(57)【要約】【課題】マイクロプレートの各ウェル内で培養されている細胞を、培養液の液面の高さや湾曲状態にかかわらず簡易かつ鮮明に観察する。【解決手段】光源２からの照明光を透明な標本Ｘに照射する照明光学系３と、標本Ｘからの観察光を集光する対物レンズ４と、対物レンズ４により集光された観察光を検出する検出光学系５と、標本Ｘを挟んで対物レンズ４と反対側に配置され、複数の微小な反射要素を配列してなる再帰性反射部材６とを備え、重力方向において、標本Ｘよりも下側に対物レンズ４および照明光学系３が配置されている観察装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの照明光を透明な標本に照射する照明光学系と、
前記標本からの観察光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記観察光を検出する検出光学系と、
前記標本を挟んで前記対物レンズと反対側に配置され、複数の微小な反射要素を配列してなる再帰性反射部材とを備え、
重力方向において、前記標本よりも下側に前記対物レンズおよび前記照明光学系が配置されている観察装置。
【請求項２】
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由せずに前記標本に前記照明光を照射する暗視野照明光学系である請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由せずに前記標本に前記照明光を照射して蛍光を発生させる励起照明光学系である請求項１に記載の観察装置。
【請求項４】
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本に前記照明光を照射する請求項１に記載の観察装置。
【請求項５】
前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置に光学的に共役な位置に配置された開口を備え、
前記検出光学系が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置に光学的に共役な位置に配置され前記開口の形状に対応する形状を有する位相膜を備える請求項４に記載の観察装置。
【請求項６】
前記照明光学系が、ポラライザを備え、
前記対物レンズの瞳位置近傍に、前記ポラライザを透過した前記照明光を透過させかつ前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記観察光を透過させる複屈折素子を備え、
前記検出光学系が、前記複屈折素子を透過した前記標本からの前記観察光を透過させるアナライザを備える請求項４に記載の観察装置。
【請求項７】
前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置に光学的に共役な位置に配置された開口を備え、前記標本に対して特定の角度で前記照明光を照射する請求項４に記載の観察装置。
【請求項８】
前記検出光学系が、前記対物レンズの前記瞳位置に光学的に共役な位置近傍に減光部材を備える請求項７に記載の観察装置。
【請求項９】
前記照明光学系が、前記標本に前記照明光を照射して蛍光を発生させる請求項４に記載の観察装置。
【請求項１０】
前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記照明光および前記観察光を透過させる複数のピンホールを備えた共焦点ディスクを備える請求項９に記載の観察装置。
【請求項１１】
前記照明光がレーザ光であり、
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記レーザ光を走査させるスキャナを備え、
前記検出光学系が、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記標本における前記レーザ光の走査位置において発生し前記対物レンズおよび前記スキャナを介して戻る前記蛍光を通過させるピンホールを備える請求項９に記載の観察装置。
【請求項１２】
前記標本と前記再帰性反射部材との間に配置され、前記標本において発生した前記蛍光を遮断する光学フィルタを備える請求項９から請求項１１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１３】
前記照明光が、極短パルスレーザ光であり、
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記極短パルスレーザ光を走査させるスキャナを備える請求項９に記載の観察装置。
【請求項１４】
前記照明光が、極短パルスレーザ光であり、
