(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞を競走馬または競技馬に投与することを前提とし、投与時の幹細胞の生細胞数が所望の数となるように事前に調整し、幹細胞調製施設とは異なる投与場所に幹細胞サンプルを提供可能な幹細胞サンプルの提供方法及び幹細胞提供セットの提供。【解決手段】動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程Ｓ１、凍結された幹細胞を解凍する解凍工程Ｓ２、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から幹細胞が競走馬または競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、競走馬又は技馬へ幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程Ｓ３、生細胞絶対数を満たす幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程Ｓ４、及び実施エリアに上記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程Ｓ５、を含む、競走馬又は競技馬に投与される幹細胞含有剤の提供方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
競走馬または競技馬に投与される幹細胞含有剤の提供方法であって、
動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程、
前記凍結保存工程において凍結された前記幹細胞を解凍する解凍工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、前記競走馬または前記競技馬へ前記幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、前記生細胞絶対数を満たす前記幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程、および、
投与が実施される実施エリアに前記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程、
を含むことを特徴とする幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項２】
前記輸送工程は、前記幹細胞含有剤が収容された第一容器と共に、前記第一容器とは異なる第二容器を輸送することを含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている請求項１に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項３】
前記動物が、ウマ科の動物である請求項１または２に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項４】
前記ウマ科の動物が、ドナー競走馬であるか、またはドナー競技馬である請求項３に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項５】
前記凍結保存工程は、凍結保存される前記幹細胞のドナーとなった前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名が確認可能な状態で当該幹細胞を保存する請求項４に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項６】
凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競走馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競走馬と、の血統または兄弟関係を照合し、または、
凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競技馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競技馬と、の血統または兄弟関係を照合し、
同一血統、または兄弟である前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の前記幹細胞を前記解凍工程に供与する幹細胞として決定する血統照合工程を前記解凍工程前に含む請求項４または５に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項７】
前記生細胞数決定工程は、前記解凍工程によって解凍された前記幹細胞の生細胞数を測定し、前記所定の時の前記生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程をさらに含む請求項１から６のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項８】
前記輸送工程が、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施される請求項１から７のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項９】
前記所定の時から、７２時間未満に前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与可能に前記輸送工程を完了する請求項１から８のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、予め幹細胞投与を受けた前記動物から採取された幹細胞である請求項１から９のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項１１】
前記幹細胞含有剤の提供方法は、
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞自体を前記生細胞数決定工程に供する第一態様、または
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞を継代培養し、前記継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を前記生細胞数決定工程に供する第二態様を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法によって提供される幹細胞含有剤を含み、
前記幹細胞含有剤は、前記幹細胞含有剤の提供方法における解凍工程後の所定の時から、前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの時間の情報が付されていることを特徴とする幹細胞提供セット。
【請求項１３】
前記幹細胞含有剤が収容された第一容器と、前記第一容器とは異なる第二容器と、を含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容された請求項１２に記載の幹細胞提供セット。
【請求項１４】
前記第一容器が、前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与するために用いられる注射針に、直接または間接に連結される注射用容器である請求項１３に記載の幹細胞提供セット。
【請求項１５】
前記幹細胞含有剤が採取された動物がドナー競走馬またはドナー競技馬であり、
前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名情報が含まれている請求項１２から１４のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。
【請求項１６】
前記幹細胞含有剤を注射投与する前に投与される鎮痛剤を含む請求項１２から１５のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞含有剤の提供方法、および幹細胞提供セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、種々の幹細胞を動物に投与する技術が提案されている。
たとえば特許文献１には、ヒト間葉系幹細胞を有効性成分として含んでなるアトピー性皮膚炎治療剤の発明が開示されている。
【０００３】
また特許文献２には、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞を培地で培養し、培養された細胞を回収する工程を含み、所定の特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法の発明が開示されている。同文献の明細書の実施例には、上記羊水由来多分化能幹細胞の、軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞への分化能を確認する試験を実施したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２４２２６５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５４１３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、競走馬は、競走馬特有の怪我や障害が生じることが知られており、競走馬の健康を維持し、怪我を未然に防ぎ、また怪我を早期に治療することについて強い要望がある。そこで、競走馬に幹細胞を投与することにより、上記要望の少なくとも一部を満たすことが期待される。
