(57)【要約】【課題】本発明の目的は、ノブドウ、あるいはノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを含有することを特徴とする、ヒアルロン酸合成促進剤を提供することである。【解決手段】ノブドウは、ヒアルロン酸合成促進作用を示すことから、優れたヒアルロン酸合成促進作用を有する食品、医薬部外品又は医薬品として利用できる。また、ヒアルロン酸量増加作用や関節疾患、生理的飛蚊症又は皮膚老化の予防改善作用を有する食品、医薬部外品又は医薬品として利用できる。更に、ノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを併用することで極めて著しいヒアルロン酸合成促進作用を示すため、より有用なヒアルロン酸量増加作用や関節疾患、生理的飛蚊症又は皮膚老化の予防改善作用を有する食品、医薬部外品又は医薬品として利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノブドウを含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項２】
ノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有するヒアルロン酸量増加剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有する関節疾患予防改善剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有する生理的飛蚊症予防改善剤。
【請求項６】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有する皮膚老化予防改善剤。
【請求項７】
請求項１又は２記載のヒアルロン酸合成促進剤を含有するヒアルロン酸合成促進用、ヒアルロン酸量増加用、関節疾患予防改善用、生理的飛蚊症予防改善用、又は皮膚老化予防改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノブドウ、あるいはノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを有効成分とするヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロン酸量増加剤、関節疾患予防改善剤、生理的飛蚊症予防改善剤、皮膚老化予防改善剤、及びこれらの用途を有する食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの一種で、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。生体内では、皮膚、関節、眼球硝子体、脳、血管等に広く分布している。また、非常に多量の水と結合する性質を有しており、関節や皮膚では、コラーゲン等と共に細胞外マトリックスを形成することで組織や細胞の機能、形態の維持に重要な役割を果たしている。生体内のヒアルロン酸量はヒアルロン酸合成酵素とヒアルロン酸分解酵素による合成と分解のバランスによって決定され、皮膚や関節等に存在するヒアルロン酸量は加齢とともに減少することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
関節において、ヒアルロン酸は関節軟骨や関節液に存在し、運動による衝撃を吸収したり、潤滑性により動きを滑らかにする役割を担っており、関節疾患にも深く関与している。例えば、正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬに減少することが知られている（非特許文献３）。他にも、化膿性関節炎、痛風性関節炎等においてもヒアルロン酸量の減少が起こることが知られている（非特許文献４）。また、関節疾患を改善するための手段としてヒアルロン酸量を増加させることが考えられており、慢性関節リウマチ、外傷性関節炎、変形性関節症がヒアルロン酸の関節注入療法による改善が報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。このように関節のヒアルロン酸量を増加させることは関節疾患の治療に有効であるが、治療は医師の処方を必要とすることから、日常生活の中で簡便に利用することができるヒアルロン酸合成促進剤が好ましいといえる。また、疼痛の原因の一つであり、ＩＬ１β等の炎症性サイトカインによって惹起される炎症を抑制することで関節疾患を予防、治療する手段も提案されているが（特許文献１）、運動による衝撃を緩和しきれないことで生じる疼痛や動きの滑らかさを改善するには関節のヒアルロン酸量を増加させる必要がある。加えて、変形性関節症等では軟骨細胞のコラーゲン合成低下とコラーゲン分解亢進が起きることが報告されていることから、前述のヒアルロン酸合成促進剤がコラーゲン合成促進作用とコラーゲン分解抑制作用を有していれば、より効果的な関節疾患予防改善剤が得られると考えられる。
【０００４】
皮膚において、ヒアルロン酸は主に真皮層に存在し、皮膚の保湿や弾力性に寄与している。皮膚におけるヒアルロン酸合成は主に真皮層に存在する線維芽細胞が担っている。しかし、加齢や各種ストレスにより、皮膚のヒアルロン酸量は減少し、その結果、乾燥、肌荒れ、しわの形成、皮膚のたるみ、はりの消失、バリア機能の低下等の皮膚の老化をもたらすとされている。そのため、生体内のヒアルロン酸量を増加させることで、皮膚中のヒアルロン酸量が減少することで生じる皮膚老化を改善することができる。そのため、このような皮膚老化の改善剤として、ヒアルロン酸を配合した化粧料が数多く提案され、ヒアルロン酸の合成を促進したり（特許文献２）、分解酵素を阻害する技術（特許文献３）も提示されているが、外用剤よりも食品、内服剤がより好ましいと考える。
【０００５】
