(57)【要約】【課題】検出対象が発する蛍光の検出が分子レベルで可能な蛍光検出方法及び蛍光検出装置の提供。【解決手段】蛍光性を有する検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する工程と、を含み、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である、蛍光検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性を有する検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する工程と、を含み、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である、蛍光検出方法。
【請求項２】
前記基材はグラフェン構造を有する、請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記脱離は、前記検出対象が吸着した前記基材と、前記検出対象が吸着した前記基材を分散又は溶解可能な媒体とを含む試料に界面活性剤を添加することで行われる、請求項１又は請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記観察は、前記試料を薄層化して行われる、請求項３に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記薄層化は、一対の光透過性基材の間に前記試料を注入することにより行われ、前記観察は、前記基材から脱離した前記検出対象が前記光透過性基材の表面に吸着した状態で行われる、請求項４に記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記検出対象が前記光透過性基材の表面に吸着した状態は、前記試料に添加される界面活性剤の量を調節することで制御される、請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程を制御する制御部と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する観察部と、を備え、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である、蛍光検出装置。
【請求項８】
前記制御部は、前記検出対象が吸着した前記基材と、前記検出対象が吸着した前記基材を分散又は溶解可能な媒体とを含む試料への界面活性剤の添加の状態を制御する、請求項７に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出方法及び蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の蛍光性化合物はカーボンナノチューブに吸着すると消光（光をあてても蛍光を発しない）し、カーボンナノチューブから脱離すると再び発光する現象が知られており、この現象を応用した技術が検討されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、酵素（トロンビン）により分解されるペプチドに蛍光性化合物を付加したものをカーボンナノチューブに吸着させて蛍光性化合物を消光した状態とし、次いで酵素を添加してペプチドを分解することによりカーボンナノチューブから蛍光性化合物を脱離させ、脱離した蛍光性化合物が発する蛍光を定量的に確認する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shuyun Shu et al., Chem. Eur. J. 2012, 18, 16556-16561
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載の方法では、蛍光の検出はラマン分光測定とＩＲ分光測定により行われている。つまり、ペプチドの分解によりカーボンナノチューブから脱離した蛍光性化合物が発する蛍光を試料全体の蛍光強度として検出することで、ペプチドの分解に寄与した酵素の存在がいわばマクロ的に確認されている。
【０００６】
上述のような蛍光性化合物の消光及び発光現象を何らかの用途に利用しようとしたとき、蛍光強度よりも直接的かつミクロ的な検出結果が求められる場合も想定される。本発明は上記事情に鑑み、検出対象が発する蛍光の検出が分子レベルで可能な蛍光検出方法及び蛍光検出装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞蛍光性を有する検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する工程と、を含み、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である、蛍光検出方法。
＜２＞前記基材はグラフェン構造を有する、＜１＞に記載の蛍光検出方法。
＜３＞前記脱離は、前記検出対象が吸着した前記基材と、前記検出対象が吸着した前記基材を分散又は溶解可能な媒体とを含む試料に界面活性剤を添加することで行われる、＜１＞又は＜２＞に記載の蛍光検出方法。
＜４＞前記観察は、前記試料を薄層化して行われる、＜３＞に記載の蛍光検出方法。
