(57)【要約】      （修正有）【課題】被験化合物の固相担体への固定方法などを提供する。【解決手段】以下の工程（１）及び（２）を含む、被験化合物の固相担体への固定方法；（１）被験化合物と光反応性化合物を光照射により反応させる工程（２）工程（１）の生成物を、固相担体と反応させ固相に担持させる工程であり、光反応性化合物がナイトレン，カルベン，ラジカル，または炭素求電子剤を発生し得る化合物であり，ジアゾニウム基，アジド基，ジアジリン環，またはジアゾ基を含む化合物であり，特定の式で表わされる化合物または塩である固定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（1）及び（2）を含む、被験化合物の固相担体への固定方法。
（1）被験化合物と光反応性化合物を光照射により反応させる工程
（2）工程（1）の生成物を、固相担体と反応させ固相に担持させる工程
【請求項２】
光反応性化合物が、ナイトレン、カルベン、ラジカル、または炭素求電子剤を発生し得る化合物である、請求項１記載の固定方法。
【請求項３】
光反応性化合物が、ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、またはジアゾ基を含む化合物である、請求項１記載の固定方法。
【請求項４】
光反応性化合物が、以下の式（I）
【化１４】
2018021909.tif 000015
｛式中、R1は以下の式（II）
【化１５】
2018021909.tif 000016
［式中、Aは低級アルキレンを表し、Bはジスルフィド結合または単結合を表し、Eは単結合または低級アルキレンを表し、Gは単結合、-NR4aC(=O)-（式中、R4aは水素原子もしくは低級アルキルを表す）または-C(=O)NR4b-（式中、R4bは水素原子もしくは低級アルキルを表す）を表し、Jは低級アルキレンを表し、R3a及びR3bは同一または異なって水素原子またはスルホン酸基を表す］で表わされる基を表し、R2は低級アルキルを表す｝で表わされる化合物またはその塩である、請求項１記載の固定方法。
【請求項５】
R2がメチルである、請求項４記載の固定方法。
【請求項６】
光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【化１６】
2018021909.tif 000017
である請求項１記載の固定方法。
【請求項７】
光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【化１７】
2018021909.tif 000018
である請求項１記載の固定方法。
【請求項８】
光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【化１８】
2018021909.tif 000019
である請求項１記載の固定方法。
【請求項９】
光反応性化合物が、以下の化合物
【化１９】
2018021909.tif 000020
である、請求項１記載の固定方法。
【請求項１０】
工程１が紫外線照射によって行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の固定方法。
【請求項１１】
固相担体がビーズである、請求項１〜１０のいずれかに記載の固定方法。
【請求項１２】
ビーズがナノ磁性微粒子である、請求項１〜１１のいずれかに記載の固定方法。
【請求項１３】
ビーズがアガロースビーズである、請求項１〜１１のいずれかに記載の固定方法。
【請求項１４】
ビーズがアミノ基を有するアガロースビーズである、請求項１〜１１のいずれかに記載の固定方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の固定方法を含む、固相担体に固定された被検化合物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の固定方法を含む、被験化合物と相互作用する物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば被検化合物の固相担体への固定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物の標的分子同定のための手法として、リンカーを介して化合物を固定化したビーズを用い、細胞抽出液から結合タンパク質をアフィニティー精製することがしばしば行われる。この「アフィニティー精製法」は成功例が多いものの、ビーズ作製のためには化合物の構造活性相関の把握や、活性に影響を与えない位置からリンカーを伸長する必要があり、長い時間と多くの労力を要する。これを回避する簡便な方法として、光反応を利用したアフィニティービーズ作製法が報告されている（非特許文献1、特許文献1）。この方法では、光反応基を付けたビーズと化合物を混合して紫外線照射することにより、化合物をランダムな位置でビーズに固定化することができる。この方法により製造したアフィニティービーズを用いて、化合物が相互作用する分子を特定した例が知られている（非特許文献1および2、特許文献2）。
【０００３】
また、光反応性糖化合物を利用し固相に糖受容体（特許文献3）を捕捉させた例が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2005-221394号公報
【特許文献２】特開2004-309372号公報
【特許文献３】特開2004-18841号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Angewandte Chemie International Edition）」、2005年、第44巻、p.3559-3562
