(57)【要約】【課題】本発明は、細胞挙動を制御することのできる化合物及び新規な手法を提供することを課題とする。【解決手段】下式（１）で表される化合物を含む、細胞伸展・増殖調節剤。2018068192.tif 000051【選択図】図６
2018068192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）で表される化合物を含む、細胞伸展・増殖調節剤。
2018068192.tif 000044
式中、
Ar1は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表し、
Ar2は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表すか、又は存在せず、Ar2が複数存在するとき、Ar2はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Rは、水素原子、ハロゲン原子、又はC1〜3アルキル基を表し、
Yは、以下から選択される基を表し、Yはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
2018068192.tif 000045
Wは、酸素原子又は硫黄原子を表し、
R1は、−(CH2)m1-N+A-又は−(CH2)m1-SO3-M+を表し、
A-は、ハロゲン原子のアニオンを表し、
M+は、一価の金属原子のカチオンを表し、
m1は、１〜５の整数を表し、
Z1及びZ2は、それぞれ、アルキレン、オキシアルキレン又は脂環式構造を表すか、或いは存在せず、
n1は、0又は1を表し、n1が1のときは、Z1はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2は、0又は1を表し、n2が1のときは、Z2はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
sは、0〜3の整数を表し、
tは、0又は1の整数を表し、
AUは、分子量500〜100,000の親水性ブロックポリマー単位を表し、
BUは、分子量500〜100,000の疎水性ブロックポリマー単位を表す。
【請求項２】
Ar1がフェニレンを表し、
Yが以下から選択される基を表し、
2018068192.tif 000046
Rが水素原子を表す、
請求項１に記載の細胞伸展・増殖調節剤。
【請求項３】
親水性ブロックポリマー単位が、ポリエチレングリコール構造、ポリエチレンイミン構造、又は以下の式（２）により表される繰り返し構造を有する、請求項１又は２に記載の細胞伸展・増殖調節剤。
R'−(CA-CB)p-(CH2)q-        （２）
式中、
CAは、少なくとも１つの基−RAによって水素原子が置換されている、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1〜8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCBに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1〜3アルキル基及び／又はハロゲン原子で更に置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RAは、−L−(Ra)rを表し、
Raは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン基、ホスホン基、チオール基、グアニジル基、アミジル基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、アンモニウム基、グアニジウム基、ホスホリルコリン基、−(CH2CH2O)x1CH3、又は単糖類を表し、
x1は、１〜１０００の整数を表し、
rは、１以上の整数を表し、rが２以上のとき、Raはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、リンカーであり、アルキレン基、アリーレン基、トリアゾーレン基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合、並びにそれらの組み合わせを有する単位構造から選択され、
CBは、カーボネート結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合から選択されるか、或いは存在せず、
pは、2〜2000の整数を表し、
qは、0〜20の整数を表し、
R'は、水素原子であるか、以下から選択される基を表す。
2018068192.tif 000047
【請求項４】
疎水性ブロックポリマー単位が、以下の式（３）により表される繰り返し構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞伸展・増殖調節剤。
−(CX-CY)u-R'        （３）
式中、
CXは、カーボネート結合、エステル結合又はカルボニル結合を表すか、或いは存在せず、
CYは、少なくとも１つの基−RBによって水素原子が置換されていてもよい、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1~8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCXに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1〜3アルキル基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RBは、−L−(Rb)vを表し、
Rbは、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂環式構造、疎水性アミノ酸又は疎水ペプチドを表し、これらの基において、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換されていてもよく、
vは、１以上の整数を表し、vが２以上のとき、Rbはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、式（２）で定義されるものと同じ範囲のリンカーを表し、
R'は、式（２）で定義されるものと同じ範囲の基を表し、
uは、2〜3000の整数を表す。
【請求項５】
式（１）で表される化合物が以下から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞伸展・増殖調節剤。
2018068192.tif 000048
2018068192.tif 000049
2018068192.tif 000050
（式中、
n4は、3〜700を表し
n5は、4〜900を表し、
n6は、5〜1000を表し、
m2は、10〜2300を表す。）
【請求項６】
請求項１に記載の式（１）で表される化合物を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞の伸展及び／又は増殖を調節する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の式（１）で表される化合物を備える、細胞培養用キット。
【請求項８】
請求項１に記載の式（１）で表される化合物を含む、細胞培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の化合物を含む、細胞伸展・増殖調節剤に関する。また、本発明は、細胞の伸展及び／又は増殖を調節する方法、細胞培養用キット及び細胞培養用培地等に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己の細胞を利用し、病変・欠損した組織を再生させる「再生医療」は、幹細胞研究の発展も相まって、近年ますます注目を浴びている。一般に、細胞を直接患部に移植・注入しても組織の修復は芳しくないため、生体外で培養し、増殖させて移植片を構築させる手法がとられる。実用的な移植片に必要な細胞数は数千万〜数億と言われ、近年、3Dプリンティングや「細胞シート」積層化、細胞積層・集積技術など「トップダウン」型手法を用いて、複数異種の細胞からなる「生体に近い」秩序的な三次元組織の構築が可能になってきたが、大型化や量産化、コスト面など改善すべき技術的課題は未だ多く残されている。
一方、培養器の構造や材質によって、単純な培養操作でサブミリサイズの球状の細胞凝集体（スフェロイド）を形成させることができるため、生産性の点で優位であるが、秩序的な組織構造構築が難しく、細胞塊の生存性が低い。
【０００３】
