(57)【要約】【課題】肥満症、ＩＩ型糖尿病、食物誘導性クッシング症候群、またはメタボリックシンドロームを治療する方法を提供すること。【解決手段】これらの方法は全て、人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む。分子アンタゴニストは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）肥満症を治療する、
（２）ＩＩ型糖尿病を治療する、
（３）食物誘導性クッシング症候群を治療する、
（４）メタボリックシンドロームを治療する、
（５）肝臓内での脂肪組織の集積を減少させる、
（６）網内での脂肪組織の集積を減少させる、または
（７）皮下脂肪組織の集積を減少させる
ための組成物であって、
薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含み、
前記分子アンタゴニストが、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含み、
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、組成物。
【請求項２】
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第1の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２１、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記分子アンタゴニストが、約０．１ｎＭ〜約７ｎＭのＩＣ５０によって特徴付けられる、ＧＩＰに対する結合親和性を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記分子アンタゴニストが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記分子アンタゴニストが、ヒト定常領域を含むモノクローナル抗体全体である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記分子アンタゴニストが、約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／９１７，１３６号、２０１４年４月３日に出願された米国仮特許出願第６１／９７４，６６０号、２０１４年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／００７，２５５号、２０１４年９月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０４５，１８９号、２０１４年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７４，２２５号、２０１４年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７４，２２７号、および２０１４年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７４，２３４号に基づく優先権を主張する。これらの出願の開示は、本明細書に参照により完全に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
配列表は、ファイル名「ＭＨＭＳ２０００１４ＵＳ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１４年１２月１７日作成、ファイルサイズ２４，９９５バイトのＡＳＣＩＩテキストファイルとしてここに提出されている。このテキストファイル内のデータは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、種々の例示的な実施形態において、一般に、グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド（ＧＩＰ）に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの分子アンタゴニストを使用して、組織内での脂肪の集積を治療するための組成物および方法に関する。脂肪組織の集積は、いくつかの異なる疾患または状態において起こり、そのようなアンタゴニスト／モノクローナル抗体を使用して治療することができる。本開示はそのようなアンタゴニスト／モノクローナル抗体を投与することにより、血清インスリンの上昇を必要とせずに耐糖能を改善することによるそのような疾患または状態の治療にも関する。
【０００４】
肥満症とは、健康に対して負の影響を及ぼすほどに過剰な体脂肪が蓄積している医学的状態である。米国では、肥満症は、人間の体重を人間の身長の二乗で割ることにより算出される人間の肥満度指数（ＢＭＩ）が３０ｋｇ／ｍ２またはそれ超になると生じると考えられる。肥満症は、過剰なカロリー摂取、不健康な食事、身体活動の不足、遺伝、年齢、および睡眠不足を含めた因子の組合せから生じ得る。肥満症により、心疾患、２型糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸、いくつかのがん、および変形性関節症を含めた種々の疾患の可能性が上昇する。
【０００５】
以下の医学的状態５つのうち３つが共に診断され多場合に、メタボリックシンドロームと診断される：血圧上昇、ウエスト周囲の過剰な体脂肪、空腹時血中グルコースが高いこと、血清トリグリセリドが高いこと、および高密度コレステロール（ＨＤＬ）レベルが低いこと。メタボリックシンドロームによっても、２型糖尿病、冠動脈心疾患、リポジストロフィー、および潜在的にいくつかの精神病を含めた疾患のリスクが上昇する。治療は、生活様式の変化および薬物療法を含む。
【０００６】
高脂血症とは、血液中の脂質および／またはリポタンパク質のレベルが異常に上昇する状態である。原発性高脂血症は通常、遺伝的原因によるものであるが、二次性高脂血症は、真性糖尿病、ある特定の薬物の使用、およびアルコール消費などの他の基礎的因子から生じる。高脂血症は、高コレステロール血症と高トリグリセリド血症に分けることができる。高コレステロール血症は、一般に、米国では、総コレステロールレベルが２４０ｍｇ／ｄｌを超えた場合に診断される。高トリグリセリド血症は通常、米国では、トリグリセリドレベルが５００ｍｇ／ｄｌよりも高い場合に診断される。
【０００７】
インスリン非依存性（ＩＩ型）真性糖尿病は、インスリン抵抗性として知られている状態である、身体の細胞がインスリンに適正に応答しない場合に起こる。結果として、高血糖レベルが長期間にわたって持続する。主要な原因は、体重が過剰であること、および運動が不十分であることである。長期合併症としては、心血管疾患、脳卒中、腎不全、および眼の損傷が挙げられる。
【０００８】
クッシング症候群は、異常に高いレベルのホルモンコルチゾールへの長期曝露に関連する。コルチゾールは、副腎において産生され、通常、コルチコトロピンによって誘導される。しかし、食物誘導性クッシング症候群は、副腎が胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）に対して異常に応答する場合に起こる。
【０００９】
脂肪肝疾患（ＦＬＤ）は、成体と小児の両方で生じる世界的な慢性健康問題である。臨床的にカテゴリー化すると、ＦＬＤは２つの広範な群：非アルコール性ＦＬＤ（ＮＡＦＬＤ）およびアルコール性ＦＬＤ（ＡＦＬＤ）に入る。ＮＡＦＬＤおよびＡＦＬＤは、肝臓の脂肪含有率が５〜１０％を超えることによって特徴付けられ、区別する因子は疾患の根本的原因のみである。しかし、一般に、この２つのクラスのＦＬＤを形態学的特徴だけに基づいて区別することは難しい。一般に、ＦＬＤは、過剰量のアルコールを消費する者、脂肪酸代謝に影響を及ぼす代謝障害もしくは遺伝的素因を有する可能性がある者、および／または肥満の者において発症する。一般的な共存症としては、肥満症、２型（インスリン非依存性）真性糖尿病、および高脂血症が挙げられる。
【００１０】
ＦＬＤの中心的な病態としては、硬変症への進行を伴う肝脂肪症および脂肪性肝炎が挙げられる。脂肪症は、肝臓内の脂質含有率が５〜１０重量％を超えると発症し、脂質小胞の保持の異常および脂肪酸酸化の阻害を示すものである。脂肪症は、疾患の根本的原因が同定され、消散すれば、可逆的であると考えられる。
【００１１】
脂肪症が持続すると、重症度および誘因に応じて非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）またはアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）に進展する可能性がある。脂肪症とは異なり、ＮＡＳＨおよびＡＳＨは可逆的ではなく、治療可能なだけである。これらは、より多くの脂肪の蓄積、混合小葉炎症、肝細胞の風船変性、肝細胞核のグリコーゲン形成（ｇｌｙｃｏｇｅｎａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅｉ）、および細胞周囲線維症によって特徴付けられる。これらは硬変症、最終的には肝がんに進行し得る。
【００１２】
ＦＬＤに対する現行の療法としては、（１）適度な食事および運動の計画に従うこと、（２）突発的な体重減少または薬物乱用によって起こり得る肝臓損傷の悪化を回避すること、（３）体重を減少させること、（４）インスリン抵抗性を低下させ、血中グルコースを制御するためにインスリン抵抗性改善剤を摂取すること、（５）血中脂質を減少させる薬物または肝疾患を好転させるための薬物を使用すること、ならびに（６）肝移植を試みることが挙げられる。
【００１３】
臨床の場では、食欲抑制薬は、一部において、悪心を生じさせることによって働く。したがって、当該プロセスの間に気分が悪くなることを厭わないのであれば、体重を減少させることができる。そのような副作用は、特に、患者に体重減少レジメンのコンプライアンスを維持するよう患者に求めることに関して、望ましくない。
【００１４】
ＦＬＤおよび脂肪の集積を伴う他の疾患に対する追加的な療法が望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示の概要
本開示は、グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチドとしても知られている胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、および、そのようなｍＡｂの、組織内での脂肪の集積を伴う疾患を治療するための使用方法を対象とする。
【００１６】
いくつかの異なる疾患または状態を治療する方法が、本明細書において種々の実施形態で開示されている。これらとしては、肥満症、ＩＩ型糖尿病、食物誘導性クッシング症候群、またはメタボリックシンドロームが挙げられる。肝臓内の組織内、網内の組織内、または皮下組織内での脂肪の蓄積を減少させる方法も開示されている。これらの方法は全て、人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含む。
【００１７】
分子アンタゴニストは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む。
【００１８】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含み、各ＣＤＲが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。分子アンタゴニストの第１のＣＤＲと第２のＣＤＲは、連結基によって互いに接合している。連結基は、アミノ酸の鎖であってよい。
【００１９】
他の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含む。分子アンタゴニストの第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ、および第３のＣＤＲは、連結基によって互いに接合している。連結基は、独立にアミノ酸の鎖であってよい。
【００２０】
さらに他の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００２１】
さらなる実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する重鎖可変ドメインを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。
【００２３】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、ここで、軽鎖可変ドメインは、第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを含み、各ＣＤＲは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、重鎖可変ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを含む。分子アンタゴニストは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体であってよい。
【００２４】
他の実施形態では、分子アンタゴニストは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、重鎖可変ドメインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。分子アンタゴニストは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体であってよい。
【００２５】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体である。
【００２６】
さらなる特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体全体である。
【００２７】
分子アンタゴニストは、ＧＩＰのアミノ酸配列に結合し得、アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される。
【００２８】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、ヒト定常領域を含むモノクローナル抗体全体である。
【００２９】
分子アンタゴニストは、約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａのＭＷを有し得る。分子アンタゴニストは、約０．１ｎＭ〜約７ｎＭのＩＣ５０によって特徴付けられる、ＧＩＰに対する結合親和性を有し得る。
【００３０】
組成物は、静脈内、腹腔内、または皮下に投与することができる。組成物は、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、増量剤、ポリマー、および安定化剤からなる群から選択される不活性な医薬賦形剤をさらに含んでよい。組成物は、散剤、注射剤、液剤、懸濁剤、または乳剤の形態であってよい。
【００３１】
組成物は、組成物１ミリリットル当たり約０．１ミリグラムから約１０００ミリグラムまでの量のモノクローナル抗体アンタゴニストを含有してよい。時には、組成物は凍結乾燥されていてよい。
【００３２】
脂肪肝疾患は、アルコール性脂肪肝疾患または非アルコール性脂肪肝疾患のいずれかであり得る。
【００３３】
モノクローナル抗体全体およびそのバリアントなどのいくつかの形態をとり得る、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストも本明細書に開示されている。分子アンタゴニストは上記の通りである。
【００３４】
