(57)【要約】      （修正有）【課題】狂犬病ウイルス株のＧタンパク質に由来し、予想外の特性を示す、ニューロンの再生および保護のためのＭＡＳＴ２高親和性ポリペプチドおよびその使用方法の提供。【解決手段】細胞質ドメインを含むまたはからなる、３５０アミノ酸以下のポリペプチドであって、前記細胞質ドメインはＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインのサイズは１１〜１３アミノ酸残基であり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最初の２つの残基はＳおよびＷであり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最後の４つの残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、前記ポリペプチドは、ＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへのＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ配列を含む狂犬病ウイルスＧタンパク質の結合親和性より高い、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの結合親和性を呈するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質ドメインを含むまたはからなる、３５０アミノ酸以下のポリペプチドであって、前記細胞質ドメインはＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインのサイズは１１〜１３アミノ酸残基であり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最初の２つの残基はＳおよびＷであり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最後の４つの残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインは：
（Ａ）サイズが１１残基であり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基であり（配列番号１９）、式中、Ｘ1は任意のアミノ酸、好ましくはＥもしくはＡ（配列番号２０および２１）、より好ましくはＥであり、および／またはＸ2はＳ、ＥもしくはＶ、より好ましくはＶ（配列番号２２〜２４）である配列；
（Ｂ）サイズが１１残基であり：ＳＷＸ1ＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号７６）、ＳＷＸ1ＳＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号７７）、ＳＷＸ1ＳＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号７８）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号７９）、ＳＷＸ1ＳＨＫＳＱＴＲＬ（配列番号８０）、ＳＷＸ1ＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号８６）、ＳＷＸ1ＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号８７）、ＳＷＸ1ＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号８８）、ＳＷＸ1ＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号８９）、ＳＷＸ1ＳＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号９０）、ＳＷＸ1ＳＨＳＧＱＴＲＬ（配列番号９１）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号９２）およびＳＷＸ1ＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号９３）からなる群から選択され、式中、Ｘ1は任意のアミノ酸、好ましくはＥまたはＡ、より好ましくはＥである配列（配列番号８１〜８５および９４〜１０１）；
（Ｃ）サイズが１２残基であり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸残基であり（配列番号１１２）、式中、Ｘ1は好ましくはＥもしくはＡ、より好ましくはＥであり、および／またはＸ2はＳ、ＥもしくはＶ、より好ましくはＶである配列；ならびに
（Ｄ）サイズが１２残基であり：ＳＷＸ1ＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０２）、ＳＷＸ1ＳＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０３）、ＳＷＸ1ＳＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０４）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０５）およびＳＷＸ1ＳＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号１０６）からなる群から選択され、式中、Ｘ1は任意のアミノ酸、好ましくはＥもしくはＡ、より好ましくはＥである配列（配列番号１０７〜１１１）；
（Ｅ）サイズが１３残基であり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7の各々は任意のアミノ酸残基であり（配列番号１９２）、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１）からなるものではない配列からなる群から選択され、前記ポリペプチドは、ＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへのＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ配列を含む狂犬病ウイルスＧタンパク質の結合親和性より高い、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの結合親和性を呈するポリペプチド。
【請求項２】
前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインが１１残基配列ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥもしくはＡであり、および／またはＸ2はＳ、ＥもしくはＶであり、および／またはＸ3はＨ、ＡもしくはＹであり、および／またはＸ4はＧもしくはＴであり、および／またはＸ5はＧもしくはＱであり、好ましくは、配列番号６１で規定される配列Ｓ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｓ／Ｅ／Ｖ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−Ｑ−Ｔ−Ｒ−Ｌを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインが配列番号６３で規定される１１残基配列Ｓ−Ｗ−Ｅ−Ｖ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−Ｑ−Ｔ−Ｒ−Ｌからなり、好ましくは、ＳＷＥＶＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号６４）、ＳＷＥＶＨＧＱＱＴＲＬ（配列番号６５）、ＳＷＥＶＨＴＧＱＴＲＬ（配列番号６６）、ＳＷＥＶＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号６７）、ＳＷＥＶＡＧＧＱＴＲＬ（配列番号６８）、ＳＷＥＶＡＧＱＱＴＲＬ（配列番号６９）、ＳＷＥＶＡＴＧＱＴＲＬ（配列番号７０）、ＳＷＥＶＡＴＱＱＴＲＬ（配列番号７１）、ＳＷＥＶＹＧＧＱＴＲＬ（配列番号７２）、ＳＷＥＶＹＧＱＱＴＲＬ（配列番号７３）、ＳＷＥＶＹＴＧＱＴＲＬ（配列番号７４）またはＳＷＥＶＹＴＱＱＴＲＬ（配列番号７５）からなる群から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインが１２残基配列ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬからなり、式中、配列番号１９１で規定されるように、Ｘ1はＥ、Ａ、ＶまたはＳであり、Ｘ2はＳ、Ｖ、Ｈ、ＡまたはＹであり、Ｘ3はＨ、Ａ、Ｙ、ＫまたはＱであり、Ｘ4はＫ、Ａ、Ｑ、ＳまたはＨであり、Ｘ5はＳ、Ｈ、ＧまたはＴであり、Ｘ6はＧ、ＴまたはＱである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインが１３残基配列ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥもしくはＡであり、および／またはＸ2はＳ、ＶもしくはＥであり、および／またはＸ3はＨ、ＡもしくはＹであり、および／またはＸ4はＫ、ＡもしくはＱであり、および／またはＸ5はＳもしくはＨであり、および／またはＸ6はＧもしくはＴであり、および／またはＸ7はＧもしくはＱであり、好ましくは、配列番号２０６で規定される配列Ｓ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｓ／Ｖ／Ｅ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｋ／Ａ／Ｑ−Ｓ／Ｈ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−ＱＴＲＬを有し、より好ましくは、ＳＷＡＥＡＱＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号２０８）またはＳＷＥＶＨＡＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号２０９）からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＭＡＳＴ−２結合ドメインの上流の細胞質ドメインの前記配列が：
−  ２０〜４０アミノ酸残基、好ましくは３１残基を含有するポリペプチド；または
−  配列番号２で規定される配列からなる狂犬病ウイルスＧタンパク質の細胞質ドメインの断片、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する変異体、例えばＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＬＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳ（配列番号５）のいずれかである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
シグナルペプチドならびに小胞体膜および／またはゴルジ膜に前記ポリペプチドを固着させるためのドメイン（すなわち、アンカードメイン）をさらに含み、前記ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（１）前記シグナルペプチド、（２）前記アンカードメインおよび（３）前記細胞質ドメインを含むまたはからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記アンカードメインが：
−  サイズが１８〜２６残基であり、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜に前記ポリペプチドを固着させるペプチド、好ましくは膜貫通ドメイン；または
−  配列番号４で規定される配列からなる狂犬病ウイルスＧタンパク質の膜貫通ドメイン、または、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜に前記ポリペプチドを固着させる能力を保持している、前記配列番号４と少なくとも８１％の同一性を有する変異体のいずれかである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
−  サイズが３〜６０残基であり、任意に分泌経路を通して、前記ポリペプチドを小胞体内に向かわせるペプチド；または
−  配列番号３で規定される配列からなる狂犬病ウイルスＧタンパク質のシグナルペプチド、または、任意に分泌経路を通して、前記ポリペプチドを小胞体内に向かわせる能力を保持している、前記配列番号３と少なくとも６８％の同一性を有する変異体のいずれかであるシグナルペプチドを含む、請求項７または８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記シグナルペプチドと前記アンカードメインの間に、１〜４アミノ酸残基、好ましくは狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインのＣ末端の１〜４アミノ酸残基、好ましくは狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基からなるリンカーを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｎ末端からＣ末端にかけて：
（１）配列番号３で規定されるシグナルペプチド、または、任意に分泌経路を通して、前記ポリペプチドを小胞体内に向かわせる能力を保持している、前記配列番号３と少なくとも６８％の同一性を有する変異体；
（２）任意に、狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基；
（３）配列番号４で規定されるアンカードメイン、または、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜に前記ポリペプチドを固着させる能力を保持している、前記配列番号４と少なくとも８１％の同一性を有する変異体；ならびに
（４）（ａ）配列番号２で規定されるペプチド、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する変異体、ならびに（ｂ）配列番号１９〜配列番号２０９で規定され、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインを含むまたはからなる細胞質ドメインを含むまたはからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインの間で形成される複合体の解離定数（ＫD）が、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）で測定して、０．５μＭ未満、好ましくは０．２μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列が配列番号２１０〜配列番号２１８からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードし、配列は１０５０ヌクレオチド以下であるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２１９〜配列番号２２７からなる群から選択される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが転写調節エレメント（複数可）、例えばプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターの制御下にある発現ベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの発現調節エレメント、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルを含む、発現レンチウイルス由来ベクター、特にプラスミド。
【請求項１９】
（ａ）Ｐｏｌタンパク質ならびに（ｂ）請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの発現調節エレメント、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルを含むレンチウイルスベクターゲノム、から作製されるＧＡＧ構造タンパク質およびウイルスコアを含むレンチウイルスベクター偽型粒子であって、ＶＳＶウイルスのＧタンパク質または狂犬病ウイルスのＧタンパク質で偽型化される粒子。
【請求項２０】
前記ＰＯＬタンパク質のインテグラーゼタンパク質に欠陥のある、請求項１９に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項２１】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のベクターによってトランスフェクトされるか、請求項１９または２０に記載のレンチウイルス粒子によって形質導入された細胞または細胞培養物。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項１９または２０に記載のレンチウイルス粒子または請求項２１に記載の細胞、および任意に薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤または担体を含む組成物。
【請求項２３】
医薬用の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４もしくは１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項１９もしくは２０に記載のレンチウイルス粒子、請求項２１に記載の細胞もしくは細胞培養物、または請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系（ＰＮＳ）を変化させる疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１４もしくは１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクター、請求項１９もしくは２０に記載のレンチウイルス粒子、請求項２１に記載の細胞もしくは細胞培養物、または請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
細胞内の分子、特に請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドの、神経生存および／または神経保護活性を判定する方法であって：
（ａ）細胞または細胞培養物と接触するようにアッセイ対象の分子を加えることと；
（ｂ）ステップａ）の細胞または細胞培養物中で、５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子、ならびに任意に１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子の発現を測定することと；および
（ｃ）ステップｂ）で測定される遺伝子の各々の発現を、前記分子と接触していない同じ細胞型の細胞または細胞培養物で測定される同じ遺伝子の発現で標準化することとを含み、前記セットの遺伝子の発現の統計的に有意なモジュレーションは、前記分子が神経生存および／または神経保護活性を有することを明らかにする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法を実行するのに適するキットであって、
ａ．５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子、ならびに任意に１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子に特異的な複数の対のプライマー；ならびに
ｂ．任意に、前記プライマーによるこれらの遺伝子のヌクレオチド標的の増幅のために必要な試薬、および任意に増幅生成物を検出するための試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる細胞質ドメインを含有するポリペプチドに関し、最初の２つの残基はＳおよびＷであり、最後の４つの残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、前記ポリペプチドはヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの高い親和性を呈する。本発明は、ポリヌクレオチド、ベクター、レンチウイルス粒子、細胞ならびにそれらを含む組成物にも関する。本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系（ＰＮＳ）を変化させる疾患、障害または状態の処置および／または予防における、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、レンチウイルス粒子、細胞および組成物の使用も対象とする。本発明は、神経生存および／または神経保護活性を判定するための、細胞遺伝子の分子サインにも関する。
【発明の背景】
【０００２】
神経系の発達の間、ニューロンは、適当な様式でそれらの標的に神経を分布させるために、かなりの距離にわたって軸索を伸長させる。これは、成長円錐の活性を刺激することができる特定のシグナル伝達経路の細胞における刺激を伴う。  発達中の神経系、より詳しくは発達中の中枢神経系は高度に可塑性であるが、成人の神経系、より詳しくは成人の脳はより限定的な修復能を有する。したがって、神経突起−軸索伸長および変性からの保護は、神経変性の疾患、障害または状態、例えば神経系の急性損傷または慢性神経変性障害の転帰を向上させるために考慮すべき重要な要素である。そのような神経細胞からの神経突起伸長を誘導することが可能である製品は、そのような疾患、障害または状態への非常に有益な治療的および／または予防的および／または緩和的解決法をもたらすであろう。
【０００３】
ニューロン発達過程の他の側面では、成熟したニューロン構造に分化しないニューロン前駆体の増殖は、神経系の新生物につながる。そのような前駆細胞からの神経突起伸長を誘導することが可能である製品は、そのような新生物への治療的および／または予防的および／または緩和的解決法をもたらすであろう。
【０００４】
狂犬病ウイルス株の病原性はアポトーシスを誘導するその能力と逆に相関することが記載されている（ＷＯ０３／０４８１９８；Ｕｇｏｌｉｎｉ  １９９５；Ｓａｒｍｅｎｔｏら２００５；Ｕｇｏｌｉｎｉ  ２００８；Ｊａｃｋｓｏｎら２００８）。したがって、狂犬病ウイルス株の病原性がより強いほど、アポトーシス性はより低い。ＣＶＳ株などの病原性の強い狂犬病ウイルス株がニューロンアポトーシスを誘導しないとの知見は、病原性の強い狂犬病ウイルス株が、疾患の徴候および症状の出現の前にＣＮＳの中でかように大規模に増殖することができる理由を説明する。
【０００５】
より近年、Ｐｒｅｈａｕｄら（２０１０）は、狂犬病ウイルスのＧタンパク質の細胞質ドメインのＣ末端領域が、ヒト微小管関連セリントレオニンキナーゼ２ＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへのＧタンパク質の結合に関与することを報告した。このＣ末端領域は、病原性の強い狂犬病株において配列ＱＴＲＬを、および弱毒化株において配列ＥＴＲＬを有する、ＰＤＺ−ＢＳ（ＰＤＺ結合部位）と呼ばれる４アミノ酸モチーフを有する。したがって、病原性の強い狂犬病ウイルス株のＧタンパク質は、ＭＡＳＴ−１およびＭＡＳＴ−２に高い親和性で結合するが、ＰＴＰＮ４、ＤＬＧ２およびＭＰＤＺに結合しないことが示されている。対照的に、弱毒化狂犬病ウイルス株のＧタンパク質は、ＭＡＳＴ−１、ＭＡＳＴ−２、ＰＴＰＮ４、ＤＬＧ２およびＭＰＤＺに結合することが示されている。病原性の強いおよび弱毒化された狂犬病ウイルス株のＧタンパク質の結合パートナーに関するこの差は、これらの株の病原性の差と相関するようである（図２）。
【０００６】
したがって、出願ＷＯ２０１０／１１６２５８で実証されるように、狂犬病ウイルスのＧタンパク質の４９１位（Ｈ／Ｌ）および５２１位（Ｑ／Ｅ）のアミノ酸残基の性質は、ニューロン生存および神経突起伸長に及ぼす作用にとって重要である。４９１位でＨ残基および５２１位でＱ残基を提示する病原性の強い狂犬病ウイルス株のＧタンパク質は、非アポトーシス性であり、神経突起伸長に有利に働く。対照的に、４９１位でＬ残基および５２１位でＥ残基を提示する弱毒化狂犬病ウイルス株のＧタンパク質は、アポトーシス性であり、神経突起伸長を促進しない。
【０００７】
これらの結果に基づいて、神経突起伸長の促進および神経生存において向上した特性を有する手段を同定し、設計する必要性が当技術分野にある。本発明は、狂犬病ウイルス株のＧタンパク質に由来し、予想外の特性を示す、ニューロンの再生および保護のための手段を提供する。本発明は、ニューロンの再生および保護のために適する分子のスクリーニング手段にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞内の狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）タンパク質Ｇプロセシング：翻訳の結果、膜貫通型Ｉ糖タンパク質であるタンパク質Ｇは小胞体（ＥＲ）で合成され、その後分泌経路を通してプロセシングされてゴルジ装置に到達し、そこで細胞外ドメインでグリコシル化される。次に、タンパク質は細胞膜へ送達され、そこで膜貫通ドメインにより固着される。Ｇタンパク質の細胞質ドメインは、常に細胞質と接触している。
【図２】（Ａ）それらの細胞パートナー、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質（微小管関連セリンスレオニンキナーゼ２）との相互作用を通しての、本発明のポリペプチド（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチド）の作用モデルの概略図（Ｂ）ニューロン生理におけるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の関与の概略図。
【図３】ＲＡＢＶ媒介神経保護の間に刺激されるキナーゼの同定：ヒト有糸分裂後ニューロンＮＴ２−ＮでのＫｉｎｏｍｅプロファイリング。（Ａ）ヒトｋｉｎｏｍｅ全体をカバーするペプチドマイクロアレイのスライド。（Ｂ）組換えｒＲＡＢＶ（ＲＡＢＶ−ＣＶＳＨＱ）に４５時間感染させたＮＴ２−Ｎ細胞について得られたｋｉｎｏｍｅプロファイリングの概略図。点は、ＮＴ２−Ｎ細胞でのｒＲＡＢＶ神経生存感染の結果活性化されるキナーゼを表す。
【図４】（Ａ）Ｇタンパク質（第１の系）およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチド（第２の系）の概略図；ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＣ：細胞外ドメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質ドメイン、ＰＤＺ−ＢＳ：ＰＤＺ結合部位。各ドメインのアミノ酸残基（ａａ）の数も示す（Ｂ）感染後（ｐ．ｉ．）４８時間におけるウェスタンブロットによるＮＳ細胞またはヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）でのレンチベクターによるＮｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳの発現（１．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１；２．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ；３．陰性対照）（Ｃ）４８時間ｐ．ｉ．の免疫蛍光検査によるＮＳ細胞でのレンチウイルスベクターによるＮｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳの発現。（Ｂ）および（Ｃ）では、検出はＲＡＢＶ  Ｃｙｔｏ−Ｇに特異的な抗体で実行した。
【図５】Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１は、ＰＤＺ−ＢＳ依存的にＮＳおよびＳＨ−ＳＹ５Ｙでの神経突起伸長を誘発する（Ａ）レンチウイルスベクター感染後（３０時間ｐ．ｉ．）の、ＳＨ−ＳＹ−５Ｙヒト神経芽腫細胞での神経突起伸長アッセイ。細胞は、ｄＢ  ｃ−ＡＭＰ（１０μＭ）で処置した（Ｂ）レンチウイルスベクター感染後（７２時間ｐ．ｉ．）の、ＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイ。細胞は、ＮＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処置した（*：ｐ＜０．０５スチューデントのｔ検定）。
【図６】（Ａ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１媒介神経保護の遺伝子分子サインの同定；遺伝子発現は、ヒト神経形成および神経幹細胞ＰＣＲならびにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路アレイで、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１を発現するレンチウイルスベクターを有するＮＴ２−Ｎ細胞において２４時間ｐ．ｉ．で測定した（Ｂ）経路に焦点を合わせた遺伝子発現プロファイリング（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で得たＮｅｕｒｏｖｉｔａ１遺伝子分子サインの概略図。遺伝子のクラスターは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１感染の後に調節されるが、非感染培養物またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳに感染させた培養物では調節されない遺伝子を表す（点はＮｅｕｒｏｖｉｔａ１特異的遺伝子である；ひし形は関係する遺伝子である）。
【図７】ＭＡＳＴ２の不在下でのＮｅｕｒｏｖｉｔａ１の分子サイン；ヒト神経形成および神経幹細胞ＰＣＲならびにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路アレイでの、レンチベクターＮｅｕｒｏｖｉｔａ１感染の４８時間前に、Ｓｈ  ＲＮＡ  ＭＡＳＴ２特異的組換えレンチウイルス感染によってＭＡＳＴ２発現がノックアウトされたＮＴ２−Ｎ細胞の、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１を発現するレンチベクターによる感染の後の遺伝子分子サイン（２４時間ｐ．ｉ．）。
