(57)【要約】      （修正有）【課題】両末端に互いに異なる官能基を高純度で含有する分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの提供。【解決手段】式（１）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。2018062655.tif 000110（Ｘ１及びＹ１は、生体機能性分子と反応して共有結合を形成する官能基を含む原子団、Ｘ１が含む官能基とＹ１が含む官能基とは互いに異なる；ｎは６〜３０の整数；ＥはＬ２に対して２価の結合価数を有し、Ｌ３に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位；Ｌ１及びＬ２は、夫々独立して、単結合又は２価の有機基；Ｌ３は単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−又は−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−；Ｌ４はエーテル結合、アミド結合又はウレタン結合；Ｌ５はアミド結合又はウレタン結合；ｍ１〜ｍ３は夫々独立して１〜５の整数）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されることを特徴とする、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【化１】
2018062655.tif 000098
（式（１）中、
Ｘ１、Ｙ１は、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基を少なくとも含む原子団であり、原子団Ｘ１が含む前記官能基と原子団Ｙ１が含む前記官能基とは互いに異なる。
ｎは６〜３０の整数である。
Ｅは、Ｌ２に対して２価の結合価数を有し、Ｌ３に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位を表す。
Ｌ１、Ｌ２は、それぞれ独立して、単結合または２価の有機基を表す。
Ｌ３は、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１、ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。）
【請求項２】
Ｌ３が、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１，ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表すことを特徴とする、請求項１記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【請求項３】
式（１）中に含まれるＬ２が、エーテル結合であることを特徴とする、請求項１または２記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【請求項４】
式（２）で表される、請求項１または２記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【化２】
2018062655.tif 000099
（式（２）中、
Ｘ１、Ｙ１は、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基を少なくとも含む原子団であり、原子団Ｘ１が含む前記官能基と原子団Ｙ１が含む前記官能基とは互いに異なる。
ｎは６〜３０の整数である。
Ｌ１は、単結合または２価の有機基を表す。
Ｌ３は、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１，ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。）
【請求項５】
式（３）で表される、請求項４記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
【化３】
2018062655.tif 000100
（式（３）中、
ｎは６〜３０の整数を表す。
Ｙ２は、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２で表され、ｍ４は、１〜５の整数を表す。）
【請求項６】
請求項５記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体を製造する方法であって、
下記式（４）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体と下記式（５）で表される化合物とを、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０である塩基触媒を用いてカップリングさせ、下記式（６）で表される化合物を得る工程（１）と、
【化４】
2018062655.tif 000101
（式（４）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｂは脱離基である。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【化５】
2018062655.tif 000102
（式（５）中、
Ｚは、−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。）
【化６】
2018062655.tif 000103
（式（６）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（６）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（７）で表される化合物を得る工程（２）と、
【化７】
2018062655.tif 000104
（式（７）中、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（７）で表される化合物に分液精製を施す工程（３）と、
前記式（７）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して式（３）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程（４）と、
を上記の順で含むことを特徴とする分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【請求項７】
前記塩基触媒が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドおよびナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールに、生体機能性分子が結合されていることを特徴とする、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール結合体。
【請求項９】
式（４０）で表される、請求項４記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
【化８】
2018062655.tif 000105
（式（４０）中、
ｎは６〜３０の整数を表す。
Ｙ２は、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２で表され、ｍ４は、１〜５の整数を表す。）
【請求項１０】
請求項９記載の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体を製造する方法であって、
下記式（４１）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体と下記式（４２）で表される化合物とを、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０である塩基触媒を用いてカップリングさせ、下記式（４３）で表される化合物を得る工程（１’）と、
【化９】
2018062655.tif 000106
（式（４１）中、
Ｚは、−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
Ｂは脱離基である。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【化１０】
2018062655.tif 000107
（式（４２）中、
Ａは水酸基の保護基）
【化１１】
2018062655.tif 000108
（式（４３）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（４３）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（４４）で表される化合物を得る工程（２’）と、
【化１２】
2018062655.tif 000109
（式（４４）中、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（４４）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して式（４０）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程（３’）と、
前記式（４０）で表される化合物に分液精製を施す工程（４’）と、
を上記の順で含むことを特徴とする分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【請求項１１】
前記塩基触媒が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドおよびナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール結合体に関する。より詳しくは、生体機能性高分子、ドラッグデリバリーシステムにおける薬物または薬物キャリア、または診断用材料やデバイスなどの修飾に用いられ、特に抗体結合医薬用のリンカーとして有用な分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品分野において、薬剤をリンカーを介して抗体と結合させ、抗原提示細胞に薬物を能動的に運搬する、抗体結合医薬（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）が実用化され、高い注目を集めている（Ｔｏｘｉｎｓ、２０１１年、３、ｐ．８４８−８８３（非特許文献１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４、ｐ．３６０６−３６２３（非特許文献２））。
【０００３】
一般的に薬剤は疎水性のものが多いため、ＡＤＣとして使用した際に凝集が生じることがある。そこで検討されているリンカーの一つが、親水性リンカーであるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールである。
【０００４】
ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとは、薬剤と抗体を両末端に区別して結合させるために、両末端に互いに異なる官能基を有し（ヘテロ型）、かつ、医薬品申請およびＡＤＣ製造、精製、分析を簡便にするために、特定のエチレングリコール鎖長を有する化合物が90%以上含まれる化合物のことである。
【０００５】
前記ＡＤＣでは、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをリンカーとして、その各末端に抗体と薬剤とを区別して結合させるため、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に、両末端に互いに同じ官能基を有する化合物（ホモ型ポリエチレングリコール等）が不純物として存在すると、抗体が２つ結合した化合物又は薬剤が２つ結合した化合物が生成する。抗体が２つ結合した化合物は、薬剤が結合していないためにＡＤＣとしての効果が奏されず、薬剤が２つ結合した化合物は抗体が結合していないために抗原提示細胞以外の箇所に運搬されて副作用を引き起こす原因となる。また、目的の官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールと異なる組み合わせで官能基を有する他のヘテロ型化合物が不純物として存在する場合も、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成するため、上記と同様の問題が生じる。したがって、薬剤の使用、効果の観点から、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを高純度で含有する、すなわち官能基純度が高いことが重要といえる。
【０００６】
また近年、前記ＡＤＣにおいて薬物の運搬効率を向上させることを目的として、抗体に対して複数個の薬剤を結合させたＡＤＣを使用することが望まれており、その一つとして、リンカーを分岐型の構造にする方法が試みられている。
【０００７】
例えば、特許文献１（US20130052130A1）では、トリスヒドロキシルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）や、リシンなどのアミノ酸からなる分岐部位に単分散ポリエチレングリコールを結合させることで、前記エチレングリコール鎖が３本あるいは４本導入された分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールが開示されている。
【０００８】
また、特許文献２（CN104530415A）では、グリセリンやチオグリセリンからなる分岐部位に単分散ポリエチレングリコールを結合させることで、前記エチレングリコール鎖が３本導入された分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールが開示されている。
【０００９】
これら特許文献１および特許文献２は共通して、分岐部位が有する結合点の全てに単分散ポリエチレングリコールが結合され、その先に抗体や薬物へ結合可能な官能基が結合している。これを下記のように概略的に示すことができる。
（Ｘ−ＰＥＧ１−）ｎ−Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ
（式中、Ｘ，Ｙはそれぞれ異なる官能基であり、ｎは２または３の整数である。Ｂは分岐骨格を表す。ＰＥＧ１およびＰＥＧ２は直鎖型単分散ポリエチレングリコールを表す。）
【００１０】
これら特許文献１および特許文献２において、前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールを得る方法としては、末端官能基が異なる２種類の直鎖型単分散ポリエチレングリコール（Ｘ−ＰＥＧ１およびＰＥＧ２−Ｙ）を用意し、はじめにＸ−ＰＥＧ１と分岐部位とを反応させ、その後、ＰＥＧ２−Ｙを反応させる、もしくは、はじめにＰＥＧ２−Ｙと分岐部位とを反応させ、その後、Ｘ−ＰＥＧ１を反応させる方法が記載されている。はじめにＰＥＧ２−Ｙを反応させる場合の例を次式に示す。
【００１１】
・１段階目
Ｂ  ＋  ＰＥＧ２−Ｙ  →  Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ
・２段階目
Ｘ−ＰＥＧ１  ＋  Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ  →  （Ｘ−ＰＥＧ１−）ｎ−Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ
（式中、Ｘ，Ｙはそれぞれ異なる官能基であり、ｎは２または３の整数である。Ｂは分岐部位を表す。ＰＥＧ１およびＰＥＧ２は直鎖型単分散ポリエチレングリコールを表す。）
【００１２】
前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造において、１段階目の分岐部位ＢとＰＥＧ２−Ｙとの反応では、下記式に示すようにＰＥＧ２−Ｙが残存する可能性がある。これは、目的の分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールと片末端のみ同じ官能基を有している。そのため、過剰に加えた単分散ポリエチレングリコールを含む分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いた場合、官能基純度が低いため、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
Ｂ  ＋  ＰＥＧ２−Ｙ  →  Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ  ＋  ＰＥＧ２−Ｙ
【００１３】
また、２段階目のＸ−ＰＥＧ１との反応では、下記式に示すように過剰に加えたＸ−ＰＥＧ１が残存する可能性がある。これは、目的の分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールと片末端のみ同じ官能基を有している。そのため、過剰に加えた単分散ポリエチレングリコールを含む分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いた場合、官能基純度が低いため、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
Ｘ−ＰＥＧ１  ＋  Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ  →
（Ｘ−ＰＥＧ１−）ｎ−Ｂ−ＰＥＧ２−Ｙ  ＋  Ｘ−ＰＥＧ１
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】US20130052130A1
【特許文献２】CN104530415A
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
以上のように、特許文献１および特許文献２に記載の分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールにおいては、末端官能基が異なる２種類の直鎖型単分散ポリエチレングリコールを２段階で反応させる必要があるため、過剰に加えた直鎖型単分散ポリエチレングリコールの残存により、目的の分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールの純度が低下し、薬剤の使用、効果の観点で問題となる恐れがある。
