(57)【要約】      （修正有）【課題】選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質の機能が欠損している宿主糸状菌を提供する。【解決手段】標的遺伝子の、コード領域、プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット、及びプロモーターが改変された選択マーカー遺伝子を用いて、該宿主糸状菌を形質転換することを含む、糸状菌の形質転換方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
コードする蛋白質の機能が欠損している選択マーカー遺伝子を含む宿主糸状菌を提供すること、
標的遺伝子の、コード領域、プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット、及びプロモーターを改変することで発現量を低下させた選択マーカー遺伝子を用いて、該宿主糸状菌を形質転換すること、
選択マーカー遺伝子を用いて選択培地で生育可能な形質転換体を選択することを含む、糸状菌の形質転換方法。
【請求項２】
選択する形質転換体が、標的遺伝子が複数コピー挿入された形質転換体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌が、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属、クモノスカビ属に属する糸状菌から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・サイトイである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
選択マーカーが、ｐｙｒＧ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ａｄｅＡ遺伝子、ａｄｅＢ遺伝子、ａｒｇＢ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子、ｓＣ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｌｅｕ２遺伝子、ｂｉｏＤＡ遺伝子、ｐｔｒＡ遺伝子、又はｂｅｎＡ遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
選択マーカーが、ｐｙｒＧ遺伝子もしくはａｄｅＡ遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
選択マーカー遺伝子のプロモーターの長さを２５０ｂｐ以下にまで欠損させた請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1〜９のいずれか１項に記載の方法で取得した形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーター領域を改変することで発現量を低下させた選択マーカー遺伝子を用いて、任意の遺伝子を糸状菌の細胞へ多コピーで導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属などに代表される糸状菌は一般的に高い蛋白質生産能力を有しており、産業上有用な蛋白質の生産宿主として広く用いられている。また、糸状菌は多様な二次代謝産物を生産することでも知られており、低分子化合物の生産宿主としても有用性が高い。そのため、糸状菌においても遺伝子組み換え技術を用いた蛋白質発現系の研究は盛んに行われている。その中でも、目的の蛋白質や化合物を高生産させるためには、特に蛋白質の高発現系の構築が重要であると考えられている。
【０００３】
目的の蛋白質を高発現させる方法としては、一般的には高発現プロモーターを用いる方法、目的の遺伝子を高コピーで複製可能なプラスミドを用いる方法、あるいは目的の遺伝子を高コピーでゲノム上に導入する方法等が知られている。
【０００４】
糸状菌においても、高発現プロモーターの探索はこれまでに数多く実施されており、多くの報告例がある（特許文献１〜７）。また、既存のプロモーターを基にして、特定の塩基配列を付加・欠失させる等により改良することによる高発現プロモーターも報告されている（特許文献８〜１１）。
【０００５】
また、細菌や酵母においては、高コピーで複製が可能な自律複製型プラスミドを用いることで、目的の蛋白質を高発現させることが可能である。一方、糸状菌においては、複製起点としてＡＭＡ１を含むベクターは自律複製可能なプラスミドとして機能し得ることが報告されている。ただし、本プラスミドが染色体外で自律複製可能であるのは一部の糸状菌であり、また、そのような糸状菌においても低頻度ながら染色体ＤＮＡとの組換えが起こり得ることも報告されていることなどから、産業用途としては適していない。よって、糸状菌において蛋白質を高生産する場合、目的蛋白質をコードする遺伝子の発現カセットを染色体に組み込む方法が一般的である。
【０００６】
そこで、目的蛋白質を高発現させるためには、目的蛋白質をコードする遺伝子の発現カセットを高コピーで染色体に組み込むことも方策として考えられる。例えば、硫酸塩資化に関与するＡＴＰスルフリラーゼ（ｓＣ）を選択マーカーとして用いることで、遺伝子が多コピーで染色体に組み込まれることが知られている。しかしながら、そのコピー数は数コピー程度である株が多く、よりコピー数の多い株を選抜するためには多大な労力を要する。また、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）を選択マーカーと用いることで数十コピーの遺伝子挿入が可能であることが知られている（非特許文献２）。しかし、本システムは清酒用麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ等もともとａｍｄＳ遺伝子を有している株では利用が難しいことが知られており（非特許文献３）、一部の糸状菌ではこのマーカーを利用できないという欠点がある。また、ａｍｄＳはアセトアミドやアクリルアミド等のアミド化合物が単一炭素源である場合には必須であるが、一般的に製造で実際に用いられるようなグルコースやデキストリン等を炭素源とした富栄養培地中ではａｍｄＳを必要とせず、培養中に挿入された遺伝子が欠失しやすい点も懸念される。他にも、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのアルギニン要求株に対し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＢ）を選択マーカーとして用いることで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅにおいて約６０コピーの遺伝子が挿入されたこと（非特許文献４）や、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのロイシン要求株に対し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のＡＮｌｅｕ２Ｂ遺伝子を選択マーカーとして用いることで、６４〜１２８コピーの遺伝子が挿入されたことが報告されている（特許文献１２）。しかしながら、これらの方法は、ａｒｇＢやＡＮｌｅｕ２Ｂ以外の選択マーカー遺伝子には応用できないため、使用できる宿主が限定されており、汎用性に欠ける。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３３７２０８７号公報
【特許文献２】特許第３７５９７９４号公報
【特許文献３】特許第３７９２４６７号公報
【特許文献４】特許第４６７６６３９号公報
【特許文献５】特許第３７４３８０３号公報
【特許文献６】国際公開第２００７／０７１３９９号
【特許文献７】特許第５５０７０６２号公報
【特許文献８】特許第３３４３５６７号公報
【特許文献９】特許第４４９５９０４号公報
【特許文献１０】特許第４４９０２８４号公報
【特許文献１１】特開２００９−２５４３４９公報
【特許文献１２】特許第５４７３１７９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gene. 1991 Feb 1;98(1):61-7
【非特許文献２】More Gene Manupirations in Fungi, page 409