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する相補ＤＮＡ配列も本明細書に開示されている。
【００３５】
本発明は、例えば、以下項目も提供する。
（項目１）
肥満症を治療する方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップ
を含み、
前記分子アンタゴニストが軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する、方法。
（項目２）
前記軽鎖可変ドメインの前記第１のＣＤＲ、前記第２のＣＤＲ、および前記第３のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記連結基が独立にアミノ酸の鎖である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記重鎖可変ドメインの前記第１のＣＤＲ、前記第２のＣＤＲ、および前記第３のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記連結基が独立にアミノ酸の鎖である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記分子アンタゴニストが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記分子アンタゴニストが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記分子アンタゴニストが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体全体である、項目１に記載の方法。
（項目９）
肥満症を治療する方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップ
を含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１０）
ＩＩ型糖尿病を治療する方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップ
を含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１１）
食物誘導性クッシング症候群を治療する方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１２）
メタボリックシンドロームを治療する方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１３）
肝臓内での脂肪組織の集積を減少させるための方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１４）
網内での脂肪組織の集積を減少させるための方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１５）
皮下脂肪組織の集積を減少させるための方法であって、
人間に薬学的有効量の胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含み、
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、方法。
（項目１６）
前記分子アンタゴニストが第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含み、各ＣＤＲが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記分子アンタゴニストの前記第１のＣＤＲと前記第２のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記連結基がアミノ酸の鎖である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記分子アンタゴニストが、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含む、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記分子アンタゴニストの前記第１のＣＤＲ、前記第２のＣＤＲ、および前記第３のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記連結基が独立にアミノ酸の鎖である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記分子アンタゴニストが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記分子アンタゴニストが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する重鎖可変ドメインを含む、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記分子アンタゴニストが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記分子アンタゴニストが軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、
前記軽鎖可変ドメインが第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを含み、各ＣＤＲが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを含む、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記分子アンタゴニストが軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記分子アンタゴニストが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体である、項目２５から２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記分子アンタゴニストが、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体である、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。（項目２９）
前記分子アンタゴニストが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体全体である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記分子アンタゴニストが、ＧＩＰのアミノ酸配列に結合し、前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記分子アンタゴニストが、ヒト定常領域を含むモノクローナル抗体である、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記分子アンタゴニストが、約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有する、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記分子アンタゴニストが、約０．１ｎＭ〜約７ｎＭのＩＣ５０によって特徴付けられる、ＧＩＰに対する結合親和性を有する、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記組成物が静脈内、腹腔内、または皮下に投与される、項目９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、増量剤、ポリマー、および安定化剤からなる群から選択される医薬賦形剤をさらに含む、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記組成物が、散剤、注射剤、液剤、懸濁剤、または乳剤の形態である、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記組成物が、前記組成物１ミリリットル当たり約０．１ミリグラムから約１０００ミリグラムまでの量の前記モノクローナル抗体アンタゴニストを含有する、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物が、凍結乾燥されている、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含む、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）の分子アンタゴニスト。
（項目４０）
第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含み、各ＣＤＲが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４１）
前記第１のＣＤＲと前記第２のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目４０に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４２）
前記連結基がアミノ酸の鎖である、項目４１に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４３）
配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含む、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４４）
前記第１のＣＤＲ、前記第２のＣＤＲ、および前記第３のＣＤＲが、連結基によって互いに接合している、項目４３に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４５）
前記連結基が独立にアミノ酸の鎖である、項目４４に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４６）
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４７）
配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する重鎖可変ドメインを含む、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４８）
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目４９）
軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、
前記軽鎖可変ドメインが第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを含み、各ＣＤＲが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを含む、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５０）
軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、
前記重鎖可変ドメインが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５１）
前記軽鎖可変ドメインおよび前記重鎖可変ドメインが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはモノクローナル抗体の一部である、項目４９から５０までのいずれか一項に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５２）
配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体である、項目３９に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５３）
配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体全体である、項目５２に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５４）
ＧＩＰのアミノ酸配列に結合し、前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される、項目３９から５３までのいずれか一項に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５５）
ヒト定常領域を含むモノクローナル抗体全体である、項目３９から５３までのいずれか一項に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５６）
約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有する、項目３９から５３までのいずれか一項に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５７）
約０．１ｎＭ〜約７ｎＭのＩＣ５０によって特徴付けられる、ＧＩＰに対する結合親和性を有する、項目３９から５３までのいずれか一項に記載の分子アンタゴニスト。
（項目５８）
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する相補ＤＮＡ配列。
本開示のこれらおよび他の非限定的な特徴を以下により詳細に論じる。
【００３６】
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。
【００３７】
以下は、図面の簡単な説明であり、本明細書に開示されている例示的な実施形態を例示する目的で示すものであり、それらを限定する目的のものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】図１Ａは、１７週の試験期間にわたる、３つの異なるマウスのセットについての、時間に対するマウスの体重を示すグラフである。高脂肪食を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスは、食餌誘導性の肥満および付随するメタボリックシンドロームの確立されたモデルである。「ＨＦＤ−対照」マウスには、高脂肪食（ＨＦＤ）を与え、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内注射によって投与した。「ＨＦＤ−ｍＡｂ」マウスには、ＨＦＤ食を与え、ＰＢＳ中の胃抑制ポリペプチドのモノクローナル抗体アンタゴニスト（ＧＩＰ  ｍＡｂ）を１週間当たり体重（ＢＷ）１ｋｇ当たり６０ｍｇで腹腔内注射によって投与した。「Ｉｓｏ食」マウスには、低脂肪の等カロリー食を与え、処置を行わなかった。ＨＦＤ食では、総カロリーの約６０％が脂肪に由来するが、等カロリー食では、総カロリーの約１０％が脂肪に由来する。ＧＩＰ  ｍＡｂを投与したマウスの体重増加ははるかに緩やかであった。１７週の試験期間にわたるＨＦＤ−対照マウスの平均体重増加は２１．５±１．０グラムであった。１７週の試験期間にわたるＨＦＤ−ｍＡｂマウスの平均体重増加は１１．５±０．５グラムであった。これらの２つの群間の体重増加の差異は、ｐ値０．０００００００７で有意であった。
【００３９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、３つの異なるマウスのセットについての、時間に対するパーセント体重増加を示すグラフである。ＧＩＰ  ｍＡｂを投与したマウスの体重増加ははるかに緩やかであった。ＨＦＤ−対照マウスの体重増加は、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスの速度のほぼ２倍であった。