＜５＞前記薄層化は、一対の光透過性基材の間に前記試料を注入することにより行われ、前記観察は、前記基材から脱離した前記検出対象が前記光透過性基材の表面に吸着した状態で行われる、＜４＞に記載の蛍光検出方法。
＜６＞前記検出対象が前記光透過性基材の表面に吸着した状態は、前記試料に添加される界面活性剤の量を調節することで制御される、＜５＞に記載の蛍光検出方法。
＜７＞検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程を制御する制御部と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する観察部と、を備え、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である、蛍光検出装置。
＜８＞前記制御部は、前記検出対象が吸着した前記基材と、前記検出対象が吸着した前記基材を分散又は溶解可能な媒体とを含む試料への界面活性剤の添加の状態を制御する、＜７＞に記載の蛍光検出装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検出対象が発する蛍光の検出が分子レベルで可能な蛍光検出方法及び蛍光検出装置が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本発明を制限するものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
【００１０】
＜蛍光検出方法＞
本発明の蛍光検出方法は、蛍光性を有する検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程（脱離工程）と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する工程（観察工程）と、を含み、前記検出対象は、前記検出対象が基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記検出対象が基材から脱離しているときは発光した状態である。
【００１１】
本発明の蛍光検出方法では、検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する。このため、蛍光強度測定のようなマクロ的手法で確認する方法に比べ、より直接的かつミクロ的な検出結果が求められる場合にも好適に用いることができる。また、検出対象がごく微量であっても充分な検出結果を得ることができる、検出結果をより短時間で得ることができる等の利点を活かした用途への応用も期待できる。
【００１２】
（検出対象）
検出対象は、蛍光性を有し、基材に吸着しているときは消光した状態であり、基材から脱離しているときは発光した状態であるものであれば特に制限されない。検出対象が消光又は発光した状態であるか否かの確認は、所定の波長の光を検出対象に照射したときに蛍光を発するか否かによって確認することができる。
【００１３】
検出対象として具体的には、ローダミンＢ等のローダミン化合物、フロオレッセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニンなどの蛍光性を有する有機化合物が挙げられる。本発明の蛍光検出方法に使用する検出対象は、１種のみでも２種以上であってもよい。
【００１４】
検出対象は、上記有機化合物のような蛍光性を有する物体のみからなっていても、蛍光性を有する物体と別の物体とが複合化したもの（以下、複合体ともいう）であってもよい。例えば、蛍光性を有する物体と生体由来分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、ペプチド等）、金属、セラミックス、有機高分子化合物などの別の物体との複合体であってもよい。
【００１５】
（基材）
基材は、これに吸着した検出対象が消光した状態となるものであれば特に制限されない。基材として具体的には、グラフェン構造を有する（検出対象が吸着する部分が少なくともグラフェン構造である）ものが挙げられる。グラフェン構造を有する基材としては、グラファイト、カーボンナノチューブ、フラーレン等のグラフェン構造を有する炭素材料、及びこれら炭素材料と他の材料との複合体が挙げられる。検出対象の吸着量の観点からはカーボンナノチューブが好ましい。カーボンナノチューブはシングルウォールでもマルチウォールでもよいが、キラリティ事における制御の観点からはシングルウォールカーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）が好ましい。
【００１６】
検出対象が基材に吸着している態様は特に制限されず、ファンデルワールス力による物理吸着であっても共有結合による化学吸着であってもよい。検出対象の基材への吸着又は基材からの脱離のしやすさの観点からは、結合力が比較的弱い物理吸着であることが好ましい。検出対象が蛍光性を有する物体と別の物体との複合体である場合、基材への吸着作用は蛍光性を有する物体によるものであっても、これと複合化している別の物体によるものであってもよい。
【００１７】
検出対象を基材に吸着させる具体的な方法は、特に制限されない。例えば、検出対象と基材とを、これらを分散又は溶解可能な媒体に添加し、超音波処理を施す方法が挙げられる。