【非特許文献３】改訂版分子麹菌学、日本醸造協会
【非特許文献４】Agric. Biol. Chem., 51 (9), 2549-2555, 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、糸状菌において、任意の遺伝子を多コピーで染色体に組み込むための汎用性の高い方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、プロモーター領域を改変し、発現量を低下させた選択マーカー遺伝子を用いることによって、任意の遺伝子を糸状菌の細胞へ多コピーで挿入することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  下記工程：
コードする蛋白質の機能が欠損している選択マーカー遺伝子を含む宿主糸状菌を提供すること、
標的遺伝子の、コード領域、プロモーター及びターミネーターを含む発現カセット、及びプロモーターが改変された選択マーカー遺伝子を用いて、該宿主糸状菌を形質転換すること、
を含む、糸状菌の形質転換方法、
［２］
糸状菌が、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属、クモノスカビ属に属する糸状菌から選択される、［１］に記載の方法、
［３］
糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌から選択される、［１］又は［２］に記載の方法、
［４］
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、又はアスペルギルス・サイトイである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法、
［５］
糸状菌が、アスペルギルス・ソーヤ、又はアスペルギルス・オリゼである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法、
［６］
プロモーターの改変が、プロモーターの一部の欠損である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法、
［７］
選択マーカーが、ｐｙｒＧ遺伝子、ｐｙｒＦ遺伝子、ａｄｅＡ遺伝子、ａｄｅＢ遺伝子、ａｒｇＢ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子、ｓＣ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｌｅｕ２遺伝子、ｂｉｏＤＡ遺伝子、ｐｔｒＡ遺伝子、又はｂｅｎＡ遺伝子である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法、
［８］
選択マーカーが、ｐｙｒＧ遺伝子である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法、
［９］
プロモーターの４０％、６０％又は８０％の長さ以上の配列が欠損している、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法、
［１０］
プロモーターの長さを２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、８０ｂｐ、又は６０ｂｐ以下にまで欠損させた［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法、
［１１］
形質転換に用いる遺伝子が、発現カセット、そして選択マーカー遺伝子の順で連結されている、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
また、本発明は、上記の方法で取得した形質転換体、及びその形質転換体を用いて標的タンパク質を製造する方法にも関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、糸状菌において、任意の遺伝子の多コピー挿入が可能となり、産業用途として有用な蛋白質や２次代謝産物の高生産化を実現できる。
また、本方法は、これまでに知られている糸状菌への遺伝子の多コピー挿入方法に比べて、汎用性が高く、実用性に優れる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子）
プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子とは、選択マーカーの機能発現に十分な転写活性を有するプロモーターから任意の領域の遺伝子配列を欠失、置換すること、あるいは任意の遺伝子配列を挿入すること等によって、プロモーターの機能を低下させ、それによってコード領域の遺伝子の転写量が低下することで、コード領域の発現量が低下した選択マーカー遺伝子のことである。ここでいう「選択マーカーの機能発現に十分な転写活性を有するプロモーター」とは、該選択マーカー遺伝子が染色体上へ１コピーのみ挿入されることにより選択培地での生育（選択マーカーの機能発現）が可能となるために必要な転写活性を有するプロモーターのことである。
【００１４】
コード領域の発現量の低下とは、コード領域の遺伝子の転写量が、プロモーターが改変されていない場合と比べて、５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上低下していることをいう。ここでいう「改変されていない」プロモーターとは、染色体上に１コピーのみ挿入されるだけで選択マーカー遺伝子の機能発現を可能とする転写活性を有する該選択マーカー遺伝子のプロモーターのことである。なお、プロモーター活性（コード領域の遺伝子の転写量）の違いは、例えばルシフェラーゼ等のレポータータンパク質を用いて、各プロモーター下で発現させたレポータータンパク質の活性を比較することで調べることができる（Eukaryot Cell., 7(1), 28-37, 2008）。
【００１５】
このようなコード領域の発現量が低下するように改変したプロモーターを有する選択マーカー遺伝子を形質転換に用いた場合、選択マーカー遺伝子が１コピーのみ染色体上に挿入された形質転換株は選択マーカーの機能発現が不十分であり生育できないが、複数コピーで染色体上に挿入された形質転換株では選択マーカーの発現量の低下がコピー数によって補われることで生育が可能となる。よって、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と任意の標的遺伝子の発現カセットを連結したＤＮＡコンストラクトを形質転換に用いることで、目的とする遺伝子が複数コピーで染色体上に挿入された株を容易に取得することが可能となる。
【００１６】
選択マーカー遺伝子のプロモーターの機能を低下させる方法は、特に限定されず、公知の種々の方法を用いてよい。例えば、具体的な方法としては、１コピーのみで選択マーカー遺伝子のコード領域の機能発現が可能である、該選択マーカー遺伝子のプロモーター配列の一部あるいは全てを欠損させること、あるいは、該選択マーカー遺伝子のプロモーター配列の一部あるいは全てに対して、任意の塩基配列で置換、挿入することが挙げられる。あるいは、該選択マーカー遺伝子のプロモーターを全て欠損させ、転写活性の弱いプロモーターや潜在性プロモーターで置換する方法が挙げられる。任意のプロモーターの転写活性を低下させる方法は、公知の種々な方法を用いることができる。例えば、転写活性を低下させたいプロモーター配列の一部を欠損／置換／挿入させた種々のプロモーター下でＧＦＰ、ルシフェラーゼやβガラクトシダーゼ等のレポータータンパク質を発現させ、そのレポータータンパク質の光量や活性を比較することで、該プロモーター配列中の転写活性に必要な領域を特定し、その領域を欠損、あるいはその領域に対し任意の塩基配列を置換／挿入することでプロモーターの転写活性を低下させる方法がある（Mol Cell Biol., 7(7), 2352-9, 1987、Appl Environ Microbiol., 72(8), 5266-73, 2006、Yeast., 7(7), 679-89, 1991、Curr Genet., 43(2), 96-102, 2003、J Biol Chem., 272(28), 17802-9, 1997）。あるいは、転写活性の弱いプロモーターを見出す方法として、マイクロアレイ等により、転写量の低い遺伝子を探索し、該遺伝子の上流配列を転写活性の弱いプロモーターとして利用する方法もある。あるいは、条件発現プロモーター等を用いて形質転換株の選択培地中で転写活性の弱いプロモーターを利用する方法もある。また、一般的にはコード領域に隣接する上流領域をプロモーターとして用いることが多いが、例えば、コード領域から離れて存在するような潜在性プロモーターであっても転写活性を有する場合があり、そのようなプロモーターも本発明に利用することは可能である。
