(57)【要約】【課題】皮膚細胞のエストロゲンレセプター産生促進組成物を提供することを課題とする。【解決手段】バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物を有効成分として含有する皮膚細胞のエストロゲン受容体産生促進組成物。 【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物を有効成分として含有する皮膚細胞のエストロゲン受容体産生促進組成物。
【請求項２】
バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物が、水、アルコール、またはその混合溶媒の抽出物である請求項１に記載のエストロゲン受容体産生促進組成物。
【請求項３】
アルコールが１，３−ブチレングリコールである請求項２に記載のエストロゲン受容体産生促進組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエストロゲン受容体産生促進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲン受容体（Estrogen Receptor、以下「ER」）とはステロイド受容体スーパーファミリーに属する分子の一つである。卵胞ホルモン受容体とも呼ばれる。そもそもエストロゲンとはエストロン(E1)、エストラジオール(E2)およびエストリオール(E3)の3種類の分子を指しており、いずれもERとの結合能を有する。エストロゲンはステロイドホルモンの一種であり、生殖機能の形成および細胞の増殖を促進する働きを持つ。その生理作用を発現するためには標的組織に存在しているERへの結合を介する必要がある。ERに対してリガンドが結合するとERは活性化を受けてDNAへの結合が促進され、遺伝子の転写を制御する転写因子として機能する。また、植物中に含まれるイソフラボンなどの分子（植物性エストロゲン）や内分泌撹乱物質もERに対して結合能を有し、作用を発現することが知られている。思春期に女性ホルモンであるエストロゲンの分泌が開始され、更年期をむかえ閉経することでエストロゲンの分泌は急激に低下する。
このため、皮膚老化を抑制するためにエストロゲンなどのステロイドホルモンやイソフラボンなどの植物性エストロゲンやエストロゲンの受容体のアゴニストを投与することで皮膚老化を抑制しようとする試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、皮膚老化の抑制のために、ビタミンA 0.001〜0.01重量％及びエストロゲン0.001〜0.01重量％を配合した皮膚化粧料が提案されている。
特許文献２には、エストロゲン様作用剤であるダイズ抽出物、カッコン抽出物、プエラリア・ミリィフィカ抽出物、レッドクローバー抽出物から選ばれる１種以上を配合した抗老化化粧料が提案されている。
特許文献３には、バラ科アロニア属の植物の果実を搾汁した搾汁液もしくは搾汁残渣に含まれる、筋芽細胞の増殖及び筋管細胞への分化を促進する物質がエストロゲン受容体βアゴニストとして機能しエストロゲン効果を促進することが記載されている。
特許文献４には、バラの子房内から胎座組織を分離して培養することにより得られたバラ胎座組織培養物を水に混合させた後、超音波抽出した後、熱水抽出して得られる、バラ胎座組織培養抽出物が皮膚老化抑制作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２５３２４９５号公報
【特許文献２】特許第４４２５１６３号公報
【特許文献３】特開２０１５−２０２０６６号公報
【特許文献４】特許第５５７７４４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、皮膚の老化研究を行う過程で、皮膚細胞のERは単なる継代の繰り返しでは減少しないが、皮膚の老化の因子の一つである紫外線によって減少することを見いだし、さらに研究を継続したところ、バラ科バラ属の花の抽出物に、特異的にERを増加させる作用を見いだし、本発明を完成するにいたった。
本発明は新たなER産生促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、次の構成からなる。
（１）バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物を有効成分として含有する皮膚細胞のエストロゲン受容体産生促進組成物。
（２）バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物が、水、アルコール、またはその混合溶媒の抽出物である（１）に記載のエストロゲン受容体産生促進組成物。
（３）アルコールが１，３−ブチレングリコールである（２）に記載のエストロゲン受容体産生促進組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、あらたな皮膚細胞のエストロゲン受容体産生促進組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】３０代継代培養した老化細胞の増殖能が低下したことを示すグラフである。
【図２】正常細胞と老化細胞のエストロゲンレセプター産生量を示すグラフである。
【図３】活性化酸素によって皮膚細胞のエストロゲンレセプター産生量が低下することを示すグラフである。
【図４】UVA照射によって皮膚細胞のエストロゲンレセプター産生量が低下することを示すグラフである。
