(57)【要約】【課題】血液透析患者のＱＯＬを低下させる痒みの起因物質を明らかにし、痒みのメカニズムの解明を行うこと。【解決手段】β２マイクログロブリンは、痒みの起因物質であり、β２マイクログロブリンをバイオマーカーとして利用することで、透析患者の痒みを評価することができる。また、β２マイクログロブリンを利用するアッセイ系を構築することで、痒みのメカニズムの解明、抗掻痒薬・掻痒予防薬のスクリーニングや薬効評価を行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
痒みのバイオマーカーとしてのβ２マイクログロブリンの利用。
【請求項２】
痒みが透析患者の痒みである請求項１に記載のβ２マイクログロブリンの利用。
【請求項３】
生体試料中のβ２マイクログロブリン量を測定することを特徴とする痒みの評価方法。
【請求項４】
生体試料が透析患者の血液、尿または皮膚組織のいずれかである請求項３に記載の痒みの評価方法。
【請求項５】
被験化合物をげっ歯類に投与する工程、被験化合物が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる抗掻痒化合物のスクリーニング方法。
【請求項６】
げっ歯類がマウスである請求項５に記載の抗掻痒化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗掻痒薬または掻痒予防薬をげっ歯類に投与する工程、抗掻痒薬または掻痒予防薬が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる掻痒の治療薬または予防薬の評価方法。
【請求項８】
げっ歯類がマウスである請求項７に記載の掻痒の治療薬または予防薬の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透析患者の痒みのバイオマーカー並びに該バイオマーカーを利用する透析患者の痒みの評価方法、痒みの抑制化合物のスクリーニング方法および痒みの治療薬・予防薬の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎不全は、血液透析の必要性につながる可能性のある数年にわたる腎機能の進行性喪失である。血液透析を受けている患者は、重度の尿毒症性掻痒症を発症する（非特許文献１）。国際的前向き観察研究DOPPS（the Dialysis Outcomes and Practice Patterns Study）の結果は、血液透析を受けている患者の掻痒と死亡率との間の関係を示し、この研究では、痒みと死亡率の関係は、睡眠の質が低いことが原因と考えられている（非特許文献２）。従って、痒みの制御は、血液透析を受けている患者にとって非常に重要である。
【０００３】
肥満細胞からのヒスタミンは、かゆみメディエーターとしてよく知られており、H1ヒスタミン受容体アンタゴニストはかゆみの治療のために最初に選択される薬物である。血漿ヒスタミン濃度は尿毒症性掻痒症患者で上昇するが（非特許文献３）、抗ヒスタミン剤は関連する掻痒症を抑制しない（非特許文献４）。
また、肥満細胞は、セリンプロテアーゼ、トリプターゼも放出する。トリプターゼは、ヒトにおけるPAR2の活性化およびげっ歯類を通してかゆみまたは掻痒を誘発する。
【０００４】
アラキドン酸代謝物であるトロンボキサンA2およびロイコトリエンB4は起痒物質であり、アトピー性皮膚炎などの掻痒性皮膚疾患の痒みに関与している。しかし、プロスタグランジンE2およびロイコトリエンD4などの他のアラキドン酸代謝物は、マウスにおいて引っ掻きを誘発しない。
【０００５】
唐辛子の成分であるカプサイシンによる繰り返し治療が、いくつかの掻痒症（例えば、サブスタンスP、セロトニン、およびヒスタミンによって誘発される掻痒、血液透析治療を必要とする慢性腎不全（非特許文献５）、ヒドロキシエチルデンプン誘発掻痒症および錯感覚性背痛で行われている。また、カプサイシン感受性ニューロンを枯渇させたマウスでは、皮膚アレルギー誘発掻爬が消失する（非特許文献６）。
【０００６】
βマイクログロブリンは、透析患者の血中で増加する蛋白であり（非特許文献７）、血中・尿中のβマイクログロブリンは、糸球体と尿細管機能の評価するバイオマーカーとして利用されている。また、透析患者の皮膚に蓄積することが知られている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Saudi J Kidney Dis Transpl 2011;22(2):268-272.
【非特許文献２】Nephrol Dial Transplant (2006) 21 (12): 3495-3505.
