(57)【要約】      （修正有）【課題】ファージディスプレイによってファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化するための方法の提供。【解決手段】標的ペプチドを含むファージと標的ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させて、ペプチド誘導体を形成する工程と、検出マーカーを含む捕捉剤とペプチド誘導体とを反応させることによって、ペプチド誘導体内に検出マーカーを組み込む工程と、検出マーカーの量を測定することによって、ファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化する工程と、ペプチド誘導体を第２の試薬と反応させることで検出マーカーを除去する工程と、第２の反応の後に検出マーカーの量を測定することによって、ペプチド誘導体を定量化する工程とを含み、この検出マーカーは、少量である１〜１００コピーのペプチド誘導体の検出に適する検出マーカーである方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージディスプレイによってファージに提示されるペプチド誘導体を定量化するための方法であって、
標的ペプチドが提示されているファージを提供する工程と、
前記標的ペプチドを含むファージと前記ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させ、ペプチド誘導体を形成する工程と、
検出マーカーを含む捕捉剤と前記ペプチド誘導体とを反応させることによって、前記ペプチド誘導体内に前記検出マーカーを組み込む工程と、
前記検出マーカーの量を測定することによって、前記ファージに提示される前記ペプチド誘導体の量を定量化する工程と、
前記ペプチド誘導体を第２の反応で第２の試薬と反応させることで前記検出マーカーを除去する工程と、
前記第２の反応の後に前記検出マーカーの量を測定することによって、前記第２の反応後の前記ペプチド誘導体の量を定量化する工程と、を含み、
前記検出マーカーは、少量である１〜１００コピーの前記ペプチド誘導体の検出に適する検出マーカーである方法。
【請求項２】
ファージディスプレイによってファージに提示され、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含むペプチド誘導体を定量化するための方法であって、
標的ペプチドを含むファージを提供する工程と、
前記標的ペプチドを含むファージと前記標的ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させることによって、前記標的ペプチドを酸化し、アルデヒド基を含むペプチド誘導体を形成する工程と、
前記ペプチド誘導体上のアルデヒド基と検出マーカーを含む捕捉剤とを反応させることによって、前記ペプチド誘導体内に前記検出マーカーを組み込む工程と、
前記検出マーカーの量を測定することによって、前記ファージに提示される前記ペプチド誘導体の量を定量化する工程と、
前記ペプチド誘導体を第２の反応で第２の試薬と反応させることで前記検出マーカーを除去する工程と、
前記第２の反応の後に前記検出マーカーの量を測定することによって、前記第２の反応後の前記ペプチド誘導体の量を定量化する工程と、を含み、
前記検出マーカーは、少量である１〜１００コピーの前記ペプチド誘導体の検出に適する検出マーカーである方法。
【請求項３】
ファージディスプレイによってファージに提示される大環状ペプチドを定量化するための方法であって、
標的ペプチドを含むファージを提供する工程と、
前記標的ペプチドを含むファージと前記標的ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させて、ペプチド誘導体を形成する工程と、
前記ペプチド誘導体と−Ｃ≡Ｎ＋−ビオチンとを反応させることによって、前記ペプチド誘導体内に前記−Ｃ≡Ｎ＋−ビオチンを組み込んで、大環状ペプチドを形成する工程と、
前記検出マーカーの量を測定することによって、前記ファージに提示される前記大環状ペプチドの量を定量化する工程と、
前記ペプチド誘導体を第２の反応で第２の試薬と反応させることで前記検出マーカーを除去する工程と、
前記第２の反応の後に前記検出マーカーの量を測定することによって、前記第２の反応後の前記ペプチド誘導体の量を定量化する工程と、を含み、
前記検出マーカーは、少量である１〜１００コピーの前記大環状ペプチドの検出に適する検出マーカーである方法。
【請求項４】
ファージディスプレイによってファージに提示されるペプチド誘導体を定量化するための方法であって、
標的ペプチドを含んで提示するファージを提供する工程と、
第１の反応において、前記標的ペプチドを含むファージと前記標的ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させ、第１の官能基（Ｆ１）を有する第１のペプチド誘導体を形成する工程と、
第２の反応において、前記第１のペプチド誘導体を、第１の検出マーカーと結合している第１の捕捉剤（ＣＡ１）と反応させ、前記第１の官能基（Ｆ１）を第２の官能基（Ｆ２）とする工程と、
前記第１のペプチド誘導体を、前記第１の検出マーカーと異なる第２の検出マーカーと結合し、かつ前記第１の官能基（Ｆ１）と反応する第２の捕捉剤（ＣＡ２）と反応させる工程と、
前記第１の検出マーカーの量を測定することで、前記第２の官能基（Ｆ２）を有する前記ペプチド誘導体を定量化する工程と、
前記第２の検出マーカーの量を測定することで、前記第１の官能基（Ｆ１）を有するペプチド誘導体を定量化する工程と、を含む方法。
【請求項５】
前記第１の試薬はＮ末端アミノ酸を酸化してアルデヒド部分を生成し、前記第２の試薬は前記アルデヒド部分をオキシムに変換する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の試薬はジスルフィド結合を還元し、第１の捕捉剤（ＣＡ１）は、前記ペプチドをアルキル化する
請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ファージ（Ａ）に提示される第１のペプチド誘導体の第１の遺伝的にコードされたライブラリー、又はファージ（Ｂ）に提示される複数の第２のペプチド誘導体の第２の遺伝的にコードされたライブラリーを選択する方法であって、
標的ペプチドを含んで提示するファージを提供する工程と、
複数の前記標的ペプチドから中間ペプチド誘導体のライブラリーを形成する工程と、
前記中間ペプチド誘導体を、検出マーカーと結合している捕捉剤と完全に反応した場合には前記検出マーカーを提示する前記第１のペプチド誘導体となり、不完全に反応した場合には前記検出マーカーを提示しない前記第２のペプチド誘導体となる反応にかける工程と、
前記検出マーカーを用いて前記第１のペプチド誘導体を分離する工程と、を含む方法。
【請求項８】
前記複数の標的ペプチドは反応して、末端アルデヒド部分を有する中間ペプチド誘導体を形成する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検出マーカーと結合している前記捕捉剤は−Ｃ≡Ｎ＋−ビオチンを含み、前記−Ｃ≡Ｎ＋−ビオチンは、前記アルデヒド部分と完全に反応した場合に大環状ペプチドを形成する、
請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、組換えタンパク質技術の分野に関する。より詳細には、本願は、ファージディスプレイを用いてペプチド誘導体ライブラリーを定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的の標的に特異的に結合する低分子ライブラリーの生成およびそれらの分子の選択は、創薬にとって重要である。各ライブラリーメンバーがＤＮＡまたはＲＮＡなどの情報テンプレートに結合している遺伝的にコードされたライブラリーの生成により、個々の溶液および反応容器内で個々のライブラリーメンバーを分離することなく、大規模化学ライブラリーの処理が可能となる。遺伝的にコードされた分子の混合物から標的分子を選択し、その情報テンプレートを使用して、目的の選択された分子を同定または増幅することができる。
