(57)【要約】      （修正有）【課題】癌細胞の細胞増殖を阻害する方法の提供。【解決手段】癌細胞を有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストに接触させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において癌を治療する方法において、個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含み、治療がＲスポンジン転位を含む癌を有する個体に基づいている、方法。
【請求項２】
Ｒスポンジン転位を含む癌細胞を治療する方法であって、有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを提供することを含む、方法。
【請求項３】
個体がＲスポンジン転位を含む癌を有することが分かっているという条件で、個体において癌を治療する方法であって、個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含む、方法。
【請求項４】
個体において癌を治療するための方法において、個体から得られる試料がＲスポンジン転位を含むことを判定し、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を個体に投与し、それにより癌を治療することを含む、方法。
【請求項５】
癌を治療する方法において、（ａ）Ｒスポンジン転位を含む癌を有する個体を選択し、（ｂ）こうして選択された個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与し、それにより癌を治療することを含む、方法。
【請求項６】
ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いまたは低い癌に罹った個体を同定する方法であって、個体から得られる試料におけるＲスポンジン転位の存在または非存在を判定することを含み、試料におけるＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いことを示し、またはＲスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が低いことを示す、方法。
【請求項７】
癌に罹っている個体が、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療を用いた治療に効果的に応答する可能性が高いかまたは低いかを予測するための方法であって、Ｒスポンジン転位を判定することを含み、それによりＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が高いことを示し、Ｒスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が低いことを示す、方法。
【請求項８】
ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する癌に罹った個体の応答または応答の欠如を予測する方法であって、個体から得られる試料においてＲスポンジン転位の存在または非存在を検出することを含み、Ｒスポンジン転位の存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答を予測し、Ｒスポンジン転位の非存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答の欠如を予測する、方法。
【請求項９】
個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
癌細胞の増殖を阻害する方法において、癌細胞を有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストに接触させることを含む、方法。
【請求項１１】
個体において癌を治療する方法において、個体に有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストを投与することを含む、方法。
【請求項１２】
癌または癌細胞がＲスポンジン転位を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒスポンジン転位がＲＳＰＯ１転位、ＲＳＰＯ２転位、ＲＳＰＯ３転位および／またはＲＳＰＯ４転位である、請求項１から９および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒスポンジン転位がＲＳＰＯ２転位である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＳＰＯ２転位がＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＳＰＯ２転位がＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＳＰＯ２転位がＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＳＰＯ２転位が配列番号７１を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒスポンジン転位がＲＳＰＯ３転位である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＳＰＯ３転位がＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＳＰＯ３転位がＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＲＳＰＯ３転位がＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＳＰＯ３転位が配列番号７２および／または配列番号７３を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒスポンジン転位が、染色体レベル（例えば、ＦＩＳＨ）、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル（例えば、ＲＳＰＯ１転位融合転写物）、および／またはタンパク質レベル（例えば、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチド）で検出される、請求項１から９および１２から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
癌または癌細胞が結腸直腸癌である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
癌または癌細胞が結腸癌または直腸癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｗｎｔ経路アンタゴニストが、抗体、結合ポリペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである、請求項１から９および１３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ｗｎｔ経路アンタゴニストがＲスポンジンアンタゴニストである、請求項１から９および１３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ｗｎｔ経路アンタゴニストが、Ｒスポンジンに結合する単離されたモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＲスポンジンがＲＳＰＯ２および／またはＲＳＰＯ３である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲスポンジンアンタゴニストがＲスポンジン転位アンタゴニストである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
抗体、結合ポリペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである、単離されたＲスポンジン転位アンタゴニスト。
【請求項３３】
Ｒスポンジン転位アンタゴニストが、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドならびに／またはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドに結合する、請求項３１に記載の方法または請求項３２に記載のアンタゴニスト。
【請求項３４】
Ｒスポンジン転位アンタゴニストが、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドに結合する、請求項３３に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項３５】
ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む、請求項３４に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項３６】
ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む、請求項３４に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項３７】
ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む、請求項３４に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項３８】
ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが配列番号７１を含む、請求項３４に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項３９】
Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項４０】
ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む、請求項３９に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項４１】
ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む、請求項３９に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項４２】
ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドがＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む、請求項３９に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項４３】
ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが配列番号７２および／または配列番号７３を含む、請求項３９に記載の方法またはアンタゴニスト。
【請求項４４】
追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１２年２月１１日提出の米国特許出願第６１／５９７，７４６号および２０１２年７月２３日提出の米国特許出願第６１／６７４，７６３号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の下での利益を主張するものであり、その全内容は出典明示により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出される配列表を含んでおり、これにより配列表はその全体が出典明示により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１３年１月３１日に作成され、Ｐ４８５３Ｒ１ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名されており、サイズは５８，９８０バイトである。
【０００３】
癌などの病態の治療に関連する療法が提供される。
【背景技術】
【０００４】
米国では、１００，０００件を超える新たな症例が毎年報告されている結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、４番目に蔓延している癌であり、１年につき５０，０００を超える死亡の原因となっている（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．ら、ＣＡ：Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ６１：２１２〜２３６（２０１１））。ＣＲＣのおよそ１５％が、ＤＮＡミスマッチペア（ＭＭＲ）システムの欠損から生じるマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示している（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．６：４７９〜５０７（２０１１））。マイクロサテライト安定な（ＭＳＳ）ＣＲＣのその他の約８５％は、染色体不安定性（ＣＩＮ）の結果である（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．６：４７９〜５０７（２０１１））。ゲノム研究により、ＣＲＣ進行中のＡＰＣ、ＫＲＡＳ、およびＴＰ５３のような遺伝子における変異の獲得が同定されてきた（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．６：４７９〜５０７（２０１１））。少数の試料中の結腸癌タンパク質コードエクソンおよび全ゲノムの塩基配列決定により、おそらく腫瘍形成の一因となるいくつかの追加の変異および染色体構造バリアントが同定された（Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１１０８〜１１１３（２００７）；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１５６６１（２０１０））。しかし、結腸癌のマウスモデルにおける最近の挿入変異スクリーニングによれば、ＣＲＣ発生における追加の遺伝子および経路の関与が示唆された（Ｓｔａｒｒ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１７４７〜１７５０（２００９）；Ｍａｒｃｈ，Ｈ．Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３：１２０２〜１２０９（２０１１））。
【０００５】
癌、特にヒト結腸癌の病変形成をさらによく理解し、また新たな治療標的を同定する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｒスポンジン転位アンタゴニストを含む経路アンタゴニストおよびその使用方法を提供する。
【０００７】
本明細書では、癌細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、癌細胞を有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストに接触させる方法が提供される。本明細書では、個体において癌の治療をする方法であって、個体に有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストを投与することを含む方法がさらに提供される。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、癌または癌細胞はＲスポンジン転位を含む。
【０００８】
本明細書では、個体において癌を治療する方法において、個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含み、治療がＲスポンジン転位を含む癌を有する個体に基づいている方法が提供される。本明細書では、Ｒスポンジン転位を含む癌細胞を治療する方法であって、有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを提供することを含む方法が提供される。本明細書では、個体がＲスポンジン転位を含む癌を有することが分かっているという条件で、個体において癌を治療する方法において、治療が個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含む方法も提供される。
【０００９】
さらに、本明細書では、個体において癌を治療するための方法であって、個体から得られる試料がＲスポンジン転位を含むことを判定し、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を個体に投与し、それにより癌を治療することを含む方法が提供される。
【００１０】
本明細書では、癌を治療する方法において、（ａ）Ｒスポンジン転位を含む癌を有する個体を選択し、（ｂ）こうして選択された個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与し、それにより癌を治療することを含む方法が提供される。
【００１１】
本明細書では、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いまたは低い癌に罹った個体を同定する方法であって、個体から得られる試料におけるＲスポンジン転位の存在または非存在を判定することを含み、試料におけるＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いことを示し、またはＲスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が低いことを示す方法も提供される。いくつかの実施態様では、方法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を投与することをさらに含む。
【００１２】
本明細書では、癌に罹っている個体が、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療を用いた治療に効果的に応答する可能性が高いかまたは低いかを予測するための方法であって、Ｒスポンジン転位を判定することを含み、それによりＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が高いことを示し、Ｒスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が低いことを示す方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を投与することをさらに含む。
【００１３】
本明細書では、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する癌に罹った個体の応答または応答の欠如を予測する方法であって、個体から得られる試料においてＲスポンジン転位の存在または非存在を検出することを含み、Ｒスポンジン転位の存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答を予測し、Ｒスポンジン転位の非存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答の欠如を予測する方法がさらに提供される。いくつかの実施態様では、方法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を投与することをさらに含む。
【００１４】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位はＲＳＰＯ１転位、ＲＳＰＯ２転位、ＲＳＰＯ３転位および／またはＲＳＰＯ４転位である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位はＲＳＰＯ２転位である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位はＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位は配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位はＲＳＰＯ３転位である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位はＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位はＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位はＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位は配列番号７２および／または配列番号７３を含む。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位は染色体レベル（例えば、ＦＩＳＨ）、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル（例えば、ＲＳＰＯ１転位融合転写物）、および／またはタンパク質レベル（例えば、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチド）で検出される。
【００１５】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施態様では、癌は結腸癌または直腸癌である。
１）方法のいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは抗体、結合ポリペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＲＳＰＯ１アンタゴニスト、ＲＳＰＯ２アンタゴニスト、ＲＳＰＯ３アンタゴニストおよび／またはＲＳＰＯ４アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは、Ｒスポンジンに結合する単離されたモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ２および／またはＲＳＰＯ３である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位アンタゴニストは、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドならびに／またはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位アンタゴニストは、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドが配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。いくつかの実施態様では、方法は追加の治療薬をさらに含む。
【００１６】
本明細書では、Ｒスポンジン転位アンタゴニストが抗体、結合ペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである、単離されたＲスポンジン転位アンタゴニストが提供される。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位アンタゴニストは、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドならびに／またはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位アンタゴニストは、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＭＲＰＬ３３の別の新規な５’エクソンの腫瘍特異的な活性化が、ＭＲＰＬ３３のＮ末端を変化させ、タンパク質を長くする。
【図１Ｂ】箱ヒゲ図は、ＭＲＰＬ３３に対してアライメントした各試料のリードの総数により正規化した、上流エクソンのリードのカウントを示す。
【図１Ｃ】ＵＳＣＳゲノムブラウザおよび上流エクソンに対するＥＳＴマッピングによるＨ３Ｋ２７Ａｃのマーク付けを示す、別の上流ＭＲＰＬ３３プロモーター領域の証拠をさらに示す。ＭＲＬＰ３３のアミノ酸配列ＭＦＬＳＡＶＦＦ  ＡＫＳＫＳＮＥＴＫＳＰＬＲＧＫＥＫＮＴＬＰＬＮＧＧＬＫＭＴＬＩＹＫＥＫＴＥＧＧ  ＤＴＤＳＥＩＬ  （配列番号９）；ＭＲＬＰ３３の代替プロモーターのアミノ酸配列ＭＭＡＨＬＤＦＦＬＴＹＫＷＲＡＰＫＳＫＳＬＤＱＬＳＰＮＦＬＬＲＧＲＳ  ＥＴＫＳＰＬＲＧＫＥＫＮＴＬＰＬＮＧＧＬＫＭＴＬＩＹＫＥＫＴＥＧＧＤＴＤＳＥＩＬ（配列番号１０）。
【図２Ａ】Ｒスポンジンの再発転位。結腸癌におけるＲスポンジン遺伝子融合の型および頻度のリスト。
【図２Ｂ】ゲノムにおけるＥＩＦ３Ｅ−ＲＳＰＯ２融合の位置、配向およびエクソン−イントロン構造を表す挿絵。ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して同定されたＥＩＦ３Ｅ（ｅ１）−ＲＳＰＯ２（ｅ２）融合のリードの証拠を示す。
【図２Ｃ】アガロースゲルにおいて分離した、ＥＩＦ３Ｅ−ＲＳＰＯ２体細胞融合を確認する、独立したＲＴ−ＰＣＲ由来産物。ＲＴ−ＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒ法によりシーケンシングし、融合ジャンクションを確認し、関連する代表的クロマトグラムを提示する。
【図２Ｄ】得られたＥＩＦ３Ｅ−ＲＳＰＯ２融合タンパク質の概略図。
【図２Ｅ】Ｒスポンジン融合を担持する腫瘍は、対応するＲＳＰＯ遺伝子の発現の上昇を示すことを、ヒートマップで示す。図２は、それぞれ、配列番号８５〜９２および７１を、出現の順に開示している。
【図３Ａ】ＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３遺伝子融合の再発。ゲノムにおけるＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３遺伝子融合の位置、配向およびエクソン−イントロン構造を表す挿絵。ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して同定されたＰＴＰＲＫ（ｅ１）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）融合のリードの証拠を示す。
【図３Ｂ】アガロースゲルにおいて分離した、ＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３体細胞融合を確認する、独立したＲＴ−ＰＣＲ由来産物。ＲＴ−ＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒ法によりシーケンシングし、融合ジャンクションを確認し、関連する代表的クロマトグラムを提示する。
【図３Ｃ】ＰＴＰＲＫ、ＲＳＰＯ３および得られたＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３融合タンパク質の概略図。図３は、それぞれ、配列番号９３〜９９および７２を、出現の順に開示している。
【図４Ａ】ＰＴＰＲＫ（ｅ７）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）の融合。
【図４Ｂ】この融合のＲＴ−ＰＣＲによる検証を示すゲル。
【図４Ｃ】天然および融合タンパク質の概略図。図４は、それぞれ、配列番号１００〜１０４および７３を、出現の順に開示している。
【図５Ａ】ＲＳＰＯ融合産物が、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する。（Ａ）融合タンパク質をコードする発現構築物をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の培地において、ウエスタンブロットにより検出された分泌ＲＳＰＯ融合タンパク質。期待された産物は、ＲＳＰＯ１−３８７である。
【図５Ｂ】ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して測定した場合、ＲＳＰＯ融合タンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化し、増強する。示されたデータは、融合構築物をトランスフェクトした細胞由来の馴化培地からのものである。少なくとも３回の実験から代表的データを示す。
【図５Ｃ】ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して測定した場合、ＲＳＰＯ融合タンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化し、増強する。示されたデータは、細胞にレポーター構築物を一緒に直接トランスフェクトしたものからのものである。少なくとも３回の実験から代表的データを示す。
【図５Ｄ】Ｒスポンジン媒介性Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化を提示する挿絵。
【図５Ｅ】Ｗｎｔシグナル伝達経路遺伝子の選択されたセットにわたったＲＳＰＯ融合および体細胞変異を表すプロット。
【図６Ａ】ＫＲＡＳ変異はＲＳＰＯ遺伝子融合とオーバーラップする。
【図６Ｂ】結腸癌におけるＲＡＳ／ＲＴＫ経路の変化。
【図７】全ゲノムＥＩＦ３Ｅ−ＲＳＰＯ２の座標略図および配列。図７は、それぞれ、配列番号１０５〜１０８を、出現の順に開示している。
【図８】全ゲノムＥＩＦ３Ｅ−ＲＳＰＯ２の座標略図および配列。図８は、それぞれ、配列番号１０９〜１１１を、出現の順に開示している。
【図９】全ゲノムＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３の座標略図および配列。図９は、それぞれ、配列番号１１２〜１１６を、出現の順に開示している。
【図１０】全ゲノムＰＴＰＲＫ−ＲＳＰＯ３の座標略図および配列。図１０は、それぞれ、配列番号１１２および１１７〜１２０を、出現の順に開示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｉ．定義
用語「Ｒスポンジン」および「ＲＳＰＯ」とは本明細書では、別段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物供給源由来の天然Ｒスポンジンのことである。前記用語は、「完全長」非処理Ｒスポンジンおよび細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のＲスポンジンを包含する。前記用語は、Ｒスポンジンの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。Ｒスポンジンは４種のタンパク質、Ｒスポンジン１（ＲＳＰＯ１）、Ｒスポンジン２（ＲＳＰＯ２）、Ｒスポンジン３（ＲＳＰＯ３）、およびＲスポンジン４（ＲＳＰＯ４）のファミリーである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ１である。例となるヒトＲＳＰＯ１核酸配列の配列は配列番号１であり、または例となるヒトＲＳＰＯ１は配列番号２のアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ２である。例となるヒトＲＳＰＯ２核酸配列の配列は配列番号３であり、または例となるヒトＲＳＰＯ２は配列番号４のアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ３である。例となるヒトＲＳＰＯ３核酸配列の配列は配列番号５であり、または例となるヒトＲＳＰＯ３は配列番号６のアミノ酸配列である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ４である。例となるヒトＲＳＰＯ４核酸配列の配列は配列番号７であり、または例となるヒトＲＳＰＯ４は配列番号８のアミノ酸配列である。
【００１９】
「Ｒスポンジンバリアント」、「ＲＳＰＯバリアント」、またはその変種は、本明細書で開示されるＲスポンジンのいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有すると本明細書で定義される一般に活性ＲスポンジンポリペプチドであるまたはこれをコードするＲスポンジンポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。そのようなＲスポンジンバリアントには、例えば、１つまたは複数の核酸またはアミノ酸残基が付加されているまたは欠失しているＲスポンジンが含まれる。通常、Ｒスポンジンバリアントは、本明細書で開示されるＲスポンジンに対して少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有することになる。通常、Ｒスポンジンバリアントは少なくとも約１０残基長である、または少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００長、もしくはそれよりも長い。場合により、Ｒスポンジンバリアントは、Ｒスポンジンと比べた場合、１つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいはＲスポンジンと比べた場合、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０以下の保存的アミノ酸置換を有する配列を有するまたはコードすることになる。
【００２０】
用語「Ｒスポンジン転位」および「ＲＳＰＯ転位」とは本明細書では、例えば、Ｒスポンジン、バリアント、もしくはその断片または第二の遺伝子、バリアント、もしくはその断片を含む切れた染色体の一部が異なる染色体位置、例えば、Ｒスポンジン天然位置とは異なる染色体位置または第二の遺伝子の天然位置とは異なるＲスポンジン天然位置中および／もしくはその周囲の染色体位置に再結合するＲスポンジンのことである。Ｒスポンジン転位は、ＲＳＰＯ１転位、ＲＳＰＯ２転位、ＲＳＰＯ３転位、および／またはＲＳＰＯ４転位であってもよい。
【００２１】
用語「Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチド」および「ＲＳＰＯ転位融合ポリヌクレオチド」とは本明細書では、Ｒスポンジン転位遺伝子産物または融合ポリヌクレオチドの核酸配列のことである。Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチドは、ＲＳＰＯ１転位融合ポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチド、ＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチド、および／またはＲＳＰＯ４転位融合ポリヌクレオチドであってもよい。用語「Ｒスポンジン転位融合ポリペプチド」および「ＲＳＰＯ転位融合ポリペプチド」とは本明細書では、Ｒスポンジン転位遺伝子産物または融合ポリヌクレオチドのアミノ酸配列のことである。Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドは、ＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチド、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチド、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチド、および／またはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドであってもよい。
【００２２】
本明細書で定義される用語「Ｒスポンジン転位アンタゴニスト」は、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドにより媒介される生物活性を部分的にもしくは完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子である。いくつかの実施態様では、そのようなアンタゴニストはＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する。一実施態様によれば、アンタゴニストはポリペプチドである。別の実施態様によれば、アンタゴニストは抗Ｒスポンジン転位抗体である。別の実施態様によれば、アンタゴニストは小分子アンタゴニストである。別の実施態様によれば、アンタゴニストはポリヌクレオチドアンタゴニストである。Ｒスポンジン転位アンタゴニストは、ＲＳＰＯ１転位アンタゴニスト、ＲＳＰＯ２転位アンタゴニスト、ＲＳＰＯ３転位アンタゴニスト、および／またはＲＳＰＯ４転位アンタゴニストであってもよい。
【００２３】
本明細書で定義される用語「ｗｎｔ経路アンタゴニスト」は、ｗｎｔ経路（例えば、ｗｎｔ経路ポリペプチド）により媒介される生物活性を部分的にもしくは完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子である。いくつかの実施態様では、そのようなアンタゴニストはｗｎｔ経路ポリペプチドに結合する。一実施態様によれば、アンタゴニストはポリペプチドである。別の実施態様によれば、アンタゴニストは抗体アンタゴニストである。別の実施態様によれば、アンタゴニストは小分子アンタゴニストである。別の実施態様によれば、アンタゴニストはポリヌクレオチドアンタゴニストである。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」、または「核酸」とは、本明細書では互換的に使用されるように、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことであり、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であることが可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびその類似体を含んでいてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に標識へのコンジュゲーションなど（１つまたは複数の）改変を含んでもよい。他の種類の改変には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似物での置換、例えば、無電荷連鎖（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバミン酸、等）および電荷連鎖（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等）を有する修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシン、等）などのペンダント部分を含有する修飾、介入物（例えば、アクリジン、ソラレン、等）を有する修飾、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属、等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、改変された連鎖（例えば、アルファアノマー核酸、等）を有する修飾などのヌクレオチド間修飾、ならびに非改変型の（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれでも、例えば、ホスホン酸エステル基、リン酸基で置換される、標準保護基により保護される、または活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の連鎖を調製してもよいし、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’および３’末端ＯＨはリン酸化するまたはアミンもしくは１から２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも標準保護基に誘導体化しうる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似物、α−アノマー糖、アラビノーズ、キシロース、またはリキソースなどのエピメリック糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有することができる。１つまたは複数のホスホジエステル連鎖は代わりの連結基で置換してもよい。これらの代わりの連結基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ギ酸アセタール」）で置換されており、それぞれのＲまたはＲ’は独立してＨであるまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）連鎖、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有する置換されたもしくは非置換���ルキル（１〜２０Ｃ）である実施態様が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内のすべての連鎖が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００２５】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは、一般に約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうではない、一般的に一本鎖の合成ポリヌクレオチドのことである。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記説明は、オリゴヌクレオチドに対して等しく、完全に適用可能である。
