(57)【要約】【課題】本発明は、鎖間システイン残基への薬物コンジュゲートの結合から生じる非共有結合した抗体重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）のインタクト質量の迅速な測定のための方法とシステムとを提供する。【解決手段】非変性脱塩条件下で抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を分析することにより、通常はＬＣＭＳのために典型的に使用される変性性クロマトグラフィー条件の結果として分解するであろうＡＤＣのインタクト２価構造が維持される。次に、脱溶媒和化およびイオン化ＥＳＩ−ＭＳ条件を使用して、脱塩されたＡＤＣの質量が決定される。本明細書に記載の方法は、鎖間システイン残基で結合したＡＤＣのインタクト質量の直接測定を提供する。本明細書に記載の方法はまた、個々のＡＤＣ分子種の相対的定量を提供する。【選択図】図１
2018063265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
［１］  タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法であって、
（ａ）不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、
（ｂ）該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、
（ｃ）該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析計により直接確立する工程と、を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法を実施するように構成されたシステム。
【請求項３】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５４０，８３９号と２０１２年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７０１，４８９号号（これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の優先権と利益とを主張する。
【背景技術】
【０００２】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、標的へのペイロードの標的化送達のための化合物である。多くの例において、標的は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、ペイロードは薬物である。
【０００３】
ＩｇＧ１やＩｇＧ２を含む様々なクラスの抗体が存在する。ＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２抗体の構造は、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）とを含む。複合体として提示されるこれらの２つの重鎖と２つの軽鎖は、インタクト抗体を構成する。各ＩｇＧ１抗体は１２個の鎖内ジスルフィド結合と４個の鎖間ジスルフィド結合とを有し、これらは各抗体鎖上にあるそれぞれのシステインの酸化により形成される。重鎖と軽鎖との間に２つのジスルフィド結合が、そして重鎖と重鎖との間に２つのジスルフィド結合とがある。ＩｇＧ１抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、非共有結合で維持される抗体複合体を与える。
【０００４】
ＩｇＧ１抗体の鎖間ジスルフィド結合の完全な還元は、一般にリンカーを介して、薬物との結合のための８個の利用可能なチオールを与える。還元パラメータを変化させることにより、結合に利用できる０〜８個のチオールを有する抗体異性体を得ることができる。例えば、ＩｇＧ１をＤＴＴで還元すると、２、４、６、又は８個の利用可能なチオールを有する抗体を与えることができる。完全に還元されたＡＤＣは、水素結合、イオン結合、疎水結合、及びファンデアワールス相互作用などの非共有結合により結びつけられ、変性条件（例えば逆相クロマトグラフィー）下で軽鎖と重鎖とに分離するであろう。完全には還元されていないＡＤＣは、共有結合と非共有結合とにより結びつけられる。共有的手段により結合された完全には還元されていないＡＤＣの部分はまた、変性条件下で分離することができる。
【０００５】
完全に搭載されたＩｇＧ１  ＡＤＣは、抗体の鎖間ジスルフィドを構成する各システインに１つの薬物分子が結合しており、従って抗体１つあたり全部で８個の薬物がある。部分的に搭載されたＡＤＣは一般に、システイン残基に２、４、又は６個の薬物分子が結合している。部分的に搭載されたＡＤＣはまた、システイン残基に１、３、及び５個の薬物分子が結合していることも観察されている。搭載されたＡＤＣの構成断片の質量は質量分析法（ＭＳ）により測定されているが、インタクト搭載されたＡＤＣの質量の測定については、本発明が関連する分野においてまだ問題がある。
【０００６】
インタクト搭載されたＡＤＣの質量を直接測定するための方法は欠如しているが、搭載されたＡＤＣの質量を測定するための種々の間接的手段が知られている。例えば、ＡＤＣの質量は、典型的にはイオン対合性の酸（例えばトリフルオロ酢酸）を含有し、不揮発性酸や界面活性剤が試料から洗浄される（一般に脱塩と呼ばれる）ことを可能にする有機溶媒の存在下又は非存在下で、加熱された逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（ｒｐ−ＨＰＬＣ）に試料（例えばＡＤＣ）を結合させることにより、測定されている。この例では、疎水性タンパク質ドメインとｒｐ−ＨＰＬＣカラムの表面との相互作用が非極性有機溶媒により破壊される点まで溶媒の有機物含量を上昇させることにより、タンパク質がｒｐ−ＨＰＬＣカラムから溶出される。この方法の望ましくない作用は、タンパク質試料を加熱、酸、及び有機溶媒（これらのいずれも、タンパク質を変性させタンパク質構造を破壊することができる）に付すことにより、これがタンパク質構造を破壊することである。非共有結合性タンパク質複合体は、ｒｐ−ＨＰＬＣに付されると、共有性構成成分に分かれる。８個の鎖間結合したシステイン薬物を有するＩｇＧ１の場合、ｒｐ−ＨＰＬＣカラム上での脱塩は、１個の鎖当たり３個の薬物を有する重鎖と１個の鎖当たり１個の薬物を有する軽鎖への、ＡＤＣの完全な解離を引き起こす。構成断片の質量は質量分析法（ＭＳ）により測定できるが、本発明が関連する分野では、インタクト物質の質量を測定するための技術が欠如している。
【０００７】
現在のＭＳ技術は、一部は、これらの技術がタンパク質を変性させ、及び／又は本明細書で企図される用途には時間を使いすぎるため、インタクトＡＤＣの質量を測定するための技術が欠如している。タンパク質の固有の電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）ＭＳの実質的にすべての方法は、標準的ＥＳＩで使用される加熱シースと脱溶媒和ガスから発生し得るタンパク質構造の破壊を最小にするために、この方法がナノ噴霧スケール（１００〜５００ナノリットル／分の流速）で行われるべきであると記載する。従来法のナノ噴霧ＥＳＩ−ＭＳ法を使用してＡＤＣの完全な質量を測定するための試料取り扱い法は、非常に時間がかかり、高処理能力化に適さない。抗体を脱グリコシル化する時間を含めなくても、質量測定値を得るために１試料につき少なくとも１時間がかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さらに、鎖間でシステイン結合したＡＤＣを分析するための公知の方法は、オンライン質量分析法（例えばＨＩＣ）に適していないか、又はクロマトグラフィー分離及び以後の質量測定（例えばｒｐ−ＨＰＬＣ）中の結合した重鎖と軽鎖の変性的解離を引き起こす。従って、本発明が関連する分野には、システイン結合ＡＤＣのインタクト質量を日常的にかつ迅速に測定するための方法に対するニーズがある。
【０００９】
驚くべきことに、本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート（protein agent conjugate）の質量を検出するための方法、装置、及びシステムを提供することにより、このニーズおよび関連分野の満たされていないニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ある形態において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートの質量を検出するための方法を提供する。この方法は、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合している非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程とを含む。
【００１１】
第２の携帯において本発明は、特に限定されないが、本明細書に記載の方法の１つを実施するように構成された質量分析計などのシステムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、抗体と、ある形態において薬物、別の形態において標識物、さらに別の形態において毒素である作用物質との結合により産生される異性体を含む、０〜８のＭＲを有する種々の代表的ＡＤＣのＩｇＧ１構造を示す。抗体（図ではｍＡｂとして表示される）（ＭＲ＝０）のサブユニット間のジスルフィド結合は、ＡＤＣ中の薬物に結合しており、非共有結合した２ＬＣ−２ＨＣ薬物結合分子種を与える。
【００１３】
【図２】図２は、変性及び非変性条件下での、脱グリコシル化ｍＡｂ−Ａの質量測定に関連する未処理ＭＳとデコンボリューションされた（deconvoluted）ＭＳとを示す。変性条件下で得られた未処理ＭＳとデコンボリューションされたＭＳデータはそれぞれパネルＡとＣに示され、非変性条件下で得られた未処理ＭＳとデコンボリューションされたＭＳデータはそれぞれパネルＢとＤに示される。変性した抗体が明らかとなるであろう領域であるパネルＢ中の２００〜３５００ｍ／ｚ間で明らかなイオンは、脱グリコシル化のために使用されたＰＮＧａｓｅＦと非イオン性界面活性剤ツイーン８０との存在が原因である。
【００１４】
【図３】図３は、変性及び非変性条件下での、脱グリコシル化マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチン（auristatin）Ｆ（ｍｃＭＭＡＦ）コンジュゲートＡＤＣ−Ａの質量測定に関連する未処理ＭＳとデコンボリューションされたＭＳとを示す。変性条件下で得られた未処理ＭＳとデコンボリューションされたＭＳデータはそれぞれパネルＡとＣに示され、非変性条件下で得られた未処理ＭＳとデコンボリューションされたＭＳデータはそれぞれパネルＢとＤに示される。インタクトＡＤＣ−Ａについての多重荷電したイオンは、パネルＢ中の囲み部分で示され、パネルＣとＤ中のデコンボリューションされたアーチファクトは星印で示される。
【００１５】
【図４】図４は、脱グリコシル化マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＦ（ｍｃＭＭＡＦ）コンジュゲートＡＤＣ−Ａと、対応する親物質ｍＡｂ−Ａのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。非共有結合したＡＤＣ構造は、ＭＳ中で対応するイオンの上に示される。
【００１６】
【図５】図５は、脱グリコシル化ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢモノメチルアウリスタチンＥ（ｖｃＭＭＡＥ）コンジュゲートＡＤＣ−Ｂと、対応する親物質ｍＡｂ−Ｂのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。非共有結合したＡＤＣ構造は、ＭＳ中で対応するイオンの上に示される。
【００１７】
【図６】図６は、デコンボリューションされた質量スペクトルからのＭＳに基づく定量とＩＣにより分離された分子種のＵＶ積分により測定される、ＩｇＧ１  ＡＤＣ−Ａに対するｖｃＭＭＡＦ（パネルＡ）とＩｇＧ１  ＡＤＣ−Ｂに対するｖｃＭＭＡＥ（パネルＢ）のモル比の相対的レベルを示す。
【００１８】
【図７】図７は、脱塩したＡＤＣと、対応する出発物質の２重カラムＳＥＣ分析からのクロマトグラムの比較を示す。
【００１９】
【図８】図８は、０、２、４、６、及び８のＭＲ値を有するコンジュゲートの、塩濃度に対するｖｃＭＭＡＥの相対的パーセントを示す。
【００２０】
【図９】図９は、ＨＩＣ（パネルＡ）と次のＳＥＣ−ＭＳ（パネルＢ）による採取した画分の分析による、ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣの分離の性状解析の結果を示す。
【００２１】
【図１０】図１０は、ＨＩＣ分離からの個々の画分の分析を示し、ＡＤＣポリペプチド鎖上の薬物結合の位置が、ＳＥＣ−ＭＳを使用して解離された断片の質量により評価できることを示す。
【００２２】
【図１１】図１１は、ＭＲ＝０、２、４、６、又は８を有するタンパク質作用物質コンジュゲートのデコンボリューションされたＭＳ質量測定を示す。
【００２３】
【図１２】図１２は、ＭＲ＝０、２、４、又は６を有するタンパク質作用物質コンジュゲートのデコンボリューションされたＭＳ質量測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．総論
本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を示す。これらの方法は、（ａ）マトリックス中でタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、（ｂ）溶出したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、（ｃ）質量分析法により、このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を直接確立する工程と、を含む。さらなる態様において、分離媒体は、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で適用して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を分離させる。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性していない。さらなる態様において、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、揮発性塩中で分離媒体から溶出される。
【００２５】
Ｉ．定義
特に明記しない場合は、本明細書で使用されるすべて技術用語、表記及び他の科学用語または専門用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合に、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために及び／または即時参照のために本明細書で定義されるが、そのような定義の包含は、必ずしも当技術分野で一般に理解されているものに対して実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される技術及び手順の多くは、当業者によりよく理解され従来の方法論を用いて一般的に使用される。特に明記しない場合は、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は適宜、一般に、製造業者により規定されたプロトコル及び／またはパラメータに従って行われる。
【００２６】
本明細書において商品名が使用される時、これは、商品名製品の調合物、商品名製品のジェネリック医薬品及び活性医薬成分を、独立に含むことを意図する。
【００２７】
本明細書において、略語「ＭＲ」は、例えばタンパク質又は抗体に結合した薬物分子の数をいう。例えば、ＭＲ＝０は、あるタンパク質又はある抗体に０個の薬物分子が結合していることを意味する。ＭＲ＝８は、あるタンパク質又はある抗体に８個の薬物分子が結合していることを意味する。ＭＲは、０、１、２、３、４、５、６、７、及び８を含んでよい。
【００２８】
特に明記しない場合は、本明細書において以下の用語及び語句は以下の意味を有することが意図される。
【００２９】
本明細書において用語「ＡＤＣ」は、抗体薬物コンジュゲートをいう。ＡＤＣの抗体部分は、抗原に対する特異性を有する。目的の抗原は、特に限定されないが、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、及びＣＤ７０を含む。
