(57)【要約】【課題】本発明は、緑内障の病態を正確に再現できる緑内障モデルを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、  Ａ）加圧容器（２）と、  Ｂ）網膜組織（５）と培養液（４）を内部に収容する培養容器（３）と、  Ｃ）不活性ガス流量制御弁（９）と、酸素ガス流量制御弁（１０）を備え、二つの加圧ガスを混合するガス混合器（６）と、  Ｄ）ガス注入管（１２）と、  Ｅ）圧力調節弁（１４）と、  Ｆ）溶存酸素濃度センサ（１６）と、  Ｇ）溶存酸素濃度センサの計測値を受信するとともに、溶存酸素濃度を任意の値に設定する溶存酸素濃度入力部（１８）を備え、溶存酸素濃度センサの計測値が溶存酸素濃度入力部により設定された値と一致するように、不活性ガス流量制御弁及び／又は酸素ガス流量制御弁を制御する制御装置（１１）とを有する実験装置（１）を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外に摘出された眼の網膜組織を培養して緑内障の病態を再現できる実験装置において、
加圧容器と、
前記加圧容器内に存在し、前記網膜組織と培養液を内部に収容する培養容器と、
不活性ガスを含む加圧ガスの流量を制御する不活性ガス流量制御弁と、酸素を含む加圧ガスの流量を制御する酸素ガス流量制御弁を備え、二つの加圧ガスを混合するガス混合器と、
前記ガス混合器により混合された加圧混合ガスを、前記加圧容器内に注入するガス注入管と、
前記加圧容器内の圧力を制御する圧力調節弁と、
前記培養液中の溶存酸素濃度を計測する溶存酸素濃度センサと、
前記溶存酸素濃度センサの計測値を受信するとともに、溶存酸素濃度を任意の値に設定する溶存酸素濃度入力部を備え、前記溶存酸素濃度センサの計測値が前記溶存酸素濃度入力部により設定された値と一致するように、前記不活性ガス流量制御弁及び／又は前記酸素ガス流量制御弁を制御する制御装置と
を有する実験装置。
【請求項２】
緑内障の病態を再現する場合に、前記圧力調節弁により制御できる前記加圧容器内の圧力が大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い圧力の範囲内であるとともに、前記溶存酸素濃度入力部により設定できる溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％の範囲内である
ことを特徴とする、請求項１に記載の実験装置。
【請求項３】
前記実験装置が、
前記培養液の温度を計測する温度センサと、
媒体を収容し、前記媒体を加熱する加熱装置を備える恒温槽をさらに有するとともに、
前記加圧容器が内壁と外壁を備える二重構造となっており、前記内壁と前記外壁の間の空間に前記恒温槽から前記媒体が供給されて循環し、
前記制御装置が、前記温度センサからの計測値を受信するとともに、前記培養液の温度を任意の値に設定する温度入力部を備え、前記温度センサの計測値が前記温度入力部により設定された値と一致するように、前記加熱装置の出力を制御する
ことを特徴とする、請求項１又２に記載の実験装置。
【請求項４】
前記ガス注入管に連結するバブリング管をさらに備え、前記バブリング管が前記培養液中に前記加圧混合ガスを注入する
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の実験装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の実験装置を用いて、
生体外に摘出された眼の網膜組織を培養する
ことを含む、緑内障の病態を再現する実験方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の実験装置を用いて、
前記培養液中に薬の候補となる物質を添加し、
前記網膜組織を所定の時間培養し、
前記網膜組織の変化を観察して、前記添加した物質の中から、前記網膜組織の変化を抑制する物質を選択する
ことを含む、緑内障の治療薬又予防薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記圧力調節弁により前記加圧容器内の圧力を大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い状態に制御するとともに、前記溶存酸素濃度入力部により設定する溶存酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％とする
ことを特徴とする、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記薬の候補となる物質がステロイド類の有機化合物である
ことを特徴とする、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器の内部の圧力や溶存酸素濃度を制御することが可能であり、眼の網膜組織を培養することにより、緑内障の病態を再現できる実験装置に関する。
また、本発明は、当該実験装置を使用した、緑内障の病態を再現する実験方法、及び緑内障の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障とは、網膜神経節細胞（retinal ganglion cell）が死滅していく進行性の眼の疾患であり、失明の原因ともなる病気である。緑内障の発症機序は十分に解明されていないが、「眼圧」の上昇が、網膜神経節細胞の死滅の要因になると考えられている。眼球の内部には「房水」と呼ばれる体液が満たされているが、この房水は、毛様体という組織で作られ、隅角にある線維柱帯を経てシュレム管から排出されることにより循環している。この房水の循環によって、眼内にほぼ一定の圧力が発生しており、これが「眼圧」と呼ばれるものである。ここで、線維柱帯やシュレム管が目詰まりする等して房水の循環に障害が生じると、眼圧が上昇することが知られている。
【０００３】
緑内障のメカニズムや治療法を研究するため、様々な緑内障のモデルが人工的に作製されているが、それらは大別すると、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏ緑内障モデル、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ緑内障モデル、（３）遺伝子組み換え緑内障モデル、そして、（４）ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルに分けることができる（非特許文献１）。
