(57)【要約】      （修正有）【課題】疼痛、特に、神経障害性疼痛の治療または予防に有効な化合物の提供。【解決手段】（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの単離された立体異性体。特定的には、少なくとも９０％の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドおよび１０％未満の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも９０％の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドおよび１０％未満の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドからなる式Ｉ
【化１】
2018021023.tif 000019
の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の、疼痛の治療用または予防用の医薬品の製造のための使用であって、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、１回の投与の後に２４時間を越えて疼痛の治療に有効である、使用。
【請求項２】
（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの少なくとも９５％が（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの少なくとも９８％が（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
有効成分として（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド：
【化２】
2018021023.tif 000020
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含み、
（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドならびにその薬学的に許容される塩および水和物を含まない、
請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記疼痛が急性疼痛または慢性疼痛である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記疼痛が神経障害性疼痛または侵害受容性疼痛である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記神経障害性疼痛は、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、糖尿病性神経痛、癌性疼痛、持続性術後または外傷後疼痛、痛覚過敏、アロディニア、開胸術後疼痛、ＣＲＰＳ、多発性硬化症と関連する疼痛、ＡＩＤＳ、視床痛、ミエロパチーにより引き起こされる対麻痺疼痛、有痛知覚麻痺および幻肢痛における神経障害性疼痛から選択される少なくとも１つの症状である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物で投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が単位剤形として製剤化される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物が経口投与用に製剤化される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物が、０．１〜５００ｍｇの（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む単位剤形として製剤化される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物が２４時間ごとに投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの単離された立体異性体型に関する。特定的には、本発明は疼痛、特に、神経障害性疼痛の治療または予防における（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドは、Ｕ．Ｓ．７，７５４，７７１号において開示されており、ＨＩＶ−１感染の治療に効果があることが証明されている。この化合物は、さらにＷＯ２００９／１０９９８５０号、ＷＯ２０１１／０３０１０５号およびＵＳ２０１１／００８６９１０号において疼痛および炎症の治療または予防における使用に対し開示されている。この化合物に関する前の開示は、４つ全ての鏡像異性体およびジアステレオマー、すなわち（Ｓ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）、（Ｒ，Ｒ）および（Ｒ，Ｓ）を含むラセミ体に関連した。アミドに隣接するキラル位のＳ鏡像異性体を含むラセミ体が特に有利な実施形態として開示された。
【０００３】
疼痛は様々な刺激条件に対する多面的または多次元的な、経験的反応である。疼痛は、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）により「実際のまたは潜在的な組織損傷と関連する、またはそのような損傷の観点から説明される不快な感覚および情動経験」として規定される。
【０００４】
疼痛は急性または慢性であり得る。急性疼痛は通常、いくつかある原因の中で特に軟部組織損傷、感染および／または炎症により引き起こされる。慢性疼痛は、明らかな原因は有さず、または進行性疾病または不均衡により引き起こされ得る。慢性疼痛は、疼痛の疾患として規定される；その起源、持続期間、強度および特定の症状は変動し得る。その上、慢性疼痛は、侵害受容性または神経障害性のいずれかとして分類することができる。侵害受容性疼痛としては、組織傷害誘発性疼痛および炎症痛、例えば、関節炎と関連するものが挙げられる。侵害受容性疼痛は、非オピオイド鎮痛薬、例えばアセチルサリチル酸、コリンマグネシウムトリサリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、およびナプロキセン；またはオピオイド鎮痛薬、例えば、モルヒネ、ヒドロモルホン、メサドン、レボルファノール、フェンタニル、オキシコドン、およびオキシモルフォンを投与することにより伝統的に管理されてきた。神経障害性疼痛、神経損傷後の衰弱性慢性疼痛は、その慢性性質、痛覚過敏、または非侵害性刺激に対する異常疼痛過敏症（接触性アロディニア）により特徴付けられる。痛覚過敏は有痛性刺激に対する過剰反応である。アロディニアは正常な刺激の疼痛としての知覚である（例として、衣服、暖または冷気の接触、などが挙げられる）。神経障害性疼痛は四肢、例えば腕、大抵は脚における神経損傷の結果であり得る。誘発事象としては、外傷または切断（例えば、幻肢痛）が挙げられる。神経障害性疼痛は、薬物療法、例えば、ビンクリスチンまたはパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））の有害作用により起こる可能性があり、または疾患病状、例えば１型または２型糖尿病、帯状疱疹、ＨＩＶ−１感染、などの構成要素として起こり得る。典型的には、神経障害性疼痛はオピエートまたは非ステロイド性抗炎症薬、例えばアスピリンに応答しない。神経障害性疼痛に対して現在提案される医薬としては、抗てんかん薬（例えば、ガバペンチン、カルバマゼピン、バルプロ酸、トピラマート、フェニロイン（ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ））、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、ケタミン、デキストロメトルファン）、局所リドカイン（帯状疱疹後神経痛のため）、および三環系抗うつ薬（例えば、フルオキセチン、セルトラリンおよびアミトリプチリン）が挙げられる。
【０００５】
神経障害性疼痛の基礎となるメカニズムはまだ決定すべきことが残されている。しかしながら、Ｌｙｎチロシンキナーゼ、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）のメンバーは、神経障害性疼痛の発病に重要な役割を果たすことが、最近示唆されている。脊髄におけるＬｙｎ発現はミクログリアに非常に制限され、そのレベルは神経損傷後増加した。Ｌｙｎ欠損マウスは神経損傷後の接触性アロディニアに対するそれらの能力の著しい低減を示すことが示されている。神経障害性疼痛はＬｙｎチロシンキナーゼの上方制御と関連する可能性があると結論づけられた（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｉａ、２００８、５６：５０−８を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
神経障害性疼痛のために現在使用できる治療は、低〜中の効力しか有さず、多くの患者は著しい疼痛緩和がないままである。神経障害性疼痛を有する何百万の人々、ならびに他の型の疼痛を有するものに対する十分な疼痛緩和の欠如は、大きな満たされていない医学的必要性を表し、この発明はその必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、式Ｉの化合物（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの単離された立体異性体型に関する。
【化１】
2018021023.tif 000002
特定的には、本発明は疼痛、特に、神経障害性疼痛の治療または予防において使用するための単離された鏡像異性体（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド）に関する。