【００４０】
【図２】図２は、腹腔内（ｉ．ｐ．）グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の結果を示すグラフである。１７週の試験期間後、各群から６匹のマウスをＩＰＧＴＴに供した。グルコース溶液（マウス体重１ｋｇ当たりグルコース２ｍｇ）をｉ．ｐ．投与した後、０分、１０分、３０分、６０分および１２０分の時点で血液を採取し、グルコース含量を測定した。グラフでは、血中グルコース濃度が時間に対してプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスは、ＨＦＤ−ｍＡＢマウスまたはＩｓｏ食マウスのいずれと比べても、ｉ．ｐ．グルコース負荷に対応するそれらの能力の効率が低かった。これは、ＨＦＤ−対照マウスでは耐糖能障害が発生したがＨＦＤ−ｍＡｂマウスまたはＩｓｏ食マウスでは耐糖能障害が発生しなかったことと一致する。
【００４１】
【図３】図３は、マウスの代表的な磁気共鳴画像である。ＨＦＤ−対照マウスからの代表的な画像（左側）およびＨＦＤ−ｍＡｂマウスからの代表的な画像（右側）が示されている。画像はマウスの側面画像を示すものであり、マウスの前側が画像の上になっており、マウスの後側が画像の下になっている。白色または明るいエリアは、脂肪含量が多いエリアを表す。
【００４２】
【図４】図４は、緩和補正脂肪フラクション（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ  Ｆａｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＦＦ）ＭＲＩから導き出された肝臓内脂肪フラクションを示すグラフである。１７週の食餌期間の最後に、各群から６匹のマウスを麻酔し、ＭＲＩに供した。ＲＣＦＦ技法を使用して、各マウスにおける肝臓内脂肪フラクションを定量的に評価した。各処置群についての平均肝臓内脂肪フラクションがプロットされている。対照の動物の肝臓内に蓄積した脂肪体積は、ＧＩＰ特異的ｍＡｂを用いて処置したマウスの２倍であった（ｐ＝０．０３）。
【００４３】
【図５】図５は、１７週の食餌期間後に緩和補正脂肪フラクション（ＲＣＦＦ）ＭＲＩから導き出された網内脂肪フラクションを示すグラフである。各処置群についての平均網内脂肪フラクションがプロットされている。対照の動物において蓄積した網内脂肪体積は、ＧＩＰ特異的ｍＡｂを用いて処置したマウスのほぼ３．５倍であった（ｐ＝０．０００５）。
【００４４】
【図６】図６は、緩和補正脂肪フラクション（ＲＣＦＦ）ＭＲＩによって導き出された皮下脂肪フラクションを示すグラフである。各処置群についての平均皮下脂肪フラクションがプロットされている。対照の動物において蓄積した皮下脂肪体積は、ＧＩＰ特異的ｍＡｂを用いて処置したマウスのおよそ２倍であった（ｐ＝０．０００２）。
【００４５】
【図７】図７は、１７週の試験期間後に屠殺したマウスから取得した肝臓の染色した組織断面の代表的な写真である。肝臓を取り出し、ホルマリン中に固定した。固定した組織を切片作製し、中性トリグリセリドおよび脂質を染色するために使用されるリゾクロム（ｌｙｓｏｃｈｒｏｍｅ）ジアゾ色素であるオイルレッドＯを用いて染色した。パネルは代表的な試料を示し、ＨＦＤ−ｍＡｂマウス（右側）における、ＨＦＤ−対照マウス（左側）と比較した肝臓内の暗赤色の脂肪滴の顕著な減少が示されている。
【００４６】
【図８】図８は、１７週の試験期間後にＨＦＤ−対照マウスにおいて見いだされた網内脂肪（左側）とＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおいて見いだされた網内脂肪（右側）を比較する２枚の写真のセットである。脂肪は、白色であり、ＨＦＤ−対照マウスでは、はるかに多くの脂肪が見える。
【００４７】
【図９】図９は、マウスの血清において測定されたトリグリセリド（ＴＧ）レベルを示すグラフである。１７週の食餌期間の最後に、マウスを屠殺し、全血を採取し、血清を調製し、血清トリグリセリドを測定した。各群のマウスについての平均血清ＴＧレベルがプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＴＧレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＴＧレベルの１．４４倍であった（ｐ＝０．０２）。ＴＧレベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【００４８】
【図１０】図１０は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定された総コレステロール（ＴＣ）レベルを示すグラフである。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＴＣレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＴＣレベルの１．５５倍であった（ｐ＝０．００６）。ＴＣレベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【００４９】
【図１１】図１１は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定された総コレステロール（ＴＣ）に対する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の比を示すグラフである。各群についての平均値がプロットされている。ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおける総コレステロールに対するＨＤＬの比は、ＨＦＤ−対照マウスにおける総コレステロールレベルに対するＨＤＬの比よりも２５％高かった（ｐ値＝０．０３）。総コレステロールレベルに対するＨＤＬの比が高いことは、低比率であることが肥満症およびメタボリックシンドロームに関連するので、望ましい。
【００５０】
【図１２】図１２は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを示すグラフである。各群のマウスについての平均血清ＬＤＬレベルがプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＬＤＬレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＬＤＬレベルの１．９５倍であった（ｐ＝０．００７）。ＬＤＬ（「悪玉」コレステロール）レベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【００５１】
【図１３】図１３は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定されたインスリンレベルを示すグラフである。各群から５匹のマウスについての平均血清インスリンレベルがプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスにおけるインスリンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるインスリンレベルの２．６倍であった（ｐ＝０．０３）。インスリンレベルが高いことは、肥満症、インスリン抵抗性、およびメタボリックシンドロームに関連する。ｙ軸の単位はピコグラム／ミリリットルであることに留意されたい。
【００５２】
【図１４】図１４は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定されたアディポネクチンレベルを示すグラフである。各群のマウスについての平均血清アディポネクチンレベルがプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスにおけるアディポネクチンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるアディポネクチンレベルの１．３５倍であった。アディポネクチンレベルが高いことは、総体脂肪量の増加に関連する。ｙ軸の単位はマイクログラム／ミリリットルであることに留意されたい。
【００５３】
【図１５】図１５は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定されたレプチンレベルを示すグラフである。各群のマウスについての平均血清レプチンレベルがプロットされている。ＨＦＤ−対照マウスにおけるレプチンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるレプチンレベルの５．７３倍であった（ｐ＝０．００６）。レプチンレベルが高いことは、総体脂肪の増加に関連する。ｙ軸の単位はピコグラム／ミリリットルであることに留意されたい。
【００５４】
【図１６】図１６は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定されたグルカゴンレベルを示すグラフである。各群のマウスについての平均血清グルカゴンレベルが上にプロットされている。群間で血清グルカゴンのレベルに有意差はなかった。ｙ軸の単位はピコグラム／ミリリットルであることに留意されたい。
【００５５】
【図１７】図１７は、１７週の食餌期間後にマウスの血清において測定されたグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）レベルを示すグラフである。各群のマウスについての平均血清ＧＬＰ−１レベルがプロットされている。群間で血清ＧＬＰ−１のレベルに有意差はなかった。ｙ軸の単位はピコグラム／ミリリットルであることに留意されたい。
【００５６】
【図１８】図１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおける、ＧＩＰに対するヒト化抗体３種と、併せて、元の抗体、陽性対照、および陰性対照の相対的な活性を示すグラフである。ｙ軸は相対的な活性であり、単位はない。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」という単数形は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、オープンエンドの移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」およびその変形は、指定された成分／ステップの存在を必要とし、かつ他の成分／ステップの存在が許容される。これらの句はまた、指定された成分／ステップおよび不可避の不純物のみが許容され、他の成分／ステップは排除されるクローズドエンドの句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」も開示するものと解釈されるべきである。
【００５９】
本出願の明細書および特許請求の範囲における数値は、同じ数の有効数字に減少させた場合に同じである数値、および、明示された値と、値を決定するための本出願に記載されている型の従来の測定技法の実験誤差未満だけ異なる数値を包含するものと理解されるべきである。
【００６０】
本明細書に開示されている範囲は全て、列挙された終点を含み、独立に組み合わせ可能である（例えば、「２グラムから１０グラムまで」という範囲は、終点である２グラムおよび１０グラム、ならびに全ての中間値を含む）。
【００６１】
「約」という用語を使用して、変動し得る任意の数値を、その値の基本的な機能を変化させずに含めることができる。範囲に使用される場合、「約」は、２つの終点の絶対値によって定義される範囲も開示し、例えば、「約２〜約４」は、「２から４まで」の範囲も開示する。「約」という用語は、示されている数のプラス１０％またはマイナス１０％を指し得る。
【００６２】
「同一性」という用語は、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の対間の類似性を指す。同一性は、同一の残基の数を残基の総数で割り、その結果に１００を掛けて百分率を得ることによって測定する。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが、あまり高度に保存的ではなく、欠失、付加、または置き換えを有する配列は、より低い程度の同一性を有し得る。配列同一性を決定するために、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用するものなどのいくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることが当業者には認識されよう。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施し、ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラムを実施し、それぞれのプログラムの初期パラメータを使用する。
【００６３】
２つの異なる配列は、その配列によりコードされるタンパク質の全体的な機能に影響を及ぼすことなく互いに変動し得る。この点について、化学的に類似したアミノ酸を、多くの場合、機能を変化させることなく互いに置き換えることができることが当技術分野で周知である。関連する特性としては、酸性／塩基性、極性／非極性、電荷、疎水性、および化学構造が挙げられ得る。例えば、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇは、化学的に類似しているとみなされ、多くの場合、互いに置き換えられ、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒ、芳香族残基Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐ、および非極性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔも同様である。これらの置換は、「保存的」であるとみなされる。同様に、ヌクレオチドコドンおよび許容される変動が当技術分野で公知である。例えば、コドンＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧは全てアミノ酸トレオニンをコードする、すなわち、３番目のヌクレオチドを、生じるアミノ酸を変化させずに改変することができる。類似性は、類似した残基の数を残基の総数で割り、その結果に１００を掛けて百分率を得ることによって測定する。類似性と同一性の測定値は特性が異なることに留意されたい。
【００６４】
「抗体」とは、免疫系により、標的抗原を同定するために使用されるタンパク質である。抗体の基本的な機能単位は、免疫グロブリン単量体である。単量体は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖とで構成され、Ｙ形のタンパク質が形成される。各軽鎖は定常ドメイン１つと可変ドメイン１つとで構成される。軽鎖に関しては、定常ドメインは「定常領域」とも称することができ、可変ドメインは「可変領域」とも称することができる。各重鎖は可変ドメイン１つと定常ドメイン３つまたは４つとで構成される。重鎖に関しては、定常ドメインは合わせて「定常領域」と称され、可変ドメインも「可変領域」と称することができる。Ｙのアームは断片、抗原結合性（Ｆａｂ）領域と称され、各アームはＦａｂ断片と称される。各Ｆａｂ断片は重鎖からの定常ドメイン１つと可変ドメイン１つ、および軽鎖からの定常ドメイン１つと可変ドメイン１つで構成される。Ｙの基部はＦｃ領域と称され、これは各重鎖からの定常ドメイン２つまたは３つで構成される。Ｆａｂ領域内の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、抗体のＧＩＰと結合する部分である。より詳細には、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それらの抗原（すなわちＧＩＰ）に結合する。各可変ドメインのアミノ酸配列内には、３つＣＤＲが非連続的に配置されている。「全体」という用語は、本明細書では、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを含有する抗体を指すために使用される。