【０００４】
（１）ｉｎ  ｖｉｖｏ緑内障モデルとは、動物の眼の網膜組織において緑内障の病態を人工的に再現したものである。このような緑内障モデルとしては、例えば、動物の眼の隅角等をレーザーで焼灼することにより、房水の排出を阻害して眼圧を高めた緑内障モデル動物が開発されている。
また、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ緑内障モデルとは、人工的な条件下に培養された細胞を用いて緑内障の病態を再現したものである。このような緑内障モデルとしては、例えば、圧力を加えた条件下に、網膜神経節細胞や視神経乳頭星状膠細胞（optic nerve head astrocyte）等をプレート上で培養した緑内障モデルが開発されている。
そして、（３）遺伝子組み換え緑内障モデルとは、遺伝子組み換え動物を作製することにより、当該動物の眼の網膜組織において緑内障の病態を再現したものである。このような緑内障モデルのうち、例えば、ＧＬＡＳＴ遺伝子又はＥＡＡＣ−１遺伝子マウスでは、網膜神経節細胞が加齢とともに自発的に死滅してしまう。
【０００５】
これらの緑内障モデルに対して、本発明者らは、（４）ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルを以前に開発している。この緑内障モデルは、眼球組織を生体外に摘出し、これを人工的な条件下で培養することにより緑内障の病態を再現したものである。具体的には、ラットから眼球を摘出して、その前半部分を取り除いて眼杯標本を作製し、人工脳脊髄液を満たした１ｍの高さのあるシリンダーの底部に眼杯標本を保持し、あるいは、加圧チェンバー内で人工脳脊髄液を満たしたビーカー中に眼杯標本を沈めることにより、圧力を加えた条件で眼杯標本を培養するものである（非特許文献２〜５）。
ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルは、人工的な条件下に培養するので、ｉｎ  ｖｉｖｏ緑内障モデルや遺伝子組み換え緑内障モデルとは異なり、培養環境を任意に設定することができ、未知の条件がないため、設定した条件以外の要因による影響を排除することができる。また、ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルは、摘出した眼球組織を用いるので、神経細胞間の相互作用や、神経細胞と神経膠細胞の相互作用を維持することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ緑内障モデルよりも正確に緑内障の病態を再現することができる。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ緑内障モデルの中には、眼圧の上昇に加えて、血流障害を再現したモデルが開発されている（特許文献１）。この緑内障モデルでは、培養細胞を載せたプレートを収容するチャンバーと、チャンバー内の圧力を変化させる変圧機構と、チャンバー内に供給するガスの酸素濃度をコントロールできる空気供給機構とを備えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２４２５８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】石川誠（Makoto Ishikawa）、吉冨健志（Takeshi Yoshitomi）外２名、BioMed Research International誌（略号 Biomed ResInt）、発行元 Hindawi Publishing Corporation、2015年発行、Vol.2015、281214
【非特許文献２】石川誠（Makoto Ishikawa）、吉冨健志（Takeshi Yoshitomi）外２名、Investigative Ophthalmology & Visual Science誌（略号 Invest Ophthalmol Vis Sci）、発行元 TheAssociation for Research in Vision and Ophthalmology, Inc.、2010年12月発行、Vol.51、No.12、pp.6414-6423
【非特許文献３】石川誠（Makoto Ishikawa）、吉冨健志（Takeshi Yoshitomi）外２名、Investigative Ophthalmology & Visual Science誌（略号 Invest Ophthalmol Vis Sci）、発行元 The Associationfor Research in Vision and Ophthalmology, Inc.、2011年8月発行、Vol.52、No.9、pp.6604-6616
【非特許文献４】石川誠（Makoto Ishikawa）、吉冨健志（Takeshi Yoshitomi）外２名、Investigative Ophthalmology & Visual Science誌（略号 Invest Ophthalmol Vis Sci）、発行元 TheAssociation for Research in Vision and Ophthalmology, Inc.、2014年12月発行、Vol.55、No.12、pp.8531-8541
【非特許文献５】石川誠、「緑内障神経保護薬の画期的スクリーニング装置の開発」、Ａ−ＳＴＥＰ技術移転シーズ集、［online］、平成２５年２月１８日公開、発行元：国立研究開発法人科学技術振興機構、  インターネット＜URL:http://www.jst.go.jp/a-step/seeds/index.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の緑内障モデルには、酸素濃度を低下させて血流障害を再現するｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルは存在しなかった。
