(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中のアミノ酸を高感度かつ高精度に分析することができる分析方法を提供する。【解決手段】特定の式で表される化合物を試料に添加し誘導体化アミノ酸を形成すること、および、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出することを含む、アミノ酸の分析方法；特定の式で表される化合物を含むアミノ酸分析用誘導体化剤；および誘導体化剤を含むアミノ酸分析用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2018163155.tif 000037
（一般式（１）中、Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化２】
2018163155.tif 000038
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を試料に添加し誘導体化アミノ酸を形成すること、および、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出することを含む、アミノ酸の分析方法。
【請求項２】
Ｒ1は、式（７）、（８）または（９）：
【化３】
2018163155.tif 000039
（一般式（７）中、Ｒ4は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ2は、式（２）〜（４）のいずれか：
【化４】
2018163155.tif 000040
で表される基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃは、不斉炭素原子Ｃ*である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
一般式（１）で表される化合物はＲ体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
【化５】
2018163155.tif 000041
で表される化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
検出される誘導体化アミノ酸は、少なくとも１つの誘導体化Ｄ−アミノ酸および少なくとも１つの誘導体化Ｌ−アミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１〜１００種類の誘導体化アミノ酸を検出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
誘導体化アミノ酸は、一般式（１４）または（１５）：
【化６】
2018163155.tif 000042
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を示す。
一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を示す。）
で表される化合物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分離が、クロマトグラフィー法、電気泳動法、またはイオン移動度分光法により行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
分離が、疎水性カラムを用いた液体クロマトグラフィー法により行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
分離および検出は、液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法により行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で使用される移動相のｐＨが７〜１２である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
移動相のｐＨが８〜９．５である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料に一般式（１）で表される化合物を添加する前に内標準物質を添加することを更に含み、Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量の、Ｌ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比が、１００／１〜１／１００である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
試料は、生物学的試料である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料は、血液、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、髄液、組織、羊水、乳汁、子宮液、卵胞液、細胞、核酸溶液、微生物懸濁液、食品および飼料からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一般式（１）：
【化７】
2018163155.tif 000043
（一般式（１）中、Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化８】
2018163155.tif 000044
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を含む、アミノ酸分析用誘導体化剤。
【請求項１９】
Ｒ1は、式（７）、（８）または（９）：
【化９】
2018163155.tif 000045
（一般式（７）中、Ｒ4は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、請求項１８に記載の剤。
【請求項２０】
Ｒ2は、式（２）〜（４）のいずれか：
【化１０】
2018163155.tif 000046
で表される基である、請求項１８または１９に記載の剤。
【請求項２１】
一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
【化１１】
2018163155.tif 000047
である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の剤と、内標準物質とを含む、アミノ酸分析用キット。
【請求項２３】
一般式（１４）：
【化１２】
2018163155.tif 000048
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化１３】
2018163155.tif 000049
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。
【請求項２４】
一般式（１５）：
【化１４】
2018163155.tif 000050
（一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化１５】
2018163155.tif 000051
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中にはＬ−アミノ酸の他にＤ−アミノ酸が含まれているが、Ｄ−アミノ酸の量はＬ−アミノ酸の量と比べて非常に微量であることが知られている。従来、生体試料中のＤ−アミノ酸等のアミノ酸を分析する方法として、二次元蛍光ＨＰＬＣ法（特許文献１および非特許文献１）、およびプレカラム誘導体化液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献２および３）、アミノ酸を誘導体化せずにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で分析する方法（非誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法：非特許文献４）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４２９１６２８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈａｍａｓｅ  Ｋ，Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ａ，Ｏｈｇｕｓｕ  Ｔ，Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｗ，Ｚａｉｔｓｕ  Ｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ａｌｉｐｈａｔｉｃ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ｌｏｏｐ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏｌｕｍｎ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ２００７；１１４３：１０５−１１．
【非特許文献２】Ｖｉｓｓｅｒ  ＷＦ，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ−Ｄｕｉｆ  ＮＭ，Ｏｐｈｏｆｆ  Ｒ，Ｂａｋｋｅｒ  Ｓ，Ｋｌｏｍｐ  ＬＷ，Ｂｅｒｇｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ−ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ２０１１；１２１８：７１３０−６．
【非特許文献３】Ｍｉｎ  ＪＺ，Ｈａｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｙｕ  ＨＦ，Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｔ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｓ，Ｔｏｙｏ’ｏｋａ  Ｔ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＬ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒ（−）−４−（３−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−７−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ，ｉｎ  ｎａｉｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０１１；８７９：３２２０−８．