【０００８】
本発明は、一部は、実質的に純粋な鏡像異性体（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体またはＥ１としても知られている）および（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体またはＥ２としても知られている）は、特定のチロシンキナーゼの活性を逆の様式で調節するという驚くべき発見に基づく。（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体はタンパク質チロシンキナーゼＬｙｎＡおよびＢＬＫを活性化したが、（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体はそれらの活性を阻害したことが予想外に見出された。さらに、（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体は疼痛の動物モデルにおいて鎮痛薬として有効であったが、（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体はこれらのモデルにおいて無効またはより有効でないことが示されたことが予想外に見出された。さらに、投与後５時間にもはや有効ではなかった、通常使用される鎮痛薬ガバペンチンに比べ、（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体の鎮痛効果は投与後２４時間超で有効であったので長時間作用した。
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、実質的に純粋な形態における、（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの特定の立体化学を有する式ＩＩの化合物
【化２】
2018021023.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【００１０】
第２の態様によれば、本発明は、実質的に純粋な形態における、（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの特定の立体化学を有する式ＩＩＩの化合物
【化３】
2018021023.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。
【００１１】
本明細書では、別記されない限り、「実質的に純粋な」という用語は、化合物の鏡像異性体を説明するために使用される場合、１つの鏡像異性体が実質的に化合物の他の立体異性体型を含まないことを意味する。代表的な実質的に純粋な鏡像異性体は、９０重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および１０重量％未満の化合物の他の立体異性体型、好ましくは９５重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および５重量％未満の化合物の他の立体異性体型、さらにいっそう好ましくは９８重量％超の化合物の１つの鏡像異性体型および２重量％未満の化合物の他の立体異性体型を含む。本明細書では、「他の立体異性体型」は化合物２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの（Ｓ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）および（Ｒ，Ｒ）鏡像異性体またはジアステレオマー型の少なくとも１つを含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、式ＩＩの実質的に純粋な鏡像異性体（（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体）は、ＢＬＫおよびＬｙｎＡチロシンキナーゼを活性化することができる。他の実施形態によれば、式ＩＩＩの実質的に純粋な鏡像異性体（Ｓ，Ｒ鏡像異性体）はＢＬＫおよびＬｙｎＡチロシンキナーゼを阻害することができる。驚いたことに、（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体は、ＬｙｎＢチロシンキナーゼの活性に効果を有さなかったが、（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体はその活性を阻害した。
【００１３】
第２の態様によれば、本発明は、活性成分としてＢＬＫおよび／またはＬｙｎＡチロシンキナーゼの活性化薬を含む、疼痛の治療のための治療薬を提供する。いくつかの実施形態によれば、疼痛は急性疼痛である。いくつかの他の実施形態によれば疼痛は慢性疼痛である。いくつかの実施形態によれば、慢性疼痛は侵害受容性疼痛である。いくつかの現在好ましい実施形態によれば、慢性疼痛は神経障害性疼痛である。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、ＢＬＫおよび／またはＬｙｎＡチロシンキナーゼの活性化薬は実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物である。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、神経障害性疼痛は下記から選択される少なくとも１つ症状である：帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、糖尿病性神経痛、癌性疼痛、持続性術後または外傷後疼痛、痛覚過敏、アロディニア、開胸後疼痛、ＣＲＰＳ、多発性硬化症と関連する疼痛、ＡＩＤＳ、視床痛、ミエロパチーにより引き起こされる対麻痺疼痛、有痛知覚麻痺および幻肢痛における神経障害性疼痛。
【００１６】
第３の態様によれば、本発明は活性成分として、ＢＬＫおよび／またはＬｙｎＡチロシンキナーゼの活性化薬を含む医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は疼痛の治療に有用である。いくつかの実施形態によれば、疼痛は急性または慢性であり得る。いくつかのさらなる実施形態によれば、慢性疼痛は侵害受容性疼痛または神経障害性疼痛であり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は単位剤形として製剤化される。いくつかの実施形態によれば、単位用量は０．１〜５００ｍｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。
【００１８】
さらなる態様によれば、本発明は、治療の必要な被験体における疼痛の治療または予防のための方法を提供し、これは、被験体に、活性成分として、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む化合物を含有する医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、１．０ｍｇ〜１５ｇの活性成分の１日用量を投与することを含む。特定の実施形態によれば、発明の方法は医薬組成物の単回投与後２４時間の期間にわたって鎮痛を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、疼痛の治療または予防のための医薬の調製のための、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用に関する。いくつかの実施形態によれば、疼痛は神経障害性疼痛である。特定の実施形態によれば、発明の方法は医薬組成物の単回投与後２４時間の期間にわたって鎮痛を提供する。
【００２０】
本発明は、その好ましい実施形態の下記図面および詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】テールフリックテストを用いた平均潜時測定値を示す。左から右の研究グループは下記を含む：ビヒクル（グループ１）；モルヒネ（グループ２）；３ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ３）；１０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ４）；２０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ５）および１０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ６）。＊＝ｐ＜０．０１対ビヒクル；＆＝ｐ＜０．０５処置前対処置後；＾＝ｐ＜０．０５処置前対処置後。
【図２】テールフリック（秒）を用いて測定した処置後と処置前潜時の間の差を示す。左から右の研究グループは下記を含む：ビヒクル（グループ１）；モルヒネ（グループ２）；３ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ３）；１０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ４）；２０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ５）および１０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ６）。＊＝ｐ＜０．０１対ビヒクル；＃＝ｐ＜０．０５対ビヒクル。
【図３】研究過程中に測定した異なる研究グループの平均グループ体重を示す（第１、７、１４および２１日）。左から右の研究グループは下記を含む：ビヒクル（グループ１）；ガバペンチン（グループ２）；３０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ３）；１５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ４）；７．５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ５）。
