(57)【要約】【課題】改良されたグルコースの電気化学的測定方法及びグルコース測定用組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、フラビン化合物を含むグルコース測定用組成物を提供する。また本発明はフラビン化合物を含む電極を提供し、また、そのような電極を有するセンサー及びグルコース燃料電池を提供する。さらに本発明は、フラビン化合物を用いるグルコースの電気化学的測定方法、及び発電方法を提供する。【効果】本発明のフラビン化合物は毒性がないか又は低く、例えば体内埋め込み型の連続グルコース測定に用いることができる。【選択図】図２
2018068287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物、
ただし該組成物は、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
前記グルコース測定用組成物。
【請求項２】
遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む、アノード電極、
ただし該電極は、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
前記アノード電極。
【請求項３】
請求項２に記載のアノード電極、カソード電極、及び、グルコースを含む燃料槽を有する、グルコース燃料電池。
【請求項４】
遊離型のフラビン化合物及び、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを有する、グルコースセンサー、
ただし該センサーは、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、前記センサー。
【請求項５】
フラビン化合物が固相中に固定化されている非酵素型のフラビン化合物である、請求項２に記載の電極、請求項３に記載の電池又は請求項４に記載のセンサー。
【請求項６】
精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが固相中に固定化されている、請求項２又は５に記載の電極、請求項３又は５に記載の電池或いは請求項４又は５に記載のセンサー。
【請求項７】
フラビン化合物が以下の化学式（Ｉ）
【化１】
2018068287.tif 000018
［式中、Ｒ１は存在しないか又は−ＣＨ３、若しくは
【化２】
2018068287.tif 000019
であり、Ｒ１が存在しない場合には、Ｒ１が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しておりかつＲ２はＨであり、
Ｒ２は存在しないか、又はＨであり、Ｒ２が存在しない場合には、Ｒ２が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しており、
Ｒ３は、Ｈ、リン酸基、又は
【化３】
2018068287.tif 000020
である］
で表される化合物である、請求項１に記載の組成物、請求項２、５若しくは６に記載の電極、請求項３、５若しくは６に記載の電池又は請求項４、５若しくは６に記載のセンサー。
【請求項８】
フラビン化合物が、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、ルミクロム、フラビンアデニンジヌクレオチド又はルミフラビンである、請求項１若しくは７に記載の組成物、請求項２、５、６若しくは７に記載の電極、請求項３、５、６若しくは７に記載の電池又は請求項４、５、６若しくは７に記載のセンサー。
【請求項９】
前記(i)において、人工電子メディエーターが、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、チオレドキシン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセン、フェロセン誘導体、及び金属錯体である、
前記(ii)において、非水溶性の電子メディエーターがフェロセン、非水溶性のキノン類、非水溶性のフェナジン類、非水溶性のビオロゲン類、非水溶性のチオレドキシン類、非水溶性のフェノキサジン類、非水溶性のフェノチアジン類、非水溶性のフェレドキシン類、及び非水溶性のフェロセン誘導体である、又は
前記(iii)において、さらに、酸化還元電位が０．２Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
請求項１、７若しくは８に記載の組成物、請求項２、５、６、７若しくは８に記載の電極、請求項３、５、６、７若しくは８に記載の電池又は請求項４、５、６、７若しくは８に記載のセンサー。
【請求項１０】
グルコースを含みうる試料と、遊離型のフラビン化合物と、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程、及び電流を測定する工程を含む、グルコースの電気化学的測定方法、
ただし該方法は、
(i)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から添加しない、
(ii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを外部から添加しない、又は
(iii)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
前記方法。
【請求項１１】
遊離型のフラビン化合物を電子メディエーターとして用いる発電方法であって、アノード及びカソードを使用し、
電解質に接触しているアノードにフラビン化合物を供給し、グルコース燃料を供給する工程を有し、
該アノードが、精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼを有する電極である、該発電方法、
ただし該方法は、
(i)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から添加しない、
(ii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを外部から添加しない、又は
(iii)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
前記方法。
【請求項１２】
該フラビン化合物が固相中に固定化されている非酵素型のフラビン化合物である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが固相中に固定化されている、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
フラビン化合物が以下の化学式（Ｉ）
【化４】
2018068287.tif 000021
［式中、Ｒ１は存在しないか又は−ＣＨ３、若しくは
【化５】
2018068287.tif 000022
であり、Ｒ１が存在しない場合には、Ｒ１が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しておりかつＲ２はＨであり、
Ｒ２は存在しないか、又はＨであり、Ｒ２が存在しない場合には、Ｒ２が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しており、
Ｒ３は、Ｈ、リン酸基、又は
【化６】
2018068287.tif 000023
である］
で表される化合物である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
フラビン化合物が、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、ルミクロム、フラビンアデニンジヌクレオチド又はルミフラビンである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記(i)において、人工電子メディエーターが、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、チオレドキシン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセン、フェロセン誘導体、及び金属錯体である、
前記(ii)において、非水溶性の電子メディエーターがフェロセン、非水溶性のキノン類、非水溶性のフェナジン類、非水溶性のビオロゲン類、非水溶性のチオレドキシン類、非水溶性のフェノキサジン類、非水溶性のフェノチアジン類、非水溶性のフェレドキシン類、及び非水溶性のフェロセン誘導体である、又は
前記(iii)において、さらに、酸化還元電位が０．２Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビン化合物を用いたグルコース酸化還元反応及びフラビン化合物を含む組成物に関する。より詳細には、本発明は、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼのメディエーターとしてフラビン化合物を用いるグルコース測定法に関する。また本発明は、糖尿病の診断試薬として、グルコースセンサーとして、また、グルコース測定キットに有利に利用され得るフラビン化合物を含むグルコース測定用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース測定は、糖尿病患者の血糖値モニタリングなどに用いられる。グルコースの定量には通常、グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤともいう）やグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨともいう）が用いられる。これらは家庭で使用できる血中グルコース濃度の自己測定（ＳＭＢＧ）装置や、持続血糖測定（ＣＧＭ又はＦＧＭともいう）装置に用いられている。
【０００３】
グルコースオキシダーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−１，５−ラクトン（グルコノラクトン）へ酸化する反応を触媒する酸化還元酵素である。グルコースオキシダーゼは酸素を電子受容体とし、また補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いる。
【０００４】
グルコースデヒドロゲナーゼは酸化還元酵素に分類され、グルコース及び電子アクセプターを基質とし、グルコノラクトン及び還元型アクセプターを生成する反応を触媒する。グルコースデヒドロゲナーゼとしてはニコチンアミドジヌクレオチド依存性ＧＤＨ、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸依存性ＧＤＨ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性ＧＤＨ、ＦＡＤ依存性ＧＤＨ（フラビン結合型ＧＤＨ）等が挙げられる。
【０００５】
グルコース測定にＧＯＤを用いる際、過酸化水素電極を使用することができる。この方法では、過酸化水素電極に＋０．６Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）〜＋０．９Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、グルコースからグルコノラクトンが生じる際に生成する過酸化水素を測定する。この方法は主としてＳＭＢＧやＣＧＭに用いられている。しかしながらこの方法は比較的高い電圧を印加するため、測定溶液に含まれるアスコルビン酸などの夾雑物質の影響を受けるという問題があった。
【０００６】
そこで過酸化水素に代えて人工電子メディエーター（以下、単にメディエーターともいう）を用いる方法が開発された。この方法では、酵素的にグルコースがグルコノラクトンへと変換される際に、酸化型メディエーターが還元型となる。そして還元型メディエーターが電極に電子を受け渡し、酸化型に戻る。メディエーターを用いる方法の利点として印加電圧を過酸化水素電極の場合と比較して低くすることができる。しかし、従来のメディエーターは高価であったり毒性であるという問題があった。例えば典型的なメディエーターであるフェリシアン化カリウム等の金属錯体はヒトの体内に入ると有害である。
【０００７】
その他の従来のメディエーターとしては、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセンまたはフェロセン誘導体、オスミウム錯体などが知られていた。
【０００８】
ＧＯＤやＧＤＨは、補因子ＦＡＤが酵素分子の内部に埋没していることが多いため、これらをグルコース測定に用いる場合には通常、メディエーターが存在しないと電極へと電子を受け渡すことができない。ところがメディエーターは高価であり、また、電極表面に固定化するのが困難である。例えば糖尿病患者のグルコース測定において、メディエーターを電極に固定化せずにＣＧＭ機器やＦＧＭ機器に用いようとすると、測定溶液中に存在するメディエーターが体内へ流入する可能性があるが、メディエーターは多くの場合、生体適合性を有しない又は毒性であり、これが体内へ流入することは望ましくない。そのため、従来のメディエーターを用いるグルコース測定法はＣＧＭやＦＧＭの機器には向いておらず、メディエーターが体内へ流入しないような工夫が別途必要となる。
