(57)【要約】【課題】生体分子のデジタルカウント法において、高空間分解能と深い被写界深度とを両立する光学系を実現することにより、高いダイナミックレンジを得る。【解決手段】蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を含む試料溶液が注入されるフローセル１０１を戴置するステージ（１０３，１０４）と、励起光を発生させる光源１１６と、試料溶液に焦点合わせ可能な対物レンズ１１１と、対物レンズの瞳面に配置される位相板１１２と、励起光を試料溶液に照射することにより蛍光標識が発する蛍光による輝点像を撮像する撮像装置１１７と、画像処理を行う計算機１３０とを有する生体分子分析装置であって、光源は、励起光が位相板及び対物レンズを通して試料溶液に照射されるよう配置され、計算機は、蛍光を対物レンズ及び位相板を通して撮像装置の撮像素子に結像させて得られる中間画像に波面コード化法による画像処理を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を含む試料溶液が注入されるフローセルを戴置するステージと、
前記蛍光標識を励起させるための励起光を発生させる光源と、
前記試料溶液に焦点合わせ可能な対物レンズと、
前記対物レンズの瞳面に配置される位相板と、
前記励起光を前記試料溶液に照射することにより前記蛍光標識が発する蛍光による輝点像を撮像する撮像装置と、
画像処理を行う計算機とを有し、
前記光源は、前記励起光が前記位相板及び前記対物レンズを通して前記試料溶液に照射されるよう配置され、
前記計算機は、前記蛍光を前記対物レンズ及び前記位相板を通して前記撮像装置の撮像素子に結像させて得られる中間画像に波面コード化法による画像処理を行う生体分子分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記位相板は、光軸に対して回転対称な輪帯構造をもつ位相板である生体分子分析装置。
【請求項３】
請求項１において、
前記位相板は、三次位相関数を実現した位相板である生体分子分析装置。
【請求項４】
請求項１において、
ダイクロイックミラーを有し、
前記ダイクロックミラーは、前記光源からの前記励起光を前記対物レンズに向けて反射もしくは透過させて前記試料溶液に照射し、前記対物レンズ及び前記位相板を通った前記蛍光を透過または反射させて前記撮像装置の撮像素子に結像させるよう配置された生体分子分析装置。
【請求項５】
請求項４において、
前記光源から発生される光の波長を所定の波長に制限する励起フィルタと、前記撮像装置に結像する前記蛍光以外の波長の光を除く吸収フィルタとを有する生体分子分析装置。
【請求項６】
請求項１において、
前記フローセルは少なくとも前記試料溶液を注入する流路が形成される基板が樹脂である生体分子分析装置。
【請求項７】
請求項６において、
前記フローセルの前記基板の表面に微細構造が形成されている生体分子分析装置。
【請求項８】
瞳面に位相板が配置された対物レンズを有し、波面コード化法を適用する光学系を有する生体分子分析装置を用いた生体分子分析方法であって、
蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を含む試料溶液が注入されるフローセルをステージに戴置し、
第１の計測視野にて前記対物レンズの焦点合わせを行い、
前記位相板及び前記対物レンズを通して前記試料溶液に励起光を照射し、
前記励起光を前記試料溶液に照射することにより前記蛍光標識が発する蛍光を前記対物レンズ及び前記位相板を通して撮像素子に結像させて中間画像を得、
前記中間画像に波面コード化法による画像処理を行う生体分子分析方法。
【請求項９】
請求項８において、
前記第１の計測視野と異なる第２の計測視野にステージを移動させ、
前記対物レンズは前記第１の計測視野で行った焦点合わせによる設定のまま、前記位相板及び前記対物レンズを通して前記試料溶液に前記励起光を照射し、前記励起光を前記試料溶液に照射することにより前記蛍光標識が発する前記蛍光を前記対物レンズ及び前記位相板を通して前記撮像素子に結像させることによりスキャニング撮影を行う生体分子分析方法。
【請求項１０】
請求項８において、
前記フローセルとして、少なくとも前記試料溶液を注入する流路が形成される基板が樹脂であるフローセルを用いる生体分子分析方法。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記フローセルとして、前記基板の表面に微細構造が形成されているフローセルを用いる生体分子分析方法。