【非特許文献４】Ｎａｋａｎｏ  Ｙ，Ｋｏｎｙａ  Ｙ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｆｕｋｕｓａｋｉ  Ｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｃｅ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１７；１２３：１３４−１３８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
二次元蛍光ＨＰＬＣ法は、蛍光検出であるため選択性が劣ること、および分析に長時間を要することが課題である。また、生体試料中のＤ−アミノ酸を二次元蛍光ＨＰＬＣ法で定量する場合、アミノ酸安定同位体などでの回収率補正ができない点および微量のＤ−アミノ酸量を正確に特定できない点も大きな課題である。
【０００６】
プレカラム誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、ＵＶ検出用や蛍光検出用として過去に開発された既存の誘導体化試薬を質量分析計に適用したものであり、質量分析計での検出用に最適化された誘導体化試薬ではない。そのため、生体試料中の微量なＤ−アミノ酸を検出するのに感度が不十分であることが課題であった。また、試料がＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を含む場合、Ｌ−アミノ酸の次にＤ−アミノ酸を溶出する場合が多く、クロマトグラムにおいて微量なＤ−アミノ酸の小さなピークがＬ−アミノ酸の大きなピークの裾に埋もれ、Ｄ−アミノ酸を正確に定量することが困難となり、分析が不可能となるＤ−アミノ酸もある（例えば、図１）。また、非特許文献２の試薬では試薬の構造に分析対象のアミノ酸であるフェニルアラニンの構造が含まれており、試薬由来のフェニルアラニンが分析試料中のフェニルアラニンの定量を妨害してしまい、フェニルアラニンの定量ができないという課題がある。
【０００７】
非誘導体化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、アミノ酸を誘導体化しないため、選択性と感度が劣り、生体試料中の微量なＤ−アミノ酸まで分析することが困難であった。
【０００８】
また、上記先行技術を用いて同一分析条件で複数のアミノ酸を一斉分析する際、分析できるアミノ酸の種類が限られており、すべてのＤ−アミノ酸を測定する際には移動相の条件、カラム等を測定するアミノ酸に応じてそれぞれ変更する必要が生じるという課題があった。
【０００９】
本発明は、生体試料中のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を、その種類、含量の多少に拘らず高感度かつ高精度に分析することができるアミノ酸の分析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
〔１〕一般式（１）：
【化１】
2018163155.tif 000002
（一般式（１）中、Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化２】
2018163155.tif 000003
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を試料に添加し誘導体化アミノ酸を形成すること、および、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出することを含む、アミノ酸の分析方法。
〔２〕Ｒ1は、式（７）、（８）または（９）：
【化３】
2018163155.tif 000004
（一般式（７）中、Ｒ4は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、〔１〕記載の方法。
〔３〕Ｒ2は、式（２）〜（４）のいずれか：
【化４】
2018163155.tif 000005
で表される基である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕Ｃは、不斉炭素原子Ｃ*である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕一般式（１）で表される化合物はＲ体である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
【化５】
2018163155.tif 000006
で表される化合物である、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕検出される誘導体化アミノ酸は、少なくとも１つの誘導体化Ｄ−アミノ酸および少なくとも１つの誘導体化Ｌ−アミノ酸を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕１〜１００種類の誘導体化アミノ酸を検出する、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕検出される誘導体化アミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸の誘導体化アミノ酸である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕誘導体化アミノ酸は、一般式（１４）または（１５）：
【化６】
2018163155.tif 000007
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を示す。
一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を示す。）
で表される化合物である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕分離が、クロマトグラフィー法、電気泳動法、またはイオン移動度分光法により行われる、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕分離が、疎水性カラムを用いた液体クロマトグラフィー法により行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕分離および検出は、液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法により行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕液体クロマトグラフィー質量分析法または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で使用される移動相のｐＨが７〜１２である〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕移動相のｐＨが８〜９．５である〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕検出は、内標準に基づく補正を含む、〔９〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１７〕試料に一般式（１）で表される化合物を添加する前に内標準物質を添加する、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量の、Ｌ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比が、１００／１〜１／１００である、〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕試料は、生物学的試料である〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２０〕生物学的試料は、血液、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、髄液、組織、羊水、乳汁、子宮液、卵胞液、細胞、核酸溶液、微生物懸濁液、食品および飼料からなる群から選択される、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕血液は、全血、血清および血漿からなる群から選択される、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕一般式（１）：
【化７】
2018163155.tif 000008
（一般式（１）中、Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基であり、Ｘは酸素原子または硫黄原子を示し、Ｃは炭素原子を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化８】
2018163155.tif 000009
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される化合物を含む、アミノ酸分析用誘導体化剤。
〔２３〕Ｒ1は、式（７）、（８）または（９）：
【化９】
2018163155.tif 000010
（一般式（７）中、Ｒ4は、ハロゲン原子を示す。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示す。）
で表される基、もしくはハロゲン原子である、〔２２〕に記載の剤。
〔２４〕Ｒ2は、式（２）〜（４）のいずれか：
【化１０】
2018163155.tif 000011
で表される基である、〔２２〕または〔２３〕に記載の剤。
〔２５〕一般式（１）で表される化合物は、下記式（１０）、（１１）、（１２）または（１３）：
【化１１】
2018163155.tif 000012
である〔２２〕〜〔２４〕のいずれか１項に記載の剤。
〔２６〕〔２２〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載の剤と、内標準物質とを含む、アミノ酸分析用キット。
〔２７〕一般式（１４）：
【化１２】
2018163155.tif 000013
（一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示し、Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示し、ｎ２は１以上の整数を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化１３】
