(57)【要約】【課題】糖及び／又は脂質の代謝改善剤を提供すること。【解決手段】GPLD1抑制剤を含有する、糖及び／又は脂質の代謝改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPLD1抑制剤を含有する、糖及び／又は脂質の代謝改善剤。
【請求項２】
前記GPLD1抑制剤が、GPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、GPLD1特異的アンチセンス核酸、及びこれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の代謝改善剤。
【請求項３】
前記GPLD1抑制剤が、有効成分として含有されている亜鉛キレート剤である、請求項１に記載の代謝改善剤。
【請求項４】
前記GPLD1抑制剤が、GPLD1ドミナントネガティブ変異体及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の代謝改善剤。
【請求項５】
糖の代謝改善に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項６】
血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、及び血中中性脂肪値抑制からなる群より選択される少なくとも1種の用途に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項７】
血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、及び耐糖能向上からなる群より選択される少なくとも1種の用途に用いられる、請求項１〜５のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項８】
糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝、及び肝臓がんからなる群より選択される少なくとも1種の予防又は改善に用いられる、請求項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項９】
糖尿病の予防又は改善に用いられる、請求項１〜５のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項１０】
医薬である、請求項１〜９のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項１１】
食品組成物である、請求項１〜９のいずれかに記載の代謝改善剤。
【請求項１２】
GPLD1抑制剤を含有する、医薬。
【請求項１３】
糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝、及び肝臓がんからなる群より選択される少なくとも1種の予防又は改善に用いられる、請求項１２に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖及び／又は脂質の代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活や生活習慣の変化に伴い、現代、脂質異常症、糖尿病などの生活習慣病は、増加の一途を辿っている。これらは、心筋梗塞、脳梗塞などのリスク要因であるとされており、糖や脂質の代謝改善によって、予防すること或いはより早期に改善することが望まれる。
【０００３】
数多くの細胞表面タンパク質が、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーに対する共有結合によって、細胞膜に結合していることが報告されている。GPLD1タンパク質は、このようなGPIアンカー型タンパク質を基質として、イノシトール リン酸結合を加水分解する酵素である。また、GPLD1タンパク質は、細胞内の特に小胞体においてGPIアンカーを切断することで、ホスファチヂン酸及びジアシルグリセロールの産生を促進し、PKCを活性化させることが報告されている（非特許文献１）。さらに、GPLD1タンパク質は主に肝臓で産生され、循環血中に分泌されると考えられており、血中ではアポリポタンパク質A1やA4と結合していることが報告されている。
【０００４】
特許文献１においては、GPLD1タンパク質が、糖尿病や肝機能不全疾患の治療に有効である旨、報告されている。しかしながら、これまでGPLD1タンパク質に関する研究報告は少なく、特に当該タンパク質のin vivoでの役割について、さらにはGPLD1を抑制した場合の影響については、未だ不明な部分が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2002-533119号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem J. 1999 ;342:449-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糖及び／又は脂質の代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、GPLD1の抑制により、糖及び脂質の代謝が改善され、血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、血中中性脂肪値抑制などが可能であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  GPLD1抑制剤を含有する、糖及び／又は脂質の代謝改善剤．
項２．  前記GPLD1抑制剤が、GPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、GPLD1特異的アンチセンス核酸、及びこれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の代謝改善剤．
項３．  前記GPLD1抑制剤が、有効成分として含有されている亜鉛キレート剤である、項１に記載の代謝改善剤．
項４．  前記GPLD1抑制剤が、GPLD1ドミナントネガティブ変異体及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の代謝改善剤．
項５．  糖の代謝改善に用いられる、項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤．
項６．  血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、及び血中中性脂肪値抑制からなる群より選択される少なくとも1種の用途に用いられる、項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤．