また、近年、ナノ材料の形状が与える生体内動態への影響に注目が集まっている。両親媒性ブロック共重合体が水中で形成するナノ会合体は、ドラッグデリバリーシステムへの応用が検討されてきた。更には、非特許文献１には、親水性のポリエチレングリコール（PEG）と疎水性のポリ−Ｌ−乳酸（PLLA）からなる両親媒性ブロック共重合体のブロック間に、芳香環と水素結合ユニットからなるN-(4-(ureidomethyl)benzyl)benzamide（4UMBA）を導入したPEG-4UMBA-PLLAが、ナノチューブを形成することが報告されている。非特許文献２及び３には、ドラッグデリバリーシステムや抗菌剤において、ナノ形状効果が報告されている。
しかしながら、これら従来技術においては、PEG-4UMBA-PLLAやその類似体が形成するナノ会合体が、細胞挙動に対してどのような影響を与えるかについて何ら示されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S-H. Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 4508-4512
【非特許文献２】D. Li et al., Adv. Funct. Mater., 2016, 26, 66-79
【非特許文献３】K. Fukushima et al., ACS Nano, 2012, 6, 9191-9199
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、再生医療に関連する細胞培養技術において、改善すべき技術的課題が未だ多く残されている状況に鑑み、本発明は、細胞挙動を制御することのできる化合物及び新規な手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、両親媒性ブロック共重合体のブロック間に芳香環と水素結合ユニットからなる構造を有する化合物が、細胞の増殖や形態制御に作用することを新たに見出した。本発明は、これらの新規な知見に基づいて完成されたものである。
一実施態様において、本発明は、下式（１）で表される化合物を含む、細胞伸展・増殖調節剤に関する。
2018068192.tif 000003
（式中、
Ar1は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表し、
Ar2は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表すか、又は存在せず、Ar2が複数存在するとき、Ar2はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Rは、水素原子、ハロゲン原子、又はC1〜3アルキル基を表し、
Yは、以下から選択される基を表し、Yはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
2018068192.tif 000004
Wは、酸素原子又は硫黄原子を表し、
R1は、−(CH2)m1-N+A-又は−(CH2)m1-SO3-M+を表し、
A-は、ハロゲン原子のアニオンを表し、
M+は、一価の金属原子のカチオンを表し、
m1は、１〜５の整数を表し、
Z1及びZ2は、それぞれ、アルキレン、オキシアルキレン又は脂環式構造を表すか、或いは存在せず、
n1は、0又は1を表し、n1が1のときは、Z1はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2は、0又は1を表し、n2が1のときは、Z2はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z2はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
sは、0〜3の整数を表し、
tは、0又は1の整数を表し、
AUは、分子量500〜100,000の親水性ブロックポリマー単位を表し、
BUは、分子量500〜100,000の疎水性ブロックポリマー単位を表す。）
【０００７】
本発明の一実施態様によれば、式（１）中、
Ar1がフェニレンを表し、
Yが以下から選択される基を表し、
2018068192.tif 000005
Rが水素原子を表す、
上記細胞伸展・増殖調節剤が提供される。
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、式（１）中、親水性ブロックポリマー単位が、ポリエチレングリコール構造、ポリエチレンイミン構造、又は以下の式（２）により表される繰り返し構造を有する、上記細胞伸展・増殖調節剤が提供される。
R'−(CA-CB)p-(CH2)q-        （２）
（式中、
CAは、少なくとも１つの基−RAによって水素原子が置換されている、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1〜8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCBに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1〜3アルキル基及び／又はハロゲン原子で更に置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RAは、−L−(Ra)rを表し、
Raは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン基、ホスホン基、チオール基、グアニジル基、アミジル基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、アンモニウム基、グアニジウム基、ホスホリルコリン基、−(CH2CH2O)x1CH3、又はグルコース、ガラクトース、マンノース及びフルクトース等の単糖類を表し、
x1は、１〜１０００の整数を表し、
rは、１以上の整数を表し、rが２以上のとき、Raはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、リンカーであり、アルキレン基、アリーレン基、トリアゾーレン基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合、並びにそれらの組み合わせを有する単位構造から選択され、
CBは、カーボネート結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合から選択されるか、或いは存在せず、
pは、2〜2000の整数を表し、
qは、0〜20の整数を表し、
R'は、水素原子であるか、以下から選択される基を表す。）
2018068192.tif 000006
【０００９】
本発明の一実施態様によれば、式（１）中、疎水性ブロックポリマー単位が、以下の式（３）により表される繰り返し構造を有する、上記細胞伸展・増殖調節剤が提供される。
−(CX-CY)u-R'        （３）
（式中、
CXは、カーボネート結合、エステル結合又はカルボニル結合を表すか、或いは存在せず、
CYは、少なくとも１つの基−RBによって水素原子が置換されていてもよい、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1~8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCXに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1~3アルキル基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RBは、−L−(Rb)vを表し、
Rbは、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂環式構造、疎水ペプチド又はコレステロールを表し、これらの基において、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換されていてもよく、
vは、１以上の整数を表し、vが２以上のとき、Rbはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、式（２）で定義されるものと同じ範囲のリンカーを表し、
R'は、式（２）で定義されるものと同じ範囲の基を表し、
uは、2〜3000の整数を表す。）
【００１０】
本発明の一実施態様によれば、式（１）で表される化合物が以下から選択される、前記細胞伸展・増殖調節剤。
2018068192.tif 000007
2018068192.tif 000008
2018068192.tif 000009
（式中、
n4は、3〜700を表し、
n5は、4〜900を表し、
n6は、5〜1000を表し、
m2は、10〜2300を表す。）
【００１１】
別の一実施態様において、本発明は、式（１）で表される化合物を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞の伸展及び／又は増殖を調節する方法に関する。