2018163155.tif 000014
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。
〔２８〕一般式（１５）：
【化１４】
2018163155.tif 000015
（一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示し、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）：
【化１５】
2018163155.tif 000016
（一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。）
で表される基を示し、
Ｒ3は、アルキル基または水素原子である。）
で表される誘導体化アミノ酸。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、生体試料中のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を、その種類、含量の多少に拘らず高感度かつ高精度に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、非特許文献２のアミノ酸分析法により得られるＤ，Ｌ−アミノ酸の抽出マスクロマトグラムである。
【図２】図２は、実施例１にて得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。
【図３】図３は、実施例１にて得られたヒト血漿中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例１にて得られたヒト血漿中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１にて得られたヒト糞便中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例１にて得られたヒト糞便中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例４で得られたラット組織中のＤ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例４で得られたラット組織中のＬ−アミノ酸濃度を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例９で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、実施例１０で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、実施例１１で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液濃度０．５μＭ）のピークエリア値である。
【図１２】図１２は、実施例１１で得られた誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液濃度１．０μＭ）のピークエリア値である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「試料」とは、任意の試料であり、例えば、生物由来の生物学的試料、ならびに有機合成反応により得られる合成試料、天然環境中に存在する環境試料などの非生物学的試料が挙げられる。生物学的試料が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類、昆虫、軟体動物等の動物、微生物、菌類、植物が挙げられるが、好ましくは哺乳動物である。生物学的試料の種類としては、例えば、血液試料（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、糞便、胆汁、汗、涙、髄液（例、脳脊髄液、関節髄液）、組織（例、角層、上皮、真皮等の皮膚組織、神経組織、筋肉組織、消化管上皮）、羊水、乳汁、子宮液、卵胞液、細胞（例、細胞抽出液、細胞懸濁液、細胞溶解液）、核酸溶液、および微生物懸濁液等が挙げられる。生物学的試料は、生体から単離されている試料が好ましい。また、生物学的試料としては、例えば、食品および飼料（例、卵、精肉、魚介、果実、野菜、豆類、それらの加工品、乳製品）も挙げられる。合成試料としては、例えば、アミノ酸を生じる有機合成反応により得られる反応生成物が挙げられる。環境試料としては、例えば、土壌、岩石、隕石、海水、淡水、工業用水由来等の試料が挙げられる。本発明の分析対象としての試料は、これらのうち生物学的試料が好ましい。
【００１４】
本明細書において「アミノ酸」とは、通常は遊離アミノ酸であり、例えば、α−アミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、アロトレオニン、アロイソロイシン、ホモセリン、ホモアルギニン、ホモシステイン、シトルリン、セレノシステイン、オルニチン、ピロリシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、α−アミノ酪酸、チロキシン、ドーパ、ホスホセリン、２−フェニルグリシン、テアニン、カイニン酸、イボテン酸、トリコロミン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、２−アミノ−４−ブロモ酪酸、２−アリルグリシン、２−シクロヘキシルグリシン、シスチン）、β−アミノ酸（例、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、３−アミノイソ酪酸、３−アミノ酪酸、２−アミノシクロヘキサンカルボン酸、β−フェニルアラニン、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例、スタチン、３−アミノシクロヘキサンカルボン酸）が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法は、以下の誘導体化工程、分離および検出工程を含む。これにより、試料中のアミノ酸の分析が可能である。試料中のアミノ酸の分析としては、例えば、試料中の少なくとも１つのアミノ酸の有無、試料中の少なくとも１つのアミノ酸の定量、試料中の２以上のアミノ酸の組成の確認、試料中のアミノ酸の鏡像異性体の比率（Ｌ−アミノ酸の量／Ｄ−アミノ酸の量）の確認、試料中のバイオマーカーとしてのアミノ酸の組成の確認による罹患または罹患リスクの確認、試料中のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸組成の確認等が挙げられる。
【００１６】
（誘導体化工程）
本工程においては、試料にまず、以下の一般式（１）で表される化合物を添加し誘導体化アミノ酸を形成する。一般式（１）で表される化合物は、その構造中に非天然アミノ酸の構造を有し得るため、一般式（１）で表される化合物を用いることにより、試料中のアミノ酸の分析を、試薬由来のアミノ酸による妨害を受けずに行うことができ、高感度かつ高精度の分析が可能である。
【化１６】
2018163155.tif 000017
【００１７】
一般式（１）中、Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と反応する基を示す。なお、ここでいう「アミノ基と反応する基」とは、一般式（１）中のＣ＝Ｘ結合の炭素原子にアミノ基が付加することで脱離する脱離基を言う。Ｒ1は、アミノ基以外の基（例えば、チオール等の、アミノ酸が有することがあるアミノ基以外の基）と反応してもよく、反応することが好ましい。Ｒ1は、アミノ酸が有する少なくとも１つのアミノ基と温和な条件で反応することが好ましい。これにより、反応時の長時間加熱を省略できるので、反応中のアミノ酸のラセミ化を抑制することができる。Ｒ1は、以下の式（７）、（８）または（９）で示される基、もしくはハロゲン原子が好ましい。
【化１７】
2018163155.tif 000018
【００１８】
一般式（７）中、Ｒ4は、それぞれ独立して、ハロゲン原子を示す。Ｒ4の少なくとも１つがフッ素原子であることが好ましく、すべてのＲ4がフッ素原子であることが好ましい。
一般式（９）中、ｎ１は、１以上の整数を示し、１〜５の整数が好ましい。
Ｒ1としてのハロゲン原子は、塩素原子または臭素原子が好ましい。
【００１９】
一般式（１）中、Ｘは、酸素原子または硫黄原子を示す。
【００２０】
一般式（１）中、Ｒ2は、一般式（２１）、（２２）または（２３）で表される基である。
【化１８】
2018163155.tif 000019
【００２１】
一般式（２１）中、Ｒ7は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ7は、窒素原子である。Ｒ7のうちの１つが窒素原子であることが好ましい。
一般式（２２）中、Ｒ9は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子であり、少なくとも１つのＲ9は、窒素原子である。Ｒ9のうちの１つが窒素原子であることが好ましい。
一般式（２３）中、Ｒ10は、それぞれ独立して炭素原子または窒素原子である。Ｒ10に結合する水素原子は、極性基で置換されていてもよい。これにより、誘導体化アミノ酸のイオン化が促進され得る。極性基は、溶液中で容易にイオン化する極性基が好ましく、一般にイオン交換基と称される置換基でもよい。極性基としては例えば、アミノ基、アルキルアミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基、トリメチルアミノ基、トリエチルアミノ基等のトリアルキルアミノ基）、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基などが挙げられる。
【００２２】
Ｒ2は、式（２）〜（４）のいずれかで表される基であることが好ましい。
【化１９】
2018163155.tif 000020
【００２３】
一般式（１）中のＲ3は、アルキル基または水素原子である。アルキル基としては例えば、炭素原子数１〜４のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基もしくはｔ−ブチル基）が挙げられ、メチル基がより好ましい。
【００２４】
一般式（１）で表される化合物中のＣは、不斉炭素原子Ｃ*であることが好ましく、化合物はＲ体、すなわち以下の一般式（１´）で表されることが好ましい。これにより、試料中のＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸よりも先に溶出させることができ、Ｄ−アミノ酸のより正確な定量が可能となる点で好ましい。