【０００９】
特許文献１は、試薬の保存期間の前後で電流値の変化が抑制されるメディエーター化合物を記載している。
特許文献２は酸化還元酵素を用いたバイオセンサを記載している。メディエーター化合物としてはフェロシアン化合物等が用いられている。
特許文献３は電子移動剤を用いる酸化還元反応を記載している。
【００１０】
燃料電池への関心が高まっているが、従来の燃料電池は白金を使用することが多く、また電子伝達メディエーターとしてオスミウム錯体等の人工化合物が使用されることが多かった。白金は高価であり、また人工化合物は毒性であるなど廃棄処理コストを伴う。そのような中で、白金の代わりに酵素電極を用いた燃料電池が報告されている（例えば特許文献４）。特許文献４で使用されているメディエーターは金属錯体である。
【００１１】
ＦＡＤ依存性ＧＤＨ（フラビン結合型ＧＤＨ）は、それをコードするｍＲＮＡからポリペプチドが合成されフォールディングする際、ＦＡＤ結合部位にＦＡＤが取り込まれることが知られている。したがって活性を有するＦＡＤ依存性ＧＤＨはＦＡＤと非共有結合的に結合している（ホロ酵素）。また、ＦＡＤと結合していないＦＡＤ依存性ＧＤＨは安定に存在しないことが知られている（アポ酵素）。一方、ＮＡＤ依存性ＧＤＨは、アポ酵素としても存在でき、活性を示すにはＮＡＤを外部から添加する必要がある。ＦＡＤ依存性ＧＯＤは、一般に、タンパク質発現時にＦＡＤ結合部位にＦＡＤが取り込まれることが知られている。ただし、一部、アポ型として存在するものもあり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４２９０３号
【特許文献２】特表２００７−５０９３５５号（特許第４８３９２１９号）
【特許文献３】特開平１−３１７４２５号（特許第３０７１７９０号）
【特許文献４】特開２００８−７１５８４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ある実施形態において本発明は、上記の問題を解消しうる、グルコースの電気化学的測定方法及びグルコース測定用組成物を提供することを課題とする。別の実施形態において本発明は、改良されたグルコース燃料電池及び発電方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、フラビン化合物が、酵素により触媒されるグルコースの酸化還元反応に関し、驚くべきことにメディエーターとして機能しうることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、化合物にはそれぞれ固有の酸化還元電位があり、一般的には遊離型のフラビン化合物の酸化還元電位の方が、フラボタンパク質中のフラビン化合物の酸化還元電位よりもマイナス側にある（酸化還元電位が低い）。例えば遊離型ＦＡＤの酸化還元電位（−０．２１９Ｖ（ｖｓ．  ＮＨＥ））はフラボタンパク質中のＦＡＤの酸化還元電位（〜０  Ｖ（ｖｓ．  ＮＨＥ））よりも低電位側にある（ヴォート生化学（上）第２版、第１５章参照）。このような場合、理論上、酸化還元電位の高い化合物から低い化合物へと電子が移動することはないと考えられる。ところが本発明において、フラボタンパク質と遊離型のフラビン化合物とを混合した系について電気化学的測定を行ったところ、電流が観察された。これは上記に鑑みれば驚くべき知見である。
【００１６】
本発明は以下を包含する。
[１]  遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物、
ただし該組成物は、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
前記グルコース測定用組成物。
[２]  遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む、アノード電極、
ただし該電極は、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
前記アノード電極。
[３]  ２に記載のアノード電極、カソード電極、及び、グルコースを含む燃料槽を有する、グルコース燃料電池。
[４]  遊離型のフラビン化合物及び、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを有する、グルコースセンサー、
ただし該センサーは、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、前記センサー。
[５]  フラビン化合物が固相中に固定化されている非酵素型のフラビン化合物である、２に記載の電極、３に記載の電池又は４に記載のセンサー。
[６]  精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが固相中に固定化されている、２又は５に記載の電極、３又は５に記載の電池或いは４又は５に記載のセンサー。
[７]  フラビン化合物が以下の化学式（Ｉ）
【化１】
2018068287.tif 000003
［式中、Ｒ１は存在しないか又は−ＣＨ３、若しくは
【化２】
2018068287.tif 000004
であり、Ｒ１が存在しない場合には、Ｒ１が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しておりかつＲ２はＨであり、
Ｒ２は存在しないか、又はＨであり、Ｒ２が存在しない場合には、Ｒ２が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しており、
Ｒ３は、Ｈ、リン酸基、又は
【化３】
2018068287.tif 000005
である］
で表される化合物である、１に記載の組成物、２、５若しくは６に記載の電極、３、５若しくは６に記載の電池又は４、５若しくは６に記載のセンサー。
[８]  フラビン化合物が、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、ルミクロム、フラビンアデニンジヌクレオチド又はルミフラビンである、１若しくは７に記載の組成物、２、５、６若しくは７に記載の電極、３、５、６若しくは７に記載の電池又は４、５、６若しくは７に記載のセンサー。
[９]  前記(i)において、人工電子メディエーターーが、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、チオレドキシン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセン、フェロセン誘導体、及び金属錯体である、
前記(ii)において、非水溶性の電子メディエーターーがフェロセン、非水溶性のキノン類、非水溶性のフェナジン類、非水溶性のビオロゲン類、非水溶性のチオレドキシン類、非水溶性のフェノキサジン類、非水溶性のフェノチアジン類、非水溶性のフェレドキシン類、及び非水溶性のフェロセン誘導体である、又は
前記(iii)において、さらに、酸化還元電位が０．２Ｖ以上の電子メディエーターを含まない、
１、７若しくは８に記載の組成物、２、５、６、７若しくは８に記載の電極、３、５、６、７若しくは８に記載の電池又は４、５、６、７若しくは８に記載のセンサー。
[１０]  グルコースを含みうる試料と、遊離型のフラビン化合物と、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程、及び電流を測定する工程を含む、グルコースの電気化学的測定方法、
ただし該方法は、
(i)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から添加しない、
(ii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを外部から添加しない、又は
(iii)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
前記方法。
[１１]  遊離型のフラビン化合物を電子メディエーターとして用いる発電方法であって、アノード及びカソードを使用し、
電解質に接触しているアノードにフラビン化合物を供給し、グルコース燃料を供給する工程を有し、
該アノードが、精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼを有する電極である、該発電方法、
ただし該方法は、
(i)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から添加しない、
(ii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを外部から添加しない、又は
(iii)   単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
前記方法。
[１２]  該フラビン化合物が固相中に固定化されている非酵素型のフラビン化合物である、１０又は１１に記載の方法。
[１３]  精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが固相中に固定化されている、１０〜１２のいずれかに記載の方法。
[１４]  フラビン化合物が以下の化学式（Ｉ）
【化４】
2018068287.tif 000006
［式中、Ｒ１は存在しないか又は−ＣＨ３、若しくは
【化５】
2018068287.tif 000007
であり、Ｒ１が存在しない場合には、Ｒ１が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しておりかつＲ２はＨであり、
Ｒ２は存在しないか、又はＨであり、Ｒ２が存在しない場合には、Ｒ２が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しており、
Ｒ３は、Ｈ、リン酸基、又は
【化６】
2018068287.tif 000008
である］
で表される化合物である、１０〜１３のいずれかに記載の方法。
[１５]  フラビン化合物が、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、ルミクロム、フラビンアデニンジヌクレオチド又はルミフラビンである、１０〜１４のいずれかに記載の方法。
[１６]  前記(i)において、人工電子メディエーターが、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、チオレドキシン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセン、フェロセン誘導体、及び金属錯体である、
前記(ii)において、非水溶性の電子メディエーターがフェロセン、非水溶性のキノン類、非水溶性のフェナジン類、非水溶性のビオロゲン類、非水溶性のチオレドキシン類、非水溶性のフェノキサジン類、非水溶性のフェノチアジン類、非水溶性のフェレドキシン類、及び非水溶性のフェロセン誘導体である、又は
前記(iii)において、さらに、酸化還元電位が０．２Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない、
１０〜１５のいずれかに記載の方法。
【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−２０５８８９号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のフラビン化合物は、フェリシアン化カリウムのような従来のメディエーターと異なり、一般的には生体内に存在するものであり生体適合性が高く、人体に対する毒性がないか又は毒性が低いと考えられる。そのため、本発明のフラビン化合物を含む組成物や該フラビン化合物を用いる測定方法は、体内埋め込み型の連続グルコース測定に用いることができる。また本発明のフラビン化合物はグルコース燃料電池に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＡｔＧＬＤ及び種々のフラビン化合物を用いた場合の応答電流を示す。
【図２】ＧＬＤ１及び種々のフラビン化合物を用いた場合の応答電流を示す。
【図３】ＧＯＤ及び種々のフラビン化合物を用いた場合の応答電流を示す。
【図４】ＭｐＧＤＨ及び種々のフラビン化合物を用いた場合の応答電流を示す。
【図５】種々の濃度のグルコースを含む試料について、ＧＬＤ１及びＦＭＮを用いた場合の応答電流を示す。
【図６】種々の濃度のグルコースを含む試料について、ＧＤＨ−Ｍ２及びＦＭＮを用いた場合の応答電流を示す。
【図７】種々の濃度のグルコースを含む試料について、ＧＬＤ１及びＦＡＤを用いた場合の応答電流を示す。
【図８】種々の濃度のグルコースを含む試料について、ＧＤＨ−Ｍ２及びＲＦを用いた場合の応答電流を示す。
【図９】種々の濃度のグルコースを含む試料について、ＧＬＤ１及びＬＣを用いた場合の応答電流を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（フラビン化合物及びフラビン化合物を含む組成物）