【０００３】
ファージディスプレイは、遺伝的にコードされたライブラリーの一例である。ファージディスプレイは、タンパク質抗原、特に、目的のヒトタンパク質の解析、提示および産生に用いられる公知の技術である。ファージディスプレイは、細菌ウイルスであるファージが、その表面にヒト抗体を含む異なるペプチドまたはタンパク質を露出または「提示」するように作製されるプロセスである。目的のペプチドまたはタンパク質は、遺伝子工学によって、ファージの細胞表面タンパク質分子（通常、遺伝子ＩＩＩタンパク質、ｇ３ｐ）に個々に取り付けられる。このようなファージ集団（ファージライブラリー）において、各ファージは、異なるペプチドまたはタンパク質−ｇ３ｐ融合の遺伝子を保有し、その表面にその融合タンパク質を露出する。様々な選択手順によって、目的の特定の標的分子にバインダーを「提示」するファージを同定および単離することができる。これらのバインダーは、タンパク質の相互作用の相手を含み、そのタンパク質、（例えば、診断および治療的標的に使用するための）抗原を認識し、結合するペプチド、ならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用に関与するタンパク質（例えば、新規転写因子）の新しい機能または作用機序を決定することができる。
【０００４】
ファージディスプレイ法は、医薬品および／または診断薬の発見ならびに開発に非常に有用であり得る。ファージディスプレイでは、ファージ全体が結合し、固定化した標的分子から溶出させることができる。ファージは感染性が残っているので、細菌細胞にそのＤＮＡを注入し、増殖することができる。しかし、ファージディスプレイの主な制限は、結合段階中にファージの非特異的吸着が起こることであり、これは、いくつかのラウンドにわたる濃縮ならびに個別に調整された洗浄条件および溶出条件を必要とする。ファージディスプレイ法は、通常、直接的なＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質情報転送によってコードされ得るライブラリーの作製に制限される。これらの方法は、典型的にはわずか２０種類の天然アミノ酸で構成されるペプチドの直鎖状配列に限定される。
【０００５】
一般に、ファージの表面のペプチドライブラリーの増幅は、ＤＮＡが目的の提示されるペプチドを発現するように改変されたインビトロ翻訳系を必要とする。このような翻訳系の生成および使用は、高価で時間がかかり得る。適切な資源が与えられた場合に、各ライブラリーメンバーは「自然に」増幅されるので、ファージまたは細菌などの自己複製種の使用は、ライブラリーの増幅を簡略化する。例えば、ファージディスプレイライブラリーの場合、細菌を含む単純な培養液に１つのファージを添加すると、非常に低コストで、ファージの任意の大集団を産生することができる。
【０００６】
ファージディスプレイされたポリペプチドライブラリーをペプチド誘導体のライブラリーに変換することを含むいくつかの方法が存在する。一般に、これらの方法は、ペプチド上での有機合成を用いて、ペプチド誘導体を作製する。反応収率のキャラクタライゼーションおよび向上は、有機合成の重要な礎石である。ウェスタンブロットおよび質量分析法などの生化学的なバルク法を用いて、得られた生成物の量を定量化するか、または所望の反応産物生成の成功を決定する場合が多い。しかし、このキャラクタライゼーションがない場合には、合成は、信頼性があるまたは再現性があると主張することはできない。ペプチド誘導体のこのようなライブラリーの合成に用いられる反応は、典型的には、１種類のファージクローンまたは１種類の精製されたペプチドを使用して検証されてきた。ライブラリーの実際の合成は、典型的には、「無分別に」行われ、そのような合成の効率は不明である。したがって、この方法によって生成されたライブラリーの質は、通常は不明である。これらのライブラリーからの選択は、有用な非ペプチド分子を提供することができるが、全体的なこのような選択の効率は不明である。
【０００７】
Ｊｅｓｐｅｒらの米国特許第６，０１７，７３２号は、ファージミド上に提示される抗体のポイント残基の化学修飾について記載している。この特許は、抗体内のＣｙｓ残基のアルキル化、ならびに蛍光および放射性プローブでのその後の検出を含む反応の限定されたセットについて説明している。Ｊｅｓｐｅｒに記載された技術は、ファージの巨大クローン集団（＞１０10コピー）における収率を推定するために設計される。しかし、誘導体ライブラリー合成の定量化もしくは最適化の教示または提案はない。
【０００８】
Ｎｏｒｅｎらの米国特許第７，１４１，３６６号は、ファージディスプレイペプチドの特定の位置にユニークな化学残基のセレノシステイン（Ｓｅｃ）が組み込まれたファージの産生について記載している。Ｓｅｃを含むファージディスプレイペプチドライブラリーが生成され、したがって、改変されたペプチドライブラリーが作製された。ウェスタンブロットなどの生化学的なバルク法を用いて、Ｓｅｃ残基上に生じる化学修飾を定性的に特徴付けた。しかし、この方法は、Ｓｅｃを含まないペプチドライブラリーに拡張することができず、さらに、誘導体ライブラリー合成の定量化もしくは最適化の教示または提案はない。
【０００９】
Ｓｃｈｕｌｔｚらの米国特許公開第２００９／０１３７４２４号は、直交ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、ファージディスプレイペプチド内の特定の場所に組み込まれた非天然アミノ酸を有するファージの産生について記載している。アジドフェニルアラニン（ＡｚＰｈｅ）を含有するファージディスプレイペプチドライブラリーが生成される。ウェスタンブロットおよび質量分析法などの生化学的なバルク法を用いて、ＡｚＰｈｅ残基で生じる化学修飾を定性的に特徴付ける。ライブラリーの合成の単一または多段階反応において化学収率の定量化のための方法についても、化学的収率の向上のための戦略についても記載されていない。
【００１０】
Ｐｅｄｅｒｓｅｎらの米国特許第６，６４２，０１４号は、改善された活性または新しい活性を有する酵素を選択するための捕捉剤の使用について記載している。この特許は、直接化学変換ではなく、酵素触媒による化学物質の生成について説明している。特異的に操作されたファージミドは、ファージの表面に酵素および基質の両方を提示するために使用され、必要とされる。
【００１１】
ＷｉｎｔｅｒおよびＨｅｉｎｉｓらの米国特許公開第２０１０／０３１７５４７号は、３つのシステイン残基が隣接したランダムなアミノ酸を含む直鎖ペプチドからファージに提示された二環式ペプチドのライブラリーを生成するための方法について記載している。
【００１２】
典型的には、上記の参考文献に示されるように、当該分野で公知のファージディスプレイ法は、合成中の反応の効率および成功のために設計されていない。これらの従来のシステムは、誘導体化反応が行われた後に、ファージから精製されたタンパク質について十分にキャラクタライゼーションされる場合が多い。したがって、ファージ上の反応の収率、ならびにライブラリーの品質および純度は、一般的に知られていない。
【００１３】
したがって、ファージディスプレイ法の品質および対応する手順の最適化を決定し、反応産物の最適な収率を確実にするために、ペプチド誘導体ファージディスプレイの定量的キャラクタライゼーションが未だ必要とされている。
【００１４】
本背景情報は、本願人が本願に関連する可能性があると考える情報を知らせる目的で提供される。前述の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成すると自認することを必ずしも意図しておらず、またそのように解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１５】
