(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍細胞に対する免疫を誘導して、腫瘍の成長阻害をも誘導し得る組成物の提供。【解決手段】式（I)で示される５−アミノレブリン酸類を含む、腫瘍免疫誘導用組成物。好ましくは腫瘍への光照射を伴わない態様で用いられ、電離放射線治療の治療効果の為に使用する、腫瘍免疫誘導用組成物。2018076347.tif 000007（Ｒ１はＨ又はアシル基；Ｒ２はＨ、直鎖／分岐状のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化１】
2018076347.tif 000004
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を含むことを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記組成物は腫瘍への光照射を伴わない態様で用いられることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記組成物は哺乳動物に投与されることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記組成物は前記哺乳動物に少なくとも２回以上反復して投与されることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージが前記哺乳動物における腫瘍細胞に誘導されることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
放射線治療の治療効果の増強のために使用することを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記放射線治療が、前記哺乳動物における腫瘍細胞に対して放射線を少なくとも２回以上反復して照射することを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
さらに、鉄化合物が前記哺乳動物に併用して投与されることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及びグリシン第一鉄硫酸塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物であって、
前記腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物。
【請求項１２】
同時または順次に投与される、（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物と（２）抗がん剤とを組み合わせてなることを特徴とする、がんの予防用又は治療用医薬。
【請求項１３】
請求項１２に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記組み合わせの態様が、配合剤であるか、または、キットであることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項１４】
がんの予防又は治療のための、（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の腫瘍免疫誘導用組成物と（２）抗がん剤との組み合わせであって、
前記（１）腫瘍免疫誘導用組成物と前記（２）抗がん剤が、同時または順次に投与されることを特徴とする、
組み合わせ。
【請求項１５】
がんを患っている対象における腫瘍免疫を誘導する方法であって、
（Ａ）がんを患っている対象に対して、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化２】
2018076347.tif 000005
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を１回又は複数回投与するステップ；および、
（Ｂ）場合により、前記対象における前記がんに対して放射線を１回又は複数回照射することを特徴とする、
腫瘍免疫を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の腫瘍免疫を誘導する方法であって、
（Ｃ）前記対象に抗がん剤を、同時または順次に、さらに投与するステップ
を含む、
腫瘍免疫を誘導する方法。
【請求項１７】
腫瘍免疫誘導用医薬の製造のための、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化３】
2018076347.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＬＡ類を含むことを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線治療はがんに電子線あるいは粒子線を照射することによりがんを治療する手法で、手術や抗がん剤治療と並ぶがんの３大治療法の一つである。放射線治療に用いる電子線としてはＸ線やγ線が、粒子線としては重粒子線、陽子線、中性子線が実用化されている。これら放射線治療では照射線量が多いほど、当然に殺がん効果は高くなるが、正常細胞に対する放射線障害が問題となる。放射線障害は、被曝することにより発生する身体的な障害や損傷の総称であり、その原因として放射線照射や放射能汚染等が知られている。放射線障害には、放射線被曝直後〜数ヶ月以内に出現する急性期症状の放射線障害である早発性放射線障害（急性放射線障害）と、放射線被曝後数年ないし数十年後に出現する放射線障害である晩発性放射線障害（遅延性放射線障害）がある。
【０００３】
細胞の放射線に対する感受性は、活発に分裂している細胞ほど高くなり、造血器などの細胞再生系が最も影響を受けやすくなる。例えば、早発性放射線障害においては、１Ｇｙ（グレイ）以上被曝すると、一部の人に悪心、嘔吐、全身倦怠などの二日酔いに似た放射線宿酔という症状が現れ、１．５Ｇｙ以上の被曝では、最も感受性の高い造血細胞が影響を受け、白血球と血小板の供給が途絶えることにより出血が増加すると共に免疫力が低下し、重症の場合は３０〜６０日程度で死亡する。また、皮膚は上皮基底細胞の感受性が高く、３Ｇｙ以上で脱毛や一時的紅斑、７〜８Ｇｙで水泡形成、１０Ｇｙ以上で潰瘍がみられる。５Ｇｙ以上被曝すると、小腸内の幹細胞が死滅し、吸収細胞の供給が途絶する。このため吸収力低下による下痢や、細菌感染が発生し、重症の場合は２０日以内に死亡する。１５Ｇｙ以上の非常に高い線量の被曝では、中枢神経に影響が現れ、意識障害、ショック症状を伴うようになる。中枢神経への影響の発現は早く、ほとんどの被曝者が５日以内に死亡する。他方、晩発性放射線障害においては、白血病をはじめとした各種の悪性腫瘍、放射線性白内障などの発病率が上昇する。
【０００４】
本発明者らは、これまでに、放射線障害を予防又は低減する技術を提案し、放射線治療の有効化に貢献してきた（特許文献１）。
また、別のアプローチとして、放射線治療の増強剤を用いて、低照射量でも殺がん効果を高める試みが知られている。放射線療法は効果発現に酸素を要求し、一般に、がん（腫瘍内）は低酸素であるため、放射線増感剤としては放射線照射で分解して酸素を発生するものが多い（非特許文献１）。また、ヘマトポルフィリンなどのポルフィリン類が、正常細胞よりがん細胞により多く蓄積することに注目し、ポルフィリン類で放射線治療を行おうという研究も知られている（特許文献２）。
【０００５】
一方、ポルフィリンの前駆物質であり、生体物質である５−アミノレブリン酸類（本明細書において、「ＡＬＡ類」ともいう）は、動物や植物や菌類に広く存在するテトラピロール生合成経路の中間体として知られており、通常５−アミノレブリン酸合成酵素により、スクシニルＣｏＡとグリシンとから生合成される。ＡＬＡ類それ自体には光感受性はないものの、ＡＬＡ類は、細胞内で、ヘム生合成経路の一連の酵素群により代謝活性化されてポルフィリン（主としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ））となることが知られている。そして、ＰｐＩＸは、４１０ｎｍ、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍ、６３０ｎｍ等にピークを有する光増感剤として知られている。ＡＬＡは生体内で代謝され、４８時間以内に排泄されるため、全身の光感受性にはほとんど影響しないという特徴がある。したがって、ＡＬＡ類を用いた光線力学的療法又は光動力学的治療（「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）も開発され、侵襲性が低くＱＯＬが保たれる治療法として注目されており、ＡＬＡを用いた腫瘍診断・治療剤等が報告されている。また、ＡＬＡ類は、成人病、がん、男性不妊の予防改善剤や治療剤として有用であることも知られている（例えば、特許文献３〜５）。
【０００６】
ＡＬＡを投与すると、腫瘍細胞に主にＰｐＩＸが蓄積するため、これまでに、ＡＬＡを放射線治療の増強剤に使うことを意図して研究が行われてきたが、矛盾した結果が得られており、その有用性は判然としていない（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。非特許文献２では、残念ながら、ＡＬＡは放射線治療の増強剤として有用ではないことが示された。非特許文献３では、すべての実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行っており、細胞株によって実験結果が異なることが示されたため、ＡＬＡの、放射線治療の増強剤としての有用性は必ずしも明らかではない。非特許文献４でも、実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行っており、１回の放射線照射とＡＬＡの投与により得られた放射線増感作用は、ごくわずかに過ぎなかった。特許文献２はすべての実験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行っているのみならず、ＡＬＡそのものの実験データは何ら開示されていない。また、Ｘ線も１回照射したに過ぎない。
このように、従来技術からは、ＡＬＡの、放射線治療の増強剤としての有用性は判然としない。また、これらの技術文献には、放射線とＡＬＡとの関係について、最大限開示していたとしても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性酸素種又はフリーラジカルに基づく腫瘍細胞の細胞傷害効果しか説明されていない。
また、非特許文献５では、腫瘍（肺がん腫）を移植したマウスにＡＬＡ−ＰＤＴを実施後、腫瘍を単離し、免疫担当細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍に直接接触させて、腫瘍内に細胞が浸潤するのを確認してはいる。しかしながら、非特許文献４は、専ら、ＰＤＴの光力学作用にフォーカスしており、ＡＬＡ単独（光照射なし）の効果、ＡＬＡの、放射線治療の増強剤としての有用性、腫瘍成長阻害の有無等について何ら記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／０１７０４６
【特許文献２】特開２００９−１５５２３９
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０５０１７９
【特許文献４】特開２０１１−１６７５３
【特許文献５】ＷＯ２００９／１３９１５６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Transl Oncol. 2011 Aug;4(4):189-98. Epub 2011 Aug 1. Six degrees of separation: the oxygen effect in the development of radiosensitizers. Oronsky BT1, Knox SJ, Scicinski J.
【非特許文献２】Schaffer M, Schaffer PM, Jori G, Corti L, Sotti G, Hofstetter A, et al.: Radiation therapy combined with photofrin or 5-ALA: effect on Lewis sarcoma tumor lines implanted in mice. Preliminary results. Tumori 88:407-10, 2002.
【非特許文献３】Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, Kitagawa T, Nakano Y, Saito T, et al.: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27:1748-52, 2012.