【００１６】
更に、分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールの精製方法としては、再結晶やカラム精製等が挙げられ、特許文献１および特許文献２では、過剰に加えた単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２−Ｙ、およびＸ−ＰＥＧ１）を、カラムクロマトグラフィーにより除去している。しかし、単分散ポリエチレングリコールは、末端官能基が同じ場合、鎖長が異なるものであっても類似の物性を有していることから、上記カラム精製は困難であり、歩留りが低下する原因となる。
【００１７】
本発明の課題は、両末端に互いに異なる官能基を高純度で含有する分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール、前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体、及び分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールと生体機能性分子とが結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体、並びに、前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、式（１）に示すように、両末端にそれぞれ異なる官能基を高純度で有し、分岐部位が有する３つの結合点のうちの１つに単分散ポリエチレングリコールが結合していない分岐型単分散ポリエチレングリコールが得られることを見出した。さらに、前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールを製造するための中間体を、末端に特定の官能基を用いて合成することにより、カラムクロマトグラフィー等の精製方法を用いなくとも、簡便な分液抽出のみで、両末端に異なる官能基を高純度で有する分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（１１）を提供する。
（１）  式（１）で表されることを特徴とする、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【化１】
2018062655.tif 000002
（式（１）中、
Ｘ１、Ｙ１は、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基を少なくとも含む原子団であり、原子団Ｘ１が含む前記官能基と原子団Ｙ１が含む前記官能基とは互いに異なる。
ｎは６〜３０の整数である。
Ｅは、Ｌ２に対して２価の結合価数を有し、Ｌ３に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位を表す。
Ｌ１、Ｌ２は、それぞれ独立して、単結合または２価の有機基を表す。
Ｌ３は、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１、ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。）
【００２０】
（２）  Ｌ３が、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１，ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表すことを特徴とする、（１）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【００２１】
（３）  式（１）中に含まれるＬ２が、エーテル結合であることを特徴とする、（１）または（２）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【００２２】
（４）  式（２）で表される、（１）または（２）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール。
【化２】
2018062655.tif 000003
（式（２）中、
Ｘ１、Ｙ１は、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基を少なくとも含む原子団であり、原子団Ｘ１が含む前記官能基と原子団Ｙ１が含む前記官能基とは互いに異なる。
ｎは６〜３０の整数である。
Ｌ１は、単結合または２価の有機基を表す。
Ｌ３は、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表し、ｍ１，ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。）
【００２３】
（５）  式（３）で表される、（４）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
【化３】
2018062655.tif 000004
（式（３）中、
ｎは６〜３０の整数を表す。
Ｙ２は、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２で表され、ｍ４は、１〜５の整数を表す。）
【００２４】
（６）  （５）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体を製造する方法であって、
下記式（４）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体と下記式（５）で表される化合物とを、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０である塩基触媒を用いてカップリングさせ、下記式（６）で表される化合物を得る工程（１）と、
【化４】
2018062655.tif 000005
（式（４）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｂは脱離基である。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【化５】
2018062655.tif 000006
（式（５）中、
Ｚは、−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。）
【化６】
2018062655.tif 000007
（式（６）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（６）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（７）で表される化合物を得る工程（２）と、
【化７】
2018062655.tif 000008
（式（７）中、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（７）で表される化合物に分液精製を施す工程（３）と、
前記式（７）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して式（３）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程（４）と、
を上記の順で含むことを特徴とする分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【００２５】
（７）  前記塩基触媒が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドおよびナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかであることを特徴とする、（６）の方法。
【００２６】
（８）  （１）〜（４）のいずれかの分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールに、生体機能性分子が結合されていることを特徴とする、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール結合体。
【００２７】
（９）  式（４０）で表される、（４）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
【化８】
2018062655.tif 000009
（式（４０）中、
ｎは６〜３０の整数を表す。
Ｙ２は、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２で表され、ｍ４は、１〜５の整数を表す。）
【００２８】
（１０）  （９）の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体を製造する方法であって、
下記式（４１）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体と下記式（４２）で表される化合物とを、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０である塩基触媒を用いてカップリングさせ、下記式（４３）で表される化合物を得る工程（１’）と、
【化９】
2018062655.tif 000010
（式（４１）中、
Ｚは、−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
Ｂは脱離基である。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【化１０】
2018062655.tif 000011
（式（４２）中、
Ａは水酸基の保護基）
【化１１】
2018062655.tif 000012
（式（４３）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（４３）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（４４）で表される化合物を得る工程（２’）と、
【化１２】
2018062655.tif 000013
（式（４４）中、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
前記式（４４）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して式（４０）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程（３’）と、
前記式（４０）で表される化合物に分液精製を施す工程（４’）と、
を上記の順で含むことを特徴とする分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【００２９】
（１１）  前記塩基触媒が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドおよびナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかであることを特徴とする、（１０）の方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の前記式（１）または前記式（２）で表される化合物は、両末端にそれぞれ異なる官能基を高純度で有するため、ＡＤＣとして使用する場合、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物の生成が抑制され、前記ＡＤＣの効果の向上が期待できる。
【００３１】
また、本発明の前記式（１）または前記式（２）で表される化合物の製造方法では、分岐部位が有する３つの結合点のうちの１つに単分散ポリエチレングリコールが結合していないため、両末端にそれぞれ異なる官能基を高純度で有する前記式（１）または前記式（２）を容易に得ることができる。
【００３２】
さらに、本発明の前記式（３）で表される化合物の製造方法では、前記工程（１）において特定の塩基触媒を用いることで、副反応を抑制し、かつ前記工程（１）〜（４）をこの順で行うことで、工程（１）で過剰に加えた前記式（４）で表される化合物由来の不純物を、分液精製のみで除去することができるため、鎖長純度および官能基純度の高い前記式（３）で表される化合物を容易に得ることができる。
また、記工程（１’）において特定の塩基触媒を用いることで、副反応を抑制し、かつ前記工程（１’）〜（４’）をこの順で行うことで、工程（１’）で過剰に加えた前記式（４１）で表される化合物由来の不純物を、分液精製のみで除去することができるため、鎖長純度および官能基純度の高い前記式（４０）で表される化合物を容易に得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明における分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールとは、末端に２種の官能基を高純度で有し、分岐部位が有する３つの結合点のうちの１つに単分散ポリエチレングリコールが結合していない化合物である。また、末端官能基が高純度であることとは、特定の組み合わせの官能基を有する化合物の純度（以下、官能基純度という）が９５％以上となることである。さらに、単分散ポリエチレングリコールとは、特定のエチレングリコール鎖長を有する化合物の純度（以下、鎖長純度という）が90％以上となることである。
【００３４】
この分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールは式（１）で表される。
【化１３】
2018062655.tif 000014
【００３５】
式（１）において、Ｘ１、Ｙ１はそれぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基を少なくとも含む原子団であり、原子団Ｘ１が含む前記官能基と原子団Ｙ１が含む前記官能基とは互いに異なる。ｎは単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表す６〜３０の整数である。Ｅは、Ｌ１に対して２価の結合価数を有し、Ｌ３に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位を表す。Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ独立して単結合または２価の有機基を表す。Ｌ３は、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−を表し、Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表す。ｍ１、ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。
【００３６】
前記式（１）において、Ｘ１及びＹ１は、互いに異なる官能基であり、分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールによる修飾の対象となる生体機能性分子（タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤）に存在する官能基と反応して共有結合を形成し得る官能基であれば特に制限は無い。中でも、Ｘ１及びＹ１としては、それぞれ独立に、タンパク質に代表される天然の生体機能性分子に存在する基（アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基等）や前記生体機能性分子に人工的に導入可能な基（マレイミド基、ケトン基、アジド基、アルキニル基等）に温和な条件で、かつ、高い反応効率で反応可能な官能基であることが好ましく、より具体的には、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基、アリル基、ビニル基、アルキニル基、アジド基が好ましい。さらに、反応効率等を考慮すると、Ｘ１及びＹ１としては、マレイミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、アルキニル基、アジド基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基であることがより好ましい。
【００３７】
また、Ｘ１及びＹ１としては、それぞれ独立に、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアミノ基である場合には、アルデヒド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、ケトン基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がチオール基である場合には、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、アリル基、ビニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルデヒド基、ケトン基である場合には、アミノ基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がカルボキシル基である場合には、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がマレイミド基である場合には、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアジド基である場合にはアルキニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルキニル基である場合にはアジド基であることが好ましい。
【００３８】
Ｘ１とＹ１との好ましい組み合わせとしては、例えばＸ１が活性エステル基である場合には、Ｙ１はマレイミド基、アジド基、アルキニル基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、ビニルスルホン基、オキシアミノ基、チオール基、アリル基、ビニル基であることが好ましく、Ｘ１が活性カーボネート基である場合には、Ｙ１はマレイミド基、アジド基、アルキニル基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、ビニルスルホン基、オキシアミノ基、チオール基、アリル基、ビニル基であることが好ましく、Ｘ１がマレイミド基である場合には、Ｙ１は活性エステル基、活性カーボネート基、アジド基、アルキニル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、オキシアミノ基、ケトン基であることが好ましく、Ｘ１がアジド基である場合には、Ｙ１は活性エステル基、活性カーボネート基、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、アルデヒド基、ビニルスルホン基、カルボキシル基、アミノ基、オキシアミノ基、チオール基、アリル基、ビニル基、ケトン基であることが好ましく、Ｘ１がアルキニル基である場合には、Ｙ１は活性エステル基、活性カーボネート基、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、アルデヒド基、ビニルスルホン基、カルボキシル基、アミノ基、オキシアミノ基、チオール基、アリル基、ビニル基、ケトン基であることが好ましい。
