(57)【要約】      （修正有）【課題】真菌由来のリボソームペプチドの生合成に関与する遺伝子クラスターを特定し、生産する方法の提供。【解決手段】工程ａ）小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、特定の配列からなる塩基配列特定のアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、若しくは１及び/又は２種の別の特定のアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させる工程、並びに工程ｂ）細胞からリボソームペプチドを回収する工程を含む、製造方法。【選択図】図１
2018050623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌ゲノム上のリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補を推定する方法であって、
小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、並びに
配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子若しくは
配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
及び／又は
配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を少なくとも含み、前記リボソームペプチド前駆体遺伝子とその他の前記遺伝子とが隣接している又は最大で２５Ｋｂの範囲内に位置している遺伝子クラスターをリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補であると推定する工程を含む、前記推定方法。
【請求項２】
ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む遺伝子クラスターをリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補であると推定する、請求項１に記載の推定方法。
【請求項３】
真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌である、請求項１又は２に記載の推定方法。
【請求項４】
真菌のリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを同定する方法であって、
小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、並びに
配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、
配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子若しくは
配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
及び／又は
配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を少なくとも含み、前記リボソームペプチド前駆体遺伝子とその他の前記遺伝子とが隣接している又は最大で２５Ｋｂの範囲内に位置している遺伝子クラスターをリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補であると推定する工程、並びに
推定されたリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補を構成する１又は複数の遺伝子を欠失させることでリボソームペプチド産生量の減少が確認された場合に前記遺伝子クラスターはリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターであると同定する工程
を含む、前記同定方法。
【請求項５】
ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む遺伝子クラスターをリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター候補であると推定する、請求項４に記載の同定方法。
【請求項６】
真菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌である、請求項４又は５に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌が産生するペプチド性二次代謝産物に関与する真菌特異的な生合成遺伝子クラスターを利用したペプチド性二次代謝産物の製造方法、及び前記クラスターにおいて発現誘導されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌、放線菌及び細菌を含む微生物が産生する二次代謝産物は、医薬又は医薬原料を含む様々な用途に用いられている。
【０００３】
幾つかの真菌、代表的にはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の真菌の幾つかのゲノム解析が行われた結果、真菌には、ポリケタイド化合物、非リボソーム型ペプチド（リボソームを経由せずに非リボソームペプチド合成酵素によりアミノ酸から合成される、ペプチド結合を有する化合物）、テルペン類又はアルカロイドなどを含む多様な二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子クラスター（生合成遺伝子クラスター）が存在していることが明らかにされている。
【０００４】
例えば、黄色麹菌（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）では、５５種類の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターが染色体上にコードされていることが示されている。しかし、この様な遺伝子クラスターの半数以上は真菌細胞内において殆ど発現されていないか、あるいは極めて微量の二次代謝産物しか産生されない程度にしか発現されていないのが現実である。
【０００５】
このことは、未だその具体的な構造や機能が特定されていない多数の未知の二次代謝産物を生産する能力を真菌が潜在的に有していることを意味する。そこで、真菌の潜在的な二次代謝産物の生産能力を発揮させるために、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの発現を人為的に誘導し、十分な量の二次代謝産物を合成させようとする試みが提唱されている。その１つは、目的となる二次代謝産物生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子クラスターの転写因子を過剰発現させ、二次代謝産物の合成量を高める方法である。もう一つは、二次代謝産物生合成遺伝子クラスターのｃＤＮＡを構築し、これを適当な宿主発現系を用いて高発現させて二次代謝産物を合成させる方法である。特に後者の場合、複数の生合成遺伝子クラスターの間で各クラスターの構成遺伝子を組み換えて非天然の二次代謝産物を合成しようとする試みも提唱されている。
【０００６】
ところで、放線菌の一部では、二次代謝産物としてリボソームペプチドと称される化合物を生成することが知られている。リボソームペプチドは、タンパク質合成の場であるリボソームを介して生合成されるが、環状構造、枝状構造あるいは非天然アミノ酸を含むなど、通常の構成タンパク質や酵素タンパク質にはあまり見られない化学的特徴を伴った、ペプチド結合を有する化合物である。一方、前述のように真菌が産生する二次代謝産物としてはポリケタイド化合物、非リボソーム型ペプチド、テルペン類又はアルカロイドなどが知られているが、真菌由来のリボソームペプチド及びその生合成に関する生合成遺伝子クラスターに関する報告は、これまでのところＡｍａｎｉｔａ属由来のものが知られている程度しかない（非特許文献１）。
【０００７】
本発明者らは、塩基配列情報を基にして二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの存在を推定するバイオインフォマティクス的手法を提唱している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｌｌｅｎら、２００７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第１０４巻、１９０９７−１９１０１ページ
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０３９４８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、真菌由来のリボソームペプチドの生合成に関与する遺伝子クラスターを特定し、これを用いて真菌由来のリボソームペプチドを組換え的に生産する方法を提供することを目的とするものである。真菌由来のリボソームペプチドの生合成遺伝子クラスターのさらなる存在を明らかにすること、及びその組換え的生産を可能にするための真菌由来のリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの特定及び利用は、真菌由来のリボソームペプチドの有効利用において重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、稲コウジ病菌（ウスチラギノイデア・ヴィレンス、Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）が産生する二次代謝産物として知られているウスチロキシン（ｕｓｔｉｌｏｘｉｎ）Ｂの生合成経路に関する研究過程において、ウスチロキシンＢ生合成に関連する遺伝子が遺伝子クラスターを形成していることを見いだした。さらに、小胞体移行シグナル配列とウスチロキシンＢの化学構造中に見られるアミノ酸配列が複数回繰り返されてなる反復配列とを含むウスチロキシンＢの前駆体ペプチドをコードする遺伝子（ｕｓｔＡ）が同クラスターの構成遺伝子であること、真菌特異的なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子が同クラスターの構成遺伝子として存在することを見いだした。さらに、前記小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むという特徴を有するリボソームペプチド前駆体遺伝子、前記真菌特異的なアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターが、Ａ．ｆｌａｖｕｓを含む複数の糸状菌のゲノムに多数存在していることを確認し、下記の各発明を完成させた。
【００１２】
（１）真菌由来のリボソームペプチドを製造する方法であって、
工程ａ）小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、並びに配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させる工程、並びに
工程ｂ）細胞からリボソームペプチドを回収する工程を含む、前記製造方法。
（２）リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子が、ＡｓｐＧＤ  ＩＤ番号がＡＦＬ２Ｇ＿０８５１６、Ａｃａｒ５０１０＿２１１９２１、Ａｃａｒ５０１０＿１３１０４０、ＡＣＬＡ＿０６３３２０、Ａｓｐｂｒ１＿０１４８４０６、Ａｎ０６ｇ０２１３０、Ａｓｐｚｏ１＿１５０１７２７、Ａｃａｒ５０１０＿２１０４４１、Ａｓｐｚｏ１＿０１３２９６１、Ａａｃｕ１６８７２＿０４２３３４、Ａｎ０３ｇ０５２３０、Ａｓｐｔｕ１＿００４７１０９、Ａｓｐｆｏ１＿００４８０５８、Ａｓｐｋａ１＿０１７８０５８、Ａｓｐｚｏ１＿０６７３７５６、ＡＦＵＢ＿０９６７８０、Ａｓｐｗｅ１＿００２８７５６、Ａｓｐｗｅ１＿０１７７５５１、Ａｓｐｆｏ１＿００４１５２８、Ａｓｐｋａ１＿０１７６１７４、Ａｓｐｚｏ１＿０１３８８４０及びＡａｃｕ１６８７２＿０４４６５８である遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子である、（１）に記載の製造方法。
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、ＡｓｐＧＤ  ＩＤ番号がＡＦＬ２Ｇ＿０８５１７、Ａｃａｒ５０１０＿１５６５２１、Ａｃａｒ５０１０＿１３１０４１、ＡＣＬＡ＿０６３３００、ＡＣＬＡ＿０６３３１０、Ａｓｐｂｒ１＿００７３５８０、Ａｎ０６ｇ０２１２０、Ａｓｐｚｏ１＿００２０６１５、Ａｓｐｚｏ１＿０１４７５９３、Ａｃａｒ５０１０＿３９９４０９、Ａｓｐｚｏ１＿００９７３９７、Ａａｃｕ１６８７２＿０４２３３３、Ａｎ０３ｇ０５２２０、Ａｓｐｔｕ１＿００４７１０８、Ａｓｐｆｏ１＿００４８０６１、Ａｓｐｋａ１＿０１７８０５９、Ａｓｐｚｏ１＿００７０５５５、ＡＦＵＢ＿０９６７９０、Ａｓｐｗｅ１＿００４１４０１、Ａｓｐｗｅ１＿０１８８２４２、Ａｓｐｆｏ１＿０２０３５７２、Ａｓｐｋａ１＿０１７６１７３、Ａｓｐｚｏ１＿０１６３５６２及びＡａｃｕ１６８７２＿０４４６５７である遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子である、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）工程ａ）の強制発現が、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターに含まれる転写因子をコードする遺伝子のプロモーターを高発現プロモーターに組み換えることによって達成される、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）前記リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターが、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）細胞が真菌細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属真菌の細胞である、（６）に記載の製造方法。
