(57)【要約】      （修正有）【課題】胃癌患者の予後の検査方法を提供すること。【解決手段】（１）胃癌患者から取得した胃癌組織の癌浸潤最深部でのＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陽性であるか陰性であるかを測定する工程、（２）上記（１）の測定結果により、全て陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、及び、全て陰性カテゴリーのいずれか１のカテゴリーに属するかを選別する工程、を含む胃癌患者の予後の検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、胃癌患者の予後の検査方法；
（１）胃癌患者から取得した胃癌組織の癌浸潤最深部でのＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陽性であるか陰性であるかを測定する工程、
（２）上記（１）の測定結果により、全て陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、及び、全て陰性カテゴリーのいずれか１のカテゴリーに属するかを選別する工程。
【請求項２】
以下のように判定することを特徴とする請求項１に記載の検査方法。
（１）全て陽性カテゴリーに属する場合には最も予後不良であると判定する
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には２番目に予後不良であると判定する
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には３番目に予後不良であると判定する
（４）全て陰性カテゴリーに属する場合には予後良好であると判定する
【請求項３】
さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、リンパ管浸潤が陽性であると判定することを含む、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、血管浸潤が陽性であると判定することを含む、請求項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項５】
さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、浸潤深度がｐＴ３又はｐＴ４であると判定することを含む、請求項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項６】
さらに、ＣＤ４４ｓ陽性の場合には、腹膜性再発、リンパ性再発、及び／又は血行性再発を含むと判定することを含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項７】
さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定することを含む、請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項８】
さらに、ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定することを含む、請求項１〜７のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項９】
抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及びは抗ＣＤ４４ｖ９抗体を含む、胃癌患者の予後の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌患者の予後の検査方法及び胃癌患者の予後の検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（胃癌）
胃癌は、我が国で最も罹患率の高い悪性腫瘍であり、男性で最多、女性では乳癌、大腸癌に次いで多い。胃癌は、世界的に減少傾向にあるが、日本では、人口の高齢化に伴い罹患患者数は、男女共に未だ増加傾向を示している。現在、我が国で発見される胃癌のほぼ半数が早期癌であり、内視鏡的切除等様々な低侵襲治療法の開発が進む一方、進行癌に対する化学療法の成績は、未だ十分とはいえない（非特許文献１）。
【０００３】
（ＣＤ４４）
ＣＤ４４は、膜貫通糖タンパク質受容体ファミリーの一員であり、ヒアルロン酸に結合し、その結果生じる細胞内シグナル伝達は、細胞接着、細胞移動及び細胞侵入を含む多様な細胞機能に関与している（非特許文献２及び非特許文献３）。
ＣＤ４４は、癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）において発現している。癌幹細胞は、腫瘍を引き起こす能力及び癌幹細胞を起源とする腫瘍特有の細胞異質性を再構築する能力を有する腫瘍細胞サブ集団である（非特許文献４）。
【０００４】
（ＣＤ４４バリアントアイソフォーム）
ＣＤ４４ｓｔａｎｄａｒｄアイソフォーム（ＣＤ４４ｓ）をコードする遺伝子は、２０エクソンからなる。ＣＤ４４ｓの遠位（ｄｉｓｔａｌ）細胞外ドメインは、ヒアルロン酸への結合を引き起こし、近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ）細胞外ドメインは、選択的ｍＲＮＡスプライシングの部位であり、複数のバリアントアイソフォーム（ＣＤ４４ｖ２〜ｖ１０）を引き起こす（非特許文献３）。
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ；ＧＣ）のＣＤ４４陽性画分は、非接着条件下で球状コロニーを形成し、さらに、少数のＣＤ４４陽性細胞は、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を生成できる（非特許文献５）。これらの事実は、ＣＤ４４発現癌細胞が、癌幹細胞を含むことを示している。
【０００５】
