(57)【要約】【課題】本発明は、液体試料から細胞外小胞を迅速、簡便に濃縮することを課題とする。【解決手段】細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程を含み、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む方法により細胞外小胞を濃縮する。【選択図】図１
2018163043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞の濃縮方法であって、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程を含み、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、
濃縮方法。
【請求項２】
前記混合液調製工程の後、前記第１画分を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項３】
前記混合液調製工程の後、かつ前記第１画分回収工程の前に、前記混合液を遠心する工程を含む、請求項１又は２に記載の濃縮方法。
【請求項４】
前記遠心が、10,000 g未満で行われる、請求項３に記載の濃縮方法。
【請求項５】
前記遠心が、２分以内である、請求項３又は４に記載の濃縮方法。
【請求項６】
前記混合液調製工程の後、かつ前記遠心工程の前に、前記混合液を撹拌する工程を含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項７】
前記多糖が、ホモ多糖、ヘテロ多糖及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１から６のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項８】
前記ホモ多糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース及びグルコサミンよりなる群から選択されるいずれか一種の単糖類により構成される、請求項７に記載の濃縮方法。
【請求項９】
前記ヘテロ多糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、マンノース及びイドースよりなる群から選択される二種以上の単糖類により構成される、請求項７に記載の濃縮方法。
【請求項１０】
前記多糖が、デキストラン、ヘパリン、キチン、イヌリン、アルギン酸、セルロース、メチルセルロース及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の濃縮方法。
【請求項１１】
前記ポリエーテルの平均分子量が、1,500以上である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項１２】
前記ポリエーテルが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール及びこれらの混合物よりなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項１３】
前記混合液中のポリエーテルの濃度が、４ w/v%以上である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項１４】
前記混合液中の多糖の濃度が、２ w/v%以上である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項１５】
前記第１画分が前記多糖を含み、かつ実質的に前記ポリエーテルを含まない多糖画分であり、
前記第２画分が前記ポリエーテルを含み、かつ実質的に前記多糖を含まないポリエーテル画分である、
請求項３から１４のいずれか一項に記載の濃縮方法。
【請求項１６】
下記工程を含む細胞外小胞の検出方法であって、
細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程であって、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、工程と、
前記第１画分を回収する工程と、
前記第１画分中の細胞外小胞を検出する工程と、
を含む、検出方法。
【請求項１７】
下記工程を含む生体分子の検出方法であって、
細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程であって、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、工程と、
前記第１画分を回収する工程と、
前記第１画分中の細胞外小胞に含まれる生体分子を検出する工程と、
を含む、検出方法。
【請求項１８】
前記第１画分回収工程と、前記検出工程の間に、回収された前記第１画分中の細胞外小胞を分散させる工程を含む、請求項１６又は１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記生体分子が、ポリペプチド及びRNAよりなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１７又は１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルよりなる群から選択される少なくとも一種を含む、細胞外小胞濃縮用試薬。
【請求項２１】
