(57)【要約】【課題】多種多様の皮膚常在菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌を簡易かつ迅速に検出できるＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法を提供することを目的とする。【解決手段】主成分としてペプトン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−トレハロース、ポリミキシンＢを含有する培地を用いて培地上で表皮ブドウ球菌を発育させる。培地上で発育した表皮ブドウ球菌と推定される菌株に対して、特定の配列のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、短時間で表皮ブドウ球菌であるか否かの鑑別を可能とする。【選択図】図３
2018068261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、皮膚常在菌のうち表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項２】
皮膚常在菌の菌株よりブドウ球菌属をスクリーニングする培地と、
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、前記前記ブドウ球菌属の菌株うち表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットと、を備える
表皮ブドウ球菌の検査キット。
【請求項３】
前記培地が、
少なくともペプトン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−トレハロース、ポリミキシンＢを含有する
請求項２に記載の表皮ブドウ球菌の検査キット。
【請求項４】
前記培地が、
精製水１０００ｍｌ当たり１２．０ｇのペプトン、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−マンニトール、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−トレハロース、５．０ｍｇ〜１０．０ｍｇのポリミキシンＢ、を含有する請求項２または請求項３に記載の表皮ブドウ球菌の検査キット。
【請求項５】
前記培地が、
精製水１０００ｍｌ当たり５．０ｇのハートエキス末、８．５ｇのカゼイン由来の消化ペプトン、３．５ｇの大豆由来のペプトン、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−マンニトロール、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−トレハロース、５０ｍｌの５０％卵黄液、５．０〜１０．０ｍｇのポリミキシンＢ、５．０ｍｇのアズトレオナム、１５．０ｍｇの寒天を含み、ｐＨ７．３±０．２である
請求項２から請求項４の何れか一項に記載の表皮ブドウ球菌の検査キット。
【請求項６】
検体をブドウ球菌属の菌株のうち表皮ブドウ球菌の発育条件下で培養する工程と、
発育菌から所定の菌株を釣菌する工程と、
釣菌した前記所定の菌株に対して配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅する工程と、
増幅産物を解析する工程と、を備える
表皮ブドウ球菌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法に関する。詳しくは、多種多様の皮膚常在菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を簡易かつ迅速に検査することができるＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚には、多種多様な皮膚常在菌が生息しており、健常な皮膚表面に存在する主要な菌として表皮ブドウ球菌が知られている。この表皮ブドウ球菌を主体とする皮膚常在菌は、紫外線を吸収することによって紫外線による障害から皮膚を保護したり、活性酸素除去能を有する酵素を産生する。また、皮脂を代謝して、その代謝産物により皮膚を乾燥や炎症から保護する役割がある（特許文献１）。
【０００３】
このような表皮ブドウ球菌の特性を活かし、例えば特許文献２には、表皮ブドウ球菌を用いた美容方法が開示されている。具体的には、ヒトの皮膚表面から採取した皮膚常在菌から表皮ブドウ球菌を選択的に所定の分別方法で釣菌した後、増殖させ、ヒトの皮膚に投与（戻す）することにより、ヒトの皮膚表面に表皮ブドウ球菌を確実に定着させ、表皮水分量を一定値に保つことが可能なものとなっている。
【０００４】
ここで、表皮ブドウ球菌の検出・同定には、一般に選択培地による分離や増殖培地による培地、顕微鏡観察や免疫学的な反応性を利用した方法など様々なものが用いられている。なお、ヒトの皮膚には約１０００菌種もの細菌が存在することが知られているが、この多種多様な細菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌を生菌状態で取り出す技術としては、表皮ブドウ球菌の選択性と発育性とを高めた培養法で分別したあと、遺伝子検査により同定する方法がもっとも合理的な方法であると考えられている。
【０００５】
具体的には、まず、何らかの方法（擦過、綿棒、懸濁など）にてヒトの皮膚表層上の菌を採取し、ブドウ球菌属の選択培地に塗布して１〜２日間培養する。その後、表皮ブドウ球菌と疑わしき微小菌集落の数株を釣菌し、非選択培地に植菌して所定温度で純培養させる。最後に遺伝子検査により、分離菌株の菌種を同定するというものである。
【０００６】
