(57)【要約】      （修正有）【課題】様々な蛍光波長の新規の蛍光物質及びその製造方法を提供する。【解決手段】３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類から選択される１種以上とを混合し、反応を行う反応工程を備える蛍光物質の製造方法。前記アミン類がＣ１〜１０以下の鎖式モノアミン又はジアミンであることが、好ましい、螢光物質の製造方法。好ましくは、芳香環を有せずに、分子量が１〜７ｋＤａである螢光物質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応を行う反応工程を備えることを特徴とする蛍光物質の製造方法。
【請求項２】
前記アミン類が炭素数１以上１０以下の鎖式のモノアミン又はジアミンである請求項１に記載の蛍光物質の製造方法。
【請求項３】
３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応させて得られたことを特徴とする蛍光物質。
【請求項４】
芳香環を有しない請求項３に記載の蛍光物質。
【請求項５】
分子量が１ｋＤａ以上７ｋＤａ以下である請求項３又は４に記載の蛍光物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグニンは、植物細胞壁の１５〜３０％を占める主要な成分であり、複雑な構造を有し、未利用バイオマスの一つである。微生物機能を利用して、このようなリグニンを有用性が高い物質に変換する方法の開発は、未利用バイオマスの有効利用という観点から非常に重要である。
【０００３】
一方、有機発光材料は、その多彩で鮮やかな発色性、優れた加工性に加え、検出感度が高く、分子設計により種々の機能付加が可能であり、発光素子、トレーサー、診断薬、試薬等、種々の分野への利用が見込まれることから、優れた化学素材として大きく期待されている。このような有機発光材料のうち、例えば、芳香環を有する有機蛍光物質については、リグニン由来の成分以外のものを原料として用い、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物により産生されることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
このような中、本発明者らは、リグニンを高付加価値物質へ変換する微生物のスクリーニングを行い、低分子リグニンの一種であるシリングアルデヒド（Ｓｙｒｉｎｇａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＹＡＬ）を変換、重合し、有機緑色蛍光物質を生産する菌株シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＩＴＨ−ＳＡ−１株を海水より単離した。本蛍光物質は、平均分子量が７．２ｋＤａで励起波長（Ｅｘ）／蛍光波長（Ｅｍ）＝３６５／４９８ｎｍの蛍光スペクトルを示す物質であり、ＮＭＲ分析等からベンゼン環由来のシグナルが全く検出されないことが示唆された（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照。）。
【０００５】
さらに、本発明者らは、ＳＹＡＬの下流の代謝産物である３−Ｏ−メチルガリック酸（３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇａｌｌａｔｅ；３−ＭＧＡ）とトリプトンとを反応させることにより、同様の性質を有する蛍光物質が産生されることを見出した（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−１６６１４３号公報
【特許文献２】特開２０１６−０４４１９４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kolesnikova IG, at al., “Formation of pigments by Pseudomonas bacteria in relation to the ratio of medium components.”, Mikrobiologiia,  vol.40, no.3, p485-489, 1971.
【非特許文献２】Iwabuchi N., at al., “Transformation of Lignin-Derived Aromatics into Nonaromatic Polymeric Substances with Fluorescent Activities (NAPSFA) by Pseudomonas sp. ITH-SA-1”, ACS Sustainable Chem. Eng., vol.3, p2678-2685, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献２に記載の蛍光物質では、蛍光物質を製造するのに必要な有機物が特定されておらず、新規の蛍光物質を得る試みは、その蛍光物質の有用性に比して、未だ十分になされたとは言えないのが実情である。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、様々な蛍光波長の新規の蛍光物質及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トリプトンの構成成分のうち、カゼインダイジェストが３−ＭＧＡとの反応に必要であり、さらに塩基性アミノ酸、又はアミン類も３−ＭＧＡと反応して、それぞれ異なる蛍光波長の新規の蛍光物質を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応を行う反応工程を備えることを特徴とする蛍光物質の製造方法。
［２］前記アミン類が炭素数１以上１０以下の鎖式のモノアミン又はジアミンである［１］に記載の蛍光物質の製造方法。
［３］３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応させて得られたことを特徴とする蛍光物質。
［４］芳香環を有しない［３］に記載の蛍光物質。
