(57)【要約】      （修正有）【課題】多相混合物から生体分子を含む水相を回収するための方法の提供。【解決手段】生体分子が溶解した水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から生体分子を回収するための方法で、濾過ユニットが、生体分子が溶解した水相は透過させるが炭化水素を含むさらなる液相は透過させない少なくとも１つの親水性濾過材を含み、前記多相混和物を濾過ユニットを通過させることにより生体分子が溶解した水相を回収する方法。前記デバイスが入口および出口を有する中空体を含み，中空体が好ましくはフリットまたはプレートの形態の支持構造によって支えられている親水性濾過材を含む、生体分子を単離および／または精製するためのキットの使用。【選択図】図２
2018068295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子が溶解した水相を、少なくとも前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から回収するための方法であって、任意の対象の生体分子が溶解した前記水相は透過させるが、前記少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相は透過させない濾過ユニットの表面に前記多相混合物の供給液を導くステップを含む方法。
【請求項２】
前記濾過ユニットが、少なくとも１つの親水性濾過材を含む、好ましくは膜、フィルター、フリット、フィルム、フリース、多孔質のモノリシックブロックまたは親水性濾過材の粉末、粒子、ビーズ、顆粒もしくは球体を含む濾床の形態で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記親水性濾過材が、酢酸セルロース、ポリアミド、ポリエーテルスルホンおよびポリフッ化ビニリデンならびにそれらの混合物を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水相を、重力、圧力、真空、吸引、または遠心法によって前記濾過ユニットを通して通過させる、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記多相混合物が、前記水相および前記水相と不混和性のさらなる液相を含有する二相混合物である、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記多相混合物が、ワックスに包埋した生体試料を水性溶解バッファーと接触させ、場合によって前記試料を前記水性溶解バッファーの存在下で加熱することによって得られる、請求項１から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記多相混合物が、
１）ワックスに包埋した生体試料を水と不混和性の有機溶媒を少なくとも１つ含むワックス可溶化剤と接触させるステップと、
２）場合によって、ステップ１で得られた混合物をインキュベートするステップと、
３）前記ワックス可溶化剤をなお含んでいる混合物に水性溶解バッファーを加えるステップと、
４）ステップ３で得られた混合物をインキュベートして、溶解したワックスおよび前記ワックス可溶化剤を実質的に含む少なくとも１つの有機相と、溶解した生体分子を含む水相とを含む多相混合物を得るステップ、
によって得られ、
ステップ１および３は１つの複合ステップとして実施することもできる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、パラフィン包埋試料、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋試料（ＦＦＰＥ試料）であり、前記ワックス可溶化剤が、好ましくは直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカン、オレフィン、またはそれらの混合物を含む群から選択され、より好ましくは直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカンまたはそれらの混合物を含む群から、なおより好ましくはＣ13〜Ｃ16アルカンまたはそれらの混合物を含む群から選択され、最も好ましくはテトラデカン、ペンタデカン、またはヘキサデカンを表す少なくとも１つの有機溶媒を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質分解剤を前記溶解バッファーに加えてステップ３の混合物に加えるか、またはタンパク質分解剤がステップ３の試料に加える前記溶解バッファーにすでに含まれているかのいずれかであり、前記タンパク質分解剤がプロテアーゼおよび非酵素的タンパク質分解性化合物を含む群から選択され、好ましくはプロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ブロモシアン、組換えバチルス属プロテアーゼ、リゾチーム、またはこれらの混合物を表す、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記濾過ユニットを通過させた後に前記水相を収集するさらなるステップ、および場合によって、前記水相から対象の生体分子、好ましくは核酸を表す前記生体分子を検出、分析、単離および／または精製するさらなるステップを含む、請求項１から９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記水相に溶解した前記生体分子を単離および／または精製するステップを、好ましくはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび親和性結合を含む群から選択される少なくとも１つのクロマトグラフィーおよび／または固相に基づく方法によって実施する、請求項１から１０に記載の方法。
【請求項１２】
親水性濾過材、前記親水性濾過材を含むデバイス、または前記デバイスを含むキットの使用であって、前記デバイスは生体分子、好ましくは核酸が溶解した水相を、少なくとも１つの炭化水素化合物、好ましくは直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカン、オレフィン、またはそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの有機溶媒に溶解したワックス、より好ましくはテトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、またはこれらの混合物に溶解したパラフィンを含む、前記水相と不混和性のさらなる液相から回収するためのデバイスである、使用。
【請求項１３】
前記デバイスが入口（６）および出口（７）を有する中空体（５）を含み、前記中空体（５）が、好ましくはフリットまたはふるいプレートの形態の支持構造（８）によって好ましくは支えられている親水性濾過材（３）を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記デバイスが、漏斗、カラム体、シリンジまたは多ウェルブロックを表し、好ましくはスピンカラムを表す、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記キットが、請求項１３または１４に記載のデバイスに好ましくは含まれた親水性濾過材、ならびにキットを使用するための説明書、溶解バッファー、ワックス可溶化剤、タンパク質分解剤、および対象の生体分子をクロマトグラフィーおよび／または親和性結合によって精製するための固相を含む群から選択される少なくとも１つの追加的な構成成分を含む、請求項１２から１４までのいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子が溶解した水相を、少なくとも前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から回収するための方法に関する。本発明は、さらに、親水性濾過材、そのような濾過材を含むデバイスまたは生体分子が溶解した水相を、前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相との混合物から回収するための前記デバイスを含むキットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
長期貯蔵および／または組織学的検査のために、生物検体は、一般に、例えばホルマリンなどの化学的固定液によって試料内のタンパク質の架橋を誘導することによって保護され、したがって、組織の構造および細胞の形態の両方が保護される。固定後、試料は、通常、顕微鏡への適用および／または組織化学的な適用のための検体の切片作製およびマウンティングを可能にするために、ワックス、最も一般的にはパラフィンに包埋される。
【０００３】