【非特許文献３】T Mettang et al. Clin Nephrol 34 (3), 136-141. 9 1990.
【非特許文献４】Weisshaar et al. Exp. Dermatol. 13, 298-304 2004.
【非特許文献５】Breneman et al. J. Am. Acad. Dermatol. 26, 91-94 1992.
【非特許文献６】Nakano et al. Acta Derm Venereol 2008; 88: 449-454.
【非特許文献７】Teruel-Briones et al. Nefrologia. 2013; 33(5): 640-9.
【非特許文献８】Assounga et al. Am J Kidney Dis. 1990 Jun; 15(6): 556-61.
【非特許文献９】Kumagai et al. Am J Nephrol 2012; 36: 175-183
【非特許文献１０】Peer et al. Lancet 348, 1552-1554 1996.
【非特許文献１１】Pauli-Magnus et al. J Am Soc Nephrol 11: 514-519, 2000.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、オピオイドκ受容体アゴニストの塩酸ナルフラフィン（非特許文献９）およびオピオイド受容体アンタゴニストのナルトレキソン塩酸塩は、血液透析を受けている患者において痒みを抑制することが見出された（非特許文献１０）。一方で、塩酸ナルトレキソンが掻痒を和らげないことも報告されている(非特許文献１１）。  
臨床経験によれば、塩酸ナルフラフィンは、血液透析を受けている患者の痒みをコントロールしているかもしれないし、コントロールしていないかもしれない。さらに、塩酸ナルフラフィンは投与を中止した後に痒みが再発する。オピオイド系の活性化は、血液透析を受けている患者の掻痒の原因ではない可能性がある。したがって、掻痒の根底にあるメカニズムは不明なままである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、マウスの吻側背中にβ２マイクログロブリンを皮内注射すると、後足の引っ掻きが誘発されることを見出し、さらに研究を進め、掻爬はオピオイド受容体アンタゴニストであるナルトレキソンによって阻害されること、β２マイクログロブリンをマウス頬に皮内注射した場合、後肢による注射部位への引っ掻き動作は観察されるが、前肢による擦る動作は観察されないなどの知見を得た。一方で、血液透析治療を必要とする慢性腎不全（非特許文献５）の掻痒症にカプサイシンによる繰り返し治療が行われており、カプサイシン感受性ニューロンを枯渇させたマウスでは、皮膚アレルギー誘発掻爬が消失する（非特許文献６）との報告があることから、反復カプサイシンの処理がβ２マイクログロブリン誘発掻爬に及ぼす影響を検討した結果、カプサイシンを用いた前処理の繰り返しは、β２マイクログロブリン誘発掻爬を阻害した。すなわち、β２マイクログロブリンは起痒物質であり、カプサイシン受容体TRPV1発現感覚ニューロンの活性化を介してその効果が発揮されることが明らかとなった。それら知見より発明者らは、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、以下のとおりである。
［１］痒みのバイオマーカーとしてのβ２マイクログロブリンの利用。
［２］透析患者の痒みのバイオマーカーとしてのβ２マイクログロブリンの利用。
［３］生体試料中のβ２マイクログロブリン量を測定することを特徴とする痒みの評価方法。
［４］透析患者の血液、尿または皮膚組織のいずれかのβ２マイクログロブリン量を測定することを特徴とする痒みの評価方法。
［５］被験化合物をげっ歯類に投与する工程、被験化合物が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる抗掻痒化合物のスクリーニング方法。
［６］被験化合物をマウスに投与する工程、被験化合物が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる抗掻痒化合物のスクリーニング方法。
［７］抗掻痒薬または掻痒予防薬をげっ歯類に投与する工程、抗掻痒薬または掻痒予防薬が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる掻痒の治療薬または予防薬の評価方法。
