(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌を抗菌薬に対して感作させるための細菌侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻外する薬剤とを含む組成物及び方法の提供。【解決手段】細菌及び細菌の抗菌薬耐性プロファイルを特定し、それに合わせて方法を調節するステップを含むこともできる。提供する侵入促進剤が、環式ポリモノグアナイド／ポリグアニジン、ポリビグアナイドであり、好ましくは、例示的に、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）及びポリヘキサメチレングアナイド（ＰＨＭＧ）である。抗菌薬耐性を阻害する例示的な薬剤は、ベータラクタマーゼ、ＰＢＰ２ａ、ＮＤＭ−１、Ｖｉｍ２などの抗菌薬耐性決定因子に結合し、該抗菌薬耐性決定因子を阻害する薬剤である、組成物、薬剤組成物／製剤及びその医学的使用方法。【選択図】図２
2018076338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む組成物。
【請求項２】
前記組成物がさらに抗菌薬を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記侵入促進剤が、以下の式１ａ又は式１ｂに係る線状及び／又は分枝又は環式ポリモノグアナイド／ポリグアニジン、ポリビグアナイド、それらの類似体又は誘導体を含み、又はそれらからなり、
【化１】
2018076338.tif 000022
式中、
「ｎ」は、ポリマー中の繰り返し単位の数を指し、ｎは２から１０００まで、例えば、２又は５から１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００又は９００までとすることができ、
Ｇ１及びＧ２は、独立に、ビグアナイド又はグアニジンを含むカチオン基であり、
Ｌ１及びＬ２は、前記グアナイドの窒素原子に直接結合し、
Ｌ１及びＬ２は、前記ポリマーにおけるＧ１カチオン基とＧ２カチオン基の連結基であり、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０、アルキルなどのアルキル基、又はＣ１〜Ｃ１４０（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル若しくはオキシアルキレン基、又は場合によっては１個以上の、好ましくは１個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基又は飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基であり、
Ｎ及びＧ３は任意に選択できる末端基であり、
Ｘは存在してもしなくてもよく、
Ｌ３、Ｌ４及びＸは、前記ポリマーにおけるＧ４カチオン基とＧ５カチオン基の連結基であり、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０、アルキルなどのアルキル基であり、又はＬ３及びＬ４及びＸは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、オキシアルキレン基とすることができ、又は場合によっては１個以上の、好ましくは１個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基とすることができ、
「Ｇ４」及び「Ｇ５」は、カチオン部分であり、同じでも異なってもよく、その少なくとも一方は、ビグアニジン部分又はカルバモイルグアニジンであり、他方の部分は、ビグアニジン又はカルバモイルグアニジン又はアミンとすることができ、
カチオン部分Ｇ４及びＧ５は、単一のグアニジン基を含まない、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
式１ａに係る前記侵入促進剤が以下の１種以上を含む、若しくはそれらからなる、
【表１】
2018076338.tif 000023
又は式１ｂに係る前記侵入促進剤が、ポリ（アリルビグアニジノ−コ−アリルアミン）、ポリ（Ｎ−ビニルビグアナイド）、ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ−コ−アリルアミン）若しくはポリアリルビグアナイドを含む、若しくはそれらからなる、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記侵入促進剤がナノ粒子中に含まれる、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤が、ペプチド、核酸又は小分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤が酵素阻害剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチド又は核酸が、ＰＢＰ２ａ、ＮＤＭ−１又はＶｉｍ２からなる群から選択される抗菌薬耐性決定因子に結合し、該抗菌薬耐性決定因子を阻害することができる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドがＰＢＰ２ａ（ｍｅｃＡの遺伝子産物）に結合し、該ＰＢＰ２ａ（ｍｅｃＡの遺伝子産物）を阻害する、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号１から４の１つ若しくは組合せ、又はその少なくとも９０％相同である任意のペプチド配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記核酸がＮＤＭ−１に結合する、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酵素阻害剤がクラブラン酸又はその塩である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記侵入促進剤が、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）又はその類似体若しくは誘導体である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記侵入促進剤が、ポリヘキサメチレングアナイド（ＰＨＭＧ）又はその類似体若しくは誘導体である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
細菌がグラム陰性、グラム陽性である、又はマイコバクテリウムである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
細菌が、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ＰＺ−６０１、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン及びトロバフロキサシンからなる群から選択される１種以上の抗菌薬に対して耐性がある、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
細菌が、シプロフロキサシン、メロペネム、セフタジジム、アズトレオナム、アジスロマイシン、メチシリン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、オキシテトラサイクリン及びイミペネム／シラスタチンからなる群から選択される１種以上の抗菌薬に対して耐性があるシュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブルクホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロビデンシア  スチュアルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）又はアシネトバクター  バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）からなる群から選択される多剤耐性（ＭＤＲ）株である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ヒト又は動物における細菌感染症の治療又は予防に使用される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細菌感染症が、口腔、生殖器系、尿路、気道、消化管、腹膜、中耳、前立腺、血管内膜、結膜若しくは角膜組織を含めた眼、肺組織、心臓弁、皮膚、頭皮、爪の表面、副腎、肝臓、腎臓、すい臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、真皮、表皮若しくは骨組織の創傷内部若しくは表面からなる群から選択される内部若しくは外部の体表、又は血液、血しょう、血清、脳脊髄液、消化管内容物、痰、肺分泌物及び精液から選択される体液中、又は副腎、肝臓、腎臓、すい臓、脳、心臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、表皮及び骨組織から選択される体組織の中若しくは上である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ヒト又は動物の抗菌薬耐性細菌感染に対処する方法であって、
（ａ）細菌のタイプ及び前記細菌の少なくとも１種の抗菌薬耐性決定因子の性質を特定するステップと、
（ｂ）決定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤を選択するステップと、
（ｃ）特定された抗菌薬耐性決定因子によって前記細菌が耐性である抗菌薬を選択するステップと、
（ｄ）前記ヒト又は動物に、侵入促進剤の存在下で、特定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤と前記抗菌薬を投与するステップと
を含む、方法。
【請求項２１】
前記侵入促進剤及び特定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤を前記抗菌薬と同時に又は逐次的に投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数の異なるタイプの細菌が特定される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
細菌を抗菌薬に対して感作させる方法であって、前記細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップを含む方法。
【請求項２４】
抗菌薬耐性菌を死滅させる方法であって、細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露し、前記細菌を抗菌薬に暴露するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記細菌を、侵入促進剤の存在下で、前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップと、前記細菌を前記抗菌薬に暴露するステップが同時に又は逐次的に行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の異なるタイプの細菌を死滅させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記侵入促進剤及び抗菌薬耐性を阻害する薬剤が請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物で形成される、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌が、無生物材料の中又は上、無生物表面上などのヒト又は動物の体の外側に存在する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗菌薬耐性を阻害する複数の薬剤を含む部品のキット。
【請求項３０】
細菌を特定する手段、及び／又は細菌中の抗菌薬耐性決定因子を特定する手段をさらに含む、請求項２９に記載の部品のキット。
【請求項３１】
１種以上の抗菌薬をさらに含む、請求項２９又は３０に記載の部品のキット。
【請求項３２】
好ましくは抗菌薬耐性を阻害する薬剤と組み合わせて、侵入促進剤をさらに含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の部品のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌薬耐性菌に対処するための組成物及び方法に関する。特に、細菌を死滅させるために、細菌を抗菌薬に対して感作させ、感作させた抗菌薬に細菌を暴露する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、最も重篤なヒト及び動物の感染症の幾つかを引き起こし、依然として世界中の死亡率の主原因である。抗菌薬耐性の発生は、病院及び地域社会における細菌感染症の治療において主要な問題である。所与のクラスの抗菌物質とは必ずしも関連がない一般的適応プロセスの結果である内因性耐性など、抗菌物質に対する耐性の機序は様々である。かかる耐性の一例をシュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に見ることができ、その低い膜透過性は、恐らく多数の抗菌薬に対するその固有の耐性の主な理由であろう。獲得された耐性は、活性な抗菌物質耐性の主要な機序であり、抗菌物質に対して感受性であった細菌が耐性になる特定の進化的圧力の結果である。かかる耐性としては、例えば酵素修飾による、排出ポンプの過剰発現を含めた透過障壁の変化、抗菌薬の標的の変化、及び抗菌薬の不活性化が挙げられる。細菌における抗菌物質耐性は、非特許文献１に概説されている。
【０００３】
