(57)【要約】      （修正有）【課題】セルロース系物質を可溶性糖類に転換する方法の提供。【解決手段】セルロース物質とセルラーゼを組合わせて、重量により、１〜３０％のセルラーゼを含むセルロース系物質とセルラーゼの組合せを提供する工程、前記セルロース系物質とセルラーゼとの組合せを、セルラーゼの変性温度又は変性温度付近で、すなわち、約３８〜約１００℃、約ｐＨ４〜９で、０．１〜９６時間、インキュベートして、加水分解反応を生じさせ、少なくとも２０％のセルロース系物質を可溶性糖に転換する工程、を含み、前記可溶性糖がグルコース及びセロビオースを含み、グルコースの分画が前記可溶性糖に対して少なくとも０．７５である、方法。セルロース系物質は蒸気噴写、パルプ化粉砕、酸加水分解等の前処理を施してから、セルラーゼと組み合わせた方が好ましい、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系物質をグルコースに転換する方法であって、
前記セルロース物質とセルラーゼを組合わせて、重量により、１％乃至３０％のセルラーゼを含むセルロース系物質とセルラーゼの組合せを提供する工程、前記セルロース系物質とセルラーゼとの組合せを、約３８℃乃至約１００℃、約ｐＨ４乃至９で、０．１乃至９６時間、インキュベートして、加水分解反応を生じさせ、少なくとも２０％のセルロース系物質を可溶性糖に転換する工程、を含み、
前記可溶性糖がグルコース及びセロビオースを含み、グルコースの分画が前記可溶性糖に対して少なくとも０．７５であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記セルロース系物質が、生物燃料エネルギーの収穫物、農業の残分、地方自治体の固形廃棄物、産業の固形廃棄物、庭ゴミ、材、林業廃棄物、スイッチグラス、故紙、紙製造からのスラッジ、コーングレーン、コーン穂軸、コーンの殻、コーンストーバー、草、コムギ、小麦わら、干し草、稲ワラ、糖きびバガス、ソーガム、大豆、木、スイッチグラス、干し草、大麦、大麦わら、稲ワラ、および草からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
更に前記セルロース系物質の前処理を含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記前処理剤処理が、蒸気噴射、パルプ化（蒸解法）、粉砕、酸加水分解、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
更に、グルコース量を決定する工程を更に含む、請求項１の方法。
【請求項６】
可溶性糖の量を決定する工程を更に含む、請求項１の方法。
【請求項７】
セルラーゼの量が約２乃至４０ｍｇ／ｇセルロース系物質である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記セルラーゼが完全セルラーゼを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記完全セルラーゼがトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）完全セルラーゼである、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が組換酵素を発現する請求項９の方法。
【請求項１１】
前記組み換え酵素がベータグルコシダーゼである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
セルロース系物質をセロビオースに転換する方法であって、
セルロース系物質をエンドグルカナーゼ１を含むセルラーゼ混合物と組み合わせて、セルラーゼを重量により約１％乃至約３０％含む、セルロース系物質と酵素混合物との組合せを提供する工程、及び
前記セルロース系物質とセルラーゼ混合物との組合せを、約１００℃乃至約２５０℃の温度、約４乃至約９のｐＨで約０．１時間乃至約９６時間インキュベートして、加水分解を行い、前記セルロース系物質の５０％までを可溶性糖類に転換する工程を含む方法であって、前記可溶性糖類がグルコースとセロビオースを含み、グルコース分画の可溶性糖類に対する割合が約０．５未満である、方法。
【請求項１３】
前記セルロース系物質が、前記セルロース系物質が、生物燃料エネルギーの収穫物、農業の残分、地方自治体の固形廃棄物、産業の固形廃棄物、庭ゴミ、材、林業廃棄物、スイッチグラス、故紙、紙製造からのスラッジ、コーングレーン、コーンの穂軸、コーンの殻、コーンスチーバー、草、コムギ、小麦わら、干し草、稲ワラ、砂糖きびバガス、ソーガム、大豆、木、スイッチグラス、干し草、大麦、大麦わら、稲ワラ、および草からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１４】
更にセルロース系物質の前処理工程を更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記前処理剤処理が、蒸気噴射、パルプ化（蒸解法）、粉砕、酸加水分解、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
更に、グルコース量を決定する工程を更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１７】
可溶性糖の量を決定する工程を更に含む、請求項１２の方法。
【請求項１８】
セルラーゼの量が約２乃至４０ｍｇ／ｇセルロース系物質である、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記セルラーゼ混合物が更にセロビオハイドロラーゼ１を含む、請求項１３の方法。
【請求項２０】
前記セルラーゼ混合物がセロビオハイドロラーゼ２１を更に含む、請求項１３の方法。
【請求項２１】
前記セルラーゼ混合物が更に、セルモモスポラフースカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｅｒａ ｆｕｓｃａ）Ｅ３を含む請求項１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本研究は米国エネルギー省の国立再生エネルギー研究所の元請負契約Ｎｏ．ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１００３３７の受注Ｎｏ．ＺＣＯ−０−３００１７−１０により資金を受けている。従って、米国政府は本発明の一部の権利を有する。
【０００２】
本出願は、２００６年１１月１３日に出願された、米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／８５８，５７９、標題「セルロース転換工程の改善方法」に対して優先権を主張する。本出願を参照により本明細書に援用する。
【０００３】
本発明はセルロース系物質の酵素的転換において、所望の糖類の生産性を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
セルロース系物質から糖類を生産する方法は知られており、これらの糖類を生産した後に、発酵及び／又は蒸留を行い、エタノールへ転換することもしばしば行われている。従来技術の多くは、ドイツ、日本、及びソビエト連邦のような国々において燃料が高価なものであった、第二次世界大戦の頃に発展した。これらの初期の方法は主に酸加水分解についてのものであり、構成が非常に複雑であり、転換方法に用いる、温度、圧力、及び酸濃度等の条件の僅かな変動にも敏感な方法であった。これらの初期の方法の包括的な議論は、「高圧塩化水素を用いて木材からの糖類の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒｓ Ｆｒｏｍ Ｗｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）」、バイオテクノロジーアンドバイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｖｏｌｕｍｅ ＸＸＶ、２７５７−２７７３（１９８３）に記載されている。
【０００５】
第二次世界大戦から１９７０年代の初期にかけての豊富な石油供給は、エタノール転換の研究にブレーキをかけた。しかしながら、１９７３年のオイル危機により、代替エネルギー資源として、木材及び農業副生成物を利用するための方法を発展させるために、研究者達は努力した。この研究は、特に、米国で消費される燃料の海外依存を減らし、燃料のオクタン価を高め、及び環境的尺度では、汚染ガスを減らすという点において、ガソリン添加物としてのエタノール開発についての研究は重要であった。