【非特許文献２】「バイオコンジュゲート・ケミストリー（Bioconjugate Chemistry）」、2010年、第21巻、第1号、p.182-186
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、例えば被検化合物の固相担体への固定方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（1）〜（16）に関する。
（1）以下の工程1及び2を含む、被験化合物の固相担体への固定方法。
工程1：被験化合物と光反応性化合物を光照射により反応させる工程
工程2：工程（1）の生成物を、固相担体と反応させ固相に担持させる工程
（2）光反応性化合物が、ナイトレン、カルベン、ラジカル、または炭素求電子剤を発生し得る化合物である、前記（1）記載の固定方法。
（3）光反応性化合物が、ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、またはジアゾ基を含む化合物である、前記（1）記載の固定方法。
（4）光反応性化合物が、以下の式（I）
【０００８】
【化１】
2018021909.tif 000002
【０００９】
｛式中、R1は以下の式（II）
【００１０】
【化２】
2018021909.tif 000003
【００１１】
［式中、Aは低級アルキレンを表し、Bはジスルフィド結合または単結合を表し、Eは単結合または低級アルキレンを表し、Gは単結合、-NR4aC(=O)-（式中、R4aは水素原子もしくは低級アルキルを表す）または-C(=O)NR4b-（式中、R4bは水素原子もしくは低級アルキルを表す）を表し、Jは低級アルキレンを表し、R3a及びR3bは同一または異なって水素原子またはスルホン酸基を表す］で表わされる基を表し、R2は低級アルキルを表す｝で表わされる化合物またはその塩である、前記（1）記載の固定方法。
（5）R2がメチルである、前記（4）記載の固定方法。
（6）光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【００１２】
【化３】
2018021909.tif 000004
【００１３】
である前記（1）記載の固定方法。
（7）光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【００１４】
【化４】
2018021909.tif 000005
【００１５】
である前記（1）記載の固定方法。
（8）光反応性化合物が、以下のいずれかの化合物
【００１６】
【化５】
2018021909.tif 000006
【００１７】
である前記（1）記載の固定方法。
（9）光反応性化合物が、以下の化合物
【００１８】
【化６】
2018021909.tif 000007
【００１９】
である、前記（1）記載の固定方法。
（10）工程１が紫外線照射によって行われる、前記（1）〜（9）のいずれかに記載の固定方法。
（11）固相担体がビーズである、前記（1）〜（10）のいずれかに記載の固定方法。
（12）ビーズがナノ磁性微粒子である、前記（1）〜（11）のいずれかに記載の固定方法。
（13）ビーズがアガロースビーズである、前記（1）〜（11）のいずれかに記載の固定方法。
（14）ビーズがアミノ基を有するアガロースビーズである、前記（1）〜（11）のいずれかに記載の固定方法。
（15）前記（1）〜（14）のいずれかに記載の固定方法を含む、固相担体に固定された被検化合物の製造方法。
（16）前記（1）〜（14）のいずれかに記載の固定方法を含む、被験化合物と相互作用する物質の検出方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、被検化合物の固相担体への固定方法などが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1は、本発明の方法により得られたローダミンB固定化ビーズの顕微鏡写真を示す。上段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した位相差画像であり、下段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した蛍光顕微鏡画像である。左から、それぞれSDAD:ローダミンB比が1:1、1:2、1:5にて行った場合の画像である。
【図２】図2は、本発明の方法により得られたローダミンB固定化ビーズ、及び公知の方法（特開2004-309372）により得られたローダミンB固定化ビーズの顕微鏡写真を示す。右列が本発明の方法により得られたローダミンB固定化ビーズの写真、左列が公知の方法により得られたローダミンB固定化ビーズの写真である。上段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した位相差画像であり、下段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した蛍光顕微鏡画像である。
【図３】図3は、公知の方法（特開2004-309372）により得られたローダミンB固定化ビーズの顕微鏡写真を示す。上段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した位相差画像であり、下段の図は蛍光倒立顕微鏡（ニコン、TE300）で撮影した蛍光顕微鏡画像である。左から、それぞれローダミンB非添加かつ紫外線照射15分、ローダミンB添加かつ紫外線照射0分、ローダミンB添加かつ紫外線照射15分の場合の画像である。