本願の目的は、ファージディスプレイを用いてペプチド誘導体ライブラリーを定量化するための方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の一態様によると、ファージディスプレイによってファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化するための方法であって、ファージに提示された標的ペプチドを含むファージを提供する工程と、この標的ペプチドを含むファージとペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させ、ペプチド誘導体を形成する工程と、検出マーカーを含む捕捉剤とペプチド誘導体とを反応させることによって、ペプチド誘導体内に検出マーカーを組み込む工程と、検出マーカーの量を測定することによって、ファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化する工程と、を含む方法を提供する。
【００１７】
本願は、個々のファージクローンまたはファージのライブラリーの反応収率の定量的キャラクタライゼーションのための高感度な方法を提供する。理想的には、この方法は、本明細書に記載の反応によって誘導体化されたわずか１〜１００コピー程度の分子の検出に適する。
【００１８】
本方法は、当技術分野で公知の検出アッセイを含む公知の技術と共に用いることができる。したがって、本方法は、生化学的なバルク法に依存する従来のファージディスプレイ法に優る利点を提供することができる。さらに、本方法は、従来のファージディスプレイ法および提示されたペプチドを検出するために使用されるアッセイでは得られない、ペプチド誘導体を検出するための感度の増加を提供することが見出された。
【００１９】
特定の実施形態において、本方法は、検出マーカーを組み込むためにファージの表面に提示されるペプチド上の末端官能基の反応を利用する。検出マーカーは、捕捉剤を形成するために、化学的部分に結合されている。これらの捕捉剤は、目的のペプチド残基から修飾された所望の官能基と反応する。検出マーカーには、ビオチン、フルオレセインおよびマンノースが含まれ得るが、これらに限定されない。当技術分野で公知の他の適切な検出マーカーを用いてもよい。
【００２０】
本方法は、特定のライブラリーまたはサブライブラリーに最適化された特定の反応条件を用いて所望のファージライブラリーまたはサブライブラリーの収率のアッセイを可能にするので、従来のファージディスプレイ法を上回る改善を提供する。これは、その後にアッセイされる固有の特性を有するようにライブラリーメンバーの官能基を修飾することにより達成される。これらの特性には、蛍光または酵素結合の定量化が含まれ得る。さらに、誘導体ライブラリーは、（ペプチド残基および光応答のリンカーを組み込んだ）大員環または（典型的には、リボソーム合成もしくは酵素合成を介して組み込むことができない）複合糖質部分を含むことができるか、または本方法は、天然ペプチドには存在しない結合によって連結した複雑な環状ペプチドおよび多環状ペプチドのライブラリーの定量的合成のための複数の反応を使用することができる。次いで、これらの反応は、ファージライブラリーの産生の効率を決定するために、標準的な定量化手順を用いて定量化することができる。
【００２１】
本方法を用いて、例えば、天然ペプチドからの一連の化学工程で合成することができる誘導体を含む濃縮されたファージライブラリーを生成することができる。したがって、各誘導体は、容易に増幅され、特徴付けることができる。本方法は、アッセイ対象の官能基に応じて、特定の反応条件に対して最適化することができる。
【００２２】
ファージディスプレイは、堅牢な手順であるが、プロセスの間に定量的に最小限監視することで「無分別に」行われる場合が多い。本方法は、所望のペプチド誘導体の収率を向上させるために最適化された反応条件を与えるように誘導体化されたファージディスプレイペプチドの定量化を用いる。理想的には、本方法を用いて、反応過程のより早い段階でファージディスプレイの成功を監視することができる。これは、本質的に感度が低く、時間がかかり、プロセス中のかなり後に行われる場合が多い生化学的なバルク法の必要性を低減する。
【００２３】
本方法は、任意の酵素の共同提示を必要としない。合成ライブラリーの生成は、任意のファージまたはウイルスディスプレイから行うことができる。本方法は、化学的に修飾されたペプチドを提示するファージを作製することができる。さらに、ファージ内の翻訳後修飾の必要がない。検出および定量化のためのペプチドの誘導体化は、提示されたペプチド上で起こる。
【００２４】
本発明の別の態様において、ファージディスプレイによってファージに提示され、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含むペプチド誘導体の量を定量化するための方法であって、標的ペプチドを含むファージを提供する工程と、標的ペプチドを含むファージと標的ペプチドを誘導体化するための第１の試薬とを反応させることにより、ペプチドを酸化し、アルデヒド基を含むペプチド誘導体を形成する工程と、検出マーカーを含む捕捉剤とペプチド誘導体上のアルデヒド基とを反応させることにより、ペプチド誘導体内に検出マーカーを組み込む工程と、検出マーカーの量を決定することにより、ファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化する工程と、を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明の別の態様は、反応性アルデヒド基の消失を監視することにより、ペプチドまたはペプチドライブラリー上に提示されたアルデヒドの多様な反応の定量法である。本明細書に記載の反応は、オキシムおよびヒドラジン形成、Ｗｉｔｔｉｇ反応、芳香族ビス−アミンとの環化付加、ジムロート転位である。当技術分野の現在の状態に基づいて、示さないが実行可能な実施例には、限定されないが、森田・ベイリス・ヒルマン反応、ペタシス反応、有機触媒反応（不斉アルドール反応、リスト・バルバスアルドール反応）および金属触媒反応（水性インジウム触媒によるアリル化、末端アルキンによる金触媒によるアルキル化）などの、水性媒体中で生じるアルデヒドまたはアルデヒド由来のイミンの任意の他の反応が含まれる。
【００２６】
本発明のさらに別の態様によると、ファージディスプレイによってファージに提示される大環状ペプチドの量を定量化するための方法であって、標的ペプチドを含むファージを提供する工程と、標的ペプチドを含むファージと標的ペプチドを誘導体化する第１の試薬とを反応させ、ペプチド誘導体を形成する工程と、ペプチド誘導体と-Ｃ≡Ｎ+−ビオチンとを反応させることによって、ペプチド誘導体内に-Ｃ≡Ｎ+−ビオチンを組み込み、大環状ペプチドを形成する工程と、検出マーカーの量を決定することによって、ファージに提示される大環状ペプチドの量を定量化する工程と、を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によると、ステップ１で検出マーカーを組み込み、ステップ２で検出マーカーを除去することによって、両方の反応ステップを定量化し、選択することによる環化などの２つのステップの反応順序を定量化し、選択する方法を提供する。
【００２８】
本発明の別の態様によると、ファージディスプレイによってファージに提示されるペプチド誘導体の量を定量化するためのキットであって、ペプチド誘導体を形成するためにファージに提示された標的ペプチドと反応させるための第１の試薬と、ペプチド誘導体内に組み込むための検出マーカーを含む捕捉剤と、を含むキットを提供する。このキットは、反応基を提示するために化学的または遺伝的に修飾され、ワンステップで反応剤と混合することによりバイオコンジュゲーション分野で訓練を受けていない人でも修飾することができるファージライブラリーも提供することができる。このキットは、修飾の前後に反応基の量を評価することによって、修飾の収率の簡単かつ正確な測定を提供することができる捕捉試薬を提供することができる。１つのキットにおいて、ライブラリーはすでに反応性があり、活性化を必要としない。捕捉剤は、ライブラリーの質（すなわち、反応基の量）および修飾の程度（すなわち、修飾後に残る反応基の量）の両方をユーザーが評価することを可能にする。例えば、これは、ファージ上にすでに存在する特定の反応基へのバイオコンジュゲーションを含むことができる（例えば、ファージはアルデヒドを有し、ユーザーはこのようなアルデヒドの形成を心配することなく、簡単にアルデヒドを修飾する）。本発明による別のキットを用いて、（例えば、ファージをアルデヒドに酸化し、次いでアルデヒドを反応させる）任意の活性化を行い、定量化することができる。