【図８】レンチベクターＮｅｕｒｏｖｉｔａ１は、ＮＴ２−Ｎ軸索の創傷治癒に有利に働く（Ａ）スクラッチアッセイの図（Ｂ）負傷後６日の再生の図示（Ｃ）レンチベクターＮｅｕｒｏｖｉｔａ１またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ感染の後の軸索再生の比較。
【図９】Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１の分子サインは、軸索再生を媒介した；経路に焦点を合わせた遺伝子発現プロファイリングは、負傷から２日後にＮＴ２−Ｎ細胞培養物で確立した。（Ａ）ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に関与する遺伝子（ヒトＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達ＰＣＲアレイ）（Ｂ）細胞増殖、接着、分化、増殖因子およびシナプス機能に関与する遺伝子（ヒト神経形成および神経幹細胞ＰＣＲアレイ）。（Ｃ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１媒介軸索再生に関与する遺伝子クラスターの概略図（点はｎｅｕｒｏｖｉｔａ特異的遺伝子である；ひし形は関係する遺伝子である）。
【図１０】構造／機能分析（Ａ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１配列の配列および三次元構成。（Ｂ）ＭＡＳＴ２−ＰＤＺへの本発明のポリペプチド（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチド）の親和性とそれらの神経生存特性の間の関係。
【図１１】（Ａ）本発明のポリペプチドの概略図；ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＣ：細胞外ドメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質ドメイン。各ドメインのアミノ酸残基（ａａ）の数も示す（Ｂ）本発明の２つの特定のポリペプチドのタンパク質配列（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ３）ならびにＮｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳポリペプチドの配列との比較（Ｃ）ＲＡＢＶ  Ｃｙｔｏ−Ｇに特異的な抗体による４８時間ｐ．ｉ．のウェスタンブロット法で測定された、ＮＳ細胞でのレンチウイルスベクター（レンチベクター）によるＮｅｕｒｏｖｉｔａ１、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳおよびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２の発現（１：Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２；２：Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ；３：Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１および４：陰性対照）。
【図１２】レンチベクター感染後（７２時間ｐ．ｉ．）のＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイ。細胞は、ＮＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処置した（Ｎ．Ｉ．非感染細胞）。
【図１３】Ｎｅｕｒｏｖｉｔａは、ＮＳ細胞で神経突起樹状分枝を誘導する（Ａ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２（上の写真）またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１（下の写真）のいずれかに感染した代表的ＮＳ細胞の樹状分枝の再描画概略図（Ｂ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１（黒四角）およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２（黒丸）レンチベクターで７２時間感染させたＮＳ培養で、Ｓｈｏｌｌ分析で測定した神経突起ツリー（neurite tree）の複雑性。
【図１４】Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２の遺伝子分子サインの同定。（Ａ）２４時間ｐ．ｉ．のＮＴ２−Ｎ細胞での、ＰＯＵ４Ｆ１、ＤＲＤ２、ＦＯＳおよびＢＴＫのレンチベクターによる下方制御（Ｂ）経路に焦点を合わせた遺伝子発現プロファイリング（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で得たＮｅｕｒｏｖｉｔａ２遺伝子分子サインの概略図。遺伝子のクラスターは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２感染の後に調節されるが、非感染培養またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳに感染させた培養では調節されない遺伝子を表す（点はｎｅｕｒｏｖｉｔａ特異的遺伝子である；ひし形は関係する遺伝子である）。
【図１５】Ｎｅｕｒｏｖｉｔａレンチウイルスベクター感染の後のＮＴ２−Ｎ細胞での、（Ａ）２４時間ｐ．ｉ．のｒＲＡＢＶおよび（Ｂ）４８時間ｐ．ｉ．のレンチベクターの転写。転写は、ＲＴ−ＱＰＣＲで測定した。
【図１６】生得の免疫遺伝子の活性化（Ａ）ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱおよびｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨΔ４による感染の後（Ｎ．Ｉ．：未感染）または（Ｂ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳおよびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２レンチベクターによる感染の後（ｎｅｇ：陰性対照）の、免疫遺伝子（ＮＴ２−Ｎ細胞での）の代表セットの転写。
【図１７】ＮＴ２−Ｎ細胞での負傷後の軸索再生（Ａ）ＮＴ２−Ｎ細胞でのドーパミン作動性ニューロンのマーカー、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現（Ｂ）ＮＴ２−Ｎ培養でのＴＨ  ｍＲＮＡ転写、標準として１８Ｓ（Ｃ）ＭＡＳＴ−２（ｓｉＭＡＳＴ２）に対するＳＨＲＮＡの存在下または不在下での、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１によるレンチベクター感染の後の軸索再生；Ｎ．Ｉ．：未感染。結果は、再生した、スクラッチされたニューロンの百分率で表す（Ｄ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２レンチベクターによる感染の後の軸索再生；Ｎ．Ｉ．：未感染。
【図１８】（Ａ）ＫＣｌの不在下（円）もしくは存在下（四角）での陰性対照によるレンチウイルス感染から２７時間後、または（Ｂ）ＫＣｌの存在下（星）でのＮｅｕｒｏｖｉｔａ２レンチベクターによる感染の後の、ＮＳ培養でのＳｈｏｌｌ分析で測定した神経突起ツリーの複雑性。
【図１９】ＬｉＣｌの不在下または存在下での（Ａ）未感染（Ｎ．Ｉ．）ＮＳ細胞、および（Ｂ）未感染（Ｎ．Ｉ．）またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１（ＮＶ１）、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ（ＮＶ１Δ）もしくはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２（ＮＶ２）レンチベクターによる感染の後のＬｉＣｌ処理ＮＳ細胞での、神経突起伸長アッセイ。
【図２０】Ｇ  ｆｕｌｌ、ＮＶ１およびＮＶ１  ｃｙｔｏによって誘発された神経突起伸長の比較（Ａ）ＲＡＢＶ  Ｇ  ｆｕｌｌ、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１のサイトゾル形（ＮＶ１  ｃｙｔｏ）の概略図；ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＣ：細胞外ドメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質ドメイン、ＰＤＺ−ＢＳ：ＰＤＺ結合部位。各ドメインのアミノ酸残基（ａａ）の数も示す（Ｂ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ、ＲＡＢＶ  Ｇｆｕｌｌ、ＲＡＢＶ  ＧｆｕｌｌデルタＰＤＺ−ＢＳ、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１−ｃｙｔｏおよびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１−ｃｙｔｏデルタＰＤＺ−ＢＳによるＮＳの感染後の神経突起伸長アッセイ（Ｎ．Ｉ．：未感染）。
【図２１】ＮＳ細胞での二シストロン性レンチベクターからのＮｅｕｒｏｖｉｔａ分子の発現（Ａ）ｐＬｅｎｔｉ７．３  Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ二シストロン性レンチベクターの概略図（Ｂ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ（ＮＶ１Δ）、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１（ＮＶ１）、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２（ＮＶ２）またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ３（ＮＶ３）のｍＲＮＡの相対的増加倍率、標準として１８Ｓ（Ｃ）フローサイトメトリーによる、ＮＶ１Δ−、ＮＶ１−、ＮＶ２−またはＮＶ３−を発現するレンチベクターによるＮＳ細胞の感染後のＧＦＰ発現；結果は、培養内でＧＦＰを発現する細胞の百分率として表す；Ｎｅｇは、未感染細胞である。（Ｄ）ウェスタンブロット法による、ＮＳ細胞でのＮＶ１Δ、ＮＶ１、ＮＶ２またはＮＶ３の発現。（Ｅ）対応する溶解物での、内部タンパク質負荷対照としてのチューブリンの発現。
【図２２】ＮＳ培養物中でＮＶ３によって誘発された神経突起伸長（Ａ）未感染（左パネル）またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ３に感染した（右パネル）代表的ＮＳ細胞の樹状分枝の再描画概略図；（Ｂ）ＮＶ１Δ、ＮＶ１、ＮＶ２またはＮＶ３レンチベクターによる感染後のＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイ；（Ｃ）スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）。
【図２３】ＮＳ培養物中でＮＶ３によって誘発された樹状分枝（Ａ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１に感染したものに対して未感染の、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３に感染したものに対してＮｅｕｒｏｖｉｔａ１に感染した、またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ３に感染したものに対してＮｅｕｒｏｖｉｔａ２に感染したＮＳ細胞での、Ｓｈｏｌｌ分析によって測定された神経突起ツリーの複雑性；（Ｂ）二元配置ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）。
【図２４】ＮＶ３サイトゾル（ＮＶ３  ｃｙｔｏ）レンチベクターの構築（Ａ）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ３のサイトゾル形（ＮＶ３  ｃｙｔｏ）の概略図；ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＣ：細胞外ドメイン、ＴＭ：膜貫通ドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質ドメイン、ＰＤＺ−ＢＳ：ＰＤＺ結合部位。各ドメインのアミノ酸残基（ａａ）の数も示す（Ｂ）ＮＶ３またはＮＶ３−ｃｙｔｏを発現するｐＬｅｎｔｉ７．３  Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ二シストロン性レンチベクターの概略図；（Ｃ）ＮＶ３およびＮＶ３ｃｙｔｏの相対的増加倍率、標準として１８Ｓ；（Ｄ）細胞蛍光測定法による、ＮＶ３またはＮＶ３ｃｙｔｏを発現するレンチベクターによる感染後のＧＦＰ発現；結果は、培養内でのＧＦＰ陽性細胞の百分率で表す；ｎｅｇは、未感染細胞である。
【図２５】ＮＶ３−ｃｙｔｏによって誘導された神経突起伸長とＮＶ１およびＮＶ３のそれらとの比較（Ａ）ＮＶ１、ＮＶ３またはＮＶ３−ｃｙｔｏに感染させた代表的ＮＳ細胞の樹状分枝の再描画概略図；（Ｂ）ＮＶ１、ＮＶ２、ＮＶ３またはＮＶ３−ｃｙｔｏレンチベクターによる感染後のＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイ；（Ｃ）スチューデントのｔ検定（ｐ＜０．０５）。
【図２６】ＮＶ３−ｃｙｔｏによって誘導された神経突起ツリーとＮＶ１およびＮＶ３のそれらとの比較（Ａ）ＮＶ３ｃｙｔｏに感染したものに対してＮＶ１に感染したか、ＮＶ３ｃｙｔｏに感染したものに対してＮＶ３に感染したＮＳ培養物でのＳｈｏｌｌ分析によって測定された神経突起ツリーの複雑性；（Ｂ）二元配置ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）。
【図２７】ＮＶ１およびＮＶ１デルタによって誘導された、Ｅ１６マウスの胎児皮質ニューロンの培養での神経突起生成。（Ａ）未感染またはＮＶ１（Ｂ）もしくはＮＶ１Δ（Ｃ）レンチベクターに３日間感染させた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３日間のβＩＩＩチューブリン（ニューロン形）染色Ｅ１６マウス皮質ニューロンの代表的写真；（Ｄ）ＮＶ１またはＮＶ１Δレンチベクターに感染後の皮質ニューロンでの神経突起伸長アッセイ。
【図２８】ＮＶ１またはＮＶ１デルタレンチベクターを脳内経路によって注射した新生マウスでの毒性アッセイ（Ａ）注射を受けていないマウスまたはＮＶ１もしくはＮＶ１Δレンチベクターを注射されたマウスで測定された重量；（Ｂ）レンチウイルス感染から３カ月後における脳でのＮＶ１またはＮＶ１Δ転写産物の発現、標準として１８Ｓ。
【図２９】脳にＮＶ１またはＮＶ１Δレンチベクターを注射されたマウスの表現型。（Ａ）ＮＶ１、注射後（ｐｉ）４日目；（Ｂ）ＮＶ１を注射したマウス、２０日目ｐｉ；（Ｃ）ＮＶ１Δを注射したマウス、４日目ｐｉ；（Ｄ）ＮＶ１Δを注射したマウス、２０日目ｐｉ；矢印は、注射されない（Ｎ．Ｉ．）マウス（切断された尾）を表す。
【図３０】ＮＶ１レンチベクターを脳内経路によって注射したマウスの脳（線条体）の免疫染色。（Ａ）ＧＦＰ蛍光（緑色）、Ｍａｐ２染色（赤色）およびＧＦＡＰ染色（紫色）による線条体の免疫染色（Ｂ）ＧＦＰ蛍光（緑色）、Ｍａｐ２染色（赤色）およびＧＦＡＰ染色（紫色）による樹枝状軸索ツリーの免疫染色。
【図３１】脳にＮＶ１Δレンチベクターを注射されたマウスの線条体の免疫染色；ＧＦＰ蛍光（緑色）、Ｍａｐ２染色（赤色）およびＧＦＡＰ染色（紫色）。
【詳細な説明】
【０００９】
本出願では、発明者は、配列が残基ＳＷおよび残基ＱＴＲＬを含み、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインに高い親和性を有するポリペプチドが、神経突起伸長の促進および神経生存特性に特定の興味深い作用を有することを予想外にも示した。したがって、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数（ＫD）が低いほど、本発明のポリペプチドの神経生存特性はより高い。
【００１０】
本発明は、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの高い親和性を呈する、ここで規定されるポリペプチドを対象とする（完全長ヒトＭＡＳＴ２タンパク質は配列番号６、ＰＤＺドメインは配列番号７）。
【００１１】
換言すれば、ここで規定される本発明のポリペプチドは、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとそれが形成する複合体の解離定数（ＫD）が非常に低く、その結果、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの親和性が非常に高いように設計される（親和性はＫDの逆数）。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明のポリペプチドは、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインに対して、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ配列（配列番号１）を含む狂犬病ウイルスＧタンパク質のＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの結合親和性より高い結合親和性を呈する。
【００１３】
特定の態様では、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬからなるＭＡＳＴー２結合ドメインを有するポリペプチドと比較して、本発明のポリペプチドの親和性の増加（例えば、ＫD比）は、２．５〜２０の範囲、特に５〜２０、５〜１５、または５〜１０の範囲である。
【００１４】
特定の態様では、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数（ＫD）は、１μＭ未満、０．８μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満または０．３μＭ未満である。好ましい態様では、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数は、０．２μＭ未満、好ましくは０．１５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満である。
【００１５】
特定の態様では、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメイン（ＭＡＳＴ２−ＰＤＺ）とによって形成される複合体の解離定数（ＫD）は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって測定される。
【００１６】
ＩＴＣの特定の態様として、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメイン（ＭＡＳＴ２−ＰＤＺ）とによって形成される複合体の解離定数は、２５０μＭ〜３５０μＭの範囲（好ましくは５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液で）のポリペプチド濃度および３０μＭのＭＡＳＴ２−ＰＤＺドメインの初期濃度について測定される。
【００１７】
ＩＴＣの特定の態様として、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数は、以下の通りに測定される：本発明のポリペプチドは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．５で、２５０μＭ〜３５０μＭの範囲の初期濃度で調製される。ＩＴＣ（等温滴定熱量測定）測定は、上で調製される本発明のポリペプチドの注射により、Ｍｉｃｒｏｃａｌ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）からのＭｉｃｒｏｃａｌ  ＶＰ  ＩＴＣ２００等温滴定熱量計を用いて、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺ（３０μＭの初期濃度で）を２９８Ｋで滴定することによって行われる（特定のポリペプチドの各滴定は、６分間隔での５〜７μＬの一定分量の２５〜４５回の連続注射を含む）。生データを標準化し、ポリペプチドの希釈熱について補正する。Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を用いて、一セットの部位を有するモデルへの補正データの非線形の曲線あてはめを実施して、平衡解離定数を判定する。
【００１８】
ヒトＰＴＰＮ４タンパク質のＰＤＺドメインへの本発明のポリペプチドの親和性は低く、すなわち、本発明のポリペプチドとヒトＰＴＰＮ４タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数（ＫD）は高く、詳細には５００μＭを超える（例えばＩＴＣによって、特に上のＭＡＳＴ２−ＰＤＺと同じ条件、および同じ濃度で測定される）。ＫDのこの高い値（ヒトＰＴＰＮ４タンパク質のＰＤＺドメインについて）は、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである本発明のポリペプチドで到達されることが示されている。
【００１９】
したがって、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの高い親和性を有し、および／またはヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとそれが形成する複合体の解離定数（Ｋｄ）が上記の範囲内にあるように設計されるポリペプチドは、以下の構造上の特徴によってここに記載される。
【００２０】
したがって、本発明は、細胞質ドメインを含むまたはからなる、３５０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドに関する。「細胞質ドメイン」という表現は、ここで規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わり、細胞の細胞質中に、好ましくは細胞膜での固着を可能にする構造または配列をポリペプチドが保有する場合に露出されるタンパク質ドメインを意味する。本発明により、ポリペプチドは、膜での本発明のポリペプチドの固着を可能にする構造または配列を含んでもよく、含まなくてもよい。ポリペプチドが膜での固着を可能にする構造または配列を保有しない場合、例えば、ポリペプチドがここで規定される細胞質ドメインからなる場合は、本発明のポリペプチドはサイトゾルである。
【００２１】
特定の態様では、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインと、膜での固着を可能にする構造または配列を保有しない本発明のポリペプチド、特にここで規定される細胞質ドメインからなるポリペプチドとの間で形成される複合体の解離定数（ＫD）は、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満または０．３μＭ未満、好ましくは０．２μＭ未満、０．１５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満である。
【００２２】
特定の態様では、本発明は、（１）シグナルペプチド、（２）前記ポリペプチドを小胞体膜および／またはゴルジ膜へ固着させるためのドメイン（アンカードメインとも呼ばれる）、ならびに（３）ポリペプチドが膜に固着されるときに細胞質に露出されるドメイン（細胞質ドメインとも呼ばれる）を含む、３５０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドに関する。これらのドメインは、シグナルペプチドが、それ自体細胞質ドメインのＮ末端側であるアンカードメインのＮ末端側であるように構造的に組織される。この態様により、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（１）シグナルペプチド、（２）アンカードメインおよび（３）細胞質ドメインを含む。
【００２３】
本発明のポリペプチドの細胞質ドメインは、サイズが１１〜１３アミノ酸残基であるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる。「で終わる」とは、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの１１〜１３個の連続する残基が細胞質ドメインの最後のＣ末端残基であること、および特定の態様では本発明のポリペプチドの最後のＣ末端残基であることを意味する。
【００２４】
本発明のポリペプチドのＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１〜１３残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである配列からなる（これらの４つの最後のアミノ酸残基は、いわゆるＰＤＺ−ＢＳを表す）。ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、いずれの群であっても、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最初の２つのアミノ酸残基はＳおよびＷであり、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの最後の４つのアミノ酸残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬであることを承知した上で、以下の群の１つによって規定される。
【００２５】
（Ａ）第１の群では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる（配列番号１９）。
【００２６】
特定の態様では、Ｘ1はＥまたはＡ、より好ましくはＥであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２０）またはＳＷＡＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２１）からなり、式中、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００２７】
別の態様では、Ｘ2はＳ、ＥまたはＶ、より好ましくはＶであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1ＶＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２２）、ＳＷＸ1ＥＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２３）またはＳＷＸ1ＳＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２４）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００２８】
特定の態様では、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2ＨＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２５）、ＳＷＸ1Ｘ2ＡＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２６）またはＳＷＸ1Ｘ2ＹＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号２７）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００２９】
特定の態様では、Ｘ4はＧまたはＴであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号２８）またはＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号２９）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３０】
