(57)【要約】【課題】生体試料の３次元構造を維持したまま深さ方向における化学薬品の刺激性を評価する。【解決手段】本発明の生体試料の刺激性評価方法は、深さ方向に複数の層を有する３次元的な生体試料に対する化学薬品の刺激性を評価する方法であって、化学薬品で処理された生体試料内の生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の細胞の、蛍光マーカで標識された核の蛍光画像を、生体試料の異なる深さにおいて取得する画像取得工程Ｓ３と、複数の蛍光画像に基づき、深さ方向に存在する少なくとも一方の細胞の数の比率を算出する評価工程Ｓ４とを含む。【選択図】図１
2018066642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
深さ方向に複数の層を有する３次元的な生体試料に対する化学薬品の刺激性を評価する刺激性評価方法であって、
前記化学薬品で処理された前記生体試料内の生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の細胞の、蛍光マーカで標識された核の蛍光画像を、前記生体試料の異なる深さにおいて取得する画像取得工程と、
該画像取得工程において取得された複数の前記蛍光画像に基づき、前記深さ方向に存在する前記少なくとも一方の細胞の数の比率を算出する評価工程とを含む生体試料の刺激性評価方法。
【請求項２】
前記画像取得工程において、前記生体試料の表面を含む蛍光画像を取得し、
前記評価工程が、前記比率と、前記生体試料の表面または表層からの深さ方向の距離との相関を評価する工程をさらに含む請求項１に記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項３】
前記評価工程において、前記生体試料の表面形状に応じて、前記生体試料の深さ方向における前記比率および位置に基づき、前記相関を評価する請求項２に記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項４】
前記画像取得工程において、前記複数の層に略平行な２次元平面の前記蛍光画像を取得し、
前記評価工程において、前記２次元平面内の細胞について１以上の層に関する前記比率を算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項５】
前記画像取得工程において取得された前記複数の蛍光画像から前記生体試料の３次元画像を再構成する３次元画像再構成工程を含む請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項６】
前記評価工程が、前記深さ方向に沿う方向の垂直断面画像からなる部分的な３次元画像を作成する垂直断面画像作成工程を含む請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項７】
前記垂直断面画像作成工程において、前記蛍光画像上の異なる位置に相当する２以上の垂直断面画像を作成し、
前記評価工程において、前記２以上の垂直断面画像における前記比率を比較する請求項６に記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項８】
前記画像取得工程において、前記死細胞の核の蛍光画像を取得し、
前記評価工程において、前記死細胞の数の比率を算出する請求項１から請求項７のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項９】
前記評価工程において、前記蛍光画像内の前記死細胞の核のサイズに基づき、前記死細胞の核の形態的な消失の有無を判定する請求項８に記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項１０】
前記画像取得工程において、互いに異なる発光波長を有する蛍光マーカで蛍光標識された前記生細胞の核および前記死細胞の核の蛍光画像を取得し、
前記評価工程において、前記生細胞と前記死細胞の数の和に対する前記生細胞の数の比率を算出する請求項１から請求項９のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【請求項１１】
前記評価工程において、前記生細胞の数の比率が所定の閾値よりも大きい場合に前記化学薬品の刺激性が無いと判定し、前記生細胞の数の比率が所定の閾値以下である場合に前記化学薬品の刺激性が有ると判定し、