【００３０】
本明細書において用語「タンパク質」は、典型的には３次元形に折り畳まれた１つ以上のポリペプチドを含み、生物学的機能を促進し得る化合物をいう。
【００３１】
本明細書において用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー及びその同等物をいい、特定の長さの生成物をいうものではない。すなわち「ペプチド」及び「タンパク質」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。またタンパク質の定義には、本明細書に記載の「抗体」も含まれる。「ポリペプチド領域」はポリペプチドの部分をいい、この部分は、例えば１つ以上のドメイン又はモチーフを含んでよい（例えば、抗体のポリペプチド領域は、例えば１つ以上のＣＤＲを含むことができる）。
【００３２】
本明細書において用語「断片」は、典型的には、ポリペプチドの少なくとも２０個の連続アミノ酸又は少なくとも５０個の連続アミノ酸を有するポリペプチドの部分をいう。
【００３３】
本明細書において用語「非共有結合したタンパク質」は、ポリペプチド鎖間の少なくとも１つの共有結合が破壊されており、かつ完全な３次又は４次構造を維持しているタンパク質をいう。例えば、ＡＤＣについて、非共有結合したタンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の還元を受けているが、その完全な構造を維持しているタンパク質である（すなわち、２つの重鎖が２つの軽鎖に結合されたままである）。ＡＤＣは、共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用の複合体である。共有結合的相互作用は一部のＡＤＣ、例えば２、４、又は６個の薬物が搭載されたＡＤＣで維持されている。２個の薬物を搭載を有するＡＤＣの例では、ＡＤＣは２個の重鎖と１個の軽鎖間に共有結合性鎖間ジスルフィドを有し、他の軽鎖−重鎖は非共有結合構造として存在する。同様に、４個の薬物が搭載されたＡＤＣの例では、これも重鎖と軽鎖間の共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用との複合体である。
【００３４】
本明細書において用語「タンパク質作用物質コンジュゲート化合物」は、作用物質に結合したタンパク質を含む化合物をいう。タンパク質は、特に限定されないが、抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質、又は非共有結合タンパク質複合体でもよい。ある形態において、タンパク質は抗体でもよい。別の形態において、タンパク質は抗体断片である。他の形態において、タンパク質はＦｃ融合タンパク質でもよい。さらに別の形態において、タンパク質は、共有結合によっては結合されていないサブユニットの複合体から構成されてもよい。これらのタイプのタンパク質の例は、２つのアルファ鎖と２つのベータ鎖が非共有結合的に結合したテトラマーアセンブリーであるヘモグロビン、テトラマーであるコンカナバリンＡ、及びダイマーであるエストロゲン受容体である。Ｆｃタンパク質は、Ｆｃダイマーへの機能性タンパク質又はタンパク質ドメインの移植を含み、ここでＦｃモノマーは、Ｆｃのヒンジ領域でシステイン残基により結合される。このタンパク質は、共有結合によっては結びつけられておらず、非共有結合によってのみ結びつけられている４次構造を有してもよい。例はヘモグロビンであり、これは、変性条件下で解離させることができる４個のサブユニットからなる。ヘモグロビンのシステインは、薬物と結合してもよいが、抗体とは異なり、システインは、サブユニット構造を共有結合により結びつけることには実際には参加していない。
【００３５】
本明細書において用語「作用物質」は、薬物、標識物、毒素などをいう。
【００３６】
本明細書において用語「マトリックス」は、タンパク質又はタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が存在する背景又は環境をいう。例えば、「マトリックス」は、調製緩衝液、生物学的血清、界面活性剤、賦形剤、又は細胞培養培地を含む。
【００３７】
本明細書において用語「非変性条件」は、タンパク質（例えば抗体）がその２次、３次、又は４次構造を喪失しない条件をいう。非変性条件は、熱的展開を引き起こすような過剰レベルの熱（例えば５０℃以上）や極端なｐＨ（例えばｐＨ５未満及びｐＨ８超）が存在しないことを含む。
【００３８】
本明細書において用語「非変性タンパク質」は、その２次、３次、及び適宜４次構造を維持しているタンパク質（例えば抗体）を意味する。
【００３９】
本明細書において用語「還元されたタンパク質」（例えば抗体）は、鎖間ジスルフィド結合が破壊されているタンパク質をいう。
【００４０】
本明細書において用語「変性タンパク質」（例えば抗体）は、タンパク質がその２次、３次、又は４次構造を喪失したタンパク質である。
【００４１】
本明細書において用語「実質的に」は、デコンボリューションされた質量スペクトルからのＭＳに基づく定量、及びＨＩＣにより分離された分子種のＵＶ積分により測定されるモル比の相対レベルにより測定される量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％を意味し、このタンパク質（例えば抗体）は、分離媒体工程（例えばＳＥＣ）後に変性されない。
【００４２】
本明細書において用語「溶離液」は、クロマトグラフィーカラムの固定相からアナライトを解離させる液体移動相をいう。アナライトは、特に限定されないが、測定すべき目的の化合物を含む。
【００４３】
本明細書において用語「直接」は、完全な４元集合体（例えば、抗体複合体などのインタクト物質）の質量を測定することを含む、タンパク質の質量を確立する状況をいう。
【００４４】
本明細書において用語「間接的」は、４元集合体を構成するサブユニット（例えば、抗体の軽鎖と重鎖）の質量を測定し、これらの質量を一緒に加えてインタクト物質の数を求めることにより、タンパク質の質量を測定することを意味する。
【００４５】
「脱塩」は、不揮発性塩、賦形剤、及び／又は界面活性剤からタンパク質（タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を含む）試料を分離することをいう。
【００４６】
「揮発性塩」は、周囲環境圧力（１気圧）で気相に入る塩をいう。揮発性塩は、例えばギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウムを含む。
【００４７】
「界面活性剤」は、特に限定されないが、マトリックスの不揮発性化合物をいう。例えば界面活性剤は、非イオン性及び双性イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０（「ツイーン２０」）及びポリソルベート８０（「ツイーン８０」）を含む。
【００４８】
「カオトロピック剤」は、タンパク質間の及びタンパク質内のサブドメイン間の水素結合、ファンデアワールス力、及び疎水性相互作用を不安定化させこうして変性を引き起こす化学物質をいう。化合物の例は、特に限定されないが、グアニジン−ＨＣｌ、尿素、及び当業者に公知の他の化合物を含む。
【００４９】
「賦形剤」は、糖及びポリオール、例えばショ糖、トレハロース、及びソルビトールなどの化合物を含む。
【００５０】
「質量分析法」（ＭＳ）は、荷電粒子の質量電荷比を測定するために使用される分析技術である。これは、タンパク質の１次構造を解明するために使用してもよい。
【００５１】
「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」は、混合物の分離のための方法をいう。混合物は、固定相と呼ばれる構造中をタンパク質を運搬する移動相と呼ばれる流体に溶解される。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の場合、混合物の種々の成分は異なる速度で移動し、これが分離を引き起こす。分離は、移動相と固定相間の示差的配置に基づく。
【００５２】
「サイズ排除クロマトグラフィー」（ＳＥＣ）は、分子がそのサイズにより分離され、他の分離パラメータ（例えば分子量又は極性）によっては分離されないクロマトグラフィー法をいう。これは、タンパク質などの大きな分子に適用される。サイズ排除クロマトグラフィーでは、塩は主に移動相として使用される。ある場合には、移動相内に有機物質及びカオトロピック剤も存在してもよい。固定相は通常、特に限定されないが、以下の１つである：架橋ポリスチレン、誘導体化シリカ、アクリル、ヒドロキシル化アクリル、アクリル、アガロース、又はポリヒドロキシオキシエチル−アスパルトアミド骨格。樹脂骨格は、任意の数の分子種を用いて誘導体化され、誘導体化剤の選択は典型的には、分離すべきアナライトと、化合物のサイズ以外の分離パラメータに基づく分離法で使用されるであろうカラムとの、望ましくない分子的相互作用を低下させる必要性により決定される。
【００５３】
本明細書において用語「質量分析法に適合性の揮発性ＳＥＣ緩衝液」は、ＭＳで使用するのに適合したＳＥＣ用の移動相をいう。
【００５４】
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で本発明が関連する分野で使用される抗体をいい、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び抗体断片を包含する。抗体は、ネズミ、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種由来でもよい。
【００５５】
本明細書において用語「抗体」はまた、完全長免疫グロブリン分子又は完全長免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、目的の標的の抗原又はその部分に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をいい、そのような標的は、特に限定されないが、癌細胞又は自己免疫疾患に関連する自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は免疫グロブリン分子のサブクラスでもよい。
【００５６】
本明細書において用語「抗原断片」は、特に限定されないが、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ断片；Ｆｃ、半Ｆｃ（１／２）、ダイアボディ；線状抗体；Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、ＥＣＤ（細胞外ドメイン）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原もしくは微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合断片；１本鎖抗体分子；及び抗原断片から形成される多重特異的抗体を含む。
【００５７】
本明細書において「インタクト抗体」は、ＶＬ及びＶＨドメインと、完全な軽鎖及び重鎖定常ドメインとを含み、少なくとも１種の非共有結合性相互作用を介して結合している抗体をいう。「インタクト抗体断片」は、少なくとも１種の非共有結合性相互作用を介して結合している完全長抗体の一部を含む。
【００５８】
用語「鎖間ジスルフィド結合」は、抗体の文脈において、２つの重鎖間、又は重鎖と軽鎖間のジスルフィド結合をいう。
【００５９】
用語「鎖内ジスルフィド結合」は、抗体の文脈において、同じポリペプチド鎖上の２つのシステイン残基から形成されるジスルフィド結合をいう。
【００６０】
用語「鎖間チオール」は、鎖間ジスルフィド結合の形成に参加することができる抗体の重鎖又は軽鎖のチオール基をいう。
【００６１】
本明細書において用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原性部位に向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。
【００６２】
本明細書においてモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同的であり、鎖の残りは別の種から誘導される抗体、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同的である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片を含む。
【００６３】
インタクト抗体は、抗体のＦｃ領域（未変性の配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変種Ｆｃ領域）に帰因する生物活性をいう１つ以上の「エフェクター機能」を有することができる。抗体のエフェクター機能の例は、特に限定されないが、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；及び細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含む。
【００６４】
抗体は、抗体の融合タンパク質、又はその機能活性断片でもよい。例えば抗体は、Ｎ末端又はＣ末端で、抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列（又はその一部、例えばそのタンパク質の少なくとも１０、２０、又は５０アミノ酸の部分）に、共有結合（例えばペプチド結合）を介して融合されてよい。抗体又はその断片は、定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に共有結合されてよい。
【００６５】
本明細書において用語「融合タンパク質」は、また文脈で、結合ドメイン−Ｉｇ融合体をいい、ここで、結合ドメインは、例えばリガンド、受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、天然に存在しないペプチドなどでもよいが、但し、結合ドメインは抗体の可変ドメインを含まない。本明細書に記載のタンパク質及び抗体と同様に、融合タンパク質のＩｇ部分は、少なくとも１つの還元性ジスルフィド結合を含まなければならない。ある形態においてＩｇドメインは、抗体のＦｃ領域であろう。ドメイン−Ｉｇ融合タンパク質の例は、ｓＴＮＦＲＩＩとＦｃ領域との融合タンパク質であるエタネルセプト（米国特許第５，６０５，６９０号）、抗原提示細胞上に発現されたＬＦＡ−３とＦｃ領域との融合タンパク質であるアレファセプト（米国特許第５，９１４，１１１号）、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）とＦｃ領域との融合タンパク質（J. Exp. Med. 181:1869 (1995)）、インターロイキン−１５とＦｃ領域との融合タンパク質（J. Immunol. 160:5742 (1998)）、第ＶＩＩ因子とＦｃ領域との融合タンパク質（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12180 (2001)）、インターロイキン−１０とＦｃ領域との融合タンパク質（J. Immunol. 154:5590 (1995)）、インターロイキン２とＦｃ領域との融合タンパク質（J. Immunol. 146:915 (1991)）、ＣＤ４０とＦｃ領域との融合タンパク質（Surgery 132: 149 (2002)）、Ｆｌｔ−３（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）と抗体Ｆｃ領域との融合タンパク質（Acta. Haeraato. 95:218 (1996)）、ＯＸ４０と抗体Ｆｃ領域との融合タンパク質（J. Leu. Biol. 72:522 (2002)）、及び、他のＣＤ分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−Ｉ）、ＣＤ１３７）、接着分子（例えばＡＬＣＡＭ（活性化白血球接着分子）、カドヘリン、ＩＣＡＭ（細胞内接着分子）−ｌ、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３）サイトカイン受容体（例えばインターロイキン−４Ｒ、インターロイキン−５Ｒ、インターロイキン−６Ｒ、インターロイキン−９Ｒ、インターロイキン−１０Ｒ、インターロイキン−１２Ｒ、インターロイキン−１３Ｒアルファ１、インターロイキン−１３Ｒアルファ２、インターロイキン−１５Ｒ、インターロイキン−２１Ｒアルファ）、ケモカイン、細胞死滅誘導シグナル分子（例えばＢ７−Ｈ１、ＤＲ６（Death receptor ６）、ＰＤ−１（Programmed death−１）、ＴＲＡＩＬＲｌ）、同時刺激分子（例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ２、ＩＣＯＳ（誘導性同時刺激物質））、増殖因子（例えばＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＨＧＦＲ）、分化誘導因子（例えばＢ７−Ｈ３）、活性化因子（例えばＮＫＧ２Ｄ）、シグナル伝達分子（例えばｇｐ１３０）、ＢＣＭＡ、及びＴＡＣＩとの融合タンパク質を含む。