【００３９】
前記式（１）において、Ｌ１は、ポリエチレングリコール鎖とＸ１との結合を担うリンカーであり、共有結合によって構成される部位であれば特に制限は無いが、好ましくは、単結合、二価の飽和炭化水素基、及びウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、カーボネート結合もしくはこれらを含む二価の飽和炭化水素基が挙げられる。前記飽和炭化水素基としては、炭素数が１０以下であることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【００４０】
式（１）において、Ｌ３は、Ｙ１と分岐部位Ｅとの結合を担うリンカーであり、単結合、−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ１−または−Ｌ４−（ＣＨ２）ｍ２−Ｌ５−（ＣＨ２）ｍ３−で表される。Ｌ４は、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合のいずれかを表し、Ｌ５は、アミド結合またはウレタン結合を表す。ｍ１、ｍ２、ｍ３はそれぞれ独立して１〜５の整数を表す。
【００４１】
本発明におけるＬ４がエーテル結合であり、Ｌ５がアミド結合である場合のＬ３の好ましい例としては、次式：
−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ３−  ・・・（８）
−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ３−          ・・・（９）
のいずれかで表される。
【００４２】
本発明におけるマレイミド基とは、Ｌ１、Ｌ３も含めて次式：
【化１４】
2018062655.tif 000015
で表される基であり、チオール基等の求核性基と反応する基である。前記式（１０）中、Ｒ１としては、水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子がより好ましい。
【００４３】
本発明におけるＸ１とＹ１がマレイミド基である場合、−Ｌ１−Ｘ１および−Ｌ３−Ｙ１の好ましい例としては、次式：
【化１５】
2018062655.tif 000016
で表され、前記式（１１）中、ａは１〜５の整数を示し、Ｒ１は前記式（１０）中のＲ１と同義である。
【００４４】
本発明における活性エステル基とは、Ｌ１、Ｌ３も含めて次式：
【化１６】
2018062655.tif 000017
で表される基であり、アミノ基等の求核性基と反応する。前記式（１２）中、Ｒ２としては、フェニル基、３−ピリジル基、スクシンイミド基、２−ベンゾチアゾール基、又は１−ベンゾトリアゾール基が好ましく、スクシンイミド基又は１−ベンゾトリアゾール基がより好ましく、スクシンイミド基が最も好ましい。
【００４５】
本発明におけるＸ１とＹ１が活性エステル基である場合、−Ｌ１−Ｘ１および−Ｌ３−Ｙ１の好ましい例としては、次式：
【化１７】
2018062655.tif 000018
で表され、前記式（１３）中、ｂは１〜５の整数を示し、Ｒ２は前記式（１２）中のＲ２と同義である。
【００４６】
本発明における活性カーボネート基とは、Ｌ１、Ｌ３も含めて次式：
【化１８】
2018062655.tif 000019
で表される基であり、アミノ基等の求核性基と反応する。前記式（１４）中、Ｒ３としては、フェニル基、３−ピリジル基、スクシンイミド基、４−ニトロフェニル基、２−ベンゾチアゾール基、又は１−ベンゾトリアゾール基が好ましく、スクシンイミド基又は１−ベンゾトリアゾール基がより好ましく、スクシンイミド基が最も好ましい。
【００４７】
本発明におけるＸ１とＹ１が活性カーボネート基である場合、−Ｌ１−Ｘ１および−Ｌ３−Ｙ１の好ましい例としては、次式：
【化１９】
2018062655.tif 000020
で表され、前記式（１５）中、Ｒ３は前記式（１４）中のＲ３と同義である。
【００４８】
本発明におけるアルキニル基とは、Ｌ１、Ｌ２も含めて次式：
【化２０】
2018062655.tif 000021
【化２１】
2018062655.tif 000022
【化２２】
2018062655.tif 000023
【化２３】
2018062655.tif 000024
のうちのいずれかで表される基であり、アジド基等と反応する。前記式中、Ｒ４としては、炭素数８以下の飽和炭化水素基又は水素原子が好ましく、水素原子がより好ましい。
【００４９】
本発明におけるＸ１とＹ１がアルキニル基である場合、−Ｌ１−Ｘ１および−Ｌ３−Ｙ１の好ましい例としては、次式：
【化２４】
2018062655.tif 000025
【化２５】
2018062655.tif 000026
【化２６】
2018062655.tif 000027
で表され、前記式（２０）中、ｃは２〜５の整数を示し、Ｒ４は前記式（２１）中のＲ４と同義である。また、前記式（２２）中、ｄは１〜６の整数を示す。
【００５０】
本発明におけるＸ１とＹ１がヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基である場合のＸ１とＹ１とは、Ｌ１、Ｌ３も含めて次式：
【化２７】
2018062655.tif 000028
【化２８】
2018062655.tif 000029
で表され、チオール基と反応する。
【００５１】
ｎは単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表す６〜３０の整数である。ＡＤＣ用のリンカーとして使用する観点からは、ｎは６〜２４の整数であることが好ましい。
【００５２】
Ｅは、Ｌ２に対して２価の結合価数を有し、Ｌ３に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位を表す。
【００５３】
本発明におけるグリセリン部位とは、Ｌ２、Ｌ３も含めて次式：
【化２９】
2018062655.tif 000030
【化３０】
2018062655.tif 000031
のいずれかで表され、原料純度の観点からは、式（２５）で表される構造であることが好ましい。
【００５４】
Ｌ２はポリエチレングリコール鎖と分岐部位Ｅとの結合を担うリンカーであり、共有結合によって構成される部位であれば特に制限は無いが、単結合、二価の飽和炭化水素基、及びウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、カーボネート結合もしくはこれらを含む二価の飽和炭化水素基等が挙げられ、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合のいずれかであることが好ましく、原料純度の観点からは、エーテル結合であることがより好ましい。前記飽和炭化水素基としては、炭素数が１０以下であることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【００５５】
前記式（１）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの好ましい例としては、下記式（２８）で表される化合物が挙げられる。
【化３１】
2018062655.tif 000032
【００５６】
本発明における分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、下記式（２９）で表される。
【化３２】
2018062655.tif 000033
【００５７】
前記式（２９）において、ｎは６〜３０の整数を表す。Ｘ２及びＹ２は、互いに異なる官能基であり、Ｘ２は水素、もしくは二価の飽和炭化水素基を含むアミノ基、カルボキシル基のいずれかを表す。Ｙ２は、−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯＯＨのいずれかを表す。ｍ４およびｍ６は、１〜５の整数を表す。Ｌ２は、二価の有機基を表す。Ｅは、Ｌ２に対して２価の結合価数を有し、Ｙ２に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、グリセリン部位を表す。
【００５８】
前記式（２９）において、ｎは単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表す６〜３０の整数である。ＡＤＣ用のリンカーとして使用する観点からは、ｎは６〜２４の整数であることが好ましい。
【００５９】
前記式（２９）において、Ｘ２は、式（１）中のＸ１へと変換可能な官能基であれば特に限定は無いが、水素、もしくは二価の飽和炭化水素基を含むアミノ基、カルボキシル基、のいずれかであることが好ましく、水素であることがより好ましい。前記飽和炭化水素基としては、炭素数が１０以下であることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【００６０】
前記式（２９）において、Ｙ２は、式（１）のＹ１へと変換可能な官能基であれば特に限定は無いが、−ＮＨ２、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯＯＨのいずれかであることが好ましく、合成容易性の観点からは、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２であることがより好ましい。ｍ４およびｍ６は、１〜５の整数を表す。
【００６１】
前記式（２９）におけるＸ２とＹ２は、前記式（１）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールを合成する観点から、互いに異なる官能基であることが好ましい。Ｘ２とＹ２との好ましい組み合わせとしては、例えばＹ２が−ＣＯＯＨまたは−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ６−ＣＯＯＨである場合には、Ｘ２は水素、もしくは二価の飽和炭化水素基を含むアミノ基であることが好ましく、Ｙ２が−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２である場合には、Ｘ２は水素、もしくは二価の飽和炭化水素基を含むカルボキシル基であることが好ましい。
【００６２】
前記式（２９）において、Ｌ２は、ポリエチレングリコール鎖と分岐部位Ｅとの結合を担うリンカーであり、前記式（１）中のＬ２と同義である。原料純度の観点からは、前記式（２９）におけるＬ２としては、エーテル結合であることが好ましい。
【００６３】
Ｅは、Ｌ２に対して２価の結合価数を有し、Ｙ２に対して１価の結合価数を有する分岐部位であり、前記式（２５）あるいは前記式（２６）で表されるグリセリン部位である。原料純度の観点からは、Ｅは前記式（２５）で表される分岐部位であることが好ましい。
【００６４】
前記式（２９）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の好ましい例としては、前記式（３）で表される化合物が挙げられる。
【化３３】
2018062655.tif 000034
【００６５】
前記式（２９）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いて前記式（１）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールを得る方法としては、適宜公知の合成方法で得られたものを用いることができる。例えば、マレイミド基を導入する方法としては、３−マレイミドプロピオン酸やマレイミド酪酸等を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤と反応させた後、式（２９）で表される本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基と反応させる方法や、トリエチルアミン等の塩基存在下、式（２９）で表される本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基に対して３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルやマレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させる方法が挙げられる。
【００６６】
また、例えば、活性エステル基を導入する方法としては、式（２９）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のカルボキシル基に対して、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させる方法や、トリエチルアミン等の塩基存在下、式（２９）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の水酸基に対して、炭酸ジスクシンイミジルと反応させる方法等が挙げられる。
【００６７】
さらに、例えば、ヨードアセトアミド基を導入する方法としては、式（２９）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基に対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、二（ヨード酢酸）無水物等を反応させる方法が挙げられる。
【００６８】
さらにまた、例えば、アルキニル基を導入する方法としては、式（２９）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基に対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ−４−ｙｎ−９−ｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ等を反応させる方法が挙げられる。
【００６９】
前記式（２９）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いて前記式（１）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールを典型的な例としては、以下のような工程が挙げられる。
【００７０】
（ａ）末端に活性カーボネート基、マレイミド基を有する化合物の合成
【化３４】
2018062655.tif 000035
【００７１】
前記式（３０）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基へ、クロロホルム溶媒中、トリエチルアミン存在下、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させ、下記式（３１）で表される化合物を得る。
【化３５】
2018062655.tif 000036
【００７２】
前記式（３１）で表される化合物の水酸基へ、ジクロロメタン溶媒中、トリエチルアミン存在下、炭酸ジスクシンイミジルを反応させ、下記式（３２）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールを得る。式（３２）で表される化合物は、前記式（１）中のＸ１が活性エステル基であり、Ｙ１がマレイミド基である化合物と同義である。
【化３６】
2018062655.tif 000037
【００７３】
（ｂ）末端に活性エステル基、ヨードアセトアミド基を有する化合物の合成
【化３７】
2018062655.tif 000038
【００７４】
前記式（３３）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基へ、クロロホルム溶媒中、トリエチルアミン存在下、二（ヨード酢酸）無水物を反応させ、下記式（３４）で表される化合物を得る。
【化３８】
2018062655.tif 000039
【００７５】
前記式（３４）で表される化合物のカルボキシル基へ、ジクロロメタン溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させ、下記式（３５）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールを得る。式（３５）で表される化合物は、前記式（１）中のＸ１が活性エステル基であり、Ｙ１がヨードアセトアミド基である化合物と同義である。
【化３９】
2018062655.tif 000040
【００７６】
（ｃ）末端にアルキニル基、活性エステル基を有する化合物の合成
【化４０】
2018062655.tif 000041
【００７７】
前記式（３６）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体のアミノ基へ、クロロホルム溶媒中、トリエチルアミン存在下、（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ−４−ｙｎ−９−ｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅを反応させ、下記式（３７）で表される化合物を得る。
【化４１】
2018062655.tif 000042
【００７８】
前記式（３７）で表される化合物のカルボキシル基へ、ジクロロメタン溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させ、下記式（３８）で表される分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコールを得る。式（３８）で表される化合物は、前記式（１）中のＸ１がアルキニル基であり、Ｙ１が活性エステル基である化合物と同義である。
【化４２】
2018062655.tif 000043
【００７９】
更に、本発明における分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、下記式（４０）で表される。