【化２０】
2018163155.tif 000021
一般式（１´）中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を表す。
【００２５】
一般式（１）で表される化合物としては例えば、以下の式（１０）〜（１３）で表される化合物が例示され、これらのうち、式（１０）又は（１１）で表される化合物が好ましく、式（１１）で表される化合物がより好ましい。
【化２１】
2018163155.tif 000022
【００２６】
一般式（１）で表される化合物は、試料にアミノ酸が含まれる場合、そのアミノ酸と結合し、構造的に類似した他のアミノ酸と区別し得る誘導体化アミノ酸を形成することができる。形成される誘導体化アミノ酸は、イオン化しやすいことから、後の工程における定量が容易となる。また、試料中にＤ−アミノ酸とその鏡像異性体であるＬ−アミノ酸が含まれる場合、一般式（１）で表される化合物は、それらから各誘導体化アミノ酸を形成するが、各誘導体化アミノ酸は、以下説明するように下記の分離および検出工程において容易に定量可能である。すなわち、同一のクロマトグラム上における誘導体化Ｄ−アミノ酸と誘導体化Ｌ−アミノ酸の溶出順は、前者の方が先となり得るため、Ｄ−アミノ酸のピークとＬ−アミノ酸のピークとの重なりを抑制し識別が容易となる。そのため、試料中のＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸と比べて微量の場合にも、Ｄ−アミノ酸の小さなピークがＬ−アミノ酸の大きなピークの裾に埋もれることを防ぐことができる。
【００２７】
試料は、先に定義した試料であればよく、アミノ酸の分析が望まれる試料であればよい。試料は、生物学的試料が好ましく、血液試料、糞便、皮膚組織が好ましい。試料は、一般式（１）で表される化合物を反応させる前に、前処理がなされていてもよい。前処理としては例えば、濾過、濃縮、酵素反応等が挙げられる。これにより、試料中のアミノ酸を高濃度含有する画分を得ることができ、この画分で更なる分析を行ってもよい。
【００２８】
試料に、一般式（１）で表される化合物を添加し、試料中のアミノ酸と一般式（１）で表される化合物を反応させることにより、誘導体化アミノ酸が形成される。一般式（１）で表される化合物の添加量、溶媒、温度、試薬等の反応条件は、誘導体化アミノ酸が形成される条件であればよく、特に限定されない。
【００２９】
誘導体化アミノ酸は、通常は、一般式（１４）または（１５）で表される化合物である。
【化２２】
2018163155.tif 000023
【００３０】
一般式（１４）中、Ｒ’、Ｒ’’は、それぞれ独立して、アミノ酸の側鎖を示す。Ｒ’’’は、水素原子、金属原子（例えば、Ｎａ，Ｋ，Ｍｇ）またはアルキル基（例えば、炭素原子数１〜６の直鎖または分岐アルキル基）を示す。ｎ２は１以上の整数を示す。ｎ２が２以上の整数の場合も、複数のＲ’およびＲ’’はそれぞれ独立である。Ｒ’、Ｒ’’から選ばれる少なくとも２つが互いに結合して環を形成していてもよい。Ｒ’、Ｒ’’の定義におけるアミノ酸は、以下の一般式（１６）で示される化合物である。一般式（１６）中のＲ’、Ｒ’’およびｎ２は、一般式（１４）のそれぞれと同じ意味を示す。
【化２３】
2018163155.tif 000024
【００３１】
一般式（１４）および（１６）におけるアミノ酸の側鎖としては、例えば、プロリン以外のタンパク質構成アミノ酸の側鎖が挙げられ、例えば、水素原子、窒素原子および酸素原子から選ばれる少なくとも１つを含有してもよい炭化水素基（アルキル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基）、ヒドロキシル基、アミノ基、ニトロ基、スルホ基、メルカプト基、カルボキシル基が挙げられる。アルキル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基は、それぞれを構成する水素原子の少なくとも１つが置換基（例えば、アルキル基、カルボキシル基、カルバモイル基、ヒドロキシル基、アルケニル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルチオ基、メルカプト基）で置換されていてもよい。アミノ酸の側鎖の具体例としては、水素原子、２−メチルブチル基、イソプロピル基、３−グアニジノプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、メルカプトメチル基、１Ｈ−イミダゾール−４−イル−メチル基、１−メチルプロピル基、４−アミノブチル基、メチルチオエチル基、ベンジル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、１Ｈ−インドール−４−イル−メチル基、ヒドロキシベンジル基が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’から選ばれる少なくとも２つが互いに結合して環を形成する場合の例としては、シクロヘキシル基を形成する場合が挙げられる。アミノ酸の側鎖の具体例は、さらに以下を含む：
ｎ２が１の場合（通常はα−アミノ酸）：Ｒ’、Ｒ’’とも水素原子の組み合わせ（グリシンの側鎖）；Ｒ’、Ｒ’’の一方が水素原子、もう一方が、メチル基（アラニンの側鎖）、２−メチルブチル基（ロイシンの側鎖）、イソプロピル基（バリンの側鎖）、３−グアニジノプロピル基（アルギニンの側鎖）、カルバモイルメチル基（アスパラギンの側鎖）、２−カルバモイルエチル基（グルタミンの側鎖）、カルボキシメチル基（アスパラギン酸の側鎖）、２−カルボキシエチル基（グルタミン酸の側鎖）、メルカプトメチル基（システインの側鎖）、１Ｈ−イミダゾール−４−イル−メチル基（ヒスチジンの側鎖）、１−メチルプロピル基（イソロイシンの側鎖）、４−アミノブチル基（リシンの側鎖）、２−（メチルチオ）エチル基（メチオニンの側鎖）、ベンジル基（フェニルアラニンの側鎖）、ヒドロキシメチル基（セリンの側鎖）、１−ヒドロキシエチル基（トレオニンの側鎖）、１Ｈ−インドール−３−イル−メチル基（トリプトファンの側鎖）、４−ヒドロキシベンジル基（チロシンの側鎖）；
ｎ２が２の場合（通常はβ−アミノ酸）：β位の炭素原子に結合するＲ’またはＲ’’がフェニル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の側鎖）；α位の炭素原子に結合するＲ’、Ｒ’’の一方がメチル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノイソ酪酸の側鎖）；β位の炭素原子に結合するＲ’、Ｒ’’の一方がメチル基、それ以外のＲ’およびＲ’’が水素原子（３−アミノ酪酸の側鎖）；α位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかおよびβ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかが互いに結合しシクロヘキシル基を形成し、それ以外の２つが水素原子（２−アミノシクロヘキサンカルボン酸の側鎖）；Ｒ’およびＲ’’はいずれも水素原子（β−アラニンの側鎖）；ならびに
ｎ２が３の場合（通常はγ−アミノ酸）：β位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’の一方がヒドロキシル基、γ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’の一方がイソブチル基、それら以外の４つが水素原子（スタチンの側鎖）、α位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかおよびγ位の炭素原子に結合するＲ’およびＲ’’のいずれかが互いに結合しシクロヘキシル基を形成し、それ以外の４つが水素原子（３−アミノシクロヘキサンカルボン酸の側鎖）。
【００３２】
Ｒ’’’は、水素原子、金属原子またはアルキル基を示す。Ｒ2およびＲ3は、前記と同じ意味を示す。ｎ２は、１以上の整数を示す。α−アミノ酸のｎ２は１であり、β−アミノ酸のｎ２は２であり、γ−アミノ酸のｎ２は３である。
【００３３】
一般式（１５）中、円は５員環または６員環を示す。プロリン以外のアミノ酸の誘導体化アミノ酸は、一般式（１４）で表される構造を示し、誘導体化プロリンは、一般式（１５）で表される構造を示す。
【００３４】
後述する分離および検出工程にて内標準（内部標準）による補正を行う場合、試料にあらかじめ内標準物質（内部標準物質）を添加してから一般式（１）で表される化合物を添加するか、または、試料に一般式（１）で表される化合物を添加して誘導体化アミノ酸を形成した後に、一般式（１）で表される化合物で標識された内標準を添加してもよく、前者が好ましい。内標準物質は、通常、分析対象であるアミノ酸の同位体である。アミノ酸の同位体としては、例えば、対象であるアミノ酸のアミノ酸構造中の、構造が類似するアミノ酸構造中の、または対象であるアミノ酸と保持時間（溶出時間）が近いアミノ酸構造中の、少なくとも１つの原子が2Ｈ（Ｄ）、13Ｃ、および15Ｎ等の安定同位体元素で置換されているアミノ酸安定同位体が挙げられる。
【００３５】
分析対象が２以上のアミノ酸である場合、各アミノ酸の内標準物質からなる内標準物質群が用いられる。分析対象がＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸である場合、Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量のＬ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比率は、通常は１００／１〜１／１００であり、好ましくは１／３〜１／１００であり、より好ましくは１／１０〜１／１００である。これにより、試料中のアミノ酸をより正確に定量できる。中でも、試料中の、鏡像異性体を構成するＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸とを分析する場合、それぞれのピークの溶出位置が明確に識別可能となる。
【００３６】
反応により得られた誘導体化アミノ酸を含む試料は、続く誘導体化アミノ酸の分離の前に、後処理に付されてもよい。後処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、アフィニティー処理、加熱、濃縮、希釈および凍結が挙げられる。
【００３７】
（分離および検出工程）
本工程においては、誘導体化アミノ酸を試料から分離し、分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸を検出する。
