(57)【要約】【課題】  細胞が有する生体膜の透過効率を改善し、前記細胞の染色像を改善する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  固定試薬で固定した細胞を、メタノールなどアルコールを含む試薬およびサポニンなど界面活性剤を含む試薬で処理することで前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させることで、蛍光色素を標識した抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬の浸透を促進させ、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞の染色方法。
（１）固定化試薬を用いて細胞を固定する工程
（２）固定した前記細胞をアルコールを含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（３）固定した前記細胞を界面活性剤を含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬を用いて膜透過した前記細胞を染色する工程
【請求項２】
固定試薬がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、請求項１に記載の染色方法。
【請求項３】
アルコールがメタノールである、請求項１または２に記載の染色方法。
【請求項４】
界面活性剤がサポニンである、請求項１から３のいずれかに記載の染色方法。
【請求項５】
細胞が多能性幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の染色方法。
【請求項６】
以下の（１）から（４）に記載の試薬を少なくとも含むキット。
（１）ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定試薬
（２）メタノールを含む生体膜透過試薬
（３）サポニンを含む生体膜透過試薬
（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる細胞を染色する方法に関する。特に本発明は、試料中に含まれる細胞を膜透過させた後、染色試薬を用いて前記細胞を染色する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内における標的タンパクの局在や発現量の確認を、当該標的タンパクを認識する標識抗体を含む染色試薬で前記細胞を染色（染色工程）して確認する場合、前記染色工程前に前記細胞が有する生体膜（細胞膜や核膜など）を透過させる工程（膜透過工程）が必要である。膜透過工程では、生体膜への浸透性を増強するために一般的に界面活性剤やアルコール等が用いられる。例えば、非特許文献１では抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬を用いて人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を染色する前に、界面活性剤であるサポニンを含む試薬を用いて前記細胞の膜透過処理を行っている。
【０００３】
しかしながら、膜透過工程で生体膜の透過処理が不十分だと、後続の染色工程で細胞内に染色試薬が十分に拡散せず、染色が不均一になり、偽陰性が増えるという問題があった。特にｉＰＳ細胞から目的細胞に分化誘導させる工程では、ｉＰＳ細胞が造腫瘍能を有するため、分化誘導工程後に含まれるｉＰＳ細胞を極めて高感度に検出する（すなわち偽陰性を極力減らす）必要があり、より効果的な生体膜の透過処理法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７（１１），１０３３−１０３７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、細胞が有する生体膜の透過効率を改善し、前記細胞の染色像を改善する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明の第一の態様は、以下の（１）から（４）に示す工程を含む、細胞の染色方法である。
（１）固定試薬を用いて細胞を固定する工程
（２）固定した前記細胞をアルコールを含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（３）固定した前記細胞を界面活性剤を含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬を用いて膜透過した前記細胞を染色する工程
【０００８】
また、本発明の第二の態様は、固定試薬がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、前記第一の態様に記載の染色方法である。
【０００９】
また、本発明の第三の態様は、アルコールがメタノールである、前記第一または第二の態様に記載の染色方法である。
【００１０】
また、本発明の第四の態様は、界面活性剤がサポニンである、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の染色方法である。
【００１１】
また、本発明の第五の態様は、細胞が多能性幹細胞である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の染色方法である。
【００１２】
さらに、本発明の第六の態様は、以下の（１）から（４）に示す試薬を少なくとも含むキットである。
