(57)【要約】【課題】  溶液中に含まれる目的粒子を、当該目的粒子を保持可能な凹部を設けた粒子保持手段を用いて、当該目的粒子を個別に回収する方法において、溶液中に目的粒子以外の粒子（夾雑粒子）が多く含まれている場合でも、目的粒子を個別に回収可能な方法および装置を提供すること。【解決手段】  目的粒子を含む溶液を当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法において、粒子保持手段に設ける凹部が連通部を介して隣接した凹部と連通しており、前記連通部が溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、凹部に目的粒子を保持させる工程を誘電泳動力を用いて行なうことで、前記課題を解決する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的粒子を含む溶液を、当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、
前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法であって、
粒子保持手段に設ける凹部は、連通部を介して隣接した凹部と連通しており、
前記連通部は、溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、
前記凹部に目的粒子を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、
前記回収方法。
【請求項２】
粒子保持手段に設ける凹部の上面形状が多角形であり、連通部を当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つと隣接した凹部における当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つとが連通するよう設けた、請求項１に記載の目的粒子の回収方法。
【請求項３】
目的粒子を含む溶液が血液試料であり、目的粒子が腫瘍細胞であり、夾雑粒子が白血球、赤血球、血小板、小胞、細胞デブリから選ばれるいずれか１つ以上である、請求項１または２に記載の目的粒子の回収方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法で回収した目的粒子を、当該目的粒子が有する特徴に基づき検出する、目的粒子の検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で検出した目的粒子を、当該目的粒子を採取する手段で取得する、目的粒子の取得方法。
【請求項６】
溶液中に含まれる目的粒子を保持可能な凹部を複数設け、当該凹部は連通部を介して隣接した凹部と連通しており、当該連通部は前記目的粒子は保持できない一方、当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能な、粒子保持手段と、
前記目的粒子および前記夾雑粒子を保持させるための誘電泳動力を発生させる手段と、を備えた、目的粒子の回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的粒子を含む溶液から当該目的粒子を回収する方法および装置に関する。特に本発明は、目的粒子以外の夾雑粒子が多く含む溶液に対しても、目的粒子を回収可能な方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に同じ種類の目的細胞が含まれていたとしても、当該目的細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる目的細胞から通常得られる情報は、当該目的細胞個々の情報を平均化した情報となるため、当該目的細胞の情報を個々に得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる目的細胞を個々に解析し、当該目的細胞に関する情報を個々に得ることへの関心が高まっている。
【０００３】
溶液中に含まれる目的細胞を個々に解析する例として、血液試料中に含まれる血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、以下ＣＴＣ）の解析があげられる。ＣＴＣはガンの転移や再発に重要な役割を果たすと考えられており、ＣＴＣの解析が可能になると、ガン患者の術後診断や投薬方針を決定することができるため、治療の最適化や効率化につながると考えられる。しかしながら、ＣＴＣは未解明な点が多く、またＣＴＣが有する遺伝子の変異やコピー数変化が個々のＣＴＣで異なるという報告もあるため、ＣＴＣを個々に解析する必要がある（非特許文献２）。
【０００４】
溶液中に含まれる目的細胞を個々に解析可能な手段の一例として、特許文献１に記載の粒子保持手段があげられる。特許文献１に記載の粒子保持手段は、溶液中に含まれる目的粒子を保持可能な凹部を複数設けており、誘電泳動力を発生させることで、目的粒子を前記凹部へ個々に保持し目的粒子を回収することができる。前記粒子保持手段に設けた凹部に保持された目的粒子は、顕微鏡など当該目的粒子が有する特徴を検出可能な手段により検出することで、形態学的分析、組織分析を行なった後、検出した目的粒子をマイクロマニピュレーターなどの採取手段で取得することで、当該目的粒子に含まれる物質（目的粒子が細胞といった生体材料の場合は核酸やタンパク質など）の分析が行なえる。しかしながら、溶液中に目的細胞以外の細胞（夾雑細胞）が多く含まれる場合は、粒子保持手段に設けた凹部に目的細胞と夾雑細胞とが混在した状態で回収されるおそれがあり、目的細胞の正確な検出、取得、解析ができないおそれがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２７３４５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９−２２６５（１９８４）