【００２９】
本発明、ならびに他の態様およびそのさらなる特徴をより良く理解するために、図面の簡単な説明を行うが、これは添付の図面と併せて使用されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ファージに提示されるＮ末端アミノ酸の酸化中の、ファージ上の化学反応を最適化および定量化する例を示す図である。
【図２】反応効率に対する酸化−クエンチャーの影響のプロファイルを示す図である。
【図３】ファージ上のＮ末端Ｓｅｒの酸化の反応速度の評価を示すグラフである。
【図４】アルデヒドおよびオキシムの形成に対する酸化の代表的な収率を示すグラフである。
【図５】酸化およびカップリング中に反応性のあるライブラリーのサブセットを選択するための概略図である。
【図６】グリコペプチド（Ａ）または大環状ペプチド（Ｂ）の遺伝的にコードされた化学ライブラリーの合成を示す図である。
【図７】酸化オキシムライゲーションを介して合成されたペプチド誘導体のパニングおよび増幅の反応速度を示すグラフである。
【図８】ジスルフィドの還元およびシステインのアルキル化によるペプチド誘導体の合成の最適化を示す反応の図である。
【図９】還元およびアルキル化の反応速度の概略図および解析結果を示すグラフである。
【図１０】リンカーカップリングの最適化およびクローンファージ上の環化反応の概略図ならびにその結果を示すグラフである。
【図１１】ライブラリーファージ上の環化反応の最適化のための概略図およびファージのクローン集団とファージライブラリーの間の反応性の差異を示すグラフである。
【図１２】光応答性リンカーでの環化を用いた光応答性ライブラリーを生成するための概略図である。
【図１３】非天然の光感受性リンカーで環化したライブラリーのパニングの結果を示すグラフである。
【図１４】他の生化学的方法を用いた、図１〜図７に記載の反応の定量化を示す写真である。
【図１５】ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動を用いた、リンカーによるマーカーの検出を示すグラフである。
【図１６】ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によるペプチド誘導体の捕捉の最適化を示すグラフである。
【図１７】ファージ上の様々なアルデヒド反応の最適化を示す図である。
【図１８】段階的な環化反応の例（Ａ）を示す図及び対ｐＨの補足％を示すグラフ（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
【００３２】
特に定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３３】
特に文脈が明確に指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は複数の言及を含む。
【００３４】
本明細書で使用する「含む」という用語は、以下のリストが限定的であり、必要に応じて、任意の他の追加の適切な項目、例えば、１つ以上のさらなる特徴、構成成分および／または成分を含んでも、含まなくてもよいことを意味すると理解される。
【００３５】
「アッセイ」という用語は、試料中の物質の存在を定性的または定量的に検出するための試験を指すために使用される。
【００３６】
「生物学的試料」という用語は、生きているかまたは死んだ生物から得られる動物およびヒトの両方の体液、排泄物ならびに組織を指すために使用される。本明細書で使用する「体液」という用語は、ヒトまたは動物の体表面または体内からの天然および／もしくは分泌されたおよび／もしくは排泄されたおよび／もしくは排出された体液ならびに／または洗浄液を含み、唾液、痰、血清、血漿、血液、咽頭、鼻／鼻咽頭および副鼻腔の分泌物、尿、粘液、糞便、糜粥、嘔吐、胃液、膵液、精液／精子、脳脊髄液、乳汁分泌物もしくは月経、卵黄、羊水、房水、硝子体液、頸部の分泌物、膣液／分泌物、骨髄穿刺液、胸水、汗、膿、涙、リンパ液および気管支洗浄液または肺洗浄液を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用する「身体組織」または「組織」という用語は、植物または動物の構造物質の一つを形成し、動物では、例えば、結合組織、上皮、粘膜、筋肉組織、胎盤組織、ならびに肝臓、腸、脾臓、腎臓、脳、心臓、および神経組織などからの組織を含むそれらの細胞間質と共に、通常特定の種類の細胞の集合を表す。身体組織の試料は、細針吸引、擦過標本もしくは生検組織などの様々な非限定的な方法によって生きているヒトまたは動物から得ることができるか、または死んだヒトもしく動物の残骸から得ることができる。「組織」という用語は、天然組織または合成組織を表すために用いることができる。
【００３８】
生物学的試料は、植物、肉および加工食品の試料を含む前処理された食品、ならびに食品加工施設、病院、水、土壌、および大気などの環境供給源からのスワブ試料も含むことができる。他の生物学的試料の種類は、臍帯血または胎盤血、骨髄、吸引物、微細針器官吸引液もしくは病変吸引液、子宮頚部試料、培養細胞、体の拭き取り検体、または体のなすりつけ標本を含む血液（例えば、血小板、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の単離物／画分／濃縮物を含む。
【００３９】
「休止状態のバクテリオファージ」および「休止状態のファージ」という用語は、感染性はないが、活性化後に感染性となるバクテリオファージを表すために互換的に使用される。
【００４０】
本明細書で使用する「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターまたはエンハンサーエレメントに結合したコード配列を含むコンストラクトを指し、その発現産物は、例えば、レポーター遺伝子を保有するバクテリオファージによる感染を介して、構築物が細菌に導入された場合に、容易にかつ定量的にアッセイすることができる。
【００４１】
本明細書で使用する「標的ペプチド」は、誘導体化およびアッセイされるファージの表面に提示される目的のペプチドである。理解されるとおり、ファージの表面は、複数のペプチドを提示することができる。したがって、標的ペプチドは、誘導体化およびアッセイを目的とされた複数の提示されたペプチドの一つである。
【００４２】
本明細書で使用する「捕捉剤」という用語は、ファージディスプレイされたペプチド上の特定の官能基と反応する化合物を表す。捕捉剤は、所望の官能基と反応する反応性部分と、ペプチドと捕捉剤の結合を定量化するために使用される検出マーカーと、を含む。したがって、「検出マーカー」は、捕捉剤を形成するための部分と関連し、捕捉剤が反応して、所望の官能基に結合した時にアッセイすることが可能である分子を表す。代表的な捕捉剤には、例えば、ファージディスプレイされたペプチド上の末端アルデヒド基と反応する反応性部分を含むものが含まれる。代表的な検出マーカーには、ビオチン、フルオレセインおよびマンノースが含まれる。
【００４３】
本明細書で使用する「誘導体化されたファージ分子」または「ペプチド誘導体」との関連の「誘導体化」とは、捕捉剤との反応の前に、ファージの表面に提示された標的ペプチド残基の修飾を表す。この修飾は、典型的には、末端ペプチド残基などの標的ペプチド上に提示されることにより、ペプチド誘導体などの誘導体化されたファージ分子を形成する特定の官能基の反応を含む。その後、このペプチド誘導体は捕捉剤により検出され、反応する。
【００４４】
ファージディスプレイの定量プロセス
【００４５】
本明細書に記載の定量化プロセスは、一般的に、ペプチド−提示ファージ「Ｐ」および対照のペプチドを含まないファージ「Ｃ」の２種類のファージを用いる。Ｐは、そのゲノム中に、そのコートタンパク質を有するペプチドをコードし、提示するインサートを含む。Ｐは、配列のライブラリー（Ｐlib）も表すことができる。本方法は、１つのファージＰまたはファージライブラリーＰlibにおける反応を特徴付ける場合に、手順の変更を必要としないように設計される。
【００４６】
