(57)【要約】      （修正有）【課題】がんの処置または診断のための医薬組成物の提供。【解決手段】ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと治療用または診断用エフェクター部分とを含む、コンジュゲートもしくは融合タンパク質を含む、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントであって、
ａ）ＩＤ１、および
ｂ）ＤＢＬ２Ｘｂ、ならびに場合によっては
ｃ）ＩＤ２ａ
の連続するアミノ酸配列からなるフラグメント。
【請求項２】
プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）上のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に、１００ｎＭ未満、例えば８０ｎＭ未満、例えば７０ｎＭ未満、例えば６０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば４０ｎＭ未満、例えば３０ｎＭ未満、例えば２６ｎＭ未満、例えば２４ｎＭ未満、例えば２２ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば１８ｎＭ未満、例えば１６ｎＭ未満、例えば１４ｎＭ未満、例えば１２ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば９ｎＭ未満、例えば８ｎＭ未満、例えば７ｎＭ未満、例えば６ｎＭ未満、または４ｎＭ未満の、ＫＤによって測定されるアフィニティで結合する、請求項１に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項３】
配列番号１の１〜５７７、配列番号３の１〜５９２、配列番号４の１〜５７９、配列番号５の１〜５７６、配列番号１０の１〜５８６、配列番号１１の１〜５７９、配列番号２９の１〜５６５、配列番号３４の１〜５８４、配列番号３６の１〜５６９、配列番号３７の１〜５７５、配列番号３８の１〜５９２、配列番号４１の１〜６０３、配列番号４３の１〜５８８、配列番号４４の１〜５６５、配列番号４５の１〜５８９、配列番号４８の１〜５７３、配列番号５３の１〜５８３、または配列番号５４の１〜５６９のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項４】
配列番号１の５７８〜６４０、配列番号３の５９３〜６５６、配列番号４の５８０〜６４３、配列番号５の５７７〜６４０、配列番号１０の５８７〜６５０、配列番号１１の５８０〜６４３、配列番号２９の５６６〜６２８、配列番号３４の５８５〜６４７、配列番号３６の５７０〜６３２、配列番号３７の５７６〜６３９、配列番号３８の５９３〜６５５、配列番号４１の６０４〜６６７、配列番号４３の５８９〜６５２、配列番号４４の５６６〜６２８、配列番号４５の５９０〜６５３、配列番号４８の５７４〜６３７、配列番号５３の５８４〜６４６、または配列番号５４の５７０〜６３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項５】
配列番号２、６、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４６、４７、４９、５０、５１、または５２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項６】
配列番号１の１〜５７７、配列番号３の１〜５９２、配列番号４の１〜５７９、配列番号５の１〜５７６、配列番号１０の１〜５８６、配列番号１１の１〜５７９、配列番号２９の１〜５６５、配列番号３４の１〜５８４、配列番号３６の１〜５６９、配列番号３７の１〜５７５、配列番号３８の１〜５９２、配列番号４１の１〜６０３、配列番号４３の１〜５８８、配列番号４４の１〜５６５、配列番号４５の１〜５８９、配列番号４８の１〜５７３、配列番号５３の１〜５８３、または配列番号５４の１〜５６９のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項７】
配列番号１、３〜５、１０、１１、２９、３４、３６〜３８、４１、４３〜４５、４８、５３、および５４からなるリストから選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項８】
７００アミノ酸未満、例えば６９０アミノ酸未満、例えば６８０アミノ酸未満、例えば６７０アミノ酸未満、例えば６６０アミノ酸未満、例えば６５０アミノ酸未満、例えば６４０アミノ酸未満、例えば６３０アミノ酸未満、例えば６２０アミノ酸未満、例えば６１０アミノ酸未満、例えば６００アミノ酸未満、例えば５９０アミノ酸未満、例えば５８０アミノ酸未満、例えば５７０アミノ酸未満の長さを有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項９】
実質的に純粋である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下に約１００ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項１１】
組換えタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項１２】
非グリコシル化体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントを生産するための方法であって、請求項１６に記載の細胞を適当な成長培地中、ポリヌクレオチドコンストラクトの発現を可能にする条件下で培養し、その結果生じたタンパク質フラグメントを培養培地から回収することを含む、方法。
【請求項１８】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと、治療用または診断用エフェクター部分、例えば細胞毒性部分、蛍光ラベル、および／または放射性ラベルとを含む、コンジュゲートまたは融合タンパク質。
【請求項１９】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントであるか、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメントを含む、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
細胞毒性部分が、カリケアマイシン、オーリスタチン、ドキソルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン、メトトレキサートおよびそれらの誘導体、細胞毒性タンパク質、例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシン毒素、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、ならびにそれらの機能的変異体、フラグメント、および組み合わせから選択される、請求項１８または１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
細胞毒性部分が、天然化合物から誘導されたものではない合成化学毒素である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
該ラベルが、蛍光色素および金属、発色性色素、化学発光性化合物および生物発光性タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群より選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
治療用または診断用エフェクター部分が抗炎症剤である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
治療用または診断用エフェクター部分が、ＣＳＰＧ４、ＣＤ４４、または限定するわけではないが表１に記載のプロテオグリカンによって例示される他のプロテオグリカンである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、請求項１３に記載の抗体、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、組成物。
【請求項２６】
医薬または診断剤として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、請求項１３に記載の抗体、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
診断において使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、請求項１３に記載の抗体、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項２９】
生物学的試料中の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを検出するための方法であって、
ａ）生物学的試料を取得すること；
ｂ）該生物学的試料を請求項１３に記載の抗体と接触させること；および
ｃ）該抗体と該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体が、もし存在すれば、それを、該試料における該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートの存在の指標として検出すること
を含む、方法。
【請求項３０】
医薬を調製するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３１】
例えばがん、関節炎、関節症、多発性硬化症、および神経損傷後の治癒、軟骨修復、創傷治癒において、ならびに乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）を伴う状態に関連する任意の適応症を処置するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
該がんが、癌（例えば、限定するわけではないが、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、精巣癌、基底細胞皮膚癌、明細胞腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、外陰角化型扁平上皮癌および外陰基底細胞癌）、肉腫（例えば、限定するわけではないが、線維肉腫、脱分化型軟骨および脂肪肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、粘液性脂肪肉腫、子宮体部平滑筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫、滑膜肉腫、孤立性線維性腫瘍）、造血器がん（例えば、限定するわけではないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および大顆粒性リンパ腫）、神経上皮組織の腫瘍、例えば限定するわけではないが星状細胞種（多形性黄色星状膠細胞腫、原線維性星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢腫瘍、乏突起星細胞腫、神経膠肉腫、神経節膠腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、神経芽細胞腫（感覚神経芽腫および神経節芽細胞腫）、髄芽腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍およびあらゆるタイプの神経内分泌がん、ならびに他の任意のＣＳＡ発現がんを含む、全てのＣＳＡ発現悪性疾患から選択される、請求項３１に記載のタンパク質フラグメント。
【請求項３３】
例えばがん、関節炎、関節症、多発性硬化症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチ、軟骨修復または創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態において、または乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する任意の適応症を処置するための方法であって、治療有効量または予防有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
例えばがん、多発性硬化症、関節炎、関節症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチ、軟骨修復もしくは創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態において、または乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する適応症または状態の発生を防止するための方法であって、治療有効量または予防有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有する、核酸プローブ。
【請求項３６】
ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する適応症または状態、例えば悪性疾患、関節炎、関節症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチもしくは創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態、またはがん疾患、例えば脳腫瘍、肝腫瘍および生殖器官の腫瘍の診断および／または予後のための、体液、例えば血液、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、リンパ液、胃液、胸水、軟骨液、精子、および／または組織中のバイオマーカーとしての、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３７】
対象の免疫化のための、例えばワクチンにおける、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項２４に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３８】
ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞を単離するための、ターゲティング部分としての、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項２４に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項３９】
生物学的試料中の、ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞、例えばがん幹細胞または循環がん細胞（ＣＴＣ）を単離および／または検出するための方法であって、
ａ）ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞を含む生物学的試料を取得すること；
ｂ）該生物学的試料を、場合によっては固形支持体にカップリングされた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させること；および
ｃ）該ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞と該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体を精製、単離および／または検出すること
を含む、方法。
【請求項４０】
悪性腫瘍に呼応する、体液、例えば血液、血漿、尿、脊髄液、胸膜滲出液、関節液、骨髄、精液、精子、前立腺液、糞便、胃液、唾液、眼液、肺吸引液、およびリンパ液中の、上昇したＣＳＡレベルを検出するための診断方法であって、該体液を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させるステップ、および該体液中のＣＳＡによって形成された複合体を検出するステップを含む、方法。
【請求項４１】
生物学的試料中のＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを精製するための方法であって、
ａ）ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを含む生物学的試料を取得すること；
ｂ）該生物学的試料を、場合によっては固形支持体にカップリングされた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させること；および
ｃ）該ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンと該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体を精製または単離すること
を含む、方法。
【請求項４２】
他の任意の適切な抗癌剤と組み合わされた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡの最小結合フラグメントを含む機能的結合フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡの前記結合フラグメントに対する抗体、ＶＡＲ２ＣＳＡの前記フラグメントをコードする核酸、ならびにそれらの生産方法に関する。さらに本発明は、最小結合フラグメントを含むＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのコンジュゲートおよび融合タンパク質、ならびにそれらの使用、特にコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）の発現（例えばコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）の不適切な発現）に関連する状態の処置における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテオグリカンは、１つ以上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖にコンジュゲートされたタンパク質である。これらのタンパク質は、細胞内部、細胞膜上、および細胞外マトリックスに分布して、さまざまな機能、すなわち軟骨マトリックス形成；組織の構造的編成；基底膜の編成；分泌小胞の役割の調節；サイトカイン、ケモカイン、成長因子、およびモルフォゲンの結合；プロテアーゼ受容体およびプロテアーゼインヒビター；補助受容体、チロシン−キナーゼ型成長因子受容体；エンドサイトーシス受容体としての機能を果たし、細胞付着、細胞間相互作用、および細胞運動性ならびに細胞遊走を助長する。
【０００３】
マラリア寄生虫である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、その複雑な生活環のほとんど全てのステージにおいて、宿主細胞プロテオグリカンを利用する。スポロゾイトは、高硫酸化ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と相互作用する表面発現スポロゾイト周囲タンパク質を介して、肝臓中の幹細胞に感染する。赤血球のメロゾイト感染は、グリコホリンＡ上のシアル酸に結合するＥＢＡ−１７５によって媒介される。加えて、宿主内皮接着を媒介するいくつかの熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＰｆＥＭＰ１）タンパク質は、グリカン結合性であると記述されている。その一つがＶＡＲ２ＣＳＡであり、これはＰｆＥＭＰ１タンパク質ファミリーのユニークなメンバーである。ＶＡＲ２ＣＳＡは、胎盤の絨毛間腔において、プロテオグリカン、いわゆるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）に取り付けられた珍しい低硫酸化型のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に、高いアフィニティで結合する。ＶＡＲ２ＣＳＡは熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（ＩＥ）の表面に発現する大きなマルチドメインタンパク質（３５０ｋＤａ）であり、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ相互作用は、胎盤マラリア（ＰＭ）における胎盤特異的ゼクエストレーション（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）の原因である。重要なことに、ＦＣＲ３型および３Ｄ７型寄生虫由来の組換え完全長ＶＡＲ２ＣＳＡエクトドメインは、低ナノモル濃度域のＣＳＡに対してアフィニティを示している。
【０００４】
ＣＳＡはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のファミリーに属し、ＧＡＧは、プロテオグリカンに取り付けられた、アミノ糖残基とヘキスロン酸残基とが交互する線状ポリマーである。ＧＡＧには、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳまたはＣＳＢ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびヘパリンを含む、いくつかのタイプがある。これらのＧＡＧの多糖主鎖は単純であるが、硫酸化およびウロン酸のエピマー化などといった修飾には、かなりの多様性が生じる。これが、異なるＧＡＧのドメイン構造および生物学的活性の幅広い多様性の根拠である。
【０００５】
ＣＳは、成長ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子など、数多くの重要な因子と相互作用し、構造安定化、細胞質分裂、細胞増殖、分化、細胞遊走、組織形態形成、器官形成、感染、および創傷修復に関与すると考えられている。ＣＳ鎖はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基とグルクロン酸残基との交互ユニットから構成される。グルクロン酸はそのＣ２位が硫酸化可能であり、ＧａｌＮＡｃはＣ４および／またはＣ６が硫酸化されうるので、さまざまな二糖ユニットを生じうる。糖主鎖のさまざまな修飾は、ＣＳ鎖の構造的および機能的不均一性を可能にする。胎盤接着性熱帯熱マラリア原虫寄生虫は、ＧａｌＮＡｃのＣ４だけが硫酸化されている低硫酸化ＣＳＡと特異的に会合する。
【０００６】
初期の研究では、ＣＳＡが胎盤におけるＩＥゼクエストレーションの原因であると、核心を衝く指摘がなされた。しかし特異的受容体はわからなかった。さらなる研究により、ヒト胎盤は３つの異なるタイプのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を含有しているが、絨毛間腔ではＩＥが低硫酸化ＣＳＰＧに特異的に接着することが見出された。このタイプのＣＳＰＧに特有なことは、二糖ユニットの２〜８％しかＣ４硫酸化されていないことである。ＣＳＡの具体的構造要件を同定しようとする付随の研究において、ＣＳＰＧへの寄生虫の接着は、３０〜５０％のＣ４硫酸化を含んでいて残り５０〜７０％の二糖ユニットが非硫酸化型であるＣＳＡによって阻害されることが見出された。ＣＳＡにとっての最小結合阻害要件は、最低２〜３個または４〜５個のＣ４硫酸化二糖ユニットを含有するる１２糖（６個の二糖）であることが示された。
【０００７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）は、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）または黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＳＣＰ）とも呼ばれ、黒色腫細胞によって発現されることが示されている細胞表面プロテオグリカンである。
【０００８】
ＣＳＰＧ４／ＭＳＣＰ／ＨＭＶ−ＭＡＡは、タンパク質主鎖上にＣＳ鎖を有することを特徴とする大きなプロテオグリカンである。これらのＣＳ鎖の硫酸化は、主にＧａｌＮＡｃのＣ４で起こっていると思われるが（ＣＳＡ）、硫酸化度はわかっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の目的
本発明の実施形態の目的は、コンドロイチン硫酸グリカンのターゲティングおよび／または検出に適したＶＡＲ２ＣＳＡの最小機能的結合フラグメントを提供することである。本発明の実施形態の別の目的は、コンドロイチン硫酸グリカン（例えばＣＳＡ）の発現（例えば不適切な発現）に関連する状態を処置するための方法であって、コンドロイチン硫酸グリカンの発現（例えば不適切な発現）を有する組織または細胞をターゲットとし、かつ／または検出するために、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのフラグメントが、単独で、またはコンジュゲートもしくは融合タンパク質の一部として使用される方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡが、一定のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに高いアフィニティおよび特異性で結合するその能力を、ポリペプチド配列の最小構造要素に保持していることを見出した。より重要なことに、本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、高い特異的アフィニティでがん細胞およびがん組織に結合することを見い出し、この結合は、がん細胞の表面または周囲の細胞外マトリックスに発現したコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとの特異的相互作用によるものであると、本発明者らは考えている。したがって本発明者らは、この特定タイプのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが大量に、または他の形で発現している、例えば不適切に発現している、がん細胞または他の組織のターゲティングに、この特異的な高アフィニティ結合を使用することを提案する。
【００１１】
そこで、第１の態様において、本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントであって、
ａ）ＩＤ１、および
ｂ）ＤＢＬ２Ｘｂ、ならびに場合によっては
ｃ）ＩＤ２ａ
の連続するアミノ酸配列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなるフラグメントに関する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントが、ＩＤ２ａを含む。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、ａ）ＩＤ１、およびｂ）ＤＢＬ２Ｘｂ、ならびに場合によってはｃ）ＩＤ２ａの連続するアミノ酸配列からなるＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が、完全長ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドには結合しない。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、ａ）ＩＤ１、およびｂ）ＤＢＬ２Ｘｂ、ならびに場合によってはｃ）ＩＤ２ａの連続するアミノ酸配列からなるＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、ストリンジェントな条件下でそのような核酸配列にハイブリダイズする能力を有する核酸プローブに関する。
【００１５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明の単離された核酸分子を含むベクターに関する。
【００１６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明の単離された核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のタンパク質フラグメントを生産するための方法であって、ここに定義する細胞を適当な成長培地中、ポリヌクレオチドコンストラクトの発現を可能にする条件下で培養し、その結果生じたタンパク質フラグメントを培養培地から回収することを含む方法に関する。
【００１８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと、治療用または診断用エフェクター部分、例えば細胞毒性部分、蛍光ラベル、および／または放射性ラベルとを含む、コンジュゲートまたは融合タンパク質に関する。
【００１９】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含むコンジュゲート、融合またはキメラタンパク質には、ここに定義する任意のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを使用することができると理解すべきである。したがってこの態様は最小結合フラグメントの使用に限定されない。このことは、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドという用語が使用される場合はいつでも当てはまり、したがって、医学的処置、ターゲティングまたは診断に使用される場合には、等しく該当する。
【００２０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ここに定義するタンパク質フラグメント、本発明の抗体、または本発明のコンジュゲートを含む組成物に関する。
【００２１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、医薬または診断剤として使用するための、ここに定義するタンパク質フラグメント、本発明の抗体、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートに関する。
【００２２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、診断において使用するための、ここに定義するタンパク質フラグメント、本発明の抗体、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートに関する。
【００２３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【００２４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、生物学的試料中の、ここに定義するタンパク質フラグメント、または本発明のコンジュゲートを検出するための方法であって、ａ）生物学的試料を取得すること；ｂ）該生物学的試料を本発明の抗体と接触させること；およびｃ）該抗体と該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体が、もし存在すれば、それを、該試料における該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートの存在の指標として検出することを含む方法に関する。
【００２５】
したがって、生物学的試料中のＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントのレベルを測定するための方法が提供される。これは、処置の一部として、または処置の進行をモニタリングするために、あるいは本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを生産する生産方法の一部として、使用し、応用することができる。
【００２６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、医薬を調製するための、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートの使用に関する。
【００２７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、例えばがん、関節炎、関節症、多発性硬化症、神経損傷後の治癒、軟骨修復、創傷治癒において、および乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）を伴う状態に関連する任意の適応症を処置するための、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートに関する。
【００２８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、例えばがん、関節炎、関節症、多発性硬化症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチ、軟骨修復もしくは創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態において、または乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する任意の適応症を処置するための方法であって、治療有効量または予防有効量の、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートを、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００２９】
さらにもう一つの態様において、本発明は、例えばがん、多発性硬化症、関節炎、関節症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチ、軟骨修復もしくは創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態において、または乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する適応症または状態の発生を防止するための方法であって、治療有効量または予防有効量の、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートを、そのような防止を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００３０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する適応症または状態、例えば悪性疾患、関節炎、関節症、神経損傷が引き起こす病理学的状態、リウマチまたは創傷治癒などにおける軟骨および瘢痕組織の状態、またはがん疾患、例えば脳腫瘍、肝腫瘍および生殖器官の腫瘍の診断および／または予後のための、バイオマーカーとしての、例えば血液、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、リンパ液、胃液、胸水、軟骨液（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）、精子などの体液、および／または組織におけるＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）を検出するためのツールとしての、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートの使用に関する。
【００３１】
ここで使用するバイオマーカーという用語は、ＣＳＡの発現（例えばＣＳＡの不適切な発現）に関連する適応症または状態の診断および／または予後の手段としてＣＳＡ発現を検出するために生物に導入された場合の、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、コンジュゲートおよび融合タンパク質の使用を指すものであると理解すべきである。
【００３２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、対象の免疫化のための、例えばワクチンにおける、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートの使用に関する。
【００３３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＣＤ４４および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞を単離するための、ターゲティング部分としての、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートの使用に関する。
【００３４】
［表１］ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドによってターゲティングされる可能性がある分子
【表１】
2018076333.tif 000002
【００３５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、生物学的試料中の、ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞、例えばがん幹細胞を単離するための方法であって、
ａ）ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞を含む生物学的試料を取得すること；
ｂ）該生物学的試料を、場合によっては固形支持体にカップリングされた、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートと接触させること；および
ｃ）該ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを発現する細胞と該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体を精製または単離すること
を含む方法に関する。
【００３６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、悪性腫瘍または不適切なＣＳＡ発現に関連する他の状態に呼応する、体液、例えば血液、血漿、尿、脊髄液、胸膜滲出液、関節液、骨髄、胃液、糞便、精液、精子、前立腺液、唾液、眼液（ｅｙｅ  ｆｌｕｉｄ）、肺吸引液（ｌｕｎｇ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、およびリンパ液中の、上昇したＣＳＡレベルを検出するための診断方法であって、該体液を、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートと接触させるステップ、および該体液中のＣＳＡによって形成された複合体を検出するステップを含む方法に関する。
【００３７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、生物学的試料中のＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを精製するための方法であって、
ａ）ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンを含む生物学的試料を取得すること；
ｂ）該生物学的試料を、場合によっては固形支持体にカップリングされた、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートと接触させること；および
ｃ）該ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他の任意のプロテオグリカン、例えば表１に列挙するプロテオグリカンと該タンパク質フラグメントまたはコンジュゲートとの複合体を精製または単離すること
を含む方法に関する。
【００３８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、他の任意の適切な抗癌剤と組み合わされた、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な開示
本発明は、マラリアタンパク質、いわゆるＶＡＲ２ＣＳＡの一部分が、がん特異的抗原および細胞外ＣＳＰＧに、極めて高い特異性および極めて高い結合強度で結合することができるという事実に基づく。
【００４０】
ＶＡＲ２ＣＳＡは、もっぱら、妊婦の胎盤においてプロテオグリカン（ＣＳＰＧ）に取り付けられた低硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）への、寄生虫の接着を媒介する。組換えタンパク質は、かつてない高いアフィニティおよび特異性で、ＣＳＡに結合することが示されている。これは、荷電した硫酸基に依存するだけでなくＣＳ主鎖にも依存するＣＳＡとの相互作用によるものであるだろう。本発明者らは、胎盤中に存在するＣＳが、がん幹細胞を含むさまざまながん細胞上に提示されるＣＳと極めて似ていることを想起する。これは、ＶＡＲ２ＣＳＡを発現するマラリア寄生虫がＣ３２黒色腫細胞上のＣＳＡおよびヒト脳がん細胞に特異的に接着するという事実によって実証される。
【００４１】