【非特許文献４】Berg K, et al. Combined treatment of ionizing radiation and photosensitization by 5-aminolevlulinic acid-induced protoporphyrin IX. Radiation Res. 1995 Jun; 142(3):340-346
【非特許文献５】Skivka LM, Gorobets OB, Kutsenok VV, Lozinsky MO, Borisevich AN, Fedorchuk AG, et al.: 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic therapy of Lewis lung carcinoma: a role of tumor infiltration with different cells of immune system. Exp Oncol 26:312-5, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腫瘍免疫を誘導して、腫瘍の成長阻害をも誘導し得る組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＡＬＡ投与を組み合わせることにより放射線治療の効果を増強しようという研究を精密に解析する過程の中で、驚くべきことに、ＡＬＡ自身が単独でも、宿主の抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強可能であることをｉｎ  ｖｉｖｏ実験で見出した。
また、本発明者らは、ヘムの前駆体として免疫にも関係するＡＬＡの内在物としての特徴に思いを寄せ、ＡＬＡ投与と放射線照射の組み合わせを複数回実施することで、ＡＬＡが、放射線による直接的な細胞傷害効果のみならず、放射線照射後も、腫瘍における遅発性活性酸素産生の増加や、腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージの誘導などの長期にわたる免疫学的効果の誘導に貢献して、腫瘍の成長を効率的に阻害できることを見出した。
また、本発明者らは、鋭意検討の結果、抗原提示の作用機序に着目することで、ＡＬＡ投与と組み合わせる放射線を、高エネルギーで１回で照射するよりも、低エネルギーで複数回に分けて分割照射した方が、放射線治療におけるＡＬＡの増感効果が著しく高まることに驚くべきことに想到し、本発明を完成させた。
【００１１】
（１）すなわち、一実施態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化１】
2018076347.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を含むことを特徴とする、
腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（２）また、本発明は、一実施態様において、前記組成物は、腫瘍への光照射を伴わない態様で用いられることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（３）また、本発明は、一実施態様において、前記組成物は、哺乳動物に投与されることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（４）また、本発明は、一実施態様において、前記組成物は、前記哺乳動物に少なくとも２回以上反復して投与されることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（５）また、本発明は、一実施態様において、腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージが前記哺乳動物における腫瘍細胞に誘導されることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（６）また、本発明は、一実施態様において、放射線治療の治療効果の増強のために使用することを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（７）また、本発明は、一実施態様において、前記放射線治療が、前記哺乳動物における腫瘍細胞に対して放射線を少なくとも２回以上反復して照射することを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（８）また、本発明は、一実施態様において、さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（９）あるいは、本発明は、一実施態様において、さらに、鉄化合物が前記哺乳動物に併用して投与されることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（１０）また、本発明は、一実施態様において、前記鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及びグリシン第一鉄硫酸塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（１１）また、本発明は、一実施態様において、前記腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする、腫瘍免疫誘導用組成物に関する。
（１２）さらに、本発明は、別の実施態様において、同時または順次に投与される、（ｉ）上述のいずれかの腫瘍免疫誘導用組成物と（２）抗がん剤とを組み合わせてなることを特徴とする、がんの予防用又は治療用医薬に関する。
（１３）また、本発明は、一実施態様において、前記組み合わせの態様が、配合剤であるか、または、キットであることを特徴とする、予防用又は治療用医薬に関する。
（１４）さらに、本発明は、別の実施態様において、がんの予防又は治療のための、（ｉ）上述のいずれかの腫瘍免疫誘導用組成物と（ｉｉ）抗がん剤との組み合わせであって、
前記（ｉ）腫瘍免疫誘導用組成物と前記（ｉｉ）抗がん剤が、同時または順次に投与されることを特徴とする、組み合わせに関する。
（１５）さらに、本発明は、別の実施態様において、がんを患っている対象における腫瘍免疫を誘導する方法であって、
（Ａ）がんを患っている対象に対して、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を１回又は複数回投与するステップ；および、
（Ｂ）場合により、前記対象における前記がんに対して放射線を１回又は複数回照射することを特徴とする、腫瘍免疫を誘導する方法に関する。
（１６）また、本発明は、一実施態様において、前記腫瘍免疫を誘導する方法であって、
（Ｃ）前記対象に抗がん剤を、同時または順次に、さらに投与するステップ
を含む、腫瘍免疫を誘導する方法に関する。
（１７）さらに、本発明は、別の実施態様において、腫瘍免疫誘導用医薬の製造のための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩の使用に関する。
（１８）以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、技術的に矛盾しない限り、本発明の範囲に含まれるのは当然である。
【発明の効果】
【００１２】
一態様において、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物は、腫瘍における遅発性活性酸素産生の増加を誘導し、さらに、宿主の抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強する、新たな作用機序を提供できる。例えば、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物は、放射線治療に用いることで、ヒトに対して、高い安全性を有する、放射線治療の増強剤としても利用することができる。
また、別の態様において、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物は、ＡＬＡ投与と放射線照射の組み合わせを複数回実施することで、放射線による直接的な細胞傷害効果のみならず、放射線照射後も、腫瘍における遅発性活性酸素産生の増加や、腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージの誘導などの長期にわたる免疫学的効果の誘導に貢献して、腫瘍の成長をより効果的に阻害できる。
また、別の態様において、本発明者らは、ＡＬＡと組み合わせる放射線を、高エネルギーで１回照射するよりも、低エネルギーで複数回照射した方が、ＡＬＡの放射線治療の増強効果が著しく高いことに驚くべきことに想到した。すなわち、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物は、放射線の分割照射を組み合わせることで、一括で照射する同じ線量の放射線治療と比較して、治療効果を増強し、また、同じ効果を得るための合計線量を低減させることが出来る。
すなわち、本発明は、医学上極めて重要な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】外科的露出後のラットの皮下腫瘍の代表的な画像（図１Ａ〜図１Ｄ）と、ＰｐＩＸの腫瘍内取込みの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析結果（図１Ｅ）を示す。図１Ａ、図１Ｂは対照群の腫瘍を表し、図１Ｃ、図１ＤはＡＬＡ投与群の腫瘍を表す。図１Ａ、図１Ｃは腫瘍の明視野を示す。図１Ｂ、図１Ｄは４１０ｎｍの波長の光で照射された腫瘍の蛍光画像を示す。図１Ｅ中、ＮＤは検出されなかったことを示す。
【図２】処置後１６日目までのラット皮下腫瘍の代表的な画像（図２Ａ）と、皮下腫瘍の成長曲線（図２Ｂ）を示す。皮膚を覆う体毛は除去した。皮下腫瘍が直径６〜８ｍｍのサイズまで成長した後に、ラットをランダムに４群に分類して腫瘍を処置した。  図２Ｂ中、ｃｏｎｔｒｏｌ＝対照群（ｎ＝５）；５‐ＡＬＡ＝ＡＬＡ複数回投与群（ｎ＝５）；ＲＴ＝電離放射線の複数回照射群（ｎ＝７）；５‐ＡＬＡ  ＋  ＲＴ＝ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群（ｎ＝７）をそれぞれ示し、各ドットは平均値を示す。＊＊はｐ<０．０１を示し、電離放射線の複数回照射群の平均腫瘍体積とＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群の平均腫瘍体積とを比較した。
【図３】処置後１６時間後のラット皮下腫瘍の病理所見を示す。図３Ａ、図３Ｅ、図３Ｉ：対照群；図３Ｂ、図３Ｆ、図３Ｊ：ＡＬＡ複数回投与群；図３Ｃ、図３Ｇ、図３Ｋ：電離放射線の複数回照射群；図３Ｄ、図３Ｈ、図３Ｌ：ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群  図３Ａ〜図３Ｄはヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の結果を示す。図３Ｅ〜図３ＬはＩｂａ１染色の結果を示す。各群に関して、Ｉｂａ１で染色された部分（図３Ｅ〜図３Ｈ）は、ＨＥで染色された部分にそれぞれ対応する。Ｉｂａ１で染色した、皮下腫瘍の表面の拡大図をそれぞれ図３Ｉ〜図３Ｌに示す。スケールバー：５ｍｍ（図３Ａ〜図３Ｈ）；２００μｍ（図３Ｉ〜図３Ｌ）
【図４】ミクロデンシトメトリー解析による、Ｉｂａ１のｍｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ（ＭＧＶ）の相対強度（図４Ａ）と、ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群における皮下腫瘍中の凝固壊死と生存腫瘍細胞との間の境界域の、代表的な病理所見を示す（図４Ｂ；Ｉｂａ１染色）。ｃｏｎｔｒｏｌ＝対照群；５‐ＡＬＡ＝ＡＬＡ複数回投与群；ＲＴ＝電離放射線の複数回照射群；５‐ＡＬＡ  ＋  ＲＴ＝ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群図４Ａ中、＊はｐ<０．０５を示し、＊＊はｐ<０．０１を示す。スケールバー：１２０μｍ（図４Ｂ）
【図５】図５は、図３で用いた腫瘍標本について、抗ＣＤ６８抗体で免疫染色を行った結果を示す。
【図６】図６は、電離放射線照射後の５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸ蛍光の経時的な変化を示す。
【図７】図７は、電離放射線照射後の細胞内ＲＯＳ値の評価を示す。図７Ａは、それぞれの群における処置のスケジュールを示す。図７Ｂは、９Ｌ細胞における、細胞内ＲＯＳ値のフローサイトメトリーデータを示す。図７Ｃは、９Ｌ細胞における、電離放射線照射後の細胞内ＲＯＳ値の相対ＭＦＩを示す。図７Ｄは、Ｕ２５１細胞における、電離放射線照射後の細胞内ＲＯＳ値の相対ＭＦＩを示す。
【図８】図８は、９Ｌ細胞（図８Ａ−Ｆ）及びＵ２５１細胞（図８Ｇ−Ｌ）における、電離放射線照射１２時間後の細胞内ＲＯＳの可視化を示す。図８Ｄ−Ｆ、Ｊ−Ｌにおいては、細胞を１ｍＭ  ５−ＡＬＡで４時間インキュベートし、電離放射線を照射した。電離放射線照射から１２時間後、全ての細胞を１０μＭ  ＤＣＦＤで処理し、細胞内ＲＯＳを特定した。図８Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｉで示した対照の細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、電離放射線照射前に５−ＡＬＡの前処理を行っていない。
【図９】図９は、９Ｌ細胞及びＵ２５１細胞における、５−ＡＬＡ処理のタイミングの違いによる、電離放射線照射１２時間後の細胞内ＲＯＳ産生への影響を示す。図９Ａは、異なるタイミングの５−ＡＬＡ処理のスケジュールを示す。図９Ｂは、９Ｌ細胞を用いた場合の、それぞれの群における相対ＭＦＩ値を示す。図９Ｃは、Ｕ２５１細胞を用いた場合の、それぞれの群における相対ＭＦＩ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、ＡＬＡ類とは、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。
【００１５】
本明細書において、ＡＬＡは、５−アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。
【００１６】