【請求項１２】
請求項１０〜１１のいずれか一項において、
前記試料溶液は、抗体標識磁気微粒子と蛍光標識抗体と抗原とが結合した抗原抗体複合体を含み、
前記抗原抗体複合体は磁石により前記フローセルの流路の底面に固定される生体分子分析方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１１のいずれか一項において、
前記試料溶液は、前記フローセルの流路の底面に固定された抗体と蛍光標識抗体と抗原とが結合した抗原抗体複合体を含む生体分子分析方法。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記フローセルの流路の底面に抗体固定反応の起点となる官能基を含んだ分子からなるゲルが塗布された生体分子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子分析装置および生体分子分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる極微量の生体分子を定量的に計測する手法としてデジタルカウント法が開発されている。デジタルカウント法は、解析対象分子を標識する蛍光体を含む標識分子と解析対象分子との複合体を形成した後、個々の標識分子を観察・計数することにより、複合体の数、即ち解析対象分子の数を直接計数するものである。具体的には以下のように計測が行われる。溶液中のタンパク質などの生体分子を、第１の抗体を固定した基板に結合させる。基板に結合された生体分子に対してさらに蛍光標識を施した第２の抗体を反応させ、サンドイッチ状態の抗原抗体複合体を形成した後、蛍光顕微鏡を用いて個々の蛍光輝点数を数える。他には特許文献１に開示されているように、抗体を固定した基板の代わりに抗体固定磁気ビーズを用いる例がある。蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を調製した後に、磁気などを用いて磁気ビーズを平滑な基板表面に固定した状態で蛍光顕微鏡を用いて蛍光輝点数を数えるものである。いずれの場合も、解析対象分子と標識分子とを含む複合体の一つ一つを検出し、その数を計数することで、解析対象分子数の定量的な計測を実現しており、高感度に微量の生体分子を検出する手法である。
【０００３】
一方、画像処理の分野においては、特許文献２、特許文献３のように、結像光学系においてアナログ変調とデジタル画像処理を組み合わせることにより、レンズを絞ることなく被写界深度を深くする波面コード化法（ＷＦＣ：Wave Front Coding）が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０５１６５１号公報
【特許文献２】特表平１１−５００２３５号公報
【特許文献３】特開２０１４−１９７１１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
デジタルカウント法において、測定濃度のダイナミックレンジを確保するには高い空間分解能を持った光学系で複数視野をスキャニング観察する必要がある。すなわち、解析対象分子が高密度に存在する場合、高密度の複合体を個別に計数するために高い空間分解能をもった光学系が要求される。これに対して、解析対象分子が低密度である場合、一視野だけではなく複数視野で計測しなければ、複合体の総数を求めることができない。
【０００６】
高い空間分解能を実現するためには、高倍率・高開口数の光学系を用いる必要がある。さらに、一般に単一の標識から得られる信号は微弱であることから、光学系は高開口数であることが求められる。このため、光学系の被写界深度は浅くなり、焦点からわずかに光軸方向にずれただけでも像が大きくボケてしまう。
【０００７】
一方、観察対象を光学系の光軸に対して真に垂直に配置することは現実的には不可能であり、光軸と観察対象との間には一定の傾きがある。このため、浅い被写界深度の光学系で上述のような複数視野の測定を行うには、複数の視野毎に焦点調整が必要となる。これは測定時間の増大を招くとともに、焦点調整のために複合体に励起光を照射することによって標識分子に含まれる蛍光物質に劣化が生じる（退色）ことにより、本観察時に蛍光体が発光しない、または発光量が少なく検出困難な複合体を生じ、計測誤差につながるおそれがある。
【０００８】
