(57)【要約】【課題】本発明は、酵素を必要とせず、かつ高感度に標的物質を検出又は定量する方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】試料中の標的物質を検出する方法であって、（ｉ）標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程、（ｉｉ）洗浄する工程、（ｉｉｉ）過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、（ｉｖ）色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び（ｖ）呈色反応に基づいて標的物質の存在を判定する工程を含む、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的物質を検出する方法であって、
（ｉ）標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程、
（ｉｉ）標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
（ｉｖ）複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
（ｖ）試料中の呈色反応が標的物質を含まない陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
金ナノ粒子がカーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金ナノ粒子がマルチウォール型カーボンナノチューブに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料中の標的物質を定量する方法であって、
（ｉ）標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程、
（ｉｉ）標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
（ｉｖ）複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
（ｖ）試料中の呈色反応の強度を、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量する工程
を含む、方法。
【請求項５】
金ナノ粒子がカーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
金ナノ粒子がマルチウォール型カーボンナノチューブに結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体、
過酸化水素水、及び
色原性基質
を含む、標的物質を検出又は定量するためのキット。
【請求項８】
金ナノ粒子がカーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合している、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
金ナノ粒子がマルチウォール型カーボンナノチューブに結合している、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸、
標的物質に対する抗体を金ナノ粒子に結合させる試薬、
過酸化水素水、及び
色原性基質
を含む、標的物質を検出又は定量するためのキット。
【請求項１１】
カーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
マルチウォール型カーボンナノチューブをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質を検出又は定量する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原と抗体の反応を利用した測定法である免疫測定法は、高価な設備を必要としないことから、様々な分野で用いられている。例えば、医学分野では疾患の診断に利用されたり、食品分野では野菜の残留農薬の測定に使用されたりしている。免疫測定法の代表的なものとして、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）があり、インフルエンザウイルスの検出等に利用されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０８８３６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＥＬＩＳＡ法に代わる、新たな免疫測定法を提供することを目的とする。より具体的には、酵素を必要とせず、かつ高感度に標的物質を検出又は定量する方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、標的物質に対する抗体を金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）に結合させた複合体を用いることで、金ナノ粒子が有するペルオキシダーゼ様活性による過酸化水素（Ｈ２０２）下での色原性基質の呈色反応に基づき、高感度に標的物質を検出又は定量することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、試料中の標的物質を検出する方法であって、
（ｉ）標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程、
（ｉｉ）標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
（ｉｖ）複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
（ｖ）試料中の呈色反応が標的物質を含まない陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する工程
を含む、方法を提供する。
金ナノ粒子はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びグラフェン（Ｇｒ）から選択される担体に結合していてもよく、マルチウォール型カーボンナノチューブに結合していてもよい。
【０００７】
本発明は、試料中の標的物質を定量する方法であって、
（ｉ）標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程、
（ｉｉ）標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
（ｉｖ）複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
（ｖ）試料中の呈色反応の強度を、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量する工程
を含む、方法も提供する。
金ナノ粒子はカーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合していてもよく、マルチウォール型カーボンナノチューブに結合していてもよい。
【０００８】
本発明は、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体、
過酸化水素水、及び
色原性基質
を含む、標的物質を検出又は定量するためのキットも提供する。
金ナノ粒子はカーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合していてもよく、マルチウォール型カーボンナノチューブに結合していてもよい。
【０００９】
本発明は、テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸、
標的物質に対する抗体を金ナノ粒子に結合させる試薬、
過酸化水素水、及び
色原性基質
を含む、標的物質を検出又は定量するためのキットも提供する。
標的物質を検出又は定量するためのキットは、カーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体をさらに含んでもよい。標的物質を検出又は定量するためのキットは、マルチウォール型カーボンナノチューブをさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵素を必要とせず、かつ高感度に標的物質を検出又は定量する方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１で得られた（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体の、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）存在下における吸光度（図１（ａ））及びインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の濃度に対する吸光度（図１（ｂ））を示すグラフである。
【図２】インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の濃度に対する、実施例１で得られた（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ３Ｎ２抗体複合体の吸光度（図２（ａ））、従来のＥＬＩＳＡ法の吸光度（図２（ｂ））及びヒト血清中の（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ３Ｎ２抗体複合体の吸光度（図２（ｃ））を示すグラフである。
【図３】インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の濃度に対する、サンドイッチ法に適用した場合の実施例１で得られた（＋）ＡｕＮＰｓ−ＮＡ抗体複合体の吸光度（図３（ａ））及び従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の吸光度（図３（ｂ））を示すグラフである。
【図４】実施例２で得られたＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の透過電子顕微鏡像を示す写真であり、結合しているＡｕＮＰｓの粒子径が約６０ｎｍ（図４（Ｂ））、約４０ｎｍ（図４（Ｃ））、約２５ｎｍ（図４（Ｄ））、約１０ｎｍ（図４（Ｅ））であるＣＮＴを示す。図４（Ａ）はＡｕＮＰｓが結合していないＣＮＴ単体を示し、図４（Ｆ）は約３μｍの広いスケールで観察したＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を示す。
【図５】実施例２で得られたＨ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）存在下における吸光度（図５（ａ））及びインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）の濃度に対する吸光度（図５（ｂ））を示すグラフである。図５（ｂ）の黒丸はＨ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を用いた方法を表し、白丸は従来のＥＬＩＳＡ法を表す。