項７．  血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、及び耐糖能向上からなる群より選択される少なくとも1種の用途に用いられる、項１〜５のいずれかに記載の代謝改善剤．
項８．  糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝、及び肝臓がんからなる群より選択される少なくとも1種の予防又は改善に用いられる、項１〜４のいずれかに記載の代謝改善剤．
項９．  糖尿病の予防又は改善に用いられる、項１〜５のいずれかに記載の代謝改善剤．
項１０．  医薬である、項１〜９のいずれかに記載の代謝改善剤．
項１１．  食品組成物である、項１〜９のいずれかに記載の代謝改善剤．
項１２．  GPLD1抑制剤を含有する、医薬．
項１３．  糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝、及び肝臓がんからなる群より選択される少なくとも1種の予防又は改善に用いられる、項１２に記載の医薬．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、糖及び／又は脂質の代謝改善剤を提供することができる。この代謝改善剤によって、血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、血中中性脂肪値抑制などが可能となり、さらには糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝などの疾患又は状態の予防又は改善を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】NIH Knockout Mouse Project (KOMP) Repositoryより購入、固体復元した、GPLD1欠損マウスの設計の詳細を示す。
【図２】実施例1の結果を示す。（A）は検体のボディマス指数（BMI）と血中GPLD1タンパク質濃度との関係性を示す散布図を示し、（B）は検体の血中中性脂肪値と血中GPLD1タンパク質量との関係性を示す散布図を示す。図中の直線は回帰直線を示し、PはP値を示し、Rは相関係数を示す。
【図３】実施例2の結果を示す。（A）は血中GPLD1タンパク質をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す。（B）は肝臓におけるGPLD1 mRNA量をリアルタイムPCRにより測定した結果を示す。（C）は肝臓におけるSREBP-1c mRNA量をリアルタイムPCRにより測定した結果を示す。（D）は肝臓におけるFAS mRNA量をリアルタイムPCRにより測定した結果を示す。WTは野生型マウスを用いた場合を示し、GKOはGPLD1欠損マウスを用いた場合を示し、Fedは自由摂食時に解剖した群を示し、Fast又は48hr Fastは48時間絶食した後に解剖した群を示し、Refed又は16hr Refedは48時間絶食後に16時間再摂食（refed）した後に解剖した群を示す。**は、WTと比較した場合のP値が0.01未満であることを示す。
【図４】実施例3の結果を示す。（A）は血中中性脂肪の測定結果を示す。（B）は血糖値の測定結果を示す。（C）は血中インスリン値の測定結果を示す。WTは野生型マウスを用いた場合を示し、GKOはGPLD1欠損マウスを用いた場合を示し、0wは高脂肪高蔗糖食の負荷前を示し、4wは高脂肪高蔗糖食の負荷4週後を示し、8wは高脂肪高蔗糖食の負荷8週後を示す。*は、WTと比較した場合のP値が0.05未満であることを示し、**は同P値が0.01未満であることを示す。
【図５】実施例4の結果を示す。（A）は通常食時（高脂肪高蔗糖食負荷前）の経口ブドウ糖負荷試験結果を示す。（B）は高脂肪高蔗糖食負荷5週後の同試験結果を示す。（C）は血糖値−時間曲線（（A）及び（B）のグラフ）下面積を示す。WTは野生型マウスを用いた場合を示し、GKOはGPLD1欠損マウスを用いた場合を示し、（A）及び（B）の横軸はブドウ糖負荷からの経過時間を示し、Chowは通常食時を示し、HF/HSは高脂肪高蔗糖食負荷5週後を示す。*は、WTとGKOとを比較した場合のP値が0.05未満であることを示し、**は同P値が0.01未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１３】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００１４】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１５】
本明細書中において、「GPLD1」は「GPI-PLD」と表記することもある。
【００１６】
2．代謝改善剤
本発明は、一実施形態として、GPLD1抑制剤を含有する、糖及び／又は脂質の代謝改善剤（本明細書において、「本発明の代謝改善剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００１７】
2-1．GPLD1抑制剤
「GPLD1抑制剤」は、代謝改善対象の生物内（特に、肝臓細胞内）で発現しているGPLD1を抑制可能なものである限り特に制限されず、GPLD1発現抑制剤（GPLD1 mRNA発現抑制剤、GPLD1タンパク質発現抑制剤などを包含する）、GPLD1タンパク質活性抑制剤のいずれも包含する。
【００１８】
GPLD1抑制剤は、1種単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００１９】
2-1-1．抑制対象
抑制対象であるGPLD1タンパク質及びGPLD1 mRNAは、GPLD1（PLD、GPI-PLD、GPIPLD、PIGPLD、GPIPLDM、PIGPLD1などと称されることもある）遺伝子の発現産物であり、代謝改善対象の生物内で発現しているGPLD1タンパク質又はGPLD1 mRNAである。よって、該対象の生物種に応じて、抑制対象であるGPLD1タンパク質及びGPLD1 mRNAも変わる。該生物種としては、特に制限されず、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類が挙げられる。
【００２０】
