(57)【要約】【課題】嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際に匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫嗅覚受容体共受容体を提供すること。【解決手段】本発明の嗅覚受容体共受容体は、以下の第一のアミノ酸配列と、第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に続いて以下の第二のアミノ酸配列とを有する：（１）第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ末端から、第４膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列、及び（２）第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つカルボキシル末端側のアミノ酸残基から、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのカルボキシル末端までの連続したアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の第一のアミノ酸配列と、前記第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に続いて以下の第二のアミノ酸配列とを有する嗅覚受容体共受容体：
（１）第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、前記第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ末端から、第４膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列、及び
（２）前記第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、前記第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて前記第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つカルボキシル末端側のアミノ酸残基から、前記第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのカルボキシル末端までの連続したアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列。
【請求項２】
前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、内翅上目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項１に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項３】
前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、双翅目昆虫、鱗翅目昆虫及び膜翅目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項１又は２に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項４】
前記第一の昆虫及び前記第二の昆虫が、カ科昆虫、ショウジョウバエ科昆虫、カイコガ科昆虫及びミツバチ科昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、請求項１から３のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項５】
前記第一の昆虫が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のいずれかの昆虫である、請求項１から４のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項６】
前記第一のアミノ酸配列が、配列番号１、１３５又は１３６のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１から５のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項７】
前記第二の昆虫が、ネッタイシマカ又はセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のいずれかの昆虫である、請求項１から６のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項８】
前記第二のアミノ酸配列が、配列番号２又は１３７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１から７のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項９】
前記第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、前記第二の昆虫がセイヨウミツバチである、請求項１から４のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１０】
配列番号１００に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１１】
前記第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、前記第二の昆虫がネッタイシマカである、請求項１から４のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１２】
配列番号７１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１３】
前記第一の昆虫がネッタイシマカであり、前記第二の昆虫がセイヨウミツバチである、請求項１から４のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１４】
配列番号１０８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の嗅覚受容体共受容体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリヌクレオチド又は請求項１６に記載の発現プラスミドが導入された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嗅覚受容体共受容体に関する。本発明はまた、嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド、及び当該発現プラスミドが導入された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、揮発性化学物質（匂い物質）を測定する様々な技術が知られている。このような技術は、癌診断等の診断・ヘルスケア分野、人探索、麻薬等の検出等の防災・セキュリティ分野、有害物質の検出等の環境分野等への応用が期待されている。
【０００３】
匂い物質の検出には犬や線虫等の生物を利用することがある。しかしながら、生物を利用する方法は高感度に匂い物質を検知できるものの、体調や個体によってバラツキがあるため安定性に欠け、また、集中力の持続時間に限界があるため長時間の利用が難しいといった側面もあった。
【０００４】
そのため、生物そのものではなく、生物が備える嗅覚機能が注目されている。特に昆虫の嗅覚機能は匂い物質の認識特異性が高いとされており、嗅覚センサー等への利用が模索されている。昆虫の嗅覚器には、匂い物質を認識する嗅覚受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲ」という場合もある。）と嗅覚受容体共受容体（ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲＣＯ」又は「共受容体」という場合もある。）とが形成した嗅覚受容体複合体が存在しており、匂い物質により活性化されると、上記複合体がイオンチャネル活性を示し、それにより匂い物質が検知される（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｕ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｋａｕｐｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  １１（２０１０），ｐ１８８−２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、匂い物質を現場で検出しようとする場合、その濃度は非常に低い場合がある。そのため、匂い物質を検出するために用いられる嗅覚センサーは、高感度であることが求められる。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際に匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、嗅覚受容体共受容体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、異種の２つの昆虫の嗅覚受容体共受容体を組み換えたキメラ嗅覚受容体共受容体を検討した結果、上記２種類の嗅覚受容体共受容体の組み換え位置が嗅覚受容体共受容体における第４膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基付近である場合に、得られたキメラ嗅覚受容体共受容体を有する嗅覚受容体複合体は、元の（オリジナルの）嗅覚受容体共受容体を有する嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］  以下の第一のアミノ酸配列と、第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に続いて以下の第二のアミノ酸配列とを有する嗅覚受容体共受容体：
（１）第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ末端から、第４膜貫通ドメインの最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である第一のアミノ酸配列、及び
（２）第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列であって、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて第一のアミノ酸配列の最もカルボキシル末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つカルボキシル末端側のアミノ酸残基から、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのカルボキシル末端までの連続したアミノ酸配列である第二のアミノ酸配列。
