(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便かつ信頼性の高い補体系の検査方法を提供する。【解決手段】スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とをインビトロで共存させる反応工程、並びに反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程を含む、前記被験者の補体系を検査する方法に関する。本発明にかかる補体系の検査方法は、血液試料の段階的希釈を不要とし、また赤血球の溶血を指標としないことから、作業の煩雑さ及びこれに起因する測定誤差並びにロット間差という問題を有しない、簡便かつ信頼性の高い補体系の検査方法である。【選択図】図１
2018028450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とをインビトロで共存させる反応工程、並びに
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法。
【請求項２】
検出工程においてさらに補体活性化前期反応を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応工程が、哺乳動物細胞上に存在するスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞がヒト胎児腎由来細胞である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
反応工程が、支持体に固定されたスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
スカベンジャー受容体の機能的等価物が、スカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含むペプチド断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スカベンジャー受容体がＣＬ−Ｐ１、ＳＲ−ＡＩ又はＬＯＸ−１である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ペントラキシンファミリーに属するタンパク質がＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＰ成分又はペントラキシン３である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
補体活性化増幅反応の検出がプロパージン及び／又はＢ因子若しくはその分解物の検出により行われる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
補体活性化後期反応の検出がＣ５ｂ−９の検出により行われる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
補体活性化前期反応の検出がＣ３分解物の検出により行われる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物を発現するヒト細胞、及びペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物を含む、補体系を検査するためのキット。
【請求項１４】
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料と、被験物質とをインビトロで共存させる被験物質反応工程、
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料とをインビトロで共存させる対照反応工程、
各反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程、並びに
被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より大きい場合に被験物質は補体系の活性化能を有すると判定し、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より小さい場合に被験物質は補体系の抑制能を有すると判定する判定工程
を含む、被験物質の補体系の活性化能又は抑制能を試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の補体系の活性化及び／又は補体系の異常を検査する方法、及び当該検査のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、病原体の侵入によって活性化される自然免疫の一種であり、膜結合タンパク質又は血液中の可溶性タンパク質として存在する、多数の補体タンパク質によって構成される。
【０００３】
補体系の活性化経路は、病原体に対する抗原抗体反応により特異的に活性化される古典経路、病原体の認識機構を伴わない第２経路、及び病原体の糖鎖を認識することで活性化されるレクチン経路の３種類に大別される。補体活性化の各経路及びそれらを構成する補体タンパク質を図１に模式的に表す。
【０００４】
補体活性化の３つの経路はすべて、補体タンパク質の一種であるＣ３の分解によるＣ３ｂの生成（Ｃ３活性化、Ｃ３ｂ沈着とも表現される）を経由する。Ｃ３は炎症の中心的な媒介因子であり、炎症を引き起こす多数の要因（典型的には感染）によって活性化される。補体系の活性化において、Ｃ３活性化は、Ｃ３ｂがＢ因子の分解物であるＢｂと結合してＣ３ｂＢｂを形成し、これがさらにＣ３活性化を促すという増幅経路によって増幅される。また、補体活性化の３つの経路はすべて終末補体複合体（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＴＣＣ）の形成に至る。ＴＣＣは、Ｃ５ｂ〜Ｃ９の複合体であり、Ｃ５ｂ−９とも表される。Ｃ５ｂ−９は膜侵襲性複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＡＣ）として、病原体細胞を溶解し、排除する機能を有する。
【０００５】
補体系は本来、病原体の侵入に対する生体防御機構であるが、ＭＡＣは病原体以外の細胞、例えば生体自身の細胞の溶解も引き起こすため、補体系の過剰な活性化は、生体に深刻な組織損傷を与え得る。
【０００６】
補体系は自己免疫疾患、炎症性疾患といった様々な疾患に関係すると考えられている。これまでに、補体系のダウンレギュレーション（活性化の抑制）が治療として有効であると示唆された疾患としては、例えば全身性エリテマトーデス及び腎炎（非特許文献１）、リウマチ性関節炎（非特許文献２）、心筋梗塞（非特許文献３）、再潅流傷害（非特許文献４）などが挙げられ、これらの疾患では補体系の活性化がそれぞれの症状を引き起こすか又は増悪させているものと推察される。
【０００７】
したがって、患者において補体系が活性化されているか否か、さらには補体系の制御機構に異常が存在するか否かを知ることは、疾患への補体系の関与を推測することを可能とし、治療方針の決定又は適切な治療の選択のための臨床上有益な情報となる。
【０００８】
補体系が活性化されているか否かの検査方法として、最終的な細胞破壊を指標とする方法（一括測定法）がある。その代表例はＣＨ５０（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ５０％）であり、溶血素で感作したヒツジ赤血球に対する５０％溶血活性を指標とする方法である。
【０００９】
ＣＨ５０の測定結果は補体価として示される。一般に、補体系が活性化することで溶血活性が高まり、補体価は高くなる（高補体価）が、活性化が亢進すると補体タンパク質がより多く消費される結果、補体価は低くなる（低補体価）と理解されている。そのため、高補体価より低補体価が臨床的には重要な情報と考えられている。例えば、免疫複合体疾患、慢性肝疾患及び補体成分欠損症などで、補体価は低下する傾向にある。
【００１０】
ＣＨ５０は、補体価の測定方法として広く利用されているが、検査試料を段階的に希釈する作業が煩雑であること、段階的希釈に起因して測定誤差が生じること、ヒツジ赤血球の感受性にロット間差が存在すること（赤血球を調製する毎に補体系に対する感受性が異なる）などの問題を有する。さらに、補体系の活性化を一括して測定することから、どの補体タンパク質に異常（タンパク質の欠損、発現量の過不足など）が存在するかを特定することは困難である。ＡＣＨ５０と称される、ウサギ赤血球の５０％溶血活性を指標とした第２経路の活性化能を検査する方法も、ＣＨ５０と同様の問題を有する。
【００１１】
ＣＨ５０とは異なる一括測定法として、赤血球に代えて補体活性により膜損傷反応を受け易いように調製したリポソームを用いたリポソーム法が報告されている（例えば特許文献１）。リポソームを用いることでロット間差という問題は解消されるが、検体の希釈に伴う問題、異常の所在を特定できないという問題はいずれも解消されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１−１５５２７１号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；１９９６，９３：８５６３−８５６８
【非特許文献２】Ｙ．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９５；  ９２：  ８９５５−８９５９
【非特許文献３】Ｊ．Ｗ．Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；１５０：１０５５−１０６４
【非特許文献４】Ｅ．Ａ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５；２６８：Ｈ４４８−Ｈ４５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、より簡便かつ信頼性の高い補体系の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、スカベンジャー受容体とペントラキシンファミリータンパク質との相互作用が補体系の活性化に関与していること、及びインビトロでスカベンジャー受容体とペントラキシンファミリータンパク質の結合を再現し、これらと被験者の血液試料とを共存させることで補体系の検査が可能であることを見出し、下記の各発明を完成させた。
【００１６】