近年、ＤＮＡ、ＲＮＡを含めた巨大分子、および、ほんの最近には、タンパク質さえも、そのようなワックス包埋試料から単離し、分析するための方法が開発されてきた。しかし、これらの適用では、通常、任意のさらなるプロセスのステップの前に包埋媒体を試料から除去すること（いわゆる「脱ワックス」／「脱パラフィン」）が必要である。同様に、脱ワックスは多くの組織学的染色プロトコールでも有利である。
【０００４】
伝統的に、脱ワックスは、トルエン、特にキシレンなどの芳香族溶媒の使用を伴う。一般には、新鮮な薄片または顕微鏡スライドにマウンティングした検体を、パラフィンが可溶化するまでキシレンバスに浸漬する。その後のステップにおいて、水を使用する最後の洗浄の前に、試料を例えば溶解バッファーまたは染色溶液などの水性反応物／試薬溶液を利用できるようにするために、脱パラフィンされた検体をアルコール濃度を漸減させた一連のアルコール溶液で洗浄してキシレンを除去するが、キシレンは可燃性、揮発性および毒性の有機溶媒である。このような理由で、過去何年もの間、キシレンをより毒性が少ない脱パラフィン剤で置き換えるためのかなりの試みが行われてきた。組織化学的な適用におけるキシレン置換えの例としては、鉱質およびテルペン油、例えば、ｄ−リモネンなど、および脂肪族またはイソパラフィン系炭化水素が挙げられる（非特許文献１参照）。
【０００５】
同出願人の同時係属の特許文献１には生体分子をワックス包埋試料から抽出する方法であって、生体分子を検出、分析、単離および／または精製するさらなるステップのために生体分子を溶液中に放出させるための試料細胞の溶解を、少なくとも１つの水性溶解バッファーならびにワックス可溶化剤および可溶化したワックスを含む有機相を含む二相系または多相系において実現される方法が記載されている。
【０００６】
別の手法は、包埋した生体試料を水溶液中で単に維持し、次いで、それを包埋媒体の融点を上回る温度でインキュベートして、さらなる処理のために細胞材料を溶液中に放出させる（例えば、特許文献２を参照されたい）。
【０００７】
上述の方法のどちらでも、毒性の脱パラフィン剤の使用および労力を要する洗浄ステップは回避されるが、溶解した、溶融したまたは再凝固した包埋媒体を、生体分子が溶解した水相から物理的に除去するステップは依然として必要である。生体分子が溶解した水相を、前記水相および炭化水素を含む相で形成される二相または多相混合物から回収するステップは、通常、上部の疎水性層をデカンティングすること、いずれかの層を他方から吸引して取ること、または層を互いにピペッティングすることによって実施する。しかし、一方の層を他方から回収するための上述の方法は全て、自動化することができない、または自動化したとしても、いずれにせよ故障が発生しやすい。
【０００８】
一般に、流体から固体材料を分離するためには濾過を使用し、通常、不混和性の液体の混合物を分離するためには従来の濾過ユニット、例えば、フリット、ふるいなどは適していない。
【０００９】
水の除染の分野では、水と炭化水素、例えば油の液体混合物を分離するために、いわゆるクロスフロー濾過（接線流濾過としても公知）が用いられる（例えば、特許文献３および特許文献４を参照されたい）。クロスフロー濾過では、供給液が陽圧でフィルター表面（通常は膜）を接線方向に導かれ、それにより材料の一部が膜の細孔を透過することによって膜を通過することが可能になる。従来のいわゆるデッドエンド濾過では、供給液がフィルター表面上に導かれ、濾液はフィルターを通過して反対側の端から出ていくが、保持液はフィルターの中および／またはその表面上に捕捉される。クロスフロー濾過により、継続的な処理が可能になるが、複数の小試料体積を急速に低費用で処理するためには、特に自動化を考慮するとあまり適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許出願第１０１６５７９９．７号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／４６４６３Ａ２号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，１５８，６８１号明細書
【特許文献４】独国特許第４３００４３８Ｃ１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】アール・ジェイ・ブエサ（R. J. Buesa）、エム・ブイ・ペショフ（M. V. Peshov）、Annals of Diagnostic Pathology 2009、13、246-256
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の問題は、対象の生体分子が溶解した水相を、前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を少なくとも１つ含む多相混合物からを回収するための方法であって、前記生体分子を単離するための完全に自動化された方法の間に使用することができる方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の方法はこの目的を達成する。驚いたことに、多相混合物の供給液を、任意の対象の生体分子が溶解した水相は透過させるが、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相は透過させない濾過ユニットの表面上に導くことによって、対象の生体分子が溶解した水相を、少なくとも前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から高速および信頼できる様式で回収することができることが見いだされた。
【００１４】
したがって、本発明は、対象の生体分子が溶解した水相を、少なくとも前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から回収するための方法であって、任意の対象の生体分子が溶解した水相は透過させるが、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相は透過させない濾過ユニットの表面への多相混合物の供給液を導くステップを含む方法を提供する。特に、本発明の方法は、前記多相混合物から対象の生体分子を単離する方法において用いることができる。
【００１５】
この目的のための最新技術の公知の方法と比較して、本発明の方法は、対象の生体分子が溶解した水相の、例えばＦＦＰＥ試料由来の液化パラフィンのような液化した包埋媒体を含むさらなる液相からの、完全に自動化することができる高速および信頼できる分離を可能にする。同様に、本発明の方法は他の疎水性化合物、例えば脂肪または油を、通常の時間のかかる液−液抽出ステップを回避する１つまたは複数のアルキル溶媒を活用して生体試料から分離するために用いることができる。
【００１６】
本発明に関して、「水相を多相混合物から回収する」という用語は、一方の相を他方の相から物理的（空間的）に分離することを意味し、例えば、エマルションの崩壊だけではない。「多相混合物」という用語は、混合物が、生体分子が溶解した水相を少なくとも１つ、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含むという条件で、２つ、３つ、４つなどの相を含む混合物を包含する。しかし、多相混合物は、３つ以上の異なる相、例えば、水相、ならびに安定なエマルション相または任意の界面相（複数可）である少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相のどちらにも不溶性である固体を表す第３の相を含んでもよい。しかし、ほとんどの場合、および好ましくは本発明の多相混合物は、水相をちょうど１つと、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を１つ含む（任意の界面相とは独立して）液体の二相混合物を表してもよい。
【００１７】
本発明に関して、さらなる液相は、室温（２３℃＋／−２℃）で水と混合した際に均一の溶液が形成されなければ、水と不混和性である。本発明に関して、「少なくとも１つの炭化水素化合物」という用語は、例えばキシレンまたはトルエンなどの芳香族炭化水素を含めた直鎖状および分枝状の脂肪族炭化水素および環状炭化水素を含めた、炭素および水素を含み、好ましくはそれからなる任意の有機化合物を指す。本発明の少なくとも１つの炭化水素化合物は、リモネンなどのテルペンテン（ｔｅｒｐｅｎｔｅｎｅ）、アレーン、好ましくは例えばキシレンもしくはトルエンなどの置換または非置換の単環式および／もしくは二環式の同素環式アレーン、ならびに／または全ての種類の置換または非置換の単環式、二環式および／もしくは多環式の複素環式アレーンならびにそれらの混合物を含めた、直鎖状および環状の、アルカン、１つ、２つ、３つ以上のＣ＝Ｃ二重結合を伴う炭化水素を含むオレフィンを含む群から選択されることが好ましい。好ましくは、前記炭化水素化合物（複数可）は大気圧（１，０１３．２５ｍｂａｒ）下で室温（２３℃＋／−２℃）を上回る沸点を有してよい。