【０００６】
「オイル危機」と時を同じくして、米国の環境保護会社は、空気汚染を減らすためには、従来の添加剤を減らす必要があると提唱した。エタノールが従来の添加物の好適な代替物であり、特にエタノールは莫大な費用を投じなくても精製油肯定に容易に取り込むことができるので、幾つかの精製油工程はエタノールを代替物として、選択した。
【０００７】
１０年前に発達した高圧及び高温気相糖化法の改善に加えて、近年の研究は主に酵素転換法に向けられている。これらの方法は、セルロースを発酵可能な糖に分解する、中等温度好性及び好熱性の糸状菌、酵母、及びバクテリア等の各種有機体からの酵素を用いる。これらの方法及びこれらの有機体の能力を、商業的規模にスケールアップするための課題及びエタノール生産における非効率性についての課題がいまだに存在する。
【０００８】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物性物質である。
これらは、ポリマー性基質を糖類の単体に加水分解することができる細胞外酵素を生産する、バクテリア、酵母、及び糸状菌を含む多くの微生物により、エネルギー資源として用いるために、分解される（Ａｒｏら、２００１）。生物が利用する糖の種類は種により限られており、このことはどの糖を転換するのが最も効率的であるかということを示唆している。再生できない資源の限界が近くなるにつれて、主要な再生可能エネルギー資源となるセルロースの可能性は大きくなる（Ｋｒｉｓｈｎａら、２００１年）。生物学的方法を解してのセルロースの有効利用は食品、飼料、及び燃料の貯蔵問題を克服するための１つのアプローチである（Ｏｈｍｉｙａら、１９９７年）。
【０００９】
セルラーゼはセルロース（ベータ−１，４−グルカン、又はベータ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド等を生成する酵素である。セルラーゼは従来、エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（ＥＧ）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（ＥＣ３．２．１．９）（ＣＢＨ）、及びベータグルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコハイドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２１）（ＢＧ）の、３つの主要なクラスに分類されている。（Ｋｎｏｗｌｅｓら、１９８７年及びＳｈｕｌｅｉｎら、１９８８年）エンドグルカナーゼは主にセルロース繊維のアモルファス部分に作用する。セロビオハイドロラーゼは結晶性セルロースも分解することができる。
【００１０】
飼料添加剤として用いる機械処理されたパルプ（Ｐｅｒｅら、１９９６年）及び穀物湿式粉砕物のような、セルロースバイオマスを分解してエタノールを生成することが有効であることが証明されている（セルラーゼはセルロースを分解してグルコースを生産し、酵母又は他の微生物は更にグルコースをエタノールに発酵する）。糖化及び発酵を別個に行うことは、バイオマス、例えば、コーンストーバー中に存在するセルロースをグルコースに転換し、続いて、酵母株でグルコースをエタノールに転換する工程である。糖化工程と発酵工程を同時に行うことは、バイオマス、例えば、コーンストーバー中に存在するセルロースをグルコースに添加して、同時に同じ反応器で、酵母株がグルコースをエタノールに転換する工程である。セルラーゼのような容易に利用可能な資源からエタノールを生産することは、安定な、再生可能な燃料源を提供することになる。
【００１１】
セルラーゼは数多くのバクテリア、酵母、及び糸状菌により生産されることが知られている。完全なセルラーゼシステム（すなわち、完全セルラーゼ）を生産する特定の糸状菌は結晶状のセルロースを分解することができる。結晶性セルロースをグルコースに効率的に転換するために、ＣＢＨ、ＥＧ、及びＢＧに分類されている各成分を含む完全セルラーゼシステムが必要とされる。これらの成分を別々に用いると、結晶性セルロースの加水分解は非効率的となる（Ｆｉｌｈｏら、１９９６年）。特に、ＥＧタイプのセルラーゼとＣＢＨタイプのセルラーゼを相互作用させると、これらの各成分を単独で用いたときよりも、効率的にセルロースを分解することができる（Ｗｏｏｄ、１９８５年；Ｂａｋｅｒら、１９９４年；及びＮｉｅｖｅｓら、１９９５年）。
【００１２】
更に、セルラーゼは、洗剤組成物の洗浄能力を高める目的での布製品への使用、柔軟剤としての使用、及び綿布の風合い及び外観を改善するための使用において、有用であることが知られている（Ｋｕｍａｒら、１９９７年）。改善された洗浄能力を有するセルラーゼ含有洗浄組成物（米国特許Ｎｏ．４，４３５，３０７；英国特許出願Ｎｏｓ．２，０９５，２７５及び２，０９４，８２６）及び布製品を処理して風合い及び外観を改善するための使用（米国特許Ｎｏ．５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び ５，７７６，７５７、及び英国特許出願Ｎｏ．１，３５８，５９９）が開示されている。
【００１３】
糸状菌及び酵母生産されるセルラーゼは大いに注目を集めている。特に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株（例えば、トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）又はトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））の発酵は結晶状のセルロースを分解する能力を有する完全セルラーゼシステムを生産することが確認されている。長年に渡り、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）セルラーゼ生産は従来の変異誘発、スクリーニング、及び高度に精製された大容量の発酵条件を発展させることにより改善されてきた。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株の複数成分セルラーゼシステムがセルロースを加分解してグルコースを生産するが、セルロースの加水分解について異なる性質を有するほかの微生物、特に糸状菌由来のセルラーゼがあり、工業的スケールのセルラーゼ生産のために、糸状菌において、これらのタンパク質を発現することが有利である。しかしながら、糸状菌からのバクテリア酵素の生産性が低いことが多くの研究により証明されている（Ｊｅｅｖｅｓら、１９９１年）。
【００１４】
グルコース及びセロビオース等の可溶性糖は化学的及び生物学的生成物の工業的生産に数多く用いられている。セルロース加水分解を最適化して、酵素の使用量を少なくさせ、可溶性糖類の生産の費用を改善することができる。数多くのアプローチが発達してきたにも関わらず、セルロース系物質から得られた可溶性糖類の生産性を改善する必要性が今だに存在している。
【発明の概要】
【００１５】
本発明はセルラーゼと共に、セルラーゼの変性温度又は変性温度付近で、セルロース系基質又は前処理されたセルロース系基質をインキュベートして、セルロース系開始物質を酵素的に糖化させて、可溶性糖の生産を高める方法に関する。本発明は、セルラーゼの変性温度又は変性温度付近で、セルロース系基質又は前処理されたセルロース系基質を、セルラーゼと共にインキュベートすることにより、セルロース系開始物質を酵素的に糖化させて、グルコースの生産を高める方法に関する。
【００１６】
本発明は、セルロース系物質をセルラーゼと組み合わせ、約３８℃以上の温度でこの組み合わせをインキュベートして、加水分解を起こし、セルロース系物質の少なくとも２０％を可溶性糖類に転換する方法も提供する。可溶性糖類中のグルコース分画の相対的量は、少なくとも０．７５である。本発明は更に、セルロース系物質をエンドグルカナーゼ１を含む酵素混合物と組み合わせて、このセルロース系物質とセルラーゼ混合物との組合わせをインキュベートして加水分解を生じさせて、このセルロース系物質の５０％までを可溶性糖類に転換することにより、セルロース系物質をセロビオースに転換する方法も提供する。この可溶性糖類中のグルコース分画は約０．５未満である。