【００３８】
分離は、誘導体化アミノ酸を分離できる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、電気泳動法、イオン移動度分光法（例、イオンモビリティー）、沈殿、結晶化、膜分離等が挙げられ、クロマトグラフィー法、電気泳動法、またはイオン移動度分光法が好ましい。液体クロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が好ましい。これらの方法は、公知の方法により行うことができる。
【００３９】
分離は、液体クロマトグラフィーによることが好ましい。液体クロマトグラフィーとしては、例えば、固定相の極性が移動相の極性よりも高い分離系である順相液体クロマトグラフィー、および固定相の極性が移動相の極性よりも低い分離系である逆相液体クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）等が挙げられる。
【００４０】
順相液体クロマトグラフィーは、公知の方法により行うことができる。例えば、順相液体クロマトグラフィーは、シリカ、アルミナ等の固定相、ならびにヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、テトラヒドロフランおよびこれらの混合溶媒等の移動相を用いて行うことができる。順相液体クロマトグラフィーの中でも、親水性相互作用型カラムクロマトグラフィーが好ましい。
【００４１】
逆相液体クロマトグラフィーは、公知の方法により行うことができる。逆相液体クロマトグラフィーの固定相としては、例えば、疎水性化合物で修飾された充填剤が挙げられる。具体的には、逆相液体クロマトグラフィーの固定相としては、例えば、疎水性化合物で修飾されたシリカゲルが挙げられる。逆相液体クロマトグラフィーの移動相としては、例えば、有機溶媒、水溶液およびこれらの混合溶媒が挙げられる。有機溶媒としては例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。水溶液としては、例えば、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、アンモニア水、緩衝液等が挙げられる。また、イオンペア試薬を溶媒に追加してもよく、アルキルスルホン酸ナトリウムおよびその塩や、テトラアルキルアンモニウムまたはトリアルキルアミンおよびその塩などが用いられる。これによりピーク分離が悪い場合、分離能を向上させることができる。液体クロマトグラフィーにおいて、移動相を混合溶媒とする場合、混合比を段階的に変化させてもよく、連続的に変化させてもよい。液体クロマトグラフィーの温度条件、移動相流量は、誘導体化アミノ酸の性質等に応じて適宜設定され得る。
【００４２】
好ましくは、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーである。
【００４３】
分離はまた、疎水性カラムを用いて行われることが好ましい。疎水性カラムとは、固定相として疎水性充填材を用いたカラムを意味する。疎水性充填材としては、例えば、アルキル化合物（例、Ｃ１〜Ｃ４０化合物、アダマンチル基）や芳香族性化合物（例、ベンゼン、ナフタレン等のアリール化合物）で修飾された充填剤（例、シリカゲルまたはポリマー系の充填剤）が挙げられる。なお、これら修飾に関しては、充填剤表面と修飾基の間にリンカーを含んでもよい。
【００４４】
好ましくは、分離は、上記疎水性カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）により行われる。この場合、移動相としては、水溶液（例、水、ギ酸水溶液、ギ酸アンモニウム水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、酢酸水溶液、酢酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液、アンモニア水）と有機溶媒（例、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール）との混合溶媒を用いることができる。分離は、勾配条件により行うことができる。勾配条件として、先ず、水溶液の比率が有機溶媒の比率より高い混合溶媒を使用し、次いで、段階的または連続的に水溶液の比率を低下させることにより、水溶液の比率が有機溶媒の比率より低い混合溶媒を使用する条件を利用することができる。
【００４５】
分離において、誘導体化アミノ酸の保持時間は、適宜設定することができるが、本発明の方法によれば、誘導体化アミノ酸の保持時間を短時間に設定することが好ましい。これにより、アミノ酸の分析時間を短縮できる。保持時間は、特に限定されず、分析対象であるアミノ酸の種類、および本発明の方法の目的等に応じて適宜設定することができる。誘導体化アミノ酸の保持時間は、例えば、約１２０分以内、約９０分以内、約６０分以内、約５０分以内、約４０分以内、約３０分以内、約２０分以内、約１５分以内、または約１０分以内である。
【００４６】
分離された誘導体化アミノ酸のうち少なくとも１つの誘導体化アミノ酸の検出は、通常は質量分析法により行われる。
【００４７】
質量分析法は、特に限定されず、例えば、各種イオン化方法、各種イオン分離方法、各種検出器を組み合わせた質量分析法が挙げられる。
【００４８】
イオン化方法としては、例えば、電子イオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＩ）法、化学イオン化（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩ）法、高速原子衝撃（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰＰＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）法、ソフトレーザー脱離イオン化質量分析（Ｓｏｆｔ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＤＩ）法、脱離エレクトロスプレーイオン化（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＤＥＳＩ）法、探針エレクトロスプレーイオン化（Ｐｒｏｂｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＰＥＳＩ）法等が挙げられる。
【００４９】
イオン分離方法としては、例えば、磁場型質量分離方法、四重極型質量分離方法、イオントラップ型質量分離方法、飛行時間型質量分離方法、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離方法、電場型フーリエ変換型質量分析装置を用いたイオン分離方法が挙げられる。
【００５０】
検出器としては、例えば、二次電子増倍管、後段加速型検出器、チャンネルトロン、マルチチャンネルトロン、アレイ検出器、位置・時間分解型アレイ検出器、光電子増倍管等が挙げられる。
【００５１】
質量分析法は、負電荷を検出するネガティブモードで行われても、正電荷を検出するポジティブモードで行われてもよいが、好ましくは、正電荷を検出するポジティブモードで行われる。
【００５２】
質量分析法による検出は、１つの質量分離装置で行ってもよいし、直列につながれた２以上の質量分離装置を含む装置で行われてもよい。例えば、検出は、直列につながれた３つの質量分離装置を含む装置（例：三連四重極型質量分析計、四重極−飛行時間型質量分析計、四重極−キングドントラップ型質量分析計等）で行うことができる。検出を三連四重極型質量分析計により行う場合、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、プロダクトイオンスキャンモード、プリカーサーイオンスキャンモード、ニュートラルロススキャンモードのいずれの方法によっても行うことができる。さらに、質量分析装置の前に、イオンモビリティー分離機能を搭載した質量分析計を用いてもよい。
【００５３】
検出を三連四重極型質量分析計により行う場合、好ましくはＭＲＭ、より好ましくはＳｃｈｅｄｕｌｅｄ  ＭＲＭにより検出を行う。ここで、３つの四重極を、イオン源に近い方から、それぞれＱ１、Ｑ２、Ｑ３と名付けると、Ｑ１において、特定のイオンをプリカーサーイオンとして選択し、Ｑ２においてプリカーサーイオンを分解し、Ｑ３において、プリカーサーイオンの分解により生じたプロダクトイオンのうち特定のイオンを選択する。したがって、ＭＲＭにより検出を行うことにより、夾雑成分の影響を取り除いた検出を行うことができる。
検出の際には、少なくとも１つの誘導体化アミノ酸の検出感度を調整することが好ましく、少なくとも１つの誘導体化Ｌ−アミノ酸の検出感度を調整する（例えば、抑制する）ことがより好ましく、すべての誘導体化Ｌ−アミノ酸の検出感度を調整する（例えば、抑制する）ことがさらに好ましい。調整される誘導体化アミノ酸は、特に限定されないが、好ましくは、試料中の濃度が１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらに好ましくは１０００μＭ以上の、誘導体化Ｌ−アミノ酸を少なくとも１つ含むことが好ましい。生物学的試料中のＬ−アミノ酸の濃度は、一般に、Ｄ−アミノ酸の濃度に対し１００倍以上である。そのため、上記条件で検出することにより、高濃度側での検量線の直線性を確保することができ、高濃度のＬ−アミノ酸と低濃度のＤ−アミノ酸を同時に、より高感度かつ高精度に分析することができる。
前記調整は検出方法により適宜選択できるが、例えば検出をＭＲＭ又はＳＲＭにより行う場合、トランジッションの選択によればよい。例えば、Ｑ３において感度の悪いフラグメントイオンを選択すること（例：Ｄ−Ａｌａ（２９６／２０７）、Ｌ−Ａｌａ（２９６／９２．９））、Ｑ１において天然同位体のｍ＋１を選択すること（例、Ｄ−Ａｌａ（２９６／２０７）、Ｌ−Ａｌａ（２９７／２０７））が挙げられる。
【００５４】
検出の際は、内標準（内部標準）に基づく補正を行うことが好ましい。これにより、アミノ酸をより正確に定量することができる。内標準に基づく補正は、例えば、誘導体化アミノ酸の検出結果（実測値）を、試料に既定量添加された内標準の検出結果と比較して補正することにより実施される。
【００５５】
検出の際は、内標準に基づく補正以外の方法による補正を行ってもよい。このような補正方法としては、例えば、外標準に基づく補正が挙げられる。外標準に基づく補正を行うことにより、アミノ酸をより正確に定量することができる。外標準に基づく補正は、標準添加法に基づき行うことができる。外標準物質としては、検出したいアミノ酸の誘導体化アミノ酸であればよい。外標準物質は、通常、検出までの間にサンプルに所定濃度添加される。