特定の態様では、Ｘ5はＧまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＱＴＲＬ（配列番号３０）またはＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＱＱＴＲＬ（配列番号３１）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３１】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＳ、ＥまたはＶ、より好ましくはＶであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３２）、ＳＷＥＳＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３３）またはＳＷＥＥＸ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３４）からなり、式中、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３２】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＸ2ＨＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３５）、ＳＷＥＸ2ＡＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３６）またはＳＷＥＸ2ＹＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号３７）からなり、式中、Ｘ2、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３３】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＸ2Ｘ3ＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号３８）またはＳＷＥＸ2Ｘ3ＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号３９）からなり、式中、Ｘ2、Ｘ3およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３４】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ5はＧまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＧＱＴＲＬ（配列番号４０）およびＳＷＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＱＱＴＲＬ（配列番号４１）からなり、式中、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３５】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＨＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号４２）、ＳＷＥＶＡＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号４３）またはＳＷＥＶＹＸ4Ｘ5ＱＴＲＬ（配列番号４４）からなり、式中、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３６】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＸ3ＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号４５）またはＳＷＥＶＸ3ＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号４６）からなり、式中、Ｘ3およびＸ5の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３７】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ5はＧまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＸ3Ｘ4ＧＱＴＲＬ（配列番号４７）またはＳＷＥＶＸ3Ｘ4ＱＱＴＲＬ（配列番号４８）からなり、式中、Ｘ3およびＸ4の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３８】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＨＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号４９）、ＳＷＥＶＨＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号５０）、ＳＷＥＶＡＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号５１）、ＳＷＥＶＡＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号５２）、ＳＷＥＶＹＧＸ5ＱＴＲＬ（配列番号５３）またはＳＷＥＶＹＴＸ5ＱＴＲＬ（配列番号５４）からなり、式中、Ｘ5は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００３９】
特定の態様では、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、Ｘ5はＧまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＨＸ4ＧＱＴＲＬ（配列番号５５）、ＳＷＥＶＨＸ4ＱＱＴＲＬ（配列番号５６）、ＳＷＥＶＡＸ4ＧＱＴＲＬ（配列番号５７）、ＳＷＥＶＡＸ4ＱＱＴＲＬ（配列番号５８）、ＳＷＥＶＹＸ4ＧＱＴＲＬ（配列番号５９）またはＳＷＥＶＹＸ4ＱＱＴＲＬ（配列番号６０）からなり、式中、Ｘ4は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００４０】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、式中Ｘ1はＥまたはＡであり、Ｘ2はＳ、ＥまたはＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、Ｘ5はＧまたはＱである配列からなる（配列番号６１）。この態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、Ｓ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｓ／Ｅ／Ｖ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−Ｑ−Ｔ−Ｒ−Ｌからなる。
【００４１】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＳ、ＥまたはＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、Ｘ5はＧまたはＱである配列からなる（配列番号６２）。この態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、Ｓ−Ｗ−Ｅ−Ｓ／Ｅ／Ｖ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−Ｑ−Ｔ−Ｒ−Ｌからなる。
【００４２】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥであり、Ｘ2はＶであり、Ｘ3はＨ、ＡまたはＹであり、Ｘ4はＧまたはＴであり、Ｘ5はＧまたはＱである配列からなる（配列番号６３）。この態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、Ｓ−Ｗ−Ｅ−Ｖ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−Ｑ−Ｔ−Ｒ−Ｌからなる。より特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の４つの残基がＳ、Ｗ、ＥおよびＶであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＶＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号６４）、ＳＷＥＶＨＧＱＱＴＲＬ（配列番号６５）、ＳＷＥＶＨＴＧＱＴＲＬ（配列番号６６）、ＳＷＥＶＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号６７）、ＳＷＥＶＡＧＧＱＴＲＬ（配列番号６８）、ＳＷＥＶＡＧＱＱＴＲＬ（配列番号６９）、ＳＷＥＶＡＴＧＱＴＲＬ（配列番号７０）、ＳＷＥＶＡＴＱＱＴＲＬ（配列番号７１）、ＳＷＥＶＹＧＧＱＴＲＬ（配列番号７２）、ＳＷＥＶＹＧＱＱＴＲＬ（配列番号７３）、ＳＷＥＶＹＴＧＱＴＲＬ（配列番号７４）またはＳＷＥＶＹＴＱＱＴＲＬ（配列番号７５）からなる配列からなる。
【００４３】
特に、上記方法で測定したときに、この群のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数が０．３μＭ未満、好ましくは０．２５μＭ未満、好ましくは０．２μＭ未満、好ましくは０．１５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満である、この群で記載される定義の１つを満たすポリペプチドが好ましい。より好ましい態様では、この群で記載される定義の１つを満たすポリペプチドは、上記方法で測定したときに、０．０９μＭ未満、０．０８μＭ未満、０．０７μＭ未満、０．０６μＭ未満または０．０５μＭ未満である、本発明のポリペプチドとヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインとによって形成される複合体の解離定数を有する。
【００４４】
（Ｂ）第２の群では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである配列からなり、前記ドメインは、ＳＷＸ1ＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号７６）、ＳＷＸ1ＳＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号７７）、ＳＷＸ1ＳＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号７８）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号７９）、ＳＷＸ1ＳＨＫＳＱＴＲＬ（配列番号８０）、ＳＷＸ1ＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号８６）、ＳＷＸ1ＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号８７）、ＳＷＸ1ＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号８８）、ＳＷＸ1ＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号８９）、ＳＷＸ1ＳＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号９０）、ＳＷＸ1ＳＨＳＧＱＴＲＬ（配列番号９１）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号９２）およびＳＷＸ1ＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号９３）からなる群から選択され、式中、Ｘ1は任意のアミノ酸、好ましくはＥまたはＡであり、より好ましくはＥである。したがって特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである配列からなり、前記ドメインは、ＳＷＥＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号８１）、ＳＷＥＳＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号８２）、ＳＷＥＳＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号８３）、ＳＷＥＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号８４）、ＳＷＥＳＨＫＳＱＴＲＬ（配列番号８５）、ＳＷＥＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号９４）、ＳＷＥＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号９５）、ＳＷＥＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号９６）、ＳＷＥＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号９７）、ＳＷＥＳＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号９８）、ＳＷＥＳＨＳＧＱＴＲＬ（配列番号９９）、ＳＷＥＳＨＫＧＱＴＲＬ（配列番号１００）およびＳＷＥＳＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０１）からなる群から選択される。特定の態様では、細胞質ドメインのＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＧＧＱＴＲＬ（配列番号８３）である。
【００４５】
この第２群のＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ配列（配列番号１）からの、連続するか不連続の２つのアミノ酸残基の欠失によって得られてよい。
【００４６】
（Ｃ）第３の群では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる（配列番号１１２）。
【００４７】
特定の態様では、Ｘ１はＥ、Ａ、ＶまたはＳであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＥＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１３）、ＳＷＡＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１４）、ＳＷＶＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１５）またはＳＷＳＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１６）からなり、式中、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなる。
【００４８】
特定の態様では、Ｘ2はＳ、Ｖ、Ｈ、ＡまたはＹであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1ＳＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１７）、ＳＷＸ1ＶＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１８）、ＳＷＸ1ＨＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１１９）、ＳＷＸ1ＡＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２０）またはＳＷＸ1ＹＸ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２１）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸である配列からなる。
【００４９】
特定の態様では、Ｘ3はＨ、Ａ、Ｙ、ＫまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2ＨＸ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２２）、ＳＷＸ1Ｘ2ＡＸ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２３）、ＳＷＸ1Ｘ2ＹＸ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２４）、ＳＷＸ1Ｘ2ＫＸ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２５）またはＳＷＸ1Ｘ2ＱＸ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２６）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸である配列からなる。
【００５０】
特定の態様では、Ｘ4はＫ、Ａ、Ｑ、ＳまたはＨであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＫＸ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２７）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＡＸ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２８）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＱＸ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１２９）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＳＸ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１３０）またはＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3ＨＸ5Ｘ6ＱＴＲＬ（配列番号１３１）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5およびＸ6の各々は任意のアミノ酸である配列からなる。
【００５１】
特定の態様では、Ｘ5はＳ、Ｈ、ＧまたはＴであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＳＸ6ＱＴＲＬ（配列番号１３２）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＨＸ6ＱＴＲＬ（配列番号１３３）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ6ＱＴＲＬ（配列番号１３４）またはＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＴＸ6ＱＴＲＬ（配列番号１３５）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ6の各々は任意のアミノ酸である配列からなる。
【００５２】
特定の態様では、Ｘ6はＧ、ＴまたはＱであり、その結果ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＧＱＴＲＬ（配列番号１３６）、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＴＱＴＲＬ（配列番号１３７）またはＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＱＴＲＬ（配列番号１３８）からなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の各々は任意のアミノ酸である配列からなる。
【００５３】
特定の態様では、上で規定される配列番号１１２および配列番号１２２〜配列番号１３８のポリペプチドに関して、表１（次ページ）で開示されるように、Ｘ1はＥであり、および／またはＸ2はＶである。
【００５４】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは１２残基からなり、最初の２つの残基はＳおよびＷであり、最後の４つの残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、配列ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥ、Ａ、ＶまたはＳであり、Ｘ2はＳ、Ｖ、Ｈ、ＡまたはＹであり、Ｘ3はＨ、Ａ、Ｙ、ＫまたはＱであり、Ｘ4はＫ、Ａ、Ｑ、ＳまたはＨであり、Ｘ5はＳ、Ｈ、ＧまたはＴであり、Ｘ6はＧ、ＴまたはＱである（配列番号１９１）。この態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、配列Ｓ−Ｗ−Ｅ／Ａ／Ｖ／Ｓ−Ｓ／Ｖ／Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｈ／Ａ／Ｙ／Ｋ／Ｑ−Ｋ／Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｈ−Ｓ／Ｈ／Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｔ／Ｑ−ＱＴＲＬからなる。
【００５５】
（Ｄ）第４の群では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである配列からなり、前記ドメインは、ＳＷＸ1ＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０２）、ＳＷＸ1ＳＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０３）、ＳＷＸ1ＳＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０４）、ＳＷＸ1ＳＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０５）およびＳＷＸ1ＳＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号１０６）からなる群から選択され、式中、Ｘ1は任意のアミノ酸、好ましくはＥまたはＡであり、より好ましくはＥである。したがって特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の３つの残基がＳ、ＷおよびＥであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬである配列からなり、前記ドメインは、ＳＷＥＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０７）、ＳＷＥＳＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０８）、ＳＷＥＳＨＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１０９）、ＳＷＥＳＨＫＧＧＱＴＲＬ（配列番号１１０）およびＳＷＥＳＨＫＳＧＱＴＲＬ（配列番号１１１）からなる群から選択される。
【００５６】
この第４群のＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ配列（配列番号１）からの１つのアミノ酸残基の欠失によって得られてよい。
【表１−１】
2018086001.tif 000002
【表１−２】
2018086001.tif 000003
【００５７】
（Ｅ）第５の群では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１３残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7の各々は任意のアミノ酸残基である配列からなり（配列番号１９２）、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインはＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬからなるものではない。特定の態様では、サイズが１３残基であるＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１）またはＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１６）のいずれでもない。
【００５８】
特定の態様では、１３残基のＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１）とアミノ酸残基の少なくとも１つの置換、少なくとも２つの置換、または少なくとも３つの置換で異なるが、ただし、最初の２つの残基はＳおよびＷであり、最後の４つの残基はＱ、Ｔ、ＲおよびＬである；より特定の態様では、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬと少なくとも１つの置換で異なる１３残基のＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１６）ではない。
【００５９】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは１３残基からなり、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬとは、ＳＷとＱＴＲＬの間に位置する残基の１つの置換で異なる。特定の態様では、これはチロシン残基（Ｙ）でのヒスチジン残基（Ｈ）の置換でない。
【００６０】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ1はＥまたはＡであり、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7の各々は任意のアミノ酸残基である（配列番号１９３）。
【００６１】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ2は極性の中性残基、負荷電の残基または疎水性の残基から選択され（配列番号１９４）、好ましくはＳ、ＶまたはＥであり（配列番号１９５）、式中、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は任意のアミノ酸残基である。
【００６２】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ3は正荷電の残基、小容量の非極性の残基、および極性の芳香族の残基から選択され（配列番号１９６）、好ましくはＨ、ＡまたはＹであり（配列番号１９７）、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は任意のアミノ酸残基である。
【００６３】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ4は小容量の非極性の残基、極性の中性残基および正荷電の残基から選択され（配列番号１９８）、好ましくはＫ、ＡまたはＱであり（配列番号１９９）、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は任意のアミノ酸残基である。
【００６４】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ5は極性の中性残基および正荷電の残基から選択され（配列番号２００）、好ましくはＳまたはＨであり（配列番号２０１）、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6およびＸ7は任意のアミノ酸残基である。
【００６５】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ6は、好ましくはフレキシブルな小容量の非極性の残基および極性の中性残基から選択され（配列番号２０２）、好ましくはＧまたはＴであり（配列番号２０３）、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ7は任意のアミノ酸残基である。
【００６６】
ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬの特定の態様では、Ｘ7は、好ましくはフレキシブルな小容量の非極性の残基および極性の中性残基から選択され（配列番号２０４）、好ましくはＧまたはＱであり（配列番号２０５）、式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6は任意のアミノ酸残基である。
【００６７】
極性の中性残基、正荷電の残基、負荷電の残基、疎水性の残基、小容量の非極性の残基、および極性の芳香族残基に対応するアミノ酸残基は従来の文献に従い、下記のリストで確認される。
【００６８】
より特定の態様では、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインは配列ＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＱＴＲＬからなり、式中、Ｘ1はＥもしくはＡであり、および／またはＸ2はＳ、ＶもしくはＥであり、および／またはＸ3はＨ、ＡもしくはＹであり、および／またはＸ4はＫ、ＡもしくはＱであり、および／またはＸ5はＳもしくはＨであり、および／またはＸ6はＧもしくはＴであり、および／またはＸ7はＧもしくはＱであり、そこで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は、一緒にＥ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、ＧおよびＧであることはない。特定の態様では、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6およびＸ7は、一緒にそれぞれＥ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、ＧおよびＧであること、または一緒にそれぞれＥ、Ｓ、Ｙ、Ｋ、Ｓ、ＧおよびＧであることのいずれでもない。
【００６９】
したがって、好ましい態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列は、配列番号２０６で規定されるＳ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｓ／Ｖ／Ｅ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｋ／Ａ／Ｑ−Ｓ／Ｈ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−ＱＴＲＬであり、ただしＭＡＳＴ−２結合ドメインはＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１）ではない；より特定の態様では、配列Ｓ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｓ／Ｖ／Ｅ−Ｈ／Ａ／Ｙ−Ｋ／Ａ／Ｑ−Ｓ／Ｈ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−ＱＴＲＬのＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１）またはＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１６）のいずれでもない。別の好ましい態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列は、配列番号２０７で規定されるＳ−Ｗ−Ｅ／Ａ−Ｖ／Ｅ−Ｈ／Ａ−Ａ／Ｑ−Ｓ／Ｈ−Ｇ／Ｔ−Ｇ／Ｑ−ＱＴＲＬである。好ましいＭＡＳＴ−２結合ドメインは、配列ＳＷＡＥＡＱＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号２０８）またはＳＷＥＶＨＡＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号２０９）からなる。
【００７０】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１または１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、上記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）群で選択される配列からなる
別の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１１残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、上記の（Ａ）および（Ｂ）群で選択される配列からなる。