（８）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質。
（９）（８）に記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡ。
（１０）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質。
（１１）（１０）に記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡ。
（１２）真菌由来のリボソームペプチドを製造する方法であって、
工程ａ）小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、並びに配列番号３に示されるアミノ酸配列の８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列の５７番目〜２５９番目のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させる工程、並びに
工程ｂ）細胞からリボソームペプチドを回収する工程を含む、前記製造方法。
（１３）リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子が、ＡｓｐＧＤ  ＩＤ番号がＡＦＬ２Ｇ＿０８５１６、Ａｃａｒ５０１０＿２１１９２１、Ａｃａｒ５０１０＿１３１０４０、ＡＣＬＡ＿０６３３２０、Ａｓｐｂｒ１＿０１４８４０６、Ａｎ０６ｇ０２１３０、Ａｓｐｚｏ１＿１５０１７２７、Ａｃａｒ５０１０＿２１０４４１、Ａｓｐｚｏ１＿０１３２９６１、Ａａｃｕ１６８７２＿０４２３３４、Ａｎ０３ｇ０５２３０、Ａｓｐｔｕ１＿００４７１０９、Ａｓｐｆｏ１＿００４８０５８、Ａｓｐｋａ１＿０１７８０５８、Ａｓｐｚｏ１＿０６７３７５６、ＡＦＵＢ＿０９６７８０、Ａｓｐｗｅ１＿００２８７５６、Ａｓｐｗｅ１＿０１７７５５１、Ａｓｐｆｏ１＿００４１５２８、Ａｓｐｋａ１＿０１７６１７４、Ａｓｐｚｏ１＿０１３８８４０及びＡａｃｕ１６８７２＿０４４６５８である遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子である、（１２）に記載の製造方法。
（１４）配列番号３に示されるアミノ酸配列の８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列と２０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子が、ＡｓｐＧＤ  ＩＤ番号がＡＦＬ２Ｇ＿０８５１７、Ａｃａｒ５０１０＿１５６５２１、Ａｃａｒ５０１０＿１３１０４１、ＡＣＬＡ＿０６３３００、ＡＣＬＡ＿０６３３１０、Ａｓｐｂｒ１＿００７３５８０、Ａｎ０６ｇ０２１２０、Ａｓｐｚｏ１＿００２０６１５、Ａｓｐｚｏ１＿０１４７５９３、Ａｃａｒ５０１０＿３９９４０９、Ａｓｐｚｏ１＿００９７３９７、Ａａｃｕ１６８７２＿０４２３３３、Ａｎ０３ｇ０５２２０、Ａｓｐｔｕ１＿００４７１０８、Ａｓｐｆｏ１＿００４８０６１、Ａｓｐｋａ１＿０１７８０５９、Ａｓｐｚｏ１＿００７０５５５、ＡＦＵＢ＿０９６７９０、Ａｓｐｗｅ１＿００４１４０１、Ａｓｐｗｅ１＿０１８８２４２、Ａｓｐｆｏ１＿０２０３５７２、Ａｓｐｋａ１＿０１７６１７３、Ａｓｐｚｏ１＿０１６３５６２及びＡａｃｕ１６８７２＿０４４６５７である遺伝子よりなる群から選ばれる遺伝子である、（１２）又は（１３）に記載の製造方法。
（１５）工程ａ）の強制発現が、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターに含まれる転写因子をコードする遺伝子のプロモーターを高発現プロモーターに組み換えることによって達成される、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）前記リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターが、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の製造方法。
（１７）細胞が真菌細胞である、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、これまでに報告のない新規な真菌由来のリボソームペプチドを製造することができる。これにより、医薬その他の有用物質への応用が期待される真菌由来の二次代謝産物であるリボソームペプチドを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ウスチロキシンＢの化学構造を示す一般式である。
【図２】ウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子を欠失させたＡ．ｆｌａｖｕｓ変異体のウスチロキシンＢ産生能を示すグラフである。パネルＡは各変異体の培養液中に含まれるウスチロキシンＢのＬＣ−ＭＳ解析のチャートを示す。パネルＢは培養液中のウスチロキシンＢを定量した結果を示すグラフである。
【図３】ウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスター内における各構成遺伝子の配置を示す。
【図４】ｍＲＮＡから実際に翻訳されるウスチロキシンＢ生合成に関与するタンパク質とウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターのゲノム配列から演繹推定される推定アミノ酸配列それぞれについて、ゲノム配列に対するＯＲＦの位置を対比させた図（上流側）である。図中、濃いグレーがゲノム配列から演繹推定されるＯＲＦを、薄いグレーがｍＲＮＡから翻訳されるアミノ酸配列のＯＲＦをそれぞれ示す。
【図５】ｍＲＮＡから実際に翻訳されるウスチロキシンＢ生合成に関与するタンパク質とウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターのゲノム配列から演繹推定される推定アミノ酸配列それぞれについて、ゲノム配列に対するＯＲＦの位置を対比させた図（下流側）である。図中、濃いグレーがゲノム配列から演繹推定されるＯＲＦを、薄いグレーがｍＲＮＡから翻訳されるアミノ酸配列のＯＲＦをそれぞれ示す。
【図６】Ａ．ｆｌａｖｕｓ及びＵ．ｖｉｒｅｎｓのウスチロキシン生合成遺伝子クラスター内における各構成遺伝子の配置の比較を示す図である。
【図７】（Ａ）Ａ．ｆｌａｖｕｓの産生するウスチロキシン前駆体の構造を示す図である。（Ｂ）Ｕ．ｖｉｒｅｎｓが産生するウスチロキシン前駆体の構造を示す図である。
【図８】ウスチロキシンＦの化学構造を示す図である。
【図９】ウスチロキシンＦからメチル基が除去された化合物ＦΔＭｅの化学構造を示す図である。
【図１０】ｕｓｔＹａのＨＸＸＨＣモチーフの点変異体をコードする遺伝子で形質転換されたＡ．ｆｌａｖｕｓがウスチロキンＢの産生能を失うことを示すＬＣ−ＭＳ解析のチャートである。
【図１１】特許文献１に記載された方法によってウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターとは別にＡ．ｆｌａｖｕｓで見いだされた、分子量１０１９のリボソームペプチドの生合成に関与する遺伝子クラスター領域を示す図である。
【図１２】分子量１０１９のリボソームペプチドの生合成遺伝子クラスターの一部が破壊されたＡ．ｆｌａｖｕｓ変異株が、分子量１０１９のリボソームペプチドの産生能を失うことを示すＬＣ−ＭＳ解析チャートである。
【図１３】特許文献１に記載された方法によってウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターとは別にＡ．ｆｌａｖｕｓで見いだされた、分子量８０９のリボソームペプチドの生合成に関与する遺伝子クラスター領域を示す図である。
【図１４】分子量８０９のリボソームペプチドの生合成遺伝子クラスターの一部が破壊されたＡ．ｆｌａｖｕｓ変異株が、分子量８０９のリボソームペプチドの産生能を失うことを示すＬＣ−ＭＳ解析チャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、真菌由来のリボソームペプチドを製造する方法であって、工程ａ）小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子、並びに配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させる工程、並びに工程ｂ）細胞からリボソームペプチドを回収する工程を含む、前記製造方法を提供する。
【００１６】
本発明者らは、前記特許文献１に記載された二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの存在を推定するバイオインフォマティクス的手法をさらに発展させて、ＭＩＤＤＡＳ−Ｍ（Ｍｏｔｉｆ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を開発した（Ｕｍｅｍｕｒａら、２０１３年、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、第８巻、ｅ８４０２８、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰＭＣ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３８７７１３０／ｐｄｆ／ｐｏｎｅ．００８４０２８．ｐｄｆ）。このＭＩＤＤＡＳ−Ｍを用いて、Ａ．  ｆｌａｖｕｓを含む３種類のカビのゲノム塩基配列上で、４８０の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの存在を推定し、Ａ．ｆｌａｖｕｓが産生するウスチロキシンＢがリボソームペプチドであり、遺伝子情報のデータベースを提供しているＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）遺伝子ＩＤでＡＦＬＡ＿０９４９４０からＡＦＬＡ＿０９５１１０遺伝子で構成される遺伝子クラスターの働きによって産生されることを明らかにした。
【００１７】
ウスチロキシンＢは、図１に示される一般式で表される物質で、稲コウジ病菌（ウスチラギノイデア・ヴィレンス、Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓ）が産生する二次代謝産物として知られている。ウスチロキシンＢは、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びグリシン（Ｇｌｙ）がペプチド結合によって繋がった基本構造と、ＴｙｒとＩｌｅの間の環状構造とを有し、Ｔｙｒの芳香環にノルバリンが硫黄原子を介して結合している構造を有する。
【００１８】
＜リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子＞
本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子（以下、リボソームペプチド前駆体遺伝子と表す）を含む。ここで小胞体移行シグナル配列とは、タンパク質分子のＮ末端に位置する、正に荷電したアミノ酸、疎水性アミノ酸に富む領域及び極性を有するアミノ酸から構成されるアミノ酸配列として一般に認識されているアミノ酸配列であり、その具体的なアミノ酸配列は多数存在することが当業者に広く知られている。
【００１９】
リボソームペプチドは、非リボソームペプチドとは異なり、タンパク質合成の場であるリボソームを介して生合成されるが、環状構造、枝状構造あるいは非天然アミノ酸を含むなど、通常の構造タンパク質や酵素タンパク質にはあまり見られることのない化学的特徴を伴った、ペプチド結合を有する化合物をいう。本発明は、真菌由来のリボソームペプチドを製造する方法であり、かかるリボソームペプチドは、真菌のゲノムにコードされるリボソームペプチド前駆体から生合成される。
【００２０】
ウスチロキシンＢの生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子を詳細に解析したところ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤがＡＦＬＡ＿０９４９８０である機能未同定であった遺伝子が、小胞体移行シグナル配列とウスチロキシンＢに見られる４つのアミノ酸（Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ）がこの順序で並ぶ配列が１６回繰り返されてなる反復配列とを含むアミノ酸配列をコードしていることが確認された。
【００２１】
上記解析の結果から、ＡＦＬＡ＿０９４９８０は、小胞体移行能を有し、小胞体内でのペプチド合成経路を経てウスチロキシンＢに変換されるウスチロキシンＢ前駆体をコードする遺伝子、すなわちリボソームペプチド前駆体遺伝子であると判断される。
【００２２】
また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌の分子生物学的情報をデータベース化しているＡｓｐＧＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｐｇｄ．ｏｒｇ／、Ｃｅｒｑｕｅｉｒａら、２０１３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第４２巻、７０５−７１０ページ）に対して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈら、１９８１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１４７巻、１９５−１９７ページ）を用いて自己配列内で局所的に類似する配列を有する反復配列を含むタンパク質を探索し、さらにフリーソフトであるＳｉｇｎａｌＰ  ４．１（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、第１０巻、１−６ページ及びＰｅｔｅｒｓｅｎら、２０１１年、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第８巻、７８５−７８６ページ）を用いてシグナルペプチドの有無を確認したところ、リボソームペプチド前駆体遺伝子が下記表１に示されるように複数のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌において見いだされた。これら遺伝子は、本発明における真菌由来のリボソームペプチド前駆体遺伝子としての好適な例を構成する。
