(57)【要約】【課題】  食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギー症状を引き起こすIgE抗体を減少させ,尚且つ、腸管のＭ細胞が機能する粘膜免疫を制御する乳酸菌を提供する。【解決手段】  Ｍ細胞に侵入可能な乳酸菌であり、さらにフィラメント化することによりガレクチン-９が結合することが可能となり、Ｍ細胞を通過することによりＭ細胞に発現しているガレクチン-９がフィラメント乳酸菌に結合する。更にガレクチン-９結合フィラメント乳酸菌がIgE抗体を結合でき、尚且つ免疫を調整させる乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発乳酸菌としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivarius を、乳糖を含まない培地で３９℃以上４１℃以下の温度で３０時間以上培養することで長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のフィラメント状の形態を有することを特徴とするＭ細胞の免疫調整作用が期待できる乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）において、この乳酸菌はＭ細胞からのサイトカインＴＧＦ−β１を増加させる機能を有することを特徴とするＭ細胞の免疫調整作用が期待できる乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）において、この乳酸菌はガレクチン-9の結合でマクロファージからのサイトカインＩＬ−６を減少させる機能を有することを特徴とするＭ細胞の免疫調整作用が期待できる乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭ細胞内に侵入することで免疫機能を調整する乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
小腸の内側の粘膜固有層にリンパ小節が平板状に集合したパイエル板と呼ばれるリンパ組織がある。このパイエル板の一部で繊毛が未発達の領域に免疫に関して重要な働きをするＭ細胞（Microfold  cell）が存在する。このＭ細胞は特殊に分化した腸管の上皮組織の一部と考えられ、腸管内腔側からエンドサイトーシスによって細菌（抗原）を取込み、基底膜（バソラテラル）側で接しているＴ細胞、Ｂ細胞或いはマクロファージに抗原を提示する。
【０００３】
特定の食品に関して過剰な免疫反応を起こす食物アレルギーは、Ｍ細胞ポケット内のマクロファージに貪食された消化食品による炎症が起因と考えられる。このような過剰反応を抑える免疫抑制機構として、Ｍ細胞に発現するガレクチン-９がＭ細胞に取り込まれた抗原に結合して免疫抑制することが考えれている。
【０００４】
本発明者は、ガレクチン-９と乳酸菌との関係に着目し、実験の結果、以下の知見を得た。
（１） 乳酸菌をグルコースやガラクトースなどの糖を含まない液体培地で、所定温度で培養するとフィラメント状の乳酸菌が得られた。このフィラメント状に変化した乳酸菌にはガレクチン-９が結合した。
（２） フィラメント乳酸菌はガレクチン-９が発現しているシート状Ｍ細胞へ侵入（透過）することが観察された。
（３） 試験管内でガレクチン-９を結合させたフィラメント乳酸菌と既定量のIｇＥ抗体を反応させると、試験管の中のIｇＥが減少した。
（４）ＯＶＡで感作したマウス・パイエル板のＭ細胞にはガレクチン-９とＧＰ２が発現していた。
（５）フィラメント乳酸菌をマウスに３週間経口投与したところ血中IｇＥが半減した。
【０００５】
上記の知見に基づき、特許文献１を出願人は提案した。この特許文献１では、Ｍ細胞通過後にアレルギー抗体であるＩｇＥ抗体を吸収するガレクチン-９が結合するフィラメント乳酸菌の培養方法として、糖を含まない培地で３７℃〜４８の範囲で培養することを提案している。
【０００６】
また、特許文献１以外にＭ細胞、ガレクチン-９、ＧＰ２、ＩｇＥ抗体に関する先行文献として、特許文献２〜５及び非特許文献１〜４が挙げられる。
【０００７】
特許文献２には、ＧＰ２がＭ細胞、特にヒトＭ細胞に特異的に発現しており、このＧＰ２をＭ細胞のマーカーとして使用することが提案されている。
【０００８】
特許文献３には、ガレクチン-９が免疫細胞に作用し、免疫を抑制する方向に制御し過剰な炎症を抑える機能を有していることが記載されている。
【０００９】
特許文献４には、ＧＰ２とガレクチン-９の関連性について検証し、Ｍ細胞中のＧＰ２をタイトジャンクションに移動させることでシート形成能が発揮され、同時にＭ細胞はアレルゲンや細菌と結合するガレクチン-９を発現するという知見を得、これに基づき、Ｍ細胞を培養することでシート状の人工皮膚とすることを提案している。