ある実施形態において本発明はフラビン化合物を提供する。別の実施形態において本発明はフラビン化合物を含むグルコース測定用組成物を提供する。本発明のフラビン化合物は、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼにより触媒されるグルコース酸化還元反応において、メディエーターとして機能する。メディエーターとして機能するとは、フラビン化合物が電子移動に与ることをいい、例えば電極を用いる系では、本発明のフラビン化合物は、ＧＯＤ又はＧＤＨから電子を受け取って還元型となり、電極に電子を渡して酸化型に戻る。このような観点から、本発明のフラビン化合物のことを電子移動媒介剤と呼ぶこともできる。本明細書においてこれらの用語は同義とする。
【００２１】
ＦＡＤ依存性の、ＧＯＤやＧＤＨは、補酵素であるフラビン系化合物ＦＡＤと共にホロ酵素を形成する。本明細書においてＧＯＤという場合、特に断らない限り、これはＦＡＤ依存性ＧＯＤをいうものとする。本明細書においてＧＤＨという場合、特に断らない限り、これはＦＡＤ依存性ＧＤＨをいうものとする。ホロ酵素においてＦＡＤは非共有結合により酵素と複合体を形成しており、通常、酵素中に埋没している。すなわちホロ酵素に含まれるＦＡＤは、溶液中に遊離していない。補酵素を有しないＧＯＤやＧＤＨはアポ酵素と呼ばれグルコースに対する活性を示さない。本明細書において本発明のフラビン化合物というとき、これはホロ酵素中に含まれる補酵素を包含しないものとする。すなわち本発明のフラビン化合物は酵素から遊離している状態で存在する。特に断らない限り、本明細書において本発明のフラビン化合物というとき、これは遊離状態のフラビン化合物、遊離型のフラビン化合物をいうものとする。また、その裏返しとして、ＧＯＤやＧＤＨのホロ酵素中に含有される補酵素ＦＡＤは、本明細書にいう「本発明のフラビン化合物」に該当しない。
【００２２】
なお、ある実施形態において、本発明のフラビン化合物は、電極表面など固相中に固定化して使用することができる。このような場合にも、当該固定化されたフラビン化合物は、ホロ酵素中に含まれておらず、ＧＯＤやＧＤＨ酵素と独立して存在する。したがって、このような固定化されたフラビン化合物も、便宜上、本明細書において、「遊離型のフラビン化合物」との用語に包含されるものとする。また、このようなＧＯＤやＧＤＨ酵素と独立して存在するフラビン化合物を、非酵素型フラビン化合物、非酵素結合型フラビン化合物、ということがある。非酵素型フラビン化合物や非酵素結合型フラビン化合物もまた、固相中に固定化されていてもよい。
【００２３】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物は下記の一般式Ｉの化合物でありうる：
【化７】
2018068287.tif 000009
［式中、Ｒ１は存在しないか又は−ＣＨ３、若しくは
【化８】
2018068287.tif 000010
であり、Ｒ１が存在しない場合には、Ｒ１が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しておりかつＲ２はＨであり、
Ｒ２は存在しないか、又はＨであり、Ｒ２が存在しない場合には、Ｒ２が連結して描かれている窒素原子は隣接炭素原子との間に二重結合を形成しており、
Ｒ３は、Ｈ、リン酸基、又は
【化９】
2018068287.tif 000011
である］。
【００２４】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物はリボフラビン（ＲＦ）である（ＣＡＳ  ８３−８８−５）。 
【化１０】
2018068287.tif 000012
【００２５】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物はフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）である（ＣＡＳ  １４６−１７−８）。
【化１１】
2018068287.tif 000013
【００２６】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物はルミクロム（ＬＣ）である（ＣＡＳ  １０８６−８０−２）。
【化１２】
2018068287.tif 000014
【００２７】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物はフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である（ＣＡＳ  １４６−１４−５）。
【化１３】
2018068287.tif 000015
【００２８】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物はルミフラビン（ＬＦ）である（ＣＡＳ  １０８８−５６−８）。
【化１４】
2018068287.tif 000016
【００２９】
フラビン化合物には、一般に、３種の酸化還元状態及び３種のイオン化状態があることが知られている。上記の化学式では、本発明のフラビン化合物を、中性型で酸化型の形態で記載した。しかしながらこの形態のみならず、本発明のフラビン化合物は、酸化型（キノン型）、セミキノン型、又は還元型（ヒドロキノン型）であり得る。また、本発明のフラビン化合物は、中性型、又はアニオン型でありうる。便宜上、本発明のフラビン化合物、例えば上記化学式で表される本発明のフラビン化合物という場合、これは、中性型、又はアニオン型の、酸化型、セミキノン型、又は還元型の形態のものを包含するものとする。例えば、測定系に、本発明のフラビン化合物として中性型で酸化型の化合物を添加した後、溶液のｐＨやプロトン授受によりそれが酸化型でアニオン型の化合物に変化することがあり得るが、そのような化合物も本発明のフラビン化合物に包含されるものとする。
【００３０】
本発明のフラビン化合物は、人工合成してもよく、天然物を取得してもよい。また市販されているものであってもよい。
【００３１】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物は、グルコースデヒドロゲナーゼと共に使用しうる（ＦＡＤ依存性ＧＤＨ）。別の実施形態において、本発明のフラビン化合物は、グルコースオキシダーゼと共に使用しうる（ＦＡＤ依存性ＧＯＤ）。別の実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物は、グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼをさらに含む。ＧＤＨ又はＧＯＤは溶液中に遊離していてもよく、固相に固定化された状態でもよい。ＧＤＨ又はＧＯＤは、単独で存在してもよく、別の化合物やタンパク質、例えば酵素や抗体に連結されたものでもよい。
【００３２】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物は、
(i)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを含まない、
(ii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを含まない、又は
(iii)  外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを含まない。ある実施形態において、本発明の電極及び本発明のセンサーについても同様である。なお、本明細書では特に断らない限り、酸化還元電位は、銀塩化銀電極を基準としたものとする。
【００３３】
また、ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を用いたグルコースの電気化学的測定方法及び発電方法は、
(i)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から添加しない、
(ii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる非水溶性の電子メディエーターを外部から添加しない、又は
(iii)  単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上の電子メディエーターを外部から添加しない。なおここでいう外部から添加とは、測定直前や測定中の添加も、測定試薬調製における添加も包含する。
【００３４】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物、電極、及びセンサーは、外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０．３Ｖ以上、０．２Ｖ以上、０．１Ｖ以上、または０Ｖ以上、０．８Ｖ以下、０．７Ｖ以下、０．６Ｖ以下の電子メディエーターを含まない。別の実施形態では、本発明のフラビン化合物を含む組成物、電極、及びセンサーは、外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、酸化還元電位が０〜０．８Ｖ、０〜０．７Ｖ、０〜０．６Ｖ、０．１〜０．７Ｖ、０．２〜０．６Ｖ、０．３〜０．８Ｖ、０．３〜０．７Ｖ、０．３〜０．６Ｖの電子メディエーターを含まない。ある実施形態において本発明のフラビン化合物を用いる方法についても同様にこれらは除外される。
【００３５】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物、電極、及びセンサーは、外部から添加される、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる、非水溶性の電子メディエーターを含まない。非水溶性の電子メディエーターとしては、フェロセン、非水溶性のキノン類、例えばフェナントロリンキノン、非水溶性のフェナジン類、例えばフェナジン、非水溶性のビオロゲン類、非水溶性のチオレドキシン類、非水溶性のフェノキサジン類、非水溶性のフェノチアジン類、非水溶性のフェレドキシン類、及び非水溶性のフェロセン誘導体等が挙げられるがこれに限らない。ある実施形態において本発明のフラビン化合物を用いる方法についても同様にこれらは除外される。
【００３６】
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物、電極、及びセンサーは、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる従来の人工電子メディエーターを含まない。ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を用いる方法についても同様にこれらは除外される。単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる従来の人工電子メディエーターとしては、系に人工的に外部から添加される、フェリシアン化カリウム、キノン類、アントラキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類、チオレドキシン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセンまたはフェロセン誘導体、オスミウム錯体、コバルト錯体、ルテニウム錯体、鉄錯体、バナジウム錯体などの金属錯体であって、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできるものが挙げられる。これらの化合物や誘導体は、スルホニル基、スルホ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、ヒドロキシ基、アルキル基（例えばＣ１〜Ｃ１６アルキル、例えばメチル基）、アルコキシル基、アシル基、シアノ基、ハロゲン基などの官能基を一又は複数、有しうる。具体的な電子メディエーター化合物としては、例えば１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸、フェロセンカルボキシアルデヒド、ベンゾキノン、ヒドロキノン、フェリシアン／フェロシアン化物（K若しくはNa塩、例えばフェリシアン化カリウム）、フェリシニウム／フェロセン、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、クロラニル(Chloranil)、ブロマニル（Bromanyl）、フェナントロリンキノン、アントラキノン、オクタシアノタングステン酸イオン、オクタシアノモリブデン酸イオン、[Ni(PQ3)]2+イオン、例えば[Ni(PQ3)]Cl2、[Ni(PQ)3]Br2、[Os(dmo)2(1-ビニルイミダゾール)X]X、[Os(dmo)2(1-ビニルイミダゾール)X]X2、[Os(dmo)2(イミダゾール)X]X、[Os(dmo)2(イミダゾール)X]X2、[Os(dmo)2(1-メチルイミダゾール)X]X2、及び[Os(dmo)2(メチルイミダゾール)X]X2（これらの化合物においてdmoは4,4′-ジメトキシ-2,2′-ビピリジンであり、Xはハロゲンである）であって、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできるもの等が挙げられる。