また別の一実施態様において、本発明は、式（１）で表される化合物を備える、細胞培養用キットに関する。
また更に別の一実施態様において、本発明は、式（１）で表される化合物を含む、細胞培養用培地に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞挙動を制御することのできる化合物及び新規な手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-ポリεカプロラクトン（PCL）及びPEG-4UMBA-ポリトリメチレンカーボネート（PTMC）の透過型電子顕微鏡（TEM）画像である。
【図２】PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMCのTEM画像である。
【図３】PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCに関する、動的光散乱解析の結果である。
【図４】培養6時間後の、正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）の位相差像である。
【図５】培養48時間後、クリスタルバイオレットで染色したNHDFの位相差像である。
【図６】培養48時間後の、NHDFの伸展及び増殖を示すグラフである。
【図７】培養48時間後の、NHDFの伸展及び増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳述する。
本発明において、細胞挙動を制御することのできる化合物は、以下の式（１）で表される（以下、本明細書において、式（１）で表される化合物を、「本発明ポリマー」という。）。
2018068192.tif 000010
（式中、
Ar1は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表し、
Ar2は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表すか、又は存在せず、Ar2が複数存在するとき、Ar2はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Rは、水素原子、ハロゲン原子、又はC1〜3アルキル基を表し、
Yは、以下から選択される基を表し、Yはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
2018068192.tif 000011
Wは、酸素原子又は硫黄原子を表し、
R1は、−(CH2)m1-N+A-又は−(CH2)m1-SO3-M+
A-は、ハロゲン原子のアニオンを表し、
M+は、一価の金属原子のカチオンを表し、
m1は、１〜５の整数を表し、
Z1及びZ2は、それぞれ、アルキレン、オキシアルキレン又は脂環式構造を表すか、或いは存在せず、
n1は、0又は1を表し、n1が1のときは、Z1はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z1はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
n2は、0又は1を表し、n2が1のときは、Z2はC1〜2アルキレンであるか存在せず、Z2はそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
sは、0〜3の整数を表し、
tは、0又は1の整数を表し、
AUは、分子量500〜10万の親水性ブロックポリマー単位を表し、
BUは、分子量500〜10万の疎水性ブロックポリマー単位を表す。）
なお、Yは２価の基であるが、表記されているとおりの向きだけでなく、表記されているのとは左右反対の向きで結合していてもよい。
【００１５】
本発明ポリマーは、両親媒性ブロック共重合体のブロック間に、芳香環と水素結合ユニットを含む構造を有する。この芳香環と水素結合ユニットを含む構造は、液晶性を発現する部位でもあり得、メソゲンとも呼ばれる。
本発明ポリマーは、水中で異方性のナノ会合体を形成し、この異方性ナノ会合体が、細胞培養液内に添加される液性因子として作用、又は細胞培養液内成分（血清タンパク質等）に作用し、細胞の増殖や形態の制御に作用するものと考えられる。異方性ナノ会合体の形成は、アミド基やウレア基等が形成する水素結合と、芳香環のπ−π相互作用等の平面性構造間に働く分子間相互作用による配向誘起を、疎水性ブロックが補足・強化することで行われると考えられる。従って、本明細書において、上記式（１）で示される構造中、AUで示される親水性ブロック単位及びBUで示される疎水性ブロック単位以外の部分を、「配向誘起ユニット」と言う。
【００１６】
上記式（１）中、Ar1は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表す。C6〜18アリーレンは、炭素数６〜１８のアリーレンを意味する。本明細書において、「Co〜o」との記載は、いずれも炭素数を意味する。
C6〜18アリーレンとしては、例えば、フェニレン、ナフチレン、アントリレン、フェナントリレン、ピレニレン、ナフタセニレン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、Ar1はフェニレンであるが、これに限定されない。
フェニレンとしては、１，３−フェニレン、１，４−フェニレンが好ましい。
ナフチレンとしては、１，３−ナフチレン、１，４−ナフチレン、１，６−ナフチレン、１，７−ナフチレン、２，６−ナフチレン、２，７−ナフチレンが好ましい。
アントリレンとしては、１，３−アントリレン、１，４−アントリレン、１，５−アントリレン、１，６−アントリレン、１，７−アントリレン、１，８−アントリレン、２，５−アントリレン、２，６−アントリレン、２，７−アントリレン、２，８−アントリレンが好ましい。
フェナントリレンとしては、１，６−フェナントリレン、１，７−フェナントリレン、１，８−フェナントリレン、２，６−フェナントリレン、２，７−フェナントリレン、２，８−フェナントリレンが好ましい。
ピレニレンとしては、１，６−ピレニレン、１，７−ピレニレン、１，８−ピレニレン、２，６−ピレニレン、２，７−ピレニレン、２，８−ピレニレンが好ましい。
ナフタセニレンとしては、１，３−ナフタセニレン、１，４−ナフタセニレン、１，７−ナフタセニレン、１，８−ナフタセニレン、１，９−ナフタセニレン、１，１０−ナフタセニレン、２，７−ナフタセニレン、２，８−ナフタセニレン、２，９−ナフタセニレン、２，１０−ナフタセニレンが好ましい。
ピリジレンとしては、２，４−ピリジレン、２，５−ピリジレン、２，６−ピリジレンが好ましい。
Ar1において、Rは、水素原子、ハロゲン原子、又はC1~3アルキル基を表し、好ましくは水素である。
【００１７】
上記式（１）中、Ar2は、少なくとも１つの基−Rによって水素原子が置換されていてもよい、C6〜18アリーレン又はピリジレンを表すか、又は存在せず、Ar2が複数存在するとき、Ar2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
C6〜18アリーレン及びピリジレンの例としては、Ar1について上記したものと同じである。
Ar2において、Rは、水素原子、ハロゲン原子、又はC1〜3アルキル基を表し、好ましくは水素である。
【００１８】
上記式（１）中、Yは、以下から選択される基を表し、Yはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
2018068192.tif 000012
ここで、Wは、酸素原子又は硫黄原子を表し、好ましくは、酸素原子である。
R1は、−(CH2)m-N+A-又は−(CH2)m-SO3-M+を表し、A-は、ハロゲン原子のアニオンを表し、M+は、一価の金属原子のカチオンを表す。
本明細書において、ハロゲン原子には、例えば、F、Cl、Br、Iが含まれ、一価の金属原子には、例えば、Li、Na、K、Agが含まれるが、これらに限定されるものではない。
mは、１〜５の整数を表し、好ましくは、２〜４である。
R1の具体例としては、−CH2-N+Br-、−CH2-N+Cl-、−(CH2)2-N+Br-、−(CH2)2-N+Cl-、−(CH2)3-N+Br-、−(CH2)3-N+Cl-、−(CH2)4-N+Br-、−(CH2)4-N+Cl-、−(CH2)5-N+Br-、−(CH2)5-N+Cl-、−CH2-SO3-Li+、−CH2-SO3-Na+、−(CH2)2-SO3-Li+、−(CH2)2-SO3-Na+、−(CH2)3-SO3-Li+、−(CH2)3-SO3-Na+、−(CH2)4-SO3-Li+、−(CH2)4-SO3-Na+、−(CH2)5-SO3-Li+、−(CH2)5-SO3-Na+が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
好ましいYとしては、例えば、