（１）スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とをインビトロで共存させる反応工程、並びに
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法。
（２）検出工程においてさらに補体活性化前期反応を検出する、（１）に記載の方法。
（３）反応工程が、哺乳動物細胞上に存在するスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）哺乳動物細胞がヒト細胞である、（３）に記載の方法。
（５）哺乳動物細胞がヒト胎児腎由来細胞である、（３）又は（４）に記載の方法。
（６）反応工程が、支持体に固定されたスカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とを共存させる工程である、（１）又は（２）に記載の方法。
（７）スカベンジャー受容体の機能的等価物が、スカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含むペプチド断片である、（６）に記載の方法。
（８）スカベンジャー受容体がＣＬ−Ｐ１、ＳＲ−ＡＩ又はＬＯＸ−１である、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ペントラキシンファミリーに属するタンパク質がＣ反応性タンパク質、血清アミロイドＰ成分又はペントラキシン３である、（１）から（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）補体活性化増幅反応の検出がプロパージン及び／又はＢ因子若しくはその分解物の検出により行われる、（１）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）補体活性化後期反応の検出がＣ５ｂ−９の検出により行われる、（１）から（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）補体活性化前期反応の検出がＣ３分解物の検出により行われる、（１）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）スカベンジャー受容体又はその機能的等価物を発現するヒト細胞、及びペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物を含む、補体系を検査するためのキット。
（１４）スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料と、被験物質とをインビトロで共存させる被験物質反応工程、
スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、血液試料とをインビトロで共存させる対照反応工程、
各反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程、並びに
被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より大きい場合に被験物質は補体系の活性化能を有すると判定し、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より小さい場合に被験物質は補体系の抑制能を有すると判定する判定工程
を含む、被験物質の補体系の活性化能又は抑制能を試験する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明にかかる補体系の検査方法は、血液試料の段階的希釈を不要とし、またヒツジ赤血球の溶血を指標としないことから、作業の煩雑さ及びこれに起因する測定誤差並びにロット間差という問題を有しない。また、本発明の検査方法は、補体活性化増幅反応及び補体活性化後期反応のいずれも検出対象とすることができ、さらに補体活性化前期反応も検出対象とすることで、補体系活性化の一括評価を可能にすると共に、どの補体タンパク質に異常（タンパク質の欠損、発現量の過不足など）が存在するかを特定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】補体活性化の各経路及びそれらを構成する補体タンパク質を示す模式図である。
【図２】ＥＬＩＳＡ系におけるＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）又はペントラキシン３（ＰＴＸ３）との結合を示すグラフであり、図２ＡはＣＲＰ、図２ＢはＳＡＰ、図２ＣはＰＴＸ３の結果である。アスタリスクはＢＳＡコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０００１）を、二重のダガーは非変性のＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３のコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０００１）を表す。
【図３】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１及びＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３を検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図４】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１及びＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３を検出した蛍光画像の平均蛍光強度から算出した、ＣＬ−Ｐ１発現量に対するＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３結合量を示すグラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰの存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下で１ｑ欠損血清又はＣ１ｑを補充したＣ１ｑ欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図７】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰの存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１及びＣ３ｄを検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図８】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰの存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図９】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰの存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣ１ｑ及びＣ３ｄを検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図１０】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣ１ｑ欠損血清又はＣ１ｑを補充したＣ１ｑ欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図１１】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＢ欠損血清又はＣＦＢを補充したＣＦＢ欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図１２】ＣＬ−Ｐ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１及びＣＦＢを検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図１３】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＢ欠損血清又はＣＦＢを補充したＣＦＢ欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図１４】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でプロパージン欠損血清又はプロパージンを補充したプロパージン欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図１５】ＣＬ−Ｐ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１及びプロパージンを検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図１６】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でプロパージン欠損血清又はプロパージンを補充したプロパージン欠損血清とインキュベートすることにより生じたＣ３ｄ沈着量を示すグラフである。
【図１７】ＣＬ−Ｐ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でヒト補体血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１、Ｃ５ｂ−９（図１７Ａ）、ＣＦＨ（図１７Ｂ）及びＣ４ＢＰ（図１７Ｃ）を検出した蛍光顕微鏡写真（スケールバー２０μｍ）である。
