(57)【要約】【課題】認知症の病態を適切に表現する認知症モデル動物を提供する。【解決手段】GluN1-NT抗体を非ヒト動物に投入する工程を含む。認知症は、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病、又は、前頭側頭型認知症の何れかである。GluN1-NT抗体は、GluN1（NR1）分子の細胞外N末のペプチドを抗原とする抗体である。本発明の認知症モデル動物は、記憶障害、不安症状、社会的交流障害といった認知症の特徴を示す。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
GluN1-NT抗体を非ヒト動物に投入する工程を含むことを特徴とする認知症モデル動物の製造方法。
【請求項２】
前記GluN1-NT抗体を前記非ヒト動物の海馬に投入することを特徴とする請求項１項に記載の認知症モデル動物の製造方法。
【請求項３】
前記認知症は、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病、又は、前頭側頭型認知症の何れかであることを特徴とする請求項１又は２項に記載の認知症モデル動物の製造方法。
【請求項４】
前記非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の認知症モデル動物の製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法により得られる認知症モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症モデル動物の製造方法及びその方法により得られる認知症モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は８５歳以上の日本人口の約２５％が発症するcommon diseaseであり、アルツハイマー型認知症がそのうち約半数を占めている。アルツハイマー型認知症（以下、Alzheimer's disease;ＡＤと略することがある。）は、認知機能低下や人格の変化を主な症状とする。現在の日本には約１８０万人のアルツハイマー型認知症の患者が存在し、今後の高齢化に従い患者数は増加の一途を辿る。
【０００３】
ＡＤの臨床症状は、(i)記憶障害、見当識障害、遂行機能障害等の認知症状（中核症状）と、(ii)不安感や恐怖感等を背景として生じる妄想、易怒性、徘徊等の多彩な行動・心理症状（いわゆる周辺症状）に大別されるが、さらに(iii)より高次なメタ認知の障害としての社会参加や対人交流技能の障害（社会的交流障害）、生活管理能力の障害や作業遂行能力の低下による生活活動上の障害等、認知症に特有な社会生活上の症状が生じる。
【０００４】
アルツハイマー型認知症の発症メカニズムとしてアミロイドカスケード説が提唱されている。アミロイドカスケードとは、加齢に伴うアミロイドベータ（以下、Ａβと略することがある。）が蓄積した老人斑が引き金となり、炎症反応の発生や、最終的な神経細胞の機能不全（細胞死）に至る経路である。
【０００５】
一方、アルツハイマー型認知症の脳では、Ａβが蓄積した老人斑だけでなく、リン酸化タウタンパク質が蓄積した神経原線維変化が形成されることが知られており、神経原線維変化数、神経脱落数、及び、認知機能低下には相関があることが知られている。
【０００６】
このようにアルツハイマー型認知症の発症メカニズムには複数の説が提唱されており、発症メカニズムの複雑さから有効な予防法や治療法が確立されていない。そのためアルツハイマー型認知症の原因の解明とその予防法、そして治療法及び治療薬の確立開発のためにはモデル動物が不可欠である。
【０００７】
認知症モデル動物としては、複数のモデル動物が提唱されており、例えばラットに対して両側総頸動脈永久閉塞を行なうことにより、慢性の脳虚血又は大脳白質病変が生じ、認知機能の低下又は学習機能の低下が認められることが報告されている（非特許文献１，２，３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tomimoto, H. et al., Acta Neuropathol(Berl).(2003) 106:527-534
【非特許文献２】Wakita. H. et al., Acta Neuropathol(Berl).(1994) 87:484-492
【非特許文献３】Hattori. H. et al., Acta Neuropathol(Berl).(1992) 84:437-442
