(57)【要約】      （修正有）【課題】微小残存病変（MRD）診断のための診断キットとMRDを発見するための方法を提供する。【解決手段】ヒト被験体における多発性骨髄腫（MM）または形質細胞疾患（PCD）のフローサイトメトリー検出のための２つの８色試薬組成物を含む診断キットであって、以下のものに特異的な蛍光色素結合化抗体を含む8色試薬組成物マーカーの組み合わせ：（i）CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117およびCD81;そして（ii）CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CyIgκ及びCyIgλである、診断キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体における多発性骨髄腫（MM）または形質細胞疾患（PCD）のフローサイトメトリー検出のための２つの８色試薬組成物を含む診断キットであって、
以下のものに特異的な蛍光色素結合化抗体を含む8色試薬組成物 マーカーの組み合わせ：
（i）CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117およびCD81; そして
（ii）CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CyIgκ及びCyIgλである、診断キット。
【請求項２】
(1) pacific blue (PacB)、brilliant violet 421 (BV421)またはHorizon V450、(2) pacific orange (PacO)、Horizon V500 (HV500)、BV510、Khrome orange (KO) またはOC515、(3) フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはAlexa488、(4) フィコエリトリン(PE)、(5) ペリジニンクロロフィルタンパク質/シアニン5.5 (PerCP-Cy5.5)，PerCPまたはPE-TexasRed、(6) フィコエリトリン/シアニン7 (PE-Cy7)、(7) アロフィコシアニン(APC)またはAlexa647、および(8) アロフィコシアニン/ハイライト7 (APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、APC-A750、APC-C750またはAlexa700である蛍光色素の組み合わせを使用する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
PacB、BV421またはHV450が結合化されているCD138に対する抗体；HV500またはPacOが結合化されたCD27に対する抗体；FITC結合のCD38に対する抗体；PerCPCy5.5結合のCD45に対する抗体；PECy7結合のCD19に対する抗体；APC結合の、CD117に対する抗体およびCyIgκに対する抗体；そして、APCH7、APCA750またはAPCC750結合の、CD81に対する抗体およびCyIgλに対する抗体である、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117、CD81、CyIgκおよびCyIgλに対して指向された別個の蛍光色素結合抗体を含む、ヒト対象における多発性骨髄腫（MM）または形質細胞疾患（PCD）のフローサイトメトリー検出のための１０色試薬組成物。
【請求項５】
CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117、CD81、CyIgκ、CyIgλ、CD229およびCD28に対する特異的蛍光色素結合抗体を含む、ヒト被験体における多発性骨髄腫（MM）または形質細胞疾患（PCD）のフローサイトメトリー検出のための１２色試薬組成物。
【請求項６】
以下の工程からなる、好ましくはリンパ球である細胞を含む生体試料中の、多発性骨髄腫（MM）または形質細胞疾患（PCD）を検出するための多色フローサイトメトリーの方法：
（i）請求項１−３のいずれか１項に記載の２つの８色MM/PCD試薬組成物または請求項４または５に記載の試薬組成物で試料を染色し、
（ii）該試料をフローサイトメトリーに供し;
（iii）選択マーカーの発現を前記試薬組成物中に含まれる抗体によって検出し細胞をゲーティングし;
（iv）CD38、CD27、CD45、CD19およびCD81は正常細胞と比較して悪性細胞において低発現し、CD56、CD28およびCD117は正常細胞と比較して悪性細胞において過剰発現し、そしてCyIgκおよびCyIgλの発現は、悪性細胞中の一方または他方のIg軽鎖に限定されるという、複数のマーカーの発現プロファイルに基づき、正常と悪性の細胞とを区別する。
【請求項７】
工程（iv）が多変量解析、好ましくは主成分分析（PCA）を含むものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が末梢血試料または骨髄試料である、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断の分野に関するものであり、より具体的には、治療中及び治療後における病態進行の監視のため、または、微小な播種性病変の検出のための、手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖抑制性または細胞毒性治療は、リンパ性悪性疾患を有する患者の大部分に寛解をもたらす。それにもかかわらず、患者の大半は疾患を再発する。現在の細胞増殖抑制性または細胞毒性治療のプロトコルは、そのような再発患者においては、全ての悪性細胞を殺すことができていないように見受けられる。それがたとえ細胞形態学的基準におけるいわゆる完全寛解に達していたとしてもである。細胞形態学的手法の検出限界値が悪性細胞の１〜５％という値よりも小さくなることはないという事実がある以上、そのような手法は、治療の有効性に関し表面的な情報を提供しているに過ぎないことは明らかであり、１０10個以上もの腫瘍細胞が、患者体内には依然として潜在的に残存しているのである。