【図１８】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＨ欠損血清又はＣＦＨを補充したＣＦＨ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図１９】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣ４ＢＰ欠損血清又はＣ４ＢＰを補充したＣ４ＢＰ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２０】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＩ欠損血清又はＣＦＩを補充したＣＦＩ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２１】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＨ欠損血清又はＣＦＨを補充したＣＦＨ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２２】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣ４ＢＰ欠損血清又はＣ４ＢＰを補充したＣ４ＢＰ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２３】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＩ欠損血清又はＣＦＩを補充したＣＦＩ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２４】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下で非典型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）患者血清又はＣＦＨを補充したａＨＵＳ患者血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２５】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でａＨＵＳ患者血清又はＣＦＨを補充したａＨＵＳ患者血清とインキュベートすることにより形成された反応上清中のＳＣ５ｂ−９の量を示すグラフである。
【図２６】ＣＬ−Ｐ１、ＬＯＸ−１、ＳＲ−Ａ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰの存在下でａＨＵＳ患者血清とインキュベートした後、特異抗体を用いてＣＬ−Ｐ１、ＬＯＸ−１、ＳＲ−Ａ１及びＣ５ｂ−９を検出した蛍光顕微鏡写真である。
【図２７】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡを、ＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下で、ヒト補体血清又はａＨＵＳ患者血清若しくはＣＦＨ若しくはｓＣＲ１を加えたａＨＵＳ患者血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２８】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＨ欠損血清又はｓＣＲ１を加えたＣＦＨ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図２９】ＥＬＩＳＡ系において、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン又はＢＳＡをＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣ４ＢＰ欠損血清又はｓＣＲ１を加えたＣ４ＢＰ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図３０】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰの存在下又は非存在下でａＨＵＳ患者血清又はｓＣＲ１を補充したａＨＵＳ患者血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図３１】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣＦＨ欠損血清又はｓＣＲ１を補充したＣＦＨ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【図３２】ＣＬ−Ｐ１又はｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させたＨＥＫ２９３細胞をＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下でＣ４ＢＰ欠損血清又はｓＣＲ１を補充したＣ４ＢＰ欠損血清とインキュベートすることにより形成されたＣ５ｂ−９の沈着量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の第一の態様は、スカベンジャー受容体又はその機能的等価物と、ペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物と、被験者から採取した血液試料とをインビトロで共存させる反応工程、並びに
反応工程後の反応物からスカベンジャー受容体又はその機能的等価物とペントラキシンファミリーに属するタンパク質又はその機能的等価物との相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程
を含む、前記被験者の補体系を検査する方法に関する。
【００２０】
スカベンジャー受容体は、変性ＬＤＬ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を細胞内に取込む膜貫通型受容体タンパク質であり、動脈硬化性病変進展時の泡沫マクロファージの形成をはじめとする、様々な生理機能に関与する重要な分子である。本発明では特に断らない限り、用語「スカベンジャー受容体」はヒトのそれを意味するものとする。
【００２１】
これまでに、ＣＬ−Ｐ１（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  １）、ＳＲ−ＡＩ（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＡＩ）、ＬＯＸ−１（ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）、ＳＲＥＣ（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）、ＣＤ３６及びＣＤ８６の６種類のスカベンジャー受容体が報告されており、それぞれをコードする遺伝子もクローニングされている。塩基配列データベースであるＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＣＬ−Ｐ１はアクセッション番号ＡＢ００５１４５として、ＳＲ−ＡＩはＢＣ０６３８７８として、ＬＯＸ−１はＡＢ１０２８６１として、ＳＲＥＣはＢＣ０３９７３５として、ＣＤ３６はＭ２４７９５として、ＣＤ８６はＫＵ２８４８４８として登録されている。
【００２２】
本発明においては、これら６種類のスカベンジャー受容体のいずれも利用することができる。また、これら６種類のスカベンジャー受容体の他に、これらの機能的等価物も本発明において利用することができる。ここでスカベンジャー受容体の機能的等価物とは、後述するペントラキシンファミリータンパク質との相互作用によって補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を誘導する機能を保持した変異体、修飾体及びペプチドフラグメントを意味する。変異体の例としては、遺伝子多型によって又は遺伝子工学的手法によってアミノ酸残基が欠失、付加、置換されたアミノ酸配列からなるスカベンジャー受容体を、修飾体の例としては、糖鎖、ポリエチレングリコール、標識化合物その他の化学物質で修飾されたスカベンジャー受容体を、ペプチドフラグメントの例としては、スカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含む受容体フラグメントを、それぞれ挙げることができる。以下、特に断らない限り、スカベンジャー受容体又はその機能的等価物をＳＲと表す。
【００２３】
本発明の検査方法に好ましく利用されるＳＲはＣＬ−Ｐ１、ＳＲ−ＡＩ若しくはＬＯＸ−１又はそれらの機能的等価物であり、より好ましくはＣＬ−Ｐ１又はその機能的等価物である。
【００２４】
ＳＲは、これを発現している天然の細胞から分離又は精製して使用することができる。また、ＳＲは、公的なデータベースに登録されている塩基配列情報及びアミノ酸配列情報と、当業者に公知の遺伝子工学的方法とを利用して、組換えタンパク質として調製して使用することができる。
【００２５】
ペントラキシンファミリーは、ペントラキシンシグニチャー（ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と称される特徴的な８アミノ酸残基からなるモチーフを含むＰＴＸドメインを有するサブユニットが複数会合してなる環状多量体タンパク質のスーパーファミリーである。本発明では特に断らない限り、用語「ペントラキシンファミリー」はヒトのそれを意味するものとする。
【００２６】
ペントラキシンファミリーに属するタンパク質の例は、炎症性タンパク質として知られているＣ反応性タンパク質（Ｃ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ成分（Ｓｅｒｕｍ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＡＰ）及び血管内皮細胞で発現するペントラキシン３（ＰＴＸ３）を挙げることができる。ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３をコードする遺伝子はそれぞれクローニングされ、その塩基配列はＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいてそれぞれアクセッション番号Ｘ５６６９２、Ｍ１０９４４、Ｘ６３０５３として登録されている。
【００２７】
本発明において、これら３種類のペントラキシンファミリータンパク質のいずれも利用することができる。また、これら３種類のペントラキシンファミリータンパク質の他に、それらの機能的等価物も本発明において利用することができる。ここでペントラキシンファミリータンパク質の機能的等価物とは、上述したＳＲとの相互作用によって補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を誘導する機能を保持した変異体、修飾体及びペプチドフラグメントを意味する。変異体の例としては、遺伝子多型によって又は遺伝子工学的手法によってアミノ酸残基が欠失、付加、置換されたアミノ酸配列からなるペントラキシンファミリータンパク質を、修飾体の例としては、糖鎖、ポリエチレングリコール、標識化合物その他の化学物質で修飾されたペントラキシンファミリータンパク質を、ペプチドフラグメントの例としては、ＳＲとの結合部位であるＢ−ｆａｃｅを含むフラグメントを、それぞれ挙げることができる。以下、特に断らない限り、ペントラキシンファミリータンパク質又はその機能的等価物をＰＴＸｓと表す。