【００３７】
ある実施形態において、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターは、フェリシアン化カリウム、フェロセン、[Ni(PQ3)]Cl2、及び[Ni(PQ)3]Br2である。したがって、ある実施形態において、本発明のフラビン化合物を含む組成物、電極、及びセンサーは、フェリシアン化カリウム、フェロセン、[Ni(PQ3)]Cl2、及び[Ni(PQ)3]Br2を含まない。またある実施形態において、本発明の方法ではこれらは添加されない。
【００３８】
ルテニウム錯体を単独の電子メディエーターとした場合、所定の電位を印加しても、ＦＡＤ依存性ＧＤＨはルテニウム錯体から電子を受け取らないことが知られている。一方で、ルテニウム錯体及びＦＡＤ依存性ＧＤＨを含む系に１−ｍＰＭＳを添加すると、所定の電位を印加した場合、ルテニウム錯体が電子を受け取ることができるようになることが知られている（特開2013-083634参照）。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ルテニウム錯体とＦＡＤ依存性ＧＤＨ間における相互作用により、ＧＤＨに含有されているＦＡＤに、ルテニウム錯体が電子を受け取ることができる程度に十分に近接することができないと考えられる。そのため、ルテニウム錯体を単独の電子メディエーターとしてＦＡＤ依存性ＧＤＨと共に使用した場合、所定の電位を印加しても応答電流が観測されないものと考えられる。他方で、この系に単独で電子をＦＡＤ依存性ＧＤＨから直接受け取ることのできる別の人工電子メディエーターである１−ｍＰＭＳが存在すると、まず、１−ｍＰＭＳがＦＡＤ依存性ＧＤＨから電子を受け取り、次いでルテニウム錯体に電子を受け渡すと考えられる。このとき、単独の電子メディエーターとしてのルテニウム錯体及びＦＡＤ依存性ＧＤＨを含む系にあっては、ルテニウム錯体は、本明細書にいう「単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーター」に該当しない。しかしながら、系に１−ｍＰＭＳがさらに存在するとルテニウム錯体は電子を受け取ることができるようになる。そのため、電子メディエーターとして１−ｍＰＭＳ及びルテニウム錯体を含み、ＦＡＤ依存性ＧＤＨを含む系にあっては、１−ｍＰＭＳ及びルテニウム錯体の組み合わせは、電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることができる。このとき、１−ｍＰＭＳの代わりに本発明のフラビン化合物を用いると、ＦＡＤ依存性ＧＤＨから溶液中に存在する遊離型のフラビン化合物が電子を受け取り、次いで該フラビン化合物が該電子をルテニウム錯体に受け渡すことができるようになると考えられる。ある実施形態において、本発明は、このような電子メディエーターと本発明のフラビン化合物の組み合わせを含む。すなわち、ある実施形態において、本発明のグルコース測定用組成物は、遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又は精製されたＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、単独では電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることができないが、本発明のフラビン化合物との共存下では、本発明のフラビン化合物から電子を受け取ることのできるルテニウム錯体、例えばヘキサアンミンルテニウムを含む。また、逆にいうと、このような電子メディエーターと本発明のフラビン化合物の組み合わせは本発明から除外されない。したがって、本発明の組成物からは、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターは除かれるが、ＦＡＤ依存性���ルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから電子を受け取った遊離型の本発明のフラビン化合物から電子をさらに受け取ることのできる従来の人工電子メディエーターは除かれない（本発明に含まれる）。別の言い方をすると、本発明の組成物からは、単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから直接受け取ることのできる人工電子メディエーターは除かれる。本発明の電極、センサー、方法についても同様である。
【００３９】
なお、上記において、組成物または測定系に外部から添加される、とは、グルコース濃度測定において、応答電流に影響を及ぼしうる濃度での添加をいう（グルコース測定上有効な量での添加）。例えばグルコース濃度測定において、応答電流に影響を及ぼさない程度の微少量の人工電子メディエーターを外部から本発明の組成物に添加したとしても、それは本発明の組成物を用いたグルコース濃度測定に何ら影響を及ぼすものではなく、したがって本発明に包含される。また、本発明の組成物が、外部添加される人工電子メディエーターを含まない、とは、外部添加される人工電子メディエーターを実質的に含まないことを意味し、すなわち、応答電流に影響を及ぼさない程度の微少量の人工電子メディエーターを含んでもよいが、応答電流に影響を及す実質的な量の人工電子メディエーターは含まないことをいう。したがってある実施形態において、応答電流に影響を及す実質的な量の単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを含む組成物は本発明から除かれる。また、人体に関連するグルコース濃度測定において、人体に悪影響を及ぼさず許容される量であって、応答電流に影響を及ぼさない程度のごく微少量の単独で電子をＦＡＤ依存性グルコースオキシダーゼ又はＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼから受け取ることのできる人工電子メディエーターを外部から本発明の組成物に添加したとしても、それは本発明の組成物を用いたグルコース濃度測定に何ら影響を及ぼすものではなく、したがって本発明に包含される。本発明の電極、センサー、及び方法についても同様である。
【００４０】
本発明者は、以前にＦＡＤ依存性ＧＤＨをシトクロムと連結した融合タンパク質について報告した（国際公開第2017/094776号)。当該文献では融合タンパク質は、Cytb-GDHやGDH-Cytbと表記されている。ある実施形態では、ＦＡＤ依存性ＧＤＨとしてこのような融合タンパク質を使用しうる。このとき、融合タンパク質（Cytb-GDH等）に包含されるシトクロム部分は、融合タンパク質の一部であって、本明細書にいう、外部から添加されるシトクロムに該当しない。したがってある実施形態では、遊離型のフラビン化合物を含み、精製されたグルコースデヒドロゲナーゼ−シトクロム融合タンパク質を含む、グルコース測定用組成物が提供され、ただし、この組成物は外部から添加されるシトクロムを含まない。
【００４１】
（ＧＤＨ又はＧＯＤの固定化方法）
ＧＤＨやＧＯＤは任意の公知の方法により固相に固定化されうる。例えばＧＤＨやＧＯＤをビーズや膜、電極表面に固定化してもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＧＯＤ又はＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。固定化するＧＤＨやＧＯＤの量は、電気化学的測定或いは燃料電池発電に必要な電流を生じうる量とすることができ、適宜決定しうる。
【００４２】
（本発明のフラビン化合物の固定化方法）
ある実施形態において、本発明のフラビン化合物は、溶液中に単独で存在していてもよく、また、ビーズや膜、電極表面等の固相に固定化されていてもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。固定化するフラビン化合物の量は、電気化学的測定或いは燃料電池発電に必要な電流を生じうる量とすることができ、適宜決定しうる。
【００４３】
ある実施形態では、本発明のフラビン化合物が固定化され、さらにＧＤＨ又はＧＯＤが固定化されていてもよい。この場合、これらは同一又は異なる方法により固定化されていてもよい。
【００４４】
試料溶液に添加する本発明のフラビン化合物の終濃度は特に限定されず、例えば、０．０１〜２００ｍＭ、０．０２〜１５０ｍＭ、０．０３〜１００ｍＭ、０．０４〜８０ｍＭ、０．０５〜６０ｍＭ、０．０６〜５０ｍＭ、０．０８〜４０ｍＭ、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、０．１５〜２０ｍＭ、０．２〜１０ｍＭ、０．３〜５ｍＭ、０．４〜３ｍＭ、例えば０．０５〜１０ｍＭの範囲であり得る。試料溶液に添加する本発明のフラビン化合物の終濃度は特に限定されず、例えば０．００１〜５％（ｗ／ｖ）、０．００３〜３％（ｗ／ｖ）、０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、０．０２〜０．３％（ｗ／ｖ）、０．０３〜０．１％（ｗ／ｖ）であり得る。なお、フラビン化合物と他の酵素や試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
【００４５】
フラビン化合物をＧＯＤと共に使用する場合、試料に含まれる又は試料中に生成すると推定される還元型のメディエーターの濃度範囲に対応して、電気化学的測定用試薬の各成分の濃度を調節することができる。
【００４６】
特に断らない限り、本発明の組成物に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースオキシダーゼは、精製された酵素である。ＧＯＤ又はＧＤＨを含む細胞抽出物や細胞破砕液、粗酵素抽出液は、ＧＯＤやＧＤＨ以外にも様々な夾雑物質を含む。例えば微生物では粗酵素抽出液中のリボフラビン量は約５３〜１３３μＭとの報告がある（Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９９９，２２，ｐｐ．８−１８）。このような粗酵素抽出液等は、そのまま電気化学的測定に供すると、夾雑物質が電子を受け取るなどして電極への電子の授受が妨害されるため、粗酵素抽出液において、このリボフラビン濃度では正確な電気化学的測定は困難である。そこで本発明の電気化学的グルコース測定法では、夾雑物質が除去されたＧＯＤ又はＧＤＨを使用する。本明細書においてＧＯＤ又はＧＤＨが精製されている、又は精製酵素である、とは、必ずしもタンパク質が純品である必要はなく、グルコースの電気化学的測定が可能な程度に酵素標品から夾雑物質が除去されていることをいう。
【００４７】
（グルコースデヒドロゲナーゼ）
グルコースデヒドロゲナーゼは天然に広く存在し、微生物や動植物起源の酵素を探索することにより得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは例えば、ケカビ亜門、ケカビ綱、ケカビ目、ケカビ科に分類される微生物、例えばムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属などの生物種に由来するＧＤＨまたはその改変体であり得る。
【００４８】
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物としては、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコール・サブチリスマス（Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）、ムコール・ギリエルモンディ（Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属の微生物としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、アブシジア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属微生物としては、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）を挙げることができる。カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属の微生物としては、シルシネラ・シンプレックス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、シルシネラ属種（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シルシネラ・アンガレンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ａｎｇａｒｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・シネンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｌａｃｒｙｍｉｓｐｏｒａ）、シルシネラ・マイナー（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ）、シルシネラ・ムコロイデス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ）、シルシネラ・リジダ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ）、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）及びシルシネラ・ムスカエ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ）を挙げることができる。ある実施形態において、ＧＤＨはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のものでありうる。ある実施形態において、ＧＤＨはＢＢＩ社の製品コードＧＬＤ１のＧＤＨでありうる（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）。ある実施形態においてＧＤＨはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＧＤＨでありうる（特許第５０２００７０号参照）。