【００１８】
本発明に関して、さらなる液相中に存在する炭化水素化合物は、好ましくは、（１）例えば、テトラデカン、ヘキサデカンまたは鉱油などのアルキル溶媒またはアルキル溶媒の混合物、（２）水相と不混和性であるが、アルキル溶媒を表さない溶融したパラフィンまたは有機溶媒に溶解したパラフィンを表し得る。液相は、アルキル溶媒（１）とそれに溶解したパラフィン（２）の両方（３）を含んでよく、したがって、炭化水素化合物の混合物を含むことがより好ましい。
【００１９】
少なくとも１つの炭化水素化合物（または、炭化水素化合物の混合物がさらなる液相中に存在する場合は炭化水素化合物のそれぞれ）の鎖長は、炭素原子少なくとも６個、より好ましくは炭素原子少なくとも１０個、なおより好ましくは炭素原子少なくとも１４個、最も好ましくは炭素原子少なくとも１６個であり、例えば、それぞれアルキル溶媒として直鎖状非分枝アルカンであるヘキサン、デカン、テトラデカンおよびヘキサデカンに対応することが好ましい。さらなる液相は、対象の生体分子が溶解した水相と不混和性であり、例えば、一般には石油を蒸留することによって調製される室温で固体の主に飽和炭化水素の混合物であるパラフィンなどの、好ましくは異なる炭化水素化合物の混合物、好ましくは鎖長が異なる炭化水素化合物の混合物を含む。前記さらなる液相は、追加的な炭化水素化合物、例えば、直鎖状アルキル溶媒（室温で液体の直鎖アルカン）などを含んでよく、例えば、パラフィンと有機溶媒、例えばヘキサデカンの混合物、または、ヘキサデカン、鉱油、ｄ−リモネンなどのような炭化水素溶媒中パラフィン溶液を表し得る。前記さらなる液相は、炭化水素化合物を表さないが、例えばエステル、アルデヒドなどを表す追加的な構成成分を含んでよいにもかかわらず、前記相中の炭化水素化合物の量は、好ましくは５０％（ｗ／ｗ）を上回ってよく、より好ましくは７５％を上回ってよく、なおより好ましくは９０％を上回ってよく、最も好ましくは９５％を上回ってよい。
【００２０】
生体分子を含む水相を、前記水相と不混和性のさらなる液相から物理的に分離することは、多相混合物の供給液を濾過ユニットの表面上に導くことによって実現される。本発明に関して、濾過ユニットは、支持構造によって支えることができることが好ましい親水性濾過材を少なくとも１つ含む。その代わりにまたはそれに加えて、濾過ユニットは予備濾過（ｐｒｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）構造を含んでよい。したがって、本明細書では、「濾過ユニット」という用語は、（ｉ）親水性濾過材を、（ｉｉ）予備濾過および（ｉｉｉ）
支持構造の一方または両方が存在する場合にはそれと組み合わせて包含する。濾過ユニットに含まれる親水性濾過材により、水相は通過させるがさらなる液相は保持することが可能になる。したがって、油と水の混合物を分離するための最新技術の公知のクロスフロー膜分離技法とは対照的に、供給液は接線様式で膜を通過するのではなく、１５°〜１６５°、好ましくは３０°〜１５０°、より好ましくは４５°〜１３５°、なおより好ましくは７０°〜１１０°の衝突角度で、最も好ましくは基本的に垂直に（９０°＋／−５°の衝突角度）濾過材、例えば膜上に導かれる。
【００２１】
差異は図１および図２に例示されている。クロスフロー濾過（図１）では、供給液（１）はフィルター／膜表面（３）を横切って接線方向に通過し、そこでフローの一部分が膜を透過し、フローから約９０°の角度で分離され（濾液／透過液４）、保持液（２）はフロー（１）と共に膜に沿って運ばれる。
【００２２】
本発明の方法（図２）では、供給液（１）がフィルター／膜表面（３）上に導かれ、濾液（４）はフィルター／膜（３）を通過するが、保持液（２）はフィルターの反対側の側面に捕捉される。
【００２３】
本発明の方法では、水相とさらなる液相との分離は（大部分は）濾過による物理的な分離に基づくことが想定されている。これに基づいて、本発明の方法が吸着プロセスに基づく分離方法と比較して有利であることも明白である。例えば、吸着に基づく方法では、吸着構造、例えば膜は、常に、取り出される化合物の特異的な化学構造を踏まえて吸着／結合構造と化合物との間の吸着／結合相互作用が可能になるように選択しなければならない。さらに、試料から取り出すことができる化合物の量は、通常は吸着／結合構造内の相互作用／結合部位の数によって限定される。対照的に、本発明の方法は、濾過ユニットを特異的に適合させることを必要とせずに多種多様な異なる化学化合物に適用することができる。さらに、本発明の方法は濾過ユニット内のいくつもの可能性のある相互作用／結合部位によって限定されないので、ある程度小さな濾過ユニットを使用して非常に多量の化合物を試料から取り出すことができる。したがって、本発明の方法は、水相から分離される分子の数と、おそらく静電気、イオンおよび／またはファンデルワールスによる相互作用または共有結合によって前記分子と結合／相互作用することができる濾過ユニット内の全ての部位の数の比が１より大きい、１０より大きい、５０より大きい、または、さらには１００より大きいのであれば、同様に適用することができる。
【００２４】
本発明に関して、濾過ユニットは、支持構造によって支えることができることが好ましい親水性濾過材を少なくとも１つ含む。その代わりにまたはそれに加えて、濾過ユニットは、予備濾過構造を含んでよい。
【００２５】
したがって、本明細書では、「濾過ユニット」という用語は、（ｉ）親水性濾過材を、（ｉｉ）予備濾過および（ｉｉｉ）支持構造の一方または両方が存在する場合にはそれと組み合わせて包含する。濾過ユニットに含まれる親水性濾過材により、水相は通過させるが、さらなる液相は保持することが可能になる。
【００２６】
本発明において使用される親水性濾過材は、任意の対象の生体分子が溶解した水相を透過させるが、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相は透過させない。本発明に関して、「任意の対象の生体分子が溶解した水相を透過させる」とは、試料をさらに処理する間に検出、分析、単離および／または精製される任意の生体分子が、水相を、前記濾過ユニットを通して通過させるステップの間に、濾過ユニットの任意の一部分によって／それに実質的にはじかれず、保持されず、吸収されず、結合しないことなどを意味する。膜１ｍｇ当たりに保持される対象の生体分子は０．１μｇ未満であることが好ましい。本発明に関して、濾過材は、さらなる液相を遠心分離機において１，０００×ｇ、好ましくは２，０００×ｇ、より好ましくは３，５００×ｇ、なおより好ましくは５，０００×ｇ、最も好ましくは６，０００×ｇで１分回転させた時に濾過材を通過するのが１００μＬのうち１０μＬ未満、好ましくは５μＬ未満、より好ましくは１μＬ未満、最も好ましくは０．１μＬ未満である場合、前記さらなる液相を透過させない。
【００２７】
濾過ユニットは、少なくとも１つの親水性濾過材を含む、好ましくは膜、フィルター、細孔の直径が小さな（例えば約０．２μｍ）フリット、フィルム、フリース、多孔質のモノリシックブロック、または親水性濾過材の粉末、粒子、ビーズ、顆粒、もしくは球体を含む濾床の形態で含むことが好ましい。親水性濾過材は中空繊維の形態では存在しないことが好ましい。
【００２８】
親水性濾過材は、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）およびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはそれらの混合物、例えばＣＡおよびＰＡの混合物；ＣＡおよびＰＥＳの混合物；ＣＡおよびＰＶＤＦの混合物；ＣＡ、ＰＡおよびＰＥＳの混合物；ＣＡ、ＰＡおよびＰＶＤＦの混合物；ＣＡ、ＰＡ、ＰＥＳおよびＰＶＤＦの混合物；ＰＡおよびＰＥＳの混合物；ＰＡおよびＰＶＤＦ、ＰＡ、ＰＥＳおよびＰＶＤＦまたはＰＥＳおよびＰＶＤＦの混合物を含む群から選択することができることが好ましい。親水性濾過材は酢酸セルロースおよびポリアミドを含む群から選択されることがより好ましい。濾過材の最大孔径は０．４５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．４０μｍ、なおより好ましくは０．３５、０．３０、０．２９または０．２５μｍ、最も好ましくは０．２２μｍである。最小孔径は、好ましくは少なくとも０．０１μｍ、より好ましくは少なくとも０．０５μｍ、なおより好ましくは少なくとも０．１０または０．１５μｍ、最も好ましくは少なくとも０．２０μｍであってよい。
【００２９】
親水性濾過材の厚さは、好ましくは少なくとも１０μｍ、より好ましくは少なくとも２５μｍ、なおより好ましくは少なくとも５０μｍ、特に好ましくは少なくとも７５μｍ、最も好ましくは少なくとも１００μｍであってよい。
【００３０】