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，４，８１２−８１３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、溶液中に含まれる目的粒子を、当該目的粒子を保持可能な凹部を設けた粒子保持手段を用いて、当該目的粒子を個別に回収する方法において、溶液中に目的粒子以外の粒子（夾雑粒子）が多く含まれている場合でも、目的粒子を個別に回収可能な方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、目的粒子を保持可能な粒子保持手段の形状を工夫することで、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
目的粒子を含む溶液を、当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、
前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法であって、
粒子保持手段に設ける凹部は、連通部を介して隣接した凹部と連通しており、
前記連通部は、溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、
凹部に目的粒子を保持させる工程を、誘電泳動力を用いて行なう、
前記回収方法である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、粒子保持手段に設ける凹部の上面形状が多角形であり、連通部を当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つと隣接した凹部における当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つとが連通するよう設けた、前記第一の態様に記載の目的粒子の回収方法である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、目的粒子を含む溶液が血液試料であり、目的粒子が腫瘍細胞であり、夾雑粒子が白血球、赤血球、血小板、小胞、細胞デブリから選ばれるいずれか１つ以上である、前記第一または第二の態様に記載の目的粒子の回収方法である。
【００１２】
また本発明の第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法で回収した目的粒子を、当該目的粒子が有する特徴に基づき検出する、目的粒子の検出方法である。
【００１３】
また本発明の第五の態様は、前記第四の態様で検出した目的粒子を、当該目的粒子を採取する手段で取得する、目的粒子の取得方法である。
【００１４】
さらに本発明の第六の態様は、
溶液中に含まれる目的粒子を保持可能な凹部を複数設け、当該凹部は連通部を介して隣接した凹部と連通しており、当該連通部は前記目的粒子は保持できない一方、当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能な、粒子保持手段と、
前記目的粒子および前記夾雑粒子を保持させるための誘電泳動力を発生させる手段と、
を備えた、目的粒子の回収装置である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において粒子とは、溶液中に単独または凝集状態で分散する不溶性物質のことをいう。具体例としては、ビーズ、粉砕用ボール、液晶用スペーサー、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤といった工業材料からなる粒子や、細胞、ウイルス、オルガネラ、小胞といった生体材料からなる粒子があげられる。特に本発明は、前記生体材料からなる粒子の回収に好ましい方法および装置である。
【００１７】
目的粒子が前述した生体材料からなる粒子である場合の、本発明における目的粒子を含む溶液の一例としては、全血、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水、腹腔洗浄液などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料または前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、があげられる。このうち生体試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００１８】
目的粒子を含む溶液が血液試料である場合の、目的粒子の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞があげられる。一方、夾雑粒子は前述した目的粒子以外の粒子であり、具体的には、血液試料中に含まれる細胞である白血球、赤血球、血小板および小胞、ならびにこれら細胞または前述した目的粒子由来のデブリがあげられる。なお本発明における血液試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液検体に限らず、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料や、当該血液検体より分離して得られる、前記血液検体由来の細胞を含む画分も、血液試料に含まれる。
【００１９】
本発明において粒子保持手段に設ける凹部の上面形状（平面図における形状）は、目的粒子を保持できれば特に限定はなく、円形であってもよく、楕円形であってもよく、正方形、ひし形、平行四辺形、六角形、八角形といった多角形であってもよい。また、凹多角形や、凸多角形も前記多角形に含まれる。なお前記凹部を構成する壁面は直線形状または凹形状（例えば、前記凹多角形）とすると、夾雑粒子を後述する連通部へ速やかに効率よく誘導し、前記凹部への夾雑粒子の混入を抑制できるため、好ましい。