【００２６】
用語「プライマー」とは、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離の３’−ＯＨ基を与えることにより続いて相補的核酸を重合化することができる一本鎖ポリヌクレオチドのことである。
【００２７】
用語「小分子」とは、分子量が約２０００ダルトンまたはそれよりも少ない、好ましくは約５００ダルトンまたはそれよりも少ない任意の分子のことである。
【００２８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、および「宿主細胞培養」は互換的に使用されており、そのような細胞の子孫を含む、外来性核酸が導入されている細胞のことである。宿主細胞には、原発性形質転換細胞および継代の数とは無関係にそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は核酸含有量が親細胞と完全に同一というわけではないことがあるが、変異を含有することがある。最初の形質転換細胞においてスクリーニングしてまたは選択して求めた機能または生物活性と同じ機能または生物活性を有する変異体子孫は本明細書に含まれる。
【００２９】
用語「ベクター」とは、本明細書で使用されるように、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸のことである。前記用語には、自己複製核酸構造体としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターが含まれる。ある種のベクターは、それが作動可能に連結した核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００３０】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離されている抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％よりも多いまたは９９％純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法についての概説は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９〜８７（２００７）を参照されたい。
【００３１】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常その核酸分子を含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、前記核酸分子は染色体外にまたはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在する。
【００３２】
用語「抗体」は本明細書では、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限りで抗体断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造体を包含する。
【００３３】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子のことである。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
基準抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて基準抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体のことであり、逆に基準抗体は競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。例となる競合アッセイは本明細書に提供されている。
【００３５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」は本明細書では互換的に使用されて、天然の抗体構造に実質的に類似する構造を有するまたは本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００３６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、例えば、天然に存在する変異を含有するまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能なバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に少量存在する）を除いて、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、その集団を構成する個々の抗体が同一であるおよび／または同じエピトープに結合する）から得られる抗体のことである。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられている異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特長を指しており、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製しうる（モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例となる方法は本明細書に記載されている）。
【００３７】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子のことである。例えば、天然ＩｇＧ抗体は約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖で構成されている。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられることもある。
【００３８】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来しており、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体のことである。
【００３９】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されるまたはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００４０】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体のことである。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＨＶＲに一致しており、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに一致している少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含むことがある。「ヒト化型の」抗体、例えば、非ヒト抗体とはヒト化を受けた抗体のことである。
【００４１】
抗体の「クラス」とは、定常領域またはその重鎖により所有される定常領域の種類のことである。抗体には５つの主要クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらの抗体のいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４２】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因し、抗体アイソタイプにより異なる生物活性のことである。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、およびＢ細胞活性化が含まれる。
【００４３】
本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。用語は天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在していることもあれば存在しないこともある。本明細書において別段に明記されなければ、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番方式に従っており、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されている。
【００４４】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基のことである。可変ドメインのＦＲは一般に４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲとＦＲ配列は一般に以下の配列、ＶＨ（またはＶＬ）：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で現れる。
【００４５】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列のセレクションにおいて最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列のセレクションは可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１〜３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１）、１〜３巻におけるのと同じサブグループである。一実施態様では、ＶＬでは、サブグループはＫａｂａｔら、上記参照におけるのと同じサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨでは、サブグループはＫａｂａｔら、上記参照におけるのと同じサブグループＩＩＩである。
【００４６】
本明細書での目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含むことがあり、またはアミノ酸配列変化を含有することもある。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００４７】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体重鎖または軽鎖のうち抗体を抗原に結合させることに関与しているドメインのことである。天然抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨとＶＬ）は一般に類似する構造を有しており、それぞれのドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．、９１ページ（２００７）を参照）。単一のＶＨまたはＶＬドメインで抗原結合特異性を与えるのに十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離し、それぞれ相補的ＶＬまたはＶＨのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０〜８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）を参照されたい。
【００４８】
本明細書で使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、抗体可変ドメインのうち配列が超可変であるおよび／または構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する領域のそれぞれのことである。一般には、天然の４つの鎖抗体は６つのＨＶＲ、すなわちＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つを含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループ由来のおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高度な配列可変性であるかつ／または抗原認識に関与している。例となる超可変ループはアミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に存在する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。例となるＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、およびＨ３の９５〜１０２に存在する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。ＶＨにおけるＣＤＲ１という例外はあるが、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、ＣＤＲのうちの短縮型ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれる領域内に含有される。例となるａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、およびＨ３の９５〜１０２に存在する（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）参照）。別段に示されなければ、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書ではＫａｂａｔら、上記参照に従って付番されている。
【００４９】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の総和の強度のことである。他の方法で指示されていなければ、本明細書で使用されるように、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する内因性結合親和性のことである。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般には解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例となる実施態様は以下に記載されている。
【００５０】
「親和性成熟」抗体とは、変更により抗原に対する抗体の親和性が改善されるような変更がない親抗体と比べて、１つまたは複数の高頻度可変性領域（ＨＶＲ）に１つまたは複数の変更がある抗体のことである。
【００５１】
用語「抗Ｒスポンジン転位抗体」および「Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する抗体」とは、抗体がＲスポンジン転位を標的にする際に診断薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合することができる抗体のことである。一実施態様では、抗Ｒスポンジン転位抗体が無関係な非Ｒスポンジン転位融合ポリペプチド、および／または非転位Ｒスポンジンポリペプチドに結合する程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定された場合、抗体のＲスポンジン転位融合ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。ある種の実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する抗体は、１≦μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある種の実施態様では、抗Ｒスポンジン転位抗体は、Ｒスポンジン転位の中で独特であるＲスポンジン転位のエピトープに結合する。
【００５２】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは減少させる抗体である。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００５３】
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識にコンジュゲートしない抗体のことである。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
【００５４】
「免疫コンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【００５５】
基準ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要な場合はギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なすことなく、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセントと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大アライメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書での目的のために、％アミノ酸配列同一性値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生み出される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により生み出され、ソースコードは米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９にユーザードキュメンテーションと一緒に提出され、そこに米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公表されており、またはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており変動しない。
【００５６】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂにとっての、これとの、またはこれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂにとって、これと、またはこれに対してある％のアミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言い表すことができる）は以下の通りに計算され、
１００掛ける分数Ｘ／Ｙ
ＸはＡとＢのそのプログラムアライメントにおいて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことは認識されるであろう。他の方法で特に記述されていなければ、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用するすぐ前のパラグラフに記載されている通りに得られる。
【００５７】
用語「検出」は直接的検出と間接的検出を含む、いかなる検出手段でも含む。
【００５８】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」とは、試料中で検出することができる、例えば、予測的、診断的および／または予後的指標物質のことである。バイオマーカーは、ある種の分子的、病態的、組織学的、および／または臨床的特長に特徴のある疾患または障害（例えば、癌）の特定のサブタイプの指標物質としての働きをすることができる。いくつかの実施態様では、バイオマーカーは遺伝子である。いくつかの実施態様では、バイオマーカーは遺伝子のバリアント（例えば、変異および／または多型）である。いくつかの実施態様では、バイオマーカーは転位である。バイオマーカーには、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、ポリペプチド、ポリペプチドとポリヌクレオチド修飾（例えば、翻訳後修飾）、炭水化物、および／または糖脂質ベースの分子マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
個体にとっての臨床的利益の増加と関連するバイオマーカーの「存在」、「量」、または「レベル」は、生体試料における検出可能なレベルである。これらは当業者に公知であり本明細書でも開示されている方法により測定することができる。評価されるバイオマーカーの発現レベルまたは量を使用して、治療に対する応答を判定することができる。
【００６０】
用語「発現のレベル」と「発現レベル」は一般に互換的に使用され、一般には生体試料中のバイオマーカーの量のことである。「発現」とは一般には、（例えば、遺伝子にコードされたおよび／またはエピジェネティックな）情報が細胞内に存在し作用する構造物に変換されるプロセスのことである。したがって、本明細書で使用されるように、「発現」とはポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）さえも指すことがある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチド、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片も、選択的スプライシングにより生成された転写物または分解した転写物由来であれ、例えば、タンパク質分解によりポリペプチドの翻訳後プロセシング由来であれ、発現されたと見なすことにする。「発現された遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後ポリペプチドに翻訳される遺伝子、およびＲＮＡに転写されるがポリペプチドには翻訳されない（例えば、トランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）遺伝子も含まれる。
【００６１】
「上昇した発現」、「上昇した発現レベル」、または「上昇したレベル」とは、疾患または障害（例えば、癌）に罹っていない個体（単数または複数）などの対照、または内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）と比べて個体におけるバイオマーカーの増加した発現または増加したレベルのことである。
【００６２】
「低下した発現」、「低下した発現レベル」、または「低下したレベル」とは、疾患または障害（例えば、癌）に罹っていない個体（単数または複数）などの対照、または内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）と比べて個体におけるバイオマーカーの減少した発現または減少したレベルのことである。
【００６３】
用語「ハウスキーピングバイオマーカー」とは、典型的にはあらゆる細胞型に類似して存在するバイオマーカーまたはバイオマーカーの群（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）のことである。いくつかの実施態様では、ハウスキーピングバイオマーカーは「ハウスキーピング遺伝子」である。「ハウスキーピング遺伝子」とは本明細書では、その活性が細胞機能の維持に不可欠なタンパク質をコードし、典型的にはあらゆる細胞型に類似して存在する遺伝子または遺伝子の群のことである。
【００６４】
本明細書で使用される「増幅」とは一般に、所望の配列の複数のコピーを産生するプロセスのことである。「複数のコピー」は少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は鋳型配列に対して必ずしも完全な配列相補性または同一性を意味するわけではない。例えば、コピーには、デオキシイノシンなどの類似物、意図的配列変化（例えば、鋳型にハイブリダイズすることが可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを通じて導入される配列変化）、および／または増幅中に生じる配列エラーが含まれうる。
【００６５】
用語「多重ＰＣＲ」とは、１回の反応で２つ以上のＤＮＡ配列を増幅する目的で１つよりも多いプライマーセットを使用して単一供給源（例えば、個体）から得られる核酸で実行される単一ＰＣＲのことである。
【００６６】
ハイブリダイゼーション反応の「厳密性」は当業者であれば容易に決定可能であり、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依拠する経験的計算である。一般に、プローブが長くなるほど適切なアニーリングには高い温度が必要であり、プローブが短いほど必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がその融解温度よりも低い環境中に存在する場合に変性ＤＮＡが再アニールする能力に依拠している。プローブとハイブリダイズすることが可能な配列の間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することができる相対的温度も高くなる。その結果、相対的温度が高いほど反応条件はさらに厳密になる傾向にあり、温度が低いほど厳密性も低くなることになる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性についての追加の詳細および説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照されたい。
【００６７】
本明細書で定義される「厳密な条件」または「高厳密性条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる、（２）ハイブリダイゼーション中は、ホルムアミド、例えば、０．１％牛血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムのｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどの変性剤を４２℃で用いる条件により、または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で用いる溶液中での一晩ハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で１０分間洗浄、続いてＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる５５℃での１０分間の抗厳密性洗浄により確認することができる。
【００６８】
「中程度厳密条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９により記載されている通りに確認することができ、上記の条件よりも厳密性の低い洗浄液とハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用が含まれる。中程度厳密条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃、一晩の培養、続いて約３７〜５０℃、１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄である。当業者であれば、プローブ長および同類のものなどの要因を収容するように温度、イオン強度、等を必要に応じて調整する方法を認識している。
【００６９】
用語「診断」は本明細書では、分子状態または病理学的状態、疾患または状態（例えば、癌）の同定または分類を指すのに使用される。例えば、「診断」は特定種類の癌の同定を指すことがある。「診断」は、例えば、組織病理学的基準による、または分子特長（例えば、バイオマーカー（例えば、特定の遺伝子または前記遺伝子によりコードされるタンパク質）のうちの１つまたは組合せの発現に特徴のあるサブタイプ）による癌の特定のサブタイプの分類を指すこともある。
【００７０】
用語「診断を支援する」は本明細書では、疾患または障害（例えば、癌）の特定種類の症状または状態の存在、または性質に関して臨床的決定を下すのを支援する方法を指すのに使用される。例えば、疾患または状態（例えば、癌）の診断を支援する方法は、個体由来の生体試料におけるある種のバイオマーカーを検出することを含むことができる。
【００７１】
用語「試料」は、本明細書で使用されるように、例えば、物理的、生化学的、化学的および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けられるかつ／または同定されることになる細胞実体および／または他の分子実体を含有する対象および／または対象の個体から得られるまたはこれに由来する組成物のことである。例えば、語句「疾患試料」およびその変種とは、特徴付けられることになる細胞実体および／または分子実体を含有することが予測されるまたは分かっている関心の対象から得られる任意の試料のことである。試料には、一次細胞もしくは培養細胞または細胞系統、細胞上澄み、細胞可溶化物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、発汗、粘液、腫瘍可溶化物、および組織培養培地、均質化された組織などの組織抽出物、腫瘍組織、細胞抽出物、ならびにその組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【００７２】
「組織試料」または「細胞試料」とは、対象または個体の組織から得られる類似の細胞の収集物を意味する。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結したかつ／もしくは保存された器官由来の固形組織、組織試料、生検ならびに／または吸引液；血液または血漿などの任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液などの体液；対象の妊娠または発生における任意の時間に由来する細胞でもよい。組織試料は一次細胞もしくは培養細胞または細胞系統でもよい。場合により、組織または細胞試料は疾患組織／器官から得られる。組織試料は、保存剤、抗凝血剤、バッファー、固定液、栄養剤、抗生物質または同類のものなどの、天然の組織と天然に混ざり合ってはいない化合物を含有していてもよい。
【００７３】
「基準試料」、「基準細胞」、「基準組織」、「対照試料」、「対照細胞」、または「対照組織」とは、本明細書で使用されるように、比較目的で使用される試料、細胞、組織、標準、またはレベルのことである。一実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、同じ対象または個体の身体（例えば、組織または細胞）の健康なおよび／または非疾患部分から得られる。例えば、疾患細胞または組織に隣接する健康なおよび／または非疾患細胞または組織（例えば、腫瘍に隣接する細胞または組織）である。別の実施態様では、基準試料は同じ対象または個体の身体の非治療組織および／または細胞から得られる。さらに別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は対象でも個体でもない個体の身体（例えば、組織または細胞）の健康なおよび／または非疾患部分から得られる。さらに別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は対象でも個体でもない個体の身体の非治療組織および／または細胞から得られる。
【００７４】
本明細書での目的のために、組織試料の「切片」とは、組織試料の単一部分または片、例えば、組織試料から切断される組織または細胞の薄切片を意味する。組織試料の同じ切片は形態的レベルでも分子レベルでも分析される、またはポリペプチドとポリヌクレオチドの両方に関して分析されると理解されているという条件で、組織試料の複数の切片が採取され分析にかけられてもよいと理解されている。
【００７５】
「相関させる（correlateまたはcorrelating）」とは、いかなる方法であれ、第一の分析またはプロトコールの成績および／または結果を第二の分析またはプロトコールの成績および／または結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコールを実行するのに第一の分析またはプロトコールの結果を使用してもよいし、第二の分析またはプロトコールを実施すべきかどうかを決定するために第一の分析またはプロトコールの結果を使用してもよい。ポリヌクレオチド分析またはプロトコールの実施態様に関して、特定の治療計画を実施すべきかどうかを決定するのにポリヌクレオチド発現分析またはプロトコールの結果を使用してもよい。
【００７６】
「個体の応答」または「応答」は、（１）減速および完全停止を含む疾患進行（例えば、癌進行）のある程度の阻害、（２）腫瘍サイズの減少、（３）隣接する末梢器官および／もしくは組織への癌細胞浸潤の阻害（例えば、減少、減速または完全停止）、（４）転移の阻害（例えば、減少、減速または完全停止）、（５）疾患もしくは障害（例えば、癌）に関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減、（６）無増悪生存期間の長さの増加、ならびに／または（９）治療に続く所与の時点での死亡率の減少を含むが、これらに限定されない、個体に対する利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価することができる。
【００７７】
語句「実質的に類似する」は、本明細書で使用されるように、当業者であれば２つの値の差を、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴という文脈内で統計的に有意ではないと見なすほど２つの数値（一般には、１つは分子に関連しもう１つは基準／コンパレーター分子に関連する）間の十分高度な類似性のことである。前記２つの値の差は、基準／コンパレーター値の関数として、例えば、約２０％未満、約１０％未満、および／または約５％未満であってもよい。語句「実質的に正常な」とは、基準（例えば、正常な基準）に実質的に類似していることである。
【００７８】
語句「実質的に異なる」とは、当業者であれば２つの値の差を、前記値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴という文脈内で統計的に有意であると見なすほど２つの数値（一般には、１つは分子に関連しもう１つは基準／コンパレーター分子に関連する）間の十分に高度な差のことである。前記２つの値の差は、基準／コンパレーター分子の値の関数として、例えば、約１０％よりも大きい、約２０％よりも大きい、約３０％よりも大きい、約４０％よりも大きい、および／または約５０％よりも大きくてもよい。
【００７９】
本明細書で使用される場合の単語「標識」とは、検出可能な化合物または組成物のことである。標識は典型的には、ポリヌクレオチドプローブまたは抗体などの試薬に直接的にまたは間接的にコンジュゲートされるまたは融合され、前記標識がコンジュゲートされているまたは融合されている試薬の検出を促進する。標識はそれ自体が検出可能であってもよい（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）し、または酵素標識の場合は、基質化合物または組成物の化学的変化を触媒して、検出可能な産物を生じてもよい。
【００８０】
「有効量」の薬剤とは、必要な用量で必要な期間、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量のことである。
【００８１】
本発明の「治療的有効量」の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストは、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力に応じて変化しうる。治療的有効量は、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果のほうが上回る量でもある。「予防的有効量」とは、必要な用量で必要な期間、所望の予防結果を達成するのに有効な量のことである。典型的にはしかし必ずしもではないが、予防用量は疾患に先立ってまたはその初期段階で対象において使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないことになる。
【００８２】
用語「薬学的製剤」とは、そこに含有される活性成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態であり、前記製剤が投与されると考えられる対象にとって容認できないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物のことである。
【００８３】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的製剤中の、対象にとって無毒の成分のことである。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定化剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用されるように、「治療」（および、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的変形）とは、治療を受けている個体の自然経過を変える試みにおける臨床的介入のことであり、予防のためにまたは臨床病理の経過中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状の軽減、疾患のいかなる直接的または間接的病理学的結果も減少すること、転移を予防すること、疾患進行の速度を減少すること、疾患状態の寛解または緩和、および寛解または予後改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体を使用して疾患の発症を遅らせるまたは疾患の進行を遅くする。
【００８５】
用語「癌」および「癌性の」は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指すまたは記述する。癌の例には、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびに様々な種類の頭頸部癌が含まれる。
【００８６】
用語「抗癌療法」とは、癌を治療するのに有用な療法のことである。抗癌治療剤には、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法に使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（イマチニブメチル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、（１つまたは複数の）ＢＣＭＡ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに他の生体活性剤および有機化学剤、等が含まれるが、これらに限定されない。それらの組合せも本発明に含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される用語「細胞傷害剤」とは、細胞機能を阻害するもしくは妨害するかつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質のことである。細胞傷害剤には、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤もしくは薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンもしくは他の挿入剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、その断片および／もしくはバリアントも含む；ならびに下に開示される様々な抗腫瘍もしくは抗癌剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００８８】