［５］分子量が１ｋＤａ以上７ｋＤａ以下である［３］又は［４］に記載の蛍光物質。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、様々な蛍光波長の蛍光物質及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】実施例１におけるカゼインダイジェストを用いたサンプルでの反応開始直後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例１におけるカゼインダイジェストを用いたサンプルでの反応開始から４日後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図２Ａ】実施例１におけるカザミノ酸を用いたサンプルでの反応開始直後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】実施例１におけるカザミノ酸を用いたサンプルでの反応開始から４日後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例１におけるラクトアルブミン水解物を用いたサンプルでの反応開始直後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】実施例１におけるラクトアルブミン水解物を用いたサンプルでの反応開始から４日後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図４】３−Ｏ−メチルガリック酸（３−ＭＧＡ）、カゼインダイジェスト、及び実施例１におけるカゼインダイジェストを用いたサンプルで生成された蛍光物質（分画分子量３５００以上、及び分画分子量１０００以上）のＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲスペクトルデータである。
【図５Ａ】実施例１におけるカゼインダイジェストを用いたサンプルで生成された蛍光物質の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータである。
【図５Ｂ】実施例１におけるカゼインダイジェストを用いたサンプルで生成された蛍光物質の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータである。
【図６Ａ】実施例３におけるモノアミン類を用いて、４℃、２０℃、又は２８℃で反応を行ったサンプルでの経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図６Ｂ】実施例３におけるジアミン類を用いて、４℃、２０℃、又は２８℃で反応を行ったサンプルでの経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図７】実施例４におけるエチルアミンを用いて、４℃、２０℃、又は３７℃で反応を行ったサンプルでの経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図８】実施例１〜５において生成された各種蛍光物質での励起・蛍光分布と簡易蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜蛍光物質の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応を行う反応工程を備える蛍光物質の製造方法を提供する。
【００１５】
本実施形態の蛍光物質の製造方法によれば、簡便に様々な蛍光波長の蛍光物質を得ることができる。
本発明者らは、トリプトンの構成成分のうち、カゼインダイジェストが３−Ｏ−メチルガリック酸（３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇａｌｌａｔｅ；３−ＭＧＡ）との反応に必要であることを見出し、本発明の完成に至った。さらに、カゼインダイジェストは、核酸、ペプチド、及びアミノ酸等と無機物との混合物であることから、アミノ酸及びアミン類に注目し、３−ＭＧＡとアミノ酸、又はアミン類とが反応し、トリプトン、又はカゼインダイジェストを用いた場合とは、異なる蛍光波長の蛍光物質が得られることを見出した。
本実施形態の蛍光物質の製造方法における各工程について、以下に詳細に説明する。
【００１６】
［反応工程］
まず、３−ＭＧＡ及びその塩（以下、３−ＭＧＡとその塩とをまとめて「３−ＭＧＡ等」と称する場合がある。）からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応を行う。
なお、本明細書において、「３−ＭＧＡ等」とは、特に断りのない限り、上記のように３−ＭＧＡ及びその塩を包括したものを意味する。
【００１７】
（３−ＭＧＡ及びその塩）
３−ＭＧＡは市販品を入手可能である。
一方、下記式に示すように、３−ＭＧＡは、リグニン由来の成分であるシリングアルデヒド（以下、「ＳＹＡＬ」と略記することがある）から、シリンガ酸（Ｓｙｒｉｎｇａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＹＡＣ）を経て誘導可能な化合物である。３−ＭＧＡは、このような経路を経る化学的手法によっても得ることが可能である。リグニンは、植物細胞壁の１５〜３０％を占める主要な成分であり、複雑な構造を有し、未利用バイオマスの一つである。本発明は、このようなリグニン由来の成分であるＳＹＡＬが利用可能であり、未利用バイオマスの有効利用という観点でも非常に有用性が高い。
【００１８】
【化１】
2018028017.tif 000002
【００１９】
本実施形態の蛍光物質の製造方法においては、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合対象として、３−ＭＧＡ及びその塩からなる群から選択される１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。すなわち、本実施形態の蛍光物質の製造方法においては、３−ＭＧＡ又は３−ＭＧＡの塩を単独で用いてもよいし、３−ＭＧＡ及び−３ＭＧＡの塩を併用してもよい。また、３−ＭＧＡの塩を用いる場合には、この塩は１種のみでもよいし、２種以上でもよく、２種以上である場合、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
【００２０】