親水性濾過材の１ｃｍ2当たりの水の流速は、ＤＩＮ５８３５５に従って圧力差１バールで決定して、好ましくは約５〜５０ｍＬ／分、より好ましくは約１０〜３０ｍＬ／分であってよい。
【００３１】
親水性濾過材の水を用いた泡立ち点は、ＤＩＮ５８３５５に従って室温で決定して、好ましくは約少なくとも２．０バール、より好ましくは少なくとも２．５バール、なおより好ましくは少なくとも２．９バールであってよい。
【００３２】
少なくとも１つの親水性濾過材の層に加えて、本発明の濾過ユニットは、固体粒子が親水性濾過材の表面および／または親水性濾過材を支え、定位置に維持する支持構造を詰まらせることを防ぐために、水相およびさらなる液相の両方を透過させる予備濾過構造を含んでよい。予備濾過構造および支持構造はどちらも、それぞれ独立に、これらに限定されることなく、フリット、ふるいプレートなどの形態で存在し、炭化水素化合物、水相、それに溶解した任意の生体分子、例えば、ポリエチレンなどのいずれにも干渉しない任意の不活性な材料で構成されていてよい。
【００３３】
本発明の方法では、水相を、重力、圧力、真空、吸引、または遠心法によって濾過ユニットを通過させることが好ましい。分離プロセスを加速するために、水相を、これらに限定することなく圧力、真空／吸引または遠心力を適用することによって濾過ユニットを通すことが好ましい。濾過ユニットに適用する力（ｆｏｒｃｅ／ｐｏｗｅｒ）は、分離させる相および使用する濾過材に応じることが好ましい。濾過ユニットが損傷すること、および／またはさらなる液相を透過させるようになることなく妥当なスピードで分離することを可能にする前記力（ｆｏｒｃｅ）の適切な範囲は、日常的な実験によって容易に決定することができる。
【００３４】
上記の通り、多相混合物は、水相および水相と不混和性のさらなる液相を含有する二相混合物であることが好ましい。前記さらなる液相は、好ましくは上記の炭化水素化合物の混合物を含んでよい。
【００３５】
濾過ユニットの表面に導かれる多相混合物は、前記さらなる液相中水相のエマルションまたは逆のエマルション（それぞれｗ／ｏ−エマルションまたはｏ／ｗ−エマルション）を表さないことが好ましい。水相および前記さらなる液相は、互いに物理的には接触しているが実質的に分離した２つの液相の形態で存在することが好ましい。水相およびさらなる液相は、同じ密度を有さないことが好ましく、したがって、２つの相の混合物は、液−液界面相で互いに物理的に接触している２つの別々の層の形態で存在することが好ましい。好ましくはさらなる液相の密度は水相の密度よりも低くてよく、さらなる液相の密度は１ｇ／ｍＬ未満であることがより好ましい。好ましくは多相混合物の５０％超、より好ましくは７５％超、なおより好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超（ｗ／ｗ）が、濾過ユニットの表面と接触させた際にエマルションの形態で存在しないことが好ましい。多相混合物がエマルションとして存在する場合、エマルションを液−液界面相で互いに物理的に接触した２つの別々の層に分離させるために、前記エマルションを濾過ユニットと接触させる前に遠心分離機で回転させることができる。
【００３６】
多相混合物は、ワックスに包埋した生体試料を少なくとも１つの水性溶解バッファーと接触させ、場合によって、前記試料を前記水性溶解バッファーの存在下で加熱することによって得ることができる。
【００３７】
多相混合物は、
１）ワックスに包埋した生体試料を、水と不混和性の有機溶媒を少なくとも１つ含むワックス可溶化剤と接触させるステップと、
２）場合によって、ステップ１で得られた試料をインキュベートするステップと、
３）水性溶解バッファーを、ワックス可溶化剤をなお含んでいる試料に加えるステップと、
４）ステップ３で得られた混合物をインキュベートして、溶解したワックスおよびワックス可溶化剤を実質的に含む少なくとも１つの有機相を少なくとも１つのさらなる液相として、ならびに対象の生体分子が溶解した水相を含む多相混合物を得るステップと
によって得ることができることが好ましく、
ステップ２を省略する場合にはステップ１および３を１つの複合ステップとして実施することもできる。
【００３８】
本発明に関して、「ワックス包埋試料」という用語は、例えば組織化学的もしくはさらなる化学的分析および／または生物学的分析のために調製した、ワックスに包埋した任意の生体試料を含む。そのようなワックスは、通常、高級炭化水素の複合混合物からなり、さらなる構成成分、例えば、高級脂肪酸および／またはグリコールなどのエステルなどを含んでよい。しかし、例えば、ポリエステルワックスなどの、生体試料に対する包埋媒体として使用するために適した、炭化水素に可溶性の任意の他のワックスも同様に使用することができる。ワックスは天然起源および／または合成起源であってよく、その試料包埋性またはワックスの特定の特性を増強または改善する添加物、例えば、少量の有機ポリマー、ＤＭＳＯまたは高級ポリオレフィンなどをさらに含有してよい。好ましくは、ワックスは、一般には石油を蒸留することによって調製される、主に室温で固体である飽和炭化水素の混合物であるパラフィンを表し得る。いわゆる高融解性パラフィンまたは低融解性パラフィンまたはこれらの混合物のどの種類のパラフィンを使用するかには関係なく、本発明の方法、デバイスおよび／またはキットを用いて試料を処理することができる。
【００３９】
好ましくは、試料は、生体試料をホルムアルデヒドを使用して固定した後にパラフィンに包埋した、ホルマリン固定パラフィン包埋試料であってよい。生体試料は、生物体全体、生物体の一部、具体的には、ヒト、動物もしくは植物、または、例えば、細菌、酵母、ウイルスまたは真菌などの微生物に由来する組織断片または組織切片であってよい。細胞培養物から単離した包埋細胞も同様に使用することができる。
【００４０】
溶解バッファーとして、細胞を含有する材料中の細胞を溶解させ／破壊し、したがって、その中に含まれる生体分子を、対象の生体分子を破壊することなく溶液中に放出させることができる任意の水溶液を使用することができる。どの種類の溶解バッファーが対象の生体分子を細胞から放出させるために適するかは細胞型に依存し、当業者に公知である。本発明の方法において使用することができる多くの水性溶解バッファーが最新技術で公知である。包埋試料が固定試料、例えばホルマリン固定試料である場合、前記溶解バッファーは試料中の架橋結合の数を減少させる最新技術の公知の追加的な構成成分を含有してよい。しかし、架橋結合は、架橋結合の数を低下させるための化合物の不在下であっても、例えば約９０℃のインキュベーション温度を適用すれば、上記の実施形態のステップ４によるインキュベーションの間に効率的に除去することができるので、溶解バッファー中にそのような追加的な構成成分が存在することは義務ではない。
【００４１】
本発明の方法のこの実施形態の大きな利点は、試料を脱ワックスするための毒性の化学物質が必要ないという事実である。さらに、溶解したワックスを試料から分離するための労力を要する洗浄ステップまたは特異的に適合させた樹脂は必要ない。さらに、ステップ３において使用する溶解バッファー、ならびに回収された水相を収集した後に水相から核酸を単離および／または精製する任意選択のステップにおいて使用する任意のさらなる試薬および手段は、広範囲の方法および／または手段からほぼ自由に選択可能であり得る。これは、該方法を試料の特定の要件に特異的に適合させることができることを意味する。
【００４２】
ワックス可溶化剤は好ましくは無毒性であってよく、水と不混和性の少なくとも１つの有機溶媒／化合物を含んでよい。ワックス可溶化剤は、少なくとも試料を含むワックスと接触させている間は液体であってよい。好ましくは、前記溶媒は、好ましくは直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカンまたはそれらの混合物を含む群から選択され、より好ましくはＣ10〜Ｃ16アルカンまたはそれらの混合物を含む群から選択され、なおより好ましくはＣ13〜Ｃ16アルカン、またはそれらの混合物を含む群から選択され、最も好ましくはテトラデカン、ペンタデカンまたはヘキサデカンを表し得る炭化水素化合物を表してよい。芳香族溶媒、例えば、キシレン、トルエンまたはそれらの混合物なども同様に使用することができる。脱ワックスのためにワックス包埋試料に適用する、純粋な形態または溶媒の混合物としてのいずれかの任意の溶媒の融点は、それぞれ大気圧において室温（２３±２℃）を下回ることが好ましい。さらに、前記溶媒または溶媒の混合物は、水に可溶性であるべきでない、すなわち水への溶解性が０．０１％（ｗ／ｗ）未満であるべきであり、また水と混和性であるべきでない、すなわち水と混合した際に均一な溶液を形成するべきでない。本明細書では、「純粋な形態」という用語は、予め希釈することおよび／または他の溶媒と混合することなくワックスを溶解させるためにワックス包埋試料に適用する溶媒を指す。しかし、この用語は、溶媒を表さない、さらなる化合物の存在に関して特定の純度の程度には言及しない。溶媒を純粋な形態で試料に適用する場合、その融点は室温を下回ることが好ましい。しかし、融点が室温を上回る「溶媒」が大気圧、室温（２３±２℃）で液体である溶媒の混合物中に存在する場合は、ワックス包埋試料に適用することができる。