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物のことである。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン、ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似物トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似物を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似物ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）；フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）参照）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４インテグリン阻害剤；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、��ルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソームインジェクション（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソーマルドキソルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソーマルドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似物；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似物；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似物；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナル（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸などの葉酸補液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム：エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳ天然物、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ト��コテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、およびカルボプラチンなどの白金薬剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＥＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む、レチノイン酸などのレチノイド；クロドロン酸（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロン酸（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスホネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似物）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウムなどのＢｃｌ−２阻害剤（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下の定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下の定義参照）；ラパマイシンなどのセリン−スレオニンキナーゼ阻害剤（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ロナファーニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ  ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法を表す略字）；ならびにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと併用した治療レジメンを表す略字）などの上記のうちの２つ以上の薬剤の組合せが含まれる。
【００８９】
本明細書に定義される化学療法剤には、癌の増殖を促進することができるホルモンの効果を調節する、減少する、ブロックするまたは阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌療法」が含まれる。化学療法剤は、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケイキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、およびＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（そのような薬剤はエストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲターンオバーを増加させ、および／またはＥＲレベルを抑制しうる）などのアゴニスト特性のない純粋な抗エストロゲン；ホルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などのステロイドアロマターゼ阻害剤、ならびにアナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミドなどの非ステロイドアロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、ならびに他のアロマターゼ阻害剤にはボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）−イミダゾールが含まれる；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリンを含む、黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、オールトランスレチオニン酸（ａｌｌ  ｔｒａｎｓｒｅｔｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む、性ステロイド；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；抗プロゲステロン（ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｓ）；エストロゲン受容体下方調節因子（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記のうちの２つ以上の組合せを含むが、これらに限定されず、ホルモンそれ自体でもよい。
【００９０】
本出願において使用される用語「プロドラッグ」とは、親ドラッグと比べて腫瘍細胞に対して細胞傷害性が少なく、酵素的に活性化されるまたはより活性な親形態に転換することができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態のことである。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２ページ、６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ  （１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、（編）、２４７〜２６７ページ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグには、より活性な無細胞傷害性ドラッグに転換することができるリン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、場合により置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するためにプロドラッグ形態に誘導化することができる細胞傷害性薬物の例には、上記の化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００９１】
本明細書で使用される場合の「増殖阻害薬剤」とは、細胞（例えば、その増殖がインビトロまたはインビボのどちらかでｗｎｔ経路遺伝子および／またはＲスポンジン転位発現に依拠している細胞）の増殖を阻害する化合物または組成物のことである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの細胞周期進行をブロックする（Ｓ期以外の場所で）薬剤が含まれる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびアラビノフラノシル−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤はＳ期停止にも波及する。追加の情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ、編、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、ｅｎｔｉｔｌｅｄ「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉら、（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５）、特に１３ページに見ることができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌薬である。ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、ヨーロッパイチイに由来するが、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似物である。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管の構築を促進し、細胞において有糸分裂を阻害する脱重合を妨げることにより微小管を安定化する。
【００９２】
「放射線療法」は、正常に機能する細胞の能力を制限するまたは細胞を完全に破壊するように細胞に対する十分な損傷を誘導する有向のガンマ線またはベータ線を使用することを意味する。治療の投与用量および持続時間を決定する当技術分野で公知の方法が数多く存在することが認識される。典型的な治療は１回投与として与えられ、典型的な投与用量は１日当たり１０から２００単位（グレイ）に及ぶ。
【００９３】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。ある特定の実施態様では、個体または対象はヒトである。
【００９４】
用語「同時に」とは、投与の少なくとも一部が時間的に重なっている２つ以上の治療薬の投与を指すのに本明細書では使用される。したがって、同時投与には、１つまたは複数の他の薬剤の投与を中断した後に１つまたは複数の薬剤の投与が続く投与計画が含まれる。
【００９５】
「減少させる」または「阻害する」は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも多い全体的減少を引き起こす能力を意味する。減少させるまたは阻害するは、治療されている障害の症状、転移の存在もしくは大きさ、または原発性腫瘍の大きさに言及することができる。
【００９６】
用語「添付文書」は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症および／またはそのような治療製品に関する警告についての情報を含む、治療製品のコマーシャルパッケージに通例含まれる使用説明書に言及するのに使用される。
【００９７】
「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患もしくは障害（例えば、癌）の治療のための薬物、または本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。ある種の実施態様では、製造品またはキットは、本明細書に記載される方法を実施するためのユニットとして販売促進され、流通され、または販売される。
【００９８】
「標的オーディエンス」は、特に特定の使用、治療、または効能のために市場に出すまたは宣伝することにより、特定の薬物が販売促進されているまたは販売促進されることが意図されている対象となる人の集団または施設であり、例えば、個体、全住民、新聞、医学文献、および雑誌の読者、テレビまたはインターネット視聴者、ラジオまたはインターネットの聴取者、医者、製薬会社、等である。
【００９９】
当業者により理解されているように、本明細書の値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体に向けられている実施態様を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は「Ｘ」の記述を含む。
【０１００】
本明細書に記載される本発明の態様および実施態様には、態様および実施態様「からなる」および／または「基本的にからなる」が含まれることは理解されている。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には他の方法で指示されていなければ複数の参照が含まれる。
【０１０１】
ＩＩ．方法および使用
本明細書ではｗｎｔ経路アンタゴニストを利用する方法が提供される。特に、本明細書ではＲスポンジン転位アンタゴニストを利用する方法が提供される。例えば、本明細書では癌細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、癌細胞を有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストに接触させることを含む方法が提供される。本明細書では個体において癌を治療する方法において、個体に有効量のＲスポンジン転位アンタゴニストを投与することを含む方法も提供される。いくつかの実施態様では、癌または癌細胞はＲスポンジン転位を含む。
【０１０２】
本明細書では個体において癌の治療をする方法であって、個体に有効量の抗癌療法を投与することを含み、治療が１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌を有する個体に基づいている方法も提供される。いくつかの実施態様では、抗癌療法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む。例えば、個体において癌の治療をする方法であって、個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含み、治療がＲスポンジン転位を含む癌を有する個体に基づいている方法が提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０３】
個体が１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌を有することが分かっているという条件で、個体において癌の治療をする方法であって、治療が個体に有効量の抗癌療法を投与することを含む方法がさらに提供される。いくつかの実施態様では、抗癌療法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む。例えば、本明細書では、個体がＲスポンジン転位を含む癌を有することが分かっているという条件で、個体において癌の治療をする方法であって、治療が個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０４】
本明細書では、１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌細胞を治療する方法であって、有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを提供することを含む方法が提供される。例えば、本明細書では、Ｒスポンジン転位を含む癌細胞を治療する方法であって、有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを提供することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０５】
本明細書では、個体において癌を治療するための方法であって、個体から得られる試料が１つまたは複数のバイオマーカーを含むことを判定し、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を個体に投与し、それによって癌を治療することを含む方法が提供される。例えば、本明細書では、個体において癌を治療するための方法であって、個体から得られる試料がＲスポンジン転位を含むことを判定し、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む有効量の抗癌療法を個体に投与し、それによって癌を治療することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０６】
本明細書では、癌を治療する方法において、（ａ）１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌を有する個体を選択し、（ｂ）こうして選択された個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与し、それにより癌を治療することを含む方法も提供される。例えば、本明細書では、癌を治療する方法において、（ａ）Ｒスポンジン転位を含む癌を有する個体を選択し、（ｂ）こうして選択された個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与し、それにより癌を治療することを含む方法も提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０７】
本明細書では、抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いまたは低い癌に罹った個体を同定する方法であって、個体から得られる試料における１つまたは複数のバイオマーカーの存在または非存在を判定することを含み、試料における１つまたは複数のバイオマーカーの存在が、個体が抗癌療法を用いた治療が有益である利益を示す可能性が高いことを示し、または１つまたは複数のバイオマーカーの非存在が、個体が抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が低いことを示す方法がさらに提供される。いくつかの実施態様では、抗癌療法はｗｎｔ経路アンタゴニストを含む。例えば、本明細書では、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いまたは低い癌に罹った個体を同定する方法であって、個体から得られる試料におけるＲスポンジン転位の存在または非存在を判定することを含み、試料におけるＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が高いことを示し、またはＲスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療が有益である可能性が低いことを示す方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法は、有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０８】
本明細書では、癌に罹っている個体が、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療に効果的に応答する可能性が高いかまたは低いかを予測するための方法であって、１つまたは複数のバイオマーカーを判定することを含み、それにより１つまたは複数のバイオマーカーの存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が高いことを示し、１つまたは複数のバイオマーカーの非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が低いことを示す方法が提供される。例えば、本明細書では、癌に罹っている個体が、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法を用いた治療に効果的に応答する可能性が高いかまたは低いかを予測するための方法であって、Ｒスポンジン転位を判定することを含み、それによりＲスポンジン転位の存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が高いことを示し、Ｒスポンジン転位の非存在が、個体がｗｎｔ経路アンタゴニストを用いた治療に効果的に応答する可能性が低いことを示す方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法は有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１０９】
本明細書では、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する癌に罹った個体の応答または応答の欠如を予測する方法であって、個体から得られる試料において１つまたは複数のバイオマーカーの存在または非存在を検出することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答を予測し、１つまたは複数のバイオマーカーの非存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌治療に対する個体の応答の欠如を予測する方法が提供される。例えば、本明細書では、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法に対する癌に罹った個体の応答または応答の欠如を予測する方法であって、個体から得られる試料においてＲスポンジン転位の存在または非存在を検出することを含み、Ｒスポンジン転位の存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法に対する個体の応答を予測し、Ｒスポンジン転位の非存在がｗｎｔ経路アンタゴニストを含む抗癌療法に対する個体の応答の欠如を予測する方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法は有効量のｗｎｔ経路アンタゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位アンタゴニストはＲスポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）に結合する単離された抗体である。
【０１１０】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表２に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は表２に収載される１つまたは複数の遺伝子の変種（例えば、多型または変異）の存在を含む（例えば、表２における変種（例えば、多型または変異））。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表３に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は表３に収載される１つまたは複数の遺伝子の変種（例えば、多型または変異）の存在を含む（例えば、表３における変種（例えば、多型または変異））。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表４に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は表４に収載される１つまたは複数の遺伝子の変種（例えば、多型または変異）の存在を含む（例えば、表４における変種（例えば、多型または変異））。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表５に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は表５に収載される１つまたは複数の遺伝子の変種（例えば、多型または変異）の存在を含む（例えば、表５における変種（例えば、多型または変異））。いくつかの実施態様では、変種（例えば、多型または変異）は体細胞変種（例えば、多型または変異）である。
【０１１１】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＣＳＭＤ１、ＮＲＸＮ１、ＤＮＡＨ５、ＭＲＶＩ１、ＴＲＰＳ１、ＤＭＤ、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＴＭ、ＦＡＭ５Ｃ、ＥＶＣ２、ＯＲ２Ｗ３、ＳＩＮ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＮＣＯＲ１、ＪＡＲＩＤ２、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ７Ｌ２、ＰＨＦ２、ＳＯＳ２、ＲＡＳＧＲＦ２、ＡＲＨＧＡＰ１０、ＡＲＨＧＥＦ３３、Ｒａｂ４０ｃ、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＥＰ４００、ＭＬＬ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＥＲＢＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＦＮＢ３、ＥＰＨＡ１、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１、ＦＬＴ、ＲＩＯＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＭＵＳＫ、ＭＡＰ２Ｋ７、ＭＡＰ４Ｋ５、ＰＴＰＲＮ２、ＧＰＲ４、ＧＰＲ９８、ＴＯＰＯＲＳ、およびＳＣＮ１０Ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＣＳＭＤ１、ＮＲＸＮ１、ＤＮＡＨ５、ＭＲＶＩ１、ＴＲＰＳ１、ＤＭＤ、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＴＭ、ＦＡＭ５Ｃ、ＥＶＣ２、ＯＲ２Ｗ３、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、およびＳＣＮ１０Ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＲＡＢ４０Ｃ、ＴＣＦ１２、Ｃ２０ｏｒｆ１３２、ＧＲＩＮ３Ａ、および／またはＳＯＳ２を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＥＴＶ４、ＧＲＩＮＤ２Ｄ、ＦＯＸＱ１、および／またはＣＬＤＮ１を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＭＲＰＬ３３を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは１つまたは複数の転写調節因子（例えば、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ７Ｌ２および／またはＰＨＦ２）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数のＲａｓ／Ｒｈｏ関連調節因子（例えば、ＳＯＳ１（例えば、Ｒ５４７Ｗ、Ｔ６１４Ｍ  Ｒ８５４＊、Ｇ１１２９Ｖ）、ＳＯＳ２（例えば、Ｒ２２５＊、Ｒ８５４Ｃ、およびＱ１２９６Ｈ）、ＲＡＳＧＲＦ２、ＡＲＨＧＡＰ１０、ＡＲＨＧＥＦ３３および／またはＲａｂ４０ｃ（例えば、Ｇ２５１Ｓ））を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは１つまたは複数のクロマチン修飾酵素（例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＥＰ４００および／またはＭＬＬ）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のクロマチン修飾酵素はＴＥＴ１および／またはＴＥＴ３である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のクロマチン修飾酵素は、ＴＥＴ１（例えば、Ｒ８１Ｈ、Ｅ４１７Ａ、Ｋ５４０Ｔ、Ｋ７９２Ｔ、Ｓ８７９Ｌ、Ｓ１０１２＊、Ｑ１３２２＊、Ｃ１４８２Ｙ、Ａ１８９６Ｖ、およびＡ２１２９Ｖ）、ＴＥＴ２（例えば、Ｋ１０８Ｔ、Ｔ１１８Ｉ、Ｓ２８９Ｌ、Ｆ３７３Ｌ、Ｋ１０５６Ｎ、Ｙ１１６９＊、Ａ１４９７Ｖ、およびＶ１８５７Ｍ）、および／またはＴＥＴ３（例えば、Ｔ１６５Ｍ、Ａ８７４Ｔ、Ｍ９７７Ｖ、Ｇ１３９８Ｒ、およびＲ１５７６Ｑ／Ｗ）である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数の受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＲＢＢ３、ＥＰＨＢ���、ＥＦＮＢ３、ＥＰＨＡ１、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１およびＦＬＴ４）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは１つまたは複数のキナーゼ（例えば、ＲＩＯＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＭＵＳＫ、ＭＡＰ２Ｋ７およびＭＡＰ４Ｋ５）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数のタンパク質ホスファターゼ（例えば、ＰＴＰＲＮ２）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数のＧＰＲＣ（例えば、ＧＰＲ４および／またはＧＰＲ９８）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数のＥ３−リガーゼ（例えば、ＴＯＰＯＲＳ）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表２、３、４、および／または５に収載される１つまたは複数のバイオマーカーの変種（例えば、多型または変異）の存在を含む（例えば、表２、３、４、および／または５における変種（例えば、多型または変異））。いくつかの実施態様では、変種（例えば、多型または変異）は体細胞変種（例えば、多型または変異）を含む。
【０１１２】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、１つまたは複数のＲＳＰＯ（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、１つまたは複数のＲＳＰＯ（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）の（例えば、基準と比べて）上昇した発現レベルの存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲＳＰＯ１を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲＳＰＯ４を含む。
【０１１３】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、表６に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表６に収載される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、基準と比べて）上昇した発現レベルの存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＦＯＸＡ１、ＣＬＮＤ１、および／またはＩＧＦ２を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、ＦＯＸＡ１、ＣＬＮＤ１、および／またはＩＧＦ２の（例えば、基準と比べて）上昇した発現レベルの存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、カルシウムシグナル伝達、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達、グルタミン酸受容体シグナル伝達、筋萎縮性側索硬化症シグナル伝達、窒素代謝、軸索誘導シグナル伝達、乾癬におけるＩＬ−１７Ａの役割、セロトニン受容体シグナル伝達、慢性閉塞性肺疾患における気道病変、タンパク質キナーゼＡシグナル伝達、膀胱癌シグナル伝達、ＨＩＦ１αシグナル伝達、心臓βアドレナリンシグナル伝達、シナプス長期増強、アテローム動脈硬化症シグナル伝達、サーカディアンリズムシグナル伝達、神経におけるＣＲＥＢシグナル伝達、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達、白血球管外遊出シグナル伝達、補体系、エイコサノイドシグナル伝達、チロシン代謝、システイン代謝、シナプス長期抑制、関節炎におけるＩＬ−１７Ａの役割、シルデナフィル（バイアグラ）の細胞効果、脊髄後角ニューロンにおける神経障害性疼痛シグナル伝達、ＤアルギニンとＤオルニチン代謝、アレルギー性炎症性気道疾患におけるＩＬ−１７Ｆの役割、甲状腺癌シグナル伝達、肝線維症／肝星細胞活性化、ドーパミン受容体シグナル伝達、哺乳動物胚幹細胞多能性におけるＮＡＮＯＧの役割、コンドロイチン硫酸生合成、エンドセリンー１シグナル伝達、ケラタン硫酸生合成、光伝達経路、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達、ケモカインシグナル伝達、アラニンとアスパラギン酸代謝、スフィンゴ糖脂質生合成−ネオラクトシリーズ（Ｎｅｏｌａｃｔｏｓｅｒｉｅｓ）、肝汁酸生合成、マクロファージの役割、関節リウマチにおける線維芽細胞と内皮細胞、αアドレナリンシグナル伝達、タウリンとヒポタウリン代謝、ＲＸＲ機能のＬＰＳ／ＩＬ−１媒介阻害、結腸直腸癌転移シグナル伝達、好酸球におけるＣＣＲ３シグナル伝達、および／またはＯ−グリカン生合成を含むがこれらに限定されない差次的に発現されるシグナル伝達経路を含む。
【０１１４】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、表７に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表７に収載される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、基準と比べて）上昇した遺伝子コピー数の存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＩＧＦ２、ＫＲＡＳ、および／またはＭＹＣを含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、ＩＧＦ２、ＫＲＡＳ、および／またはＭＹＣの（例えば、基準と比べて）上昇した遺伝子コピー数の存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表７に収載される１つまたは複数の遺伝子の（例えば、基準と比べて）低下した遺伝子コピー数の存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＦＨＩＴ、ＡＰＣ、および／またはＳＭＡＤ４を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、ＦＨＩＴ、ＡＰＣ、および／またはＳＭＡＤ４の（例えば、基準と比べて）低下した遺伝子コピー数の存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、染色体２０ｑの（例えば、基準と比べて）上昇したコピー数の存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、染色体１８ｑの（例えば、基準と比べて）低下したコピー数の存在により示される。
【０１１５】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、表９に収載される１つまたは複数の遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、１つもしくは複数のバイオマーカーの存在は、表９に収載される１つもしくは複数の遺伝子の変種（例えば、多型または変異）（例えば、表９における変種（例えば、多型または変異））および／または表９に収載される１つもしくは複数の遺伝子の（例えば、基準と比べた）選択的スプライシングの存在により示される。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＴＰ５３、ＮＯＴＣＨ２、ＭＲＰＬ３３、および／またはＥＩＦ５Ｂを含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＭＲＰＬ３３である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、ＴＰ５３、ＮＯＴＣＨ２、ＭＲＰＬ３３、および／もしくはＥＩＦ５Ｂの変種（例えば、多型または変異）（例えば、表９における変種（例えば、多型または変異））ならびに／またはＴＰ５３、ＮＯＴＣＨ２、ＭＲＰＬ３３、および／もしくはＥＩＦ５Ｂの（例えば、基準と比べた）選択的スプライシングの存在により示される。
【０１１６】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは、表１０に収載される１つまたは複数の遺伝子の転位（例えば、再配列および／または融合）を含む。いくつかの実施態様では、１つもしくは複数のバイオマーカーの存在は、表１０に収載される１つまたは複数の遺伝子の転位（例えば、再配列および／または融合）の存在を含む（例えば、表１０における転位（例えば、再配列および／または融合））。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＶＴ１転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＰＶＴ１転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＶＴ１およびＭＹＣを含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＶＴ１およびＩｎｃＤＮＡを含む。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）はＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ１転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は、配列番号１２、４１、および／または４２を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７２および／または配列番号７３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号１３、１４、４３、および／または４４を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫ分泌シグナル配列を含む（かつ／またはＲＳＰＯ３分泌シグナル配列を含まない）。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ４転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）は、（例えば、Ｒスポンジン転位のない基準と比べて）Ｒスポンジンの上昇した発現レベルをもたらす。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）は、（例えば、Ｒスポンジン転位のない基準と比べて）Ｒスポンジンの上昇した活性および／または活性化をもたらす。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表１０における転位（例えば、再配列および／または融合）ならびにＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦなどのＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）を含む。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表１０における転位（例えば、再配列および／または融合）、ならびに変種（例えば、多型または変異）ＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦなどの、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）の存在である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、表１０における転位（例えば、再配列および／または融合）などの、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）の存在であり、１つまたは複数のバイオマーカーの非存在は、変種（例えば、多型または変異）ＣＴＮＮＢ１および／またはＡＰＣの非存在である。
【０１１７】
転位（例えば、再配列および／または融合）のいずれかのいくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は体細胞転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は染色体内転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は染色体間転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は浸潤である。いくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は欠失である。いくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）は、機能的転位融合ポリヌクレオチド（例えば、機能的Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチド）および／または機能的転位融合ポリペプチド（例えば、機能的Ｒスポンジン転位融合ポリペプチド）である。いくつかの実施態様では、機能的転位融合ポリペプチド（例えば、機能的Ｒスポンジン転位融合ポリペプチド）は、転位した遺伝子のうちの１つにより調節されることが分かっている経路（例えば、ｗｎｔシグナル伝達経路）を活性化する。いくつかの実施態様では、経路はカノニカルｗｎｔシグナル伝達経路である。いくつかの実施態様では、経路は非カノニカルｗｎｔシグナル伝達経路である。いくつかの実施態様では、経路活性化を決定する方法は当技術分野では公知であり、本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイが含まれる。