［８］抗掻痒薬または掻痒予防薬をマウスに投与する工程、抗掻痒薬または掻痒予防薬が投与されたマウスの吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる掻痒の治療薬または予防薬の評価方法。
【発明の効果】
【００１１】
血液透析を受けている患者では、β２マイクログロブリンが皮膚に沈着しており、患者の血液中のβ２マイクログロブリンの増加がこの皮膚組織に漏れることを示唆している。また、血液透析を受けている患者では、表皮への神経の伸長が増加するが、神経の伸長は感覚ニューロンの感受性を増加させるので、血液透析を受けている患者では、β２マイクログロブリンに対する感受性もまた増加する。従って、β２マイクログロブリンを痒みのバイオマーカーとして使用し、血液や皮膚組織におけるβ２マイクログロブリンを測定することで、痒みの程度を客観的に評価することができる。
また、β２マイクログロブリンを起痒物質とするアッセイ系を構築することで、痒みのメカニズムの解明、抗掻痒薬・掻痒予防薬のスクリーニングや薬効評価を行うことができる。
【００１２】
β２マイクログロブリンは、ヘモクロマトーシス（HFE）タンパク質または一次求心性ニューロン上の未確認の受容体を介して引っ掻き行動を起こさせている可能性があり、β２マイクログロブリンを利用したアッセイ系を構築することで、新たな作用機序の抗掻痒剤をスクリーニングすることができる。また、新たな作用機序の解明により、血液透析患者の痒みを効果的に抑制する方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウスにおけるβ２マイクログロブリンの掻き動作の誘発を説明する図である。図中、β2-MGはβ２マイクログロブリンを、Heatedβ2-MGはβ２マイクログロブリンを100℃で1時間処理したものを、VHはビヒクル（生理食塩水：溶媒）をそれぞれ意味する。値は平均±SEM（n = 8）を表す。 * VH処置マウスと比較してP <0.05。 β2-MG処置マウス（Holm-Sidak試験）と比較して#P <0.05であった。マウス吻側背部へのβ２マイクログロブリン（10μg/部位）の皮内注射は、ビヒクル処置マウスと比較して、後肢による注射部位への掻き動作をより多く誘発した（図1A）。 この効果は、2番目の10分間にピークに達し、30分でほぼ完全に低下した（図1A）。 引っ掻きは、注射部位あたり0.1〜10μgのβ2-MGの範囲で用量依存的に増加した; 3および10μg/部位で有意な増加が観察された（図1B）。 熱処理したβ2-MGは、掻き動作を誘発しなかった（図1C）。
【００１４】
【図２】β2-ミクログロブリンをマウス頬に皮内注射した後の掻き動作を説明する図である。図中、β2-MGはβ２マイクログロブリンを、VHはビヒクル（生理食塩水）をそれぞれ意味する。マウスの頬にβ2-MG（10μg/部位）またはビヒクル（V H）を皮内注射した後、注射部位への後肢による掻き動作を1時間計数した。値は平均±SEM（n = 8）を表す。 * VH処置マウス（Holm-Sidak試験）と比較してP <0.05。
【００１５】
【図３】オピオイド受容体アンタゴニストであるナルトレキソンのβ２マイクログロブリン誘発掻痒に対する影響を説明する図である。図中、β2-MGはβ２マイクログロブリンを、VHはビヒクル（生理食塩水）をそれぞれ意味する。値は平均±SEM（n = 8）を表す。 * VH1 + VH2で処置したマウスと比較してP <0.05。 #P <0.05であり、VH1 +β2-MG（Holm-Sidak試験）で処置したβ2-MG処置マウスと比較した。オピオイド受容体アンタゴニストのナルトレキソン（1および10mg / kg）による前処理は、β2-MG（10μg/部位）皮内注射によって誘発された掻き動作を有意に用量依存的に阻害した。
【００１６】
【図４】β２マイクログロブリン誘発掻痒反応に対する各種抗掻痒薬の効果を説明する図である。図中、DCHCHは7-[2α, 4α-(dimethylmethano)-6β-(2-cyclohexyl-2β-hydoxyacetamino)- 1α-cyclohexyl]-5(Z)-heptanoic acidを、CMHVAは5-[2-(2-carboxyethyl)- 3-[6- (4-methoxyphenyl)-5E-hexenyl]oxyphenoxy] valeric acid)をそれぞれ意味する。H1ヒスタミン受容体アンタゴニストのテルフェナジン（30mg / kg）、TPトロンボキサン受容体アンタゴニストDCHCH （100mg / kg）、BLT1ロイコトリエンB4受容体アンタゴニストCMHVA（30 mg / kgおよび50 mg / kg）、プロテアーゼ活性化受容体2（PAR2）アンタゴニストFSLLRY-NH2（30 mg / kg）は、β２マイクログロブリン（10μg/部位）皮内注射によって誘発される掻き動作に影響しなかった。