しかし、ＣＤ４４発現の有無を調べるために、生検材料からＣＤ４４  ｍＲＮＡを定量する作業は煩雑であり、さらに、予後判別の確実性が低いという問題があった。
また、癌組織の癌浸潤最深部（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｆｒｏｎｔ；ＩＴＦ）におけるＣＤ４４バリアントアイソフォームの存在する数に応じて予後が層別化できることは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】佐野  武、他、”胃癌治療ガイドライン″、［online］、２０１４年５月、日本胃癌学会、［平成２８年１１月２５日検索］、〈http://www.jgca.jp/guideline/fourth/category1-1.html#H2-A_1〉
【非特許文献２】J Biol Chem 1992; 267(7): 4732-4739
【非特許文献３】Mol Pathol 1998; 51(4): 191-200
【非特許文献４】J Gastroenterol 2014; 49(4): 618-627
【非特許文献５】Stem Cells 2009; 27(5): 1006-1020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、胃癌患者の予後の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、胃癌組織の癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ−６（ＣＤ４４ｖ６）及びＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ−９（ＣＤ４４ｖ９）の存在する数に応じて予後が層別化できることを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は以下の通りである。
１．下記の工程を含む、胃癌患者の予後の検査方法；
（１）胃癌患者から取得した胃癌組織の癌浸潤最深部でのＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陽性であるか陰性であるかを測定する工程、
（２）上記（１）の測定結果により、全て陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、及び、全て陰性カテゴリーのいずれか１のカテゴリーに属するかを選別する工程。
２．以下のように判定することを特徴とする前項１に記載の検査方法。
（１）全て陽性カテゴリーに属する場合には最も予後不良であると判定する
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には２番目に予後不良であると判定する
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には３番目に予後不良であると判定する
（４）全て陰性カテゴリーに属する場合には予後良好であると判定する
３．さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、リンパ管浸潤が陽性であると判定することを含む、前項１又は２に記載の検査方法。
４．さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、血管浸潤が陽性であると判定することを含む、前項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
５．さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、浸潤深度がｐＴ３又はｐＴ４であると判定することを含む、前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
６．さらに、ＣＤ４４ｓ陽性の場合には、腹膜性再発、リンパ性再発、及び／又は血行性再発を含むと判定することを含む、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
７．さらに、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定することを含む、前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
８．さらに、ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定することを含む、前項１〜７のいずれか１に記載の検査方法。
９．抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及びは抗ＣＤ４４ｖ９抗体を含む、胃癌患者の予後の検査キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、胃癌患者の予後の検査方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）染色による胃原発癌（ＧＣ）におけるＣＤ４４ｓ及びＣＤ４４ｖ９発現の確認。各ＣＤ４４アイソフォームの発現に関し、２症例の代表的画像を示す。Ａ及びＣ、Ｂ及びＤは、それぞれ同一患者由来である。Ａ：胃癌中の漿膜を露出した癌切片全体及び癌浸潤最深部（ＩＴＦ）の両方におけるＣＤ４４ｓ陽性染色（元画像の拡大率：×４０）。Ｂ：固有筋層浸潤胃癌の表層においてＣＤ４４ｖ９陰性染色、かつ、癌浸潤最深部において陽性染色（元画像の拡大率：×４０）。Ｃ：Ａの高倍率視野。Ｄ：Ｂの高倍率視野。Ｃ、Ｄの高倍率視野において、各ＣＤ４４アイソフォームの発現は、癌細胞の細胞膜に沿って同定した（元画像の拡大率：×２００）。