【００７１】
別の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１２残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、上記の（Ｃ）および（Ｄ）群で選択される配列からなる。
【００７２】
別の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、サイズが１３残基であり、最初の２つの残基がＳおよびＷであり、最後の４つの残基がＱ、Ｔ、ＲおよびＬであり、上記の（Ｅ）群で選択される配列からなる。
【００７３】
特定の態様では、本発明のポリペプチドのＭＡＳＴ−２結合ドメインの上流の細胞質ドメインの配列は、以下のいずれかである：
−  ２０〜４０アミノ酸残基を含有し、その結果、細胞質ドメイン全体（ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質ドメインおよびＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列）のサイズが３１〜５３残基、好ましくは３１〜５２または３１〜５１残基であるポリペプチド。特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの上流の細胞質ドメインの配列は、２５〜４５残基からなる。別の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質ドメインの配列は３１残基であり、その結果、細胞質ドメイン全体は４２〜４４残基、好ましくは４２残基、４３残基または４４残基である。細胞質ドメインがヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへのＭＡＳＴ−２結合ドメインの結合を可能にする限り、いかなる細胞質ドメインを選択することもできる。Ｇタンパク質の細胞質ドメインの特定の例は、Ｓｃｈｎｅｌｌ
ＭＪら（１９９８）およびＯｗｅｎｓ  ＲＪら（１９９３）に見出すことができる。ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへのＭＡＳＴ−２結合ドメインの結合、したがってヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの本発明のポリペプチドの親和性は、ＫD計算のために上で詳述される方法によってアッセイされてよい；または
−  ＭＡＳＴ−２結合ドメインの細胞質ドメイン上流の配列は、狂犬病ウイルスＧタンパク質の細胞質ドメインの断片、特に弱毒化狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質の細胞質ドメインの断片または病原性の強い狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質の細胞質ドメインの断片である；特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの細胞質ドメイン上流の配列は、以下の配列ＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳ（配列番号２）、または配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性を有する変異体からなり、前記変異体は、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインに本発明のポリペプチドのＭＡＳＴ−２結合ドメインを結合させる能力を保持している。同一性百分率は、２つの配列の最短のもので、すなわち配列番号２および前記変異体の最短のもので計算される。配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の同一性を有する変異体は、１つ以上の付加および／または１つ以上の欠失および／または１つ以上の置換によって変異体と定義される。配列番号２の変異体の例は、配列ＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＬＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳ（配列番号５）からなるポリペプチドである。特定の態様では、変異体は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号２での１、２または３個の置換、好ましくは文献で規定されるか以下のリストによる保存的置換（複数可）によって得られる：
−  非極性（すなわち、疎水性）のアミノ酸残基の群：第１のサブグループはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）およびプロリン（Ｐ）を含み、第２のサブグループはロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）およびバリン（Ｖ）を含む；
−  極性の中性（無電荷）アミノ酸残基の群：第１のサブグループはセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）を含み、第２のサブグループはアスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む；
−  アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）を含む、正荷電（すなわち、塩基性）残基の群；
−  アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含む、負荷電（すなわち、酸性）残基の群；ならびに
−  フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含む、芳香族残基の群。
【００７４】
特定の態様では、ポリペプチドが細胞質ドメインからなる場合、ポリペプチドのサイズは、３１〜５３残基、好ましくは３１〜５２もしくは３１〜５１残基、または４２〜４４残基、好ましくは４２残基、４３残基もしくは４４残基である。
【００７５】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質ドメインの配列およびＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列が何であっても、本発明のポリペプチドのアンカードメイン（それは、それ自体、またはシグナルペプチドと一緒に任意であってよい）は、以下のいずれかである：
−  サイズが１８〜２６アミノ酸であり、ポリペプチドを細胞（特に神経細胞、より詳しくはヒト神経細胞）中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜に固着させる（または、固着させることが示された）ペプチド（図１）。アンカードメインの特定の例は、Ｓｃｈｒｏｔｈ−Ｄｉｅｚ  Ｂら（２０００）で見出すことができる。特定の態様では、アンカードメインのサイズは、２０〜２４アミノ酸残基である。特定の態様では、アンカードメインのサイズは、２２アミノ酸残基である。それが本発明のポリペプチドを細胞（特に神経細胞、より詳しくはヒト神経細胞）中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜に固着させる限り、いかなるアンカードメインが選択されてもよい。特定の態様では、アンカードメインは膜貫通ドメイン、すなわち、脂質二重層と相互作用すること、特に、それを含むポリペプチドを脂質二重層に、特に細胞膜に固着させることができる任意のドメインである。膜貫通ドメインは、疎水性の残基（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｉおよび／またはＶ）に富み、膜内で安定するドメインであり、１つ以上の疎水性のαヘリックスで組織される。特定の態様では、ここで記載されるポリペプチドで用いられる膜貫通ドメインは、公知の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン（断片として）である。膜貫通ドメインの特定の例は、Ｓｃｈｒｏｔｈ−Ｄｉｅｚ  Ｂら（２０００）で見出すことができる。本発明のポリペプチドの正しい固着は、ＫD計算のために上で詳述される方法を実施することによって、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの本発明のポリペプチドの親和性を調べることによって判定されてもよい；または
−  狂犬病ウイルスＧタンパク質の膜貫通ドメイン、特に弱毒化狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質の膜貫通ドメイン、または病原性の強い狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質の膜貫通ドメイン；好ましい態様では、膜貫通ドメインは、配列ＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣ（配列番号４）または前記配列番号４と少なくとも８１％、少なくとも８６％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する変異体を含むかそれからなり、前記変異体は、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜にポリペプチドを固着させる能力を保持している；同一性百分率は、２つの配列の最短のもので、すなわち配列番号４および前記膜貫通ドメイン変異体の最短のもので計算される。配列番号４と少なくとも８１％、少なくとも８６％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する変異体は、１つ以上の付加および／または１つ以上の欠失および／または１つ以上の置換によって変異体と定義される。特定の態様では、配列番号４と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する変異体は、配列番号４でのそれぞれ１つまたは２つの置換、好ましくは文献で規定されるか上のリストによる保存的置換（複数可）によって得られる。
【００７６】
ここで規定されるアンカードメイン（好ましくは膜貫通ドメイン）の配列が何であっても：
−  前記アンカードメインのＮ末端先端は、ここで規定されるシグナルペプチドのＣ末端先端に直接または間接に連結される；および
−  前記アンカードメインのＣ末端先端は、ここで規定される細胞質ドメインの第１のＮ末端アミノ酸残基に直接または間接に、好ましくは直接に連結される。
【００７７】
特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質ドメインの配列、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列およびアンカードメインの配列が何であっても、本発明のポリペプチドのシグナルペプチド（それは、それ自体、またはアンカードメインと一緒に任意であってよい）は、以下のいずれかである：
−  サイズが３〜６０残基であり、任意に分泌経路を通して、小胞体をポリペプチドの標的にさせる（または、標的にさせることが示された）ペプチド（図１）；特定の態様では、シグナルペプチドのサイズは、１０〜４０、好ましくは１５〜３０、より好ましくは１５〜２５アミノ酸残基である。特定の態様では、シグナルペプチドのサイズは、１９アミノ酸残基である。任意に分泌経路を通してそれが小胞体を本発明のポリペプチドの標的にさせる限り、任意のシグナルペプチドが選択されてよい。特定の態様では、ここで記載されるポリペプチドで用いられるシグナルペプチドは、公知のタンパク質、例えばＣＤ４およびＣＤ８タンパク質、血球凝集素（ＨＡ）またはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ１Ｒ１、ＥＧＦＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４）のシグナルペプチドである。本発明のポリペプチドの正しいターゲティングは、ＫD計算のために上で詳述される方法を実施することによって、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの本発明のポリペプチドの親和性を調べることによって判定されてよい；または
−  狂犬病ウイルスＧタンパク質のシグナルペプチド、特に弱毒化狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質のシグナルペプチド、または病原性の強い狂犬病ウイルス株からのＧタンパク質の細胞質ドメインのシグナルペプチド；好ましい態様では、狂犬病ウイルスＧタンパク質のシグナルペプチドは、Ｇタンパク質の最初の１９アミノ酸残基に対応する。特定の態様では、前記シグナルペプチドは、配列ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧ（配列番号３）または前記配列番号３と少なくとも６８％、少なくとも７３％、少なくとも８９％または少なくとも９４％の同一性を有する変異体を含むかそれからなり、前記変異体は、任意に分泌経路を通して、ポリペプチドを小胞体内に向かわせる能力を保持している；同一性百分率は、２つの配列の最短のもので、すなわち配列番号３および前記シグナルペプチド変異体の最短のもので計算される。配列番号３と少なくとも６８％、少なくとも７３％、少なくとも８９％または少なくとも９４％の同一性を有する変異体は、１つ以上の付加および／または１つ以上の欠失および／または１つ以上の置換によって変異体と定義される。特定の態様では、配列番号３と少なくとも８９％または少なくとも９４％の同一性を有する変異体は、配列番号３でのそれぞれ１つまたは２つの置換、好ましくは文献で規定されるか上のリストによる保存的置換（複数可）によって得られる。
【００７８】
ここで規定されるシグナルペプチドの配列が何であっても、存在する場合、前記シグナルペプチドは本発明のポリペプチドのＮ末端に最も近いエレメントである。
【００７９】
「直接的な連結」は、ドメインの最後のＣ末端残基が、ペプチド結合によって続くドメインの最初のＮ末端残基に連結することを意味する。
【００８０】
対照的に、「間接的な連結」は、ドメインの最後のＣ末端残基が、ペプチド結合によってペプチドリンカーの最初のＮ末端残基に連結することを意味し、リンカーの最後のＣ末端残基は、続くドメインの最初のＮ末端残基に連結する。特定の態様では、ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質ドメインの配列、ＭＡＳＴ−２結合ドメインの配列、シグナルペプチドの配列およびアンカードメインの配列が何であっても、本発明のポリペプチドは、共にここで規定されるシグナルペプチドとアンカードメインの間に、１〜４アミノ酸、好ましくは狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインのＣ末端の１〜４アミノ酸、好ましくは狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基、例えばアミノ酸残基ＧＫからなるペプチドリンカーを任意に含む。
【００８１】
したがって、本発明の特定のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、以下を含むまたはからなる：
（１）配列番号３で規定されるシグナルペプチド、または前記配列番号３と少なくとも６８％の同一性を有する変異体、前記変異体は、任意に分泌経路を通して、ポリペプチドを小胞体内に向かわせる能力を保持している；
（２）任意に、狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基、好ましくはアミノ酸残基ＧＫ；
（３）配列番号４で規定されるアンカードメイン、または前記配列番号４と少なくとも８１％の同一性を有する変異体、前記変異体は、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜にポリペプチドを固着させる能力を保持している；ならびに
（４）（ａ）配列番号２で規定されるペプチド、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する変異体、ならびに（ｂ）配列番号１９〜配列番号２０９で規定され、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインを含むまたはからなる細胞質ドメイン。特定の態様では、配列番号２で規定されるペプチドまたは配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する変異体は、上流に（すなわち、Ｎ末端側に）位置し、好ましくはＭＡＳＴ−２結合ドメインに直接に連結している。
【００８２】
本発明のポリペプチドのサイズは、３５０以下、２５０以下、２００以下または１５０以下のアミノ酸残基である。好ましい態様では、本発明のポリペプチドのサイズは、１００アミノ酸残基以下であり、好ましくは８５〜８７アミノ酸残基、より好ましくは８５、８６または８７アミノ酸残基である。
【００８３】
本発明の特定の態様では、本発明のポリペプチドは、好ましくは外部ドメインのＣ末端の最後の２つのアミノ酸を除いて、狂犬病ウイルスのＧタンパク質の外部ドメインが失われている。特に、本発明のポリペプチドは、狂犬病ウイルス株の野生型完全長Ｇタンパク質でなく、非アポトーシス株（ＣＶＳ−ＮＩＶ株などの神経毒性株）またはアポトーシス株（弱毒化株）のいずれからでもない。別の特定の態様では、本発明のポリペプチドは、２つの配列の最短のものにわたって（すなわち、本発明のポリペプチドおよび狂犬病ウイルス株の野生型完全長Ｇタンパク質の最短のものにわたって）、狂犬病ウイルス株の野生型完全長Ｇタンパク質と、７５％未満の同一性、６０％未満の同一性または５０％未満の同一性を有する。
【００８４】
特定の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１９〜配列番号２０９で規定され、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインに直接に連結している、配列ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳ（配列番号１７）からなる。別の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１９〜配列番号２０９で規定され、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインに直接に連結している、配列ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＬＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳ（配列番号１８）からなる。
【００８５】
本発明のポリペプチドは、配列番号９で規定される配列（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１）を含まないか、それからなるものではない。
【００８６】
さらに、受託番号ＮＣＢＩ  ＣＡＩ４３２１８は、以下の配列からなるＧ糖タンパク質を指す：ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＧＦＳＬＣＦＧＫＦＰＩＹＴＩＰＤＥＬＧＰＷＳＰＩＤＩＨＨＬＳＣＰＮＮＬＶＶＥＤＥＧＣＴＮＬＳＥＦＳＹＭＥＬＫＶＧＹＩＳＡＩＫＶＮＧＦＴＣＴＧＶＶＴＥＡＥＴＹＴＮＦＶＧＹＶＴＴＴＦＫＲＫＨＦＲＰＴＰＤＡＣＲＡＡＹＮＷＫＭＡＧＤＰＲＹＥＥＳＬＨＮＰＹＰＤＹＨＷＬＲＴＶＲＴＴＫＥＳＬＩＩＩＳＰＳＶＴＤＬＤＰＹＤＫＳＬＨＳＲＶＦＰＧＧＫＣＳＧＩＴＶＳＳＴＹＣＳＴＮＨＤＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＲＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＫＧＮＫＴＣＧＦＶＤＥＲＧＬＹＫＳＬＫＧＡＣＲＬＫＬＣＧＶＬＧＬＲＬＭＤＧＴＷＶＡＭＱＴＳＤＥＴＫＷＣＰＤＱＬＶＮＬＨＤＦＲＳＤＥＩＥＨＬＶＶＥＥＬＶＫＫＲＥＥＣＬＤＡＬＥＳＩＭＴＴＫＳＶＳＦＲＲＬＳＨＬＲＫＬＶＰＧＧＫＡＹＴＩＦＮＫＴＬＭＥＡＤＡＨＹＫＳＶＲＴＷＮＥＩＩＰＳＫＧＣＬＫＶＧＧＲＣＨＰＨＶＮＧＶＦＦＮＧＩＩＬＧＰＤＧＨＶＬＩＰＥＭＱＳＳＬＬＱＱＨＭＥＬＬＫＳＳＶＩＰＬＭＨＰＬＡＤＰＳＴＶＦＫＥＧＤＥＡＥＤＦＶＥＶＨＬＰＤＶＹＫＱＩＳＧＶＤＬＧＬＰＮＷＧＫＹＶＬＭＴＡＧＡＭＩＧＬＶＬＩＦＳＬＭＴＷＣＲＲＡＮＲＰＥＳＫＱＲＳＦＧＧＴＧＲＮＶＳＶＴＳＱＳＧＫＶＩＰＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１４）。
【００８７】
したがって、特定の態様では、本発明のポリペプチドは、ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＧＦＳＬＣＦＧＧＫＹＶＬＭＴＡＧＡＭＩＧＬＶＬＩＦＳＬＭ  ＴＷＣＲＲＡＮＲＰＥＳＫＱＲＳＦＧＧＴＧＲＮＶＳＶＴＳＱＳＧＫＶＩＰＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１５）を含まないか、それからなるものではない。
【００８８】
別の特定の態様では、本発明のポリペプチドのＭＡＳＴ−２結合ドメインは、ＳＷＥＳＹＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号１６）でない。
【００８９】
本発明のポリペプチドの特定の例は、以下からなる群で選択される（ＭＡＳＴ−２結合ドメインは太字である）：（１）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＨＧＧＱＴＲＬ（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２）（配列番号２１０）；（２）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＨＧＱＱＴＲＬ（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３）（配列番号２１１）；（３）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＡＴＱＱＴＲＬ（配列番号２１２）；（４）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＹＴＧＱＴＲＬ（配列番号２１３）；（５）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＨＴＧＱＴＲＬ（配列番号２１４）；（６）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号２１５）；（７）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＡＧＧＱＴＲＬ（配列番号２１６）；（８）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＡＥＡＱＨＴＱＱＴＲＬ（配列番号２１７）；および（９）ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＶＨＡＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号２１８）。
【００９０】
ここで規定される用語「ポリペプチド」は、生じる改変ポリペプチドが、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインへの、上で規定される高い親和性を保持する限り、転写後修飾および／または合成化学、例えば非タンパク質性化学基の添加および／またはポリペプチドの三次構造の改変、例えばアセチル化、アシル化、ヒドロキシル化、環化、ラセミ化、リン酸化などによって改変されたポリペプチドを包含する。
【００９１】
本発明は、上のＡ〜Ｅ群で規定される１１〜１３アミノ酸残基からなるＭＡＳＴ−２結合ドメインそれ自体にも関する。
【００９２】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、以下を含むまたはからなるポリペプチドも対象とする：
（１）任意にシグナルペプチド、好ましくは配列番号３で規定されるシグナルペプチド、または前記配列番号３と少なくとも６８％の同一性を有する変異体、前記変異体は、任意に分泌経路を通して、ポリペプチドを小胞体内に向かわせる能力を保持し 
（２）任意に、狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基；
（３）アンカードメイン、好ましくは配列番号４で規定されるアンカードメイン、または、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜にポリペプチドを固着させる能力を保持している、前記配列番号４と少なくとも８１％の同一性を有する変異体；ならびに
（４）（ａ）ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質部分、好ましくは配列番号２で規定されるペプチド、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する変異体、ならびに（ｂ）上のＡ〜Ｅ群で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインを含むまたはからなる細胞質ドメイン。特定の態様では、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、配列番号１９〜配列番号２０９で規定されるものであり、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるものである。
【００９３】
したがって、特定の態様として、本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記ポリペプチドを小胞体膜および／またはゴルジ膜へ固着させるためのドメイン（すなわち、固着ドメイン）、ならびにポリペプチドが膜に固着されるときに細胞質に露出されるドメイン（すなわち、細胞質ドメイン）を含む、３５０アミノ酸以下のポリペプチドに関し、そこで、前記細胞質ドメインは、サイズが１１〜１３アミノ酸残基である、上のＡ〜Ｅ群で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる。このポリペプチドは、上で規定されるポリペプチドに対応するが、上で規定されるポリペプチドが膜に固着するときに、このシグナルペプチドの切断の後、それらのシグナルペプチドは失われる。したがって、本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、以下を含むまたはからなるポリペプチドにも関する：
（１）任意に、狂犬病ウイルスＧタンパク質の外部ドメインの最後の２つのＣ末端残基；
（２）アンカードメイン、好ましくは配列番号４で規定されるアンカードメイン、または、細胞中の小胞体の膜および／またはゴルジ装置の膜にポリペプチドを固着させる能力を保持している、前記配列番号４と少なくとも８１％の同一性を有する変異体；ならびに
（３）（ａ）ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質部分、好ましくは配列番号２で規定されるペプチド、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する変異体、ならびに（ｂ）上のＡ〜Ｅ群で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインを含むまたはからなる細胞質ドメイン。特定の態様では、前記ＭＡＳＴ−２結合ドメインは、配列番号１９〜配列番号２０９で規定されるものであり、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるものである。
【００９４】
特定の態様として、このポリペプチドは、以下の配列からなる：
−  上のＡ〜Ｅ群で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメイン、例えば、配列番号１９〜配列番号２０９で規定されるもの、好ましくは配列番号１９〜配列番号１０１、配列番号１０２〜配列番号１９１および配列番号１９２〜２０９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号６４〜６８、７１、７４および２０８〜２０９で規定されるものに直接に連結される、配列番号１７もしくは１８の残基２０〜７４；または
−  配列、配列番号２１０〜２１６のうちの１つの残基２０〜８５、または配列番号２１７もしくは２１８の残基２０〜８７。
【００９５】
汎用遺伝子コードに従って、変性を十分に考慮して、本発明は、ここで規定される本発明のポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド（または核酸）も対象とする。特定の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、正の鎖もしくは負の鎖（例えばウイルス粒子で見出される場合）のいずれかとしてのＲＮＡ、またはｃＤＮＡ（例えばウイルス粒子によってトランスフェクトされた細胞で発現される場合）である。本発明のポリヌクレオチドのサイズは、１０５０個以下、７５０個以下、６００個以下または４５０個以下の塩基対（ｂｐ）である。好ましい態様では、本発明のポリヌクレオチドのサイズは、３００ｂｐ以下であり、好ましくは２５５〜２６１ｂｐ、より好ましくは２５５、２５８または２６１ｂｐである。
【００９６】
これらは、ここで記載される本発明のポリペプチドの異なるドメインをコードするポリヌクレオチドの例である：
−  シグナルペプチドは、例えば、下の配列番号２１９のヌクレオチド１〜５７に位置するポリヌクレオチドによってコードされ；
−  外部ドメインの最後の２つのアミノ酸残基は、例えば、下の配列番号２１９のヌクレオチド５８〜６３に位置するポリヌクレオチドによってコードされ；
−  膜貫通ドメインは、例えば、下の配列番号２１９のヌクレオチド６４〜１２９に位置するポリヌクレオチドによってコードされ；
−  ＭＡＳＴ−２結合ドメイン上流の細胞質部分は、例えば、下の配列番号２１９のヌクレオチド１３０〜２２２に位置するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９７】
ＭＡＳＴ−２結合ドメインのサイズにより、ＭＡＳＴ−２結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１９〜２２５からなる群から選択される配列番号のヌクレオチド２２３〜２５５、または配列番号２２６もしくは２２７のヌクレオチド２２３〜２６１のいずれかに位置する。