【０００３】
「微小残存病変」または最小限の病変（MRD）を検出するより高感度の技法は、誘導治療中の腫瘍塊の減少および１つまたは複数の組織からの維持療法中の悪性細胞のさらなる撲滅に関するより良い洞察を得るために、必要とされている。フローサイトメトリーを適用したMRDの検出の方法は、伝統的には、抗原の異常発現、過剰発現、および相互系列発現などの悪性腫瘍に関連する表現型特徴を介し、悪性細胞と正常な白血球とを識別ことに基づいている。
【０００４】
現在の４色と６色フローサイトメトリー法は、血液学的悪性腫瘍患者のほとんどにおいて、１０-3（から１０-4）の公正感度に達する。しかし、治療中及び治療後、及び、造血幹細胞移植後における、血液、骨髄及び脳脊髄液のような他の体液中における低頻度の腫瘍細胞の存在の検出は、高頻度に存在する正常に再生する細胞により妨害され得ることに留意すべきである。細胞再生の程度及びパターンは、治療プロトコルごと、治療の段階ごと、サンプリングの時間ごとに異なっていて、治療をより集中的に行ったり、造血細胞の再生をより顕著に行わせるという、先行して行われた治療に、より強く依存する。
【０００５】
論理的には、再生し続ける細胞によるバックグラウンドおよび薬剤誘発性免疫表現型の変化という二つの要因によって、従来の４色又は６色フローサイトメトリーを用いたMRDの検出法は、感度と特異性が減少している。このことは主に、マーカーの複数の組み合わせを、患者におけるMRDの評価に使用するか、あるいは、１または少数の患者固有マーカーの組み合わせを使用するという、取り組みにつながった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
MRDのための改良された診断法の必要性を認識し、本発明者らは、特に、複数のマーカの情報に多変量解析を組み合わせる完全に統合された手法に基づき、MRDを検出するためのより高感度で信頼性の高い検出法を得るために使用することができる追加のマーカーの同定に着手した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そして、この新しいアプローチは、もはや、個々の患者に限定されるものではなく、B細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）、B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）及び多発性骨髄腫（MM）といった、特定の疾患カテゴリーに属するすべての患者にも適用可能である。
【０００８】
関連するマーカーの慎重な選択、多色チューブにおける抗体の適切な組み合わせの設計、および（輝度、補正、安定性などの必要性に基づき）適した蛍光色素の選択の後、抗体試薬の組合せが開発された。研究は、再修正し、最適な効率を達成するために、コンセンサスパネルの大規模多施設評価によって補完された。本発明者らは、厳選された徹底的にテスト済みの抗体の組合せを用い、設計−試験−再設計−再試験−再設計（など）により、１０-4から１０-5の感度に達することのできる新規な８色以上の染色法を設計し、BCP-ALL、B-CLL及びMMといった疾患の種別毎に、蛍光色素標識抗体の特定の組合せを開発した。
【発明の効果】
【０００９】
患者ごとに１または２種の、８色以上の組合せを用いることで、少なくとも１０-4の感度にて慎重なMRDのモニタリングを行うことが可能となる。１０色及び１２色の抗体による組合せによって、正常細胞とそれらが悪性化した細胞とを、より適切に区別することができ、その結果、MRDを１０-5以下の感度にて検出することが出来るようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CD19およびCD45とを識別するそれぞれのマーカーと側方光散乱とを組み合わせて（パネルＡ〜Ｃ）、治療中のBCP-ALL患者から得られた骨髄サンプル中のBCP細胞と他の有核細胞との区別に使用する方法の代表的な例。各プロットにおいて、ライトグレーで示すイベントはサンプル中の非B細胞に対応し、濃い灰色で示すイベントは成熟B細胞に対応し、黒で示すイベントはBCP細胞に対応する。主成分１対主成分２の多変量解析結果（APS1）において(パネルＤ)、成熟B細胞およびBCP細胞はいずれも、すべての有益なパラメータ（例えばCD19、CD45、側方光散乱）に基づく他のすべてのイベントから明確に分離されている。
【図２】治療中のBCP-ALL患者から得られた骨髄試料中のBCP-ALL細胞および正常残留B細胞との区別において、CD10、CD20、CD34、CD66c/CD123およびCD38の免疫表現型特性化マーカーと側方光散乱とを組み合わせて使用する方法の例を示す（パネルＡ〜Ｄ）。図１で記載したようにゲートされ、選択された後、骨髄中のB細胞のみが示される。各プロットにおいて、黒点は、試料中のBCP-ALL細胞に対応し、灰色の点は正常のB細胞に対応する。正常B細胞と比べると、BCP-ALL細胞は、CD81（パネルＤ）、CD10（パネルＡ及びＤ）およびCD66c/ CD123（パネルＣ）が過剰発現を示す。全ての免疫表現型マーカーと散乱特性に基づいたAPS1（主成分１対主成分２）の表示（パネルＥ）において、正常残留B細胞（灰色）はBCP-ALL細胞（黒）から明確に区別される。
【図３】CLL患者からの末梢血試料中の成熟B細胞と他の有核細胞とを区別するための、CD19およびCD3識別マーカーを側方光散乱と組み合わせて（パネルＡ〜Ｃ）使用する方法の例を示す。各プロットでは、灰色のイベントが、試料中の非B細胞に対応し、黒のイベントは全末梢血B細胞に対応する。主成分１対主成分２の多変量解析結果（APS1）において(パネルＤ)、B細胞は、すべての有益なパラメータ（例えばCD19，CD3，側方光散乱）に基づく他のすべてのイベントから明確に分離されている。