前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記極短パルスレーザ光を走査させるスキャナを備え、前記標本における前記極短パルスレーザ光の走査位置において高次高調波を発生させる請求項４に記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、マイクロプレートの複数の小さなウェル内に培養液とともに収容された細胞を生きたまま観察する場合に、ウェル内の培養液の液面が表面張力によって湾曲してレンズ効果を起こしてしまう不都合を防止するために、液面の屈折力をキャンセルするマイクロレンズアレイからなる蓋を配置して観察する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−４８７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法では、マイクロレンズアレイによって照明光が集光されるため各ウェルの端部に照明光が届きにくくなり、ウェルの中央近傍の細胞のみしか観察できないという不都合がある。また、液面の高さや湾曲状態はウェル毎に異なる場合があるので、このような場合にはマイクロレンズアレイにより液面の屈折力をキャンセルする効果がウェル毎にばらつくという不都合もある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、マイクロプレートの各ウェル内で培養されている細胞を、培養液の液面の高さや湾曲状態にかかわらず簡易かつ鮮明に観察することができる観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からの照明光を透明な標本に照射する照明光学系と、前記標本からの観察光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記観察光を検出する検出光学系と、前記標本を挟んで前記対物レンズと反対側に配置され、複数の微小な反射要素を配列してなる再帰性反射部材とを備え、重力方向において、前記標本よりも下側に前記対物レンズおよび前記照明光学系が配置されている観察装置を提供する。
【０００７】
本態様によれば、光源から発せられた照明光が照明光学系によって標本に照射されると、その少なくとも一部が標本を透過し、標本を挟んで対物レンズとは反対側に配置された再帰性反射部材に入射する。再帰性反射部材は、複数の微小な反射要素を配列して構成されているので、入射した光をほとんどシフトさせることなく入射方向と全く同一の方向に反射する。これにより、標本には該標本を透過した照明光の射出方向と全く同一の方向から照明光が再度入射する。そして、標本からの観察光が対物レンズにより集光され、検出光学系により検出される。これにより、検出された観察光により標本の観察を行うことができる。
【０００８】
この場合において、再帰性反射部材が入射した光をほとんどシフトさせることなく入射方向と全く同一の方向に反射するので、マイクロプレートの各ウェル内の培養液の液面の高さおよび屈折力がウェル毎に異なっていても、各ウェルに均一な照明光を再帰性反射部材側からも入射させることができる。これにより、マイクロプレートの各ウェル内で培養されている細胞を、培養液の液面の高さや湾曲状態にかかわらず簡易かつ鮮明に観察することができる。また、対物レンズおよび照明光学系が標本よりも重力方向下側に配置されているので、マイクロプレートの各ウェル内の培養液の液面が表面張力によって湾曲してレンズ効果を起こしてしまう不都合を防止することができる。
【０００９】
上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由せずに前記標本に前記照明光を照射する暗視野照明光学系であってもよい。
このようにすることで、暗視野照明光学系からなる照明光学系により、対物レンズを経由せずに標本に照明光が照射され、標本における散乱光が対物レンズにおいて集光されて検出光学系により検出される。
【００１０】
これにより、標本の暗視野像を観察することができる。この場合において、標本における散乱は、光源側から入射した照明光に対する後方散乱および再帰性反射部材側から入射した照明光に対する前方散乱の両方が検出される。後方散乱よりも前方散乱の方が明るく観察できる。すなわち、標本に対して光源と同じ側に検出光学系を配置して、反対側の設置スペースを縮小しながら、透過観察と同様の前方散乱による明るい観察光を観察することができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由せずに前記標本に前記照明光を照射して蛍光を発生させる励起照明光学系であってもよい。
このようにすることで、励起照明光学系からなる照明光学系により、対物レンズを経由せずに標本に照明光が照射され、標本において発生した蛍光が対物レンズにおいて集光されて検出光学系により検出される。
【００１２】
これにより、標本の蛍光像を観察することができる。この場合において、標本には光源側から照明光が入射した後、再帰性反射部材において反射した光も標本に入射する。これにより、明るい蛍光像を観察することができる。
【００１３】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本に前記照明光を照射してもよい。