【００４３】
好ましくは、溶媒または溶媒の混合物の沸点は大気圧で１５０℃超、より好ましくは２００℃超、最も好ましくは２５０℃超である。沸点が１５０℃超のワックス可溶化剤を選択することにより、一度液化した試料のパラフィンが液体の状態にとどまり、意図されたものではないワックス可溶化剤の蒸発に起因して再凝固することがないことが確実になる。さらに、上記の有機溶媒またはそれらの混合物は、一般に、ステップ３に従って溶解バッファーを加えた後に得られる水相と安定なエマルションを形成する傾向が非常に低いことが見いだされている。これは、驚いたことに、ＳＤＳのような界面活性剤の存在下でさえも真である。さらに、上記の溶媒は、固体パラフィンを室温で数秒以内または長くても数分以内に（好ましくは約１５秒〜約１５分）溶解させることができる。
【００４４】
ワックス可溶化剤に、前記ワックス可溶化剤には可溶性であるが、水には不溶性である色素／着色料、例えば、水に不溶性のアントラキノン溶媒色素、例えば、「ｏｉｌ  ｇｒｅｅｎ」として市販されている１，４−ビス［（４−メチルフェニル）アミノ］−９，１０−アントラセンジオンなどを加えることまたは含めることができる。例えば、およそ０．００３％（ｗ／ｖ）と等しい、ワックス可溶化剤、例えばヘキサデカン約３０ｍＬ中約１μｇほどの少量の「ｏｉｌ  ｇｒｅｅｎ」は有機相に非常に濃い色を与えるためには十分であるが、水相の色は変化しないままであり、これにより、完全な相分離の視覚的制御および水相の回収が著しく容易になる。
【００４５】
ステップ２に従ってワックス包埋試料中のワックス可溶化剤の混合物をインキュベートするステップは、１５〜８５℃、好ましくは２０〜５５℃、より好ましくは室温〜３５℃の範囲内の温度で、最も好ましくは室温で実施することができる。このインキュベーションステップを実施する場合、これは、好ましくは１秒〜３時間、より好ましくは１０秒〜１時間、なおより好ましくは２０秒〜３０分、最も好ましくは３０秒〜５分続いてよい。同様に、ワックス可溶化剤および水性溶解バッファーは、試料に同時にまたは「ほぼ同時に」、すなわち一方のすぐ後に他方を、つまり、脱ワックス剤のすぐ後に溶解バッファー、またはその逆で適用することができる。この場合、任意選択のステップ２は省略し、ステップ１および３を同時にまたは「ほぼ同時に」実施する。
【００４６】
上記のアルカンをワックス可溶化剤として使用する本発明の方法の好ましい実施形態では、水性溶解バッファーをワックス可溶化剤と同時にまたは「ほぼ同時に」試料に加えたとしても、包埋媒体を試料から低温で非常に速くおよび（ほぼ）定量的な様式で回収することができることが特に有利である。その結果、細胞溶解の前の、労力を要し時間のかかる脱ワックスおよび相分離ステップが必要性なくなる。
【００４７】
したがって、いくつかの最新技術の公知の方法とは対照的に、特に、プロテイナーゼによって（まだ）不活化されていないＲＮＡ分解酵素（RNase）およびＤＮＡ分解酵素（DNase）などの核酸消化酵素が試料中に存在する場合に、生体分子、例えば核酸の品質および収率に対して負の影響を及ぼす可能性があるワックスを除去するために温度の上昇および／または長いインキュベーション時間は必要ない。水性溶解バッファーは脱パラフィン試料を包埋試料よりも速くおよび効率的に浸透することができる、すなわち、より短い溶解時間および／またはより低い溶解温度を適用することができるので、溶解の前または溶解と同時にパラフィンを除去することにより、必要な溶解時間が短縮される。それゆえ、生体分子を含む水相の回収が本発明の方法によって高速および信頼できる様式で実現され、したがって、溶解および分離を含めた方法全体が高速になり、自動化されることができる。
【００４８】
上記の通り、水性溶解バッファーを加える前に試料をワックス可溶化剤と接触させてインキュベートすることさえ必要ない。同様に、ワックス可溶化剤および水性溶解バッファーを試料に同時に加えることができる。この場合、試料を、例えば、これらに限定することなく、ボルテックスすること、実験室振とう機で振とうさせること、ピペッティングで上下させる（pipetting up and down）ことなどによって混合して、相の徹底的な接触を確実にすることが好ましい。プロテアーゼなどの追加的な化合物も加えることができる。
【００４９】
さらなる利点は、例えば、キアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）  ＦＦＰＥキットに含まれるバッファー（buffer）  ＡＴＬ、キアシンフォニー（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ）  ＤＮＡキットに含まれるバッファー（buffer）  Ｐ１（どちらもキアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany）から入手可能である）、またはバッファー（buffer）  ＰＢＳなどの最新技術で公知の広範囲の溶解バッファーおよび溶解プロトコールと組み合わせた本発明の方法の普遍的な適用である。溶解バッファーは、例えば、好ましくはトリス、Ｍｏｐｓ、Ｍｅｓ、Ｈｅｐｅｓ、ホウ酸塩、リン酸塩および炭酸塩を含む群から選択される緩衝剤、ならびに、好ましくは非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤、またはこれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含んでよい。より好ましい界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤から選択される。なおより好ましくは、溶解バッファーは、陰イオン性界面活性剤、最も好ましくはドデシル硫酸ナトリウムを含んでよい。さらに非イオン性界面活性物質、例えば、トリトンＸ−１１４（ダウ ケミカル社、ミッドランド、ミシガン、米国（Dow Chemical Co.、Midland、Michigan、USA）、トリトンＸ−１００（ダウ ケミカル社、ミッドランド、ミシガン、米国（Dow Chemical Co.、Midland、Michigan、USA）またはＴｗｅｅｎ２０（メルク、ダームスタット、ドイツ（Merck、Darmstadt、Germany）として市販されている置換されたフェノールまたは糖ポリエトキシレートなど、ならびにカチオン性界面活性物質として、例えば、第四級アンモニウム界面活性物質、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）またはオクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）などを使用することができる。
【００５０】
溶解バッファーは、キレート化剤、還元剤、硫酸アンモニウムなどの無機塩、ｐＨ指示薬およびアジ化ナトリウムなどの安定剤を含む群から選択されることが好ましい１つまたは複数の追加的な物質を含んでよい。好ましくは、溶解バッファーのｐＨは４〜１１、好ましくは７〜１０、最も好ましくは８〜９の範囲内であってよい。
【００５１】
溶解バッファーに加えて、タンパク質分解剤をステップ３の混合物に加えることができる。タンパク質分解剤は、ステップ３の試料に加える溶解バッファー中にすでに含まれていてもよい。前記タンパク質分解剤は、好ましくは、プロテアーゼおよび非酵素的タンパク質分解性化合物を含む群から選択することができ、より好ましくは、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ブロモシアン、例えばキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プロテアーゼリゾチームなどの組換えバチルス属プロテアーゼ、またはこれらの混合物を表し得る。
【００５２】
ステップ４に従って水性溶解バッファーを試料に加えた後に得られる混合物をインキュベートするステップは、好ましくは、５６℃を含めた、１５〜９５℃、好ましくは２０〜７０℃、最も好ましくは３７〜６５℃の範囲内の温度で実施することができる。このインキュベーションは、好ましくは、３０秒〜２４時間、より好ましくは４５秒〜１２時間、なおより好ましくは５０秒〜５時間、最も好ましくは１分〜２時間にわたって実施することができる。しかし、インキュベーションの温度および時間は、どちらも、使用する試料および溶解バッファーの種類、量および経年数で変動してよい。これは当業者には周知であり、最適な溶解条件、特にインキュベートする時間および温度に関する条件は、当業者が日常的な実験によって容易に決定することができる。いくつかの場合には、まず混合物を３７〜６５℃の範囲内の温度で例えば約１分〜約３時間インキュベートし、次いで、場合によって、本発明に従って水相を有機相から回収し、水相を、温度を例えば、約９０℃まで上昇させて例えば約１０分〜約５時間インキュベートする「二段階インキュベーション」手順を実施することが好ましい場合もある。同様に、場合によって、有機相からの水相の回収は、温度を例えば、９０℃などに上昇させてインキュベーションした後に実施することができる。この場合、意図されたものではない水相の蒸発の程度が減少する。