対照ファージＣは、典型的には遺伝的にＰと類似しているが、ファージゲノム中にインサートを欠いており、したがって、コートタンパク質領域中のペプチドをコードするＤＮＡ配列を欠く。同じ溶液中にＰファージおよびＣファージ粒子の数の独立した定量化を行うことができることが望ましい。
【００４７】
当技術分野で公知の方法を用いて、ＰファージとＣファージを区別することができる。例えば、ｉ）ＰはＬａｃＺを含むが、ＣはＬａｃＺを含まない。ＰおよびＣに対応するプラークは、比色分析用試薬のＸ−ｇａｌを含むプレート上で色によって区別可能である。ＬａｃＺ以外の任意の適切な酵素を用いて、蛍光基質などを用いる公知の手段を用いて可視化することができる。
【００４８】
ｉｉ）Ｐは、ゲノム中にＧＦＰ、ＲＦＰまたは他の蛍光レポーターをコードする遺伝子を含むが、Ｃはレポーターを含まない。レポーターは、ファージのいずれかのタンパク質に物理的に結合する必要はない。レポーターは、簡単に宿主細胞でのみ発現させることができる。ＰおよびＣに対応するプラークは、前述のようにプレート上で色または蛍光により識別することができる。
【００４９】
ｉｉｉ）Ｐは、ファージゲノム中に抗生物質耐性遺伝子を含むが、Ｃは、耐性遺伝子を含まない。ＰおよびＣに対応するプラークは、抗生物質の有無に関わらず、２つのプレート上のファージの混合物をプレーティングすることによって識別することができる。あるいは、ＰおよびＣは、２種類の抗生物質に対する耐性を保有し、別々に可視化することができる。
【００５０】
ｉｖ）Ｐは、抗ＦＬＡＧ抗体などの特異的リガンドによって認識されるＦＬＡＧなどの短いペプチド配列をコードする配列を含むが、Ｃはその配列を含まない。ＰファージおよびＣファージは、ニトロセルロース紙にそれらのコロニーを移して、抗体または他のリガンドを用いて探索することによって区別することができる。
【００５１】
ｖ）ＰおよびＣの混合物を溶解して、ＤＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲまたは他の定量法により、特定のＤＮＡ配列の定量化に供することができる。ＰＣＲ用プライマーは、ＣではなくＰのＤＮＡのみを認識するインサート領域用に設計されている。
【００５２】
ＰおよびＣの混合物のキャラクタライゼーションは、ファージディスプレイ法の成功を決定するのに有益である。あるいは、ＰおよびＣは、化学的に修飾され、２つの別々の溶液中で定量化することができる。簡単に説明すると、次の全ての議論で、本明細書に記載の本方法の実施例は、Ｃではなく、Ｐの中のＸｇａｌレポーターの存在に基づく。この方法は、プラーク形成アッセイにおいて特定の色（Ｐについては青、Ｃについては白）のプラークを計数することによりＰおよびＣの迅速な定量化を可能にする。
【００５３】
ファージディスプレイされるペプチド誘導体の分析および定量化
【００５４】
各ライブラリーメンバーは、単一分子（単一クローン）として混合物中に存在する場合が多いので、ファージライブラリーのキャラクタライゼーションを行うことができる。本方法は、各反応段階用の一連の捕捉剤を使用して、クローン（例えば、最大１０9の異なるペプチド）の複雑な混合物における多段階反応の反応収率の定量化を可能にする。本明細書に記載の方法は、任意の公知の基質分子およびアミノ酸配列に実施可能な検出技術を用いる。
【００５５】
ペプチドライブラリーにおける化学反応の定量化およびキャラクタライゼーションは重要視されてこなかった。分光法（質量分析、元素分析）および生化学的方法（ゲル電気泳動、ウエスタンブロットなど）による定量的なキャラクタライゼーションのための既存のアプローチは、一般的に大規模なクローン集団またはファージおよびウイルス（例えば、１０10〜１０13の粒子）にのみ適用できる。それらは、各クローンが少量（例えば、１〜１００コピー）で存在する何百万もの異なるファージクローンを含む集団中に生じる修飾を検出することはできない。本方法は、誘導体化されたペプチドライブラリーをアッセイするために最適化された反応条件を提供する。
【００５６】
本方法はまた、誘導体化されたペプチドライブラリーで行われる化学反応の収率の向上のために使用することもできる。多くのペプチドの集合において、特定のペプチドが他よりも速く特定の種類の反応を受ける。例えば、環化は、特定の構造のペプチドでより速く生じ得るが、置換または除去は、特定の立体的および電子的性質のペプチドで生じ得る。ユニークな反応性を有する個々のペプチド配列の選択は、以前に記載されており（Ｂａｒｂａｓら、１９９５年１２月１５日に出願された米国特許出願第０８／５７３、４１５号、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ,Ｇ.Ｍ.,Ｗｅｉｓｓ,Ｇ.Ａ.（２０１１）,Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ.Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.２２：２１４３−２１５３）、本発明は、高収率で非ペプチド構造の大規模ライブラリー（１０3〜１０8）を作製するために、ペプチドにおける多段階反応の最適化を可能にする。これらのライブラリーは、本来は非ペプチドであるが、それらは親ペプチドと同様に定量的に増幅可能である。それらの同一性は遺伝的にコードされ、元のペプチド出発物質から推定することができる。
【００５７】
本方法の１つの利点は、ファージライブラリーの２段階修飾の連続最適化である。一例では、アルデヒドへのＮ末端セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）求電子付加の酸化の定量化を行う。別の例では、光感受性リンカーによる部位選択的還元またはジスルフィドおよびそのアルキル化の定量化を示す。しかし、提示されるペプチド内の末端であろうと内部であろうと、他のアミノ酸上の他の官能基が企図され得ることが理解されるであろう。本明細書に示す実施例は、本方法の特定の実施形態のみを例示する。
【００５８】
定量化手法の助けを借りて作製されたファージディスプレイされたペプチド誘導体のライブラリーは、定義された構造の明確に定義された数のリガンドを含む。標準的なファージディスプレイにおいて、パニングおよび増幅のラウンドは、新たなペプチドを発見する。ペプチド誘導体ライブラリーにおける修飾、パニングおよび増幅のラウンドによって、新しいペプチド誘導体が発見される。
【００５９】
上記のシステムおよび方法を説明するために、（ビオチンに結合するための）ストレプトアビジンおよび（マンノースに結合するための）コンカナバリンＡなどのモデルタンパク質標的におけるペプチド誘導体の代表的なパニングを示す。しかし、他の捕捉剤および検出マーカーを用いる他のタンパク質標的を使用することができることは容易に理解されるであろう。
【００６０】
本方法で測定されるファージ濃度[Ｐ]0、［Ｃ］0、［Ｐ］b4、［Ｃ］b4、［Ｐ］afおよび［Ｃ］afは、反応の収率および特異性（最初のステップ１）、ならびにそのファージの生存能力との干渉についての情報を提供する。次いで、反応条件を連続的に変化させることにより、それらのパラメータの最良の結果を特定することができる。
【００６１】
本方法は、他の多段階反応に適用することができる。例えば、多段階反応（Ｒｘｎ１、Ｒｘｎ２など）は、異なる反応条件を使用することができる。Ｒｘｎ２は、Ｒｘｎ１からの官能基Ｆ１を別の官能基Ｆ２に変換する。Ｒｘｎ２をキャラクタライゼーションするために、反応１からのファージの混合物を適切な試薬（Ｒｅａｇ２．１、Ｒｅａｇ２．２など）にさらす。適当な時間後、反応を停止し、Ｆ２と反応する基を含む捕捉剤２（ＣＡ２）を用いて、Ｆ２基の収率（濃度）を決定する。元のＦ１基に反応する捕捉剤ＣＡ１にさらすことにより、未反応基Ｆ１の量を定量化することができる。例えば、ヒドロキシルアミンとアルデヒドの反応の定量化は、アルデヒド反応性捕捉剤を使用して、未反応のアルデヒド基を有するファージを計数することによって行うことができる。さらに、チオールの反応の定量化（未反応チオールの定量化）は、チオール特異的捕捉剤を用いて行うことができる。また、環化の定量化は、クロロアセトアミド反応性捕捉剤を用いて行うことができる。これらの反応の例を本明細書に記載する。
【００６２】