多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む、細胞外小胞濃縮用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞の濃縮方法、細胞外小胞の検出方法、生体分子の検出方法、細胞外小胞濃縮用試薬及び細胞外小胞濃縮用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームを始めとした種々の細胞外小胞が、細胞内から細胞外へと放出されることが知られている。細胞外小胞は、血液、唾液、リンパ液等の液体試料中に存在することが知られている。近年、細胞外小胞の存在や、細胞外小胞に内包されているmiRNAやタンパク質等の分子と疾患との関係性が盛んに研究され、医療におけるバイオマーカーの１つとして着目されている。しかし、一般的に細胞外小胞は低濃度であるため、細胞外小胞あるいは細胞外小胞内マーカーを検出するためには、細胞外小胞を濃縮することが好ましい。細胞外小胞の濃縮方法として、ポリエチレングリコールとデキストランとの二相分配を利用し、下層のデキストラン画分から細胞外小胞を回収する方法が開示されている（非特許文献１、非特許文献２）。また、細胞外小胞を沈殿させて回収するpolymeric precipitation法を行うためのキットも市販されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Balaj, N et al., Scientific Reports, 5, Article number: 13103 (2015)
【非特許文献２】Kim, J et al., PLoS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0129760 June 19, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、液体試料から細胞外小胞を迅速、簡便に濃縮することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究を重ねたところ、多糖と比較的分子量の小さいポリエーテルを用いた二相分配により、液体試料から細胞外小胞を回収率よく濃縮できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明の第１の態様は、細胞外小胞の濃縮方法であって、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程を含み、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、濃縮方法に関する。
本態様によれば、液体試料から細胞外小胞を迅速に濃縮することができる。
【０００７】
本発明の第２の態様は、下記工程を含む細胞外小胞の検出方法であって、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程であって、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、工程と、前記第１画分を回収する工程と、前記第１画分中の細胞外小胞を検出する工程と、を含む、検出方法に関する。
本態様によれば、液体試料から細胞外小胞を迅速に検出することができる。
【０００８】
本発明の第３の態様は、下記工程を含む生体分子の検出方法であって、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを混合することにより第１画分及び第２画分を含む混合液を調製する工程であって、前記第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含み、前記第１画分は前記液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む、工程と、前記第１画分を回収する工程と、前記第１画分中の細胞外小胞に含まれる生体分子を検出する工程と、を含む、検出方法に関する。
本態様によれば、細胞外小胞を迅速に濃縮することができるため、細胞外小胞に存在する生体分子を迅速に検出することができる。
【０００９】
本発明の第４の態様は、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルよりなる群から選択される少なくとも一種を含む、細胞外小胞濃縮用試薬に関する。
本発明の第５の態様は、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む、細胞外小胞濃縮用キットに関する。
本発明の第４、及び第５の態様によれば、細胞外小胞を迅速、簡便に濃縮することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、液体試料から細胞外小胞を回収率よく濃縮することができる。また、液体試料から細胞外小胞を迅速、簡便に濃縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１(a)は、本発明の細胞外小胞の濃縮方法の概略を示す。また、図１(b)は、実際に遠心した後のチューブの写真である。
【図２】図２は、血清及び希釈血清を液体試料として、PEG6000-PTPP法及びPEG35000-PTPP法を行った結果を示す写真である。
【図３】図３は、PTPP法によって濃縮された細胞外小胞に含まれるCD9をELISA法で検出した結果を示す。
【図４】図４は、陽性対照と、PTPP法又はEXO-Prep法により濃縮された細胞外小胞に含まれるmiRNA21のコピー数を示すグラフである。
【図５】図５は、各200μLのPEG6000水溶液又はPEG35000水溶液をそれぞれピペットマンで吸引する際にかかった時間を示すグラフである。
【図６】図６は、細胞外小胞濃縮用キットの一例を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［用語の説明］
初めに本明細書において使用される用語を説明する。特に断りがない限り、本発明の用語は、この項の記載に基づいて解釈される。
【００１３】