ＡＬＡ誘導体としては、上記式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。なお、式（Ｉ）において、ＡＬＡは、Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合に相当する。
【００１７】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、エステル、または生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することができる。
【００１８】
式（Ｉ）のＲ１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基を挙げることができる。
【００１９】
式（Ｉ）のＲ２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基を挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）のＲ２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基を挙げることができる。
【００２１】
式（Ｉ）のＲ２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基を挙げることができる。
【００２２】
式（Ｉ）のＲ２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基を挙げることができる。
【００２３】
好ましいＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。
【００２４】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【００２５】
以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、及び、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。
【００２６】
上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。
【００２７】
上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
【００２８】
本明細書において、腫瘍免疫とは、典型的には、腫瘍細胞（がん細胞）に対する免疫機構を意味する。宿主の免疫機構は腫瘍細胞を認識して、排除することが可能である。腫瘍免疫には自然免疫系と獲得免疫系の両方が関与しており、腫瘍の成長を抑制できることが知られている。本発明者らは、ＡＬＡ自身が、腫瘍への光照射を伴わない環境下でも、宿主の抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強可能であることをｉｎ  ｖｉｖｏ実験で見出した。したがって、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬は、対象（好ましくはヒト）において、単独又は、例えば、放射線治療や光線力学的療法、腫瘍の外科的切除、抗がん剤治療等と組み合わせることで、腫瘍細胞に対する免疫機構を誘導し、腫瘍の成長の抑制に寄与することができる。好ましい一態様において、本発明の組成物は、放射線治療の増強剤として機能することができる。
細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は腫瘍免疫の主役を担う細胞であり、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞等の除去を担当する。ＣＴＬによって非自己（生体異物）とみなされた細胞は細胞死（アポトーシス）へと誘導される。ＣＴＬの分化は樹状細胞からの抗原提示によって誘導される。樹状細胞は抗原提示細胞として働くことが知られており、抗原を細胞内に取り込んだ後に分解を行い、その断片を細胞表面に提示する。抗原提示を受けたヘルパーＴ細胞は活性化してサイトカインを放出し、ＣＴＬの分化・増殖を促す。また、腫瘍免疫には適応免疫系だけではなく、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞、マクロファージ、顆粒球などの自然免疫も関与しており、腫瘍の成長を抑制していることが知られている。また、例えば、腫瘍細胞では、腫瘍抗原（特には、腫瘍特異抗原：正常細胞では発現しないが腫瘍細胞で発現する抗原）等が発現しており、ＣＴＬ等によって認識されて、腫瘍細胞は排除され得る。
ＡＬＡ類による腫瘍免疫誘導の作用機序は完全には明らかではないが、例えば、腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージを腫瘍細胞に誘導又は活性化等することによって、ＡＬＡ類は腫瘍の成長の抑制に寄与し得る。
【００２９】
本明細書において、がんは、悪性であるのが好ましく、限定はされないが、脳腫瘍、脊髄腫瘍、上顎洞癌、膵液腺癌、歯肉癌、舌癌、口唇癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肺癌、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、胆管癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣腫瘍、副腎癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、外陰癌、卵巣癌、骨腫瘍、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、基底細胞腫、リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫及び線維肉腫を含む、原発性又は転移性の、かつ、浸潤性又は非浸潤性の、癌又は肉腫等であってよい。がんは、脳腫瘍が特に好ましい。また、がんは、固形がんであることが好ましい。本発明における腫瘍細胞（がん細胞）は、上述の癌又は肉腫由来であってよい。
【００３０】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬の投与経路としては、全身投与であっても、局所投与であってもよい。限定はされないが、舌下投与も含む経口投与、あるいは、点鼻投与、吸入投与、標的組織若しくは臓器に対するカテーテルによる直接投与、点滴を含む静脈内投与、パップ剤等による経皮投与、座薬、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃漏チューブ若しくは腸漏チューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。
【００３１】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物の剤型や、本発明の予防用又は治療用医薬（配合剤又はキット等）の各成分の剤型としては、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座薬剤等を挙げることができる。本発明の腫瘍免疫誘導用組成物の剤型や、本発明の予防用又は治療用医薬の各成分は、医薬用途の他、錠剤やカプセル剤のサプリメントの形態とすることもできる。また特に、嚥下することが困難な高齢者や乳幼児等には、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊錠の形態や、経鼻胃管投与に適した液剤の形態が好ましい。
【００３２】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や本発明の予防用又は治療用医薬（配合剤又はキット等）を調製するために、必要に応じて、例えば、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加してよい。これらによって、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や本発明の予防用又は治療用医薬の吸収性や血中濃度に影響を及ぼし、体内動態の変化をもたらしてもよい。具体的には、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリン等を例示することができる。
【００３３】
本発明の、予防用又は治療用医薬とは、２以上の物質や組成物の組み合わせであって、その組み合わせの態様を限定しない医薬を意味する。
【００３４】
本発明の予防用又は治療用医薬は、必要に応じて他の薬効成分、栄養剤、担体等の他の任意成分を加えることができるのは言うまでもない。任意成分として、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコール等の、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
【００３５】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬（配合剤又はキット等）の投与の対象は、典型的には哺乳動物（好ましくはヒト）であり、愛玩動物、実験動物、家畜など非ヒト動物である場合も含む。また、好ましくない場合には、対象からヒトを除いてもよい。前記対象には、がんを患っている対象のみならず、がんを患う、もしくは、患っている恐れのある対象も含まれてよい。
【００３６】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬（配合剤又はキット等）の、投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等としては、対象において腫瘍免疫を誘導できる有効量であれば特に限定されず、当業者は適宜、決定できる。例えば、対象がヒトの場合、それらは例えばがん患者の年齢、体重、症状等により異なり得る。
ＡＬＡ類のヒトへの投与量は、ＡＬＡ塩酸塩の経口投与の場合、ＡＬＡ換算で、体重１ｋｇあたり、１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ〜２５ｍｇであってもよい。
ＡＬＡ類のヒトへの投与のタイミングは、治療の目的に併せて、適宜変更してよい。例えば、ＡＬＡ類の投与と放射線治療を組み合わせる場合には、放射線照射の２〜１２時間前、好ましくは３〜９時間前、より好ましくは３〜６時間前にＡＬＡを投与してよい。
ＡＬＡ類の投与頻度としては、一日１回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。例えば、腫瘍近くに線源（放射性同位体）を留置する手法である、ブラキテラピー（小線源療法）の場合、ＡＬＡ類の投与頻度としては、一日１回〜複数回の投与又は点滴等による連続的投与を行ってもよい。
ＡＬＡ類の投与期間は、例えば、対象の症状等に鑑みて、種々の臨床学的指標等に基づいて、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することができる。
【００３７】
本発明者らは、ＡＬＡ単独の反復投与によっても、腫瘍の成長が阻害されることを発見した。したがって、ＡＬＡ類は少なくとも２回以上反復して（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上）投与することが好ましい。
また、放射線療法は、対象における腫瘍細胞に対して放射線を１回又は複数回照射することが好ましい。本発明者らは、ＡＬＡの投与と組み合わせる放射線を、高エネルギーで１回照射するよりも、低エネルギーで複数回照射した方が、放射線治療におけるＡＬＡの増感効果が著しく高まることに驚くべきことに想到したことから、放射線は、少なくとも２回以上反復して（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上）照射することが好ましい。
例えば、用いる放射線としては、電子線としてはＸ線やγ線が、粒子線としては重粒子線、陽子線、中性子線を用いてもよい。放射線の照射線量、照射タイミング、照射頻度等は、ＡＬＡ類等の投与による組合せも考慮しながら、治療の目的に併せて、適宜変更してよい。放射線治療は、例えば、外部照射、密封小線源治療、非密封小線源治療を利用してよい。例示として、Ｘ線を用いる場合には、ヒトに対して、１回あたり、１Ｇｙ〜２０Ｇｙ照射してもよく、好ましくは、１．５Ｇｙ〜３Ｇｙ照射してもよく、さらに好ましくは１．８Ｇｙ〜２Ｇｙ照射してもよい。当業者は照射線源、照射部位や照射目的等によって、線量等を適宜変更できる。例えば、中枢神経の放射線治療の場合、１．８〜２Ｇｙ／日であってよいし、例えば、骨転移の緩和的放射線治療を目的とする場合には、１回あたりの線量をさらに増やしてよい。また、定位的照射（外部照射による短期間、多方向からの照射）の場合には、１回線量が２０Ｇｙ程度となってもよい。生体への副作用が生じないように留意しながら、低線量で複数回に分割して放射線を照射することが好ましい。
なお、本明細書において、反復とは、特定の行為（ＡＬＡの投与や放射線の照射等）を繰り返し行うことを単に意図している。各行為における各投与量や各線量、各投与間隔や各照射間隔等は、同一であっても異なってもよいのは言うまでもない。
さらに、ＡＬＡ類の複数回投与（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上）と放射線の複数回照射（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上）を適宜組み合わせることで、がんの治療に関して、一層の相乗効果を期待できるため、好ましい。ＡＬＡは生体内で代謝され、４８時間以内に排泄されるため、臨床上の安全性が高い。したがって、ＡＬＡ類の複数回投与と放射線の複数回照射を組み合わせることで、生体への安全性を確保しつつ、腫瘍免疫をいっそう活性化させることができるので有利である。また、放射線の分割照射を組み合わせることで、一括で照射する同じ線量の放射線治療と比較して、治療効果を増強し、また、同じ効果を得るための合計線量を低減させることが出来るので有利である。
例えば、ＡＬＡ類を投与後に放射線を照射し、再度、ＡＬＡ類を投与後に放射線を照射することにより、初回のＡＬＡ類投与及び放射線照射では効果が得られない、腫瘍深部の腫瘍細胞をも死滅させることが可能となる。ＡＬＡ類を複数回投与する場合、各投与の間に放射線照射を複数回実施してもよい。
あるいは、臨床的に、放射線照射（治療）後しばらくの期間（例えば２〜３か月間）、治療効果が持続し得る（効果が出現し得る）場合には、放射線治療後も、しばらくの期間（例えば２〜３か月間）、ＡＬＡ類を投与してもよい。