2018068192.tif 000013
が挙げられる。
【００１９】
上記式（１）中、Z1及びZ2は、それぞれ、アルキレン、オキシアルキレン又は脂環式構造を表すか、或いは存在せず、好ましくは、C1〜C20アルキレン、C1〜C20オキシアルキレンであるか、存在しない。例えば、アルキレン及びオキシアルキレンの炭素数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０のうちのいずれの数であってもよい。アルキレン及びオキシアルキレンは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
アルキレンには、例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、メチルエチレン、ジメチルメチレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ジメチルエチレン、メチルプロピレン、エチルエチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ネオペンチレン、トリメチルエチレン、ジメチルプロピレン、メチルブチレン、エチルプロピレン、ｎ−ヘキシレン、イソヘキシレン、ネオヘキシレン、メチルペンチレン、ジメチルブチレン、トリメチルプロピレン、メチルエチルプロピレン、ｎ−ヘプチレン、イソヘプチレン、ネオヘプチレン、ジメチルペンチレン、エチルペンチレン、トリメチルブチレン、メチルエチルブチレン、ｎ−オクチレン、イソオクチレン、ネオオクチレン、メチルヘプチレン、ジメチルヘキシレン、トリメチルペンチレン、メチルエチルペンチレン、ｎ−ノニレン、イソノニレン、ネオノニレン、メチルオクチレン、ジメチルヘプチレン、トリメチルヘキシレン、メチルエチルヘキシレン、ｎ−デシレン、イソデシレン、ネオデシレン、メチルノニレン、ジメチルオクチレン、トリメチルヘプチレン、メチルエチルヘプチレン、トリメチルオクチレン、メチルエチルオクチレン、及びテトラメチルヘキシレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
オキシアルキレンには、例えば、オキシメチレン、オキシエチレン、オキシｎ−プロピレン、オキシメチルエチレン、オキシジメチルメチレン、オキシｎ−ブチレン、オキシイソブチレン、オキシジメチルエチレン、オキシメチルプロピレン、オキシエチルエチレン、オキシｎ−ペンチレン、オキシイソペンチレン、オキシネオペンチレン、オキシトリメチルエチレン、オキシジメチルプロピレン、オキシメチルブチレン、オキシエチルプロピレン、オキシｎ−ヘキシレン、オキシイソヘキシレン、オキシネオヘキシレン、オキシメチルペンチレン、オキシジメチルブチレン、オキシトリメチルプロピレン、オキシメチルエチルプロピレン、オキシｎ−ヘプチレン、オキシイソヘプチレン、オキシネオヘプチレン、オキシジメチルペンチレン、オキシエチルペンチレン、オキシトリメチルブチレン、オキシメチルエチルブチレン、オキシｎ−オクチレン、オキシイソオクチレン、オキシネオオクチレン、オキシメチルヘプチレン、オキシジメチルヘキシレン、オキシトリメチルペンチレン、オキシメチルエチルペンチレン、オキシｎ−ノニレン、オキシイソノニレン、オキシノニレン、オキシメチルオクチレン、オキシジメチルヘプチレン、オキシトリメチルヘキシレン、オキシメチルエチルヘキシレン、オキシｎ−デシレン、オキシイソデシレン、オキシネオデシレン、オキシメチルノニレン、オキシジメチルオクチレン、オキシトリメチルヘプチレン、オキシメチルエチルヘプチレン、オキシトリメチルオクチレン、オキシメチルエチルオクチレン、及びオキシテトラメチルヘキシレンが含まれるが、これらに限定されるものではない。なお、オキシアルキレン中の酸素原子は、２価のアルキレン鎖のいずれの末端にあってもよく、いずれか一方の末端において酸素原子であり、酸素原子を介して他の分子構造に結合するものである。
【００２１】
脂環式構造とは、芳香族性を有しない環式炭化水素基であり、単環式であっても多環式であってもよい。
単環式炭化水素基としては、例えば、シクロアルキレン又はシクロアルケニレンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
多環式炭化水素基としては、ビシクロアルキレン、ビシクロアルケニレン、トリシクロアルキレン、トリシクロアルケニレン、以下のコレステロール骨格を有する基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
2018068192.tif 000014
脂環式構造の炭素数は、例えば、３〜３０である。
単環式炭化水素基の炭素数は、３以上であり、好ましくは、４以上であり、より好ましくは、５以上であり、例えば、１２以下であり、好ましくは、１０以下であり、より好ましくは、８以下である。
シクロアルキレンには、例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、及びシクロオクチレンが含まれる。
シクロアルケニレンには、例えば、シクロペンテニレン、シクロヘキセニレン、シクロヘプテニレン、及びシクロオクテニレンが含まれる。
【００２２】
上記式（１）中、n1は、0又は1を表し、n1が1のときは、Z1はC1〜2アルキレンであるか存在しない。Z1はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
上記式（１）中、n2は、0又は1を表し、n2が1のときは、Z2はC1〜2アルキレンであるか存在しない。Z2はそれぞれ同じでも異なっていてもよい。
【００２３】
上記式（１）中、AUは、分子量500〜100,000の親水性ブロックポリマー単位を表す。親水性ブロックポリマー単位の分子量は、好ましくは1,000以上、より好ましくは2,000以上であり、好ましくは20,000以下、より好ましくは10,000以下である。
なお、本明細書において、分子量の値は、別に記載がない限り、数平均分子量（Mn）を意味する。
AUは、例えば、ポリエチレングリコール構造、ポリエチレンイミン構造、又は以下の式（２）により表される繰り返し構造を有するが、これらに限定されるものではない。
R'−(CA-CB)p-(CH2)q-        （２）
（式中、
CAは、少なくとも１つの基−RAによって水素原子が置換されている、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1〜8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCBに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1〜3アルキル基及び／又はハロゲン原子で更に置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RAは、−L−(Ra)rを表し、
Raは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルホン基、ホスホン基、チオール基、グアニジル基、アミジル基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、アンモニウム基、グアニジウム基、ホスホリルコリン基、−(CH2CH2O)x1CH3、又はグルコース、ガラクトース、マンノース及びフルクトース等の単糖類を表し、
x1は、１〜１０００の整数を表し、好ましくは２以上、より好ましくは３以上で、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、
rは、１以上の整数を表し、rが２以上のとき、Raはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、リンカーであり、アルキレン基、アリーレン基、トリアゾーレン基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合、並びにそれらの組み合わせを有する単位構造から選択され、
CBは、カーボネート結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合及びウレア結合から選択されるか、或いは存在せず、
pは、2〜2000の整数を表し、好ましくは5〜1000であり、
qは、0〜20の整数を表し、好ましくは0〜10であり、より好ましくは0〜5であり、
R'は、水素原子であるか、以下から選択される基を表す。）
2018068192.tif 000015
【００２４】
リンカーLの構造中のアルキレンには、式（１）で定義されるものと同じ範囲のものが含まれ、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレンであるが、これらに限定されるものではない。