【図４】研究の第１４日、処置後２、５および２４時間、ならびに研究の第２１日、７日処置後２、５、２４および４８時間で測定した左の手術した脚の引っ込めに必要とされる平均Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ力を示す。左から右の研究グループは下記を含む：ビヒクル（グループ１）；ガバペンチン（グループ２）；３０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ３）；１５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ４）；７．５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ５）。＊ｐ＜０．０５対ビヒクル＃ｐ＜０．０５処置前対処置後。
【図５】研究の第１４日、処置後２、５および２４時間、研究の第２１日、処置後２、５、２４および４８時間に測定した右の健康な脚と左の手術した脚の間の力差（Δ）を示す。左から右の研究グループは下記を含む：ビヒクル（グループ１）；ガバペンチン（グループ２）；３０ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ３）；１５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ４）；７．５ｍｇ／ｋｇの実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミド（グループ５）。＊ｐ＜０．０５対ビヒクル＃ｐ＜０．０５処置前対処置後。
【図６】図６Ａ−Ｄは、ＩＣ５０およびＥＣ５０曲線の形態で提示される、発明の化合物によるタンパク質チロシンキナーゼ、ＢＬＫ、ＬｙｎＡ、ＬｙｎＢおよびＳｒｃの調節を示す。
【図７】図７Ａ−Ｃは、キラル固定相と組み合わせた超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を使用した、（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドおよび（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドのキラル分離を示す。Ａ：Ｅ１およびＥ２鏡像異性体のラセミ体；Ｂ：実質的に純粋なＥ１鏡像異性体；Ｃ：実質的に純粋なＥ２鏡像異性体。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は化合物（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの単離された立体異性体型およびキナーゼ媒介過程の治療的調節、ならびに疾患および疾患症状、特にある一定のキナーゼ酵素により媒介されるもの治療のためのその使用に関する。特定的には、本発明は疼痛、好ましくは神経障害性疼痛の治療における実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの使用に関する。
【００２３】
本明細書では、別記されない限り、「実質的に純粋な」という用語は、化合物の鏡像異性体を説明するために使用される場合、１つの鏡像異性体が実質的に化合物の他の立体異性体型を含まないことを意味する。代表的な実質的に純粋な鏡像異性体は、約８０重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および約２０重量％未満の化合物の他の立体異性体型、好ましくは約８５重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および約１５重量％未満の化合物の他の立体異性体型、好ましくは約９０重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および約１０重量％未満の化合物の他の立体異性体型、より好ましくは約９５重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および約５重量％未満の化合物の他の立体異性体型、より好ましくは約９６重量％超の化合物の１つの鏡像異性体および約４重量％未満の化合物の他の立体異性体型、さらにいっそう好ましくは約９７重量％超の化合物の１つの鏡像異性体型および約３重量％未満の化合物の他の立体異性体型、さらにいっそう好ましくは約９８重量％超の化合物の１つの鏡像異性体型および約２重量％未満の化合物の他の立体異性体型、ならびに、最も好ましくは約９９重量％超の化合物の１つの鏡像異性体型および約１重量％未満の化合物の他の立体異性体型を含む。本明細書では、「他の立体異性体型」は化合物２−Ｎ（３−Ｏ−（プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの（Ｓ，Ｓ）、（Ｓ，Ｒ）、（Ｒ，Ｓ）および（Ｒ，Ｒ）鏡像異性体またはジアステレオマー型の少なくとも１つを含み得る。
【００２４】
「約」という用語は、本明細書では、指示された値のせいぜい±１０％、好ましくは±５％以下を示す。
【００２５】
発明のいくつかの実施形態による単離された鏡像異性体は、例えば、ＵＳ７，７５４，７７１号、ＵＳ７，６４２，２９０号、ＵＳ７，６７４，８２９号またはＵＳ２０１１／００８６９１０号において記載される当技術分野で知られている方法により、ラセミ体として合成され得る。ラセミ体はさらに、キラル化合物の分離のための当技術分野で知られている方法により分離され得る。例示的な実施形態によれば、鏡像異性体はラセミ体（（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドおよび（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｒ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドを含む）として合成され、さらにキラル固定相と組み合わせた超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により分離され得る。特定的には、（Ｓ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）化合物は、幅広いラセミ体クラスの鏡像異性体分離のために一般に使用される、ＲｅｇｉｓＰａｃｋ（商標）カラム、多糖コートキラルカラム上で（トリス−（３，５−ジメチルフェニル）カルバモイルセルロースセレクターを用いて）分離され得る（図７Ａ−Ｃ）。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、鏡像異性体は、例えば、（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体の調製のためのスキーム１で記載されるプロセスを使用して直接合成され得る。
【化４】
2018021023.tif 000005
したがって、（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体は、（Ｓ）−ＯＢｎチロシノールを（Ｒ）−メシレートと反応させて、（Ｓ，Ｒ）−ビス−保護を形成させることにより合成され得る。
【００２７】
キラル化合物の合成手順で遭遇し得る問題の１つは、合成工程の１つ（またはそれ以上）でのラセミ化の発生である。ここで、初めて反応温度および原料の添加順序が、形成される生成物のキラル純度において非常に重要な役割を果たすことが示される。さらに、ラセミ化は、特定的には最初の反応工程で起こり、この工程には、乳酸メチル（ＳまたはＲ鏡像異性体）の２−ベンジルオキシメチルラクテート（ＳまたはＲ鏡像異性体）への変換が含まれることが示された。いくつかの実施形態によれば、（Ｓ，Ｓ）または（Ｓ，Ｒ）化合物の調製のためのプロセスにおいてラセミ化の発生を低減させるために、最初の反応工程で、臭化ベンジルおよび乳酸メチルがそれらの塩基溶液（例えば水素化ナトリウム）への添加前に一緒に混合されるべきである。いくつかの実施形態によれば、ラセミ化の発生は、室温より低い、好ましくは、１０℃より低い、好ましくは、５℃より低い、好ましくは、２℃より低い温度で、より好ましくは−１０℃より低い温度で、最も好ましくは−１５℃以下の温度で反応を実施すると低減させることができる。いくつかのある一定の好ましい実施形態によれば、最低ラセミ化（すなわち＜１％ラセミ化）が少なくとも約−１０℃、好ましくは少なくとも約−１５℃の温度のＴＨＦ中で水素化ナトリウムをスラーリング（ｓｌｕｒｒｉｎｇ）することにより得られた。（Ｓ）乳酸メチルおよび臭化ベンジルの混合物を、少なくとも約−１０℃、好ましくは少なくとも約−１５℃の温度の水素化ナトリウム溶液に添加した。
【００２８】
さらに、（Ｓ）−ＯＢｎ−チロシノールおよびメシレート（ＳまたはＲ鏡像異性体）の反応を含む反応工程の収率が、いくつかの実施形態によれば、溶媒として、ＤＭＳＯの代わりにＤＭＦを、塩基としてカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの代わりに水素化ナトリウムを使用すると、約１５％まで、好ましくは約２０％まで、より好ましくは約２５％まで、増加し得ることが初めて見出された。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００２９】
本発明は、（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドを活性成分として含む疼痛、好ましくは神経障害性疼痛を治療または防止するための治療薬；治療的有効量の（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドおよび薬学的に許容される担体を含む疼痛、好ましくは神経障害性疼痛を治療または防止するための医薬組成物、ならびに、治療的有効量のＳ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドを含む医薬組成物の投与を含む疼痛、特定的には神経障害性疼痛を治療または防止するための方法を提供する。