種々の生物種由来GPLD1タンパク質のアミノ酸配列及びGPLD1 mRNAの塩基配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトGPLD1タンパク質としては配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001494.2）が挙げられ、マウスGPLD1タンパク質としては配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_032182.2）などが挙げられ、ラットGPLD1タンパク質としては配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001093982.1）が挙げられ、ウシGPLD1タンパク質としては配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_777241.1）などが挙げられ、ヒトGPLD1 mRNAとしては配列番号5に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_001503.3）が挙げられ、マウスGPLD1 mRNAとしては配列番号6に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_008156.2）などが挙げられ、ラットGPLD1 mRNAとしては配列番号7に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_001100512.1）が挙げられ、ウシGPLD1 mRNAとしては配列番号8に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_174816.2）などが挙げられる。また、GPLD1タンパク質は、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。
【００２１】
抑制対象であるGPLD1タンパク質は、その本来の活性、すなわちGPIアンカー型タンパク質のイノシトール リン酸結合を加水分解する活性（イノシトール リン酸結合加水分解活性）を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
【００２２】
抑制対象であるGPLD1 mRNAも、該mRNAから翻訳されるタンパク質が、その本来の活性、すなわちGPIアンカー型タンパク質のイノシトール リン酸結合を加水分解する活性（イノシトール リン酸結合加水分解活性）を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などの塩基変異を有していてもよい。変異としては、該mRNAから翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。
【００２３】
抑制対象であるGPLD1タンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
（a）配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（b）配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
【００２４】
上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
【００２５】
上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1〜4のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質
が挙げられる。
【００２６】
上記（b’）において、複数個とは、例えば2〜40個であり、好ましくは2〜10個であり、より好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
【００２７】
抑制対象であるGPLD1 mRNAの好ましい具体例としては、下記（c）に記載するmRNA及び下記（d）に記載するmRNA：
（c）配列番号5〜8のいずれかに示される塩基配列からなるmRNA、及び
（d）配列番号5〜8のいずれかに示される塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質をコードするmRNA
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
【００２８】
上記（d）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
【００２９】
上記（d）に記載するmRNAの一例としては、例えば
（d’）配列番号5〜8のいずれかに示される塩基配列に対して1若しくは複数個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質をコードするmRNA
が挙げられる。
【００３０】
上記（d’）において、複数個とは、例えば2〜400個であり、好ましくは2〜100個であり、より好ましくは2〜50個であり、よりさらに好ましくは2〜10個である。
【００３１】
2-1-2．発現抑制剤
GPLD1発現抑制剤としては、GPLD1タンパク質、GPLD1 mRNAなどの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えばGPLD1特異的small interfering RNA（siRNA）、GPLD1特異的microRNA（miRNA）、GPLD1特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；  GPLD1特異的リボザイム；  CRISPR/CasシステムによるGPLD1遺伝子編集剤などが挙げられる。
【００３２】
なお、発現抑制とは、GPLD1タンパク質、GPLD1 mRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
【００３３】
2-1-2-1．siRNA、miRNA、アンチセンス核酸、リボザイム
GPLD1特異的siRNAは、GPLD1をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
【００３４】
siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となるGPLD1をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。
【００３５】
GPLD1特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2〜4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
【００３７】
GPLD1特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19−21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19−21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００３８】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
【００３９】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００４０】