細胞外小胞は、細胞から放出されるリン脂質を主成分とする膜で覆われた数十から数千nm程度の大きさを有する粒子である。細胞外小胞には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が含まれる。多くの場合、細胞外小胞には、生体分子が存在している。例えば、エクソソーム又はマイクロベシクルは、ポリペプチド及び核酸（mRNA、miRNA、ノン・コーディングRNA等のRNA）よりなる群から選択される少なくとも一種の生体分子を含む。例えば、アポトーシス小体は、断片化された核及び細胞小器官よりなる群から選択される少なくとも一種を含む。細胞外小胞は、好ましくは、ポリペプチド及びRNAよりなる群から選択される少なくとも一種の生体分子を含む。より好ましくは、細胞外小胞は、ポリペプチド及びRNAよりなる群から選択される少なくとも一種の生体分子を含む。ここで、ポリペプチドは、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合した化合物をいい、分子量の比較的大きいタンパク質及び分子量の比較的小さいペプチドを含む。
【００１４】
液体試料とは、動物又は植物から採取される液体成分の試料である。具体的には、動物から採取される液体試料は、血清、血漿、リンパ液、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、間質液等を含む。また、植物から採取される液体試料は、間質液、導管液、師管液等を含む。
【００１５】
多糖は、ホモ多糖、ヘテロ多糖及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも一種を含む。ホモ多糖は、多糖を構成する糖骨格が１種類の単糖類である多糖を示す。ホモ多糖は、好ましくはグルコース、フルクトース、ガラクトース及びグルコサミンよりなる群から選択されるいずれか一種の単糖類により構成される多糖を含む。ホモ多糖は、より好ましくはグルコースにより構成される多糖である。
【００１６】
ヘテロ多糖は、多糖を構成する糖骨格が少なくとも二種類の単糖類である多糖を示す。ヘテロ多糖は、好ましくはグルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコサミン、マンノース及びイドースよりなる群から選択される二種以上の単糖類により構成される多糖を含む。ヘテロ多糖は、好ましくはグルコース、グルコサミン及びイドースよりなる群から選択される二種以上の単糖類により構成される多糖である。
【００１７】
糖骨格とは、単糖類が有する置換基を除去した基本骨格をいう。例えばＮ−アセチルグルコサミンは、糖骨格はグルコサミンであり置換基がアセチル基である。また、グルクロン酸は、糖骨格はグルコースであり置換基はカルボキシ基である。さらに、イズロン酸は、糖骨格はイドースであり置換基はカルボキシル基である。さらにまた、マンヌロン酸は、糖骨格はマンノースであり置換基はカルボキシ基である。
【００１８】
多糖は、具体的には、デキストラン、ヘパリン、キチン、イヌリン、アルギン酸、セルロース、メチルセルロース及びこれらの塩よりなる群から選択される少なくとも一種を含むことが好ましい。多糖は、好ましくは、デキストランである。
多糖の塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等を含む。
【００１９】
多糖の平均分子量は、重量平均分子量で3,000から800,000である。多糖の平均分子量の下限値は、好ましくは10,000、より好ましくは100,000、さらに好ましくは400,000である。多糖の平均分子量の上限値は、好ましくは700,000である。多糖の平均分子量として最も好ましくは、450,000〜650,000の範囲である。
【００２０】
多糖の重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）分析により、分子量分布範囲が公知であり測定される多糖と同種である多糖の分子量標準物質と比較することにより決定することができる。
【００２１】
ポリエーテルは、複数のエーテル結合を含むポリマーである。ポリエーテルは、好ましくはアルキレングリコール単位がエーテル結合でつながったポリマーである。前記アルキレンは、炭素数1〜６の直鎖状のアルキレン又は炭素数３〜６の分岐鎖状のアルキレンである。アルキレンとして好ましくは、炭素数１〜３の直鎖状のアルキレン又は炭素数３の分岐鎖状アルキレンである。ポリエーテルとして、さらに好ましくはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール及びこれらの混合物よりなる群から選択される少なくとも一種を含む。ポリエーテルとしてより好ましくはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びこれらの混合物よりなる群から選択される少なくとも一種であり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００２２】
ポリエーテルの平均分子量は、下記滴定法により決定される平均分子量で20,000以下、好ましくは10,000以下、より好ましくは6,000以下である。また、前記ポリエーテルの平均分子量は2,000以上であることが好ましい。ポリエーテルの平均分子量分布の範囲を示す規格値としてポリエーテルの平均分子量の好ましい範囲を示す場合、下限値は1,500、好ましくは2,700、より好ましくは7,400である。当該範囲の上限値は25,000、好ましくは10,200である。規格値で表すポリエーテルの最も好ましい範囲は7,400〜10,200である。
ポリエーテルの平均分子量は、以下の滴定法によって求めることができる。
(a)初めに、平均分子量を測定するポリエーテル20.0000ｇを正確に計量し、耐圧瓶100mlに入れる。
(b)ポリエーテルの入った耐圧瓶に、正確に計量した無水フタル酸・ピリジン溶液25 mlを加え密栓する。ここで、前記無水フタル酸・ピリジン溶液は、正確に計量した無水フタル酸42 gを遮光した共栓瓶に入れ、そこに正確に計量したピリジン300mlを加え、16時間以上放置して無水フタル酸を溶解することにより調製される。