【図５】各種バラ科抽出物の示すエストロゲンレセプター産生活性の相違を示すグラフである。
【図６】バラ抽出原料として胎座を高含有した抽出物が、エストロゲンレセプター産生活性が高いことを示すグラフである。
【図７】本発明のバラ抽出物による、活性酸素によって低下したエストロゲンレセプターの産生量が回復したことを示すグラフである。
【図８】本発明のバラ抽出物による、UVBによって低下したエストロゲンレセプターの産生量が回復したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、バラの花の抽出物を有効成分とする皮膚細胞のER産生促進組成物に係る発明である。ERは紫外線や活性酸素の曝露によって産生量が低下するが、本発明の組成物は、細胞内に発現するERを増加させ、皮膚細胞を活性化させる作用を有する。
【００１０】
本発明において、バラは、双子葉植物バラ目バラ科（Rosaceae）バラ属（Rosa）に属する植物の総称であり、低木性の花木である。バラ属の植物は落葉性の低木であり、時にはツル性になる。萼および花弁は通常５個であり、まれに４個の場合もある。栽培種の場合、花弁は多層に重なり合って１０〜２０枚以上となる。
【００１１】
今日、バラと称されるものは、野生種の自然雑種と改良種を意味する。各種には、個体変異が多く、種間雑種になりやすい。バラは、花の美しい形と香りのため観賞用と香料用に栽培されてきており、改良を加えて育成した園芸種（Rosa hybrida Hort.）を意味する。バラは西欧では古代から最も愛される観賞低木であり、現代に至っても、世界で最も人気の高い観賞低木の一つである。西欧の古代のものはRosa gallica、R. centifolia、R. damascenaなどであった。現代のものは、中国の月季花やR. odorataと地中海のR. gallica、R. damascena、R. moschataとの複雑な交配からHybrid Teaが作られた。純黄品種は、イラン原産のR. foetidaとHybrid Teaとの交配によって作られた。野いちごの花と月季花を交配したものにHybird Teaを交配することで、花が大きい多化性フロリバンダ（floribunda）が作られた。
【００１２】
本発明において、「バラ」はこれらをバラ科バラ属に属する植物を意味している。本発明にあっては、抽出素材は、好ましくはバラ科バラ属のダマスクバラ（Rosa damascena）であって、ダマスクバラであれば、どのような品種（交配種、亜種も含む）であってもよい。また、バラの花弁のみであってもよいし、バラの花床全体でも良い。特に好ましくは、バラの花弁と胎座を含む雌蕊が含まれるものが良い。雌蕊は、１輪のバラの花に、複数個（５〜５０）存在する。雌蕊は花柱と子房からなり、胎座は子房内の胚珠にあり、受精したのちに成熟し種子となる胚珠は胎座を介して、成熟に必要な成分を受容する。本発明にあっては、胎座組織及びバラの花弁に、目的とするER産生促進作用を有する成分が多く含まれている。
【００１３】
抽出は、極性の溶媒を使用する。使用可能な極性溶媒として、水、Ｃ１−Ｃ４のアルコール、例えばエタノール、グリセロール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、が例示できる。アルコールとして好ましくは、１，３−ブチレングリコールである。また、これらの溶媒の混合物であっても良い。特に好ましくは水と１，３−ブチレングリコールの１：１の混合溶媒である。
【００１４】
抽出において、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、抽出時間を、それぞれ任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、４〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００１５】
本発明で用いる各抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことも可能であり、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等のクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組み合わせた処理操作を行うことができる。
１，３−ブチレングリコールを用いた抽出の場合、抽出液から減圧濃縮などの方法で濃縮した濃縮物を本発明のエストロゲン受容体産生促進組成物とすることができる。
【００１６】
本発明のエストロゲン受容体産生促進組成物は皮膚の外用剤とすることができる。この場合の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、抽出状況にあわせて最適な外用剤としての形状を任意に選択することができる。
【００１７】
本発明のエストロゲン受容体産生促進組成物を含む外用剤には、抽出物の含有量として、ER発現量を増強させることが確認できる範囲であれば特に制限はない。製剤として、一般的には製剤重量当たり０．０１ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇとなるように配合する。
これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【実施例】
【００１８】
以下に、試験例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（ヒト皮膚線維芽細胞株を用いた加齢による老化モデル細胞の作成試験）