【０００６】
競走馬は、病気などで動物病院に連れてこられるペット動物や、病院または研究室で使用されるマウスなどと異なり、大型の動物であるため、移動させることが容易ではない。幹細胞投与のために、所定期間内に１回または複数回、馬房と幹細胞を調製する施設（以下、幹細胞調製施設ともいう）とを往復させることによって、競走馬に精神的な疲労を与える虞もある。そのため、競走馬の健康維持や怪我の防止、治療などを日常の居所である馬房または馬房に近い病院などの施設（以下、馬房等ともいう）で行いたいという事情があった。特に、競走馬を、連闘、または中１週もしくは中２週程度の比較的短い間隔でレースに出走させる場合には、馬房等と幹細胞調製施設との往復を避け、馬房等にて適切な処置を受けさせたいという要望があった。上述する競走馬に関する特有の課題は、競技馬に関しても同様のことがいえる。
【０００７】
しかしながら、これまで幹細胞を馬房等で競走馬または競技馬に投与することについての具体的な検討は行われていなかった。競走馬または競技馬に限らず、幹細胞を任意の動物に投与する研究において、幹細胞調製施設とは異なる投与場所へ、幹細胞を提供する方法についての具体的な検討はほとんどなされていない。とりわけ、投与時の生細胞数が所望の数となるように調整された幹細胞サンプルを提供し、幹細胞調製施設とは異なる投与場所で所望の生細胞数を満たす幹細胞サンプルを動物に投与するといった観点の検討はなかった。
たとえば、特許文献１には、有効成分であるヒト間葉系幹細胞を凍結保存状態で供給し、投与直前に解凍し、水性溶質に懸濁して投与してもよいこと、または培養したヒト間葉系幹細胞を回収し、凍結することなく懸濁して投与することが、記載されている。しかし、同文献には、ヒト間葉系幹細胞の具体的な提供方法および投与時の生細胞数について何ら記載も示唆もない。
また特許文献２は、実施例において羊水由来多分化能幹細胞の分化能が確認されたに過ぎず、当該羊水由来多分化能幹細胞を幹細胞調製施設から投与場所まで提供することについて記載も示唆もない。
【０００８】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものである。即ち、本発明は、幹細胞を競走馬または競技馬に投与することを前提とし、投与時の幹細胞の生細胞数が所望の数となるように事前に調整し、幹細胞調製施設とは異なる投与場所に幹細胞サンプルを提供可能な幹細胞サンプルの提供方法および幹細胞提供セットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の幹細胞含有剤の提供方法は、競走馬または競技馬に投与される幹細胞含有剤の提供方法であって、動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程、上記凍結保存工程において凍結された上記幹細胞を解凍する解凍工程、上記解凍工程後の上記幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から上記幹細胞が上記競走馬または上記競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、上記競走馬または上記競技馬へ上記幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程、上記解凍工程後生細胞数である上記幹細胞を用い、上記生細胞絶対数を満たす上記幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程、および、投与が実施される実施エリアに上記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程、を含むことを特徴とする。
【００１０】
また本発明の幹細胞提供セットは、本発明の幹細胞含有剤の提供方法によって提供される幹細胞含有剤を含み、上記幹細胞含有剤は、上記幹細胞含有剤の提供方法における解凍工程後の所定の時から、上記幹細胞が上記競走馬または上記競技馬に投与されるまでの時間の情報が付されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の幹細胞含有剤の提供方法によれば、幹細胞を競走馬または競技馬に投与することを前提とし、投与する幹細胞の生細胞数を所望の数に調整された幹細胞を、幹細胞調製施設とは異なる投与場所まで輸送にて提供することが可能である。
【００１２】
また本発明の幹細胞提供セットによれば、幹細胞調製施設とは異なる投与場所にて、競走馬または競技馬に所望の生細胞数を含む幹細胞含有剤を投与することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は本発明の第一実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の一例を示すフローチャートであり、（ｂ）は本発明の第一実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の変形例を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第一実施形態にかかる幹細胞提供セットの一例を示す説明図である。
【図３】競走馬の第４世代までの血統を示す説明図である。
【図４】本発明の第二実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。説明には適宜、図面を用いる。すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。また、本発明の幹細胞含有剤の提供方法を説明するにあたり、順番に記載された複数の工程を用いて説明される場合があるが、その記載の順番は複数の工程を実行する順番やタイミングを限定するものではない。このため、本発明の幹細胞含有剤の提供方法を実施するときには、その複数の工程の順番は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することができ、また複数の工程の実行タイミングの一部または全部が互いに重複していてもよい。
【００１５】
本発明において競走馬とは、競馬の競走に用いられる馬を意味し、少なくとも父馬および母馬の血統が明らかである馬を意味する。
本発明に関し、競技馬とは、競技を行うために大会に出場することが可能な馬を指す。競技馬には、血統を有し、血統情報を付して登録されている競技馬、および血統情報を有さずに登録された競技馬を含む。たとえば、オリンピックや国体、国際試合へ参加できる競技馬の年齢は１０歳以上と規定されており、種々の症状を改善し、また健康状態を良好に維持するために、競技馬に本発明を適用することは非常に有効である。
ここで競技とは、乗馬競技、馬術競技、牛追い、ロデオ、ポロ、ホルター等を含み、複数の競技馬が参加して、種々の観点で優劣を競うことを趣旨とする。
【００１６】
以下に述べる本発明の実施形態は、競走馬を例に説明するが、当該説明は競走馬に限定されるものではなく、適宜、競技馬に関する本発明の説明として参照され、また適宜、競走馬を競技馬と読み替えることができる。
本明細書中、幹細胞が投与される競走馬を「被投与競走馬」と呼ぶ場合がある。また幹細胞のドナーとなる動物が競走馬である場合に、上記被投与競走馬と区別して当該競走馬を幹細胞のドナーである「ドナー競走馬」と呼ぶ。本実施形態において、ドナー競走馬とは、幹細胞を採取される競走馬を意味し、現役の競走馬だけではなく、デビュー前の競走馬用の馬、および競馬を引退した馬を含む。競走馬の血統の維持という観点からは、血統の明らかである競馬用の馬であることが重要であって、現役の競走馬であるか否かは問題とならないためである。
また本発明において解凍工程後とは、解凍工程を実施した後の所定の時間範囲を含み、解答工程を実施した直後から、たとえば解凍工程を実施し、次いで継代培養を行い当該継代培養が終了した時点を含む。
【００１７】
＜第一実施形態＞
以下に、本発明の幹細胞含有剤の提供方法および幹細胞提供セットの第一実施形態に関し、説明する。説明には適宜、図１から３を用いる。図１（ａ）は、本発明の第一実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の一例を示すフローチャートであり、図１（ｂ）は本発明の第一実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の変形例を示すフローチャートである。図２は、本発明の第一実施形態にかかる幹細胞提供セット１００の一例を示す説明図である。図３は、被投与競走馬Ｘの第４世代までの血統を示す説明図である。
【００１８】
本実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法（以下、単に本提供方法ともいう）は、競走馬（被投与競走馬Ｘ、図３参照）に投与される幹細胞含有剤の提供方法である。