また、被写界深度の浅い光学系において厳密な焦点調整が必要になるため、光学装置が複雑化し、コストの増大につながる。また、観察対象も完全に平滑にはなっておらず、材質によって程度の差はあるがうねりをもっている。一般に安価なガラス基板やプラスチック基板を用いた場合、基板のうねりが焦点ボケに及ぼす影響が無視できないため、細かな焦点調整が必要となり測定時間の増大につながる。これに対して、うねりの少ない基板を用いた場合、コスト高となってしまう。
【０００９】
このように、デジタルカウント法においては光学系が高い空間分解能を有することによる副作用といえる浅い被写界深度が、測定濃度のダイナミックレンジを高くする妨げとなっていた。本発明の課題は、生体分子のデジタルカウント法において、高空間分解能と深い被写界深度とを両立する光学系を実現することにより、高いダイナミックレンジを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を含む試料溶液が注入されるフローセルを戴置するステージと、蛍光標識を励起させるための励起光を発生させる光源と、試料溶液に焦点合わせ可能な対物レンズと、対物レンズの瞳面に配置される位相板と、励起光を試料溶液に照射することにより蛍光標識が発する蛍光による輝点像を撮像する撮像装置と、画像処理を行う計算機とを有する生体分子分析装置であって、光源は、励起光が位相板及び対物レンズを通して試料溶液に照射されるよう配置され、計算機は、蛍光を対物レンズ及び位相板を通して撮像装置の撮像素子に結像させて得られる中間画像に波面コード化法による画像処理を行う。
【発明の効果】
【００１１】
高いダイナミックレンジをもつ光学系を有する生体分子分析装置を実現できる。上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】生体分子分析装置の概略図である。
【図２Ａ】蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を注入したフローセルの例である。
【図２Ｂ】蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を注入したフローセルの例である。
【図３】生体分子分析装置で取得できる画像の例である。
【図４】生体分子分析装置を用いたデジタルカウント法の効果を示す図である。
【図５】三次元位相関数型の位相板を用いた場合の中間画像と最終画像である。
【図６】磁石により抗原抗体複合体がフローセルの基板に固定される状態を示す図である。
【図７】フローセルの支持基板表面に微細構造を設けた例である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、図２Ａ〜Ｂに本実施例の生体分子分析装置の観察対象とする、蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体を注入したフローセルの例を示す。まず、図２Ａ〜Ｂに示すように、観察対象となる試料溶液はフローセル１０１に注入される。フローセル１０１には、支持基板（フローセル下側部材）６０１とフローセル上側部材６０２とにより流路が形成されている。図２Ａの場合、試料溶液には蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体６０３が懸濁されている。抗原抗体複合体６０３は、抗体標識磁気微粒子６０６、抗原分子６０７、蛍光標識抗体６１０の三者が反応した複合体である。
【００１４】
例えば、抗原分子６０７を前立腺特異抗原（ＰＳＡ：Prostatic Specific Antigen）とすると、抗体６０４、抗体６０８としては各々異なる認識部位を持つ抗ＰＳＡ抗体を用いる。磁気微粒子６０５としてはCOOH修飾された直径３００ｎｍの磁気微粒子を、蛍光標識６０９としてはCOOH修飾された直径１００ｎｍの蛍光ビーズを用いる。それぞれのCOOH末端を用いて活性化し、それぞれ抗体６０４，６０８と反応、固定することで、抗体標識磁気微粒子６０６、蛍光標識抗体６１０が得られる。抗体標識磁気微粒子６０６と抗原分子６０７とを反応させ、さらに蛍光標識抗体６１０を反応させることにより、蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体６０３が得られる。なお、本実施例は特定の抗原−抗体に特定されるものではなく、標識物質についても特に制限はない。例えば、蛍光ビーズに代えて、十分な蛍光強度さえ得られるのであれば、蛍光タンパク質や量子ドットなどのような標識物質でもよい。磁気微粒子についても同様で、特段そのサイズや表面修飾に制限はない。
【００１５】