細菌感染に対処する更なる方法が依然として必要であり、本発明は、抗菌薬の作用に対して抗菌薬耐性菌を感作させ、それによって抗菌薬耐性の克服を助ける方法を対象とする。抗菌薬耐性決定因子を阻害する薬剤は公知であるが、抗菌薬耐性菌に進入し、標的部位に到達することができないために、すべてが細菌を抗菌薬に対して感作させるのに有用であると証明されているわけではない。本発明は、これらの難点の一部を克服することを目的にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ボックスタエル（Ｂｏｃｋｓｔａｅｌ）＆ファン  アエルショット（Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ）（２００９）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．）４（２），１４１−１５５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、細菌侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む組成物を提供する。
【０００６】
組成物は、さらに、抗菌薬を含むことができる。
【０００７】
本発明の別の一態様は、細菌を抗菌薬に対して感作させる方法であって、細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の追加の一態様は、抗菌薬耐性菌を死滅させる方法であって、細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露し、細菌を抗菌薬に暴露するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の任意の態様又は実施形態における侵入促進剤は、好ましくは、参照により本明細書に援用する２０１２年１０月１１日に出願されたＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５２６に記載の侵入促進剤である。
【００１０】
「侵入促進剤」という用語は、細菌のきょう膜及び／又は細胞壁への侵入を可能にする化合物又は組成物を意味するものとする。好ましくは、この薬剤は、さらに、抗菌薬耐性を阻害する薬剤が細菌の細胞膜も通過することを可能にする。
【００１１】
侵入促進剤
本発明の任意の態様又は実施形態の侵入促進剤は、一般に、ポリマーであり、このポリマーは、例えば以下の式１ａ又は式１ｂに係る、線状及び／又は分枝ポリモノグアナイド／ポリグアニジン、ポリビグアナイド、それらの類似体又は誘導体を含む。例を下の表１及び２に示す。
【００１２】
【化１】
2018076338.tif 000003
【００１３】
式中、
「ｎ」は、ポリマー中の繰り返し単位の数を指し、ｎは２から１０００まで、例えば、２又は５から１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００又は９００までとすることができ、
Ｇ１及びＧ２は、独立に、ビグアナイド又はグアニジンを含むカチオン基であり、
Ｌ１及びＬ２は、グアナイドの窒素原子に直接結合する。したがって、ビグアナイド又はグアニジン基は、ポリマー骨格に不可欠である。ビグアナイド又はグアニジン基は、式１ａの側鎖部分ではない。
【００１４】
【化２】
2018076338.tif 000004
【００１５】
本発明においては、Ｌ１及びＬ２は、ポリマーにおけるＧ１カチオン基とＧ２カチオン基の連結基である。Ｌ１及びＬ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０、アルキルなどのアルキル基とすることができ、又はＬ１及びＬ２は（独立に）、Ｃ１〜Ｃ１４０（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、オキシアルキレン基とすることができ、又はＬ１及びＬ２は（独立に）、場合によっては１個以上の、好ましくは１個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基とすることができる。適切なＬ１及びＬ２の例は、表１に列挙した基である。
【００１６】
Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１及びＧ２は、脂肪族、脂環式、複素環式、アリール、アルカリール及びオキシアルキレン基を用いて改変されていてもよい。
【００１７】
Ｎ及びＧ３は、好ましくは、末端基である。一般に、本発明に使用されるポリマーは、末端のアミノ（Ｎ）及びシアノグアニジン（Ｇ３）又はグアニジン（Ｇ３）末端基を有する。かかる末端基は、（例えば、１，６−ジアミノヘキサン、１，６−ジ（シアノグアニジノ）ヘキサン、１，６−ジグアニジノヘキサン、４−グアニジノ酪酸を用いて）脂肪族、脂環式、複素環式、複素環式、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、オキシアルキレン基との結合によって改変することができる。さらに、末端基は、受容体リガンド、デキストラン、シクロデキストリン、脂肪酸若しくは脂肪酸誘導体、コレステロール若しくはコレステロール誘導体、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）との結合によって改変することができる。場合によっては、ポリマーは、Ｎ及びＧ３位置がグアニジン若しくはビグアナイド若しくはシアノアミン若しくはアミン若しくはシアノグアニジンで終端することができ、又はＮがシアノアミン、Ｇ３位置がシアノグアニジンで終端することができ、又はＮがグアニジン、Ｇ３位置がシアノグアニジンで終端することができ、又はＧ３がＬ１アミン、Ｎがシアノグアニジンで終端することができる。Ｇ３は、Ｌ１−アミン、Ｌ２−シアノグアニジン又はＬ２−グアニジンとすることができる。重合数（ｎ）又はポリマー鎖切断及び合成中の副反応に応じて、末端基の不均一混合物が、例として上述したように、生じ得る。したがって、Ｎ基とＧ３基は、上述したように、不均一混合物として交換／存在することができる。あるいは、Ｎ及びＧ３が存在せず、ポリマーが環式でもよい。その場合、それぞれの末端Ｌ１基と末端Ｇ２基が直接結合する。
【００１８】
式１ｂにおいては、Ｘが存在してもしなくてもよい。Ｌ３、Ｌ４及びＸは、「Ｌ１又はＬ２」について上述したのと同様である。したがって、Ｌ３及びＬ４及びＸは、ポリマーにおけるＧ４カチオン基とＧ５カチオン基の連結基である。Ｌ３及びＬ４及びＸは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０、アルキルなどのアルキル基とすることができ、又はＬ３及びＬ４及びＸは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１４０（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９若しくはＣ１０；Ｃ１〜Ｃ１０、〜Ｃ２０、〜Ｃ３０、〜Ｃ４０、〜Ｃ５０  〜Ｃ６０、〜Ｃ７０、〜Ｃ８０、〜Ｃ９０、〜Ｃ１００、〜Ｃ１１０、〜Ｃ１２０、〜Ｃ１３０若しくは〜Ｃ１４０）、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、オキシアルキレン基とすることができ、又はＬ３及びＬ４及びＸは、独立に、場合によっては１個以上の、好ましくは１個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基とすることができる。適切なＬ３及びＬ４及びＸの例は、表２に列挙した基である。
【００１９】
「Ｇ４」及び「Ｇ５」は、カチオン部分であり、同じでも異なってもよい。その少なくとも一方は、ビグアニジン部分又はカルバモイルグアニジンであり、他方の部分は、上記（ビグアニジン又はカルバモイルグアニジン）又はアミンとすることができる。不確かにならないように、式１ｂにおいては、カチオン部分Ｇ４及びＧ５は、単一のグアニジン基のみを含まない。例えば、Ｇ４及びＧ５は、一般に、単一のグアニジン基を含まない。かかる化合物の例は、表２に列挙した、ポリアリルビグアナイド、ポリ（アリルビグアニジノ（ａｌｌｙｌｂｉｇｕａｎｉｄｎｉｏ）−コ−アリルアミン）、ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ−コ−アリルアミン）、ポリビニルビグアナイドである。
【００２０】
ポリアリルビグアナイドの例は、以下に示す通りである。
【００２１】
【化３】
2018076338.tif 000005
【００２２】
ポリアリルビグニジン（ｐｏｌｙａｌｌｙｌｂｉｇｕｎｉｄｉｎｅ）の場合、Ｌ３とＬ４は同一であり、Ｇ４とＧ５は類似しており、したがってポリアリルビグアナイドは、以下のように単純化することができる。
【００２３】
【化４】
2018076338.tif 000006
【００２４】
ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ−コ−アリルアミン）の例は、以下に示す通りである。
【００２５】
【化５】
2018076338.tif 000007
【００２６】
本発明に使用されるポリマーは、一般に、それに付随する対イオンを有する。適切な対イオンとしては、以下が挙げられるが、それだけに限定されない：ハロゲン化物（例えば、塩化物）、リン酸、乳酸、ホスホン酸、スルホン酸、アミノカルボン酸、カルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、有機リン酸、有機ホスホン酸、有機スルホン酸及び有機硫酸。
【００２７】
本発明に使用されるポリマーは、異なる「ｎ」数のポリマーの不均一混合物、又は標準精製法によって精製された特定「ｎ」数を含む均一画分とすることができる。上述したように、ポリマーは環式とすることもでき、さらに分枝とすることができる。
【００２８】
「ｎ」の好ましい数としては、２〜２５０、２〜１００、２〜８０及び２〜５０が挙げられる。
【００２９】
【表１】
2018076338.tif 000008
【００３０】
【表２】
2018076338.tif 000009
【００３１】
【表３】
2018076338.tif 000010
【００３２】
本発明の方法、組成物、製剤、使用及びキットに使用される侵入促進剤は、線状、分枝又は樹状分子を含むことができる。侵入促進剤は、線状、分枝又は樹状分子の組合せを含むことができる。侵入促進剤は、例えば上述したように、式１ａ又は式１ｂの分子の１種又は任意の組合せを含むことができる。
【００３３】
例えば、侵入促進剤は、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ：ｐｏｌｙｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）、ポリヘキサメチレンモノグアナイド（ＰＨＭＧ：ｐｏｌｙｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｍｏｎｏｇｕａｎｉｄｅ）、ポリエチレンビグアナイド（ＰＥＢ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）、ポリテトラメチレンビグアナイド（ＰＴＭＢ：ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）又はポリエチレンヘキサメチレンビグアナイド（ＰＥＨＭＢ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）の１種以上を含むことができる。幾つかの例を表１及び２に列挙する。本発明の任意の態様の侵入促進剤は、好ましくは、ＰＨＭＢ若しくはＰＨＭＧ、又はその類似体若しくは誘導体である。
【００３４】
すなわち、侵入促進剤は、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）、ポリヘキサメチレンモノグアナイド（ＰＨＭＧ）、ポリエチレンビグアナイド（ＰＥＢ）、ポリテトラメチレンビグアナイド（ＰＴＭＢ）、ポリエチレンヘキサメチレンビグアナイド（ＰＥＨＭＢ）、ポリメチレンビグアナイド（ＰＭＢ：ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）、ポリ（アリルビグアニジノ−コ−アリルアミン）、ポリ（Ｎ−ビニルビグアナイド）、ポリアリルビグアナイドの１種以上の均一又は不均一混合物を含むことができる。
【００３５】
これらの化合物は、当業者に周知のように、実験室で標準手順によって合成することができ、又は供給業者から入手することができる。
【００３６】
ＰＨＭＢは、例えば、同義語としてポリ（ヘキサメチレン）ビグアナイド塩酸塩、重合ビグアナイド塩酸塩、ポリヘキサニド、ビグアナイド、ＣＡＳ番号２７０８３−２７−８、３２２８９−５８−０、ＩＵＰＡＣ名ポリ（イミノイミドカルボニル）イミノヘキサメチレン塩酸塩を有することもできる。ＰＨＭＢは、実験室で標準手順によって合成することができ、又は供給業者、例えば、Ａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｃｈｃｈｅｍｉｃａｌｓ．ｃｏｍ／Ｆｅｄ／ＢＩＯ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｈｍｂ．ｈｔｍ）から入手することができる。一般に、ｎ＝２から４０、平均ｎ：１１、平均分子量：３０２５。ＰＨＭＢは、例えば、衛生用品、水泳プール水処理及び創傷被覆材に使用される殺生物剤として販売されている。
【００３７】
ポリヘキサメチレンモノグアナイド（ＰＨＭＧ）は、実験室で標準手順によって合成することができ、又は供給業者、例えば、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｃｕｎｄｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ｈｔｔｐ：／／ｓｃｕｎｄｅｒ．ｅｎ．ｂｕｓｙｔｒａｄｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｆｏ／６８３６３３／ＰＨＭＧ．ｈｔｍｌから入手することができる。
【００３８】
当業者には理解されるように、侵入促進ポリマーはコポリマー又はヘテロポリマーとすることができ、すなわちモノマーは、同一であることが意図されなくてもよい。しかし、一般に、モノマー単位は、同一であるように意図することができる。
【００３９】
抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤は、共有結合することができる。あるいは、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤は、製剤として、例えば、非共有結合複合体として提供することができる。製剤は、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤を適切な比で、例えばｐＨ及び塩濃度の、適切な条件下で混合することによって調製することができる。方法は、例えば、侵入促進剤よりも最高１００倍モル過剰の抗菌薬耐性を阻害する薬剤から、等モル濃度の担体及びカーゴ分子を用いて、抗菌薬耐性を阻害する薬剤よりも最高１０００倍モル過剰の侵入促進剤まで、実施することができる。例えば、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤の適切なモル比は、１：０．１から１：５０、又は１：０．５から１：１０００の範囲、例えば１：１から１：１０又は１：５、例えば約１：１．５とすることができる。抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤の適切な重量：重量比は、１：０．１から１：５０、又は１：０．５から１：１０００の範囲、例えば１：１から１：１０又は１：５、例えば約１：１．５とすることができる。複合体の形成については、後で更に考察する。
【００４０】
侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤を混合／インキュベートするｐＨは、後で更に考察するように、高ｐＨ、例えば１０〜１３．５とすることができる。抗菌薬耐性を阻害する薬剤が核酸であるときには、薬剤を高ｐＨで混合／インキュベートすることが特に好ましい。
【００４１】
あるいは、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤を混合／インキュベートするｐＨは、中性ｐＨ、例えば６．５から８．６とすることができる。抗菌薬耐性を阻害する薬剤がペプチドであるときには、薬剤を中性ｐＨで混合することが特に好ましい。適切なインキュベーション条件は、当業者が確認し、利用する薬剤の正確な性質に応じて最適化することができる。細菌細胞への送達が最も効率的な条件を選択する。適切な状況においては、ｐＨは低ｐＨ、すなわち６未満とすることができる。
【００４２】
一実施形態においては、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、高ｐＨの緩衝剤中で一緒に提供することができる。すなわち、細菌細胞への抗菌薬耐性を阻害する薬剤の侵入を促進する方法は、（すべて上述したように）抗菌薬耐性を阻害する薬剤に侵入促進剤の存在下で細菌細胞を暴露するステップを含むことができ、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤を高ｐＨで、例えば、高ｐＨの緩衝剤中で混合又はインキュベートする。「高ｐＨ」という用語は、当業者に周知であり、一般に、９を超える、例えば、９．５を超える、又は１０を超える、例えば、１０から１３．５のｐＨを指す。一般に、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に侵入促進剤の存在下で細菌細胞を暴露する前に、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤を高ｐＨで混合してナノ粒子を形成する。
【００４３】
別の一実施形態においては、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、中性ｐＨの緩衝剤中で一緒に提供することができる。すなわち、細菌細胞への抗菌薬耐性を阻害する薬剤の侵入を促進する方法は、（すべて上述したように）抗菌薬耐性を阻害する薬剤に侵入促進剤の存在下で細菌細胞を暴露するステップを含むことができ、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤を中性ｐＨで、例えば、中性ｐＨの緩衝剤中で混合又はインキュベートする。「中性ｐＨ」という用語は、当業者に周知であり、一般に、約７、例えば、６を超える又は９未満、例えば、６．５から８．６のｐＨを指す。抗菌薬耐性を阻害する薬剤に侵入促進剤の存在下で細菌細胞を暴露する前に、抗菌薬耐性を阻害する薬剤と侵入促進剤を中性ｐＨで混合してナノ粒子を形成することができる。
【００４４】
具体的には、ｐＨ６〜１３．５の範囲の緩衝剤（付加塩を含む又は含まない、例えば、分子生物学緩衝剤に一般に使用される、例えば、ＰＢＳ、ＮａＣｌ又は多数の他の緩衝剤）は、当業者によって理解されるように、送達効率が改善された製剤を与えると考えられ、ｐＨは、送達する薬剤の性質に応じて変更される。得られる複合体は、適切な増殖媒体で１：１から１：１０００に希釈することができ、複合体を幾つかの時点で細胞に添加して（繰り返しの複数の移入）、より効率的にすることさえ可能である。手順は、中性ｐＨから高ｐＨの緩衝剤中の侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤の両方の別々の希釈、及びそれらを混合してナノ粒子を形成することを含む。侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤の比及び濃度は、製剤及び非共有結合複合体の調製に関連して、並びに部品のキットに関連して、上述した通りとすることができる。
【００４５】
当業者は、例えば、ＮａＯＨ又はＫＯＨを使用して、高ｐＨ緩衝剤を容易に調製できることを理解されたい。これらの緩衝条件は、一般的な複合体形成時間、例えば３０分間としたときに、移入効率を改善する。したがって、高ｐＨ緩衝剤（及び本明細書に記載の侵入促進剤）は、研究者によって現在利用されているプロトコルに容易に組み込むことができる。
【００４６】
当業者は、同様に、任意の適切な緩衝剤をＨＣｌ及び／又はＮａＯＨ若しくはＫＯＨで調節することによって中性ｐＨ緩衝剤を容易に調製できることを理解されたい。これらの緩衝条件は、一般的な複合体形成時間、例えば３０分間としたときに、移入効率を改善する。したがって、中性ｐＨ緩衝剤（及び本明細書に記載の侵入促進剤）は、研究者によって現在利用されているプロトコルに容易に組み込むことができる。
【００４７】
本発明の別の一態様は、侵入促進剤（例えば、ＰＨＭＢ又はＰＨＭＧ）と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む複合体を調製する方法であって、侵入促進剤及び抗菌薬耐性を阻害する薬剤を複合体形成緩衝剤中でインキュベートすることを含む方法を提供する。複合体形成緩衝剤は、例えば、薬剤に応じて中性（ｎｅｕｒａｌ）ｐＨ又は高ｐＨとすることができる。例えば、緩衝剤は、抗菌薬耐性を阻害する薬剤がペプチドである場合は中性ｐＨ、薬剤がヌクレオチドであるときには高ｐＨとすることができる。適切なｐＨ緩衝剤を上で考察したが、最適な緩衝剤は、各薬剤に対して当業者によって決定されるであろう。侵入促進剤（例えば、ＰＨＭＢ又はＰＨＭＧ）と抗菌薬耐性を阻害する薬剤、例えば、ペプチド、核酸若しくは他のポリマー又は小分子とを含むナノ粒子が形成されると考えられる。抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、酵素阻害剤とすることができる。具体的には、ナノ粒子は、細胞と一緒に使用する前に、ＰＨＭＢ及び上述した類似分子をペプチド、核酸若しくは他のポリマー又は小分子と一緒に適切な緩衝剤中でインキュベートすることによって形成することができる。適切なインキュベーション緩衝剤としては、水、ＰＢＳ、及び研究室で一般に使用される他の緩衝剤を挙げることができる。高ｐＨ緩衝剤については上述した。最適な緩衝剤は、当業者には明らかなように、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤の両方の具体的素性に依存し得る。ナノ粒子形成及び細菌細胞送達は、一般に、２成分を混合する前に両方のパートナー分子を複合体形成緩衝剤で希釈することによって成される。さらに、２成分の混合は、一般に、他の賦形剤又は活性成分と組み合わせる前、及び生体内での使用を含めて、細菌細胞に適用する前に、実施される。効率的ナノ粒子形成は、数秒又は数分内に生じると考えられるが、手順は数時間にわたって実施することができる。効率的ナノ粒子形成の適切な比は、パートナーの組合せに応じて変わる。例えば、ＰＨＭＢ：プラスミドＤＮＡの場合１〜２０：１（ｗｔ：ｗｔ）が、効率的ナノ粒子形成をもたらす。さらに、ＰＨＭＢ：ＭｅｃＡペプチドの場合０．１：１（ｗｔ：ｗｔ）から１００：１までが、効率的ナノ粒子形成をもたらす（等量又は過剰の担体が好ましく、良好に作用する）。当業者は、異なるパートナー分子比を用いるとナノ粒子形成及び送達効率を評価することができるはずである。ナノ粒子形成は、幾つかの方法で評価することができる。例えば、個々の当業者は、動的光散乱（ＤＬＳ）及び顕微鏡法を用いてナノ粒子形成を評価することができるであろう。
【００４８】
本発明の別の一態様は、本明細書に定義された侵入促進剤（例えば、ＰＨＭＢ又はＰＨＭＧ）と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む複合体であって、侵入促進剤及び導入薬剤を複合体形成緩衝剤中で、例えば、高又は中性ｐＨ、例えば、ｐＨ１０〜１３．５又はｐＨ６．５から８．６で、インキュベートするステップを含む方法によって得ることができる（又は得られた）複合体を提供する。
【００４９】
侵入促進剤がナノ粒子に含まれると好ましい。ナノ粒子の寸法は、ナノメートル範囲などのマイクロメートル以下の範囲である。
【００５０】
抗菌薬耐性を阻害する薬剤
抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、抗菌薬の作用に対して抗菌薬耐性菌を感作させる任意の薬剤とすることができる。例えば、阻害剤は、抗菌薬又はあるクラスの抗菌薬に対する耐性の原因である、細菌内の分子又は細菌によって生成される分子に結合し、それを不活性化することができる。細菌中の標的分子は、例えば、細菌細胞の内部、細胞周囲腔中、又は細菌細胞壁の内部に存在し得る。好ましくは、抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、ペプチド、核酸、他のポリマー又は小分子である。薬剤は酵素阻害剤とすることができる。不確かにならないように、酵素阻害剤は、ペプチド又は核酸とすることができる。一般に、酵素阻害剤は、分子量４０，０００ダルトン未満の分子などの分子である。
【００５１】
抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、ペプチドアプタマー又はＲＮＡアプタマーとすることができる。ペプチドアプタマーは、アンキリンリピートタンパク質に基づくＤＡＲＰｉｎ骨格（カレント・オピニオン・イン・ドラッグ・ディスカバリ＆ディベロップメント（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．）２００７年３月；１０（２）：１５３−９．、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）２００３年９月１２；３３２（２）：４８９−５０３）、ヒトＳｔｅｆｉｎ  Ａ三重変異体に基づくアフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒ）（ウッドマン（Ｗｏｏｄｍａｎ），Ｒ．、イエ（Ｙｅｈ），Ｊ．Ｔ−Ｈ．、ローレンソン（Ｌａｕｒｅｎｓｏｎ），Ｓ．及びコ  フェリーニョ（Ｋｏ  Ｆｅｒｒｉｇｎｏ），Ｐ．「ペプチドアプタマーの提示に対する中性骨格の設計及び検証（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｔａｍｅｒｓ．）」ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）３５２：１１１８−１１３３（２００５））、化学的に束縛されたペプチドに基づく二環式（ｂｉｃｙｃｌｅ）ペプチド（ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）５，５０２−５０７（２００９））など、その構造安定性、ｐＨ変化に対する耐性、プロテアーゼ切断及び温度変化に対する耐性を増強する骨格構造を有することができる。
【００５２】
抗菌薬耐性を阻害するペプチド薬剤は、その抗体、抗体断片又は誘導体とすることができる。すなわち、抗体、抗体断片又はその誘導体は、抗菌薬耐性の原因である、又はその機序に関与する、細菌細胞若しくは細胞壁中に存在する、又はそれに付随する（タンパク質などの）標的分子に特異的に結合し、それを阻害し、又は隔離し、したがって抗菌薬に対して細菌細胞を感作させることができる。「抗体」とは、実質的に完全な抗体分子、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（少なくとも１個のアミノ酸は、天然ヒト抗体に比べて変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、抗原結合性断片及びその誘導体を含む。抗体及びその抗原結合性断片の変異体、融合体及び誘導体も「抗体」及び「その抗原結合性断片」という用語の意味に含まれる。「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含めて、すべてのクラスの抗体も含む。したがって、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４分子などのＩｇＧ分子とすることができる。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ分子、又は抗原結合性断片、又はその変異体、融合体若しくは誘導体である。より好ましくは、抗体は、ＩｇＧ２分子である。抗体又はその断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片及びＦａｂ様断片からなる群から選択される抗原結合性断片を含むことができ、又はそれからなることができる。別の一実施形態においては、Ｆｖ断片は、単鎖Ｆｖ断片又はジスルフィド結合Ｆｖ断片とすることができる。Ｆａｂ様断片は、Ｆａｂ’断片又はＦ（ａｂ）２断片とすることができる。抗体又はその断片は、モノクローナル抗体であること、又はモノクローナル抗体に由来することが想定される。モノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知であり、ハイブリドーマ産生、又は組換え技術の使用を含む。
