(57)【要約】      （修正有）【課題】難治性の神経変性疾患であるＰｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＰｒＬＤ）、ＲＮＡ結合部位、核外排出シグナル（ＮＥＳ）を備える、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）/前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の病態を再現することができるモデルを作製する方法の提供。【解決手段】ＡＬＳ／ＦＴＤを引き起こす原因遺伝子６つＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＴＡＦ１５、ＥＳＷＲ１、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２の特徴を抽出し、人工合成遺伝子を作製することにより、原因遺伝子の毒性を強調した病態モデルを作製する方法。【選択図】図１
2018050605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＰｒＬＤ）、ＲＮＡ結合部位、核外排出シグナル（ＮＥＳ）を備えることを特徴とする筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＦＴＤ）を誘導する人工合成遺伝子。
【請求項２】
前記ＰｒＬＤが、グリシン／セリン−チロシン−グリシン／セリン（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）の繰り返し配列であることを特徴とする請求項１記載の人工合成遺伝子。
【請求項３】
さらに、グルタミン（Ｑ）及び／又はアスパラギン（Ｎ）に富む配列を備えていることを特徴とする請求項２記載の人工合成遺伝子。
【請求項４】
前記ＲＮＡ結合部位は、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｐｅｒａ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １のＲＮＡ認識モチーフであることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の人工合成遺伝子。
【請求項５】
前記ＮＥＳは、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １のｒｅｖ  ｐｒｏｔｅｉｎのＮＥＳであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の人工合成遺伝子。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７記載のＡＬＳ／ＦＴＤを誘導する人工合成遺伝子。
【請求項７】
配列番号２、４、６、８記載のＡＬＳ／ＦＴＤを誘導する人工合成タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜６いずれか１項記載の人工合成遺伝子を培養細胞、又は哺乳動物に導入することによって得られるＡＬＳ／ＦＴＤ病態モデル。
【請求項９】
請求項８記載のＡＬＳ／ＦＴＤ病態モデルに候補化合物を投与し、
ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を指標として、
候補化合物をスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ、以下ＡＬＳと略記する。）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＦＴＤ、以下ＦＴＤを略記する。）の病態を誘導することのできる人工的な遺伝子配列に関する。また、当該配列を導入して作製した培養細胞を用いた病態モデル、哺乳動物モデルに関する。さらに、これらの病態モデルを使用した医薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＳは、進行性に運動ニューロンが障害を受け、数年のうちに呼吸不全に陥る難治性の神経変性疾患である。極めて進行が速く、人工呼吸器を装着しなければ、半数ほどが発症後３年から５年で呼吸筋麻痺により死亡する。１年間に新たに発症する人の割合は、人口１０万人あたり約１〜２．５人であり、日本では２０１４年度の患者数は約１０，０００人であると報告されている。
【０００３】
治療薬としては、グルタミン酸作動性神経においてグルタミン酸伝達を抑制する作用のあるリルゾールが、神経細胞保護作用を有し有効性が認められている。しかしながら、リルゾールは病状の進行を遅らせることができるものの、一旦低下した筋力を回復させることができる根本的な治療薬ではない。そのため、運動機能や筋力の低下を改善したり、病気の進行を顕著に抑制することができる有効な治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
ＡＬＳの有効な治療薬が開発されていない原因の一つとして、ＡＬＳ発症の原因が解明されていない点が挙げられる。ＡＬＳは遺伝子の変異により発症すると考えられ、解析が進められているものの、多くの遺伝子の関与が示唆されており、統一的な見解が得られるにはいたっていない。
【０００５】