また、例えば、最初に腫瘍の外科的切除、抗がん剤治療や光線力学的療法を実施し、大部分のがん細胞を死滅させた後に、残存する腫瘍細胞に対して、又は、腫瘍細胞が残存する恐れがある組織に対して、ＡＬＡの投与及び、場合により放射線照射をそれぞれ１回又は複数回実施してもよい。このような複合的な治療を適宜、所望により施すことで、残存したがん細胞を死滅させ、又は、がんの再発や転移を予防することが挙げられる。
【００３８】
一態様において、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬は、生体等に許容できない悪影響を与えず、本発明の目的及び課題を達成できる限り、金属含有化合物を含んでもよい。このような金属含有化合物における金属部分としては、限定はされないが、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、バナジウム、コバルト、銅、クロム、モリブデン等を挙げることができる。当業者は、本発明の目的及び課題に照らして、適宜、金属含有化合物の適切な投与量を選択し、ＡＬＡ類と共に投与できる。
例えば、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物と金属含有化合物（例えば、鉄化合物）は、ＡＬＡ類と金属含有化合物とを含む組成物として、あるいは、それぞれ単独で投与することができる。それぞれ単独で投与する場合、同時又は前後して投与してよい。ここで、同時とは、同時刻に行われることのみならず、同時刻でなくともＡＬＡ類と金属含有化合物との投与が、生体に相加的効果、好ましくは相乗的効果を与えることができるように、両者間で相当の間隔をおかずに行われることを意味する。
【００３９】
例えば、金属含有化合物が鉄化合物である場合、当該化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、グリシン第一鉄硫酸塩（ｆｅｒｒｏｕｓ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）を挙げることができる。中でもクエン酸第一鉄ナトリウムやクエン酸鉄ナトリウムが好ましい。
【００４０】
上記鉄化合物は、それぞれ単独でも、２種以上を混合して用いてもよい。鉄化合物の投与量としては、ＡＬＡ類の投与量（ＡＬＡ換算）に対してモル比で０．０１〜１００倍であればよく、０．０５倍〜１０倍が望ましく、０．１倍〜８倍がより望ましい。ＡＬＡ類の投与方法と鉄化合物の投与方法は、同じでもよく、異なってもよい。例えば、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物又は本発明の予防用又は治療用医薬がＡＬＡ類に加えて鉄化合物を含有していてもよいし、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物又は本発明の予防用又は治療用医薬とは別個に、対象に対して鉄化合物を併用して投与してもよい。鉄化合物の対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等としては、鉄化合物の性質、種類も考慮しつつ、ＡＬＡ類と同様に、当業者は適宜決定できるのは言うまでもない。
【００４１】
また、本発明における抗がん剤としては、当業者に公知の抗がん剤であれば特に限定されず、例えば、アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミド等）；ニトロソウレア類等）；白金化合物（シスプラチン等）；代謝拮抗薬（５−フルオロウラシル等）；葉酸代謝拮抗薬（ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬等）；ピリミジン代謝阻害薬；プリン代謝阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ヌクレオチドアナログ（プリンアナログ、ピリミジンアナログ等）；トポイソメラーゼ阻害薬（Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤；ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤等）；微小管阻害薬（微小管重合阻害薬；微小管脱重合阻害薬等）；抗腫瘍性抗生物質；内分泌療法；ワクチン療法；分子標的薬（低分子医薬品（チロシンキナーゼ阻害剤；Ｒａｆキナーゼ阻害薬；プロテアソーム阻害剤等）；抗体医薬品等）が挙げられる。これらの抗がん剤は、ＡＬＡや放射線治療とは作用メカニズムが根本的に異なると考えられるため、相加的な、また、場合によっては、相乗的な効果が期待できる。
【００４２】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬に、抗がん剤を組み合わせて、同時または順次に、対象に投与してもよい。ＡＬＡ類の投与方法と、抗がん剤の投与方法とは、同じでもよく、異なってもよい。例えば、ＡＬＡ類を対象に経口投与し、抗がん剤を静脈内投与してもよい。抗がん剤の対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等としては、抗がん剤の性質、種類も考慮しつつ、当業者は適宜決定できるのは言うまでもない。
一態様において、ＡＬＡ類と、抗がん剤とは、予防用又は治療用医薬として、ＡＬＡ類と抗がん剤とを含む組成物（配合剤）、又は、別々のキットとして使用してもよい。あるいは、それぞれ単独で投与してもよい。それぞれ単独で投与する場合、同時また順次に投与してよい。ここで、同時とは、同時刻に行われることのみならず、同時刻でなくともＡＬＡ類と抗がん剤との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように、両者間で相当の間隔をおかずに行われることを意味してよい。
【００４３】
また、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬は、放射線治療の増強効果を有することから、ＡＬＡ類を公知の放射線増感剤（例えば、ニトロイミダゾール系の放射線感剤等）や高気圧酸素療法等と組み合わせることで、相加的、好ましくは相乗的効果を期待することができる。また、同様に、例えば、十全大補湯などの放射線の副作用抑制剤と組み合わせてもよい。さらに、本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や、本発明の予防用又は治療用医薬に、造血促進するサイトカイン、ニトロプルシド、ラクトフェリン、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン、ピラゾロン誘導体、増殖因子ＳＣＦ、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ６、（±）−Ｎ，Ｎ’−プロピレンジニコチンアミド、１３−オキシゲルミルプロピオン酸、β−ラパコン、アルカロイドの燐誘導体、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−Ｌ−アスコルビン酸、アミフォスチン、インターフェロン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、ニューキノロン製剤、スタチン製剤等の既存の放射線障害の予防・治療剤を１種又は２種以上を組み合わせて併用してもよい。これらの追加の成分の、対象への投与の量、タイミング、投与頻度、投与期間等としては、成分の性質、目的、種類も考慮しつつ、当業者は適宜決定できるのは言うまでもない。
【００４４】
ＡＬＡ類、抗がん剤、放射線治療を組み合わせて、がんの予防又は治療を行う場合には、例えば、抗がん剤を投与し、ＡＬＡ類を投与後、放射線を１回又は複数回照射するサイクルを１回又は複数回実施してもよいし；ＡＬＡ類を投与後に、抗がん剤を投与して、次いで、放射線を１回又は複数回照射するサイクルを１回又は複数回実施してもよいし；ＡＬＡ類を投与後、放射線を１回又は複数回照射するサイクルを１回又は複数回実施した後に、抗がん剤を１回又は複数回投与してもよい。同様に、適宜、鉄化合物や公知の放射線増感剤等を組み合わせて対象に投与してもよい。
このように、１回又は複数回のＡＬＡ類の投与に加えて、１回又は複数回の抗がん剤の投与、１回又は複数回の放射線照射等の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれることは言うまでもない。
【００４５】
本発明の腫瘍免疫誘導用組成物や本発明の予防用又は治療用医薬は、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品、飼料、餌料、ペットフードとして用いることもできる。
【００４６】
本発明のがんを患っている対象における腫瘍免疫を誘導する方法について、各成分の投与の量、タイミング、投与頻度及び投与期間、放射線の線量や照射頻度、各治療の順番や組み合わせ等に関しても、上述と同様に企図されることは言うまでもない。
【００４７】
［本発明のその他の効果］
ＡＬＡ類を放射線増感剤として使用することで、さまざまな癌腫に対する治療効果を高めることが可能となる。放射線治療は、悪性腫瘍に対して一般的に使用されているが、一方で、正常組織への障害も懸念される。そこで、ＡＬＡ類を併用することで、治療効果を高められるのみならず、放射線照射線量を減量し、正常組織への影響を減少でき得る。
また、悪性脳腫瘍においては、術後放射線治療と化学療法が典型的には行われている。しかしながら、悪性度が最も高い膠芽腫においては、平均余命が約１年程度しかない。脳腫瘍に対しては、放射線照射を併用することで、腫瘍増殖抑制が可能となるが、中枢神経系に対する遅発性の放射線障害（放射線壊死、白質脳症等）が問題となる。これらの副作用は、放射線照射線量に依存する。
本発明者らは、ＡＬＡ類の投与を放射線照射（分割照射）に組み合わせることで、有意に腫瘍増殖抑制が可能となることを見出した。本発明により、がん患者のさらなる生存期間の延長や、放射線照射線量の減量による副作用軽減が可能となる。一方、ＡＬＡ類から誘導されるＰｐＩＸは、悪性脳腫瘍のみならず、さまざまながんでその蓄積が報告されていることから、様々ながんで同様の効果が期待できることが当業者には当然に理解できる。さらに、ＡＬＡは臨床的に既に幅広く使用され、安全性も確立されている。したがって、ＡＬＡ類の放射線増感剤（放射線治療の増強剤）としての利用価値は非常に高い。
【００４８】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００４９】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００５０】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００５１】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
【００５２】
第１の、第２の、・・・等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、技術的に矛盾しない限り、本発明の範囲を逸脱することなく可能であることが理解される。
【００５３】
本明細書において、例えば、「炭素数１〜８のアルカノイル基」と表現されている場合、当業者は、当該表現が、炭素数が１、２、３、４、５、６、７又は８のアルキル基を個別具体的に指すことを理解する。
【００５４】
本明細書において、成分含有量や数値範囲を示すのに用いられるあらゆる数値は、特に明示がない限り、用語「約」の意味を包含するものとして解釈される。
【００５５】
本明細書中に引用される文献は、それらのすべての開示が、本明細書中に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの先行技術文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解する。
【００５６】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ＡＬＡの投与による、マクロファージの腫瘍組織部位への集積
【００５８】
材料と方法
［化学物質］
ＡＬＡをＣｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｋ．Ｋ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入して、１００ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。１０Ｎ  水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを６．０〜６．３に調整した。溶液は調製後１０分以内に使用した。
［脳腫瘍細胞株及び動物］
脳腫瘍細胞株として、同系ラットにおける神経膠腫の実験モデル用に広く使用されている、Ｉｎｂｒｅｄ  Ｆｉｓｈｅｒラット由来の９Ｌ神経膠肉腫細胞（Benda P, Someda K, Messer J, Sweet WH: Morphological and immunochemical studies of rat glial tumors and clonal strains propagated in culture. J Neurosurg 34:310-23, 1971.; Schmidek HH, Nielsen SL, Schiller AL, Messer J: Morphological studies of rat brain tumors induced by N-nitrosomethylurea. J Neurosurg 34:335-40, 1971.）を用いた。なお、当該細胞は、神経膠芽腫及び肉腫の両方の外観を有するので、９Ｌ神経膠肉腫細胞と命名されている。９Ｌ神経膠肉腫細胞をＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ＪａｐａｎのＤｒ．Ｔｏｋｕｙａｍａから入手した。使用前に、当該細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で数日間培養した。