本提供方法は、図１（ａ）に示すように、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２、生細胞数決定工程Ｓ３、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４、輸送工程Ｓ５を備える。本実施形態では、図１（ａ）に示すとおり、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２、生細胞数決定工程Ｓ３、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４、および輸送工程Ｓ５が、記載の順に実施される。
凍結保存工程Ｓ１は、動物から採取された幹細胞を凍結する工程である。
解凍工程Ｓ２は、凍結保存工程Ｓ１において凍結された幹細胞を解凍する工程である。
生細胞数決定工程Ｓ３は、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から幹細胞が競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、競走馬（被投与競走馬Ｘ）へ幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する工程である。
幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、解凍工程Ｓ２後の前記幹細胞を用い、上記生細胞絶対数を満たす幹細胞を含む幹細胞含有剤１２（図２参照）を調製する工程である。
輸送工程Ｓ５は、投与が実施される実施エリアに幹細胞含有剤１２を輸送する工程である。
【００１９】
本提供方法によれば、凍結保存工程Ｓ１後に生細胞数決定工程Ｓ３を実施し、その後に輸送工程Ｓ５を行うことによって、投与の現場において、所望の生細胞数の幹細胞を確実に被投与競走馬Ｘに投与することが可能である。これにより、被投与競走馬Ｘを馬房等から幹細胞調製施設に移動させることなく、所望の場所（例えば馬房など）で幹細胞を被投与競走馬Ｘに投与することが可能である。本提供方法は、たとえばレースの出走間隔が短い場合、あるいは短期間に複数回の幹細胞投与が望まれる場合など、特に被投与競走馬Ｘが馬房と細胞調製施設とを往復することを回避したい状況において、非常に望ましく幹細胞の投与を実現可能とする。
以下に、本提供方法の詳細を説明する。
【００２０】
（凍結保存工程Ｓ１）
本実施形態における凍結保存工程Ｓ１は、動物から採取された幹細胞を凍結する工程である。凍結保存工程Ｓ１において凍結保存される幹細胞の形態は、幹細胞単体の状態であってもよいが、採取された幹細胞を含む採取物、当該採取物を遠心分離等して得られた幹細胞含有分画物、採取された幹細胞を継代培養して得られた継代培養物、当該継代培養物を遠心分離等して得られた幹細胞含有培養分画物など、任意の混合物であってもよい。上述する任意の状態の幹細胞は、たとえば、不凍液を含む凍結保存液に混合した状態で凍結保存される。凍結保存液としては、たとえば、１０〜２０％のジメチルスルホキシド (ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ)および、５〜１０％のグリセロールを含有することができるが、これに限定されない。
【００２１】
凍結保存工程Ｓ１における凍結温度および凍結方法は特に限定されず、幹細胞を所望の期間、良好に保存できる方法であればよい。良好に保存とは、保存中または保存後の生存率を高い状態（たとえば７０％以上９５％以下）に保つことをいう。保存期間が比較的短期間である場合には、設定温度が−２０℃前後であるフリーザ、または設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることができる。幹細胞の保存期間が数年以上となることが予想される場合には、設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることが好ましく、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）がより好ましい。凍結保存される幹細胞の形態にもよるが、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）を行う場合には、幹細胞を、まず−８０℃のディープフリーザにて２４時間程度保存して凍結し、次いで液体窒素タンクに移すことが好ましい。
【００２２】
本実施形態において、幹細胞は、自己複製能および多分化能（種々の細胞に分化する能力）を有する細胞である。本実施形態において動物から採取された幹細胞とは、特段の断りがない場合には、動物から採取された幹細胞自体または当該採取された幹細胞を継代培養して得られた幹細胞の少なくとも一方である。
本実施形態に用いられる幹細胞は、現在知られている幹細胞あるいは今後の研究で明らかにされる幹細胞より適宜選択することができる。たとえば、脂肪由来の幹細胞（脂肪幹細胞）、臍帯、臍帯血、または胎盤由来の幹細胞（臍帯幹細胞）、骨髄由来の幹細胞（骨髄幹細胞）などを挙げることができるが、これに限定されない。また幹細胞の調製方法も特に限定されず、動物における任意の組織から幹細胞のみを採取する方法、または幹細胞以外の任意の他の生体成分とともに幹細胞を採取する方法を含む。ここで生体成分とは、幹細胞以外の細胞、ホルモンまたは血液成分などの上記動物の生体物質または生体物質から構成される物質を意味する。生体物質とは、生体を構成する生体高分子（多糖、核酸、またはタンパク質など）や、当該生体高分子を構成する各種の糖、脂質、ビタミン、ホルモンなどを意味する。尚、以下の説明において「臍帯、臍帯血、または胎盤」を「臍帯等」と称呼する場合がある。
【００２３】
幹細胞を採取するための動物（即ち、ドナー）は、当該動物の幹細胞を被投与競走馬Ｘに投与可能な範囲において特に限定されない。たとえば動物とは哺乳類である。従来は、自己の幹細胞を投与するという手法が一般的であったが、近年は、一の動物から採取された幹細胞を他の動物に投与する手法（固体間投与）が可能となっている。
【００２４】
たとえば幹細胞は、予め幹細胞投与を受けた動物から採取された幹細胞であることが好ましい。詳細なメカニズムは明らかではないが、幹細胞を投与された経験のある動物から最小された幹細胞は、良質であり再生医療効果が高いからである。
【００２５】
たとえば上記動物は、ウマ科の動物であることが好ましい。ウマ科の動物としては、たとえばウマ、ロバ、シマウマ、およびノロバなどを挙げることができる。ウマ科の動物から採取された幹細胞は、特にウマである競走馬に対する生体適合性または親和性が良好であることが期待される。
【００２６】
また上記ウマ科の動物は、ドナー競走馬であることがより好ましい。全ての競走馬は血統が証明され登録されている。換言すると、父および母の両方の血統が証明されている馬のみが競走馬としての資格を有する。ドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬Ｘに投与することによって、競走馬ではない動物の幹細胞が被投与競走馬Ｘに混入することを回避し、被投与競走馬Ｘの血統の維持に疑念が生じることを回避する。尚、ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとは異なる競走馬であってもよいし、同一の競走馬であってもよい。
【００２７】
凍結保存工程Ｓ１は、凍結保存される幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名が確認可能な状態で当該幹細胞を保存すると良い。これにより、本提供方法により、幹細胞含有剤を提供するにあたり、ドナー競走馬と、被投与競走馬Ｘと、の血統の関係を把握することができる。
【００２８】
ドナー競走馬の馬名が確認可能な状態とは、たとえば、凍結保存される幹細胞が収容された容器、または凍結保存される幹細胞が収容された容器を収納する棚等に当該馬名、または馬名を照合可能な整理番号などを付した状態が例示されるがこれに限定されない。
【００２９】
尚、本実施形態において馬名とは、競走馬として競馬に出走するにあたり登録された当該競走馬の正式名称を意味する。競走馬は馬名登録義務があり、たとえば日本では、所定の団体（平成２７年４月現在、公益財団法人ジャパン・スタッドブック・インターナショナル）による馬名審査を通過した名前が正式な馬名として登録される。
【００３０】
本実施形態における幹細胞含有剤の提供方法は、図１（ａ）に示すように血統照合工程Ｓ１０を備えてもよい。
血統照合工程Ｓ１０は、凍結保存された幹細胞のドナーとなったドナー競走馬と、幹細胞含有剤の投与が予定される競走馬（被投与競走馬Ｘ）と、の血統または兄弟関係を照合し、同一血統または兄弟であるドナー競走馬の幹細胞を後述する解凍工程Ｓ２に供与する幹細胞として決定する工程である。血統照合工程Ｓ１０は、解凍工程Ｓ２前に実施されることが好ましい。
【００３１】