一方、若年性認知症の一つであるＦＴＤは、前頭葉と側頭葉の萎縮によって認知症が起こる病気である。発症初期から記憶力が低下するが人格が保たれているアルツハイマー病とは対照的に、初期の頃は記憶力は保たれているものの、人格、性格が極端に変わってしまうという変化が症状として見られる病気である。進行はゆっくりと年単位ではあるものの有効な治療薬は未だに開発されていない。
【０００６】
ＡＬＳとＦＴＤは異なる２つの疾患であるが、分子遺伝学の発展により原因遺伝子が次々と同定され、両疾患が一つの疾患スペクトルを形成していることが明らかになってきた。しかし、ＡＬＳ／ＦＴＤの原因は依然として明らかではなく、難治性の疾患であることから、治療薬開発のために分子病態の早期解明が強く望まれている。そのためには、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を再現することのできる病態モデルが必要であると考えられている。
【０００７】
病態モデルとしては、家族性ＡＬＳの約２割で変異が認められているスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）のＡＬＳ変異を導入したモデルマウスが開示されている（非特許文献１）。しかし、このマウスは運動ニューロンの減少による麻痺を生じ、早期に死亡するものの、ＦＴＤ症状はなく、ＲＮＡ結合タンパク質の病理学的蓄積も見られないことから、通常のＡＬＳを反映しているものではないと考えられている。
【０００８】
特許文献１には、神経変性疾患の病態モデルとして弓部大動脈を一定時間遮断することによって作製するマウスモデルが開示されている。しかしながら、このマウスモデルは、ＡＬＳに特異的なものではなく、アルツハイマー病、パーキンソン病など、神経細胞にアポトーシスが生じることにより発症する神経変性疾患のモデルである。そのため、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を解明し、これを根本的に治療する薬剤をスクリーニングすることはできない。そのため、ＡＬＳ/ＦＴＤの病態を反映する動物モデル、さらには簡便に実験を行うことのできる培養細胞モデルの作製が望まれている。
【０００９】
病態モデルの作製には原因の解明が不可欠であるが、ＡＬＳ発症の詳細な機構は依然として不明である。ＡＬＳは約１０％が家族性に発症することが知られている。上述のように家族性ＡＬＳの約２割でＳＯＤ１に変異が認められているが、その他にも多くの原因遺伝子が報告されている。ワシントン大学の神経筋疾患センター（Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）によれば、２０１５年４月の時点で家族性、孤発性ＡＬＳ患者から３０以上の遺伝子がＡＬＳ原因遺伝子として報告されている。このように多くの原因遺伝子が報告されているにも関わらず、ＡＬＳの病態解明には至っていない。その理由としては、これらの遺伝子は相互に関連があるわけではなく、また、生化学的、細胞生物学的にも共通性が乏しいことが挙げられている。
【００１０】
近年同定されたＡＬＳ／ＦＴＤを引き起こす６つの原因遺伝子ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＴＡＦ１５、ＥＳＷＲ１、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２は、生化学的、細胞生物学的に以下の共通性が見られることから、ＡＬＳの病態解明が進展するのではないかと期待が持たれている。
（１）ＲＮＡ結合タンパク質である（非特許文献２）。
（２）Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＰｒＬＤ）を有し、凝集性が高い（非特許文献３〜５）。
（３）ストレス顆粒の構成分子である（非特許文献６）。
（４）細胞質に封入体を形成する（非特許文献７）。
【００１１】
しかしながら、これらＡＬＳ原因遺伝子や、これら遺伝子がコードするタンパク質の性質がある程度明らかになっているとはいえ、それぞれ異なる作用を持つ遺伝子であり、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態は未だ不明の点が多い。従来は、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態は、疾患原因遺伝子にＡＬＳ患者で発見された変異を個々に、あるいは複数導入した遺伝子を用いて研究されていた。しかしながら、いずれも弱い細胞毒性を示すものしか得られず、再現性に乏しいという問題があった。
【００１２】
本発明者らのグループも、ＡＬＳ遺伝子変異を有するＦＵＳを導入したトランスジェニックマウスを作製し、ＡＬＳ患者に特有の運動障害の進行や、脳神経における異常タンパク質の蓄積、運動神経細胞の減少といったＡＬＳ患者に見られる病理学的変化を認め、これを報告している（非特許文献８）。しかしながら、より簡便な実験ツールとなり得る培養細胞系でのＡＬＳ病態モデルの確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２１０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Gurney, M. E.,et  al., Science, 1994, Vol.264(5166), p.1772-1775.