３ＭＧＡの塩としては、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）が塩を形成したものが例示でき、より具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；アンモニウム塩（アンモニアとの反応で形成した塩、「−ＣＯＯ−ＮＨ４＋」を有する塩）；トリエチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩等の第一級、第二級又は第三級アミン塩等が例示できる。
【００２１】
（カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類）
本実施形態の蛍光物質の製造方法においては、３−ＭＧＡ等との混合対象として、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
【００２２】
本明細書において、「カゼインダイジェスト」とは、リンタンパク質であるカゼインを脾臓酵素消化した物を意味し、核酸、ペプチド、及びアミノ酸等の有機物と無機物との混合物である。
【００２３】
前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。
前記アミン類としては、炭素数１以上１０以下の鎖式のモノアミン又はジアミンであればよく、具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、イソペンチルアミン、ペンチルアミン、へプチルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エタノールアミン等のモノアミン；メタンジアミン、１，２−エタンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、１，７−ヘプタンジアミン、１，８−オクタンジアミン、１，９−ノナンジアミン、１，１０−デカンジアミン等のジアミンが挙げられる。
【００２４】
３−ＭＧＡ等は、あらかじめ溶媒に溶解させた溶液として、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合に供することが好ましい。このようにすることで、蛍光物質の収量が顕著に向上する。
３−ＭＧＡ等を溶解させる溶媒としては、水、有機溶媒が例示でき、前記有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド等、親水性溶媒が例示できる。
ここで、「親水性溶媒」とは、水と均一に混合可能な溶媒を意味する。
【００２５】
３−ＭＧＡ等の前記溶液において、３−ＭＧＡ等の合計濃度は、特に限定されないが、５００ｍｇ／ｍＬ以上１５００ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
【００２６】
前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上は、あらかじめ溶媒に溶解させた溶液として、３−ＭＧＡ等との混合に供することが好ましい。このようにすることで、蛍光物質の収率が向上する。
前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上を溶解させる溶媒としては、水が例示できる。
【００２７】
３−ＭＧＡ等とカゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合時には、３−ＭＧＡ等の前記溶液とカゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の前記溶液とを混合することが特に好ましい。
【００２８】
３−ＭＧＡ等とカゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合時において、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の使用量は、３−ＭＧＡ等の使用量１質量部に対して、０．５質量部以上４００質量部以下であることが好ましく、０．８質量部以上２５０質量部以下であることがより好ましく、２．５質量部以上８０質量部以下であることが特に好ましい。カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の使用量がこのような範囲であることで、蛍光物質の収量がより向上する。
【００２９】
３−ＭＧＡ等とカゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合物は、通常、溶媒を含有する混合液であり、例えば、３−ＭＧＡ等の前記溶液と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の前記溶液とを混合した場合には、得られた混合液でそのまま反応を行えばよいし、３−ＭＧＡ等の前記溶液と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の前記溶液と、のいずれか一方又は両方で用いた溶媒を、３ＭＧＡ等とカゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とに別途添加して混合液とし、反応を行ってもよい。また、前記溶媒とは異なるその他の溶媒を、３−ＭＧＡ等と前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とに別途添加して、反応を行ってもよい。
【００３０】
３−ＭＧＡ等と前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合して得られた混合液において、反応前の３−ＭＧＡ等の濃度（初期濃度）は、０．２質量％以上１０質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることがより好ましい。
また、前記混合液において、反応前の前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上の濃度（初期濃度）は、０．０１質量％以上１５質量％以下であることが好ましく、０．０５質量％以上１０質量％以下であることがより好ましい。
【００３１】
