(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物が生産するプロジギニンを大量に生産する方法の提供。【解決手段】プロジギニンを生産できる微生物を、色素及び固体化担体を含有する発酵培地に接種して、混合物を形成する工程と、前記混合物を発酵培養して、プロジギニンを含有する発酵培養物を得る工程と、を備えるプロジギニンの生産方法。前記発酵培養している期間に、混合物に対して電磁波照を行い、発酵培養物に含有する、プロジギニンを純化する工程を含む、プロジギニンの生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロジギニンを生産できる微生物を、色素及び固体化担体を含有する発酵培地に接種して、混合物を形成する工程と、
前記混合物を発酵培養して、プロジギニンを含有する発酵培養物を得る工程と、を備えることを特徴とするプロジギニンの生産方法。
【請求項２】
前記混合物を発酵培養している期間に、前記混合物に対して電磁波照射を行うことを特徴とする請求項１に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項３】
前記発酵培養物に含有するプロジギニンを純化する工程を更に備えることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項４】
プロジギニンとしては、ウンデシルプロジギニン、プロジギオシン、２−メチル−６−メトキシプロジギニン、ブチル−ｍ−シクロヘプチル−プロジギニン、２−メチル−３−プロピル−６−メトキシプロジギニンからなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項５】
前記電磁波照射としては、マイクロ波照射、レーザー照射からなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項２に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項６】
前記色素としては、カロテノイド、葉緑素、紅麹色素、アナトー、カプサンチン、カンタキサンチン、リコピン、紫蘇色素、ケルセチン、アピゲニンからなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項７】
プロジギニンを生産できる前記微生物としては、ストレプトマイセス属の種、セラチア属の種、シュードモナス属の種からなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項８】
プロジギニンを生産できる前記微生物としては、ストレプトマイセス・セリカラー、セラチア・マルセッセンス、セラチア・ルビデア、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ロンギスポルス・フラバス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・マグネシオルブラからなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項７に記載のプロジギニンの生産方法。
【請求項９】
前記固体化担体としては、活性炭、アルギン酸カルシウムビーズ、シリカゲル、粘土れんが、ゼオライト、セラミック、骨炭、樹脂、木材チップ、コークス、もみ殻、綿、トウモロコシの茎からなる群より少なくとも１つ選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載のプロジギニンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロジギニンの生産方法に関し、その方法において、プロジギニンを生産できる微生物を色素及び固体化担体を用いて発酵培養することに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロジギニン（ｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）は、主にストレプトマイセス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）［例えば、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・ロンギスポルス・フラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ ｆｌａｖｕｓ）］、セラチア属の種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．）［例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・ルビデア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）］、シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）［例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・マグネシオルブラ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｇｎｅｓｉｏｒｕｂｒａ）］などの微生物から生産する赤い色素である。
【０００３】
一般のプロジギニンとしては、ウンデシルプロジギニン（ｕｎｄｅｃｙｌｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）、ブチル−ｍ−シクロヘプチル−プロジギニン（ｂｕｔｙｌ−ｍ−ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｙｌ−ｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）、２−メチル−３−プロピル−６−メトキシプロジギニン（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｒｏｐｙｌ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）、２−メチル−３−ペンチル−６−メトキシプロジギニン（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｅｎｔｙｌ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）［別名：プロジギオシン（ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ）］が挙げられる。