【非特許文献２】Ito, D. &  Suzuki, N., Neurology, 2011, Vol. 77(17),  p.1636-1643.
【非特許文献３】Kato, M. et al., Cell, 2012, Vol.149(4), p.753-767.
【非特許文献４】DePace A. H. et al., Cell,1998, Vol.93(7), p.1241-1252.
【非特許文献５】King, O. D. et al., Brain  research,2012, Vol.1462, p.61-80.
【非特許文献６】Anderson, P. & Kedersha, N., Trends  Biochem. Sci., 2008, Vol.33(3), p.141-150.
【非特許文献７】Hasegawa, M. et al., Ann.Neurol., 2008, Vol.64(1), p.60-70.
【非特許文献８】Shiihashi, G., et al., Brain, 2016, Vol.139(9), p.2380-2394.
【非特許文献９】Ito, D. et al., Annals of  neurology,2010, Vol.69(1), p.152-162
【非特許文献１０】Nishimoto, Y. et  al., J. Biol. Chem., 2010, Vol.285(1), p.608-619.
【非特許文献１１】Liu-Yesucevitz,  L., et al., J. Neurosci., 2014, Vol.34(12), p.4167-4174.
【非特許文献１２】Kim H. J. et al., Nature. 2013, Vol.495(7442), p.467-473.
【非特許文献１３】Toombs, J. A. et  al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2012, Vol.109(17), p.6519-6524
【非特許文献１４】Egawa, N. et al.,Sci. Transl. Med. 2012, Vol.4(145), 145ra04.
【非特許文献１５】Ichiyanagi, N. et  al., Stem Cell Reports. 2016, Vol.6(4), p.496-510
【非特許文献１６】Chen, H. et al., Cell Stem Cell, 2014, Vol.14(6), p.796-809.
【非特許文献１７】Neumann, M., et  al., Science, 2006, Vol.314(5796), p.130-133.
【非特許文献１８】Arai, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, Vol.351(3),p.602-611.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ＡＬＳの病態を解明し、ひいては創薬に利用することができる病態モデルを提供することを課題とする。
【発明の効果】
【００１６】
ＡＬＳ／ＦＴＤの病態解明に資する病態モデルを提供することが可能となった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（１）Ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＰｒＬＤ）、ＲＮＡ結合部位、核外排出シグナル（ＮＥＳ）を備えることを特徴とする筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＦＴＤ）を誘導する人工合成遺伝子。
（２）前記ＰｒＬＤが、グリシン／セリン−チロシン−グリシン／セリン（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）の繰り返し配列であることを特徴とする（１）記載の人工合成遺伝子。
（３）さらに、グルタミン（Ｑ）及び／又はアスパラギン（Ｎ）に富む配列を備えていることを特徴とする（２）記載の人工合成遺伝子。
（４）前記ＲＮＡ結合部位は、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｐｅｒａ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １のＲＮＡ認識モチーフであることを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の人工合成遺伝子。
（５）前記ＮＥＳは、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １のｒｅｖ  ｐｒｏｔｅｉｎのＮＥＳであることを特徴とする（１）〜（４）いずれか１つ記載の人工合成遺伝子。
（６）配列番号１、３、５、７記載のＡＬＳ／ＦＴＤを誘導する人工合成遺伝子。
（７）配列番号２、４、６、８記載のＡＬＳ／ＦＴＤを誘導する人工合成タンパク質。
（８）（１）〜（６）いずれか１つ記載の人工合成遺伝子を培養細胞、又は哺乳動物に導入することによって得られるＡＬＳ／ＦＴＤ病態モデル。