【００１０】
特許文献５には、サルモネラ菌のワクチン株として使われる無害化されたサルモネラ菌（Ty21a)等が知られている。サルモネラ菌（Ty21a)はサルモネラ菌（Ty2)から突然変異（vi抗原の欠損,galE遺伝子の変異）したものであり、Ｍ細胞の機能を強化することが記載されている。
【００１１】
非特許文献１には、乳酸菌（Ｒ２１）のアレルギー抑制機能の報告がなされている。
【００１２】
非特許文献２には、乳酸菌（シロタ株）のアレルギー抑制機能の報告がなされている。
【００１３】
非特許文献３には、アレルギー疾患で増加するIgE抗体とガレクチン-９が結合することについて述べている。
【００１４】
非特許文献４には、乳酸菌とオリゴ糖によりガレクチン-９を増加させ、アレルギー反応を抑制させることについて述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第５７７８３２５号公報
【特許文献２】特開２００８−１４１９９５号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０７７８１１
【特許文献４】特許第５１９７８８０号公報
【特許文献５】特許第５４２０７９１号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lactobacillus acidophilus strain L-92 induces CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells and suppresses allergic contact dermatitis.   Mohammad Monir Shah et al.  Biological and Pharmaceutical BulletinVol. 35 (2012) No. 4 P 612-616.
【非特許文献２】Lactobacillus casei strain Shirota suppresses serum immunoglobulin E and immunoglobulin G1 responses and systemic anaphylaxis in a food allergy model. Shida K et al.  Clin Exp Allergy. 2002 Apr;32(4):563-70.
【非特許文献３】Galectin-9 Is a High Affinity IgE-binding Lectin with Anti-allergic Effect by Blocking IgE-Antigen Complex Formation; Toshiro Niki,; Shoko Tsutsui,; Shigeru Hirose,; Sachiko Aradono‡,; Yasushi Sugimoto; Keisuke Takeshita,; Nozomu Nishi and; Mitsuomi Hirashima. J Biol Chemv.284(47); Nov 20, 2009
【非特許文献４】Galectin-9 Induced by Dietary Synbiotics Is Involved in Suppression of Allergic Symptoms in Mice and Humans.S de Kivit, E Saeland, AD Kraneveld. Allergy. 2012;67(3):343−352
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
Ｍ細胞で発現したガレクチン‐９が消化食品に結合できないと食物アレルギーが引き起こされると考えられる。ガレクチン‐９が消化食品に結合できない場合として、Ｍ細胞とＭ細胞とを結合しているタイトジャンクションの結合が緩く、その隙間から消化食品が漏れ、ガレクチン‐９が結合していない消化食品がマクロファージに貪食され、その結果免疫抑制ができなくなることが想定される。
【００１８】
図７に示すように、特許文献１で提案したフィラメント乳酸菌にはガレクチン‐９が結合し、このガレクチン‐９が結合したフィラメント乳酸菌にＩｇＥ抗体が結合して免疫調整の方向に誘導されるのであるが、フィラメント乳酸菌の長さが長すぎるとＭ細胞を透過できず、また短かすぎるとガレクチン‐９の結合が不十分となる。
【００１９】
特許文献１にあっては、Ｍ細胞を透過したフィラメント乳酸菌にはガレクチン‐９が結合し免疫調整に寄与するが、菌体サイズが大きいフィラメント乳酸菌はＭ細胞を透過できず免疫調整に寄与していないことが判明した。
【００２０】