ヒト皮膚線維芽細胞株（NHDF(NB)）を4×105cells/3.5mL dishになるように播種し、37 ℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清(FBS) (Hyclone Laboratories)10%、Penicillin-Streptomycin(Sigma Aldrich)1%を添加したDMEM high glucose, liquid (DMEM) (Life Technologies)を用いた。通常培養には100mmディッシュに細胞を播種し80〜90%コンフルエント時に0.05%Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich)にて剥離し継代を行った。この条件で３０回継代を繰り返し、加齢による老化細胞を得た。
正常細胞と３０代目の老化細胞を同様に4×105cells/3.5mL dishになるように播種し、１０時間経過後と４０時間経過後の細胞数をカウントした。細胞数の計数はBECKMAN COULTER製のセルカウンターを用いて行った。計数結果を図１に示す。
図１に示すように、３０代目の細胞は増殖能が明らかに低下していた。また顕微鏡観察の結果、３０代目の細胞の形態は、加齢による老化細胞の典型的な形態を呈していた。
【００１９】
２．試験例２（老化細胞におけるER発現量）
試験例１で作成した加齢による老化細胞及び正常細胞に発現するERを確認した。
なお、以下の試験系において、ERとあるのは、特に断りのない限りERβのことである。
（１）ERの測定
35mmディッシュに正常細胞及び老化細胞を、それぞれ8×105 cells/mL濃度に調整したDMEM 2mLを播種し、24時間培養を行った。培養および細胞はD-PBSにて洗浄の後、TRIzol Reagent (Life Technologies)にて細胞を溶解し回収した。回収した細胞溶液は-80℃で保存した。
【００２０】
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００２１】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００２２】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer：TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer：TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００２３】
（２）データ解析
controlに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図２に示す。
図２に示すように正常細胞と老化モデル細胞間では有意差がなかった。すなわち、ERの発現は、加齢による老化では低下しないことが確認された。
【００２４】
３．試験例３（環境老化因子である活性酸素のERに及ぼす影響）
老化因子である活性酸素のERに及ぼす影響を確認した。
（１）試験方法
試験例１と同様に正常ヒト線維芽細胞株（NHDF(NB)）を培養し、細胞がコンフルエントに生育した段階で活性酸素に細胞を曝露した。活性酸素による曝露は、過酸化水素水（０．０５ｍM、０．５ｍM）に１時間処理することで行った。
【００２５】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００２６】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００２７】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer: TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer: TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００２８】
（３）データ解析
Controlとして、活性酸素処理なしの細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図３に示す。
図３に示すように正常細胞は活性酸素処理によってERの発現が有意に低下した。すなわち、ERの低下は、活性酸素曝露によって発生することが確認された。その影響は、過酸化水素濃度が０．０５ｍMの場合、ERの発現は、５０％以上低下することが明らかとなった。
【００２９】
４．試験例４（環境因子である紫外線のERに及ぼす影響）
老化因子である紫外線のERに及ぼす影響を確認した。
（１）試験方法
試験例１と同様に正常ヒト線維芽細胞株（NHDF(NB)）を培養し、細胞がコンフルエントに生育した段階で紫外線に細胞を曝露した。紫外線による曝露は、UVA７．５J/cm2を照射することで行った。
【００３０】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００３１】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００３２】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer : TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer : TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００３３】