［２］第一の昆虫及び第二の昆虫が、内翅上目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、［１］に記載の嗅覚受容体共受容体。
［３］第一の昆虫及び第二の昆虫が、双翅目昆虫、鱗翅目昆虫及び膜翅目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、［１］又は［２］に記載の嗅覚受容体共受容体。
［４］第一の昆虫及び第二の昆虫が、カ科昆虫、ショウジョウバエ科昆虫、カイコガ科昆虫及びミツバチ科昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫である、［１］〜［３］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［５］第一の昆虫が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のいずれかの昆虫である、［１］〜［４］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［６］第一のアミノ酸配列が、配列番号１、１３５又は１３６のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、［１］〜［５］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［７］第二の昆虫が、ネッタイシマカ又はセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のいずれかの昆虫である、［１］〜［６］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［８］第二のアミノ酸配列が、配列番号２又は１３７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、［１］〜［７］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［９］第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである、［１］〜［４］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［１０］配列番号１００に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、［９］に記載の嗅覚受容体共受容体。
［１１］第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がネッタイシマカである、［１］〜［４］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［１２］配列番号７１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項［１１］に記載の嗅覚受容体共受容体。
［１３］第一の昆虫がネッタイシマカであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである、［１］〜［４］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体。
［１４］配列番号１０８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、［１３］に記載の嗅覚受容体共受容体。
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載の嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド。
［１７］［１５］に記載のポリヌクレオチド又は［１６］に記載の発現プラスミドが導入された細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際に匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、キメラ嗅覚受容体共受容体を提供することができる。本発明のキメラ嗅覚受容体共受容体を有する嗅覚受容体複合体は、当該キメラ嗅覚受容体共受容体の元の２種類の嗅覚受容体共受容体をそれぞれ有する嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れる。本発明はまた、本発明に係るキメラ嗅覚受容体共受容体をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが導入された発現プラスミド、及び当該ポリヌクレオチドもしくは当該発現プラスミドが導入された細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡａＯＲＣＯ、ＤｍＯＲＣＯ、又は組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体（Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ）のいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図２】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡｍＯＲＣＯ、ＤｍＯＲＣＯ、又は組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体（Ｄｍ−ＡｍＯＲＣＯ）のいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図３】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡａＯＲＣＯ、ＤｍＯＲＣＯ、又は各種キメラ共受容体（Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ）のいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図４】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡａＯＲＣＯ、ＤｍＯＲＣＯ、又は各種キメラ共受容体（Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ）のいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図５】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡａＯＲＣＯ、ＤｍＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ、又は、膜貫通ドメイン若しくは細胞内領域及び細胞外領域を組み換えた各種キメラ共受容体（Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ）のいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図６】嗅覚受容体としてＤｍＯＲ４７ａを、共受容体としてＤｍＯＲＣＯ、ＡｍＯＲＣＯ、又はＤｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかを発現する細胞に対し、ペンチルアセテートを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図７】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡａＯＲＣＯ、ＡｍＯＲＣＯ、又はＡａ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図８】嗅覚受容体としてＡａＯＲ８を、共受容体としてＡｇＯＲＣＯ、ＡｍＯＲＣＯ、又はＡｇ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかを発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。
【図９】嗅覚受容体としてＢｍＯＲ５６を、共受容体としてＢｍＯＲＣＯ、又はＤｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかを発現する細胞に対し、ｃｉｓ−ジャスモンを添加した際の発光量の相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
昆虫の嗅覚受容体は、７回膜貫通構造を有するＧタンパク質共役型受容体の一種であり、その匂い物質の認識特異性が高い。いくつかの匂い物質特異的な嗅覚受容体が知られている。
【００１４】
昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に７回膜貫通構造を有する膜タンパク質であるものの、それ自身は匂い物質を認識せず、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。上記嗅覚受容体共受容体は、全ての昆虫に保存されており、Ｏｒｃｏファミリーとして知られている。Ｏｒｃｏファミリーの嗅覚受容体共受容体の多くは、そのアミノ末端（以下、「Ｎ末端」という場合もある。）からカルボキシル末端（以下、「Ｃ末端」という場合もある。）に向かって順に、Ｎ末端領域（ＮＴ）、第１膜貫通ドメイン（ＴＭ１）、第１細胞外ループ（ＥＣ１）、第２膜貫通ドメイン（ＴＭ２）、第１細胞内ループ（ＩＣ１）、第３膜貫通ドメイン（ＴＭ３）、第２細胞外ループ（ＥＣ２）、第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）、第２細胞内ループ（ＩＣ２）、第５膜貫通ドメイン（ＴＭ５）、第３細胞外ループ（ＥＣ３）、第６膜貫通ドメイン（ＴＭ６）、第３細胞内ループ（ＩＣ３）、第７膜貫通ドメイン（ＴＭ７）、及びＣ末端領域（ＣＴ）が連結されて構成される。
【００１５】
上記嗅覚受容体と上記嗅覚受容体共受容体とから構成されるヘテロ複合体である嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャンネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）等の陽イオンを細胞内に流入させる。
【００１６】