【００６６】
略語「ＭＭＡＥ」は、モノメチルアウリスタチンＥをいう。
【００６７】
略語「ＭＭＡＦ」は、ドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニンをいい、モノメチルアウリスタチンＦともいわれる。
【００６８】
用語「標識物」は、抗体に共有結合されることができる部分であり、かつ（ｉ）検出可能なシグナルを与える、（ii）第２の標識物と相互作用して、第１又は第２の標識物、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により与えられる検出可能なシグナルを修飾する、（iii）抗原又はリガンドとの相互作用を安定させるか又は結合の親和性を上昇させる、（iv）電荷、疎水性、形、又は他の物理的パラメータにより、移動度（例えば電気泳動移動度）又は細胞透過性に影響を与える、又は（ｖ）捕捉部分を与えて、リガンド親和性、抗体／抗原結合、又はイオン錯体形成を調節する、ように機能する部分を意味する。
【００６９】
抗体は、システインチオールを介して抗体に共有結合することができる任意の標識物部分と結合してもよい。診断用途では、抗体は典型的には検出可能な部分で標識されるであろう。
【００７０】
「薬物」又は「薬物部分」は、任意の細胞毒性、細胞増殖抑制性、又は免疫調節性（例えば、免疫抑制）薬物でもよい。多くの例において、薬物は、リンカーを介して抗体に結合される。例えばリンカーは、米国特許第７，７５４，６８１号、７，３７５，０７８号、７，８２９，５３１号、７，６５９，２４１号、７，８５１，４３７号、７，８２９，５３１号、７，６５９，２４１号、７，４９８，２９８号、７，９９４，１３５号、７，９６４，５６７号、及び７，９６４，５６７号（これらのそれぞれは、参照することにより及びすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある形態においてリンカーは、バリン−シトルリン（「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」又は「ｖｃ」）である。別の形態においてリンカーは、マレイミドカプロイル（「ｍｃ」）である。
ＩＩ．方法
【００７１】
ここで、いくつかの態様が詳細に参照される。列挙された態様に関連して本発明が説明されるが、これらが、本発明をこれらの実施形態に限定するものではないことは理解されるであろう。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、修正物、及び等価物を包含することを意図している。
【００７２】
当業者は、本発明の実施において使用され得る多くの方法、及び本明細書に記載のものと類似または同等の物質を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び物質に限定されるものではない。
【００７３】
ある態様において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を提供する。ある態様において本方法は以下の工程を含む：（ａ）不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程、（ｂ）このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程、及び（ｃ）このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程。
【００７４】
ある態様において本発明は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を提供する。ある態様において本方法は以下の工程を含む：（ａ）不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程、（ｂ）このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程、及び（ｃ）このタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する工程。
【００７５】
本明細書に記載のある方法では、この方法はさらに、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物のための非変性条件下で分離媒体を適用して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行うことを含み、従って、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性しない。他の態様において本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物のための非変性条件下で分離媒体を導入して、マトリックスからタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う工程を含み、従って、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性しない。
【００７６】
本明細書に記載の方法のある態様において、この方法は、分離媒体から、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を溶出する方法を含む。ある態様において非変性条件は、質量分析法に適合性のある揮発性ＳＥＣ緩衝液を含む。あるさらなる態様において、揮発性塩はギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムを含む。ある態様において、揮発性塩はギ酸アンモニウムである。他のある態様において、揮発性塩は酢酸アンモニウムである。他の態様において、揮発性は炭酸アンモニウムである。他のある態様において、揮発性塩は、本明細書に記載の揮発性塩の混合物である。
【００７７】
ある態様において本発明は、マトリックスが不揮発性塩、界面活性剤、又は緩衝液を含んでなる、本明細書に記載の方法を提供する。
【００７８】
本明細書に記載した方法のさらなる態様において、本発明は、デコンボリューションされたイオン強度により、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量することを含む方法を提供する。これらのある態様において本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量することを含む方法を提供する。これらのある態様において本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布を定量するために、本明細書に記載のアッセイのイオン強度をデコンボリューションすることを含む方法を提供する。
【００７９】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が抗体薬物コンジュゲートを含むことを記載する。
【００８０】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、マトリックスが調合物を含むことを記載する。ある態様において、マトリックスは調合物である。
【００８１】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、分離媒体がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含むことを記載する。ある態様において、分離媒体はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。本明細書に記載のいくつかの方法において、本方法は、本明細書に記載の、タンパク質作用物質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離する工程を含む。
【００８２】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、作用物質が、薬物、毒素、又は標識物を含むことを記載する。本発明のいくつかの態様において、作用物質は薬物である。本発明のいくつかの他の態様において、作用物質は毒素である。本発明のいくつかの他の態様において、作用物質は標識物である。ある態様において作用物質は、本明細書に記載の任意の作用物質の組合せである。
【００８３】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、ＳＥＣが、シリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含むことを記載する。ある態様において、ＳＥＣはシリカカラムを含む。他のある態様において、ＳＥＣはポリスチレン−ジビニルベンゼンカラムを含む。他のある態様において、ＳＥＣはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含む。
【００８４】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、非変性条件が５０℃の温度を含むことを記載する。ある態様において、非変性条件の温度は５０℃以下である。ある態様において、非変性条件の温度は室温である。室温は、特に限定されないが、２０〜２４℃の温度を含む。
【００８５】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、質量分析法がＥＳＩ−ＭＳで行われることを記載する。他の態様において、本発明は、質量分析法が、分析すべき試料をＭＳに送るためのクロマトグラフ又は噴霧ノズルなどの別の器具に結合されている質量分析計で行われることを記載する。
【００８６】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本発明は、揮発性塩の濃度が５０〜４００ｍＭであることを記載する．ある態様において、揮発性塩の濃度は５０ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は４００ｍＭである。ある態様において揮発性塩の濃度は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１  １５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、又は４００ｍＭである。ある態様において揮発性塩の濃度は、約５０〜約４００ｍＭである。本文脈において、約は、約という単語で修飾される値の１０％以内の値をいう。例えば、約５０ｍＭは、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、及び５５ｍＭを含む。例えば．約４００ｍＭは、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、及び４４０ｍＭを含む。ある態様において、揮発性塩の濃度は、約５０〜約３００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約２００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約１００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約１００〜約４００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約２００〜約４００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約３００〜約４００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約１００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約２００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約３００ｍＭである。ある態様において、揮発性塩の濃度は約５０〜約３５０ｍＭである。
【００８７】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、直ちに質量分析計に導入される。
【００８８】
本明細書に記載の方法のある態様において、溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、連続的に質量分析計に導入される。ある態様において分離媒体は、非変性条件下で運転されるＨＩＣカラムである。他の態様において、ＳＥＣはポリヒドロキシエチル−Ａカラムである。
【００８９】
本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、ＳＥＣカラムのサイズは、内径０．１〜７．８ｍｍで長さ１００〜３００ｍｍである。
【００９０】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を脱グリコシル化試薬で処理する工程を含む。ある態様において、脱グリコシル化試薬はＰＮＧａｓｅＦである。他の態様において、脱グリコシル化剤は、エクソグリコシダーゼ酵素処理、エンドグリコシダーゼ処理、又はＮ−グリカン上の第１Ｎ−アセチルグルコサミン残基と第２Ｎ−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理を含む。
【００９１】
本明細書に記載のいくつかの態様において、エクソグリコシダーゼ酵素処理は、シアリダーゼ又はベータガラクトシダーゼを含む。
【００９２】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、Ｎ−グリカン上の第１Ｎ−アセチルグルコサミン残基と第２Ｎ−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理は、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｆ２、又はＦ３を含む。
【００９３】
本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、揮発性塩のｐＨは５．５〜７．０である。他の態様において本明細書に記載の方法は、揮発性塩のｐＨが、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７．０である工程を含む。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のｐＨは６．０である。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のｐＨは６．５である。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、揮発性塩のｐＨは７．０である。
【００９４】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、本方法は、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を、質量分析法により定量することを含む。
【００９５】
本明細書に記載の方法のいくつかのさらなる態様において、非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、重鎖又は軽鎖抗体断片を含む。これらのある態様において、重鎖又は軽鎖抗体断片は、１つ以上の薬物をさらに含む。
【００９６】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体は抗体断片である。
【００９７】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、又は１本鎖抗体分子から選択される。本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体は、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、又は抗ＣＤ７０抗体からなる群から選択される。他の態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体である。ある態様において、抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体を含む。