【０００４】
非特許文献１〜４によれば、プロジギニンには、抗がん（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ）、抗菌（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ）、抗真菌（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）、抗マラリア（ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ）、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）、抗酸化（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）などの活性を有することが既に知られている。プロジギニンの医薬領域における効果に基づいて、広い市場の需要を満足するために、本技術分野の研究者はプロジギニンを大量生産できる方法の開発を目指している。
【０００５】
微生物発酵は、生産コストが低く、生産スピードが速く、安全性が高いなどの利点を有する、工業用物質または医薬用物質を生産する方法である。従って、微生物発酵の技術は、プロジギニンの生産に広く使用されている。例えば、非特許文献５において、Ｇｉｒｉ Ａ．Ｖ．らは、土壌から分離されたセラチア・マルセッセンスを、ニュートリエントブロス（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）とパウダー状ゴマシードブロス（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｓｅｓａｍｅ ｓｅｅｄ ｂｒｏｔｈ）とパウダー状ピーナツシードブロス（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｐｅａｎｕｔ ｓｅｅｄ ｂｒｏｔｈ）とそれぞれに接種し、それぞれのプロジギオシンの生産量を比較した。その実験の結果、パウダー状ピーナツシードブロスで培養されたセラチア・マルセッセンスは、より高い産量のプロジギオシンを得られる。
【０００６】
非特許文献６において、作者はセラチア・マルセッセンスを、固体化担体とする活性炭を添加した発酵培地、固体化担体とするスポンジを添加した発酵培地、固体化担体とするヘチマたわしを添加した発酵培地、固体化担体とするアルギン酸ビーズ（ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄ）を添加した発酵培地それぞれに発酵培養し、そして、それぞれのプロジギオシンの生産量を分析した。その実験の結果によれば、固体化担体を添加していない発酵培地と比べると、固体化担体とするアルギン酸ビーズを添加した発酵培地のみ、セラチア・マルセッセンスの発酵を促進してプロジギオシンを生産することができる。
【０００７】
非特許文献７において、Ｓｈｒｅｙａ Ｒ．らは、低出力マイクロ波照射がセラチア・マルセッセンスの成長及びプロジギオシンの生産量に与える影響を研究した。その実験の結果によれば、２分間のマイクロ波照射及び４分間のマイクロ波照射は、セラチア・マルセッセンスの成長に顕著な影響がないが、プロジギオシンの生産量が激しく減少した。６分間のマイクロ波照射は、セラチア・マルセッセンスの成長が明らかに阻害された上、プロジギオシンの生産量も減少し、特に後者に与える影響が大きかった。しかし、Ｓｈｒｅｙａ Ｒ．らは、６分間のマイクロ波照射の実験を三回繰り返すうちに、一回の実験における培養物のプロジギオシンの生産量が顕著に増加し、Ｓｈｒｅｙａ Ｒ．らは更に、該培養物の中にプロジギオシンの生産量がマイクロ波照射されていない菌株より多い突然変異株を分離した。しかし、該突然変異株のプロジギオシンを大量生産できる特性は、その娘個体群（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）に維持されないので、そのマイクロ波照射による突然変異は可逆突然変異と判る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｎ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５６：９７１−９８９
【非特許文献２】Ｖａｉｓｈｎａｖ Ｐ． ａｎｄ Ｄｅｍａｉｎ Ａ．Ｌ． （２０１０）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｄｖ．， ２９：２２３−２２９
【非特許文献３】Ｐａｐｉｒｅｄｄｙ Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２０１１）， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５４：５２９６−５３０６
【非特許文献４】Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ Ｋ． ａｎｄ Ｊａｇａｔｈｙ Ｋ． （２０１６）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｄｖ． Ｒｅｓ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．， ３：７５−８８
