(57)【要約】【課題】高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供すること。【解決手段】化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃにより表されるコカインアプタマー。ここで、Ｒは、Ｒ１−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−を表す。Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択される。ｎ１は、自然数を表す。ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなる。Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーである。Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーである。Ｌ２は、なし、または、任意のリンカーである。ｎ２は、自然数を表す。Ｆｃはフェロセン基を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーであって、
Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ      （ＣＩ）
ここで、
Ｒは、Ｒ１−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−であり、
Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ｎ１は、自然数を表し、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーであり、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、
Ｌ２は、なし、または、任意のリンカーであり、
ｎ２は、自然数を表し、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す、
コカインアプタマー。
【請求項２】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
コカインアプタマー。
【請求項３】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
Ｒ１は、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−であり、
ここで、
ｎ３は自然数である、
コカインアプタマー。
【請求項４】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
Ｌ１はなし、かつ
Ｌ２はアミド結合である、
コカインアプタマー。
【請求項５】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
Ｌ１は、以下の化学式（ＣＩＩ）を表し、
−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−        （ＣＩＩ）
ここで、
ｎ４は自然数を表す、
コカインアプタマー。
【請求項６】
請求項１に記載のコカインアプタマーであって、
Ｌ２はアミド結合である、
コカインアプタマー。
【請求項７】
試料溶液に含有されるコカインを検出する方法であって、
（ａ）  請求項１に記載のコカインアプタマーを前記試料溶液と混合して混合液を調製する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において調製された混合液に、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加する工程、および
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記混合液を電気化学的に測定することによって、コカインを検出する工程、
を具備する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれる前記フェロセン基Ｆｃの濃度が測定される、
方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法であって、
Ｒ１は、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−を表し、
ここで、
ｎ３は自然数である、
方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法であって、
Ｌ１はなし、かつ
Ｌ２はアミド結合である、
方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の方法であって、
Ｌ１は、以下の化学式（ＣＩＩ）を表し、
−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−        （ＣＩＩ）
ここで、
ｎ４は自然数を表す、
方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
Ｌ２はアミド結合である、
方法。
【請求項１５】
試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  請求項１に記載のコカインアプタマーおよび前記試料溶液を混合して混合液を調製する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において調製された混合液に、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、サイクリックボルタンメトリー法により所定の酸化電位に対する前記フェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１を測定する工程、および
（ｄ）  以下の数式（Ｍ１）が充足された場合には、前記試料溶液がコカインを含有すると判定する工程、
ＲＣ１／ＲＣ２  ＞  １．０      （Ｍ１）
を具備し、
ここで、
ＲＣ２は、コカインを含有しない試料溶液の前記所定の酸化電位に対する予め測定された前記フェロセン基Ｆｃの還元電流を表す、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記遺伝子配列が、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される、