従来の競走馬の研究において、競走馬は、血統により引き継がれる性質を有する傾向にあることが知られており、一世代前（即ち、父母）の性質は３割強程度、引き継がれるとされている。競走馬において血統は重要な要素である。したがって被投与競走馬Ｘに対し、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を提供することは、被投与競走馬Ｘの血統の維持という観点で望ましい影響を与え得る。従来、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬Ｘに対し提供することで血統を維持するという技術的思想は何ら報告されておらず、本発明者が初めてその有効性の示唆とともに実現可能な提供方法を示す。
【００３２】
被投与競走馬Ｘの血統を表す図３を示す。図３は、被投与競走馬Ｘの１代先祖から４代先祖までを示す図であり、４代血統表である。本実施形態において同一血統とは、ドナー競走馬が被投与競走馬Ｘの先祖であるか、ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとが同一の競走馬である場合をいう。ドナー競走馬が、被投与競走馬Ｘの第９世代以下の範囲で同一血統であることが好ましく、第５世代以下の範囲で同一血統であることがより好ましい。たとえば、ドナー競走馬が図３における馬名ＡＢである場合には、当該ドナー競走馬は、被投与競走馬Ｘの父の父の父であり、３代先祖であって被投与競走馬Ｘと同一血統である。
本実施形態において競走馬に関し兄弟とは、両親が同じである全兄弟、父または母のいずれか一方が同じである半兄弟を含む。また兄弟は、姉妹、姉弟、兄妹、および双子を含む。
ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとの兄弟関係を照合するために、凍結保存工程Ｓ１は、凍結保存される幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の父および母の馬名情報が確認可能な状態で当該幹細胞を保存すると良い。例えば、凍結保存される幹細胞の容器に当該幹細胞に固有のロット番号を付すとともに、当該幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名および父、母の馬名である馬名情報を保有するとよい。
【００３３】
血統照合工程Ｓ１０は、ドナー競走馬が被投与競走馬Ｘの先祖であること、または兄弟であることが照合可能な手段により適宜実施することができる。例えば、図３に示す被投与競走馬Ｘの血統表に示される先祖にドナー競走馬が含まれることを確認することで血統照合工程Ｓ１０を実行することができる。血統表におけるドナー競走馬の馬名の確認方法は特に限定されず、血統表を目視で確認して行ってもよいし、情報処理システムを用いてもよい。情報処理システムとしては、たとえば、被投与競走馬Ｘの血統関係が構築されたデータベースを作成し、ドナー競走馬の馬名を入力する馬名入力ステップ、馬名入力ステップで入力された馬名と同一の馬名が上記データベースに存在するか否かを照合する照合ステップ、照合ステップにより照合された結果を表示する表示ステップを有する馬名照合処理システムを用いてもよい。
【００３４】
尚、臍帯は母馬と子馬とを繋ぐものであるところ、本実施形態において、臍帯等から採取された幹細胞は、母馬側の幹細胞であると定義する。したがって本発明において、臍帯等から採取された幹細胞のドナー競走馬は、当該母馬である。
【００３５】
（解凍工程）
次に、解凍工程Ｓ２について説明する。解凍工程Ｓ２は、凍結保存工程Ｓ１において凍結された幹細胞を解凍する工程である。解凍方法は特に限定されず、たとえば、ディープフリーザで約−８０℃で凍結保存された幹細胞の場合、当該ディープフリーザから当該幹細胞を取出し、約３７℃に水温が調製されたウォーターバスに容器ごと浸漬させた状態を数分間保持し解凍することができる。解凍工程Ｓ２では、凍結された幹細胞になるべくダメージを与えない条件で解凍することを配慮する。また凍結前の幹細胞に対する解凍後の幹細胞の生存率を予備実験で確認した場合（即ち、後述する凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を実施した場合）には、当該予備実験と同様の条件で解凍するとよい。
【００３６】
本実施形態では、解凍工程Ｓ２の後、解凍工程Ｓ２により解凍された幹細胞自体を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する。ここでいう幹細胞自体とは、解凍工程Ｓ２において解凍された後、継代培養されていない幹細胞を意味する。
【００３７】
（生細胞数決定工程）
生細胞数決定工程Ｓ３は、本提供方法によって提供される幹細胞含有剤を被投与競走馬Ｘに投与するときに、当該幹細胞含有剤に、所望の数（希望生細胞数）の生きた幹細胞が含まれていることを担保するための生細胞絶対数を決定する工程である。
即ち、生細胞数決定工程Ｓ３は、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から幹細胞が競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における幹細胞の生存率と、競走馬（被投与競走馬Ｘ）へ幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、から生細胞絶対数を決定する工程である。本実施形態では、図１（ａ）に示すとおり、上述する生細胞絶対数を決定するために、演算工程Ｓ３０２を実施する。
【００３８】
具体的に、たとえば上記所定の時から本提供方法により提供される幹細胞含有剤が被投与競走馬Ｘに投与されるまでの推奨される時間である推奨時間が４８時間である場合における生細胞絶対数とそれを決定するための具体的な演算工程Ｓ３０２について説明する。所定の時から４８時間経過時における幹細胞の生存率が上記所定の時の生細胞数（解凍工程後生細胞数）１００％に対し約７０％であり、被投与競走馬Ｘに対し投与が希望される幹細胞の希望生細胞数が１０００万個である場合には、生細胞絶対数Ｚは、以下のとおりの計算式（１）により約１４２９万個である。即ち、演算工程Ｓ３０２は、希望生細胞数を生存率で除して１００倍することによって生細胞絶対数を求めることができる。
[数１]
生細胞絶対数Ｚ（万個）＝１０００（万個）÷７０（％）×１００  （１）
尚、推奨時間経過時における生存率は、用いられる幹細胞の所定の時から適宜の時間経過後の生存率を予め実測して把握することができる。生細胞数決定工程Ｓ３以降の工程に供与される幹細胞は、可能な限り当該幹細胞の生存に適した温度環境（たとえば０℃以上１０℃以下、好ましくは４℃±３℃程度）で取り扱われることが好ましい。したがって、所定の時以降、当該温度環境下において管理された幹細胞の適宜の時間経過時の生細胞数を測定し、上述する所定の時の生細胞数（解凍工程後生細胞数）に対する当該適宜の時間経過時の生細胞数の比率から、適宜の時間経過時の生存率を算出することができる。そして、上述する適宜な時間のうち、充分な生存率が確認された時間を推奨時間とすることができる。たとえば本発明者の事前の実測によれば、馬から採取した一般的な幹細胞は、解凍工程Ｓ２後の所定の時から、冷蔵環境下で保存された幹細胞の生存率は、２４時間経過時では約８０％、４８時間経過時では約７０％、７２時間経過時では約６０％であることが把握されている。ここで冷蔵環境下とは、０℃超えて１０℃以下の温度環境下のことをいう。
【００３９】
ここで所定の時とは、生細胞数決定工程Ｓ３において、解凍工程後生細胞数が任意の方法で確認される時のことをいう。所定の時は、幹細胞含有剤を投与するまでの推奨時間の起算開始時となる。ただし、所定の時は、解凍工程後生細胞数が任意の方法で確認される時と秒単位または数分単位で厳密に一致することまで必ずしも求めなくてもよい。
解凍工程後生細胞数とは、解凍工程Ｓ２を経て、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数を意味する。解凍工程Ｓ２の後に速やかに生細胞数決定工程Ｓ３が実施される態様では、解凍工程後生細胞数は、解凍工程Ｓ２の後、継代培養を経ずに速やかに生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数である。解凍工程Ｓ２の後、継代培養工程Ｓ３０（図４、第二実施態様参照）により得られた継代培養幹細胞を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する態様では、解凍工程後生細胞数は、決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数である。
即ち、本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３の前工程として凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２を含む。凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２においてある程度、幹細胞の死滅が予想される。そのため、解凍工程Ｓ２後に生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数（解凍工程後生細胞数）を確認し、その確認した時を所定の時と呼ぶものである。解凍工程後生細胞数の確認方法は特に限定されず、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数を把握可能な方法であればよい。本実施形態では、解凍工程後生細胞数を確認するために、生細胞数決定工程Ｓ３において解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１さらに含む。