３−ＭＧＡ等と前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合して得られた混合液においては、３−ＭＧＡ等が溶解していることが好ましい。このようにすることで、蛍光物質の収量が顕著に向上する。
同様に、前記混合液においては、前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上が溶解していることが好ましい。このようにすることで、蛍光物質の収量が向上する。
そして、前記混合液においては、３−ＭＧＡ等及び前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上が共に溶解していることが特に好ましい。
【００３２】
前記反応は、本実施形態の製造方法で得られる蛍光物質が有する効果を損なわない範囲内において、３−ＭＧＡ等、前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上及び溶媒以外に、これらに該当しないその他の成分を用いて行ってもよい。
前記その他の成分の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。また、前記
その他の成分の使用量も、その種類に応じて適宜調節すればよい。
本実施形態の製造方法においては、蛍光物質の生成が阻害される傾向があることから、前記その他の成分として、グルコース等の糖類（単糖、オリゴ糖）を用いないことが好ましい。
【００３３】
３−ＭＧＡ等と前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上との混合後に行う反応の条件は、特に限定されず、適宜調節すればよい。
通常、反応温度は、４℃以上１００℃以下であることが好ましく、４℃以上６０℃以下であることがより好ましく、２０℃以上４０℃以下であることが特に好ましい。
反応時間は、反応温度に応じて適宜調節すればよいが、例えば１２時間以上１０００時間以下であればよく、例えば２４時間以上７２０時間以下であればよい。
【００３４】
前記反応は、空気雰囲気下等、酸素ガスを含む雰囲気下で行うことが好ましい。このようにすることで、蛍光物質の収量が顕著に向上する。
【００３５】
前記混合液の溶媒成分として水を用いた場合には、３−ＭＧＡ等と前記カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合した直後の混合液のｐＨは、６以上８以下であることが好ましい。
【００３６】
前記反応は、前記混合液を撹拌又は振盪しながら行うことが好ましい。
撹拌は、例えば、撹拌子又は撹拌翼等を回転させる方法、超音波を加える方法等、公知
の方法等で行えばよい。
振盪は、例えば、振盪培養器を用いる方法等、公知の方法等で行えばよい。
【００３７】
［その他工程］
このように、本実施形態の製造方法において、反応工程の他に、必要に応じて、その他の工程を行って製造してもよい。
例えば、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、蛍光物質を取り出すことができる。すなわち、適宜必要に応じて、例えば、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮、ゲルろ過等の後処理操作をいずれか単独で、又は二種以上組み合わせて行い、濃縮、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥等の操作をいずれか単独で、又は二種以上組み合わせて行うことで、蛍光物質を取り出せる。また、蛍光物質は、さらに必要に応じて、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、抽出、溶媒による撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は二種以上組み合わせて一回以上行うことで、精製してもよい。
また、反応終了後は、必要に応じて後処理を行った後、蛍光物質を取り出すことなく、
引き続き目的とする用途に蛍光物質を用いてもよい。
【００３８】
本実施形態の製造方法により得られる蛍光物質は、例えば、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、赤外分光法（ＩＲ）等の分析によって、有機化合物であるものの、芳香環を有しないことが確認されている。
ここで「芳香環」とは、芳香族炭化水素環及び芳香族複素環の両方を含む概念である。従来知られている有機蛍光物質は芳香環を有するものが一般的であるのに対し、本実施形態の製造方法により得られる蛍光物質は、非芳香族性の有機化合物である点で、従来のものとは全く相違するものである。
本実施形態の製造方法により得られる蛍光物質は原料として、芳香環を有する３−ＭＧＡを用いるが、得られる蛍光物質は芳香環を有しないものであることは本発明者らにより確かめられている。本実施形態の製造方法により得られる蛍光物質の生成機構及びその構造については確定されていないが、従来の有機蛍光物質とは異なった構造を有する新規の蛍光物質であると推察される。
【００３９】
＜＜蛍光物質＞＞
一実施形態において、本発明は、３−Ｏ−メチルガリック酸及びその塩からなる群から選択される１種以上と、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、及びアミン類からなる群から選択される１種以上とを混合し、反応させて得られた蛍光物質を提供する。
【００４０】
本実施形態の蛍光物質は、多彩で鮮やかな発色性を有し、加工性に優れるため、照明、有機ＬＥＤ、トレーサー、診断薬、試薬等、幅広く応用することができる。
【００４１】
本実施形態の蛍光物質は、３−ＭＧＡと、カゼインダイジェスト、塩基性アミノ酸、又はアミン類という特定の原料化合物とを用いて、微生物の培養を伴うことなく、反応を行うことで得られる、新規の蛍光性高分子化合物である。
【００４２】
本実施形態の蛍光物質は、有機化合物であるものの、芳香環を有しない。
従来知られている有機蛍光物質は芳香環を有しているのに対し、本実施形態の蛍光物質は、非芳香族性の有機化合物である点で、従来のものとは全く相違するものである。
【００４３】