【００１８】
（脱離工程）
脱離工程では、検出対象が吸着した基材から検出対象を脱離させる。検出対象を基材から脱離させる方法は特に制限されない。例えば、検出対象を変性（分解等）する方法、検出対象の基材からの脱離を促進する物質（界面活性剤等）と接触させる方法、検出対象に熱又は圧力を加える方法などが挙げられる。
【００１９】
検出対象を変性する場合、その方法は特に制限されない。例えば、検出対象が蛍光性を有する有機化合物と生体由来分子との複合体である場合、この生体由来分子を分解する作用を有する酵素等の化合物を用いて生体由来分子を分解する方法が挙げられる。
【００２０】
検出対象の基材からの脱離を促進する物質として界面活性剤を用いる場合、その種類は特に制限されない。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム（ＳＣ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩等のアニオン性界面活性剤、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等のカチオン性界面活性剤、アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ−１４）、ジメチルアンモニオプロパンスルホネート（Ｃ７ＢｚＯ）等の両性界面活性剤、デオキシコールアミド、ジギトニン等のノニオン性界面活性剤などが挙げられる。界面活性剤は１種を単独で使用しても２種以上を併用してもよい。
【００２１】
検出対象の基材からの脱離は、可逆的（脱離した検出対象が再び基材に吸着する）であっても不可逆的（脱離した検出対象が再び基材に吸着しない）であってもよい。
【００２２】
検出対象の基材からの脱離及びその制御のしやすさの観点からは、脱離工程は、検出対象が吸着した基材と、これを分散又は溶解可能な媒体とを含む試料中で行うことが好ましい。
【００２３】
試料に含まれる媒体の種類は、特に制限されない。安全性及び取り扱い性の観点からは、蛍光検出方法を実施している間に揮発しにくい媒体を用いることが好ましい。このような媒体としては、水又は水とアルコール等の水溶性有機溶媒との混合物が挙げられる。試料に含まれる媒体は１種のみであっても２種以上であってもよい。
【００２４】
試料は、検出対象が吸着した基材と、これを分散又は溶解可能な媒体に加え、その他の物質を含んでもよい。例えば、検出対象が吸着した基材又は基材から脱離した検出対象が媒体中に分散した状態を安定させるための分散剤を含んでいてもよい。
【００２５】
（観察工程）
観察工程では、基材から脱離した検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する。１分子蛍光イメージング法による観察の条件は、所望の検出結果が得られるのであれば特に制限されない。１分子蛍光イメージング法による観察は、例えば、全反射照明蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。
【００２６】
１分子蛍光イメージング法による観察は、基材から脱離した検出対象を含む試料を薄層状にした状態で行うことが好ましい。試料を薄層状にする方法としては、脱離工程を実施した後の試料を１対の光透過性基材（カバーグラス等）の間に注入する方法が挙げられる。この場合、光透過性基材間の距離は、例えば、０．０８０ｍｍ〜０．０９１ｍｍの間で設定することが好ましい。
【００２７】
薄層状にした試料に含まれる検出対象は、光透過性基材の表面に吸着した状態であることが好ましい。これにより、光透過性基材の表面に吸着した状態の検出対象が発する蛍光を、分子レベルで明瞭に観察することができる。
【００２８】
検出対象が光透過性基材の表面に吸着した状態とするためには、上述した脱離工程を、検出対象が吸着した基材と、これを分散又は溶解可能な媒体とを含む試料に界面活性剤を添加して行うことが好ましい。本発明者らの検討の結果、界面活性剤の添加量が光透過性基材への検出対象の吸着量に影響する（界面活性剤の添加量が多くなるにつれて検出対象の吸着量が減少する）ことがわかった。従って、試料に添加する界面活性剤の量を調節することで、１分子蛍光イメージング法による観察に適した状態を作り出すことができる。また、界面活性剤の添加による検出対象の脱離は比較的高速かつ安定的に生じるという意味でも１分子蛍光イメージング法への適合性が高い。
【００２９】
光透過性基材の表面に検出対象が吸着した状態を作り出すうえで好適な界面活性剤の添加量は特に制限されず、試料に含まれる検出対象の量や所望の吸着量により変動するが、例えば、試料中の界面活性剤の濃度が１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲となる量から選択することが好ましい。
【００３０】
１分子蛍光イメージング法による観察を安定的に行う観点からは、脱離工程前に基材に吸着している検出対象の量が、基材から脱離させる検出対象の量よりも多いことが好ましい。こうすることで、脱離工程において基材から脱離させる検出対象の量をより制御しやすくなり、１分子蛍光イメージング法による観察をより安定的に行うことができる。
【００３１】