０
【００２８】
ＰＴＸｓは、血液から分離又は精製して使用することができる。また、ＰＴＸｓは、公的なデータベース等に登録されている塩基配列情報・アミノ酸配列情報と、当業者に公知の遺伝子工学的手法とを利用して、組換えタンパク質として調製して使用することができる。
【００２９】
本発明の検査方法は、ＳＲとＰＴＸｓと被験者から採取した血液試料（以下、血液試料と表す）とを共存させる反応工程を含む。反応工程の好ましい一例は、哺乳動物細胞上に存在するＳＲとＰＴＸｓと血液試料とを共存させる反応工程である。また、反応工程の別の例は、シャーレ、ウェルプレートその他の適当な支持体に固定されたＳＲ、特に支持体に固定されたスカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含む受容体フラグメントとＰＴＸｓと血液試料とを共存させる反応工程である。
【００３０】
本発明において利用される哺乳動物細胞は、ヒト細胞であることが好ましい。ヒト細胞を用いることによって、細胞上のＳＲの存在に依存しない非特異的な補体系の活性化（バックグラウンドの上昇）を回避することができる。ヒト細胞の例としては、ヒト胎児腎由来細胞、ヒト心筋細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト上皮細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト平滑筋細胞などを挙げることができる。特に好ましいヒト細胞はヒト血管内皮細胞又はヒト胎児腎由来細胞である。
【００３１】
哺乳動物細胞は、シャーレ、ウェルプレートその他の細胞を付着させることのできる適当な支持体に付着させて用いることができる。
【００３２】
哺乳動物細胞上に存在するＳＲは、天然に存在する細胞の表面上で発現しているＳＲであってもよいが、ＳＲをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換した哺乳動物細胞、特にヒト細胞の表面上で発現しているＳＲであることが好ましい。かかるＳＲの例としては、Ｊａｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４，３９５６−３９６５）に記載の方法に従って、ＣＬ−Ｐ１全長を発現するベクターを構築し、ヒトの細胞を該ベクターで形質転換することで調製されるＨＥＫ２９３細胞で発現しているＣＬ−Ｐ１を挙げることができる。ＣＬ−Ｐ１以外のＳＲについては、ＣＬ−Ｐ１をコードする遺伝子を他のＳＲをコードする遺伝子に置き換える他は、上記Ｊａｎｇらの記載の方法に準じて調製すればよい。
【００３３】
支持体に固定されたＳＲは、ＳＲを含む溶液、好ましくはスカベンジャー受容体の細胞外ドメインを含む受容体フラグメントを含む溶液を、シャーレ、ウェルプレートその他のタンパク質を吸着することのできる適当な支持体上に置き、適当な条件下でインキュベートすることで調製することができる。
【００３４】
血液試料は、被験者から採取した血液そのものであっても、血液から分離した血清又は血漿であってもよい。また、特定の補体タンパク質の異常の検査を目的とする場合、当該補体タンパク質を欠損させた又は補充した血液試料を用いてもよい。補体タンパク質を欠損させた血液試料は、公知の方法により、例えば被験者から採取した血液又は血清若しくは血漿を、当該補体タンパク質に対する特異抗体を結合させたアフィニティークロマトグラフィーに供することにより調製することができる。
【００３５】
ＳＲとＰＴＸｓと血液試料を共存させる反応は、適当な溶媒中、典型的には緩衝液中又は細胞培養に用いられる液体培地中で、好ましくはタンパク質が活性を失わない生理的条件の緩衝液中又は液体培地中で行われる。哺乳動物細胞上に存在するＳＲを用いる場合、溶媒は、細胞が生存可能な生理的条件の緩衝液又は液体培地であることが好ましい。支持体に固定されたＳＲを用いる場合、溶媒は、タンパク質が変性等しない生理的条件の緩衝液であることが好ましい。
【００３６】
本発明の検査方法は、反応工程後の反応物からＳＲとＰＴＸｓとの相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程を含む。
【００３７】
補体活性化増幅反応の検出は、増幅反応の活性化因子であるプロパージン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）、Ｄ因子（Ｃｏｍｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄ、ＣＦＤ）、Ｂ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂ、ＣＦＢ）、Ｂａ（ＣＦＢの分解物）及び／又はＣ３ｂＢｂ（Ｃ３分解物であるＣ３ｂとＣＦＢ分解物であるＢｂが結合したもの）を、補体活性化後期反応の検出は、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ及び／又はＣ５ｂ−９を測定対象とし、各成分に対する抗体を利用したイムノアッセイによって行うことができる。好ましくは、補体活性化増幅反応の検出は、プロパージン又はＣＦＢを測定対象とした、補体活性化後期反応はＣ５ｂ−９を測定対象としたイムノアッセイにより行われる。イムノアッセイは、当業者に知られた一般的な方法により、又は市販されているキットを利用して行うことができる。
【００３８】
また本発明の検査方法では、補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応の検出に加えて、補体活性化前期反応の検出を行うことが好ましい。補体活性化前期反応の検出は、Ｃ３活性化すなわちＣ３分解物であるＣ３ｂ又はＣ３ｄを測定対象として行われることが好ましい。
【００３９】
補体タンパク質はその種類によって活性化時の局在が異なり、例えばプロパージン、ＣＦＤ、ＣＦＢ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄはＳＲ又は細胞膜に存在し、Ｂａ、Ｃ５ａは液相中に存在し、Ｃ５ｂ−９はＴＣＣとしてＳＲ若しくは細胞膜に、又はＳＣ５ｂ−９として液相中に存在する。したがって、活性化時にＳＲ又は細胞膜に存在する補体タンパク質を測定対象とする場合は反応工程終了後の支持体又は細胞を、活性化時に液相中に存在する補体タンパク質を測定対象とする場合は反応工程終了後の液相を測定に供することにより、活性化された補体タンパク質の量を測定することができる。さらに、反応工程において哺乳動物細胞上に存在するＳＲを用いる本発明の検査方法によると、細胞における各補体タンパク質の共局在の情報を得ることもできる。
【００４０】
本発明の検査方法は、血液試料に含まれる補体系が活性化されているか否か、さらに補体系に異常が存在するか否か、どの補体タンパク質が異常に関与しているかを、検査することができる。具体的には、血液試料の他に、特定の前処理を行った血液試料を用いた本発明の検査方法、さらには異常が疑われる補体タンパク質を添加した反応工程を含む本発明の検査方法を組み合わせて実行することで、様々な情報を得ることができる。以下、本発明の検査方法の実行例と得られる情報を示す。
【００４１】
＜検査例１＞
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はＣＦＢが検出される、
Ｃ５ｂ−９が検出される、及び
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出される；
↓
血液試料には、補体活性化後期反応の補体制御因子（ＣＦＨ、Ｃ４ＢＰ又はＣＦＩ）の欠損若しくは機能低下、又は増幅反応の活性化因子（Ｃ３、ＣＦＢ）の異常亢進の可能性ありと判断する。この場合、補体制御因子を添加した反応工程、又は増幅反応の活性化因子に対する中和抗体を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行うことで、異常の原因を特定することができる。
【００４２】
＜検査例２＞
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はＣＦＢが検出される、
Ｃ５ｂ−９が検出されない、及び
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出される；
さらに、補体制御因子を人為的に除去した血液試料を用いた本発明の方法を追加的に行った結果、
Ｃ５ｂ−９が検出される；
↓
血液試料に含まれる補体系タンパク質はいずれも正常であり、かつ正常に制御されていると判断する。
【００４３】
＜検査例３＞
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はＣＦＢが検出される、
Ｃ５ｂ−９が検出されない、及び
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出されないか、又はわずかにしか検出されない；
さらに、補体活性化前期反応に関与する補体タンパク質（Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ４）を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出される、又は検出される量が増加する；
↓
血液試料は、添加した補体活性化前期反応に関与する補体タンパク質について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
【００４４】
＜検査例４＞
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はＣＦＢが検出されない、
Ｃ５ｂ−９が検出されない、及び
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出されないか、又はわずかにしか検出されない；