フローセル１０１の下部には磁石１０２が配置されている。観察時には、抗原抗体複合体６０３が懸濁された試料溶液がフローセルの流路に注入され、磁気微粒子が磁石１０２に引き寄せられることにより、抗原抗体複合体６０３は支持基板６０１の表面に収集、固定される。
【００１６】
図２Ｂはフローセル１０１の支持基板６０１表面に抗体６１１を固定し、支持基板６０１上で抗原６１２と蛍光標識抗体６１５とを含む抗原抗体複合体６１６の形成反応を行ったものである。抗体６１１、抗体６１４、抗原６１２、蛍光標識６１３は図２Ａについて説明したものと同じものとする。支持基板６０１がガラスである場合、以下のようにして抗体６１１を支持基板６０１に固定する。まず、支持基板６０１を洗浄後、末端にアジド基を有するシランカップリング剤（（ＭｅＯ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３）を反応させる。一方、抗体６１１はプロパギルＮＨＳとあらかじめ反応させておくことにより、アジドとアルキンのクリック反応を用いて、抗体６１１を基板６０１の表面に固定する。フローセルの流路に抗原６１２溶液を注入して反応させ、次いで蛍光標識抗体６１５を反応させることにより、支持基板６０１に固定された蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体６１６が得られる。なお、抗体の固定方法に関しては、クリック反応による抗体固定に限定されるものではなく、例えばエポキシシラン剤などを用いてガラスにエポキシ基を導入し抗体のアミノ基と反応させてもよいし、末端にOH基を有するシランカップリング剤を用いて、OH基をガラスに導入後その水酸基を臭化シアンで活性化して、抗体のアミノ基と反応させてもよい。
【００１７】
図１に、図２Ａ〜Ｂにより説明したようなフローセル１０１に注入された試料溶液を分析する生体分子分析装置１００の概略を説明する。フローセル観察対象となる試料はフローセル１０１内に注入され、ステージ上に戴置される。図１の例では、ステージはＸＹ方向にスキャニング撮影可能なように、フローセルをＸ軸方向に移動させるＸ軸ステージ１０３、フローセルをＹ軸方向に移動させるＹ軸ステージ１０４を有している。例えば、Ｘ軸ステージ、Ｙ軸ステージの駆動にはステッピングモーターを用いる。なお、図ではＸ軸方向、Ｙ軸方向に移動させるステージを別々に設けているが、一つのステージにＸ軸に移動させる機構、Ｙ軸に移動させる機構の双方を設け、Ｘ軸、Ｙ軸のいずれの方向にも動かせるように構成してもよい。また、図１ではフローセル１０１がステージ上に設置された磁石１０２の上に戴置されているが、これは図２Ａのような磁気微粒子を含む抗原抗体複合体６０３を懸濁した試料溶液を分析対象とする場合の構成である。図２Ｂのように抗体を基板に固定した抗原抗体複合体６１６を分析対象とする場合は、磁石１０２は不要となる。
【００１８】
照射・撮像光学系１１０は、その基本的な光学素子として対物レンズ１１１、位相板１１２、ダイクロイックミラー１１３、励起フィルタ１１４、吸収フィルタ１１５、光源１１６、撮像装置１１７を有している。撮像装置１１７は撮像素子としてＣＣＤやＣＭＯＳイメージセンサを含み、撮像装置１１７の出力は計算機１３０に送られ、計算機１３０において画像処理がなされ、その結果がその表示部に出力される。本撮像光学系においては、被写界深度を深くするために波面コード化法（ＷＦＣ）を適用する。このため、対物レンズ１１１の瞳面に位相板１１２を配置しており、これにより撮像装置１１７ではボケた像が得られるが、この撮像装置１１７からの出力信号に対してデジタル信号処理を行うことにより被写界深度の深いシャープな像が得られる。
【００１９】
光源１１６は、抗原抗体複合体に含まれる蛍光標識を励起させるための励起光を発生させる光源である。例えば、キセノン光源を用いることができる。励起光１２１は、光源１１６から発生され、励起フィルタ１１４を透過し、ダイクロイックミラー１１３で反射され、ステージ方向に進行し、フローセル１０１内の試料溶液に照射される。励起光１２１は抗原抗体複合体に含まれる蛍光標識と反応することにより、蛍光標識は蛍光１２２を発する。蛍光１２２は対物レンズ１１１、位相板１１２、ダイクロイックミラー１１３、吸収フィルタ１１５を透過し、撮像装置１１７の撮像素子にて結像される。なお、励起フィルタ１１４は、光源１１６から発生される光のうち、試料溶液に照射したい波長以外の光を除くためのものであり、吸収フィルタ１１５は検出対象とする蛍光波長以外の光を除くために設けられているものである。また、光源１１６と撮像装置１１７の配置関係によっては、励起光はダイクロイックミラーを透過させ、蛍光はダイクロイックミラーを反射させるように構成することも可能である。