前記凹部の大きさは、回収対象である目的粒子の大きさや形状に応じ適宜選択すればよいが、前記凹部の大きさを前記目的粒子が一つだけ保持可能な大きさとすると、その後の目的粒子の形態学的分析（例えば、高速フーリエ変換）、組織型分析、核酸分析、タンパク質分析などの解析が容易に行なえる点で好ましい。例えば目的粒子がＣＴＣ（直径：１０から２５μｍ）の場合は、前記凹部を直径２５μｍから３０μｍの粒子が一つだけ保持可能な大きさとすると好ましい。
【００２０】
本発明において粒子保持手段に設ける凹部は、連通部を介して隣接した凹部と連通している。なお前記凹部の上面形状が多角形の場合、前記連通部は当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つと隣接した凹部における当該多角形の頂点のうちの少なくとも一つとが連通するよう設けると好ましい。当該好ましい連通部の具体例として、前記多角形の頂点のうちの一つと隣接した凹部における前記多角形の頂点のうちの一つとが連通した連通部や、前記多角形の頂点のうちの二以上または全ての頂点と隣接した凹部における前記多角形の頂点のうちの一つとが連通した連通部や、前記多角形の頂点のうちの二以上または全ての頂点と隣接した凹部における前記多角形の頂点のうちの二以上または全ての頂点とが連通した連通部があげられる。前記連通部の幅は、溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能な幅とすればよい。一例として、溶液が血液試料で、目的粒子がＣＴＣ（直径：１０から２５μｍ）で、夾雑粒子が赤血球（直径：７から８μｍ）、白血球（直径：大半は６から１５μｍ）および血小板（直径：１から４μｍ）の場合、連通部の幅は５から１５μｍまでの範囲とするとよく、８から１２μｍまでの範囲とするとより好ましい。前記連通部の長さは特に限定はないものの、長さを長くすると夾雑粒子の前記連通部への保持量が増大する一方、夾雑粒子の前記凹部への混入量は減少するため、好ましいといえる。
【００２１】
また、夾雑粒子が前記連通部への保持量が増大する理由は、本発明における粒子保持手段に設ける凹部には、一様でない不均一な電界（電気力線）が与えられるからである。従って、凹部よりも連通部の方がより面積が小さいため、当該目的粒子は電界の集中する方向（電気力線が密な方向）、つまり凹部よりも連通部の方向へ引き寄せられる。言い換えると、連通部は凹部よりも電界が集中することになり、目的粒子よりも小さい夾雑粒子はより連通部に粒子が引き寄せられやすくなる。
【００２２】
本発明の方法で溶液から回収した目的粒子の検出は、当該目的粒子が有する特徴に基づき行なえばよい。一例として、明視野像、蛍光画像、化学発光画像といった目的粒子の光学的特徴に基づき検出する場合は光学検出器や光学顕微鏡などの光学測定器を用いて検出すればよく、目的粒子の弾性や粘性といった特徴に基づき検出する場合は超音波顕微鏡などの超音波測定器を用いて検出すればよく、放射性同位元素を標識した目的粒子など目的粒子の放射化学的特徴に基づき検出する場合はシンチレーション検出器などの放射線検出器を用いて検出すればよく、目的粒子の熱応答性や熱物性に基づき検出する場合は当該熱応答性や熱物性を検出可能な装置を用いて検出すればよい。具体例として、目的粒子がＣＴＣなどの細胞であり、当該細胞の検出を光学測定器を用いて行なう場合、前記目的細胞を含む溶液を、前記細胞を保持可能な凹部を有した粒子保持手段に導入し、誘電泳動力を用いて前記凹部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などの光学測定器で観察すればよい。その際前記凹部の下面は、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で被覆してもよい。
【００２３】
前述した方法で検出した目的粒子は、光ピンセット、誘電泳動力を発生させる手段、マイクロマニピュレーションなどの採取手段を用いることで、当該目的粒子を取得できる。目的粒子が細胞などの生体材料の場合、前記取得した目的粒子は、当該目的粒子中の核酸やタンパク質などの分析が行なえる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、目的粒子を含む溶液を当該目的粒子を保持可能な凹部を複数設けた粒子保持手段に導入する工程と、前記凹部に前記目的粒子を保持させる工程とを含む、目的粒子の回収方法において、粒子保持手段に設ける凹部が連通部を介して隣接した凹部と連通しており、前記連通部が溶液中に含まれる目的粒子は保持できない一方、溶液中に含まれる当該目的粒子以外の夾雑粒子は保持可能であり、凹部に目的粒子を保持させる工程を誘電泳動力を用いて行なうことを特徴としており、溶液中に含まれる目的粒子を、夾雑粒子の影響を受けることなく、粒子保持手段に設けた凹部に保持させることができる。従って、個々の目的粒子の正確な検出、取得、解析が行なえる。
【００２５】
特に本発明は、溶液中に含まれる目的粒子数が少なく、かつ夾雑粒子数が当該目的粒子数と比較して極めて多い場合に有用であり、例えば、本発明を血液中に含まれる血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出に適用することで、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上し、精度高くガンを診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の粒子回収装置の一態様を示した図（分解図）である。ただし、凹部同士を連通する連通部の記載は省略している。
【図２】図１に示す粒子回収装置の正面図である。
【図３】図１に示す粒子回収装置に備える粒子保持手段の一態様を示した図である。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のうちａ）の領域を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２８】
本発明の粒子回収装置の一態様を図１に示す。また図１に示した粒子回収装置の正面図を図２に示す。なお図１および図２では、凹部１６１同士を連通する連通部の記載は省略している。