【非特許文献５】Ｇｉｒｉ Ａ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２００４）， ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４：１１
【非特許文献６】台湾元智大学バイオテクノロジー及びバイオエンジニアリング大学院の余宛儒（よえんじゅ）著の修士論文“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｄｒｕｇｓ−ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ ｂｙ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｃ３″
【非特許文献７】Ｓｈｒｅｙａ Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１４）， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５：４−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、既に様々のプロジギニンの生産に関する研究が存在しているが、まだプロジギニンの生産量が市場の需要を満足できないので、プロジギニンを更に大量生産できる技術が必要とされている。
【００１０】
従って、本発明は、プロジギニンの生産方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成すべく、本発明は、プロジギニンを生産できる微生物を、色素及び固体化担体を含有する発酵培地に接種して、混合物を形成する工程と、前記混合物を発酵培養して、プロジギニンを含有する発酵培養物を得る工程と、を備えることを特徴とするプロジギニンの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
上記の生産方法によれば、従来より大量のプロジギニンを生産できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明をより詳細に説明する前に、本願開示における「含有する」とは、「含むがそれらに限らない」という意味であることを理解されたい。
【００１４】
また、この明細書に引用されている先行技術文献は、日本、台湾及び他の国において発明が属する技術分野の通常の知識を有する者（以下、当業者と称する）における一般常識ではないことを理解されたい。
【００１５】
特に定義していない限り、本明細書にて使用するあらゆる技術的または学術的用語は、当業者が一般に認識している意味で用いている。当業者の技術範囲内において、本明細書に記載されている材料または方法と類似または同等の効果を有する材料または方法によっても、本発明を実施できる。本発明は、本明細書に記載されている内容に限定されない。
【００１６】
プロジギニンを大量生産できる方法を開発するために、本出願人は鋭意検討を行った。その結果、色素及び固体化担体を使用して、プロジギニンを生産できる微生物を発酵培養することにより、プロジギニンの生産を促進することができ、そして、その発酵培養期間に、マイクロ波照射またはレーザー照射を行うことにより、プロジギニンの生産量が顕著に増えることを見出した。
【００１７】
従って、本発明は、プロジギニンを生産できる微生物を、色素及び固体化担体を含有する発酵培地に接種することにより混合物を形成する工程と、前記混合物を発酵培養して、プロジギニンを含有する発酵培養物を得る工程と、を備える。
【００１８】
本発明に適用するプロジギニンを生産できる微生物として、例えばストレプトマイセス属の種（例えば、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ロンギスポルス・フラバス）、セラチア属の種（例えば、セラチア・マルセッセンス、セラチア・ルビデア）、シュードモナス属の種（例えば、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・マグネシオルブラ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の実施例１では、ストレプトマイセス・セリカラーをプロジギニンを生産できる微生物とし、本発明の実施例２では、セラチア・マルセッセンスをプロジギニンを生産できる微生物とし、本発明の実施例３では、セラチア・ルビデアをプロジギニンを生産できる微生物とする。
【００１９】
本発明により生産するプロジギニンとして、例えばウンデシルプロジギニン、プロジギオシン、２−メチル−６−メトキシプロジギニン、ブチル−ｍ−シクロヘプチル−プロジギニン、２−メチル−３−プロピル−６−メトキシプロジギニン及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の実施例１では、ウンデシルプロジギニンをプロジギニンとし、本発明の実施例２では、プロジギオシンをプロジギニンとし、本発明の実施例３では、２−メチル−６−メトキシプロジギニンをプロジギニンとする。
【００２０】
本発明に適用する色素として、例えばカロテノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）、葉緑素（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）、紅麹色素（ｍｏｎａｓｃｕｓ ｃｏｌｏｒ）、アナトー（ａｎｎａｔｔｏ）、カプサンチン（ｃａｐｓａｎｔｈｉｎ）、カンタキサンチン（ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ）、リコピン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）、紫蘇色素（ｓｈｉｓｏｎｉｎ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の実施例１では、カロテノイドを色素とし、本発明の実施例２では、葉緑素を色素とし、本発明の実施例３では、紅麹色素及びアナトーの混合物を色素とする。
【００２１】