したがって、Ｎ−ステップ反応の定量化および最適化は、各ステップでの収率を定量化するためにＮ捕捉剤を用いて行うことができる。各ステップでの条件を変更すると、各ステップでの収率が最適化される。
【００６３】
捕捉剤（上記の定量化のためのＣＡ１、ＣＡ２など）は、別の目的を果たすことができる。それらを用いて、より効果的に特定の反応を受ける傾向のあるライブラリーのメンバーを選択することができる。この選択は、ペプチドライブラリーＰlibを提示するファージの混合物において反応が行われる場合に適用することができる。特定の条件でＰlibおよびＣにおいて反応を実行することによって、収率は捕捉剤ＣＡ１を用いて定量化することができる。未反応ペプチドは、反応したものから分離することができる。ペプチド誘導体を含むサブライブラリーを増幅して、修飾されたリガンドのみを含むファージの純粋な亜集団を得ることができる。本方法は、（１）酸化に反応するＮ−アミノ酸を用いてサブライブラリーを選択するためのランダムライブラリーの修飾；および（２）非天然リンカーにより効率的な環化を受けることができるサブライブラリーを選択するための、２つのシステインが隣接する７個のアミノ酸のランダムライブラリーの修飾を含むいくつかの例を提供する。
【００６４】
収率および生存率の計算
【００６５】
特異的な反応の収率は以下のように求められる。
Ｙs＝１００％×［Ｐ］af／［Ｐ］b4
【００６６】
非特異的な反応の収率は以下のように求められる。
Ｙn＝１００％×［Ｃ］af／［Ｃ］b4
【００６７】
ファージの任意の他のタンパク質断片とは対照的に、ペプチドに特異的に生じる反応の収率は、ＹsとＹnを比較することによって決定される。理想的には、Ｙnは０であり、Ｙsは１００％に近い。
【００６８】
反応の間のファージの生存能力は、以下のように求められる。
【００６９】
Ｖ＝１００％×［Ｐ］b4／［Ｐ］0
【００７０】
理想的には、反応の生存率はほぼ１００％に維持されるべきであり、反応の長さの最適化、および試薬の濃度、またはそれらの提示を用いて、Ｖを最大にすることができる。これは、本明細書に示すとおり、収率を増加させ、生存率を低下させ得る（例えば、図１および図３を参照されたい）。
【００７１】
収率を定量化する能力は、収率および特異性を最大化し、生存率との干渉を最小限に抑える最適な反応条件の迅速な選択を可能にする。収率および特異性を最適化するために変えることができるパラメータには、試薬濃度、反応時間、および触媒の存在が含まれる。これらのパラメータを本明細書に例示する。
【００７２】
本明細書に記載の本発明をさらに理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的のみのためであることが理解されるべきである。したがって、これらは本発明の範囲を限定するものでない。
【００７３】
実施例
実施例１：ファージライブラリーの二段階修飾
【００７４】
ペプチド誘導体の合成は一連の反応（例えば、標識された「Ｒｘｎ１」、「Ｒｘｎ２」など）である。反応１において、既知の濃度［Ｐ］0のペプチド−ディスプレイファージ[Ｐ]と既知の濃度［Ｃ］0のペプチドを含まない対照ファージ［Ｃ］の混合物を適切な試薬（「Ｒｅａｇ１．１」、「Ｒｅａｇ１．２」など）と共に混合する。適当な時間後、反応を停止し、捕捉剤１（ＣＡ１）を添加する。捕捉剤は、典型的には、相補的反応性基と、例えば、ビオチンを含む。次いで、この溶液を（ビオチン結合タンパク質のストレプトアビジン含有磁気ビーズなどの）捕捉支持体と混合する。Ｒｘｎ１を受けるファージはうまく支持体上に捕捉される。捕捉前のファージの数（[Ｐ]b4および[Ｃ]b4）ならびに捕捉後のファージの数（[Ｐ]afおよび[Ｃ]af）を記録する。
【００７５】
図１は、ファージに提示されるＮ末端アミノ酸の酸化中の、ファージにおける化学反応の最適化および定量化を示す。図１Ａでは、Ｒｘｎ１は、アルデヒド部分を生成するＲｅａｇ１．１＝ＮａＩＯ4によるＮ末端セリン残基の酸化を含む。捕捉剤ＣＡ１は、アルデヒド反応性ビオチンヒドロキシルアミンである。Ｎ末端ＳｅｒまたはＴｈｒを有するペプチドを提示するファージまたはファージライブラリーは、アルデヒドに酸化することができる。アルデヒドの量および酸化の特異性は、アルデヒド反応性捕捉剤（２）を用いて評価することができる。その後、ファージを、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを用いて捕捉する。捕捉前後のファージの数の定量化を用いて、反応の収率を計算することができる。試薬の濃度および反応のタイミングを用いて、収率を最大限にした。
【００７６】
図１Ｂは、異なる反応条件における反応の収率および特異性のプロファイルを示す。反応は、ファージクローンの（１）Ｎ末端Ｓｅｒを有するペプチドを提示するファージ（「ＳＶＥＫファージ」）と（２）Ｎ末端のＡｌａを含むファージ（「ＷＴ」）の混合物で行った。ＳＶＥＫはＬａｃＺレポーターを含み、青色プラークを形成するが、ＷＴが白いプラークを形成するので、２つのファージクローンを独立してキャラクタライゼーションした。同一の特徴付けは、Ｎ末端Ｓｅｒを含むクローンのライブラリーを用いて行うことができる。
【００７７】
図１Ｃは、個々の反応条件におけるファージの生存率プロファイルを示す。この方法を用いて、ＳＶＥＫファージ上での特定の反応の収率を最大にし、ＷＴファージ上での非特異的反応を最小限に抑え、反応時間を最小化し、ファージの生存率を最大にする条件を選択するために複数の条件を迅速にプロファイルすることができる（四角の中の値を参照されたい）。本明細書に示すとおり、Ｒｘｎ１におけるＮａＩＯ4の理想的な濃度は、２０〜５００μΜ、より具体的には２０μΜまたは５００μΜである。
【００７８】
ビオチン−ＡＲＰの濃度も、非特異的結合を回避するために最適化した。理想的には、ビオチン−ＡＲＰの濃度は約０.２〜５ｍＭ、典型的には０.２ｍＭ、１ｍＭまたは５ｍＭである。理想的な反応時間（Ｒｘｎ２）は、１〜４時間、典型的には１、２、３または４時間のインキュベーション時間であることが見出された。アニリン触媒の添加は、良好に反応を促進することが見出された。
【００７９】
図２は、反応効率に対する酸化−クエンチャーの影響のプロファイルを示す。ファージ上でのＮ末端Ｓｅｒの酸化は、様々な還元剤によって停止することができる。いくつかの還元剤（チオ対硫化物）の使用は、著しく収率を向上させることができる。チオール系還元剤は同様の収率を提供するが、グルタチオンはファージの生存率に少なくとも負の影響を与える。
【００８０】
図３Ａにおいて、ファージに提示されるＮ末端のＳｅｒの酸化を、捕捉されるファージの最適な収率が得られるように「微調整」した。全ての反応は、１０11ｐｆｕ／ｍＬのファージを用いて行った。各酸化後に、反応を４−メトキシベンゼンチオールで停止した。ファージを１時間、１ｍＭのビオチン−ヒドロキシルアミンに曝露し、１,０００,０００倍に希釈し、Ｓｔｒｅｐ−ＭＢ上に捕捉した。得られた反応速度曲線（図３Ｂ）は、これらの条件での反応収率が酸化剤濃度または反応時間に関わらず９０％を超えて増加することができないことを示す（上の２つのパネル）。延長された反応時間または高い酸化剤濃度では、生存率の減少が生じる（下のパネル）。ＷＴファージの修飾を含む副反応は、これらの反応レジームで最小である。
【００８１】
図４は、未反応のアルデヒドをキャラクタライゼーションすることによって、アルデヒドへの酸化およびオキシム形成の２段階の反応の収率プロファイルを示す。パネルＡにおいて、ファージを最適な酸化条件（５分間、０.０６ｍＭのＮａＩＯ4）に曝露し、グルタチオンでクエンチした。その後、ファージを、マンノース−ヒドロキシルアミンに曝露した。未反応のアルデヒドの量を、捕捉剤ビオチン−ヒドロキシルアミンへの暴露によって定量化した（パネルＢ）。その中のグラフに示すように、ファージの約９０％がビオチンヒドロキシルアミンに対して反応性を示すが、ファージのわずか１０％が、１ｍＭのマンノースヒドロキシルアミンへの１時間の暴露後にビオチン−ヒドロキシルアミンによって修飾可能である。マンノース−ヒドロキシルアミンとの反応の収率は、９０〜１０＝８０％（パネルＣ）である。パネルＤは、ランダムライブラリー中のファージの２０％が、酸化後にビオチン−ヒドロキシルアミンに対して反応性があることを示し、ライブラリーの２０％がＮ末端ＳｅｒまたはＴｈｒ残基を含むことを裏付ける。パネルＥは、ファージ上の化学結合が、複数日間安定であることを示す。