【００２３】
【表１】
2018050623.tif 000003
【００２４】
＜ｕｓｔＹａホモログ＞
本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００２５】
また本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、配列番号１に示される塩基配列に対するビットスコア（ｂｉｔ  ｓｃｏｒｅ）が５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。
【００２６】
さらに本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、配列番号３に示されるアミノ酸配列の８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。
【００２７】
また本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列に対するＥ値が１ｅ−４未満でリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
又は
（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
であって、かつ、少なくとも一つの２核型金属捕捉モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。２核型金属捕捉モチーフの好ましいアミノ酸配列はＨｉｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（ＨＸＸＨＣ）である。
【００２８】
配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子（以下、ｕｓｔＹａと表す）は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤがＡＦＬＡ＿０９４９９０である機能未同定であった遺伝子である。本発明者らの研究により、ウスチロキシンＢを生合成することのできる黄色麹菌（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）のゲノム上でｕｓｔＹａが破壊された株は、ウスチロキシンＢを生産しなくなることが確認された。すなわちｕｓｔＹａは、リボソームペプチドであるウスチロキシンＢの生合成に関与する遺伝子である。また、ゲノム上の位置は、ウスチロキシンＢの前駆体をコードしている前記ＡＦＬＡ＿０９４９８０に隣接して存在しており、ウスチロキシンＢの生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子の１つである。
【００２９】
また、配列番号２は、配列番号１の塩基配列から演繹推定されたアミノ酸配列として、ＮＣＢＩデータベースに登録されているアミノ酸配列である。このアミノ酸配列を基に、２０１３年１２月１６日の時点の前記ＡｓｐＧＤ及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１３＿０８、Ｍａｇｒａｎｅら、２０１１年、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｂａｒ００９）に対してＢｌａｓｔｐ検索を行ったところ、Ｅ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている遺伝子が、下記表２に示されるように複数のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌において見いだされた。さらに、これら遺伝子はいずれも、各真菌においてリボソームペプチド前駆体遺伝子に隣接あるいは最大で２５Ｋｂの範囲内（遺伝子の数では、リボソームペプチド前駆体遺伝子との間に最大で１０遺伝子が存在している程度の範囲）といった近傍に位置していることも確認された。これら遺伝子は、リボソームペプチド前駆体遺伝子と共に真菌由来のリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子であり、当該リボソームペプチド前駆体からのリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子としての好適な例を構成する。なお、表中のＡｓｐＧＤ  ＩＤ番号は、前記ＡｓｐＧＤにおいて使用されている、登録された遺伝子のＩＤ番号である。
【００３０】
【表２】
2018050623.tif 000004
【００３１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列は、後に説明するように、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子から転写翻訳されることで実際に生合成されるタンパク質（以下、ｕｓｔＹａタンパク質と表す）のアミノ酸配列である。
【００３２】
Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ、ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）とは、ある配列（クエリー配列）ともう一つの配列との間の相同性を評価する指標の一つであり、あるクエリー配列に対してランダムな配列データベースを検索した際に、そのスコア以上の値になるアライメントの本数の期待値をいう。特に本発明では、配列データベースに対して検索手段としてｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｐ、又はｐｓｉ−ｂｌａｓｔのいずれかの相同性検索プログラム（以下、纏めてＢｌａｓｔ法と表す）を用いた相同性検索を実行したときのＥ値を採用する。特にＢｌａｓｔ法においてデフォルトのパラメータ条件で相同性検索を実行したときのＥ値であることが好ましい。従って、ある１つの種の微生物の全配列情報に対して、配列番号１に示される塩基配列をクエリー配列とし、Ｂｌａｓｔ法を用いた相同性検索の結果としてＥ値が１ｅ−４未満である塩基配列を含む遺伝子、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列をクエリー配列とし、Ｂｌａｓｔ法を用いた相同性検索の結果としてＥ値が１ｅ−４未満であるアミノ酸配列をコードする遺伝子などを含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターが、本発明の対象とされる。また、検索対象とされるデータベースとしては、前述のＵｎｉＰｒｏｔ若しくはＡｓｐＧＤ、又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）などを挙げることができる。
【００３３】
ビットスコアは、Ｂｌａｓｔ法においてデフォルトのパラメータ条件で相同性検索を実行したときの値であることが好ましい。
【００３４】
また本発明では、配列番号３に示されるアミノ酸配列の８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターも対象とされる。前記８１番目〜２２５番目のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の膜貫通（ＴＭ）へリックスよりもＣ末端側の領域である。
【００３５】
本発明では、ｕｓｔＹａと上記の一定の相同性を示す遺伝子をＵｓｔＹａホモログ遺伝子と表す。
【００３６】
本発明にいうリボソーム前駆体ペプチドとｕｓｔＹａホモログ遺伝子との組合せは、前記表１に示されるリボソーム前駆体ペプチドをコードする遺伝子２２種類と表２に示されるｕｓｔＹａホモログ遺伝子２２種類を含み、２０１３年１２月１６日の時点でＡｓｐＧＤに登録されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属細菌において多数存在することが本発明者らにより確認された。これら両遺伝子の組合せを表３〜表６に示す。これら組合せを含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは本発明の製造方法において利用可能なものの例である。
【００３７】
【表３】
2018050623.tif 000005
【００３８】
【表４】
2018050623.tif 000006
【００３９】
【表５】
2018050623.tif 000007
【００４０】
【表６】
2018050623.tif 000008
【００４１】
＜ｕｓｔＹｂホモログ＞
本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、上記ｕｓｔＹａホモログ遺伝子と共に又はこれに代えて、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいるものでもよい。
【００４２】
また本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、上記ｕｓｔＹａホモログ遺伝子と共に又はこれに代えて、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。
【００４３】
また、本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、上記ｕｓｔＹａホモログ遺伝子と共に又はこれに代えて、配列番号６に示されるアミノ酸配列の５７番目〜２５９番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいるものでもよい。
【００４４】
また本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対するビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列の５７番目〜２５９番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ少なくとも一つの２核型金属捕捉モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。２核型金属捕捉モチーフの好ましいアミノ酸配列はＨｉｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（ＨＸＸＨＣ）である。
【００４５】
配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤがＡＦＬＡ＿０９５０２０である機能未同定であった遺伝子である。本発明者らの研究により、ウスチロキシンＢを生合成することのできる黄色麹菌（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）のゲノム上で遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０を欠失させた株は、ウスチロキシンＢを殆ど生産しなくなることが確認された。すなわち遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０は、リボソームペプチドであるウスチロキシンＢの生合成に関与する遺伝子である。また、ゲノム上の位置は、ウスチロキシンＢの前駆体をコードしている前記ＡＦＬＡ＿０９４９８０から２ｋｂほどの範囲内といった近傍に存在しており、ウスチロキシンＢの生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子の１つである。
【００４６】
一方、遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０から演繹推定され、ＮＣＢＩに登録されているタンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に示されるものであるが、実際に遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０を含むゲノム領域から転写翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に示されるものであることが確認された。したがって、かかる配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、ｕｓｔＹｂタンパク質と表す）が、ウスチロキシンＢ生合成経路に関与していることが明らかとなった。
【００４７】
本発明は、前記リボソームペプチド前駆体遺伝子、及びｕｓｔＹｂタンパク質に対する先に説明したＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなりリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子（以下、ｕｓｔＹｂホモログ遺伝子と表す）を含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターも、対象とするものである。
【００４８】
ここで、Ｅ値、ビットスコア、Ｂｌａｓｔ法の検索条件、対象データベース等については先に述べたとおりである。従って、データベースに登録されたアミノ酸配列情報に対して、配列番号６に示されるアミノ酸配列をクエリー配列とし、Ｂｌａｓｔ法を用いた相同性検索の結果としてＥ値が１ｅ−４未満であるアミノ酸配列又はビットスコアが５０以上、好ましくは６０以上、さらに好ましくは７５以上であるアミノ酸配列をコードする遺伝子及び前記リボソームペプチド前駆体遺伝子を含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、本発明の対象とされる。
【００４９】