したがって本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡ組換えタンパク質と低硫酸化ＣＳＡとの間の高いアフィニティおよび特異性に依拠している。このタンパク質にタグ付けすることにより、本発明を、インビボでの転移の追跡や、転移性疾患を診断することを含む、広範囲にわたる応用例に使用することができる。ＶＡＲ２ＣＳＡをアポトーシス試薬または細胞毒性試薬にカップリングすることにより、がん細胞およびがん幹細胞を特異的にターゲティングし、それらを排除するために、本発明を使用することができる。ＶＡＲ２ＣＳＡ組換えタンパク質を使った簡単な治療により、ＣＳＡの活性を中和し、それによってＣＳＡ発現がん細胞の腫瘍発生および／または転移を阻害することが可能であるだろう。ＣＳＡは、いくつかのタンパク質主鎖上に、例えばＣＳＰＧ４、ＣＤ４４、バイグリカン、デコリン、バーシカン、アグリカン（軟骨中の主要ＣＳＰＧ）、パーレカン、シンデカン、および表１に列挙する他のタンパク質上に、存在することができる。
【００４２】
本発明は、とりわけ、黒色腫細胞の表面にＣＳＡ鎖を伴うＣＳＰＧ４を持つ皮膚、眼内および結膜黒色腫を含む悪性黒色腫がんに関連すると考えられる。このＧＡＧ鎖は有糸分裂および転移に関与すると思われる。しかしＣＳＰＧ４は黒色腫に特有ではない。ヒト組織および細胞株の大きなパネルからのデータに対して本発明者らが行ったマイクロアレイおよび組織アレイ解析により、ＣＳＰＧ４および他のタイプのＣＳＡ含有プロテオグリカンは、３つの細胞胚葉（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ）の全てに由来する広範ながんタイプ上に存在しうることが示唆される。これらのがんタイプには、癌（乳癌、膵癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、精巣癌、基底細胞皮膚癌、明細胞腎細胞癌、角化型（ｋｒｅａｔｉｎｚｅｄ）頭頸部扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、外陰角化型扁平上皮癌および外陰基底細胞癌）、肉腫（胸部脂肪肉腫、線維肉腫、脱分化型軟骨および脂肪肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、粘液性脂肪肉腫、子宮体部平滑筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫）、造血器がん（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および大顆粒性リンパ腫）、神経上皮組織の腫瘍、例えば星状細胞腫（多形性黄色星状膠細胞腫、原線維性星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｒｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、脳室上衣腫、脈絡叢腫瘍（ｃｈｏｒｏｉｄ  ｐｌｅｘｕｓ  ｔｕｒｍｏｒ）、乏突起星細胞腫、神経膠肉腫、神経節膠腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、神経芽細胞腫（感覚神経芽腫および神経節芽細胞腫）、髄芽腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍およびあらゆるタイプの神経内分泌がんが含まれる。
【００４３】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）は、眼を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞外マトリックスおよび関節軟骨の細胞外マトリックスの重要な構成要素も構成する。細胞外ＣＳＰＧは関節炎の病理発生と神経損傷後の再生の欠如に決定的に関与する。細胞外ＣＳＰＧの喪失は関節炎および関節症の発生にとって不可欠であり、細胞外ＣＳＰＧの局所濃度が高ければ、神経損傷後の神経伸長が妨げられる。
【００４４】
ＶＡＲ２ＣＳＡ組換えタンパク質を使用することができるのは、がんで起こるような悪性成長に関連する適応症の処置だけではない。細胞外環境におけるＣＳＰＧ存在量を増加または減少させるための治療は、関節炎、関節症を処置するために使用することができ、多発性硬化症を含む神経突起損傷後の神経回復を強化するためにも使用することができる。これらの戦略のために、本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡを、直接インヒビターとして使用するか、または患部組織にＣＳＰＧ代謝を変化させる薬物をターゲティングし、維持する分子として、使用することができると考えている。
【００４５】
本発明者らは、胎盤の絨毛間腔中のＣＳＡに１０ｎＭ未満のアフィニティで結合するマラリアタンパク質を同定した。完全長ネイティブＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質の特性と類似する特性でＣＳＡに結合する、より小さなＶＡＲ２ＣＳＡの組換え部分が、高い収率で生産された。組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質は、他のＣＳ、例えばコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ６Ｓ）または高硫酸化ＧＡＧ、例えばヘパラン硫酸（ＨＳ）に結合しない。Ｓ２細胞、Ｔ．Ｎｉ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＢＬ２１およびＳｈｕｆｆｌｅ細胞（商標）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む大腸菌株などといったさまざまな発現系において、ＣＳＡに高いアフィニティで結合するように、組換えタンパク質を作製することができる。
【００４６】
本発明者らは、ＣＳＡに極めて高いアフィニティ（ｎＭ）および高い特異性で結合する単一の小さな（７５ｋＤａ）抗原も同定した。表３（実施例２参照）に、バイオセンサー技術を使って解析したＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質の全てのＣＳＡアフィニティを列挙する。
【００４７】
本発明者らは、このＶＡＲ２ＣＳＡ組換えタンパク質が、皮膚黒色腫（Ｃ３２、ＭｅＷｏ）、肺癌（Ａ５４９）、乳癌（ＨＣＣ１３９５）、骨肉腫（ｏｓｔｅｒｏｓａｒｃｏｍａ）（Ｕ２ＯＳ、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ）、横紋筋肉腫（ＲＨ３０）および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（表４および表５）を含む広範ながん細胞株に、低い濃度で強く結合することを示した。対照分子として、分子のＣ末端部分の１５１アミノ酸が切断されていることを除けば最小結合性ＶＡＲ２ＣＳＡコンストラクトと同一であるもう一つのＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質を使用した。この切断によってＣＳＡ結合性が取り除かれる。組換えＶＡＲ２ＣＳＡは、全てのＣＳＰＧ４発現細胞株、およびＣＳＡ鎖を有する他のＣＳＰＧ分子を発現するがん細胞株（例えばＴ細胞性リンパ腫）に結合する。組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質は、ヒト赤血球および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とは相互作用できない（表４）。
【００４８】
本発明者らは、マラリア寄生虫が、おそらくはＣＳＰＧ４とＶＡＲ２ＣＳＡとの間の特異的相互作用によって、Ｃ３２黒色腫細胞に接着することを、ここに示す。したがって、組換えＶＡＲ２ＣＳＡおよびそのコンジュゲートは、さまざまながん細胞上のＣＳＡをターゲットとする治療化合物として使用することができると考えられる。
【００４９】
他の現行治療法との比較で、ＶＡＲ２ＣＳＡを使ってがん細胞上のＣＳＡをターゲットとすることの利点は、数多い：
１）ＶＡＲ２ＣＳＡとＣＳＡとの間の相互作用は、かつてない高いアフィニティを有し、高度に特異的である。
２）ＶＡＲ２ＣＳＡは進化的に洗練されたマラリアタンパク質であり、それゆえに、治療が寛容性を破って患者の自己免疫反応を引き起こす可能性は低い。
３）ＶＡＲ２ＣＳＡはよく特徴づけられた安定なタンパク質であり、大規模タンパク質生産に適合する生物において大量に発現させることができる。
４）ＶＡＲ２ＣＳＡはいくつかの血清型（ｓｅｒｏｖａｒｉａｎｔ）を持つ多形タンパク質である。反復治療は、中和抗体による問題を避けるために異なる血清型によって施行することができるだろう。
５）ＶＡＲ２ＣＳＡはもともと熱帯熱マラリア原虫感染赤血球上で細胞外に露出しているので、ヒト血清中では本質的に安定なタンパク質であり、プロテアーゼ耐性は高いことが示されている。
【００５０】
本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡとＣＳＡとの間の相互作用に焦点を当てている。この相互作用は高アフィニティ相互作用であり、主な用途はＣＳＡ発現がん細胞のターゲティングである。
【００５１】
ＣＳＡは、他の疾患および病理学的状態、例えば関節炎、関節症、多発性硬化症および神経損傷後の治癒、軟骨修復、創傷治癒などにも、また乾癬にも関与しうる。したがってＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、そのような疾患または状態のいずれの処置にも使用することができる。
【００５２】
加えて、ＶＡＲ２ＣＳＡとＣＳＡとの間の相互作用は、生物工学的ツールとして、例えばタンパク質精製および細胞選別アッセイなどに使用することができる。
【００５３】
したがって本発明者らは、本発明の用途をいくつか考えている：
１）トレース可能な組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、がん患者における腫瘍および転移を追跡するために使用することができる。
２）組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、がん細胞におけるＣＳＡ活性を直接ターゲティングし中和するために使用することができる。
３）組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲート、例えば細胞毒性分子にカップリングされたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、ＣＳＡ陰性組織への有害な毒性を最小限に抑えつつ、がん細胞をターゲットとするために使用することができる。
４）タグ付き組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、がん細胞上のＣＳＡを調べる研究ツールまたは臨床開発ツールとして使用することができる。
５）タグ付き組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、生物工学および生命科学においてＣＳＡ陽性細胞を選別するためのアッセイに使用することができる。これは、それをがん幹細胞などのＣＳＰＧ４発現細胞を精製するために使用することができるように、そして効率のよい新規な生物工学ツールが得られるように、組換えＶＡＲ２ＣＳＡを樹脂にカップリングすることによって行うことができるだろう。
６）ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、自家移植の一部として、がん細胞などのＣＳＰＧ４発現細胞のインビトロ枯渇に使用することができる。
７）ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは抗ＣＳＰＧ４ワクチンに使用することができるだろう。動物をＣＳＰＧ４−ＶＡＲ２ＣＳＡ複合体またはコンジュゲートで免疫化することにより、ＶＡＲ２ＣＳＡは、ＣＳＰＧ４に対する寛容を破ることを目的とするＣＳＰＧ４に対する免疫応答のための担体およびエンハンサーとして作用するかもしれない。
８）ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、悪性腫瘍に呼応する、体液（すなわち、尿、脊髄液、胸膜滲出液、関節、骨髄、およびリンパ液）中の増加したＣＳＡレベルのモニタリングに使用することができるだろう。これは、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが低硫酸化ＣＳＡに対する特異性を有し、増加した非硫酸化ＣＳ（Ｃ０Ｓ）の比率の関数として腫瘍の進行を検出することができるだろうという事実に基づいている。
９）ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、関節炎および関節症の処置において使用することができるだろう。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、関節炎および関節症において、プロテアーゼが媒介するアグリカンの分解をブロックするか、それをブロックする薬物をターゲティングすることができるだろう。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、患部組織に抗炎症薬をターゲティングするため、ならびにＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５インヒビターなどのインヒビターを送達するためにも、使用することができる。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、軟骨細胞によるアグリカンの生産を刺激する薬物をターゲティングするために使用することができるだろう。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドにカップリングされたアグリカンの反復ｉ．ｖ．注射は、アグリカンに対する寛容を誘導するために使用することができるだろう。
１０）ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートは、神経組織中の細胞外ＣＳＰＧに結合することにより、例えばチロシンホスファターゼ−シグマ受容体を介したシグナリングをブロックすることによって、神経突起伸長に対するＣＳＰＧの効果を不活化することができるだろう。ＶＡＲ２ＣＳＡペプチドは、患部神経組織においてＣＳＰＧを分解するかＣＳＰＧ生産を阻害する薬物をターゲティングすることができるだろう。例えば、次に挙げる薬物をＶＡＲ２ＣＳＡにカップリングすることが考えられるだろう：ＣＳＰＧ分子のタンパク質コアの糖鎖を切断するコンドロイチナーゼＡＢＣ、またはＣＳＰＧ生産を低減するキシロシド（ｘｙｌｏｃｉｄｅｓ）、またはＣＳＰＧ生産にとって重要な酵素、例えばコンドロイチンシンターゼもしくはコンドロイチン重合化因子を阻害する薬物。そのような薬物の例として、４−フルオロ−グルコサミン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロキシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｘｙｌｏｘｉｄｅ）、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。
１１）ＡＤＡＭＴＳ４の生産を刺激し、次にそれがＣＳＰＧを切断することになる、ＩＬ１−αなどのサイトカインをターゲティングし、維持するためにも、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはコンジュゲートを使用することができるだろう。
１２）がん細胞上のＣＳＰＧ４発現は薬物耐性に影響を及ぼしうる。多くの患者における腫瘍は、通常、最初は治療に応答するが、時間が経つと、化学療法抵抗性が発生し、がんが進行する。ＣＳＰＧ４発現は多剤耐性に関連し、これは、ＣＳＰＧ４発現と、ＰＩ３Ｋ経路のインテグリン誘発性活性化との関連によって媒介される。がん細胞上のＣＳＰＧ４をターゲットとする組換えＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、化学療法抵抗性を低減しまたは妨害することができるので、例えばＢＲＡＦＶ６００ＥインヒビターであるＰＬＸ４０３２との併用療法に使用することができるだろう。
【００５４】
定義
本明細書において使用する用語「ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）と相互作用する熱帯熱マラリア原虫が発現し、配列番号５５もしくは配列番号５６の配列を有することを特徴とする、特殊な赤血球膜タンパク質１（ＰｆＥＭＰ１）タンパク質の細胞外部分、またはプロテオグリカン（ＣＳＰＧ）上に提示されうるコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に結合する能力を持つそのフラグメントもしくは変異体を指す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、少なくとも、ａ）ＩＤ１とｂ）ＤＢＬ２Ｘｂの連続するアミノ酸配列からなるＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、少なくとも、ａ）ＩＤ１とｂ）ＤＢＬ２Ｘｂとｃ）ＩＤ２ａの連続するアミノ酸配列からなるＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントを含む。
【００５７】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの定義には、Ｓａｌａｎｔｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏ  ２００３  Ｊｕｌ；４９（１）：１７９−９１、Ｋｈｕｎｒａｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０  Ａｐｒ  ２；３９７（３）：８２６−３４、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１０  Ｍａｒ  １６；１０７（１１）：４８８４−９、Ｄａｈｌｂａｅｃｋ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１  Ｍａｙ  ６；２８６（１８）：１５９０８−１７、またはＳｒｉｖａｓｔａｖａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１１；６（５）：ｅ２０２７０に記載のポリペプチドが包含される。
【００５８】
本明細書において使用する用語「ＩＤ１」は、配列番号１の１〜１５２によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有することを特徴とするＶＡＲ２ＣＳＡのドメインを指す。
【００５９】
本明細書において使用する用語「ＤＢＬ２Ｘｂ」は、配列番号１の１５３〜５７７によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有することを特徴とするＶＡＲ２ＣＳＡのドメインを指す。
【００６０】
本明細書において使用する用語「ＩＤ２ａ」は、配列番号１のアミノ酸５７８〜６４０のＮ末端から少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、または少なくとも６２個、例えば６３個の連続アミノ酸（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）のアミノ酸配列を有することを特徴とし、そのような連続アミノ酸の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つ、ＶＡＲ２ＣＳＡのドメインを指す。
【００６１】
いくつかの実施形態において、配列番号１〜７５によって同定されるいずれか一つの配列またはそのフラグメントの少なくとも７０％と本明細書にいうアミノ酸配列同一性は、この配列に対して少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を持つ配列を指す。
【００６２】
本明細書において使用する用語「変異体」（ｖａｒｉａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔｓ）は、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列を有するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または配列番号１〜５４のアミノ酸配列を含むＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのフラグメントであって、そのフラグメントまたは変異体は、プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）上のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に結合する能力を保持しており、１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換され、かつ／または１つ以上のアミノ酸が除去され、かつ／または１つ以上のアミノ酸がポリペプチド中に挿入され、かつ／または１つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加されているものを指す。  そのような付加は、Ｎ末端にも、Ｃ末端にも、その両方にも行うことができる。この定義に包含される「変異体」（ｖａｒｉａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔｓ）は、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に結合することができるという点で、依然として機能的活性を有している。いくつかの実施形態では、変異体が、配列番号１〜７５の配列、例えば配列番号１、３〜５、１０、１１、２９、３４、３６〜３８、４１、４３〜４５、４８、５３〜５６、６０〜７０、７２〜７５の配列と、少なくとも７０％、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する。
【００６３】
本明細書において使用する「機能的変異体」、「機能的フラグメント」および「機能的誘導体」という表現は、配列番号５５または配列番号５６の変異体、フラグメント、切断型、ならびに誘導体、例えば配列番号１、３〜５、１０、１１、２９、３４、３６〜３８、４１、４３〜４５、４８、５３〜５６、６０〜７０、７２〜７５ののいずれか一つを指し、そのポリペプチドは、配列番号５５または配列番号５６の本質的結合配列部分を含み、少なくとも、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に結合する能力を保有している。ＶＡＲ２ＣＳＡの機能的変異体または機能的フラグメントは、変異体および／またはフラグメントおよび／または誘導体であることから選択される２つまたは３つの特徴を有しうると理解すべきである。
【００６４】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの機能的変異体または機能的フラグメントには、本明細書に記載するアッセイで試験した場合に、同じ細胞タイプにおいて生産された野生型ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの結合アフィニティの少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約９０％を呈するものが包含される。
【００６５】
本明細書において使用する用語「免疫性フラグメント」（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、あるアミノ酸配列のフラグメントであって、抗体に認識されるべく、本質的に同じ機能的活性と、同じ空間的配向とを保有しているものを指す。したがって特異的抗体は、ポリペプチドとその免疫性フラグメントとの両方に結合するであろう。
【００６６】
本明細書において使用する用語「別のアミノ酸」とは、その位置にもともと存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸を意味する。これには、ポリヌクレオチドによってコードされうるアミノ酸が含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、その異なるアミノ酸が天然Ｌ型であり、ポリヌクレオチドによってコードされうる。
【００６７】
本明細書において使用する用語「誘導体」とは、配列番号５５または配列番号５６によって同定される野生型ＶＡＲ２ＣＳＡまたはそのフラグメントと比較して、実質的に同じかまたは改良された生物学的活性を呈するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドであって、例えばアルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって親ペプチドのアミノ酸の１つ以上が化学修飾されているものを示すものとする。
【００６８】
用語「コンストラクト」は、ポリヌクレオチドセグメントを示すものとし、このポリヌクレオチドセグメントは、目的のポリペプチドをコードする完全なまたは部分的な天然のヌクレオチド配列に基づきうる。コンストラクトは、場合によっては、他のポリヌクレオチドセグメントを含有してもよい。同様に、「ポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされうるアミノ酸」という用語は、上に定義したポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされうるアミノ酸、すなわちＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｎなどのアミノ酸を包含する。
【００６９】
本明細書において使用する用語「ベクター」は、宿主細胞中で増幅する能力を有する任意の核酸実体を意味する。したがってベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外実体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいはベクターは、宿主細胞中に導入された時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製するものであってもよい。ベクターの選択は、多くの場合、それを導入しようとする宿主細胞に依存するであろう。ベクターには、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスまたはコスミドベクターなどがあるが、これらに限るわけではない。ベクターは通常、複製起点と、少なくとも１つの選択可能遺伝子、すなわち容易に検出することができる産物または細胞の成長にとってその存在が不可欠である産物をコードする遺伝子とを含有する。
【００７０】
本明細書において使用する用語「適当な成長培地」は、細胞の成長と本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドをコードする核酸配列の発現とに必要な栄養素および他の構成要素を含有する培地を意味する。
【００７１】
本発明に関して「処置」という用語は、例えばがんにおける、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）が関与する疾患、障害または状態の症状の防止、治癒および軽減を包含するものとする。したがって、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、コンジュゲートまたは誘導体の予防的投与および治療的投与は、「処置」という用語に包含される。
【００７２】
本明細書において使用する用語「対象」は、任意の動物、特に哺乳動物、例えばヒトを意味し、適宜、用語「患者」と可換的に使用することができる。
【００７３】
用語「配列同一性」は、当技術分野において知られているとおり、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係を指す。当技術分野において「同一性」とは、場合により、２つ以上のヌクレオチド残基または２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致数によって決定される、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の度合いも意味する。「同一性」では、２つ以上の配列の小さい方と、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアライメントとの完全一致のパーセントを（もしあれば）測定する。
【００７４】
用語「類似性」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、完全一致と保存的置換一致との両方を包含する配列の関係を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば分数１０／２０の同一アミノ酸を有し、残りは全て非保存的置換であったとすると、パーセント同一性とパーセント類似性は、どちらも５０％であるだろう。同じ例で、さらに５つの位置に保存的置換があったとすると、パーセント同一性は５０％のままだが、パーセント類似性は、７５％（分数１５／２０）になるだろう。それゆえに、保存的置換がある場合、２つのポリペプチド間の類似性の度合いは、それら２つのポリペプチド間のパーセント同一性より高くなる。
【００７５】
配列番号１〜５６、６０〜７０、および７２〜７５のアミノ酸配列に対する保存的修飾（およびそれをコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、天然ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのものと類似する機能的特徴および化学的特徴を有するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドをもたらすであろう。これに対して、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換領域における分子主鎖の構造、例えばシートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーション、（ｂ）ターゲット部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持することに関するその効果が著しく異なる、配列番号１〜５６、６０〜７０、および７２〜７５のアミノ酸配列中の置換を選択することによって、達成することができる。
【００７６】
例えば「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないような、非ネイティブ残基によるネイティブアミノ酸残基の置換を伴いうる。さらにまた、「アラニンスキャニング変異導入」について過去に記載されているように、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基をアラニンで置換することもできる（例えばアラニンスキャニング変異導入について考察しているＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．  ６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５：１−２４を参照されたい）。
【００７７】
望ましいアミノ酸置換は（保存的置換であれ非保存的置換であれ）、そのような置換が望まれる時に、当業者が決定することができる。例えばアミノ酸置換は、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの重要残基を同定するために、または本明細書に記載するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのアフィニティを増加もしくは減少させるために使用することができる。
【００７８】
天然残基は、共通する側鎖の性質に基づいて、複数のクラスに分類することができる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７９】
例えば非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーと別のクラスからのメンバーとの交換を伴いうる。そのような置換残基は、非熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと相同な熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの領域に、またはその分子の非相同領域に、導入することができる。
【００８０】
そのような改変を加える際には、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特徴に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられており、それらは次のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００８１】
相互作用する生物学的機能をタンパク質に付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野では理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１  （１９８２）。一定のアミノ酸で、類似するハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を置換することができ、それでもなお、類似の生物学的活性が保たれることは知られている。ハイドロパシー指数に基づいて改変を加える際には、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものは特に好ましく、±０．５以内のものはさらに好ましい。
【００８２】
創製される生物学的機能の等価なタンパク質またはペプチドが、この例と同様に、免疫学的実施形態での使用を意図するものである場合は特に、類似するアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行いうることも、当技術分野では知られている。隣接アミノ酸の親水性に支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性と（すなわちタンパク質の生物学的性質と）相関する。
【００８３】
アミノ酸残基には以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（’３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて改変を加える際は、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものは特に好ましく、±０．５のものはさらに好ましい。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００８４】
当業者は、周知の技法を使って、配列番号１〜７５に示すポリペプチドの適切な変異体を決定することができるであろう。活性を破壊せずに変化させることができる分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域をターゲットにすることができる。例えば、同じ種または異なる種に由来する類似の活性を持つ類似のポリペプチドが知られている場合、当業者は、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプチドと比較することができる。そのような比較により、分子の残基および部分であって、類似するポリペプチド間で保存されているものを同定することができる。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのうち、そのような類似ポリペプチドとの比較で保存されていない領域の変化が、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの生物学的活性および／または構造に悪影響を及ぼす可能性が少ないことは、理解されるであろう。たとえ比較的保存された領域であっても、活性を保ったまま化学的に類似するアミノ酸で天然の残基を置換しうることは、当業者にはわかるだろう（保存的アミノ酸残基置換）。それゆえに、生物学的活性または構造にとって重要でありうる領域でも、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に付すことができる。
【００８５】
加えて、活性または構造にとって重要な類似ポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を精査することもできる。そのような比較を考慮して、類似ポリペプチドにおいて活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドの、重要と予測されるそれらアミノ酸残基に対して、化学的に類似するアミノ酸置換を選択することができる。
【００８６】
当業者は、類似ポリペプチドの構造との関連において、三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。その情報を考慮して、当業者は、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測することができる。当業者は、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に根本的な改変を加えるような選択はできない、というのも、そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与しうるからである。さらにまた、当業者は、所望するアミノ酸残基のそれぞれに単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を生成させることができる。次に、それらの変異体を、本明細書に記載する活性アッセイを使ってスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体に関する情報を集めるために使用することができるだろう。例えば、特定アミノ酸残基への改変が、活性の破壊、活性の望ましくない低減、不適切な活性をもたらすことが見出されたとすると、そのような改変を持つ変異体は避けられることになるだろう。言い換えると、そのようなルーチン実験から集められた情報に基づいて、単独での、または他の変異との組み合わせでの、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を、当業者は容易に決定することができる。
【００８７】
二次構造の予測を扱っている科学的刊行物がいくつかある。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７  （１９９６），  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５  （１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２  （１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ４７：４５−１４８  （１９７８）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４  （１９７９）を参照されたい。さらにまた、現在では、二次構造の予測を支援するコンピュータプログラムを利用することができる。二次構造を予測する方法の一つはホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％より高い配列同一性または４０％より高い類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似する構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展により、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的フォールド数を含む二次構造の予測可能性は強化されている。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７  （１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質中のフォールドの数は限られていること、および構造の臨界数（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）が解明されていれば、構造予測の確度は劇的に向上することが、示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６  （１９９７））。
【００８８】