【化４３】
2018062655.tif 000044
（式（４０）中、
ｎは６〜３０の整数を表す。
Ｙ２は、−ＮＨ２または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ４−ＮＨ２で表され、ｍ４は、１〜５の整数を表す。）
【００８０】
［鎖長純度の測定］
前記式（１）で表される化合物の鎖長純度は、前記式（３）で表される化合物の逆相クロマトグラフィーにより測定した鎖長純度を用いた。これは、前記式（１）で表される化合物がＸ１およびＹ１に活性エステル基または活性カーボネート基を含む化合物である場合、測定中に分解して逆相クロマトグラフィーによる正確な鎖長純度の測定ができないためである。尚、前記式（３）で表される化合物から前記式（１）で表される化合物を得る反応は、酸塩化物や酸無水物との縮合反応であるため、鎖長純度に影響を及ぼさない。
【００８１】
［官能基純度の測定］
前記式（１）で表される化合物の官能基純度は、前記式（３）で表される化合物の官能基純度を基に１Ｈ−ＮＭＲ測定により求められる。これは、上記と同様に、前記式（１）で表される化合物の逆相クロマトグラフィーによる正確な官能基純度の測定ができないためである。測定方法としては、まず前記式（３）で表される化合物の逆相クロマトグラフィーにより、前記式（３）で表される化合物の官能基純度を測定する。次に前記式（１）で表される化合物および前記式（３）で表される化合物の１Ｈ−ＮＭＲ測定を行うことで官能基Ｘ１、Ｙ１の導入率を求め、下記式（Ｆ１）：
式（１）で表される化合物の官能基純度＝
｛（式（３）で表される化合物の官能基純度）×（Ｘ１の導入率）×（Ｙ１の導入率）｝
・・・（Ｆ１）
により官能基純度を算出する。
【００８２】
前記逆相クロマトグラフィー測定においては、検出器に質量分析計を用いて各ピークの同定を行った後に、検出器に示差屈折率計を用いて算出された各ピークの面積値より純度を求める。測定条件としては、各ピークが分離して検出されていれば特に制限はないが、検出器に質量分析計を用いた場合は、例えば下記の条件で測定を行う。
【００８３】
検出器：Ｗａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径５  μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝ｊ／ｋ
ｊおよびｋは、メタノールと蒸留水の体積比を表す。ｊおよびｋは、測定する化合物の単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数ｎや末端官能基の種類により適宜選択される。
【００８４】
検出器に示差屈折率計を用いた場合は、例えば下記の条件で測定を行う。
検出器：東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝ｊ／ｋ
ｊおよびｋは、メタノールと蒸留水の体積比を表し、検出器に質量分析計を用いた場合の測定条件に用いるｊおよびｋと同義である。
【００８５】
前記１Ｈ−ＮＭＲ測定において、官能基Ｘ１およびＹ１の導入率は、前記式（３）から前記式（１）を得る反応で影響を受けないピークの積分値を基準とし、官能基Ｘ１およびＹ１に由来するピークの積分値より算出する。基準とするピークは、官能基Ｘ１およびＹ１の種類によって適宜選択される。
【００８６】
＜分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体の製造方法＞
前記特定の条件を満たす本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法により得ることができる。前記式（３）で表される本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法は、下記の工程（１）、工程（２）、工程（３）及び工程（４）を少なくともこの順で含むことを特徴とするものである。
【００８７】
［工程（１）］
本発明に係る工程（１）は、下記式（４）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体
【化４４】
2018062655.tif 000045
と下記式（５）で表される化合物
【化４５】
2018062655.tif 000046
とを、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシド、ナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかを塩基触媒として用いてカップリングさせ、下記式（６）
【化４６】
2018062655.tif 000047
で表される化合物を得る工程である。
【００８８】
前記式（４）で表す単分散ポリエチレングリコールは、公知の方法が利用可能であり、例えばPolym.  Chem.,  2016,  7,  2389＿2394に記載されている方法が有効である。
【００８９】
Ａは水酸基の保護基であり、前記カップリングでの塩基触媒に対して安定な保護基であれば特に制限は無いが、例えばメトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、アリル基、ベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリメチルベンジル基、トリフェニルメチル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。合成容易性の観点からは、Ａはベンジルオキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、ベンジル基、トリメチルベンジル基、トリフェニルメチル基が好ましく、ベンジル基、トリフェニルメチル基がより好ましい。
【００９０】
Ｂは脱離基であり、前記カップリングにおいて反応性を有する脱離基であれば特に制限は無いが、例えばクロロ基、ブロモ基、ヨード基、メシラート基、トシラート基、クロロメタンスルホナート基、トリフルオロメタンスルホナート基等が挙げられる。合成容易性の観点からは、Ｂはブロモ基、メシラート基、トシラート基、クロロメタンスルホナート基が好ましく、メシラート基がより好ましい。
【００９１】
ｎは単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表す６〜３０の整数である。ＡＤＣ用のリンカーとして使用する観点からは、ｎは６〜２４の整数であることが好ましい。
【００９２】
前記式（５）で表される化合物は、市販の２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールより適宜公知の方法を利用することで合成可能である。
【００９３】
前記式（５）で表される化合物において、Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表される。ｍ５は、１〜５の整数を表す。合成容易性の観点からは、Ｚは−Ｚ１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｚ１、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｚ１、−Ｏ−（ＣＨ２）５−Ｚ１のいずれかであることが好ましい。Ｚ１は前記カップリングでの塩基触媒に対して安定な官能基であれば特に制限されないが、前記式（４）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を製造する観点からは、Ｚ１はアミノ基に変換可能な窒素原子を含む原子団であることが好ましく、例えばアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基が好ましい。
【００９４】
また、アミノ基の保護体とは、アミノ基と保護基との結合体のことである。保護基としては、前記カップリングでの塩基触媒に対して安定な保護基であれば特に制限されないが、例えば９−フルオレニルメチルカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ジベンジル基等が挙げられ、好ましくはｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ジベンジル基が挙げられる。
【００９５】
前記式（４）中の保護基Ａと、前記式（５）中のＺ１との組み合わせとしては、Ｚ１が工程（２）における保護基Ａの脱保護条件に対して安定であれば特に制限は無い。工程（２）における脱保護が酸性条件下での加水分解反応である場合、Ｚ１としては、アミノ基の９−フルオレニルメチルカルボニル基保護体、アミノ基のｔ−ブトキシカルボニル基保護体、アミノ基のベンジルオキシカルボニル基保護体、アミノ基のジベンジル基保護体、アジド基、シアノ基であることが好ましく、工程（２）における脱保護が接触水素添加である場合、Ｚ１としては、アミノ基の９−フルオレニルメチルカルボニル基保護体、アミノ基のｔ−ブトキシカルボニル基保護体であることが好ましい。
【００９６】
前記カップリングにおける塩基触媒としては、反応が進行する塩基触媒であれば特に制限は無いが、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０の塩基触媒であることが好ましく、例えば水酸化カリウム（ｐＫａ＝１５．７）、水酸化ナトリウム（ｐＫａ＝１５．７）、カリウムｔ−ブトキシド（ｐＫａ＝１９）、ナトリウムｔ−ブトキシド（ｐＫａ＝１５．７）、ナトリウムメトキシド（ｐＫａ＝１５．５）、ナトリウムエトキシド（ｐＫａ＝１６）等が挙げられる。より好ましくは、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシド、ナトリウムｔ−ブトキシドが挙げられる。水素化ナトリウム等の、水溶液中でのｐＫａが２０を超える塩基では、塩基触媒との反応により前記式（５）で表される分岐部位が分解し、カップリングにおける収率や、純度が低下する。他方、トリエチルアミン等の、水溶液中でのｐＫａが１５未満の塩基では、前記カップリングの進行が遅くなる傾向にある。また、前記塩基触媒の使用量としては、反応が進行すれば問題ないが、前記式（５）で表される化合物に対して、通常、モル比で２．０〜１０倍、好ましくは２．１〜５倍である。前記塩基触媒の使用量が前記下限未満である場合、反応が完全に進行せず、前記式（５）で表される化合物の水酸基に単分散ポリエチレングリコール鎖が導入されずに水酸基が残る傾向がある。他方、前記上限を超える場合、過剰な塩基によって副反応が進行する恐れがある。
【００９７】
前記カップリングは、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（４）及び前記式（５）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム等の非プロトン性極性溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（４）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記上限を超える場合には、前記カップリングの進行が遅くなる傾向にある。
【００９８】
前記カップリングの反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記カップリングの反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常１〜４８時間程度が好ましい。
【００９９】
前記カップリングにおける前記式（４）で表される化合物の使用量としては、前記式（５）表される化合物に対して、通常、モル比で２．０〜１０倍、好ましくは２．１〜４倍である。前記式（４）で表される化合物の使用量が前記下限未満である場合、反応が完全に進行せず、前記式（５）で表される化合物の水酸基に単分散ポリエチレングリコール鎖が導入されずに水酸基が残る傾向がある。他方、上限を超える場合、過剰の前記式（４）が無駄になり、製造コストが増大するだけでなく、過剰の前記式（４）を反応生成物である前記式（６）と分離することが困難であるため、歩留まりが低下する。
【０１００】
工程（１）においては、このようなカップリングにより、前記式（６）で表される化合物を得ることができる。前記化合物は、そのまま未精製で次の工程（２）に用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや吸着剤処理等によって精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【０１０１】
［工程（２）］
本発明に係る工程（２）は、前記式（６）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（７）で表される化合物を得る工程である。
【化４７】
2018062655.tif 000048
【０１０２】
前記式（７）中、Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかである。ｍ５は１〜５の整数を表す。ｎは６〜３０の整数を表す。前記アミノ基の保護体は、前記式（６）で表される化合物中のＺ１に由来するものであり、前記式（６）中のＺ１と同義である。
【０１０３】
前記式（６）中の保護基Ａを脱保護する方法は、保護基の種類によって異なるが、公知の方法を利用して脱保護を行う方法が挙げられる。例えば、Ａがメトキシメチル基やテトラヒドロピラニル基、トリチル基等のエーテル系保護基の場合、脱保護は酸性条件下での加水分解による方法が挙げられる。また、例えば、Ａがベンジル基、トリチル基等のベンジル基を有する保護基の場合、脱保護は触媒存在下での接触水素添加による方法が挙げられる。さらに、例えば、Ａがトリエチルシリル基等のシリル系保護基の場合、脱保護はフッ化テトラブチルアンモニウム等のフッ化物イオンによる脱シリル化反応が挙げられる。
【０１０４】
前記脱保護が加水分解である場合、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール等のプロトン性極性溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。また、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ等、水と任意の割合で混和する有機溶媒を含んでいてもよい。前記溶媒の使用量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記上限を超える場合には、前記加水分解の進行が遅くなる傾向にある。前記加水分解は、酸触媒を用いて反応を行う。前記酸触媒としては、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸や、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物やメタンスルホン酸等の有機酸、アンバーリスト等の陽イオン交換樹脂が挙げられる。前記酸触媒の当量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、モル比で０．１〜２倍、好ましくは０．２〜１倍である。前記加水分解の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記加水分解の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常１〜４８時間程度が好ましい。
【０１０５】
前記脱保護が接触水素添加である場合、触媒存在下で反応を行う。前記触媒としては、パラジウム炭素や水酸化パラジウム炭素等が挙げられる。前記触媒の当量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、重量比で０．０１〜１倍、好ましくは０．０５〜０．２倍である。前記接触水素添加は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ＤＭＦ及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記上限を超える場合には、前記接触水素添加の進行が遅くなる傾向にある。前記接触水素添加の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記加水分解の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常１〜４８時間程度が好ましい。
【０１０６】
前記脱保護が脱シリル化反応である場合、酸加水分解による脱保護とフッ化物イオンによる脱保護が挙げられる。酸加水分解による脱保護は、前記エーテル系保護基の加水分解による脱保護と同様の方法で行うことができる。フッ化物イオンによる脱保護は、フッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化水素等のフッ化物イオンを有する試薬を用いて行う。前記フッ化物イオンを有する試薬の当量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．０〜２倍、好ましくは１．１〜１．５倍である。前記フッ化物イオンによる脱保護は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ＤＭＦ及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記上限を超える場合には、前記接触水素添加の進行が遅くなる傾向にある。前記フッ化物イオンによる脱保護の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記加水分解の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常１〜４８時間程度が好ましい。
【０１０７】
工程（２）においては、このような脱保護により、前記式（７）で表される化合物を得ることができる。前記化合物は、そのまま未精製で次の工程（３）に用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや吸着剤処理等によって精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【０１０８】
［工程（３）］
本発明に係る工程（３）は、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液精製を施す工程である。