【００３０】
神経障害性疼痛の非限定的な例としては、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、糖尿病性神経痛、癌性疼痛、持続性術後または外傷後疼痛、非特異的腰痛、痛覚過敏、アロディニア、坐骨神経痛、開胸後疼痛、ＣＲＰＳ、多発性硬化症と関連する疼痛、ＡＩＤＳ（またはＨＩＶ関連ニューロパチー）、線維筋痛症、視床痛、ミエロパチーにより引き起こされる対麻痺疼痛、有痛知覚麻痺、幻肢痛などにおける神経障害性疼痛が挙げられる。本発明による神経障害性疼痛のための治療薬は、痛覚過敏およびアロディニアを治療するのにとりわけ有効である。加えて、神経障害性疼痛状態としては、通常は無痛の感覚、例えば「しびれてピリピリする感覚」と関連する疼痛（錯感覚および異常感覚）、接触への感受性の増加（知覚過敏）、非侵害性刺激後の有痛性感覚（動的、静的、熱または冷感アロディニア）、侵害刺激への感受性の増加（熱、冷、機械的痛覚過敏）、刺激除去後の継続する疼痛感覚（ヒペルパチー）あるいは選択感覚経路の非存在または欠損（痛覚鈍麻）が挙げられる。
【００３１】
「治療的有効量」という用語は、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドが投与される被験体に有益な効果を提供するのに十分である、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドのその量である。より特定的には、治療的有効量は、治療される被験体において疼痛の症状を軽減または寛解するのに有効な、実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドの量を意味する。
【００３２】
本発明との関連で、「治療」という用語は対症療法を示し、「予防」という用語はすでに苦しんでいる被験体において症状を防止すること、または苦しんでいる被験体において症状の再発を防止することを意味するために使用され、苦痛の完全な防止に制限されない。
【００３３】
本発明による疼痛の治療または防止のための治療薬は実質的に純粋な（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドから選択され、経口的にまたは非経口的に、投与方法の特定的な制限なしで投与され得る。本発明による神経障害性疼痛のための治療薬の活性成分としての（Ｓ）２−Ｎ（３−Ｏ−（（Ｓ）プロパン２−オール）−１−プロピル−４−ヒドロキシベンゼン）−３−フェニルプロピルアミドは、独立して提供され、または製剤中に、薬学的に許容される担体または医薬添加物と一緒に含められたものとして提供され得る。
【００３４】
本発明において使用可能な薬学的に許容される担体または添加物の例としては、賦形剤、崩壊薬、バインダー、潤滑剤、コーティング剤、着色剤、希釈剤、溶解剤、溶解助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定剤、などが挙げられる。
【００３５】
好適には、本発明の組成物は単位剤形として製剤化され得る。各単位剤形は、発明の１つ以上の化合物の１日用量の全てまたはあらかじめ決められた割合、例えば、１日用量の半分または４分の１を含み得る。
【００３６】
よって、組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、細粒、顆粒、無菌非経口溶液または懸濁液、定量エアロゾルまたは液体スプレー、シロップ、液滴、アンプル、自動注入装置、坐薬、クリームまたはゲルとして製剤化され得る。前記組成物は、経口、経腸、非経口、くも膜下腔内、鼻腔内、舌下、直腸または局所投与に、または吸入または吹送による投与に適合させることができる。経口組成物、例えば錠剤、丸薬、カプセルまたはウエハースが特に好ましい。
【００３７】
錠剤などの固体剤形を調製するために、前記１つ以上の化合物が、１つ以上の医薬賦形剤、例えば、微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カリウム、グリシンなどと混合され、下記のいずれかと一緒に使用され得る：様々な崩壊薬、例えばデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、アルギン酸、ある一定の型のケイ酸複塩など；および顆粒形成バインダー、例えばポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、アラビアゴムなど。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクなどはしばしば、錠剤形成に非常に有効である。同じ型の固体組成物で充填されたゼラチンカプセルが使用され得る。好ましくはこれと関連して使用可能な物質としては、ラクトースならびに高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。経口投与のための水性懸濁液および／またはエリキシル剤を調製するために、活性成分は、様々な型の甘味料、香味、着色剤または染料のいずれか、任意で乳化剤および／または懸濁剤、ならびに、希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリセロール、グリセロール、などまたはそれらの組み合わせと一緒に使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、固体製剤前組成物はその後、上記種類の単位剤形にさらに分割され、これらは各々、０．１ｍｇ〜約５００ｍｇの発明の化合物を含み得る。いくつかの実施形態によれば、単位剤形は、１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば１、５、１０、２５、５０、１００、２００、３００または５００ｍｇの化合物を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、錠剤または丸薬として製剤化される場合、前記錠剤または丸薬はコートすることができ、あるいは別の方法で配合され、持続性作用の利点を可能にする剤形を提供することができる。例えば、前記錠剤または丸薬は、内側用量および外側用量構成成分を含むことができ、後者は前者上の外被の形態である。これらの２つの構成成分は、腸溶層により分離することができ、これは、胃での崩壊に抵抗するように機能し、内側構成成分が無傷で十二指腸に通過して入り、またはその放出が遅延されることを可能にする。様々な材料がそのような腸溶層またはコーティングにおける使用で知られており、そのような材料としては多くのポリマー酸およびポリマー酸のシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物が挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、経口的にまたは非経口的に注射、坐薬などにより投与するための液体剤形として製剤化され得；例えば、水溶液、好適には、香味づけたシロップ、水性または油懸濁液または、例えば、綿実油、ゴマ油、ヤシ油またはピーナッツ油などの可食油を有する香味づけたエマルジョン、ならびにエリキシル剤または同様の医薬ビヒクルである。水性懸濁液のための好適な分散または懸濁剤としては、合成および天然ガム、例えば、トラガント、アラビアゴム、アルギナート、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニル−ピロリドンまたはゼラチンが挙げられる。必要とあれば、水溶液は適切に緩衝され（好ましくは、ｐＨ８以上に）、液体希釈剤が等張化される。そのような水溶液は静脈内注射に好適であり、油性溶液は関節内注射、筋肉内注射および皮下注射に好適である。液体剤形は無菌条件下、当業者によく知られている標準製薬技術により容易に生成させることができる。加えて、本発明の活性成分は、皮膚などに局所的に投与され得る。そのような場合、標準薬務に従い、活性成分をクリーム、ゼリー、ペーストまたは軟膏剤の形態で局所的に投与することが望ましい。
【００４１】
本発明による神経障害性疼痛のための治療薬は適切な用量で、特定の制限なしで投与することができ、これは、様々な条件、例えば疼痛の型、患者の年齢または症状、投与経路、治療目的、およびこの薬剤と共に使用される別の医薬の有無に従い選択される。本発明による神経障害性疼痛のための治療薬の１日用量は、例えば、約０．１ｍｇ／Ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／Ｋｇ体重、好ましくは１〜５０ｍｇ／Ｋｇ体重、より好ましくは５−３０ｍｇ／Ｋｇ体重である。
【００４２】
実施例
下記実施例は、本開示を説明することを意図し、しかしながらその範囲を制限しない。
【００４３】
実施例１：Ｅ１の合成
Ｅ１の一般合成手順を、スキーム１で要約する。特定的には、Ｅ１は下記工程を含むプロセスを使用して合成した：
１．  ２ｇｒの乳酸メチルを、過剰の臭化ベンジルと反応させ、８８０ｍｇの（Ｓ）−ベンジルオキシメチルラクテートを得た。反応を、水素化ナトリウムをＴＨＦ中でスラーリングし、およそ−１５℃まで冷却することにより実施した。反応混合物をその後、徐々に室温まで温め、およそ１〜２時間撹拌した。反応を、飽和塩化アンモニウム溶液で停止させ、ＭＴＢＥで２回抽出し、その後、ロータリー・エバポレーター上で溶媒を除去し、粗油を得た。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製し、純粋（Ｓ）−２−ベンジルオキシメチルラクテートを得た。（Ｒ）−２−ベンジルオキシメチルラクテート異性体は０．９３％のみで存在した。いくつかの実施形態によれば、この工程の収率は、反応溶液（すなわちＴＨＦ）中の水分の存在を回避することにより増加させることができる。
