(57)【要約】【課題】凝集が起こりにくく、分散性に優れるプローブ結合担体を提供すること。【解決手段】プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合し、担体表面にプローブを結合する工程を含む、プローブ結合担体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合し、担体表面にプローブを結合する工程を含む、プローブ結合担体の製造方法。
【請求項２】
前記両親媒性物質がカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤またはノニオン性界面活性剤である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記両親媒性物質が、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤およびアミン塩型カチオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記官能基がトシル基またはカルボキシ基である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項５】
前記担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａが、５Å2／官能基以上である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項６】
前記担体が磁性粒子である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項７】
前記磁性粒子の体積平均粒子径が０．１〜２０μｍである、請求項１〜６のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項８】
前記プローブが２５℃の水に難溶である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
前記プローブ結合担体が体外診断薬用または生体関連物質検出用である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１つに記載の製造方法で得られたプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。
【請求項１１】
プローブと両親媒性物質との複合体が化学結合された表面を有する、プローブ結合担体。
【請求項１２】
両親媒性物質を含む、タンパク質または核酸の安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ結合担体の製造方法、標的物質を検出または分離する方法、プローブ結合担体、および、タンパク質または核酸の安定化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機ポリマー粒子や磁性粒子等の担体は、例えば、感染症・癌マーカー・ホルモン等の検査対象物質の検出を行うための、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相などとして用いられている。例えば、このような診断薬においては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が担体上に固定化される。サンプル中の検査対象物質は一次プローブを介して担体上に捕捉された後、第二の検査プローブ（二次プローブ）と反応する。二次プローブが蛍光物質や酵素で標識等されていれば、蛍光や酵素反応等によって検出を行うことができる。
【０００３】
近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。担体を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。
【０００４】
このような用途における前記担体としては、担体表面に抗体や抗原、核酸などの一次プローブとの結合を容易にするための官能基を有する担体が一般的であり、例えば、表面にトシル基を有する磁性粒子が知られている（特許文献１）。
また、担体上に一次プローブを固定化させる際に、より高い検査感度を得るための工夫がなされてきている（特許文献２−３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−０４６５６５号公報
【特許文献２】特開平６−３００７５９号公報
【特許文献３】特開２００１−３３０６１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来用いられている手法では、得られるプローブ結合担体の分散性が悪く、凝集しやすかった。
本発明が解決しようとする課題は、凝集が起こりにくく、分散性に優れるプローブ結合担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記構成例によれば前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の構成例は以下の通りである。
【０００８】
＜１＞  プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合し、担体表面にプローブを結合する工程を含む、プローブ結合担体の製造方法。
【０００９】
＜２＞  前記両親媒性物質がカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤またはノニオン性界面活性剤である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  前記両親媒性物質が、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤およびアミン塩型カチオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
【００１０】
＜４＞  前記官能基がトシル基またはカルボキシ基である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の製造方法。
＜５＞  前記担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａが、５Å2／官能基以上である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１１】
＜６＞  前記担体が磁性粒子である、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の製造方法。
＜７＞  前記磁性粒子の体積平均粒子径が０．１〜２０μｍである、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１２】
＜８＞  前記プローブが２５℃の水に難溶である（以下、該プローブを「難溶性プローブ」ともいう。）、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
＜９＞  前記プローブ結合担体が体外診断薬用または生体関連物質検出用である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１０＞  ＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の製造方法で得られたプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。
【００１４】
＜１１＞  プローブと両親媒性物質との複合体が化学結合された表面を有する、プローブ結合担体。
【００１５】
＜１２＞  両親媒性物質を含む、タンパク質または核酸の安定化剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、凝集が起こりにくく、分散性に優れるプローブ結合担体を容易に得ることができる。
特に、本発明によれば、プローブの活性を維持したまま、プローブを担体に結合させることができ、得られるプローブ結合担体を用いることで、診断や検出等の際、特に化学発光免疫測定（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）、生物発光酵素免疫測定（ＢＬＥＩＡ）や電気化学発光免疫測定（ＥＣＬＩＡ）等のイムノアッセイの際に、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の高い結果を得ることができる（診断や検出等を高感度化することができる）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係る好適な実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下に記載された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含むものとして理解されるべきである。なお、本明細書において、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」等の記載は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、ＡおよびＢをその数値範囲内に含む。
また、本明細書において、「〜（メタ）アクリレート」とは、「〜アクリレート」および「〜メタクリレート」の双方を包括する概念である。同様の記載は、同様の意味を有する。
【００１８】
≪プローブ結合担体の製造方法およびプローブ結合担体≫
本発明に係るプローブ結合担体の製造方法（以下「本方法」ともいう。）は、プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合し、担体表面にプローブを結合する工程（以下「結合工程」ともいう。）を含む。
【００１９】
また、本発明に係るプローブ結合担体は、プローブと両親媒性物質との複合体が化学結合された表面を有する。
本発明に係るプローブ結合担体は、このように、前記複合体が表面に化学結合しているため、該担体を用いた診断や検出等を正確に行うことができ、かつシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が高い結果を得ることができる。
該本発明に係るプローブ結合担体の製造方法は特に制限されず、従来公知の方法であってもよいが、本方法によれば、プローブと両親媒性物質との複合体が化学結合された表面を有するプローブ結合担体が容易に得られると考えられるため、本方法であることが好ましい。
【００２０】
＜結合工程＞
本方法は、プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合することを特徴とする。前記担体とプローブとを結合させる際の系中に両親媒性物質が存在していることで、プローブの凝集が起こりにくく、難溶性プローブを用いた場合でも該プローブの凝集が起こりにくく、また、得られるプローブ結合担体も凝集が起こりにくく、分散性に優れる。
従来の方法では、プローブ、特に難溶性プローブは、担体と結合する際に凝集した状態で結合しやすかった。このようにプローブが凝集した状態で担体に結合していると、プローブ中の反応部位等のプローブの活性部位が凝集体中に埋没し、プローブの有する特性が十分に発揮できず（プローブの活性が低下する）、更に、担体が粒子などの場合には、担体表面に凝集したプローブ存在していることにより、担体粒子自体が凝集する傾向にあった。凝集したプローブ結合担体を用いて診断や検出等を行うと、高ノイズや低シグナルといった問題が発生し、正確な測定を妨げる一因となっていた。
一方、本方法では、プローブの有する特性が十分に発揮される（プローブの活性が維持された）プローブ結合担体を容易に得ることができるため、該担体を用いた診断や検出等の際において、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比の高い結果を得ることができる。
【００２１】