【図２】切除可能な胃癌の胃切除手術を受けた患者におけるカプランマイヤー法により算出された疾患特異的生存率。ａ：癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ発現陽性又は陰性の患者における疾患特異的生存率。ｂ：癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６発現陽性又は陰性の患者における疾患特異的生存率。ｃ：癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９発現陽性又は陰性の患者における疾患特異的生存率。ｄ：癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォームの発現陽性数と患者における疾患特異的生存率。全陰性（ａｌｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）は、癌浸潤最深部において全てのＣＤ４４アイソフォームが陰性染色であった患者を示す。一陽性（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は、癌浸潤最深部において１つのＣＤ４４アイソフォームについて陽性染色であった患者を示す。二陽性（ｄｏｕｂｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は、癌浸潤最深部において１つのＣＤ４４アイソフォームについて陽性染色であった患者を示す。全陽性（ａｌｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は、癌浸潤最深部において全てのＣＤ４４アイソフォームについて陽性染色であった患者を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、胃癌患者の予後の検査方法及び胃癌患者の予後の検査キットを対象とする。
【００１３】
（胃癌患者の予後の予測検査方法）
本発明の胃癌患者の予後の予測検査方法の工程は、以下の通りである。
（１）胃癌患者から取得した胃癌組織の癌浸潤最深部でのＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陽性であるか陰性であるかを測定する工程。
（２）上記（１）の測定結果により、全て陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、ＣＤ４４ｖ６陽性又はＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー、及び、全て陰性カテゴリーのいずれか１のカテゴリーに属するかを選別する工程。
【００１４】
さらに、前記の検査方法において、以下のように判定する。
全て陽性カテゴリーに属する場合には最も予後不良であると判定する。
ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には２番目に予後不良であると判定する。
ＣＤ４４ｖ６陽性又はＤ４４ｖ９陽性カテゴリーに属する場合には３番目に予後不良であると判定する。
全て陰性カテゴリーに属する場合には予後良好であると判定する。
【００１５】
（胃癌患者）
本発明の胃癌患者（ヒトを含む哺乳類）は、ステージは特に限定されないが、好ましくは切除可能な胃癌患者である。また、胃癌組織切除前及び切除後の両方の患者を対象とする。
【００１６】
（胃癌組織の癌浸潤最深部）
本発明の胃癌組織の「癌浸潤最深部」（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｆｒｏｎｔ；ＩＴＦ；癌浸潤先進部）とは、病理学的所見により癌化した組織の表層から深部へ向かって浸潤する最深部を意味する。癌浸潤最深部の細胞（細胞膜及び細胞質）は、当該技術分野における通常の知識を有する者が、公知の手段（例えば、形態観察）により識別することができる。「浸潤」とは、癌細胞が、成長して、周囲の組織を破壊しながらその中に入り込んでいくことをいう。
胃癌患者から胃癌組織の癌浸潤最深部を取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。
なお、癌組織全体、粘膜層をサンプルとした場合には、ＣＤ４４アイソフォームの存在する数に応じて予後が層別化できないことを確認している。
【００１７】
（ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９）
ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９は、哺乳類由来であれば特に限定されないが、ヒト由来であることが好ましい。
ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９のアミノ酸配列に関する情報は、公知であり、ＮＣＢＩの遺伝子データベース等に登録されている。
例えば、ＣＤ４４ｓはNP_000601.3、ＣＤ４４ｖ６はNP_001189484.1、ＣＤ４４ｖ９はCancer Res Treat. 2016;48(1):142-152等を参照することができる。
【００１８】
（陽性及び陰性の判定）
本発明において、ＣＤ４４アイソフォーム（ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９）の発現が陽性とは、胃癌患者由来の胃癌組織の癌浸潤最深部（サンプル）の免疫組織染色の結果、サンプル全体における染色陽性細胞の割合が、５０％以上、４０％以上、３０％以上又は２０％以上、好ましくは１０％以上、９％以上、８％以上、７％以上又は６％以上、最も好ましくは５％以上であることをいう。当該基準に基づき、陽性と判定されない場合は、陰性と判定する。
【００１９】
（免疫組織染色）
上記の陽性及び陰性の判定のための免疫組織染色は、自体公知の方法を用いることができる。以下に一例を記すが、特に限定されない。
（１）胃癌患者から切除した胃癌組織標本をホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックを、適当な厚さの切片に切り分け、脱パラフィンし、再水和する。
（２）各切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、その後、免疫染色に使用する。癌浸潤最深部は、腫瘍の最も深い浸潤切片で評価する。