（９）（８）記載のＡＬＳ／ＦＴＤ病態モデルに候補化合物を投与し、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を指標として、候補化合物をスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＡＬＳ／ＦＴＤ病態誘導人工合成遺伝子の構成を模式的に示す図。
【図２】ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ及びＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰの培養細胞での発現を示す図。図２Ａは、導入された遺伝子により発現しているＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰの蛍光顕微鏡像を示す。ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰが封入体に局在するのに対し、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰは封入体に局在しないことを示す。図２Ｂは、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰが封入体マーカーであるｐ６２と、図２ＣはＡＬＳ原因遺伝子ＴＤＰ-４３と共局在することを示す。
【図３】ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰがストレス顆粒の構成分子であることを示す顕微鏡像。
【図４】ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ発現による神経細胞における神経突起伸展作用の抑制を示す図。
【図５】ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰによる細胞死誘導を示すグラフ。
【図６】ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰの凝集性を示す図。
【図７】Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞にＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰを導入し樹立した細胞株の顕微鏡像を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は、ＡＬＳ／ＦＴＤを引き起こす６つの原因遺伝子ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＴＡＦ１５、ＥＳＷＲ１、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２の共通の性質を抽出し、これを備えた遺伝子を合成し、哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、人工的なＡＬＳ／ＦＴＤモデルを作製することに成功した。すなわち、本発明者は、これら６つの原因遺伝子の遺伝子産物の共通の性質のうち、（１）ＲＮＡ結合タンパク質である、（２）ＰｒＬＤを有し、凝集性が高い、（４）細胞質に封入体を形成するように人工的な遺伝子をデザインした。
【００２０】
これらの人工合成遺伝子を培養細胞に導入することによって、人工合成遺伝子から産生されるタンパク質（以下、人工合成タンパク質という。）は、細胞質に封入体を形成し、ストレス顆粒の構成成分となり、細胞毒性を備えている。すなわち、これら人工合成タンパク質は、ＡＬＳ／ＦＴＤに特有の性質を表している。人工合成遺伝子／タンパク質によるＡＬＳ/ＦＴＤ病態モデルは、本発明者により初めて創出されたものであり、個々の原因遺伝子／タンパク質を導入した病態モデルよりも強い毒性を有し、その病態解明にきわめて有用である。
【００２１】
これら人工合成遺伝子は、培養細胞や哺乳動物に導入することにより、ＡＬＳ/ＦＴＤの病態を解明するための研究ツールとして非常に有用である。ＡＬＳ/ＦＴＤの病態解明が進まない理由の一つとして、有用な実験系、モデル動物がないことが挙げられる。本発明の人工合成遺伝子を導入することによって、ＡＬＳ／ＦＴＤに特有の性質を再現することができる。したがって、培養細胞モデル、モデル動物として、病態解明が進展することが期待される。
【００２２】
さらに、基礎的研究のツールにとどまらず、創薬研究においても重要な役割を果たすことが期待される。例えば、これら人工合成遺伝子を導入した培養細胞の培地中に候補化合物等を添加し、ストレス顆粒への移行の低下、細胞毒性の軽減を指標として、医薬のスクリーニングを行うことができる。さらに、動物モデルに候補化合物を投与することも可能となる。
【００２３】
培養細胞としては、Ｎｅｕｒｏ２ａのように神経細胞へと分化が誘導できる細胞だけではなく、目的によって種々の細胞を使い分けることが可能である。また、遺伝子導入は、その都度導入してもよいし、後述するように人工合成遺伝子を導入した細胞株を樹立して用いてもよい。
【００２４】
哺乳動物モデルとしては、本発明の人工合成遺伝子を目的の細胞で発現する動物を定法により作製すればよい。例えば、ＡＬＳの病態を備えたトランスジェニックマウスとしてはＦＵＳ遺伝子を導入したマウスモデルがすでに本発明者らのグループによって開示されているが（非特許文献８）、これと同様の方法を用いて作製することができる。具体的には、Ｔｈｙ−１プロモーターやＣＡＧＳプロモーターの下流に、本発明の人工合成遺伝子を配置することによりトランスジェニックマウスの作製が可能である。