【０１０９】
例えば、前記工程（１）において、過剰に加えた前記式（４）で表される化合物は、反応生成物である前記式（６）で表される化合物中に残存する。この前記式（４）で表される化合物の保護基Ａは、工程（２）において前記式（６）で表される化合物と同様に脱保護され、下記式（３９）で表される化合物となる。
【０１１０】
【化４８】
2018062655.tif 000049
【０１１１】
前記式（３９）中、Ｂは脱離基であり、ｎは単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表す６〜３０の整数である。前記脱離基は、前記式（４）で表される化合物中のＢに由来するものであり、前記式（４）中のＢと同義である。
【０１１２】
前記工程（３）は、有機溶媒に溶解した前記式（７）で表される目的の化合物に含まれる前記式（３９）で表される化合物を、水溶液で分液洗浄する工程である。
【０１１３】
前記工程（３）に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられ、目的の化合物の溶解性の観点からは、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、前記式（７）で表される化合物と前記式（３９）で表される化合物とを含む反応生成物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（７）で表される化合物が水溶液に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、前記式（３９）で表される化合物の洗浄効率が低下する傾向にある。
【０１１４】
前記工程（３）に用いる水溶液としては、前記式（３９）で表される化合物を溶解可能であれば特に限定されず、例えば、イオン交換水、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の低塩濃度の水溶液が挙げられる。前記水溶液の使用量としては、前記式（７）で表される化合物と前記式（３９）で表される化合物とを含む反応生成物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（３９）で表される化合物の洗浄効率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、前記式（７）で表される化合物が水層に溶け込む恐れがある。
【０１１５】
前記工程（３）において、前記有機溶媒と前記水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／水溶液の値が、０．２〜３．０であり、０．５〜２．０であることが好ましい。
【０１１６】
前記工程Ｃの温度としては、ｎによって異なる。ｎが６〜１０の場合、前記温度としては、１〜２５℃であることが好ましく、５〜２０℃であることがより好ましい。ｎが１１〜３０の場合、前記温度としては、１〜１５℃であることが好ましく、５〜１０℃であることがより好ましい。前記温度が前記上限を超える場合には、前記式（３９）で表される化合物が有機層に溶解するため除去できない。また、前記分液洗浄を行う回数としては、特に限定はなく、ＴＬＣやＭＳ測定等によって有機溶媒中に含まれる前記式（３９）で表される化合物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
【０１１７】
［工程（４）］
本発明に係る工程（４）は、前記式（７）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して前記式（３）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程である。
【０１１８】
前記工程（４）に用いる処理は、前記式（３９）で表される化合物中のＺ１の種類によって異なるが、Ｚ１の種類によって適宜公知の方法により行うことができる。例えば、Ｚ１がアミノ基の保護体である場合、前記工程（４）に用いる処理は、脱保護処理である。前記脱保護処理は、前記アミノ基の保護体における保護基の種類によって異なるが、保護基が９−フルオレニルメチルカルボニル基である場合、脱保護はピペリジンやピロリジン等の２級アミンを用いた反応が挙げられる。保護基がｔ−ブトキシカルボニル基である場合、脱保護はトリフルオロ酢酸や４Ｎ塩酸等を用いた反応が挙げられる。保護基がベンジルオキシカルボニル基である場合、脱保護は、パラジウム炭素触媒存在下での接触水素添加が挙げられる。例えば、Ｚ１がアジド基およびシアノ基である場合、前記工程（４）に用いる処理は、還元処理である。前記還元処理は、Ｚ１の種類によって異なるが、Ｚ１がアジド基である場合、還元はトリフェニルホスフィンを還元剤として用いるＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ還元や、パラジウム炭素触媒存在下での接触水素添加が挙げられる。Ｚ１がシアノ基である場合、還元はパラジウム炭素触媒やニッケル触媒存在下での接触水素添加等が挙げられる。
【０１１９】
前記反応生成物は、前記工程（３）における分液精製処理により、不純物を除去することが可能であるため、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等による精製が不要である。なお、得られた前記式（３）で表される化合物を含有する分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、そのまま上記本発明の分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの製造に用いることが可能であるが、更に晶析、吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の処理により精製をして用いてもよい。
【０１２０】
以上の製造方法により、前記式（３）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得ることができる。本発明の前記式（３）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、鎖長純度および官能基純度が高いことから、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の処理による精製を行わずに、前記式（１）および前記式（２）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールを高い鎖長純度および官能基純度で得ることができる。
【０１２１】
前記式（３）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の鎖長純度および官能基純度は、逆相クロマトグラフィー測定により求めることができる。
式（１）で表される化合物のＬ３が単結合の場合、式（４０）で表される化合物の水酸基へ、ジクロロメタン溶媒中、トリエチルアミン存在下、炭酸ジスクシンイミジルを反応させることにより得られる。
【０１２２】
前記式（４０）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール中間体の製造方法は下記の工程（１’）〜（４’）を少なくともこの順で含むことを特徴とするものである。
【０１２３】
［工程（１’）］
下記式（４１）で表される単分散ポリエチレングリコール誘導体と下記式（４２）で表される化合物とを、水溶液中でのｐＫａが１５〜２０である塩基触媒を用いてカップリングさせ、下記式（４３）で表される化合物を得る工程（１’）と、
【化４９】
2018062655.tif 000050
（式（４１）中、
Ｚは、−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
Ｂは脱離基である。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【化５０】
2018062655.tif 000051
（式（４２）中、
Ａは水酸基の保護基）
【化５１】
2018062655.tif 000052
（式（４３）中、
Ａは水酸基の保護基、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１はアミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【０１２４】
［工程（２’）］
前記式（４３）で表される化合物の保護基Ａを脱保護させ、下記式（４４）で表される化合物を得る工程（２’）と、
【化５２】
2018062655.tif 000053
（式（４４）中、
Ｚは−Ｚ１または−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ５−Ｚ１で表され、Ｚ１は、アミノ基の保護体、アジド基、シアノ基のいずれかであり、ｍ５は１〜５の整数を表す。
ｎは６〜３０の整数を表す。）
【０１２５】
［工程（３’）］
前記式（４４）で表される化合物に脱保護処理あるいは還元処理を施して式（４０）で表される前記分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程（３’）と、
【０１２６】
［工程（４’）］
前記式（４０）で表される化合物に分液精製を施す工程（４’）
前記塩基触媒は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドおよびナトリウムｔ−ブトキシドのいずれかであることが好ましい。
【０１２７】
前記式（４０）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の鎖長純度および官能基純度は、逆相クロマトグラフィー測定により求めることができる。
【０１２８】
＜分岐型へテロ単分散ポリエチレングリコール結合体＞
本発明の式（１）または前記式（２）で表される分岐型ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、これらの化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）と生体機能性分子とが結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得ることができる。
【０１２９】
前記生体機能性分子としては、タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤が挙げられる。
【０１３０】
前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得る方法としては、例えば、先ず、前記式（１）または前記式（２）で表される化合物のＸ１に対して抗がん剤やタンパク薬剤といった薬剤を導入し、もう一方のＹ１に抗体を結合する例が挙げられる。この前記式（１）または前記式（２）で表される化合物は、両末端にそれぞれ異なる官能基を高純度で有していることから、ＡＤＣとして使用する場合、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物の生成が抑制されるため、前記ＡＤＣの効果の向上が期待できる。
【実施例】
【０１３１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、各合成例において、核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）測定には日本電子社製
ＪＭＴＣ−４００を用い、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）測定にはＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ タンデム型質量分析計を用いた。
【０１３２】
（実施例１−１）
式（５）のＺ１がアジド基である化合物４の合成
【化５３】
2018062655.tif 000054
（式中、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０１３３】
ナスフラスコに化合物１（20.0g,  0.151mol）およびトルエン（200mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（18.4g,  0.182mol）を加えた。0℃で塩化メタンスルホニル（19.1g,  0.167mol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物１の消失を確認し、1M 塩酸 150 mLを加え、分液した。有機相を1M  塩酸  150mLで1回、飽和重曹水  150mLで2回、飽和食塩水  150mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２を得た。
【化５４】
2018062655.tif 000055
（式中、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０１３４】
ナスフラスコに化合物２（20.8g,  0.099mol）およびＮ，Ｎ‘−ジメチルホルムアミド（100mL）、アジ化ナトリウム（7.72g,  0.119mol）を加え、100℃で5時間攪拌した。5時間後、1H  NMR測定により化合物２の消失を確認し、酢酸エチル  150mLで希釈した。この溶液を飽和食塩水  100mLで1回、60mLで2回洗浄した。また、一回目の飽和食塩水層に酢酸エチル  100mLを加えて抽出し、更にこの有機層を飽和食塩水  50mLで2回洗浄した。2つ有機層に合わせ、硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物３を得た。
収量  15.3g
【０１３５】
【化５５】
2018062655.tif 000056
【０１３６】
ナスフラスコに化合物３（13.3g,  mol）、テトラヒドロフラン（5mL）、および1M  塩酸（10mL）を入れ、室温で5時間攪拌した。5時間後、ESI-MS測定により化合物３の消失を確認し、反応溶液を減圧濃縮した（テトラヒドロフランのみ）。残渣に酢酸エチル  50mLを加えて分液し、有機層を飽和食塩水  30mLで3回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物４を得た。
収量  2.01g
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物４  １１８．１［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：
３．８９（ｍ，１Ｈ），  ３．７１（ｄｄ，１Ｈ），
３．６１（ｄｄ，１Ｈ），  ３．４１（ｍ，２Ｈ）
【０１３７】
（実施例１−２）
式（３）のＹ２が−ＮＨ２、ｎが１２である化合物９の合成
【化５６】
2018062655.tif 000057
（式中、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０１３８】
ナスフラスコにPolym.  Chem.,  2016,  7,  2389＿2394に記載の方法で得られる化合物５（50.0g,  63.4mmol）およびトルエン（250mL）を加えた。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（10.5mL,  76.1mmol）を加えた。0℃で塩化メタンスルホニル（5.4mL,  69.8 mol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物５の消失を確認し、1M塩酸  100mLを加え、分液した。有機相を1M塩酸  100mLで1回、飽和重曹水  100mLで2回、飽和食塩水  100mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体化合物６を得た。
収量  52.0g
【０１３９】
［工程（１）］
【化５７】
2018062655.tif 000058
（式中、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０１４０】
ナスフラスコに化合物４（1.64g,  14.0mmol）、化合物６（36.4g,  42.0mmol）を入れ、トルエン共沸（30mL×2）した。テトラヒドロフラン（270mL）を加え、ナスフラスコ内を窒素パージした。水酸化カリウム（粉末,  2.36g,  42mmol）を加え、加熱還流下で7時間攪拌した。7時間後、ESI-MS測定により化合物４の消失を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液  10mLを加えクエンチした。この溶液を減圧濃縮し（テトラヒドロフランのみ）、残渣をトルエン  150mLに溶解させた。イオン交換水  100mLで２回、飽和重曹水  100mLで1回、飽和食塩水  100mLで1回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物７を得た。
収量  35.5g
【０１４１】
［工程（２）〜（３）］
【化５８】
2018062655.tif 000059
（式中、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０１４２】
ナスフラスコに化合物７（35.5g）およびメタノール（180mL）を加えた。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（3.99g,  21.0mmol）、ヘキサン（150mL）を加え、室温で30分攪拌した。30分後、ヘキサン層を除去した後にヘキサン（150mL）を加え、室温で30分攪拌した。同様の操作を4回行った後、ESI-MS測定により化合物７の消失を確認し、飽和重曹水  120mLを加えた。この混合溶液をヘキサン150mLで2回洗浄した。生成物の溶液を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン  180mLを加え、イオン交換水  180mLで3回、飽和食塩水  180mLで1回洗浄した（１０℃）。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、茶色固体の化合物８を得た。
収量  11.5g
【０１４３】
［工程（４）］
【化５９】
2018062655.tif 000060