【図４】CLL患者からの末梢血試料中のCLL細胞と正常な成熟B細胞とを区別するための、CD27、CD5、CD22、CD200およびCD79bの免疫表現型特性化マーカー（パネルＡ〜Ｃ）を使用する方法の例を示す。図３で記載したようにゲートされ、選択された後、末梢血B細胞のみが示される。各プロットでは、灰色の点は正常末梢血B細胞に対応し、黒の点は、試料中のCLL細胞に対応する。正常B細胞と比較して、CLL細胞は、CD200（パネルＢ）およびCD5（パネルＡおよびＣ）が過剰発現を示すとともに、CD22（パネルＢ）およびCD79b（パネルＣ）が低発現を示す。全ての免疫表現型マーカーと散乱特性に基づいたAPS1（主成分１対主成分２）の表示（パネルＤ）において、CLL細胞は正常なB細胞から明確に区別されるが、個々のマーカーに基づいて区別することはできなかった。
【図５】MM患者からの骨髄サンプル中の形質細胞と他の有核細胞とを区別するための、CD38およびCD138識別マーカーを側方光散乱と組み合わせて（パネルＡ〜Ｃ）使用する方法の例を示す。各プロットでは、灰色のイベントが、試料中の非形質細胞に対応し、黒のイベントは全骨髄中の形質細胞に対応する。主成分１対主成分２の多変量解析結果（APS1）において(パネルＤ)、B細胞は、すべての有益なパラメータ（例えばCD138、CD38、側方光散乱）に基づく他のすべてのイベントから明確に分離されている。
【図６】治療後のMM患者から得られた骨髄試料中の骨髄腫/悪性形質細胞と正常残留形質細胞との区別において、CD81、CD19、CD45、CD56、CD27、CD117及びCD38の免疫表現型特性化マーカーと側方光散乱とを組み合わせて使用する方法の例を示す（パネルＡ〜Ｄ）。図５で記載したようにゲートされ、選択された後、骨髄形質細胞のみが示される。各プロットでは、灰色の点は正常残留骨髄形質細胞に対応し、黒の点は、試料中の骨髄腫/クローン性形質細胞に対応する。正常形質細胞と比較して、骨髄腫/クローン性形質細胞は、CD81、CD19、CD45、CD27およびCD38が低発現を示すとともに、高い側方光散乱とCD56 and CD117の過剰発現が示された。主成分１対主成分２の(APS1)として示された(パネルＥの)多変量解析結果において、正常残留形質細胞（灰色）は骨髄腫/悪性形質細胞（黒）から明確に区別されるが、個々のマーカーに基づいて区別することはできなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここでは、サンプル中のMRDを検出するための新たな８色、１０色および１２色の抗体の組合せを提示する。
サンプルは、例えば血液または骨髄であって、以下の患者から単離される。
−  B細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）、
−  B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）、又は、
−  多発性骨髄腫（MM）及び形質細胞疾患（PCD）。
【００１２】
これらの多色免疫染色は、Van Dongenら，Leukemia 2012; 26: 1908-1075、および、Kalinaら，Leukemia 2012; 26: 1986-2010に記載される、いわゆるEuroFlowプロトコルに従って行うことができる。
【００１３】
したがって、本発明は、MRDのフローサイトメトリー検出のため、少なくとも８種類の相異なる蛍光色素結合化抗体の組合せを含む、独自の試薬組成物を提供する。具体的には、それら試薬組成物は、BCP-ALL、B-CLL又はMM/PCDを有する患者におけるMRDを検出するために使用されるものとなる。好ましい実施形態において、組成物は、特定のCD抗原に対するモノクローナル抗体を含む。CDは分化抗原群（cluster designation）の略であり、特定の細胞表面抗原またはモノクローナル抗体によって定義される細胞内抗原を同定するための名称である。個々のマーカーに対する（モノクローナル）抗体は、ベクトン/ディキンソン（BD）バイオサイエンス、ダコ、ベックマン・コールター、サイトグノス、カルタグ、ファーミンゲン、エクスバイオ、サンクイン、インビトロジェンなどを含む様々な企業から商業的に得ることができる。
【００１４】
フローサイトメトリーによるBCP-ALLにおけるMRDの検出
一実施形態において、本発明は、少なくとも８つの異なる蛍光色素結合化抗体のパネルを含む、ヒト被験体におけるBCP-ALL細胞のフローサイトメトリー検出のための試薬組成物を提供する。BCP-ALLパネルは、４つの「中核となるマーカー」であるCD10、CD19、CD20、CD34と、CD45とに対する各抗体を含む。好ましくは、パネルはさらに、CD38、CD81、CyIgμ、及びデオキシヌクレオチド転移酵素（NuTdT）に対する抗体の群から選択される１つまたはそれ以上の抗体を含む。パネルはさらに、(a)CD66cおよびCD123に対する各抗体のセット、(b)CD304及びCD73に対する各抗体のセット、及び、(c)SmIgκとSmIgλに対する各抗体のセットであって、各セット内の各抗体は同じ蛍光色素が結合化されている、該抗体のセットを１つまたは複数を含む場合、非常に良好な結果が得られる。特定の態様では、BCP-ALLパネルは、CD10、CD19、CD20、CD34、CD45に対する各抗体と、CD38、CD81、CyIgμ、NuTdTに対する各抗体の群から選択される一つまたは複数の抗体と、(a)CD66cおよびCD123に対する各抗体のセット、(b)CD304及びCD73に対する各抗体のセット、および、(c)SmIgκとSmIgλに対する各抗体のセットであって、各セット内の抗体が同じ蛍光色素に結合化されている、該抗体のセットを、２またはそれ以上と、を含む。例えば、試薬組成物は、以下のマーカーの組合せのうちの１つに対するものである、相異なる蛍光色素結合化抗体を含む：
(i)  CD20、CD45、CD81、CD66c、CD123、CD34、CD19、CD10およびCD38、ただしCD66cおよびCD123に対する各抗体は同じ蛍光色素が結合されている；