(c)あらかじめ96〜100 ℃に加熱した水浴中に(b)の耐圧瓶の中の溶液が水浴の液の中に浸るように入れ、2時間放置する。
(d)水浴中から耐圧瓶を取り出し、室温で放冷する。
(e)放冷後の耐圧瓶中の溶液を、300 ml容量の三角フラスコにピリジンで洗いながら移す。
(f)(e)の三角フラスコに、正確に計量した0.5 mol/L水酸化ナトリウム溶液50mlを加え、さらに10 g/Lフェノールフタレイン・ピリジン溶液を10滴滴下する。
(g)(f)で得られた三角フラスコ内の溶液を、0.5 mol/L水酸化ナトリウム溶液で滴定し、滴定量a mlを求める。滴定の終点は15秒間紅色を保つ点である。 
(h)ポリエーテルを加えずに、(b)〜(g)の工程を行う空試験を上記とは別に行い、滴定量b mlを求める。
(i)以下の計算式１及び計算式２からポリエーテルの平均分子量を求める。
【数１】
2018163043.tif 000003
【数２】
2018163043.tif 000004
【００２３】
上記計算式において、Aはポリエーテルの水酸基価、Bはポリエーテルの平均分子量、Sは計りとった試料の質量（g）、fは0.5 mol/L水酸化ナトリウム溶液の力価（ファクター）を示す。
【００２４】
混合は、後述する方法の各工程で必要とされる材料を混ぜ合わせることを意図する。混合液は、混合液中に含まれる成分の全部又は一部が分散又は溶解している状態であってもよく、分離した２以上の液相を含んでいてもよい。
【００２５】
第１画分は、少なくとも多糖を含む多糖画分である。好ましくは、実質的にポリエーテルを含まない。また、第２画分は、少なくともポリエーテルを含むポリエーテル画分である。好ましくは実質的に多糖を含まない。ここで、「実質的にポリエーテルを含まない」とは、本発明の作用効果を失わない程度の微量のポリエーテルを含み得ることを意味する。「実質的に多糖を含まない」とは、本発明の作用効果を失わない程度の微量の多糖を含み得ることを意味する。また、第１画分は、第２画分よりも高濃度の細胞外小胞を含む。第２画分は、第１画分よりも低濃度で細胞外小胞を含むか、細胞外小胞を実質的に含まない。
【００２６】
第１画分と第２分画が分離した状態は、第１画分と第２画分が相分離を起こしている状態をいう。各相の境界は明確に目視できる必要はなく、細胞外小胞の濃度が異なる少なくとも２の画分を得られればよい。遠心等によってより明確な境界を有する２画分を得ることもできる。
【００２７】
単位w/v%は質量／容積％を表す。
【００２８】
本発明は、複数の態様を含む。
【００２９】
［細胞外小胞の濃縮方法］
本発明の第１の態様は、細胞外小胞をインビトロで濃縮する方法に関する。
具体的には、第１の態様は、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルの混合液を調製する工程を含む。混合液は少なくとも第１画分及び第２画分を含む。第１画分において、細胞外小胞は、分散した状態、沈降した状態、又はペレット状となっている。第１画分は第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含む。また、第１画分は液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む。
ここで、細胞外小胞を濃縮するとは、液体試料よりも、高濃度の細胞外小胞を含む液体を調製することを意味する。本態様の濃縮方法は、細胞外小胞の検出や細胞外小胞内のマーカーの検出のための前処理として用いられ得る。
【００３０】
混合液中の多糖の含有量は、終濃度として、2 w/v％以上であり、好ましくは5 w/v％以上である。多糖の含有量の上限値は、8 w/v％である。
【００３１】
混合液中のポリエーテルの含有量は、終濃度として、4 w/v％以上であり、好ましくは5 w/v％以上である。ポリエーテルの含有量の上限値は、10 w/v％であり、好ましくは8 w/v％である。
【００３２】
混合液中の多糖とポリエーテルの終濃度比は、８：２〜４：８であり、好ましくは８：２〜５：５である。ポリエーテルの分子量が平均分子量規格値で2,700〜3,500の時には、混合液中の多糖とポリエーテルの終濃度比は、10：５〜４：８であることが好ましい。また、ポリエーテルの分子量が平均分子量規格値で15,000〜25,000の時には、混合液中の多糖とポリエーテルの終濃度比は、８：２〜５：５であることが好ましい。前記終濃度比は、質量比である。
【００３３】
液体試料と混合される多糖及びポリエーテルは、固体であっても、液体であってもよい。また、多糖又はポリエーテルを溶媒に溶解してから液体試料と混合してもよい。溶媒として、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、PBS）等を挙げることができる。
【００３４】
また、本態様は、混合液を調製する工程の後に、第１画分を回収する工程をさらに含んでいてもよい。回収方法は、第１画分の全部又は一部を第２画分から分けて取得できる限り制限されない。例えば、回収方法は、第１画分と第２画分を相分離させたあと、第２画分を除去し第１画分を残すこと、又は第１画分をピペット等で吸引し、必要に応じて別の容器に移すことを含む。
【００３５】
さらに、本態様は、混合液を調製する工程の後、前記第１画分を回収する工程の前に、少なくとも前記第１画分と前記第２画分をより明確に相分離させるために、混合液を遠心する工程を含んでいてもよい。本態様によれば、従来よりも低い遠心加速度であっても容易に相分離を行うことができる。例えば、10,000 g未満、5,000 g以下、あるいは3,000 g以下であってもよい。遠心加速度の下限値は、1,000 gであることが好ましい。遠心加速度の範囲として好ましくは、1,000〜3,000 gである。また、遠心時間は好ましくは２分以内であり、好ましくは１分30秒以内であり、より好ましくは1分以内である。遠心時間の下限値は、30秒間であることが好ましい。遠心する際の温度は、作業雰囲気温度である限り制限されない。好ましくは5℃〜40℃である。