飛蚊症とは、視界内に糸くずや蚊のように見える薄い影が現れる症状で、目の内部を満たす硝子体内の混濁が網膜上に影を落とすことで発生する。飛蚊症は大きく２種類に分けることができ、加齢や紫外線、活性酸素等の影響で発症する生理的飛蚊症と網膜剥離、網膜裂孔、硝子体出血、ぶどう膜炎等の疾患の一症状として現れる病的飛蚊症がある。生理的飛蚊症は、硝子体の主要成分であるヒアルロン酸の減少による液状化と、それに伴うコラーゲン線維の分解で硝子体内が混濁することで生じる。治療法として、硝子体切除手術やレーザー治療があるが、これらの施術は安全性の観点から日本ではあまり行われていないという実情があり、外国で治療を行うには多額の費用が必要となる。そのため、生理的飛蚊症を予防改善するためには日常的に利用可能なヒアルロン酸合成促進剤が望まれる。
【０００６】
ノブドウは、中国では漢方の生薬として古くから飲用されており、解毒や肝機能改善効果があるとされている。また、薬理作用として、ノブドウの果実をアルコールで浸出した浸出液を主成分として成る肝硬変の予防及び治療剤（特許文献４）、ノブドウ根のメタノール冷浸エキスを酢酸エチル−水混合溶媒で分配し、酢酸エチル層を濃縮して得られるノブドウ根抽出物よりなる肝疾患治療剤（特許文献５）、ノブドウに含まれる没食子酸エステルの有効量を含む線維化抑制剤（特許文献６）、ノブドウのエキスを主成分とする免疫調節剤（特許文献７）、ノブドウ抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物（特許文献８）等が知られている。しかしながら、ノブドウのヒアルロン酸合成促進作用については知られていない。
【０００７】
Ｎ−アセチルグルコサミンはグルコースの２位ヒドロキシル基がアセチルアミノ基に置換された単糖で、ヒアルロン酸の構成成分、甲殻類の殻や菌体の細胞壁に含まれるキチンの構成成分である。Ｎ−アセチルグルコサミンは皮膚細胞や軟骨細胞のヒアルロン酸産生を促進することが知られている（非特許文献７、非特許文献８）。また、経口摂取することで、肌の乾燥や変形性関節症を改善するという報告がある（特許文献９、非特許文献９）。しかしながら、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用した場合のヒアルロン酸合成促進作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５９００８１５号公報
【特許文献２】特開２００１−１６３７９４号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９６号公報
【特許文献４】特開昭６０−７９７４号公報
【特許文献５】特開平２−４８５３３号公報
【特許文献６】特開平５−２７１０６７号公報
【特許文献７】特開平８−３０５２号公報
【特許文献８】特開２０１０−１２０９４６号公報
【特許文献９】特許第４２４９８５３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．Ｏ．Ｌｏｎｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＲＢＯＨＹＤＲ．ＲＥＳ.  １５９，１２７−１３６（１９８７）
【非特許文献２】岡本影夫、日本バイオレオロジー学会誌、１３（４）、１７−２３（１９９９）
【非特許文献３】Ｂａｌａｚｓ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  １０，３５７−３７６（１９６７）
【非特許文献４】結合組成（金原出版）、４８１頁（１９８４）
【非特許文献５】炎症（日本炎症学会）、１１巻、１６頁（１９９１）
【非特許文献６】結合組織と疾患（講談社）、１５３頁、２４６頁（１９８０）
【非特許文献７】久保村大樹ら、Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ、３４（６），７８−８１（２００６）
【非特許文献８】Ｓｈｉｋｈｍａｎ  ＡＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １７，１０２２−１０２８（２００９）
【非特許文献９】梶本修身ら，新薬と臨床、５２（４）、７１−８２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ノブドウ、あるいはノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを含有するヒアルロン酸合成促進剤、ヒアルロン酸量増加剤、関節疾患予防改善剤、生理的飛蚊症予防改善剤、皮膚老化予防改善剤、及びこれらの用途を有する食品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはこれら課題を解決するために鋭意検討し、ブドウ科ノブドウ属に属するノブドウがヒアルロン酸合成促進作用を有し、更にノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用することで一層高いヒアルロン酸合成促進作用を示すことを見出した。ヒアルロン酸の合成を促進することで、ヒアルロン酸量増加剤、関節疾患予防改善剤、生理的飛蚊症予防改善剤、皮膚老化予防改善剤、及びこれらの用途を有する食品組成物として利用できることから本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に用いるノブドウ（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ）は、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）ノブドウ属（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ）に属する植物で、北海道から沖縄までの日本全土や中国等の東アジア一帯の山野に自生するつる性落葉低木である。生食やワイン原料として用いられるブドウ属とは異なり、ノブドウ属は食味が不味いため、漢方や園芸用植物として利用されている。別名として野葡萄、蛇葡萄、イヌブドウ、カラスブドウと言われることもある。本発明では、ブドウ科ノブドウ属に属する植物を用いることができ、使用する部位は特に限定されないが、例えば、植物体全体、部位（花、葉、茎、果実、果皮、種子等の地上部、根、もしくはこれらの混合物等）等が挙げられ、特に地上部を使用することが好ましい。
【００１３】