【００８２】
図５（パネルＡからＣ）は、末端にＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を含むディスプレイされたペプチド（「Ｓ／Ｔ末端サブライブラリー」）対Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基を含まないライブラリーメンバー（「非Ｓ／Ｔ末端ライブラリーメンバー」）の収率を決定するために、酸化またはカップリングで反応するライブラリーのサブセットを選択する方法を示す。この実施例において、ファージのランダムライブラリー（パネルＡ）を最適な酸化条件（５分間、０.０６ｍＭのＮａＩＯ4）に暴露し、グルタチオンおよびオキシム形成条件（１ｍＭのビオチン−ＴＥＶ−ヒドロキシルアミン）でクエンチした。ランダムライブラリーのわずか２０％がＮ末端Ｓｅｒを含むので、未処理のランダムライブラリーにおける反応の収率は約２０％である。捕捉されたファージの放出および再増幅後（パネルＣ）に、同一条件下での同一反応の収率は典型的には高く、数ラウンドのこの選択後に、ほぼ１００％の収率に近づく。したがって、このプロセスは、これらの反応条件下で最適に反応するライブラリーのサブセットを選択する。
【００８３】
図７は、酸化オキシムライゲーションを介して合成されたペプチド誘導体のライブラリーが、パニングおよび増幅に使用することができることを示す。モデルマンノース結合標的であるコンカナバリンＡに対するペプチド−マンノースコンジュゲートのパニング、ならびに修飾されていないペプチドライブラリーのパニングの例を示す。パニングの効率を評価するために、各ステップで洗浄したファージの量を測定した。これらの値およびビーズから溶出したファージの量から、各洗浄工程におけるビーズ上のファージの量の逆算によりファージの量を決定した。これらの値は、標準的な一次オフ速度式に従う。各ライブラリーにはインサートを含まない野生型ファージを意図的に混ぜており、それらは白色のプラークを形成するので、混合物で定量化することができる。これに反して、このライブラリーは青色のプラークを形成する。インサートを含まないファージは、非特異的結合のための内部コントロールとして機能する。パニングの効率を評価するために、各ステップで洗浄される「青」および「白」のファージの量を測定した。最後の洗浄工程（洗浄１０）と比較して、溶出工程（ＥＬ）におけるファージの数の増加は、ファージが非特異的な相互作用により回収されたことを示した。ファージディスプレイパニングにおける青白スクリーニングについてのさらに詳しい方法については、Ｒ Ｄｅｒｄａ,Ｓ Ｍｕｓａｈ,ＢＰ Ｏｒｎｅｒ,ＪＲ Ｋｌｉｍ,Ｌ Ｌｉ,ＬＬ Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ”Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.２０１０,１３２,１２８９を参照されたい。
【００８４】
実施例２：システイン（Ｃｙｓ）含有残基の最適化
【００８５】
図８は、ファージディスプレイペプチドの還元およびアルキル化を介したペプチド誘導体の合成の最適化を示す。（Ａ）ジスルフィドＣＰＡＲＳＰＬＥＣを提示し、青色プラークを形成するＬ−ファージと、ペプチドを提示せず、白色プラークを形成するＷＴファージの混合物を用いて反応を行った。（Ｂ）ＷＴ＋Ｌ混合物のｉＴＣＥＰおよびＢＩＡへの暴露後、反応後の青白プラーク（WTＮおよびLＮ）ならびにビオチン化ファージをストレプトアビジンによって捕捉した後の青白プラーク（WTＮsおよびLＮs）の計数をした。Ｌファージの捕捉（LＣａｐ）は、ビオチン化の尺度として用いた。ＷＴファージの捕捉（WTＣａｐ）は、典型的には、非特異的還元またはアルキル化を示す。しかし、顕著な捕捉は観察されなかった（Ｄ〜Ｇ参照）。（Ｃ）０〜１０個のビオチンを有するファージを与える５つのｐＩＩＩ提示ジスルフィドのビオチン化（Ｂ0−Ｂ10）を示す。反応収率を捕捉画分から計算する。（Ｄ）ｉＴＣＥＰおよびＢＩＡへのＷＴ＋Ｌ混合物の暴露後、還元およびアルキル化の時間と共にＬ−ファージの捕捉が増加する。（Ｅ）捕捉を、式（Ｃ）を用いて収率に変換し、データを擬一次速度式に適合させた。［ｉＴＣＥＰ］および［ＢＩＡ］≫[ファージ]、ならびに特定の時間におけるファージの還元（Ｆ）およびアルキル化（Ｇ）の収率はファージの濃度と無関係であるので、この反応速度は適切であった。
【００８６】
図９は、ＴＣＥＰによるＣｙｓ上のジスルフィド残基の還元およびアルキル化ならびにＢＩＡによるそれらのその後のアルキル化の反応速度を調整する一実施形態を示す。（Ａ）ファージのアルキル化は、還元剤の非存在下では生じない。パネルＢは、ＴＣＥＰによる還元後のＢＩＡによるファージクローンＬのアルキル化の収率の定量化を示す。パネルＣは、ＴＣＥＰによる還元が３０分未満で完了することを示す。全反応時間はＸ分である。パネルＤは、ファージの２時間の還元後のアルキル化時間の最適化を示す。全反応時間は、Ｘ＋Ｙ分である。パネルＥは、（Ｆ）ＴＣＥＰの濃度および（Ｇ）還元時間を変化させることによりファージのワンポット還元／アルキル化の最適化を示す。パネルＨに示すとおり、ファージ濃度が１０9ＰＦＵ／ｍＬ未満である場合には、これらの濃度においてＴＣＥＰ還元効率は低いので、ワンポット反応の効率は６０％に低下する。
【００８７】
図１０は、クローンファージおよびライブラリーファージ上でのリンカーカップリングならびに環化の最適化の一例を示す。パネルＡにおいて、ファージに提示されるジスルフィドペプチドの還元およびアルキル化ならびに副産物が生じる可能性を示す。（Ｂ）ＢＩＡへの曝露を用いて、還元ジスルフィドまたは（Ｃ）未反応チオールを定量化する。パネルＤは、ビオチン−チオール（ＢＳＨ）への曝露が、非環化ペプチドを定量化することを示す。パネルＥでは、ビオチン化ファージの画分が、ＢＳＢＣＡを有するファージの培養後に減少する。ＢＳＨへの暴露後にビオチン化が起こらないことは、ＢＳＢＣＡカップリングが主産物として環状ペプチドを生成したことを示した。パネルＦにおいて、ＢＳＢＣＡによるアルキル化の速度定数（ｋ）を算出するために、ビオチン化ファージの消失を擬一次速度式に適合させた。パネルＧにおいて、２種類のファージディスプレイペプチド（Ｆ１、Ｆ２）について測定した２つの速度定数は、ＨＰＬＣならびに同じアミノ酸配列（Ｐ１、Ｐ２）の合成ペプチドを用いて測定したものと同様であった。パネルＨに示すとおり、質量分析により、環状生成物がＢＳＢＣＡとペプチドＡＣＰＡＲＳＰＬＥＣＧＧＧＳＡＥＴＶＥＳＣ（Ｃａｍ）ＬＡＫＳ（下線の配列は、ｐＩＩＩの合成断片である）の反応の主産物であることが確認された。
【００８８】
実施例３：環化反応
【００８９】
定量的Ｎ末端酸化、ならびにＵｇｉ反応を介した求核置換、環化および転位による効率的な３段階環化を受ける、ランダムペプチドライブラリーからの大規模サブライブラリーの生成について本明細書に例示する。
【００９０】
複数の天然側鎖が関与する複雑な多成分反応を受けることができる配列のサブライブラリーの選択。一例として、Ｕｇｉ多成分反応を行った。この反応は、アミン、カルボン酸、アルデヒドおよびイソシアン化物を必要とする（図６参照）。ファージライブラリー内の成分は、Ｎ末端で酸化することができる（ＳｅｒおよびＴｈｒ−末端ペプチド）。いくつかの配列のみが、効率的な環化を受けることができる。（ビオチンなどの）捕捉剤とイソシアニドを用いて、効率的な環化を受ける配列をそうでないものから分離することができる。サブライブラリーを用いて、ファージディスプレイされた大環状化合物の純粋なライブラリーを作製することができる。
【００９１】
図６は、グリコペプチド（Ａ）または大環状ペプチド（Ｂ）の遺伝的にコードされた化学ライブラリーについて選択する一例を示す。これらのペプチドは、アルデヒド含有ペプチド（Ｄ、および中間体Ｃ）から誘導される。アルデヒドを提示するライブラリーを、任意の天然のファージディスプレイペプチドライブラリーから定量的に作製することができる。図５で説明したとおり、この反応の収率を最大にすることができる。重要なアルデヒド中間体（Ｃ）は、一段階合成で異なるライブラリーを与える。Ｕｇｉ反応を示す-Ｃ≡Ｎ+−ビオチンの付加は、複雑な大環状ペプチドを得るために環化および転位のカスケードを開始する。完全な変換を受ける生成物にのみ、その中にビオチンが組み込まれる。したがって、Ｕｇｉ大環状化を受けるサブライブラリーを分離および再増幅して、遺伝的にコードされた大環状分子の純粋なライブラリーを得ることができる。