（１）ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定試薬
（２）メタノールを含む生体膜透過試薬
（３）サポニンを含む生体膜透過試薬
（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明において細胞とは、Ｎａｎｏｇを発現している細胞であればよく、例としてｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性がん（ＥＣ）細胞があげられるが、中でも多能性幹細胞が好ましい。また、細胞の状態・形状についても限定はなく、培養器材に接着している細胞や酵素処理等により分散・懸濁された細胞であってもよく、スフェロイド等の細胞塊や組織などの形状であってもよい。
【００１５】
本発明の染色方法は、以下の（１）から（４）に示す工程を含むことを特徴としている。
（１）固定試薬を用いて細胞を固定する工程
（２）固定した前記細胞をアルコールを含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（３）固定した前記細胞を界面活性剤を含む試薬で処理することで、前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させる工程
（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬を用いて膜透過した前記細胞を染色する工程
前記（１）の固定工程で用いる固定試薬は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど、当業者間で一般的に広く使用される組織高分子を架橋する試薬の中から適宜選択すればよく、好ましい固定試薬の態様として、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む試薬があげられる。なお、前記固定試薬には前記（２）の工程で用いる試薬の主成分であるアルコールを含んではならない。
【００１６】
前記（２）および（３）の膜透過工程は、前記（１）の固定工程の後、実施する。前記（２）の膜透過工程において、アルコールは水溶性であれば特に限定はなく、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどがあげられる、中でもエタノールやメタノールが好ましく、メタノールが特に好ましい。また、前記（２）の処理条件も当業者間で一般的に行われる条件であれば良い。例えば、−２０℃から５℃の範囲で最低５分間の処理条件が例として挙げられる。前記（３）の膜透過工程において、界面活性剤は生体膜の脂質成分を可溶化できるものであれば特に限定はなく、一例として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ  ２０（いずれも商品名）など略無差別に脂質分子を可溶化する界面活性剤や、サポニンやジギトニンなどコレステロールを特異的に可溶化する界面活性剤が挙げられるが、中でもコレステロールを特異的に可溶化する界面活性剤が好ましく、サポニンが特に好ましい。前記（３）の条件は業者間で一般的に行われる条件であれば良く、１５℃から２５℃の範囲で１５分間から１２０分間の処理条件や１℃から１０℃の範囲で１０時間から１８時間の処理条件が例として挙げられる。
【００１７】
前記（４）の染色工程では、標的タンパク質であるＮａｎｏｇを特異的に標識可能な色素（化学発光色素や蛍光色素など）を添加して染色する方法も考えられるが、汎用性の点からＮａｎｏｇに対する標識抗体を用いる方法が一般的である。前記標識抗体中の標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質があげられる。前記標識抗体における抗体と標識物質との結合態様に限定はなく、前記抗体が標識物質と化学結合などにより直接結合された態様であってもよく、標識物質が結合された前記抗体に対する抗体（標識二次抗体）によって間接的に結合された態様であってもよい。
【００１８】
なお、本発明の染色方法において、膜透過工程の順序に限定はなく、前記（２）の工程の後に前記（３）の工程を実施してもよいし、前記（３）の工程の後に前記（２）の工程を実施してもよい。また前記（４）の染色工程を実施する際、前記（３）の膜透過工程と同時に（すなわちＮａｎｏｇ抗体の染色試薬中に界面活性剤を含有した態様で実施してもよい。
【００１９】
上述した染色方法を簡便に実施するために、（１）ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む固定試薬、（２）メタノールを含む生体膜透過試薬、（３）サポニンを含む生体膜透過試薬、（４）抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬を少なくとも含むキットを準備してもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の染色方法および染色キットは、固定試薬で固定した細胞を、アルコールを含む試薬および界面活性剤を含む試薬で処理することで前記細胞が有する生体膜の脂質成分を可溶化し透過させた後、蛍光色素を標識した抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬で染色することを特徴としており、多能性幹細胞などＮａｎｏｇを発現する細胞を極めて高感度に検出する一方、偽陰性を大幅に減少できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１の結果を示す図である。上段はＮａｎｏｇ陽性ｉＰＳ細胞の結果であり、下段はＮａｎｏｇ陰性である巨核球芽細胞株Ｋ５６２細胞の結果である。（ａ）はメタノールおよびサポニンによる膜透過処理を行なわなかったときの、（ｂ）はメタノールで膜透過処理したときの、（ｃ）はサポニンで膜透過処理したときの、（ｄ）はメタノールおよびサポニンで膜透過処理したときの、それぞれ結果である。グラフ内の数字はＮａｎｏｇ陽性細胞の割合［％］であり、高い値であるほど膜透過性が向上したことを示す。