【００４９】
（グルコースオキシダーゼ）
グルコースオキシダーゼは天然に広く存在し、微生物や動植物起源の酵素を探索することにより得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。本発明のグルコースオキシダーゼは例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ミツバチ（Ａｐｉｓ）属、ムコール属、フザリウム属、ストレプトマイセス属、タラロマイセス属などの生物種に由来するＧＯＤまたはその改変体であり得る。ある実施形態において、ＧＯＤは東洋紡社のカタログ番号ＧＬＯ−２０１のものでありうる（アスペルギルス属由来）。なお、ＧＬＯ−２０１の製品カタログの構造（Structure）の欄には、２モルのＦＡＤを伴った糖タンパク質（Glycoprotein with 2 moles of FAD）とあり、これはホロ酵素である。
【００５０】
（ＧＯＤ又はＧＤＨ遺伝子）
ＧＯＤ又はＧＤＨをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、ＧＯＤ又はＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００５１】
次いで、ＧＯＤ又はＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成し、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００５２】
ＧＤＨをコードする遺伝子としては公知のあらゆる遺伝子が使用可能であり、例えばＭｕｃｏｒ属由来のＧＤＨ遺伝子（特許第４６４８９９３号に記載のもの）が挙げられる。この遺伝子を改変したものを用いてもよく、例えば国際公開第２０１２／１６９５１２号及び国際公開第２０１５／０９９１１２号に記載の改変遺伝子などが挙げられる。また特許第４６４８９９３号に記載のＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来のＧＤＨ（ＭｐＧＤＨともいう）にＴ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔ変異を導入した変異体を用いてもよい。またＧＤＨをコードする遺伝子の例として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のＧＤＨ遺伝子（ＡｔＧＬＤ）が挙げられる（特許第５０２００７０号）。
【００５３】
ＧＯＤをコードする遺伝子としては公知のあらゆる遺伝子が使用可能であり、例えばアスペルギルス属由来のＧＯＤ遺伝子が挙げられる。遺伝子は改変されたものでもよい。
【００５４】
これらの遺伝子は、各種ベクターに連結または挿入してもよく、染色体やゲノムに組み入れてもよい。ベクターを用いる場合、ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）やＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
【００５５】
（ＧＯＤ又はＧＤＨの製造）
ＧＯＤ又はＧＤＨは、上述のように取得した形質転換細胞を培養し、前記細胞中に含まれるＧＯＤ又はＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物から発現タンパク質を単離することにより製造すればよい。
【００５６】
糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。また、上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００５７】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＤＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３〜５日間の振盪培養が挙げられる。微生物宿主細胞を培養する際は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
【００５８】
培養終了後、該培養物よりＧＯＤ又はＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、培地上清画分を回収するか、または、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、ＧＯＤ又はＧＤＨの粗酵素を得る。
【００５９】
粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；疎水性クロマトグラフィー法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることができる。
【００６０】
酵素が精製されているか否かの判断は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び染色により行ってもよく、また、濃度既知のグルコース試料を用いて適性にグルコースの電気化学的測定ができるか試験することにより行ってもよい。
【００６１】
（ＧＤＨの活性測定）
ＧＤＨ（ＥＣ  １．１．９９．１０）は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。このとき電子受容体が電子を受け取り、還元型電子受容体になる。ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス  ＋  ＰＭＳ（酸化型）
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型）＋  ＤＣＩＰ（酸化型）
→  ＰＭＳ（酸化型）＋  ＤＣＩＰ（還元型）
【００６２】
具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ−グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
【００６３】
ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．０５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液  ０．６ｍＬおよび２ｍＭ  ＤＣＩＰ溶液  ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ  ＰＭＳ溶液  ０．１ｍＬ及び酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【００６４】
【数１】
2018068287.tif 000017
【００６５】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００６６】
（ＧＯＤの活性測定）
ＧＯＤ（ＥＣ  １．１．３．４）は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトン及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。
ＧＯＤの活性は、この作用原理を利用し、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼと反応させ、発色剤を発色させることにより測定することができる。
【００６７】
グルコースオキシダーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
１００ｍＭ  ＭＥＳ−Ｎａ緩衝液ｐＨ５．７
０．５％  ４−アミノアンチピリン（東京化成工業社製、４ＡＡ）溶液
５．０ｇ／Ｌ  ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、同仁化学社製）溶液
４００Ｕ／ｍＬ  パーオキシダーゼ（キッコーマン社製、ＰＯＤ）溶液
１．２Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＭＥＳ−Ｎａ緩衝液３０．０ｍＬ、４ＡＡ溶液０．３ｍＬ、ＴＯＯＳ溶液０．３ｍ
Ｌ、ＰＯＤ溶液０．３ｍＬ、Ｄ―グルコース溶液６．０ｍＬを混合して反応試薬とする。
【００６８】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＯＤ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変化とする。３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．１×ｄｆ｝÷（３２．８×０．５×０．１）
ΔＡｓ  ：  反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０  ：  対照液の１分間あたりの吸光度変化
３２．８：  反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．５  ：  １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ    ：  希釈係数
【００６９】
（グルコースアッセイキット）
ある実施形態において本発明は、本発明のフラビン化合物を含むグルコースアッセイキットを提供する。ある実施形態において、このキットはＧＤＨを含む。別の実施形態においてこのキットはＧＯＤを含む。このキットを用いることにより、ＧＯＤ又はＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。測定は連続的に行ってもよい。
【００７０】
本発明のグルコースアッセイキットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明のフラビン化合物を含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のフラビン化合物に加えて、ＧＯＤ又はＧＤＨ、アッセイに必要な緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに指針を含む。ある実施形態において、本発明のグルコースアッセイキット、例えばＳＭＢＧ用、ＣＧＭ用、またはＦＧＭ用のグルコースアッセイキットは、本発明のフラビン化合物とＧＯＤ又はＧＤＨとを同一試薬として含む。別の実施形態において、本発明のグルコースアッセイキットは、フラビン化合物とＧＯＤ又はＧＤＨとを別々の試薬として含む。本発明のフラビン化合物は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、ビーズや電極表面に固定化された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液、好ましくは遮光されている溶液として提供することができる。
【００７１】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のように行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＧＤＨ、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬（変色試薬）を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、ＧＤＨより電子を直接受け取ることによって重合し生成する色素もしくは還元された色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【００７２】