【００１７】
例えば、プロモーターの一部を欠損させるための一例としては、任意の選択マーカーのプロモーターの長さを２５０ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ、より好ましくは１５０ｂｐ、より好ましくは１００ｂｐ、より好ましくは８０ｂｐ、より好ましくは６０ｂｐ以下にまで欠損させる方法がある。
【００１８】
例えば、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーターの機能を低下させる方法としては、１コピーで十分な機能を有するｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーターから、５’末端の任意の長さの配列を欠損させ、プロモーターを短縮させることが挙げられる。好ましくは、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流２２９ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。さらに好ましくは、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流１２９ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。最も好ましくは、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流５６ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。あるいはｐｙｒＧマーカーのプロモーター領域を全て欠損させても良く、その上で別の遺伝子由来の弱いプロモーター（例えば、ａｄｅＡマーカー遺伝子由来の短縮化プロモーターや、ａｌｐターミネーター由来の潜在性プロモーター等）で置換させても良い。
【００１９】
例えば、ａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーターの機能を低下させる方法としては、１コピーで十分な機能を有するａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーターから、５’末端の任意の長さの配列を欠損させ、プロモーターを短縮させることが挙げられる。好ましくは、ａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流１２６ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。さらに好ましくは、ａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流１２０ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。最も好ましくは、ａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーターの長さがコード領域の上流８０ｂｐ以下にまで短縮されていることが好ましい。あるいはａｄｅＡマーカーのプロモーター領域を全て欠損させても良く、その上で別の遺伝子由来の弱いプロモーター（例えば、ｐｙｒＧマーカー遺伝子由来の短縮化プロモーターや、ａｌｐターミネーター由来の潜在性プロモーター等）で置換させても良い。
【００２０】
本発明において使用可能な選択マーカー遺伝子としては、糸状菌で使用可能な選択マーカー遺伝子全てであり得る。例えば、ウラシルの生合成に関与するｐｙｒＧ遺伝子（オロチジン−５‘−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子）、ｐｙｒＦ遺伝子（オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子）、アデニンの生合成に関与するａｄｅＡ遺伝子Ｎ−スクシニル−５−アミノイミダゾール−4−カルボキシアミドリボタイド合成酵素遺伝子）、ａｄｅＢ遺伝子（ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ遺伝子）、アルギニンの生合成に関与するａｒｇＢ遺伝子（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子）、硝酸塩の資化に関与するｎｉａＤ遺伝子（硝酸還元酵素遺伝子）、硫酸塩資化に関与するｓＣ遺伝子（ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子）、アセトアミド資化に関与するａｍｄＳ遺伝子（アセトアミダーゼ遺伝子）、トリプトファンの生合成に関与するｔｒｐＣ遺伝子（グルタミンアミドトランスフェラーゼ遺伝子／インドールグリセロリン酸合成酵素遺伝子／ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ遺伝子）、ビオチンの生合成に関与するｂｉｏＤＡ遺伝子（７,８‐ジアミノペラルゴン酸合成酵素遺伝子／デチオビオチン合成酵素遺伝子）、ロイシンの生合成に関与するｌｅｕ２遺伝子（β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）、ピリチアミン耐性マーカーｐｔｒＡ遺伝子（チアゾール合成酵素遺伝子）、ベノミル耐性マーカーｂｅｎＡ遺伝子（β−チューブリン遺伝子）等のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００２１】
また、選択マーカー遺伝子の由来が使用する宿主と必ずしも同じでなくても良い。由来が異なる選択マーカー遺伝子であってもその宿主で発現し、機能し得る場合は本発明において使用することができる。
【００２２】
（形質転換に用いる遺伝子の構成）
本発明で形質転換に用いる遺伝子は、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子、高発現させたい標的遺伝子、標的遺伝子を発現させるためのプロモーター及びターミネーターを連結することによって構成される。本発明で使用する標的遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、高発現プロモーターであることが望ましく、例えば、プロモーターとしては、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）のプロモーター領域、及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）のプロモーター領域などが挙げられる。また、本発明で使用する標的遺伝子を発現させるためのターミネーターは、その宿主で機能し得る限り特に限定されないが、例えば、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のターミネーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）のターミネーター領域等が挙げられる。なお、標的遺伝子を発現させるための発現カセットには、標的遺伝子のコード領域、プロモーター、ターミネーター以外にも、分泌シグナル配列や翻訳エンハンサー配列、オルガネラ局在配列等の遺伝子も含みうる。
【００２３】
プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子の発現カセットを連結させた遺伝子をそのまま形質転換に用いることも可能であるが、その際には標的遺伝子の発現カセット、選択マーカー遺伝子の順で連結することが望ましい。プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子、標的遺伝子の発現カセットの順で連結した場合、該連結遺伝子が染色体上の何らかの遺伝子のプロモーター領域に挿入された株では、挿入された該連結遺伝子のコピー数が１コピーであっても選択マーカー遺伝子が十分量発現してしまい、多コピー株の選抜が困難になる可能性が考えられる。また、標的遺伝子の発現カセット、選択マーカー遺伝子の順で連結する場合でも、標的遺伝子発現のターミネーター遺伝子中に、強い転写活性を有するプロモーターとして機能し得る配列が含まれないことが重要である。