(ii)  CD20、CD45、CD81、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10及びCD38、ただしCD304およびCD73に対する各抗体は同じ蛍光色素が結合されている；
(iii)  CD20、CD45、NuTdT、SmIgκ、SmIgλ、CyIgμ、CD19、CD34およびCD10、ただしSmIgκとSmIgλに対する各抗体は同じ蛍光色素が結合されている。８色BCP-ALL MRDのパネル１Ａを参照のこと。
【００１５】
別の例としては、異なる種類の蛍光色素を結合した、マーカーであるCD20、CD45、CD81、NuTdT、CD34、CD19、CD10及びCD38に対する各抗体と、(a)CD66cおよびCD123に対する各抗体のセット、(b)CD304及びCD73に対する各抗体のセット、及び、(c)SmIgκとSmIgλに対する各抗体のセットであって、上記各セットに含まれる各抗体は全て同じ蛍光色素が結合化されている、該抗体のセットを、１またはそれ以上と、を含む。マーカーのCD20、CD45、CD81、NuTdT、CD66c、CD123、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10及びCD38に対する各抗体を含むパネル１Ｂにおける１０色チューブを参照のこと。
【００１６】
更なる特定の態様では、組成物は、マーカーであるCD20、CD45、CD81、NuTdT、CD66c、CD123、CD304、CD73、SmIgκ、SmIgλ、CyIgμ、CD34、CD19、CD10およびCD38に直接対応する、相異なる蛍光色素結合化抗体を含み、ただし、CD66c/CD123、CD304/CD73とSmIgκ/SmIgλの各組合せに対する抗体は、同じ蛍光色素が結合化されているものである、前記各蛍光標識化抗体の組み合わせを含むものである。パネル１Ｃの１２色のチューブを参照。
【００１７】
本発明において使用するための、列挙された各マーカーに対する抗体に結合化させるために適した各蛍光色素は、当該分野で公知である。当然のことながら、試薬組成物内で使用される各蛍光色素は、フローサイトメトリーによって相互に区別され得るべきである。各蛍光色素は、好ましくは、明るさ、制限されたスペクトルの重なり、および、補償、安定性、他の、制限された必要性に応じて、選ばれる（カリーナら，Leukemia 2012: 26: 1986-2010を参照）。
【００１８】
次に示す蛍光色素のパネルは、本発明のBCP-ALL試薬組成物において特に有用である：(1) pacific blue (PacB)、brilliant violet 421 (BV421)またはHorizon V450、(2) pacific orange (PacO)、Horizon V500 (HV500)、BV510、Khrome orange (KO) またはOC515、(3) フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはAlexa488、(4) フィコエリトリン(PE)、(5) ペリジニンクロロフィルタンパク質/シアニン5.5 (PerCP-Cy5.5)，PerCPまたはPE-TexasRed、(6) フィコエリトリン/シアニン7 (PE-Cy7)、(7) アロフィコシアニン(APC)またはAlexa647、および(8) アロフィコシアニン/ハイライト7 (APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、APC-A750、APC-C750またはAlexa700。複数回の試験の結果、本発明者らは、以下の蛍光色素が選択される場合に非常に良好な結果が得られることを見出した：Pacific Blue、brilliant violet 421またはHorizon V450、PacOまたはHorizon V500、FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、およびAPC-H7またはAPC-A750またはAPC-C750。特定の態様において、本発明は、表１のパネル１Ａ、パネル１Ｂまたはパネル１Ｃに示す試薬組成物を提供する。
【００１９】
表１．BCP-ALLにおけるMRD検出のための代表的な試薬組成物
パネル１Ａ．  本発明の８色BCP-ALL MRDパネルのマーカー構成
2018066752.tif 000002
【００２０】
パネル１Ｂ．  本発明の１０色のBCP-ALL MRDパネルのマーカー構成
2018066752.tif 000003
【００２１】
パネル１Ｃ．  本発明の１２色のBCP-ALL MRDパネルのマーカー構成
2018066752.tif 000004
【００２２】
フローサイトメトリーによるB-CLLにおけるMRDの検出
別の実施形態において、本発明は、少なくとも８種類の相異なる蛍光色素結合化抗体を含むパネルからなる、ヒト被験体におけるB細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）フローサイトメトリー検出のための試薬組成物を提供し、BCP-ALLパネルは、少なくとも７つの「中核となるマーカー」であるCD5、CD27、CD79b、CD3、CD200、CD81およびCD19に対する各抗体を含む。CD22および/または受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ROR1）が有用な追加のマーカー（複数のマーカー）として使用できることが見出された。非常に良好な結果が、マーカーCD43とCD38との組み合わせで得られた。
【００２３】
B-CLLを検出するための好ましいマーカーの組み合わせは以下のとおりである：
(a) CD27、CD3、CD79b、CD5、CD22、CD19、CD200およびCD81
(b) CD5、CD3、CD79b、ROR1、CD27、CD19、CD200およびCD81
(c) CD27、CD3、CD79b、ROR1、CD5、CD22、CD19、CD20、CD200およびCD81