【００２５】
トランスジェニックマウスは、生化学的、組織学的検査以外に、行動解析としては運動能力（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ、Ｒｏｔａ−ｒｏｄ  ｔｒｅａｄｍｉｌｌ、ｈａｎｇｉｎｇ  ｗｉｒｅ  ｔｅｓｔ）や認知機能障害（社交性（ｔｈｒｅｅ  ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｓｏｃｉａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、活動性・不安様行動（Ｈｏｍｅ  ｃａｇｅ、ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ）、空間作業記憶（Ｙ  ｍａｚｅ  ｔｒａｃｅ  ｔｙｐｅ）、文脈記憶（Ｔｒａｃｅ  ｆｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ））などの解析が可能となり、ＡＬＳ／ＦＴＤモデル動物として、薬効評価にも応用可能である。
【００２６】
以下に、実施例を詳細に説明しながら説明するが、本発明は以下の実施例に限定されることはない。
[実施例１]人工合成遺伝子の作製
上記６つの原因遺伝子、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＴＡＦ１５、ＥＳＷＲ１、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２のＰｒＬＤについて解析するとグリシン／セリン−チロシン−グリシン／セリン（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）の繰り返し配列があり（非特許文献３）、さらにグルタミン（Ｑ）とアスパラギン（Ｎ）に富む（非特許文献４、５）ことが明らかとなった。そこで、（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）のリピートをコードする配列、あるいは、（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）のリピートにもう一つの特徴であるグルタミン（Ｑ）に富む配列、ＲＮＡ結合部位、核外搬出シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ、ＮＥＳ）を備えた人工合成遺伝子をデザインした。ＲＮＡ結合部位としては、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｐｅｒａ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １のＲＮＡ認識モチーフを用いた。ＮＥＳはＨｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  １のｒｅｖ  ｐｒｏｔｅｉｎのＮＥＳを用いた。また、タグとしてＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）をＣ末端に配置した（図１）。
【００２７】
ここでは、ＰｒＬＤとして、（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）、あるいは（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）に、さらにＱに富む配列を備えたものを示しているが、Ｎに富む配列、あるいはＱ／Ｎの両方に富む配列を加えてもよい。また、ＲＮＡ結合部位やＮＥＳとしては、ここで用いた上記配列の他に公知のどのような配列を用いてもよい。そのような配列としては、例えばＲＮＡ結合部位であれば、ＡＬＳ関連ＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ−４３やＦＵＳのＲＮＡ認識モチーフ、ＮＥＳであればがん遺伝子ｐ５３  ＮＥＳやｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＰＫＩａｌｐｈａ）のＮＥＳなどがある。さらに、ここではタグとしてＣ末端にＧＦＰを配置しているが、タグとして機能するものであれば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質以外であっても、ＦＬＡＧ、ＧＳＴなど目的に応じてどのようなものを用いてもよいことは言うまでもない。
【００２８】
図１に示すように人工合成遺伝子をデザインし（配列番号１、３）、ジェンスクリプトジャパンに依頼作製した人工合成遺伝子はｐｃＤＮＡ３．１（−）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にサブクローニングした。
【００２９】
［実施例２］人工合成遺伝子の細胞内での局在