【００１７】
セルラーゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、あるいは、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）及びハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）等の代替的な有性型遺伝子を有する微生物から得られた、完全セルラーゼ、セルラーゼ混合物、又はこれらの組合せでよい（Ｋｕｈｌｓら、１９９６年）。好ましくは、アシドサーマスセルロイティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、セルモビフィダフースカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）、フミコーラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、又はトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が用いられる。
【００１８】
これらの又は他の本発明の他の特徴を以下で説明する。
【００１９】
以下の図は本発明を説明するために用いられ、本発明の発明の技術的特徴をこれらに限定することを意図していないことを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図１Ａ及びＢは３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを３．３ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２１】
図２Ａ及びＢは３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを１２ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２２】
図３Ａ及びＢは３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを１８ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２３】
図４Ａ及びＢは３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを２０ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２４】
図５Ａ及びＢは３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを１２ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２５】
図６Ａ及びＢは、３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを２０ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２６】
図７Ａ及びＢは、３８℃（白）及び５３℃（黒）において、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を過剰発現している、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の完全セルラーゼを２０ｍｇ／ｇ用いた、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２７】
図８Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１（四角）、あるいはＥ１とハイポクレアグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２８】
図９Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２（四角）、あるいはＥ１とハイポクレアグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００２９】
図１０Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１とＴ．ｆｕｓｃａＥ３（四角）、あるいはＥ１とＨ．ｇｒｉｓｅａＣＢＨ１とＴ．ｆｕｓｃａＥ３（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００３０】
図１１Ａ乃至Ｆは、５３℃（白）及び５９℃（黒）において、トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株による、希酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【００３１】
図１２Ａ乃至Ｆは、５３℃（白）及び５９℃（黒）において、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を発現しているトリコデルマレーシ由来の完全セルラーゼによる、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に通常理解されているのと同様の意味に用いる。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎらの、「ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ａｎｄ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」、第二版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍの、「ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ」、ＨＡＲＰＥＲ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）は本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書として提供される。本明細書で用いることものと同様又は等しい任意の方法及び物質を本発明の実施又は試験に用いることができるけれども、好適な方法及び物質を説明する。数値範囲は、定義されている数を含む。本明細書で説明する方法論、プロトコル、及び試薬は変更することができるので、本発明を本明細書で説明する特定のものに限定することを意図しない。
【００３３】
本明細書における、標題は本発明の側面又は態様を限定するものではなく、本発明は明細書全体を参照することにより理解することができる。従って、以下で定義されている用語の意味も明細書全体を参照することにより理解されるべきである。
【００３４】
「セルラーゼ」の語はセルロースポリマー（ベータ１，４−グルカン又はベータＤ−グルコシド結合）を短いセロオリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース、及び／又はグルコースに加水分解することあできる酵素のカテゴリーを意味する。
【００３５】
「エキソセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）」の語はＥＣ３．２．９１に分類されるセルラーゼ酵素のグループを意味する。これらの酵素はエキソグルカナー前記又はセロビオハイドロラーゼとしても知られている。ＣＢＨ酵素はセロビオースをセルロースの還元末端又は非還元末端から加水分解する。
【００３６】
