(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を簡便に特定するためのマーカーを見出し、当該マーカーに基づいて自己免疫疾患の診断を可能とする。【解決手段】ＣＸＣＬ１３を、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を特定するためのマーカーとして用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から採取された末梢血またはリンパ組織の中に、ＣＸＣＬ１３を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含することを特徴とする、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法。
【請求項２】
上記判定する工程では、更に、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記ＣＤ４  Ｔ細胞が、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物に、自己免疫疾患の治療剤の候補物質を投与する工程と、
上記候補物質を投与する前の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、上記候補物質を投与した後の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、を比較する工程と、を有することを特徴とする、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法、および、自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来、外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかしながら、この免疫系の働きが、生体にとって有害であることもある。
【０００３】
免疫系は、外界からの異物に対してのみならず、自己の構成成分に対しても応答を起こすことが知られている。そして、自己の構成成分に対する免疫系の応答によってある種の病態が生じた疾患は、自己免疫疾患と呼ばれている。
【０００４】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患（臓器特異的自己免疫疾患）と、臓器特異性のない疾患（臓器非特異的自己免疫疾患）とに大別される。これら自己免疫疾患の多くは、組織に病変が認められるとともに、組織傷害を伴うものである。
【０００５】
臓器非特異的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、抗ｄｓＤＮＡ抗体などの自己抗体の産生の増加に起因することが知られているが、ＳＬＥを引き起こすメカニズムの分子生物学的な研究、ＳＬＥと多様な病態との関連の解明、さらには、ＳＬＥの治療法の開発が期待されている。
【０００６】
実験動物を同一の抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。その結果、組織傷害を伴う種々の自己免疫疾患（病態）が生じることが知られている（例えば、特許文献１参照および非特許文献１参照）。
【０００７】
自己免疫疾患による組織傷害に関する研究は進みつつあり、組織傷害に、抗原提示細胞による抗原のクロスプレゼンテーションが関わっていることが明らかにされている。具体的には、（１）自己免疫疾患を患うと、樹状細胞における抗原のクロスプレゼンテーションが増強されること、（２）樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションが増強されるとＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化し、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞によって細胞傷害が誘導されること、が明らかにされている（例えば、特許文献２および非特許文献１参照）。
【０００８】
本発明者らは、マウスに対して抗原による免疫操作を繰り返すことによって、自己応答性・自己抗体誘導性ＣＤ４  Ｔ細胞（autoantibody-inducing CD4 T cells；ａｉＣＤ４  Ｔ細胞）という新たなタイプのＴ細胞が末梢にて生成され、ａｉＣＤ４  Ｔ細胞が、多様な自己抗体を誘導するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を成熟させて種々の臓器障害を惹起してＳＬＥを発症させることを報告している（非特許文献１）。本発明者らは、さらに、ａｉＣＤ４  Ｔ細胞が、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＣＤ１２２ｌｏｗ（ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏ）ＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団に存在すること、このＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団をナイーブなマウスに養子移入すると、移入２週間後のレシピエントマウスの血清中に自己抗体が観察されることを報告している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２８８３８２号公報
【特許文献２】特開２０１０−００４７５０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tsumiyama K. et al., PLoS ONE, Vol.4, No.12, e8382, 2009
【非特許文献２】Miyazaki Y. et al., The Journal of Immunology vol.192, no.2,supplement 177.7、2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を簡便に特定するためのマーカーを見出し、当該マーカーに基づいて自己免疫疾患の診断を可能とすることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法は、上記課題を解決するために、被験体から採取された末梢血またはリンパ組織の中に、ＣＸＣＬ１３を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含することを特徴としている。
【００１３】
本発明の自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法では、上記判定する工程では、更に、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定することが好ましい。
【００１４】