そこで、本発明は、上記従来の状況に鑑み、ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルにおいて、酸素濃度を低下させて血流障害を再現し、緑内障の病態をより正確に再現する緑内障モデルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究した結果、ｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルにおいて、酸素濃度を低下させるにあたり、単に供給するガスの酸素濃度をコントロールしただけでは、緑内障の病態を正確に再現できることができず、また、再現性も低いことが明らかとなった。これは、網膜組織を培養する溶液中の溶存酸素濃度は、供給するガスの酸素濃度だけでなく、気圧、温度、飽和溶存酸素量、網膜組織による酸素消費量等によって影響を受けるためであると考えられた。そこで、網膜組織を培養する溶液中の溶存酸素濃度を計測するセンサを設け、その計測値が予め設定した溶存酸素濃度と一致するように、供給するガスの酸素分圧を制御装置でコントロールすることにより、正確にかつ再現性よく、緑内障の病態を再現できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養して緑内障の病態を再現できる実験装置に関する第１の発明と、緑内障の病態を再現する実験方法に関する第２の発明と、緑内障の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法に関する第３の発明を提供する。
第１の発明は、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養して緑内障の病態を再現できる実験装置であり、
加圧容器と、
加圧容器内に存在し、網膜組織と培養液を内部に収容する培養容器と、
不活性ガスを含む加圧ガスの流量を制御する不活性ガス流量制御弁と、酸素を含む加圧ガスの流量を制御する酸素ガス流量制御弁を備え、二つの加圧ガスを混合するガス混合器と、
ガス混合器により混合された加圧混合ガスを、加圧容器内に注入するガス注入管と、
加圧容器内の圧力を制御する圧力調節弁と、
培養液中の溶存酸素濃度を計測する溶存酸素濃度センサと、
溶存酸素濃度センサの計測値を受信するとともに、溶存酸素濃度を任意の値に設定する溶存酸素濃度入力部を備え、溶存酸素濃度センサの計測値が溶存酸素濃度入力部により設定された値と一致するように、不活性ガス流量制御弁及び／又は酸素ガス流量制御弁を制御する制御装置と
を有することを特徴とする。
【００１２】
第１の発明の実験装置においては、緑内障の病態を再現する場合に、圧力調節弁により制御できる加圧容器内の圧力が大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い圧力の範囲内であるとともに、溶存酸素濃度入力部により設定できる溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％の範囲内であることが好ましい。
【００１３】
また、上記いずれかの実験装置においては、
培養液の温度を計測する温度センサと、
媒体を収容し、媒体を加熱する加熱装置を備える恒温槽をさらに有するとともに、
加圧容器が内壁と外壁を備える二重構造となっており、内壁と外壁の間の空間に恒温槽から媒体が供給されて循環し、
制御装置が、温度センサからの計測値を受信するとともに、培養液の温度を任意の値に設定する温度入力部を備え、温度センサの計測値が温度入力部により設定された値と一致するように、加熱装置の出力を制御することが好ましい。
【００１４】
また、上記いずれかの実験装置においては、
ガス注入管に連結するバブリング管をさらに備え、バブリング管が培養液中に加圧混合ガスを注入することが好ましい。
【００１５】
第２の発明は、緑内障の病態を再現する実験方法であり、
第１の発明のいずれかの実験装置を用いて、
生体外に摘出された眼の網膜組織を培養することを含む実験方法である。
【００１６】
第３の発明は、緑内障の治療薬又予防薬のスクリーニング方法であり、
第１の発明のいずれかの実験装置を用いて、
培養液中に薬の候補となる物質を添加し、
網膜組織を所定の時間培養し、
網膜組織の変化を観察して、添加した物質の中から、網膜組織の変化を抑制する物質を選択することを含むことを特徴とする。
【００１７】
第２の発明のスクリーニング方法においては、圧力調節弁により加圧容器内の圧力を大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い状態に制御するとともに、溶存酸素濃度入力部により設定する溶存酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％とすることが好ましい。
【００１８】
第３の発明のスクリーニング方法においては、薬の候補となる物質がステロイド類の有機化合物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
第１の発明に係る実験装置及び第２の発明に係る実験方法は、生体外に摘出された眼の網膜組織を用い、これを加圧容器内で培養することにより、眼圧が高まった状態を再現することができるとともに、供給するガスの酸素分圧を低下させつつ、培養液中の溶存酸素濃度を計測してこれを一定の値に制御することにより、血流障害の状態を再現することができるので、正確に且つ再現性よく、緑内障の病態を再現することができるという効果を奏する。
第２の発明に係るスクリーニング方法は、第１の発明に係る実験装置を用いており、正確に且つ再現性よく緑内障の病態を再現できるので、緑内障の治療薬又は予防薬を高い精度でスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実験装置の一つの実施形態を模式的に示す図面である。
【図２】温度調節機構を設けた本発明の実験装置の一つの実施態様を模式的に示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．緑内障の病態を再現できる実験装置
１−１．本発明の実験装置の概要
本発明の実験装置は、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養して緑内障の病態を人工的に再現することができる装置である。
【００２２】
本発明の実験装置は、生体外に摘出された眼の網膜組織を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ緑内障モデルを提供するので、特許文献１に記載された培養細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ緑内障モデルとは異なり、神経細胞間の相互作用や、神経細胞と神経膠細胞の相互作用を維持することができ、より正確に緑内障の病態を再現することができる。