（３）免疫染色は、抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及び抗ＣＤ４４ｖ９抗体を用いて自体公知の自動染色装置を使用して又は手作業で行う。
（４）ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９発現は、それぞれ、癌浸潤最深部の陽性腫瘍細胞の割合として算出する。
【００２０】
（抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及び抗ＣＤ４４ｖ９抗体）
本発明に使用する抗体は、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９を認識する抗体であり、胃癌組織内のＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９と特異的に結合し、ＣＤ４４アイソフォームの発現パターンを解析することができる抗体である。該抗体は、自体公知の方法により作製することができ、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９を認識する特性を失わない限り、低分子化抗体や、修飾された抗体などの抗体フラグメントであってもよい。
また、本発明の抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及び抗ＣＤ４４ｖ９抗体は、市販されている抗体を使用してもよい。
市販されている抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ４４ｓ抗体はＨ−ＣＡＭ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等、抗ＣＤ４４ｖ６抗体はＶＦＦ−１８（Ａｂｃａｍ社製）等、抗ＣＤ４４ｖ９抗体はＲＶ３（コスモ・バイオ社製）等が使用可能である。
【００２１】
（カテゴリーによる予後の階層化）
本発明の胃癌患者の予後の検査方法では、以下の４つのカテゴリーに分別する。
（１）全て陽性カテゴリー：ＣＤ４４ｓの発現が陽性（ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性も含む）であり、最も予後不良である。
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陽性であり、２番目に予後不良である。
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９のいずれか１つの発現が陽性であり、３番目に予後不良である。
（４）全て陰性カテゴリー：ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９の発現が陰性であり、予後良好である。
これにより、上記（１）の場合には、より強力な化学療法が必要である可能性が高いと判定することができ、上記（２）、（３）の場合には、現状（又は予定）の補助化学療法で良いと判定することができ、上記（４）の場合には、手術後補助化学療法が不要になる可能性が高いと判定することができる。
【００２２】
（予後）
本発明の「予後」とは、外科的手術（例えば、治癒切除）後の約２０月、約３０月、約４０月、約５０月、約６０月、約７０月、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率、好ましくは胃癌特異的生存率を意味する。
すなわち、本発明の「予後の予測検査方法」とは、外科的手術後の約２０月、約３０月、約４０月、約５０月、約６０月、約７０月、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率、好ましくは胃癌特異的生存率（の確率）を予測する方法である。
【００２３】
（カテゴリーによる予後の階層化の評価）
各カテゴリーの生存率は、下記の実施例の結果を基にして、以下のように例示することができる。
（１）全て陽性カテゴリー：約２０月での生存率は０．６〜１．０である。約３０月、約４０月、約５０月、約６０月での生存率は０．４〜０．６である。約７０月、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率は０．２〜０．４である。
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：約２０月での生存率は０．８〜１．０である。約６０月、約７０月、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率は０．６〜０．８である。
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：約２０月、約３０月、約４０月、約５０月、約６０での生存率は０．８〜１．０、好ましくは、０．８〜０．９５である。約７０、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率は０．７〜０．９、好ましくは、０．７〜０．８である。 
（４）全て陰性カテゴリー：約２０月、約３０月、約４０月、約５０月、約６０月、約７０月、約８０月、約９０月、約１００月、約１１０月又は約１２０月での生存率は０．８〜１．０、好ましくは、０．９〜１．０である。
【００２４】
６０月での生存率は、下記の実施例の結果を基にして、以下のように設定することができる。
（１）全て陽性カテゴリー：０．４０〜０．６０
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー： ０．６０〜０．８０
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：０．８０〜０．９５ 
（４）全て陰性カテゴリー：０．９５〜１．００
８０月での生存率は、下記の実施例の結果を基にして、以下のように設定することができる。
（１）全て陽性カテゴリー：０〜０．７０
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性及びＣＤ４４ｖ９陽性カテゴリー： ０．７０〜０．７５
