐＥＴ−Ａｍ６の抽出、ならびに改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の塩基配列の確認は以下に記す組換えベクター抽出方法および配列解析方法をそれぞれ用いて行なった。
【０２３５】
組換えベクター抽出方法：形質転換体を培養し（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）、３７℃で一晩、好気的）、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて組換えベクターを抽出した。
【０２３６】
配列解析方法：組換えベクターのうち、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６をコードするＤＮＡおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて塩基配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号９２または配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【０２３７】
（３）改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の製造
形質転換体Ａｍ６を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬに接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。前培養後、０．０１ｍＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２０ｍＬに前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、２０℃で２４時間、好気的に振とう培養し、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６を生産させた。
【０２３８】
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、培養液から遠心分離により集菌した菌体から改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６を含む可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度測定は、以下に記すＥＬＩＳＡ方法２により行なった。可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度を基に計算した結果、培養液１Ｌあたりの改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の生産性は４．７±０．１ｍｇ（ｎ＝２、可溶性タンパク質抽出液の回収および測定を２連で実施）であった。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡ方法２：抗ＦｃγＲＩＩａ抗体（Ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＡＦ１８７５）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗ＦｃγＲＩＩａ抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌと２．６８ｍＭのＫＣｌと０．５％（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎとを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を各ウェルに添加し、ブロッキングを行なった（３０℃で２時間）。洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で各ウェルを洗浄後、調製した可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で段階希釈し、それらをウェルに添加して固定化抗ＦｃγＲＩＩａ抗体と反応させた（３０℃で１時間半）。反応終了後、洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度の糖鎖付組換えＦｃγＲＩＩａ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ（Ｒ１６７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号１３３０−ＣＤ−０５０／ＣＦ）の測定結果を基準として、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出液中の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度を決定した。
【０２４０】
実施例１８  改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６のＩｇＧ結合性
実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６についてＩｇＧ結合性の評価を行なった。
【０２４１】
ＩｇＧ結合性の評価は、前記のＥＬＩＳＡ方法１を利用して行なった。具体的には、前記のＥＬＩＳＡ方法１どおりのＩｇＧ固定化ありの条件と、前記のＥＬＩＳＡ方法１からＩｇＧ固定化操作を行なわない変更をしたＩｇＧ固定化無しの条件の２条件で実験を行なった（各２連で実験を行なった）。実験では、実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６を含む可溶性タンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で５倍希釈したものをサンプルとして用いた。
【０２４２】
対照として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、サンプル緩衝液とする）を用いて同様の実験を行なった。
【０２４３】
改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６のＩｇＧ結合性の評価結果を表１８に示す。表１８に示すように、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６のサンプルを用いて前記のＥＬＩＳＡ方法１（ＩｇＧ固定化ありの条件）の実験を行なった場合でのみ高い検出値が得られた。この結果から、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６はＩｇＧ結合性を有することが確認された。
【０２４４】
【表１８】
2018050616.tif 000020
【０２４５】
実施例１９  改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の熱安定性
実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６について熱安定性の評価を行なった。
【０２４６】
熱安定性の評価では、実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６を含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた。サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００倍希釈し、４℃で３０分間の処理または５０℃で３０分間の熱処理を行なった。各処理後のサンプルについて改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度を実施例１７の（９）に記載のＥＬＩＳＡ方法２により測定した。４℃で３０分間の処理の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度を１００％として、５０℃で３０分間の熱処理の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の濃度の割合を算出し、熱処理後の検出率（％）とした。実験は２連で行なった。その結果、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の５０℃で３０分間の熱処理後の検出率（％）は８６±９％（ｎ＝２）であった。
【０２４７】
比較例４  組換えＦｃγＲＩＩａの作製
配列番号８８で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩａの作製を行なった。
（１）組換えＦｃγＲＩＩａをコードする塩基配列（配列番号１０５）を含むＤＮＡの作製
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号９３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ１と命名した。
【０２４８】
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９４および配列番号９５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ２と命名した。