【０１１８】
癌および癌細胞の例には、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、および膵島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、および白血病またはリンパ系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌（転移性乳癌を含む）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、ならびに頭頸部癌が含まれる。いくつかの実施態様では、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施態様では、癌は結腸癌である。いくつかの実施態様では、癌は直腸癌である。
【０１１９】
バイオマーカー（例えば、Ｒスポンジン転位）の存在および／または発現レベル／量は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な判断基準に基づいて定性的におよび／または定量的に決定することができる。ある種の実施態様では、第一の試料中のバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、第二の試料中の存在／非存在および／または発現レベル／量と比べて増加している。ある種の実施態様では、第一の試料中のバイオマーカーの存在／非存在および／または発現レベル／量は、第二の試料中の存在および／または発現レベル／量と比べて減少している。ある種の実施態様では、第二の試料は、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織である。遺伝子の存在／非存在および／または発現レベル／量を決定するための追加の開示は本明細書に記載されている。
【０１２０】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、上昇した発現とは、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比べた場合、本明細書に記載される方法などの公知の標準技術法により検出されるバイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ））のレベルにおける約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多いのいずれかである全増加のことである。ある種の実施態様では、上昇した発現とは、試料中のバイオマーカーの発現レベル／量の増加のことであり、増加は基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織中のそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、または１００×のうちのいずれかである。いくつかの実施態様では、上昇した発現とは、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、対照組織、または内部標準（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比べた場合、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、または約３．２５倍よりも多い全増加のことである。
【０１２１】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、低下した発現とは、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比べた場合、本明細書に記載される方法などの公知の標準技術法により検出されるバイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ））のレベルにおける約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも多いのいずれかである全低下のことである。ある種の実施態様では、低下した発現とは、試料中のバイオマーカーの発現レベル／量の減少のことであり、減少は基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織中のそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９×、０．８×、０．７×、０．６×、０．５×、０．４×、０．３×、０．２×、０．１×、０．０５×、または０．０１×のうちのいずれかである。
【０１２２】
試料中の様々なバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、免疫組織化学的（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標識細胞分取（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースのアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡとして）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム塩基配列決定、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）ならびに、例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡおよび同類のものなどの他の増幅型検出法、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、ならびに／または遺伝子発現のシリアル分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子、および／もしくは組織アレイ分析により実施することができる多種多様なアッセイのうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない多くの方法により分析することができ、その多くが当技術分野では公知であり、当業者には理解されている。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコールは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔｓ  ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）ａｎｄ  １８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見られる。Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｒ  Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から利用可能なアッセイなどの多重免疫アッセイも使用しうる。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、（ａ）遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（例えば、ｒｔＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、または試料（例えば、対象癌試料）上でのＦＩＳＨを実施し、（ｂ）試料中のバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量を決定することを含む方法を使用して、決定される。いくつかの実施態様では、マイクロアレイ法は、厳密な条件下で上記の遺伝子をコードする核酸分子にハイブリダイズすることができる１つまたは複数の核酸分子を有するまたは上記の遺伝子にコードされるタンパク質のうちの１つまたは複数に結合することができる１つまたは複数のポリペプチド（例えば、ペプチドまたは抗体）を有するマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法はｑＲＴ−ＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は多重ＰＣＲである。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はマイクロアレイにより測定される。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はｑＲＴ−ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施態様では、発現は多重ＰＣＲにより測定される。
【０１２４】
細胞中のｍＲＮＡを評価するための方法は周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、１つまたは複数の遺伝子に特異的な標識リボプローブを使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連技法）および様々な核酸増幅アッセイ（例えば、遺伝子の１つまたは複数に特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびに、例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡおよび同類のものなどの他の増幅型検出法）が含まれる。
【０１２５】
哺乳動物由来の試料は、ノーザン、ドットブロットまたはＰＣＲ分析を使用してｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。さらに、そのような方法は、生体試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定することが可能になる１つまたは複数のステップを含むことができる（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に試験することにより）。場合により、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
【０１２６】
本発明の随意の方法には、マイクロアレイ技術により組織または細胞試料中の標的ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを試験するまたは検出するプロトコールが含まれる。核酸マイクロアレイを使用して、試験および対照組織試料由来の試験および対照ｍＲＮＡ試料は逆転写され標識されて、ｃＤＮＡプローブを生成する。次に、プローブは、固体支持体上に固定された核酸のアレイにハイブリダイズされる。アレイは、アレイのそれぞれのメンバーの配列と位置が分かるように配置される。例えば、その発現が抗血管新生療法の増大したまたは減少した臨床的有用性と相関している遺伝子のセレクションを固体支持体上に整列させてもよい。標識プローブが特定のアレイメンバーとハイブリダイズすれば、プローブが由来する試料はその遺伝子を発現していることが示される。
【０１２７】
いくつかの実施態様によれば、存在および／または発現レベル／量は、前述の遺伝子のタンパク質発現レベルを観察することにより測定される。ある種の実施態様では、方法は、バイオマーカーの結合に許容的である条件下で本明細書に記載されるバイオマーカーに対する抗体（例えば、抗Ｒスポンジン転位抗体）に生体試料を接触させ、抗体とバイオマーカーの間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法はインビトロ法でもインビボ法であってもよい。一実施態様では、抗体を使用して、ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニスト、例えば、個体を選択するためのバイオマーカーを用いる療法に適格な対象を選択する。
【０１２８】
ある種の実施態様では、試料中のバイオマーカータンパク質の存在および／または発現レベル／量はＩＨＣと染色プロトコールを使用して試験される。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を決定するまたは検出する信頼性の高い方法であることが明らかにされている。一態様では、バイオマーカーの発現レベルは、（ａ）抗体を用いて試料（例えば、対象癌試料）のＩＨＣ分析を実施し、（ｂ）試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む方法を使用して決定される。いくつかの実施態様では、ＩＨＣ染色強度は、基準値と比べて決定される。
【０１２９】
ＩＨＣは、形態染色および／または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの追加の技法と組み合わせて実施してもよい。ＩＨＣの２つの一般的方法、直接的アッセイと間接的アッセイが利用可能である。第一のアッセイに従えば、標的抗原への抗体の結合は直接的に決定される。この直接的アッセイは、さらなる抗体相互作用なしで可視化することができる蛍光タグまたは酵素標識一次抗体などの標識試薬を使用する。典型的な間接的アッセイでは、非コンジュゲート一次抗体は抗原に結合し、次に標識二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートされる場合、発色性または蛍光発生基質が添加されて抗原を可視化する。いくつかの二次抗体は一次抗体上の異なるエピトープと反応することがあるために、シグナル増幅が起こる。
【０１３０】
ＩＨＣのために使用される一次および／または二次抗体は検出可能な部分で標識されることになる。一般的には以下の範疇、（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉなどの放射性同位元素、（ｂ）コロイド状金粒子、（ｃ）希土キレート（ユーロピウムキレート）、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリテリン（ｐｈｙｃｏｃｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、またはＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ７およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ７などの市販されているフルオロフォアならびに／または上記のうちのいずれか１つもしくは複数の誘導体を含むがこれらに限定されない蛍光標識、（ｄ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのうちのいくつかの概説を提供している、に分類することができる多数の標識が利用可能である。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ならびに同類のものが含まれる。
【０１３１】
酵素−基質組合せの例には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてのパラニトロフェニルリン酸、およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）が含まれる。これらの概評は、米国特許第４，２７５，１４９号および米国特許第４，３１８，９８０号を参照されたい。
【０１３２】
このようにして調製された検体はマウントされ、カバースリップを載せてもよい。次に、スライド評価は、例えば、顕微鏡を使用して決定され、当技術分野で常用される染色強度基準を用いてもよい。いくつかの実施態様では、約１＋またはそれよりも高い染色パターンスコアは診断に用いるおよび／または予後に用いる。ある種の実施態様では、ＩＨＣアッセイにおける約２＋またはそれよりも高い染色パターンスコアは診断に用いるおよび／または予後に用いる。他の実施態様では、約３またはそれよりも高い染色パターンスコアは診断に用いるおよび／または予後に用いる。一実施態様では、腫瘍または結腸腺腫由来の細胞および／または組織がＩＨＣを使用して試験される場合、染色は一般に（試料中に存在することがある間質または周辺組織と対照的に）腫瘍細胞および／または組織において決定されるまたは評価されると理解されている。
【０１３３】
別の方法では、試料を、抗体−バイオマーカー複合体が形成されるのに十分な条件下で前記バイオマーカーに特異的な抗体（例えば、抗Ｒスポンジン転位抗体）に接触させ、次に前記複合体を検出することができる。バイオマーカーの存在は、血漿または血清を含む多種多様な組織および試料をアッセイするためのウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ手順によりなどの多くの方法で検出しうる。そのようなアッセイフォーマットを使用する広範囲の免疫アッセイ法が利用可能であり、例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、米国特許第４，４２４，２７９号および米国特許第４，０１８，６５３号を参照されたい。これには、単一部位と二部位の両方のアッセイまたは非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、および従来の競合結合アッセイが含まれる。これらのアッセイは、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接的結合も含まれる。
【０１３４】
組織または細胞試料中の選択されたバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、機能的または活性ベースのアッセイにより試験してもよい。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、当技術分野で公知のアッセイを行って、組織または細胞試料中の所与の酵素活性の存在を決定するまたは検出してもよい。
【０１３５】
ある種の実施態様では、試料はアッセイされるバイオマーカーの量の違いと使用される試料の質のばらつきの両方、およびアッセイ実行のばらつきについて正規化される。そのような正規化は、ＡＣＴＢなどの周知のハウスキーピング遺伝子を含むある種の正規化バイオマーカーの発現を検出し組み入れることにより実現することができる。代わりに、正規化は、アッセイされた遺伝子のすべてまたはその大きなサブセットの平均または中央値シグナルに基づかせることができる（グローバル正規化アプローチ）。遺伝子単位で、測定され正規化された量の対象腫瘍ｍＲＮＡまたはタンパク質は基準セットに見られる量と比較される。対象あたりの試験された腫瘍あたりのｍＲＮＡまたはタンパク質ごとの正規化発現レベルは、基準セットにおいて測定された発現レベルの百分率として表すことができる。分析される特定の対象試料において測定される存在および／または発現レベル／量は、当技術分野で周知の方法により決定することができるこの範囲内のあるパーセンタイルに入ることになる。
【０１３６】
ある種の実施態様では、遺伝子の相対的発現レベルは以下のように決定される。
相対的発現遺伝子１試料１＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）、Ｃｔは試料において決定される。
相対的発現遺伝子１基準ＲＡＮ＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）、Ｃｔは基準試料において決定される。
正規化相対的発現遺伝子１試料１＝（相対的発現遺伝子１試料１／相対的発現遺伝子１基準ＲＮＡ）×１００
Ｃｔは閾値サイクルである。Ｃｔは、反応内で生成される蛍光が閾値線を横切るサイクル数である。
【０１３７】
すべての実験は、様々な組織供給源由来のＲＮＡの網羅的混合物である基準ＲＮＡに正規化される（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ製の基準ＲＮＡ  ＃６３６５３８）。同一の基準ＲＮＡはそれぞれのｑＲＴ−ＰＣＲ実行に含まれ、異なる実験実行間の結果の比較が可能になる。
【０１３８】
一実施態様では、試料は臨床試料である。別の実施態様では、試料は診断アッセイにおいて使用される。いくつかの実施態様では、試料は原発または転移腫瘍から得られる。組織検体は腫瘍組織の代表的小片を得るのに使用されることが多い。代わりに、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含有すると分かっているまたは考えられる組織または体液の形態で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病巣の試料は、切除、気管支鏡検査、穿刺吸引、気管支擦過法により、または痰、胸膜液もしくは血液から得ることができる。遺伝子または遺伝子産物は癌もしくは腫瘍組織からまたは尿、痰、血清もしくは血漿などの他の身体試料から検出することが可能である。癌試料中の標的遺伝子または遺伝子産物の検出のための上記の同じ技法は、他の身体試料に適用することができる。癌細胞は癌病巣から剥がれ落ちてそのような身体試料に現れることがある。そのような身体試料をスクリーニングすることにより、これらの癌について簡単な早期診断を達成することができる。さらに、療法の進行は、標的遺伝子または遺伝子産物についてそのような身体試料を検査することによりさらに容易にモニターすることができる。
【０１３９】
ある種の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、試験試料が得られるときとは異なる１つまたは複数の時点で得られる同じ対象または個体由来の単一試料または混合した複数の試料である。例えば、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、試験試料が得られるときより早期の時点で同じ対象または個体から得られる。そのような基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、基準試料が癌の初期診断中に得られるのであれば有用であることがあり、試験試料は後の癌が転移性になったときに得られる。
【０１４０】
ある種の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象でも個体でもない１つまたは複数の健康な個体由来の混合した複数の試料である。ある種の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象でも個体でもない疾患または障害（例えば、癌）に罹った１つまたは複数の健康な個体由来の混合した複数の試料である。ある種の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象でも個体でもない１つまたは複数の個体由来の正常組織からプールされたＲＮＡ試料またはプールされた血漿もしくは血清試料である。ある種の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象でも個体でもない疾患または障害（例えば、癌）に罹った１つまたは複数の個体由来の腫瘍組織からプールされたＲＮＡ試料またはプールされた血漿もしくは血清試料である。
【０１４１】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４アンタゴニスト）である。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストは、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストは、抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は抗体断片であり、抗体断片は、ｗｎｔ経路ポリペプチド、特にＲスポンジンアンタゴニストおよび／またはＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する。
【０１４２】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、上の実施態様のいずれかに従った個体はヒトであってよい。
【０１４３】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、方法は、そのような癌を有する個体に有効量のｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストを投与することを含む。そのような一実施態様では、下に記載されるように、方法は個人に有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を投与することを含む。いくつかの実施態様では、個体はヒトであってよい。
【０１４４】
本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストは、療法において単独でもまたは他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。例えば、本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストは、別のｗｎｔ経路アンタゴニストを含む少なくとも１つの追加の治療薬と同時投与してもよい。ある特定の実施態様では、追加の治療剤は化学療法剤である。
【０１４５】
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別々の製剤に含まれている）、および別々の投与を包含しており、後者の場合、ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストの投与は追加の治療剤および／またはアジュバンドの投与に先立って、同時におよび／または続いて行うことができる。ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニストは、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０１４６】
本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジン転位アンタゴニスト（例えば、抗体、結合ポリペプチド、および／または小分子）（および任意の追加の治療薬）は、非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに局所治療が望ましい場合には病巣内投与を含むいかなる適切な手段によっても投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投与は、いかなる適切な経路によっても、例えば、一部、投与が短期か長期かにより、静脈注射または皮下注射などの注射によっても可能である。様々な時点にわたる単回または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが本明細書では想定されている。
【０１４７】
本明細書に記載のｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニスト（例えば、抗体、結合ポリペプチド、および／または小分子）は、良好な医療行為と一致する様式で処方されうる、服用されうる、および投与されうる。この文脈で考慮する要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個人の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に知られている他の要因が含まれる。ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストは、問題の障害を予防するまたは治療するのに現在使用されている１つまたは複数の薬剤と一緒に処方される必要はないが、場合によりそのように処方される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストの量、障害または治療の種類、および上で考察された他の要因に依拠する。これらの薬剤は一般に、本明細書に記載されるのと同じ投与量で投与経路を用いて、または本明細書に記載される投与量の約１〜９９％、または経験的に／臨床的に適切であると判定されているいかなる投与量でもおよびいかなる経路でも使用される。
【０１４８】
疾患の予防または治療では、本明細書に記載のｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストの適切な投与量（単独でまたは１つもしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストが予防目的でまたは治療目的で投与されるのかどうか、前の療法、ｗｎｔ経路アンタゴニストに対する対象の臨床歴および応答、ならびに主治医の慎重さに依拠することになる。ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストは１回または一連の治療にわたって個人に適切に投与される。１つの典型的な一日投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれよりも多いに及んでいてもよい。数日またはそれよりも長い期間にわたる繰り返し投与では、状態に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されることになる。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、個人がｗｎｔ経路アンタゴニストの約２〜約２０、または、例えば、６容量を受けるように）投与してもよい。もっと多い初回負荷量とそれに続くもっと低い１または複数回の用量を投与してもよい。例となる投与計画は投与することを含む。しかし、他の投与量計画が有用である場合もある。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされる。
【０１４９】
上記製剤または治療方法のいずれも、ｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストの代わりにまたはｗｎｔ経路アンタゴニスト、特にＲスポンジンアンタゴニストに加えて本発明の免疫コンジュゲートを使用して実施しうることは理解される。
【０１５０】
ＩＩＩ．治療組成物
本明細書に記載される方法において有用なｗｎｔ経路アンタゴニストが本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは、抗体、結合ポリペプチド、結合小分子、および／またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはカノニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは非カノニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＲスポンジン転位アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＬＰＲ６媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＬＰＲ６の相互作用を阻害するおよび／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストＬＧＲ５媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＬＧＲ５の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＫＲＭ媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＫＲＭの相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストはシンデカン（例えば、シンデカン４）媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、Ｒスポンジンとシンデカン（例えば、シンデカン４）の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。Ｒスポンジンアンタゴニストの例には、ＷＯ２００８／０４６６４９、ＷＯ２００８／０２０９４２、ＷＯ２００７／０１３６６６、ＷＯ２００５／０４０４１８、ＷＯ２００９／００５８０９、ＵＳ８，０８８，３７４、ＵＳ７，５４１，４３１、ＷＯ２０１１／０７６９３２、および／またはＵＳ２００９／００７４７８２に記載されているアンタゴニストが含まれるがこれらに限定されない。前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０１５２】
ｗｎｔシグナル伝達経路成分またはｗｎｔ経路ポリペプチドは、Ｗｎｔタンパク質とＦｚ受容体の間の相互作用から生じるシグナルを伝達する成分である。ｗｎｔシグナル伝達経路は複雑であり、広範なフィードバック調節を伴う。ｗｎｔシグナル伝達経路成分の例には、Ｗｎｔ（例えば、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６）、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）（例えば、Ｆｒｚ１−１０）、ＲＳＰＯ（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、および／またはＲＳＰＯ４）、ＬＧＲ（例えば、ＬＧＲ５）、ＷＴＸ、ＷＩＳＰ、（例えば、ＷＩＳＰ１、ＷＩＳＰ２、および／またはＷＩＳＰ３）、βＴｒＣｐ、ＳＴＲＡ６、膜結合タンパク質であるＬＲＰ（例えば、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６）、アキシン、およびディシブルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）、細胞外Ｗｎｔ相互作用タンパク質であるｓＦＲＰ、ＷＩＦ−１、ＬＲＰ不活化タンパク質であるＤｋｋおよびＫｒｎ、細胞質タンパク質βカテニン、βカテニン「分解複合体」のメンバーであるＡＰＣ、ＧＳＫ３β、ＣＫＩαおよびＰＰ２Ａ、核輸送タンパク質であるＡＰＣ、ピゴパス（ｐｙｇｏｐｕｓ）およびｂｃｌ９／レグレス（ｌｅｇｌｅｓｓ）、ならびに、転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ、グルーチョ（Ｇｒｏｕｃｈｏ）およびＣＢＰ／ｐ３００とＢｒｇ−１などの様々なヒストンアセチラーゼが含まれる。
【０１５３】
Ａ．抗体
一態様では、ｗｎｔ経路ポリペプチドに結合する単離された抗体が本明細書で提供される。上記実施態様のいずれにおいても、抗体はヒト化されている。本発明の追加の態様では、上記実施態様のいずれかに従った抗ｗｎｔ経路抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１’’抗体または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１５４】
抗体のいずれかのいくつかの実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は抗ＬＲＰ６抗体である。抗ＬＲＰ６抗体の例には、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１２７号に記載される抗ＬＲＰ６抗体が含まれるがこれに限定されない。前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。いくつかの実施態様では、抗ＬＲＰ６抗体は、第一のＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を阻害し、第二のＷｎｔアイソフォームにより誘導されるシグナル伝達を増強する。いくつかの実施態様では、第一のＷｎｔアイソフォームはＷｎｔ３およびＷｎｔ３ａからなる群から選択され、第二のＷｎｔアイソフォームはＷｎｔ１、２、２ｂ、４、６、７ａ、７ｂ、８ａ、９ａ、９ｂ、１０ａ、および１０ｂからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、第一のＷｎｔアイソフォームはＷｎｔ１、２、２ｂ、６、８ａ、９ａ、９ｂ、および１０ｂからなる群から選択され、第二のＷｎｔアイソフォームはＷｎｔ３およびＷｎｔ３ａからなる群から選択される。
【０１５５】
抗体のいずれかのいくつかの実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は抗フリズルド抗体である。抗フリズルド抗体の例には、米国特許第７，９４７，２７７号に記載される抗フリズルド抗体が含まれるがこれに限定されない。前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０１５６】
抗体のいずれかのいくつかの実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は抗ＳＴＲＡ６抗体である。抗ＳＴＲＡ６抗体の例には、米国特許第７，１７３，１１５号、米国特許第７，７４１，４３９号、および／または米国特許第７，８５５，２７８号に記載される抗ＳＴＲＡ６抗体が含まれるがこれに限定されない。前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０１５７】
抗体のいずれかのいくつかの実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は抗Ｓ１００様サイトカインポリペプチド抗体である。いくつかの実施態様では、抗Ｓ１００様サイトカインポリペプチド抗体は抗Ｓ１００−Ａ１４抗体である。抗Ｓ１００様サイトカインポリペプチド抗体の例には、米国特許第７，５６６，５３６号、および／または米国特許第７，００５，４９９号に記載される抗Ｓ１００様サイトカインポリペプチド抗体が含まれるがこれに限定されない。前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０１５８】
抗体のいずれかのいくつかの実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体は抗Ｒスポンジン抗体である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ１である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ２である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ３である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ４である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＬＲＰ６媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＬＲＰ６の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＬＧＲ５媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＬＧＲ５の相互作用を阻害するおよび／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＬＧＲ４媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＬＧＲ４の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンアンタゴニストはＫＲＭ媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、ＲスポンジンとＫＲＭの相互作用を阻害するかつ／または遮断する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストはシンデカン（例えば、シンデカン４）媒介ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジンアンタゴニストは、Ｒスポンジンとシンデカン（例えば、シンデカン４）の相互作用を阻害するかつ／または遮断する。Ｒスポンジン抗体の例には、ＵＳ２００９／００７４７８２、ＵＳ８０８８３７４、ＵＳ８，１５８，７５７、ＵＳ８，１５８，７５８および／またはＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒ９４１７−５０Ｃに開示される任意の抗体を含むがこれらに限定されない。前記文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、抗Ｒスポンジン抗体はＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する抗体はＲスポンジン転位融合ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型のＲスポンジンおよび／または転位の第二の遺伝子には実質的に結合しない。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドは配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。