実験動物として、同系の雄のＦｉｓｈｅｒ３４４ラット（８週齢）（ＳＬＣ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を、９Ｌ神経膠肉腫細胞の接種に用いた。接種の手順は、次の文献：Yamamoto J, Hirano T, Li S, Koide M, Kohno E, Inenaga C, et al.: Selective accumulation and strong photodynamic effects of a new photosensitizer, ATX-S10.Na (II), in experimental malignant glioma. Int J Oncol 27:1207-13, 2005.; Yamamoto J, Yamamoto S, Hirano T, Li S, Koide M, Kohno E, et al.: Monitoring of singlet oxygen is useful for predicting the photodynamic effects in the treatment for experimental glioma. Clin Cancer Res 12:7132-9, 2006.に記載の手順に従った。手短には、９Ｌ神経膠肉腫細胞（１ｘ１０６細胞）をＦｉｓｈｅｒ３４４ラットの背面皮膚に移植して、ラット皮下腫瘍モデルを作製した。
【００５９】
［ラット皮下腫瘍モデルにおける、ＡＬＡによって誘導されたＰｐＩＸの蓄積の評価］
本発明者らは、初めに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）解析および蛍光観察によって、上述のように作製したラット皮下腫瘍モデルにおける、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸの蓄積を確認した。
すなわち、移植した腫瘍が直径約１ｃｍにまで増殖した後に、１００ｍｇ／ｋｇ体重のＡＬＡを、尾静脈に注射した（ｉ．ｖ．）。３時間後、ラットを麻酔して、背面皮膚を覆っている部分を除く腫瘍部分を切除し、即座にドライアイスで凍結処理後、−８０℃の暗所に保存した。
次いで、ＨＰＬＣ解析を、次の文献：Hagiya Y, Fukuhara H, Matsumoto K, Endo Y, Nakajima M, Tanaka T, et al.: Expression levels of PEPT1 and ABCG2 play key roles in 5-aminolevulinic acid (ALA)-induced tumor-specific protoporphyrin IX (PpIX) accumulation in bladder cancer. Photodiagnosis Photodyn Ther 10:288-95, 2013.; Ishizuka M, Hagiya Y, Mizokami Y, Honda K, Tabata K, Kamachi T, et al.: Porphyrins in urine after administration of 5-aminolevulinic acid as a potential tumor marker. Photodiagnosis Photodyn Ther 8:328-31, 2011.に記載の手順に従って行った。
すなわち、腫瘍標本（直径約１ｍｍ）を、２００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨで処理した後に、Ｐｏｗｅｒｍａｓｈｅｒ  ＩＩ（Ａｓｓｉｓｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて氷上でホモジナイズした。ＮａＯＨで処理した試料の一部（１０μｌ）を取り、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｑｕｉｃｋ  ＳｔａｒｔＴＭ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）に用いた。また、ＮａＯＨで処理した試料に対して３倍の体積（１５０μｌ）のＮ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液（１００：１，ｖ／ｖ）を添加して、細胞タンパク質の残りの５０μｌを変性させた。
暗所で一晩保管した、調製した試料を、次の文献：Hagiya Y, Fukuhara H, Matsumoto K, Endo Y, Nakajima M, Tanaka T, et al.: Expression levels of PEPT1 and ABCG2 play key roles in 5-aminolevulinic acid (ALA)-induced tumor-specific protoporphyrin IX (PpIX) accumulation in bladder cancer. Photodiagnosis Photodyn Ther 10:288-95, 2013.；Ishizuka M, Hagiya Y, Mizokami Y, Honda K, Tabata K, Kamachi T, et al.: Porphyrins in urine after administration of 5-aminolevulinic acid as a potential tumor marker. Photodiagnosis Photodyn Ther 8:328-31, 2011.に記載の手順に一部変更を加えて処理した。手短には、４０℃に維持しながら、逆相Ｃ１８カラム（ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ，Ｃ１８，ＳＧ３００，５μｍ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；Ｓｈｉｓｅｉｄｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたＨＰＬＣシステム（Ｔｙｐｅ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ポルフィリンを分離した。溶出溶媒として、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ（１２．５％  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを含む１Ｍ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ５．２）及びＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂ（８０％  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを含む５０ｍＭ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ５．２）を使用した。
溶出は、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａを５分間用い、次いで、直線勾配のＳｏｌｖｅｎｔ  Ｂ（０〜１００％）を２５分間用い、その後、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂを１０分間用いて実施した。溶出流量を、蛍光分光光度計（４０４ｎｍで励起，６２４ｎｍで検出）を用いて定速で維持した。基準となるポルフィリンを用いて作成した検量線から、試料中のポルフィリン濃度を推量した。
【００６０】
さらに、麻酔下にあるラットの、接種した腫瘍を覆う背面皮膚を裏返しにめくって、１００ｍｇ／ｋｇ体重のＡＬＡを静脈内投与して３時間後における皮下腫瘍を、皮膚の裏側から観察した。皮下腫瘍の明視野を、光源として外付けハロゲンランプ（Ｃ−ＦＩＤ，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）とロングパスフィルターを用いてデジタルカメラ（Ｄ９０，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。次いで、当該皮下腫瘍に青紫色光を照射し（４１０ｎｍ  Ｌｉｇｈｔ−Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ，ＳＢＩ  Ｐｈａｒｍａ  ＣＯ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ロングパスフィルターを用いてデジタルカメラで腫瘍画像を撮影した。
【００６１】
［ラット皮下腫瘍モデルを用いた、電離放射線の複数回照射時の、ＡＬＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線増感効果の評価］
上述したように、同系のＦｉｓｈｅｒ３４４ラットに９Ｌ神経膠肉腫細胞を接種した。以前の研究によれば、同系のＦｉｓｈｅｒラットに皮下移植した９Ｌ神経膠肉腫細胞（９Ｌ腫瘍）の腫瘍成長は、１０Ｇｙ以上の１回の電離放射線の照射により阻害されることが示されていた（Cerniglia GJ, Wilson DF, Pawlowski M, Vinogradov S, Biaglow J: Intravascular oxygen distribution in subcutaneous 9L tumors and radiation sensitivity. J Appl Physiol (1985) 82:1939-45, 1997.）。また、別の以前の研究によれば、１回あたりのＡＬＡの静脈注射による投与用量は、齧歯類の光線力学的療法（ＰＤＴ）において１００〜５００ｍｇ／ｋｇ体重であることが報告されていた（Yamamoto J, Yamamoto S, Hirano T, Li S, Koide M, Kohno E, et al.: Monitoring of singlet oxygen is useful for predicting the photodynamic effects in the treatment for experimental glioma. Clin Cancer Res 12:7132-9, 2006.；Abels C, Heil P, Dellian M, Kuhnle GE, Baumgartner R, Goetz AE: In vivo kinetics and spectra of 5-aminolaevulinic acid-induced fluorescence in an amelanotic melanoma of the hamster. Br J Cancer 70:826-33, 1994.；Abels C, Fritsch C, Bolsen K, Szeimies RM, Ruzicka T, Goerz G, et al.: Photodynamic therapy with 5-aminolaevulinic acid-induced porphyrins of an amelanotic melanoma in vivo. J Photochem Photobiol B 40:76-83, 1997.；Bozzini G, Colin P, Betrouni N, Maurage CA, Leroy X, Simonin S, et al.: Efficiency of 5-ALA mediated photodynamic therapy on hypoxic prostate cancer: a preclinical study on the Dunning R3327-AT2 rat tumor model. Photodiagnosis Photodyn Ther 10:296-303, 2013.）。したがって、本研究において、本発明者らは、電離放射線の最大線量とＡＬＡの最大投与量をそれぞれ１０Ｇｙと５００ｍｇ／ｋｇ体重とした。本発明者らは、これまでに、電離放射線の複数回照射とＡＬＡの投与を組み合わせることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍の増殖が抑制され得ることを示した（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, Kitagawa T, Nakano Y, Saito T, et al.: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27:1748-52, 2012.）。ラットの尾静脈への複数回の静脈注射は技術的に困難であるが、本発明者らの経験上最大５回まで可能であった。したがって、本発明者らは、最適な電離放射線照射スケジュールとして、２Ｇｙ／日の電離放射線照射と１００ｍｇ／ｋｇ体重／日のＡＬＡ複数回投与とを５日間連続行うこととした。皮下腫瘍が直径６〜８ｍｍのサイズまで成長した後に、ラットをランダムに４群に分類して、次のように処置した：
対照群（処置なし）（ｎ＝５）；
ＡＬＡ複数回投与群（ｎ＝５）；
電離放射線の複数回照射群（ＲＴ）（ｎ＝７）；
ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群（５‐ＡＬＡ  ＋  ＲＴ）（ｎ＝７）
ＡＬＡのみの投与群では、ラットに、５日間連続して、尾静脈からＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）のみを投与した。電離放射線のみの複数回照射群では、ラットに麻酔をして、５日間連続して、２Ｇｙ／日の電離放射線を照射した（合計１０Ｇｙ）。ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群では、ラットに、５日間連続して、ＡＬＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与して３時間後に麻酔をし、皮下腫瘍に暗所中で２Ｇｙ／日の電離放射線を照射した（合計１０Ｇｙ）。電離放射線は、Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５２０Ｒ；ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ&Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、０．６５Ｇｙ／分の速度で照射した。このとき、ラットの腫瘍部位以外をＸ線防護シートで完全に覆うことで、体の残りの部分への電離放射線による過剰な曝露を避けた。光化学効果を避けるために、全てのラットを、ＡＬＡを投与して１２時間、暗所中で飼育した。その後は、室内光へのラットの直接の曝露を避けた。処置後、腫瘍の成長を、２日置きに、１６日目まで評価した。腫瘍体積を式：Ｖ＝ａ２ｂ／２（式中、Ｖは体積を示し、ａとｂはそれぞれ短径と長径を示す）を用いて計算した（Niclou SP, Danzeisen C, Eikesdal HP, Wiig H, Brons NH, Poli AM, et al.: A novel eGFP-expressing immunodeficient mouse model to study tumor-host interactions. Faseb J 22:3120-8, 2008.）。処置後１６日目に、ラットを深い麻酔下でサクリファイスした。全ての腫瘍標本を、背面皮膚を覆っている部分も含めて速やかに切除した後、さらなる病理検査のために２０％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。