リンカーLの構造中のアリーレンには、式（１）で定義されるC6〜18アリーレンと同じ範囲のものが含まれ、好ましくは、フェニレンであるが、これに限定されるものではない。
リンカーLは、例えば、以下に示される基から選択され得る。
2018068192.tif 000016
2018068192.tif 000017
【００２５】
ここで、ポリエチレングリコール構造とは、例えば、以下の構造である。
RC−(CH2CH2O)p1-(CH2)q1-
（式中、
RCは、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリール基、又は式（２）で定義されるR'を表し、
p1は、5〜2500の整数を表し、好ましくは10〜1000であり
q1は、0〜20の整数を表し、好ましくは0〜10であり、より好ましくは0〜5である。）
RCのアルコキシ基は、例えば、炭素数１〜10であり、好ましくは、炭素数１〜6である。アルコキシ基の具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等が挙げられる。
RCのアリール基は、例えば、炭素数１〜10であり、好ましくは、フェニル基又はナフチル基である。
【００２６】
ここで、ポリエチレンイミン構造とは、例えば、以下の構造である。
RD−(CH2CH2N)p2(CH2)q2-
（式中、
RDは、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリール基、又は式（２）で定義されるR'を表し、
p2、5〜2500の整数を表し、好ましくは10〜1000であり、
q2、0〜20の整数を表し、好ましくは0〜10であり、より好ましくは0〜5である。）
RDのアルコキシ基は、例えば、炭素数１〜10であり、好ましくは、炭素数１〜6である。アルコキシ基の具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等が挙げられる。
RDのアリール基は、例えば、炭素数１〜10であり、好ましくは、フェニル基又はナフチル基である。
【００２７】
AUの具体例としては、例えば、下式（２a）で示されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
R'−(AU')m'-(CH2)q-          （２a）
（式中、
R'及びqは、式（２）で定義されるとおりであり、
m'は、2〜2300の整数を表し、
(AU')は、以下に示される構造から選択される。）
2018068192.tif 000018
2018068192.tif 000019
2018068192.tif 000020
2018068192.tif 000021
（式中、
FGは、H、−(CH2)x2−ヒドロキシ、−(CH2)x2−アミノ、−(CH2)x2−カルボキシ、−(CH2)x2−スルホン、−(CH2)x2−ホスホン、−(CH2)x2−チオール、−(CH2)x2−グアニジル、−(CH2)x2−アミジル、−(CH2)x2−ピリジニウム、−(CH2)x2−ホスホニウム、−(CH2)x2−アンモニウム、−(CH2)x2−グアニジウム、−(CH2)x2−ホスホリルコリン、−(CH2CH2O)x1CH3、又は−(CH2)x2−単糖類を表し、好ましくは、H、−(CH2CH2O)x1CH3、−CH2CH2N+H3、−CH2CH2OH、又は−CH2COOHを表し、
x1は、１〜１０００の整数を表し、好ましくは２以上、より好ましくは３以上で、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、
x2は、0〜8の整数を表し、好ましくは0〜5、より好ましくは0〜3である。）
【００２８】
−(AU')m'-として、より好ましくは、以下の構造が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
2018068192.tif 000022
2018068192.tif 000023
（式中、
FGは、式（２a）で定義されるとおりであり、
m2は、10〜2300の整数を表し、好ましくは20以上、より好ましくは45以上で、好ましくは450以下、より好ましくは230以下であり、
m3は、2〜500の整数を表し、好ましくは5以上、より好ましくは10以上で、好ましくは100以下、より好ましくは50以下である。）
【００２９】
上記式（１）中、BUは、分子量500〜100,000の疎水性ブロックポリマー単位を表す。疎水性ブロックポリマー単位の分子量は、好ましくは1,000以上、より好ましくは2,000以上であり、好ましくは20,000以下、より好ましくは10,000以下である。
疎水性ブロックポリマー単位の分子量は、親水性ブロックポリマー単位の分子量と同程度であることが好ましい。例えば、親水性ブロックポリマー単位の分子量：疎水性ブロックポリマー単位の分子量は、1:0.7〜1.3、1:0.8〜1.2、1:0.9〜1.1であり得る。
本発明の一実施態様において、疎水性ブロックポリマー単位は、疎水性結晶性ブロックポリマー単位である。異方性ナノ会合体の形成は、アミド基やウレア基等が形成する水素結合と、芳香環のπ−π相互作用等の平面性構造間に働く分子間相互作用による配向誘起を、疎水性ブロックが補足・強化することで行われると考えられるが、疎水性ブロックが結晶性であると、上記補足・強化する作用がより向上するため、異方性ナノ会合体の形成に有利である。
【００３０】
BUは、例えば、以下の式（３）により表される繰り返し構造を有するが、これらに限定されるものではない。
−(CX-CY)u-R'        （３）
（式中、
CXは、カーボネート結合、エステル結合又はカルボニル結合を表すか、或いは存在せず、
CYは、少なくとも１つの基−RBによって水素原子が置換されていてもよい、鎖状又は環式の、飽和又は不飽和C1~8脂肪族炭化水素基であって、当該脂肪族炭化水素基中のCXに隣接する炭素原子以外の少なくとも１つの炭素原子がＮ、Ｏ又はＳから選択されるヘテロ原子で置換されていてもよく、当該脂肪族炭化水素基中、少なくとも１つの水素原子がC1~3アルキル基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、更に２つの水素原子が合わせて=Oで置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を表し、
RBは、−L−(Rb)vを表し、
Rbは、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂環式構造、疎水性アミノ酸又は疎水ペプチドを表し、これらの基において、少なくとも１つの水素原子が、F、Cl、Br、I等のハロゲン原子で置換されていてもよく、
vは、１以上の整数を表し、vが２以上のとき、Rbはそれぞれ同じでも異なっていてもよく、
Lは、式（２）で定義されるものと同じ範囲のリンカーを表し、
R'は、式（２）で定義されるものと同じ範囲の基を表し、
uは、2〜3000の整数を表し、好ましくは10〜2000である。）
【００３１】
Rbのアルキル基は、例えば、炭素数１〜30であり、好ましくは、炭素数1〜20であり、より好ましくは、炭素数1〜12であり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。アルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、メチルエチル、ジメチルメチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ジメチルエチル、メチルプロピル、エチルエチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、トリメチルエチル、ジメチルプロピル、メチルブチル、エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル、メチルペンチル、ジメチルブチル、トリメチルプロピル、メチルエチルプロピル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ネオヘプチル、ジメチルペンチル、エチルペンチル、トリメチルブチル、メチルエチルブチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ネオオクチル、メチルヘプチル、ジメチルヘキシル、トリメチルペンチル、メチルエチルペンチル、ｎ−ノニル、イソノニル、ネオノニル、メチルオクチル、ジメチルヘプチル、トリメチルヘキシル、メチルエチルヘキシル、ｎ−デシル、イソデシル、ネオデシル、メチルノニル、ジメチルオクチル、トリメチルヘプチル、メチルエチルヘプチル、トリメチルオクチル、メチルエチルオクチル、及びテトラメチルヘキシルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