本発明の蛍光検出方法は、種々の用途に適用することができる。例えば、基材から脱離した検出対象の検出自体を目的とするものであっても、得られた検出結果を他の用途に利用するものであってもよい。他の用途としては、バイオセンシング、スイッチング、イメージング、モニタリング、スクリーニング等が挙げられる。また、検出対象を基材から脱離させる物質の存在の確認等を目的とするものであっても、その結果を他の用途に利用するものであってもよい。
【００３２】
＜蛍光検出装置＞
本発明の蛍光検出装置は、蛍光性を有する検出対象が吸着した基材から前記検出対象を脱離させる工程を制御する制御部と、脱離した前記検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する観察部と、を備え、前記検出対象は、前記基材に吸着しているときは消光した状態であり、前記基材から脱離しているときは発光した状態である。
【００３３】
本発明の蛍光検出装置において、使用される検出対象その他の材料の詳細は、上述した蛍光検出方法において記載したものと同様である。また、基材から検出対象を脱離させる方法及び脱離した検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察する方法の詳細は、上述した蛍光検出方法において記載したものと同様である。
【００３４】
蛍光検出装置が備える制御部は、検出対象の基材からの脱離の状態を制御する。具体的には、基材から脱離した検出対象が１分子蛍光イメージング法による観察に適した状態となるように、脱離の条件を制御する。例えば、基材に吸着した検出対象を脱離させる工程を界面活性剤を用いて行う場合は、基材に吸着した検出対象を含む試料への界面活性剤の添加の状態（添加量、添加速度等）を制御する。
【００３５】
蛍光検出装置が備える観察部は、検出対象が発する蛍光を１分子蛍光イメージング法により観察できるものであれば特に制限されない。例えば、上述した蛍光検出方法において使用される全反射照明蛍光顕微鏡であってもよい。
【００３６】
本発明の蛍光検出装置は、制御部及び観察部に加え、検出結果の定量化、記録等を行うための機構をさらに備えていてもよい。また、得られた検出結果を他の用途に利用するための機構をさらに備えていてもよい。他の用途としては、バイオセンシング、スイッチング、イメージング、モニタリング、スクリーニング等が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明に係る実施形態を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例１＞
（１）使用した材料
基材としては、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ、精製方法：ＨｉＰｃｏ法、ＮａｎｏＩｎｔｅｇｒｉｓ社）を使用した。
検出対象としては、ローダミンＢ（ＲＢ、和光純薬工業株式会社）を使用した。
界面活性剤としては、コール酸ナトリウム（ＳＣ、和光純薬工業株式会社）を使用した。
【００３９】
（２）試料の調製
ＤＮＡの濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶媒（滅菌水）で調整したＤＮＡ溶液にＳＷＮＴの粉末を加え、超音波装置（ＶＣＸ１３０、家田貿易株式会社）を用いて、ＤＮＡが吸着したＳＷＮＴ（ＤＮＡ−ＳＷＮＴ）の分散液を得た。この分散液に対し、ＲＢの最終濃度が１００ｐＭ〜１００ｍＭ、ＳＷＮＴの最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように、ＲＢを溶媒（滅菌水）に溶解して得たＲＢ溶液を添加した。次いで同超音波装置を用いて１時間の超音波処理を施し、ＲＢが吸着したＤＮＡ−ＳＷＮＴを含む試料を調製した。
【００４０】
（３）脱離工程
予めＫＯＨ処理を施した１対のカバーグラスをスペーサを介して対向させ（カバーグラス間の距離：０．０１１ｍｍ）、カバーグラス間の空隙に試料を注入した。次いで、ＳＣを試料中の濃度が５０ｍＭとなるように注入した。
【００４１】
（４）観察工程
試料へのＳＣ注入前とＳＣ注入から２分後のＲＢが発する蛍光を、１分子蛍光イメージング法による観察が可能な蛍光顕微鏡を用いてそれぞれ観察した。その結果、ＳＣ注入前はＲＢの発光に起因する輝点が殆ど観察されなかったが、ＳＣ注入後はＲＢの発光に起因する輝点が多数観察された。
【００４２】
＜実施例２＞
試料へのＳＣ注入量を濃度が１００ｍＭとなるようにした以外は実施例１と同様にして、ＳＣ注入前とＳＣ注入から２分後のＲＢが発する蛍光を観察した。その結果、ＳＣ注入後はＲＢの発光に起因する輝点が観察されたが、その数は実施例１において観察された輝点の数よりも少なかった。
【００４３】
以上の実験から、本発明の蛍光検出方法によればＳＷＮＴから脱離したＲＢが発する蛍光を分子レベルで観察できることがわかった。また、ＳＣ注入後に観察された輝点の数は、実施例１の方が実施例２よりも多かった。この理由としては、実施例２で試料に添加したＳＣの濃度が実施例１よりも高いためにＳＷＮＴから脱離したＲＢのカバーグラス表面への吸着量が少なく、観察可能なＲＢの数が少なかったことが考えられる。従って、１分子蛍光イメージング法による観察を所望の条件で行うにあたっては、試料に添加する界面活性剤の量を調節することが有効であると考えられる。