前記所定の閾値が、前記蛍光画像毎に設定される請求項１から請求項１０のいずれかに記載の生体試料の刺激性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の刺激性評価方法に関し、特に３次元ヒト皮膚モデルに対する化学薬品の刺激性の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒト皮膚に対する各種の化学薬品の刺激性を評価する動物実験代替法の１つとして、３次元ヒト皮膚モデルを用いた皮膚刺激性試験（ＲＨＥ法）がＯＥＣＤ（経済協力開発機構）のテストガイドラインで認可されている（非特許文献１参照。）。ＲＨＥ法は、試験試料で処理された皮膚モデル内の細胞の生存率をＭＴＴ試験によって測定し、細胞の生存率に基づいて刺激性の有無を判定する方法である。例えば、特許文献１には、被験試料を収容した複数のウェルを搬送しながら上方に設けられたカメラで連続的に順次撮像することで生細胞の数をカウントする方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】OECD、「Test No.439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method」、OECD Guidelines for the Testing of Chemicals、2015年
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２４５７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＴＴ試験においては、測定時に細胞を破砕した後に所定の色素による吸光度を測定する場合、皮膚モデルの３次元構造が失われるという問題がある。また、１枚ずつ２次元的な画像だけを用いて生細胞数をカウントする場合、表面付近の情報しか得られなかったり、深さ方向の異なる位置に存在する細胞が同一の画像内に混在したりするので、皮膚表面からの化学薬品の深さ方向における影響について正確に評価できない可能性がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体試料の３次元構造を維持したまま深さ方向における化学薬品の刺激性を評価することができる生体試料の刺激性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、深さ方向に複数の層を有する３次元的な生体試料に対する化学薬品の刺激性を評価する刺激性評価方法であって、前記化学薬品で処理された前記生体試料内の生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の細胞の、蛍光マーカで標識された核の蛍光画像を、前記生体試料の異なる深さにおいて取得する画像取得工程と、該画像取得工程において取得された前記複数の蛍光画像に基づき、前記深さ方向に存在する前記少なくとも一方の細胞の数の比率を算出する評価工程とを含む生体試料の刺激性評価方法である。
【０００８】
本態様によれば、画像取得工程において、生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の核の蛍光画像が生体試料の深さ方向の複数の位置で取得される。化学薬品が細胞に対して刺激性を有しない場合には蛍光画像内の生細胞の核の数の比率（すなわち、細胞の生存率）は大きくなり、死細胞の核の数の比率（すなわち、細胞の死亡率）は小さくなるが、化学薬品が細胞に対して刺激性を有する場合には、生体試料内で細胞死が起こることにより、蛍光画像内の生細胞の核の数の比率は小さくなり、死細胞の核の数の比率は大きくなる。したがって、評価工程において、各蛍光画像内の生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の数の比率に基づき、化学薬品の生体試料に対する刺激性の有無を評価することができる。一般に、生体モデルは、略一定の既知の数の細胞を含んでいるので、試験前の生体モデルに含まれる細胞の総数を予め得ることができる。こうして得られた細胞の総数に対する蛍光画像から求めた生細胞および／または死細胞の数の比率もまた、刺激性評価の判断基準となり得る。必要に応じて、試験を行う前に、生体モデルの深さ方向に存在する全ての細胞の位置や個数を位相差顕微鏡等のような蛍光を用いない観察手段によって予め得てもよい。
【０００９】
この場合に、生体試料を破壊することなく取得することができる蛍光画像を用いることによって、生体試料の３次元構造を維持したまま刺激性を評価することができる。また、生体試料の異なる深さで取得された複数の蛍光画像を用いることによって、生体試料内の深さ方向における化学薬品の刺激性を評価することができる。
【００１０】
上記態様においては、前記画像取得工程において、前記生体試料の表面を含む蛍光画像を取得し、前記評価工程が、前記比率と、前記生体試料の表面または表層からの深さ方向の距離との相関を評価する工程をさらに含んでいてもよい。この場合、前記生体試料の表面形状に応じて、前記生体試料の深さ方向における前記比率および位置に基づき、前記相関を評価してもよい。
このようにすることで、生体試料の深さ方向の各位置における刺激性をより詳細に評価することができる。
【００１１】