また、前記担体とプローブとを混合する際の系中に両親媒性物質が存在することで、前記担体へのプローブの結合量が増加し、特に、難溶性プローブを用いる場合には、担体とプローブとの結合量が低下しやすいが、両親媒性物質によるプローブ（例：タンパク質）の親水化により、このようなプローブを用いた場合でも、前記担体へのプローブ結合量が多いプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００２２】
前記結合工程は、プローブと官能基を有する担体とを両親媒性物質の存在下で混合すれば特に制限されないが、まず、前記担体と両親媒性物質とを接触させ、担体表面を両親媒性物質に接触させてから、プローブを添加する工程であることが好ましい。斯かる工程によれば、プローブが局所的に高濃度の両親媒性物質に晒されることを抑制できるため、プローブがより沈殿や凝集し難く、より均一にプローブを担体に結合させることができるため、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等の際により低ノイズ、高シグナルを発現できる。
【００２３】
また、前記結合工程は、両親媒性物質を含む液体中で前記担体とプローブとを混合する工程であることが好ましい。この場合の該液体中の両親媒性物質の濃度は、プローブの難溶性の度合に応じて調整すればよく、特に限定されないが、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは０．０００１〜５質量％、特に好ましくは０．００１〜２質量％である。
濃度が前記下限未満の場合、担体に十分な量のプローブを結合できない、または、プローブの活性が低下した状態でプローブが担体と結合する恐れがあり、このために、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。濃度が前記上限を超える場合、前記液体の粘度の上昇によるプローブ結合量の低下や、プローブ結合後の両親媒性物質の除去が難しくなる場合がある。特に、プローブが２５℃の水に難溶性の抗原（以下「難溶性抗原」ともいう。）である場合、両親媒性物質の濃度が前記下限未満の場合には、抗原の凝集が十分に解消されないまま担体に結合する可能性が高く、分析対象物以外の物質の非特異的結合によりＳ／Ｎ比の低下を引き起こしたり、２次プローブとの反応点が凝集塊中に埋没してしまうことに起因するシグナルの低下が起こる場合がある。
【００２４】
プローブの結合を液体中で行う場合、該液体としては特に制限されず、用いる担体やプローブに応じて選択すればよいが、生化学用途等に好適に使用することができ、環境に対して悪影響を及ぼす程度が低くなり、取扱作業者に対する安全性も高くなる等の点から、通常、水系媒体が用いられる。より具体的には、各種緩衝液、水、水と任意の割合で混和するアルコール等の有機溶剤と水との混合溶媒等が用いられる。これらの中でも緩衝液が好ましい。
【００２５】
一般的には緩衝液のｐＨは、４〜１０が好ましい。
官能基がトシル基の場合には、緩衝液のｐＨとしては６〜１０で緩衝能を有する緩衝液が好ましく、ｐＨ７〜９で緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。
官能基がカルボキシ基の場合には、緩衝液ｐＨとしては４〜８で緩衝能を有する緩衝液が好ましく、ｐＨ５〜７で緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。
【００２６】
このような緩衝液としては、前記担体が有する官能基と反応する、または、該官能基の反応を妨害する成分を含まないことが好ましく、このような緩衝液の例としてはＭＥＳ緩衝液やＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００２７】
前記水系媒体としては、水を含有すれば特に制限されず、１種または２種以上の水以外の非水媒体を含んでいてもよい。
また、前記液体には、前記担体、プローブおよび水系媒体の他に、従来公知の添加剤が含まれていてもよく、このような添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、塩類、高分子ポリマーなどが挙げられる。
【００２８】
前記結合工程で用いるプローブの使用量は、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化できる等の点から、プローブを結合する前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、該結合工程で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂの割合（Ｓ１Ｂ／Ｓ１Ａ×１００％）が下記範囲となる量で使用することが好ましい。
【００２９】
また、担体として磁性粒子を用いる態様では、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化できる等の点から、前記結合工程で用いるプローブの使用量は、磁性粒子１００質量部に対して、０．３質量部以上であることが好ましく、１質量部以上であることがより好ましい。また上限は、２００質量部以下であることが好ましく、１００質量部以下であることがより好ましい。
【００３０】
前記結合工程における混合の方法としては特に制限されず、液体中で前記担体とプローブとを混合する場合には、静置するだけでもよく、撹拌等してもよい。
【００３１】
前記混合の時間は、用いる担体やプローブの種類、量等により変化するが、プローブが十分に結合したプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、好ましくは３０分以上、より好ましくは６０分〜２４時間である。
【００３２】
前記結合工程は、室温で行ってもよく、加熱等の下で行ってもよい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やプローブの種類等により適宜選択すればよいが、プローブ活性を保ちつつ、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは１０〜４５℃、特に好ましくは１５〜４０℃である。
【００３３】
前記結合工程は、通常大気中で行われるが、用いる担体やプローブ等に応じて、不活性ガス雰囲気などの特定のガス雰囲気下や、グローボックス等の特定の容器や装置内で行ってもよい。
【００３４】
前記結合工程で得られた担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂは、好ましくは１０Å2／官能基以上、より好ましくは２５Å2／官能基以上、特に好ましくは４０Å2／官能基以上である。
面積Ｓ１Ｂが前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００３５】
前記プローブ結合前の担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａに対する、結合工程で得られた担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂの割合（Ｓ１Ｂ／Ｓ１Ａ×１００％）は、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、特に好ましくは１３０％以上である。
面積の割合が斯かる範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
【００３６】
本発明者が鋭意検討した結果、担体が官能基としてトシル基を有し、かつ、有機ポリマーを含む粒子である場合、有機溶媒中でトシル基量を測定すると、該担体の膨潤によって担体表面だけでなく、内部に存在するトシル基量も併せて測定され、担体の表面物性を評価する方法として適さないことが分かった。このため、詳細は後述するが、担体表面のトシル基量を水系媒体中で測定することで、担体表面のみのトシル基を定量することに成功した。これによりプローブの結合に関与するトシル基量や、非特異吸着の一因となり得るトシル基量を評価することが可能となった。
本発明におけるトシル基１個あたりが占める面積は、詳細は後述するが、水系媒体中で測定した値である。
【００３７】
［官能基を有する担体］
前記担体はその表面に官能基を有すれば特に制限されない。前記担体は２種以上を用いてもよいが、通常は１種である。
【００３８】
前記官能基はプローブを化学的に結合させることができる基であることが好ましく、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、トシル基、メルカプト基、ヒドロキシ基、エポキシ基およびＮ−ヒドロキシスクシミジル基等が挙げられ、中でもトシル基およびカルボキシ基が好ましく、トシル基がより好ましい。なお、本発明においてトシル基とは、ｐ−トルエンスルホニル基のことをいう。
担体に含まれる官能基は２種以上であってもよい。
【００３９】
該トシル基は、通常、プローブと混合または接触させるだけで、プローブを担体の表面に化学的に結合させることができるため、トシル基を有する担体が好適に用いられる。また、担体がトシル基を有することで、縮合剤等を用いなくても、該担体とプローブとを結合させることができるため、該担体を用いることで、簡便に診断や検出等を行うためのプローブ結合担体を得ることができる。
【００４０】
なお、表面にトシル基を有する担体は疎水的な担体であり、該担体と、プローブ、特に２５℃の水に難溶のプローブ等の疎水的なプローブとを結合させる際には、疎水性親和作用により、一般的に担体とプローブとは結合しやすいと考えられ、この結合の際に界面活性剤等の添加剤は必要ないと考えられる。しかしながら、本発明者が鋭意検討した結果、このように担体とプローブとが結合しやすい場合であっても、該結合の際に両親媒性物質を用いた場合に初めて、前記効果を奏することが分かった。
【００４１】
〈担体〉
前記担体の形状は特に限定されず、粒子状、プレート状、フィルター状、シート状等のいずれでも構わないが、粒子状が好ましい。粒子状の担体としては、有機ポリマーから構成される粒子、無機材料から構成される粒子、または、その両方を含む粒子が挙げられる。これらの中でも、軽量であり、所望の粒子を容易に形成できる等の点から、有機ポリマーを含む有機ポリマー粒子が好ましい。
【００４２】
前記有機ポリマー粒子は、架橋重合体であっても非架橋重合体であってもよいが、架橋重合体を少なくとも表面に有する粒子が好ましい。この架橋重合体による架橋構造によって、液体中で本方法を行う場合の、液体への粒子の溶解、または、該液体による粒子表面の膨潤を抑制することができる。有機ポリマー粒子において、架橋重合体を少なくともその表面に有さない場合であって、液体中で本方法を行う場合、該液体に粒子表面が溶解し、結合したプローブが脱離して感度低下を招く場合があり、または、該液体により粒子表面が膨潤して生体関連物質の非特異吸着を増加させる場合がある。
【００４３】
前記担体は、官能基を少なくとも粒子表面に有するものであれば特に制限されない。なお、該「少なくとも粒子表面に有する」とは、粒子表面を構成する成分を指し、有機ポリマー粒子が必ずしもコアシェル構造を有することを要件とするわけではない。従って、前記担体は、全体が架橋重合体である有機ポリマー粒子であってもよい。
【００４４】
前記担体としては、磁性体を有する磁性粒子が好ましい。前記担体として磁性粒子を用いることで、該担体に結合した成分とそれ以外の成分とを除去等することが容易となるため、診断、検出、分離等の操作を大幅に簡略化できる。
【００４５】
前記磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの粒子が挙げられる。これらの中でも、粒径や磁性体含量を容易に調整できる等の点から、コアシェル構造を有する下記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の粒子が好ましく、（ｉｉｉ）の粒子がより好ましい。