GPLD1特異的miRNAは、GPLD1をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百〜数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50〜80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18〜30塩基である。一実施形態において、GPLD1特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このようなGPLD1特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
【００４１】
GPLD1特異的アンチセンス核酸とは、GPLD1をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、GPLD1タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、GPLD1遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、GPLD1遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【００４２】
GPLD1特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてGPLD1タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。GPLD1特異的アンチセンス核酸は、GPLD1をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、GPLD1遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
GPLD1特異的アンチセンス核酸は、GPLD1遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
【００４４】
上記したGPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、及びGPLD1特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
【００４５】
GPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、及びGPLD1特異的アンチセンス核酸などは、GPLD1遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００４６】
GPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、又はGPLD1特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、GPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、又はGPLD1特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及びGPLD1特異的siRNA、GPLD1特異的miRNA、又はGPLD1特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；  マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
【００４７】
GPLD1発現抑制剤の別の例としては、GPLD1特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。GPLD1遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００４８】
2-1-2-2．遺伝子編集剤
CRISPR/CasシステムによるGPLD1遺伝子編集剤は、CRISPR/Casシステムにより、GPLD1遺伝子の発現を抑制可能なものである限り特に制限されない。GPLD1遺伝子の発現抑制は、例えばGPLD1遺伝子の破壊、GPLD1遺伝子のプロモーターの改変による該プロモーターの活性抑制により可能である。
【００４９】
GPLD1遺伝子編集剤としては、典型的には、GPLD1遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA発現カセット、及びCasタンパク質発現カセットを含むベクター（GPLD1遺伝子編集用ベクター）を用いることができるが、これに限定されない。この典型例以外にも、例えばGPLD1遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA及び／又はその発現カセットを含むベクターと、Casタンパク質発現カセット及び／又はその発現カセットを含むベクターとの組み合わせを、GPLD1遺伝子編集剤として用いることが可能である。
【００５０】
ガイドRNA発現カセットは、代謝改善対象の生物内でガイドRNAを発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたガイドRNA全体又は一部のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、換言すれば、ガイドRNAコード配列が、該配列の転写がプロモーターによって制御されるように配置されていることを意味する。具体的な配置の態様としては、例えばプロモーターの3´側直下にガイドRNAコード配列が配置されている態様（例えば、プロモーター3´末端の塩基からガイドRNAコード配列の5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下である態様）が挙げられる。
【００５１】
ガイドRNA発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。
【００５２】
ガイドRNAコード配列は、ガイドRNAをコードする塩基配列である限り特に制限されない。
【００５３】
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位（例えばGPLD1遺伝子、そのプロモーターなど）に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００５４】
本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその5´側に隣接する17〜30塩基長（好ましくは18〜25塩基長、より好ましくは19〜22塩基長、特に好ましくは20塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムDNA上の部位である。
【００５５】