本発明の自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法では、上記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスであることが好ましい。
【００１５】
本発明の自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法では、上記ＣＤ４  Ｔ細胞が、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞であることが好ましい。
【００１６】
本発明の自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法は、上記課題を解決するために、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物に、自己免疫疾患の治療剤の候補物質を投与する工程と、上記候補物質を投与する前の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、上記候補物質を投与した後の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、を比較する工程と、を有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を簡便に特定することができる。
【００１８】
本発明によれば、自己免疫疾患の処置（予防、改善または治療）に有用な物質を簡便にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の実施例における、フローサイトメトリーの試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【００２１】
〔１．自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法〕
本実施の形態の判定方法では、被験体の末梢血またはリンパ組織に存在するＴ細胞の中に、ＣＸＣＬ１３（以下、これを「マーカー」とも呼ぶ場合もある。）を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定することによって、被験体が、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定することができる。そして、その判定結果に応じて、被験体が自己免疫疾患を発症しているか否か、または、発症する可能性があるか否か、を判定することができる。
【００２２】
本実施の形態の判定方法では、被験体の末梢血またはリンパ組織に存在するＴ細胞の中に、更に、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つ（以下、これらを「マーカー」とも呼ぶ場合もある。）を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定することによって、被験体が、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを、更に精度高く判定することができる。そして、その判定結果に応じて、被験体が自己免疫疾患を発症しているか否か、または、発症する可能性があるか否か、を更に精度高く判定することができる。
【００２３】
例えば、被験体から取得したＴ細胞における上記マーカーを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞の割合が、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＴ細胞における上記マーカーを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞の割合よりも増加していれば、「被験体には、上記マーカーを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在する」と判定する。なお、上記マーカーを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞の割合の増加の程度は、統計的に有意な程度であればよく、特に限定されない。
【００２４】
本実施の形態の自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法は、被験体から採取された末梢血またはリンパ組織の中に、ＣＸＣＬ１３を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含していればよく、その他の具体的な工程、条件、材料等は特に限定されない。
【００２５】
本実施の形態の判定方法は、上述した４つのマーカーの中の少なくとも１つ（具体的には、ＣＸＣＬ１３）を発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定すればよいが、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を、より簡便に、かつ、より精度高く特定するという観点からは、好ましくは２つのマーカーを同時に発現しているＣＤ４  Ｔ細胞、より好ましくは３つのマーカーを同時に発現しているＣＤ４  Ｔ細胞、最も好ましくは４つのマーカーを同時に発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かを判定することが好ましい。なお、複数のマーカーは、同じＣＤ４  Ｔ細胞内で同時に発現せず、別々のＣＤ４  Ｔ細胞内で別々に発現していてもよい。
【００２６】
本実施の形態の判定方法は、例えば、自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））の産生量を測定する工程を包含してもよく、健常者と比較して上記自己抗体の産生が亢進しているか否かを確認する工程をさらに包含してもよい。なお、本実施の形態の判定方法は、医師の行為および判断を排除した「判定を補助する方法」または「判定に用いられるデータを取得する方法」でもあり得る。
【００２７】
本明細書において、「ＣＸＣＬ１３」、「ＥＰＳ１５Ｒ」、「ATP-binding cassette subfamily F member 1」および「CD43 activation-associated glycoform」の各々は、特に説明がない場合は、タンパク質、および、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の両方を意図する。例えば、本明細書において、「ＣＸＣＬ１３」は、ＣＸＣＬ１３タンパク質、および、ＣＸＣＬ１３タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の両方を意図する。
【００２８】
上記マーカーは、哺乳動物に由来するものであれば特に限定されず、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００２９】