二次構造を予測する他の方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７−８７  （１９９７）；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５−９  （１９９６））、「プロファイル解析（ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４−１７０  （１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３：１４６−１５９  （１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４（１３）：４３５５−４３５８  （１９８７））、および「進化的リンケージ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、前掲およびＢｒｅｎｎｅｒ、前掲）などがある。
【００８９】
関連ポリペプチドの同一性と類似性は、既知の方法により、容易に算出することができる。そのような方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １」Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．編，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．編，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３  （１９８８）に記載されているものなどがあるが、これらに限るわけではない。
【００９０】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、一般に利用することができるコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  １２：３８７  （１９８４）；ウィスコンシン大学ェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージがあるが、これに限るわけではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源から一般に入手することができる（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ、メリーランド州２０８９４ベセスダ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用することができる。
【００９１】
２つのアミノ酸配列を整列させるための一定のアライメントスキームには、２つの配列の短い領域の一致だけをもたらすものがあり、そして、たとえ２つの完全長配列間に有意な関係がなくても、整列されたこの小さな領域が極めて高い配列同一性を有する場合がある。したがって好ましい実施形態では、選択したアライメント法（ＧＡＰプログラム）が、ターゲットポリペプチドの少なくとも５０個の連続アミノ酸をまたぐアライメントをもたらすであろう。
【００９２】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（ウィスコンシン大学ジェネティクス・コンピュータ・グループ、ウィスコンシン州マディソン）を使って、パーセント配列同一性を決定しようとする２つのポリペプチドを、各々のアミノ酸の最適な一致が得られるように整列させる（アルゴリズムによって決定される「一致区間（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）。ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは平均ダイアゴナル（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）の３倍として算出される；「平均ダイアゴナル」は使用する比較行列のダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」（ｄｉａｇｏｎａｌ）は、その比較行列によって各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（これは通常、ギャップ開始ペナルティの分数１／１０倍である）ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムと共に使用される。標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．  ５，  ｓｕｐｐ．３  （１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９：１０９１５−１０９１９  （１９９２）参照）も、アルゴリズムによって使用される。
【００９３】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータには、次に挙げるものがある：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：１０９１５−１０９１９  （１９９２）のＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２、ギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：４、類似性の閾（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０。
【００９４】
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータで有用である。上述のパラメータは（エンドギャップのペナルティなし（ｎｏ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）と共に）ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９５】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータには、次に挙げるものがある：
アルゴリズム：  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；比較行列：一致（ｍａｔｃｈ）＝＋１０、不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝０、ギャップペナルティ：５０、ギャップ長ペナルティ：３。
【００９６】
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータで有用である。上述のパラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９７】
他の例示的アルゴリズム、ギャプ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較行列、類似性の閾なども、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＰｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌバージョン９（１９９７年９月）に示されているものを含めて、使用することができる。為すべき選択は当業者には明白であるだろうし、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡなど、為すべき具体的比較や、比較が所与の配列ペア間で行われるのか（この場合はＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般に好ましい）、ある配列と大きな配列データベースとの間で行われるのか（この場合はＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）に依存するであろう。
【００９８】
本発明者らは、ＰＭの胎盤接着の背景にある分子機序に関する以下の基本的疑問に取り組み、ここにその答えを見出した：１）記載されたＣＳＡ接着の差異はＶＡＲ２ＣＳＡ配列に関係するか、２）ＣＳＡへのＶＡＲ２ＣＳＡ結合に関する正確な最小構造要件は何か、３）ＶＡＲ２ＣＳＡとＣＳＡとの間にはどんなタイプの化学的相互作用が存在するか、そして最後に４）この情報を最適なワクチン抗原の設計に利用することができるか。
【００９９】
同一のＦＣＲ３および３ｄ７  ＶＡＲ２ＣＳＡ切断物を発現させることにより、本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡが、寄生虫株起源とは無関係に、類似するアフィニティおよび特異性で、ＣＳＡに結合することを示した。これら２つの配列は７９．６％の配列同一性を有する。本発明者らはさらに、高いＣＳＡ結合アフィニティがいくつかの短いフラグメントでも保持されること、および隣接するドメイン間配列（ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ）からの小さな配列を含むＤＢＬ２Ｘは、高アフィニティＣＳＡ結合部位を含有するコンパクトなコアを形成することを実証する。インシリコで、本発明者らはＶＡＲ２ＣＳＡ中の推定ＧＡＧ結合部位を特定し、欠失および置換により、本発明者らは、これらの部位における変異がＣＳＰＧ結合に影響を及ぼさないことを示した。多価電解質−タンパク質相互作用の理論を使って、本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ相互作用がイオン相互作用だけに依存するのではないだろうということを示した。最後に本発明者らは、いくつかの短いＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントが、接着阻止抗体の生産を誘導する能力を有すること、および抗接着抗体が、提案されるＣＳＡ結合領域をターゲットとすることを示した。これらのデータは、ＰｆＥＭＰ１分子とそのリガンドとの間の相互作用の生化学的性質についての詳細な洞察を初めて提供するものである。
【０１００】
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドの調製
本発明は、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを調製する方法にも関係する。本明細書に記載する本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドは、組換え核酸技法を使って生産することができる。一般的には、クローニングされた野生型ＶＡＲ２ＣＳＡ核酸配列を、所望のタンパク質をコードするように修飾する。次に、この修飾配列を発現ベクターに挿入し、次いでそれを、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培養哺乳動物細胞を、宿主細胞として使用することができる。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）または大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの原核細胞も、それらの原核生物がジスルフィド結合を生じさせることができる限り、またはタンパク質が正しくリフォールディングされるか正しくリフォールディングされうる限り、ポリペプチドを発現させるために使用することができる。加えて、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．ピキア（Ｐ．  Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母株も、タンパク質を発現させるために使用することができる。
【０１０１】
アミノ酸配列の改変は、さまざまな技法によって達成することができる。核酸配列の修飾は部位特異的変異導入法によって行うことができる。部位特異的変異導入の技法は当技術分野では周知であり、例えばＺｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（ＤＮＡ  ３：４７９−４８８，  １９８４）または「オーバーラップ伸長によるスプライシング（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｖｅｒｌａｐ）」Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７７，  １９８９，  ｐｐ．６１−６８に記載されている。したがって、ＶＡＲ２ＣＳＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を使って、選択した改変を導入することができる。また、特異的プライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応を使ってＤＮＡコンストラクトを調製するための手順も、当業者には周知である（「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」１９９０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ参照）。
【０１０２】
本発明のポリペプチドは非天然アミノ酸残基も含むことができる。非天然アミノ酸には、β−アラニン、デスアミノヒスチジン、ｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロスレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンなどがあるが、これらに限るわけではない。当技術分野では、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むための方法が、いくつか知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使ってナンセンス変異が抑制されるインビトロ系を使用することができる。アミノ酸を合成するための方法およびｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は当技術分野では知られている。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌Ｓ３０抽出液ならびに市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系で行われる。ポリペプチドはクロマトグラフィーによって精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：２７２２，  １９９１；Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０２：３０１，  １９９１；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８０６−９，  １９９３；およびＣｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１０１４５−９，  １９９３を参照されたい。２つ目の方法では、変異させたｍＲＮＡと化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡとのマイクロインジェクションにより、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞で翻訳が行われる（Ｔｕｒｃａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：１９９９１−８，  １９９６）。３つ目の方法では、置き換えようとする天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下、かつ所望の非天然アミノ酸（例えば２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で、大腸菌細胞を培養する。非天然アミノ酸は、その天然対応物の代わりに、ポリペプチドに組み込まれる。Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３：７４７０−６，  １９９４を参照されたい。天然アミノ酸残基はインビトロ化学修飾によって非天然種に転化することができる。置換の範囲をさらに広げるために化学修飾を部位特異的変異導入法と併用することができる（Ｗｙｎｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２：３９５−４０３，  １９９３）。
【０１０３】
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、好ましくは、ゲノム起源またはｃＤＮＡ起源であることができ、例えば標準的技法に従って、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを使ったハイブリダイゼーションによって、ポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることなどにより、取得することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）。
【０１０４】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、確立された標準的方法によって、例えばＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２  （１９８１），  １８５９−１８６９に記載のホスホアミダイト法により、またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３  （１９８４），  ８０１−８０５に記載の方法により、合成的に調製することもできる。ホスホアミダイト法では、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４，６８３，２０２、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９  （１９８８），  ４８７−４９１、またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）に記載されているように、特異的プライマーを使って、ポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【０１０５】
さらにまた、核酸コンストラクトは、（適宜）合成起源、ゲノム起源またはｃＤＮＡ起源のフラグメント（これらのフラグメントは核酸コンストラクト全体のさまざまな部分に対応する）を、標準的技法でライゲートすることによって調製される、合成およびゲノム複合起源、合成およびｃＤＮＡ複合起源、またはゲノムおよびｃＤＮＡ複合起源のものであってもよい。
【０１０６】
核酸コンストラクトは、好ましくは、ＤＮＡコンストラクトである。本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドの生産に使用するためのＤＮＡ配列は、典型的には、適正な翻訳後プロセシングおよび宿主細胞からの分泌が得られるように、ＶＡＲ２ＣＳＡのアミノ末端にあるプレプロポリペプチドをコードするであろう。
【０１０７】
本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、通常、組換えベクターに挿入される。このベクターは、組換えＤＮＡ手法に便利に付すことができる任意のベクターであってよく、ベクターの選択は、多くの場合、それを導入しようとする宿主細胞に依存するであろう。したがってベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外実体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないベクター、例えばプラスミドであることができる。あるいはベクターは、宿主細胞中に導入された時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれている染色体と一緒に複製するものであってもよい。
【０１０８】
ベクターは、好ましくは、本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、そのＤＮＡの転写に必要な追加セグメントに作動的に連結されている発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されるか、または両者の要素を含有しうる。「作動的に連結された」という用語は、それらのセグメントが、意図する目的のために協力して機能するように、例えば転写がプロモーターで始まり、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に沿って進行するように、配置されていることを示す。
【０１０９】
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを発現させる際に使用するための発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指示する能力を有するプロモーターを含むであろう。プロモーターは選択した宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞にとって同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。
【０１１０】
哺乳動物細胞における熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を指示するための適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１），  ８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３），  ８０９−８１４）、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０，  １９８５）またはアデノウイルス２主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２：１３０４−１３１９，  １９８２）である。
【０１１１】
昆虫細胞における使用に適したプロモーターの一例は、ポリヘドリンプロモーター（ＵＳ４，７４５，０５１；Ｖａｓｕｖｅｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３１１，  （１９９２）７−１１）、Ｐ１０プロモーター（Ｊ．Ｍ．  Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９，  １９８８，  ｐｐ．７６５−７７６）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ３９７  ４８５）、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター（ＵＳ５，１５５，０３７；ＵＳ５，１６２，２２２）、またはバキュロウイルス３９Ｋ遅延初期遺伝子プロモーター（ＵＳ５，１５５，０３７；ＵＳ５，１６２，２２２）である。
【０１１２】
酵母宿主細胞における使用に適したプロモーターの例には、酵母解糖系遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５  （１９８０），  １２０７３−１２０８０；Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １  （１９８２），  ４１９−４３４）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２）に由来するプロモーター、またはＴＰＩ１（ＵＳ４，５９９，３１１）もしくはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０４  （１９８３），  ６５２−６５４）プロモーターがある。
【０１１３】
糸状菌宿主細胞における使用に適したプロモーターの例は、例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４  （１９８５），  ２０９３−２０９９）またはｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリゼ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーまたはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ．オリゼ・アルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリゼ・トリオースリン酸イソメラーゼまたはＡ．ニデュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。好ましいのは、ＴＡＫＡ−アミラーゼおよびｇｌｕＡプロモーターである。適切なプロモーターは、例えばＥＰ２３８  ０２３およびＥＰ３８３  ７７９において言及されている。
【０１１４】
本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２，  １９８３，  ｐｐ．８０９−８１４）またはＴＰＩ１（Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １，  １９８２，  ｐｐ．４１９−４３４）もしくはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４，  １９８５，  ｐｐ．２０９３−２０９９）ターミネーターなどの適切なターミネーターに作動的につなぐこともできる。発現ベクターは、プロモーターの下流かつＶＡＲ２ＣＳＡ配列自体の挿入部位の上流に位置する一組のＲＮＡスプライス部位も含有しうる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。挿入部位の下流に位置するポリアデニル化部位も発現ベクターに含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０からの初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、同上書）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域からのポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：３７１９−３７３０，  １９８１）または熱帯熱マラリア原虫、ヒトもしくはウシ遺伝子からのポリアデニル化シグナルがある。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置するアデノウイルス２トリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーなどの非コードウイルスリーダー配列；およびＳＶ４０エンハンサーなどのエンハンサー配列も含みうる。
【０１１５】
本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列とも呼ばれている）を組換えベクターに用意することができる。分泌シグナル配列は、本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、正しい読み枠で接合される。分泌シグナル配列は一般に、ペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に置かれる。分泌シグナル配列は、通常そのタンパク質に付随しているものであってもよいし、別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【０１１６】
酵母細胞からの分泌の場合、分泌シグナル配列は、発現した本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを細胞の分泌経路へと効率よく導くことを保証する任意のシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドは天然のシグナルペプチドまたはその機能的部分であってもよいし、合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α因子シグナルペプチド（ＵＳ４，８７０，００８参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．  Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８９，  １９８１，  ｐｐ．６４３−６４６参照）、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．  Ｖａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４８，  １９８７，  ｐｐ．８８７−８９７）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．  Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ  ６，  １９９０，  ｐｐ．１２７−１３７参照）であることが見出されている。
【０１１７】
酵母における効率のよい分泌のために、シグナル配列の下流かつ本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に、リーダーペプチドをコードする配列を挿入することもできる。リーダーペプチドの機能は、発現したペプチドが、小胞体からゴルジ装置へと導かれ、さらに培養培地への分泌（すなわち、細胞壁を横切っての、または少なくとも細胞膜を通って酵母細胞のペリプラズム間隙への、本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドの輸出）のために、分泌小胞へと導かれることを可能にすることである。リーダーペプチドは、酵母α因子リーダー（その使用は、例えばＵＳ４，５４６，０８２、ＵＳ４，８７０，００８、ＥＰ１６  ２０１、ＥＰ１２３  ２９４、ＥＰ１２３  ５４４およびＥＰ１６３  ５２９に記載されている）であることができる。あるいは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド、つまり自然界には見出されないリーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、例えばＷＯ８９／０２４６３またはＷＯ９２／１１３７８に記載されているように構築することができる。
【０１１８】
糸状菌における使用の場合、シグナルペプチドは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のアミラーゼまたはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイのリパーゼもしくはプロテアーゼまたはフミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードする遺伝子から、都合よく得ることができる。シグナルペプチドは、好ましくは、Ａ．オリゼＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性アミラーゼ、またはＡ．ニガー・グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来する。適切なシグナルペプチドは、例えばＥＰ２３８  ０２３およびＥＰ２１５  ５９４に開示されている。
【０１１９】
昆虫細胞における使用の場合、シグナルペプチドは、例えば鱗翅目タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド（ＵＳ５，０２３，３２８参照）など、昆虫遺伝子から、都合よく得ることができる（ＷＯ９０／０５７８３参照）。
【０１２０】
本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター、そして場合によってはターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれライゲートし、それらを複製に必要な情報を含有する適切なベクターに挿入するために使用される手法は、当業者には周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）。
【０１２１】
哺乳動物細胞をトランスフェクトし、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９  （１９８２），  ６０１−６２１；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １  （１９８２），  ３２７−３４１；Ｌｏｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９  （１９８２），  ４２２−４２６；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４  （１９７８），  ７２５；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７  （１９８１），  ６０３、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２  （１９７３），  ４５６；およびＮｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １  （１９８２），  ８４１−８４５に記載されている。
【０１２２】
クローニングされたＤＮＡ配列は、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４：７２５−７３２，  １９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３−６１６，  １９８１；Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２ｄ：４５６−４６７，  １９７３）またはエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：８４１−８４５，  １９８２）などによって、培養哺乳動物細胞に導入される。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し選択するために、一般に、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択可能マーカー）が、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子がある。選択可能マーカーは増幅可能な選択可能マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。選択可能マーカーについてはＴｈｉｌｌｙによる総説がある（引用により本明細書に組み込まれる「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ，  ＭＡ）。当業者は適切な選択マーカーを容易に選ぶことができるであろう。
【０１２３】
選択可能マーカーは、別個のプラスミドにのせて、目的の遺伝子と同時に細胞に導入するか、または同じプラスミドにのせて導入することができる。同じプラスミドにのせる場合、選択可能マーカーと目的の遺伝子は、異なるプロモーターの制御下にあってもよいし、同じプロモーターの制御下にあってもよく、後者の配置はジシストロン性メッセージをもたらす。このタイプのコンストラクトは当技術分野では知られている（例えばＬｅｖｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，  Ｕ．Ｓ．４，７１３，３３９）。細胞中に導入される混合物に「キャリアＤＮＡ」と呼ばれる追加ＤＮＡを加えることも、有益でありうる。
【０１２４】
細胞がＤＮＡを取り込んだら、目的の遺伝子を発現し始めるように、細胞を適当な成長培地で典型的には１〜２日間成長させる。本明細書において使用する用語「適当な成長培地」は、細胞の成長および目的の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの発現にとって必要な栄養素および他の構成要素を含有する培地を意味する。培地は一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩類、リン脂質、タンパク質および成長因子を含む。次に、選択可能マーカーを安定に発現している細胞の成長を選択するために、薬物選択を適用する。増幅可能な選択可能マーカーがトランスフェクトされている細胞の場合、クローニングされた配列のコピー数の増加を選択し、よって発現レベルを増加させるために、薬物濃度を増加させることができる。次に、安定トランスフェクト細胞のクローンを、目的の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの発現についてスクリーニングする。
【０１２５】
本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が導入される宿主細胞は、翻訳後修飾ポリペプチドを生産する能力を有し、これには、酵母、真菌および高等真核細胞が含まれる。
【０１２６】
本発明で使用するための哺乳動物細胞株の例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）および２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９−７２，  １９７７）細胞株である。好ましいＢＨＫ細胞株はｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株（引用により本明細書に組み込まれるＷａｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｒｇａ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：１１０６−１１１０，  １９８２）であり、以下、これをＢＨＫ５７０細胞という。ＢＨＫ５７０細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州２０８５２ロックビル、パークローンドライブ１２３０１）に、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０３１４として寄託されている。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株は受託番号ＣＲＬ１６３２としてＡＴＣＣから入手することもできる。加えて、ラットＨｅｐＩ（ラット肝癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６００）、ラットＨｅｐＩＩ（ラット肝癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，  １９８０）を含め、他にもいくつかの細胞株を、本発明において使用することができる。
【０１２７】
適切な酵母細胞の例には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロミセス・セレビシアまたはサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）の株の細胞がある。異種ＤＮＡで酵母細胞を形質転換し、そこから異種ポリペプチドを生産するための方法は、例えばＵＳ４，５９９，３１１、ＵＳ４，９３１，３７３、ＵＳ４，８７０，００８、５，０３７，７４３、およびＵＳ４，８４５，０７５に記載されており、これらは全て、引用により本明細書に組み込まれる。形質転換細胞は選択可能マーカーが決定する表現型、一般的には薬物耐性または特定栄養素（例えばロイシン）の非存在下で成長する能力によって選択される。酵母で使用するための好ましいベクターは、ＵＳ４，９３１，３７３に開示されているＰＯＴ１ベクターである。本発明の熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の前には、シグナル配列と、場合によってはリーダー配列、例えば上述のものを置くことができる。適切な酵母細胞のさらなる例は、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、例えばＨ．ポリモルファ（Ｈ．  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株である（Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３２，  １９８６，  ｐｐ．３４５９−３４６５；ＵＳ４，８８２，２７９参照）。
【０１２８】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、特にＡ．オリゼ、Ａ．ニデュランスまたはＡ．ニガーの株の細胞である。タンパク質の発現を目的とするアスペルギルス属の使用は、例えばＥＰ２７２  ２７７、ＥＰ２３８  ０２３、ＥＰ１８４  ４３８に記載されている。例えば、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の形質転換は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６に記述されているように行うことができる。トリコデルマ属の形質転換は、例えばＥＰ２４４  ２３４に記載されているように行うことができる。