このようにすることで、同軸落射観察を行うことができる。例えば、標本からの反射光または透過光を観察する明視野観察を行う場合には、光源から対物レンズを経由して標本に照射された照明光の標本における反射光および標本を透過して再帰性反射部材において反射した照明光が標本を透過した透過光を対物レンズによって集光して検出光学系により検出することができる。標本の落射明視野像と透過明視野像の両方を観察することができるとともに、標本の透過率に応じて見え方の異なる明視野像を観察することができる。
【００１４】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置に光学的に共役な位置に配置された開口を備え、前記検出光学系が、前記対物レンズの瞳位置または該瞳位置に光学的に共役な位置に配置され前記開口の形状に対応する形状を有する位相膜を備えていてもよい。
【００１５】
このようにすることで、落射位相差観察を行うことができる。すなわち、光源から対物レンズの瞳位置に光学的に共役な位置に配置された開口を通過した照明光は、標本を透過した後に再帰性反射部材において反射されて、同一方向に戻り、標本に再照射されて、標本において回折させられる。標本において回折することなく直進した照明光は位相膜を通過させられることにより位相をずらされる。そして、位相をずらされた直進光と回折光とが干渉させられることにより、透明な標本を明暗によって観察することができる。
【００１６】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、ポラライザを備え、前記対物レンズの瞳位置近傍に、前記ポラライザを透過した前記照明光を透過させかつ前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記観察光を透過させる複屈折素子を備え、前記検出光学系が、前記複屈折素子を透過した前記標本からの前記観察光を透過させるアナライザを備えていてもよい。
【００１７】
このようにすることで、照明光がポラライザを透過させられることにより偏光方向を一方向に設定され、複屈折素子を透過させられることにより偏光方向の異なる２つの照明光に分けられた後に標本を透過させられる。光路の異なる２つの照明光には標本の厚さが変化している部位を透過する際に光路差が与えられ、再帰性反射部材によって反射された後に、再度標本の同一位置を透過させられて、光路差が再度与えられる。そして、複屈折素子を再度通過させられることにより同じ光路に合成されアナライザを通過させられる。これにより、２つの照明光に光路差が存在すると干渉により明暗のコントラストが発生する。これにより標本を微分干渉像により観察することができる。
【００１８】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記対物レンズの瞳位置に光学的に共役な位置に配置された開口を備え、前記標本に対して特定の角度で前記照明光を照射してもよい。
このようにすることで、標本に偏斜照明を行って、標本を立体感のある像により観察することができる。
【００１９】
また、上記態様においては、前記検出光学系が、前記対物レンズの前記瞳位置に光学的に共役な位置近傍に減光部材を備えていてもよい。
このようにすることで、減光部材によって開口を通過した直接光の光量が抑えられるので、暗視野観察を行うことができる。
【００２０】
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記標本に前記照明光を照射して蛍光を発生させてもよい。
このようにすることで、照明光学系により、対物レンズを経由して標本に照明光が照射され、標本において発生した蛍光が対物レンズにおいて集光されて検出光学系により検出される。
【００２１】
これにより、標本の蛍光像を観察することができる。この場合において、標本には光源側から照明光が入射した後、再帰性反射部材において反射した光も標本に入射する。これにより、明るい蛍光像を観察することができる。
【００２２】
また、上記態様においては、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記照明光および前記観察光を透過させる複数のピンホールを備えた共焦点ディスクを備えていてもよい。
このようにすることで、光源からの照明光が共焦点ディスクのピンホールを通過して、対物レンズによって標本上に複数のスポットを形成し、各スポット位置において蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。発生した蛍光の内、対物レンズにより集光され共焦点ディスクのピンホールを通過した蛍光が撮影される。この場合に、共焦点ディスクを回転等させることにより、標本上においてスポットを走査させて２次元的な蛍光像を撮影することができる。
【００２３】
この場合において、標本に入射されることにより蛍光を発生させた照明光は、標本を透過し再帰性反射部材によって折り返された後に、再度標本の同じ位置に入射されるので、蛍光を再度発生させることができ、検出される蛍光量を増大させて明るい蛍光像による観察を行うことができる。
【００２４】