本発明に適用する固体化担体として、例えば活性炭（ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｎ）、アルギン酸カルシウムビーズ（ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄｓ）、シリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ）、粘土れんが（ｃｌａｙ ｂｒｉｃｋ）、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｅ）、セラミック（ｃｅｒａｍｉｃ）、骨炭（ｂｏｎｅ ｃｈａｒ）、樹脂（ｒｅｓｉｎ）、木材チップ（ｗｏｏｄ ｃｈｉｐ）、コークス（ｃｏｋｅ）、もみ殻（ｒｉｃｅ ｈｕｓｋ）、棉（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシの茎（ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の実施例１では、活性炭を固体化担体とし、本発明の実施例２では、アルギン酸カルシウムビーズを固体化担体とする。
【００２２】
本明細書で使う「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ） 」、「養成（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ） 」、「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） 」との用語は、互いに交換して使用することができる。最大の培養効果を得るために、発酵培養の操作プロセスとパラメータ（例えば、温度、時間、振動率、溶存酸素量など）は、使用する微生物により変動する。その変動は、当業者であれば適宜に選択でき、また、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７及び中国特許出願公開第１０３６２７７４７Ａ号明細書の内容を参考することもできる。
【００２３】
本発明の発酵培養は、温度が２０℃〜３７℃の範囲内で行う。一部の実施例において、発酵培養は、温度が２６±２℃〜３０±２℃の範囲内で行う。
【００２４】
本発明の発酵培養の時間は、１２時間〜４８時間の範囲内に設定できる。一部の実施例において、発酵培養の時間は４０時間に設定する。
【００２５】
本発明の発酵培養は、振動率が１００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの範囲内で行う。一部の実施例において、発酵培養は、振動率が１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍの範囲内で行う。
【００２６】
本発明の発酵培養は、溶存酸素量が０．０５ｍＬ/分〜０．５ｍＬ/分の範囲内で行う。一部の実施例において、発酵培養は、溶存酸素量が０．１５ｍＬ/分〜０．２５ｍＬ/分の範囲内で行う
該発酵培養に使用する発酵培地は、プロジギニンを生産できる微生物の成長に好適の炭素源（ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ）、窒素源（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ）及び無機塩などの物質を含有する。それらの炭素源、窒素源及び無機塩の選択は、当業者の専門且つ一般的技術である
一部の実施例において、発酵培養期間に、混合物に対して電磁波照射を行って、混合物における微生物の集合を低減する。電磁波照射として、例えばマイクロ波照射（ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）、レーザー照射（ｌａｓｅｒ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の一部の実施例では、マイクロ波照射を電磁波照射とし、本発明の他の一部の実施例では、レーザー照射を電磁波照射とする。
【００２７】
マイクロ波照射またはレーザー照射などの電磁波照射の操作条件は、最良の照射効果が得られるように、プロジギニンを生産できる微生物により変動できる。電磁波照射の操作条件の選択は、当業者の専門且つ一般的技術である。
【００２８】
例えば、ストレプトマイセス・セリカラーでウンデシルプロジギニンを発酵生産する際に、その発酵培養の期間に、混合物に対して、出力が１Ｗ〜４０Ｗの範囲内にあり且つ周波数が９１５ＭＨｚ〜２５００ＭＨｚの範囲内にあるマイクロ波照射を行い、或は、波長が５２０ｎｍ〜５４０ｎｍの範囲内にあるレーザー照射を行う。一部の実施例において、マイクロ波照射は１０秒〜１２０秒間行うことができ、一部の実施例において、レーザー照射は１０秒〜４０秒間行うことができる。
【００２９】
セラチア・マルセッセンスでプロジギオシンを発酵生産する際に、その発酵培養の期間に、混合物に対して、出力が１Ｗ〜１０Ｗの範囲内にあり且つ周波数が２４００ＭＨｚ〜２５００ＭＨｚの範囲内にあるマイクロ波照射を行い、或は、波長が５８０ｎｍ〜５９０ｎｍの範囲内にあるレーザー照射を行う。一部の実施例において、マイクロ波照射は６０秒〜４８０秒間行うことができ、一部の実施例において、レーザー照射は９０秒〜５４０秒間行うことができる。
【００３０】
セラチア・ルビデアで２−メチル−６−メトキシプロジギニンを発酵生産する際に、その発酵培養の期間に、混合物に対して、出力が０．５Ｗ〜５Ｗの範囲内にあり且つ周波数が２４００ＭＨｚ〜２５００ＭＨｚの範囲内にあるマイクロ波照射を行い、或は、波長が１１５５０ｎｍ〜１１６５０ｎｍの範囲内にあるレーザー照射を行う。一部の実施例において、マイクロ波照射は１２０秒〜９６０秒間行うことができ、一部の実施例において、レーザー照射は１２０秒〜７２０秒間行うことができる。
【００３１】
レーザー照射は、固体レーザー器、液体レーザー器または気体レーザー器で照射を行う。
【００３２】