【０１６０】
追加の態様では、上記実施態様のいずれかに従った、抗ｗｎｔ経路抗体、特に抗Ｒスポンジン転位抗体は、下のセクションに記載されるように、特長のいずれでも、単独でまたは組み合わせて組み込んでもよい。
【０１６１】
１．抗体親和性
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は解離定数（Ｋｄ）≦１μＭを有する。一実施態様では、Ｋｄは、以下のアッセイにより説明される対象の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施される放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定シリーズの存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原で平衡にし、次に結合抗原を抗Ｆａｂ被覆プレートで捕捉することにより測定される（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）参照）。前記アッセイの条件を確立するため、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩被覆され、それに続いて室温（およそ２３℃）で２から５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックされる。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの（１２５Ｉ）−抗原は対象のＦａｂの段階希釈を用いて混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次に、対象のＦａｂは一晩インキュベートされるが、インキュベーションは平衡に達していることを確実にするためにさらに長い期間（例えば、約６５時間）続いてもよい。その後、前記混合物は室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移される。次に、溶液は取り除かれ、プレートはＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートは１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で計測される。最大結合の２０％以下を与えるそれぞれのＦａｂの濃度が、競合結合アッセイにおいて使用するために選択される。
【０１６２】
別の実施態様に従えば、Ｋｄは約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。手短に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、流量５μｌ／分での注入前に１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈されて、およそ１０応答単位（ＲＵ）の連結タンパク質を達成する。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基をブロックする。動態測定では、Ｆａｂの２倍の段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が、２５℃、流量およそ２５μｌ／分で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）と一緒にＰＢＳに注入される。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合および解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）を参照されたい。上記のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）が表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オンレートは、流れ停止装備スペクトロフォメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌されたキュベット付の８００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される場合、増加する濃度の抗原の存在下、２５℃でＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）、ｐＨ７．２の蛍光放出強度の増加または減少を測定する（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）蛍光消光技法を使用することにより決定することができる。
【０１６３】
２．抗体断片
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片ならびに下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５ページ（１９９４）を参照されたい。ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増大しているＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１６４】
ダイアボディは、二価または二重特異性のこともある２つの抗原結合部位のある抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４（２００３）に記載されている。
【０１６５】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。
【０１６６】
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
【０１６７】
３．キメラおよびヒト化抗体
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変えられている「クラス転換された」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
【０１６８】
ある特定の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を抑えるために親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持したままヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体由来でＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列由来である１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１６９】
ヒト化抗体およびそれを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５〜３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植法を記載している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３〜６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１〜６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２〜２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
【０１７０】
ヒト化のために使用されうるヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３））；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））；ヒト成熟（体細胞的に変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８））；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８〜１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１〜２２６１８（１９９６））が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
４．ヒト抗体
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的には、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８〜７４（２００１）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０〜４５９（２００８）に記載されている。
【０１７２】
ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製しうる。そのような動物は典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有しており、その遺伝子座は内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わる、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中に無作為に取り込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般的には不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７〜１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号およびＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物により産生されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変しうる。
【０１７３】
ヒト抗体はハイブリドーマベースの方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体も、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７〜３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５〜２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されている方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ（Ｔｒｉｏｍａ）技術）も、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７〜９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａ．、２７（３）：１８５〜９１（２００５）に記載されている。
【０１７４】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても産生しうる。次に、そのような可変ドメイン配列は所望のヒト定常ドメインと組み合わせうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技法は下に記載されている。
【０１７５】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、１種または複数の所望の活性を有する抗体を求めてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離しうる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し所望の結合特徴を有する抗体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法は当技術分野では公知である。そのような方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９２）；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２４８：１６１〜１７５（Ｌｏ編  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；ならびにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９〜１３２（２００４）にさらに記載されている。
【０１７６】
ある種のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換えられ、これは次に抗原結合ファージを求めてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで抗体断片を提示する。免疫源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を要することなく免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。代わりに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２：７２５〜７３４（１９９３）により記載されているように、未処置のレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）いかなる免疫化もせずに広範な非自己抗原および自己抗原にも単一源の抗体を提供することができる。最後に、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１〜３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞から再配列されていないＶ−遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を実現するランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより、未処置のライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号、および米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１７７】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１７８】
６．多特異的抗体
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は多特異的抗体、例えば、二重特異的抗体である。多特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の１つは、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドなどのｗｎｔ経路ポリペプチドを目標とし、残りの１つは他の任意の抗原を目標とする。ある特定の実施態様では、二重特異的抗体はＲスポンジン転位融合ポリペプチドなどのｗｎｔ経路ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異的抗体を使用して、細胞傷害性薬剤をＲスポンジン転位融合ポリペプチドなどのｗｎｔ経路ポリペプチドを発現する細胞に局在化させてもよい。二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【０１７９】
多特異的抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）参照）、および「ノブインホール」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号参照）が含まれるが、これらに限定されない。抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作する（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つまたはそれよりも多い抗体または断片を架橋する（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異的抗体を産生する（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）参照）；二重特異的抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用する（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）参照）；ならびにＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異的抗体を調製することにより、多特異的抗体を作製してもよい。
【０１８０】
「オクタパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多い機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６参照）。
【０１８１】
本明細書の抗体または断片には、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドなどのｗｎｔ経路ポリペプチドおよび別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０参照）。
【０１８２】
７．抗体バリアント
ａ）グリコシル化バリアント
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加するまたは減少するように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または削除は、１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるまたは取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現しうる。
【０１８３】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物を変化させうる。哺乳動物細胞により産生された未処置の抗体は典型的には、一般的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造体の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含むことがある。いくつかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを生み出すためになされうる。
【０１８４】
一実施態様では、Ｆｃ領域に結合している（直接的にまたは間接的に）フコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％まででもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合しているすべてのグリコ構造体（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造体）の合計と比べたＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域のおおよそ２９７位（Ｆｃ残基のＥｕ番号付け）に位置しているアスパラギン残基のことであるが、Ａｓｎ２９７は、抗体中の小さな配列変動のせいで、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位〜３００位までの間に位置していることもある。そのようなフコシル化バリアントは改善されたＡＤＣＣ機能を有することがある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「デフコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」または「フコース欠損」抗体バリアントに関係する出版物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９〜１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞系の例には、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３〜５４５（１９８６）；ＵＳ２００３／０１５７１０８、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）；およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４ページ（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０〜６８８（２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【０１８５】
二分されたオリゴ糖を有する、すなわち、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている抗体バリアントがさらに提供される。そのような抗体バリアントは減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは改善されたＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１８６】
ｂ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施態様では、１つまたは複数のアミノ酸改変を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを産生しうる。前記Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１８７】
ある特定の実施態様では、本発明は、いくつかのしかしすべてではないエフェクター機能を有する抗体バリアントであって、そのエフェクター機能のおかげで、インビボでの抗体の半減期は重要であるがある種のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）は必要ではないまたは有害である適用のための望ましい候補になる抗体バリアントを想定している。インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行えば、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合力は保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、すなわちＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜４９２（１９９１）の４６４ページ表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９〜７０６３（１９８６）参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９〜１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１〜１３６１（１９８７）参照）に記載されている。代わりに、非放射アッセイ法を用いることもある（例えば、ＡＣＴＩ（商標）ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに、またはさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されている動物モデルなどの動物モデルで評価しうる。Ｃ１ｑ結合アッセイも実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができずしたがってＣＤＣ活性を欠くことを確認しうる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを実施しうる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５〜１０５２（２００３）；ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８〜２７４３（２０��４）参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボ排除／半減期決定も、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９〜１７６９（２００６）参照）。
【０１８８】
エフェクター機能が減少した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つまたは複数の置換がある抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換があるいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位のうちの２つまたはそれよりも多い位での置換のあるＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１８９】
ＦｃＲｓへの結合が改善されているまたは減少しているある種の抗体バリアントは記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）参照）。ある特定の実施態様では、抗体バリアントはＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、および／または３３４位での置換のあるＦｃ領域を含む（残基のＥＵ番号付け）。いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善されたまたは減少した）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域においてなされる。
【０１９０】
半減期が増加し、母性ＩｇＧの胎児への移行の原因となる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体はＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つまたは複数の置換がその中にあるＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つまたは複数に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換のあるＦｃバリアントが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８〜４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１９１】
ｃ）システイン操作抗体バリアント
ある特定の実施態様では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作り出すのが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基は抗体の接触可能部位に存在する。さらに本明細書で説明されるように、それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作り出しうる。ある特定の実施態様では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数をシステインで置換しうる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載される通りに産生しうる。
【０１９２】
Ｂ．免疫コンジュゲート
化学療法剤もしくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素またはその断片）または放射性同位体などの１つまたは複数の細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた本明細書のＲスポンジン転位融合ポリペプチドなどの抗ｗｎｔ経路抗体を含む免疫コンジュゲートが本明細書でさらに提供される。
【０１９３】
一実施態様では、免疫コンジュゲートは、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０  ４２５  ２３５Ｂ１参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および米国特許第５，７８０，５８８号および米国特許第７，４９８，２９８号参照）；ドラスタチン；カリチアマイシンもしくはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、および米国特許第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５〜２９２８（１９９８）参照）；ダウノマイシンもしくはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７〜５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８〜３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７〜７２１（２００５）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９〜８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９〜１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６〜４３４３（２００２）；および米国特許第６，６３０，５７９号参照）；メトトレキセート；ビンデシン；ドセタキシル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の薬物に抗体がコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０１９４】
別の実施態様では、免疫コンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらの限定されない酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
【０１９５】
別の実施態様では、免疫コンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、Ｔｃ９９もしくはＩ１２３、または再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）用のスピン標識を含むことがある。
【０１９６】
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシニミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６−ジイソシアン酸）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二機能的タンパク質カップリング剤を使用して作製しうる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載される通りに調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例となるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。前記リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬の放出を促進する「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７〜１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
【０１９７】
本明細書の免疫コンジュゲートまたはＡＤＣは、市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）を含むがこれらの限定されない架橋剤試薬で調製されたそのようなコンジュゲートを明確に想定しているが、これらに限定されない。
【０１９８】
Ｃ．結合ポリペプチド
本明細書に記載される方法のいずれかにおいてｗｎｔ経路アンタゴニストとして使用するためのｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストが本明細書では提供される。ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストは、ｗｎｔ経路ポリペプチドに好ましくは特異的に結合するポリペプチドである。
【０１９９】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストはキメラポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストは、（ａ）フリズルドドメイン成分、および（ｂ）Ｆｃドメインを含む。例えば、米国特許第７，９４７，２７７号に記載される任意のｗｎｔ経路アンタゴニストであり、前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０２００】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストはＤｖｌ  ＰＤＺに特異的に結合するポリペプチドであり、前記ポリペプチドは−２位にＧｌｙ、−１位にＴｒｐまたはＴｙｒ、０位にＰｈｅまたはＬｅｕ、および−３位に疎水性または芳香族残基のある配列を含むＣ末端領域を含み、アミノ酸付番はＣ末端残基が０位にあることに基づいている。いくつかの実施態様では、−６位はＴｒｐである。いくつかの実施態様では、−１位はＴｒｐである。ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストは、結合親和性ＩＣ５０＝１．５μＭ以上でＤｖｌ  ＰＤＺに特異的に結合するポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドはその内在性結合パートナーとのＤｖｌ  ＰＤＺ相互作用を阻害する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは内在性Ｄｖｌ媒介Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドはＫＷＹＧＷＬ（配列番号８０）からなるＣ末端を含む。いくつかの実施態様では、ポリペプチドはアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｗ−Ｘ３−Ｄ−Ｘ４−Ｐを含み、Ｘ１はＬまたはＶ、Ｘ２はＬ、Ｘ３はＳまたはＴ、およびＸ４はＩ、ＦまたはＬである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドはアミノ酸配列ＧＥＩＶＬＷＳＤＩＰＧ（配列番号８１）を含む。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、米国特許第７，９７７，０６４号および／または米国特許第７，６９５，９２８号に記載される任意のポリペプチドであり、前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０２０１】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、結合ポリペプチドはＷＩＳＰに結合する。いくつかの実施態様では、ＷＩＳＰはＷＩＳＰ１、ＷＩＳＰ２、および／またはＷＩＳＰ３である。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、米国特許第６，３８７，６５７号、米国特許第７，４５５，８３４号、米国特許第７，７３２，５６７号、米国特許第７，６８７，４６０号、および／もしくは米国特許第７，１０１，８５０号、ならびに／または米国特許出願第２００６／０２９２１５０号に記載される任意のポリペプチドであり、前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０２０２】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、結合ポリペプチドはＳ１００様サイトカインポリペプチドに結合する。いくつかの実施態様では、Ｓ１００様サイトカインポリペプチドはＳ１００−Ａ１４ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは米国特許第７，５６６，５３６号および／または米国特許第７，００５，４９９号に記載される任意のポリペプチドであり、前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０２０３】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストは、ＳＴＲＡ６に特異的に結合するポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは米国特許第７，１７３，１１５号、米国特許第７，７４１，４３９号および／または米国特許第７，８５５，２７８号に記載される任意のポリペプチドであり、前記特許文献は出典明示によりその全体を組み込まれる。
【０２０４】
ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストのいずれかのいくつかの実施態様では、結合ポリペプチドはＲスポンジンポリペプチドに結合する。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンポリペプチドはＲＳＰＯ１ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンポリペプチドはＲＳＰＯ２ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンポリペプチドはＲＳＰＯ３ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンポリペプチドはＲＳＰＯ４ポリペプチドである。
【０２０５】
結合ポリペプチドのいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路結合ポリペプチドアンタゴニストはＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する。いくつかの実施態様では、結合ポリペプチドはＲスポンジン転位融合ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型のＲスポンジンおよび／または転位の第二の遺伝子には実質的に結合しない。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドは配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。
【０２０６】
結合ポリペプチドは、既知のポリペプチド合成法を使用して化学的に合成してもよいし、または組換え技術を使用して調製し精製してもよい。結合ポリペプチドは通常、少なくとも約５アミノ酸長、または少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸長もしくはそれよりも長く、そのような結合ポリペプチドは、本明細書に記載される標的、ｗｎｔ経路ポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。結合ポリペプチドは、周知の技法を使用する必要以上の実験をせずに同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができる結合ポリペプチドを求めてポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることは知られている（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第４，７０８，８７１号、米国特許第４，８３３，０９２号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、米国特許第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：３９９８〜４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１７８〜１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０〜１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９〜２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：６１１〜６１６（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８参照）。