２．  ８８０ｍｇの、工程１で得られた（Ｓ）−２−ベンジルオキシメチルラクテートを、水素化アルミニウムリチウムを用いて還元させ、（Ｓ）−２−ベンジルオキシプロピレングリコールを８３．８％収率、９８．７％純度で得た。純粋（Ｓ）−２−ベンジルオキシメチルラクテートを含む塩化メチレンの溶液を撹拌し、水素化アルミニウムリチウムの溶液を徐々に、これにおよそ５℃で添加した。反応をＴＬＣシステムによりモニタし、ＵＳＰ−ＰＷ水により、非常に注意深く反応停止させた。この工程ではラセミ化は起こらなかった。
３．  （Ｓ）−２−ベンジルオキシプロピレングリコールをその後、メタンスルホニルクロリドと塩化メチレン中、トリエチルアミンの存在下で反応させ、メシレートを８８％収率で得た。工程２の溶液を塩化メチレン中で撹拌し、メタンスルホニルクロリドをこれに、＜５℃で滴下した。添加が完了した後、反応の進行をＴＬＣシステムによりモニタした。反応を、ＵＳＰ−ＰＷ水で停止させた。層を分離した後、水層を、塩化メチレンで逆抽出した。塩化メチレン層をその後合わせ、ＵＳＰ−ＰＷ水で３回洗浄し、メタンスルホン酸の大部分を除去した。この工程ではラセミ化は起こらなかった。
４．  （工程３の）メシレートを、Ｓ−Ｏベンジルチロシノールとカップリングさせ、ビス保護Ｅ１を２２．７％収率、９７．４％の純度で形成させた。反応は、室温で溶媒としてのＤＭＦおよび塩基としての水素化ナトリウムの組み合わせを使用して実施した。反応は、少なくとも１２時間室温で撹拌した後、完了した。ＤＭＳＯを溶媒として、塩基としてのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドと共に使用した場合、塩基のＤＭＳＯとの反応によるデムシル（ｄｅｍｓｙｌ）アニオン形態はメシレートを分解し、またはこれを不純物に変換すると考えられた。その結果、ごく微量の生成物が形成するか、生成物は形成しなかった。
５．  ３４０ｍｇの、工程４の生成物を、１０％パラジウム／炭素触媒および塩酸の存在下、塩化メチレンを溶媒として使用する、５０℃での水素化により還元させた。反応はおよそ４時間で完了し、ラセミ化はなく、Ｅ１が８４．３％収率および９８．９％で得られた。
【００４４】
実施例２：Ｅ２の合成
Ｅ２鏡像異性体を、ＵＳ２０１１／００８６９１０号において記載されるように、（Ｓ，Ｓ）および（Ｓ，Ｒ）鏡像異性体のラセミ体として合成し、さらにＲｅｇｉｓＰａｃｋ（商標）カラム、多糖コートキラルカラム上で分離した（トリス−（３，５−ジメチルフェニル）カルバモイルセルロースセレクターを用いて）（図７Ａ−Ｃ）。
【００４５】
実施例３：テールフリックテストにおけるＥ１およびＥ２の鎮痛効果の評価：
本研究では、実質的に純粋な鏡像異性体Ｅ１およびＥ２の鎮痛効果を、マウスにおける侵害受容性疼痛に対するテールフリックモデルを使用して評価した。
試験アイテムおよび材料の調製：
【表１】
2018021023.tif 000006
【００４６】
モルヒネ調製：１９ｍｌの生理食塩水を、１ｍｌのモルヒネアンプルに添加し、０．１ｍｌの受理溶液を２０ｇマウス毎に注射した（５ｍｌ／ｋｇ）。
【００４７】
ビヒクル調製：１ｍｌのＤＭＳＯを４ｍｌの生理食塩水に溶解した。
【００４８】
Ｅ１およびＥ２試料調製（１０ｍｇ／ｋｇの投与のための２ｍｇ／ｍｌの濃度）：
・４ｍｇのＥ１またはＥ２を秤量した。
・測定したＥ１またはＥ２を０．４ｍｌのＤＭＳＯに完全に溶解した。
・その後、溶液を１．６ｍｌの生理食塩水で希釈した。
【００４９】
パートＢのためのＥ１の調製：
Ｅ１原液を下記の通り調製した：
・１６．５ｍｇのＥ１を秤量した。
・測定したＥ１を０．８２ｍｌのＤＭＳＯに完全に溶解した。
・溶液をその後３．２８ｍｌの生理食塩水中で希釈した。
【００５０】
Ｅ１調製（２０ｍｇ／ｋｇの投与のための４ｍｇ／ｍｌの濃度）：
２０ｍｇ／ｋｇのＥ１溶液を、原液から、ＩＰ投与を介して５ｍｌ／ｋｇ注射体積で投与した。
【００５１】
Ｅ１調製（１０ｍｇ／ｋｇの投与のための２ｍｇ／ｍｌの濃度）：
原液からの０．７ｍｌを０．７ｍｌのビヒクル中で希釈した。
１０ｍｇ／ｋｇのＥ１溶液を、原液から、ＩＰ投与を介して５ｍｌ／ｋｇ注射体積で投与した。
【００５２】
Ｅ１調製（３ｍｇ／ｋｇの投与のための０．６ｍｇ／ｍｌの濃度）：
原液からの０．５ｍｌを３．３５ｍｌのビヒクル中で希釈した。
３ｍｇ／ｋｇのＥ１溶液を、原液から、ＩＰ投与を介して５ｍｌ／ｋｇ注射体積で投与した。
【００５３】
試験系（表１を参照されたい）：
雄ＩＣＲ系統７週齢マウス（２５−２７ｇ）を使用して実験を実施した（Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．により供給）。
【００５４】
実験は、総数１８匹マウス（パートＡ）および２０匹マウス（パートＢ）を含んだ。
【００５５】
処置開始時の動物の体重変動は平均体重の±２０％を超えなかった。
【００５６】
この研究で使用した動物の健康状態を到着時に検査した。良好な健康状態の動物のみ研究室条件に順化させ、研究で使用した。
【００５７】
動物を５日間順化させた。順化中および全研究期間を通して、動物はアクセスが制限された齧歯類施設内で飼育し、ポリプロピレンケージ１つあたり最大６匹のマウスのグループで維持した。ケージに固い底部を取り付け、寝床材料として無菌木材削りくずで満たした。動物に、自由に市販の無菌齧歯類食を与え、ステンレス鋼シッパーチューブを有するポリエチレン瓶を介して各ケージに供給された飲料水に自由にアクセスさせた。水を定期的にモニタした。自動的に制御される環境条件は、研究室において、２０−２４℃の温度、３０−７０％の相対湿度（ＲＨ）、１２：１２時間の明：暗サイクルおよび１５−３０空気交換／ｈを維持するように設定した。温度およびＲＨは毎日モニタした。
【００５８】
実験中、各投与グループを別々のケージで維持し、糞便物質の摂取により起こり得る相互汚染を回避した。研究の終わりに、生存する動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。
【表２】
2018021023.tif 000007
【００５９】
テールフリックテストの原理：
疼痛に対する反応を、テールフリック法を使用して評価した。これは、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅテールフリック機器を使用する。動物をＵｇｏ  Ｂａｓｉｌｅテールフリック（ＴＦ）機器表面上に、尾をまっすぐ後に、熱源として機能する光電池上にあるように置き、優しく保持する。熱源およびタイマーは足ペダル押しによりスイッチオンし、動物がその尾をエミッタから振り払った時に自動的にスイッチオフする。潜時を測定し、鎮痛効果として分析する。
【００６０】
研究の説明：
ベースラインテールフリックを、実験を開始する１日前に測定した。実験の日に、動物の体重を最初に測定し、続いて試験アイテム（ビヒクル、モルヒネ、ＮＲＤ  １３  Ｓ  Ｅ１およびＥ２）のＩＰ投与を実施した。試験アイテムの投与後３０分に、動物を、テールフリックテストに供した。テールフリック実験に続いて、全てのグループの採血を実施した。全てのグループの脊髄および脳を収集した後に実験を終了した。
【００６１】
統計およびデータ評価：
全てのパラメータは平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。データを両側独立Ｔ検定を用いて分析し、各処置グループをビヒクル処置動物と比較した。両側対応Ｔ検定を使用して、各処置グループの処置前および処置後を比較した。確率値ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５は有意であると考えられる。
【００６２】
結果：
体重：全ての動物に対する平均体重は２７．４２±０．２２ｇであった。グループ間で統計学的差は見られなかった。
【００６３】
テールフリックテスト：
テールフリックテストの結果を図１に、動物が尾を熱源から振り払うのにかかる潜時（秒）として提示する。結果はまた、処置後ＴＦ潜時−処置前のＴＦ潜時の差としても提示する（図２）。潜時の差の増加は動物に対するより健康な状態を示す。
【００６４】
テールフリックまでの潜時（秒）を表２、列４−５にまとめて示す：ベースライン（処置前）でのビヒクル処置動物（グループ１）に対する平均潜時は８．７２±０．６５秒であった。薬物投与３０分で、平均潜時は７．７８±０．３６秒であり、これは、統計学的にベースラインとは異ならない。
【００６５】
５ｍｇ／ｋｇの用量でのモルヒネ（グループ２）による処置は、処置前値に比べると、潜時増加に著しく有効であった：７．９２±０．１７秒処置前対１５．３８±１．４７秒処置後（ｐ＜０．０１）。
【００６６】
１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置（グループ４）は、処置前値に比べると潜時増加に著しく有効であった：８．１６±０．３９秒処置前対１０．６３±０．６４秒処置後（ｐ＜０．０１）。加えて、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はビヒクル処置動物（グループ１）に比べると疼痛緩和活性を示した：１０．６３±０．６４秒（グループ４）および１０．６５±０．８１秒（グループ５）対７．７８±０．３６秒ビヒクル（ｐ＜０．０１）。
【００６７】
潜時は処置前と処置後状態間で増加したが、この増加は、３ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１または１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ２による処置では統計学的に有意ではなかった。加えて、ビヒクルに比べるとこれらの処置は疼痛を低減させるのに有意に活性ではなかった。