【００２０】
ＷＦＣを適用した撮像光学系において、撮像装置１１７で得られる画像（以下、「中間画像」という）は、位相板１１２を通すことにより、位相板なしに焦点位置で結像される画像よりも劣化するが、位相板１１２は、位相板挿入による劣化の仕方が焦点はずれ量を変えても変化しないような形状とされているのが特徴である。すなわち、焦点を中心にＺ軸方向（光軸方向）の前後にずれた像は、所定の範囲であれば、どこでとっても同等の中間画像が得られることになる。
【００２１】
照射・撮像光学系１１０では、照射光学系においても光源１１６からの光を同じ位相板１１２を通して励起光１２１をフローセル１０１の試料溶液に照射させている。これは以下の理由による。撮像光学系にＷＦＣを適用することにより、Ｚ方向に厚さをもつ領域が鮮明に撮像されることになる。一方、生体分子分析装置１００の計測対象は、励起光を照射することにより蛍光標識より発せられる蛍光であるため、撮像範囲であるＺ方向に厚さをもつ領域に分散して存在する蛍光標識に励起光が均一に照射されていることが望ましい。Ｚ方向に厚さをもつ領域が鮮明に撮像できるとしても、照射される励起光強度がばらついていれば、蛍光標識の発光にばらつきが生じ、計測や分析の誤差が生じるおそれがある。これに対して、同じ位相板１１２を通して励起光を照射させることにより、励起光も対物レンズ１１１の焦点に完全に集束せず、光軸方向にボケた、すなわち光軸方向の励起強度がより均質化された状態で照射されることになる。これにより、生体分子分析装置１００の計測精度を高めることができる。
【００２２】
図３に、図２Ａで説明した試料溶液に対して、図１に示した生体分子分析装置により得られる画像を比較例とともに示す。Ａ欄は対物レンズの焦点位置での画像、Ｂ欄は対物レンズの焦点位置から１０μｍずれた位置での画像、Ｃ欄は対物レンズの焦点位置から２０μｍずれた位置での画像、Ｄ欄は対物レンズの焦点位置から３０μｍずれた位置での画像である。また、上段は位相板のない状態での撮像画像（比較例）、中段は撮像装置１１７からの中間画像（比較例）、下段は中間画像に対して画像処理を施して得られる最終画像（実施例）である。
【００２３】
ＷＦＣを適用しない光学系においては、上段に示されるように、焦点位置からずれるにつれ、輝点像のボケが大きくなることが認められる。対物レンズの焦点位置から３０μｍずれた位置ではもはや像を得ることもできない。中段にはＷＦＣを適用した光学系において得られる中間画像が示されているが、ＷＦＣを適用しない光学系においては輝点像が得られなかった、焦点位置から３０μｍずれた位置においても輝点像が認められる。また、中段の輝点像はいずれもボケているが、上段と異なり、ボケ量が焦点はずれ量の大きさに依存しない。下段は、中段の中間画像に対してそれぞれ計算機によりデコンボリューション（画像処理）した最終画像であり、０μｍ（焦点位置）〜３０μｍにわたって同様に鮮明な輝点像が得られている。図４にこのようにして得られた画像の輝点数をカウントした結果を比較例とともに示す。丸印のプロットが本実施例に相当する図３の下段相当の画像に対して輝点をカウントした輝点数であり、四角形のプロットが比較例に相当する図３の上段相当の画像に対して輝点をカウントした輝点数である。横軸は焦点位置を中心に、Ｚ軸（光軸）に沿って対物レンズを移動させた距離を示している。このように、ＷＦＣを適用することによって、従来の光学系では実現し得ないほどの広範囲（−３６〜＋３６μｍ）にわたって、ほぼ一定の計数が可能となることが確認できた。
【００２４】
位相板１１２としては、特許文献３に開示される、光軸に対して回転対称な輪帯構造をもつ位相板（「輪帯構造型位相板」）を適用することが望ましい（図３の画像及び図４のカウントは、輪帯構造型位相板を用いた光学系を適用している）。特許文献３に開示される位相板の各輪帯は入射光束に対して瞳面の半径方向に凹レンズとして作用する凹面と凸レンズとして作用する凸面とを交互に備え、各輪帯が入射光速を焦点面上で一様に拡大し相互にオーバーラップさせる略放物断面形状を有している。
【００２５】