【０２４９】
鋳型ＤＮＡとして下記の参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９６および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ３と命名した。
【０２５０】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ１、Ａｐ２とＡｐ３を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ４と命名した。
【０２５１】
ＰＣＲ産物Ａｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ５と命名した。
【０２５２】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号９８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ６と命名した。
【０２５３】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９９および配列番号１００に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ７と命名した。
【０２５４】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０１および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ８と命名した。
【０２５５】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ６、Ａｐ７とＡｐ８を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ９と命名した。
【０２５６】
ＰＣＲ産物Ａｐ９を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ１０と命名した。
【０２５７】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ１０を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０２および配列番号１０３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ１１と命名した。
【０２５８】
鋳型ＤＮＡとしてＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ１０を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０４および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ１２と命名した。
【０２５９】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物Ａｐ１１とＡｐ１２を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＡｐ１３と命名した。
【０２６０】
ＰＣＲ産物Ａｐ１３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号１０２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、組換えＦｃγＲＩＩａをコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０２６１】
（２）組換えＦｃγＲＩＩａをコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを有する形質転換体の作製
前記の組換えＦｃγＲＩＩａをコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩａとする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩａを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩａと命名した。
【０２６２】
形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩａからの組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩａの抽出ならびに組換えＦｃγＲＩＩａをコードするＤＮＡおよびその周辺の領域の配列の確認は実施例１７の（８）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０２６３】
（３）組換えＦｃγＲＩＩａの製造
実施例１７の（９）に記載の方法と同様の方法により、形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩａを用いた組換えＦｃγＲＩＩａの製造を行なった。培養液１Ｌあたりの組換えＦｃγＲＩＩａの生産性は１．５±０．４ｍｇ（ｎ＝２）であった。この結果と実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の生産性の結果を表１９にまとめて示す。表１９に示すように、実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６は組換えＦｃγＲＩＩａよりも生産性が高いことがわかる。すなわち、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６は前記の置換（７）から置換（１２）を有することで生産性（発現量）が向上したことがわかる。
【０２６４】
【表１９】
2018050616.tif 000021
【０２６５】
比較例５
比較例４に記載の組換えＦｃγＲＩＩａについて熱安定性の評価を行なった。熱安定性の評価では、比較例４に記載の組換えＦｃγＲＩＩａを含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた。実験は実施例１９に記載の方法と同様の方法で行なった。その結果、組換えＦｃγＲＩＩａの５０℃で３０分間の熱処理後の検出率（％）は６６±４％（ｎ＝２）であった。
【０２６６】
実施例１９に記載のように改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６の５０℃で３０分間の熱処理後の検出率は８６±９％（ｎ＝２）であり、組換えＦｃγＲＩＩａより熱安定性が高いことがわかる。すなわち、改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６は前記の置換（７）から置換（１２）を有することで熱安定性が向上したことがわかる。
【０２６７】
参考例１  組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂの作製
比較例４に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂの作製について以下に記載する。なお、組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂは配列番号１０６で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂの発現に用いる組換えベクターである。
【０２６８】
ヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列（配列番号１０７）を基にＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いてコドンを大腸菌型に変換し、配列番号１０８に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計した。
【０２６９】
配列番号１０９から配列番号１５０に示す４２種類のオリゴヌクレオチドを使用した二段階のＰＣＲにより、配列番号１０８に示すヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製した。
【０２７０】
一段階目のＰＣＲは、表２０に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。なお、表２０のＤＮＡ  ｍｉｘとは、配列番号１０９から配列番号１５０に示す４２種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【０２７１】
【表２０】
2018050616.tif 000022
【０２７２】
二段階目のＰＣＲは、表２１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９４℃で５分の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返した後、７２℃で７分処理後に４℃に冷却することで実施した。
【０２７３】
【表２１】
2018050616.tif 000023
【０２７４】