【００９８】
特定の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをそれらのＮ末端部分に含む。
【００９９】
特定のポリヌクレオチドは、以下の配列からなる：（１）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２（配列番号２１０で規定される）をコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＧＧＧＧＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２１９）；（２）Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３（配列番号２１１で規定される）をコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３）（配列番号２２０）；（３）配列番号２１２で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２１）；（４）配列番号２１３で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２２）；（５）配列番号２１４で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２３）；（６）配列番号２１５で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２４）；（７）配列番号２１６で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２５）；（８）配列番号２１７で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２６）；（９）配列番号２１８で規定されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号２２７）。
【０１００】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で規定される配列（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１）を含まないか、それからなるものではない。
【０１０１】
本発明は、ここで規定されるポリヌクレオチド、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸ベクター（プラスミドなど）にも関する。特定の態様では、ベクターは発現ベクター、すなわち、明示的に指摘されるエレメントの他に、本発明のポリヌクレオチドの発現を作動させるのに必要な全てのエレメント（発現調節エレメント）、特に転写調節エレメントを含むベクターである。「転写調節エレメント」は、ポリヌクレオチドの転写の調節に関与する任意のＤＮＡ領域を規定し、プロモーター、例えばＣＭＶもしくはＥＦ１α、エンハンサーまたはシス作用性調節エレメントを包含する。これらのエレメント、特にプロモーターは、核酸ベクターでトランスフェクトさせる細胞の性質によって選択される。求める発現レベルまたはトランスフェクション細胞による適するプロモーターの判定は、当分野の技術者の知識の一部である。核酸ベクターがいくつかのポリヌクレオチド（１つは本発明のポリヌクレオチドである）を含有する場合、転写調節エレメント（複数可）は全てのポリヌクレオチドについて特異であるかそれらのいくつかによって共有されてよいか、または対照的に、各ポリヌクレオチドは１つ以上の特定の転写調節エレメント（複数可）と関連してよいことは注目に値する。後者の場合、いくつかの転写調節エレメントは類似するか、異なってもよい。
【０１０２】
本発明の中で、本発明の核酸ベクターに挿入される発現調節エレメントは、好ましくは、神経細胞、特にヒト神経細胞、例えばヒト神経芽腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙでの本発明のポリヌクレオチドの発現に適合する。これらのプロモーターには、それらに限定されないが以下のプロモーターが含まれる：ニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、シナプシン−１（ＳＹＮ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）（Ｂｏｕｌａｉｒｅら；（２００９））。
【０１０３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に加えて、前記ポリヌクレオチドの転写および発現のための調節シグナル（発現調節エレメント）、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルを含む、発現レンチウイルス由来ベクター、特にプラスミドにも関する。トランス相補系（ベクター／パッケージング系）で用いられる場合は、このベクターはトランスファーベクターである（下記参照）。
【０１０４】
特定の態様では、発現レンチウイルス由来ベクターは、レンチウイルスまたはレトロウイルスのゲノムから調製することができ、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築物とは別に、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成およびプロセシングのために認識シグナルを提供するのに必要である、前記ゲノムの非コード領域であるレンチウイルスまたはレトロウイルスゲノムの配列だけを含有する。したがって、発現レンチウイルス由来ベクターは、レンチウイルスまたはレトロウイルスゲノムの２つの末端反復配列（ＬＴＲ）の間の全てのウイルスコード配列が、本発明のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの転写および発現のための調節シグナル（発現調節エレメント）、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルによって置きかえられた置換ベクターであってよい。特定の態様では、発現レンチウイルス由来ベクターは、２つの末端反復配列（ＬＴＲ）の間の全てのウイルスコード配列が、本発明のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの転写および発現のための調節シグナル（発現調節エレメント）、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルによって置きかえられた、ＨＩＶゲノム、特にＨＩＶ−１ゲノムから得られ、発現ＨＩＶ由来ベクター、特に発現ＨＩＶ−１由来ベクターを与える。
【０１０５】
本発明は、レンチウイルスベクターゲノム、すなわちトランス相補系での粒子の形成後の、レンチウイルスベクター粒子に含有される遺伝物質、ならびに発現レンチウイルス由来ベクターとレンチウイルスベクター粒子に含有される遺伝物質との間の任意の核酸中間体にも関し、前記レンチウイルスゲノムまたは核酸中間体は、本発明のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの転写および発現のための調節シグナル（発現調節エレメント）、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルを含む。
【０１０６】
したがって本発明は、任意の適当な核酸、すなわち、粒子の周期によって、三重配列としてＤＮＡフラップを含有する形を含む、二本または一本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡも包含し、例えば、粒子、または形成される場合の粒子のＲＮＡゲノムの発現のための発現レンチウイルス由来−キャプシド形成プラスミドおよびエンベローププラスミドによる宿主細胞の同時トランスフェクションのために用いられる−またはベクター前組込み複合体を含む、粒子が投与される宿主の形質導入細胞中のこのゲノムの核酸の様々な形が含まれる。
【０１０７】
したがって、本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、レンチウイルスベクターゲノムまたは任意の核酸中間体は、非レンチウイルス起源の転写および発現のための調節シグナル、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー、好ましくは神経細胞、特に上記のヒト神経細胞での本発明のポリヌクレオチドの発現に適合するプロモーターを含む。プロモーターの例は、ＣＭＶｉｅ（前初期のＣＭＶ）とも呼ばれるＣＭＶ、ＥＦ１αプロモーター、ＰＧＫ等である。特定の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、転写および発現のための調節シグナルの制御下にある。
【０１０８】
本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、レンチウイルスベクターゲノムまたは任意の核酸中間体は、共にレンチウイルス起源であるシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）も含む。これらの２つの領域は、ＤＮＡフラップまたはＤＮＡトリプレックスとして知られる。本発明に適するＤＮＡフラップは、レンチウイルスまたはレトロウイルス様生物体、例えばレトロトランスポゾンから得られるか、合成的（化学合成）に、または、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって任意のレンチウイルスゲノムからのＤＮＡフラップの増幅によって調製されてもよい。ＤＮＡフラップは、レンチウイルス、特にＨＩＶレトロウイルスから、またはＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）ウイルス、ＥＩＡＶ（ウマ伝染性貧血ウイルス）ウイルス、ビスナウイルス、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）ウイルス、またはＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）ウイルスから得られてもよい。より好ましい態様では、ＤＮＡフラップは、ＨＩＶレトロウイルス、例えばそれらの２つの型の任意の分離株を含むＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスから得られる。好ましいＤＮＡフラップは、配列番号２２８〜２３４で規定される配列を含むまたはからなる。ＤＮＡフラップは、天然の（レンチウイルスゲノム）ヌクレオチド環境から、すなわちそれがレンチウイルスゲノムに天然に含有されるｐｏｌ遺伝子の環境から単離されるＤＮＡ断片として用いられることは注目に値する。したがって本発明では、ＤＮＡフラップは、ｐｏｌ遺伝子の不必要な５’および３’部分から削除されて用いられ、異なる起源の配列と再結合される。
【０１０９】
特定の態様によると、ＤＮＡフラップは、約９０〜約１４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。ＨＩＶ−１では、ＤＮＡフラップは安定した９９ヌクレオチド以上の長さの鎖の重複部分である。本発明のレンチウイルスベクターのゲノムベクターで用いられる場合、特にＰＣＲ断片として調製される場合は、それはより長い配列として挿入されてもよい。ＤＮＡフラップを提供する構造を含む特定の適当なポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１  ＤＮＡのｃＰＰＴおよびＣＴＳ領域を包含する１７８塩基対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片である。
【０１１０】
特定の態様では、逆転写の間にトリプレックス立体構造を採用するために、ｃＰＴＴおよびＣＴＳ領域は、ベクターまたはレンチウイルスゲノムに機能的配向で挿入される。
【０１１１】
特定の態様では、ベクターゲノムの中央かほとんど中央の位置を有利に占めるために、ＤＮＡフラップは、本発明のポリヌクレオチドのすぐ上流か、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターのすぐ上流に挿入される。
【０１１２】
本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、レンチウイルスベクターゲノムまたは任意の核酸中間体は、逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルも含む。そのようなエレメントの例は、少なくとも１つの（好ましくは２つの）末端反復配列（ＬＴＲ）、例えばＬＴＲ５’およびＬＴＲ３’、ならびにレンチウイルスゲノムキャプシド形成に関与するｐｓｉ配列である。本発明の特定の態様では、ＬＴＲ、好ましくはＬＴＲ３’は、Ｕ３領域のプロモーターおよびエンハンサーのために削除される；この改変は、レンチウイルスゲノムに挿入された導入遺伝子の転写を実質的に増加させることが示されている（ＷＯ０１／２７３０４）。
【０１１３】
本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、レンチウイルスベクターゲノムまたは任意の核酸中間体は、以下のエレメントの少なくとも１つを任意に含んでもよい：
−  スプライスドナー部位（ＳＤ）、スプライス受容部位（ＳＡ）および／もしくはＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）の間で選択されるエレメント；ならびに／または
−  本発明のポリヌクレオチドをクローニングするためのいくつかの特異な制限部位；ならびに／または
−  配列がレンチウイルスゲノムが発現されるべき細胞の性質に依存する、複製が開始されるＤＮＡの配列、複製起点（ｏｒｉ）。前記ｏｒｉは、哺乳動物起源、最も好ましくはヒト起源であり、好ましくはヒト神経細胞での複製に適合させてもよい。レンチウイルスゲノムが細胞宿主ゲノムに組み込まれない場合に、本発明のレンチウイルスゲノムまたは発現レンチウイルス由来ベクターにｏｒｉを挿入することは本発明の有利な態様である；したがって、ｏｒｉの存在は、細胞分裂の後でさえ、少なくとも１つのレンチウイルスゲノムが各細胞に存在することを保証する；ならびに／または
−  少なくとも１つの足場付着領域（ＳＡＲ）および／またはマトリックス付着領域（ＭＡＲ）。実際、これらのＡＴに富む配列は、細胞染色体のマトリックスにレンチウイルスゲノムを固着させることを可能にし、このように、本発明のポリヌクレオチドの転写を調節する。
【０１１４】
明細書全体で議論される態様とは独立して、または一緒に、本発明の特定の態様では、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは、機能的なｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖレンチウイルス遺伝子を欠いている。「機能的」は、正しく転写され、および／または正しく発現される遺伝子を意味する。したがって、この態様での本発明の発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは、転写されないか、不完全に転写される、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを含有する；「不完全に転写される」という表現は、転写産物ｇａｇ、ｇａｇ−ｐｒｏまたはｇａｇ−ｐｒｏ−ｐｏｌの変化を指し、これらの１つまたはこれらのいくつかは転写されない。特定の態様では、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖレンチウイルス遺伝子が欠けている。特定の態様では、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは、Ｖｉｆ−、Ｖｐｒ−、Ｖｐｕ−およびＮｅｆ−副遺伝子（ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターの場合）のコード配列、またはそれらの完全か機能的な遺伝子も欠けている。
【０１１５】
本発明のレンチウイルスベクターは複製をせず、すなわち、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは感染宿主細胞から出芽する新しい粒子を形成することができない。上の段落で示されるように、これは、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムでのｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ遺伝子の不在によって達成されてよい；これは、粒子形成のために必要とされる他のウイルスコード配列（複数可）および／またはシス作用性遺伝子エレメントの欠失によって達成することもできる。粒子の形成の不在は、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムの複製と区別するべきである。実際、前述のように、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムは、粒子の形成を確保することなく、発現レンチウイルス由来ベクターまたはレンチウイルスベクターゲノムの複製を確保する複製起点を含有してもよい。
【０１１６】
本発明は、（ａ）ＰＯＬタンパク質ならびに（ｂ）本発明のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの発現調節エレメント、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルを含むレンチウイルスベクターゲノムから作製されるＧＡＧ構造タンパク質およびウイルスコアを含むレンチウイルスベクター偽型粒子（pseudotyped particle）にも関し、そこで、前記粒子は、ＶＳＶウイルスのＧタンパク質または狂犬病ウイルスのＧタンパク質で偽型化される。
【０１１７】
「レンチウイルスベクター偽型粒子」という表現は、タンパク質と、好ましくはこれらのタンパク質のキャプシドに包まれる遺伝物質の両方を含むレンチウイルス粒子を包含する。粒子は、ウイルスのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）ならびに構造タンパク質（ｇａｇ遺伝子によってコードされる）で作製される。粒子の中には、３つの酵素（ｐｏｌ遺伝子によってコードされる）、すなわち、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼで形成されるウイルスのコア（またはキャプシド）、ならびに遺伝物質（レンチウイルスゲノム）がある。レンチウイルスゲノムに含有される、前記ポリヌクレオチドの発現調節エレメント、共にレンチウイルス起源のシス作用性中心開始領域（ｃＰＰＴ）およびシス作用性終止領域（ＣＴＳ）、ならびに逆転写、発現およびパッケージングのためのレトロウイルス起源の調節シグナルの特徴は、発現レンチウイルス由来ベクターについて上で規定される通りである。実際、レンチウイルス粒子に含有されるレンチウイルスゲノムは、発現レンチウイルス由来ベクターに含有される核酸の転写産物である。
【０１１８】
本発明のレンチウイルスベクターのエンベロープタンパク質は、レンチウイルスベクターを調製するために用いられるレンチウイルスのエンベロープタンパク質で、あるいは、宿主内に向かわせる細胞に関して選択される異種エンベロープタンパク質で偽型化されてよい。
【０１１９】
特定の態様では、前記レンチウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化される。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、血清型Ｉｎｄｉａｎａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、Ｐｉｒｙ、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ、Ｉｓｆａｈａｎ、Ｃｏｃａｌまたはこれらの血清型の少なくとも２つの組合せを起源とする。特定の態様では、ＶＳＶを起源とするＶＳＶ−Ｇタンパク質は、特に偽型化を向上させるために天然形に対して改変される。
【０１２０】
別の態様では、前記レンチウイルス粒子は、狂犬病ウイルスのＧタンパク質で偽型化される。特定の態様では、Ｇタンパク質は弱毒化株、例えばＥＲＡ−ＮＩＶ（ＥＲＡ）株を起源とする。特定の態様では、Ｇタンパク質は病原性の強い株、例えばＣＶＳ−ＮＩＶ（ＣＶＳ）株、ＣＶＳ−Ｇｉｆ−ｓｕｒ−Ｙｖｅｔｔｅ株（Ｐｒｅｈａｕｄら１９８８）、ＣＶＳ−１１株、Ｎ２Ｃ株またはＣＶＳ−２４株を起源とする。特定の態様では、Ｇタンパク質はＣＶＳ２４  Ｂ２ｃ株を起源とする（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら１９９８；Ｍｅｎｔｉｓら２００６）。狂犬病ウイルスのＧタンパク質で偽型化された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをレンチウイルスゲノムに含むレンチウイルス粒子は、本発明の好ましい生成物である。
【０１２１】
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）の元のＥＲＡおよびＣＶＳ株は、それぞれ寄託番号ｖｒ３３２およびｖｒ９５９の下でＡＴＣＣから入手できる（Ｐｒｅｈａｕｄ  Ｃら、２００３、およびＷＯ２０１０／１１６２５８）。
【０１２２】
ＣＶＳ−ＮＩＶ株のＧタンパク質の配列は、受託番号ＡＦ４０６６９４の下で入手でき、配列番号１２で規定される通りである。ＣＶＳ−ＮＩＶ株のＧタンパク質は、２００１年１１月３０日にブダペスト条約の条項の下でＣＮＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ１５−Ｆｒａｎｃｅ）に番号Ｉ−２７５８の下で寄託された組換え大腸菌株から入手できる。この組換え大腸菌は、ＣＶＳーＮＩＶ株のＧタンパク質を誘導可能に発現するプラスミド（プラスミドｐＲｅｖ−ＴＲＥ−Ｇ−ＣＶＳ；ＷＯ０３／０４８１９８）を含む。
【０１２３】
ＥＲＡ−ＮＩＶ株のＧタンパク質の配列は、受託番号ＡＦ４０６６９３の下で入手でき、配列番号１３で規定される通りである。ＥＲＡ株のＧタンパク質は、２００１年１１月３０日にブダペスト条約の条項の下でＣＮＣＭに番号Ｉ−２７６０の下で寄託された組換え大腸菌株から入手できる。この組換え大腸菌は、ＥＲＡ株のＧタンパク質を誘導可能に発現するプラスミド（プラスミドｐＲｅｖ−ＴＲＥ−Ｇ−ＥＲＡ；ＷＯ０３／０４８１９８）を含む。
【０１２４】
プラスミドＣＮＣＭ  Ｉ−２７５８またはプラスミドＣＮＣＭ  Ｉ−２７６０を含有する組換え大腸菌株の培養のための適当な条件は、標準ＬＢ−ＴＹＭ増殖培地（アンピシリンの存在下）での前記組換え大腸菌株の３７℃でのインキュベーションを含む。
【０１２５】
ＣＶＳ２４  Ｂ２ｃ株のＧタンパク質のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、それぞれ配列番号２８７および配列番号２８８で規定される通りである。
【０１２６】
特定の態様では、レンチウイルスベクター偽型粒子に含有されるインテグラーゼタンパク質は、欠陥がある。インテグラーゼタンパク質は、ｐｏｌ遺伝子によってコードされるタンパク質の１つである。「欠陥のある」は、レンチウイルス起源のインテグラーゼが、宿主細胞のゲノムへのレンチウイルスゲノムの組込み能力が欠けていること、すなわちインテグラーゼタンパク質がインテグラーゼ活性を特異的に変更するように突然変異されることを意味する。したがって、タンパク質のインテグラーゼ能力が変更される一方で、ＧＡＧ、ＰｒｏおよびＰｏＬタンパク質の正しい発現および／またはキャプシド、したがってベクター粒子の形成、ならびに組込みステップの前か後のウイルス周期の他のステップ、例えば逆転写、核移入は原状のままである。インテグラーゼは、それが可能にするべきである組込みが、対応する野生型インテグラーゼを含有するレンチウイルスベクターと比較したときに、組込みステップが１０００に１未満、好ましくは１００００に１未満で起こるような方法で変更される場合に欠陥と言われる。
【０１２７】
本発明の特定の態様では、インテグラーゼの欠陥特性は、クラス１の突然変異から、好ましくは前節の必要条件を満たすタンパク質を生成するアミノ酸置換（１アミノ酸置換）または短い欠失から生じる。突然変異は、ｐｏｌ遺伝子の中で実行される。ＨＩＶ−１を変更し、組込みのために機能しないインテグラーゼ（組込み能力のないインテグラーゼ）を得ることを可能にする突然変異の例は、以下である：Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｉ、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９Ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３ＡおよびＫ２６４Ｈ。別の提案された置換は、アミノ酸残基ＡＡＨによるアミノ酸残基ＲＲＫ（２６２位〜２６４位）の置きかえである。特定の態様では、以下の置換が好ましい：Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｉ、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９Ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３ＡおよびＫ２６４Ｈ。他の突然変異は、ＷａｎｉｓｃｈおよびＹａｎｅｚ−Ｍｕｎｏｚ（２００９）で開示される。特に適切な突然変異は、Ｄ６４Ｖ突然変異である。
【０１２８】
レンチウイルスベクターゲノムに含有されるエレメント、粒子のエンベロープタンパク質の性質およびインテグラーゼタンパク質の欠陥のあるなしの特徴が何であっても、レンチウイルスベクター偽型粒子は、好ましくは、トランス相補系（ベクター／パッケージング系）によって得られる。したがって、許容細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）は、ここで規定される発現レンチウイルス由来ベクターであるトランスファーベクターで、および、ポリペプチドＧＡＧ、ＰＯＬおよびエンベロープタンパク質（複数可）、またはレンチウイルス粒子の形成を可能にするのに十分なこれらのポリペプチドの一部をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をトランスで提供する少なくとも１つの他のプラスミドで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされる。トランスファーベクターは、転写産物としてレンチウイルスゲノムを生成するが、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは、ＧＡＧ構造タンパク質ウイルスコアのためのＰＯＬタンパク質（好ましくは欠陥のあるインテグラーゼと）および偽型ＥＮＶタンパク質（好ましくはＶＳＶからのＧタンパク質または狂犬病ウイルスからのＧタンパク質）をそれぞれ提供する。
【０１２９】
例えば、許容細胞は、本発明の発現レンチウイルス由来ベクターである第１のプラスミド（トランスファーベクター）、エンベロープタンパク質（複数可）（例えば、ＶＳＶ−Ｇまたは狂犬病ウイルスのタンパク質Ｇ）をコードする遺伝子を含む第２のプラスミド（エンベロープ発現プラスミドまたは偽型ｅｎｖプラスミド）、ならびにＧＡＧおよびＰＯＬタンパク質を発現する第３のプラスミド（キャプシド形成プラスミドまたはパッケージング構築物）でトランスフェクトされる。
【０１３０】
本発明は、本発明のベクターでトランスフェクトされたか、本発明のレンチウイルス粒子によって形質導入された細胞（好ましくは単離された）または細胞培養物も対象とする。したがって、本発明の細胞または細胞培養物は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含むか発現し、ならびに／または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび／もしくは本発明の少なくとも１つのベクターを含む。
【０１３１】
前記細胞は、真核生物の細胞［または真核生物の細胞で作製された細胞培養物］、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞またはヒト以外の細胞、最も好ましくはヒト細胞であってよい。好ましくは、前記細胞は、ヒト胎児細胞でもヒト胚細胞でもない。
【０１３２】
特定の態様では、前記細胞は、神経細胞、好ましくはヒト神経細胞である。特定の態様では、前記細胞は、ヒト前有糸分裂前ニューロン、未熟ヒトニューロン、例えば神経芽腫細胞、Ｎｔｅｒａ  ２Ｄ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９７３）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ
ＨＴＢ１１）、ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）、Ｕ３７３ＭＧ（ヒト星状細胞腫細胞系；Ｂａｂａｕｌｔ  Ｎら、２０１１）である（Ｐｒｅｈａｕｄ  Ｃ．ら、２０１０、２００５および２００３；Ｌａｆｏｎ  Ｍ．ら、２００８および２００６；Ｍｅｇｒｅｔ  Ｆ．ら２００７）。
【０１３３】
これらは、本明細書によりトランスフェクトまたは形質導入されてもよい特定の細胞または細胞培養物である：
−  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養物、ヒト神経芽腫細胞系、アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．；Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９；Ｕ．Ｓ．Ａ．）から寄託番号ＣＲＬ−２２６６の下で入手できる。ヒト神経芽腫細胞系ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ１１）のサブクローンであるこれらの細胞は、細胞透過性ｄｂ−ｃＡＭＰで処理したときに分化してもよい。これらの分化細胞は、高い可塑性、伸長および退縮を示した（Ｌｏｈ  ＳＨＹら２００８）；