しかしながら、輪帯構造型位相板に限られず、特許文献２に開示されるような三次位相関数を実現した位相板（「三次位相関数型位相板」）であっても同様に被写界深度の拡大効果が得ることができる。図５に三次位相関数型位相板を用いた場合の中間画像（デコンボリューション前）と最終画像（デコンボリューション後）とを示す。三次位相関数型位相板では、焦点方向のずれがＸＹ平面上での位置ずれに反映されるため、稀ではあるが、隣接するスキャニング画像間で二重カウントが生じる可能性がある。これに対して、輪帯構造型位相板では焦点方向のずれがＸＹ平面上での位置ずれを起こさないため、デジタルカウントによる計数には、より適しているといえる。また、三次位相関数型位相板は、光軸に対して回転対称な構造ではないので、位相板の取り付け角度とデコンボリューション処理時の画像角度を一致させるという調整が必要となるのに対して、輪帯構造型位相板は光軸に対して回転対象なので、光軸中心とフィルタの中心を合わせるだけでよく、取り付け・調整の作業性の点でも優れている。
【００２６】
このように被写界深度を深くした光学系を有することにより、ＸＹのスキャニング撮影も容易になる。被写界深度の浅い光学系であれば、計測する視野ごとにまず焦点合わせを行い（フォーカスマッピング）、その後計測視野にステージ移動、焦点合わせ（フォーカスマッピングにて設定した位置に対物レンズを移動させる）、本測定、次の計測視野にステージ移動、を繰り返してスキャニング撮影を実施する必要があった。これに対して、本実施例では、フォーカスマッピングをすることなく、最初の一視野にて焦点合わせを行い、対物レンズ位置はそのままで計測視野ごとの焦点合わせを行うことなく、スキャニング撮影を行うことができるようになる。
【００２７】
また、図６に示すように、磁石１０２を用いて抗体標識磁気微粒子６０６、抗原抗体複合体６０３をフローセル下側部材（支持基板）６０１の表面に固定すると、磁力線４０１にそって磁気微粒子が厚みを持った束４０２を形成する場合があることが分かっている。その厚みはおよそ５〜１０μｍ程度だが、被写界深度の浅い光学系ではその厚み全体で合焦した像を得ることができなかった。本実施例ではこのような束４０２の上に形成された蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体６０３であっても計数可能となる。これにより、図２Ａのように磁気微粒子を用いた計測手法において計数データのブレを防ぎ、信頼性の向上に有効である。
【００２８】
本実施例の被写界深度を深くした光学系を採用することにより、計測精度を損なうことなく生体分子分析装置や計測の低コスト化を図ることが可能になる。以下、かかる変形例について説明する。
【００２９】
まず、フローセルの支持基板（下側部材）６０１として樹脂を用いる。被写界深度の浅い光学系では、抗原抗体複合体を固定させるフローセル下側部材６０１にはうねりの少ないガラスを用いる必要があり、高価であった。樹脂板としては、シクロオレフィン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレンなどを用いることができる。これらの樹脂を用いて輝点計数を行った結果、何れの樹脂を用いても計数結果に有意差は認められず、代替可能であることが示された。樹脂板では、射出成形による引けとそれに伴う歪みを有しているが、これによる計測への影響は認められなかった。またフローセル上側部材６０２についても、これらの樹脂材への変更による問題は生じなかった。フローセル１０１を形成させる樹脂については、観察波長において強い自家蛍光を示さない樹脂であれば、特に材質に制限はない。
【００３０】
また、図２Ａのような磁気微粒子を用いた計測において、スキャニング観察中、ステージの移動により、極稀にではあるが、フローセルの下側基板に磁石により固定されている磁気微粒子や抗原抗体複合体が横滑りを起こしてしまうことがある。これを防ぐため、図７に示すように、磁気微粒子を固定するフローセルの底面５０１に、すべり止めとして微細構造を設ける。例えば、フローセル下側部材に深さ５μｍ、幅５μｍの線状の溝５０２を１０μｍごとに繰り返し設ける。
【００３１】
このような立体構造を持ったフローセルの支持基板の表面に磁力を用いて磁気微粒子６０６、抗原抗体複合体６０３を固定させると、多くは磁石に近い凹部へ集まったが、一部は凸部に残存した。このため、正しく蛍光標識を含んだ抗原抗体複合体６０３の数を計数するためには、支持基板表面の凹部と凸部の両方に固定された抗原抗体複合体を観察する必要がある。被写界深度の浅い光学系であっても、Ｚ軸（光軸）方向にステージもしくは対物レンズを駆動しつつ複数の画像を取得し、そこから焦点のあった像を合成し、計数することで高さの異なる位置にある両方の複合体を計測することは可能である。しかしながら、本実施例の生体分子分析装置では、支持基板の表面に微細な構造が設けてあっても、一枚の取得画像から計数可能となった。これにより計測時間を伸ばすことなく、磁気微粒子の移動に伴う二重カウントや計数漏れを防ぎ、計数データの信頼を高めることが可能になる。