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上述のモデル動物は、記憶障害、不安症状、社会的交流障害といったアルツハイマー型認知症の特徴を適切に表現するものではない。
【００１０】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、アルツハイマー型認知症をはじめとする認知症の特徴を適切に表現する認知症モデル動物の製造方法及びその方法により得られる認知症モデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にかかる認知症モデル動物の製造方法は、GluN1-NT抗体を非ヒト動物に投入する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アルツハイマー型認知症をはじめとする認知症の特徴を適切に表現する認知症モデル動物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】NMDA型GluR（NR）に対する抗体とその抗原認識部位を説明する図である。
【図２】ウサギGluN1-NT抗体をマウスに投与するスケジュールを説明する図である。
【図３】高架式十字迷路試験のオープンアームでの滞在時間の結果を示す図である。
【図４】高架式十字迷路試験のオープンアームへの侵入回数の結果を示す図である。
【図５】受動回避試験潜時の結果を示す図である。
【図６】社会的行動観察試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本実施形態にかかる認知症モデル動物は、GluN1-NT抗体を非ヒト動物に投入する工程を含む。
【００１６】
認知症モデル動物は、ヒトの認知症の病態を反映した動物であり、該動物を用いて、認知症発症のメカニズムの解明、処置法・予防法の探索が可能である。認知症は、例えば、アルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病、又は、前頭側頭型認知症の何れかである。
【００１７】
非ヒト動物は、好ましくは齧歯目動物であり、より好ましくはマウスである。
【００１８】
本実施形態にかかる発明では、NMDA型グルタミン酸受容体抗体におけるGluN1-NT抗体（NR1-NT抗体）を使用する。図１に、NMDA型GluR（NR）に対する抗体とその抗原認識部位を示す。
【００１９】
ELISA法による抗体は、サブユニットの一部のドメインの合成ペプチドを抗原として用い、ELISAで検出する抗体であり、GluN1-NT抗体は、GluN1（NR1）分子の細胞外N末のペプチドを抗原とする抗体である。
【００２０】
NMDA型グルタミン酸受容体抗体は、非ヒト動物の側脳室に投入され、好ましくは海馬に投入される。
【００２１】
投与量については、特に限定されるものではないが、例えば8mg/mL〜12mg/mL好ましくは10mg/mLのGluN1-NT抗体を、非ヒト動物の海馬に2.4μL〜3.6μL好ましくは3.0μLを７日おきに計２回投与することが可能である。
【００２２】
本実施形態にかかる認知症モデル動物は、短期間で作成可能であり、認知症の特徴である記憶障害、不安症状、及び、社会的交流障害を適切に表現する。本実施形態にかかる認知症モデル動物は、創薬において、行動解析のみならず、遺伝子発現変化による定量的な解析評価が可能である。
【実施例】
【００２３】
（１）認知症モデル動物の作成及び検査スケジュール
ヒトNMDA型グルタミン酸受容体のサブユニットの一つであるGluN1のＮ末ペプチド（GluN1-NTペプチド：QKR LET LLE ERE SK(配列番号１)）で家兎を免疫し、ポリクローナルIgG抗体（ウサギGluN1-NT抗体）を得た。ウサギGluN1-NT抗体がGluN2BとGluN1を発現するHEK細胞と反応することを確認した後、予め脳内にカニューラを留置したマウス脳室内に１週おきにウサギGluN1-NT抗体を2回投与した（図２）。マウスの行動観察を盲検下にて実施し、中枢神経系への影響を検討した。対照として、生理食塩液投与群、正常ウサギ血清protein A 吸着fraction（以下、正常ウサギ血清）投与群を用いた。
【００２４】
マウスには、Day0（初回投与日）及びDay7に計２回、１回あたり１０mg/mLの濃度のものを３μL/head投与した。行動観察は、Day0、Day7の投与前及びDay14に盲検下にて実施した。
（２）高架式十字迷路試験（Elevated plus-maze test）による行動解析