この方法において使用できる発色試薬（変色試薬）としては、たとえば２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する発色試薬（変色試薬）はこれらに限定されない。
【００７３】
（グルコースセンサー）
ある実施形態において本発明は、本発明のフラビン化合物を用いるグルコースセンサーを提供する。本発明のグルコースセンサーは、本発明のフラビン化合物及びＧＤＨ又はＧＯＤを有する。グルコースセンサーの電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＯＤ又はＧＤＨ酵素を塗布または固定化することができる。さらに、或いはこれと独立して、本発明のフラビン化合物を電極上に塗布または固定化してもよい。固定化方法としては、上記の「ＧＤＨ又はＧＯＤの固定化方法」の段落を参照のこと。
【００７４】
本発明のフラビン化合物及びＧＯＤ又はＧＤＨは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に用いることができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、例えばクロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、例えばサイクリックボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、グルコースが還元される際の電流を測定することで、試料中のグルコース濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば−１０００ｍＶ〜＋１０００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）などとすることができる。
【００７５】
（グルコースの電気化学的測定）
ある実施形態において、本発明は、グルコースを含みうる試料と、遊離型フラビン化合物と、精製されたグルコースオキシダーゼ又は精製されたグルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程及び電流を測定する工程を含む、グルコースの電気化学的測定方法を提供する。該フラビン化合物及び／又は酵素は固相中に固定化されていてもよい。
【００７６】
例えばグルコース濃度の電気化学的測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極としてＧＤＨ又はＧＯＤを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極やＡｇ／Ａｇ＋電極）を用いる。反応液に本発明のフラビン化合物を添加する。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。印加する電位は、例えば＋８００ｍＶ以下、＋７００ｍＶ以下、＋６００ｍＶ以下、＋５００ｍＶ以下、＋４００ｍＶ以下、＋３００ｍＶ以下、＋２００ｍＶ以下、＋１００ｍＶ以下、＋５０ｍＶ以下とすることができ、−２００ｍＶ以上、−１００ｍＶ以上、−５０ｍＶ以上、例えば０ｍＶ以上、とすることができ、例えば＋８００ｍＶ〜−２００ｍＶ、＋８００ｍＶ〜−１００ｍＶ、＋８００ｍＶ〜−５０ｍＶ、＋６００ｍＶ〜０ｍＶ、＋５００ｍＶ〜０ｍＶ、＋４００ｍＶ〜０ｍＶ、＋３００ｍＶ〜０ｍＶ、＋２００ｍＶ〜０ｍＶとすることができる（いずれも銀塩化銀参照電極に対し）。
【００７７】
具体的な例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に０．２Ｕ〜１５０Ｕ、より好ましくは、０．５Ｕ〜１００ＵのＧＤＨ又はＧＯＤを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１０．０ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線を作成する。これよりＧＤＨ又はＧＯＤ酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【００７８】
さらに電気化学測定のために印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。作用極の面積は、所望の応答電流に応じて設定することができる。例えばある実施形態では、作用極の面積を１ｍｍ２以上、１．５ｍｍ２以上、２ｍｍ２以上、２．５ｍｍ２以上、３ｍｍ２以上、４ｍｍ２以上、５ｍｍ２以上、６ｍｍ２以上、７ｍｍ２以上、８ｍｍ２以上、９ｍｍ２以上、１０ｍｍ２以上、１２ｍｍ２以上、１５ｍｍ２以上、２０ｍｍ２以上、３０ｍｍ２以上、４０ｍｍ２以上、５０ｍｍ２以上、１ｃｍ２以上、２ｃｍ２以上、３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、例えば１０ｃｍ２以上とすることができる。ある実施形態では、作用極の面積を１０ｃｍ２以下、５ｃｍ２以下、例えば１ｃｍ２以下、とすることができる。対極も同様でありうる。
【００７９】
ある実施形態では、本発明のグルコースセンサーを有する持続血糖測定装置を提供する。持続血糖測定装置は、２４時間を通した血糖値の変動を把握することが可能となるCGM(continuous glucose monitoring)デバイスやFGM(Flash glucose monitoring)デバイスを含みうる。またある実施形態において、本発明は、本発明の組成物、電極又はセンサーを用いる連続グルコースモニタリング方法を提供する。
【００８０】
ある実施形態において、本発明のCGMデバイスは、皮膚の下に配置するためのグルコースセンサーを有しうる。センサーは一定期間、例えば1日〜３週間、装着されうる。センサーは使い捨て型であってもよく、再利用可能であってもよい。センサーは、組織と酵素の直接接触を防ぐためのセンサーメンブレン層を有し得る。センサーは、アプリケーターを用いて腹部に挿入するよう設計しうる。ある実施形態において、本発明は発信機及びセンサーから発信機への連結部をさらに有するCGMデバイスを提供する。発信機はインプラントせずともよい。好ましくは発信機は、電波受信機と通信可能である。CGMデバイスはさらに、グルコースレベルを連続的に表示する電気的受信機を有し得る。CGMデバイスは場合により、キャリブレーション用のフィンガースティック（指先穿刺部材）を有し得る。CGMデバイスは使用説明書を有し得る。
【００８１】
（本発明の燃料電池）
ある実施形態において本発明は、本発明のフラビン化合物や、フラビン化合物を含む組成物を有する燃料電池用のアノード及び当該アノードを備えた燃料電池を提供する。ある実施形態において本発明は、本発明のフラビン化合物や、フラビン化合物を含む組成物、または該アノードを使用し、グルコースを燃料とする発電方法を提供する。
【００８２】
本発明の燃料電池は、本発明のフラビン化合物、燃料槽、カソード、ＧＯＤ又はＧＤＨを有するアノード、及び電解質を備えている。また本発明の燃料電池は、必要に応じて、アノードとカソードとの間に負荷抵抗を配置することができ、そのための配線を備えうる。ある実施形態において負荷抵抗は、本発明の燃料電池の一部である。ある実施形態において、負荷抵抗は、本発明の燃料電池の一部ではなく、本発明の燃料電池は、適当な負荷抵抗に接続できるよう構成されている。本発明の燃料電池においてＧＯＤ又はＧＤＨはアノードの一部を構成する。例えばＧＯＤ又はＧＤＨはアノードに近接若しくは接触していてもよく、固定化されていてもよく、又は吸着していてもよい。燃料槽はグルコースを含む。すなわち本明細書において燃料電池という場合、特に断らない限りこれはグルコースを燃料とするものをいう。ＧＯＤ又はＧＤＨの作用によりグルコースが酸化され還元型メディエーターが生じ、これが電極に電子を受け渡すと電流が流れる。ある実施形態において本発明の燃料電池はアノードとカソードを分離するイオン交換膜を有し得る。イオン交換膜は１ｎｍ〜２０ｎｍの孔を有し得る。アノードは炭素電極のような一般的な電極であり得る。例えば、カーボンブラック、グラファイト、活性炭等の導電性炭素質からなる電極や、金、白金等の金属からなる電極を用いることができる。具体的には、カーボンペーパー、グラッシーカーボン、ＨＯＰＧ（高配向性熱分解グラファイト）等が挙げられる。対をなすカソードとしては、例えば、白金や白金合金等、燃料電池において一般的に用いられている電極触媒を、カーボンブラック、グラファイト、活性炭のような炭素質材料、又は金、白金等からなる導電体に担持させた電極や、白金や白金合金等の電極触媒そのものからなる導電体をカソード電極として用い、酸化剤（カソード側基質、酸素等）を電極触媒に供給するような形態とすることができる。
【００８３】
別の実施形態では、上記のような基質酸化型酵素電極からなるアノードと対をなすカソードとして、基質還元型酵素電極を使用しうる。酸化剤を還元する酸化還元酵素としては、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼなど公知の酵素が挙げられる。酸化剤を還元する触媒として酸化還元酵素を用いる場合には、必要に応じて、公知の電子伝達メディエーターを用いてもよい。カソード用メディエーターはアノード用メディエーターと同一でも異なってもよい。酸化剤としては、酸素、過酸化水素等が挙げられる。
【００８４】
ある実施形態において、カソードにおける電極反応を妨害する不純物（アスコルビン酸や尿酸等）による影響を回避するために、酸素選択性の膜（例えばジメチルポリシロキサンの膜）をカソード電極の周囲に配置することができる。
【００８５】
本発明の発電方法は、ＧＯＤ又はＧＤＨを有するアノードに燃料となるグルコースを供給する工程を含む。ＧＯＤ又はＧＤＨを有するアノードにグルコースが供給されると、グルコースが酸化され、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンとなり、同時に生成した電子を、ＧＯＤ又はＧＤＨは、該酸化酵素と電極との間の電子伝達を仲介する電子伝達メディエーター、例えばフラビン化合物へと受け渡し、該電子伝達メディエーターによって導電性基材（アノード電極）へ電子が受け渡される。アノード電極から配線（外部回路）を通って電子がカソード電極に到達することで、電流が発生する。
【００８６】
上記過程において発生するプロトン（Ｈ＋）は、電解質溶液内をカソード電極まで移動する。そして、カソード電極では、電解質溶液内をアノードから移動してきたプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤（カソード側基質）とが反応して水が生成される。これを利用し発電を行うことができる。
【００８７】
本発明のフラビン化合物や、フラビン化合物を含む組成物は、試料中のグルコース濃度測定に使用することができ、これは例えば糖尿病の診断や血糖値の自己モニタリングに役立てることができる。また、本発明の組成物は酵素電極と共に使用することができ、種々の電気化学的測定に用いることができる。また、本発明の組成物は酵素センサーと共に使用することができる。また、本発明の組成物はグルコース測定キットやグルコースセンサーに利用することができる。さらに本発明のフラビン化合物や、フラビン化合物を含む組成物は、燃料電池に用いることができる。すなわち本発明のフラビン化合物や、フラビン化合物を含む組成物は、グルコースを燃料とする発電方法に使用することができる。これは例示であり、本発明のフラビン化合物又はフラビン化合物を含む組成物の用途はこれに限られない。
【００８８】
以下の実施例により、本発明をさらに例証する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
［実施例１］
１．Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の宿主への導入とＧＤＨ活性の確認
まず特許第４６４８９９３号に記載のＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ）にＴ３８７Ａ／Ｉ５４５Ｔの各変異を導入したＧＤＨ変異体をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ変異体のアミノ酸配列は配列番号１に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す。プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ変異体遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。具体的には、ｐＵＣ１９は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅにて、ＭｐＧＤＨ変異体遺伝子を、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ変異体）を得た。
【００９０】