本実施形態の嗅覚受容体共受容体は、そのＮ末端から順に、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列である第一のアミノ酸配列と、第一の昆虫とは異種の第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの部分アミノ酸配列である第二のアミノ酸配列と、を有する。すなわち、本実施形態の嗅覚受容体共受容体は、第一のアミノ酸配列と、第一のアミノ酸配列の最もＣ末端側のアミノ酸残基に続いて、第二のアミノ酸配列とを有する。
【００１７】
本明細書において「バリアント」とは、対象となるタンパク質と比べ、共受容体としての機能は維持しているが、そのアミノ酸配列において、数アミノ酸残基が異なるタンパク質を指し、具体的には、アミノ酸残基が１〜１０個異なるものであってもよく、１〜５個異なるものであってもよく、１個もしくは２個異なるものであってもよい。かかるアミノ酸残基の相違は、具体的には、アミノ酸相違の欠失、置換、付加等である。これらには、共受容体が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への保存的置換をあげることができる。
【００１８】
第一の昆虫及び第二の昆虫は、互いに異種の昆虫である。第一の昆虫及び第二の昆虫は、内翅上目昆虫であってもよい。内翅上目昆虫としては、例えば、カ科、ショウジョウバエ科等の双翅目、カイコガ科等の鱗翅目、又はミツバチ科等の膜翅目が挙げられる。第一の昆虫及び第二の昆虫は、双翅目昆虫、鱗翅目昆虫及び膜翅目昆虫からなる群から選ばれる異種の昆虫であってもよい。カ科の昆虫としては、例えば、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、ネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）等が挙げられる。ショウジョウバエ科の昆虫としては、例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ウスグロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ）、クロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｖｉｒｉｌｌｉｓ）等が挙げられる。カイコガ科の昆虫としては、例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、イチジクカサン（Ｔｒｉｌｏｃｈａ  ｖａｒｉａｎｓ）等が挙げられる。ミツバチ科の昆虫としては、例えば、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、ヒメミツバチ（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒｅａ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）、セイヨウオオマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）等が挙げられる。
【００１９】
第一の昆虫としては、ネッタイシマカ、ガンビエハマダラカ又はキイロショウジョウバエが好ましい。第二の昆虫としては、ネッタイシマカ又はセイヨウミツバチが好ましい。第一の昆虫及び第二の昆虫は、互いに異種の昆虫であれば任意で組み合わせることができる。第一の昆虫及び第二の昆虫の具体的な組み合わせとしては、例えば、第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである組み合わせであってもよく、第一の昆虫がキイロショウジョウバエであり、第二の昆虫がネッタイシマカである組み合わせであってもよく、第一の昆虫がネッタイシマカであり、第二の昆虫がセイヨウミツバチである組み合わせであってもよい。
【００２０】
本実施形態の嗅覚受容体共受容体において、第一のアミノ酸配列は、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのＮ末端から、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列である。すなわち、第一のアミノ酸配列は、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのＮ末端領域（ＮＴ）から、第１膜貫通ドメイン（ＴＭ１）、第１細胞外ループ（ＥＣ１）、第２膜貫通ドメイン（ＴＭ２）、第１細胞内ループ（ＩＣ１）、第３膜貫通ドメイン（ＴＭ３）及び第２細胞外ループ（ＥＣ２）を経て、第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）の最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列である。第一のアミノ酸配列の最もＣ末端側のアミノ酸残基は、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおける、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基であってもよく、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後１５アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基であってもよく、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後１０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基であってもよく、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後５アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基であってもよく、第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基であってもよい。
【００２１】
第一のアミノ酸配列は、例えば、キイロショウジョウバエの嗅覚受容体共受容体のＮ末端領域のＮ末端アミノ酸残基から第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列（配列番号１）と、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、１００％同一であってもよい。
【００２２】
第一のアミノ酸配列は、例えば、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体のＮ末端領域のＮ末端アミノ酸残基から第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列（配列番号１３５）と、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、１００％同一であってもよい。
【００２３】
第一のアミノ酸配列は、例えば、ガンビエハマダラカの嗅覚受容体共受容体のＮ末端領域のＮ末端アミノ酸残基から第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列（配列番号１３６）と、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、１００％同一であってもよい。
【００２４】
本実施形態の嗅覚受容体共受容体において、第二のアミノ酸配列は、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列と第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのアミノ酸配列とをアライメント解析した場合、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントにおいて第一のアミノ酸配列の最もＣ末端側のアミノ酸残基に相当する位置の一つＣ末端側のアミノ酸残基から、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントのＣ末端までの連続したアミノ酸配列である。第二のアミノ酸配列は、例えば、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体又はそのバリアントの第２細胞内ループ（ＩＣ２）の最もＮ末端側のアミノ酸残基の前後約２０アミノ酸残基の範囲に位置するいずれかのアミノ酸残基から始まり、第５膜貫通ドメイン（ＴＭ５）、第３細胞外ループ（ＥＣ３）、第６膜貫通ドメイン（ＴＭ６）、第３細胞内ループ（ＩＣ３）、第７膜貫通ドメイン（ＴＭ７）を経て、Ｃ末端領域（ＣＴ）までのアミノ酸配列である。
【００２５】
すなわち、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とを有する本実施形態の嗅覚受容体共受容体は、第一の昆虫の嗅覚受容体共受容体において第二のアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸配列が、第二の昆虫の嗅覚受容体共受容体のアミノ酸配列に入れ替わったものである。第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列との間で、元の２種の嗅覚受容体共受容体のアミノ酸配列のアライメントにおいて相当する位置のアミノ酸残基に重複又は欠損は存在しない。
【００２６】
第二のアミノ酸配列は、例えば、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体の第２細胞内ループの最もＮ末端側のアミノ酸残基から、Ｃ末端領域のＣ末端アミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列（配列番号２）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、１００％同一であってもよい。
【００２７】
第二のアミノ酸配列は、例えば、ネッタイシマカの嗅覚受容体共受容体の第２細胞内ループの最もＮ末端側のアミノ酸残基から、Ｃ末端領域のＣ末端アミノ酸残基までの連続したアミノ酸配列（配列番号１３７）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、１００％同一であってもよい。
【００２８】
本実施形態のキメラ嗅覚受容体共受容体は、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とを有し、約４６０個から約５００個のアミノ酸残基からなる。本実施形態のキメラ嗅覚受容体共受容体は、そのＮ末端からＣ末端に向かって順に、Ｎ末端領域（ＮＴ）、第１膜貫通ドメイン（ＴＭ１）、第１細胞外ループ（ＥＣ１）、第２膜貫通ドメイン（ＴＭ２）、第１細胞内ループ（ＩＣ１）、第３膜貫通ドメイン（ＴＭ３）、第２細胞外ループ（ＥＣ２）、第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）、第２細胞内ループ（ＩＣ２）、第５膜貫通ドメイン（ＴＭ５）、第３細胞外ループ（ＥＣ３）、第６膜貫通ドメイン（ＴＭ６）、第３細胞内ループ（ＩＣ３）、第７膜貫通ドメイン（ＴＭ７）、及びＣ末端領域（ＣＴ）が連結されて構成される。
