(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドに関し、修飾を含まない同じペプチドで得られたＣＤ４＋Ｔ細胞応答よりもはるかに強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答が得られるように修飾され、感染症もしくはアレルギー性疾患および自己免疫性疾患のような疾患を治療、抑制もしくは防止する際または移植片拒絶を防止もしくは抑制する際または腫瘍細胞の根絶に使用されるペプチドの提供。【解決手段】ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、特定のモチーフを有する配列を有する、抗原性タンパク質の野生型配列に発生する配列と異なる人工ペプチドである、分離された免疫原性ペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された免疫原性ペプチドであって、
ａ）ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、
ｂ）エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、モチーフＣｘｘ［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］ｘｘＣを有する配列が、発生すれば、前記エピトープに隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって前記エピトープから離れている場合、前記システインは、当該モチーフを有する配列に発生せず、
前記分離された免疫原性ペプチドは人工ペプチドであり、部分ａ）およびｂ）において規定される配列は、前記抗原性タンパク質の野生型配列に発生する配列と異なる、ペプチド。
【請求項２】
部分ｂ）に規定される前記配列は、ただ１つのシステインを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記エピトープはＭＣＨクラスＩＩエピトープである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
９個と１００個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
９個と５０個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
９個と２０個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１〜５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記エピトープと前記システインアミノ酸との間にアミノ酸なしで、前記システインアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端方向に前記エピトープに隣接して位置する、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
【請求項８】
前記Ｔ細胞エピトープは感染因子のＴ細胞エピトープである、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
【請求項９】
前記Ｔ細胞エピトープは、自己抗原、アレルゲン、同種因子または同種移植片の抗原のＴ細胞エピトープである、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞エピトープは腫瘍に特異的または優先的であるＴ細胞エピトープである、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１１】
分離された免疫原性ペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、
ａ）ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、
ｂ）エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、モチーフＣｘｘ［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］ｘｘＣを有する配列が、発生すれば、前記エピトープに隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって前記エピトープから離れている場合、前記システインは、当該モチーフを有する配列に発生せず、さらに、
ｃ）溶剤、希釈剤、キャリアまたはアジュバントの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１２】
分離された免疫原性ペプチドであって、前記ペプチドは、
ａ）ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、
ｂ）エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、薬剤としての使用のために、モチーフＣｘｘ［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］ｘｘＣを有する配列が、発生すれば、前記エピトープに隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって前記エピトープから離れている場合、前記システインは、当該モチーフを有する配列に発生しない、ペプチド。
【請求項１３】
部分ｂ）において規定される配列は、ただ１つのシステインを含む、請求項１２に記載の薬剤としての使用のためのペプチド。
【請求項１４】
前記エピトープはＭＣＨクラスＩＩエピトープである、請求項１１または１２に記載の薬剤としての使用のためのペプチド。
【請求項１５】
８個と１００個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤としての使用のためのペプチド。
【請求項１６】
８個と５０個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤としての使用のためのペプチド。
【請求項１７】
８個と２０個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤としての使用のためのペプチド。
【請求項１８】
感染症を治療または防止するための薬剤としての使用のための、請求項１１〜１６のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
【請求項１９】
自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、または同種因子を中和する免疫応答を治療または防止するための、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項２０】
腫瘍を治療または防止するための薬剤としての使用のための、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項２１】
エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するため、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞応答を誘導するため、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導するための薬剤としての使用のための、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項２２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、過剰に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン２のような、サイトカインの生成を介した間接的な活性化である、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
障害の治療または防止方法であって、
有効な量の分離された免疫原性ペプチドを投与するステップを含み、前記ペプチドは、
ａ）ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、
ｂ）前記エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、薬剤としての使用のために、モチーフＣｘｘ［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］ｘｘＣを有する配列が、発生すれば、前記エピトープに隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって前記エピトープから離れている場合、前記システインは、当該モチーフを有する配列に発生せず、前記疾患は、感染症、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、腫瘍、または同種因子を中和している免疫応答からなる群から選択される、障害の治療または防止方法。
【請求項２４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘発可能な抗原性タンパク質のペプチドを調製するための方法であって、
ａ．前記抗原性タンパク質のＴ細胞エピトープからなるペプチド配列を提供するステップと、
ｂ．システイン残基を含む配列を（ａ）の前記ペプチド配列にリンクするステップとを含み、前記システイン残基は最大５個のアミノ酸によってエピトープ配列から離れており、モチーフ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］を有する配列が、発生すれば、前記ＭＨＣ結合領域に隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって前記ＭＨＣ結合領域から離れている場合、前記システインは、当該モチーフを有する配列にシステインとして発生せず、さらに、
ｃ．ステップａ）およびｂ）に規定されるような配列を含むペプチドを合成するステップを含む、方法。
【請求項２５】
抗原性タンパク質におけるＴ細胞エピトープの配列は、コンピュータアルゴリズムおよび／または生化学分析によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
部分ｂのペプチド配列が、前記エピトープ配列の６個のアミノ酸のＮ末端またはＣ末端までの領域において、抗原性タンパク質のアミノ酸配列を修飾することによって得られる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
突然変異は、システインの導入、モチーフ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］におけるシステインとして発生するシステインの削除、および１つの位置でのシステインの削除および別の位置でのシステインの導入からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
部分ｂのペプチド配列は、６個のアミノ酸までの領域において前記エピトープ配列のＮ末端またはＣ末端に存在する、前記抗原性タンパク質の配列と関係のない人工配列である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドに関する。上記ペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が得られ得るように修飾される。当該ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、上記修飾を含まない同じペプチドで得られたＣＤ４＋Ｔ細胞応答よりもはるかに強い。特にこの修飾は、ペプチドのＭＨＣ結合部位に隣接するがその外側の位置でのシステインの付加、システインの挿入または残基のシステインへの突然変異である。さらに、移植片拒絶の防止もしくは抑制または腫瘍細胞の根絶において、感染症、アレルギー性疾患、および自己免疫性疾患のような病気の治療、抑制または防止におけるこのような修飾されたペプチドの使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
病原体に対するワクチン接種の目的は、可能な限り強い特定の免疫応答を誘発することである。このようなワクチン接種は、弱い内因性の免疫原性を有する抗原を利用する。このような弱い免疫原性の理由は、ヒト集団における組織適合性複合体の大きな多様性に関係付けられる。このような複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞への提示のためのクラスＩまたはＣＤ４＋Ｔ細胞への提示のためのクラスＩＩのいずれも、抗原提示細胞と呼ばれる特殊化される細胞の表面にてＴ細胞に抗原を提示する。Ｔ細胞が活性化される強さは、抗原処理の後に得られたペプチドが装填された抗原提示細胞と特定のＴ細胞との間に形成されるシナプスの強さおよび持続期間に依存する。
【０００３】
弱い免疫原性が回避される従来の方法は、アジュバントの添加である。アルミニウム塩から油乳剤まで、これらのアジュバントのいくつかが記載されている。アジュバントが免疫原性を増加させるメカニズムは、非特異的であり、使用されるアジュバントのタイプに依存する。しかしながら、多くの場合、炎症性の悪影響により、アジュバントの使用は限定される。
【０００４】
ワクチン抗原の免疫原性が具体的に増える一般的な方法が非常に望ましい。これは、バクテリアまたは寄生生物のような細胞外の病原に対するワクチン抗原と、ウイルスのような細胞内の病原へのワクチン抗原とに関する。
【０００５】
免疫応答は、調節性Ｔ細胞によって抑制され得る。このような細胞は、胸腺において中心にて選択された自然のサブセットまたは抗原との遭遇によって末梢において得られた末梢サブセットに属しており、ＩＬ−１０またはＴＧＦベータのような抑制性サイトカインの生産、アルギニンもしくはトリプトファンのような必須の栄養素からの標的細胞の欠乏、または細胞接触を含む、免疫反応を抑える多くのメカニズムを用いる。自然な調節性Ｔ細胞のレパートリは、胸腺における自己抗原提示の際の選択の結果、自己反応性である。自己抗原または同種抗原のいずれかとの接触によって、末梢または誘導された調節性Ｔ細胞が形成および活性化される。
【０００６】
抗原特異性の調節性Ｔ細胞のパーセンテージは非常に低く、これらの細胞はインヴィトロで展開するのが難しい。さらに、このような細胞をインヴィヴォで展開する方法もあまり成功していない。たとえば、アジュバントが存在しない状態でのＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩエピトープを含む合成ペプチドの投与により、ＩＬ−１０を作り出す調節性Ｔ細胞の展開が誘発される。しかしながら、調節性Ｔ細胞の活性化および展開は、同時刺激に厳しく依存することが知られている。すなわちＴ細胞表面にて表面ＣＤ２８
と相互作用する、Ｂ７ファミリーの分子を含む、同時刺激分子の表面発現につながる抗原提示細胞の活性化に厳しく依存することが知られている。ＣＤ２８が不足しているマウスは調節性Ｔ細胞を作り出さず、自己免疫性疾患の発生率が大きく増加している。
【０００７】
したがって、調節性Ｔ細胞を展開するのに必要なワクチン抗原の免疫原性が改善される一般的な方法が非常に必要とされている。このセッティングにおけるワクチン抗原は、自己抗原または同種抗原を含む。
【０００８】
多くの腫瘍は、治療の対象として機能し得る抗原を発現する。このような抗原は腫瘍によって発せられ、宿主抗原提示細胞によって宿主の免疫系に提示される。このプロセスは、間接的抗原提示経路と呼ばれており、腫瘍に特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する。しかしながら、多くの場合、腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ決定子を発現せず、効率的な免疫応答は、ＭＨＣクラスＩ決定子によって提示された腫瘍由来のペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞にのみ依存する。これは、クラスＩ拘束性ペプチドを用いて腫瘍に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を向上する多くの試みによって示されるように、あまり効率的でない（Boon et al. 2006, Ann Rev Immunol 24, 175-208）。したがって、新規なスト
ラテジが必要である。