PAM配列は、利用するCasタンパク質の種類によって異なる。例えば、S. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）に対応するPAM配列は5´-CCNであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）に対応するPAM配列は5´-TCNであり、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）に対応するPAM配列は5´-TTCであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）に対応するPAM配列は5´-AWGであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NNAGAAであり、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. aureus由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NGRRT又は5´-NGRRNであり、N. meningitidis由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NNNNGATTであり、T. denticola由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NAAAACである。
【００５６】
ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列（crRNA（CRISPR RNA）配列といわれることもある）を有しており、このcrRNA配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。
【００５７】
なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００５８】
具体的には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列は、標的鎖と例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。なお、ガイドRNAの標的部位への結合には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基が重要であるといわれている。このため、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列が、標的鎖と完全同一ではない場合、標的鎖と異なる塩基は、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基以外に存在することが好ましい。
【００５９】
ガイドRNAは、Casタンパク質との結合に関与する配列（tracrRNA（trans-activating crRNA）配列といわれることもある）を有しており、このtracrRNA配列が、Casタンパク質に結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。
【００６０】
tracrRNA配列は、特に制限されない。tracrRNA配列は、典型的には、複数（通常、3つ）のステムループを形成可能な50〜100塩基長程度の配列からなるRNAであり、利用するCasタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。tracrRNA配列としては、利用するCasタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。
【００６１】
ガイドRNAは、通常、上記したcrRNA配列とtracr RNA配列を含む。ガイドRNAの態様は、crRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNA（sgRNA）であってもよいし、crRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体であってもよい。
【００６２】
Casタンパク質発現カセットは、代謝改善対象の生物内でCasタンパク質を発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたCasタンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、ガイドRNA発現カセットにおける定義と同様である。
【００６３】
Casタンパク質発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどが挙げられる。
【００６４】
Casタンパク質コード配列は、Casタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。
【００６５】
Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断できるものを各種使用することができる。Casタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばS. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. aureus由来のCas9タンパク質、N. meningitidis由来のCas9タンパク質、T. denticola由来のCas9タンパク質、F. novicida由来のCpf1タンパク質（V型）などが挙げられる。これらの中でも、好ましくはCas9タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス属に属する細菌が内在的に有するCas9タンパク質が挙げられる。各種Casタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBIなどの各種データベース上で容易に得ることができる。
【００６６】
Casタンパク質は、野生型の2本鎖切断型Casタンパク質であってもよいし、ニッカーゼ型Casタンパク質であってもよい。また、Casタンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよいし、公知のタンパク質タグ、シグナル配列、酵素タンパク質などのタンパク質が付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグなどが挙げられる。シグナル配列としては、例えば細胞質移行シグナルなどが挙げられる。
【００６７】
GPLD1遺伝子編集用ベクターは、他の配列を有していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００６８】
薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００６９】
ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミドなどのプラスミドベクター；  レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター；  アグロバクテリウムベクターなどが挙げられる。
【００７０】
GPLD1遺伝子編集剤は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術などを利用して作製することができる。
【００７１】
2-1-3．活性抑制剤
GPLD1活性抑制剤は、GPLD1タンパク質の本来の活性、すなわちGPIアンカー型タンパク質のイノシトール リン酸結合を加水分解する活性（イノシトール リン酸結合加水分解活性）を低下させることができる限りにおいて特に制限されず、例えば亜鉛キレート剤、GPLD1ドミナントネガティブ変異体及び発現ベクターなどが挙げられる。
【００７２】
なお、活性抑制とは、GPLD1タンパク質の活性を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
【００７３】
ここで、GPLD1タンパク質の活性は、公知の方法に従って又は準じて測定することができる。例えば、学術論文：Mol Genet Metab. 2002 ;75:154-61.に記載の方法に従って測定することができる。
【００７４】
GPLD1のイノシトールリン酸結合加水分解活性には亜鉛の存在が重要であることが知られている（Cancer Letters 234, 2006, 158-167.）。このため、亜鉛キレート剤により、GPLD1の活性を抑制することが可能である。亜鉛キレート剤としては、特に制限されず、例えば1,10-フェナントロリンなどが挙げられる。
【００７５】
GPLD1ドミナントネガティブ変異体は、特に制限されない。該変異体となる変異としては、例えばGPLD1タンパク質の亜鉛結合残基であるヒスチジン（例えば配列番号1〜4のN末端から29番目のアミノ酸であるヒスチジン、125番目のアミノ酸であるヒスチジン、133番目のアミノ酸であるヒスチジン、及び158番塩のアミノ酸であるヒスチジン）のいずれかをアスパラギンに置換した変異体が挙げられる（Biochem J. 2005;391:285-9.）。GPLD1ドミナントネガティブ変異体は、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。
【００７６】
GPLD1ドミナントネガティブ変異体は、上記以外にも、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などの変異（好ましくは保存的置換）を有していてもよい。
【００７７】
GPLD1ドミナントネガティブ変異体の好ましい具体例としては、下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質：
（e）配列番号1〜4のいずれかにおいて、N末端から29番目のアミノ酸であるヒスチジン、125番目のアミノ酸であるヒスチジン、133番目のアミノ酸であるヒスチジン、及び158番塩のアミノ酸であるヒスチジンからなる群より選択される少なくとも1種がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（f）上記（e）のタンパク質と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
【００７８】
上記（f）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。
【００７９】
上記（f）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（f’）上記（e）のタンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００８０】
上記（f’）において、複数個とは、例えば2〜40個であり、好ましくは2〜10個であり、より好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
【００８１】
GPLD1ドミナントネガティブ変異体の発現ベクターの態様については、上記Casタンパク質発現カセット、GPLD1遺伝子編集用ベクターなどと同様である。
【００８２】
2-2．用途、その他の成分
GPLD1抑制剤は、糖及び／又は脂質の代謝改善剤作用を有することから、糖及び／又は脂質の代謝改善剤（例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）など）の有効成分としての利用が可能である。GPLD1抑制剤は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
【００８３】
なお、糖の代謝改善とは、例えば血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上などに繋がる糖代謝の変化（改善）を意味する。また、脂質の代謝改善とは、例えば血中中性脂肪値抑制に繋がる脂質代謝の変化（改善）、一例として脂質合成関連遺伝子（例えばterol regulatory element-binding protein 1c（SREBP-1c）、fatty acid synthase（FAS）など）などの発現抑制（特に肝臓における発現抑制）を意味する。これらの観点から、本発明の代謝改善剤は、血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、血中中性脂肪値抑制などの用途に用いることが可能である。
【００８４】
本発明の代謝改善剤は、特に、一定時間絶食後に摂食するような場合（この場合、通常は脂質合成関連遺伝子の発現が上昇する）や、比較的高カロリー食（例えば、高脂肪、高蔗糖食）を日常的に接触する場合（この場合、通常食を日常的に摂食する場合に比べて、摂食直後のみならず、摂食から一定時間経過後における血糖値、血中中性脂肪値、などがより高まり、インスリン抵抗性がより低下する。）において、より効率的に、血糖値抑制、インスリン抵抗性向上、耐糖能向上、血中中性脂肪値抑制、脂質合成関連遺伝子の発現抑制が可能である。
【００８５】
本発明の代謝改善剤は、糖代謝や脂質代謝に関連する種々の疾患又は状態の予防又は改善に用いることができる。該疾患又は状態として、具体的には、例えば糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、脂肪肝（例えば非アルコール性脂肪性肝炎など）、肝臓がんなどが挙げられる。
【００８６】
本発明の代謝改善剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