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性又はＤ４４ｖ９陽性カテゴリー：０．７５〜０．９０
（４）全て陰性カテゴリー：０．９０〜１．００
【００２５】
本発明の胃癌患者の予後の検査方法では、下記の実施例の結果を基にして、さらに以下のいずれか１の判定を含むことができる。
（１）ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、リンパ管浸潤が陽性であると判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、陰性に比べてリンパ管浸潤陽性が有意に多いと判定する。
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、血管浸潤が陽性であると判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、陰性に比べて血管浸潤陽性が有意に多いと判定する。
（３）ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、浸潤深度がｐＴ３又はｐＴ４であると判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、陰性に比べて、浸潤深度が浅い（ｐＴ１又はｐＴ２）ことよりも浸潤深度が深い（ｐＴ３又はｐＴ４）ことが有意に多いと判定する。
（４）ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、腫瘍サイズが５ｃｍ以上であると判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、陰性に比べて、腫瘍サイズが５ｃｍ以上であることが有意に多いと判定する。
【００２６】
本発明の胃癌患者の予後の検査方法では、下記の実施例の結果を基にして、さらに以下のいずれか１の判定を含むことができる。
（１）ＣＤ４４ｓ陽性の場合には、腹膜性再発、リンパ性再発、及び／又は血行性再発を含むと判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｓ陽性の場合には、陰性に比べて、腹膜性再発、リンパ性再発、及び／又は血行性再発が有意に多いと判定する。
（２）ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には、陰性に比べて、腹膜性再発が有意に多いと判定する。
（３）ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、腹膜性再発を含むと判定する。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ９陽性の場合には、陰性に比べて、腹膜性再発が有意に多いと判定する。
なお、再発には、上記腹膜性再発、リンパ性再発、及び血行性再発だけでなく、胃での再発も含む場合がある。
【００２７】
（胃癌患者の予後の検査キット）
本発明の胃癌患者の予後の検査キットは、少なくとも抗ＣＤ４４ｓ抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体及びは抗ＣＤ４４ｖ９抗体を含む。
本キットを使用すれば、本発明の胃癌患者の予後の検査方法を実施することができる。
【００２８】
以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。本実施例は、滋賀医科大学の倫理委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｈｉｇａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により承認されている。
【実施例１】
【００２９】
胃癌におけるＣＤ４４アイソフォームの発現結果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３０】
（患者および材料）
滋賀医科大学医学部附属病院（日本）で、２０ＸＸ年１月〜２０ＹＹ年１２月の間に、胃切除を経験した患者から１７５の胃原発腺癌標本を得た。このうち、遠隔転移、腹膜播種性転移、又は腫瘍の粘膜浸潤｛ｐＴ１（Ｍ）｝を有する患者由来の標本を除外し、１２３の標本を解析に用いた。
【００３１】
（組織型の分類）
組織型は、分化又は未分化として決定した。具体的には、高度かつ適度に分化した管状腺癌又は乳頭腺癌は分化型として分類し、低分化の腺癌及び印環細胞癌は未分化型として分類した。
粘液性腺癌は、他のプレドミナント（優勢）な要素により分類した。腫瘍ステージ及び病理学的分類は、胃癌取り扱い規約（第１４版）（２０１０、金原出版）に従って、決定した。
【００３２】
（術後補助化学療法）
術後補助化学療法を、病理学的Ｔ２−Ｔ４腫瘍又はリンパ節転移を有する５１人の患者に対して行った。これらの５１人の患者のうちで、２５人をテガフール、５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジン及びオキソニン酸で治療し（Ｓ１）、１１人をテガフール及びウラシルで治療し（ＵＦＴ）、８人をＳ１＋ドセタキセルで治療し、６人をＳ１＋イリノテカンで治療し、そして１人をＳ１＋パクリタキセルで治療した。
【００３３】
（追跡期間）
追跡期間中央値は、６８か月（最短期間１か月〜最長期間９７か月）だった。合計２２人の患者は、試験期間中に胃癌関連の原因で死亡した。腹膜性、リンパ性、及び血行性の再発は、それぞれ、１７症例、８症例及び９症例で発症した。同意書は、試験地域における倫理ガイドラインに従って、全ての患者から得た。
【００３４】
（病理学的試験）
（材料）
免疫組織化学的分析（免疫染色）は、メーカーの指示に従い、自動染色装置（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ツーソン、アリゾナ、アメリカ）を使用して行った。