【００２９】
本実施形態のキメラ嗅覚受容体共受容体は、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有する。嗅覚受容体共受容体が嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力は、例えば、測定対象の嗅覚受容体共受容体と昆虫嗅覚受容体とを共発現する培養細胞を用いて測定することができる。具体的には、上記培養細胞に上記嗅覚受容体のリガンドを接触させ、細胞内カルシウム濃度の一過性の変化を測定する。測定対象の嗅覚受容体共受容体が上記能力を有していれば、嗅覚受容体の活性化によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の上昇が検出される。
【００３０】
本実施形態のキメラ嗅覚受容体共受容体のより具体的な例としては、
第一のアミノ酸配列がキイロショウジョウバエ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がセイヨウミツバチ共受容体の部分アミノ酸配列である嗅覚受容体共受容体、
配列番号１００に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
第一のアミノ酸配列がキイロショウジョウバエ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がネッタイシマカ共受容体の部分アミノ酸配列である上記嗅覚受容体共受容体、
配列番号７１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
第一のアミノ酸配列がネッタイシマカ共受容体の部分アミノ酸配列であり、第二のアミノ酸配列がセイヨウミツバチ共受容体の部分アミノ酸配列である上記嗅覚受容体共受容体、及び
配列番号１０８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体共受容体、
を挙げることができる。ここで、「９０％以上の同一性」としては、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％以上の同一性、又は１００％の同一性が挙げられる。
【００３１】
本実施形態の嗅覚受容体共受容体は、第一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、第二のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを、これらが読み枠を合わせて連結されるように一つの発現用プラスミドに導入し、この発現用プラスミドを細胞に導入して目的とするタンパク質を発現させた後、発現したタンパク質を精製する方法等により調製することができる。嗅覚受容体共受容体を細胞で発現させる方法は、特に限定されるものではなく公知の方法を用いることができる。第一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、第二のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを一つの発現用プラスミドに導入する際におけるＤＮＡ断片の比率（モル比率）は１：１が好ましい。細胞に発現プラスミドが導入されたことは、ＰＣＲ等の方法により確認することができる。細胞で発現させた嗅覚受容体共受容体は、細胞膜を可溶化した後、各種精製用カラムに供することにより精製することができる。
【００３２】
本実施形態のキメラ嗅覚受容体共受容体によれば、元の２種の嗅覚受容体共受容体よりも、嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際、匂い物質に対する検出感度に優れる。このような特性を有する嗅覚受容体共受容体は、より低濃度の匂い物質を検出することができる嗅覚センサーとして有用である。
【００３３】
本実施形態の嗅覚受容体共受容体を嗅覚受容体と共に用いて嗅覚受容体複合体を調製する場合、嗅覚受容体の種類は、標的とするリガンドに応じて適宜選択することができる。嗅覚受容体は、具体的には、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８、若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０、若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａであってもよい。
【００３４】
本実施形態のポリヌクレオチドは、上記キメラ嗅覚受容体共受容体をコードする。本実施形態のポリヌクレオチドは、第一のアミノ酸配列をコードする第一の塩基配列と、第二のアミノ酸配列をコードする第二の塩基配列とを有する。本実施形態のポリヌクレオチドは、第一の塩基配列を有するポリヌクレオチドと第二の塩基配列を有するポリヌクレオチドとを結合させる方法等により調製することができる。ポリヌクレオチド同士を結合させる方法は、特に限定されるものではなく公知の方法を用いることができ、例えば、発現用プラスミドと共にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）等を用いてもよい。この場合、本実施形態のポリヌクレオチドは、プラスミドに導入された状態で得ることができる。発現用プラスミドは、特に限定されるものではなく、例えば、ｐＣＤＮＡ３．１等を使用することができる。
【００３５】
本実施形態の細胞は上記本実施形態のポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドが導入された発現プラスミドが導入されており、上記嗅覚受容体共受容体を発現することができる。本実施形態の細胞は、上記本実施形態のポリヌクレオチド又は発現プラスミドを細胞に導入することで調製することができる。細胞としては、導入する発現プラスミドの種類に応じて適宜選択することができる。細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  由来の  Ｓｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系等の昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ−１１５細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
本実施例に記載の昆虫は以下のとおりである。
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ：以下、「ハマダラカ」又は「Ａｇ」という場合もある。）
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ：以下、「シマカ」又は「Ａａ」という場合もある。）
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：以下、「ショウジョウバエ」又は「Ｄｍ」という場合もある。）
セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ：以下、「ミツバチ」又は「Ａｍ」という場合もある。）
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ：以下、「カイコ」又は「Ｂｍ」という場合もある。）
【００３８】
＜共受容体の発現プラスミドの作製＞
ショウジョウバエ共受容体（以下、「ＤｍＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）成虫ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を鋳型に用いて、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgacaacctcgatgcagccgagcaagt；配列番号３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttgagctgcaccagcaccataaagt；配列番号４）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ-ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合し室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号５で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号５で示される塩基配列は配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００３９】
シマカ共受容体（以下、「ＡａＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；  ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号７）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaacacc；配列番号８）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した後、大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号９で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号９で示される塩基配列は配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００４０】
ミツバチ共受容体（以下、「ＡｍＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１１で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｍＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagttcaagcaacaagggctaa；配列番号１２）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa；配列番号１３）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した後、大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号１１で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１１で示される塩基配列は配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００４１】