【００２９】
図１に示す粒子回収装置１００は、
貫通部１１１ａを有した平板上の遮光部材１１１と、貫通部１１２ａを有した平板上の絶縁体１１２から構成される凹部壁面部材１１０と、
凹部壁面部材１１０の上部に密着して設けた、導入口１２１、排出口１２２および貫通部１２３を有した平板上のスペーサ１２０と、
凹部壁面部材１１０の下部およびスペーサ１２０の上部を密着して挟むよう設けた電極１３１・１３２と、
電極１３１・１３２同士を接続する導線１４０と、
電極１３１・１３２に信号を印加する信号発生器１５０と、
を備えている。遮光部材１１１が有する貫通部１１１ａと絶縁体１１２が有する貫通部１１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通部の位置が一致するよう遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けている。貫通部１１１ａ、貫通部１１２ａおよび遮光部材１１１の下部に密着して設けた電極１３１により凹部１６１が構成され、導入口１２１から目的粒子２００を含む液体を導入すると、貫通部１２３を通じて凹部１６１へ目的粒子２００が導入される。電極１３２はスペーサ１２０上部に密着して設けており、導入口１２１から導入した、粒子を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお凹部１６１に保持した粒子の回収を容易にするため、電極１３２はスペーサ１２０から取り外し可能な構造となっている。
【００３０】
図１に示す粒子回収装置１００のうち、電極１３１、遮光部材１１１および絶縁体１１２から構成される粒子保持手段１６０の一態様を図３に示す。図３に示す粒子保持手段１６０には、目的粒子を保持可能な凹部１６１と、目的粒子は保持できない一方、夾雑粒子は保持可能な、凹部１６１同士を連通する連通部１６２とを設けている（図３（Ｂ））。凹部１６１の上面形状（平面図における形状）は一辺３０μｍの正方形を４５度回転した形状であり、その深さは４０μｍである。凹部１６１同士の間隔（隣接する凹部の中心間距離）は５０μｍである。なお連通部１６２の幅は１０μｍである。
【００３１】
次に本発明の粒子回収装置を用いた目的粒子の回収方法の一例を説明する。
【００３２】
図１に示す粒子回収装置１００に設けた導入口１１３ａから目的粒子２００を含む液体を導入し、誘電泳動力を利用して目的粒子２００を凹部１６１へ導入させる。具体的には、信号発生器１５０から電極１３１・１３２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力を発生させ、凹部１６１へ目的粒子２００を導入する。なお目的粒子２００以外の粒子（夾雑粒子）のうち、目的粒子よりも径が小さい粒子は連通部１６２へ優先的に導入される。その理由は、連通部１６２に働く誘電泳動力は凹部１６１に働く誘電泳動力よりも大きい一方、連通部１６２の幅は目的粒子２００よりも狭く、目的粒子２００が連通部１６２に導入される可能性は低いためである。一方、目的粒子よりも径が大きい夾雑粒子は凹部１６１および連通部１６２には導入されないため、その後行なう洗浄工程により粒子回収装置１００系外へ排出される。
【００３３】
粒子が細胞である場合、図１に示す粒子回収装置１００に導入する目的細胞を含む液体は、誘電泳動力で目的細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、目的細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に目的細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。信号発生器１５０から電極１３１・１３２へ印加する交流電圧は、凹部１６１に保持された目的細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解後、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
（２）イミダゾリジニル尿素２ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２ｇ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１００ｍｇ、および塩化ナトリウム６００ｍｇを、超純水１００ｍＬに溶解し、得られた溶液を安定化剤として用いた。
（３）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に（２）で調製した安定化剤３ｍＬを添加し、得られた溶液を保存処理した希釈血液試料とした。
（４）保存処理した希釈血液試料を室温で１０分放置し、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した後、チューブ内で密度１．０８６ｇ／ｍＬの密度勾配溶液上に重層し、室温で２０００×ｇで１０分間遠心した。
（５）遠心後、目的粒子の位置する画分を含む溶液を５０ｍＬ容量の容器に回収した。
（６）回収後数分以内に０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップ後、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊され、分離回収した粒子の観察が良好になる。
（７）遠心後の上清を除去した後、粒子ペレットを、（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
（８）再懸濁液を３００×ｇで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、再度、粒子ペレットを、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血液成分を除去し、目的粒子（本実施例ではＣＴＣなどの腫瘍細胞（直径：１０から２５μｍ））を濃縮するための操作である。