【００６８】
処置前および処置後に対するテールフリック潜時の差（秒）：
処置前と処置後潜時の差が大きいほど、疼痛緩和活性が大きい。この差を、表２、右列で要約する。Ｅ１は、ビヒクル処置に比べると、特に１０および２０ｍｇ／ｋｇの用量で著しい疼痛緩和活性を示したことがわかる（ｐ＜０．０１）。対照的に、Ｅ２はテールフリック潜時において統計学的に有意な差を引き起こさなかった。
【表３】
2018021023.tif 000008
【００６９】
結論：
この研究の条件下で得られ、生存中データに限定される所見を考慮すると、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１は、侵害受容に対するテールフリックモデルにおいて、ビヒクル処置グループに比べると疼痛を低減させるのに活性であった。
【００７０】
３ｍｇ／ｋｇの用量での試験アイテムＥ１は、処置前および処置後に対するＴＦ潜時の間の計算された差においてのみ著しい疼痛緩和活性を示し、活性の傾向が示唆された。１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ２はこの研究において活性ではなかった。
【００７１】
実施例４：ラットにおける脊髄神経結紮（Ｃｈｕｎｇ）モデルを用いたＥ１の治療活性の評価：
ラットにおける神経障害性疼痛に対する脊髄神経結紮（ＳＮＬまたはＣｈｕｎｇ）モデルにおいて、Ｅ１の抗侵害受容性および鎮痛活性を評価した。
【００７２】
第０研究日に、全ての動物はＣｈｕｎｇ外科手術を受けた、これは、左Ｌ５−Ｌ６脊髄神経を分離し、切断する手術から構成された。外科手術後１４日に、動物をＶｏｎ  Ｆｒｅｙテストからの疼痛閾値結果を使用して選択した。機械的アロディニアの徴候を示した動物のみを研究に含めた。選択プロセス後、動物をグループ分けし、試験アイテムをＩＰを介して投与した。疼痛応答を、第１４研究日に試験アイテム投与後２、５および２４時間に、７日の試験アイテム投与後第２１研究日に２、５、２４および４８時間にＶｏｎ  Ｆｒｅｙ方法を使用して測定した。
【００７３】
全ての動物は研究中に体重が増えた。グループ間で体重増加に有意の差はなかった。この体重増加は研究を通して一般的に良好な健康を反映する。
【００７４】
材料およびそれらの調製：
ビヒクル：１ｍｌＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を、４ｍｌの生理食塩水に溶解した（供給者：ＴＥＶＡ  ｍｅｄｉｃａｌ）。
【００７５】
陽性対照：ガバペンチン（供給者：ＵＳＰ）は粉末として存在する。１５０ｍｇ／ｋｇの用量を達成するために、２５０ｍｇのガバペンチンを、５ｍｌの生理食塩水に溶解した（５０ｍｇ／ｍｌ）。
【００７６】
体重２００ｇのラットに０．６ｍｌの溶解溶液を注射した。
【００７７】
Ｅ１原液：２．４３ｇのＥ１を８１ｍｌのＤＭＳＯに完全に溶解した。
・Ｅ１調製（３０ｍｇ／ｋｇの投与のための６ｍｇ／ｍｌの濃度）：原液からの３ｍｌを１２ｍｌの生理食塩水で希釈した。
・Ｅ１調製（１５ｍｇ／ｋｇの投与のための３ｍｇ／ｍｌの濃度）：原液からの１．５ｍｌを１．５ｍｌのＤＭＳＯおよび１２ｍｌの生理食塩水で希釈した。
・Ｅ１調製（７．５ｍｇ／ｋｇの投与のための１．５ｍｇ／ｍｌの濃度）：原液からの０．７５ｍｌを２．２５ｍｌのＤＭＳＯおよび１２ｍｌの生理食塩水で希釈した。
全ての製剤に対し、適用体積を５ｍｌ／ｋｇとした。
【００７８】
試験系：
本研究の試験グループおよび用量レジメンを表３にまとめて示す。
【００７９】
種：５０匹のＳＤの若い成体雄ラット、２２５−２６０、研究開始時（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ．Ｌｔｄ．）
【００８０】
体重：処置開始時の動物の体重変動は、平均体重の±２０％を超えなかった。
【００８１】
動物健康：この研究で使用した動物の健康状態を到着時に検査した。良好な健康状態の動物のみ研究室条件に順化させ、研究で使用した。
【００８２】
順化：５日。
【００８３】
ハウジング：順化中および全研究期間を通して、動物を、アクセスが制限された齧歯類施設内で飼育し、ポリプロピレンケージ１つあたり最大３匹のラットを有するグループで維持した。ケージに固い底部を取り付け、寝床材料として無菌木材削りくずで満たした。
【００８４】
食物と水：動物に、自由に市販の無菌齧歯類食を与え、ステンレス鋼シッパーチューブを有するポリエチレン瓶を介して各ケージに供給された飲料水に自由にアクセスさせた。研究で使用した食餌バッチの食物ロット分析を、研究データを有する保存記録に包含させた。水を定期的にモニタした。
【００８５】
環境：自動的に制御される環境条件は、研究室において、２０−２４℃の温度、３０−７０％の相対湿度（ＲＨ）、１２：１２時間の明：暗サイクルおよび１５−３０の空気交換／ｈを維持するように設定した。温度およびＲＨは毎日モニタした。明サイクルを制御時計によりモニタした。
【００８６】
各投与グループを別々のケージで維持し糞便物質の摂取により起こり得る相互汚染を回避した。２または３匹の動物を１つのケージに収容した。
【００８７】
終了：研究の終わりに、生存する動物ＣＯ２により安楽死させた。
【表４】
2018021023.tif 000009
【００８８】
試験手順：
Ｃｈｕｎｇ誘発モデルの原理：Ｃｈｕｎｇモデルはニューロパチー疼痛に対する信頼できるモデルであり、動物が外科手術から目覚めた直後に動物の疼痛閾値を測定することができる。
【００８９】
手術および処置を含む研究スケジュール（第１研究日から第１４研究日）を、表４で要約する：
【表５】
2018021023.tif 000010
【００９０】
神経障害性疼痛誘発：ケタミン／キシラジンナトリウムを使用して麻酔下で、その領域を剪毛した後、ラットを腹臥位で置き、傍脊柱筋群をＬ４−Ｓ２レベルで棘突起から分離した。Ｌ６椎骨横突起を注意深く小さな骨鉗子を用いて除去し、視覚的にＬ５−Ｌ６脊髄神経を同定した。左Ｌ５−Ｌ６脊髄神経を切断した。筋肉をその後、４−０絹縫合糸で閉じ、皮膚をクランプにより閉じた。外科手術後、ラットをケージに戻し、目が覚めるまで加熱灯下で維持した。
【００９１】
前選択のための包含／排除基準：手術後１４日に、動物は、それらの実験グループに入れる前に、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ方法を用いて機械的アロディニアに対して試験した。手術した脚に対し≦２６ｇの疼痛閾値を有する動物のみを研究に含めた。均一な処置グループを形成させ、ランダム化を実行するために、包含／排除基準に従い、手術したラット全てをグループ分けした。
【００９２】
処置：
処置開始：動物を疼痛発生のパラメータを使用して選択し（Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテスト）、その後、それらの実験グループに入れた。
【００９３】
ビヒクルおよびＥ１を、第１４研究日から第２１研究日まで投与した。
【００９４】
ガバペンチン、陽性対照を、試験第１４、１５および２１日のみに投与した。
【００９５】
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテストを試験アイテムの投与前（ＴＩ注射前）ならびに第１４および２１研究日にＴＩ投与後（ＴＩ注射後）２および５時間にて実施した。
【００９６】
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテストを第１５研究日（第１４研究日でＴＩの投与後２４時間）でのＴＩの投与前、第２２および２３研究日（第２１研究日でのＴＩの投与後それぞれ、２４および４８時間）に実施した。
【００９７】
投与経路：Ｅ１（試験アイテム）；ビヒクルおよび陽性対照（ガバペンチン）をＩＰ投与した。全ての場合において、研究の過程において別に決定されない限り、全ての投与溶液は繰り返し投与セッションの各々で、１日に１回投与として適用した。
【００９８】
終了：研究の終わりに、動物をＣＯ２で安楽死させた。
【００９９】
実験的観察：
体重：体重を一定の間隔で第−１研究日にベースライン値に対し、および外科手術後７日（第７研究日）に測定した。加えて、第１４研究日に機械的アロディニアに対する基準を示した動物はまた、第１４および２１研究日に選択およびグループ分けした後に体重測定した。
【０１００】
疼痛応答評価：疼痛応答を機械的アロディニアに対するＶｏｎ  Ｆｒｅｙテストを使用して評価した。
【０１０１】
機械的アロディニアに対するＶｏｎ  Ｆｒｅｙテストは、無処置動物にとっては有痛性ではない短い圧力パルスを適用することに基づく。実際、無処置動物から足の引っ込めを達成するためには、適用される圧力は時として、６０gより高くなる。これによりしばしば、研究者は、無処置動物の足を実際に挙げさせるためにＶｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントにより十分な圧力を適用することを要求される。しかしながら、疾患状態では、動物は、ずっと低い圧力および通常は無痛の刺激の結果としての疼痛経験に感受性が高くなる。
【０１０２】
機械的アロディニア評価（Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテスト）：触覚刺激に対するアロディニア応答をＶｏｎ  Ｆｒｅｙ装置（Ｔｏｕｃｈ（登録商標））を使用して評価した。
【０１０３】
