(57)【要約】【課題】ポリオキソメタレートの新たな用途を提供する。或いは、新たなチオール検出剤を提供する。【解決手段】ポリオキソメタレート化合物を含むチオール検出剤であって、前記ポリオキソメタレート化合物が、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む、チオール検出剤。【選択図】図３
2018146433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオキソメタレート化合物を含むチオール検出剤であって、前記ポリオキソメタレート化合物が、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む、チオール検出剤。
【請求項２】
前記ポリオキソメタレート化合物が、[ＰＭｏ12Ｏ40]3-又は[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]6-により表されるポリオキソメタレートを構成分子として含む、請求項１に記載のチオール検出剤。
【請求項３】
ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物を、液相でチオールと反応させることを含む、チオール検出方法。
【請求項４】
前記ポリオキソメタレート化合物が、[ＰＭｏ12Ｏ40]3-又は[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]6-により表されるポリオキソメタレートを構成分子として含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
液相の色の変化がチオールの存在を示す、請求項３又は４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリオキソメタレート化合物を含むチオール検出剤、及びポリオキソメタレート化合物を用いてチオールを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物系においてチオールは重要な役割を担っており、細胞内チオール濃度の変化は毒物や疾患に関連している。例えば、ホモシステインは、心臓血管疾患及びアルツハイマー病などの疾患の危険因子であるところ、システイン残基中のチオール基は、ジスルフィド結合の形成を通じてタンパク質の三次元構造に関与しており、システインの欠損は、重篤な健康問題を引き起こす可能性がある。
従来、チオールを特異的に検出する試薬はいくつか知られているが、作製に高額な資金や手間が必要であったり、官能基選択性に乏しかったりなど欠点が知られていた。
【０００３】
ポリオキソメタレートは、ＭＯ6を基本骨格とする酸化物クラスターアニオンであり、これまでに様々な構造体が報告され、燃料電池での使用や触媒としての使用が示唆されている（特許文献１〜３）。しかしながら、その機能性に関して実用的な成果があまり報告されていないため材料として実用化には至っておらず、有効かつ実用的な用途が見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５９１３３６４号
【特許文献２】特許第６０４１９９７号
【特許文献３】特許第５７８２３６５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ポリオキソメタレートの新たな用途を提供することを目的とする。或いは、本発明は、新たなチオール検出剤及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定のポリオキソメタレート化合物が、特異的にチオール（チオール基を有する化合物）と反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことを新たに見出した。本発明は、このような新たな知見に基づくものである。
【０００７】
本発明の一実施態様によれば、ポリオキソメタレート化合物を含むチオール検出剤であって、前記ポリオキソメタレート化合物が、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む、チオール検出剤が提供される。
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物を、液相でチオールと反応させることを含む、チオール検出方法が提供される。
【０００９】
本発明の一実施態様において、ポリオキソメタレート化合物は、[ＰＭｏ12Ｏ40]3-又は[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]6-により表されるポリオキソメタレートを構成分子として含む。
本発明の一実施態様において、液相の色の変化がチオールの存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｌ−システイン水溶液にＰＯＭ１〜８水溶液を添加してから24時間後の水溶液の様子を示した写真である。
【図２】Ｌ−システイン水溶液にＰＯＭ１〜８水溶液を添加してから24時間後に測定した吸光スペクトルのグラフである。
【図３】Ｌ−システイン水溶液にＰＯＭ１〜８水溶液を添加してから24時間後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図４】20種類のアミノ酸水溶液それぞれにＰＯＭ４水溶液を添加してから24時間後の各水溶液の様子を示した写真である。