【図２】実施例２の結果を示す図である。上段はＮａｎｏｇ陽性ｉＰＳ細胞の結果であり、下段はＮａｎｏｇ陰性である巨核球芽細胞株Ｋ５６２細胞の結果である。（ｅ）はエタノールで膜透過処理したときの、（ｆ）はエタノールおよびサポニンで膜透過処理したときの、それぞれ結果であり、比較として実施例１（ａ）および（ｃ）の結果も示している。グラフ内の数字はＮａｎｏｇ陽性細胞の割合［％］であり、高い値であるほど膜透過性が向上したことを示す。
【図３】実施例３の結果を示す図である。上段はＮａｎｏｇ陽性ｉＰＳ細胞の結果であり、下段はＮａｎｏｇ陰性である巨核球芽細胞株Ｋ５６２細胞の結果である。（ｇ）はメタノールおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で膜透過処理したときの結果であり、比較として実施例１（ｄ）の結果も示している。グラフ内の数字はＮａｎｏｇ陽性細胞の割合［％］であり、高い値であるほど膜透過性が向上したことを示す。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、当該実施例は例示のために提供されるものに過ぎず、本発明が当該実施例に示された態様に限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）
膜透過工程による細胞染色の違いを以下に示す方法で評価した。
（１）ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパンより購入）をｉＭａｔｒｉｘ（タカラバイオ社製）でコートしたシャーレに播種し、ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）で培養した。
（２）（１）で７日間培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（りん酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）との混合液で前記細胞を剥離した。
（３）剥離した細胞を回収後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。
（４）固定した細胞を０．５％ＢＳＡと２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）で２回洗浄後、（ｂ）および（ｄ）の条件では９０％（ｖ／ｖ）メタノールに置換し氷上で３０分静置することで膜透過処理を行なった。
（５）（ａ）および（ｂ）の条件ではＢｕｆｆｅｒ  Ａで、（ｃ）および（ｄ）の条件では５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）と０．７５％（ｗ／ｖ）サポニンとを含むＰＢＳ（ＢｕｆｆｅｒＢ）で、それぞれ洗浄した。
（６）（ａ）および（ｂ）の条件ではウサギ由来抗マウスＮａｎｏｇ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を含むＢｕｆｆｅｒ  Ａに浸し、（ｃ）および（ｄ）の条件では前記抗体を含むＢｕｆｆｅｒ  Ｂに、それぞれ室温で９０分間浸すことで、未分化ｉＰＳ細胞と当該細胞が有するタンパク質（Ｎａｎｏｇ）に対する抗体との複合体を形成させた。
（７）（ａ）および（ｂ）の条件ではＢｕｆｆｅｒ  Ａで、（ｃ）および（ｄ）の条件ではＢｕｆｆｅｒ  Ｂで、それぞれ２回洗浄した。
（８）（ａ）および（ｂ）の条件では標識二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を含むＢｕｆｆｅｒ  Ａに浸し、（ｃ）および（ｄ）の条件では前記抗体を含むＢｕｆｆｅｒ  Ｂに浸し、それぞれ室温で９０分間反応させた。
（９）Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで３回洗浄後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス社製）にてＮａｎｏｇ陽性ｉＰＳ細胞の割合を測定した。
（１０）Ｎａｎｏｇを発現していない細胞として巨核球芽細胞株Ｋ５６２細胞を用いて前記（３）から（９）に示す工程を同様に行ない、ＦＡＣＳＡｒｉａにてＮａｎｏｇ陽性とＮａｎｏｇ陰性の境界線を作成した。
【００２４】
ＦＡＣＳＡｒｉａの結果を図１に示す。アルコールであるメタノールおよび／または界面活性剤であるサポニンを用いて膜透過処理（（ｂ）から（ｄ）の条件）することで、膜透過処理を行なわなかったとき（（ａ）の条件）と比較し、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合が向上しており、アルコールまたは界面活性剤により細胞が有する生体膜の脂質成分が可溶化されることがわかる。
【００２５】