【００６５】
「ＧＩＰのアンタゴニスト」とは、本開示によると、ＧＩＰに結合し、ＧＩＰの生物学的作用に干渉する分子である。
【００６６】
本開示は、ＧＩＰと拮抗する、すなわち、ＧＩＰに結合する分子を用いて患者を治療する方法に関する。この点について、胃抑制ポリペプチドまたはＧＩＰとも称されるグルコース依存性インスリン分泌ポリペプチドは、食後の期間に腸のＫ−細胞から放出されるインスリン分泌性ペプチドである。インクレチンと同様に、ＧＩＰは、食物摂取に応答して膵ベータ細胞を刺激することによってインスリン分泌を刺激する。ＧＩＰは、本明細書ではＧＩＰ（１−４２）とも記され、主に４２アミノ酸のポリペプチドとして循環しているが、Ｎ末端アミノ酸の最初の２つを欠く形態（ＧＩＰ（３−４２））でも存在する。ＧＩＰ（１−３０）−ＮＨ２またはＧＩＰ（１−３０）−アルファアミドは、Ｃ末端アミノ酸の最後の１２個を欠くＧＩＰ（１−４２）の合成誘導体である。ＧＩＰ（１−３０）−ＮＨ２はＧＩＰ（１−４２）と同じ生物学的機能を有する。天然に存在するＧＩＰ（１−３０）−ＮＨ２は、仮説は立てられているが、いかなる生物種においても同定されていない。
【００６７】
ＧＩＰは、標的細胞の表面上に見いだされるその同族受容体（ＧＩＰＲ）に結合することによって機能する。ＧＩＰＲは、膜貫通ドメインを７つ有するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のグルカゴン−セクレチンファミリーのメンバーである。ネイティブなＧＩＰ（１−４２）および合成誘導体ＧＩＰ（１−３０）−ＮＨ２は、高親和性でＧＩＰＲに結合し、アゴニスト性を有する。ＧＩＰ受容体は、脂肪細胞においても、脂肪細胞内のグルコースの取り込み、脂肪酸合成、および脂肪酸の脂質への組み入れの増加に伴うＧＩＰレベルの上昇に応答して発現する。ネイティブなＧＩＰ（１−４２）および合成誘導体ＧＩＰ（１−３０）−ＮＨ２は同様に、グルカゴンとイソプロテレノールを含めたβ−アドレナリン作動性受容体アゴニストとによって誘導される脂肪細胞における脂肪分解を阻害する。
【００６８】
ＧＩＰは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号１）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（配列番号２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号３）、およびブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）（配列番号４）の間で良く保存されている。これらの４つの配列の間では置換が４つのみあり、その全てが保存的である。これらの４種からの４２アミノ酸配列を以下に列挙する：
【化１】
2018076376.tif 000002
【００６９】
本出願は、ＧＩＰに結合する分子アンタゴニストを含有する組成物を使用して、脂肪肝疾患（ＦＬＤ）ならびに脂肪組織の集積を伴う他の疾患を治療する方法に関する。特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、モノクローナル抗体全体（すなわち、ＧＩＰ  ｍＡｂ）である。脂肪肝疾患では、脂肪症により、肝臓細胞内でのトリグリセリド脂肪の蓄積が生じる。経口的グルコース投与後、血清ＧＩＰレベルが５〜６倍に上昇し、それにより、インスリン放出が刺激され、それにより、グルコースの取り込みが促進されることが知られている。ＧＩＰはまた、Ａｋｔ／ＰＫＢを活性化し、それにより、グルコーストランスポーター−４の膜移行が促進され、グルコースの脂肪細胞取り込みが増強され、それにより、脂肪の生成および貯蔵が導かれる。結果として、ＧＩＰと拮抗し、その生物活性を低下させることにより、グルコースの吸収が阻害され、したがって、脂肪の生成および貯蔵が減少することが仮定された。本開示は、患者にＧＩＰモノクローナル抗体アンタゴニストを含む組成物を投与することによって肝臓、網、または皮下組織における脂肪の保持を減少させることができることを示す。モノクローナル抗体のＣＤＲに関する変形である他の分子アンタゴニストも、脂肪組織の集積を減少させるのに有効であり得る。
【００７０】
本明細書に記載のＧＩＰ分子アンタゴニストは、肥満症、メタボリックシンドローム、高脂血症、ＩＩ型糖尿病、および食物誘導性クッシング症候群などの、ＧＩＰ発現を低下させることによって、またはカロリー摂取を減少させるもしくは体重を減少させることによって治療することができる他の疾患または状態を好転させることにも役立ち得る。
【００７１】
本開示のＧＩＰモノクローナル抗体アンタゴニストは、以下の様式で生成し、スクリーニングすることができる。以下のアミノ酸配列を有する２つのペプチドを化学的に合成した：
【化２】
2018076376.tif 000003
【００７２】
ＧＩＰ（１−１７）＋Ｃのアミノ酸配列は、一般に成熟ヒト、マウス、ラット、およびブタＧＩＰに共有される最初の１７アミノ酸に対応する。この配列は、Ｎ末端に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とのコンジュゲーションを容易にする余剰のシステイン残基も含有する。Ｃ＋ｍＧＩＰ（２６−４２）のアミノ酸配列は、成熟マウスＧＩＰの最後の１７アミノ酸に対応し、これは、ヒトＧＩＰまたはブタＧＩＰと別々に比較した場合には置換を２つ有するのみであり、ラットＧＩＰと比較した場合には置換を３つ有するのみである。この配列は、Ｃ末端に、ＫＬＨとのコンジュゲーションを容易にする付加的なシステイン残基も含有する。この２つのペプチドをＫＬＨとコンジュゲートした。次いで、各コンジュゲートを別々に使用して、４つの異なる場合においてマウス４匹の群に注射した。脾臓を採取する１週間前、４週間前、７週間前、１０週間前および２４週間前にマウスに注射した。
【００７３】
免疫したマウスから脾臓を取り出し、脾細胞を単離した後にＢ細胞を不死化骨髄腫細胞とｉｎ  ｖｉｔｒｏで融合した。効率を上昇させるために融合プロセスにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めた。融合した細胞またはハイブリドーマをヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地中で１４日間インキュベートして、Ｂ細胞と融合しなかった骨髄腫細胞を死滅させた。次いで、ハイブリドーマ細胞をインキュベーション培地で希釈し、一連の９６ウェルプレートに移した。希釈は、各ウェルがおよそ１つの細胞を含有する程度までのものであった。ハイブリドーマ細胞を数日間増大させた後、馴化培地または上清をスクリーニングのために収集した。
【００７４】
９６ウェルプレートを、合成マウスＧＩＰ（１−４２）（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌ溶液５０μｌで使用してコーティングした。次いで、ハイブリドーマ上清を収集し、マウスＧＩＰ（１−４２）を含有するウェルに添加して３７℃で４時間置いた。次いで、上清を取り出し、洗浄してマウスＧＩＰに結合しないあらゆる抗体を除去した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧの溶液をウェルに添加した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、５０００分の１の希釈度で使用した。３７℃で１時間インキュベートした後、抗体溶液を除去し、ウェルを、ＰＢＳ中０．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いて２回洗浄した。
【００７５】
次いで、０．４ｍｇ／ｍｌの尿素・過酸化水素および０．０５Ｍのリン酸クエン酸、ｐＨ５．０中４ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＯ）を含有する溶液を各ウェルに添加した。ＨＲＰ活性を定量化するために、各ウェルについて４９０ｎｍの波長における吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。これにより、ウェル内のマウスＧＩＰに結合するモノクローナル抗体を生成したハイブリドーマを同定することが可能になった。
【００７６】
次に、これらの同定されたハイブリドーマ由来の上清をその後にマウスＧＩＰの４μｇ／ｍｌ溶液と混合して３７℃で３０分置き、次いで、上記の通りマウスＧＩＰでコーティングしたウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰをウェルに添加した。１時間インキュベートした後、試料を洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌの尿素・過酸化水素、および０．０５Ｍのリン酸クエン酸、ｐＨ５．０中４ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ基質ＯＰＯを含有する溶液を各ウェルに添加した。各ウェルにおけるＨＲＰ活性を定量化した。このスクリーニングでは、懸濁液中のＧＩＰに結合したモノクローナル抗体は「中和」され、ウェルに固定されたＧＩＰには結合することができない。したがって、ＨＲＰ活性が低いウェルは、懸濁液中のＧＩＰにより有効に結合したモノクローナル抗体に対応する。これらの基準を使用して、懸濁液中のマウスＧＩＰに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を最も良好に生成する５つのハイブリドーマを同定した。マウスＧＩＰとヒトＧＩＰの間の同一性の対応が高度であるので、マウスＧＩＰに結合したこれらのｍＡｂはヒトＧＩＰにも結合することが予測された。
【００７７】
次に、ＧＩＰを中和し、リガンド−受容体相互作用、受容体の活性化および受容体依存性シグナル伝達を妨げるハイブリドーマ上清の能力を、細胞培養系を使用して試験した。この系では、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ−）−応答性プロモーターの制御下でｌａｃＺ遺伝子を有し、細胞表面上にラットＧＩＰＲを発現するレポーター細胞（ＬＧＩＰＲ２細胞）を使用した。これらの細胞へのＧＩＰの添加により、ＧＩＰＲの活性化、ｃＡＭＰの蓄積を導くシグナル伝達カスケードの誘導、ｌａｃＺ遺伝子の誘導およびβ−ガラクトシダーゼの合成が導かれる。試験試料を添加し、４時間インキュベートした後、比色定量アッセイを用いて細胞溶解物中のβ−ガラクトシダーゼ含量を測定した。色の変化の程度はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルに比例する。β−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、試験試料中の遊離の生物活性ＧＩＰの量に左右される。
【００７８】
懸濁液アッセイにおいて陽性にスコア付けされた、培養物中で成長させた５つのハイブリドーマクローン由来の上清を、マウスＧＩＰまたはヒトＧＩＰの溶液を用いて１：１および１：２０に希釈した。次いで、混合物をＬＧＩＰＲ２細胞に添加し、インキュベートした後、洗浄し、β−ガラクトシダーゼについてアッセイした。５つの上清のうち３つで、１：１に希釈した場合にマウスＧＩＰの有意な阻害が示され、これらの３つの上清のうち２つで、１：２０に希釈した場合にマウスＧＩＰの有意な阻害が示された。
【００７９】
モノクローナル抗体がＧＩＰに特異的であることを実証するために、懸濁液アッセイにおいて陽性にスコア付けされた５つのハイブリドーマ由来の上清を、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の０．１ｎＭ溶液を用いて１：１に希釈した。次いで、混合物をＬＧＬＰ−１Ｒ細胞に添加した。ＬＧＬＰ−１Ｒ細胞は、ＧＬＰ−１受容体を発現し、ＧＩＰＲを発現しないこと以外はＬＧＩＰＲ２細胞と同一である。細胞を３７℃で４時間インキュベートした後、混合物を取り出し、細胞を洗浄し、β−ガラクトシダーゼ含量をアッセイした。ネイティブなＧＬＰ−１を阻害した上清はなく、これにより、ＧＩＰに対する特異性が示される。
【００８０】
次に、１：２０に希釈した場合にマウスＧＩＰの有意な阻害を示す上清を産生した２つのハイブリドーマを増大させ、細胞およそ５×１０５個を採取し、Ａｍｂｉｏｎから購入したキット（ＲＮａｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを調製した。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したｃＤＮＡ合成用のＳｕｐｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍを使用して第１鎖ｃＤＮＡを作出するために全ＲＮＡ２マイクログラムを使用した。得られたｃＤＮＡを使用して、重鎖可変配列および軽鎖可変配列をコードするｃＤＮＡを２つの別々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において増幅した。
【００８１】
重鎖可変配列を増幅するために、配列ＣＡＧＴＣＧＡＡＧＣ  ＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡ  ＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧ  ＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ  ＣＣＣＡＧ（配列番号４３）を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用し、配列：ＣＡＡＣＴＡＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＧＴＳＭＡＲ  ＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴ  ＣＷＧＧ（配列番号４４）を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用した。リバースプライマーは、その５’末端に配列ＡＡＧＣＴＴ（配列番号４５）を含有し、これは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに対する認識配列である。フォワードプライマーは、その５’末端に配列ＧＧＡＴＣＣ（配列番号４６）を含有し、これは、制限酵素ＢａｍＨＩに対する認識配列である。得られたＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したプラスミドｐＵＣ１８にライゲーションした。ライゲーション反応を、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから購入したＦａｓｔ−Ｌｉｎｋキットを使用して実施した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のカルベニシリンを含有する寒天プレート上で、プラスミドを取り込んだ細菌を選択した。カルベニシリン寒天プレート上で成長したコロニーを選び取り、培養物２ｍｌ中で１６時間成長させた。細菌を採取し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ性溶解ミニプレップ法を使用して単離した。精製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した後、ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液中１．２％アガロースゲルを通じた電気泳動によって分解した。ゲル中のＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色し、紫外線ランプを使用して可視化した。おおよその分子サイズが３７４塩基対である制限断片を生じたプラスミドについて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入したサービスを使用して配列決定した。