「セロビオハイドロラーゼ活性」の語は、本明細書において、セルロース、セロテトリオース中の１，４−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ結合又はポリマーを含む任意のベータ１，４−Ｄグルコシド結合の加水分解を触媒して、鎖の末端からセロビオースを放出する、１，４−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．９１）を意味する。本発明の目的のために、セロビオヒドロラーゼ活性は、ＬｅｖｅｒらのＰＨＢＡＨ方法（１９７２年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２７３−２７９）で測定した場合、セルロースから水溶性の還元糖を放出することにより決定することができる。セロビオヒドロラーゼの作用とエンドグルカナーゼモードとエンドグルカナーゼモードの作用の区別は、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシメチルセルロース置換セルロースから放出される還元糖の類似の測定方法によりなされる（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８）。本来のセロビオヒドロラーゼは置換セルロースよりも未置換のセルロースに対して非常に高い活性を示す（Ｂａｉｌｅｙら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：６５−７６）。
【００３７】
「エンドグルカナーゼ（ＥＧ）」の語は、Ｅｃ３．２．１．４として分類されるセルラーゼ酵素の群を意味する。ＥＧ酵素はセルロースの内部ベータ１，４−グルコシド結合を加水分解する。「エンドグルカナーゼ」の語は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース）、リケニン、穀物のベータＤ−グルカン又はキシログルカン等のベータ１，３−グルカンを含むベータ１，４−結合、及びセルロース成分を含む他の植物中の１，４−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルコシド結合の加水分解を触媒する、エンド１，４−（１，３；１，４）−ベータ−Ｄ−グルカン４−グルカノハイドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．３．２．１．４）として、定義される。本発明の目的のために、エンドグルカナーゼ活性はＧｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８の方法により、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の加水分解を用いて決定することができる。
【００３８】
「ベータグルコシダーゼ」は、セロビオースを加水分解して、ベータＤ−グルコースを放出することを触媒する、ベータＤ−グルコシドグルコハイドロラーゼであると定義される。本発明の目的のために、ベータグルコシダーゼ活性は例えば、ＨＰＬＣ等の既知の方法で決定することができる。
【００３９】
「セルロース分解活性」の語は、ベータグルコシダーゼ活性の他に、エキソグルカナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、又は両タイプの酵素活性を意味する。
【００４０】
アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、セルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等のバクテリア；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等の酵母、並びにアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレロバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クリプトココウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フラリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフィソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィリウム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、セルモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）及びハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）等の代替的な有性型等の糸状菌を含む多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を生産する（Ｋｕｈｌｓら、１９９６年参照）。
【００４１】
「非自然発生的組成物」の語は、（１）自然発生的な割合又は非自然発生学的な割合（即ち、変更された割合）のいずれかで、セルロース分解酵素成分を組み合わせる、又は（２）１つ以上のセルロース分解酵素を過剰発現又は発現させないように、微生物を修飾する、又は（３）少なくとも１つのセルロース分解酵素を欠失させるように、微生物を修飾する、又は（４）異種のセルロース分解酵素成分を発現させるように微生物を修飾することにより生産させた組成物を含む。セルロース分解酵素成分は、非自然発生組成物を形成するために組み合わせる前に単離されたポリペプチドとして提供される。
【００４２】
一部分において、糖化温度を高くすると、セルロース系物質からもグルコース生産が高められ、及びより高いインキュベーション温度において、転換生成物中のグルコース分画が多くなるように、セルロース転換全体が改善されることが、発明者らにより発見された。
【００４３】
本発明は、セルラーゼの熱変温度において、又はこの温度の付近において、セルラーゼを用いてセルロース系物質又は前処理されたセルロース系物質をインキュベートすることにより、セルロース系開始物質の酵素的糖化から可溶性糖類の生産性を高める方法を提供する。本発明は更に、セルラーゼの変性温度において、又はこの付近の温度において、セルラーゼでセルロース系基質又は前処理されたセルロース系基質をインキュベートすることにより、セルロース系開始物質をからのグルコースの生産性を高める方法も提供する。
【００４４】
本発明の方法において、セルロース系物質は任意のセルロース含有物質でよい。このセルロース物質は、セルロース、ヘミセルロース、リグノセルロース系物質を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、このセルロース物質は、バイオマス、草のような物質、農業活動の残の物、林業活動の残りの物、自治体の固形廃棄物、古紙、コーンの繊維、紙及びパルプ生産により生じた廃棄物を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、セルロース系物質は、木材、木材パルプ、製紙工程の廃棄物、製紙及びパルプ製造における排出液、パーチクルボード、コーンストーバー、コーン繊維、米、紙、及びパルプ処理における廃棄物、木材又は収穫された植物、果肉、野菜、軽石、蒸留かす、草、米、種子などの殻、とうきびバガス、コットン、ジュート、ヘンプ、麻、竹、サイザル繊維、アバカ、麦わら、コーンコブ、蒸留かす、木の葉、小麦、ココナッツ繊維、藻類、スイッチグラス、及びこれらの混合物を含む（例えば、Ｗｉｓｅｌｏｇｅｌら、１９９５年、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ」（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅ． Ｗｙｍａｎ編），ｐｐ．１０５−１１８，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ； Ｗｙｍａｎ，１９９４年，「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」５０：３−１６；Ｌｙｎｄ， １９９０年，「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」２４／２５：６９５−７１９；Ｍｏｓｉｅｒら、１９９９年，「Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｙｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｓ， ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｔ．Ｓｃｈｅｐｅｒ， ｍａｎａｇｉｎｇ編，Ｖｏｌｕｍｅ ６５，ｐｐ．２３−４０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【００４５】