ここで、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）の代表的な菌種である表皮ブドウ球菌、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、メチシリン耐性（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）株を含むため、ＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、およびＭＡＳＥ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などのメチシリン耐性ブドウ球菌の選択培地として開発されたＭＲＳＡスクリーニング培地から、選択剤であるメチシリン（もしくは相当抗生剤）を除くとブドウ球菌属培地としての用途が高いことが知られている。（特許文献３）。
【０００７】
また、表皮ブドウ球菌の遺伝子検査としては、表皮ブドウ球菌の特異遺伝子を視覚的・機器的に捉えることができる程度まで増幅し、定量的に判別することが可能なＰＣＲ法が提案されている（特許文献４、特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０９−７７６５３号公報
【特許文献２】ＰＣＴ／２０１２／０７８８３５
【特許文献３】特開２００２−３４５５３号公報
【特許文献４】米国特許第８６７３５６６号明細書
【特許文献５】米国特許第８１１０１９８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、特許文献３に開示されているＭＲＳＡスクリーニング培地からメチシリン（もしくは相当抗生剤）を除いた培地は、表皮ブドウ球菌、および黄色ブドウ球菌を主に培養することができるため、選択性を高めることは可能であるが、その他の多くのブドウ球菌属やコリネバクテリア属の菌種も混在して発育するため、外観上の識別から表皮ブドウ球菌を見分けることは困難であり、表皮ブドウ球菌の釣菌での的確性は決して高いものではなかった。
【００１０】
また特許文献４、または特許文献５に開示されたＰＣＲ法を用いた表皮ブドウ球菌の検査法は、反応を行うための特殊な遺伝子増幅装置を必要とし、最終的な判定操作は電気泳動法等の特殊な手法や機器、もしくは紫外線を照射する装置などが必要で、操作工程が多く、検査操作の開始から判定までに長時間（約４〜５時間）を要する。
【００１１】
一方、最近ではＰＣＲ法に代わる遺伝子増幅法として、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による手法が栄研化学株式会社より開発された。この手法は、特殊な大型機器を用いることなく、また反応時間も短く簡便であるため、迅速な判定を可能としている。しかしながら、表皮ブドウ球菌に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーは未だ報告されていない。
【００１２】
そのため、表皮ブドウ球菌の検出に際しては、ブドウ球菌スクリーニング培地、およびＰＣＲ法による遺伝子検査方法の組み合わせが主に使用されている。しかしながら、この従来の方法では、多種多様なブドウ球菌属の菌種が存在する中から表皮ブドウ球菌のみを分離同定するには多大な工数と費用が必要とされており、より効率的な検査方法の開発が望まれていた。
【００１３】
本発明は、以上の点に鑑みて創案されたものであり、多種多様の皮膚常在菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌を簡易かつ迅速に検出することができるＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の目的を達成するために、本発明のＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、皮膚常在菌のうち表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなる。
【００１５】
ここで、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行うことにより、皮膚常在菌のうち表皮ブドウ球菌の特異的な核酸配列を増幅することが可能となるため、多種多様な皮膚常在菌の中から表皮ブドウ球菌の検出、および判別が可能となる。
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明の表皮ブドウ球菌の検査キットは、皮膚常在菌の菌株よりブドウ球菌属をスクリーニングする培地と、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、前記ブドウ球菌属の菌種のうち表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットとを備える
【００１７】
ここで、表皮ブドウ球菌の検査キットが皮膚常在菌の菌群から所定のブドウ球菌属をスクリーニングする培地を備えることにより、多種多様な皮膚常在菌の菌群からブドウ球菌属の菌種（特に表皮ブドウ球菌）を選択的に発育・検出することができる。
【００１８】
また、ブドウ球菌属の菌種のうち表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであり、配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行うことにより、スクリーニング培地により発育・検出した菌株の中から表皮ブドウ球菌の特異的な塩基配列を増幅することが可能となるため、多種多様な皮膚常在菌の中から表皮ブドウ球菌の菌種の検出、および判別が可能となる。
【００１９】
さらに、スクリーニング用の培地が、少なくともペプトンを有することにより、ブドウ球菌属の菌種の発育を促進させることができる。
【００２０】