また本発明では、前記リボソームペプチド前駆体遺伝子及び配列番号６に示されるアミノ酸配列の５７番目〜２５９番目のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、なおより好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、リボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターも本発明の対象に含まれる。配列番号６に示されるアミノ酸配列の５７番目〜２５９番目のアミノ酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の膜貫通（ＴＭ）へリックスよりもＣ末端側の領域である。
【００５０】
本発明では、ｕｓｔＹｂと上記の一定の相同性を示す遺伝子をＵｓｔＹｂホモログ遺伝子と表す。
【００５１】
＜強制発現＞
本発明は、前述のリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子並びにｕｓｔＹａホモログ遺伝子及び／又はｕｓｔＹｂホモログ遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させる工程ａ）を含む。
【００５２】
真菌における前記特徴を有するリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターに関する報告は非特許文献１以外にはなく、またかかるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを細胞内で強制発現させて真菌由来のリボソームペプチドを製造しようとする試みも行われてはいなかった。本発明は、これまでに報告のない新規な真菌由来のリボソームペプチドを製造する方法を提供するものである。
【００５３】
リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子並びにｕｓｔＹａホモログ遺伝子及び／又はｕｓｔＹｂホモログ遺伝子を少なくとも含むリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、ＭＩＤＤＡＳ−Ｍアルゴリズムを用いることで、ゲノム配列上において特定すればよい。また、真菌由来のリボソームペプチドの配列情報が蓄積されたときは、ＳＭＵＲＦ（Ｊ．Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｈｔｔｐ：／／ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｓｍｕｒｆ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）又はａｎｔｉＳＭＡＳＨ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ＆Ｓｅｃｏｎｄｅｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＳＨｅｌｌ、ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｓｍａｓｈ．ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ｏｒｇ／）等の既知の二次代謝遺伝子クラスター予測アルゴリズムも利用可能となる。あるいは、配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列又は塩基配列を基にそれぞれのホモログ遺伝子を検索し、その結果を基に当該遺伝子の近傍にあるリボソームペプチド前駆体遺伝子を含むクラスターを特定してもよい。なお、前記リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子とｕｓｔＹａホモログ遺伝子及び／又はｕｓｔＹｂホモログ遺伝子とが、隣接している又は最大で２５Ｋｂの範囲内に位置している、又はリボソームペプチド前駆体遺伝子とｕｓｔＹａホモログ遺伝子及び／又はｕｓｔＹｂホモログ遺伝子との間に最大で１０遺伝子が存在している程度の範囲内に位置しているリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターが、本発明の対象である。
【００５４】
本発明におけるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターは、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むように特定することが好ましい。ペプチダーゼ活性を有するタンパク質は、リボソームペプチド前駆体の反復配列を切断するなどして、リボソームペプチドの生合成に関与する。ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ゲノムの塩基配列から演繹推定される既知のペプチダーゼドメイン配列又はこれに類似するアミノ酸配列をコードする遺伝子として特定することができる。
【００５５】
リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの強制発現は、かかるリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターをゲノム上に有する真菌細胞内において行ってもよく、又は当業者に知られた遺伝子組換え手法を用いてリボソームペプチド生合成遺伝子クラスター全体を適当な発現ベクターにクローニングし、異種若しくは同種の真菌細胞、酵母、又は細菌その他の宿主細胞に導入した後にこれを強制発現させてもよい。真菌細胞を宿主とするときは、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅその他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌細胞を用いることが好ましい。
【００５６】
上記アルゴリズムあるいは相同性検索によって特定されたリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの強制発現は、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスター自身が有する転写因子をコードする遺伝子（以下、Ｃ６型ＴＦ遺伝子と称する）の転写を誘導することにより行うことができる。Ｃ６型ＴＦ遺伝子の転写は、Ｃ６型ＴＦ遺伝子自身のプロモーターによるものでもよく、又はＣ６型ＴＦ遺伝子のプロモーターを細胞内で機能する別のプロモーターに置き換えて誘導してもよい。また、Ｃ６型ＴＦ遺伝子のプロモーターに細胞内で機能する別のプロモーターを連結させて、Ｃ６型ＴＦ遺伝子の転写を誘導してもよい。あるいは、Ｃ６型ＴＦ遺伝子全体を細胞内で機能するプロモーターを有する別のＴＦ遺伝子に置き換えて、リボソーム生合成遺伝子クラスター全体の発現を誘導してもよい。また、上記の方法に準じて、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の一つ一つの発現を誘導することにより、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスター全体を強制発現させてもよい。
【００５７】
細胞内で機能する別のプロモーターは、リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを強制発現させようとする細胞の種類によって適宜選択し、当業者に知られた遺伝子組換え手法によってゲノム上で又はベクター上で組み換えることができる。真菌細胞内でリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターを強制発現させるために好適なプロモーターの例としては、アスペルギルス属菌由来のｔｅｆ１遺伝子プロモーター（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５０巻、８５−９２ページ）、ｇｐｄＡ遺伝子プロモーター（Ｐｕｎｔら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１年、第１７巻、１９−３３ページ）、β−キシロシダーゼｘｌｎＤプロモーター、アルコール脱水素酵素（ａｌｃＡ）のプロモーター（Ｗａｒｉｎｇら、Ｇｅｎｅ，１９８９年、第７９巻、１１９−１３０ページ）、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｔａｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第２２９巻、３０１−３０６ページ）、ＴｈｉＡプロモーター（Ｓｈｏｊｉら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２００５年、第２４４巻、４１−４６ページ）、大腸菌のβ−グルクロニダーゼ遺伝子プロモーター（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１５巻、１７７−１８０ページ）、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーターなどを挙げることができる。
【００５８】
細胞内でのリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの強制発現は、当該クラスターを有する細胞を、その細胞に適した培地で培養することにより行うことができる。真菌の培養に適した培地としては、サブローデキストロース培地、ポテトデキストロース培地、マイコセル培地、ブレインハートインフュージョン培地、野菜ジュース培地、イーストエクストラクト培地、トリプティックソイ培地等を挙げることができ、その形態は液体培地でも寒天培地等の固形培地でもよい。培養は、真菌に一般的な条件、例えば３０℃前後の温度で好気的に培養すればよい。
【００５９】
＜回収＞
本発明は、細胞からリボソームペプチドを回収する工程ｂ）を含む。リボソームペプチドの細胞からの回収は、リボソームペプチドを生産可能な条件で培養した細胞の培地から、一般的に知られた手法により回収することができる。また、当該細胞の内部にリボソームペプチドが蓄積しているときは、細胞を適当な方法で破壊した後に通常の手法により回収すればよい。回収されたリボソームペプチドは、水又は適当な緩衝溶液あるいは有機溶媒などに溶解又は懸濁して保存し、使用してもよい。また、凍結乾燥その他の適当な方法によって乾燥させてもよい。
【００６０】
＜ｕｓｔＹａタンパク質＞
本発明はさらに、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質、及びこれをコードするｃＤＮＡを提供する。
【００６１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子すなわちｕｓｔＹａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ  ＡＦＬＡ＿０９４９９０）から転写翻訳され、生合成されるタンパク質である。ｕｓｔＹａの塩基配列の開始コドン及び読み枠を考慮した解析は、複数のイントロン及びエクソンの存在と、ｕｓｔＹａ遺伝子産物として配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を示す。しかしながら、Ａ．ｆｌａｖｕｓ細胞内で転写されているｍＲＮＡの塩基配列を実験的に決定した結果、ｕｓｔＹａタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３に示されるものであり、演繹推定される配列番号２のそれとは異なることが確認された。この様に、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は新規な物質である。
【００６２】
後に実施例で示すように、Ａ．ｆｌａｖｕｓのゲノム上のｕｓｔＹａ遺伝子を外来遺伝子で置換してｕｓｔＹａ遺伝子の機能を失わせることにより、Ａ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシンＢ及びウスチロキシンＦの生産能が失われる。すなわち、ｕｓｔＹａタンパク質はウスチロキシンＢ及びウスチロキシンＦの生合成に関与するタンパク質である。ｕｓｔＹａタンパク質には、金属イオン、特に亜鉛イオンとの結合に関与するモチーフ配列領域、及びＷＨ１ドメインに似た領域などが認められ、リボソームペプチド前駆体の翻訳過程におけるタンパク質輸送、ｔｙｒとＩｌｅとの間の環状構造の形成、酸化還元活性、ＧＴＰａｓｅ活性、ＡＴＰ結合能、遺伝子発現又は転写制御能などの機能を通じて、ウスチロキシンＢの生合成に関与していると推察される。
【００６３】
また、配列番号３に示されるアミノ酸配列を基にタンパク質配列データベースである前記ＵｎｉＰｒｏｔＫＢについてＢｌａｓｔ検索したところ、真菌類（Ｆｕｎｇｉ）以外の生物種において相同性が認められる配列は検出されなかった。
【００６４】
なお、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質も、本発明の一態様である。
【００６５】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。
【００６６】
したがって、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、真菌由来のリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質、特にリボソームペプチド前駆体の翻訳過程におけるタンパク質輸送又はＴｙｒとＩｌｅとの間の環状構造の形成に関与するタンパク質は、本発明の一態様として理解される。
【００６７】
＜ｕｓｔＹｂタンパク質＞
本発明はさらに、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質、及びこれをコードするｃＤＮＡを提供する。