特にアルコールであるメタノールおよび界面活性剤であるサポニンを用いて膜透過処理したとき（（ｄ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：８４．４％）は、メタノールまたはサポニンのいずれか一方を用いて膜透過処理したとき（（ｂ）および（ｃ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：７７．１％および６６．２％）と比較し、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合がさらに向上していることから、アルコールによる膜透過処理と界面活性剤による膜透過処理とを組み合わせることによって、膜透過処理効率がさらに向上し、抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬が細胞内へ拡散しやすくなり、細胞中のＮａｎｏｇタンパクとの結合性を改善でき、Ｎａｎｏｇ発現細胞をより高感度に検出できることが示唆される。
【００２６】
なお、（ａ）から（ｄ）の条件でＮａｎｏｇ陰性細胞（Ｋ５６２株）を測定したところ、いずれの条件もＮａｎｏｇ陽性細胞の割合が１％以下となり、膜透過処理による偽陽性の発生はないことを確認した。
【００２７】
（実施例２）
実施例１（ｂ）および（ｄ）の条件のうち、（４）の膜透過処理で用いるアルコールを９０％（ｖ／ｖ）エタノールとした他は、実施例１と同様な方法で行ない、アルコールによる細胞染色の違いを評価した。
【００２８】
ＦＡＣＳＡｒｉａの結果を図２に示す。膜透過工程で用いるアルコールをエタノールに替えても、実施例１と同様、界面活性剤であるサポニンを用いた膜透過処理を組み合わせる（（ｆ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：７９．９％）ことによって、エタノールまたはサポニンのいずれか一方を用いて膜透過処理したとき（（ｅ）および（ｃ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：７３．４％および６６．２％）と比較し、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合がさらに向上していることから、アルコールによる膜透過処理と界面活性剤による膜透過処理とを組み合わせることによって、膜透過処理効率がさらに向上し、抗Ｎａｎｏｇ抗体を含む染色試薬が細胞内へ拡散しやすくなり、細胞中のＮａｎｏｇタンパクとの結合性を改善でき、Ｎａｎｏｇ発現細胞をより高感度に検出できることが示唆される。
【００２９】
一方、実施例１（ｄ）の条件（Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：８４．４％）と、本実施例（ｆ）の条件（Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：７９．９％）とを比較すると、（ｄ）の条件の方がＮａｎｏｇ陽性細胞の割合が高いことから、本発明の染色方法において膜透過工程で用いるアルコールとしてはメタノールが好ましいことがわかる。
【００３０】
なお、（ｅ）および（ｆ）の条件でＮａｎｏｇ陰性細胞（Ｋ５６２株）を測定したところ、いずれの条件もＮａｎｏｇ陽性細胞の割合が１％以下となり、膜透過処理による偽陽性の発生はないことを確認した。
【００３１】
（実施例３）
実施例１（ｄ）の条件のうち、
（６）の未分化ｉＰＳ細胞−抗Ｎａｎｏｇ抗体複合体形成を、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）を含むＰＢＳ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ）でウサギ由来抗マウスＮａｎｏｇ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を希釈した反応液に室温で９０分間浸すことで行ない、
（７）の洗浄をＢｕｆｆｅｒ  Ｃを用いて行ない、
（８）の標識をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を含むＢｕｆｆｅｒ  Ｃに浸し室温で９０分間反応させることで行なった他は、実施例１と同様な方法で行ない、界面活性剤による細胞染色の違いを評価した。
【００３２】
ＦＡＣＳＡｒｉａの結果を図３に示す。アルコールと界面活性剤とを組み合わせて膜透過処理を行なう際、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）を用いる（（ｇ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：７６．２％）と、サポニンを用いたとき（（ｄ）の条件、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合：８４．４％）と比較し、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合が低下したことから、本発明の染色方法において膜透過工程で用いる界面活性剤としてはコレステロールを特異的に可溶化するサポニンが好ましいことがわかる。
【００３３】
なお、（ｇ）の条件での、Ｎａｎｏｇ陰性細胞（Ｋ５６２株）を測定したところ、Ｎａｎｏｇ陽性細胞の割合が１％以下と、膜透過処理による偽陽性の発生はないことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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