本発明者の更なる追試の結果、Ｍ細胞の透過とガレクチン-９の結合の両方を満足するフィラメント乳酸菌の長さは４μｍ以上で１０μｍ以下が好ましいことが分かった。
しかしながら、乳酸菌の種類は約３５０種あるが、多くの限られた乳酸菌は培養条件を変えることでフィラメント状になるが、その長さをコントロールすることが困難で、培養後に４μｍ以上且つ２０μｍ以下の長さを維持できない。尚、２０μｍになる過程では、一時的に４μｍ〜１０μｍになっているのであるが、その長さで成長を停止することができない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のフィラメント乳酸菌を培養するために、出発乳酸菌としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivariusを、乳糖を含まない培地で、極めて限られた温度範囲（３９℃以上４１℃以下）で３０時間以上培養するようにした（以下Lactobacillus salivarius  AI-001とする）。
【００２２】
上記の長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のLactobacillus salivarius AI-001は、Ｍ細胞からのサイトカインＴＧＦ−β１を増加させる機能を有し、マクロファージからのサイトカインＩＬ−６を減少させる機能を有する。
【００２３】
乳糖を含まない培地の例として、無調整豆乳が挙げられる。４μｍ以上で１０μｍ以下の乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI-001）が培養された無調整豆乳は、ヨーグルト状の食品として食することができる。また、無調整豆乳で培養したものを凍結乾燥してカプセル化することも可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明者に係る培養方法によれば、出発乳酸菌としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivariusを乳糖を含まない培地で３９℃以上４１℃以下の温度で３０時間以上培養することで、Ｍ細胞の透過及びガレクチン-９の結合に適した長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のフィラメント状乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI-001）を得ることができる。
【００２５】
本方法は、遺伝子組換えや化学物質を用いて作成するのではなく、乳糖を含まない培地を用いて製造されたものであり安全性は極めて高い。
【００２６】
本発明に係る乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001は、経口投与することで、Ｍ細胞に侵入してＭ細胞内のガレクチン-９を菌体表面に結合する。ガレクチン-９はＭ細胞を通過する細菌や消化食物に結合し、免疫寛容を誘導する。またＭ細胞ポケット（Ｍ細胞の窪みに免疫細胞が集積している特殊な構造）で分泌されたガレクチン-９は、ＩｇＥ抗体に結合して不活性化し、その結果、食物アレルギーやアトピー性疾患が改善される。
【００２７】
ガレクチン-９が結合した乳酸菌Lactobacills salivarius AI-001がマクロファージに貪食されるとマクロファージからの炎症サイトカインであるインターロインキン-6(IL-6)の産生を減少させ、結果的に免疫調整するＴ細胞（制御性T細胞）を活性化させる環境を作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】乳酸菌Lactobacillus salivariusを乳糖を含まない無調整豆乳で４０℃、３０時間培養したときの（ａ）は菌体のSEM(透過電顕)写真、（ｂ）はガレクチン-９が結合した共焦点顕微鏡写真。
【図２】乳酸菌Lactobacillus casei を乳糖を含まないミュラーヒントン培地（MH）培地で４４℃、２４時間培養したときの（ａ）は微分干渉画像と蛍光画像を重ねた写真（ガレクチン-９：赤色）、（ｂ）は微分干渉画像のみの写真、（ｃ）は蛍光画像のみの写真（ガレクチン-９：赤色）。  図２から、フィラメント化しているが非常に長い形態（約25〜50μm）で、ガレクチン-９が結合していることが分かる。
【図３】乳酸菌Lactobacillus saliveriusを２つの培地で培養し、グラム染色し、菌体の大きさを比較したもので、（ａ）はミュラーヒントン培地（MH）（乳糖陰性、ブドウ糖陰性）を用いて４０℃で３０時間培養した写真、（ｂ）はＭＲＳブロス培地（MRS）（乳糖陰性、ブドウ糖を非常に多く含有）を用いて３７℃で２４時間培養した写真。  （ａ）からはフィラメントの長さが4μｍを超えていることが右下のスケールから観察でき、（ｂ）からは１．４μｍ前後のサイズで菌体のフィラメント化は認められない。