【００９８】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、７．５Ｄａ以内で測定される。他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は２５Ｄａ以内で測定される。ある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１．０、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２．０、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３．０、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、１４．０、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、１４．９、１５．０、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、１５．９、１６．０、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４、１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、１６．９、１７．０、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５、１７．６、１７．７、１７．８、１７．９、１８．０、１８．１、１８．２、１８．３、１８．４、１８．５、１８．６、１８．７、１８．８、１８．９、１９．０、１９．１、１９．２、１９．３、１９．４、１９．５、１９．６、１９．７、１９．８、１９．９、２０．０、２０．１、２０．２、２０．３、２０．４、２０．５、２０．６、２０．７、２０．８、２０．９、２１．０、２１．１、２１．２、２１．３、２１．４、２１．５、２１．６、２１．７、２１．８、２１．９、２２．０、２２．１、２２．２、２２．３、２２．４、２２．５、２２．６、２２．７、２２．８、２２．９、２３．０、２３．１、２、２３．３、２３．４、２３．５、２３．６、２３．７、２３．８、２３．９、２４．０、２４、１、２４．２、２４．３、２４．４、２４．５、２４．６、２４．７、２４．８、２４．９、２５．０、２５．１、２５．２、２５．３、２５．４、２５．５、２５．６、２５．７、２５．８、又は２５．９Ｄａ以内で測定される。
【００９９】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、８．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、９．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１０．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１１．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１２．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１３．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１４．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１５．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１６．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１７．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１８．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、１９．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２０．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２１．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２２．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２３．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２４．０Ｄａ以内で測定される。本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、２５．０Ｄａ以内で測定される。
【０１００】
本明細書に記載の方法のさらなる態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の１００ｐｐｍ以内で測定される。他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の８０、９０、１００、１１０、１２０、又は１３０ｐｐｍ以内で測定される。
【０１０１】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートの未変性のインタクト質量をアッセイする方法を示す。本発明はまた、タンパク質作用物質コンジュゲートの未変性のインタクト質量をしてする方法を示す。
【０１０２】
本発明は、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供し、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計中に導入し、そしてタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立することにより、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法を示す。
【０１０３】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらの態様の１つにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、ギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、酢酸アンモニウム中である。これらの態様の他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、炭酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性であり炭酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でありギ酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性であり酢酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物である。
【０１０４】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計中に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらの態様の他のいくつかにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で炭酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でギ酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で酢酸アンモニウム中である、抗体作用物質コンジュゲート化合物の断片である。
【０１０５】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計中に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらの任意の態様において、薬物はＭＭＡＥ又はＭＭＡＦを含む。
【０１０６】
関連する態様において、本明細書に記載の方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が、非変性の抗体抗体作用物質コンジュゲート化合物であることを記載する。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は薬物である。これらのある態様において本発明は、薬物が、特に限定されないが、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦを含む方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、薬物がＭＭＡＥである方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、薬物がＭＭＡＦである方法を提供する。
【０１０７】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。いくつかの他の態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、作用物質は毒素である。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が毒素である方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、塩の濃度が任意選択的に５０〜４００ｍＭである方法を提供する。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が薬物である方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物である。これらの任意の態様において、本発明は、塩の濃度が５０〜４００ｍＭである方法を提供する。これらのある態様において、作用物質は薬物である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。
【０１０９】
本明細書に記載のこれらの任意の態様において、本方法は、コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される工程を含んでよい。
【０１１０】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。いくつかの態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。いくつかの態様において、塩の濃度は５０〜４００ｍＭである。いくつかの態様において、塩の濃度は２００ｍＭである。他の関連する態様において、作用物質は薬物である。他の態様において、緩衝液のｐＨは５．０〜７．０である。これらの任意の態様において、本発明は、作用物質が薬物でもよい方法を提供する。
【０１１１】
本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性でギ酸アンモニウム中にある抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、塩の濃度は２００ｍＭであり、作用物質は薬物であり、そして緩衝液のｐＨは５．０〜７．０である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。
【０１１２】
本発明の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性で酢酸アンモニウム中にある抗体作用物質コンジュゲート化合物である。いくつかの態様において、塩の濃度は２００ｍＭであり、緩衝液のｐＨは５．０〜７．０であり、そして作用物質は薬物である。
【０１１３】
本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、非変性の抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、塩の濃度は２００ｍＭであり、作用物質は薬物であり、緩衝液のｐＨは６．５である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、作用物質は薬物を含み、ここで薬物は本明細書に記載の薬物である。
【０１１４】
本発明のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う。いくつかの態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、そしてインタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又はギ酸アンモニウム中である。
【０１１５】
本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される方法を提供する。これらのさらなる態様において、インタクトタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、こうしてタンパク質作用物質コンジュゲートは実質的に非変性である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物はギ酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は炭酸アンモニウム中である。これらのある態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行う。関連する態様において、分離媒体はＳＥＣである。
【０１１６】
上記方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従ってタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣであることを含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中である。
【０１１７】
上記方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中のタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからのタンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従ってタンパク質作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣであることを含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。本明細書に記載の任意の方法において、分離媒体はＳＥＣを含んでよい。
【０１１８】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体はＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１１９】
タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲートは実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２０】
タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲートは実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、分離媒体はＳＥＣであり、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。
【０１２１】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳであり、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物は直接測定される。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２２】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２３】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣであり、コンジュゲートは質量分析計に導入され、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２４】