以下の一次抗体を使用した：
抗ＣＤ４４ｓ一次抗体（Ｈ−ＣＡＭ、１：２００希釈；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ニューカッスル・アポン・タイン、イギリス）、
抗ＣＤ４４ｖ６一次抗体（ＶＦＦ−１８、１：５００希釈；Ａｂｃａｍ社製、ケンブリッジ、イギリス）、及び、
抗ＣＤ４４ｖ９一次抗体（ＲＶ３、１：５０００希釈；コスモ・バイオ社製、東京、日本）。
（免疫染色）
切除した胃癌組織標本をホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックを、３μｍ厚切片に切り分け、脱パラフィンし、再水和した。各切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、その後、免疫染色に使用した。
ＣＤ４４ｓ発現のポジティブ・コントロールとして、リンパ節を使用し、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９発現のポジティブ・コントロールとして、皮膚組織を使用した（参照：Mol Pathol1998; 51(4): 191-200）。ネガティブ・コントロールは、一次抗体の代わりに、同様に希釈した非免疫化マウス血清を使用した。
免疫染色試験は、臨床的又は病理学的特徴を知らされていない２人の病理医により、独立して評価した。不一致が生じた場合の最終的決定は、双頭顕微鏡を使用した再評価により確定した。癌浸潤最深部（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｆｒｏｎｔ；ＩＴＦ）は、腫瘍の最も深い浸潤切片で評価した（参照：Gastric Cancer 2014; 17(3): 412-422）。
ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９発現は、それぞれ、陽性腫瘍細胞の割合として、腫瘍組織切片全体又は癌浸潤最深部において、半定量的に解析した。陽性腫瘍細胞の割合は、腫瘍切片全体における低倍率視野（×４０）において評価した。その後、腫瘍細胞の陽性膜染色は、×１００の倍率で確認した。
（陽性細胞の同定）
５％以上の癌細胞が陽性染色されたときに「陽性」と定義し、５％未満の癌細胞が陽性染色されたときに陰性と定義した。５％のカットオフ値は、以前の報告で使用された数値を採用した（参照：Oncol Rep 2009; 22(4): 745-755、HumPathol2012; 43(4): 520-528、Int J Clin Exp Med 2015;8(3):3595-3606及びInt J Oncol 1998; 12(6): 1253-1258）。腫瘍細胞及び間質細胞は、陽性細胞の形態学的特徴に基づいて同定した。形態学的方法を用いて腫瘍細胞であるか間質細胞であるかが不明確である場合（特に、低分化である腺癌において）は、サイトケラチンに対する免疫染色を、形態学的方法と組み合わせて同定した。
【００３５】
（胃癌におけるＣＤ４４アイソフォームの発現結果）
患者及び腫瘍特性の結果は、下記表１に要約した。
胃癌患者の腫瘍組織切片全体において、ＣＤ４４ｓ陽性染色を２７人（２２．０％）、ＣＤ４４ｖ６陽性染色を１０８人（８７．８％）、ＣＤ４４ｖ９陽性染色を７２人（５８．５％）であることを確認した（表１）。
胃癌患者の癌浸潤最深部において、ＣＤ４４陽性染色を１３人（１０．６％）、ＣＤ４４ｖ６陽性染色を７９人（６４．２％）、ＣＤ４４ｖ９陽性染色を４７人（３８．２％）であることを確認した（表１）。
胃癌患者の腫瘍組織切片全体又は癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ及びＣＤ４４ｖ９の免疫組織化学的染色結果を、図１に示した。
膜性の免疫反応性に関し、ＣＤ４４ｓ（図１Ａ、図１Ｃ）、及びＣＤ４４ｖ９（図１Ｂ、図１Ｄ）について確認した。なお、ＣＤ４４ｖ６についても同様に確認した（図なし）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
（表中の用語の説明）
ｐＴ１（ＳＭ）：粘膜下層まで浸潤する腫瘍
ｐＴ２（ＭＰ）：固有筋層まで浸潤する腫瘍
ｐＴ３（ＳＳ）：漿膜下層まで浸潤する腫瘍
ｐＴ４ａ（ＳＥ）：漿膜に隣接する又は漿膜を超えて拡大する腫瘍浸潤
ｐＴ４ｂ（ＳＩ）：隣接臓器へ浸潤する腫瘍
ｐＮ０：領域リンパ節転移なし
ｐＮ１：領域リンパ節における転移が１または２個
ｐＮ２：領域リンパ節における転移が３〜６個
ｐＮ３：７個以上の領域リンパ節における転移
ＬＮ：リンパ節
ＣＹ１を示した１１人の患者をステージＩＶに分類した。
【実施例２】
【００３８】
ＣＤ４４発現、初再発パターン及び生存率について確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３９】
（初再発パターン及び疾患特異的生存率の決定）
術後のフォローアップ（追跡期間）の間に検出された、最初の再発病巣に基づく初再発パターンは、少なくとも６か月の間隔で、コンピュータ断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＣＴ）を用いて、決定した。再発パターンは、腹膜性、リンパ性、及び血行性（すなわち、肝臓、肺、脳、及び骨転移）の３タイプに分類した。
疾患特異的生存率は、胃の手術日から胃癌による死亡日又は最後のフォローアップの日のいずれかまでで計算した。
【００４０】
（統計学的解析）
単変量解析及び多変量解析では、臨床共変数及び疾患特異的生存率の間の関連を評価するために、コックス比例ハザードモデルを用いて行った。単変量解析におけるｐ＜０．０５の生存率と関連する変数を、多変量解析のために使用した。カプランマイヤー生存曲線は、陽性及び陰性ＣＤ４４発現の患者を比較するために作成した。有意差は、対数順位検定を用いて決定した。ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９発現の臨床病理学的変数の関連は、カイ二乗検定又はフィッシャー直接検定を適宜用いて評価した。ｐ＜０．１０の有意差を示した変数は、多変量ロジスティック回帰分析に含めた。