【図４】乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001及びその他のフィラメント乳酸菌、（L. casei, L. gasser, L. rhamnosus）,サルモネラ・ワクチン株（Ty21a）のシート状Ｍ細胞に取り込まれた菌数を表した図（培養時間：２時間）。
【図５】無調整豆乳（乳糖不含有）を用いて４０℃、３０時間培養した乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001及びその他のフィラメント乳酸菌（L. casei, L. gasser, L. rhamnosus）、サルモネラ・ワクチン株（Ty21a）のシート状Ｍ細胞に取り込まれたときにＭ細胞で産生されたTGF-β1を測定結果を示す図。
【図６】無調整豆乳（乳糖不含有）を用いて４０℃、３０時間培養した乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001にガレクチン-９を結合させ、マウスのマクロファージに貪食させ２時間後にサイトカインIL-6を測定した結果を示す図。  コントロールとしてガレクチン-９を結合させていないLactobacillus salivarius AI-001を用いた。
【図７】フィラメント乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001の機能を説明した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
Ｍ細胞を透過でき且つガレクチン-９が結合するのに適した長さ（４μｍ以上、１０μｍ以下）のサイズの乳酸菌を得るには、乳酸菌としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivariusを乳糖を含有しない無調整豆乳を培地として３９℃以上４１℃以下の温度で３０時間以上培養することである。これにより作製された豆乳ヨーグルトは食物アレルギー患者のマクロファージから炎症サイトカインIL-6の産生を抑制することにより、パイエル板での局所的な免疫反応を調整し、食物アレルギー患者の症状を軽減することが期待される。
【００３０】
乳酸菌の選別
馬乳酒に含まれる乳酸菌を分離し（５菌種）、その中からフィラメント形成をする乳酸菌を選別するため、培養温度を３７℃から４８℃まで変化させた。菌体がフィラメント化する乳酸菌の中で４μｍ以上、１０μｍ以下のサイズの乳酸菌を選別した(菌体を遠心分離するための遠心力を２４００Ｇで行った)。選別された乳酸菌は培養温度３９℃以上４１℃以下では発育するが、４２℃では発育することができず、３０時間以上の培養でガレクチン-９が結合するようになった。
３８℃以下では、図３（ｂ）に示すように４μｍ以上の乳酸菌を得ることができなかった。
【００３１】
乳酸菌の同定１
細菌を鑑別するために多くの市販キットが入手可能である。具体的にはアピ５０ＣＨＩ（ビオメリュージャパン、東京）を用いて同定を行った。５０個のプラスチック・ウェルに細菌が分解する可能性のある基質（糖やタンパク質）もしくは菌が合成する可能性があるアミノ酸を検出する試薬をあらかじめウェルに加え乾燥されたものがキットとして用意されている。
【００３２】
目的の細菌が発育可能な寒天培地に接種し、３７℃の培養器で４８時間培養する。発育してきた細菌はコロニー（肉眼で確認できる菌の塊）を形成している。
上記のコロニーの一部を滅菌綿棒で掻き取り、キットに添付されている５ｍｌの生理食塩水容器に均一な細菌の混濁液を作成し、２０個のプラスチック・ウェルに流し込む。２０個のプラスチック・ウェルは１枚のプラスチック・トレイに固定されているため、取り扱いが容易であるように設計されている。このトレイを３７℃の培養器で１８時間培養する。目的とする細菌により利用・分解するパターンが異なっている。このキットを用いて乳酸菌の一種と推定した。
【００３３】
乳酸菌の同定２
この乳酸菌を正確に同定する必要があり、以下の方法を用いて同定を行った。
ＤＮＡ抽出キット（Mora遺伝子抽出キット、AMR）を用いて乳酸菌Lactobacills salivarius AI-001よりＤＮＡを抽出・精製を行った。細菌同定で用いられる１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子配列を決定するため１６Ｓ共通領域のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い。ＰＣＲ産物を用いたダイレクトシーケンス解析を行った。得られた配列情報を公共データベースＮＣＢＩでBLAST検索を行った。