【００６２】
［病理検査］
固定後の全ての腫瘍標本を、腫瘍の中心で、長軸方向にカットした。断片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色し、また、マクロファージ検出用にＩｂａ１またはＣＤ６８で染色した。手短には、標本を水浴させて前処理（４０分、９５℃）した後に、ＫＮ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＫＮ−０９００２；Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｒｐ，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いて脱パラフィン化した部分を洗浄した。次いで、断片をｇｏａｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｉｂａ１（１：３０００，ａｂ１０７１５９，Ａｂｃａｍ）または抗ＣＤ６８抗体（１：１００、ＭＣＡ−３４１Ｒ、ＡｂＤ）で３０分間インキュベートしてから、ＫＮ  Ｂｕｆｆｅｒでさらに洗浄した。次いで、Ｉｂａ１については、断片をＳｉｍｐｌｅ  ＳｔａｉｎＴＭ  ＭＡＸ−ＰＯ（Ｇ）（Ｈ１３０１；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．  Ｊａｐａｎ）で３０分間インキュベートした。ＣＤ６８については、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  ＨＲＰ標識・ポリマー試薬（Ｄａｋｏ社：Ｋ４０６１）で３０分間インキュベートした。ＫＮ  Ｂｕｆｆｅｒで最終洗浄を行った後に、ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）で１０分間処理して発色させ、当該断片を、ヘマトキシリンで対比染色した。
また、以前の研究（Prall F, Maletzki C, Linnebacher M: Microdensitometry of osteopontin as an immunohistochemical prognostic biomarker in colorectal carcinoma tissue microarrays: potential and limitations of the method in 'biomarker pathology'. Histopathology 61:823-32, 2012.）の手順に一部変更を加えて、パブリック・ドメイン・ソフトウェアであるＩｍａｇｅＪ（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて、デジタル顕微鏡写真上でのＩｂａ１の免疫組織化学の定量的評価に関するミクロデンシトメトリーを実施した。手短には、全てのＩｂａ１染色腫瘍標本を、カラースキャナーを用いてスキャンし、次いで撮影した。Ｉｂａ１の免疫組織化学的ＤＡＢのカラー信号の定量化を実施するために、全ての試料の画像データをＩｍａｇｅＪに移して８ビットグレースケール画像に変換した。次いで、全ての腫瘍断片において、フリーハンドツールを用いて、各腫瘍標本中、皮下腫瘍の割面全体を関心領域（ＲＯＩ）として描出し、ＲＯＩ内のｍｅａｎ  ｇｒａｙ  ｖａｌｕｅ（ＭＧＶ）をヒストグラムで得た。本発明者らは、対照群（ｎ＝５）の腫瘍標本全ての平均ＭＧＶを代表値として規定し、当該代表値に対する他の群のＭＧＶの相対強度を計算した。
【００６３】
［統計解析］
データを平均値±ＳＥとして表した。Ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて腫瘍の平均体積を分析し、Ｉｂａ１のＭＧＶの相対強度をＦｉｓｈｅｒ  ｅｘａｃｔ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔを用いて計算した。統計的有意性はｐ<０．０５として規定した。
【００６４】
結果
［ラット皮下腫瘍モデルにおける、ＡＬＡによって誘導されたＰｐＩＸの腫瘍内への蓄積］
本発明者らが作製したラット皮下腫瘍モデルでは、ＡＬＡを投与しなかった対照の腫瘍（図１Ｂ）と比較して、ＡＬＡを静脈内投与して３時間後の皮下腫瘍は強い蛍光を発した（図１Ｄ）。
また、ＨＰＬＣ解析では、ＡＬＡを静脈内投与して３時間後にＡＬＡによって誘導される腫瘍内のＰｐＩＸの量が３．６６±０．９１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であり、対照群のそれと比較して有意に高いことが示され（ｐ<０．０１）、ＡＬＡの腫瘍内部への高い蓄積が認められた（図１Ｅ）。一方、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸは、ＡＬＡを投与しなかった対照群の腫瘍では検出できなかった（０．１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満）。
【００６５】
［電離放射線の複数回照射時の、ＡＬＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線増感効果］
皮下移植した９Ｌ神経膠肉腫細胞は、ほぼ指数関数的な割合で成長した（図２、表１）。
【表１】
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腫瘍の処置の初日（０日目）には、電離放射線の複数回照射群と、ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群との間では、腫瘍サイズに差異はなかった（ｐ＝０．８４５７，表１）。しかしながら、処置後１０日目には、電離放射線の複数回照射群と比較して、ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群は、有意に腫瘍成長を阻害した（１０日目以降、ｐ<０．０１）（図２及び表１）。処置後１６日目には、電離放射線の複数回照射群と比較しての平均腫瘍成長阻害率は、ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群では４２．５％であった（図２Ａ及び表１）。興味深いことに、腫瘍の成長は、対照群と比較して、ＡＬＡ複数回投与群でも阻害された（１６日目、ｐ＝０．０４４８）。
【００６６】
［電離放射線の複数回照射後の、皮下移植した９Ｌ神経膠肉腫の病理学的評価］
腫瘍標本では、群間で相違はあるものの、皮下腫瘍内に凝固壊死が観察された（図３Ａ〜図３Ｄ）。興味深いことに、Ｉｂａ１陽性のマクロファージもまた、群間で相違が観察された（図３Ｅ〜図３Ｌ）。対照群では、皮下腫瘍内に非常に低量のＩｂａ１陽性のマクロファージしか蓄積しなかった（図３Ｅ、図３Ｉ）。ＡＬＡ複数回投与群では、Ｉｂａ１陽性のマクロファージは、主には皮下腫瘍の表面に集まり、また、わずかに腫瘍内へ侵入した（図３Ｆ、図３Ｊ）。同様に、多くのＩｂａ１陽性のマクロファージが、電離放射線照射後に皮下腫瘍の表面及び内部に集まり（図３Ｇ、図３Ｋ）、特に、ＡＬＡの投与と組み合わせて電離放射線を照射後にはいっそう顕著であった（図３Ｈ、図３Ｌ）。
ミクロデンシトメトリー解析により、ＡＬＡ複数回投与＋電離放射線の複数回照射群のＭＧＶは、他の群のＭＧＶに比べて有意に高く、より多くのＩｂａ１陽性のマクロファージが皮下腫瘍細胞に集まったことが判明した（電離放射線の複数回照射群と比較してｐ<０．０５；ＡＬＡ複数回投与群と比較してｐ<０．０１）（図４Ａ）。
また、腫瘍内部におけるＩｂａ１陽性のマクロファージの分布解析では、Ｉｂａ１陽性のマクロファージが、凝固壊死した帯域内ではなくて、主には凝固壊死と生存腫瘍細胞との間の境界域に集まるのが観察された（図４Ｂ）。多くのＩｂａ１陽性のマクロファージは食細胞と食作用過程の特徴を示した（図４Ｂ中の矢印）。
【００６７】
また、抗ＣＤ６８抗体を用いて免疫染色を行った結果においても、上記の結果と同様の傾向がみられた（図５）。
【００６８】
考察
本発明者らは、神経膠腫の実験モデルを用いて、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸがｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線増感効果を有することを初めて実証した。
【００６９】
ポルフィリン化合物の放射線増感効果の基礎にある機序は未だ明らかではない。本発明者らは、これまでに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、ＡＬＡによって誘導される細胞内のＰｐＩＸが、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生及び放射線増感に重要な役割を果たすことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, Kitagawa T, Nakano Y, Saito T, et al.: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27:1748-52, 2012.）。この放射線増感効果は、ポルフィリン化合物の細胞内濃度に依存し得る。しかしながら、ＡＬＡ投与後、ヘマトポルフィリン誘導体やフォトフリンなどのポルフィリン化合物の細胞内濃度は低いことが知られている（Yamamoto J, Yamamoto S, Hirano T, Li S, Koide M, Kohno E, et al.: Monitoring of singlet oxygen is useful for predicting the photodynamic effects in the treatment for experimental glioma. Clin Cancer Res 12:7132-9, 2006.）。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞内で高濃度のヘマトポルフィリン誘導体やフォトフリンに１回の電離放射線照射を組み合わせる方が、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸに１回の電離放射線照射を組み合わせる場合よりも、放射線増感効果は強いであろう（Luksiene Z, Juzenas P, Moan J: Radiosensitization of tumours by porphyrins. Cancer Lett 235:40-7, 2006.；Berg K, Luksiene Z, Moan J, Ma L: Combined treatment of ionizing radiation and photosensitization by 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX. Radiat Res 142:340-6, 1995.；Schaffer M, Schaffer PM, Jori G, Corti L, Sotti G, Hofstetter A, et al.: Radiation therapy combined with photofrin or 5-ALA: effect on Lewis sarcoma tumor lines implanted in mice. Preliminary results. Tumori 88:407-10, 2002.；24.；Kostron H, Swartz MR, Miller DC, Martuza RL: The interaction of hematoporphyrin derivative, light, and ionizing radiation in a rat glioma model. Cancer 57:964-70, 1986.）。一部の細胞株では、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸは、１回の電離放射線照射では低い放射線増感効果しかないようであった（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, Kitagawa T, Nakano Y, Saito T, et al.: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27:1748-52, 2012.；Ito E, Yue S, Moriyama EH, Hui AB, Kim I, Shi W, et al.: Uroporphyrinogen decarboxylase is a radiosensitizing target for head and neck cancer. Sci Transl Med 3:67ra7, 2011.）。また、電離放射線の照射は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト結腸腺がん細胞におけるＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸの合成を、阻害するよりはむしろ増加させることが別の研究で指摘されていた（Berg K, Luksiene Z, Moan J, Ma L: Combined treatment of ionizing radiation and photosensitization by 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX. Radiat Res 142:340-6, 1995.）。
本発明者らは、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸが電離放射線の複数回照射に対する腫瘍の感受性を有意に増加させることを示した。したがって、ＡＬＡの投与と組み合わせて、電離放射線を繰り返し照射することで、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸの放射線増感効果を上昇させて、腫瘍成長を強く阻害し得る。