【００４０】
即ち、図１（ａ）に示すとおり、本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３が、解凍工程Ｓ２によって解凍された幹細胞の生細胞数を測定し、解凍工程後生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１をさらに含む。解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含むことにより、後述する幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製される幹細胞含有剤に含有される生細胞数の精度が高くなる。
【００４１】
ただし、生細胞数決定工程Ｓ３における確認方法は、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１に限定されない。解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含まない、本実施形態の変形例を図１（ｂ）に示す。当該変形例は、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含まず、凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を有する。
かかる変形例では、予め、凍結保存工程Ｓ１と同様の温度条件で凍結保存し、解凍工程Ｓ２と同様の解凍条件で解凍した幹細胞の生細胞数の生存率を確認する凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を行う。凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３において、解凍後の生細胞数の確認が、当該解凍後Ｘ分後であるとき、変形例における所定の時は、解凍工程Ｓ２における幹細胞の解凍後Ｘ分後である。
このように、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の生細胞数を実際に測定する以外の方法で、解凍工程Ｓ２の幹細胞の生細胞数を把握してもよい。
【００４２】
尚、本発明は、さらなる変形例として、凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３および解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１のいずれも含む本提供方法を包含する。即ち、凍結保存生細胞数予め凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を実施し、凍結保存工程Ｓ１前の生細胞数に対する凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２実施後の生細胞数の概数を把握する。加えて、解凍工程Ｓ２後に、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施して所定の時の生細胞数を正しく測定してもよい。
【００４３】
（幹細胞含有剤調製工程）
次に幹細胞含有剤調製工程Ｓ４について説明する。幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、上述する前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、生細胞数決定工程Ｓ３において決定された上記生細胞絶対数を満たす幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する工程である。
本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３および幹細胞含有剤調製工程Ｓ４を含むことにより、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２および後述する輸送工程Ｓ５を有しながらも、所望の生細胞数以上の幹細胞を被投与競走馬Ｘに対し投与することを可能とする。
【００４４】
幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において生細胞絶対数を満たす幹細胞とは、生細胞絶対数以上の生細胞を含む幹細胞を意味する。即ち、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、生細胞絶対数以上の生きた幹細胞が含有されるよう幹細胞含有剤における幹細胞の含有量を調整する。具体的には、たとえば、生細胞数決定工程Ｓ３において確認された解凍工程後生細胞数がＹ個／ｍｌであって、上記計算式（１）によって算出された生細胞絶対数Ｚが、約１４２９万個である場合には、幹細胞含有剤に含有される幹細胞（厳密には生細胞数決定工程Ｓ３に供された、幹細胞を含有する材料）は、（１４２９÷Ｙ）ｍｌ以上である。
【００４５】
本実施形態において、幹細胞含有剤とは、幹細胞を含有し、被投与競走馬Ｘに投与可能な剤を意味する。幹細胞含有剤は、幹細胞と当該幹細胞を含有する媒体のみから構成することもできるが、幹細胞と幹細胞以外の上記生体成分とが含まれていてもよい。また本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、幹細胞含有剤には、幹細胞および上記媒体以外の任意の添加剤が含有されていてもよい。
【００４６】
幹細胞含有剤の形態は特に限定されない。たとえば幹細胞含有剤は、幹細胞をリンゲル液などの適宜の液体に含有させた液状幹細胞含有剤、幹細胞を含みゼラチン化またはゲル化させてなる半固体状幹細胞含有剤、または幹細胞を含み上記半固体状幹細胞含有剤よりも体積変化が小さい固体状幹細胞含有剤などであってよい。液状幹細胞含有剤は、被投与競走馬Ｘに対し、注射により幹細胞を投与することができるため、投与作業が容易であり、後述する輸送工程完了後、速やかに被投与競走馬Ｘに対し幹細胞を投与することができる。
【００４７】
（輸送工程）
次に輸送工程Ｓ５について説明する。輸送工程Ｓ５は、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製した幹細胞含有剤を、投与が実施される実施エリアに輸送する工程である。
【００４８】
輸送工程Ｓ５における輸送とは、道路、鉄道、船舶および航空などの公衆の利用できる公開された施設を利用する移動を意味する。利用可能な輸送の手段としては、郵便や宅配便などが挙げられるがこれに限定されず、幹細胞が凍結保存された施設から、上記公開された施設を用いて、幹細胞含有剤を移動させる種々の手段を広く包含する。
【００４９】
実施エリアとは、投与が実施される所定の場所、または当該場所に近接する施設を含む所定領域を意味する。所定領域とは、投与が実施される所定の場所まで上述する輸送の施設を使用せずとも移動可能な領域である。より具体的には、たとえば実施エリアとは、投与が実施される馬房または当該馬房に近接する施設を含む領域であり、輸送工程Ｓ５においてたとえば当該馬房または当該施設に幹細胞含有剤が送り届けられる。
【００５０】
輸送工程Ｓ５は、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施されることが好ましい。これにより、輸送工程Ｓ５における幹細胞の死滅や活性低下を抑制し、良質な幹細胞含有剤を提供することが可能であるからである。たとえば民営会社の有料サービスである低温温度管理可能な宅配便などを利用してもよい。
【００５１】
輸送工程Ｓ５に費やされる時間は、上述する所定の時から幹細胞含有剤が被投与競走馬Ｘに投与されるまでの推奨される推奨時間未満であることが望ましい。
より具体的には、たとえば上記所定の時から、７２時間未満に幹細胞含有剤を競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与可能に輸送工程を完了することが好ましく、４８時間以内であることがより好ましく、３０時間以内であることがさらに好ましい。
本発明者の検討によれば、幹細胞含有剤は、冷蔵保存（０℃を超えて１０℃以下で保存）の状態を維持した場合であっても、保存時間があまり長くなると、生存率が顕著に低下するという弊害とともに、死滅した幹細胞が変質し、被投与競走馬Ｘに対し望ましくない影響を与える虞があることがわかった。これを回避するために、所定の時から輸送工程の完了までの時間を上述する範囲とすることが好ましい。
【００５２】
本実施形態における輸送工程Ｓ５は、図２に示すとおり、幹細胞含有剤１２が収容された第一容器１０と共に、第一容器１０とは異なる第二容器４０を輸送することを含む。第二容器４０は、幹細胞含有剤１２と同一の組成である生細胞数確認用サンプル１２０が収容されている。
【００５３】
上記実施エリアにおいて確認用サンプル１２０の生細胞数を測定し希望生細胞数を満たすことを確認することによって、幹細胞含有剤１２の生細胞数が希望生細胞数を満たすことを把握することができる。これにより幹細胞含有剤１２の投与の確実性と信頼性を向上させることができる。