【図５】20種類のアミノ酸水溶液それぞれにＰＯＭ４水溶液を添加してから10分後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図６】20種類のアミノ酸水溶液それぞれにＰＯＭ５水溶液を添加してから10分後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図７】20種類のアミノ酸水溶液それぞれにＰＯＭ６水溶液を添加してから10分後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図８】ＰＯＭ４に、エタノール、アセトアルデヒド及びエタンチオールをそれぞれ添加してから24時間後の各溶液の様子を示した写真である。
【図９】Ｌ−システイン水溶液に、様々な濃度のＰＯＭ４水溶液を添加してから24時間後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図１０】Ｌ−システイン水溶液に、様々な濃度のＰＯＭ６水溶液を添加してから24時間後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【図１１】4種類の保護システイン水溶液それぞれにＰＯＭ４水溶液を添加してから24時間後の各溶液の様子を示した写真である。
【図１２】ジペプチド水溶液にＰＯＭ４水溶液を添加してから24時間後に測定した波長580 nmにおける吸光度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳述する。
本発明の一実施態様は、ポリオキソメタレート化合物を含むチオール検出剤に関する。ポリオキソメタレート化合物としてこれまでに様々な構造体が報告されているが、本発明において、ポリオキソメタレート化合物は、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む。
例えば、ポリオキソメタレート化合物は、ポリ原子としてモリブデンを６個以上、８個以上、１０個以上、又は１２個含むケギン型ポリオキソメタレートを構成分子として含み得る。また、例えば、ポリオキソメタレート化合物は、ポリ原子としてタングステンを９個以上、１２個以上、１５個以上、又は１８個含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含み得る。ポリオキソメタレート化合物に含まれ得るモリブデン及びタングステン以外のポリ原子としては、例えば、Ｖ、Ｎｂ、Ｔｉなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
「ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む」とは、ポリオキソメタレート化合物が、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート自体（アニオンの形態）であってもよいし、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレートを含む構造を有するもの（例えば、塩の形態）であってもよいことを意味する。
ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレートには、非欠損ケギン型ポリオキソメタレート、１欠損ケギン型ポリオキソメタレート、２欠損ケギン型ポリオキソメタレート、３欠損ケギン型ポリオキソメタレートなどが含まれるが、この中でも非欠損ケギン型ポリオキソメタレートが好ましい。
「ポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む」とは、ポリオキソメタレート化合物が、ポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレート自体（アニオンの形態）であってもよいし、ポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを含む構造を有するもの（例えば、塩の形態）であってもよいことを意味する。
【００１３】
ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレートとしては、例えば、以下の式（１）〜（４）で示されるものが挙げられる。
[ＸＭｏ12Ｏ40]na-          （１）
[ＸＭｏ11Ｏ39]nb-          （２）
[ＸＭｏ10Ｏ36]nc-          （３）
[ＸＭｏ9Ｏ34]nd-           （４）
（Ｘはヘテロ原子を表し、ｎ-は負電荷数を表す。）
【００１４】
Ｘは、具体的には、Ｈ2、Ｂ、Ａｌ、Ｇａ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ｚｒ及びＩｎからなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子である。式（１）において、Ｘは、好ましくはＳｉ、Ｇｅ、Ｐ又はＡｓであり、より好ましくはＳｉ又はＰであり、特に好ましくはＰである。Ｘは、１種のみであってもよいし、２種以上が混在していてもよい。
ｎaは、Ｘに応じて変化するものであるが、例えば、３、４、５又は６である。具体例としては、ＸがＰであるとき、ｎaは３であり、ＸがＳｉであるとき、ｎaは４である。ｎaの値は、Ｘに応じて当業者が適宜理解し得るものである。