本発明に適用する固体レーザー器として、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザー、エルビウム：ＹＡＧレーザー（ｅｒｂｉｕｍ： ＹＡＧ ｌａｓｅｒ）、ルビーレーザー（ｒｕｂｙ ｌａｓｅｒ）、砒化ガリウムアルミニウム・レーザー（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｇａｌｌｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｄｅ ｌａｓｅｒ）が挙げられる。本発明の１つの実施例において、固体レーザー器はＮｄ：ＹＡＧレーザーである。
【００３３】
本発明に適用する液体レーザー器として、例えば色素レーザー（ｄｙｅ ｌａｓｅｒ）、希土類金属溶液レーザー（ｒａｒｅ ｅａｒｔｈ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌａｓｅｒ）が挙げられる。本発明の１つの実施例において、液体レーザー器は色素レーザーである。
【００３４】
本発明に適用する気体レーザー器として、例えば二酸化炭素レーザー（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｌａｓｅｒ）、不活性ガスレーザー（ｉｎｅｒｔ ｇａｓｅｏｕｓ ｌａｓｅｒ）、イオンガスレーザー（ｉｏｎ ｇａｓｅｏｕｓ ｌａｓｅｒ）が挙げられる。本発明の１つの実施例において、気体レーザー器は二酸化炭素レーザーである。
【００３５】
本発明は、プロジギニンを含有する発酵培養物に対して純化処理を行って、プロジギニンを得る工程を更に備える。この純化処理は、当業者が公知の純化方法で行うことができる。純化処理として、例えばエタノール抽出（ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、ゲルろ過クロマトグラフィ（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、逆相クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びそれらの組み合わせを挙げられる。
【００３６】
以下、各実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００３７】
實施例
＜一般実験材料＞
１．接種材料の準備
下記の実施例に使用するストレプトマイセス・セリカラー菌株ＢＣＲＣ  １１４３９、セラチア・マルセッセンス菌株ＢＣＲＣ  １０７６８、セラチア・ルビデア菌株ＢＣＲＣ  ８０６４０は、台湾の財団法人食品工業発展研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＦＩＲＤＩ）の バイオソース収集研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＢＣＲＣ）から購入したものである。
【００３８】
ストレプトマイセス・セリカラー菌株ＢＣＲＣ  １１４３９、セラチア・マルセッセンス菌株ＢＣＲＣ １０７６８、セラチア・ルビデア菌株ＢＣＲＣ  ８０６４０それぞれを、表１〜３に示されている培地（５０ｍＬ）に接種し、温度が２４℃〜３２℃に設定された培養器内で２４時間〜４８時間の嫌気性培養法（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。この培養で生成された培養物を、それぞれストレプトマイセス・セリカラー菌株ＢＣＲＣ  １１４３９の接種材料、セラチア・マルセッセンス菌株ＢＣＲＣ １０７６８の接種材料、セラチア・ルビデア菌株ＢＣＲＣ  ８０６４０の接種材料として使用した。
【００３９】
【表１】
2018068288.tif 000002
【００４０】
【表２】
2018068288.tif 000003
【００４１】
【表３】
2018068288.tif 000004
【００４２】
＜一般の実験方法及び設備＞
１．高性能液体クロマトグラフィー(ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ)分析及びエレクトロスプレーイオン化質量分析(ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ-ＭＳ)：
以下の実施例において、発酵培養物から得たエタノール抽出物は、以下の方法で成分及び含有量の分析を行った。先ず、得たエタノール抽出物を９９．９%のメタノールに溶解して所定の濃度のサンプル溶液を得た。そして、高性能液体クロマトグラフィーを用いて該サンプル溶液の成分を分離純化した。また、濃度が異なるウンデシルプロジギニン（０．０５−１．０ ｇ／Ｌ） (中国Ａｎｇｅｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ社から購入)、プロジギオシン（０．０１−１．０ ｇ／Ｌ）(米国Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入)及び２−メチル−６−メトキシプロジギニン（０．０５−１．０ ｇ／Ｌ）(米国Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入)それぞれをプロジギニンの対照基準(ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔａｎｄａｒｄ)とし、同じ分析を行った。その後、プロジギニンの対照基準の溶出ピーク位置により、各サンプル溶液の溶出パターンにおいて該ピーク位置に対応する溶出液(ｅｌｕａｔｅ)を収集して、その溶出液のピーク面積によりプロジギニンの含有量を算出した。
【００４３】
上記分析に使用した設備は、高性能液体クロマトグラフィー(Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ、日立製)、ＬａＣｈｒｏｍ ＨＰＬＣポンプ(日立製)、５４１０ ＵＶ検出器（５４１０ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）(日立製)、分析カラム：Ｃ１８（ＬａｃｈｒｏｍＵｌｔｒａ Ｃ１８ ＩＩ、日立製)、長さ２５０ｍｍ×３．０ｍｍ。ＨＰＬＣの操作条件は表４に示されている。