【図６】インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の濃度に対する、サンドイッチ法に適用した場合の実施例２で得られたＮＡ抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の吸光度（図６（ａ））及び従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の吸光度（図６（ｂ））を示すグラフである。
【図７】実施例３で得られたＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の、ＮｏＶ−ＬＰｓ存在下における吸光度（図７（ａ））及びＮｏＶ−ＬＰｓの濃度に対する吸光度（図７（ｂ））を示すグラフである。図７（ｂ）の黒丸はＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体を用いた方法を表し、黒四角は従来のＥＬＩＳＡ法を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の試料中の標的物質を検出又は定量する方法は、酵素標識した抗体に代えて抗体と金ナノ粒子を含む複合体を用いる点を除いて、既知のＥＬＩＳＡ法と同様の手法を利用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法の直接吸着法、サンドイッチ法及び競合法のいずれも利用可能であり、高感度の点からサンドイッチ法が好ましい。以下に、直接吸着法及びサンドイッチ法について具体的に説明する。
【００１３】
直接吸着法では、標的物質を固相に接触させて吸着させる。次に、固相のブロッキング処理を行う。次に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加して、固相に吸着させた標的物質に複合体を結合させる。次に標的物質に結合していない複合体を洗い流す。次に、過酸化水素及び色原性基質を添加する。次に、複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する。
標的物質を検出する方法では、標的物質を含まない陰性対照に対して同様の処理を行い、試料中の呈色反応が陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定することができる。陰性対照に対する処理及び陰性対照の呈色反応の強度の測定は、試料中の呈色反応の強度の測定と同時に行ってもよく、先に行ってもよく、後に行ってもよい。
標的物質を定量する方法では、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料に対して同様の処理を行い、試料中の呈色反応の強度を、複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量することができる。標準試料に対する処理及び標準試料の呈色反応の強度の測定は、試料中の呈色反応の強度の測定と同時に行ってもよく、先に行ってもよく、後に行ってもよい。
【００１４】
すなわち、一実施形態に係る、試料中の標的物質を検出する方法は、
試料を固相に接触させて吸着させる工程、
固相をブロッキングする工程、
ブロッキングした固相に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
試料中の呈色反応が標的物質を含まない陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する工程
を含む。
また、一実施形態に係る、試料中の標的物質を定量する方法は、
試料を固相に接触させて吸着させる工程、
固相をブロッキングする工程、
ブロッキングした固相に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
試料中の呈色反応の強度を、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量する工程
を含む。
【００１５】
サンドイッチ法では、標的物質に対する抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。捕獲抗体が認識するエピトープは、複合体における抗体が認識するエピトープとは異なる。次に固相のブロッキング処理を行う。ブロッキングした固相に、試料を添加する。次に、捕獲抗体と結合していない標的物質を洗浄する。次に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加して、捕獲抗体を介して固相に吸着させた標的物質に複合体を結合させる。その後の工程は、直接吸着法と同様である。
【００１６】
すなわち、一実施形態に係る、試料中の標的物質を検出する方法は、
標的物質に対する捕獲抗体が吸着した固相を準備する工程、
固相をブロッキングする工程、
ブロッキングした固相に、試料を添加する工程、
捕獲抗体と結合していない標的物質を洗浄する工程、
固相に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
試料中の呈色反応が標的物質を含まない陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する工程
を含む。
また、一実施形態に係る、試料中の標的物質を定量する方法は、
標的物質に対する捕獲抗体が吸着した固相を準備する工程、
固相をブロッキングする工程、
ブロッキングした固相に、試料を添加する工程、
捕獲抗体と結合していない標的物質を洗浄する工程、
固相に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の試料に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する工程、及び
試料中の呈色反応の強度を、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量する工程
を含む。
【００１７】
（標的物質及び標的物質に対する抗体）
標的物質としては、特に限定されず、抗原となる物質であればよい。例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、化学物質、ホルモン、ウイルス等が挙げられる。抗体は、これらの抗原と特異的に結合するものを用いる。
標的物質に対する抗体とは、標的物質を認識する抗体のみならず、標的物質を認識する抗体（一次抗体）を認識する抗体（二次抗体）も意味する。標的物質に対する抗体を二次抗体として用いる場合には、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を試料に添加する工程の前に、標的物質を認識する一次抗体を試料に添加する工程を行う。一次抗体を試料に添加する工程に続けて、標的物質に結合していない一次抗体を洗浄する工程を行ってもよい。
検出又は定量対象である標的物質は、液体中に存在していてもよく、固体、粉末、流動体、気体等の試料中に存在していてもよい。本実施形態に係る、試料中の標的物質を検出又は定量する方法は、液体中で実施することが好ましい。このため、試料が液体以外である場合には、適切なバッファー等に試料を溶解又は懸濁し、液体にすることが好ましい。
例えば、ヒトにおけるウイルス等の感染の診断に利用する場合には、感染が疑われるヒトから採取した血液及び粘膜等を試料とし、試料中の標的物質であるウイルス等を検出又は定量する方法とすることができる。特異的な抗体を用いて診断される代表的なウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、及び肝炎ウイルス等が挙げられる。ウイルスが標的物質である場合、ウイルスの表面抗原に対する抗体を標的物質に対する抗体として利用し得る。既知のウイルスの表面抗原を利用することができ、例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ノロウイルスのＧｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩおよびＧｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩ等が挙げられる。
【００１８】
（金ナノ粒子）
金ナノ粒子は、ナノオーダーの粒径を有する金粒子を意味する。
金ナノ粒子の粒径の下限値は、特に限定されないが、１ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ及び２０ｎｍであってよい。金ナノ粒子の粒径の上限値は、特に限定されないが、１０ｎｍ、２０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、７０ｎｍ及び１００ｎｍであってよい。金ナノ粒子の粒径が小さい程、検出感度が高くなる傾向がある。
金ナノ粒子は、例えば、テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸を還元剤で還元して調製することができる。還元剤として、水素化ホウ素ナトリウム、クエン酸、タンニン酸、没食子酸、イソフラボン等が挙げられる。
【００１９】
（金ナノ粒子の帯電）
一実施形態において、金ナノ粒子は、帯電させて用いることができる。帯電させることで、金ナノ粒子のペルオキシダーゼ様活性を向上させることができる。帯電は正電荷でも負電荷でもよいが、金ナノ粒子を担体と結合させず単体で用いる場合には、正電荷が好ましい。カーボンナノチューブ又はグラフェンを用いる場合には、正電荷でも負電荷でもよい。
正電荷を有する金ナノ粒子を作成する方法は、例えば、システアミン等のチオール基及びアミノ基を有する化合物の存在下でテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸を還元する方法（Jv et al.,2010, Chem Commun 46, 8017-8019）が挙げられる。負電荷を有する金ナノ粒子を作成する方法は、例えば、８−メルカプトオクタン酸等のチオール基及びカルボキシ基を有する化合物の存在下でテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸を還元する方法が挙げられる。これらの方法等により、化学的に構造を変化させることにより金ナノ粒子を帯電させた場合、金ナノ粒子は正電荷又は負電荷を有したまま安定的に保存できる。
【００２０】
（抗体と金ナノ粒子を含む複合体）