累積罹患率は、初再発パターンと、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９発現との間の関連を評価するために計算した。各再発型の累積罹患率は、他の原因による死亡を競合リスクとした競合リスク法を用いて、算出した。陽性及び陰性ＣＤ４４発現の患者間の比較は、グレイ検定を用いて行った。全てのｐ値は両側性であり、有意水準は、ｐ＜０．０５に設定した。グレイ検定を除く統計解析は、ＳＰＳＳ  ２２．０を用いて行った（ＳＰＳＳ社製、シカゴ、イリノイ、アメリカ）。グレイ検定は、Ｒによるグラフィカルユーザインタフェースである（Ｔｈｅ  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウィーン、オーストリア）ＥＺＲを用いて行った（自治医科大学附属さいたま医療センター、さいたま、日本）。
【００４１】
（ＣＤ４４アイソフォーム発現及び患者結果）
癌浸潤最深部における癌幹細胞様細胞の存在の予後を評価するために、腫瘍組織切片全体又は癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォーム発現と、疾患特異的生存率との間の関係を調べた。その結果を表２に示す。
単変量コックス解析により、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ発現（ＨＲ＝６．８０；９５％ＣＩ，２．７３−１６．９５；ｐ＜０．０００１）、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６発現（ＨＲ＝４．１５；９５％ＣＩ，１．２３−１４．０８；ｐ＝０．０２２）、及び癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９発現（ＨＲ＝４．６５；９５％ＣＩ，１．８９−１１．４９；ｐ＝０．００１）が、疾患特異的生存率と関連したことを確認した（下記、表２）。
より詳しくは、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ発現、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６発現、及び癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９発現は、ＨＲ（ハザード比）が１より大きく、かつ、９５％ＣＩ（９５％信頼区間）の最小値が１より大きいことから、有意に疾患特異的生存率の低下と関連することを示している。
なお、胃癌全組織におけるＣＤ４４ｓ発現及びＣＤ４４ｖ６発現は、疾患特異的生存率と関連していないことを確認した。
これらの結果は、胃癌全組織のＣＤ４４アイソフォーム発現ではなく、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォーム発現が、胃癌の強力な予後因子であることを示す。
さらに、多変量コックス解析により、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ発現が、独立した予後不良因子であることが明らかになった（ＨＲ＝３．１３；９５％ＣＩ，１．０９−９．０１；ｐ＝０．０３５）（表２）。
【００４２】
（カプランマイヤー生存曲線による生存率の評価）
癌浸潤最深部における各ＣＤ４４アイソフォームの発現ごとのカプランマイヤー生存曲線を図２に示す。癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６又はＣＤ４４ｖ９陽性発現の患者は、陰性発現の患者よりも有意に低い生存率を示した（ＣＤ４４ｓはｐ＜０．０００１、ＣＤ４４ｖ６はｐ＝０．０１３、ＣＤ４４ｖ９はｐ＝０．０００２）（図２ａ、図２ｂ、図２ｃ）。
胃癌手術を行った患者の詳細な予測モデルを作成するために、癌浸潤最深部における各ＣＤ４４アイソフォームの発現に基づいて、患者を層別化した（図２ｄ）。
以下の４つの患者集団の間で、生存率に有意差があることを確認した。
（１）全てのＣＤ４４アイソフォームについて陰性発現の患者（全陰性；ａｌｌ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）（ｎ＝４１）、
（２）１つのＣＤ４４アイソフォームについて陽性発現の患者（一陽性；ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（ｎ＝３８）、
（３）２つのＣＤ４４アイソフォームについて陽性発現の患者（二陽性；ｄｏｕｂｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（ｎ＝３１）、
（４）全てのＣＤ４４アイソフォームについて陽性発現の患者（全陽性；ａｌｌ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（ｎ＝１３）（ｐ＜０．０００１）。
全陽性集団は、最も悪い生存率、すなわち５１．９％の５年生存率を示した。二陽性集団は７３．７％の５年生存率を示し、一陽性集団は９０．８％の５年生存率を示した。全陰性集団は、最も良い５年生存率、すなわち９７．４％を示した。
以上により、ＣＤ４４アイソフォームの数に基づく当該層別化モデルは、胃癌患者生存率を予測するができる。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
（表中の用語及び記号の説明）
ＣＩ：信頼区間
ＨＲ：ハザード比
＊：統計学的に有意
ＣＹ１を示した１１人の患者をステージＩＶに分類した。
【００４５】
（癌浸潤最深部におけるＣＤ４４発現及び臨床病理学的特徴）
癌浸潤最深部における癌幹細胞様細胞の存在に影響を及ぼす因子を明らかにするため、従来の臨床病理学的変数と、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォーム発現との間の相関性を調べた。その結果を表３に示す。