【００５３】
小分子薬剤は、抗菌薬耐性の細菌的機序の原因である、又はそれに関与する、細菌細胞中の標的分子を阻害する任意の適切な有機分子とすることができる。すなわち、小分子薬剤は、その機序を破壊し、当該抗菌薬に対して細菌細胞を感作させる。
【００５４】
多様な細菌が、抗菌薬による死滅に抵抗する幾つかの異なる機序を利用している。異なる機序は、当該細菌及び抗菌薬に応じて、細菌細胞中の異なるタンパク質又は他の標的を含む。様々なクラスの抗菌薬に対する耐性の機序の例を、以下の表３から５に示す。表は、これらの様々なクラスの薬物に対して耐性である細菌の例も示す。抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、これらの表中の抗菌薬耐性決定因子を参照して選択することができる。非特許文献１も抗菌薬耐性決定因子を１４６及び１４７ページの表２に記載しており、論文全体、特に表２を参照により本明細書に援用する。
【００５５】
例えば、阻害剤は、ｍｅｃＡ遺伝子産物、ペニシリン結合タンパク質２Ａ（ＰＢＰ２Ａ：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ａ）、ベータラクタムに対する耐性を付与する改変ペニシリン結合タンパク質に結合し、その抗菌薬耐性作用を阻害するペプチドとすることができる。ペニシリン結合タンパク質などの抗菌薬耐性決定因子に結合し、それを阻害するペプチドは、標的に結合するその能力によってペプチドを選択する方法によって特定することができる。かかる方法としては、ファージディスプレイシステムの使用が挙げられる（その両方を参照により本明細書に援用する、ウィラツ（Ｗｉｌｌａｔｓ）（２００２）プラント・モレキュラ・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（２００２）５０，８３７−８５４及びモレク（Ｍｏｌｅｋ）ら（２０１１）モレキュルズ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）１６，８５７−８８７参照）（実施例１も参照されたい）。市販ファージディスプレイライブラリー及びシステムは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能である。実施例１は、ＰＢＰ２ａタンパク質の調製と、それに続くＰＢＰ２ａに結合し、それを阻害する結合部分の特定のためのプロトコルを提供する。これらの例示方法によって生成されるかかる結合タンパク質を本発明の方法に使用することができる。
【００５６】
適切なペプチドの特定に使用することができる更なるシステムは、参照により本明細書に援用するオデグリップ（Ｏｄｅｇｒｉｐ）ら（２００４）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）（２００４）１０１，２８０６−２８１０に記載のＣＩＳディスプレイシステムである。
【００５７】
抗菌薬耐性を阻害するペプチド薬剤は線状であり得ることが想定される。一般に、ペプチドは、５０から４００個のアミノ酸を有する。ペプチドは、一般に、分子量範囲が５．５ｋＤａから４０ｋＤａである。ペプチドが３５ｋＤａ未満のサイズであれば特に好ましい。
【００５８】
更なる例として、阻害剤は、（ｂｌａＮＤＭ−１としても知られる）クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＤＭ−１由来の金属ベータラクタマーゼに結合し、それを阻害する、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸とすることができる（参照により本明細書に援用するシュレジンジャ（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）ら（２０１１）ファーマシューティカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）４，４１９−４２８参照）。ペプチド及びペプチドアプタマーによるターゲティングに適切な同じ標的は、ＲＮＡ又は改変ＲＮＡアプタマーによるターゲティングにも適切であると予想される。参照により本明細書に援用するシュレジンジャ（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）ら（２０１１）ファーマシューティカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）４，４１９−４２８に記載の試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技術を用いて特定することができる核酸など、抗菌薬耐性決定因子に結合し、それを阻害する一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸。ＳＥＬＥＸ手法は、参照により本明細書に援用するツエルク（Ｔｕｅｒｋ）＆ゴールド（Ｇｏｌｄ）（１９９０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９，５０５−５１０に、より詳細に記述されている。参照により本明細書に援用する、特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子のインビトロ選択を記述したエリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）＆スゾスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）（１９９０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４６，８１８−８２２も参照されたい。一般に、核酸は、一本鎖であり、１００から５０００個の塩基を有する。
【００５９】
ペプチドは、配列番号１から４の１つ若しくは組合せ、又はその類似の相同性を有する任意のペプチド配列を含むことが好ましい。ペプチドは、これらの配列ＩＤと少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは少なくとも９５％相同であることが好ましい。
【００６０】
【表４−１】
2018076338.tif 000011
【００６１】
【表４−２】
2018076338.tif 000012
【００６２】
これらの機序のいずれかを本発明の方法によって標的にすることができる。
【００６３】
【表５】
2018076338.tif 000013
【００６４】
本発明は、上記酵素又は遺伝子産物のいずれかのターゲティングを含み得ることが想定される。
【００６５】
更なる例として、阻害剤は、表５に示すベータラクタマーゼ阻害剤、排出ポンプ阻害剤、アミノグリコシドキナーゼ阻害剤などの酵素阻害剤とすることができる。クラブラン酸又はその塩は、ある種のベータラクタマーゼの活性部位に不可逆的に結合する適切な酵素阻害剤である。
【００６６】
【表６】
2018076338.tif 000014
【００６７】
表５に列挙した阻害剤のどれでも本発明の方法、組成物、キット及び使用に利用できると予想される。
【００６８】
ペプチド又は核酸が、ＰＢＰ２ａ、ｂｌａＮＤＭ−１又はＶｉｍ２からなる群から選択される抗菌薬耐性決定因子に結合し、それを阻害すれば特に好ましい。
【００６９】
本発明の侵入促進剤がポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）若しくはポリヘキサメチレングアナイド（ＰＨＭＧ）又はその類似体若しくは誘導体であれば好ましい。
【００７０】
抗菌薬に対して感作させ、続いて抗菌薬によって死滅させ得る本発明の任意の態様における細菌は、グラム陰性、グラム陽性とすることができ、又はマイコバクテリウムとすることができる。細菌は、腸内細菌科に由来することができ、又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）若しくはストレプトコッカス（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）とすることができ、又はエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属に由来することができる。細菌は、一般に、クレブシエラ  ニューモニエ、シュードモナス  エルジノーサ、ノカルジア  オチチディスカビアルム（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｔｉｔｉｄｉｓｃａｖｉａｒｕｍ）、マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エンテロコッカス  フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス  ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｕｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バクテロイデス  フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター  ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の１種である。
【００７１】
本発明の任意の態様における細菌は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ＰＺ−６０１、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン及びトロバフロキサシンからなる群から選択される１種以上の抗菌薬に対して耐性があり得る。
【００７２】
本発明の任意の態様の一実施形態においては、細菌は、シプロフロキサシン、メロペネム、セフタジジム、アズトレオナム、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、オキシテトラサイクリン及びイミペネム／シラスタチンからなる群から選択される１種以上の抗菌薬に対して耐性があるシュードモナス  エルジノーサ、クレブシエラ  ニューモニエ、ブルクホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、プロビデンシア  スチュアルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）又はアシネトバクター  バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）からなる群から選択される多剤耐性（ＭＤＲ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）株である。別の一実施形態においては、細菌は、オキサシリンに対して耐性があるスタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。
【００７３】
細菌は臨床株又は臨床分離株であり得ることが想定される。
【００７４】
本発明の方法は、細菌がヒト又は動物中に存在する状況に適しており、この方法を使用して、ヒト又は動物の細菌感染に対処する。したがって、本発明は、抗菌薬耐性菌に感染したヒト又は動物を治療する方法であって、ヒト又は動物に有効量の抗菌薬耐性を阻害する薬剤を侵入促進剤及び抗菌薬と組み合わせて投与する方法を含む。
【００７５】
したがって、本発明は、抗菌薬耐性菌に感染したヒト又は動物の治療に使用される侵入促進剤及び抗菌薬と組み合わせた有効量の抗菌薬耐性を阻害する薬剤も含む。
【００７６】
本発明は、抗菌薬耐性菌に感染したヒト又は動物の治療用医薬品の製造における、侵入促進剤及び抗菌薬と組み合わせた有効量の抗菌薬耐性を阻害する薬剤の使用も含む。
【００７７】
医薬品は、以下で更に説明するように、さらに、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤又は担体を含むことができる。
【００７８】
抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、適宜、医師によって決定される様式で、投与用とすることができ、又は侵入促進剤と同時に若しくは逐次的に、さらに抗菌薬と同時に若しくは逐次的に投与できると予想される。抗菌薬耐性を阻害する薬剤、侵入促進剤及び抗菌薬は、適宜、一緒に又は別々に処方することができる。
【００７９】
一般に、細菌感染症は、口腔、生殖器系、尿路、気道、消化管、腹膜、中耳、前立腺、血管内膜、結膜若しくは角膜組織を含めた眼、肺組織、心臓弁、皮膚、頭皮、爪の表面、副腎、肝臓、腎臓、すい臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、真皮、表皮若しくは骨組織の創傷内部若しくは表面からなる群から選択される内部若しくは外部の体表、又は血液、血しょう、血清、脳脊髄液、消化管内容物、痰、肺分泌物及び精液から選択される体液中、又は副腎、肝臓、腎臓、すい臓、脳、心臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、表皮及び骨組織から選択される体組織の中若しくは上である。
【００８０】
本発明の方法、組成物／製剤及び使用による治療を受ける患者は、単一又は複数の薬物に対する耐性菌に感染した、感染した疑いがある、又は感染リスクがある患者であることが予想される。
【００８１】
本発明の方法、組成物／製剤及び使用による治療を受けるヒト又は動物患者は、既に感染している恐れがあり、免疫無防備状態の患者、集中治療若しくは重症治療を受けている患者、外傷のある患者、熱傷のある患者、急性及び／又は慢性創傷のある患者、新生児患者、高齢患者、癌患者、自己免疫疾患の患者、上皮若しくは内皮分泌及び／又は分泌排出能の少ない若しくはない患者、又は医療機器を装着された患者であり得ることが想定される。言うまでもなく、方法及び組成物／製剤は、抗菌薬耐性菌に感染した任意の患者の治療に使用することができる。
【００８２】