【００２４】
また、形質転換に用いる際に、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と標的遺伝子の発現カセットが必ずしも連結させていなくても良い。プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と標的遺伝子の発現カセットが連結させていなくても、形質転換処理後に宿主細胞の染色体上でそれらが連結されるように遺伝子を設計することも可能である。例えば、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と相同組み換え用配列を連結させたＤＮＡ断片と、相同組み換え用配列と標的遺伝子の発現カセットを連結させたＤＮＡ断片を一緒に形質転換に用いた場合、宿主細胞の染色体上で相同組み換え配列を介して、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と標的遺伝子の発現カセットが連結し得る。
【００２５】
本発明において形質転換に用いるＤＮＡは、直鎖状であっても、環状であっても良い。例えば、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子の発現カセットを連結させたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９等の任意の領域に挿入したものを形質転換用ＤＮＡとして用いてもよい。あるいは、標的遺伝子の発現カセットを連結させたＤＮＡをセルフライゲーションにより環状化したものを用いてもよい。
【００２６】
また、形質転換に用いるＤＮＡは、プロモーターが改変された選択マーカー遺伝子、標的遺伝子の発現カセット、ベクターＤＮＡ以外の任意のＤＮＡ配列を含んでいても良い。例えば、宿主の染色体上に存在するＤＮＡ配列と相同な配列を有する領域（相同領域）を含んでいてもよい。染色体へＤＮＡが挿入される際、酵母では相同組み換えによってＤＮＡが挿入されるため、形質転換に用いるＤＮＡには相同領域が含まれている必要がある。一方、糸状菌においては、相同組み換え、非相同組み換えの両方の機構でＤＮＡが挿入されうるため、形質転換に用いるＤＮＡに、必ずしも相同領域が含まれている必要はない。つまり、形質転換に用いるＤＮＡに相同領域が含まれない場合にも、糸状菌においては非相同組み換えにより染色体上に遺伝子がランダムに挿入されうるが、形質転換に用いるＤＮＡに相同領域が含まれている場合には相同組み換えも同時に起こることが想定される。さらに、相同領域が染色体上に複数コピー存在する場合は、それぞれの所定の位置で相同組み換えが起こることが想定されるため、より好ましい。
【００２７】
（宿主細胞）
本発明で形質転換に使用できる宿主細胞は糸状菌であれば特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属などに属する糸状菌が挙げられる。
【００２８】
アスペルギルス属糸状菌の具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・サイトイ等が挙げられる。
【００２９】
その中でも、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルウチウエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・サイトイなどのアスペルギルス属であることが好ましい。
【００３０】
また、本発明において形質転換に用いる宿主糸状菌は、使用する選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質の機能が欠損している株である必要がある。その中でも、使用する選択マーカー遺伝子のコード領域の一部分もしくはて全領域の遺伝子が欠損している株がより好ましい。
【００３１】
（形質転換体、形質転換方法）
本発明における形質転換体は、使用する選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質の機能が欠損している任意の糸状菌に対し、上記のプロモーターが改変された選択マーカー遺伝子と、標的遺伝子の発現カセット等で構成された遺伝子を用いて形質転換を行うことによって取得できる。
【００３２】
糸状菌の形質転換方法としては、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いて遺伝子を導入する方法（ＰＥＧ−プロトプラスト法、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９−１０４（１９８９））や、発芽してすぐの分生子に対してエレクトロポレーションによって遺伝子を導入する方法（Biosci Biotechnol Biochem. 1994 Dec;58(12):2224-7.）等が知られている。所望の形質転換体は、選択マーカー遺伝子を用いることによって、たとえば、マーカー遺伝子に関する栄養要求性や薬物耐性等を用いることによって、選択することができる。例えば、栄養要求性によって選択を行う場合は、該栄養要求性を相補するような化合物を含まない培地において所望の形質転換体を選択することができる。また、例えば薬物耐性によって選択を行う場合は、該薬物を適当な濃度で含む培地において所望の形質転換体を選択することができる。
【００３３】
本発明における形質転換体の一例としては、ｐｙｒＧ遺伝子のコードする蛋白質の機能が欠損した糸状菌株に対し、プロモーターが改変されて発現量が低下したｐｙｒＧ遺伝子と、標的遺伝子の発現カセット等を連結した遺伝子、もしくはそれらが細胞内で連結されるように設計した遺伝子を用いて形質転換処理を行い、ウラシル／ウリジンを含まない培地上で生育可能な形質転換体を挙げることができる。その中でも標的遺伝子が複数コピー挿入されている形質転換体が好ましく、標的遺伝子が５コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が１０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が１５コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が２０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が３０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が４０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が５０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が６０コピー以上挿入されている形質転換体が最も好ましい。
【００３４】
また、本発明における形質転換体の別の一例としては、ａｄｅＡ遺伝子のコードする蛋白質の機能が欠損した糸状菌株に対し、プロモーターが改変されて発現量が低下したａｄｅＡ遺伝子と、標的遺伝子の発現カセット等を連結した遺伝子、もしくはそれらが細胞内で連結されるように設計した遺伝子を用いて形質転換処理を行い、アデニンを含まない培地上で生育可能な形質転換体を挙げることができる。その中でも標的遺伝子が複数コピー挿入されている形質転換体が好ましく、標的遺伝子が５コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が１０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が１５コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましく、標的遺伝子が２０コピー以上挿入されている形質転換体がより好ましい。
【００３５】