【０００９】
腫瘍がＭＨＣクラスＩＩ決定子を発現しない場合であっても、腫瘍に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が腫瘍拒絶において役割を果たし得るといういくつかの示唆が存在しており（Perez-Diez et al. 2007, Blood 15, 5346-5354）、これはＮＫ細胞またはストロマ細胞のい
ずれかに対する間接的な効果を示唆している。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を向上する試みは提案されていない。
【００１０】
間接的経路によって提示された腫瘍抗原についてのＣＤ４＋Ｔ細胞に特異的な応答が増加される一般的な方法が、非常に望ましい。これは、腫瘍が作り出す腫瘍遺伝子または腫瘍原遺伝子、ウイルス由来のタンパク質、生存因子、またはクローン形質の決定子に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって上記において、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を向上してエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞機能の増加、調節性Ｔ細胞機能の増加、およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の増加の１つ以上が得られる薬品または方法の発見が共通に切望されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、活性化される際に本来、細胞毒性または細胞溶解性ではない。酸化還元活性ペプチドタグ（「ＣＸＸＣ」、「ＣＸＸ［Ｓ／Ｔ］」または「［Ｓ／Ｔ］ＸＸＣ」ペプチドモチーフ）を本来そのようなタグを含んでいないＴ細胞抗原に付加することで、このような修飾されたＴ細胞抗原によって活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を非細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞から細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞に変換することが開示されている（ＷＯ２００８／０１７５１７；ＷＯ２００９／１００５０５；ＷＯ２００９／１００２０４；ＷＯ２００９／１００２０５；ＷＯ２００９／１００２０６；ＷＯ２００９／１００２０７；ＷＯ２００９／１００２０８）。しかしながらこれらの文献のいずれもが、非細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞から細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞に変換することのないＣＤ４＋Ｔ細胞の「正常な」活性化の増強を記載していない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明のある局面は分離された免疫原性ペプチドに関し、当該ペプチドは、
ａ）ＭＨＣタンパク質の間隙に結合するＴ細胞エピトープと、
ｂ）エピトープのｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システイン残基を含む１個
と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、モチーフＣｘｘ［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］ｘｘＣを有する配列が、発生すれば、上記エピトープに隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって上記エピトープから離れている場合、上記システインは、当該モチーフを有する配列に発生せず、
上記分離された免疫原性ペプチドは人工ペプチドであり、部分ａ）およびｂ）において規定される配列は、上記抗原性タンパク質の野生型配列に発生する配列と異なる。
【００１３】
特定の実施形態では、部分ｂ）に規定される上記配列は、ただ１つのシステインを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、上記エピトープはＭＣＨクラスＩＩエピトープである。
特定の実施形態では、上記ペプチドは、９個と１００個との間のアミノ酸の長さ、９個と５０個との間のアミノ酸の長さ、または９個と２０個との間のアミノ酸の長さを有する。
【００１５】
他の特定の実施形態では、上記エピトープと上記システインアミノ酸との間にアミノ酸なしで、上記システインアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端方向に上記エピトープに隣接して位置する。
【００１６】
本発明の文脈における疾病に関連するＴ細胞エピトープの例は、感染因子のＴ細胞エピトープ、自己抗原、アレルゲン、同種因子または同種移植片の抗原のＴ細胞エピトープである。疾病に関連するＴ細胞エピトープの他の例は、腫瘍に特異的または優先的なＴ細胞エピトープである。
【００１７】
本発明は、免疫原性ペプチドに関する。特に、上記免疫原性ペプチドは（ｉ）Ｔ細胞エピトープと、（ｉｉ）システインアミノ酸とからなり、
上記Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣに結合するアミノ酸残基以外でそれに隣接するアミノ酸残基を含んでいる場合、上記隣接するアミノ酸残基が、上記Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ結合領域に隣接する６個までのアミノ酸内に自然にシステインアミノ酸を含んでおらず、モノシステインまたはジシステインの酸化還元モチーフを含んでおらず、
上記システインアミノ酸は、Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ結合領域の外側の位置に存在しており、上記システインアミノ酸は、上記位置にてＴ細胞エピトープに添加または挿入され、または上記システインアミノ酸は、Ｔ細胞エピトープの上記位置での非システインアミノ酸をシステインに突然変異させることにより得られる。
【００１８】
本発明に従った免疫原性ペプチドにおいて、（ｉｉ）の上記システインアミノ酸は、最大５個のアミノ酸によってＭＨＣ結合領域から離れられた位置にてＴ細胞エピトープに添加または挿入されてもよいか、または（ｉｉ）の上記システインアミノ酸は、最大５個のアミノ酸によってＭＨＣ結合領域から離れた位置でのシステインアミノ酸への非システインアミノ酸の突然変異から得られてもよい。
【００１９】
さらに、本発明に従った免疫原性ペプチドにおいて、（ｉｉ）の上記システインアミノ酸は、最大５個のアミノ酸の人工リンカーアミノ酸配列によって、Ｔ細胞エピトープＭＨＣ結合領域から離れてもよい。
【００２０】
本発明に従った免疫原性ペプチドのうちのいずれか１つにおいて、上記システインアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端方向に上記ＭＨＣ結合領域に隣接して位置してもよい。
【００２１】
本発明に従った免疫原性ペプチドのいずれか１つにおいて、上記疾病に関連するＴ細胞エピトープは、感染因子、自己抗原、アレルゲン、同種因子もしくは同種移植片の抗原の
Ｔ細胞エピトープであるか、または腫瘍に特異的または優先的なＴ細胞エピトープを含む。
【００２２】
本発明はさらに、本発明に従った免疫原性ペプチドと、さらに溶剤、希釈剤、キャリアまたはアジュバントの少なくとも１つを含む組成物に関する。
【００２３】
本発明に従った免疫原性ペプチドまたは本発明に従ったこのようなペプチドを含む組成物は、薬剤として使用に適している。免疫原性ペプチドに含まれるＴ細胞エピトープの性質に依存して、免疫原性ペプチドを含む薬剤は、感染症を治療もしくは防止するための薬剤として、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患を治療、防止、もしくは抑制するための薬剤として、移植片拒絶を防止もしくは抑制するために、同種因子を中和させている免疫反応を防止もしくは抑制するために、または腫瘍もしくは癌細胞を治療、防止、もしくは根絶するために、使用することができる。一般に、本発明に従った免疫原性ペプチドまたは本発明に従ったこのようなペプチドを含む組成物は、有効なエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞応答、有効な調節性Ｔ細胞応答、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の有効な活性化につながり得る有効なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するための薬剤としての使用のためのものである。
【００２４】
本願明細書において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、過剰に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン２のような、サイトカインの生成を介した間接的な活性化である。
【００２５】
本発明の別の局面は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発可能な抗原性タンパク質のペプチドを調製する方法に関し、上記方法は、
（ａ）上記抗原性タンパク質のＴ細胞エピトープからなるペプチド配列を提供するステップと、
（ｂ）システイン残基を含む（ａ）配列のペプチド配列にリンクするステップとを含み、上記システイン残基は最大５個のアミノ酸によってエピトープ配列から離れており、モチーフ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］を有する配列が、発生すれば、上記ＭＨＣ結合領域に隣接するかまたは最大７個のアミノ酸によって上記ＭＨＣ結合領域から離れている場合、上記システインは、当該モチーフを有する配列にシステインとして発生せず、さらに、
（ｃ）ステップａ）およびｂ）に規定されるような配列を含むペプチドを合成するステップを含む。
【００２６】
本願明細書において、抗原性タンパク質におけるＴ細胞エピトープの配列は、コンピュータアルゴリズムおよび／または生化学分析によって決定され得る。
【００２７】
この方法では、部分ｂのペプチド配列が、上記エピトープ配列の６個のアミノ酸のＮ末端またはＣ末端までの領域において、抗原性タンパク質のアミノ酸配列を修飾することによって得られ得る。
【００２８】
これは、システインの導入、モチーフ［ＣＳＴ］−ｘｘ−ＣまたはＣ−ｘｘ−［ＣＳＴ］におけるシステインとして発生するシステインの削除、および１つの位置でのシステインの削除および別の位置でのシステインの導入からなる群から選択される突然変異によってなされ得る。
【００２９】
代替的には、部分ｂのペプチド配列は、６個のアミノ酸までの領域において上記エピトープ配列のＮ末端またはＣ末端に存在する、上記抗原性タンパク質の配列と関係のない人工配列であり得る。
【００３０】
本発明に従った免疫原性ペプチドの使用、または自己免疫性疾患、アレルギー性疾患を治療、防止、もしくは抑制するための薬剤、移植片拒絶を防止もしくは抑制するための薬剤、同種因子を中和させている免疫反応を防止または抑制するための薬剤、または腫瘍もしくは癌細胞を治療、防止、もしくは根絶するための薬剤の生成のためにこのようなペプチドを含む組成物の使用も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ペプチドが装填されていない（「ペプチドなし」）か、自然のｐ２１−３５ペプチド（「Ｄｅｒ  ｐ２  ｐ２１−３５」）が装填されるか、または、位置２１（ｐ２１−３５ペプチドのＮ末端アミノ酸）でのシステインがアラニン（「Ｄｅｒ  ｐ２  ｐ２１−３５  Ｃｙｓ２１Ａｌａ」）に突然変異されたｐ２１−３５ペプチドが装填される投薬されていない抗原提示細胞の存在下におけるＤｅｒ  ｐ２  ｐ２１−３５のペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの増殖の図である。
【図２】あらかじめ治療されていない免疫適格のＣ５７ＢＬ／６マウス（三角形）か、または、Ｔ細胞抗原のＭＨＣ結合領域に隣接するシステインを含む、ＡＬＫタンパク質に由来したＴ細胞抗原での前免疫措置によってあらかじめ治療された免疫適格のＣ５７ＢＬ／６マウス（正方形）におけるＮＰＭ−ＡＬＫ腫瘍の成長の図である。
【図３】トリチウム化チミジンの取り込みによって評価される、細胞の刺激の後のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度の図であって、当該刺激は、（ａ）その自然もしくは野生型（図におけるｗｔＡＬＫ）配列におけるＡＬＫタンパク質のアミノ酸１５４１−１５５５に対応する配列ＧＡＡ  ＥＧＧ  ＷＴＧＰＧＡＧＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のペプチドによるか、または（ｂ）単一のシステインがＡＬＫタンパク質の位置１５４４に加えられた配列ＣＧＧ  ＷＴＧＰＧＡＧＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）のペプチドによる図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
定義
本願明細書において使用される場合の「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって接続される２個と２００個との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含む分子を指すが、特定の実施形態では、（たとえば結合有機化合物のような）非アミノ酸構造を含み得る。本発明に従ったペプチドは、従来の２０個のアミノ酸またはその修飾されたバージョンのいずれかを含み得るか、または化学ペプチド合成または化学もしくは酵素修飾によって組込まれた非自然発生のアミノ酸を含み得る。
【００３３】
本願明細書において使用される場合の「エピトープ」という用語は、抗体もしくはその部分（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）またはＢもしくはＴ細胞のリンパ球の細胞表面にて提示される受容体によって具体的に認識および結合され、上記の結合によって、免疫反応を誘導し得るタンパク質または因子の（配座エピトープを規定し得る）１つまたはいくつかの部分を指す。
【００３４】
本願明細書において使用される場合の「抗原」という用語は、（キャリアに付与された時だけ免疫応答を誘発する）１つ以上のハプテンを含み、および／または１つ以上のＴ細胞エピトープを含む高分子の構造を指す。典型的に、上記高分子は、（多糖類を有するまたは有さない）タンパク質もしくはペプチドであるか、またはタンパク質組成物から形成され、１つ以上のエピトープを含む。上記高分子は代替的には、本願明細書において「抗原性タンパク質」または「抗原性ペプチド」と称され得る。
【００３５】
「同種因子（allofactor）」という用語は、同じ種の２つの個体間で比較した場合に多
型性を示すタンパク質、ペプチドまたは因子（すなわち任意の分子）を指し、より一般的には、同種因子を受ける対象における（同種反応性の）免疫応答を誘導する任意のタンパク質、ペプチドまたは因子を指す。
【００３６】
本発明の文脈における「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ドミナント、サブドミナント、またはマイナーなＴ細胞エピトープ、すなわち、Ｔリンパ球の細胞表面にて受容体によって特異的に認識および結合される抗原性タンパク質または因子の部分を指す。エピトープがドミナントか、サブドミナントか、またはマイナーかどうかは、エピトープに対して誘発される免疫反応に依存する。ドミナンスは、タンパク質のすべての可能なＴ細胞エピトープのうち、このようなエピトープがＴ細胞によって認識され、それらを活性化することが可能である頻度に依存する。特に、Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子によって結合されたエピトープである。タンパク質配列におけるＴ細胞エピトープは、機能的な分析および／または１つ以上のコンピュータ予測分析（silico
prediction assay）において識別され得る。Ｔ細胞エピトープ配列におけるアミノ酸は