単変量解析により、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ発現は、いかなる臨床病理学的変数とも相関しなかったことが明らかになった（表３ａ）。癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６発現は、腫瘍浸潤の深度（ｐ＝０．００４）、リンパ管浸潤（ｐ＝０．００５）及び血管浸潤（ｐ＝０．０１１）と有意に相関した（表３ｂ）。癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９発現は、腫瘍サイズ（ｐ＝０．０３６）と有意に相関した（表３ｃ）。
さらに、多変量ロジスティック回帰分析を行うと、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォームの発現と関連する、独立した臨床病理学的因子は、無かった。すなわち、ＣＤ４４ｓ、ＣＤ４４ｖ６及びＣＤ４４ｖ９は、それぞれ、従来の臨床病理学的因子から独立した、独自の予後因子であることが明らかになった。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
（表中の用語及び記号の説明）
＊：統計学的に有意
ＬＮ：リンパ節
【００４８】
（癌浸潤最深部におけるＣＤ４４発現と再発との関係）
癌浸潤最深部における各ＣＤ４４アイソフォームの発現が、切除可能な胃癌の手術後の再発と関連したかどうかを調べた。その結果を下記表４に示す。
ＣＤ４４ｓ発現と再発との関係について、各再発型の５年間の蓄積再発率は、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ陰性発現の患者よりも、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ陽性発現の患者において、有意に高かった。より詳しくは、腹膜性再発（ｐ＜０．００１）は、ＣＤ４４ｓ陽性発現患者が４３．４％（９５％ＣＩ：１４．１−７０．０％）であるのに対し、ＣＤ４４ｓ陰性発現患者が５．８％（９５％ＣＩ：２．４−１１．５％）であった。リンパ性再発（ｐ＜０．００１）は、ＣＤ４４ｓ陽性発現患者が５１．３％（９５％ＣＩ：１２．１−８０．９％）であるのに対し、ＣＤ４４ｓ陰性発現患者が４．３％（９５％ＣＩ：１．４−１０．０％）であった。血行性再発（ｐ＝０．００８）は、ＣＤ４４ｓ陽性発現患者が２９．４％（９５％ＣＩ：５．４−５９．７％）であるのに対し、ＣＤ４４ｓ陰性発現患者が６．２％（９５％ＣＩ：２．５−１２．２％）であった（表４）。
ＣＤ４４ｖ６発現と再発との関係について、５年間の累積の腹膜性再発率は、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６陰性発現の患者よりも、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６陽性発現の患者において、有意に高かった。より詳しくは、ＣＤ４４ｖ６発現（ｐ＝０．００７）について、陽性が１３．８％（９５％ＣＩ：７．０−２２．８％）であるのに対し、陰性が２．４％（９５％ＣＩ：０．２−１１．２％）であった（表４）。
ＣＤ４４ｖ９発現と再発との関係について、５年間の累積の腹膜性再発率は、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９陰性発現の患者よりも、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ９陽性発現の患者において、有意に高かった。
より詳しくは、ＣＤ４４ｖ９発現（ｐ＝０．０４１）について、陽性が２１．２％（９５％ＣＩ：１０．３−３４．６％）であるのに対し、陰性が２．９％（９５％ＣＩ：０．５−９．０％）であった（表４）。
【００４９】
以上の結果により、本発明の胃癌患者の予後の検査方法において、ＣＤ４４ｓ陽性の場合には腹膜性再発、リンパ性再発、及び／又は血行性再発が好発すると判定でき、ＣＤ４４ｖ６陽性の場合には腹膜性再発が好発すると判定でき、及びＣＤ４４ｖ９陽性の場合には腹膜性再発が好発すると判定するができる。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
（表中の記号の説明）
＊：統計学的に有意
【００５２】
（総論）
（１）本実施例の結果により、癌浸潤最深部における各ＣＤ４４アイソフォームの発現が、従来の臨床病理学的因子から独立したものであり、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４アイソフォームの発現が、独自の予後因子であることを示した。
（２）癌浸潤最深部において発現したＣＤ４４アイソフォームの数に基づき分類した場合、より多くのＣＤ４４アイソフォームを発現している患者の予後がより悪いことを確認した。
（３）本実施例において、ＣＤ４４ｓ陽性細胞を有する全ての患者が、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｖ６陽性細胞及びＣＤ４４ｖ９陽性細胞も有しており、癌浸潤最深部におけるＣＤ４４ｓ陽性細胞を有する胃癌患者は、生存率の予測モデルにおける予後が最も悪いことを確認した。
（４）ＣＤ４４アイソフォームの数に基づく分類は、患者治療の指針とすることができる。即ち、臨床の観点から、癌浸潤最深部における全てのＣＤ４４アイソフォームの発現が陽性である患者は、予後が極めて不良であり、より強力な術後補助化学療法が必要であり、全てのＣＤ４４アイソフォームの発現が陰性である患者は、予後が極めて良好であり、術後補助化学療法が不要である可能性が高いことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
新規な胃癌患者の予後の検査方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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