ｎbは、Ｘに応じて変化するものであるが、例えば、７、８、９又は１０である。具体例としては、ＸがＰであるとき、ｎbは７であり、ＸがＳｉであるとき、ｎbは８である。ｎbの値は、Ｘに応じて当業者が適宜理解し得るものである。
ｎcは、Ｘに応じて変化するものであるが、例えば、７、８、９又は１０である。具体例としては、ＸがＰであるとき、ｎcは７であり、ＸがＳｉであるとき、ｎcは８である。ｎcの値は、Ｘに応じて当業者が適宜理解し得るものである。
ｎdは、Ｘに応じて変化するものであるが、例えば、９、１０、１１又は１２である。具体例としては、ＸがＰであるとき、ｎdは９であり、ＸがＳｉであるとき、ｎdは１０である。ｎdの値は、Ｘに応じて当業者が適宜理解し得るものである。
【００１５】
式（１）で示されるポリオキソメタレートは、好ましくは[ＰＭｏ12Ｏ40]3-である。
式（２）で示されるポリオキソメタレートは、好ましくは[ＰＭｏ11Ｏ39]7-である。
式（３）で示されるポリオキソメタレートは、好ましくは[ＰＭｏ10Ｏ36]7-である。
式（４）で示されるポリオキソメタレートは、好ましくは[ＰＭｏ9Ｏ34]9-である。
【００１６】
ポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートとしては、例えば、以下の式（５）で示されるものが挙げられる。
[Ｚ2Ｗ18Ｏ62]m-          （５）
（Ｚはヘテロ原子を表し、ｍ-は負電荷数を表す。）
【００１７】
Ｚは、具体的には、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐ、Ａｓ、Ｓｂ、Ｓ及びＳｅからなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子である。式（５）において、Ｚは、好ましくはＳｉ、Ｐ、Ａｓ又はＳであり、より好ましくはＰ又はＡｓであり、特に好ましくはＰである。Ｚは、１種のみであってもよいし、２種以上が混在していてもよい。
ｍは、Ｚに応じて変化するものであるが、例えば、４、５、６、７又は８である。具体例としては、ＺがＰ又はＡｓであるとき、ｍは６であり、ＺがＳであるとき、ｍは４である。ｍの値は、Ｚに応じて当業者が適宜理解し得るものである。
式（５）で示されるポリオキソメタレートは、好ましくは[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]6-である。
【００１８】
ポリオキソメタレート化合物は、ポリオキソメタレートの塩の形態であってもよい。ポリオキソメタレートの塩の形態を形成するカチオンとしては、無機でも有機でもよく、例えば、Ｈ+、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、遷移金属イオン、アンモニウムイオン、有機アンモニウムイオン等が挙げられる。好ましいカチオンとしては、Ｈ+、Ｎａ+、Ｋ+、ＮＨ4+等が挙げられる。
一実施態様においては、ポリオキソメタレート化合物は、Ｈ3[ＰＭｏ12Ｏ40]、Ｎａ3[ＰＭｏ12Ｏ40]、Ｋ3[ＰＭｏ12Ｏ40]又は(ＮＨ4)3[ＰＭｏ12Ｏ40]である。
一実施態様においては、ポリオキソメタレート化合物は、Ｈ6[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]、Ｎａ6[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]、Ｋ6[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]又は(ＮＨ4)6[Ｐ2Ｗ18Ｏ62]である。
ポリオキソメタレート化合物は、水和物の形態であってもよい。結晶水の数は、通常、１〜２０程度であるが、これに限定されるものではない。
ポリオキソメタレートには、α、β、γ等の異性体が存在し得る。本発明において、異性体は特に限定されるものではないが、一実施態様において、ポリオキソメタレートはα体である。
【００１９】
上述のとおり、ポリオキソメタレート化合物は様々な構造体が報告されているものであり、その製造方法も公知である。従って、当業者は技術常識を参酌して、適宜、ポリオキソメタレート化合物を製造することができる。しかも、ポリオキソメタレート化合物の製造方法は簡便なものが多く、低費用で行うことができる。
本発明のチオール検出剤は、ポリオキソメタレート化合物のみからなるものであってもよいし、ポリオキソメタレート化合物以外に他の成分を含んでもよい。他の成分としては、水、メタノール、ジメチルスルホキシド等の溶媒や、通常使用され得る緩衝剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者の技術常識に基づいて適宜選択され得る。
【００２０】
本発明の一実施態様は、ポリオキソメタレート化合物を用いてチオールを検出する方法に関する。具体的には、本発明の一実施態様は、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物を、液相でチオールと反応させることを含む、チオール検出方法に関する。本発明の方法において、ポリオキソメタレート化合物、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート及びポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートは、上記説明したとおりである。