【図４】図4は、本発明の方法及び公知の方法（特開2004-309372）により得られたローダミンB固定化ビーズからの切り出し反応により得られた化合物のLC-MSクロマトグラムである（上段は本発明の方法に、下段は公知の方法に相当する）。それぞれの縦軸はイオン強度を表し、横軸は保持時間（分）を表す。
【図５】図5は、タクロリムスを固定化したアミノ基を有するアガロースビーズを用いたプルダウン実験のSDS-PAGEの結果を示す。左より、1列目が細胞抽出液、2列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、3列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたもの、4列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、5列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたものを表す。
【図６】図6は、タクロリムスを固定化したアミノ基を有するアガロースビーズを用いたプルダウン実験のウェスタンブロッティングの結果を示す。左より、1列目が細胞抽出液、2列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、3列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたもの、4列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、5列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたものを表す。
【図７】図7は、タクロリムスを固定化したナノ磁性微粒子を用いたプルダウン実験のSDS-PAGEの結果を示す。左より、1列目が細胞抽出液、2列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、3列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたもの、4列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、5列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたものを表す。
【図８】図8は、タクロリムスを固定化したナノ磁性微粒子を用いたプルダウン実験のウェスタンブロッティングの結果を示す。左より、1列目が細胞抽出液、2列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、3列目がブランクビーズ（被検化合物を固定化していないビーズ）において10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたもの、4列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて固定していないタクロリムスを反応液中に存在させなかったもの、5列目がタクロリムス固定化ビーズにおいて10μmol/Lの固定していないタクロリムスを反応液中に存在させたものを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
被験化合物としては、例えば、低分子化合物、糖、核酸、脂質、タンパク質等を用いることができ、それらは修飾されていてもよく、中でも低分子化合物が好ましい。
光反応性化合物としては、光照射によって活性化され、被験化合物と反応する化合物であればいかなるものも用いられる。光反応性化合物としては、例えばナイトレン、カルベン、ラジカル、または炭素求電子剤を発生し得る化合物があげられ、それらの化合物としては、例えばジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、またはジアゾ基を含む化合物等があげられる。より具体的には、例えば以下の化合物、文献（Molecules 2013, 18, pp.10425-10451）記載の化合物等が用いられる。
【００２３】
【化７】
2018021909.tif 000008
【００２４】
【化８】
2018021909.tif 000009
【００２５】
【化９】
2018021909.tif 000010
【００２６】
【化１０】
2018021909.tif 000011
【００２７】
式（I）及び（II）の定義において、低級アルキルとしては、例えば炭素数1〜10の直鎖状または分枝鎖状のアルキルが挙げられ、より具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル等があげられる。
低級アルキレンは、前記低級アルキルの定義から水素原子を1つ除いたアルキレンがあげられる。
【００２８】
式（I）で表わされる化合物の塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。
光照射に用いられる光の波長としては、用いる光反応性化合物の種類によって適切な波長を用いることができ、10〜400nmの範囲の波長の光が通常用いられ、254nm付近、360nm付近、365nm付近の波長の光が好ましい。
光照射に用いられる光の光源としては、太陽光、例えば水銀灯等の電灯光、例えば半導体レーザー、固体レーザー、ガスレーザー等のレーザー光、発光ダイオード、エレクトロルミネッセント素子等が用いられる。