Rbのアリール基は、例えば、炭素数6〜40であり、好ましくは、炭素数6〜30であり、より好ましくは、炭素数6〜20である。アリール基には、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、及びピレニル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
Rbのアリールアルキル基は、前記Rbのアルキル基において、少なくとも１つの水素原子が前記Rbのアリール基により置換された基を意味する。
Rbのアルキルアリール基は、前記Rbのアリール基において、少なくとも１つの水素原子が前記Rbのアルキル基により置換された基を意味する。
Rbの脂環式構造は、式（１）で定義されるとおりである。
Rbの疎水性アミノ酸は、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
Rbの疎水ペプチドは、例えば、少なくとも、前記疎水性アミノ酸が2〜50個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜5個結合して構成されるペプチドであるが、これに限定されるものではない。また、疎水ペプチドは、疎水性を保つ範囲内で、前記疎水性アミノ酸以外にも、他の親水的な残基を持つアミノ酸（アスパラギン酸、リシン、グルタミン酸、アルギニン、システイン、ヒスチジン、セリン、プロリン、トレオニン、チロシン）を含んでいてもよい。
【００３３】
BUの具体例としては、例えば、下式（３a）で示されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
−(BU')n'-R'          （３a）
（式中、
R'は、式（２）で定義されるものと同じ範囲の基を表し、
n'は、2〜1000の整数を表し、
(BU')は、以下に示される構造から選択される。）
2018068192.tif 000024
2018068192.tif 000025
2018068192.tif 000026
2018068192.tif 000027
2018068192.tif 000028
（式中、
FG'は、アルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂環式構造、またはこれらのハロゲン置換物、疎水性アミノ酸又は疎水ペプチドを表し、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ベンジル、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、アダマンチル、コレステロイル、アゾベンジル、トリチル、ノルボルニル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロフェニル、ペンタフルオロエチルを表す。）
【００３４】
−(BU')n'-として、より好ましくは、以下の構造が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
2018068192.tif 000029
2018068192.tif 000030
（式中、
FG'は、式（３a）で定義されるとおりであり、
n4は、3〜700を表し、好ましくは7以上、より好ましくは15以上で、好ましくは150以下、より好ましくは70以下であり、
n5は、4〜900を表し、好ましくは8以上、より好ましくは15以上で、好ましくは200以下、より好ましくは90以下であり、
n6は、5〜1000を表し、好ましくは10以上、より好ましくは20以上で、好ましくは250以下、より好ましくは100以下であり、
n7は、6〜1200を表し、好ましくは12以上、より好ましくは25以上で、好ましくは300以下、より好ましくは120以下であり、
n8は、2〜500の整数を表し、好ましくは5以上、より好ましくは10以上で、好ましくは100以下、より好ましくは50以下である。）
【００３５】
本発明ポリマーの一例として、以下の化合物が例示される。
2018068192.tif 000031
2018068192.tif 000032
2018068192.tif 000033
（式中、
n4は、3〜700を表し、好ましくは7以上、より好ましくは15以上で、好ましくは150以下、より好ましくは70以下であり、
n5は、4〜900を表し、好ましくは8以上、より好ましくは15以上で、好ましくは200以下、より好ましくは90以下であり、
n6は、5〜1000を表し、好ましくは10以上、より好ましくは20以上で、好ましくは250以下、より好ましくは100以下であり、
m2は、10〜2300を表し、好ましくは20以上、より好ましくは45以上で、好ましくは450以下、より好ましくは230以下である。）
【００３６】
本発明ポリマーの分子量分布（ＤM）は、特に限定されるものではないが、例えば、2.0以下、好ましくは1.5以下、より好ましくは1.2以下である。分子量分布が狭いほど、本発明ポリマーが水中で形成する異方性ナノ会合体のサイズが均一となり、本発明の効果を発揮しやすくなると考えられるが、上記のとおり、本発明ポリマーの分子量分布は特に限定されない。
【００３７】
本発明ポリマーは、公知の方法に従って製造することができる。例えば、S-H. Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 4508-4512に記載の方法に従って、或いは、目的物の構造に応じて使用する原料化合物を変更する以外は、S-H. Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 4508-4512に記載の方法と同様の方法で、本発明ポリマーを製造し得る。
例えば、第一に、「配向誘起ユニット」に相当する化合物を合成し、次いで、その化合物の一端にポリエチレングリコール等の親水性ブロックポリマーを結合させる。その後、「配向誘起ユニット」と親水性ブロックポリマーが結合してなる化合物の、親水性ブロックポリマーが結合している部位とは反対の「配向誘起ユニット」の端部に、L-乳酸（LLA）、ε−カプロラクトン（CL）及びトリメチレンカーボネート（TMC）等のモノマーを重合させて結合させ、疎水性ブロックポリマーを結合させる。このように、本発明ポリマーを製造し得るが、PEG-4UMBA-PLLA等の製造方法が既に公知であり、当業者はこれに基づいて、適宜、本発明ポリマーを製造し得る。
【００３８】
本発明ポリマーは、培地中に添加して用いることができる。本発明ポリマーを含む培地中で細胞を培養することで、細胞挙動の制御、例えば、細胞の伸展や増殖を調節することができる。
培地中に添加し得る本発明ポリマーの最終濃度は、例えば、0.01 ppm以上、好ましくは1 ppm以上、より好ましくは0.001%以上であり、例えば、10%以下、好ましくは1%以下、より好ましくは0.1%以下であるが、特に限定されるものではない。
【００３９】
本発明において、培養することのできる細胞については、特に限定されるものではなく、初代培養細胞、培養細胞株、組換培養細胞株であってもよい。培養することのできる細胞の由来について、その種類は特に限定されるものではないが、例えば、哺乳類（ヒト、チンパンジー、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスターなど）、鳥類（ニワトリなど）などが例示される。本発明において、種の異なる２つ以上の細胞をハイブリッドさせて作成された細胞を用いることもできる。
細胞が由来する器官・組織としては、例えば、血球・リンパ系、血管系、脳・神経系、骨髄、筋組織、胸腺、唾液腺、口腔、食道、胃、肝臓、胆嚢、脾臓、小腸、大腸、直腸、皮膚、角膜、肺、甲状腺、哺乳器、子宮、子宮頸部、卵巣、精巣、膵臓、腎臓、副腎皮質、膀胱、胎盤、臍帯、胎仔、胎子、尾、間葉系幹細胞、癌細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)、核移植ES細胞、体細胞由来ES細胞等の分化多能性を有する幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、その他間質由来幹細胞、Muse細胞、神経幹細胞等の組織幹細胞、多分化能を有する幹細胞、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、神経組織等の各種組織における前駆細胞や線維芽細胞等の各種の幹細胞の培養にも用いることができる。
【００４０】
本発明において、本発明ポリマーが添加される、細胞を培養するための培地は、細胞が生存・増殖できるものであれば特に制限されず、培養する細胞の種類に応じて従来公知のものから適宜選択し得る。細胞を培養するための培地は、無血清培地又は血清含有培地であり得るが、好ましくは血清含有培地である。血清含有培地において、ウシ胎仔血清（FBS）、ウマ血清、ヒト血清等の血清を、例えば30%以下の濃度で配合し得るが、これらに限定されるものではない。