【０１２９】
糸状菌を宿主細胞として使用する場合は、その糸状菌を本発明のＤＮＡコンストラクトで（宿主染色体にＤＮＡコンストラクトを組み込むことによって都合よく）形質転換して、組換え宿主細胞を得ることができる。この組込みは、ＤＮＡ配列が細胞内に安定に維持される可能性が高くなるので、一般に利点であると考えられる。宿主染色体へのＤＮＡコンストラクトの組込みは、従来の方法に従って、例えば相同組換えまたは非相同組換え（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって、行うことができる。
【０１３０】
昆虫細胞の形質転換と、そこでの異種ポリペプチドの生産は、ＵＳ４，７４５，０５１；ＵＳ４，８７９，２３６；ＵＳ５，１５５，０３７；５，１６２，２２２；ＥＰ３９７，４８５に記載されているように行うことができ、これらは全て引用により本明細書に組み込まれる。宿主として使用される昆虫細胞株は、好適には、鱗翅目細胞株、例えばヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞であることができる（ＵＳ５，０７７，２１４参照）。培養条件は、好適には、例えばＷＯ８９／０１０２９もしくはＷＯ８９／０１０２８、または上述の文献のいずれかに記載されているとおりであることができる。
【０１３１】
上述の形質転換宿主細胞またはトランスフェクト宿主細胞は、次に、適切な栄養培地中、熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの発現が可能な条件下で培養される、その後、結果として生じたペプチドは培養物から回収することができる。細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を成長させるのに適した従来の任意の培地、例えば適当なサプリメントを含有する最小培地または天然培地であることができる。適切な培地は、供給業者から入手するか、（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに）公表されている配合表に従って調製することができる。次に、細胞によって生産された熱帯熱マラリア原虫ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、遠心分離または濾過によって宿主細胞を培地から分離すること、上清または濾液のタンパク質性構成要素を塩、例えば硫酸アンモニウムを使って沈殿させること、さまざまなクロマトグラフィー手法、例えば、問題のポリペプチドのタイプに応じてイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を含む従来の手法によって、培養培地から回収することができる。
【０１３２】
トランスジェニック動物技術を使って本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを生産してもよい。宿主雌哺乳動物の乳腺内でタンパク質を生産することが好ましい。乳腺における発現と、続いて起こる目的タンパク質の乳汁への分泌では、他の供給源からタンパク質を単離する際に直面する数多くの困難が克服される。乳汁は容易に収集することができ、大量に入手することができ、生化学的によく特徴づけられている。さらにまた、主要乳汁タンパク質は乳汁中に高濃度に存在する（典型的には約１〜１５ｇ／ｌ）。
【０１３３】
商業的観点からは、乳量の多い種を宿主として使用することが、明らかに好ましい。マウスやラットなどの小動物も使用することはできる（そして原理証明段階では好ましい）が、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含む（ただしこれらに限るわけではない）家畜哺乳動物を使用することが好ましい。ヒツジは、この種における遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の前例があること、乳量、コスト、および羊乳を収集するための装置の入手が容易であることなどの要因により、特に好ましい（宿主種の選択に影響を及ぼす因子の比較については例えばＷＯ８８／００２３９を参照されたい）。搾乳用に育種された宿主動物の品種、例えば東フリージア羊（Ｅａｓｔ  Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  Ｓｈｅｅｐ）を選択するか、または後日、トランスジェニック系統の育種によって、搾乳用家畜を導入することが、一般に望ましい。いずれにせよ、健康状態が良いことがわかっている動物を使用すべきである。
【０１３４】
乳腺での発現を得るには、乳汁タンパク質遺伝子からの転写プロモーターを使用する。乳汁タンパク質遺伝子には、カゼイン（Ｕ．Ｓ．５，３０４，４８９参照）、βラクトグロブリン、ラクトアルブミン、および乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子がある。βラクトグロブリン（ＢＬＧ）プロモーターは好ましい。ヒツジβラクトグロブリン遺伝子の場合、一般的には、その遺伝子の５’隣接配列の少なくとも近位４０６ｂｐの領域が使用されるであろうが、最大約５ｋｂｐまでの、さらに大きな５’隣接配列の一部、例えば５’隣接プロモーターとβラクトグロブリン遺伝子の非コード部分とを包含する約４．２５ｋｂｐ  ＤＮＡセグメントが、好ましい（Ｗｈｉｔｅｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２８６：  ３１  ３９  （１９９２）参照）。他の種に由来するプロモーターＤＮＡの類似するフラグメントも適切である。
【０１３５】
βラクトグロブリン遺伝子の他の領域もコンストラクトに組み込むことができ、発現させようとする遺伝子のゲノム領域も同様である。例えば、イントロンを欠くコンストラクトが、そのようなＤＮＡ配列を含有するコンストラクトと比較して、弱く発現するという考えは、当技術分野では一般に受け入れられている（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：８３６  ８４０  （１９８８）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：４７８  ４８２  （１９９１）；Ｗｈｉｔｅｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  １：３  １３  （１９９１）；ＷＯ８９／０１３４３；およびＷＯ９１／０２３１８参照、これらはそれぞれ引用により本明細書に組み込まれる）。この点で、可能であれば、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子のネイティブイントロンの全部または一部を含有するゲノム配列を使用することが、一般に好ましい、したがって、例えばβラクトグロブリン遺伝子からのイントロンの少なくとも一部をさらに含めることが好ましい。そのような領域の一つは、ヒツジβラクトグロブリン遺伝子の３’非翻訳領域からのイントロンスプライシングとＲＮＡポリアデニル化をもたらすＤＮＡセグメントである。このヒツジβラクトグロブリンセグメントは、遺伝子の天然の３’非コード領域の代わりに使用した場合に、目的のタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを強化することも安定化することもできる。他の実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡ配列の開始ＡＴＧを取り囲む領域を、乳汁特異的タンパク質遺伝子からの対応する配列で置き換える。そのような置き換えは推定組織特異的開始環境を与えて発現を強化する。ＶＡＲ２ＣＳＡプレプロおよび５’非コード配列全体を、例えばＢＬＧ遺伝子のもので置き換えることが便利であるが、それより小さな領域を置き換えてもよい。
【０１３６】
トランスジェニック動物において本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドを発現させるには、発現ユニットを作製するために、ＶＡＲ２ＣＳＡをコードするＤＮＡセグメントを、その発現に必要な追加ＤＮＡセグメントに作動的に連結する。そのような追加セグメントには、上述のプロモーター、ならびに転写の終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化をもたらす配列が含まれる。発現ユニットはさらに、修飾ＶＡＲ２ＣＳＡをコードするセグメントに作動的に連結された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントを含むであろう。分泌シグナル配列は、ネイティブ分泌シグナル配列であってもよいし、別のタンパク質、例えば乳汁タンパク質のものであってもよい（例えばｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：  ４６８３  ４６９０  （１９８６）；およびＭｅａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．４，８７３，３１６を参照されたい。これらは引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３７】
発現ユニットは本質的にどのライゲーション順序でも構築しうるが、トランスジェニック動物において使用するための発現ユニットの構築は、追加のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドまたはファージベクターにＶＡＲ２ＣＳＡ配列を挿入することによって行うと好都合である。乳汁タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターを用意し、乳汁タンパク質のコード配列をＶＡＲ２ＣＳＡ変異体のコード配列で置き換えることによって、乳汁タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を作出することは、とりわけ好都合である。いずれにせよ、プラスミドまたは他のベクターへの発現ユニットのクローニングは、ＶＡＲ２ＣＳＡ配列の増幅を容易にする。増幅は細菌（例えば大腸菌）宿主細胞中で行うのが便利なので、ベクターは典型的には、細菌宿主細胞中で機能する複製起点と選択可能マーカーとを含むであろう。次に、選んだ宿主種の受精卵（初期胚を含む）に発現ユニットを導入する。異種ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション（例えば米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス感染（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １４６８  １４７４  （１９８８））または胚性幹（ＥＳ）細胞を使った部位特異的組込み（Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  ５３４  ５３９  （１９９２）に総説がある）を含めて、いくつかある経路の一つによって達成することができる。次に、卵を偽妊娠雌の卵管または子宮に移植し、分娩日まで発生させる。導入されたＤＮＡをその生殖系列に保因している子孫は、そのＤＮＡを通常のメンデルの法則に従って子孫に伝えることで、トランスジェニック群（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｅｒｄ）の発生を可能にする。トランスジェニック動物を作出するための一般的手法は当技術分野では知られている（例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８６；Ｓｉｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９  １８３  （１９８８）；Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ３２：６４５  ６５１  （１９８５）；Ｂｕｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１４０  １４３  （１９９０）；Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８３５  ８３８  （１９９１）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８４４  ８４７  （１９９１）；Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９：１１３  １２０  （１９９２）；Ｕ．Ｓ．４，８７３，１９１；Ｕ．Ｓ．４，８７３，３１６；ＷＯ８８／００２３９、ＷＯ９０／０５１８８、ＷＯ９２／１１７５７；およびＧＢ８７／００４５８）を参照されたい）。哺乳動物およびその生殖細胞に外来ＤＮＡ配列を導入するための技法は、もともとはマウスで開発された（例えばＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：７３８０  ７３８４  （１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ���  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：１２４４  １２４６  （１９８１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ４１：３４３  ３４５  （１９８５）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４４３８  ４４４２  （１９８５）；およびＨｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（同上書）を参照されたい）。その後、これらの技法は、家畜種を含む、より大きな動物での使用に適合するように改変された（例えばＷＯ８８／００２３９、ＷＯ９０／０５１８８、およびＷＯ９２／１１７５７；ならびにＳｉｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９  １８３  （１９８８）を参照されたい）。要約すると、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニック家畜の作出において現在までに使用された最も効率のよい経路では、目的のＤＮＡの線状分子数百個が、確立された技法によって受精卵の前核の一つに注入される。接合体の細胞質にへのＤＮＡの注入も使用することができる。
【０１３８】
トランスジェニック植物における生産も使用することができる。発現は全般性であってもよいし、特定器官、例えば塊茎に向けられてもよい（Ｈｉａｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４６９  ４７９  （１９９０）；Ｅｄｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．  １２：４４９  ４５３  （１９９２）；Ｓｉｊｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２１７  ２２１  （１９９０）；およびＥＰ０  ２５５  ３７８参照）。
【０１３９】
ＶＡＲ２ＣＳＡ精製
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドは、細胞培養培地または乳汁から回収することができる。本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドは、当技術分野において知られるさまざまな手法、例えば限定するわけではないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば分取用等電点電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度差（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出などによって、精製することができる（例えば「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｊ．−Ｃ．  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９参照）。好ましくは、それらを抗ＶＡＲ２ＣＳＡ抗体カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。さらなる精製は、従来の化学的精製手段、例えば高速液体クロマトグラフィーなどによって達成することができる。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法も当技術分野では知られており、本明細書に記載する新規ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドの精製に応用することができる（例えばＳｃｏｐｅｓ，  Ｒ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８２を参照されたい）。
【０１４０】
治療的目的には、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドが実質的に純粋であることが好ましい。したがって本発明の好ましい実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよび他のポリペプチドが、少なくとも約９０〜９５％の均一度（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）まで、好ましくは少なくとも約９８％の均一度まで精製される。純度は例えばゲル電気泳動およびアミノ末端アミノ酸配列決定によって評価することができる。
【０１４１】
「単離されたポリペプチド」という用語は、（１）そのポリペプチドに天然に付随しているポリヌクレオチド、脂質、糖質または他の物質（すなわち夾雑物）の少なくとも約５０パーセントから分離されている本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離されたポリペプチドが、その天然環境において見出される他の任意の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その治療的、診断的、予防的または研究的使用を妨げるものを、実質的に含まない。
【０１４２】
本明細書において使用する用語「微生物」は、細菌、真菌、古細菌、原生生物；微細な植物および動物（例えば緑藻類またはプランクトン）、プラネリアおよびアメーバを指す。この定義には病原性微生物が包含される。
【０１４３】
投与および医薬組成物
併用処置
本明細書において定義されるＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、誘導体、またはコンジュゲートは、１つ以上の他の制がん剤（ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）と共に、同時に投与するか、逐次的に投与することができ、かつ／または他の既知の治療法との併用処置に使用することができる。これらの因子は、両方の化合物を含有する単一剤形で供給するか、第１単位剤形としてのＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの調製物と、第２単位剤形としての前記１つ以上の他の化合物の調製物とを含むパーツキット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）の形態で供給することができる。本明細書において第１または第２または第３単位用量などという場合、これは、好ましい投与順序を示しているのではなく、便宜上そうしているにすぎない。
【０１４４】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと併用することができる適切な他の制がん剤または制がん治療には、既に市販されている抗体または開発中の抗体、例えばベムラフェニブ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ＭＣＳＰに対するヒトモノクローナル抗体、ＢｉＴＥ抗体プラットフォーム技術を使った治療用（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  Ｉｎｃ）抗ＭＣＳＰ、およびＭＣＳＰに対する特異性を持つ細胞障害性Ｔ細胞の養子移入が含まれる。
【０１４５】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの調製物と１つ以上の他の化合物の調製物との「同時」投与とは、単一剤形中の化合物の投与を意味するか、または第１剤の投与後、１５分以下、好ましくは１０分、より好ましくは５分、さらに好ましくは２分以下の時間間隔で、第２剤を投与することを意味する。どちらの因子を最初に投与してもよい。
【０１４６】
「逐次的」投与とは、第１剤の投与後、１５分を上回る時間間隔で、第２剤を投与することを意味する。２つの単位剤形のどちらを最初に投与してもよい。好ましくは、両方の製品を、同じ静脈内アクセスで注入する。
【０１４７】
本発明のもう一つの目的は、０ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの血清／血漿中濃度で存在するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含み、２．０から１０．０までのｐＨを有する医薬製剤を提供することである。製剤は、緩衝液系、保存剤、張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、キレート剤、安定剤および界面活性剤を、さらに含みうる。本発明のいくつかの実施形態では、医薬製剤が水性製剤、すなわち水を含む製剤である。そのような製剤は、典型的には、溶液または懸濁液である。本発明のさらにもう一つの実施形態では、医薬製剤が水溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤と定義される。同様に用語「水溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義され、用語「水性懸濁液」は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液と定義される。
【０１４８】
別の実施形態では、医薬製剤が凍結乾燥製剤であり、医師または患者はそこに溶剤および／または希釈剤を加えてから使用する。
【０１４９】
別の実施形態では、医薬製剤が、事前の溶解を行わずに直ぐに使用することができる乾燥製剤（例えば凍結乾燥製剤または噴霧乾燥製剤）である。
【０１５０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの水溶液と緩衝剤とを含み、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが０〜１ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の血清／血漿中濃度で存在し、製剤が約２．０から約１０．０までのｐＨを有する、医薬製剤に関する。
【０１５１】
本発明の他の実施形態では、製剤のｐＨが、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、および１０．０からなるリストから選択される。
【０１５２】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、緩衝剤が、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはその混合物からなる群より選択される。これら具体的緩衝剤の各々は、本発明の代替的実施形態を構成する。
【０１５３】
本発明のさらにもう一つの実施形態において、製剤はさらに、医薬上許容される保存剤を含む。本発明のさらにもう一つの実施形態では、保存剤が、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア（ｉｍｉｄｕｒｅａ）、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎｅ）（３ｐ−クロルフェノキシプロパン−１，２−ジオール）またはそれらの混合物からなる群より選択される。本発明のさらにもう一つの実施形態では、保存剤が０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、保存剤が０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、保存剤が５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、保存剤が１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの具体的保存剤の各々は本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物における保存剤の使用は当業者には周知である。便宜のために「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版（１９９５）を挙げておく。
【０１５４】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、製剤がさらに等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含む。本発明のさらにもう一つの実施形態では、等張化剤が、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、またはそれらの混合物からなる群より選択される。任意の糖、例えば単糖、二糖、もしくは多糖、または水溶性グルカン、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース−Ｎａなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、糖添加物がスクロースである。糖アルコールは少なくとも１つの−ＯＨ基を持つＣ４−Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。いくつかの実施形態では、糖アルコール添加物がマンニトールである。上述の糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて使用することができる。糖または糖アルコールがその液状調製物に可溶であり、本発明の方法を使って達成される安定化効果に有害な影響を及ぼさない限り、使用する量に決まった限度はない。いくつかの実施形態では、糖または糖アルコール濃度が、約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間にある。本発明のさらにもう一つの実施形態では、等張化剤が１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、等張化剤が１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、等張化剤が８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、等張化剤が２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。これらの具体的等張化剤の各々は、本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物における等張化剤の使用は、当業者には周知である。便宜のために「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版（１９９５）を挙げておく。
【０１５５】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、製剤がさらにキレート剤を含む。本発明のさらにもう一つの実施形態では、キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにそれらの混合物から選択される。本発明のさらにもう一つの実施形態では、キレート剤が、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、キレート剤が、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。本発明のさらにもう一つの実施形態では、キレート剤が、２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で存在する。これらの具体的キレート剤の各々は、本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物におけるキレート剤の使用は当業者には周知である。便宜のために「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版（１９９５）を挙げておく。
【０１５６】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、製剤がさらに安定剤を含む。医薬組成物における安定剤の使用は当業者には周知である。便宜のために「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版（１９９５）を挙げておく。
【０１５７】
より具体的には、本発明の組成物は、その治療活性構成要素が、液状医薬製剤における貯蔵中に凝塊形成を呈する可能性のあるポリペプチドを含む、安定化された液状医薬組成物である。「凝塊形成」とは、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用を意味し、それは可溶性のままであってもよいし、溶液から沈降する大きな可視的凝集体であってもよい。「貯蔵中に」とは、ひとたび調製された液状の医薬組成物または製剤が、対象に直ぐには投与されないことを意味する。そうではなく、調製後に、液状、凍結状態、または乾燥形態のいずれかで、貯蔵のために包装され、後で対象への投与に適した液状その他の形態に再構成される。「乾燥形態」とは、液状医薬組成物または製剤がフリーズドライ（すなわち凍結乾燥；例えばＷｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ  （１９８４）Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３８：４８−５９参照）、噴霧乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ  （１９９１）「Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（第５版；Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，  Ｅｓｓｅｚ，  Ｕ．Ｋ．）のｐｐ．４９１−６７６；Ｂｒｏａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．  １８：１１６９−１２０６；およびＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１２−２０）、または空気乾燥（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ  （１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９−４７０；およびＲｏｓｅｒ  （１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ４：４７−５３）のいずれかによって乾燥されていることを意味する。液状医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝塊形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に有害な影響を及ぼし、医薬組成物の治療有効性の喪失をもたらす。さらにまた、凝塊形成は、注入システムを使ってポリペプチド含有医薬組成物を投与する場合に、チューブ、膜、またはポンプの閉塞など、他の問題も引き起こしうる。
【０１５８】
本発明の医薬組成物はさらに、組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝塊形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含みうる。「アミノ酸塩基」とは、任意の所与のアミノ酸がその遊離塩基型またはその塩型として存在する、アミノ酸またはアミノ酸の組成物を意味する。アミノ酸の組み合わせを使用する場合、アミノ酸の全てがそれぞれの遊離塩基型で存在してもよいし、全てがそれぞれの塩型で存在してもよいし、一部がその遊離塩基型で存在し、かつその他はその塩型で存在してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を調製する際に使用するためのアミノ酸が、荷電側鎖を持つもの、例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。特定アミノ酸（例えばグリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびそれらの混合物）の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、またはＤＬ異性体）またはこれらの立体異性体の組み合わせが、その特定アミノ酸がその遊離塩基型またはその塩型で存在する限り、本発明の医薬組成物中に存在しうる。いくつかの実施形態では、Ｌ−立体異性体が使用される。本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体を使って製剤化することもできる。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液状医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝塊形成を減少させるという望ましい効果をもたらす天然アミノ酸の誘導体を意味する。適切なアルギニン類似体には、例えばアミノグアニジン、オルニチンおよびＮ−モノエチル−Ｌ−アルギニンなどがあり、適切なメチオニン類似体にはエチオニンおよびブチオニンがあり、適切なシステイン類似体には、Ｓ−メチル−Ｌ−システインがある。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、その遊離塩基型またはその塩型のいずれかで組成物に組み込まれる。本発明のさらにもう一つの実施形態では、アミノ酸またはアミノ酸類似体が、タンパク質の凝集を防止しまたは遅延するのに十分な濃度で使用される。
【０１５９】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、治療剤として作用するポリペプチドが、メチオニンスルキシドへの酸化を起こしやすいメチオニン残基を少なくとも１つは含むポリペプチドである場合に、そのような酸化を阻害するために、メチオニン（または他の含硫アミノ酸または含硫アミノ酸類似体）を加えることができる。「阻害する」とは、経時的なメチオニン酸化分子種の蓄積が最低限であることを意味する。メチオニン酸化を阻害すると、適正な分子形態にあるポリペプチドが、より良く保持されることになる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ、Ｄ、またはＤＬ異性体）またはそれらの組み合わせを使用することができる。添加する量は、メチオニンスルホキシドの量が調節作用にとって許容されうる程度になるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量とすべきである。これは、典型的には、組成物が含有するメチオニンスルオキシドが、約１０％〜約３０％を上回らないことを意味する。一般に、これは、添加されるメチオニンの、メチオニン残基に対する比が、約１：１から約１０００：１までの範囲、例えば１０：１〜約１００：１になるようにメチオニンを加えることによって達成することができる。
【０１６０】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、製剤がさらに、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物の群から選択される安定剤を含む。本発明のさらにもう一つの実施形態では、安定剤が、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロースまたはその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−ＬおよびＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および２−メチルチオエタノールなどの含硫物質、およびさまざまな塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの具体的安定剤の各々は、本発明の代替的実施形態を構成する。
【０１６１】
医薬組成物は、治療的に活性なポリペプチドのそこでの安定性をさらに強化する追加の安定剤も含みうる。本発明にとって特に興味深い安定剤には、ポリペプチドをメチオニン酸化から保護するメチオニンおよびＥＤＴＡ、ならびに凍結融解または機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護するノニオン性界面活性剤などがあるが、これらに限るわけではない。
【０１６２】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、製剤がさらに界面活性剤を含む。本発明のさらにもう一つの実施形態では、界面活性剤が、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセライド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー１８８および４０７などのポロキサマー、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えばアルキル化およびアルコキシル化誘導体（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、例えばツイーン−２０、ツイーン−４０、ツイーン−８０、およびブリッジ（Ｂｒｉｊ）−３５）、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）およびリゾリン脂質の誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル−Ｌ−セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸エステル）ならびにリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、および極性頭部、すなわちコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールの修飾、および正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン、およびグリセロリン脂質（例えばセファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド（ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｓｏｉｄｅ））、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロジヒドロフジシン酸ナトリウムなど）、Ｃ６−Ｃ１２長鎖脂肪酸およびその塩（例えばオレイン酸およびカプリル酸）、アシルカルニチンおよび誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのＮα−アシル化誘導体、またはリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと中性または酸性アミノ酸との任意の組み合わせを含むジペプチドのＮα−アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの荷電アミノ酸との任意の組み合わせを含むトリペプチドのＮα−アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］）、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩ならびにグリシンまたはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリコロール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニアオ−１−プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル−アリール−スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン界面活性剤（例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−コラミド−１−プロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（４級アンモニウム塩基）（例えばセチル−トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド）、ノニオン性界面活性剤（例えばドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、エチレンジアミンへのプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドの逐次的付加から誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン（例えばテトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ））から選択されるか、または界面活性剤はイミダゾリン誘導体またはそれらの混合物の群から選択することができる。これらの具体的界面活性剤の各々は、本発明の代替的実施形態を構成する。