【００２１】
本発明の方法は、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物を、液相でチオールと反応させることを含む。ポリオキソメタレート化合物とチオールとの反応は、チオールを酸化する反応であり得、酸化されたチオールはジスルフィドを形成し得る。チオールを酸化すると、ポリオキソメタレート化合物は還元される。この還元されたポリオキソメタレート化合物によって、液相の色の変化がもたらされると考えられる。
ポリオキソメタレート化合物とチオールとの反応は、例えば、ポリオキソメタレート化合物を適当な液体媒体中に溶かした溶液を、チオールを含有するサンプル中に添加し、適宜混合するという非常に簡便な手順で行うことができる。ポリオキソメタレート化合物とチオールとの反応は、チオールを含有する液体媒体又は液体チオール中に、ポリオキソメタレート化合物を添加して行われてもよいし、ポリオキソメタレート化合物を適当な液体媒体中に溶かした溶液中に、チオールを添加して行われてもよい。
【００２２】
反応温度及び反応時間は、当業者の技術常識に基づき適宜選択され得るものであり、チオールの種類によっても異なり得るが、例えば、ポリオキソメタレート化合物とチオールを、20〜95℃の温度にて1分〜24時間反応させることができ、少なくとも2分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも30分間、又は少なくとも1時間反応させることが好ましい。
用いられるポリオキソメタレート化合物とチオールの割合は特に限定されるものではないが、例えば、ポリオキソメタレート化合物：チオール＝1：0.01〜1：10（モル比）で使用され得る。検出感度をより高めるためには、ポリオキソメタレート化合物：チオール＝1：1〜1：10（モル比）で使用されることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法により検出されるチオールとしては、特に限定されるものではなく、例えば、システイン、システインを含むペプチド、チオール基を含む他の有機化合物等が挙げられる。本発明の方法において、反応の起こりやすさを考えると、チオールは立体障害をもたらすような嵩高い置換基を有しないことが好ましいが、嵩高い置換基を有するチオールであっても、本発明により検出ができないというわけではない。
本発明の方法において用いられ得る液体媒体としては、特に限定されるものではないが、水、メタノール、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。液体媒体は、例えば、ポリオキソメタレート化合物を溶解するのに適したものであることが好ましく、また、無色透明であることが好ましい。操作の簡便性、色の変化の観察のし易さ等の観点から、液体媒体は水であることが特に好ましい。
【００２４】
本発明においては、ポリオキソメタレート化合物がチオールと特異的に反応し、液相の視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらし得る。このような液相の色の変化は、検出されるチオールの量、及び使用するポリオキソメタレート化合物の量に依存して増加し得る。
具体的には、ポリオキソメタレート化合物を水中に溶かした溶液の色は無色〜黄色で透明であるが、ポリオキソメタレート化合物がチオールと反応することで、溶液の色が濃青色へと変化する。これは、ポリオキソメタレート化合物がチオール基を酸化するとともに、自身が還元されることによってもたらされるものと考えられる。
【００２５】
しかしながら、下記の実施例において判明しているとおり、このような液相の色の変化は、ケギン型リンタングステン酸ポリオキソメタレートの構造や、欠損ドーソン型リンタングステン酸ポリオキソメタレートの構造を有するポリオキソメタレート化合物でははっきりと観察することはできない。ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含む特定のポリオキソメタレート化合物においてこのような液相の色の変化が生じ得ることは、全くもって予期せぬことである。
このような液相の色の変化は、目視で明確に判別できるものであるが、適宜、吸光度測定を行うなどして、液相の色の変化を定量的に評価することができる。吸光度測定の測定波長は、例えば、450〜700nmの範囲内、好ましくは550〜700nmの範囲内であり、より具体的には580 nmであり得る。
【００２６】
本発明の一実施態様では、ポリオキソメタレート化合物を用いてチオールを定量することができる。即ち、上記のように、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物を、液相でチオールと反応させた後、吸光度測定を行い、測定された吸光度に基づいてチオールの量を測定することができる。チオールの量の測定は、検量線法等、当業者の技術常識に基づいて適宜行えばよい。
【実施例】
【００２７】
以下において、本発明について、具体的な実施例を参照しながら更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２８】
１．ポリオキソメタレート化合物の準備
以下の表１に示されるＰＯＭ１〜ＰＯＭ８を使用した。なお、ＰＯＭ１〜ＰＯＭ８はいずれもα体であった。
【表１】