本発明は、ノブドウの植物体全体あるいは部位をそのまま用いても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ったものでも良い。また、溶媒での抽出物を用いても良い。抽出には、ノブドウの植物体全体あるいは部位をそのまま用いても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってから抽出を行っても良い。抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール類（１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。これらの溶媒は、１種又は２種以上を混合して用いても良い。本発明では地上部の抽出物を用いることが望ましく、抽出溶媒は水、低級アルコール等の極性溶媒、特に含水エタノールが好ましい。
【００１４】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００１５】
本発明の各組成物におけるノブドウの使用量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等によって適宜調整することができる。ノブドウ抽出物の乾燥物の１日当りの使用量として０．１ｍｇ〜２０００ｍｇが好ましく、特に１ｍｇ〜５０ｍｇで使用することが好ましい。上記範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えた量が必要となる場合もある。
【００１６】
Ｎ−アセチルグルコサミンは、グルコースの２位ヒドロキシル基がアセチルアミノ基に置換された単糖で、カニやエビ等の甲殻類の外殻を由来とする天然多糖類キチンを公知の方法、例えば酸及び酵素により加水分解して得られるものであり、それらの塩を用いても良い。また、市販品を使用することも可能である。
【００１７】
本発明の各組成物におけるＮ−アセチルグルコサミンの使用量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等によって適宜調整することができる。１日当りの使用量として１０ｍｇ〜５０００ｍｇが好ましく、特に２００〜２０００ｍｇが好ましい。上記範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えた量が必要となる場合もある。
【００１８】
本発明においては、ノブドウをＮ−アセチルグルコサミンと併用することによって、さらに高いヒアルロン酸合成促進作用をもたらすことができる。
【００１９】
本発明における関節疾患は、慢性関節リウマチ、化膿性関節炎、痛風性関節炎、外傷性関節炎、変形性関節症を対象とすることができる。また、日常で感じる関節の痛みや、きしみ、重さ、引っかかり、曲げづらさ、こわばり等の違和感も対象となる。また、関節疾患の部位としては、膝、股、肩、腰、顎、頚椎、脊椎等のあらゆる部位の関節を対象とすることができる。
【００２０】
本発明における皮膚老化は、皮膚中のヒアルロン酸量の減少、乾燥、かさつき、肌荒れ、しわの形成、皮膚のたるみ、はりの消失、皮膚バリア機能の低下を対象とすることができる。また、皮膚老化の部位としては、顔、首、背中、胸、腕、手、足、頭皮等全身の皮膚を対象とすることができる。
【００２１】
本発明における生理的飛蚊症は、加齢、紫外線、青色光、活性酸素、精神的ストレス、身体的ストレス等が原因となり生じる症状を対象とすることができる。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤は、食品、医薬部外品又は医薬品として用いることができる。特に、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、くま笹抽出物、リンデン抽出物、キャッツクロー抽出物等を含有することが望ましい。食品としては、飲料、硬カプセル、軟カプセル、タブレット、顆粒剤、ゼリー等として用いることができる。また、医薬部外品や医薬品では、経口用の散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤等、非経口用の注射剤、座剤等として用いることができる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤は、ノブドウをそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、必要に応じて通常の食品、医薬部外品又は医薬品に用いられる賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料等の成分を含有することもできる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のノブドウ、あるいはノブドウ及びＮ−アセチルグルコサミンを含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤は、ヒアルロン酸量増加作用、関節疾患予防改善作用、生理的飛蚊症予防改善作用、皮膚老化予防改善作用を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す含有量の％は重量％を示す。
【００２６】
以下に、ノブドウを用いた溶媒抽出物の製造例を示す。
【実施例１】
【００２７】
製造例１  ノブドウ３０％エタノール抽出物
ノブドウの地上部の破砕物２０ｇに精製水３５０ｍＬとエタノール１５０ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、ノブドウ３０％エタノール抽出物０．９ｇを得た。
【００２８】
製造例２  ノブドウ５０％エタノール抽出物
ノブドウの地上部の破砕物２５ｇに精製水２５０ｍＬとエタノール２５０ｍＬを加え、常温で５日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、ノブドウ５０％エタノール抽出物１．４ｇを得た。
【００２９】
製造例３  ノブドウ７０％エタノール抽出物
ノブドウの地上部の破砕物１０ｇに精製水１５０ｍＬとエタノール３５０ｍＬを加え、常温で６日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、ノブドウ７０％エタノール抽出物１．１ｇを得た。