さらに、補体活性化増幅反応の活性化因子を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出される、又は検出される量が増加する；
↓
血液試料は、添加した補体活性化増幅反応の活性化因子について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
【００４５】
＜検査例５＞
本発明の検査方法を行った結果、
プロパージン又はＣＦＢが検出されない；
Ｃ５ｂ−９が検出されない
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出されないか、又はわずかにしか検出されない；
さらに、補体活性化増幅反応の活性化因子を添加した反応工程を含む本発明の方法を追加的に行った結果、
Ｃ３ｂ又はＣ３ｄが検出される、及び
Ｃ５ｂ−９は検出されない
さらに、補体制御因子を人為的に除去した血液試料を用いた本発明の方法を追加的に行った結果、
Ｃ５ｂ−９が検出される。
↓
血液試料は、補体活性化後期反応は正常だが、添加された補体活性化増幅反応の活性化因子について欠損又は機能低下の可能性ありと判断する。
【００４６】
上述の検査例１は従来の一括測定法に相当するものであり、補体が活性化され又は異常亢進されている被験者は、この実行例１によって容易に判別することができる。また、検査例２は、補体系が正常であるか又は補体系の活性化を妨げる何らかの異常があるかを判別するものであり、検査例３及び４は特定の補体タンパク質に異常があるかを判別するものであり、検査例５はどの補体タンパク質に異常があるかを判別するものである。
【００４７】
本発明の第二の態様は、ＳＲ及びＰＴＸｓを含む、補体系を検査するためのキットに関する。特にＳＲを発現する細胞及びＰＴＸｓを含むキットが好ましい。
【００４８】
本発明のキットに含まれるＳＲ及びＰＴＸｓは、前記第一の態様において説明されている通りである。また、キットは、補体タンパク質の検出に利用可能な物質、例えば補体タンパク質に対する特異抗体、特異抗体に対する二次抗体、検出試薬、発色試薬、緩衝液その他の任意の試薬類を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明の第三の態様は、ＳＲとＰＴＸｓと血液試料と被験物質とをインビトロで共存させる被験物質反応工程、ＳＲとＰＴＸｓと血液試料とをインビトロで共存させる対照反応工程、各反応工程後の反応物からＳＲとＰＴＸｓとの相互作用により誘導される補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応を検出する検出工程、並びに被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より大きい場合に被験物質は補体系の活性化能を有すると判定し、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応が対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／若しくは補体活性化後期反応より小さい場合に被験物質は補体系の抑制能を有すると判定する判定工程を含む、被験物質の補体系の活性化能又は抑制能を試験する方法に関する。
【００５０】
本発明の試験方法における被験物質反応工程及び対照反応工程の両反応工程並びに検出工程は、被験物質反応工程において被験物質を共存させる以外は、前記第一の態様において説明されている通りである。
【００５１】
被験物質反応工程及び対照反応工程において用いられる血液試料は、健常者由来の血液試料であっても患者由来の血液試料であってもよいが、健常者の血液には補体制御因子が含まれるため補体活性化後期反応が検出されない又は低レベルでしか検出されず、活性が弱い被験物質の試験を感度良く行えないことがある。したがって、特に補体活性化後期反応の活性化能又は抑制能を試験する場合は、補体制御因子を欠損又は減少させた血液試料、すなわち補体制御因子を欠損若しくは減少させた健常者由来の血液試料又は補体制御因子の欠損若しくは減少が知られている患者由来の血液試料を用いることが好ましい。また、特定の補体活性化反応の活性化能又は抑制能を試験する場合、当該反応に関与する補体タンパク質を欠損又は強化した血液試料を用いて試験を行うこともできる。
【００５２】
判定工程においては、被験物質反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応と、対照反応工程後の反応物から検出された補体活性化増幅反応及び／又は補体活性化後期反応とが比較される。その結果、前者が後者より大きい場合、すなわち被験物質反応工程後の反応物のほうが対照反応工程後の反応物よりも補体活性化の指標となる補体タンパク質を多く含む場合には、被験物質は補体系の活性化能を有していると判定することができる。一方、前者が後者より小さい場合、すなわち対照反応工程後の反応物のほうが被験物質反応工程後の反応物よりも補体活性化の指標となる補体タンパク質を多く含む場合には、被験物質は補体系の抑制能を有すると判定することができる。補体系の活性化能又は抑制能を有すると判定された被験物質は、補体系の制御機構に異常が存在する患者に対する医薬となり得る。
【００５３】
また、第三の態様の試験方法においては、さらに補体活性化前期反応を検出し、被験物質反応工程と対照反応工程それぞれの反応物から検出された補体活性化前期反応の大きさを比較することにより、補体系の活性化能又は抑制能を試験することもできる。
【００５４】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００５５】
＜材料及び方法＞
細胞
機能的ＬＤＬ受容体を欠損したＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞はＭ．Ｋｒｉｅｇｅｒ博士（ＭＩＴ）から分与された。ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）細胞はＡＴＣＣから購入した。
【００５６】
タンパク質及び試薬
使用した試薬と購入元は以下の通りである：ネイティブのＣＲＰ、Ｃ１ｑ欠損血清及び抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；組換えヒトペントラキシン２（ＳＡＰ）、組換えヒトペントラキシン３（ＰＴＸ３）、可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１、組換えヒトＣＤ３５）、ビオチン化抗マウスペントラキシン２（ヒトペントラキシン２と交差反応する）、ビオチン化抗ヒトＰＴＸ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；精製ネイティブＣ１ｑ、精製ヒトＣＦＨ、精製ヒトプロパージン、精製ヒトＣＦＢ、精製ヒトＣＦＩ、ウサギ抗ヒトＣ５ｂ−９抗体、ヤギ抗ヒトＣＦＨ抗体、ヤギ抗ヒトＣＦＢ抗体、ヤギ抗ヒトプロパージン抗体、プロパージン欠損血清、ＣＦＢ欠損血清、ＣＦＩ欠損血清及びＣＦＨ欠損血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；マウス抗ヒトＣ４ＢＰ抗体、精製ヒトＣ４ＢＰ及びＭｉｃｒｏＶｕｅ  ＳＣ５ｂ−９  ｐｌｕｓ  ＥＩＡ  キット（Ｑｕｉｄｅｌ）；ＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びヒト補体血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；抗ｍｙｃモノクローナル抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５抗体ラベリングキット、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ウサギ抗ヒトＣ３ｄ抗体（Ｄａｋｏ）。
【００５７】
Ｃ４ＢＰ欠損血清は、ＰＢＳで希釈した４０％ヒト補体血清を、約１０ｍｇのヒツジ抗Ｃ４ＢＰ  ＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）を結合させたＨｉｓＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化カラム（１ｍｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことで調製した。得られた血漿にＣ４ＢＰが含まれないことをウエスタンブロット分析により確認した。非典型的溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）患者の血清は日高義彦教授（信州大学）から供与されたものであり、塩基配列解析の結果、ＦＨ１中にヘテロ接合性のＧ３７１７Ａ変異、並びにＣ−２５７Ｔ、Ａ２０８９Ｇ、Ｇ２８８１Ｔ及びＧ１４９２Ａのヘテロ接合性多型が見出された。この患者血清から抗ＣＦＨ抗体は検出されなかった。
【００５８】
スカベンジャー受容体を発現させた細胞の調製
文献（Ｓ．Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４，３９５６−３９６５）に記載の方法に従って、ヒト完全長ＣＬ−Ｐ１をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ発現ベクターにクローニングした。ヒトＬＯＸ−１及びＳＲ−Ａ１についても、同様にｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞は５％熱不活化ＦＢＳを含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２培地で、ＨＥＫ２９３細胞は１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地で、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。ＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞をポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたガラス製ディッシュ（Ｉｗａｋｉ、Ｊａｐａｎ）上に、ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲンでコーティングしたガラス製ディッシュ（Ｉｗａｋｉ、Ｊａｐａｎ）上に播種し、２４時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて上記ベクターを各細胞に導入した。トランスフェクションの６時間後に培地を交換し、２４時間後に細胞を以下のアッセイにおいて用いた。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ系を用いたＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合アッセイ