上記方法のいずれかにおいて、本方法は、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される工程を含んでよい。上記方法のいずれかにおいて、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２５】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。関連する態様において、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。いくつかの他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは連続的に質量分析計に導入される。
【０１２６】
タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される本明細書に記載のいずれかの方法において、コンジュゲートは連続的な方法で導入されてよい。タンパク質作用物質コンジュゲートが質量分析計に導入される本明細書に記載のいずれかの方法において、コンジュゲートは連続的に導入されてよい。
【０１２７】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２８】
ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１２９】
本明細書に記載のいずれかの形態において、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。
【０１３０】
上記方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、質量分析計はＥＳＩ−ＭＳである。
【０１３１】
本発明は、分離媒体がＳＥＣであり、タンパク質コンジュゲートが質量分析計に導入され、質量分析計がＥＳＩ−ＭＳであり、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、抗体薬物コンジュゲート化合物の質量が定量される、方法を提供する。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、分離媒体は非変性条件下のＨＩＣである。
【０１３２】
ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲートは抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドであり、抗体作用物質コンジュゲート化合物は質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量は直接測定される。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１３３】
上記方法のある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣである。関連する態様において、ＳＥＣはシリカである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、ＳＥＣはポリスチレン−ジビニルベンゼンを含む。
【０１３４】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法はさらに、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物が非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドであることを、含んでよい。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１３５】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１３６】
関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは任意選択的に脱グリコシル化されており、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中、ギ酸アンモニウム中、又は酢酸アンモニウム中である。
【０１３７】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される方法の別の形態において、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは脱グリコシル化されており、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性である。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは炭酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は５０〜４００ｍＭである。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは酢酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は５０〜４００ｍＭである。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートはギ酸アンモニウム中であり、炭酸アンモニウムの濃度は５０〜４００ｍＭである。
【０１３８】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが炭酸アンモニウムであり、炭酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが酢酸アンモニウムであり、酢酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートがギ酸アンモニウムであり、ギ酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。
【０１３９】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定される本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法はさらに、以下の形態を含んでよい。ある形態において、分離媒体は、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件を有し、適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣである。関連する態様において、ＳＥＣカラムはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが炭酸アンモニウムであり、炭酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートが酢酸アンモニウムであり、酢酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本方法は、タンパク質作用物質コンジュゲートがギ酸アンモニウムであり、ギ酸アンモニウムの濃度が５０〜４００ｍＭであることを規定してもよい。
【０１４０】
関連する態様において、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートが非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物が実質的に非変性であり、分離媒体はがＥＣであり、ＳＥＣカラムがシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである、方法を提供する。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が５０〜４００ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が５０〜４００ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が５０〜４００ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。他の関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１４１】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。
【０１４２】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が１５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が１５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が１５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。
【０１４３】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。
【０１４４】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、本発明は、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が４００ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が４００ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートが、濃度が４００ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中であることを、本方法が任意選択的に含んでよいことを規定する。
【０１４５】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がＥＳＩ−ＭＳである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、非変性である。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１４６】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がＥＳＩ−ＭＳである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、タンパク質作用物質コンジュゲートは非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１４７】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がＥＳＩ−ＭＳである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。ある形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物で、非変性であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１４８】
本明細書に記載のいくつかの方法において、抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１４９】
抗体作用物質コンジュゲート化合物が質量分析計に導入され、インタクト抗体作用物質コンジュゲート化合物の質量が直接測定され、かつ質量分析計がＥＳＩ−ＭＳである本明細書に記載の方法の別の形態において、本方法は、以下の形態を含んでよい。本明細書に記載の方法の別の形態において、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体作用物質コンジュゲート化合物であり、作用物質は薬物であり、マトリックス中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体が適用されて、マトリックスからの抗体作用物質コンジュゲート化合物の分離を行い、従って抗体作用物質コンジュゲート化合物は実質的に非変性であり、分離媒体はＳＥＣであり、ＳＥＣカラムはポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドである。関連する態様において、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５であるギ酸アンモニウム中、タンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である炭酸アンモニウム中、又はタンパク質作用物質コンジュゲートは、濃度が２５０ｍＭでｐＨが６．５である酢酸アンモニウム中である。
【０１５０】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲート化合物のインタクト質量の迅速測定を含む。ある態様において、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）の抗体作用物質コンジュゲート化合物は、抗体の還元と以後の鎖間システイン残基への薬物の結合により生じる複合体として存在する。本明細書に記載の方法は、ＡＤＣのインタクト２価構造が維持される固有の脱塩条件を使用して、ＡＤＣを分析する工程を含んでよい。本発明のさらなる態様は、次に、脱溶媒和化とイオン化条件を使用して、脱塩されたＡＤＣの質量が測定される工程を含む。これらのある態様において、脱溶媒和化とイオン化条件は、標準的脱溶媒和化とイオン化条件である。
【０１５１】
本明細書に記載の方法は、脱塩と質量測定法に基づいて半固有サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を提供することにより、システイニル結合ＡＤＣを分析することを含んでよい。この方法はまた、鎖間システイン結合ＡＤＣのインタクト質量を測定し、デコンボリューションされたイオン強度により薬物結合分子種の相対分布を定量することを含んでよい。本明細書に記載の方法は、ＡＤＣの高処理能力質量測定に適合させてもよい。
【０１５２】
本明細書に記載の方法は、ＡＤＣを脱グリコシル化する任意の工程を含んでよい。脱グリコシル化工程は、ＰＮＧａｓｅＦ又は当業者に公知の他の化合物を使用することを含んでよい。本明細書に記載の方法は、グリカンの不均一性を排除する工程を含んでよい。ある実施態様において、本方法は、各薬物搭載分子種の改善された又は強化された又はより大きなシグナル強度を与える。さらなる態様において、本方法は定量する工程を含む。本発明は、上昇したＭＳシグナル強度のために、脱グリコシル化がより良好な質量の正確性を可能にする方法を提供する。
【０１５３】
任意の脱グリコシル化以外に、本明細書に記載の方法は分離媒体工程を含んでよい。分離媒体工程は、例えばＳＥＣ又はＨＩＣなどの種々のクロマトグラフィー法を含む。この工程においてＡＤＣは、緩衝液系から、質量測定のために基礎アミノ酸の陽性荷電を支持する揮発性塩に交換される。これらのある態様において、不揮発性塩、界面活性剤、及び緩衝液はＡＤＣから除去される。他の形態において、ＳＥＣを非変性条件下で使用してクロマトグラフィー工程が行われ、揮発性塩へのＡＤＣの緩衝液交換が可能になる。
【０１５４】
本明細書に記載の方法は、質量分析工程を含んでよい。ある形態において、ＭＳ工程は、分離媒体工程の直後に行われてよい。他の形態において、分離媒体工程とＭＳ工程との間に介在工程があってもよい。さらに別の形態において、ＭＳ工程は、分離媒体工程後に連続してもよい。ＭＳ工程では、ＡＤＣの質量が測定される。さらに本明細書に記載の方法は、定量的薬物搭載が豊富なＭＳイオン量を介して測定されることを規定してもよい。ある形態において、ＭＳは、ＴＯＦ−ＭＳ、Ｑ−ＴＯＦ、ＦＴＩＣＲ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、又は高分解イオン捕捉ＭＳで行われる。この工程では、質量は高分解能質量分析計を用いて測定され、多重荷電（ｍ／ｚ）データはゼロ荷電質量スペクトルにデコンボリューションされる。個々の薬物搭載分子種は、未処理の生データの強度の積であるデコンボリューションされたスペクトルのイオン強度に基づいて定量される。タンパク質からのＥＳＩ−ＭＳ生データは、典型的には、ある単一の分子種が、そこに結合したいくつかのイオンを有し、各関連イオンは陽性荷電の数が異なる連続荷電イオンとして視覚化される。生データのデコンボリューションは、各イオンが運搬している電荷の数を測定し、すべての関連イオンをゼロ電荷質量スペクトル（これは、分析されている分子種の分子量である）に変換するプロセスをいう。デコンボリューションされた質量スペクトルで特定の分子種に関連する生データ中の各イオンは、そこに結合した強度又は量の尺度を有し、特定の分子種に結合したすべてのイオンの量は、分析される試料中のその分子種の量の近似値を構成する。分子種が定量されると、試料中の特定の分子種の量は、試料中のすべての関連する分子種の量の合計と比較され、こうして、その特定の分子種の相対的モル過剰量の尺度を与える。こうして定量することは、ある例では、すべての分子種がほぼ同等のイオン化効率を有することを仮定する。