標的物質に対する抗体を金ナノ粒子又は担体に結合している金ナノ粒子に結合させる方法は、例えば、金ナノ粒子の表面にアミノ基、カルボキシ基、チオール基等の官能基を導入し、抗体を結合することができる。反応に際し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等の縮合剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等のカルボン酸の活性化試薬、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等の架橋剤を用いてもよい。金ナノ粒子の表面に官能基を導入する方法としては、例えば、上述したようなアミノ基又はカルボキシ基を有するチオール化合物の存在下でテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸を還元する方法が挙げられる。使用する抗体の種類に応じて、カルボキシ基、アミノ基、チオール基等の官能基を適宜選択することができる。また、金ナノ粒子が正電荷を有する場合には、静電気的作用により抗体と結合させることもできる。
【００２１】
（担体に結合した金ナノ粒子）
標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体において、金ナノ粒子は担体と結合していてもよい。担体に結合した金ナノ粒子は、金ナノ粒子単体よりもペルオキシダーゼ様活性が向上し、より高感度に標的物質を検出又は定量することができる。金ナノ粒子に結合させる担体は、例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン等が挙げられる。カーボンナノチューブとして、シングルウォール型カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、マルチウォール型カーボンナノチューブ等のいずれの種類のカーボンナノチューブを用いることができ、マルチウォール型カーボンナノチューブを用いることが好ましい。
【００２２】
金ナノ粒子を担体に結合させる方法は特に限定されず、従来の方法（Ahmed etal., 2015, Biosens Bioelectron. 75, 181-187）によって金ナノ粒子を担体に結合させることもできるが、還元剤を用いてワンステップで行うこともできる。還元剤としては、例えばギ酸ナトリウム、Ｌ−リンゴ酸ナトリウム、及びトリエタノールアミン等を用いることができるが、ギ酸ナトリウムを用いることが好ましい。還元剤としてギ酸ナトリウムを使用すると、特殊な処理をすることなく、担体表面に金ナノ粒子を結合させることができる。すなわち、従来の金ナノ粒子−担体ハイブリッドを作成するために必要とされていた、担体の酸による前処理、安定化剤の添加等が不要である。
ギ酸ナトリウムを用いてワンステップで金ナノ粒子を担体に結合させる方法は、例えば、テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸と担体を混合する工程、及び得られる混合物にギ酸ナトリウムを添加する工程を含むことができる。添加するギ酸ナトリウムの濃度の下限値は特に限定されないが、例えば１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ及び５００ｍＭとすることができる。また、添加するギ酸ナトリウムの濃度の上限値は特に限定されないが、例えば５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ及び１Ｍとすることができる。
【００２３】
（色原性基質）
本発明の標的物質を検出又は定量において、色原性基質の酸化による呈色反応が利用される。色原性基質は、酸化されて呈色性となる色素であれば特に限定されない。色原性基質として、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）が挙げられ、高感度の点からＴＭＢが好ましい。例えば、ＴＭＢは酸化されることにより青色を呈する。
【００２４】
（標的物質又は捕獲抗体の固相への固定化）
標的物質又は捕獲抗体を固定化させる固相は、通常のＥＬＩＳＡ法に用いられている固相、例えば、ポリスチレン製、ポリエチレン製、及びポリプロピレン製等のプレート等が利用可能である。また、通常のイムノクロマト法に用いられている固相、例えば、ニトロセルロース膜等のメンブレンも利用可能である。標的物質又は捕獲抗体を固相に固定化させる方法は、常法により行うことができる。例えば、標的物質又は捕獲抗体を含む溶液を固相に添加し、所定時間インキュベートすることにより固相に標的物質又は捕獲抗体を吸着させる方法、及び標的物質又は捕獲抗体を含む溶液を固相に塗布し、乾燥することにより固相に標的物質又は捕獲抗体を固定化する方法が挙げられる。
【００２５】
（ブロッキング）
固相のブロッキング処理は、スキムミルク、アルブミン又は動物血清などを用いて、室温にて３０分〜２時間又は４℃にて２４時間の条件下で行うことができる。ブロッキング処理により、標的物質に対する抗体の固相への非特異的な結合を抑えることができる。
【００２６】
（インキュベーション）
標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程の後、洗浄工程の前に、適宜インキュベーションを行ってよい。インキュベーションにより、試料中に標的物質が存在する場合には、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体と、標的物質が結合する。インキュベーションは、例えば、４〜３７℃で３０分〜２４時間行うことができる。
【００２７】
（洗浄工程）
標的物質に結合していない複合体を洗浄することで、標的物質に結合していない複合体による呈色反応への影響を減少させ、測定工程におけるバックグラウンドの上昇を抑えることができる。洗浄工程に用いる洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と非イオン性界面活性剤（ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテルポリソルベート、又はポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルなど）を含むバッファーが挙げられる。また、洗浄は複数回行ってもよい。
【００２８】
（呈色反応）
色原性基質の呈色反応は、例えば、室温にて５〜３０分間反応させればよい。所定の反応時間経過後に反応停止液を添加して、反応を確実に停止させ、それにより再現性よく測定を行うこともできる。反応停止液は、塩酸、硫酸等の酸が挙げられる。反応停止液の添加により、色原性基質の色がさらに変化することもあり、その場合、変化後の呈色反応を測定する。例えば、ＴＭＢは酸化により青色を呈するが、反応停止液として硫酸を添加すると、黄色に変化する。この場合、黄色への呈色反応を測定する。
【００２９】
（判定工程）
本発明の試料中の標的物質を検出する方法において、試料中の呈色反応が陰性対象の呈色反応よりも強いか否かの判断は、肉眼で観察することにより行っても、機器を用いて行ってもよい。肉眼で観察する場合には、例えば、試料及び陰性対象の色を比較し、試料の色が陰性対象の色強度が強い場合に試料中に標的物質が存在すると判定してもよい。また、例えば、標的物質が存在する試料及び陰性対象の色見本を予め準備し、陰性対象の色見本よりも標的物質が存在する試料の色見本に近い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定してもよい。機器を用いる場合には、例えば、分光光度計等により吸光度を測定し、陰性対象の呈色反応との吸光度の値の差が一定以上の場合に、試料中に標的物質が存在すると判定してもよい。また、例えば、陰性対象の吸光度に基づき予め設定しておいた吸光度以上の場合に、試料中に標的物質が存在すると判定してもよい。
【００３０】
（定量工程）
本発明の試料中の標的物質を定量する方法において、複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を測定する方法は、特に限定されず、肉眼で観察することにより行ってもよいが、分光光度計等の機器により吸光度を測定することによる方法が一般的である。
試料中の標的物質を定量は、複数の標準試料中の呈色反応の吸光度と比較することにより、試料中の標的物質の存在量を求めることにより行われる。例えば、異なる濃度の標的物質を有する複数の標準試料中の呈色反応の吸光度を測定し、予め検量線を作成しておき、測定した試料の呈色反応の吸光度をこの検量線にあてはめることにより、試料中の標的物質の濃度を求めることができる。
【００３１】
一実施形態において、標的物質を検出又は定量するためのキットは、以下の要素を含む：
標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体、
過酸化水素水、及び
色原性基質。
標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体が既に用意されているため、使用者は自ら複合体を作製することなく、標的物質を検出又は定量することができるため便利である。金ナノ粒子は、カーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体に結合していてもよく、マルチウォール型カーボンナノチューブに結合していてもよい。キットは、ブロッキング剤、洗浄剤、反応停止剤等をさらに含んでいてもよい。直接吸着法用のキットは、標的物質を吸着させる固相をさらに含んでいてもよく、サンドイッチ法用のキットは、捕獲抗体を吸着させた固相をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
別の実施形態において、標的物質を検出又は定量するためのキットは、以下の要素を含む：
テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸、
標的物質に対する抗体を金ナノ粒子に結合させる試薬、
過酸化水素水、及び
色原性基質。
標的物質を検出又は定量する際に、使用者は、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を結合させて複合体を自ら作製する。この場合、標的物質に対する抗体を自由に選択することができるという利点がある。標的物質に対する抗体を金ナノ粒子に結合させる試薬には、還元剤、縮合剤、カルボン酸の活性化試薬、架橋剤及びアミノ基又はカルボキシ基を有するチオール化合物等が含まれる。キットは、カーボンナノチューブ及びグラフェンから選択される担体をさらに含んでいてもよく、マルチウォール型カーボンナノチューブをさらに含んでいてもよい。使用者は、標的物質に対する抗体、金ナノ粒子及び担体を含む複合体を自ら作製する。キットは、ブロッキング剤、洗浄剤、反応停止剤等をさらに含んでいてもよい。直接吸着法用のキットは、標的物質を吸着させる固相をさらに含んでいてもよく、サンドイッチ法用のキットは、捕獲抗体を吸着させる固相をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の試料中の標的物質を検出又は定量する方法は、酵素標識した抗体に代えて抗体と金ナノ粒子を含む複合体を用いて、既知のイムノブロッティング法を利用することもできる。