【００２９】
光照射を行う際の温度、溶媒等の条件は特に限定されず、各反応に応じて適した温度、溶媒等の条件を用いることができる。溶媒としては、特に限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、1,2-ジメトキシエタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソピロピルアルコール、水等から選ばれる任意の溶媒を単独で、または組み合わせて用いることができる。また、無溶媒で反応を行うこともできる。
固相担体としては、被験化合物と光反応性化合物との生成物と反応し得るものであれば特に限定されず、本発明の分野で通常使用されるものが用いられる。固相担体の形状は、例えばビーズ［例えば、磁気ビーズ（例えば、ナノ磁性微粒子、磁気アガロースビーズ等）、アガロースビーズ（例えば、アミノ基を有するアガロースビーズ等）等］、板、膜、薄膜、糸、コイル等のいかなる形状でもよく、固相担体の材質としては、例えば樹脂（ポリエチレン、ポリスチレン等のポリオレフィン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス、金属（鉄、ニッケル、白金、金、銀等）、シリコン、セラミックス等のいかなる材質も用いられる。固相担体としては、例えばマイクロアレイ用基板、ビーズ等が好ましい。
被験化合物と光反応性化合物との生成物を固相担体に固定する手段は特に限定されないが、例えば、有機合成化学の分野で通常用いられる反応［例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Comprehensive Organic Transformations, second edition）、ラロック（R. C. Larock）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley & Sons Inc.）（1999年）等に記載の方法］、特開2001-178482記載の固定方法等を用いることができる。
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
実施例
以下の反応スキームに従って、被験化合物をビーズに固定した。実施例1に被験化合物としてローダミンB（Rhodamine B）を用いた例を、実施例2に被験化合物としてタクロリムス（Tacrolimus）を用いた例を示す。
【００３１】
【化１１】
2018021909.tif 000012
【００３２】
（式中、RはローダミンBまたはタクロリムスに由来する残基を表し、黒丸はビーズを表し、Etはエチルを表し、iPrはイソプロピルを表す）
【実施例１】
【００３３】
透明ガラスバイアル（マルエム スクリュー管、No.01 210629）中、メタノール（411 μL）に溶解した3-[[2-[[3-(3-メチル-3H-ジアジリン-3-イル)-1-オキソプロピル]アミノ]エチル]ジチオ]プロパン酸 2,5-ジオキソ-1-ピロリジニルエステル｛Propanoic acid, 3-[[2-[[3-(3-methyl-3H-diazirin-3-yl)-1-oxopropyl]amino]ethyl]dithio]-, 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl ester、以下SDAD｝（Thermo Fisher Scientific）（1.6 mg）とローダミンB（シグマ）（5.35 mg）を異なるモル比（SDAD:ローダミンB = 1:1, 1:2, 1:5）で混合し、窒素パージ10分間および減圧30分間により溶媒を完全に除去した。その後、バイアルの上下から0 cmの距離で紫外線（365 nm）を15分間ずつ照射し、SDADとローダミンBを反応させた。反応物をイソピロピルアルコール/DMFの混合溶媒（1:1）に溶解し、SDADの0.5当量相当のアミノ基を有するアガロースビーズ［EAH Sepharose 4Bビーズ（登録商標）］（20 μL）および8当量のトリエチルアミンを添加し、37℃終夜でビーズへの固定化反応を行った。反応液を除去し、得られたビーズをイソピロピルアルコールで5回、buffer 1［50 mmol/L Tris (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L CaCl2, 2 mmol/L MgCl2, 0.3% TritonX-100］で2回、buffer 2［50 mmol/L Tris (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L CaCl2, 2 mmol/L MgCl2］で1回洗浄し、ローダミンB固定化ビーズを得た。図1にローダミンB固定化ビーズの顕微鏡写真を示す。この図からローダミンBがビーズに固定出来ていることが分かる。従って本発明の方法により被験化合物を固相に固定化できることが示された。本方法ではビーズに紫外線を照射せず、ビーズの乾固も行わないため、ビーズの凝集、収縮が見られなかった。
【００３４】
また、SDADとローダミンBのモル比を1:1/8とし、その他は上記と同様の手順にてローダミンB固定化ビーズを得た。図2にその顕微鏡写真を示す。
【実施例２】
【００３５】