コピー数を調べる方法としては、標的遺伝子が１コピー挿入された株と取得した形質転換株における標的蛋白質の生産量もしくは活性を比べることで算出する方法や、標的遺伝子が１コピー挿入された株と取得した形質転換株における標的遺伝子のサザンブロットのバンドの濃さにより算出する方法や、形質転換株の染色体ＤＮＡを用いた定量ＰＣＲ法等がある。
【００３６】
（産業上有用な蛋白質や２次代謝産物の製造方法）
目的としている蛋白質や２次代謝産物を製造するためには、本発明を用いて取得した、目的物質の生産に必要な遺伝子が多コピーで挿入された形質転換体を培養し、前記培養物から目的物質を抽出すればよい。
【００３７】
上記の形質転換体を培養する培地としては、糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも、液体培地及び固体培地のいずれでも使用できる。一例としては、後述の実施例で用いているＧＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。目的としている蛋白質、２次代謝産物によっては、その物質を生産するために必要な特異的な物質を培地に添加する場合も想定される。
【００３８】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、一般的には溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。ただし、目的としている蛋白質、２次代謝産物によっては、溶存酸素が少ない方が高生産になる場合も想定される。培養条件の一例としては、後述する実施例に記載があるＧＰＹ培地を用いた、３０℃、３日間の振盪培養が挙げられるが、特に限定されない。
【００３９】
培養終了後に培養物から目的の蛋白質や２次代謝産物を抽出する方法は特に限定されなされず、通常の公知の抽出手段を用いればよい。
【００４０】
例えば、標的蛋白質を抽出する際において、標的蛋白質が培地中に分泌される場合には、培養後の菌体を濾過や遠心処理等により取り除き、培地上清のみを回収し、限外濾過等により培地成分の除去及び濃縮処理を行うことで粗酵素を得ることができる。標的蛋白質が菌体内に生産される際には、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法や、ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、ＳＤＳ、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理を行うことで抽出できる。得られた粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることができる。
【００４１】
例えば、培養物から二次代謝産物を抽出する際には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。抽出溶媒はその２次代謝産物が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒、これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒、水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理や熱処理等を加えながら目的の２次代謝産物を抽出する。得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより精製することができる。
【００４２】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
（プロモーターを短縮した改変型ｐｙｒＧマーカー遺伝子を含む形質転換用ＤＮＡコンストラクトの作製）
（１）プロモーターを短縮した改変型ｐｙｒＧ１〜３遺伝子の取得
配列番号１は、従来Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅにおいて使用されていたｐｙｒＧマーカー遺伝子の配列である（ＷＯ２０１４／１２６１８６参照）。配列番号１のｐｙｒＧマーカー遺伝子はプロモーター領域４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及びターミネーターを含む５３５ｂｐの領域で構成されており、この全長１８３８ｂｐの配列が染色体上に１コピー挿入されることで、ウリジン／ウラシル要求性の形質を相補できることがわかっている。
【００４４】
染色体上に多コピー挿入されないとウリジン／ウラシル要求性を十分に相補できない改変型ｐｙｒＧマーカー遺伝子を創出することを目的として、配列番号１のｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーター領域を短縮した改変型ｐｙｒＧマーカー遺伝子（改変型ｐｙｒＧ１〜３、配列番号２〜４）を下記のようにして設計した。配列番号１のｐｙｒＧマーカー遺伝子を鋳型として、改変型ｐｙｒＧ１遺伝子（配列番号２、プロモーター領域２２９ｂｐ）は配列番号５、６のプライマーを用いて、改変型ｐｙｒＧ２遺伝子（配列番号３、プロモーター領域１２９ｂｐ）は配列番号７、６のプライマーを用いて、改変型ｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号４、プロモーター領域５６ｂｐ）は配列番号８、６のプライマーを用いて、Ａ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）によるＰＣＲ反応によって取得した。なお、配列番号５〜１０のプライマーは後のＩｎ  ｆｕｓｉｏｎ反応に必要な１５ｂｐの相同配列を５‘末端に含んでいる。
【００４５】
（２）レポーター遺伝子発現カセットと各改変型ｐｙｒＧ遺伝子マーカーを含む形質転換用ベクターの作製
染色体上にどのくらい遺伝子が挿入されたかを検証するためのレポーター遺伝子として、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）遺伝子（特許第４６４８９９３号公報の配列番号４参照）を用いた。糸状菌で発現させたＧＤＨは後述の活性測定方法により容易にその活性を測定することができる。
ＷＯ２０１４／１２６１８６と同様にして、Ａ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、レポーター遺伝子（ＧＤＨ遺伝子）を発現させるためのｔｅｆ１プロモーター（Ｐｔｅｆ）領域およびアルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター（Ｔａｌｐ）領域をＰＣＲ反応により増幅させた。また、レポーター遺伝子であるＧＤＨ遺伝子は特許文献ＷＯ２０１２／１６９５１２号公報のｐＹＥＳ２Ｃ−ＭｐプラスミドＤＮＡを鋳型にして、配列番号９、１０のプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅させた。次に、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて、キットに付属されている直鎖状ｐＵＣ１９、Ｐｔｅｆ、ＧＤＨ遺伝子、Ｔａｌｐ、及びｐｙｒＧ遺伝子（配列番号１）、ｐｙｒＧ１遺伝子（配列番号２）、ｐｙｒＧ２遺伝子（配列番号３）、ｐｙｒＧ３遺伝子（配列番号４）のＤＮＡ断片をそれぞれ連結した。これにより、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＰｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ１、Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ２、Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ３がそれぞれ挿入された形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ１、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ２、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ３を取得した。
【実施例２】
【００４６】
（Ａ．ｓｏｊａｅにおける改変型ｐｙｒＧの多コピー挿入効果の検証）