感染を引き起こす細菌のタイプを特定することが望ましい場合もあり、細菌の抗菌薬耐性の性質を特定することが望ましい場合もあることを理解されたい。したがって、本発明は、上述したヒト又は動物の抗菌薬耐性細菌感染に対処する方法を含み、本方法は、さらに、（ａ）細菌のタイプ及び細菌の少なくとも１種の抗菌薬耐性決定因子の性質を特定するステップと、（ｂ）決定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤を選択するステップと、（ｃ）特定された抗菌薬耐性決定因子によって細菌が耐性である抗菌薬を選択するステップと、（ｃ）ヒト又は動物に、侵入促進剤の存在下で、特定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤と抗菌薬を投与するステップを含む。
【００８３】
病原性微生物の性質の特定は、細菌培養技術、系統学などの任意の適切な方法によって決定することができる。ＤＮＡマイクロアレイの使用など、分子技術を採用して、病原性微生物を特徴づけることが好ましい。血流感染を引き起こす病原性微生物のＤＮＡマイクロアレイによる特定及び特性分析の一例が、参照により本明細書に援用する、クレベン（Ｃｌｅｖｅｎ）ら（２００６）ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４４（７），２３８９−２３９７に記載されている。この論文は、抗菌薬耐性の測定についても記述している。抗菌薬耐性菌の抗菌薬耐性決定因子の性質は、表現型的には感受性試験によって決定することができるが、マイクロアレイ検出などの分子技術を採用すれば好ましい。グラム陽性菌の９０個の抗菌薬耐性遺伝子のマイクロアレイ検出が、参照により本明細書に援用する、ペレテン（Ｐｅｒｒｅｔｅｎ）ら（２００５）ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー４３，２２９１−２３０２に記載されている。
【００８４】
１つを超えるタイプの細菌を特定することができ、１つを超えるタイプの抗菌薬耐性を特定することができることを理解されたい。１つを超えるタイプの細菌を感作させ、続いて死滅させることが望ましい場合があることも理解されたい。したがって、本発明の方法は、１つを超えるタイプの細菌を特定し、抗菌薬に対して感作させ、適切な抗菌薬で死滅させる可能性を含む。
【００８５】
本発明の第１及び第２の態様においては、細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップと細菌を抗菌薬に暴露するステップを同時に行えば好ましい。好都合には、例えば、侵入促進剤、抗菌薬耐性を阻害する薬剤、及び抗菌薬は、同じ組成物中に存在する。同様に好都合には、侵入促進剤、抗菌薬耐性を阻害する薬剤、及び抗菌薬は、細菌が接するナノ粒子中に存在する。好都合には、細菌に感染したヒト又は動物にナノ粒子を投与して、感染に対処する。ナノ粒子は、希釈剤若しくは担体に包含することができ、又は他の医薬品賦形剤と一緒に存在することができる。
【００８６】
本発明の方法は、ヒト又は動物の体の中又は上に存在する細菌に限定されない。したがって、一実施形態においては、細菌は、無生物材料の中又は上、無生物表面などのヒト又は動物の体の外側に存在し、本方法を使用して、病棟などにおける消毒管理体制の一部として、細菌を感作させ、死滅させることができる。すなわち、本発明の薬剤を消毒薬として使用するために適切な液体（すなわち、水性溶媒又は他の溶媒）、ガス又は固体形態で提供することができる。かかる調製物は、当業者によって理解されるように、液体、ミスト、エアロゾル、蒸気、粉末、結晶形、任意の他の適切な形態などの任意の適切な様式で投与することができる。したがって、本発明はかかる調製物を含む。
【００８７】
更に別の一態様においては、本発明は、侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む組成物／製剤を提供する。適切な薬剤は、上記態様に関連して上に示した薬剤である。
【００８８】
更に別の一態様においては、本発明は、ヒト又は動物における細菌感染に対処するのに使用される侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む組成物／製剤を提供する。さらに、適切な薬剤は、上記態様に関連して上に示した薬剤である。
【００８９】
前述の態様の一実施形態においては、ヒト又は動物に抗菌薬を投与することができる。実際、組成物／製剤は、さらに、抗菌薬を含むことができる。抗菌薬は、上記任意の抗菌薬とすることができる。
【００９０】
本発明の前述の態様の組成物は、さらに、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤又は担体を含むことができる。
【００９１】
「薬学的に許容される」とは、製剤が無菌であり、発熱物質を含まないことを含む。適切な薬剤担体は、薬学の当該技術分野で周知である。担体（単数又は複数）は、本発明の薬剤に適合し、そのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容される」必要がある。一般に、担体は、無菌であり発熱物質を含まない水又は食塩水であるが、他の許容される担体を使用することができる。
【００９２】
本発明の薬剤組成物／製剤は、ヒト又は動物患者に静脈内、筋肉内、皮下、経口、直腸、膣、経鼻、眼球又は局所送達するために処方することができる。投与経路及び製剤は、当業者によって理解されるように、対処するべき細菌感染の場所及び重症度に基づいて選択される。
【００９３】
好ましくは、本発明の薬剤組成物／製剤は、活性成分（単数又は複数）の１日量若しくは単位、１日量未満、又はその適切な一部を含む単位投与量である。
【００９４】
本発明の薬剤組成物／製剤は、通常、経口的に、又は任意の非経口経路によって、活性成分（単数又は複数）を含む医薬製剤の形で、場合によっては無毒の有機、又は無機、酸、又は塩基、付加塩の形で、薬学的に許容される剤形で、投与される。治療する感染症及び患者、並びに投与経路に応じて、組成物を異なる用量で投与することができる。
【００９５】
ヒトの治療においては、本発明の薬剤組成物／製剤は、単独で投与することができるが、一般には、意図された投与経路及び標準薬務に関して選択された適切な医薬品賦形剤希釈剤又は担体との混合物として投与される。
【００９６】
例えば、本発明の薬剤組成物／製剤は、経口、頬側又は舌下に、香味剤又は着色剤を含むことができる錠剤、カプセル剤、卵形剤（ｏｖｕｌｅｓ）、エリキシル剤、液剤又は懸濁液剤の形で、即時、遅延又は制御放出適用のために投与することができる。発明の薬剤組成物／製剤は、陰茎海綿体内注射によって投与することもできる。
【００９７】
かかる錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、ある種の複合体シリカートなどの崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ：ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ：ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、スクロース、ゼラチン、アラビアゴムなどの顆粒化結合剤を含むことができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリン、タルクなどの潤滑剤を含むことができる。
【００９８】
類似タイプの固体組成物をゼラチンカプセル剤中の充填剤として採用することもできる。この点で好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水系懸濁液剤及び／又はエリキシル剤の場合、本発明の化合物は、種々の甘味剤又は香味剤、着色剤又は色素、乳化剤及び／又は懸濁化剤、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどの希釈剤、並びにその組合せと組み合わせることができる。
【００９９】
本発明の薬剤組成物／製剤は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下に投与することもでき、又は注入技術によって投与することができる。本発明の薬剤組成物／製剤は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含むことができる無菌水溶液の形で最適に使用される。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝されなくてはならない（好ましくは、ｐＨ３から９）。適切な非経口製剤の無菌条件下での調製は、当業者に周知の標準製薬技術によって容易に実施される。
【０１００】
非経口投与に適切な製剤としては、抗酸化剤と、緩衝剤と、静菌剤と、製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質とを含むことができる水系及び非水系無菌注射液、並びに懸濁化剤と増粘剤を含むことができる水系及び非水系無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアル中で提供することができ、使用直前に無菌液状担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時注射液及び懸濁液は、上記種類の無菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【０１０１】
本発明の薬剤組成物／製剤は、鼻腔内に、又は吸入によって、投与することもでき、好都合には、ドライパウダー吸入器の形で、又は適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素若しくは他の適切なガスを使用した、加圧容器、ポンプ、噴霧器若しくはネブライザからのエアロゾル噴霧（ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形で送達される。加圧エアロゾルの場合には、単位用量は、計量された量を送達するための弁を備えることによって、決定することができる。加圧容器、ポンプ、噴霧器又はネブライザは、例えばエタノールと噴霧剤の混合物を溶媒として用いて、さらに潤滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを含むことができる、活性化合物の溶液又は懸濁液を含むことができる。吸入器又は注入器用の（例えば、ゼラチン製）カプセル及びカートリッジは、本発明の薬剤組成物／製剤とラクトース、デンプンなどの適切な粉末基剤との混合粉末を含むように処方することができる。
【０１０２】
エアロゾル又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量用量又は「一吹き（ｐｕｆｆ）」が、患者に送達される少なくとも１ｍｇの本発明の薬剤組成物／製剤を含むように設計される。エアロゾルの全１日量は、患者ごとに異なり、単一用量で投与することができ、より一般的には、１日を通して分割用量で投与できることを理解されたい。
【０１０３】
あるいは、本発明の薬剤組成物／製剤は、坐剤若しくは膣坐剤の形で投与することができ、又はローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤若しくは散布粉剤の形で局所的に適用することができる。本発明の化合物は、例えば、皮膚貼付薬を使用して、経皮投与することもできる。本発明の化合物は、特に眼の疾患を治療するために、眼球経路によって投与することもできる。
【０１０４】
眼に使用する場合、本発明の薬剤組成物／製剤は、等張性のｐＨ調節された無菌食塩水中の微粉懸濁液として、又は、好ましくは、等張性のｐＨ調節された無菌食塩水中の溶液として、場合によっては塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ）などの防腐剤と組み合わせて、処方することができる。あるいは、本発明の薬剤組成物／製剤は、ワセリンなどの軟膏剤中に処方することができる。
【０１０５】
皮膚に局所的に適用する場合、本発明の薬剤組成物／製剤は、例えば、以下、すなわち鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ及び水の１種以上との混合物中に懸濁又は溶解した活性化合物を含む適切な軟膏剤として処方することができる。あるいは、本発明の薬剤組成物／製剤は、例えば、以下、すなわち鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水の１種以上の混合物中に懸濁又は溶解した適切なローション剤又はクリーム剤として処方することができる。
【０１０６】
口内局所投与に適切な製剤としては、風味付けされた基剤、通常はスクロースとアラビアゴム又はトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ、ゼラチンとグリセリン、スクロースとアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ剤、及び適切な液状担体中に活性成分を含む洗口剤が挙げられる。
【０１０７】
一般に、ヒトにおいては、本発明の薬剤組成物／製剤の経口又は局所投与が好ましい経路であり、最も好都合である。レシピエントが、経口投与後に、えん下障害又は薬物吸収障害がある状況では、薬物を非経口的に、例えば、舌下又は頬側に投与することができる。
【０１０８】
獣医用途の場合、本発明の薬剤組成物／製剤は、通常の獣医学実務に従って適切に許容される製剤として投与され、獣医は、個々の動物に最も適切である投与計画及び投与経路を決定する。
【０１０９】
患者はヒトであることが好ましいが、患者は、治療の恩恵を受けることができる任意の他のほ乳動物とすることができる。例えば、患者は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、サル又は類人猿とすることができる。
【０１１０】
本明細書では「治療有効量」又は「有効量」又は「治療上有効な」とは、所与の症状及び投与計画に対して治療効果をもたらす量を指す。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわち担体又は投与ビヒクルと共に所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の所定量である。さらに、宿主の活性、機能及び反応における臨床的に重大な欠陥を抑制又は予防するのに十分な量を意味するものとする。あるいは、治療有効量は、宿主、例えば、ほ乳動物における臨床的に重大な症状を改善するのに十分である。