イムノブロッティング法では、標的物質を電気泳動により分離する。次に、分離した標的物質を膜に転写する。次に、膜のブロッキング処理を行う。次に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加して、膜に転写させた標的物質に複合体を結合させる。次に、標的物質に結合していない複合体を洗い流す。次に、過酸化水素及び色原性基質を添加する。複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応により、膜に転写された標的物質周辺が呈色する。次に、標的物質周辺の呈色反応の強度を測定する。
標的物質を検出する方法では、標的物質を含まない陰性対照に対して同様の処理を行い、試料の呈色反応が陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定することができる。
標的物質を定量する方法では、既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料に対して同様の処理を行い、試料の呈色反応の強度を、複数の標準試料の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量することができる。
【００３４】
すなわち、一実施形態に係る、試料中の標的物質を検出する方法は、
試料及び標的物質を含まない陰性対照を電気泳動により分離する工程、
分離した試料及び標的物質を含まない陰性対照を膜に転写する工程、
膜をブロッキングする工程、
ブロッキングした膜に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の膜に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を、試料及び陰性対照のそれぞれで測定する工程、及び
試料の呈色反応が陰性対照の呈色反応よりも強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する工程
を含む。
また、一実施形態に係る、試料中の標的物質を定量する方法は、
試料及び標的物質を含まない陰性対照を電気泳動により分離する工程、
分離した試料及び標的物質を含まない陰性対照を膜に転写する工程、
膜をブロッキングする工程、
ブロッキングした膜に、標的物質に対する抗体と金ナノ粒子を含む複合体を添加する工程、
標的物質に結合していない複合体を洗浄する工程、
洗浄後の膜に、過酸化水素及び色原性基質を添加する工程、
複合体及び過酸化水素によって酸化される色原性基質の呈色反応の強度を、試料及び標準試料のそれぞれで測定する工程、及び
試料の呈色反応の強度を、複数の標準試料中の呈色反応の強度と比較して、試料中の標的物質を定量する工程
を含む。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて、本発明について説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１  正電荷を有する金ナノ粒子を用いたインフルエンザウイルスの検出）
１．正電荷を有する金ナノ粒子（（＋）ＡｕＮＰｓ）の合成
システアミン溶液（４００μＬ，２１３ｍＭ，シグマ  アルドリッチ社）をテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸・３水和物（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ，４０ｍＬ，１．４２ｍＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）に加えた。２５℃で２０分間撹拌した後、ＮａＢＨ４溶液（１０μＬ，１０ｍＭ，和光純薬社）を加え、暗条件下において２５℃で１０分間激しく撹拌した。その後混合物をさらに１５分間撹拌し、得られたワインレッド色の溶液を４℃で保存した。
【００３７】
２．（＋）ＡｕＮＰｓの特性評価
紫外可視光分光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ５００，Ｔｅｃａｎ社）を用いて、合成した（＋）ＡｕＮＰｓのＵＶ／ｖｉｓ吸収測定を行ったところ、（＋）ＡｕＮＰｓ溶液の吸光度は、５２６ｎｍでピークが得られた。また、ＡｕＮＰｓの濃度をＨａｉｓｓ法（Haiss et al., 2007, Anal Chem 79: 4215-5221）により算出したところ、３．５×１０−１０Ｍであった。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像は、ＴＥＭ  ＪＥＭ−２１００Ｆ（ＪＥＯＬ社）を１００ｋＶで操作して生成した。透過電子顕微鏡像により、（＋）ＡｕＮＰｓの平均粒子径が３５ｎｍであることが分かった。
【００３８】
３．ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）抗体結合（＋）ＡｕＮＰｓの作製
合成した（＋）ＡｕＮＰｓ溶液を５，０００ｒｐｍで３０分間超遠心（Ｋｕｂｏｔａ６２００，久保田商事（株））して、上清を分離した。その後、（＋）ＡｕＮＰｓを超純水で分散させた。１ｍＬの合成した（＋）ＡｕＮＰｓ溶液及び１ｍＬのＨＡ抗体（Ａｂ６６１８９，Ａｂｃａｍ社，最終濃度５ｎｇｍＬ−１）を、３０分間インキュベートし、４℃で２４時間維持した。この段階で、静電気的相互作用によりＡｕＮＰｓは抗体と結合していた。結合した（＋）ＡｕＮＰｓ及び抗体を、５，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離し、１ｍＬの超純水に再分散させた。
【００３９】
抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）が（＋）ＡｕＮＰｓに結合していることを金ナノビーズベースＥＬＩＳＡ試験により確認した。サンプルを１００μｌの２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて２５℃で２時間ブロッキングした。１ｎｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を各サンプルに添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で三回洗浄した。ＨＲＰを１００μLのＴＭＢ基質溶液（１０μｇ／ｍＬ  ＴＭＢ，１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ中の１０％Ｈ２Ｏ２，ｐＨ６．０，Ｄｏｊｉｎｄｏ社）と２５℃で５〜３０分間反応させた。この段階では青色の溶液となった。１００μＬの１０％Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させると、溶液の色は黄色となった。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてその溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗体と結合させた（＋）ＡｕＮＰｓの方が、（＋）ＡｕＮＰｓ単体よりも約１０倍高い吸光度がＵＶスペクトルにおいて観察されたことから、（＋）ＡｕＮＰｓが抗体に結合していることが確認された。
【００４０】
抗体が（＋）ＡｕＮＰｓに結合していることをゼータ電位分析により確認した。表面の電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ−ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いて測定した。抗体と結合させた（＋）ＡｕＮＰｓの表面のゼータ電位（ｍＶ）（＋２９．３）が、（＋）ＡｕＮＰｓ単体の表面のゼータ電位（＋３４．５）から変化したことからも、（＋）ＡｕＮＰｓが抗体に結合していることが示された。
以下、ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）抗体に結合した（＋）ＡｕＮＰｓを、「（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体」とも表す。
【００４１】
４．（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体の活性の確認
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体の含まれる溶液の色は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加した数秒後に濃い青色に呈色した。一方、Ｈ１Ｎ１抗体のみが含まれる溶液では、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加してもすぐに色は変化せず、最終的に非常に薄い青色となった。このことから、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体のペルオキシダーゼ様活性が確認された。
【００４２】
５．抗原−抗体反応によるインフルエンザウイルスの検出
ウイルスストック溶液（インフルエンザウイルスＡ，Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９，Ｈ１Ｎ１型，Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を、センシング実験のためにｐＨ７．５のＰＢＳで段階的に希釈した。１００μＬのウイルス溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ポリスチレン製，平底，非滅菌，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社）の各ウェルに添加し、４℃にてオーバーナイトでインキュベートして、ウイルスをプレートに吸着させた。その後プレートをｐＨ７．５のＰＢＳでリンスし、１００μＬの２％スキムミルクを用いて２５℃で２時間ブロッキングした。１ｎｇ／ｍＬの抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）に結合した（＋）ＡｕＮＰｓを、血清で吸着済みのウェルに添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＢＳＡ（１ｎｇ／ｍＬ）をネガティブコントロールとして、１００μＬのインフルエンザウイルスＡ（１ｎｇ／ｍＬ，Ｙｏｋｏｈａｍａ／１１０／２００９，Ｈ３Ｎ２型）を選択性を証明するためのコントロールとして用いた。３回の洗浄後、ＴＭＢ（２ｎＭ）及びＨ２Ｏ２（５ｎＭ）の混合溶液１００μＬを各ウェルに添加した。その後プレートを２５℃で１分間インキュベートした。１００μＬの１０％Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、反応を停止させた。その溶液のマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。異なる濃度のインフルエンザウイルスＡ（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９，Ｈ１Ｎ１型）に対する吸光度値に基づき、用量依存曲線を構築した。検出限界（ＬＯＤ）は標準偏差法（Apostol et al., 2009, Anal Biochem 385: 101-106）に基づいて算出した。なお、上記で用いた抗ＨＡ（Ｈ１Ｎ１）抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）のインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１型）に対する特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認済である。