また、上記態様においては、前記照明光がレーザ光であり、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記レーザ光を走査させるスキャナを備え、前記検出光学系が、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、前記標本における前記レーザ光の走査位置において発生し前記対物レンズおよび前記スキャナを介して戻る前記蛍光を通過させるピンホールを備えていてもよい。
このようにすることで、光源からの照明光が対物レンズによって標本上にスポットを形成し、各スポット位置において蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。スキャナによってスポットを標本上で移動させることにより標本の２次元的な蛍光像を取得することができる。
【００２５】
この場合において、標本に入射されることにより蛍光を発生させた照明光は、標本を透過し再帰性反射部材によって折り返された後に、再度標本の同じ位置に入射されるので、蛍光を再度発生させることができ、検出される蛍光量を増大させて明るい蛍光像による観察を行うことができる。
【００２６】
また、上記態様においては、前記標本と前記再帰性反射部材との間に配置され、前記標本において発生した前記蛍光を遮断する光学フィルタを備えていてもよい。
このようにすることで、照明光が照射されることにより標本において発生した蛍光の内、再帰性反射部材側に射出された蛍光は光学フィルタによって遮断されるので、再帰性反射部材によって折り返されて標本に再度入射することが防止される。これにより、標本で散乱された蛍光を検出することによるコントラストの低下を防止することができる。
【００２７】
また、上記態様においては、前記照明光が、極短パルスレーザ光であり、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記極短パルスレーザ光を走査させるスキャナを備えていてもよい。
このようにすることで、光源からの極短パルスレーザ光が対物レンズによって標本に集光されることにより、集光位置における光子密度が高められて多光子励起効果により蛍光が発生する。スキャナの作動により極短パルスレーザ光の集光位置を変化させることにより、２次元的な蛍光像を取得することができる。
【００２８】
この場合において、標本を透過した極短パルスレーザ光が再帰性反射部材によって折り返されて、標本に再度入射されても多光子励起効果を再度発生させることはできないが、最初の入射によって発生した蛍光の内、対物レンズとは反対側に射出された蛍光が再帰性反射部材によって折り返されて標本を透過し、対物レンズによって集光されるので、検出される蛍光量を増大させることができ、明るい蛍光像による観察を行うことができる。
【００２９】
また、上記態様においては、前記照明光が、極短パルスレーザ光であり、前記照明光学系が、前記対物レンズを経由して前記標本上で前記極短パルスレーザ光を走査させるスキャナを備え、前記標本における前記極短パルスレーザ光の走査位置において高次高調波を発生させてもよい。
【００３０】
このようにすることで、極短パルスレーザ光が標本に照射されると、標本内の特定成分における非線形光学効果により、１／２波長の高調波（ＳＨＧ）および１／３波長の高調波（ＴＨＧ）が誘起されるので、これを検出することにより、標本を蛍光標識することなく観察することができる。この場合に、発生した高調波は、標本を透過する方向に発生する成分が多いが、再帰性反射部材によって、光源側に折り返すことができる。したがって、極短パルスレーザ光を集光する対物レンズによって、高調波を集光することができ、コンパクトな高次光調波像の観察装置を構成することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、マイクロプレートの各ウェル内で培養されている細胞を、培養液の液面の高さや湾曲状態にかかわらず簡易かつ鮮明に観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置を模式的に示す図である。
【図２】図１の観察装置に用いられる再帰性反射部材の一例を示す縦断面図である。
【図３】図１の観察装置の作用を説明する図である。
【図４】図１の観察装置の第１の変形例を模式的に示す図である。
【図５】図１の観察装置の第２の変形例を模式的に示す図である。
【図６】図１の観察装置の第３の変形例を模式的に示す図である。
【図７】図１の観察装置の第４の変形例を模式的に示す図である。
【図８】図１の観察装置の第５の変形例を模式的に示す図である。
【図９】図１の観察装置の第６の変形例を模式的に示す図である。
【図１０】図１の観察装置の第７の変形例を模式的に示す図である。
【図１１】図１の観察装置の第８の変形例を模式的に示す図である。
【図１２】図１の観察装置の第９の変形例を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の一実施形態に係る観察装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡であって、光源２からのレーザ光（照明光）を標本Ｘに照射する照明光学系３と、標本Ｘにおいて発生した蛍光（観察光）を集光する対物レンズ４と、集光された蛍光を検出する検出光学系５と、標本Ｘを挟んで対物レンズ４とは反対側に配置された再帰性反射部材６とを備えている。