ラットをエンクロージャに入れ、金属メッシュ表面上に置いたが、自由に動けるにようにした。ラットのキャビンを赤いセロハンで覆い、環境的妨害を減少させた。テストを探索行動の休止後に開始した。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙモノフィラメントの組は、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ装置の製造業者（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌ）により提供される実際の力のおおよその対数目盛および知覚された強度の均等目盛を与える。動作原理：所定の長さおよび直径のファイバの先端を皮膚に直角に当てる場合、ファイバが曲がるまで研究者がプローブを前進させ続ける限り、適用力は増加する。ファイバが曲がった後、プローブは前進し続け、これによりファイバはより大きく曲がるが、追加の力は足に適用されない。
【表６】
2018021023.tif 000011
【０１０４】
齧歯類はその足が予想外に接触されると足引っ込め反射を示す。Ｔｏｕｃｈ  Ｔｅｓｔ（商標）感覚評価装置は、ラットの足の足底表面上で使用することができる。動物は、その足を引き戻すことにより感覚を示すであろう。引っ込め反射を引き上げるのに必要とされる最小の力は、参照値として指定され／考えられる。
【０１０５】
統計／データ評価：全てのデータは平均±ＳＥＭとして提示される。各処置グループを、両側独立Ｔ検定（ソフトウェア：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ）を使用してその関連ビヒクルグループと比較した。両側、対応Ｔ検定を使用して、各試験グループに対し、処置前疼痛応答を処置後疼痛応答と比較した。ｐ値＜０．０５は、有意の差を表すと考えられる。
【０１０６】
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテストを、第２２および２３研究日（それぞれ、第２１研究日のＴＩの投与後２４および４８時間）に実施した。
【０１０７】
結果：
体重（表６；図３）：全ての動物は研究中に体重が増えた；しかしながら、グループ間で体重増加に有意の差はなかった。全ての動物に対するベースライン体重は、第−１研究日に２４３．７６±１．２１ｇであった。
【０１０８】
体重はまた、第７、１４および２１研究日に測定した。第７研究日では、全てのグループに対する平均体重は２５８．１２±１．７１ｇであった。第１４研究日では、全てのグループに対する平均体重は２８６．３４±１．９３ｇであった。第２１研究日に、平均体重は３０２．３４±２．２９ｇであった。
【表７】
2018021023.tif 000012
【０１０９】
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテスト（表７、８、９および１０；図４および５）：結果は、左の手術した脚の平均引っ込め力として提示した（ｇ）。機械的アロディニアは、第１４研究日（２、５および２４時間）ならびに第２１研究日（２、５、２４および４８時間）の異なる時間点でのＶｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントに対する動物感受性の増加として観察した。全ての値はまた、右の健康な脚を引っ込めるのに必要とされる力−左の手術した脚を引っ込めるのに必要とされる力として計算し、提示した。この計算は健康な状態の動物の値を０付近で表し、よって、両脚に対する引っ込め力は等しい。有痛状態にある動物は右の健康な脚と左の手術した脚の間の力のより大きなギャップとして提示される。引っ込め力差（Δ力）の増加は、より有痛性の状態を提示する。
【０１１０】
試験アイテム対ビヒクルのＶｏｎ  Ｆｒｅｙ応答：ビヒクル処置動物（グループ１）の左の手術した脚を引っ込めるのに必要とされるベースライン平均力は５６．６０±３．４０ｇであった。第１４研究日に、処置前では、左脚の引っ込め力は、ベースライン測定よりも著しく低く、有痛性状態を示した：１０．００±０．９３ｇ；ｐ＜０．０５。
【０１１１】
Ｅ１  ３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ３）：ビヒクル対照（グループ１）に比べると、第１４研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、その投与後２時間にアロディニアを阻害しなかった（１３．２０±１．７０ｇ  ｎｓ．対ビヒクルグループにおける１０．７０±０．９８ｇ）。第１４研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、ビヒクル処置動物に比べ、その投与後５時間にアロディニアを効果的に阻害し：３０．６０±５．１０ｇ対ビヒクルグループにおける１０．１０±０．６０ｇ；ｐ＜０．０５、およびまた、その投与後２４時間にもそうであった：２５．２０±６．２５ｇ  ｎｓ対ビヒクルグループにおける１１．８０±１．７９ｇ；ｐ＝０．０５。
【０１１２】
ビヒクル対照に比べると、第２１研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、その投与後２時間にアロディニアを効果的に阻害し：１９．４０±１．８０ｇ対ビヒクルグループにおける１１．４０±１．０１ｇ、ｐ＜０．０５、その投与後５時間：２２．９０±４．６４ｇ対ビヒクルグループにおける９．８０±０．９０ｇ；ｐ＜０．０５およびまた、その投与後２４時間にもそうであった：１７．５０±２．４８ｇ対ビヒクルグループにおける１１．００±１．１１ｇ；ｐ＜０．０５。
【０１１３】
ビヒクル対照に比べると、第２１研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、その投与後４８時間にアロディニアを阻害しなかった：８．９０±０．８２ｇ対ビヒクルグループにおける９．９０±１．２１ｇ。
【表８】
2018021023.tif 000013
【０１１４】
Ｅ１  １５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ４）：ビヒクル対照（グループ１）に比べると第１４研究日での１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後２時間にアロディニアを阻害しなかった。
【０１１５】
第１４研究日での１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、ビヒクル処置動物に比べ、その投与後５およびさらに２４時間にアロディニアを阻害した。
【０１１６】
ビヒクル対照に比べると、１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は第２１研究日に処置前；その投与後２、５および２４時間にアロディニアを阻害したが、しかしながら、第２１研究日での１５ｍｇ／ｋｇの用量による処置は、その投与後４８時間により有効でなくなった。
【表９】
2018021023.tif 000014
【０１１７】
Ｅ１  ７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ５）：ビヒクル対照（グループ１）に比べると、第１４研究日での７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は、その投与後２、５およびまた２４時間にアロディニアを効果的に阻害した。
【０１１８】
ビヒクル対照に比べると、７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置は第２１研究日処置前およびまたその投与後２、５、２４およびさらに４８時間にアロディニアを阻害した。
【０１１９】
ガバペンチン１５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ２）：ビヒクル対照（グループ１）に比べると、第１４研究日でのガバペンチンによる処置はその投与後２時間にアロディニアを阻害した；が、その投与後５時間に有効ではなかった。
【０１２０】
ビヒクル対照に比べると、第２１研究日でのガバペンチンによる処置は、その投与後２時間にアロディニアを効果的に阻害した；が、その投与後５時間にすでに有効ではなかった。
【表１０】
2018021023.tif 000015
【０１２１】
試験アイテムのＶｏｎ  Ｆｒｅｙ応答−処置後対処置前：
Ｅ１  ３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ３）：処置前値に比べると、第１４研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５時間、処置前および後にアロディニアを阻害した。処置前値に比べると、第２１研究日での３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後２、５およびさらに２４時間にアロディニアを阻害した。
【表１１】
2018021023.tif 000016
【０１２２】
Ｅ１  １５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ４）：処置前値に比べると、第１４研究日での１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５時間およびさらに２４時間にアロディニアを阻害した。
【０１２３】
Ｅ１  ７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ５）：処置前値に比べると、第１４研究日での７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後２、５およびさらに２４時間にアロディニアを阻害した。処置前値に比べると、第２１研究日での７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５時間にアロディニアを阻害した。
【０１２４】
ガバペンチン１５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ２）：処置前値に比べると、第１４研究日でのガバペンチンによる処置はその投与後２時間にアロディニアを阻害した；が、その投与後２４時間に有効ではなかった。
【０１２５】