【００８２】
軽鎖可変配列を増幅するために、上記と同じ手順に概ね従った。主要な差異は、配列：ＣＡＧＴＣＧＡＡＧＣ  ＴＴＧＴＴＡＧＡＴＣ  ＴＣＣＡＧＣＴＴＧ  ＧＴＣＣＣ（配列番号４７）を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列ＣＡＡＣＴＡＧＧＡＴ  ＣＣＧＡＣＡＴＴＣＡ  ＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ  ＴＣＴＣＣＡ（配列番号４８）を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用したことである。重ねて、フォワードプライマーはＨｉｎｄＩＩＩに対する認識配列（配列番号４５）を含有し、リバースプライマーはＢａｍＨＩに対する認識配列（配列番号４６）を含有する。おおよその分子サイズが３５５塩基対である制限断片を生じたプラスミドについて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入したサービスを使用して配列決定した。
【００８３】
上記の手順を使用して同定して得られたｍＡｂはマウス抗体である。これらのマウス抗体を、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域にそれぞれ融合したマウス重鎖の可変ドメインおよびマウス軽鎖の可変ドメインを有するキメラ抗体を形成することによって部分的にヒト化した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して重鎖可変配列および軽鎖可変配列を増幅することによって行った。ＰＣＲに使用した鋳型は、対応する可変重鎖ｃＤＮＡ配列または可変軽鎖ｃＤＮＡ配列を含有するｐＵＣ１８誘導体であった。重鎖可変領域は、配列ＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣ  ＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧ  ＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴ（配列番号４９）を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列ＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧ  ＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣ  ＧＧＴＧＡＣＣＧＴ（配列番号５０）を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用して増幅した。フォワードプライマーは、その５’末端に配列ＧＡＡＴＴＣ（配列番号５１）を含有し、これは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識配列である。リバースプライマーは、その５’末端に配列ＧＣＴＡＧＣ（配列番号５２）を含有し、これは、制限酵素ＮｈｅＩに対する認識配列である。ＰＣＲ増幅の後、ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩを用いて消化したプラスミドｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１とライゲーションした。プラスミドｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した哺乳動物発現ベクターである。可変重鎖ｃＤＮＡ配列をこのプラスミドにクローニングすることにより、マウス可変領域とヒト定常領域とからなるキメラ重鎖をコードする遺伝子を作製した。ライゲーション反応を、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから購入したＦａｓｔ−Ｌｉｎｋキットを使用して実施した。ライゲーション反応物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのゼオマイシンを含有する寒天プレート上で、プラスミドを取り込んだ細菌を選択した。ゼオマイシン寒天プレート上で成長したコロニーを選び取り、培養物２ｍｌ中で１６時間成長させた。細菌を採取し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ性溶解ミニプレップ法を使用して単離した。精製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩＩおよびＮｈｅＩを用いて消化した後、ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液中１．２％アガロースゲルを通じた電気泳動によって分解した。ゲル中のＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色し、紫外線ランプを使用して可視化した。クローニングの成功を、分子サイズが３７３塩基対のＤＮＡ断片を同定することによって確認した。
【００８４】
軽鎖可変領域を、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識配列（配列番号５１）を含有する配列ＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号５５）を有するオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列ＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡ  ＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴ  ＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴ  ＣＣＣＡ（配列番号５３）を有するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして使用して増幅した。リバースプライマーは、その５’末端に配列ＣＧＴＡＣＧ（配列番号５４）を含有し、これは、制限酵素ＢｓｉＷＩに対する認識配列である。ＰＣＲ増幅の後、ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｗｉＩで消化し、同様に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｗｉＩを用いて消化したプラスミドｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈＫとライゲーションした。プラスミドｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈＫは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した哺乳動物発現ベクターである。可変軽鎖ｃＤＮＡ配列をこのプラスミドにクローニングすることにより、マウス可変領域とヒト定常領域とからなるキメラ軽鎖をコードする遺伝子を作製した。ライゲーション反応を、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから購入したＦａｓｔ−Ｌｉｎｋキットを使用して実施した。ライゲーション反応物を使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細菌細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換した。５０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含有する寒天プレート上で、プラスミドを取り込んだ細菌を選択した。ブラストサイジン寒天プレート上で成長したコロニーを選び取り、培養物２ｍｌ中で１６時間成長させた。細菌を採取し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ性溶解ミニプレップ法を使用して単離した。精製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩＩおよびＢｓｉＷＩを用いて消化した後、ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液中１．２％アガロースゲルを通じた電気泳動によって分解した。ゲル中のＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色し、紫外線ランプを使用して可視化した。クローニングの成功を、分子サイズが３５３塩基対のＤＮＡ断片を同定することによって確認した。
【００８５】
ハイブリドーマからクローニングされた可変領域とヒト定常領域とを含有するキメラ抗体を発現させるために、それぞれ可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含有するｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１誘導体およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈＫ誘導体を培養物中のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−１）細胞に導入した。ＤＮＡの培養細胞への侵入を容易にするためにカチオン性脂質試薬Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用したトランスフェクションによってプラスミドＤＮＡを導入した。トランスフェクションの２日後、細胞上清を収集し、ＧＩＰ−中和活性について分析した。キメラｍＡｂのＧＩＰを中和する能力を実証するために、細胞上清を等体積の２×１０−９ＭのｈＧＩＰと混合した後、培養物中のＬＧＩＰＲ２細胞に添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。このアッセイでは、ハイブリドーマ由来の可変軽鎖配列および可変重鎖配列を含有するプラスミドの組合せは、１０ｇ１０と称され、細胞に基づくレポーターアッセイにおいてＧＩＰ活性を中和することができるものであった。
【００８６】
上に開示されている手順を使用して作出し、同定したｍＡｂの可変領域を維持し、定常領域をヒト定常領域で置換した。あるいは、ＧＩＰ  ｍＡｂアンタゴニストは、「完全」ヒトｍＡｂが作出されるように、トランスジェニックマウスを使用して作出することもでき、他の技術を使用することもできる。例えば、マウス抗体において保存されている可変ドメイン内のアミノ酸をヒト抗体において保存されているアミノ酸で置き換えることができる。
【００８７】
したがって、生じたモノクローナル抗体アンタゴニストはＧＩＰに結合する。特定の実施形態では、本開示の組成物に使用される分子アンタゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択されるアミノ配列に結合することができる。言い換えると、アンタゴニスト（例えば、モノクローナル抗体）は、これらの４つの配列に含有されるエピトープに結合する。
【００８８】
種々の実施形態では、分子アンタゴニストは、約１２０ｋＤａ〜約５００ｋＤａを含めた、約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。他の実施形態では、分子アンタゴニストは、約０．１ｎＭ〜約７ｎＭのＩＣ５０によって特徴付けられる、ＧＩＰに対する結合親和性を有する。
【００８９】
既に論じた通り、ＧＩＰに結合するモノクローナル抗体アンタゴニストは、ＧＩＰに結合する軽鎖および重鎖内の可変ドメイン、またはより詳細には、ＧＩＰに結合する軽鎖および重鎖の可変ドメインのＣＤＲを有する。本開示の分子アンタゴニストは、ＧＩＰに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含有することが一般に意図されている。より詳細には、分子アンタゴニストは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲを少なくとも１つ含有する。これらのＣＤＲは、上記の１０ｇ１０ハイブリドーマにおいて同定された軽鎖および重鎖内の可変ドメインの種々の改変を通じて同定した。これらの改変は、下の実施例の節においてより詳細に論じられている。ＣＤＲ（複数可）は、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有すること、またはこれらのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有することがより望ましい。さらなる特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、上記の群内の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの異なるアミノ酸配列に対して必要な同一性を有するＣＤＲを２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ含有する。
【００９０】
いくつかのさらなる特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含み、各ＣＤＲは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する。これらのＣＤＲは、軽鎖の可変ドメインにおいて同定された。ＣＤＲは、これらのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有することがより望ましい。
【００９１】
他の特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する軽鎖可変ドメインを含む。これらの３つのＣＤＲの組合せを含有する可変ドメインを、ＧＩＰに対する非常に高い結合親和性を有するものとして同定した。３つのＣＤＲは、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有すること、あるいはこれらのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有することがより望ましい。
【００９２】
追加的な実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを有する重鎖可変ドメインとを含む。これらの３つのＣＤＲの組合せを含有する可変ドメインを、ＧＩＰに対する非常に高い結合親和性を有するものとして同定した。３つのＣＤＲは、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有すること、あるいはこれらのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有することがより望ましい。