【００６８】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ  ＡＦＬＡ＿０９５０２０）を一部に含む周辺領域から転写翻訳され、生合成されるタンパク質である。遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０から演繹推定され、ＮＣＢＩに登録されているタンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に示されるものであるが、実際に遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０を含むゲノム領域から転写翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に示されるものであることが確認された。この様に、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は新規な物質である。
【００６９】
後に実施例で示すように、Ａ．ｆｌａｖｕｓのゲノム上の遺伝子ＡＦＬＡ＿０９５０２０を外来遺伝子で置換して欠失させることにより、Ａ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシン生産能が失われる。すなわち、ｕｓｔＹｂタンパク質はウスチロキシンＢの生合成に関与するタンパク質である。ｕｓｔＹｂタンパク質には、金属イオン、特に亜鉛イオンとの結合に関与するモチーフ配列領域が２箇所、及びヒスチジン−リッチ領域などが認められ、リボソームペプチド前駆体の翻訳過程におけるタンパク質輸送、ｔｙｒとＩｌｅとの間の環状構造の形成、酸化還元活性、ＧＴＰａｓｅ活性、ＡＴＰ結合能、遺伝子発現又は転写制御能などの機能を通じて、ウスチロキシンＢの生合成に関与していると推察される。
【００７０】
また、配列番号６に示されるアミノ酸配列を基にタンパク質配列データベースである前記ＵｎｉＰｒｏｔＫＢについてＢｌａｓｔ検索したところ、真菌類（Ｆｕｎｇｉ）以外の生物種において相同性が認められる配列は検出されなかった。
【００７１】
なお、配列番号６に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、真菌細胞内におけるリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質も、本発明の一態様である。
【００７２】
前述の通り、タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。
【００７３】
したがって、配列番号６に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、真菌由来のリボソームペプチドの生合成に関与するタンパク質、特にリボソームペプチド前駆体の翻訳過程におけるタンパク質輸送又はｔｙｒとＩｌｅとの間の環状構造の形成に関与するタンパク質は、本発明の一態様として理解される。
【００７４】
＜ｃＤＮＡ＞
本発明はさらに、前記ｕｓｔＹａタンパク質又はｕｓｔＹｂタンパク質をコードするｃＤＮＡも提供する。ここにいうｃＤＮＡとは、配列番号３又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を組換え的に生産するに適した、ゲノム上の塩基配列の一部に改変が加えられた塩基配列からなるＤＮＡ分子を意味する。その好適な例は、配列番号３又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を一続きのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）としてコードするｃＤＮＡ、又は配列番号３又は配列番号６に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失若しくは置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を一続きのＯＲＦとしてコードするｃＤＮＡである。異なる態様として、ゲノム上の塩基配列にあるイントロン配列の一部を含むｃＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
【００７５】
本発明のｃＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有する核酸と結合した２本鎖、３重鎖であってもよい。また、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
【００７６】
本発明のｃＤＮＡは、配列番号１〜６に示される配列情報を基に、ハイブリダイゼーションやＰＣＲ法などの遺伝子工学的手法を用いたクローニングや、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法を利用して、当業者が容易に製造することができる。また本発明のｃＤＮＡは、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターに組み換えて使用することができる。ベクターは、必要に応じて他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列の例としては、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のタンパク質をコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等を挙げることができる。
【００７７】
本発明のｃＤＮＡ、これを含む組み換えベクター、及び該ベクターによって形質転換された宿主細胞は、ｕｓｔＹａタンパク質、ｕｓｔＹｂタンパク質の組換え的生産に利用することができる。本発明のタンパク質を組み換え生産するには、本発明のｃＤＮＡ又は該ｃＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞を適当な条件下で培養して培養混合物を回収し、本発明のタンパク質を回収し、必要に応じて精製すればよい。培養混合物から本発明のタンパク質を精製する方法としては、タンパク質や低分子化合物の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００７８】
なお、本発明のタンパク質を他のタンパク質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合タンパク質として発現させることも可能である。この様な融合タンパク質もまた、本発明の一態様である。これらの融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、タンパク質の調製をより有利に行うことが可能となる。
【００７９】
この様に、本発明のタンパク質は、それ単独の形態でも別種のタンパク質との融合タンパク質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明のタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、タンパク質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている種々の手法による加工も可能である。
【００８０】
本発明を通じて特定される真菌由来のリボソームペプチド合成遺伝子クラスターは、リボソームペプチド前駆体遺伝子並びにｕｓｔＹａホモログ遺伝子及び／又はｕｓｔＹｂホモログ遺伝子の他に、様々な修飾反応に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、それらタンパク質はそれぞれのリボソームペプチドの生合成に最適化されたタンパク質であると推察される。そのため、各クラスターの構成遺伝子を相互に組換え、あるいは複数の構成遺伝子を任意に組み合わせることで、天然に生産されるものとは異なる構造や生理活性を有する非天然型のリボソームペプチドを製造することも可能となる。
【００８１】
また、特定されたリボソームペプチド合成遺伝子クラスターが、例えば調節因子をコードする遺伝子を欠いている、あるいはｕｓｔＹａ遺伝子ホモログ及び／又はｕｓｔＹｂ遺伝子ホモログの一部が欠失している等の場合には、他のリボソームペプチド合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子から相当する機能を有する遺伝子又は別のｕｓｔＹａ遺伝子ホモログ及び／又はｕｓｔＹｂ遺伝子ホモログを補填することで、新たなリボソームペプチドを製造することも可能である。
【００８２】
本発明における遺伝子組換え手法、細胞培養、タンパク化学的手法は、当業者に知られた種々の実験ハンドブック、マニュアル、教科書あるいは様々な学術文献や特許文献に記載された手法を適宜選択して採用することができる。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年）その他の実験操作マニュアルに記載された方法などを挙げることができる。
【００８３】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００８４】
＜実施例１＞ウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターの同定
（１）ＧｅｎＢａｎｋＥＱ９６３４７２−ＥＱ９６６２３２として登録されている黄色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）の全ゲノム情報を基に、ＭＩＤＤＡＳ−Ｍ法を用いて二次代謝産物合成遺伝子クラスター解析を行った。その結果、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤのＡＦＬＡ＿０９５０４０からＡＦＬＡ＿０９５１１０までの１８遺伝子が、上記クラスターを構成する候補遺伝子として推定された。
【００８５】
（２）Ｍｉｎら（２００７年、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４２巻、７２９−７３３頁）の方法に従い、ｐｙｒＧ遺伝子を選択マーカーとして上記遺伝子を１つずつ選択マーカー遺伝子と置換することで欠失させた、計１８種類のＡ．ｆｌａｖｕｓ変異株を作成した。具体的な作業は次の通りである。
【００８６】
まず、標的となる１８の遺伝子それぞれについて、その上流及び下流各１ｋｂを含むゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ゲノム領域の増幅断片１を作製した。一方、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｐｙｒＧ遺伝子を含む約１．８ｋｂのゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ｐｙｒＧ遺伝子を含むゲノム領域の増幅断片２を作製した。さらに、増幅断片１及び２を鋳型として、両断片が連結した核酸が増幅されるよう設計されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、両ゲノム領域の融合ＰＣＲ増幅断片３を調製した。
【００８７】
１．１２ｍｇ／ｍＬのウラシルを含む２４ｇ／ＬのＤｉｆｃｏポテトデキストロース培地にＡ．ｆｌａｖｕｓ（ＣＡ１４株、Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）の分生胞子を懸濁し（１０６／ｍＬ）、３７℃で２日間培養した。菌体を回収し、溶菌酵素（Ｓｉｇｍａ社のｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ、ＴａＫａＲａ社のＹａｔａｌａｓｅ、ヤクルト社のセルラーゼ）を含む緩衝液中に懸濁して３０℃で３時間インキュベートして、プロトプラストを調製した。このプロトプラストを等張液に懸濁後、前記１８種類の融合ＰＣＲ増幅断片３（１μｇ）を別々に加えて形質転換させ、ポリエチレングリコールの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、プロトプラストを再生培地上に置き、３〜５日間培養して真菌細胞を再生させた。再生された１８の変異株が、導入されたｐｙｒＧ遺伝子との置換によって各標的遺伝子が欠失したゲノム構造を有するものであることを、組み換えられたゲノム領域を鋳型にＰＣＲで増幅させた核酸断片の配列解析により、確認した。
【００８８】
（３）１８の変異体それぞれを３０ｍＬのＶ８ジュース培地（２０％キャンベル社Ｖ８野菜ジュース及び０．３％炭酸カルシウムを含む）中で３０℃で５日間した後、２３ｍＬのアセトンを加えて室温で１時間インキュベートした。菌糸体をフィルターで取り除いた抽出液からアセトンを蒸発させ、残った濃縮液に等量の酢酸エチルを添加して１時間静置後、水相をポアサイズ０．２２μｍのフィルターに通して、ＬＣ−ＭＳ用試料を調製した。
【００８９】
ＬＣ−ＭＳ用試料を、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＸＧ−Ｃ１８Ｍ−５逆相カラム（野村化学社）をセットしたＵｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社）及び水／アセトニトリルのグラジエント（０％−１００％）溶媒を用いて分画した。溶出画分中のウスチロキシンＢの含有量をｍｉｃｒＯＴＯＦＩＩ  ＫＩＫ２  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて定量した。定量は、ＲＴ＝９分におけるｍ／ｚ６４４．２±０．１のＥＩＣｓ［Ｍ−Ｈ］−のピークエリアの算出によって行った。上記ＬＣ−ＭＳの結果を図２に示す。
【００９０】
上記の遺伝子のうち、ｕｓｔＨ（ＡＦＬＡ＿０９５０３０、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）の欠失はウスチロキシンＢの再生能に影響を与えなかったが、これはＡ．ｆｌａｖｕｓのゲノムに同一の生理活性を有するタンパク質をコードする別の遺伝子（ＡＦＬＡ＿０７４１００）が存在しており、これが欠失したｕｓｔＨの機能を補っているためと推察される。
【００９１】
ｕｓｔＦ１（ＡＦＬＡ＿０９４９５０）及びｕｓｔＰ２（ＡＦＬＡ＿０９５０１０）がそれぞれ欠失した変異株はいずれも少量のウスチロキシンＢの産生能を示した。Ａ．ｆｌａｖｕｓのゲノムにはこれら遺伝子と高い相同性を有する別の遺伝子が存在しており、これらが欠失した遺伝子の機能を補っているものと推察される。
【００９２】