、ＭＨＣタンパク質の結合溝におけるそれらの位置に従って番号が付けられる。本発明のペプチド内に存在するＴ細胞エピトープは、８個と２５個との間のアミノ酸からなり得、８個と１６個との間のアミノ酸からなり得、または８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１６個のアミノ酸からなり得る。本発明の免疫原性ペプチドのＴ細胞エピトープは、タンパク質の自然のエピトープ配列に対応し得、または、修飾されたＴ細胞エピトープがＭＨＣ間隙内に結合する能力を保持していれば、自然のＴ細胞エピトープ配列に類似したその修飾されたバージョンであり得る。修飾されるＴ細胞エピトープは、ＭＨＣタンパク質について、自然のエピトープと同じ結合親和性を有し得るが、それよりも低い親和性を有し得る。特定の実施形態では、修飾されたペプチドの結合親和性は、元々のペプチドの１０倍以上であり、より特定的には、５倍以上である。
【００３７】
「ＭＨＣ」という用語は、「主要組織適合抗原」を指す。ヒトにおいては、ＭＨＣ遺伝子はＨＬＡ（「ヒト白血球抗原」）遺伝子として公知である。一貫して続く規則は存在しないが、ある文献は、ＨＬＡタンパク質分子を参照するためにＨＬＡを使用し、またＨＬＡタンパク質をエンコードする遺伝子を参照するためにＭＨＣを使用する。したがって、本願明細書において使用される場合、「ＭＨＣ」および「ＨＬＡ」という用語は、等価である。ヒトにおけるＨＬＡ系は、マウスにおけるその等価物、すなわちＨ２系を有する。もっとも深く研究されたＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１といった９つのいわゆる古典的なＭＨＣ遺伝子である。ヒトでは、ＭＨＣは、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩといった３つの領域に分割される。Ａ、ＢおよびＣ遺伝子がＭＨＣクラスＩに属し、６つのＤ遺伝子がクラスＩＩに属する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面にてベータ２ミクログロブリンに提携する、３つのドメイン（アルファ１、２および３）を含む単一の多形鎖から形成される。クラスＩＩ分子は、各々が２つの鎖（アルファ１および２ならびにベータ１および２）を含む２つの多形鎖から形成される。
【００３８】
クラスＩ  ＭＨＣ分子は、事実上すべての有核細胞上で発現される。クラスＩ  ＭＨＣ分子の文脈において提示されたペプチドフラグメントは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞毒性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）によって認識される。ＣＤ８＋Ｔリンパ球はしばしば、刺激する抗原を担持する細胞を溶解する細胞毒性のエフェクターに発達する。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子はまず、活性化リンパ球および抗原提示細胞上に発現される。ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴリンパ球またはＨＴＬ）は、マクロファージまたは樹状細胞のような抗原提示細胞上に通常発見されるクラスＩＩ  ＭＨＣ分子によって提示されたユニークなペプチドフラグメントの認識によって活性化される。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は増殖し、サイトカインを分泌する。サイトカインは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の生成を通じて抗体を介した
応答をサポートするか、またはＩＬ−２およびＩＦＮ−γの生成を通じて細胞を介した応答をサポートする。
【００３９】
機能的なＨＬＡは、内因的かつ異種の潜在的に抗原性のペプチドが結合する深い結合溝によって特徴付けられる。この溝はさらに、よく規定された形状および物理化学的性質によって特徴付けられる。ＨＬＡクラスＩ結合部位は閉じられており、ペプチド終端は、溝の端へと固定される。さらにそれらは、保存されたＨＬＡ残基を有する水素結合のネットワークに含まれる。これらの制約に鑑みると、結合されたペプチドの長さは８〜１０個の残基に限定される。しかしながら、１２個までのアミノ酸残基のペプチドはＨＬＡクラスＩを結合することが可能であるということが示されている。異なるＨＬＡ複合体の構造の重なりが結合の一般的なモードを確かなものにしており（confirm）、ペプチドが相対的
に線形の拡張された配座を採用している。
【００４０】
ＨＬＡクラスＩ結合部位とは対照的に、クラスＩＩ部位は両端で開いている。これによってペプチドが結合の実際の領域から延在することが可能になり、これにより両端にて「外側に出る（hanging out）」。したがって、クラスＩＩ  ＨＬＡは、９個から２５個よ
り多いアミノ酸残基の範囲の可変長のペプチドリガンドを結合し得る。ＨＬＡクラスＩと同様に、クラスＩＩリガンドの親和性は、「定数」および「変数」要素によって決定される。定数の部分はまた、ＨＬＡクラスＩＩ溝における保存された残基と、結合されたペプチドの主鎖との間に形成される水素結合のネットワークに起因する。しかしながら、この水素結合パターンは、ペプチドのＮ−またはＣ−末端残基に制限されないが、鎖全体の上に分散される。後者は、複合化されたペプチドの配座を厳密に線形の結合モードに拘束するので、重要である。これは、すべてのクラスＩＩアロタイプに一般的である。クラスＩＩ結合部位内における多型性のある位置により、ペプチドの結合親和性を決定する第２の要素は可変である。異なるアロタイプは、溝の内に異なる相補的なポケットを形成し、これによりペプチドのサブタイプ依存の選択または特異性を構成する。重要なことに、クラスＩＩポケット内に保持されたアミノ酸残基の制約は、一般にクラスＩについてよりも「よりソフト」である。異なるＨＬＡクラスＩＩアロタイプの間でペプチドの交差反応がさらに多く存在する。ＭＨＣ  ＩＩ分子の溝に嵌合するＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープの＋／−９のアミノ酸の配列は通常、Ｐ１からＰ９まで番号付けされる。エピトープの付加的なアミノ酸Ｎ末端は、Ｐ−１、Ｐ−２などと番号付けされ、エピトープのアミノ酸Ｃ末端は、Ｐ＋１、Ｐ＋２などと番号付けされる。
【００４１】
「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍または腫瘍細胞に関連付けられる（担持、生成、分泌などされる）任意のタンパク質、ペプチドまたは抗原を指す。腫瘍関連抗原は、（ほとんど）専ら腫瘍または腫瘍細胞に関連付けられ得、健康な正常細胞には関連付けられ得ないか、または腫瘍または腫瘍細胞において、健康な正常細胞と比較して（たとえば１０倍、１００倍、１０００倍以上）過剰に発現され得る。より特定的には、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞のＭＨＣ決定子によって（処理された形で）提示可能な抗原である。したがって、腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子を発現する腫瘍または腫瘍細胞とのみ関連しやすい。腫瘍関連抗原はさらに、腫瘍に特異的または優先的である抗原と称され得る。腫瘍関連抗原に含まれるＴ細胞エピトープは、本願明細書において、腫瘍に特異的または優先的であるＴ細胞エピトープとも称され得る。
【００４２】
「アレルゲン」は、かかりやすい、特に遺伝的にかかる個体の（アトピー）患者において、ＩｇＥ抗体の生成を誘発する通常高分子またはタンパク質組成物である物質として規定される。
【００４３】
「治療上有効な量」という用語は、患者における所望の治療または予防効果を作り出す、本発明のペプチドまたはその誘導体の量を指す。たとえばこれは、疾患または障害に関
して、疾患または障害の１つ以上の症状をある程度まで低減する量であり、より特定的には、部分的または完全に正常な、疾患もしくは障害に関連付けられるまたは原因となる生理的または生化学のパラメータに戻す量である。本発明の１つの特定の実施形態に従うと、治療上有効な量は、正常な生理的な状態の改善または回復につながる本発明のペプチドまたはその誘導体の量である。たとえば、免疫不全によって影響を受けた哺乳動物を治療上扱うために使用される場合、毎日の量のペプチド／上記の哺乳動物のｋｇ体重である。代替的には、投与が遺伝子療法を通じて行われる場合、裸のＤＮＡまたはウイルスベクターの量は、本発明のペプチド、その誘導体または相同体の適切な量の局所的な生成を確実にするよう調節される。
【００４４】
本発明のペプチドに関して本願明細書において使用された場合の「誘導体」という用語は、少なくともペプチド活性部分を含む（すなわち細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘発可能である）とともに、これに加えて、ペプチドを安定させるか、またはペプチドの薬物動態学的もしくは薬力学的な特性を変更するといった異なる目的を有し得る相補的な部分を含む分子を指す。
【００４５】
本願明細書において使用された場合の「ペプチドエンコーディングポリヌクレオチド（または核酸）」および「ポリヌクレオチド（または核酸）エンコーディングペプチド」という用語は、適切な環境で発現された際に、適切なペプチド配列またはその誘導体もしくは相同体の生成につながるヌクレオチド配列を指す。このようなポリヌクレオチドまたは核酸は、ペプチドをエンコードする正常な配列と、必要とされた活性でペプチドを発現することができるこれらの核酸の誘導体およびフラグメントとを含む。一実施形態に従うと、本発明に従ったペプチドまたはそのフラグメントをエンコーディングする核酸は、哺乳動物から得られるかまたは哺乳動物に対応する、もっとも特定的にはヒトのペプチドフラグメントのペプチドまたはそのフラグメントをエンコードする配列である。
【００４６】
説明
上述したように、Ｔ細胞抗原に４−アミノ酸酸化還元活性ペプチドタグ（「ＣＸＸＣ」または「ＣＸＸ［Ｓ／Ｔ］」または「［Ｓ／Ｔ］ＸＸＣ」モチーフ）を（上記タグが抗原のＭＨＣ結合部位の外側または隣接する状態で）添加することにより、活性化の際に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞に変換される。この変換は通常自然に生じず、自然な免疫応答中に誘導された細胞溶解性細胞は、細胞溶解性のＣＤ８＋Ｔ細胞に拘束される。上記の系を調査して本発明に結びつくさらに別の研究において、酸化還元活性タグにおけるシステイン残基の少なくとも１つを非システイン残基に（しかしながら非システイン残基としてセリンまたはトレオニンを除外して）変換することによって、Ｔ細胞抗原に加えられたペプチドタグの酸化還元反応の活性が消失されると、その後、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化され得るということが分かった。しかしながら驚くべきことに、この活性化は、システイン残基がペプチドタグ中に全くなかった場合よりもはるかに強かった。ＭＨＣ結合領域または上記Ｔ細胞抗原の部位に隣接する単一のシステイン残基のＴ細胞抗原における存在が、上記のより強いＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘発するのに十分であったことがさらに分かった。
【００４７】
したがって、任意の理論または作用の機序に縛られることなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の以下のタイプには連続性があるように思われる。すなわち、（ｉ）上述したようにＭＨＣ結合部位に隣接する領域において酸化還元活性ペプチドタグまたは単一のシステインを含まないＴ細胞抗原による「基礎的な」自然な活性化と、（ｉｉ）ＭＨＣ結合部位に隣り合う／隣接する領域における単一のシステインを含むＴ細胞抗原による（基礎的な活性化と比較して）増加した活性化と、（ｉｉｉ）Ｔ細胞抗原のＭＨＣ結合部位に隣り合う／隣接する領域における酸化還元活性ペプチドタグを含むＴ細胞抗原によって活性化される際の細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞の変換とである。
【００４８】
本発明は、抗原性ペプチド配列のＭＨＣ結合部位の外側にシステイン残基を含むよう修飾される分離されたＴ細胞抗原と、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を増加させるためのこのような修飾された抗原の使用とに関する。上記の増加した活性化は、抗原性ペプチド配列の外側にこのようなシステイン残基を含まないＴ細胞抗原によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に対して比較される。本発明に従ったこれらの免疫原性ペプチドと、それらの使用とを以下により詳細に記載する。
【００４９】
したがって、本発明は免疫原性ペプチドに関する。特に、上記の免疫原性ペプチドは、（ｉ）Ｔ細胞エピトープと、（ｉｉ）システインアミノ酸とからなり、
上記Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣに結合するアミノ酸残基に隣接する（またはＴ細胞エピトープのＭＨＣ結合部位を構成するアミノ酸残基に隣接する）アミノ酸残基を含んでいる場合、上記隣接するアミノ酸残基は本来、当該Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ結合領域に隣接（および接触）する６個までのアミノ酸内の位置にてシステインアミノ酸を含んでおらず、モノシステインもしくはジシステインの酸化還元または酸化還元活性モチーフを含んでおらず、
上記システインアミノ酸はＴ細胞エピトープのＭＨＣ結合領域の外側の位置にあり、当該システインアミノ酸は、上記位置にてＴ細胞エピトープに添加または挿入されるか、またはＴ細胞エピトープの上記位置にある非システインアミノ酸をシステインに突然変異させることで得られる。
【００５０】
本発明の免疫原性ペプチドは、Ａ−Ｌ−ＢまたはＢ−Ｌ−Ａとして概略的に示され得る。ＡはＴ細胞エピトープを示し、Ｌはリンカーを示し、Ｂは遊離システイン残基を示す。本発明の免疫原性ペプチドは、非天然アミノ酸の取り込みを可能にする化学合成によって作製され得る。したがって、システイン残基は、メルカプトバリン、ホモシステインといったチオール基を有する別のアミノ酸またはチオール官能基を有する他の自然もしくは非自然のアミノ酸によって置換され得る。還元活性を有するために、システイン残基は、システインジスルフィド架橋の一部として生じるはずはない。しかしながら、たとえばシステイン残基はメチル化によって修飾され得る。これは、メチル化システインは、インヴィヴォで遊離チオール基を有するシステインに変換されるからである。
【００５１】
本発明の免疫原性ペプチドは、たとえば約１２〜１３個のアミノ酸（８〜９個のアミノ酸のＴ細胞エピトープと、システイン残基を含む４個の隣接するアミノ酸）から５０個以上のアミノ酸までの長さで実質的に変動し得る。たとえば、本発明に従った免疫原性ペプチドは、４０個のアミノ酸のエンドソームターゲット配列と、システインを含む約６個のアミノ酸の隣接配列と、９個のアミノ酸のＴ細胞エピトープペプチドとを含んでもよい。特定の実施形態では、本発明の免疫原性ペプチドは、１２個と２０個から２５個、３０個、５０個、７５個、１００個または２００個との間のアミノ酸からなる。さらに特定の実施形態では、ペプチドは、１０個と２０個との間のアミノ酸からなる。随意に、このようなペプチドはエンドソームターゲットシグナルに結合され得る。
【００５２】
上記において、Ｔ細胞エピトープは、自然発生のタンパク質の接触部分であるということが意図される。このような接触部分は、たとえば抗原提示細胞のプロテアソームまたはエンドソームによって消化される自然発生のタンパク質の消化の結果であり得る。代替的には、このような部分は人工であってもよい（たとえば、組み換えまたは合成的／化学的に作り出されてもよい）。すべての場合において、Ｔ細胞エピトープは、自然発生のタンパク質の部分と同じであるアミノ酸配列を有する、すなわち、自然において／自然に発生するような接触するアミノ酸配列を有する。
【００５３】
Ｔ細胞エピトープは単に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の溝に結合するアミノ酸か