【０２０７】
この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大量のポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、標的ポリペプチド、ｗｎｔ経路ポリペプチドに特異的に結合することができるライブラリーの１つまたは複数のメンバーを同定することができる１つの周知の技法である。ファージディスプレイは、バリアントポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示される技法である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質バリアント（または無作為にクローニングされたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを、標的分子に高親和性で結合する配列について迅速かつ効率的に分類することができることにある。ファージ上へのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８）またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３）ライブラリーの提示は、特異的結合特性を有するものを求めて何百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されてきた（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８）。ランダム変異体のファージライブラリーを分類するには、多数のバリアントを構築し増殖させるための戦略、標的受容体を使用する親和性精製のための手順、および結合濃縮の結果を評価する手段が必要である。米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、および米国特許第５，６６３，１４３号。
【０２０８】
大半のファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用してきたが、ラムダ状ファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８（１５）：３２０９〜３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５（１１）：４７７０〜４７７７（１９９７）；Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９５（２）：３０３〜３１１（１９９７）；Ｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、１０：１７３（１９９５））およびＴ７ファージディスプレイシステム（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７：２２８〜２５７（１９９３）；Ｕ．Ｓ．５，７６６，９０５）も知られている。
【０２０９】
追加の改良により、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、所望の特性を求めてこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性のある機能的タンパク質を提示するディスプレイシステムの能力は増強されている。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置が開発され（ＷＯ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリーを使用して、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）および束縛されたヘリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を解析し制御してきた。ＷＯ９７／３５１９６は、ファージディスプレイライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する１つの溶液とアフィニティーリガンドが標的分子に結合しない第２の溶液に接触させて、結合リガンドを選択的に単離する、アフィニティーリガンドを単離する方法を記載している。ＷＯ９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリーを親和性精製された抗体でバイオパンし、次に結合ファージを単離し、続いて高親和性結合ファージを単離するためのマイクロプレートウェルを使用するマイクロパンニングプロセスの方法を記載している。親和性タグとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの使用も報告されている（Ｌｉら、（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：１８７）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーであることもあるコンビナトリアルライブラリーを使用して酵素特異性を区別するための基質サブストラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイを使用する洗剤中で使用するのに適した酵素を選択するための方法はＷＯ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、米国特許第５，４３２，０１８号、およびＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
【０２１０】
ペプチドライブラリーを作製しこれらのライブラリーをスクリーニングする方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，４９８，５３０号、米国特許第５，７７０，４３４号、米国特許第５，７３４，０１８号、米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，７６３，１９２号、および米国特許第５，７２３，３２３号に開示されている。
【０２１１】
Ｄ．結合小分子
本明細書に記載される方法のいずれかにおいてｗｎｔ経路アンタゴニストとして使用するためのｗｎｔ経路小分子アンタゴニストが本明細書では提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはコニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは非コニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。
【０２１２】
小分子のいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路小分子アンタゴニストはＲスポンジン小分子アンタゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１、２、３、および／または４小分子アンタゴニスト）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン小分子アンタゴニストはＲＳＰＯ１転位小分子アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン小分子アンタゴニストはＲＳＰＯ２転位小分子アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン小分子アンタゴニストはＲＳＰＯ３転位小分子アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン小分子アンタゴニストはＲＳＰＯ４転位小分子アンタゴニストである。
【０２１３】
小分子のいずれかのいくつかの実施態様では、小分子はＲスポンジン転位融合ポリペプチドに結合する。いくつかの実施態様では、小分子はＲスポンジン転位融合ポリペプチドに特異的に結合するが、野生型のＲスポンジンおよび／または転位の第二の遺伝子には実質的に結合しない。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ１転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチドはＲＳＰＯ４転位融合ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリペプチドは配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリペプチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。
【０２１４】
小分子は好ましくは、本明細書に記載されるｗｎｔ経路ポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書で定義される結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子である。有機小分子は公知の方法を使用して同定され化学的に合成されうる（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５参照）。有機小分子は通常大きさは約２０００ダルトン未満である、または大きさは約１５００、７５０、５００、２５０もしくは２００ダルトン未満であり、本明細書に記載されるポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、周知の技法を使用する不必要な実験なしで同定しうる。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子を求めて有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は当技術分野では周知であることが知られている（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５参照）。有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバミン酸、炭酸、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン（oxazolidine）、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリド、または同類のものでありうる。
【０２１５】
Ｅ．アンタゴニストポリヌクレオチド
本明細書に記載される方法のいずれかにおいてｗｎｔ経路アンタゴニストとして使用するためのｗｎｔ経路ポリヌクレオチドアンタゴニストが本明細書では提供される。ポリヌクレオチドはアンチセンス核酸および／またはリボザイムでもよい。アンチセンス核酸は、ｗｎｔ経路遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいけれども、必要ではない。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはカノニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは非カノニカルｗｎｔ経路アンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路ポリヌクレオチドはＲスポンジンである。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ１である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ２である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ３である。いくつかの実施態様では、ＲスポンジンはＲＳＰＯ４である。ポリヌクレオチドアンタゴニストの例には、ＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号８２）および／またはＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＴＧＴ（配列番号８３）などのＷＯ２００５／０４０４１８に記載されているポリヌクレオチドアンタゴニストが含まれる。
【０２１６】
ポリヌクレオチドのいずれかのいくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはＲスポンジン転位融合ポリヌクレオチドに結合する。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはＲスポンジン転位融合ポリヌクレオチドに特異的に結合するが、野生型のＲスポンジンおよび／または転位の第二の遺伝子には実質的に結合しない。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチドはＲＳＰＯ１転位融合ポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチドはＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチドはＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位融合ポリヌクレオチドはＲＳＰＯ４転位融合ポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチドはＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチドはＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位融合ポリヌクレオチドは配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチドはＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位融合ポリヌクレオチドは配列番号７２および／または配列番号７３を含む。
【０２１７】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、前記ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖ｗｎｔ経路アンチセンス核酸の場合、したがって、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することができ、または三重鎖形成をアッセイしうる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さの両方に依拠することになる。一般に、ハイブリダイズしている核酸が大きいほど、核酸はｗｎｔ経路ＲＮＡとそれだけ多くの塩基ミスマッチを含有するが、それでも安定な二重鎖（または、場合によっては、三重鎖）を形成しうる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準法の使用によりミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０２１８】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列に相補的であるポリヌクレオチドは翻訳の阻害に最も効率よく機能するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが明らかにされている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３〜３３５を参照されたい。したがって、ｗｎｔ経路遺伝子の５’−または３’−非翻訳、非コード領域のどちらかに相補的であるオリゴヌクレオチドであれば、内在性ｗｎｔ経路ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのにアンチセンスアプローチを使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドであればＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは翻訳を阻害する効率は低くなるが、本発明に従えば使用することができる。ｗｎｔ経路ｍＲＮＡの５’−、３’−またはコード領域にハイブリダイズするように設計されていようと、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長に及ぶオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２１９】
一実施態様では、本発明のｗｎｔ経路アンチセンス核酸は、外来性配列の転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は転写されて、ｗｎｔ経路遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。そのようなベクターであれば、ｗｎｔ経路アンチセンス核酸をコードする配列を含有していると考えられる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができさえすれば、エピソームのままであるまたは染色体に組み込まれることも可能である。そのようなベクターは、当技術分野で標準的方法である組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用されるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で公知の他のものであることが可能である。ｗｎｔ経路をコードする配列またはその断片の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する当技術分野で公知のいかなるプロモーターによっても可能である。そのようなプロモーターは誘導性でも構成的でも可能である。そのようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９：３０４〜３１０（１９８１））、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２（１９８２））、等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２０】
Ｆ．抗体および結合ポリペプチドバリアント
ある特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが想定されている。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましいことがある。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、適切な改変を抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、またはペプチド合成により調製しうる。そのような改変には、例えば、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの残基の欠失、および／または内への残基の挿入および／または残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、標的結合性を有するのであれば、欠失、挿入、および置換のどんな組合せでも行って最終構築物に到達することができる。
【０２２１】
ある特定に実施態様では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントおよび／または結合ポリペプチドバリアントが提供される。置換的変異誘発のための対象の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は表１の「保存的置換」の項目の下に示されている。さらに多くの実質的変化は表１の「例となる置換」の項目の下に提供されており、アミノ酸側鎖クラスに関しては下にさらに記載されている通りである。アミノ酸置換は対象の抗体および／または結合ポリペプチドに導入され、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされうる。
2018021068.tif 000002
【０２２２】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化されうる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２２３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
【０２２４】
置換的バリアントの一種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の高頻度可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される１つまたは複数のこうして得られるバリアントは、親抗体と比べてある種の生物学的特性（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）に改変（例えば、改善）を有することになるおよび／または親抗体のある種の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例となる置換的バリアントは親和性成熟抗体であり、この抗体は、例えば、本明細書に記載されている技法などのファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して都合よく産生しうる。手短に言えば、１つまたは複数のＨＶＲ残基は変異され、バリアント抗体はファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）を求めてスクリーニングされる。
【０２２５】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて変更（例えば、置換）を加えることもできる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされている残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９〜１９６（２００８）参照）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において加えることができ、こうして得られるバリアントＶＨまたはＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍｒａ、ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１７８：１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００１））に記載された。親和性成熟のいくつかの実施態様では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、チェインシャフッリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異）のうちのいずれかにより成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ領域（例えば、１度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に同定しうる。ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は特に標的にされることが多い。
【０２２６】
ある特定の実施態様では、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいて加えうる。そのような変更はＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であってよい。上に提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施態様では、それぞれのＨＶＲは変更されない、または１つ以下、２つ以下または３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２２７】
変異誘発のために標的にされうる抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の同定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または残基のグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）は中性または負電荷を帯びたアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により同定され置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。追加の置換が前記アミノ酸位に導入されて、最初の置換に対する機能的感受性を実証してもよい。その代わりに、またはそれに加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定する抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接する残基は置換の候補として標的されても取り除かれてもよい。バリアントはスクリーニングされて、所望の特性を含有するかどうかを決定してもよい。
【０２２８】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００またはそれよりも多い残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ−および／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）またはポリペプチドへの抗体のＮ−またはＣ−末端の融合が含まれる。
【０２２９】
Ｇ．抗体および結合ポリペプチド誘導体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドは、当技術分野では公知であり容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物。エチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のおかげで製造に有利でありうる。前記ポリマーはいかなる分子量でもよく、分岐していることも分岐していないこともある。抗体および／または結合ポリペプチドに結合しているポリマーの数は変動してもよく、１つよりも多いポリマーが結合している場合、前記ポリマーは同じまたは異なる分子であることが可能である。一般に、誘導化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能、抗体誘導体および／または結合ポリペプチド誘導体が限定された条件下の治療において使用されるのかどうか、等を含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定することができる。
【０２３０】
別の実施態様では、放射線に曝露されることにより選択的に加熱されうる非タンパク質性部分への抗体および／または結合ポリペプチドのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００〜１１６０５（２００５））。放射線はどんな波長でもよく、普通の細胞を損傷しないが、抗体および／または結合ポリペプチド−非タンパク質性部分の近位の細胞を死滅させる温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【０２３１】
Ｈ．組換え法および組成物
抗体および／または結合ポリペプチドは、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている組換え法および組成物を使用して産生しうる。一実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体）をコードする単離された核酸。そのような核酸は抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしうる。追加の実施態様では、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするそのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。追加の実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一そのような実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、これらのベクターで形質転換されている）。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ｗｎｔ経路抗体などの抗体および／または結合ポリペプチドを作製する方法であって、抗体および／または結合ポリペプチドの発現に適した条件下で、上に提供される抗体および／または結合ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、場合により、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体および／またはポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【０２３２】
抗ｗｎｔ経路抗体および／または結合ポリペプチドの組換え産生では、例えば、上に記載される抗体および／または結合ポリペプチドをコードする核酸は単離され宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つまたは複数のベクター内に挿入される。そのような核酸は従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され塩基配列決定される。
【０２３３】
ベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載される原核または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合は細菌において産生しうる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい（大腸菌における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、２４５〜２５４ページも参照）。発現後、抗体は可溶画分中の細菌細胞ペーストから単離しうる。
【０２３４】
原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンで抗体が産生される真菌および酵母株を含む、繊維状真菌または酵母などの真核微生物はベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９〜１４１４（２００４）、およびＬｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０〜２１５（２００６）を参照されたい。
【０２３５】
グリコシル化抗体および／またはグリコシル化結合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物および昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用しうる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０２３６】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
【０２３７】
脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、懸濁液で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系統は有用でありうる。有用な哺乳動物細胞系統の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されているサル腎臓ＣＶ１系統、ヒト胚性腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されている２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ，  ｅ．ｇ．，  ｉｎ  Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２）に記載されているＴＲＩ細胞、ＭＲＣ  ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞系統には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が含まれる。抗体産生および／または結合ポリペプチド産生に適したある種の哺乳動物宿主細胞系の概説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ、編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５〜２６８ページ（２００３）を参照されたい。
【０２３８】
本説明は主に抗体および結合ポリペプチドコード核酸を含有するベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞を培養することによる抗体および／または結合ポリペプチドの産生に関係するが、当然のことながら、当技術分野で周知の代替の方法を用いて抗体および／または結合ポリペプチドを調製しうることを想定している。例えば、適切なアミノ酸配列、またはその一部は固相技法［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５４（１９６３）参照］を使用する直接ペプチド合成により産生しうる。インビトロタンパク質合成は手作業技法を使用してまたは自動化により実施しうる。自動化合成は、例えば、製造業者の使用説明書を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実現しうる。抗体および／または結合ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わせて所望の抗体および／または結合ポリペプチドを産生してもよい。
【０２３９】
ＩＶ．所望の機能のあるＷｎｔ経路アンタゴニストをスクリーニングするおよび／または同定する方法
抗体、結合ポリペプチド、および／または小分子などのｗｎｔ経路アンタゴニストを作製するための技法は上に記載されている。本明細書に提供される抗ｗｎｔ経路抗体、結合ポリペプチド、小分子、および／またはポリヌクレオチドなどの追加のｗｎｔ経路アンタゴニストは、当技術分野で公知の様々なアッセイにより同定し、それを求めてスクリーニングし、その物理的／化学的特性および／または生物活性について特徴付けることができる。
【０２４０】
本明細書では、ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害する、癌細胞周期停止を誘導する、癌細胞増殖を阻害する、および／または癌細胞死を促進するｗｎｔ経路アンタゴニストを求めてスクリーニングするおよび／または同定する方法であって、（ａ）（ｉ）１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌細胞、癌組織、および／または癌試料、ならびに（ｉｉ）基準癌細胞、基準癌組織、および／または基準癌試料をｗｎｔ経路候補アンタゴニストに接触させ、（ｂ）ｗｎｔ経路シグナル伝達のレベル、細胞周期段階の分布、細胞増殖のレベル、および／または癌細胞死のレベルを決定し、それにより１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌細胞、癌組織、および／または癌試料と基準癌細胞、基準癌組織、および／または基準癌試料の間のｗｎｔ経路シグナル伝達の減少したレベル、細胞周期段階の分布の差異、細胞増殖の減少したレベル、および／または癌細胞死の増加したレベルが、ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害する、癌細胞周期停止を誘導する、癌細胞増殖を阻害する、かつ／または癌細胞死を促進するｗｎｔ経路アンタゴニストとしてｗｎｔ経路候補アンタゴニストを同定することを含む前記方法が提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニストである。
【０２４１】
本明細書では、ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害する、癌細胞周期停止を誘導する、癌細胞増殖を阻害する、かつ／または癌細胞死を促進するｗｎｔ経路アンタゴニストを求めてスクリーニングするかつ／または同定する方法であって、（ａ）１つまたは複数のバイオマーカーを含む癌細胞、癌組織、および／または癌試料をｗｎｔ経路候補アンタゴニストに接触させ、（ｂ）ｗｎｔ経路候補アンタゴニストの非存在下での癌細胞、癌組織、および／または癌試料にとってのｗｎｔ経路シグナル伝達のレベル、細胞周期段階の分布、細胞増殖のレベル、および／または癌細胞死のレベルを決定し、それによってｗｎｔ経路候補アンタゴニストの存在下での癌細胞、癌組織、および／または癌試料とｗｎｔ経路候補アンタゴニストの非存在下での癌細胞、癌組織、および／または癌試料の間のｗｎｔ経路シグナル伝達の減少したレベル、細胞周期段階の分布の差異、細胞増殖の減少したレベル、および／または癌細胞死の増加したレベルが、ｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害する、癌細胞周期停止を誘導する、癌細胞増殖を阻害する、かつ／または癌細胞死を促進するｗｎｔ経路アンタゴニストとしてｗｎｔ経路候補アンタゴニストを同定することを含む前記方法がさらに提供される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストはＲスポンジンアンタゴニストである。
【０２４２】
方法のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表９に収載される１つまたは複数の遺伝子の転位（例えば、再配列および／または融合）である。方法のいずれかのいくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）はＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ１転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は、配列番号１２、４１、および／または４２を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７２および／または配列番号７３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は、配列番号１３、１４、４３、および／または４４を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫ分泌シグナル配列を含む（かつ／またはＲＳＰＯ３分泌シグナル配列は含まない）。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ４転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）は、（例えば、Ｒスポンジン転位なしの基準と比べて）Ｒスポンジンの上昇した発現レベルをもたらす。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）ならびにＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦである。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）ならびに変種（例えば、多型または変異）ＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦの存在である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）の存在であるならびに１つまたは複数のバイオマーカーの非存在は変種（例えば、多型または変異）ＣＴＮＮＢ１および／またはＡＰＣの非存在である。