たとえば輸送工程Ｓ５における輸送トラブルによって、予定していた輸送時間を超過し、また輸送時の温度管理が不徹底になる等して、幹細胞含有剤１２が希望生細胞数を下回ってしまった場合、その幹細胞含有剤１２の投与を回避することができる。かかる趣旨からは、確認用サンプル１２０の生細胞数の測定は、輸送工程Ｓ５後、幹細胞含有剤１２を被投与競走馬Ｘに対し投与する前に実施されることが望ましい。
ただし上述は、希望生細胞数を下回ってしまった幹細胞含有剤１２を被投与競走馬Ｘに投与することを禁止する趣旨ではない。たとえば、本提供方法を複数回実施し、幹細胞含有剤１２が所定期間を空けて複数回投与される場合、希望生細胞数を下回った幹細胞含有剤１２を投与するとともに、それ以降に実施する投与時の希望生細胞数を適宜増加するよう調整することができる。
また確認用サンプル１２０と投与用の幹細胞含有剤１２とを異なる容器に収容しているため、投与前の生細胞数の測定作業時における幹細胞含有剤１２のコンタミネーションを回避することができる。そのため馬房などのクリーンルームのない環境でも安心して投与前に、生細胞数の測定を実施することができる。
【００５４】
（幹細胞提供セット）
次に図２を用いて、幹細胞提供セット１００について説明する。
幹細胞提供セット１００は、本実施形態の幹細胞含有剤の提供方法によって提供される幹細胞含有剤１２を含む。本実施形態の幹細胞含有剤１２は、幹細胞含有剤の提供方法における解凍工程Ｓ２後の所定の時から、幹細胞が競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの時間の情報（投与時間情報２２）が付されている。そのため幹細胞提供セット１００を受け取った者は、時間の情報（投与時間情報２２）を容易に知ることができる。
たとえば、時間の情報（投与時間情報２２）とは、上述する推奨時間により決定された時刻である。図２に示す幹細胞提供セット１００には、マニュアル２０が含まれており、マニュアル２０に「○月×日△時までに投与してください」なる時間の情報（投与時間情報２２）が記されている。推奨時間が守られることにより、希望生細胞数を被投与競走馬Ｘに投与することの確実性が図られる。
【００５５】
本実施形態の幹細胞提供セット１００は、幹細胞含有剤１２が含有された第一容器１０と、第一容器１０とは異なる第二容器４０と、を含む。第二容器４０は、幹細胞含有剤１２と同一の組成である生細胞数確認用サンプル１２０が収容されている。第二容器４０が輸送されることによる効果は、上述したとおりであるため、ここでの説明は割愛する。
【００５６】
本実施形態における第一容器１０は、幹細胞含有剤１２を競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与するために用いられる注射針（図示省略）に、直接または間接に連結される注射用容器である。幹細胞含有剤１２が注射容器に収容された状態で提供されることで、馬房などの雑菌の多い場所で投与が実施される場合であっても、輸送工程Ｓ５後、速やかに、かつ汚染を回避して、投与を実施することができる。
【００５７】
上記注射容器は、たとえば注射筒や点滴バックなどを挙げることができるが、これに限定されない。針は、幹細胞提供セット１００に同封してもよいし、輸送先で調達されてもよい。図２に示す第一容器１０は、幹細胞含有剤１２を収容可能な本体１６と、針結合部１７と、ピストン１８とを備える注射筒である。幹細胞提供セット１００において、本体１６に幹細胞含有剤１２が収容されている。注射筒である第一容器１０は、本体１６に対し相対的にピストンヘッド１８０の位置を固定するための、ストッパ１５が設けられている。これによって、本体１６に収容された幹細胞含有剤１２に対し、ピストン１８の圧力がかからないようになっている。ストッパ１５は第一容器１０から取り外し可能であり、幹細胞含有剤１２を投与する前にストッパ１５を容易に取り外すことができる。ストッパ１５の取り外し手段は特に限定されない。また、針結合部１７には、キャップ１９が嵌められており、本体１６に収容された幹細胞含有剤１２が針結合部１７から漏れ出ること、および針結合部１７を通じて幹細胞含有剤１２が汚染されることが防止されている。
【００５８】
本実施形態における幹細胞提供セット１００において、幹細胞含有剤１２が採取された動物がドナー競走馬である場合、当該ドナー競走馬の馬名情報２４が含まれていることが好ましい。これにより、幹細胞提供セット１００において、幹細胞含有剤１２に含まれる幹細胞の由来を、競走馬（ドナー競走馬）の個体で認識することができ、幹細胞含有剤１２の信頼性を向上させることができる。また馬名情報２４が付与されることにより、被投与競走馬Ｘとドナー競走馬との血統の関係を確認することが容易である。
本実施形態では、馬名情報２４は、図２に示すとおり、本体１６の外表面に付されたラベル１４に印字されている。また任意で幹細胞提供セット１００に同封されるマニュアル２０に馬名情報２４が記載されていてもよい。幹細胞提供セット１００には、馬名情報２４の替りに、または馬名情報２４とともに、ドナー競走馬の馬名２８が含まれていてもよい。たとえば馬名２８は図２に示すとおりマニュアル２０に記載することができる。
マニュアルには、その他、幹細胞含有剤１２の投与方法（注射方法）等の投与に関する任意の事項が記載されていてもよい。
【００５９】
第二容器４０は、比較的小型の容器である。容器４０の形状および構造は確認用サンプル１２０を収容可能な範囲において特に限定されないが、たとえば、第二容器４０は、容器本体４２と、容器本体４２に対し開閉が繰り返し可能な蓋部４４とを備える。第二容器４０には確認用サンプル１２０が収容されている。幹細胞含有剤１２と確認用サンプル１２０とは、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製された同一の幹細胞含有剤であり、幹細胞の濃度が略等しく、一般的には、確認用サンプル１２０の量の方が少ない。
【００６０】
幹細胞提供セット１００は、さらに幹細胞含有剤１２を注射投与する前に投与される鎮痛剤５２を含む。鎮痛剤５２は、幹細胞含有剤１２を注射投与する前に、被投与競走馬Ｘに投与されるための剤であり、幹細胞含有剤１２を注射投与したときに、被投与競走馬Ｘが痛がって暴れることを防止する。鎮痛剤５２が幹細胞提供セット１００にセットされていることで、投与作業がスムーズである。
【００６１】
本実施形態において鎮痛剤５２は、第三容器５０に収容されている。第三容器５０は、収容された液が鎮痛剤５２であること、およびラベル１４が本体１６の外表面に付されていないこと以外は、第一容器１０と同様の構成であってよい。たとえば、予め被投与競走馬Ｘの首筋などに打たれた留置針（図示省略）に対し、まず第三容器５０の針結合部１７を結合して鎮痛剤５２を被投与競走馬Ｘに投与する。次いで、第三容器５０を留置針から取り外し、第一容器１０の針結合部１７を留置針に結合して、幹細胞含有剤１２を投与することができる。ただし、幹細胞含有剤１２の投与方法はこれに限定されるものではない。
【００６２】
幹細胞提供セット１００は、第一容器１０、マニュアル２０、第二容器４０、および第三容器５０以外のさらなる投与に関連する物品を含めてもよい。
たとえば、幹細胞提供セット１００は、幹細胞含有剤１２を注射により投与した後に本体１６の内側面に付着した残余の幹細胞を洗浄し、次いで当該残余の幹細胞とともに上記競走馬に投与される洗浄液をさらに備えてもよい（図示省略）。
【００６３】
幹細胞提供セット１００では、第一容器１０が密封容器３０に滅菌状態で収納されている。密封容器３０は、収納物を滅菌状態で収納可能なものであればよく、袋状でもよいし、所定形状が保持された容器であってもよい。本実施形態では密封容器３０に、さらに第二容器４０および第三容器５０が収納されている。これは、被投与競走馬Ｘの体内に投与するものであるため、輸送工程Ｓ５において滅菌状体が保たれていることが好ましいからである。これらは、それぞれ個別の密封容器３０に収納されてもよい。
【００６４】
以上に本発明の第一実施形態について説明した。尚、第一実施形態における解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１または、投与前に確認用サンプル１２０を用いて行われる生細胞数の測定は、任意の方法で実施してよい。たとえば、一般的には、カウントされる幹細胞を少量採取しトリパンブルーなどの染色液で正確に希釈し、血球計算盤で生細胞数と死細胞数とを測定する方法が挙げられる。異なる方法としては、上述のとおりトリパンブルーで希釈された幹細胞を、色の違いにより死細胞（青色に染色された幹細胞）と生細胞（染色されなかった幹細胞）とに識別可能な画像処理装置に読み込み生細胞数をカウントしてもよい。
【００６５】
以上に説明する第一実施形態の幹細胞含有剤の提供方法は、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞自体を生細胞数決定工程Ｓ３に供する第一態様について示した。ただし幹細胞含有剤の提供方法は、これに限定されず、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞を継代培養し、継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程に供する第二態様を含む。