【００１７】
【図５】カプサイシンの前処理がβ２マイクログロブリン誘発掻痒反応に及ぼす影響を説明する図である。図中、β2-MGはβ２マイクログロブリンを、CAPはカプサイシンを、VH１は生理食塩水を、VH2はエタノールをそれぞれ意味する。値は平均±SEM（n = 8）を表す。 * VH1 + VH2で処置したマウスと比較してP <0.05。 VH1 +β2-MG（Holm-Sidak試験）で処置したマウスと比較して、＃P <0.05。カプサイシンを用いた前処理の繰り返しは、β2-MG誘発掻痒反応を完全に阻害した。カプサイシンの代わりにビヒクルで前処置したマウスでは、皮内のβ2-MG（10μg/部位）が皮内ビヒクルと比較して有意に掻き動作を誘発した。
【００１８】
【図６】DRGニューロンの初代培養におけるErkのリン酸化を説明する写真である。  図中、p-Erkはリン酸化Erkを意味する。β2-MG（10μg/ mL）で処置したDRGニューロンでは、p-Erk免疫反応性を示すニューロンの数が増加した。 対照的に、対照DRGニューロンにはp-Erk免疫反応性はなかった。 特に、TRPV1免疫反応性DRGニューロンは、β2-MG（p-Erk / TRPV1 = 52.9％[108/204ニューロン]）によって誘導されるp-Erk免疫反応性を示した。 一方、DRG TRPV1免疫反応性ニューロン（108/155）の70％がp-Erk免疫反応性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、β２マイクログロブリンとは、電気泳動でβ２位に移動度を示す分子量11,800の低分子タンパク質であり、ＨＬＡクラスI抗原のL鎖として自己・非自己も認識に不可欠な構造蛋白である
【００２０】
本発明は、β２マイクログロブリンを痒みのバイオマーカーとして利用する方法を提供する。特にβ２マイクログロブリンを痒みの起因物質としての性質を利用したバイオマーカーとしての使用方法の提供である。
β２マイクログロブリンを痒みのバイオマーカーとして利用するには、β２マイクログロブリンを測定する必要があるが、その測定方法として、β２マイクログロブリンに対する抗体を用いるイムノアッセイが好ましい。イムノアッセイを用いることでβ２マイクログロブリンを高感度かつ高精度に検出することができる。
ヒトβ２マイクログロブリンに対する抗体および該抗体を用いるキットは、市販のものを用いることもできるが、常法によりβ２マイクログロブリンに対する抗体を取得し、常法によりELISAなどのイムノアッセイ系を構築してもよい。
【００２１】
本発明は、生体試料中のβ２マイクログロブリン量を測定することを特徴とする痒みの評価方法を提供する。特に生体試料中として、透析の患者、好ましくは血液透析の患者から採取した生体試料中のβ２マイクログロブリンを測定することを特徴とする痒みの評価方法を提供する。
本発明の痒みの評価方法において、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、皮膚組織などが挙げられるが、好ましくは、常法に従って血液から液性成分を分離した血清または血漿である。
評価方法は、点数法やVAS(Visual Analogus Scale)などの主観的な評価方法と生体試料中のβ２マイクログロブリン量の増減との関連付けを行って実施すればよい。
【００２２】
本発明は、被験化合物をげっ歯類に投与する工程と、被験化合物が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程と、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる抗掻痒化合物のスクリーニング方法を提供する。
げっ歯類として、マウス、ラットが挙げられるが、マウスが好ましい。
被験化合物の投与部位は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、皮膚表面のいずれであってもよいが、被験化合物の溶解性などその特性に応じて適宜選択すればよい。
投与部位の掻き動作を計測の計測は、例えば、後肢による引っ掻き挙動をデジタルビデオカメラで記録し、再生して、後肢による注射部位傷かきの数を数えるなどすればよい。
【００２３】