【００３６】
さらにまた、本態様は、混合液を調製する工程の後、かつ混合液を遠心する工程の前に、混合液を撹拌する工程を含んでいてもよい。撹拌方法は特に限定されず、ボルテックスミキサーによる撹拌であっても、ピペッティングを２〜５回行う撹拌でもよい。
［細胞外小胞の検出方法及び生体分子の検出方法］
本発明の第２の態様は、細胞外小胞をインビトロで検出する方法に関する。
【００３７】
具体的には、第２の態様は、細胞外小胞を含む液体試料、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルの混合液を調製する工程を含む。混合液は少なくとも第１画分及び第２画分を含む。第１画分において、細胞外小胞は、分散した状態、沈降した状態、又はペレット状となっている。第１画分は前記第２画分よりも細胞外小胞を高い濃度で含む。また、第１画分は液体試料よりも細胞外小胞を高い濃度で含む。
また、細胞外小胞の検出方法は、第１画分を回収する工程と、第１画分中の細胞外小胞を検出する工程とを含む。
【００３８】
細胞外小胞は、粒子を検出するための公知の方法に従って検出することができ、例えば、光学顕微鏡、電子顕微鏡、フローサイトメータ等を用いて検出することができる。ここで、検出とは、定性的検出、定量、及び半定量的検出を含む。ここで、半定量的検出とは、「陰性」、「弱陽性」、「強陽性」等のように濃度を段階的に判定することである。
【００３９】
細胞外小胞に存在する生体分子は、生体分子を検出するための公知の方法に従って検出することができる。例えば生体分子が、タンパク質やポリペプチドである場合には、ELISA法又はウエスタンブロッティング法により検出することができる。例えば、生体分子が核酸である場合には、PCR法、RT-PCR法、又はマイクロアレイ法等で検出することができる。
【００４０】
言い換えると、本第２の態様における第１画分中の細胞外小胞を検出する工程を第１画分中の細胞外小胞に含まれる生体分子を検出する工程に替えることで、本発明の第３の態様である生体分子の検出方法とすることができる。
【００４１】
第２の態様及び第３の態様は、混合液を調製する工程の後、かつ第１画分を回収する工程の前に、少なくとも第１画分と第２画分をより明確に相分離させるために、混合液を遠心する工程を含んでいてもよい。
また、第２の態様及び第３の態様は、混合液を調製する工程の後、かつ混合液を遠心する工程の前に、混合液を撹拌する工程を含んでいてもよい。
【００４２】
第２の態様及び第３の態様において、第１画分を回収する工程の後、細胞外小胞が溶液中に沈降している状態又はペレット状となっている場合は、検出工程（細胞外小胞を検出する工程又は生体分子を検出する工程）の前に細胞外小胞を分散させる工程を実施してもよい。分散工程では、第１画分中で細胞外小胞を分散させるか、あるいは水、生理食塩水、緩衝液（例えば、PBS）等の他の溶媒に分散させることができる。
第２の態様及び第３の態様において、第１の態様と共通する工程及び操作については、第１の態様における説明をここに援用する。第２の態様及び第３の態様において、第１の態様と共通する用語については、第１の態様における説明をここに援用する。
【００４３】
［細胞外小胞濃縮用試薬及び細胞外小胞濃縮用キット］
本発明の第４の態様は、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルよりなる群から選択される少なくとも一種を含む細胞外小胞濃縮用試薬に関する。
第４の態様において、多糖又は平均分子量20,000以下のポリエーテルは、固体であっても、溶液であってもよい。
【００４４】
本発明の第５の態様は、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む、細胞外小胞濃縮用キットに関する。本発明のキットには、１つの容器で構成されるものも含む。
第５の態様において「多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む」とは、前記キットが、
（ｉ）最初から多糖とポリエーテルの両方が含まれている配合試薬である場合、つまり、多糖とポリエーテルが１つの容器に入っている場合、
（ｉｉ）多糖とポリエーテルとがおのおの別個の包装形態で存在し、組み合わせ物として提供される場合、又は
（ｉｉｉ）多糖とポリエーテルとがおのおの別個の包装形態で、また別個の流通経路で市場に存在し、使用時に組み合わせて使用される場合を包含する意味で用いられる。
【００４５】
キットの１例を図６に示す。キット１０には、多糖を含む第１の容器１１、平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む第２の容器１２が含まれる。また、キット１０には水、生理食塩水、緩衝液（例えば、PBS）等の溶媒を含む第３の容器１３がさらに梱包されていてもよい。さらに、キット１０には、箱１５が含まれていてもよい。さらにまた、キット１０には取扱説明書あるいは取り扱い説明書を閲覧できるURLを記載した用紙１４が含まれてもよい。
【００４６】
第５の態様において、平均分子量20,000以下のポリエーテル又は多糖は、固体の状態であっても、溶液の状態であってもよい。
【００４７】
本発明の第４の態様、及び第５の態様にかかる前記溶液の調製に用いられる溶媒は、水、生理食塩水、又は緩衝液（例えば、PBS）等を含む。また、溶液中の多糖又はポリエーテルの濃度は、上記細胞外小胞の濃縮方法において説明した、混合物中での終濃度に調整できる限り制限されない。
【００４８】
本明細書において「多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテル」との表現には、「多糖と平均分子量20,000以下のポリエーテルを含む」、「実質的に多糖と平均分子量20,000以下のポリエーテルからなる」、「多糖と平均分子量20,000以下のポリエーテルからなる」のすべての意味が含まれるものとする。