【０１１１】
本発明は、さらに、抗菌薬耐性を阻害する複数の薬剤を含む部品のキットを提供する。部品のキットは、さらに、細菌を特定する手段、及び／又は細菌中の抗菌薬耐性決定因子を特定する手段を含むことができる。かかる手段は、上記態様に関連して上で説明した手段とすることができる。
【０１１２】
部品のキットは、さらに、１種以上の抗菌薬を含むことができる。適切な抗菌薬は、上記態様に関連して上で列挙した抗菌薬とすることができる。
【０１１３】
本発明の部品のキットは、さらに、好ましくは抗菌薬耐性を阻害する薬剤と組み合わせて、侵入促進剤を含むことができる。適切な薬剤は、上記態様に関連して上に列挙されている。
【０１１４】
以下、本発明を以下の図及び非限定的実施例を参照してより詳細に記述する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】オキサシリンの異なる濃度におけるＰＨＭＢ及びＭｅｃＡペプチドのＦＩＣ指数。
【図２】発明の実施の長期戦略的展望。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
組換えＰＢＰ２ａの産生、及びＰＢＰ２ａを阻害するのに適切な結合剤の選択
ＰＢＰ２ａ産生
切断型ｍｅｃＡ遺伝子のクローニング。ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３００）の染色体ＤＮＡをＰＣＲ用テンプレートとして使用した。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公表されたｍｅｃＡ配列に基づいてプライマーを設計した。プライマーは、順方向プライマー５＿−ＰＢＰ２ａ−ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ（５＿−ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡ−３＿）（配列番号７）及び逆方向プライマー３＿−ＰＢＰ２ａ−ＸｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ（５＿−ＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＧＴＡ−３＿）（配列番号８）であった。Ｎ末端の最初の２３アミノ酸が欠失するようにプライマーを設計した。ゲル精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の手順に従って、生成したＤＮＡ断片（＿２ｋｂ）をゲル精製し、次いで抽出した。遺伝子をＴ４リガーゼを用いてｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に連結し、コンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に転換した。ｐＧＥＭ−Ｔベクター中のｍｅｃＡ遺伝子の配列をＴ７及びＳＰ６プロモータープライマーを用いて決定した。検証済み挿入ＤＮＡとｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の両方を同じ制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）で消化し、次いで連結して、発現ベクターｐＧＥＸ−ＰＢＰ２ａを得た。
【０１１７】
ＰＢＰ２ａ発現。組換えベクターｐＧＥＸ−ＰＢＰ２ａをタンパク質発現のためにエシェリキア  コリＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転換した。培養物の６００ｎｍにおける光学濃度が０．６に達するまで、アンピシリン１００＿ｇ／ｍｌを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中で細胞を３７℃で増殖させた。培養物を氷浴で１０分間冷却し、次いで振とう機に１８℃で置き、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−＿−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加してタンパク質発現を誘発した。次いで、細胞を振とうしながら１８℃で終夜（１６ｈ）増殖させ、次いで遠心分離によって４℃で収集した。大規模生産では、各々培養物３５０ｍｌを含む３個の１リットルフラスコを使用した。
【０１１８】
ＧＳＴ−ＰＢＰ２ａ精製。すべての精製ステップを４℃で実施した。細菌細胞ペレットを冷たい溶解緩衝剤（４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ［ｐＨ７．４］）６０ｍｌに再懸濁させた。細菌細胞をマイクロフルイダイザー（モデルＭ１００Ｌ；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いて溶解させた。細菌抽出物を３０，０００＿ｇで３０分間遠心分離し、上清を収集し、さらに２０分間遠心分離し、上清を再度収集し、＿８０℃で凍結貯蔵した。ＧＳＴ−ＰＢＰ２ａ融合タンパク質をＧＳＴ樹脂（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ｌ００２０６）上で製造者の指示に従って精製した。
【０１１９】
ＧＳＴタグの切断。トロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２７−０８４６−０１）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を用いて液状に戻して、１Ｕ／＿ｌの最終溶液を得た。少量の一定分量を−８０℃で貯蔵した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグを精製ＧＳＴ−ＰＢＰ２ａから切断するために、ＧＳＴ−ＰＢＰ２ａ  ５ｍｇをトロンビン７０Ｕを用いて４℃で終夜処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、切断を確認した。上述したようにＧＳＴ樹脂上を通過させて、遊離ＧＳＴタグ及び未切断ＧＳＴ−ＰＢＰ２ａを切断生成物ＰＢＰ２ａから除去した。精製されたタグなしＰＢＰ２ａは、フロースルー時にカラムを通過したが、ＧＳＴ及びＧＳＴ−ＰＢＰ２ａは保持された。画分を収集し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって分析し、次いで濃縮した。
【０１２０】
あるいは、ＰＢＰ２ａタンパク質をＳｕｎｎｙ  ｌａｂｓカタログ番号Ｐ５５５から購入することができる。
【０１２１】
ＰＢＰ２ａの阻害の特性分析。阻害剤スクリーニングのために、組換え発現され、精製されたＰＢＰ２ａを、親和性タグを用いてマイクロタイタープレートのウェルの表面に固定する。次いで、ウェルをペプチドアプタマー又は実際にＢＩＯ−ＡＭＰ（ボバ（Ｂｏｂｂａ）ら、２０１１）などの任意の可能なＰＢＰ２ａ阻害剤プラスＰＢＰ２ａ基質の段階希釈溶液と一緒にＰＢＳ中の固定濃度でインキュベートする。約１５分後、結合反応を停止し、プレートを記載されたように展開した（ボバら、２０１１）。対照反応の蛍光のバックグラウンドレベルを差し引き、次いで阻害剤結合データを計算し、プロットして、結合のＫｉａｐｐを求める。
【０１２２】
参考文献−スドヒール  ボバ（Ｓｕｄｈｅｅｒ  Ｂｏｂｂａ）、Ｖ．Ｋ．チャイタンヤ  ポナルリ（Ｃｈａｉｔｈａｎｙａ  Ｐｏｎｎａｌｕｒｉ）、ムリヅル  ムクヘルジ（Ｍｒｉｄｕｌ  Ｍｕｋｈｅｒｊｉ）及びウィリアム（Ｗｉｌｌｉａｍ）Ｇ．グトハイル（Ｇｕｔｈｅｉｌ）「メチシリン耐性スタフィロコッカス  アウレウス由来のペニシリン結合タンパク質２ａの阻害剤のマイクロタイタープレートアッセイ（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２ａ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）」アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）２０１１年６月５５巻６号２７８３−２７８７
【０１２３】
標的分子（例えば、ＰＢＰ２ａ）結合パートナーをスクリーニングするための適切なファージディスプレイプロトコル。
材料
・ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１４４１）
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ８４１８）
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭリン酸；２．７ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ７．４）
・ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）
・スピン脱塩カラム、７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号８９８８２／８９８８３）
・Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）ストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４６９９４９）
・１０ｘブロッキング緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ６４２９）
・高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１３０）
・ＴＭＢ（Ｓｅｒａｍｕｎ、カタログ番号Ｓ−００１−ＴＭＢ）
・ＥＲ２７３８  Ｅ．コリ細胞
・２ＴＹ培地（１リットル当たり：酵母エキス１０ｇ；トリプトン１６ｇ；ＮａＣｌ５ｇ）
・テトラサイクリン塩酸塩（７０％エタノール中１２ｍｇ／ｍｌ）
・ストレプトアビジン被覆（ＨＢＣ）８ウェルストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号１５５０１）
・０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１
・トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ０８８６）
・１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７
・１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天板
・カルベニシリン（５００ｘ原液：ｄｄＨ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍｌ）
・Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ
・カナマイシン（５００ｘ原液：ｄｄＨ２Ｏ中２５ｍｇ／ｍｌ）
・ＰＥＧ−ＮａＣｌ沈殿溶液（２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）
・ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）
・グリセロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ６２７９）
・エッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号００３０  １０８．１１６）
・ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＴ１、１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号６５６．０１／６５６．０２）
・深いウェル９６プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９５０４０４５０）
・ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（２００ｕｌ）９６プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９７００２５４０）
・ニュートラアビジン被覆（ＨＢＣ）８ウェルストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号１５５０８）
・ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
【０１２４】
方法
パニング１回目
ステップ１：標的タンパク質をビオチンに架橋
１．ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１４４１）のバイアルを開口前に室温に平衡にする。使用直前に、ＤＭＳＯ中のＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンの５ｍｇ／ｍｌ溶液（例えば、ＤＭＳＯ１００μｌ中ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン０．５ｍｇ）を調製する。
２．適切な体積のＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン溶液をタンパク質に添加する。例えば、１２ＫＤａタンパク質の場合、１ｍｇ／ｍｌ溶液５μｌを、ＰＢＳ（又は疎水性タンパク質の場合はＰＢＳＴ）総体積５０μｌ中のＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン０．４μｌに添加する。添加するタンパク質の体積をその分子量（ＭＷ）に応じて調節する。すなわち、ＭＷが低いタンパク質を少なく、ＭＷが高いタンパク質を多く添加する。
３．室温で１時間インキュベートする。
４．残留ビオチンをＺｅｂａスピン脱塩カラム７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号８９８８２／８９８８３）を用いて製造者の指示に従って脱塩、除去する。