らなり得るか、または隣接アミノ酸残基とともに同じアミノ酸を含み得る。このような隣接する残基は、ＭＨＣへのエピトープの結合に寄与しておらず、ＭＨＣ溝の外側に「出て」いる。隣接残基は、Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ結合部分のＮ末端および／またはＣ末端に存在し得る。本発明の免疫原性ペプチドにおいて、上記のシステイン残基は、エピトープがＭＨＣ溝に嵌合すると、上記システイン残基がＭＨＣ結合溝の外側に残るように配置される。隣接残基を含むＴ細胞エピトープは、それらのアミノ酸配列において、部分的に本発明の起源にある、本願明細書における実施例２において使用されるＴ細胞エピトープのようなシステイン残基を自然に含み得る（上記のＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合部分の、およびＭＨＣ結合部分に接触するＮ末端側に２つの隣接アミノ酸残基を含んでおり、上記の隣接アミノ酸残基が自然発生のシステインを含む）。本発明に従って必要とされるような位置にシステインを自然に含むＴ細胞エピトープは、システイン残基が、すなわちＭＨＣ結合アミノ酸のＮ末端またはＣ末端に直接に隣接するとともに自然に接触する６個までのアミノ酸内の接触する自然配列に発生している場合に本発明から除外される。さらに、ＭＨＣ結合部位の外側に存在する隣接アミノ酸残基を含む免疫原性ペプチドが本発明から除外される。隣接アミノ酸残基は、（自然に、非自然に、または本発明によって示されるようにシステインの添加／システインの挿入／システインへの突然変異の後のいずれかで）モノシステインまたはジシステイン酸化還元モチーフを含む。上で説明したように、後者のペプチド中の酸化還元モチーフの存在により、非細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞が細胞溶解性のＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわち、本発明において求められない特性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞に自然に変換される。上記におけるジシステイン酸化還元モチーフは「ＣＸＸＣ」モチーフであることが意図されており、モノシステイン酸化還元モチーフは「ＣＸＸ［Ｓ／Ｔ］」または「［Ｓ／Ｔ］ＸＸＣ」モチーフであることが意図される。自身のＭＨＣ結合領域内のシステインアミノ酸を含む（または代替的には、ＭＨＣ分子に結合する際にＭＨＣ間隙内に埋められる）本発明に従った免疫原性ペプチドは、本発明から除外されない。
【００５４】
本発明に従った免疫原性ペプチドにおいて、（ｉｉ）の上記システインアミノ酸が、ＭＨＣ結合領域から最大５個のアミノ酸によって分離された位置にＴ細胞エピトープに添加または挿入され得る（すなわち、最大５個のアミノ酸は、上記システインとＭＨＣ結合領域の終端アミノ酸との間にあり得る）か、または（ｉｉ）の上記システインアミノ酸は、ＭＨＣ結合領域から最大５個のアミノ酸によって分離された位置でのシステインアミノ酸への非システインアミノ酸の突然変異から得られ得る（すなわち最大５個のアミノ酸は、上記システインとＭＨＣ結合領域の終端アミノ酸との間にあり得る）。
【００５５】
さらに本発明に従った免疫原性ペプチドにおいて、（ｉｉ）の上記システインアミノ酸は、最大５個のアミノ酸の人工のリンカーアミノ酸配列によってＴ細胞エピトープのＭＨＣ結合領域から分離され得る（すなわち最大５個のアミノ酸は、上記システインとＭＨＣ結合領域の終端アミノ酸との間にあり得る）。ペプチドリンカーを除いて、免疫原性ペプチドの部分を互いにリンクするリンカーとして他の有機化合物が使用され得る。
【００５６】
本発明に従った免疫原性ペプチドのうちのいずれか１つにおいて、上記システインアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端方向にＭＨＣ結合領域に隣接するよう位置し得る。
【００５７】
本発明に従った免疫原性ペプチドのいずれか１つにおいて、上記疾患に関連するＴ細胞エピトープは、感染因子、自己抗原、アレルゲン、同種因子または同種移植片抗原のＴ細胞エピトープおよび腫瘍に特異的または優先的なＴ細胞エピトープを含む。
【００５８】
本発明の免疫原性ペプチドのいずれかはさらに、ＭＨＣクラスＩＩ決定子内での処理および提示のために、（後期）エンドソームへのペプチドを取り込みを促進するアミノ酸配列（または別の有機化合物）を含んでもよい。したがって、本発明に従った免疫原性ペプ
チドはさらに、たとえばエンドソームターゲット配列を含んでもよい。後期エンドソームターゲッティングは、タンパク質の細胞質尾に存在するシグナルによって媒介されており、ジロイシンベースの［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬモチーフ（たとえばＤＸＸＸＬＬ）、チロシンベースのＹＸＸφモチーフまたはいわゆる酸性クラスタモチーフといったよく識別されたペプチドモチーフに対応する。記号φは、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐといった大きな疎水性側鎖を有するアミノ酸残基を示す。後期エンドソームターゲット配列は、ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原由来のＴ細胞エピトープの処理および効率的な提示を可能にする。このようなエンドソームターゲット配列は、たとえばｇｐ７５タンパク質（Vijayasaradhi et al. 1995, J Cell Biol 130, 807-820）、ヒトのＣＤ３ガ
ンマタンパク質、ＨＬＡ−ＢＭ  β（Copier et al. 1996, 3 Immunol 157, 1017-1027）、ＤＥＣ２０５受容体の細胞質尾（Mahnke et al. 2000, J Cell Biol 151, 673-683）といった中に含まれる。エンドソームに対して局在化シグナルとして機能するペプチドの他の例は、Bonifacio and Traub (2003), Annu Rev Biochem 72, 395-447のレビューに開示される。代替的には、配列は、タンパク質からのサブドミナントまたはマイナーなＴ細胞エピトープの配列であり得、病原関連由来のＴ細胞エピトープまたは自己抗原または同種抗原由来のＴ細胞エピトープへのＴ細胞応答を克服することなく後期エンドソームにおける取り込みを促進する。
【００５９】
上記の免疫原性ペプチドのいずれかは、化学合成または組換発現によって作り出され得る。
【００６０】
本発明はさらに、本発明に従う免疫原性ペプチドと、さらに溶剤、希釈剤、キャリアまたはアジュバントのうちの少なくとも１つとを含む組成物に関する。
【００６１】
本発明は、ワクチン接種ストラテジにおいて使用される感染因子に由来した特異性抗原への免疫応答を増加させることによる対象における感染の予防、治療または抑制のための分離された免疫原性ペプチドの使用に関する。特に、免疫応答は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化であり、および／または上記対象の抗体応答である。上記においては、上記病原関連抗原は、ウイルス、バクテリアまたは寄生生物に由来し得る。特に本発明は、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞とも称されるエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の展開および機能的活性を増強、向上または増大する方法を提供する。このようなエフェクターまたはヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞は、自身の表面フェノタイプ、サイトカインおよびトランスクリプトームの生成に従って規定される細胞のいくつかのサブセットに属する。したがって、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＴｆｈ細胞は、異なったエフェクターサブセットの代表例として示されている。さらに、Ｔｈ９細胞は最近記載されている（レビューについては、Locksley et al. 2009, J Exp Med 206, 1643-1646を参照）。特に、本発明は、特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を展開する方法を提供する。その結果は、より高い抗体濃度の生成を含む、病原へのより効率的な応答である。
【００６２】
本発明はさらに、アレルゲンまたは自己抗原に特異的な調節性Ｔ細胞応答を増加させることによる対象における当該アレルゲンまたは自己抗原に対する免疫応答の抑制のための単離された免疫原性ペプチドの使用に関する。本発明はさらに、その同種抗原に特異的な調節性Ｔ細胞応答を増加させることによる対象における同種抗原に対する免疫応答の抑制のための分離された免疫原性ペプチドの使用に関する。上記において、当該自己抗原または同種抗原は、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、多発性硬化症、慢性関節リウマチといった自己免疫性疾患に関連付けられる自己抗原を含み、クラスＩもしくはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、副組織適合性抗原または組織特異性抗原から由来する同種抗原を含む。同種抗原（本願明細書において使用される類義語：同種因子）への免疫応答の場合には、免疫応答は、同種因子の生物活性を中和し得る。後者の一例は、たとえば血友病患者における中和抗体の外因栄養素ＶＩＩＩへの進展を含む。本発明は、対象に
おいて自己免疫性疾患もしくは移植片拒絶を防止、治療もしくは抑制する方法、または対象において同種因子（それを必要とするレシピエントが投与された因子ＶＩＩＩを中和している免疫応答を上昇させることが可能である血液凝固因子ＶＩＩＩのような）を中和している免疫反応を防止、治療もしくは抑制する方法を提供する。特に本発明は、調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞の展開および機能的活性を増大する方法を提供する。このような調節性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３転写抑制体の発現によって規定される自然調節性Ｔ細胞集団か、またはＩＬ−１０およびＴＧＦ−β（レビューについて、Yi et al. 2006, Cell Mol Immunol 3, 189-195を参照）のような抑制性サイトカインの生成によって主に規定される誘導また
は適応性調節性Ｔ細胞のサブセットのうちの１つのいずれかに属する。特に本発明は、特異的なＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を展開する方法を提供する。その結果は、自己抗原への免疫応答のより効率的な抑制と、移植片拒絶割合の低減である。
【００６３】
本発明はさらに、ワクチン接種ストラテジにおいて腫瘍が発した腫瘍特異抗原に対する免疫応答を増加させることによる対象における腫瘍の治療のための単離された免疫原性ペプチドの使用に関する。特に、免疫応答は、上記対象におけるエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞反応の活性化である。上記において、上記腫瘍由来の抗原は、腫瘍遺伝子または腫瘍原遺伝子、ウイルス由来のタンパク質、生存因子またはクローン形質決定子から由来され得る。本発明は、対象において腫瘍もしくは癌細胞の成長を防止もしくは抑制する方法または腫瘍もしくは癌を治療する方法を提供する。これはさらに、腫瘍を引き起こす病原または癌を引き起こす病原（たとえば、ヒトパピローマウイルスのある株）への感染を防止する意図を有するワクチン接種を含んでいる。特に、本発明は、増大または増加したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を介して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の展開および機能的活性を増大する方法を提供する。特に、本発明は、特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を展開する方法を提供する。その結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い活性による、腫瘍由来の抗原または腫瘍を引き起こす病原からの抗原へのより効率的な応答である。
【００６４】
上記のうちのいずれにおいても、「治療」は、治療された疾患もしくは障害の少なくとも安定化につながるか、または健康な状態への疾患もしくは障害の部分的もしくは完全な反転につながることであると理解される。疾患または障害の「抑制」は、上記疾患または障害が治療されないままにされた場合の平均的なさらなる進行と比較して、上記疾患または障害がより遅く進行することであると理解される。本発明の免疫原性ペプチドはワクチン接種アプローチにおいて用いられ得るので、このようなペプチドは、ターゲットの疾患もしくは障害をまだ示していないまたは当該疾患もしくは障害を病んでいない対象に投与することができるということが理解される。上記投与は、上記ターゲット疾患または障害が進行するのを防止する目的を有する。このような予防的もしくは先行する免疫処置または防止処置は、ターゲットの疾患もしくは障害の進行を完全にブロックし得るか、またはたとえば衰弱するレベルに向かって進行するターゲットの病気または障害を防止し得る。予防接種または免疫処置は、たとえば病原にさらされること（リスク）が増加したこと、遺伝的または他の素質、先天的欠陥などにより、疾患または障害の進行のリスクがある対象において特に興味深い。
【００６５】
本発明の使用によって増加した免疫応答により病気を予防、改善、または治療することができる疾患の例が以下に記載される。本発明における使用のためにＴ細胞エピトープが由来し得る抗原も例示される。
・アレルギー性疾患に対するワクチン接種
Ｔ細胞エピトープの選択に使用され得るアレルゲンは典型的に、以下のものからなる群から選択されるアレルゲンである。すなわち、当該アレルゲンは、
−ピーナッツ（Ａｒａ  ｈ１）、たとえばタラのような魚（パラアルブミン）、卵白（オバルブミン）、たとえばエビのような甲殻類（トロポミオシン）、たとえば牛乳のようなミルク（ベータラクトグロブリン）、小麦（グルテン）、穀物、酒さ科（リンゴ、プラム
、イチゴ）の果物、ユリ科、十字花科、ナス科およびセリ科の野菜、クルミ、胡麻、ピーナッツ、大豆および他のマメ科アレルゲン、香辛料、メロン、アボカド、マンゴー、イチジク、バナナなどに存在する食物アレルゲンと、
−ヒョウヒダニ（Dermatophagoides spp）またはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）、コナヒョウヒダニ（D. farinae）およびササラダニ（D. microceras）、シワダニ（Euroglyphus maynei）またはタマニクダニ（Blomia sp.）から得られたイエダニアレルゲン
と、
−ゴキブリ（Ｂｌａ  ｇ２）または膜し類に存在する昆虫からのアレルゲンと、
−花粉、特に木、草および雑草の花粉からのアレルゲンと、
−動物、特に猫（Ｆｅｌ  ｄ１）、犬、馬およびげっ歯類（ｍｕｓ  ｍ１）からのアレルゲンと、
−菌類、特にアスペルギルス（ａｓｐｆ１）、アルタネリア（Ａｌｔ  Ａ６）またはクラドスポリウム（ｃｌａ  ｈ３）からのアレルゲンと、
−ラテックス、アミラーゼなどのような製品に存在する職業性アレルゲンと、からなる群から選択される。
・細胞内および細胞外の病原に対するワクチン接種
−細胞内の病原体は、細胞内の生活環を有するウイルス、バクテリア、マイコバクテリアまたは寄生生物に由来する任意の抗原からなる群から選択される。ウイルスは、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含み、例として、ヘルペスウイルス科、フラビウイルス科およびピコルナウイルス科、インフルエンザ、麻疹および免疫不全ウイルスがある。バクテリアおよびマイコバクテリアは、結核菌、ヒトまたは動物に対して病原性の他のマイコバクテリア、エルジニア、ブルセラ、クラミジア、マイコプラズマ、リケッチア、サルモネラおよびシゲラを含む。寄生生物は、プラズモディウム、リーシュマニア、トリパノゾーマ、トキソプラズマゴンディ、リステリア、ヒストプラズマなどを含む。
−細胞外の病原は、主として細胞外の生活環を有するウイルス、バクテリアおよび寄生生物からなる群から選択され、本発明において使用される抗原はそこから由来し得る。
・腫瘍に対するワクチン接種
本発明の生成物によってターゲットとされ得る例示的な腫瘍と、本発明において使用され得る例示的な関連する抗原とは、以下のものからなる群から選択される。すなわち、当該群は、
−いくつかのメラノーマにおいて同定されるＭＡＧＥのような腫瘍遺伝子と、
−腎臓または副甲状腺のような軟組織癌腫上に発現されるとともに多発性骨髄腫において発現されるサイクリンＤ１のような腫瘍原遺伝子と、
−いくつかの癌腫およびいくつかのホジキンタイプのリンパ腫におけるエプスタインバーウイルスからのもののようなウイルス由来のタンパク質と、