また、スクリーニング用の培地が、少なくともＤ−マンニトールを有することにより、ブドウ球菌属の菌種のうち、表皮ブドウ球菌はＤ−マンニトールから酸産生できないため、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルが青紫色のまま変色せず、ブドウ球菌属の菌種から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２１】
また、スクリーニング用の培地が、少なくともＤ−トレハロースを有することにより、ブドウ球菌属の菌種のうち、表皮ブドウ球菌はＤ−トレハロースから酸産生できないため、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルが青紫色のまま変色せず、ブドウ球菌属の菌種から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２２】
また、スクリーニング用の培地が、少なくともポリミキシンＢを有することにより、ブドウ球菌属の菌種のうち、抗生剤であるポリミキシンＢに耐性を有しない菌株の発育を抑制することができる。一方で、表皮ブドウ球菌はポリミキシンＢに耐性を有するため、ポリミキシンＢが存在する環境下においても発育が可能であり、多種多様なブドウ球菌属の菌種から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２３】
また、スクリーニング用の培地が、精製水１０００ｍｌ当たり１２．０ｇのペプトンを有することにより、ブドウ球菌属の菌種の発育を最も効率的に促進させることができる。
【００２４】
また、スクリーニング用の培地が、精製水１０００ｍｌ当たり８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−マンニトールを有することにより、ブドウ球菌属の菌種のうち、表皮ブドウ球菌はＤ−マンニトールを利用できないため、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルが青紫色のまま変色せず、ブドウ球菌属の菌種から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２５】
また、スクリーニング用の培地が、精製水１０００ｍｌ当たり８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−トレハロースを有することにより、ブドウ球菌属の菌種のうち、表皮ブドウ球菌はＤ−トレハロースを利用できないため、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルが青紫色のまま変色せず、ブドウ球菌属の菌種から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２６】
また、スクリーニング用の培地が、５．０ｍｇ〜１０．０ｍｇのポリミキシンＢを有することにより、グラム陰性菌群の発育抑制のみならず、ブドウ球菌属の菌種のうち、抗生剤であるポリミキシンＢに耐性を有しない菌株の発育を最も効率的に抑制することができる。一方で、表皮ブドウ球菌はポリミキシンＢに耐性を有するため、ポリミキシンＢが存在する環境下においても発育が可能であり、多種多様なブドウ球菌属の菌株から表皮ブドウ球菌の検出を容易なものとすることができる。
【００２７】
また、スクリーニング用の培地が、精製水１０００ｍｌ当たり５．０ｇのハートエキス末、８．５ｇのカゼイン由来の消化ペプトン、３．５ｇの大豆由来のペプトン、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−マンニトロール、８．０ｇ〜１５．０ｇのＤ−トレハロース、５０ｍｌの５０％卵黄液、５．０〜１０．０ｍｇのポリミキシンＢ、５．０ｍｇのアズトレオナム、１５．０ｍｇの寒天を含み、ｐＨ７．３±０．２である場合には、最も効率的に皮膚常在菌から選択的に表皮ブドウ球菌の菌種を発育・検出することが可能となる。
【００２８】
上記の目的を達成するために、本発明の表皮ブドウ球菌の検査方法は、検体をブドウ球菌属の菌種のうち表皮ブドウ球菌の発育条件下で培養する工程と、発育菌から所定の菌株を釣菌する工程と、釣菌した前記所定の菌株に対して配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅する工程と、増幅産物を解析する工程とを備える。
【００２９】
ここで、検体を表皮ブドウ球菌の発育条件下で培養する工程を備えることにより、多種多様な皮膚常在菌の菌種から表皮ブドウ球菌の菌種を選択的に発育・検出することができる。
【００３０】
また、発育菌から所定の菌株を釣菌する工程を備えることにより、培地上で発育した発育菌の中から表皮ブドウ球菌と推察される菌株を特定し釣菌することが可能となる。
【００３１】
また、釣菌した所定の菌株に対して配列番号９〜１２に示される４種のプライマーからなるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により表皮ブドウ球菌に特異的な塩基配列を増幅する工程を有することにより、表皮ブドウ球菌の特異的な核酸配列を増幅することが可能となるため、釣菌した菌株の中から表皮ブドウ球菌の菌株の検出、および判別が可能となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係るＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法は、多種多様の皮膚常在菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌を簡易かつ迅速に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】プライマーセット１における濁度の経時的変化を示すグラフである。
【図２】プライマーセット２における濁度の経時的変化を示すグラフである。
【図３】プライマーセット３における濁度の経時的変化を示すグラフである。