【０２４３】
ｗｎｔ経路シグナル伝達のレベルを決定する方法は当技術分野では公知であり本明細書の実施例に記載されている。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路シグナル伝達のレベルは、実施例に記載されているルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して決定される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは、ｗｎｔ経路シグナル伝達のレベルを約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％のいずれか減少させることによりｗｎｔ経路シグナル伝達を阻害する。
【０２４４】
本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニストの増殖阻害効果は、当技術分野で公知の方法、例えば、内在的にまたはそれぞれの遺伝子（複数可）でのトランスフェクションに続いてｗｎｔ経路を発現する細胞を使用して評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞系、およびｗｎｔ経路ポリペプチドトランスフェクト細胞を、本明細書に記載のｗｎｔ経路アンタゴニストで数（例えば、２〜７）日間、様々な濃度で処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し、または何か他の比色アッセイにより分析してもよい。増殖を測定する別の方法は、本発明の抗体、結合ポリペプチド、小分子および／またはポリヌクレオチドの存在または非存在下で処理された細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる方法になるであろう。処理後、細胞は収穫され、ＤＮＡに取り込まれた放射線の量がシンチレーション計測器において定量される。適切な陽性対照には、選択された細胞系をその細胞系の増殖を阻害することが分かっている増殖阻害抗体で処理することが含まれる。インビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当技術分野で公知の様々なやり方で決定することができる。
【０２４５】
細胞周期段階の分布、細胞増殖のレベル、および／または細胞死のレベルを決定する方法は当技術分野では公知である。いくつかの実施態様では、癌細胞周期停止はＧ１での停止である。
【０２４６】
いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは、インビトロまたはインビボで癌細胞、癌組織、または癌試料の癌細胞増殖を、未処置の癌細胞、癌組織、または癌試料と比べて約２５〜１００％、さらに好ましくは、約３０〜１００％、さらに好ましくは約５０〜１００％または約７０〜１００％阻害することになる。例えば、増殖阻害は、細胞培養中約０．５から約３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭから約２００ｎＭのｗｎｔ経路アンタゴニスト濃度で測定することができ、増殖阻害はｗｎｔ経路候補アンタゴニストへの腫瘍細胞の曝露の１〜１０日後に決定される。ｗｎｔ経路候補アンタゴニストの約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重での投与により、ｗｎｔ経路候補アンタゴニストの最初の投与から約５日〜３か月以内に、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍サイズが減少するまたは腫瘍細胞増殖が減少すれば、ｗｎｔ経路アンタゴニストはインビボで増殖阻害性である。
【０２４７】
癌細胞死を誘導するｗｎｔ経路アンタゴニストを求めて選択するため、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みにより示される膜統合性の消失は基準と比べて評価しうる。ＰＩ取り込みアッセイは補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で実施することができる。ｗｎｔ経路発現腫瘍細胞は、培地単独とまたは適切なｗｎｔ経路アンタゴニストを含有する培地と一緒にインキュベートされる。細胞は３日の期間インキュベートされる。それぞれの処理に続いて、細胞は洗浄され、細胞集塊を取り除くために３５ｍｍストレーナーキャップ付き１２×７５チューブ（チューブあたり１ｍｌ、処理群あたり３チューブ）にアリコートされる。次に、チューブはＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を受ける。試料はＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して解析しうる。ＰＩ取り込みにより決定される場合、統計的に有意なレベルでの細胞死を誘導するｗｎｔ経路アンタゴニストは細胞死誘導抗体、結合ポリペプチド、小分子、および／またはポリヌクレオチドとして選択することができる。
【０２４８】
対象の抗体が結合しているポリペプチド上のエピトープに結合する、またはポリペプチドと相互作用するｗｎｔ経路アンタゴニストを求めてスクリーニングするため、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、編  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているアッセイなどの常用のクロスブロッキングアッセイを実施することができる。このアッセイを使用すれば、候補ｗｎｔ経路アンタゴニストが既知の抗体と同じ部位またはエピトープに結合するかどうかを決定することができる。その代わりに、またはそれに加えて、当技術分野で公知の方法によりエピトープマッピングを実施することができる。例えば、抗体および／または結合ポリペプチド配列はアラニンスキャニングなどにより変異誘発させて接触残基を同定することができる。変異抗体は最初、ポリクローナル抗体および／または結合ポリペプチドとの結合について試験されて適切なフォールディングを確認する。異なる方法では、ポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドは、候補抗体および／またはポリペプチドとのまたは候補抗体および／または結合ポリペプチドと特徴付けられたもしくは既知のエピトープを有する抗体との競合アッセイに使用することができる。
【０２４９】
スクリーニングするかつ／または同定する方法のいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路候補アンタゴニストは抗体、結合ポリペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路候補アンタゴニストは抗体である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）は小分子である。
【０２５０】
一態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの公知の方法によりその抗原結合活性について試験される。
【０２５１】
Ｖ．薬学的製剤
本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニストの薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を１つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡ．ＳＣＩ．第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥剤または水溶液の形態で調製される。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニストは小分子、抗体、結合ポリペプチド、および／またはポリヌクレオチドである。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度ではレシピエントには無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。例となる薬学的に許容される担体は、本明細書ではさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質性薬分散剤が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある種の例となるｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０２５２】
例となる凍結乾燥製剤は米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載されている製剤が含まれ、後者の製剤にはヒスチジン−アセテートバッファーが含まれる。
【０２５３】
本明細書の製剤は治療されている特定の適応症に必要な１つよりも多い、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的活性を有する活性成分も含有しうる。そのような活性成分は、意図している目的に有効である量で組み合わせて適切に存在している。
【０２５４】
活性成分は、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）においてまたはマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技法によりまたは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入してもよい。そのような技法はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡ．ＳＣＩ．第１６版  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０２５５】
徐放性製剤を調製しうる。徐放性製剤の適切な例には、ｗｎｔ経路アンタゴニストを含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、前記マトリックスは造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形状をしている。
【０２５６】
インビボ投与のために使用される製剤は一般に無菌である。無菌性は、例えば、除菌膜を通す濾過により容易に実現しうる。
【０２５７】
ＶＩ．製造品
本発明の別の態様では、上記障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器および容器上のまたはこれに付属するラベルもしくは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、注射器、ＩＶ溶液袋、等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成しうる。容器には、状態を治療する、予防するおよび／または診断するのに単独で効果的なまたはこれに効果的な別の組成物と組み合わされる組成物が入っており、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈注射液袋または皮下注射針により突き刺し可能な栓付のバイアルでもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載されるｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジンアンタゴニスト、例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）である。ラベルまたは添付文書は、組成物が最適の状態を治療するのに使用されることを表示している。さらに、製造品は、（ａ）ｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジンアンタゴニスト、例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）を含む組成物がそこに含有されている第１の容器、ならびに（ｂ）追加の細胞傷害性または他の方法での治療薬を含む組成物がそこに含有されている第２の容器を含んでいてもよい。
【０２５８】
いくつかの実施態様では、製造品は容器、前記容器上のラベル、および前記容器内に含有される組成物を含み、組成物には１つまたは複数の試薬（例えば、１つもしくは複数のバイオマーカーに結合する一次抗体または本明細書に記載されるバイオマーカーのうちの１つもしくは複数に対するプローブおよび／もしくはプライマー）が含まれ、容器上のラベルは、組成物を使用して試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を評価できること、および試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を評価するための試薬を使用するための説明書を表示している。製造品は試料を調製し試薬を利用するための説明書および材料のセットをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、製造品は一次と二次抗体の両方などの試薬を含んでいることもあり、二次抗体は標識、例えば、酵素標識にコンジュゲートされている。いくつかの実施態様では、製造品は本明細書に記載されるバイオマーカーのうちの１つまたは複数に対する１つまたは複数のプローブおよび／またはプライマーを含む。
【０２５９】
製造品のいずれかのいくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーは表９に収載される１つまたは複数の遺伝子の転位（例えば、再配列および／または融合）を含む。製造品のいずれかのいくつかの実施態様では、転位（例えば、再配列および／または融合）はＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ１転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３ＥおよびＲＳＰＯ２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅエクソン１およびＲＳＰＯ２エクソン３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７１を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）は、配列番号１２、４１、および／または４２を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＥＩＦ３Ｅプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ２転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ２プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン１およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫエクソン７およびＲＳＰＯ３エクソン２を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は配列番号７２および／または配列番号７３を含む。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）は、配列番号１３、１４、４３、および／または４４を含むプライマーにより検出可能である。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫプロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ３プロモーターにより推進される。いくつかの実施態様では、ＲＳＰＯ３転位（例えば、再配列および／または融合）はＰＴＰＲＫ分泌シグナル配列を含む（かつ／またはＲＳＰＯ３分泌シグナル配列を含まない）。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）はＲＳＰＯ４転位（例えば、再配列および／または融合）である。いくつかの実施態様では、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）は、（例えば、Ｒスポンジン転位なしの基準と比べて）Ｒスポンジンの上昇した発現レベルをもたらす。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーはＲスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）ならびにＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦである。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）ならびに変種（例えば、多型または変異）ＫＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦの存在である。いくつかの実施態様では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、Ｒスポンジン転位（例えば、再配列および／または融合）の存在であるならびに１つまたは複数のバイオマーカーの非存在は変種（例えば、多型または変異）ＣＴＮＮＢ１および／またはＡＰＣの非存在である。
【０２６０】
製造品のいずれかのいくつかの実施態様では、製造品はプライマーを含む。いくつかの実施態様では、プライマーは配列番号１２、１３、１４、４２、４３、および／または４４のいずれかである。
【０２６１】
製造品のいずれかのいくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）は抗体、結合ペプチド、小分子、またはポリヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）は小分子である。いくつかの実施態様では、ｗｎｔ経路アンタゴニスト（例えば、Ｒスポンジン転位アンタゴニスト）は抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は抗体断片であり、抗体断片はｗｎｔ経路ポリペプチド（例えば、Ｒスポンジン転位融合ポリペプチド）に結合する。
【０２６２】
本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを表示する添付文書をさらに含んでいてもよい。その代わりに、またはそれに加えて、製造品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２（または第３）の容器をさらに含んでいてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、および注射器を含む、商業的および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０２６３】
製造品中の他の随意の構成要素には、１つまたは複数のバッファー（例えば、遮断バッファー、洗浄バッファー、基質バッファー、等）、酵素標識により化学的に変化される基質（例えば、色素原）などの他の試薬、エピトープ検索溶液、対照試料（正および／または負の対照）、対照スライド（複数可）、等が含まれる。
【０２６４】
上記製造品のいずれも、ｗｎｔ経路アンタゴニストに代わってまたはこれに加えて本明細書に記載の免疫コンジュゲートを含んでいてもよいことは理解される。
【実施例】
【０２６５】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上で提供される概要を考慮すれば、様々な他の実施態様を実行しうることは理解される。
【０２６６】
実施例のための材料および方法
試料、ＤＮＡおよびＲＮＡの調製ならびにＭＳＩ試験
患者に対応する新鮮な凍結原発性結腸腫瘍および正常な組織試料を、市販の供給源から得、下記のゲノム解析に供した。すべての腫瘍および正常組織を、病理学的に見直した。９０の試料のセットから、７４の腫瘍ペアを、さらなる解析のために同定した。腫瘍のＤＮＡおよびＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を使用して抽出した。腫瘍試料を、マイクロサテライト不安定性に関して、ＭＳＩ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を使用して評価した。
【０２６７】
エキソームのキャプチャーおよびシーケンシング
７２の腫瘍試料および対応する正常組織を、エキソームシーケンシングにより解析した。エキソームキャプチャーを、ＳｅｑＣａｐ  ＥＺヒトエキソームライブラリーｖ２．０（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、ＷＩ）を使用して実施し、このライブラリーは、約３０，０００のコード遺伝子（約３００，０００のエクソン、全サイズ３６．５Ｍｂ）を標的とする、２１０万の経験的に最適化された長鎖オリゴヌクレオチドからなった。該ライブラリーは、ＲｅｆＳｅｑ（２０１０年１月）、ＣＣＤＳ（２００９年９月）およびｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．１４、２００９年９月）に提示された遺伝子およびエクソンを含む、総計４４．１Ｍｂのゲノムをキャプチャーすることが可能であった。作製されたエキソームキャプチャーライブラリーを、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）でシーケンシングした。２×７５ｂｐのペアエンドデータの１レーンを、各試料に関して収集した。
【０２６８】
ＲＮＡ−ｓｅｑ
６８の結腸腫瘍と対応する正常試料とのペア由来のＲＮＡを使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）を使用して作製した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーは、マルチプレックス（２／レーン）であり、ＨｉＳｅｑ２０００で、製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）の推奨によりシーケンシングした。約３０００万の２×７５ｂｐペアエンドシーケンスリード／試料を作製した。
【０２６９】
配列データ処理
すべての短いリードデータを、品質管理に関してＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＳｈｏｒｔＲｅａｄ  ｐａｃｋａｇｅを使用して評価した。Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５、２６０７−２６０８（２００９）。すべての試料が正確に同定されたことを確認するために、Ｉｌｌｕｍａｎ２．５Ｍアレイデータとオーバーラップする、すべてのエキソームおよびＲＮＡ−ｓｅｑデータのバリアントを比較して、一貫性をチェックした。網羅的（ａｌｌ  ｂｙ  ａｌｌ）生殖細胞バリアントの比較もまたすべての試料の間で実施し、すべてペアが腫瘍と正常の間で正確に対応し、それに応じて、カットオフである９０％を超えて、任意の他の患者のペアと対応しなかったことをチェックした。
【０２７０】
バリアントコール
シーケンシングリードを、ＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）に、ＢＷＡソフトウェアをデフォルトパラメータにセットして使用し、マッピングした。Ｌｉ，Ｈ．＆Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５、１７５４−１７６０（２００９）。ローカルリアライメント、重複のマークおよび粗バリアントコールを、前記のように実施した。ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３、４９１−４９８（２０１１）。ｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ  １３１（Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９、３０８−３１１（２００１））において表されたが、ＣＯＳＭＩＣ（Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８、Ｄ６５２−６５７（２０１０））では表されない公知の生殖細胞変異を、さらにフィルタリングした。加えて、腫瘍および正常試料の両方において提示されたバリアントを、生殖細胞変異として除去した。腫瘍細胞に存在するが、対応する正常試料には不在である残りの変異は、体細胞であることが予測された。予測された体細胞変異を、腫瘍および対応する正常試料の両方において最低１０ｘのカバレッジで、対応する正常試料において観察されたバリアント対立遺伝子頻度が＜３％ならびにＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用してバリアント対立遺伝子のカウントに有意差を有する位置だけを含むようにさらにフィルタリングした。このアルゴリズムの性能を評価するために、８０７のタンパク質改変バリアントをランダムに選択し、前記のＳｅｑｕｅｎｏｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）核酸技術を使用して、これらのバリアントを検証した。Ｋａｎ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６６、８６９−８７３（２０１０）。これらのバリアントのうち、９３％（７５３）が、癌特異的であることが検証され、無効であるバリアントは、腫瘍においてみられないものと、隣接する正常組織においても見出されるもの（生殖細胞）との間で、同じ程度に分かれた。挿入欠失を、ＧＡＴＫ  Ｉｎｄｅｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２を使用してコールし、ＧＡＴＫ  Ｉｎｄｅｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２は、所与のペアに関する腫瘍および正常試料の両方のＢＡＭファイルを読み込む。ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３、４９１−４９８（２０１１）。
【０２７１】
二項仮定を大きく外れたバリアントまたは特定のマッパーにより影響を受けたバリアントコールを特定するために、Ｓｅｑｕｅｎｏｍにより検証されたバリアントが、下記のアルゴリズムを使用してさらに含まれた。リードを、ＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にＧＳＮＡＰを使用してマッピングした。Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．  ＆  Ｎａｃｕ，Ｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６、８７３−８８１（２０１０）。所与の位置に少なくとも２回見られ、対立遺伝子頻度が１０％を超えるバリアントを選択した。これらのバリアントを、鎖および位置において有意なバイアスに関して、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用してさらにフィルタリングした。加えて、隣接する正常試料において十分なカバレッジを有さず、ベータ二項分布を使用して、正常対立遺伝子頻度１２．５％において見落とす可能性が少なくとも１％であると決定されたバリアントを排除した。第２のアルゴリズムに含まれるすべての新規なタンパク質改変バリアントは、Ｓｅｑｕｅｎｏｍにより検証され、合計５１５の追加のバリアントが得られた。すべての非同義体細胞変異の遺伝子機能に対する効果を、ＳＩＦＴ（Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２、４３６−４４６（２００２））およびＰｏｌｙＰｈｅｎ（Ｒａｍｅｎｓｋｙ，Ｖ．，Ｂｏｒｋ，Ｐ．  ＆  Ｓｕｎｙａｅｖ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０、３８９４−３９００（２００２））を使用して予測した。すべてのバリアントを、Ｅｎｓｅｍｂｌ（リリース５９、ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）を使用してアノテーションした。
【０２７２】
体細胞変異および挿入欠失の検証
一塩基対伸長法、それに続いて核酸の質量分析（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、ＣＡ）を前記のように使用し、予測体細胞変異を検証した。腫瘍および対応する正常ＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を使用して全ゲノム増幅し、製造業者の推奨によりクリーンアップし、使用した。腫瘍において期待通り見出されたが正常試料には不在であるバリアントを、体細胞に指定した。腫瘍および正常試料の両方に存在したバリアントは、生殖細胞として分類した。腫瘍または正常試料において検証できなかったバリアントは、無効とした。挿入欠失の検証のために、ＰＣＲのためのプライマーを、挿入欠失領域を含有する約３００ｂｐのアンプリコンを生じるように設計した。該領域を、腫瘍および対応する正常試料において、Ｐｈｕｓｉｏｎ（ＮＥＢ、ＭＡ）を製造業者の取扱説明書により使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片を、続いてゲルにより精製し、関連するバンドを単離し、このバンドをＳａｎｇｅｒ法でシーケンシングした。シーケンシング・トレース・ファイルを、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＰＡ）を使用して解析した。腫瘍に存在し、正常試料に不在であった挿入欠失を体細胞に指定し、表３に報告する。
【０２７３】
変異の有意性
遺伝子の変異の有意性を、前記の方法を使用して評価した。簡潔に言うと、この方法は、計算されたバックグラウンドの変異率に基づき期待されるものより、統計的に有意に多いタンパク質改変変異を有する遺伝子を同定可能である。バックグラウンドの変異率は、６つの異なるヌクレオチド変異カテゴリー（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＣＧ１、ＣＧ２）に関して計算され、このカテゴリーにおいて、腫瘍および対応する正常試料の両方において、十分なカバレッジがあった（≧１０×）。非同義対同義の比率、ｒｉ、を、すべてのタンパク質コードヌクレオチドの変異および得られた変化が同義または非同義の変化をもたらすかどうかの探索のシミュレーションを使用して計算した。バックグラウンドの変異率、ｆｉ，を、同義体細胞バリアントの数にｒｉを掛け、タンパク質コードヌクレオチドの総数により正規化することによって決定した。所与の遺伝子に関して期待される変異の数を、タンパク質コード塩基の数×ｆｉとして決定し、すべての変異カテゴリーにわたって統合した。Ｐ値を、各遺伝子に関する変異の期待数および観察数を所与として、ポアソン確率関数を使用して計算した。Ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して多重検定に関して補正し、得られたｑ値を、ｑ値の負のｌｏｇ１０を取ることによりｑスコアに変換した。異なる変異率が、ＭＳＩおよびＭＳＳ試料に存在することを考え、ｑスコアはそれぞれ別々に計算し、２つの超変異試料を完全に除去した。バックグラウンドの変異率を過小評価しないために、腫瘍含有量が５０％未満である７つの試料を、解析から排除した。経路の変異有意性もまた、ＭＳｉｇＤＢ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｏｆ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２、１５５４５−１５５５０（２００５））の一部としてダウンロードした、ＢｉｏＣａｒａ  Ｐａｔｈｗａｙを使用したことを除き、前記のように計算した。
【０２７４】
全ゲノムのシーケンシングおよび解析
ペアエンドＤＮＡ−Ｓｅｑのリードを、ＢＷＡを使用してＧＲＣｈ３７にアライメントした。変異コールを得るためのアライメントのさらなる処理は、ＧＡＴＫパイプラインを使用するエキソームシーケンシング解析と同様であった。コピー数を、１０ｋｂの非オーバーラップビン中のリード数を計算し、これらのカウントの腫瘍／正常比を取ることによって計算した。染色体切断点を、ブレイクダンサーを使用して予測した。Ｃｈｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６、６７７−６８１（２００９）。ゲノムプロットを、Ｃｉｒｃｏｓ（Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９、１６３９−１４５９（２００９））を使用して作成した。
【０２７５】
ＲＮＡ−ｓｅｑのデータ解析
ＲＮＡ−Ｓｅｑのリードを、ＧＳＮＡＰ（Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．  ＆  Ｎａｃｕ，Ｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６、８７３−８８１（２０１０））を使用して、ヒトゲノム・バージョンＧＲＣｈ３７にアライメントした。発現カウント／遺伝子を、アライメントが一致し、ＣＣＤＳにより定義された各遺伝子座に対してユニークであるリードの数をカウントすることによって得た。遺伝子カウントを、続いてライブラリーサイズに対して正規化し、次いでＤＥＳｅｑ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒソフトウェアパッケージを使用して、分散を安定化させた。Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．  ＆  Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１、Ｒ１０６（２０１０）。差次的遺伝子発現を、分散安定化カウントについてのペアワイズｔ検定、続く、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ＆  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用する多重検定に関する補正により、計算した。
【０２７６】
ＳＮＰアレイデータの作成および解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＯｍｎｉ２．５＿４ｖ１アレイを使用して、７４の結腸腫瘍および対応する正常試料を、遺伝子型、ＤＮＡコピーおよびＬＯＨに関して、約２５０万のＳＮＰ位置においてアッセイした。これらの試料は、試料の同定およびデータの品質のための本発明者らの品質管理基準をすべて通過した（下記を参照されたい）。２２９５２３９の高品質のＳＮＰのサブセットを、すべての解析のために選択した。
【０２７７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイデータを使用可能にするための修正後、ＰＩＣＮＩＣ（Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １１、１６４−１７５（２０１０））アルゴリズムを適用し、総コピー数および対立遺伝子特異的コピー数／ＬＯＨを推定した。修正は、セグメント初期化コンポーネントとＣＢＳアルゴリズム（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｅ．Ｓ．  ＆  Ｏｌｓｈｅｎ，Ａ．Ｂ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３、６５７−６６３（２００７））との置き換え、ならびにバックグラウンドの生コピー数シグナルに関する事前分布の調整（調整平均が０．７３９３および平均偏差が０．０５）を含んだ。ＰＩＣＮＩＣの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）により要求される前処理のために、ベイズモデルにより各ＳＮＰのクラスターの重心を推定した。ＳＮＰ  ｋおよび表現型ｇに関して、正常試料において観察されたデータを、２変数ガウス分布に従ってモデル化した。３つの２倍体遺伝子型のクラスター中心を、６次元ガウス分布と、ハイパーパラメータとして処理された平均および１５６の正常試料のトレーニングセットに経験的に基づくセットとを合わせてモデル化した。クラスター中心および遺伝子型内の共分散マトリックスを、逆ウィシャートでモデル化し、スケールマトリックスのハイパーパラメータをさらに経験的に設定し、自由度を手作業で調整して、広範囲のプローブ挙動および低い対立遺伝子頻度のための満足のいく結果を提供した。最終的に、ＳＮＰ  ｋ（ＡおよびＢの対立遺伝子に対して別々に）に関するシグナルを、非線形関数：
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を用いて変換し、上で計算した事後分布に基づいて選択した。
【０２７８】
試料の同一性を、すべての試料の間の遺伝子型一致を使用して検証した。同じ患者由来の腫瘍のペアは、＞９０％の一致であることが期待され、他のすべてのペアは＜８０％の一致であることが期待された。それらの基準を満たさなかった試料は、すべての解析から排除した。ＰＩＣＮＩＣの修正後、ＨＭＭにフィットした全部の品質を、各ＳＮＰの生の値と、ＨＭＭにフィットした値との間の２乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を測定することによって評価した。ＲＭＳＥ＞１．５の試料を、すべての解析から排除した。最終的に、共通して観察された２つの人為的結果を説明するために、フィットしたコピー数が０である単集合に関して、またはコピー数の増加が推測された領域に対して、観察され、フィットした平均が２を上回り異なる場合、フィットしたコピー数値を「ＮＡ」に設定した。
【０２７９】
ＤＮＡコピー数の再発増減
ＤＮＡコピー数の増減が再発されるゲノム領域を、ＧＩＳＴＩＣ、バージョン２．０．  Ｍｅｒｍｅｌ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２、Ｒ４１（２０１１）を使用して同定した。ＰＩＣＮＩＣにより得られた、セグメント化された整数の総コピー数値ｃを、ｌｏｇ２比の値、ｙに変換し、ｙ＝ｌｏｇ２（ｃ＋０．１）−１であった。＋／−０．２のカットオフを、それぞれｌｏｇ２比値の増減の分類に使用した。最小セグメント長２０ＳＮＰおよびｌｏｇ２比「ｃａｐ」値３を使用した。
【０２８０】
融合の検出および検証
推定融合を、ＧＳＴＲＵＣＴ−融合と呼ばれる、開発された計算パイプラインを使用して、同定した。このパイプラインは、リードスルー融合を見出すための、今までに報告された方法論と基本的に同様の生成・試験戦略に基づく。Ｎａｃｕ，Ｓ．ら、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４、１１（２０１１）。ペアエンドリードを、本発明者らのアライメントプログラムＧＳＮＡＰを使用して、アライメントした。Ｎａｃｕ，Ｓ．ら、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４、１１（２０１１）。ＧＳＮＡＰは、スプライシング表示転位、逆位および単一リードエンド内の他の遠位融合を検出する能力を有する。
【０２８１】
これらの遠位スプライシングは、次の試験段階のための１セットの融合候補を提供した。融合候補の他のセットは、ペアエンドのリードの各エンドを、異なる染色体に対してユニークにアライメントした、ペアでないユニークなアライメント、およびペアエンドに由来するが、各エンドを、同じ染色体であるが、２００，０００ｂｐを超える見かけのゲノム距離または逆位もしくはスクランブリング事象を示唆するゲノムの配向を有する染色体に対してユニークにアライメントした、不一致のユニークなアライメントに由来する。
【０２８２】
融合候補を、続いて、ＲｅｆＳｅｑに由来する公知の転写物に対してフィルタリングし、ＧＭＡＰを使用してゲノムにアライメントした。Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．  ＆  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｃ．Ｋ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１、１８５９−１８７５（２００５）。遠位スプライシングに隣接する両方の断片またはペアでないもしくは不一致のペアエンドアライメントの両方のエンドを、公知のエクソン領域にマッピングすることが必要であった。このフィルタリングステップは、候補のおよそ９０％を除去した。同じ遺伝子の再配列およびゲノム中の隣接遺伝子を伴う見かけのリードスルー融合事象を示唆する逆位および欠失の候補をさらに排除し、これらは、本発明者らの今までの調査により、転写起源であってゲノム起源ではない可能性が高かった。
【０２８３】