透明ガラスバイアル（マルエム  スクリュー管、No.01 210629）中、メタノール（257 μL）に溶解したSDAD（1.0 mg）とメタノール（122 uL）に溶解したタクロリムス1水和物（シグマ）（1 mg）をモル比8:1で混合し、窒素パージ10分間および減圧30分間により溶媒を完全に除去した。その後、バイアルの上下から0 cmの距離で紫外線（365 nm）を15分間ずつ照射し、SDADとタクロリムスを反応させた。反応物をイソピロピルアルコール/DMFの混合溶媒（1:1）で溶解し、SDADの0.5当量相当のアミノ基を有するアガロースビーズ［EAH Sepharose 4Bビーズ（登録商標）］（50 μL）またはナノ磁性微粒子［FGビーズ（登録商標）（多摩川精機）］（2mg）および8当量のトリエチルアミンを添加し、37℃終夜でビーズへの固定化反応を行った。反応液を除去し、得られたビーズをイソピロピルアルコールで5回、buffer 1で2回、buffer 2で1回洗浄し、タクロリムス固定化ビーズを得た。
【００３６】
比較例
以下の比較例において、公知の方法（特開2004-309372）による被験化合物のビーズへの固定化の例を示す。比較例1に被験化合物としてローダミンBを用いた例を、比較例2に被験化合物としてタクロリムスを用いた例を示す。
【００３７】
【化１２】
2018021909.tif 000013
【００３８】
（式中、R、黒丸、Et及びiPrはそれぞれ前記と同義である）
比較例１：公知の方法（特開2004-309372）によるローダミンB固定化ビーズの作成
アミノ基を有するアガロースビーズ［EAH Sepharose 4Bビーズ（登録商標）］（10 μL）をイソピロピルアルコールで3回洗浄後、イソピロピルアルコール/DMF（1:1）（120 μL）に溶解したビーズ上のアミノ基の2.5当量のSDAD（600 nmol）および3当量のトリエチルアミン（ナカライテスク）（100 mmol/Lを18 μL）を添加し、イソピロピルアルコール（170 μL）中で37℃終夜反応させることによりSDADをビーズ上に固定した。翌日、ビーズをイソピロピルアルコールで3回洗浄して未反応のSDADを除去した後、再びイソピロピルアルコール（120 μL）に懸濁して必要量（37 μL）をエッペンチューブ（ビーエム機器、509-GRD-Q）に分注し、遠心濃縮機により乾固させた。その後、1 mmol/L ローダミンB−メタノール溶液（ビーズ10 μLに対して10 μL）を添加し、再度遠心濃縮機により乾固した。エッペンチューブの上方0 cmの距離から紫外線（8w, 365 nm）を照射して反応させた後（3UV-38, Thermo Fisher Scientific）、ビーズをメタノールで3回洗浄後、buffer 1で2回、buffer 2で1回洗浄し、ローダミンB固定化ビーズを得た。図3にローダミンB固定化ビーズの顕微鏡写真を示す。この図からローダミンBがビーズに固定出来ていることが分かる。公知の方法に、光反応性基としてジアジリンを適用した実験にて固定化ビーズが得られたため、光反応性基としてジアジリンが使用可能であることが確認できた。
また、SDADとローダミンBのモル比を1:1/8とし、その他は上記と同様の手順にてローダミンB固定化ビーズを得た。図2にその顕微鏡写真を示す。図2から、等しいSDADとローダミンBのモル比にて、本発明の方法（実施例1）及び公知の方法（比較例1）によりローダミンB固定化ビーズを作成した場合、本発明の方法の方がより多くのローダミンBを固定化できていることが分かる。
【００３９】
比較例２：公知の方法（特開2004-309372）によるタクロリムス固定化ビーズの作成
アミノ基を有するアガロースビーズ（EAH Sepharose 4Bビーズ（登録商標））（60 μL）をイソピロピルアルコールで3回洗浄後、イソピロピルアルコール/DMF（1:1）に溶解したビーズ上のアミノ基の2.5当量のSDAD（10 mmol/Lを360 μL）および3当量のトリエチルアミン（ナカライテスク）（100 mmol/Lを108 μL）を添加し、イソピロピルアルコール（518 μL）中で37℃終夜反応させることによりSDADをビーズ上に固定した。翌日、ビーズをイソピロピルアルコールで3回洗浄して未反応のSDADを除去した後、再びイソピロピルアルコール（120 μL）に懸濁して必要量（30 μL）をエッペンチューブ（ビーエム機器、509-GRD-Q）に分注し、遠心濃縮機により乾固させた。その後、10 mmol/L タクロリムス1水和物−メタノール溶液（ビーズ30 μLに対して45 μL）を添加し、再度遠心濃縮機により乾固した。エッペンチューブの上方0 cmの距離から紫外線（8w, 365 nm）を照射して架橋させた後（3UV-38, Thermo Fisher Scientific）、ビーズをメタノールで3回洗浄後、buffer 1で2回、buffer 2で1回洗浄し、タクロリムス固定化ビーズを得た。
【００４０】
試験例
試験例１：LC-MSによる被験化合物の固定化量の測定
実施例1または比較例1にて作製したローダミンB固定化ビーズを、50 mmol/Lジチオスレイトール水溶液（50 μL）で37℃、30分間処理することにより、切り出し反応を行った（本反応の生成物の構造を以下に示す）。
【００４１】
【化１３】
2018021909.tif 000014
【００４２】
質量分析装置はSynapt G2 HDMS（Waters）を用いた。液体クロマトグラフィー装置はAquity UPLC H-Class（Waters）を用い、分離カラムはAquity UPLC BEH C18（1.7 μm x 50 mm x 2.1 mmφ, Waters）を使用した。溶媒はA液（0.1%ギ酸水溶液）、B液（0.1%ギ酸−アセトニトリル溶液）を用い、40℃、流速約0.4 mL/分で分離した。5% B液から95% B液の5分のグラジエントの後、95% B液で4分の洗浄を行った。データ取得はm/z 100-1,000でスキャンすることにより行った。