また、Mucor属由来GDH（MpGDH、配列番号１）にN66Y/N68G/C88A/Q233R/T387C/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH(MpGDH-M1)をコードする遺伝子を取得した。MpGDH-M1のアミノ酸配列は配列番号３に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号４に示す。プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。上記と同様に、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅにて、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１）を得た。
【００９１】
得られた組換え体プラスミドｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型として、配列番号７−１２の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
【００９２】
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるMpGDH-M1遺伝子を連結させたDNAコンストラクトを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」−「50℃、30秒」−「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。
【００９３】
反応液の一部を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、約8,000bpのDNAが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製）で処理し、残存している鋳型DNAを切断した後、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicillin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を7,000rpmで、5分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100(キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドを抽出して精製し、DNA2.5μgを得た。該プラスミド中のMpGDH-M1をコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンをシステインに、２１４位のアスパラギンをシステインに、及び４６６位のグリシンをアスパラギン酸に置換した変異体であるMpGDH-M1/A175C/N214C/G466D（配列番号５）をコードするDNAコンストラクトを得た(ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ２)（配列番号６）。
【００９４】
これらの遺伝子をコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ；  アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのＧＤＨ活性を評価した。
【００９５】
具体的には、ＭｐＧＤＨ変異体及びＭｐＧＤＨ−Ｍ２を取得することを目的として、ＧＤＨ遺伝子を用いて、Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ  ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＥＦ１プロモーター遺伝子〜フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
【００９６】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、ＰＣＲで確認して選抜した。
【００９７】
ＭｐＧＤＨ変異体の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのＧＤＨ生産を行った。
【００９８】
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍＬまで濃縮し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、ＧＤＨ活性を示す画分を回収し、ＭｐＧＤＨ変異体及びＭｐＧＤＨ−Ｍ２の精製標品を得た。なお、この酵素はそのＦＡＤ結合部位を介してＦＡＤと結合している状態のものである（ホロ酵素）。
【００９９】
２．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＧＤＨ遺伝子の宿主への導入と精製標品の取得
特許第５０２００７０号に記載のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＧＤＨ（ＡｔＧＬＤ）遺伝子を上記と同様にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅで発現させた。さらに上記と同様にＧＤＨ生産させ、得られた培地上清画分を精製し、ＡｔＧＬＤの精製標品を得た。なお、この酵素はそのＦＡＤ結合部位を介してＦＡＤと結合している状態のものである（ホロ酵素）。
【０１００】
３．フラビン系化合物を用いたセンサー評価
ＭｐＧＤＨ変異体の精製標品と２種のフラビン化合物（リボフラビン（ＲＦ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ））を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、グラッシーカーボンの作用電極（２．６４ｍｍ２）、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）上に、３５ｍｇ／ｍｌの精製酵素ＭｐＧＤＨ変異体溶液を１０μＬ載せた。その後、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、ＡＬＳ  電気化学アナライザー  ８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続した。そして、＋３００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の電圧を印加したクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、終濃度５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び２０ｍＭグルコース、１００μＭのＲＦ溶液を１０μＬ電極上に載せて反応を行い、６０秒間の電流値を測定した。同様にして、１００μＭのＲＦの代わりに１ｍＭのＦＭＮを用いて測定した。また、対照として、ＲＦやＦＭＮを含んでいないグルコース溶液を用いて同様の試験を行った。
【０１０１】
結果を図４に示す。図４はＭｐＧＤＨ変異体酵素とＲＦもしくはＦＭＮを混合したクロノアンペロメトリー測定結果である。ＲＦやＦＭＮを混合しなかった場合と比べて、ＲＦやＦＭＮを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋３００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の印加電圧で測定開始から６０秒後において応答電流がＲＦやＦＭＮを添加しなかった際は３０．６ｎＡであったが、ＲＦを添加した際には３３．５ｎＡであり、ＦＭＮを添加した際には５３．２ｎＡと高い値が示された。
【０１０２】
続いて、ＧＤＨ−Ｍ２の精製標品を用いて上記と同様の測定を行った。その結果、ＲＦやＦＭＮを混合しなかった場合と比べて、ＲＦやＦＭＮを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋３００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の印加電圧で測定開始から６０秒後において応答電流がＲＦやＦＭＮを添加しなかった際は１７．５ｎＡであったが、ＲＦを添加した際には１９．２ｎＡであり、ＦＭＮを添加した際には１９．６ｎＡと高い値が示された。すなわち、バックグラウンドと比較して、測定可能な応答電流が観測された。
【０１０３】
続いて、ＡｔＧＬＤの精製標品と４種のフラビン化合物（ＲＦ、ＦＭＮ、ルミクロム（ＬＣ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ））を用いて、上記と同様に印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。ただし、印加電圧を＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）とし、１００μＭのＲＦ、１ｍＭのＦＭＮ、１００μＭのＬＣ、１ｍＭのＦＡＤをそれぞれ用いた。結果を図１に示す。図１はＡｔＧＬＤ酵素とＲＦもしくはＦＭＮ、ＬＣ、ＦＡＤを混合したクロノアンペロメトリー測定結果である。フラビン化合物を混合しなかった場合と比べて、ＲＦやＦＭＮ、ＬＣ、ＦＡＤを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の印加電圧で測定開始から６０秒後において応答電流がフラビン化合物を添加しなかった際は１．４ｎＡであったが、ＲＦを添加した際には３．３ｎＡであり、ＦＭＮを添加した際には１７．９ｎＡであり、ＬＣを添加した際には１０．３ｎＡであり、ＦＡＤを添加した際には２．７ｎＡと高い値が示された。すなわち、バックグラウンドと比較して、測定可能な応答電流が観測された。なお、グルコース未添加でフラビン化合物を混合した場合はいずれも、１．４ｎＡより応答電流は下回った。
【０１０４】
続いて、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）（ＢＢＩ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ１、以下ＧＬＤ１と表記する）と４種のフラビン化合物（ＲＦ、ＦＭＮ、ＬＣ、ＦＡＤ）を用いて、上記と同様に印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。なお、これらのＧＤＨも、そのＦＡＤ結合部位を介してＦＡＤと結合している状態のものである（ホロ酵素）。ただし、印加電圧を＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）とした。結果を図２に示す。図２はＧＬＤ１酵素とＲＦもしくはＦＭＮ、ＬＣ、ＦＡＤを混合したクロノアンペロメトリー測定結果である。フラビン化合物を混合しなかった場合と比べて、ＲＦやＦＭＮ、ＬＣ、ＦＡＤを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の印加電圧で測定開始から６０秒後において応答電流がフラビン化合物を添加しなかった際は１．１ｎＡであったが、ＲＦを添加した際には２．１ｎＡであり、ＦＭＮを添加した際には３０．８ｎＡであり、ＬＣを添加した際には３．５ｎＡであり、ＦＡＤを添加した際には５．７ｎＡと高い値が示された。すなわち、バックグラウンドと比較して、測定可能な応答電流が観測された。
【０１０５】
続いて、Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ（東洋紡社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ：ＧＬＯ−２０１、以下ＧＯＤと表記する）と２種のフラビン化合物（ＲＦ、ＦＭＮ）を用いて、上記と同様に印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。なお、これらのＧＤＨも、そのＦＡＤ結合部位を介してＦＡＤと結合している状態のものである（ホロ酵素）。ただし、印刷電極はカーボンの作用電極（１２．６ｍｍ２）、銀の参照電極が印刷されてなる、ＳＣＲＥＥＮ−ＰＲＩＮＴＥＤ  ＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ（Ｄｒｏｐ  Ｓｅｎｓｅ社製、ＤＲＰ−１１０）を用い、専用コネクター（Ｄｒｏｐ  Ｓｅｎｓｅ社製、ＤＲＰ−ＣＡＣ）を用いて、ＡＬＳ  電気化学アナライザー  ８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続した。そして、印加電圧を＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）とした。結果を図３に示す。図３はＧＯＤ酵素とＲＦもしくはＦＭＮを混合したクロノアンペロメトリー測定結果である。フラビン化合物を混合しなかった場合と比べて、ＲＦやＦＭＮを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａｇ＋）の印加電圧で測定開始から６０秒後において応答電流がフラビン化合物を添加しなかった際は９．８ｎＡであったが、ＲＦを添加した際には２５．０ｎＡであり、ＦＭＮを添加した際には３１．６ｎＡと高い値が示された。すなわち、バックグラウンドと比較して、測定可能な応答電流が観測された。