Ｎ末端にインスリンリーダーペプチド及びＦＬＡＧタグを付加したヒトＣＬ−Ｐ１の細胞外ドメイン（ＣＬ−Ｐ１アミノ酸配列の５９〜７４２番目）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。このプラスミドをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  トランスフェクション試薬を用いてＥｘｐｉ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。７日間の細胞培養後、培養上清を回収し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）を用いて可溶性の組換えヒトＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを精製した。
【００６０】
９６ウェルイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン（０．１μｇ）又はＢＳＡ（０．１μｇ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングバッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ  ９．６）中で４℃で一晩インキュベートすることにより固定した。ＴＢＳＴＣ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、ＢｌｏｃｋＡｃｅ／ＰＢＳ（ＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して３７℃で１時間プレートをブロッキングした。ＴＢＳＴＣで洗浄後、ＣＲＰ、ＳＡＰ若しくはＰＴＸ３又はこれらを５分間煮沸して熱変性させたものを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いでビオチンコンジュゲート抗体を加えて３７℃で１時間置き、Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えてさらに１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルにアプライし、室温で１５分間インキュベートした。最後に１００μｌの１Ｍ  リン酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度をモデル６８０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．）で測定した。
【００６１】
ＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞表面に発現させたＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合アッセイ
ＣＬ−Ｐ１を発現させたＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞を、１０μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  ５５５−ＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３を含む氷冷ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中で、４℃で１時間インキュベートした。細胞を４％  リン酸緩衝ホルマリン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して室温で３０分間固定し、洗浄して、抗ｍｙｃ抗体、又は抗ｍｙｃ抗体とビオチン化抗マウスペントラキシン２抗体（ヒトペントラキシン２と交差反応する）若しくはビオチン化抗ＰＴＸ３抗体との組み合わせと共に、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  ４８８−抗マウスＩｇＧ抗体、又はＡｌｅｘａ  ４８８−抗マウスＩｇＧ抗体とストレプトアビジンＡｌｅｘａ  ５５５コンジュゲートとの組み合わせと共に、室温で３０分間インキュベートした。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００、Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて×４０で画像を取得した。各画像から、ＢＺ−ＨＩＣプログラム（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてシグナル強度を算出した。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ系を用いた補体活性化アッセイ
９６ウェルイムノプレートの各ウェルにコーティングバッファーで希釈したＣＬ−Ｐ１細胞外ドメイン（５μｇ／ｍｌ）又は熱不活化ＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ加え、４℃で一晩インキュベートすることにより固定した。ＰＢＳで３回洗浄した後、２％  ＢＳＡ  ＰＢＳ溶液を使用して３７℃で１時間プレートをブロッキングした。洗浄後、１％  ヒト補体血清又は各種補体欠損血清若しくはａＨＵＳ患者血清と共に、２０μｇ／ｍｌ（全血清）のＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３を添加した又は添加しない０．１％ゼラチンを含有するベロナールバッファー（０．８２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４５．４５ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３．１１ｍＭバルビツール、１．８ｍＭバルビツール酸ナトリウム）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで洗浄後の各ウェルに１％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで希釈した３．５μｇ／ｍｌウサギ抗ヒトＣ３ｄ抗体又はウサギポリクローナル抗ヒトＣ５ｂ−９抗体を加えてインキュベートし、その後に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（１：５０００）を加えてインキュベートした後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質と反応させてペルオキシダーゼ活性を上記と同様に測定することにより、補体活性化により生成したＣ３ｄ及びＣ５ｂ−９の量を測定した。
【００６３】
また、一部のアッセイにおいて、Ｃ１ｑ（２００μｇ／ｍｌ全血清）、プロパージン（６μｇ／ｍｌ全血清）、ＣＦＢ（２００μｇ／ｍｌ全血清）、ＣＦＨ（４００μｇ／ｍｌ全血清）、Ｃ４ＢＰ（１６０μｇ／ｍｌ全血清）又はＣＦＩ（３５μｇ／ｍｌ全血清）を対応する欠損血清に加えた。また実施例６においては、ｓＣＲ１（１０．６５μｇ／ｍｌ）をさらに加えた阻害アッセイを行った。
【００６４】
ＨＥＫ２９３細胞系を用いた補体活性化アッセイ
ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ヒト補体血清又は各種補体欠損血清若しくはａＨＵＳ患者血清を含むＤＭＥＭ−高グルコース培地中で、２０μｇ／ｍｌ（全血清）のＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を４％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定し、ウサギ抗ヒトＣ３ｄ抗体（３．５μｇ／ｍｌ）又はウサギポリクローナル抗ヒトＣ５ｂ−９抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４抗ウサギＩｇＧ抗体と組み合わせた免疫染色を行って、補体活性化によって生成したＣ３ｄ及びＣ５ｂ−９を検出した。蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングし、シグナル強度をＢＺ−ＨＩＣプログラムにより算出し、その平均値である平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各補体タンパク質の定量値とした。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ系と同様、一部のアッセイにおいて、Ｃ１ｑ（２００μｇ／ｍｌ全血清）、プロパージン（６μｇ／ｍｌ全血清）、ＣＦＢ（２００μｇ／ｍｌ全血清）、ＣＦＨ（４００μｇ／ｍｌ全血清）、Ｃ４ＢＰ（１６０μｇ／ｍｌ全血清）又はＣＦＩ（３５μｇ／ｍｌ全血清）を対応する欠損血清に加えた。また実施例６においては、ｓＣＲ１（１０．６５μｇ／ｍｌ）をさらに加えた阻害アッセイを行った。
【００６６】
また、２０μｇ／ｍｌ（全血清）のＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下又は非存在下で１０％ヒト補体血清とインキュベートした細胞を固定後、ヤギポリクローナル抗ヒトＣＦＨ抗体、ヤギ抗ヒトプロパージン抗体、ヤギ抗ヒトＣＦＢ抗体又は抗ヒトＣ４ＢＰ抗体と、その後にＡｌｅｘａ−コンジュゲート２次抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。細胞をイメージングしてシグナル強度を算出することで、ＣＦＨ、Ｃ４ＢＰ、ＣＦＢ及びプロパージンのリクルートを評価した。
【００６７】