ｕｓｔＰ１（ＡＦＬＡ＿０９５０００）及びｕｓｔＹｂ（ＡＦＬＡ＿０９５０２０）については相同性の高い他の遺伝子がゲノム上には存在しないが、ｕｓｔＰ１及びｕｓｔＹｂがそれぞれ欠失した変異株も、少量のウスチロキシンＢの産生能を示した。後に説明するが、ＲＮＡシーケンスによって決定されるｕｓｔＰ１及びｕｓｔＹｂそれぞれから発現されるタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてアノテーションされているアミノ酸配列とは異なるものであった。推測に拘束されるものではないが、結果的にｐｙｒＧ遺伝子との置換はｕｓｔＰ１及びｕｓｔＹｂそれぞれから発現されるタンパク質の一部が欠損した変異体の発現を許しており、これが前記少量のウスチロキシンＢの産生能をもたらしているものと推察される。
【００９３】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに対するＢｌａｓｔｐサーチの結果によると、ｕｓｔＰ１はＳ４１ペプチダーゼファミリーのＮ末端領域に、及びｕｓｔＰ２は同じＳ４１ペプチダーゼファミリーの活性領域にそれぞれ相当する配列をコードしており、両遺伝子で１つのタンパク質をコードしていることが推察された。
【００９４】
ｕｓｔＹａ（ＡＦＬＡ＿０９４９９０）及びｕｓｔＹｂは、Ｂｌａｓｔデータベースに対する検索の結果、真菌に特異的な遺伝子であることが確認された。
【００９５】
ｕｓｔＳ（ＡＦＬＡ＿０９５１１０、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）は、ウスチロキシンＢの生合成において必須の反応工程である、ウスチロキシンを構成するチロシン残基の芳香環にＳ−ノルバリンを転移させる反応を触媒する酵素である。しかし、ｕｓｔＳの欠失はウスチロキシン産生能に影響を与えなかった。これは遺伝子クラスターの外に存在する相同遺伝子ＡＦＬＡ＿０８７２４０が欠失したｕｓｔＳの機能を補っているためと推察される。
【００９６】
ＡＦＬＡ＿０９５０８０及びＡＦＬＡ＿０９５０９０にコードされているアミノ酸配列はそれぞれ、真菌特異的な転写因子ドメイン（ｐｆａｍドメイン）及びＺｎ２Ｃｙｓ６バイヌクレアクラスターＤＮＡ結合ドメインを完全に保持した、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来の転写因子（遺伝子名；ＡＯ０９０１１３００００３５）のＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列はと一致していた。ｃＤＮＡとしてＡＦＬＡ＿０９５０８０及びＡＦＬＡ＿０９５０９０をつなぐ領域が増幅されることが、定量的リアルタイムＰＣＲ法によって確認された。以上から、ＡＦＬＡ＿０９５０８０及びＡＦＬＡ＿０９５０９０は連続して転写され、一つの転写因子（ｕｓｔＲ）を形成していることが確認された。
【００９７】
上記の変異体の解析結果から、遺伝子の欠失でウスチロキシンＢの産生が消失する遺伝子、欠失してもウスチロキシンＢの産生能は維持されるが生合成経路上重要な役割を有する遺伝子として、ｕｓｔＯ（ＡＦＬＡ＿０９４９４０）〜ｕｓｔＳ（ＡＦＬＡ＿０９５１１０）までの遺伝子をウスチロキシンＢの生合成に実質的に関与しているウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターと判断した。これらの遺伝子のＮＣＢＩ  ＩＤ番号、推定機能、及び大きさ（塩基対数）を表７に、またゲノム上の配置を図３に示す。
【００９８】
【表７】
2018050623.tif 000009
【００９９】
＜実施例２＞ｕｓｔＲの過剰発現によるｕｓｔＢの産生量の亢進
Ａ．ｆｌａｖｕｓのｔｅｆ１遺伝子（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５０巻、８５−９２ページ）のプロモーター領域を増幅断片として得ることができるように設計したプライマーを用いて調製した増幅断片４と、ウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターをコードする核酸中のｕｓｔＲプロモーター領域を増幅断片として得ることができるように設計したプライマーを用いて調製した増幅断片５とを用いて、ｕｓｔＲのプロモーター領域がｔｅｆ１遺伝子プロモーターに置き換わった増幅断片６を、融合ＰＣＲ法で調製した。この増幅断片６を用いてＡ．ｆｌａｖｕｓ  ＣＡ１４株（Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）を形質転換して、ｕｓｔＲの過剰発現変異株ｕｓｔＲＯＥを得た。
【０１００】
ｕｓｔＲＯＥを１００ｍＬのＶ８ジュース培地（２０％キャンベル社Ｖ８野菜ジュース及び０．３％炭酸カルシウムを含む）に植菌し、３０℃で４日間撹拌培養した後、菌体を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを菌体から抽出し、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを誘導した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、ｑＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＲＢ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｕｓｔＲの発現の定量解析を行った。発現量は、チューブリンβサブユニット（ＡＦＬＡ＿０５１８４０）の発現量を元に標準化した。
【０１０１】
その結果、ｕｓｔＲＯＥにおけるｕｓｔＲの発現量は、対照と比較して１５倍に上昇することが確認された。また、実施例１と同様にしてウスチロキシンＢの定量を行ったところ、ウスチロキシンＢの産生量も４．８倍に上昇していた。
【０１０２】
＜実施例３＞ＲＮＡシーケンシングによるｕｓｔＢクラスター遺伝子翻訳領域の再アノテーション
Ａ．ｆｌａｖｕｓ  ＣＡ１４株（Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）を親株としてｐｙｒＧ遺伝子を復帰させた復帰変異株を用意した。復帰変異株を１００ｍＬのＶ８ジュース培地（２０％キャンベル社Ｖ８野菜ジュース及び０．３％炭酸カルシウムを含む）に植菌し、３０℃で４日間撹拌培養した。培養後に回収された菌体を液体窒素で凍らせ、乳鉢内で十分に粉砕した。粉砕された菌体を、１５ｍＬのＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）に加えて十分に混和し、氷上に置いた。遠心後の上清を３ｍＬのクロロホルムに加えて十分に混和したのち、室温で３分間静置した。再び遠心して回収した水層を７．５ｍＬのイソプロパノールに加え、室温で１０分間静置した。再度遠心して得たペレットをエタノール洗浄して、ＲＮＡサンプルとした。
【０１０３】
ＳＯＬｉＤ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、メーカーの取扱説明書に基づいてフラグメントライブラリを作成した。次世代シークエンサーシステムＳＯＬｉＤ  ５５００ｘｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、プロトコールに従ってＲＮＡシークエンシングを行った。
【０１０４】
ＳＯＬｉＤシステムから算出されたＸＳＱファイルを展開し、各サンプルに対応したｆａｓｔｑファイルを得た。本データ及び公共配列リードデータベースＮＣＢＩ  ＳＲＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＲＡ）に登録されたリードデータとして、ＳＲＲ２８３８５７、ＳＲＲ２８３８５８、ＳＲＲ４９５７７８、ＳＲＲ４９５９４２、ＳＲＲ４９５９４３、ＳＲＲ５４４８７１、ＳＲＲ５４４８７２、ＳＲＲ５４４８７３、ＳＲＲ６１０５３１、ＳＲＲ６１０５３２、ＳＲＲ６１０５３３、ＳＲＲ６１０５３４、ＳＲＲ６１０５３５、ＳＲＲ６１０５３７及びＳＲＲ６１０５３８を用いて、以下の作業を行った。未同定塩基を含まず、Ｑ値（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が連続７塩基平均２０未満の塩基をトリムした後の長さが３０塩基以上のリードを用いて、マッピング作業を行った。ソフトウェアにはｂｏｗｔｉｅ及びｔｏｐｈａｔを使用した。作業はコンピューター（ＤＥＬＬ社製：ＣＰＵ  Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  Ｅ５２６４３、メモリー２５６ＧＢ、ハードディスク４０ＴＢ、ＯＳ：Ｕｂｕｎｔｕ  Ｌｉｎｕｘ（登録商標）１３．１０））上で行った。マッピング結果をゲノム情報可視化ツールで表示の上、該当遺伝子領域（スキャフォールドＧｅｎＢａｎｋ  ＥＱ９６３４８０上の遺伝子ＡＦＬＡ＿０９４９４０−ＡＦＬＡ＿０９５１１０）を目視で確認し、開始コドンとコドンの読み枠に矛盾のない領域をＣＤＳ領域と同定した。この結果を表８〜表１２に示す。また、得られた結果すなわちｍＲＮＡから実際に翻訳される各タンパク質とゲノム配列から演繹推定される推定アミノ酸配列それぞれについて、それらのゲノム配列に対するＯＲＦの位置を対比させた図を図４及び図５に示す。
【０１０５】
【表８】
2018050623.tif 000010
【０１０６】
【表９】
2018050623.tif 000011
【０１０７】
【表１０】
2018050623.tif 000012
【０１０８】
【表１１】
2018050623.tif 000013
【０１０９】
【表１２】
2018050623.tif 000014
【０１１０】
＜実施例４＞Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓのウスチロキシン生合成遺伝子クラスターの同定
Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４年、第５巻、３８４９ページ）によって報告され、ＮＣＢＩに登録されているＵｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ  ｖｉｒｅｎｓ（Ｕ．ｖｉｒｅｎｓ）のゲノム塩基配列ＵＶ−８ｂ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＨＴＲ０１０００００１−ＪＨＴＲ０１０００４４９）に対して、前記表８〜１２に示されるＡ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターのうちの、ｕｓｔＵを除く遺伝子の各塩基配列（表に示された各アミノ酸配列をコードするＣＤＳ領域に相当する塩基配列）をそれぞれクエリーとし、Ｅ値が１ｅ−４未満であることを相同性のカットオフ値としてｔＢＬＡＳＴｘ検索を行った。検出された領域についてＡＬＮ法及びＧｌｉｍｍｅｒＨＭＭ法を使用したパイプラインによる遺伝子アノテーションを再度行った後、アノテーションされた遺伝子がコードするアミノ酸配列情報をクエリーとして、Ａ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターを構成する各遺伝子に対するＢｌａｓｔｐサーチを行い、相同性を評価した。また同様のクエリーで、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに対するＢｌａｓｔｐサーチを行い、機能予測を行った。これらの解析により、ＮＣＩＢアクセッション番号ＪＨＴＲ０１００００６３．１であるＵ．ｖｉｒｅｎｓゲノムのスキャフォールドにおいて、表１３に示される１３の遺伝子が特定された。
【０１１１】
ＺｈａｎｇらによってアノテーションされているＵＶ８ｂ＿７４８４〜ＵＶ８ｂ＿７４９４の他に、３つの遺伝子（ｕｖ＿ｕｓｔＴ、ｕｖ＿ｕｓｔＣ及びｕｖ＿ｕｓｔＹｂ）が新たに本発明者らによってアノテーションされた。また、これら１３の遺伝子はいずれもＡ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターを構成する各遺伝子に対するＥ値は１ｅ−４未満であり、相同性が高いことが確認された。なお、上記の検索条件では、Ａ．ｆｌａｖｕｓのウスチロキシンＢ生合成遺伝子クラスターに含まれるｕｓｔＰ及びｕｓｔＨに相同性のある遺伝子は、Ｕ．ｖｉｒｅｎｓの上記スキャフォールドの範囲からは見いだされなかった。また、遺伝子の順序はＡ．ｆｌａｖｕｓのそれとは異なるものであった（図６）。
【０１１２】
各遺伝子にコードされるアミノ酸配列の解析により、ｕｖ＿ｕｓｔＡは、小胞体移行シグナル配列と、ウスチロキシンＡを構成するアミノ酸残基であるＴｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ及びＧｌｙがこの順序で並ぶ反復配列及びウスチロキシンＢを構成するアミノ酸残基であるＴｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ及びＧｌｙがこの順序で並ぶ反復配列とをコードしていることが確認された（図７（Ｂ））。
このことから、ｕｖ  ｕｓｔＡはウスチロキシンＡ前駆体及びウスチロキシンＢ前駆体をコードする遺伝子であると推察された。また、Ａ．ｆｌａｖｕｓのｕｓｔＹａ及びｕｓｔＹｂと相同性の高い（Ｅ値が１ｅ−４未満、ビットスコアが５０以上）遺伝子として、ｕｖ＿ｕｓｔＹａ及びｕｖ＿ｕｓｔＹｂがそれぞれ見いだされた。これらは、本発明にいうｕｓｔＹａホモログ遺伝子及びｕｓｔＹｂホモログ遺伝子にそれぞれ相当する。
【０１１３】
さらに、表１３に示される１３の遺伝子は、前記スキャフォールド内において概ね３０ｋｂほどの範囲内にまとまって存在していることが確認された。さらに、ｕｖ＿ｕｓｔＡとｕｖ＿ｕｓｔＹａとの間及びｕｖ＿ｕｓｔＡとｕｖ＿ｕｓｔＹｂとの間は、それぞれ１．４Ｋｂ及び３．０ｋｂであった。
【０１１４】
以上から、Ｕｖｉｒｅｓｎｓにおいて今回確認された１３の遺伝子は、ウスチロキシンＡ及びＢを合成することのできるＵ．ｖｉｒｅｎｓの、ウスチロキシンＡ及びＢの生合成遺伝子クラスターを構成しているものと推察された。
【０１１５】
【表１３】
2018050623.tif 000015
【０１１６】
＜実施例５＞ウスチロキシン生合成遺伝子クラスター中の各遺伝子破壊株の分析