−サバイビンまたはｂｃｌ２のような抗アポトーシス因子である生存因子と、
−濾胞性リンパ腫もしくは多発性骨髄腫におけるＢ細胞受容体またはＴ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定子に由来するイディオタイプ決定子のようなクローン形質の決定子と、からなる。
【００６６】
本発明の使用による調節性Ｔ細胞の誘発による寛容性の増加により病気を防止、改善または治療することができる疾患の例が以下に記載される。本発明での使用のためにＴ細胞エピトープが誘導され得る抗原も例示される。
・上述したようなアレルギー性疾患
・自己免疫疾患
自己免疫性疾患は、次のものからなる群から選択される。当該群は、
（ａ）アジソン病、溶血性または悪性貧血、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、若年性糖尿病、ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変
症、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、糸球体腎炎および自発不妊といった臓器特異的疾患と、
（ｂ）紅斑性狼瘡、乾癬、脈管炎、多発性筋炎、強皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、慢性関節リウマチおよびシェーグレン症候群のような全身性疾患と、からなる。したがって、自己免疫障害は自身の細胞または組織に関し、特定の哺乳類生物体の自身の構成部分である抗原（たとえばタンパク質）を意味する「自己抗原」への反応を含む。このメカニズムでは、自己抗原に対する免疫反応を導入するＢ細胞および／またはＴ細胞によって上記自己抗原が認識される。
【００６７】
したがって、「自己免疫性疾患」または「自己免疫性障害」という用語が包含する疾患の非限定的なリストは、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、円形脱毛症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、ベーチェット病、小児脂肪便症、（クローン病および潰瘍性大腸炎のような）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚筋炎、糖尿病タイプ１、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、脈管炎、ヴェグナー肉芽腫症およびアトピー性皮膚炎を含む。
【００６８】
【表１】
2018076329.tif 000003
【００６９】
・移植
本発明において用いられる同種抗原は、以下のものに由来する群から選択される。すなわち当該群は、
−クラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体と、
−副組織適合性複合体と、
−組織特異性抗原と、
に由来する。
・同種因子への免疫反応
本発明で使用される同種因子は次のものからなる群から選択される。すなわち当該群は、−第ＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびスタフィロキナーゼを含む、凝固欠陥または繊維素溶解欠陥のための置換療法と、
−成長ホルモンまたはインシュリンのようなホルモンと、
−サイトカイン、ならびにインターフェロンα、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦのような成長因子と、
−アレルギー性疾患における抗ＩｇＥ抗体、移植片拒絶における抗ＣＤ３および抗ＣＤ４
抗体、さまざまな自己免疫性疾患、非ホジキンリンパ腫における抗ＣＤ２０抗体、ならびに腎不全におけるエリトロポイエチンを含む免疫応答の調整のための抗体と、からなる。
【００７０】
上記に記載された使用と方法とのうちのいずれにおいて、本発明に従った免疫原性ペプチドは、上記免疫原性ペプチドで初回抗原刺激を受けた（primed）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞によって置換され得るか、または（免疫原性ペプチドの代わりにたとえば個体に投与される裸のＤＮＡまたはウイルスベクターの形で）免疫原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列によって置換され得る。さらに、複数の、すなわち１より多い（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の免疫原性ペプチドの組合せが、上記のうちのいずれにおいても使用され得る。
【００７１】
本発明はさらに、本発明に従った免疫原性ペプチドを発現することができることを特徴とする分離されたウイルスベクターを包含する。
【００７２】
上に記載の使用のうちのいずれにおいても、レシピエントは、哺乳動物、特に（ヒトではない）霊長動物またはヒトである。
【００７３】
本発明に従った免疫原性ペプチドは、対象の抗原のＴ細胞エピトープから開始するよう生成され得る。特に、使用されるＴ細胞エピトープはドミナントなＴ細胞エピトープであり得る。本発明の文脈での使用のための対象の抗原からのＴ細胞エピトープの同定および選択は、当業者の知見内にある。たとえば、対象の抗原から分離されたペプチド配列は、ペプチド配列がＴ細胞応答を誘発するかどうかを判断するよう、たとえばＴ細胞生物技術によってテストされ得る。Ｔ細胞応答を誘発することが分かったそれらのペプチド配列は、Ｔ細胞刺激活性を有すると規定される。対象の抗原に由来するペプチド／エピトープで、対象の抗原に敏感になった個体から得られたＴ細胞を培養し、次いで、たとえばトリチウム化チミジンの細胞の取り込みによって、測定される際にペプチド／エピトープに応答してＴ細胞の増殖が発生するかどうか判断することにより、ヒトのＴ細胞刺激活性がさらにテストされ得る。ペプチド／エピトープへのＴ細胞による応答について刺激指数が、コントロールＣＰＭで分けられたペプチド／エピトープに応答して、最大のＣＰＭとして計算され得る。バックグラウンドレベルの２倍以上のＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）が「陽性」と考えられる。陽性の結果は、テストされたペプチド／エピトープの群について、各ペプチド／エピトープごとの平均刺激指数を計算するよう使用される。非自然（または修飾された）Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するそれらの結合親和性についてさらに随意にテストされ得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子への非自然な（または修飾された）Ｔ細胞エピトープの結合は、異なる態様で行われ得る。たとえば、可溶のＨＬＡクラスＩＩ分子が、所与のクラスＩＩ分子について同型接合の細胞の溶解によって得られる。後者は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。可溶のクラスＩＩ分子が、そのクラスＩＩ分子についての強い結合親和性に従って生成されるビオチン標識付基準ペプチドとともに、インキュベートされる。クラスＩＩ結合について評価されるべきペプチドはその後、異なる濃度でインキュベートされ、そのクラスＩＩ結合からの基準ペプチドを変位させるそれらの能力が、ニュートラアビジンの添加によって計算される。たとえば、Texier et al. 2000, J Immunol 164, 3177-3184において、方法が発見され得る。本発明の免疫原性ペプチドは、２．０以上の平均Ｔ細胞刺激指数を有する。２．０以上のＴ細胞刺激指数を有する免疫原性ペプチドは、予防薬または治療薬として有用であると考えられる。本発明に従った免疫原性ペプチドは、少なくとも２．５、少なくとも３．５、少なくとも４．０、またはさらに少なくとも５．０の平均Ｔ細胞刺激指数を有し得る。さらに、このようなペプチドは典型的には、少なくとも約１００、少なくとも１５０、少なくとも約２００または少なくとも約２５０の陽性指数（Ｐ．Ｉ．）を有する。ペプチドについての陽性指数が、ペプチドに応答するＴ細胞を有する（したがって、乱交雑の性質のペプチド／エピトープで乗算されたＳＩに対応する）、対象の抗原に敏感である個体の集団（たとえ
ば少なくとも９の個体、少なくとも１６の個体、少なくとも２９もしくは３０の個体またはそれ以上）において、平均Ｔ細胞刺激指数に個体のパーセントを乗算することによって決定される。したがって、陽性指数は、対象の抗原に敏感な個体の集団において、ペプチドに対するＴ細胞応答の強さ（Ｓ．Ｉ．）と、ペプチドに対するＴ細胞反応の頻度との両方を示す。たとえば微細なマッピング技術によって最適なＴ細胞エピトープを決定するために、Ｔ細胞刺激活性を有ししたがってＴ細胞生物技術によって決定されるように少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいてアミノ酸残基の添加または欠失により修飾され、修飾されるペプチドへのＴ細胞反応の変化を決定するようテストされる。天然タンパク質配列において重なる領域を共有する２つ以上のペプチドがヒトのＴ細胞刺激活性を有することが分かった場合、Ｔ細胞生物技術によって決定されたように、このようなペプチドのすべてまたは一部を含む付加的なペプチドが生成され得、これらの付加的なペプチドは、同様の処置によってテストされ得る。この技術に従って、ペプチドは選択され組み換え的または合成的に生成される。Ｔ細胞エピトープまたはペプチドは、個体の集団における、ペプチド／エピトープに対するＴ細胞応答の強さ（たとえば刺激指数）と、ペプチドに対するＴ細胞応答の頻度とを含むさまざまな因子に基づいて選択される。
【００７４】
抗原の同定に使用された方法は、当該技術において公知である。したがって、位置クローニングまたは発現クローニングストラテジが、候補の抗原を同定するよう用いられ得る。方法の詳細な記載については、たとえばMendoza et al. 1997, Immunity 7, 461-472を参照のこと。代替的には、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子のいずれかにおいてＡＰＣによって実際に提示されたペプチドは、さまざまなクロマトグラフィ法によって、溶出および分離され得る。このような方法の詳細な記載は、Scott et al. 2000, Immunity 12, 711-720において発見されるであろう。候補抗原は、抗原性タンパク質内のＴ細胞エピ
トープ配列を同定するよう、１つ以上のインヴィトロアルゴリズムによってスクリーニングされ得る。好適なアルゴリズムは以下のウェブサイトで発見されるアルゴリズムを含むが、これらに限定されない。
【００７５】
【数１】
2018076329.tif 000004
【００７６】
これらのアルゴリズムのより多くの詳細はたとえば、Zhang et al. (2005) Nucleic Acids Res 15 33, W180-W183 (PREDBALB)、Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501 (MHCBN)、Schuler et al. (2007) Methods Mo/ Biol. 409, 75-93 (SYFPEITHI)、Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34, W194-W197 (SVMHC)、Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172- 174およびGuan et al. (2003) Appl Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred)に記載される。
【００７７】
より特定的には、このようなアルゴリズムは、ＭＨＣＩＩ分子の溝に入ることになる１つ以上のノナペプチド配列の抗原性タンパク質内での予測を可能にする。
【００７８】
本発明の免疫原性ペプチドは、たとえばバクテリア細胞（たとえば大腸菌）、酵母菌（
たとえばピチア属種、ハンゼヌラ種、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス種）、（たとえばスポドプテラ・フルギペルダまたはキンウワバからの）昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ、ＣＯＳ細胞）において、組み換え発現によって生成され得る。一方、（プロモータおよび終止配列のようなさらに別の情報を含む）したがって必要とされる好適な発現ベクターの構成は、標準的な組換ＤＮＡ技術を伴う。本発明の組み換えにより生成される免疫原性ペプチドは、たとえば免疫原性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に隣接して挿入される酵素開裂部位の酵素的開裂を介してより大きな前駆体タンパク質に由来し得、次いで好適な精製が行われる。
【００７９】
本発明の免疫原性ペプチドの限定された長さを考慮して、それらは化学ペプチド合成によって調製され得る。ペプチドは、異なるアミノ酸を互いに結合することにより調製される。化学合成は、たとえばＤ−アミノ酸、非自然発生の側鎖を有するアミノ酸、またはメチル化システインのような修飾される側鎖を有する自然のアミノ酸の包含に特に適している。ペプチド化学合成の方法は、よく記載されており、ペプチドは、Applied Biosystems社などのような会社から注文され得る。ペプチド合成は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）または液相ペプチド合成の反対のいずれかとして行われ得る。最もよく知られているＳＰＰＳ法は、当業者には詳細に既知であるｔ−ＢｏｃおよびＦｍｏｃ固相化学である。さらに、元々Kent(Schnolzer & Kent 1992, Int J Pept Prot Res 40, 180-193)によって記載され、たとえばTam et al. 2001, Biopolymers 60, 194-205においてレビューされたように、ペプチドは、ライゲーションストラテジ（２つの保護されていないペプチドフラグメントの化学選択的なカップリング）を用いて、より長いペプチドを形成するよう互いにリンクされ得る。これは、ＳＰＰＳの範囲を超えたタンパク質合成を達成する並はずれた可能性を提供する。１００〜３００個の残基のサイズを有する多くのタンパク質は、この方法によって合成が成功した。合成ペプチドは、ＳＰＰＳにおける莫大な進歩により、生化学、薬理学、神経生物学、酵素学および分子生物学の研究分野において、増加し続ける重大な役割を果たし続けている。
【００８０】
対象の免疫原性ペプチドの物理的および化学的性質（たとえば可溶性、安定性）が、ペプチドが治療組成物への使用に適しているどうか判断するために検査される。典型的にはこれは、ペプチドの配列の調節することにより最適化される。随意に、当該技術において公知の技術を使用して、合成の後にペプチドが修飾され得る（化学的修飾、たとえば官能基を添加／削除））。
【００８１】
さらに本発明は、インヴィヴォまたはインヴィトロ（エスクヴィヴォ）のいずれかで抗原特異性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞または抗原特異性調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇｓまたはＣＤ４＋調節性Ｔ細胞）を生成するための方法を提供する。本発明に従う方法は、より多くの数のＣＤ４＋エフェクターＴ細胞またはＣＤ４＋調節性Ｔ細胞が生成されるということと、対象の抗原について特異的な当該細胞が生成され得るということといった長所を有する。
【００８２】
このような方法は、増殖性が増加したＣＤ４＋エフェクター細胞の集団を得るための方法を含む。当該方法は、
・末梢血球を提供するステップと、
・これらの血球（cells）を本発明に従った免疫原性ペプチドに接触させるステップとを
含み、Ｔ細胞抗原が感染因子に由来しており、さらに
・ＩＬ−２が存在する状態でこれらの血球（cells）を展開するステップを含む。
【００８３】
このような方法はさらに、増殖性が増加したＣＤ４＋エフェクター細胞の集団を得ることを目的とした方法を含む。当該方法は、
・本発明に従った免疫原性ペプチドを提供するステップと、
・対象に免疫原性ペプチドを投与するステップとを含み、Ｔ細胞エピトープは感染因子に由来しており、さらに
・増殖性が増加したＣＤ４＋エフェクター細胞の集団を得るステップを含む。
【００８４】
このような方法はさらに、抑制性が増加したＣＤ４＋調節性細胞の集団を得るための方法を含む。当該方法は、