さらに、２０μｇ／ｍｌ（全血清）のＣＲＰの存在下又は非存在下で１０％  ＣＦＨ欠損血清若しくは５％  ａＨＵＳ患者血清又は精製ＣＦＨ（４００μｇ／ｍｌ  全血清）を補充したこれらの血清とインキュベートした細胞の培地を回収し、補体活性化によって生成したＳＣ５ｂ−９をＭｉｃｒｏＶｕｅ  ＳＣ５ｂ−９  ｐｌｕｓ  ＥＩＡ  キットを用いて定量した。
【００６８】
統計解析
統計解析は、ＪＭＰ統計ソフトウェアパッケージ（バージョン７、ＳＡＳ）に包まれる対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を用いて行った。なお、実施例において、データは平均値±標準誤差で表す。特に記載がないかぎり、グラフ中のアスタリスクは有意差（ｐ＜０．０００１）を、ｎｓは有意差がないことを表す。
【００６９】
＜実施例１  ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合の評価＞
１−１．ＥＬＩＳＡ系を用いた評価
ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＰＴＸｓ（ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３）との結合をＥＬＩＳＡを用いて評価した。結果を図２Ａ〜Ｃに示す。ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３は、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインと特異的かつ用量依存的に結合し、それぞれの熱変性はＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとの結合能を失わせた。
【００７０】
１−２．細胞系を用いた評価
ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合を、ＣＨＯ／ｌｄｌＡ７細胞を用いて評価した。図３に示すように、ＣＬ−Ｐ１発現細胞においてはＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＣＬ−Ｐ１と共局在したが、ｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを発現させた細胞においてはＣＲＰ、ＳＡＰ、ＰＴＸ３のいずれも検出されなかったことから、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３は細胞表面のＣＬ−Ｐ１と結合することが示された。また、それぞれの蛍光画像から平均蛍光強度を算出し、ＣＬ−Ｐ１発現量に対するＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の結合量の比較を行った。ＣＬ−Ｐ１へのＣＲＰの結合量は、ＳＡＰ及びＰＴＸ３の結合量と比べて低レベルであった（図４）。
【００７１】
＜実施例２  ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合により誘導される補体活性化前期反応の評価＞
２−１．ＥＬＩＳＡ系を用いた補体活性化前期反応の評価
ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＰＴＸｓとの結合による補体活性化前期反応の誘導を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。図５に示すように、ヒト補体血清の存在下で、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおいてＣＲＰの添加に応じたＣ３ｄ沈着量の増加が認められた。また、Ｃ１ｑ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおけるＣ３ｄ沈着量はＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加したが、Ｃ１ｑを補充したＣ１ｑ欠損血清を用いると、このＣ３ｄ沈着量の増加はさらに増強された（図６）。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＣＬ−Ｐ１の細胞外ドメインと結合し、Ｃ１ｑを介して補体活性化前期反応を活性化させてＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７２】
２−２．細胞系を用いた補体活性化前期反応の評価
ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓ結合による補体活性化前期反応の誘導を、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞においてＣＲＰの添加に応じたＣ３ｄ沈着量の増加が認められた（図７〜図９）。このときＣ３ｄはＣＬ−Ｐ１（図７）及びＣ１ｑ（図９）と共局在しており、これらはいずれも細胞表面全体にわたって存在が確認された。Ｃ１ｑを含まないＣ１ｑ欠損血清を用いた場合、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３添加によるＣ３ｄ沈着は起こらず、Ｃ１ｑを欠損血清に補充することでＣ３ｄ沈着は回復した（図１０）。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＨＥＫ２９３細胞表面上のＣＬ−Ｐ１と結合し、Ｃ１ｑを介して補体活性化前期反応を活性化させて細胞表面へのＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７３】
＜実施例３  ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合により誘導される補体活性化増幅反応の評価＞
３−１．ＥＬＩＳＡ系を用いたＣＦＢを介した補体活性化増幅反応の評価
ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＰＴＸｓ結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。ＣＦＢ欠損血清を用いた場合と比べて、ＣＦＢを補充したＣＦＢ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおいてＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３の添加に応じたＣ３ｄ沈着量のさらなる増加が認められた（図１１）。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＣＬ−Ｐ１の細胞外ドメインと結合し、ＣＦＢを介して補体活性化増幅反応を活性化させてＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７４】
３−２．細胞系を用いたＣＦＢを介した補体活性化増幅反応の評価
ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓ結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞においてＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の添加に応じたＣＦＢのリクルートが観察された（図１２）。ＣＦＢ欠損血清を用いた場合と比べて、ＣＦＢを補充したＣＦＢ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞においてＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の添加に応じたＣ３ｄ沈着量のさらなる増加が認められた（図１３）。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＨＥＫ２９３細胞表面上のＣＬ−Ｐ１と結合し、ＣＦＢを介して補体活性化増幅反応を活性化させて細胞表面へのＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７５】
３−３．ＥＬＩＳＡ系を用いたプロパージンを介した補体活性化増幅反応の評価
ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＰＴＸｓ結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。プロパージン欠損血清を用いた場合と比べて、プロパージンを補充したプロパージン欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおけるＣ３ｄ沈着量はＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加によってさらに増加した一方、ＳＡＰ添加はＣ３ｄ沈着量に影響しなかった（図１４）。以上から、ＣＲＰ及びＰＴＸ３はＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインと結合し、プロパージンを介して補体活性化増幅反応を活性化させてＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７６】
３−４．細胞系を用いたプロパージンを介した補体活性化増幅反応の評価
ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓ結合による補体活性化増幅反応の誘導を、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて評価した。ヒト補体血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞においてＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加に応じたプロパージンのリクルートが観察されたが、ＳＡＰ添加ではこの現象は観察されなかった（図１５）。プロパージン欠損血清を用いた場合と比べて、プロパージンを補充したプロパージン欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣ３ｄ沈着量はＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加によってさらに増加した一方、ＳＡＰ添加はＣ３ｄ沈着量に影響しなかった（図１６）。以上から、ＣＲＰ及びＰＴＸ３はＨＥＫ２９３細胞表面上のＣＬ−Ｐ１と結合し、プロパージンを介して補体活性化増幅反応を活性化させて細胞表面へのＣ３ｄの沈着を誘導することが示された。