ここで、生体外に摘出された眼の網膜組織としては、容易に入手できる実験動物を用いれば、簡便に緑内障のモデルを構築することができる。
【００２３】
本発明の実験装置は、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養することにより、緑内障の病態を再現するものであるが、その培養条件は、人工的に制御することが可能である。したがって、本発明の実験装置は、ｉｎ  ｖｉｖｏ緑内障モデルや遺伝子組み換え緑内障モデルとは異なり、未知の条件が存在しないため、設定した条件以外の要因による影響を排除することができる。
本発明の実験装置は、網膜組織の培養条件として、培養液の圧力と溶存酸素濃度を人工的に制御することが可能であり、それを実現するための装置構成として、以下のＡ）〜Ｇ）の特徴を有している。
【００２４】
Ａ）加圧容器を有する。
Ｂ）加圧容器内に、網膜組織と培養液を収容する培養容器を有する。
Ｃ）不活性ガスを含む加圧ガスの流量を制御する不活性ガス流量制御弁と、酸素を含む加圧ガスの流量を制御する酸素ガス流量制御弁を備え、これらの加圧ガスを混合するガス混合器を有する。
Ｄ）ガス混合器により混合された加圧混合ガスを、加圧容器内に注入するガス注入管を有する。
Ｅ）加圧容器内の圧力を制御する圧力調節弁を有する。
Ｆ）培養液中の溶存酸素濃度を計測する溶存酸素濃度センサを有する。
Ｇ）溶存酸素濃度センサの計測値を受信するとともに、溶存酸素濃度を任意の数値に設定する溶存酸素濃度入力部を備え、溶存酸素濃度センサの計測値が溶存酸素濃度入力部により設定された数値と一致するように、不活性ガス流量制御弁及び／又は酸素ガス流量制御弁を制御する制御装置を有する。
【００２５】
本発明の実験装置の一つの実施態様を図１に示す。
図１に示されるように、実験装置（１）は、内部の圧力を高めることができる加圧容器（２）を有している。加圧容器（２）は、培養容器（３）を収納することが可能であり、培養容器（３）に充填された培養液（４）中で、生体外に摘出された眼の網膜組織（５）を培養することができる。
【００２６】
加圧容器（２）に供給するガスは、ガス混合器（６）により調整する。ガス混合器（６）のガス管には、不活性ガスを含む加圧ガスのボンベ（７）と酸素を含む加圧ガスのボンベ（８）が取り付けられている。そして、ボンベ（７）から供給された不活性ガスを含む加圧ガスは、ガス管の途中に設けられた不活性ガス流量制御弁（９）により流量を調節することが可能であり、ボンベ（８）から供給された酸素を含む加圧ガスは、ガス管の途中に設けられた酸素ガス流量制御弁（１０）により流量を調節することが可能である。これら２つのガス流量制御弁（９，１０）は、制御装置（１１）によって流量調節の動作を制御することが可能である。そして、これらの加圧ガスを供給するガス管は合流しており、不活性ガスを含む加圧ガスと酸素を含む加圧ガスとが混合して、加圧混合ガスとなる。
加圧混合ガスは、ガス注入管（１２）を経由して、加圧容器（２）内に供給される。ガス注入管（１２）はバブリング管（１３）と連結しており、バブリング管（１３）の先端から加圧混合ガスが培養液（４）中に吐出される。
【００２７】
加圧容器（２）内に加圧混合ガスが供給されることにより、加圧容器（２）内に圧力が加えられるが、加圧容器（２）内の圧力は、圧力調節弁（１４）により制御することができる。圧力調節弁（１４）は、加圧容器（２）に設けられたガス排出管（１５）に取り付けられており、加圧容器（２）内の圧力が所定の値よりも大きくなると、開弁してガスを排出することにより、圧力を所定の値に維持する。所定の圧力は、圧力調節弁（１４）により調整することができる。したがって、本発明の実験装置（１）によれば、任意の圧力条件下に、眼の網膜組織を培養することができ、眼圧の高まった状態を再現することができる。
【００２８】
実験装置（１）は、溶存酸素濃度センサ（１６）を有しており、溶存酸素を感知する溶存酸素濃度センサの感知部（１７）が培養液（４）中に浸漬されていることにより、培養液（４）中の溶存酸素濃度を計測することができる。
溶存酸素濃度センサ（１６）によって計測された値は、制御装置（１１）によって受信される。制御装置（１１）は溶存酸素濃度入力部（１８）を有しており、実験装置（１）のユーザーが、この溶存酸素濃度入力部（１８）を通じて、任意の溶存酸素濃度の値を設定することができる。制御装置（１１）は、溶存酸素濃度センサ（１６）から受信した計測値が、溶存酸素濃度入力部（１８）を通じて設定された値と一致するように、不活性ガス流量制御弁（９）及び酸素ガス流量制御弁（１０）を制御する。
【００２９】
具体的には、溶存酸素濃度センサ（１６）から受信した計測値が、溶存酸素濃度入力部（１８）を通じて設定された値よりも高い場合には、不活性ガス流量制御弁（９）を動作させることにより不活性ガスを含む加圧ガスの流量を高め、それとともに／あるいは、酸素ガス流量制御弁（１０）を動作させることにより酸素ガスを含む加圧ガスの流量を減少させて、供給する加圧混合ガスの酸素分圧を減少させる。逆に、溶存酸素濃度センサ（１６）から受信した計測値が、溶存酸素濃度入力部（１８）を通じて設定された値よりも低くなった場合には、不活性ガス流量制御弁（９）を動作させることにより不活性ガスを含む加圧ガスの流量を減少させ、それとともに／あるいは、酸素ガス流量制御弁（１０）を動作させることにより酸素ガスを含む加圧ガスの流量を高めて、供給する加圧混合ガスの酸素分圧を高める。
単に加圧容器内に供給するガスの酸素濃度をコントロールしただけでは、気圧、温度、飽和溶存酸素量、網膜組織による酸素消費量等によって培養液中の溶存酸素濃度が影響を受けるため、溶存酸素濃度を所定の値に制御することができず、緑内障の病態を正確に再現できることができないものである。しかしながら、本発明の実験装置（１）によれば、培養液（４）中の溶存酸素濃度を、溶存酸素濃度センサ（１６）で計測しつつ、溶存酸素濃度入力部（１８）を通じて設定した値に維持することができるので、任意の溶存酸素濃度条件下に、眼の網膜組織を培養することができ、正確に且つ再現性よく血流障害の状態を再現することができる。
【００３０】