残りの融合事象候補に関して、担持されたドナーエクソンから遠位のエクソンおよび担持されたアクセプターエクソンから近位のエクソンからなる人工のエクソン−エクソンジャンクションを構築した。近位および遠位の計算に含まれるエクソンは、各遺伝子に沿った累積長が、推定最大インサート長が２００ｂｐ以内であるように限定された。対照として、同じ遺伝子内のエクソンの組合せからなるすべてのエクソン−エクソンジャンクションを、融合事象候補に寄与するすべての遺伝子に関して構築した。
【０２８４】
本発明者らのパイプラインの試験段階において、本発明者らは、人工のエクソン−エクソンジャンクションおよび対照から、ＧＭＡＰおよびＧＳＮＡＰパッケージの一部として含まれたＧＭＡＰ＿ＢＵＩＬＤプログラムを使用して、ゲノムインデックスを構築した。このゲノムインデックスおよびスプライシングの検出を停止したＧＳＮＡＰプログラムを使用して、ゲノムに一致しなかった元々のリードエンドを再アライメントした。融合候補に対応する遺伝子間ジャンクションにアライメントされたが、対象の遺伝子内ジャンクションにはアライメントされなかったリードを抽出した。
【０２８５】
リアライメントの結果をフィルタリングし、各融合候補が、２０ｂｐのオーバーハングを含む少なくとも１つのリードを有するように要求した。さらに、各融合候補が、少なくとも１０の支持リードを有するように要求した。残りの各融合候補に関して、２つのコンポーネント遺伝子を、ＧＭＡＰを使用して、互いにアライメントし、アライメントが７５ｂｐのウインドウ中に６０のマッチを含有する任意の領域を有する場合、この融合を排除した。エクソン−エクソンジャンクションを、ＧＭＡＰを使用してコンポーネント遺伝子のそれぞれに対してさらにアライメントし、アライメントが、ジャンクションの９０％を上回るカバーを有し、９５％を上回る同一性を有した場合、この融合を排除した。
【０２８６】
遺伝子融合の検証を、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ法を使用し、結腸腫瘍および対応する正常試料を使用して実施した。５００ｎｇの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、ｃＤＮＡに逆転写した。５０ｎｇのｃＤＮＡを、４００ｐＭの各プライマー、３００μＭのデオキシヌクレオシド三リン酸および２．５単位のＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ）を含有する、２５μｌの反応液中で増幅した。ＰＣＲを、初期変性が９５℃で３分間、続いて、９５℃において１０秒間、５６℃において１分間および６８℃において３０秒間を３５サイクルならびに最終伸長ステップが６８℃において１０分間で実施した。３μｌのＰＣＲ産物を、１．２％のアガロースゲルにおいて泳動させ、遺伝子融合を含有する試料を同定した。特異的ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔまたはＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）のいずれかを用いて精製した。精製したＤＮＡを、各融合に特異的なＰＣＲプライマーを用いた直接シーケンシング、またはＴＯＰＯクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）内にクローニングおよびその後のＳａｎｇｅｒ法によるシーケンシングのいずれかを行った。クローンを、Ｓａｎｇｅｒ法によるシーケンシングを使用して、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）で製造業者の取扱説明書によりシーケンシングした。Ｓａｎｇｅｒ法によるシーケンシングのトレースファイルを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｒｄｅｓ  Ｃｏｒｐ、ＭＩ）を使用して解析した。
【０２８７】
ＲＳＰＯ融合活性試験
ｃ末端ＦＬＡＧタグＥＩＦ３Ｅ、ＰＴＰＫＲ（アミノ酸１〜３８７）、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＥＩＦ３Ｅ（ｅ１）−ＲＳＰＯ２（ｅ２）、ＰＴＰＲＫ（ｅ１）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）、ＰＴＰＲＫ（ｅ７）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）の発現を駆動する真核性発現プラスミドｐＲＫ５Ｅを、標準的ＰＣＲおよびクローニング戦略を使用して作製した。
【０２８８】
細胞、馴化培地、免疫沈降およびウエスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ、ヒト胚腎臓細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭにおいて維持した。発現解析および馴化培地の作製のために、３×１０５のＨＥＫ２９Ｔ細胞を、６ウェルプレートの１０％ＦＢＳを含有する１．５ｍｌ  ＤＭＥＭに播種した。細胞に、１μｇのＤＮＡを、図６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクトした。培地を４８時間馴化し、回収し、遠心分離にかけ、ルシフェラーゼレポーターアッセイを刺激するために使用した（最終濃度０．１〜０．４倍）。発現解析のために、培地を回収し、遠心分離にかけ、残屑を除去し、免疫沈降に使用した。
【０２８９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５０，０００細胞／ｍｌの密度で、９６ウェルプレートに９０μｌの２．５％ＦＢＳ含有培地／ウェルで播種した。２４時間後、細胞に、図６を使用して、製造業者の取扱説明書（Ｒｏｃｈｅ、ＣＡ）に従って、以下のＤＮＡ／ウェルをトランスフェクトした：０．０４μｇのＴＯＰｂｒｉｔｅホタルレポーター（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５、２１７−２１９（２００９））、０．０２μｇのｐＲＬ  ＳＶ４０−Ｒｅｎｉｌｌａ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）および０．０１μｇの適切なＲスポンジンまたは対照構築物。細胞を、２５μｌの、１０％ＦＢＳを含有し、ｒｍＷｎｔ３ａ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ（最終）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を含むか、または含まない、新鮮な培地または馴化培地のいずれかにより刺激した。２４時間の刺激後、５０μｌの培地を除去し、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）で、製造業者の取扱説明書に従って置き換えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を使用して、発光を検出した。トランスフェクションの効率を調節するために、ホタルルシフェラーゼレベルを、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼレベルに対して正規化し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）の尺度を作製した。実験データを、３つの独立したウェルの平均±ＳＤとして表した。
【０２９０】
免疫沈降およびウエスタンブロット
ＲＳＰＯ野生型およびＲＳＰＯ融合タンパク質が分泌されていることを確認するために、ＦＬＡＧタグ付したタンパク質を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体をカップリングさせたビーズ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して、培地から免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で煮沸し、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において分離し、ニトロセルロース膜に転写した。細胞中で発現したＲＳＰＯおよび他のＦＬＡＧタグ付タンパク質を、細胞溶解物から、前記（Ｂｉｊａｙ  ｐ８５  ｐａｐｅｒ）のようにウエスタンブロットにより検出した。簡潔に言うと、免疫沈降させたタンパク質および細胞溶解物由来のタンパク質を、ＦＬＡＧ−ＨＲＰ−コンジュゲート抗体および化学発光Ｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学発光検出基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ）を使用して、ウエスタンブロットにより検出した。
【０２９１】
実施例１−ＣＲＣ変異プロファイル
癌ゲノムの変化を同定および理解することは、標的治療薬の開発にとって必須である。これらの実施例において、７０ペアを超えるヒト原発性結腸癌の系統的解析を、次世代シーケンシングを適用し、これらのエキソーム、トランスクリプトームおよびコピー数変化を特徴付けることにより着手した。３６，３０３のタンパク質改変体細胞変化を同定し、この変化は、いくつかの新しい再発変異を、Ｗｎｔ経路遺伝子であるＴＣＦ１２およびＴＣＦ７Ｌ２など、クロマチンリモデリングタンパク質、例えばＴＥＴ２およびＴＥＴ３ならびにＥＲＢＢ３を含む受容体型チロシンキナーゼに含んだ。有意な癌遺伝子に関する解析により、細胞周期チェックポイントキナーゼＡＴＭを含む、１８の候補を同定した。コピー数およびＲＮＡ−ｓｅｑデータの解析により、結腸腫瘍のサブセットにおいて、ＩＧＦ２の増幅および対応する過剰発現を同定した。さらに、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して多重融合転写物を同定し、この中には、試料の１０％において起こる、Ｒスポンジン遺伝子であるＲＳＰＯ２およびＲＳＰＯ３の再発遺伝子融合が含まれた。ＲＳＰＯ融合タンパク質は、生物学的に活性であり、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することが実証された。ＲＳＰＯ融合とＡＰＣの変異は相互に排他的であり、ＲＳＰＯ融合が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化および腫瘍形成において役割を果たしている可能性が高いことを示している。これらの実施例において同定されたＲスポンジン遺伝子融合およびいくつかの他の遺伝子の変異は、結腸癌における治療的介入の新しい可能性を提供する。
【０２９２】
７４の原発性結腸腫瘍およびそれらの対応する隣接正常試料を特徴付けた。７４の結腸腫瘍および隣接正常試料のペアのうちの７２（１５がＭＳＩおよび５７がＭＳＳ）に関する全エキソームシーケンシングを実施し、変異スペクトルを評価した。これらの７４の腫瘍／正常ペアを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ２．５Ｍアレイにおいてさらに解析し、染色体コピー数の変化を評価した。６８の腫瘍／正常ペアに関するＲＮＡ−ｓｅｑデータもまた得た。最終的に、試料のこのセットから３０×のカバレッジで、ＭＳＩおよびＭＳＳの腫瘍／正常ペアのゲノムをシーケンシングおよび解析した。
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【０２９３】
エクソンを、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＥＺヒトエキソームライブラリーｖ２．０を使用してキャプチャーし、ＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）でシーケンシングし、７５ｂｐのペアエンドシーケンシングリードを作製した。標的化領域は、平均カバレッジ１７９ｘを有し、９７．４％の塩基が≧１０倍でカバーされた。分析した７２の結腸腫瘍試料において９５，０７５の体細胞変異が同定され、そのうち３６，３０３がタンパク質改変性であった。２つのＭＳＳ試料は、異常な多数の変異（それぞれ２４，８３０および５，７８０の変異のうち９，４７９および２，３３２がタンパク質改変変異であった）を示した。これらは超変異として指定され、バックグラウンドの変異率の計算には考慮されなかった。研究した１５のＭＳＩ試料中の５２，３１２の体細胞変異（１８，４３６がミスセンス、９２９がナンセンス、２２が終止喪失、４３６が基本的スプライシング部位、３６３がタンパク質改変挿入欠失、８，０６５が同義、１６，６７５がイントロンおよび７，３８６がその他）および５５のＭＳＳ試料中１２，１５３の体細胞変異（３，９２２がミスセンス、２８９がナンセンス、６が終止喪失、６９が基本的スプライシング部位、２０がタンパク質改変挿入欠失、１，５８４が同義、４，３７５がイントロンおよび１，８８８がその他）を見出した（表２および３）。これらの実施例において報告された、約９８％（３５，５２４／３６，３０３）のタンパク質改変単一ヌクレオチドバリアントは新規であり、ＣＯＳＭＩＣ  ｖ５４（Ｆｏｒｂｅｓ、Ｓ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：Ｄ６５２−６５７（２０１０））において報告されていなかった。報告された体細胞変異の３７％を、ＲＮＡ−ｓｅｑデータまたは質量分析遺伝子型判定を使用して、９３％の検証率で検証した（表２）。報告されたすべての挿入欠失が、Ｓａｎｇｅｒ法によるシーケンシングを使用して体細胞と確認された（表３−体細胞挿入欠失）。ＭＳＳ試料中２．８／Ｍｂ（５５試料中３１〜１４９のコード領域変異）およびＭＳＩ試料中４０／Ｍｂ（１５試料中７６４〜３１１３のコード領域変異）の平均非同義変異率が観察され、後のＭＭＲ検出と一致した。
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【０２９４】
変異部位における塩基レベルの移行およびトランスバージョンの解析により、ＭＭＲの状態と関係なく、全エキソームおよび全ゲノム解析の両方で、ＣＲＣにおいてＣからＴへの移行が優勢であることが明らかにされた。これは、今までの変異レポート（Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１１０８−１１１３（２００７）；Ｓｊｏｂｌｏｍ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：２６８−２７４（２００６）；Ｂａｓｓ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３：９６４−９６８（２０１１））と一致する。検査した２つの超変異腫瘍試料もまた、ＣからＡおよびＴからＧへのトランスバージョンを高い割合で示し、これらの試料に観察された非常に高い変異率と一致した。
【０２９５】
エキソーム変異データと一致して、解析したＭＳＳ全ゲノムは、１７，６５１の変異を示し、それと比較してＭＳＩ全ゲノムにおいて９７，９６８の変異が観察された。平均全ゲノム変異率は、それぞれＭＳＳおよびＭＳＩゲノムに関して６．２／Ｍｂおよび３４．５／Ｍｂであった。４．０〜９．８／Ｍｂの変異率が、ＭＳＳ  ＣＲＣゲノム（Ｂａｓｓ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３：９６４−９６８（２０１１））に関して以前に報告されていた。
【０２９６】
実施例２−変異遺伝子の解析
変異解析により、ＭＳＳ試料中３，２５７、ＭＳＩ試料中９，８５１および２つの超変異試料中６，８９１を含む１２，９５６の遺伝子において、タンパク質改変体細胞の単一ヌクレオチドバリアントを同定した。タンパク質の頻繁に変異を起こすクラスの１つが、ＲＴＫ、Ｇタンパク質共役受容体および核ホルモン受容体を含むヒトキナーゼである。変異が遺伝子機能に与える影響を理解する取り組みにおいて、ＳＩＦＴ（Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２：４３６−４４６（２００２））、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ（Ｒａｍｅｎｓｋｙ，Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：３８９４−３９００（２００２））およびｍＣｌｕｓｔｅｒ（Ｙｕｅ，Ｐ．ら、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  ３１：２６４−２７１（２０１０））を適用し、３つの方法の少なくとも２つに基づき、３６．７％の変異がおそらく機能的結果を有する可能性が高いことが見出され、それとは対照的に、正常試料由来の生殖細胞バリアントに関しては１２％であった（表２）。
【０２９７】
変異遺伝子の関連をさらに理解するために、前記ｑスコア計量を適用して、有意に変異した癌遺伝子を、順位付けした（Ｋａｎ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６６：８６９−８７３（２０１０））。ＭＳＳ試料において、１８の有意な癌遺伝子（ｑスコア≧１；≦１０％偽発見率）を同定した（ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＣＳＭＤ１、ＮＲＸＮ１、ＤＮＡＨ５、ＭＲＶＩ１、ＴＲＰＳ１、ＤＭＤ、ＫＩＦ２Ｂ、ＡＴＭ、ＦＡＭ５Ｃ、ＥＶＣ２、ＯＲ２Ｗ３、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ，およびＳＣＮ１０Ａ）。有意に変異したＭＳＳ結腸癌遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７およびＰＩＫ３ＣＡを含む先に報告した遺伝子ならびに細胞周期チェックポイント遺伝子ＡＴＭを含むいくつかの新しい遺伝子を含んだ。ＫＲＡＳおよびＴＰ５３などの遺伝子は、最も変異したＭＳＩ結腸癌遺伝子の中に入るが、解析したＭＳＩ試料の数が限られたので、統計的有意を達成した遺伝子はなかった。
【０２９８】
変異遺伝子の関連性を確立する取り組みにおいて、変異遺伝子を、癌のマウスモデルを伴うスクリーニングにおいて同定された、３９９の結腸癌遺伝子候補に対して比較した（Ｓｔａｒｒ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３、１７４７−１７５０（２００９）；Ｍａｒｃｈ，Ｈ．Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３、１２０２−１２０９（２０１１））。３９９の遺伝子のうち、３２７において変異が見出された。データセットを、別の方法により解析した場合、４３２の遺伝子のうち、３５６において変異が見出された。マウス結腸癌モデルとオーバーラップする、データセット中の高頻度の変異遺伝子がヒットし、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７およびＥＰ４００を含んだ。さらに、マウスＣＲＣスクリーニングにおいて見出された、ＳＩＮ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡ５およびＮＣＯＲ１などのクロマチンリモデリングならびにヒストン修飾酵素ＪＡＲＩＤ２に関与する遺伝子（Ｓｔａｒｒ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３，１７４７−１７５０（２００９）；Ｍａｒｃｈ，Ｈ．Ｎ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４３，１２０２−１２０９（２０１１））もまた、本発明者らのエキソームスクリーニングにおいて変異していた。さらに、マウス結腸癌モデルスクリーニングにおいて同定されたＴＣＦ１２は、本発明者らの試料の５つ（Ｑ１７９＊、Ｇ４４４＊およびＲ６０３Ｗ／Ｑ）（７％）において変異し、Ｒ６０３においてホットスポット変異を含有した（５の変異のうちの３；Ｒ６０３Ｗ／Ｑ）。ＴＣＦ１２ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン内のこのホットスポット変異は、ＤＮＡと結合するその能力を破棄する可能性が高いと思われ、機能喪失変異を示唆する。興味深いことに、ＴＣＦ１２変異のすべてが、ＭＳＩ試料において同定された。ＴＣＦ１２転写因子は、以前は結腸癌の転移に関係があるとされていた（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２７９８−２８０９（２０１１））。この遺伝子におけるホットスポットの存在およびマウスＣＲＣモデルスクリーニングにおけるその同定は、この遺伝子が、ＣＲＣドライバー遺伝子として機能する可能性が高いことを示している。
【０２９９】
遺伝子の同じ位置が独立した試料にわたって変異した、変異ホットスポットは、機能的に関連するドライバー癌遺伝子を表示している。この研究において、２７０の遺伝子にホットスポット変異があることを同定した（表４）。これらの遺伝子の７０は、ＣＯＳＭＩＣにおいてまだ報告されていなかった。本発明者らの変異とＣＯＳＭＩＣにおいて報告された変異との比較により、追加の２４５のホットスポット変異を１６６の遺伝子において同定した（表５）。別のデータ解析方法を利用して、ホットスポット変異を有する２７４の遺伝子を同定し、これらの遺伝子のうち４０がまだＣＯＳＭＩに存在せず、追加の４３５ホットスポット変異が３６１の遺伝子に存在した。新規なホットスポット変異を有する遺伝子は、転写制御因子（ＴＣＦ１２、ＴＣＦ７Ｌ２およびＰＨＦ２）、Ｒａｓ／Ｒｈｏ関連制御因子（ＳＯＳ１（例えば、Ｒ５４７Ｗ、Ｔ６１４Ｍ  Ｒ８５４＊、Ｇ１１２９Ｖ）、ＳＯＳ２（例えば、Ｒ２２５＊、Ｒ８５４ＣおよびＱ１２９６Ｈ）、ＲＡＳＧＲＦ２、ＡＲＨＧＡＰ１０、ＡＲＨＧＥＦ３３およびＲａｂ４０ｃ（例えばＧ２５１Ｓ））、クロマチン修飾酵素（ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＥＰ４００およびＭＬＬ）、グルタミン酸受容体（ＧＲＩＮ３ＡおよびＧＲＭ８）、受容体型チロシンキナーゼ（ＥＲＢＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＦＮＢ３、ＥＰＨＡ１、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１およびＦＬＴ４）、他のキナーゼ（ＲＩＯＫ３、ＰＲＫＣＢ、ＭＵＳＫ、ＭＡＰ２Ｋ７およびＭＡＰ４Ｋ５）、タンパク質ホスファターゼ（ＰＴＰＲＮ２）、ＧＰＲＣｓ（ＧＰＲ４およびＧＰＲ９８）およびＥ３−リガーゼ（ＴＯＰＯＲＳ）を含む。この遺伝子セットのさらに興味深いものは、ＴＥＴ２およびＴＥＴ３であり、これらは両方とも、ＤＮＡのメチル化に関与するメチルシトシンジオキシゲナーゼをコードする（Ｍｏｈｒ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：２７２−２８１（２０１１））。ＴＥＴ２の変異は骨髄の癌において報告されているが、今までのところ、ＴＥＴ３またはＴＥＴ１における変異は、固形腫瘍、特にＣＲＣでは報告されていない（Ｍｏｈｒ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：２７２−２８１（２０１１））。３つすべてのファミリーメンバー、ＴＥＴ１（例えば、Ｒ８１Ｈ、Ｅ４１７Ａ、Ｋ５４０Ｔ、Ｋ７９２Ｔ、Ｓ８７９Ｌ、Ｓ１０１２＊、Ｑ１３２２＊、Ｃ１４８２Ｙ、Ａ１８９６ＶおよびＡ２１２９Ｖ）、ＴＥＴ２（例えば、Ｋ１０８Ｔ、Ｔ１１８Ｉ、Ｓ２８９Ｌ、Ｆ３７３Ｌ、Ｋ１０５６Ｎ、Ｙ１１６９＊、Ａ１４９７ＶおよびＶ１８５７Ｍ）およびＴＥＴ３（例えば、Ｔ１６５Ｍ、Ａ８７４Ｔ、Ｍ９７７Ｖ、Ｇ１３９８ＲおよびＲ１５７６Ｑ／Ｗ）は、これらの実施例において変異される。
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【０３００】
実施例３−発現およびコピー数変化
ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、腫瘍と正常試料との間の差次的発現遺伝子を計算した（表６）。最も差次的に過剰発現した遺伝子は、ＦＯＸＱ１およびＣＬＮＤ１を含み、これらは両方とも腫瘍形成に関係があるとされている（Ｋａｎｅｄａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：２０５３−２０６３（２０１０））。重要なことには、ＲＮＡ−ｓｅｑデータの解析において、ＩＧＦ２の上方制御が、検査した結腸腫瘍の１２％（８／６８）において同定された。ＩＧＦ２を過剰発現する腫瘍の大部分（７／８）もまた、Ｉｌｌｕｍｉｎａ２．５Ｍアレイにより測定すると、ＩＧＦ２遺伝子座の局所的増幅を示した。全差次的発現遺伝子は多数のシグナル伝達経路に影響を与え、これらの経路は、カルシウムシグナル伝達、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達、グルタミン酸受容体シグナル伝達、筋萎縮性側索硬化症シグナル伝達、窒素代謝、軸索ガイダンスシグナル伝達、乾癬におけるＩＬ−１７Ａの役割、セロトニン受容体シグナル伝達、慢性閉塞性肺疾患の気道病変、プロテインキナーゼＡシグナル伝達、膀胱癌シグナル伝達、ＨＩＦ１αシグナル伝達、心臓β−アドレナリン作用性シグナル伝達、シナプス長期増強、アテローム性動脈硬化シグナル伝達、概日リズムシグナル伝達、ニューロンにおけるＣＲＥＢシグナル伝達、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、白血球の血管外遊出シグナル伝達、補体系、エイコサノイドシグナル伝達、チロシン代謝、システイン代謝、シナプス長期抑圧、関節炎におけるＩＬ−１７Ａの役割、シルデナフィル（バイアグラ）の細胞効果、脊髄後角ニューロンにおける神経障害性疼痛シグナル伝達、Ｄ−アルギニンおよびＤ−オルニチンの代謝、アレルギー性炎症性気道疾患におけるＩＬ−１７Ｆの役割、甲状腺癌シグナル伝達、肝線維症／肝星細胞活性化、ドーパミン受容体シグナル伝達、哺乳動物の胚性幹細胞多能性におけるＮＡＮＯＧの役割、コンドロイチン硫酸生合成、エンドセリン−１シグナル伝達、ケラタン硫酸生合成、光情報伝達経路、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達、ケモカインシグナル伝達、アラニンおよびアスパルテートの代謝、グリコスフィンゴリピド生合成−ネオラクトシリーズ（Ｎｅｏｌａｃｔｏｓｅｒｉｅｓ）、胆汁酸生合成、マクロファージの役割、関節リウマチにおける線維芽細胞および内皮細胞、α−アドレナリン作用性シグナル伝達、タウリンおよびヒポタウリンの代謝、ＲＸＲ機能のＬＰＳ／ＩＬ−１媒介性阻害、結腸直腸癌転移シグナル伝達、好酸球におけるＣＣＲ３シグナル伝達およびＯ−グリカン生合成を含む。
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【０３０１】
７４の腫瘍／正常ペアにおけるコピー数変化を、ＧＩＳＴＩＣをＰＩＣＮＩＣのセグメント化コピー数データに適用することによって評価した。ＩＧＦ２の増幅に加えて、ＫＲＡＳ（１３％；１０／７４）およびＭＹＣ（３１％；２３／７４）を伴う公知の増幅が、染色体８ｑ上の広いアンプリコンに位置することが見出された（表７）。腫瘍抑制因子であるＦＨＩＴを伴う局所的欠失が、試料の２１％（１６／７４）に観察された（表８）。プリンの代謝に関与するジアデノシン５’，５’’’−Ｐ１，Ｐ３−トリホスファターゼ加水分解酵素をコードするＦＨＩＴは、他の癌において喪失されていることが既に報告されている（Ｐｉｃｈｉｏｒｒｉ，Ｆ．ら、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．４：８１５−８２４（２００８））。ＡＰＣ（１８％；１４／７４）およびＳＭＡＤ４（２９％；２２／７４）の欠失もまた観察された。最終的に、染色体２０ｑが高頻度で増加し、対照的に１８ｑが喪失されていることが見出された。
【０３０２】
コピー数変化を、ＰＩＣＮＩＣのプローブ−レベルのコピー数コール、コピー数の腫瘍／正常試料比のＣＢＳセグメント化およびこれらの腫瘍／正常試料比におけるＧＩＳＴＩＣを使用して解析した場合、最もコピー数が変化した遺伝子のセットは同様であるが、パーセントの変化はわずかであった。ＫＲＡＳ（１３％；１０／７４）およびＭＹＣ（２３％；１７／７４）を伴う公知の増幅は、染色体８ｑ上の広いアンプリコンに位置した。腫瘍抑制因子であるＦＨＩＴの欠失は、試料の３０％（２２／７４）において観察された。ＡＰＣ（８％；６／７４）、ＰＴＥＮ（４％、３／７４）およびＳＭＡＤ３（９％、１０／７４）の欠失が観察された。ＳＭＡＤ４およびＳＭＡＤ２は、両方とも、試料の２７％（２０／７４）において変化し、頻繁に喪失される１８ｑにおいて互いに３Ｍｂ以内に位置する。
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【０３０３】
発現の評価の他に、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを、スプライシングパターンの検査に活用できる。変異遺伝子の中に、それらのスプライシングに影響を与える可能性が高い、標準的なスプライシング部位に体細胞変異を担持する変異遺伝子がいくつか存在する。１１２の遺伝子が、正統なスプライシング部位の変異を有することが見出されたが、これらは、ＲＮＡ−ｓｅｑデータに基づく、スプライシングの欠陥に関する証拠を示している。影響を受けた遺伝子は、ＴＰ５３、ＮＯＴＣＨ２およびＥＩＦ５Ｂを含む（表９）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータをさらに使用して、遺伝子コード領域におけるある特定のエクソンの腫瘍特異的発現を解析した。ミトコンドリアの大型サブユニットＭＲＰＬ３３遺伝子のアノテーションされたエクソンの最初の５’の上流に、２つの新規な腫瘍特異的エクソンを同定した（図１）。このゲノム領域の解析により、これらの新規なエクソンの転写因子結合部位５’が同定され、本発明者らの観察をさらに裏付けた。
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【０３０４】
実施例４−Ｒスポンジンの再発融合がＷｎｔ経路シグナル伝達を活性化する。
ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、次に、染色体内および染色体間の再配列、例えば癌ゲノムにおいて起こる遺伝子融合を同定した（Ｏｚｓｏｌａｋ，Ｆ．  ＆  Ｍｉｌｏｓ，Ｐ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．１２：８７−９８（２０１１））。マッピングにおいて、ペアエンドＲＮＡ−ｓｅｑデータ、２つの再発遺伝子融合を含む３６の体細胞遺伝子融合を、解析したＣＲＣトランスクリプトームにおいて同定した。融合の体細胞特性を、腫瘍中のその存在および対応する正常試料中の不在を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認することによって確立した。さらに、これらの実施例において報告されたすべての融合を、Ｓａｎｇｅｒ法によりシーケンシングし、検証した（表１０）。同定された予測体細胞融合の大部分（８９％；３２／３６）は、染色体内であった。
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【０３０５】
これらの実施例において同定された再発融合は、ＭＳＳ  ＣＲＣ試料中に見出されたＲスポンジンファミリーのメンバーであるＲＳＰＯ２（３％；２／６８）およびＲＳＰＯ３（８％；５／６８；図２Ａ）を伴う。Ｒスポンジンは分泌タンパク質であり、正統なＷｎｔシグナル伝達を増強することが公知であり（Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｋ．  ＆  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．２４（２）：３６９−７７（２０１２））、これは、おそらくＧＰＣＲのＬＧＲファミリーに結合することによるものである（Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８：１１４５２−１１４５７（２０１１）；ｄｅ  Ｌａｕ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４７６：２９３−２９７（２０１１）；Ｇｌｉｎｋａ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：１０５５−１０６１（２０１１））。２つの腫瘍試料において同定された再発ＲＳＰＯ２融合は、ＥＩＦ３Ｅ（真核細胞翻訳開始因子３）のエクソン１およびＲＳＰＯ２のエクソン２を伴う（図２Ｂ）。この融合転写物は、ＥＩＦ３Ｅプロモーターにより駆動される機能性ＲＳＰＯ２タンパク質を生成することが期待された（図２Ｄ）。同じ試料において検出された第２のＲＳＰＯ２融合は、ＥＩＦ３Ｅのエクソン１およびＲＳＰＯ２のエクソン３を伴う（表１０）。しかし、このＥＩＦ３Ｅ（ｅ１）−ＲＳＰＯ２（ｅ３）は、機能性タンパク質を生成することが期待されない。ゲノムレベルで変化の特性を確認するために、ＲＳＰＯ２融合を含有する、腫瘍の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施した。ジャンクションにまたがるリード（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）、メイトペアリードおよびＷＧＳデータに由来するコピー数データの解析により、１試料中に１５８ｋｂの欠失および第２の試料中に１１３ｋｂの欠失が同定され、これらは両方ともＲＳＰＯ２の５’末端にごく接近したＥＩＦ３Ｅのエクソン１に位置した。
【０３０６】
ＲＳＰＯ３の転位が、６８の腫瘍のうち５つにおいて観察され、この転位は、ＰＴＰＲＫ（タンパク質チロシンキナーゼ受容体カッパ）をその５’パートナーとして伴う。ＲＳＰＯ３融合を発現する５つの腫瘍に由来するＷＧＳリードは、単一（３試料）または複合（２試料）の逆位を伴う再配列を示し、この逆位は、染色体６ｑ上のＰＴＰＲＫと同じ鎖のＰＴＰＲＫに近接したＲＳＰＯ３に位置する。ＰＴＰＲＫのエクソン１（ｅ１）またはエクソン７（ｅ７）およびＲＳＰＯ３のエクソン２（ｅ２）からなる、２つの異なるＲＳＰＯ３融合バリアントを同定した（図３および図４）。通常ＰＴＰＲＫおよびＲＳＰＯ３は、染色体６ｑ上の対向する鎖において８５０Ｋｂ離れているので、ＲＳＰＯ３融合は、染色体レベルで欠失−逆位事象により起こる可能性が高い。４試料において見出されるＰＴＰＲＫ（ｅ１）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）は、ＲＳＰＯ３の全コード配列を保存するインフレーム融合であり、その分泌シグナル配列とＰＴＰＲＫの分泌シグナル配列とが置き換わっている（図３Ｃ）。１試料において検出されたＰＴＰＲＫ（ｅ７）−ＲＳＰＯ３（ｅ２）もまたインフレーム融合であり、その分泌シグナル配列を含むＰＴＰＲＫの最初の３８７のアミノ酸および天然のシグナルペプチドを欠いた、ＲＳＰＯ３のアミノ酸３４〜２７２からなる約７０ＫＤａのタンパク質をコードする（図４Ｃ）。興味深いことに、ＰＴＰＲＫは、ＲＳＰＯ３と比較して非常により強力な分泌シグナル配列を含有し、同定された融合バリアントのより効率的な分泌をもたらす可能性がある。さらに、ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、融合を含有する結腸腫瘍試料におけるＲＳＰＯ２およびＲＳＰＯ３のｍＲＮＡの発現が、それらの対応する正常試料およびＲスポンジン融合を欠いた腫瘍試料と比較して上昇していた（図２Ｅ）。さらに、すべてのＲＳＰＯ陽性融合腫瘍は潜在的Ｒスポンジン受容体ＬＧＲ４／５／６２３−２５を発現していたが、ＬＧＲ６の発現は、ＬＧＲ４／５と比較して低かった。
【０３０７】
予測Ｒスポンジン融合タンパク質が機能性であるかどうかを決定するために、Ｃ−末端ｆｌａｇタグを含有する発現構築物を作製し、哺乳動物２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後に、それらの発現を試験した。馴化培地のウエスタンブロット分析は、融合タンパク質が発現され、分泌されたことを示した（図５Ａ）。Ｒスポンジン融合産物は、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターを使用して、Ｗｎｔシグナル伝達を増強するそれらの能力により決定したところ、生物学的に活性であった。野生型ＲＳＰＯ２／３で観察した場合、ＲＳＰＯ融合の発現構築物をトランスフェクトした細胞の馴化培地を用いた刺激は、対照をトランスフェクトした細胞と比較して、Ｗｎｔルシフェラーゼレポーターの活性化をもたらした（図５Ｂ）。観察された活性化は、外因性ＷＮＴの不在下でも明らかであるが、組換えＷＮＴの存在下でさらに増強され、Ｗｎｔシグナル伝達におけるＲスポンジンの公知の役割と一致した（Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８：１１４５２−１１４５７（２０１１）；ｄｅ  Ｌａｕ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４７６：２９３−２９７（２０１１）；Ｇｌｉｎｋａ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：１０５５−１０６１（２０１１））。
【０３０８】
ＲＳＰＯ遺伝子融合をさらに特徴付けるために、ＲＳＰＯ遺伝子融合を、変異およびＷｎｔシグナル伝達カスケードを含む細胞内シグナル伝達経路のコンポーネントにおいて起こる他の変化に関連して解析した（図６Ｂ）。ＲＳＰＯ２およびＲＳＰＯ３の融合は、ＡＰＣ変異と相互排他的であること（図５Ｅ）の他に、ＡＰＣコード領域に単一コピーの欠失を有する１試料を除き（図５Ｅ）、それら自体の間で相互排他的である。さらに、ＲＳＰＯ遺伝子融合は、ＣＲＣにおいて変異した別のＷｎｔ経路遺伝子であるＣＴＮＮＢ１と、相互に排他的であった。さらに、ＲＳＰＯ遺伝子融合を有する試料のすべてが、ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦに変異を担持していた（図６Ａ）。ＡＰＣ変異体試料の大部分は、ＲＡＳ経路遺伝子変異を有し、結腸腫瘍発生に際してＷｎｔシグナル伝達を促進することによって、ＡＰＣ変異と同じ役割を果たしている可能性が高いことを示していた。非掲載のデータにおいて、ＲＳＰＯ遺伝子融合を有する腫瘍は、ＡＰＣ変異体腫瘍と同様のＷＮＴ発現サインを表すことが示されたが、これは、Ｒスポンジンが、下流のＷＮＴ変異が不在下で、結腸腫瘍においてＷＮＴ経路を活性化できることを示している。これらの発見は、Ｒスポンジンが、ヒトＣＲＣにおいてドライバーとして機能する可能性が高いことを示している。
【０３０９】
これらの実施例において、ヒト原発性結腸腫瘍の詳細な広範囲のゲノム解析を報告した。ヒトＣＲＣのエキソームおよびトランスクリプトームのシーケンシングおよび解析において、多数の新しい再発体細胞変異が見出された。これらの実施例において、有意に変異した遺伝子の多く（ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＴＰ５３、ＴＣＦ７Ｌ２）は、以前の発見と一致する。加えて、１４０遺伝子のうちの１１１における多数の変異を研究において強調し、報告した。さらに、ＡＴＭおよびＴＭＰＲＳＳ１１Ａを含む１１の、今まで報告されていなかった追加の有意な結腸癌遺伝子が同定された。この実施例は、ＴＣＦ１２およびＥＲＢＢ３を含む遺伝子を含有する、多数のホットスポットを同定した。本明細書において同定されたＥＲＢＢ３腫瘍形成性変異体は、ＣＲＣにおいて治療的介入の新しい可能性を提供する可能性がある。発現およびコピー数データの組合せ解析は、本発明者らのヒトＣＲＣ試料のサブセットにおいて、ＩＧＦ２の過剰発現を同定した。
【０３１０】
最終的に、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して、Ｒスポンジンを伴う新しい再発融合は、およそ１０％の頻度で起こることが同定されている。この融合は、Ｗｎｔシグナル伝達を増強する機能性Ｒスポンジンタンパク質をもたらす。Ｒスポンジンは、Ｒスポンジンを担持する結腸癌患者において、抗体に基づく療法の魅力的な標的を提供する。Ｒスポンジンの直接標的化の他に、Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する他の治療戦略が、Ｒスポンジン融合が陽性の腫瘍に対して効果的である可能性が高いであろう。
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【０３１１】
上述の発明は、理解の明確さを目的に図解と実施例によりある程度詳細に説明されてきたが、説明と実施例を発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献は出典明示によりその全体が明示的に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月6日(2017.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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