その結果、選別された乳酸菌はLactobacills salivariusと同定された。
【００３４】
ガレクチン-９の乳酸菌との結合性
具体的には、ガレクチン-９遺伝子組み換え体（R&D,USA）を滅菌蒸留水１ｍｌに溶解させ、プロテイン蛍光ラベルキット（モレキュラープローブ、USA）を用いて蛍光色素であるAlexa 594をガレクチン-９に結合させる。添付の蛍光色素含有チューブに溶解したガレクチン-９溶液を加え、室温で1時間、転倒混和させる。この溶液に添付の緩衝溶液を５００ｍｌ加え、蛍光色素結合ガレクチン-９とした。乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001は乳糖を含まない食物エキス（豆乳、ブドウ皮粉砕液）を用いて４０℃で３０時間の培養時間で培養された一部を取り出し、滅菌リン酸緩衝液（PBS）を用いて１０7 CFU/ｍｌの濃度に調整（CFUは菌の数の単位）した。蛍光色素結合ガレクチン-９の２０μｌを調整した菌液１ｍｌに加え、３７℃で1時間、転倒混和させる。この一部をコラーゲン固定した共焦点顕微鏡用カバーグラスにとり、乾燥させた後、共焦点顕微鏡で観察した。（図１ｂ）
【００３５】
ガレクチン-９を結合可能な乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001
乳酸菌Lactobacillus salivarius の一般的な形状は図３（ｂ）に示すような１．４μｍ前後のサイズの桿菌であるが、３９℃〜４１℃で３０時間以上培養した場合には、図３（ａ）に示すように、フィラメントの長さが４μｍを超えていることが右下のスケールから観察できる。
【００３６】
Ｍ細胞およびマクロファージに貪食された乳酸菌の検出
次に、本発明に係る乳酸菌のＭ細胞およびマクロファージによる貪食に関して、Lactobacillus salivarius AI-001と他の乳酸菌及び陰性対象としてサルモネラ・ワクチン株（Ty21a）と比較した。
尚、実験にはシート状Ｍ細胞およびiNOS-KOマウス・マクロファージとBALB/Cマウス・マクロファージを用いた。このシート状Ｍ細胞は本発明者が開発したもので、iNOS-KOマウスはチフス菌感染モデル・マウスであり、BALB/Cマウスは対照として、それぞれ以下の手順によって作製した。
【００３７】
先ず、Ｍ細胞をTranswell（登録商標）のフィルター上に培養する。この培養は、先ずＭ細胞の濃度を8×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、培養容器４ｃｍ2に対し２ｍｌの割合で細胞溶液をTranswellのフィルター上に加えた。上層及び下層には２０％ウシ胎児血清を含んだ細胞培養溶液を加えた。当初４日目に上下層の細胞培養溶液を新しい溶液を交換し、次の４日目に再度、細胞培養溶液を交換した。更に２日後にM細胞がフィルター面いっぱいに増えていることを確認した。Ｍ細胞が培養容器全面に広がった時点で、上下層の細胞培養溶液を血清成分がない細胞培養液に交換し、下層には抗ＬＴβＲ抗体２０μｌを添加した。この抗ＬＴβＲ抗体の刺激により、細胞内のＧＰ２が細胞間接着部（タイトジャンクション）に移動し、細胞同士の結合が強固になる。２日後に培養液を交換、以降２日毎に細胞培養液を交換し６日後にＭ細胞シートが完成した。
【００３８】
Ｍ細胞内に侵入した細菌数を定量する方法として以下の方法を実施した。菌液を５０μｌ加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器に2時間静置した。Transwellを３７℃に加温した血清成分のない細胞培養溶液で其々のウェルの上下層を３回洗浄し、添加した余分の細菌を除去した。更に血清成分のない細胞培養溶で抗生物質ゲンタマイシン２５０μｇ/ｍｌ濃度溶液を作成し、Transwellの上下層にそれぞれ２ｍｌを加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器で２時間静置した。
【００３９】
これによりＭ細胞周辺の余分な細菌が殺菌され、Ｍ細胞に侵入した乳酸菌だけを検出できる。（抗生物質ゲンタマイシンは細胞に取り込まれない性質がある。この性質を利用し、細胞侵入性細菌を定量検出することができる。
【００４０】
２時間後、細胞周辺のゲンタマイシンを滅菌PBSで３回洗浄する。細胞内に生きている細菌を取り出すため、界面活性剤Triton-X 100  0.1％溶液でＭ細胞を溶解させ、細菌を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、MRS寒天培地に接種した。３７℃の５%炭酸ガス培養器内に４８時間静置。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内に侵入した細菌を定量検出した。