高架式十字迷路試験に使用した高架式十字迷路は、高所で壁の無い通路（オープンアーム）と、壁で囲まれた通路（エンクローズドアーム）とが十字型に交差した迷路であった。迷路の高さは床から60cmの高さに設置し、各アーム長は30cm、アーム幅は6cmであった。10分間の行動を目視及びビデオ記録で観察し、オープンアームとエンクローズドアームとでの滞在時間及び侵入回数を測定した。
【００２５】
高架式十字迷路試験のオープンアームでの滞在時間の結果を図３に示す。図３に示すように、高架式十字迷路試験のオープンアームでの滞在時間は、GluN1-NT抗体投与群では生食投与群に比べて有意に低下しており、不安感や恐怖感の増加を示唆した。
【００２６】
高架式十字迷路試験のオープンアームへの侵入回数の結果を図４に示す。図４に示すように、高架式十字迷路試験のオープンアームへの侵入回数は、３群とも低下していくが、Day14においてGluN1-NT抗体投与群では生食投与群に比べて有意に低下しており、不安感や恐怖感の増加を示唆した。
【００２７】
以上の結果から、ウサギGluN1-NT抗体をマウス海馬に投与することで、マウスに不安感や恐怖感をもたらすことが判明した。
（３）受動回避試験（Passive avoidance test）による行動解析
受動回避試験ではメルクエスト社の受動的回避実験装置MPB-M010(暗室進入感知センサー付装置)を使用した。明室と暗室のつながった装置であり、明室寸法は100(w)×100(D)×145(H)であり、暗室寸法は180(w)×180(D)×145(H)であった。動物が明室から暗室に入った際に電気刺激を与えることにより、暗室への進入とショックの恐怖を関連づけて記憶させる試験（受動的回避試験）に使用する装置である。
【００２８】
装置の明室側にマウスを入れ、その20秒後に扉を開け、暗室への移動を可能にし、マウスが暗室に移動後に電気刺激(0.3mA,3秒間)を加えた。
【００２９】
暗室への侵入と電気刺激による痛みである恐怖を関連づけて記憶させ、動物が嫌悪刺激（電気刺激）に対する記憶を取得し、明室に留まった時間が300秒以上であることを確認、学習が成立したとみなした。
【００３０】
訓練試行で恐怖記憶が獲得できているマウスを用い、海馬に試験薬を投与した後、各検査時点の暗室への移行時間を反応潜時として最長５分間測定した。受動回避試験潜時の結果を図５に示す。図５に示すように、潜時は３群とも低下していくが、Day14においてGluN1-NT抗体投与群では他の２群に比べて有意に低下しており、長期記憶障害を示唆した。
【００３１】
以上の結果から、ウサギGluN1-NT抗体をマウス海馬に投与することで、マウスに長期記憶障害をもたらすことが判明した。
（４）社会的行動観察試験（Social interaction test）による行動解析
社会的行動観察試験ではメルクエスト社の小動物行動解析装置(SCANET MV-40,SIモード)を使用して10分間測定した。本体外形寸法は560(W)×560(D)×330(H)であった。
【００３２】
見知らぬ２匹のネズミが互いに接近(接触)しているとき、運動を伴うActive social interaction(２匹が接触して動いている状態)と運動を伴わないPassive social interaction(２匹が接触して止まっている状態)の回数、時間、運動量を同時にビデオ撮影し、匂い嗅ぎ行動、追随行動、グルーミング回数及び時間を測定した。
【００３３】
社会的行動観察試験の結果を図６に示す。図６に示すように、活性化社会的交流の一つである匂い嗅ぎ行動回数は、生食群、正常群では投与経過で変化がなかったが、GluN1-NT抗体投与群では投与経過で低下する傾向にあった。Day14ではGluN1-NT抗体投与群では他の２群に比べて有意に低下しており、Sniffingが減少していた。
【００３４】
以上の結果から、ウサギGluN1-NT抗体をマウス海馬に投与することで、マウスに社会的交流障害をもたらすことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
認知症病態解析、抗認知症薬開発に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１：抗原
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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