公知の培地としては、例えば、イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地（低グルコース又は高グルコース）、イーグルＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地や、これらのブレンド培地が挙げられるが、前述のとおり、本発明においては、培養する細胞の種類に応じて適宜培地を選択し得る。
また、培地中には、必要に応じて、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ等）、補酵素（葉酸等）、アミノ酸（グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、等）、炭素源としての糖又は有機酸（乳酸等）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＦＧＦ、ＴＧＦ−β等）、インターロイキン（ＩＬ−１，ＩＬ−６等）、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、レプチン等）、金属トランスポーター（トランスフェリン）、金属イオン（鉄イオン、セレンイオン、亜鉛イオン等）、ＳＨ試薬（β−メルカプトエタノール、グルタチオン等）、血清由来成分（アルブミン）等を添加してもよい。
【００４１】
本発明における細胞の培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、細胞の培養は、３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３７℃の温度で、７０〜１００％の範囲内、好ましくは９５〜１００％の範囲内の湿度で、２％〜７％ＣＯ2、好ましくは５％ＣＯ2環境下で行われる。また、細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、公知の方法に則って行うことができる。
【００４２】
本発明の一実施態様において、本発明ポリマーを備える、細胞培養用キットが提供される。当該キットは、本発明ポリマーを備える容器とは別の容器に、それぞれ、培養する細胞、培養培地等を備えることができる。また、当該キットは、使用説明書等や、培養に使用する器具等を備えていてもよい。
【実施例】
【００４３】
以下において、本発明について、具体的な製造例及び実施例を参照しながら更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの製造例及び実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４４】
＜製造例＞
（１）本発明ポリマー（PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMC）の調製
S-H. Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 4508-4512に記載の方法に準じて、以下のとおりPEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCを調製した。
（i）PEG-4UMBA-OHの合成
2018068192.tif 000034
上記化学反応式中、-(OCH2CH2)-は、PEGを意味する。以下同じである。
（ii）PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCの合成
2018068192.tif 000035
【００４５】
本発明ポリマーであるPEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCは、それぞれ以下の構造を有する。
PEG-4UMBA-PLLA
2018068192.tif 000036
PEG-4UMBA-PCL
2018068192.tif 000037
PEG-4UMBA-PTMC
2018068192.tif 000038
【００４６】
得られたPEG-4UMBA-PLLAは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.17であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 31 (4.5k) であった。
得られたPEG-4UMBA-PCLは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.25であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 41 (4.7k) であった。
得られたPEG-4UMBA-PTMCは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.15であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 45 (4.6k) であった。
【００４７】
（２）比較例ポリマー（PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMC）の調製（bは単にブロックを意味する。）
PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMCを、MeO-PEG-OHから以下のとおり合成した。
2018068192.tif 000039
【００４８】
得られたPEG-b-PLLAは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.02であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 35 (5.0k) であった。
得られたPEG-b-PCLは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.10であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 48 (5.5k) であった。
得られたPEG-b-PTMCは、サイズ排除クロマトグラフィー（溶離液：THF、標準物質のポリマー：ポリスチレン）で測定したところ、ＤM = 1.02であった。また、NMRにより、各ブロックの重合度n, mを求めたところ、m = 113 (5.0k)、n = 50 (5.1k) であった。
【００４９】
（３）透過型電子顕微鏡（TEM）及び動的光散乱での解析
得られたPEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCについて、各々、水分散液とし、TEMで観察した。その結果を図１に示す。
PEG-4UMBA-PLLAではロッド状構造が観察され、PEG-4UMBA-PCLでは繊維状構造が観察され、PEG-4UMBA-PTMCでは球状構造が観察された。
同様に、PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMCについてもTEMで観察した。その結果を図２に示す。
PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMCのいずれにおいても、球状構造が観察された。
【００５０】
次いで、得られたPEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCについて、動的光散乱にて詳細に解析した。その結果を図３に示す。会合体の円柱型構造の高さに相応する長さをＬとし、底面の直径の長さをＤとしたとき、PEG-4UMBA-PLLAでは、Ｌが330〜400 nm、Ｄが〜30 nmであり、PEG-4UMBA-PCLでは、Ｌが310〜330 nm、Ｄが〜20 nmであり、PEG-4UMBA-PTMCでは、Ｌが180〜200 nm、Ｄが〜45 nmであった。
この解析結果から、PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCはいずれも、水中で異方性会合体を形成していることが判明した。前述のTEMでの観察では、試料作製の際に乾燥工程があるため、その影響により観察された画像がPEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMCで異なったものと考えられる。
【００５１】
＜実施例＞
（１）本発明ポリマーを含有する培地の作製
上記製造例に示すとおり製造した本発明ポリマーを0.1 w/v%水分散液とし、本発明ポリマー0.1 w/v%水分散液を、10％ウシ胎仔血清（FBS）添加α改変型イーグル最少必須培地 (10％ FBS α-MEM）と混合し、0.05 w/v%の本発明ポリマーを懸濁させた10％ FBS α-MEMを作製した。