上記態様においては、前記画像取得工程において、前記複数の層に略平行な２次元平面の前記蛍光画像を取得し、前記評価工程において、前記２次元平面内の細胞について１以上の層に関する前記比率を算出してもよい。
このようにすることで、各蛍光画像には一の層内の細胞の核が含まれるので、層毎の刺激性の有無の評価をより正確に行うことができる。
【００１２】
上記態様においては、前記画像取得工程において取得された前記複数の蛍光画像から前記生体試料の３次元画像を再構成する３次元画像再構成工程を含んでいてもよい。
このようにすることで、生体試料の表面が平坦でなかったり、蛍光画像の平面に対して生体試料の表面が平行でなかったりする場合においても、３次元画像に基づき、深さ方向における刺激性の評価を正確に行うことができる。
【００１３】
上記態様においては、前記評価工程が、前記深さ方向に沿う方向の垂直断面画像からなる部分的な３次元画像を作成する垂直断面画像作成工程を含んでいてもよい。
垂直断面画像には生体試料の複数の層が含まれる。したがって、垂直断面画像に基づいて、刺激性の有無および程度を層毎に容易に評価することができる。
【００１４】
上記態様においては、前記垂直断面画像作成工程において、前記蛍光画像上の異なる位置に相当する２以上の垂直断面画像を作成し、前記評価工程において、前記２以上の垂直断面画像における前記比率を比較してもよい。
このようにすることで、化学薬品の刺激性を、層に平行な方向に２次元的に評価することができる。
【００１５】
上記態様においては、前記画像取得工程において、前記死細胞の核の蛍光画像を取得し、前記評価工程において、前記死細胞の数の比率を算出してもよい。
上記態様においては、前記評価工程において、前記蛍光画像内の前記死細胞の核のサイズに基づき、前記死細胞の核の形態的な消失の有無を判定してもよい。
化学薬品の刺激に因る細胞死には、核の形態を維持したまま細胞死に至る過程の他に、核の破壊を伴う過程もある。死細胞の核のうち、破壊されて形態を失った核は、形態を維持した核に比べて、蛍光画像内において大きな蛍光領域として表れる。したがって、蛍光画像内の死細胞の核のサイズに基づいて、細胞の死に方の違いを判別することができる。
【００１６】
上記態様においては、前記画像取得工程において、互いに異なる発光波長を有する蛍光マーカで蛍光標識された前記生細胞の核および前記死細胞の核の蛍光画像を取得し、前記評価工程において、前記生細胞と前記死細胞の数の和に対する前記生細胞の数の比率を算出してもよい。
このようにすることで、細胞の生存率に基づいて化学薬品の刺激性を評価することができる。
【００１７】
上記態様においては、前記評価工程において、前記生細胞の数の比率が所定の閾値よりも大きい場合に前記化学薬品の刺激性が無いと判定し、前記生細胞の数の比率が所定の閾値以下である場合に前記化学薬品の刺激性が有ると判定し、前記所定の閾値が、前記蛍光画像毎に設定されてもよい。
生体試料には、化学薬品による処理の前に既に死細胞が含まれていることがあり、このような化学薬品の処理とは無関係の死細胞の比率は層によって異なる。したがって、各層内に含まれる、化学薬品の処理とは無関係の死細胞の数の比率に応じて蛍光画像毎に閾値を設定することによって、各層内の細胞の生存率をさらに正確に算出し、化学薬品の刺激性をさらに正確に評価することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、生体試料の３次元構造を維持したまま深さ方向における化学薬品の刺激性を評価することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法で使用される生体試料の層構造を示す模式図である。
【図３】本発明の実施例において取得された生細胞の核の蛍光画像の一例である。
【図４】本発明の実施例において取得された死細胞の核の蛍光画像の一例である。
【図５】本発明の実施例において、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図６】本発明の実施例において、１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図７】本発明の実施例において、１％酢酸で刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図８】本発明の実施例において、１０％酢酸で刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図９】本発明の実施例において、ＰＢＳで刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図１０】本発明の実施例において、５％ＳＤＳで刺激処理されたヒト皮膚モデルの細胞核の、３次元の再構成された蛍光画像である。