（３）データ解析
Controlとして、紫外線照射処理なしの細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図４に示す。
図４に示すように正常細胞は老化因子である紫外線照射処理によってERの発現が有意に低下した。すなわち、ERの低下は、環境要因である紫外線曝露によって発生することが確認された。
【００３４】
５．試験例５（バラの花抽出物によるER産生促進効果）
本発明の組成物である、ダマスクバラの花抽出物を用いて試験を行った。なお、用いたバラの花抽出物は、バラの花弁と胎座を含む雌蕊の水と１，３−ブチレングリコールの混合溶媒の抽出物である（製造例１）。この抽出物は総重量の５０％相当が１，３−ブチレングリコールであり、還元糖が０．１％〜０．４％、蒸発残分０．５〜２％を含有する組成物である。
（製造例１）
ダマスクバラの花弁、雌蕊の乾燥物を、その乾燥物の約１０〜５０倍の５０％１，３−ブチレングリコール水溶液を用いて４℃〜室温で抽出し、抽出物を得た。また、ダマスクバラの花１００ｇあたり花弁９５ｇ、雌蕊５ｇとした。特に断りのない限り、当該抽出物を本発明の「バラの花の抽出物」として全ての試験に用いた。
また比較対照として、同様の抽出を行った次のバラ科の植物の花又は葉抽出物を用いた。
ビワリーフB Lot.121009(一丸ファルコス)  以下「ビワ」
セイヨウサンザシB Lot.140588(一丸ファルコス)以下「セイヨウサンザシ」
トウニンB Lot.120940(一丸ファルコス)以下「トウニン」
リンゴ抽出液BG-J Lot.211E412J7(丸善製薬)以下「リンゴ」 
【００３５】
（１）試験方法
試験例１と同様にヒト正常線維芽細胞株（NHDF(NB)）を培養し、細胞がコンフルエントに生育した段階で1日間前培養の後、サンプルを0.01%添加して２４時間培養した。
【００３６】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００３７】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００３８】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer: TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer: TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００３９】
（３）データ解析
Controlとして、試料無添加の細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図５に示す。
図５に示すように正常細胞は、リンゴ、セイヨウサンザシ、トウニン、ビワ、バラの添加により異なる反応を示す。すなわちリンゴ、ビワは、ER産生に影響を及ぼさなかった。セイヨウサンザシ、トウニンは、ERの産生に抑制作用を示した。一方、バラは顕著な発現亢進を示した。
【００４０】
６．試験例６（バラの花抽出物の部位の相違によるER産生促進効果）
本発明の組成物である、ダマスクバラの花抽出物について、バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物（製造例１）、そして、胎座を含む雌蕊を高含有したバラの花の抽出物（製造例２）それぞれの抽出物を用いてER産生促進効果を確認した。
（製造例２）
ダマスクバラの花弁、胎座を含む雌蕊の乾燥物を、その乾燥物の約１０〜５０倍の５０％１，３−ブチレングリコール水溶液を用いて４℃〜室温で抽出し、抽出物を得た。また、ダマスクバラの花１００ｇあたり花弁２ｇ、胎座を含む雌蕊９８ｇとした。これを胎座高含有の組成物として用いた。
【００４１】
（１）試験方法
試験例１と同様に正常ヒト線維芽細胞株（NHDF(NB)）を培養し、細胞がコンフルエントに生育した段階で1日間前培養の後、サンプルを0.01%添加して２４時間培養した。
【００４２】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００４３】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００４４】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer: TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer: TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００４５】
（３）データ解析
Controlとして、試料無添加の細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図６に示す。
図６に示すように正常細胞は、バラの花弁と胎座を含む雌蕊の抽出物（製造例１）、そして胎座を含む雌蕊を高含有したバラの花の抽出物（製造例２）とでその効果に差が出現した。すなわち、胎座を含む雌蕊をより多く含むバラの花の抽出物（製造例２）が明らかに高い効果を示した。ERの産生促進効果は、胎座を含む雌蕊の量に依存しているということができる。
【００４６】
７．試験例７（バラの花抽出物による活性酸素のER抑制障害からの予防試験）