【００３０】
製造例４  ノブドウエタノール抽出物
ノブドウの地上部の破砕物５０ｇにエタノール１０００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾液を濃縮乾固して、ノブドウエタノール抽出物１．２ｇを得た。
【００３１】
製造例５  ノブドウ熱水抽出物
ノブドウの地上部の破砕物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾液を濃縮し、凍結乾燥することでノブドウ熱水抽出物１．８ｇを得た。
【実施例２】
【００３２】
処方例１  飲料
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ３０％エタノール抽出物（製造例１）              ０．０５
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                                ２．００
３．マルチトール                                            ５．００
４．リンゴ酸                                                １．００
５．香料                                                    ０．５０
６．精製水                                                ９１．４５
[製造方法]成分１〜５を成分６の一部に攪拌溶解する。次いで、成分６の残りを加えて混合し、９０℃に加熱して３０ｍＬのガラス瓶に充填する。
[用法]１日当り１本（３０ｍＬ）を摂取する。
【００３３】
処方例２  飲料
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ３０％エタノール抽出物（製造例１）              ０．０５
２．マルチトール                                            ５．００
３．リンゴ酸                                                １．００
４．香料                                                    ０．５０
５．精製水                                                ９３．４５
[製造方法]成分１〜４を成分５の一部に攪拌溶解する。次いで、成分５の残りを加えて混合し、９０℃に加熱して３０ｍＬのガラス瓶に充填する。
[用法]１日当り１本（３０ｍＬ）を摂取する。
【００３４】
処方例３  飲料
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ５０％エタノール抽出物（製造例２）              ０．０２
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                                １．５０
３．コラーゲンペプチド                                    １５．００
４．マルチトール                                            ５．００
５．リンゴ酸                                                １．００
６．香料                                                    ０．５０
７．精製水                                                ７６．９８
[製造方法]成分１〜６を成分７の一部に攪拌溶解する。次いで、成分７の残りを加えて混合し、９０℃に加熱して３０ｍＬのガラス瓶に充填する。
[用法]１日当り１本（３０ｍＬ）を摂取する。
【００３５】
処方例４  散剤
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ７０％エタノール抽出物（製造例３）                ０．１
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                                ３０．０
３．乾燥コーンスターチ                                      ２５．０
４．微結晶セルロース                                        ４４．９
[製造方法]成分１〜４を混合し、散剤とする。
[用法]１日当り１包（３ｇ）を摂取する。
【００３６】
処方例５  錠剤
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ７０％エタノール抽出物（製造例３）                ２．５
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                                ４０．０
３．乳糖                                                    １０．０
４．コーンスターチ                                            ５．０
５．結晶セルロース                                          ４０．０
６．グリセリン脂肪酸エステル                                  ２．５
[製造方法]成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後、乾燥する。成型した顆粒に成分６を加えて混合し、打錠する。１錠０．５ｇとする。
[用法]１日当り４錠を摂取する。
【００３７】
処方例６  ゼリー