【００４９】
本発明は、細胞外小胞濃縮用試薬又は細胞外小胞濃縮用キットの製造のための、多糖及び平均分子量20,000以下のポリエーテルの用途を含む。細胞外小胞濃縮用試薬及び細胞外小胞濃縮用キットについては、上述の通りである。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定し解釈されるものではない。
【００５１】
実験例１：液−液相分離の検証
１．方法
相分離に与えるポリエーテルの分子量の影響、及びポリエーテルと多糖の比率が相分離に与える影響を検証するため、以下のプロトコールで実験を行った。ポリエーテルとしてポリエチレングリコール（以下、「PEG」と略す）を使用し、多糖としてデキストラン（以下、「Dex」と略す）を使用した。
（１）200μLのサンプル（水、PBSもしくは培地）に対して、30 w/v% PEG（ナカライテスク株式会社）水溶液、及び30 w/v% Dex（Sigma-Aldrich社（米国）, 平均分子量: 450,000-650,000）水溶液を最終合計容量が300μLとなるように添加した。すなわち、PEG水溶液とDex溶液の合計容量は100μlとした。相分離に与えるPEGの平均分子量の影響を検証する際には、表１に示す平均分子量のPEG水溶液を50μl、及びDex水溶液を50μlずつサンプルに添加した。また、PEGとDexの比率が相分離に与える影響を検証する際には、平均分子量15,000-25,000のPEGを用い、PEG水溶液とDex水溶液を表２及び３に示す各混合液中の終濃度となるように混合した。培地はRPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich社、R8758)に10％（終濃度） FBS （HycloneLaboratories, GEヘルスケア・ジャパン株式会社）、及び100倍希釈Gibco（商標）Antibiotic-Antimycotic （Thermo Fisher Scientific株式会社、15240-062）を添加し使用した。
（２）サンプルにPEG水溶液、及びDex水溶液を添加後、数回ピペッティングにより攪拌した。
（３）ピペッティング後、卓上遠心分離機を用いて、1,260〜2,840 gで１分間遠心した。図１(a)に上記工程の概略図を示す。また、図１(b)には、実際に遠心した後のチューブの写真を示す。
【００５２】
２．結果
２−１．ポリエーテルの分子量が相分離に与える影響
PBSをサンプルとして平均分子量の異なるPEGを用いて液相の分離の有無を検証した。
表１に示すように、PEGの平均分子量が2,700以上で液相の分離が確認された。
【００５３】
【表１】
2018163043.tif 000005
＊１：表中「○」は、液相が２層に分離したことを示す。
＊２：平均分子量の規格値は、ポリマーの分子量の平均値が含まれる範囲を示す。
＊３：平均分子量の試験値は、試薬メーカで実際に測定した平均分子量を示す。
【００５４】
２−２．PEGとDexの比率が相分離に与える影響
（１）PEG20000の場合
PEG20000及びDexの比率を変化させて相分離の有無を検証した。
表２に示す終濃度となるようにPEGとDexを混合したことを除いては、上記プロトコールにしたがった。表２に示すように、PEGとDexの終濃度比が５：５から８：２の間で液相の分離が確認された。
【００５５】
【表２】
2018163043.tif 000006
＊１：表中「○」は、液相が２層に分離したことを示す。また、表中「×」は液相が２層に十分に分離しなかったことを示す。
【００５６】
（２）PEG4000の場合
PEG4000及びDEXを用いて上記と同様に相分離の有無を検証した。
表３に示す終濃度となるようにPEGとDexを混合したことを除いては、上記プロトコールにしたがった。表３に示すように、PEGとDexの終濃度比が４：８及び10：５の間で液相の分離が確認された。
【００５７】
【表３】
2018163043.tif 000007
＊１：表中「○」は、液相が２層に分離したことを示す。
【００５８】
（１）及び（２）の結果から、混合液に含まれるPEGの濃度が高いほど、相分離が起こりやすいと考えられた。
【００５９】
２−３．ポリエーテルとデキストランの比率が液相の上層と下層の容積に与える影響
水、PBSもしくは培地をサンプルとして、表４から表６に示す終濃度となるようにPEGとDexを混合したことを除いては、上記プロトコールにしたがって、遠心した後の２層に分離した液相の上層と下層の容積比率を検討した。
【００６０】
【表４】
2018163043.tif 000008
【００６１】
【表５】
2018163043.tif 000009
【００６２】
【表６】
2018163043.tif 000010
【００６３】
溶液中のポリエーテルの濃度が増加するに従い、下層の容積が減少する傾向が認められた。この傾向から、下層に目的分子を選択的に分配することで濃縮が実現できると考えられた。
【００６４】
実施例１：二相分配による細胞外小胞の濃縮
実験例１の結果に基づいて確立されたPolymer two phase partition (PTPP)法に従って、実際に血清からの細胞外小胞の濃縮を行った。
【００６５】
１．方法
１−１．細胞外小胞の濃縮
以下の工程にしたがって、患者血清から細胞外小胞を濃縮した。
（１）PEG6000を含むPEG水溶液又はPEG35000を含むPEG水溶液と、分子量500000を有するDex水溶液をそれぞれ30w/v%となるように調製した。
（２）PBS、大腸がん患者由来の血清あるいは当該血清をPBSで4倍希釈した希釈血清をそれぞれ別の1.5 mlチューブに200μLずつ添加した。