・末梢血球を提供するステップと、
・これらの血球（cells）を本発明に従った免疫原性ペプチドに接触させるステップとを
含み、Ｔ細胞エピトープは自己抗原または同種抗原に由来しており、さらに
・ＩＬ−２が存在する状態でこれらの血球（cells）を展開するステップを含む。
【００８５】
このような方法はさらに、抑制性が増加したＣＤ４＋調節性細胞の集団を得ることを目的とした方法を含む。当該方法は、
・本発明に従った免疫原性ペプチドを提供するステップを含み、Ｔ細胞エピトープは、自己抗原または同種抗原に由来しており、さらに
・対象に免疫原性ペプチドを投与するステップと、
・抑制性が増加したＣＤ４＋調節性細胞の集団を得るステップとを含む。
【００８６】
このような方法はさらに、増殖性が増加したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得るための方法を含む。当該方法は、
・末梢血球を提供するステップと、
・これらの血球（cells）を本発明に従った免疫原性ペプチドに接触させるステップとを
含み、Ｔ細胞エピトープは腫瘍に由来した抗原に由来しており、さらに、
・ＩＬ−２が存在する状態でこれらの血球（cells）を展開するステップを含む。
【００８７】
このような方法はさらに、増殖性が増加したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得ることを目的とした方法を含む。当該方法は、
・本発明に従った免疫原性ペプチドを提供するステップを含み、Ｔ細胞エピトープは腫瘍に由来した抗原に由来しており、さらに
・対象に免疫原性ペプチドを投与するステップと、
・増殖性が増加したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得るステップとを含む。
【００８８】
上記の方法によって得られる増殖性が増加したエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の集団および抑制性が増加したＣＤ４＋調節細胞の集団、ならびにターゲットの疾病または病気の治療のための薬剤の製造のためのそれらの使用も、本発明の一部である。
【００８９】
本発明の免疫原性ペプチドの上記の使用のうちのいずれかについて、上記ペプチドは、抗原特異性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞によってかまたは抗原特異性の調節性Ｔ細胞によって置換され得る。同種異型細胞および自己原性細胞（autogeneic cell）の使用の両方
が意図される。上記抗原特異性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞または抗原特異性調節性Ｔ細胞を必要としている対象に投与することを含む任意の方法は、さらに養子細胞治療として知られている。疾病または障害の急性発作を治療する場合およびこのような疾病または障害の再発を治療する場合において、このような治療は特に重要である。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、ウイルス性、細菌性または寄生虫性の病気のような感染症の防止のために非常に重要であり、したがって大きな可能性がある。それらの効能は抗原特異性に依存する。ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞は、免疫調節において非常に重要であり、大きな治療上の可能性を有する。調節性Ｔ細胞に基づいた免疫療法の効能は調節性Ｔ細胞の抗原特異性に依存する。さらに、多クローン性展開調節性Ｔ細胞に対する抗原特異性の調節性Ｔ細胞の使用により、治療に必要な調節性Ｔ細胞の総数が低減される。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、腫瘍遺伝子、腫瘍原遺伝子、ウイルス由来のタンパク質、生存因子またはクローン形質
決定子を発現する腫瘍のような腫瘍の治療に非常に重要である。
【００９０】
本発明はさらに、本発明の免疫原性ペプチドをエンコードする核酸配列と、たとえば組み換え発現または遺伝子治療におけるそれらの使用方法とに関する。特に、上記核酸配列は、本発明の免疫原性ペプチドを発現することができる。
【００９１】
本発明の免疫原性ペプチドは確かに、任意の好適な遺伝子治療方法を使用することにより、必要としている対象に投与され得る。本発明の免疫原性ペプチドによる免疫処置と、好適な遺伝子治療の使用による免疫処置と、養子細胞移入とが組み合わせられてもよい。組み合わせられる場合、上記免疫処置、養子細胞移入および遺伝子治療は、任意の可能な組合せで同時または連続して使用され得る。
【００９２】
遺伝子治療においては、免疫原性ペプチドのエンコードする組み換え核酸分子は、標的細胞への送達のための裸のＤＮＡとしてまたはリポソームもしくは他の脂質系において使用され得る。ヒトの遺伝子治療における使用のための細胞の中へのプラスミドＤＮＡの直接移入のための他の方法は、当業者に周知であり、プラスミドＤＮＡをタンパク質に複合化することにより、細胞上にて受容体にＤＮＡを向けることを含む。そのもっとも単純な態様では、遺伝子移入は、ミクロ注入のプロセスを通じて、細胞の核に単に微量のＤＮＡを注入することにより行なわれ得る。組み換え遺伝子は、細胞へ導入されると、転写と翻訳について細胞の正常なメカニズムによって認識され得、遺伝子産物が発現されることになる。より多くの細胞にＤＮＡを導入するために他の方法も試みられている。これらの方法は、ＤＮＡがリン酸カルシウムとともに沈降されピノサイトーシスによって細胞に入れられるトランスフェクションと、細胞が大きな電圧パルスに晒されて膜に正孔を導入するエレクトロポレーションと、ＤＮＡが、標的細胞と融合する脂肪親和性小胞に詰め込まれるリポフェクション／リポソーム融合と、小さな発射体に結合されたＤＮＡを使用する粒子衝撃とを含む。細胞にＤＮＡを導入する別の方法は、化学的に修飾されるタンパク質にＤＮＡを結合することである。アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化可能であり、細胞へのＤＮＡの取り込みを増強可能である。ＤＮＡ複合体を含む溶液にアデノウイルスを混合すること、またはタンパク質橋架剤を使用して共有結合でアデノウイルスに付与されたポリリシンへのＤＮＡの結合は、実質的に組み換え遺伝子の取り込みおよび発現を改善する。アデノ関連ウイルスベクターも、血管細胞中への遺伝子送達に使用されてもよい。本願明細書において使用されるように、「遺伝子移入」は、異物の核酸分子を細胞に導入するプロセスを意味しており、遺伝子によってエンコードされた特定の生成物の発現を可能にするよう一般的に行われる。上述の生成物は、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または酵素活性ＲＮＡを含んでもよい。遺伝子移入は、培養細胞中で行なわれ得るか、または哺乳動物中への直接投与によって行われ得る。別の実施形態では、本発明に従った免疫原性ペプチドをエンコードする核酸分子配列を含むベクターが提供される。特定の実施形態では、核酸分子配列が特定の組織においてのみ発現されるようにベクターが生成される。具体的に１つ以上の組織または器官においてペプチドの発現を方向付けるプロモータの制御の下で、たとえば本発明の免疫原性ペプチドをエンコードする配列を配置することによって、組織特異的遺伝子発現を達成する方法が当該技術において周知である。レトロウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターが、ターゲットとされた組織または細胞集団への、本発明に従ったペプチド、その相同体または誘導体をエンコードするヌクレオチド配列（たとえばｃＤＮＡ）の送達のために用いられてもよい。このようなコーディング配列を含んでいる組み換えウイルスベクターを構成するよう、当業者に周知の方法が用いられ得る。代替的には、本発明に従った免疫原性ペプチドをコーディングする核酸分子を含む操作された細胞が遺伝子治療において使用され得る。
【００９３】
遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種のためのウイルスベクターは、組み換え核酸技術によって、修飾に対して非常に影響を受けやすい。上記を考慮して当業者であれば、本発明に従った免疫原性ペプチドおよびそれらの使用において適用されるようなウイルスベクターＴ細胞エピトープへの修飾は、ウイルスベクター自体において直ちに導入され得るということをさらに容易に考察するだろう。したがって本発明は、ウイルスベクタータンパク質の少なくとも１つに存在する少なくとも１つのＴ細胞エピトープが、本発明に従う免疫原性ペプチドについて記載されたようにシステイン残基を導入することにより修正されるということを特徴とする、分離されたウイルスベクターとして規定される修飾されるウイルスベクターをさらに包含する。それへの一実施形態において、上記ウイルスベクターはさらに、上記の修飾されるＴ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩＩ決定子によって提示されることができるということを特徴とする。別の実施形態において、上記の分離されたウイルスベクターはさらに、Ｔ細胞エピトープ修飾を伴わない同じウイルスベクターと比較して、それらの細胞変換特性が著しく変更されないということを特徴とする。
【００９４】
本発明に従う１つ以上のペプチドの投与（すなわち投与の際にインヴィヴォで、本発明に従うペプチドの発現を保証する核酸の投与）が遺伝子移入を通じて保証される場合、導入された核酸の結果として発現されたペプチドの量に基づき核酸の適切な量が決定され得る。
【００９５】
本発明の薬剤は通常、本発明の免疫原性ペプチド、当該免疫原性ペプチドに特異的なＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（の集団）もしくはＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（の集団）、または上記免疫原性ペプチドを発現することが可能な遺伝子治療ベクターの少なくとも１つを有効成分として含む（医薬）製剤であるが、必ずしも当該（医薬）製剤である必要はない。上記の有効成分とは別に、このような製剤は、（医薬的に許容される）希釈剤、溶剤、キャリアまたはアジュバントの少なくとも１つを含む。典型的に、（希釈剤、溶剤、キャリアおよびアジュバントのような）医薬的に許容される化合物は、たとえば薬局方の手引き（たとえば米国薬局方、欧州薬局方または国際薬局方）において発見され得る。本発明の薬剤または医薬組成物は通常、（予防的または治療上）有効な量の有効成分を含み、当該有効性は、防止または治療される状態または障害に対するものである。特に、本発明の医薬組成物は、予防用途または治療用途のためのワクチンである。
【００９６】
本発明の薬剤または医薬組成物は、上記薬剤または組成物の複数の投与を含む予防的または治療上の養生法の一部として、必要としている対象に投与される必要があり得る。上記複数の投与は、通常連続して行われ、２つの投与間の時間間隔は変動し得、有効成分の性質と、防止または治療される状態の性質とに調節される。必要としている対象に単一の投与で与えられる有効成分の量も、変動し得、対象の肉体的ステータス（たとえば重量、年齢）、防止または治療されるべき状態のステータス、および治療を行う医者、内科医または看護師の経験といった要因に依存する。
【００９７】
「希釈剤」という用語はたとえば、生理的食塩水を指す。「アジュバント」という用語は通常、単独で与えられた場合に、直接の効果があったとしてもほとんどない、他の薬品（たとえば医薬品、ワクチン）の影響を修正（好ましくは増加）する薬剤または免疫剤を指す。アジュバントの一例として、本発明の免疫原性ペプチドが吸着され得る水酸化アルミニウム（ミョウバン）が与えられる。さらに、他の多くのアジュバントが、当該技術において公知であり、ＭＨＣクラスＩＩ提示およびＴ細胞活性化においてペプチド提示を促進するのであれば、使用され得る。「医薬的に許容されるキャリア」という用語は、たとえば上述の組成物を溶解、分散もしくは拡散することによって、治療されるべき個所への適用もしくは送達を促進するために、および／またはその有効性を損なうことなしにその貯蔵、搬送または取り扱いを促進するために上記有効成分が調剤される任意の材料または物質を意味する。これらは、任意およびすべての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤お
よび抗カビ剤（たとえばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、ならびに（砂糖または塩化ナトリウムのような）アイソトニック剤などを含む。組成物において、有効成分の作用時間を制御するために、付加的な成分が含まれ得る。医薬的に許容されるキャリアは、固体、液体、または液体を形成するよう圧縮されている気体であり得る、すなわち、この発明の組成物は、濃縮物、乳剤、溶液、粒状体、粉剤、スプレー、エアゾール剤、懸濁液、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、ペレット剤またはパウダーとして好適に使用され得る。上記医薬組成物およびそれらの製剤における使用に好適な医薬のキャリアは当業者に周知であり、本発明におけるそれらの選択について特定の限定はない。それらはさらに、湿潤剤、分散剤、固着剤、接着剤、乳化剤、溶剤、コーティング、抗菌剤および抗カビ剤（たとえばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、および（砂糖または塩化ナトリウムのような）アイソトニック剤など添加物を、薬務と一致している場合、すなわち哺乳動物に永久的な損傷を与えないキャリアおよび添加剤である場合に、含んでもよい。本発明の医薬組成物は、たとえば、選択されたキャリア材料と、適切な場合、界面活性剤のような他の添加剤とともに均質的に有効成分を１ステップまたは複数ステップの処置で混合、コーティングおよび／または粉砕することによって、任意の公知の態様で調製されてもよい。さらに、たとえばそれらを約１〜１０μｍの直径を通常有する微小球の形で得る目的で、それらは微粉化によって調製されてもよい。すなわち有効成分の制御または維持された放出のためのマイクロカプセルの製造のために調製されてもよい。
【００９８】
本発明に従った免疫原性ペプチド、その相同体または誘導体（およびすべて「有効成分」という用語に含まれるそれらの医薬的に許容される塩または医薬組成物）は、防止または治療される状態について適切であり、ここでは投与されるべき免疫原タンパク質である化合物について適切である任意の経路で投与されてもよい。可能な経路は、局部経路、全身経路、経口経路（固体形態または吸入）、直腸経路、鼻腔経路、局所的経路（目の経路、経口経路および舌下経路を含む）、腟経路および腸管外経路（皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、皮内経路、動脈内経路、鞘内経路および硬膜外経路を含む）を含む。好ましい投与経路は、たとえばレシピエントの状態または防止または治療されるべき状態により変動し得る。
【００９９】
製剤は、単位投薬の形で簡便に提示され得、薬学技術において周知の方法のうちのいずれによっても調製され得る。経口投与に好適な本発明の製剤は、所定の量の有効成分を各々含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤のような個別的な単位としてか、パウダーまたは粒状体としてか、溶液または水性液もしくは非水性液中の懸濁液としてか、または水中油液状エマルジョンもしくは油中水液状エマルジョンとして提示され得る。有効成分も大型丸薬、舐剤またはペーストとして提示され得る。錠剤は、随意に１つ以上の副成分とともに圧縮または成形によって作られ得る。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と随意に混合される、パウダーまたは粒状体のように自由流動する形態の有効成分を好適なマシンにおいて圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性液希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適なマシンにおいて成形することによって作られ得る。錠剤は随意に、コーティングされてもよく、刻み目を付けられてもよく、その中の有効成分の遅いまたは制御放出を提供するよう調剤されてもよい。
【０１００】
ここで、本発明を如何なる限定の意図もなく提供される以下の実施例によって説明する。さらに、本願明細書において記載されたすべての参照は、参照によって本願明細書において明示的に含まれる。
【０１０１】
実施例
【実施例１】
【０１０２】