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウエタノール抽出物（製造例４）                      ０．３
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                                  １．５
３．カラギーナン                                              ２．０
４．ゼラチン                                                  １．０
５．砂糖                                                    ２７．０
６．精製水                                                  ６８．２
[製造方法]成分１〜６を混合し、加熱しながら煮詰め、ゼリーの型に流し込み、冷却する。
[用法]１日当り１個（１００ｇ）を摂取する。
【００３８】
処方例７  顆粒剤
処方                                                      含有量（％）
１．ノブドウ熱水抽出物（製造例５）                          ０．０５
２．Ｎ−アセチルグルコサミン                              ３０．００
３．乳糖                                                  ４９．９５
４．セルロース                                            ２０．００
[製造方法]成分１〜４を流動槽により造粒し、顆粒剤を得る。
[用法]１日当り１包（１ｇ）を摂取する。
【００３９】
比較例１  従来の飲料
処方例１の飲料において、ノブドウ３０％エタノール抽出物、Ｎ−アセチルグルコサミンを水に置換えたものを従来の飲料とした。
【００４０】
比較例２  Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料
処方例１の飲料において、ノブドウ３０％エタノール抽出物を水に置換えたものを、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料とした。
【実施例３】
【００４１】
試験例１  ノブドウによるヒアルロン酸合成促進作用の検討
軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５をＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）＋５％ＦＢＳ中でコンフルエントになるまで培養した後、分化誘導培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）＋５％ＦＢＳ＋１％Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ））に置換え、分化を開始した。分化開始７日目にノブドウ３０％エタノール抽出物（製造例１）を添加した。試料添加２４時間後に抽出したＲＮＡからｃＤＮＡ溶液を調製し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析はヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２で行った。その際、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部標準として、目的遺伝子とＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【００４２】
ＨＡＳ２用のプライマーセット
（配列番号１）ＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＡＴＧＴＡＣ
（配列番号２）ＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡ
【００４３】
試験例１の結果を表１に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物により、ＨＡＳ２の遺伝子発現量は増加した。よって、ノブドウ３０％エタノール抽出物には、ヒアルロン酸合成促進作用があることが示された。
【００４４】
【表１】
2018111657.tif 000002
【００４５】
尚、試験例１のノブドウによるヒアルロン酸合成促進作用の検討で、ノブドウ３０％エタノール抽出物を、製造例２、３、４，５のノブドウ抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、ノブドウによるヒアルロン酸量増加作用、関節疾患予防改善作用、生理的飛蚊症予防改善作用、及び皮膚老化予防改善作用が期待できる。
【００４６】
試験例２  ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンの併用によるヒアルロン酸合成促進作用の検討
線維芽細胞ＮＢ１をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＢＳ中でコンフルエントになるまで培養した後、ノブドウ３０％エタノール抽出物（製造例１）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。試料添加３０時間後に抽出したＲＮＡからｃＤＮＡ溶液を調製し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析はヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２で行った。その際、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部標準として、目的遺伝子とＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【００４７】