セルロース系物質はそのままで、又は当業者に知られている方法で前処理をして用いることができる。例えば、物理的な前処理方法は、粉引き、粉砕、蒸気処理／蒸気噴射、放射能照射、及び水熱処理を含む。化学的な前処理は、希酸、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、及びｐＨ制御した水熱処理処理を含む。生物学的な前処理は、リグニンを溶かすことができる微生物を適用することを含む。前処理は、数分から数時間、例えば、１時間乃至約１２０時間、行う。
【００４６】
１つの態様において、この前処理は、温度を高くして、希酸、濃縮酸、又は希アルカリ溶液を添加することにより行われる。この前処理溶液はヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間、添加され、その後に中和される。
【００４７】
幾つかの態様において、この前処理は、蒸気に曝すこと、パルプ化、研削、酸加水分解、及びこれらの組合せからなる群より選択される。
【００４８】
セルラーゼは、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃で、セルラーゼ系物質と反応させる。幾つかの態様において、酵素はセルラーゼの変性温度又はこの温度付近の温度で基質と反応させる。ｐＨの範囲は、約ｐＨ５、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．０から約ｐＨ８．５の間の範囲である。通常、ｐＨの範囲は約ｐＨ４．０乃至約９．０である。
これらの条件下で細胞をインキュベートすると、セルロース系物質から相当量の可溶性糖類の放出又は分離が生じる。この相当量とは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の可溶性糖類が利用可能となることを意味している。
【００４９】
セルラーゼ処理は、数分間から数時間、例えば、約０．１時間乃至約１２０時間、好ましくは約１２時間乃至約７２時間、より好ましくは約クローン２４時間乃至約４８時間の範囲で行われる。
【００５０】
セルラーゼの量は用いる酵素、反応時間、及び条件に依存している。好ましくは、セルラーゼは約２乃至４０ｍｇ／ｇセルロース系物質の濃度で投与される。
【００５１】
本発明の方法において、セルラーゼは完全セルラーゼ、１つ以上の酵素活性を補った完全セルラーゼ、及びセルラーゼ混合物である。幾つかの態様において、このセルラーゼは完全セルラーゼ調製物である。本明細書において、「完全セルラーゼ調製物」の語は、自然発生の又は非自然発生セルラーゼ含有組成物を意味する。「自然発生組成物」の語は、天然の源により生成されたものであり、１つ以上のセロビオハイドロラーゼタイプ、１つ以上のエンドグルカナーゼタイプ、及び１つ以上のベータグルコシダーゼタイプの成分を含み、これらの各成分が天然に見られる割合と同じ割合で含まれているものを意味する。自然発生組成物は、天然乳気体により生成された酵素成分の割合を変えていない、セルロース分解酵素を修飾していない有機体により生成されたものである。
【００５２】
一般的に、セルラーゼは、（ｉ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、又は１，４−β−ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、（ｉｉ）１，４−β−ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（セロデキストリナーゼとして知られている）（ＥＣ３．２．１．７４）及び１，４−β―ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（エキソーセロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ）（ＥＣ３．２．１．９１）を含むエキソグルカナーゼ、及び（ｉｉｉ）βグルコシダーゼ（ＢＧ）又はβ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．２１）を含むがこれらに限定されない。
【００５３】
本明細書において、セルラーゼはセルロース系物質を加水分解するために用いる任意の微生物から得ることができる。幾つかの態様において、セルラーゼは糸状菌完全セルラーゼである。「糸状菌」の語は、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に分類されている全ての糸状菌を含む。
【００５４】
幾つかの態様において、セルラーゼは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフィソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロルポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）シエレビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の完全セルラーゼである。
【００５５】
幾つかの態様において、このセルラーゼは、アスペルギルスアキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニヂュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギスルオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）完全セルラーゼである。他の側面において、セルラーゼは、フサリウムバクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウムクロクウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウムクルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウムグラニネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウムヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムレチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウムロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウムサムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウムサルコオコラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウムスポロトリキオデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムサルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウムトルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウムトリコセシオデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）又はフサリウムベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。
【００５６】
幾つかの態様において、セルラーゼはトリコデルマレーシＡＴＣＣ５６７６５として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができるトリコデルマレーシＲｕｔＣ３０完全セルラーゼである。
【００５７】
本明細書において、セルラーゼはセルロース系物質を加水分解することができる酵素を発現する、既知の微生物培養方法から得ることができる。発酵は、セルラーゼを発現又は分泌させるのに、好適な培地及び条件を含む、実験室又は工業的発酵における、振とうフラスコ、連続、バッチ、フェドバッチ、又は固形発酵等の小スケール又は大スケールの発酵を含む。
【００５８】