ハマダラカ共受容体（以下、「ＡｇＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）Ｋｉｓｕｍ系統又はＧ３系統の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ1μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgcaagtccagccgaccaagtacgtcggcct；配列番号１５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttcagctgcaccagcaccatgaagt；配列番号１６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．４ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、当該プラスミドは、配列番号１７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１７で示される塩基配列は配列番号１８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００４２】
ショウジョウバエ共受容体とシマカ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミド
上述したＤｍＯＲＣＯの発現プラスミド１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマー１μＬと、１０μＭのリバースプライマー１μＬと、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び得られたＰＣＲ産物を表１に示す。
また、上述したＡａＯＲＣＯの発現プラスミド１μＬ（１００ｎｇ）を鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマー１μＬと、１０μＭのリバースプライマー１μＬと、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び得られたＰＣＲ産物を表２に示す。
【００４３】
表１に記載のＰＣＲ産物の一つと表２に記載のＰＣＲ産物の一つとを、表３に示す組合せで、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ショウジョウバエ共受容体及びシマカ共受容体に由来する各種キメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られたキメラ受容体発現プラスミドの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、各プラスミドはそれぞれ、配列番号５９〜６８で示される塩基配列のいずれかを含有することが判った。配列番号５９〜６８で示される塩基配列はそれぞれ、配列番号６９〜７８で示されるアミノ酸配列をコードする。上記キメラ受容体発現プラスミドの作製に用いたＰＣＲ産物の組み合わせと、キメラ共受容体コード領域の塩基配列の配列番号及びキメラ共受容体のアミノ酸配列の配列番号を表３に示す。
【００４４】
得られた発現プラスミドにコードされるキメラ共受容体のアミノ酸配列の構成を以下に示す。
Ｄｍ（ＮＴ−ＥＣ１）ＡａＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第１細胞外ループ（ＥＣ１）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２膜貫通ドメインからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ３）ＡａＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第３膜貫通ドメイン（ＴＭ３）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２細胞外ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）までのアミノ酸配列（そのＮ末端アミノ酸残基から２３４番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列）がショウジョウバエ共受容体由来（Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）、配列番号１）であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来（Ａａ（ＩＣ２−ＣＴ）、配列番号１３７）である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）ＡａＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第５膜貫通ドメイン（ＴＭ５）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第３細胞外ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ６）ＡａＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第６膜貫通ドメイン（ＴＭ６）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第３細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−７９２）ＡａＯＲＣＯでは、そのＮ末端アミノ酸残基から２６４番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、２６５番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−８７９）ＡａＯＲＣＯでは、そのＮ末端アミノ酸残基から２９３番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、２９４番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−９６９）ＡａＯＲＣＯでは、そのＮ末端アミノ酸残基から３２３番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、３２４番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−１０８０）ＡａＯＲＣＯでは、そのＮ末端アミノ酸残基から３６０番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、３６１番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−６３６）ＡａＯＲＣＯでは、そのＮ末端アミノ酸残基から２１２番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、２１３番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
【００４５】
【表１】
2018050556.tif 000002
【００４６】
【表２】
2018050556.tif 000003
【００４７】
【表３】
2018050556.tif 000004
【００４８】
膜貫通ドメインがショウジョウバエ共受容体由来であり、それ以外の領域がシマカ共受容体由来のキメラ共受容体（以下、「Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号７９で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号８０）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＡａＯｒｃｏ（ＩＣ２−ＣＴ）−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaaca；配列番号８１）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号７９で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号７９で示される塩基配列は配列番号８２で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯｒｃｏにコードされるキメラ共受容体では、第１膜貫通ドメイン、第２膜貫通ドメイン、第３膜貫通ドメイン、及び第４膜貫通ドメインのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、それ以外の領域のアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
【００４９】
アミノ末端領域、第１細胞外ループ、第１細胞内ループ、及び第２細胞外ループがショウジョウバエ共受容体由来であり、それ以外の領域がシマカ共受容体由来のキメラ共受容体（以下、「Ｄｍ（ＴＭ１−４Ａａ）ＡａＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号８３で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯｒｃｏ（ＮＴ−ＴＭ４）−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgacaacctcgatgcagccgagcaa；配列番号８４）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＡａＯｒｃｏ  （ＩＣ２−ＣＴ）−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaaca；配列番号８５）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｄｍ（ＴＭ１−４Ａａ）ＡａＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号８３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号８３で示される塩基配列は配列番号８６で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯｒｃｏにコードされるキメラ共受容体では、アミノ末端領域、第１細胞外ループ、第１細胞内ループ、及び第２細胞外ループのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第１膜貫通ドメイン、第２膜貫通ドメイン、第３膜貫通ドメイン、及び第４膜貫通ドメインのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来である。