【００４３】
６．（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体によるウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の検出
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体のペルオキシダーゼ様活性を利用した、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の検出を検討した。検出システムの選択性を、以下の４つの異なる混合成分を用いて評価した。
ａ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ１Ｎ１抗体）結合（＋）ＡｕＮＰｓ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｂ）標的ウイルス／非特異的抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体，Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）結合（＋）ＡｕＮＰｓ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｃ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ１Ｎ１抗体）結合（＋）ＡｕＮＰｓ／Ｈ２Ｏ２、
ｄ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ１Ｎ１抗体）結合（＋）ＡｕＮＰｓ／ＴＭＢ。
ａ）の溶液は、標的ウイルス及び特異的抗体結合（＋）ＡｕＮＰｓの存在下で、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加すると、濃い青色を呈し、６５５ｎｍで吸光度のピークが得られた（図１（ａ））。ｂ）〜ｄ）の溶液では、特徴的なピークは観察されなかった。これにより、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体を用いたインフルエンザウイルスの検出方法が、非常に高い特異性を示し、ＴＭＢ及びＨ２Ｏ２存在下で呈色反応を示すことが確認された。
【００４４】
７．ウイルス（Ｈ１Ｎ１型）濃度と（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体による検出の関係
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体のペルオキシダーゼ様活性による特徴的な呈色反応の吸光度と、標的ウイルスであるインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の濃度との関係について調べた。その結果、ウイルス濃度が１０ｐｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲において、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図１（ｂ））。なお、検出限界は１０．７９ｐｇ／ｍＬと算出された。一方、ＢＳＡを用いた場合及び特異的な関係にないインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）を用いた場合には、顕著な呈色反応は確認されなかった。
【００４５】
８．Ｈ３Ｎ２抗体結合（＋）ＡｕＮＰｓの作製
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体と同様の方法により、（＋）ＡｕＮＰｓ−ＨＡＨ３Ｎ２抗体複合体を作製した。Ｈ３Ｎ２抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）と（＋）ＡｕＮＰｓの結合を金ナノビーズベースＥＬＩＳＡ試験により確認したところ、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体は、（＋）ＡｕＮＰｓ単体と比較して約６倍高い吸光度を示し、Ｈ３Ｎ２抗体と（＋）ＡｕＮＰｓの結合が確認された。なお、抗ＨＡ（Ｈ３Ｎ２）抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）のインフルエンザウイルスＡ（Ｈ３Ｎ２型）に対する特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認済である。
【００４６】
９．ウイルス（Ｈ３Ｎ２型）濃度と（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ３Ｎ２抗体複合体による検出の関係
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体と同様に、呈色反応の吸光度と、標的ウイルスであるインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の濃度との関係について調べた。インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）をインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）、Ｈ１Ｎ１型に対する特異的抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）をＨ３Ｎ２型に対する特異的抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）に変更し、Ｈ１Ｎ１抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）はコントロールとして用いた。
その結果、ウイルス濃度が１０から５０，０００ＰＦＵ／ｍＬの範囲において、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図２（ａ））。なお、検出限界は１１．６２ＰＦＵ／ｍＬと算出された。一方、ＢＳＡを用いた場合及び特異的な関係にないインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を用いた場合には、顕著な呈色反応は確認されなかった。
【００４７】
また、上記結果を、従来のＥＬＩＳＡ法及び市販のインフルエンザ診断キット（ＩｍｍｕｎｏＡｃｅ  Ｆｌｕ，ＴＡＵＮＳ  Ｌａｂ社）の結果と比較した。従来のＥＬＩＳＡ法では、ウイルス濃度が１０００ＰＦＵ／ｍＬとなる付近から、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図２（ｂ））。市販のインフルエンザ診断キットを用いた場合には、ウイルス濃度が５０００ＰＦＵｍＬ−１となる付近から、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（Ahmed et al., 2014, Biosens Bioelectron 58: 33-39）。これにより、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ３Ｎ２抗体複合体を用いた場合の検出感度が、従来のＥＬＩＳＡ法よりも１００倍以上感度が高く、市販のインフルエンザ診断キットよりも５００倍以上感度が高いことが示された。
【００４８】
さらに、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）がヒト血清中（１ｄＬ中に鉄  ３５−１８０ｇ，コレステロール  １１０−２１０ｍｇ，トリグリセリド  ３０−１７５ｍｇ，グルコース  ６０−１４０ｍｇ，エンドトキシンレベル＜１０ＥＵ及びヘモグロビン＜２０ｍｇを含む，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）にある場合にも、検出が確認されるウイルス濃度が高くなる以外は、同様の結果が示された（図２（ｃ））。検出が確認されたウイルス濃度の吸光度は５０ＰＦＵ／ｍＬと顕著に低く、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ３Ｎ２抗体複合体を用いた検出方法の信頼性の高さが示された。
【００４９】
１０．（＋）ＡｕＮＰｓ−ＮＡ抗体複合体のウイルス（Ｈ１Ｎ１型）のサンドイッチ法への応用
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体と同様の方法により、（＋）ＡｕＮＰｓとインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１型）に対するＮＡ抗体（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の複合体を調製した。
インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、４℃でオーバーナイトでインキュベートして、抗体をプレートに吸着させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、１００μＬのスキムミルクを用いて２５℃で１時間ブロッキングした。５０μＬのインフルエンザウイルスＡ（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９，Ｈ１Ｎ１型）を、ウェルに添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、５０μＬの抗体（ＮＡ抗体）に結合した（＋）ＡｕＮＰｓを、ウェルに添加し、プレートを２５℃で１時間インキュベートした。５０μＬのＢＳＡ（１ｎｇｍＬ−１）をネガティブコントロールとして、５０μＬのインフルエンザウイルスＡ（Ｈ３Ｎ２型）を選択性を証明するためのコントロールとして用いた。３回の洗浄後、ＴＭＢ（２ｎＭ）及びＨ２Ｏ２（５ｎＭ）の混合溶液５０μＬを各ウェルに添加した。その後プレートを２５℃で１０分間インキュベートした。５０μＬの１０％Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、反応を停止させた。その溶液のマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。異なる濃度のインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１型）に対する吸光度値に基づき、用量依存曲線を構築した。比較対象として、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法による検出、すなわち、ＮＡ抗体と（＋）ＡｕＮＰｓの複合体に代えて、ＨＲＰ標識ＮＡ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１型）の検出も行った。なお、上記で用いた抗ＮＡ抗体のインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１型）に対する特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認済である。また、抗ＮＡ抗体と（＋）ＡｕＮＰｓの結合も、金ナノビーズベースＥＬＩＳＡ試験及びゼータ電位分析により確認済である。