本実施形態の蛍光物質は、分子量が好ましくは１ｋＤａ以上７ｋＤａ以下、より好ましくは２ｋＤａ以上６ｋＤａ以下であり、数平均分子量が好ましくは２ｋＤａ以上６ｋＤａ以下、より好ましくは３ｋＤａ以上５ｋＤａ以下である。分子量、数平均分子量は、ＨＰＬＣ分析でのピーク面積値のデータを用いて算出する方法等、公知の方法で算出できる。
【００４４】
本実施形態の蛍光物質は、例えば、極大波長が３１５ｎｍ以上４５５ｎｍ以下の光で励起され、極大波長が４２０ｎｍ以上５４０ｎｍ以下の蛍光を発生する。すなわち、前記蛍光物質は、紫外線又は可視光線により励起され、紫色〜緑色の蛍光を発生する。
【００４５】
本実施形態の蛍光物質は、従来の蛍光物質のように芳香環を有していることによる制約を受けない。したがって、本実施形態の蛍光物質は、従来の蛍光物質では実現できなかった新規の利用法の開発に有望なものである。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実施例１］トリプトンの構成成分を用いた新規蛍光物質の製造及び解析
（１）１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の作製
まず、１ｇの３−ＭＧＡ（フナコシ社製）を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。タッチミキサー及び振盪により完全に溶解するまで、激しく撹拌した。完全溶解後、２ｍＬチューブに入れて、遮光で保存した。
【００４８】
（２）５％カゼインダイジェスト溶液、５％カザミノ酸溶液、及び５％ラクトアルブミン水解物溶液の作製
次いで、５ｇのＤｉｆｃｏ（登録商標）  カゼインダイジェスト粉末（ＢＤ社製）、Ｂａｃｔｏ  カザミノ酸粉末（ＢＤ社製）、又はラクトアルブミン水解物粉末（ＢＤ社製）を適量のミリＱ水で溶解させ、これを雌シリンダーで１００ｍＬにフィルアップして２５０ｍＬ容メディウム瓶に移した。次いで、蓋の部分をアルミ箔で覆い、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、滅菌後、室温で保存した。
なお、カゼインダイジェストはカゼインを膵臓酵素消化したものであり、カザミノ酸はカゼインの酸加水分解物であり、ラクトアルブミン水解物は乳清を膵臓酵素消化したものである。
【００４９】
（３）反応工程
次いで、（２）で作製した５％カゼインダイジェスト溶液、５％カザミノ酸溶液、及び５％ラクトアルブミン水解物溶液をそれぞれ、５０ｍＬ容コニカルチューブに４ｍＬずつとり、オートクレーブ滅菌済みミリＱ水をそれぞれ１６ｍＬずつ加えて、終濃度１％に調製した。次いで、（１）で作製した１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、撹拌した。次いで、５０ｍＬ容コニカルチューブをアルミ箔により遮光し、恒温振盪培養機（ＭＬＵ−２−ＭＲ−２０  いわしや生物科学社製）を用いて、３７℃、１１０ｒｐｍの条件下で４日間好気的に振盪反応を行い、それぞれ生成物を得た。
【００５０】
（４）蛍光スペクトル測定
次いで、各サンプルを１．５ｍＬチューブに約１ｍＬずつ採取し、使用直前まで遮光して保存した。測定には分光蛍光光度計（ＦＰ−６５００、ＪＡＳＣＯ社製）を用いた。四面透過セルに各サンプルを１ｍＬずつ入れて、測定を行った。測定前後及びサンプルの切り替わりのタイミングで、四面透過セルを純水で洗浄し、水気を取った。測定後の結果を以下の表１に示す。なお、トリプトンを用いて得られる蛍光物質は、励起光極大波長が約３７０ｎｍ、蛍光極大波長が約５１０ｎｍである（例えば、特開２０１６−０４４１９４号公報参照。）。
【００５１】
【表１】
2018028017.tif 000003
【００５２】
表１から、カゼインダイジェスト及びラクトアルブミン水解物を用いて得られた高分子化合物では、トリプトンを用いて得られる蛍光物質と同様の蛍光スペクトルを示した。一方、カザミノ酸を用いて得られた高分子化合物では、トリプトンを用いて得られる蛍光物質と同様の蛍光スペクトルを得られなかった。
【００５３】
（５）逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた生成物の解析
次いで、バイアル瓶に樹脂脚付３００ｍＬ容ガラスインサートをセットした。次いで、前記ガラスインサートに（３）の反応開始直後、又は反応開始から４日後の各サンプルを１００ｍＬ加えて、測定に用いた。測定には、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  Ｖａｌｕｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて行った。溶離液には０．１％ギ酸水溶液（Ａ液）を用い、グラジエント溶出用溶液には０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。流量は０．８ｍＬ／分、カラム温度は約４０℃、分析時間は６５分間で行った。グラジエントはＢ液５％から開始し、５０分後に８０％になるように設定し、５０．０１分から６５分までは５％となるように設定した。ダイオードアレイ検出器の測定波長は主に、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍに設定し、蛍光検出器の測定波長は主に、Ｅｘ（励起光極大波長）／Ｅｍ（蛍光極大波長）＝３３０／４３５ｎｍ、Ｅｘ／Ｅｍ＝３９０／４７０ｎｍ、Ｅｘ／Ｅｍ＝３４０／５１０ｎｍ、Ｅｘ／Ｅｍ＝３６５／５１０ｎｍに設定した。使用前には、Ａ液を用いて、約３０分以上の通液を行った。結果を図１〜３に示す。図１Ａは、カゼインダイジェストを用いたサンプルでの反応開始直後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフであり、図１Ｂは、カゼインダイジェストを用いたサンプルでの反応開始から４日後での逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図１Ａにおいて、上からダイオードアレイ検出器の測定波長２５４ｎｍでの測定結果、ダイオードアレイ検出器の測定波長３２０ｎｍでの測定結果、ダイオードアレイ検出器の測定波長２８０ｎｍでの測定結果、蛍光検出器の測定波長Ｅｘ／Ｅｍ＝３３０／４３５ｎｍでの測定結果を示したものである。また、図１Ｂにおいて、上からダイオードアレイ検出器の測定波長２５４ｎｍでの測定結果、ダイオードアレイ検出器の測定波長３２０ｎｍでの測定結果、ダイオードアレイ検出器の測定波長２８０ｎｍでの測定結果、蛍光検出器の測定波長Ｅｘ／Ｅｍ＝３６５／５１０ｎｍでの測定結果、蛍光検出器の測定波長Ｅｘ／Ｅｍ＝３４０／５１０ｎｍでの測定結果を示したものである。