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ＰＯＭ１〜ＰＯＭ４については、日本無機化学工業株式会社から市販品を購入して使用した。
ＰＯＭ５〜ＰＯＭ８については、以下のとおり製造したものを使用した。
【００２９】
＜ＰＯＭ５＞
モリブデン酸アンモニウム水溶液（0.2 M）をピペッターで400 μLとり、遠心分離用サンプルチューブに入れた。ここへ濃硝酸を225 mL加え、さらにリン酸水素二ナトリウム（0.2 M）を400 μL加えた。黄色の目的化合物が沈殿析出し、これをろ過により採取した。  なお、結晶水の数は特定していないが、10〜20程度であると推測された。
【００３０】
＜ＰＯＭ６＞
Na2WO4・2H2O（10 g、0.03 mol）を蒸留水（35 mL）に溶解し、沸騰するまで加熱した。その沸騰した溶液にH3PO4（15 mL、0.22 mol）をゆっくり加えた。溶液は黄緑色になり、その溶液を10分間還流した。放冷後、KCl（10 g、0.13 mol）を加えて淡緑色の結晶を析出させた。その結晶を吸引ろ過で取り、約60℃の蒸留水で再溶解し、冷蔵庫で一晩冷却し結晶化させた。
次に、得られたα，β−K6P2W18O62を精製した。結晶を蒸留水（25 mL）に溶解後、加熱し、温かいままHNO3を３滴加え、溶液の色を淡緑色から黄色に変えた。室温まで放冷後、その溶液を攪拌しながら10% KHCO3（25 mL）を加えると、白色塩のK10P2W17O61が沈殿し始めた。塩が生じなくなるまで10% KHCO3（約40 mL）を加え続けた。その後、慎重に6M HCl（約11 mL）を加え、溶液を透明な黄色に戻した。そして、溶液を１時間ほど沸騰させて体積を100 mL前後に調節した。その後、熱いままろ過をして不純物を取り除き、その高温溶液にKCl（10 g、0.13 mol）を加えて放冷後に冷蔵庫で一晩冷却した。
なお、結晶水の数は特定していないが、10〜20程度であると推測された。
【００３１】
＜ＰＯＭ７＞
K6P2W18O62（6.76 g、1.47 mmol）を約40℃の蒸留水（15 mL）に溶解し、1M KHCO3（25 mL）を加えて30分間強く撹拌した。吸引ろ過により粗結晶を得て乾燥させた。その粗結晶を沸騰した蒸留水（10 mL）に溶解し、放冷後に冷蔵庫で一晩冷却した。析出した結晶を吸引ろ過で取り、蒸留水（2.5 mL×3）、95%エタノール（2.5 mL×3）、無水ジエチルエーテル（2.5 mL×3）の順に洗浄した。
なお、結晶水の数は特定していないが、10〜20程度であると推測された。
【００３２】
＜ＰＯＭ８＞
K6P2W18O62（4.0 g、0.87 mmol）を約50℃の蒸留水（10 mL）に溶解し、室温まで冷却後、NaClO4（3 g、0.024 mol）を加えて１時間撹拌した。自然ろ過後、ろ液1M Na2CO3を加えながら１時間保った。その後、吸引ろ過を行い、飽和NaCl（15 mL）、95%エタノール（15 mL）、ジエチルエーテル（15 mL）の順に洗浄した。
なお、結晶水の数は特定していないが、10〜20程度であると推測された。
【００３３】
２．システインの検出
エッペンドルフチューブにＬ−システインを10 mg取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのＬ−システイン水溶液を調製した。同様の操作を繰り返し、この水溶液を8つ調整した。  次に、別の8個のエッペンドルフチューブに、ＰＯＭ１〜８を各々10 mgずつ取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのポリオキソメタレート水溶液を調製し、この水溶液をそれぞれＰＯＭ１〜８水溶液とした。続いて、8つのＬ−システイン水溶液500 μＬに、ＰＯＭ１〜８水溶液を各々100 μＬずつ添加した。添加24時間後の水溶液の様子を図１に示す。
また、添加24時間後、水溶液の吸光スペクトルを測定し、波長580 nmにおける吸光度を測定した。それぞれ結果を図２及び３に示す。
【００３４】
ＰＯＭ水溶液添加24時間後、ＰＯＭ４〜６水溶液を添加したものは濃青色を呈し、ＰＯＭ７水溶液を添加したものは薄青色を呈した。それ以外のものは何ら変化を示さなかった。この結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、システインと反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことが示された。
波長580 nmにおける吸光度は、ＰＯＭ４水溶液を添加したものが最も高い値を示した。また、ＰＯＭ４水溶液を添加したものは、添加後数分で濃青色を呈した。
【００３５】
３．ＰＯＭ４〜６と20種類のアミノ酸との反応観察
20個のエッペンドルフチューブに、生体におけるタンパク質を構成する主要な20種類のアミノ酸（グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、フェニルアラニン(Phe)、システイン(Cys)、セリン(Ser)、プロリン(Pro)、メチオニン(Met)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、スレオニン(Thr)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、アルギニン(Arg)、リシン(Lys)；いずれもＬ体）を各々10 mgずつ取り、純水1 mLを添加して10 mg/mLのアミノ酸水溶液を20種類調製した。