方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｒ１は、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−を表し、
ここで、
ｎ３は自然数である、
方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｌ１はなし、かつ
Ｌ２はアミド結合である、
方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｌ１は、以下の化学式（ＣＩＩ）を表し、
−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−        （ＣＩＩ）
ここで、
ｎ４は自然数を表す、
方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法であって、
Ｌ２はアミド結合である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コカインアプタマーおよびそれを用いてコカインを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１は、５’−ＨＳ−（ＣＨ2）11−ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ−（ＣＨ2）7−ＭＢ−３’（配列番号：０１、ＭＢはメチレンブルーを表す）により表されるコカインアプタマーを開示している。図１１は、非特許文献１に含まれる図３の写しである。図１１に示されるように、０μＭの濃度を有するコカイン水溶液（すなわち、コカインを含有しない水溶液）に対するＭＢの還元電流は約３８０ナノアンペアである。２５０μＭの濃度を有するコカイン水溶液に対するＭＢの還元電流は約４００ナノアンペアである。従って、非特許文献１において開示されたコカインアプタマーのＳ／Ｎ比は、およそ１．０５（＝４００／３８０）である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】James S. Swensen et al, "Continuous, Real-Time Monitoring of cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor" Journal of American Chemical Society, 2009, 131, 4262-4266
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の化学式（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーである。
Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ      （ＣＩ）
ここで、
Ｒは、Ｒ１−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−を表し、
Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ｎ１は、自然数を表し、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーであり、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、
Ｌ２は、なし、または、任意のリンカーであり、
ｎ２は、自然数を表し、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、高感度にコカインを検出可能なコカインアプタマーを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態によるコカインアプタマーの第１合成スキームを示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに続き、実施形態によるコカインアプタマーの合成スキームを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、実施形態によるコカインアプタマーの第２合成スキームを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａに続き、実施形態によるコカインアプタマーの第２合成スキームを示す図である。
【図３】図３は、実施例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図４】図４は、実施例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図５】図５は、実施例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図６】図６は、実施例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７】図７は、比較例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図８】図８は、比較例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、比較例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａに含まれる破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、比較例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。
【図１１】図１１は、非特許文献１に含まれる図３の写しである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態が説明される。
【０００９】
（コカインアプタマー）
本実施形態によるコカインアプタマーは、以下の化学式（ＣＩ）により表される。
Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−Ｆｃ      （ＣＩ）
ここで、
Ｒは、Ｒ１−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−を表し、
Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
ｎ１は、自然数を表し、
ＤＮＡは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーであり、
Ｌ１は、なし、または、任意のリンカーであり、
Ｌ２は、なし、または、任意のリンカーであり、
ｎ２は、自然数を表し、かつ
Ｆｃはフェロセン基を表す。
【００１０】
非特許文献１にも開示されているように、コカインに結合可能な遺伝子配列の例は、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）である。
【００１１】
Ｒ１は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択される限り、Ｒは限定されない。なぜなら、後述されるように、Ｒ１はコカインの検出には影響を与えないからである。Ｒ１の例は、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−である（ここで、ｎ３は、自然数を表す）。
【００１２】
本実施形態によるコカインアプタマーは、後述される実施例および比較例から明らかなように、（Ｉ）Ｒに含まれるＰＯ4基および（ＩＩ）フェロセン基Ｆｃにより特徴づけられる。これらの２つの特徴（Ｉ）および（Ｉ））により、本実施形態によるコカインアプタマーは、高いコカイン検出感度を有する。
【００１３】
Ｌは、−Ｌ１−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーである限り、Ｌは限定されない。Ｌ１およびＬ２もまた、それぞれ独立して、なし、または任意のリンカーである限り、限定されない。なぜなら、後述されるように、Ｌ１およびＬ２はコカインの検出には影響を与えないからである。望ましくは、Ｌ１はなし、かつＬ２はアミド結合を表す。あるいは、望ましくは、Ｌ１は、以下の化学式（ＣＩＩ）により表される。
−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−        （ＣＩＩ）
ここで、ｎ４は自然数を表す。
この場合でも、Ｌ２はアミド結合であることが望ましい。
【００１４】
望ましくは、ｎ１、ｎ２、ｎ３、およびｎ４は、それぞれ独立して１以上２０以下の自然数である。より望ましくは、ｎ１は、９以上１５以下の自然数である。より望ましくは、ｎ２は、３以上９以下の自然数である。より望ましくは、ｎ３は、３以上９以下の自然数である。より望ましくは、ｎ４は、９以上１５以下の自然数である。
【００１５】
（コカインアプタマーの製法）
次に、本実施形態によるコカインアプタマーの製法が説明される。図１Ａおよび図１Ｂは、本実施形態によるコカインアプタマーの第１の合成スキームを示す。第１の合成スキームでは、Ｌ１はなしであり、かつＬ２はアミド結合であるコカインアプタマーが得られる。
【００１６】
まず、ＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧ（配列番号：０１）により表される遺伝子配列が、一般的な人工遺伝子合成法により合成される。上述したように、配列番号：０１により表される遺伝子配列は、非特許文献１に開示されている。
【００１７】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n1−ＯＨにより表されるジヒドロキシアルカン（図１では、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）12−ＯＨにより表される１，１２−ジヒドロキシドデカン、すなわち、ｎ１＝１２）が遺伝子配列に混合される。このようにして、脱水縮合により、遺伝子配列の５’末端にヒドロキシアルキル基が連結される。以下、ヒドロキシアルキル基が連結された５’末端を有する遺伝子配列は「遺伝子配列（Ａ）」と呼ばれる。
【００１８】
これとは別に、リン酸が、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＯＨにより表されるビス（ヒドロキシアルキル）ジスルフィド（ｎ５は自然数を表す。図１Ａでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）6−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）6−ＯＨにより表されるビス（６−ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド、すなわち、ｎ５＝ｎ３＝６）と混合され、脱水縮合により一方のヒドロキシル基がリン酸基に置換される。このようにして、図１Ａでは、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4Ｈ2により表される化合物が得られる。以下、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4Ｈ2により表される化合物は、「化合物（Ｂ）」と呼ばれる。
【００１９】
遺伝子配列（Ａ）は、化合物（Ｂ）と混合される。このようにして、遺伝子配列の５’末端を伸ばすように、脱水縮合により、Ｒ１’−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡが得られる。Ｒ１’は、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−を表す。上述の通り、図１Ａでは、ｎ１＝１２、ｎ３＝６、かつｎ５＝６である。
【００２０】
化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルカノール（図１Ａでは、ＨＯ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2、すなわち、ｎ２＝６）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端を伸ばすように、脱水縮合によりＲ１’−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−ＤＮＡ−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2が得られる。
【００２１】
フェロセン基Ｆｃ誘導体（図１Ａでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。
【００２２】