【０１６３】
医薬組成物における界面活性剤の使用は当業者には周知である。便宜のために「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第１９版（１９９５）を挙げておく。
【０１６４】
本発明のペプチド医薬組成物には他の成分も存在しうると考えることができる。そのような追加成分として、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、毒性調整剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および両性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を挙げることができる。そのような追加成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的安定性に有害な影響を及ぼしてはならない。
【０１６５】
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含有する医薬組成物は、そのような処置を必要とする患者のいくつかの部位に、例えば外用部位（ｔｏｐｉｃａｌ  ｓｉｔｅ）、例えば皮膚および粘膜部位に、吸収を回避する部位に（例えば動脈、静脈、心臓への投与）、および吸収を必要とする部位に（例えば皮膚、皮下、筋肉内、または腹部への投与）、投与することができる。
【０１６６】
外用投与は、局所的炎症が関係する状態の処置において、例えば熱傷に関連する炎症または皮膚に関連する他の状態の処置において、特に有利であるだろう。したがって、いくつかの実施形態では、投与が外用投与によって行われる。
【０１６７】
いくつかの特定実施形態では、眼に関連する状態、例えばびまん性層間角膜炎（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｋｅｒａｔｉｔｉｓ：ＤＬＫ）などの角膜縁において、点眼剤を使用することができる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路によって、例えば舌、舌下、口腔粘膜、口内、経口、胃腸内、鼻、肺、例えば細気管支および肺胞経由またはそれらの組み合わせ、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜経由、尿管、および非経口的に、そのような処置を必要とする患者に対して行うことができる。
【０１６９】
本発明の組成物は、いくつかの剤形で、例えば溶液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロエマルション、多重乳剤、フォーム剤、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ペースト剤、硬膏（ｐｌａｓｔｅｒ）、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、錠剤、コート錠、リンス剤、カプセル剤、例えば硬ゼラチンカプセル剤および軟ゼラチンカプセル剤、坐剤、直腸カプセル剤、滴剤、ゲル剤、噴霧剤、粉末剤、エアロゾル剤、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、洗眼剤（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｒｉｎｓｅ）、膣内ペッサリー、腟内リング、膣軟膏、注射用溶液剤、インサイチュー変換溶液剤（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、例えばインサイチューゲル化、インサイチュー硬化、インサイチュー沈殿、インサイチュー結晶化、注入溶液剤、および植込み剤として投与することができる。
【０１７０】
本発明の組成物はさらに、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの安定性をさらに強化し、バイオアベイラビリティを増加させ、溶解度を増加させ、有害作用を減少させ、当業者に周知の時間治療法を達成し、患者コンプライアンスを増大させるために、またはそれらの任意の組み合わせのために、例えば共有結合相互作用、疎水性相互作用および静電相互作用を介して、薬物担体、薬物送達システム（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）および先進薬物送達システム（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）に配合し、または取り付けることができる。担体、薬物送達システムおよび先進薬物送達システムの例には、ポリマー、例えばセルロースおよび誘導体、多糖、例えばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにそのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者に周知のブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、マイクロスフェア、ナノ粒子、ウイルス様粒子、細菌様粒子、液晶およびその分散系、脂質−水系における相挙動に関する当業者には周知のＬ２相およびその分散系、ポリマーミセル、多重エマルション、自己乳化、自己マイクロエマルション化シクロデキストリンおよびその誘導体、ならびにデンドリマーなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０１７１】
本発明の組成物は、例えば定量吸入器、乾燥粉末吸入器および噴霧器など（これらはいずれも当業者には周知のデバイスである）を使ってＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを経肺投与するための固形剤、半固形剤、粉末剤および溶液剤の形成に有用である。
【０１７２】
本発明の組成物は、制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）放出性、持続（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）放出性、遷延（ｐｒｏｔｒａｃｔｉｎｇ）放出性、遅延（ｒｅｔａｒｄｅｄ）放出性、および緩徐（ｓｌｏｗ）放出性薬物送達システムの製剤において、とりわけ有用である。より具体的に述べると、限定するわけではないが、組成物は、当業者には周知の非経口制御放出システムおよび非経口持続放出システム（共に投与の回数を何分の一にも減少させるシステムである）の製剤に有用である。さらに好ましくは、制御放出システムおよび持続放出システムは皮下に投与される。本発明の範囲を限定するわけではないが、有用な制御放出システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、マイクロスフェア、ナノ粒子である。
【０１７３】
本発明の組成物にとって有用な制御放出システムを生産するための方法には、結晶化、凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）、共結晶化、沈殿、共沈、乳化、分散、高圧ホモジナイゼーション、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、マイクロスフェアを生産するための溶媒蒸発、押出および超臨界流体法などがあるが、これらに限るわけではない。一般論については「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」（Ｗｉｓｅ，  Ｄ．Ｌ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００）および「Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」ｖｏｌ．  ９９「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（ＭａｃＮａｌｌｙ，  Ｅ．Ｊ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００）を参照されたい。
【０１７４】
非経口投与は、注射器、場合によってはペン型注射器を使って、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うことができる。あるいは、注入ポンプを使って非経口投与を行うこともできる。さらにもう一つの選択肢は、鼻スプレーまたは肺スプレーの形態でＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを投与するための溶液剤または懸濁剤となりうる組成物である。さらにもう一つの選択肢として、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含有する医薬組成物は、例えば無針注射による、または貼付剤、場合によってはイオントフォレーシス用貼付剤からの経皮投与、または経粘膜（例えば口腔粘膜）投与に適合させることもできる。
【０１７５】
「安定化された製剤」という用語は、物理的安定性が増加しているか、化学的安定性が増加しているか、物理的および化学的安定性が増加している製剤を指す。
【０１７６】
本明細書において使用するタンパク質製剤の「物理的安定性」という用語は、熱機械的応力ならびに／または不安定化する界面および表面、例えば疎水性表面および界面との相互作用にタンパク質が曝された結果として、タンパク質の生物学的に不活性なかつ／または不溶性の凝集体を形成する、タンパク質の傾向を指す。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適当な容器（例えばカートリッジまたはバイアル）に充填した製剤を機械的／物理的応力（例えば撹拌）に、さまざまな温度でさまざまな期間、曝した後に、目視検査および／または濁度測定によって評価される。製剤の目視検査は、背景を暗くしてシャープな集束光（ｓｈａｒｐ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｌｉｇｈｔ）で行われる。製剤の濁度は、例えば０から３までの尺度で濁度をランク付けする視覚スコアによって特徴づけられる（濁りを示さない製剤は視覚スコア０に相当し、昼光下で視覚的濁りを示す製剤は視覚スコア３に相当する）。昼光下で視覚的濁りを示す場合、製剤は、タンパク質凝集に関して物理的に不安定と分類される。あるいは、当業者に周知の簡単な濁度測定によって、製剤の濁りを評価することもできる。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、タンパク質のコンフォメーション状態の分光学的な薬剤またはプローブを使用することによって評価することもできる。プローブは、好ましくは、タンパク質の非ネイティブコンフォーマーに優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴはアミロイドフィブリルの検出に広く使用されてきた蛍光色素である。フィブリルの存在下では、そしておそらく他のタンパク質コンフィギュレーションの存在下でも、フィブリルタンパク質形態に結合した時に、チオフラビンＴは、約４５０ｎｍに新しい励起極大を生じ、約４８２ｎｍに強化された発光を生じる。結合していないチオフラビンＴはこれらの波長では本質的に非蛍光性である。
【０１７７】
他の小分子も、ネイティブ状態から非ネイティブ状態へのタンパク質構造の変化のプローブとして使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、タンパク質の三次構造がネイティブ状態にある場合は、一般に埋没しているが、タンパク質がアンフォールディングまたは変性を始めると、露出した状態になる。これらの小分子分光学プローブの例は、芳香族疎水性色素、例えばアントラセン（ａｎｔｒｈａｃｅｎｅ）、アクリジン、フェナントロリンなどである。他の分光学的プローブは、金属−アミノ酸錯体、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなどの疎水性アミノ酸のコバルト金属錯体などである。
【０１７８】
本明細書において使用するタンパク質製剤の「化学的安定性」という用語は、ネイティブタンパク質構造と比較して潜在的に低下した生物学的力価および／または潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的分解産物の形成につながる、タンパク質構造の化学的な共有結合性の変化を指す。ネイティブタンパク質のタイプおよび性質ならびにタンパク質が暴露される環境に依存して、さまざまな化学的分解産物が形成されうる。化学的分解の排除を全く避けて通ることは、まずできないだろう、そして、当業者には周知のとおり、タンパク質製剤の貯蔵および使用中は、多くの場合、化学的分解産物の量の増加がみられる。大半のタンパク質は、グルタミニル残基またはアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボン酸を形成する過程である脱アミドを起こしやすい。他の分解経路は、２つ以上のタンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用で互いに共有結合して、共有結合による二量体、オリゴマーおよび多量体分解産物の形成をもたらす、高分子量変換産物の形成を伴う（「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」Ａｈｅｒｎ．  Ｔ．Ｊ．  ＆  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｃ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２）。化学的分解のもう一つの形として酸化（例えばメチオニン残基の酸化）を挙げることができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件への暴露後にさまざまな時点で化学的分解産物の量を測定することによって、評価することができる（分解産物の形成は、例えば温度を増加させることによって、加速させうることが多い）。個々の分解産物の量は、さまざまなクロマトグラフィー技法（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび／またはＲＰ−ＨＰＬＣ）を使って、分解産物を分子サイズおよび／または電荷に応じて分離することにより、決定されることが多い。
【０１７９】
したがって、上に概説したように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加しているか、化学的安定性が増加しているか、物理的および化学的安定性が増加している製剤を指す。一般に製剤は、使用期限に達するまでは（推奨される使用および貯蔵条件に従った）使用中および貯蔵中に安定でなければならない。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含む医薬製剤が、使用時に６週間以上、貯蔵時には３年以上安定である。本発明の別の実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含む医薬製剤が、使用時に４週間以上、貯蔵時に３年以上安定である。本発明のさらにもう一つの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含む医薬製剤が、使用時に４週間以上、貯蔵時に２年以上安定である。本発明のさらにもう一つの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを含む医薬製剤が、使用時に２週間以上、貯蔵時に２年以上安定である。
【０１８１】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドおよびそのコンジュゲートの適応症
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する広範な適応症、例えばさまざまながん、例えば転移がん、例えば黒色腫（Ｃ３２黒色腫など）、肉腫、肺癌、乏突起膠細胞種（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｏｍａ）、ヒト脳腫瘍、例えば神経膠腫、白血病、例えばリンパ芽球性白血病および急性骨髄性白血病、ならびに癌、例えば扁平上皮癌および乳癌、腎細胞癌、軟骨肉腫、および膵臓細胞癌などに使用することができる。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのコンジュゲートはがん幹細胞にも使用することができ、したがってがんに発展する前に、その細胞をターゲットとすることができる。ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）に関連する他の状態は、軟骨および／または瘢痕組織の発生の状態である。
【０１８２】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、インビボでの遠隔微小転移の同定、追跡、ターゲティングに使用することができる。造血系のがんを含めて、事実上全ての原発腫瘍は、患者の低い治療成績との関連性が非常に高い転移性疾患へと発展する可能性を秘めている。
【０１８３】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、細胞外ＣＳＰＧの分解を防止しまたは細胞外ＣＳＰＧを修復する化合物、例えば成長ホルモン、抗炎症性化合物またはタンパク質インヒビターを、軟骨組織、関節、および神経組織にターゲティングするために使用することができる。
【０１８４】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、細胞外ＣＳＰＧの分解を強化しまたは細胞外ＣＳＰＧの生産を防止する化合物、例えばＣＳＰＧ分子のタンパク質コアの糖鎖を切断するコンドロイチナーゼＡＢＣ、ＣＳＰＧ生産を減少させるキシロシド、またはＣＳＰＧ生産にとって重要な酵素（例えばコンドロイチンシンターゼまたはコンドロイチン重合化因子）を阻害する薬物（例えば４−フルオロ−グルコサミン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロキシド、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロピラノシド）を、損傷した神経組織にターゲティングするために使用することができる。
【０１８５】
核酸、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびロックト核酸（ＬＮＡ（商標））などにコンジュゲートされたＶＡＲ２ＣＳＡは、ＣＳＡを提示する分子をコードするＲＮＡを除去するために使用することができる。
【０１８６】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのコンジュゲート
細胞毒性部分および検出部分などの治療用または診断用エフェクター部分
本発明のいくつかの態様では、炎症剤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）、ステロイドホルモン、細胞毒性剤などの治療用エフェクター部分、または有機分子、放射性核種、もしくは細胞毒性酵素などの検出剤または検出部分をさらに含む、本開示において定義するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。
【０１８７】
本発明のいくつかの態様では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはＶＡＲ２ＣＳＡ融合タンパク質が、配列番号５７〜５９および７１から選択される１つ以上の配列によって定義される配列、またはその機能的変異体もしくはフラグメントを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはＶＡＲ２ＣＳＡ融合タンパク質が、プロテアーゼインヒビター、例えば塩基性膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、例えば配列番号５７によって定義される配列を、タンパク質配列の末端（例えばＮ末端）に含みうる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドまたはＶＡＲ２ＣＳＡ融合タンパク質が、毒素タンパク質配列、例えば配列番号５８、５９および７１から選択される１つ以上の配列によって定義される配列、例えば免疫原性が低くなるように最適化された毒素タンパク質配列、例えば配列番号５９によって定義される配列を含みうる。いくつかの実施形態では、配列番号５８または５９のシグナル配列ＫＤＥＬが、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡ融合タンパク質に存在し、いくつかの実施形態では、配列番号５８または５９のシグナル配列ＫＤＥＬが、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡ融合タンパク質中に存在しない。したがってシグナル配列ＫＤＥＬは、本発明のコンストラクトにとっては随意でありうる。
【０１９０】
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドに融合またはコンジュゲートすることができる細胞毒性部分の非限定的な例は、がん治療に適したカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、アドリアマイシン、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン、メイタンシノイド、タキソール、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン、メトトレキサートおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの組み合わせなどから選択される化学療法剤である。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドに融合される細胞毒性タンパク質の例は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｎｏａｓ）外毒素Ａ、ジフテリア毒素、リシン毒素、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニンおよびそれらの変異体である。
【０１９１】
アルブミンと、がん用のドキソルビシン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４５：５５２３−３３，  ２００２）および関節リウマチ用のメトトレキサート（ｍｅｔｏｔｒｅｘａｔｅ）（Ｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４７９３−４８０１，  ２００３）とのコンジュゲートは、記述されている。反応性酸素種を増加させる化合物、すなわちピペルロングミン（Ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ）も、記述されている（Ｒａｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：  ２３１−２３４，  ２０１１）。また、標的細胞毒性、すなわち腫瘍細胞の死滅を提供するために、治療用酵素、アポトーシスを誘導する薬剤なども、使用することができる。
【０１９２】
本明細書に記載するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が媒介する溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が媒介する溶解、アポトーシス、同型接着、および／または貪食を誘導することにより、例えばＣＤＣが媒介する溶解および／またはＡＤＣＣが媒介する溶解を誘導することにより、細胞の死滅を媒介しうる。本明細書に記載するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、免疫系の構成要素と、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して相互作用しうる。しかし、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、単に細胞表面上の腫瘍抗原に結合し、よって例えば細胞の増殖を阻止することによっても、作用を発揮しうる。
【０１９３】
本発明によれば、「治療用エフェクター部分」という用語は、治療効果を発揮しうる任意の分子を意味する。本発明によれば、治療用エフェクター分子は、好ましくは、ＣＳＡを発現する細胞に選択的に誘導され、これには、抗がん剤、放射性同位体、毒素、細胞分裂停止薬または細胞溶解薬などが含まれる。抗がん剤は、例えばアントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン）、白金ベースおよび非白金ベースのアルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロルエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、カルムスチン、ダカルバジン、ロムスチン、プロカルバジン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）、タキサン（タキソールおよびドセタキセル（ｄｅｃｅｔａｘｅｌ））、トポイソメラーゼＩインヒビター（カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン）、トポイソメラーゼＩＩインヒビター（アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドおよびアメリカミヤオソウ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｙａｐｐｌｅ）（ポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｐｅｌｔａｔｕｍ））の根に天然に存在する他のアルカロイド派生物）、非アントラサイクリン細胞毒性抗生物質（ダクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシン）、抗ステロイド（例えばアミノグルテチミド）、ヌクレオシド類似体（シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｄｉｎｅ）、フルオロウラシルおよびメルカプトプリン）、代謝拮抗物質（メトトレキサートおよびチオグアニン）、ジクロロジフェニルトリクロロエタン類似体（ミトタンなど）、および反応性酸素種（ＲＯＳ）誘導性化合物（例えば、限定するわけではないが、ピペロングミンおよびβ−フェニルエチルイソチオシアネート）を含む。他の抗がん剤は、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９０，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．の特にＣｈａｐｔｅｒ  ５２「Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス外毒素などのタンパク質でありうる。毒素残基は、コバルト−６０などの高エネルギー放射性核種であってもよい。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、細胞形質膜を横切るＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドとそれに連結された任意の分子の輸送を容易にするために、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と一緒に使用することができる。細胞透過性ペプチドは、がんを含むさまざまな疾患の処置における薬物送達剤や、ウイルス阻害剤として、数多く応用されている。ＣＰＰの例には、次に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：ヒト免疫不全ウイルス由来のトランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）；ｐｅｐ−１（Ｃｈａｒｉｏｔ（商標））；Ｒ８、ａｚｏ−Ｒ８；ＳＭ��Ｃ．（Ｏｋｕｙａｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００７  Ｆｅｂ；４（２）：１５３−９Ｍ；Ｓｏａｎｅ  Ｌ  ａｎｄ  Ｆｉｓｋｕｍ  ＧＪ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ２００５  Ｏｃｔ；９５（１）：２３０−４３；Ｌｏｕｄｅｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００８  Ｄｅｃ  ２１；６（２４）：４５１６−２２）。
【０１９４】
放射性核種
ポリアミノポリカルボキシレートキレーターにカップリングされたここに記載する態様のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、キレーターにカップリングされたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと医学的イメージングに適した放射性核種（これらの放射性各種は、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、４４Ｓｃ、８９Ｚｒおよび８６Ｙからなる群より選択される）または治療に適した放射性核種（これらの放射性核種は２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｃｕ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、２１２Ｐｂ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、２２７Ｔｈおよび９０Ｙからなる群より選択される）との放射性キレートからなる放射標識ポリペプチドを提供するために使用することができ、ここでは、放射性核種が、キレーターなどを介して、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドとの複合体を形成している。
【０１９５】
したがって、ここに記載する態様のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、固形腫瘍または転移、例えば黒色腫患者におけるものを含む、がん細胞の放射線イメージングに使用することができる。
【０１９６】
その実施形態において、ポリペプチドは、いわゆる間接標識法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）を使って、非金属放射性同位体で放射標識することもできる。したがって、例えば１８Ｆ、７６Ｂｒ、さまざまなヨウ素同位体および２１１Ａｔで標識するには、中間「リンカー分子」を標識に使用する。そのようなリンカー分子は、迅速かつ効率のよい放射標識を与える官能基と、タンパク質への、例えばアミン基への、または好ましくはユニークなシステインのチオール基への迅速かつ効率のよいカップリングを可能にする官能基という、２つの官能部分を含有すべきである。例えばマレイミド基はチオール基と反応して安定チオエーテル結合を形成する。「リンカー分子」は、まず放射性ラベルと反応させ、次にタンパク質のチオール基またはセレノチオール基と反応させることができる。
【０１９７】
他の代替的検出部分には、発蛍光団または蛍光色素、例えばヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、Ｒｅｄ６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、テキサスレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲートから選択されるものなどがある。
【０１９８】
発蛍光団または蛍光色素を含む検出部分とのそのようなコンジュゲートは、がん細胞または腫瘍のイメージングに使用することができる。
【０１９９】
ステロイドホルモンまたは抗炎症剤
本発明のいくつかの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを、ステロイドホルモンを含む抗炎症剤とコンジュゲートする。
【０２００】
軟骨および瘢痕組織はＣＳＰＧを多量に含有することが知られている。したがって、非ステロイド抗炎症化合物などの抗炎症剤、疾患修飾抗リウマチ薬（例えばメトトレキサート、アザチオプリン、スルファサラジン、シクロスポリン、ペニシラミン、レフルノミド、または金）、生物学的抗リウマチ薬（例えば腫瘍壊死因子インヒビター、インターロイキン−１−受容体アンタゴニスト、ＣＤ２０抗体、インスリン成長因子１）およびステロイドホルモンまたは代替化合物を、そのような組織に向かわせることは魅力的でありうる。
【０２０１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドを、非ステロイド抗炎症化合物などの抗炎症剤、疾患修飾抗リウマチ薬（例えばメトトレキサート、アザチオプリン、スルファサラジン、シクロスポリン、ペニシラミン、レフルノミド、または金）、生物学的抗リウマチ薬（例えば腫瘍壊死因子インヒビター、インターロイキン−１−受容体アンタゴニスト、ＣＤ２０抗体、インスリン成長因子１）およびステロイドホルモンまたは代替化合物とコンジュゲートする。
【０２０２】
ＣＳＰＧ４とのコンジュゲート
本発明のいくつかの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドをＣＳＰＧ４とコンジュゲートする。
【０２０３】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのＣＳＰＧ４とのコンジュゲートは、免疫化剤として使用することができると考えられる。この用途の目的には、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、抗体を与えるであろうコンフォメーションでＣＳＰＧ４をＴ細胞にディスプレイすることを容易にしうるシャペロンとして機能すると考えられる。したがってＣＳＰＧ４とコンジュゲートされたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドはワクチンに使用することができると考えられる。
【０２０４】
本明細書において使用する用語「ＣＳＰＧ４」は、ＵｎｉｐｒｏｔによりＱ６ＵＶＫ１（ＣＳＰＧ４＿ＨＵＭＡＮ）と同定される２３２２アミノ酸の完全長ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４ならびにその変異体、機能的フラグメント、およびオルソログを指す。ＣＳＰＧ４は、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）またはニューロン−グリア（ｎｅｕｒｏｎ−ｇｌｉａｌ）抗原２（ＮＧ２）と呼ぶこともできる。
【０２０５】
ＣＤ４４または他のプロテオグリカンのターゲティング
がん適応症の処置においてＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのコンジュゲートを使用する目的には、ＣＳＰＧ４発現腫瘍細胞だけでなく、ＣＤ４４発現細胞、例えばがん幹細胞、および例えば限定するわけではないが表１のプロテオグリカンなどのプロテオグリカンを発現する細胞をターゲットとするためにも、本発明のコンジュゲートを使用することができると考えられる。このターゲティングはＣＤ４４抗原上のＣＳＡへの結合によって媒介される。したがって、本発明のコンジュゲートは、ＣＳＰＧ４陰性であるがＣＤ４４陽性である細胞をターゲットとするために使用することができる。これは、ＣＳＰＧ４発現腫瘍細胞のターゲティングの代替法として、またはＣＳＰＧ４発現腫瘍細胞のターゲティングと同時に、使用することができる。
【０２０６】
ＣＤ４４、および／またはＣＳＰＧ４、および／または他のプロテオグリカン、例えば表１に記載のものへの結合によるがん幹細胞の単離における使用
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの、例えばＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのコンジュゲートの形態での、特異的高アフィニティ結合は、ＣＤ４４および／またはＣＳＰＧ４を発現する幹細胞、例えばがん幹細胞を単離するために使用することができる。
【０２０７】
ＣＳＡ含有プロテオグリカンへの結合による循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の単離または検出における使用
本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの、例えばＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのコンジュゲートの形態での、特異的高アフィニティ結合は、１つ以上のＣＳＡ含有プロテオグリカン（例えば表１に記載のもの）を発現する上皮由来および非上皮由来のＣＴＣを単離または検出するために使用することができる。
【０２０８】
抗イディオタイプ抗体
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの使用に代えて、またはその使用に加えて、ＶＡＲ２ＣＳＡを模倣する抗イディオタイプ抗体またはさらにはミモトープを使用することも可能である。抗原エピトープを模倣する抗イディオタイプ抗体を調製するための技術は当技術分野では知られており、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドに結合する第１モノクローナル抗体の用意と、それに続いて該第１抗体のイディオタイプに結合する第２抗体の生産とを必要とする。ミモトープは、ランダムペプチドのライブラリーから単離することができ、このライブラリーは、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドに特異的に結合する抗体に対して、ファージディスプレイでスクリーニングされる。
【０２０９】
抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体、例えば宿主由来抗体に対するヒト抗体であってその宿主由来抗体を阻害するものなどを取得し、スクリーニングするために、ＶＡＲ２ＣＳＡに対する宿主または患者由来の阻害抗体で免疫化することによって調製することもできる。ＶＡＲ２ＣＳＡは一般に、患者における自己免疫反応を引き起こす可能性が低い進化的に洗練されたマラリアタンパク質であるが、処置期間後はそのような免疫反応の可能性を排除することができない。その場合は、抗イディオタイプ抗体を、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと組み合わせて使用するか、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの代用品として使用することができる。
【０２１０】
本発明の具体的実施形態
本明細書において説明するとおり、本発明は、ＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントであって、
ａ）ＩＤ１、および
ｂ）ＤＢＬ２Ｘｂ、ならびに場合によっては
ｃ）ＩＤ２ａ