【図１１】図１の生体試料の刺激性評価方法の変形例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明の一実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法は、皮膚に対する化学薬品の刺激性を評価する方法であって、図１に示されるように、皮膚を模した３次元的な生体試料を化学薬品を含む試験試料で処理する薬品処理工程Ｓ１と、生体試料内の細胞の核を蛍光標識する蛍光標識工程Ｓ２と、核が蛍光標識された生体試料の蛍光画像を取得する画像取得工程Ｓ３と、蛍光画像を解析して化学薬品の刺激性を評価する評価工程Ｓ４とを含む。
【００２１】
生体試料１は、図２に示されるように、ヒトの表皮の層構造（角質層、顆粒層、有棘層、基底層を含む多層構造）を模して再構築された３次元構造を有し、薬品処理により化学物質等と接触する表面と、表面から内部に向かう深さ方向（図２の縦方向）に積層された複数の層Ｌ４，Ｌ３，Ｌ２，Ｌ１を含む。少なくとも１つ層には、細胞Ａが含まれる。符号Ｂは、核である。
【００２２】
このような生体試料１として、ＯＥＣＤのテストガイドライン（ＴＧ）４３９（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  皮膚刺激性：再生ヒト表皮試験法）で認可されている３次元ヒト皮膚モデル、例えば、約１００μｍの厚さを有するＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  ＲＨＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製：フランス）が好適に使用される。他にも、本実施形態において使用可能な３次元ヒト皮膚モデルとして、ＥｐｉＤｅｒｍ（クラボウ社製：日本）、ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製：日本）、Ｔｅｓｔｓｋｉｎ  ＬＳＥ（東洋紡社製：日本）、Ｅｐｉｓｋｉｎ（ＥｐｉｓｋｉｎＳＮＣ社製：フランス）等を挙げることができる。刺激性評価のために、表皮以外に真皮組織を含んでいてもよい。
【００２３】
ヒト皮膚モデルは、例えば、血管、リンパ管、脂腺、汗腺、毛、および毛嚢等の付随要素を含んでいてもよい。付随要素としては、例えば、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、免疫細胞、メラニン細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、毛胞細胞、毛乳頭細胞、皮脂腺細胞、および脂肪細胞等が挙げられる。また、生体モデルは、対象となる臓器に付随する他の付随要素を含んでいてよい。さらに、生体モデルは、腫瘍、炎症、ポリープ、プラークのような病態に特有の新生細胞を含んでいてもよい。
【００２４】
薬品処理工程Ｓ１は、ＴＧ４３９に則って行われる。具体的には、薬品処理工程Ｓ１において、化学薬品を含む試験試料を生体試料の表面に均一に塗布し、生体試料を試験試料で４２分間（±１分間）処理し、その後に生体試料をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄する。化学薬品としては、化粧品や医薬部外品に含まれる成分、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのような界面活性剤や、酢酸のような弱酸が挙げられる。液体状の化学薬品は、噴霧することで生体試料に塗布してもよい。化学薬品として気体中に存在し得る物質（例えば、揮発性物質、エアロゾル、放射性物質）を試験に供する場合は、一定濃度の気体中に生体試料を所定時間暴露するようにすればよい。この薬品処理工程Ｓ１は、通常は試験者が手動で行うが、自動分注装置で行ってもよい。
【００２５】
洗浄後の生体試料は、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４２時間培養される。化学薬品が細胞に対して刺激性を有しない場合、４２時間の培養後も細胞は高い確率で生存するが、化学薬品が細胞に対して刺激性を有する場合、細胞は培養期間中にアポトーシスまたはネクローシス等により細胞死に至る。
【００２６】
薬品処理工程Ｓ１において、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして、試験試料に代えて陰性標準試料および陽性標準試料でそれぞれ生体組織が処理され培養される。陰性標準試料および陽性標準試料はそれぞれ、ＴＧ４３９で推奨されているＰＢＳおよび５％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）水溶液であることが好ましい。
【００２７】