上記で取得した形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ１、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ２、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ３を用いて、Ａ．ｓｏｊａｅのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、Ａ．ｓｏｊａｅ形質転換株Ａｓ−ｐｙｒＧ株を４８株、Ａｓ−ｐｙｒＧ１株を２３株、Ａｓ−ｐｙｒＧ２株を２６株、Ａｓ−ｐｙｒＧ３株を１８株取得した。
【００４７】
取得した形質転換株Ａｓ−ｐｙｒＧ株、Ａｓ−ｐｙｒＧ１株、Ａｓ−ｐｙｒＧ２株、Ａｓ−ｐｙｒＧ３株をＧＰＹ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後の菌体を濾紙上に回収した後、吸引濾過により水分を取り除き、湿菌体重量５０ｍｇの菌体をチューブに入れた。これを液体窒素で凍結させてマルチビーズショッカーにより破砕し、破砕した菌体に１ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、遠心分離後の上清を回収することで菌体破砕液を調製した。この菌体破砕液のＧＤＨ活性を下記の測定方法に従って測定し、５０ｍｇ菌体あたりのＧＤＨ活性を算出した。
【００４８】
また、特許第４６４８９９３号公報と同様にして、５’アーム領域（Ａｌｐ上流遺伝子）−ｐｙｒＧ遺伝子−Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−３’アーム領域（Ａｌｐ下流遺伝子、Ｔａｌｐ領域含む）のＤＮＡコンストラクトを用いてＡ．ｓｏｊａｅのｐｙｒＧ遺伝子破壊株を形質転換し、ＧＤＨ遺伝子が染色体上のａｌｐ遺伝子の領域に１コピー挿入された株を取得した。この１コピー株についても上記と同様にして湿菌体重量５０ｍｇあたりのＧＤＨ活性を算出し、この値を基に今回取得した形質転換株のコピー数を算出した。
【００４９】
＜ＧＤＨ活性測定方法＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【数１】
2018068292.tif 000002
【００５０】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００５１】
Ａｓ−ｐｙｒＧ株、Ａｓ−ｐｙｒＧ１株、Ａｓ−ｐｙｒＧ２株、Ａｓ−ｐｙｒＧ３株において、挿入されたＧＤＨ遺伝子のコピー数と取得できた株数の結果を表１に示した。
【００５２】
【表１】
2018068292.tif 000003
【００５３】
表１より、１０コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合はＡｓ−ｐｙｒＧ３株の３３％、Ａｓ−ｐｙｒＧ２株の１９％、Ａｓ−ｐｙｒＧ１株の１７％、Ａｓ−ｐｙｒＧ株の２％の順で高くなっていることがわかる。このことからｐｙｒＧ遺伝子のプロモーターを短縮することでＧＤＨ遺伝子を効率よく多コピーで挿入できることがわかった。また、表１で解析したＡｓ−ｐｙｒＧ３株の１８株中には、３０コピー以上のＧＤＨ遺伝子が挿入されている株も存在した。さらに、ｐｙｒＧ３遺伝子を用いてより多くの形質転換体を取得したところ、６０コピー以上相当のＧＤＨ活性を有する株も取得可能であることがわかった。また、取得した該６０コピー相当株及び３０コピー相当株について、定量ＰＣＲにより染色体上に存在するＧＤＨ遺伝子のコピー数を調べたところ、それぞれ約６０コピー、約３０コピーのＧＤＨ遺伝子が実際に染色体上へ挿入されていることがわかった。
【００５４】
以上より、選択マーカーのプロモーターを短縮し、転写活性を低下させる方法が任意の遺伝子を多コピー挿入するための方法として非常に有効であることがわかった。さらに、該多コピー体が最少培地で複数回植え継いでもＧＤＨ活性を維持していること、実製造で用いるような冨栄養培地における培養においても再現性良く同じ値を示し、且つ高活性であることから、本方法で取得した株は安定性にも優れ、産業上実用可能な株であることがわかった。
【実施例３】
【００５５】
（Ａ．ｏｒｙｚａｅにおける改変型ｐｙｒＧの多コピー挿入効果の検証）
上述のように、プロモーターを短縮した選択マーカーを用いることで効率よく遺伝子を多コピーで挿入できることがＡ．  ｓｏｊａｅにおいて確認された。そこで、本方法が他の糸状菌でも応用可能であるかどうかを検証するため、Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株のｐｙｒＧ遺伝子破壊株に対し、上記のｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ、ｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ３を用いて形質転換を行った。そして、取得した形質転換体Ａｏ−ｐｙｒＧ株、Ａｏ−ｐｙｒＧ３株をＧＰＹ培地において３０℃で３日間培養した後、培養液中のペレット状の菌体をヒスコトロンでせん断し、マルチビーズショッカーによりさらに菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心し、上清を回収することでＡｏ−ｐｙｒＧ株、Ａｏ−ｐｙｒＧ３株の粗酵素液を取得した。そして、これらの粗酵素液のＧＤＨ活性を測定することで、Ａｏ−ｐｙｒＧ株、Ａｏ−ｐｙｒＧ３株におけるＧＤＨ生産量（Ｕ／ｍL ｃｕｌｔｕｒｅ）を算出した（表２）。
【００５６】
【表２】
2018068292.tif 000004
【００５７】
表２より、プロモーターを短縮したｐｙｒＧマーカー遺伝子ｐｙｒＧ３を用いて取得したＡｏ−ｐｙｒＧ３株は、プロモーターが短縮されていないｐｙｒＧマーカー遺伝子ｐｙｒＧを用いて取得したＡｏ−ｐｙｒＧ株に比べて、ＧＤＨ活性の高い株を取得できる割合が高くなっていることがわかった。
【００５８】
このことから、プロモーターを短縮し、転写量を低下させた選択マーカーを用いて、効率よく遺伝子を多コピーで挿入する方法は、Ａ．ｓｏｊａｅ以外の他の糸状菌でも応用可能であることが示された。
【実施例４】
【００５９】
（プロモーターを短縮した改変型ａｄｅＡマーカーによる多コピー挿入効果の検証）
（１）プロモーターを短縮した改変型ａｄｅＡ１〜３遺伝子の取得
上述のように、プロモーターを短縮し、転写量を低下させたｐｙｒＧマーカーを用いることで効率よく遺伝子を多コピーで挿入できることがＡ．ｓｏｊａｅ及びＡ．ｏｒｙｚａｅにおいて確認された。そこで、ｐｙｒＧ以外の選択マーカーでも同様の効果が得られるかどうかを検証した。具体的には、ｐｙｒＧマーカーと同様、糸状菌の選択マーカーとしてよく用いられているａｄｅＡマーカー（FEMS Microbiol Lett., 239(1), 79-85, 2004）を用いて、プロモーターを短縮し、選択マーカー遺伝子の発現量を低下させることによる標的遺伝子の多コピー挿入効果を検証することにした。配列番号１１はＡ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９由来のａｄｅＡマーカー遺伝子の配列であり、プロモーター領域６４２ｂｐ、コード領域１１２８ｂｐ及びターミネーターを含む２４１ｂｐで構成されている。この全長２０１１ｂｐのａｄｅＡマーカー遺伝子の配列が染色体上に１コピー挿入されることで、アデニン要求性であるＡ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９のａｄｅＡ遺伝子破壊株（ａｄｅＡ遺伝子の上流２５８ｂｐ、コード領域１１２８ｂｐ、下流８３ｂｐ欠損株）の形質を相補できることがわかっている。
【００６０】