本発明は、抗掻痒薬または掻痒予防薬をげっ歯類に投与する工程と、抗掻痒薬または掻痒予防薬が投与されたげっ歯類の吻側背部にβ２マイクログロブリンを皮内投与し痒みを惹起させる工程と、後肢による投与部位の掻き動作を計測する工程からなる掻痒の治療薬または予防薬の評価方法を提供する。
げっ歯類として、マウス、ラットが挙げられるが、マウスが好ましい。
抗掻痒薬または掻痒予防薬の投与部位は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、皮膚表面のいずれであってもよいが、抗掻痒薬または掻痒予防薬の溶解性などその特性に応じて適宜選択すればよい。
投与部位の掻き動作の計測は、例えば、後肢による引っ掻き挙動をデジタルビデオカメラで記録し、再生して、後肢による注射部位への掻き動作を数えるなどすればよい。
【実施例】
【００２４】
以下、試験例により本発明をさらに詳細に説明する。
＜実験動物＞
雄のICRマウス（日本SLC、浜松、日本）4〜8週齢を用いた。
【００２５】
＜行動観察＞
マウスを順応のために少なくとも1時間4つの区画からなるアクリル製ケージ（13×9×35cm）に個々に配置した。 予め除毛しておいた吻側背部皮膚に50μLの容量の生理食塩水に溶解したβ2-MG（BBI Solutions、Cardiff、UK）を皮内注射し、直後にマウスを同じケージに戻し、その挙動を１時間デジタルビデオカメラ（HDC-TM25、Panasonic、Osaka、Japan）を用いて記録した。後肢による注射部位への掻き動作回数を数えるためにデジタル記録を再生した。マウスは通常1秒間に数回掻くので、足を挙げて降ろすまでの一連の動作を掻き動作の1回として数えた。
【００２６】
・試験例１
＜マウスにおけるβ２マイクログロブリンの掻き動作の誘発＞
マウス吻側背部へのβ２マイクログロブリン（10μg/部位）の皮内注射し、掻き動作を観察した。その結果、β２マイクログロブリン投与マウスは、ビヒクル処置マウスと比較して、後肢による注射部位への掻き動作をより多く誘発した（図1A）。 この効果は、2番目の10分間にピークに達し、30分でほぼ完全に終息した（図1A）。 掻き動作は、注射部位あたり0.1&#12316;10μgのβ2-ミクログロブリンの範囲で用量依存的に増加した; 3および10μg/部位で有意な増加が観察された（図1B）。 100℃で1時間熱処理したβ２マイクログロブリンは、掻き動作をほとんど誘発しなかった（図1C）。
【００２７】
・試験例２
＜β2-ミクログロブリンをマウス頬に皮内注射した後の掻き動作＞
β２マイクログロブリンを頬に皮内注射した。 β２マイクログロブリン（1および10μg/部位）は、後肢による掻き動作（かゆみ関連反応）を誘発した（図２）。 しかし、同部位への前肢による擦り動作（痛み関連反応）は認められなかった（データは示されていない）。
【００２８】
・試験例３
＜β２マイクログロブリン誘発掻痒に対するオピオイド受容体アンタゴニストの影響＞
オピオイド受容体アンタゴニストのナルトレキソン塩酸塩（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）を生理食塩水に溶解し、β２マイクログロブリンの15分前に皮下注射した。その結果、ナルトレキソン（1および10mg / kg）による前処理は、β２マイクログロブリン（10μg/部位）によって誘発される掻き動作を有意に用量依存的に阻害した（図３）。
【００２９】
・試験例４
＜β2-ミクログロブリン誘発掻痒に対する各種薬剤の効果＞
β2-ミクログロブリン（10μg/部位）の皮内注射後、注射部位への後肢による掻き動作を1時間計数した。各種薬剤に関しては以下のとおり。
テルフェナジン（Sigma-Aldrich）を0.5％カルボキシメチルセルロースナトリウムに溶解し、β２マイクログロブリン皮内注射の30分前に経口投与した。
7- [2α,4α-(ジメチルメタン)-6β-(2-シクロヘキシル-2β-ヒドロキシアセトアミノ)-1α-シクロヘキシル]-5(Z)-ヘプタン酸（DCHCH）および5-[2-(2-カルボキシエチル)-3-[6-(4-メトキシフェニル)-5E-ヘキセニル]オキシフェノキシ]吉草酸（CMHVA）は、それぞれ、0.5％カルボキシメチルセルロースに溶解し、β2-ミクログロブリン皮内注射の60分前に経口投与した。