【０１４４】
ナスフラスコに化合物８（11.5g）およびメタノール（60mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素置換した。パラジウム炭素（1.2g）を加え、ナスフラスコ内を水素置換して室温で5時間攪拌した。5時間後、ESI-MS測定により化合物８の消失を確認し、反応溶液をろ過した（グラスファイバーろ紙）。ろ液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタン  60mLに溶解させた。この溶液を1M塩酸  60mLで1回抽出し、ジクロロメタン  60mLで2回洗浄した。水層に食塩を加えて飽和させ、ジクロロメタン  60mLで3回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は５１．０％であった。表１に結果をまとめる。
収量  9.6g
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物９  １１４８．２［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：
３．６２（ｍ，９９Ｈ），  ３．１６（ｄｄ，１Ｈ），
３．０４（ｄｄ，１Ｈ）
【０１４５】
（実施例１−３）
式（１）のＸ１が活性カーボネート基、Ｙ１がマレイミド基、Ｌ２がエーテル結合、Ｌ３が−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−、ｎが１２である化合物１１の合成
【化６０】
2018062655.tif 000061
【０１４６】
ナスフラスコに、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（301mg,  1.1mmol）、ジブチルヒドロキシトルエン（4 mg,  0.018mmol）クロロホルム（30mL）を入れた。化合物９（1.0g,  0.87mmol）およびトリエチルアミン（0.17mL,  1.2mmol）をクロロホルム（20mL）に溶解し、室温で滴下した。室温で4時間攪拌後、ESI-MSにより化合物９の消失を確認し、飽和食塩水（pH=  2.0）  50mLを加え、分液した。有機相を飽和食塩水（pH=  2.0）  50mLで洗浄し、減圧濃縮した。残渣にクエン酸バッファー（pH=  3.0）  50mLを加え、トルエン−クロロホルム（10  :  3,w/w）  50mLで3回洗浄した。水相をクロロホルム  50mLで3回抽出した。有機相を合わせ、硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物１０を得た。
収量  928mg
【０１４７】
【化６１】
2018062655.tif 000062
【０１４８】
ナスフラスコに、化合物１０（928mg,  0.71mmol）、トリエチルアミン（0.32mL,  2.3mmol）、ジブチルヒドロキシトルエン（3mg,  0.014mmol）、ジクロロメタン（45mL）を入れた。炭酸ジスクシンイミジル（538mg,  2.1mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。５時間後、ESI-MSにより化合物１０の消失を確認し、食塩水（pH=  2.0）  45mLを加え、分液した。有機相を食塩水（pH=  2.0）  45mLで洗浄し、減圧濃縮した。残渣に１M塩酸  45mLを加え、酢酸エチル  45mLで２回洗浄し、水相をジクロロメタン  45mLで２回抽出した。有機層を合わせ、20%食塩水  45mLで２回洗浄後、有機相を合わせ、硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物１１を得た。
収量  994mg
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１１  １５９８．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）：
６．８３（ｓ，２Ｈ），  ４．４７（ｍ，４Ｈ），
３．６２（ｍ，９７Ｈ），  ３．３８（ｄｄ，１Ｈ），
３．１８（ｄｄ，１Ｈ），  ２．８３（ｓ，８Ｈ），  ２．４９（ｔ，２Ｈ）
【０１４９】
（実施例２−１）
式（５）のＺ１がアミノ基の保護体、ｍ５が３である化合物１５の合成
【化６２】
2018062655.tif 000063
【０１５０】
二つ口ナスフラスコに３−Ｂｏｃａｍｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ  １２（5.0g,  28.5mmol）およびトルエン（25mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（5.14 mL,  37.1mmol）を加えた。0℃で塩化メタンスルホニル（2.43mL,  31.4mmol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物１２の消失を確認し、1M塩酸  25 mLを加え、分液した。有機相を飽和重曹水  25mLで1回、飽和食塩水  25mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウム  3gを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１３を得た。
収量  6.9g
【０１５１】
【化６３】
2018062655.tif 000064
（式中、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０１５２】
四つ口ナスフラスコに水素化ナトリウム（1.5g）を入れ、窒素置換した。ヘキサン  10mLで2回洗浄し、Ｎ，Ｎ‘−ジメチルホルムアミド  30mLを加えて0℃に冷却した。化合物１（5.31g,  40.2 mmol）にＮ，Ｎ‘−ジメチルホルムアミド  20mLを混合し、滴下ロートに入れて30分かけて滴下した。滴下終了後、化合物１３（6.87g,  28.7mmol）にＮ，Ｎ‘−ジメチルホルムアミド  20mLを混合し、同じ滴下ロートに入れて15分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を40℃に昇温し、3時間撹拌した。3時間後、ESI-MS測定により化合物１３が消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液に酢酸エチル  150mLを加え、飽和塩化アンモニウム水溶液  100mLで1回、飽和食塩水  100mLで2回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウム  15gを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１４を得た。
収量  6.9g
【０１５３】
【化６４】
2018062655.tif 000065
【０１５４】
ナスフラスコに化合物１４（6.90g,  23.8mmol）、テトラヒドロフラン（20mL）および1M塩酸（20mL）を入れ、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物１４が消失したことを確認し、反応混合液に酢酸エチル  50mLを加えた。この混合溶液を飽和食塩水  50mLで2回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウム  5gを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１５を得た。
収量  1.7g
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１５  ２５０．２［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：
４．８３（ｓ，１Ｈ），  ３．８５（ｍ，１Ｈ），
３．７０（ｄｄ，１Ｈ），  ３．６４（ｄｄ，１Ｈ），
３．５１（ｍ，４Ｈ），  ３．２５（ｍ，２Ｈ），
１．７４（ｍ，２Ｈ），  １．４４（ｓ，９Ｈ）
【０１５５】
（実施例２−２）
式（３）のＹ１−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、ｎが２４である化合物２３の合成
【化６５】
2018062655.tif 000066
（式中、Bnはベンジル基、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０１５６】
1L四つ口ナスフラスコに水素化ナトリウム（1.83g）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（20mL）で2回洗浄し、アセトニトリル  80mLを加えて0℃に冷却した。トルエン  20mLで3回共沸脱水した化合物５（30.0g,  38.0mmol）にアセトニトリル  40 mLを混合し、滴下ロートに入れて30分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を40℃に昇温し、30分撹拌した。塩化ベンジル（4.15mL,  36.1mmol）を同じ滴下ロートに入れて15分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を40℃に昇温し、2時間撹拌した。2時間後、薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝  4：1  by  vol）を用いて塩化ベンジルが消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液に飽和アンモニウム水溶液  20mLを加えた後に減圧濃縮し、残渣にトルエン  100mLを加えた。このトルエン溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液  100mLで2回、飽和食塩水  100mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウム  10gを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１６を得た。
収量  30.9g
【０１５７】
【化６６】
2018062655.tif 000067
（式中、Bnはベンジル基、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０１５８】
1Lナスフラスコに化合物１６（30.9g,  35.1mmol）及びメタノール（240mL）を入れた後、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（3.3g,  17.6mmol）、ヘキサン（90mL）を加え、室温で30分間攪拌した。30分後、上層のヘキサン層を除去した後にヘキサン（90mL）を加え、室温で30分間攪拌した。同様の操作を6回行った後、ESI-MSにより化合物１６の消失を確認し、0℃で飽和重曹水  100mLを加えた。この混合溶液をヘキサン  90mLで2回洗浄した。生成物の溶液を減圧濃縮し、イオン交換水  100mLに溶解し、トルエン  100mLで2回洗浄した。下層の水溶液に塩化ナトリウム  30gを加えて飽和濃度とした後に、ジクロロメタン  100mLで2回抽出した。抽出した有機層に硫酸ナトリウム  20gを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１７を得た。
収量  15.6g
【０１５９】
【化６７】
2018062655.tif 000068
（式中、Trtはトリフェニルメチル基、Bnはベンジル基を表す。）
【０１６０】
二口ナスフラスコに水素化ナトリウム（219g,  50.2mmol）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（25mL×2回）で2回洗浄し、アセトニトリル  50mLを加えて0℃に冷却した。化合物１７（22.8g,  35.8mmol）をトルエン  15mLで3回共沸脱水した後にアセトニトリル  25mLを混合し、滴下ロートに加えて30分かけて滴下した。トルエン  50mLで3回共沸脱水した化合物６（52.8g,  60.9mmol）にアセトニトリル  30mLを混合し、同じ滴下ロートに加えて15分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を80℃に昇温し、2時間撹拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物１６が消失をしたこと確認し、ナトリウムメトキシドメタノール溶液（3.5mL）を加え、30分攪拌した。30分後、ESI-MS測定により化合物１６が消失をしたこと確認し、室温へと放冷した。反応混合液を減圧濃縮し、残渣にトルエン  350mLを加えた。このトルエン溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液  350mLで2回、飽和食塩水  350mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１８を得た。
収量  55.8g
【０１６１】
【化６８】
2018062655.tif 000069
（式中、Trtはトリフェニルメチル基、Bnはベンジル基を表す。）
【０１６２】
ナスフラスコに化合物１８（55.8g）およびメタノール（300mL）を加えた。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（3.76g,  19.8mmol）、ヘキサン（320mL）を加え、室温で30分攪拌した。30分後、ヘキサン層を除去した後にヘキサン（200mL）を加え、室温で30分攪拌した。同様の操作を6回行った後、ESI-MS測定により化合物１８の消失を確認し、飽和重曹水  300mLを加えた。この混合溶液をヘキサン  200mLで2回洗浄した。生成物の溶液を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン  400mLを加え、イオン交換水400 mLで3回、飽和食塩水  400mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物１９を得た。
収量  39.3g
【０１６３】
【化６９】
2018062655.tif 000070
（式中、Bnはベンジル基、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０１６４】
ナスフラスコに化合物１９（14.7g,  12.6mmol）およびトルエン（70mL）を加えた。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（2.1mL,  15.1mmol）を加えた。0℃で塩化メタンスルホニル（1.1mL,  13.9mmol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物１９の消失を確認し、1M塩酸  70mLを加え、分液した。有機相を1M塩酸  70mLで1回、飽和重曹水  70mLで2回、飽和食塩水  70mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２０を得た。
収量  12.7g
【０１６５】
【化７０】
2018062655.tif 000071
【０１６６】
ナスフラスコに化合物１５（0.82g,  3.29mmol）、化合物２０（12.7g,  10.2mmol）を入れ、トルエン共沸（15mL×2）した。テトラヒドロフラン（60mL）を加え、ナスフラスコ内を窒素パージした。水酸化ナトリウム（408mg,  10.2mmol）を加え、加熱還流下で7時間攪拌した。7時間後、ESI-MS測定により化合物１５の消失を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液  20mLを加えクエンチした。この溶液を減圧濃縮し（テトラヒドロフランのみ）、残渣をトルエン  60mLに溶解させた。この溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液  60mLで1回、飽和食塩水  60mLで1回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２１を得た。
収量  8.5g
【０１６７】
【化７１】
2018062655.tif 000072
【０１６８】
ナスフラスコに化合物２１（8.5g）およびメタノール（40mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素置換した。パラジウム炭素（900mg）を加え、ナスフラスコ内を水素置換して室温で5時間攪拌した。5時間後、ESI-MS測定により化合物２１の消失を確認し、反応溶液をろ過した（グラスファイバーろ紙）。ろ液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタン  40mLに溶解させた。この溶液をイオン交換水  40mLで３回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２２を得た。
収量  3.9g
【０１６９】
【化７２】
2018062655.tif 000073
【０１７０】
ナスフラスコに化合物２２（3.9g,  1.6mmol）、ジクロロメタン（20 mL）を加え、ナスフラスコ内を窒素パージした。０℃にてトリフルオロ酢酸（0.15mL,  1.9mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。５時間後、ESI-MS測定により化合物２２の消失を確認し、トリエチルアミン（0.31mL,  2.2mmol）でクエンチした。この溶液を1M  塩酸  20mLで３回抽出した。水層を合わせてジクロロメタン  20mLで３回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２３を得た。
収量  3.4g
【０１７１】
（実施例２−３）
式（１）のＸ１がアジド基、Ｙ１がブロモアセトアミド基、Ｌ１が−（ＣＨ２）２−、Ｌ２がエーテル結合、Ｌ３が−Ｏ−（ＣＨ２）３−、ｎが２３である化合物２５の合成
【０１７２】
【化７３】