次に、蛍光標識工程Ｓ２において、生体組織中の細胞の核を所定の蛍光マーカを用いて蛍光標識する。蛍光標識には、例えば生細胞の核を特異的に標識する第１の蛍光色素と、該第１の蛍光色素とは異なる波長の蛍光を発し死細胞の核を特異的に標識する第２の蛍光色素とが用いられる。第１および第２の蛍光色素として、例えば、細胞膜透過性を有し生細胞の核を特異的に標識する色素と、細胞膜透過性を有さず死細胞の核を特異的に標識する色素とが混合されたＮｕｃｌｅａｒ−ＩＤ細胞生死判定試薬（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）が使用される。
【００２８】
あるいは、生細胞と死細胞の両方の核を標識する第１の蛍光マーカと、死細胞の核のみを特異的に標識し、第１のマーカとは異なる発光波長を有する第２の蛍光マーカとを用いてもよい。第１の蛍光マーカとしては、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｄｒａｑ５、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ等が用いられる。第２の蛍光マーカとしては、例えば、ＤＡＰＩ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ等が用いられる。この場合には、後述する評価工程Ｓ４において、細胞の全数と死細胞の数との比から、化学薬品の刺激性を評価することができる。
【００２９】
次に、画像取得工程Ｓ３において、蛍光顕微鏡を用いて生体試料の異なる深さ位置における生細胞および死細胞の核の蛍光画像を取得する。具体的には、共焦点レーザ顕微鏡等を使用し、生体試料と対物レンズとの相対距離を一定の光軸上で経時的に変化させることによって、焦点面を生体試料の深さ方向に一定の微小距離（例えば、１μｍ〜５μｍ、好ましくは２μｍまたは３μｍ）ずつずらしながら、生体試料の各層に略平行な２次元平面の蛍光画像を順次２次元走査して撮像を行い、取得された蛍光画像を深さ方向に積み重ねる。
【００３０】
蛍光顕微鏡の照明装置は、蛍光標識に用いたマーカの種類に応じた波長の励起光を発生するレーザ光源を有し、あるいは、白色光のように励起波長以外の波長も含むレーザ光源を有していてもよい。対物レンズは、生体試料の表面に対向するように該生体試料を収容する培養プレートの上方または下方に配置されており、対物レンズの焦点面を、生体試料の表面よりも若干上方を含む平面まで移動させることで、生体試料の表面を含むスライス画像（蛍光画像）を取得する。撮像する順番は、表面から深部、または深部から表面のいずれでもよいが、表面に関する情報に基づき画像処理する場合には表面から深部へ順次撮像することが好ましい。
【００３１】
焦点面を移動させる微小距離は、深さ方向に分布して存在する細胞を漏れなく捉えることができるように設定され、設定された微小距離を用い、表面を含む全ての層から２次元の蛍光画像を取得する。蛍光の利用は、細胞の核の形状が化学薬品等により変化したり細胞膜が破壊等して輪郭が不明瞭になったりした場合であっても、細胞核の有無および位置を突き止め、細胞の生死の情報を正確に把握できる点で好ましい。深さ毎に励起光の焦点を変更することにより選択的に蛍光を励起することができるので、蛍光画像を取得することは深さ毎の画像を得るのに好都合である。各蛍光画像には、一の層内の細胞の核が含まれ、生細胞の核および死細胞の核が互いに異なる色の高輝度領域として表現された複数の蛍光画像が取得される。このようにして、複数の層について画像評価に適した高精度な３次元画像を取得することができる。
【００３２】
画像取得工程Ｓ３においては、必ずしも全ての層の蛍光画像を取得する必要はなく、複数の層のうち、一部の層（例えば、表層に相当する角質層のみ、中層に相当する顆粒層のみ、または深層に相当する有棘層または基底層のみ）の蛍光画像を取得してもよい。画像取得工程Ｓ３は、培養室で行ってもよく、培養装置内部で行ってもよい。
【００３３】
図３および図４はそれぞれ、生細胞の核および死細胞の核の蛍光画像を示している。図３および図４は、共焦点レーザ顕微鏡で取得された多数の２次元的なスライス画像から再構成された３次元画像のうち、中間地点の深さにおける１枚のスライス画像を示しており、生細胞の核と死細胞の核とを明確に識別することができるように、１つのスライス画像から分離した２つの色チャネル（例えば、赤色のチャネルと緑色のチャネル）の画像を示している。
【００３４】
次に、評価工程Ｓ４は、各蛍光画像内における、生体試料の深さ方向に存在している生細胞の核の数および死細胞の核の数を計測する。ここで、蛍光画像は、生体試料の表面を含んでいるので、化学薬品と接触する生体試料表面から内部への距離（深さ）について正確な情報が得られる。さらに生体モデルにおいては、通常、試料表面から各層までの距離が予め決まっており、表面から各層までの距離を画像から容易に識別することもできる。また、蛍光画像内の核のサイズは一定の範囲内である。したがって、色、輝度値およびサイズに基づいて蛍光画像内の生細胞の核および死細胞の核を認識して数を計測することができる。
【００３５】