ＨＡＳ２用のプライマーセット
（配列番号３）ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ
（配列番号４）ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ
【００４８】
試験例２の結果を表２に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物により、ＨＡＳ２の遺伝子発現量は増加した。また、ノブドウ３０％エタノール抽出物とＮ−アセチルグルコサミンを個別に添加するよりも同時に添加した場合の方が、ＨＡＳ２の遺伝子発現量は極めて著しく増加した。よって、ノブドウ３０％エタノール抽出物には、ヒアルロン酸合成促進作用があり、Ｎ−アセチルグルコサミンと併用することで、極めて著しいヒアルロン酸合成促進作用があることが示された。
【００４９】
【表２】
2018111657.tif 000003
【００５０】
尚、試験例２のノブドウとＮ−アセチルグルコサミンの併用によるヒアルロン酸合成促進作用の検討で、ノブドウ３０％エタノール抽出物を、製造例２、３、４，５のノブドウ抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用することで、極めて著しいヒアルロン酸量増加作用、関節疾患予防改善作用、生理的飛蚊症予防改善作用、及び皮膚老化予防改善作用が期待できる。
【００５１】
試験例３  軟骨細胞を用いた関節疾患予防改善作用の検討
試験例１と同様の方法でＡＴＤＣ５を分化させ、分化開始７日後にＩＬ１β（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）１ｎｇ／ｍＬ及びノブドウ３０％エタノール抽出物（製造例１）を添加した。試料添加２４時間後に遺伝子発現解析及び蛍光免疫染色を行った。遺伝子発現解析は試験例１と同様の方法で行い、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２、ヒアルロン酸分解酵素ＨＹＡＬ１、コラーゲン合成酵素ＣＯＬ２、コラーゲン分解酵素ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、軟骨細胞の転写因子ＨＩＦ２Ａ、ＳＯＸ９、ＩκＢα、ｐ５０、ｐ６５、炎症性サイトカインＩＬ１β、ＩＬ６を測定し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。免疫蛍光染色は、試料添加２４時間後に４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで置換えて１５分間常温静置し、ＮＦκＢ  ｐ６５（Ｃ２０）（コスモバイオ）、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）で染色を行い、ＮＦκＢが核内移行した細胞数の割合を比較した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
【００５２】
ＨＹＡＬ１用のプライマーセット
（配列番号５）ＧＴＡＣＣＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＣＡＧ
（配列番号６）ＣＴＣＡＧＧＡＴＡＡＣＴＴＧＧＡＴＧＧＣ
ＣＯＬ２用のプライマーセット
（配列番号７）ＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡ
（配列番号８）ＴＣＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＣＣＡＡＡＣＣＣ
ＭＭＰ３用のプライマーセット
（配列番号９）ＴＧＡＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＡＴ
（配列番号１０）ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡ
ＭＭＰ１３用のプライマーセット
（配列番号１１）ＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＣＧＡ
（配列番号１２）ＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＧ
ＨＩＦ２Ａ用のプライマーセット
（配列番号１３）ＧＡＴＡＡＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴ
（配列番号１４）ＴＡＧＴＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＡＡＧＴＣＣＣ
ＳＯＸ９用のプライマーセット
（配列番号１５）ＡＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣ
（配列番号１６）ＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧ
ＩκＢα用のプライマーセット
（配列番号１７）ＡＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＧＡ
（配列番号１８）ＣＡＴＣＡＴＡＧＧＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣ
ｐ５０用のプライマーセット
（配列番号１９）ＣＴＴＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＧＧ
（配列番号２０）ＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣ
ｐ６５用のプライマーセット
（配列番号２１）ＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣ
（配列番号２２）ＡＣＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣ
ＩＬ１β用のプライマーセット
（配列番号２３）ＧＡＴＧＡＴＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＡ
（配列番号２４）ＧＴＴＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＡＧ
ＩＬ６用のプライマーセット
（配列番号２５）ＴＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡ
（配列番号２６）ＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＴＴ
【００５３】
試験例３の遺伝子発現解析の結果を表３に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物は、ＩＬ１βによるＨＡＳ２、ＣＯＬ２、ＳＯＸ９の減少を抑制した。また、ノブドウ３０％エタノール抽出物は、ＩＬ１βによるＨＹＡＬ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＩκＢα、ｐ５０、ｐ６５、ＩＬ１β、ＩＬ６の増加を抑制した。よって、ノブドウ３０％エタノール抽出物による関節疾患予防改善作用が期待できる。
【００５４】
【表３】
2018111657.tif 000004
【００５５】
試験例３の蛍光免疫染色の結果を表４に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物により、ＩＬ１βによるＮＦκＢが核内移行した細胞数の割合の増加が抑制された。よって、ノブドウ３０％エタノール抽出物による関節疾患予防改善作用が期待できる。
【００５６】
【表４】
2018111657.tif 000005
【００５７】
尚、試験例３の軟骨細胞を用いた関節疾患予防改善作用の検討で、ノブドウ３０％エタノール抽出物を、製造例２、３、４，５のノブドウ抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、ノブドウによる関節疾患予防改善作用が期待できる。
【００５８】
試験例４  関節疾患モデルを用いた関節疾患予防改善作用の検討
関節疾患のモデルとして関節炎誘発マウスを以下の方法を用いて作製した。始めに、ウシ関節由来ＩＩ型コラーゲン（コラーゲン技術研修会）に等量のフロイント完全アジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を添加し、混合して均一なエマルジョン溶液を調製した。次いで、６週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウスに対し、調製したエマルジョン溶液０．１ｍＬを尾部皮内投与した。１回目の投与から２１日後、上記フロイント完全アジュバントをフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に換えて調製したエマルジョン溶液を尾部皮内投与し、関節炎を誘発した。試験では、対照群、関節炎誘発マウス群、関節炎誘発マウス＋２％ノブドウ３０％エタノール抽出物群の３群を設けた。関節炎誘発マウス＋２％ノブドウ３０％エタノール抽出物群には、ノブドウ３０％エタノール抽出物を２％混合した粉末飼料を、１回目の投与後から自由摂取させた。１回目の投与後２１日目から３５日目まで経時的に、マウスの四肢における関節炎発症の程度を目視により判断し、発症率の算出、関節炎スコア判定、後肢肥厚測定を行った。関節炎スコアは０点（指の腫脹を認めない）、１点（１〜２本の腫脹を認める）、２点（３〜５本の腫脹や、紅斑を認める）、３点（指や足全体に強い腫脹と紅斑を認める）、４点（肢全体に強い腫脹と紅斑を認める）として１肢毎に判定を行い、四肢の合計を個体当りの関節炎スコアとして算出した。後肢肥厚は足の甲と足底の距離を厚み測定器（ＰＥＡＣＯＣＫ）を用いて測定した。また、３５日目には右後肢の皮膚、筋肉を除く膝関節周辺組織を採取し、試験例１と同様の方法で遺伝子発現解析を行った。ＨＹＡＬ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＩＬ１β、ＩＬ６を測定し、目的遺伝子と内部標準であるＧＡＰＤＨの比率から発現量を算出した。
【００５９】
試験例４の発症率の結果を表５、関節炎スコアの結果を表６、後肢肥厚の結果を表７に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物を摂取することで、関節炎誘発マウスにおける発症率、関節炎スコア、後肢肥厚の増加が抑制された。試験例４の遺伝子発現解析の結果を表８に示す。ノブドウ３０％エタノール抽出物を摂取することで、関節炎誘発マウスにおけるＨＹＡＬ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＩＬ１β、ＩＬ６の増加が抑制された。ノブドウ３０％エタノール抽出物は、ヒアルロン酸、コラーゲンの分解と炎症を抑制する作用を示すことから、ノブドウによる関節疾患予防改善作用が期待できる。
【００６０】
【表５】
2018111657.tif 000006
【００６１】
【表６】
2018111657.tif 000007
【００６２】
【表７】
2018111657.tif 000008
【００６３】
【表８】
2018111657.tif 000009
【００６４】
尚、試験例４の関節疾患モデルを用いた関節疾患予防改善作用の検討で、ノブドウ３０％エタノール抽出物を、製造例２、３、４，５のノブドウ抽出物に置き換えた場合のいずれにおいても同様の効果が得られた。以上の結果から、ノブドウによる関節疾患予防改善作用が期待できる。
【００６５】
試験例５  関節疾患予防改善作用の検討
日常生活で膝、肩、腰等の関節の痛みや違和感を感じている男女４０人（３５〜８９歳）を１０人ずつ４群に分け、それぞれにノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料（処方例１）、ノブドウを含有する飲料（処方例２）、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料（比較例２）、従来の飲料（比較例１）を用いて、１回３０ｍＬを１日１回、３ヶ月間摂取させた。本試験による違和感とは、きしみ、重さ、引っかかり、曲げづらさ、こわばり等を指す。飲用３ヵ月後に、関節の痛みや違和感の自覚症状に関するアンケートを行った。アンケートでは、関節の痛みや違和感が、「改善した」「やや改善した」「変化なし」「悪化した」の４段階の回答を設け、「改善した」を２点、「やや改善した」を１点、「変化なし」を０点、「悪化した」を−１点として、関節の痛みや違和感の自覚症状の合計点を算出した。