ＤＮＡ断片精製した二段階目のＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化し（ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社）、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドベクターにライゲーションにより連結し、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することでベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを調製した。
【０２７５】
鋳型ＤＮＡとして前記のベクターｐＵＣ−ＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１５１および配列番号１５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で５分の熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分処理後に４℃に冷却することで実施した。得られたＰＣＲ産物をｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１と命名した。ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製した。この制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＰＣＲ産物ｒｈＦｃγＲＩＩｂ−ｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクター（ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターはＨａｔａｙａｍａ  ＆  Ｉｄｅが報告した方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１１１，１−８，２０１５）で作製）へライゲーションにより連結することで組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを作製し、これを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂと命名した。形質転換体ｒｈＦｃγＲＩＩｂを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて抽出することで組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを調製した。
【０２７６】
組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂのうち、制限酵素ＸｂａＩ認識配列からＨｉｎｄＩＩＩ認識配列までのＤＮＡの塩基配列を配列番号１５３に示す。配列番号１５３の５’末端側から５０番目のアデニンから６７６番目のチミンは、配列番号１０６で示されるアミノ酸配列からなる組換えＦｃγＲＩＩｂをコードする。
【０２７７】
参考例２  組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの作製
実施例１７に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの作製について以下に記載する。組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂはＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ法およびエラープローンＰＣＲ法）を利用して、参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを基に、組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）、組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの順に改変して作製した。
【０２７８】
（１）組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３の作製
組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３を下記の方法で作製した。なお、組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３は配列番号１５４で示されるアミノ酸配列からなる改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３の発現に用いる組換えベクターである。
【０２７９】
鋳型ＤＮＡとして参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰと命名した。
【０２８０】
【表２２】
2018050616.tif 000024
【０２８１】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させた。前記の形質転換体の各コロニー（約１８００）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。培養後、２０μＬの培養液を６００μＬのＬＢ培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。培養後、遠心操作により得られる培養上清をサンプル溶液とした。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて５倍希釈した各サンプル溶液について、それに含まれる可溶性の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂの量を前記のＥＬＩＳＡ方法１（改良型組換えＦｃγＲＩＩａを含有するサンプル溶液の代わりに前記の遠心操作により得られる培養上清のサンプル溶液を使用）の測定値により評価した。このＥＬＩＳＡ方法１による評価結果から、形質転換体（以下、形質転換体ａ４Ｆ３とする）を選抜し、取得した。
【０２８２】
形質転換体ａ４Ｆ３からの組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ａ４Ｆ３（配列番号１５４）をコードするＤＮＡ（配列番号１５５）およびその周辺の領域の配列の確認は実施例１７の（８）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０２８３】
（２）組換えベクターｐＥＴ−ｍ３の作製
組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を下記の方法で作製した。なお、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３は配列番号１５６で示されるアミノ酸配列からなる改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の発現に用いる組換えベクターである。
【０２８４】
鋳型ＤＮＡとして参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号１５７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ１と命名した。
【０２８５】
鋳型ＤＮＡとして前記の組換えベクターｐＥＴ−ａ４Ｆ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１５８および配列番号１５９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ２と命名した。
【０２８６】
鋳型ＤＮＡとして参考例１に記載の組換えベクターｐＥＴ−ｒｈＦｃγＲＩＩｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６０および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ３と命名した。
【０２８７】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３ｐ１、ｍ３ｐ２およびｍ３ｐ３を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｐ４と命名した。
【０２８８】
ＰＣＲ産物ｍ３ｐ４を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０２８９】
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３をコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３とする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ３と命名した。
【０２９０】
形質転換体ｍ３からの組換えベクターｐＥＴ−ｍ３の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３（配列番号１５６）をコードするＤＮＡ（配列番号１６１）およびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１７の（８）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０２９１】