【００５３】
本発明の方法は、濾過ユニットを通過させた後に水相を収集するさらなるステップを含んでよい。濾過ユニットを通過させた後に試料溶液を収集するための手段およびデバイスは最新技術で周知である。該方法は、さらに、前記水相から対象の生体分子を検出、分析、単離および／または精製する任意のステップを含んでよく、検出、分析、単離および／または精製される生体分子に依存する方法、デバイスおよび試薬は当業者には周知である。
【００５４】
本発明に関して、「生体分子」とは、これらに限定することなく、ＤＮＡまたはＲＮＡのような任意の核酸、具体的には直鎖状、分枝状または環状の一本鎖または二本鎖の核酸、より具体的にはｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＡＮ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはリボザイム、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはオルガネラＤＮＡ、合成、改変または標識されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含めた任意のヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；ＰＣＲ−プライマー、ハイブリダイゼーションのための短いＤＮＡまたはＲＮＡの断片；ＰＮＡ（ペプチド核酸）；標識されていないまたは標識された抗体、受容体、ホルモン、増殖因子および修飾されたタンパク質、感染起源の核酸、タンパク質およびペプチドを含めた任意のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸；代謝産物、任意の脂質；糖（単量体、オリゴマーまたはポリマー）；プロテオグリカン；任意の低分子経路産物、シグナル分子、受容体または酵素活性化因子または阻害剤；医薬品および医薬品代謝産物を包含する。
【００５５】
生体分子は核酸を表すことが好ましい。核酸は、好ましくは、これらに限定することなく、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、またはその断片を含めた、天然に存在する、組換え型のおよび／または化学的にまたはバイオテクノロジーによって工学的に作製された、真核生物起源、原核生物起源またはウイルス起源の核酸を含めたリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む群から選択することができる。適切な溶解バッファー、例えば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）（ヒルデン、ドイツ（Hilden、Germany））から市販されているバッファー（buffer）  ＰＫＤなどを使用する場合、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方でさえ、本発明の方法を用いて同じ試料から単離することができる。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ、より好ましくは長さが少なくとも１００ｂｐのＤＮＡを表し得る。
【００５６】
水相に溶解した生体分子を単離および／または精製するステップは、好ましくは、順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、三重らせんアフィニティークロマトグラフィー、結合剤によって媒介されるシリカまたはポリスチレンマトリックス／表面への吸着を含めたカオトロープ媒介性またはカオトロープによらない親和性結合（吸着）を含めた少なくとも１つのクロマトグラフィーおよび／または固相に基づく方法によって実施することができる。好ましくは、少なくとも１つのクロマトグラフィーおよび／または固相に基づく方法は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび親和性結合を含む群から選択することができる。その代わりにまたはそれに加えて、生体分子は、試料中に存在する対象の生体分子または不純物／望ましくないさらなる化合物のいずれかを選択的に沈殿させることによって精製することもできる。対象の生体分子が核酸を表す場合、例えば、タンパク質を、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）などのカチオン性界面活性物質を加えることによって沈殿させることができる。
【００５７】
生体分子を検出、分析、単離および／または精製するためのいくつかのキットが市販されており、その多くは、本発明に従って多相混合物から回収された水相中に存在する生体分子を検出、分析、単離および／または精製するために使用することができる。核酸を単離および／または精製する場合、それらとして、例えば、これらに限定することなく、キアアンプ（QIAamp）、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡおよびキアシンフォニー（QIAsymphony）組織キット（全てキアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））が挙げられる。
【００５８】
本発明は、さらに、親水性濾過材、前記濾過材を含むデバイス、または前記デバイスを含むキットの使用であって、前記デバイスは生体分子、好ましくは核酸またはタンパク質が溶解した水相を、前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含む、好ましくは上記の少なくとも１つの有機溶媒に溶解したワックスを含むさらなる液相から回収するためのデバイスである、使用に関する。有機溶媒は、直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカン、オレフィン、またはそれらの混合物を含む群から選択されることが好ましく、前記さらなる液相は、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、またはこれらの混合物に溶解したパラフィンを表すことがより好ましい。
【００５９】
本発明の方法を実行するためのデバイスは、入口および出口を有する中空体を含み、前記中空体は、好ましくはフリットまたはふるいプレートの形態の支持構造によって好ましくは支えられている親水性濾過材を含む。
【００６０】
親水性濾過材は、好ましくは膜、フィルター、細孔の直径が小さい（例えば約０．２μｍ）フリット、フィルム、フリース、多孔質のモノリシックブロック、または親水性濾過材の粉末、粒子、ビーズ、顆粒、もしくは球体を含む濾床の形態であってよい。親水性濾過材は中空繊維の形態では存在しないことが好ましい。
【００６１】
好ましくは、親水性濾過材は、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）およびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはそれらの混合物、例えばＣＡおよびＰＡの混合物；ＣＡおよびＰＥＳの混合物；ＣＡおよびＰＶＤＦの混合物；ＣＡ、ＰＡおよびＰＥＳの混合物；ＣＡ、ＰＡおよびＰＶＤＦの混合物；ＣＡ、ＰＡ、ＰＥＳおよびＰＶＤＦの混合物；ＰＡおよびＰＥＳの混合物；ＰＡおよびＰＶＤＦ、ＰＡ、ＰＥＳおよびＰＶＤＦまたはＰＥＳおよびＰＶＤＦの混合物を含む群から選択することができる。親水性濾過材は、酢酸セルロースおよびポリアミドならびにそれらの混合物を含む群から選択されることがより好ましい。濾過材の最大孔径は、好ましくは０．４５μｍ、より好ましくは０．４０μｍ、なおより好ましくは０．３５、０．３０、０．２９または０．２５μｍ、最も好ましくは０．２２μｍである。最小孔径は、好ましくは少なくとも０．０１μｍ、より好ましくは少なくとも０．０５μｍ、なおより好ましくは少なくとも０．１０または０．１５μｍ、最も好ましくは少なくとも０．２０μｍであってよい。
【００６２】
親水性濾過材の厚さは、好ましくは少なくとも１０μｍ、より好ましくは少なくとも２５μｍ、なおより好ましくは少なくとも５０μｍ、特に好ましくは少なくとも７５μｍ、最も好ましくは少なくとも１００μｍであってよい。
【００６３】