次に、別の3個のエッペンドルフチューブに、ＰＯＭ４〜６を各々10 mgずつ取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのポリオキソメタレート水溶液を調製し、この水溶液をそれぞれＰＯＭ４〜６水溶液とした。続いて、20種類のアミノ酸水溶液100 μＬに、ＰＯＭ４〜６水溶液を各々20 μＬずつ添加した。ＰＯＭ４水溶液添加24時間後の水溶液の様子を図４に示す。
また、ＰＯＭ４〜６水溶液添加10分後、波長580 nmにおける吸光度を測定した。それぞれ結果を図５〜７に示す。
【００３６】
Ｌ−システイン水溶液のみ、ＰＯＭ４水溶液を添加して少なくとも約2〜3分後には濃青色を呈し、少なくとも10分後には吸光度の測定値が上昇した。添加後24時間が経過してもＬ−システイン水溶液以外に変化は観察されなかった。
ＰＯＭ５水溶液やＰＯＭ６水溶液を添加した場合には、ＰＯＭ４水溶液を用いた場合に比べてＬ−システイン水溶液が濃青色を呈し吸光度の測定値が上昇するのには時間がかかったものの、添加後24時間が経過した段階では、Ｌ−システイン水溶液のみに変化が観察され、それ以外に変化は観察されなかった。
これらの結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、上記20種類のアミノ酸の中で、Ｌ−システインに特異的に反応することが示された。また、ＰＯＭ４〜６の中では、ＰＯＭ４がＬ−システインに対して最も反応性の点で優れていることが示された。
【００３７】
４．種々のチオールの検出
3個のエッペンドルフチューブにＰＯＭ４を10 mgずつ取り、エタノール、アセトアルデヒド、エタンチオールを各々1 mLずつ添加した。添加24時間後の溶液の様子を図８に示す。
エタノール、アセトアルデヒド、エタンチオールを添加したもののうち、エタンチオールを添加したものだけが濃青色を呈した。この結果より、ＰＯＭ４は、Ｌ−システイン以外のチオールとも反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことが示された。即ち、ＰＯＭ４は、チオールと特異的に反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことが示された。
また、ＰＯＭ４に代えてＰＯＭ５又は６を用いてエタノール、アセトアルデヒド及びエタンチオールについて試験した場合にも、ＰＯＭ４を用いた場合と同様の結果が得られた。これらの結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、チオールと特異的に反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことが示された。
【００３８】
５．種々の濃度のＰＯＭによるシステインの検出
エッペンドルフチューブにＬ−システインを10 mg取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのＬ−システイン水溶液を調製した。同様の操作を繰り返し、この水溶液を9つ調整した。
次に、別の9個のエッペンドルフチューブに、ＰＯＭ４を0 mg, 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mgずつ取り、純水1 mLを添加して0 mg/mLから4 mg/mLのＰＯＭ４水溶液を調製した。続いて、9つのＬ−システイン水溶液800 μＬに、各濃度のＰＯＭ４水溶液を200 μＬずつ添加した。24時間後、測定波長580 nmにおいて吸光度測定を行った。結果を図９に示す。
用いたＰＯＭ４の濃度が増大するにつれて、それに比例して、測定された吸光度も増大した。また、ＰＯＭ４に代えてＰＯＭ５又は６を用いて同様に試験した場合にも、ＰＯＭ４を用いた場合と同様の結果が得られた。ＰＯＭ６を用いて得られた結果を図１０に示す。これらの結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物の使用量を増大させることにより、チオールの検出感度を高められることが示された。
【００３９】
６．保護システインの検出
4個のエッペンドルフチューブに、Boc-Cys-OH、Fmoc-Cys-OH、H-Cys-OMe、Fmoc-Cys(Trt)-OHを各々10 mgずつ取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLの保護システイン水溶液を調製した。
次に、エッペンドルフチューブにＰＯＭ４を10 mg取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのＰＯＭ４水溶液を調製した。続いて、4種類の保護システイン水溶液100 μＬに、ＰＯＭ４水溶液を20 μＬずつ添加した。ＰＯＭ４水溶液添加24時間後の水溶液の様子を図１１に示す。
【００４０】
Ｌ−システインのアミノ基を保護したBoc-Cys-OH及びFmoc-Cys-OH、並びにＬ−システインのカルボン酸基を保護したH-Cys-OMeについては、ＰＯＭ４水溶液を添加後、濃青色を呈した。一方、Fmoc-Cys-OHのチオール基をトリチル基で更に保護したFmoc-Cys(Trt)-OHにＰＯＭ４水溶液を添加しても、変化は観察されなかった。