（ｉ）有機ポリマーを含む連続相やシリカ等の無機材料中に磁性体粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体粒子または磁性体粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマーやシリカ等の無機材料をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）有機ポリマーやシリカ等の無機材料からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、有機ポリマーを含む層をシェルとする粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に有機ポリマーを含む層がシェルとして設けられていてもよい、有機ポリマーや無機材料からなる多孔質粒子の孔内に磁性体粒子が分散している粒子
【００４６】
前記有機ポリマーとしては特に限定されず、アガロース、デキストラン、セルロース等の天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。前記有機ポリマーとしては、単官能性モノマーおよび架橋性モノマーから選ばれる１種または２種以上に由来するポリマーが挙げられる。
【００４７】
単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマー；グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシル（メタ）アクリレート、メチルグリシジル（メタ）アクリレート等のグリシジル基含有モノマー；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリルアミド等の水酸基含有モノマーが挙げられる。
【００４８】
架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンが挙げられる。
【００４９】
前記有機ポリマーとしては、担体表面に容易にカルボキシ基やトシル基を導入できる等の点から、グリシジル基含有モノマーおよび水酸基含有モノマーから選ばれる１種または２種以上を用いることが好ましい。また、担体表面への官能基の導入を容易に行うことができる等の点から、グリシジル基含有モノマーおよび水酸基含有モノマーの使用量は、担体表面を形成するモノマー全量に対し、５質量％以上であることが好ましい。
【００５０】
以下、（ｉｉｉ）の粒子について具体的に説明する。
【００５１】
前記核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、プローブ結合担体の使用目的等によって適宜選択することができるが、複合化の際の加工性、軽量性等の点から有機ポリマーからなる粒子が好ましい。
前記核粒子を構成する有機ポリマーとしては、ビニル系ポリマーが好ましく、より好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋アクリレート、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていてもよい。
このような核粒子は、従来公知の方法、例えば、特公昭５７−２４３６９号公報、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、特開昭６１−２１５６０４号公報に記載の方法によって製造することができる。
【００５２】
前記核粒子の体積平均粒子径（以下、単に「粒径」ともいう。）は、実施例に記載の方法により測定できる。粒径は、磁気分離性に優れ、重力沈降が起こりにくく、反応場を均一にできる等の点から、好ましくは０．１〜１０μｍ、さらに好ましくは０．２〜５μｍ、特に好ましくは０．３〜２μｍである。
【００５３】
前記磁性体しては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金が挙げられる。
これらの中でも、粒径が５０ｎｍ以下、好ましくは５〜３０ｎｍの酸化鉄系の超常磁性微粒子が好ましく、ＡＦｅ2Ｏ4（Ａは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、ＺｎまたはＬｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表されるフェライト、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはγ−Ｆｅ2Ｏ3を含む超常磁性微粒子がより好ましく、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない等の点から、γ−Ｆｅ2Ｏ3およびＦｅ3Ｏ4からなる超常磁性微粒子が特に好ましい。なお、磁性体の粒子径は、電子顕微鏡写真中の無作意に選択した１００個の粒子の粒子径の平均値である。
【００５４】
前記磁性体粒子の表面は、親水性、疎水性のどちらでも構わないが、粒子の作製が簡便であることから、疎水化処理された粒子であることが好ましい。磁性体粒子表面の疎水化処理方法は特に限定されないが、例えば、磁性体粒子と親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する疎水性物質を、磁性体粒子に接触させて結合させる方法が挙げられる。該方法としては、より具体的には、市販の油性磁性流体から粒子を得、該粒子を乾燥させる方法等が挙げられる。また、磁性体粒子表面を親水化処理する場合には、磁性体粒子表面にグリシジル基などの加水分解され得る基を有する層を導入しておき、該基を加水分解することによって表面を親水化処理することが好ましい。
【００５５】
前記磁性体粒子の使用量は、母粒子や磁性体粒子の粒径等により適宜変化させればよく、特に制限されないが、複数の磁性体粒子が核粒子表面の全体を被覆するような量で使用することが好ましく、核粒子と磁性体粒子の質量比が１０：１〜１：３となるような量で使用することがより好ましい。
【００５６】
核粒子の表面に前記磁性体層が形成された母粒子の製造方法としては特に制限されないが、例えば、非磁性体である有機ポリマー粒子などの核粒子と磁性体粒子とをドライブレンドして、物理的な力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法が挙げられる。
物理的な力をかける方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用する方法や、ジェットミル、ハイブリダイザーなどの高速気流中での衝撃を利用する方法が挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、例えば、撹拌翼付き容器中で撹拌翼の周速度が、好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で撹拌することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、核粒子の表面に磁性体粒子を十分に吸着させることができない場合がある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から決定すればよい。
【００５７】
前記シェルは、例えば前述の方法で調製される母粒子の存在下で、主原料（前記単官能性モノマーおよび架橋性モノマーから選ばれる１種または２種以上）と、必要に応じて副原料（重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤など）とが添加された液体中で重合を行なうことにより形成することができる。
【００５８】
前記有機ポリマー粒子や磁性粒子は、例えば、その表面にトシル基を有することが好ましい。表面にトシル基を有する粒子の製造方法は、トシル基を有するモノマーを用いて粒子を作製する方法や、シェル等を形成する際の反応等によってトシル基を生じさせる方法等であってもよいが、所望の担体を容易に得ることができる等の点から、水酸基を表面に有する粒子を作製した後、該水酸基に対し、アミン等の存在下で塩化ｐ−トルエンスルホニルなどのトシル基含有化合物を反応させるなどによりトシル基を導入する方法が好ましい。
【００５９】
前記有機ポリマー粒子や磁性粒子は、例えば、その表面にカルボキシ基を有することも好ましい。表面にカルボキシ基を有する粒子の製造方法は、カルボキシ基を有するモノマーを用いて粒子を作製する方法や、シェル等を形成する際の反応等によってカルボキシ基を生じさせる方法等であってもよいが、所望の担体を容易に得ることができる等の点から、水酸基を表面に有する粒子を作製した後、該水酸基に対し、トリエチルアミン等の塩基存在下で無水コハク酸、無水マレイン酸、無水アジピン酸などの酸無水物を反応させるなどによりカルボキシ基を導入する方法が好ましい。
【００６０】
前記水酸基を表面に有する粒子の製造方法は特に制限されず、従来公知の方法で行えばよいが、例えば、前記シェルを形成する際の有機ポリマーとして、前記水酸基含有モノマーを用いる方法や、前記シェルを形成する際の有機ポリマーとして、グリシジル基含有モノマーを用い、該グリシジル基を酸などにより開環する方法が好ましい。
前記水酸基としては、担体表面に容易に、効率的にカルボキシ基、トシル基を導入できる等の点から、２，３−ジヒドロキシプロピル基（−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2（ＯＨ））が好ましい。
【００６１】
官能基導入前の担体表面は、診断薬などで使用することを考慮する場合には、標的物質以外の物質が担体表面に吸着するのを抑制できる等の点から、親水性が高いことが好ましく、水（２５℃）との接触角が、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下、特に好ましくは１０°〜２５°である。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の上限を超えると、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着が増加する場合がある。
【００６２】
なお、本発明において、担体が粒子状である場合には、接触角は、担体からなる乾燥塗膜を用いて測定する。
該乾燥塗膜は、５０ｍｇの担体粒子を含む０．２ｍｌの水分散液を、アプリケーターを用いてスライドガラス等の平滑な基材に塗布し、湿度４０％、気温２５℃で２４時間乾燥することにより得られる塗膜である。
該乾燥塗膜と水との接触角は、約１μＬの水滴（２５℃）を乾燥塗膜に滴下し、直ちに該塗膜の水平方向からの画像をカメラで撮影し、水滴の輪郭を円周の一部と仮定して塗膜の水平線との角度から求めることができる。
【００６３】
接触角が前記範囲にある官能基を導入する前の担体は、粒子（表面）を形成する際に用いるモノマーの量および種類等により調整することができる。
【００６４】
・粒径
前記担体が粒子である場合、好ましくは磁性粒子である場合、担体の粒径は、好ましくは０．１〜２０μｍ、より好ましくは０．２〜１５μｍ、特に好ましくは０．３〜１０μｍである。
粒径が前記範囲にあると、単位体積当たりのプローブの結合量が多い担体を容易に得ることができ、該担体を用いることで、診断や検出等の際における感度が良好になる。粒径が前記範囲の下限を下回る場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要しやすく、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になる傾向にあるため、目的外の分子（例えば、タンパク質や核酸等の生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が前記範囲の上限を上回ると、比表面積が小さくなり、プローブの結合量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
粒径は、詳細は後述するが、細孔電気抵抗法（電気的検知帯法）により求められる。
【００６５】
・担体表面の官能基１個あたりが占める面積
前記担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ１Ａ（プローブ結合前の担体表面のトシル基１個あたりが占める面積）は、好ましくは５Å2／官能基以上、より好ましくは１０Å2／官能基以上、特に好ましくは２０Å2／官能基以上であり、好ましくは８０Å2／官能基以下、より好ましくは６０Å2／官能基以下、特に好ましくは４０Å2／官能基以下である。