の連続するアミノ酸配列からなるフラグメントに関する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントがＩＤ２ａを含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントがＩＤ２ａを含まない。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントが、ＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＣ末端または配列内に、ここに定義するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの任意の一部であって、ＩＤ１、ＤＢＬ２Ｘｂ、またはＩＤ２ａの一部ではない部分に由来する、１００アミノ酸以下、例えば９０アミノ酸以下、例えば８０アミノ酸以下、例えば７０アミノ酸以下、例えば６０アミノ酸以下、例えば５０アミノ酸以下、例えば４０アミノ酸以下、例えば３０アミノ酸以下、例えば２０アミノ酸以下、例えば１８アミノ酸以下、例えば１６アミノ酸以下、例えば１４アミノ酸以下、例えば１２アミノ酸以下、例えば１０アミノ酸以下、例えば８アミノ酸以下、例えば６アミノ酸以下、例えば４アミノ酸以下、例えば２アミノ酸以下のアミノ酸配列をさらに含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡの単離されたタンパク質フラグメントが、ＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＣ末端または配列内に、ここに定義するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドのどの部分にも由来しない１００アミノ酸以下、例えば９０アミノ酸以下、例えば８０アミノ酸以下、例えば７０アミノ酸以下、例えば６０アミノ酸以下、例えば５０アミノ酸以下、例えば４０アミノ酸以下、例えば３０アミノ酸以下、例えば２０アミノ酸以下、例えば１８アミノ酸以下、例えば１６アミノ酸以下、例えば１４アミノ酸以下、例えば１２アミノ酸以下、例えば１０アミノ酸以下、例えば８アミノ酸以下、例えば６アミノ酸以下、例えば４アミノ酸以下、例えば２アミノ酸以下のアミノ酸配列をさらに含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）上のコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に、１００ｎＭ未満、例えば８０ｎＭ未満、例えば７０ｎＭ未満、例えば６０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば４０ｎＭ未満、例えば３０ｎＭ未満、例えば２６ｎＭ未満、例えば２４ｎＭ未満、例えば２２ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば１８ｎＭ未満、例えば１６ｎＭ未満、例えば１４ｎＭ未満、例えば１２ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば９ｎＭ未満、例えば８ｎＭ未満、例えば７ｎＭ未満、例えば６ｎＭ未満、または４ｎＭ未満の、ＫＤによって測定されるアフィニティで結合する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、配列番号１の１〜５７７、配列番号３の１〜５９２、配列番号４の１〜５７９、配列番号５の１〜５７６、配列番号１０の１〜５８６、配列番号１１の１〜５７９、配列番号２９の１〜５６５、配列番号３４の１〜５８４、配列番号３６の１〜５６９、配列番号３７の１〜５７５、配列番号３８の１〜５９２、配列番号４１の１〜６０３、配列番号４３の１〜５８８、配列番号４４の１〜５６５、配列番号４５の１〜５８９、配列番号４８の１〜５７３、配列番号５３の１〜５８３、または配列番号５４の１〜５６９のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、配列番号１の５７８〜６４０、配列番号３の５９３〜６５６、配列番号４の５８０〜６４３、配列番号５の５７７〜６４０、配列番号１０の５８７〜６５０、配列番号１１の５８０〜６４３、配列番号２９の５６６〜６２８、配列番号３４の５８５〜６４７、配列番号３６の５７０〜６３２、配列番号３７の５７６〜６３９、配列番号３８の５９３〜６５５、配列番号４１の６０４〜６６７、配列番号４３の５８９〜６５２、配列番号４４の５６６〜６２８、配列番号４５の５９０〜６５３、配列番号４８の５７４〜６３７、配列番号５３の５８４〜６４６、または配列番号５４の５７０〜６３２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、配列番号２、６、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４６、４７、４９、５０、５１、または５２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、配列番号１の１〜５７７、配列番号３の１〜５９２、配列番号４の１〜５７９、配列番号５の１〜５７６、配列番号１０の１〜５８６、配列番号１１の１〜５７９、配列番号２９の１〜５６５、配列番号３４の１〜５８４、配列番号３６の１〜５６９、配列番号３７の１〜５７５、配列番号３８の１〜５９２、配列番号４１の１〜６０３、配列番号４３の１〜５８８、配列番号４４の１〜５６５、配列番号４５の１〜５８９、配列番号４８の１〜５７３、配列番号５３の１〜５８３、または配列番号５４の１〜５６９のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、配列番号１、３〜５、１０、１１、２９、３４、３６〜３８、４１、４３〜４５、４８、５３、および５４からなるリストより選択されるアミノ酸配列からなる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、７００アミノ酸未満、例えば６９０アミノ酸未満、例えば６８０アミノ酸未満、例えば６７０アミノ酸未満、例えば６６０アミノ酸未満、例えば６５０アミノ酸未満、例えば６４０アミノ酸未満、例えば６３０アミノ酸未満、例えば６２０アミノ酸未満、例えば６１０アミノ酸未満、例えば６００アミノ酸未満、例えば５９０アミノ酸未満、例えば５８０アミノ酸未満、例えば５７０アミノ酸未満の長さを有するアミノ酸配列からなる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが実質的に純粋である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下に約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが組換えタンパク質である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質フラグメントが非グリコシル化体である。
【０２２６】
本発明はさらに、例えばがん、関節炎、多発性硬化症および神経損傷後の治癒、軟骨修復、創傷治癒において、および乾癬において、ＣＳＡの発現（例えば不適切な発現）が関与する状態に関連する任意の適応症を処置するための、ここに定義するタンパク質フラグメント、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、または本発明のコンジュゲートに関する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、コンジュゲートまたは融合タンパク質が、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントであるか、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡのタンパク質フラグメントを含む。
【０２２８】
したがって、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、コンジュゲートまたは融合タンパク質は、配列番号１〜７５のいずれかの配列によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含みうる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本発明のＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、配列番号６０〜７０、７２〜７５から選択されるアミノ酸配列からなる。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、がんが、皮膚、眼内または結膜黒色腫、癌（トリプルネガティブおよび化生性乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、精巣癌、基底細胞皮膚癌、明細胞腎細胞癌、角化型頭頸部扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、外陰角化型扁平上皮癌および外陰基底細胞癌）、肉腫（胸部脂肪肉腫、線維肉腫、脱分化型軟骨および脂肪肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、粘液性脂肪肉腫、子宮体部平滑筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫）、造血器がん（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および大顆粒性リンパ腫）、神経上皮組織の腫瘍、例えば星状細胞腫（多形性黄色星状膠細胞腫、原線維性星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢腫瘍、乏突起星細胞腫、神経膠肉腫、神経節膠腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、神経芽細胞腫（感覚神経芽腫および神経節芽細胞腫）、髄芽腫および非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、ならびに他の任意のＣＳＡ発現がんサブタイプから選択される。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、がんが、癌（例えば、限定するわけではないが、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、精巣癌、基底細胞皮膚癌、明細胞腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、外陰角化型扁平上皮癌および外陰基底細胞癌）、肉腫（例えば、限定するわけではないが、線維肉腫、脱分化型軟骨および脂肪肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、粘液性脂肪肉腫、子宮体部平滑筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫、滑膜肉腫、孤立性線維性腫瘍）、造血器がん（例えば、限定するわけではないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および大顆粒性リンパ腫）、神経上皮組織の腫瘍、例えば限定するわけではないが星状細胞種（多形性黄色星状膠細胞腫、原線維性星細胞腫、退形成性星細胞腫、多形性神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢腫瘍、乏突起星細胞腫、神経膠肉腫、神経節膠腫、網膜芽細胞腫、神経細胞腫、神経芽細胞腫（感覚神経芽腫および神経節芽細胞腫）、髄芽腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍およびあらゆるタイプの神経内分泌がんを含む、全てのＣＳＡ発現悪性疾患から選択される。
【０２３２】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの配列を含む配列：
＞ｆｃｒ３  ７４５アミノ酸｜６４０ａａ；下線付きの配列はＦＣＲ３のＩＤ１ドメインに対応し、ボールド体の配列はＦＣＲ３のＤＢＬ２Ｘｂドメインに対応する。残りの配列はＩＤ２ａである。（配列番号１）
【化１】
2018076333.tif 000003
＞ｇｉ｜２５４９５２６１０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３５．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４１ａａ（配列番号２）
【化２】
2018076333.tif 000004
＞Ｍ２４  ７４５アミノ酸｜６５６ａａ（配列番号３）
【化３】
2018076333.tif 000005
＞ＫＭＷＩＩ  ７４５アミノ酸｜６４３ａａ（配列番号４）
【化４】
2018076333.tif 000006
＞１２４８  ７４５アミノ酸｜６４０ａａ（配列番号５）
【化５】
2018076333.tif 000007
＞ｇｉ｜２５４９５２６１８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３９．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５８ａａ（配列番号６）
【化６】
2018076333.tif 000008
＞ｇｉ｜２５４９５２５９２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１２６．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３３ａａ（配列番号７）
【化７】
2018076333.tif 000009
＞ｇｉ｜９０１９３４６７｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３２９．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６９ａａ（配列番号８）
【化８】
2018076333.tif 000010
＞ｇｉ｜２５４９５２６１６｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３８．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３３ａａ（配列番号９）
【化９】
2018076333.tif 000011
＞ｈｂ３１  ７４５アミノ酸｜６５０ａａ（配列番号１０）
【化１０】
2018076333.tif 000012
【０２３３】
＞ｈｂ３２  ７４５アミノ酸｜６４３ａａ（配列番号１１）
【化１１】
2018076333.tif 000013
＞ｇｉ｜９０１９３４７５｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３３３．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６９ａａ（配列番号１２）
【化１２】
2018076333.tif 000014
＞ｇｉ｜２５４９５２６００｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３０．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４４ａａ（配列番号１３）
【化１３】
2018076333.tif 000015
＞ｇｉ｜２５４９５２５９８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１２９．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３４ａａ（配列番号１４）
【化１４】
2018076333.tif 000016
＞ｇｉ｜２５４９５２５９６｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１２８．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３２ａａ（配列番号１５）
【化１５】
2018076333.tif 000017
＞ｇｉ｜９０１９３４６５｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３２８．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６７ａａ（配列番号１６）
【化１６】
2018076333.tif 000018
＞ｇｉ｜９０１９３４７７｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３３４．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６３ａａ（配列番号１７）
【化１７】
2018076333.tif 000019
＞ｇｉ｜２５４９５２５９４｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１２７．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３８ａａ（配列番号１８）
【化１８】
2018076333.tif 000020
＞ｇｉ｜２５４９５２６０２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３１．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４１ａａ（配列番号１９）
【化１９】
2018076333.tif 000021
＞ｇｉ｜２５４９５２６６０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１６０．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５２ａａ（配列番号２０）
【化２０】
2018076333.tif 000022
【０２３４】
＞ｇｉ｜２５４９５２６５２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５６．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４４ａａ（配列番号２１）
【化２１】
2018076333.tif 000023
＞ｇｉ｜２５４９５２６２２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４１．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５０ａａ（配列番号２２）
【化２２】
2018076333.tif 000024
＞ｇｉ｜２５４９５２６２６｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４３．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５９ａａ（配列番号２３）
【化２３】
2018076333.tif 000025
＞ｇｉ｜９０１９３４６９｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３３０．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２７０ａａ（配列番号２４）
【化２４】
2018076333.tif 000026
＞ｇｉ｜２５４９５２６４４｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５２．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３４ａａ（配列番号２５）
【化２５】
2018076333.tif 000027
＞ｇｉ｜２５４９５２６４２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５１．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５１ａａ（配列番号２６）
【化２６】
2018076333.tif 000028
＞ｇｉ｜２５４９５２６５８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５９．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５３ａａ（配列番号２７）
【化２７】
2018076333.tif 000029
＞ｇｉ｜２５４９５２６４０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５０．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３２７ａａ（配列番号２８）
【化２８】
2018076333.tif 000030
＞ｄｄ２ｆｕｌｌ  ７４５アミノ酸｜６２８ａａ（配列番号２９）
【化２９】
2018076333.tif 000031
＞ｇｉ｜２５４９５２６３６｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４８．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５０ａａ（配列番号３０）
【化３０】
2018076333.tif 000032
【０２３５】
＞ｇｉ｜２５４９５２６３８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４９．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３０ａａ（配列番号３１）
【化３１】
2018076333.tif 000033
＞ｇｉ｜２５４９５２６２８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４４．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３４ａａ（配列番号３２）
【化３２】
2018076333.tif 000034
＞ｇｉ｜２５４９５２６３０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４５．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３５０ａａ（配列番号３３）
【化３３】
2018076333.tif 000035
＞Ｐ１３  ７４５アミノ酸｜６４７ａａ（配列番号３４）
【化３４】
2018076333.tif 000036
＞ｇｉ｜２５４９５２６０８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１３４．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４１ａａ（配列番号３５）
【化３５】
2018076333.tif 000037
＞７ｇ８  ７４５アミノ酸｜６３２ａａ（配列番号３６）
【化３６】
2018076333.tif 000038
＞Ｉｎｄｏ  ７４５アミノ酸｜６３９ａａ（配列番号３７）
【化３７】
2018076333.tif 000039
＞ＭＣ  ７４５アミノ酸｜６５５ａａ（配列番号３８）
【化３８】
2018076333.tif 000040
＞ｇｉ｜２５４９５２６５０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５５．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４７ａａ（配列番号３９）
【化３９】
2018076333.tif 000041
＞ｇｉ｜２５４９５２６４８｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５４．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３５ａａ（配列番号４０）
【化４０】
2018076333.tif 000042
【０２３６】
＞ｇｈａｎａ２  ７４５アミノ酸｜６６７ａａ（配列番号４１）
【化４１】
2018076333.tif 000043
＞ｇｉ｜２５４９５２６３４｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４７．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４８ａａ（配列番号４２）
【化４２】
2018076333.tif 000044
＞ｇｈａｎａ１  ７４５アミノ酸｜６５２ａａ（配列番号４３）
【化４３】
2018076333.tif 000045
＞Ｖ１Ｓ１  ７４５アミノ酸｜６２８ａａ（配列番号４４）
【化４４】
2018076333.tif 000046
＞ｒａｊ１１６＿ｖａｒ２５  ７４５アミノ酸｜６５３ａａ（配列番号４５）
【化４５】
2018076333.tif 000047
＞ｇｉ｜３１３２３０４８｜ｇｂ｜ＡＡＰ３７９４０．１｜ｖａｒ２ｃｓａ［熱帯熱マラリア原虫］｜４９０ａａ（配列番号４６）
【化４６】
2018076333.tif 000048
＞ｇｉ｜２５４９５２６２０｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４０．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３５ａａ（配列番号４７）
【化４７】
2018076333.tif 000049
＞Ｔ２Ｃ６  ７４５アミノ酸｜６３７ａａ（配列番号４８）
【化４８】
2018076333.tif 000050
＞ｇｉ｜２５４９５２６３２｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１４６．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３３０ａａ（配列番号４９）
【化４９】
2018076333.tif 000051
＞ｇｉ｜９０１９３４８７｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３３９．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６９ａａ（配列番号５０）
【化５０】
2018076333.tif 000052
【０２３７】
＞ｇｉ｜２５４９５２６４６｜ｇｂ｜ＡＣＴ９７１５３．１｜ＶＡＲ２ＣＳＡ［熱帯熱マラリア原虫］｜３４７ａａ（配列番号５１）
【化５１】
2018076333.tif 000053
＞ｇｉ｜９０１９３４８５｜ｇｂ｜ＡＢＤ９２３３８．１｜赤血球膜タンパク質１［熱帯熱マラリア原虫］｜２６９ａａ（配列番号５２）
【化５２】
2018076333.tif 000054
＞ＭＴＳ１  ７４５アミノ酸｜６４６ａａ（配列番号５３）
【化５３】
2018076333.tif 000055
＞Ｑ８Ｉ６３９（Ｑ８Ｉ６３９＿ＰＬＡＦ７）熱帯熱マラリア原虫（分離株３Ｄ７），６３２ａａ  細胞外部分（配列番号５４）
【化５４】
2018076333.tif 000056
＞Ｑ８Ｉ６３９  （Ｑ８Ｉ６３９＿ＰＬＡＦ７）熱帯熱マラリア原虫（分離株３Ｄ７），完全２７３０ａａ  細胞外部分（配列番号５５）
【化５５】
2018076333.tif 000057
＞ＦＣＲ３（配列番号５６）完全２７３４ａａ  細胞外部分（強調表示した５７７ａａはＩＤ１−ＤＢＬ２ｂに対応する）
【化５６】
2018076333.tif 000058
＞ＢＰＴＩ，プロテアーゼインヒビター（配列番号５７）
【化５７】
2018076333.tif 000059
＞ＰＥ３８，シュードモナス外毒素Ａ（配列番号５８）（ＫＤＥＬの下線はシグナル配列を表し、本発明のコンストラクトには随意でありうる）
【化５８】
2018076333.tif 000060
＞ＰＥ３８ＬＲ，  ＰＥ３８の変異体（配列番号５９）（ＫＤＥＬの下線はシグナル配列を表し、本発明のコンストラクトには随意でありうる）
【化５９】
2018076333.tif 000061
【０２３８】
シュードモナス外毒素Ａの切断型フラグメント（ＰＥ３８）と融合されたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの配列
融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＰＥ３８タンパク質は、修飾、例えばＮ末端のプロテアーゼインヒビター（ＢＰＴＩ）および／または免疫原性が低下している最適化ＰＥ３８配列（ＰＥ３８ＬＲ）を持ちうる。
＞ＢＰＴＩ−ＩＤ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６０）下線付きの配列はＦＣＲ３のＩＤ１ドメインに対応し、ボールド体の配列はＦＣＲ３のＤＢＬ２Ｘｂドメインに対応し、下線付きボールド体配列はＩＤ２ａである。
【化６０】
2018076333.tif 000062
＞ＢＰＴＩ−ＩＤ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８（配列番号６１）
【化６１】
2018076333.tif 000063
＞ＩＤ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８（配列番号６２）
【化６２】
2018076333.tif 000064
＞ＩＤ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６３）
【化６３】
2018076333.tif 000065
＞ＢＰＴＩ−ＤＢＬ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６４）
【化６４】
2018076333.tif 000066
＞ＢＰＴＩ−ＤＢＬ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８（配列番号６５）
【化６５】
2018076333.tif 000067
＞ＤＢＬ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６６）
【化６６】
2018076333.tif 000068
＞ＤＢＬ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８（配列番号６７）
【化６７】
2018076333.tif 000069
＞ＩＤ１−ＩＤ２ａ３Ｄ７−ＰＥ３８（配列番号６８）
【化６８】
2018076333.tif 000070
＞ＩＤ１−ＩＤ２ａ３Ｄ７−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６９）
【化６９】
2018076333.tif 000071
＞ＩＤ１−ＤＢＬ２ｂＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号７０）
【化７０】
2018076333.tif 000072
【０２３９】
＞ＤＴ３８８，ジフテリア毒素の配列（配列番号７１）
【化７１】
2018076333.tif 000073
【０２４０】
ジフテリア毒素の切断型フラグメントと融合されたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの配列
＞ＤＴ３８８−ＤＢＬ１−ＩＤ２ａ  ３Ｄ７（配列番号７２）
【化７２】
2018076333.tif 000074
＞ＤＴ３８８−ＤＢＬ１−ＩＤ２ａ  ＦＣＲ３（配列番号７３）
【化７３】
2018076333.tif 000075
＞ＤＴ３８８−ＩＤ１−ＩＤ２ａ  ３Ｄ７（配列番号７４）
【化７４】
2018076333.tif 000076
＞ＤＴ３８８−ＩＤ１−ＩＤ２ａ  ＦＣＲ３（配列番号７５）
【化７５】
2018076333.tif 000077
【実施例】
【０２４１】
実施例１−切断型組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質の生産
タンパク質切断はすべて、以前明確にされた境界に従って行った（Ｄａｈｌｂａｅｃｋ  Ｍ，  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＬＭ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＭＡ，  Ｃｌａｕｓｅｎ  ＴＭ，  Ｄｉｔｌｅｖ  ＳＢ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：  １５９０８−１５９１７）。簡略化のために、本発明者らはＣＩＤＲＰＡＭドメインを２つのドメインＩＤ２ａとＩＤ２ｂとに分割した、ここで、ＩＤ２ａはＣＩＤＲ様配列を含有しないＣＩＤＲＰＡＭのＮ末端部分であり、ＩＤ２ｂはＣＩＤＲ様配列に相当する。本発明者らは、ＩＤ２ａの９３アミノ酸が組み込まれている新しいＤＢＬ２Ｘ境界も使用した。簡略化のために、本発明者らはこの境界をＤＢＬ２Ｘｂと呼び、古い境界をＤＢＬ２Ｘａと呼ぶことにする。クローニングに使用したプライマーを表２に列挙する。フラグメントは、方法１で述べるように、バキュロウイルス感染昆虫細胞中で、可溶性タンパク質として発現させた。大半のタンパク質は、ＦＣＲ３遺伝子型に基づいて生産された。いくつかのＦＣＲ３フラグメントは発現しなかったので、それらは代わりに３Ｄ７遺伝子型に基づいて作製した。本発明者らはどちらの遺伝子型からの組換えＶＡＲ２ＣＳＡもＣＳＡに等価に結合することを示すので、これらのタンパク質は可換的に使用した。還元試料と非還元試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較したところ、全てのタンパク質が、ゲル移動度のシフトを示した（方法２）。これは、分子内ジスルフィド橋の形成と合致する。いくつかのタンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出される高分子量複合体を形成した。これはおそらく、対を形成していないシステイン間の分子間ジスルフィド橋の形成によるのであろう。これは、ＤＴＴを使ってその複合体を単量体タンパク質に還元することによって確認された。
【０２４２】
［表２］クローニングプライマー
【表２−１】
2018076333.tif 000078
【表２−２】
2018076333.tif 000079
【０２４３】
実施例２−ＦＣＲ３および３Ｄ７由来のＶＡＲ２ＣＳＡは類似するアフィニティおよび特異性でＣＳＡに結合する
ＦＣＲ３感染赤血球（ＩＥ）は、３Ｄ７またはＮＦ５４（ＩＥ）と比較すると、インビトロでＣＳＡにはるかに強く接着する。この相違が、発現されたＶＡＲ２ＣＳＡの配列の相違に関係しているのだとすると、この情報は、接着過程に関与する残基を明確にするために使用することができるだろう。これを検証するために、本発明者らは、ＦＣＲ３について本発明者らが以前調べたものと同じ一連のオーバーラップ３Ｄ７  ＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントを作製した。
【０２４４】
タンパク質をまず特異的ＣＳＰＧ結合について固相結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングした（方法３で説明）。次に、ＣＳＰＧに特異的に結合するタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製することで、純粋な単量体タンパク質を取得し、それを水晶微量天秤（Ａｔｔａｎａ  Ａ１００）での速度論的解析に付した（それぞれ方法２および方法４）。３Ｄ７  ＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントは、固相結合アッセイにおいて、そのＦＣＲ３対応物と極めて類似する結合特徴を示した。同じことが速度論的解析でも言える（表３）。センサーグラムは、異なるタンパク質濃度で収集された会合および解離データを示す。これにより、会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、および平衡定数（ＫＤ）の決定が可能になる。これらのパラメータは、ピーク応答レベルと共に、ＣＳＰＧ結合アフィニティの推定を与える。３Ｄ７フラグメントとＦＣＲ３フラグメントの間に明白な相違はない。いくつかのフラグメントは低いアフィニティを示すが、この特徴は、そのフラグメントの対応物でも保たれている。このことは、３Ｄ７  ＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質とＦＣＲ３  ＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質が、同じ方法でフォールディングし、機能することを示している。
【０２４５】
［表３］作製されたＶＡＲ２ＣＡタンパク質のＣＳＡ結合アフィニティ
水晶微量天秤バイオセンサー（Ａｔｔａｎａ  Ａ１００）を用いる速度論的実験で決定されたＫＤ（ｎＭ）値として、アフィニティを記載する。Ｎ／Ａ：ＣＳＡへの結合を欠くためにＫＤ値を決定することができなかったタンパク質。
【表３】
2018076333.tif 000080
＊（Ｄａｈｌｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  ＪＢＣ，  ２０１１）で公表されたタンパク質
【０２４６】
実施例３−コアＣＳＡ結合部位はＤＢＬ２Ｘドメイン内にある
ＶＡＲ２ＣＳＡ中の最小ＣＳＡ結合領域はＤＢＬ２Ｘ−ＩＤ２ｂ内にあり、完全なアフィニティ結合には隣接ドメインを必要とすることが示唆されている（Ｄａｈｌｂａｅｃｋ  Ｍ，  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＬＭ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＭＡ，  Ｃｌａｕｓｅｎ  ＴＭ，  Ｄｉｔｌｅｖ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：１５９０８−１５９１７）。ここで、本発明者らは、ＣＳＡ結合に必要な領域をさらにマッピングするために、ＶＡＲ２ＣＳＡのさらに短いフラグメントを解析した。
【０２４７】
切断型タンパク質をまずＣＳＡプロテオグリカン（ＣＳＰＧ）への結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングし、次に、それをさらに精製することにより、水晶微量天秤で試験するための単量体を得た（それぞれ方法３、２および４）。最小結合領域はＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘｂである（表３）。この領域は２１．８ｎＭの結合アフィニティを示した、これは完全長ＶＡＲ２ＣＳＡの結合アフィニティに匹敵した。
【０２４８】
胎盤ＩＥは低硫酸化胎盤ＣＳＰＧに高度に選択的である。それらはヘパラン硫酸（ＨＳ）などの他のどのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）にも接着しない。同じことが完全長組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質にも言える。固相結合アッセイは、最小ＣＳＡ結合領域を含有するＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントがＣＳＡに特異的に結合することを示した。これを確認するために、最小結合フラグメントを、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への結合について、水晶微量天秤で、さらに調べた（方法４）。どのフラグメントもＨＳＰＧには結合しなかった。
【０２４９】
実施例４−新規最小結合領域に対して誘導された抗体は強力な寄生虫抗接着免疫応答を誘導した
ＰＭに対するＶＡＲ２ＣＳＡベースのワクチンは、強力な防御免疫応答を誘導することができなければならない。この際、最も重要な側面は、胎盤ゼクエストレーションを阻害する能力を有する抗ＶＡＲ２ＣＳＡ  ＩｇＧ抗体の形成である。本発明者らは、最適なワクチン抗原を設計する目的で、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ相互作用の基礎にある分子機序を調べた。本発明者らが作製したＶＡＲ２ＣＳＡ組換えフラグメントが接着阻止免疫応答を誘導する能力を示すかどうかを検証するために、それらをラットの免疫化に使用した（方法６）。
【０２５０】
ＶＡＲ２ＣＳＡフラグメント特異的血清を、ＣＳＰＧへのＩＥ接着を阻害する能力について調べた（方法１１）。どのＣＳＡ結合フラグメントに対して生じさせた抗体も極めて強力な結合の阻害剤だった。実際、全ての例で、結合はほぼ１００％阻害された。ＤＢＬ１Ｘ−ＤＢＬ２ＸａおよびＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘａは良い阻害剤ではなく、これらのフラグメントのＣＳＡ結合がないことと合致した（表３）。このデータは、これらのＣＳＡ結合タンパク質が適正に折りたたまれて、上に定義した最小結合領域の局在化を裏付けていることを含意している。
【０２５１】
実施例５−抗接着抗体の誘導の原因となるエピトープは最小結合領域内にある
阻害性抗ＦＶ２応答が最小結合領域に対するものであるかどうかを調べるために、本発明者らは、以前記載したＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントのうちの４つで、ＦＶ２抗体をアフィニティ精製した（方法７）。次に、フラグメント特異的抗体を、ＶＡＲ２ＣＳＡ発現寄生虫がＣＳＰＧに結合するのを阻害する能力について試験した（方法１１）。固定化ＩＤ１−ＤＢＬ４ε、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａおよびＩＤ１−ＩＤ２ａで精製した抗体は、寄生虫接着を完全に阻害した。さらにまた、枯渇ＦＶ２試料は、その阻害能のかなりの部分を失った。これは、抗接着抗体を誘導するエピトープがこれらのフラグメント内に存在することを示している。ＤＢＬ１Ｘ−ＤＢＬ２Ｘａで精製した抗体は、低下した阻害能を示し、このフラグメントのＣＳＡ結合がないことと合致する（表３）。このデータは、阻害抗体の誘導の原因となるエピトープが、最小結合領域（ここではＩＤ１−ＩＤ２ａによって例示されている）内に位置することを示唆している。