上記マーカーの塩基配列およびアミノ酸配列は、様々な哺乳動物で同定され、既にＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている。
【００３０】
例えば、ＣＸＣＬ１３の塩基配列およびアミノ酸配列は、マウス（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_018866.2、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH12965.1）、ラット（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_001017496.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH88260.1）、および、ヒト（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_006419.2、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH12589.1）のものが同定されている。
【００３１】
ＥＰＳ１５Ｒの塩基配列およびアミノ酸配列は、マウス（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：U29156.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH15259.1）、および、ヒト（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：AB015346.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：BAA88118.1）のものが同定されている。
【００３２】
ATP-binding cassette subfamily F member 1の塩基配列およびアミノ酸配列は、マウス（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_013854.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_038882.1）、ラット（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_001109883.2、アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_001103353.1）、および、ヒト（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：AB202093.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH34488.1）のものが同定されている。
【００３３】
CD43 activation-associated glycoformの塩基配列およびアミノ酸配列は、マウス（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：NM_009259.5、アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_001032899.1）、ラット（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：MN_001271086.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：NP_001258015.1）、および、ヒト（塩基配列（ｍＲＮＡ）のアクセッション番号：M61827.1、アミノ酸配列のアクセッション番号：AAH12350.1）のものが同定されている。
【００３４】
本明細書において「自己免疫疾患」とは、自己成分（例えば、免疫グロブリンなど）に対する自己抗体（例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））が検出され、自己免疫が病態に関与している疾患が意図される。自己免疫疾患としては、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群など）、および臓器非特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病など）が挙げられる。関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症および混合結合組織病は、膠原病として知られている。すなわち膠原病は、全身性自己免疫疾患に含まれるものである。本発明における自己免疫疾患は、膠原病であることが好ましい。
【００３５】
本明細書において、「被験体」は哺乳動物が意図され、ヒトであってもヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）であってもよい。「非ヒト哺乳動物」は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、個体発生および生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、特にマウス、ラット等が好ましい。
【００３６】
本明細書において、「リンパ組織」は、免疫反応の担い手であるリンパ球の発生、分化、増殖、および機能発現の場となる器官であるリンパ組織のうち、リンパ球の抗原依存性の増殖および反応の場となる器官が意図され、二次的（末梢性）リンパ器官（secondary lymphoid tissue）ともいう。すなわち、「リンパ組織」は、リンパ球の増殖、分化の場で、免疫応答の場でない一次（中枢性）リンパ器官（primary lymphoid tissue）である胸腺、哺乳類の骨髄、鳥類のファブリキウス嚢（bursa of Fabricius）以外のリンパ組織をいう。
【００３７】
このような「リンパ組織」としては、例えば、リンパ節、脾（臓）、腸リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue（扁桃、Peyer板など））などが挙げられる。なかでも、リンパ組織としては、脾臓が好ましい。
【００３８】
本実施の形態の判定方法に末梢血または脾臓を用いることにより、簡便かつ正確に、本実施の形態の判定方法を実施することができる。特に、末梢血を用いる場合は、生体から容易に検体を採取することができる点で、非常に有用である。
【００３９】
本実施の形態の判定方法の判定対象となるＣＤ４  Ｔ細胞としては、特に限定されないが、本発明者らが同定に成功したＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞（例えば、非特許文献２など参照）であることが好ましい。当該構成であれば、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を、より簡便に、かつ、より精度高く特定することができる。