【００５０】
（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ１Ｎ１抗体複合体と同様の方法により、呈色反応の吸光度と、標的ウイルスであるインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の濃度との関係について調べた。その結果、ウイルス濃度が１０ｐｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲において、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図３（ｂ））。なお、検出限界は１０．７９ｐｇ／ｍＬと算出された。
【００５１】
また、上記の結果を、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果と比較した。従来のＥＬＩＳＡ法では、ウイルス濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなる付近から、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図３（ａ））。これにより、（＋）ＡｕＮＰｓ−のＨ１Ｎ１抗体複合体を用いた場合の検出感度が、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法よりも１０００倍以上高いことが示された。
【００５２】
（実施例２  金ナノ粒子−カーボンナノチューブ複合体を用いたインフルエンザウイルスの検出）
１．金ナノ粒子−カーボンナノチューブ複合体（ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体）の合成
ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体は、ワンステップ調製により以下のように調製した。
１ｍＬの２０ｍＭテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸・３水和物（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及び２ｍｇのマルチウォール型カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を５分間混合した。続いて混合液に２ｍＬの２００−５００ｍＭ  ギ酸ナトリウム（和光純薬（株））を加え、室温で維持した。表面のエッチングにより、ＨＡｕＣｌ４が水性媒体中のＭＷＣＮＴｓの分散を促進し、ギ酸ナトリウムがＣＮＴ表面に付着した金イオンを還元させ、ナノ構造の形成が促進された。
【００５３】
２．ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の特性評価
合成したＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の形態を観察した。ＴＥＭ像の生成及びナノ構造フィルムのＵＶ／ｖｉｓ吸収測定は、実施例１と同様の方法により行った。図４（Ａ）はＣＮＴ単体の形態を示す。合成に用いられたギ酸ナトリウムの濃度により、異なるサイズの金ナノ粒子及びナノクラスターが、ＣＮＴ表面に分布していた。ギ酸ナトリウムの濃度が２００ｍＭの場合には、約６０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子（図４（Ｂ））、ギ酸ナトリウムの濃度が３００ｍＭの場合には、約４０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子（図４（Ｃ））、ギ酸ナトリウムの濃度が４００ｍＭの場合には、約２５ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子（図４（Ｄ））、ギ酸ナトリウムの濃度が５００ｍＭの場合には、約１０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子（図４（Ｅ））がそれぞれ付着していた。これは、合成に用いるギ酸ナトリウムの濃度によって、付着する金ナノ粒子の粒子径を調整し得ることを意味する。また、この方法により精製したＣＮＴは、表面の広いエリアにおいて、金ナノ粒子及びナノクラスターが分布していた（図４（Ｆ））。この実施例２においては、約１０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子を用いて以下実験を行った。
【００５４】
３．ＨＡ抗体（Ｈ３Ｎ２）結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴの作製
合成したＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ溶液（１μｇ／ｍＬ）１ｍＬ、４ｍＭの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を混合し、１０分間インキュベートした。その後、１μＬのＨ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を添加した。溶液を４℃で８時間撹拌した。遠心分離により上清及び結合していない抗体を除去し、Ｈ３Ｎ２抗体と結合したＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体（以下、「Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体」とも表す）を１ｍＬの超純水に再分散させた。Ｈ３Ｎ２抗体とＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体は、アミド結合により結合する。ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴとＨ３Ｎ２抗体が結合していることを、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ分光光度計，ＦＴ／ＩＲ６３００，ＪＡＳＣＯ（株））を用いて確認した。
【００５５】
４．ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の分散性及び酵素活性
ＣＮＴの表面に金ナノ粒子が蓄積したことで、ＣＮＴの水性溶媒における分散性は顕著に向上した。ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体は、安定かつ１分以内に水によく分散した懸濁液を形成し、フロックも形成した。一方、ＣＮＴ単体は、水性溶媒への分散性は劣っていた。
また、ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様の活性を調べた。ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体の含まれる溶液の色は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加した数秒後に濃い青色に呈色し、ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様活性が確認された。一方、ＣＮＴ単体を含む溶液及び金ナノ粒子単体を含む溶液は、長時間経過しても薄い青色のままであった。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２を添加した後のＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を含む溶液の吸光度は、ＣＮＴ単体を含む溶液の吸光度の約６倍、金ナノ粒子単体を含む溶液の吸光度の約３倍高かった。これにより、金ナノ粒子をＣＮＴのハイブリッド構造に加えることで、Ｈ２Ｏ２によるＴＭＢの触媒による酸化を高めることが示された。
【００５６】
ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様活性を最大とする最適な条件について検討したところ、最適な溶媒はＰＢＳであり、最適なｐＨはｐＨ７．５であり、最適な反応濃度は２５℃であり、５分以内に最大のペルオキシダーゼ様活性が確認されることが分かった。また、ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様活性を最大にするには、Ｈ２Ｏ２とＴＭＢの比率は２：１が好ましいことが分かった。
【００５７】
４．抗原−抗体反応によるインフルエンザウイルスの検出
インフルエンザウイルスＡ（Ｙｏｋｏｈａｍａ／１１０／２００９，Ｈ３Ｎ２型）のウイルスストック溶液（８×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）をヒト血清で希釈したものを用いた点、血清吸着済みウェルに添加したのが５０μＬのＨ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体（１ｎｇ／ｍＬ）である点、ＢＳＡ（１００μＬ，１ｎｇ／ｍＬ）及びインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１型，１００μＬ，１μｇ／ｍＬ）をネガティブコントロールとして用いた点、ＴＭＢ（５ｍＭ）及びＨ２Ｏ２（１０ｍＭ）の混合溶液１００μＬを添加した後、室温で１０分間インキュベートした点、並びに４５０ｎｍの吸光度を測定した点を除き、実施例１と同じ方法でインフルエンザウイルスの検出を行った。異なる濃度のインフルエンザウイルスＡ（Ｈ３Ｎ２型）に対する吸光度値に基づき、用量依存曲線を構築した。
【００５８】
５．Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体によるウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の検出
Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様活性を利用した、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の検出を検討した。検出システムの選択性を、以下の４つの異なる混合成分を用いて評価した。