染色体上に多コピー挿入されないとアデニン要求性を十分に相補できない改変型ａｄｅＡマーカー遺伝子を創出することを目的として、配列番号１１のａｄｅＡマーカー遺伝子のプロモーター領域を短縮した改変型ａｄｅＡマーカー遺伝子（改変型ａｄｅＡ１〜３、配列番号１２〜１４）を下記のようにして設計した。Ａ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、改変型ａｄｅＡ１遺伝子（配列番号１２、プロモーター領域１２６ｂｐ）は配列番号１５、１６のプライマーを用いて、改変型ａｄｅＡ２遺伝子（配列番号１３、プロモーター領域１２０ｂｐ）は配列番号１７、１６のプライマーを用いて、改変型ａｄｅＡ３遺伝子（配列番号１４、プロモーター領域８０ｂｐ）は配列番号１８、１６のプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）によるＰＣＲ反応によって取得した。次に、特開平２−１７１１８９号公報記載のヘイケホタル由来ルシフェラーゼにＡ２１７Ｌの耐熱性変異を導入したアミノ酸配列を基に、麹菌発現用にコドン改変したルシフェラーゼ遺伝子を、ａｄｅＡ及びａｄｅＡ１〜３由来の各プロモーター下でＡ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株において発現させ、ルシフェラーゼによる発光強度を測定することでａｄｅＡ及びａｄｅＡ１〜３のプロモーター活性を比較した。各ルシフェラーゼ遺伝子の発現カセットが染色体中に１コピーのみ挿入されていることを確認し、特開２００７−３２５５４６号公報記載の方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した結果、ａｄｅＡ１プロモーター（１２６ｂｐ）、ａｄｅＡ２プロモーター（１２０ｂｐ）は、ａｄｅＡプロモーター（６４２ｂｐ）に比べて、それぞれ約１／９０、約１／５０００のプロモーター活性であることがわかった。また、ａｄｅＡ３のプロモーター領域（８０ｂｐ）下ではルシフェラーゼによる発光は検出できなかった。なお、プロモーター領域が１２８ｂｐ、１２７ｂｐである短縮化ａｄｅＡプロモーターを用いた場合は、ａｄｅＡプロモーター（６４２ｂｐ）の約４０％及び約２０％のルシフェラーゼ活性を維持していた。このことから、ａｄｅＡ１プロモーター（１２６ｂｐ）、ａｄｅＡ２プロモーター（１２０ｂｐ）、ａｄｅＡ３プロモーター（８０ｂｐ）を用いて、多コピー挿入検討を行うことにした。
【００６１】
（２）レポーター遺伝子発現カセットと各改変型ａｄｅＡマーカーを含む形質転換用ベクターの作製
染色体上にどのくらい遺伝子が挿入されたかを検証するためのレポーター遺伝子としては上記と同様グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）遺伝子を用いた。Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて、上記と同様にして、ｐＵＣ１９、遺伝子 、Ｐｔｅｆ、遺伝子 、ＧＤＨ遺伝子、Ｔａｌｐ遺伝子 、ａｄｅＡ１遺伝子（配列番号１２）、ａｄｅＡ２遺伝子（配列番号１３）、ａｄｅＡ３遺伝子（配列番号１４）のＤＮＡ断片をそれぞれ連結した。これにより、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＰｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ａｄｅＡ１、Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ａｄｅＡ２、Ｐｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ａｄｅＡ３がそれぞれ挿入された形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ１、ｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ２、ｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ３を取得した。
【００６２】
（３）ＧＤＨ発現カセットと各改変型ａｄｅＡマーカーを挿入した形質転換株の解析
上記で取得した形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ１、ｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ２、ｐ１９−ＧＤＨ−ａｄｅＡ３を用いて、Ａ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９のａｄｅＡ遺伝子破壊株（ａｄｅＡ遺伝子の上流２５８ｂｐ、コード領域１１２８ｂｐ、下流８３ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、Ａｓ−ａｄｅＡ１株を１９株、Ａｓ−ａｄｅＡ２株を１２株、Ａｓ−ａｄｅＡ３株を７株取得した。
【００６３】
取得した形質転換株Ａｓ−ａｄｅＡ１株、Ａｓ−ａｄｅＡ２株、Ａｓ−ａｄｅＡ３株をＧＰＹ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後の菌体を濾紙で 上に回収した後、よく 吸引濾過により水分を取って 取り除き、湿菌体重量５０ｍｇの菌体をチューブに入れた。これを、液体窒素で凍結させてマルチビーズショッカーにより破砕し、破砕した菌体に１ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、遠心分離後の上清を回収することで菌体破砕液を調製した 。この菌体破砕液のＧＤＨ活性を下記の測定方法に従って測定し、５０ｍｇ菌体あたりのＧＤＨ活性を算出した。その後、上記と同様にして１コピー株のＧＤＨ活性値を基に、取得した形質転換株のコピー数を算出した。
【００６４】
Ａｓ−ａｄｅＡ１株、Ａｓ−ａｄｅＡ２株、Ａｓ−ａｄｅＡ３株において、挿入されたＧＤＨ遺伝子のコピー数と取得できた株数の結果を表３に示した。
【００６５】
【表３】
2018068292.tif 000005
【００６６】
表３より、５コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合はＡｓ−ａｄｅＡ３株の４３％、Ａｓ−ａｄｅＡ２株の２５％、Ａｓ−ａｄｅＡ１株の２１％の順で高くなっており、このことからａｄｅＡ遺伝子のプロモーターを短縮し、プロモーター活性を低下させることでＧＤＨ遺伝子を効率よく多コピーで挿入できることがわかった。また、表３で解析した形質転換株の中で最も多コピーであった株は、Ａｓ−ａｄｅＡ１株では１０コピー株、Ａｓ−ａｄｅＡ２株では１２コピー株、Ａｓ−ａｄｅＡ３株では２１コピー株であり、プロモーターを短縮することで、よりコピー数の多い株が取得できることがわかった。
【００６７】
以上より、本発明における選択マーカー遺伝子の発現量を低下させ、任意の標的遺伝子を多コピー挿入する方法は様々な選択マーカーにおいても有効であることがわかった。
【実施例５】
【００６８】
（ａｄｅＡマーカー由来のプロモーターを連結したｐｙｒＧマーカー遺伝子による多コピー挿入効果の検証）
（１）レポーター遺伝子発現カセットとａｄｅＡマーカー由来のプロモーター領域を連結したｐｙｒＧマーカーを含む形質転換用ベクターの作製
上記のとおり、ｐｙｒＧマーカー、ａｄｅＡマーカーのどちらの選択マーカーにおいても、自身のプロモーター領域を短縮化することでプロモーター活性を低下させ、結果的に選択マーカータンパク質の発現量を低下させることで、任意の標的遺伝子を多コピー挿入できることがわかった。任意の標的遺伝子を多コピー挿入するためには、選択マーカータンパク質の発現量を低下させることが重要であり、そのための方策としては、該選択マーカー遺伝子自身のプロモーター領域を短縮化する方法以外にも、プロモーター活性が弱いことがわかっている別の遺伝子由来のプロモーターに置換する方法も考えうる。そこで、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーター領域（６４３ｂｐ）を全て欠損させ、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のコード領域の上流にＡｓ−ａｄｅＡ３由来のプロモーター（８０ｂｐ）を連結させた改変型ｐｙｒＧマーカー遺伝子（ｐｙｒＧ４、配列番号１９）を作製した。次に、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて、上記と同様にして、ｐＵＣ１９、Ｐｔｅｆ 、ＧＤＨ遺伝子、Ｔａｌｐ 、ｐｙｒＧ４遺伝子（配列番号１９）のＤＮＡ断片をそれぞれ連結した。これにより、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＰｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ４が挿入された形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ４を取得した。