【００５６】
分離および検出工程は、分離装置および検出装置を併用して、または１つの分離検出装置を用いて行うことができるが、１つの分離検出装置を用いて行うことが好ましい。これにより、短時間でアミノ酸を分析できる。１つの分離検出装置を用いる方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ法）、または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を利用することができる。
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ法）、または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を利用して分離および検出工程を行う場合は次のことが言える。
誘導体化工程の一般式（１）で表される化合物がＲ体である場合、移動相が酸性であると、Ｌ体が先に溶出し、Ｄ体のピークがＬ体のピークに埋もれてしまう場合がある。そのため、移動相のｐＨ値は、中性またはアルカリ性が好ましい。また、移動相がアルカリ性であると、ピークを高感度で検出し得るが、カラムの耐久性を保つためには、中性〜弱アルカリ性が好ましい。従って、移動相のｐＨ値は、７〜１２が好ましく、８〜１２がより好ましく、８〜９．５がさらにより好ましい。
【００５７】
検出対象である少なくとも１つの誘導体化アミノ酸は、分析が望まれるアミノ酸の誘導体であればよく、２つ以上の誘導体化アミノ酸が好ましい。検出対象である誘導体化アミノ酸の数の上限は特になく、１００種類でもよい。検出対象である誘導体化アミノ酸の数は、１〜１００種類であってもよい。誘導体化アミノ酸のアミノ酸としては、例えば、前述した具体例が挙げられ、このうち、タンパク質構成アミノ酸が好ましく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、およびプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸がより好ましい。検出対象である誘導体化アミノ酸は、キラル不斉炭素を有するアミノ酸（例えば、上記具体例のうちグリシン以外の１９種のアミノ酸）の誘導体が好ましく、そのＤ体およびＬ体のうち、Ｄ体が好ましい。上記具体例のうちグリシン以外の１９種のアミノ酸のうち、好ましくはプロリン以外の１８種のアミノ酸を構成するＤ体およびＬ体から選ばれる１種以上である。検出対象である少なくとも１つの誘導体化アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸の誘導体を含むことが好ましく、Ｄ−アミノ酸とその鏡像異性体であるＬ−アミノ酸の各誘導体の組み合わせを少なくとも１種含むことがより好ましい。
【００５８】
一般式（１）で表される化合物は、上述のように、アミノ酸分析用誘導体化剤として有用である。また、一般式（１）で表される化合物と、少なくとも１つの内標準物質とを含む分析キットは、上述の分析方法を実施するために用いられ得る。分析対象が２以上のアミノ酸である場合、分析キットには、各アミノ酸の内標準物質からなる内標準物質群が含まれ得る。分析対象がＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸である場合、Ｄ−アミノ酸の内標準物質の量のＬ−アミノ酸の内標準物質の量に対する比率は、通常は１００／１〜１／１００であり、好ましくは１／３〜１／１００であり、より好ましくは１／１０〜１／１００である。分析キットは、通常は外標準物質をさらに含む。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【００６０】
実施例１（ヒト血漿サンプル中のアミノ酸の分析）
サンプルの前処理（除タンパク質処理）
被験者より常法に従い採血し、血漿サンプルを調製した。
【００６１】
標準溶液またはヒト血漿サンプル２０μＬに、内標準物質（Ｄ，Ｌ−アミノ酸安定同位体混合溶液）を２０μＬ添加し、さらに、アセトニトリル４０μＬを加えて、ボルテックスで攪拌した後、遠心し（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）、上清を回収した。上清２０μＬを誘導体化に用いた。なお、標準溶液に用いるＤ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｄ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｄ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｄ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｄ−ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ、Ｄ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｄ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｄ−ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ、Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｄ−ｖａｌｉｎｅ、Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎはＳｉｇｍａ社から、Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄはＡｌｄｒｉｃｈ社から、Ｄ−ａｌｌｏ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｄ−ａｌｌｏ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅは東京化成工業社から、その他Ｌ−アミノ酸は和光純薬工業社から、それぞれ購入した。これらのＤ−アミノ酸の濃度が０．１μＭ、Ｌ−アミノ酸濃度が１μＭになるように標準溶液を調製した。
【００６２】
サンプルの（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
上清サンプル２０μＬとアミノタグワコー用ほう酸緩衝液２０μＬをボルテックスで攪拌した後、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬（（Ｒ）−Ｎ−（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）−β−（３−ｐｙｒｉｄｙｌ）−ａｌａｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ；５ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液として調製）を２０μＬ加えて室温で１０分間静置した。次に、０．１Ｍ塩酸水溶液を４０μＬ加えて攪拌したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析サンプルとした。
【００６３】
分析装置および分析条件は以下のとおりである。
【００６４】
（分析装置）
ＨＰＬＣシステム：Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２（島津製作所）
・デガッサー：ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒ
・ポンプ：ＬＣ−３０ＡＤ
・オートサンプラー：ＳＩＬ−３０ＡＣ  ＭＰ
・カラム恒温槽：ＣＴＯ−２０ＡＣ
・コミュニケーションバスモジュール：ＣＢＭ−２０Ａ
（ミキサー容量：２１．２μＬ）
質量分析計：Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ６５００（ＳＣＩＥＸ）
【００６５】
（ＨＰＬＣ分析条件）
ガードカラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＶａｎＧｕａｒｄ（２．１ｘ５ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００３９７５)
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（２．１ｘ１００ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００２３５２)
移動相Ａ：１０ｍＭ  重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）
移動相Ｂ：８０％メタノール／水
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表１のとおり
【００６６】
【表１】
2018163155.tif 000025
【００６７】
（質量分析計分析条件）
イオン化法：ＥＳＩ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：Ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  ＭＲＭ（Ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
スキャン条件：ＭＲＭ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ  ６０ｓｅｃ，Ｔａｒｇｅｔ  ｓｃａｎ  ｔｉｍｅ  ０．５ｓｅｃ
イオンソースパラメーター：ＣＵＲ４０，ＣＡＤ８，ＩＳ４５００，ＴＥＭ６００，ＧＳ１  ７０，ＧＳ２  ７０
データ解析：データの取得は付属ソフトであるＡｎａｌｙｓｔ  １．６．２（ＳＣＩＥＸ）を用い、解析はＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（ＳＣＩＥＸ）およびＥｘｃｅｌ  ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ)を用いて行った。
Ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  ＭＲＭ測定条件：表２のとおり
【００６８】
【表２】
2018163155.tif 000026
【００６９】
定量分析における各アミノ酸の内標準物質を表３に示す。Ｄ−アミノ酸の内標準物質の添加量は１μＭ、Ｌ−アミノ酸の内標準物質の添加量は１０μＭとした。
【００７０】