【００４０】
被験体から採取された末梢血またはリンパ組織の中に、上記マーカーを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在するか否かは、例えば、（１）免疫測定法（例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay（ＥＩＡ）、Enzyme-linked Immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ））、または、Immunoblotting）、（２）フローサイトメトリー、（３）ＤＮＡマイクロアレイ解析、（４）ＰＣＲ法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、（５）ノザンハイブリダイゼーション法、または、（６）ドットブロット法、によって判定することができる。
【００４１】
なお、上述した（１）〜（６）の具体的な方法は、特に限定されず、周知の方法に従えばよい。また、上述した（１）〜（６）の具体的な方法は、後述する〔２．自己免疫疾患の診断のためのキット〕を用いて行うことが可能である。
【００４２】
〔２．自己免疫疾患の診断のためのキット〕
本実施の形態の自己免疫疾患の診断のためのキットは、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するための、プライマー、プローブ、マイクロアレイ、および、抗体からなる群より選択される少なくとも１つを備えていることを特徴としている。
【００４３】
本実施の形態の自己免疫疾患の診断のためのキットは、ＣＸＣＬ１３の発現を検出するための、プライマー、プローブ、マイクロアレイ、および、抗体からなる群より選択される少なくとも１つを備え、好ましい形態として、更にＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つの発現を検出するための、プライマー、プローブ、マイクロアレイ、および、抗体からなる群より選択される少なくとも１つを備えていてもよい。
【００４４】
本実施の形態のキットが備えているプライマー、プローブ、マイクロアレイ、および、抗体は、（１）免疫測定法（例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay（ＥＩＡ）、Enzyme-linked Immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ））、または、Immunoblotting）、（２）フローサイトメトリー、（３）ＤＮＡマイクロアレイ解析、（４）ＰＣＲ法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、（５）ノザンハイブリダイゼーション法、または、（６）ドットブロット法などによって、上記マーカーの発現を検出するためのものであって、その具体的な構成は特に限定されない。
【００４５】
上記プライマーは、上述した（４）ＰＣＲ法などに使用するためのものであって、例えば、検出対象（具体的には、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、または、CD43 activation-associated glycoform）のＲＮＡの一部分に対応するポリヌクレオチドであるフォワードプライマーと、検出対象のＲＮＡの一部分に相補的なポリヌクレオチドであるリバースプライマーとからなる、プライマーセットであり得る。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列および塩基長は、特に限定されず、検出対象の塩基配列、および、検出条件（例えば、ＰＣＲの条件）などに基づいて、適宜、設定すればよい。なお、上記プライマーは、周知の合成方法によって作製することができる。
【００４６】
例えば、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ、および、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。そして、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量が、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量よりも多ければ、「被験体には、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在する」と判定できる。
【００４７】
上記プローブは、上述した（５）ノザンハイブリダイゼーション法などに使用するためのものであって、例えば、検出対象のＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであり得る。プローブの塩基配列および塩基長は、特に限定されず、検出対象の塩基配列、および、検出条件（例えば、ノザンハイブリダイゼーション法の条件）などに基づいて、適宜、設定すればよい。なお、上記プローブは、周知の合成方法によって作製することができる。
【００４８】
例えば、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ、および、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを用いてノザンハイブリダイゼーションを行う。そして、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量が、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量よりも多ければ、「被験体には、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在する」と判定できる。
【００４９】
上記マイクロアレイは、上述した（３）ＤＮＡマイクロアレイ解析などに使用するためのものであって、例えば、検出対象のＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドが支持体上に固定化されたＤＮＡマイクロアレイであり得る。マイクロアレイの具体的な構成は、特に限定されないが、ＣＸＣＬ１３のＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド、ＥＰＳ１５ＲのＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド、ATP-binding cassette subfamily F member 1のＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド、および、CD43 activation-associated glycoformのＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドのうちの、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つ、が支持体上に固定化されたものであり得る。なお、上記ポリヌクレオチドは、周知の合成方法によって作製することができる。