【００６９】
（２）ＧＤＨ発現カセットとｐｙｒＧ４マーカーを挿入した形質転換株の解析
上記で取得した形質転換用プラスミｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ４を用いて、Ａ．ｓｏｊａｅのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、Ａｓ−ｐｙｒＧ４株を３２株取得した。
【００７０】
取得した形質転換株Ａｓ−ｐｙｒＧ４株をＧＰＹ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後の菌体を濾紙で 上に回収した後、よく 吸引濾過により水分を取って 取り除き、湿菌体重量５０ｍｇの菌体をチューブに入れた。これを、液体窒素で凍結させてマルチビーズショッカーにより破砕し、破砕した菌体に１ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、遠心分離後の上清を回収することで菌体破砕液を調製した 。この菌体破砕液のＧＤＨ活性を下記の測定方法に従って測定し、５０ｍｇ菌体あたりのＧＤＨ活性を算出した。その後、上記と同様にして１コピー株のＧＤＨ活性値を基に、Ａｓ−ｐｙｒＧ４株のコピー数を算出した。
【００７１】
Ａｓ−ｐｙｒＧ４株において、挿入されたＧＤＨ遺伝子のコピー数と取得できた株数の結果を表４に示した。
【表４】
2018068292.tif 000006
【００７２】
表４より、Ａｓ−ｐｙｒＧ４株のうち１０コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合は１３％であり、Ａｓ−ｐｙｒＧ株の２％より高いことがわかった。また、５コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合は、Ａｓ−ｐｙｒＧ株が４％であるのに対し、Ａｓ−ｐｙｒＧ４株では２２％であった。これらのことからプロモーター活性の低いプロモーターで置換することで選択マーカー遺伝子の発現量を低下させることによって、ＧＤＨ遺伝子を効率よく多コピーで挿入できることがわかった。また、表４のＡｓ−ｐｙｒＧ４株のうち、最もＧＤＨ活性が高かった株は１８コピー株であった。
【００７３】
以上より、本来の選択マーカー遺伝子のプロモーターを全て欠損させ、プロモーター活性の低い別の遺伝子由来のプロモーターで置換することでマーカー遺伝子の発現量を低下させる方法は、任意の遺伝子を多コピー挿入するための方法として有効であることがわかった。
【実施例６】
【００７４】
（プロモーター領域を持たないｐｙｒＧマーカー遺伝子による多コピー挿入効果の検証）
（１）レポーター遺伝子発現カセットとａプロモーター領域を持たないｐｙｒＧマーカーを含む形質転換用ベクターの作製
実施例４より、プロモーター活性が著しく低いａｄｅＡ３マーカーを用いても多コピー遺伝子の挿入が可能であった。このことから、プロモーター領域を持たない選択マーカー遺伝子も多コピー挿入のために使用できる可能性が考えられた。そこで、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のプロモーター領域（６４３ｂｐ）を全て欠損させた改変型ｐｙｒＧマーカー遺伝子（ｐｙｒＧ５、配列番号２０）を作製した。次に、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて、上記と同様にして、ｐＵＣ１９、Ｐｔｅｆ 、ＧＤＨ遺伝子、Ｔａｌｐ 、ｐｙｒＧ５遺伝子（配列番号２０）のＤＮＡ断片をそれぞれ連結した。これにより、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにＰｔｅｆ−ＧＤＨ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧ５が挿入された形質転換用プラスミドｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ５を取得した。
【００７５】
（２）ＧＤＨ発現カセットとｐｙｒＧ５マーカーを挿入した形質転換株の解析
上記で取得した形質転換用プラスミｐ１９−ＧＤＨ−ｐｙｒＧ５を用いて、Ａ．ｓｏｊａｅのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、Ａｓ−ｐｙｒＧ５株を１９株取得した。
【００７６】
取得した形質転換株Ａｓ−ｐｙｒＧ４株をＧＰＹ培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後の菌体を濾紙で 上に回収した後、よく 吸引濾過により水分を取って 取り除き、湿菌体重量５０ｍｇの菌体をチューブに入れた。これを、液体窒素で凍結させてマルチビーズショッカーにより破砕し、破砕した菌体に１ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、遠心分離後の上清を回収することで菌体破砕液を調製した 。この菌体破砕液のＧＤＨ活性を下記の測定方法に従って測定し、５０ｍｇ菌体あたりのＧＤＨ活性を算出した。その後、上記と同様にして１コピー株のＧＤＨ活性値を基に、Ａｓ−ｐｙｒＧ５株のコピー数を算出した。
【００７７】
Ａｓ−ｐｙｒＧ５株において、挿入されたＧＤＨ遺伝子のコピー数と取得できた株数の結果を表５に示した。
【表５】
2018068292.tif 000007
【００７８】
表５より、Ａｓ−ｐｙｒＧ５株のうち１０コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合は２１％であり、Ａｓ−ｐｙｒＧ株の２％より高いことがわかった。また、５コピー以上のＧＤＨ活性を有する株の割合は、Ａｓ−ｐｙｒＧ株が４％であるのに対し、Ａｓ−ｐｙｒＧ５株では３２％であった。これらのことからプロモーター領域を持たない選択マーカー遺伝子を用いることでＧＤＨ遺伝子を効率よく多コピーで挿入できることがわかった。なお、表５のＡｓ−ｐｙｒＧ５株のうち、最もＧＤＨ活性が高かった株は２１コピー株であった。
【００７９】
以上より、プロモーター領域を全て欠損させたｐｙｒＧ５により、任意の遺伝子を効率的に多コピー挿入することが可能であることがわかった。なお、本実施例で形質転換に用いたＤＮＡ配列中で、ｐｙｒＧ５の上流はａｌｐターミネーター（Ｔａｌｐ）である。Ｔａｌｐの領域にはＯＲＦは含まれておらず、また、Ａ．ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９の染色体上でＴａｌｐの下流にはａｌｐのコード領域と同じ向きの別の遺伝子のコード領域が存在しているものの、該コード領域の開始コドンはＴａｌｐの３´末端より約１．２ｋｂ離れていることから、Ｔａｌｐの領域単独では有効なプロモーターとして働く可能性は低いと予想していた。しかしながら、プロモーター領域を持たないｐｙｒＧ５を用いてもウリジン／ウラシル要求性の相補が可能であったことから、Ｔａｌｐが潜在的な弱いプロモーターとして機能し、多コピー導入されることによって相補可能なレベルにまでマーカー遺伝子が発現した可能性が示唆された。
【００８０】
以上より、選択マーカー遺伝子の本来のプロモーター領域を全て欠損させマーカー遺伝子の発現量を低下させる方法は、任意の遺伝子を多コピー挿入するための方法として有効であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上より、プロモーターを改変し、コード領域の発現量を低下させた選択マーカーを用いる方法が糸状菌において任意の遺伝子を効率よく多コピーで挿入するために有効であることが示された。また、今回はｐｙｒＧマーカー遺伝子、ａｄｅＡマーカー遺伝子を用いた例を示したが、他の選択マーカー遺伝子においても同様にして、プロモーターを改変し、マーカー遺伝子の発現量を低下させることで、任意の遺伝子を効率よく多コピーで挿入することが可能である。本方法は、これまでに知られている糸状菌への遺伝子の多コピー挿入方法に比べて、汎用性が高く、実用性に優れた方法であり、産業上非常に有用である。
【配列表】
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