【図４】プライマーセット４における濁度の経時的変化を示すグラフである。
【図５】プライマーセット５における濁度の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、ＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法に関する本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明し、本発明の理解に供する。
【００３５】
まず、本発明において皮膚常在菌から表皮ブドウ球菌の同定検査は、等温核酸増幅法であるＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いて核酸増幅反応を行う。
【００３６】
ここで、ＬＡＭＰ法とは鋳型となる塩基配列に自身の鋳型となる塩基配列に、自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このときに形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。
【００３７】
次に、ＬＡＭＰ法による表皮ブドウ球菌の同定検査の一連の流れについて説明を行う。
【００３８】
１．検体試料の準備
まず、検体試料としては、被験者５名（女性３名、弾性２名）の顔面の皮膚表面を減菌ガーゼで軽く拭き取ることにより得た。
【００３９】
２．培地
培地としては、ＯＰＡＩＩ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｇａｒ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）からＭＲＳＡの選択剤であるセフォキシチンを除去した培地組成を基本として、さらに表皮ブドウ球菌の発育に好適な環境となるように各成分を見直し、主に以下の４種類の培地を準備した。
【００４０】
（培地１）
培地１は、精製水１０００ｍｌあたり表１に示す成分配合で調整した。
【表１】
2018068261.tif 000003
【００４１】
（培地２）
培地２は培地１に対してＤ−トレハロースを除いたものであり、精製水１０００ｍｌあたり表２に示す成分配合で調整した。
【表２】
2018068261.tif 000004
【００４２】
（培地３）
培地３は、培地１に対してポリミキシンＢを除いたものであり、精製水１０００ｍｌあたり表３に示す成分配合で調整した。
【表３】
2018068261.tif 000005
【００４３】
（培地４）
培地４は、培地１に対してＤ−トレハロースとポリミキシンＢを除いたものであり精製水１０００ｍｌあたり表４に示す成分配合で調整した。
【表４】
2018068261.tif 000006
【００４４】
ここで、必ずしも、ハートエキス末、カゼイン―スイ消化ペプトンを使用する必要はない。ハートエキス末、カゼイン―スイ消化ペプトンは表皮ブドウ球菌が発育を促進する成分であるが、表皮ブドウ球菌が増殖可能な成分であれば本発明に使用可能である。
【００４５】
また、必ずしも、アズトレオナムを使用する必要はない。アズトレオナムはグラム陰性菌種の大半の発育を抑制する抗生剤であるが、同様な効果を有する抗生剤であれば本発明に使用可能である。
【００４６】
なお、各培地においてＤ−マンニトールの組成は８．０ｇ〜１５．０ｇの範囲内であれば表皮ブドウ球菌の検出において優位的なものとなるが、特に１０．０ｇとした場合が最も効率的に検出が可能となる。
【００４７】
また、培地１、および培地３においてＤ−トレハロースの組成は８．０ｇ〜１５．０ｇの範囲内であれば表皮ブドウ球菌の検出において優位的なものとなるが、特に１０．０ｇとした場合が最も効率的に検出が可能となる。
【００４８】
また、培地１、および培地２においてポリミキシンＢの組成は５．０ｍｇ〜１０．０ｍｇの範囲内であれば表皮ブドウ球菌の検出において優位的なものとなるが、特に５．０ｍｇとした場合が最も効率的に検出が可能となる。
【００４９】
次に、検体試料を培地１乃至培地４のそれぞれの培地に塗布し、３５℃の一定温度条件のもとで２日間培養させ、培地１乃至培地４において外観判断により表皮ブドウ球菌と推察されるコロニーを３株ずつ釣菌し、同定操作を行った。なお同定操作には、最も同定確立が高いとされるマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ（ブルカー・ダルトニクス社）を用いた。その結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
2018068261.tif 000007
【００５１】
表５に示す通り、培地１が表皮ブドウ球菌の釣菌率が最も高く、表皮ブドウ球菌のスクリーニング用の培地として好適であることが分かる。なお、表５において「Ｓ．」は「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ」の略語であり、「Ｃ．」は「Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ」の略語である。
【００５２】
すなわち、表皮ブドウ球菌はＤ−マンニトール、およびＤ−トレハロースの何れからも酸産生することができないため、ｐＨ指示薬であるブロモクレゾールパープルが青紫色のまま変色しない。一方で、ブドウ球菌属の菌種のうち、Ｄ−マンニトール、およびＤ−トレハロースから酸産生する菌種の菌集落周辺は黄色となる。
【００５３】
また、表皮ブドウ球菌はポリミキシンＢに対して耐性を有するため、ポリミキシンＢの存在下でも発育が可能である。一方、ブドウ球菌属の菌種のうちポリミキシンＢに耐性を有しない菌種はその発育が抑えられる。
【００５４】
以上から、培地１においてはｐＨ指示薬の菌株の反応状況、および培地上における各菌種の発育状況から、外観判断に基づいて容易に表皮ブドウ球菌の検出が可能となる。