【０１５５】
ＩＩＩ．薬物動態
哺乳動物における薬物動態（ＰＫ）測定値（半減期、クリアランス、曲線下の面積（ＡＵＣ）、及び分布容量を含む）について、治療薬の循環レベルを追跡することは、安全性／毒性限界及び投与処方を確立するために必要である（Welling, P. (1997) Pharmacokinetics Processes, Mathematics, and Applications, 2nd Ed., American Chemical Society, Washington, D.C.）。バイオアベイラビリティは、投与された化合物が、投与された剤型から全身循環に到達する程度であり、通常投与された用量のパーセントとして表される。化合物の半減期は、排泄又は生物変換（代謝）により化合物のピーク血漿濃度の５０％が除去されるのに必要な時間である。治療指数は、所望の治療活性と望ましくない毒性副作用との間の化合物の選択性を表す。本発明の方法からの薬物動態測定は、抗体及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の吸収、分布、代謝、及び排泄（ＡＤＭＥ）を解明する。
【０１５６】
ＩＶ．薬物搭載
結合反応からのＡＤＣの調製において抗体当たりの薬物の平均数は、本発明の方法により解析し得る。本発明の方法は、ＡＤＣの抗体当たりの結合薬物の量（搭載）及び重鎖や軽鎖などの断片上の薬物部分の分布を決定することができる。
【０１５７】
Ｖ．抗体薬物コンジュゲートの投与
ＡＤＣは、治療すべき症状に適した任意の経路により、生物学的供給源に接触又は投与することができる。ＡＤＣは典型的には、哺乳動物に非経口的に、例えば注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下、及び硬膜外投与されるであろう。
【０１５８】
ＶＩ．本明細書に記載の方法での使用に適した薬物
抗体への結合用の薬物の例は、細胞毒性薬物又は作用物質、特に癌治療法に使用されるものを含む。そのような薬物は、一般にＤＮＡ損傷作用物質、代謝拮抗物質、天然の生成物、及びこれらの類似体を含む。細胞障害剤のクラスの例は、例えばジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤及びチミジレートシンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン群の薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジン群の薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド（maytansinoid）、分化誘導剤、及びタキソールを含む。薬物部分の例は、特に限定されないが、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥ）、メソトレキサート、メトプテリン、ジクロロメソトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、 ロイロシデイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンA 、メイタンシノイド、 カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、及びポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテール、レチノイン酸、酪酸、カンプトテシン、カリケアマイシン、エスペラマイシン、エンジイン、及びこれらの誘導体及び類似体）を含む。
【０１５９】
ＡＤＣの薬物部分はまた、ドラスタチンとそのペプチド類似体で誘導体であるアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、５，７８０，５８８号）を含むことができる。ドラスタチンとアウリスタチンは、微小管動力学、ＧＴＰ加水分解、及び核分裂と細胞分割を妨害し（Woyke et al (2001）Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）と抗真菌活性（Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965）を有することが証明されている。いくつかの態様において、薬物は抗チューブリン剤のアウリスタチンである。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は抗体に、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して結合してもよい（ＷＯ０２／０８８１７２）。アウリスタチンＥの変種は、米国特許第５，７６７，２３７号及び米国特許第６，１２４，４３１号に開示されている。
【０１６０】
ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ免疫コンジュゲート、これらの合成と構造は、米国特許第７，８５１，４３７号、７，８２９，５３１号、７，６５９，２４１号、７，４９８，２９８号、７，９９４，１３５号、７，９６４，５６７号（これらの各々は、参照することにより及びすべての目的のために本明細書に組み込まれる）に開示されている。アウリスタチンは、特に限定されないが、アウリスタチンＥ及びその誘導体を含む。ＡＦＰ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＦ、及びＭＭＡＥは、本明細書で使用できるアウリスタチンの例である。
【０１６１】
ＶＩＩ．医薬調合物
治療用ＡＤＣの医薬調合物は、典型的には非経口投与（例えばボーラス、静脈内、筋肉内注射）のために、医薬的に許容し得る非経口ビヒクルを用いて、単位用量注射可能形態で調製される。所望の純度を有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、任意選択的に医薬的に許容し得る希釈剤、担体、賦形剤、又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.）と、凍結乾燥製剤または水溶液の形で混合される。
【０１６２】
許容し得る希釈剤、担体、賦形剤、及び安定剤は、使用される用量及び濃度で生物学的起源の受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグアーガム及びデキストリンを含む他の炭水化物；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又は、ツイーン（登録商標）、プルロニクス（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１６３】
ＶＩＩＩ．脱グリコシル化
Ｎ−グリカン上の末端シアル酸及びガラクトース残基の変化の程度から生じる不均一性を低下させるために、任意の脱グリコシル化工程が使用される。末端Ｎ−グリカン不均一性は、エクソグリコシダーゼ酵素処理（例えば、それぞれシアリダーゼ及びベータガラクトシダーゼ）、又は占有されたＡｓｎ残基からＮ−グリカンを除去する酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ−Ｆ）を用いる、又はエンドグリコシダーゼ処理、又はＮ−グリカン上の第１Ｎ−アセチルグルコサミン残基と及び第２Ｎ−アセチルグルコサミン間を切断する酵素（例えば、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｆ２、又はＦ３）により、低下させることができる。
【０１６４】
ある形態において、Ｎ−グリカンからの不均一性を低下させるための最も簡単で最も有効な方法は、ＰＮＧａｓｅ−Ｆを用いて消化することである。未変性で残されたグリカンを用いてまだ定量が可能であるという点で、脱グリコシル化工程は任意選択である。しかし、ＭＳスペクトルは必要以上に複雑であり、再現性ある定量のためには高性能の質量分析計が必要であろう。
【０１６５】
ＩＸ．クロマトグラフィー
タンパク質試料からの不揮発性塩及びイオン性及び非イオン性界面活性剤の除去は、質量測定の前に行われる。ある態様において、ＡＤＣは質量分析計に導入され、不揮発性塩を含まない。別の態様において、ＡＤＣは質量分析計に導入され、不揮発性塩を実質的に含まない。さらに別の態様において、ＡＤＣは質量分析計に導入され、例えば界面活性剤を除いて、不揮発性塩を含まない。システイン結合されたＡＤＣの脱塩技術は、非イオン性塩及び界面活性剤を除去しながら、天然のタンパク質構造をインタクトに保持しなければならない。ＭＳ適合性緩衝液系で脱塩し及び天然の構造を保持できるクロマトグラフィーカラムの種類は、サイズ排除（ＳＥ）及びＨＩＣカラムを含む。ＳＥＣ様モードで、ＳＥＣカラムとはいえないカラム（例えばＨＩＣカラム）を使用できることが企図される。カラムは、例えば均一溶媒の酢酸アンモニウム緩衝液中で実行されるであろう。カラムは、不揮発性塩がクロマトグラフィー媒体の孔に入ることを可能にしながら、タンパク質がクロマトグラフィー媒体の孔に入ることを防ぐように作動するため、移動相の条件下でタンパク質が最初に溶出され、塩を後で溶出される。
【０１６６】
ＳＥＣカラムは、典型的にはシリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミド固定相からなるクロマトグラフィー媒体を、直径１．７〜２０ミクロンで孔径が６０〜２０００オングストロームの範囲の大きさの粒子の形で使用する。ある形態において、孔径は、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、５００、１０００、２０００、又は４０００Åである。ある形態において、任意のＳＥＣカラム充填材料が使用され、カラムサイズは、内径０．１〜７．８ｍｍで長さ５０〜６００ｍｍでもよい。カラムサイズは、０．１、０．１５、０．３、０．５、１、２．０、２．１、３．０、４．０、４．６、又は７．８ｍｍでもよい。カラムの長さは、５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００ｍｍでもよい。
【０１６７】
このクラスのカラムは、不揮発性塩や界面活性剤とタンパク質のサイズは大きく異なるため、タンパク質から不揮発性塩及び界面活性剤を除去する。具体的には、小分子の塩と界面活性剤はクロマトグラフィー粒子中の孔と相互作用（例えば中に入る）して、これが、これらの分子種のカラム内の通過を遅延させ、一方、充分なサイズのタンパク質は粒子の多孔性構造と相互作用せず、従って不揮発性塩や界面活性剤よりはるかに前に溶出する。脱塩システムの別の形態は、ＭＳ適合性ＳＥＣ緩衝塩とその塩のｐＨ及び濃度の選択である。緩衝塩は、ＭＳ入り口の結晶化と腐食とを避けるために揮発性でなければならない。一般に使用される揮発性のＭＳ緩衝塩は、ギ酸アンモニウム／ギ酸、および酢酸アンモニウム／酢酸（例えば、酸／塩基対）である。例えば、カラムは、ｐＨ７の酢酸アンモニウムで洗浄し、酢酸で６．５のｐＨまで滴定することができる。ある形態において塩は酢酸アンモニウムである。
【０１６８】
塩の濃度は、５０〜４００ｍＭである。ある形態において、塩濃度は２００ｍＭである。別の形態において、塩濃度は２５０ｍＭである。緩衝液のｐＨは、５．０〜７．０である。ある形態において、ｐＨは５．５〜７．０である。別の形態において、ｐＨは６．５である。さらに別の形態において、ｐＨは７．０である。ｐＨの範囲は有用な質量データを与えるようなもの（例えば、有用な質量データはｐＨ７．５又は８．０で得られる）であることは、当業者に理解されるであろう。
【０１６９】
分析が有機溶媒と酸性イオン対合試薬の非存在下で行われるなら、ＡＤＣの変性とその後の断片化を防ぐことができる。ある形態において、ポリヒドロキシエチル−Ａカラムとともに使用されるｐＨ６．５の２００ｍＭの酢酸アンモニウムは、脱グリコシル化ＩｇＧ１  ｍＡｂの脱塩を提供する。
【０１７０】
Ｘ．質量分析法
ＭＳ法では、試料はＭＳ装置に投入される。試料はタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を含む。試料は、陽性又は陰性イオン化ＭＳについて、それぞれ酸または塩基でイオン化される。試料は、小滴の微細スプレーとしてソースに入る。小滴を含有する試料は、加熱された乾燥ガスにより脱溶媒和化（蒸発）される。小滴のサイズは、陽性荷電したタンパク質分子が、静電的反発により小滴が爆発してより小さい小滴になるようにする点まで低下する。このプロセスは、真のガス相のタンパク質イオンを有するようになるまで、ほんの一瞬で何度も繰り返され、このイオンは次に質量測定のために質量分析計に入る。このプロセスは典型的には、電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）と呼ばれる。分子イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）が決定され、この生データが、販売業者の特異的なソフトウェアによりさらに処理（デコンボリューション）されて、目的のアナライトについてゼロ電荷分子質量を与える。、ＭＳは、薬物動態を研究し、未知のタンパク質又は小分子を特定し、タンパク質に起きる翻訳後修飾と分解を性状解析するために、使用される。典型的なＥＳＩ装置は、水Xevo Q-TOF, Agilent 6510 Q-TOFを含む。
【０１７１】
タンパク質の１次構造を確認するために、質量分析データが使用される。１次構造の確認は、タンパク質の実験的に測定された質量が、あるエラー閾値内で理論的質量（これは、予測されるアミノ酸配列から求められる）に一致する時に得られる。組換えｍＡｂのインタクト質量の測定は、商業的に最も利用されている飛行時間質量分析計を使用して行うことができる。変性溶媒系を使用する典型的な脱塩法は、しばしば理論値の５０ｐｐｍ（約７．５Ｄａ）以内でｍＡｂの実験的質量データを与える。別の形態において、質量データは約２５Ｄａ以内である。酢酸アンモニウム緩衝液系でＳＥＣ−ＭＳを使用するｍＡｂとＡＤＣの本来の脱塩は、塩基性残基が中性緩衝液ｐＨでは陽性に荷電しているため、より低いイオン化効率を与える。低強度生データは、理論的質量からの、実験的に測定された質量のより大きなずれを引き起こす。しかし、本明細書に記載のＳＥＣ−ＭＳを使用して脱塩されたＡＤＣについて得られた実験的質量データは、日常的に閾値の５０ｐｐｍ（約７．５Ｄａ）以内でいつも１００ｐｐｍ未満である質量データを与える。高度の質量正確度は、タンパク質に結合している可能性のあるすべての一般的な塩付加物が質量を少なくとも１８Ｄａ（アンモニウムイオンの質量）だけ上昇させるであろうから、ＡＤＣが完全に脱塩されていることを示す。非共有結合されているサブユニットを有するＡＤＣの質量を測定するための従来のアプローチは、遠心ろ過、単回使用ゲル浸透カートリッジ、および透析などのオフライン技術と、その後の脱塩されたＡＤＣのナノ噴霧ＭＳによる脱塩を含む。このアプローチを使用する不完全な脱付加物化は極めて一般的であり、理論値から最大５０００ｐｐｍずれている質量データを与えることがある。
【０１７２】