【００４４】
【表４】
2018068288.tif 000005
【００４５】
エレクトロスプレーイオン化質量分析で得た溶出液の含有成分の化学構造式を分析した。該分析に使用した設備はＬＣＭＳ-８０５０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ質量分析計（Ｍａｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。
【００４６】
２．統計分析（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）：
以下の実施例の実験データは、ＳＡＳ ９．０統計ソフトにより統計分析を行なった。実験データは、平均値±標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｓ．Ｄ．）で示す。全てのデータは、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＰＣＡ）により分析して、各実施例の間の差を評価した。得た統計対照結果がｐ＜０．０５の場合、統計的有意性（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）があることを示す。
３．以下の実施例に使用する発酵タンク（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔａｎｋ）は、米国Ｗｉｎｐａｃｔ社から購入した番号ＦＳ−０１−Ａ、作業体積（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）が７Ｌのものである。
【００４７】
＜実施例１＞ストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９でウンデシルプロジギニン（ｕｎｄｅｃｙｌｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）を生産する。
【００４８】
本実施例の目的は、電磁波照射（マイクロ波照射またはレーザー照射）、及び、発酵培地にカロテノイドとアルギン酸カルシウムビーズとを添加する条件で、ストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９がウンデシルプロジギニンを發酵生成することに対する影響を研究することにある。
実験方法：
Ａ. ストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の発酵培養物（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＢＣＲＣ  １１４３９）の準備：
上記「一般実験材料」の第１項「接種材料の準備」で得たストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の接種材料を、３つの対照組（ｃｏｎｔｒｏｌ）（対照組１〜３）と３つの実験組（実験組１〜３）計６組に分けて、各組それぞれを２．５％（ｖ／ｖ）の接種量で表５に示されている４Ｌの発酵培地を有する発酵タンクに接種した。
【００４９】
【表５】
2018068288.tif 000006
【００５０】
そして、各組の混合物のｐＨ値を７．５になるように調整した後、温度３０±２℃、溶存酸素量０．２５ ｍＬ／分及び振動率１５０ｒｐｍで４０時間の発酵培養を行った。該発酵培養を行っている期間に、マイクロ波照射器（９１５−ＶＹＳ−６０ＨＭ、中国華清社製)で実験組２及び対照組２の混合物に対して１０秒間マイクロ波照射（４０ Ｗ、９１５ ＭＨｚ）を行い、且つ、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ）（ＴＳ−５３２、独Ａｓｃｌｅｐｉｏｎ社製）で実験組３及び対照組３の混合物に対して１５秒間レーザー照射（５３２ ｎｍ）を行った。マイクロ波照射及びレーザー照射それぞれは、毎８〜１０時間に一回の照射を行い、計４回の照射を行った。該照射によりストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の集合を低減する。実験組１及び対照組１の混合物に対しては照射を行わない。
【００５１】
Ｂ. ウンデシルプロジギニンの純化と含有量の分析：
上記の工程により得た各組のストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の発酵培養物を６０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する。沈殿物を収集して９９．９％のエタノール２０ｍＬを添加してエタノール抽出を行って、８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、上澄み（以下、第１抽出物と称する）及びアルコールに溶解しない物質を含む沈殿物を得た。その沈殿物に９９．９％のエタノール２０ｍＬを添加してエタノール抽出を行って、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上澄み（以下、第２抽出物と称する）及びアルコールに溶解しない物質を含む沈殿物を得た。その沈殿物に９９．９％のエタノール２０ｍＬを添加してエタノール抽出を行って、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、上澄み（以下、第３抽出物と称する）を取った。第１抽出物、第２抽出物及び第３抽出物を混合し、減圧濃縮によりエタノールを除去して、更に凍結乾燥により水分を完全に除去し、ストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の発酵培養物のエタノール抽出物を得た。該エタノール抽出物に対して上記「一般の実験方法及び設備」の第１項「高性能液体クロマトグラフィー分析及びエレクトロスプレーイオン化質量分析」に記載されている方法で成分と含有量の分析を行った。
結果：