サブクローニングした人工合成遺伝子をＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｔ細胞）で発現させ、その局在を観察した。シカゴ大学のＴｈｉｎａｋａｒａｎ博士より供与されたＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて培養した。細胞への遺伝子導入はリポフェクタミン２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。具体的には、遺伝子導入前日２４ウェルプレートに細胞を１．５×１０５個播種し培養する。導入当日、プラスミドベクター１．６μｇとリポフェクタミン２０００  ２μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１００μＬと混合する。室温で２０分静置後、細胞にリポフェクタミン２０００とプラスミドベクターの混合物を加え、ディッシュをゆすって拡散させる。その後、４８時間培養し、免疫細胞染色を行った。
【００３０】
遺伝子を導入した培養細胞は、４％パラフィルムアルデヒドにより氷上で１０分間固定し、次に、０．２％  トリトンＸ−１００（シグマアルドリッチ社製）により室温で１０分間透過処理を行った。その後、４％パラフィルムアルデヒドにより氷上で５分間後固定を行い、ブロッキングし定法により免疫染色を行った。抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体（ミリポア社製）、抗ＴＤＰ−４３抗体（プロテインテック社製）を一次抗体として用い、Ａｌｅｘａ５８６標識された抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を二次抗体として用い染色を行った。また、核染色はＤＡＰＩ（シグマアルドリッチ社製）を用いて行った。
【００３１】
図２Ａは、配列番号１に示す（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）繰り返し配列、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ、ＲＲＭ）、ＮＥＳ、及びＧＦＰを備えた配列であるＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、あるいは、配列番号３に示すＱに富んだ（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）繰り返し配列、ＲＲＭ、ＮＥＳ、及びＧＦＰを備えた配列であるＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞に導入し、４８時間後の像を示したものである。
【００３２】
配列番号２、及び４に各遺伝子がコードするアミノ酸配列を示しているが、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰでは、（Ｇ／Ｓ−Ｙ−Ｇ／Ｓ）配列が６７回、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰでは、５０回繰り返されている。
【００３３】
図２Ａに示すように、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは封入体を形成するのに対し（図２において封入体は矢印で示している。）、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰは封入体を形成しない。さらに、封入体マーカーである抗ｐ６２抗体を用いて共染色すると、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰタンパク質は、ｐ６２と共局在していることが観察された（図２Ｂ）。
【００３４】
また、ＡＬＳ原因遺伝子であるＴＤＰ−４３（ボストン大学医学部  Ｗｏｌｏｚｉｎ博士より供与。）をＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ  遺伝子とともに導入して発現させ、局在を観察した。図２Ｃに示すように、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰタンパク質はＴＤＰ−４３とともに、封入体に共局在しており、ＡＬＳの病理学的特徴を再現している。
【００３５】
［実施例３］
上述のＡＬＳ／ＦＴＤの上記６つの原因遺伝子の特徴としてストレス顆粒の構成成分であることが挙げられている。ストレス顆粒は低酸素、小胞体ストレス、熱ショックなどの特定のストレスによって、細胞質内に一過性に形成される構造体であり、その本体はｍＲＮＡ、４０Ｓリボソーム、およびＲＮＡ結合蛋白質などからなる凝集体である（非特許文献６）。このストレス顆粒は、ｍＲＮＡの翻訳制御、安定化、編集などＲＮＡの品質管理機構を担うと考えられている。ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、及びＡｔａｘｉｎ２は、いずれもストレス顆粒の構成分子でありＲＮＡ品質管理機構にかかわっているとされている（非特許文献９〜１２）。そこで、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ遺伝子をＨｅＬａ細胞で発現させ、細胞にストレスを与え、その挙動を観察した。
【００３６】
ＨｅＬａ細胞は、理研バイオリソースセンターより得て、実施例２と同様にして培養し、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、またはＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ  遺伝子を導入した。