イエダニ由来のアレルゲンＤｅｒ  ｐ２は、Ｈ−２ｂまたはＨ−２ｄ拘束ＭＨＣクラス
ＩＩエピトープか、またはＥが第１のアンカー残基に対応する配列ＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；Ｄｅｒ  ｐ２のアミノ酸残基２５−３５）を含む１４ｋＤの非グリコシル化タンパク質である。配列ＣＨＧＳのアミノ末端隣接残基（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２；Ｄｅｒ  ｐ２のアミノ酸残基２１−２４）は、モノシステイングルタレドキシンモチーフを包含する。
【０１０３】
アミノ酸ＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ（ＭＨＣ結合部位に隣接するアミノ酸残基にはアンダーラインが付されている）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を包含するペプチドが装填された抗原提示細胞との関連する相互作用の際に、Ｐ（−４）に位置するシステイン残基が、特異的なＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖応答を増加させたかどうかを決定するよう、隣接配列の４つのアミノ酸残基の各々がアラニンに置換された。
【０１０４】
投薬を受けていないＢＡＬＢ／ｃマウスからのＴ細胞低減マイトマイシンＣ処理された脾細胞が抗原提示細胞として用いられ、さまざまな変異ペプチド（０．１μΜ）が装填される。次いで、４８時間のインキュベーションのために、ｐ２１−３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンが培養物に加えられ、その後、３Ｈチミジンが加えられ、さらなる１８ｈの培養の後にその取り込みを測定した。結果は、ｐ２１−３５野生型配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と比較によって、得られた取り込みのパーセンテージとして図１に示される。アラニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のペプチド：ＡＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦ）によるＰ（−４）におけるシステインの置換により、特異的なＴ細胞クローンの増殖応答が７０％低減されたということが示される。データは、３つの独立した実験を示す。
【実施例２】
【０１０５】
ＮＰＭ−ＡＬＫキメラ遺伝子は、潜在的な腫瘍遺伝子であることが示された構成的に活性化されたチロシンキナーゼをエンコードする。この融合遺伝子はヌクレオホスミン（ＮＰＭ）と、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）という名称を有する新規な受容体チロシンキナーゼ遺伝子とから構成される。ＮＰＭ−ＡＬＫ融合タンパク質について遺伝子組み換えされたマウス株に由来するリンパ腫細胞株は、腫瘍形成特性を示した。免疫適格のレシピエントに接種されると、このような細胞は攻撃的な腫瘍を進行させる。このような腫瘍細胞株の表現型の評価は、それらはクラスＩＩ主要組織適合決定子を発現しないが、クラスＩ  ＭＨＣ決定子について陽性であるということを示す。
【０１０６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、１００μｌのＰＢＳに懸濁されたＮＰＭ−ＡＬＫ腫瘍細胞（２×１０６腫瘍細胞（Ｒ８０  ＮＰＭ−ＡＬＫ細胞、Ｈ−２ｂ拘束））の皮下注射により接種され、最後のペプチド注入の１０日後、わき腹に皮下注射され、腫瘍の成長をカリパスで評価した。通常、このようなマウスには５〜６日以内に腫瘍が生じ、当該腫瘍は、その後３週以内に±１２ｍｍの直径に達するよう成長した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスには、５０μｇの配列ＹＣＴ  ＱＤＰＤＶＩＮＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のペプチドによって、１０日の間隔で４回、腫瘍細胞の接種の前に免疫性が与えられ、当該ペプチドはミョウバン（アルハイドロゲル）キャリア上に吸着された。このＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープは、ＡＬＫタンパク質の隣接部分であり、GenBank Accession Number Q9UM73（バー
ジョンＱ９ＵＭ７３．２）に記載されるようにＡＬＫタンパク質のアミノ酸１３８５−１３９６に対応する。腫瘍細胞は、最後の免疫処置の１０日後に接種された。その後、あらかじめ免疫性が与えられたマウスにおいて腫瘍成長があり、予め免疫性が与えられなかった対照群と比較された。図２に提示された結果は、腫瘍成長は予め免疫性が与えられたマウスにおいて非常に低減されたということを示している。配列ＹＣＴＱＤＰＤＶＩＮＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のペプチドは、ＡＬＫに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を向上することを実証された。群同士間の差は、マン・ホイットニーＵ検定によって評価された際、２０日目で非常に有意であった（ｐ＜０．００８）。
【実施例３】
【０１０７】
結核菌
結核菌は毎年、何千もの死の原因である。唯一の利用可能なワクチン接種であるカルメット・ゲラン・マイコバクテリウム・ボビスに基づくワクチン（Calmette-Guerin Mycobacterium bovis-based vaccine；ＢＣＧ）は、効率的ではない。さらに、いくつかのマイ
コバクテリウム株は、従来の化学療法に対する耐性を示している。抗原特異性ＣＤ４＋細胞は結核において発生することが公知であり（Winslow et al. (2003) J. Immunol.170: 2046-2052）、これは予防可能である（Khader et al. (2007) Nature Immunol. 8:369-377）。
【０１０８】
結核菌は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ決定子の両方によって提示される多くの抗原を産生する。クラスＩ決定子によって提示される抗原は、結核菌に感染した細胞の除去を目的とする細胞溶解性活性を担持するＣＤ８＋Ｔリンパ球によって認識される。しかしながら、慢性保菌患者においては、このメカニズムは感染細胞を除去するのに十分に効率的ではない。
【０１０９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、他のリンパ球サブセット、特にＣＤ４＋系列に属する細胞からの助けを必要とする。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、完全な細胞溶解性能力を得るようＣＤ８＋Ｔ細胞について必要なシグナルを提供しているＩＬ−２の生成に繋がる。特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化される治療ストラテジはしたがって、結核菌感染細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞依存の除去において有益である。
【０１１０】
このような目的に最良である候補抗原の１つは、細胞内結核菌によって生成されるタンパク質である抗原８５ｂ（Ａｇ８５ｂ）である。アミノ酸配列２６６〜２７５に対応するドミナントなＴ細胞エピトープがマッピングされている。このようなエピトープの完全な配列はＹＷＧＡＱＬＮＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ末端およびカルボキシ末端における隣接残基の検査では、６個のアミノ酸の長さにおいてシステインが同定されなかった。システイン残基は、位置Ｐ−４において、ＣＳＷＥ  ＹＷＧＡＱＬＮＡＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；システインにはアンダーラインが引かれており、Ａｇ８５ｂ抗原のアミノ酸１６３−２７５の先に存在する）といった配列を有する修飾されるＴ細胞エピトープを生成したペプチドのアミノ末端にて加えられた。
【０１１２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ミョウバンのようなアジュバントと一緒に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のペプチドにより免疫性が与えられる。５０μｇのペプチドの３回の注入が２週間間隔で行われる。最後の免疫処置の２週後、マウスは犠牲にされ、密度勾配遠心分離と、抗体がコーティングされた磁気ビーズに対する選択との組合せによって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が脾臓から調製される。その後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のペプチドが装填され限界希釈によってクローン化された抗原提示細胞を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞は活性化され、インヴィトロで展開した。
【０１１３】
対照実験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のペプチドにより免疫性が与えられる。上述したように抗体がコーティングされる磁気ビーズとの選択ステップの組合せを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞が脾臓から得られる。
【０１１４】
特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の源を得るよう、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは組み換えＡｇ８５ｂにより免疫性が与えられ、上述したように、抗ＣＤ８＋抗体が装填された磁気ビーズを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞が脾臓から調製されている。
【０１１５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られたマクロファージは、３７℃で６０分間Ａｇ８５ｂとともにインキュベートされ、タンパク質の取り込みとクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ決定子の両方における提示とのために、４℃で一晩インキュベートされる。このようなマクロファージは、ＣＤ８Ｔ細胞依存のマクロファージの死滅の評価のために、クロム放出分析を使用して、５１Ｃｒとともにさらにインキュベートされる。
【０１１６】
マクロファージ溶解のためにＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＣＤ４＋Ｔ細胞の能力を調べるよう、以下の実験が行なわれる。Ａｇ８５ｂ由来のエピトープを提示する５１Ｃｒが標識付けされたマクロファージの培養物において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のペプチドが注入されたマウスから上述したように得られたＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ａｇ８５ｂによって免疫性が与えられたマウスから得られたＣＤ８＋Ｔ細胞の集団と一緒に加えられる。対照実験として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のペプチドで免疫性が与えられたマウスから得られたＣＤ４＋Ｔ細胞は、マクロファージと、Ａｇ８５ｂで免疫性が与えられた動物から得られたＣＤ８＋とともにインキュベートされる。
【０１１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のペプチドの免疫処置によって誘発されるＣＤ４＋ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のペプチドで免疫性が与えられたマウスから得られる場合に、（５１Ｃｒ放出によって測定される）有意な程度のマクロファージ溶解が得られるということが理解され得る。
【０１１８】
したがって、クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの隣接領域におけるシステインの存在が、Ａｇ８５ｂ由来のＴ細胞エピトープを提示するマクロファージの死滅を強化するのに十分であると結論付けられる。この死滅は、非常に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって行われる。
【実施例４】
【０１１９】
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスは、他のウイルスと同様に、絶対的な細胞内病原である。その高い程度の感染性と急速に突然変異する能力と関連付けられる理由により、年ごとに獲得免疫が作用しなくなり毎年、何百万もの人々に影響することは周知である。当該ウイルスは、非常に有意な罹患率および死亡率とをもたらす。現在のワクチン接種ストラテジは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼのような、高いタイターの特異抗体を誘導する表面タンパク質を利用するが、感染細胞を除去する細胞溶解性のＴ細胞の誘発についてはかなり非能率的である。
【０１２０】
ヘマグルチニン抗原はＭＨＣクラスＩＩ決定子の文脈において提示される多くのＴ細胞エピトープを担持し、特異抗体の生成を補助するエフェクターＴ細胞を活性化する。クラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、さらにＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発によって生成される。しかしながら、感染細胞上のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性活性は、身体を通じての感染の広がりを除去するには不十分である。細胞毒性のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性が増加され得る方法は、インフルエンザ感染の防止および治療に有益である。
【０１２１】
したがって、ペプチドＹＳＴＶＡＳＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；たとえばGenBank accession number AF408859_1のヘマグルチニン前駆アミノ酸配列のアミノ酸５３４−
５４２）は、Ｈ１Ｎ９インフルエンザウイルスからのクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを包含する。隣接残基の配列の検討は、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、システイン残基が６個までのアミノ酸の隣接領域内に存在しないということを示す。
【０１２２】
さらにカルボキシ末端隣接領域の３個のアミノ酸を含む配列ＣＬＡＩ  ＹＳＴＶＡＳＳ
ＬＶ  ＬＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；システインにはアンダーラインが引かれており、たとえばGenBank accession number AF408859_1のヘマグルチニン前駆アミノ酸配列の
アミノ酸５３１−５４５に先行する）を有する、位置Ｐ−４にシステイン残基を含む合成ペプチドが生成される。
【０１２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のペプチドは、実施例３において記載されるのと同じプロトコルを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに免疫性を与えるために使用され、これにより特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を得た。
【０１２４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群は、実施例３において記載されるように特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の源を得るよう、Ｈ１Ｎ９インフルエンザウイルスの組み換えヘマグルチニンにより免疫性が与えられる。