【００７７】
＜実施例４  ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合により誘導される補体活性化後期反応の評価＞
４−１．補体制御因子のリクルート
ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞系において、ヒト補体血清を用いた場合、ＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の存在下及び非存在下のいずれにおいてもＣ５ｂ−９沈着は認められなかった（図１７Ａ）。ＣＲＰ又はＰＴＸ３の存在下では補体制御因子であるＣＦＨが、ＳＡＰの存在下ではＣ４ＢＰがＣＬ−Ｐ１と共局在していたことから（図１７Ｂ及び図１７Ｃ）、これらの補体制御因子のリクルートがＴＣＣの形成を阻害していることが推測された。
【００７８】
４−２．ＥＬＩＳＡ系を用いた補体活性化後期反応の評価
ＥＬＩＳＡ系を用いて、補体制御因子の欠損血清存在下でのＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインとＰＴＸｓとの結合による補体活性化後期反応の誘導を評価した。ＣＦＨ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおけるＣ５ｂ−９沈着量はＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加した一方、ＳＡＰ添加はＣ５ｂ−９沈着量に影響しなかった（図１８）。Ｃ４ＢＰ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおけるＣ５ｂ−９沈着量はＳＡＰの添加によって増加した一方、ＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加はＣ５ｂ−９沈着量に影響しなかった（図１９）。ＣＦＩ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインを固定したウェルにおけるＣ５ｂ−９沈着量はＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加した（図２０）。さらに、ＣＦＨ、Ｃ４ＢＰ、ＣＦＩを対応する欠損血清に補充すると、いずれの場合もＣ５ｂ−９沈着量の増加が抑制された。反応上清中の可溶性Ｃ５ｂ−９（ＳＣ５ｂ−９）含有量も、Ｃ５ｂ−９沈着量と同様に、ＣＦＨ欠損による増加及びＣＦＨ補充による増加抑制が認められた（データは示さず）。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＣＬ−Ｐ１細胞外ドメインと結合することで補体活性化後期反応を活性化させてＴＣＣ形成を誘導することができるが、ＣＲＰ及びＰＴＸ３はＣＦＨ存在下で、ＳＡＰはＣ４ＢＰ存在下で、並びにＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はいずれもＣＦＩ存在下で、ＴＣＣ形成能を阻害されることが示された。
【００７９】
４−３．細胞系を用いた補体活性化後期反応の評価
ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、補体制御因子の欠損血清存在下でのＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合による補体活性化後期反応の誘導を評価した。ＣＦＨ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣ５ｂ−９沈着量はＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加した一方、ＳＡＰ添加はＣ５ｂ−９沈着量に影響しなかった（図２１）。Ｃ４ＢＰ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣ５ｂ−９沈着量はＳＡＰの添加によって増加した一方、ＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加はＣ５ｂ−９沈着量に影響しなかった（図２２）。ＣＦＩ欠損血清を用いた場合、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣ５ｂ−９沈着量はＣＲＰ、ＳＡＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加した（図２３）。さらに、ＣＦＨ、Ｃ４ＢＰ、ＣＦＩを対応する欠損血清に補充すると、いずれの場合もＣ５ｂ−９沈着量の増加が抑制された。以上から、ＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はＨＥＫ２９３細胞表面上のＣＬ−Ｐ１と結合することで補体活性化後期反応を活性化させてＴＣＣ形成を誘導することができるが、ＣＲＰ及びＰＴＸ３はＣＦＨ存在下で、ＳＡＰはＣ４ＢＰ存在下で、並びにＣＲＰ、ＳＡＰ及びＰＴＸ３はいずれもＣＦＩ存在下で、ＴＣＣ形成能を阻害されることが示された。
【００８０】
＜実施例５  細胞系を用いたａＨＵＳ患者血清における補体活性化後期反応の評価＞
ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ａＨＵＳ患者血清における補体活性化後期反応を評価した。ａＨＵＳ患者血清の存在下でＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣ５ｂ−９沈着量はＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加によって増加し、ａＨＵＳ患者血清へのＣＦＨの補充によりＣ５ｂ−９沈着量の増加は抑制された（図２４）。Ｃ５ｂ−９沈着量と同様、反応上清中のＳＣ５ｂ−９含有量もＣＲＰ又はＰＴＸ３の添加により増加し、その増加はＣＦＨ補充により抑制された（図２５）。以上から、このａＨＵＳ患者血清においては、ＣＦＨが正常に機能しない結果、ＣＬ−Ｐ１とＰＴＸｓとの結合による補体後期反応の活性化が抑制されず、ＴＣＣ形成が亢進していることが明らかとなった。
【００８１】
次いで、ＣＬ−Ｐ１の代わりにＬＯＸ−１又はＳＲ−ＡＩを発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、ａＨＵＳ患者血清におけるＣＲＰ存在下での補体活性化後期反応を同様に評価した。ＬＯＸ−１又はＳＲ−ＡＩを発現させたＨＥＫ２９３細胞においても、ＣＬ−Ｐ１発現ＨＥＫ２９３細胞で観察されたようなＣＲＰ存在下でのＣ５ｂ−９沈着量の増加が認められ（図２６）、ＣＬ−Ｐ１、ＬＯＸ−１、ＳＲ−ＡＩはいずれも補体反応評価系において利用可能であることが示された。
【００８２】
＜実施例６  ｓＣＲ１による補体活性化後期反応阻害の評価＞
ｓＣＲ１は、補体活性化後期反応を阻害することが知られている。そこでｓＣＲ１を阻害物質として上記ＥＬＩＳＡ系及びＨＥＫ２９３細胞系に加えることで、補体活性化後期反応の阻害を再現できるか評価した。ＥＬＩＳＡ系においてヒト補体血清、ａＨＵＳ患者血清、ＣＦＨ欠損血清、Ｃ４ＢＰ欠損血清を用いてＣ５ｂ−９沈着量を測定した結果を図２７〜図２９に示す。ａＨＵＳ患者血清添加時のＣＲＰ又はＰＴＸ３存在下でのＣ５ｂ−９沈着量の増加は、ＣＦＨ添加と同様、ｓＣＲ１添加によっても抑制された（図２７）。ＣＦＨ欠損血清添加時のＣＲＰ又はＰＴＸ３存在下でのＣ５ｂ−９沈着量の増加、及びＣ４ＢＰ欠損血清添加時のＳＡＰ存在下でのＣ５ｂ−９沈着量の増加もまた、ｓＣＲ１添加によって抑制された（図２８、図２９）。ＨＥＫ２９３細胞系において各種欠損血清又はａＨＵＳ患者血清を用いた場合も、ｓＣＲ１添加によってＣ５ｂ−９沈着量の増加は抑制された（図３０〜図３２）。以上から、上記ＥＬＩＳＡ系及びＨＥＫ２９３細胞系のいずれにおいても、ｓＣＲ１により補体活性化後期反応の阻害が起こることが確認された。
【００８３】
これらの実施例から、上記のＥＬＩＳＡ系及び細胞系はいずれもヒトの補体系を反映したものであることが確認され、補体系の活性化及び／又は異常の検査のために、並びに補体系に作用する薬剤のスクリーニングのために用いることが可能であることが示された。
【図１】
2018028450.tif 000003
【図２】
2018028450.tif 000004
【図３】
2018028450.tif 000005
【図４】
2018028450.tif 000006
【図５】
2018028450.tif 000007
【図６】
2018028450.tif 000008
【図７】
2018028450.tif 000009
【図８】
2018028450.tif 000010
【図９】
2018028450.tif 000011
【図１０】
2018028450.tif 000012
【図１１】
2018028450.tif 000013
【図１２】
2018028450.tif 000014
【図１３】
2018028450.tif 000015
【図１４】
2018028450.tif 000016
【図１５】
2018028450.tif 000017
【図１６】
2018028450.tif 000018
【図１７】
2018028450.tif 000019
【図１８】
2018028450.tif 000020
【図１９】
2018028450.tif 000021
【図２０】
2018028450.tif 000022
【図２１】
2018028450.tif 000023
【図２２】
2018028450.tif 000024
【図２３】
2018028450.tif 000025
【図２４】
2018028450.tif 000026
【図２５】
2018028450.tif 000027
【図２６】
2018028450.tif 000028
【図２７】
2018028450.tif 000029
【図２８】
2018028450.tif 000030
【図２９】
2018028450.tif 000031
【図３０】
2018028450.tif 000032
【図３１】
2018028450.tif 000033
【図３２】
2018028450.tif 000034