次に、深さ毎に取得された複数の蛍光画像の各々において、各蛍光画像としての２次元平面内の核の全数（生細胞の核の数と死細胞の核の数の和）に対する生細胞の核の数の比率（すなわち、細胞の生存率）を算出する。そして、生体試料の全ての層または特定の層における細胞の生存率が５０％（所定の閾値）よりも大きい場合には、化学薬品の刺激が無いと判定し、細胞の生存率が５０％以下である場合には、化学薬品の刺激が有ると判定する。これにより、蛍光画像が撮影された生体試料の各深さ位置について、刺激の有無が判定される。ここで、ユーザは、ディスプレイに表示された画像やプリンタで出力された画像を目視で計測することで生細胞および／または死細胞の比率を算出することができる。
【００３６】
一つの層の深さ方向の全長に対する、深さ方向に存在する生細胞の数が占める比率を求めることで、層内での刺激性を単独で評価することができる。生体試料の表面または表層よりも深い層では、老化や培地の劣化等による細胞死が深い側で発生したり進行したりする傾向があるが、刺激性試験による細胞死は化学薬品を塗布等する生体試料の表面に近い側から進行する場合が殆どである。したがって、深さ方向における生細胞の比率と位置（表面からの距離）の両方を比較することで、実際の生体試料における生体モデルの劣化や培養装置の機器の故障等と取り違うことなく、化学薬品の影響を評価することができる。例えば、生体試料の表層から離間した深部の層で特異的に生細胞の数が減った場合には、試験結果から除外するか、異常として別個に認識することができる。一方で、生体試料の表面からの距離とは関係なく、特定の層において選択的に刺激性を有する（または刺激性が増強している）という判定が得られる場合もある。いずれにしても、化学薬品の刺激性と生体試料の表面からの距離との相関の有無が、刺激性試験において有用な情報を提供する。なぜなら、皮膚表面を含む表層は、健康状態やアレルギー体質により多様な状態を有するので、生体試料の表面または表層における刺激性が表層よりも深い層での刺激性に影響する場合がある。また、これとは逆に、生体試料の表面または表層における刺激性が表層よりも深い層での刺激性と関係ない場合には、表面または表層での生細胞の数を含んだ刺激性評価は有用ではない。よって、本発明によれば、深さ方向に生細胞の数を個別に評価できる方法を提供することで、生体試料の表面または表層での刺激性との相関の有無の両方を正確に評価できる方法を提供し得る。
【００３７】
以上の評価工程Ｓ４の処理は、コンピュータ上で実行される刺激性評価プログラムによって実現される。一方、３次元的な蛍光画像をディスプレイ上に表示または上映することで、観察者が直感的に刺激性を評価することも可能である。また、上記評価プログラムにより評価された情報としての生細胞数の比率を、ディスプレイ上の３次元画像に対し層毎に重ね合わせたり、グラフ等の統計データを生成して出力したりしてもよい。
【００３８】
このように、本実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法によれば、深さ方向に等間隔をあけて複数の蛍光画像を取得する３次元の蛍光イメージングを用いることによって、生体試料の３次元構造を維持したまま生体試料内の生細胞および死細胞の数を計測し、生体試料に対する化学薬品の刺激性を評価することができる。
【００３９】
特に、ＭＴＴ試験とは異なり、生体試料の深層から表層までの任意の深さ位置における細胞の生存率を算出することができる。皮膚への浸透性が高い化学薬品と皮膚への浸透性が低い化学薬品とでは、各層に与える影響が異なる。例えば、皮膚への浸透性が低い化学薬品は、表層にのみ作用し、中層および深層には作用しないが、皮膚への浸透性が高い化学薬品は、全ての層に作用する。本実施形態によれば、ＭＴＴ試験とは異なり、化学薬品の刺激性の評価を層毎に行うことができる。
【００４０】
図５から図１０に、本実施形態に係る生体試料の刺激性評価方法において取得された蛍光画像から再構成された３次元画像の一例を示す。図５および図６はそれぞれ、１％および１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで処理された生体試料の蛍光画像である。図７および図８はそれぞれ、１％および１０％の酢酸で処理された生体試料の蛍光画像である。図９および図１０は、コントロールとして、ＰＢＳおよび５％ＳＤＳ水溶液で処理された生体試料の蛍光画像である。
【００４１】
図５から図１０の実施例において、ヒト皮膚モデルであるＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  ＲＨＥを用い、ＴＧ４３９に則って化学薬品で処理し、Ｎｕｃｌｅａｒ−ＩＤ細胞生死判定試薬で生細胞および死細胞の核を蛍光標識した。