また、ＰＯＭ４に代えてＰＯＭ５又は６を用いて同様に試験した場合にも、ＰＯＭ４を用いた場合と同様の結果が得られた。これらの結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、チオールと特異的に反応し、視覚的かつ鮮明な色調の変化をもたらすことが示された。
【００４１】
７．システイン含有ジペプチドの検出
（１）ジペプチドの調製
以下のとおり、Boc-Phe-Cys-OMeを合成した。また、適宜用いる原料を変更するなどして、下記表２に記載の14種類のジペプチドを調製した。
【００４２】
i) Ｌ−システインのメチルエステル化
2018146433.tif 000004
Ｌ−システイン（H-Cys-OH）(3 g, 25 mmol) をMeOH (50 mL) に溶解し、溶液を-78℃に冷却した。次に、SOCl2 (2.2 mL, 30 mmol) を滴下し、10分間撹拌後、室温で15時間撹拌した。その後、ジエチルエーテルで洗浄し、MeOHを減圧濃縮することでH-Cys-OMeを白色固体として得た。
【００４３】
ii) Ｌ−フェニルアラニンのBoc保護
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Ｌ−フェニルアラニン（H-Phe-OH）(1.65 g, 10 mmol) をTHF/H2O (20 mL / 10 mL) に溶解し、溶液を氷冷した。次に、(Boc)2O (2.18 g, 10 mmol) を加えた後、1M NaOH (15 mL, 15 mmol) を滴下し、室温で14時間撹拌した。THFを減圧除去した後、1M HClを加えてpH = 1 とし、酢酸エチルで3回抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、続いて無水MgSO4で乾燥した後、ろ液を減圧濃縮することでBoc-Phe-OH をオイル状の無色液体として得た。
【００４４】
iii) 縮合
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H-Cys-OMe (68 mg, 0.5 mmol) とBoc-Phe-OH (133 mg, 0.5 mmol) をCH2Cl2 (2 mL)に溶解し、反応液を氷冷した。次に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）(288 mg, 1.5 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（HOBt・H2O）(230 mg, 1.5 mmol)、及びジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）(0.35 mL, 2.0 mmol) を加えた後、室温で8時間撹拌した。その後、飽和NH4Cl水溶液とH2Oを加えて酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和NaHCO3水溶液とブラインで洗浄し、無水MgSO4で乾燥した後、ろ液を減圧濃縮することでBoc-Phe-Cys-OMeを黄色液体として得た。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
（２）ジペプチドの検出
14個のエッペンドルフチューブにジペプチド(1)-(14)を各々10 mgずつ取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのジペプチド水溶液を14種類調製した。
次に、エッペンドルフチューブにＰＯＭ４を10 mg取り、純水1 mLを加えて10 mg/mLのＰＯＭ４水溶液を調製した。続いて、14種類のジペプチド水溶液800 μＬにＰＯＭ４水溶液を200 μＬずつ添加した。24時間後、測定波長580 nmにおいて吸光度測定を行った。結果を図１２に示す。
【００４７】
システイン非含有ペプチドであるジペプチド(1)-(4)については、ＰＯＭ４水溶液を添加しても、変化は観察されず、吸光度の値もほぼ０であった。一方、システイン含有ペプチドであるジペプチド(5)-(14)については、ＰＯＭ４水溶液を添加後、濃青色を呈し、吸光度の値も増大した。
また、ＰＯＭ４に代えてＰＯＭ５又は６を用いて同様に試験した場合にも、ＰＯＭ４を用いた場合と同様の結果が得られた。これらの結果より、ＰＯＭ４〜６等の、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、ペプチド中のシステイン（チオール基）に特異的に反応することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、チオールと特異的に反応し得る。
また、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、チオールと短時間で反応し得る。
更に、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、安価に製造することができる。
従って、ポリ原子としてモリブデンを含むケギン型ポリオキソメタレート又はポリ原子としてタングステンを含む非欠損ドーソン型ポリオキソメタレートを構成分子として含むポリオキソメタレート化合物は、チオール検出試薬として又はチオールの検出方法において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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