ａ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｂ）標的ウイルス／非特異的抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｃ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ／Ｈ２Ｏ２、
ｄ）標的ウイルス／特異的抗体（Ｈ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体）結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ／ＴＭＢ。
ａ）の溶液は、標的ウイルス及び特異的抗体結合ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴの存在下で、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加すると、濃い青色を呈し、６５５ｎｍで吸光度のピークが得られた（図５（ａ））。ｂ）〜ｄ）の溶液では、特徴的なピークは観察されなかった。これにより、Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を用いたインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の検出方法が、非常に高い特異性を示し、ＴＭＢ及びＨ２Ｏ２存在下で呈色反応を示すことが確認された。
【００５９】
６．ウイルス（Ｈ３Ｎ２型）濃度とＨ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体による検出の関係
Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のペルオキシダーゼ様活性による特徴的な呈色反応の吸光度と、標的ウイルスであるインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）の濃度との関係について調べた。その結果、ウイルス濃度が１０から５０，０００ＰＦＵ／ｍＬの範囲において、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図５（ｂ））。一方、ＢＳＡを用いた場合及び特異的な関係にないインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を用いた場合には、顕著な呈色反応は確認されなかった。なお、Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体によるウイルスの検出限界は３．４ＰＦＵ／ｍＬと算出された。一方、従来のＥＬＩＳＡ法の検出限界は１３１２ＰＦＵ／ｍＬであった。
【００６０】
また、上記結果を、従来のＥＬＩＳＡ法及び市販のインフルエンザ診断キット（ＩｍｍｕｎｏＡｃｅ  Ｆｌｕ，ＴＡＵＮＳ  Ｌａｂ社）の結果と比較した。従来のＥＬＩＳＡ法では、ウイルス濃度が１０００ＰＦＵ／ｍＬとなる付近から、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図５（ｂ））。市販のインフルエンザ診断キットを用いた場合には、ウイルス濃度が５０００ＰＦＵ／ｍＬとなる付近から、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（Ahmed et al., 2014, Biosens Bioelectron 58: 33-39）。これにより、Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を用いた場合の検出感度が、従来のＥＬＩＳＡ法よりも１００倍以上高く、市販のインフルエンザ診断キットよりも５００倍以上高いことが示された（表１）。
【００６１】
【表１】
2018021864.tif 000002
【００６２】
また、ＩｇＧ（ヤギ  抗ウシ  ＩｇＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）及びＢＳＡを用いて阻害物質の影響も調べた。その結果、Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体を用いた比色免疫測定法は、たとえ複雑な生物学マトリックスにおいても他の物質によって阻害されることはなく、信頼性の高い検出方法であることが示された。
【００６３】
７．Ｈ1Ｎ1抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体のウイルス（Ｈ1Ｎ1型）のサンドイッチ法への応用
Ｈ３Ｎ２抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ複合体と同様の方法により、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ1Ｎ1型）に対するＮＡ抗体とＡｕＮＰｓ−ＣＮＴの複合体を調製した。
ＮＡ抗体に結合した（＋）ＡｕＮＰｓに代えて、ＮＡ抗体に結合したＡｕＮＰｓ−ＣＮＴを用いた点を除き、（＋）ＡｕＮＰｓ−Ｈ1Ｎ1抗体複合体と同様の方法により、サンドイッチ法へ適用した。なお、抗ＮＡ抗体とＡｕＮＰｓ−ＣＮＴの結合は、金ナノビーズベースＥＬＩＳＡ試験及びゼータ電位分析により確認済である。
【００６４】
実施例１と同様に、呈色反応の吸光度と、標的ウイルスであるインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）の濃度との関係について調べた。その結果、ウイルス濃度が１０ｐｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲において、ウイルス濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図６（ｂ））。なお、検出限界は５．１２ｐg／ｍＬと算出された。
【００６５】
また、上記の結果を、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡの結果（図６（ａ））と比較すると、Ｈ１Ｎ１抗体−ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴのＨ１Ｎ１抗体複合体を用いた場合の検出感度が、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法よりも１０００倍以上高いことが示された。
【００６６】
（実施例３  金ナノ粒子−グラフェン複合体を用いたノロウイルスの検出）
１．金ナノ粒子−グラフェン複合体（ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体）の合成
ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体は、ワンステップ調製により以下のように調製された。
１ｍＬの２０ｍＭテトラクロリド金（ＩＩＩ）酸・３水和物及び２ｍｇのグラフェンフレーク（Ｍｏｄｅｌ  ＡＯ−３，Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｍａｒｋｅｔ社）を５分間混合した。続いて混合液に２ｍＬの２００−５００ｍＭ  ギ酸ナトリウムを加え、室温で１時間維持した。金イオンが静電気的作用によりグラフェンフレークに付着し、ギ酸ナトリウムによりグラフェン表面に付着した金イオンが還元され、グラフェン表面に安定化した。
【００６７】
２．ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の特性評価
合成したＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の形態を観察した。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像の生成及びナノ構造フィルムのＵＶ／ｖｉｓ吸収測定は、実施例１と同様の方法により行った。合成に用いられたギ酸ナトリウムの濃度により、異なるサイズの金ナノ粒子及びナノクラスターが、Ｇｒ表面に分布していた。ギ酸ナトリウムの濃度が２００ｍＭの場合には、約５００ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子、ギ酸ナトリウムの濃度が３００ｍＭの場合には、約２００ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子、ギ酸ナトリウムの濃度が４００ｍＭの場合には、約８０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子、ギ酸ナトリウムの濃度が５００ｍＭの場合には、約１０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子がそれぞれ付着していた。これは、合成に用いるギ酸ナトリウムの濃度によって、吸光度の範囲を調整し得ることを意味する。驚くべきことに、約５００ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子は非球状の構造をしていた。この実施例３においては、約１０ｎｍの粒子径を有する金ナノ粒子を用いて以下実験を行った。
【００６８】
３．ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の活性の確認
ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の含まれる溶液の色は、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加した数秒後に濃い青色に呈色し、ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のペルオキシダーゼ様活性が確認された。ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体は、Ｇｒ単体よりも高いペルオキシダーゼ様活性を示した。また、金ナノ粒子の粒径が１０ｎｍであるＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体は、Ｇｒ単体の約８倍、金ナノ粒子の粒径が５００ｎｍであるＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体の、約６倍の吸光度を示した。これにより、複合体に含まれるＡｕＮＰｓの粒子径を小さくすることで、Ｈ２Ｏ２によるＴＭＢの触媒による酸化を高められることが示された。
ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のペルオキシダーゼ様活性を最大とする最適な条件について検討したところ、最適なｐＨはｐＨ７．５であり、最適な反応時間は５分であることが分かった。また、ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のペルオキシダーゼ様活性を最大にするには、Ｈ２Ｏ２とＴＭＢの比率は２：１が好ましいことが分かった。