親水性濾過材の１ｃｍ2当たりの水の流速は、ＤＩＮ５８３５５に従って圧力差１バールで決定して、好ましくは約５〜５０ｍＬ／分、より好ましくは約１０〜３０ｍＬ／分であってよい。
【００６４】
親水性濾過材の水を用いた泡立ち点は、ＤＩＮ５８３５５に従って室温で決定して、好ましくは約少なくとも２．０バール、より好ましくは少なくとも２．５バール、なおより好ましくは少なくとも２．９バールであってよい。
【００６５】
中空体は、プラスチック、金属、ガラス、磁器などのような試料の収集、貯蔵または処理に適した任意の材料製であってよい。該体はプラスチック製であることが好ましく、該体は、これらに限定することなく、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリプロピレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、エチレン−ポリ酢酸ビニル、塩化ビニル、酢酸ビニル共重合体、ポリアセテート、ポリエーテルアルコール、酢酸ビニル共重合体などのような熱可塑性樹脂製であることがより好ましい。
【００６６】
デバイスの入口はデバイスの「上端」にある開口であり、出口はデバイスの「底側」にある開口であることが好ましい。入口と出口は互いと向かい合っていることが特に好ましい。場合によって、デバイスは、デバイスの入口および／または出口を閉鎖するための少なくとも１つの取り外し可能な閉鎖デバイスを含んでよい。中空体は、中空体の内側またはその下端、すなわち出口側に、実質的に供給液中に存在する水相全てが、出口を通って中空体を出る前に親水性濾過材の層を通過しなければならないようにフロー領域に配置された少なくとも１つの親水性濾過材の層を備える。適切な親水性濾過材およびそれらの性質は上に記載されている。
【００６７】
デバイスは、好ましくは親水性濾過材の層の機械的安定性を改善するため、および前記材料を中空体の内側の定位置に保持するために親水性濾過材の層を支える支持構造をさらに含んでよい。前記支持構造は、例えば、フリット、ふるいプレートなどの形態であってよい。デバイスは、さらに、そうでなければ親水性膜を詰まらせる可能性がある、供給液中に存在する固体粒子を保持するために親水性濾過材の上に配置された予備濾過構造を含んでよい。前記予備濾過構造は、フリット、ふるいプレート、フィルターなどの形態であってよい。予備濾過構造ならびに支持構造はどちらも、供給液を形成する多相混合物中に存在する化合物、具体的には対象の生体分子とも溶媒とも共有結合または非共有結合、吸着、化学反応、静電気的相互作用またはイオン性相互作用などによって相互作用しないことが好ましい。本発明に関して、親水性濾過ユニットは、上記の少なくとも１つの親水性濾過材と予備濾過または支持構造の少なくとも１つを兼ね備える。
【００６８】
好ましくは、デバイスは、上記の親水性濾過材または親水性濾過ユニットを備えた漏斗、カラム体、シリンジ、または多ウェルプレート、より好ましくはスピンカラムを表してもよい。本発明のデバイスは、そのような親水性濾過材／親水性濾過ユニットを備えたスピンカラムを表すことが好ましい。
【００６９】
本発明の方法を実行するためのキットは、上記のデバイス内に含まれていることが好ましい親水性濾過材、ならびにキットを使用するための説明書、溶解バッファー、ワックス可溶化剤、タンパク質分解剤および対象の生体分子をクロマトグラフィーおよび／または親和性結合によって精製するための固相を含む群から選択される少なくとも１つの追加的な構成成分を含む。溶解バッファー、ワックス可溶化剤およびタンパク質分解剤は、好ましくは上記のものを表し得る。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】クロスフロー濾過の原理を例示している図である。
【図２】本発明の方法において用いられるデッドエンド濾過の原理を例示している図である。
【図３】中空体（５）、入口（６）および出口（７）を含み、前記中空体（５）が多孔質フリットの形態の支持構造（８）によって支えられている親水性濾過材（３）を備えたスピンカラムである本発明のデバイスの一実施形態を示す図である。
【図４】本発明の方法に従ってＦＦＰＥ組織切片から単離され、精製されたｇＤＮＡを含む４つの試料のＯＤスキャンを示すグラフである（実施例２を参照されたい）。
【図５】上記のＦＦＰＥ試料のゲル電気泳動分析の結果を示す写真である（実施例２）。
【図６】本発明の方法を用いてＦＦＰＥ試料から得られたヒト扁桃ＤＮＡにおけるＫＲＡＳのコドン１２およびコドン１３における突然変異についての分析の結果を示すグラフである（実施例２）。
【図７】本発明の方法を用いて水性溶解バッファーおよびｄ−リモネンとヘキサデカンの混合物から形成されたエマルションの分離を示す写真である（実施例３）。
【図８】本発明の方法を用いて水性溶解バッファーおよびキシレンから形成されたエマルションの分離を示す写真である（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７１】
実施例１
【００７２】
本発明に従ったデバイスの調製
フリットを備えた標準のスピンカラム（キアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））中に、孔径が０．２μｍ（ＯＥ６６、シュライヒャー＆シュエル  マイクロサイエンス社、ダッセル、ドイツ（Schleicher&Schull Microscience GmbH、Dassel、Germany））の酢酸セルロースフィルターを入れ、メスを使用してフィットするように切断した。操作中フィルターを定位置に保持するために、フィルターをプラスチックリングで固定した。
実施例２
【００７３】
ＦＦＰＥ試料からのｇＤＮＡの単離
ラット肝臓由来のＦＦＰＥブロックからの薄片（試料１：薄片１枚、試料２：薄片２枚、試料３：薄片３枚）およびヒト女性扁桃（試料４：薄片１枚）を反応チューブに入れた。各薄片の厚さは１０μｍであった。ヘキサデカンおよび油可溶性色素を含む同時係属出願第１０１６５７９９．７号に記載のワックス可溶化剤２００μＬならびにバッファー（buffer）  ＡＴＬ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））１８０μＬを溶解バッファーとして、ならびにプロテイナーゼＫ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））２０μＬを試料に加えた。試料をボルテックスすることによって混合し、振とうインキュベーターにおいて、５６℃、１，０００ｒｐｍで１時間振とうした。試料を室温、２０，４００×ｇで１分遠心分離した。ホルムアルデヒド誘導性架橋結合を除去するために、次いで試料を約９０℃で１時間インキュベートした。上部の炭化水素層により、このステップの間に水相が蒸発することが回避される。試料を室温まで冷まし、実施例１のスピンカラムに移した。次いで、試料を２，０００×ｇで遠心分離し、そこで水相は親水性濾過ユニットを通過するが、液化パラフィンおよびワックス可溶化剤を含む炭化水素相はカラム内にとどまる。水相を収集し、キアアンプ（QIAamp）  ＦＦＰＥ  ミネルート  ハンドブック（Minelute Handbook）に従い、前記キットで提供されるカラムを使用して精製した。バッファー（buffer）  ＡＴＥ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））１００μＬを使用して試料をミネルート（Minelute）カラムから溶出させ、さらに１００μＬのバッファー（buffer）  ＡＴＥで希釈した後、試料中に存在するｇＤＮＡの量を決定するために光学濃度（ＯＤ）を測定した。結果が、バッファー（buffer）  ＡＴＥ中に希釈したｇＤＮＡ試料についての通常のスペクトルを示す図４に示されている。試料中に存在するｇＤＮＡの量は、
試料１  ６．２μｇのｇＤＮＡ（１０μｍ  ＦＦＰＥラット肝組織の薄片１枚）
試料２  １５．８μｇのｇＤＮＡ（１０μｍ  ＦＦＰＥラット肝組織の薄片２枚）
試料３  ２０．４μｇのｇＤＮＡ（１０μｍ  ＦＦＰＥラット肝組織の薄片３枚）
試料４  ２２．８μｇのｇＤＮＡ（１０μｍ  ＦＦＰＥヒト扁桃組織の薄片１枚）
である。
【００７４】
各試料１０μＬを、２．５μＬのＧｅｌ  Ｒｅｄを含有する０．８％アガロースゲル（５０ｍＬ）上、１×ＴＡＥバッファー中、１００Ｖで４０分にわたって分析した。ブランクバッファーとしてＡＴＥを使用した。結果が、ＦＦＰＥ試料から単離されたｇＤＮＡに典型的なゲルを示す図５に示されている。
【００７５】