本発明の組成物である、ダマスクバラの花抽出物について、活性酸素によるER抑制障害からの予防試験を行った。
【００４７】
（１）試験方法
ヒト皮膚角化細胞株（HaCaT）を培養し、細胞がサブコンフルエントに生育した段階でバラの花抽出物を0.01%添加し、24時間後に過酸化水素による処理を行った。過酸化水素曝露は、0.5mMを1時間処理することで行った。
【００４８】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００４９】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００５０】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer: TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer: TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００５１】
（３）データ解析
Controlとして、過酸化水素無添加及び試料無添加の細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図７に示す。
図７に示すように正常細胞のER産生能は、活性酸素に曝露することにより低下した。しかし、活性酸素によるER産生能の低下は、バラの花抽出物の前処理にて予防した。
【００５２】
８．試験例８（バラの花抽出物による紫外線のER抑制作用からの予防試験）
本発明の組成物である、ダマスクバラの花抽出物について、紫外線によるER抑制障害予防試験を行った。
【００５３】
（１）試験方法
ヒト皮膚角化細胞株（HaCaT）を培養し、細胞がサブコンフルエントに生育した段階でバラの花抽出物0.01%を処理し、24時間後に紫外線照射を行った。紫外線による曝露は、UVB100J/mm2照射することで行った。
【００５４】
（２）ERの測定
試験例２と同様に以下の操作を行って測定した。
<total RNAの抽出>
溶解した細胞溶液にクロロホルム(和光純薬工業)200μLを加えて15秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて15分間遠心を行った。上層を回収し、2-プロパノールを500μL添加して15秒間激しく混合し、室温で3分間静置の後、4℃、13000rpmにて10分間遠心を行った。上清を取り除いた後、ペレットに70vol%エタノール(和光純薬工業)1mLを添加し、5秒間激しく混合、室温で3分間静置の後、4℃、10000rpmにて5分間遠心を行った。上清を取り除いた後、RNase-free水20μLにて溶解しtotal RNA溶液とした。
【００５５】
<cDNAの合成>
cDNAの合成はPrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)(タカラバイオ)を用いて行った。すなわち、5×PrimeScript RT Master mix：total RNA溶液：RNase-free水を1：1：3の割合で混合し、サーマルサイクラー(MJ Research)を用いて逆転写(37℃ 15分)、逆転写酵素の熱失活(85℃ 5秒)を行い合成した。
【００５６】
<遺伝子発現量の測定>
PCR反応はSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ)を用いて行った。
SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus)(2X)に、
PCR Forward Primer: TGACCGATGCTTTGGTTTGG (0.4μM)、
PCR Reverse Primer: TACTTGTATACACAGGACCTCGC (0.4μM)、
およびcDNAを混合しRNase-free水を加え調整した。その後、LightCycler 480 System(Roche Diagnostics) にて初期変性(95℃ 30秒)、PCR反応(95℃ 5秒、60℃ 30秒、40サイクル)、融解曲線分析(95℃ 5秒、60℃ 1分)を行い、後冷却(50℃ 30秒)した。増幅効率は、比較Ct法(ΔΔCt法)を用いて算出した。サンプル添加時の遺伝子発現量を、サンプル無添加(control)の遺伝子発現量に対する相対比として算出した。
【００５７】
（３）データ解析
Controlとして、紫外線曝露なし・試料無添加の細胞を同様に調整し、これに対する分散性をF検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Student'sのt検定、仮定できない場合にはWelchのt検定を用いて行った。有意水準はp<0.05とした。
結果を図８に示す。
図８に示すように正常細胞のER産生能は、紫外線曝露により低下した。しかし、紫外線によるER産生能の低下は、バラの花抽出物の前処理にて予防した。
以上の試験結果から、皮膚細胞のER産生能は、紫外線や活性酸素の曝露によって低下し、バラの花の抽出物を前処理することによって予防できることが明らかとなった。すなわちバラの花の抽出物は、皮膚の環境要因によって進行する老化を予防し回復させるということができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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