【００６６】
試験例５の関節の痛みや違和感の自覚症状に関するアンケートの結果を表９に示す。その結果、従来の飲料を摂取した群と比較して、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料を摂取した群とノブドウを含有する飲料を摂取した群で関節の痛みや違和感の自覚症状が改善した。さらに、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料を摂取した群は他の群と比較して関節の痛みや違和感の自覚症状が極めて著しく改善した。よって、ノブドウは関節の痛みや違和感の自覚症状を改善することから、関節疾患予防改善作用が示された。また、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用することで、極めて著しい関節疾患予防改善作用が示された。なお、試験期間中、膝、肩、腰等の関節の痛みや違和感以外の不調や体調悪化を訴えた被験者は一人もいなかった。
【００６７】
【表９】
2018111657.tif 000010
【００６８】
試験例６  生理的飛蚊症予防改善作用の検討
日常生活で生理的飛蚊症の症状である視界内の小さな影が気になる男女６０人（２５〜７０歳）を１５人ずつ４群に分け、それぞれにノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料（処方例１）、ノブドウを含有する飲料（処方例２）、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料（比較例２）、従来の飲料（比較例１）を用いて、１回３０ｍＬを１日１回、３ヶ月間摂取させ、飲用３ヵ月後の視界内の小さな影の自覚症状に関するアンケートを行った。アンケートでは、視界内の小さな影が、「見えなくなった」「少なくなった」「変化なし」「多くなった」の４段階の回答を設け、「見えなくなった」を２点、「少なくなった」を１点、「変化なし」を０点、「多くなった」を−１点として、視界内の小さな影の自覚症状の合計点を算出した。
【００６９】
試験例６の視界の自覚症状に関するアンケートの結果を表１０に示す。その結果、従来の飲料を摂取した群と比較して、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料を摂取した群とノブドウを含有する飲料を摂取した群で視界内の小さな影の自覚症状が改善した。さらに、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料を摂取した群は他の群と比較して視界内の小さな影の自覚症状が極めて著しく改善した。よって、ノブドウは視界内の小さな影の自覚症状を改善することから、生理的飛蚊症予防改善作用が示された。また、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用することで、極めて著しい生理的飛蚊症予防改善作用が示された。なお、試験期間中、視界の小さな影以外の不調や体調悪化を訴えた被験者は一人もいなかった。
【００７０】
【表１０】
2018111657.tif 000011
【００７１】
試験例７  皮膚老化予防改善作用の検討
日常生活でしわが気になる男女４０人（２０〜７８歳）を１０人ずつ４群に分け、それぞれにノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料（処方例１）、ノブドウを含有する飲料（処方例２）、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料（比較例２）、従来の飲料（比較例１）を用いて、１回３０ｍＬを１日１回、３ヶ月間摂取させた。飲用３ヵ月後に、しわの自覚症状に関するアンケートを行った。アンケートでは、しわが、「減少した」「やや減少した」「変化なし」「増加した」の４段階の回答を設け、「減少した」を２点、「やや減少した」を１点、「変化なし」を０点、「減少した」を−１点として、しわの自覚症状の合計点を算出した。
【００７２】
試験例７のしわの自覚症状に関するアンケートの結果を表１１に示す。その結果、従来の飲料を摂取した群と比較して、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する従来の飲料を摂取した群とノブドウを含有する飲料を摂取した群でしわの自覚症状が改善した。さらに、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを含有する飲料を摂取した群は他の群と比較してしわの自覚症状が極めて著しく改善した。よって、ノブドウはしわの自覚症状を改善することから、皮膚老化予防改善作用が示された。また、ノブドウとＮ−アセチルグルコサミンを併用することで、極めて著しい皮膚老化予防改善作用が示された。なお、試験期間中、しわの悩み以外の不調や体調悪化を訴えた被験者は一人もいなかった。
【００７３】
【表１１】
2018111657.tif 000012
【００７４】
ノブドウはヒアルロン酸合成促進作用を有し、更にＮ−アセチルグルコサミンと組み合わせて使用することで極めて著しいヒアルロン酸合成促進作用を示すことが明らかとなった。以上の作用を有することから、ヒアルロン酸量増加剤、関節疾患予防改善剤、生理的飛蚊症予防改善剤、皮膚老化予防改善剤、及びこれらの用途を有する食品組成物に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、ヒアルロン酸合成促進作用を有することから、ヒアルロン酸量増加、関節疾患予防改善、生理的飛蚊症予防改善、皮膚老化予防改善を目的とした食品、医薬部外品、医薬品に利用できる。また、本発明によって、これらの予防改善がより簡便な方法で行うことが可能となる。
【配列表】
2018111657000001.app