（３）上記（１）で調製したPEG6000を含むPEG水溶液又はPEG35000を含むPEG水溶液を80μLずつ上記（２）の血清を添加したチューブと、希釈血清を添加したチューブにそれぞれ添加した。
（４）上記（１）で調製したDex水溶液を20μLずつ上記（３）の各チューブに添加し、数回ピペッティングすることにより攪拌した。
（５）卓上微量遠心機で1,260〜2,840 gで１分間遠心分離した。
（６）上層、下層に分離したことを確認し、氷上で保管した。
【００６６】
１−２．細胞外小胞のELISA解析
１−２−１．ELISA解析用サンプル
以下の手順に従って、ELISA解析用のサンプルを調製した。
（１）上記１−１．で遠心分離した各チューブの上層からそれぞれ200μLを回収した（以下、「上層サンプル」と呼ぶ）。
（２）上層を回収した各チューブにPBSを50μLずつ添加し、沈殿物を分散させた。以下、「下層サンプル」と呼ぶ）。
（３）それぞれのサンプルを解析まで4℃で保管した。
【００６７】
１−２−２．ELISA解析用プレートの作成
以下の手順に従って、ELISA解析用の96ウェルプレートを作成した。
（１）96ウェルプレート（イムノプレート（Thermo Fisher Scientific株式会社））の各ウェルに、捕捉抗体である抗CD9抗体（BioLegend社（米国）を5μg/mLに希釈し90μLずつ添加し、4℃で一晩静置した。
（２）0.05% Tween20添加PBS（PBST）250μLで各ウェルを３回洗浄し、最後にPBSTをできる限り除去した。
【００６８】
１−２−３．ELISA解析
以下の手順にしたがって、ELISA法により細胞内小胞に含まれるCD9タンパク質の測定を行った。
（１）１−２−２で作成した96ウェルプレートをブロッキングするため、１% BSAを含むPBSTを200μLずつ各ウェルに添加し、室温で1時間30分静置した。
（２）PBST  250μLで各ウェルを３回洗浄し、最後にPBSTをできる限り除去した。
（３）コントロールのエクソソーム（HCT116細胞由来）及び上記１−２−１．で調製した上層サンプルと下層サンプルを、ブロッキングした96ウェルプレートに50μLずつに添加した。
（４）37℃で、400rpmで振盪しながら2時間インキュベーションした。
（５）上記（４）の反応終了後、PBST  250μLで各ウェルを３回洗浄し、最後にPBSTをできる限り除去した。
（６）検出用のアルカリホスファターゼ標識抗CD9抗体を1,200倍に希釈し、50μLずつ各ウェルに添加した。アルカリホスファターゼ標識抗CD9抗体は、Alkaline Phosphatase Labeling Kit（Dojindo株式会社、日本）を使い、キットに添付のプロトコールにしたがって抗CD9抗体（BioLegend社）にアルカリホスファターゼを標識することにより調製した。
（７）検出用抗体を添加後、37℃で、400rpmで振盪しながら1時間30分インキュベーションした。
（８）上記（７）の反応終了後、PBST  250μLで各ウェルを３回洗浄し、最後にPBSTをできる限り除去した。
（９）HISCL発光基質R4及びR5（シスメックス株式会社）をR4：R5＝1:2で混合し、当該混合液を100μLずつ各ウェルに添加し、室温で10分間静置した。
（１０）その後、ルミノメータ（TECANジャパン）で発光強度を測定した。
【００６９】
１−３．結果
図２に、血清及び希釈血清に対して、PEG6000を使用したPTPP法（PEG6000-PTPP法）及びPEG35000を使用したPTPP法（PEG35000-PTPP法）を行った結果を示す。
【００７０】
PEG6000-PTPP法に比べ、PEG35000-PTPP法では第２画分に相当する上層の白濁が顕著であった。このことから、PEG35000-PTPP法では下層へ濃縮できていない細胞外小胞が存在していると考えられた。そして、この結果として、細胞外小胞の濃縮率や回収率や低下する畏れがあると考えられた。
【００７１】
次にELISA法によって細胞外小胞中のCD9タンパク質を測定し、その発光強度により細胞外小胞の回収率を評価した。図３に、血清に対して、PEG6000-PTPP法あるいはPEG35000-PTPP法を行い回収した各上層サンプル及び各下層サンプルの発光強度を示した。PEG6000を使用した場合であっても、PEG35000を使用した場合であっても、ほとんどの細胞外小胞は、下層に含まれていた。しかし、PEG6000-PTPP法では、PEG35000を使用したPTPP法と比較してCD9タンパク質に由来する発光が強く、多くの細胞外小胞を含んでいると考えられた。
また、表７に希釈血清を用いた場合の細胞外小胞の回収率を示す。
【００７２】
【表７】
2018163043.tif 000011
【００７３】
表７に示すように、PEG6000-PTPP法とPEG35000-PTPP法とで下層サンプルに含まれる細胞外小胞と上層サンプルに含まれる細胞外小胞の比（下層／上層）を比較すると、PEG6000-PTPP法では、20.2であり、PEG35000-PTPP法では、14.4であった。また希釈血清に替えてPBSに対してPEG6000-PTPP法あるいはPEG35000-PTPP法を行い分離した下層サンプルの発光強度をnとし、希釈血清に対してPEG6000-PTPP法あるいはPEG35000-PTPP法を行い分離した下層サンプルの発光強度をsとして、s/n比を求めると、PEG6000-PTPP法では、s/n比が193.6であり、PEG35000-PTPP法では、s/n比が108.0であった。さらに、PTPP法で得られた下層サンプルと上層サンプルの発光強度の合計と下層サンプルの発光強度から細胞外小胞の回収率を算出すると、PEG6000-PTPP法は45.5%であるのに対して、PEG35000-PTPP法は27.2%であり、PEG35000-PTPP法よりもPEG6000-PTPP法の方が回収率は1.7倍高かった。
【００７４】