実施例１で特定したウスチロキシン生合成遺伝子クラスター中の１５の遺伝子各々の破壊株の培養上清についてＬＣ−ＭＳ分析を行ったところ、ウスチロキシンＢに対応するｍ／ｚ  ６４４．２［Ｍ−Ｈ］−のＭＳピークに加えて、いくつかの破壊株でのみ顕著に蓄積する２つのＭＳピーク（ｍ／ｚ  ４６５．２［Ｍ−Ｈ］−及びｍ／ｚ  ４５１．２［Ｍ−Ｈ］−）が見いだされた。これらのピークを分取してＮＭＲにより構造決定を行ったところ、それぞれウスチロキシンＢからＳ−ノルバリンが除かれたウスチロキシンＦ（図８）及びさらにメチル基が除去された化合物ＦΔＭｅ（図９）であると同定された。
【０１１７】
また、ｕｓｔＡ、ｕｓｔＲ、ｕｓｔＹａ、ｕｓｔＹｂ及びｕｓｔＱの各遺伝子の破壊株において、ウスチロキシンＢ、ウスチロキシンＦ及び化合物ＦΔＭｅの各環状ペプチドのピークはいずれも消失することが確認された。ｕｓｔＡはリボソームペプチドの前駆体タンパク質遺伝子であり、またｕｓｔＲは遺伝子クラスターの発現を誘導する転写因子であることから、ｕｓｔＹａ、ｕｓｔＹｂ及びｕｓｔＱが、前記各化合物を環状化させてゴルジ体等のペプチダーゼによる分解から保護する役割を担っていると推定された。
＜実施例６＞ｕｓｔＹａの機能同定
【０１１８】
ｕｓｔＹａ（ＡＦＬＡ＿０９４９９０）に含まれる２つの２核型金属捕捉モチーフであるＨＸＸＨＣモチーフについて、それぞれのＨＣ（配列番号３の１６８−１６９番目のＨＣと１９５−１９６番目のＨＣ）をＡＳ−ＡＳ、ＡＳ−ＨＣ、ＨＳ−ＨＣ、ＨＣ−ＨＳへと変異させた４種類のｕｓｔＹａ変異体をコードする遺伝子を含む発現ベクターを次のようにして構築した。
【０１１９】
上流１４５ｂｐ及び下流４４３ｂｐを含むｕｓｔＹａの塩基配列を、両端に制限酵素サイトＳｍａＩを付加した形で、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡、ＴＡＫ−２０１）を用いてＴＡクローニングによりプラスミドベクターに導入した。配列を確認後、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、Ｒ０４６Ａ）を用いて、モチーフ中の２つのＨＣをＨＣ−ＨＣ（コントロール）、ＡＳ−ＡＳ、ＡＳ−ＨＣ、ＨＳ−ＨＣ、ＨＣ−ＨＳとなるよう変異させた５種類のクローニングベクターを作製した。この際用いたコドンは、Ａ：ＧＣＣ、Ｓ：ＴＣＣ、Ｈ：ＣＡＴである。
【０１２０】
５種類それぞれについて、プラスミドベクター上で変異箇所の配列を確認した後、制限酵素ＳｍａＩによって切り出したＤＮＡコンストラクトを、ｕｓｔＹａと隣接するｕｓｔＰ配列及びその下流でありｕｓｔＹａの残りの上流部分でもあるＤＮＡコンストラクト、及びマーカーリサイクルシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰ配列にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｐｙｒＧマーカーをつないだＤＮＡコンストラクトとｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ法により融合させて、７ｋｂ弱のＤＮＡコンストラクトを作製した。
【０１２１】
このＤＮＡコンストラクトをプロトプラスト法によってＡ．ｆｌａｖｕｓ  ＣＡ１４株に形質転換し、ゲノム配列上での上記コンストラクト増幅によるＰＣＲ確認及び塩基配列確認を行い、ｕｓｔＹａの２種類のＨＸＸＨＣモチーフを変化させた上記４種類の点変異株（それぞれＡＳ−ＡＳ株、ＡＳ−ＨＣ株、ＨＳ−ＨＣ株、ＨＣ−ＨＳ株）とコントロール株（ＨＣ−ＨＣ株）を取得した。
【０１２２】
取得した４種類の点変異株及びＨＣ−ＨＣ株を、１％キシロースを含む培地で培養してＣｒｅ−ｌｏｘＰ配列を除去した後、コーン固体培地上で培養を行い、８０％アセトン及び等量の酢酸エチルによる抽出後の水層をＬＣ−ＭＳ分析した。その結果、コントロール株であるＨＣ−ＨＣ株では、ウスチロキシンＢ及びウスチロキシンＦに対応するｍ／ｚ  ６４４．２及びｍ／ｚ  ４６５．２の［Ｍ−Ｈ］−ＭＳピークが確認されたが、残りの点変異株４株ではいずれもこれらのピークが消失した（図１０）。
【０１２３】
以上より、ｕｓｔＹａ及びそのホモログであるｕｓｔＹｂはウスチロキシン生産に必須な活性を持つ酵素であり、その活性中心は２つのＨＸＸＨＣモチーフを中心とする２核型金属捕捉モチーフ部分であると推定された。
【０１２４】
＜実施例７＞分子量１０１９のペプチド化合物を生合成するリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの同定
ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＱ９６３４７２−ＥＱ９６６２３２として登録されている黄色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）の全ゲノム情報を基に、小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子及び配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＵｓｔＹａ）に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を、前述のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ｓｉｇｎａｌＰ  ４．１及びＢｌａｓｔ法によって検索した。その結果、リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子（ＡＦＬＡ＿０６３２６０）及び配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＵｓｔＹａ）に対するＥ値が１ｅ−１１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を有する５つの遺伝子（ＡＦＬＡ＿０６３２７０〜ＡＦＬＡ＿０６３３１０）が隣接する領域が見いだされた。
【０１２５】
さらに、公共データベース（ＮＣＢＩ  ＧＥＯ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に登録された、二次代謝物質を多く産生する培養条件を含む２８条件下で取得された発現情報（ＧＳＥ１５４３５）及び前述のＭＩＤＤＡＳ−Ｍを利用して、上記遺伝子を含み共同的に発現している遺伝子領域を調べた。
【０１２６】
その結果（図１１）及び遺伝子機能アノテーションから、少なくともＮＣＢＩ遺伝子ＩＤがＡＦＬＡ＿０６３１７０〜ＡＦＬＡ＿０６３３３０からなる領域が新規リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターとして推定された。
【０１２７】
さらに、上記クラスター領域のうちＡＦＬＡ＿０６３２６０からＡＦＬＡ＿０６３３２０の７つの遺伝子全て、ＡＦＬＡ＿０６３２８０及びＡＦＬＡ＿０６３３１０それぞれを選択マーカー遺伝子（ｐｙｒＧ）と置換することで欠失させた、計３種類のＡ．ｆｌａｖｕｓ変異株を作成した。具体的な作業は次の通りである。
【０１２８】
上記３種類の標的遺伝子領域それぞれについて、その上流及び下流各１ｋｂを含むゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ゲノム領域の増幅断片１を作製した。一方、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｐｙｒＧ遺伝子を含む約１．８ｋｂのゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ｐｙｒＧ遺伝子を含むゲノム領域の増幅断片２を作製した。さらに、増幅断片１及び２を鋳型として、両断片が連結した核酸が増幅されるよう設計されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、両ゲノム領域の融合ＰＣＲ増幅断片３を調製した。
【０１２９】
１．１２ｍｇ／ｍＬのウラシルを含む２４ｇ／ＬのＤｉｆｃｏポテトデキストロース培地にＡ．ｆｌａｖｕｓ（ＣＡ１４株、Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）の分生胞子を懸濁し（１０６／ｍＬ）、３７℃で２日間培養した。菌体を回収し、溶菌酵素（Ｓｉｇｍａ社のｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ、ＴａＫａＲａ社のＹａｔａｌａｓｅ、ヤクルト社のセルラーゼ）を含む緩衝液中に懸濁して３０℃で３時間インキュベートして、プロトプラストを調製した。このプロトプラストを等張液に懸濁後、前記３種類の融合ＰＣＲ増幅断片３（１μｇ）を別々に加えて形質転換させ、ポリエチレングリコールの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、プロトプラストを再生培地上に置き、３〜５日間培養して真菌細胞を再生させた。再生された３つの変異株が、導入されたｐｙｒＧ遺伝子との置換によって各標的遺伝子が欠失したゲノム構造を有するものであることを、組み換えられたゲノム領域を鋳型にＰＣＲで増幅させた核酸断片の配列解析により確認した。
【０１３０】
３つの変異体それぞれを、１．２ｍＬの蒸留水を加えて滅菌処理をした２．５ｇの粉砕とうもろこし上で、３０℃で６日間した後、１０ｍＬの８０％アセトンを加えて室温で１時間インキュベートした。菌体や固形培地を除いた抽出液からアセトンを蒸発させ、残った濃縮液に等量の酢酸エチルを添加して１時間反応後、水相をポアサイズ０．２２μｍのフィルターに通して、ＬＣ−ＭＳ用試料を調製した。この試料をＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＸＧ−Ｃ１８Ｍ−５逆相カラム（野村化学社）をセットしたＵｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社）及び水／アセトニトリルのグラジエント（０％−１００％）溶媒を用いて分画した。
【０１３１】
３種類の破壊株及びコントロール株（ｐｙｒＧマーカー復帰株）間で保持時間と分子量に相当するｍ／ｚの値のパターンを比較したところ、コントロール株では存在するが、上記リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターに相当する３種類の破壊株でのみ消失するｍ／ｚ  １０１８．４［Ｍ−Ｈ］−（陽イオンでｍ／ｚ  １０２０．４［Ｍ＋Ｈ］＋）のＭＳピークを保持時間１２分の位置に見いだした（図１２）。
【０１３２】
上記ピークを分取して構成アミノ酸の種類を酸分解法で解析し、本化合物が新規リボソームペプチド前駆体タンパク質のコアペプチド配列を構成要素とする分子量１０１９のペプチド化合物（以下、ＰＭＷ１０１９と表す）であることを同定した。
【０１３３】
以上の変異体の解析結果から、ＡＦＬＡ＿０６３１７０〜ＡＦＬＡ＿０６３３３０の１７遺伝子を、ＰＭＷ１０１９の生合成に実質的に関与している生合成遺伝子クラスターの構成遺伝子と判断した。これらの遺伝子のＮＣＢＩ  ＩＤ番号、推定機能、及び大きさ（塩基対数）を表１４に示す。
【表１４】
2018050623.tif 000016
【０１３４】
＜実施例８＞転写因子の過剰発現によるＰＭＷ１０１９の産生量の亢進
実施例６で特定した生合成遺伝子クラスターに含まれるＮＣＢＩ遺伝子ＡＦＬＡ＿０６３１８０は、転写因子に含まれるジンクフィンガーＣ２Ｈ２モチーフを含むタンパク質と相同性があることが、アミノ酸配列解析によって明らかとなった。そこで、Ａ．ｆｌａｖｕｓのｔｅｆ１遺伝子（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、１９９８年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５０巻、８５−９２ページ）のプロモーター領域を増幅断片として得ることができるように設計したプライマーを用いて調製した増幅断片４と、ＡＦＬＡ＿０６３１８０の翻訳領域約１ｋｂを増幅断片として得ることができるように設計したプライマーを用いて調製した増幅断片５とを用いて、ＡＦＬＡ＿０６３１８０のプロモーター領域がｔｅｆ１遺伝子プロモーターに置き換わった増幅断片６を、融合ＰＣＲ法で調製した。この増幅断片６を用いてＡ．ｆｌａｖｕｓ  ＣＡ１４株（Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）を形質転換して、ＡＦＬＡ＿０６３１８０の過剰発現変異株を得た。
【０１３５】
ＡＦＬＡ＿０６３１８０過剰発現変異株を、１．２ｍＬの蒸留水を加えて滅菌処理を施した２．５ｇの粉砕とうもろこし上で、３０℃で６日間培養した後、１０ｍＬの８０％アセトンを培地に加えて室温で１時間インキュベートした。菌体や固形培地を除いた抽出液からアセトンを蒸発させ、残った濃縮液に等量の酢酸エチルを添加して１時間反応後、水相をポアサイズ０．２２μｍのフィルターに通してＬＣ−ＭＳ測定用試料を調製し、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＸＧ−Ｃ１８Ｍ−５逆相カラム（野村化学社）をセットしたＵｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社）及び水／アセトニトリルのグラジエント（０％−１００％）溶媒を用いて分画した。溶出画分中のＰＭＷ１０１９の含有量を、ｍｉｃｒＯＴＯＦＩＩ  ＫＩＫ２  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて定量した。定量は、ＲＴ＝１２分におけるｍ／ｚ  １０１８．４±０．１のＥＩＣｓ［Ｍ−Ｈ］−のピークエリアの算出によって行った。
その結果、ＡＦＬＡ＿０６３１８０過剰発現変異株のＰＭＷ１０１９の産生量は、対照である野生株と比較して１．８倍に上昇することが確認された。
【０１３６】
＜実施例９＞  ＰＭＷ１０１９の構成アミノ酸の同定