なお、図２はカザミノ酸を用いたサンプル、図３はラクトアルブミン水解物を用いたサンプルでの結果であり、それぞれ図２Ａ及び図３Ａは反応開始直後、図２Ｂ及び図３Ｂは反応開始から４日後の逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。また、図２Ａ及び図３Ａのグラフの測定波長は図１Ａと同様であり、図２Ｂ及び図３Ｂのグラフの測定波長は図１Ｂと同様である。図１〜３において、横軸はリテンションタイム（単位：ｍｉｎ）、縦軸は任意単位を用いた相対的なシグナル強度を示す（単位：ｍＡＵ、又はＬＵ）。また、図１〜３において、ＤＡＤはダイオードアレイ検出器の略称であり、設定した波長を吸収する物質を検出する。また、図１〜３において、ＦＬＤは蛍光検出器の略称であり、設定した励起及び蛍光波長をもつ物質を検出する。
【００５４】
図１〜３において、測定波長２５４ｎｍのクロマトグラムは主にベンゼン環を有する物質の検出を得意としており、７．４分付近のピークは３−ＭＧＡ由来のピークである。図１Ｂ、図２Ｂ、及び図３Ｂにおいて、７．４分付近のピークが残っており、反応せずに残った３−ＭＧＡのシグナルであると推察された。
また、図１Ｂ及び図３Ｂから、カゼインダイジェストを用いたサンプル、及びラクトアルブミン水解物を用いたサンプルでの反応開始から４日後では、ＦＬＤクロマトグラムにブロードはピークが確認されており、これは測定波長２５４ｎｍのクロマトグラムでは検出されないピークであった。一方、図２Ｂから、カザミノ酸を用いたサンプルでの反応開始から４日後では、ＦＬＤクロマトグラムに同様のブロードなピークは見られなかった。
このことから、カゼインダイジェストを用いたサンプル、及びラクトアルブミン水解物を用いたサンプルでは、芳香環を含まない高分子化合物であって、重合度の異なる蛍光物質が生成されているため、ピークがブロードとなったと推察された。
【００５５】
（６）構造解析
次いで、カゼインダイジェストと３−ＭＧＡとを反応させて得られた蛍光物質について、ＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析を行った。このとき取得したＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲのスペクトルデータを図４に示す。なお、３−Ｏ−メチルガリック酸（３−ＭＧＡ）、及びカゼインダイジェストのＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲスペクトルデータも合わせて示す。また、図４において、「ＮＭＷＬ＞３５００」とは分画分子量３５００以上を意味し、「ＮＭＷＬ＞１０００」とは分画分子量１０００以上を意味する。
また、得られた蛍光物質の１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルデータを図５Ａに、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータを図５Ｂに、それぞれ示す。
【００５６】
ＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲは、フーリエ変換赤外分光光度計（日本分光社製「ＦＴ／ＩＲ−６６００型」、ＡＴＲ  ＰＲＯ  ｏｎｅ（プリズム：ダイアモンド））、検出器（ＤＬＡＴＧＳ）を用いて、一回反射型ＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）法で行い、得られたスペクトルは、ＡＴＲ補正を行って得られたものである。分析は、分解４ｃｍ−１、積算１２８回の条件で行った。また、ＦＴ−ＩＲでは、試料の屈折率を１．５、プリズムの屈折率を２．４とし、入射光の入射角度を４５°に設定して解析を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子社製「ＥＣＡ−５００」を用いて分析を行い、溶媒として重水（Ｄ２Ｏ）を用い、積算回数を１Ｈ−ＮＭＲでは３２回、１３Ｃ−ＮＭＲでは１５０００回とした。
【００５７】
図４から、蛍光物質はＡＴＲ−ＦＴ／ＩＲのスペクトルにおいて、Ｃ＝Ｏに由来するシグナル（１６５０ｃｍ−１付近）と、Ｏ−Ｈに由来するシグナル（３３００ｃｍ−１付近）が見られ、それ以外のシグナル（ピーク）はブロードであった。ただし、芳香環に由来するシグナル（９００〜６５０ｃｍ−１、芳香環のＣ−Ｈ面外変角振動）が見られず、蛍光物質が非芳香族の有機化合物であることを示していた。
【００５８】
また、図５Ａに示すように、１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルにおいて、６〜８ｐｐｍ付近の領域に、芳香環に由来すると解されるシグナルはほとんど見られなかった。
【００５９】
また、図５Ｂに示すように、１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルにおいて、通常、芳香環に由来するシグナルが見られる１１０〜１３０ｐｐｍ付近に、シグナルはほとんど認められず、蛍光物質が非芳香族性の有機化合物であることを示していた。
【００６０】
このように、本発明の蛍光物質は、芳香環を有しない高分子化合物であることが確認
された。
【００６１】
［実施例２］各種アミノ酸を用いた新規蛍光物質の製造及び解析
次いで、より蛍光物質の製造を簡便化するために、アミノ酸に注目し、トリプトンの構成成分の代わりに、各種アミノ酸を用いて反応を行い、蛍光物質を製造することを試みた。
【００６２】
（１）１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を作製した。
【００６３】
（２）各種アミノ酸溶液の作製
下記表２に示す各種アミノ酸粉末（全てＳｉｇｍａ−Ａｉｄｒｉｃｈ社製）０．１ｇずつを適当量のフィルター滅菌ミリＱ水に溶解させ、メスシリンダーで１０ｍＬにフィルアップ後、５０ｍＬ容チューブに移した。使用するまで、室温で保存した。