FSLLRY-NH2（Bachem、Bubendorf、Switzerland）を生理食塩水に溶解し、β2-ミクログロブリンと共に皮内注射した。その結果、H1ヒスタミン受容体アンタゴニストのテルフェナジン（30mg / kg）、TPトロンボキサン受容体アンタゴニストDCHCH （100mg / kg）、BLT1ロイコトリエンB4受容体アンタゴニストCMHVA（30 mg / kgおよび50 mg / kg）、プロテアーゼ活性化受容体2（PAR2）アンタゴニストFSLLRY-NH2（30 mg / kg）は、β２マイクログロブリン（10μg/部位）によって誘発される掻き動作に影響しなかった（図４）。
【００３０】
・試験例５
＜カプサイシンの繰り返し処理がβ２マイクログロブリン誘発掻き動作に及ぼす影響＞
β２マイクログロブリン（10μg/部位）の皮内注射後、注射部位への後肢による掻き動作を1時間計数した。 β２マイクログロブリンまたはそのビヒクル（生理食塩液）の皮内注射前に、あらかじめ除毛しておいた吻側背部皮膚にエタノールに溶解したカプサイシン（1％）（Sigma-Aldrich）またはそのビヒクル（エタノール）を100μLの容量で3回塗布した。その結果、カプサイシンを用いた前処理の繰り返しは、β２マイクログロブリン誘発の掻き動作を完全に阻害した。カプサイシンの代わりにビヒクルで前処置したマウスでは、皮内のβ２マイクログロブリン（10μg/部位）が皮内ビヒクルと比較して有意に掻き動作を誘発した（図５）。
【００３１】
・試験例６
＜後根神経節（DRG）ニューロンの初代培養およびβ2-MGによる処理＞
胸椎〜腰椎(T1-L6)レベルのDRGをマウスから取り出し、直ちに氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸漬した。DRGをトランスフェクション培地OPTI-MEM（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）中の0.25％コラゲナーゼ（Wako Pure Chemical Industries）で37℃、1時間、次いで0.25％トリプシン-EDTA（Invitrogen）37℃、10分間処理し、細胞を分離する。グリア細胞および線維芽細胞を死滅させる2μMシトシンアラビノシド（Sigma-Aldrich）の存在下、10％熱不活性化ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen）中で細胞を少なくとも3日間培養した。 OPTI-MEMでDRGニューロンを洗浄した後、10μg/ mLのβ2-ミクログロブリンを10分間添加した。次いで、ニューロンをPBSで洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、細胞を0.3％Triton X-100を含むPBSで処理し、次いで0.25％ウシ胎仔血清で処理して、非特異的免疫グロブリン結合をブロックした。細胞を一次抗体（モノクローナルウサギ抗リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ（p-Erk）（Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）およびヤギ抗TRPV1（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）で処理した。洗浄後、調製物をRhodamine (TRTIC)結合抗ヤギIgG（Molecular Probes、Eugene、OR、USA）およびAlexa Fluor 488結合抗ウサギIgG（4℃で1：細胞をPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を用いて蛍光シグナルについて評価した。その結果、β2-ミクログロブリンは、TRPV1カプサイシン受容体陽性DRGニューロンの70％を活性化した。一方、β2-ミクログロブリンによって活性化されるDRGニューロンの約47％がTRPV1陰性であった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
β２マイクログロブリンを痒みのバイオマーカーとして使用し、血液や皮膚組織におけるβ２マイクログロブリンを測定することで、痒みの程度を客観的に評価することができる。また、β２マイクログロブリンを起痒物質とするアッセイ系を構築することで、痒みのメカニズムの解明、抗掻痒薬・掻痒予防薬のスクリーニングや薬効評価を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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