【０２５２】
実施例６−最小結合領域中の推定ＧＡＧ結合部位を変異させてもＣＳＰＧ結合に影響はない
ＶＡＲ２ＣＳＡとＣＳＡとの間の相互作用の性質を特徴づけることは、多価ＰＭワクチンの設計にとって重要である。この際、主要な部分は、特異的ＣＳＡ結合部位の同定と、その基礎にある化学的相互作用の特徴づけである。最小ＣＳＡ結合領域の配列解析により、保存された２つの推定ＧＡＧ結合部位が明らかになった。一つはＩＤ１領域内に位置し、古典的なカルダン−ワイントラウブ（Ｃａｒｄｉｎ−Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）ＸＢＢＢＸＸＢＸモチーフを有する（Ｃａｒｄｉｎ，  Ａ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｈ．Ｊ．  （１９８９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ９，  ２１−３２）（４５８−ＮＫＫＫＥＣＫＤ−４６５）。ＤＢＬ２Ｘ中のもう一つは同じモチーフを逆向きに持っている（６２５−ＧＫＮＬＫＫＲＹ−６３２）。ＤＢＬ２ＸのＮ末端部分に見いだされる二形性配列モチーフ（ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆ）（ＤＳＭ）がＣＳＡの結合に関与するという仮説も立てられている（Ｓａｎｄｅｒ，  Ａ．  Ｆ．，  Ｓａｌａｎｔｉ，  Ａ．，  Ｌａｖｓｔｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｍａｇｉｓｔｒａｄｏ，  Ｐ．，  Ｌｕｓｉｎｇｕ，  Ｊ．，  Ｎｄａｍ，  Ｎ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ａｒｎｏｔ，  Ｄ．Ｅ．  （２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  ｅ６６６７）。これらの推定部位がＣＳＡ結合に機能を果たしているかどうかを調べるために、本発明者らは古典的ＧＡＧ結合部位中の塩基性アミノ酸をアラニンで置換し、ＤＳＭ領域内の表面露出ループの中央にある１０アミノ酸（５９０−ＫＬＥＮＶＣＥＤＶＫ−６０３）を欠失させた。全ての変異導入はＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａフラグメントで行った。
【０２５３】
推定ＩＤ１およびＤＢＬ２Ｘ  ＧＡＧ結合部位中の塩基性アミノ酸をアラニンで置換してもＣＳＰＧ結合には影響がなかった。ＥＬＩＳＡ（方法３）では、野生型タンパク質と比較してＣＳＰＧ結合の減少が見られなかった。４つのアラニン置換、アラニン置換（Ａｌａｎｉｎｅ  Ｓｕｂ．）Ｋ（４５９，４６０，４６１，４６４）を持つコンストラクトは、かなりのＨＳＰＧ結合を示すが、これは、変異導入に呼応したタンパク質構造の変化が引き起こすのかもしれない。２つの突然変異体アラニン置換Ｋ（６２６，６２９，６３０），Ｒ（６３１）およびアラニン置換Ｋ（４５９，４６０，４６１，４６４）は、陽性対照と類似するＣＳＰＧ結合速度を示した（方法４）。これは、類似するＫＤ値とピーク応答とによって明白である。
【０２５４】
ＤＳＭ領域の欠失は、ＣＳＰＧへの結合を低減しなかった（方法３および方法４）。ＤＳＭノックアウト突然変異体は、ＥＬＩＳＡにおいてＨＳＰＧにかなりの結合を示す。これはおそらく、ＤＢＬ１Ｘの１００アミノ酸を失った間違ったクローニングが引き起こすのだろう。重要なことに、ＣＳＰＧは影響を受けなかった。
【０２５５】
実施例７
ＣＳＰＧへのＶＡＲ２ＣＳＡ結合はイオン相互作用に依存しない
古典的カルダン−ワイントラウブＧＡＧ結合モチーフへの変異導入はＣＳＰＧ結合に影響を及ぼさなかった。これは、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ結合機序が、古典的ＧＡＧ結合モデルにおける一般的な硫酸基結合様式とは異なることを示している。硫酸化ＧＡＧ構造とのイオン相互作用に対する依存性をほとんど示さないＧＡＧ結合タンパク質の例がある。これが当てはまるかどうかを調べるために、本発明者らは多価電解質理論（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｔｈｅｏｒｙ）に従ってイオン依存性を調べた（Ｒｅｃｏｒｄ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｊｒ．，  Ｌｏｈｍａｎ，  Ｍ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｈａｓｅｔｈ，  Ｐ．  （１９７６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０７，  １４５−１５８）。
【０２５６】
グリコサミノグリカンは、ＤＮＡと同様、高度に荷電したポリマーであり、しばしば多価電解質と呼ばれる。陰性荷電基は各ポリマー内で高度な反発エネルギーを受ける。Ｎａ＋などの一価カチオンは陰性荷電基と相互作用することで反発エネルギーを最小限に抑える。硫酸基への塩基性アミノ酸の結合は結合しているカチオンと置き換わり、自由エネルギーの放出をもたらす。結合しているＮａ＋イオンの有利な放出は、多価電解質効果（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれる。
【０２５７】
この理論は、ＧＡＧへのタンパク質の結合を、
【数１】
2018076333.tif 000081
によって記述することができると述べている。式中、ｍは、一つのタンパク質が結合した時に放出されるＮａ＋イオンの数であり、ｆはＮａ＋イオンによって遮蔽されていないアニオンの分率である。したがってこの理論によれば、観測されるＫＤ値は、
【数２】
2018076333.tif 000082
により、イオン性寄与と非イオン性寄与とに関係する。式中、ＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃはイオン相互作用が存在しない場合の解離定数である。Ｌｏｇ［Ｎａ＋］に対するＬｏｇＫＤ，ｏｂｓｅｒｖｅｄのプロットは傾きｍ（１−ｆ）の直線である。したがって、もし非遮蔽アニオンの分率（ｆ）が既知であれば、結合に関与するイオン相互作用の数を決定することができる。ヘパリンの場合、（１−ｆ）は０．８である（Ｏｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｔ．，  Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ，  Ｈ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋ，  Ｉ．（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６，  ６３４２−６３５２）。この値はＣＳＡについてはわかっていないが、（１−ｆ）は１を超えることができない。そこで我々は、関与するイオン相互作用の最大数を見積もることができる。さらにまた、［Ｎａ＋］＝１Ｍの場合、Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＝０であり、これは、このＮａ＋濃度ではＬｏｇＫＤ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ＝ＬｏｇＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃであることを意味する。
【０２５８】
本発明者らは、１：２希釈系列で４００ｎＭタンパク質から１．６５ｎＭタンパク質まで結合のタイトレーションを行うことにより、異なる濃度のＮａＣｌ（１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ）において、ＣＳＰＧへのＦＶ２、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａおよびＩＤ１−ＩＤ２ａの結合を、固相結合アッセイで調べた（方法５）。ＫＤ観測値は、最大（Ｂｍａｘ）半値応答を与えるタンパク質濃度として決定された。これはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて非線形回帰（ヒル係数の最小二乗フィッティング）を使って行った。これ以上高い塩濃度は、結合がほぼ完全に阻害されるので、含めなかった。これはおそらくタンパク質構造の変化によるのであろう。この考えは、ＬｏｇＫＤ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ対Ｌｏｇ［Ｎａ＋］が１５０ｍＭと３００ｍＭの間でのみ直線であるという事実（これはこれより高いＮａＣｌ濃度では他の因子が関与することを示唆している）によって裏付けられる。
【０２５９】
ＬｏｇＫＤ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ対Ｌｏｇ［Ｎａ＋］は線形関係を示す。傾きｍ（１−ｆ）はＩＤ１−ＩＤ２ａでの２．７と完全長（ＦＶ２）での３．４との間にある。我々はｆの値を知らないが、結合に関与するイオン相互作用の最大数は２と３の間にあるに違いない。完全長タンパク質についての値が、短いフラグメントより高く、このタンパク質がＣＳＰＧと余分なイオン相互作用をすることを示している点は興味深い。１５０ｎＭ  ＮａＣｌは生理学的ＮａＣｌ濃度であるので、この濃度におけるＫＤ値を、ここでの基準点とする。線形関係を外挿し、ｙ切片を求めることにより、本発明者らは、ＦＶ２についてはＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝５．９μＭ、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａについてはＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝３．４μＭ、およびＩＤ１−ＩＤ２ａについてはＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝０．７μＭであることを見出した。これらと基準点（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の対数値を比較することで、本発明者らは、ＶＡＲ２ＣＳＡ結合の２５〜３５％がイオン相互作用で説明することができると推定する。これは、ＶＡＲ２ＣＳＡに対する高いＣＳＡアフィニティを、硫酸化ＧＡＧ構造とのイオン相互作用だけでは説明できないことを示唆している。この高いアフィニティは、ＣＳＡ糖質主鎖と多価相互作用する複雑な結合部位によって達成されるのだろう。
【０２６０】
実施例８
ＶＡＲ２ＣＳＡ最小ＣＳＡ結合領域はがん細胞の広範なパネルに特異的に結合する
多くの異なるがん細胞が、プロテオグリカンＣＳＰＧ４の高発現と関連付けられている。この分子は、最初は黒色腫のマーカーとして記載されたが、最近になって、がん幹細胞を含む多くの形態のがんに見出されている。ＣＳＰＧ４に取り付けられているＣＳ鎖は主としてＣＳＡであることが知られている。最も小さいＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントの一つ（ＩＤ１−ＩＤ２ａ）を、さまざまな癌細胞株の大きなパネルへの結合について、フローサイトメトリーによって解析した（方法１２ａおよび方法１２ｂ）。非ＣＳＡ結合タンパク質ＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘａを陰性対照として使用した。ＶＡＲ２ＣＳＡ組換えタンパク質（ＩＤ１−ＩＤ２ａ）は、皮膚黒色腫（Ｃ３２、ＭｅＷｏ）、肺癌（Ａ５４９）、乳癌（ＨＣＣ１３９５）、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ）、横紋筋肉腫（ＲＨ３０）を含め、ＣＳＰＧ４を転写（マイクロアレイデータ）する全ての癌細胞株に、７５ｎＭで強く結合する（表４および表５）。このタンパク質は、ＣＳＰＧ４を発現しない皮膚Ｔ細胞性リンパ腫にも強く結合する（表４）。陰性対照タンパク質ＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘａは、試験したどの細胞株にも結合しなかった（表４）。加えて、ＩＤ１−ＩＤ２ａは、対照細胞として使用したヒト赤血球とは相互作用しなかった。野生型およびＧＡＧ欠損型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞も、ＩＤ１−ＩＤ２ａ相互作用について解析した。ＩＤ１−ＩＤ２ａについて見られた野生型ＣＨＯ細胞との強い相互作用は、ＧＡＧ合成が破壊されているＣＨＯ−７４５細胞株を解析すると、完全に消滅していた。相互作用のＣＳＡ特異性は、ＶＡＲ２ＣＳＡをＣＳＡ、ＣＳＣまたはＨＳと前もって混合することで細胞へのＶＡＲ２ＣＳＡ結合を阻害することによっても立証された。ＣＳＣとＨＳが結合に何も影響を及ぼさなかったのに対し、ＣＳＡは、がん細胞へのＶＡＲ２ＣＳＡの結合を効率よく抑止した。
【０２６１】
これらの結果に続いて、がん細胞のさらに大きなパネルを、ＶＡＲ２ＣＳＡのＤＢＬ１−ＩＤ２ａフラグメントまたはＩＤ１−ＩＤ２ａフラグメントを使って、フローサイトメトリーによってスクリーニングした（表６および表７）。このスクリーニングの主目的は、インビボでの異種移植片モデル化に適した細胞株を同定することである。
【０２６２】
［表４］ＶＡＲ２ＣＳＡの最小結合ドメイン（ＩＤ１−ＩＤ２ａ）を使ったがん細胞株および陰性対照細胞の染色
細胞を培地のみ（ブランク）または７５ｎＭの組換えタンパク質（ＩＤ１−ＤＢＬ２またはＩＤ１−ＩＤ２ａ）と共に３０分間インキュベートし、次に、１：８００で抗Ｖ５−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、各インキュベーションの間に細胞を３回洗浄した。ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って最低５０００細胞から記録された平均ＦＩＴＣ蛍光値を示す。
【表４】
2018076333.tif 000083
【０２６３】
［表５］組換えＶＡＲ２ＣＳＡを使ったがん細胞株の染色
細胞を培地のみ（ブランク）または７５ｎＭの組換えタンパク質（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａまたはＩＤ１−ＩＤ２ａ）と共に３０分間インキュベートし、次に、１：８００で抗Ｖ５−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、各インキュベーションの間に細胞を３回洗浄した。ＨＡＬ１００  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使った最低４つの高倍率視野像から記録されたＦＩＴＣ蛍光強度の中間スコア（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｃｏｒｅ）を示す。ＮＳ：染色なし；＋：弱い；＋＋：中間；＋＋＋：強い；＋＋＋＋：極めて強い。
【表５】
2018076333.tif 000084
【０２６４】
［表６］組換えＶＡＲ２ＣＳＡ（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａまたはＩＤ１−ＩＤ２ａを使用）の結合に関する多様なヒトがん細胞株のスクリーニング
方法１２で述べるようにフローサイトメトリーによって結合を測定した。
ＮＳ：染色なし；＋：弱い；＋＋：中間；＋＋＋：強い；＋＋＋＋：極めて強い。
【表６】
2018076333.tif 000085
【０２６５】
［表７］組換えＶＡＲ２ＣＳＡ（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａまたはＩＤ１−ＩＤ２ａを使用）の結合に関する、より多くのヒト細胞がん細胞株のスクリーニング
方法１２で述べるようにフローサイトメトリーによって結合を測定した。
表示の値は２００ｎＭのタンパク質濃度を使った場合の平均蛍光強度である。
【表７】
2018076333.tif 000086
【０２６６】
実施例９
組換えＶＡＲ２ＣＳＡはがん細胞に高いアフィニティで結合する
水晶微量天秤バイオセンサー（Ａｔｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  ２００）を使って、がん細胞株Ｃ３２黒色腫および２つのＣｈｏ細胞株（実施例８に記載）への組換えＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントＤＢＬ１−ＩＤ２ａの結合アフィニティを解析した。それぞれの新たなタンパク質注入の間に結合表面の再生を行いながら、タンパク質の２倍希釈系列（２５〜４００ｎＭ）を、細胞表面への結合について解析した。結合アフィニティは名のモル濃度域にあると推定され（表８）、これは純粋な受容体への結合アフィニティに似ている（表３）。
【０２６７】
［表８］ＣＳＡを発現するがん細胞（Ｃ３２およびＣｈｏ野生型）への組換えＤＢＬ１−ＩＤ２ａ（大腸菌）の推定結合アフィニティ（ＫＤ）とＣＳＡ陰性細胞株（Ｃｈｏ７４５）への結合の欠如
Ｎ／Ａ：細胞への結合を欠くためにＫＤ値を決定することができなかった。
【表８】
2018076333.tif 000087
【０２６８】
実施例１０
組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質はがん組織に高い特異性で結合する
ヒト患者から得た初代がん組織への組換えＶＡＲ２ＣＳＡの結合を、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使って調べる。陽性対照としてヒト胎盤組織を使用し、陰性対照として扁桃および肝臓組織を使用して、この方法を開発した。染色プロトコールは、エピトープ回復なしで、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴプラットフォームにおいて最適化した。ガラススライド上にスポットしたパラフィン包埋組織を０．１〜５００ｎＭのＶ５−ＶＡＲ２ＣＳＡ（ＩＤ１−ＩＤ２ａ）またはＶ５−対照タンパク質（ＤＢＬ４）と共に室温で１時間インキュベートし、８分間洗浄し、１：７００マウス抗Ｖ５抗体と共に３０分間インキュベートし、８分間洗浄した。次に、結合している抗Ｖ５を、ＵｌｔｒａＭａｐ抗マウスＨＲＰを使って検出した。Ｖ５−ＶＡＲ２ＣＳＡは０．５ｎＭ濃度でヒト胎盤を染色するが、扁桃または正常な肝臓では染色がない。反応緩衝液に２００μｇ／μｌのＣＳＡを加えることにより、染色を完全に阻止することができる。Ｖ５−対照タンパク質は試験したどの濃度でもヒト胎盤組織を染色しない。２４の正常臓器を表す多臓器組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は１ｎＭ  Ｖ５−ＶＡＲ２ＣＳＡでの染色時に低い染色または無染色を示したが、胸部、大腸、直腸、前立腺、腎臓、肝臓、膀胱、膵臓、扁平細胞、肺、胆嚢、胃、精巣、卵巣、子宮、副腎、甲状腺および胸腺、造血系、ならびに結合組織（肉腫）のがん標本は、ヒト胎盤陽性対照組織と同等またはそれ以上の強度で、陽性に染色された（表９）。
【０２６９】
［表９］組換えＶＡＲ２ＣＳＡを使った初代ヒト腫瘍標本上のＣＳＡの検出。表は、主要ながん群について、実施例１０で述べたように染色された陽性症例数／総症例数を示す。陽性染色は胎盤組織で観察されるものと等しいかそれ以上の強度と定義する。
【表９】
2018076333.tif 000088
【０２７０】
実施例１１
組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質による形質転換パラメータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ）の阻害
インビトロでの腫瘍細胞形態に対する、カップリングされていないＶＡＲ２ＣＳＡの阻害効果を、３つの異なるアッセイで調べる：
ｉ）軟寒天コロニー形成アッセイでは、三次元マトリックスで増殖するがん細胞の能力を、ＶＡＲ２ＣＳＡが阻害できるかどうかを扱う。
ｉｉ）遊走アッセイでは、ボイデンチャンバーにおいて化学誘引物質に向かって垂直に遊走するがん細胞の能力を、ＶＡＲ２ＣＳＡが阻害できるかどうかを扱う。
ｉｉｉ）浸潤アッセイでは、人工基底膜を通って侵入するがん細胞の能力を、ＶＡＲ２ＣＳＡが阻害できるかどうかを扱う。
【０２７１】
軟寒天コロニー形成アッセイ：細胞を２５〜１００ｎＭ  ＶＡＲ２ＣＳＡで２４時間処理してから軟寒天マトリックスに播種し、３７℃で１０〜１２日間放置する。位相差顕微鏡で画像をキャプチャし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量する。組換えＶＡＲ２ＣＳＡは、ＭＧ６３骨肉腫およびＲＨ３０横紋筋肉腫細胞の軟寒天コロニー形成を、７５〜１５０ｎＭの濃度で阻害する。
【０２７２】
基底膜抽出物（ＢＭＥ）コート細胞浸潤アッセイ：浸潤過程をモデル化するために、本発明者らは、ＣｕｌｔｒｅＣｏａｔ（登録商標）２４ウェルＢＭＥコート細胞浸潤プラットフォーム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、製造者のプロトコールに従い、以下の改変を加えて利用した。アッセイの１日前に、２５〜１００ｎＭ  ＶＡＲ２ＣＳＡの存在下または非存在下で、細胞を血清飢餓させる。２日目に、上記の条件下で維持した細胞を、上室にプレーティングし（１×１０５細胞／ウェル）、下室には陰性対照として血清枯渇培地を含めるか、または１０％ＦＢＳを補足した培地を含めた。次に細胞をさらに１８時間インキュベートする。ＢＭＥを通って侵入する細胞を、カルセインＡＭを含有する解離緩衝液を使って収集する、このカルセインＡＭは生細胞内で蛍光性の高い化合物へと転化する。放射された蛍光を蛍光プレートリーダーを使って測定し、ＦＬＵＯＳｔａｒソフトウェアによって解析し、標準曲線に当てはめ、対応する細胞数へと変換する。
【０２７３】
遊走アッセイ．遊走アッセイは、基底膜抽出物（ＢＭＥ）コート細胞浸潤アッセイと本質的に同じ手法であるが、ＢＭＥを使わない。
【０２７４】
ＭＧ６３骨肉腫、ＲＨ３０横紋筋肉腫、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳がんの遊走および浸潤能力は、７５〜１５０ｎＭ組換えＶＡＲ２ＣＳＡによって阻害される。
【０２７５】
実施例１２
ＣＳＡ含有プロテオグリカンによって調節されるがん細胞形質転換パラメータを制御する細胞内シグナリング事象の解析
ＣＳＰＧ４は、Ｒａｓ、Ｒａｃ１およびＰＩ３キナーゼ依存的機序によって増殖、遊走および浸潤を助長する。実施例１０で得られた結果に基づいて、本発明者らは、増殖、遊走および浸潤の潜在的ＶＡＲ２ＣＳＡ媒介性阻害につながる細胞内シグナリング事象を調べることにする。これは、Ｒａｃ１活性化アッセイ、経路構成要素の免疫ブロッティング、および反応性酸素種（ＲＯＳ）生成の細胞内測定など（ただしこれらに限るわけではない）、最新の生化学的および分子生物学的方法を使って行われる。この一連の実験により、ＣＳＡ含有プロテオグリカンへのＶＡＲ２ＣＳＡ結合が影響を及ぼすシグナリング経路が明白になるであろう。
【０２７６】
Ｒａｃ１活性アッセイ：Ｒａｃ１活性アッセイは、製造者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、無処理のままの、または組換えＶＡＲ２ＣＳＡで処理した、適当なヒトがん細胞株で行われる。
【０２７７】
反応性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ：ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、製造者のガイドラインに従って、粗ＲＯＳレベルを測定する。スーパーオキシドレベルは、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を使って測定されるであろう。スーパーオキシドアニオンＯ２−の存在下で、ジヒドロエチジウムは迅速に酸化されてオキシエチジウムになり、これがＤＮＡに結合し、４８８ｎｍで励起すると、５７０〜５８０ｎｍ域の光を放射する。細胞培養の場合、適当な処理の後、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、１０μＭ  ＤＨＥを含有するＨＢＳＳ中で３０〜６０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄し、落射蛍光ＨＡＬ１００顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で、オキシエチジウム蛍光について直接解析する。腫瘍切片の場合、クライオスタットを使って瞬間凍結腫瘍を２０μｍ切片に切断し、洗浄し、細胞株について述べたようにＤＨＥ処理し、カバースライドにマウントし、細胞株と同様に解析する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使って、オキシエチジウム発光を解析し、定量する。全ての腫瘍標本について、組織の完全性および病態を確かめるために、標準的方法を使って、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を並行して行う。予備データは、組換えＶＡＲ２ＣＳＡが、ＭＧ６３細胞およびＵ２ＯＳ細胞におけるＲＯＳ生成を阻害することを示している。
【０２７８】
免疫検出．免疫ブロッティングのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しニトロセルロースメンブレンに転写したタンパク質を、適切な一次抗体と適当な二次抗体、ＥＣＬウェスタンブロッティング試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびフィルム（ＫｏｄａｋおよびＣｏｖａｎｃｅ（ＨＡ）で検出する。顕微鏡法では、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、適当な一次抗体と共にインキュベートし、適当な二次ＦＩＴＣコンジュゲート抗体と共にインキュベートし、実施例９で述べたように、顕微鏡法によって解析する。ヒトがん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＧ６３、Ｕ２ＯＳ、ＴＣ３２、ＴＣ７１およびＲＨ３０）を、組換えＶＡＲ２ＣＳＡ（ＩＤ１−ＩＤ２ａ）または対照タンパク質（ＤＢＬ４）と共に、２４時間、血清飢餓させ、血清を再び細胞に加えた後、０、１、２、３、４、５、６および１２時間の時点で、溶解物を調製した。このアプローチを使うと、１００ｎＭ  ＶＡＲ２ＣＳＡは、がん原遺伝子チロシンプロテインキナーゼＳｒｃのＴ４１６でのリン酸化、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のＴ３９７におけるリン酸化、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１−および２の、ヒトＥＲＫ１ではＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４におけるリン酸化、ヒトＥＲＫ２ではＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７におけるリン酸化を、効率よく阻害した。これは、組換えＶＡＲ２ＣＳＡが、がん細胞におけるカノニカルＥＲＫシグナリングを阻害することを示唆している。
【０２７９】
実施例１３
組換えＶＡＲ２ＣＳＡによって修飾される細胞内シグナリング事象の不偏解析（ｕｎｂｉａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＶＡＲ２ＣＳＡが細胞内シグナリング事象に与える幅広い影響は、発現マイクロアレイ技術を使って解析することができる。ＭＧ６３骨肉腫細胞を、処置なしで、またはＶＡＲ２ＣＳＡもしくは対照（ＤＢＬ４）と共に、２４時間血清飢餓させ、１時間の血清添加後にＲＮＡを収穫した。全ＲＮＡを品質検査し（ＲＩＮ＜８）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）プローブ構築用のテンプレートとして使用し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａｐｌｕｓ２．０（登録商標）チップシステムにハイブリダイズさせた。この読出しは、血清を１時間戻した後に活性化されたまたは不活化されたシグナリングのスナップショットになる。予備データにより、ＥＲＫシグナリングに対する阻害効果が確認された。
【０２８０】
実施例１４
組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質によるインビボでのがん細胞成長の阻害
免疫不全マウスにおけるインビボ皮下および転移異種移植片モデルには、インビトロ解析からの結果に基づいて、適当な細胞株が選択されるであろう。インビボ試験が取り扱うのは、次に挙げる５つの主要な疑問である：
ｉ）ｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与された組換えＶＡＲ２ＣＳＡは、インビボで、ヒトがん細胞をトレースし、ヒトがん細胞に結合することができるか？
ｉｉ）組換えＶＡＲ２ＣＳＡのｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与は、インビボで腫瘍形成を阻害することができるか？
ｉｉｉ）組換えＶＡＲ２ＣＳＡのｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与は、インビボで、樹立した腫瘍の成長を阻害することができるか？
ｉｖ）組換えＶＡＲ２ＣＳＡのｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与は、インビボで、ヒトがん細胞の転移拡散を阻害することができるか？
ｖ）組換えＶＡＲ２ＣＳＡのｉ．ｖ．投与またはｉ．ｐ．投与は、インビボで、ヒトがん細胞における、ＣＳＡ含有プロテオグリカンが支配するシグナリング事象を変化させるか（剖検病理学および生化学）？
【０２８１】
インビボモデル：ＶＡＲ２ＣＳＡへの強い結合を示すがんタイプを代表する選択したがん細胞株を、Ｒａｇ２ｍまたはＳＣＩＤ免疫不全マウスの皮下に、およそ５×１０６細胞／匹の割合で接種する。腫瘍が樹立されたら、マウスに媒体（食塩水）および組換えＶＡＲ２ＣＳＡ（１ｍｇ／Ｋｇ）の初回注射を与える。約３０日間にわたる実験期間を通して処置を週に１回繰り返す。動物の体重と腫瘍体積を２日ごとまたは３日ごとおよび最後に測定し、腫瘍を取り出し、半分に分割し、片方を液体窒素中で瞬間凍結し、他方をパラフィンに包埋する。瞬間凍結腫瘍を、実施例１１で述べたように（ＤＨＥ）スーパーオキシド検出用に加工する（同じ腫瘍標本の対応するヘマトキシリンおよびエオシン［Ｈ＆Ｅ］染色も行う）。
【０２８２】
実施例１５
トレーサーをカップリングした組換えＶＡＲ２ＣＳＡペプチドによるインビボでの微小転移の追跡
組換えＶＡＲ２ＣＳＡは、社外パートナーと協力して、または契約に基づく同意による外部委託で、応用可能な異なるトレーサー分子にカップリングされるであろう。トレース可能な組換えＶＡＲ２ＣＳＡ分子を、異種移植片マウスモデルとトランスジェニックマウスモデルとの両方で、微小転移を追跡しレポートするその能力について解析する。インビボモデルは実施例１２で述べたように樹立される。トレーサーをカップリングしたＶＡＲ２ＣＳＡをインビボで試験するために、転移がんを持つマウスを、微小転移を追跡し、そこに結合するＶＡＲ２ＣＳＡの能力について、インビボイメージングによって解析する。
【０２８３】
実施例１６
組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質のインターナリゼーション
組換えＶＡＲ２ＣＳＡはがん細胞によってインターナライズされる。これは、まずＶＡＲ２ＣＳＡフラグメント（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａ）を発蛍光団とコンジュゲートし、次にＶＡＲ２ＣＳＡの取り込みを、ライブイメージングによって解析すると共に、固定細胞でも解析することによって示された。がん細胞株（Ｃ３２黒色腫およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を播種し、６０〜８０％コンフルエントまで終夜成長させた。細胞を発蛍光団コンジュゲートＶＡＲ２ＣＳＡと共に４℃で１０〜１５分間インキュベートして、ＶＡＲ２ＣＳＡを表面結合させた。次に、細胞を洗浄して未結合のＶＡＲ２ＣＳＡを除去してから、３７℃でインキュベートすることにより、１０分間、１時間、２時間、４時間および最長２２時間のインターナリゼーションを開始した。最終的にリソソームに至るトランスフェリンの古典的クラスリン依存性取り込みを追跡するために、発蛍光団コンジュゲートトランスフェリンを使用した。加えて、いくつかの実験については、リソソームを検出するために、発蛍光団コンジュゲートデキストランを使用した。ライブイメージング解析により、ＶＡＲ２ＣＳＡはおよそ４時間後にリソソームに到達し始め、２２時間後には全てのＶＡＲ２ＣＳＡがリソソームコンパートメントに局在化されうることが示された。しかし、ＶＡＲ２ＣＳＡとトランスフェリンとの共局在はほとんどなく、ＶＡＲ２ＣＳＡはトランスフェリンよりはるかに遅く取り込まれた。組換えＶＡＲ２ＣＳＡががん細胞によって取り込まれるという事実から、がん細胞の内部で活性になる細胞毒性化合物にＶＡＲ２ＣＳＡを融合またはコンジュゲートすることが可能になる。表１０に、組換えＶＡＲ２ＣＳＡのインターナリゼーションについて試験した表示のがん細胞株からの結果を要約する。
【０２８４】
［表１０］細胞を培地のみ（ブランク）または７５ｎＭの組換えタンパク質（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａまたはＩＤ１−ＩＤ２ａ）と共に１時間インキュベートした後、１：８００で抗Ｖ５−ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートし、各インキュベーションの間に細胞を３回洗浄した。ＨＡＬ１００  Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使った最低４つの高倍率視野像から記録された形質膜または細胞内構造のどちらかにおけるＦＩＴＣ蛍光強度の中間スコアを示す。スコアリングシステムは次のとおりである：
＋：弱い；＋＋：中間；＋＋＋：強い；＋＋＋＋：極めて強い。
【表１０】
2018076333.tif 000089
【０２８５】
実施例１７
融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−毒素タンパク質はがん細胞を殺す
ＤＢＬ１−ＩＤ２ａおよびＩＤ１−ＩＤ２ａ  ＶＡＲ２ＣＳＡ遺伝子フラグメントを、シュードモナス外毒素Ａおよびジフテリア毒素に、さまざまなコンストラクトとして融合した（配列番号６０〜７０、７２）。これらの融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−毒素タンパク質を大腸菌で発現させる。ＶＡＲ２ＣＳＡ由来のＩＤ１−ＩＤ２ａとＰＥ３８とに基づくＢＰＴＩ−ＩＤ１−ＩＤ２ａＦＣＲ３−ＰＥ３８ＬＲ（配列番号６０）と呼ばれるタンパク質コンストラクトは生産に成功しており、がん細胞への結合（表１１）と、方法１３に述べる細胞毒性活性について解析されている。予備データは、この融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−毒素タンパク質がＣＳＡ発現がん細胞に結合すること、および細胞死を誘発できることを示している（Ｕ２ＯＳ細胞株の場合、ＩＣ５０は１ｎＭ未満である）。
【０２８６】
［表１１］フローサイトメトリーで解析したがん細胞へのＶＡＲ２ＣＳＡ−ＰＥ３８の結合
Ｍｙｌａ２０５９細胞（Ｔ細胞リンパ腫）への、２００ｎＭのＤＢＬ１−ＩＤ２ａ（裸のタンパク質）およびＩＤ１−ＩＤ２ａ−ＰＥ３８の結合を、抗ペンタＨＩＳ抗体および抗マウス−ＦＩＴＣ抗体で検出し、フローサイトメトリーによって解析した。結合を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として記載する。ａ）細胞表面からＣＳ鎖を除去するために細胞をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した、ｂ）タンパク質を可溶性ＣＳＡ（４００μｇ／ｍ）と混合してから細胞に加えた、ｃ）対照は、第１層および第２層の抗体だけで染色された細胞に等しい。
【表１１】
2018076333.tif 000090
【０２８７】
実施例１８
組換えＶＡＲ２ＣＳＡにカップリングされた細胞毒性化合物の抗腫瘍効果の解析
実施例１４での結果に基づいて、組換えＶＡＲ２ＣＳＡを関連細胞毒性化合物にカップリングして、その働きをインビボで試験することになるだろう。ＶＡＲ２ＣＳＡへの関連化合物のカップリングは、社外パートナーと協力して、または契約に基づく同意による外部委託で、行われるであろう。特に、本発明者らは、これらのＶＡＲ２ＣＳＡ：化合物−融合物が
ｉ）インビボで腫瘍環境に特異的に送達されうるかどうか、
ｉｉ）インビボの腫瘍環境において特異的に濃縮され（ｕｐ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）、保持されうるかどうか、
ｉｉｉ）インビボで、正常組織への損傷を最小限に抑えつつ、腫瘍細胞を特異的に殺すことができるかどうか、
を解析する。インビボモデルは実施例１２で述べたように樹立される。非コンジュゲートタンパク質について実施例１２で述べたように、マウスを細胞毒性ＶＡＲ２ＣＳＡコンジュゲートで処置し、アッセイする。
【０２８８】
実施例１９
不均一細胞集団からのＣＳＡ発現幹細胞の精製
多能性幹細胞は高レベルのＣＳＰＧ４を発現すると報告されている。幹細胞は、ＶＡＲ２ＣＳＡが結合することのできる他のＣＳＡ含有プロテオグリカン、例えばＣＤ４４も発現する。そこで、組換えＶＡＲ２ＣＳＡを適当な樹脂（ビーズ）にコンジュゲートし、不均一な、しかし幹細胞またはがん幹細胞を含有する細胞集団と混合し、従来の遠心分離プロトコールで精製することが考えられる。精製された細胞は、免疫ブロッティング（実施例１１と同様）、顕微鏡法およびＦＡＣＳ（実施例９と同様）により、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ネスチンおよびＮａｎｏｇを含む多様な幹細胞マーカーの発現について解析されるであろう。がん幹細胞の一般的形質は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａの高発現（ＡＬＤＨ１  Ｈｉｇｈ）である。これはＡｌｄｅＦｌｕｏｒ（登録商標）キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って便利に測定することができる。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１への組換えＶＡＲ２ＣＳＡ結合は、ＡＬＤＨ１  Ｈｉｇｈ細胞の亜集団を検出することから、ＶＡＲ２ＣＳＡがヒトがん幹細胞に結合できることが示唆される。
【０２８９】
実施例２０
ＣＤ４４発現がん幹細胞の同定およびターゲティング
ＣＤ４４は現在最もよく知られているがん幹細胞のマーカーであり、これは、組換えＶＡＲ２ＣＳＡに結合することができるＣＳＡ含有プロテオグリカンである。実施例１２〜１５と同じアプローチを使うことにより、無修飾および修飾組換えＶＡＲ２ＣＳＡペプチドが高抵抗性ＣＤ４４陽性がん幹細胞の位置を特定し、それに結合し、それを精製し、潜在的にそれを殺すことができるかどうかが調べられるであろう。
【０２９０】
実施例２１
循環腫瘍細胞の検出
本発明者らは、組換えＶＡＲ２ＣＳＡをがん再発の予後マーカーとして使用することができるかどうかを調べるであろう。がん細胞は、原発腫瘍から剥離した後、血液系を通って拡散する。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の発生に続くリスクは血管外遊出と転移である。ＣＴＣを検出するために使用されている現在のアッセイは感度が低く、転移のリスクと直接的に相関させることができない。ＶＡＲ２ＣＳＡをカップリングした磁気ビーズとフローサイトメトリーとを使って、本発明者らは、血流中のＣＳ発現がん細胞を検出することの予後的価値（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ）を調べるであろう。この方法は迅速で痛みのない患者の検査として使用されるであろう。
【０２９１】
実施例２２
ＶＡＲ２ＣＳＡのターゲットとなった潜在的ＣＳＰＧ分子の同定