図１Ｂに示されるように、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。図１Ｂでは、Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−を表す。Ｌは、−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯ−を表す。還元剤の例は、Tris-(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (以下、「TCEP」という)である。
【００２３】
図１Ｂでは、
Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−を表し、かつ
Ｌは、−（ＣＨ2）n2−Ｌ２−により表されるリンカーである。
ここで、ｎ１は１２に等しく、ｎ２は６に等しく、ｎ３は６に等しく、かつＬ２はＮＨＣＯにより表されるアミド結合である。
【００２４】
図２Ａおよび図２Ｂは、本実施形態によるコカインアプタマーの第２の合成スキームを示す。第２の合成スキームでは、Ｌ１は化学式（ＣＩＩ）を表し、かつＬ２はアミド結合であるコカインアプタマーが得られる。
【００２５】
図１Ａの場合と同様に、遺伝子配列（Ａ）は、化合物（Ｂ）と混合される。このようにして、遺伝子配列の５’末端を伸ばすように、脱水縮合により、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡが得られる。図２Ａでは、ｎ１＝１２、ｎ３＝６、かつｎ５＝６である。
【００２６】
次に、化学式ＨＯ−（ＣＨ2）n4−ＯＨにより表されるジヒドロキシアルカン（図２Ａでは、ＨＯ-（ＣＨ2）12-ＯＨ。すなわち、ｎ４＝１２）が添加される。ジヒドロキシアルカンは、脱水縮合により遺伝子配列の３’末端に連結され、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡ-（ＣＨ2）n4-ＯＨが得られる。
【００２７】
次に、化学式Ｈ2ＰＯ4-（ＣＨ2）n2−ＮＨ2により表されるアミノアルキルリン酸誘導体（図２Ａでは、Ｈ2ＰＯ4-（ＣＨ2）6−ＮＨ2。すなわち、ｎ２＝６）が添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミノアルキルリン酸誘導体の脱水縮合を介してＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4−（ＣＨ2）n1−ＤＮＡ−（ＣＨ2）n4−ＰＯ4−（ＣＨ2）n2−ＮＨ2が得られる。
【００２８】
図２Ｂに示されるように、フェロセン基Ｆｃ誘導体（図２Ｂでは、フェロセン基Ｆｃ−ＣＯＯ−スクシンイミド）がさらに添加される。このようにして、遺伝子配列の３’末端をさらに伸ばすように、アミド結合によりフェロセン基Ｆｃが連結される。このようにして、ＨＯ−（ＣＨ2）n5−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）n3−ＰＯ4―（ＣＨ2）n1―ＤＮＡ-（ＣＨ2）n4-ＰＯ4-（ＣＨ2）n2-ＮＨＣＯ-Ｆｃが得られる。
【００２９】
最後に、還元剤を用いてジスルフィド基が切断される。このようにして、化学式Ｒ−ＤＮＡ−Ｌ−フェロセン基Ｆｃ（ＣＩ）により表されるコカインアプタマーが得られる。図２Ｂでは、Ｒは、ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−を表す。Ｌは、−（ＣＨ2）12−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯ−を表す。還元剤の例は、Tris-(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (以下、「TCEP」という)である。
【００３０】
本実施形態によるこれらのコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成され得る。
【００３１】
（コカインアプタマーの使用方法）
以下、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液に含有されるコカインを検出する方法が説明される。すなわち、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法が説明される。
【００３２】
（工程（ａ））
まず、本実施形態によるコカインアプタマーが、試料溶液と混合される。このようにして、混合液が調製される。試料溶液は、水溶液であることが望ましい。本実施形態によるコカインアプタマーは、１本鎖であることが望ましい。そのため、本実施形態によるコカインアプタマーが試料溶液と混合される前に、本実施形態によるコカインアプタマーは熱処理に供されることが望ましい。熱処理の一例として、本実施形態によるコカインアプタマーは、摂氏８０度で５分間加熱され、次いで３０分間で摂氏２５度に冷却される。このようにして、１本鎖のコカインアプタマーが得られる。
【００３３】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが、工程（ａ）において調製された混合液に添加される。制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩは、２本鎖デオキシリボ核酸に特異的な３′→５′エキソヌクレアーゼであり、二本鎖デオキシリボ核酸の３′−ＯＨ
末端から５′−モノヌクレオチドを遊離させる。試料溶液がコカインを含有する場合、コ
カインアプタマーは２本鎖を形成するようにコカインに結合する。従って、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの働きにより、コカインに結合したＤＮＡは分解される。ＤＮＡの分解により、フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する。ＤＮＡの分解により、Ｒ１も混合液中で遊離するが、フェロセン基Ｆｃに影響を与えない。従って、Ｒ１は限定されない。同様に、フェロセン基Ｆｃに影響を与えない限り、Ｌも限定されない。
【００３４】
一方、試料溶液がコカインを含有しない場合、コカインアプタマーはほとんど２本鎖を形成しない。従って、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが添加された後であっても、本実施形態によるコカインアプタマーは変化せず、かつフェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部は遊離しない。