【００６６】
（第二実施形態）
次に図４を用い、本発明の第二実施形態として、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞を継代培養し、継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程に供する第二態様について以下に説明する。第二実施形態は、解凍工程Ｓ２と、生細胞数決定工程Ｓ３との間に継代培養工程Ｓ３０を有する。
図４は、本発明の第二実施形態にかかる幹細胞含有剤の提供方法の一例を示すフローチャートである。第二実施形態における本提供方法は、解凍工程Ｓ２の後であって生細胞数決定工程Ｓ３の前に、解凍された幹細胞を用いて継代培養を行う継代培養工程Ｓ３０を実施し、当該継代培養によって得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する点で、第一実施形態と異なる。第二実施形態に関し、第一実施形態と同様の工程については、適宜第一実施形態の説明が参照される。
継代培養工程Ｓ３０を備える第二実施形態において、所定の時とは、解凍工程Ｓ２後であって継代培養工程Ｓ３０を実施した後の上記継代培養幹細胞の生細胞数が確認される時である。
【００６７】
第二態様は、たとえば、凍結保存工程Ｓ１における保存期間が充分に長い場合に、有効である。即ち、長期間、冷凍状態にあった幹細胞は、解凍後、継代培養によりリフレッシュし、本来の活性を充分に取り戻すことが可能だからである。また、凍結保存工程Ｓ１においてストックされる幹細胞が少ない場合にも、第二態様は有効である。継代培養において幹細胞を所望の数に増やし、当該継代培養にて数の増大した継代培養幹細胞を細胞数決定工程Ｓ３に供与することができるからである。
一方、上述する第一態様は、凍結保存工程Ｓ１において保存された幹細胞を被投与競走馬Ｘに対し投与する必要が生じた場合に、速やかに当該幹細胞を提供できる点で優れている。
【００６８】
上記継代培養を実施する第二態様は、図１（ａ）に示す生細胞数決定工程Ｓ３と同様に、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施し、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の解凍工程後生細胞数を測定するとよい。継代培養後に生細胞数を測定することによって正しく把握し、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において希望生菌数を満たす幹細胞を含有する幹細胞含有剤を調製するためである。
第二実施形態において、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施する場合には、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数が、解凍工程後生細胞数に相当する。換言すると、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数を測定することによって解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施することができる。これにより解凍工程後生細胞数を把握することができ、続く、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製される幹細胞含有剤に含有される生細胞数の精度を高くすることができる。
【００６９】
尚、第二実施形態において実施される継代培養の培養方法および用いられる培地は特に限定されず、幹細胞の継代培養として知られる培養方法および培地を用いることができる。継代培養における培地は、細胞培養に適した培地から適宜選択して用いることができる。たとえば細胞用の培地として一般的に知られる血清培地または無血清培地を用いることもできる。上記培地は、市販品または公知の培地組成に倣って調製されたものであってもよいし、あるいは幹細胞を継代培養するために新たに好適化された培地組成を適宜、調製して作成されたものであってもよい。無血清培地を用いることにより、ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとが異なる場合であっても、良好に異なる個体間において幹細胞を移植することができる。
【００７０】
上述する各実施態様は、競走馬を例に説明したが、いずれも競技馬の実施態様として参照することができる。競走馬および競技馬は、競馬の試合または各種の大会に出場するにあたり厳密なドーピング検査を受ける必要があり、治療等において、規制物質を除く限定的な薬剤等の使用が余儀なくされている。これに対し、規制物質として定義されていない幹細胞を競走馬または競技馬に提供可能とする本発明は、幹細胞の提供のタイミングを気にせずに実施することができる。そのため本発明の実施によれば、適宜のタイミング（または所望のタイミング）で幹細胞を投与し、競走馬または競技馬の症状を改善し、または体調を良好に維持することが可能であり非常に有効である。また幹細胞が、将来的に規制物質として定義された場合であっても、本発明は、幹細胞の投与のタイミングを計ることで充分に競走馬または競技馬に対し実施することができ、その結果、競走馬または競技馬の症状改善等を図ることが可能である。
【実施例】
【００７１】
以下に、幹細胞の採取から、採取された幹細胞を競走馬に投与するまでの実施例を示す。尚、本実施例では、幹細胞を採取し、採取された幹細胞を培養し、培養された幹細胞を凍結保存した後に解凍し、次いで、生細胞数決定工程、幹細胞含有剤調製工程、および輸送工程を実施して競走馬に投与した。競走馬への投与は、所定の時から投与までの推奨時間を４８時間、一回の投与における生きた幹細胞の希望投与数である希望生細胞数を約１×１０７個とした。
【００７２】
（幹細胞の採取）
馬の臀部を切開し脂肪細胞を約５ｇ採取した。次いで、上記サンプル前駆体をコラゲナーゼ溶液を用いて３７℃１時間処理し、次いで、処理後の当該サンプル前駆体を１０分間、４００×ｇにて遠心分離し、１００μｍのメッシュを備えたセルストレイナーで未消化の脂肪組織片を除去した後、脂肪由来間葉系幹細胞を含む間質血管画分（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。
【００７３】
（幹細胞の培養）
市販の動物細胞用の無血清培地に抗生物質（ゲンタシン）を添加して調製した培地が収容されたフラスコを準備した。上記フラスコに上述で得た間質血管画分を播種し、３７℃／５％ＣＯ２条件下で液体静置培養を行った。２日置きに培地の上澄みを全量収集してフレッシュな培地に交換し、位相差顕微鏡にてフラスコの底面の面積１００％に対し、約８０％以上９０％以下の範囲に細胞が付着したことが確認された段階で培養を終了し、プロテアーゼを含む剥離剤をフラスコに添加してフラスコの内側壁面（特に内側底面）に付着した細胞を回収した。回収された細胞の生細胞数を血球測定版を用いて測定し、適当な細胞数となるまで上述と同様の方法で継代培養を繰り返した。ジメチルスルホキシドを含有する無血清細胞凍結保存液に上記細胞を混合し、凍結用サンプルを得た。
【００７４】
（凍結保存工程）
上述のとおり得た凍結用サンプル１ｍｌ（生きた幹細胞を約２×１０７個を含む）を凍結保存容器に収容し、−８０℃に調整されたディープフリーザにて凍結保存した。
【００７５】
（解凍工程）
凍結保存工程終了後、凍結保存容器をディープフリーザから取出し、３７℃に調整されたウォーターバスにて凍結用サンプルを解凍し、幹細胞を含む解凍済サンプルを得た。
【００７６】
（生細胞数決定工程）
上述のとおり解凍されて得た幹細胞を、リンゲル液で洗浄した。洗浄後の幹細胞の一部にトリパンブルーを添加して、死滅した幹細胞を染色した上、生細胞数を測定（解凍工程後生細胞数測定工程）したところ、解凍済サンプル１ｍｌに、約１．５×１０７個以上の生きた幹細胞が含まれていることが確認された。上述のとおり生細胞数の測定を行った時点を所定の時とした。
本実施例では、上記所定の時から被投与競走馬に投与されるまでの推奨される推奨時間が４８時間、希望生細胞数が１×１０７個、および事前に確認した４８時間における幹細胞の生存率が７０％である。これらの条件から、輸送工程を経て、被投与競走馬に対し希望生細胞数を投与可能とするための生細胞絶対数Ｚは、以下のとおりの計算式（２）により約１４２９万個であると決定した。
[数２]
生細胞絶対数Ｚ（万個）＝１０００（万個）÷７０（％）×１００  （２）
尚、本実施例の前に、予め、上述する幹細胞の培養、凍結保存工程、解凍工程、生細胞数決定工程を実施して、凍結保存生細胞数確認試験を行い、当該解凍工程後において、約５％以上２０％以下の幹細胞が死滅していたことを確認した。本実施例における凍結保存工程に供与した幹細胞の生細胞数に対する解凍工程後に測定した生細胞数は、この凍結保存生細胞数確認試験で把握した生細胞数と同程度であった。
【００７７】
（幹細胞含有剤調製工程）
つづいて、上記生細胞数決定工程にて得られた、解凍工程後生細胞数（解凍済サンプル１ｍｌ中に、生きた幹細胞約１．５×１０７個を含む）が確認された幹細胞を用い、上記生細胞絶対数Ｚ（約１４２９万個）を満たす、幹細胞含有剤を調製した。