(d) CD27、CD3、CD79b、ROR1、CD5、CD22、CD19、CD20、CD200、CD43、CD81およびCD38。
【００２４】
次に示す蛍光色素のパネルは、本発明のBCP-ALL試薬組成物において特に有用である：(1) pacific blue (PacB)，brilliant violet 421 (BV421)またはHorizon V450、(2) pacific orange (PacO)、Horizon V500 (HV500)、BV510、Khrome orange (KO)またはOC515、(3) フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはAlexa488，(4) フィコエリトリン(PE)、(5) ペリジニンクロロフィルタンパク質/シアニン5.5 (PerCP-Cy5.5)、PerCPまたはPE-TexasRed、(6) フィコエリトリン/シアニン7 (PE-Cy7)、(7) アロフィコシアニン(APC)またはAlexa647、および(8) アロフィコシアニン/ハイライト7 (APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、APC-A750、APC-C750またはAlexa700。複数回の試験の結果、本発明者らは、以下の蛍光色素が選択される場合に非常に良好な結果が得られることを見出した：Pacific Blue、brilliant violet 421またはHorizon V450、PacOまたはHorizon V500、FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、およびAPC-H7またはAPC-A750またはAPC-C750。
【００２５】
特定の態様において、本発明は、表２に示す試薬組成物を提供する。
【００２６】
表２：B-CLLにおけるMRD検出のための代表的な試薬組成物
パネル２Ａ．  ８色CLL MRDパネルの構成
2018066752.tif 000005
【００２７】
パネル２Ｂ．  １０色CLL MRDパネルの構成
2018066752.tif 000006
【００２８】
パネル２Ｃ．  １２色CLL MRDパネルの構成
2018066752.tif 000007
【００２９】
フローサイトメトリーによる多発性骨髄腫/形質細胞疾患（MM/PCD）におけるMRDの検出
本発明のさらなる態様は、MMまたはPCD細胞を検出するための試薬組成物に関する。パネルは、少なくとも４つの「中核となるマーカー」であるCD138、CD38、CD56およびCD19に対する各抗体と、CD27、CD117、CD81、CD229、CD45、CyIgκおよびCyIgλからなる群から選択される少なくとも4つの追加のマーカーとを含む。CD45は、好適な第５のマーカーであり、CD27、CD117およびCD81またはCD229、CyIgκおよびCyIgλと組み合わせるのに好ましい。
【００３０】
マーカーに関する以下のパネルのいずれか１つに対する、相異なる蛍光色素結合化抗体を用いた試薬組成物が提供される：
(n)  CD45  CD138  CD38  CD56  CD27  CD19  CD117  CD81
(o)  CD45  CD138  CD38  CD56  CD229  CD19  CyIgκ  CyIgλ
(p)  CD138  CD27  CD38  CD56  CD45   CD19  CD117   CD81
(q)  CD138  CD27  CD38  CD56  CD229  CD19  CyIgκ  CyIgλ
(r)  CD138  CD27  CD38  CD56  CD45   CD19  CyIgκ  CyIgλ
【００３１】
例えば、ヒト被験体におけるMMまたはPCDのフローサイトメトリー検出のための試薬組成物は、少なくとも８種類の相異なる蛍光色素結合化抗体を含むパネルからなり、該パネルは、少なくとも中核となるマーカーであるCD138、CD38、CD56およびCD19に対する各抗体と、CD27、CD117、CD81、CD229、CD45、CyIgκおよびCyIgλの群から選択される少なくとも４つの追加のマーカーとを含む。好ましくは、CD45を第５のマーカーとし、より好ましくは、さらに、CD27、CD117およびCD81を組み合わせるか、または、CD229、CyIgκおよびCyIgλを組み合わせる。好ましい試薬組成物は、以下のマーカーの組合せのうちの１つに対するものである、相異なる蛍光色素結合化抗体を含むものである：
(iv)  CD45、CD138、CD38、CD56、CD27、CD19、CD117およびCD81
(v)   CD45、CD138、CD38、CD56、CD229、CD19、CyIgκおよびCyIgλ
(vi)  CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117およびCD81
(vii) CD138、CD27、CD38、CD56、CD229、CD19、CyIgκおよびCyIgλ
(viii)CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CyIgκおよびCyIgλ。
例として、８色BCP-ALL MRDパネル３Ａを参照。
【００３２】
非常に良好な結果が、CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117、CD81に対する蛍光標識抗体、および、(a)CD229およびCD28に対するに対する抗体のセット；および(b)CyIgκおよびCyIgλに対する抗体のセットから選択された１または両方の抗体のセットとを用いることで得られた。パネル３Ｂの１０色のチューブとパネル３Ｃの１２色のチューブを参照。
【００３３】