【００９２】
図１１は、ファージライブラリーの最適化のための一つの例示的なスキームを示す。個々の配列を提示するファージに最適な条件は、複数の反応性ペプチドを含むライブラリーにおいて同じ収率が得られるとは限らない。パネルＡは、還元およびアルキル化反応の１つのスキームを示す。パネルＢでは、ライブラリーのアルキル化の観察された収率が約３５％であり、ファージのクローン集団に対する同じ条件では、アルキル化ファージは８０％を超える（図１０）。パネルＣでは、ファージのクローン集団に対して最適化された条件（図２および図３）に基づいて、オキシム修飾で予想されるカップリングは約８０％である。ライブラリーの観察された収率は５０％（パネルＤ）である。したがって、意外なことに、ペプチドの一種類を提示するクローンに対して最適化された条件は、多様なペプチドを提示するクローンの大規模ライブラリーにおいてはるかに低い収率が得られることが見出された。差異は、特定の反応に依存し、ライブラリーの６０％における微妙な差異の８０％（クローン）から、５０％（ライブラリー）における９９％を超える（クローン）著しい変化まで変動する。
【００９３】
図１２は、化学的に修飾され、遺伝的にコードされたライブラリーの選択の一例および遺伝的にコードされた光応答性ファージライブラリーの合成のための一般的な戦略を示す。本明細書に記載のステップ（図７〜図９）を使用して、全てのメンバーが光応答性リンカーを含む純粋なライブラリーを与えるように各工程（還元、アルキル化、環化）の収率を改善することができる。
【００９４】
図１３は、非天然の光感受性リンカーで環化したライブラリーのパニングの結果を示す。パネルＡにおいて、ストレプトアビジンに対する修飾ライブラリーのパニング手順のスキームを示す。パネルＢにおいて、積み重ねられたバーは、パニングの各ラウンド前のライブラリーの組成を示す。パネルＣは、各ラウンドでのファージの投入数に対する溶出された結合ファージ数の比として表されるパニングの各ラウンド後の結合リガンド濃縮を示す。パネルＤは、パニング後のファージ集団のベン図表示を示す。領域は、結合／非結合ファージクローンの数に比例する。データは８０個のクローンのＥＬＩＳＡスクリーニングに基づく。パネルＥに示すとおり、Ｌ３６およびＬ４２の反復照射は、リガンドの光スイッチング能力を大きく変化させることはなかった。*は、複合体が観察されなかったことを示す。Ｕｇｉ反応は、実行され得る修飾されたサブライブラリーのごく一例である。他の反応は、Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ反応、Ｐｅｔａｓｉｓ反応、Ｗｉｔｔｉｇ反応、または向山アルドール反応などのアルデヒドが関わる適用可能な反応として使用することができる。
【００９５】
実施例４：他の生化学的な方法と本方法の比較
【００９６】
図１４は、他の生化学的方法を使用して、図１〜図７に記載の反応の定量化を示す。フルオレセインのカップリングを用いて、ファージのどのタンパク質上で反応が生じるかを可視化した。マイナーなタンパク質ｐＩＩＩに相当するＳＤＳｐａｇｅゲルのバンドは、（半定量分析を用いて）フルオロフォアの濃度の増加とともに次第に蛍光性が強くなる。ｐＩＩＩタンパク質は、ファージ上の他のタンパク質（例えば、ｐＶＩＩＩは１０００倍を超える高い濃度で存在する）と比較してはるかに低い量で存在し、ゲルの全体的な解釈が困難である。大量の非特異的な蛍光がゲルの底に観察され、これは、主要なコートタンパク質ｐＶＩＩＩと関連し得るか、またはゲル上に保持された遊離フルオレセインに相当し得る。
【００９７】
図１５（ＡからＣ）は、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動を用いてリンカーによるマーカーの検出を示す。ファージを、リンカーとの反応前後にヨードアセトアミドフルオレセイン（ＦＩＡ）と反応させた。リンカーとの反応後の蛍光は残っている未反応基を示す（すなわち、リンカーカップリングの効率の指標）。ゲルは、ＢＳＢＣＡリンカーの低濃度でのカップリングが、より高い反応温度でも動作しないことを示す。高濃度のリンカー（１ｍＭ）での反応は、５５℃および室温で同様に良好に進行する。
【００９８】
したがって、本方法は、従来のバルク法に比べて、ペプチド誘導体の改善された検出および定量を提供することがわかる。
【００９９】
実施例５：ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によるペプチド誘導体の捕捉の最適化
【０１００】
図１６は、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によるペプチド誘導体の捕捉の最適化を示す。その下で、ビオチン化ファージが磁気ビーズ（ＭＢ）−ストレプトアビジンによって定量的に捕捉されるが、非ビオチン化ファージの捕捉はゼロである条件を選択した。さらに、ビオチン化ファージの捕捉はビオチン特異的である。ＭＢ−ストレプトアビジンが可溶性ビオチンで事前にブロックされている場合には捕捉は生じない。
【０１０１】
実施例６：ファージ上の様々なアルデヒドの反応の最適化
【０１０２】
図１７は、ファージ上の様々なアルデヒド反応の最適化を示す。この図では、上から下に、複合体グリカンのオキシムライゲーション、アミノベンジルアミンライゲーション／ジムロート転位、Ｗｉｔｔｉｇ反応を示す。それぞれの場合において、ライブラリーのファージは酸化され、アルデヒドを形成する。図４に記載したとおり、反応前後でのアルデヒドの量を、ビオチン−ヒドロキシルアミンを用いて特徴付けた。「１００％変換」は、反応性アルデヒドが適切な試薬とのインキュベーション後に検出されなかったことを意味する。Ｎ末端アルデヒドの上記の構造への変換は、液体クロマトグラフィー質量分析法により監視される同じ条件（ｐＨ、濃度、緩衝液、温度）での合成ペプチド上の独立した反応で確認された。
【０１０３】
図１８は、段階的な環化反応の例（Ａ）を示す図及び対ｐＨの補足％を示すグラフ（Ｂ）である。第１ステップにおいて、ファージは、検出マーカー、ここではビオチンを含むリンカーにより修飾される。第２ステップにおいて、検出マーカーが除去される。ステップ１およびステップ２を定量化し、独立して選択することができる。ステップ１の後に、未反応の分子を廃棄することができる。ｐＨを上げると、第２の反応（環化）が促進され、同時にビーズからのファージの溶出が促進される。ステップ２で反応した分子だけが、次のラウンドへ運ばれ得る。提供した例は、反応条件１でアルデヒドと反応する基（「基１」）および反応条件２（ｐＨ＞８）で反応するエステルなどの脱離基を含む分子（オキシム、ｐＨ＝４.７で反応する）とファージディスプレイアルデヒドとの反応である。基１には、ヒドロキシルアミン（またはアミノオキシ基）が含まれる。ｐＨ＜８でアルデヒドと反応する他の基が適切である。このような基の例としては、安定化された蛍光体イリド（Ｗｉｔｔｉｇ反応）、アミノベンズアミドオキシムおよびアミノベンジルアミンが挙げられる。
【０１０４】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルの指標であり、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
したがって、記載される本発明は、多くの方法で変更することができることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの逸脱と見なされるべきではなく、当業者には明らかであろう全てのこのような改変は、以下の特許請求の範囲の中に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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