即ち、生きた幹細胞約１×１０７×１．５個を含む解凍済サンプル１ｍｌに対し、リンゲル液を１．５ｍｌ添加して混合し、幹細胞含有剤を調製した。
【００７８】
（出荷準備）
上述のとおり調製された幹細胞含有剤を、図２で示した第一容器１０に収容するとともに、第一容器１０に幹細胞が接種されたドナー馬の馬名情報２４を示すラベル１４を貼り、滅菌状態が維持される密封バックに収納した。当該密封バックと、所定の時から幹細胞が被投与競走馬に投与されるまでの時間の情報が記載されたマニュアルを同封した幹細胞提供セットを作製した。幹細胞提供セットは、保冷バックに梱包した。
【００７９】
（輸送工程）
保冷バックに梱包された上記幹細胞提供セットをヤマト運輸のクール便（温度管理条件：０℃〜１０℃）で出荷した。出荷後、約２４時間後に、投与が実施される実施エリアに幹細胞提供セットが到着し、幹細胞の提供を完了した。これによって幹細胞調製施設において凍結保存されていた幹細胞を、輸送工程を必要とする程度に離れた実施エリアまで、希望生細胞数を約１×１０７個を含んだ状態で提供することができた。
尚、上述する解凍工程後、輸送工程までの間、および輸送工程後、投与までの間は、可能な限り、約４℃の温度管理を維持した。
【００８０】
上記実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
（１）競走馬または競技馬に投与される幹細胞含有剤の提供方法であって、
動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程、
前記凍結保存工程において凍結された前記幹細胞を解凍する解凍工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、前記競走馬または前記競技馬へ前記幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、前記生細胞絶対数を満たす前記幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程、および、
投与が実施される実施エリアに前記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程、
を含む幹細胞含有剤の提供方法。
（２）前記輸送工程は、前記幹細胞含有剤が収容された第一容器と共に、前記第一容器とは異なる第二容器を輸送することを含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている上記（１）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（３）前記動物が、ウマ科の動物である上記（１）または（２）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（４）前記ウマ科の動物が、ドナー競走馬であるか、またはドナー競技馬である上記（３）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（５）前記凍結保存工程は、凍結保存される前記幹細胞のドナーとなった前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名が確認可能な状態で当該幹細胞を保存する上記（４）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（６）凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競走馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競走馬と、の血統または兄弟関係を照合し、または、
凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競技馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競技馬と、の血統または兄弟関係を照合し、
同一血統、または兄弟である前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の前記幹細胞を前記解凍工程に供与する幹細胞として決定する血統照合工程を前記解凍工程前に含む上記（４）または（５）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（７）前記生細胞数決定工程は、前記解凍工程によって解凍された前記幹細胞の生細胞数を測定し、前記所定の時の前記生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程をさらに含む上記（１）から（６）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（８）前記輸送工程が、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施される上記（１）から（７）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（９）前記所定の時から、７２時間未満に前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与可能に前記輸送工程を完了する上記（１）から（８）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（１０）前記幹細胞が、予め幹細胞投与を受けた前記動物から採取された幹細胞である上記（１）から（９）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（１１）前記幹細胞含有剤の提供方法は、
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞自体を前記生細胞数決定工程に供する第一態様、または
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞を継代培養し、前記継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を前記生細胞数決定工程に供する第二態様を含む上記（１）から（９）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（１２）上記（１）から（１１）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法によって提供される幹細胞含有剤を含み、
前記幹細胞含有剤は、前記幹細胞含有剤の提供方法における解凍工程後の所定の時から、前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの時間の情報が付されていることを特徴とする幹細胞提供セット。
（１３）前記幹細胞含有剤が含有された第一容器と、前記第一容器とは異なる第二容器と、を含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容された上記（１２）に記載の幹細胞提供セット。
（１４）前記第一容器が、前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与するために用いられる注射針に、直接または間接に連結される注射用容器である上記（１３）に記載の幹細胞提供セット。
（１５）前記幹細胞含有剤が採取された動物がドナー競走馬またはドナー競技馬であり、
前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名情報が含まれている上記（１２）から（１４）のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。
（１６）前記幹細胞含有剤を注射投与する前に投与される鎮痛剤を含む上記（１２）から（１５）のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。
【符号の説明】
【００８１】
１０・・・第一容器
１２・・・幹細胞含有剤
１４・・・ラベル
１５・・・ストッパ
１６・・・本体
１７・・・針結合部
１８・・・ピストン
１９・・・キャップ
２０・・・マニュアル
２２・・・投与時間情報
２４・・・馬名情報
２６・・・馬名
２８・・・投与方法
３０・・・密封容器
４０・・・第二容器
４２・・・容器本体
４４・・・蓋部
５０・・・第三容器
５２・・・鎮痛剤
１００・・・幹細胞提供セット
１２０・・・確認用サンプル
１８０・・・ピストンヘッド
Ｓ１・・・凍結保存工程
Ｓ２・・・解凍工程
Ｓ３・・・決定工程
Ｓ４・・・幹細胞含有剤調製工程
Ｓ５・・・輸送工程
Ｓ１０・・・血統照合工程
Ｓ３０・・・継代培養工程
Ｓ３０１・・・解凍工程後生細胞数測定工程
Ｓ３０２・・・演算工程
Ｓ３０３・・・凍結保存生細胞数確認試験
Ｘ・・・被投与競走馬
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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