【００４３】
定量の結果、本発明の方法により、公知の方法と比べて500倍以上のローダミンBを固定化できていることが分かった。図4にそれぞれのイオンクロマトグラムを示す。
試験例２：プルダウン実験
ヒト大腸癌細胞株HCT116は10%牛胎仔血清（FBS; インビトロジェン）を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; インビトロジェン)で、37℃のCO2インキュベーター（エスペック）中にて維持・培養した。
【００４４】
10 cmディッシュ（CORNING、353003）にHCT116細胞を播種してコンフルエントになるまで培養した。ディッシュ上の細胞を5 mLの氷冷PBSで2回洗浄後、1 mLのlysis buffer［50 mmol/L Tris (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L CaCl2, 2 mmol/L MgCl2、Complete mini EDTA-free（ロシュ）を含む］を添加し、スクレーパーを用いて細胞を回収した。回収した細胞に対して、超音波洗浄機で30秒間の処理を 5回繰り返した後、15,000 rpm、4℃で15分間遠心し不溶物を除去した。BCAプロテインアッセイ（Thermo Fisher Scientific）でタンパク質濃度を定量し、濃度が1 mg/mlになるようlysis bufferで調整した。エッペンチューブ（ビーエム機器、509-GRD-Q）に500 μLずつ分注し、DMSOもしくは10 mmol/L タクロリムス1水和物−DMSO溶液を終濃度0.1 %になるよう添加し、氷上に2時間静置後、実施例2で調製したタクロリムス固定化ビーズまたはタクロリムスを固定してないビーズ（ブランクビーズ）を添加した。冷室で2時間ローテーションの後、500 μLの洗浄バッファー（50 mmol/L Tris (pH7.5), 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L CaCl2, 2 mmol/L MgCl2, 0.3% TritonX-100）で3回洗浄し、残ったビーズに水で1/2希釈したLane Marker Reducing Sample Buffer（サーモサイエンティフィク）を40 μL添加し、95℃で5分加熱した。
【００４５】
上記のサンプル及び細胞抽出液をポリアクリルアミド5-20%分離ゲル（和光純薬）（アミノ基を有するアガロースビーズを用いて得たタクロリムス固定化ビーズに対して使用）もしくは15%分離ゲル（和光純薬）（ナノ磁性微粒子を用いて得たタクロリムス固定化ビーズに対して使用）を用いてSDS-PAGEを行った。電気泳動はTris-glycine緩衝液（25 mmol/L Tris, 0.192 mol/L glycine, 0.1 % SDS）を泳動緩衝液とし、20〜40 mAの定電流で行った。ゲルはSYPRO Ruby（インビトロジェン）により染色し、Amersham Imager 600（GEヘルスケア）で画像取り込みを行った。
ウェスタンブロッティングについては上記と同様にSDS-PAGEを行ったゲル中のタンパク質をブロッティング緩衝液［10 mmol/L cyclohexylamino propanesulfonic acid (CAPS)-NaOH (pH 11.0)、10%メタノール］でPVDF膜（Immobilon Transfer Membranes, ミリポア）に転写した。PVDF膜を1%のスキムミルク（ナカライテスク）を含むPBST（0.1% Tween-20/PBS）で室温、1時間ブロッキングした。その後、同じバッファーで1:1,000に希釈した抗FKBP12ポリクローナル抗体（Cat. No. PA1-026A, Thermo Fisher Scientific）に浸して4℃で終夜反応させた。PBSTで3回洗浄し、さらに1:1,000希釈したペルオキシダーゼが共有結合された抗ラビットIgG（Cat. NO. NA934V, GEヘルスケア）と室温で1時間反応させ、PBSTで3回洗浄した。SuperSignal WestPico（ピアス）を用いて発光させAmersham Imager 600でバンドの検出を行った。
図5にタクロリムスを固定化したアミノ基を有するアガロースビーズを用いたプルダウン実験のSDS-PAGEの結果、図6にウェスタンブロッティングの結果を示す。図7にタクロリムスを固定化したナノ磁性微粒子を用いたプルダウン実験のSDS-PAGEの結果、図8にウェスタンブロッティングの結果を示す。これらの結果から、アミノ基を有するアガロースビーズおよびナノ磁性微粒子のいずれを用いた場合でもFKBP12を特異的にプルダウン出来ていることが分かる。従って、本発明の方法によりタクロリムスが標的分子と結合可能な状態で固相に固定化でき、化合物の標的分子探索に応用し得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、例えば被験化合物の固相担体への固定方法などに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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