【表３】
2018163155.tif 000027
【００７１】
（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムを図２に示す。ヒト血漿中のＤ−アミノ酸濃度およびＬ−アミノ酸濃度をそれぞれ図３および４に示す。
【００７２】
図２〜４から明らかなとおり、各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しており、微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できていることが分かる。また、保持時間はいずれも２０分以内であり、また分析条件は共通であったことから、迅速にかつ正確に定量できたことが分かる。
【００７３】
実施例２（ヒト糞便中のアミノ酸分析）
血漿サンプルの代わりにヒト糞便サンプルを用いたこと、除タンパクに８０％メタノールを使用し、クロロホルムで脱脂処理をしたほかは、実施例１と同様に行った。ヒト糞便サンプルは、被験者１名より採取し抽出、除タンパク、脱脂処理したものを用いた。
【００７４】
ヒト糞便中のＤ−アミノ酸濃度およびＬ−アミノ酸濃度をそれぞれ図５および６に示す。図５〜６から明らかなとおり、実施例１の血漿の結果と同様、微量Ｄ−アミノ酸を正確に定量できたことが分かる。
【００７５】
実施例３（ヒト角層中のアミノ酸分析）
ヒト血漿サンプルの代わりにヒト角層サンプルを用いたこと、内標準による補正を行った場合と行わない場合の両方について分析を行ったこと、を除き、実施例１と同様に行った。ヒト角層サンプルは、以下のようにしてテープストリッピング法により調製した。被験者（全員女性、年齢構成：２０〜３０代  ３１名、４０〜６０代  ４０名：合計人数  ７１名）は洗顔した後、恒温恒湿室（湿度４０％、室温２０℃）にて２０分間馴化した。被験者の頬中央部に３ｃｍ×３ｃｍにカットしたテープを貼付し、角層を採取した。１回目に採取した最表層の角層は分析には利用せず、２回目または３回目を利用した。採取したテープは、コニカルチューブ（５０ｍｌ）に入れて密閉し、−８０℃にて保存した。  採取したテープ（角層）を９５％メチルアルコール水溶液を用いて超音波処理を２回繰り返し、水溶成分を抽出した。抽出液には内標準物質（Ｄ−ＡｒｇやＤ−Ａｓｐ等複数種のＤ，Ｌ−アミノ酸安定同位体を含む）を添加した。得られたメチルアルコール水溶液を、遠心エバポレーターで乾固し、ヒト角層サンプルとした。
【００７６】
Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸の角層抽出条件における添加回収率（添加濃度Ｄ−アミノ酸１μＭ、Ｌ−アミノ酸１０μＭ）を表４および５に示す。
【００７７】
【表４】
2018163155.tif 000028
【００７８】
【表５】
2018163155.tif 000029
【００７９】
表４および５の結果から、内標準による補正を行ったほうが補正を行わない場合よりもより正確なアミノ酸の定量が可能であることが分かる。
【００８０】
実施例４（ラット組織中のＤ−アミノ酸分析）
ラット組織（視床下部、海馬）は凍結粉砕したのち、１００倍量の８０％メタノール水溶液（内標準含有）で除タンパクした後、クロロホルムで脱脂したサンプルを、実施例１と同じ方法で分析した。結果を図７および８に示す。図７および８から明らかなとおり、各組織のＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸を各アミノ酸に共通の分析条件で定量することができ、微量アミノ酸も正確に定量することができることが分かる。
以上の実施例の結果は、本発明により生体試料中のアミノ酸を高感度かつ高精度に分析することができることを示している。
【００８１】
実施例５（式（１０）で表される化合物の合成）
窒素雰囲気下、Ｈ−Ｄ−３ＰｙｒＡｌａ−ＯＭｅ二塩酸塩１２５ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン５ｍＬに懸濁させ、氷冷にて、トリエチルアミン１５０μＬ（１．１ｍｍｏｌ）および炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）１４０ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温まで徐々に昇温させ、一晩撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮した後、（ＳｕＯ）ＣＯ−Ｄ−３ＰｙｒＡｌａ−ＯＭｅを含むサンプルを３５５ｍｇ、アモルファスとして得た。
【００８２】
実施例６（式（１２）で表される化合物の合成）
【化２４】
2018163155.tif 000030
【００８３】
５０ｍＬフラスコに１００ｍｇのＤ−２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｂａｃｈｅｍ製）をメタノール（和光純薬製）に懸濁させ、氷冷下約５分撹拌し、ＳＯＣｌ2（関東化学製、５０μＬ）をピペッターで滴下した。滴下後、無色透明の溶液となったのを確認し、室温下一晩反応させ、溶媒と過剰量の試薬を減圧下留去し、対応するアミノ酸メチルエステル２塩酸塩を得た。得られた塩酸塩は２０ｍＬの酢酸エチルに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約１０ｍＬにて３回、約１０ｍＬの飽和食塩水にて１回洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、フリーのＤ−２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌａｌａｎｉｎｅメチルエステル３５．２ｍｇを得た。得られた化合物はジクロロメタン（純正化学製、５ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル)（東京化成製）を３９．２ｍｇ加えて室温下反応させた。一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、黄色の目的物（Ｒ）−３−（２−Ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−Ａｌａｎｉｎｙｌ−Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｃａｒｂａｍａｔｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ８．１４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８３−７．７７（ｍ，１Ｈ），７．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，６．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．８，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，２Ｈ），４．９０−４．７６（ｍ，１Ｈ），３．７８−３．６７（ｍ，４Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ）．
【００８４】
実施例７（式（１３）で表される化合物の合成）
【化２５】
2018163155.tif 000031
Ｄ−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ塩酸塩（国産化学製、１．０ｇ）を２０ｍＬの酢酸エチルに懸濁させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約１０ｍＬにて３回、約１０ｍＬの飽和食塩水にて１回洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、Ｄ−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒのフリー体を得た。得られた化合物はジクロロメタン（純正化学製、１０ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（東京化成製）を１６９．５ｍｇ加えて室温下反応させた。一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、白色の目的物（Ｒ）−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ｎ’−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｃａｒｂａｍａｔｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ７．３８（ｍ，５Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ）．
【００８５】
実施例８（式（１１）で表される化合物の合成）
【化２６】
2018163155.tif 000032
Ｄ−３−Ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ製、３００ｍｇ）を陰イオン交換カラム（三菱化学製ＰＡ４０８）に通し、得られた溶液を凍結乾燥させ、得られた化合物から４８ｍｇとり、ジクロロメタン（純正化学製、１０ｍＬ）を加えて溶解させ、さらに炭酸ビス（ペンタフルオロフェニル）（東京化成製）を１０５ｍｇ加えて室温下反応させた。５分撹拌した後、溶媒を減圧留去し、白色の目的物（Ｒ）−３−Ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｙｌ−Ｎ’−Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｃａｒｂａｍａｔｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒを得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）：δ８．５３（ｄｄ，Ｊ＝４．９，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．４７−８．３２（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．９，５．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｄｔ，Ｊ＝７．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．８Ｈｚ，１Ｈ）.