以上のとおり、本発明の実験装置によれば、生体外に摘出された眼の網膜組織を用い、これを加圧容器内で培養することにより、眼圧が高まった状態を再現することができるとともに、供給するガスの酸素分圧を低下させつつ、培養液中の溶存酸素濃度を計測してこれを一定の値に制御することにより、血流障害の状態を再現することができるので、より正確に且つ再現性よく、緑内障の病態を再現することができるという効果を奏する。
【００３１】
１−２．本発明の実験装置の詳細な説明
以下、本発明の実験装置をさらに詳細に説明する。
本発明の実験装置は、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養して緑内障の病態を再現できる実験装置である。ここで、本発明の実験装置で用いる「生体外に摘出された眼の網膜組織」は、動物から外科的に眼を摘出し、さらに眼の網膜組織以外の部分を必要により取り除くことで得ることができる。ここで、眼を摘出する動物としては、眼に網膜を有する動物であればいかなる動物であってもよいが、哺乳類の動物から眼を摘出することが好ましい。哺乳類の動物としては、ヒトの献体から摘出した眼や手術により摘出されたヒトの眼から網膜組織を得ることもできるが、哺乳類の実験動物から眼を摘出して網膜組織を得ることが簡便で好ましい。哺乳類の実験動物としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、サル等を用いることができる。
生体外に摘出した眼から網膜組織以外の部分を取り除く場合には、網膜組織が十分に培養液と接触できるようにする観点からは、眼球から角膜や水晶体を取り除くことが好ましく、より好ましくは、さらにゼリー状の硝子体を取り除くことが好ましい。このようにして得られた標本を「眼杯標本」という。
【００３２】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ａ）加圧容器を有する」ことを特徴とするが、ここで、「加圧容器」とは、内部を加圧することができる密閉した容器であり、ガス注入管と連結するガス注入口を有するものであれば、いかなるものでも用いることができる。
「加圧容器」は、培養容器を出し入れする観点からは、密閉可能な蓋を有することが好ましく、また、内部を観察可能とするためには、透明な材料で形成されていることが好ましい。
【００３３】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｂ）加圧容器内に、網膜組織と培養液を収容する培養容器を有する」ことを特徴とする。ここで、「培養容器」としては、網膜組織と培養液を保持できる容器であれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、これらに限定されるわけではないが、円筒状の容器や、皿状の容器、フラスコ状の容器等を「培養容器」として用いることができる。また、「培養容器」は、加圧容器と一体化したものであってもよく、例えば、加圧容器自体を培養容器として用いてもよい。培養容器は、内部を観察可能とするためには、透明な材料で形成されていることが好ましい。
【００３４】
また、本発明の実験装置で用いる「培養液」とは、網膜組織にダメージを与えることなく少なくとも数時間培養することができる組成の培養液であれば、いかなるものであってもよい。例えば、これらに限定されるわけではないが、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清及び／又はウマ血清を含む組織培養液等を用いることができる。
これらのうち、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を培養液として用いることが好ましく、この培養液は、例えば、124mM NaCl、5mM KCl、2mM MgSO4、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、22mM NaHCO3、及び10mM グルコースからなる組成のものを用いることができる。
【００３５】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｃ）不活性ガスを含む加圧ガスの流量を制御する不活性ガス流量制御弁と、酸素を含む加圧ガスの流量を制御する酸素ガス流量制御弁を備え、これらの加圧ガスを混合するガス混合器を有する」ことを特徴とする。
ここで、「不活性ガスを含む加圧ガス」とは、反応性の低い不活性ガスを主成分とする加圧ガスであり、大気よりも酸素濃度が低いことが好ましく、より好ましくは、酸素を含有しない加圧ガスを用いるのがよい。ここで、不活性ガスとしては、窒素ガスや、アルゴンガス、ヘリウムガス等を用いることができるが、生体が取り込む大気の主成分となる気体である窒素ガスを用いることが好ましい。一方、「酸素を含む加圧ガス」とは、少なくとも大気よりも酸素濃度が高い加圧ガスであり、好ましくは、酸素を主成分とする加圧ガスを用いるのがよい。尚、生体の体液中には二酸化炭素が溶存していることから、生体に近い条件を再現するため、不活性ガスを含む加圧ガスと、酸素を含む加圧ガスには、二酸化炭素ガスを１〜２０％、より好ましくは３〜１０％含ませることが好ましい。また、二酸化炭素をこれらの加圧ガスに含ませる場合には、不活性ガスを含む加圧ガスと酸素を含む加圧ガスの混合比が変化したときに、二酸化炭素濃度が変化して培養液のｐＨが変化してしまうことを防ぐため、同一濃度の二酸化炭素を含ませることが好ましい。
【００３６】
本発明の実験装置で用いる「不活性ガス流量制御弁」と「酸素ガス流量制御弁」は、それぞれ、ボンベ等から供給された不活性ガスを含む加圧ガスと酸素を含む加圧ガスの流量や圧力を制御する弁である。これらの流量制御弁は、制御装置によって開閉を制御できるものであり、電気的に駆動する電磁弁を用いることが好ましい。
本発明の実験装置では、流量制御弁に、ガスの質量流量を計測するマスフローメーターを組み合わせて、質量流量を計測しつつ流量を制御できるマスフローコントローラーとすることもできる。また、本発明の実験装置では、流量制御弁の他に、ボンベから供給されるガスの圧力を低下させる減圧弁を用いることもできる。
【００３７】
本発明の実験装置で用いる「ガス混合器」においては、不活性ガスを含む加圧ガスの流路と、酸素ガスを含む加圧ガスの流路とが合流することにより、これらのガスを混合することができる。