【００５０】
例えば、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ、および、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ解析を行う。そして、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量が、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞由来のｍＲＮＡに含まれる上記マーカーのｍＲＮＡの量よりも多ければ、「被験体には、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在する」と判定できる。
【００５１】
上記抗体は、上述した（１）免疫測定法、（２）フローサイトメトリー、または（６）ドットブロット法などに使用するためのものであって、例えば、検出対象のタンパク質を認識するものであればよく、具体的な構成は特に限定されない。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。なお、当該ポリクローナル抗体、および、モノクローナル抗体は、周知の方法によって作製することができる。
【００５２】
例えば、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞由来のタンパク質、および、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞由来のタンパク質を用いて免疫測定法、フローサイトメトリー、または、ドットブロットを行う。そして、被験体から取得したＣＤ４  Ｔ細胞に含まれる上記マーカーのタンパク質の量が、自己免疫疾患に罹患していない健常者から取得したＣＤ４  Ｔ細胞に含まれる上記マーカーのタンパク質の量よりも多ければ、「被験体には、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つを発現しているＣＤ４  Ｔ細胞が存在する」と判定できる。
【００５３】
〔３．自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法〕
本実施の形態の自己免疫疾患の治療剤をスクリーニングする方法は、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物に、自己免疫疾患の治療剤の候補物質を投与する工程と、上記候補物質を投与する前の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、上記候補物質を投与した後の上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現と、を比較する工程と、を有することを特徴としている。
【００５４】
上記比較する工程では、ＣＸＣＬ１３の発現以外に、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformからなる群より選択される少なくとも１つの発現を比較してもよい。
【００５５】
本実施の形態のスクリーニング方法は、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物に、自己免疫疾患の治療剤の候補物質を投与する工程を有している。
【００５６】
自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物は、例えば、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４  Ｔ細胞、staphylococcal enterotoxin B（ＳＥＢ）、または、keyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）を、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど）に繰り返して免疫することによって作製することができる（例えば、特願２００８−１６４５８４、および、特願２０１５−１１５１８９参照）。
【００５７】
治療剤の候補物質は、特に限定されず、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）、ペプチド（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質など）、糖類（例えば、オリゴ糖または多糖類など）、または、合成化合物であり得る。
【００５８】
本実施の形態のスクリーニング方法は、上記非ヒト哺乳動物のＣＤ４  Ｔ細胞における、マーカーの発現を、候補物質の投与前と投与後とで比較する工程を有している。マーカーの発現の検出は、上述した〔２．自己免疫疾患の診断のためのキット〕の欄に記載のキットを用いればよい。
【００５９】
候補物質の投与後のマーカーの発現量が、候補物質の投与前のマーカーの発現量よりも少なければ、当該候補物質を、自己免疫疾患の治療剤として用いることができると判定することができる。なお、上記マーカーの発現量の低下の程度は、統計的に有意な程度であればよく、特に限定されない。
【００６０】
候補物質の投与後のマーカーの発現量と、候補物質の投与前のマーカーの発現量とは、同じ個体の非ヒト哺乳動物を用いて比較してもよいし、異なる個体の非ヒト哺乳動物を用いて比較してもよい。つまり、候補物質の投与後のマーカーの発現量を測定する自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物と、候補物質の投与前のマーカーの発現量を測定する自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物とは、同じ個体であってもよいし、異なる個体であってもよい。
【実施例】
【００６１】
＜１．樹状細胞（Dendritic Cell：ＤＣ）におけるＣＸＣＬ１３の発現解析＞
８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc.）に、卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．５ｍｇまたはＰＢＳ（phosphate buffered saline）を、５日毎に１２回、繰り返し腹腔内投与した。なお、ＯＶＡの投与には、ＰＢＳにＯＶＡを溶かした溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、１回の投与あたり２５０μＬ用いた。
【００６２】