【０１２５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のいずれかのペプチドにより免疫性が与えられたマウスの各群の脾臓から調製された。
【０１２６】
樹状細胞には、クラスＩおよびクラスＩＩ決定子の両方におけるエピトープの提示のために、Ｈ１Ｎ９インフルエンザウイルスの組み換えヘマグルチニンが装填された。装填された樹状細胞の培養物がさらに、樹状細胞溶解（クロム放出分析）のためのマーカとして５１Ｃｒとともにインキュベートされた。
【０１２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９のペプチドで免疫性が与えられたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞と、ヘマグルチニンで免疫性が与えられたマウスから調製されたＣＤ８＋Ｔ細胞とのこのような樹状細胞のインキュベーションは、ヘマグルチニンが装填された樹状細胞の有意な溶解を誘導し、その一方、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のペプチドでの免疫処置の後で得られるＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて行なわれた実験は、溶解を示さない。培養物においてＣＤ８＋Ｔ細胞をオミットすることで完全に樹状細胞溶解を抑制しており、これは、溶解が活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されるということを示している。
【０１２８】
したがって、クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの隣接領域内の単一のシステイン残基の導入は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を向上するのに十分であり、ターゲット細胞の有意な溶解が得られる。
【実施例５】
【０１２９】
抗同種因子抗体
（本例では同種因子と呼ばれる）治療タンパク質の投与は、医学における慣例である。一例は、血友病Ａ患者における凝固経路の第ＶＩＩＩ因子の投与である。多くの場合、このような投与は、治療タンパク質の活性を認識および中和する抗体の誘発が発生するという問題がある。血友病Ａでは、第ＶＩＩＩ因子の注入によって治療される患者の約３０％には、第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を抑制する抗体が発生する。したがって、望ましくない抗同種因子抗体が具体的に除去され得る方法を有することは有利である。
【０１３０】
ＢＯ２Ｃ１１抗体は、Ｃ２ドメインに結合し、これによりリン脂質への第ＶＩＩＩ因子の結合を防止することにより、第ＶＩＩＩ因子の機能を抑制するヒトモノクローナル抗体である（Jacquemin et al. (1998) Blood 92: 496-506）。ＢＯ２ＣＩＩの重鎖（ＶＨ領
域）の可変部分の配列は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とオーバーラップしているクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含む。このようなエピトープを認識するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することによってＢＯ２Ｃ１１に対する抗体を発生させることは、循環するＢＯ２Ｃ１１を有する複合体を形成することと、Ｂ細胞受容体のレベルでのＢＯ２Ｃ１１抗体の生成を抑制することとの両方によって、ＢＯ２Ｃ１１抗体を除去する特定の方法を構成する
。
【０１３１】
配列ＹＣＡＶＰＤＰＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；GenBank accession number CAA11829のアミノ酸配列のアミノ酸１１４〜１２２に対応する）は、ＢＯ２Ｃ１１  ＶＨ領
域のＣＤＲ３領域に位置するクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを包含する。このエピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にあるアミノ酸配列の検査により、６個のアミノ酸内にシステインが存在しないことが同定された。システイン残基が位置Ｐ−４に加えられ、カルボキシ末端の自然の隣接配列の３つのアミノ酸を含む配列ＣＡＶＹ  ＹＣＡＶＰＤＰＤＡ  ＦＤＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；システインにはアンダーラインを引かれており、GenBank accession number CAA11829のアミノ酸配列のアミノ酸１１１−
１２５に先行する）を与えるペプチドが生成された。
【０１３２】
Ｂ細胞受容体としてＢＯ２Ｃ１１分子を発現するマウス株が作り出された。このようなマウスは、ミョウバン上に吸着されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のペプチドにより、１０日間の間隔で５０μｇを４度使用することで免疫性が与えられた。その後、マウスは放血され、直接結合ＥＬＩＳＡ分析法により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のペプチドを認識する抗体およびＢＯ２Ｃ１１抗体の存在に関してテストされた。ＳＥＱ  ＩＤ  １０のペプチドまたはＢＯ２Ｃ１１抗体のいずれかに対する高濃度の抗体が検出される。
【０１３３】
さらに、循環Ｂ細胞、脾臓Ｂ細胞および骨髄Ｂ細胞上のＢＯ２Ｃ１１  ＢＣＲの存在が、抗ヒトＦｃガンマ抗体を使用してＦＡＣＳによって評価された。ＳＥＱ  ＩＤ  １１のペプチドで免疫性が与えられたマウスは、循環、脾臓または骨髄において遺伝子組み換えＢＣＲを発現するＢ細胞を有していないということが示される。
【０１３４】
抗体のＶＨ領域に由来し隣接残基内にシステインを含むクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを包含するペプチドの投与により、ターゲット抗体、およびそのような抗体を生成するＢ細胞が除去されるということが結論付けられた。
【実施例６】
【０１３５】
抗Ｔ細胞受容体抗体
病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、アレルギーおよび自己免疫性疾患を含む多くの病理の重要な要素として考えられる。このような細胞はＢ細胞が抗体を生成するのを支援するようサイトカインを生成し、完全な活性化およびエフェクター機能の獲得のためにＣＤ８＋Ｔ細胞３９に支援を提供する。したがって、具体的に病原性のＣＤ４＋Ｔ細胞を除去することが実現可能であろう方法が非常に望ましい。
【０１３６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞のアルファ・ベータＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、重鎖および軽鎖内の可変部分を含む。このような可変部分は、本発明の範囲の内で用いられ得るクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを包含する。
【０１３７】
クローンＧ１２１は、ヤケヒョウヒダニ（Dermatophagus pteronyssinus）のアレルゲ
ンＤｅｒ  ｐ２に対して生成されるＣＤ４＋Ｔ細胞である。ＴＣＲのＶＨ領域は、Ｇ１２１  ＴＣＲ  ＶＨ領域のアミノ酸１０６〜１１４に対応するＶＹＦＣＡＳＳＥＲ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：１２）という配列のクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含む。この配列は、ＶＨのＣＤＲ３領域に属するカルボキシ末端にて５個のアミノ酸を含む。
【０１３８】
隣接残基の配列の検査では、エピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端上のいずれかにおいて６個のアミノ酸配列においてシステインを同定しなかった。システイン残基が位置Ｐ−４に加えられ、カルボキシ末端の自然の隣接配列の３つのアミノ酸を含む配列ＣＱＴＡ  ＶＹＦＣＡＳＳＥＲ  ＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、システインにはアン
ダーラインが引かれている）を与えたペプチドが生成された。
【０１３９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスには、抗体由来のＴ細胞エピトープについて、実施例５において記載されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３のペプチドで免疫性が与えられた。Ｇ１２１  ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンはＣＦＳＥで標識付けされ、１マウス当たり２００，０００個の細胞を尾静脈において注入することによって、免疫性が与えられたマウスに投与された。細胞投与の１日後、マウスは殺され、ＦＡＣＳ分析によって、ＣＦＳＥ標識付けされたＧ１２１クローンの存在が末梢血および脾臓において検出された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のペプチドで免疫性が与えられたマウスは、末梢血または脾臓のいずれかにおいて残余のＧ１２１細胞を有していないことが示される。免疫性を有していないマウスで行なわれた対照実験は、脾臓におけるＣＦＳＥ標識付Ｇ１２１細胞を示す。さらに、免疫性が与えられたマウスの血清は、Ｆａｃｓ分析によって同定される場合、Ｇ１２１  ＴＣＲに対する抗体を含む。Ｆａｃｓ分析では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３のペプチドで免疫性が与えられたマウスの血清の稀釈液でＧ１２１細胞がまずインキュベートされ、洗浄され、さらにＦＩＴＣ標識付抗マウスＦｃガンマ抗体とともにインキュベートされる。
【０１４０】
ＴＣＲの可変領域に位置するクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを包含するペプチドでの免疫処置により、対応するエピトープ、すなわちＧ１２１クローンを担持する細胞を除去するのに十分である抗体応答が誘発されると結論される。
【実施例７】
【０１４１】
ＡＬＫ＋腫瘍
実施例２において報告された実験は、隣接残基において単一のシステインを含むＡＬＫのクラスＩＩ拘束エピトープを包含するペプチドでのマウスの直接的な免疫処置により、腫瘍成長の有意な遅延および腫瘍サイズの減少が得られたということを示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のペプチドは、クラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して活性化特性の増加を誘発した。このような前免疫のインヴィヴォ効果は、腫瘍細胞に対する細胞溶解性によるＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発に帰着された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、完全なエフェクター特性を得るようＣＤ４＋Ｔ細胞によって提供される補助を必要とするということは当技術において周知である。
【０１４２】
特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の増加が、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のペプチドによって例示されるように）隣接残基において単一のシステインを含むエピトープでの免疫処置による一次効果であったことを確認するために、投薬を受けていないＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＡＬＫのクラスＩＩ拘束エピトープへの暴露によって効果のあるエフェクター細胞に変換されたインヴィトロの実験をセットアップした。
【０１４３】
したがって、磁気ビーズ選別を使用して、投薬を受けていないＣＤ４＋Ｔ細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から分離された。細胞は、その自然または野生型（図ではｗｔ）配列においてＡＬＫタンパク質のアミノ酸１５４１−１５５５に対応する配列ＧＡＡ  ＥＧＧ  ＷＴＧＰＧＡＧＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のペプチドか、または単一のシステインがＡＬＫタンパク質の位置１５４４に加えられた配列ＣＧＧ  ＷＴＧＰＧＡＧＰＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）のペプチドが装填される同質遺伝子的な樹状細胞とともにインキュベートされた。
【０１４４】
いずれかのペプチドを２０μｇ使用する刺激の４サイクルの後に、細胞が洗浄され、抗原提示細胞として使用されるとともに１μΜまたは１０μΜのいずれかのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のペプチドが装填されたＴ細胞由来の脾細胞に対して５／１の比率で加えられた。
【０１４５】
図３は、トリチウム化チミジンの取り込みによって評価されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖速度が、単一のシステイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含むペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するよう使用された際に、著しく増加されたことを示す。
【０１４６】
以下の配列が本願において開示されており、配列リスティングに組み入れられる。
【０１４７】
【数２】
2018076329.tif 000005
【図１】
2018076329.tif 000006
【図２】
2018076329.tif 000007
【図３】
2018076329.tif 000008
【配列表】
2018076329000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月6日(2017.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９個と３０個との間のアミノ酸の長さを有する、非細胞溶解性ＣＤ４＋  Ｔ細胞を活性化可能な単離された免疫原性ペプチドを含む、感染症、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患および腫瘍からなる群から選択される疾患を治療または防止するための医薬組成物であって、
前記ペプチドは、
ａ）抗原性タンパク質の８個または９個のアミノ酸のＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープと、
ｂ）ａ）の前記８個または９個のアミノ酸エピトープ配列のｎ末端および／またはｃ末端側に存在し、システインジスルフィド架橋の一部ではない還元システイン残基を含む１個と６個との間のアミノ酸の配列とを含み、薬剤としての使用のために、前記１個と６個との間のアミノ酸の配列は、Ｃ−ｘｘ−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−ｘｘ−Ｃ酸化還元モチーフ配列を含まない、医薬組成物。
【請求項２】
部分ｂ）において規定される配列は、ただ１つのシステインを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
９個と２０個との間のアミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記エピトープ配列とシステイン残基との間にアミノ酸なしで、前記システイン残基は、Ｎ末端またはＣ末端方向に８個または９個のアミノ酸のエピトープに隣接して位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｔ細胞エピトープは感染因子または腫瘍関連抗原のＴ細胞エピトープである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2018076329000001.pdf