また、本発明の実験装置で用いる「ガス混合器」は、３つ以上のガスを混合する装置であってもよく、不活性ガスを含む加圧ガスと、酸素ガスを含む加圧ガスの他に、例えば、二酸化炭素を含む加圧ガスを混合して、血流障害による溶存二酸化炭素濃度上昇の条件を再現できるものであってもよい。
【００３８】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｄ）ガス混合器により混合された加圧混合ガスを、加圧容器内に注入するガス注入管を有する」ことを特徴とするが、ここで「ガス注入管」とは、ガス混合器から加圧容器に向けて加圧ガスを供給するガス管であればいかなるものであってもよく、例えば、逆流防止弁を含む管であってもよい。
【００３９】
ガス注入管の加圧容器側の先端には、さらにバブリング管を設け、バブリング管の先端を培養液中に浸すことにより、加圧混合ガスを培養液中に直接吐出してバブリングを行うことが好ましい。このようなバブリングを行うことにより、制御装置によって加圧混合ガス中の酸素分圧を変更した場合に、これに応じて速やかに培養液中の溶存酸素濃度を変化させることができ、溶存酸素濃度を効率的に制御することができるという効果を奏する。
【００４０】
ガス注入管やバブリング管の途中には、供給するガスを滅菌するフィルターを設けることができ、また、抗生物質等の殺菌・殺ウイルス成分を有する薬剤液中に加圧混合ガスをバブリングすることにより、加圧混合ガスから細菌やウイルスを除去することもできる。
【００４１】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｅ）加圧容器内の圧力を制御する圧力調節弁を有する」ことを特徴とする。ここで、「圧力調節弁」とは、加圧容器内の圧力を制御できるものであればいかなるものであってもよく、これらに限定されるわけではないが、例えば、加圧容器の排出管に設ける背圧弁や、加圧容器のガス注入管側に設ける減圧弁を用いることができる。これらのうち、加圧用器内の圧力を精密に制御するためには、加圧容器の排出管に設けた背圧弁を用いることが好ましい。このような背圧弁は、加圧容器内の圧力が所定の値よりも大きくなると、開弁してガスを排出することにより、圧力を所定の値に維持することができる。所定の圧力は、圧力調節弁により調整することができるので、加圧混合ガスの圧力を超えない範囲で、加圧容器内の圧力を任意に設定することができる。圧力調節弁としては、圧力の数値を設定できる圧力調節弁を用いることができる。また、圧力調節弁に数値設定機能がない場合には、気圧を計測しつつ圧力調整弁を調節して、任意の圧力に設定することが可能である。
【００４２】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｆ）培養液中の溶存酸素濃度を計測する溶存酸素濃度センサを有する」ことを特徴とする。ここで、溶存酸素濃度センサとは、溶液中の溶存酸素濃度を計測できるものであればいかなるものであってもよく、これらに限定されるわけではないが、例えば、隔膜電極法によるセンサや、蛍光法によるセンサを用いることができる。
隔膜電極法によるセンサとは、溶存酸素の透過性に優れた隔膜で覆われた内部溶液内に二つの電極を設けた検知部を有するセンサであり、試料溶液中にこの検知部を浸すことにより、試料溶液中の溶存酸素が隔膜を透過し、溶存酸素の酸素還元により発生する電極間の電流を測定することにより、溶存酸素濃度を測定するセンサである。また、蛍光法によるセンサとは、溶存酸素透過層と蛍光物質含有層とが積層した検知部を有するセンサであり、ＬＥＤによる光で励起された蛍光物質含有層より発せられる蛍光が、溶存酸素透過層を透過してきた酸素により消光（クエンチング）される現象を利用して、溶存酸素濃度を測定するセンサである。
【００４３】
本発明の実験装置は、前記のとおり、「Ｇ）溶存酸素濃度センサの計測値を受信するとともに、溶存酸素濃度を任意の数値に設定する溶存酸素濃度入力部を備え、溶存酸素濃度センサの計測値が溶存酸素濃度入力部により設定された数値と一致するように、不活性ガス流量制御弁及び／又は酸素ガス流量制御弁を制御する制御装置を有する」ことを特徴とする。
ここで、制御装置による制御は、例えば、溶存酸素濃度センサから受信した計測値が、溶存酸素濃度入力部を通じて設定された値よりも高い場合には、不活性ガス流量制御弁を動作させることにより不活性ガスを含む加圧ガスの流量を高め、それとともに／あるいは、酸素ガス流量制御弁を動作させることにより酸素ガスを含む加圧ガスの流量を減少させて、供給する加圧混合ガスの酸素分圧を減少させるものである。また、これとは逆に、溶存酸素濃度センサから受信した計測値が、溶存酸素濃度入力部を通じて設定された値よりも低くなった場合には、不活性ガス流量制御弁を動作させることにより不活性ガスを含む加圧ガスの流量を減少させ、それとともに／あるいは、酸素ガス流量制御弁を動作させることにより酸素ガスを含む加圧ガスの流量を高めて、供給する加圧混合ガスの酸素分圧を高めるものである。これらの制御には、工学の分野で一般的に使用されるフィードバック制御の技術を用いることもできる。そして、このような制御装置は、パーソナルコンピュータによって実現することができ、また、制御回路によって実現することもできる。
【００４４】
本発明の実験装置においては、緑内障の病態を再現するモードと、正常な網膜の状態を再現するモードとを切り替えることを可能とすることが好ましい。そして、緑内障の病態を再現するモードを選択した場合には、圧力調節弁により制御できる加圧容器内の圧力が大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い圧力の範囲内となるように、大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い圧力の範囲で設定すべき圧力を表示し、あるいは、設定できる圧力の範囲を、大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い圧力の範囲内に限定することが好ましい。また、緑内障の病態を再現するモードを選択した場合には、溶存酸素濃度入力部により設定できる溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％の範囲内となるように、飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％の範囲で設定すべき溶存酸素濃度を表示し、あるいは、設定できる溶存酸素濃度の範囲を、飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％の範囲内に限定することが好ましい。