処置前値に比べると、第２１研究日でのガバペンチンによる処置はその投与後２時間にアロディニアを阻害した。
【０１２６】
試験アイテム対ビヒクルのΔ引っ込め力：
Ｅ１  ３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ３）：第１４日での２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は、３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、その投与後５時間に著しい疼痛緩和活性を示した。第２１日での２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、その投与後２、５およびさらに２４時間に著しい疼痛緩和活性を示した。
【０１２７】
Ｅ１  １５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ４）：第１４日での２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、その投与後５およびさらに２４時間に著しい疼痛緩和活性を示した：２９．２０±６．６６ｇ対ビヒクルグループにおける４９．９０±０．６０ｇ；ｐ＜０．０５。
【０１２８】
２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、第２１研究日処置前；その投与後２、５およびさらに２４時間に著しい疼痛緩和活性を示した。
【０１２９】
Ｅ１  ７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ５）：第１４日での２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、その投与後２、５およびさらに２４時間に著しい疼痛緩和活性を示した。
【０１３０】
２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１に対し、第２１研究日処置前に；その投与後２、５、２４およびさらに４８時間に著しい疼痛緩和活性を示した。
【０１３１】
ガバペンチン１５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ２）：第１４日および第２１日での２つの脚間のΔ引っ込め力の計算は、ガバペンチンに対し、その投与後２時間に著しい疼痛緩和活性を示した。
【０１３２】
試験アイテムのΔ引っ込め力−処置後対処置前：
Ｅ１  ３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ３）：第１４日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５時間にアロディニアを阻害した。第２１日での、Δ引っ込め力の処置前値に比べると、３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後２、５および２４時間にアロディニアを阻害した。
【０１３３】
Ｅ１  １５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ４）：第１４日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５およびさらに２４時間にアロディニアを阻害した。
【０１３４】
Ｅ１  ７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ５）：第１４日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後２、５および２４時間にアロディニアを阻害した。
【０１３５】
第２１日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１による処置はその投与後５時間にアロディニアを阻害した。
【０１３６】
ガバペンチン１５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ（グループ２）：第１４日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、ガバペンチンによる処置はその投与後２時間にアロディニアを阻害したが、しかしながら投与後５時間に有効ではなかった。
【０１３７】
第２１日でのΔ引っ込め力の処置前値に比べると、ガバペンチンによる処置はその投与後２時間にアロディニアを効果的に阻害した。
【０１３８】
以上で記載される試験化合物による処置では、Ｅ１により処置された動物は完全に手術された足をＶｏｎ  Ｆｒｅｙ装置の金属メッシュ表面上に置いたことに注意すべきである。
【０１３９】
結論：
この研究の条件下で得られた所見を考慮すると、３０ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１は、第１４研究日での試験アイテム投与後５時間での、ならびに第２１研究日での試験アイテム投与後の２、５および２４時間での機械的アロディニアのパラメータにおいて反映されるように、ラットにおける神経障害性疼痛のための脊髄神経結紮モデルで鎮痛アイテムとして有効であった。
【０１４０】
１５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１は、第１４研究日での試験アイテム投与後５および２４時間、ならびに第２１研究での試験アイテム投与後２、５および２４時間での機械的アロディニアのパラメータにおいて反映されるように、鎮痛アイテムとして有効であった。
【０１４１】
７．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＥ１は、第１４研究日での試験アイテム投与後２、５および２４時間、第２１研究日での試験アイテム投与後２、５、２４および４８時間での機械的アロディニアのパラメータにおいて反映されるように、鎮痛アイテムとして有効であった。
【０１４２】
ガバペンチン、この研究における陽性対照は、第１４および２１研究日でその投与後２時間に活性であった。試験アイテムと対照的に、ガバペンチンの鎮痛活性は、投与後５時間、２４時間および４８時間にもはや検出されなかった。
【０１４３】
実施例５：Ｅ１およびＥ２鏡像異性体はチロシンキナーゼ−活性を調節する
Ｅ１およびＥ２鏡像異性体をＢＬＫ、ＬｙｎＡ、ＬｙｎＢおよびＳｒｃ（Ｅ１のみ）キナーゼアッセイにおいて、１．０Ｅ−０３〜１．０Ｅ−０５（Ｍ）の５つの濃度範囲で試験した。研究はＢＬＫ、ＬｙｎＡ、ＬｙｎＢ、およびＳｒｃキナーゼアッセイを含んだ。各化合物および濃度を二組のウェルで試験した。
【０１４４】
このプロジェクトは、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ３０００および１２−シッパーＬａｂＣｈｉｐを用いて達成した。ＬａｂＣｈｉｐアッセイは分離に基づき、生成物および基質が電気泳動的に分離され、よって妨害が最小に抑えられ、全てのスクリーニングプラットフォームで有効な最高データ品質が得られることを意味する。ＥＺ  ＲｅａｄｅｒおよびＬＣ３０００酵素アッセイの両方に対するＺ’因子は、ルーチン的に０．８〜０．９の範囲にある。ＬａｂＣｈｉｐアッセイの利点は、高いＺ’値、少ない偽陽性、少ない偽陰性および分析品質再現性を含む。
【０１４５】
オフチップインキュベーション移動度シフトキナーゼアッセイは蛍光ペプチド基質のリン酸化生成物への変換を測定するためにマイクロ流体チップを使用する。マイクロタイタープレートウェルからの反応混合物を、キャピラリーシッパーを介してチップ上に導入し、そこで、非リン酸化基質およびリン酸化生成物を電気泳動により分離し、レーザ誘起蛍光により検出する。時間に伴う蛍光シグナルの特徴は、反応の程度を明らかにする。
【０１４６】
マイクロフルイディクスの精度により、薬物候補と治療標的の間のわずかな相互作用の検出が可能になる。この技術は高い正確さで強いおよび弱い阻害剤の両方を検出することができ、ルーチン的に従来の技術が見逃す薬物候補を同定する。アッセイ条件を表８にまとめて示す： 
【表１２】
2018021023.tif 000017
【０１４７】
アッセイ制御データ：全てのアッセイは内部ＱＡ／ＱＣ標準に合格しなければならず、各アッセイ実行に対する参照ＩＣ５０（これは許容される歴史的平均の（＋または−）２分の１対数単位内になければならない）が挙げられる。アッセイ制御データを表９にまとめて示す：
【表１３】
2018021023.tif 000018
【０１４８】
結果：様々なタンパク質チロシンキナーゼのモジュレーターとしてのＥ１およびＥ２鏡像異性体の活性を図６Ａ−Ｄにおいてグラフ（ＩＣ５０曲線）により示す。ＩＣ５０曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ５および標準４−パラメータ非線形回帰モデル（ｌｏｇ（阻害剤）対応答−可変勾配）を用いて作成する。ＥＣ５０曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ５および標準４−パラメータ非線形回帰モデル（シグモイド用量応−可変勾配）を用いて作成する。データ点は二組のウェルの平均である。エラーバーは平均±再現％活性を表す。
【０１４９】
本発明は、本明細書にて以上で特定的に示され、記載されるものに限定されないことは、当業者により認識されるであろう。むしろ、発明の範囲は、下記特許請求の範囲により規定される。
【図１】
2018021023.tif 000021
【図２】
2018021023.tif 000022
【図３】
2018021023.tif 000023
【図４】
2018021023.tif 000024
【図５】
2018021023.tif 000025
【図６】
2018021023.tif 000026
【図７】
2018021023.tif 000027