−  当技術分野で、例えばＰｒｅｈａｕｄら２００５に記載される胎児がん腫細胞系ＮＴｅｒａ  ２ｃｌ．−Ｄ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９７３）から得られる、純粋な有糸分裂後ヒトニューロン（ＮＴ２−Ｎ）。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）による分化の誘導、その後有糸分裂阻害剤による処理およびトリプシン処理によってアレンジされる精製の後に、Ｔｅｒａ細胞Ｎ２Ｄ１はヒト有糸分裂後ニューロン（ＮＴ２−Ｎ）の純粋な培養に分化することができる（Ａｎｄｒｅｗｓ  ＰＷ、１９９８）。ＮＴ２−Ｎ細胞は、分化したヒトニューロンの全ての特異マーカーを有する（Ｇｕｉｌｌｅｍａｉｎ  Ｉ．２０００）。それらはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの間でシナプス接触を、および共培養の星状神経膠細胞と機能的接触を、ならびに機能的シナプシスを確立することができる。
【０１３４】
−  ＮＧＦで分化させた、ＰＣ１２細胞のサブクローンである、ラット褐色細胞腫細胞（ＮＳ細胞、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＵＳＡ）。これらの分化細胞は強力で組織化された神経突起ネットワークを提示し、ハイスループットスクリーニングについて検証されている。ＮＳ細胞は神経突起を伸長させ、電気的に励起しやすくなり、外部から加えたアセチルコリンにより応答性になり、より多くのカルシウムチャネルを有し、いくつかの神経伝達物質の合成を増加させる。ＮＧＦの存在下で増殖させたＮＳ細胞は、交感神経細胞に類似し、ノルアドレナリンニューロンのモデルである。
【０１３５】
−  アドレナリン作用性の未熟なニューロンのプロトタイプであるＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽腫細胞系（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ１１）（Ｖｏｎ  Ｒｅｉｔｚｅｎｔｓｔｅｉｎ、２００１）。これらの細胞は、ＡＴＲＡ処理でさらに分化させることができる（Ｇａｉｔｏｎｄｅら  ２００１；Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら  ２００１）。
【０１３６】
あるいは、前記細胞は、原核細胞［または原核細胞で作製される細胞培養物］、好ましくは細菌、例えば大腸菌であってよい。
【０１３７】
特定の態様では、細胞は、特に細胞または細胞培養物が本発明のレンチウイルス粒子によって前もって形質導入されている場合、ゲノムに組み込まれている本発明のポリヌクレオチド（本発明のポリペプチドを発現する）を含有する。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、それが本発明のレンチウイルス粒子によって前もって形質導入されている場合でも、欠陥のあるインテグラーゼのために細胞のゲノムに組み込まれない。この後者の場合、有利には、本発明のポリヌクレオチドは複製起点を含む。
【０１３８】
本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、本発明のレンチウイルスベクター偽型粒子または本発明の細胞、および任意に薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤または担体を含む組成物にも関する。組成物は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、発現レンチウイルス由来ベクター、レンチウイルスベクター偽型粒子または細胞を有効成分として含み、前記組成物は、宿主、好ましくはヒト宿主への投与に適する。
【０１３９】
好ましい組成物は、本発明の狂犬病Ｇタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子を含む。実際は、本発明の狂犬病Ｇタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子は、少なくとも２つの有利な特徴を合わせ持つ：
（１）本発明のポリペプチドは、上で規定される細胞質ドメインのＭＡＳＴ−２結合ドメインの特徴を通して、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインに高い親和性を有する。したがって、先行技術のポリペプチドと比較して、本発明のポリペプチドの使用は、神経突起伸長の誘導および／もしくは刺激、ならびに／または神経生存に及ぼす観察される作用を向上させる；
（２）狂犬病ウイルスのＧタンパク質による粒子の偽型化は、筋肉（組成物の注射部位）からの逆行性輸送によって神経細胞を特異的標的にすること、したがって他の細胞型の不必要な形質導入を避けることを可能にする。
【０１４０】
「薬学的に許容される担体」は、任意の従来の型の非毒性固体、半固体もしくは液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材または補助製剤を指す。「薬学的に許容される担体」は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに非毒性で、製剤の他の成分に適合する；適する担体には、それらに限定されないが、リン酸緩衝食塩水溶液、蒸留水、乳濁液、例えば油／水乳濁液、様々な型の湿潤剤無菌液など、ブドウ糖、グリセロール、食塩水、エタノールおよびその組合せが含まれる。そのような担体は、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。非経口投与のための担体には、ブドウ糖、マンニトール、マンノース、ソルビトール、食塩水、純水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、落花生油、ゴマ油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマーなどの水溶液が含まれる。
【０１４１】
「薬学的に許容される賦形剤」は、担体として用いられるか、本発明のポリペプチド（複数可）の投与可能な形を製造するために用いられる物質を指す。適する賦形剤には、フィラー、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、メイズ、コムギ、米またはジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム；および／または生理的に許容されるポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれる。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてもよい。したがって、本発明のポリペプチド（複数可）の経口使用のために、固体賦形剤を用いることができ、生じる混合物を任意に磨砕し、所望により適する補助剤を加えた後に顆粒剤の混合物を加工して、錠剤または糖衣剤のコアを得てもよい。糖衣剤または錠剤のコーティングのための賦形剤の例は濃縮糖溶液であり、それらは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適する有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有してもよい。識別のために、または活性化合物用量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣剤コーティングに色素または顔料を加えてもよい。
【０１４２】
本発明は、医薬または薬物として用いるための、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、本発明のレンチウイルスベクター偽型粒子、本発明の細胞、または本発明の組成物（以後、本発明の生成物として開示される）にも関する。
【０１４３】
医薬としての使用、ならびに下で詳述される使用および処置に関して、本発明の狂犬病ウイルスＧタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子、または本発明の狂犬病ウイルスＧタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子（複数可）を含む組成物が好ましい。
【０１４４】
したがって、本発明の生成物は、神経突起伸長を誘導および／または刺激するために、より特に、不十分であるか障害のある神経突起生成、より特に不十分であるか障害のある神経突起伸長が関与する疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防で用いられる。
【０１４５】
本発明に従って、本発明の生成物は、例えばニューロン前駆体もしくは新生物ニューロンからのニューロン分化のための、および／または障害のあるニューロンのニューロン再生のための（両作用は神経突起伸長の刺激から得られる）、神経突起伸長（および／または軸索および／または樹状突起発達）のエフェクターを意図する。特定の態様では、本発明の生成物は、神経突起生成、より特に神経突起伸長、さらにより特にヒト神経突起伸長を誘導および／または刺激するための使用のためのものである。別の特定の態様では、本発明の生成物は、神経突起生成、より特に有糸分裂前ニューロン、新生物ニューロン、ニューロン前駆体、ならびに障害のあるニューロンからの神経突起伸長を誘導および／または刺激するための使用のためのものである。
【０１４６】
本発明の生成物は、神経再生性（新しい機能的ニューロン、グリア、軸索、ミエリンおよび／またはシナプシスの生成）および／または神経保護剤（アポトーシスまたは変性からのニューロンの保護）としての使用のためのものである。
【０１４７】
本発明の生成物は、神経突起出芽および／または軸索増殖および／または樹状ツリーの伸長を刺激および／または誘導するための使用のためのものである。
【０１４８】
本発明の生成物は、シナプス形成および／または神経伝達を刺激および／または誘導するための使用のためのものである。実際、本発明のポリペプチドは、成長円錐の活性を刺激する。さらに、それは、成長円錐が成長崩壊剤、例えばＬＰＡまたは酸化的ストレスと接触した結果として崩壊することを予防する。
【０１４９】
本発明の生成物は、ニューロン発達および／またはニューロン再生および／または軸索増殖および／または樹状突起発達および／または樹状ツリー伸長および／またはニューロン可塑性および／またはシナプス形成および／または神経伝達を刺激するために用いるためのものである。
【０１５０】
本発明の生成物は、神経突起退縮および／または成長円錐崩壊につながるいかなる種類の神経毒性も予防および／または阻止および／またはブロックするために用いるためのものである。
【０１５１】
本発明の生成物は、前記神経突起および／または円錐が神経毒性剤と接触した後に、神経突起伸長および／または成長円錐活性を刺激および／または誘導するための使用のためのものである。
【０１５２】
本発明の生成物は、成長円錐の崩壊および／または神経突起退縮および／または軸索樹状突起間の傷害もしくは病変および／またはシナプス完全性の破壊および／またはニューロン結合性の喪失および／または神経終末への傷害および／または神経伝達障害を予防および／または阻止および／またはブロックするための使用のためのものである。
【０１５３】
本発明の生成物は神経突起伸長を誘導および／または刺激するための使用のためのものであり、それは特に、
−  例えば神経系の新生物の処置および／または緩和および／または予防で、ニューロン分化を誘導すること、ならびに
−  障害のあるニューロン、より特に障害のある神経突起を再生すること、例えば、
−  神経変性の疾患、障害もしくは状態の処置および／もしくは緩和および／もしくは予防、ニューロンの微生物感染の処置および／もしくは緩和および／もしくは予防、またはニューロンを神経毒性剤もしくは酸化的ストレスから保護することにおいて有益である。
【０１５４】
したがって、本発明は、不十分であるか障害のある神経突起生成、より特に不十分であるか障害のある神経突起伸長または不十分な樹状突起分枝が関与する任意の疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防で用いるための、本発明の生成物に関する。
【０１５５】
前記疾患、障害または状態は、代替的にまたは補足的に、不均衡なニューロン細胞周期が関与する任意の疾患、障害または状態と規定され、ここで、前記ニューロン細胞周期は以下のいずれか：
−  有糸分裂前のニューロンの過剰であるか望ましくない存在（より特に、新生物が神経系内で発達する場合のように、不十分なニューロン分化によっておよび／またはニューロン細胞周期への有糸分裂後ニューロンの過剰であるか望ましくない再入によって）、または
−  過剰であるか望ましくないニューロン変性、より特に過剰であるか望ましくない神経突起変性（神経変性の疾患、障害または状態、およびニューロンの確実な微生物感染の場合のように）によって均衡を失う。
【０１５６】
本発明の生成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系（ＰＮＳ）を変化させる疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防における、例えば神経修復の療法および／または予防および／または緩和としての使用のためのものである。ここで「中枢神経系」または「ＣＮＳ」という表現は、脳および（脊椎動物の場合）脊髄を意味するものとする。末梢神経系（ＰＮＳ）は、体と脳および脊髄を結ぶ脊髄および頭蓋神経の巨大なネットワークである。ＰＮＳは、自律神経系（交感神経ＮＳおよび副交感神経ＮＳ）および体神経系に細分化される。ＰＮＳは、刺激受容体からＣＮＳへ走る感覚ニューロンならびにＣＮＳから筋肉および腺へ走る運動ニューロンからなる。
【０１５７】
本発明の態様により、前記疾患、障害または状態は、神経系の微生物感染、例えば細菌および／またはウイルスの感染、より特にウイルスの感染であるかそれを含む。好ましくは、前記微生物感染は、ニューロンアポトーシスを誘導する微生物感染、例えば灰白髄炎である（Ｂｌｏｎｄｅｌら、２００５）。ウイルス感染の例は、ポリオウイルス感染または西ナイルウイルス感染である。
【０１５８】
本発明の別の態様により、前記疾患、障害または状態は、非ウイルス性の疾患、障害または状態、より好ましくは非細菌性および非ウイルス性の疾患、障害または状態、さらにより好ましくは非微生物性の疾患、障害または状態であるかそれを含む。
【０１５９】
本発明の態様により、前記疾患または障害は、神経変性性の疾患または障害（例えば、慢性神経変性性の疾患または障害）、例えば、非ウイルス脳症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、ハンチントン舞踏病、多発硬化症（ＭＳ）または稀な遺伝病であるかそれを含む。好ましくは、前記神経変性性の疾患または障害は、非ウイルス性の疾患または障害、より好ましくは非細菌性および非ウイルス性の疾患または障害、さらにより好ましくは非微生物性の障害である。
【０１６０】
本発明の態様により、前記状態は神経変性性の状態、例えば加齢であるかそれを含む。好ましくは、前記神経変性性の状態は非ウイルス性の状態、より好ましくは非細菌性および非ウイルス性の状態、さらにより好ましくは非微生物性の状態である。
【０１６１】
本発明の態様により、前記疾患、障害または状態は、神経系の物理的または虚血性の傷害、例えば発作、脳卒中、外傷、てんかんであるかそれを含む。好ましくは、前記物理的または虚血性の傷害は、非ウイルス性の疾患、障害または状態、より好ましくは非細菌性および非ウイルス性の疾患、障害または状態、さらにより好ましくは非微生物性の疾患、障害または状態である。
【０１６２】
本発明の態様により、前記疾患、障害または状態は、化学的神経毒剤および／または酸化的ストレスの存在を含む。好ましくは、前記疾患、障害または状態は、非ウイルス性の疾患、障害または状態、より好ましくは非細菌性および非ウイルス性の疾患、障害または状態、さらにより好ましくは非微生物性の疾患、障害または状態である。
【０１６３】
本発明の態様により、前記疾患は、新生物、より特に新生物ニューロンを含む新生物である。ここで用語「新生物」は、より特に悪性の新生物、より特にがん、さらにより特に腫瘍または白血病、さらにより特に腫瘍を意図する。
【０１６４】
当業者が適当であることを見出すであろういかなる投与様式も、本発明に包含される。本発明の生成物の製剤化方法によって、それは非経口または腸内（例えば、経口）投与によって、好ましくは非経口投与によって、より好ましくは非経口注射によって投与することができる。
【０１６５】
本発明は、上で規定される任意の疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防のための医薬または薬物の製造のための、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、本発明のレンチウイルスベクター偽型粒子、本発明の細胞または組成物の使用にも関する。
【０１６６】
本発明は、それを必要とする対象、より特にヒトの処置方法にも関し、この方法は、前記対象またはヒトに、少なくとも本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の発現レンチウイルス由来ベクター、本発明のレンチウイルスベクター偽型粒子、本発明の細胞または本発明の組成物を投与することを含む。この処置方法は、上で規定される任意の疾患、障害または状態の処置および／または緩和および／または予防を意図する。
【０１６７】
本発明の生成物は、免疫原性の薬剤でもアジュバントでもなく、または少なくとも免疫原性薬剤もしくはアジュバントとしても用いられず、本発明のポリペプチドが免疫原性薬剤もしくはアジュバントとして作用することを可能にする条件の下で用いられない。本発明の生成物は、投与後に検出可能な体液性免疫応答を起こさない。
【０１６８】
本発明は、細胞内の所与の分子の神経生存および／または神経保護活性を判定する方法にも関し、この方法は：
（ａ）細胞または細胞培養物と接触するようにアッセイ対象の分子を加えること；
（ｂ）ステップａ）の細胞または細胞培養物中で、５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子の発現を測定すること；ならびに
（ｃ）ステップｂ）で測定される遺伝子の各々の発現を、前記分子と接触していない同じ細胞型の細胞で測定される同じ遺伝子の発現で標準化することを含み、そこで、前記セットの遺伝子の発現の統計的に有意なモジュレーションは、前記分子が神経生存および／または神経保護活性を有していてもよいことを明らかにする。
【０１６９】
特定の態様では、ステップｂ）は、１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子の発現の測定をさらに含む。その場合、各さらなる遺伝子は、ステップｃ）において、前記分子と接触していない同じ細胞型の細胞で測定される同じさらなる遺伝子の発現で標準化される。
【０１７０】
したがって、特定の態様では、細胞内の分子の神経生存および／または神経保護活性を判定する方法は、
（ａ）細胞または細胞培養物と接触するようにアッセイ対象の分子を加えること；
（ｂ）ステップａ）の細胞または細胞培養物中で、５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子、ならびに任意に１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子の発現を測定すること；ならびに
（ｃ）ステップｂ）で測定される遺伝子の各々の発現を、前記分子と接触していない同じ細胞型の細胞で測定される同じ遺伝子の発現で標準化することを含み、そこで、前記セットの遺伝子の発現の統計的に有意なモジュレーションは、前記分子が神経生存および／または神経保護活性を有していてもよいことを明らかにする。
【０１７１】
ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号２３６〜配列番号２５２でそれぞれ規定される通りである。
【０１７２】
この方法（プロセス）は、第１のステップで、細胞または細胞培養物と接触するようにアッセイ対象の分子を加えることを含む。
【０１７３】
「細胞または細胞培養物と接触するようにアッセイ対象の分子を加えること」は、分子がヒトＭＡＳＴ２タンパク質のＰＤＺドメインと相互作用することができなければならないこと、したがって、この細胞または細胞培養物の細胞質で、特にヒトＭＡＳＴ−２タンパク質を発現する細胞または細胞培養物で発現されなければならないことを意味する。したがって、第１のステップは、細胞の細胞質でアッセイ対象の分子を発現させることからなる。
【０１７４】
したがって、細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するために、または特に分子の性質によって細胞を分子に透過性にするために、当分野の技術者に公知である任意の方法が用いられてよい。
【０１７５】
細胞質への前記発現の例示として、アッセイ対象の分子の性質が何であっても、リポソームを用いて、アッセイ対象の分子を含有するリポソームと前記細胞を接触させることによって、またはエレクトロポレーションによって、またはナノ粒子送達によって、分子を細胞の細胞質に輸送してよい。
【０１７６】
特定の態様として、および分子がタンパク質またはポリペプチドである場合は、発現は、このタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸、プラスミドまたはベクターによるこの細胞のトランスフェクションから生じることができる。この態様では、この方法の第１のステップは、このタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸、任意のプラスミドまたはベクターで前記細胞をトランスフェクトすることにある。特定の態様では、分子は、ここで規定される本発明のポリペプチドである。この態様では、この方法の第１のステップは、本明細書で規定されるポリヌクレオチドまたはベクターで前記細胞をトランスフェクトすることにある。公知の方法は、化学物質をベースとしたトランスフェクション、例えばリン酸カルシウム、カチオン性リポソーム（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびＵｐｔｉＦｅｃｔｉｎ）、カチオンポリマー（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、Ｆｕｇｅｎｅ、ＬＴ−１、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅおよびＪｅｔＰＥＩ）、および非化学的方法、例えばエレクトロポレーション、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、遺伝子エレクトロトランスファーまたはインペールフェクションを包含する。
【０１７７】
あるいは、細胞または細胞培養物は、ウイルスゲノム中にアッセイ対象のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含むウイルス粒子によって形質導入されてもよい。特定の態様として、本明細書で規定される粒子は、細胞または細胞培養物を形質導入するために用いられてもよい。
【０１７８】
分子の神経生存および／または神経保護活性を判定するために、本方法は、特にＭＡＳＴ−２タンパク質を発現する神経細胞、好ましくはヒト神経細胞に実施される。特定の態様では、前記細胞は、ヒト有糸分裂前ニューロン、未熟なヒトニューロン、例えば神経芽腫細胞である。本方法は、好ましくは、上で規定されるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＮＴ２−Ｎ細胞、ＮＳ細胞またはＮＳ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞で実施される。
【０１７９】
第２のステップは、アッセイ対象の分子と接触させた細胞または細胞培養物中で、５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子の発現を測定することを含む。このステップは、１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の遺伝子の発現の測定をさらに含んでよい。
【０１８０】
「測定すること」は、細胞遺伝子の発現からもたらされる生成物またはいくつかの生成物をアッセイすること、特に検出することを意味し、この生成物は、核酸、特にＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または任意の他の形式の形である。特定の態様では、遺伝子発現の測定は一セットのヌクレオチド標的を検出することを含み、各ヌクレオチド標的はセットに包含される遺伝子の発現生成物に対応する。
【０１８１】
「ヌクレオチド標的」という表現は、その発現を測定、好ましくは定量的に測定しなければならない核酸分子を意味する。「測定される発現」は、発現生成物（複数可）、特に遺伝子の転写生成物（複数可）が測定されることを意味する。「定量的」は、その方法が、発現生成物、特に転写生成物またはヌクレオチド標的の量またはコピー数を判定するために用いられることを意味する。これは、前記発現生成物（複数可）の存在または不在だけを判定することを目的とする定性的な測定とは対照的なものである。
【０１８２】
ヌクレオチド標的は、特にＲＮＡ、最も特には全ＲＮＡである。好ましい態様では、ヌクレオチド標的は、ｍＲＮＡまたは転写産物である。遺伝子発現レベルを測定するために用いられる方法に従って、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを得るためにｍＲＮＡを用いてもよく、その後に検出され、測定が可能である。
【０１８３】
発現生成物またはヌクレオチド標的は、好ましくは細胞培養物から、特に単離の後に、または精製の後にでも、調製される。ヌクレオチド標的がｍＲＮＡである場合は、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）への前記ｍＲＮＡの逆転写を含むまたはからなるさらなるステップを、発現を検出するステップの前に実施してもよい。任意に、ｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写して、ｃＲＮＡを与えてもよい。
【０１８４】
調製ステップの間、および発現をアッセイする前に、発現生成物（複数可）またはヌクレオチド標的（複数可）は、同位体（例えば放射性）もしくは非同位体（例えば、蛍光性、着色、発光性、親和性、酵素、磁気、熱的または電気的）マーカーまたは標識で標識されてもよい。
【０１８５】
遺伝子発現をアッセイするために実行されるステップが、発現生成物（複数可）またはヌクレオチド標的（複数可）の定性的または定量的発現（コピー数）を変更してはならないこと、または前記発現生成物（複数可）またはヌクレオチド標的（複数可）の定性的または定量的発現をアッセイすることを含む以降のステップに干渉してはならないことは注目に値する。
【０１８６】
遺伝子発現のプロファイリングステップは、一セットの遺伝子の発現を判定することを含む。そのようなセットは、１つの試験のためにアッセイされ、特に同じ細胞培養物で同時に実施されなければならない一群の遺伝子と規定される。
【０１８７】
一セットの遺伝子は、５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む。遺伝子セットは、１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子をさらに含んでもよい。
【０１８８】
さらに、これらの遺伝子に加えて、ステップｂ）は、他の細胞遺伝子の発現の測定、特に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に関与する遺伝子、または細胞増殖、細胞接着、細胞分化、増殖因子およびシナプス機能に関与する遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの細胞遺伝子（複数可）の発現の測定を包含してもよい。
【０１８９】
特定の態様では、ステップｂ）で用いられる遺伝子セットは、５〜１７個の遺伝子、特に（１）正確に５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１、または（２）少なくとも５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ならびに１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される１〜１２個の遺伝子、特に１〜１０個または１〜５個の遺伝子を含む。したがって、特定の態様では、遺伝子セットは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の遺伝子からなる。
【０１９０】
本方法のステップｃ）では、ステップｂ）で測定されるセットの各遺伝子の発現は標準化され、すなわち、各遺伝子について、ステップｂ）で測定される発現は、アッセイ対象の分子と接触していない、特に同じ細胞培養物または細胞系の同じ細胞型の細胞で測定される同じ遺伝子の発現と比較される。したがって、以下の比が計算される：
アッセイ対象の分子と接触している細胞で測定される遺伝子発現／前記分子と接触していない細胞で測定される同じ遺伝子の発現。
【０１９１】
この比は、各遺伝子の相対的発現、すなわち、アッセイ対象の分子との接触の結果、各遺伝子の発現が増加するかまたは減少するかの判定を可能にする。「増加」または「減少」は、その分子と接触していない同じ細胞型の細胞と比較して、アッセイ対象の分子と接触している細胞で、遺伝子の発現が統計学的により高いか統計学的により低いことを意味する。スチューデントのｔ検定によって計算されるｐ値（ｐ）が＜０．０５であるとき、発現は統計学的に異なるとみなされる。
【０１９２】
ここで記載される方法を実行すると、ここで規定されるセットに含まれる遺伝子の発現が統計学的に有意な様式で改変される場合、分子、特に本発明のポリペプチドは、神経生存表現型（すなわち、神経保護、および／または神経形成および／または神経再生および／または樹状分枝および／または神経修復）を有するとみなされる。
【０１９３】
例として、分子、特に本発明のポリペプチドは、それぞれのＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子が、特に、前記分子と接触していない細胞（培養）（陰性対照）での同じ遺伝子の発現と比較して少なくとも１．５倍、統計学的に過小発現される場合、神経生存表現型（すなわち、神経保護、および／または神経形成および／または神経再生および／または樹状分枝および／または神経修復）を有するとみなされる；過小発現は、陰性対照が模擬感染細胞培養物である、ポイントＡ．５（結果はポイントＢ．１０）で以下に記載される実験を実施することによって計算されてよい。
【０１９４】
本発明は、ここで規定される方法の実行に適する、以下を含むキットも対象とする