【００８７】
本発明の代謝改善剤の形態は、特に限定されず、本発明の代謝改善剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【００８８】
形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
【００８９】
形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
【００９０】
形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
【００９１】
本発明の代謝改善剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【００９２】
本発明の代謝改善剤のGPLD1抑制剤の含有量は、GPLD1抑制剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【００９３】
本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００９４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９５】
特に制約されない限り、SDS電気泳動とウェスタンブロッティングについては次のように行った。マウス血漿試料を生理食塩水にて100倍に希釈溶解した。このサンプルに6%SDSを含むSDS-sample bufferを1/2容混合し、98℃で5分間加熱変性した。加熱変性後のサンプルを4〜20%TGX SDS-pageゲル（BioRad）にて泳動分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ウェスタンブロッティングを行った。
【００９６】
特に制約されない限り、リアルタイムPCRについては、次のように行った。マウス肝臓組織よりRNA STAT-60 (Tel-Test Inc.)を用いてRNAを抽出し、RNAをND-1000 Spectrophotometer (Nano DropTechnologies)を用いて定量した。約2000ngのRNAから、Thermoscript RT (Invitrogen Corp.) 及びoligo(dT) primerを用いてcDNAを合成した。定量的PCRはPower SYBR green PCR master mix (Life Technologies) を用いて、ViiATM 7 real-time PCR system により評価した。mRNA発現レベルはハウスキーピング遺伝子である、18sにより標準化した。PCRに使用したプライマーの名称、塩基配列、及び配列番号を表１に示す。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
参考例1：GPLD1欠損マウスの作製
NIH Knockout Mouse Project (KOMP) RepositoryよりGPLD1欠損マウスの凍結精子を購入し、体外受精により固体復元を行った。GPLD1欠損マウスの設計の詳細を図１に示す。
【００９９】
実施例1：ヒト臨床検体における血中GPLD1濃度の測定
＜方法＞
大阪大学内分泌代謝内科外来に通院中の男性患者88名の保存血清を用いて血中GPLD1タンパク質濃度を測定した。GPLD1タンパク質濃度の測定には、GPLD1酵素結合免疫吸着測定キット（SEH975Hu, Cloud-Clone Corp.Wuhan）を使用した。血中GPLD1タンパク質濃度の測定値と各検体のボディマス指数（BMI）及び血中中性脂肪値に基づいて散布図を作成し、回帰直線を示した。
【０１００】
＜結果＞
結果を図２に示す。血中GPLD1タンパク質濃度は肥満度（BMI）及び血中中性脂肪値と、有意な正の相関を示した。
【０１０１】
実施例2：GPLD1欠損マウスにおける、再摂食による脂質合成関連遺伝子の発現上昇の抑制
＜方法＞
野生型（WT）マウスおよびGPLD1欠損（GKO）マウスそれぞれについて、自由摂食（fed）時、48時間絶食（fast）した後、及び48時間絶食後に16時間再摂食（refed）した後に、解剖した。血中GPLD1濃度をウェスタンブロッティングにより、肝臓での各種遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより評価した。
【０１０２】
＜結果＞
結果を図３に示す。WTマウスにおいては、摂食時と比較して再摂食時で血中GPLD1濃度の上昇が認められ、肝臓でのGPLD1遺伝子発現も同様に上昇していた。再摂食時には脂質合成関連遺伝子であるsterol regulatory element-binding protein 1c（SREBP-1c）及びfatty acid synthase（FAS）の肝臓での遺伝子発現の上昇がみられたが、GKOマウスではWTマウスと比較して有意に上昇が抑制されていた。
【０１０３】
実施例3：GPLD1欠損マウスにおける、高脂肪高蔗糖食負荷による血糖値および血中中性脂肪値の上昇抑制
＜方法＞
野生型（WT）マウス及びGPLD1欠損（GKO）マウスに高脂肪高蔗糖食（F2HFHSD; Oriental Yeast）を負荷した。負荷前、負荷4週後及び負荷8週後において、4時間絶食下で尾静脈より採血して、血糖値、血中中性脂肪（TG）値、及び血中インスリン値を測定した。これらの測定に使用したキットは次のとおりである：血糖値測定キット（グルテストNEOセンサー、三和化学研究所社製）、血中TG値測定キット（トリグリセライドEテストワコー、和光純薬工業社製）、血中インスリン値測定キット（超高感度マウスインスリン測定キット、森永生科学研究所社製）。
【０１０４】
＜結果＞
結果を図４に示す。WTマウスでは高脂肪高蔗糖食負荷に伴い、血糖値と血中TG値の上昇が認められた。一方、GKOマウスではこれらの上昇は有意に抑制されていた。また、血中インスリン値には両群で差はみられなかった。
【０１０５】
実施例4：GPLD1欠損マウスにおける耐糖能の改善
＜方法＞
野生型（WT）マウスおよびGPLD1欠損（GKO）マウスに高脂肪高蔗糖食負荷前と負荷5週後において、経口ブドウ糖負荷（2g/kg・bodyweight）試験を行った。ブドウ糖負荷前、負荷後30分、60分、60分、90分において、尾静脈より採血し、血糖値を測定した。
【０１０６】
＜結果＞
結果を図５に示す。GKOマウスではWTマウスと比較して、通常食下と高脂肪蔗糖負荷後のいずれにおいても、経口ブドウ負荷後の血糖上昇が有意に抑制された。また、GKOマウスにおける血糖上昇の抑制は、高脂肪蔗糖負荷後においてより顕著であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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