タンパク質（例えばＡＤＣ）がＳＥＣカラムから揮発性塩（例えば酢酸アンモニウム）で溶出されると、そのタンパク質は、１〜１０００μｌ／分で流れている緩衝液中でタンパク質を脱溶媒和及びイオン化できる市販の分析ＥＳＩ源を使用して、質量分析計に導入される。流速は、操作者により決定され、カラム直径に依存することがある。例えば、０．１ｍｍのカラムは１μｌ／分の流速で操作することができ、７．８ｍｍのカラムは１０００μｌ／分で操作することができる。この流速は、はるかに高速の質量測定を可能にする。キャピラリー電圧、ガス流速（脱溶媒和およびシース）及びコーン電圧は、ＡＤＣを脱溶媒和（例えば、溶媒を蒸発）するのに充分な値に設定しなければならないが、薬物結合重鎖及び軽鎖へのＡＤＣのソース内断片化を最小にするのに充分に穏やかでなければならない。ＡＤＣの天然の折り畳まれた構造が維持されると、生データは、４８００〜７０００ｍ／ｚの間の電荷エンベロープとして明らかである。天然の構造が維持されない場合、これは２０００〜４０００のｍ／ｚ間の電荷エンベロープを有するＡＤＣの有意な集団として明らかである。ＡＤＣのＭＳ測定からの生データは、市販のデコンボリューションソフトウェア（例えば、Agilent MassHunter 最大エントロピーデコンボリューション）を使用してゼロ電荷質量スペクトルに変換され、各薬物結合分子種の量は、特定の薬物結合分子種のイオン量を全イオン量（すべての薬物結合分子種の合計量）で割ることにより定量される。完全なタンパク質の質量測定は、典型的には飛行時間及び四重極飛行時間（それぞれＴＯＦおよびＱＴＯＦ）装置で行われるが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）とオービトラップ質量分析計で行ってもよい。ある形態において、この作業は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析計と高解像度イオントラップ質量分析計で行うことができる。
【０１７３】
本発明と異なり、以前はクロマトグラフィー工程から採取された各画分は、個々にＭＳに導入された。各画分の構成化合物とコンジュゲートの質量をアッセイすることにより、すべての採取されたピークの質量の合計が計算されて全体の質量が求められた。本明細書に記載のように、本発明は、インタクトＡＤＣをＭＳにより直接分析する方法を提供する。
【０１７４】
ＸＩ．電子噴霧イオン化質量分析法（ＥＳＩ）
抗体などの比較的高分子量の化合物の質量は、ほとんどの質量分析計により容易に測定される質量電荷比（ｍ／ｚ）で検出することができる（典型的なｍ／ｚ範囲は最大２０００、最大３０００、最大８０００）。電子噴霧イオン化質量分析法ＥＳＩ−ＭＳは特に、荷電した、極性の、又は塩基性の化合物に適しており、及び優れた検出限界を有する多重荷電化合物を分析するのに適している。すなわちＥＳＩは、分子量（ＭＷ）が１５０，０００又はそれ以上の抗体−薬物コンジュゲートなどの大きな生物学的分子の検出と性状解析とを可能にする。
【０１７５】
ＸＩＩ．システム
ある態様において本発明は、本明細書に記載の方法を実施するように構成されたシステムを提供する。これらのいくつかの態様において、本システムは質量分析計を含む。
【０１７６】
ある態様において質量分析計は、本明細書に記載の方法を実施するように構成されており、非共有結合したタンパク質作用物質コンジュゲートの質量を検出するための手段を含む。ある態様において、この手段は質量分析計を含む。ある態様において、本システムは、不揮発性塩を含まない揮発性塩中で変性していないタンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供するための手段をさらに含む。さらなる態様において、本システムは、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入するための手段を含む。さらに別の態様において、本システムは、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析法により直接確立する手段を含む。
【実施例１】
【０１７７】
ＸＩＩＩ．実施例
以下の例は本発明を例示するが、これらは本発明を限定することを意図しない。
【０１７８】
材料
抗体−薬物コンジュゲート
組換えモノクローナル抗体はＣＨＯ細胞で発現され、Shukia, A et al, (2007) J Chromatogr B Anafyt Techno! Biomed Life Sci 848, 28-39に記載の標準的方法に従って精製された。Ｖａｌ−ＣｉｔモノメチルアウリスタチンＥ（ｖｃＭＭＡＥ）又はマレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンＦ（ｍｃＭＭＡＦ）へのｍＡｂシステイン残基の結合は、Sun, M. et al, (2005) Bioconjug Chem 16, 1282-1290で確立された方法に従って行われた。抗体は、１００μｇの抗体又はＡＤＣ当たり１μｌのＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs, Ipswich, MA）を加えて脱グリコシル化し、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。
【０１７９】
実施例１
ＳＥＣ−ＭＳクロマトグラフィー
ｍＡｂとＡＤＣを、大きさが２．１×２００ｍｍで、３００Å孔を有する５ミクロン粒子を含むポリヒドロキシエチル−Ａカラム（PolyLC, Columbia, MD）で分離させた。カラムを、非変性質量分析のために２００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５〜７．０）で、又は変性質量分析（対照）のために３０％アセトニトリル、０．２％ギ酸で平衡化させた。実験中流速を０．１ｍｌ／分に維持し、ｍＡｂ又はＡＤＣは３．５〜４．５分で溶出された。ｍＡｂとＡＤＣの溶出後、流れと緩衝液組成を維持し、総サイクル時間は、実験当たり１０分であった。
【０１８０】
質量分析法
ｍＡｂとＡＤＣの質量分析データは、Agilent 6510 Q-TOF（Agilent, Santa Clara, CA）で陽性ＥＳＩモードで１０００〜８０００ｍ／ｚの範囲で得られた。乾燥ガス温度は３５０℃であり、乾燥ガスの流速とネブライザーガスのガス圧は、それぞれ１２Ｌ／時間と３５ｐｓｉであった。キャピラリー電圧、フラグメンター電圧、および八重極ＲＦ電圧は、それぞれ５０００、４５０、及び３５０に設定された。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンＢ．０３．０１内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性電荷質量スペクトルに変換した。
【０１８１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ｖｃＭＭＡＥとｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣは、McDonagh, C.F. et al., (2006) Protein Eng Des Sel 19, 299-307に記載された方法に従ってＨＩＣにより分離された。薬物搭載分子種の定量は、２８０ｎｍでのＵＶ積分により測定された。図６では、ＨＩＣデータは、本明細書に記載のインタクト質量データから、ＡＤＣＭＲ０〜８の相対的パーセントの比較として使用される。
【０１８２】
図６以外に、表１は、個々の薬物搭載分子種のＭＲについてのイオン面積とＨＩＣ  ＵＶ面積値とを示す。
【表１】
2018063265.tif 000003
【０１８３】
３０％アセトニトリル、０．２％ギ酸の存在下で脱塩された対照ｍＡｂ試料から得られた生ＭＳデータと、ｍＡｂ／酢酸アンモニウム脱塩試料の比較は、前者の条件が、電荷エンベロープにより証明されるように、抗体を完全に変性させる（これは、２０００〜４０００ｍ／ｚで観察された）ことを示し、一方、酢酸アンモニウム脱塩は、４８００〜６８００ｍ／ｚで観察される電荷エンベロープ（それぞれ図２のパネルＡとＢ）を与えた。変性抗体が明らかである領域であるパネルＢ中の２００〜３５００ｍ／ｚで明らかなイオンは、脱グリコシル化のために使用されたＰＮＧａｓｅＦと非イオン性界面活性剤ツイーン８０の存在のためである。いずれかの方法により測定された抗体のデコンボリューションされたＭＳは、理論値の１０ｐｐｍ以内であった（図２、パネルＣとＤ）。
【０１８４】
上記のｍＡｂ−ＡのｍｃＭＭＡＦコンジュゲートはまた、変性及び非変性クロマトグラフィー脱塩法を使用して分析された。３０％アセトニトリル、０．２％ギ酸の存在下でのＡＤＣの脱塩は、１５００〜４０００ｍ／ｚの電荷エンベロープを与えた（図３、パネルＡ）。デコンボリューションされたＭＳは、薬物結合抗体断片（１つの薬物を有する１ＬＣ、２つの薬物を有する１ＬＣ１ＨＣ、２つの薬物を有する２ＨＣ、及び１つの薬物を有する１ＬＣ２、および０個の薬物を有する２ＬＣ２ＨＣを含む）で占められた（図３、パネルＣ）。対照条件は、インタクトＡＤＣ−Ａの存在の証拠を示さなかった。酢酸アンモニウム脱塩ＡＤＣ−Ａ  ＭＳ中の同じｍ／ｚ領域（図３、パネルＢ）もまたデコンボリューションされ、ＡＤＣの観察された断片化ははるかに小さく、１つの薬物を有する１ＬＣと２つの薬物を有する１ＬＣ１ＨＣのみが観察された（図３、パネルＤ）。ＡＤＣ−Ａの多重荷電されたイオンは、酢酸アンモニウム脱塩試料についての生データでのみ観察され、図３、パネルＢで括弧で示した領域に示される。
【０１８５】
本明細書で上記した同じ酢酸アンモニウム脱塩法によるｍｃＭＭＡＦとｖｃＭＭＡＥ  ＡＤＣの分析は、０〜８個の薬物の取り込みを有するｍＡｂに一致する質量を有する分子種の分布を与えた。ｍｃＭＭＡＦコンジュゲートＡＤＣ−Ａと親物質（ｍＡｂ−Ａ）のインタクト質量スペクトルは図４に示される。個々の薬物搭載分子種の相対的イオン強度は、デコンボリューションされた質量スペクトルに関連するイオン量から定量された。インタクト質量データからと直交法ＨＩＣとから測定されたＡＤＣ  ＭＲ０〜８の相対量の比較は、図６のパネルＡに示される。ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートＡＤＣ−Ｂと親物質（ｍＡｂ−Ｂ）の分析について同様の結果が得られ、図５に示される。インタクト質量データからとＨＩＣにより測定されたＡＤＣ  ＭＲ０〜８の相対量の比較は、図６のパネルＢに示される。
【０１８６】
実施例２
サイズ排除クロマトグラフィー
ＡＤＣ試料は、２重カラムＳＥＣによりオフラインで分析された。２５０Å孔を有する５μm粒子を充填した２つの７．８ｍｍ×３０ｃｍのＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh, JPN）は、直列に連結された。ＡＤＣ試料は、２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）からなる移動相を０．８ｍｌ／分の流速で使用して分離された。低波長で移動相の妨害性バックグランド吸収のために、２８０ｎｍでのＵＶ吸収が検出に使用された。
【０１８７】
ＡＤＣサブユニットの解離に対する脱塩法の作用は、脱塩カラムからＡＤＣを採取し、次に脱塩カラムから採取したＡＤＣ並びに脱塩前のＡＤＣを２重カラムＳＥＣにより分析することにより評価された。図７において、脱塩されたＡＤＣと対応する出発物質の２重ＳＥＣ分析からのクロマトグラムの比較は、脱塩法の結果としての解離の増加は無いことを示した。
【０１８８】
実施例３
実験
５０ｍＭ〜４００ｍＭの範囲の種々の塩濃度の酢酸アンモニウム緩衝液で、ＰＨＥＡ  ＳＥＣカラムを平衡化させた。脱グリコシル化したＡＤＣ−Ｂは、上記の移動相塩濃度で運転したＳＥＣ−ＭＳにより分析され、ＭＲ０〜ＭＲ８の相対レベルは、既に記載されているようにデコンボリューションされたイオン強度に基づいて定量された。
【０１８９】
結果
５０ｍＭの塩濃度では、ＭＲ２とＭＲ６のレベルは、すべての他の塩濃度で観察されるレベルと比較して、より高くおよびより低くなっているようである。これは、ＳＥＣ−ＭＳ移動相中の酢酸アンモニウムの濃度は、５０ｍＭより上でなければならないこと、及び１００〜４００ｍＭの移動相酢酸アンモニウム塩濃度は、相対的ＭＲ分布について大きく異なる結果を与えないことを示差するであろう。
【０１９０】
図８は、塩濃度が１００〜４００ｍＭである時、移動相中の酢酸アンモニウムの濃度を変化させても、個々の薬物搭載形態の相対的分布に影響を与えないことを例示する。
【０１９１】
実施例４
実験
ＡＤＣ−Ｃは、ｍｃ−ＭＭＡＦに結合したＩｇＧ１分子である。種々の薬物搭載形態は、ＨＩＣクロマトグラフィーにより分離され精製された（図９Ａ）。次に、精製された画分並びにＡＤＣ−Ｃ出発物質（ＨＩＣ分離前）は、既に記載されているようにＳＥＣ−ＭＳにより評価された（図９Ｂ）。
【０１９２】
結果
ＳＥＣ−ＭＳからの結果は、直交データ（還元された軽鎖と重鎖のＬＣＭＳ分離）に一致し、ピークＡ〜ＦがＡＤＣ−Ｃの種々の薬物搭載形態に対応することを示す（図９Ｂ）。ＨＩＣピークＣとＤは同じ名目質量を有し、その質量はＭＲ４分子種に一致する。１５００〜４０００の低ｍ／ｚ範囲の生データのデコンボリューション（図１０）は、２つの薬物を有する観察された薬物結合ＬＣ及びＨＣダイマーにより証明されるように、ピークＣが主に、抗体Ｆａｂ中に取り込まれる薬物を有するＭＲ４から構成されることを示す。ＨＩＣピークＤの同様の分析は、これが主に、２つの薬物を有する観察される共有結合性ＨＣ−ＬＣにより証明されるように、抗体ヒンジ中に取り込まれる薬物を有するＭＲ４から構成されることを示す。解離された抗体鎖の分析から得られる情報に基づいて、ＨＩＣによりピークＣとＤに分離されたＭＲ４位置異性体の本体を決定することができる。
【０１９３】
図９は、ＨＩＣ（パネルＡ）と、次にＳＥＣ−ＭＳ（パネルＢ）により採取された画分の分析による、ｍｃＭＭＡＦ  ＡＤＣの分離の性状解析の結果を示す。図１０において、ＨＩＣ分離からの個々の画分の分析は、ＡＤＣポリペプチド鎖上の薬物結合の位置が、ＳＥＣ−ＭＳを使用して解離された断片の質量により評価できることを示す。
【０１９４】
実施例５
マイクロフローＳＥＣ−ＭＳクロマトグラフィー
ＡＤＣは、３００Å孔を有する５ミクロン粒子を含有する０．３×１５０ｍｍの大きさのポリヒドロキシエチル−Ａカラム（PolyLC, Columbia, MD）を使用して分離された。カラムは、非変性質量分析用に、２００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５〜７．０）を用いて平衡化させた。カラムに投入された試料の量は、２．５μｇ〜５０ｎｇの範囲であった。ポジティブフィードバックマイクロフローＬＣコントローラーとＥＳＩマイクロフロー噴霧装置を使用して、２５分間の２００ｍＭ酢酸アンモニウムの均一溶媒勾配中、流速は１．０μｌ／分に維持されると、ＡＤＣ溶出が１５．５〜１９．５分に観察された。
【０１９５】
質量分析法
ＡＤＣの質量分析データは、Agilent 6510 Q-TOF（Agilent, Santa Clara, CA）を使用して陽性ＥＳＩモードで１０００〜８０００ｍ／ｚの範囲で得られた。乾燥ガス温度は３５０℃であり、乾燥ガスと流速とネブライザーガスのガス圧は、それぞれ５．０Ｌ／時間と１５ｐｓｉに設定された。それぞれ３０００ボルトと３００ボルトに設定されたキャピラリー電圧とスキマー電圧を含むマイクロフロー／マイクロＥＳＩインターフェースについて最適化されたものを除いて、すべての他のＭＳ設定は分析スケール実験と同じであった。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンＢ．０３．０１内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性質量単位に変換された。
【０１９６】
分析法と比較して、低流速は溶出時間を遅延させたが、検出限界は劇的に上昇し、すべての４つの薬物搭載分子種は、カラム上で５０ｎｇの脱グリコシル化ＡＤＣまで視覚化できた。例えば、５００ｎｇのＡＤＣ注入（図１１参照）では、ＭＲＤは分析シリカＳＥＣ法とＨＩＣ分析を使用して観察されるものに匹敵する。観察された質量正確度／質量誤差はまた、実質的に装置の規格より下である。
【０１９７】
実施例６
血漿安定性／ＡＤＣ親和性精製
ろ過した雌のＫ２ＥＤＴＡスプラーグドーレイ（Sprague-Dawley）ラットの血漿を、MabSelectとインキュベートして、内因性ＩｇＧを枯渇させた。ＩｇＧ欠損ラット血漿にＡＤＣを１ｍｇ／ｍｌで加え、アリコートを取り、３７℃で保存した。３７℃保存からアリコートを取り出し、指定に時点（０時間、６時間、１日、２日、４日、７日）に−８０℃に分析するまで保存した。次に、５００μｌの１ｍｇ／ｍｌのＡＤＣをMabSelectに結合させ、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１００μｌのＩｇＧ溶出緩衝液で溶出させ、１Ｍトリス（ｐＨ８）（１：１０ｖ／ｖ）で中和した。
【０１９８】
マイクロフローＳＥＣ−ＭＳクロマトグラフィー
ＡＤＣは、３００Å孔を有する５ミクロン粒子を含有する０．３×１５０ｍｍの大きさのポリヒドロキシエチル−Ａカラム（PolyLC, Columbia, MD）を使用して分離された。カラムは、非変性質量分析用に、２００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５〜７．０）を用いて平衡化させた。ポジティブフィードバックマイクロフローＬＣコントローラーとＥＳＩマイクロフロー噴霧装置を使用して、２００ｍＭ酢酸アンモニウムの均一溶媒勾配中８５分間、流速を１．０μｌ／分に維持すると、ＡＤＣ溶出が１５．５〜１９．５分に観察された。各採取のために、約１μｇのＡＤＣが注入された。