【００９３】
これらの可変ドメインは、上に明記されているＣＤＲを２つまたは３つ含有し、ＣＤＲは連結基によって互いに接合していることが一般に意図されている。連結基は、一般に、ＣＤＲがＧＩＰに結合することを可能にする任意の基であってよい。例えば、連結基は、抗体の天然の可変ドメインに存在するように、アミノ酸の鎖であってよい。アミノ酸は任意の所望の長さであってよい。
【００９４】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。軽鎖可変ドメインは、これらのアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する、あるいは１００％の同一性を有することがより望ましい。これらの可変ドメインは、アミノ酸と一緒に連結した、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲの種々の組合せを含有する。
【００９５】
他の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインは、これらのアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有すること、あるいは１００％の同一性を有することがより望ましい。これらの可変ドメインは、アミノ酸で連結した、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４の重鎖ＣＤＲの種々の組合せを含有する。
【００９６】
上に開示されている軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの任意の組合せを有する分子アンタゴニストも意図されている。より詳細には、いくつかの分子アンタゴニストは、軽鎖可変ドメインをただ１つと重鎖可変ドメインをただ１つ含有する。その他は、複数の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含有し、これらの実施形態では、通常、複数の軽鎖可変ドメインは同じものであり、複数の重鎖可変ドメインは同じものである。
【００９７】
一部の特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含む。軽鎖可変ドメインは、第１のＣＤＲと第２のＣＤＲとを含み、各ＣＤＲは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、重鎖可変ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第１のＣＤＲと、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第２のＣＤＲと、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する第３のＣＤＲとを含む。軽鎖可変ドメインは、列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して１００％の同一性を有し得る。より詳細には、重鎖可変ドメインは、列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する、あるいは１００％の同一性を有する。
【００９８】
他の特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含む。軽鎖可変ドメインは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、重鎖可変ドメインは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。より詳細には、軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインは、それらの列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する、あるいは１００％の同一性を有する。
【００９９】
さらなる特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有する。重ねて、これらのドメインは、それらの列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％の同一性を有し得る。
【０１００】
特に望ましい実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、および配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを有する。さらなる特定の実施形態では、これらのドメインは、それらの列挙されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し得る、または１００％の同一性を有し得る。
【０１０１】
本開示の分子アンタゴニストは、いくつかの異なる実施形態では、上記の通り軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを有する。分子アンタゴニストは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、またはこれらの可変ドメインを一部とするモノクローナル抗体であり得ることが特に意図されている。
【０１０２】
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、通常約１０〜約２５アミノ酸（しかし、この範囲内である必要はない）の長さの連結基で接合した軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含む。一方の可変ドメインのＮ末端と他方の可変ドメインのＣ末端が接続している。所望であれば、セルトリズマブペゴルのように、ｓｃＦＶをペグ化して（ポリエチレングリコールを用いて）、そのサイズを増大させることができる。２つのｓｃＦｖを別の連結基で接合して、タンデムなｓｃＦｖを作製することができる。
【０１０３】
軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインが短い連結基で接合してｓｃＦｖを形成している場合、この２つの可変ドメインは一緒にフォールディングすることはできず、ｓｃＦｖは二量体化してダイアボディを形成する。さらに短い連結基では三量体（すなわち、トリアボディ）および四量体（すなわち、テトラボディ）の形成がもたらされ得る。
【０１０４】
モノクローナル抗体全体は、２つの重鎖と２つの軽鎖とから形成される。重ねて、各軽鎖および各重鎖は、可変ドメインを含有する。各軽鎖は重鎖と結合している。２つの重鎖はヒンジ領域において接合している。重鎖の定常領域をヒンジ領域の下で取り除くと、合計４つの可変ドメインを含有するＦ（ａｂ’）２断片が生じる。次いで、Ｆ（ａｂ’）２断片を２つのＦａｂ’断片に分けることができる。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域由来のスルフヒドリル基を含有する。重鎖の定常領域をヒンジ領域の上で取り除くとＦａｂ断片が形成され、スルフヒドリル基はヒンジ領域に由来しない。しかし、これらの断片は全て、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含有する。
【０１０５】
下記の実験において探究される望ましい実施形態では、分子アンタゴニストは、上に開示されている可変領域／ドメインとヒト定常領域との組合せを有する軽鎖および重鎖から形成されたモノクローナル抗体全体である。重鎖の定常領域は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭを含めた任意のヒトアイソタイプのものであってよい。軽鎖のヒト定常領域は、カッパまたはラムダアイソタイプであってよい。特定の実施形態では、重鎖定常領域はＩｇＧ１アイソタイプであり、軽鎖定常領域はカッパアイソタイプである。
【０１０６】
特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体である。これらのドメインは、それらの列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％の同一性を有し得る。
【０１０７】
他の特定の実施形態では、分子アンタゴニストは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号２９に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体全体である。これらのドメインは、それらの列挙されているアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し得る、または１００％の同一性を有し得る。
【０１０８】
特定の形態がモノクローナル抗体であるＧＩＰの分子アンタゴニストは、次いで、人間に投与することができる組成物に使用することができる。組成物は、薬学的有効量のＧＩＰの分子アンタゴニストを含有する。特定の実施形態では、組成物は、組成物１ミリリットル当たり約０．１〜約１０００ミリグラム（ｗ／ｖ）の量の分子アンタゴニストを含有する。
【０１０９】
ＧＩＰの分子アンタゴニストを含有する医薬組成物は、一般に、薬物の選択および疾患による必要に応じて、非経口（すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、胸膜内、小胞内またはくも膜下腔内）経路によって投与する。特定の製剤または適用において使用する用量は、疾患の特定の状態の必要量および担体材料の能力の特徴により課される制約によって決定される。最も望ましい形態では、組成物を静脈内、腹腔内、または皮下に投与することが意図されている。
【０１１０】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。担体は、分子アンタゴニストを送達するためのビヒクルとして作用する。薬学的に許容される担体の例としては、分子アンタゴニストを溶解または懸濁させることができる、水、油、およびアルコールのような液体担体が挙げられる。
【０１１１】
医薬組成物は、賦形剤も含んでよい。特定の賦形剤としては、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、増量剤、ポリマー、および安定化剤が挙げられ、これらは、これらの分子アンタゴニストに有用である。緩衝剤は、組成物のｐＨを制御するために使用する。界面活性剤は、タンパク質を安定化するため、タンパク質の凝集を阻害するため、表面へのタンパク質の吸着を阻害するために使用し、タンパク質のリフォールディングに役立つ。例示的な界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、およびドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。保存剤は、微生物の成長を防止するために使用する。保存剤の例としては、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、およびフェノールが挙げられる。増量剤は、かさを増すために凍結乾燥の間に使用する。デキストラン、ヒドロキシルエチルデンプン、ポリエチレングリコール、およびゼラチンなどの親水性ポリマーを、タンパク質を安定化するために使用することができる。ポリエチレングリコールなどの非極性部分を有するポリマーも界面活性剤としても使用することができる。タンパク質安定化剤としては、ポリオール、糖、アミノ酸、アミン、および塩を挙げることができる。適切な糖としては、スクロースおよびトレハロースが挙げられる。アミノ酸としては、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、プロリン、リシン、グルタミン酸、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ヒト血清アルブミンのようなタンパク質を表面に競合的に吸着させ、タンパク質様分子アンタゴニストの凝集を減少させることもできる。特定の分子が多数の目的に役立ち得ることに留意するべきである。例えば、ヒスチジンは、緩衝剤および抗酸化剤としての機能を果たし得る。グリシンは、緩衝剤として、かつ増量剤として使用することができる。
【０１１２】
医薬組成物は、散剤、注射剤、液剤、懸濁剤、または乳剤の形態であってよい。組成物を注射によって送達することが意図されている。時には、ＧＩＰの分子アンタゴニストを、当業者に公知の標準の技法を使用して凍結乾燥させることができる。次いで、凍結乾燥させたアンタゴニストを、例えば、適切な希釈剤、例えば、通常の生理食塩水、滅菌水、氷酢酸、酢酸ナトリウム、これらの組合せなどを用いて再構成することができる。
【０１１３】
用量は、薬物の治療指数、疾患の型、患者の年齢、患者の体重、および耐容性を含めた種々の因子に左右される。用量は、一般に、患者において約０．１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌまでの血清中濃度が実現されるように選択する。特定の患者の用量は、熟練臨床医が、上記の因子を考慮して、標準の薬理学的手法を使用して決定することができる。治療に対する応答は、血中または体液中のグルコースレベルまたはインスリンレベルを分析することによって、または、患者における脂肪レベルをモニターすることによってモニターすることができる。熟練臨床医は、これらの測定によって明らかになった治療に対する応答に基づいて用量を調整する。通常、治療効果をもたらすためには単回投与で十分であり得るが、実質的な期間にわたって継続した応答を保証するために多数回投与を使用することが意図されている。本明細書に開示されている分子アンタゴニストのタンパク質様の性質に起因して、アンタゴニストの体内半減期は長く、したがって、組成物は、月に１回もしくは２回、または場合によって週に１回投与するだけでよいと考えられている。分子アンタゴニストの循環濃度は、食事中または食事後に生成するＧＩＰを中和するために十分なものであるはずである。
【０１１４】
本開示のＧＩＰ分子アンタゴニストを含有する医薬組成物は、脂肪肝疾患または組織内での脂肪の蓄積を伴う他の疾患を治療するために使用することができる。「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、疾患の進行の低減、疾患の後退、および／または疾患の発現の確率を低下させるための予防的使用を指すために使用される。これは、肝臓内脂肪フラクション、網内脂肪フラクション、または皮下脂肪フラクションを介するものなどの、いくつかの異なるやり方で測定することができる。
【０１１５】
肥満の個体に関しては、ＧＩＰ分子アンタゴニストにより、腸細胞におけるＧＩＰのその受容体との結合が阻害され、それにより、細胞質から管腔膜へのＧＩＰに誘導されるナトリウム／グルコース輸送（ＳＧＬＴ１）の移行が阻害されることによって食後のグルコースの吸収が減少すると考えられている。ＧＩＰに誘導される膵ベータ細胞からのインスリン分泌も弱まり、それにより、インスリン応答の上昇に伴う栄養分の貯蔵が減少する。脂肪細胞におけるＧＩＰのその受容体への結合を阻害することにより、脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）へのＧＩＰに誘導されるグルコースの取り込みも減少し、ＧＩＰによる脂肪分解の阻害が防止されるはずである。全体的に、これにより、栄養分の取り込みおよび貯蔵の効率が低下し、体重減少が促進される。これらの効果は、メタボリックシンドロームまたは高脂血症の患者にも有益である。