【００５５】
一方で、培地２乃至培地４においては、表皮ブドウ球菌以外の菌株も釣菌されていることがわかる。このことから、培地１が表皮ブドウ球菌の釣菌の的確性が高く、表皮ブドウ球菌のスクリーニング用の培地として最も好適であるといえる。
【００５６】
３．ＬＡＭＰ法による表皮ブドウ球菌の同定検査
ＬＡＭＰ法による同定検査に際しては、塩基配列情報の取得、プライマーの設計、核酸増幅反応操作、核酸増幅産物の検出の手順で進めた。以下、各手順の詳細について説明する。
【００５７】
（塩基配列情報の取得）
通常、表皮ブドウ球菌の同定検査を目的とする遺伝子検査では、表皮ブドウ球菌のみが有する特異的な遺伝子（gene）、もしくは、表皮ブドウ球菌および他の菌種も有する遺伝子であるが表皮ブドウ球菌に特徴ある塩基配列（非相同塩基箇所）が多く存在する遺伝子を使用する。これらの目的遺伝子としては、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｌｉｐａｓｅ、ＳＥＲＰ０１０７、Ｃａｔａｌａｓｅ、および１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子などが挙げられる。本件では、ブドウ球菌属の根幹的性状であるＣａｔａｌａｓｅ  ｇｅｎｅを選択した。
【００５８】
表皮ブドウ球菌Ｃａｔａｌａｓｅ  ｇｅｎｅのＤＮＡ塩基配列データは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢＡＮＫ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）より以下のデータをＦＡＳＴＡ形式にて入手した。
＞ｇｉ｜２７４６６９１８：１０２１７１８−１０２３２３２  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００４４６１．１
【００５９】
（プライマーの設計）
プライマーの設計に際しては、ブドウ球菌属の菌種のうち前記した培地１において発育可能な菌種を中心に、以下の表６に示す８つの類族菌種のＤＮＡ塩基配列を公開ソフトＤＤＢＪ（ＤＮＡ  ＤＡＴＥ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）にて多重整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）し、ＤＮＡ塩基配列の相同箇所を調査した。
【表６】
2018068261.tif 000008
【００６０】
多重整列の結果から、他菌種とＤＮＡ塩基配列の相同性の高い、５'−側から５５０塩基を外し、５５１塩基から１５１５塩基領域を用いＬＡＭＰ法プライマーを設計した。プライマーの設計には、ＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトウェアーＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ５（栄研化学株式会社）を用いた。この際、多重整列の結果から、＞ｇｉ｜２７４６６９１８：１０２１７１８−１０２３２３２  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００４４６１．１の塩基が、配列上他の菌種と全く異なる、もしくは他の１菌種のみと相同な塩基配列領域を用いてプライマー設計をおこなった。その結果、配列表、および以下に示す５組のプライマーセット１〜プライマーセット５を得た。
【００６１】
プライマーセット１（５'→３'）
Ｆ３（配列番号１）：ＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣ
Ｂ３（配列番号２）：ＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＴＴＧＡ
ＦＩＰ（配列番号３）：ＧＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴ−ＴＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧＧ
ＢＩＰ（配列番号４）：ＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧ−ＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣ
【００６２】
プライマーセット２（５'→３'）
Ｆ３（配列番号５）：ＴＧＴＣＣＡＴＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧ
Ｂ３（配列番号６）：ＣＧＣＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＡ
ＦＩＰ（配列番号７）：ＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＴ−ＧＣＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧ
ＢＩＰ（配列番号８）：ＣＡＴＴＣＣＣＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧ−ＡＡＴＡＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡ
【００６３】
プライマーセット３（５'→３'）
Ｆ３（配列番号９）：ＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＧ
Ｂ３（配列番号１０）：ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧ
ＦＩＰ（配列番号１１）：ＡＴＣＡＣＧＡＣＴＡＡＡＴＧＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴ−ＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣ
ＢＩＰ（配列番号１２）：ＣＴＴＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣ−ＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴ
【００６４】
プライマーセット４（５'→３'）
Ｆ３（配列番号１３）：ＣＡＡＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴ
Ｂ３（配列番号１４）：ＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧ
ＦＩＰ（配列番号１５）：ＣＧＡＣＴＡＡＡＴＧＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡ−ＡＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴ
ＢＩＰ（配列番号１６）：ＣＴＴＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣ−ＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴ
【００６５】
プライマーセット５（５'→３'）
Ｆ３（配列番号１７）：ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
Ｂ３（配列番号１８）：ＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＣＴＴ
ＦＩＰ（配列番号１９）：ＧＧＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴ−ＣＣＣＡＡＣＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧ
ＢＩＰ（配列番号２０）：ＴＴＡＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧ−ＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣ
【００６６】
（核酸増幅反応操作）
次に、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い前記した５組のプライマーセットについて反応性を調べた。具体的には、前記したプライマーセットと、表７のように調整したＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）、および表８に示すａ．〜ｆ．のＤＮＡ抽出液を用いて、リアルタイム濁度測定装置（栄研化学株式会社製）にて一定温度（本実施例では６２℃）で６０分間、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行った。なお、表８における「Ｓ．」は「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ」の略語である。また、「Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＮＯ．１）」と「Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＮＯ．２）」は同じ菌種であるが異なる菌株に基づくＤＮＡ抽出液である。
【００６７】
【表７】
2018068261.tif 000009
【００６８】
【表８】
2018068261.tif 000010
【００６９】
前記した５組のプライマーセットと表７に示すＤＮＡ増幅試薬キット、および表８に示すａ．〜ｅ．のＤＮＡ抽出液との組み合わせ（計２５通り）について、リアルタイム濁度測定装置による測定結果を図１〜図５に示す。なお、図中における符号ａ〜ｅは表８におけるＤＮＡ抽出液に対応している。
【００７０】
プライマーセット２、プライマーセット４、およびプライマーセット５においては濁度の経時的な変化は確認できなかった。一方、プライマーセット１、およびプライマーセット３においては、図１、図３に示すように反応時間３０分位から顕著な立ちあがりが確認できた。特にプライマーセット３における濁度の立ち上がりの形状、および特異性において良好な結果が得られたため、本発明においてはプライマーセット３のプライマーをＬＡＭＰ法におけるプライマーと決定した。
【００７１】
（特異性調査）
プライマーセット３を使用して、釣菌した１８菌株に対してＬＡＭＰ反応を実施した結果を表９に示す。表９に示すように、プライマーセット３を使用することで、全ての表皮ブドウ球菌株において陽性反応を示す一方、その他のブドウ球菌属の菌株については陰性反応を示した。すなわち、プライマーセット３は表皮ブドウ球菌を特異的に検出するためのプライマーとして有効であることが示された。なお、表９における「Ｓ．」は「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ」の略語である。
【００７２】
【表９】
2018068261.tif 000011
【００７３】
以上、本発明を適用したＬＡＭＰ法プライマーセット、表皮ブドウ球菌の検査キット、および表皮ブドウ球菌の検査方法は、多種多様の皮膚常在菌の中から皮膚に有益とされる表皮ブドウ球菌を簡易かつ迅速に検出することができるものとなっている。
【図１】
2018068261.tif 000012
【図２】
2018068261.tif 000013
【図３】
2018068261.tif 000014
【図４】
2018068261.tif 000015
【図５】
2018068261.tif 000016
【配列表】
2018068261000001.app