また、前記官能基がトシル基である場合、面積Ｓ１Ａは、好ましくは５Å2／官能基以上、より好ましくは１０Å2／官能基以上、特に好ましくは２０Å2／官能基以上であり、上限は、前記上限と同程度であり、前記官能基がカルボキシ基である場合、面積Ｓ１Ａは、好ましくは１０Å2／官能基以上、より好ましくは１５Å2／官能基以上、特に好ましくは２０Å2／官能基以上であり、上限は、前記上限と同程度である。
【００６６】
面積Ｓ１Ａが前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
面積Ｓ１Ａが前記範囲の下限を下回る場合、担体表面の官能基密度が高いためにプローブが担体表面に多点で結合しやすい傾向にあり、プローブが変性することによるシグナルの低下を招く場合があり、また、プローブ結合担体に過剰な官能基が残存しやすくなり、担体表面がより疎水的になる傾向にあるため、該担体を用いた診断や検出等の際のノイズの増大を招く場合がある。一方、面積Ｓ１Ａが前記範囲の上限を上回る場合、担体に十分な量のプローブを結合できない傾向にあり、このために、該担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。
【００６７】
・接触角
官能基を有する担体表面の水（２５℃）との接触角は５０°以上であることが好ましい。該担体が粒子状である場合には、該担体からなる乾燥塗膜と水（２５℃）との接触角が、好ましくは７０°以上、より好ましくは９０°以上、特に好ましくは１０５°〜１２０°である。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の下限未満であると、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等の際の感度が低下する場合がある。
また、トシル基を導入する前の担体の接触角が前記範囲にあり、かつ、トシル基を導入した後の担体の接触角がこの範囲にある担体を用いることで、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着を抑制することができ、プローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる。
【００６８】
［プローブ］
前記プローブとしては特に制限されず、診断や検出等に用いる物質であればよいが、特異結合性物質であることが好ましく、具体的には、タンパク質または核酸が好ましく、抗原、抗体がより好ましい。
本方法に使用するプローブは、１種類であることが多いが２種以上であってもよく、特に制限されない。
【００６９】
本方法によれば、前記プローブが２５℃の水に難溶であり、従来の方法で担体に結合させた場合には失活しやすいプローブを用いても活性を保った状態で担体に結合させることができる。なお、ここで「難溶性」とは、疎水性だが水に溶ける性質をいい、より具体的には一般的に血漿分画法として用いられているコーン分画法の各工程において分画沈殿として生成するタンパク質や、３３質量％の硫酸アンモニウム水溶液（２５℃）において塩析による沈殿を生じるものをいう。プローブが難溶性の場合、従来の方法では、粒子に結合させた際にプローブの活性が低下したり、粒子が凝集して再分散性が悪化したが、本方法における、両親媒性物質、好ましくは界面活性剤、特に好ましくはカチオン性界面活性剤の存在下でプローブを担体に結合させることにより、プローブの担体への結合効率や活性の維持率が高まり、担体の凝集、再分散性も改善する。
【００７０】
前記抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであることが好ましく、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗ＴＡＴ抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクログロブリン検査用抗β２−ミクログロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１−ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体が挙げられる。
前記抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【００７１】
［両親媒性物質］
前記両親媒性物質としては、１分子中に親水性基と疎水性基とを有する化合物が挙げられ、より具体的には、界面活性剤；一般的にＮＤＳＢと呼ばれる非界面活性剤型スルホベタインなどの両イオン性有機低分子；ベンジルアルコールなどの芳香族アルコール；エタノール、イソプロパノールなどの脂肪族一価アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；炭酸エチレンなどのアルキレンカーボネート等の有機溶剤等が挙げられる。これらの中でも、容易にプローブの凝集を抑制でき、水系媒体中で結合工程を行うことができ、担体とプローブとの結合量が多く、より分散性に優れるプローブ結合担体を得ることができる等の点から、界面活性剤が好ましい。
本方法に使用する両親媒性物質は、１種類であることが多いが２種以上であってもよく、特に制限されない。
【００７２】
前記界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤および両性界面活性剤が好ましく、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤がより好ましく、カチオン性界面活性剤が特に好ましい。
前記担体がトシル基を有する場合には、前記と同様の理由から、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤がより好ましく、カチオン性界面活性剤が特に好ましく、前記担体がカルボキシ基を有する場合には、前記と同様の理由から、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤がより好ましく、カチオン性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤が特に好ましい。
【００７３】
〈カチオン性界面活性剤〉
前記カチオン性界面活性剤としては特に制限されないが、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、アミン塩型カチオン性界面活性剤等が好ましい。該アミン塩型カチオン性界面活性剤は、第１級〜第３級アミン塩型のいずれでもよいが、前記と同様の理由から第３級アミン塩型であることが好ましい。
また、前記カチオン性界面活性剤としては、前記と同様の理由から、炭素数５以上の有機基を有する界面活性剤が好ましく、炭素数５以上の炭化水素基を有する界面活性剤がより好ましく、炭素数８以上の炭化水素基を有する界面活性剤がより好ましく、炭素数５以上の直鎖アルキル基を有する界面活性剤がさらに好ましく、炭素数８以上の直鎖アルキル基を有する界面活性剤が特に好ましく、芳香環（芳香族ヘテロ環を除く）を有さない界面活性剤が好ましい。
【００７４】
前記カチオン性界面活性剤としては、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性、プローブ結合担体の分散性維持性に優れる等の点から、炭素数５以上の有機基を有する第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤および炭素数５以上の有機基を有する第３級アミン塩型カチオン性界面活性剤が好ましく、下記式（１）で表される界面活性剤（以下「カチオン性界面活性剤（１）」ともいう。）および下記式（２）で表される界面活性剤がより好ましい。
【００７５】
【化１】
2018146535.tif 000002
【００７６】
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数５以上の有機基を示し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して有機基を示し、
ｎは１以上の整数を示し、
Ｚn-はｎ価のアニオンを示す。〕
【００７７】
式（１）中、Ｒ1は、炭素数５以上の有機基を示す。ここで、Ｒ1で示される有機基が、２種以上の炭素数の有機基である場合、その炭素数は平均炭素数を意味とするものとする。平均炭素数は、カチオン性界面活性剤（１）に該当する全分子のＲ1の炭素数の総和を求めて、炭素数を１分子あたりに換算することで算出できる（全分子のＲ1の炭素数の総和／分子の数）。
【００７８】
前記Ｒ1で示される有機基としては、炭素数５〜３０の炭化水素基、炭素数５〜３０のヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５〜３０の基、炭素数が５以上であり、−（ＲＯ）n−Ｈで表されるポリオキシアルキレン基（Ｒ：アルキル基、ｎ：１０以下の整数）、該ポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数５〜３０の基が好ましい。
【００７９】
Ｒ1における炭素数５〜３０の炭化水素基の炭素数としては、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、好ましくは６〜２４、より好ましくは８〜２２、さらに好ましくは９〜２０、特に好ましくは１０〜１８である。
【００８０】
前記炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基が挙げられるが、アルキル基が好ましい。
前記アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、１−メチルデシル基、ドデシル基、１−メチルウンデシル基、１−エチルデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基が挙げられる。
前記アルケニル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。例えば、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基が挙げられる。
前記アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基が挙げられる。
【００８１】
Ｒ1におけるヒドロキシアルキル基の炭素数は５〜３０であるが、好ましくは６〜２４、より好ましくは８〜２２、さらに好ましくは９〜２０、より好ましくは１０〜１８、特に好ましくは１０〜１６である。ヒドロキシアルキル基に含まれるアルキル基としては、前記アルキル基と同様の基が挙げられる。
【００８２】
前記ポリオキシアルキレン基としては、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＨ（ｐは３〜１０の整数を示すが、好ましくは５〜８の整数である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
【００８３】
Ｒ1におけるヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基、および、前記ポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基の総炭素数は、５〜３０であるが、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、好ましくは８〜２６、より好ましくは９〜２５、さらに好ましくは１２〜２４、より好ましくは１４〜２２、特に好ましくは１６〜２０である。また、ポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基におけるポリオキシアルキレン基としては、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）qＨ（ｑは１〜１０の整数を示すが、好ましくは１〜７の整数、より好ましくは１〜４の整数、特に好ましくは１または２である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