【０１１６】
ＩＩ型糖尿病の患者に関しては、腸細胞におけるＧＩＰのその受容体への結合を阻害することにより、食後のグルコースの吸収および血糖が減少する。過食の患者にも、ＧＩＰを中和することによる体重減少効果が有益である。
【０１１７】
脂肪肝疾患にかかりやすいまたは罹患している患者に関しては、ベータ細胞におけるＧＩＰのその受容体への結合を阻害することにより、食後のインスリン分泌が減少し、したがって、肝臓におけるインスリンに誘導される脂肪の蓄積が減少する。
【０１１８】
食物誘導性クッシング症候群に罹患している患者に関しては、副腎細胞におけるＧＩＰのその受容体への結合を阻害することにより、食物摂取後のＧＩＰに誘導されるコルチゾール分泌が減少するまたはその増加が防止される。
【０１１９】
以下の非限定的な実施例の３つのセットにおいて本開示をさらに例示し、これらの実施例は、単に例示的なものであること、および本開示は、本明細書において列挙されている材料、条件、プロセスパラメータなどに限定されるものではないことを意図していることが理解される。別段の指定のない限り割合は全て重量によるものである。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
上記の通りモノクローナル抗体を生成し、ハイブリドーマを使用してスクリーニングして、懸濁液中の胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）に対する高い結合親和性を有するモノクローナル抗体を同定した。このようにして、１０ｇ１０モノクローナル抗体が同定された。
【０１２１】
１０ｇ１０軽鎖可変ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第１のＣＤＲは、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第２のＣＤＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第３のＣＤＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。１０ｇ１０軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する。
【０１２２】
１０ｇ１０重鎖可変ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第１のＣＤＲは、配列番号３１のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第２のＣＤＲは、配列番号３４のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第３のＣＤＲは、配列番号３３のアミノ酸配列を有する。１０ｇ１０重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、配列番号３９のヌクレオチド配列を有する。
【０１２３】
比較のために、ＧＩＰに対する結合親和性を有さないものとして１４Ｂ９抗体を同定した。１４Ｂ９軽鎖可変ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第１のＣＤＲは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第２のＣＤＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変ドメインの第３のＣＤＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。１４Ｂ９軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列を有する。
【０１２４】
１４Ｂ９重鎖可変ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第１のＣＤＲは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第２のＣＤＲは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。重鎖可変ドメインの第３のＣＤＲは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。１４Ｂ９重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列を有する。
【０１２５】
（実施例２）
材料および方法
【０１２６】
９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス３０匹をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。試験の１日目に、各マウスの体重を計り、１９グラムから２５グラムの間であった。次いで、マウスをその後ランダムにそれぞれマウス１０匹の３つの群に分けた。
【０１２７】
全てのマウスが試験全体を通して食物および水を自由に摂ることができた。全てのマウスを動物設備に収容し、２２±２℃、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルで維持した。マウスをケージ当たり５匹の群で、それぞれが体重２５グラムに達するまで収容した。次いで、マウスをその後ケージ当たり動物２〜３匹で収容した。
【０１２８】
高脂肪食（ＨＦＤ）（カタログ番号ＴＤ．０６４１４）および低脂肪等カロリー食（カタログ番号ＴＤ．０８８０６）をＨａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。ＨＦＤは、重量で、およそ２３．５％のタンパク質、２７．３％の炭水化物および３４．３％の脂肪からなった。ＨＦＤは、総カロリーをタンパク質から１８．４％、炭水化物から２１．３％、および脂肪から６０．３％をもたらすものであり、５．１ｋｃａｌ／グラムであった。等カロリー食は、重量で、およそ１８．６％のタンパク質、６２．６％の炭水化物および４．２％の脂肪からなった。等カロリー食は、総カロリーをタンパク質から２０．５％、炭水化物から６９．１％、および脂肪から１０．４％をもたらすものであり、３．６ｋｃａｌ／グラムであった。
【０１２９】
マウス１０匹の１つの群（ＨＦＤ−対照群）にはＨＦＤを１７週間与え、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．１ｍＬを１週間当たり５回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した。
【０１３０】
マウス１０匹の第２群（ＨＦＤ−ｍＡｂ群）にはＨＦＤを１７週間与え、ＰＢＳ中１０ｇ１０  ＧＩＰ  ｍＡｂを１週間当たり５回投与した。月曜日から木曜日までは、ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂからなる溶液０．１ｍＬをｉ．ｐ．注射によって投与した。各金曜日には、ＰＢＳ中０．４ｍｇ／ｍＬのｍＡｂからなる溶液０．１ｍＬをｉ．ｐ．注射によって投与した。これにより、試験の各週について、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＧＩＰ  ｍＡｂの投与が週４日、および２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＧＩＰ  ｍＡｂの投与が週１日もたらされた。この投薬レジメンを試験の過程にわたって継続した。
【０１３１】
マウス１０匹の第３群（Ｉｓｏ食群）には等カロリー食を１７週間与えた。この群には注射を行わなかった。
【０１３２】
試験期間中の各月曜の夕方に各マウスの体重を測定し、記録した。さらに、各群について消費された食物の量も試験の過程全体を通して測定し、記録した。
【０１３３】
結果
【０１３４】
ＨＦＤ−対照群はＨＦＤ−ｍＡｂ群またはＩｓｏ食群のほぼ２倍の速度で体重が増加した。
【０１３５】
時間に対する全体重が図１Ａに例示されている。各週についての体重増加の百分率が図１Ｂに例示されている。特別食を１週間与えた後、どちらの高脂肪食（ＨＦＤ）群（ＧＩＰ  ｍＡｂを用いたものと用いなかったもの）も体重がおよそ１０％増加した。両方のＨＦＤ群の体重増加は、第４週までほぼ同等のままであり、この時、ＨＦＤ−ｍＡｂ群の体重増加は減速し始めたが、ＨＦＤ−対照群の体重は着実に増加した。体重増加の差異は７週までに非常に有意なものになった（ｐ＜０．００１）。Ｉｓｏ食群は、試験期間を通じてより遅い速度で体重が増加した。ＨＦＤ−ｍＡｂ群とＩｓｏ食群の体重増加は１７週間後にほぼ同じ量であった。ＧＩＰ  ｍＡｂアンタゴニストの投与には、マウスの体重増加に対する明白な効果があった。
【０１３６】
図１Ｂに基づいて、ＧＩＰ  ｍＡｂの効果は即時的なものではなく、ある期間にわたって一貫した投薬が必要であると思われる。実験の第１週〜第４週では、ＨＦＤを与えた両群のマウスの体重増加はほぼ同一であった。第５週目から初めて、ＨＦＤ−ｍＡｂ群の体重増加がＨＦＤ−対照群と比較して遅い速度で増加し始めた。
【０１３７】
ＭＲＩ
材料および方法
【０１３８】
特別食を１７週間与えた後、ＨＦＤ−対照群から６匹のマウスおよびＨＦＤ−ｍＡｂ群から６匹のマウスを磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のためにランダムに選択した。全てのマウスを麻酔した後、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて画像化を行った。
【０１３９】
２Ｄ  Ｔ１強調非対称エコー、Ｒａｐｉｄ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ（ａＲＡＲＥ）シーケンスをＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃ  ７Ｔ  ｓｍａｌｌ  ａｎｉｍａｌ  ＭＲＩ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）（ＴＲ＝１０８７ｍｓ、ＴＥ＝９．１ｍｓ、ＦＯＶ＝１００×５０ｍｍ、５１２×２５６マトリックス、平均４、エコートレイン数＝４、スライス厚＝１ｍｍ）で実施した。ａＲＡＲＥシーケンスにより、脂肪と水の間のπ／６、５π／６、および３π／２放射シフト（７Ｔでエコーシフト７９、３９６、および７１４μｓ）を実現するためのユーザーが選択可能なエコー遅延がもたらされる。
【０１４０】
ａＲＡＲＥ取得から得たＭＲ画像を使用して、７Ｔについて改変ＩＤＥＡＬ画像再構成技法によって別々の脂肪および水画像を生成し、マウスにおける脂質の体内分布の決定を可能にした。この点について、肥満症、メタボリックシンドロームおよびＮＡＦＬＤは全体重に関する結果だけではなく、どこに過剰な脂肪が貯蔵されているかにも左右される。
【０１４１】
結果
【０１４２】
図３は、ＨＦＤ−対照マウスからの代表的な磁気共鳴画像（左側）およびＨＦＤ−ｍＡｂマウスからの代表的な磁気共鳴画像（右側）を示す。画像はマウスの側面画像を示すものであり、マウスの前側が画像の上になっており、マウスの後側が画像の下になっている。白色または明るいエリアは、脂肪含量が多いエリアを表す。ＨＦＤ−対照マウスの脂肪はＨＦＤ−ｍＡｂと比較してはるかに多かった。
【０１４３】
図４は、緩和補正脂肪フラクション（ＲＣＦＦ）ＭＲＩから導き出された肝臓内脂肪フラクションを示す。ＨＦＤ−対照群の肝臓内に蓄積した脂肪堆積は、ＨＦＤ−ｍＡｂ群のマウスの２倍であった。
【０１４４】
図５は、緩和補正脂肪フラクション（ＲＣＦＦ）ＭＲＩから導き出された網内脂肪フラクションを示す。ＨＦＤ−対照群において蓄積した網内脂肪体積は、ＨＦＤ−ｍＡｂ群のマウスのほぼ３．５倍であった。
【０１４５】
図６は、緩和補正脂肪フラクション（ＲＣＦＦ）ＭＲＩによって導き出された皮下脂肪フラクションを示す。ＨＦＤ−対照の動物において蓄積した皮下脂肪体積は、ＨＦＤ−ｍＡｂ群のマウスのおよそ２倍であった。
【０１４６】
図７は、屠殺したマウスから取得した肝臓の染色した組織断面の代表的な写真を示す。肝臓を取り出し、ホルマリン中に固定した。次いで、固定した組織を切片作製し、中性トリグリセリドおよび脂質を染色するために使用されるリゾクロムジアゾ色素であるオイルレッドＯを用いて染色した。ＨＦＤ−対照肝臓が左側に示されており、ＨＦＤ−ｍＡｂ肝臓が右側に示されている。ＨＦＤ−対照肝臓では、ＨＦＤ−ｍＡｂ肝臓よりも肝臓内の赤色に染色された（暗い）脂肪滴が多い。また、脂肪滴のサイズがＨＦＤ−対照肝臓ではＨＦＤ−ｍＡｂ肝臓よりも大きい。これにより、ＧＩＰ  ｍＡｂを投与すると肝臓に蓄積する脂肪が減少することが例示される。これらの結果は、図４の肝臓内脂肪フラクションの体積と一致する。
【０１４７】
図８は、ＨＦＤ−対照マウスにおいて見いだされた網内脂肪（左側）とＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおいて見いだされた網内脂肪（右側）を比較する２枚の写真のセットである。脂肪は、白色であり、ＨＦＤ−対照マウスでは、はるかに多くの脂肪が見える。
【０１４８】
総合すると、データから、ＧＩＰに結合するモノクローナル抗体アンタゴニストの投与により、高脂肪食を与えたマウスによって貯蔵される脂肪の量が有意に減少することが示された。これは、肝臓内に貯蔵される脂肪、網内に貯蔵される脂肪、および皮下に貯蔵される脂肪を含むものであった。
【０１４９】
グルコース負荷試験
材料および方法
【０１５０】
特別食を１７週間与えた後、腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）のために各食事群から６匹のマウスをランダムに選択した。全ての動物を最初に６時間にわたって絶食させた後、各動物の尾静脈から血液およそ２μＬを収集した。これらの第１の試料は、ベースライン血中グルコースレベルまたはＩＰＧＴＴ曲線上のゼロ時間を表すものであった。Ｔｒｕｅｔｅｓｔ（商標）ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＮＩＰＲＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｏｒｔ  Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を使用して血中グルコースを測定した。
【０１５１】
次いで、各マウスに体重１ｋｇ当たりおよそ２ミリグラムのグルコースを腹腔内注射によって投与した。グルコースは、水中２０％溶液として送達した。投与後、１０分、３０分、６０分、および１２０分の時点で各マウスの尾静脈から血液およそ２μＬを収集した。血中グルコース濃度レベルを測定し、記録した。
【０１５２】
結果
【０１５３】
結果が図２に示されている。ＨＦＤ−対照マウスにおける血清グルコースレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスおよびＩｓｏ食マウスと比較してはるかに高い濃度まで上昇した。さらに、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおける血清グルコースレベルおよびＩｓｏ食マウスにおける血清グルコースレベルは、より早い時点で減少し始めた。これは、ＨＦＤ−対照マウスでは耐糖能障害が発生したが、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスまたはＩｓｏ食マウスでは耐糖能障害が発生しなかったことと一致する。
【０１５４】
血清測定
材料および方法
【０１５５】
特別食を１７週間与えた後、３つの群のマウスを屠殺した。全血を採取し、血清を調製し、多くの異なる構成成分のレベルを測定した。