【００８６】
実施例９（標準溶液中のアミノ酸の分析）
サンプルの前処理
各種Ｄ−アミノ酸濃度を１μＭ、各種L-アミノ酸の濃度を１０μＭに調整した以外は実施例１と同じ標準溶液を調製した。この標準溶液２０μＬに、内標準物質（Ｄ，Ｌ−アミノ酸安定同位体混合溶液）を２０μＬ添加し、さらに、アセトニトリル４０μＬを加えて、ボルテックスで攪拌した後、遠心し（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２０℃）、上清を回収した。上清２０μＬを誘導体化に用いた。
【００８７】
サンプルの（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
上清サンプル２０μＬとアミノタグワコー用ほう酸緩衝液２０μＬをボルテックスで攪拌した後、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬（（Ｒ）−３−ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｙｌ−Ｎ−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ；５ｍｇ／ｍＬのアセトニトリル溶液として調製）を２０μＬ加えて室温で１０分間静置した。次に、０．０５Ｍ塩酸水溶液を４０μＬ加えて攪拌したものをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析サンプルとした。
【００８８】
ＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである。なお、分析装置は、実施例１と同じ分析装置を用いた。また、質量分析計分析条件は、Ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  ＭＲＭ測定条件を表７のとおりに変更したこと以外は、実施例１と同じである。さらに、内標準物質は、実施例１と同じである。
【００８９】
（ＨＰＬＣ分析条件）
ガードカラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＶａｎＧｕａｒｄ（２．１ｘ５ｍｍ，１．７μｍ，Ｐ／Ｎ１８６００３９７５）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８  （２．１ｘ１５０ｍｍ，２μｍ）
移動相Ａ：１０ｍＭ  重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．８）
移動相Ｂ：８０％メタノール／水
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表６のとおり
【００９０】
【表６】
2018163155.tif 000033
【００９１】
【表７】
2018163155.tif 000034
【００９２】
上記に示す条件で測定した、（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ誘導体化Ｄ，Ｌ−アミノ酸（標準溶液）の抽出マスクロマトグラムを図９に示す。
【００９３】
図９から明らかなとおり、本分析条件の各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しており、微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できていることが分かる。また、実施例１と比較して、誘導体化試薬、カラム及び移動相条件の変更により、分離性能がより向上した分析方法であることが分かる。
【００９４】
実施例１０（標準溶液中のアミノ酸の分析：移動相ｐＨの評価）
サンプルの前処理および（Ｒ）−３ＰｙｒＡｌａ試薬による誘導体化
実施例９と同様にして行った。
【００９５】
ＨＰＬＣ分析条件は、以下のとおりである。なお、分析装置は、ＨＰＬＣにはＳｈｉｍａｄｚｕ  ２０Ａシリーズを、質量分析計にはＴｈｅｒｍｏ  ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＥＭＲを、それぞれ用いた。質量分析計分析条件は、実施例１と同じである。さらに、内標準物質は、実施例１と同じである。
【００９６】
（ＨＰＬＣ分析条件（ｉ））
ｐＨ  ９．５
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  （２．１ｘ１００ｍｍ，３．５μｍ）
移動相Ａ：１０ｍＭ  重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ  ９．５）
移動相Ｂ：９０％アセトニトリル／水
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表８のとおり
【００９７】
【表８】
2018163155.tif 000035
【００９８】
（ＨＰＬＣ分析条件（ｉｉ））
ｐＨ  ２．０
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  （２．１ｘ１００ｍｍ，３．５μｍ）
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液（ｐＨ  ２．０）
移動相Ｂ：６０％アセトニトリル／水
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
サンプル注入量：１μＬ
グラジエント条件：表９のとおり
【００９９】
【表９】
2018163155.tif 000036
【０１００】
移動相Ａの条件を、１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム（ｐＨ  ９．５）、０．１％ギ酸（ｐＨ  ２．０）で分析した際の抽出マスクロマトグラムを図１０に示す。
【０１０１】
図１０から明らかなとおり、移動相条件がｐＨ９．５のアルカリ性条件では、各抽出マスクロマトグラムにおいてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸よりも先に溶出しているのに対し、移動相条件がｐＨ２の酸性条件では、各抽出マスクロマトグラムにおいてＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸よりも先に溶出している。従って、アルカリ性の移動相条件において微量Ｄ−アミノ酸のピークがＬ−アミノ酸のピークの裾に埋もれず、正確に定量できることが分かる。
【０１０２】
実施例１１（標準溶液中のアミノ酸の分析：移動相ｐＨの検討）
実施例９において、以下の２点の変更のほかは同様にして標準溶液中のＤ−アミノ酸の分析を行った。第１に、ＨＰＬＣ分析条件における移動相Ａの組成を、それぞれ、２５ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４，５，６，８）、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０，９．０，９．５）に変更した。第２に、サンプルの各種Ｄ−アミノ酸の標準溶液濃度を１μＭ及び０．５μＭに変更した。
【０１０３】
標準溶液濃度０．５μＭのサンプルを使用した際のピークエリア値を図１１に示し、標準溶液濃度１．０μＭのサンプルを使用した際のピークエリア値を図１２に示す。
【０１０４】
図１１から明らかなとおり、各Ｄ−アミノ酸の検出ピークのエリア値は、酸性条件（ｐＨ４〜６）よりも塩基性条件（ｐＨ８）において高く、塩基性条件でより高感度に検出可能であることが分かる。図１２から明らかなとおり、塩基性条件（ｐＨ８．０〜９．５）においては、ピークエリア値の差はなく、同等の感度で検出されることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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