【００５０】
ショウジョウバエ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミド
表１に示すＰＣＲ産物のＤｍ（ＮＴ−ＴＭ３）、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）及びＤｍ（ＮＴ−Ｔｍ６）を調製した。
【００５１】
上述したＡｍＯＲＣＯの発現プラスミド１μＬ（１００ｎｇ）を鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマー１μＬと、１０μＭのリバースプライマー１μＬと、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせ及び得られたＰＣＲ産物を表４に示す。
【００５２】
上記ＰＣＲ産物Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ３）、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）又はＤｍ（ＮＴ−Ｔｍ６）の一つと、表４に記載のＰＣＲ産物の一つとを、表５に示す組合せで、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ショウジョウバエ共受容体及びミツバチ共受容体に由来する各種キメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られたキメラ受容体発現プラスミドの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、各プラスミドはそれぞれ、配列番号９５〜９８で示される塩基配列のいずれかを含有することが判った。配列番号９５〜９８で示される塩基配列はそれぞれ、配列番号９９〜１０２で示されるアミノ酸配列をコードする。上記キメラ受容体発現プラスミドの作製に用いたＰＣＲ産物の組み合わせと、キメラ共受容体コード領域の塩基配列の配列番号及びキメラ共受容体のアミノ酸配列の配列番号を表５に示す。
【００５３】
得られた発現プラスミドにコードされるキメラ共受容体のアミノ酸配列の構成を以下に示す。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ３）ＡｍＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第３膜貫通ドメイン（ＴＭ３）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２細胞外ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来（Ａｍ（ＩＣ２−ＣＴ）、配列番号２）である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来（Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）、配列番号１）であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）ＡｍＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第５膜貫通ドメイン（ＴＭ５）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第３細胞外ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ６）ＡｍＯＲＣＯでは、Ｎ末端領域（ＮＴ）から第６膜貫通ドメイン（ＴＭ６）までのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第３細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来である。
【００５４】
【表４】
2018050556.tif 000005
【００５５】
【表５】
2018050556.tif 000006
【００５６】
シマカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体（以下、「Ａａ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯ」という場合がある。）の発現プラスミド
上述したＡａＯＲＣＯの発現プラスミド１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ（ＮＴ−ＴＭ４）−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号１０３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯｒｃｏ（ＮＴ−ＴＭ４）−３’（5’-caaatgttgcagctgttcgcaagtga；配列番号１０４）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。上述したＡｍＯＲＣＯの発現プラスミド１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＡｍＯｒｃｏ（ＩＣ２−ＣＴ）−５’（5’-cagctgcaacatttgaagaatatcatgaagcctttgatggaa；配列番号１０５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＡｍＯｒｃｏ  （ＩＣ２−ＣＴ）−３’（5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa；配列番号１０６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られた２つのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＡｍＯｒｃｏと名付けたシマカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＡｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１０７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１０７で示される塩基配列は配列番号１０８で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＡｍＯｒｃｏにコードされるキメラ本共受容体では、そのＮ末端領域（ＮＴ）から第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来（Ａａ（ＮＴ−ＴＭ４）、配列番号１３５）であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来（Ａｍ（ＩＣ２−ＣＴ）、配列番号２）である。
【００５７】
ハマダラカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体（以下、「Ａｇ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯ」という場合もある。）の発現プラスミド
上記のハマダラカ共受容体の発現プラスミド１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯｒｃｏ（ＮＴ−ＴＭ４）−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgcaagtccagccgaccaagtacgt；配列番号１０９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯｒｃｏ  （ＮＴ−ＴＭ４）−３’（5’-caagtgttgcagctgctcgcaggcta；配列番号１１０）１μＬ及びＫＯＤＰｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。上記のミツバチ共受容体の発現プラスミド１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＡｍＯｒｃｏ  （ＩＣ２−ＣＴ）−５’（5’-cagctgcaacacttgaagaatatcatgaagcctttgatgg；配列番号１１１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa；配列番号１１２）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られた２つのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入してクローニングすることにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡｇＡｍＯｒｃｏと名付けたハマダラカ共受容体とミツバチ共受容体とのキメラ共受容体の発現プラスミドを得た。得られた発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡｇＡｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１１３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１１３で示される塩基配列は配列番号１１４で示されるアミノ酸配列をコードする。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡｇＡｍＯｒｃｏにコードされるキメラ共受容体では、アミノ末端領域（ＮＴ）から第４膜貫通ドメイン（ＴＭ４）までのアミノ酸配列がハマダラカ共受容体由来（Ａｇ（ＮＴ−ＴＭ４）、配列番号１３６）であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までの塩基配列がミツバチ共受容体由来（Ａｍ（ＩＣ２−ＣＴ）、配列番号２）である。
【００５８】
＜嗅覚受容体発現プラスミドの作製＞