【００８４】
また、ヒドロキシアルキル基またはポリオキシアルキレン基を置換する炭化水素基の置換位置としては、ヒドロキシアルキル基またはポリオキシアルキレン基に含まれる水酸基中の水素原子が好ましい。
該置換基における炭化水素基としては、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基、、炭素数７〜２０のアルキルアリール基が好ましい。
【００８５】
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4における有機基としては、炭素数１〜３０の炭化水素基、炭素数１〜３０のヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基、−（ＲＯ）n−Ｈで表されるポリオキシアルキレン基（Ｒ：アルキル基、ｎ：１０以下の整数）、該ポリオキシアルキレン基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された総炭素数２以上の基が好ましい。
【００８６】
Ｒ2における炭素数１〜３０の炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アラルキル基が挙げられる。
【００８７】
Ｒ2におけるアルキル基の炭素数としては、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、１〜１２が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３がより好ましく、１または２が特に好ましい。また、前記アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。該アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。
【００８８】
Ｒ2におけるアルケニル基の炭素数としては、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、２〜１２が好ましく、２〜８がより好ましく、２〜４がさらに好ましく、２または３が特に好ましい。また、前記アルケニル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。該アルケニル基としては、具体的には、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基等が挙げられる。
【００８９】
Ｒ2におけるアラルキル基の炭素数としては、７〜２０が好ましく、７〜１０がより好ましく、７または８が特に好ましい。該アラルキル基としては、具体的には、ベンジル基、フェネチル基等が挙げられる。
【００９０】
Ｒ2におけるヒドロキシアルキル基の炭素数は、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、１〜１２が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３がより好ましく、１または２が特に好ましい。ヒドロキシアルキル基に含まれるアルキル基としては、前記Ｒ2におけるアルキル基と同様の基等が挙げられる。
また、ヒドロキシアルキル基の水素原子の一部が炭化水素基で置換された基に含まれるヒドロキシアルキル基としては、該ヒドロキシアルキル基と同様の基等が挙げられる。
【００９１】
Ｒ2におけるポリオキシアルキレン基としては、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）rＨ（ｒは１〜１０の整数を示すが、好ましくは１〜７の整数、より好ましくは１〜４の整数、特に好ましくは１または２である）で表されるポリオキシエチレン基が好ましい。
【００９２】
Ｒ2において、ヒドロキシアルキル基またはポリオキシアルキレン基を置換する炭化水素基の置換位置としては、ヒドロキシアルキル基またはポリオキシアルキレン基に含まれる水酸基中の水素原子が好ましい。
該置換基における炭化水素基としては、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基、炭素数７〜２０のアルキルアリール基が好ましい。
【００９３】
前記Ｒ2の中でも、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、炭素数１〜３０の炭化水素基、炭素数１〜３０のヒドロキシアルキル基、前記ポリオキシアルキレン基が好ましく、炭素数１〜３０の炭化水素基がより好ましく、アルキル基が特に好ましい。
【００９４】
Ｒ3およびＲ4における有機基としては、炭素数１〜３０の炭化水素基が好ましい。Ｒ3およびＲ4における炭化水素基の炭素数としては、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性に優れる等の点から、１〜１２が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３がより好ましく、１または２が特に好ましい。
Ｒ3およびＲ4における炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。該アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。該アルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。
【００９５】
式（１）中のｎは、対アニオンとなる原子または原子団の価数を意味し、１以上の整数を示す。ｎは好ましくは１である。
【００９６】
式（１）中のＺ（原子又は原子団）としては、具体的には、ハロゲン原子、ＣＨ3ＳＯ4、ＣＨ3ＣＨ2ＳＯ4、ＯＨの他、アミノ酸に由来する原子団、脂肪酸に由来する原子団、炭素数１〜３０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有するリン酸エステルに由来する原子団、ホスホン酸エステルに由来する原子団、スルホン酸エステルに由来する原子団、硫酸エステルに由来する原子団、重合度３以上のスチレンスルホン酸を有するもしくは置換基として炭化水素基を有していてもよい多環式芳香族化合物のスルホン化物のホルマリン縮合物を含有するアニオン性オリゴマーまたはポリマーに由来する原子団が挙げられる。
これらの中でも、ハロゲン原子が好ましく、塩素原子、臭素原子がより好ましく、前記担体がトシル基を有する場合には塩素原子が特に好ましく、前記担体がカルボキシ基を有する場合には臭素原子が特に好ましい。
【００９７】
【化２】
2018146535.tif 000003
〔式（２）中、
Ｒ1、ｎおよびＺは、前記Ｒ1、ｎおよびＺと同義であり、
式（２）における窒素原子は、Ｒ1と該窒素原子を含む環を有することを意味する。〕
【００９８】
前記窒素原子を含む環としては、窒素原子を含み、該窒素原子に結合する２つの結合手のうちの一方が二重結合であり、もう一方が単結合である環であれば、特に制限されないが、例えば、ピリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、チアゾール環等が挙げられ、これらの中でもピリジン環が好ましい。
【００９９】
前記カチオン性界面活性剤の具体例としては、塩化オクチルトリメチルアンモニウム、塩化デシルトリメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジウム、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
これら中でも、難溶性プローブの可溶化、プローブの活性維持性、プローブ結合担体の分散維持性に優れる等の点から、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウムが好ましい。この中でも、プローブ結合担体の分散性とプローブの活性維持性にバランスよく優れる等の点から、前記担体がトシル基を有する場合には臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムが特に好ましく、前記担体がカルボキシ基を有する場合には、塩化セチルピリジニウムが特に好ましい。
【０１００】
前記カチオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【０１０１】
〈アニオン性界面活性剤〉
前記アニオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、炭素数５以上の有機基を有する界面活性剤が好ましく、炭素数５以上の炭化水素基を有する界面活性剤がより好ましく、炭素数８以上の炭化水素基を有する界面活性剤がより好ましく、炭素数５以上の直鎖アルキル基を有する界面活性剤がさらに好ましく、炭素数８以上の直鎖アルキル基を有する界面活性剤が特に好ましく、硫酸塩である界面活性剤が特に好ましい。
アニオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【０１０２】
前記アニオン性界面活性剤としては、具体的には、スルホサクシネート型アニオン性界面活性剤、アルキルエーテルサルフェート型アニオン性界面活性剤、アルカンスルホネート型アニオン性界面活性剤およびその他のアニオン性界面活性剤等が挙げられる。
【０１０３】
（１）スルホサクシネート型アニオン性界面活性剤
スルホサクシネート型アニオン性界面活性剤としては、モノもしくはジアルキル（ラウリル、オクチル、２−エチルヘキシル、ミリスチル、ステアリルなど）スルホコハク酸エステルジもしくはモノナトリウム、および、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）モノもしくはジアルキル（ラウリルオクチル、２−エチルヘキシル、ミリスチル、ステアリルなど）スルホコハク酸エステルジもしくはモノナトリウムなどの炭素数８〜２４の炭化水素基を有するスルホコハク酸エステル塩等が挙げられる。
【０１０４】
（２）アルキルエーテルサルフェート型アニオン性界面活性剤
アルキルエーテルサルフェート型アニオン性界面活性剤としては、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルサルフェートナトリウム塩、および、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜５０）テトラデシルエーテルサルフェートナトリウム塩などの炭素数８〜２４のアルキル基を有するエーテルサルフェート等が挙げられる。
【０１０５】
（３）アルカンスルホネート型アニオン性界面活性剤
アルカンスルホネート型アニオン性界面活性剤としては、ドデシルスルホン酸ナトリウムなどの炭素数８〜２４のアルキル基を有するスルホン酸塩等が挙げられる。
【０１０６】
（４）その他のアニオン性界面活性剤
その他のアニオン性界面活性剤としては、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウムなどの炭素数８〜２４の炭化水素基を有するエーテルカルボン酸またはその塩；（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸ナトリウム；アルキルベンゼンスルホン酸塩；ラウリルリン酸ナトリウム、（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウムなどの炭素数８〜２４の炭化水素基を有するリン酸エステル塩；ラウリン酸ナトリウム、ラウリン酸トリエタノールアミンなどの脂肪酸塩；ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウムなどのアシル化アミノ酸塩等が挙げられる。
【０１０７】
これらのうち好ましいのは、アルカンスルホネート型アニオン性界面活性剤、アルキルエーテルサルフェート型アニオン性界面活性剤のうちの１種以上である。
【０１０８】
〈ノニオン性界面活性剤〉
ノニオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、診断や検出等の際に高いＳ／Ｎ比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、糖由来の構造を有する界面活性剤が好ましく、炭素数５以上の炭化水素基を有する界面活性剤がより好ましく、炭素数５以上の直鎖アルキル基を有する界面活性剤がさらに好ましく、ポリオールであることが好ましく、糖由来の構造を有する界面活性剤が好ましく、チオグリコシド構造を有する界面活性剤がより好ましい。
ノニオン性界面活性剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【０１０９】
ノニオン性界面活性剤としては、アルキルグルコシド、ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルグルカンアミド、シユクロースモノアルキレート、アルキルフェノールアルコキシレート、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０等が挙げられる。これらの界面活性剤中のアルキル基部分の炭素数は５〜１３程度が好ましい。
このようなノニオン性界面活性剤の具体例としては、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなどのアルキルグルコシド；ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカンアミド、ｎ−メナノイル−Ｎ−メチルグルカンアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカンアミドなどのｎ−アルカノイル−Ｎ−メチルグルカンアミド；β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエート、β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエートなどのシュクロースモノアルキレートが挙られる。
【０１１０】
〈両性界面活性剤〉
両性界面活性剤としては、特に限定されないが、具体的には、アミドアルキルベタイン系、スルホベタイン系、カルボキシベタイン系、イミダゾリニウムベタイン系などのベタイン型；アルキルアミノ酢酸系、アルキルアミノプロピオン酸系、アルキル・ジメチルアミノ酢酸系、アルキルアミノジプロピオン酸系などのアミノ酸型やアミノ脂肪酸型；コール酸アミドアルキル・ジメチルアンモニオプロパンスルホン酸型；アルキルアミドタウリン塩型；アルキルアミドプロピルアミンオキシド型；レシチン型などの界面活性剤が挙げられる。
両性界面活性剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【０１１１】
このような両性界面活性剤の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ：ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。
なお、以上の両性界面活性剤は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、塩酸塩、酢酸塩などの塩であってもよい。
【０１１２】
＜ブロッキング工程＞
本方法は、さらにブロッキング工程を有していてもよい。ブロッキング工程は、前記結合工程後の担体表面に疎水性の高い官能基、例えば、トシル基が残存する場合に、該基の担体表面の残存量を減少させる工程（例：トシル基の遊離）であることが好ましい。該ブロッキング工程は、通常、前記結合工程の後に行う。
例えば前記結合工程の後に残存するトシル基は、疎水性が高いために、生体関連物質の非特異吸着の要因となる傾向にあり、トシル基が残存したプローブ結合担体を診断や検出等の際に用いると、ノイズの増大を招く傾向にあるため、前記結合工程において、トシル基を有する担体を用いる場合には、結合工程で得られた担体表面のトシル基を遊離すること、特に化学的にトシル基を遊離することが好ましい。
【０１１３】
前記ブロッキング工程は、具体的には、酸またはアルカリによってトシル基などの官能基を加水分解により遊離する方法、ブロッキング剤をトシル基などの官能基と反応させ、該官能基を遊離する方法などが挙げられる。前記ブロッキング工程は、これらの方法のうちどちらか一方を行ってもよく、２つ以上の方法を行ってもよい。
前記ブロッキング工程としては、得られるプローブ結合担体の非特異吸着性をより抑制できる等の点から、ブロッキング剤をトシル基などの官能基と反応させる方法が好ましい。
【０１１４】
前記ブロッキング剤をトシル基などの官能基と反応させる際には、担体とブロッキング剤とを混合すれば特に制限されないが、担体とブロッキング剤とが容易に接触して、所望のプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、液体中で担体とブロッキング剤とを混合する方法であることが好ましい。この方法における液体は、前記結合工程で挙げた液体と同様の液体が挙げられ、結合工程を液体中で行う場合には、結合工程で得られた液体をそのままブロッキング工程に用いてもよい。
【０１１５】
前記混合の方法としては特に制限されず、液体中で前記担体とブロッキング剤とを混合する場合には、静置するだけでもよく、撹拌等してもよい。
【０１１６】
前記混合の際の混合時間は、用いる担体やブロッキング剤の種類、量等により変化するが、ブロッキングが十分に行われ、ブロッキング工程で得られた担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ２が下記範囲にあるプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、好ましくは２時間以上、より好ましくは６時間以上、特に好ましくは８時間以上である。また、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４８時間以下、より好ましくは３６時間以下、特に好ましくは２４時間以下である。
【０１１７】
前記ブロッキング工程は、室温で行ってもよく、加熱等の下で行ってもよい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やブロッキング剤等の種類などにより適宜選択すればよいが、効率よく所望のプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、特に好ましくは３５〜４０℃である。
【０１１８】
前記ブロッキング工程は、通常大気中で行われるが、用いる担体やブロッキング剤等に応じて、不活性ガス雰囲気などの特定のガス雰囲気下や、グローボックス等の特定の容器や装置内で行ってもよい。
【０１１９】
前記ブロッキング剤としては、トシル基などの官能基に対し反応性の官能基を有する物質であれば特に制限されないが、被検体中のタンパク質や脂質、核酸等の生体分子や細胞、測定試薬中のタンパク質や発光基質、吸光物質等の担体表面への非特異吸着を抑制できる親水性官能基を有する物質であることが好ましい。
【０１２０】
前記トシル基に対し反応性の官能基としては、アミノ基やメルカプト基等の求核性基が挙げられる。
前記親水性官能基としては、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、糖を含む基、双性イオンを含む基、ポリエチレングリコールを含む基等が挙げられる。
【０１２１】
前記ブロッキング剤は、プローブ結合担体への非特異吸着をより抑制できる等の点から、水溶性であることが好ましい。ここで水溶性とは、水と任意の割合で混和するか、２５℃の水１ｇに対し、１０ｍｇ以上溶解する性質のことをいう。
【０１２２】
前記ブロッキング剤としては、低分子化合物、ペプチドやタンパク質等の生体高分子、合成高分子のいずれであってもよいが、立体障害による非特異吸着抑制効果が高い点で生体高分子または合成高分子が好ましく、測定系に生体由来物質を持ち込こまない等の点で合成高分子がより好ましい。
【０１２３】
ブロッキング剤として機能する低分子化合物としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、エタノールアミン等が挙げられ、非特異吸着を特に抑制できる等の点からトリスヒドロキシメチルアミノメタンが好ましい。
ブロッキング剤として機能する生体高分子としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ゼラチンが挙げられ、非特異吸着を特に抑制できる等の点からＢＳＡが好ましい。
ブロッキング剤として機能する合成ポリマーとしては、ポリオキシエチレン等の親水ポリマーを側鎖に有するビニルモノマーの共重合体、ポリオキシエチレン等の親水性ポリマーと他ポリマーのブロック共重合体、末端に官能基を有するポリオキシエチレン等の親水性ポリマーなどが公知である。特に、特開２００８−１７０４１７号公報に示されるポリオキシエチレンの片末端にポリアミンを有する構造の合成ポリマーは、担体表面への非特異吸着抑制のみならず、抗体等プローブの配向を整列させ反応性を向上させる効果も見られることから、本発明の目的に好適に使用できる。このようなブロッキング剤としてＪＳＲライフサイエンス（株）製ブロックマスターＣＥ５１０やＣＥ２１０が挙げられる。
【０１２４】
前記ブロッキング剤を用いる場合の該ブロッキング剤の使用量は、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる等の点から、前記結合工程で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記ブロッキング工程で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）が下記の範囲となる量で使用することが好ましい。
【０１２５】
また、担体として磁性粒子を用いる態様では、前記結合工程で用いるブロッキング剤の使用量は、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化できる等の点から、磁性粒子１００質量部に対して、１質量部以上であることが好ましく、２質量部以上であることがより好ましい。また上限は、２００質量部以下であることが好ましく、１００質量部以下であることがより好ましい。
【０１２６】
・ブロッキング工程で得られた担体表面の官能基１個あたりが占める面積
前記ブロッキング工程で得られた担体表面の官能基１個あたりが占める面積Ｓ２は、好ましくは１５Å2／官能基以上である。
このような面積を有するプローブ結合担体は、プローブ活性が高く、該担体を用いる診断や検出等の際において、非特異吸着をより低減できる。
また、面積Ｓ２は、非特異吸着を少なくし、プローブ活性を高める等の点で、好ましくは３０Å2／官能基以上、より好ましくは４０Å2／官能基以上、特に好ましくは４５Å2／官能基以上である。
なお、トシル基などの官能基は、プローブ結合担体表面に存在していなくてもよい。
【０１２７】
また、前記結合工程で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ１Ｂに対する、前記工程２で得られた担体表面のトシル基１個あたりが占める面積Ｓ２の割合（Ｓ２／Ｓ１Ｂ×１００％）は、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５〜１６０％、さらに好ましくは１２０〜１５０％、特に好ましくは１２５〜１４０％である。
面積の割合が斯かる範囲にあるプローブ結合担体は、タンパク質や核酸等の生体関連物質などの非特異吸着を十分に抑制できるだけトシル基が低減されており、該担体を用いることで、診断や検出の際に、特にＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ等のイムノアッセイにおいて優れた低ノイズ、高いＳ／Ｎ比を達成できる。
面積の割合が前記範囲の下限未満の場合、生体関連物質の非特異吸着が増大する傾向にあり、面積の割合が前記範囲の上限を超える場合、十分な量のプローブが結合したプローブ結合担体が得られない傾向にあり、該担体を用いた診断や検出等において高いシグナルが得られない場合がある。