【００５２】
（２）ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）培養試験
24ウェルプレート中のポリエチレンテレフタラート（PET）基板上にNHDFを播種（播種密度: 5.0×103 cells/cm2）し、10％ FBS α-MEMと共にCO2 5%、37℃の環境下で24時間培養した。(24時間培養後をday 0とした。)
培養後、10％ FBS α-MEMを、（１）で作製した0.05 w/v%の本発明ポリマーを懸濁させた10％ FBS α-MEMに交換し、CO2 5%、37℃の環境下で48時間培養した。6、12、18、24、48時間培養後、位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察した。6時間培養後に観察された位相差像を図４に示す。
48時間培養後、本発明ポリマー懸濁10％ FBS α-MEMを取り除き、PBS(-)を加え室温で10分静置後、0.1 w/v%グルタルアルデヒドを加え、37℃のインキュベーターに6時間静置し、細胞を固定した。固定後、0.1 w/v%グルタルアルデヒドを取り除き超純水で洗浄後、クリスタルバイオレットを加え20分静置し、細胞を染色した。20分後、クリスタルバイオレットを取り除き超純水で2回洗浄し、室温で１晩乾燥後、位相差顕微鏡を用いて接着している細胞数を観察した。位相差像を図５に示す。また、比較例として、本発明ポリマーを全く添加しない場合についても同時に試験を行った。結果を表１及び２、並びに図６に示す。
【００５３】
【表１】
2018068192.tif 000040
Ｌは、図６に示すとおり、細胞の長さ（最大長）である。
【００５４】
【表２】
2018068192.tif 000041
Ｌは、図６に示すとおり、細胞の長さ（最大長）である。
ポリマー無添加条件での総細胞数を基準とし、全て％で表している。
【００５５】
更に、比較例として、本発明ポリマーに代えて、上記製造例に示すとおり製造した比較例ポリマーを添加した場合と、本発明ポリマーも比較例ポリマーも添加しない場合について、別途、試験を行った。結果を表３及び４、並びに図７に示す。
【００５６】
【表３】
2018068192.tif 000042
Ｌは、図７に示すとおり、細胞の長さ（最大長）である。
【００５７】
【表４】
2018068192.tif 000043
Ｌは、図７に示すとおり、細胞の長さ（最大長）である。
ポリマー無添加条件での総細胞数を基準とし、全て％で表している。
【００５８】
得られた結果によると、PEG-4UMBA-PLLA添加の場合、48時間培養後の140 μm以上の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合と比較して約164%となっている。一方、PEG-b-PLLA添加の場合、48時間培養後の140 μm以上の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合と比較して大きく減少している。従って、PEG-4UMBA-PLLA添加の場合、ポリマー無添加の場合やPEG-b-PLLAと比較して、140 μm以上の最大長を有する細胞を顕著に増加させたことがわかる。これは、PEG-4UMBA-PLLAが、細胞挙動を制御し、特に細胞の伸展を促進したことを意味する。
PEG-4UMBA-PCL添加の場合では、48時間培養後の140 μm以上の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合と比較して約109%となっている。一方、PEG-b-PCL添加の場合、48時間培養後の140 μm以上の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合と比較して大きく減少している。従って、PEG-4UMBA-PCL添加の場合、ポリマー無添加の場合やPEG-b-PCLと比較して、140 μm以上の最大長を有する細胞を増加させたことがわかる。これは、PEG-4UMBA-PCLが、細胞挙動を制御し、特に細胞の伸展を促進したことを意味する。
PEG-4UMBA-PTMC添加の場合では、48時間培養後の140 μm以上の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合と比較して約68%となっており、PEG-4UMBA-PTMCが、細胞挙動を制御し、特に細胞の伸展を抑制したことを意味する。
【００５９】
比較例ポリマー（PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMC）添加の場合、48時間培養後の合計細胞数はいずれも5,000程度に留まっていた。細胞を10％ FBS α-MEMと共にCO2 5%、37℃の環境下で24時間培養した時点（day 0）での細胞数は、およそ5,000個であったと想定されることに鑑みると、比較例ポリマーを添加すると細胞の増殖がほとんど進んでいないことがわかる。
一方、本発明ポリマー（PEG-4UMBA-PLLA、PEG-4UMBA-PCL及びPEG-4UMBA-PTMC）添加の場合、48時間培養後の合計細胞数は少なくとも6,000個を超えており、比較例ポリマーとは異なり細胞の増殖を抑制する作用は大きくない。PEG-4UMBA-PCL添加の場合では、ポリマー無添加の場合と比較して、140 μm以上の最大長を有する細胞を増加させただけでなく、全体の細胞数に関してはポリマー無添加の場合と同程度である。即ち、PEG-4UMBA-PCLは、全体の細胞数に関してはほとんど影響を与えることなく、細胞の伸展のみを促進したことを意味する。
【００６０】
70 μm未満の最大長を有する比較的小さな細胞には、細胞分裂直後の細胞が多く含まれるものと考えられるところ、比較例ポリマー（PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMC）添加の場合、48時間培養後の70 μm未満の最大長を有する細胞数が著しく減少している。この結果からも言えるとおり、比較例ポリマーを添加すると細胞の増殖がほとんど進んでいないことがわかる。
PEG-4UMBA-PTMC添加の場合では、一見して、ポリマー無添加の場合と比較して、総細胞数の観点から細胞の増殖がほとんど進んでいないようにも見える。しかしながら、48時間培養後の70 μm未満の最大長を有する細胞数は、PEG-4UMBA-PTMC添加の場合とポリマー無添加の場合とでほぼ同じである。このことから、PEG-4UMBA-PTMC添加の場合とポリマー無添加の場合とで、細胞分裂直後の細胞数は大差ないことが予想され、PEG-4UMBA-PTMCは、
細胞の増殖、或いは細胞の分裂に関してはあまり影響を与えることなく、細胞の伸展のみを、或いは伸展した細胞の数のみを抑制したと考えられる。
PEG-4UMBA-PCL添加の場合では、48時間培養後の70 μm未満の最大長を有する細胞数は、ポリマー無添加の場合よりも増えている。従って、PEG-4UMBA-PCLは、細胞の増殖、或いは細胞の分裂をむしろ促進しているのかもしれない。
【００６１】
PEG-4UMBA-PLLAにおいても、PEG-4UMBA-PCLにおいても、PEG-4UMBA-PTMCにおいても、それぞれ比較例ポリマー（PEG-b-PLLA、PEG-b-PCL及びPEG-b-PTMC）と比較すると、「配向誘起ユニット」の存否により、細胞挙動への影響が顕著に異なることがわかる。本発明ポリマーは、「配向誘起ユニット」におけるアミド基やウレア基等が形成する水素結合と、芳香環のπ−π相互作用等の平面性構造間に働く分子間相互作用による配向誘起を、疎水性ブロックが補足・強化することで、水中で異方性会合体形成していると考えられる。一方で、比較例ポリマーにおいては「配向誘起ユニット」が存在せず、本発明ポリマーのような異方性会合体を形成することはできない。その結果、本発明ポリマーと比較例ポリマーとの間で、細胞挙動への影響が顕著に異なることとなるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、細胞挙動を制御することのできる化合物及び新規な手法を提供することができる。本発明は、細胞の接着・増殖・分化・機能発現を司る細胞外基質（ECM）の人工材料化・高機能化のために利用し得、「混ぜたらできる」フルボトムアップ型三次元複合組織の構築を可能にする、中心的な基盤技術となり得る。
【図１】
2018068192.tif 000052
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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