【００６４】
（３）反応工程
次いで、カゼインダイジェスト溶液、カザミノ酸溶液、及びラクトアルブミン水解物溶液の代わりに、終濃度１％の各種アミノ酸溶液を用いて、２０℃、１７日間の条件で反応を行った以外は、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、それぞれ生成物を得た。
【００６５】
（４）蛍光スペクトル測定
次いで、実施例１の（４）と同様の方法を用いて、それぞれ得られた生成物の蛍光スペクトルを測定した。結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2018028017.tif 000004
【００６７】
表２から、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンの塩基性アミノ酸において、高い傾向強度の蛍光物質が生成されたことが確認された。また、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンの塩基性アミノ酸を用いたサンプルで生成された蛍光物質は、トリプトンを用いて得られる蛍光物質（励起光極大波長が約３７０ｎｍ、蛍光極大波長が約５１０ｎｍ）とは、異なる蛍光スペクトルを有する蛍光物質であることが明らかとなった。
【００６８】
（５）逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた生成物の解析
次いで、アルギニンを用いたサンプル、及びリジンを用いたサンプルについて、反応開始から１日後、又は反応開始から１７日後の各サンプルを実施例１の（５）と同様の方法を用いて解析した（図示せず）。
その結果、アルギニン、及びリジンを用いたサンプルの反応開始から１日後、及び反応開始から１７日後の各サンプルにおいて、測定波長２５４ｎｍのクロマトグラムでは検出されないピークがＦＬＤクロマトグラムに確認された。
このことから、アルギニンを用いたサンプル、及びリジンを用いたサンプルでは、芳香環を含まない蛍光物質が生成されたと推察された。
【００６９】
［実施例３］アミン類を用いた新規蛍光物質の製造及び解析（１）
次いで、塩基性アミノ酸のうち、アルギニン及びリジンは２つのアミノ基を有していることから、蛍光物質の生成に２つのアミノ基が関与していると推察し、塩基性アミノ酸の代わりに、アミン類を用いて反応を行い、蛍光物質を製造することを試みた。
【００７０】
（１）１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を作製した。
【００７１】
（２）アミン類溶液の作製
下記表３に示す各種アミン類（イソペンチルアミン、ブタンジアミンはＡＬＤＲＩＣＨ社製、それ以外は全て和光純薬工業社製）を終濃度１％になるようにミリＱ水を用いて溶解、又は希釈した。
【００７２】
（３）反応工程
次いで、カゼインダイジェスト溶液、カザミノ酸溶液、及びラクトアルブミン水解物溶液の代わりに、終濃度１％の各種アミン類溶液を用い、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬの３−ＭＧＡ溶液を用いて、４℃、２０℃、２８℃、又は３７℃、最大２８日間の条件で反応を行った以外は、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、それぞれ生成物を得た。
【００７３】
（４）蛍光スペクトル測定
次いで、実施例１の（４）と同様の方法を用いて、それぞれ得られた生成物の蛍光スペクトルを測定した。結果を表３、並びに図４及び図５に示す。表３において、各アミン類において、蛍光強度は最も高いピークを示した反応温度及び反応日数の条件を記載している。図６Ａは、モノアミン類を用いて、４℃、２０℃、又は２８℃で反応を行ったサンプルでの経時的な蛍光強度の変化を示すグラフであり、図６Ｂは、ジアミン類を用いて、４℃、２０℃、又は２８℃で反応を行ったサンプルでの経時的な蛍光強度の変化を示すグラフである。
【００７４】
【表３】
2018028017.tif 000005
【００７５】
図６Ａ及び図６Ｂから、全てのアミン類において、２０℃、又は２８℃での反応による最大蛍光強度への影響の差はほとんど見られなかった。また、２８℃での反応の方が、２０℃での反応よりも早い段階で最大蛍光強度に到達した。また、４℃での反応では、エチレンジアミン溶液、又はプロパンジアミン溶液を用いたサンプルを除き、蛍光強度の増加がほとんど見られなかった。
表３から、モノアミン類とジアミン類とで、励起・蛍光スペクトルの明白な違いは見られなかった。観察されたピークは主に、Ｅｘ／Ｅｍ＝３３０／４３０ｎｍ付近に集約されていた。
また、エチルアミン溶液を用いたサンプルにおいて、最も高い蛍光強度の蛍光物質が生成された。また、各アミノ酸溶液を用いたサンプルにおける最大蛍光強度には、アミノ基の数や鎖長との関連性は見られなかった。
【００７６】
（５）逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた生成物の解析
次いで、各種アミン類溶液を用いたサンプルについて、反応開始から２８日後の各サンプルを実施例１の（５）と同様の方法を用いて解析した（図示せず）。
その結果、モノアミン類溶液を用いたサンプルでは、測定波長２８０ｎｍのクロマトグラムにおいて、主に２〜３本の高いピークを有しており、アミンの鎖長が高いほど、それらのピークリテンションタイムは低極性側にシフトしていた。一方、ジアミン類溶液を用いたサンプルでは、測定波長２８０ｎｍのクロマトグラムにおいて、同様の特徴は見られなかった。
また、いずれのアミン類溶液を用いたサンプルにおいても、測定波長２５４ｎｍのクロマトグラムにおける３−ＭＧＡ由来の７．４分付近のピークがほぼ消失しており、反応でほぼ全ての３−ＭＧＡが使用されたと推察された。
【００７７】
［実施例４］アミン類を用いた新規蛍光物質の製造及び解析（２）
次いで、３−ＭＧＡの終濃度の違いによる励起・蛍光スペクトルの変化を検証するために、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の代わりに、終濃度１ｍｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を用いて反応を行い、蛍光物質を製造することを試みた。