図５から図８から分かるように、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、酢酸およびＰＢＳで処理されたヒト皮膚モデルでは、核等の細胞の３次元構造が維持されていた。また、これら３次元画像から、生細胞および死細胞の両方が混在する領域が存在し、生体試料の深層に死細胞が散在したり、逆に表層に生細胞が散在することがあることが分かった。また、生体モデルでさえ、生体試料の表面は必ずしも平坦ではなく、部分的または全体的に起伏がある場合や、局所的に微小な窪みや突出部が存在する場合がある。これらの内部構造や表面形状の多様性は、生体モデルだけでなく生物由来の生体試料でも同様である。
【００４２】
さらに、１０％酢酸で処理されたヒト皮膚モデルでは、死細胞の核の構造が維持されていたのに対し、５％ＳＤＳ水溶液で処理されたヒト皮膚モデルでは、死細胞の核等の構造が破壊されていた。このような細胞の構造の破壊は、ＭＴＴ試験では検出することができない現象である。
【００４３】
本実施形態においては、評価工程Ｓ４において、刺激性の有無の判定用の閾値として、全ての蛍光画像に対して同一の値（５０％）を用いることとしたが、これに代えて、蛍光画像毎に閾値を設定してもよい。
生体試料の各層には、薬品処理工程Ｓ１の前に既に死細胞が存在する可能性がある。このような化学薬品による刺激とは関係の無い死細胞の数が細胞の生存率の算出に加味された場合、化学薬品の刺激性を正確に評価することができない。
【００４４】
ＰＢＳのような陰性標準試料で処理された細胞はほとんどが生存し続ける。したがって、陰性標準試料で処理された生体試料について、試験試料で処理された生体試料と同様にして、複数の蛍光画像を取得し、各蛍光画像内の死細胞の数を計測することによって、化学薬品による刺激とは無関係の死細胞の数が得られる。そして、得られた死細胞の数を考慮して各蛍光画像用の閾値を設定する（例えば、化学薬品による刺激とは無関係の死細胞の数が多い程、閾値を高く設定する）ことによって、化学薬品の刺激に対する細胞の正確な生存率が得られる。これにより、化学薬品の刺激性をさらに正確に評価することができる。
【００４５】
本実施形態においては、画像取得工程Ｓ３と評価工程Ｓ４との間に、図１１に示されるように、３次元画像再構成工程Ｓ５をさらに含んでいてもよい。
３次元画像再構成工程Ｓ５においては、画像取得工程Ｓ３において取得された複数の２次元の蛍光画像の全体を、ＸＹ方向のアドレスが互いに合致するように深さ方向に積層することによって、生体試料の３次元画像を再構成する。３次元画像に基づき、深さ毎の評価を実施することにより、生体試料の表面形状が平坦でなかったり、対物レンズの光軸に対して生体試料の表面が垂直でなかったりする場合であっても、表面の位置に応じて深さ方向に正確な評価を実施することが可能となる。
【００４６】
また、画像取得工程Ｓ３と評価工程Ｓ４との間に、３次元画像再構成工程Ｓ５の後または単独で、部分的な３次元画像としての垂直断面画像を作成する垂直断面画像作成工程Ｓ６を含んでいてもよい。垂直断面画像作成工程Ｓ６においては、図１１に示されるように、３次元画像再構成工程Ｓ５において３次元画像を再構成した後に、３次元画像を構成する全ての２次元画像上の直線または矩形の領域に相当する同一のアドレス部分のみを抽出することによって、深さ方向に沿う方向の生体試料の垂直断面画像を作成できる。３次元画像を再構成せずに、各２次元画像の直線または矩形の領域に相当する同一のアドレス部分を互いに積層することによって、深さ方向に沿う方向の生体試料の垂直断面画像を単独で作成してもよい。
垂直断面画像には、生体試料内の複数の層が含まれ、好ましくは生体試料の表面が含まれる。したがって、評価工程Ｓ４において、垂直断面画像内の各層内の生細胞および死細胞の核の数を計測することによって、細胞の生存率を層別に算出することができる。
【００４７】
以上の３次元画像再構成工程Ｓ５および／または垂直断面画像作成工程Ｓ６の処理は、画像処理装置、または、コンピュータ上で実行される画像処理プログラムによって実現される。再構成された３次元画像は、ディスプレイ上で見たい角度に回転させることができ、また、必要に応じて画像上の任意の位置で垂直断面画像を表示するように表示を切り替えることができる。また、作成された垂直断面画像は、切り出したいアドレス情報を画像処理装置に指定することで、シート状、板状、ブロック状、柱状といった様々な断面をディスプレイ上に１以上表示することができる。
【００４８】
２以上の異なるアドレスに基づき２以上の垂直断面画像を作成し、作成された垂直断面画像を表示または計測し、２以上の垂直断面画像間での比較を行うことにより、生体試料の表面または深部の２次元画像において刺激が最も強い位置および深さを決定するような評価工程を付加することができる。このようにして得た、生体試料の表面に垂直な断面における生細胞数の違いは、生体試料に対する２次元的な化学薬品の影響の違いを反映するので、接触密度または浸透量が最も大きい可能性のある部位を特異的に評価できる。このことは、試験すべき化学薬品による最大のリスクを高精度に知る上で効果的である。
【００４９】