【０１２８】
＜用途＞
前記本方法で得られるプローブ結合担体および本発明に係るプローブ結合担体は、被検体の診断や検出に、特にＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ等のイムノアッセイに好適に用いることができる。具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として用いることができ、好ましくは免疫診断や核酸検出に用いられ、特に、抗原または抗体等のプローブを結合させた免疫検査用のプローブ結合粒子として用いることができる。
【０１２９】
前記被検体としては特に制限されないが、前記プローブと特異的に結合する物質であることが好ましく、具体的には、免疫検査用試薬および被検査試料等に含まれる生体関連物質および化学物質などが挙げられる。
前記生体関連物質とは、生体に関するすべての物質をいうが、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。前記生体関連物質としては特に限定されないが、例えば、タンパク質（例：酵素、抗体、アプタマー、受容体）、ペプチド（例：グルタチオン）、核酸（例：ＤＮＡ、ＲＮＡ）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例：血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞）が挙げられる。
【０１３０】
≪標的物質を検出または分離する方法≫
本発明における、標的物質を検出または分離する方法は、前記プローブ結合担体を用いる。
該方法では、前記プローブ結合担体を用いるため、特出する高感度で被検出物質を検出することができる。
【０１３１】
検出方法の一例としては、前記プローブ結合担体と、被検体中の標的物質とを接触させることで、標的物質をプローブ結合担体に含まれるプローブを介して該担体上に捕捉した後、二次プローブと反応させる。この際に、二次プローブとして、蛍光物質や放射性同位体、酵素等で標識されたプローブを用い、必要に応じさらに発光試薬等を用いることで、蛍光や酵素反応等によって標的物質の検出を行うことができる。
【０１３２】
分離方法の一例としては、前記プローブ結合担体と標的物質とを反応させた後、集磁し、洗浄することで、標的物質以外を除去分離する方法が挙げられる。
【０１３３】
≪安定化剤≫
前記両親媒性物質は、本方法において、前記効果を奏するだけではなく、プローブ、特にタンパク質や核酸の水系媒体中での凝集や沈殿を抑制し、活性を維持し、分散性を安定化させる役割を果たす。
従って、該両親媒性物質は、プローブ、特にタンパク質または核酸の安定化剤、特に、水系媒体中でのタンパク質または核酸の安定化剤であるともいえる。
【０１３４】
該安定化剤は、両親媒性物質を含めば特に制限されず、前記結合工程の欄に記載の液体や添加剤等を含んでいてもよい。
また、該安定化剤中の両親媒性物質の量は、該安定化剤が、前記水系媒体中に溶解または分散している場合、前記結合工程の欄に記載の濃度と同様の濃度が挙げられる。
該安定化剤中に含まれる両親媒性物質は、１種でもよく２種以上でもよい。
【実施例】
【０１３５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【０１３６】
［粒径の測定］
各粒子の粒径は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４ｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で測定した。電解液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製ＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ）１００ｍＬに、０．１質量％Ｔｗｅｅｎ  ２０水溶液に分散させた１質量％の磁性粒子を、濃度センサが４〜１０％の値を示すまで投入し、粒子５０，０００個の粒子の粒径を測定し、その平均値を算出することで、体積平均粒子径を測定した。
【０１３７】
［トシル基の定量］
水１ｍＬに分散させた磁性粒子（Ａ）１００ｍｇをマイクロチューブに採取し、エチレンジアミンを１００μＬ加え、４０℃で１５時間反応した。反応後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収した。上清２０μＬをイオンクロマトグラフィー（装置：ＤＩＯＮＥＸ社製ＩＣＳ２０００、カラム：ＡＳ１８、検出：電気伝導度、流速：１．０ｍＬ／分、測定時間：３０分、溶離液：５０ｍＭ  水酸化カリウム水溶液）で分析し、保持時間２３分程度に現れるピークの面積を求めた。別途、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムをイオンクロマトグラフィーで分析することで得られた検量線から、磁性粒子（Ａ）１００ｍｇあたりの表面トシル基量を算出した。
【０１３８】
［カルボキシ基の定量］
カルボキシ基の定量は、「表面荷電量」として電導度滴定法により、磁性粒子の表面に存在する酸を測定することで行った。測定法が記載された文献「Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３７，Ｐ．１６１，（１９７２）」を参照し、Ｍｅｔｒｏｈｍ社製の７９４  Ｂａｓｉｃ  Ｔｉｔｒｉｎｏを用いて定量した。
【０１３９】
［磁性粒子表面の官能基１個あたりが占める面積の算出］
磁性粒子表面の官能基１個あたりが占める面積は、以下の式で求められる。
磁性粒子表面の官能基１個あたりが占める面積＝磁性粒子の表面積／表面官能基の個数
具体的には以下の式で求められる。
磁性粒子表面の官能基１個あたりが占める面積［Å2／官能基］＝１／（１．００４×磁性粒子比重［ｇ／ｃｍ3］×粒径［μｍ］×官能基量［ｍｍｏｌ／ｇ］）
【０１４０】
実施例で用いた磁性粒子の比重は、以下の方法で求めた。
磁性粒子粉末３０ｍｇを、示差熱熱重量同時測定装置（（株）日立ハイテクサイエンス製ＳＴＡ７３００）に入れ、昇温速度：１０℃／分、リミット温度：５００℃、ホールド時間：２０分、サンプリング時間：１．０秒、ガス種：窒素、ガス流量：２００ｍＬ／分の条件で測定し、磁性粒子に含まれる酸化鉄と樹脂の質量％をそれぞれ求めた。酸化鉄比重を５．２［ｇ／ｃｍ3］、樹脂比重を１．１［ｇ／ｃｍ3］とし、前記得られたそれぞれの質量％の値から、磁性粒子の比重を算出した。
【０１４１】
［磁気分離時間］
０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液を用い、磁性粒子を０．０１質量％含む試験液を調製した。この試験液よく分散させた後、光路長１ｃｍの角型光学セルに入れ、分光光度計（日本分光（株）製、Ｖ−７５０型）にセットし、セルホルダー横であって、分光光度計が発する光の光路から外れる位置に磁性粒子を引きつけることが可能な位置に表面磁束密度２９００ガウスのネオジム磁石を置いた時を０秒として、５５０ｎｍにおける吸光度が初期の１０％に減衰するまでの時間（秒）を測定し、この時間を磁気分離時間とした。
【０１４２】
磁気分離時間は、粒子の分散度合の尺度を示す数値として用いることができる。一般的には、プローブ結合前の粒子（ベース粒子）が最も分散した状態であり（分散性が良く）、従って磁気分離時間は遅くなる。ベース粒子にプローブを結合した際に、プローブが良く分散した状態で粒子に結合している場合には、プローブ結合粒子の分散性も良く磁気分離時間も遅いままであるが、プローブが凝集状態で結合した場合には、プローブ結合粒子でも凝集が起こり、従って磁気分離時間は早くなる。分散性の良いプローブ結合粒子においては磁気分離時間がベース粒子と比較して８０％以上を維持しているが、軽度の凝集がある場合にはベース粒子の磁気分離時間の５０〜８０％となり、極度に凝集が起こると、磁気分離時間はベース粒子の磁気分離時間の５０％未満となる。
【０１４３】
［粒子の分散度合いの測定］
リコンビナントＨＩＶ抗原結合磁性粒子の分散度合いを、以下の基準に基づき判断した。
○：ベース粒子の磁気分離時間と比較して、８０％以上の磁気分離時間である
△：ベース粒子の磁気分離時間と比較して、５０％以上８０％未満の磁気分離時間である
×：ベース粒子の磁気分離時間と比較して、５０％未満の磁気分離時間である
【０１４４】
［抗原結合量の定量］
ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、磁性粒子に結合した抗原の定量を行った。まず、リコンビナントＨＩＶ抗原０μｇ、５μｇ、１０μｇまたは１５μｇが溶解したＭＥＳ緩衝液（（２−（４−モルホリノ)エタンスルホン酸：（株）同仁化学研究所製）、０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．０）５０μＬをそれぞれマイクロチューブに分注し、前記キット中の試薬Ａと試薬Ｂとを５０／１（ｖ／ｖ）で混合して作製したｗｏｒｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ０．５ｍＬを各マイクロチューブに添加した。３７℃で６０分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、ＯＤ５６２の測定を行い、検量線を作成した。
続いて、リコンビナントＨＩＶ抗原結合磁性粒子１ｍｇをマイクロチューブに採取し、５０μＬのＭＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．０）に分散させた。そこに、Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ０．５ｍＬを添加し、３７℃で６０分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、ＯＤ５６２の測定を行った。検量線から抗体結合量を算出した。
【０１４５】
［化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）］
白色９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のウェル１およびウェル２に、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（以下「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」ともいう。）、０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）５０μＬに分散したリコンビナントＨＩＶ抗原結合磁性粒子１５μｇをそれぞれ添加した。
次に、ノイズ測定用として、ＢＳＡ／ＴＢＳ緩衝液（１質量％ＢＳＡ、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）１０μＬをウェル１に添加した。
また、シグナル測定用として、ＢＳＡ／ＴＢＳ緩衝液（１質量％のＢＳＡを含む）１０μＬに溶解した抗リコンビナントＨＩＶ抗体１０μｇをウェル２に添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後、粒子を磁石で集磁し上清除去を行い、９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャー（テカンジャパン（株）製、Ｈｙｄｒｏ  Ｆｌｅｘ）を用い、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で粒子を洗浄した。この集磁−洗浄操作を計５回行った。次に、アルカリフォスファターゼを標識したリコンビナントＨＩＶ抗原を５０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。反応後、前記と同様に９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャーを用いて集磁−洗浄操作を計５回行った。