【００４５】
１−３．温度調節機構
本発明の実験装置において温度が変化すると、培養液のｐＨや溶存酸素濃度にも影響を及ぼすことから、本発明の実験装置においては温度を厳密に管理することができる温度調節機構を設けることが好ましい。
【００４６】
このような温度調節機構としては、
培養液の温度を計測する温度センサと、
媒体を収容し、媒体を加熱する加熱装置を備える恒温槽をさらに有するとともに、
加圧容器が内壁と外壁を備える二重構造となっており、内壁と外壁の間の空間に恒温槽から媒体が供給されて循環し、
制御装置が、温度センサからの計測値を受信するとともに、培養液の温度を任意に設定する温度入力部を備え、温度センサの計測値が温度入力部により設定された値と一致するように、加熱装置の出力を制御する
ことを特徴とする温度調節機構を設けることが好ましい。
【００４７】
このような温度調節機構を設けた実験装置の一つの実施態様を図２に示す。
尚、図２においては、ガス注入管（１２）の元にあるガス混合器や、ガス排出管（１５）の先に取り付けられている圧力調節弁を、省いて描いている。
図２に示されるように、実験装置（１）は、温度センサ（１９）を有しており、温度を感知する温度センサの感温部（２０）が培養液（４）に浸漬されていることにより、培養液（４）の温度を計測することができる。温度センサ（１９）によって計測された値は、制御装置（１１）によって受信され、温度制御に使用される。
実験装置（１）は、さらに恒温槽（２１）を有しており、内部には水等の媒体（２２）が収容されている。媒体（２２）は、電熱コイル等を有する加熱装置（２３）によって、一定の温度に保たれている。加熱装置（２３）は、制御装置（１１）により出力を制御することができる。恒温槽内には、さらに、制御装置（１１）と連結した温度センサ（図示せず）を設けることにより、制御装置（１１）によって恒温槽（２１）内の媒体（２２）の温度を一定に保つ制御を行うこともできる。
【００４８】
加圧容器（２）は、内壁（２４）と外壁（２５）を有する二重構造となっており、内壁（２４）の内部に培養容器（３）を収容できるようになっている。加圧容器（２）は、全体が二重構造となっている必要はないが、少なくとも加圧容器の底面と側面の一部は二重構造とする。内壁（２４）と外壁（２５）の間には空間が形成されることになり、この空間内に、恒温槽（２１）から加熱された媒体（２２）を供給して、加圧容器（２）の内部を温めることができる。加圧容器（２）と恒温槽（２１）とは供給パイプ（２６）で連結されており、ポンプ（２７）を用いて、恒温槽（２１）から加圧容器（２）の外周の空間に、加熱された媒体（２２）を供給する。また、別の箇所に設けられた排出パイプ（２８）により、加圧容器（２）と恒温槽（２１）とが連結されており、加圧容器（２）の外周の空間に満たされた媒体（２２）を恒温槽（２１）に排出する。このような機構により、加熱された媒体（２２）が、加圧容器（２）と恒温槽（２１）の間で循環し、加圧容器（２）の内部を均一に温めることができる。ここで、さらに均一な加熱を行うためには、ガス注入管（１２）やバブリング管（１３）が加熱された媒体中を経由するように配管して、供給する加圧混合ガスを温めることもできる。
【００４９】
制御装置（１１）は、培養液（４）の温度を任意に設定する温度入力部（２９）を備えている。そして、制御装置（１１）は、温度センサ（１９）の計測値が温度入力部（２９）により設定された値と一致するように、加熱装置（２３）の出力を制御する。これにより、培養液（４）を任意の温度に一定に保つことができる。
【００５０】
このような温度調節機構を備えることにより、本発明の実験装置は、培養液を均一に加熱しつつ、任意の一定の温度に維持することができるので、厳密な温度管理ができるという効果を奏する。
【００５１】
２．緑内障の病態を再現する実験方法
本発明の実験方法は、本発明の実験装置のいずれかを用い、生体外に摘出された眼の網膜組織を培養することを含み、緑内障の病態を再現する実験方法である。
【００５２】
本発明の実験方法は、前記１．に記載した本発明の実験装置のいずれかを使用する実験方法である。そして、本発明の実験方法の詳細は、前記１．において記載した本発明の実験装置の使用方法のとおりである。
【００５３】
本発明の実験方法は、生体外に摘出された眼の網膜組織を用い、これを加圧容器内で培養することにより、眼圧が高まった状態を再現することができるとともに、供給するガスの酸素分圧を低下させつつ、培養液中の溶存酸素濃度を計測してこれを一定の値に制御することにより、血流障害の状態を再現することができるので、より正確に且つ再現性よく、緑内障の病態を再現することができるという効果を奏する。
【００５４】
３．緑内障の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法
３−１．本発明のスクリーニング方法の概要
本発明のスクリーニング方法は、本発明の実験装置のいずれかを用いたスクリーニング方法であり、以下のステップを含むことを特徴とする。
Ａ）培養液中に薬の候補となる物質を添加する。
Ｂ）網膜組織を所定の時間培養する。
Ｃ）網膜組織の変化を観察して、添加した物質の中から、網膜組織の変化を抑制する物質を選択する。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の実験装置を用いていることから、前記のとおり、正確に且つ再現性よく緑内障の病態を再現することができるので、緑内障の治療薬又は予防薬を高い精度でスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【００５６】
３−２．本発明のスクリーニング方法の詳細な説明
本発明のスクリーニング方法のＡ）のステップにおいて、培養液中に添加する「薬の候補となる物質」とは、薬となり得るものであればどのような物質であってもよく、これらに限定されるわけではないが、例えば、有機化合物、タンパク質、核酸、イオン等を用いることができる。
ここで、有機化合物とは、天然の有機化合物だけでなく、合成された有機化合物や、天然の低分子有機化合物の誘導体を含む。また、コンビナトリアルケミストリーにより合成された低分子有機化合物のライブラリーを用いてもよい。
【００５７】