遺伝子導入４８時間後に、０．５μＭのヒ素によって１時間処理し、ストレスを誘導した。ストレス顆粒は、ストレスマーカーとして知られているＨｕｒ陽性であることから、抗Ｈｕｒ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジーズ社製）を一次抗体として用い、免疫染色を行い観察した。ＳＹＧ／ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰタンパク質は、ともにストレス顆粒に明確に共局在した（図３上段ＳＹＧ−ＮＥＳ、第２段ＳＹＧＱ−ＮＥＳ、共局在している代表的なストレス顆粒を矢印で示している。）。
【００３７】
さらに、それぞれＳＹＧリピートを半数に減らした遺伝子を発現させ、ストレス顆粒への移行を解析した。ＳＹＧリピートを３６回に減らした遺伝子（配列番号５、図３第４段、ＳＹＧ（３６）−ＮＥＳ、人工合成タンパク質の配列は配列番号６に示す。）、リピートを２５回に減らした遺伝子（配列番号７、図３第５段、ＳＹＧＱ（２５）−ＮＥＳ、人工合成タンパク質の配列は配列番号８に示す。）を導入して発現させた人工合成タンパク質も、ストレス顆粒への移行性は保たれていた（図中、共局在している代表的なストレス顆粒を同様に矢印で示している。）。ＦＵＳでは２７回のＳＹＧリピートがあることが知られていることも併せて考えると、ＳＹＧリピートは２５回以上繰り返して存在すれば、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を再現するものと考えられる。また、ＳＹＧリピートが多いほど、反応性、毒性が高い傾向が見られた。
【００３８】
一方、別の神経疾患であるプリオン病を想定した人工合成遺伝子（ｓＰＦＤ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、配列番号９）は非特許文献１３に開示されている塩基配列に基づき、ジェンスクリプトジャパンに依頼作製して用いた。ｓＰＦＤ−ＮＥＳ−ＧＦＰを発現させても、ストレス顆粒と有意な共局在は見られなかった。したがって、ＳＹＧ／ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰはＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子の特徴を反映しているものと考えられる。
【００３９】
［実施例４］
疾患特異的ｉＰＳ細胞の研究よりＡＬＳ／ＦＴＤ患者由来分化誘導神経細胞では、突起伸展障害が共通の表現型として報告されている（非特許１４〜１６）。本人工合成遺伝子の突起伸展に関する作用について検討するため、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に遺伝子を導入しレチノイン酸にて分化誘導を行った。まず、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に、ネオマイシン耐性遺伝子を骨格に持つｐｃＤＮＡにサブクローニングされている遺伝子を導入後、ジェネティシン（Ｇ４１８、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で薬剤セレクションを行い、定常発現細胞株を樹立した。遺伝子導入により、コントロールであるＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、野生型ＴＤＰ−４３（Ｗｔ  ＴＤＰ−４３）、３３１位のグルタミン（Ｑ）がリシン（Ｋ）に変異しているＴＤＰ−４３（Ｑ３３１Ｋ  ＴＤＰ−４３）、３４３位のグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）に変異しているＴＤＰ−４３（Ｑ３４３Ｒ  ＴＤＰ−４３）、野生型ＦＵＳ（Ｗｔ  ＦＵＳ）、５２５位のプロリン（Ｐ）がロイシン（Ｌ）に変異しているＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ  ＦＵＳ）を定常的に発現している細胞株を樹立した。各遺伝子を発現しているＮｅｕｒｏ２ａ細胞の分化誘導は、２％ウシ胎仔血清を含有しているαＭＥＭに２０μＭレチノイン酸（シグマ社製）を添加して２４時間培養することにより行った（図４）。
【００４０】
抗βＩＩＩ−チューブリン抗体（ミリポア社製）を用い、神経突起を染色して突起伸展長を計測した。図４右のグラフは、細胞体の長軸の２倍以上の神経突起を持つ細胞の割合を算出し、まとめたものである。図４のグラフにおいて＊はコントロールであるＧＦＰに対し、ｐ＜０．００５（Ｎ＝４）で有意差があることを示す。神経突起伸展長は、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰともにコントロールであるＧＦＰ発現細胞と比較して有意に低下していた。ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは、従来のＡＬＳ変異ＴＤＰ−４３やＦＵＳより強く神経突起身長を阻害しており、より毒性が高く、顕著な効果を有していた。
【００４１】
［実施例５］人工合成遺伝子による細胞死誘導