【０１５６】
結果
【０１５７】
図９は、各群のマウスの血清において測定されたトリグリセリド（ＴＧ）レベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＴＧレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＴＧレベルの１．４４倍であった。ＴＧレベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【０１５８】
図１０は、各群のマウスの血清において測定された平均総コレステロール（ＴＣ）レベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＴＣレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＴＣレベルの１．５５倍であった。ＴＣレベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【０１５９】
図１１は、各群のマウスの血清において測定された総コレステロール（ＴＣ）に対する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の平均比を示す。ＨＦＤ−対照マウスにおける総コレステロールに対するＨＤＬの比は、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおける総コレステロールレベルに対するＨＤＬの比よりも２０％低かった。総コレステロールレベルに対するＨＤＬの比がより低いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【０１６０】
図１２は、各群のマウスの血清において測定された平均低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるＬＤＬレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるＬＤＬレベルの１．９５倍であった。ＬＤＬ（「悪玉」コレステロール）レベルが高いことは、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連する。
【０１６１】
図１３は、各群のマウスの血清において測定された平均インスリンレベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるインスリンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるインスリンレベルの２．６倍であった。インスリンレベルが高いことは、肥満症、インスリン抵抗性、およびメタボリックシンドロームに関連する。
【０１６２】
図１４は、各群のマウスの血清において測定された平均アディポネクチンレベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるアディポネクチンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるアディポネクチンレベルの１．３５倍であった。アディポネクチンレベルが高いことは、総体脂肪の増加に関連する。
【０１６３】
図１５は、各群のマウスの血清において測定された平均レプチンレベルを示す。ＨＦＤ−対照マウスにおけるレプチンレベルは、ＨＦＤ−ｍＡｂマウスにおけるレプチンレベルの５．７３倍であった。レプチンレベルが高いことは、総体脂肪の増加に関連する。
【０１６４】
図１６は、各群のマウスの血清において測定された平均グルカゴンレベルを示す。群間で血清グルカゴンのレベルに有意差はなかった。
【０１６５】
図１７は、各群のマウスの血清において測定された平均グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）レベルを示す。群間で血清ＧＬＰ−１のレベルに有意差はなかった。
【０１６６】
総合すると、このデータから、ＧＩＰに結合するモノクローナル抗体アンタゴニストの投与により、肥満症およびメタボリックシンドロームに関連するマーカーの全てが有意に改善されることが示された。このデータから、ｍＡｂの投与により、肥満症およびメタボリックシンドロームに伴う合併症を減少させることができることが示唆される。血清グルカゴンまたはＧＬＰ−１のレベルに変化がなかったという事実から、ｍＡｂがＧＩＰに特異的であることが示され、また、ＧＩＰといくつかの共通の生物学的経路を共有するが、ＧＩＰと共通して共有されない他の生物学的効果も有するグルカゴンまたはＧＬＰ−１を阻害することによる副作用はわずかである（あったとしても）はずであることが示唆される。
【０１６７】
考察
これらの実験の結果から、腹腔内に送達された、ＧＩＰに結合するモノクローナル抗体が肝臓内での脂肪組織の蓄積および脂肪の蓄積を有意に減少させ得ることが示された。高脂肪食（ＨＦＤ）を与え、ＧＩＰ  ｍＡｂを与えたマウスでは、ＨＦＤ−対照マウスよりも脂肪含量が著しく少なかった。肝臓内、網内、および皮下内の脂肪フラクションに関して脂肪含量の減少が見られた。これにより、中程度の量のＧＩＰ  ｍＡｂアンタゴニストにより、ＧＩＰが阻害されることによって組織内での脂肪の蓄積が減少し得るまたは防止され得ることが示される。ＧＩＰの阻害により、腸でのグルコースの取り込みが減少し、腸でのペプチドの取り込みが減少し、食後のインスリン分泌が減少し、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みが減少し、脂肪分解が増大し、栄養分の取り込みが阻害される。肥満症およびメタボリックシンドロームに関連するマーカーの血清中レベルの変化によっても、ＧＩＰ  ｍＡｂアンタゴニストがこれらの状態の健康上の影響に対して有用であり得ることが示される。
【０１６８】
（実施例３）
抗体の改変
１０ｇ１０  ｍＡｂの軽鎖可変領域を、マウス抗体において保存されている特定のアミノ酸をヒト抗体において保存されている特定のアミノ酸で置換することによってさらに改変した。これは、軽鎖可変領域を「ヒト化」してヒト可変領域により類似させるため、およびヒト免疫系が「ヒト化」ｍＡｂを外来物質として認識しない見込みを増大させるために行った。軽鎖可変領域をヒト化するために、オリゴヌクレオチドを化学的に合成した。オリゴヌクレオチドの配列は、特定の塩基を変化させた以外は、１０ｇ１０  ｍＡｂ軽鎖可変領域の配列と同様であった。塩基対の変化により、配列がタンパク質に翻訳された際に軽鎖可変領域の特定のアミノ酸が変化することが予測された。ＤＮＡ合成反応を使用して二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを作製した。３つの異なるｄｓ−オリゴヌクレオチドを合成し、次いで、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した後、哺乳動物発現ベクターにライゲーションした。哺乳動物発現ベクターは、シグナル配列およびヒト軽鎖の定常領域を含有するものであった。ｄｓ−オリゴヌクレオチドを、ベクターに、可変領域と定常領域が、ｍＲＮＡとして発現され、次いでタンパク質に翻訳された際に、抗体軽鎖を生成するようにライゲーションした。
【０１６９】
得られたヒト化軽鎖３種は、本明細書ではＬＣ１、ＬＣ２、およびＬＣ３と称される。ＬＣ１のアミノ酸配列は配列番号１７であり、ＬＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号３６である。ＬＣ２のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＬＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号３７である。ＬＣ３のアミノ酸配列は配列番号１９であり、ＬＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号３８である。
【０１７０】
１０ｇ１０  ｍＡｂの重鎖可変領域も同じ様式でさらに改変した。重ねて、塩基対の変化により、配列がタンパク質に翻訳された際に重鎖可変領域の特定のアミノ酸が変化することが予測された。鎖に対して３つの異なるｄｓ−オリゴヌクレオチドを合成し、次いで、哺乳動物発現ベクターにライゲーションした。哺乳動物発現ベクターは、シグナル配列およびヒト重鎖の定常領域を含有するものであった。ｄｓ−オリゴヌクレオチドを、ベクターに、可変領域と定常領域が、ｍＲＮＡとして発現され、次いでタンパク質に翻訳された際に、抗体重鎖が生成するようにライゲーションした。
【０１７１】
得られたヒト化重鎖３種は、本明細書ではＨＣ１、ＨＣ２、およびＨＣ３と称される。ＨＣ１のアミノ酸配列は配列番号２８であり、ＨＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号４０である。ＨＣ２のアミノ酸配列は配列番号２９であり、ＨＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号４１である。ＨＣ３のアミノ酸配列は配列番号３０であり、ＨＣ１のｃＤＮＡ配列は配列番号４２である。
【０１７２】
ヒト化軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＣＨＯ細胞において産生させた。抗体軽鎖のコード配列を有する哺乳動物ベクターを、抗体重鎖のコード配列を有する哺乳動物ベクターと同時トランスフェクトした。全部で９種の独特の組合せをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした：ＬＣ１／ＨＣ１、ＬＣ１／ＨＣ２、ＬＣ１／ＨＣ３、ＬＣ２／ＨＣ１、ＬＣ２／ＨＣ２、ＬＣ２／ＨＣ３、ＬＣ３／ＨＣ１、ＬＣ３／ＨＣ２、およびＬＣ３／ＨＣ３。これらの組合せに由来するモノクローナル抗体を１０ｇ１０  ｍＡｂと比較した。
【０１７３】
哺乳動物の発現ベクターを同時トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、培養物中で成長させ、上清を収集した。上清をＧＩＰ−結合性ｍＡｂの存在について、直接結合ＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトＧＩＰを９６ウェルプレートのウェルの底部に固定した。上清の段階希釈物を９６ウェルプレートの異なるウェルに添加した。１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、その後、ヒトＩｇＧに特異的に結合する二次抗体を各ウェルに添加した。ヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体を酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした。１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、その後、ＨＲＰ基質を添加した。ＨＲＰがウェルに存在すると、基質が変換されて呈色した化合物になる。呈色強度の量を、分光光度計を使用して読み取った。生じる呈色の量は、各ウェル内に残ったＨＲＰ−抗体コンジュゲートの量に比例する。生じる呈色の量はまた、各ウェル内のｈＧＩＰに結合したｍＡｂの量にも比例する。
【０１７４】
この評価の結果から、軽鎖／重鎖ベクターの種々の組合せが、ヒトＧＩＰに以下の順序（最も高い結合親和性〜最も低い結合親和性）で結合したことが示された：ＬＣ２／ＨＣ１、ＬＣ２／ＨＣ２、ＬＣ３／ＨＣ２、ＬＣ１／ＨＣ２、ＬＣ２／ＨＣ３、ＬＣ３／ＨＣ１、ＬＣ１／ＨＣ１、１０ｇ１０、ＬＣ１／ＨＣ３、およびＬＣ３／ＨＣ３。
【０１７５】
発現ベクターの組合せ、ＬＣ２／ＨＣ１を同時トランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ＬＣ２／ＨＣ２を同時トランスフェクトしたＣＨＯ細胞、およびＬＣ２／ＨＣ３を同時トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の浮遊培養物１００ｍｌ中で産生された抗体を、プロテインＡアガロースを使用して精製した。
【０１７６】
次に、これらの精製されたｍＡｂ３種の、ｈＧＩＰを中和し、リガンド−受容体相互作用、受容体の活性化および受容体依存性シグナル伝達を妨げる能力を、細胞培養系を使用して試験した。この系では、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）−応答性プロモーターの制御下でｌａｃＺ遺伝子を有し、細胞表面上にラットＧＩＰＲを発現するレポーター細胞（ＬＧＩＰＲ３ａ細胞）を使用した。これらの細胞へのＧＩＰの添加により、ＧＩＰＲの活性化、ｃＡＭＰの蓄積を導くシグナル伝達カスケードの誘導、ｌａｃＺ遺伝子の誘導およびβ−ガラクトシダーゼの合成が導かれる。試験試料を添加し、４時間インキュベートした後、比色定量アッセイを用いて細胞溶解物中のβ−ガラクトシダーゼ含量を測定した。色の変化の程度は、β−ガラクトシダーゼ活性のレベルに比例した。β−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、試験試料中の遊離の生物活性ＧＩＰの量に左右された。
【０１７７】
ｍＡｂを、ＤＭＥＭ培地中ヒトＧＩＰ（ｈＧＩＰ）の溶液と、ｍＡｂの最終濃度２５ｇ／ｍｌおよびｈＧＩＰの最終濃度０．１ｎＭで混合した。次いで、混合物をＬＧＩＰＲ３ａ細胞に添加し、インキュベートした後、洗浄し、β−ガラクトシダーゼについてアッセイした。結果が図１８に示されている。１０ｇ１０は、元のマウスｍＡｂを表す。ＧＩＰは陽性対照として機能した。Ｆｃは、精製されたヒトＦｃ断片を表し、これは陰性対照として機能した。
【０１７８】
結果から、ヒト化抗体が、ｈＧＩＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０ｇ１０マウスｍＡｂと同様に中和することが示された。ＬＣ２／ＨＣ２ヒト化抗体が３種のヒト化ｍＡｂの中で最も有効であった。ＬＣ２／ＨＣ２ヒト化抗体はまた、元のマウスｍＡｂよりも有効であった。ここでは相対的な活性が低いことが望まれ、ＬＣ２／ＨＣ２の相対的な活性は０．００３５であり、それに対して１０ｇ１０マウスｍＡｂの相対的な活性は０．００５５であった。
【０１７９】
６つのヒト化軽鎖（ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３）および重鎖（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３）の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）も決定した。ＬＣ１は、配列番号２０、配列番号２３、および配列番号２２のＣＤＲを有した。ＬＣ２は、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２のＣＤＲを有した。ＬＣ３は、配列番号２０、配列番号２４、および配列番号２２のＣＤＲを有した。ＨＣ１、ＨＣ２、およびＨＣ３は全て同じＣＤＲを有し、これは、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３であった。
【０１８０】
特定の実施形態が記載されているが、現在は予測されていないまたは予測されていない可能性がある代替物、改変、変形、改善、および実質的な等価物が出願人らまたは他の当業者に生じ得る。したがって、出願されたおよび補正され得る添付の特許請求の範囲は、そのような代替物、改変、変形、改善、および実質的な等価物の全てを包含することを意図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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