【００４１】
Ｍ細胞シートを通過した乳酸菌の検出
Transwell のフィルター上に形成されたＭ細胞シートを作成した。シートに隙間が開いていないかを確認するため細胞間抵抗測定装置（Millicell; Millipore）を用いて電気抵抗を測定した。電気抵抗値が200Ω・ｃｍ2 以上であることを確認することでシートに隙間が無いと判断した。このＭ細胞シートを形成したTranswellの上層から細菌を加えた。加えた時間から２時間後にTranswellの下層の培養液を回収した。回収液に含まれている乳酸菌を計数した。
同時に乳酸菌接種２４時間後、再度、Ｍ細胞シートの電気抵抗を測定し、変化の無いことを確認した。このことより、検出された乳酸菌はＭ細胞内を通過してきたと断定した。
【００４２】
乳酸菌Lactobacillus salivarius AI-001及び陰性コントロールとしてサルモネラ・ワクチン株(Ty21a)を１０7CFU/mlに調整し、それぞれを別のＭ細胞シートが形成されたウェルの上層に菌液を５０μl加えた。３７℃、５％炭酸ガスの培養器に静置。滅菌ピペットで下層の培養溶液を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、ＭＲＳ寒天培地に接種。３７℃の恒温培養器内に４８時間培養した。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内を通過した細菌を定量検出した。
【００４３】
マクロファージに貪食された乳酸菌の検出とサイトカイン測定
マクロファージに貪食された細菌数を定量する方法として以下の方法を実施した。マクロファージはチフス菌感染モデルとして用いたiNOS-KOマウスのマクロファージ及びBALB/Cマウスのマクロファージを用いた。マウスの腹腔よりマクロファージの取り出しはLissner et al.（J Immunol 131:3006-3013）に従い実施した。
【００４４】
マウスから取り出したマクロファージを６ウェル・プレート（コーニング）加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器に４日間静置した。３７℃に加温した血清成分のない細胞培養溶液で其々のウェルの上下層を３回洗浄し、細菌（乳酸菌AI-001およびコントロールのTy21a）を接種し、２時間培養した。２時間後、余分の細菌を除去するため３７℃に加温した血清成分のない細胞培養溶液で其々のウェルを３回洗浄した。更に抗生物質ゲンタマイシン２５０μｇ/ｍｌを加えた血清成分のない細胞培養液で、６ウェル・プレートにそれぞれ２ｍｌを加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器で２時間静置した。
【００４５】
これによりマクロファージ周辺の余分な細菌が殺菌され、マクロファージに侵入した細菌だけを検出できる。（抗生物質ゲンタマイシンは細胞に取り込まれない性質がある。この性質を利用し、マクロファージに取り込まれた細菌を定量検出することができる。
【００４６】
２時間後、細胞周辺のゲンタマイシンを滅菌PBSで３回洗浄する。細胞内に生きている細菌を取り出すため、界面活性剤Triton-X 100  0.1％溶液でＭ細胞を溶解させ、細菌を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、MRS寒天培地に接種した。３７℃の５%炭酸ガス培養器内に４８時間培養した。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、マクロファージ内に侵入した細菌を定量検出した。
【００４７】
ガレクチン-９を結合させたLactobacills salivarius AI-001（ガレクチン-９(+)）と、結合させないLactobacills salivarius AI-001（ガレクチン-９(-)）を取り込んだマクロファージから産生されたサイトカインを測定した。ガレクチン-９を結合させるLactobacills salivarius AI-001は豆乳で40℃、30時間培養した菌体（対照としてＭＲＳ培地で37℃、24時間培養した菌体）にリコビナントGalectin-９（R&D）２０μlを加え、１時間室温に静置し、マクロファージを発育させたプレートに20μl添加した（105CFU/ml）。2時間培養し、前記記載の方法で細胞溶解液を作製した。この細胞溶解液にプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma）を1/100の割合で加え、その一部50μlを用いてELISAキット(R&D)でIL-6を測定した。（図６）