【００３５】
工程（ｂ）の最後には、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させることが望ましい。具体的には、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）が混合液に添加される。
【００３６】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いたサイクリックボルタンメトリー法により測定される。フェロセン基Ｆｃは還元体であるため、本実施形態によるサイクリックボルタンメトリーにおいては、酸化電位が連続的に変化されながら、フェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１が測定される。具体的には、酸化電位は、まず、０ボルトから０．６ボルトに増加される。次いで、酸化電位は０．６ボルトから０ボルトに低下される。この期間の還元電位は、０ボルトに設定される。言い換えれば、この期間では、酸化電位の変化に拘わらず、還元電位は０ボルトに設定される。
【００３７】
所定の酸化電位（例えば、０．５ボルト）に対して測定されたフェロセン基Ｆｃの還元電流ＲＣ１に基づいて、コカインが検出される。以下、試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法がより詳細に説明される。
【００３８】
（工程（ｄ））
以下の数式（Ｍ１）が充足された場合には、試料溶液がコカインを含有すると判定される。
ＲＣ１／ＲＣ２  ＞  １．０      （Ｍ１）
ここで、
ＲＣ２は、コカインを含有しない試料溶液の所定の酸化電位（例えば、０．５ボルト）に対する予め測定されたフェロセン基Ｆｃの還元電流を表す。
【００３９】
ＲＣ２の値は、以下のように測定される。コカインを含有しない混合液に含有されるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いたサイクリックボルタンメトリー法により、バックグラウンドノイズの値として測定される。ＲＣ２の値は、本実施形態による方法が実施される前に予め測定される。
【００４０】
言うまでもないが、工程（ｂ）においてコカインアプタマーに含まれるフェロセン基Ｆｃが混合液中で遊離しない場合（すなわち、試料溶液がコカインを含有しない場合）、等式ＲＣ１＝ＲＣ２（すなわち、ＲＣ１／ＲＣ２＝１）が成立する。言い換えれば、遺伝子配列（代表的には、配列番号：０１により表される）が分解されていないコカインアプタマーに含まれるフェロセン基Ｆｃは、還元電流ＲＣ１の値の増加には寄与しない。
【００４１】
後述される実施例および比較例から明らかなように、ＭＢ（ＭＢはメチレンブルーを表す）が用いられた場合よりもフェロセン基Ｆｃが用いられた場合の方が、より高い感度でコカインが検出される。さらに、ＲがＰＯ4基を含むので、より高い感度でコカインが検出される。
【００４２】
（実施例）
以下、実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。以下の実施例においては、ＤＮＡは、配列番号：０１により表される遺伝子配列からなる。
【００４３】
（実施例１）
実施例１は、実施例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）および実施例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）から構成される。
【００４４】
株式会社  日本遺伝子研究所により、以下の化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーが合成された。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−ＤＮＡ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｃ）
【００４５】
まず、混合溶媒が調製された。混合溶媒は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、および５ｍＭのＭｇＣｌ2を含有していた。
【００４６】
（実施例１Ａ）
コカインが混合溶媒に添加され、混合液を得た。コカインの濃度は、２５０μＭであった。次いで、上記のコカインアプタマー（濃度：１０μＭ）が、混合液に添加された。
【００４７】
次いで、混合液は、熱処理に供された。具体的には、コカインアプタマーを含有する水溶液は、摂氏８０度で５分間、加熱された。次いで、水溶液は、３０分間かけて摂氏２５度に冷却された。熱処理により、混合液中でコカインアプタマーは、１本鎖のコカインアプタマーとして遊離し、次いでコカインと２本鎖を形成するようにコカインに結合した。
【００４８】
混合液に、２ユニット／１００μＬの濃度を有する制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩが添加された。混合液は、１０秒間、撹拌された。制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの作用により、２本鎖を形成するようにコカインに結合していたコカインアプタマーは分解された。その結果、フェロセン基Ｆｃを含むコカインアプタマーの一部が遊離した。
【００４９】
次いで、５０ｍＭの濃度を有するＥＤＴＡが混合液に添加され、制限酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させた。
【００５０】
遊離したコカインアプタマーの一部に含まれるフェロセン基Ｆｃの還元電流が、ポテンシオスタットを用いてサイクリックボルタンメトリー法により測定された。板状の測定電極（ビー・エー・エス株式会社より入手、商品名：くし型電極Ａｕ）がポテンシオスタットに接続された。板状の測定電極は、互いに係合した２つのくし形電極を表面に有していた。各くし型電極は、１本の長い電極および多数の針電極から構成されていた。各針電極は、１本の長い電極と直交するように１本の長い電極から伸び出ていた。一方のくし形電極が酸化電極として用いられる一方、他方のくし形電極が還元電極として用いられた。２つのくし形電極に含まれる針電極の総数は１３０本（＝６５×２本）であった。１本の針電極の幅は２マイクロメートルであった。隣接する２本の針電極の間の距離もまた、２マイクロメートルであった。Ａｇ／ＡｇＣｌの参照電極がポテンシオスタットに接続された。