ａ．ここで規定される一セットの遺伝子、特に５つの細胞遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１からなるかそれらを含む一セットの遺伝子、ならびに任意に１２個の細胞遺伝子ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＤＲＤ２、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ、ＢＴＫおよびＦＯＳからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子に特異的な複数の対のプライマー；ならびに
ｂ．任意に、前記プライマーによるこれらの細胞遺伝子のヌクレオチド標的の増幅のために必要な試薬、および任意に増幅生成物を検出するための試薬。
【０１９５】
ここで規定されるように、一対のプライマーは、フォワードポリヌクレオチドおよびバックワードポリヌクレオチドからなり、各プライマーは、適当な条件および試薬がもたらされるとき、ヌクレオチド標的に合致して増幅する能力を有し、ヌクレオチド配列は、それらのヌクレオチド標的の配列内にそれらの相補配列によってはめられる。
【０１９６】
本発明のキットに存在するプライマー対は遺伝子に特異的であり、すなわち、プライマーの各対は、セット中の１つ、およびただ１つの遺伝子のヌクレオチド標的を増幅する。したがって、遺伝子に特異的な一対のプライマーが、試料に含まれる別の遺伝子および／または他の核酸のヌクレオチド標的を、指数関数的に、または直線的にでさえ、増幅することが排除される。この方法では、プライマー（その対は遺伝子に特異的である）の配列は、別の遺伝子で見出される配列で見出されないように選択され、この別の遺伝子で見出される配列に相補的でなく、および／または、本出願で規定される増幅条件で、この別の遺伝子のヌクレオチド標的の配列とハイブリダイズすることができない。
【０１９７】
特定の態様では、フォワードおよび／またはバックワードプライマー（複数可）は、同位体（例えば放射性）または非同位体（例えば蛍光、ビオチン、蛍光色素）のいずれかの方法で標識されてもよい。プライマーは最終生成物に組み込まれるので、プライマー（複数可）の標識は、アンプリコン（増幅生成物）の標識につながる。
【０１９８】
プライマー対の設計は当技術分野で周知であり、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；ｃｈａｐｔｅｒ８、特に８．１３〜８．１６）を参照して実行してよい。プライマー対を設計するために、様々なソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏ（商標）またはＰｒｉｍｅｒ３が入手できる。
【０１９９】
したがって、対の各プライマー（フォワードおよびバックワード）は、互いに独立して以下の特徴を有する：
−  それらのサイズは１０〜５０ｂｐ、好ましくは１５〜３０ｂｐであり；
−  それらは、遺伝子のヌクレオチド標的の配列とハイブリダイズする能力を有する。
【０２００】
特定の態様では、試料で実行される同時増幅反応でプライマー対が用いられる場合、様々なプライマーは同じ温度および同じ条件でそれらのそれぞれのヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力を有する。
【０２０１】
ＰＣＲ増幅のための従来の条件は当技術分野で、特にＳａｍｂｒｏｏｋらで周知である。ＰＣＲによる増幅のための一般的な条件の例は、ｄＮＴＰ（２００ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（０．５〜３ｍＭ）およびプライマー（１００〜２００ｎＭ）である。
【０２０２】
特定の態様では、プライマーの配列は、それがハイブリダイズしなければならないヌクレオチド標的の配列の鎖の１つと１００％同一である、すなわち、それがハイブリダイズしなければならないヌクレオチド標的の配列と１００％相補的である。別の態様では、同一性または相補性は１００％でないが、類似性は、ヌクレオチド標的の相補的配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。特定の態様では、プライマーは、ヌクレオチド標的の配列の配列中の対応物と、１、２、３、４または５個の突然変異（複数可）（欠失、挿入および／または置換）、好ましくは１、２、３、４または５個のヌクレオチド置換まで異なる。特定の態様では、突然変異はプライマーの３’末端の最後の５つのヌクレオチドに位置しない。
【０２０３】
特定の態様では、１００％同一でないか相補的でないプライマーは、ヌクレオチド標的の配列と１００％同一または１００％相補的であるプライマーと同様に、ヌクレオチド標的の配列とハイブリダイズする能力を保つ（ここで規定されるハイブリダイゼーション条件で）。特異的であるために、遺伝子に特異的な対のプライマー（上で規定されるように少なくとも８０％の類似性を有する）の少なくとも１つは、セットの別の遺伝子および試料の別の遺伝子のヌクレオチド標的で見出される配列とハイブリダイズすることができない。
【０２０４】
ここで掲載される細胞遺伝子の発現を測定するために用いられてもよいプライマーの例は、表２に開示される。
【表２】
2018086001.tif 000004
【０２０５】
本出願においては、「含む（comprising）」または「含有する（containing）」と同義である用語「含む（comprising）」は開放的であり、さらなる列挙されていないエレメント（複数可）、成分（複数可）または方法ステップ（複数可）を排除しないが、用語「からなる（consisting of）」は限定的用語であり、それは明示的に列挙されていないあらゆる追加のエレメント、ステップまたは成分も排除する。
【０２０６】
用語「から実質的になる（essentially consisting of）」は部分的に開放的な用語であり、それは、それらの追加のエレメント（複数可）、ステップ（複数可）または成分（複数可）が本発明の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼさない限り、さらなる列挙されていないエレメント（複数可）、ステップ（複数可）または成分（複数可）を排除しない。
【０２０７】
したがって、用語「含む（comprising）」（または、「含む（comprise(s)）」）は、用語「からなる（consisting of）」（「からなる（consist(s) of）」）、ならびに用語「から実質的になる（essentially consisting of）」（「から実質的になる（essentially consist(s) of）」）を含む。したがって、用語「含む（comprising）」（または、「含む（comprise(s)）」）は、本出願においては、より特に用語「からなる（consisting of）」（「からなる（consist(s) of）」）、および用語「から実質的になる（essentially consisting of）」（「から実質的になる（essentially consist(s) of）」）を包含するものとする。
【０２０８】
ここで引用される全文献の関連する開示の各々は、参照により具体的に組み込まれる。以下の例は、例示として提供され、限定するためではない。
【０２０９】
［実施例］
Ａ．材料および方法
Ａ．１．等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）計算
ＩＴＣ測定は、ＶＰ−ＩＴＣ  ＶＰ−ＩＴＣ２００熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ）を用いて行った。ＭＡＳＴ２−ＰＤＺは、ポリペプチドの注射（６分間隔の５〜７μＬの連続する２５〜４５分量）によって、２９８Ｋで滴定した。生データを標準化し、ポリペプチドの希釈熱について補正した。Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を用いて、一セットの部位を有するモデルへの補正データの非線形の曲線あてはめを実施して、平衡解離定数（ＫD）を求めた。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．５で、全ての試料を調製した。３０μＭの初期濃度のＭＡＳＴ２−ＰＤＺ、および２５０μＭ〜３５０μＭの範囲の初期濃度のペプチドでデータを記録した。
【０２１０】
Ａ．２．細胞培養
ヒト神経芽腫細胞、ＳＨ−ＳＹ−５ＹおよびヒトＮＴ２−Ｎ細胞培養は、それぞれＰｒｅｈａｕｄ  Ｃ．ら（２０１０）およびＰｒｅｈａｕｄ  Ｃ．ら（２００５）に記載され、上の明細書で詳述される。製造業者の説明書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｍｅｎｕ／Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１＿Ｃｅｌｌｓ／）によって記載される通り、ＲＰＭＩ培地でＮＳ細胞を増殖させる。
【０２１１】
Ａ．３．レンチウイルス生成
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳのヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１０／１１６２５８出願に記載されるプラスミドＧ−［ＳＰ−（２ａａ）−ＴＭ−Ｃｙｔｏ］からクローニングした。Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ（ＷＯ２０１０／１１６２５８で開示される）、ならびにＮｅｕｒｏｖｉｔａ２のヌクレオチド配列をＰＣＲによって得、ＴＡクローニングキット（Ｋ５３１５−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングした。Ｖｉｔｒｙ  Ｓ．ら（２００９）に記載の標準手順によってレンチウイルスを２９３Ｔ細胞で得、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳまたはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトした。ＨＩＶ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＮＥＫ０５０）を用いて、ＨＩＶ粒子の量をアッセイした。ＮＳ、ＳＨ−ＳＹ−５ＹおよびＮＴ２−Ｎ細胞への組換えレンチベクターの感染性を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって系統的に監視した。
【０２１２】
Ａ．４．Ｋｉｎｏｍｅプロファイリング
ｋｉｎｏｍｅプロファイリングは、製造業者の説明書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｓｃａｎ．ｃｏｍ／ｐｒｅｓｔｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐｅｐｃｈｉｐ／＃ｋｉｎａｓｅ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）に従って、ＰｅｐＣｈｉｐキナーゼアレイでＰｅｐｓｃａｎ  ｐｒｅｓｔｏ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が行った。簡潔には、ＮＴ２−Ｎ細胞を４５時間模擬感染（対照）させたか、神経生存ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱ（ＰｒｅｈａｕｄＣ．ら、２０１０）に感染させた後に収集した。ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱ（ＣＶＳ−ＮＩＶ株）は、寄託番号Ｉ−４１４０の下で２００９年４月１日にＣＮＣＭに寄託した。各条件のために、ＮＴ２−Ｎ細胞の１００００ｍｍ2を２反復で処理した。細胞溶解物を抗プロテアーゼ含有ＭＰＥＲ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）で調製し、上清を液体窒素で超低温冷凍させた後に用いた。ＰｅｐＣｈｉｐキナーゼアレイは、ヒトｋｉｎｏｍｅ全体をカバーした（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｇ．ら、２００２）。データは、検証前のｐ＝０．００１のカットオフで、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ統計分析にかけた。＞１．９６ＳＥの閾値平均比を選択した（高いストリンジェンシー）。点は、Ｇｅｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｅｎｔｒａｌプロ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で規定される、組織化されたキナーゼクラスターを表す
Ａ．５．経路に焦点をあてたプロファイリング
遺伝子発現は、製造業者の説明書（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ＲＴＰＣＲ．ｐｈｐ）に従って、ＱＩＡＧＥＮ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からの以下の経路に焦点をあてたプロファイリングＰＣＲアレイを用いて監視した：ヒトＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達ＰＣＲアレイ（ｒｅｆ．ＰＡＨＳ−０５８）ならびにヒト神経形成および神経幹細胞ＰＣＲアレイ（ｒｅｆ．ＰＡＨＳ−４０４）。簡潔には、１５．７ｍｍ2のＮＴ２−Ｎ細胞に、９００ｎｇのｐ２４レンチベクターを感染させた。ＲＮＥａｓｙ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、ＤＮアーゼ１処理を含む）を用いて全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）およびｑＰＣＲ（ＡＢＩ  Ｆａｓｔ  ７５００リアルタイムＰＣＲ機器）にかけた。実験を２反復で行い、各ＰＣＲプレートについて品質標準をアッセイした。データは、ＱＩＡＧＥＮウェブインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒａｒｒａｙｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ．ｐｈｐ）で分析した。
【０２１３】
調節倍率を、比較法に従って計算した。ｑＰＣＲデータ分析の比較またはΔΔｃｔ法では、２つの異なるＲＮＡ実験試料から得られたｃｔ値を、ハウスキーピング遺伝子へ直接に標準化し、次に比較した。この方法は、対象の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の増幅効率が約１００％であると仮定する（−３．３２の標準または較正曲線勾配を意味する）。最初に、対象の遺伝子とハウスキーピング遺伝子の間のＣｔ値の差（ΔＣｔ）を、各実験試料について計算した。次に、実験試料と対照試料（模擬感染細胞）の間のΔＣｔ値の差（ΔΔＣｔ）を計算した。次に、２つの試料間での対象の遺伝子の発現の変化倍率は、２＾（−ΔΔＣｔ）に等しい。倍差（変化倍率）は、式２（−ΔΔＣ（ｔ）によって計算される。調節倍率については、１未満（遺伝子が下方制御されることを意味する）のいかなる調節倍率（または変化倍率）も負の逆数にし、分数を整数に変化させた［例えば、０．３１の変化倍率値を有する遺伝子については、与えられる調節倍率は−３．２倍であり、この特定の遺伝子が３．２倍下方制御されることを意味する］。
【０２１４】
遺伝子クラスター化は、Ｇｅｎｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｅｎｔｒａｌプロ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実現した。
【０２１５】
Ａ．６．神経突起伸長
神経突起伸長のアッセイは、Ｐｒｅｈａｕｄ  Ｃ．ら（２０１０）に広く記載されている。２４ウェルプレート（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄプラスチックウェア、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞を、非分化培地［２０％ウシ胎児血清プラス１％のＰｅｎ：Ｓｔｒｅｐおよび１％グルタミンを含むＤＭＥＭＦ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕ．Ｋ．）］に１ウェルにつき４０，０００細胞数の密度で播種し、３７℃で一晩培養する。播種してから２４時間後に、非分化培地を分化培地［Ｂ２７補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕ．Ｋ．）、１％Ｐ／Ｓ、１％グルタミンおよび１ｍＭのｄｂーｃＡＭＰ（ジブチリルｃ−ＡＭＰは膜透過性である、Ｓｉｇｍａ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕ．Ｋ．）］と交換し、細胞を６時間インキュベートする。次に、細胞を、分化培地中の３０ｎｇのｐ２４レンチベクターに感染させる。１時間のインキュベーションの後、細胞を分化培地で一度洗浄し、分化培地を加えた後に、それらを３７℃で２４時間インキュベートする。分化から３０時間後、室温（ＲＴ）で２０分間リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、続いて０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５分間およびＲＴで１時間、ＰＢＳ中の５０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で処理する。神経突起を染色し、ＲＡＢＶ感染をそれぞれ明らかにするために、ニューロン特異的抗βＩＩＩチューブリン抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｒａｎｃｅ）および抗ＲＡＢＶヌクレオカプシド抗体が用いられる。あるいは、神経突起プロセスを保持するクリスタルバイオレットでも細胞は染色される。
【０２１６】
ＮＳ細胞を７２時間監視し、０時間時に（１ヒットだけ）２００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。ＮＯを感染後７２時間監視し、ＮＳ細胞を常にそれらの供給培地（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、ＵＳＡ）で増殖させたことを除いて、神経突起伸長（ＮＯ）は、基本的にＳＨ−ＳＹ５Ｙについて上で記載された通りに行われた。
【０２１７】
いずれの場合も、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞およびＮＳ細胞は、ＤＣ  ３００ＦＸカメラ（×４０または×２０対物）を備えているＬｅｉｃａ  ＤＭ５０００Ｂ  ＵＶ顕微鏡を用いて画像化し、ＩｍａｇｅＪ  １．３８Ｘソフトウェア（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ、ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）およびプラグインＮｅｕｒｏｎＪ（Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇら  ２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍａｇｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｅｕｒｏｎｊ／）を用いて分析する。１ニューロンあたりの平均神経突起長は、３反復の実験から求められる。
【０２１８】
Ａ．７．スクラッチアッセイ（軸索再生）
スクラッチ誘導アッセイのために、３０ｎｇのｐ２４レンチベクターに感染させた２００ｍｍ2のＮＴ２−Ｎ細胞（ｎ＝８）を、ポリ−Ｄ−リシン−ラミニンでコーティングされた細胞＋（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１２ウェルプラスチックウェアに播種し、トリプシン処理の後完全に回収するために２日の間増殖させた。培地は、スクラッチの２時間前に交換した。個々の傷は、注射針（２６ＧＸ１／２”、１２−４．５）で付けた。各個々のウェルの上で、少なくとも１０回のスクラッチを行った。傷つけから６日後に細胞をＰＦＡ（４％）で固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。細胞は、ＤＣ  ３００ＦＸカメラ（×２０対物）を備えているＬｅｉｃａ  ＤＭ５０００Ｂ顕微鏡を用いて画像化し、ＩｍａｇｅＪ  １．３８Ｘソフトウェア（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ、ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）およびプラグインＮｅｕｒｏｎＪを用いて分析する。再生中のニューロンの平均百分率は、８回の実験から求める。
【０２１９】
Ａ．８．樹状分枝
樹状分枝を測定する手段であるＳｈｏｌｌ分析は、Ｓａｈａｙ  Ａ．らおよびＬｉｏｙ
ＤＴ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１に従ってアッセイした。神経突起の複雑性は、ＩｍａｇｅＪ  Ｓｈｏｌｌ分析プラグイン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｌａｂｓ／ｇｈｏｓｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を用いて、８ビット画像から分析した。画像は、レンチベクターによる感染から７２時間後（ｐ．ｉ．）にとった。
【０２２０】
Ａ．９．ＭＡＳＴ２のサイレンシング
ＲＮＡＩ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって開発されたｓｈＲＮＡをベースとしたレンチウイルス（ＴＲＣ、ＭＩＴおよびＨａｒｖａｒｄ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ＡＢｇｅｎｅから販売される、ＲＨＳ４５３３−ＮＭ＿０１５１１２）の特異的セットで、ＭＡＳＴ２遺伝子発現を抑制した。組換えレンチウイルスは、上記の通りに生成した。１５．７ｍｍ2のＮＴ２−Ｎ細胞を、９００ｎｇの各レンチベクターのｐ２４に感染させた。サイレンシング効率は、特異的プライマーセットＱＴ０００４２５７４（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による感染から２日後に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。次に、実験のために細胞をすぐに用いた
Ａ．１０．マウス胎児皮質ニューロンでの神経突起生成
Ｅ１６スイスマウス皮質ニューロンを、Ｖｉｔｒｙら（２００９）に従って調製した。１０4個の皮質ニューロンを９６ウェルの側が暗色の細胞結合プレート（＃３３４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）で平板培養し、播種の２時間後に、１ウェルにつき１０ｎｇのｐ２４のレンチベクター（ＮＶ１  ｅＧＦＰまたはＮＶ１Δ  ｅＧＦＰ）に感染させた。培地は、感染の１２時間後に交換した。感染から３日後に培地を慎重に除去し、室温で２０分間、ニューロンを４％ＰＦＡで固定した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次に、室温で１０分間、細胞を０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で透過性化させた。Ｌｏｈ  Ｓｈｙら（２００８）に従って、βＩＩＩニューロンチューブリン免疫蛍光検査を実行した。ニューロンプロファイリングバイオアプリケーション（ｎ＝１０ウェル、２０視野／ウェル、１ウェルにつき２５０個のニューロン）を用いることにより、セロミクス（ＵＳＡ）ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔリーダーでのハイスループットスクリーニングによって神経突起伸長を監視した。スチューデントのｔ検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（ＵＳＡ）で実行した。
【０２２１】
Ａ．１１．レンチベクターＮＶ１  ｅＧＦＰおよびＮＶ１Δ  ｅＧＦＰによるマウス実験
Ｖｉｔｒｙら（２００３）に記載の通り、１０匹のスイスマウス（３日齢）の群を、各レンチベクターの１００ｎｇのｐ２４（ビヒクルは１％ＢＳＡ含有ＰＢＳであった）またはビヒクルだけ（１匹のマウス）で、脳に直接に注射した。マウスの発達および表現型を、４カ月の間記録した。注射後２０日間、重量を監視した。Ｖｉｔｒｙら（２００３）に記載の通り、注射の４カ月後に動物を安楽死させ、免疫化学およびリアルタイムＰＣＲのために脳を単離した。Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ発現は、ｅ−ＧＦＰ発現で監視した。樹状突起を検出するために、Ｍａｐ２抗原のための免疫染色を用いた。星状神経膠症を監視するために、ＧＦＡＰ（グリア原線維酸性タンパク質）のための免疫染色を用いた。抗ｍａｐ２抗体は、ＳＩＧＭＡ、ＵＳから（Ｍ１４０６）；抗ＧＦＡＰ抗体は、Ｄａｋｏから（Ｚ０３３４）；抗ＧＦＰ抗体は、Ｒｏｃｋｌａｎｄから（６００−１０６−２１５）からのものであった。
【０２２２】
Ｂ．結果
Ｂ．１．ＲＡＢＶ媒介神経保護の間のＮＴ２−Ｎ細胞でのＫｉｎｏｍｅプロファイリング
神経生存ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱに感染（４５時間）させたＮＴ２−Ｎ細胞に由来する細胞溶解物との、ＰｅｐＣｈｉｐ  Ｋｉｎｏｍｉｃｓアレイ（ヒトｋｉｎｏｍｅ全体をカバーする、すなわち５１８個を超えるキナーゼ）のインキュベーションは、高いストリンジェンシー条件で１７個のキナーゼだけが刺激されることを明らかにする（表３）。図３Ｂに示すように、全てのこれらのキナーゼは共にリンクしている。
【表３−１】
2018086001.tif 000005
【表３−２】
2018086001.tif 000006
【０２２３】
Ｂ．２．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１発現レンチベクターで形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＮＳ細胞での神経突起伸長
以下の構築物を設計した：Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドおよびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳポリペプチド（図４Ａ）。それらのヌクレオチドおよびタンパク質配列は以下の通りである：
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１−ポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡ（配列番号８）。
【０２２４】
−ポリペプチド：ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＳＨＫＳＧＧＱＴＲＬ（配列番号９）。
【０２２５】
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ（ＰＤＺ−ＢＳドメインなし）−ポリヌクレオチド：ＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＡ（配列番号１０）。
【０２２６】
−ポリペプチド：ＭＶＰＱＡＬＬＦＶＰＬＬＶＦＰＬＣＦＧＧＫＹＶＬＬＳＡＧＡＬＴＡＬＭＬＩＩＦＬＭＴＣＣＲＲＶＮＲＳＥＰＴＱＨＮＬＲＧＴＧＲＥＶＳＶＴＰＱＳＧＫＩＩＳＳＷＥＳＨＫＳＧＧ（配列番号１１）。
【０２２７】
ウェスタンブロット実験は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳが両方の細胞系で発現されることを示す（図４Ｂ）。さらに、図４Ｃは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳがラブドウイルス糖タンパク質で予想される典型的な免疫蛍光パターンを示すことを確認する。
【０２２８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞での神経突起伸長アッセイは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドが、ＰＤＺ−ＢＳによって媒介される強力な神経突起伸長表現型を示すことを示す（図５Ａの、ＰＤＺ−ＢＳドメインがある、およびそれがないポリペプチドを比較されたい）。同様に、ＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドが、ＰＤＺ−ＢＳによって媒介される強力な神経突起伸長表現型を示すだけでなく、感染させた培養で神経突起ネットワークも増加させることを示す（図５Ｂ）。
【０２２９】
Ｂ．３．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１によって媒介される保護の分子サイン
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１発現レンチベクターでトランスフェクトさせたＮＴ２−Ｎ細胞の経路に焦点をあてた遺伝子発現プロファイリング（ヒト神経形成および神経幹細胞アレイおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路）は、図６Ａおよび６Ｂで表される遺伝子分子サインを明らかにする。このサインは、以下の調節倍率によって特徴づけられる：ＳＨＨ遺伝子（−１．８２）、ＲＯＢＯ１遺伝子（−１．６９）、ＰＴＮ遺伝子（−１．８３）、ＰＯＵ４Ｆ１遺伝子（−１．５０）、ＰＡＲＤ６Ｂ遺伝子（−１．６２）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子（−１．５７）、ＩＮＨＢＡ遺伝子（−１．９２）、ＨＥＹ２遺伝子（−３．４９）、ＨＤＡＣ７遺伝子（−１．６０）、ＤＲＤ２遺伝子（−１．６４）、Ｓ１００Ａ６遺伝子（＋３．３８）、ＰＡＸ５遺伝子（＋１．９７）、ＤＲＤ１遺伝子（＋１．５９）、ＢＭＰ２遺伝子（＋１．５２）およびＰＩＫ３ＣＧ遺伝子（＋１．７９）。
【０２３０】