５．等分し、４℃で貯蔵。
【０１２５】
ステップ２：ビオチン化をチェックするためのＥＬＩＳＡ
１．ＰＢＳ５０μｌ／ウェルをＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）ストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４６９９４９）に分注する。
２．ビオチン化タンパク質１、０．１及び０．０１μｌを添加する。すなわち、０．１μｌの場合１：１０希釈物１μｌを添加し、０．０１μｌの場合１：１００希釈物１μｌを添加する。
３．４℃で終夜インキュベートする。
４．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。
５．１０ｘブロッキング緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ６４２９）２５０μｌ／ウェルを分注し、３７℃で３時間インキュベートする。
６．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。
７．高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１３０）を２ｘブロッキング緩衝剤（ＰＢＳＴで希釈されたＳｉｇｍａ１０ｘブロッキング緩衝剤）で１：１０００希釈し、５０μｌ／ウェルを分注する。
８．振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）上で室温で１時間インキュベートする。
９．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで６回洗浄する。
１０．ＴＭＢ５０μｌ／ウェル（ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ（登録商標）ｆａｓｔ  ＴＭＢ／基質溶液、Ｓｅｒａｍｕｎ、カタログ番号Ｓ−００１−ＴＭＢ）を分注し、展開する。（プレートを展開する時間を記録する。）
１１．６２０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０１２６】
ステップ３：ストレプトアビジンプレート及びＥＲ２７３８Ｅ．コリ細胞を準備し、ファージディスプレイを実施する。
１．ＥＲ２７３８Ｅ．コリ細胞のコロニーを１２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む２ＴＹ培地５ｍｌに採取し、軌道恒温器（ｏｒｂｉｔａｌ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）中で３７℃、２２５ｒｐｍで終夜インキュベートする。
２．２ｘブロッキング緩衝剤３００μｌ／ウェルをストレプトアビジン被覆（ＨＢＣ）８ウェルストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号１５５０１）に分注し、（撹拌せずに）３７℃で終夜インキュベートする。各標的タンパク質に対して合計４ウェルを準備する（ファージをプレパニング（ｐｒｅ−ｐａｎｎｉｎｇ）するために３ウェル、及び標的タンパク質と結合し、ファージを用いてパニングするために１ウェル）。
３．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。
４．２ｘブロッキング緩衝剤１００μｌ／ウェルを分注し、ビオチン化タンパク質２．５μｌをウェルに添加して、パニングに使用する。
５．振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）機上で室温で２時間インキュベートする。その間に、ファージのプレパニングを開始する。
６．緩衝剤を第１のプレパニングウェルから除去し、２ｘブロッキング緩衝剤１００μｌを添加する。これに、最適な骨格ペプチドを発現する好ましいペプチドディスプレイファージライブラリー、すなわちＤＡＲＰＩｎ、アフィマー、線状５μｌを添加する。振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）上で４０分間混合し、インキュベートする。
７．第２のプレパニングウェルから緩衝剤を除去し、ファージを含む緩衝剤を第１のプレパニングウェルから第２のプレパニングウェルに移す。４０分間インキュベートし、次いで第３のプレパニングウェルに対して繰り返す。
８．標的タンパク質を含むウェルを多チャネルピペットを用いてＰＢＳＴ２００μｌ／ウェルで６回洗浄する。
９．ファージをプレパニングウェルから標的タンパク質を含むウェルに移し、振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）上で室温で２時間インキュベートする。
１０．その間に、終夜培養物を約１：１５希釈し、３７℃、２２５ｒｐｍで約１時間インキュベートして０．６のＡ６００を与えることによって、ＥＲ２７３８細胞の新しい培養物を準備する。
１１．パニングウェルをプレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで６回洗浄する。
１２．０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートして、ファージを溶出させる。
１３．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を１５μｌ添加して中和する。混合し、５０ｍｌファルコンチューブ中の８ｍｌ一定分量のＥＲ２７３８細胞にすぐに添加する。
１４．トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ０８８６）１４μｌをＰＢＳ９８６μｌで希釈する。
１５．希釈トリエチルアミン１００μｌを添加し、室温で６分間インキュベートして、残留ファージを溶出させる。
１６．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７を５０μｌ添加して中和する。混合し、ＥＲ２７３８細胞にすぐに添加する。
１７．細胞を３７℃で１時間インキュベートする（振とうなし、又は低速振とう、最高９０ｒｐｍ）。
１８．ファージ感染Ｅ．コリＫ１２ＥＲ２７３８細胞１μｌを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天板に蒔き、３７℃で終夜インキュベートする。
１９．残りの細胞を３，０００ｘｇで５分間遠心分離して、より小さい体積で再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢ寒天板上に蒔き、室温で終夜インキュベートする。
２０．翌日、細胞１μｌを含むプレート上のコロニーを数え、８，０００を掛けて、細胞８ｍｌ当たりの総数を求める（０．５〜２×１０６である必要がある）。
２１．残りのプレートから細胞をこすり落す。これをするために、２ＴＹ培地５ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンをプレートに添加し、使い捨てプラスチック延展器を用いてこすり落し、５０ｍｌファルコンチューブに移し、混合する。さらに２ＴＹ培地２ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを添加して、残留細胞をこすり落す。
２２．１：１０希釈物の６００ｎｍにおける吸光度を測定して、Ａ６００＝０．２において培養物２５ｍｌに必要な希釈を決定する。
２３．細胞を１２５ｍｌガラスフラスコ中で２ＴＹ培地＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンで希釈する。
２４．３７℃、２３０ｒｐｍで１時間インキュベートする。
２５．Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（力価約１０１４／ｍｌ）１μｌを添加し、３７℃、９０ｒｐｍで３０分間インキュベートする。
２６．カナマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、軌道恒温器中で２５℃、１７０ｒｐｍで終夜インキュベートする。
２７．ファージ感染培養物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、３，５００ｘｇで１０分間遠心分離する。
２８．２回目のパニングのためにファージ含有上清５００μｌを取り出す。
２９．残りの上清を新しい管に移し、ＰＥＧ−ＮａＣｌ沈殿溶液（２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）６ｍｌを添加する。４℃で２時間インキュベートする。
３０．５，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、ファージをペレット化する。
３１．上清を捨て（管をティッシュペーパーで拭き、上清すべてを除去する）、ペレットをＴＥ１ｍｌに再懸濁させる。
３２．微量遠心管に移し、１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離する。上清はファージを含む。４℃で貯蔵する。または、長期貯蔵のために、４０〜５０％グリセロールで希釈し、−８０℃で貯蔵する。
【０１２７】
パニング２回目
１．ＥＲ２７３８Ｅ．コリ細胞のコロニーを１２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む２ＴＹ培地５ｍｌに採取し、３７℃、２２５ｒｐｍで終夜インキュベートする。
２．標的タンパク質１種当たり２０μｌのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＴ１、１０ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号６５６．０１／６５６．０２）を磁石を用いて２ｘブロッキング緩衝剤５００μｌで３回洗浄する。
３．ストレプトアビジンビーズ２０μｌ当たり１００μｌの２ｘブロッキング緩衝剤に再懸濁させ（又は２００μｌ最小体積）、Ｓｔｕａｒｔ  ＳＢ２固定速度回転装置（２０ｒｐｍ）上で室温で終夜インキュベートする。
４．１，０００ｘｇで１分間遠心分離し、ストレプトアビジンビーズを磁石で固定し、ブロッキング緩衝剤を除去する。
５．新しい２ｘブロッキング緩衝剤で置換し、ストレプトアビジンビーズ２０μｌ当たり１００μｌに再懸濁させる。
６．ファージのプレパニング：１回目のパニングからのファージ含有上清１２５μｌを２ｘブロッキング緩衝剤１２５μｌと混合し、あらかじめブロックされたストレプトアビジンビーズ５０μｌを添加する。エッペンドルフタンパク質ＬｏＢｉｎｄ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号００３０  １０８．１１６）を使用する。回転装置上で室温で４時間インキュベートする。
７．同時に、標的をストレプトアビジンビーズに結合させる：ビオチン化標的タンパク質２．５μｌを２ｘブロッキング緩衝剤２００μｌ及びあらかじめブロックされたストレプトアビジンビーズ５０μｌに添加する。Ｓｔｕａｒｔ  ＳＢ２回転装置上で室温で４時間インキュベートする。
８．その間に、プレートをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）用にあらかじめブロックする：
ａ．深いウェル９６プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９５０４０４５０）の十分なウェルを２ｘブロッキング緩衝剤１ｍｌ／ウェルであらかじめブロックする。これをパニングに使用する。
ｂ．２個のＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（２００ｕｌ）９６プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９７００２５４０）の十分なウェルを２ｘブロッキング緩衝剤３００μｌ／ウェルであらかじめブロックする。一方をグリシンによる溶出に使用し、他方をトリエチルアミンによる溶出に使用する。３７℃で４時間ブロックする。
９．２ｘブロッキング緩衝剤９５０μｌ／ウェルを用いて４枚の深いウェル９６プレート中に十分なウェルを用意する。これらをＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒプロトコルの洗浄ステップに使用する。あらかじめブロックされた溶出プレートから緩衝剤を除去する。１００μｌ／ウェルの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２を１枚のプレートに分注する。トリエチルアミン１４μｌをＰＢＳ９８６μｌで希釈し、１００μｌ／ウェルをその他のプレートに分注する。あらかじめブロックされた深いウェル９６プレートから緩衝剤を除去する。
１０．プレパニングされたファージ及びビオチン化標的を含む管を１，０００ｘｇで１分間遠心分離し、磁石の上に置く。
１１．ビオチン化標的タンパク質を含むビーズを２ｘブロッキング緩衝剤５００μｌで３回洗浄する。
１２．ファージを含む上清をビオチン化標的タンパク質を含むビーズに移し、再懸濁させる。あらかじめブロックされた深いウェル９６プレートに移す。
１３．その間に、終夜培養物を約１：１５希釈し、３７℃、２２５ｒｐｍで約１時間インキュベートして、ＥＲ２７３８細胞の新しい培養物を準備する。
１４．プロトコルは、グリシン中で１０分間溶出する。終了後すぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．１を１５μｌ添加して中和する。混合し、８ｍｌ一定分量のＥＲ２７３８細胞に添加する。
１５．次いで、プロトコルは、トリエチルアミン中で６分間溶出する。終了後すぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７を５０μｌ添加して中和する。混合し、ＥＲ２７３８細胞に添加する。
１６．細胞を３７℃で１時間インキュベートする（振とうなし、又は低速振とう、最高９０ｒｐｍ）。パニング１回目のステップ１７〜３１に記述したようにファージを蒔き、調製する。
【０１２８】
パニング３回目