【００５１】
サイクリックボルタンメトリー法においては、酸化電位が、１０ｍＶ／秒の速度で、０ボルトから０．６ボルトに増加された。次いで、同じ速度で、酸化電位が０．６ボルトから０ボルトに低下された。このように酸化電位を変化させることにより、混合液はサイクリックボルタンメトリー法により掃引された。還元電位は、０ボルトに固定された。
【００５２】
図３は、実施例１Ａによるサイクリックボルタモグラムを示す。図３に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．４７ナノアンペアであった。
【００５３】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ｂにおいては、コカインが混合溶媒に添加されなかったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。言い換えれば、実施例１Ｂにおいては、コカインの濃度は０μＭであった。図４は、実施例１Ｂによるサイクリックボルタモグラムを示す。図４に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ４．８２ナノアンペアであった。従って、実施例１において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．９６であった。
【００５４】
（実施例２）
実施例２においては、化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｄ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＰＯ4−（ＣＨ2）12−ＤＮＡ−（ＣＨ2）12−ＰＯ4−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｄ）
化学式（ＣＩｄ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００５５】
図５は、実施例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図５に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ９．２３ナノアンペアであった。
【００５６】
図６は、実施例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図６に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ６．９９ナノアンペアであった。
【００５７】
従って、実施例２において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．３２であった。
【００５８】
（比較例１）
比較例１においては、化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式（ＣＩｅ）により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）6−ＤＮＡ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ−フェロセン基Ｆｃ−３’    （ＣＩｅ）
化学式（ＣＩｅ）により表されるコカインアプタマーは、株式会社  日本遺伝子研究所により合成された。
【００５９】
図７は、比較例１Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図７に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ１は、およそ１０．０８ナノアンペアであった。
【００６０】
図８は、比較例１Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図８に示されるように、０．５ボルトの酸化電位に対する還元電流ＲＣ２は、およそ８．６７ナノアンペアであった。
【００６１】
従って、比較例１において、０．５ボルトの酸化電位に対するＲＣ１／ＲＣ２の値は、１．２４であった。
【００６２】
（比較例２）
比較例２においては、以下の事項（Ｉ）〜（ＩＩ）を除き、実施例１と同様の実験が行われた。
（Ｉ）  化学式（ＣＩｃ）により表されるコカインアプタマーに代えて、以下の化学式（ＣＩｆ）により表されるコカインアプタマーが用いられた。化学式（ＣＩｆ）により表されるコカインアプタマーは、非特許文献１に開示されたコカインアプタマーと同一であり、かつ非特許文献１の開示内容に従って合成された。
５’−ＨＳ−（ＣＨ2）11−ＤＮＡ−（ＣＨ2）7−ＮＨ−ＣＯ−ＭＢ−３’    （ＣＩｆ）
ここで、ＭＢはメチレンブルーを表す。
（ＩＩ）  メチレンブルーは、酸化体であるので、サイクリックボルタンメトリー法においては、還元電流に代えて酸化電流が測定された。
【００６３】
図９Ａは、比較例２Ａ（コカインの濃度：２５０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図９Ｂは、図９Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。図９Ｂに示されるように、−０．５ボルトの還元電位に対する酸化電流は、およそ４．６２ナノアンペアであった。
【００６４】
図１０Ａは、比較例２Ｂ（コカインの濃度：０μＭ）によるサイクリックボルタモグラムを示す。図１０Ｂは、図１０Ａの破線Ａで囲まれた部分の拡大図である。図１０Ｂに示されるように、−０．５ボルトの還元電位に対する酸化電流は、およそ４．２０ナノアンペアであった。
【００６５】
従って、比較例２において、−０．５ボルトの還元電位に対して測定された２つの酸化電流の比は、おおよそ１．１０（＝４．６２／４．２０）であった。
【００６６】
実施例１および実施例２を比較例１と比較すれば明らかなように、ＰＯ4基を含むＲが、コカインの検出感度を向上させる。
【００６７】
実施例１および実施例２を比較例２と比較すれば明らかなように、フェロセン基Ｆｃが、コカインの検出感度を向上させる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、コカインの検出に用いられ得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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