シマカ嗅覚受容体ＯＲ８（以下、「ＡａＯＲ８」という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用いて、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ８−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgggaggtaagttctc；配列番号１１５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ８−３’（5’-gccactgtgctggattcacttctgacttggttc；配列番号１１６）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３０サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１１７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１１７で示される塩基配列は配列番号１１８で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５９】
ショウジョウバエ嗅覚受容体ＯＲ４７ａ（以下、「ＤｍＯＲ４７ａ」という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたショウジョウバエ成虫由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＬのフォワードプライマーＤｍＯＲ４７ａ−５’（5’-caccatggacagttttctgcaagtacagaa；配列番号１１９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯＲ４７ａ−３’（5’-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta；配列番号１２０）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．２ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ-ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼII（インビトロジェン社製）を混合し室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１２１で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１２１で示される塩基配列は配列番号１２２で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００６０】
カイコガ嗅覚受容体ＯＲ５６（以下、「ＢｍＯＲ５６」という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１２３で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１２３で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用いて、１０μＭのフォワードプライマーＢｍＯＲ５６−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag；配列番号１２４）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＢｍＯＲ５６−３’（5’-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac；配列番号１２５）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１２３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１２３で示される塩基配列は配列番号１２６で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００６１】
＜イクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）発現プラスミドの作製＞
Ａｅｑｕｏｒｉｎをコードする配列番号１２７で示される塩基配列がｐＭＤ１９ベクターにクローニングされたプラスミド（ｐＭＤ１９−ＡＥＱ）５０ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡＥＱ−５’（5’-caccatgacaagcaaacaatactc；配列番号１２８）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡＥＱ−３’（5’-ttaggggacagctccaccgtag；配列番号１２９）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。配列番号１２７で示される塩基配列は配列番号１３０で示されるアミノ酸配列をコードする。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡＥＱ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合し室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し増幅することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号１３１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号１３２）１μＬ及びＫＯＤ  ｎｅｏ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収してこれをインサートＤＮＡ１とした。ＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）をベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ１をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。ｐｃＤＮＡ３．１−ＡＥＱ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号１３３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号１３４）１μＬ及びＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収���てこれをインサートＤＮＡ２とした。ＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）（インビトロジェン社製）をベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ２をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した。連結されたＤＮＡを大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）−ＡＥＱと名付けた発現プラスミドを得た。
【００６２】
＜発現プラスミドの細胞への導入＞
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を１０ｃｍシャーレに３×１０６ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。作製したいずれかの共受容体発現プラスミド３μｇと、作製したいずれかの嗅覚受容体発現プラスミド１．５μｇと、Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド８μｇとを、１２．５μＬのＰｌｕｓ試薬及び３１．２５μＬのリポフェクトアミンＬＴＸ（インビトロジェン社製）と混合し、３０分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション開始４時間後に９６ｗｅｌｌプレートに９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。これにより、共受容体発現プラスミド、嗅覚受容体発現プラスミド及びＡｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミドがトランジェントに導入された形質転換細胞を得た。
【００６３】
＜活性測定＞
イクオリンはカルシウムイオンと結合すると活性化されてセレンテラジン等の基質を酸化して発光する。したがって、イクオリンを発現する細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は直接、発光量の増大として現れることになるため、被検物質の添加により嗅覚受容体複合体がイオンチャネルとして機能しているかどうかを発光量の変化から測定することができる。
上記形質転換細胞の培養液を除去してＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５μＭセレンテラジンｈ（プロメガ社製）及び０．３％のＢＳＡを含むＨａｎｋｓ−ＨＥＰＥＳ（２０  ｍＭ  ｐＨ  ７．４））に置換し、更に４時間、室温で静置した。次いで、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、嗅覚受容体に対応する被検物質を細胞の培養液中に添加するとともに細胞の発光量を測定した。対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した細胞での発光量を１とし、被検物質を添加した細胞の発光量を相対値として算出した。
【００６４】
（試験例１）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯもしくはＤｍＯＲＣＯ、又は、組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ［Ｄｍ（ＮＴ−ＥＣ１）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ３）ＡａＯＲＯＣ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）ＡａＯＲＣＯ、もしくはＤｍ（ＮＴ−ＴＭ６）ＡａＯＲＣＯ］のいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図１に示す。ＤｍＯＲＣＯとＡａＯＲＣＯとのキメラ共受容体のうち、Ｎ末端領域から第４膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であるキメラ共受容体［Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ］と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のＡａＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクテン−３−オールの添加による発光量の増加が大きかった。Ｎ末端領域から第４膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がシマカ共受容体由来であるキメラ共受容体［Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ］と嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のＡａＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクテン−３−オールに対してより強く応答することが示された。