（９）（８）で上清を除去した粒子懸濁液を、図１および図２に示す粒子回収装置１００に導入し、信号発生器１５０から電極１３１・１３２へ交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚ、矩形波）を３分間印加することで粒子回収装置１００が有する凹部１６１に粒子を保持させた。図１および図２に示す粒子回収装置１００に備える粒子保持手段は図３に示す粒子保持手段１６０を用いた。具体的には、上面形状（平面図における形状）が一辺が３０μｍの正方形を４５度回転したひし形であり深さが４０μｍである凹部１６１を上下左右５０μｍの間隔（中心間距離）で格子状に配置し、当該ひし形の頂点同士が連通するよう幅１０μｍ、深さ４０μｍの連通部１６２を設けた。また粒子回収装置１００に備えるスペーサー１２０の厚さは１ｍｍとした。
（１０）粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率を算出した。なお本実施例で用いた血液試料は健常人由来の試料であり、目的粒子である腫瘍細胞（ＣＴＣ）は含まれていない。従って、本実施例で凹部に保持された粒子は目的粒子以外の夾雑粒子（具体的には、前記（４）から（８）に示す前処理操作を行なっても残存する、白血球（直径：大半は６から１５μｍ）、赤血球（直径：７から８μｍ）、血小板（直径：１から４μｍ）、小胞、細胞デブリといった血液試料中に含まれる夾雑細胞）であり、算出した導入率は夾雑粒子の凹部への混入率となる。
【００３６】
比較例１
実施例１（９）において、交流電圧を印加しない他は、実施例１と同様な方法で、（夾雑）粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率（夾雑粒子の混入率）を算出した。
【００３７】
比較例２
実施例１（９）において、粒子保持手段を連通部を設けない手段（具体的には、図３に示す粒子保持手段１６０のうち連通部１６２を除いた手段）とした他は、実施例１と同様な方法で、（夾雑）粒子が保持された凹部数を計測し、全体の凹部数で除することで凹部への粒子の導入率（夾雑粒子の混入率）を算出した。
【００３８】
実施例１ならびに比較例１および２での凹部への粒子の導入率（夾雑粒子の混入率）の結果をまとめて表１に示す。実施例１の条件での夾雑粒子の混入率１１．４％と低い結果だが、誘電泳動力を発生しない条件（比較例１）では、混入率５３．９％と高い結果となった。このことから、誘電泳動力によって、連通部へより強く夾雑粒子が引き寄せられ、夾雑粒子の凹部への混入率が減少したことがわかる。また粒子保持手段に連通部を設けない場合（比較例２）も、混入率が４４．５％と高い結果となり、連通部を設けないと、凹部に多く夾雑粒子が混入することがわかる。
【００３９】
【表１】
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実施例２
（１）目的粒子としてヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から剥離し、チューブに回収した。回収後、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。
（２）（１）のＳＫＢＲ３細胞数が約１００から１５０個となる様に調整後、実施例１（２）の安定化剤を等量添加し、得られた溶液を保存処理した目的粒子懸濁液とした。
（３）保存処理した目的粒子懸濁液を室温で１０分放置し、１０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、粒子ペレットを、実施例１（１）のＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液１ｍＬで再懸濁した。
（４）（３）で上清を除去した粒子懸濁液を用いる他は、実施例１（９）と同様の方法で粒子回収装置に導入した。
（５）ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を、図１および図２に示す粒子回収装置１００（粒子保持手段１４０は図３に示す手段を使用）へ２回導入した。
（６）凹部に保持されたＳＫＢＲ３細胞数を計測し、粒子保持装置へ導入した目的粒子懸濁液中に含まれるＳＫＢＲ３細胞数で除することで、凹部へのＳＫＢＲ３細胞（目的粒子）の保持率を算出した。
【００４０】
比較例３
（１）実施例２（５）において、粒子回収装置１００に備える粒子保持手段１６０を連通部を設けない手段（具体的には、図３に示す粒子保持手段１６０のうち連通部１６２を除いた手段）とした他は、実施例２と同様な方法で、凹部に保持されたＳＫＢＲ３細胞数を計測し、粒子保持装置へ導入した目的粒子懸濁液中に含まれるＳＫＢＲ３細胞数で除することで、凹部へのＳＫＢＲ３細胞（目的粒子）の保持率を算出した。
【００４１】
実施例２および比較例３でのＳＫＢＲ３細胞（目的粒子）の保持率の結果を表２に示す。実施例２の条件での保持率は１００％と、比較例３の条件での保持率９９．０％と同様に高い保持率となっており、粒子保持手段に連通部を設けても目的粒子であるＳＫＢＲ３細胞の凹部への保持率に変化は見られなかった。
【００４２】
【表２】
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【符号の説明】
【００４３】
１００：粒子回収装置
１１０：凹部壁面部材
１１１：遮光部材
１１２：絶縁体
１１１ａ、１１２ａ：貫通部
１２０：スペーサ
１２１：導入口
１２２：排出口
１２３：貫通部
１３１、１３２：電極
１４０：導線
１５０：信号発生器
１６０：粒子保持手段
１６１：凹部
１６２：連通部
２００：目的粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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