次に示す蛍光色素のパネルは、本発明のMM/PCD試薬組成物において特に有用である：(1) pacific blue (PacB)、brilliant violet 421 (BV421)またはHorizon V450、(2) pacific orange (PacO)、Horizon V500 (HV500)、BV510, Khrome orange (KO)またはOC515、(3) フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはAlexa488、(4) フィコエリトリン(PE)、(5) ペリジニンクロロフィルタンパク質/シアニン5.5 (PerCP-Cy5.5)、PerCPまたはPE-TexasRed、(6) フィコエリトリン/シアニン7 (PE-Cy7)、(7) アロフィコシアニン(APC)またはAlexa647、および(8) アロフィコシアニン/ハイライト7 (APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、APC-A750、APC-C750またはAlexa700。複数回の試験の結果、本発明者らは、以下の蛍光色素が選択される場合に非常に良好な結果が得られることを見出した：Pacific Blue、brilliant violet 421またはHorizon V450、PacOまたはHorizon V500、FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、およびAPC-H7またはAPC-A750またはAPC-C750。
【００３４】
表３：MM/PCDにおけるMRD検出のための代表的な試薬組成物
パネル３Ａ． PCD MRDパネルの構成
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【００３５】
パネル３Ｂ． １０色PCD MRDパネルの構成
2018066752.tif 000009
【００３６】
パネル３Ｃ． １２色PCD MRDパネルの構成
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【００３７】
本発明の更なる態様は、特にBCP-ALL MRD、CLL MRDまたはMM/PCD MRDなどの、MRDを検出するための診断キットに関し、本明細書の先に記載の試薬組成物の１つ以上を含み、必要に応じて、使用説明書、緩衝液、および／または対照試料を含む（カリーナら，Leukemia 2012: 26: 1986-2010を参照）。一実施形態では、表１の一つ以上の試薬組成物を含むBCP-ALLキットが提供される。別の実施形態では、表２の一つ以上の試薬組成物を含むCLLのキットが提供される。さらに別の実施形態では、表３の一つ以上の試薬組成物を含むPCDのキットが提供される。
【００３８】
また、本発明は、また、MRDのフローサイトメトリーによる検出のための方法に関し、ヒト被験体由来の生物学的サンプルを用意し、本明細書に記載される試薬組成物と該サンプルの少なくとも一部（一定分量）とを接触させる工程を含む。白血球を含むことが判明しているか、含むことが想定されるどのようなサンプルであっても、直接、または無核赤血球を溶血した後、または密度勾配遠心分離を行った後、またはセルソーティングを行った後に利用できる。例えば、試料は、末梢血、骨髄、リンパ節、アデノイド、脾臓または肝臓などの組織、または脳脊髄液、硝子体液、滑液、胸水や腹水などの他のタイプの体液である。末梢血または骨髄が好ましい。好ましくはB系統細胞（B細胞前駆体、Bリンパ球、および形質細胞）である細胞からなる生物学的サンプル中の微小残存病変（MRD）を検出するための多色フローサイトメトリー法が提供され、以下の工程を含む：
(i)  試料を本発明の試薬組成物で染色し、
(ii)  フローサイトメトリーに試料を供する；
(iii)  選択マーカーの発現を試薬組成物中に含まれる抗体によって検出し細胞をゲーティングする；
(iv)  複数のマーカーの発現プロファイルに基づき、正常および悪性細胞を区別する。
好ましくは、工程(iv)における分析は多変量解析、好ましくは、主成分分析(PCA)を含み、各マーカーには、主成分分析により判別される値が付与される。有利には、例えばInfinicytソフトウェア、または多次元スケーリング(MDS)分析を用い、自動化された集団の分離法−APS view−が適用される。PCAは、直交変換を使用して、おそらく相関がある観測値の集合を主成分と呼ばれる非相関変数の値の集合に変換する、数学的な手順である。主成分の数は、元の変数の数かそれ以下である。この変換は、最初の主要な成分はできるだけ高い分散を有し（つまり、可能な限りデータが変動し）、続くの各構成成分は、可能な限り最高の分散を有するように、先の成分と（無相関に）直交するよう、定義されている。主成分は、データセットが共同で正規分布している場合にのみ依存しないように保証されている。主成分は、連帯して正規分布している場合に限り独立であることが保証されている。PCAは、元の変数の相対的なスケーリングに敏感である。アプリケーションの分野に応じて、それはまた、離散カルーネン−レーブ変換(KLT)、ホテリング変換または固有直交分解(POD)と命名されている。PCAの代わりに、MDSまたは十分に確立された任意の他の多変量解析を使用することができる（ペドレイラら，Trends Biotechnol 2013参照)。
【００３９】
一実施形態では、リンパ球を含む生物学的サンプル中に存在する微小残存病変(MRD)を検出するための多色フローサイトメトリー法が提供され、該MRDがBCP-ALLであることを特徴とし、以下の段階を含む：
(i) 好ましくは、パネル１Ａ、１Ｂまたは１Ｃのいずれか１つから選択される本発明のBCP-ALL試薬組成物により試料を染色し；
(ii)フローサイトメトリーに試料を供し;
(iii)試薬組成物中の抗体によって検出された各マーカーの発現により成熟したB細胞及びBCP細胞をゲートし；
(iv)それぞれが主成分分析により判別処理において値を付加した複数のマーカーを用いた分析法に基づき、正常および悪性BCP細胞を区別する。
BCP-ALL患者におけるMRDの検出を可能にする分析の例として、実施例１と、図１および２を参照のこと。
【００４０】