【００７８】
（１）１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を作製した。
【００７９】
（２）エチレンアミン溶液の作製
エチレンアミン粉末を終濃度１％になるようにミリＱ水を用いて溶解した。
【００８０】
（３）反応工程
次いで、カゼインダイジェスト溶液、カザミノ酸溶液、及びラクトアルブミン水解物溶液の代わりに、終濃度１％のエチレンアミン溶液を用い、さらに終濃度１ｍｇ／ｍＬの３−ＭＧＡ溶液を用いて、４℃、２０℃、又は３７℃、最大２０日間の条件で反応を行った以外は、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、それぞれ生成物を得た。
【００８１】
（４）蛍光スペクトル測定
次いで、実施例１の（４）と同様の方法を用いて、それぞれ得られた生成物の蛍光スペクトルを測定した。結果を図７に示す。
【００８２】
図７から、温度による反応速度は、３７℃、２０℃、４℃の順に温度が高いほど、早かった。また、反応開始直後を除いて、経時的に励起波長は変化せず、３９０ｎｍ付近であった。
また、３７℃で反応開始から１７日後のサンプルにおける励起波長は３９０ｎｍであり、蛍光波長は４６０ｎｍであり、最大蛍光強度は５７５．６２であった。この励起波長及び蛍光波長は、実施例３での終濃度１％のエチレンアミン溶液、及び終濃度０．１ｍｇ／ｍＬの３−ＭＧＡ溶液を用いたサンプルと異なっていた。
このことから、３−ＭＧＡの濃度依存的に、蛍光スペクトルのピークがシフトすることが明らかとなった。
【００８３】
（５）逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた生成物の解析
次いで、エチレンアミン溶液を用いたサンプルについて、反応開始から２８日後の各サンプルを実施例１の（５）と同様の方法を用いて解析した（図示せず）。
その結果、測定波長２８０ｎｍのクロマトグラムにおいて、主に２〜３本の高いピークを有している。
また、測定波長２５４ｎｍのクロマトグラムにおける３−ＭＧＡ由来の７．４分付近のピークがほぼ消失しており、反応でほぼ全ての３−ＭＧＡが使用されたと推察された。
【００８４】
［実施例５］アミン類を用いた新規蛍光物質の製造及び解析（３）
次いで、エチレンアミン溶液以外のアミン類を用いて、終濃度１ｍｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を用いて反応を行い、蛍光物質を製造することを試みた。
【００８５】
（１）１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液の作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、１ｇ／ｍＬ  ３−ＭＧＡ溶液を作製した。
【００８６】
（２）アミン類溶液の作製
下記表４に示す各種アミン類を終濃度１％になるようにミリＱ水を用いて溶解、又は希釈した。
（３）反応工程
次いで、カゼインダイジェスト溶液、カザミノ酸溶液、及びラクトアルブミン水解物溶液の代わりに、終濃度１％の各種アミン類溶液を用い、終濃度１ｍｇ／ｍＬの３−ＭＧＡ溶液を用いて、３７℃、最大８日間の条件で反応を行った以外は、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、それぞれ生成物を得た。
【００８７】
（４）蛍光スペクトル測定
次いで、実施例１の（４）と同様の方法を用いて、それぞれ得られた生成物の蛍光スペクトルを測定した。結果を表４に示す。表４において、各アミン類において、蛍光強度は最も高いピークを示した反応温度及び反応日数の条件を記載している。
【００８８】
【表４】
2018028017.tif 000006
【００８９】
表４から、エチレンジアミン溶液を用いたサンプル、及びプロパンジアミンを用いたサンプルでは、励起波長は３９０ｎｍにシフトしなかった。一方、その他のアミン類溶液を用いたサンプルでは、励起波長は３９０ｎｍにシフトしていた。
【００９０】
さらに、実施例１〜５で製造された蛍光物質について、蛍光強度が１００以上のサンプルでの励起・蛍光分布と簡易蛍光強度を示すグラフを作成した（図８参照。）。参考として、１％トリプトン溶液を用いて製造された蛍光物質の分布も記載している。また、図８において、蛍光強度の強いものほど、プロットの大きさを大きく表示している。
【００９１】
図８から、トリプトン、及びその構成成分（カゼインダイジェスト、及びラクトアルブミン水解物）と、アミン類と、塩基性アミノ酸とでは、励起波長及び蛍光波長が異なる蛍光物質が得られることが明らかとなった。
また、アミン類においては、反応条件（３−ＭＧＡの濃度）の違いにより、励起波長及び蛍光波長が異なる蛍光物質が得られることが明らかとなった。
以上のことから、本発明によれば、簡便に様々な蛍光波長の蛍光物質を得ることができることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、簡便に様々な蛍光波長の蛍光物質を得ることができる。また、本発明の蛍光物質は、多彩で鮮やかな発色性を有し、加工性に優れるため、照明、有機ＬＥＤ、トレーサー、診断薬、試薬等、幅広く応用することができる。
【図１Ａ】
2018028017.tif 000007
【図１Ｂ】
2018028017.tif 000008
【図２Ａ】
2018028017.tif 000009
【図２Ｂ】
2018028017.tif 000010
【図３Ａ】
2018028017.tif 000011
【図３Ｂ】
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【図４】
2018028017.tif 000013
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2018028017.tif 000017
【図７】
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【図８】
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