【０１０６】
以上のように、フラビン系化合物を用いると、ＧＤＨやＧＯＤがグルコースと反応した際に得られる応答電流が高められ、感度よくグルコースを測定できるといえる。また、応答電流がグルコース濃度に依存していることから、濃度既知のグルコース含有サンプルに基づく応答電流を予め測定して検量線を作成しておき、濃度未知のグルコース含有サンプルの応答電流を測定し、当該検量線から、グルコース濃度を測定することができる。なお、上記はあくまで例証であり、本発明はこれに何ら限定されない。例えば、より大きな応答電流が好ましい場合には、電極面積、例えば作用極の面積をスケールアップすることができる。
【０１０７】
以上より、フラビン化合物不在下の場合と比較して、本発明のフラビン化合物の存在下で応答電流の増大が観察されたことから、本発明の遊離型フラビン化合物は、メディエーターとして機能し、ＧＯＤ又はＧＤＨがグルコースをグルコノラクトンへ酸化するときに、電子の受け渡しを媒介していることが裏付けられた。フラビン化合物の酸化還元電位は知られており、相手化合物の酸化還元電位次第で電子の授受が可能であることは知られているが、実際にフラビン化合物をＧＤＨやＧＯＤと混合してグルコースを測定した例はこれまで報告されていない。
【０１０８】
［実施例２］
１．電気化学的測定におけるグルコース濃度依存性の確認
３５ｍｇ／ｍｌのＧＬＤ１溶液を２μＬ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３μＬ、さらに１ｍＭのＦＭＮを５μＬ、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極に混合して載せた。そして、−４００ｍＶから＋２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は１０ｍＶ／ｓｅｃで行った。続いて、種々のグルコース濃度になるように２Ｍグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。ある特定電位における酸化電流値(IＯ)と還元電流値（IＲ）を足して２で割った値を算出し、この算出値がグルコース濃度依存的に増加するか調べた。一般的に、ある特定電位で印加したクロノアンペロメトリーにて一定の応答電流となった際の値が基質濃度依存的に増加すれば、サイクリックボルタンメトリーにおける先と同じ電位における(IＯ＋IＲ）／２の値も同様に増加し、連動することが知られている。
【０１０９】
ＧＬＤ１とＦＭＮを混合して測定し、グルコース濃度と(IＯ＋IＲ）／２値をプロットした結果を図５に示す。その結果、＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認され、ＦＭＮがメディエーターとして機能していることが分かった。さらに、−１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてもグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認された。
【０１１０】
なお、本発明のフラビン化合物の代わりに、従来の人工電子メディエーターを用いて上記の条件で応答電流を測定しても、応答電流は観測されないと考えられる。なぜならば、従来の人工電子メディエーターは酸化還元電位が本発明のフラビン化合物のそれと異なり、たとえばフェリシアン化カリウムは、酸化還元電位が２５０ｍＶ前後である。そうすると、フェリシアン化カリウムをメディエーターとして用いても１００ｍＶ程度の印加電位では応答電流は流れず、応答電流を観察するには約３５０ｍＶ以上の電位を印加する必要があると考えられる。ところが本発明の化合物では、＋１００ｍＶという低電位でも応答電流が観察された。これは種々の用途において有利となるものである。
【０１１１】
続いて上記と同様に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ２とＦＭＮを混合し、−４００ｍＶから＋２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。グルコース濃度と(IＯ＋IＲ）／２値をプロットした結果を図６に示す。その結果、＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認され、ＦＭＮがメディエーターとして機能していることが分かった。
【０１１２】
続いて、３５ｍｇ／ｍｌのＧＬＤ１溶液を２μＬ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３μＬ、さらに１ｍＭのＦＡＤを５μＬ、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極に混合して載せた。そして、０ｍＶから＋６００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は１０ｍＶ／ｓｅｃで行った。続いて、種々のグルコース濃度になるように２Ｍグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。ＧＬＤ１とＦＡＤを混合して測定し、グルコース濃度と(IＯ＋IＲ）／２値をプロットした結果を図７に示す。その結果、＋１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認され、ＦＡＤがメディエーターとして機能していることが分かった。
【０１１３】
続いて、３５ｍｇ／ｍｌのＭｐＧＤＨ―Ｍ２溶液を２μＬ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３μＬ、さらに１００μＭのＲＦを５μＬ、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極に混合して載せた。そして、０ｍＶから＋６００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は１０ｍＶ／ｓｅｃで行った。続いて、種々のグルコース濃度になるように２Ｍグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。ＭｐＧＤＨ―Ｍ２とＲＦを混合して測定し、グルコース濃度と(IＯ＋IＲ）／２値をプロットした結果を図８に示す。その結果、＋５００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認され、ＦＡＤがメディエーターとして機能していることが分かった。さらに、＋４００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においても同様にグルコース濃度依存性が確認された。
【０１１４】
続いて、３５ｍｇ／ｍｌのＧＬＤ１溶液を２μＬ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３μＬ、さらに１００μＭのＬＣを５μＬ、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極に混合して載せた。そして、０ｍＶから＋６００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は１０ｍＶ／ｓｅｃで行った。続いて、種々のグルコース濃度になるように２Ｍグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。ＧＬＤ１とＬＣを混合して測定し、グルコース濃度と(IＯ＋IＲ）／２値をプロットした結果を図９に示す。その結果、＋５００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてグルコース濃度依存的に(IＯ＋IＲ）／２値も増加していることが確認され、ＬＣがメディエーターとして機能していることが分かった。
【０１１５】
またルテニウム錯体とＦＭＮを組み合わせた際の効果を確認した。３５ｍｇ／ｍｌのＧＬＤ１溶液を２μＬ、１．５Ｍの塩化カリウムを含有した２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３μＬ、さらに１００μＭのヘキサアンミンルテニウムを２．５μＬ、１ｍＭのＦＭＮを２．５μＬ、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極に混合して載せた。そして、―４００ｍＶから＋２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は１０ｍＶ／ｓｅｃで行った。続いて、１８ｍＭのグルコース濃度になるように２Ｍグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。比較として、同様の濃度でヘキサアンミンルテニウム単独、ＦＭＮ単独で試験を行った。その結果、ＧＬＤ１とヘキサアンミンルテニウムを混合して測定し、１８ｍＭグルコースを添加した際の０Ｖにおける(IＯ＋IＲ）／２値は２ｎＡであった。ＧＬＤ１とＦＭＮを混合して測定し、１８ｍＭグルコースを添加した際の(IＯ＋IＲ）／２値は３ｎＡであった。ＧＬＤ１とヘキサアンミンルテニウム、ＦＭＮを混合して測定し、１８ｍＭグルコースを添加した際の(IＯ＋IＲ）／２値は１１ｎＡであり、相乗的な応答電流の増加を確認することができた。なお、いずれの場合においてもグルコース未添加時における(IＯ＋IＲ）／２値は０〜１ｎＡの範囲内であった。
【０１１６】
なお、数ｎＡの感度があれば十分に電気化学的測定装置でグルコースを検出できるため、上記測定により、検量線を作成すれば濃度未知のグルコースを含みうるサンプルに関し、含有されるグルコースを検出することが可能である。したがって、実施例１においてグルコース添加時にグルコースが無い時と比較して応答電流が僅かでも向上した場合、さらにグルコースを添加した際に応答電流も向上するといえる。
【０１１７】
［実施例３］
１．燃料電池の構築
精製ＧＤＨをカーボン電極にグルタルアルデヒドによる架橋固定化することでアノード電極を作製する。また、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ、天野エンザイム社製）を多孔質カーボン電極に固定化することでカソード電極を作製する。アノード電極とカソード電極との間に固体高分子電解質膜としてナフィオン膜を挟んだ、バイオ電池を構築する。また、アノード電極とカソード電極を結ぶ配線の間に、一定の負荷抵抗と電圧計をそれぞれ直列と並列に挿入する。アノード側には、１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＦＭＮ、４００ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む電解質溶液を入れ、グルコースを供給し、３０℃，ｐＨ７の条件で作動させ、電流が流れるようにする。
【０１１８】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の燃料電池について以下のように考察される。すなわち、実施例１において１００ｍＶという低電位を印加した場合にも、本発明の化合物の存在下では応答電流が観察された。したがって例えば酸素を用いる燃料電池であれば、酸素の酸化還元電位から１００ｍＶを減算した大きな起電力が期待される。これは種々の用途において有利となる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のフラビン化合物または本発明のフラビン化合物を含む組成物を用いることにより、毒性の低い又は毒性のないメディエーターにより、グルコース測定を行うことができる。これは例えば、体内埋め込み型の連続グルコース測定に用いることができる。またこれはグルコース燃料電池に使用しうる。
【０１２０】
本明細書で言及又は引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れられるものとする。
【０１２１】
配列の簡単な説明
配列番号１  Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨのアミノ酸配列
配列番号２  Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨの核酸配列
配列番号３  MpGDH-M1（aa）
配列番号４  MpGDH-M1（DNA）
配列番号５  MpGDH-M2（aa）
配列番号６  MpGDH-M2（DNA）
配列番号７−１２  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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