この図６から、豆乳で培養したガレクチン-９結合Lactobacills salivarius AI-001（ガレクチン-９(＋)）はサイトカインIL-6の産生を減少させることができた。（p<0.1）
【００４８】
以上をまとめたのが図７である。本発明のLactobacills salivarius AI-001の菌体表面にはガレクチン-9が結合する糖鎖（ガラクトース・ポリマー）が発現しているため、Ｍ細胞表面にあるガレクチン-9と結合することでＭ細胞内に多く取り込まれる。
（１）Lactobacills salivarius AI-001を取り込んだＭ細胞にはLTβＲが発現し、そのリガンドである活性化リンパ球が結合する。
（２）この結合刺激よりタイトジャンクションは強化される。
（３）Ｍ細胞内にTGF-βの産生が増加する。
（４）Ｍ細胞にあるガレクチン-9を結合したLactobacills salivarius AI-001がＭ細胞からＭ細胞ポケットに排出される。
（５）ガレクチン-9を結合したLactobacills salivarius AI-001がマクロファージに貪食され、IL-6の産生を抑制する。
（６）TGF-βの産生が増加、IL-6の産生を抑制により制御性Ｔ細胞（Treg）が活性化される。
（７）活性化したTreg細胞はマスト細胞のヒスタミンの放出を抑制する。（８）ガレクチン-9結合Lactobacills salivarius AI-001はアレルギー抗体であるIgE抗体と結合する。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に係る乳酸菌Lactobacills salivarius AI-001は、その用途をＭ細胞に大量に取り込まれ、TGF-β1を産生し、更に菌体にガレクチン-９の結合することによりマクロファージからの炎症サイトカインであるインターロインキン-6(IL-6)の産生を減少させる。したがって、乳酸菌Lactobacills salivarius AI-001は、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などのアレルギーや炎症を調整することを効果とする保健機能食品や医薬品としての開発が可能となる。
【図１】
2018068175.tif 000003
【図２】
2018068175.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月6日(2017.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のフィラメント状の形態を有するＭ細胞を制御する乳酸菌（Lactobacillus salivarius AI001）を生成する方法であって、この方法は、出発原料としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivarius を、乳糖を含まない培地で３９℃以上４１℃以下の温度で３０時間以上培養することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌の生成方法において、この乳酸菌はＭ細胞からのサイトカインＴＧＦ−β１を増加させる機能を有することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌の生成方法において、この乳酸菌はガレクチン-9の結合でマクロファージからのサイトカインＩＬ−６を減少させる機能を有することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月14日(2017.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが４μｍ以上で１０μｍ以下のフィラメント状の形態を有するＭ細胞を制御する乳酸菌（Lactobacillus salivarius ）を生成する方法であって、この方法は、出発原料としてLactobacillus salivariusを選定し、このLactobacillus salivarius を、乳糖を含まない培地で３９℃以上４１℃以下の温度で３０時間以上培養することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌の生成方法において、この乳酸菌はＭ細胞からのサイトカインＴＧＦ−β１を増加させる機能を有することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌の生成方法において、この乳酸菌はガレクチン-9の結合でマクロファージからのサイトカインＩＬ−６を減少させる機能を有することを特徴とするＭ細胞を制御する乳酸菌の生成方法。