通常、微生物はセルロース形物質を加水分解することができる酵素の生産に適した栄養培養培地中で培養される。培養は、本分野において知られている方法を用いて、炭素及び窒素の源、並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。育成及びセルラーゼ生産に好適な培養培地、温度範囲、及び他の条件は当業者に知られている。非限定的な例としては、トリコデルマレーシによるセルラーゼの生産についての通常用いられる温度は２４℃乃至２８℃である。
【００５９】
特定の糸状菌は、エキソセロビオハイドロラーゼ又はＣＢＨタイプセルラーゼ、エンドグルカナーゼ又はＥＧタイプセルラーゼ、及びベータグルコシダーゼ又はＢＧタイプセルラーゼを含む完全セルラーゼシステクを生産する（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８年）。しかしながら、時々、これらのシステムは、例えば、バクテリアからのセルラーゼがまったく又は少しのＣＢＨタイプセルラーゼしか含まない、ＣＢＨタイプセルラーゼを欠いている。更に、ＥＧ成分とＣＢＨ成分の相互作用によりセルロースを効率的に分解できることが知られている。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５年参照のこと。異なる成分、即ち、複数成分又は完全セルラーゼシステムにおいて、各種エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼは、等電点、分子量、糖化の程度、基質特異性、酵素の作用パターン等の性質が異なっている。
【００６０】
幾つかの態様において、このセルラーゼは発酵、及び／又は最小回収、及び／又は生成することにより生産される。例えば、一旦セルラーゼが細胞培養培地中に分泌されると、このセルラーゼを含む細胞培養培地を用いることができる。幾つかの態様において、完全セルラーゼ調製物は細胞培養培地、細胞外酵素、及び細胞を含む発酵物を含む。代替的に、完全セルラーゼ調製物は沈殿、遠心分離、親和、ろ過、又は当業者に知られている任意の方法により処理することができる。幾つかの態様において、この完全セルラーゼ調製物は、濃縮することができ、その後、他の処理を行わずに用いられる。幾つかの態様において、この完全セルラーゼ調製物は細胞の活性を低める又は細胞を殺す化学薬品を含む。幾つかの態様において、この細胞は当業者に知られている方法を用いて、溶解又は透析される。
【００６１】
高められた量のセロビオハイドロラーゼ及び／又はベータグルコシダーゼを含むセルラーゼはエタノール生産に用いることができる。この方法からの燃料源としてのエタノールは、石油由来製品よりも環境にやさしいので、オクタン価エンハンサーとして、又は有利には直接ガソリンの代わりに用いることができる。エタノールの使用は空気の質を改善し、部分的なオゾンレベル及びスモッグを減らす可能性がある。更に、ガソリンの代わりにエタノールを用いると、非再生エネルギー及び石油供給における突発的な変動による衝撃を和らげることができるので、戦略的には重要である。
【００６２】
エタノールは木、草のような植物、自治体の固形廃棄物、及び農業及び林業からの残り物等のセルロース系バイオマスを糖化及び発酵させて提供することができる。しかしながら、微生物が生産する自然発生セルラーゼ混合物中のセルラーゼ酵素類のそれぞれの割合はバイオマスをグルコースに急速に転換することにおいては、最も効果的ではない。エンドグルカナーゼはセルラーゼを分解してそれ自身がセロビオハイドロラーゼの基質となる新たな鎖を生成し、従って、完全セルラーゼシステムによる加水分解効率を改善することが知られている。それゆえ、高められた又は最適化されたセロビオハイドロラーゼ活性を使用することがエタノール生産を非常に高めることになる。
【００６３】
エタノールはバイオマスの酵素的分解及び放出された糖類をエタノールに転換することにより生産される。この種のエタノールはしばしばバイオエタノール又はバイオ燃料と言われている。この種のエタノールを１％未満から１００％（燃料代替物）までの範囲で、ブレンドして燃料添加物又はエンハンサーとして用いることができる。
【００６４】
高められたセルロース転換率は、例えば、米国特許出願Ｎｏｓ．２００５００５４０３９，２００５００３７４５９，２００６０２０５０４２，２００５００４８６１９Ａ１及び２００６０２１８６７１に記載のＣＢＨポリペプチドを用いて、高められた温度において達成される。ベータグルコシダーゼを発現する方法は当業者に知られている。例えば、米国特許第Ｎｏ．６，０２２，７２５参照のこと、米国特許出願Ｎｏ．２００５５０２１４９２０参照のこと。
【００６５】
幾つかの態様において、セルラーゼはエキソセロビオハイドロラーゼ融合タンパク質であり、好適な例としては、ＣＢＨ１及びアシドアーマスセルロース分解エンドクルカナーゼ又はセルモビフィダフースカエンドグルカナーゼ、ＣＢＨ１及びアシドサーマスセルロース分解エンドグルカナーゼ及び特にアシドサーマスセルロース分解Ｅ１又はＧＨ７４エンドグルカナーゼ（例えば、米国特許出願Ｎｏ．２００６００５７６７２参照）がある。
【００６６】
幾つかの態様において、このセルラーゼ混合物はトリコデルマレーシエンドグルカナーゼ１（ＥＧ１）、トリコデルマレーシセロビオハイドロラーゼ１（ＣＢＨ１）、及びトリコデルマレーシセロビオハイドロラーゼ２（ＣＢＨ２）、フミコーラグリセアセロビオハイドロラーゼ１（ＣＢＨ１）、及びアシドサーマスセルロイティクスエンドグルカナーゼＥ１（Ｅ１）、セルモモノスポラフースカＥ３エンドグルカナーゼ、及びこれらの組合せを含む。
【００６７】
本発明の方法は、化合物、微生物のための発酵原料、タンパク質、有機生産物、化学品、プラスチック、及び他の生産物又は中間体を生産するための誘発剤として、モノサッカライド、ジサッカライド、及びポリサッカライドの生産に用いることができる。特に、（乾燥された蒸留かす、醸造に用いた後の穀物、シュガーコーンバッガス等の）処理残渣の価値をセルロース又はヘミセルロースの部分的な又は完全な可溶化により高めることができる。エタノールに加え、セルロース又はヘミセルロースから生産される幾つかの化学薬品は、アセトン、酢酸、グリシン、リジン、（酪酸等の）有機酸、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリセロール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス、シスムコン酸、動物飼料及びキシロースを含む。
【００６８】
本発明は更に、セルラーゼとセルロース系物質とを組み合わせる工程、このセルロースとセルラーゼ物質の組合せをインキュベートして、加水分解させて、セルロース形物質を可溶性糖類に転換する工程を含む、セルロース系物質をグルコースに転換する方法も提供する。前記可溶性糖類はグルコースを含み、可溶性糖類中のグルコース分画の割合は少なくとも０．７５である。
【００６９】
本発明は更に、セルロース系物質と、エンドグルカナーゼ１を含むセルラーゼ混合物を組み合わせる工程を含む、セルロース系物質をセロビオースに転換する工程も含む。幾つかの態様において、エンドグルカナーゼ１は米国特許第Ｎｏｓ．５，５３６，６５５及び６，０１３，８６０、及び米国特許出願Ｎｏ．２００３／０１０９０１１、２００６／００２６７１５、２００６／００５７６７２に記載のものを含む、アシドフィリスエンドグルカナーゼ１を含む。
【００７０】
幾つかの態様において、本発明の方法は更に、グルコース又は可溶性糖類の量を決定する肯定を含む。
【００７１】
本発明は、セルロース系物質をセルラーゼの組合せにおいて、セルロースが重量により１％乃至３０％となるようにセルロース系物質とセルラーゼを組み合わせる工程、及び前記セルロース系物質とセルラーゼとの組合せを３８℃より高い温度から１００℃で、約０．１時間乃至約９６時間、約ｐＨ４乃至約ｐＨ９の条件でインキュベートして、加水分解により、セルロース系物質の少なくとも２０％を可溶性糖類に転換する工程を含む。この可溶性糖類はグルコースとセロビオースを含み、可溶性糖類中のグルコース分画は少なくとも０．７５である。
【００７２】
本発明は、セルロースが重量により１％乃至３０％となるようにセルロース系物質とエンドグルカナーゼ１を含む酵素混合物と組み合わせる工程、及びこのセルロース系物質とセルラーゼの組み合わせを、約１００℃乃至約２５℃の温度、約０．１時間乃至約９６時間、約ｐＨ４乃至約ｐＨ９でインキュベートして、加水分解によりセルロース系物質の５０％までを可溶性糖類に転換する工程を含む、セルロース系物質をセロビオースに転換する方法を提供する。前記可溶性糖類はグルコース及びセロビオースを含み、この可溶性糖類に対して約０．５未満のグルコース分画を含む。