（３）組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）の作製
組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を下記の方法で作製した。なお、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）は配列番号１５６で示されるアミノ酸配列からなる改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３の発現に用いる組換えベクターである。組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）は、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を基に、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３のアミノ酸配列の一部（配列番号１５６のアミノ酸配列のＮ末端側１０７番目セリンから１０９番目プロリンまで）をコードするＤＮＡ領域に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を設ける改変を行なったものである。
【０２９２】
鋳型ＤＮＡとして前記の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号１６２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ１と命名した。
【０２９３】
鋳型ＤＮＡとして前記の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６３および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ２と命名した。
【０２９４】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３（Ｂ）ｐ１およびｍ３（Ｂ）ｐ２を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３（Ｂ）ｐ３と命名した。
【０２９５】
ＰＣＲ産物ｍ３（Ｂ）ｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を有し、かつ前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３と同一のアミノ酸配列をコードした塩基配列を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）とする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ３（Ｂ）と命名した。
【０２９６】
形質転換体ｍ３（Ｂ）からの組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）の抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ３（配列番号１５６）をコードするＤＮＡ（配列番号１６４）およびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１７の（８）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０２９７】
（４）組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの作製
組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを下記の方法で作製した。なお、組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂは配列番号１６５で示されるアミノ酸配列からなる改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂの発現に用いる組換えベクターである。
【０２９８】
鋳型ＤＮＡとして前記の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号１６６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ１と命名した。
【０２９９】
鋳型ＤＮＡとして前記の組換えベクターｐＥＴ−ｍ３（Ｂ）を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６７および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ２と命名した。
【０３００】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ１とｍ５ｃｐ２を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｃｐ３と命名した。
【０３０１】
ＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製し、ｍ５ｃｐ４と命名した。
【０３０２】
鋳型ＤＮＡとして前記のＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号９２および配列番号１６８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ１と命名した。
【０３０３】
鋳型ＤＮＡとして前記のＰＣＲ産物ｍ５ｃｐ４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６９および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ２と命名した。
【０３０４】
ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ６ｂｐ１とｍ６ｂｐ２を混合後、表１６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を表１７に示す条件で反応させることでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐ３と命名した。
【０３０５】
ＰＣＲ産物ｍ６ｂｐ３を鋳型ＤＮＡとし、配列番号９２および配列番号９７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を表１５に示す条件で反応させることで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
【０３０６】
前記の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードする塩基配列を含むＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結して組換えベクター（以下、組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂとする）を作製した。組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂを用いて大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を形質転換体ｍ６ｂと命名した。
【０３０７】
形質転換体ｍ６ｂからの組換えベクターｐＥＴ−ｍ６ｂの抽出と改良型組換えＦｃγＲＩＩｂ−ｍ６ｂをコードするＤＮＡ（配列番号１７０）およびその周辺の領域の塩基配列の確認は実施例１７の（８）に記載の方法と同様の方法により行なった。
【０３０８】
実施例２０  改良型組換えＦｃγＲＩＩａの酸安定性
実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６について酸安定性の評価を行なった。
【０３０９】
実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６を含む可溶性タンパク質抽出液のサンプル溶液を３０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈したサンプル溶液１００μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）２００μＬとを混合し、３０℃でそれぞれ２４時間、４８時間、７２時間静置した。
【０３１０】
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を、実施例１７の（９）に記載のＥＬＩＳＡ方法２によって測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【０３１１】
比較例６  組換えＦｃγＲＩＩａの酸安定性
比較例４に記載の組換えＦｃγＲＩＩａについて酸安定性の評価を行なった。酸安定性の評価は、比較例４に記載の組換えＦｃγＲＩＩａを含む可溶性タンパク質抽出液をサンプルとして用いた他は、実施例２０に記載の方法と同様の方法で行なった。
【０３１２】