【００６５】
（試験例２）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡｍＯＲＣＯもしくはＤｍＯＲＣＯ、又は、組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Ｄｍ−ＡｍＯＲＣＯ［Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ３）ＡｍＯＲＯＣ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）ＡｍＯＲＣＯ、もしくはＤｍ（ＮＴ−ＴＭ６）ＡｍＯＲＣＯ］のいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図２に示す。ＤｍＯＲＣＯとＡｍＯＲＣＯとのキメラ共受容体においてもＤｍＯＲＣＯとＡａＯＲＣＯとのキメラ共受容体と同様に、Ｎ末端領域から第４膜貫通ドメインまでのアミノ酸配列がショウジョウバエ共受容体由来であり、第２細胞内ループからＣ末端領域までのアミノ酸配列がミツバチ共受容体由来であるキメラ共受容体［Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯ］と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のＡｍＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクテン−３−オールの添加による発光量の増加が大きかった。試験例１及び２の結果から、嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際にリガンドへの応答強度が大きいキメラ共受容体を作製するには、第４膜貫通ドメインのＣ末端付近で、元の２種の共受容体のアミノ酸配列を組み換えることが重要であることが示された。
【００６６】
（試験例３）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯもしくはＤｍＯＲＣＯ、又は組み換え位置の異なる各種キメラ共受容体Ｄｍ−ＡａＯＲＣＯ［Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−７９２）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−８７９）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−９６９）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−１０８０）ＡａＯＲＣＯ、Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ５）ＡａＯＲＣＯ、もしくはＤｍ（ＮＴ−６３６）ＡａＯＲＣＯ］のいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図３及び４に示す。Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞は、１−オクテン−３−オールに対して、元のＡａＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも応答強度が高かった。それに対し、ＤｍＯＲＣＯ由来のアミノ酸配列がＤｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯよりも３０アミノ酸残基Ｃ末端側に長いＤｍ（７９２）ＡａＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のＡａＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも１−オクテン−３−オールに対する応答強度が減少した。ＤｍＯＲＣＯ由来のアミノ酸配列がＤｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯよりも２２アミノ酸残基Ｎ末端側に短いＤｍ（ＮＴ−６３６）ＡａＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞でも、元のＡａＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクテン−３−オールに対する応答強度が減少した。これらの結果から、キメラ共受容体において、第一の昆虫のＯＲＣＯ由来のアミノ酸配列は、Ｎ末端から第４膜貫通ドメインの最もＣ末端側のアミノ酸残基の前後２０アミノ酸残基程度以内の範囲のいずれかのアミノ酸残基までが好ましいことが示唆された。
【００６７】
（試験例４）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯもしくはＤｍＯＲＣＯ、又は、キメラ共受容体Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡａＯＲＣＯ、ＡａＯＲＣＯから第一から第四までの膜貫通ドメインのみをＤｍＯＲＣＯに組み替えたＡａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯＲＣＯ、もしくは、ＡａＯＲＣＯからＮ末端領域、第一及び第二細胞外領域、第一細胞内領域をＤｍＯＲＣＯに組み替えたＤｍ（ＴＭ１−４Ａａ）ＡａＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図５に示す。その結果、膜貫通領域や細胞内領域及び細胞外領域のみを組み替えたキメラ共受容体［Ａａ（ＴＭ１−４Ｄｍ）ＡａＯＲＣＯ又はＤｍ（ＴＭ１−４Ａａ）ＡａＯＲＣＯ］と嗅覚受容体とを発現する細胞では、元のＡａＯＲＣＯ又はＤｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクテン−３−オールに対する応答強度が減少した。嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際にリガンドへの応答強度が大きいキメラ共受容体を作製するには、Ｎ末端から第４膜貫通ドメインまで連続して同種のＯＲＣＯ由来の領域であることが必要なことが示された。
【００６８】
（試験例５）
嗅覚受容体ＤｍＯＲ４７ａの発現プラスミド、
共受容体ＤｍＯＲＣＯもしくはＡｍＯＲＣＯ、又はキメラ共受容体Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはペンチルアセテートを用い、１０−４Ｍ、１０−４．５Ｍ、１０−５Ｍ、１０−５．５、Ｍ１０−６Ｍ、１０−６．５Ｍ、又は１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図６に示す。Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のＤｍＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、ペンチルアセテートに対して、より強く応答することが示された。
【００６９】
（試験例６）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯもしくはＡｍＯＲＣＯ、又はキメラ共受容体Ａａ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクタン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図７に示す。Ａａ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、１−オクタン−３−オールに対して、より強くに応答することが示された。
【００７０】
（試験例７）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡｇＯＲＣＯもしくはＡｍＯＲＣＯ、又はキメラ共受容体Ａｇ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクタン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図８に示す。嗅覚受容体と結合して嗅覚受容体複合体を形成した際に、Ａｇ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯと嗅覚受容体とを発現する細胞は、元のＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかと嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、より低濃度の１−オクタン−３−オールに、応答することが示された。
【００７１】
（試験例８）
嗅覚受容体ＢｍＯＲ５６の発現プラスミド、
共受容体ＢｍＯＲＣＯ、又はキメラ共受容体Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
が導入された細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはｃｉｓ−ジャスモンを用い、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、又は１０−１１Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図９に示す。Ｄｍ（ＮＴ−ＴＭ４）ＡｍＯＲＣＯとＢｍＯＲ５６とを発現する細胞は、ＢｍＯＲＣＯとＢｍＯＲ５６とを発現する細胞よりも、ｃｉｓ−ジャスモンに対し、より強く応答することが示された。また、実施例７及び８の結果から、キメラ共受容体を構成する元のＯＲＣＯの由来となるそれぞれの昆虫とは異なる種の昆虫由来の嗅覚受容体本実施形態のキメラ共受容体とを発現する細胞は、元の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とを発現する細胞よりも、リガンドに対して強く又は感度良く応答することが示された。
【図１】
2018050556.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018050556.tif 000014
【図９】
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【配列表】
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