【００７０】
次いで、本発明者らは、マクロファージ検出用にＩｂａ１を用いた免疫組織化学的染色を実施して、電離放射線の複数回照射と組み合わせたときの、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸに対する免疫反応を調べた。電離放射線を複数回照射すると、ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸは、皮下腫瘍の表面及び内部で、Ｉｂａ１陽性のマクロファージの強い凝集を誘導した。一般に、Ｉｂａ１の発現は、典型的には、活性化されたマクロファージ／ミクログリア中で上方制御されて、アメーバ様の形状と短突起を有する目立った形態を示す（David S, Kroner A: Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci 12:388-99, 2011.；Lynch MA: The multifaceted profile of activated microglia. Mol Neurobiol 40:139-56, 2009.）。マクロファージは大まかには次の２グループに分類され得る：
（１）古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）：ＩＬ‐１Ｂ、ＩＬ‐１２及びＴＮＦ‐αなどの前炎症性メディエーターの産生を主として介した、免疫原性抗原に対する協調応答に典型的には関与し、病原性物質を貪食する能力を全般的に向上させる（MacMicking J, Xie QW, Nathan C: Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev Immunol 15:323-50, 1997.；Boehm U, Klamp T, Groot M, Howard JC: Cellular responses to interferon-gamma. Annu Rev Immunol 15:749-95, 1997.）；
（２）選択的活性化マクロファージ（Ｍ２）：ＩＬ−１ＢやＴＮＦ−αなどの前炎症性メディエーターを分泌せず（Hussain SF, Yang D, Suki D, Grimm E, Heimberger AB: Innate immune functions of microglia isolated from human glioma patients. J Transl Med 4:15, 2006.）、強力な免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０やＴＧＦ−βの分泌を主として介した免疫調節に影響を及ぼし、貪食能を低下させると考えられている（Li W, Graeber MB: The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro Oncol 14:958-78, 2012.；Filipazzi P, Huber V, Rivoltini L: Phenotype, function and clinical implications of myeloid-derived suppressor cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother 61:255-63, 2012.）。
本実験では、ＡＬＡの投与と組み合わせて電離放射線を複数回照射させることで、多くのＩｂａ１陽性のマクロファージが皮下腫瘍の表面及び内部に集まった。特に、食細胞の特徴を有するＩｂａ１陽性のマクロファージは、凝固壊死と生存腫瘍細胞との間の境界域に主に集まった。対照的に、凝固壊死性変化は各群の皮下腫瘍内で見られたものの、Ｉｂａ１陽性のマクロファージは対照群の皮下腫瘍の表面にはほとんど集まらなかった。このことは、Ｉｂａ１陽性のマクロファージは、ただ単に、凝固壊死変性した組織を処理する目的で集簇（しゅうぞく）しているのではなく、抗腫瘍目的に誘導されていることを示唆する所見である。
【００７１】
ＡＬＡを用いた光線力学的療法によって、ルイス肺がんでの腫瘍浸潤性単核細胞が増加し、ルイス肺がん担持マウスにおいて腹腔内マクロファージが活性化したことが報告されている（Skivka LM, Gorobets OB, Kutsenok VV, Lozinsky MO, Borisevich AN, Fedorchuk AG, et al.: 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic therapy of Lewis lung carcinoma: a role of tumor infiltration with different cells of immune system. Exp Oncol 26:312-5, 2004.）。本発明者らは、ＡＬＡ単独の反復投与によっても、腫瘍の成長が阻害されることを発見した（図２Ｂ）。光力学作用による可能性は完全には除外できないが、室内光への曝露は制限され間接的であったことから、ＡＬＡ自身が宿主の抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強可能であることを本発明者らは見出した。
【００７２】
悪性脳腫瘍の患者は、腫瘍の外科切除後に、分割放射線照射治療をしばしば受ける。定位放射線治療（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ、ＳＲＴ）、定位手術的照射（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｒａｄｉｏｓｕｒｇｅｒｙ、ＳＲＳ）、強度変調放射線治療（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）などの様々な放射線治療モダリティは、電離放射線照射の強度を精密に制御できるので、健常組織の被爆を回避するか又は減少させ、治療の副作用を制限できる。したがって、ＳＲＴやＳＲＳ等により、例えば、頭蓋内病巣の小領域への精密な高線量照射が可能になる（Starke RM, Williams BJ, Hiles C, Nguyen JH, Elsharkawy MY, Sheehan JP: Gamma knife surgery for skull base meningiomas. J Neurosurg 116:588-97, 2012.；Torres RC, Frighetto L, De Salles AA, Goss B, Medin P, Solberg T, et al.: Radiosurgery and stereotactic radiotherapy for intracranial meningiomas. Neurosurg Focus 14:e5, 2003.）。ＡＬＡは、例えば、悪性脳腫瘍に高いアフィニティーを有し、他の光増感剤と比較して、皮膚への光毒性が低いなどのたくさんの利点を有する。ＡＬＡによって誘導されるＰｐＩＸを用いた電離放射線の複数回照射が、例えば、悪性神経膠腫などの脳腫瘍に対する新規の治療アプローチとなり、臨床への応用が可能であることに本発明者らは想到した。
【００７３】
結論
本発明者らは、神経膠腫の実験モデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＬＡによる放射線増感効果を初めて示した。ＡＬＡの投与と電離放射線の複数回照射を組み合わせることで、神経膠腫の実験モデルにおいて、抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強して、腫瘍成長の強い阻害を誘導できる。
【００７４】
実施例２：ＡＬＡの投与による、電離放射線照射後の遅発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加
【００７５】
上記の実施例１によって、ＡＬＡの投与による腫瘍免疫誘導効果は十分実証されているが、本発明者らは、補足的に、ＡＬＡの投与による電離放射線照射後の遅発性の活性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加効果についても検証した。
【００７６】
材料と方法
［化学物質］
５−ＡＬＡをＣｏｓｍｏｂｉｏ（Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究のため、新鮮な培養液に、１ｍＭの最終濃度で溶解させた。２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＤ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。ＤＣＦＤは、新鮮な培養液またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に、１０μＭの最終濃度で溶解させた。他の物質は、入手可能な最上級グレードのものであった。
【００７７】
［培養及び細胞の取り扱い］
２種のラット神経膠腫細胞株（９Ｌ及びＣ６）、及び、ヒト神経膠腫細胞株（Ｕ２５１及びＴ９８Ｇ）を用いた。９Ｌ及びＴ９８ＧはＲＰＭＩ−１６４０中で、Ｃ６及びＵ２５１は１０％ＦＢＳ添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）中で、それぞれ数日間、３７℃で、使用前に培養した。これらの細胞株は、加湿インキュベータ内で、３７℃、５％ＣＯ２の状態で維持された。細胞は、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸を含む０．０５％トリプシン溶液を用いて、指数増殖期に継代した。７０％密集度の細胞を、以後の実験に用いた。５−ＡＬＡは、ＲＰＭＩ−１６４０（９Ｌ及びＴ９８Ｇ）、または、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（Ｃ６及びＵ２５１）に溶解させ、最終濃度を１ｍＭとした。
【００７８】
［フローサイトメトリー分析を用いた、神経膠腫細胞における５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸの細胞内レベルの評価］
１００−ｍｍ培養皿に細胞を播種し、培養した。１ｍＭ  ５−ＡＬＡを含む完全培地中で、細胞を４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。トリプシン処理によって細胞を底層から剥離させ、遠心分離（４００ｘｇ、３ｍｉｎ、４℃）によって回収した。その直後、細胞を冷ＰＢＳ／ＦＢＳ中で再懸濁し、フローサイトメトリー（ＥＣ８００；Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析した。概して、それぞれの試料中の３０，０００個の細胞を評価した。４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー線によって、細胞内ＰｐＩＸからの蛍光を励起させ、６４０／３０ｎｍ帯域フィルターを用いて蛍光を検出した。５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸの光活性化を防ぐため、全ての手順は暗室中で実施した。フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて実施した。５−ＡＬＡ処理を実施しなかった細胞のそれに対する、５−ＡＬＡ処理を行った細胞中のＰｐＩＸ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれの細胞株において計算した。
【００７９】
［神経膠腫細胞への電離放射線照射後の細胞内ＲＯＳレベルの評価］
ＲＯＳの細胞内産生を、オキシダント感受性蛍光プローブＤＣＦＤおよびフローサイトメトリーを用いて評価した（Yamamori T, Yasui H, Yamazumi M, et al: Ionizing radiation induces mitochondrial reactive oxygen species production accompanied by upregulation of mitochondrial electron transport chain function and mitochondrial content under control of the cell cycle checkpoint. Free Radic Biol Med 53: 260-270, 2012.）。１００−ｍｍ培養皿に細胞を播種し、次いで、Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５２０Ｒ；Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）（０．６７Ｇｙ／ｍｉｎ）を用いて、暗室中で１０Ｇｙ照射を行った。電離放射線照射中、培養皿は室温で暗容器（ｄａｒｋ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）中に維持された。５−ＡＬＡ及び電離放射線照射群（ＲＴ，１２ｈ＋ＡＬＡ）においては、細胞を１ｍＭの５−ＡＬＡで４時間処理し、ただちに電離放射線を照射し、細胞を１０μＭ  ＤＣＦＤとともに１５分間、３７℃でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。そして、上述のとおり、フローサイトメーター（励起，４８８ｎｍ；放射，５２５／５０ｎｍ帯域フィルター）を用いて分析した。対照の細胞では、電離放射線または５−ＡＬＡへは曝さなかった。５−ＡＬＡ群においては、細胞を１ｍＭの５−ＡＬＡで４時間処理したが、電離放射線へは曝さなかった。対照の細胞及び５−ＡＬＡ群の細胞は、同様にＤＣＦＤで処理した。５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸ及びＤＣＦＤの光活性化を防ぐため、全ての手順は暗室中で実施した。フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて実施した。対照の細胞のそれに対する、細胞のＤＣＦ蛍光のＭＦＩを、それぞれの細胞株において計算した。
【００８０】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経膠腫細胞への電離放射線照射１２時間後におけるＲＯＳの細胞内局在の検出］