改良型組換えＦｃγＲＩＩａ（実施例２０）および組換えＦｃγＲＩＩａ（比較例６）の酸安定性の評価結果を合わせて表２３に示す。表２３に示すように、実施例１７に記載の改良型組換えＦｃγＲＩＩａは比較例４に記載の組換えＦｃγＲＩＩａよりも酸安定性（酸処理後の残存活性）が高いことがわかる。以上のことより、前記改良型組換えＦｃγＲＩＩａは前記組換えＦｃγＲＩＩａと比較し、熱安定性が向上（実施例１９および比較例５比較例５）するとともに酸安定性も向上することがわかる。
【０３１３】
【表２３】
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【０３１４】
実施例２１  システインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−ｍ６＿Ｃｙｓの作製
（１）実施例１７で作製した配列番号８９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号９１に記載のポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターｐＥＴ−Ａｍ６を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号１７１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号１７２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＡＡＣＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表１４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【０３１５】
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【０３１６】
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−Ａｍ６＿Ｃｙｓを得た。
【０３１７】
（４）ｐＴｒｃ−Ａｍ６＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号１７３（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号１７４（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシーケンス用プライマーに使用した以外は、実施例１７の（２）と同様の方法で行なった。
【０３１８】
発現ベクターｐＴｒｃ−Ａｍ６＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓのアミノ酸配列を配列番号１７５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７６にそれぞれ示す。なお配列番号１７５に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでのアミノ酸残基がＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２３番目のメチオニンおよび２４番目のグリシンがリンカーであり、２５番目のグルタミンから１９７番目のグルタミンまでのアミノ酸残基が改良型ＦｃγＲＩＩａ細胞内領域（配列番号８９に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基に相当）であり、１９８番目のグリシンおよび１９９番目のシステインがリンカーであり、２００番目のアルギニンから２０５番目のグリシンまでのアミノ酸残基がシステインタグである。また前記改良型ＦｃγＲＩＩａ細胞内領域が有するアミノ酸置換のうち、配列番号８９の６８番目のバリン（置換（７））は配列番号１７５では６４番目に、配列番号８９の８０番目のグルタミン（置換（８））は配列番号１７５では７６番目に、配列番号８９の８４番目のトレオニン（置換（９））は配列番号１７５では８０番目に、配列番号８９の９０番目のトレオニン（置換（１０））は配列番号１７５では８６番目に、配列番号８９の９１番目のセリン（置換（１１））は配列番号１７５では８７番目に、配列番号８９の１２５番目のアルギニン（置換（１２））は配列番号１７５では１２１番目に、それぞれ相当する。
【０３１９】
実施例２２  システインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例２１で作製したシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【０３２０】
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（７）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％（ｗ／ｖ）アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
【０３２１】
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
【０３２２】
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【０３２３】
（５）回収した菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【０３２４】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
【０３２５】
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
【０３２６】
前記精製により、高純度のシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。
【０３２７】
実施例２３  改良型組換ＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓ固定化ゲルの作製と分離性能評価
（１）２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例２２で調製したシステインタグを付加した改良型組換えＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６＿Ｃｙｓを４ｍｇ反応させることにより、ＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６固定化ゲルを得た。
【０３２８】
（２）（１）で作製したＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６固定化ゲル１．２ｍＬをφ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填してＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６カラムを作製した。
【０３２９】
（３）（２）で作製したＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６カラムを高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ８．５）の平衡化緩衝液で平衡化した。
【０３３０】
（４）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン（全薬工業製）；ベバシズマブ；インフリキシマブ）およびポリクローナル抗体（ヒト免疫グロブリン）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎにて５μＬ添加した。
【０３３１】
（５）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で１０分洗浄後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（３０分で５０ｍＭのＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【０３３２】
結果（溶出パターン）を図３に示す。図３中、ａ）はリツキサンを、ｂ）はベバシズマブを、ｃ）はインフリキシマブを、ｄ）はヒト免疫グロブリンを、それぞれＦｃγＲＩＩａ−Ａｍ６カラムへアプライしたときの結果である。モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の種類が異なると、それぞれの抗体の構造（アミノ酸配列や付加している糖鎖構造）が異なるため、これらの構造の違いがＦｃ結合性タンパク質との相互作用に寄与し、それぞれの抗体ごとに異なるピークに分離されることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０３３３】
本発明の改良型組換えＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａは、診断薬を含む医薬品、生化学試薬およびＩｇＧを精製または分析するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして有
用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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