エレクトロスプレーイオン化質量分析により高性能液体クロマトグラフィーで収集した溶出液の成分を分析した結果、Ｃ２５Ｈ３５Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋のＥＳＩ値：３９２．３３というＥＳＩ質量分析データを得た。
【００５２】
該質量分析データにより、その溶出液の成分は、下記の化学構造式を有するものであることが確認された。即ち、ウンデシルプロジギニンである。
【００５３】
【化１】
2018068288.tif 000007
【００５４】
また、各組のストレプトマイセス・セリカラーＢＣＲＣ  １１４３９の発酵培養物のエタノール抽出物中における、高性能液体クロマトグラフィー法で測定したウンデシルプロジギニンの含有量が表６に示されている（表６において、「*」が付いている実験組は、それぞれに対応する対照組と比べて、ｐ＜０．０５であり統計的有意性を有する実験組である）。
【００５５】
【表６】
2018068288.tif 000008
【００５６】
表６により、実験組１〜３それぞれのウンデシルプロジギニンの含有量は、対照組１〜３より高い。また、実験組２と実験組３のウンデシルプロジギニンの含有量も実験組１より顕著に高い。従って、アルギン酸カルシウムビーズを含有する発酵培地に更にカロテノイドを添加することにより、ストレプトマイセス・セリカラーがウンデシルプロジギニンを発酵生産することを促進できる。そして、その発酵培養の期間にマイクロ波またはレーザー照射を更に行うことにより、ウンデシルプロジギニンの産量が顕著に増えた。
【００５７】
＜実施例２＞セラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ １０７６８でプロジギオシン（ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ）を生産する。
【００５８】
本実施例の目的は、電磁波照射（マイクロ波照射またはレーザー照射）、及び、発酵培地に葉緑素と活性炭とを添加する条件で、セラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ １０７６８がプロジギオシンを發酵生成することに対する影響を研究することにある。
実験方法：
Ａ.セラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ １０７６８の発酵培養物（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＢＣＲＣ １０７６８）の準備：
一般実験材料の第１項「接種材料の準備」で得たセラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ  １０７６８接種材料を、３つの対照組（対照組１〜３）と３つの実験組（実験組１〜３）計６組に分けて、各組それぞれを２．５％（ｖ／ｖ）の接種量で表７に示されている４Ｌの発酵培地を有する発酵タンクに接種した。
【００５９】
【表７】
2018068288.tif 000009
【００６０】
そして、各組の混合物のｐＨ値を７．０になるように調整した後、温度２６±２℃、溶存酸素量０．１５ ｍＬ／分及び振動率２５０ｒｐｍで４０時間の発酵培養を行った。該発酵培養を行っている期間に、マイクロ波照射器で実験組２及び対照組２の混合物に対して６０秒間マイクロ波照射（５Ｗ、２４５０ ＭＨｚ）を行い、且つ、色素レーザー（ｄｙｅ ｌａｓｅｒ）（ＰＤＬ−３、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）で実験組３及び対照組３の混合物に対して９０秒間レーザー照射（５８５ ｎｍ）を行った。マイクロ波照射は、毎４〜５時間に一回の照射を行い、計８回の照射を行い、レーザー照射は、毎５〜７時間に一回の照射を行い、計６回の照射を行った。該照射によりセラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ １０７６８の集合を低減する。実験組１及び対照組１の混合物に対しては照射を行わない。
【００６１】
Ｂ. プロジギオシンの純化と含有量の分析：
上記の工程により得た各組のセラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ  １０７６８の発酵培養物を上記実施例１の第Ｂ項の方法で抽出して、セラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ  １０７６８の発酵培養物のエタノール抽出物を得た。該エタノール抽出物に対して上記「一般の実験方法及び設備」の第１項「高性能液体クロマトグラフィー分析及びエレクトロスプレーイオン化質量分析」に記載されている方法で成分と含有量の分析を行った。
結果：
エレクトロスプレーイオン化質量分析により高性能液体クロマトグラフィーで収集した溶出液の成分を分析した結果、Ｃ２０Ｈ２５Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋のＥＳＩ値：３２４.３２というＥＳＩ質量分析データを得た。
【００６２】
該質量分析データにより、その溶出液の成分は、下記の化学構造式を有するであることが確認された。即ち、プロジギオシンである。
【００６３】
【化２】
2018068288.tif 000010
【００６４】
また、各組のセラチア・マルセッセンスＢＣＲＣ  １０７６８の発酵培養物のエタノール抽出物中における、高性能液体クロマトグラフィー法で測定したプロジギオシンの含有量が表８に示されている（表８において、「*」が付いている実験組は、それぞれに対応する対照組と比べて、ｐ＜０．０５であり統計的有意性を有する実験組である）。
【００６５】
【表８】
2018068288.tif 000011
【００６６】
表８により、実験組１〜３それぞれのプロジギオシンの含有量は、対照組１〜３より高い。また、実験組２と実験組３のプロジギオシンの含有量も実験組１より顕著に高い。従って、活性炭を含有する発酵培地に更に葉緑素を添加することにより、セラチア・マルセッセンスがプロジギオシンを発酵生産することを促進できる。そして、その発酵培養の期間にマイクロ波またはレーザー照射を更に行うことにより、プロジギオシンの産量が顕著に増えた。