Ｖ５タグを持つ組換えＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質（ＤＢＬ１−ＩＤ２ａ）を、３０００を上回るヒト膜受容体を発現するトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のパネルへの結合についてスクリーニングした。ＶＡＲ２ＣＳＡの潜在的ターゲットとして２５の受容体のセットが同定された（表１２）。ＶＡＲ２ＣＳＡとこれらの受容体との間の相互作用は、ＨＥＫ２９３系とＥＬＩＳＡとの両方で、ＣＳＡおよびＨＳを使った阻害による結合特異性の解析を行うことで、さらに立証されるであろう。
【０２９２】
［表１２］ＶＡＲ２ＣＳＡの潜在的ターゲットであると実験的に同定された受容体
【表１２−１】
2018076333.tif 000091
【表１２−２】
2018076333.tif 000092
【０２９３】
考察
マラリアは最も一般的な感染性疾患の一つであり、最も大きな世界的健康問題の一つである。妊婦は、事前の獲得免疫にもかかわらず、とりわけ感染しやすい。この研究において本発明者らは、ＰＭにおけるＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ相互作用の背景にある分子機序に関する基本的疑問に取り組んだ。
【０２９４】
先の研究により、ＶＡＲ２ＣＳＡ中の最小ＣＳＡ結合領域はＤＢＬ２Ｘ−ＩＤ２ｂであって、完全なアフィニティ結合にはＤＢＬ１ＸまたはＤＢＬ３Ｘが必要であることが示唆されている（Ｄａｈｌｂａｃｋ，  Ｍ．，  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｃｌａｕｓｅｎ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｄｉｔｌｅｖ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｒｅｓｅｎｄｅ，  Ｍ．，  Ｐｉｎｔｏ，  Ｖ．Ｖ．，  Ａｒｎｏｔ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｔｈｅａｎｄｅｒ，  Ｔ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｓａｌａｎｔｉ，  Ａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６，  １５９０８−１５９１７）。この研究の延長として本発明者らはＤＢＬ２Ｘ領域に焦点を絞ってＶＡＲ２ＣＳＡのさらなる切断を行った。本発明者らは、コアＣＳＡ結合部位が、隣接するドメイン間領域の小さな部分を含めたＤＢＬ２Ｘドメイン内にあることを示す。結合はＩＤ２ｂ領域には依存せず、先に示唆されていたように、ＤＢＬ１ＸまたはＤＢＬ３Ｘ隣接ドメインにも依存しない。これはＩＤ１−ＩＤ２ａおよびＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘｂの特異的ＣＳＰＧ結合によって明白である（表３）。最小結合領域はＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘｂであり、これは完全長ＶＡＲ２ＣＳＡの特徴に匹敵する特徴でＣＳＰＧに結合した。
【０２９５】
これらの新しいデータが、コアＣＳＡ結合部位を単一ドメイン上にマッピングしたことは興味深い。ＣＳＡへのＤＢＬ２Ｘ（および他の任意の単一ＤＢＬドメイン）の結合は、非特異的であり、アフィニティは弱いことが先に示されている（Ｒｅｓｅｎｄｅ，  Ｍ．，  Ｄｉｔｌｅｖ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｂｏｄｅｖｉｎ，  Ｓ．，  Ｂｒｕｕｎ，  Ｓ．，  Ｐｉｎｔｏ，  Ｖ．Ｖ．，  Ｃｌａｕｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｌ．，  Ｔｈｅａｎｄｅｒ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｓａｌａｎｔｉ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｄａｈｌｂａｃｋ，  Ｍ．  （２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ３９，  １１９５−１２０４）。ＩＤ１ドメイン間配列とＩＤ２ａドメイン間配列の一部とが、ＣＳＡ結合にとって不可欠であることは明白である。ＤＢＬ１Ｘ−ＤＢＬ２ＸａとＩＤ１−ＤＢＬ２ＸａはＣＳＰＧに結合しない。２つのＣ末端ＤＢＬ２Ｘ境界（ＤＢＬ２ＸａおよびＤＢＬ２Ｘｂ）は、９３アミノ酸分が相違する。これらのアミノ酸を欠失させると結合が排除されるので、これらはＣＳＡ結合にとって重要であるに違いない。
【０２９６】
ＩＤ１−ＤＢＬ２Ｘｂ最小結合領域は、完全長ＶＡＲ２ＣＳＡよりはるかに小さく、分子量は６２ｋＤａしかない。ＶＡＲ２ＣＳＡをこれ以上実質的に切断してもＣＳＡの結合に際して機能的である可能性は低い。本発明者らのデータは、ＤＢＬ２Ｘを、隣接するＩＤ１ドメイン間配列とＩＤ２ａドメイン間配列の一部を組み込んだ、より大きな機能ドメインとして再定義するものである。
【０２９７】
ＰＭに対するＶＡＲ２ＣＳＡベースのワクチンは、強力な防御免疫応答を誘導することができなければならない。この際、最も重要な側面は、胎盤特異的寄生虫接着を阻害する能力を有するＩｇＧ抗体の生成である。本発明者らが作製したフラグメントの免疫原特徴を調べるために、それらをラットの免疫化に使用した。ＣＳＡ結合部位を含有するフラグメントに対して生じさせた血清はいずれもＣＳＡへの寄生虫の接着を阻害した。重要なことに、ＩＤ１−ＩＤ２ａに対して生じさせた血清は、ほとんど完全な阻害をもたらした。これは、最小ＣＳＡ結合フラグメントが強い抗接着免疫応答を誘導する能力を保持していることを示唆している。この結論は、ＩＤ１−ＩＤ２ａで抗ＦＶ２血清から精製された抗体が、接着阻止活性の大半を保持していたという事実、および抗ＩＤ１−ＩＤ２ａ抗体を枯渇させた抗ＦＶ２試料がその活性の大半を失ったという事実によって、さらに裏付けられた。これは、接着阻止抗体の誘導に必要なエピトープがこの領域内に位置することを示している。
【０２９８】
この研究において、本発明者らは、ＣＳＡへのＦＣＲ３寄生虫の結合の相同阻害（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）において、抗ＶＡＲ２ＣＳＡ血清を試験した。ワクチンが寄生虫株起源とは無関係に胎盤接着を阻害する能力を有することは重要である。それゆえに、ワクチン開発における大きな懸念は、寄生虫変異体間での高いクローン間多様性である。組換え完全長ＶＡＲ２ＣＳＡは非常に免疫原性であるが、産生される抗体は交差阻害性ではない（Ａｖｒｉｌ，  Ｍ．，  Ｈａｔｈａｗａｙ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ａ．，  Ｄｅｃｈａｖａｎｎｅ，  Ｓ．，  Ｈｏｍｍｅｌ，  Ｍ．，  Ｂｅｅｓｏｎ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｇａｍａｉｎ，  Ｂ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ１６６２２）。ＦＣＲ３からのＩＤ１−ＤＢＬ２ＸによるＤＮＡワクチン接種は、交差阻害性の抗体であって他の実験室株ならびに現場で分離された寄生虫のＣＳＡ接着も阻害する抗体を誘導することを、最近の研究が示している（Ｂｏｒｄｂａｒ，  Ｂ．，  Ｔｕｉｋｕｅ−Ｎｄａｍ，  Ｎ．，  Ｂｉｇｅｙ，  Ｐ．，  Ｄｏｒｉｔｃｈａｍｏｕ，  Ｊ．，  Ｓｃｈｅｒｍａｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌｏｒｏｎ，  Ｐ．  Ｖａｃｃｉｎｅ）。これは、ＰＭワクチンにおけるこの小フラグメントの使用を支持するものである。
【０２９９】
ＣａｒｄｉｎとＷｅｉｎｔｒａｕｂは、ＧＡＧ結合部位が２つの形態のうちの一つをとるであろうと予測した（Ｃａｒｄｉｎ，  Ａ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｈ．Ｊ．  （１９８９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ９，  ２１−３２）。これらは、Ｘ−Ｂ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−ＸとＸ−Ｂ−Ｂ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−Ｘであり、ここでＸは任意のハイドロパシー残基（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）であり、Ｂは任意の塩基性残基であって、アルギニンが好ましい。これらはどちらも硫酸化二糖の結合部位について述べている。多くの相互作用が起こりうるが、陰性荷電硫酸基と塩基性アミノ酸との間のイオン相互作用は最も重要であると考えられる。本発明者らは、最小結合領域内のそのような部位を２箇所、突然変異させた：ＤＢＬ２Ｘ中の６２５−ＧＫＮＬＫＫＲＹ−６３２と、ＩＤ１中の４５８−ＮＫＫＫＥＣＫＤ−４６５である。本発明者らは、ＤＢＬ２ＸのＮ末端部分に位置する二形性配列モチーフ（ＤＳＭ）内の大きな領域も欠失させた、この領域は、結合において機能することが示唆されているからである。ＤＳＭ領域の欠失はＣＳＡ結合に影響を及ぼさなかった。推定ＧＡＧ結合部位中のどの置換もそうであった。これは、ＣＳＡ結合ではこれらの部位がほとんどまたは全く機能していないことを明白に示している。
【０３００】
ヒトＣＳＡ受容体にとっての最小結合要件は、２〜４個のＣ４硫酸化ＧａｌＮＡｃ単糖を持つ１２糖であることが示されている（Ａｌｋｈａｌｉｌ，  Ａ．，  Ａｃｈｕｒ，  Ｒ．Ｎ．，  Ｖａｌｉｙａｖｅｅｔｔｉｌ，  Ｍ．，  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，  Ｃ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｇｏｗｄａ，  Ｄ．Ｃ．  （２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，  ４０３５７−４０３６４）。ＶＡＲ２ＣＳＡ発現寄生虫がインビボで、２〜８％のＣ４硫酸化二糖ユニットしか保持しないＣＳＡにきわめて特異的であることは、注目に値する。ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ複合体形成がイオン相互作用に依存するかどうかを調べるために、本発明者らは、異なる塩濃度で結合を試験した。１５０ｍＭ〜３００ｍＭ  ＮａＣｌにおけるＩＤ１−ＩＤ２ａ、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａおよびＦＶ２の結合は、Ｌｏｇ（ＫＤ，ｏｂｓｅｒｖｅｄ）対Ｌｏｇ［Ｎａ＋］をプロットした場合に、線形の関係を示す。本発明者らは、結合が、最大で２〜３個のイオン相互作用に依存していることを見出した。完全長タンパク質についての値が、短いフラグメントに関する値より高く、このタンパク質がＣＳＡとのさらなるイオン相互作用をすることを示しているのは興味深い。本発明者らは、この研究において、ＣＳＡ特異的高アフィニティ結合領域を含有するフラグメントをスクリーニングした。タンパク質の下流領域ではより多くの相互作用が起こるが、コア部位はＤＢＬ２Ｘ内にあると考えられる。外挿してＹ切片を求めると（［Ｎａ＋］＝１Ｍ、Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＝０）、ＦＶ２ではＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝５．９μＭ、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａではＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝３．４μＭ、そしてＩＤ１−ＩＤ２ａではＫＤ，ｎｏｎｉｏｎｉｃ＝０．７μＭであることがわかる。これは、イオン相互作用によって説明できるのは、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ結合の２５〜３０％にすぎないことを示している。これは、同様のアッセイにおいてイオン相互作用に対して最大８０〜９０％の依存性を示している他のＧＡＧ結合タンパク質とは対照的である（Ｆａｌｌｅｒ，  Ｂ．，  Ｍｅｌｙ，  Ｙ．，  Ｇｅｒａｒｄ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂｉｅｔｈ，  Ｊ．Ｇ．  （１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，  ８２８５−８２９０；Ｈｉｌｅｍａｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｆｒｏｍｍ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｗｅｉｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎｈａｒｄｔ，  Ｒ．Ｊ．  （１９９８）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２０，  １５６−１６７）。
【０３０１】
本発明者らのデータは、ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ相互作用が従来のＧＡＧ−タンパク質相互作用には従わないことを示唆している。本発明者らは、高いＣＳＡアフィニティが、ＣＳＡ糖質主鎖とノニオン性相互作用をする複数の結合部位を含みうる多価相互作用によって達成されるという仮説を立てている。相互作用の一部はイオン性であり、ＶＡＲ２ＣＳＡ結合にはある程度の硫酸化度が必要である。それゆえに、塩基性アミノ酸と硫酸基との間の相互作用はあるが、それはアフィニティにおける決定因子ではないと思われる。
【０３０２】
この研究において、本発明者らは、真核細胞において機能的ＣＳＡ結合タンパク質として生産することができ、かつ高度に接着阻止性の抗体を誘導する能力を有する、小さい単一ドメインＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントを定義した。このフラグメントは、ＰＭに対するワクチンの強力な候補になる潜在的可能性を持っている。
【０３０３】
このデータは、ＣＳＡに特異的に結合することによって感染赤血球の胎盤結合を媒介する、ＶＡＲ２ＣＳＡの小さな組換え部分を同定している。本発明者らは、このＶＡＲ２ＣＳＡフラグメントが、ＣＳＰＧ４またはこの研究において同定された他のタンパク質主鎖上に提示されたＣＳＡとの相互作用を介して、がん細胞に特異的に結合することも示す。加えて、本発明者らは、がん細胞へのこの小さなフラグメントに基づくＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドの結合が、細胞の遊走および浸潤を阻害することも見出す。これらのＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは、カノニカルＥＲＫシグナリングも阻害し、本発明者らは、毒素に融合されたＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドががん細胞を効率よく殺すことも見出す。
【０３０４】
方法
方法１−クローニングと昆虫細胞におけるタンパク質発現
ＶＡＲ２ＣＳＡ配列フラグメントを、コドン最適化ＦＣＲ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ２４９５９８）または３Ｄ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ２４７４２８）ＶＡＲ２ＣＳＡ遺伝子から、特異的プライマー（表２）を使って増幅した。１段階ＰＣＲでシンプルなフラグメント（ｓｉｍｐｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を増幅した。アミノ酸置換コンストラクトは２段階ＰＣＲで作製した。第１ＰＣＲでは、コドン最適化ＦＣＲ３テンプレートから、オーバーラップする相補的末端を含有する２つのフラグメントを増幅した。第２ＰＣＲでは、それら２つのオーバーラップフラグメントをテンプレートとして使用し、外側の境界に特異的なプライマーを使って、コンストラクト全体を増幅した。全てのフラグメントを検証のために配列決定した。フラグメントをバキュロウイルスベクターｐＡｃＧＰ６７−Ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングし、Ｃ末端にＶ５およびＨｉｓタグを含有するように修飾した。タンパク質を、バキュロウイルス感染昆虫細胞において、細胞培養上清中に分泌される可溶性タンパク質として発現させた。簡単に述べると、組換えウイルス粒子を生成させるために、線状化したＢａｋｐａｋ６バキュロウイルスＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｐＡｃＧＰ６７−Ａプラスミドと共にＳｆ９昆虫細胞に同時トランスフェクトした。１０ｍｌの第２増幅物を使って、４００ｍｌ無血清培地（１０４８６、ＧＩＢＣＯ）中、１×１０６細胞／ｍｌのＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞に感染させた。初回感染の３日後に、分泌された組換えタンパク質を、上清から収穫した。上清を濾過し（０．２μｍ）、透析し、濃縮してから、タンパク質精製を行った。
【０３０５】
方法２−タンパク質精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分泌された組換えタンパク質を含有する濾過済み上清を、ＡＥＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って透析した。透析は、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で行った。その結果得られた溶液を濾過（０．２μｍ）し、イミダゾール（ｉｍｉｄｉａｚｏｌｅ）を最終濃度が１５ｍＭになるように加えた。次にタンパク質を１ｍｌ  ＨｉｓＳｅｌｅｃｔカラム（Ｈ８２８６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製した。結合したタンパク質を、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５００ｍＭイミダゾールで溶出させた。水晶微量天秤測定およびＳＡＸＳに必要なタンパク質を、さらに精製して、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）および２００ｍＭ  ＮａＣｌ中のＨｉＬｏａｄ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使ったサイズ排除クロマトグラフィーで、モノマーを得た。タンパク質の純度および構造の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証した。
【０３０６】
方法３−ＥＬＩＳＡ
Ｆａｌｃｏｎマイクロタイタープレート（３５１１７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、ＣＳＰＧ（ウシ）（Ｄ８４２８、Ｓｉｇｍａ）またはＨＳＰＧ（Ｈ４７７７、Ｓｉｇｍａ）の場合は３μｇ／ｍｌ、ＣＳＡ（Ｃ９８１９、Ｓｉｇｍａ）、ＣＳＣ（４００６７５、生化学工業）、およびＣＳＢ（Ｃ３７８８、Ｓｉｇｍａ）の場合は１００μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で終夜インキュベートした。次にプレートを、ＴＳＭ結合緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％ツイーン２０、１％ＢＳＡ、２５℃でＰＨ７．４）により、振盪機上、３７℃で２時間、ブロッキングした。タンパク質の２倍希釈系列（１．５６ｍＭ〜１００ｍＭ）をＴＳＭ結合緩衝液中に調製し、プレートに加え、それを振盪機上、３７℃で１時間インキュベートした。測定は全て三重に行った。プレートをＴＳＭ洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％ツイーン２０、２５℃でＰＨ７．４）中で３回洗浄した。次にプレートをＴＳＭ結合緩衝液中、１：３０００の抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｒ９６１２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、振盪機上、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＴＳＭ洗浄緩衝液中で３回洗浄した。最後にプレートをｏ−フェニレンジアミン基質（ＤＡＫＯ）で１５分間発色させた。反応を２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【０３０７】
方法４−水晶微量天秤（Ａｔｔａｎａ  Ａ１００）
実験は、金メッキ１０ＭＨｚ、ＡＴカット水晶振動子、ポリスチレンチップ（３６１１−３１０３  Ａｔｔａｎａ  ＡＢ）を使って、Ａｔｔａｎａ  Ａ１００（Ａｔｔａｎａ  ＡＢ）で行った。緩衝液と試薬類は全て０．２μｍで濾過した。リガンドは、１００μｇ／ｍｌの濃度でコーティングしたＣＳＰＧ（ウシ）（Ｄ８４２８、Ｓｉｇｍａ）またはＨＳＰＧ（Ｈ４７７７、Ｓｉｇｍａ）であった。コーティングは、リガンド溶液を加え、室温で３０分間インキュベートすることにより、定常状態で行った。続いて、０．１％ＩｇフリーＢＳＡ（ＢＳＡ−５０、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を含有するＰＢＳを使って、プレートを室温で３０分間ブロッキングした。各実験に先立って、製造者による既定の日常洗浄プログラムを使って、Ａｔｔａｎａ  Ａ１００を１％ＳＤＳで洗浄した。洗浄後に、ランニング緩衝液を２５℃で流速２５μＬ／分のＰＢＳに切り替え、機械を０．５Ｈｚ／分の最大周波数変化に安定させた。安定したら、ＰＢＳを複数回注入して、注入プロセスがベースラインに極わずかな影響しか及ぼさないことを示した。試料注入に先立って、ＰＢＳをブランクとして注入した。分析物は、最低濃度から出発して１：３希釈系列（０．２５μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ）で注入した。会合時間は８４秒に設定し、解離時間は５分に設定した。高い結合アフィニティゆえに、注入後に結合表面を再生することはできなかった。収集したデータはＡｔｔｅｓｔｅｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｔｔａｎａ  ＡＢ）で処理した。曲線を単純な１：１モデルにフィッティングした。カーブフィッティングによってｋｏｎとｋｏｆｆを決定し、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに基づいてＫＤを算出した。
【０３０８】
方法５−塩タイトレーションアッセイ
ＶＡＲ２ＣＳＡ−ＣＳＡ結合のイオン依存性をＥＬＩＳＡベースの結合アッセイで試験した。ＣＳＰＧを３μｇ／ｍｌでコーティングした。タンパク質の１：２希釈系列（４００〜１．５６ｎＭ）を、いくつかの異なるＮａＣｌ濃度（１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、および３００ｍＭ）において加えた。実験は全て三重に行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで非線形回帰（ヒル係数の最小二乗フィッティング）を使うことで、各タイトレーション系列について、ＫＤ値を算出した。
【０３０９】
方法６−動物免疫化および血清抽出
動物免疫化は全て国内および欧州の規制を遵守した。ウィスターラットの皮下にフロイント完全アジュバント（Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の組換えタンパク質３０μｇを注射した。フロイント不完全アジュバント（Ｆ５５０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中のタンパク質１５μｇを使って、３週間間隔で、３回、追加免疫を行った。各追加免疫の１週間後に血液試料を採取し、遠心分離によって血清を抽出した。
【０３１０】
方法７−ＩｇＧアフィニティ精製
完全長ＦＣＲ３  ＶＡＲ２ＣＳＡ（ＦＶ２）で免疫化したラットからの血清のプールを、固定化マルチドメインＦＣＲ３タンパク質（ＤＢＬ１Ｘ−ＤＢＬ２Ｘａ、ＤＢＬ１Ｘ−ＩＤ２ａ、ＩＤ１−ＩＤ２ａ、またはＩＤ１−ＤＢＬ４ε）および完全長ＦＶ２を含有する１ｍｌのＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰ、１７−０７１６−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、アフィニティ精製した。精製は、製造者のプロトコールに従って行った。手短に述べると、カラムへのリガンドのカップリングは、カップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）とリガンド（濃度０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ）との１：１溶液１ｍｌをカラムに加えることによって行った。カラムを密封し、室温で３０分間インキュベートした後、４℃で終夜インキュベートした。カラムを、６ｍｌの緩衝液Ａ（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）、６ｍｌの緩衝液Ｂ（０．１Ｍ酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４）、そして最後に６ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。室温で３０分のインキュベーション期間後に、逆の順序（緩衝液Ｂ、Ａ、Ｂ）で洗浄を繰り返した。血清を精製する前に、８〜１０ｍｌのＰＢＳを注入することでｐＨを調節した。試料をカラムに３〜５回通した。カラムを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄してから、抗体を１０ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．７）で溶出させた。
【０３１１】
方法８−熱帯熱マラリア原虫寄生虫培養
熱帯熱マラリア原虫ＦＣＲ３型寄生虫は、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．１２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（ＢＥ０２０１２Ｅ、Ｌｏｎｚａ）、０．１２５μｇ／ｍｌ  ＡｌｂｕＭＡＸ  ＩＩ（１１０２１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２％正常ヒト血清を補足した寄生虫培地ＲＰＭＩ−１６４０（ＢＥ１２１１５Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中の５％ヘマトクリット（ヒト血液型Ｏ  Ｒｈ＋）を使って、培養維持した。ＩＥは、ＣＳＡ接着表現型を維持するために、ＢｅＷｏ細胞（ＣＣＬ９８、ＡＴＣＣ）で繰り返しパンニングした。さらにまた、分離株を検査してマイコプラズマ陰性であることを確かめ、ネステッドＧＬＵＲＰ（グルタミン酸リッチタンパク質）およびＭＳＰ−２（メロゾイト表面タンパク質２）プライマーを用いるＰＣＲによって、遺伝子型を定期的に同定した。
【０３１２】
方法９−後期トロフォゾイトの精製
ＭＡＣＳ  ＣＳ−カラム（１３０−０４１−３０５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）およびＶａｒｉｏ−ＭＡＣＳマグネット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使って、強い磁場下で、寄生虫培養物を、後期トロフォゾイト期およびシゾント期について濃縮した。簡単に述べると、寄生虫培養物上清をカラムに適用した。次に、ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清（Ｆ６１７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でカラムを洗浄した。マグネットからの分離後に後期感染赤血球をカラムから溶出させ、遠沈し、ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清に再懸濁し、２×１０６ＩＥ／ｍｌの濃度まで希釈した。
【０３１３】
方法１０−フローサイトメトリー（ＦＣＭ）
精製後期トロフォゾイト感染赤血球上のネイティブＶＡＲ２ＣＳＡへの抗体結合を、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって測定した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中、２×１０５ＩＥ／ｍｌの濃度の精製後期寄生虫１００μｌを、血清（非感染赤血球と共にプレインキュベートすることによって非特異的結合を枯渇させたもの）により、１：１０の最終濃度で標識した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄した。次に細胞を、最終濃度２μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（１５５８５０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ＦＩＴＣ標識二次抗ラットＩｇＧ抗体（６２−９５１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１００希釈液とで、さらに標識した。陰性対照として、後期寄生虫を、ＶＡＲ２ＣＳＡ以外の抗原で免疫化したラットからの血清および二次抗体のみともインキュベートした。ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使って５０００の臭化エチジウム陽性ＩＥからのデータを収集した。最後に、ＷｉｎＬｉｓｔ  ５．０ソフトウェア（Ｖｅｒｉｆｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ）を使って、中央蛍光強度を決定した。
【０３１４】
方法１１−ＣＳＰＧへの寄生虫の結合の阻害
血清抗体を、ＣＳＰＧへのＩＥ結合を阻害するその能力について解析した。これは、ロボット標準化洗浄方法を使って、９６穴プレートフォーマットで行った。ウェルを２μｇ／ｍｌのＣＳＰＧ（Ｄ８４２８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。１００μＬ中の合計２×１０５個のトリチウム標識（ヒポキサンチン一塩酸塩、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＴ１７７００５ＭＣ）後期ＩＥを、ウェルに三重に加えた。次に、標識ＩＥを血清と共に３７℃で９０分間インキュベートした。結合していないＩＥをピペッティングロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で洗い流した。接着ＩＥの比率をＴｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）での液体シンチレーション計数によって決定した。
【０３１５】
方法１２ａ−がん細胞結合アッセイ
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を使って、さまざまな細胞株の表面上に発現したＣＳＰＧに対するＶＡＲ２ＣＳＡ最小結合ポリペプチドの反応性を試験した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＣＨＯ細胞、Ｃ３２）、ハムＦ１２（ＢｅＷｏ）を補足したＲＰＭＩ中で培養し、３７℃で５％二酸化炭素下に保つか、ＣＰＤ緩衝液中にヒト血液試料から精製した（赤血球）。細胞のアリコート（１×１０５）を、逐次、ＦＡＣＳ２（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）に希釈したＶＡＲ２ＣＳＡ最小結合ポリペプチド（１５０、７５または３７ｎＭ）およびα−Ｖ５−ＦＩＴＣ（１：８００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、暗所、＋４Ｃで、静かに撹拌しながら、３０分間、暴露した。陰性対照として、最小結合ポリペプチドの切断型およびＦＡＣＳ２緩衝液を使用した。前方散乱シグナルおよび側方散乱シグナルに基づいて無傷の細胞をゲーティングした。データはＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使って最低５０００個の細胞から取得した。特定細胞株に関係する全ての試料を、単一のアッセイで処理し、解析した。
【０３１６】
方法１２ｂ−がん細胞結合アッセイ
上記フローサイトメトリーアッセイに代わる方法として、細胞を、ＨＢＳＳに希釈したＶＡＲ２ＣＳＡ最小結合ポリペプチドおよびα−Ｖ５−ＦＩＴＣ（１：５００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドは上記と同じ濃度で使用した。α−Ｖ５−ＦＩＴＣ染色後に細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、酵素非含有細胞剥離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に収集し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＬ−１シグナル強度について解析した。
【０３１７】
略号：ＣＩＤＲ、システインリッチドメイン間領域；ＣＳＡ、コンドロイチン硫酸Ａ；ＣＳＰＧ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン；ＤＢＬ、Ｄｕｆｆｙ結合様ドメイン；ＦＣＭ、フローサイトメトリー；ＦＶ２、Ｎ末端セグメントを伴わないＶＡＲ２ＣＳＡタンパク質の完全長エクトドメイン；ＨＳＰＧ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン；ＩＤ、ドメイン間配列；ＩＥ、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球；ＮＴＳ、Ｎ末端セグメント；ＰＭ、胎盤マラリア；ＰｆＥＭＰ１、熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質１；ＰＭ、胎盤マラリア。
【０３１８】
方法１３−融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−毒素タンパク質のインビトロ細胞毒性試験
実験の前日に、５００，０細胞／ウェルで、がん細胞株を９６穴プレートに播種した。実験当日、融合ＶＡＲ２ＣＳＡ−毒素および対照タンパク質（毒素なしのＶＡＲ２ＣＳＡ）の１０倍希釈系列（１０μｇ／ｍｌから０．０１ｎｇ／ｍｌまでの範囲）を別々のウェルに加えた。４００μｇ／ｍｌのＣＳＡも含有する同様の希釈系列を両タンパク質について作成し、別々のウェルに加えた。細胞をタンパク質と共に３７℃で７２時間インキュベートした。読出しが５７０ｎｍにおける吸光度であるＭＴＴ細胞増殖アッセイによって細胞死を解析した。
【０３１９】
方法１４−パラフィン包埋ヒト組織試料の染色
ヒト患者から得た初代がん組織への組換えＶＡＲ２ＣＳＡの結合を、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使って調べる。ガラススライド上にスポットしたパラフィン包埋組織を０．１〜５００ｎＭのＶ５−ＶＡＲ２ＣＳＡ変異体またはＶ５−対照タンパク質（ＤＢＬ４）と共に室温で１時間インキュベートし、８分間洗浄し、１：７００マウス抗Ｖ５抗体と共に３０分間インキュベートし、８分間洗浄した。次に、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴプラットフォームを使用し、ＵｌｔｒａＭａｐ抗マウスＨＲＰを使って、結合している抗Ｖ５を検出した。
【配列表】
2018076333000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月27日(2017.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの処置または診断のための、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと治療用または診断用エフェクター部分とを含む、コンジュゲートもしくは融合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２】
がんの診断および／または予後のための、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと診断用エフェクター部分とを含む、コンジュゲートもしくは融合タンパク質を含む、医薬組成物であって、前記ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはコンジュゲートもしくは融合タンパク質が、体液および／または組織中のバイオマーカーとして使用される、医薬組成物。
【請求項３】
前記ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、コンドロイチン硫酸Ａに結合する能力を有するアミノ酸配列、またはコンドロイチン硫酸Ａに結合する能力を有する、配列番号１の機能的フラグメントを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記治療用または診断用エフェクター部分が細胞毒性部分および／または放射性ラベルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
がん細胞の単離のための、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと診断用エフェクター部分とを含む、コンジュゲートもしくは融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項６】
前記ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドが、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、コンドロイチン硫酸Ａに結合する能力を有するアミノ酸配列、またはコンドロイチン硫酸Ａに結合する能力を有する、配列番号１の機能的フラグメントを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
生物学的試料中のがん細胞の単離および／または検出のための方法であって、
ａ）がん細胞を含む生物学的試料を、ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと診断用エフェクター部分とを含む、コンジュゲートもしくは融合タンパク質と接触させて、複合体を形成すること；および
ｂ）該がん細胞と該ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはコンジュゲートもしくは融合タンパク質との複合体を精製、単離および／または検出すること
を含む、方法。
【請求項８】
前記がん細胞ががん幹細胞または循環がん細胞（ＣＴＣ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記診断用エフェクター部分が、細胞毒性部分、蛍光ラベル、および／または放射性ラベルから選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記診断用エフェクター部分が固形支持体にカップリングされている、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん細胞と前記ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド、またはコンジュゲートもしくは融合タンパク質との複合体が、がん疾患の診断および／または予後のための、血液、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、リンパ液、胃液、胸水、軟骨液、精子から選択される体液および／または組織中のバイオマーカーとして使用される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がん疾患が、脳腫瘍、肝腫瘍および生殖器官の腫瘍から選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチドと磁気ビーズとを含む、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む、がんの処置または診断のための医薬組成物。
【外国語明細書】
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