本実施形態においては、死細胞の核のうち、破壊されて形態を失った核の数を、その他の死細胞の核とは区別して計測してもよい。
例えば強酸性の化学薬品に暴露された細胞の核は破壊されて形態的に消失する。ＭＴＴ試験では、形態を維持している核と形態を失った核とを区別して検出することはできない。一方、蛍光画像内では、形態を失った核が、形態を維持している核に比べて大きな蛍光領域として観察されるので、形態を失った核の数を、その他の核とは区別して計測することができる。
【００５０】
化学薬品への暴露による細胞死には、核の形態を維持したまま死に至る死に方の他に、核の破壊を伴う死に方がある。細胞がどのようにして死に至ったかという情報は、化学薬品の刺激の評価にとって有用である。本実施形態によれば、細胞の生存率のみでなく、細胞の死に方も、蛍光画像内の死細胞の核のサイズに基づいて判別することができる。
【００５１】
本実施形態においては、生体試料としてヒト皮膚モデルを使用することとしたが、本実施形態の刺激性評価方法は、他の任意の臓器の生体モデルにも適用することができる。生体試料が循環器官や消化器官のように管状部を有する場合には、管状部の内壁が生体試料の表面であり得る。３次元構造を構築するための材料は、スフェロイド、オルガノイド、マトリックス状の三次元培養用担体（例えば、マトリジェル（登録商標、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、セルベッド（登録商標、日本バイリーン社製））を用いて細胞を３次元培養したサンプル、または、細胞シートの積層体であってもよい。
【００５２】
また、本実施形態においては、化学薬品の種類や処理手順等、ＴＧ４３９に則った条件に基づいて薬品処理工程Ｓ１を行うこととしたが、薬品処理工程Ｓ１における条件は、試験の種類や適用する生産または消費国の規定に基づき変更してよい。また、薬品処理工程Ｓ１は、化学薬品を含有させた貼付用シールを生体試料の表面に貼り付けたり、生体材料を主成分とし化学薬品を含有させた移植片を生体試料に移植したりすることによって実行してもよい。
【００５３】
また、蛍光標識工程Ｓ２において蛍光標識に用いる蛍光マーカとしては、蛍光色素に限らず、蛍光タンパク質を用いてもよい。
また、本実施形態においては、生細胞の核および死細胞の核を互いに異なる発光波長を有する蛍光マーカで標識することとしたが、生細胞および死細胞のうち少なくとも一方の核を標識すればよい。例えば、生細胞のみを蛍光標識して評価してもよい。この場合には、３次元的な空間内での生細胞の分布を評価することで、深さ毎に生きた細胞の占める比率を評価することが可能となる。
【００５４】
本実施形態においては、画像取得工程Ｓ３において、共焦点顕微鏡を用いた方法以外の方法を用いて３次元の蛍光画像を取得してもよい。例えば、撮像の直前に生体試料を透明化試薬により透明化し、透明な生体試料を立体観察や位相差撮影の手法で深さ情報や表面に関する情報を得ながら、生体試料の複数の層を含むような焦点深度で撮像することで、３次元画像を一度ないし数回の撮像で高速に取得してもよい。この場合、３次元画像の撮像後に、深さ毎の画像（例えば、上記微小距離ずつずらした場合に相当する複数枚の画像）データを３次元画像から分離するとともに、表面の情報に基づき深さ方向における判定を行うようにすればよい。
【００５５】
本実施形態において、評価工程Ｓ４は、３次元画像から得られる垂直断面画像のみを用いて各層の深さ方向に分布する生細胞の数の比率を計測するように実行してもよい。この場合、１以上の垂直断面を有するスライス状またはブロック状の画像を、生体試料の異なる表面部位においてアドレス情報と関係付けながら取得することで、成分または濃度が異なる多種類の化学薬品による刺激性試験を同一の生体試料上で一度に解析するシステムを提供することができる。
【００５６】
さらに、画像取得工程Ｓ３において画像取得を経時的に実行することで、深さ方向への化学薬品の影響度を評価することもできるようになる。例えば、所定の培養期間の終了直後と、培養途中および／または培養期間終了から一定時間経過後とを含む２以上の時刻間で生細胞数の比率を比較することで、健常な生体モデルに対する刺激性のみならず、様々な病態または老化等の非健常モデルに対する治療効果または美容効果と、化学薬品の刺激性との相関関係を詳しく評価することも可能となる。
【符号の説明】
【００５７】
１  生体試料
Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４  層
Ａ  細胞
Ｂ  核
Ｓ１  薬品処理工程
Ｓ２  蛍光標識工程
Ｓ３  画像取得工程
Ｓ４  評価工程
Ｓ５  ３次元画像再構成工程
Ｓ６  垂直断面画像作成工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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