【００３４】
標本Ｘは、例えば、多数のウェルを有するマイクロプレート等の培養容器８内に培養液Ｌと共に収容された透明な細胞である。
照明光学系３は、重力方向において、培養容器８の下側に配置され、光源２からのレーザ光をリレーする２組のリレー光学系９，１０と、該リレー光学系９，１０の間に配置され、レーザ光を２次元的に走査するガルバノミラーからなるスキャナ１１とを備えている。光源２からのレーザ光はリレー光学系９，１０によってリレーされ、スキャナ１１によって２次元的に走査された後、対物レンズ４により集光されて、培養容器８内に収容されている標本Ｘに下方から照射されて、標本Ｘ内に光スポットを形成するようになっている。
【００３５】
対物レンズ４は、重力方向において、培養容器８の下側に配置されている。
検出光学系５は、対物レンズ４により集光され、リレー光学系１０およびスキャナ１１を介して戻る標本Ｘからの蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１２と、分岐された蛍光を集光する結像レンズ１３と、結像された蛍光を透過させる共焦点ピンホール（ピンホール）１４と、蛍光に含まれるレーザ光を遮断する励起光カットフィルタ１５と、光電子増倍管等の光検出器１６とを備えている。図中、符号１７は、レーザ光および蛍光を反射するミラーである。
【００３６】
再帰性反射部材６は、例えば、図２に示されるように、ベース部材１８の表面に反射膜１９を挟んで多数の微小の球状のガラスビーズあるいはプリズム等の反射要素２０を配列して構成されている。これにより、反射要素２０に入射した光が反射膜１９によって反射されて入射方向と同一方向に射出されるようになっている。ここで、反射要素２０を微小に構成しているので、入射した光をほとんどシフトさせることなく入射方向と全く同一の方向に反射するようになっている。図中、符号２１は、剥離フィルムであり、符号２２は、剥離フィルム２１とベース部材１８とを接着させる接着剤である。
【００３７】
このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について説明する。
本実施形態に係る観察装置１を用いて、培養容器８内の細胞等の透明な標本Ｘを観察するには、図３に示されるように、光源２からのレーザ光を、照明光学系３および対物レンズ４によって、培養容器８の下方から標本Ｘに入射させ、標本Ｘ内に光スポットを集光させるとともに、照明光学系３のスキャナ１１によって光スポットを２次元的に走査させる。
【００３８】
レーザ光の光スポットの各走査位置においては、標本Ｘ内に含有されている蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光は各走査位置から全方向に射出される。標本Ｘの各走査位置から下方に射出された蛍光の一部は培養容器８を透過して対物レンズ４により集光され、スキャナ１１を経由してレーザ光の光路を戻る途中でダイクロイックミラー１２により分岐され、結像レンズ１３、共焦点ピンホール１４および励起光カットフィルタ１５を通過して光検出器１６により検出される。
【００３９】
また、本実施形態に係る観察装置１においては、標本Ｘが透明であるため、標本Ｘに下方から入射されたレーザ光の一部は、標本Ｘをそのまま透過して上方に射出される。そして、上方に射出されたレーザ光は、培養容器８の上方に配置されている再帰性反射部材６によって反射されて、同じ経路を辿って、再度、標本Ｘに上方から入射される。
【００４０】
この場合において、再帰性反射部材６が多数の微小の反射要素２０によって、経路のシフトをほとんど発生させることなく同じ経路を戻すようにレーザ光を反射する。これにより、培養容器８内の液面の高さや液面の曲率等の状態に関わらず、レーザ光の光スポットを最初の走査位置とほぼ同一位置に再度形成することができる。
【００４１】
すなわち、本実施形態に係る観察装置１によれば、同じ走査位置にレーザ光を往復２回にわたって照射するので、各走査位置において発生させる蛍光をほぼ２倍に増大させることができる。これにより、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００４２】
また、本実施形態に係る観察装置１においては、対物レンズ４および照明光学系３が、標本Ｘが収容された培養容器８よりも重力方向下側に配置されているので、培養容器８内の培養液の液面が表面張力によって湾曲してレンズ効果を起こしてしまう不都合を防止することができる。
【００４３】
本実施形態に係る観察装置１はレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡なので、標本Ｘ内のレーザ光が通過する領域の全てにおいて蛍光が発生するが、対物レンズ４の焦点位置に形成される光スポット以外の領域において発生した蛍光は、共焦点ピンホール１４を通過できないため、光検出器１６により検出されることはない。