この遺伝子発現プロファイリングは、ヒトＭＡＳＴ２タンパク質をノックアウトし（７６％のＭＡＳＴ−２サイレンシング）、同じくＮｅｕｒｏｖｉｔａ１発現レンチベクターでトランスフェクトさせたＮＴ２−Ｎ細胞で得られたものと比較された。したがって、図７Ｂで同定される遺伝子のクラスターは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１感染で調節されるが、ＭＡＳＴ２発現がノックダウンされたＮＴ２−Ｎ細胞では異なって調節される遺伝子を表す。遺伝子分子サインは、以下の調節倍率によって特徴づけられる：ＳＨＨ遺伝子（−２．５２）、ＲＯＢＯ１遺伝子（＋１．００）、ＰＴＮ遺伝子（＋１．０１）、ＰＯＵ４Ｆ１遺伝子（＋１．２１）、ＰＡＲＤ６Ｂ遺伝子（＋１．４６）、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子（＋１．０３）、ＩＮＨＢＡ遺伝子（−１．３１）、ＨＥＹ２遺伝子（−２．２７）、ＨＤＡＣ７遺伝子（−１．１７）、ＤＲＤ２遺伝子（−１．１５）、Ｓ１００Ａ６遺伝子（−１．４４）、ＰＡＸ５遺伝子（−１．０１）、ＤＲＤ１遺伝子（＋２．３１）、ＢＭＰ２遺伝子（＋１．２３）およびＰＩＫ３ＣＧ遺伝子（−２．２４）。注目すべきことはＭＡＳＴ２発現が抑制されるときの、遺伝子ＲＯＢＯ１、ＰＴＮ、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＡＲＤ６Ｂ、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、Ｓ１００Ａ６、ＰＡＸ５およびＰＩＫ３ＣＧの逆調節であり、ＭＡＳＴ−２がＮｅｕｒｏｖｉｔａによって媒介される遺伝子生存パターンを制御するという結論に導かれる。
【０２３１】
Ｂ．４．軸索再生
ＮＴ２−Ｎ細胞で実施されたスクラッチアッセイは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１感染ＮＴ２−Ｎ細胞だけが、スクラッチ後にそれらの軸索を再生させることができることを示す。非感染またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳ感染のいずれの細胞も、それをすることができない（ｐ＜０．０００１）（図８）。
【０２３２】
Ｂ．５．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１媒介軸索再生の分子サイン
図９は、スクラッチ後の感染していない細胞と比較した、スクラッチ後に試験されたＮｅｕｒｏｖｉｔａ１感染ＮＴ２−Ｎ細胞（上の点Ｂ．４．）を実施する、経路に焦点をあてた遺伝子発現プロファイリング（ヒト神経形成および神経幹細胞およびヒトＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達ＰＣＲアレイ）を表す。この遺伝子分子サインは、以下の調節倍率によって特徴づけられる：
図９Ａ：ヒトＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達ＰＣＲアレイ
ＥＩＦ２ＡＫ２（＋１．５７）、ＦＡＳＬＧ（＋２．１３）、ＦＯＸＯ３（＋１．５）、ＧＳＫ３Ｂ（＋１．５３）、ＨＲＡＳ（＋１．５４）、ＩＲＡＫ１（＋１．５１）、ＭＡＰＫ８（＋１．５３）、ＭＴＣＰ１（＋１．７６）、ＰＤＫ１（＋２．７１）、ＰＩＫ３ＣＧ（＋３．７８）、ＲＨＥＢ（＋１．８４）、ＲＰＳ６ＫＡ１（＋１．９９）、ＴＣＬ１Ａ（＋２．１０）、ＡＰＣ（−１．８２）、ＢＴＫ（−１．６１）、ＧＲＢ１０（−１．７８）、ＲＰＳ６ＫＢ１（−１．６８）およびＴＬＲ４（−１．６３）；ならびに
図９Ｂ：ヒト神経形成および神経幹細胞アレイ
ＡＬＫ（＋２．４９）、ＧＤＮＦ（＋１．５）、ＮＰＴＸ１（＋１．５６）、ＮＲＧ１（＋１．５２）、ＰＡＸ５（＋１．６５）、Ｓ１００Ａ６（＋１．９９）、ＡＳＣＬ１（−１．５６）、ＢＤＮＦ（−１．７８）、ＢＭＰ１５（−２．２７）、ＢＭＰ４（−１．５８）、ＥＧＦ（−２．１０）、ＩＮＨＢＡ（−１．８９）、ＮＤＰ（−１．６８）、ＮＥＵＲＯＤ１（−３．９２）、ＮＯＴＣＨ２（−１．５７）、ＰＯＵ３Ｆ３（−１．５５）およびＲＯＢＯ１（−１．９８）。
【０２３３】
これらの分子サインは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に関与する遺伝子（図９Ａ）、ならびに細胞の増殖、接着および分化、増殖因子およびシナプス機能に関与する遺伝子（図９Ｂ）の強力な調節を示し、これらの遺伝子が高度に関係していることを実証する（図９Ｃ）。
【０２３４】
Ｂ．６．最適化された配列（解離定数および熱力学パラメータ）によるポリペプチドの設計
内因性およびウイルスのリガンドと複合したＭＡＳＴ２−ＰＤＺ（プロテインデータバンクコード２ＫＱＦ＆２ＫＹＬ）の我々の高分解能ＮＭＲ構造から、ドメインとポリペプチドの間の相互作用の予想外に大きな面が特徴づけられた。ポリペプチドが、正規のＣ末端領域の最後の４つのアミノ酸を通してだけでなく、アッセイされたペプチドのＮ末端の別のアンカー領域によっても、ＰＤＺ標的と同様に相互作用することが実証された。ペプチドのＣ末端の残基がＭＡＳＴ２−ＰＤＺとの結合強度に主に寄与するとしても、ペプチドの特異的位置およびＰＤＺドメインのオリジナルな特徴を意味しているさらなるＮ末端相互作用の存在は、相互作用の特異性および親和性を明らかに強化する。相互作用のこの大きく、オリジナルな面は、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺへのペプチド親和性および特異性を最適化する機会である。
【０２３５】
ＭＡＳＴ２−ＰＤＺ／ペプチド複合体（図１０）の我々の詳細な熱力学および構造（原子レベルでの）に関する記載は、最適化された配列を設計するために用いられた。我々はＭＡＳＴ２−ＰＤＺ（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ）へのポリペプチドの親和性とそれらの神経生存特性の間の関係のモデルを提案したが、そこにおいて、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺドメインへのポリペプチドの親和性が最も高い（すなわち、ＫDが最も低い）と、これらのポリペプチドの神経生存特性が最も高い（図１０Ｂ）。
【０２３６】
ペプチドのＮ末端およびＣ末端の結合部位によって促進され、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺとの相互作用のための内因性およびウイルスのリガンドによって選択される高い特異性を保持するために、末端配列は変更しなかった。ペプチドの中心領域は、ＭＡＳＴ２−結合ドメインが１１〜１３アミノ酸残基であるポリペプチドを設計することによって、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺへの配列の親和性を増加させるために改変した。これらのポリペプチドの一般構造は、図１１Ａに表す。
【０２３７】
下のリストに記載のポリペプチドを設計し、各ＭＡＳＴ２−ＰＤＺ／ポリペプチド複合体について完全な熱力学的説明（柔軟性および結合強度への有極接点寄与を考慮するエンタルピーおよびエントロピーのパラメータの推定による）を実行した（表４）：
−  配列番号２３５で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わるポリペプチド；
−  配列番号１で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号９で規定されるポリペプチド；
−  配列番号６７で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１５で規定されるポリペプチド；
−  配列番号６４で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１０で規定されるポリペプチド；
−  配列番号２０９で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１８で規定されるポリペプチド；
−  配列番号２０８で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１７で規定されるポリペプチド；
−  配列番号７４で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１３で規定されるポリペプチド；
−  配列番号６５で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１１で規定されるポリペプチド；
−  配列番号６６で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１４で規定されるポリペプチド；
−  配列番号６８で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１６で規定されるポリペプチド；および
−  配列番号７１で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる、配列番号２１２で規定されるポリペプチド。
【表４】
2018086001.tif 000007
【０２３８】
ＭＡＳＴ２−ＰＤＺのＩＴＣによる解離定数（ＫD）および熱力学パラメータ（ΔＨおよびＴΔＳ）の測定は、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺドメインへの、本発明の最適化されたポリペプチドの親和性の有意な増加を示す（表４）。したがって、アッセイされた全てのポリペプチドは、０．５μＭ未満のＫD、すなわち、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１と比較して少なくとも２．５の親和性の増加を有する。アッセイされたポリペプチドのＫDは０．０６２９〜０．４９μＭであり、すなわち、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１と比較した親和性の増加は２．５〜２０の範囲である。特に興味深いポリペプチドはポリペプチド４５４（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３）であり、ＭＡＳＴ２−結合ドメインはＳＷＥＶＨＧＱＱＴＲＬからなり、それは０．０６２９μＭのＫDを有する。
【０２３９】
したがって、複合体のエントロピー／エンタルピー補償を考慮して、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ配列の中央の柔軟なリンカーの配列を改変することによって、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺへの本発明のポリペプチドの親和性は大幅に強化された。
【０２４０】
例えば、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２ポリペプチド（ＭＡＳＴ２結合ドメインはＳＷＥＶＨＧＧＱＴＲＬからなる）は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１と比較して、ＭＡＳＴ２−ＰＤＺドメインへの親和性の１０倍の増加を示す（０．１２μＭ対１．２６μＭ）。Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２の細胞質ドメインの配列とＮｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳのそれとの比較は、図１１Ｂに記載される。
【０２４１】
レンチベクター（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２配列がクローニングされた）に感染したＮＳ細胞でのＮｅｕｒｏｖｉｔａ２ポリペプチドの発現は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳポリペプチドを発現するレンチウイルスベクターによる感染で得られたものに類似していた（図１１Ｃ）。
【０２４２】
Ｂ．７．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２を発現するレンチベクターに感染させたＮＳ細胞での神経突起伸長
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２を発現するレンチベクターに感染させたＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２が、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１と同様に、ＰＤＺ−ＢＳによって媒介される強力な神経突起伸長表現型を示すことを示す（ｐ＜０．０００１）（図１２）。
【０２４３】
Ｂ．８．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２を発現するレンチベクターで形質導入されたＮＳ細胞での樹状分枝
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２を発現するレンチベクターで形質導入されたＮＳ細胞での樹状分枝は、ＮＳ細胞でのＮｅｕｒｏｖｉｔａ２によって媒介される神経突起伸長が、ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１と比較して、完全に機能的な交感神経細胞に特異的な神経突起ツリーのより著しい複雑性によって特徴づけられることを実証する。したがって、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２は、機能性および生存の形質である神経突起ツリーの強度および複雑性を増加させる（図１３）。
【０２４４】
Ｂ．９．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２によって媒介される神経保護の分子サイン
前に同定された４つの細胞遺伝子の発現を、２４時間ｐ．ｉ．のＮＴ２−Ｎ細胞においてアッセイした。図１４は、以下の下方制御倍率を示す：ＢＴＫ（−１．６４）、ＦＯＳ（−１．８２）、ＤＲＤ２（−２．３５）およびＰＯＵ４Ｆ１（−１．５３）。
【０２４５】
Ｂ．１０．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２分子の遺伝子分子サイン
表５は、ＮＴ２−Ｎ細胞のＮｅｕｒｏｖｉｔａ１またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２感染で得られる調節倍率の要約を提示する。
【０２４６】
黒い四角は、スクラッチアッセイで調節される遺伝子を示す；白い四角は、ＭＡＳＴ２が抑制されるときに調節が逆になる遺伝子を示す；ハッチ四角は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２感染で調節される遺伝子を示す（閾値ｘ＜−１．５またはｘ＞＋１．５）。
【０２４７】
次に、神経生存遺伝子サインのコアはＲＯＢＯ１、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＴＮ、ＰＡＲＤ６ＢおよびＰＡＦＡＨ１Ｂ１であり、それらは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１とＮｅｕｒｏｖｉｔａ２感染の両方で同様に調節される遺伝子であり、調節はＭＡＳＴ２が抑制されるときに逆になる。注目すべきことに、ＲＯＢＯ１もスクラッチアッセイで下方制御される。
【０２４８】
他の遺伝子は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１（すなわち、ＰＩＫ３ＣＧ、ＢＭＰ２、ＤＲＤ１、ＰＡＸ５、Ｓ１００Ａ６、ＨＤＡＣ７、ＨＥＹ２、ＩＮＨＢＡ、ＳＨＨ）またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２（すなわち、ＤＲＤ２、ＢＴＫ、ＦＯＳ）のいずれかをより特異的に特徴づけるために用いられる。
【０２４９】
これらの遺伝子およびそれらの機能は、下の表７に掲載される。
【表５】
2018086001.tif 000008
【０２５０】
表６は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１遺伝子分子サイン（ａ）およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２遺伝子分子サイン（ｂ）のヒートマップ図である。
【表６】
2018086001.tif 000009
【表７】
2018086001.tif 000010
【０２５１】
Ｂ．１１．ＮＴ２−Ｎ細胞でのｒＲＡＢＶおよびレンチベクターの転写
ＮＴ２−Ｎ細胞は、上記のように組換え狂犬病ウイルス（ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱまたはｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨΔ４）またはレンチベクターのいずれかに感染させた。ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨＱウイルスは、配列番号１で規定されるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる完全長Ｇタンパク質を発現する；ｒＲＡＢＶ  ＣＶＳ  ＨΔ４ウイルスは、Ｑ、Ｔ、ＲおよびＬ残基が削除されている配列番号１からなるＭＡＳＴ−２結合ドメインで終わる完全長Ｇタンパク質を発現する。
【０２５２】
ｒＲＡＢＶ感染のためには２４時間ｐ．ｉ．に、レンチベクター感染のためには４８時間に、全ＲＮＡを抽出した。組換えウイルス（ｒＲＡＢＶ、レンチウイルス）の特異的転写は、ＲＴ−ＱＰＣＲによってアッセイした。グラフは、ＮＴ２−Ｎ細胞が両方の型のウイルスに効率的に感染することを示した。
【０２５３】
Ｂ．１２．ＮＴ２−Ｎ細胞での代表的な免疫遺伝子セットの転写
転写は、上で収集された培養において、ＲＴ−ｑＰＣＲによってアッセイした（図１５）。
【０２５４】
ＣＶＳ−ＨＱ株またはＣＶＳ  ＨΔ４株のいずれかに感染させたＮＴ２−Ｎ細胞で、免疫遺伝子セットの相対的誘導倍率をアッセイした。図１６Ａおよび１６Ｂの比較は、免疫遺伝子クラスターおよび神経生存表現型の誘導が解離することを示す。
【０２５５】
さらに、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１デルタＰＤＺ−ＢＳまたはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２を発現するレンチウイルスベクターに感染させたＮＴ２−Ｎ細胞で、免疫遺伝子セットの相対的誘導倍率をアッセイした。図１６Ｂは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチドだけでは、いずれもヒトの有糸分裂後ニューロンで免疫遺伝子応答を誘発することができないことを示す。
【０２５６】
Ｂ．１３．軸索再生
図８は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１感染ＮＴ２−Ｎ細胞が、スクラッチ後にそれらの軸索を再生させることができることを示す。発明者らは、再生機構におけるＭＡＳＴ−２の関与をアッセイした。
【０２５７】
図１７Ｃで実証されるように、ＭＡＳＴ２発現（ＮＶ１／ｓｉＭＡＳＴ２）の抑制は、スクラッチ後の軸索再生を劇的に減少させ、ヒト有糸分裂後ドーパミン作動性ニューロン（ＮＴ２−Ｎ）でのレンチベクターＮＶ１による軸索再生の促進がＭＡＳＴ２の発現に依存することを意味する。
【０２５８】
図１７Ｄは、レンチベクターＮｅｕｒｏｖｉｔａ１（ＮＶ１）と同様に、レンチベクターＮｅｕｒｏｖｉｔａ２（ＮＶ２）がヒト有糸分裂後ドーパミン作動性ニューロン（ＮＴ２−Ｎ）での軸索再生を促進することを示す。
【０２５９】
Ｂ．１４．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２による過剰な樹状分枝からの保護
図１８Ａに示すように、感染していないＮＳ細胞（黒い四角）でのＫＣｌの添加は、過剰な伸長および樹状分枝を刺激する。この観察は、ＫＣｌが持続的ニューロン活性の脱分極作用を模倣するという事実によって説明される（ニューロンファイヤリング）。
【０２６０】
ＫＣｌ処理ＮＳ細胞でのＮｅｕｒｏｖｉｔａ２レンチベクターによる感染は、同じ処理をしたが、感染していない細胞と比較して、ＮＳ細胞の伸長および樹状分枝を低減する（星印、図１８Ｂ）。これらの結果は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２が神経突起生成に関与する経路を刺激するだけでなく、これらの経路を制御して、それらの暴走を避けることによって過剰な樹状分枝から保護もすることを実証する。興味深いことに、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ２のこのモジュレーション作用は、非毒性のサインでもある。
【０２６１】
Ｂ．１５．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２によるＬｉＣｌ毒性からの保護
図１９Ａに示すように、感染していないＮＳ細胞でのＬｉＣｌの添加は、神経突起生成を阻害する。
【０２６２】
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ΔＰＤＺ−ＢＳレンチベクターでなく、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１またはＮｅｕｒｏｖｉｔａ２レンチベクターは、ＬｉＣｌ処理されたＮＳ細胞で、ＰＤＺ−ＢＳによって媒介される神経突起伸長表現型を示す（図１９Ｂ）。これらの結果は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２が、ＬｉＣｌの毒性作用から保護することを実証する。
【０２６３】
Ｂ．１６．レンチベクターによって送達されるＲＡＢＶ  ＧおよびＮｅｕｒｏｖｉｔａ１由来ポリペプチドに感染させたＮＳ細胞での神経突起伸長
以下の６種類のポリペプチドをアッセイした（図２０Ａ）：ＲＡＢＶ  Ｇ  ｆｕｌｌタンパク質、ＰＤＺ−ＢＳドメインを削除したＲＡＢＶ  Ｇタンパク質、ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチド、ＰＤＺ−ＢＳドメインを削除したｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチド、ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドのサイトゾル形、およびＰＤＺ−ＢＳドメインを削除したｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドのサイトゾル形。図２０は、神経突起伸長アッセイで、ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１ポリペプチドが最適形であることを示す。
【０２６４】
Ｂ．１７．二シストロン性レンチベクターからのＮｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチドの発現
ＮＳ細胞で、様々なＮｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチド（ＮＶ１、ＮＶ１Δ、ＮＶ２およびＮＶ３）が、二シストロン性レンチベクターを通して発現された。全てのこれらのＮｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチドは、正しく発現された（ウェスタンブロット）。ＮＶ１およびＮＶ２のｍＲＮＡは、ほぼ同じレベルで見出されるが、ＮＶ３のｍＲＮＡはより高いレベルで見出される（図２１）。
【０２６５】
実験は、細胞で、ＧＦＰタンパク質がこの二シストロン性レンチベクターから正しく、十分に発現されることも示す
Ｂ．１８．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３発現レンチベクターで形質導入されたＮＳ細胞での神経突起伸長および樹状分枝
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３発現レンチベクターで形質導入されたＮＳ細胞での樹状分枝実験は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３が、陰性対照と比較して神経突起ツリーの著しい複雑性を促進することを実証する（図２２Ａ）。表４で前に報告されるように、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３はＮＶ１のそれより２０倍高いＭＡＳＴ２親和性を有する。
【０２６６】
さらに、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３発現レンチベクターに感染させたＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイは、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３が、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１（ｐ＜０．００００１）およびＮｅｕｒｏｖｉｔａ２（ｐ＜０．０００３）より重要なことに強力な神経突起伸長表現型を示すことを示す（図２２ＢおよびＣ）。
【０２６７】
ＮＶ１、ＮＶ２およびＮＶ３の間の交差（樹状分枝）の数の比較は、ＮＶ３が、ＮＶ１（ｐ＜０．０００１）およびＮＶ２（ｐ＜０．０００７）より効率的にＮＳ細胞で神経突起ツリーの樹状分枝を促進することを実証した（図２３）。
【０２６８】
Ｂ．１９．Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３のサイトゾル形による実験
Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ３（ＮＶ３）ポリペプチドおよびそのサイトゾル形（ＮＶ３ｃｙｔｏ）（図２４Ａ）を、ＮＳ細胞での発現、神経突起伸長および樹状分枝についてアッセイした。ＮＶ３ポリペプチドは、高いＭＡＳＴ２親和性（ＮＶ１のそれより２０倍高い）を有し、ＥＲおよびゴルジによって処理され、細胞膜への固着を可能にする膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する。ＮＶ３ｃｙｔｏポリペプチドはＮＶ３と同じＭＡＳＴ−２親和性を有するが、サイトゾル分子である。
【０２６９】
二シストロン性レンチベクターを通した転写分析（図２４Ｂ）は、ＮＶ３ｃｙｔｏが正しく発現されるが、ＮＶ３より低いレベルであることを示す（図２４Ｃ）。この二シストロン性レンチベクターからのＧＦＰの発現も正しい（図２４Ｄ）。
【０２７０】
ＮＶ３およびＮＶ３ｃｙｔｏ発現レンチベクターで形質導入させたＮＳ細胞での樹状分枝実験は、ＮＶ３ｃｙｔｏが、ＮＶ３ほど複雑な神経突起ツリーを促進しないことを実証する（図２５Ａ）。
【０２７１】
さらに、ＮＶ３−およびＮＶ３ｃｙｔｏ発現レンチベクターを感染させたＮＳ細胞での神経突起伸長アッセイは、ＮＶ３ｃｙｔｏがＮＳ細胞で神経突起伸長を促進するが、ＮＶ３ほど効率的でないことを確認する。しかし、ＮＳ細胞で神経突起伸長を促進するために、ＮＶ３−ｃｙｔｏはＮＶ１（固着形）と同じくらい優れている（図２５Ｂおよび２５Ｃ）。
【０２７２】
興味深いことに、ＮＶ３ｃｙｔｏ中のＳＰおよびＴＭドメインの不在（Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチドの神経突起伸長促進を低減することが知られている不在；図２０ＢのＮＶ１ｃｙｔｏを参照）は、ＮＶ３ｃｙｔｏ（およびＮＶ３）の高いＭＡＳＴ２親和性によってバランスがとられている。
【０２７３】
この結論は、神経突起ツリー樹状分枝実験で確認され、そこにおいては、ＮＳ細胞で神経突起ツリー樹状分枝を促進するためにＮＶ３−ＣｙｔｏがＮＶ１と同じくらい優れている（図２６Ａ、上パネル）。
【０２７４】
全体として、これらの実験は、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチド、例えば本発明のポリペプチドの、神経突起伸長促進および神経突起ツリー樹状分枝の促進が、以下の２つの因子に依存することを実証する：（１）このポリペプチドのＭＡＳＴ２親和性、および（２）このポリペプチドの細胞膜での固着。したがって、細胞膜に固着し、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１のそれと同等（１．２６μＭ）以上の高いＭＡＳＴ−２親和性を有するポリペプチドは、神経突起伸長および神経突起ツリー樹状分枝を促進するのに効率的である。さらに、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａ１のそれより高く、好ましくはＮｅｕｒｏｖｉｔａ３のそれと同等であるＭＡＳＴ−２親和性を有するサイトゾルポリペプチドは、膜での固着がないにもかかわらず、神経突起伸長および神経突起ツリー樹状分枝を促進するのになお効率的である。
【０２７５】
Ｂ．２０．Ｅ１６マウス胎児皮質ニューロンでの神経突起生成
神経突起伸長実験は、ＳＨ−ＳＹ−５ＹおよびＮＳ細胞で得た結果と一致して、ＮＶ１がＥ１６マウス胎児皮質ニューロンで神経突起生成を刺激することを実証する（図２７）。
【０２７６】
Ｂ．２１．脳内経路によってレンチベクターに感染させた新生児マウスに対するＮＶ１またはＮＶ１Δレンチベクターの毒性の不在
図２８Ａで報告されるように、感染していないマウスまたはＮＶ１もしくはＮＶ１Δレンチベクターに感染させたマウスの間に重量差はない。さらに、注射から４日目または２０日目に、それらの異なるマウスの間で明らかな表現型の差を検出することはできなかった（図２９）。
【０２７７】
免疫蛍光組織化学脳分析は、ＮＶ１（ｅＧＦＰ）およびＮＶ１Δ（ｅＧＦＰ）が線状体のニューロンで発現されることを示した（図３０および３１、ニューロンマーカーＭａｐ２で印を付けたパネル）。ＮＶ１（ｅＧＦＰ）およびＮＶ１Δ（ｅＧＦＰ）感染の両方で、星状神経膠症は非常に軽度である（図３０および３１、ＧＦＡＰで印を付けたパネル）。
【０２７８】
さらに、ＮＶ１感染ニューロンは、神経突起生成および樹枝状軸索ツリーの分化の伸長を示し（図３０Ｂ）、ＮＶレンチベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏでも神経突起生成および神経突起ツリー発達を可能にすることを示唆した。これらのｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、一方では、Ｎｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチド、例えばＮＶ１のｉｎ  ｖｉｖｏ効率を確認し、他方では、動物の発達、特に脳の発達に対するこれらＮｅｕｒｏｖｉｔａポリペプチドの安全性を確認する。
【０２７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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