特に、ステロイド類の有機化合物の中には、緑内障の網膜組織における神経保護作用を有する物質があることが確認されたことから、ステロイド類の有機化合物を「薬の候補となる物質」として用いるのが好ましい。
ステロイド類の有機化合物を用いることにより、適確にターゲットを絞った緑内障の予防薬又は治療薬のスクリーニングが可能になるという効果を奏する。
本発明において「ステロイド類の有機化合物」とは、３つの六員環と１つの五員環の縮合環（ステロイド骨格）を基本構造として含む有機化合物である。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法のＢ）のステップにおいて、網膜組織を培養する「所定の時間」とは、任意に設定することができる。好ましくは、薬の候補となる物質の効果を確認できるとともに迅速にスクリーニングする観点から、５〜５０時間培養するのがよい。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法のＣ）において、網膜組織の「変化」とは、これらに限定されるわけではないが、例えば、形態学的変化、遺伝子又はタンパク質の発現又は局在の変化、細胞内物質の濃度変化、膜電位の変化等を含む。
網膜組織の形態学的変化の観察は、これらに限定されるわけではないが、例えば、網膜組織の切片を作成して顕微鏡観察により、確認することができる。
【００６０】
網膜組織の遺伝子又はタンパク質の発現又は局在の変化の観察は、これらに限定されるわけではないが、例えば、免疫染色（免疫組組織化学）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いて行うことができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法において、前記Ａ）〜Ｃ）のステップは、必ずしもこの順に行う必要はなく、順序は特定されない。例えば、Ａ）のステップは、Ｂ）のステップの前に行うこともでき、また、Ｂ）のステップの途中で行うこともできる。すなわち、網膜組織の培養を開始する前に、薬の候補となる物質を培養液中に添加してもよく、また、網膜組織の培養を開始した後に、薬の候補となる物質を培養液中に添加してもよい。
また、Ｃ）のステップは、Ｂ）のステップの後に行うこともでき、また、Ｂ）のステップの途中で行うこともできる。すなわち、網膜組織の培養を完了した後に、網膜組織の変化を観察することもでき、また、網膜組織の培養中に、網膜組織の変化を経時的に観察することもできる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法においては、網膜組織を培養する条件として、圧力調節弁により加圧容器内の圧力を大気圧よりも１０〜２００ｍｍＨｇ高い状態に制御するとともに、前記溶存酸素濃度入力部により設定する溶存酸素濃度を飽和溶存酸素濃度の５０〜９０％とすることが好ましい。
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
（実験装置の製造）
図１に示される構成を有する実験装置を以下のとおり設計・製造した。
・加圧容器として、アクリル樹脂製の加圧チェンバーを用いた。加圧チェンバーには、内部の気圧を測定する気圧計を設けた。
・加圧容器に取り付ける圧力調節弁として、コフロック社の背圧制御弁（MODEL 6800）を用いた。
・加圧容器内に収容する培養容器として、１００ｍｌビーカーを用い、培養液として、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を用いた。人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）の組成は、124mM NaCl、5mM KCl、2mM MgSO4、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、22mM NaHCO3、10mM グルコースを含む水溶液とした。網膜組織として、ラットから摘出した眼球から角膜や水晶体を取り除いた眼杯標本を用い、これを培養液中に浸漬した。加圧混合ガスを供給する管の先端を培養液中に浸漬して、培養液をバブリングすることを可能とした。
・加圧ガスの供給源として、９５％酸素−５％二酸化炭素の加圧ガスのボンベと、９５％窒素−５％二酸化炭素の加圧ガスのボンベを用いた。
・２種の加圧ガスの混合を制御し、培養液中の溶存酸素濃度を一定に保つためのコントローラとして、ａ）２種の加圧ガスの流量を制御する２つの電磁弁と、ｂ）溶存酸素濃度センサからの計測値を受信しつつ、電磁弁を制御するシーケンサと、ｃ）溶存酸素濃度等を表示するとともに、装置の操作を可能とするタッチパネルディスプレイと、ｄ）溶存酸素濃度を記録するロガーとを、一つの収納箱に納めた装置を設計・製造した。２種の加圧ガスの流量制御は、溶存酸素濃度が設定濃度より高ければ、９５％酸素−５％二酸化炭素の電磁弁は閉鎖され、９５％窒素−５％二酸化炭素の混合ガスのみが流れる制御を行う方式とした。また、コントローラには通信端子を設け、ロガーに記録されたデータをパーソナルコンピュータで読み出し可能とした。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の実験装置及びスクリーニング方法は、理化学機器の産業分野及び眼科用の医薬品の産業分野において有用である。
【符号の説明】
【００６６】
１      実験装置
２      加圧容器
３      培養容器
４      培養液
５      網膜組織
６      ガス混合器
７      不活性ガスを含む加圧ガスのボンベ
８      酸素を含む加圧ガスのボンベ
９      不活性ガス流量制御弁
１０    酸素ガス流量制御弁
１１    制御装置
１２    ガス注入管
１３    バブリング管
１４    圧力調節弁
１５    ガス排出管
１６    溶存酸素濃度センサ
１７    溶存酸素濃度センサの感知部
１８    溶存酸素濃度入力部
１９    温度センサ
２０    温度センサの感温部
２１    恒温槽
２２    媒体
２３    加熱装置
２４    加圧容器の内壁
２５    加圧容器の外壁
２６    供給パイプ
２７    ポンプ
２８    排出パイプ
２９    温度入力部
【図１】
2018050537.tif 000003
【図２】
2018050537.tif 000004