【００４４】
なお、本実施形態においては、ガルバノミラーからなるスキャナ１１と共焦点ピンホール１４とを備えるレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡を例示したが、これに代えて、図４に示されるように、対物レンズ４の焦点位置と光学的に共役な位置に配置され、励起光および蛍光を透過させる複数のピンホール２３を備えた共焦点ディスク２４を備え、検出光学系５が複数のピンホール２３を通過した蛍光を同時に検出可能なＣＣＤ等の撮像素子２５を備えるものを採用してもよい。
【００４５】
光源２からの照明光から励起フィルタ２６によって励起光が生成され、生成された励起光は共焦点ディスク２４を通過させられて集光レンズ２７により集光されることによって、標本Ｘ内に配置される対物レンズ４の焦点位置に多数の光スポットを形成する。共焦点ディスク２４を回転等させることにより、多数の光スポットを標本Ｘ内において走査させることができる。
【００４６】
各走査位置において発生した蛍光は、共焦点ディスク２４のピンホール２３を通過した後、ダイクロイックミラー１２によって励起光の光路から分岐され、励起光カットフィルタ１５によって励起光が遮断された後に撮像素子２５により撮影される。
この場合においても、再帰性反射部材６によって、各光スポットの位置に励起光を２回照射することができるとともに、各光スポットの位置において発生した蛍光も再帰性反射部材６により反射されることによって、当該光スポットから発生した蛍光の一部として検出するので、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００４７】
また、本実施形態においては、図５に示されるように、光源２として、極短パルスレーザ光を射出するものを用いた多光子励起型顕微鏡を採用してもよい。
図５の観察装置２８は、図１の観察装置１と比較して、検出光学系５のダイクロイックミラー１２を対物レンズ４の直近に配置し、共焦点ピンホール１４をなくしている点で相違している。
【００４８】
光源２からの極短パルスレーザ光はスキャナ１１によって走査され、対物レンズ４の焦点位置に集光されることにより、焦点位置における光子密度を増大させて多光子励起効果により、光スポットの位置において限定的に蛍光を発生させる。発生した蛍光の内、対物レンズ４側に射出された蛍光は、対物レンズ４により集光された後、ダイクロイックミラー１２によって極短パルスレーザ光の光路から分岐され、励起光カットフィルタ１５によってレーザ光成分を除去されて光検出器１６によって検出される。これにより、蛍光画像を取得することができる。
【００４９】
レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡と同様にして極短パルスレーザ光は再帰性反射部材６によって反射されるが、再度入射した標本Ｘ内の光スポットの位置において波面を分割して反射されることにより、パルス幅が増大するので多光子励起効果は発生しない。したがって、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡とは異なり、励起光の２回照射による蛍光量の増加効果は得られないが、蛍光を光スポットの位置において限定的に発生させるため、反射要素２０による微小なシフトが発生してもフレアを発生させることがない。したがって、再帰性反射部材６側に射出された蛍光を再帰性反射部材６によって標本Ｘの同じ位置に戻し、対物レンズ４によって集光することができ、通常の落射型の顕微鏡では捨てられている蛍光を回収することで、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５０】
また、図５と同様の構成により、多光子励起効果により発生した蛍光に代えて、極短パルスレーザ光が入射されることにより標本Ｘにおいて誘起される第２次高調波（ＳＨＧ）および第３次高調波（ＴＨＧ）を検出する観察装置２８を採用してもよい。
この場合、光源２としては、例えば、波長１２００ｎｍの極短パルスレーザ光を射出する光源を採用し、励起光カットフィルタ１５としては、波長１２００ｎｍの極短パルスレーザ光を遮断し、波長６００ｎｍおよび波長４００ｎｍの極短パルスレーザ光を透過するものを採用すればよい。
【００５１】
標本Ｘ内の特定の物質によって非線形効果によって発生する高調波を検出することにより、蛍光標識することなく透明な細胞を検出することができる。そして、通常、極短パルスレーザ光の入射方向とは反対側に透過する方向に多く発生する高調波を再帰性反射部材６によって標本Ｘ側に戻して、コンパクトな落射型の構成によって検出することができるという利点がある。
【００５２】
また、本実施形態においては、走査型の蛍光顕微鏡等について説明したが、これに代えて、図６に示されるように、光源２からの励起光を対物レンズ４によって標本Ｘの全体に照射（広視野照明）し、標本Ｘ上の各位置において発生した蛍光を対物レンズ４によって集光し、励起光を除去して撮影することにより蛍光画像を取得する顕微鏡に適用してもよい。図中、符号３７は絞りである。