2018062655.tif 000074
【０１７３】
ナスフラスコに化合物２３（1.0g,  0.44mmol）、５−アジドペンタン酸（68.7mg,  0.48mmol）、クロロホルム（5mL）を入れた。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（104mg,  0.53mmol）を加え、室温で4時間攪拌した。4時間後、ESI-MSにより化合物２３の消失を確認し、反応溶液をろ過した。ろ液を飽和重曹水  5mLで３回、飽和食塩水  5mLで１回洗浄した。硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２４を得た。
収量  1.0g
【０１７４】
【化７４】
2018062655.tif 000075
【０１７５】
ナスフラスコに、化合物２４（1.0g,  0.42mmol）、トリエチルアミン（0.32mL,  1.0mmol）、ジブチルヒドロキシトルエン（3mg,  0.014mmol）、ジクロロメタン（50mL）を入れた。炭酸ジスクシンイミジル（237mg,  0.92mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。５時間後、ESI-MSにより化合物２４の消失を確認し、食塩水（pH=  2.0）  50mLを加え、分液した。有機相を食塩水（pH=  2.0）  50mL で洗浄し、減圧濃縮した。残渣に１M  塩酸  50mLを加え、酢酸エチル  50mLで２回洗浄し、水相をジクロロメタン  50mLで２回抽出した。有機層を合わせ、20%食塩水  50mLで２回洗浄後、有機相を合わせ、硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２５を得た。
収量  1.0g
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２５  １３５２．６［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）：
４．４３（ｍ、４Ｈ），  ３．６４（ｍ，１９５Ｈ），
３．４１（ｍ，２Ｈ），  ３．２２（ｍ，２Ｈ），
２．８０（ｓ，８Ｈ），  ２．７１（ｔ，２Ｈ），
１．７４（ｍ，２Ｈ），  １．４６（ｍ，４Ｈ）
【０１７６】
（実施例３−１）
式（１）のＸ１が活性カーボネート基、Ｙ１がブロモアセトアミド基、Ｌ２がエーテル結合、ｎが１２である化合物２７の合成
【化７５】
2018062655.tif 000076
【０１７７】
ナスフラスコに実施例１−２で得られた化合物９（1.0g,  0.87mmol）およびトルエン（5mL）を加えた。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（0.145mL,  1.04mmol）を加えた。0℃でブロモアセチルブロミド（0.083mL,  0.95 mmol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物９の消失を確認し、1M  塩酸  5mLを加え、分液した。有機相を1M  塩酸  5mLで1回、飽和重曹水  5mLで2回、飽和食塩水  5mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２６を得た。
収量  1.03g
【０１７８】
【化７６】
2018062655.tif 000077
【０１７９】
ナスフラスコに化合物２６（1.03g,  0.81mmol）およびトルエン（5mL）を加えた。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（0.27mL,  1.94mmol）を加えた。0℃でクロロギ酸４−ニトロフェニル（359mg,  1.78mmol）を加え、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI-MS測定により化合物２６の消失を確認し、1M  塩酸  5mLを加え、分液した。有機相を1M  塩酸  5mLで1回、飽和食塩水  5mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２７を得た。
収量  1.20g
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２７  ８１６．８［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）：
８．３７（ｄ，２Ｈ），  ７．４４（ｄ，２Ｈ），
４．３１（ｍ，４Ｈ），  ４．１０（ｓ，２Ｈ），
３．６４（ｍ，９５Ｈ），  ３．４１（ｍ，２Ｈ）
【０１８０】
（実施例４−１）
式（１）のＸ１が活性エステル基、Ｙ１がアルキニル基、Ｌ１が−（ＣＨ２）２−、Ｌ２がエーテル結合、Ｌ３が−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−、ｎが１２である化合物３１の合成
【化７７】
2018062655.tif 000078
【０１８１】
ナスフラスコに、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（198mg,  0.48mmol）、クロロホルム（2mL）を入れた。実施例１−２で得られた化合物９（500mg,  0.44mmol）およびトリエチルアミン（0.072mL,  0.52mmol）をクロロホルム（1mL）に溶解し、室温で滴下した。室温で4時間攪拌後、ESI-MSによりＤｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒの消失を確認し、1M  塩酸  5mLを加え、分液した。有機相を1M  塩酸  5mLで1回、飽和食塩水  5mLで1回洗浄し、減圧濃縮した。有機相に硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物２８を得た。
収量  613mg
【０１８２】
【化７８】
2018062655.tif 000079
【０１８３】
ナスフラスコに化合物２８（613mg,  0.43mmol）、塩化メチレン（12mL）を入れた。0℃で水酸化カリウム（粉末）（24mg,   0.43mmol）を加え、アクリル酸ｔ−ブチル（0.38mL,  2.58mmol）を滴下し、0℃で1.5時間攪拌した。1.5時間後、ESI−MSにより反応の進行を確認し、2時間後、飽和塩化アンモニウム水溶液  5mLを加えた。この混合溶液を分液後、有機相を飽和食塩水  5mLで1回洗浄した。有機相に硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２９を得た。
収量  715mg
【０１８４】
【化７９】
2018062655.tif 000080
【０１８５】
ナスフラスコに化合物２９（715mg,  0.42mmol）および1M  塩酸（3mL）を入れ、60℃で2時間攪拌した。2時間後、ESI−MS測定により化合物２９が消失をしたこと確認し、室温まで冷却した。反応溶液にジクロロメタン  5mLを加えて分液した。有機相を飽和重曹水  5mLで１回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機相に硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物３０を得た。
収量  641mg
【０１８６】
【化８０】
2018062655.tif 000081
【０１８７】
ナスフラスコに化合物３０（641mg,  0.41mmol）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（112mg,  0.97mmol）、クロロホルム（5mL）を入れた。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（202mg,  1.05mmol）を加え、室温で4時間攪拌した。4時間後、ESI−MSにより化合物３０の消失を確認し、反応溶液をろ過した。ろ液をクエン酸バッファー（pH= 3.0）  5mLで３回、飽和食塩水  5mLで１回洗浄した。硫酸マグネシウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色固体の化合物３１を得た。
収量  633mg
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物３１  ９０４．３［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）：
７．４８（ｍ，８Ｈ），  ５．１３（ｄ，１Ｈ），
３．６４（ｍ，１０４Ｈ），  ３．４０（ｍ，２Ｈ），
２．９８（ｍ，４Ｈ），  ２．８３（ｓ，８Ｈ），
２．６６（ｔ，４Ｈ）
【０１８８】
＜式（１）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコールの鎖長純度および官能基純度＞
【０１８９】
（実施例５−１）
［鎖長純度の測定］
実施例１−３で合成した化合物１１の鎖長純度は、実施例１−２で合成した化合物９の鎖長純度を用いた。
化合物９の逆相クロマトグラフィー測定の結果、単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表すｎが１２である分岐型単分散ポリエチレングリコールが９３．４％、ｎが１２以外である化合物が計６．６％含まれていたため、鎖長純度は９３．４％であった。表１に結果をまとめる。
【０１９０】
尚、逆相クロマトグラフィー測定においては、検出器に質量分析計を用いて各ピークの同定を行った後に、検出器に示差屈折率計を用いて算出された各ピークの面積値より求めた。検出器に質量分析計を用いた場合は、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径５  μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝４５／５５を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４５℃、サンプル濃度  ０．０１ｍｇ／ｇ、注入量  ５μＬの条件で測定した。検出器に示差屈折率計を用いた場合は、機器に東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝４５／５５を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４５℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｍＬ、注入量  ４０μＬの条件で行った。
【０１９１】
［官能基純度の測定］
実施例１−３で合成した化合物１１の官能基純度は、化合物９の官能基純度を基に１Ｈ−ＮＭＲ測定により求めた。
具体的には、化合物９の逆相クロマトグラフィー測定の結果、末端に水酸基を２つ、およびアミノ基を１つ有する化合物が９９．９％、末端官能基の組み合わせが異なる化合物が０．１％含まれていたため、官能基純度は９９．９％であった。また、化合物９から化合物１０を得る反応において、化合物９のアミノ基のα位のメチレン基由来のピーク（３．１６、３．０４ｐｐｍ、２Ｈ）が消失し、３．３８、３．１８ｐｐｍに新たなピークが観測された。反応において積分値が変化しないピーク（３．６２ｐｐｍ，９７Ｈ）を基準とした場合、新たなピークの積分値は、合計で１．９９７であったため、マレイミド基の導入率は９９．９％（＝１．９９７÷２×１００）であった。
【０１９２】
続いて、化合物１１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるマレイミド基由来のピーク（６．８３ｐｐｍ、２Ｈ）の積分値を基準（２．０）とした場合、活性カーボネート基由来のピーク（４．４７ｐｐｍ、４Ｈ）の積分値は３．８４０であった。よって活性カーボネート基の導入率は９６．０％（＝３．８４０÷４）であった。したがって化合物１１の官能基純度は、９５．８％（＝９９．９×０．９９９×０．９６）であった。表１に結果をまとめる。
【０１９３】
（実施例５−２）
［鎖長純度の測定］
実施例２−３で合成した化合物２５の鎖長純度は、実施例２−２で合成した化合物２３の鎖長純度を用いた。
化合物２３の逆相クロマトグラフィー測定の結果、単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表すｎが２４である分岐型単分散ポリエチレングリコールが９１．６％、ｎが２４以外である化合物が計８．４％含まれていたため、鎖長純度は９１．６％であった。表１に結果をまとめる。逆相クロマトグラフィー測定は、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝５５／４５を用いたこと以外は、実施例５−１と同様の方法で求めた。
【０１９４】
［官能基純度の測定］
実施例２−３で合成した化合物２５の官能基純度は、実施例７−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲ測定により求めた。
化合物２３の逆相クロマトグラフィー測定の結果、官能基純度は９９．９％であった。また、化合物２３から化合物２４を得る反応において、化合物２３のアミノ基のα位のメチレン基由来のピーク（３．１０ｐｐｍ、２Ｈ）が消失し、３．４１ｐｐｍに新たなピークが観測された。反応において積分値が変化しないピーク（３．６４ｐｐｍ，１９５Ｈ）を基準とした場合、新たなピークの積分値は、合計で１．９９０であったため、アジド基の導入率は９９．５％（＝１．９９０÷２×１００）であった。続いて、化合物２５の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるアジド基由来のピーク（３．２２ｐｐｍ、２Ｈ）の積分値を基準（２．０）とした場合、活性カーボネート基由来のピーク（４．４３ｐｐｍ、４Ｈ）の積分値は３．９０５であった。よって活性カーボネート基の導入率は９７．６％（＝３．９０５÷４）であった。したがって化合物２５の官能基純度は、９７．０％（＝９９．９×０．９９５×０．９７６）であった。表１に結果をまとめる。
【０１９５】
（実施例５−３）
［鎖長純度の測定］
実施例３−１で合成した化合物２７の鎖長純度は、実施例５−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は９３．４％であった。表１に結果をまとめる。
【０１９６】
［官能基純度の測定］
実施例３−１で合成した化合物２７の官能基純度は、実施例５−１と同様に１Ｈ−ＮＭＲ測定により求めた。
化合物９の逆相クロマトグラフィー測定の結果、官能基純度は９９．９％であった。また、化合物９から化合物２６を得る反応において、化合物９のアミノ基のα位のメチレン基由来のピーク（３．１６、３．０４ｐｐｍ、２Ｈ）が消失し、３．４１ｐｐｍに新たなピークが観測された。反応において積分値が変化しないピーク（３．６２ｐｐｍ，９７Ｈ）を基準とした場合、新たなピークの積分値は１．９９２であったため、ブロモアセトアミド基の導入率は９９．６％（＝１．９９２÷２×１００）であった。続いて、化合物２７の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるブロモアセトアミド基由来のピーク（４．１３ｐｐｍ、２Ｈ）の積分値を基準（２．０）とした場合、活性カーボネート基由来のピーク（４．３１ｐｐｍ、４Ｈ）の積分値は３．８９６であった。よって活性カーボネート基の導入率は９７．４％（＝３．８９６÷４）であった。したがって化合物２７の官能基純度は、９６．９％（＝９９．９×０．９９６×０．９７４）であった。表１に結果をまとめる。
【０１９７】
（実施例５−４）
［鎖長純度の測定］
実施例４−１で合成した化合物３１の鎖長純度は、実施例５−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は９３．４％であった。
【０１９８】
［官能基純度の測定］
実施例４−１で合成した化合物３１の官能基純度は、１Ｈ−ＮＭＲ測定により求めた。
化合物３０の逆相クロマトグラフィー測定の結果、官能基純度は９９．９％であった。また、化合物９から化合物２８を得る反応において、化合物９のアミノ基のα位のメチレン基由来のピーク（３．１６、３．０４ｐｐｍ、２Ｈ）が消失し、３．４０ｐｐｍに新たなピークが観測された。反応において積分値が変化しないピーク（３．６２ｐｐｍ，９７Ｈ）を基準とした場合、新たなピークの積分値は１．９９８であったため、アルキニル基の導入率は９９．９％（＝１．９９８÷２×１００）であった。続いて、化合物３１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるアルキニル基由来のピーク（２．９８ｐｐｍ、４Ｈ）の積分値を基準（４．０）とした場合、活性エステル基由来のピーク（２．８３ｐｐｍ、８Ｈ）の積分値は７．６２４であった。よって活性エステル基の導入率は９５．３％（＝７．６２４÷８）であった。したがって化合物３１の官能基純度は、９５．１％（＝９９．９×０．９９９×０．９５３）であった。表１に結果をまとめる。
【０１９９】
【表１】
2018062655.tif 000082
【０２００】
＜式（３）で表される分岐型ヘテロ単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の鎖長純度と官能基純度＞
【０２０１】
（実施例６−１）
化合物４と化合物６との反応における塩基触媒として水酸化カリウムの代わりに水酸化ナトリウムを用いたこと以外は、実施例１−２と同様にして化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は、４８．３％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０２】
（実施例６−２）
化合物４と化合物６との反応における塩基触媒として水酸化カリウムの代わりにカリウム−ｔ−ブトキシドを用いたこと以外は、実施例１−２と同様にして化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は、５０．１％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０３】
（実施例７−１）
実施例１−２で合成した化合物９の純度は、逆相クロマトグラフィー測定により求めた。