このことから、非特許文献１及び非特許文献２において細胞外小胞の濃縮に使用されている高分子量のPEG35000よりも、低分子量であるポリエーテルを使用する方が、細胞外小胞を効率よく濃縮できることが明らかとなった。
【００７５】
実施例２：polymeric precipitation法とPTPP法との比較
１．方法
本発明のPTPP法と従来の細胞外小胞の濃縮法であるpolymeric precipitation法との間で細胞外小胞の回収率及び操作性の比較を行った。
細胞外小胞を濃縮するためのサンプルとしては、コントロールのエクソソーム（HCT116細胞由来）を含むPBSを用いた。
PTPP法は、PEG6000を使用し実施例１の１−１．と同じ方法で行った。
【００７６】
polymeric precipitation法による細胞外小胞の濃縮には、市販のEXO-Prep One step Exosome isolation Reagent（HansaBioMed社）を使用し、当該試薬に添付のプロトコールにしたがって行った（以下、「EXO-Prep法」と称する）。
前記２つの方法の回収率は、miRNA21（以下、「miR21」とも称する）のコピー数により評価した。
【００７７】
High Pure miRNA isolation kit（Roche Diagnostics株式会社）を用いて、各方法により回収した細胞外小胞濃縮液からtotal RNAを回収した。total RNA 1μLを用いて定量RT-PCRを行い、miR21のコピー数を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan （商標） MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan （商標） MicroRNA AssaysおよびTaqMan（商標）Universal Master Mix II、Applied Biosystems （商標） 7500fast（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、添付プロトコールに従って行った。  陽性対照として、細胞外小胞を濃縮する前のエクソソーム含有PBSを使用した。
【００７８】
２．結果
図４に陽性対照と、PTPP法又はEXO-Prep法により濃縮された細胞外小胞に含まれるmiR21のコピー数を示す。陽性対照のmiR21のコピー数は、陽性対照200μlに含まれるmiR21の総コピー数を表す。この陽性対照のmiR21の総コピー数を基準としてPTPP法及びEXO-Prep法の回収率を求めた場合、PTPP法は72.1％であり、EXO-Prep法は67.5％であった。PTPP法の方が高い回収率を示した。
一方で、操作性を比較すると、EXO-Pre法ではエクソソームの濃縮に1時間程度かかったが、PTPP法は1分程度で濃縮作業が完了した。
【００７９】
また、エクソソーム画分をELISA等の測定に使用する場合は、エクソソームを何らかの溶液中に分散させる必要がある。濃縮されたエクソソーム画分の分散しやすさを比較すると、EXO-Prep法で得られたエクソソーム画分は、容器底部で固いペレット状となっていたため、15分程度ピペッティングしても完全に分散させることはできなかった。一方、本発明においても遠心後のエクソソーム画分は、容器底部にペレット状となっていたが、数回のピペッティングで溶液中に分散させることができる柔らかいペレットであった。このため、ピペッティングに要した時間は数秒程度であった。
【００８０】
したがって、PTPP法は細胞外小胞の回収率、細胞外小胞の濃縮時間及び濃縮された細胞外小胞の操作性の点において、EXO-Prep法よりも顕著に優れていると考えられた。
【００８１】
実施例３：操作性の検討
PEG35000のような高分子量のPEGを使用する場合と、PEG6000のような比較的分子量の小さいPEGを使用する場合とで、細胞外小胞を濃縮する際の操作性を比較した。
【００８２】
30w/v%のPEG6000水溶液と30w/v%のPEG35000水溶液をそれぞれピペットマンで200μL吸引する際にかかった時間を指標として吸引し易さを比較した。
【００８３】
図５に示すように、PEG35000水溶液は200μLを吸引する際に16秒以上を要した。それに対して、PEG6000水溶液は10分の1以下の時間で同量を吸引することが可能であった。吸引時間に長くなるほど、ピペット操作の個人差、時間を数える速さの個人差、あるいは独立した実験における試薬の吸引量の差が出ることが危惧され、結果として実験の再現性が得られない可能性があると考えられた。さらに、ピペットマンで1つの試薬を吸引する際に16秒待つことはあまり現実的ではないと考えられた。
【００８４】
そのため、再現性良く実験を実施することや本技術の自動化を考えると、短時間で試薬を扱うことができ、より高い濃縮率が得られるPEG6000の方が適していると考えられた。
【００８５】
さらに、PEG35000を高濃度で使用すると、PEG、Dex及びサンプルの混合液の粘度が上昇し、例え室温下であっても操作性が悪いことも明らかとなった。PEG35000を使用する際に良好な操作性を得るためには、Dex及びサンプルと混合するPEG35000のような高分子量のPEGの含有量を下げる必要があった。しかし、この場合、PTPP法の操作を4℃で行わなければ、相分離が生じなかった。したがって、室温で、操作性よくPTPP法を行うためには、PEG35000よりも低分子量のPEGを使用する必要があると考えられた。
【符号の説明】
【００８６】
キット１０
第１の容器１１
第２の容器１２
第３の容器１３
取扱説明書１４
箱１５
【図１】
2018163043.tif 000012
【図２】
2018163043.tif 000013
【図３】
2018163043.tif 000014
【図４】
2018163043.tif 000015
【図５】
2018163043.tif 000016
【図６】
2018163043.tif 000017