【００５３】
この場合、観察装置１は、再帰性反射部材６に近接して配置され蛍光を遮断する光学フィルタ７を備えている。
光学フィルタ７は、レーザ光の照射により標本Ｘにおいて発生した蛍光のうち、再帰性反射部材６側に射出された蛍光を遮断するようになっている。
【００５４】
散乱の強い標本Ｘの場合には、標本Ｘにおいて発生した蛍光が再帰性反射部材６側に射出され、再帰性反射部材６で反射された蛍光が標本Ｘで再度散乱され、コントラストを低下させることがある。再帰性反射部材６と標本Ｘとの間に光学フィルタ７を配置することにより、再帰性反射部材６側に射出される蛍光が光学フィルタ７で遮断され、励起光のみが光学フィルタ７を透過し、再帰性反射部材６で反射された励起光が標本Ｘに再度入射する。これにより、コントラストの低下を防ぎつつ、蛍光強度を２倍にできる。
【００５５】
具体的には、標本Ｘの各位置を透過した励起光は再帰性反射部材６によって反射されて標本Ｘの同じ位置に再度入射されるので、標本Ｘの各位置において約２倍の蛍光を発生させることができる。
【００５６】
これにより、明るい蛍光画像を取得することができる。
この場合において、光源２が点光源ではない場合（例えば、水銀光源）には、軸上の励起光のみならず、軸外の励起光も標本Ｘに照射される。本実施形態に係る観察装置１によれば、軸上の励起光のみならず軸外の励起光についても、再帰性反射部材６によって同一経路を戻るように反射されるので、上記効果を得ることができる（図６の点線の光線を参照。）。
【００５７】
また、本実施形態と同様の構成を、落射型の微分干渉顕微鏡に適用してもよい。
この場合には、図７に示されるように、照明光学系３が、光源２からの照明光を通過させるポラライザ２９を備え、観察装置１が、対物レンズ４の瞳位置近傍に、ポラライザ２９を透過した照明光を透過させかつ対物レンズ４により集光された標本Ｘからの観察光を透過させる複屈折素子３０を備え、検出光学系５が、複屈折素子３０を透過した標本Ｘからの観察光を透過させるアナライザ３１を備えることとすればよい。
【００５８】
このようにすることで、照明光がポラライザ２９を透過させられることにより偏光方向を一方向に設定され、複屈折素子３０を透過させられることにより偏光方向の異なる２つの照明光に分けられた後に標本Ｘを透過させられる。光路の異なる２つの照明光には標本Ｘの厚さが変化している部位を透過する際に光路差が与えられ、再帰性反射部材６によって反射された後に、再度標本Ｘの同一位置を透過させられて、光路差が再度与えられる。
【００５９】
そして、複屈折素子３０を再度通過させられることにより同じ光路に合成されアナライザ３１を通過させられる。これにより、２つの照明光に光路差が存在すると干渉により明暗のコントラストが発生し、標本Ｘを微分干渉像により観察することができる。
この場合においても、標本Ｘの各位置を透過した照明光を再帰性反射部材６によって再度同一位置に通過させることにより、複屈折により発生する位相差を２倍にすることができる。
【００６０】
また、本実施形態と同様の構成を位相差顕微鏡に適用してもよい。
この場合には、図８に示されるように、照明光学系３が、対物レンズ４の瞳位置に光学的に共役な位置に配置されたリングスリット（開口）３２を備え、検出光学系５が、対物レンズ４の瞳位置または該瞳位置に光学的に共役な位置に配置されリングスリット３２の形状に対応するＯリング板状の位相膜３３を備えていればよい。図中、符号３４は、リレー光学系である。
【００６１】
このようにすることで、コンパクトな落射型の構成によって、位相差観察を行うことができる。すなわち、光源２から対物レンズ４の瞳位置に光学的に共役な位置に配置されたリングスリット３２を通過した照明光は、標本Ｘを透過した後に再帰性反射部材６において反射されて、同一方向に戻り、標本Ｘに再照射されて、標本Ｘにおいて回折させられる。標本Ｘにおいて回折することなく直進した照明光は位相膜３３を通過させられることにより位相をずらされる。そして、位相をずらされた直進光と回折光とが干渉させられることにより、透明な標本Ｘを明暗によって観察することができる。
【００６２】
この場合において、標本Ｘに対して斜め下方から照射される際にも標本Ｘにおいて回折が発生するが、標本Ｘの透過率が高く、再帰性反射部材６における反射率が十分に高ければ無視できる程度のノイズとなる。
【００６３】
また、本実施形態と同様の構成を偏斜照明による透過観察に適用してもよい。
この場合には、図９に示されるように、照明光学系３が、対物レンズ４の瞳位置に光学的に共役な位置に、光軸中心から径方向に離れた位置に配置されたリングスリット（開口）３２を備えて、標本Ｘに対して特定の角度で照明光を入射させることとしてもよい。
このようにすることで、標本Ｘに斜め下方から透過させた照明光を再帰性反射部材６によって反射することにより、標本Ｘに斜め上方から入射する偏斜照明を生成し、透過した観察光をハーフミラー３５によって分岐してＣＣＤ等の撮像素子２５により撮影することにより、標本Ｘを立体感のある像により観察することができる。
【００６４】