【００７３】
本発明は更に、以下の実施例おいて詳細に説明されるが、本発明の範囲をこれらに限定することは意図しない。添付の図、明細書及び本発明の説明の主要な部分として考慮される。全ての文献は参照により本明細書に援用される。
【００７４】
本発明の側面は以下で更に詳細に説明されるが、これらに本発明を限定することは意図しない。本発明の精神を逸脱しない範囲での、物質及び方法における変更は当業者に明らかである。
【実施例】
【００７５】
セルロース転換は既知の方法により評価することができる。例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７０−７２：３９５−４０３（１９９８）及び以下を参照のこと。リピーターピペットを用いて、１ウェルあたり１５０マイクロリットルの基質を平底の９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に添加する。２０マイクロリットルの希釈酵素溶液をそのうえから添加する。このプレートをアルミニウムプレートシーラーで覆い、特定の時間、振とうさせながら試験温度でインキュベートした。十分に混合した後、ミリポア９６フィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）を通して、内容物をろ過した。ろ過したものを１００μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ１０を含むプレートに添加して希釈し、ＨＰＬＣで可溶性糖類の量を測定した。Ａｇｉｌｅｎｔ１００シリーズＨＰＬＣは脱灰分／ガードカラム（バイオラド＃１２５−０１１８）及びＡｍｉｎｅｘリードベースド炭化水素カラム（ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｐを設置している。移動相は水で、０．６ｍｌ／分の流速である。
【００７６】
前処理されたコーンストーバー（ＰＣＳ）
Ｓｃｈｅｌｌ，Ｄ．ら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０５：６９−８６（２００３）に記載のように２％ｗ／ｗＨ２ＳＯ３を用いてコーンストーバーを前処理し、脱イオン水を用いてｐＨが４．５になるまで洗浄を行った。酢酸を最終濃度が５０ｍＭになるように添加して、この溶液をｐＨ５．０にした。セルロース濃度は約７％であった。
【００７７】
以下のセルラーゼを用いた。ベータグルコシダーゼ１を過剰発現しているトリコデルマレーシ完全セルラーゼ（ＷＣ−ＢＧＬ１）（例えば、米国特許Ｎｏ．６，０２２，７２５）；ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を過剰発現しているトリコデルマレーシ完全セルラーゼ（例えば、米国特許出願Ｎｏ．２００６／００５７６７２）、トリコデルマレーシセロビオハイドロラーゼ２（ＣＢＨ２）、フミコーラグリセアセロビオハイドロラーゼ１（ＣＢＨ１）、及びアシドサールムスセルロイティカスエンドグルカナーゼＥ１（Ｅ１）、セルモモノスポラフースカＥ３エキソセルラーゼ。酵素の量はセルロース１グラム当りのミリグラム量で示した。結果を図１乃至１２に示した。縦座標は相糖類に対するグルコース分画を示す（重量／重量ベース）。例えば、図１乃至１０（Ａ）において、横座標は転換時間を示し、図１乃至１０（Ｂ）において、横座標は観察された可用性糖類の転換率を示す。（各インキュベーション時間は示していないけれども、インキュベーション時間が長いほど転換率が高くなる。）
【００７８】
図１Ａ乃至Ｂは３８℃（白）及び５３℃（黒）における、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、３．３ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。高いベータグルコシダーゼレベルのトリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００７９】
図２Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、１２ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。高いベータグルコシダーゼレベルのトリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８０】
図３Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、１８ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。高いベータグルコシダーゼレベルのトリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８１】
図４Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、２０ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。高いベータグルコシダーゼレベルのトリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８２】
図５Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、ベータグルコシダーゼを過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、２５ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。高いベータグルコシダーゼレベルのトリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８３】
図６Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、トリコデルマレーシ由来完全セルラーゼ、１２ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。トリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８４】
図７Ａ及びＢは３８℃（白記号）及び５３℃（黒記号）における、ＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を過剰発現しているトリコデルマレーシ由来セルラーゼ、１２ｍｇ／ｇを用いた、希酸前処理されたコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示す。トリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸で前処理したコーンストーバーを３８℃及び５３℃において多くのグルコース分画に転換した。
【００８５】
図８Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１（四角）、あるいはＥ１とハイポクレアグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａＣＢＨ１）（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。Ｅ１を含むセルラーゼ混合物は、酸処理したコーンストーバーをＥＧ１を含む混合物よりも多くのグルコース分画を転換した。
【００８６】
図９Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２（四角）、あるいはＥ１とハイポクレアグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。Ｅ１を含むセルラーゼ混合物は、酸処理したコーンストーバーをＥＧ１を含む混合物よりも多くのグルコース分画を転換した。
【００８７】