ＡＬＳ患者の神経では細胞死が誘導されている。配列番号１、及び３で表す人工合成遺伝子を導入し、細胞死が誘導されるか検討を行った。プリオン病を想定した人工合成遺伝子ｃＰＦＤ-ＮＥＳ、ＡＬＳ患者に見られる変異を有するＰ５２５Ｌ  ＦＵＳ、ＡＬＳ人工合成遺伝子ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰをＮｅｕｒｏ２ａ細胞に導入し、ヨウ化プロピジウムで染色される細胞を死細胞としてセルソーターで死細胞の割合をカウントした。
【００４２】
ヨウ化プロピジウムで染色される死細胞は、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰが最も多かった。一方、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは、変異型ＦＵＳ（Ｐ５２５Ｌ  ＦＵＳ）よりは作用は弱いもののコントロール（ｃＰＦＤ−ＮＥＳ−ＧＦＰ）と比して有意に高い毒性を示していた（図５、＊はコントロールであるｃＰＦＤ−ＮＥＳ−ＧＦＰ発現細胞に対し、ｐ＜０．００５（Ｎ＝５）で有意であることを示す。）。したがって、ＳＹＧ／ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは顕著な細胞死誘導を示すことが明らかとなった。
【００４３】
［実施例６］人工合成タンパク質の凝集性
ＡＬＳ／ＦＴＤ患者の脳組織を生化学的に解析すると、蓄積ＲＮＡ結合蛋白の凝集性がウェスタンブロットで観察されることが特徴とされる（非特許文献１７、１８）。そこで、人工合成遺伝子を細胞に導入し、タンパク質の凝集が観察されるか検討を行った。ＨＥＫ２９３細胞にＳＹＧ／ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰを導入４８時間後、プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、シグマ社製）を含むｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）含有ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２５％  ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で処理し、ソニケーション後、定法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開しウサギ抗ＧＦＰ抗体（ロックランド社製）を一次抗体、ＨＲＰ標識した抗ウサギ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）、ＥＣＬ試薬（パーキンエルマー社製）を用い、ウェスタンブロットを行った。
【００４４】
図６に示すように、両タンパク質は、スタッキングゲルにスメアを形成し（図６中、＊で示す領域。）強い凝集性を示していた。すなわち、本発明の人工合成遺伝子はＡＬＳ／ＦＴＤ患者の脳組織で観察される凝集性を再現しているものと考えられる。
【００４５】
［実施例７］定常発現細胞株の作製
研究を効率化するため定常発現細胞株を作製した。ネオマイシン耐性プラスミドをバックボーンに持つＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰ、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰを神経細胞株Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に導入し、０．６ｍｇ／ｍｌジェネティシンで４週間セレクションを行った。その後０．３ｍｇ／ｍｌジェネティシンで維持培養を行い、蛍光顕微鏡で発現を確認した。図７に示すように、両導入タンパク質を定常発現したマウス神経細胞株を樹立できた。これら細胞株は安定して人工合成タンパク質を発現していることから、安定的にＡＬＳ／ＦＴＤの病態解明、創薬スクリーニング等の実験に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
上記実施例を挙げて示してきたように、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰとＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは、ＡＬＳ／ＦＴＤ関連遺伝子の重要な特性を備え、その特性を強調した遺伝子であり、ＡＬＳ／ＦＴＤの分子病態の生化学的、細胞生物学的研究に有用である。特に、ＳＹＧＱ−ＮＥＳ−ＧＦＰは封入体形成過程研究に、ＳＹＧ−ＮＥＳ−ＧＦＰは細胞毒性の研究に利用可能である。また、上記定常発現細胞株は、頻回の遺伝子導入の必要がなくＡＬＳ／ＦＴＤの病態研究を効率的推進させることができる。
【００４７】
これら人工合成遺伝子、あるいは、人工合成遺伝子導入細胞株や動物モデルを用いることにより、ＡＬＳ／ＦＴＤの病態を解明することが可能となるだけではなく、ＡＬＳ／ＦＴＤを根本的に治療可能な創薬スクリーニングを行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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