【００６９】
４．抗ノロウイルス抗体（ＮＳ１４）結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒの作製
ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴ溶液に代えて、上記１で作成したＡｕＮＰｓ−Ｇｒ溶液を用いた点、及びＨ３Ｎ２  ＭＡｂ抗体に代えて、抗ノロウイルス抗体（ＮＳ１４）を用いた点を除き、ＡｕＮＰｓ−ＣＮＴとＨ３Ｎ２抗体の結合と同様の方法により、抗ノロウイルス抗体と結合したＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体（以下、「ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体」とも表す）を得て、１ｍＬの超純水に再分散させた。ＮＳ１４抗体とＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体は、アミド結合により結合する。ＡｕＮＰｓ−Ｇｒと抗ノロウイルス抗体が結合していることを、フーリエ変換赤外分光光度計を用いて確認した。
【００７０】
５．組換えバキュロウイルスを用いたノロウイルス様粒子（ＮｏＶ−ＬＰｓ）の発現及び精製
２０１０年に、ヒトノロウイルスゲノムｃＤＮＡ（ＧＩＩ．４  ｓｔｒａｉｎ，ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ：ＬＣ１５３７４９）を、ヒトの便試料から単離した。プライマーＴＣＮＦ（５’−ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＡＴ−３’）及びＴＣＮＲ（５’−ＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＧ−３’）を用いてｃＤＮＡの全長ＯＲＦ２をＲＴ−ＰＣＴにより増幅し、開始コドンの前にＢａｍＨＩ部位、終始コドンの後にＸｂａＩ部位を付加した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより分解し、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の対応する部位にクローニングし、トランスファープラスミドｐＶＬ１３９３−ＴＣＮ−ＶＰ１を得た。ｐＶＬ１３９３−ＴＣＮ−ＶＰ１をＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）及びリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）と混合して組換えバキュロウイルスを作製し、Ｓｆ−９昆虫細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）に感染させた。その昆虫細胞を、１０％ウシ胎児血清（シグマ  アルドリッチ社）及び０．２６％トリプトースホスフェートブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を追加したＴＣ−１００培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）中で、２６．５℃でインキュベートした。Ｓｆ−９昆虫細胞における三回のプラークアッセイにより、組換えウイルスを純化し、Ａｃ［ＴＣＮ−ＶＰ１］と命名した。
【００７１】
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの昆虫細胞ラインであるＢＴＬ−Ｔｎ  ５Ｂ１−４（Ｔｎ５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大量発現を行った。Ｔｎ５細胞を、１０の感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ））でＡｃ［ＴＣＮ−ＶＰ１］に感染させ、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）４０５培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で、２６．５℃で培養した。感染細胞培養液を１０，０００ｘｇで６０分間遠心分離することにより上清を得て、その上清をさらにＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５５Ｔｉローターにおいて３２，０００ｒｐｍで３時間回転した。
得られたペレットを再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５５Ｔｉローターにおいて３５，０００ｒｐｍ（１０℃）で２４時間ＣｓＣｌ勾配遠心分離した。
【００７２】
感染７日後にＡｃ［ＴＣＮ−ＶＰ１］に感染したＴｎ５細胞から細胞培養上清を採取した。ＣｓＣｌ勾配遠心分離の画分中のＮｏＶ−ＬＰｓタンパク質をウェスタンブロットにより検出した。２本の主要タンパク質バンドが画分１０〜１４で５８ｋＤａ及び５５ｋＤａにおいて観察された。５８ｋＤａのバンドは全長ＶＰｓであり、５５ｋＤａは部分的に加工されたＶＰｓであった。ＮｏＶ−ＬＰｓのＴＥＭ像から、画分１１において、天然ノロウイルスと同様の約３８ｎｍの直径を有する単分散した球状の粒子が確認された。
【００７３】
６．抗原−抗体反応によるＮｏＶ−ＬＰｓの検出
ＮｏＶ−ＬＰｓストック溶液をヒト血清で段階的に希釈したものを用いた点、血清吸着済みウェルに添加したのが５０μＬのＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体（１ｎｇ／ｍＬ）である点、ＢＳＡ（１００μＬ，１ｎｇ／ｍＬ）及びインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１型，１００μＬ，１μｇ／ｍＬ）をネガティブコントロールとして用いた点、ＴＭＢ（５ｍＭ）及びＨ２Ｏ２（１０ｍＭ）の混合溶液１００μＬを添加した後、室温で１０分間インキュベートした点、並びに４５０ｎｍの吸光度を測定した点を除き、実施例１と同じ方法でＮｏＶ−ＬＰｓの検出を行った。異なる濃度のＮｏＶ−ＬＰｓに対する吸光度値に基づき、用量依存曲線を構築した。なお、ＮＳ１４抗体のＮｏＶ−ＬＰｓに対する特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認済である。
【００７４】
７．ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のＮｏＶ−ＬＰｓの検出への適用
ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のペルオキシダーゼ様活性を利用した、ＮｏＶ−ＬＰｓの検出を検討した。検出システムの選択性を、以下の４つの異なる混合成分を用いて評価した。
ａ）ＮｏＶ−ＬＰｓ／特異的抗体（ＮＳ１４）結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｂ）ＮｏＶ−ＬＰｓ／非特異的抗体（ＨＡ  Ａｂ  ６６１８９）結合−Ｇｒ／ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２、
ｃ）ＮｏＶ−ＬＰｓ／特異的抗体（ＮＳ１４）結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ／Ｈ２Ｏ２、
ｄ）ＮｏＶ−ＬＰｓ／特異的抗体（ＮＳ１４）結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ／ＴＭＢ。
ａ）の溶液は、ＮｏＶ−ＬＰｓ及び特異的抗体（ＮＳ１４）結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒの存在下で、ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を添加すると、濃い青色を呈し、６５５ｎｍで吸光度のピークが得られた（図７（ａ））。ｂ）〜ｄ）の溶液では、特徴的なピークは観察されなかった。これにより、特異的抗体結合ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体を用いたＮｏＶ−ＬＰｓの検出方法が、非常に高い特異性を示し、ＴＭＢ及びＨ２Ｏ２存在下で呈色反応を示すことが確認された。
【００７５】
８．ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度とＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体による検出の関係
ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体のペルオキシダーゼ様活性による特徴的な呈色反応の吸光度と、ＮｏＶ−ＬＰｓの濃度との関係について調べた。その結果、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度が１００ｐｇ／ｍＬから１０μＬ／ｍＬの範囲において、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図７（ｂ））。一方、ＢＳＡを用いた場合及び特異的な関係にないインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を用いた場合には、顕著な呈色反応は確認されなかった。なお、ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体によるＮｏＶ−ＬＰｓの検出限界は９３．５ｐｇ／ｍＬと算出された。一方、従来のＥＬＩＳＡ法の検出限界は１０,４１６ｐｇ／ｍＬであった。
【００７６】
また、上記の結果を、従来のＥＬＩＳＡ法及び市販のノロウイルス診断キット（ＮＶ−ＡＤ（ＩＩＩ），デンカ生研社）の結果と比較した。従来のＥＬＩＳＡ法では、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなる付近から、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した（図７（ｂ））。市販のノロウイルス診断キットを用いた場合には、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度が１ｎｇ／ｍＬとなる付近から、ＮｏＶ−ＬＰｓ濃度の増加に伴い呈色反応の吸光度が上昇した。なお、市販のノロウイルス診断キットの検出限界は、３．８ｎｇ／ｍＬであった。これにより、ＮＳ１４抗体−ＡｕＮＰｓ−Ｇｒ複合体を用いた場合の検出感度が、従来のＥＬＩＳＡ法よりも１０００倍以上高く、市販のノロウイルス診断キットよりも１０倍以上高いことが示された（表２）。
【００７７】
【表２】
2018021864.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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