【００３２】
特にフローセルの支持基板として熱可塑性樹脂を用いる場合、微細構造の形成も容易である。例えば、図７の例では、シクロオレフィン樹脂基板へのホットエンボス加工により溝を形成したのち、エキシマＵＶ処理を用いて親水化し、フローセル下側部材として用いることができる。
【００３３】
支持基板の表面に設ける構造としては、線状の溝以外にも、円柱群、円錐群、多角柱群、多角錐群のような形状でもよい。これらの形状も熱可塑性樹脂に対する、金型を用いたホットエンボス加工により安価に形成することができる。また材質に関しても熱可塑性樹脂であって、観察波長において強い自家蛍光を示さない樹脂であれば、特に材質に制限はない。
【００３４】
一方、図２Ｂのようにフローセルの支持基板表面に抗体を固定させる計測においても、フローセル下側部材として樹脂を用いることができる。この場合、官能基の導入には、まずコロナ放電やエキシマＵＶ処理によりカルボキシル基を形成し、その後ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてカルボキシル基を活性エステル中間体とし、抗体のアミノ基と反応させることで、固定化する。好ましくは、活性エステル中間体形成後にＮＨ２−（ＰＥＧ）ｍ−ＯＨ（ＰＥＧ：ポリエチレングリコール）やＮＨ２−（ＰＥＧ）ｍ−Ｎ３を反応させ、臭化シアンによるOH基の活性化やＮ３を利用したクリック反応によって、抗体を結合させることが望ましい。ＰＥＧを含んだ自己集合膜が非特異結合を低減するため、デジタルカウントにおける計数結果が安定しやすい。
【００３５】
また、フローセル下側部材の表面に直接官能基を導入する以外にも、抗体固定反応の起点となる官能基を含んだ分子からなるゲルを表面に塗布することによっても、抗体固定に必要な官能基をフローセル下側部材に与えることができる。例えば、アガロースなど糖を含んだゲルであればOH基を有するため、臭化シアンなどで容易に活性化と抗体の固定反応を行うことができる。このようなゲルを表面に塗布する手法の場合、ゲル自体が乾燥・膨潤するため観察面の高さ方向の位置が変動しやすい。また塗布時のムラ、微細な気泡の混入などによって平坦な観察面を得ることが難しい。このような部材であっても本実施例では深い被写界深度を得られるため、計数を行う上で支障とならない。特に官能基導入に水酸基を有する分子からなるゲルを使うことで、単に抗体分子を固定するだけでなく、結合された抗体分子を乾燥から防ぐという効果も有する。
【００３６】
また、フローセルの支持基板表面に抗体を固定させる計測手法は、磁気微粒子を用いた計測よりも同じ反応時間での輝点数が少ない傾向が見られる。これは、磁気微粒子を用いた場合との反応表面積の違いに由来するものと思われる。そこで、フローセル下側部材の表面に微細構造を形成して表面積を増やす。これにより輝点数を増加させることが可能になる。支持基板表面に、２μｍピッチで、高さ１μｍ、直径１μｍの円柱を配置したナノピラー構造を形成することにより、約1.62倍の輝点数増加効果が得られた。これは表面積の増加量、約1.78倍と概ね一致する。ナノピラー構造はシクロオレフィン系樹脂へのニッケル金型を用いたナノインプリントによって作成し、抗体の固定はコロナ放電による樹脂へのCOOH基形成とＥＤＣ／ＮＨＳを用いた抗体アミノ基固定で行った。
【００３７】
形成する構造は、ナノピラー構造に限定されるものではなく、例えば、線状の溝、円錐群、多角柱群、多角錐群の何れの構造でも、Ｚ方向に高さを持った構造となることで表面積が増加するため、同様の効果が期待できる。またこれらの構造は、ナノピラーと同様にニッケル金型などを用いたナノインプリントによって形成することができる。反応表面積が増えることで、微量成分測定時のシグナル向上、反応時間短縮などの効果が得られる。
【符号の説明】
【００３８】
１００：生体分子分析装置、１０１：フローセル、１０２：磁石、１０３：Ｘ軸ステージ、１０４：Ｙ軸ステージ 、１１０：照射・撮像光学系、１１１：対物レンズ、１１２：位相板、１１３：ダイクロイックミラー、１１４：励起フィルタ、１１５：吸収フィルタ、１１６：光源、１１７：撮像装置、１３０：計算機。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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