図１０Ａ及びＢは、３８℃（白）及び６５℃（黒）において、ＥＧ１とトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１とトリコデルマフースカ（Ｔ．ｆｕｓｃａ）Ｅ３（四角）、あるいはＥ１とハイポクレアグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１とトリコデルマフースカ（Ｔ．ｆｕｓｃａ）Ｅ３（丸）のいずれかの酵素混合物１５ｍｇ／ｇ用いた、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。Ｅ１を含むセルラーゼ混合物は、酸処理したコーンストーバーをＥＧ１を含む混合物よりも多くのグルコース分画を転換した。
【００８８】
図１１Ａ乃至Ｆは、５３℃（白）及び５９℃（黒）において、１日（ＡおよびＢ）、２日（ＣおよびＤ）、３日（ＥおよびＦ）の間のトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）完全セルラーゼによる、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。縦座標は総糖類に対するグルコース分画の割合を示している（重量／重量ベース）（Ａ、Ｂ，及びＥ）。横座標は、用いた酵素の濃度を示している（Ｂ、Ｄ、及びＥ）。横座標は観察された総可溶性糖類の転換率を示している（高い温度において、各濃度は表示していないが、より互い濃度はより多くのグルコースを転換した）。
【００８９】
図１２Ａ乃至Ｆは、５３℃（白）及び５９℃（黒）において、１日（ＡおよびＢ）、２日（ＣおよびＤ）、３日（ＥおよびＦ）の間のＣＢＨ１−Ｅ１融合タンパク質を発現しているトリコデルマレーシ由来の完全セルラーゼによる、希釈酸処理したコーンストーバーの可溶性糖類への転換を示している。縦座標は総糖類に対するグルコース分画の割合を示している（重量／重量ベース）（Ａ、Ｂ，及びＥ）。横座標は、用いた酵素の濃度を示している（Ｂ、Ｄ、及びＥ）。横座標は観察された総可溶性糖類の転換率を示している（高い温度において、各濃度は表示していないが、より互い濃度はより多くのグルコースを転換した）。高い温度において、トリコデルマレーシ完全セルラーゼは酸処理されたコーンストーバーを多くのグルコース分画に転換した。
【００９０】
本明細書で開示する実施例及び態様は例示の目的で示すものであり、本発明の範囲内の各種変更も当業者が行うことができることは理解されている。このような変更は本発明の範囲内である。本明細書で参照される全ての刊行物、特許、特許出願は参照によりその全体を本明細書に援用する。
なお、本願発明は、次の態様を含む。
[１]
セルロース系物質をグルコースに転換する方法であって、
前記セルロース物質とセルラーゼを組合わせて、重量により、１％乃至３０％のセルラーゼを含むセルロース系物質とセルラーゼの組合せを提供する工程、前記セルロース系物質とセルラーゼとの組合せを、約３８℃乃至約１００℃、約ｐＨ４乃至９で、０．１乃至９６時間、インキュベートして、加水分解反応を生じさせ、少なくとも２０％のセルロース系物質を可溶性糖に転換する工程、を含み、
前記可溶性糖がグルコース及びセロビオースを含み、グルコースの分画が前記可溶性糖に対して少なくとも０．７５であることを特徴とする、方法。
[２]
前記セルロース系物質が、生物燃料エネルギーの収穫物、農業の残分、地方自治体の固形廃棄物、産業の固形廃棄物、庭ゴミ、材、林業廃棄物、スイッチグラス、故紙、紙製造からのスラッジ、コーングレーン、コーン穂軸、コーンの殻、コーンストーバー、草、コムギ、小麦わら、干し草、稲ワラ、糖きびバガス、ソーガム、大豆、木、スイッチグラス、干し草、大麦、大麦わら、稲ワラ、および草からなる群より選択される、[１]の方法。
[３]
更に前記セルロース系物質の前処理を含む[１]の方法。
[４]
前記前処理剤処理が、蒸気噴射、パルプ化（蒸解法）、粉砕、酸加水分解、及びこれらの組合せからなる群より選択される、[３]の方法。
[５]
更に、グルコース量を決定する工程を更に含む、[１]の方法。
[６]
可溶性糖の量を決定する工程を更に含む、[１]の方法。
[７]
セルラーゼの量が約２乃至４０ｍｇ／ｇセルロース系物質である、[１]の方法。
[８]
前記セルラーゼが完全セルラーゼを含む、[１]の方法。
[９]
前記完全セルラーゼがトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）完全セルラーゼである、[８]の方法。
[１０]
前記トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が組換酵素を発現する[９]の方法。
[１１]
前記組み換え酵素がベータグルコシダーゼである、[１０]の方法。
[１２]
セルロース系物質をセロビオースに転換する方法であて、
セルロース系物質をエンドグルカナーゼ１を含むセルラーゼ混合物と組み合わせて、セルラーゼを重量により約１％乃至約３０％含む、セルロース系物質と酵素混合物との組合せを提供する工程、及び
前記セルロース系物質とセルラーゼ混合物との組合せを、約１００℃乃至約２５０℃の温度、約４乃至約９のｐＨで約０．１時間乃至約９６時間インキュベートして、加水分解を行い、前記セルロース系物質の５０％までを可溶性糖類に転換する工程を含む方法であって、前記可溶性糖類がグルコースとセロビオースを含み、グルコース分画の可溶性糖類に対する割合が約０．５未満である、方法。
[１３]
前記セルロース系物質が、前記セルロース系物質が、生物燃料エネルギーの収穫物、農業の残分、地方自治体の固形廃棄物、産業の固形廃棄物、庭ゴミ、材、林業廃棄物、スイッチグラス、故紙、紙製造からのスラッジ、コーングレーン、コーンの穂軸、コーンの殻、コーンスチーバー、草、コムギ、小麦わら、干し草、稲ワラ、砂糖きびバガス、ソーガム、大豆、木、スイッチグラス、干し草、大麦、大麦わら、稲ワラ、および草からなる群より選択される、[１]の方法。
[１４]
更にセルロース系物質の前処理工程を更に含む、[１２]の方法。
[１５]
前記前処理剤処理が、蒸気噴射、パルプ化（蒸解法）、粉砕、酸加水分解、及びこれらの組合せからなる群より選択される、[１４]の方法。
[１６]
更に、グルコース量を決定する工程を更に含む、[１２]の方法。
[１７]
可溶性糖の量を決定する工程を更に含む、[１２]の方法。
[１８]
セルラーゼの量が約２乃至４０ｍｇ／ｇセルロース系物質である、[１２]の方法。
[１９]
前記セルラーゼ混合物が更にセロビオハイドロラーゼ１含む、[１３]の方法。
[２０]
前記セルラーゼ混合物がセロビオハイドロラーゼ２１を更に含む、[１３]の方法。
[２１]
前記セルラーゼ混合物が更に、セルモモスポラフースカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｅｒａ ｆｕｓｃａ）Ｅ３を含む[１３]の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月26日(2018.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系物質をグルコースに転換する方法であって、
前記セルロース物質とセルラーゼを組合わせて、重量により、１％乃至３０％のセルラーゼを含むセルロース系物質とセルラーゼの組合せを提供する工程、前記セルロース系物質とセルラーゼとの組合せを、約６０℃乃至約１００℃、約ｐＨ４乃至９で、０．１乃至９６時間、インキュベートして、加水分解反応を生じさせ、少なくとも２０％のセルロース系物質を可溶性糖に転換する工程、を含み、
前記可溶性糖がグルコース及びセロビオースを含み、グルコースの分画が前記可溶性糖に対して少なくとも０．７５であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記セルロース系物質が、生物燃料エネルギーの収穫物、農業の残分、地方自治体の固形廃棄物、産業の固形廃棄物、庭ゴミ、材、林業廃棄物、スイッチグラス、故紙、紙製造からのスラッジ、コーングレーン、コーン穂軸、コーンの殻、コーンストーバー、草、コムギ、小麦わら、干し草、稲ワラ、糖きびバガス、ソーガム、大豆、木、スイッチグラス、干し草、大麦、大麦わら、稲ワラ、および草からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記完全セルラーゼがトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）完全セルラーゼである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が組換酵素を発現する請求項３の方法。
【請求項５】
前記組み換え酵素がベータグルコシダーゼである、請求項４の方法。