別の実施形態において、リンパ球を含む生物学的サンプル中に存在する微小残存病変(MRD)を検出するための多色フローサイトメトリー法が提供され、該MRDがCLLであることを特徴とし、以下の段階を含む：
(i) 好ましくは、パネル２Ａ、２Ｂまたは２Ｃのいずれか１つから選択される本発明のCLL試薬組成物により試料を染色し；
(ii)フローサイトメトリーに試料を供し;
(iii)試薬組成物中の抗体によって検出された各マーカーの発現によりBリンパ球をゲートし；
(iv)それぞれが主成分分析により判別処理において値を付加した複数のマーカーを用いた分析法に基づき、正常および悪性B細胞を区別する。
CLL患者におけるMRDの検出を可能にする分析の例として、実施例２と、図３および４を参照のこと。
【００４１】
さらに別の実施形態では、リンパ球を含む生物学的サンプル中に存在する微小残存病変(MRD)を検出するための多色フローサイトメトリー法が提供され、該MRDがMM/PCDであることを特徴とし、以下の段階を含む：
(i) 好ましくは、パネル３Ａ、３Ｂまたは３Ｃのいずれか１つから選択される本発明のMM/PCD試薬組成物により試料を染色し；
(ii)フローサイトメトリーに試料を供し;
(iii)試薬組成物中の抗体によって検出された各マーカーの発現により形質細胞をゲートし；
(iv)それぞれが主成分分析により判別処理において値を付加した複数のマーカーを用いた分析法に基づき、正常および悪性形質細胞を区別する。
MM/PCD患者におけるMRDの検出を可能にする分析の例として、実施例３と、図５および６を参照のこと。
【実施例】
【００４２】
本明細書に開示されEuroFlowアプローチの力は、正常細胞（例えば、正常な前駆B細胞、正常なBリンパ球及び正常な血漿細胞）を同定し、かつ、正常/反応性細胞とクローン/悪性細胞とを区別するための、各マーカーのセットの組み合わせと多変量解析の使用に基づいている。この目的のため、全ての他のマーカーとの組み合わせにおいて、その貢献度に応じて、各マーカーをパネルへ組み込んだり除外したりするよう、個々のマーカーの寄与度が強力に多変量解析される。実験的な試験を複数回、連続して繰り返し、最も特異的なマーカーの選択された組み合わせを評価するために、このような戦略がとられた。最終的に提案された抗体の組み合わせは、主成分分析と組み合わせて使用される場合、特にInfinicytソフトウェアの自動集団分別（APS）ツールと組み合わせて使用される場合に、非常に強力なものとなったため、各マーカの（独立した）追加値は、分析の単一の工程で使用される。
【００４３】
ここに、我々は、BCP-ALL（実施例１）、CLL（実施例２）及び多発性骨髄腫（実施例３）患者の血液および骨髄中のMRDを検出するのための大規模な実験的研究の結果の要約を提供する。
【００４４】
以下の実施例では、マーカーのリストが、BCP-ALL、CLL、およびMM/PCDの場合における最も頻度の高い表現型の異常とともに、示される。しかし、それは、実施例１から３に関する各図に示す主成分分析においても明確に示されているように、正常および悪性細胞との間の実際の識別力は、対応するｎ次元空間内のマーカーの組み合わせに基づいていることに留意すべきである。実際には、いくつかのマーカーにおける小さな違いは、合計され主成分分析における大きな違いとなる。したがって、本発明は、MRD検出のための単一のマーカーの研究に関するものではなく、正常なBCP細胞とBCP-ALL芽細胞、正常なBリンパ球とB-CLL細胞、及び、正常な形質細胞とMM/PCDというような、正常細胞とそれらが悪性化したものとの間の優れた識別を可能とするよう、慎重に選択がなされたマーカーのセットに関するものである。
【００４５】
実施例１．BCP-ALL患者におけるMRD検出のための抗体パネルと診断方法
骨髄中の全B細胞及びB細胞前駆体を同定するためのマーカー
関連する識別マーカーのリスト：CD19、CD45
それらを使用する方法：CD19マーカーを用いた予備的なゲーティングは、純粋なB細胞集団を同定するために不可欠である。正常B細胞前駆体（BCP）に照準を合わせるには、CD45陽性の成熟B細胞の中からBCPを識別するよう、CD45-陰性または弱陽性を使用することができる。CD19指向療法の場合には、CD19はCD22に置き換えることがある。これらのマーカーは、末梢血または骨髄または他のタイプの試料（例えば、骨髄、組織生検、髄液）におけるB細胞を同定するため、側方光散乱（SSC）、前方光散乱（FSC）、または、FSCとSSCの両方に、組み合わせて使用することもできる。注目すべきは、正常BCP細胞からBCP-ALL細胞を識別するために使用されるCD10、CD20、CD38およびCD34のような他のマーカー（下記参照）は、総BCP細胞集団（例えばCD34+、CD10+、CD20-から僅かに発現、CD38+）のゲーティングに寄与し得る点である。
【００４６】
B細胞前駆細胞を正常と悪性とに区別するためのマーカー
各マーカーと、最も頻度の高い表現型異常の一覧:
CD38：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で低発現
CD10：BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で高発現または低発現
CD45：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で低発現(通常は発現せず）
CD20：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で低発現または高発現
CD81：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で高発現または低発現
CD66c：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で高発現（特にBCR-ABL陽性ALL；TEL-AML1-陽性またはMLL-AF4-陽性ALLでは一般に陰性）
CD123：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で（特に高二倍体ALLにおいて)高発現