本発明の方法を用いてＦＦＰＥ試料から単離された核酸の可能な下流の分析の例として、試料４から得られたｇＤＮＡを、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２およびコドン１３における突然変異について、市販のｔｈｅｒａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ＫＲＡＳ  Ｐｙｒｏ（登録商標）Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ（QIAGEN、Hilden、Germany））を製造者のプロトコールに従って使用したパイロシークエンスによってスクリーニングした。それぞれ試料４由来のｇＤＮＡを１０ｎｇ含有する４つの試料を、コドン１２／１３を標的とするプライマーを使用してＰＣＲで増幅した。アンプリコンをストレプトアビジン  セファロース（Streptavidin Sepharose）（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｂｅａｄｓ上に固定化した。一本鎖ＤＮＡを調製し、パイロシークエンスを実施する。
【００７６】
結果が図６に示されている。４例全てで、突然変異を伴わないＫＲＡＳの野生型コドン１２／１３の典型的なヒストグラムが示されている（比較のために、野生型の理論ヒストグラムも示されている）。これにより、本発明の方法を用いて、さらなる精製を伴わずに下流の分析に使用することができる高品質のＤＮＡをＦＦＰＥ試料から入手することができることがさらに実証されている。
実施例３
【００７７】
水相とｄ−リモネンを含む相の混合物からの前記水相の回収
水性溶解バッファー（５０ｍＭのトリス硫酸塩  ５０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８．５）３００μＬに、シトリソルブ（CitriSolv）（フィッシャー  サイエンティフィック、シャヴェルテ、ドイツ（Fisher Scientific、Schwerte、Germany））２００μＬおよびオイル  グリーン（oil green）を着色料として含むヘキサデカン２００μＬを加えた。二相混合物（図７ａ）をボルテックスしてエマルションを形成させた（図７ｂ）。前記エマルションを実施例１のスピンカラムに移した（図７ｃ）。カラムを１，５００×ｇで２分回転させ、そこで、水相は親水性濾過ユニットを通過するが、ｄ−リモネンおよびヘキサデカンを含む炭化水素相はカラム内にとどまる（図７ｄ）。この実施例により、水相とさらなる液相のエマルションでさえも、本発明の方法によって分離することができることが示される。
【００７８】
親水性ポリアミドフィルター（サルトロン  ポリアミド（Sartolon Polyamid）、孔径０．２μｍ、サルトロリウス、ゲッチンゲン、ドイツ（Sartorius、Gottingen、Germany））を使用して同様の結果が得られた。
実施例４
【００７９】
水相とキシレンの混合物からの前記水相の回収
可視性をよくするために、使用する前に少量のオイル  グリーン（oil green）を加えることによってキシレンを染色した。キシレン２００μＬを水性溶解バッファー（５０ｍＭのトリス硫酸塩、５０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ８．５）と混合した。混合物を、エマルションが形成されるまでボルテックスした（図８ａ）。前記エマルションを、フリットおよび前に実施例３において使用した酢酸セルロース製またはポリアミド製のいずれかの膜のうちの１つを備えたスピンカラムに移した。次いで、カラムを収集チューブに入れ、卓上遠心分離機で３，０００×ｇ、１分回転させた。図８ｂから見ることができるように、どちらの場合でもエマルションが壊れ、水相が有機相とはっきりと分離された。酢酸セルロース膜を使用して得られた結果が図８ｂの左側に示されており、ポリアミド膜を使用して得られた結果が右側に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子が溶解した水相を、少なくとも前記水相、および前記水相と不混和性であり、少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相を含む多相混合物から回収するための方法であって、任意の対象の生体分子が溶解した前記水相は透過させるが、前記少なくとも１つの炭化水素化合物を含むさらなる液相は透過させない濾過ユニットの表面に前記多相混合物の供給液を導くステップを含む方法であって、
前記多相混合物が、ワックスに包埋した生体試料を水性溶解バッファーと接触させ、場合によって前記試料を前記水性溶解バッファーの存在下で加熱することによって得られ、さらに
１）ワックスに包埋した生体試料を水と不混和性の有機溶媒を少なくとも１つ含むワックス可溶化剤と接触させるステップと、
２）場合によって、ステップ１で得られた混合物をインキュベートするステップと、
３）前記ワックス可溶化剤をなお含んでいる混合物に水性溶解バッファーを加えるステップと、
４）ステップ３で得られた混合物をインキュベートして、溶解したワックスおよび前記ワックス可溶化剤を実質的に含む少なくとも１つの有機相と、溶解した生体分子を含む水相とを含む多相混合物を得るステップ、
によって得られ、ステップ１および３は１つの複合ステップとして実施することもでき、
前記試料が、パラフィン包埋試料であり、前記ワックス可溶化剤が、少なくとも１つの有機溶媒を含む、
方法。
【請求項２】
前記濾過ユニットが、少なくとも１つの親水性濾過材を含む、好ましくは膜、フィルター、フリット、フィルム、フリース、多孔質のモノリシックブロックまたは親水性濾過材の粉末、粒子、ビーズ、顆粒もしくは球体を含む濾床の形態で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
記親水性濾過材が、酢酸セルロース、ポリアミド、ポリエーテルスルホンおよびポリフッ化ビニリデンならびにそれらの混合物を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水相を、重力、圧力、真空、吸引、または遠心法によって前記濾過ユニットを通して通過させる、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記多相混合物が、前記水相および前記水相と不混和性のさらなる液相を含有する二相混合物である、請求項１から４までのいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料（ＦＦＰＥ試料）であり、前記ワックス可溶化剤が、直鎖状、分枝状および環状のＣ6〜Ｃ16アルカン、オレフィン、またはそれらの混合物を含む群から選択される少なくとも１つの有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解剤を前記溶解バッファーに加えてステップ３の混合物に加えるか、またはタンパク質分解剤がステップ３の試料に加える前記溶解バッファーにすでに含まれているかのいずれかであり、前記タンパク質分解剤がプロテアーゼおよび非酵素的タンパク質分解性化合物を含む群から選択される、請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過ユニットを通過させた後に前記水相を収集するさらなるステップ、および場合によって、前記水相から対象の生体分子を検出、分析、単離および／または精製するさらなるステップを含む、請求項１から７までのいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記水相に溶解した前記生体分子を単離および／または精製するステップを、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび親和性結合を含む群から選択される少なくとも１つのクロマトグラフィーおよび／または固相に基づく方法によって実施する、請求項１から８に記載の方法。
【請求項１０】
親水性濾過材、前記親水性濾過材を含むデバイス、または前記デバイスを含むキットの使用であって、前記デバイスは生体分子が溶解した水相を、少なくとも１つの炭化水素化合物を含む、前記水相と不混和性のさらなる液相から回収するためのデバイスである、使用。
【請求項１１】
前記デバイスが入口（６）および出口（７）を有する中空体（５）を含み、前記中空体（５）が、フリットまたはふるいプレートの形態の支持構造（８）によって支えられている親水性濾過材（３）を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記デバイスが、漏斗、カラム体、シリンジまたは多ウェルブロックを表す、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記キットが、前記親水性濾過材、ならびにキットを使用するための説明書、溶解バッファー、ワックス可溶化剤、タンパク質分解剤、および対象の生体分子をクロマトグラフィーおよび／または親和性結合によって精製するための固相を含む群から選択される少なくとも１つの追加的な構成成分を含む、請求項１０から１２までのいずれかに記載の使用。