【０１９９】
質量分析測定
ＡＤＣの質量分析データは、Agilent 6510 QTOF（Agilent, Santa Clara, CA）を使用して陽性ＥＳＩモードで１０００〜８０００ｍ／ｚの範囲で得られた。乾燥ガス温度は３５０℃であり、乾燥ガスの流速とネブライザーガスのガス圧は、それぞれ５．０Ｌ／時間と１５ｐｓｉであった。それぞれ３０００ボルトと３００ボルトに設定されたキャピラリー電圧とスキマー電圧を含むマイクロフロー／マイクロＥＳＩインターフェースについて最適化されたものを除いて、すべての他のＭＳ設定は分析スケール実験と同じであった。生データは、MassHunterワークステーションソフトウェアバージョンＢ．０３．０１内で最大エントロピーデコンボリューションアルゴリズムを用いて中性質量単位に変換された。
【０２００】
生物学的汚染物質からの干渉を低下させるために、カラム再平衡化を、血漿から精製されたＡＤＣの各注入後１時間まで延長させた。これは、シグナル対ノイズとＡＤＣピークの解像度を上昇させた。０時点のデコンボリューションされたデータは、予測されるように、偶数搭載された分子種のみで観察される。インキュベーション時間が増加すると、奇数搭載された分子種が現れ、経時的に量が増加する（図１２参照）。インキュベーションの最初のＡＤＣピークは予測されるものであるが、経時的ピークのテーリングが増加する。これは、全体の試料の不均一性が増加するためである。特に、各薬物搭載部位は、逆Michal付加又はマレイミド環の開環を受けることと競合している。これは、還元質量分析を使用して確認されている。観察されるＭＲＤの経時的減少は、３７℃でのＩｇＧ欠損ラット血漿中の薬物の喪失を反映する。
【０２０１】
前述の発明は理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、当業者は、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施できることを理解するであろう。さらに各引用文献は、個別に参照により組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願と本明細書に提供される引用文献との間に矛盾が存在する場合には、本出願が優先するものとする。
【０２０２】
［１］  タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を検出するための方法であって、
（ａ）不揮発性塩を含まない揮発性塩中で、非共有結合した非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を提供する工程と、
（ｂ）該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析計に導入する工程と、
（ｃ）該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量を質量分析計により直接確立する工程と、を含む方法。
［２］
項目１に記載の方法であって、マトリックスから該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の分離を行うために、タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の非変性条件下で分離媒体を適用する工程をさらに含み、従って該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は実質的に変性していない、方法。
［３］
非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を分離媒体から溶出する工程をさらに含む、項目２に記載の方法。
［４］
該非変性条件は、質量分析法に適合性の揮発性ＳＥＣ緩衝液を含む、項目２に記載の方法。
［５］
該揮発性塩は、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムを含む、項目１に記載の方法。
［６］
該マトリックスは、不揮発性塩、界面活性剤、又は緩衝液をさらに含む、項目２に記載の方法。
［７］
タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の相対分布をデコンボリューションされたイオン強度により定量する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
［８］
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は抗体薬物コンジュゲートを含む、項目１に記載の方法。
［９］
該マトリックスは調合物を含む、項目２に記載の方法。
［１０］
該分離媒体はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む、項目２に記載の方法。
［１１］
該作用物質は、薬物、毒素、又は標識物を含む、項目３に記載の方法。
［１２］
該ＳＥＣは、シリカ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、又はポリヒドロキシエチル−アスパルトアミドカラムを含む、項目１０に記載の方法。
［１３］
該非変性条件は、５０℃以下の温度を含む、項目２に記載の方法。
［１４］
質量分析法はＥＳＩ−ＭＳで行われる、項目１に記載の方法。
［１５］
該揮発性塩の濃度は５０〜４００ｍＭである、項目１に記載の方法。
［１６］
該揮発性塩の濃度は５０ｍＭ〜１Ｍである、項目１に記載の方法。
［１７］
該溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は直ちに質量分析計に導入される、項目３に記載の方法。
［１８］
該溶出されたタンパク質作用物質コンジュゲート化合物は連続的に質量分析計に導入される、項目３に記載の方法。
［１９］
該分離媒体は非変性条件で行われるＨＩＣカラムを含む、項目２に記載の方法。
［２０］
該ＳＥＣはポリヒドロキシエチル−Ａカラムを含む、項目１２に記載の方法。
［２１］
該ＳＥＣカラムのサイズは、直径が０．１〜７．８であり、長さが１００〜３００ｍｍである、項目１２に記載の方法。
［２２］
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を脱グリコシル化試薬で処理する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
［２３］
該脱グリコシル化試薬はＰＮＧａｓｅＦを含む、項目２２に記載の方法。
［２４］
該脱グリコシル化剤は、エクソグリコシダーゼ酵素処理、エンドグリコシダーゼ処理、又はＮ−グリカン上の第１Ｎ−アセチルグルコサミン残基と第２Ｎ−アセチルグルコサミン残基との間を切断する酵素処理を含む、項目２２に記載の方法。
［２５］
該エクソグリコシダーゼ酵素処理は、シアリダーゼ又はベータガラクトシダーゼを含む、項目２４に記載の方法。
［２６］
Ｎ−グリカン上の第１Ｎ−アセチルグルコサミン残基と第２Ｎ−アセチルグルコサミン残基との間を切断する該酵素処理は、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｆ２、又はＦ３を含む、項目２４に記載の方法。
［２７］
該揮発性塩のｐＨは５．５〜７．０である、項目１に記載の方法。
［２８］
該非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物を質量分析法により定量する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
［２９］
該非変性タンパク質作用物質コンジュゲート化合物は、重鎖又は軽鎖抗体断片を含む、項目１に記載の方法。
［３０］
該重鎖又は軽鎖抗体断片は１つ以上の薬物をさらに含む、項目２９に記載の方法。
［３１］
該抗体薬物コンジュゲートの抗体は抗体断片を含む、項目８に記載の方法。
［３２］
該抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、又は１本鎖抗体分子から選択される、項目３１に記載の方法。
［３３］
該抗体は、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、又は抗ＣＤ７０抗体からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
［３４］
該抗体薬物コンジュゲートの抗体はヒト化抗体である、項目８に記載の方法。
［３５］
該薬物はマイタンシノイドである、項目１１に記載の方法。
［３６］
該薬物はアウリスタチンである、項目１１に記載の方法。
［３７］
該薬物はＭＭＡＥである、項目１１に記載の方法。
［３８］
該薬物はＭＭＡＦである、項目１１に記載の方法。
［３９］
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は７．５Ｄａ以内で測定される、項目１に記載の方法。
［４０］
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は２５Ｄａ以内で測定される、項目１に記載の方法。
［４１］
該タンパク質作用物質コンジュゲート化合物の質量は、理論値の１００ｐｐｍ以内で測定される、項目１に記載の方法。
［４２］
項目１に記載の方法を実施するように構成されたシステム。
［４３］
該システムは質量分析計を含む、項目４２に記載のシステム。
【図１】
2018063265.tif 000004
【図２】
2018063265.tif 000005
【図３】
2018063265.tif 000006
【図４】
2018063265.tif 000007
【図５】
2018063265.tif 000008
【図６】
2018063265.tif 000009
【図７】
2018063265.tif 000010
【図８】
2018063265.tif 000011
【図９】
2018063265.tif 000012
【図１０】
2018063265.tif 000013
【図１１】
2018063265.tif 000014
【図１２】
2018063265.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月13日(2018.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物中の抗体作用物質コンジュゲート化合物の分布を定量するための方法であって、
（ａ）マトリックス中の前記混合物を、移動相を伴う非変性条件下で分離媒体に提供して、前記混合物から前記マトリックスを除去し、そして溶出物を生成し；
（ｂ）前記溶出物を質量分析に導入し；
（ｃ）デコンボリューションされた質量スペクトルから、抗体作用物質コンジュゲート化合物の各種についての質量及びイオン強度を直接決定し；そして
（ｄ）抗体作用物質コンジュゲート化合物の分布を、イオン強度により定量する
を含み、ここで抗体作用物質コンジュゲート化合物の各種が、還元型鎖内ジスルフィドに結合された１〜８の作用物質部分を有し、非共有結合性かつ非変性であり、そしてインタクトの二価抗体構造を維持し、そして移動相が、揮発性の塩を含み、非揮発性の塩を含まず、かつ質量分析との使用に適合している、前記方法。
【請求項２】
前記混合物が、コンジュゲートされていない抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が、抗体作用物質コンジュゲート化合物の各種のイオン強度を、混合物の総イオン強度と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
混合物の作用物質ロード量を定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記揮発性塩が、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記揮発性塩の濃度が、５０〜４００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記揮発性塩の濃度が、５０ｍＭ〜１Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記揮発性塩のｐＨが、５．５〜７．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マトリックスが、非揮発性塩、界面活性剤、又は緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記マトリックスが、製剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離媒体が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＥＣが、シリカ、ポリスチレン−ジビニリルベンゼン又はポリヒドロキシエチル―アスパルトアミドカラムを含む、請求項１１に気試合の方法。
【請求項１３】
前記ＳＥＣが、ポリヒドロキシエチル−Ａカラムを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＥＣカラムサイズが、０．１〜７．８ｍｍ内径及び１００〜３００ｍｍ庁である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離媒体が、ＨＩＣカラムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非変性条件が、５０°以下の温度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
質量分析を、ＥＳＩ−ＭＳで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶出液を、質量分析器に即座に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出液を、連続して質量分析器に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
混合物を、脱グリコシル化試薬で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記脱グリコシル化試薬が、ＰＮＧａｓｅＦを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記脱グリコシル化試薬が、エキソグリコシダーゼ酵素処理、エンドグリコシダーゼ処理、又はＮ−グリカンの１番目と及び２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基間をを切断する酵素処理を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記エキソグリコシダーゼ酵素処理が、シアリダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｎ−グリカンの１番目と２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基間を切断する酵素処理が、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、Ｆ２又はＦ３を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗体作用物質コンジュゲート化合物の各種が、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、及び抗ＣＤ７０抗体からなる群から選ばれる抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
抗体作用物質コンジュゲート化合物の各種が、ヒト化抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記作用物質が、マイタンシノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用物質が、オーリスタチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤が、ＭＭＡＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤が、ＭＭＡＦである、請求項１に記載の方法。