CD304：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で高発現
CD73：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で高発現
CD34：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で低発現または高発現
SSC：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で強度が増加または減少。
FSC：正常B細胞前駆細胞に対し、BCP-ALL/悪性B細胞前駆細胞で強度が増加または減少。
【００４７】
実施例２．CLL患者におけるMRD検出のための抗体パネルと診断方法
末梢血および骨髄中の全B細胞を同定するためのマーカー：
識別マーカーのリスト：CD19, CD3（除外マーカー）
それらを使用する方法：このマーカーの組み合わせを用いたプレゲーティングは、純粋なB細胞の集団を同定し、T細胞/B細胞のダブレットを除去するために不可欠である。これらのマーカーは、末梢血または骨髄または他のタイプの試料（例えば、組織生検、髄液）においてB細胞を同定するため、側方光散乱（SSC）、前方光散乱（FSC）、または、FSCとSSCの両方に、組み合わせて使用することもできる。CLL細胞をさらに濃縮するより洗練されたゲーティングのためには、CD5とCD27の両方を使用し得る。
【００４８】
CLL細胞から正常B細胞を区別するためのマーカー：
各マーカーと、最も頻度の高い表現型異常の一覧:
CD27：CLL細胞と正常B細胞の小分画において陽性
CD5：CLL細胞と正常B細胞の小分画において陽性
CD79b：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において低発現
CD22：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において低発現
CD20：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において低発現
CD200：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において高発現
ROR1：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において高発現
CD43：正常の未成熟および成熟Bリンパ球に比べ、CLL細胞において高発現
CD81：B細胞前駆細胞および、未成熟および成熟した両Bリンパ球に比べ、CLL細胞において低発現
CD38：B細胞前駆細胞に比べ、CLL細胞において低発現
【００４９】
実施例３．MM/PCD患者におけるMRD検出のための抗体パネルと診断方法
骨髄中の全ての形質細胞を同定するためのマーカー：
識別マーカーのリスト：CD38、CD138およびCD229
それらを使用する方法：３つのマーカーの任意の組み合わせを、任意の蛍光色素の位置付けにおいて使用する；そしてまた、３つのマーカーのうちの２つの任意の組み合わせを使用するか、または、(全てではないが）各症例におけるサブセットにおける３つのマーカーのうちの１つのみであっても、使用することが可能である。好ましい組み合わせは、以下に示すようにする：1 ) CD138/CD38/CD229; 2) CD138/CD38, 3) CD138/CD229; 4) CD38/CD229; 5) CD138; 6) CD38); 7) CD229。これらのマーカーのそれぞれ及びその組み合わせのいずれかが、骨髄中の形質細胞または他のタイプの試料（例えば末梢血、組織生検、髄液）を識別するために、側方光散乱（SSC）、前方光散乱（FSC）、または、FSCとSSCの両方に、組み合わせて使用することもできることに留意されたい。
【００５０】
正常形質細胞と、クローン性／悪性形質細胞を区別するためのマーカー：
各マーカーと、最も頻度の高い表現型異常の一覧：
CD38：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において低発現
CD27：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において低発現
CD45：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において低発現
CD19：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において低発現（通常は発現せず）
CD81：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において低発現
CD56：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において高発現
CD28：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において高発現
CD117：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において高発現
CyIgkおよびCyIglambda：悪性の形質細胞における発現は、1つまたは他のIg軽鎖のいずれかに限定されるがバランスのとれた分布を示す（正常な形質細胞中におけるCyIgk/CyIglambdaの比は通常は3と0.5の間の範囲）
SSC：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において強度が増加または減少。
FSC：正常な形質細胞に比べ、悪性形質細胞において強度が増加または減少。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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