ＲＯＳの細胞内産生を、ＤＣＦＤ及び共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＭＳ５  Ｐａｓｃａｌ；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、我々の方法によって検出した（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, et al: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27: 1748-1752, 2012.）。簡潔には、細胞を、３５−ｍｍガラス底培養皿（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中の１ｍＭ  ５−ＡＬＡを含む新鮮な培地に播種し、３７℃で４時間、暗室中でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０Ｇｙの電離放射線に曝した。電離放射線照射１２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０μＭ  ＤＣＦＤとともに１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ただちに観察した。ＤＣＦＤ蛍光（励起，４８８ｎｍ；放射，５０５−５３０ｎｍ帯域フィルター）を、共焦点レーザー走査型顕微鏡上にイメージした。全ての手順は暗室中で実施した。
【００８１】
［神経膠腫細胞への、異なる時間の５−ＡＬＡ処理における、遅発性の細胞内ＲＯＳ産生の変化］
細胞を１００−ｍｍ培養皿に播種し、１０Ｇｙの電離放射線に曝した。１ｍＭ  ５−ＡＬＡのインキュベーション時間（４ｈ）はそれぞれの群で同一であり、３種の５−ＡＬＡ処理時間を開始した：ｉ）電離放射線照射直前での５−ＡＬＡ処理［ＲＴ＋ＡＬＡ（ｐｒｅ）群］；ｉｉ）電離放射線照射直後での５−ＡＬＡ処理［ＲＴ＋ＡＬＡ（４ｈ）群］；ｉｉｉ）電離放射線照射８時間後での５−ＡＬＡ処理［ＲＴ＋ＡＬＡ（１２ｈ）群］。それぞれの群において、電離放射線照射から１２時間後、細胞を１０μＭ  ＤＣＦＤとともに、３７℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。その直後、上述のとおり、フローサイトメーターを用いてＤＣＦ蛍光を分析した。対照の細胞では、電離放射線又は５−ＡＬＡによる処理を行わなかった。電離放射線照射のみ（ＲＴ）の群では、細胞を５−ＡＬＡ処理を行わずに電離放射線に曝し、同様に、電離放射線への曝露から１２時間後、ＤＣＦＤで処理した。全ての手順は暗室中で実施した。フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施した。対照の細胞のそれに対する、細胞のＤＣＦ蛍光のＭＦＩを、それぞれの細胞株において計算した。
【００８２】
［統計分析］
データを平均値±ＳＥで表し、フィッシャーの制約付最小有意差検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）によって分析した；ｐ<０．０５を統計的に有意な結果として示した。
【００８３】
結果
［神経膠腫細胞への電離放射線照射後の、５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸの産生の経時的な変化］
我々はまず、フローサイトメトリー分析を用いて、神経膠腫細胞株における５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸの細胞内蓄積について検討した。それぞれの細胞株において、５−ＡＬＡ処理細胞におけるＰｐＩＸ蛍光のＭＦＩは、対照と比較して明らかに上昇した（図示せず）。ＰｐＩＸ蛍光（平均±ＳＥ）の相対ＭＦＩは、９Ｌ，Ｕ２５１，Ｃ６及びＴ９８Ｇ細胞において、それぞれ２１．５±０．１２，３７．６±０．１２，２０．２±０．５６及び１５．３±０．８９であった。これらの細胞株のうち、我々は、比較的高い相対ＭＦＩ値を示した２つ（９Ｌ及びＵ２５１）を選択し、引き続く研究にそれらを用いた。次に、我々は９Ｌ及びＵ２５１細胞株における、５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸの産生への電離放射線照射の影響について確認した（図６）。９Ｌ細胞では、電離放射線照射４、１２及び２４時間後のＰｐＩＸ蛍光の相対ＭＦＩ（平均±ＳＥ）は、それぞれ１５．２±０．１５，１５．９±０．７３及び１３．４±２．４３であった。それぞれの群間に有意な差はなかった（図６Ａ）同様に、Ｕ２５１細胞では、電離放射線照射４、１２及び２４時間後のＰｐＩＸ蛍光の相対ＭＦＩ（平均±ＳＥ）は、それぞれ４１．６±０．２０，４４．２±３．６７及び５１．１±３．７６であった。それぞれの群間に有意な差はなかった（図６Ｂ）。
【００８４】
［神経膠腫細胞における、電離放射線照射と同時に５−ＡＬＡ処理を行った後の、ＲＯＳの細胞内レベルの遅発性の増加］
図７は、９Ｌ及びＵ２５１細胞において、電離放射線照射後のＲＯＳの細胞内産生の経時的な変化を示す。ＲＯＳ産生における５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸと電離放射線照射の間の直接的な相互作用を評価するため、細胞を電離放射線照射の直前に５−ＡＬＡで前処理した（図７Ａ）。９Ｌ細胞では、５−ＡＬＡ（電離放射線照射なし）、及び、５−ＡＬＡなしでの電離放射線照射直後（ＲＴ０ｈ）のＤＣＦ蛍光の相対ＭＦＩ（平均±ＳＥ）は、それぞれ１．１９±０．０７及び１．０４±０．０７であり、いずれの群も有意な差はなかった（ｐ＝０．３８３）（図７Ｂおよび図７Ｃ）。５−ＡＬＡなしでの電離放射線照射１２時間後（ＲＴ１２ｈ）のＤＣＦ蛍光の相対ＭＦＩ（１．４１±０．１３）は、９Ｌ細胞において、ＲＴ０ｈ群よりも有意に高かった（ｐ＝０．０４７）。しかし、５−ＡＬＡありでの電離放射線照射１２時間後のＤＣＦ蛍光（１．９１±０．１９）は、ＲＴ１２ｈ群のそれよりも明らかに高かった（ｐ＝０．００９）。Ｕ２５１細胞においては、５−ＡＬＡ（電離放射線照射なし）、及び、ＲＴ０ｈ群におけるＤＣＦ蛍光の相対ＭＦＩ（平均±ＳＥ）は、それぞれ０．８７±０．０６及び０．９９±０．０３であり、いずれの群も有意な差はなかった（ｐ＝０．２６２）（図７Ｄ）。ＲＴ１２ｈ群におけるＤＣＦ蛍光の相対ＭＦＩ（１．２７±０．０８）は、ＲＴ０ｈ群のそれよりも有意に高かった（ｐ＝０．０１１）。同様に、５−ＡＬＡありでの電離放射線照射１２時間後のＤＣＦ蛍光（１．５１±０．１０）は、ＲＴ１２ｈ群のそれよりも明らかに高かった（ｐ＝０．０３１）。
【００８５】
［電離放射線照射後の神経膠腫細胞における遅発性のＲＯＳ産生］
９Ｌ及びＵ２５１細胞における、電離放射線照射後の細胞内ＲＯＳを、我々の方法（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, et al: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27: 1748-1752, 2012.）により、オキシダント感受性プローブＤＣＦＤを用いて、ＤＣＦ蛍光によって可視化した（図８）。以前、我々は共焦点レーザー走査顕微鏡上では、５−ＡＬＡ誘導ＰｐＩＸとＤＣＦ蛍光の間には相互作用がないことを確認した（Yamamoto J, Ogura S, Tanaka T, et al: Radiosensitizing effect of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in glioma cells in vitro. Oncol Rep 27: 1748-1752, 2012.）。電離放射線照射１２時間後において、ＤＣＦ蛍光は核及び細胞質に観察され、細胞株間でＤＣＦ蛍光の強度にある程度の差が見られた（９Ｌ細胞について図８Ａ−Ｃ、Ｕ２５１細胞において図８Ｇ−Ｉ）。反対に、電離放射線照射前における細胞の５−ＡＬＡによる前処理は、主に両細胞株の細胞質において、明らかにＤＣＦ蛍光を上昇させた（図８Ｄ−Ｆ及び図８Ｊ−Ｌ）。
【００８６】
［５−ＡＬＡ処理のタイミングの違いによる、電離放射線照射後の神経膠腫細胞における遅発性の細胞内ＲＯＳ産生への影響］
異なるタイミングの５−ＡＬＡ処理の遅発性の細胞内ＲＯＳ産生への影響について評価するため、我々は３つの５−ＡＬＡ処理のタイミングを採用し、それぞれの条件における電離放射線照射１２時間後のＲＯＳ産生を評価した（図９Ａ）。９Ｌ及びＵ２５１細胞において、電離放射線照射直前の５−ＡＬＡ処理（ＲＴ＋ＡＬＡ（ｐｒｅ）群）におけるＤＣＦ蛍光（９Ｌ細胞について１．９３±０．１０、Ｕ２５１細胞について１．４４±０．０２）は、５−ＡＬＡ処理なしで電離放射線照射を実施した細胞のそれ（９Ｌ細胞について１．４４±０．０３、Ｕ２５１細胞について１．３０±０．０４）よりも有意に高く（それぞれｐ＝０．０００９、０．０１３５）、これまでの実験の結果と一致していた（図９）。９Ｌ細胞においては、電離放射線照射直前の５−ＡＬＡ処理（ＲＴ＋ＡＬＡ（ｐｒｅ）群）における細胞のＤＣＦ蛍光は、電離放射線照射直後の５−ＡＬＡ処理（ＲＴ＋ＡＬＡ（４ｈ）群）を実施した細胞のそれ（１．５７±０．０５）、及び、電離放射線照射８時間後の５−ＡＬＡ処理（ＲＴ＋ＡＬＡ（１２ｈ）群）を実施した細胞のそれ（１．５８±０．１１）よりも有意に高かった（それぞれｐ＝０．００７２及び０．００７８）（図９Ｂ）。Ｕ２５１細胞における、ＲＴ＋ＡＬＡ（ｐｒｅ）群のＤＣＦ蛍光は、ＲＴ＋ＡＬＡ（４ｈ）群（１．４３±０．０２）及びＲＴ＋ＡＬＡ（１２ｈ）群（１．３８±０．０５）と比較してわずかに高い傾向があったが、有意な差ではなかった（それぞれｐ＝０．７９５８及び０．２２７５）（図９Ｃ）。
【００８７】
以上の結果から、驚くべきことに、神経膠腫細胞において、電離放射線照射前の５−ＡＬＡの投与は、電離放射線照射後において細胞質内の遅発性のＲＯＳ産生を強く誘導することが示された。
【００８８】
実施例１および実施例２から、ＡＬＡの投与により、電離放射線照射後の腫瘍細胞において、遅発性活性酸素産生の増加や、腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージの誘導などの長期にわたる免疫学的効果を誘導し、腫瘍の成長を強く阻害できることが示された。すなわち、本発明者らは、腫瘍免疫誘導用剤としてのＡＬＡの新たな用途を初めて見出した。臨床的には、ＡＬＡと組み合わせた放射線照射（治療）後しばらくの期間（例えば２〜３か月間）は、ＡＬＡの腫瘍免疫誘導効果により、持続的な治療効果が期待できる。
【図１】
2018076347.tif 000008
【図２】
2018076347.tif 000009
【図３】
2018076347.tif 000010
【図４】
2018076347.tif 000011
【図５】
2018076347.tif 000012
【図６】
2018076347.tif 000013
【図７】
2018076347.tif 000014
【図８】
2018076347.tif 000015
【図９】
2018076347.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月14日(2018.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＳ産生を増加することによって腫瘍を治療するための全身投与用医薬組成物であって、
下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化１】
2018076347.tif 000017
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩
を含んでおり、
電離放射線照射と併用されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記組成物は少なくとも２回以上反復して投与されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬組成物であって、
腫瘍細胞傷害性Ｍ１型マクロファージが腫瘍細胞に誘導されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記電離放射線照射が、腫瘍細胞に対して少なくとも２回以上反復して実施されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
さらに、鉄化合物を含有することを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
さらに、鉄化合物が併用して投与されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の医薬組成物であって、
前記鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及びグリシン第一鉄硫酸塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記腫瘍が脳腫瘍であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項９】
同時または順次に投与される、（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物と（２）抗がん剤とを組み合わせてなることを特徴とする、がんの予防用又は治療用医薬。
【請求項１０】
請求項９に記載の予防用又は治療用医薬であって、
前記組み合わせの態様が、配合剤であるか、または、キットであることを特徴とする、
予防用又は治療用医薬。
【請求項１１】
がんの予防又は治療のための、（１）請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物と（２）抗がん剤との組み合わせであって、
前記（１）医薬組成物と前記（２）抗がん剤が、同時または順次に投与されることを特徴とする、
組み合わせ。
【請求項１２】
ＲＯＳ産生を増加することによって腫瘍を治療するための全身投与用医薬の製造のための、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化３】
2018076347.tif 000018
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩の使用であって、
前記医薬は電離放射線照射と併用される
ことを特徴とする、
使用。