測定条件は実施例５−１と同様の方法で求めた。その結果、単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表すｎが１２である分岐型単分散ポリエチレングリコールが９３．４％、ｎが１２以外である化合物が計６．６％含まれていたため、鎖長純度は９３．４％であった。また、末端に水酸基を２つ、およびアミノ基を１つ有する化合物が９９．９％、末端官能基の組み合わせが異なる化合物が０．１％含まれていたため、官能基純度は９９．９％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０４】
（実施例７−２）
実施例６−１で合成した化合物９の純度は、実施例５−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は９１．８％、官能基純度は９９．９％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０５】
（実施例７−３）
実施例６−２で合成した化合物９の鎖長純度は、実施例５−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は９２．６％、官能基純度は９９．７％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０６】
（参考例１−１：工程（１）の塩基触媒を変更した場合）
化合物４と化合物６との反応における塩基触媒として水酸化カリウムの代わりに水素化ナトリウムを用いたこと以外は、実施例１−２と同様にして化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は、２３．２％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０７】
（参考例１−２：工程（３）の分液温度を変更した場合）
工程（３）における分液洗浄時の温度を２５℃にしたこと以外は、実施例１−２と同様にして化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は、５２．８％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０８】
（参考例１−３：請求項５に記載の保護基Ａと官能基Ｚが好ましくない組み合わせの場合）
化合物６の代わりに化合物３５を用いたこと以外は、実施例１−２と同様にして化合物９を得た。化合物４を基準とした３工程でのモル収率は、３６．２％であった。表２に結果をまとめる。
【０２０９】
【化８１】
2018062655.tif 000083
（式中、Bnはベンジル基、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０２１０】
ナスフラスコに化合物１７（15.6g,  24.5mmol）およびトルエン（80mL）を加えた。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（4.1mL,  29.4mmol）を加えた。0℃で塩化メタンスルホニル（2.1mL,  27.0mol）を滴下し、室温で2時間攪拌した。2時間後、ESI−MS測定により化合物１７の消失を確認し、1M  塩酸  80mLを加え、分液した。有機相を1M  塩酸  80mLで1回、飽和重曹水  80mLで2回、飽和食塩水  80mLで1回洗浄した。有機相に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物３２を得た。
収量  16.7g
【０２１１】
【化８２】
2018062655.tif 000084
（式中、Bnはベンジル基を表す。）
【０２１２】
ナスフラスコに化合物４（1.64g,  14.0mmol）、化合物３２（30.0g,  42.0mmol）を入れ、トルエン共沸（30mL×2）した。テトラヒドロフラン（270mL）を加え、ナスフラスコ内を窒素パージした。水酸化カリウム（粉末,2.36g,  42mmol）を加え、加熱還流下で7時間攪拌した。7時間後、ESI−MS測定により化合物４の消失を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液  10mLを加えクエンチした。この溶液を減圧濃縮し（テトラヒドロフランのみ）、残渣をトルエン  150mLに溶解させた。イオン交換水  100mLで２回、飽和重曹水  100mLで1回、飽和食塩水  100mLで1回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物３３を得た。
収量  30.2g
【０２１３】
【化８３】
2018062655.tif 000085
（式中、Bnはベンジル基を表す。）
【０２１４】
ナスフラスコに化合物３３（30.2g）およびメタノール（150mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素置換した。パラジウム炭素（3.0g）を加え、ナスフラスコ内を水素置換して室温で5時間攪拌した。5時間後、ESI−MS測定により化合物３３の消失を確認し、反応溶液をろ過した（グラスファイバーろ紙）。ろ液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタン  150mLに溶解させた。この溶液をイオン交換水  150mLで５回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物９を得た。化合物４を基準とした２工程でのモル収率は３６．２％であった。表２に結果をまとめる。
収量  5.8g
【０２１５】
（参考例２−１）
参考例１−１で合成した化合物９の純度は、実施例９−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は６４．９％、官能基純度は７０．４％であった。表２に結果をまとめる。
【０２１６】
（参考例２−２）
参考例１−２で合成した化合物９の純度は、実施例９−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は８６．１％、官能基純度は９２．２％であった。表２に結果をまとめる。
【０２１７】
（参考例２−３）
参考例１−３で合成した化合物９の純度は、実施例９−１と同様の方法で求めた。鎖長純度は９２．７％、官能基純度は９９．３％であった。表２に結果をまとめる。
【０２１８】
【表２】
2018062655.tif 000086
【０２１９】
上記の結果から、実施例１−２、実施例６−１、および実施例６−２で得られた化合物９は、単分散ポリエチレングリコールの繰り返し単位数を表すｎが１２である化合物の純度（鎖長純度）が９０％以上であり、かつ末端に水酸基を２つ、アミノ基を１つ有する化合物の純度（官能基純度）が９５％以上であることが確認された。
また、参考例１−１で得られた化合物９は、工程（１）のカップリングにおける塩基触媒として水素化ナトリウムを用いたために、分岐部位の分解や副反応により構造不明の不純物が複数生成し、モル収率や鎖長純度、官能基純度が低下した。この化合物９を用いて前記式（１）で表される化合物を合成した場合、鎖長純度、官能基純度の低い化合物が得られ、純度向上のためにカラムクロマトグラフィーによる精製を行った場合、モル収率が更に低下する。
【０２２０】
さらに、参考例１−２で得られた化合物９は、工程（３）の分液精製における温度が高いために、前記式（３９）で表される単分散ポリエチレングリコールが分離されなかった。この不純物は直鎖型であり、かつ末端官能基が水酸基とメシレート基の組み合わせであるため、化合物９の鎖長純度および官能基純度が低下した。
この化合物９を用いて例えば実施例１−３と同様にして化合物１１を得た場合、前記不純物は、直鎖型であり、かつ末端に活性カーボネート基およびメシレート基を有する化合物となるため、化合物１１の鎖長純度および官能基純度が低下する。純度向上のためにカラムクロマトグラフィーによる精製を行った場合、モル収率が低下する。
【０２２１】
さらにまた、参考例１−３で得られた化合物９は、工程（２）において前記式（６）で表される化合物の保護基Ａ（ベンジル基）の脱保護と官能基Ｚ１（アジド基）の還元処理が同時に行われるために、工程（３）の分液精製において前記式（３９）で表される単分散ポリエチレングリコールと共に前記式（３）で表される化合物が水層に溶出し、モル収率が低下した。この化合物９を用いて前記式（１）で表される化合物を合成した場合、鎖長純度は９０％以上であり、かつ官能基純度は９５％以上となるが、モル収率が低い。
【０２２２】
（実施例８−１）
式（４０）のＹ２が−ＮＨ２、ｎが１２である化合物４５の合成
【化８４】
2018062655.tif 000087
（式中、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０２２３】
ナスフラスコに化合物５（15g,  19.0mmol）およびジクロロメタン（71mL）を加えて溶解した。ナスフラスコ内を窒素パージし、フタルイミド（3.92g,  26.6mmol）、トリフェニルホスフィン（6.98g,  26.6 mmol）を加えた。ジクロロメタン（15mL）に溶解したアゾジカルボン酸ジイソプロピル（4.61g,  22.8mmol）を20℃から30℃で滴下し、25℃で1時間攪拌した。1時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物５の消失を確認し、メタノール（0.73mL,  22.8mmol）を加え、反応を停止した。反応液を減圧濃縮し、透明液体化合物４６を得た。
【化８５】
2018062655.tif 000088
（式中、Trtはトリフェニルメチル基を表す。）
【０２２４】
ナスフラスコに上記化合物４６全量およびメタノール（59.4mL）、エチレンジアミン・一水和物（22.28g,  285mmol）を加えて窒素パージし、溶解した。35℃から45℃で1時間攪拌し、反応した。1時間後、NMR測定により化合物４６の消失を確認した。トルエン（75mL）、20%食塩水（75mL）を加え3回洗浄し、有機層を減圧濃縮した。その後、イオン交換水（45mL）に溶解し、5%リン酸２水素ナトリウム水溶液（120mL）を加えてpH6に調整した。これを酢酸エチル（190mL）にて3回洗浄し、化合物４７の水溶液を得た。
【化８６】
2018062655.tif 000089
【０２２５】
ナスフラスコ中の上記化合物４７の水溶液全量に、６N−塩酸を少量加えてpH1に調整し、5時間攪拌した。5時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物４７の消失を確認し、析出した固体をろ別した。少量の400g/L水酸化ナトリウム水溶液でpH7.5に調節し、クロロホルム（200mL）を加え１回洗浄した。得られた水溶液に食塩を加えて飽和食塩水とし、クロロホルム（45mL）、イソプロパノール（15mL）を加えて目的物を有機層にこの有機層を減圧濃縮し、クロロホルム（75mL）で再溶解し、無水硫酸ナトリウム（10g）を加えて脱水した。この溶液をろ過して無水硫酸ナトリウムを除去した後、トルエン（35mL）を加えながら減圧濃縮し、透明液体化合物４８を得た。
収量  6.51g
【化８７】
2018062655.tif 000090
【０２２６】
ナスフラスコに化合物４８（5.93g,  10.9mmol）および水（30mL）、テトラヒドロフラン（33mL）を加え溶解した。ナスフラスコ内を窒素パージし、炭酸水素ナトリウム（2.66g,  31.6mmol）、二炭酸ジ-tert-ブチル（3.46g,  15.8 mmol）を加えて20℃から30℃にて6時間攪拌した。6時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物４８の消失を確認した。ヘキサン（45mL）を加え水層を4回洗浄し、次にジクロロメタン（22.4mL）を加えて目的物を有機層へ抽出した。この有機層に無水硫酸ナトリウム（6g）を加えて脱水し、この溶液をろ過して無水硫酸ナトリウムを除去した。その後溶液を減圧濃縮し、透明液体化合物４９を得た。
収量  6.31g
【化８８】
2018062655.tif 000091
（式中、Msはメタンスルホニル基を表す。）
【０２２７】
ナスフラスコに化合物４９（6.2g,  9.6mmol）およびトルエン（36mL）、を加え溶解した。ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（1.33g,  13.1mmol）、塩化メタンスルホニル（1.29g,  11.3mmol）を加え、20℃から30℃で4時間攪拌した。4時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物４９の消失を確認した。25％アンモニア水溶液（30mL）を加え有機層を3回洗浄し、次に飽和食塩水（30mL）を加えて有機層を1回洗浄した。この有機層に無水硫酸ナトリウム（6g）を加えて脱水し、この溶液をろ過して無水硫酸ナトリウムを除去した。その後溶液を減圧濃縮し、透明液体化合物５０を得た。
収量  5.87g
【０２２８】
［工程（１’）］
【化８９】
2018062655.tif 000092
【化９０】
2018062655.tif 000093
【０２２９】
ナスフラスコに化合物５０（4.0g,  5.5mmol）、化合物５１（0.47g,  2.6 mmol）、脱水テトラヒドロフラン（6.0mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、溶解した。水酸化カリウム（粉末,  0.15g）を加え、20℃から30℃で2時間攪拌した。2時間後、NMR測定により化合物５０の残存を確認し、水酸化カリウム（粉末,  0.15g）を追加し、20℃から30℃で2時間攪拌した。その後、エチレンジアミン一水和物（10.78g,  138mmol）を加え反応を停止した後、トルエン（46mL）を加え希釈した。25％アンモニア水溶液（20mL）を加え有機層を4回洗浄し、有機層に無水硫酸ナトリウム（4g）加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、透明液体の化合物５２を得た。
収量  3.2g
【０２３０】
［工程（２’）］
【化９１】
2018062655.tif 000094
【０２３１】
ナスフラスコに化合物５２（3.0g,  2.1mmol）およびメタノール（120mL）、5%Pd/C（1.5g）を加えた。ナスフラスコを窒素パージし、シクロヘキセン（4.1g）を加え、50℃から60℃で4時間攪拌した。30℃に冷却し、クロロホルム（300mL）を加え、Pd/Cをろ別し、トルエン（100mL）を加えながら減圧乾燥し、最終的にトルエン（40mL）に溶剤を置換した。有機相に無水硫酸ナトリウム（3g）を加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、透液体の化合物５３を得た。
収量  2.2g
【０２３２】
［工程（３’）〜（４’）］
【化９２】
2018062655.tif 000095
【０２３３】
ナスフラスコに化合物５３（2.0g,  1.48mmol）およびジクロロメタン（16mL）を入れ、ナスフラスコ内を窒素置換した。トリフルオロ酢酸（3g）を加え、室温で2時間攪拌した。2時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物５３の消失を確認し、水（40mL）を加えて目的物を水槽に抽出した。この水溶液に400g/L水酸化ナトリウム少量を加えてpH7.5とし、食塩を加えて飽和食塩水とした。次にクロロホルム（9ｍL）とイソプロパノール（3mL）を加え目的物を有機層に抽出し、飽和重曹水（20ｍL）、飽和食塩水（20mL）にて順に洗浄した。この有機層を減圧濃縮し、クロロホルム（20mL）にて再溶解させ、硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、透明液体の化合物４５を得た。化合物５０を基準とした３工程でのモル収率は５１．８％であった。鎖長純度は９４．８％、官能基純度は９８．２％であった。
収量  1.4g
【０２３４】
（実施例８−２）
式（１）のＸ１がマレイミド基、Ｙ１が活性カーボネート基、Ｌ3が単結合である化合物５４の合成
【化９３】
2018062655.tif 000096
【化９４】
2018062655.tif 000097
【０２３５】
ナスフラスコに、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（667mg,  2.5mmol）、ジブチルヒドロキシトルエン（1mg）ジクロロメタン（130mL）を入れた。化合物４５（1.2g,  1.05mmol）およびトリエチルアミン（0.38mL,  2.7mmol）をジクロロメタン（8mL）に溶解し、室温で滴下した。室温で4時間攪拌後、薄層クロマトグラフィー（TLC）測定により化合物４５の消失を確認し、有機相を15%食塩を溶解させたクエン酸バッファー（pH=  3.0）（50  mL）で3回洗浄し、減圧濃縮した。残渣にクエン酸バッファー（pH=  3.0）（50mL）を加え、トルエン−ジクロロメタン（10:  3,  w/w）（50mLで）3回洗浄した。水相をジクロロメタン50mLで3回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸マグネシウム（1g）を加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、透明液体の化合物５５を得た。
収量  890mg
【０２３６】
ナスフラスコに、化合物５５（780mg,  0.54mmol）、トリエチルアミン（0.12mL,  0.86mmol）、ジブチルヒドロキシトルエン（1mg）、ジクロロメタン（15mL）を入れた。炭酸ジスクシンイミジル（208mg,  0.81mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。５時間後、NMR測定により化合物５５の消失を確認し、15%食塩を溶解させたクエン酸バッファー（pH=  3.0）（25mL）を加え、3回洗浄した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウム（1g）を加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、透明液体の化合物５４を得た。鎖長純度は９３．２％、官能基純度は９５．８％であった。
収量  705mg