【００６７】
＜実施例３＞セラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０で２ーメチルー６ーメトキシプロジギニン（２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｄｉｇｉｎｉｎｅ）を生産する。
【００６８】
本実施例の目的は、電磁波照射（マイクロ波照射またはレーザー照射）、及び、発酵培地に紅麹色素とアナトーとアルギン酸カルシウムビーズとを添加する条件で、セラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０が２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンを發酵生成することに対する影響を研究することにある。
実験方法：
Ａ. セラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０の発酵培養物（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ ＢＣＲＣ  ８０６４０）の準備：
上記「一般実験材料」の第１項「接種材料の準備」で得たセラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０接種材料を、３つの対照組（対照組１〜３）と３つの実験組（実験組１〜３）計６組に分けて、各組それぞれを２．５％（ｖ／ｖ）の接種量で表９に示されている４Ｌの発酵培地を有する発酵タンクに接種する
【００６９】
【表９】
2018068288.tif 000012
【００７０】
そして、各組の混合物のｐＨ値を７．０になるように調整した後、温度２６±２℃、溶存酸素量０．１５ ｍＬ／分及び振動率２５０ｒｐｍで４０時間の発酵培養を行った。該発酵培養を行っている期間に、マイクロ波照射器で実験組２及び対照組２の混合物に対して１２０秒間マイクロ波照射（１Ｗ、２４５０ ＭＨｚ）を行い、且つ、二酸化炭素レーザー（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ｌａｓｅｒ）（ＭＬ−Ｚ９５００、Ｋｅｙｅｎｃｅ）で実験組３及び対照組３の混合物に対して１２０秒間レーザー照射（１１６００ ｎｍ）を行った。マイクロ波照射は、毎４〜５時間に一回の照射を行い、計８回の照射を行い、レーザー照射は、毎５〜７時間に一回の照射を行い、計６回の照射を行った。該照射によりセラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０の集合を低減する。実験組１及び対照組１の混合物に対しては照射を行わない。
【００７１】
Ｂ. ２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンの純化と含有量の分析：
上記の工程により得た各組のセラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０の発酵培養物を上記実施例１の第Ｂ項の方法で抽出して、セラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０の発酵培養物のエタノール抽出物を得た。該エタノール抽出物に対して上記「一般の実験方法及び設備」の第１項「高性能液体クロマトグラフィー分析及びエレクトロスプレーイオン化質量分析」に記載されている方法で成分と含有量の分析を行った。
結果：
エレクトロスプレーイオン化質量分析により高性能液体クロマトグラフィーで収集した溶出液の成分を分析した結果、Ｃ１５Ｈ３５Ｎ３Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋のＥＳＩ値：２６６．１というＥＳＩ質量分析データを得た。
【００７２】
該質量分析データにより、その溶出液の成分は、下記の化学構造式を有するであることが確認された。即ち、２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンである。
【００７３】
【化３】
2018068288.tif 000013
【００７４】
また、各組のセラチア・ルビデアＢＣＲＣ  ８０６４０の発酵培養物のエタノール抽出物中における、高性能液体クロマトグラフィー法で測定した２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンの含有量が表１０に示されている（表１０において、「*」が付いている実験組は、それぞれに対応する対照組と比べて、ｐ＜０．０５であり統計的有意性を有する実験組である）。
【００７５】
【表１０】
2018068288.tif 000014
【００７６】
表１０により、実験組１〜３それぞれの２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンの含有量は、対照組１〜３より高い。また、実験組２と実験組３の２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンの含有量も実験組１より顕著に高い。従って、アルギン酸カルシウムビーズを含有する発酵培地に更に紅麹色素及びアナトーを添加することにより、セラチア・ルビデアが２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンを発酵生産することを促進できる。そして、その発酵培養の期間にマイクロ波またはレーザー照射を更に行うことにより、２ーメチルー６ーメトキシプロジギニンの産量が顕著に増えた。
【００７７】
以上、本発明の実施例を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な構成として、全ての修飾および均等な構成を包含するものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のプロジギニンの生産方法は、プロジギニンを大量に生産することに適する。