その後、ウェル１およびウェル２それぞれに、発光基質（富士レビオ（株）製クラスＩＩＩシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加した。発光基質添加から５分間、２５℃で反応させた後に、発光強度を化学発光測定機（ＡＲＶＯ  Ｘ５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いてノイズおよびシグナルの発光強度を測定した。
【０１４６】
［合成例１］トシル基含有磁性粒子の作製
１．１  核粒子の作製
７５質量％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（（株）日油製、「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、以下「パーロイル」という。）２質量部を１質量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部と混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間撹拌した。別の容器でメチルメタクリレート（以下「ＭＭＡ」という。）９５質量部およびトリメチロールプロパントリメタクリレート（以下「ＴＭＰ」という。）５質量部を０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部中で乳化させた後、得られた乳化液を前記リアクターに入れ、４０℃で２時間撹拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみを取り出して水洗し、乾燥、粉砕し、核粒子を得た。得られた核粒子の粒径は１．５μｍであった。
【０１４７】
１．２  母粒子の作製（磁性体層の形成）
油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性微粒子を得た。超常磁性微粒子の平均一次粒子径は、０．０２μｍであった。
【０１４８】
次いで、前記核粒子（１５質量部）および前記疎水化された表面を有する超常磁性微粒子２０質量部をミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、超常磁性微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子を得た。母粒子の粒径は、２．０μｍであった。
【０１４９】
１．３  母粒子への第１、第２ポリマー層の形成
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液３３３質量部を１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記母粒子（１３．３質量部）を投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液１００質量部に、ＭＭＡ１８質量部、ＴＭＰ２質量部およびパーロイル０．４質量部を分散させたプレエマルションを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに２時間かけて滴下し、６０℃に保持したまま更に１時間撹拌することで、母粒子表面に第１ポリマー層を形成した。
【０１５０】
次いで、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液５０質量部に、グリシジルメタクリレート８．７５質量部、ＴＭＰ１．２５質量部およびパーロイル０．２質量部を分散させたプレエマルションを、６０℃にコントロールした１時間撹拌後の前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間２０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させることで、第１ポリマー層上に第２ポリマー層を形成した。
【０１５１】
次いで、磁気により前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、該粒子を蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子を得た。この粒子の粒径は３．０μｍであった。
【０１５２】
１．４  グリシジル基の加水分解
得られたグリシジル基を有する磁性粒子（１．０質量部）に、１質量％硫酸水溶液１０質量部を加え、超音波を５分間照射して粒子を分散させ、次いで、６０℃で５時間撹拌した。続いて、得られた液から磁性粒子を磁気分離により単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返すことによりＯＨ基含有磁性粒子を得た。
【０１５３】
１．５  トシル基含有磁性粒子の作製
前記ＯＨ含有磁性粒子（１．０質量部）をアセトニトリルで３回洗浄した後、１０質量部のアセトニトリルに分散させ、そこに、０．０２質量部のパラトルエンスルホニルクロライド（和光純薬工業（株）製）と０．０３質量部のトリブチルアミンとを加え、２５℃で４時間撹拌した（トシル基の導入）。反応終了後、磁気により得られた粒子を分離し、アセトニトリルで３回、続いて蒸留水で４回洗浄した。以上により、トシル基含有磁性粒子（磁性粒子（Ａ））を調製した。この粒子の粒径は３．０μｍ、表面トシル基量は７６μｍｏｌ／ｇ、磁性粒子表面のトシル基１個あたりが占める面積は、３２（Å2／トシル基）であった。また、プローブ結合前のベース粒子としての磁気分離時間は５８秒であった。
【０１５４】
［合成例２］カルボキシ基含有磁性粒子の作製
前記ＯＨ含有磁性粒子（１．０質量部）を１，３−ジオキソランで３回洗浄した後、１０質量部の１，３−ジオキソランに分散させ、そこに、１質量部の無水コハク酸と０．１５質量部のトリエチルアミンとを溶解した溶液を加え、２５℃で４時間撹拌した（カルボキシ基の導入）。反応終了後、磁気により得られた粒子を分離し、１，３−ジオキソランで３回、続いて蒸留水で４回洗浄した。以上により、カルボキシ基含有磁性粒子（磁性粒子（Ｂ））を調製した。この粒子の粒径は３．０μｍ、カルボキシ基量は１０μｍｏｌ／ｇ、磁性粒子表面のカルボキシ基１個あたりが占める面積は、２５（Å2／カルボキシ基）であった。また、プローブ結合前のベース粒子としての磁気分離時間は５８秒であった。
【０１５５】
［実施例１］
合成例１で得られた磁性粒子（Ａ）５ｍｇを、２ｍＬマイクロチューブに採取し、磁気スタンドを用いて上清を除去した。そこに、０．１質量％テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有したＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（（株）同仁化学研究所製）、ｐＨ７．５）を０．５ｍＬ加えて分散させ、磁気スタンドを用いて上清を除去した（洗浄工程）。再度、０．５ｍＬの該緩衝液を加えて粒子を洗浄した後に、０．４８８ｍＬの該緩衝液を加えて粒子を分散させた。続いて、リコンビナントＨＩＶ抗原（Ｆａｐｏｎ社製）を５０μｇ（１２μＬ）添加した後に、室温で１８時間反応させた。反応終了後、磁気スタンドを用いて上清を回収し、粒子ペレットをＴＢＳ−Ｔ緩衝液０．５ｍＬに分散させ、超音波照射機（シャープ（株）製：ＵＴ−２０６Ｓ）を用いて５分間処理した。その後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液０．５ｍＬを用いて粒子を３回洗浄した。以上により、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１）を作製した。
【０１５６】
［実施例２〜１０］
使用する界面活性剤の種類を表１に記載の界面活性剤に変更した以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−２〜Ａ−１０）を作製した。
なお、表中の「ＣＨＡＰＳＯ」は、（株）同仁化学研究所製の３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅである。
【０１５７】
［実施例１１］
合成例２で得られた磁性粒子（Ｂ）５ｍｇを、２ｍＬマイクロチューブに採取し、磁気スタンドを用いて上清を除去した。そこに、０．１質量％テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有したＭＥＳ緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．０）を０．５ｍＬ加えて分散させ、磁気スタンドを用いて上清を除去した（洗浄工程）。再度、０．５ｍＬの該緩衝液を加えて粒子を洗浄した後に、０．４８３ｍＬの該緩衝液を加えて粒子を分散させた。続いて、リコンビナントＨＩＶ抗原（Ｆａｐｏｎ社製）を５０μｇ（１２μＬ）添加した後に、０．１質量％ＥＤＣ（Ｎ−ジメチルアミノプロピル−Ｎ'−エチルカルボジイミド塩酸塩：（株）同仁化学研究所製）水溶液を５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、磁気スタンドを用いて上清を回収し、粒子ペレットをＴＢＳ−Ｔ緩衝液０．５ｍＬに分散させ、超音波照射機（シャープ（株）製：ＵＴ−２０６Ｓ）を用いて５分間処理した。その後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液０．５ｍＬを用いて粒子を３回洗浄した。以上により、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−１）を作製した。
【０１５８】
［実施例１２〜２０］
使用する界面活性剤の種類を表１に記載の界面活性剤に変更した以外は、実施例１１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−２〜Ｂ−１０）を作製した。
【０１５９】
［比較例１］
界面活性剤を使用しなかった以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１１）を作製した。
【０１６０】
［比較例２］
界面活性剤の代わりに０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム（和光純薬工業（株）製）を使用した以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１２）を作製した。
【０１６１】
［比較例３］
界面活性剤の代わりに１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１３）を作製した。
【０１６２】
［比較例４］
界面活性剤の代わりに１．０ｍｏｌ／Ｌ尿素（和光純薬工業（株）製）を使用した以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１４）を作製した。
【０１６３】
［比較例５］
界面活性剤の代わりに２．０ｍｏｌ／Ｌ尿素を使用した以外は、実施例１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ａ−１５）を作製した。
【０１６４】
［比較例６］
反応時に界面活性剤を使用せず、０．１質量％ＥＤＣ水溶液の添加量を２５μＬに変更した以外は、実施例１１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−１１）を作製した。
【０１６５】
［比較例７］
界面活性剤を使用せず、ＥＤＣ水溶液の濃度を１質量％に変更し、ＥＤＣ水溶液の添加量を２５μＬに変更した以外は、実施例１１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−１２）を作製した。
【０１６６】
［比較例８］
界面活性剤の代わりに１．０ｍｏｌ／Ｌ尿素を使用した以外は、実施例１１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−１３）を作製した。
【０１６７】
［比較例９］
界面活性剤の代わりに４．０ｍｏｌ／Ｌ尿素を使用した以外は、実施例１１と同様の手法にて、リコンビナントＨＩＶ抗原を結合させた磁性粒子（Ｂ−１４）を作製した。
【０１６８】
【表１】
2018146535.tif 000004