ＯＶＡまたはＰＢＳを１２回投与した後のマウスの脾細胞より、周知の方法にしたがって、ＣＤ１１ｃをマーカーとして、磁気ビーズを用いて樹状細胞を単離した。次いで、周知の方法にしたがって、単離された樹状細胞からＲＮＡを抽出した。
【００６３】
抽出したＲＮＡを用いてマイクロアレイ解析を行い、樹状細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現を検討した。なお、マイクロアレイ解析には、Agilent Technologies社製のWhole Mouse Genome Oligo Microarray 44Kx4 pack  アレイキットを用いた。
【００６４】
試験結果を下記の表１に示す。表１から明らかなように、ＯＶＡを投与したマウスの樹状細胞では、ＰＢＳを投与したマウスの樹状細胞と比較して、ＣＸＣＬ１３の発現量が増加していた。
【００６５】
【表１】
2018050532.tif 000002
【００６６】
＜２．ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現解析＞
８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＯＶＡ０．５ｍｇまたはＰＢＳを、５日毎に、６回または１２回、繰り返し腹腔内投与した。なお、ＯＶＡの投与には、ＰＢＳにＯＶＡを溶かした溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、１回の投与あたり２５０μＬ用いた。
【００６７】
ＯＶＡまたはＰＢＳを、６回または１２回投与した後のマウスの脾細胞より、周知の方法にしたがって、磁気ビーズを用いてＣＤ４  Ｔ細胞を単離した。次いで、周知の方法にしたがって、単離されたＣＤ４  Ｔ細胞からＲＮＡを抽出した。
【００６８】
抽出したＲＮＡを用いてマイクロアレイ解析を行い、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３の発現を検討した。なお、マイクロアレイ解析には、Agilent Technologies社製のWhole Mouse Genome Oligo Microarray Ver.2.0  アレイキットを用いた。
【００６９】
６回の腹腔内投与を行った場合の試験結果を下記の表２に示し、１２回の腹腔内投与を行った場合の試験結果を下記の表３に示す。表２から明らかなように、６回の腹腔内投与を行った場合には、ＯＶＡを投与したマウスのＣＤ４  Ｔ細胞では、ＰＢＳを投与したマウスのＣＤ４  Ｔ細胞と比較して、ＣＸＣＬ１３の発現量に変化がなかった。一方、表３から明らかなように、１２回の腹腔内投与を行った場合には、ＯＶＡを投与したマウスのＣＤ４  Ｔ細胞では、ＰＢＳを投与したマウスのＣＤ４  Ｔ細胞と比較して、ＣＸＣＬ１３の発現量が増加した。
【００７０】
【表２】
2018050532.tif 000003
【００７１】
【表３】
2018050532.tif 000004
【００７２】
＜３．ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞におけるＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformの発現解析＞
本発明者らはこれまでに、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団をナイーブなマウスに養子移入すると、移入２週間後のレシピエントマウスの血清中で自己抗体（ＲＦおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体）の増加が観察されることを見出している（非特許文献２参照）。そこで、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団の中にＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformを発現している細胞が存在するか否かを調べた。
【００７３】
８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＯＶＡ０．５ｍｇまたはＰＢＳを、５日毎に１２回、繰り返し腹腔内投与した。なお、ＯＶＡの投与には、ＰＢＳにＯＶＡを溶かした溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、１回の投与あたり２５０μＬ用いた。
【００７４】
ＯＶＡまたはＰＢＳを１２回投与した後のマウスから脾細胞を回収し、抗ＣＸＣＬ１３抗体、抗ＥＰＳ１５Ｒ抗体、抗ATP-binding cassette subfamily F member 1抗体、または、抗CD43 activation-associated glycoform抗体を用いて、当該脾細胞を蛍光染色した。なお、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、および、ATP-binding cassette subfamily F member 1は、脾細胞の細胞内を蛍光染色し、CD43 activation-associated glycoformは、脾細胞の細胞表面を蛍光染色した。
【００７５】
次いで、フローサイトメーターを用いて、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団を抽出するとともに（非特許文献２参照）、当該亜集団に含まれる細胞の中でＣＸＣＬ１３を発現している細胞を検出した。
【００７６】
その結果を図１（Ａ）〜図１（Ｄ）に示す。図１（Ａ）〜図１（Ｄ）から明らかなように、ＯＶＡを投与したマウスのＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞では、ＰＢＳを投与したマウスのＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ１２２ｌｏＣＤ４  Ｔ細胞と比較して、ＣＸＣＬ１３、ＥＰＳ１５Ｒ、ATP-binding cassette subfamily F member 1、および、CD43 activation-associated glycoformの発現量が増加していた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明によれば、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を簡便に特定することができるので、本発明は、検査機器の開発に利用可能である。また、本発明によれば、非ヒト哺乳動物に自己免疫疾患を発症させた自己免疫疾患モデル動物を作製し得るので、本発明は、自己免疫疾患の診断のための医薬品、自己免疫疾患の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニングなどに好適に用いることができる。
【図１】
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