１．ＥＲ２７３８Ｅ．コリ細胞のコロニーを１２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む２ＴＹ培地５ｍｌに採取し、３７℃、２２５ｒｐｍで終夜インキュベートする。
２．２ｘブロッキング緩衝剤３００μｌ／ウェルをニュートラアビジン被覆（ＨＢＣ）８ウェルストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号１５５０８）に分注し、３７℃で終夜インキュベートする。各標的タンパク質に対して合計６ウェルを準備する（ファージをプレパニングするために４ウェル、標的タンパク質に対してパニングするために１ウェル、及びブランクウェルに対してパニングするための負の対照）。
３．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄する。
４．２ｘブロッキング緩衝剤１００μｌ／ウェルを、パニングに使用するウェルに分注する（標的タンパク質に対してパニングするために１ウェル、及びブランクウェルに対してパニングするための負の対照）。ビオチン化タンパク質２．５μｌを、標的タンパク質に対するパニングに用いるウェルに添加する。振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）上で室温で４時間インキュベートする。
５．同時に、ファージのプレパニングを開始：１０ｘブロッキング緩衝剤２０μｌを第１のプレパニングウェルに分注し、２回目のパニングからのファージ含有上清２００μｌを添加する。振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；速度設定３）上で室温で１時間インキュベートする。残りのプレパニングウェルに２ｘブロッキング緩衝剤２００μｌ／ウェルを充填する。
６．第２のプレパニングウェルから緩衝剤を除去し、第１のプレパニングウェルの内容物を第２のプレパニングウェルに移す。さらに１時間インキュベートし、第３及び第４のプレパニングウェルに対して繰り返す。
７．その間に、終夜培養物を約１：１５希釈し、３７℃、２２５ｒｐｍで約１時間インキュベートして、ＥＲ２７３８細胞の新しい培養物を準備する。
８．標的タンパク質を含むウェル及び負の対照ブランクウェルをＰＢＳＴで３回（手で）洗浄する。
９．プレパニングウェルからのファージ１００μｌ／ウェルを、標的タンパク質を含むウェル及び負の対照ブランクウェルに移す。振動しているプラットフォーム振とう機（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ１００；最高速度設定３）上で室温で３０〜４５分間インキュベートする。
１０．プレート洗浄機によりＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで６回洗浄する。
１１．１００ｍＭ  ＤＴＴ１００μｌを添加し、室温で２０分間インキュベートして、ファージを溶出させる。
１２．８ｍｌ一定分量のＥＲ２７３８細胞に添加する。
１３．３７℃で１時間インキュベートする（振とうなし、又は低速振とう、最高９０ｒｐｍ）。パニング１回目のステップ１７〜３１に記述したようにファージを蒔き、調製する。
【０１２９】
実施例２
ＭｅｃＡ阻害ペプチド及びＰＨＭＢを用いたオキサシリンに対するＭＲＳＡの感作
ｍｅｃＡは、タンパク質ペニシリン結合タンパク質２Ａ（ＰＢＰ２Ａ）をコードし、メチシリン、ペニシリン、オキサシリン、エリスロマイシン、テトラサイクリンなどのβラクタム抗菌薬に対する菌耐性の原因である。ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、細菌細胞壁合成に不可欠である。ＰＢＰは、架橋ペプチドグリカンを脂質中間体から合成し、ペプチドグリカン前駆体からのＤ−アラニンの除去を媒介するプロセスに関与する幾つかの反応を触媒することが示された。ＰＢＰは、ペプチドグリカンを形成するモジュール部分に化学構造が類似しているので、βラクタム抗菌薬に結合する。ＰＢＰがペニシリンに結合すると、βラクタムアミド結合が開裂して、ＰＢＰ活性部位において触媒作用性セリン残基と共有結合を形成する。これは不可逆反応であり、酵素を不活性化する。βラクタム抗菌薬に対する耐性は、上で説明したように、ＰＢＰの過剰産生、及びβラクタム抗菌薬に対する親和性が低いＰＢＰの形成によって生じる。ＰＢＰ２Ａはβラクタム抗菌薬に対して低親和性である。したがって、ｍｅｃＡの発現は、βラクタム抗菌薬の有効性を低下させ、細菌が細胞壁成分を妨げられなくすることができる。
【０１３０】
ｍｅｃＡの最も一般的に知られる担体は、メチシリン耐性スタフィロコッカス  アウレウス（ＭＲＳＡ）である。ｍｅｃＡは、ストレプトコッカス  ニューモニエ株などの幾つかの別の細菌種にも見られる。スタフィロコッカス種においては、ｍｅｃＡは、ＳＣＣｍｅｃ遺伝因子上に広がっている。
【０１３１】
以下の実験は、本発明の方法を例証するものである。抗菌薬耐性を阻害する薬剤及び抗菌薬（オキサシリン）と組み合わせて本発明の例示的侵入促進剤を用いてＭＲＳＡ株をオキサシリンに対して感作させる。例示的侵入促進剤はＰＨＭＢである。抗菌薬耐性を阻害する例示的薬剤は、ＭｅｃＡ（すなわち、ＰＢＰ２Ａ結合ペプチド）結合ペプチドＭｅｃＡ３１３６、ＭｅｃＡ３１４０、ＨＩＷ及びＥ１である。これらのペプチドは、Ｓｔｅｆｉｎ  Ａ骨格に基づくアフィマーであり（ウッドマンら（２００５）「ペプチドアプタマーの提示に対する中性骨格の設計及び検証」ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー３５２：１１１８−１１３３参照）、以下のアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
【表７】
2018076338.tif 000015
【０１３３】
ＭｅｃＡ結合ペプチドＭｅｃＡ３１３６、ＭｅｃＡ３１４０、ＨＩＷ及びＥ１は、ＭｅｃＡに結合し、インビトロでオキサシリン（ｏｘｙｃｉｌｌｉｎ）がＭｅｃＡに結合するのを阻止する。
【０１３４】
この実施例に記載の実験の目的は、（１）ＭＲＳＡ株におけるＰＨＭＢ及びＭｅｃＡペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を求めること、並びに（２）ＰＨＭＢ及びペプチドを用いてオキサシリンの増強を試験することであった。
【０１３５】
ＨＯ５０９６  ０４１２（ＥＭＲＳＡ−１５）は、英国の病院に特有のＭＲＳＡ株である。ＥＭＲＳＡ−１５ゲノムは、２，８３２，２９９ｂｐの単一環状染色体及び２４７３ｂｐのプラスミドからなる。十分な注釈の付いた染色体がＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースから受託番号ＨＥ６８１０９７で入手可能である。プラスミドの予備的遺伝子予測をＡｒｔｅｍｉｓ形式でダウンロードすることができる。
【０１３６】
ＭＲＳＡ２５２は、英国の病院に特有の流行性ＥＭＲＳＡ−１６系列の代表である。この系統は、ＭＬＳＴによって配列タイプ（ＳＴ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｅ）３６として分類された。ＭＲＳＡ２５２ゲノムは、２，９０２，６１９ｂｐの単一環状染色体で構成される。十分な注釈の付いたゲノムがＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースから受託番号ＢＸ５７１８５６で入手可能である。
【０１３７】
方法
薬物及びペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）
ＥＭＲＳＡ−１５の抗菌薬感受性試験を、ブロスミクロブロス希釈のＮＣＣＬＳ指針に修正を加えて実施した。ＥＭＲＳＡ−１５を、−７０℃グリセロール原液から、５％ウマ血液（Ｏｘｏｉｄ）及び６μｇ／ｍｌオキサシリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したコロンビア基礎寒天（Ｏｘｏｉｄ）に画線し、３３℃で１８〜２０時間インキュベートした。２から４個の細菌コロニーを、６μｇ／ｍｌオキサシリン（Ｓｉｇｍａ）を補充した３ｍｌミュラーヒントンブロス（ＭＨＢ：Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ、Ｏｘｏｉｄ）に接種し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３３℃で１８〜２０時間インキュベートした。培養物をＭＨＢを用いてＯＤ６２５０．０８〜０．１（０．５Ｍｃｆａｒｌａｎｄ又は１〜２×１０８ｃｆｕ／ｍｌに相当）に調節し、更に１／５０希釈して、最終濃度５×１０５ｃｆｕ／ウェルにした。オキサシリン、ＰＨＭＢ又はペプチドに対する感受性を、オキサシリン（ＭＨＢ中０〜１０２４μｇ／ｍｌ）、ＰＨＭＢ（１ｘＰＢＳ中０〜５１２μｇ／ｍｌ）又はペプチド（１ｘＰＢＳ中０〜５１２μｇ／ｍｌ）を培養物７５μｌに最終体積１５０μｌ／ウェルで添加することによって試験した。プレートを３３℃で２４時間インキュベートし、増殖を目視で点数化した。
【０１３８】
ＰＨＭＢとＭｅｃＡペプチドの相乗作用
ＰＨＭＢとペプチド（ＭｅｃＡ３１３６、ＭｅｃＡ３１４０）の相乗作用を２倍希釈物の標準チェッカーボード法によって試験した。ＰＨＭＢとペプチドを適切な濃度で混合して、９６ウェルプレートの各ウェルの最終体積を３０μｌにし、培養物及びオキサシリンを添加して最終体積を１５０μｌにする前に混合物を２０〜２２℃で３０分間インキュベートした。プレートをインキュベートし、上述したように点数化した。増殖せず、ＰＨＭＢとペプチドの最低の組合せを含むウェルのＦＩＣ指数を以下のように計算した：（Ａ／ＭＩＣＡ）＋（Ｂ／ＭＩＣＢ）＝ＦＩＣＡ＋ＦＩＣＢ＝ＦＩＣ指数。ここで、Ａは、組合せのＰＨＭＢの濃度であり、ＭＩＣＡは、ＰＨＭＢ単独のＭＩＣであり、Ｂは組合せのペプチドの濃度であり、ＭＩＣＢはペプチド単独のＭＩＣである。オキサシリンを含まない対照プレート、及びオキサシリン（ｏｘｃａｉｌｌｉｎ）が増加するがＰＨＭＢもペプチドも含まない培養物の対照ウェルを含んだ。
【０１３９】
結果
【０１４０】
【表８】
2018076338.tif 000016
【０１４１】
指標：
・ＰＨＭＢ及びＭｅｃＡペプチドのＭＩＣは、オキサシリンの存在下で変化しなかった。
・ＰＨＭＢについては、ＭｅｃＡペプチドの送達に対して１／２ＭＩＣ（例えば、０．２５μｇ／ｍｌ）で試験することになる（オキサシリン感作アッセイ）。
・ＭｅｃＡペプチドは、ＭＲＳＡの増殖を阻害しない。増殖阻害は、試験濃度よりも高い濃度で起こり得るが、これについては試験しなかった。
・ＭｅｃＡペプチドはＭＩＣを持たないので、ＰＨＭＢを用いて任意の濃度で試験することになる（オキサシリン感作アッセイ）。
【０１４２】
【表９】
2018076338.tif 000017
【０１４３】
指標：
・ＰＨＭＢ単独では、オキサシリンを増強しなかった（ＭＩＣの低下なし）
・ペプチド単独では、オキサシリンを増強しなかった（ＭＩＣの低下なし）
・ＰＨＭＢは、オキサシリンに対するＭＲＳＡ−１５のＭＩＣを２倍にしたが、これは有意とはみなされず、予想外の結果である。
・しかし、これは、ある濃度において、ＰＨＭＢがオキサシリンをナノ粒子中に捕捉し、細菌がそれらを利用できないようにする、又はＰＨＭＢがｍｅｃＡの発現を上方制御し、オキサシリンに対する耐性を増加させることを示しているのかもしれない。
・ＰＨＭＢがオキサシリンと一緒にナノ粒子を形成し、もしかするとそれを細菌細胞に送達している場合、ペプチド、ＰＨＭＢ及びオキサシリンを含む３次元アッセイは、明瞭な結果を示さないかもしれない。
【０１４４】
【表１０】
2018076338.tif 000018
【０１４５】
−この実験セットにおけるオキサシリンのＭＩＣは、２５６μｇ／ｍｌであった。
−ＭｅｃＡペプチドは増殖を阻害しないので、ＦＩＣ指数の計算では、ペプチドのＭＩＣを、以前に試験して増殖抑制作用を示さなかった最大濃度である２２μＭ（又は５１２μｇ／ｍｌ）に設定した。
【０１４６】
指標：
・ある濃度におけるＰＨＭＢ及びＭｅｃＡ３１３６は、オキサシリンのＭＩＣを２５６μｇ／ｍｌから≦１６μｇ／ｍｌに増強した（ＭＩＣの１／１６の減少、図１も参照されたい）。
・ＦＩＣ＜０．５は、相乗作用を示す。ＰＨＭＢとＭｅｃＡペプチドは相乗作用を示さなかったが、オキサシリン濃度の増加に伴うＦＩＣの減少は、ＰＨＭＢ及びＭｅｃＡ３１３６を使用したときの感作、並びにＭｅｃＡに対するペプチドの特異性を示す。
・これらの結果は、ＭｅｃＡ３１３６が２つのうちでより有望であり得ることを示唆している。
【０１４７】
【表１１】
2018076338.tif 000019
【０１４８】
この実験は、０．２５μｇ／ｍｌのＰＨＭＢデータセットを最も情報価値のあるデータセットとして着目した。というのは、より高い濃度においては、ＰＨＭＢ自体が感受性に対して効果を有する可能性があり、０．５μｇ／ｍｌでは単独で殺菌し得るからである。ただし、これは１μｇ／ｍｌでは不明である。
【０１４９】
表９においては、１は増殖であり、０は増殖なしである（ｎｄ＝実施せず（ｎｏｔ  ｄｏｎｅ））。ＭｅｃＡ３１３６によるオキサシリン活性の明白な増強が見られる。表は、明白な用量反応を示している。８μＭ  ＭｅｃＡ３１３６及び３２μｇ／ｍオキサシリンにおける増殖は異常かもしれないが、これ以外は、ＭｅｃＡ３１３６がオキサシリンに対する感受性をどのように復活させるかを見ることができる。このＰＨＭＢ濃度においては、オキサシリンへの感受性に対するＭｅｃＡ３１３６の明らかな相乗効果を見ることができる。
【０１５０】
ＨＩＷ及びＥ１によるオキサシリン活性の明白な増強は、ＭｅｃＡ３１３６及びＭｅｃＡ３１４０と同様のアッセイをこれらの別のアプタマーに対して実施したときにも見られた。
【０１５１】
【表１２】
2018076338.tif 000020
【０１５２】
表１０の配列ＨＩＷは、アッセイ中に良好な効果を示す。
【０１５３】
【表１３】
2018076338.tif 000021
【０１５４】
配列Ｅ１は、ＭｅｃＡ３１３６及びＭｅｃＡ３１４０とは異なる骨格であるが、表１１においては、アッセイ中に適度の効果を示す。
【図１】
2018076338.tif 000024
【図２】
2018076338.tif 000025
【配列表】
2018076338000001.app
【外国語明細書】
2018076338000001.pdf