培養菌体を８０％アセトンで抽出、ろ過後、濃縮した。水に溶解する該当画分を吸着樹脂を用いて分離し、吸着画分を中圧クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いて精製した。さらに、該当画分を高速液体クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いてメタノール水溶液で分離し、再度高速液体クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いてアセトニトリル水溶液で分離、精製した。精製した分子量１０１９のペプチド化合物を酸加水分解に供した。得られたアミノ酸はＦＤＡＡ誘導化し、超高速液体クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いて分析した。結果、グルタミン酸、アラニン、グリシンが検出された。これらは、該当リボソームペプチド前駆体タンパク質のコアペプチド配列の構成アミノ酸である。
【０１３７】
＜実施例１０＞ＲＮＡシーケンシングによるＰＭＷ１０１９生合成遺伝子クラスターの遺伝子翻訳領域の再アノテーション
公共配列リードデータベースＮＣＢＩ  ＳＲＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＲＡ）に登録されたリードデータとして、ＳＲＲ２８３８５７、ＳＲＲ２８３８５８、ＳＲＲ４９５７７８、ＳＲＲ４９５９４２、ＳＲＲ４９５９４３、ＳＲＲ５４４８７１、ＳＲＲ５４４８７２、ＳＲＲ５４４８７３、ＳＲＲ６１０５３１、ＳＲＲ６１０５３２、ＳＲＲ６１０５３３、ＳＲＲ６１０５３４、ＳＲＲ６１０５３５、ＳＲＲ６１０５３７及びＳＲＲ６１０５３８を用いて、以下の作業を行った。
【０１３８】
未同定塩基を含まず、Ｑ値（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が連続７塩基平均２０未満の塩基をトリムした後の長さが３０塩基以上のリードを用いて、マッピング作業を行った。ソフトウェアにはｂｏｗｔｉｅ及びｔｏｐｈａｔを使用した。作業はコンピューター（ＤＥＬＬ社製：ＣＰＵ  Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  Ｅ５２６４３、メモリー２５６ＧＢ、ハードディスク４０ＴＢ、ＯＳ：Ｕｂｕｎｔｕ  Ｌｉｎｕｘ（登録商標）１３．１０））上で行った。マッピング結果をゲノム情報可視化ツールで表示の上、該当遺伝子領域（スキャフォールドＧｅｎＢａｎｋ  ＥＱ９６３４７７上の遺伝子ＡＦＬＡ＿０６３１２０〜ＡＦＬＡ＿０６３３２０）を目視で確認し、開始コドンとコドンの読み枠に矛盾のない領域をＣＤＳ領域と同定した。
【０１３９】
配列解析の結果、ＡＦＬＡ＿０６３２３０からは配列番号５０及び５１に示される２つのアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＡＦＬＡ＿０６３２７０から配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＡＦＬＡ＿０６３２８０から配列番号５３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＡＦＬＡ＿０６３３２０から配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＡＦＬＡ＿０６３３３０から配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、それぞれ転写翻訳されていることが確認された。また、表１４に示される遺伝子のうち上記以外の遺伝子から転写翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列は、各遺伝子のＮＣＢＩ遺伝子ＩＤで演繹推定されているアミノ酸配列と同一であることが確認された。
【０１４０】
＜実施例１１＞分子量８０９のペプチド化合物を生合成するリボソームペプチド生合成遺伝子クラスターの同定
ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＱ９６３４７２−ＥＱ９６６２３２として登録されている黄色麹菌（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）の全ゲノム情報を基に、小胞体移行シグナル配列及び反復配列を含むアミノ酸配列からなるリボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子及び配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＵｓｔＹａ）に対するＥ値が１ｅ−４未満のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を、前述のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ｓｉｇｎａｌＰ  ４．１及びＢｌａｓｔ法によって検索した。その結果、リボソームペプチド前駆体をコードする遺伝子（ＡＦＬＡ＿０４１４００）及び配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＵｓｔＹａ）に対するＥ値が１ｅ−４８未満のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（ＡＦＬＡ＿０４１３９０）が隣接する領域が見いだされた。
【０１４１】
さらに、公共データベース（ＮＣＢＩ  ＧＥＯ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に登録された、二次代謝物質を多く産生する培養条件を含む２８条件下で取得された発現情報（ＧＳＥ１５４３５）を用いて、上記２遺伝子を含み共同的に発現している遺伝子領域を調べた。
【０１４２】
その結果（図１３）及び遺伝子機能アノテーションから、ＮＣＢＩ遺伝子ＡＦＬＡ＿０４１３２０〜ＡＦＬＡ＿０４１４９０の計１８の遺伝子が、新規リボソームペプチド生合成遺伝子クラスターとして推定された。これらの遺伝子のＮＣＢＩ  ＩＤ番号、推定機能、及び大きさ（塩基対数）を表１５に示す。
【０１４３】
【表１５】
2018050623.tif 000017
【０１４４】
さらに、ＡＦＬＡ＿０４１３２０〜ＡＦＬＡ＿０４１４９０の１８の遺伝子すべて、並びにＡＦＬＡ＿０４１３３０（Ｃ６型転写因子）、ＡＦＬＡ＿０４１３９０（ＵｓｔＹａホモログ）及びＡＦＬＡ＿０４１４００（前駆体タンパク質）のそれぞれを選択マーカー遺伝子と置換することで欠失させた、計４種類のＡ．ｆｌａｖｕｓ変異株を作成した。具体的な作業は次の通りである。
【０１４５】
上記４種類の標的遺伝子領域それぞれについて、その上流及び下流各１ｋｂを含むゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ゲノム領域の増幅断片１を作製した。一方、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｐｙｒＧ遺伝子を含む約１．８ｋｂのゲノム領域が増幅されるよう設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記ｐｙｒＧ遺伝子を含むゲノム領域の増幅断片２を作製した。さらに、増幅断片１及び２を鋳型として、両断片が連結した核酸が増幅されるよう設計されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、両ゲノム領域の融合ＰＣＲ増幅断片３を調製した。
【０１４６】
１．１２ｍｇ／ｍＬのウラシルを含む２４ｇ／ＬのＤｉｆｃｏポテトデキストロース培地にＡ．ｆｌａｖｕｓ（ＣＡ１４株、Δｋｕ７０  ΔｐｙｒＧ  ΔｎｉａＤ）の分生胞子を懸濁し（１０６／ｍＬ）、３７℃で２日間培養した。菌体を回収し、溶菌酵素（Ｓｉｇｍａ社のｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ、ＴａＫａＲａ社のＹａｔａｌａｓｅ、ヤクルト社のセルラーゼ）を含む緩衝液中に懸濁して３０℃で３時間インキュベートして、プロトプラストを調製した。このプロトプラストを等張液に懸濁後、前記４種類の融合ＰＣＲ増幅断片３（１μｇ）を別々に加えて形質転換させ、ポリエチレングリコールの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、プロトプラストを再生培地上に置き、３〜５日間培養して真菌細胞を再生させた。再生された４つの変異株が、導入されたｐｙｒＧ遺伝子との置換によって各標的遺伝子が欠失したゲノム構造を有するものであることを、組み換えられたゲノム領域を鋳型にＰＣＲで増幅させた核酸断片の配列解析により確認した。
【０１４７】
４つの変異体それぞれを１．２ｍＬの蒸留水を加えて滅菌処理をした２．５ｇの粉砕とうもろこし上で３０℃で６日間した後、１０ｍＬの８０％アセトンを加えて室温で１時間インキュベートした。菌体や固形培地を除いた抽出液からアセトンを蒸発させ、残った濃縮液に等量の酢酸エチルを添加して１時間反応後、水相をポアサイズ０．２２μｍのフィルターに通してＬＣ−ＭＳ用試料を調製した。この試料を、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＸＧ−Ｃ１８Ｍ−５逆相カラム（野村化学社）をセットしたＵｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ社）及び水／アセトニトリルのグラジエント（０％−１００％）溶媒を用いて分画した。
【０１４８】
上記４種類の破壊株及びコントロール株（ｐｙｒＧマーカー復帰株）間で保持時間と分子量に相当するｍ／ｚの値のパターンを比較したところ、コントロール株では存在するが、ＡＦＬＡ＿０４１３２０−ＡＦＬＡ＿０４１４９０、ＡＦＬＡ＿０４１３９０（ＵｓｔＹａホモログ）、ＡＦＬＡ＿０４１４００（前駆体タンパク質）を破壊した３種類の破壊株でのみ消失するｍ／ｚ  ８０８．３［Ｍ−Ｈ］−（陽イオンでｍ／ｚ  ８１０．３［Ｍ＋Ｈ］＋）のＭＳピークを、保持時間１３．８分の位置に見いだした（図１４）。
【０１４９】
上記ピークを分取してＮＭＲによる構造解析を行った結果、本化合物が新規リボソームペプチド前駆体タンパク質のコアペプチド配列を構成要素とする、新規な分子量８０９のペプチド化合物（以下、ＰＭＷ８０９と表す）であることが確認された。一方、Ｃ６型転写因子であるＡＦＬＡ＿０４１３３０を破壊しても、またｔｅｆ１プロモーターを用いてＣ６型転写因子を過剰発現させても、ＰＭＷ８０９の生産性に変化は見られなかった。
【０１５０】
以上から、ＮＣＢＩ遺伝子ＡＦＬＡ＿０４１３７０〜ＡＦＬＡ＿０４１４００の４つの遺伝子（表１６）を、新規リボソームペプチドであるＰＭＷ８０９の生合成に実質的に関与している生合成遺伝子クラスターと判断した。
【０１５１】
【表１６】
2018050623.tif 000018
【０１５２】
＜実施例１２＞ＰＭＷ８０９の構成アミノ酸の同定
培養菌体を８０％アセトンで抽出、ろ過後、濃縮した。ブタノールに溶解する該当画分を中圧クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いて精製した。さらに、該当画分を高速液体クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いてメタノール水溶液で分離し、再度高速液体クロマトグラフィーとＯＤＳカラムを用いてアセトニトリル水溶液で分離、精製した。精製した分子量８０９のペプチド化合物の構造解析を高分解能ＥＳＩ  質量分析及び核磁気共鳴スペクトルにより行った。まず、高分解能質量分析により分子式をＣ４２Ｈ４３Ｎ５Ｏ１２と決定した。また、１３Ｃ−核磁気共鳴スペトル及び１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルから、本化合物が、フェニルアラニン、チロシン３つ、スレオニン、グリシンを含むことが分かった。これらは該当リボソームペプチド前駆体タンパク質のコアペプチド配列に含まれるアミノ酸である。
【０１５３】
＜実施例１３＞ＲＮＡシーケンシングによるＰＭＷ８０９生合成遺伝子クラスターの遺伝子翻訳領域再アノテーション
公共配列リードデータベースＮＣＢＩ  ＳＲＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＲＡ）に登録されたリードデータとして、ＳＲＲ２８３８５７、ＳＲＲ２８３８５８、ＳＲＲ４９５７７８、ＳＲＲ４９５９４２、ＳＲＲ４９５９４３、ＳＲＲ５４４８７１、ＳＲＲ５４４８７２、ＳＲＲ５４４８７３、ＳＲＲ６１０５３１、ＳＲＲ６１０５３２、ＳＲＲ６１０５３３、ＳＲＲ６１０５３４、ＳＲＲ６１０５３５、ＳＲＲ６１０５３７及びＳＲＲ６１０５３８を用いて、以下の作業を行った。未同定塩基を含まず、Ｑ値（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が連続７塩基平均２０未満の塩基をトリムした後の長さが３０塩基以上のリードを用いて、マッピング作業を行った。ソフトウェアにはｂｏｗｔｉｅ及びｔｏｐｈａｔを使用した。作業はコンピューター（ＤＥＬＬ社製：ＣＰＵ  Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  Ｅ５２６４３、メモリー２５６ＧＢ、ハードディスク４０ＴＢ、ＯＳ：Ｕｂｕｎｔｕ  Ｌｉｎｕｘ（登録商標）１３．１０））上で行った。マッピング結果をゲノム情報可視化ツールで表示の上、該当遺伝子領域（スキャフォールドＧｅｎＢａｎｋ  ＥＱ９６３４７６上の遺伝子ＡＦＬＡ＿０４１３７０〜ＡＦＬＡ＿０４１４００）を目視で確認し、開始コドンとコドンの読み枠に矛盾のない領域をＣＤＳ領域と同定した。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明によれば、これまでに報告のない新規な真菌由来のリボソームペプチドを製造することができる。これにより、医薬その他の有用物質への応用が期待される真菌由来の二次代謝産物であるリボソームペプチドを提供することが可能となる。また、各クラスターの構成遺伝子を相互に組換え、あるいは複数の構成遺伝子を任意に組み合わせることで、天然に生産されるものとは異なる構造や生理活性を有する非天然型のリボソームペプチドを製造することも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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