また、図１０に示されるように、検出光学系５が、対物レンズ４の瞳位置に光学的に共役な位置近傍のリングスリット３２に対応する位置に減光部材３６を備えていてもよい。このようにすることで、偏斜照明として再帰性反射部材６から標本Ｘを通過した直接光の光量を減光部材３６によって抑えることができ、これによって暗視野観察を行うことができる。
【００６５】
また、図１１に示されるように、本実施形態と同様の構成を有する明視野観察用の顕微鏡を採用してもよい。図中、符号３８は集光レンズである。
標本Ｘの透過率が低い場合には、照明光の一部が標本Ｘにおいて反射し、他の部分が標本Ｘを透過する。対物レンズ４により、下方から標本Ｘに照射された照明光の一部は標本Ｘにおいて反射して対物レンズ４により集光されるとともに、標本Ｘを透過した照明光は再帰性反射部材６によって反射されて再度標本Ｘに照射され、透過光として対物レンズ４により集光される。これにより、落射型の構成により、落射明視野観察と透過明視野観察とを同時に行うことができる。標本Ｘの透過率によって変化する明視野像により観察を行うことができるという利点がある。
【００６６】
また、上記実施形態においては、対物レンズ４を経由して照明光を標本Ｘに照射する場合について説明したが、これに代えて、図１２に示されるように、対物レンズ４を経由することなく照明光を照射する場合に適用してもよい。
このようにすることで、照明光学系（暗視野照明光学系）３により、対物レンズ４を経由せずに標本Ｘに照明光が照射され、標本Ｘにおける散乱光が対物レンズ４において集光されて検出光学系５により検出される。
【００６７】
これにより、標本Ｘの暗視野像を観察することができる。この場合において、標本Ｘにおける散乱は、光源２側から入射した照明光に対する後方散乱および再帰性反射部材６側から入射した照明光に対する前方散乱の両方が検出され、後方散乱よりも前方散乱の方が明るく観察できる。すなわち、標本Ｘに対して光源２と同じ側に検出光学系５を配置して、反対側の設置スペースを縮小しながら、透過観察と同様の前方散乱による明るい観察光を観察することができる。
【００６８】
また、上記実施形態においては、照明光学系３が、対物レンズ４を経由せずに標本Ｘに照明光を照射して蛍光を発生させる励起照明光学系であってもよい。
このようにすることで、照明光学系３により、対物レンズ４を経由せずに標本Ｘに照明光が照射され、標本Ｘにおいて発生した蛍光が対物レンズ４において集光されて検出光学系５により検出される。
【００６９】
これにより、標本Ｘの蛍光像を観察することができる。この場合において、標本Ｘには光源２側から照明光が入射した後、再帰性反射部材６において反射した光も標本Ｘに入射する。これにより、明るい蛍光像を観察することができる。
【００７０】
なお、本実施形態においては、標本Ｘを収容した培養容器８の上方に平面上の再帰性反射部材６を略水平に配置したが、これに限定されるものではない。すなわち、再帰性反射部材６は、標本Ｘを透過する方向に射出された照明光あるいは蛍光等を入射させる位置に配置されてさえいればよく、その高さ方向位置、形状、姿勢等は任意に設定することができる。
【００７１】
例えば、非使用時には円筒状に丸めておき、使用時に広げて湾曲した形態のまま配置してもよいし、非使用時には折りたたんでおき、使用時に広げて凹凸のある形態のまま配置してもよい。また、水平に対して傾いて配置されていてもよい。すなわち、再帰性反射部材６の配置および形態については厳密な精度を要求されないので、任意の形状のものを任意の位置に配置してもよい。標本Ｘを透過する方向に射出された照明光等が入射する範囲にわたって天井に配置されていてもよい。この場合、再帰性反射部材６への入射範囲を狭めるために培養容器８の上方に集光レンズを配置してもよい。
【００７２】
また、再帰性反射部材６を構成している反射要素２０としては、ガラス等の非樹脂材料により構成されていることが好ましい。樹脂材料の多くは自家蛍光を発生するため、自家蛍光を発生しない材質であることが好ましい。
【００７３】
また、再帰性反射部材６の１つの反射要素２０の開口サイズｄは、使用する光の波長λと一度に照射される再帰性反射部材６の開口径Ｄを用いて、以下の条件式を満たすことが好ましい。
２λ＜ｄ＜Ｄ／１０
これにより照明光を反射する際における回折を防止できるとともに、さほど大きなシフトを発生することなく照明光を同一方向に反射することができる。
【符号の説明】
【００７４】
１，２８  観察装置
２  光源
３  照明光学系（暗視野照明光学系、励起照明光学系）
４  対物レンズ
５  検出光学系
６  再帰性反射部材
７  光学フィルタ
１１  スキャナ
１４  共焦点ピンホール（ピンホール）
２０  反射要素
２３  ピンホール
２４  共焦点ディスク
２９  ポラライザ
３０  複屈折素子
３１  アナライザ
３２  リングスリット（開口）
３３  位相膜
３６  減光部材
Ｘ  標本
【図１】
2018146602.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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